FR 2892819 A1 20070504 FR 0511113 A 20051028 La présente invention a pour objet l'utilisation de nanoparticules à luminescence persistante, le cas échéant fonctionnalisées, en tant qu'agent de diagnostic destiné à l'imagerie optique in vivo. Ces nanoparticules sont de préférence constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par (1) les silicates, les aluminates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, (2) les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et (3) les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un ion d'un métal de transition. De préférence, l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de la vascularisation de l'organisme ou des organes réticulo-endothéliaux (foie, rate). L'invention a encore pour objet un procédé et un kit de détection ou de quantification in vitro d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, par mise en oeuvre desdites nanoparticules préalablement fonctionnalisées. Le développement rapide de nombreuses techniques d'imagerie durant les dernières décennies (IRM, écho-doppler, scanner, Tomographie par émission de positons...) répond à un besoin croissant de la part des biologistes et des médecins. De la simplification des travaux expérimentaux à une détection précoce de maladies, une dynamique s'est créée autour des recherches en imagerie. Chaque technique possède avantages et inconvénients, rendant ainsi l'ensemble des imageries complémentaires. L'imagerie optique, utilisant les photons comme source d'information, est essentiellement utilisée pour des études in vitro. Il s'agit d'un domaine en pleine expansion avec des retombées directes en pharmacologie, dans le développement d'outils d'aide au diagnostic et de recherches en biologie moléculaire et cellulaire. Les autres techniques d'imagerie trouvent la majorité de leurs applications en imagerie in vivo, que ce soit chez le petit animal ou chez l'homme. Une place toujours croissante est accordée à ces techniques dans les études de biodistribution en biologie. Il est en effet possible de réaliser un suivi dynamique et longitudinal sur chaque animal en diminuant de façon notable le sacrifice d'animaux. Cependant le coût élevé et un certain nombre de barrières technologiques rendent difficile leur utilisation quotidienne. Avec le développement de nouveaux capteurs optiques plus sensibles (sensibilité de l'ordre du photon) et de nouvelles sondes performantes, l'imagerie optique commence à se pencher sur la problématique des études in vivo, et ce avec des coûts plus faibles. L'imagerie optique utilise essentiellement des sondes fluorescentes, qu'elles soient moléculaires organiques (rhodamine, bromure d'éthidium...), biologiques (protéines de type GFP et analogues) ou inorganiques (Quantum Dots). Toutefois, l'autofluorescence des tissus et de l'ensemble des composants organiques, surtout en excitation UV rend l'utilisation de la fluorescence difficile. Le problème se complexifie encore dans les études in vivo à cause de la diffusion des photons par les tissus, ce qui altère la forme et la taille de la zone observée. En effet, deux phénomènes physiques bien connus û l'absorption et la diffusion û limitent la propagation d'ondes électromagnétiques dans un milieu, qu'il soit biologique ou non. De plus, l'atténuation de la lumière dans les tissus rend l'observation des tissus profonds difficile, si la propriété d'émission de la sonde ne se trouve pas dans la zone de transparence des tissus (longueur d'onde allant de 650 nm à l'infrarouge). Une illustration en est donnée aux Figures lA (spectre d'absorption de l'hémoglobine) et 1B (spectre d'absorption de l'eau). Entre 400 et 600 nm, l'absorption de l'ensemble des constituants du milieu biologique est très importante pour une imagerie des tissus profonds. Au-delà de 1300 nm, les ondes électromagnétiques sont absorbées sous forme d'énergie thermique par l'ensemble des molécules (surtout par les molécules d'eau). De surcroît, dans de nombreux cas, les composés fluorescents sont phototoxiques. En effet, quand un fluorophore (endogène ou exogène) est excité, il peut y avoir création d'un état triplet. Cet état est très réactif chimiquement et peut endommager les cellules vivantes. Un des mécanismes entraînant le plus de dommages correspond à la génération d'un oxygène singulet, donnant lieu à la chaîne du stress oxydatif. Tous ces facteurs limitent ainsi fortement le suivi des molécules d'intérêt sur l'animal vivant. Pour ces raisons, la biodistribution de composés fluorescents n'est réellement analysable que "ex vivo", c'est-à-dire en sacrifiant les animaux pour prélever les organes, extraire le fluorophore et évaluer la quantité par rapport à l'étalonnage correspondant à chaque