FR 2894981 A1 20070622 FR 0611149 A 20061220 DOMAINE TECHNIQUE La presente invention concerne un agent de regulation de la fonction cellulaire produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie et un procede de production et des procedes d'utilisation de celui-ci. ETAT DE LA TECHNIQUE L'osteogenese est un procede prefere pour traiter les maladies associees a une diminution de l'osteogenese, a une deterioration des os, ou a des deficits osseux. Quand un tissu osseux subit des dommages tels qu'une fracture ou une excision en raison d'une tumeur osseuse, les cellules favorisant la generation osseuse, connues sous le nom d'osteoblastes, proliferent et se differencient pour regenerer 1'os, et ainsi guerir la fracture osseuse ou les deficits osseux. Dans le cas de dommages legers, l'immobilisation de 1'os au niveau de la zone affectee permet aux osteoblastes d'etre actives, et ainsi la zone adjacente est reparee. Quand les osteoblastes ne peuvent pas etre efficacement actives dans des circonstances telles qu'une fracture complexe, des dommages importants de 1'osteoectomie alveolaire, ou des dommages en combinaison avec 1'osteomyelite, la greffe osseuse autologue est generalement consideree comme etant un traitement standard pour de tels dommages ou deficits. Quand la region endommagee est trop importante pour etre reparee avec un os autologue, un os artificiel peut etre utilise en combinaison partielle avec un os autologue. Cependant, chez les humains, les sources d'os autologue sont limitees et la quantite disponible pour la collecte est limitee. De plus, un inconvenient survient quand une operation supplementaire est requise pour collecter 1'os ayant une disponibilite limitee. De plus, la fourniture d'os autologue est accompagnee de coats eleves et de douleur pour le donneur. De plus, l'utilisation d'un os autologue entraine un nouveau deficit dans la region d'oa 1'os autologue normal provient. Des traitements chirurgicaux utilisant un implant d'os artificiel et autres materiaux destines a la reparation des os ont donc ete introduits. Il est egalement possible de reparer un defaut regional d'un tissu organique 2 (par exemple, os) en implantant un tissu organique reparateur tel qu'un materiau destine a la reparation des os quand une telle region presentant des defauts est issue d'un traumatisme et de la resection de tumeurs osseuses. L'hydroxyapatite (HAP) et le phosphate tricalcique (TCP) sont connus principalement en tant que materiaux de reparation des os. Cependant, par rapport aux os autologues, les implants d'os artificiels conventionnels et les materiaux de reparation osseuse ont egalement des inconvenients tels qu'une capacite osteogenique mediocre, des difficultes a generer de 1'os, une rigidite mediocre et une fragilite. Apres ces procedures chirurgicales, le pronostic pour de telles procedures est done souvent mediocre et de multiples operations sont souvent necessaires. Bien que le taux d'utilisation des os artificiels ait augmente, pour les raisons citees ci-dessus, it reste a environ 30 % tandis que les os autologues sont utilises clans les 60 a 70 % de cas restants. Aux Etats-Unis, un os allogene est souvent utilise. Par ailleurs, au Japon, l'utilisation de tissus cadaveriques n'est pas commune, et done les tissus cadaveriques ne sont pas utilises aussi souvent. Bien que les banques d'os soient une autre maniere de fournir des os autologues, jusqu'a present, le stock est insuffisant. Afin d'ameliorer les inconvenients indiques ci-dessus des os artificiels conventionnels, des tentatives ont ete faites d'utiliser la medecine regenerative utilisant la capacite regenerative des cellules, et d'appliquer des traitements pour les fractures et les deficits osseux. Ces tentatives ont egalement ete appliquees pour augmenter la vitesse de reparation des deficits osseux apres les procedures chirurgicales. Des cellules souches derivees de moelle osseuse sont generalement utilisees dans une telle medecine regenerative. On a propose d'utiliser un implant de tissus d'organismes biologiques, comprenant de 1'os cultive et autres, qui est produit en incubant des cellules souches de moelle osseuse et des osteoblastes differencies derives d'un patient avec un materiau destine a la reparation des os. Les materiaux destines a la reparation des os, qui comprennent de nombreuses cellules souches mesenchytameuses de moelle osseuse et de nombreux osteoblastes differencies, sont implantes dans une region presentant des defauts de 1'os, dans laquelle les cellules souches mesenchytameuses de moelle osseuse et les osteoblastes differencies proliferent sur un materiau destine a la reparation des os utilise comme echafaudage. Les inconvenients mentionnes ci-dessus des os artificiels peuvent etre compenses et ameliores en reduisant la periode d'osteogenese, en comparaison avec les procedes d'implantation d'un materiau destine a la reparation des os seulement. Afin de differencier les cellules souches mesenchytameuses derivees de la moelle osseuse en osteoblastes dans les procedes conventionnels de la regeneration, Maniatopoulos et al. a decrit un procede utilisant trois composes constitues par la dexamethasone, le f3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique, et un procede utilisant des concentrations de travail modifiees a egulement ete decrit. Cependant, ces procedes sont artificiels, pas naturels. Il y a des cellules souches non differenciees parmi celles traitees par ces trois composes. En consequence, le besoin en la propriete et la fonction d'un osteoblaste differencie se fait urgemment sentir. On a donc besoin de fournir des osteoblastes surs, peu couteux et stables pour traiter les maladies associees a la diminution de l'osteogenese, la deterioration des os ou les deficits osseux. On pense que la BMP ou protein morphogenetique osseuse (Bone Morphogenetic Protein)-2, la BMP-4, et la BMP-7 jouent un role important dans l'osteogenese en induisant les osteoblastes. On pense que la BMP-2, la BMP-4, et la BMP-7 induisent des osteoblastes. Il y a de nombreux membres dans la famille des BMP. Cependant, a part les autres homologues de BMP-2, de BMP-4 et de BMP-7, les membres de la famille sont obtenus en se basant sur la sequence de la BMP-2 identifiee precedemment et manquent de references quant a leur fonction, qui n'ont pas toujours le potentiel d'induire la differenciation des osteoblastes. II est indique que la BMP-2, la BMP-4 et la BMP-7 se differencient en osteoblastes efficacement chez les souris et les rats, mais I'efficacite est seulement un millieme de celle chez 1'humain (Wozney, J. M. et al.: Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988, Wuerzler KK et al. : Radiation-Induced Impairment of Bone Healing Can Be overcome by Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2. J. Craniofacial Surg., 9 : 131-137, 1996., Govender S et al.: Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 for treatment of Open Tibial Fractures. J. Bone Joint Surg., 84A : 2123-2134, 2002, Johnsson R et al.: Randomized 4 Radiostereometric Study Comparing Osteogenic Protein-1 (BMP-7) and Autograft Bone in Human Noninstrumented Posterolateral Lumber Fusion. Spine, 27 : 2654-2661, 2002.). J'ai observe que l'osteogenese due a l'ossification intracartilagineuse est induite par i'implantation des BMP dans les heterotopies. Wozney et al. qui ont clone la BMP ont utilise le terme activite d'induction de cartilage >> dans la mesure de 1'activite des BMP (Wozney, J. M. et al.: Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988.). J'ai indique que l'osteogenese n'est pas directement induite par la BMP-2, la BMP-4, et la BMP-7, mais par un agent produisant un chondrocyte capable d'hypertrophie pour differencier les osteoblastes, dans lequel le chondrocyte capable d'hypertrophie est induit par la BMP-2, la BMP-4, et la BMP-7 (Okihana, H.: seichonankotsu no seisansuru honekeiseiinshi [an osteogenesic agent producing growth cartilage], igaku no ayumi [Journal of Clinical and Experimental Medicine], 165 : 419, 1993., Okihana, H. & Shimomura, Y : Osteogenic Activity of Growth Cartilage Examined by Implanting Decalcified and Devitalized Ribs and Costal Cartilage Zone, and Living Growth Cartilage Cells. Bone, 13 : 387-393, 1992). Cet agent inconnu, qui est un peptide ou un derive d'un organisme biologique, a un poids moleculaire de 50 000 ou plus et affecte directement l'induction, la chimiotaxie et 1'activation des osteoblastes. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2004-305 259 decrit un procede de production de prothese de tissu biologique. Le procede de production comprend 1'adhesion de cellules souches a la prothese de tissu biologique, induisant la differenciation des cellules souches ayant adhere, ayant ainsi pour effet la formation d'un tissu biologique quand on utilise une prothese de tissu biologique comme echafaudage, et le traitement pour devitaliser le tissu et les cellules formes. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2004-305 259 ne decrit pas d'agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte qui soit capable d'hypertrophie et induise la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. La publication de brevet japonais mise a l'Inspection Publique N 2004-305 260 decrit un procede de production de prothese de tissu biologique. Le procede de production comprend 1'adhesion de cellules souches a la prothese de tissu biologique, induisant la differenciation des cellules souches ayant adhere, ayant ainsi pour effet la formation de tissu biologique quand on utilise une prothese de tissu biologique comme 5 &chafaudage ; et le traitement pour dissoudre le tissu et les cellules formes, dans lequel 1'&tape de traitement comprend la congelation de la prothese de tissu biologique et son sechage. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2004-305 260 ne decrit pas d'agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte qui soit capable d'hypertrophie et induise la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2004-49 142 decrit un procede de production d'os cultive. Le procede de production de 1'os cultive comprend une &tape de culture primaire pour obtenir une cellule souche mesenchytameuse en cultivant une cellule de moelle osseuse collect&& sur un patient dans un milieu de culture prescrit, une &tape de culture secondaire pour diff&rencier la cellule souche mesenchytameuse cultivee en un osteoblaste en cultivant la cellule souche mesenchytameuse cultivee dans un milieu de culture prescrit favorisant la formation osseuse, une &tape de recuperation pour recuperer les osteoblastes diff&renci&s et un substrat osseux produit et une &tape de melange pour melanger 1'ost&oblaste et le substrat osseux recuperes avec des granules de materiau prothetique osseux. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2004-49 142 ne decrit pas d'agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte qui soit capable d'hypertrophie et induise la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2005-205 074 decrit un procede de fabrication d'os cultive en preparant un materiau de remplissage osseux portant des cellules souches mesenchytameuses obtenues en cultivant les cellules prelevees sur un patient, en cultivant les cellules souches mesenchytameuses portees par le materiau de remplissage osseux, et en les diff&renciant en osteoblastes. La publication decrit &galement un procede de fabrication d'os cultive dans lequel les osteoblastes sont portes par le materiau de remplissage osseux, apres culture des cellules souches mesenchytameuses obtenues a 6 partir des cellules prelevees sur le patient et en les differenciant en osteoblastes. Dans ce procede, un plasma riche en plaquettes doit etre aj oute au liquide de culture pour cultiver les cellules prelevees sur le patient, au liquide de culture pour cultiver les cellules souches mesenchytameuses, ou au liquide de culture apres differenciation en osteoblastes. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2005-205 074 ne decrit pas d'agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte qui soit capable d'hypertrophie et induise la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. La publication de la phase nationale japonaise d'un PCT mise a l'Inspection Publique N 2003-531 604 decrit un procede d'isolement d'une cellule souche mesenchytameuse a partir de tissu humain apres la naissance et comprenant le tissu de prepuce humain apres la naissance, ainsi qu'un procede pour differencier les cellules souches mesenchytameuses isolees en divers lignages cellulaires comprenant un lignage d'osteogenese, d'adipogenese, et de formation de cartilage et autres. La publication de brevet japonais mise a 1'Inspection Publique N 2003-531 604 ne decrit pas d'agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte qui soit capable d'hypertrophie et induise la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. RESUME DE L'INVENTION L'objet de la presente invention est de fournir un agent de regulation de la fonction cellulaire produisant un chondrocyte capable d'hypertrophie, ainsi qu'un procede destine a la production et aux utilisations de celui-ci. L'agent est disponible pour traiter les maladies associees a la diminution de l'osteogenese, a la deterioration des os, ou aux deficits osseux, specialement les tumeurs osseuses, les fractures complexes et autres. L'objet de la presente invention est de fournir un agent qui produit un chondrocyte capable d'hypertrophie et est un nouvel agent de regulation des cellules en ce qui concerne la capacite osteogenetique, sa securite, la vitesse de la regeneration osseuse, la resistance mecanique de 1'os regenere et ainsi de suite. L'objet de la presente invention est de fournir un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes dans une grande gamme de cellules comprenant les lignees cellulaires conventionnelles et/ou les 7 cellules distinctes des cellules conventionnelles. Les objets mentionnes ci-dessus ont ete partiellement resolus dans la presente invention en decouvrant qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produit un agent de regulation des cellules capable d'induire la differenciation de la cellule non differenciee en un osteoblaste, et que 1'agent a le potentiel d'induire la differenciation des osteoblastes pour une grande gamme de cellules comprenant les lignees cellulaires conventionnelles et/ou les cellules non conventionnelles. La presente invention fournit un agent, qui est un peptide ou un derive d'un organisme biologique, a un poids moleculaire de 50 000 ou plus et affecte directement l'induction, la chimiotaxie, 1'activation de 1'osteoblaste. Ce chondrocyte capable d'hypertrophie est capable d'induire l'osteogenese par differenciation directe en un osteoblaste, contrairement aux inducteurs de faible poids moleculaire de BMP-2, BMP-4, et BMP-7. Pour atteindre les objets mentionnes ci-dessus, la presente invention fournit les aspects suivants : Selon un aspect, la presente invention fournit un agent pouvant are obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, ou le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention, est separable en une fraction de poids moleculaire superieur a 50 000, dans lequel le surnageant de culture cultive dans le milieu produisant un agent de differenciation est place dans un filtre centrifuge et soumis a une ultrafiltration centrifuge de 4 000 x g, 4 C pendant 30 minutes dans des conditions adequates pour la separation d'une fraction de poids moleculaire eleve et d'une fraction de faible poids moleculaire. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention est capable d'induire la differenciation des osteoblastes a partir 35 des cellules non differenciees. Dans un mode de realisation, la cellule non differenciee employee 8 dans la presente invention est une cellule qui n'est pas differenciee par le glucocorticoide, le (3-glycerophosphate et 1acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H10T1/2, qui est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle, jusqu'a plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans un milieu de base de Eagle sans 1'agent, dans lequel 1'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances A. 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 1.11 de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, dans lequel la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H10T1/2 quand la cellule C3H10T1/2 est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle, dans lequel l'activite phosphatase alcaline est determinee par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 p.1 de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance 20 pl supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1'acide chlorhydrique concentre, dans lequel la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention est capable d'augmenter 1'expression d'une substance specifique aux osteoblastes choisie clans le groupe compose du collagene 9 de type I, du proteoglycane osseux, de la phosphatase alcaline, de l'osteocalcine, de la Gla-proteine matricielle, de 1'osteoglycine, de 1'osteopontine, de la proteine d'acide sialique osseuse, de l'osteonectine et de la pleiotrophine. Dans un mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention a une propriete choisie dans le groupe compose de la prevention de l'induction de la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes et la prevention de l'induction de 1'activite phosphatase alcaline dans les cellules non differenciees en chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau en ebullition. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme a la presente invention est empeche d'induire la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes en chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau en ebullition. Dans un autre mode de realisation, 1'agent conforme A. la presente invention est empeche d'induire l'activite phosphatase alcaline en chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau en ebullition. Dans un mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans la presente invention est derive d'un 20 mammifere. Dans un autre mode de realisation, le mammifere employe dans la presente invention est un humain, une souris, un rat, ou un lapin. Dans un mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans la presente invention est une cellule 25 prelevee de la region choisie dans le groupe compose de la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, la ligne epiphysaire des os longs, la ligne epiphysaire des vertebres, la zone de proliferation du cartilage des osselets, le perichondre, le primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de 30 guerison, et la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans la presente invention est une cellule capable d'hypertrophie induite par differenciation. Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable 35 d'hypertrophie employe dans la presente invention exprime au moins un marqueur choisi dans le groupe compose du collagene de type X, de la i0 phosphatase alcaline, de 1'osteonectine, du collagene de type II, du proteoglycane de cartilage ou de ses composants, de 1'acide hyaluronique, du collagene de type IX, du collagene de type XI, ou de la chondromoduline. Dans un mode de realisation, la capacite d'hypertrophie du chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans la presente invention est discriminee par un changement morphologique. Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans la presente invention est determine comme etant capable d'hypertrophie quand une augmentation importante de la taille de celui-ci est observee par preparation d'un culot de centrifugation des cellules par centrifugation d'un milieu de culture F12 de HAM comprenant 5 x 105 cellules, culture du culot de centrifugation pendant une periode predeterminee, et comparaison de la taille des cellules observees sous microscope avant la culture avec la taille apres la culture de celles-ci. Dans un mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend a la fois le R-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend a la fois le glucocorticoide, le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (MEM) ou le milieu HAM en tant que composant du milieu de base. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (MEM) en taut que composant de base, et du 13-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de 11 differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (MEM) ou le milieu HAM en tant que milieu de base, et a la fois le glucocorticoide, le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la presente invention comprend a la fois le milieu essentiel minimal (MEM), du glucocorticoide, du (3- glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation encore, le milieu produisant un agent de differenciation employe clans la presente invention comprend en outre un composant serique. Dans un mode de realisation, 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, conformement a la presente invention, est obtenu a partir du surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. Dans un autre mode de realisation, 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, conformement a la presente invention, existe a 1'interieur du chondrocyte capable d'hypertrophie. Selon un aspect, la presente invention fournit une composition comprenant 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. Selon un aspect, la presente invention fournit une composition destinee a induire la differenciation des osteoblastes comprenant 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. Selon un aspect, la presente invention fournit une composition destinee a induire la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes comprenant 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. 12 Dans un mode de realisation, la composition conforme a la presente invention comprend en outre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticolde, du J3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, la composition conforme A. la presente invention comprend en outre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du P-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, la composition conforme a la presente invention comprend en outre a la fois du P-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans la composition conforme a la presente invention comprend en outre a la fois le glucocorticoIde, le pglycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Selon un aspect, la presente invention fournit un procede de production d'une composition comprenant un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, oil le procede comprend la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, oil le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du f3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un mode de realisation, le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend la recolte d'un surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. Dans un autre mode de realisation, le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend en outre I'extraction a partir du surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention est derive d'un 13 mammifere. Dans un autre mode de realisation, le mammifere employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention est un humain, une souris, un rat ou un lapin. Dans un mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention est une cellule prelevee de la region choisie dans le groupe compose de la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, de la ligne epiphysaire des os longs, de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des osselets, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et de la partiecartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention est une cellule capable d'hypertrophie induite par differenciation. Dans un mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend a la fois le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend a la fois le glucocorticolde, le J3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme A. la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (HEM) ou le milieu HAM en tant que composant du milieu de base. Dans un autre mode de realisation encore, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (MEM) en tant que composant de base, et du (-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend le milieu essentiel minimal (MEM) ou le milieu HAM en tant que milieu de base, et a la fois le glucocorticoide, le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente; invention comprend a la fois le milieu essentiel minimal (MEM), du glucocorticoide, du 13- glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Dans un mode de realisation, le milieu produisant un agent de differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention comprend en outre un composant serique. Dans un mode de realisation, 1'agent capable d'induire la differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention est secrete dans le surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. Dans un autre mode de realisation, 1'agent capable d'induire la differenciation employe dans le procede de production d'une composition conforme a la presente invention existe a 1'interieur du chondrocyte capable d'hypertrophie. Selon un aspect, la presente invention fournit un procede de production d'un osteoblaste par induction pour differencier une cellule 35 non differenciee en un osteoblaste, comprenant les etapes consistant a : A) inoculer la cellule non differenciee dans un echafaudage de 15 culture ou un recipient de culture ; et B) exposer la cellule non differenciee a un agent selon la revendication 1 en ajoutant une solution comprenant 1'agent selon la revendication 1 au milieu ou en echangeant le milieu avec un milieu comprenant 1'agent, apres que la cellule non differenciee est stabilisee. Dans un mode de realisation, la cellule non differenciee employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est derivee d'un mammifere. Dans un autre mode de realisation, le mammifere employe dans le 10 procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est un humain, une souris, un rat ou un lapin. Dans un mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie employe dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est une cellule prelevee de la region 15 choisie dans le groupe compose de la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, de la ligne epiphysaire des os longs, de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des osselets, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en 20 voie de guerison, et de la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. Dans un mode de realisation, le milieu de culture de la cellule non differenciee employe dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est le milieu de base de Eagle (HME), 25 le milieu essentiel minimal (MEM), le milieu de Eagle modifie par Dulbecco (MEMD) ou le milieu HAM, ou une combinaison de ceux-ci. Dans un mode de realisation, la cellule non differenciee employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est choisie dans le groupe compose d'une cellule souche 30 embryonnaire, d'une cellule souche germinale embryonnaire et d'une cellule souche tissulaire. Dans un mode de realisation, la cellule souche tissulaire employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est choisie dans le groupe compose d'une cellule souche 35 mesenchytameuse, d'une cellule souche hematopoietique, d'une cellule souche vasculaire, d'une cellule souche hepatique, d'une cellule souche 16 pancreatique (commune), et d'une cellule souche neurale. Dans un autre mode de realisation, la cellule souche tissulaire employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est une cellule souche mesenchytameuse. Dans un autre mode de realisation encore, la cellule souche mesenchytameuse employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est une cellule souche derivee de la moelle osseuse. Dans un autre mode de realisation, la cellule souche mesenchytameuse employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est derivee du coussinet adipeux, du tissu synovial, du tissu musculaire, du sang peripherique, du tissu placentaire, du sang menstruel, ou du sang de cordon ombilical. Dans un autre mode de realisation, la cellule non differenciee employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme a la presente invention est une cellule choisie dans le groupe compose d'une cellule C3H1OT1/2, d'une cellule ATDC5, d'une cellule 3T3-Swiss albinos, d'une cellule BALB/3T3, et d'une cellule NIH3T3. Dans un autre mode de realisation, la cellule non differenciee employee dans le procede de production d'un osteoblaste conforme A. la presente invention est une cellule choisie dans le groupe compose d'une cellule C3H1OT1/2, d'une cellule 3T3-Swiss albinos, d'une cellule BALB/3T3, et d'une cellule NIH3T3. Selon un aspect, la presente invention fournit un osteoblaste qui 25 est induit par contact avec un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie. Dans un mode de realisation, 1'agent employe dans 1'osteoblaste conforme a la presente invention est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H1OT1/2, qui est 30 exposes a 1'agent dans un milieu de base de Eagle, jusqu'a plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans un milieu de base de Eagle sans 1'agent, dans lequel 1'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un 35 echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 pi de tampon alcalin (pH 17 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 !Al de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, ou la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans un mode de realisation, 1'agent employe dans 1'osteoblaste conforme a la presente invention est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H l OT 1 /2 quand la cellule C3H1OT1/2 est exposes a 1'agent dans le milieu de base de Eagle, dans lequel 1'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, oil la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans un mode de realisation, 1'osteoblaste conforme a la presente invention est derive d'une cellule non differenciee. Selon un aspect, la presente invention fournit un procede de production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, ou le procede comprend la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, ou le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du 13-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Selon un aspect, la presente invention fournit une composition destines a l'utilisation dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, ou la composition comprend un 18 chondrocyte capable d'hypertrophie. Selon un aspect, la presente invention fournit un kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoIde, du f3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Selon un aspect, la presente invention fournit un materiau 10 composite destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et B) un echafaudage. Dans un mode de realisation, 1'echafaudage employe dans le 15 materiau composite conformement a la presente invention comprend un materiau choisi dans le groupe compose du phosphate de calcium, du carbonate de calcium, de 1'alumine, de la zircone, du verre depose sur apatite-wollastonite, de la gelatine, du collagene, de la chitine, de la fibrine, de 1'acide hyaluronique, du melange matriciel extracellulaire, de 20 la soie, de la cellulose, du dextrane, de 1'agarose, de la gelose, du polypeptide synthetique, de 1'acide polylactique, de la polyleucine, de 1'acide alginique, de 1'acide polyglycolique, du polymethacrylate de methyle, du polycyanoacrylate, du polyacrylonitrile, du polyurethane, du polypropylene, du polyethylene, du chlorure de polyvinyle, du 25 copolymere ethylene-acetate de vinyle, du nylon et d'une combinaison de ceux-ci. Dans un autre mode de realisation, 1'echafaudage employe dans le materiau composite conformement a la presente invention est compose d'hydroxyapatite. 30 Selon un aspect, la presente invention fournit un kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) le materiau compositeou l'echafaudage est compose d'hydroxyapatite ; et 35 B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du 13- 19 glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Selon un aspect, la presente invention fournit une utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Selon un aspect, la presente invention fournit une utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie et d'un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Selon un aspect, la presente invention fournit une composition to destinee a augmenter ou a induire l'osteogenese chez un organisme biologique, ou la composition comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui a le potentiel d'induire la differenciation des osteoblastes. Selon un aspect, la presente invention fournit un materiau 15 composite destine a augmenter ou induire l'osteogenese chez un organisme biologique, oil le materiau composite comprend : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un echafaudage qui est biocompatible avec l'organisme 20 biologique. Selon un aspect, la presente invention fournit un kit destine a augmenter ou a induire 1'osteogenese chez un organisme biologique comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et 25 B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du I3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Selon un aspect, la presente invention fournit une utilisation de : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable 30 d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un echafaudage qui est biocompatible avec l'organisme biologique, dans la fabrication d'un implant ou d'un materiau de reparation des os pour augmenter ou induire 1'osteogenese chez un organisme biologique. 35 Selon un aspect, la presente invention fournit un procede destine a augmenter ou a induire l'osteogenese chez un organisme biologique, 20 comprenant la localisation d'un materiau composite sur une region en ayant besoin, oil le materiau composite comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui a le potentiel d'induire la differenciation des osteoblastes et un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme biologique. Effet de l 'invention La presente invention fournit un nouvel agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie et un procede de production et un procede d'utilisation de celui-ci. Le nouvel agent de regulation des cellules peut induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste plus normal. Un tel agent de regulation des cellules produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie peut transformer une cellule non differenciee en un osteoblaste, permettant ainsi de traiter des regions ayant un pronostic mediocre apres implantation dans fart anterieur. Un tel agent de regulation de la fonction cellulaire produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie n'a pas ete fourni par fart anterieur, mais est en fait fourni par la presente invention pour la premiere fois. La presente invention foumit un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes pour une grande gamme de cellules comprenant les lignees cellulaires conventionnelles et/ou les cellules distinctes des cellules conventionnelles. Ainsi, la presente invention pourrait entrainer la differenciation d'une cellule en un osteoblaste, alors que la cellule est incapable de subir une differenciation en utilisant les agents de fart anterieur. Ces avantages de la presente invention et autres avantages apparaitront evidents d'apres les dessins et une lecture de la description detaillee comme suit. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1A montre des chondrocytes capables d'hypertrophie dilues dans une suspension de cellules, inocules A. de 1'hydroxyapatite, et colores avec de la phosphatase alcaline. Les cellules (1 x 106 cellules/ml) ont ete inoculees avec de l'hydroxyapatite, incubees dans un incubateur avec du CO2 a 5 % a 37 C pendant une semaine, et colorees avec de la phosphatase alcaline. L'hydroxyapatite etait coloree en rouge avec la phosphatase alcaline. 21 La figure 1B montre le resultat de la coloration avec du bleu de toluidine des echantillons colores avec de la phosphatase alcaline sur la figure IA. Avec le bleu de toluidine, les memes zones que sur la figure 1 A etaient colorees en bleu, indiquant la presence de cellules. La figure 1 C montre des cellules de cartilage residuel diluees dans une suspension de cellules, inoculees avec de 1'hydroxyapatite, et colorees avec de la phosphatase alcaline. 1 x 106 cellules/ml ont ete inoculees avec de 1'hydroxyapatite, incubees dans un incubateur avec du CO2 a 5 % a 37 C pendant une semaine, et colorees avec de la phosphatase alcaline. L'hydroxyapatite n'etait pas coloree avec la phosphatase alcaline. La figure ID montre le resultat de la coloration avec du bleu d'olivine des echantillons colores avec de la phosphatase alcaline sur la figure IC. Avec le bleu d'olivine, 1'hydroxyapatite etait coloree en bleu, indiquant la presence de cellules. La figure 1E montre des chondrocytes derives de cartilage articulaire dilues dans une suspension de cellules, inocules avec de 1'hydroxyapatite, et colores avec de la phosphatase alcaline. 