FR 2893026 A1 20070511 FR 0511354 A 20051108 Nouveaux dérivés polyphénoliques liposolubles et leur utilisation comme antioxydants La présente invention se rapporte aux nécessités de la vie, plus particulièrement à 5 l'alimentation, à la nutrition et aux compléments alimentaires. L'invention a plus précisément pour objet de nouveaux dérives polyphénoliques estérifiés par un ou des acides gras. 10 L'invention a également pour objet un procédé de production de tels composés, qui consiste à estérifier ou transestérifier des dérivés catéchiques par un dérivé fonctionnel d'acide gras en présence d'un catalyseur. L'invention a encore pour objet l'utilisation de ces esters comme antioxydants, notamment 15 pour stabiliser des acides gras insaturés ou polyinsaturés, en particulier dans les huiles contenant ce type d'acides gras, comme les huiles animales ou végétales (huiles de poisson, de bourrache, de lin, de pépin de kiwi). Le problème s'est posé en effet de trouver un agent de stabilisation protégeant les acides gras 20 insaturés, notamment ceux des séries n-3 et n-6, contre les peroxydations et les oxydations liées à la présence d'oxygène. Ces réactions conduisent en effet à des composés inutilisables, notamment à des résines polymères. Un procédé existant permet la protection des huiles ou des corps gras contenant des acides 25 gras insaturés, par incorporation dans un agent d'enrobage en formant un clathrate. Un tel procédé est peu économique car la quantité adsorbée est faible (moins de 5%) et ne peut être augmentée (EP0796238). Un autre procédé consiste à ajouter aux huiles ou corps gras des polyphénols ou des 30 caroténoïdes susceptibles de réduire les phénomènes d'oxydation. Ces antioxydants ont le défaut d'être peu lipophiles, donc peu miscibles aux huiles. Les extraits de thé vert, riches en polyphénols, ont de nombreuses propriétés bénéfiques, notamment antioxydantes. Leur utilisation est très répandue dans des préparations 35 pharmaceutiques, cosmétiques ou nutritionnelles. Ils ont par exemple été employés à la lutte contre l'hypertension (EP1214085) et contre l'amyloidose dans la maladie d'Alzheimer (EP1246632). Ils ont également été utilisés dans le traitement des peaux sèches (EP 1082100) et dans des produits bronzants (EP1089707). Enfin, ils ont été introduits dans de nombreuses préparations alimentaires, notamment des boissons (EPO416667). 40 Les catéchines sont des polyphénols abondamment présents dans les extraits de thé vert. Elles sont très solubles dans l'eau mais insolubles dans les graisses. Cette propriété a longtemps freiné leur utilisation comme antioxydants de préparations alimentaires lipidiques, comme par exemple les huiles animales ou végétales, notamment les huiles riches en acides gras 45 polyinsaturés de type Oméga-3 ou Oméga-6. Le brevet WO94/22321 (Kalamazoo Holdings) décrit la préparation de solutions liposolubles à base d'extrait de thé vert. Cette invention consiste à solubiliser les catéchines dans un solvant adapté (lécithine, alcool à longue chaîne, agent de surface...), le mélange obtenu étant 50 liposoluble. Toutefois, aucune transformation chimique des catéchines n'intervient dans cette opération. L'inconvénient de cette invention est qu'elle nécessite l'introduction d'importantes quantités d'un solvant liposoluble en même temps que l'antioxydant. Le brevet W094/22322 (Kalamazoo Holdings) décrit, en outre, la fabrication d'antioxydants à base de microparticules de catéchines extraites du thé vert. Celles-ci sont incorporées dans les lipides sous forme de suspension ou de dispersion. L'activité antioxydante des catéchines microcristallisées est toutefois moins importante que celle des èatéchincs 3olubili3éec. Le brevet EP703954 (Berkem) décrit l'estérification de composés polyphénoliques extraits de diverses sources végétales, notamment