FR 2897615 A1 20070824 FR 0601584 A 20060223 1 PEPTIDES À PROPRIETES D'ANTAGONISTE ALLOSTERIQUE SELECTIF DU RECEPTEUR ADRENERGIQUE ALPHA1a ET LEURS APPLICATIONS. La présente Invention est relative à des peptides ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala et à leurs appli- cations thérapeutiques et pharmacologiques. Les récepteurs adrénergiques (adrénorécepteurs ou RA) classiques regroupent neufs sous-types de récepteurs caractérisés pharmacologiquement : trois adrénorécepteurs alphal (al) : alphala (aga), alphalb (îlb), alphald (and)) ; trois adrénorécepteurs alpha2 (112): alpha2a (î2a), alphalb (î2b), alpha2c (azc)) et trois adrénorécepteurs béta 03): bétal ((3,), béta2 ((32), béta3 033) . Ces neuf récepteurs qui sont tous activés par les catécholamines, adrénaline et noradrénaline, produisent des effets physiologiques variés, par transduction du signal par couplage à une protéine G. Les récepteurs alphal sont surtout exprimés en position post-synaptique du système nerveux sympathique et leur activation conduit à une contrac- tion des muscles lisses qui sont sous leur contrôle. Ces récepteurs jouent un rôle majeur dans le système cardiovasculaire et génito-urinaire, à l'état normal ou pathologique (Pour une revue voir : Piascik et al., Pharmacol. Ther., 1996, 72, 215-241 ; Michelotti et al., Pharmacology & Therapeutics, 2000, 88, 281-309). En outre, il a été démontré que la tonicité musculaire de l'ensemble des organes uro-génitaux chez l'homme et chez la femme, est principalement contrôlée par l'activation du sous-type alphala, alors que celle des veines et artères est surtout contrôlée par l'activation des sous-types alphalb et alpe ald (Barrow J.C. et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 2703-2718). Par conséquent, le blocage des récepteurs alphala permet d'obtenir un relâchement des muscles lisses de l'appareil uro-génital qui peut être utilisé dans le traitement des dysfonctionnements urinaires et des troubles de l'érection (Moreland et al., The Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics, 2004, 308, 797-804 ; Guiliano et al., Progrès en Urologie, 1997, 7, 24-33). Les principales pathologies qui peuvent être traitées sont : - les obstructions fonctionnelles de l'appareil urinaire chez la femme ou chez l'homme. L'adénome prostatique, ou hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) correspond à l'évolution normale de la taille de la prostate qui augmente à 2 partir de 40 ans. Cette hypertrophie de la prostate dont la fréquence augmente avec l'âge (80% des hommes de plus de 70 ans) peut s'accompagner d'une obstruction plus ou moins importante de l'urètre, à l'origine de troubles urinaires. Différentes approches ont été envisagées pour traiter cette affection ; il s'agit à chaque fois de bloquer le fonctionnement d'une enzyme (5-a-réductase), d'un transporteur (NET). ou d'un récepteur sensible à la sérotonine, au cannabinoïde, au glutamate, au calcium ou à l'adrénaline. Toutefois, c'est en bloquant les récepteurs adrénergiques alphal que les meilleurs résultats ont été obtenus. En effet, le blocage de ces récepteurs permet ul relâchement des muscles lisses et un écoulement urinaire normal. - l'incontinence : l'incontinence peut être due à une pression de la vessie supérieure à la force de rétention de l'urètre. Le blocage des adrénorécepteurs alphal a permettrait de diminuer la pression de la vessie. - les troubles érectiles : certains problèmes érectiles peuvent être traités en inhibant l'activité des adrénorécepteurs alphala, afin de favoriser l'irrigation des corps caverneux. En outre, il a été suggéré que le blocage des adrénorécepteurs alphala aurait un effet préventif et curatif sur les tumeurs de la prostate (Brevets européens EP 0 799 618, et EP 0 799 619, Thebault et al., The J. Clin. Invest., 2003, 111, 1691-1701). Deux classes de molécules sont actuellement disponibles pour diminuer l'activité des adrénorécepteurs alphala au niveau des organes uro-génitaux : - des antagonistes du récepteur adrénergique alphal De nombreux antagonistes compétitifs de l'adrénaline qui se lient spécifiquement au niveau du site orthostérique des récepteurs adrénergiques alphal ont été identifiés : quinazolines (prazosine, térazosine, alfusozine, doxazosine), piperazines (RWJ-38063, RWJ-68 141, RWJ-68157, RWJ-69736), phénylalkamines (tamsulosine, indoramine), silodosine. Toutefois, toutes ces molécules, à l'exception du KMD3213 (silodosine), provoquent des effets secondaires indésirables (hypotension), du fait qu'ils ne possèdent pas de sélectivité pour le sous-type adrénergique alphala. Le KMD3213 (silodosine) est le premier antagoniste compétitif ayant une sélectivité pour le sous-type alphala (Shibata et al., Mol. Pharmacol., 1995, 48-250-258). Cette molécule est en phase clinique pour le traitement de l'hypertrophie de la prostate (Drugs, R. D. 2004, 5, 50-51). - des modulateurs allostériques du récepteur adrénergique alphal Les seuls