FR 2891551 A1 20070406 FR 0510051 A 20051003 INDICATION DU DOMAINE TECHNIQUE Chez un sujet sain, la plupart des cellules souches hématopoïétiques pluripotentes ainsi que les cellules progénitrices déjà commises vers une lignée, sont CD34+. La majorité de ces cellules sont CD34+CD38+ alors qu'une minorité de ces cellules ( Le phénotype CD34+CD38- identifie les cellules hématopoïétiques les plus immatures qui sont capables d'auto-renouvellement et sont multipotentes (capables de se différencier dans les différentes lignées hématologiques). La fraction cellulaire CD34+CD38- contient plus de cellules capables de donner i) des progéniteurs tardifs mis en évidence par des tests fonctionnels de type CFU-GM et BFU-E; ii) des progéniteurs précoces, testés par les cobblestone assays, ou CAFC , ou LTC-IC, correspondant à une culture de ces progéniteurs pendant 5 semaines, en l'absence de facteurs de croissance et en présence de lignées stromales murines. Les cellules CD34+CD38- permettent de générer in vitro les cellules de la lignée myéloïde et les cellules de la lignée lymphoïde et ont la capacité de repeupler une souris SCID (Bhatia et al., 1997). Les travaux déjà publiés d'expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs nécessitent comme inoculum de départ un enrichissement en progéniteurs, notamment des cellules exprimant le CD34+ ou mieux l'antigène plus précoce AC133 (Dexter et al., 1977; Muench et al., 1992; Verfaillie and Catanzaro, 1996) . En effet, il a été montré que l'expansion ex vivo à partir de la totalité de la fraction de cellules mononuclées en présence de cytokines entraîne l'amplification de colonies CFU pendant les premières semaines de culture suivie rapidement par un déclin de cette expansion. Il a donc été largement accepté que la purification des cellules CD34+ soit un pré requis pour obtenir une expansion réussie de cellules souches hématopoïétiques ainsi que des progéniteurs précoces appelés LTC-CFUc (long-tern culture colony forming cells) (Briddell et al., 1997; McNiece et al., 1998). Par conséquent, en utilisant les techniques actuelles d'expansion, les cellules souches ne peuvent être amplifiées que s'il y a une étape préalable de purification des progéniteurs CD34+, ou AC133+. De ce fait, les méthodes actuelles d'expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques sont limitées par un procédé laborieux et coûteux d'enrichissement des cellules souches CD34+ en préalable à toute culture. Les cellules dendritiques sont générées à partir de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ ou à partir de précurseurs du sang périphérique, notamment les monocytes. Les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ peuvent se différencier en cellules dendritiques après une culture en présence de GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulator factor) et TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha) qui est composée de deux sous populations de cellules dendritiques distinctes: les cellules de Langerhans et les cellules dendritiques interstitielles (Caux et al., 1992). Au contraire, les cellules dendritiques générées à partir de cultures de monocytes, en présence de GM-CSF et IL4 (interleukin-4), contiennent une population uniforme de cellules dendritiques immatures ressemblant à des cellules dendritiques interstitielles (Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Ainsi, suite à la culture des progéniteurs hématopoïétiques CD34+, en présence de GM-CSF et TNF-alpha, 2 sous populations de précurseurs de cellules dendritiques émergent. Elles expriment les phénotypes CD 1 a+ ou CD 14+ et peuvent se différentier en cellules de Langerhans et en cellules dendritiques interstitielles, respectivement (Caux et al., 1992; Caux et al., 1995a; Caux et al., 1997a; Caux et al., 1997b; Caux et al., 1995b). Ces cellules dendritiques dérivées de progéniteurs CD34+ lorsqu'elles sont incubées avec un antigène spécifique tumoral, engendrent des réponses immunes et cliniques (Banchereau et al., 2001; Paczesny et al., 2004). Indication de l'état de l'art 11 existe un besoin croissant de méthodes de culture des cellules souches hématopoïétiques en particulier dans le but d'expandre celles-ci. Cependant, les méthodes classiques d'expansion des cellules souches