FR 2888748 A1 20070126 FR 0507648 A 20050719 (1) COMPOSES NEUROPROTECTEURS ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES COMPRENANT La présente invention concerne l'utilisation de composés neuroprotecteurs dans le 5 cadre de la prévention ou du traitement des détériorations neuronales liées à des pathologies du système nerveux. La détérioration, notamment la mort, neuronale joue un rôle essentiel dans pratiquement toutes les pathologies impliquant une dégénérescence neuronale aiguë ou chronique. On pense que de nombreux modulateurs neurochimiques interviennent dans la survenue de lésions du système nerveux. Par exemple, dans l'épilepsie, la neurotransmission avec excès de glutamate, l'altération de l'inhibition liée au GABA et les altérations de l'équilibre acido-basique peuvent entraîner une série d'évènements conduisant à des altérations neuronales et à la mort cellulaire. Plusieurs voies biochimiques menant à la mort neuronale ont ainsi pu être élucidées ces dernières années. Un des cas les plus documentés concerne l'excitotoxicité du glutamate. Cet acide aminé neurotransmetteur est libéré de manière excessive en cas d'ischémie par exemple, ce qui provoque, via une activation excessive de ses récepteurs neuronaux, un afflux d'ions calcium à l'intérieur des neurones et conduit à la mort cellulaire par nécrose ou apoptose. Par définition, la neuroprotection est une activité ayant pour conséquence la récupération, la guérison ou la régénération du système nerveux, de ses cellules, sa structure et sa fonction (Vajda et al. (2002) J Clin Neurosci.9:4-8). La neuroprotection s'exerce, comme indiqué sur la Figure 9, sur les processus conduisant à la mort neuronale. Les mécanismes présumés, à la fois complexes et variés, de la mort neuronale, tels que le stress oxydatif, les dysfonctionnements mitochondriaux, l'agrégation protéique, l'apoptose et l'inflammation (Youdim et al. (2005), TIPS 26:27-35), laissent penser que les traitements neuroprotecteurs agissent à plusieurs niveaux sur le plan neurologique et biochimique (Youdim MB et al. (2005) J. Neural. Transm. 112:519-537) (Sellai et al. (2005) Therapie, 60:89-107). Ainsi, dans le cadre du traitement des accidents ischémiques cérébraux, il a pu être montré que de nombreux agents inhibant certaines étapes du processus de mort neuronale, tels que des antagonistes du glutamate, des agents anti-inflammatoires, des agents modulateurs des canaux ioniques, des agents anti-radicaux libres, ou encore des antagonistes du GABA, possédaient une action neuroprotectrice chez l'animal. Toutefois, les nombreux essais cliniques menés à ce jour n'ont pas permis de confirmer le potentiel de ces composés en tant qu'agents de neuroprotection chez l'homme. Un objet de la présente invention est donc de fournir des compositions pharmaceutiques ayant une efficacité neuroprotectrice supérieure à celle des compositions déjà connues. La présente invention découle en particulier de la mise en évidence par les Inventeurs que l'étifoxine et la déséthyl-étifoxine possèdent une action neuroprotectrice in vitro et in vivo chez l'animal. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'au moins un composé de formule (I) suivante: dans laquelle: - a représente 0 ou 1; - b représente une simple liaison ou une double liaison; - c représente une simple liaison ou une double liaison; - d représente 0 ou 1; - X représente un atome d'oxygène ou d'azote, sous réserve que lorsque X représente un atome d'oxygène alors d vaut 0 et que lorsque X représente un atome d'azote alors d vaut 1; - RI, R2, R3, et R4, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment choisi parmi F, Cl, Br, ou I, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkoxyle de 1 ou 2 atomes de carbone; - R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou cycloalkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou un groupe aryle de 6 atomes de carbone dont le noyau aromatique est éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène ou un ou plusieurs groupes hydroxyle, alkoxyle de 1 ou 2 atomes de carbone, trifluorométhyle ou nitro; - R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkyle ou hydroxyalkyle de 1 à 3 atomes de carbone; - R8 représente un atome d'oxygène ou un groupe -NR9R10, R9 et R10, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkyle ou hydroxyalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, sous réserve que lorsque R8 représente un atome d'oxygène alors a vaut 1, b représente une simple liaison et c représente une double liaison et que lorsque R8 représente un groupe -NR9R10 alors a vaut 0, b représente une double liaison et c représente une simple liaison; ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament à activité neuroprotectrice destiné à la prévention ou au traitement des détériorations neuronales. On désigne par activité neuroprotectrice une action ayant pour conséquence la récupération, la guérison ou la régénération du système nerveux, de ses cellules, de sa structure et de sa fonction. (Vajda et al. (2002) J Clin Neurosci 9:4-8). On désigne par détériorations neuronales , les lésions microscopiques des cellules observées dans différentes pathologies neurologiques. Ces lésions peuvent notamment être de type ischémique, atrophique, perte neuronale, inclusions