FR 2894831 A1 20070622 FR 0512817 A 20051216 La presente invention se rapporte a une colle biologique a base de fibrinogene, de facteur VII active et une source d'ions calcium. On entend par > un compose capable de reunir des elements tissulaires (peau, os, organes divers) et en meme temps d'assurer une hemostase des tissus leses, pouvant ainsi renforcer ou completer une reunion de ces tissus par une ou des sutures. La coagulation sanguine est realisee selon des etapes en cascade impliquant differentes proenzymes et procofateurs presents dans le sang qui sont converties, par 1'intermediaire d'enzymes proteolytiques, en leur forme activee. Cette succession d'etapes ou cascade de la coagulation est effectuee selon deux systemes de la coagulation, appeles voie extrinseque de la coagulation et voie intrinseque de la coagulation, conduisant a la transformation de la prothrombine en thrombine. La voie extrinseque implique 1'interverition du Facteur VII present dans le sang. Toutefois, celui--ci requiert une activation (facteur VIIa) pour initier cette cascade de coagulation. Le facteur VIIa presente une faible activite enzymatique jusqu'a ce tissulaires de nature lesion tissulaire. Le quill se complexe aux facteurs phospholipidiques liberes apt-8s facteur VIIa ainsi complexe transforme le facteur X en calcium. Le facteur Xa prothrombine en thrombine, (Facteur Va). La thrombine XIII (facteur XIIIa). La facteur Xa en presence d'ions a son tour transforme la laquelle active le facteur V active egalement le facteur thrombine, en presence de calcium, de facteurs tissulaires, de facteur Va, agit sur le fibrinogene en le transformant en fibrine. La presence de facteur XIIIa permet la formation d'un caillot de fibrine a reseau maille solide et adherent qui est progressivement et lentement resorbe avec 1'installation du tissu cicatriciel de consolidation, a laquelle le reseau sert de trame. Cette fibrine reticulee est insoluble et n'est pas attaquable par les enzymes fibrinolytiques, au moins durant le temps de mise en place du tissu cicatriciel. La voie intrinseque de la coagulation implique egalement le facteur VIIa. Cette voie comprend une cascade de reactions aboutissant a 1'activation de la thrombine par 1'intermediaire du facteur XII. Celui-ci active le facteur XI (Facteur XIa) qui active le facteur IX (facteur IXa) en presence de facteurs tissulaires phospholipidiques. Le facteur IXa participe a 1'activation du facteur X en facteur Xa en presence de facteur VIIIa, des facteurs tissulaires et d'ions calcium. Ceci conduit ensuite a la transformation de la prothrombine en thrombine. I1 convient de noter que la presence de facteur Xa ou de thrombine permet 1'activation du facteur VII (facteur VIIa). I1 apparait donc que le facteur VIIa joue un role preponderant dans les mecanismes de la coagulation intrinseque, aboutissant a la formation de caillot sanguin. I1 est utilise dans le traitement des homophiles A ayant un inhibiteur circulant, c'est-a-dire un anticorps specifique qui limite ou empeche 1'activation du facteur VIII. Le facteur VIIa presente l'interet de pouvoir agir localement en presence de facteurs tissulaires liberes apres lesion de tissus engendrant des hemorragies, meme en 1'absence de Facteur VIII ou IX. Cependant, dans le cas de lesions tissulaires hemorragiques engendrees par les plaies, blessures ou interventions chirurgicales externes, la reparation tissulaire par suture est une necessite pour notamment faire cesser 1'hemorragie par formation du caillot de fibrine, selon les mecanismes explicites precedemment. Il peut s'averer necessaire de favoriser, notamment dans le cas de chirurgies lourdes, 1'hemostase de tissus loses. On peut citer, a titre d'exemple, la demande de brevet W093/06855 qui decrit une composition hemostatique, exempte de thrombine et de facteurs de la coagulation, comprenant du facteur VIIa incorpore dans un vehicule compatible sur le plan biologique, 1'ensemble etant applique sur une blessure hemorragique pour en favoriser 1'hemostase et la formation de caillot de fibrine. Cependant, hormis 1'hemostase de tissus leses, it convient egalement d'accelerer, renforcer, voire completer le processus naturel de cicatrisation tissulaire, suture ou non, nee a la reunion des tissus pour eviter leur deshience et accelerer le processus. Ceci est notamment possible par 1'application locale de colle :biologique. Les