du thé vert. Toutefois, le procédé utilisé conduit à l'estérification d'une grande partie des ûOH phénoliques. Or, ce sont ces groupements qui interviennent dans la capture de l'oxygène et/ou des radicaux libres, conférant à la molécule ses propriétés antioxydantes. Une catéchine dont les groupements phénoliques sont protégés par un ester perd la majeure partie de son activité antioxydante. Afin de rendre liposolubles des dérivés polyphénoliques, sans nuire à leurs propriétés antioxydantes, il est possible de réaliser des dérivés monoestérifiés. Le brevet EP618203 (Mitsui Norin Co.) décrit la formation de catéchines 3-0-acylées par l'intermédiaire d'une carboxylestérase. Toutefois, cette méthode ne permet d'introduire que des chaînes carbonées relativement courtes, ce qui limite la liposolubilité des esters catéchiques obtenus. Ces derniers ne pourront être introduits dans les huiles qu'en faible quantité et l'effet antioxydant atteint ne sera pas toujours suffisant. Il était donc souhaitable de produire des dérivés de catéchines associant une excellente 25 liposolubilité à une activité antioxydante non amoindrie. L'objet de la présente invention est une forme monoestérifiée de catéchines, notamment extraites du thé vert, par un groupe fonctionnel à longue chaîne carbonée. Les composés obtenus sont très liposolubles tout en conservant leur activité antioxydante ; ils peuvent être 30 incorporés aux huiles de façon stable et efficace et empêcher ainsi les phénomènes d'oxydation ou de polymérisation. L'invention a spécifiquement pour objet de nouveaux esters de polyphénols répondant à la formule (I) : dans laquelle R est une chaîne alkyle, linéaire ou ramifiée, pouvant comporter une ou des insaturations et/ou un ou des groupements ûOH et comptant de 10 à 25 atomes de carbone. La ligne ondulée indique une configuration cis ou trans des deux carbones asymétriques, signalés 40 par un astérisque. HO 35 (I) Les fonctions phénol peuvent en outre être engagées dans une liaison osidique. Selon une forme préférentielle de l'invention, R est une chaîne alkyle saturée, linéaire ou ramifiée, comportant de 10 à 22 atomes de carbone. Selon une autre forme préférentielle de l'invention, R est une chaîne alkényle, linéaire ou ramifiée, comportant de 10 à 25-atomes de carbone et de 1 à 5 doubles liaisons. Selon une autre forme préférentielle de l'invention, R est une chaîne alkyle, linéaire ou 10 ramifiée, comportant de 10 à 25 atomes de carbone et de 1 à 3 groupements -OH. Ces nouveaux composés sont obtenus par une réaction d'estérification, entre des dérivés d'acides gras et des polyphénols de type catéchines, plus particulièrement la gallocatéchine ou l'épigallocatéchine, sous forme libre ou estérifiée par l'acide gallique. Les catéchines selon l'invention sont préférentiellement extraites du thé vert. En effet, les catéchines extraites des pommes, du raisin, du cacao ou de différentes écorces contiennent des mélanges complexes de catéchines polymérisées. L'intérêt des extraits de thé est de contenir essentiellement des catéchines monomères. 20 L'extrait de thé vert utilisé peut être obtenu selon un procédé d'extraction constitué des étapes suivantes : des feuilles de thé vert subissent une extraction à l'eau déionisée, à une température d'environ 50 C. Le mélange est centrifugé, la phase liquide supérieure est récupérée puis cette phase est extraite par un solvant organique à environ 40 C. Le solvant 25 est ensuite évaporé sous pression réduite pour obtenir un résidu solide concentré en polyphénols. Une deuxième phase d'extraction à l'eau déionisée / extraction par solvant organique permet une meilleure purification. A l'issue de l'évaporation des solvants, le résidu solide est réduit en poudre. 