intracytoplasmiques ou intranucléaires, dégénérescence neurofibrillaire ou granulo-vacuolaire. A titre d'exemple, les lésions neuronales observées lors de la maladie d'Alzheimer associent une dégénérescence neurofibrillaire avec une perte de synapses dans l'hippocampe et les régions voisines du lobe temporal, des foyers intracorticaux de prolongements neuronaux épaissis à la fois axonaux et dendritiques (neurites), et une dégénérescence granulovacuolaire. Les lésions ischémiques observées lors d'accidents vasculaires ischémiques associent un noyau foncé et un cytoplasme très basophile et rétracté. Les maladies neurodégénératrices s'accompagnent de lésions à type d'atrophie neuronale avec dépopulation de zones caractéristiques de la maladie (Augustinack et al. (2002); Acta Neuropathol.103:26-35) - (Harrison - Arnett Blackwell Ed 1995) - (Cambier Masson Ed 2000). Dans un mode de réalisation particulier de l'utilisation telle que définie ci-dessus, les détériorations neuronales sont liées aux pathologies choisies dans la liste comprenant: -l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la Maladie de Friedreich, - les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment liées à l'administration de vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de Guillain-Barré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, - les tumeurs cérébrales, - la maladie de Parkinson, et - les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence vasculaire. La synthèse des composés de formule (I) définis ci-dessus peut être aisément mise en oeuvre à partir des enseignements du brevet français n l 571 287. Les sels pharmaceutiquement acceptables selon l'invention apparaîtront de manière évidente pour l'homme du métier, en particulier les sels de chlorhydrate des composés de formule (I) selon l'invention sont préférés. Comme on l'entend ici, la présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (I), tels que les énantiomères suivants (lorsque R5 et R6 sont différents) : R1 (H)a R1 (H) a N b cRs R NbR8 c 2 c tR7)a R R5 R6 ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus d'un composé (VIII) suivante: R 12 (VIII) dans laquelle: - a représente 0 ou 1; - b représente une simple liaison ou une double liaison; - c représente une simple liaison ou une double liaison; - d représente 0 ou 1; - X représente un atome d'oxygène ou d'azote, sous réserve que lorsque X représente un atome d'oxygène alors d vaut 0 et que lorsque X représente un atome d'azote alors d vaut l; - Rl l et R12 identiques ou différents représentent -H ou -OH; - R13 représente -H ou un groupe -CH2-CH3; - R14 représente un atome d'oxygène ou un groupe -NH2 ou -NH-CH2-CH3, sous réserve que lorsque R14 représente un atome d'oxygène alors a vaut 1, b représente une simple liaison et c représente une double liaison et que lorsque R14 représente un groupe - NH2 ou -NH-CH2-CH3 alors a vaut 0, b représente une double liaison et c représente une simple liaison. La présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (VIII), tels que les énantiomères suivants: R12 R12 ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'un composé de formule (II) suivante: R. Rio R9 R4 (II) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9 et Rio sont tels que définis ci-dessus. La présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (II), tels que les énantiomères suivants (lorsque R5 et R6 sont différents) : R 4 R 5 1 6 R ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, des composés de formules (III) et (IV) suivantes: H NON CH2 CH3 O Cl CH3; HC1 Cl (III) NNH2 CH3 Le composé de formule (III) est l'étifoxine, ou chlorhydrate de 6-chloro-2-éthylamino-4-méthyl-4-phényl-4H- [3, 1] benzoxazine. Le composé de formule (IV), la déséthyl-étifoxine ou 2-amino-6-chloro-4méthyl-4-phényl-4H-[3,1]benzoxazine, est un métabolite de l'étifoxine. La présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (III), tels que les énantiomères suivants: H H NN CHz CH3 NN CHz CH3 O CH3 Cl ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique, notamment sous forme chlorhydrate, ainsi que l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement 10 actives du composé de formule (IV), tels que les énantiomeres suivants: NNH2 NNHZ O /ryl ni CH3 ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'un composé de formule (V) suivante: R1 H (V) dans laquelle RI, R2, R3, R5, R6, et R7 sont tels que définis cidessus. La présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (V), tels que les énantiomères suivants 20 (lorsque R5 et R6 sont différents) : Cl O CH3 ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de composés de formules (VI) et (VII) suivantes: H 1 O CH3 HO (VI) H 1 Cl CH2-CH3 (VII) Les composés de formule (VI) (6-Chloro-4-(4-hydroxyphényl)-4-méthyl-3,4-dihydro-10 1H-quinazolin-2-one) et (VII) (6-chloro-3éthyl-7-hydroxy-4-méthyl-4-phényl-3, 4-dihydro-1H-quinazolin-2-one) sont des métabolites de l'étifoxine. La présente invention concerne également l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (VI), tels que les énantiomères suivants: H 1 H 1 HO HO ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique, ainsi que l'utilisation, telle que définie ci-dessus, des formes optiquement actives du composé de formule (VII), tels que les énantiomères suivants: H 1 H 1 ou leurs mélanges, en particulier leur mélange racémique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament défini ci-dessus convient pour l'administration à un individu en ayant besoin d'une dose unitaire d'environ 50 mg à environ 1500 mg, notamment d'environ 150 à 200 mg du composé tel que défini ci-10 dessus. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament défini ci-dessus convient pour l'administration à un individu en ayant besoin d'une dose d'environ 50 mg/j à environ 1500 mg/j, notamment d'environ 150 mg/j à environ 200 mg/j, du composé tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le médicament défini ci-dessus convient pour une administration par voie orale. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le médicament défini ci- dessus se présente sous la forme d'une poudre, de cachets, de gélules ou de sachets. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le composé défini ci-dessus est 20 associé à au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement des pathologies définies ci-dessus. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active: - au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, et - au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement des pathologies choisies dans la liste comprenant: l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la Maladie de Friedreich, - les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment liées à l'administration de vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de Guillain-Barré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, - les tumeurs cérébrales, - la maladie de Parkinson, et - les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence vasculaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également des produits contenant: É au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, et É au moins un composé additionnel destiné la prévention ou au traitement des pathologies choisies dans la liste comprenant: -l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la Maladie de Friedreich, - les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment liées à l'administration de vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de Guillain-Barré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, - les tumeurs cérébrales, et - la maladie de Parkinson, et - les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence 15 vasculaire, comme produit de combinaison pour une utilisation séparée, simultanée ou étalée dans le temps pour la prévention ou le traitement des détériorations neuronales liées à ces pathologies. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention le composé additionnel défini ci-20 dessus est choisi dans la liste comprenant: un antiépileptique, notamment: É Acide valproïque, É Barbituriques, Carbamazépine, Ethosuximide, Gabapentine, É Lamotrigine, É Stiripentol, É Tiagabine, É Vigabatrin, un antiparkinsonien, notamment: É dopaminergique, tel que: Lévodopa associée à inhibiteur de la dopadécarboxylase, * Agonistes dopaminergiques, É anticholinergique, tel que: Bipéridène, -* Trihexiphénidyle, -> Tropatépine, É un inhibiteur de la monoamine oxydase B (IMAO B), É un inhibiteur de la catechol-O-méthyl transférase (COMT), un composé destiné au traitement de la maladie d'Alzheimer, notamment: É un anticholinestérasique, tel que: -* Donépézil, 10 Galantamine, - > Rivastigmine, un antagoniste des récepteurs NMDA, tel que: --> Mémantine, - un composé destiné au traitement des AVC (accidents vasculaires cérébraux) ischémiques en phase aiguë (Altéplase) et de leurs suites (Dihydroergocristine, Piracétam), notamment selon le type d'AVC: -* Héparine, Aspirine, -* Nicardipine. - un composé destiné au traitement de la sclérose en plaque, notamment: É Interféron /3, É Glatiramère acétate, É Mitoxantrone, - un composé destiné au traitement de la sclérose latérale amyotrophique, notamment: É Riluzole, - un composé destiné au traitement du syndrome de Guillain Barré, notamment: É Immunoglobulines humaines de type G, É Tegeline, - un composé destiné au traitement des hémorragies cérébrales, notamment: É Nimodipine, - un antidépresseur, notamment: É un imipraminique, tel que: > Anafranil, ---3 Clomipramine, - Amoxapine, -> Amitriptyline, É un inhibiteur sélectif de la recapture de la sérotonine, tel que: -> Fluoxétine, -* Paroxétine, - Citalopram, -Fluvoxamine. É un inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénergique, tel que: -* Venlafaxine, -+ Mirtazapine, - Tianeptine, un composé destiné au traitement de la schizophrénie, notamment: É un psychotrope, tel que: -+ Olanzapine, - Rispéridone, -> Clozapine, un neuroleptique, tel que - Halopéridol, -* Pipotiazine, - un composé destiné au traitement des tumeurs cérébrales, notamment un agent de chimiothérapie, - un composé destiné au traitement de la neuropathie diabétique, notamment un composé destiné à la correction du trouble métabolique (insuline), - un composé destiné au traitement de la polynévrite alcoolique, notamment la vitamine B1. Avantageusement, le composé de formule générale (I), ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, sont utilisés comme adjuvant destiné à augmenter les effets de composés destinés au traitement des pathologies définies ci-dessus, tel que les composés additionnels définis ci-30 dessus. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 La Figure 1 représente les effets de concentrations croissantes d'étifoxine (en abscisses, M) sur la densité de marquage des prolongements neuritiques (en ordonnées, pourcentage de surface marquée) en absence (contrôle) ou en présence de glutamate (2 ou 10 mM) après 6 heures d'incubation. Chaque colonne représente la moyenne écart standard à la moyenne (8 mesures par groupe). FGF représente le facteur de croissance. Le signe étoile (*) représente p Figure 2 La Figure 2 représente les effets de concentrations croissantes d'étifoxine (en abscisses, M) sur la densité de marquage des prolongements neuritiques (en ordonnées, pourcentage de surface marquée) en absence (contrôle) ou en présence de glutamate (2 ou 10 mM) après 24 heures d'incubation. Chaque colonne représente la moyenne écart standard à la moyenne (8 mesures par groupe). FGF représente le facteur de croissance. Le signe étoile (*) représente p Figure 3 La Figure 3 représente les effets de concentrations croissantes de déséthyl-étifoxine (en abscisses, M) sur la densité de marquage des prolongements neuritiques (en ordonnées, pourcentage de surface marquée) en absence (contrôle) ou en présence de glutamate (2 ou 10 mM) après 6 heures d'incubation. Chaque colonne représente la moyenne écart standard à la moyenne (8 mesures par groupe). FGF représente le facteur de croissance. Le signe étoile (*) représente p Figure 4A et Figure 4B Les Figures 4A et 4B représentent les effets de concentrations croissantes d'étifoxine (en abscisses, mg/kg) administrées par voie intrapéritonéale (Figure 4A) ou par voie orale (Figure 4B) sur le temps de survie (en ordonnées, en secondes, moyenne écart standard à la moyenne) de souris soumises à une hypoxie hypobare induite par une diminution de la pression atmosphérique à 160 mmHg (9 ou 10 animaux par groupe). Le signe étoile (*) représente p Figure 5A et Figure 5B Les Figures 5A et 5B représentent les effets de concentrations croissantes d'étifoxine (en abscisses, mg/kg) administrées par voie intrapéritonéale (Figure 5A) ou par voie orale (Figure 5B) sur le temps de survie (en ordonnées, en secondes, moyenne écart standard à la moyenne) de souris soumises à une hypoxie histotoxique induite par une administration intrapéritonéale de 15 mg/kg de cyanure de potassium (9 à 19 animaux par groupe). Le signe étoile (*) représente p Figure 6A et Figure 6B Les Figures 6A et 6B représentent les effets de concentrations croissantes d'étifoxine (en abscisses, mg/kg) administrées par voie intrapéritonéale (Figure 6A) ou par voie orale (Figure 6B) sur le temps de survie (en ordonnées, en secondes, moyenne écart standard à la moyenne) de rats soumis à une hypoxie histotoxique induite par une administration intraveineuse de 4 mg/kg de cyanure de potassium (9 ou 10 animaux par groupe). Le signe étoile (*) représente p Figure 7A et Figure 7B Les Figures 7A et 7B représentent les effets de concentrations croissantes de déséthylétifoxine (en abscisses, mg/kg) administrées par voie intrapéritonéale (Figure 7A) ou par voie orale (Figure 7B) sur le temps de survie (en ordonnées, en secondes, moyenne + écart standard à la moyenne) de souris soumises à une hypoxie hypobare induite par une diminution de la pression atmosphérique à 160 mmHg (10 à 20 animaux par groupe). Le signe étoile (*) représente p Figure 8A et Figure 8B Les Figures 8A et 8B représentent les effets de concentrations croissantes de déséthyl- étifoxine (en abscisses, mg/kg) administrées par voie intrapéritonéale (Figure 8A) ou par voie orale (Figure 8B) sur le temps de survie (en ordonnées, en secondes, moyenne écart standard à la moyenne) de rats soumis à une hypoxie histotoxique induite par une administration intraveineuse de 4 mg/kg de cyanure de potassium (10 animaux par groupe). Le signe étoile (*) représente p Figure 9 La Figure 9 représente l'impact des traitements de la maladie de Parkinson tels que décrits par Fénélon (2005) Rev. Prat.714-716. EXEMPLES EXEMPLE 1 Evaluation des effets neuroprotecteurs de l'étifoxine dans des cultures mélangées de neurones corticaux et d'astrocytes de rats en présence d'un excès de glutamate Le principe de l'étude a consisté à évaluer la survie des neurones corticaux en coculture avec des astrocytes après application d'un neurotoxique, le glutamate en excès. En effet, le glutamate est responsable d'une excitotoxicité (activation excessive de récepteurs neuronaux) impliquée dans la mort neuronale consécutive à de nombreux troubles, dont les accidents vasculaires cérébraux, les crises d'épilepsie ou certaines affections neurodégénératives, telles que la maladie de Huntington ou la sclérose latérale amyotrophique. La survie neuronale est quantifiée par l'importance de la densité du réseau de prolongements neuritiques marqué par un anti-corps antineurofilaments en absence ou en présence de glutamate. 