1 x 106 cellules/ml ont ete inoculees avec de 1'hydroxyapatite, incubees dans un incubateur avec du CO2 a 5 % a 37 C pendant une semaine, et colorees avec de la phosphatase alcaline. L'hydroxyapatite n'etait pas coloree avec la phosphatase alcaline. La figure 1 F montre le resultat de la coloration avec du bleu de toluidine des echantillons colores avec de la phosphatase alcaline sur la figure 1E. Avec le bleu de toluidine, 1'hydroxyapatite montrait une coloration tachetee de bleu, indiquant la presence de cellules. La figure 2 montre 1'activite phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, et les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H1OT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline du surnageant de la culture de cellules en ajoutant seulement du milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete definie comme etant 1. Dans le groupe des rats ages de 4 semaines, la valeur relative de 1'activite a augmente jusqu'a environ 4,1 fois quand un surnageant de culture etait 22 collecte 4 jours apres que le milieu avait ete ajoute, jusqu'a environ 5,1 fois quand un surnageant de culture etait collecte 1 semaine apres que le milieu avait ete ajoute, jusqu'a environ 5,4 fois quand un surnageant de culture etait collecte 2 semaines apres que le milieu avait ete ajoute, et jusqu'a environ 4,9 fois quand un surnageant de culture etait collecte 3 semaines apres que le milieu avait ete ajoute. Dans le groupe des rats ages de 8 semaines, la valeur relative de 1'activite a augmente jusqu'a environ 2,9 fois quand un surnageant de culture etait collecte 4 jours apres que le milieu avait ete ajoute, jusqu'a environ 3, 1 fois quand un surnageant de culture etait collecte 1 semaine apres que le milieu avait ete ajoute, jusqu'a environ 3,8 fois quand un surnageant de culture etait collecte 2 semaines apres que le milieu avait ete ajoute, et jusqu'a environ 4,2 fois quand un surnageant de culture etait collecte 3 semaines apres que le milieu avait ete ajoute. Il y avait peu de difference entre les activites phosphatase alcaline des groupes de rats ages de 4 et 8 semaines entre le surnageant de la culture de cellules en ajoutant du milieu de croissance MEM et en ajoutant du milieu de croissance MEM seulement. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. Surnageant de differenciation a quatre semaines : surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, derive d'un rat age de 4 semaines, cultive dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation ; Surnageant de differenciation a huit semaines : surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, derive d'un rat age de 8 semaines, cultive dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation ; Surnageant de croissance a quatre semaines : surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, derive d'un rat age de 4 semaines, cultive dans du milieu de croissance MEM ; Surnageant de croissance a huit semaines : surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, derive d'un rat age de 8 semaines, cultive dans du milieu de croissance MEM ; La figure 3A montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont etc': incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des 23 cellules C3H10T1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Les cellules C3H10T1/2 de souris ont ete inoculees dans des plaques a 24 puits (milieu MBE). Dix-huit heures apres inoculation, une fraction de chaque surnageant de culture a ete ajoutee aux plaques, puis apres 72 heures, coloree avec de la phosphatase alcaline. Colonne du haut : on a confirme que dans le cas oil l'on ajoutait un surnageant de culture provenant du milieu MEM produisant un agent de differenciation, les cellules C3H l OT 1 /2 etaient colorees en rouge et avaient les activites. Colonne du bas : on a confirme que dans le cas oil l'on ajoute un le surnageant de culture provenant du milieu de croissance MEM, les cellules C3H10T1/2 n'ataient pas colorees et n'avaient pas d'activite. La figure 3B montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H10T1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Les cellules C3HlOT1/2 de souris ont ete inoculees dans des hydroxyapatites (milieu MBE). Dix-huit heures apres inoculation une fraction de chaque surnageant de culture a ete ajoutee a 1'hydroxyapatites et, apres 72 heures, coloree avec de la phosphatase alcaline. On a confirme que dans le cas ou l'on ajoutait un surnageant de culture provenant d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation, les echantillons etaient colores en rouge et avaient les activites. La figure 3C montre le resultat de la coloration avec du bleu de toluidine quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H10T1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Les cellules C3H10T1/2 de souris ont ete inoculees dans des hydroxyapatites (milieu MBE). Dix-huit heures apres inoculation, la fraction de chaque surnageant de culture a ete ajoutee aux hydroxyapatites et, apres 72 heures, coloree avec le bleu de toluidine. Avec le bleu de toluidine, les echantillons etaient colores en bleu, indiquant la presence de cellules. La figure 3D montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie 24 derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu de croissance MEM, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H 1 OT 1 /2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Les cellules C3H10T1/2 de souris ont ete inoculees dans des hydroxyapatites (milieu MBE). Dix-huit heures apres inoculation, une fraction de chaque surnageant de culture a ete ajoutee aux hydroxyapatites et, apres 72 heures, coloree avec de la phosphatase alcaline. On a confirme que, dans le cas oil 1'on ajoutait un surnageant de culture provenant du milieu de croissance MEM, les echantillons n'ataient pas colores et n'avaient pas d'activite. La figure 3E montre le resultat de la coloration avec du bleu de toluidine quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu de croissance MEM, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H10T1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Les cellules C3H l OT 1 /2 de souris ont ete inoculees dans des hydroxyapatites (milieu MBE). Dix-huit heures apres inoculation, une fraction de chaque surnageant de culture a ete ajoutee aux hydroxyapatites et, apres 72 heures, coloree avec le bleu de toluidine. Avec le bleu de toluidine, les echantillons etaient colores en bleu, indiquant la presence de cellules. La figure 4 montre 1'activite phosphatase alcaline quand les cellules de cartilage residuel derivees du cartilage costal ont ete incubees dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, et que chaque surnageant de ceux- ci a ete ajoute a des cellules C3HlOT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. L'addition du surnageant de la culture de cellules dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et 1'addition du surnageant de la culture de cellules dans du milieu de croissance MEM differait peu de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et de 1'addition du milieu de croissance MEM seulement, quanta 1'activite phosphatase alcaline. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. Surnageant de differenciation a huit semaines : surnageant de culture d'une cellule de cartilage residuel, derivee de rats ages de 8 semaines, cultivee dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation ; Surnageant de croissance de huit semaines : surnageant de culture d'une cellule de 25 cartilage residuel, derivee de rats ages de 8 semaines, cultivee dans du milieu de croissance MEM. Chaque valeur etait indiquee par la valeur resultant de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et la valeur resultant de 1'addition du milieu de croissance MEM seulement est definie comme etant 1. La figure 5A montre 1'activite phosphatase alcaline quand des chondrocytes derives de cartilage articulaire ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, et que chaque surnageant de ceux-ci a ete ajoute a des cellules C3HlOT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. En ce qui concerne 1'activite phosphatase alcaline des chondrocytes derives de cartilage articulaire, 1'addition du surnageant de la culture de cellules dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et 1'addition du surnageant de la culture de cellules dans du milieu de croissance MEM differait peu de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et de 1'addition du milieu de croissance MEM seulement. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. Surnageant de differenciation a huit semaines : surnageant de culture d'une cellule de cartilage articulaire, derivee de rats ages de 8 semaines, cultivee dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation ; Surnageant de croissance a huit semaines : surnageant de culture d'une cellule de cartilage articulaire, derivee de rats ages de 8 semaines, cultivee dans du milieu de croissance MEM. Chaque valeur etait indiquee par la valeur resultant de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et la valeur resultant de 1'addition d'un milieu de croissance MEM seulement est definie comme etant 1. La figure 5B montre 1'activite phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3HlOT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. La valeur etait indiquee en definissant la valeur resultant de 1'addition du milieu HAM produisant un agent de differenciationseulement comme etant 1. L'activite phosphatase alcaline a augmente quand le surnageant de culture des chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal cultives 26 dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation a ete ajoute. La figure 5C montre 1'activite phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu de croissance HAM, et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H1OT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. La valeur etait indiquee en definissant la valeur resultant de ]'addition du milieu de croissance HAM seulement comme etant 1. L'activite phosphatase alcaline n'a pas augmente quand le surnageant de culture des chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal cultives dans un milieu de croissance HAM a ete ajoute. La figure 6A montre la presence de 1'agent dans le surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation. L'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline dans les cellules 3T3-Swiss albinos et les cellules BALB/3T3, et d'induire la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. Par ailleurs, la figure 6A montre 1'absence de 1'agent dans le surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu de croissance MEM. De plus, la figure 6A montre 1'absence de 1'agent dans le surnageant de culture de chondrocytes incapables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation ou du milieu de croissance MEM. La figure 6B montre 1'activite phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete incubes dans le milieu contenant de la dexamethasone, du (3-glycerophosphate, de 1'acide ascorbique ou une combinaison de ceux-ci en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes a des cellules C3H1OT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. Dex : dexamethasone, 33GP : J3-glycerophosphate, Asc : acide ascorbique. La figure 7A montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, et qu'une fraction des surnageants de ceux-ci ayant un poids moleculaire superieur a 50 000 a ete ajoutee a des cellules C3HlOT1/2 de souris inoculees dans des 27 plaques a 24 puits, qui ont alors etE cultivees. Les echantillons etaient colores en rouge. On a confirme que 1'agent capable d'augmenter la valeur de l'activite phosphatase alcaline etait present dans la fraction des surnageants de ceux-ci ayant un poids moleculaire superieur A. 50 000. La figure 7B montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, et qu'une fraction des surnageants de ceux- ci ayant un poids moleculaire superieur a 50 000 a ete ajoutee A. des cellules C3HlOT1/2 de souris inoculees avec une hydroxyapatite, qui ont alors ete cultivees. L'hydroxyapatite etait coloree en rouge. On a confirme que 1'agent capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline etait present dans la fraction des surnageants de ceux-ci ayant un poids moleculaire superieur a 50 000. La figure 7C montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, et qu'une fraction des surnageants de ceux- ci ayant un poids moleculaire inferieur a 50 000 a ete ajoutee a des cellules C3H10T1/2 de souris inoculees dans des plaques a 24 puits, qui ont alors ete cultivees. L'agent capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observe dans la fraction des surnageants ayant un poids moleculaire inferieur a 50 000. La figure 7D montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, et qu'une fraction des surnageants de ceux- ci ayant un poids moleculaire inferieur a 50 000 a ete ajoutee A. des cellules C3H10T1/2 de souris inoculees avec une hydroxyapatite, qui ont alors ete cultivees. L'agent capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observe dans la fraction des surnageants ayant un poids moleculaire inferieur a 50 000. La figure 8 montre le resultat de la coloration avec de la phosphatase alcaline quand les chondrocytes capables d'hypertrophie derives de cartilage costal de souris et les cellules de cartilage residuel 28 derivees du cartilage costal ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, et que chaque surnageant de ceux-ci a ete ajoute a des cellules C3H1OT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees. L'activite phosphatase alcaline a augmente 3,1 fois, quand les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete incubes dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et que les surnageants de ceux-ci ont ete ajoutes. L'addition du surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et 1'addition des surnageants de culture des cellules de cartilage residuel derivees du cartilage costal cultivees dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement, differait peu de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et de 1'addition du milieu de croissance MEM seulement, quanta 1'activite phosphatase alcaline. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. Surnageant de differenciation GC : Surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de croissance GC : Surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu de croissance MEM, Surnageant de differenciation RC : Surnageant de culture de cellules de cartilage residuel cultivees dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de croissance RC : Surnageant de culture de cellules de cartilage residuel cultivees dans du milieu de croissance MEM. Toutes les valeurs sont indiquees par la valeur resultant de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et la valeur resultant de 1'addition du milieu de croissance MEM seulement est definie comme etant 1. La figure 9 montre 1'effet d'un milieu de culture sur la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes. Le chondrocyte capable d'hypertrophie, les cellules de cartilage residuel et les cellules de cartilage articulaire ont ete cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance MEM, respectivement. Chaque surnageant de culture de ceux-ci a ete ajoute a des cellules C3H1OT1/2 de souris, qui ont alors ete cultivees, et ainsi les activites phosphatase alcaline ont etf mesurees. Du milieu HAM et du 29 milieu MEM ont ete utilises comme milieu pour cultiver les cellules C3H1OT1/2 de souris. Quand du milieu HAM etait utilise dans la culture des cellules C3H1OT1/2 de souris, 1'activite phosphatase alcaline n'etait observee que dans le surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie cultive dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation. Quand du milieu MEM etait utilise dans la culture de cellules C3HlOT1/2 de souris, le meme resultat a ete observe. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. Surnageant de differenciation GC : Surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de croissance GC : Surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu de croissance MEM, Surnageant de differenciation RC : Surnageant de culture de cellules de cartilage residuel cultivees dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de croissance RC : Surnageant de culture de cellules de cartilage residuel cultivees dans du milieu de croissance MEM, Surnageant de differenciation AC : Surnageant de culture de cellules de cartilage articulaire cultivees dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de croissance AC Surnageant de culture de cellules de cartilage articulaire cultivees dans du milieu de croissance MEM. Toutes les valeurs sont indiquees par la valeur resultant de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement et la valeur resultant de ['addition du milieu de croissance MEM seulement est definie comme etant 1. La figure 10 montre 1'activite phosphatase alcaline quand 1'agent, qui a ete produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie, induisant la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes, etait chauffe. Le surnageant de culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie cultive dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete chauffe pendant 3 minutes dans de 1'eau en ebullition. Le surnageant de culture n'ayant pas ete chauffe, le surnageant de culture ayant ete chauffe, et du milieu MEM produisant un agent de differenciation seul, ont ete ajoutes individuellement a des cellules C3H1OT1/2 de souris et les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees apres 72 heures. L'activite phosphatase alcaline n'a pas 30 augmente quand le surnageant de culture etait chauffe. On a confirme que 1'agent induisant la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes etait degenere (inactive) par le traitement thermique. Les abreviations suivantes montrent les surnageants de culture ajoutes. GC chauffe : Surnageant de culture traite de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, Surnageant de differenciation GC : Surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation, surnageant de differenciation seulement : milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement. Toutes les valeurs sont indiquees en definissant la valeur resultant de 1'addition du milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement comme etant 1. La figure 11A montre l'activite du TGF(3 dans du milieu MEM 15 produisant un agent de differenciation comprenant 1'agent de la presente invention. La figure 11B montre 1'activite des BMP dans du milieu MEM produisant un agent de differenciation comprenant 1'agent de la presente invention. 