FR 2898057 A1 20070907 FR 0601958 A 20060306 1 L'invention concerne l'utilisation de composés dérivés de l'adénine, substitués en positions 2 et 9, et éventuellement N(6) de l'adénine, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lupus érythémateux disséminé (LED). Les composés peuvent également être utilisés en association avec un deuxième composé utilisé dans le traitement du LED. Le lupus érythémateux disséminé ou lupus érythémateux systémique (LES) est une affection auto-immune très polymorphe d'origine multigénique. Il représente l'archétype des maladies auto-immunes non spécifiques d'organes. Il touche en moyenne 15-50 cas sur 100000 personnes/an. En France, environ 50000 à 80000 personnes sont touchées. Il survient principalement chez la femme (environ 9 cas sur 10), et certaines populations ethniques semblent prédisposées au développement de cette maladie, notamment les populations antillaises, afro-américaines et hispano-américaines. Bien que l'origine de la maladie ne soit pas connue, il est clair qu'elle est multifactorielle et différents types de facteurs étiologiques ont été identifiés. Concernant les facteurs génétiques, la susceptibilité à la maladie est clairement d'origine multigénique. En effet, plusieurs gènes impliqués dans une susceptibilité génétique ont pu être mis en évidence, tels que notamment les allèles DR2 et DR3 du système HLA. D'autres gènes non liés au système HLA sont également impliqués. De plus, des facteurs environnementaux ont été identifiés, tels que les rayons ultraviolets (caractère photosensible de l'éruption lupique) et les hormones sexuelles (femme en période d'activité génitale, rôle de et sur la grossesse). Le LED est une maladie extrêmement polymorphe et ses symptômes et manifestations cliniques sont donc très variés. Le diagnostic de la maladie est donc souvent difficile. Il ne peut être fait qu'après un interrogatoire minutieux et des examens sanguins. Pour établir le diagnostic, on utilise les critères de l'Association des 2 Rhumatologues Américains (ARA). Quatre de ces critères doivent être présents pour affirmer un diagnostic de lupus. Ils sont présents dans 96% des LED : 1. Éruption sur le visage en aile de papillon 2. Éruption du lupus discoïde 3. Photosensibilité 4. Ulcérations buccales ou nasopharyngées 5. Polyarthrite non érosive 6. Pleurésie ou péricardite 7. Néphropathie : protéinurie > 0,5 g/24 h ou cylindrurie 8. Crises comitiales ou psychose 9. Atteintes hématologiques : Anémie hémolytique ou leucopénie Parmi les manifestations cliniques du lupus, la néphropathie lupique est une manifestation fréquente (estimée entre 35 et 55 % sur les paramètres biologiques usuels) et représente un des principaux facteurs de pronostic. Elle peut être détectée par la recherche d'une hématurie et/ou leucocyturie avec formation de cylindres, d'une hypertension artérielle, ou le plus souvent d'une protéinurie. La détection d'une néphropathie constitue un tournant conditionnant le pronostic de la maladie. En effet, elle est susceptible d'évoluer vers une insuffisance rénale chronique dans un délai de 5 à 10 ans. Seule la dialyse ou une greffe de rein permet alors la survie des patients. Sur le plan biologique, le LED se caractérise par : un syndrome inflammatoire généralisé lors des poussées lupiques, caractérisé notamment par une sécrétion importante de TNF-a ; des troubles hématologiques ; - des anomalies sérologiques dominées par l'existence d'Ac anti-nucléaires (AAN) pouvant comprendre des Ac anti-ADN, anti-histones, antinucléosomes, anti-Sm, des anticorps anti-SSA ou anti-SSB, et des Ac anti- 3 ribonucléoprotéines (RNP). Les patients produisent également des Ac dirigés contre les éléments figurés du sang ou les phospholipides ; certains de ces auto-Ac pouvant participer à la formation de complexes immuns circulants ; et - une hypocomplémentémie liée à la consommation du complément par les complexes immuns (liée à une atteinte renale grave et se corrigeant lors des rémissions), et/ou à un déficit constitutionnel en C2 ou C4 (prédisposant au LED). Du fait de l'origine encore inconnue de la maladie, il n'existe actuellement aucun traitement spécifique pour le LED. En fonction de la sévérité de la maladie et des symptômes détectés, différentes alternatives thérapeutiques sont utilisées. Les lupus quiescents ne justifient qu'une simple surveillance. Le traitement des formes mineures cutanéo-articulaires repose sur les anti- inflammatoires non stéroidiens (AINS), par exemple l'aspirine (2 à 4g par jour), et les anti-paludéens de synthèse, par exemple l'hydroxychloroquine ou la chloroquine. Les AINS permettent de calmer les symptômes mais présentent des risques digestifs (ulcères de l'estomac), allergiques et rénaux (insuffisance rénale). Le mode d'action des antipaludéens de synthèse dans le lupus est mal connu, mais leur efficacité est démontrée. L'hydroxychloroquine (Plaquenil ) est généralement employée à la dose de 400 mg/j. L'efficacité est jugée après 3 mois. Cependant, une surveillance ophtalmologique annuelle (vision des couleurs, échelle d'Amsler) est nécessaire pour rechercher d'éventuels signes de toxicité rétinienne, principal effet secondaire de ces composés, qui imposent l'arrêt du traitement. Les autres effets secondaires (ex : neuromyopathie, agranulocytose) sont plus rares. La persistance de symptômes articulaires peut amener à administrer une corticothérapie douce (inférieure à 10 mg/j de prednisone). A l'inverse, une atteinte cutanée résistante aux anti-paludéens ne constitue pas une indication à la corticothérapie, mais justifie le recours à d'autres thérapeutiques (association d'antipaludéens, thalidomide....). 