1. Matériel et méthodes 1.1. Cultures cellulaires Type cellulaire: Primo culture de neurones corticaux d'embryons de rat de 14 jours et primo culture d'astrocytes corticaux de rats nouveaux nés. Milieu de culture: DMEM-Ham F12 (Invitrogen 21331020) B27 2% (invitrogen 17504044) L-glutamine 2mM (Invitrogen 25030024) Pénicilline 50 Ul/ml Streptomycine 50 g/ml (Invitrogen 15070063) Nerf Growth Factor 10 ng/ml (NGF, Invitrogen 13290.010) Milieu de survie: MEM (Invitrogen 21090022) Lglutamine 2Mm (Invitrogen 25030024) Pénicilline 50 Ul/ml Streptomycine 50 g/ml (Invitrogen 15070063) Supplément N2 (Invitrogen 17502-048) 1.2 Cytotoxicité préalable Plaques: 96 puits Temps de culture: 8 jours Cellules/puits: neurones corticaux + astrocytes Gamme de produit: à partir de 100 M puis raison 3 Replicata: 3 Contact cellules/produit: 48 heures Paramètres d'évaluation: observation microscopique et hydrolyse au MTT. MTT: 3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 1.3 Traitement et analyse du réseau des prolongements marqués avec un anticorps antineurofilaments Les neurones corticaux ont été prélevés sur des cortex d'embryons de rat de 14 jours et cultivés en milieu de culture en plaque 96 puits dans une étuve à 37 C et 5% CO2 saturée en humidité. Après 2 jours de culture, des astrocytes issus de cortex de rats nouveaux nés ont été ensemencés dans les puits (selon un ratio de 1 astrocyte pour 4 neurones). Après 10 jours de culture, les neurones matures synthétisent les neurofilaments (protéine de structure spécifique des neurones matures) ; de plus ces neurones expriment à leur surface des récepteurs fonctionnels au glutamate et peuvent donc être intoxiqués. Au 12ème jour de culture, le milieu a été remplacé par du milieu de survie avec ou sans étifoxine à 3 concentrations et les neurones ont été intoxiqués ou non par du glutamate (Sigma G1501) à 2 mM et 10 mM. Chaque condition de culture a été réalisée dans 4 puits. Les cultures ont été incubées pendant deux durées différentes (6 et 24 heures). Un contrôle positif a été réalisé en milieu de culture de survie contenant du Nerve Growth Factor (NGF; 10 ng/ml) et du Fibroblast Growth Factor basic (FGFb; 5 ng/ml) et les cellules ont été intoxiquées dans les mêmes conditions. Au terme des deux temps d'incubation (6 et 24 h), les tapis cellulaires ont été fixés et marqués par un anticorps monoclonal anti-neurofilaments 68 et 200 kD (DAKO M0762) puis 15 révélés par un conjugué anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de souris-Alexia fluor 488 (Interchim A-11029) . Des contrôles sans anticorps primaire ont été réalisés. Tous les contrôles étaient négatifs (pas de marquage non spécifique). Après lavagesextensifs en PBS, les préparations ont été observées en épi- fluorescence (microscope Nikon Diaphot 300). Pour chaque puits de culture (4 puits par condition expérimentale), 2 images ont été réalisées à l'aide d'une caméra Nikon DXM1200F pilotée par un logiciel LUCIA 6.0. Toutes les images ont été effectuées dans les mêmes conditions et avec des réglages de la caméra identiques. Des analyses de la densité des réseaux de prolongements marqués avec l'anticorps anti- neurofilaments ont été réalisées à l'aide du logiciel LUCIA 6.0. Un premier traitement des images a permis d'augmenter l'intensité du marquage spécifique des prolongements. Les zones positives au marquage ont été binarisées et le pourcentage de marquage par image a été analysé (surface marquée/surface totale analysée). 1.4. Produit étudié L'étifoxine (chlorhydrate de 6-chloro-2-éthylamino-4méthyl-4-phényl-4H-[3,1]benzoxazine) est mise en solution à la concentration de 100 mM dans le DMSO puis diluée successivement dans le milieu de culture (concentration de DMSO H NN CH-CH3 O HC1 CH3 Etifoxine 1.5. Expression et analyse statistique des résultats Les résultats (valeurs moyennes erreur standard à la moyenne (ESM), sont exprimés 25 en pourcentage de marquage par champs de microscope (n = 8 mesures/conditions de culture). L'analyse de variance à 2 facteurs (Etifoxine et glutamate), suivie du test de comparaisons multiples de Student Newman-Keuls a été utilisée pour la comparaison statistique des résultats. Les résultats obtenus avec le contrôle positif (FGF) ont été comparés aux témoins à l'aide du test t de Student ou de Mann et Whitney selon les cas. Le seuil de significativité était fixé à p 2. Résultats 2.1 Cytotoxicité de l'étifoxine Une première expérience a été réalisée (test classique utilisé pour mesurer le taux de survie cellulaire) dans le but d'étudier la cytotoxicité de l'étifoxine vis-àvis des neurones corticaux en présence d'astrocytes en culture et de déterminer ainsi la concentration maximale non toxique d'étifoxine. L'analyse visuelle réalisée au microscope après 48 h d'incubation montre une mortalité neuronale à la concentration de 33 et 100 M d'étifoxine tandis que la mortalité des astrocytes est observée à la concentration de 100 M. Les concentrations d'étifoxine retenues pour l'étude proprement dite ont été de 1, 3 et 10 M. 2.2 Effets de l'étifoxine sur la densité de neurofilaments en présence de glutamate après 6 h d'incubation (Figure 1) Dans le milieu de culture contrôle (sans glutamate), l'étifoxine accroît de manière dose dépendante la densité de neurofilaments marqués avec un effet statistiquement significatif à la 20 dose de 10 M. Le glutamate aux concentrations de 2 et 10 mM réduit de manière statistiquement significative la densité de neurofilaments. L'étifoxine aux concentrations de 3 et 10 M, ainsi que le FGF s'opposent de manière statistiquement significative à la diminution de la densité de neurofilaments induite par le glutamate. 