organe. Mais, dans ce cas encore, des difficultés importantes proviennent du fait de la photo-désactivation du chromophore organique après quelques cycles d'excitation, qui altère rapidement sa fluorescence. Ainsi, bien que les progrès aient été spectaculaires au niveau de la technologie des caméras et autres détecteurs, il reste donc encore beaucoup à faire pour développer les sondes utilisables in vivo pour l'observation optique. Les inventeurs ont ainsi développé des sondes luminescentes prometteuses, 20 utilisables à la fois en imagerie in vivo pour le petit animal et in vitro pour le développement d'outils d'analyses pour les biologistes. La présente invention a pour but d'utiliser des nanomatériaux à luminescence persistante (matériaux dont l'émission peut perdurer plusieurs heures après l'arrêt de l'excitation) pour l'imagerie optique in vivo. L'excitation du matériau peut ainsi 25 être effectuée avant que celui-ci ne soit injecté dans l'organisme à étudier. Ceci permet d'éviter l'autofluorescence des tissus, point essentiel pour l'accroissement du rapport signal sur bruit. Pour un matériau donné, la longueur d'onde d'émission dépend du dopant. Elle est donc relativement modulable et l'émission pourra être adaptée à la fenêtre de 30 transparence des tissus, entre 600 et 1300 nm. Les nanomatériaux inorganiques à luminescence persistante offrent ainsi des avantages considérables pour leur utilisation in vivo, d'une part pour améliorer la qualité des images avec une imagerie des tissus profonds, et d'autre part, sous forme de particules nanométriques, le matériau est rendu injectable, le cas échéant par traitement de surfaces avec des entités biocompatibles tout en conservant ses qualités optiques. Plusieurs applications sont aujourd'hui envisagées : grâce à ces composés, il est ainsi possible de visualiser les zones de rupture de la barrière hématoencéphalique, les zones inflammatoires et tumorales, et aussi de visualiser la biodistribution des liposomes in vivo dans une stratégie de thérapie génique ou d'administration de médicaments utilisant des nanovecteurs. Comme document de l'art antérieur, on peut citer l'article Jiang et al. (Journal of Alloys and Compounds 377 (2004) 211-215), qui a pour objet la propriété de luminescence persistante de CaMgSi2O6 dopé avec de l'europium et du dysprosium. Toutefois, ce document ne décrit pas ni ne suggère de procéder à l'excitation de ce composé puis de l'administrer in vivo, notamment à des fins d'imagerie optique. En effet, les études portant sur les matériaux à luminescence persistante concernent principalement la signalisation, l'éclairage, le marquage des textiles. Aucun article relevé dans la littérature n'est concerné par l'objet de la présente invention. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une nanoparticule à luminescence persistante pour son utilisation en tant qu'agent de diagnostic, ladite nanoparticule émettant des photons à des longueurs d'onde comprises entre 400 et 1300 nm pendant au moins 0,01 seconde, après une excitation lumineuse à des longueurs d'onde comprises entre 100 et 800 nm, ou encore après excitation par des rayons X. Les longueurs d'onde comprises entre 100 et 400 nm correspondent au domaine ultraviolet/ultraviolet extrême (VUV pour vacuum ultraviolet ), celles entre 400 et 800 nm au domaine du visible, et celles entre 800 et 1300 correspondent au domaine infrarouge. Les nanoparticules selon l'invention ne doivent pas émettre des photons à des longueurs d'onde inférieures à 400 nm, c'est-à-dire dans le domaine ultraviolet, car de telles longueurs d'onde sont absorbées par les molécules du vivant, ce qui entraîne leur détérioration progressive, la formation de composés phototoxiques et au final la destruction cellulaire. D'autre part, les nanoparticules selon l'invention ne doivent pas émettre des photons à des longueurs d'onde supérieures à 1300 nm, c'est-à-dire dans le domaine infrarouge lointain, car les ondes électromagnétiques sont absorbées sous forme d'énergie thermique par l'ensemble des molécules (surtout par les molécules d'eau). Les nanoparticules selon l'invention qui émettent des photons pendant moins de 0,01 seconde ne sont pas comprises dans la présente demande car il s'agit alors de fluorescence, et plus de luminescence persistante. De préférence, la nanoparticule émet des photons pendant au moins 1 seconde, de manière avantageuse pendant au moins 1 minute, 30 minutes, 1 heure, voire au 20 moins 10 heures. Les temps de persistance sont évalués en suivant l'intensité de luminescence en fonction du temps après excitation. Des comparaisons claires de mesures des temps de persistance doivent être réalisées dans des conditions identiques en 25 utilisant les mêmes