4 Le traitement des formes viscérales repose sur la corticothérapie. La prednisone (Cortancyl par exemple) est le corticoïde de référence. Schématiquement, la posologie employée est de 1 à 1,5 mg/kg/j dans les formes graves (glomérulonéphrite proliférative diffuse, anémie hémolytique) et de 0,5 mg/kg/j dans les sérites. Cependant, la corticothérapie produit des effets secondaires significatifs, et certains d'entre eux doivent être prévenus. En particulier, le rôle de la corticothérapie dans l'accélération de l'athérogénèse impose de prendre en compte ses diverses composantes (HTA, diabète, dyslipidémie, tabagisme...) : une diététique excluant le sodium et restreignant Ies apports glucidiques est donc conseillée, généralement associée à une supplémentation potassique. L'utilisation préventive des pansements gastriques et le traitement curatif par les anti-H2 ont réduit les complications digestives, surtout présentes en cas d'association avec les AINS. Au plan osseux, l'ostéoporose semble atténuée par l'adjonction quotidienne de vitamine D et de calcium en alternance avec les diphosphonates. Les risques infectieux sont considérablement majorés par la corticothérapie à fortes doses, ce qui justifie le dépistage et le traitement systématique des foyers infectieux latents. En pratique, la corticothérapie d'attaque est prescrite sur une durée de 6 semaines à 3 mois. La régression, progressive, se fait par diminution de 10% de la dose antérieure, tous les 5 à 15 jours. Le sevrage, lorsqu'il est tenté, doit être précédé de l'exploration de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L'administration de fortes doses de corticoïdes en bolus intraveineux est employée dans le traitement des poussées graves, notamment rénales et neurologiques. Les patients reçoivent 500mg-1g de méthylprednisolone (Solumédrol par exemple) en 3h pendant 3 jours consécutifs, administration relayée par une corticothérapie orale. Il apparaît donc clairement que la corticothérapie utilisée dans les faunes plus sévères de LED n'est pas sans incidence sur la santé et la qualité de vie des patients. Enfin, dans certains cas, des composés immunosuppresseurs sont utilisés. L'emploi des traitements immunosuppresseurs dans la maladie lupique ne se conçoit qu'avec discernement. En effet, leurs risques (infections à court terme, stérilité, oncogenèse possible à long terme) en font limiter l'indication aux formes viscérales graves ou cortico-dépendantes. Divers agents sont utilisés dans les schémas traditionnels: cyclophosphamide (Endoxan par exemple) à la dose de 2 à 3 mg/kg/jour, azathioprine (Imurel par exemple) à la dose de 2 à 4 mg/kg/jour, pour une durée de 6 mois à 2 ans. Outre leurs risques communs, le cyclophosphamide expose plus particulièrement aux cystopathies et aux cancers vésicaux. L'administration intraveineuse discontinue de cyclophosphamide (0,5 à 1 g/m2 tous les mois pendant 6 mois puis tous les trimestres pendant 2 ans) associée à une corticothérapie à doses 5 modérées est plus efficace que la seule corticothérapie. Elle est largement employée depuis quelques années. Il apparaît clairement de la description ci-dessus que les traitements actuels sont purement symptomatiques et induisent de multiples effets secondaires affectant significativement la qualité de vie des patients. Aucun traitement satisfaisant du LED n'est donc disponible à ce jour. Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux traitements capables de retarder la survenue des manifestations les plus graves, notamment la néphropathie lupique, de diminuer leur sévérité une fois qu'elles sont apparues, et surtout n'induisant pas d'effets secondaires aussi importants que les traitements actuels. Les phosphodiestérases (PDE) forment une superfamiIle comprenant 11 familles d'enzymes responsables de l'hydrolyse de l'AMPc et du GMPc, seconds messagers intracellulaires, jouant ainsi un rôle majeur dans le contrôle normal et pathologique de la réponse cellulaire. Leur rôle essentiel dans la signalisation intracellulaire a fait de ces enzymes de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans l'enthousiasme généré par la découverte de ces nouvelles cibles et de leur distribution tissulaire variée, on a assisté à l'émergence d'une littérature fournie sur les applications thérapeutiques potentielles des inhibiteurs de PDE. En particulier, de très nombreuses demandes de brevet ont été déposées concernant les applications thérapeutiques d'inhibiteurs des différentes familles de PDE. Dans à peu près toutes ces demandes, les applications thérapeutiques envisagées pour les inhibiteurs d'une famille particulière de PDE sont extrêmement larges, couvrant de nombreuses classes de maladies, aussi bien vasculaires que neurologiques, hématologiques ou inflammatoires, le nombre de maladies citées dans chaque catégorie étant très élevé. Notamment, au vu de ces demandes, il pourrait à priori sembler que le LED puisse être traité indifféremment par des inhibiteurs de l'une quelconque des familles PDE. En effet, le Tableau 1 ci-dessous regroupe un certain nombre de références de demandes de brevet concernant la possibilité d'utiliser des inhibiteurs des différentes familles PDE pour le traitement du lupus. Tableau 1. Références de demandes de brevet concernant la possibilité d'utiliser des inhibiteurs des différentes familles PDE pour le traitement du lupus Famille Déposant N publication Titre PDE 1 Bayer Healthcare W004081563 DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH PHOSPHODIESTERASE lA (PDE1A) 2 CELL PATHWAYS, W003017926 TREATMENT FOR LUPUS INC. ERYTHEMATOSUS BEAVO, Joseph, W00222661 NOVEL PDES AND USES A. THEREOF 3 Bayer Healthcare W004071377 DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH PHOSPHODIESTERASE 3A (PDE3A) 4 PFIZER LIMITED W003068235 Nicotinamide derivatives useful as PDE4 inhibitors PFIZER LIMITED W02005009964 Nicotinamide derivatives useful as PDE4 