20 MEILLEUR MODE DE REALISATION DE L'INVENTION La presente invention est decrite ci-dessous. II convient de comprendre que, sauf mention contraire, les representations au singulier tout au long de la presente description incluent le concept de pluriel. Par consequent, it convient de comprendre que, sauf mention contraire, les 25 articles singuliers tels que "a", "an" et "the" en anglais, "un", "une", "le" et "la" en franrais, et "ein", "eine", "der", "die" et "das" et similaires en allemand, ou autres, incluent le concept de pluriel. I1 convient egalement de comprendre que les termes utilises ici repondent aux definitions generalement utilisees dans fart, sauf mention contraire. Par consequent, 30 sauf definition contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilises ici ont la meme signification que celle generalement comprise par 1'homme de fart. Sinon, la presente demande de brevet (y compris les definitions) prevaut. Definition des termes 35 Les definitions des termes particulierement utilises ici sont enumerees ci-dessous. 31 Cellule Les termes "cellule de cartilage de croissance" et "chondrocyte de croissance" sont utilises de maniere interchangeable ici en reference a une cellule dans un tissu qui forme de 1'os pendant les phases de developpement ou de croissance, et les periodes de recuperation ou de proliferation osseuse (c'est-a-dire, le cartilage de croissance). Une cellule de cartilage de croissance fait generalement reference a un tissu qui forme de 1'os pendant la phase de croissance, tandis que, ici, it designe un tissu qui se forme pendant les phases de developpement ou de croissance, et les periodes de proliferation ou de recuperation osseuse. La cellule de cartilage de croissance est egalement consideree comme du cartilage capable d'hypertrophie, du cartilage calcifie ou cartilage (de ligne) epiphysaire. Lorsque Von utilise une cellule de cartilage de croissance chez des titres humains, on prefere des cellules derivees d'un titre humain, mais it est egalement possible d'utiliser des cellules non humaines, puisque les problemes tels que le rejet immunologique peuvent titre evites a 1'aide de techniques bien connues dans fart. La cellule de cartilage de croissance selon la presente invention est derivee d'un mammifere, de preference d'un titre humain, d'une souris, d'un rat ou d'un lapin. La cellule de cartilage de croissance selon la presente invention peut titre echantillonnee a partir de la jonction chondro-osseuse, de la ligne epiphysaire d'os long (par exemple, le femur, le tibia, la fibule, 1'humerus, le cubitus ou le radius), de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des os de la main, des os du pied, du sternum et autres, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et de la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. Ces cellules de cartilage de croissance peuvent titre preparees, par exemple, selon les procedes decrits dans les exemples de la presente description. "Chondrocyte capable d'hypertrophie", selon la presente description, fait reference a une cellule qui peut subir une croissance hypertrophique au cours d'une periode ulterieure. Un chondrocyte capable d'hypertrophie inclut une "cellule de cartilage de croissance" recueillie a partir d'un organisme vivant, ainsi que toutes autres cellules 32 capables d'hypertrophie, determinees selon un procede de determination de la "capacite d'hypertrophie" decrit ci-apres. Le chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention est derive d'un mammifere, de preference un titre humain, une souris, un rat ou un lapin. Lors de 1'utilisation de chondrocytes capables d'hypertrophie chez des titres humains, les cellules sont de preference derivees d'un titre humain, mais it est egalement possible d'utiliser des cellules non humaines puisque des problemes tels que le rejet immunologique peuvent titre evites a 1'aide de techniques bien connues dans fart. Le chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention peut titre obtenu, par exemple, a partir de la jonction chondroosseuse des cotes, de la ligne epiphysaire d'os long (par exemple, le femur, le tibia, la fibula, 1'humerus, le cubitus et le radius), de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage provenant, par exemple, des os de la main, des os du pied, du sternum, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison et de la partie cartilagineuse de la phase de proliferation osseuse. Le chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention peut titre obtenu par induction de la differenciation d'une cellule non differenciee. Le chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention peut titre un chondrocyte obtenu a partir d'une region autre que celles decrites precedemment. Puisqu'un os forme par ossification endochondrale (ossification enchondrale) est forme selon le meme mecanisme independamment de la region du corps. En d'autres termes, le chondrocyte est forme et substitue par un os. La majeure partie d'os autres que le crane et la clavicule est formee par ossification endochondrale (ossification enchondrale). Par consequent, it existe des chondrocytes capables d'hypertrophie dans la majeure partie des os autres que le crane et la clavicule dans le corps. Le chondrocyte capable d'hypertrophie est capable d'osteogenese. Le chondrocyte capable d'hypertrophie peut titre morphologiquement caracterise par 1hypertrophie. L"'hypertrophie" selon la presente description peut titre determinee morphologiquement sous microscope. L'hypertrophie d'une cellule fait 33 reference a une cellule observee au voisinage de la couche de croissance, qui s'aligne dans un etat prismatique, ou fait reference en variante a une cellule qui est plus grande que les cellules voisines. Les cellules sont determinees comme etant capables d'hypertrophie lorsqu'une augmentation significative de leur taille est observee par preparation d'un culot de cellules centrifugees dans un milieu de culture constitue de F12 de Ham comprenant 5 x 105 cellules, culture du culot de centrifugation pendant une periode predetermines, et comparaison de la taille des cellules observee sous microscope avant la culture avec la taille apres la culture de celles-ci. "Cellules de cartilage residuel" et "chondrocytes residuels" font reference de maniere interchangeable, selon la presente description, a une cellule cartilagineuse ou a un chondrocyte situe dans la region eloignee de la jonction chondro-osseuse des cotes (zone de proliferation du cartilage), qui est un tissu qui existe en tant que cartilage pendant toute la dui-6e de la vie. Une cellule situee dans le cartilage residuel est appelee cellule de cartilage residuel. Une "cellule de cartilage articulaire" selon la presente description fait reference a une cellule dans le tissu cartilagineux (cartilage articulaire) situee sur une surface articulaire. Le chondrocyte selon la presente description est determine par identification de 1'expression d'au moins un marqueur choisi dans le groupe compose du collagene de type II, du proteoglycane (aglycane) de cartilage ou de ses composants, de 1'acide hyaluronique, du collagene de type IX, du collagene de type XI, et de la chondromoduline. Parmi les chondrocytes, une cellule capable d'hypertrophie est davantage determines par identification de 1'expression d'au moins un marqueur choisi dans le groupe compose du collagene de type X, de la phosphatase alcaline et de 1'osteonectine. Les chondrocytes n'exprimant ni le collagene de type X, ni la phosphatase alcaline ni 1'osteonectine, sont determines comme n'ayant pas la capacite d'hypertrophie. Par consequent, le chondrocyte capable d'hypertrophie decrit ici peut egalement etre determine par identification de 1'expression d'au moins un marqueur choisi parmi les marqueurs des chondrocytes et d'au moins un marqueur choisi parmi les marqueurs des chondrocytes hypertrophiques, au lieu de 1'observation de 1hypertrophie morphologique. La localisation ou 1'expression de ces marqueurs est identifiee selon n'importe quel procede d'analyse des proteines ou de l'ARN extrait a partir de cellules cultivees, tels que la coloration specifique, les procedes immunohistochimiques, 1'hybridation in situ, le transfert Western ou la PCR. Un "marqueur de chondrocyte" selon la presente description fait reference a une substance dont la localisation ou 1'expression dans un chondrocyte facilite l'identification du chondrocyte. De preference, it fait reference a une substance qui peut etre utilisee pour identifier le chondrocyte en fonction de sa localisation ou de son expression (par exemple, localisation ou expression du collagen de type II, du proteoglycane (aglycane) de cartilage ou de composants de celui-ci, d'acide hyaluronique, du collagene de type IX, du collagene de type XI ou de la chondromoduline). Un "marqueur des chondrocytes capables d'hypertrophie" tel qu'utilise ici fait reference a une substance dont la localisation ou 1'expression dans un chondrocyte capable d'hypertrophie facilite l'identification du chondrocyte. De preference, it fait reference a une substance qui peut etre utilisee pour identifier le chondrocyte capable d'hypertrophie en fonction de sa localisation ou de son expression (par exemple, localisation ou expression du collagene de type X, de la phosphatase alcaline et de 1'osteonectine). "Proteoglycane de cartilage" selon la presente description fait reference a une macromolecule, dans laquelle la pluralite de glucosaminoglycanes, tels que le tetrasulfate de chondroitine, 1'hexasulfate de chondroItine, le sulfate de keratane, l'oligosaccharide a liaison 0, 1'oligosaccharide a liaison N et autres, sont combines avec une proteine cceur. Le proteoglycane de cartilage se lie en outre avec 1acide hyaluronique par le biais d'une proteine de liaison pour former des agregats de proteoglycane de cartilage. Dans le tissu cartilagineux, le glucosaminoglycane est riche et occupe 20-40 % du poids sec du tissu. Le proteoglycane de cartilage est egalement appele aglycane. "Proteoglycane osseux" selon la presente description fait reference a une macromolecule qui a un poids moleculaire inferieur a celui du proteoglycane de cartilage, dans laquelle des glucosaminoglycanes tels que le sulfate de chondroitine, le sulfate de dermatane, les oligosaccharides a liaison 0, les oligosaccharides a liaison N et autres, sont combines avec une proteine cceur. Dans le tissu osseux, le 35 glucosaminoglycane occupe 1 % ou moins du poids sec de 1'os decalcifie. Le proteoglycane osseux peut comprendre de la decorine et du biglycane. Un "osteoblaste" selon la presente description est une cellule qui est situee dans la matrice osseuse et forme et calcific la matrice osseuse. Les osteoblastes sont des cellules de 20-30 gm de diametre et de forme cubique ou prismatique. Tel qu'utilise ici, un osteoblaste peut comprendre un "preosteoblaste", qui est une cellule precurseur d'un osteoblaste. Les osteoblastes sont determines par 1'expression d'au moins un marqueur choisi dans le groupe compose du collagene de type I, du proteoglycane osseux (par exemple, la decorine et le biglycane), de la phosphatase alcaline, de 1'osteocalcine, de la Gla-proteine matricielle, de 1'osteoglycine, de l'osteopontine, de la proteine d'acide sialique osseuse, de 1'osteonectine et de la pleiotrophine. En outre, les osteoblastes peuvent etre determines par identification de marqueurs des chondrocytes (tels que le collagene de type II, le proteoglycane de cartilage (aglycane) ou des composants de celui-ci, 1acide hyaluronique, le collagene de type IX, le collagene de type XI, (ou la chondromoduline) qui n'y sont pas exprimes. Ces marqueurs sont identifies par leur localisation ou leur expression selon des procedes d'analyse des proteines ou de 1'ARN extrait a partir de cellules cultivees, tels que la coloration specifique, les procedes immunohistochimiques, 1'hybridation in situ, le transfert Western ou la PCR. "Marqueur des osteoblastes" selon la presente description fait reference a une substance dont la localisation ou 1'expression clans un osteoblaste facilite 1'identification de 1'osteoblaste. De preference, it fait reference a une substance qui peut etre utilisee pour identifier les osteoblastes en fonction de leur localisation ou de leur expression (par exemple, localisation ou expression du collagene de type I, du proteoglycane osseux (par exemple, decorine, biglycane), de la phosphatase alcaline, de 1'osteocalcine, de la Gla-protein matricielle, de 1'osteoglycine, de 1'osteopontine, de la proteine d'acide sialique osseuse, de 1'osteonectine ou de la pleiotrophine). L'osteoglycine est appelee facteur osteoinducteur (FOI). L'osteopontine est appelee BSP-I ou 2ar. La protein d'acide sialique osseuse est appelee BSP-II. La pleiotrophine 36 est appelee proteine specifique des osteoblastes (OSF-1). L'osteonectine est appelee SPARC ou BM-40. Les osteoblastes peuvent etre identifies, par exemple, par : determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur 5 identifiant uniquement les osteoblastes ; determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les osteoblastes et les chondrocytes capables d'hypertrophie, tout en n'identifiant pas les chondrocytes, et determination de ladite cellule comme etant positive a un marqueur qui identifie les osteoblastes 10 et les chondrocytes, tout en n'identifiant pas les chondrocytes capables d'hypertrophie ; determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les osteoblastes et les chondrocytes capables d'hypertrophie, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les 15 osteoblastes, tout en identifiant les chondrocytes capables d'hypertrophie ; ou determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les osteoblastes et les chondrocytes comme etant positifs, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les 20 osteoblastes, tout en identifiant les chondrocytes. Les chondrocytes capables d'hypertrophie peuvent etre identifies, par exemple, par : determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur qui identifie uniquement les chondrocytes capables d'hypertrophie ; 25 determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les chondrocytes capables d'hypertrophie et les osteoblastes, tout en n'identifiant pas les chondrocytes, et determination de ladite cellule comme etant positive a un marqueur qui identifie les chondrocytes capables d'hypertrophie et les chondrocytes, tout en 30 n'identifiant pas les osteoblastes ; determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les chondrocytes capables d'hypertrophie et les osteoblastes, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les chondrocytes capables d'hypertrophie, tout en identifiant les 35 osteoblastes ; ou determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur 37 identifiant les chondrocytes capables d'hypertrophie et les chondrocytes, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les chondrocytes capables d'hypertrophie, tout en identifiant les chondrocytes. Les chondrocytes (sans la capacite d'hypertrophie) peuvent etre identifies, par exemple, par : determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur qui identifie uniquement les chondrocytes ; determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les chondrocytes et les osteoblastes, tout en n'identifiant pas les chondrocytes capables d'hypertrophie, et determination de ladite cellule comme etant positive a un marqueur qui identifie les chondrocytes et les chondrocytes capables d'hypertrophie, tout en n'identifiant pas les osteoblastes ; determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les chondrocytes et les osteoblastes, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les chondrocytes, tout en identifiant les osteoblastes ; ou determination d'une cellule comme etant positive a un marqueur identifiant les chondrocytes et les chondrocytes capables d'hypertrophie, mais comme etant negative a un marqueur qui n'identifie pas les chondrocytes, tout en identifiant les chondrocytes capables d'hypertrophie. Les chondrocytes, les chondrocytes capables d'hypertrophie et les 25 osteoblastes peuvent etre identifies ici, par exemple, a 1'aide des combinaisons de marqueurs enumerees ci-dessous, dans le TABLEAU A Chondrocyte Chondrocyte capable Osteoblaste d'hypertrophie Collagene de type II, + + _ proteoglycane de cartilage (aglycane), acide hyaluronique, collagene de type IX, collagene de type XI, chondromoduline Collagene de type X - + _ Phosphatase alcaline, - + + osteonectine Collagene de type I, - - + proteoglycane osseux (par exemple, decorine, biglycane), osteocalcine, proteine Gla-matricielle, osteoglycine, osteopontine, proteine d'acide sialique osseuse, pleiotrophine + = exprime - = non exprime Tel qu'utilise ici, le terme "induire la differenciation" fait reference au processus de developpement des parties dans un organisme biologique telles que les cellules, les tissus et les organes, dans lesquelles le processus de developpement est un processus d'induction dela formation de tissus ou d'organes ayant des caracteristiques specifiques. 