systèmes de détection. L'expression matériau à luminescence persistante a été appliquée à des matériaux présentant une luminescence d'au moins 0,01 seconde jusqu'à plusieurs heures. Les matériaux à luminescence persistante, incluant des cristaux simples et des fibres de cristaux simples, peuvent présenter des temps de persistance de la luminescence supérieurs 30 à environ 3 à 5 heures, supérieurs à environ 10 à 12 heures, ou supérieurs à environ 15 à 18 heures. Le phénomène de luminescence persistante implique deux types de centres actifs : les émetteurs et les pièges (capteurs). Les émetteurs sont des centres capables d'émettre une radiation après excitation du centre. Les pièges n'émettent pas de radiation, mais stockent l'énergie de radiation et la libèrent progressivement à l'émetteur. Les centres émetteurs peuvent être créés par l'addition d'activateurs, c'est-à-dire des petites quantités d'atomes ou d'ions d'impureté ajoutés intentionnellement à la matrice hôte. Les co-activateurs sont des ions d'impuretés ou des défauts ponctuels (lacunes d'anions) ajoutés intentionnellement qui peuvent affecter (améliorer ou modifier) le temps de vie de l'émission du premier activateur. Par exemple, un co-activateur peut être ajouté pour former des centres de captage qui peuvent améliorer le temps de persistance du matériau à luminescence persistante. Il est possible pour un ion de transférer l'énergie à un autre. Si deux ions différents sont impliqués dans l'énergie de transfert, l'ion transférant l'énergie est appelé un donneur tandis que l'ion recevant l'énergie est appelé l'accepteur ou activateur (G. Blasse et B.C. Grabmaier, 1994, Luminescent materials , Springer-Verlag, Berlin, p. 91). Les matériaux de la présente invention sont basés sur le dopage d'un ou de plusieurs émetteurs dans une matrice hôte. L'hôte (ou matrice) et l'(les) ion(s) émetteur(s) est(sont) choisi(s) pour fournir l'émission souhaitée ou la couleur de luminescence persistante et un rendement quantique élevé. La présente invention est applicable à tout type d'espèce du règne animal, avantageusement aux vertébrés et plus particulièrement au petit animal (rongeurs), mais également à l'homme. Dans la présente demande, on entend désigner par nanoparticule une particule dont la taille, définie telle que la plus grande dimension selon un axe, est de 30 manière générale comprise entre 10 nm et 10 m. De préférence, la nanoparticule selon l'invention est comprise entre 25 nm et 1 m, de manière encore préférée, entre 50 nm et 500 nm. La nanoparticule à luminescence persistante peut ainsi être constituée à titre d'exemple non limitatif par un composé tel que CdSiO3 : Mn2+, ZnGa2O4 : Mn2+, ZnS:Cu ou Y2O2S : Ti, Mg, Ca. Elle peut être constituée par un composé du type silicate, aluminate, aluminosilicate, germanate, titanate, oxysulfure, phosphate ou vanadate, ledit composé comprenant au moins un oxyde de métal et étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un ion d'un métal de transition (on peut citer comme exemple le manganèse ou le chrome trivalent). Elle peut encore être constituée par un sulfure comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un ion d'un métal de transition. On peut également citer les oxydes de métaux, que l'on dope là encore avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un ion d'un métal de transition. Cette liste de composés est non limitative, et l'homme du métier est en mesure de déterminer quels matériaux à luminescence persistante peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention De préférence, la nanoparticule est constituée par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés 25 comprenant au moins un oxyde de métal, - les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec 30 au moins un ion d'un métal de transition. Comme exemple d'oxysulfures on peut citer les composés à base d'yttrium tels que les sulfures d'oxyde d'yttrium (Y202S,...). Les germanates peuvent être tels que MGeO3 dans lequel M est le magnésium, le calcium ou le zinc, de préférence le magnésium (Mg2+) et le calcium (Ca2+), de tels germanates étant de préférence dopés avec les ions manganèse et un ion trivalent de la série des lanthanides. On peut encore citer les titanates tels que MO-TiO2 dans lequel M est le magnésium ou le zinc, et les sulfures tels que le sulfure de zinc (ZnS), le sulfure de calcium (CaS) et le le sulfure de strontium (SrS). Le métal de l'oxyde de métal peut être de tout type. De préférence, il est choisi parmi le magnésium, le calcium, le strontium, le baryum, le zinc, le cadmium, l'yttrium et le gallium. Le métal de transition peut être de tout type. De préférence, le métal de transition est choisi parmi le manganèse, le chrome et le titane (Mn2+, Cri+, Tia+, ) L'ion terre rare peut être de tout type. De préférence, l'ion terre rare est choisi parmi les ions europium, ytterbium, cérium, samarium, praséodyme, dysprosium, néodyme, holmium, terbium, thulium et erbium. L'ion terre rare se trouve sous sa forme trivalente (Ce3+, Dy3+, Nd3+, Hoa+, Er3+,...) sauf pour l'europium, le samarium et l'ytterbium, qui peuvent se trouver également sous leur forme divalente (Eu2+, Sm2+et Yb2+). De préférence, la nanoparticule est constituée par un silicate comprenant un oxyde de métal dopé avec au moins un ion terre rare et au moins un ion d'un métal de transition. De manière encore préférée, le silicate est dopé avec les ions manganèse, europium et dysprosium. De manière préférée entre toutes, la nanoparticule est constituée par un composé choisi dans le groupe constitué par les silicates ZnMgSi2O6, CaMgSi2O6 et MgSiO3, de tels silicates étant dopés avec les ions manganèse, europium et dysprosium, et Sr2MgSi2O7 dopé avec les ions europium et dysprosium. De manière générale, les nanoparticules selon l'invention peuvent être administrées sans être fonctionnalisées dans l'organisme ou le tissu. En particulier, injectées par voie infra-artérielle ou intraveineuse, elles permettent une imagerie du réseau vasculaire, en particulier au niveau des poumons et du foie. Elles permettent également une imagerie fonctionnelle du foie. Un des objectifs est l'imagerie des zones tumorales ou inflammatoires qui sont hypervascularisées. Dans le cas des zones tumorales, une détection précoce d'un cancer tel que le cancer du sein est possible. Selon un mode de réalisation particulier, la nanoparticule selon l'invention est fonctionnalisée par enrobage et/ou greffage de ligand permettant une liaison avec une substance d'intérêt biologique ou chimique. Par substance d'intérêt biologique ou chimique on entend désigner toute substance dont on cherche à déterminer la biodistribution dans un organisme ou dans un tissu. La substance d'intérêt peut être par exemple une molécule chimique telle qu'un principe actif ou bien une substance toxique. Il peut encore s'agir d'un récepteur extracellulaire, d'une hormone, d'un anticorps ou d'un antigène, d'une protéine, d'une toxine telle qu'une toxine bactérienne éventuellement sous sa forme atténuée ou d'un acide nucléique, d'un virus ou autre agent pathogène (bactérie,...). Les termes protéine, polypeptide ou peptide désignent indifféremment une séquence d'acides aminés ou, pour leurs dérivés, un composé contenant une séquence d'acides aminés. De même, les termes acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, sont employés indifféremment pour désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des 2892819 lo nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels. Pour déterminer la biodistribution d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un organisme ou dans un tissu, il est nécessaire de fonctionnaliser la nanoparticule par enrobage et/ou greffage d'un ligand capable de se lier à la substance, le cas échéant présente au niveau tissulaire de l'organe d'intérêt. 10 Les méthodes d'enrobage sont bien connues de l'homme de l'art. Par exemple, l'enrobage peut être effectué par liaison avec des molécules portant des groupes phosphates, carboxylates ou thiols, ou encore par hétéroprécipitation de silice, d'aminosilane, ou de préférence de triéthoxyaminopropylsilane. L'enrobage 15 effectué avec du triéthoxyaminopropylsilane offre l'avantage qu'une seule couche se forme, sans polymérisation vers l'extérieur entraînant l'augmentation de la taille des nanoparticules. De même, les méthodes de greffage (ou couplage) du ligand sont bien connues de l'homme de l'art. Il s'agit en général d'un couplage par liaison covalente, par 20 affinité, par adsorption passive ou forcée. Dans le cas d'un couplage par liaison covalente, les nanoparticules sont porteuses de groupements chimiques capables de réagir avec un autre groupement chimique porté par le ligand pour former une liaison covalente. Comme exemple de groupements chimiques pouvant être présents à la surface des 25 nanoparticules on peut citer, mais sans s'y limiter, les groupements carboxyle, amino, aldéhyde et époxy. On peut également utiliser l'interaction par affinité, qui est généralement mise en oeuvre par deux partenaires d'un couple de liaison à haute affinité tels que notamment, mais sans s'y limiter, les couples (poly) carbohydrate/lectine, biotine 30 ou composés biotinilés/avidine ou streptavidine, récepteur /ligand spécifique, antigène ou haptène/anticorps, etc... 5 Le greffage des nanoparticules enrobées peut également être réalisé soit directement, soit en utilisant des bras espaceurs encore désignés sous les termes "linker" ou "spacer". Le couplage par adsorption passive ou forcée est connu de l'homme de l'art. On 5 pourra utiliser par exemple la BSA-biotine (Bovin Serum Albumin) (Sigma, Lyon, FR - Réf. A-8549). De préférence, l'enrobage est réalisé par précipitation à la surface de triéthoxyaminopropylsilane. Selon un autre mode préféré, on greffe du polyéthylène glycol (PEG) à des fins de furtivité (pour obtenir un temps de circulation dans l'organisme plus important). On procède généralement de la manière suivante : le PEG est d'abord couplé au ligand, puis le produit du couplage est greffé sur la nanoparticule. De manière préférée entre toutes, la nanoparticule selon l'invention est fonctionnalisée par précipitation à la surface de triéthoxyaminopropylsilane puis greffage de méthoxy-PEG5000-COOH permettant une liaison avec la substance d'intérêt biologique ou chimique. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet la nanoparticule telle que définie précédemment pour son utilisation en tant qu'agent de diagnostic destiné à l'imagerie optique in vivo. 25 De manière préférée, ladite nanoparticule est excitée avant l'administration. En effet, l'absence d'excitation optique du sujet permet d'éliminer l'autofluorescence des tissus, point essentiel pour l'accroissement du rapport signal/bruit. De préférence, l'agent de diagnostic est administré dans un organisme à étudier 30 par injection par voie intraveineuse, intraartérielle ou intramusculaire. 10 15 20 De préférence, l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de la vascularisation de l'organisme ou des organes réticulo-endothéliaux (foie, rate). De manière générale, on préfèrera les nanoparticules qui émettent des photons à des longueurs d'onde comprises entre 600 et 1300 nm (cf. Fig 1) pour l'imagerie des tissus profonds (organes, etc...). L'imagerie vasculaire est, par exemple, intéressante pour la mise en évidence de processus angiogéniques dans l'inflammation chronique, la croissance tumorale ou la localisation des métastases. Les études de biodistribution sont, par ailleurs, indispensables pour déterminer les rapports d'accumulation d'un agent vectorisé ou non par des formes particulaires au niveau des tissus cibles. De manière encore préférée, l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de zones tumorales, inflammatoires, de la rétine, lesdites zones étant susceptibles d'être hypervascularisées, ou encore des zones de rupture de la barrière hématoencéphalique. Selon un autre mode de réalisation, l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de zones hypovascularisées telles que dans le cas d'une ischémie cérébrale ou cardiaque, ou dans le cas d'un trauma crânien. Selon encore un autre mode de réalisation, l'agent de diagnostic permet de mimer la biodistribution de liposomes ou de nanovecteurs in vivo dans une stratégie de thérapie génique. Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour la détection ou la quantification in vitro d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, qui comprend les étapes suivantes : 1) la mise en contact dudit échantillon avec une solution contenant des nanoparticules à luminescence persistante préalablement fonctionnalisées de manière à former un complexe entre la substance et les nanoparticules, et 2) la détection ou la quantification dudit complexe formé, caractérisé en ce que lesdites nanoparticules sont constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un métal de transition. On entend désigner par échantillon dans le procédé selon la présente invention tout échantillon susceptible de contenir la substance d'intérêt biologique ou chimique que l'on souhaite détecter ou quantifier. Comme exemple d'oxysulfures on peut citer les composés à base d'yttrium tels que les sulfures d'oxyde d'yttrium (Y2O2S,...). Les germanates peuvent être tels que MO-GeO2 dans lequel M est le magnésium, le calcium ou le zinc, les titanates tels que MO-TiO2 dans lequel M est le magnésium ou le zinc, et les sulfures tels que le sulfure de zinc (ZnS), le sulfure de calcium (CaS) et le sulfure de strontium (SrS). De préférence, le métal de l'oxyde de métal est choisi parmi le magnésium, le calcium, le strontium, le baryum, le zinc, le cadmium, l'yttrium et le gallium. De préférence, le métal de transition est choisi parmi le manganèse, le chrome et le titane (Mn2+, Cri+, Tia+, ) De préférence, l'ion terre rare est choisi parmi les ions europium, ytterbium, cérium, samarium, praséodyme, dysprosium, néodyme, holmium, terbium, thulium et erbium. L'ion terre rare se trouve sous sa forme trivalente (Ce3+, Dy3+, Nd3+, Hoa+, Er3+,...) sauf pour l'europium, le samarium et l'ytterbium, qui peuvent se trouver également sous leur forme divalente (Eu2+, Sm2+et Yb2+). De