modulateurs allostériques connus actuellement pour ces adrénorécepteurs sont les amilorides (Leppik et al., Mol. Pharmacol., 2000, 57, 436-445) et les rho-conotoxines (p-conotoxines), représentées par le peptide p-TIA (Sharpe et al., Nature Neuroscience, 2001, 4, 902-907 ; Brevet européen EP 1 117 681). Les amilorides sont peu spécifiques et actifs à de très fortes concentrations. Le peptide p-TIA est un peptide naturel de 19 résidus réticulé par deux ponts disulfure (FNWRCCLIPACRRNHKKFC ; SEQ ID NO : 1), extrait du venin de cône marin Conus tulipa. Ce peptide présente une affinité de l'ordre de 100 nM pour les adrénorécepteurs al, et une faible sélectivité (affinité de 10 nM) pour le sous-type alb qui contrôle la tonicité des vaisseaux. Le Brevet européen EP 1 117 681 envisage l'utilisation du peptide p-TIA pour la prévention et le traitement de pathologies cardiovasculaires (hypertension), urinaires (hypertrophie de la prostate), de la douleur et de l'inflammation. Ces deux modulateurs allostériques des récepteurs adrénergiques alphal sont susceptibles de produire des effets secondaires indésirables, notamment au niveau des vaisseaux (hypotension), du fait de leur absence de sélectivité pour le sous- type alpha l a. De nombreuses neurotoxines ont été isolées à partir du venin des mambas africains Dendroaspis angusticeps (mamba vert) et Dendroaspis polylepis (mamba noir) (Pour une revue voir Bradley, N; Pharmacology & Therapeutics, 2000, 85, 87-109 ; Jolkkonen M. et al., Eur. J. Biochem., 1995, 234, 2, 579-85). La famille des toxines à trois doigts ou famille des toxines cholinergiques regroupe les toxines muscariniques (MT) qui se lient aux récepteurs de l'acétylcholine de type muscarinique, les neurotoxines alpha (a- neurotoxines) qui se lient aux récepteurs de l'acétylcholine post-synaptiques de type nicotinique et les fasciculines qui sont des inhibiteurs non-compétitifs des acétylcholinestérases. Ces toxines sont des peptides de 63 à 66 acides aminés possédant quatre ponts disulfure (entre les cystéines 1 et 3, 2 et 4, 5 et 6 et 7 et 8 : ponts 1-3, 2-4, 5-6 et 7-8) et une structure caractéristique à trois doigts dans laquelle les boucles I, II et III forment les trois doigts centraux de la main 4 et les ponts disulfure, la paume de la main. Six toxines muscariniques ont été isolées chez Dendroaspis angusticeps [MTX 1 (MT I ), MTX2 (MT2), MTX3 (MT3 ou m4-tox), MTX4 (MT4), MTXS (MT5), MIX7 (MT7, m l-tox)], et deux chez Dendroaspis polylepis [MT-alpha (MTOE) et MT-béta (Mn)]. En dépit d'une forte homologie de séquence, ces peptides possèdent une spécificité dans leurs interactions avec les différents sous-types de récepteurs muscariniques et des effets pharmacologiques distincts. Du fait de cette spécificité, ces peptides ont été utilisés comme outil pour déterminer le rôle physiologique de certains sous-types de récepteurs musca- riniques. Les inverteurs ont isolé une nouvelle toxine à partir du venin de Dendroaspis angusticeps. Cette toxine dénommée AdTxl, lie sélectivement le récepteur adrénergique alphala et diminue allostériquement l'affinité des ligands orthostériques. AdTx 1 présente une séquence de 65 acides aminés (SEQ ID NO : 2) : LTC1VTS KS I FG I TTEDC:z PDGQNLC3 FKRRHYVV PKIYDSTRGC4AATC5 P I PENYDS IHC6C7KTDKC8NE La structure d'AdTx1 comprend 4 ponts disulfure, entre les cystéines en positions 3 et 24 (cystéines 1 et 3 : pont 1-3), 17 et 42 (cystéines 2 et 4 : pont 2-4), 46 et 57 (cystéines 5 et 6 : pont 5-6), 58 et 63 (cystéines 7 et 8 : pont 7-8), caractéristiques de la famille des toxines à trois doigts agissant sur le système cholinergique. La séquence d'ATxl présente une très forte homologie avec certaines séquences de toxines à trois doigts : Tableau I : Homologie entre AdTxl et certaines toxines à trois doigts Peptide Nombre N d'accès Identité Similarité d'acides SwissProt aminés MT-béta 65 P80495 96 % (63165) 96 %(63165) Synergistic-like 65 P25518 95 % (61165) 96 % (62165) venom protein CM-3 MT3 65 P81031 81 % (53/65) 89 % (58/65) Muscarinic toxin-like 65 P82463 76 % (49/65) 79 % (51165) protein 2 (MTLP-2) MT4 66 Q9PSN1 74 % (49/66) 86 % (57/66) MT2 65 P18328 70 % (46/75) 80 % (52165) MT1 66 P81030 72 % (48/66) 84 % (56166) MT7 65 Q8QGRO 67 % (44165) 78 % (51165) MT-alpha 66 P80494 71 % (47166) 83 % (55166) Cette nouvelle toxine définit une sous-famille de peptides de la famille des toxines à trois doigts, caractérisés par leur propriété d'antagoniste allostérique du récepteur adrénergique alphala. En outre, cette propriété d'antagoniste allostérique du récepteur adrénergique alphala est nouvelle et ne découle pas de manière évidente des propriétés des toxines à trois doigts qui sont décrites dans l'état de la technique. En conséquence, la présente invention est relative à des peptides caractérisés par : a) une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 2, et les variants dérivés possédant au moins 70 % d'identité ou 80 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO : 2, b) une structure à trois doigts incluant huit résidus de cystéine (cystéines 1 à 8) reliés par quatre ponts disulfure, respectivement entre les cystéines 1 et 3, 2 et 4, 5 et 6, 7 et 8 (ponts 1-3, 2-4, 5-6 et 7-8), et c) une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (ala), pour une utilisation comme médicament. Les peptides tels que définis dans la présente invention sont capables de bloquer spécifiquement les récepteurs adrénergiques alphala, du fait de leur sélectivité pour le sous-type adrénergique alphala. En outre, contrairement aux inhibiteurs (antagonistes compétitifs), ils agissent comme modulateurs de l'affinité des agonistes ; de tels modulateurs ont l'avantage de ne pas bloquer le fonctionnement du récepteur mais seulement de moduler leurs réponses lorsqu'ils sont activés par leur agoniste naturel. Cette modulation semble plus facile à contrôler qu'avec des antagonistes compétitifs. De plus, il n'existe pas d'effet plateau lors d'une utilisation massive d'antagonistes allostériques, ce qui diminue d'autant les effets toxiques potentiels. * Définitions : - Au sens de la présente invention on entend par structure à trois doigts , la structure caractéristique de la famille des toxines à trois doigts telle que définie ci-dessus, laquelle structure comprend trois boucles (boucles I, II, II) mainte-nues par quatre ponts disulfure (ponts 1-3, 2-4, 5-6, 7-8), - L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de SEQ ID NO :2 comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'Homme du métier 15 en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 1997, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en oeuvre sur la fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la SEQ ID NO :2, indiquée comme séquence de référence. 20 Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente Invention comme un peptide dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence, en l'occurrence son activité d'antagoniste sélectif du 25 sous-type adrénergique alphala. Au sens de la présente Invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique par analogie aux séquences nucléotidiques. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence 30 s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de 10 7 la présente Invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles du peptide. Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est défini, dans la présente Invention comme un peptide dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. - Au sens de la présente invention on entend par antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphal a , un peptide qui lie sélective-ment le récepteur adrénergique alphala et est capable de diminuer allostériquement l'affinité des ligands orthostériques dudit récepteur. Selon la nomenclature conventionnelle, le site orthostérique est le site de liaison de l'agoniste endogène du récepteur (adrénaline dans le cas du récepteur adrénergique alphala). Ce site est également le site de liaison de certains antagonistes (prazosine, dans le cas du récepteur adrénergique alphala). La modulation allostérique implique que le récepteur est capable de lier deux ligands, de façon concomitante, par l'intermédiaire de deux sites de liaison topographiquement distincts ; le ligand orthostérique se lie au site orthostérique alors que le modulateur se lie à un site distinct (site allostérique). Les deux sites de liaison sont liés de façon conformationnelle, si bien que la liaison d'un ligand sur le site 1 perturbe la structure du site 2, modifiant ainsi son affinité pour son propre ligand. Dans le cas des peptides modulateurs selon l'invention, la liaison du peptide au récepteur adrénergique alphala diminue l'affinité d'antagonistes spécifiques du récepteur, tels que la prazosine et vice-versa. L'activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphal a peut étre mise en évidence par toute technique classique connue de l'Homme du métier : 8 - par mesure de la liaison d'un ligand orthostérique (prazosine) en présence du ligand allostérique (peptide), par un test de liaison ligand/récepteur classique ; le déplacement de la liaison du ligand orthostérique au récepteur adrénergique alpha I a, par des concentrations croissantes de peptide démontre que le peptide est un inhibiteur du récepteur adrénergique alphala ; l'absence de déplace-ment complet signe une modulation allostérique. La sélectivité pour le récepteur adrénergique alphal a est démontrée par des tests de liaison, en présence des autres sous-types (alphalb, alphal d) et types (alpha2, béta) de récepteurs adrénergiques. - par mesure de la cinétique de dissociation des complexes ligand orthostérique marqué-récepteur, en présence du ligand allostérique, selon le principe décrit dans Ellis J. et Seidenberg M, Mol. Pharmacol., 2000, 58 : 1451-1460. - par mesure de l'inhibition de l'activation des récepteurs alphala exprimés dans des