inhibitors Warner Lambert EP1045690 Benzenesulfonamide inhibitors Company LLC of PDE-IV and their therapeutic use WOOD, Ralph, E., W00202118 METHOD OF TREATING PERIPHERAL VASCULAR DISEASES, PERIPHERAL NEUROPATHIES, AND AUTONOMIC NEUROPATHIES 6 AMBIT W004110998 PYRROLE COMPOUNDS AND BIOSCIENCES USES THEREOF CORPORATION 7 DAIICHI W004111053 IMIDAZOTRIAZINONE SUNTORY DERIVATIVES AS PDE 7 PHARMA CO.,LTD (PHOSPHODIESTERASE 7) INHIBITORS 8 INCYTE US6080548 Cyclic nucleotide GENOMICS, INC phosphodiesterases 9 INCYTE US5922595 Cyclic GMP phosphodiesterase GENOMICS, INC INCYTE US6416991 Human cyclic nucleotide PDES GENOMICS, INC 11 Bayer Healthcare W004029617 DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH PHOSPHODIESTERASE 11A (PDE11A) Il n'est bien entendu pas possible que les inhibiteurs de toutes les familles de 5 PDE soient réellement efficaces pour le traitement de la maladie très particulière et surtout très polymorphe qu'est le LED. De plus, à l'exception de la demande W003017926 qui suggère l'utilisation d'inhibiteurs de PDE2, et éventuellement de PDE5, pour le traitement spécifique du LED, aucune des demandes citées dans le Tableau 1 ci-dessus ne présente aucun résultat susceptible d'inciter un homme du métier à penser que les inhibiteurs des autres familles de PDE pourraient réellement avoir un effet quelconque dans le traitement du lupus. Au vu de la littérature extrêmement fournie et discordante concernant les inhibiteurs de PDE et leurs applications thérapeutiques potentielles, il est clair qu'un homme du métier n'aurait pas été incité à chercher un nouveau composé efficace pour le traitement du lupus parmi les inhibiteurs de PDE, à l'exception peut-être des inhibiteurs de PDE2. De façon surprenante, les inventeurs ont pourtant pu mettre en évidence l'efficacité dans le traitement du LED de composés dérivés de l'adénine, substitués en positions 2 et 9, et éventuellement N(6) de l'adénine, et possédant des capacités inhibitrices des enzymes de la famille PDE4. Les inventeurs ont en effet démontré que ces composés sont capables d'inhiber la progression de la maladie chez des souris MRL/lpr, modèle murin du LED, notamment en s'opposant à la néphropathie, à la production de TNF-a, et au développement d'auto-Ac anti-ADN, marqueurs de la maladie, conduisant ainsi à une survie prolongée des souris MRL/lpr. L'invention concerne donc l'utilisation d'un composé de formule (I) R3 HN 7 5 8 R1 2 3 R2 (f) où Rl est choisi parmi CF3, un alkyle en C1-05, ou (CH2)ä R4 où n est de 0 à 4; R2 est choisi parmi (CH2),,,R4 ou (CH2),nAr où m est de 0 à 5; R3 est choisi parmi un hydrogène ou un méthyle ; R4 est choisi parmi un phényle, OH, un alcoxy en C1-C3, un diaikylamino en CI-25 C3, pipéridino, ou N-méthylpipérazino ; Ar représente , où X est choisi parmi F, Cl, , un alcoxy en C1-C3, ouCF3; ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable, d'un énantiomère ou d'un diastéréoisomère de celui-ci, ou d'un mélange de ceux-ci pour la fabrication 5 d'un médicament destiné au traitement du lupus érythémateux disséminé. Par alkyle en C1-C; , i >_1, on entend dans la présente demande un radical hydrocarboné saturé linéaire ou ramifié de formule -CiH2.+1, où 1 _ La présence d'un groupe méthyle en position N(6) de l'adénine améliore l'efficacité des composés définis précédemment pour le traitement du lupus. Dans un mode de réalisation avantageux, R3 est donc un méthyle. La présence en position 9 de l'adénine d'un substituant benzyle, éventuellement substitué, améliore l'efficacité des composés définis précédemment pour le traitement du lupus. Dans un mode de réalisation avantageux, R2 représente donc (CH2)Ar, où Ar est tel que défini précédemment. Le substituant X du groupe Ar peut se trouver en toute position du cycle benzénique. Toutefois, le substituant X du groupe Ar se trouve avantageusement en position 2 du cycle benzénique. En outre, X est avantageusement choisi parmi un atome de fluor et un méthoxy. Des composés particuliers susceptibles d'être utilisés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du LED ont été identifiés par les inventeurs. Notamment, de tels composés avantageux comprennent les composés représentés dans le Tableau 2 suivant. Tableau 2. Composés avantageux Nom composé Formule semi-développée* Nom nomenclature NCS 613 3 CFN9 ,CH3 9-(2-fluorobenzyl)-N(6)- N H 7 méthyl-2-3 N trifluorométhyladénine N 8F NCS 700 ,CH3 9-(2-méthoxybenzyl)- HN N(6)-méthyl-2-n- 7 N ~5 N propyladénine H CN~N9 OMe 3 3 NCS 728 ' HN N ,CH3 OMe 9-(2-méthoxybenzyl)- CF N 3 7 N(6)-méthyl-2- 3 N trifluorométhyladénine >a 4 N 9 NCS 658 CH3 9-(2-méthoxybenzyl)- HN N(6)-méthyl-2-7 ' e'4----N9 5 N OMe méthyladénine H C 2 3 >s 3 N *Me = CH3 Un composé particulièrement avantageux est la 9-(2-fluorobenzyl)-N(6)-méthyl-2-trifluorométhyladénine (NCS 613). Deux voies de synthèse peuvent être utilisées pour la préparation des composés utilisés selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du LED. La première est classique, peu convergente et utilise la chloropurine 10 correctement substituée en position R2, qui est d'abord alkylée avec différents halogénures d'alkyle (R2X), puis aminée par réaction avec la N-méthylamine (voir Schéma 1 ci-dessous). Davantage de détails concernant ce procédé de préparation peuvent être trouvés dans Bourguignon, J.J et al., J. Med. Chem. (1997) 40, 1768-1770.5 Me HN N 1) R2X, base ~~ > N \ 2) MeNH2, A Rl N H R R2 Schéma 1 La seconde voie de synthèse permet une exploration plus systématique de la position 2 de l'adénine par réaction d'amination, ou de couplage au palladium (0) (Suzuki, Sonogashira, Heck, Buchwald) à partir du dérivé 2-iodé correspondant. Ce dernier est obtenu par traitement à l'isoamyl nitrite puis à l'aide de diiodométhane du dérivé 2-amino (voir schéma 2 ci-dessous). Davantage de détails concernant cette deuxième voie de synthèse peuvent être trouvés dans Raboisson P. et al., Eur. J. Med. Chem. (2003) 38,199-214). 