colles biologiques sont constituees d'un melange de facteurs circulants de la coagulation sanguine, notamment de proteines plasmatiques fibrinogene et facteur XIII. Elles requierent en outre un apport de thrombine exogene, enzyme necessaire pour transformer le fibrinogene en fibrine insoluble, reticulable par le facteur XIII. Des composes additionnels sont necessaires pour effecteur la coagulation du fibrinogene, notamment 1'ion calcium, sous forme de CaC12r et eventuellement de 1' aprotinine, aj outee pour ses proprietes anti-fibrinolytiques. De telles colles biologiques ont ete en particulier decrites dans differentes publications et brevets, tels que EP 0 305 243, FR 2 448 900 et FR 2 448 901, ainsi que leurs applications dans diverses situations cliniques ( Fibrinkleber >>, Actes du Congres de Heidelberg, 1976, Ed. Schattauer). Les colles biologiques peuvent egalement servir a fixer des biomateriaux de nature diverse (collagene, alginates et acide polylactique) a des tissus biologiques pour renforcer leurs proprietes mecaniques en attendant une consolidation par la repousse naturelle des cellules de 1'organisme, par exemple peau artificielle. Les colles biologiques disponibles clans le commerce se presentent en realite sous forme de kits comprenant au moins les quatre composants cites ci-dessus sous forme seche dans lequel les proteines coagulables par la thrombine, le fibrinogene et le facteur XII:I, doivent etre isoles de la thrombine, car leur association engendre une prise en fibrine en un temps tres bref, de 1'ordre de quelques secondes apres reconstitution dans un liquide et melange. C'est la raison pour laquelle les kits de colle biologique sont au moins bi-composants, c'est-a-dire comprenant, d'une part, un lot a base de fibrinogene et de facteur XIII et, d'autre part, un lot a base de thrombine. La colle biologique remplit ses fonctions indiquees cidessus par reconstitution et melange des deux lots, par exemple avec des seringues et aiguilles, puis application sur le tissu a suturer. Cependant, de telles reconstitutions et melanges sont relativement complexes et source d'erreurs possibles, etant donne que des la mise en contact du fibrinogene et de la thrombine sous forme liquide, en presence des autres composants, it se forme presque instantanement de la fibrine. Le melange fibrinogene-thrombine ne peut donc se faire que juste avant 1'application sur la plaie ou zone operatoire. De plus, lorsqu'un dispositif unique de distribution de colle biologique est utilise, it existe un risque reel d'une prise en fibrine dans le dispositif meme, ce qui peut conduire a un colmatage du systeme de distribution et d'application. Les inconvenients cites ci-dessus posent donc des problemes en particulier dans le cadre d'interventions chirurgicales et/ou de situations d'urgence, ou souvent la rapidite du geste operatoire est une necessite. I1 est observe que de tels inconvenients sorit susceptibles d'engendrer une reunion inhomogene des tissus par formation d'amas de fibrine avant adhesion tissulaire, pouvant en outre etre accentues par la retraction du caillot, conduisant au final a une cicatrice irreguliere, propice a une deshience et a des saignements secondaires post-operatoires. Pour remedier a ces inconvenients, la Demanderesse a cherche a mettre au point une colle biologique repondant a un double objectif conjoint. Le premier objectif est de fournir une colle biologique comprenant des facteurs plasmatiques de la coagulation, exempte de thrombine, sans risque d'une formation de fibrine avant 1'application sur un tissu biologique. Le deuxieme objectif repond au besoin de mettre a disposition une telle cclle presentant egalement des capacites accrues, d'une part, d'hemostase de tissus leses et, d'autre part, de reunion de tissu conduisant a une cicatrisation amelioree. L'invention concerne une colle biologique a base de fibrinogene, a usage therapeutique, caracterisee en ce qu'elle comprend du facteur VIIa et une source d'ions calcium, et est exempte de thrombine. La Demanderesse a trouve qu'il est possible de mettre a disposition un nouveau medicament (colle biologique) . adjuvant de 1'hemostase, pansement, adjuvant de cicatrisation ou obturant par formation d'emboles, pour les tissus biologiques, les plaies ou les biomateriaux, sous la forme d'un simple melange comprenant les deux facteurs plasmatiques d'interet ci-dessus compatibles