nécessitent au préalable une étape d' enrichissement ou de purification et se heurtent rapidement à la diminution de la population fonctionnelle de cellules souches caractérisée par une détérioration du potentiel d'auto-renouvellement des cellules souches et une diminution du potentiel de greffe de ces cellules souches cultivées. La nécessité d'améliorer ces techniques de culture de cellules souches est communément admise. L'intérêt d'une découverte d'une méthode de culture ex-vivo de cellules souches hématopoïétiques permettant l'expansion aisée de cellules souches dont la capacité d'auto- renouvellement au long terme est conservée est d'une importance critique. Les applications thérapeutiques médicales qui en découlent sont multiples, telles que l'utilisation des cellules souches hématopoïétiques pour des besoins de greffes ou pour la production de cellules issues des lignées hématopoïétiques, telles que par exemple les cellules dendritiques. Nous avons stratégiquement décidé de présenter ici une des applications les plus intéressantes et qui pourrait rapidement être utilisée dans des essais cliniques de vaccination antitumorale: la génération en large quantité et sans purification préalable de cellules dendritiques dérivées de progéniteurs hématopoïétiques. Notre méthode d'expansion de cellules souches a été obtenue en cultivant sans enrichissement les cellules mononucléées dérivées de sang périphérique mobilisé, du sang de cordon ou de la moelle osseuse en présence de trois cytokines: thrombopoïétine (TPO), Fetal liver kinase-3 protein ligand (Flt3-ligand), Stem Cell Factor (SCF) et en recueillant ces cellules au 78me jour de culture ou bien en les cultivant sur une couche de cellules souches mésenchymateuses avec ces 3 cytokines et en les recueillant au 7ème ou 14me jour de culture. En cultivant ces cellules souches avec les mêmes cytokines citées plus haut et déjà utilisées dans la littérature mais simplement en les analysant et en les recueillant plus tôt, nous avons obtenu une expansion importante de précurseurs CD34+ au 7ème jour où ils sont utilisables notamment pour la culture de cellules dendritiques, Cependant, comme décrit dans la littérature ce chiffre de précurseurs diminue rapidement après ce 78me jour. Nous avons également trouvé qu'en cultivant les cellules souches sur une couche de cellules mésenchymateuses avec les 3 cytokines citées plus haut, les rendements d'expansion étaient meilleurs et surtout cette méthode de culture nous a permis de maintenir les précurseurs CD34+ jusqu'au 14ème jour. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention est une méthode de production de cellules dendritiques en deux étapes. La première étape consiste en l'expansion ex vivo pendant 7 à 14 jours de progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ à partir de sang périphérique mobilisé ou de sang de cordon ou de moelle osseuse, en présence de cytokines telles que thrombopoïétine (TPO), (fetal liver kinase-3 protein-ligand) F1t3-ligand et stem cell factor (SCF), sans nul besoin de les enrichir en progéniteurs CD34+ ou AC133+, auparavant. Seule une centrifugation avec un gradient de densité de type Ficoll ou équivalent, est nécessaire, pour éliminer les cellules polynucléées. Il est également montré dans notre invention que la culture de ces cellules mononucléées issues du sang périphérique mobilisé, de sang de cordon ou de moelle osseuse, peut se faire en présence d'une sous-couche de cellules souches mésenchymateuses, et que dans ce cas le taux d'amplification des cellules CD34+ est maintenu pendant 14 jours. La deuxième étape consiste à cultiver les cellules obtenues, sans les expandre, en présence de cytokines, telles que GM-CSF, Flt3-1, et TNF. L'invention décrite a essentiellement pour but la génération de cellules dendritiques très efficaces qui peuvent être utilisées en thérapie antitumorale. La méthode comprend: 1) Le recueil des cellules souches hématopoïétiques qui sont soit i) les cellules souches du sang périphérique, provenant de sujet sain ou malade, mobilisé avec un facteur permettant leur sortie de la moelle osseuse vers le sang périphérique, tel que le G-CSF, en plus ou non d'une chimiothérapie ou radiothérapie Ces cellules souches sont recueillies par aphérèse; ii) des cellules souches de sang de cordon; iii) des cellules souches médullaires par aspiration de la moelle d'un sujet sain ou malade. 