11 Cl Cl 1) R2X, base 2) isoamyl nitrite 3) CH2I2 CI N/\iN IN, \ R2 McNH2 Pd (0) catalyseur ArB(OH)2 ou R~ -CH ~Me HN R2 Me HN R2 Schéma 210 Les composés décrits précédemment peuvent être utilisés directement ou en tant que sels pharmaceutiquement acceptables. Par sel pharmaceutiquement acceptable on entend notamment des sels d'addition d'acides inorganiques tels que chlorhydrate, sulfate, phosphate, diphosphate, bromhydrate et nitrate ou d'acides organiques tels que acétate, maléate, fumarate, tartrate, succinate, citrate, lactate, méthane sulfonate, ptoluènesulfonate, pamoate, oxalate et stéarate. Entrent également dans le champ de la présente invention, lorsqu'ils sont utilisables, les sels formés à partir de bases telles que l'hydroxyde de sodium ou de potassium. Pour d'autres exemples de sels pharmaceutiquement acceptables, on peut se référer à "Pharmaceutical salts", J Pharm. Sei. 66:1 (1977). Un médicament destiné au traitement du LED fabriqué à partir d'un composé décrit précédemment peut en outre comprendre un support pharmaceutiquement acceptable connu de l'homme du métier. Un tel médicament peut également contenir tout type d'excipient pharmaceutiquement acceptable. Ces excipients peuvent notamment servir à améliorer la conservation des composés contenus dans le médicament, leur biodisponibilité, ou à permettre une libération prolongée des principes actifs dans l'organisme. Un médicament destiné au traitement du LED fabriqué à partir d'un composé décrit précédemment peut être employé par différentes voies d'administration, notamment par voie orale, nasale, rectale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, topique. En particulier, le LED est caractérisé à la fois par des manifestations systémiques telles que l'inflammation générale, ou la circulation de complexes immuns, et par des manifestations locales, notamment cutanées ou articulaires. Les médicaments selon l'invention peuvent donc être utilisés par voie invasive ou non invasive, par exemple intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, orale, nasale, topique ou par infiltration au niveau des articulations. Les inventeurs ont démontré que les composés décrits précédemment sont particulièrement efficaces pour le traitement du LED. Ces composés peuvent donc être utilisés seuls. Ils peuvent aussi être utilisés en association avec un deuxième composé 13 utile pour le traitement du lupus. De tels composés utiles pour le traitement du lupus sont de préférence choisis parmi les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les antipaludéens de synthèse, les corticoïdes ou les immunosuppresseurs. Ainsi, dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un composé tel que défini précédemment, en association avec un deuxième composé choisi parmi les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les anti-paludéens de synthèse, les corticoïdes ou les immunosuppresseurs, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lupus érythémateux disséminé, pour une administration simultanée, séparée, étalée dans le temps ou alternée. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont des médicaments symptomatiques à action rapide qui ont des propriétés analgésique, antipyrétique et anti-inflammatoire et qui, malgré leur hétérogénéité chimique, ont un mode d'action commun: diminution de la production tissulaire des prostaglandines (PG) et thromboxanes (TX), par inhibition de la cyclooxygénase (COX) dont il existe deux isoenzymes (COX-1, constitutive et ubiquitaire et COX-2, inductible dans les monocytes macrophages et les polynucléaires). Au sens de l'invention, les AINS regroupent les AINS proprement dit et les salicylés, car ils possèdent à peu près tous les mêmes effets thérapeutiques et les mêmes effets indésirables. Les AINS utiles en association avec un composé tel que décrit précédemment dans un médicament selon l'invention comprennent les AINS salicylés tels que le diflunisal, le benorilate ou l'aspirine ; les dérivés propioniques tels que l'alminoprofène, le kétoprofène, l'ibuprofène, le naproxène, le flurbiprofène ou l'acide tiaprofénique ; les dérivés indoliques tels que l'indométacine, le sulindac ou l'étodolac ; les dérivés pyrazolés tels que la phénylbutazone ; les oxicams tels que le piroxicam, le ténoxicam, ou le méooxicam ; les anti-COX2 sélectifs tels que le rofecoxib ou le celecoxib ; ou encore d'autres AINS tels que le diclofénac, le nimésulide, l'acide niflumique, l'acide méfénamique, ou la nabumétone. De préférence, PAINS utilisé en association avec un composé précédemment décrit est choisi parmi l'aspirine, l'indométacine et l'ibuprofène. Les anti-paludéens de synthèse susceptibles d'être associés à un composé dérivé de la 9-benzyladénine décrit précédemment dans un médicament selon l'invention comprennent les 4-méthanolquinoléines telles que la quinine et la méfloquine ; les 4- aminoquinoléines telles que la chloroquine, l'hydroxychloroquine et l'amodiaquine ; les 8-aminoquinoléines telles que la primaquine ; les biguanides tels que le proguanil ; les sulfonamides associées aux diaminopyrimidines telles que la sulfadoxine/pyriméthamine ; les sesquiterpènes lactones telles que l'artémisinine et dérivés. De préférence, l'anti-paludéen de synthèse utilisé en association avec un composé précédemment décrit est choisi parmi la chloroquine et hydroxychloroquine, de préférence l'hydroxychloroquine. Les corticoïdes sont formés des corticoïdes naturels (cortisone et hydrocortisone) et de leurs dérivés de synthèse. Les corticoïdes utiles en association avec un composé dérivé de la 9-benzyladénine décrit précédemment dans un médicament selon l'invention