1 o Les termes "differenciation" et "induire la differenciation" sont principalement utilises en embryologie, en biologie du developpement et similaires. Les tissus et organes clans un organisme biologique sont formes par les divisions d'un oeuf fertilise constitue d'une cellule unique jusqu'a ce que tune d'entre elles atteigne la maturite. I1 est difficile de 15 distinguer les cellules et les populations de cellules au cours du developpement precoce d'un organisme biologique, qui se situe avant la differenciation ou qui n'est pas encore bien differencie, parce que les cellules et les populations de cellules n'ont aucune caracteristique morphologique ou fonctionnelle. Une telle condition est appelee "non 38 39 differenciation". En outre, la "differenciation" a lieu dans un organe, et ainsi differentes cellules composant l'organe se developpent en une cellule et une population de cellules specifiques. Ceci est appele differenciation dans l'organe en organogenese. Une telle induction du developpement est appelee induction de la differenciation. Tel qu'utilise ici, le terme "capacite a induire la differenciation des osteoblastes" fait reference a la capacite de differenciation d'une cellule non differenciee, de preference d'une cellule souche embryonnaire, d'une cellule germinale embryonnaire ou d'une cellule souche tissulaire, plus preferablement, d'une cellule souche mesenchymateuse en un osteoblaste. La capacite a induire la differenciation des osteoblastes peut etre decidee par mesure d'un marqueur des osteoblastes (par exemple la phosphatase alcaline). Specifiquement, on determine que 1'agent de la presente invention est capable d'induire la differenciation des osteoblastes, par augmentation de la valeur de 1'activite de la phosphatase alcaline d'une cellule C3H10T1/2 (par exemple, 1'activite de la phosphatase alcaline de la cellule entiere) qui est exposee a 1'agent dans le milieu de base de Eagle pour qu'elle soit superieure a plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans le milieu de base de Eagle sans 1'agent, oil 1'activite phosphatase alcaline est determinee par les etapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, oil, pour une absorbance des echantillons de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l d'un tampon alcalin (Sigma, A9226) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et pour 1'autre absorbance des echantillons, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, oil la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. En outre, on a determine que 1'agent de la presente invention est capable d'induire la differenciation des osteoblastes par augmentation de la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) (par ex : activite phosphatase alcaline de 1'integralite de la cellule) d'une cellule C3H10T1/2 dans laquelle la cellule C3H10T1/2 est exposee A. 1'agent 40 dans du milieu de base de Eagle. L'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la deteiinination de deux absorbances a 405 nm, oil, pour une absorbance des deux echantillons de 100 gl avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (Sigma, A9926) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, alors que pour ratite absorbance des echantillons, 20 gl supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de iacide chlorhydrique concentre, of la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans chaque experience, on prepare des solutions 0-10 mM de p-nitrophenol pour mesurer 1'absorbance et pour ainsi tracer une courbe d'etalonnage lineaire de leurs valeurs en indiquant la concentration sur 1'axe des X et 1'absorbance sur 1'axe des Y. La valeur absolue est ensuite calculee a partir de 1'absorbance a 1'aide de cette courbe d'etalonnage. Tel que decrit ici, le terme "capacite a induire la differenciation des osteoblastes) pour une cellule non differenciee (par ex : cellules souches embryonnaires, cellules souches germinales embryonnaires, cellules souches mesenchymateuses, cellules souches hematopoietiques, cellules souches vasculaires, cellules souches hepatiques, cellules souches (communes) pancreatiques, cellules souches neurales) fait reference a la capacite de differenciation en osteoblaste d'une cellule non differenciee. Par exemple, la capacite de differenciation en osteoblaste peut comprendre la capacite de differenciation en osteoblaste d'une cellule non differenciee qui n'est pas differenciee par le glucocorticoIde, le R-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. La capacite de differenciation en osteoblaste peut etre decides a partir de 1'experience suivante. On inocule de maniere egale une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules sujets dans des plaques a 24 puits (Becton Dickinson, 2,5 x 104/puits) et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C pendant 72 heures, puis on mesure 1'expression induite ou 1'augmentation de 1'expression d'au moins un marqueur des osteoblastes. Tel que decrit ici, le terme "cellule non differenciee" fait reference a une cellule qui n'a pas atteint la differenciation terminale ou une cellule qui n'a pas la capacite de differenciation. Telle qu'utilisee ici, la cellule non differenciee peut titre une cellule souche (par ex : une cellule souche embryonnaire, une cellule souche germinale embryonnaire ou une cellule souche tissulaire) qui peut titre une cellule souche mesenchymateuse, une cellule souche hematopoietique, une cellule souche vasculaire, une cellule souche hepatique, une cellule souche (commune) pancreatique, une cellule souche neurale. La cellule non differenciee comprend en outre toutes les cellules en voie de differenciation, qui peuvent titre une cellule C3H1OT1/2, une cellule ATDC5, une cellule 3T3-Swiss albinos, une cellule BALB/3T3, une cellule NIH3T3 et similaires. Une cellule non differenciee utilisee dans la presente invention peut titre n'importe quelle cellule dans laquelle la cellule peut se differencier en osteoblaste. Tel qu'utilise ici, le terme "cellule souche" fait reference a une cellule capable d'autoreplication et de pluripotence (a savoir, multipotence). Typiquement, les cellules souches peuvent regenerer un tissu blesse. Les cellules souches ici peuvent titre, mais sans s'y limiter, les cellules souches embryonnaires, les cellules souches germinates embryonnaires ou les cellules souches tissulaires (egalement appelees cellules souches tissulaires, cellules souches specifiques aux tissus ou cellules souches somatiques). Une cellule souche peut titre une cellule produite artificiellement (par ex : une cellule de fusion, une cellule reprogrammee, ou similaire utilisee ici) dans la mesure ou elle peut avoir les capacites decrites precedemment. Les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches pluripotentes derivees d'embryons precoces. La premiere determination d'une cellule souche embryonnaire a eu lieu en 1981 et elle est appliquee a la production de souris knockout depuis 1989. En 1998, on a etabli 1'existence d'une cellule souche d'embryon humain qui devient actuellement disponible pour la medecine regenerative. On pense qu'une cellule germinate embryonnaire est formee par dedifferenciation par exposition d'une cellule souche primordiale a un agent environnant specifique. Tandis qu'une cellule germinate embryonnaire a une propriete en taut que cellule souche embryonnaire, la cellule germinale embryonnaire tient une partie d'une propriete de la cellule germinale primordiale dont elle derive. Les cellules souches tissulaires sont presentes dans le tissu, ont 42 un niveau de pluripotence inferieur a celui des cellules souches embryonnaires et ont un niveau de differenciation relativement limite, contrairement aux cellules souches embryonnaires. Generalement, les cellules souches ont une structure intracellulaire non differenciee, un rapport noyau/cytoplasme eleve et peu d'organelles intracellulaires. Telles qu'utilisees ici, les cellules souches peuvent etre de preference des cellules souches mesenchymateuses, bien que Pon puisse egalement employer des cellules souches tissulaires, des cellules germinales embryonnaires ou des cellules souches embryonnaires, selon les circonstances. Les cellules souches tissulaires sont separees en categories de sites a partir desquels les cellules sont derivees, tels que le systeme dermique, le systeme digestif, le systeme de la moelle osseuse, le systeme nerveux, et similaires. Les cellules souches tissulaires dans le systeme dermique comprennent les cellules souches epidermiques, les cellules souches de follicule pileux et similaires. Les cellules souches tissulaires dans le systeme digestif comprennent les cellules souches pancreatiques, les cellules souches hepatiques, et similaires. Les cellules souches tissulaires dans le systeme de la moelle osseuse comprennent les cellules souches hematopoietiques, les cellules souches mesenchymateuses, et similaires. Les cellules souches tissulaires dans le systeme nerveux comprennent les cellules souches neurales, les cellules souches retiniennes et similaires. L'origine d'une cellule souche est categorisee en ectoderme, endoderme et mesoderme. Les cellules souches d'origine ectodermique sont majoritairement presentes dans le cerveau, notamment les cellules souches neurales. Les cellules souches d'origine endodermique sont principalement presentes dans la moelle osseuse, notamment dans les cellules souches des vaisseaux sanguins, les cellules souches hematopoietiques, les cellules souches mesenchymateuses et similaires. Les cellules souches d'origine mesodermique sont principalement presentes dans les organes, notamment dans les cellules souches hepatiques, les cellules souches pancreatiques et similaires. "Cellule souche mesenchymateuse" tel que decrit ici fait reference a une cellule souche observee dans du tissu mesenchymateux. Le tissu mesenchymateux comprend, mais sans s'y limiter, la moelle osseuse, le tissu adipeux, 1'endothelium vasculaire, le muscle lisse, le muscle 43 cardiaque, le muscle squelettique, le cartilage, 1'os et le ligament. Les cellules souches mesenchymateuses sont typiquement derivees de la moelle osseuse, du tissu adipeux, du tissu synovial, du tissu musculaire, du sang peripherique, du tissu placentaire, du sang menstruel ou du sang du cordon ombilical. Un "milieu de croissance ou de culture" selon la presente description fait reference a un milieu contenant un milieu basal, des antibiotiques (par ex : de la penicilline et de la streptomycine), un agent antibacterien (par ex : 1'amphotericine B) et un composant serique (par ex : le serum humain, le serum bovin, le serum bovin foetal). Typiquement, le composant serique peut constituer jusqu'a 20 % du milieu. En outre, si le milieu de base est un milieu essentiel minimal (MEM), le milieu est appele "milieu de croissance MEM". Si le milieu de base est un milieu HAM, le milieu est appele "milieu de croissance HAM". Tel qu'utilise ici, un "milieu produisant un agent de differenciation" fait reference a un milieu qui comprend un milieu basique, et au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le glucocorticoide, le R-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. L'agent de differenciation produisant le milieu peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Le milieu produisant 1'agent de differenciation peut comprendre a la fois le glucocorticoide, le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique comme composant de differenciation des osteoblastes conventionnel. De preference, le "milieu produisant 1'agent de differenciation" comprend du milieu essentiel minimal (MEM) comme composant de base, et du J3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique comment composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. De preference, le "milieu produisant un agent de differenciation" peut en outre comprendre un composant serique (par ex : du serum humain, du serum bovin, du serum bovin foetal). Typiquement, le composant serique peut constituer jusqu'a 20 % du milieu. En outre, si le milieu de base est un milieu essentiel minimal (MEM), le milieu est appele "Milieu MEM produisant un agent de differenciation". Si le milieu de base est un milieu HAM, le milieu est appele "milieu HAM produisant un agent de differenciation". 44 On n'a pas montre que le milieu produisant un agent de differenciation en tant que tel avait la capacite de differencier une cellule C3H l OT 1 /2, une cellule 3T3-Swiss albinos, une cellule Balb 3T3 en osteoblaste. Par consequent, on pense qu'un agent clans la presente invention est different des composants inclus dans le milieu produisant un agent de differenciation. Tel que decrit ici, un "composant de differenciation des osteoblastes conventionnel" a ete propose par Maniatopoulos, C et. Al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317-330, 1988. Par consequent, le composant de differenciation des osteoblastes conventionnel est un composant utilise pour differencier une cellule de moelle osseuse en osteoblaste et fait reference a une combinaison de glucocorticolde, de (3-glycerophosphate et d'acide ascorbique. Tel que decrit ici, "glucocorticoide" est une hormone de la corticosurrenale et est un nom generique pour une hormone steroidienne associee au metabolisme du saccharose. Le glucocorticoIde est connu comme composant de differenciation d'une cellule de moelle osseuse en osteoblaste (Maniatopoulos, C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317-330, 1998), mais sans avoir le meme effet de differenciation que celui decrit precedemment. Le glucocorticoIde est egalement appele glycocorticoide. TypiquemenT, le glucocorticoIde comprend, mais sans s'y limiter, la dexamethasone, la betamethasone, la predonisolone, la predonisone, la cortisone, le cortisol, la corticosterone. De preference, on utilise la dexamethasone. Une substance synthetisee chimiquement ayant le meme effet qu'un glucocorticoide natif peut etre utilisee. Ces glucocorticoides typiques sont utilises dans la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie conjointement avec le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique, pour ainsi produire un agent ayant 1'activite de differenciation d'une cellule C3H10T1/2 en osteoblaste. Par consequent, dans la presente invention, ces glucocorticoides typiques peuvent etre incorpores dans le milieu produisant 1'agent de differenciation. Le glucocorticoIde peut avoir une concentration de 0,1 nM - 10 nM, de preference 10 - 100 nM dans le milieu produisant 1'agent de differenciation. 45 Tel que decrit ici, "P-glycerophosphate" est un nom generique d'un sel lie a un groupe phosphate a la position 13 de 1'acide glycerophosphorique (C3H5(OH)2OPO3H2). Le sel peut inclure le sel de calcium ou le sel de sodium. Le 33-glycerophosphate est connu comme composant de differenciation d'une cellule de moelle osseuse en osteoblaste (Maniatopooulos. C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res.: 254: 317-330, 1988.), mais sans avoir le meme effet de differenciation que celui decrit precedemment. Le (3-glycerophosphate est utilise dans la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie conjointement avec le glucocorticoide et 1'acide ascorbique, et produit ainsi un agent ayant 1'activite de differenciation d'une cellule C3H l OT 1 /2 en osteoblaste. Par consequent, dans la presente invention, le (3-glycerophosphate peut etre incorpore dans le milieu produisant un agent de differenciation. Le (3-glycerophosphate peut avoir une concentration de 0,1 mM - 1 M, de preference 10 mM, dans le milieu produisant un agent de differenciation. Tel que decrit ici, 1"'acide ascorbique" est une vitamine cristalline blanche soluble dans 1'eau. L'acide ascorbique est present dans la maj orite des plantes, particulierement dans les agrumes. L'acide ascorbique est egalement appele vitamine C. L'acide ascorbique est connu comme composant de differenciation d'une cellule de moelle osseuse en osteoblaste (Maniatopoulos, C. et. Al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317-330, 1988), mais sans 1'effet de differenciation tel que decrit precedernment. L'acide ascorbique, selon la presente invention, peut comprendre l'acide ascorbique et les derives de celui-ci. L'acide ascorbique comprend, mais sans s'y limiter, 1'acide L-ascorbique, le sel de sodium d'acide L-ascorbique, le palmitate de L-ascorbyle, le stearate de L-ascorbyle, le 2-glucoside d'acide L-ascorbique, 1'ascorbyle phosphate de magnesium et le glucoside d'acide ascorbique. Des substances synthetisees chimiquement ayant le meme effet que 1'acide ascorbique natif peuvent etre incluses. Ces acides ascorbiques typiques sont utilises clans la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie conjointement avec le glucocorticoide et le 13-glycerophosphate, pour ainsi produire un agent ayant 1'activite de 46 differenciation d'une cellule C3H10T1/2 en osteoblaste. Par consequent, dans la presente invention, ces acides ascorbiques typiques peuvent etre incorpores dans le milieu produisant un agent de differenciation. L'acide ascorbique peut etre compris dans une concentration de 0,1 gg/ml - 5 mg/ml, de preference 10 - 50 g/ml, dans le milieu produisant un agent de differenciation. DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES Les meilleurs modes de la presente invention sont decrits cidessous. On apprecie que les modes de realisation donnes ci-dessous soient fournis aux fins de mieux comprendre 1'invention. La portee de l'invention ne doit pas etre limitee aux descriptions suivantes. Par consequent, it apparait que 1'homme de fart peut lire les descriptions presentes et les modifier de maniere appropriee dans la portee de la presente invention. Un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes Selon un aspect, la presente invention fournit un agent qui peut etre obtenu par mise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. On sait que l'osteogenese est un procede prefere you traiter les maladies associees a une diminution de 1'osteogenese, les deteriorations de 1'os ou les deficits osseux, et que 1'osteoblaste joue un role important dans l'osteogenese. Cependant, 1'osteoblaste utilise dans ces traitements ne possede pas les qualites de securite, de faible cout et de stabilite. En tant que tel, ses proprietes et ses fonctions presentent une certaine incertitude. La presente invention a un effet qui peut differencier une cellule non differenciee en un osteoblaste par exposition de la cellule non differenciee, de preference une cellule souche mesenchymateuse, a un agent produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie. A 1'aide de 1'agent, 1'osteoblaste peut beneficier de la securite, du faible colt et de la stabilite souhaites. Un tel agent peut etre obtenu par mise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. Le milieu produisant un agent de differenciation comprend du milieu essentiel minimal (MEM) ou du milieu HAM comme milieu de base, et au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le f3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Le milieu produisant un agent de 47 differenciation peut en outre comprendre un glucocorticoide. On n'a pas montre que le milieu produisant un agent de differenciation en tant que tel avait la capacite de differencier une cellule C3H1OT1/2, une cellule 3T3-Swiss albinos ou une cellule Balb/3T3 en osteoblaste. Dans un mode de realisation prefere, 1'agent de la presente invention capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) (par ex : activite phosphatase alcaline de la cellule entiere) d'une cellule C3H1OT1/2 qui est exposee it 1'agent dans du milieu de base de Eagle pour qu'elle soit superieure a plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans un milieu de base de Eagle sans 1'agent. L'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou, pour une absorbance des echantillons de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 pl de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l d'un tampon alcalin (Sigma, A9226) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, alors que pour 1'autre absorbance des echantillons, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, ou la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. De preference, 1'activite phosphatase alcaline montre une augmentation d'au moires 2 fois, au moires 3 dois, au moires 4 fois, au moires 5 fois, au moires 6 fois, au moires 7 fois, au moires 8 fois, au moires 9 fois, au moires 10 fois, au moires 11 fois, au moires 12 fois ou au moires 13 fois. Dans un mode de realisation prefere, 1'agent de la presente invention est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) (par ex : activite phosphatase alcaline de la cellule entiere) d'une cellule C3H1OT1/2 lorsque la cellule C3H1OT1/2 est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle. L'activite phosphatase alcaline est determinee par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou, pour une absorbance des echantillons de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 1 de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l d'un tampon alcalin (Sigma, A9226) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir A. 