2) Recueillir la fraction de cellules mononuclées grâce à une centrifugation en gradient de densité (FICOLL-HYPAQUE).Les cellules à l'interphase du gradient de densité qui correspondent aux cellules mononuclées soit i) du sang périphérique mobilisé, ii) du sang de cordon, ou iii) médullaires sont ainsi collectées. Tous les tubes adaptés à la centrifugation peuvent être utilisés pour obtenir le gradient de séparation. L'utilisation de chloride de Césium (PERCOLL) ou d'équivalent de solution de colloïdes de silicium est également possible pour obtenir les cellules mononuclées. L'élutriation peut également être utilisée pour cette étape de l'invention. 3) Mettre en culture, sans enrichissement ni purification, les cellules ainsi obtenues dans des conditions qui permettent l'expansion de ces cellules souches à savoir les cytokines telles que thrombopoïétine (TPO), fetal liver kinase-3 protein ligand (Flt3-ligand) et stem cell factor (SCF) L'analyse et le recueil des cellules souches expandues au 7ème jour de culture montrent qu'en moyenne, en 1 semaine, nous passons de 3 % de cellules souches CD34+ à 30%. Le phénotype de ces cellules souches expandues est CD34+CD38- avec des marqueurs de lignées négatifs. Ces cellules souches expandues sont fonctionnelles puisque l'expansion É 2891551 7 s'accompagne i) d'une expansion des progéniteurs tardifs, testés par les cultures de CFU-GM et BFU-E; ii) une très nette amplification des progéniteurs précoces, testés par les cobblestone assays, ou CAFC , correspondant à une culture de ces progéniteurs pendant 5 semaines, en l'absence de facteurs de croissance et en présence de lignées stromales murines. 4) Cette étape d'expansion est améliorée par l'utilisation d'une coculture de cellules mésenchymateuses qui servent de cellules nourricières et augmentent le rendement et la stabilité dans le temps des fonctions d'auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques. En effet, l'expansion décrite ci-dessus, c'est-à-dire, en l'absence de cellules souches mésenchymateuses, est très efficace mais est cependant transitoire puisqu'au 14éme jour le pourcentage de cellules souches CD34+ diminue aux alentours de 3 %. C'est pourquoi, nous préconisons de co- cultiver les cellules souches en présence d'une couche de cellules mésenchymateuses (environ 200 000 à 500 000/puits), l'expansion est alors prolongée jusqu'au 14émejour. 5) Mettre en culture ces cellules expandues enrichies en progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dans des conditions qui induisent la différenciation en cellules dendritiques. Dans ce travail, nous avons utilisé le milieu RPMI avec 10 % de sérum de veau foetal et la présence de 3 cytokines granulocyte macrophage-colony stimulator factor (GM-CSF), fetal liver kinase-3 protein ligand (Flt3-ligand) et 20 tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). Après 8 jours de culture et afin d'accélerer leur maturation, nous avons cultivé ces cellules deux jours de plus en présence de Lipo-polysaccharide (LPS). Cependant tout le procédé de culture peut également se faire en présence de sérum humain et non sérum de veau fetal, ou également dans un milieu enrichi sans sérum. De plus, cette deuxième étape peut se faire en l'absence de Flt3-ligand, avec ou non présence d'interleukine 4 (IL-4). 6) Utiliser ces cellules dendritiques dérivées de progéniteurs CD34+ et incubées avec du matériel antigénique et les réinjecter aux patients comme un vaccin anti-tumoral. Ainsi, l'invention est une méthode pour produire des cellules présentatrices d'antigènes, à partir d'une expansion ex vivo de progéniteurs CD34+ sans étape préalable de purification. Après coloration Giemsa, ces cellules possèdent de longs prolongements cytoplasmiques à partir de la surface appelés dendrites. Phénotypiquement, elles ont les mêmes caractéristiques que les cellules dendritiques obtenues à partir de progéniteurs CD34+ purifiés, à savoir qu'elles expriment le CD 1 a et CD 14 formant 2 sous populations CD 1 a+ CD 14- de précurseurs de cellules de Langerhans et CD 1 a-CD 14+ de précurseurs de cellules interstitielles. Elles expriment également fortement