2.3 Effets l'étifoxine sur la densité de neurofilaments en présence de glutamate après 24 h (Figure 2) Dans le milieu de culture contrôle, comme précédemment, l'étifoxine accroît de manière statistiquement significative la densité de neurofilaments à la dose de 10 M. Les 30 concentrations de 1 et 3 M sont sans effet. Le glutamate, aux concentrations de 2 et 10 mM réduit de manière importante le marquage des neurofilaments qui est proche de O. L'étifoxine à la concentration de 10 pM et le FGF s'opposent de manière statistiquement significative aux effets de 2 mM de glutamate. Les résultats révèlent d'une part que l'étifoxine possède un effet sur la croissance neuronale ou effet neurotrophique comme le montre l'augmentation de la densité des réseaux de neurofilaments dans la culture contrôle après 6 et 24 h d'incubation. D'autre part, ils mettent aussi en évidence un effet neuroprotecteur de l'étifoxine après intoxication par le glutamate. En effet, l'étifoxine, comme les facteurs de croissance, s'oppose à la réduction des réseaux de neurofilaments induite par un excès de glutamate. EXEMPLE 2 Evaluation des effets neuroprotecteurs de la déséthyl-étifoxine dans des cultures mélangées de neurones corticaux et d'astrocytes de rats en présence d'un excès de glutamate La méthodologie de l'Exemple 1 a été appliquée à un métabolite actif de l'étifoxine, à savoir la déséthylétifoxine (2-amino-6-chloro-4-méthyl-4-phényl-4H-[3,1]benzoxazine), qui a été mise en solution à la concentration de 100 mM dans le DMSO puis diluée successivement dans le milieu de culture (concentration de DMSO 0, 1 %, v/v). Déséthyl-étifoxine Cytotoxicité de la déséthyl-étifoxine L'analyse visuelle réalisée au microscope après 48 h d'incubation montre une mortalité neuronale à la concentration de 33 et 100 M de déséthylétifoxine tandis que la mortalité des astrocytes est observée à la concentration de 100 M. Les concentrations de déséthyl-25 étifoxine retenues pour l'étude proprement dite ont été 1, 3 et 10 M. Cl Effets de la déséthyl-étifoxine sur la densité de neurofilaments en présence de glutamate après 6h d'incubation (Figure 3) Dans le milieu de culture contrôle (sans glutamate), la déséthyl-étifoxine accroît de manière statistiquement significative la densité de neurofilaments marqués à la dose de 10 5 M. Le glutamate à la concentration de 2 mM réduit de manière statistiquement significative la densité de neurofilaments. Seule la concentration de 10 M de déséthyl-étifoxine s'oppose à l'effet du glutamate. Par contre, la déséthyl-étifoxine aux concentrations de 1, 3 et 10 M, s'oppose de manière statistiquement significative à la diminution de la densité de neurofilaments marqués induite par 101.LM de glutamate. EXEMPLE 3 Effet protecteur de l'étifoxine dans 3 modèles d'hypoxie chez la souris et le rat De nombreuses situations pathologiques, telles que les crises d'épilepsie ou les accidents vasculaires cérébraux, se traduisent par une hypoxie, locale ou généralisée, des tissus nerveux, qui conduit à leur destruction, partielle ou totale, notamment par mort neuronale. Chez l'animal placé en condition d'hypoxie sévère, la destruction du tissu nerveux conduit rapidement à la mort de l'animal. Les effets de l'étifoxine sur la durée de survie de souris ou de rats placés en situation d'hypoxie a donc été étudiée afin d'évaluer son efficacité neuroprotectrice. 1. Matériel et méthodes 1.1 Hypoxie hypobare chez la souris Animaux Des souris mâles NMRI de chez Janvier, de poids compris entre 25 et 30 grammes sont utilisées après une acclimatation d'au moins 7 jours dans l'animalerie (t = 22 + 2 C; hygrométrie 50 20 % ; nourriture UAR "A04" SAFE (Augy, France) et eau du robinet ad libitum; cycle nycthéméral de 12 heures (lumière de 7 à 19 heures). Protocole Les souris non à jeun, sont réparties au hasard par lot de 10. Le protocole de Nakanishi et al. (1973) Lift Sciences, 13, 467-474 est adapté pour réaliser le modèle. Chaque souris est placée dans un dessiccateur (enceinte hermétique) dans lequel on diminue la pression atmosphérique de 760 à 160 mmHg à l'aide d'une trompe à eau. Cette dépression est effectuée en une minute et provoque la mort chez les animaux témoins en 1 minute environ. On note alors le temps de survie de l'animal qui correspond à la différence entre le 10 temps d'apparition de la mort de la souris, appréciée par l'arrêt respiratoire, moins le temps nécessaire à l'induction de l'hypoxie. Les produits à étudier sont administrés par voie intrapéritonéale (i.p.) (0,1 ml/10 g), 30 minutes avant l'induction de l'hypoxie hypobare, ou par voie orale (0,1 ml/10 g p.o.) 1 heure avant l'hypoxie. 