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a 48 la reaction, alors que pour 1'autre absorbance des echantillons, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, ou la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. De preference, 1'activite phosphatase alcaline montre une augmentation d'au moins 2 fois, au moins 3 dois, au moins 4 fois, au moins 5 fois, au moins 6 fois, au moins 7 fois, au moins 8 fois, au moins 9 fois, au moins 10 fois, au moins 11 fois, au moins 12 fois ou au moins 13 fois. Tels que decrits ici, "agent" ou "facteur" peuvent etre n'importe quelle substance ou n'importe quel composant dans la mesure ou ils atteignent 1'objectif prevu. Par exemple, un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes selon la presente invention peut etre, par exemple, une proteine, un polypeptide, un oligopeptide, un peptide, un acide amine, un acide nucleique, un polysaccharide, un lipide, une molecule organique de faible poids moleculaire ou une molecule composite de ceux-ci. Dans la presente description, un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, pouvant are obtenu par mise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans le milieu produisant un agent de differenciation, peut are simple ou complexe tant qu'il possede lui-meme 1'activite. On comprend qu'un agent obtenu selon un autre procede ou qu'un agent possedant une formation distincte est utilise de maniere interchangeable dans la presente invention, si 1'agent a la meme activite que 1'agent capable d'induire la differenciation de cellules non differenciees dans un osteoblaste de la presente invention. Un tel agent peut etre identifie a 1'aide d'une technique courante par 1'homme de fart, sur la base de la presente description, en plus des agents de base identifies dans les Exemples. Le present agent a la capacite d'augmenter 1'expression d'une substance specifique aux osteoblastes choisie dans le groupe comprenant le collagene de type I, le proteoglycane osseux (par ex : decorine, biglycane), la phosphatase alcaline, 1'osteocalcine, la Gla-proteine matricielle, 1'osteoglycine, 1'osteopontine, la proteine d'acide sialique osseuse, 1'osteonectine et la pleiotrophine. Par consequent, 1'agent ayant la capacite de differencier un osteoblaste ici est caracterise en ce qu'il augmente l'activite phosphatase alcaline d'une cellule non differenciee 49 dans 1'activite enzymatique, ou en ce qu'il a la capacite d'exprimer au moins un marqueur des osteoblastes dans la cellule non differenciee au niveau de 1'expression genique ou de 1'expression proteinique. Dans un mode de realisation prefers, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes dans la presente invention peut etre identifie par la mesure de 1'augmentation de 1'activite phosphatase alcaline, et 1'expression ou la localisation d'un marqueur des osteoblastes dans une cellule non differenciee. Dans un autre mode de realisation de la presente invention, on empeche un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes d'induire la differenciation de cellules non differenciees en osteoblastes en le chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau bouillante (generalement, environ 96-100 C, par ex : environ 96 C, environ 97 C, environ 98 C, environ 99 C et environ 100 C). L'ebullition est confirmee par observation. Le fait d'empecher l'induction de la differenciation de cellules non differenciees en osteoblastes est considers comme un etat qui n'augmente pas substantiellement la localisation ou 1'expression d'un marqueur des osteoblastes. Dans un autre mode de realisation de la presente invention, on empeche un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes d'induire 1'activite phosphatase alcaline en le chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau bouillante. Le fait d'empecher 1'induction d'une activite phosphatase alcaline de cellules non differenciees est considers comme un etat qui n'augmente pas substantiellement 1'activite phosphatase alcaline. Les termes "proteine", "polypeptide", "oligopeptide" et "peptide" tels qu'utilises ici ont la meme signification et font reference a un peptide polymere ayant n'importe quelle longueur. Ce polymere peut etre une chaine lineaire, ramifies ou cyclique. Un acide amine peut etre un acide amine existant a 1'etat naturel ou non, ou une variante d'acide amine. Ces termes, tels qu'utilises ici, font de preference reference a une forme traduite par les molecules d'acides nucleiques, mais ne sont pas limites a ceux composes d'acides amines existant a 1'etat naturel uniquement. Ce terme peut inclure ceux assembles en un compose d'une pluralite de chaines polypeptidiques. Ce terme comprend egalement un polymere d'acides amines present a 1'etat naturel ou modifie de maniere artificielle. Une telle modification comprend la formation d'une liaison disulfure, la glycosylation, la lipidation, 1'acetylat:ion, la phosphorylation, ou toute 50 autre manipulation ou modification (par exemple : conjugaison avec une fraction marqueuse). Cette definition englobe un peptide contenant au moins un analogue acide amine (par ex : un acide amine ne se trouvant pas a 1'etat naturel), un compose de type peptide (par ex : un peptoide) ou d'autres variantes connues dans fart. I1 convient de comprendre que, comme cela est mentionne specifiquement ici, "proteine" fait reference a un peptide polymere ayant un poids moleculaire relativement important ou a une variante de celuici, et "peptide" fait reference a un peptide polymere ayant un poids moleculaire relativement bas ou a une variante de celui-ci. Dans un autre mode de realisation, un chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention est derive d'un mammifere, de preference un humain, une souris, un rat ou un lapin. I1 existe deux modesd'ossification : l'ossification membranaire et l'ossification chondrale. L'ossification membranaire est un mode qui fonctionne a la formation de 1'os plat (par ex : la majorite des os craniens et la clavicule) dans la surface A. proximite. Dans 1'ossification membranaire, 1'os membranaire est directement forme sans passage d'un chondrocyte a travers le tissu conjonctif. L'ossification membranaire est egalement appelee ossification intramembranaire ou ossification du tissu conjonctif. L'ossification chondrale est un mode qui fonctionne a la formation de 1'endosquelette (par ex : vertebres, cotes, os des membres et similaires) a 1'interieur du corps. Dans l'ossification chondrale, les cartilages se forment d'abord, les vaisseaux sanguins s'infiltrent dans le cadre pour calcifier le chondrocyte et forment des cartilages calcifies. La formation de chondrocyte calcifie est momentanement arretee, puis l'osteogenese et la formation de 1'os et de la moelle osseuse primordiale a lieu. Dans cette conjoncture, une fois le primordium cartilagineux forme a travers le cartilage, le primordium cartilagineux est affecte par 1'hormone de croissance et similaire. Ainsi, un chondrocyte s'allonge et augmente sa taille en direction du petit axe et du grand axe. Ensuite, les vaisseaux sanguins s'infiltrent dans 1'epiphyse pour induire 1'ossification. L'ossification chondrale est egalement appelee ossification endochondrale ou ossification enchondrale (Voir, Fujita Hisao, Fujita Tsuneo, "bone no hassei" hyojun soshikigaku gairon, page 127 ["Developpement de 1'os" examen histologique standard, page 127] ; 51 kososhiki no kigen to shinka josetsu-, Suda Tateo, The BONE, 18 kan, pages 421-426, 2004 [Origine et evolution du tissu osseux û Introduction û Suda Tateo, the BONE, volume 18, pages 421-426, 2004 ; nainankotsu seikotsu keisei no katei, Suzuki Fujio, "hone wa donoyonishite dekiruka" Osaka Daigaku Shuppankai, page 21, 2004 [Le processus d'ossification endochondrale, Suzuki Fujio, "Comment se deroule la formation des os ?" Osaka University Press, page 21, 2004] ; Suzuki Takao et al. edit. "Hone no jiten", Asakura shoten [Suzuki Takao et al. edit, "The dictionary of bone", Asakura shoten]). Par consequent, le chondrocyte capable d'hypertrophie dans l'invention, qui est capable d'induire la differenciation de cellules non differenciees en osteoblastes, existe uniformement chez le mammifere, incluant le rat, la souris, le lapin, Pete humain et similaire. L'agent joue un role important dans 1'ossification. Ainsi, 1'agent de la presente invention peut etre produit a partir du chondrocyte capable d'hypertrophie en utilisant la meme procedure, chez les mammiferes et similaires chez lesquels 1'ossification endochondrale a lieu, quelles que soient les especes. A 1'aide de procedes de biologie moleculaire, on a demontre que 1'ossification est induite par 1'implantation de proteine BMP recombinante humaine chez le rat, et de BMP derivee de fonctions humaines de la meme maniere que la proteine BMP derivee du rat (Voir, Wozney, J. M. et al., Science, 242: 1528-1534, 1998 et Wuerzler KK. Et al., J. Cranofacial Surg., 9: 131-137, 1998). On a egalement prouve que 1'agent associe a 1'ossification peut etre utilise de maniere interchangeable chez 1'homme et le rat. On sait que ces BMP sont differents au niveau des sequences d'acides amines, mais sont substantiellement identiques aux proprietes en tant que proteine (a savoir, proprietes a 1'etat solide selon les conditions de formation, et similaire). Le chondrocyte capable d'hypertrophie selon la presente invention peut etre isole ou induit a partir de, par exemple, une region telle que la jonction chondro-osseuse des cotes, la ligne epiphysaire des os longs (par ex : femur, tibia, fibula, humerus, cubitus et radius), la ligne epiphysaire des vertebres, la zone de proliferation du cartilage des osselets (par ex : os de la main, os du pied et sternum), le perichondre, le primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison et la partie 52 cartilagineuse de la phase de proliferation osseuse. Le chondrocyte capable d'hypertrophie utilise dans la presente invention peut titre un chondrocyte obtenu a partir de n'importe quelle region dans laquelle le chondrocyte peut titre capable d'hypertrophie. Le chondrocyte capable d'hypertrophie peut titre obtenu par induction de la differenciation. Lorsqu'un agent selon la presente invention peut titre produit par un chondrocyte, les chondrocytes peuvent titre typiquement ajustes a une densite cellulaire de 4 x 104 cellules/cm2. La densite cellulaire est normalement utilisee dans de 104 cellules/cm2 a 106 cellules/cm2. Cependant, les densites cellulaires inferieures a 104 cellules/cm2 ou superieures a 106 cellules/cm2 peuvent egalement titre ajustees. Dans la presente invention, la culture du chondrocyte capable d'hypertrophie est preparee a 1'aide de cellules isolees ou induites par les procedes tels que decrits precedemment. Le chondrocyte capable d'hypertrophie utilise dans la presente invention peut titre mis en culture dans n'importe quel milieu, qui peut inclure, mais sans sly limiter, le milieu F12 de Ham (HamF 12), le milieu Eagle modifie de Dulbecco (DMEM), le milieu essentiel minimal (MEM), le milieu essentiel minimal alpha (alpha-MEM), le milieu de base de Eagle (BME), le milieu modifie de Fitton-Jackson (BGJb). Le chondrocyte capable d'hypertrophie peut titre mis en culture cellulaire dans un milieu contenant n'importe quelle substance qui ameliore la proliferation et/ou la differenciation des cellules. Dans la presente invention, le milieu produisant un agent de differenciation peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le glucocorticoide (par ex : la dexamethasone, la predonisolone, la predonisone, la cortisone, la betamethasone, le cortisol, la corticosterone), le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. L'agent de la presente invention est produit a 1'aide du milieu produisant un agent de differenciation comprenant uniquement le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. De preference, le milieu produisant un agent de differenciation comprend a la fois le glucocorticoide, le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Dans la presente invention, le milieu produisant un agent de differenciation peut en outre comprendre d'autres composants tels que le facteur de croissance transformant beta (TGF-beta), le facteur morphogenetique 53 osseux (BMP), le facteur inhibiteur de la leucemie (LIF), le facteur de stimulation des colonies (CSF), le facteur de croissance insulinomimetique (IGF), le facteur de croissance de fibroblastes (FGF), le plasma riche en plaquettes (PRP), le facteur de croissance derive des plaquettes (PDGF) et le facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF). Il peut etre utile d'utiliser le milieu produisant un agent de differenciation comprenant en outre un composant serique (par ex : serum humain, serum bovin, serum bovin foetal). L'osteoblaste produit par 1'agent capable d'induire la differenciation d'un osteoblaste selon la presente invention peut etre implante seul, ou sous forme de materiaux composites avec des implants ou des materiaux de reparation osseuse chez un sujet, pour ainsi rendre l'osteogenese possible. "Sujet", tel qu'il est utilise ici, fait reference a un organisme biologique auquel est applique un traitement selon la presente invention. I1 est egalement appele "patient". Le sujet ou patient peut etre un chien, un chat, ou un cheval, de preference un etre humain. Un "implant" ou un "materiau de reparation osseuse", tel qu'utilise ici, est utilise dans la signification generalement utilisee dans fart. Tels qu'utilises ici, ils sont substantiellement utilises dans le meme sens, mais defini particulierement, un "implant" designe tous les materiaux utilises pour remplir et un "materiau de reparation osseuse" designe un materiau utilise pour reparer une region deficiente de 1'os. Un essai sous-cutane pour l'osteogenese est un essai destine a evaluer la fonction osteogenique pour former de 1'os dans une region dans laquelle 1'os n'existe pas a 1'origine, qui est egalement appele echafaudage. Puisque cet essai peut etre facilement realise, it est largement utilise dans fart. Dans le cas du traitement osseux, un essai de deficience osseuse peut etre utilise comme procede d'essai. L'osteogenese a seulement lieu pendant cet essai dans les conditions qui promeuvent facilement l'osteogenese. L'osteogenese est realisee par les osteoblastes deja existants dans 1'environnement immediat d'une deficience et egalement ceux qui y sont induits/y ont migre. Ainsi, on pense normalement que le taux d'osteogenese est meilleur dans 1essai de deficience osseuse que dans 1essai sous-cutane. On sait bien que le resultat de 1essai sous-cutane correspond au taux d'osteogenese dans la 54 deficience osseuse reelle (voir, par ex : Urist, M. R., Science, 150: 893-899 (1965), Wozney, J. M. et al.,, Science, 242: 1528-1532 (1988), Johnson. E. E. et al., Clin. Orthop., 230: 257-265 (1988), Ekelund, A. et al., Clin. Orthop., 263: 102-112 (1991) et Riley, E. H. et al., Clin. Orthop. 324: 39-46 (1996)). Par consequent, si l'osteogenese est observee en resultat de 1'essai sous-cutane, 1'homme de fart comprend que l'osteogenese doit egalement etre induite dans 1'essai de deficience osseuse. Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable 10 d'hypertrophie Selon un aspect, la presente invention fournit une composition comprenant un agent pouvant etre obtenu par mise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans le milieu produisant un agent de differenciation. Dans un autre mode de realisation, la composition 15 selon la presente invention est utilisee pour induire la differenciation des osteoblastes, et est de preference utilisee pour induire la differenciation de la cellule non differenciee en osteoblaste. La composition de la presente invention peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe 20 comprenant le glucocorticoide, le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. La composition de la presente invention peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Dans un autre mode de realisation, la composition de la 25 presente invention peut comprendre a la fois le glucocorticoide, le 13-glycerophosphate et 1'acide ascorbique comme composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. Dans un autre mode de realisation, la composition de la presente invention peut comprendre a la fois le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique comme composants de 30 differenciation des osteoblastes conventionnels. Composition utilisee pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes Selon un aspect, l'invention fournit une composition utilisee pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des 35 osteoblastes. La composition comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie. Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la 55 differenciation des osteoblastes peut etre utilise dans n'importe quelle autre forme decrite precedemment dans (Un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et similaire dans la presente description. Composition destinee a ameliorer ou a induire l'osteogenese dans un organisme biologique Selon un aspect, la presente invention fournit une composition destinee a ameliorer ou a induire l'osteogenese dans un organisme biologique, ou la composition comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Tel qu'utilise ici, 1'agent: capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre n'importe quel agent decrit precedemment dans (Un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et similaire dans la presente description. Kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes Selon un aspect, la presente invention fournit un kit destine a la 20 production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Le kit comprend A) une composition utilisee pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation ; et B) un composant de differenciation des osteoblastes 25 conventionnel (au moins un composant choisi dans le groupe comprenant le glucocorticoide, le P-glycerophosphate et 1'acide ascorbique). Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre n'importe quel agent decrit precedemment dans (Composition utilisee pour la production d'un agent capable d'induire la 30 differenciation de 1'osteoblaste) et similaire, dans la presente description. Kit destine a l'amelioration ou a l'induction de l'osteogenese dans un organisme biologique Selon un aspect, la presente invention fournit un kit destine a 1'amelioration ou a l'induction de 1'osteogenese dans un organisme 35 biologique. Le kit peut comprendre A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et 56 B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le glucocorticoide, le f 3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre n'importe quel agent decrit precedemment dans (Composition utilisee pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et similaires, dans la presente description. Procede de production Selon un aspect, la presente invention fournit un procede de production d'une composition comprenant un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Le procede comprend la mise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. Le milieu produisant un agent de differenciation peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide (par exemple, la dexamethasone, la prednisolone, la prednisone, la cortisone, la betamethasone, le cortisol, la corticosterone), du f3-glycerophosphate et de l'acide ascorbique. L'agent de la presente invention est produit en utilisant un milieu produisant un agent de differenciation comprenant uniquement le f3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. De preference, le milieu produisant un agent de differenciation comprend A. la fois le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. Le glucocorticoide, le f3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique sont connus comme des composants de differenciation conventionnels des osteoblastes. Cependant, it est connu que leur capacite est limitee. Par exemple, it est connu que le glucocorticoide, le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique ne sont pas suffisants pour avoir un effet sur les cellules C3H1OT1/2, les cellules 3T3-Swiss albinos, les cellules BALB/3T3. En utilisant le present procede de production, la presente invention produit avec succes un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes pour un large eventail de cellules comprenant les lignees cellulaires conventionnelles et/ou les cellules distinctes des cellules conventionnelles. Un tel agent n'ayant pas ete identifie jusqu'a present, it est par consequent considers que 1'existence de 1'agent lui-meme est un effet significatif. 57 Dans un mode de realisation prefere, le milieu produisant un agent de differenciation peut egalement comprendre un composant serique (par exemple, du serum humain, du serum bovin, du serum foetal bovin). Typiquement, le composant serique peut constituer jusqu'a 20 % du milieu. Dans un autre mode de realisation prefere, un chondrocyte capable d'hypertrophie est obtenu a partir d'un mammifere, de preference un homme, une Souris, un rat ou un lapin. Le chondrocyte capable d'hypertrophie peut titre une cellule capable d'hypertrophie qui est induite par l'induction de la differenciation. Le chondrocyte capable d'hypertrophie utilise dans la presente invention peut titre un chondrocyte quelconque qui est capable d'hypertrophie. Le milieu utilise dans la presente invention peut titre tout milieu dans lequel le chondrocyte capable d'hypertrophie peut proliferer. Par exemple, un tel milieu comprend, mais sans limitation : le milieu F12 de HAM (HamF 12), le milieu d'Eagle modifie par Dulbecco (MEMD), le milieu essentiel minimal (MEM), le milieu essentiel minimal alpha (alpha-MEM), le milieu de base d'Eagle (MBE), le milieu modifie de Fitton-Jackson (BGJb). Dans un autre mode de realisation prefere, le milieu utilise pour cultiver le chondrocyte capable d'hypertrophie dans la presente invention peut contenir toute substance qui favorise la proliferation ou la differenciation des cellules ou les deux. Le milieu produisant un agent de differenciation peut comprendre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe comprenant le glucocorticoide (par exemple, la dexamethasone, la betamethasone, la prednisolone, la prednisone, la cortisone, le cortisol, la corticosterone), le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. L'agent de la presente invention est produit en utilisant le milieu produisant un agent de differenciation comprenant uniquement le f3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. De preference, le milieu produisant un agent de differenciation comprend le glucocorticoide, le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique. De maniere davantage preferee, le milieu produisant un agent de differenciation peut egalement comprendre d'autres composants, comme le facteur de croissance transformant (3 (transforming growth factor-beta, TGF-beta), le facteur 58 morphogenetique osseux (bone morphogenetic factor, BMP), le facteur inhibiteur de la leucemie (leukemia inhibitory factor, LIF), le facteur stimulant les colonies (colony stimulating factor, CSF), le facteur de croissance analogue a l'insuline (insulin-like growth factor, IGF), le facteur de croissance des fibroblastes fibroblast growth factor, FGF), du plasma riche en plaquettes (PRP), le facteur de croissance derive des plaquettes (platelet-derived growth factor, PDGF), et le facteur de croissance endotheliale vasculaire (vascular endothelial growth factor, VEGF). Il peut titre utile que le milieu produisant un agent de differenciation comprenne egalement un composant serique (par exemple du serum humain, du serum bovin, du serum foetal bovin). Dans un autre mode de realisation, le chondrocyte capable d'hypertrophie peut are obtenu a partir d'une region quelconque comprenant la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, la ligne epiphysaire des os longs (par exemple, femur, tibia, fibula, humerus, ulna et radius), la ligne epiphysaire des vertebres, la zone de proliferation du cartilage d'osselets (par exemple les os des mains, les os des pieds, et du sternum), le perichondre, le primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. Le chondrocyte capable d'hypertrophie utilise dans la presente invention peut titre un chondrocyte obtenu a partir de toute region dans laquelle le chondrocyte est capable d'hypertrophie. Dans un autre mode de realisation prefere, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes selon la presente invention peut titre obtenu uniquement par 1'etape de recueil d'un surnageant de milieu produisant un agent de differenciation, dans lequel le chondrocyte capable d'hypertrophie est cultive. De preference, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut egalement titre extrait du surnageant recueilli. L'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut titre secrete a partir d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, et peut exister dans un chondrocyte capable d'hypertrophie. Dans la presente demande, la periode de culture du chondrocyte capable d'hypertrophie peut titre une periode au cours de laquelle les agents sont produits en quantite suffisante (par exemple, de plusieurs mois a un semestre, ou de 3 jours a 3 semaines (par exemple, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 20 jours, plus d'un mois, un semestre, 5 mois, 4 mois, trois mois, 2 mois, 1 mois, moins de 3 semaines et toutes les combinaisons possibles de celles-ci dans un intervalle quelconque). Lorsque la periode de culture est allongee, et que les cellules sont confluentes dans un recipient de culture, it est preferable de repiquer les cellules. Procede de production d'un agent capable d'induire la differentiation des osteoblastes Selon un aspect, la presente invention fournit un procede de production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Le procede comprend la raise en culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, dans lequel le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du fi-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre l'un quelconque des agents decrits ci-dessus dans (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes), (Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et (Procede de production) et les sections apparentees dans la presente description. Procede d'induction de la differenciation d'une cellule non differenciee 25 en osteoblaste Dans un autre aspect, la presente invention fournit le procede de production de 1'osteoblaste par l'induction de la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste. Le procede comprenant A) l'inoculation d'une cellule non differenciee dans un 30 echafaudage de culture ou un recipient de culture ; et B) 1'exposition de la cellule non differenciee a un agent produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie par 1'addition d'une solution comprenant un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes au milieu ou 1'echange du milieu pour un milieu 35 comprenant 1'agent, apres que la cellule non differenciee est stabilisee. La cellule non differenciee et 1'agent capable d'induire la differenciation 60 des osteoblastes qui sont utilises dans le procede d'induction de la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste peut titre Fun quelconque de ceux decrits ci-dessus dans (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Procede de production) et les sections apparentees de la presente description. Conformement a la presente description, la cellule non differenciee etant stabilisee signifie que la cellule recupere 1'etat naturel, y compris 1'etat recupere apres une lesion due a une enzyme lors de la separation ou 1'etat selon lequel une cellule adhesive se fixe a un 10 vaisseau ou les etats apparentes. Osteoblaste Dans un autre aspect, la presente invention fournit un osteoblaste produit par la mise en contact d'un agent provenant d'un chondrocyte capable d'hypertrophie avec une cellule non differenciee. Dans la 15 production de 1'osteoblaste, toutes les techniques decrites ci-dessus dans (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et les techniques apparentees dans la presente description peuvent titre utilisees. L'osteoblaste produit peut titre utilise de la meme maniere qu'un osteoblaste naturel. Par consequent, 1'osteoblaste de la presente 20 invention peut titre utilise dans le traitement de pertes osseuses ou de lesions apparentees, et pour la production de l'implant seul, d'un materiau composite avec echafaudage, ou similaires. Materiau composite pour la production d 'un agent capable d 'induire la differenciation des osteoblastes 25 Selon un aspect, la presente invention fournit un materiau composite pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Le materiau composite peut comprendre A) un chondrocyte capable d.'hypertrophie ; et B) un echafaudage. Dans un mode de realisation,l'echafaudage 30 comprend, mais sans limitation, un materiau choisi dans le groupe compose du phosphate de calcium, du carbonate de calcium, de 1'alumine, du zirconium, du verre depose sur apatite-wollastonite, de la gelatine, du collagene, de la chitine, de la fibrine, de 1'acide hyaluronique, du melange de matrice extracellulaire (par exemple 35 MatrigelTM), de la soie, de la cellulose, du dextrane, de 1'agarose, de la gelose, du polypeptide synthetique (par exemple PuraMatrixTM), de 61 1'acide polylactique, de la polyleucine, de 1'acide alginique, de 1'acide polyglycolique, du polymethacrylate de methyle, du polycyanoacrylate, du polyacrylonitrile, du polyurethane, du polypropylene, du polyethylene, du chlorure de polyvinyle, du copolymere ethylene-acetate de vinyle, du nylon et d'une combinaison de ceux-ci. De preference, 1'echafaudage peut comprendre de l'hydroxyapatite. Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre rune quelconque des substances decrites dans (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et les substances apparentees dans la presente description. Dans un autre aspect, la presente invention fournit le kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) le materiau composite pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel (au moins un composant choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du R-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique). Tel qu'utilise ici, l'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre rune quelconque des substances decrites ci-dessus dans (Materiau composite) et les substances apparentees dans la presente description. Materiau composite destine a favoriser ou a induire l'osteogenese dans 25 un organisme biologique Selon un aspect, la presente invention fournit un materiau composite pour favoriser ou induire 1'osteogenese dans un organisme biologique. Le materiau composite peut comprendre A) un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable 30 d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme biologique. Dans un mode de realisation, 1'echafaudage comprend, mais sans limitation, un materiau choisi dans le groupe compose du phosphate de calcium, du carbonate de calcium, de 1'alumine, du zirconium, du 35 verre depose sur apatite-wollastonite, de la gelatine, du collagene, de la chitine, de la fibrine, de 1'acide hyaluronique, du melange de matrice 62 extracellulaire (par exemple MatrigelTM), de la soie, de la cellulose, du dextrane, de 1'agarose, de la gelose, du polypeptide synthetique (par exemple PuraMatrixTM), de 1'acide polylactique, de la polyleucine, de 1'acide alginique, de 1'acide polyglycolique, du polymethacrylate de methyle, du polycyanoacrylate, du polyacrylonitrile, du polyurethane, du polypropylene, du polyethylene, du chlorure de polyvinyle, du copolymere ethylene-acetate de vinyle, du nylon et d'une combinaison de ceux-ci. De preference, 1'echafaudage peut comprendre de l'hydroxyapatite. Tel qu'utilise ici, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre tune quelconque des substances decrites dans (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Composition comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et les substances apparentees dans la presente description. Le terme o materiau composite selon la presente description fait reference a un materiau comprenant une cellule et un echafaudage. L'expression favoriser l'osteogenese telle qu'utilisee ici fait reference a 1'augmentation du taux d'osteogenese au niveau d'un site oul'osteogenese s'est deja produite. Tel qu'utilise ici, induire l'osteogenese fait reference au fait de provoquer l'osteogenese au niveau d'un site ou l'osteogenese ne s'est pas produite. Echafaudage Un echafaudage selon la presente description fait reference a un materiau qui supporte les cellules. L'echafaudage presente une resistance mecanique constante et une biocompatibilite. Tel qu'utilise ici, 1'echafaudage est produit a partir de materiaux biologiques, de materiaux fournis naturellement ou de materiaux naturels ou de materiaux fournis synthetiquement. Tel qu'utilise ici, 1'echafaudage est forme a partir de materiaux autres que les organismes comme des tissus ou des cellules (c'est-a-dire un materiau non cellulaire). Tel qu'utilise ici, 1'echafaudage est une composition formee de materiaux autres que des organismes comme les tissus ou les cellules, comprenant les materiaux provenant d'organismes vivants comme le collagene ou 1'hydroxyapatite. Tel qu'utilise ici, un organisme fait reference a un materiau-systeme organise pour avoir une fonction vivante. C'est-a-dire que le terme organisme distingue les etres vivants des autres 63 materiaux-systemes. Le concept d'organisme comprend les cellules, les tissus ou autres, tandis que les materiaux provenant d'un etre vivant, extraits de 1'organisme, ne sont pas compris dans 1'organisme. La region de 1'echafaudage sur laquelle les cellules sont fixees comprend une surface de 1'echafaudage, ou un pore interne de 1'echafaudage s'il possede un tel pore interne qui peut contenir des cellules. Par exemple, un echafaudage constitue d'hydroxyapatite comprend de nombreux pores qui peuvent normalement contenir des cellules en quantite suffisante. Le materiau de 1'echafaudage comprend, mais sans limitation, un materiau choisi dans le groupe compose du phosphate de calcium, du carbonate de calcium, de 1'alumine, du zirconium, du verre depose sur apatite-wollastonite, de la gelatine, du collagene, de la chitine, de la fibrine, de 1'acide hyaluronique, du melange de matrice extracellulaire (par exemple MatrigelTM), de la soie, de la cellulose, du dextran, de 1'agarose, de la gelose, du polypeptide synthetique (par exemple PuraMatrixTM), de 1'acide polylactique, de la polyleucine, de 1'acide alginique, de 1'acide polyglycolique, du polymethacrylate de methyle, du polycyanoacrylate, du polyacrylonitrile, du polyurethane, du polypropylene, du polyethylene, du chlorure de polyvinyle, du copolymere ethylene-acetate de vinyle, du nylon et d'une combinaison de ceux-ci. De preference, les materiaux de 1'echafaudage sont le phosphate de calcium, la gelatine ou le collagene. De maniere davantage preferee, le materiau de 1'echafaudage est dhydroxyapatite. Ces echafaudages peuvent etre fournis sous toute forme, notamment une forme granulaire, une forme de bloc ou une forme d'eponge. Cet echafaudage peut etre poreux ou non poreux. Pour de tels echafaudages, ceux disponibles dans le commerce (par exemple, aupres de PENTAX Corporation, OLYMPUS Corporation, Kyocera Corporation, Mitsubishi Pharma Corporation, Dainippon Sumitomo Pharmaceuticals, Kobayashi Pharmaceuticals Co. Ltd., Zimmer Inc.) peuvent etre utilises. Les procedures standard pour la preparation et la caracterisation des echafaudages sont connues dans fart, et ne necessitent que des experimentations et des techniques de routine frequemment connues dans fart. Par exemple, voir les brevets americains n 4 975 526 ; n 5 011 691 ; n 5 171 574 ; n 5 266 683 ; n 5 354 557 ; et n 5 468 845, qui sont incorpores ici par voie de reference. 