CD80, CD86, CD40, les complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I et Il et CD83. Fonctionnellement, elles sont très efficaces puisqu'elles stimulent fortement les lymphocytes T dans une réaction allogénique. Le test de réaction mixte leucocytaire (mis en évidence par l'incorporation de thymidine trifide) en présence de cellules dendritiques obtenues à partir de cellules souches périphériques expandues est au moins aussi efficace qu'en présence de cellules dendritiques dérivées de progéniteurs CD34+ purifiés. Le milieu de culture décrit à cette étape est du RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal mais tout milieu habituellement utilisé pour la culture de cellules dendritiques peut être utilisé qu'il contienne ou non du sérum. Pour les essais cliniques, on préférera les milieux sans sérum tels que DMEM-12, X-vivo 15, 20 ou autre.... Par un autre aspect, l'invention est un vaccin anti-tumoral lorsque les cellules dendritiques sont chargées avec du matériel antigénique soluble ou particulaire. Le matériel antigénique utilisé dans cette procédure consiste en un ou plusieurs des produits cités ci-dessous: peptides antigéniques, peptides, protéines, poly-protéines, complexes immuns, corps apoptotiques de cellules tumorales entières, corps nécrotiques de cellules tumorales entières, lysat tumoral, liposomes, vecteurs viraux, ADN et ARN. Les cellules dendritiques générées par la méthode de l'invention et ainsi prétraitées sont capables de présenter l'antigène et d'induire des réponses T primaires, â des lymphocytes CD8+ aussi bien que des lymphocytes CD4+ auxiliaires. Ces cellules présentatrices d'antigène peuvent être employées dans des essais cliniques d'immunothérapie, d'immunoprophylaxie, seul ou en adjuvant. Par un autre aspect, l'intérêt de ce vaccin anti-tumoral est double: 1) absence de purification préalable des cellules progénitrices CD34+ 2) génération d'un grand nombre de cellules dendritiques à partir d'un petit inoculum de départ. Par un autre aspect, l'invention permet d'obtenir de grande quantité de cellules utilisables pour transférer des gènes soit dans les cellules souches pour les cellules obtenues après expansion, soit dans les cellules dendritiques pour les cellules obtenues après culture dans un milieu de différentiation en cellules dendritiques. Par un autre aspect, l'invention permet d'obtenir une quantité importante de cellules souches hématopoïétiques utilisables comme source de greffon pour une transplantation de cellules souches hématopoïétiques, qu'elle soit allogénique, ou autologue, et notamment lorsqu'un greffon est de richesse minimale. Les dessins annexés illustrent l'invention: La figure 1 représente la première étape de l'invention à savoir la méthode d'expansion ex-vivo des cellules souches hématopoïétiques à partir de sang périphérique mobilisé non purifié en présence des 3 cytokines suscitées. La figure lA montre le phénotype de ces cellules avant (JO) et après expansion, à J7 et J14, selon le marqueur CD34 qui leur est spécifique, et le marqueur de lignée dénommé Lin qui par contre marque les cellules autres que cellules souches Le pourcentage respectif des différentes populations et dess populations doublement marquées est indiqué. Dans la figure I B, la culture de ces cellules se fait en présence de cellules souches mésenchymateuses, et des mêmes cytokines La figure 2 représente la deuxième étape de l'invention à savoir l'obtention de cellules dendritiques dérivées de progéniteurs CD34+ cultivés selon l'étape 1. Le phénotype représenté est caractéristique de ces cellules. Les marqueurs CD 1 a et CD14 définissent les 2 sous-populations classiques des cellules dendritiques dérivées de progéniteurs hématopoïétiques. Les marqueurs CD80, CD86, HLA-DR sont présents sur ces cellules et augmentent (en pourcentage, et/ou en intensité) après maturation par le LPS. De plus apparaît le marqueur CD83. 