manière encore plus préférée, les nanoparticules sont constituées par un silicate comprenant un oxyde de métal dopé avec au moins un ion terre rare et au moins un métal de transition. De manière préférée entre toutes, les nanoparticules sont constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par les silicates ZnMgSi2O6, CaMgSi2O6 et MgSiO3, de tels silicates étant dopés avec les ions manganèse, europium et dysprosium, et Sr2MgSi2O7 dopé avec les ions europium et dysprosium. Les nanoparticules peuvent être fonctionnalisées comme décrit ci-dessus. Selon un dernier aspect, l'invention a pour objet un kit de diagnostic comprenant une solution contenant des nanoparticules à luminescence persistante constituées 20 par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le 25 strontium et le calcium, et les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un métal de transition. 15 30 Les exemples et figures qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : lA Coefficient d'extinction molaire de l'hémoglobine en fonction des longueurs d'onde (d'après W. B. Gratzer et N. Kollias) ; lB Coefficient d'extinction de l'eau en fonction des longueurs d'onde (d'après G. M. Hale, M. R. Querry. Applied Optics,12 (1973) 555-563) Figure 2: Décroissance typique du signal de luminescence des composés synthétisés Figure 3 : Spectre d'excitation et d'émission de ZnMgSi2O6 : Eue+ Dy3+ Mn2+ Figure 4 : Diagramme de diffraction des RX de ZnMgSi2O6 : Eue+ Dy3+ Mn2+ Figure 5 : Distribution de taille obtenue par diffusion quasi-élastique de la lumière des particules de ZnMgSi2O6 : Eue+ Dy3+ Mn2+ Figure 6 : Spectre d'excitation et d'émission de CaMgSi2O6 : Eue+ Dy3+ Mn2+ Figure 7 : Spectre d'excitation et d'émission de Sr2MgSi2O7 : Eue+ Dy3+ Figure 8 : Dynamique des nanoparticules de ZnMgSi2O6 dopé Eu, Mn, Dy après injection intraveineuse Figure 9 : Dynamique des nanoparticules de ZnMgSi2O6 dopéEu, Mn, Dy recouvertes de methoxy-PEG5000 après injection intraveineuse EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse gel du composé ZnMgSi2O6 dopé Eu, Mn, Dy 1) Synthèse du gel Dans un ballon, on dissout dans 4mL d'eau acidifiée à pH 2 (par addition d'acide nitrique) 610mg (4,98.10-3 mol) de Chlorure de Zinc, 1,150mg (4,98.10-3 mol) de Nitrate de Magnésium hexahydrate, 20mg (4,98.10-5 mol) de Nitrate d'Europium hexahydrate, 58.6mg (1,49.104 mol) de Nitrate de Dysprosium hexahydrate et 29.4 mg (1.34.104mo1) de Chlorure de Manganèse tetrahydrate. Sous agitation, on ajoute 2mL (8,96.10-3mo1) de tetraethoxysilane. On agite fortement à l'aide d'un vortex pour homogénéiser la solution puis on laisse sous agitation à température ambiante pendant 3h. 2) Séchage Lorsque la solution est totalement monophasée (après environ trois heures d'agitation), on place le ballon à l'étuve à 60 C pendant quatre heures. On obtient alors un gel translucide. On sèche ensuite les échantillons à l'étuve à 110 C pendant 12h. 3) Chauffage On chauffe ensuite les matériaux dans un four sous atmosphère réductrice (on utilise du Noxal : 90% Ar, 10% H2). Le chauffage s'effectue en trois étapes, la montée en température : 20 C/min jusqu'à 1150 C, un palier de 10h (1150 C constant) puis une descente en température de 10 C/min jusqu'à température ambiante. Après ce premier chauffage, un chauffage sous air suivi d'un chauffage sous atmosphère réductrice peut être nécessaire pour améliorer la luminescence. La synthèse gel des composés CaMgSi2O6 dopé Eu, Mn, Dy, MgSiO3 dopé Eu, Mn, Dy, et Sr2MgSi2O7 dopé Eu, Dy est effectuée de manière analogue. Exemple 2 : Propriétés physiques des composés exemplifiés Les composés ZnMgSi2O6, CaMgSi2O6, MgSiO3 dopés Eu, Mn, Dy, et Sr2MgSi2O7 dopé Eu, Dy obtenus par synthèse sol-gel comme détaillé ci-dessus (exemple 1), possèdent une luminescence persistante de plusieurs heures (supérieur à deux heures, voir Figure 2). Toutefois, ces compositions relatives peuvent être modifiées pour améliorer les propriétés de luminescence de composés. Grâce à la synthèse sol-gel décrite ci-dessus, les composés gardent une taille mésoscopique (taille entre 10 nm et 1 m, préférentiellement entre 50 et 500 nm). Il est ainsi possible de les redisperser dans une solution aqueuse pour obtenir une solution luminescente injectable. Certains composés exemplifiés possèdent une luminescence persistante à des longueurs d'onde particulièrement intéressantes pour les milieux biologiques (voir Figure 3). Le mécanisme de luminescence persistante avec un transfert de l'excitation sur le manganèse émet autour de 650 nm dans ces matrices. Grâce à cette émission longue dans le rouge, il est ainsi possible de réaliser une imagerie optique in vivo, la zone de transparence des tissus biologiques étant comprise entre 600 