cellules eucaryotes, afin de montrer son caractère antagoniste. Des cellules eucaryotes de type COS ou HEK, par exemple, exprimant un récepteur adrénergique, par exemple alphala, ont la capacité de libérer du calcium dans le cytosole lors de l'activation du récepteur, par l'adrénaline par exemple. Ainsi, lors de la liaison de l'adrénaline sur son site orthostérique, le récepteur est activé. II change de conformation afin de pouvoir lier une protéine G cytoplasmique. Cette liaison induit une cascade d'évènements permettant entre autre la synthèse de diacylglycérol et de inositol triphosphate (IP3). Ce dernier, en se fixant sur le récepteur à IP3, permet le relargage de calcium dans le cytosole. C'est cette variation de concentration en calcium qui est suivie par fluorescence. Cette technique permet de montrer le caractère agoniste ou antagoniste d'un produit. L'invention englobe l'utilisation de peptides naturels, synthétiques ou recombinants ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala. L'invention englobe notamment l'utilisation de variants obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence SEQ ID NO: 2, dès lors que ledit variant conserve une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala. L'invention englobe également l'utilisation de peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) 9 d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique al phal a. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : la substitution d'un acide aminé naturel par un acide aminé nonprotéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupe-ment chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (ûCO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'un peptide ou d'une protéine d'intérêt (épitope d'intérêt pour l'immunodétection ; étiquettes (biotine, peptides, flag, notamment) utiles pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase, protéine fluorescente ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité, ou à faciliter la purification ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de récepteurs adrénergiques alphal. On entend par acide aminé naturel ou synthétique, les 20 a-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la (3-alanine, l'acide y-aminobutyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine.... ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents. Selon un rnode de réalisation avantageux dudit peptide, il s'agit de la toxine MT-béta (SWISSPR_OT P80495, SEQ ID NO : 3), un peptide naturel extrait du venin du serpent Dendroaspis polylepis (mamba noir) ; les séquences des toxines MT- béta et AdTxl différent uniquement au niveau des résidus en positions 38 et 43 qui sont respectivement I38 et V43 (MT-béta), et S38 et A43(AdTx l ). 10 Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide, la cystéine 1 est le premier ou le second résidu d'acide aminé et/ou la cystéine 8 est l'avant dernier ou le dernier résidu d'acide aminé de la séquence dudit peptide. Ce peptide représente un peptide tronqué, dérivé des peptides précédents par délétion d'au moins un des résidus N et/ou ou C terminal, situé en amont de la cystéine 1 ou en aval de la cystéine 8. Pour les applications médicales, il est possible de modifier le peptide afin de changer ses propriétés physiologiques, comme modifier son temps de '/2 vie dans l'organisme (glycosylation : HAUBNER R. et al., J. Nucl. Med., 2001, 42, 326- 36 ; conjugaison avec du PÉG : KIM TH. et al., Biomaterials, 2002, 23, 2311-7), sa solubilité (hybridation avec de l'albumine : KOEHLER MF. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 2883-6), sa résistance aux protéases (acides aminés non naturels (conformation L, par exemple), son absorption intestinale (Lien et al., TIB, 2003, 21, 556-). La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction, pour une utilisation comme médicament. Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide ; il s'agit notamment de la séquence SEQ ID NO : 4 codant pour AdTx 1. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée. En outre, ledit polynucléotide peut être lié à au moins une séquence hétérologue. On entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant pour un peptide tel que défini dans la présente invention, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiate-ment adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide. Conformément à l'invention ledit vecteur recombinant comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la ll traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les AAV et les baculovirus, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide, un polynucléotide codant ledit peptide, ou un vecteur tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (nasale, rectale, vaginale). Les véhicules pharmaceutiquement acceptables sont ceux classi-quement utilisés. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide et/ou un vecteur tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique 12 alphala ((lia), destiné au traitement d'une pathologie uro-génitale ou cardiovasculaire, ou bien d'un cancer. Les pathologies uro-génitales comprennent les dysfonctionnements urinaires : incontinence, obstruction fonctionnelle de l'appareil urinaire chez la femme ou chez l'homme, et les troubles de l'érection. De préférence, ladite pathologie uro-génitale est l'hyperplasie bénigne de la prostate ; l'augmentation de volume de la prostate entraîne une obstruction de l'urètre, à l'origine de dysfonctionnements urinaires. Le blocage des adrénorécepteurs alphala permet un relâchement des muscles lisses et un écoulement urinaire normal. Les pathologies cardiaques comprennent principalement l'hypertension artérielle, dans la mesure où le blocage des récepteurs alphala entraîne une hypotension. Certaines formes d'hypertension sont dues à une phéochromocytome ; l'utilisation d'un alpha bloquant est recommandée avant l'opération chirurgi- cale. Les pathologies cancéreuses comprennent principalement le cancer de la prostate dans la mesure où les récepteurs adrénergiques alphala sont majoritairement exprimés dans cet organe. L'inhibition des adrénorécepteurs ralentirait la prolifération des cellules épithéliales du cancer de la prostate. La présente invention a également pour objet l'utilisation du peptide de séquence SEQ ID NO 2 ou d'un variant dérivé ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (aga) tels que définis ci-dessus, comme outil pour l'étude du récepteur adrénergique alphala. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide est couplé à un marqueur approprié. Les peptides tels que définis dans la présente Invention peuvent être marqués directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif, par couplage covalent ou non-covalent, afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifiable. Le marquage est notamment un marquage radioactif, magnétique, fluorescent, effectué selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Les marqueurs détectables de manière directe sont notamment des isotopes radioactifs tels 13 que le tritium (3H) et l'iode (1251) ou des composés luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les marqueurs détectables de manière indirecte incluent notamment la biotine et les épitopes B. Le marquage est notamment réalisé : - par greffage d'un fluorophore sur une amine réactionnelle, c'est-à-dire portée par une lysine. On peut par exemple obtenir l'AdTx1 mutée en 34, la lysine étant remplacée par une homoarginine et dans laquelle le réactif Cy3b (Amersham) a été greffé sur une ou plusieurs des autres lysines de l'AdTxl, - par incorporation directe d'un fluorophore par synthèse chimique (en N ou C-terminal), - parincorporation d'un groupement réactionnel (cystéine libre, biotine) par synthèse ou production recombinante, puis utilisation de ce groupement pour greffer un fluorophore. De tels peptides marqués sont notamment utilisés pour localiser les récepteurs adrénergiques alphala, in vitro et in vivo, de façon à déterminer leur profil d'expression tissulaire, dans des conditions physiologiques, pathologiques ou en réponse à un stimulus endogène ou exogène. La présente invention a également pour objet un procédé de détec-tion de récepteur(s) adrénergique(s) alphal a, in vitro et in vivo, comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact de cellules à analyser avec un peptide marqué tel que défini ci-dessus, et -la détection des cellules marquées par tout moyen approprié. La détection des récepteurs, in vivo, dans l'organisme d'un mammifère (imagerie cellulaire), notamment en temps réel, comprend une étape préalable d'administration dudit peptide audit mammifère (injection parentérale, administration orale). Le marquage des cellules est notamment un marquage fluorescent ou un marquage magnétique, détectable par toute technique connue de l'Homme du métier (microscopie de fi uorescence, cytométrie de flux, imagerie de résonance magnétique). 14 Alternativement les peptides marqués sont utilisés pour cribler des banques de molécules, dans le but d'identifier d'autres ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala. La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de ligands allostériques du récepteur adrénergique alphal a, comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact d'un récepteur adrénergique alphala, en présence d'une banque de molécules à tester et d'un peptide marqué tel que défini ci-dessus, et - l'identification des molécules capables de déplacer la liaison dudit peptide audit récepteur, par tout moyen approprié. En outre, les complexes entre le peptide tel que défini dans la présente invention et le récepteur adrénergique alphal a peuvent être avantageusement utilisés pour obtenir des cristaux ; de tels cristaux permettent de déterminer la stuc- ture tridimensionnelle du récepteur adrénergique alphala, par diffraction aux rayons X. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de cristaux du récepteur adrénergique alphal, comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact du récepteur adrénergique alpha 1 avec un peptide tel que défini ci-dessus, de manière à former des complexes récepteur/ligand, et b) l'incubation des complexes obtenus en a) dans des conditions et pendant une durée suffisante pour obtenir la formation de cristaux. La présente invention a également pour objet un complexe récepteur/ligand dans lequel le récepteur est le récepteur adrénergique alphala et le peptide est un peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement couplé à un marqueur approprié. La présente invention a également pour objet le peptide de séquence 30 SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il est couplé à un marqueur approprié. 25 15 La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide, une cassette d'expression, un vecteur recombinant et une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée, dérivés du peptide précédent. Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide, il présente la séquence SEQ II) NO : 4 codant pour AdTxl. L'invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules trans- formées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides tels que définis dans la présente invention. Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) et Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés) tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant clans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). De manière plus précise, - les peptides et leurs dérivés peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute perfor- mance en phase inverse, - les peptides et leurs dérivés tels que les variants peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est cloné dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre le déplacement de la liaison du peptide AdTxl radiomarqué (125I-AdTx l) au récepteur adrénergique alpha l a, en présence de prazosine (•) ou d'AdTx1 (0). Les valeurs d'IC50 sont de 2.2 10-10M et de 5 10-10 M, respectivement pour la prasozine et le peptide AdTxl. la figure 2 illustre le déplacement de la liaison de la liaison de 3H-prazosine, 3H-rauwolscine et 3H-CPG12177 aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques, par la prazosine ou le peptide AdTxl. (D) déplacement par la prazo- sine, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphal a (IC50 = 0,99.10-9 M). (•) déplacement par AdTxl, (le la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphala (IC50 =- 1,8.109 M). (a) déplacement par AdTxl, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphalb (IC50 = 2,3.10-6 M). (•) déplacement par AdTxl, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphald (IC50 = 9,9.10-6 M). (0) déplacement par AdTxl, de la liaison de 3H-rauwolsine au récepteur alpha2a (IC50 > 5.10-5 M). (0) déplacement par AdTxl, de la liaison de 3H-CGP12177 au récepteur bétal (IC50> 5.105 M).30 17 Exemple 1 : Préparation du polypeptide AdTxl 1) Synthèse chimique Le peptide AdTxl est synthétisé en phase solide par la technique Fmoc (Fluorényl méthyloxy carbonyle), en utilisant le dicyclohexylcarbodiimide/1- hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT) comme agent de couplage et le N-méthyl pyrrolidone comme solvant (Mourier et al., Molecular Pharmacology, 2003, 63, 26-35). Brièvement, la synthèse est effectuée de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale du peptide en utilisant 0,05 mmole de résine. A la fin de la synthèse, la résine/peptide est traitée avec un mélange de 9 ml d'acide trifluoroacétique, 0,5 ml de triisopropylsilane et 0,5 ml d'eau distillée. Le peptide est alors clivé de la résine après deux heures d'incubation. Le mélange est filtré sur de l'éther éthylique froid et centrifugé deux fois. Le précipité ainsi obtenu est dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % et lyophilisé. La toxine synthétique réduite est purifiée par chromatographie en phase inverse (HPLC) sur une colonne semi-preparative Discovery Bio Wide Pore C5, 25cm x 10 mm, 10 m (SUPELCO) avec un gradient de 40 % à 70 % de solvant B en 150 minutes (A : 0,1 % TFA, B : 50 % acétonitrile et 0,1 % TFA), avec un débit de 4,5 ml/min. La détection est suivie à 220 nm. La toxine synthétique est ensuite repliée en tampon Tris 100 mM, pH 8,0, en présence de glutathion réduit (GSSG) et oxydé (GSH) avec un rapport molaire GSSG/GSH de 1/1 et une concentration de 1 mM. Après trois jours à 4 C, dans le noir et sous argon, la toxine synthétique repliée est purifiée par chromatographie en phase inverse (HPLC) dans les mêmes conditions que décrites précédemment. La concentration en toxine synthétique est de 5 M. 2) Production de polypeptide recombinant Le clonage de la séquence nucléotidique codant pour AdTx 1 est réalisé par recombinaison homologue selon la technologie (Gateway ), Invitrogen). Un fragment polynucléotidique (SEQ ID NO : 4) comprenant successivement