FR 2893844 A1 20070601 FR 0512023 A 20051128 "UTILISATION DU GUANABENZ ET DE SES DERIVES POUR LA FABRICATION DE MEDICAMENTS POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE ET DE MALADIES LIEES A UN DEFAUT D'ADRESSAGE DES PROTEINES DANS LES CELLULES" L'invention vise l'utilisation du guanabenz et de dérivés du guanabenz pour fabriquer des médicaments capables de restaurer ladres .sage de protéines du réticulum endoplasmique vers les membranes plasmiques. Il existe un grand nombre de situations pathologiques humaines dans les. ;elles un défaut d'adressage est à l'origine d'une altération le la localisation des protéines, et donc de la composition membranaire et de la fonction cellulaire. Ces maladies comprennent la mucoviscidose, l'hyperinsulinémie hypoglycémiante chez l'enfant, des pathologies neuro- dégénératives comme la maladie de Parkinson, l'emphysème héréditaire, le s.,drome congénital du QT long. Un ré-adressage des protéines impliquées constitue donc un moyen thérapeutique pour ces pathologies. L'organisation fonctionnelle de la cellule eucaryote repose sur un système élaboré de compartiments membranaires ou organites (noyau, réticulum endoblastiques, appareil de Golgi, endosomes) possédant leur propre composition protéique et lipidique. L'adressage des protéines dans la cellule constitue un ensemble de mécanismes moléculaires permettant d'assurer, au cours de la synthèse protéique, le bon repliement, la maturation et la localisation des protéines fonctionnelles. La mucoviscidose (CF : Cystic Fibrosis) est la maladie génétique récessive, autosomique, létale la plus répandue dans les populations européennes et nord américaines. Le gène CF (locus 7831) code pour la protéine trans-membranaire nommée CFTP. (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Cette protéine est un canal chlorure localisé dans la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales pulmonaires et digestives chez les individus sains. Bien qu'il existe plus de 1000 mutations de la protéine CFTR, la mutation plus fréquente (70 % des patients) est la délétion d'une phénylalanine dans le domaine NBF1 en position 508 (delF508) Chez les patients CF, cette protéine est absente des membranes plasmiques du fait d'un adressage défectueux de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE), puis dégradée par le système ubiquitine/protéasome. Chez ces patients, les cellules dont la protéine CFTR est mutée en delF508 ne sont plus fonctionnelles. Physiologiquement, CFTR est responsable du transport trans-épithélial d'eau et d'électrolytes, et permet chez un individu sain, l'hydratation des voies aériennes pulmonaires, le bon fonctionnement sécrétoire digestif et des glandes exocrines en général. Une des clés pour un traitement de cette maladie, et de manière générale de tou'pathologie liée à de tels problèmes d'adressage, consiste en un ré-adressage de la protéine CFTR delF508 vers la membrane apicale des cellules. Une fois à la membrane, l'activité de transport de CFTR delF508 peut être stimulée par des agonistes physiologiques. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le guanabenz, utilisé depuis longtemps en clinique pour le traitement de l'h,-aertension, était capable d'activer le CFTR sauvage et des formes mutées et de provoquer une relocalisation membranaire de la protéine delF508-CFTR restaurant ainsi s.a capacité de transport trans-membranaire. Cette propriété a également été mise en évidence avec les dérivés du guanabenz. De manière générale, ces composés sont capables de restaerer un défaut d'adressage des protéines dans les cellules. De plus, ils présentent l'intérêt d'une innocuité élevée. L'invention -3 donc pour but de fournir une nouvelle utilisation de ces dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, en particulier telles qu'indiquées plus haut.35 Les dérivés u la formule (I) .ilisés conformément à l'invention répondent dans laquelle R = H ou Cl et le groupe phényle comporte aux moins deux substituants, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ces