entres elles, c'est-a-dire n'engendrant pas la formation de fibrine, car la colle ne comprend pas de thrombine exogene. La colle biologique de 1'invention remplit sa fonction reparatrice de tissus une fois appliquee au niveau de la plaie ou du tissu cruente, car la thrombine est formee in situ par contact de la colle biologique sur la plaie ou sur le tissu cruente En effet, cette formation de thrombine in situ est assuree par le facteur VIIa qui est donc mis en contact avec tous les composants plasmatiques autorisant le declenchement et le deroulement de la voie extrinseque de la coagulation. Comme explicite precedemment, son activite biologique est dependante de 1'interaction avec les facteurs tissulaires de nature phospholipidique. Le complexe facteur VII active/facteurs tissulaires en presence d'ions calcium transforme le facteur X present dans le plasma en facteur X active, lequel transforme la prothrombine en thrombine, enzyme responsable de la formation du caillot en generant la fibrine en presence de fibrinogene. I1 se produit alors une fibrino-formation et, par consequent, le pouvoir adhesif de la colle biologique obtenue s'en trouve renforce, car la fibrine se forme alors directement au niveau de la plaie ou du tissu a re-parer par chirurgie, ou les composants cellulaires phospholipidiques sont exposes. Bien que le fibrinogene et les ions calcium soient deja presents naturellement dans le sang, un apport supplementaire permet de renforcer et d'accelerer davantage encore le processus de reunion tissulaire et d'hemostase par la colle biologique de 1'invention. La colle biologique de 1'invention presente de nombreux avantages. Sa mise a disposition evite les inconvenients de manipulation et preparation des colles biologiques de 1'art anterieur, ce qui ameliore ses aptitudes de collage tissulaire, en termes de deshience et d'absence de saignements secondaires au niveau de la cicatrice en formation. La colle biologique de 1'invention est donc utilisee pour la preparation d'un medicament destine a 1'hemostase et/ou la cicatrisation de tissus biologiques leses, tels que la peau ou tout organe susceptible d'interventions chirurgicales (rate, foie, poumons intestins etc.), qui, comme explicite precedemment, peuvent representer les tissus cruentes ou les plaies hemorragiques, et, en presence de plasma, pour la preparation d'un medicament destine a traiter les tissus leses choisis dans le groupe constitue par le cartilage, le collagen.e, 1'os et la poudre d'os. De plus, en presence de plasma, elle est egalement utilisee pour la preparation d'un medicament destine a reunir les biomateriaux choisis dans le groupe constitue par les alginates ou 1'acide polylactique. La presence de plasma est par consequent necessaire dans certains cas pour 1'apport exogene des facteurs plasmatiques afin d'initier la cascade de la coagulation, et, de preference, est du plasma compatible ou autologue. Cet apport pourra notamment etre effectue dans le cadre d'interventions chirurgicales classiques, en stomatologie ou odontologie. Le tissu biologique peut egalement provenir de cellules-souches mises en culture et differenciees. Le medicament peut egalement etre une gelule adaptee, gastroresistante ou non, dans laquelle la colle biologique est sous forme seche, et ingeree pour le traitement d'un saignement digestif. Elie est simple a preparer et est d'une stabilite accrue dans le temps. A titre d'exemple, elle est stable sous forme liquide pendant au moins 24 heures a temperature ambiante. Avantageusement, la colle biologique comprend de 60 a 120 mg/ml, de facon plus preferee de 80 a 100 mg/ml de fibrinogene, de 50 a 150 UI/ml, de facon plus preferee de 70 a 120 UI/ml de facteur VIIa, et entre 4 et 30 mole/ml, de facon plus preferee, entre 8 et 20 mole/ml de la source d'ions calcium. Les concentrations et activites sont par millilitre de colle biologique. Comme indique cidessus, ces facteurs plasmatiques presents de preference a de telles concentrations assurent les fonctionnalites recherchees pour la presente colle biologique. De preference, la colle de 1'inventi.on comprend en outre du facteur XIII. Un apport exogene de facteur XIII favorise la reticulation du reseau de fibrine et, par consequent, son pouvoir coagulant et cicatrisant. En particulier, le facteur XIII est present a raison de 30 UI/ml a 700 UI/ml, de preference de 100 UI/ml a 400 UI/ml. Le