et 1300 nm. Exemple 3 : Précipitation de triéthoxyaminopropylsilane puis greffage de methoxy-PEG5000-COOH à la surface de nanoparticules à luminescence persistante. Prétraitement de surface : Dans un ballon contenant une solution aqueuse de hydroxyde de sodium (5mM), on disperse 75 mg de nanoparticules. On agite la suspension à température ambiante pendant 3h. Puis, après addition d'acide chlorhydrique (1M) afin de revenir à pH neutre, on centrifuge la suspension (4500rpm,10min) pour enlever le surnageant. On sèche alors la poudre récupérée à l'étuve. Précipitation de triéthoxyaminopropylsilane : Dans un ballon contenant 5mL de toluène anhydre et 90 L de triéthoxyaminopropylsilane, on disperse 75mg de nanoparticules préalablement traitées. On laisse sous agitation pendant 4h à 80 C. On centrifuge ensuite la suspension (4500rpm,10min) pour enlever le surnageant. Pour laver la solution, on redisperse alors la poudre dans 5mL de toluène anhydre puis on centrifuge. Cette opération de lavage est ainsi répétée trois fois. La poudre est finalement séchée à l'étuve. Un test caractéristique des amines primaires à l'acide 2,4,6 trinitrobenzène sulfonique se révèle positif sur les nanoparticules. Greffage methoxy-PEG-COOH activé sur les nanoparticules : Dans un ballon contenant 5mL de dichlorométhane, on dissout 250mg (5.104 mol) de méthoxy-PEG5000 COOH . On ajoute 5.8mg de N-hydroxysuccinimide (5.10-4 mol) et 10.3mg de dicyclohexylcarbodiimide (5.10-5 mol). L'ensemble est laissé sous agitation à température ambiante pendant 2h On évapore ensuite le solvant et on précipite le polymère activé dans de l'éther diéthylique. Le précipité ainsi formé est lavé à l'éther puis redissout ensuite dans 5mL de dichlorométhane. On ajoute dans cette solution 15 L de triéthylamine et 50mg de nanoparticules recouvertes d'une couche d'aminosilane. On laisse le milieu réactionnel sous agitation pendant 3 heures. On évapore ensuite le solvant et on redisperse les nanoparticules dans de l'eau. Après centrifugation (4500rpm,10min) et lavage à l'eau, on récupère les nanoparticules PEGylés que l'on sèche à l'étuve. 19 2892819 Exemple 4 : Expériences réalisées Au vu des premiers résultats physiques de la poudre synthétisée, les inventeurs ont réalisé les premières expériences in vitro (prélèvement d'organes et observation 5 sur coupes) et in vivo avec ces composés à luminescence persistante. Les injections in vivo ont été réalisées sur une souris SWISS avec une solution de matériau luminescent à une concentration de 30 mg par mL. Les expériences in vivo ont été réalisées en respectant les principes de bonnes pratiques de laboratoires. 10 L'excitation de la solution se fait avant injection par irradiation sous une lampe UV classique sans filtre. Les poudres n'ont pas subi de fonctionnalisation particulière (simple broyage en milieu acide (HCI) pour obtenir des charges de surface rendant les nanoparticules redispersables en milieu aqueux). Il est à noter que les composés restent luminescents dans les milieux biologiques (ce qui n'est 15 pas le cas pour tous les matériaux à luminescence persistante. Pour ces autres composés, il est nécessaire d'enrober les nanoparticules). Les images ont été réalisées à l'aide de la caméra Photolmager de Biospace Mesures. Après injection intramusculaire, les résultats montrent que les matériaux 20 exemplifiés, préalablement irradiés sous une lampe UV, sont toujours luminescents après injection dans l'animal. La luminescence est suffisamment importante pour traverser plusieurs millimètres de tissus classiquement étudiés en biologie. La localisation forte du signal est conforme aux attentes, les particules injectées en intramusculaire n'étant normalement pas emportées par la circulation 25 sanguine. Les injections en intraveineuse ont été réalisées au niveau de la queue de la souris. Les particules sont ainsi immédiatement emportées par la circulation sanguine. Les particules étant de taille nanométrique, elle ne se bloquent pas dans les poumons et donc se retrouvent naturellement dans le foie. 30 20 2892819 Le signal est suffisant pour obtenir une imagerie optique in vivo des particules plus de trente minutes après l'injection. La figure 8 permet de rendre compte de la dynamique des particules in vivo des particules non recouvertes de PEG après injection intraveineuse. La figure 9, quant 5 à elle, montre le comportement différent quand un greffage de PEG a été réalisé à la surface des nanoparticules. On y observe en effet une très faible rétention dans les poumons et augmentation de la luminescence provenant des zones autres que le foie et les poumons. REVENDICATIONS 1. Nanoparticule à luminescence persistante pour son utilisation en tant qu'agent de diagnostic, ladite nanoparticule émettant des photons à des longueurs d'onde comprises entre 400 et 1300 nm pendant au moins 0,01 seconde, après une excitation lumineuse à des longueurs d'onde comprises entre 100 et 800 nm, ou encore après excitation par des rayons X, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et - les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un ion d'un métal de transition. 