30 Des formes commerciales d'extraits de thé vert ou de catéchines peuvent aussi être utilisées directement selon l'invention. Selon une forme préférentielle de l'invention, l'extrait de thé vert utilisé possède le profil en catéchines suivant : Epigallocatéchine (EGC) : 9-17 % Epigallocatéchine-gallate (EGC-g) 52-59 % Gallocatéchine-gallate (GC-g) : 2-6 % Epicatéchine (EC) : 5-6 Epicatéchine-gallate (EC-g) : 10-25 % DL-Catéchine (DL-C) : 2-6 % Les formules de ces différents composés sont représentées à la figure 1. Selon une forme préférentielle de l'invention, la teneur en polyphénols de cet extrait est de 40 90% minimum. Selon une forme préférentielle de l'invention, les catéchines extraites du thé vert sont estérifiées par un acide gras ou un dérivé fonctionnel d'acide gras, comme par exemple un chlorure d'acyle, un anhydride ou un ester. 15 35 Des exemples d'acide gras sont donnés ci-après, la liste étant non limitative. Selon la nomenclature classique, le nombre d'atomes de carbone est indiqué, suivi du nombre de doubles liaisons et de l'emplacement de ces doubles liaisons sur la chaîne carbonée. Les noms des acides gras sont précisés pour les plus classiques. Il s'agit des acides undécylénique C l :1 ; 1:11:2 ; laurique C12:0 ; C13.0 , C13.2 ; myristiquc C14:0 ; C15:0 ; C15:2 ; palmitique C16:0 ; C 16:1(n-7) ; C 16:2(n-4) ; C 16:2(n-7) ; C16:3(n-4) ; C16:4 ; C17:0 ; stéarique C18:0 ; oléïque C 18:1(n-9) ; C 18:1(n-7) ; linoléique C 18:2(n-6) ; 'y-linolénique C18:3(n-6) ; a-linolénique C18:3(n-3) ; stéaridonique C18 :4(n-3) ; C20:0 ; C20:1(n-9) ; C20:2(n-6) ; dihomo-y-linolénique C20:3(n-6) ; C20:4(n-6) ; arachidonique C20:4(n-3) ; eicosapentaénoïque C20:5(n-3) ; béhénique C22:0 ; C22:1 ; C22:1(n-5) ; C22:3(n-3) ; C22:4(n-6) ; C22:4(n-3) ; C22:5(n-3) ; C22:5(n-6) ; docosahexaénoïque C22:6(n-3) ; C24:1(n-9) ; brassylique (HO2C(CH2)11CO2H) ; ricinoléique (CH3(CH2)5CH- (OH)CH2-CH=CH-(CH2)7CO2H) ; hydroxystéarique (CH3(CH2)5CH(OH)(CH2)10CO2H) ; hydroxymyristique. Selon une forme préférentielle de l'invention, les acides gras ou les dérivés d'acides gras utilisés sont les acides ou les dérivés d'acides stéarique, palmitique et/ou myristique. L'estérification des catéchines peut s'effectuer par voie chimique, à partir d'un acide gras ou d'un dérivé fonctionnel d'acide gras, en présence d'un agent de couplage approprié, tel qu'un carbodiimide ou l' hydroxybenzotriazole. 25 Selon une forme préférentielle de l'invention, les composés de formule (I) sont synthétisés par transestérification d'un ester d'acide gras, le catalyseur de cette réaction étant un enzyme, préférentiellement de type lipase. L'enzyme peut être libre ou immobilisé sur un support inerte. 30 Selon une forme préférentielle de l'invention, l'enzyme utilisé est une lipase de Candida antartica, notamment celle commercialisée sous la marque Novozym 435. Cette lipase est issue de la fermentation d'un Aspergillus génétiquement modifié. Les groupements phénoliques ayant peu d'affinité pour les lipases, l'estérification s'effectue 35 sélectivement sur l'alcool secondaire des catéchines. Dans le cas de EGC-g, EC-g et GC-g, la fonction alcool est estérifiée par un groupement gallate. Une transestérification directe s'effectue alors avec l'ester d'acide gras. A la fin de la réaction, il ne reste quasiment plus de catéchine liée à l'acide gallique. 40 Un excès d'ester d'acide gras joue le rôle de solvant. Un co-solvant peut être apporté pour améliorer la dissolution ou la dispersion des polyphénols. Ce co-solvant doit être non réactif vis-à-vis de l'estérification et suffisamment polaire pour solubiliser les polyphénols. Par exemple, un alcool tertiaire, un hydrocarbure ou une cétone aliphatiques, ou encore un éther dialiphatique, peuvent être utilisés. 