2891551 La figure 3 représente la fonction de ces cellules dendritiques en réponse à une réaction allogénique. Dans cette figure, sont comparés les cellules dendritiques issues de sang périphérique mobilisé sans purification (dénommées CSP-CD) , avec des progéniteurs CD34+ purifiés (dénommés CD 34-CD) et avec un contrôle standard de cellules mononuclées du sang périphérique (dénommées PBMC). L'abscisse représente le nombre de cellules stimulantes par puits; l'ordonnée représente le nombre de coup par minute représentant l'incorporation de thymidine tritiée, et donne un indice de prolifération des cellules. La Figure 4 représente tout le procédé de fabrication des cellules dendritiques 10 depuis la première étape, jusqu'à l'analyse de leur fonction, selon les Figures 1, 2 et 3. En référence à ces figures, l'invention comporte: Une méthode très efficace d'expansion ex vivo de progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ à partir de sang périphérique mobilisé sans purification préalable, en présence de 3 cytokines dont Flt3-ligand (fetal liver kinase-3 protein ligand) et SCF (stem cell factor), thrombopoïétine (TPO). A 37 30 % des cellules de départ sont CD34+CD38- et Lin-, phénotype classique des cellules souches. La culture des cellules lors de la première étape peut se faire également en présence de ces mêmes cytokines: FLT3-ligand, SCF, TPO, plus interleukine- 6 (IL-6), ou plus TNF-alpha, ou plus GM-CSF, ou plus toute autre cytokine. 1) Une méthode qui grâce à une coculture de cellules souches mésenchymateuses est encore plus efficace. Le pourcentage de cellules ayant le phénotype CD34+CD38- et Lin- est maintenu jusqu'à J14 (sans coculture ce phénotype décline à partir de J10). 2) Une méthode d'expansion ex vivo de progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ qui peut se faire à partir de sang périphérique mobilisé mais également à partir de sang de cordon ou de moelle osseuse. 3) Une méthode d'obtention d'une grande quantité de cellules dendritiques dérivées de progéniteurs CD34+ sans aucune purification coûteuse. Ces cellules dendritiques recueillies à J87 de culture ont le phénotype classique avec 2 sous-populations CD1a+CDl4- de précurseurs de cellules de Langerhans et CD 1 a-CD 14+ de précurseurs de cellules interstitielles. 4) Ces cellules dendritiques dérivées de progéniteurs sans purification préalable sont fonctionnelles. En effet, dans un test de réaction allogénique, elles sont au moins aussi efficaces que les cellules dendritiques dérivées de progéniteurs obtenues à partir d'une purification CD34+. REVENDICATIONS 1) Procédé en deux étapes de culture de production de cellules dendritiques à partir de progéniteurs hématopoïétiques CD34+, sans besoin de purification préalable des cellules CD34+, caractérisé : -en ce que la première étape de culture consiste à recueillir les cellules souches hématopoïétiques issues du sang périphérique mobilisé ou de sang de cordon ou de moelle osseuse, -en ce que ces cellules sont par la suite soumises à un gradient de densité pour recueillir les cellules mononuclées. -en ce que cette population cellulaire est cultivée dans un milieu adapté en présence de cytokines telles que Throbompoïétine (TPO), fetal liver kinase-3 protein ligand (Flt3-ligand) et stem cell factor (SCF) -en ce que lors de la deuxième étape de culture, les cellules sont lavées, puis de nouveau cultivées en présence de cytokines telles que granulocyte macrophage-colony stimulator factor (GM-CSF), Flt3-ligand et tumor necrosis factor- alpha (TNF-alpha). 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la culture se fait en présence de sérum humain et non du sérum de veau foetal, ou également dans un milieu 20 enrichi sans sérum 3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la culture des cellules lors de la première étape peut se faire en présence de cytokines sélectionnées à partir du groupe suivant: Flt3-ligand, SCF, thrombopoïétine (TPO), plus interleukine-6 (IL-6), ou plus TNF-alpha., ou plus GM-CSF ou plus toute autre cytokine. É 2891551 14 4) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la méthode d'expansion des cellules souches lors de la première étape est améliorée par une coculture avec des cellules souches mésenchymateuses. 5) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la méthode de différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules dendritiques, lors de la deuxième étape, peut se faire en l'absence de Flt3-ligand, avec ou non présence d'interkeukine-4 (IL-4). 6) Utilisation de la méthode selon la revendication 1 arrêtée â la première étape pour expandre des cellules souches hématopoïétiques.