2. Nanoparticule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une taille comprise entre 25 nm et 1 1am. 3. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le métal de l'oxyde de métal est choisi parmi le magnésium, le calcium, le strontium, le baryum, le zinc, le cadmium, l'yttrium et le gallium. 4. Nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'ion terre rare est choisi parmi les ions europium, ytterbium, cérium, samarium, praséodyme, dysprosium, néodyme, holmium, terbium, thulium et erbium. 30 5. Nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le métal de transition est choisi parmi le manganèse, le chrome et le titane. 22 2892819 6. Nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un silicate comprenant un oxyde de métal dopé avec au moins un ion terre rare et au moins un ion d'un métal de transition. 5 7. Nanoparticule selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un composé choisi dans le groupe constitué par les silicates ZnMgSi2O6, CaMgSi2O6 et MgSiO3, de tels silicates étant dopés avec les ions manganèse, europium et dysprosium, et Sr2MgSi2O7 dopé avec les ions europium 10 et dysprosium. 8. Nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnalisée par enrobage et greffage de ligand permettant une liaison avec une substance d'intérêt biologique ou chimique. 9. Nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 8, pour son utilisation en tant qu'agent de diagnostic destiné à l'imagerie optique in vivo. 10. Nanoparticule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est 20 excitée avant l'administration. 11. Nanoparticule selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de la vascularisation de l'organisme. 25 12. Nanoparticule selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de zones tumorales, inflammatoires, de la rétine, lesdites zones étant susceptibles d'être hypervascularisées, ou encore des zones de rupture de la barrière hémato-encéphalique. 13. Nanoparticule selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que l'agent de diagnostic est destiné à l'imagerie de zones hypovascularisées telles que 15 23 2892819 dans le cas d'une ischémie cérébrale ou cardiaque, ou dans le cas d'un trauma crânien. 14. Procédé pour la détection ou la quantification in vitro d'une substance 5 d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, qui comprend les étapes suivantes : 1) la mise en contact dudit échantillon avec une solution contenant des nanoparticules à luminescence persistante préalablement fonctionnalisées de manière à former un complexe entre la substance et les nanoparticules, 10 et 2) la détection ou la quantification dudit complexe formé, caractérisé en ce que lesdites nanoparticules sont constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les 15 oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et les oxydes de métaux, 20 ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un métal de transition. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les nanoparticules sont constituées par un silicate comprenant un oxyde de métal dopé avec au moins 25 un ion terre rare et au moins un métal de transition. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisée en ce que les nanoparticules sont constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par les silicates ZnMgSi2O6, CaMgSi2O6 et MgSiO3, de tels silicates étant dopés avec les ions 30 manganèse, europium et dysprosium, et Sr2MgSi2O7 dopé avec les ions europium et dysprosium. 17. Kit de diagnostic comprenant une solution contenant des nanoparticules à luminescence persistante préalablement fonctionnalisées, lesdites nanoparticules étant constituées par un composé choisi dans le groupe constitué par : les silicates, les aluminosilicates, les germanates, les titanates, les oxysulfures, les phosphates et les vanadates, de tels composés comprenant au moins un oxyde de métal, - les sulfures comprenant au moins un ion métallique choisi parmi le zinc, le strontium et le calcium, et les oxydes de métaux, ledit composé étant dopé avec au moins un ion terre rare, et éventuellement avec au moins un métal de transition. 18. Kit selon la revendication 17, caractérisé en ce que les nanoparticules sont 15 constituées par un silicate comprenant un oxyde de métal dopé avec au moins un ion terre rare et au moins un métal de transition.