comprennent la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone fluorée, la dexaméthasone, la bétaméthasone, la paraméthasone, la triamcinolone, le cortivazol, et le tétracosactide. La prednisone reste le corticoïde de référence dans le traitement du lupus et est utilisée préférentiellement. En cas d'association d'un corticoïde avec un composé tel que décrit précédemment dans un médicament selon l'invention, un régime sans sel et de type diabétique (réduit en glucides et en calories) et des supplémentations en potassium, calcium, vitamine D sont indispensables. Enfin, les immunosuppresseurs susceptibles d'être associés à un composé dérivé de la 9-benzyladénine décrit précédemment dans un médicament selon l'invention comprennent la cyclosporine, le tacrolimus, l'azathioprine et le cyclophosphamide. De préférence, l'immunosuppresseur utilisé en association avec un composé précédemment décrit est choisi parmi l'azathioprine et le cyclophosphamide. Lorsqu'un médicament destiné au traitement du LED est préparé à partir d'un composé tel que décrit précédemment et d'un deuxième composé utile dans le traitement du LED, ces composés actifs peuvent être administrés de façon simultanée, séparée, étalée dans le temps ou alternée. En effet, le médicament résultant de l'association des deux composés peut être présenté sous la forme d'un médicament unique, chaque prise entraînant nécessairement l'administration des deux composés de façon simultanée , ou bien sous la forme de deux unités de médicament distinctes comprenant chacune l'un des composés, l'administration pouvant alors être faite de 15 façon séparée (en même temps, mais dans deux unités distinctes, éventuellement par des voies différentes) ou bien étalée dans le temps (les deux unités étant administrées à des moments différents, à quelques heures ou quelques jours d'écart). Ces différentes possibilités pelinettent de tenir compte des propriétés particulières des différents composés. En outre, les deux composés peuvent être administrés de façon alternée , c'est-à-dire que le patient est traité d'abord par une cure de l'un des composés, puis par une cure du deuxième composé, et ainsi de suite de façon alternée. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Effet du composé NCS 613 sur la protéinurie chez les souris MRL/lpr. Les souris ont reçu jusqu'à l'âge de 13 semaines 4 administrations de 30 g de composé NCS 613. Les résultats représentent le pourcentage de souris ayant une protéinurie positive en fonction de l'âge (en semaines) des souris utilisées. Figure 2: Effet du composé NCS 613 sur la survie des souris lupiques MRL/lpr. Les souris ont reçu jusqu'à l'âge de 13 semaines 4 administrations de 30 gg de composé NCS 613. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie des souris. Les souris contrôles n'ont reçu que du PBS (solution saline tamponnée par du phosphate, pH 7.4) sans le principe actif. Figure 3: Effet du composé NCS 613 sur la production de TNF-a par les cellules issues du sang des souris traitées après stimulation par du LPS. La sécrétion du TNF-a par les cellules issues du sang des souris ayant reçu la solution saline (PBS), ou le composé NCS 613 après stimulation ex vivo par du LPS pendant 24h a été mesurée dans les surnageants par ELISA. Les barres d'erreur représentent la déviation standard des duplicata, et le pourcentage d'inhibition de la sécrétion de TNF- a en fonction de la sécrétion mesurée dans le groupe PBS est indiqué. Les figures représentent des expériences réalisées sur des souris âgées de 11 (A) et 14 (B) semaines. Figure 4: Effet du composé NCS 613 sur la production d'Ac anti-ADN double brin. La présence d'Ac dirigés contre l'ADN dans les sérums de souris a été évaluée à différents âges (en semaines) par test ELISA. Les résultats sont représentés en pourcentage de souris positives. Une souris est définie comme positive lorsque la densité optique (DO) mesurée en ELISA est supérieure à 1. 16 Figure 5. Inhibition de la sécrétion de TNF-a par le composé NCS 613 après stimulation des PBMCs de patients atteints de maladies auto-immunes par du LPS. Les cellules issues du sang de patients atteints de lupus (LED), de polyarthrite rhumatoïde (PR) et d'un syndrome de Gougerot-Sjôgren (Goug) sont incubées pendant 45 minutes en présence ou non de NCS 613 (10 M), puis stimulées par du LPS. Les surnageants sont prélevés après 24h de culture et le dosage du TNF-a dans les surnageants est réalisé par ELISA. Les résultats sont représentés en concentration de TNF-a après incubation en présence ou en absence de NCS 613 (A) ou en inhibition de la sécrétion de TNF-a après incubation avec le NCS 613 (B). Les barres d'erreur représentent la déviation standard des duplicata. Figure 6. Inhibition de la sécrétion de TNF-a par les PBMCs d'un patient lupique après incubation avec le NCS 613. Les cellules issues du sang d'un patient atteint de lupus (LED2) sont incubées en présence ou non de NCS 613 (10 M). Les surnageants sont prélevés après 24h de culture et le dosage du TNF-a dans les surnageants est réalisé par ELISA. Les résultats sont représentés en concentration de TNF-a après incubation en présence ou en absence de NCS 613 et le pourcentage d'inhibition de la sécrétion de TNF-a après incubation avec le NCS 613 est indiqué. Les barres d'erreur représentent la déviation standard des duplicata. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Effets biologiques du composé NCS 613 1.1 Matériels et méthodes 1.1.1 Expérimentation animale : étude in vivo de l'effet de l'administration du composé NCS 613 Administration et prélèvements Des souris MRL/lpr pré-autoimmunes femelles âgées de 5 semaines, ont reçu par voie intraveineuse, soit la solution saline tamponnée (PBS ; groupe contrôle, 10011l par souris), soit le composé NCS 613 (30 g/1000 par souris, dilué en solution saline contenant 10% d'éthanol). Les deux groupes de souris sont composés chacun de 10 animaux. Les administrations (au nombre de 4) ont été effectuées aux âges de 5, 7, 9 et 13 semaines, et les animaux ont été suivis régulièrement (observations, dosage de la protéinurie sur bandelette Albutix, prélèvements sanguins). Dosage des anticorps anti-ADN dans le sérum. La présence d'Ac dirigés contre l'ADN dans les sérums de souris a été évaluée à différents âges par test ELISA (Monneaux et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33, 287-296). L'ADN double brin de thymus de veau (Sigma) a été adsorbé (100ng/ml) sur des plaques 96 puits en chlorure de polyvinyle (Falcon) et incubé une nuit à 37 C. Après trois lavages et une étape de saturation en tampon PBS-Tween contenant de l'albumine sérique bovine, les sérums sont incubés (dilués au 1/500) pendant une heure à 37 C. La révélation de la liaison des Ac présents dans le sérum à l'ADN est réalisée par une incubation avec un Ac secondaire (anti-IgG de souris couplé à la peroxydase), suivie d'une incubation avec le substrat de la peroxydase et d'un chromogène. L'absorbante est mesurée à 450 nm au spectrophotomètre après arrêt de la réaction. Dosage de la sécrétion de TNF-a par les cellules issues du sang des souris traitées après stimulation par du LPS. La sécrétion du TNF-a a été mesurée après stimulation des cellules issues du sang de souris (pool du sang des 7 souris par groupe) par des lipopolysaccharides bactériens (LPS). La stimulation des cellules par du LPS pendant 24h peiinet de générer la sécrétion de TNF-a qui peut ensuite être mesurée dans les surnageants de culture. Les cellules issues du sang des 2 groupes de souris ont été purifiées par gradient de Ficoll, et ensuite stimulées par du LPS. Les surnageants ont été récupérés après 24h de culture, et la présence de TNF-a dans les surnageants a été mesurée par un test ELISA double sandwich (BD Biosciences). Cette expérience a été réalisée à différents âges (11 et 14 semaines, soit 2 semaines après la 3eme administration et 1 semaine après la 4eme administration respectivement). 1.1.2 Etude chez les patients : étude ex vivo de l'effet du composé NCS 613 sur la production de TNF-a Le sang de 5 patients atteints de lupus, polyarthrite rhumatoïde ou syndrome de Gougerot-Sjdgren est prélevé directement sur des tubes héparinés. Les cellules mononucléées du sang sont purifiées par centrifugation (30 min à 600g) sur un gradient de Ficoll. Les cellules sont ensuite mises en culture à raison de 2x105 cellules par puits en présence ou non du composé NCS 613 (1011M) pendant 45 minutes puis stimulées par du LPS. Les surnageants sont prélevés après 24h de culture et le dosage du TNF-a dans les surnageants est réalisé par test ELISA double sandwich (BD Biosciences). 1.1.3 Etude sur les phosphodiestérases des nucléotides cycliques Activités phosphodiestérasiaues L'activité de la phosphodiestérase des nucléotides cycliques a été déterminée à l'aide d'une méthode radioenzymatique en utilisant de l'AMP ou du GMP cyclique tritié (1 M) comme substrat (Lugnier C. et al., Biochem. Pharmacol. (1986) 35, 1743-1751.; Keravis T et al., Meth. Mol. Biol. (2005) 307, 63-74.). L'adénosine ou le guanosine monophosphate tritié formé par hydrolyse du nucléotide cyclique marqué a été, dans une seconde incubation avec une nucléotidase en excès, transformé en adénosine ou guanosine tritié. Le nucléoside formé a été séparé des nucléotides par chromatographie sur une résine échangeuse d'anions. La radioactivité du nucléoside a été déterminée par scintillation liquide. Les incubations enzymatiques ont été effectuées dans les conditions où il n'y a pas plus de 15% d'hydrolyse du substrat, chaque point étant répété en double. Isolement des PDE1, PDE3, PDE4 et PDE5 Un segment de 3 g de média d'aorte bovine fragmenté à l'aide de ciseaux a été homogénéisé à l'aide d'un ultra-turrax puis d'un potter verre-verre dans 7 volumes/poids de tampon A contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases (20 mM Tris-HC1, 0,25 M saccharose, 2 mM acétate de Mg, 1 mM dithiothreitol, 5 mM EGTA, 2000 U/ml aprotinine, 10 mg/1 leupeptine et 10 mg/1 d'inhibiteur trypsique de soja). L'homogénat a été centrifugé pendant 1 h à 105,000 g. Le surnageant a été déposé sur une colonne de 19 DEAE-Sephacel (15 X 1,6 cm), pré- équilibrée avec le tampon B (tampon A dépourvu de saccharose, d'EGTA et d'inhibiteurs de protéases). La colonne a été lavée jusqu'à ce qu'aucune absorption ne puisse être détectée à 280 nm, puis éluée avec un gradient linéaire en NaCl (0-0,5M) dans le tampon B. Des fractions de 3 ml ont été recueillies et les activités enzymatiques ont été déterminées dans diverses conditions de façon à caractériser les pics d'activité enzymatique contenant suivant l'ordre d'élution la PDE1, la PDE5, la PDE3 et la PDE4. Chaque fraction aliquotée est conservée à -80 C. Isolement de la PDE2 Les plaquettes humaines lavées fournies par l'Etablissement Français du Sang de Strasbourg ont été culottées, homogénéisées dans le tampon A et centrifugées pendant 1 h à 105,000 g. Le surnageant a été soumis à chromatographie suivant la procédure décrite pour la média d'aorte (C-2). Puis les fractions riches en PDE2 (activité stimulée par le GMPc 5 M) ont été soumises à chromatographie HPLC MonoQ H/R 5X 5 Pharmacia. La fraction contenant la PDE2 est aliquotée et conservée à -80 C (Kameni Tcheudji J.F et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 181-791.). Activité et profil pharmacologique des molécules Détermination de la CI50 La concentration de substance qui inhibe de 50% l'activité enzymatique (CI50) à 1 M de substrat a été calculée par régression non linéaire (Prism, GraphPad) à l'aide 20 des résultats