1.2 Hypoxie au KCN (i.p) chez la souris Animaux Des souris mâles CD 1 de chez Charles River, de poids compris entre 20 et 25 grammes sont utilisées après une acclimatation d'au moins 7 jours dans l'animalerie (t = 22 2 C; hygrométrie 50 20 % ; nourriture UAR "A04" ; cycle nycthéméral de 12 heures (lumière de 7 à 19 heures). Protocole Les souris non à jeun, sont réparties au hasard par lot de 10. Chaque souris reçoit par voie intrapéritonéale (i.p) (0,1 ml/10 g) une solution extemporanée de cyanure de potassium (KCN) dans du NaCl à 0,9 % (1,5 mg/ml). Cela correspond à une dose de 15 mg/kg de KCN qui provoque la mort chez les animaux témoins en quelques minutes. On note le temps d'apparition de la mort pour chaque souris, appréciée par l'arrêt cardiaque. Les produits à étudier sont administrés par voie intrapéritonéale (i.p.) (0,1 ml/10 g), 30 minutes avant l'injection de KCN, ou par voie orale (0, 1 ml/10 g p.o.) 1 heure avant le KCN. 1.3 Hypoxie au KCN (i.v.) chez le rat Animaux Des rats mâles Wistar de chez Janvier, de poids compris entre 180 et 200 grammes sont 5 utilisés après une acclimatation d'au moins 7 jours dans l'animalerie (t = 22 2 C; hygrométrie 50 + 20 % ; nourriture UAR "A04" SAFE (Augy, France) ; cycle nycthéméral de 12 heures (lumière de 7 à 19 heures). Protocole Les rats non à jeun, sont répartis au hasard par lot de 10. Le protocole est adapté d'après Lamar et al. (1988) Drug Develop. Res., 14, 297-304. Chaque rat reçoit par voie intraveineuse (i.v.) (0,1 ml/100 g) une solution extemporanée de cyanure de potassium (KCN) dans du NaCl à 0,9 % (4 mg/ml). Cela correspond à une dose de 4 mg/kg de KCN qui provoque la mort chez les animaux témoins en quelques minutes. On note le temps d'apparition de la mort pour chaque rat, appréciée par l'arrêt cardiaque. Les produits à étudier sont administrés par voie intrapéritonéale (i.p.) (0,5 ml/100 g), 30 minutes avant l'injection de KCN, ou par voie orale (0, 5 ml/100g p.o.) 1 heure avant le KCN. 1.4 Produits Le chlorhydrate d'étifoxine est mis en solution dans du Tween 80 à 1 %. Le cyanure de potassium (Merck) est solubilisé dans du NaCl à 0,9 %. 1.5 Statistiques Le test statistique utilisé est une analyse de variance à un facteur pour déterminer les 25 groupes traités qui diffèrent du groupe témoin recevant le véhicule, au seuil de 5 %. 2. Résultats 2.1 Hypoxie hypobare chez la souris L'induction de la dépression pour obtenir une hypoxie hypobare entraîne la mort en 40 à 60 secondes chez les souris sans traitement ou recevant le liquide véhicule. L'étifoxine augmente de manière significative le délai d'apparition de la mort à partir de 30 mg/kg i.p ou p.o (Tableau 1 et Figures 4A-4B). Voies Doses n Temps de survie Pourcentages de (mg/kg) en secondes variation (m + esm) i.p. 0 20 57.5 2.0 3 10 64.5+3.4 +12 19 66.1 + 3.0 + 15 19 81.8+4.6 +42 10 138.5 + 23.3 + 141 10 132.0 + 21.6 + 130 p.o. 0 20 55.5 2.3 10 81.5+4.5 +47 20 95.3+5.6 + 72 10 99.5 2.7 + 79 300 20 115. 5 + 8.6 + 108 Tableau 1: Effets de l'étifoxine sur le temps de survie dans l'hypoxie hypobare induite par une diminution de la pression atmosphérique à 160 mmHg chez la souris (n nombre d'animaux, m moyenne, esm écart standard de la moyenne). 2.2 Hypoxie au KCN (i.p.) chez la souris L'administration de 15 mg/kg i.p de KCN entraîne la mort en 90 à 120 secondes chez les souris sans traitement ou recevant le véhicule liquide. L'étifoxine augmente de manière significative le délai d'apparition de la mort à partir de 50 mg/kg i.p, mais ne modifie pas significativement le temps de survie par voie orale (Tableau 2 et Figures 5A-5B). Test statistique ANOVA ns ns p 2.3 Hypoxie au KCN (i.v) chez le rat L'administration de 4 mg/kg i.v de KCN entraîne la mort en 50 à 60 secondes chez les rats sans traitement ou recevant le véhicule liquide. L'étifoxine augmente de manière significative le délai d'apparition de la mort à partir de 50 mg/kg i.p et 200 mg/kg p.o (Tableau 3 et Figures 6A 6B). Voies Doses n Temps de Pourcentages Test statistique survie en de variation ANOVA secondes (m esm) 0 10 56.6 2.6 10 60.3 + 2.0 + 7 ns 10 107.3 + 6.1 + 90 p EXEMPLE 4 La méthodologie de l'Exemple 3 a été appliquée à la déséthyl-étifoxine qui a été mise en solution dans du Tween 80 à 1 %. 1 Hypoxie hypobare chez la souris La déséthyl-étifoxine montre une activité anti-hypoxique à partir de 30 mg/kg i.p. Par voie orale, elle entraîne une augmentation significative de la durée de survie à partir de 200 15 mg/kg (Tableau 4 et Figures 7A-7B). Voies Doses n Temps de Pourcentages Test statistique survie en de variation ANOVA secondes (m esm) i.p. 0 10 53.5 + 2.2 9 71.7+4.8 +34 p 2 Hypoxie au KCN (i.v.) chez le rat Dans ce test, la déséthyl-étifoxine augmente le temps de survie de manière non significative à 75 mg/kg i.p. en raison d'une forte variabilité. Par voie orale, elle montre une activité anti-hypoxique à partir de 100 mg/kg p.o. (Tableau 5 et Figures 8A-8B). 15 Voies Doses n Temps de Pourcentages Test statistique survie en de variation ANOVA secondes (m + esm) 0 10 57.1 1.2 10 55.0 + 1.5 -4 ns 10 55.6 + 1.5 - 3 ns 10 72.7 + 5.5 + 27 ns 0 10 57.3 + 1.0 10 58.8 + 1.9 + 3 ns 10 81.3+3.8 +42 p REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un composé de formule (I) suivante: (I) dans laquelle: - a représente 0 ou 1; - b représente une simple liaison ou une double liaison; - c représente une simple liaison ou une double liaison; d représente 0 ou 1; - X représente un atome d'oxygène ou d'azote, sous réserve que lorsque X représente un atome d'oxygène alors d vaut 0 et que lorsque X représente un atome d'azote alors d vaut 1; - R1, R2, R3, et R4, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, notamment choisi parmi F, Cl, Br, ou I, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkoxyle de 1 ou 2 atomes de carbone; -R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou cycloalkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou un groupe aryle de 6 atomes de carbone dont le noyau