fibrinogene peut etre prepare par toute technique de fractionnement plasmatique connue dans 1'art anterieur. I1 peut s'agir du procede decrit dans EP 0 305 243 ou encore celui mis au point par la Demanderesse dans la demande de brevet FR 05 06640. On peut egal.ement mettre en muvre du fibrinogene transgenique. Le facteur XIII peut etre isole a partir du plasma par toute methode developpee dans fart anterieur et it pourra avantageusement constituer la proteine accompagnante du fibrinogene lors du fractionnement du plasma. On prefere, dans ce cas, mettre en oeuvre le procede decrit dans la demande de brevet FR 05 06640. On peut ega_Lement mettre en oeuvre du facteur XIII transgenique. La preparation du facteur VIIa est egalement connue. On peut a titre d'exemple citer le brevet EP 346 241. On 20 peut egalement utiliser du facteur VIIa recombinant (provenant de la Societe Novo) ou transgenique. De facon preferee, la colle biologique de 1'invention est prete a 1'emploi et comprend un melange homogene de tous les composants sous forme liquide ou congelee. Elie 25 peut etre lyophilisee. En effet, selon une forme particulierement preferee de realisation de 1'invention, la colle biologique est sous forme seche, la source d' ions calcium etan.t sous la forme de poudre et les facteurs plasmatiques de la coagulation 30 de 1'invention etant sous la forme d'un soul lyophilisat, obtenu par lyophilisation des concentres liquides des facteurs plasmatiques ou de chacun des ces facteurs, comprenant, a cet effet, une formulation stabilisante de lyophilisation, telle que decrite clans la demande de 35 brevet FR 04 02001 deposee par la Demanderesse. Dans ce cas, la formulation stabilisante represente avantageusement un melange d'arginine, d'au moms un acide amine hydrophobe et de citrate trisodique et peut en outre etre additionnee de glycine et/ou de lysine. Avantageusement, les concentrations en chacun des additifs, par litre de concentre de proteines, sont les suivantes . -arginine, de 25 a 50 g/l et de preference de 35 a 45 g/l (en reference au brevet US 5 399 670); - citrate trisodique, de 0,5 a environ 12 g/l ; -leucine, isoleucine ou leur melange, de 5 a 15 g/l et de preference de 9 a 11 g/l ; et - glycine et/ou lysine, chacune de 1 a 5 g/l et de preference chacune de 1,5 a 2,5 g/l. La formulation stabilisante peut egalement, en tant 15 que de besoin, comprendre des adjuvants stabilisants connus dans la technique. I1 conviendra ensuite de reconstituer 1'ensemble par un milieu aqueux, tel que 1'eau purifiee pour injection (PPI), pour 1'obtention d'une composition de colle 20 biologique concentree au besoin, avant utilisation. On peut egalement envisager de presenter la colle biologique sous forme de kit, comprenant, d'une part, un lot de melange des facteurs plasmatiques de 1'invention lyophilise, et, d'autre part, un lot de la source d'ions 25 calcium sous forme de poudre seche, qu'il suffira simplement de reunir et de me-Langer avec de 1'eau PPI, avant utilisation. En variante, le kit peut comprendre un lot de melange facteurs plasmatiques lyophilise, et, d'autre part, un lot de la source d'ions calcium sous 30 forme de solution aqueuse. Les sources d'ions calcium representen.t des composes hydrosolubles, compatibles avec un usage clinique. De preference, ces composes sont des sels inorganiques, tels que le chlorure de calcium (CaCl2) ou le gluconate de 35 calcium. L'exemple suivant illustre 1'invention sans toutefois - 10 - en limiter la portee. Exemple On prepare 2 ml d'un echantillon de colle biologique de 1'invention (echantillon A) comprenant du fibrinogene a une concentration de 80 mg/ml, 100 UI/ml de facteur VIIa et 5 mole/ml de chlorure de calcium qui sont introduits dans une seringue unique. On prepare egalement un echantillon B standard de colle biologique de fart anterieur comprenant, d'une part, un melange B1 constitue de fibrinogene a une concentration de 80 mg/ml et contenant 100 UI/ml de facteur XIII, et, d'autre part, un melange B2 constitue de thrombine calcique a 500 UI/ml. Les melanges B1 et B2 respectif sont introduits dans deux seringues distinctes dont les extremites sont agencees pour comporter une aiguille unique permettant ainsi la reunion des melanges Bl et B2. Un lapin anesthesia est soumis a une laparotomie. Le foie est expose et on procede a une premiere incision de 1'organe afin de provoquer un saignement sur