dérivés. Ces dérivés set capables de restaurer l'adressage de la 10 protéine CFTR vers les membranes plasmiques des cellules et constituent donc des composés de grand intérêt pour le traitement de pathologies liées à de tels problèmes de défaut d'adressage. Parme les maladies concernées, on citera, outre la mucoviscidose, l'hyperinsulinémie hypoglycémiante chez 15 l'enfant, des pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, l'emphysème héréditaire, le syndrome congénital du QT long. Comme illustré par les exemples, ils sont particulièrement efficaces pour provoquer la re-localisation de la protéine 20 delF508-CFTR dans la mucoviscidose où cette protéine est retenue dans le rticulum endoplasmique, et de restaurer ainsi sa capacité de transfert trans-membranaire. L'invention 'se en particulier l'utilisation du guanabenz et de ses sels. (I) 25 30 Le terme "guanabenz", tel qu'utilisé dans la description et les revendicatto:_s, correspond au composé de formule (II) . H Cl NNNH2 NH ou à un de ce:s sels, en particulier, l'acétate de formule (III) . H NNH2 NH O \OH Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la molécule utilisée répond à la formule (IV) . H Cl NNNH2 NH Cl (IV) 15 ou à un sel pharmaceutiquement acceptable. Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ces 20 véhicules peuvent âtre solides ou liquides. Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, sirops et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité. Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, 5 sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables. Ils peuvent étre également sous forme d'émulsions ou de suspensions. Les médicaments de l'invention sont plus particulièrement 1(1 administrés sous forme d'aérosols. Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 pM en dérivé de guanabenr dans le sang du patient traité. 15 D'autres cara"téristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les résultats rapportés ci-après afin d'illustrer l'invention. Il y est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent, respectivement 2(1 - la figure : l'activation de delF508-CFTR dans des cellules CE15 après traitement par du guanabenz ; la figure : la relation dose-réponse observée avec un traitement de 2 h avec le guanabenz ; et la figure 2B : le profil pharmacologique des canaux CFTR dans des 25 cellules CF :5 après 2 h d'incubation avec du guanabenz. MATERIEL ET METHODES Ml. Culture cellulaire Cellules CHO-ET : Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) sont des fibroblastes gui ont été transfectés avec le gène du 30 CFTR sauvage (CFTR-WT). Ces cellules vont donc surexprimer la protéine CFTR. Milieu de culture : Milieu MEM alpha (GIBCO) + 7 % de sérum de veau foetal + 0,5 % de pénicilline/streptomycine + 100 pM de méthotrek_ate (améthoptérine, Sigma). 35 Cellules CFI_I : Les cellules CF15 sont des cellules épithéliales huma._es d'origine nasale qui expriment le gène AF500-CFTR. Milieu de culture : Milieu DMEM + HAM F12 + 10 % de FCS + 0,6 de pénicil--ne/streptomycine + facteurs de croissance (insaline 5 pg/mi, transferrine 5 pg/ml, épinéphrine 5,5 pM, adénine 0,18 mM, EGF 10 ng/ml, T3 2 nM, hydrocortisone 1,1 aM). Cellules Calu-3 : Les cellules Calu-3 sont des cellules épithéliales huma:nes d'origine pulmonaire qui expriment le gène du CFTR sauvage. Milieu de cultiure : Milieu DMEM/F12 avec glutamax + 7 de sérum de veau foetal + 1 de pénicilline/streptomycine. M2. Immunomar quage L'immunomargnsge permet de visualiser la localisation cellulaire de la protéine CFTR grâce à un anticorps (Ac) primaire anti-CFTR, puis un anticorps secondaire antianticorps primaire marqué au fluorophore Cy3. Les cellules sont préalablement ensemencées sur des lamelles dans du rilieu de culture approprié. 