obtenus pour des concentrations des composés variant suivant la puissance de la molécule de 1nM à 300 M. En raison de problèmes de solubilité, la concentration maximale utilisée dans les essais a été limitée à 300 M. La dételxnination des CI50 sur l'ensemble des PDE1 à PDE5 permet de caractériser la spécificité d'une molécule pour sa cible. .2 Résultats 1.2.1 Capacité inhibitrice sélective de PDE4C du composé NCS 613 La sélectivité du composé NCS 613 vis-à-vis des différentes familles d'enzymes PDE a été analysée. Les résultats présentés dans le Tableau 3 ci-dessous montrent que 5 ce composé est sélectif des enzymes de la famille PDE4. Tableau 3. Effets du composé NCS 613 sur les PDEs isolées de tissus vasculaires (CI50, M) Substances PDE1 PDE2 PDE3 PDE4 PDE5 NCS 613 39 24 n.s. 0,042 4,7 10 n.s. : CI50 > 300 M. De plus, la sélectivité du composé NCS 613 vis-à-vis des 4 sous-types d'enzymes PDE4 (A, B, C, D) a également été testée. Les résultats présentés dans le Tableau 4 ci-dessous indiquent que ce composé est sélectif du sous-type PDE4C. Tableau 4. Effets du composé NCS 613 sur les sous-types de PDE4 recombinantes (CI50, nM) Composé PDE4A PDE4B PDE4C PDE4D NCS 613 43 50 1,4 14 20 1.2.2 Effet de l'administration du composé NCS 613 à des souris préautoimmunes sur le développement de la maladie L'étude in vivo des propriétés biologiques du composé NCS 613 a été réalisée chez des souris pré-autoimmunes MRL/lpr. Chez ces souris, la présence d'une mutation appelée lpr qui concerne le gène Fas (récepteur membranaire impliqué dans l'entrée des 25 cellules en apoptose) conduit à une pathologie autoimmune, qui bien que semblable au lupus humain de par les signes cliniques et biologiques développés, est plus sévère que la pathologie observée chez l'homme. La lignée de souris MRL/lpr est caractérisée par 20 15 21 un syndrome lympho-prolifératif associé à des lésions vasculaires, des arthrites et une glomérulonéphrite à l'origine de la mort de l'animal. L'apparition de la maladie chez les souris MRL/lpr est précoce (50% de mortalité à 20 semaines) et les premiers signes cliniques (protéinurie) apparaissent dès l'âge de 13-14 semaines. Comme dans le lupus humain, on retrouve chez les souris MRL/lpr la présence d'auto-Ac dirigés contre des complexes nucléaires (spiicéosome et nucléosome). La lignée de souris MRL/lpr représente donc un très bon modèle murin du lupus érythémateux disséminé. Cependant, une autre caractéristique des souris MRL/lpr est le développement d'une arthrite accompagnée de facteurs rhumatoïdes semblable à une autre maladie auto-immune humaine, la polyarthrite rhumatoïde. En effet, vers l'âge de 3-4 mois, 45% des souris MRL/lpr présentent des infiltrations au niveau synovial accompagnées d'une érosion articulaire. Effets sur la protéinurie L'observation des paramètres cliniques révèle que l'administration du composé 15 NCS 613 jusqu' à la 13ème semaine permet de retarder l'apparition de la protéinurie. A 14 semaines, la protéinurie n'est détectée que chez 10% des souris traitées par le composé NCS 613, contre 70% des souris contrôles. De plus, au delà de la fin du traitement la protéinurie est toujours diminuée chez les souris traitées par le composé NCS 613. En effet, à 20 semaines, la protéinurie n'est détectée que chez 50% des souris 20 traitées par le composé NCS 613, contre 80% des souris contrôles non traitées (voir la Figure 1). Ainsi, pendant la phase de traitement par le composé NCS613 (jusqu'à 13 semaines), les souris traitées sont protégées de l'apparition de la protéinurie, tandis qu'une protéinurie est détectée chez certaines souris contrôles non traitées dès 10 25 semaines. Après la fin du traitement par le composé NCS 613, le nombre de souris chez qui une protéinurie est détectée reste inférieur jusqu'à 26 semaines, soit 13 semaines après la fin du traitement. En administration chronique, le composé NCS 613 semble donc permettre d'empêcher l'apparition de la protéinurie chez les souris MRL/lpr. Effet sur la durée de vie Les résultats obtenus montrent que l'administration du NCS 613 induit un effet bénéfique sur la survie des souris MRL /lpr. En effet, le composé NCS 613 prolonge la durée de vie des animaux de manière sensible à 20 semaines (p=0,0581), cet effet se prolongeant de façon moindre à 26 semaines (p=0,0881 ; voir Figure 2). Il permet d'augmenter la demi-vie des animaux auto-immuns de manière importante puisqu'il n'y a plus que 30 % de mortalité à 21 semaines au lieu de 60 % de mortalité dans le groupe contrôle non traité (voir Figure 2). Effet sur la sécrétion de TNF-a L'inhibition ex vivo de la sécrétion du TNF-a a été mesurée après stimulation des cellules issues du sang de souris (regroupant pour chaque condition le sang de 7 souris) par des lipopolysaccharides bactériens (LPS). Cette expérience a été réalisée sur des souris de différents âges (11 et 14 semaines, soit 2 semaines après la 3è'ne administration et 1 semaine après la 4ème administration respectivement). Les résultats montrent que les cellules issues du sang de souris ayant reçu le composé NCS 613 produisent moins de TNF-a en réponse au LPS que les cellules issues du sang des souris du groupe contrôle non traité (voir Figure 3). Le pourcentage d'inhibition de la sécrétion de TNF-a des cellules issues du sang de souris traitées par le composé NCS 613 par rapport aux cellules issues du sang des souris du groupe contrôle PBS est de 44% à 11 semaines, et 54% à 14 semaines (voir Figure 3). Effet sur la production d'anticorps anti-ADN double brin, marqueurs du lupus Les résultats (voir Figure 4) montrent que la présence d'Ac anti-ADN sériques apparaît dès l'âge de 11 semaines et est détectable dans pratiquement toutes les souris lupiques non traitées (contrôles) à l'âge de 20 semaines. Le composé NCS 613 retarde l'apparition de ces Ac à l'âge de 20 semaines, qui n'apparaissent en outre que dans un plus petit nombre de souris (20%). A 26 semaines, soit 13 semaines après la fin du traitement, seulement 50% des souris traitées par le composé NCS 613 sont positives pour la présence d'Ac anti-ADN sériques, contre 90% dans le groupe contrôle. 