de 5' en 3' : une séquence de recombinaison attBl, le site de clivage de la TEV (ENLYFQG), la séquence codant pour AdTxl (SEQ ID NO : 3), un pseudo stop, la séquence codant pour le peptide Stag, un codon stop, et la séquence de recombinaison attB2 a été amplifié par PCR. Le produit PCR a été cloné par recombinaison homologue dans le plasmide donneur pDONR221 (Invitrogen). Le clone ainsi obtenu est utilisé pour générer des vecteurs d'expression recombinants, adaptés à l'expression d'AdTxl dans un système cellulaire approprié. Exemple 2 : Analyse de la liaison d'AdTxl aux récepteurs adrénergiques alpha 1 1) Matériels et méthodes a) Iodation de la toxine AdTxl La iodation de AdTxl s'effectue par une réaction d'halogénation, catalysée par la lactoperoxidase. Le mélange réactionnel contenant 50 pl de tampon phosphate 0,1 M à pH 7,3, 10 pl de toxine 100 pM, 10 pl H202 1/50 000 et 1 mCi [1251] et 0,7 Unité de Lactoperoxidase (Sigma) est incubé pendant 1 minute à 25 C. La toxine iodée est ensuite purifiée par HPLC en phase inverse comme précédemment décrit (Krimm I, et al., 1 Mol. Biol., 1999, 285, 1749-63). b) Préparation de membranes contenant le récepteur adrénergique Chaque sous-type de récepteur, al a, un), al d, aga, 131 est exprimé chez la levure Pichia pastoris., transformée par un plasmide d'expression comprenant l'ADNc correspondant audit récepteur. Chaque clone est cultivé de la même façon. Les clones de Pichia pastoris sont inoculés dans 10 ml de milieu (1 % extrait de levure, 2 % peptone, 100 mM Phosphate de Potassium pH 6, 1,3 % base azotée de levure, 1 % Glycérol), pendant une nuit à 30 , puis les cultures sont diluées dans 100 ml de milieu frais et incubées à nouveau pendant 4 h à 30 C. Les cultures sont ensuite centrifugées (3000 g, 5 min), resuspendues dans 500 ml de milieu d'induction (1 % extrait de levure, 2 % peptone, 100 mM Phosphate de Potassium pH 6, 1,3 % base azotée de levure, 0,5 % Méthanol), supplémenté par 2,5 % DMSO et incubées 18 h à 20 C, sous agitation (200 rpm). Les cultures sont récoltées (3000 g, 15 min, 4 C) et resuspendues dans 3 ml de tampon (50 mM Phosphate de Potassium pH 7,4, 100 mM NaCl, 5% Glycérol. 2 mM EDTA et 1 mM PMSF), refroidi dans la glace. Des billes de verre froides (2 ml ; 400-600 pm acid washed glass beads, Sigma) sont ajoutées aux suspensions, puis le mélange est soumis à huit cycles de 30 secondes d'agitation par vortex, suivi d'un repos dans la glace. Les billes de verre et les cellules non lysées sont ensuite séparées du lysat par une centrifugation (5 min à 3000 g, 4 C), et un lavage du culot est effectué dans les mêmes conditions. Le surnageant est récupéré et centrifugé pendant 1 h à 20,000 g. Le culot de chaque préparation est resuspendu dans un tampon (50 mM Tris pH 8, 120 mM NaCl, 10 % Glycérol, 1 mM PMSF) à l'aide d'un homogénéisateur, aliquoté et conservé à -80 C jusqu'à utilisation. c) Tests de liaison. pg de membranes sont mélangés avec 1 nM final de 3H-Prazosine 5 ([7-Methoxy-3H], PerkinElmer Life Sciences), ou de 3H-rauwolscine, [Methyl-3H] (PerkinElmer Life Sciences), ou de 3H-CPG 12177 (PerkinElmer Life Sciences) dans du tampon Tris-HO pH 7,2, additionné de 10 mM de MgC12, dans un volume final de 200 l, puis le mélange est incubé pendant 5 heures à température ambiante, en présence de doses croissantes d'AdTxl (0,01 nM à 100 M). La liaison non spécifique est mesurée en présence de 1 M de prazosine (Sigma) pour la liaison avec 3H-Prazosine, de 11_tM de yohimbine (Sigma) pour la liaison avec 3H-rauwolscine, ou de 1 M de propranolol (Sigma) pour la liaison avec 3H-CPG12177. La réaction est stoppée par filtration précédée d'une dilution du milieu réactionnel dans 2 ml de tampon de lavage (Tris-HCl pH 7,2, 10 mM), à 4 C. La filtration est réalisée sur des filtres de verre (GFC, Whatman) préalablement traités dans du tampon 0,3 % PEI (Polyéthylèneimine, Sigma). Deux lavages successifs et rapides sont effectués. Les filtres sont séchés pendant une heure à 80 C et additionnés de 10 ml de Lipoluma Plus (Lumac LMC). Les émissions sont détectées par un compteur Rockbeta 1211 (LKB Wallac) donnant la valeur de chaque test en cpm (coups par minute). L'analyse des résultats est réalisée, à l'aide du logiciel Kaleidagraph (Tools for discovery, Synergy Software, PA, USA). Les tests de liaison avec le peptide iodé (0.1 nM) sont réalisés suivant le même protocole que celui utilisé pour les ligands tritiés, et la radioactivité est mesurée par un compteur Multigamma 1261 (LKB Wallac). 