45 Une agitation vigoureuse est nécessaire afin d'homogénéiser les deux phases et d'apporter un maximum de substrat disponible à l'enzyme. La réaction s'effectue à chaud, préférentiellement entre 50 et 85 C. 50 La réaction s'effectue avantageusement sous pression réduite, afin d'éliminer l'alcool formé et de déplacer l'équilibre dans le sens de la synthèse. Une gamme de pression préférentielle est 200-250 mbars. Selon une forme préférentielle de l'invention, l'ester d'acide gras utilisé est un ester alkylique, par exemple méthylique, éthylique, propylique, isopropylique ou butylique. L'alcool résiduel est éliminé au fhr et à mesure de la iéaetiun, entrc 50 et 85 C, sous une pression choisie en fonction de son point d'ébullition. Cette élimination permet de déplacer l'équilibre dans le sens de la synthèse et d'obtenir des rendements élevés. Selon une forme préférentielle de l'invention, le mélange réactionnel est ensuite soumis au traitement constitué des étapes suivantes : après une filtration visant à éliminer l'enzyme, le co- solvant éventuellement présent est distillé. Le résidu est ensuite repris dans un solvant apolaire, comme par exemple l'hexane, dans lequel les esters catéchiques précipitent. Après filtration, le précipité est lavé par un solvant alcoolique qui est également filtré. Les traces de solvant sont éliminées par évaporation afin d'obtenir une poudre d'esters de catéchines. Il est possible d'éliminer l'acide gallique résiduel par lavages successifs à l'aide d'une solution aqueuse alcaline. Toutefois, dans une forme préférentielle de l'invention, ces lavages ne se sont pas avérés nécessaires. D'autres méthodes physiques de séparation des esters peuvent être utilisées, comme par exemple la distillation moléculaire en couche mince. D'une manière préférée, le produit final sous forme de poudre contient au minimum 90% de polyphénols et au moins 85% de catéchines. Plus de 80% de ces catéchines sont des (épi et/ou)gallocatéchines d'acide gras, de formule générale (I) : OH O~R (I) dans laquelle R est défini comme précédemment. Les propriétés antioxydantes des composés selon l'invention sont avantageusement mises à profit pour la stabilisation de préparations alimentaires, nutritionnelles ou diététiques. Elles sont notamment incorporées à des huiles animales ou végétales, riches en acides gras polyinsaturés, notamment de type Oméga-3 ou Oméga-6. Une utilisation préférée réside dans la stabilisation des huiles de poisson (thon, sardine...). HO 35 40 Les composés selon l'invention sont également utilisables dans d'autres préparations, comme des préparations cosmétiques, alimentaires ou pharmaceutiques, nécessitant un antioxydant liposoluble pour éviter leur rancissement. Pour une utilisation en tant qu'antioxydant dans une huile, il est préférable de dissoudre la poudre, à hauteur de 20 à 40%, dans une huile neutre saturée, comme par exemple une huile triglycéride en C8-C10. La dissolution s'effectue préférentiellement à chaud (entre 70 C et 90 C). Plus le groupement R contient un nombre élevé de carbones, plus une température élevée est nécessaire. Une fois l'opération de solubilisation effectuée, le mélange est stable, même à basse température. Ce mélange peut alors être incorporé à l'huile à stabiliser. Une quantité préférentielle se situe entre 3.000 et 7.000 ppm, soit entre 1.000 et 2.000 ppm environ de principe actif. Toutefois, en cas de nécessité, l'excellente solubilité du mélange dans les huiles permet une incorporation en quantité bien supérieure (comme par exemple 10.000 ppm de principe actif) afin d'obtenir une meilleure protection contre les phénomènes d'oxydation. L'addition de la solution de polyphénols à l'huile polyinsaturée s'effectue de préférence entre 25 et 30 C, sous atmosphère inerte (azote ou argon) afin d'éviter toute incorporation d'oxygène dans l'huile. Dans ces conditions, la solubilité des catéchines estérifiées est excellente. Après un stockage de plusieurs jours à une température inférieure à 0 C, aucun précipité n'est apparu dans les huiles testées. Les produits ainsi obtenus se conservent dans le temps d'une manière très satisfaisante. Ils présentent une stabilité élevée aux phénomènes de rancissement et de polymérisation. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter : Exemple 1 : Formation de stéarate d'(épi et/ou)gallocatéchine - Enzyme utilisé : Lipase de Candida antartica immobilisée sur une résine acrylique macroporeuse / Novozym 435 Type B (Novo Nordisk). - Extrait de thé vert : Tecalon û 90S (Quimdis France) : Total polyphénols 96 % Total catéchines 79,2 % Epigallocatéchine (EGC) 11,1 % Epigallocatéchine-gallate (EGC-g) 42,5 % Epicatéchine (EC) 4,9 % Epicatéchine-gallate (EC-g) 13,8 % Gallocatéchine-gallate (GC-g) 3,8 % DL-Catéchine (DL-C) 2,5 % La catalyse est effectuée dans un réacteur double enveloppe de 1,5 L, sous une pression de 250 mbars et sous agitation vigoureuse. L'équivalent de 3 g de catéchines est mélangé à 700 g 40 de stéarate d'éthyle à une température de 70 C. L'enzyme sur résine est introduit à hauteur de 25 g/L. 30 35 Après 12 heures de réaction, une chromatographie sur couche mince indique que plus de 90% des catéchines sont estérifiées. Le mélange réactionnel est alors filtré, puis les esters de catéchines sont précipités par ajout de quatre volumes d'hexane. Après filtration, le précipité est lavé par un solvant alcoolique qui est lui aussi filtré. Les traces de solvant sont éliminées par évaporation sous vide. Rendement : 90% environ Exemple 2 : Formation de palmitate d'(épi et/ou)gallocatéchine La réaction s'effectue dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, en utilisant du palmitate d'éthyle au lieu de stéarate d'éthyle. Rendement : 90% environ Exemple 3 : Formation de myristate d'(épi et/ou)gallocatéchine La réaction s'effectue dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, en utilisant du myristate d'éthyle au lieu de stéarate d'éthyle. Rendement : 90% environ Exemple 4 : Evaluation des propriétés antioxydantes des esters de catéchine 25 Les propriétés antioxydantes des esters de catéchines selon l'invention ont été évaluées à partir du test RancimatTM. La méthode consiste à mesurer les variations de conductivité d'une eau distillée dans laquelle sont recueillis les acides de faible masse, comme l'acide formique, produits lorsque l'huile à analyser est soumise à des températures élevées sous balayage d'air. 30 L'appareil utilisé est un Rancimat 679 (Methrom). La température de mesure est fixée selon le cas à 80 C, 98 C ou 110 C, le débit d'air est réglé à 20 litres/h et la prise d'essai est fixée à 3 grammes afin de permettre aux tubulures d'arrivée d'air de plonger dans l'échantillon pendant toute la durée de l'expérimentation. 35 Le tracé de la conductivité (x) en fonction du temps (t) est obtenu sur enregistreur et la mesure du temps de résistance ou temps d'induction (point d'inflexion) est directe. Ce temps d'induction correspond au temps à partir duquel les réactions d'oxydation commencent à se propager dans l'huile ; il est la caractéristique de la stabilité à l'oxydation de l'échantillon analysé. Il permet de déterminer le facteur de protection (temps d'induction de l'antioxydant 40 / temps d'induction témoin) lié à chaque antioxydant. - Analyse de la stabilité d'une huile de bourrache : La stabilité à l'oxydation de deux échantillons d'huile de bourrache a été comparée. L'huile 45 contient 20% d'acide y-linolénique (GLA), appartenant à la famille des Oméga-6. Le premier échantillon ne contient pas d'antioxydant, le second (huile de bourrache QS) contient une solution de stéarate d'(épi et/ou)gallocatéchine selon l'invention, à hauteur de 1.500 ppm de principe actif. 