cette tranche. Apres tamponnage de 1'exces de sang par une compresse, on applique immediatement 1'echantillon B de colle biologique sur la tranche incisee par expulsion simultanee du contenu des deux seringues par 1'aiguille unique qui permet la preparation d'un melange homogene de B1 et de B2. Les berges de la plaie sont maintenues reunies pendant 30 seconder pour la prise de la colle biologique. Apres cicatrisation, it est observe que la cicatrice obtenue presente des irregularites et des > de fibrine visible. Ces amas sont dus a une prise inhomogene, probablement a cause de la fibrine formee avant adhesion. Une seconde incision est effectuee a un autre endroit du foie qui est chirurgicalement traitee de la meme facon que precedemment. L'echantillon A de colle biologique 2894831 - 11 - selon 1'invention, contenue dans une seule seringue, est applique sur la tranche incisee et les berges de la plaie sont maintenues reunies pendant 35 secondes pour la prise de la colle biologique. 5 Apres cicatrisation, it est observe que la cicatrice obtenue presence un trait net et resiste bien a la tentative de deshience. Aucune trace de fibrine excedentaire n'est visible, ce qui montre que 1'exces de colle n'a pas coagule en 1'absence de plaie operatoire et 10 donc sans presence de facteurs tissulaires. Revendications 1. Colle biologique a base de fibrinogene, a usage therapeutique, caracterisee en ce qu'elle comprend du facteur VIIa et une source d'ions calcium, et est exempte de thrombine. 2. Colle biologique selon la revendication 1, comprenant de 60 a 120 mg/ml de fibrinogene. 3. Colle biologique selon la revendication 2, comprenant de 80 a 100 mg/ml de fibrinogene. 4. Colle biologique selon la revendication 1, comprenant de 50 a 150 UI/ml de facteur VII active. 5. Colle biologique selon la revendication 4, 15 comprenant de 70 a 120 UI/ml de facteur VII active. 6. Colle comprenant la comprise entre 7. Colle 20 comprenant la comprise entre biologique selon la revendication 1, source d'ions calcium en une concentration 4 et 30 mole/ml. biologique selon la revendication 6, source d'ions calcium en une concentration 8 et 20 mole/ml. 8. Colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 7, comprenant en outre du facteur XIII. 9. Colle biologique selon la revendication 8, 25 comprenant de 100 UI/ml a 400 UI/ml de facteur XIII. 10. Colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 9, sous forme seche, dans lequel les facteurs plasmatiques de la coagulation sont sous la forme d'un seul lyophilisat comprenant une formulation stabilisante 30 de lyophilisation pharmaceutiquement acceptable, et la source d'ions calcium est sous la forme de poudre. 11. Colle biologique selon la revendication 10, dans lequel la formulation stabilisante represente un melange d'arginine, d'au moins un acide amine hydrophobe et de 35 citrate trisodique. 12. Colle biologique selon la revendication 10 ou 11, 2894831 - 13 - se presentant sous forme de kit comprenant un lot de melange des facteurs plasmatiques lyophilise selon 1'une des revendications 1 a 9 et un lot de source d'ions calcium sous la forme de poudre seche. 5 13. Colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 12 pour utilisation comme medicament. 14. Utilisation de la colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 12, pour la preparation d'un medicament destine a 1'hemostase et/ou la cicatrisation de tissus 10 biologiques leses. 15. Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle les tissus leses sont les tissus cruentes ou les plaies hemorragiques. 16. Utilisation selon la revendication 14 ou 15, dans 15 laquelle les tissus leses sont la peau ou tout organe susceptible d' interventions chirurgicales. 17. Utilisation selon 1'une des revendications 14 a 16, dans laquelle ledit medicament est un pansement ou une gelule dans laquelle ladite colle biologique est sous la 20 forme seche. 18. Utilisation de la colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 12 et de plasma, pour la preparation d'un medicament destine a traiter les tissus leses choisis dans le groupe constitue par le cartilage, le collagene, 25 1'os et la poudre d'os. 19. Utilisation de la colle biologique selon 1'une des revendications 1 a 12 et de plasma, pour la preparation d'un medicament destine a reunir les biomateriaux choisis dans le groupe constitue par les alginates ou 1'acide 30 polylactique. 35