2) Résultats L'analyse de la liaison du peptide AdTx1 aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques sous-types alphala, lb, Id, 2a et bétal est présentée aux figures 1 et 2. Le peptide AdTx 1 est un ligand du récepteur adrénergique alphal a (figure 1). Les tests de liaison en compétition avec des ligands orthostériques spéci- fiques des différents sous-types de récepteurs adrénergiques (figure 2) indiquent que le peptide AdTx 1 lie sélectivement le sous-type adrénergique alphal a. Ses affinités pour les sous-types alphal a, lb, Id, 2a et bétal, évaluées par la valeur d'IC50, sont respectivement de 1.,8.10-9M, 2,3.10-6 M, 9,9.106 M, > 5.10.5 M, et > 5.10-5 M. La courbe de déplacement de la liaison de la prazosine au récepteur adrénergique alphala, en présence du peptide AdTxl (figures 1 et 2) indique que le déplacement est incomplet, ce qui signe une modulation allostérique. Les résultats présentés aux figures 1 et 2 indiquent que le peptide AdTxl lie spécifiquement le récepteur adrénergique alphala et qu'il diminue allostériquement l'affinité des ligands orthostériques, du fait de cette liaison. C'est donc un antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala.10 REVENDICATIONS 1 ) Peptide caractérisé par : a) une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 2, et les variants dérivés possédant au moins 70 % d'identité ou 80 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO : 2, b) une structure à trois doigts incluant huit résidus de cystéine reliés par quatre ponts disulfure, respectivement entre la première et la troisième cystéine, la deuxième et la quatrième cystéine, la cinquième et la sixième cystéine, et la septième et la huitième cystéine, et c) une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (îia), pour une utilisation comme médicament. 2 ) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 3. 3 ) Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la première cystéine est en position 1 ou 2 et/ou la huitième cystéine est en dernière ou avant dernière position de ladite séquence définie en a). 4 ) Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction, pour une utilisation comme médicament. 5 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un vecteur tel que défini à la revendication 4, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 6 ) Utilisation d'au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un vecteur tel que défini à la revendication 4, pour la préparation d'un médicament ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphal a, destiné au traitement d'une pathologie uro- génitale ou cardiovasculaire, ou bien d'un cancer. 7 ) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite pathologie est sélectionnée dans le groupe constitué par l'hyperplasie bénigne de laprostate, l'incontinence urinaire, les troubles de l'érection, l'hypertension artérielle et le cancer de la prostate. 8 ) Utilisation du peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, in vitro, comme outil pour l'étude du récepteur adrénergique alphala. 9 ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le dit peptide est couplé à un marqueur approprié. 10 ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite étude comprend la détermination du profil d'expression tissulaire du récepteur adrénergique alphala. 11 ) Utilisation du peptide tel que défini à I'une quelconque des revendications 1 à 3 et 8, in vitro, pour cribler des ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala. 12 ) Procédé de criblage de ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala, comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact d'un récepteur adrénergique alphal a, in vitro, avec une banque de molécules à tester et un peptide marqué tel que défini à la revendication 9, et -l'identification des molécules capables de déplacer la liaison dudit peptide audit récepteur, par tout moyen approprié. 13 ) Procédé de détection d'un récepteur adrénergique alphala, in vitro, comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact de cellules à analyser avec un peptide marqué tel que défini à la revendication 9, et - la détection des cellules marquées par tout moyen approprié. 14 ) Procédé de préparation de cristaux du récepteur adrénergique alphal, comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact du récepteur adrénergique alpha 1 avec un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, de manière à former des complexes récepteur/ligand, et b) l'incubation des complexes obtenus en a) dans des conditions et pendant une durée suffisante pour obtenir la formation de cristaux.15 ) Peptide isolé, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO :2. 16 ) Peptide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est couplé à un marqueur approprié. 17 ) Complexe récepteur/ligand isolé, caractérisé en ce que ledit récepteur est le récepteur adrénergique alphala et ledit peptide est un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 8. 18 ) Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il code pour le peptide selon la revendication 15. 19 ) Polynucléotide selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 4. 20 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon la revendication 18 ou la revendication 19. 21 ) Cellule modifiée par le polynucléotide selon la revendication 15 18 ou la revendication 19, ou bien le vecteur selon la revendication 20. 10