3 lavages au TBS (NaCl : 157 mM, Tris base : 20 pM, pH 7,4) de 5 min chacun sont effectués. Les cellules sont alors fixées par ajout de TBS-paraformaldéhyie (3 5) pendant 20 min. Après 3 lavages au TBS (5 min), les cellules sont incubées avec du TBS-Triton 0,1 (10 min) qui permet la formation de trous dans la membrane cellulaire, puis 3 lavages au TBS sont à nouveau effectués avant la mise en présence des cellules avec le TBS- BSA 0,5 saponine 0,05 % pendant 1 h. Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-C terminal CFTR (2 pg/ml) pendant 1 h. Trois lavages au TBS-BSA-saponine de 5 min chacun sont réalisés avant l'incubation avec l'anticorps secondaire GAM-cy3 (1/400) pendant 1 h. Suite à 2 lavages au TBS de 5 min, les noyaux sont marqués par incubation au,opro3 (1/1000) pendant 5 min. Enfin, les lamelles peuvent étre montées sur lame après 3 derniers lavages au TBS de 5 min. Les lames sont observées au microscope confocal (Bio-Rad) grâce à une excitation au laser aux longueurs d'onde appropriées. Afin de différencier le marquage entre Cs et Topro3 la couleur de fluorescence de Topro3 a été changée en bleu (couleur des noyaux). M3. Effluc de cadiotraceurs Les mesures de transport d'ions chlorure dans les cellules ont été réalisées à l'aide de la technique des efflux d'iodure radioactif (Becq et al., 1999 ; Dormer et al., 2001). Le traceur (1251) est incorporé dans le milieu intracellulaire. Puis, la quantité de radiotraceur qui sort de la cellule est comptée après l'ajout de différents agents pharmacologiques. L'iodure est utilisé comme un traceur du transport d'ions chlorure. 125I a de plus l'avantage d'avoir une courte durée de vie comparée à ce e d'autres marqueurs comme Cl 35(1/2 vie respective : 30 cars et 300 000 ans). Les cellules sont mises en culture sur des plaques 24 puits dans un milieu adéquat. 2 rinçages avec du milieu d'efflux (NaCl : 136,6 mM, KC1 : 5,4 mM, KH2PO4 : 0,3 mM, NaHPO : 0,3 mM, NaHCO3 : 4,2 mM, CaCl2 : 1,3 mM, MgCl2 : 0,5 mM, MgSO4 : 0, mM, HEPES : 10 mM, D-glucose : 5,6 mM) sont effectués afin d'éliminer les cellules mortes qui relarguent la radioactivité de façon anarchique. Puis, les cellules sont mises à incuber emec 500 pl de charge (1 pCi/ml de 125INa) pendant 30 min pour les CHO-WT ou 1 h pour les 0E15 et Calu-3. L'iodure s'équilibre de part et d'autre de la membrane cellulaire. Le rob: t (MultiPROBE, Packard) réalise les étapes suivantes : le milieu de charge est rincé avec du milieu d'efflux pour éliminer la radioactivité extracellulaire. Le surnageant est collecté toutes les minutes dans des tubes à hémolyse et le milieu est remplacé par un volume équivalent (500 pl). Les prélèvements des 3 premières minutes ne subissent pas l'addition de drogue, ils permettent d'obtenir une ligne de base stable, caractérisant la sortie passive des ions I. Les 7 prélèvements suivants sont obtenus en présence de la molécule tester. A la fin de l'expérience, les cellules sont lycée, par ajout de 500 pl de NaOH (0,1 N)/0,1 % SDS (30 min), ainsi, la radioactivité restée à l'intérieur de la cellule peut être déterminée. La radioactivité présente dans les tubes à hémolyse est comptée en coups par minute (cpm) grâce à un compteur gamma (Cobra II, Packard). Les résultats en cpm sont exprimés sous forme de vitesse de sortie d'iodure radioactif (R) d'après la formule suivante : R (min 1) _ [In (~ ~I t l -In (1?5I t2) ] / (t1ùt2) avec 125I ti : cpm au temps t1 ; 125I t cpm au temps t2. Ce flux d'iodure est représenté sous ferme de courbe. Afin de quantifier la sortie d'iodure due à l'administration de la molécule testée, on calcule le flux relatif suivant qui permet de s'affranchir du flux de base : Vitesse relative (min-1)=Rpic-Rbasal. Enfin, ces résultats sont normalisés pour pouvoir comparer l'effet des différentes drogues entre elles. Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne +/- SEM. Le test statistique de Student est utilisé pour comparer l'effet des drogues aux contrôles (les -meurs correspondantes à P Les résultats, présentés sous forme d'histogramme ont été normalisés g i rapport à un traitement de référence (traitement des cellules au MPB-91 250 pM pendant 2 h) pour lequel on considère qu'on a 100 % d'activité CFTR. Sur la ligure 1, on rapporte les résultats de l'activation de de1F508-CFTR dans des cellules CF15 après traitement par du guanabenz. Les expériences d'efflux d'iodure sont réalisées après 2 h d'incubation avec 100 }gym du composé à tester ou en l'absence de ce composé. Les cellules CF 15, traitées 24 h à 27 ont été utilisées comme contrôle positif et les cellules CF15 non traitées comme contrôle négatif (37 C). Les résultats dose-réponse après 2 h de traitement par du guanabenz sont rapportés sur la figure 2A. La figure 2B donne le profil pharmacologique de canaux CFTR dans des cellules CF15 après 2 h d'incubation avec 100 pM de guanabenz. Les travaux: réalisés ont montré qu'un traitement des cellules CF15 (F520del/F508del) par le guanabenz permet de réadressage de la protéine mutée F508de1-CFTR à la membrane. Des expériences d'efflux d'iodure ont montré que le guanabenz permet le ré-adressage de la protéine F508de1-CFTR après 2 h de traitement avec une EC50 de 40pM. De plus, ces expériences ont révélé une compétition entre le guanabenz et le MG132, un ir ,:hibiteur du protéasome ainsi qu'entre le guanabenz et la sf.ainsonine, un inhibiteur de mannosidase. Il ressort de ces résultats que le guanabenz permet le ré-adressage de la grctéine F508de1-CFTR par l'inhibition de la voie de dégradat_en et/ou qu'il est possible de moduler l'état de glycosylation de la protéine inhibant son interaction avec les chaperonnes du réticulum endosplasmique (RE). Le tableau qui suit donne un résumé d'expériences de compétition réalisées par la technique d'efflux d'iodure entre 5 le guanabenz et la machinerie chaperone du RE. 15 On constate une inhibition de l'effet du guanabenz par la Brefeldine-A (RFA), inhibiteur du trafic ERGIC vésiculaire, ce qui montre que le guanabenz induit un ré-adressage de delF508-CFTR. 20 Aucune modulation de l'effet du guanabenz n'est observée en présence de MG132, inhibiteur du protéasome, révélant une compétition entre le guanabenz et MG132. Une faible potentialisation de l'effet du guanabenz est observée en présence de swainsonine, un inhibiteur de mannosidase, ce 25 qui montre une action potentielle du guanabenz sur le glycosylation du CFTR. Exemple de formulation : On prépare une solution pour inhalation avec un nébuliseur ampoule à partir de chlorure de sodium, de chlorure 30 de calcium déshydraté et d'eau pour préparations injectables. Le guanabenz, ou un dérivé de guanabenz est ajouté comme ingrédient actif. La solution est formulée dans des ampoules de 2,5mL. Des ampoules renfermant 5, 10 ou 20 mg de guanabenz ou de dérivés de guanabenz sont ainsi préparées. ~G1fi fi O ** * *** *** nS *" Inhibiteurs de glycosylation Inhibiteurs de calnexine Voie de dégradation des inhibiteurs Potentialisation de l'effet de la guanabenz 10 BIBLIOGRAPHIE BECQ et al. ;1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27415-27425. DORMER et a1. ;2001) Journal of Cell Science 114, 4073-4081. REVENDICATIONS 1/ Utilisatldu guanabenz et de ses dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans ies cellules, ces dérivés répondant à la formule (I) . H NNH N 2 R R (I) dans laquelle R = H ou Cl et le groupe phényle comporte aux moins deux substituants, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ces rivés. 2/ Utilisation selon la revendication 1, du guanabenz de 15 formule (II) . H Cl N~N~~NH2 NH 3/ Utilisatl 20 guanabenz, en parti selon la revendication 1 d'un sel de ulier de l'acétate de formule (III) .O OH 4/ Utilisation selon la revendication 1 d'une molécule de formule (IV) . H N,N,NH2 NH Cl Cl (IV) ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable. 5/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la 10 mucoviscidose. 6/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous formes de gélules, comprimés, dragées ou capsules. 15 7/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution. 8/ Utilisation: selon l'une quelconque des revendications 1 20 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous forme d'aérosol.