15 20 50 Tableau 1 : Temps d'induction sur une huile de bourrache û Test Rancimat (80 C, 20 L/h air) Echantillons Temps d'induction (heures) Huile de bourrache 20% GLA 24,4 Huile de bourrache QS 186,5 La présence d'antioxydant conduit à un allongement du temps d'induction d'un facteur 7,6, soit à une très bonne amélioration de la résistance aux phénomènes d'oxydation et de peroxydation. - Analyse de la stabilité d'une huile de poisson : La stabilité à l'oxydation de plusieurs échantillons d'huile de poisson a été comparée. L'huile contient 18% d'EPA (acide eicosapentaénoïque C20:5(n-3)) et 12% de DHA (acide docosahexaénoïque C22:6(n-3)). Ces deux acides gras appartiennent à la série des Oméga-3. Chaque échantillon d'huile contient un antioxydant différent. Tableau 2 : Facteur de protection (FP) à 1.500 ppm d'antioxydant, sur une huile de poisson 15 contenant 18% EPA / 12% DHA û Test Rancimat (80 C, 20 L/h air) Antioxydant FP Concentrât naturel de tocophérols (Jan Dekker) 2,45 Extrait végétal riche en d-alpha tocophérols (Cognis) 2,29 Extrait de romarin (Naturex) 1,65 Extrait de romarin (Sensient) 1,74 Solution riche en stéarate d'(épi et/ou)gallocatéchine selon l'invention 5,65 Le facteur de protection de la solution selon l'invention est significativement supérieur à celui d'autres antioxydants classiquement utilisés. On peut notamment remarquer qu'il est 2,3 fois supérieur à celui du concentrât de tocophérols. 20 Revendications : 1. Nouveaux esters de catéchine, de formule générale (I) : OH dans laquelle R représente une chaîne alkyle, linéaire ou ramifiée, pouvant comporter une ou des insaturations et/ou un ou des groupements ûOH et comptant de 10 à 25 atomes de carbone, et leurs stéréoisomères. 2. Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est une chaîne alkyle saturée, linéaire ou ramifiée, comportant de 10 à 22 atomes de carbone. 3. Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est une chaîne alkényle, linéaire ou ramifiée, comportant de 10 à 25 atomes de carbone et de 1 à 5 doubles liaisons. 4. Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est une chaîne alkyle, linéaire 20 ou ramifiée, comportant de 10 à 25 atomes de carbone et de 1 à 3 groupements -OH. 5. Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupement ûCOR est choisi parmi les radicaux des acides myristique, palmitique et/ou stéarique. 25 6. Un procédé d'obtention d'un composé ou d'un mélange de composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste en un couplage d'un polyphénol de type catéchine ou d'un mélange de polyphénols de type catéchine, avec un acide gras ou un dérivé d'acide gras. 30 7. Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polyphénol ou le mélange de polyphénols de type catéchine est sous forme d'un extrait de thé vert. 8. Un procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il consiste en une transestérification d'un ester d'acide gras par un polyphénol ou un mélange de polyphénols de 35 type catéchine, en présence d'un catalyseur de type enzyme, sous pression réduite, à une température comprise entre 50 et 85 C. 9. Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme est une lipase de Candida antartica. HO 5 OH OH (I) 10 15 40 10. Un procédé, selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que l'enzyme est immobilisée sur un support inerte. 11. Un procédé, selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la réaction s'effectue à une température de l'ordre de 70 C. 12. Un procédé, selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que l'ester d'acide gras est un ester éthylique. 13. Utilisation des composés selon l'une des revendications précédentes, comme antioxydants dans des préparations alimentaires, nutritionnelles, diététiques, pharmaceutiques et/ou cosmétiques. 14. Utilisation des composés obtenus selon l'une des revendications précédentes, comme antioxydants d'huiles contenant des acides gras polyinsaturés de type Oméga-3 ou Oméga-6.