aromatique est éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène ou un ou plusieurs groupes hydroxyle, alkoxyle de 1 ou 2 atomes de carbone, trifluorométhyle ou nitro; - R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkyle ou hydroxyalkyle de 1 à 3 atomes de carbone; - R8 représente un atome d'oxygène ou un groupe -NR9R10, R9 et R10, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou un groupe alkyle ou hydroxyalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, sous réserve que lorsque R8 représente un atome d'oxygène alors a vaut 1, b représente une simple liaison et c représente un double liaison et que lorsque R8 représente un groupe -NR9R10 alors a vaut 0, b représente une double liaison et c représente une simple liaison; ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament à activité neuroprotectrice destiné à la prévention ou au traitement des détériorations neuronales. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les détériorations neuronales sont liées aux pathologies choisies dans la liste comprenant: l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la 10 Maladie de Friedreich, -les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment à la vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de GuillainBarré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, - les tumeurs cérébrales, - la maladie de Parkinson, et - les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence 25 vasculaire. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'un composé de formule (II) suivante: (II) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9 et Rlo sont tels que définis ci-dessus. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, des composés de formules (III) et (IV) suivantes: Cl H NN CHZ CH3 O CH3 HC1 Cl (IV) 5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'un composé de formule (V) suivante: H 1 R7 (V) dans laquelle RI, R2, R3, R5, R6, et R7 sont tels que définis dans la revendication 1. 6. Utilisation selon la revendication 1, 2 ou 5, de composés de formules (VI) et (VII) suivantes: H Cl HO (VI) H 1 (VII) 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le médicament convient pour l'administration à un individu en ayant besoin d'une dose unitaire d'environ 50 mg à environ 1500 mg, notamment d'environ 150 à 200 mg, du composé tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 6. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le médicament convient pour l'administration à un individu en ayant besoin d'une dose d'environ 50 mg/j à environ 1500 mg/j, notamment d'environ 150 mg/j à environ 200 mg/j, du composé tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 6. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le médicament convient pour une administration par voie orale. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le médicament se présente 20 sous la forme d'une poudre, de cachets, de gélules ou de sachets. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle le composé tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 6 est associé à au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement des pathologies définies dans la revendication 2. 12. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active: au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 6 ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, et au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement des pathologies choisies dans la liste comprenant: -l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la Maladie de Friedreich, - les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment à la vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de Guillain-Barré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, les tumeurs cérébrales, - la maladie de Parkinson, et - les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence vasculaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13. Produits contenant: É au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 6 ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, et É au moins un composé additionnel destiné la prévention ou au traitement des pathologies choisies dans la liste comprenant: -l'épilepsie, - les accidents vasculaires cérébraux, ischémiques ou hémorragiques, - les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou la Maladie de Friedreich, - les phacomatoses, notamment les neurofibromatoses, - les neuropathies, telles que les neuropathies carentielles, notamment alcooliques, les neuropathies toxiques ou médicamenteuses, notamment à la vincristine, les neuropathies liées à une affection métabolique, telle que le diabète, les neuropathies liées à un processus inflammatoire, notamment le syndrome de Guillain-Barré, les neuropathies infectieuses, notamment le zona, et les neuropathies radiques, - la polynévrite paranéoplasique, - la sclérose en plaque, - la sclérose latérale amyotrophique, - la schizophrénie, - la dépression, - les tumeurs cérébrales, et - la maladie de Parkinson, et les démences, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick ou la démence vasculaire, comme produit de combinaison pour une utilisation séparée, simultanée ou étalée dans le temps pour la prévention ou le traitement des détériorations neuronales liées à ces pathologies.