22 Conclusion L'ensemble de ces résultats démontre que l'administration du composé NCS 613 à des souris pré-autoimmunes MRL/lpr permet de diminuer la capacité des cellules sanguines à sécréter du TNF-a en réponse à une stimulation mitogène d'origine bactérienne et de ralentir la progression de la maladie chez les souris traitées en diminuant la protéinurie et la production d'Ac anti-ADN. 1.2.3 Effet du composé NCS 613 sur la sécrétion de TNF-a après stimulation des cellules mononucléées du sang de patients auto-immuns par le LPS Des cellules mononuclées du sang de patients souffrant de maladies auto- immunes systémiques incluant le lupus (LED), la polyarthrite rhumatoïde (PR) et le syndrome de Gougerot-Sjdgren (Goug) ont été incubées ou non en présence du composé NCS 613 puis stimulées par le LPS, et la sécrétion de TNF-a a été mesurée. Les résultats (voir Figure 5) montrent clairement que le composé NCS 613 utilisé à une concentration de 101.tM, inhibe de façon très significative (de 70 à 98% environ) la production de TNF-a par les cellules issues du sang des patients auto-immuns, stimulées par les lipopolysaccharides bactériens (LPS). En particulier, le pourcentage d'inhibition de la sécrétion de TNF-a par les cellules mononuclées du sang de patients souffrant de lupus (LED) est de 69%, 91%, et 98% (86% en moyenne). Ce résultat obtenu chez l'homme est en accord avec ceux obtenus dans un modèle murin du lupus et montre que le composé NCS 613 est capable d'inhiber la capacité des cellules mononuclées du sang de patients lupiques stimulées par du LPS à sécréter la cytokine inflammatoire TNF-a caractéristique du syndrome inflammatoire induit par le LED. 1.2.4 Effet du composé NCS 613 sur la sécrétion basale de TNF-a par cellules 25 mononucléées du sang d'un patient atteint de lupus Parmi les 3 patients lupiques étudiés, l'un présentait une sécrétion basale de TNF-a, en absence de stimulation par le LPS. La capacité du composé NCS 613 à inhiber cette sécrétion basale de TNF-a a alors été étudiée à partir des cellules issues du sang de ce patient. 23 Les résultats présentés sur la Figure 6 montrent que le composé NCS 613 permet d'inhiber de 67% la sécrétion spontanée de TNF-a par les cellules issues du sang d'un patient lupique. Le composé NCS 613 apparaît donc capable d'inhiber efficacement la sécrétion de TNF-a par les cellules mononuclées du sang de patients atteints de LED. 1.3 Conclusions L'ensemble des résultats obtenus chez la souris lupique montre sans ambiguïté que le composé NCS 613 prévient le développement du lupus, en retardant et en diminuant la protéinurie et la production d'Ac anti-ADN marqueurs, en diminuant la réponse inflammatoire et en augmentant la survie des animaux traités. Son effet bénéfique se maintient longtemps après l'arrêt du traitement, suggérant qu'un traitement chronique pourrait être encore plus efficace. L'effet du NCS 613 sur la réponse inflammatoire de patients atteints de lupus comme ceux atteints des maladies auto-immunes systémiques telles que la polyarthrite rhumatoïde et le syndrome de Gougerot-Sjdgren suggère que le composé NCS 613 est potentiellement capable de traiter le lupus et d'autres maladiesauto-immunes. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un composé de formule (I) R3 (I) où R1 est choisi parmi CF3, un alkyle en C1-05, ou (CH2)r,R4 où n est de 0 à 4; R2 est choisi parmi (CH2),,,R4 ou (CH2)1r,Ar où m est de 0 à 5; R3 est choisi parmi un hydrogène ou un méthyle ; R4 est choisi parmi un phényle, OH, un alcoxy en C1-C3, un dialkylamino en C1-C3, pipéridino, ou N-méthylpipérazino ; Ar représente , où X est choisi panai F, Cl, , un alcoxy en C1-C3, ouCF3i ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable, d'un énantiomère ou d'un diastéréoisomère de celui-ci, ou d'un mélange de ceux-ci pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lupus érythémateux disséminé. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que R3 est un 20 méthyle. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que R2 représente (CH2)Ar, où Ar est tel que défini dans la revendication 1. X 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le substituant X du groupe Ar se trouve en position 2 du cycle benzénique. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le substituant X 5 du groupe Ar est choisi parmi un atome de fluor ou un méthoxy. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi la 9-(2-fluorobenzyl)-N(6)-méthyl-2-trifluorométhyladénine, la 9-(2-méthoxybenzyl)-N(6)-méthyl-2-n-propyladénine, la 9-(2méthoxybenzyl)-N(6)-méthyl-2-trifluorométhyladénine, et la 9-(2-méthoxybenzyl)-N(6)- méthyl-2-méthyladénine. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le composé est la 9-(2-fluorobenzyl)-N(6)-méthyl-2-trifluorométhyladénine. 15 8. Utilisation d'un composé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1-7, en association avec un deuxième composé choisi parmi les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les anti-paludéens de synthèse, les corticoïdes ou les immunosuppresseurs, pour la fabrication d'un médicament 20 destiné au traitement du lupus érythémateux disséminé, pour une administration simultanée, séparée, étalée dans le temps, ou alternée. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le deuxième composé utile pour le traitement du lupus est choisi parmi l'aspirine, 25 1'ibuprofène, 1'indométacine, l'hydroxychloroquine, la prednisone, le cyclophosphamide, ou l'azathioprine.