64 D'autres echafaudages sont egalement decrits, par exemple, dans les documents suivants : articles pour materiaux biocompatibles, LeGeros et Daculsi, Handbook of Bioactive Ceramics (Manuel des ceramiques bioactives), II pp. 17-28 (1990, CRC Press) ; autres descriptions publiees, notamment Yang Cao, Jie Weng, Biomaterials 17 (1996) pp. 419424 ; LeGeros, Adv. Dent. Res. 2, 164 {1988) ; Johnson et coll., J. Orthopaedic Research, 1996, vol. 14, pp. 351-369 ; et Piattelli et coll., Biomaterials 1996, vol. 17, pp. 1767-1770, dont les descriptions sont incorporees ici par voie de reference. Le terme phosphate de calcium decrit ici est le nom generique des phosphates de calcium, qui comprennent, mais sans limitation, les composes representes par les formules chimiques suivantes : CaHPO4, Ca3(PO4)2, Ca4O(PO4)2, Ca10(PO4)6(OH)2, CaP4O11, Ca(PO3)2, Ca2P2O7 ou Ca(H2PO4)2.H2O. Le terme o hydroxyapatite decrit ici fait reference a un compose dont la composition generale est Calo(PO4)6(OH)2, qui est un composant principal des tissus durs des mammiferes (os et dents), comme le collagene. Bien que l'hydroxyapatite contienne une serie de phosphates de calcium selon la description ci-dessus, les composants PO4 et OH compris dans l'apatite dans les tissus durs des organismes biologiques sont souvent substitues avec un composant CO3 dans les liquides corporels. En outre, 1'hydroxyapatite est un materiau ayant une autorisation de securite par le Ministere de la sante, du travail et du bien-etre du Japon, et la FDA (Food and Drug Administration des Etats-Unis d'Amerique). Bien que de nombreuses hydroxyapatites disponibles dans le commerce ne soient pas absorbables par 1'organisme et restent difficilement absorbees dans l'organisme, certaines sont absorbables. Le terme melange de matrice extracellulaire dans la presente description fait reference a un melange de matrice extracellulaire et de facteur de croissance. La matrice extracellulaire comprend, mais sans limitation, la laminine, le collagene et les substances apparentees. La matrice extracellulaire peut etre derivee d'un organisme biologique ou synthetisee. Le terme pertes osseuses tel qu'il est decrit ici comprend, mais sans limitation : les lesions comme les tumeurs osseuses, l'osteoporose, la polyarthrite rhumatoide, 1'arthrose, 1'osteomyelite et 1'osteonecrose ; les 65 corrections comme l'immobilisation de 1'os, la foraminotomie et 1'osteotomie ; des traumatismes comme des fractures complexes ; et des pertes osseuses provenant d'un prelevement de l'ilium. L'osteoblaste produit par 1'agent selon la presente invention peut are utilise dans la production de matrice extracellulaire, ou la reparation et la reconstitution de 1'os. La region implantee comprend, mais sans limitation, les pertes osseuses dues a la lesion et 1'excision de tumeurs osseuses et les phenomenes apparentes, que Pon desire normalement etre reparees avec reconstitution de 1'os. L'implantation peut etre effectuee de la meme maniere que l'implantation connue utilisant les cellules souches osseuses. Le nombre de cellules implantees est selectionne de maniere adaptee a la taille de la perte osseuse et aux symptomes et aux criteres apparentes, et est normalement correct avec 104 a 106 cellules. L'osteoblaste produit par 1'agent selon la presente invention peut egalement etre mis en culture dans un recipient de culture cellulaire, et soumis a une proliferation jusqu'a une quantite suffisante pouvant etre utilisee dans l'implantation. En outre, 1'osteoblaste produit par 1'agent selon la presente invention peut egalement etre fixe a un porteur adapte in vitro pour favoriser la proliferation d'une cellule et pour produire la matrice extracellulaire. La presente invention peut s'utiliser eventuellement avec une substance physiologiquement active telle qu'une cytokine. Les expressions substance physiologiquement active cellulaire ou substance physiologiquement active sont utilisees ici de maniere interchangeable pour designer une substance qui a un effet sur les cellules ou les tissus. Ces effets comprennent, par exemple, mais sans limitation, le controle ou la modification des cellules ou tissus. La substance physiologiquement active comprend les cytokines ou les facteurs de croissance. La substance physiologiquement active peut etre d'origine naturelle ou etre une substance de synthese. De preference, la substance physiologiquement active est produite dans une cellule. Elle comprend egalement des substances produites dans une cellule, ou des substances ayant une fonction similaire a, mais modifiee par rapport a celles produites dans une cellule. Dans la presente description, la substance physiologiquement active peut se presenter sous la forme de proteines, y compris de peptides, sous la forme d'acides nucleiques ou 66 sous d'autres formes. Cytokine >>, tel qu'il est utilise ici, est defini comme ayant une signification similaire a celle utilisee clans fart dans son sens le plus large. Il designe une substance physiologiquement active produite dans une cellule qui a un effet sur la meme cellule ou sur une cellule differente. En general, une cytokine est une proteine ou un polypeptide et possede des activites qui commandent la reponse immunitaire, modulent le systeme endocrinien, modulent le systeme nerveux, ont un effet sur faction antitumorale, ont un effet sur faction antivirale, modulent la croissance cellulaire, modulent la differenciation cellulaire, modulent la fonction cellulaire et d'autres. Dans la presente description, les cytokines peuvent titre des proteines, des acides nucleiques ou se presenter sous d'autres formes. Cependant, quand it s'agit d'influencer effectivement les cellules, les cytokines sont souvent des proteines, y compris des peptides. Les expressions facteur de croissance ou facteur de croissance cellulaire >>, telles qu'elles sont utilisees ici, designent de maniere interchangeable une substance qui augmente ou commande l'induction de la croissance et de la differenciation des cellules. Le facteur de croissance est egalement un facteur de proliferation ou de developpement. Dans la culture cellulaire ou la culture tissulaire, des facteurs de croissance peuvent titre ajoutes au milieu et utilises a la place de la fonction des macromolecules clans le serum. Il est prouve que, en plus de la croissance cellulaires, de nombreux facteurs de croissance fonctionnent comme des facteurs qui regulent la differenciation. Les cytokines associees a l'osteogenese comprennent typiquement des facteurs tels que le facteur de croissance transformant beta (TGF-beta), le facteur morphogenetique osseux (BMP), le facteur inhibiteur de la leucemie (LIF), le facteur de stimulation des colonies (CSF), le facteur de croissance analogue a l'insuline (IGF), le facteur de croissance fibroblastique (FGF), le plasma riche en plaquettes (PRP), le facteur de croissance derive des plaquettes (PDGF) et le facteur de croissance de 1'endothelium vasculaire (VEGF) ; et des composes tels que 1'acide ascorbique, le glucocorticoIde et 1'acide glycerophosphorique. Comme les substances physiologiquement actives telles que les cytokines et les facteurs de croissance sont generalement redondantes, 67 les cytokines ou des facteurs de croissance connus sous un autre nom et pour une autre fonction (telle qu'une activite d'adherence cellulaire ou une activite d'adherence cellule-matrice) peuvent aussi etre utilises dans la presente invention, dans la mesure ou ils presentent 1'activite de la substance physiologiquement active a utiliser dans l'invention. Les cytokines ou facteurs de croissance peuvent etre utilises dans la mise en oeuvre de l'invention, dans la mesure ou ils presentent 1'activite preferee (telle qu'une activite de croissance des cellules souches ou une activite de differenciation des osteoblastes, 1'activite de promotion d'un chondrocyte capable d'hypertrophie pour produire 1'agent de la presente invention) pour la presente invention. L'agent de la presente invention peut etre derive d'une cellule derivee d'un individu syngenique ou allogene, ou derive d'un individu heterologue. Derive d'une lignee syngeni.que >>, comme utilise ici, signifie derive d'une lignee autologue, d'une lignee pure ou d'une lignee consanguine. Derive d'un individu allogene >>, comme utilise ici, signifie derive d'un autre individu de la meme espece qui est genetiquement 20 different. Derive d'un individu heterologue >>, comme utilise ici, signifie derive d'un individu heterologue. Ainsi, par exemple, lorsque le receveur est un humain, les cellules de rat sont derivees d'un individu qui est heterologue par rapport a un organisme biologique >>. 25 Utilisation dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes Selon un premier aspect, la presente invention propose une utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Selon un 30 autre aspect, la presente invention propose une utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie et du composant de differenciation des osteoblastes conventionnel pour la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. Dans les utilisations, l'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre l'un 35 quelconque de ceux decrits ci-dessus aux paragrapher (Agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et (Composition 68 comprenant un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie) et similaires dans la presente description. Utilisation dans la fabrication d 'un implant ou d 'un materiau de reparation des os pour augmenter ou induire l'osteogenese dans un 5 organisme biologique Selon un aspect, la presente invention propose l'utilisation : A) d'un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) d'un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme biologique, dans la fabrication d'un 10 implant ou d'un materiau de reparation des os pour augmenter ou induire l'osteogenese dans un organisme biologique. L'echafaudage peut etre, sans limitation, un materiau choisi dans le groupe constitue par le phosphate de calcium, le carbonate de calcium, 1'alumine, la zircone, le verre depose sur apatite-wollastonite, la gelatine, le collagene, la chitine, 15 la fibrine, 1'acide hyaluronique, un melange de matrice extracellulaire (par exemple MatrigelTM), la soie, la cellulose, le dextrane, 1'agarose, la gelose, un polypeptide de synthese (par exemple PuraMatrixTM), 1'acide polylactique, la polyleucine, 1'acide alginique, 1'acide polyglycolique, le polymethacrylate de methyle, le polycyanoacrylate, le polyacrylonitrile, 20 le polyurethane, le polypropylene, le polyethylene, le polychlorure de vinyle, le copolymere ethylene-acetate de vinyle, le nylon et une combinaison de ceux-ci. De preference, 1'echafaudage peut se composer d'hydroxyapatite. Dans les utilisations, 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes peut etre l'un quelconque de ceux decrits 25 ci-dessus dans (Un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes) et similaires dans la presente description. Procede pour augmenter ou induire 1'osteogenese dans un organisme biologique Selon un aspect, la presente invention propose un procede pour 30 augmenter ou induire l'osteogenese dans un organisme biologique. Les procedes peuvent comprendre le positionnement d'un materiau composite dans une region qui en a besoin, dans lesquels le materiau composite comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes et un echafaudage 35 qui est biocompatible avec 1'organisme biologique. L'echafaudage peut etre, sans limitation, un materiau choisi dans le groupe constitue par le 69 phosphate de calcium, le carbonate de calcium, 1'alumine, la zircone, le verre depose sur apatite-wollastonite, la gelatine, le collagene, la chitine, la fibrine, 1'acide hyaluronique, un melange de matrice extracellulaire (par exemple MatrigelTM), la soie, la cellulose, le dextrane, 1'agarose, la gelose, un polypeptide de synthese (par exemple PuraMatrixTM), 1'acide polylactique, la polyleucine, 1'acide alginique, 1'acide polyglycolique, le polymethacrylate de methyle, le polycyanoacrylate, le polyacrylonitrile, le polyurethane, le polypropylene, le polyethylene, le polychlorure de vinyle, le copolymere ethylene-acetate de vinyle, le nylon et une combinaison de ceux-ci. De preference, 1'echafaudage peut se composer d'hydroxyapatite. En utilisation, 1'agent capable d'induire la differentiation des osteoblastes peut etre Fun quelconque de ceux decrits ci-dessus dans (Un agent capable d'induire la differentiation des osteoblastes) et similaires dans la presente description. Ci-apres, la presente invention va etre decrite par divers exemples. Les Exemples decrits ci-dessous sont prevus a des fins illustratives uniquement. En consequence, la portee de la presente invention n'est pas limitee par les modes de realisation decrits ci-dessous ou les exemples ci-apres. EXEMPLES Exemple 1 : Preparation et detection d'un agent de regulation de la fonction cellulaire produit par la raise en culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir de cartilage costal dans le milieu produisant un agent de differentiation MEM Preparation d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir de cartilage costal Dans le present exemple, on examine respectivement un groupe de rats males (Wistar) ages de 4 semaines et un groupe de rats males (Wistar) ages de 8 semaines. On sacrifie ces rats a 1'aide de chloroforme. On rase la region thoracique des rats a 1'aide d'un rasoir et on les plonge en entier dans de 1'Hibitane (dilution 10x) pour les desinfecter. On incise la region thoracique des rats et on en retire le cartilage costal sous asepsie. On preleve la region translucide du cartilage de croissance de la region frontaliere du cartilage costal. On sectionne le cartilage de croissance et on l'incube dans une solution saline tamponnee au phosphate de Dulbecco (D-PBS)/trypsine-EDTA a 0,25 % a 37 C 70 pendant 1 heure sous agitation. On lave ensuite les sections et on les preleve par centrifugation (170 x g pendant 3 min), operation suivie d'une incubation dans une solution de Collagenase (Invitrogen) a 0,2 %/D-PBS a 37 C pendant 2,5 heures, sous agitation. Apres prelevement par centrifugation (170 x g pendant 3 min), on incube les cellules dans une solution de Dispase (Invitrogen) a 0,2 %/(HAM + FBS a 10 %) dans un flacon sous agitation jusqu'au lendemain a 37 C sous agitation. Le lendemain, on filtre la suspension cellulaire resultante et on lave et on preleve les cellules par centrifugation (170 x g pendant 3 min). On colore les cellules au bleu de trypan et on les compte au microscope. On evalue les cellules en considerant que les cellules non colorees sont des cellules vivantes et que les cellules colorees en bleu sont des cellules mortes. Identification d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie Comme les cellules obtenues a 1'Exemple 1 sont alterees par les enzymes utilisees dans la separation cellulaire (par exemple trypsine, collagenase et dispase), elles sont cultivees pour recuperer. On identifie les chondrocytes capables d'hypertrophie au moyen de leur expression des marqueurs des chondrocytes et de leur hypertrophie morphologique au microscope. Localisation ou expression de marqueurs specifiques pour un chondrocyte capable d 'hypertrophie On traite avec du dodecylsulfate de sodium (SDS) une suspension cellulaire preparee en utilisant un procede comme decrit ci-dessus. On soumet la solution traitee au SDS a une electrophorese sur gel de polyacrylamide SDS. On transfert le gel sur une membrane de transfert (transfert Western), on le fait reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur de chondrocytes, et on le detecte avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase, ou un marqueur fluorescent tel que la fluorescein isothiocyanate (FITC), la phycoerythrine (PE), le rouge Texas, le 7-amino-4-methylcoumarine-3-acetate (AMCA) ou la rhodamine. On fixe les cultures cellulaires preparees au moyen d'un procede decrit ci-dessus avec un tampon de formol neutre a 10 %, on les met a reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur de chondrocytes et on les detecte avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme 71 telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase, ou un marqueur fluorescent tel que la FITC, la PE, le Rouge Texas, 1'AMCA ou la rhodamine. La phosphatase alcaline peut etre detectee par coloration. On fixe une culture cellulaire obtenue par la manipulation decrite ci-dessus avec un tampon acetone a 60 %/acide citrique, on la lave A. 1'eau demineralisee et on la trempe clans le melange de First Violet B et de Naphtol AS-MX A. la temperature ambiante dans 1'obscurite pendant 30 minutes pour la faire reagir, et on la colore ainsi. Evaluation histologique de l'aptitude a l'hypertrophie chez les chondrocytes On centrifuge 5 x 105 cellules dans un milieu de F12 de HAM pour preparer un culot de cellules. On met le culot en culture pendant une dui-6e predeterminee. On compare au microscope la taille des cellules avant et apres la culture. Quand on observe une augmentation significative de la taille, les cellules sont considerees capables d'hypertrophie. Pour determiner si des chondrocytes capables d'hypertrophie sont presents dans les suspensions cellulaires dans lesquelles les chondrocytes capables d'hypertrophie sont dilues, on effectue 1'experience suivante. On inocule a de 1'hydroxyapatite une densite de 1 x 106 cellules/ml de chondrocytes capables d'hypertrophie et on les incube dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C pendant une semaine. On colore ensuite 1'echantillon (hydroxyapatite a laquelle des cellules ont ete inoculees) avec de la phosphatase alcaline ou on le colore au bleu de toluidine. Pour la coloration A. la phosphatase alcaline, on fixe 1'echantillon par immersion dans un tampon acetone a 60 %/acide citrique pendant 30 secondes, on le rince a 1'eau et on l'incube avec une solution de coloration de phosphatase alcaline (2 ml de naphtol AS a 0,25 %- phosphate alcalin MX (Sigma-Aldrich) + 48 ml de solution salee de First Violet B a 25 % (Sigma-Aldrich) A. la temperature ambiante dans 1'obscurite pendant 30 minutes. Pour la coloration au bleu de toluidine, on incube 1'echantillon avec une solution de coloration au bleu de toluidine (solution de bleu de toluidine a 0,25 %, pH 7,0, Wako Pure Chemical Industries Ltd.) a la temperature ambiante pendant 5 min. L'echantillon presente une coloration par points rouges avec le 72 phosphate alcalin (voir les figures 1A). Avec le bleu de toluidine, le meme endroit de 1'echantillon presente une coloration par points bleus, ce qui indique la presence de cellules (voir les figures 1B). Ainsi, on observe que les cellules de 1'hydroxyapatite ont une activite phosphatase alcaline. Resultats Les cellules obtenues a 1'Exemple 1 expriment un marqueur des chondrocytes, et elles sont determinees comme etant morphologiquement hypertrophiques. Ceci montre que les cellules obtenues a 1'Exemple 1 sont des chondrocytes capables d'hypertrophie. Ces cellules sont utilisees dans les experiences suivantes. Detection de l'agent produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie preleve du cartilage costal On dilue jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2, clans du milieu produisant un agent de differenciation MEM (milieu essentiel minimum), les chondrocytes capables d'hypertrophie obtenus dans 1'Exemple 1, avec une concentration finale de 15 % de FBS (serum bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en R-glycerophosphate, 50 gg/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). On inocule la suspension cellulaire de maniere uniforme sur la plaque (Becton Dickinsin) et on la cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C, operation suivie par la collecte au cours du temps (4 j ours, 7 j ours, 11 j ours, 14 j ours, 18 j ours, 21 j ours) des surnageants du milieu. Etudes sur la question de savoir si le surnageant de culture preleve est capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits (Becton Dickinson, 2,5 x 104/puits) une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline en utilisant les modes operatoires suivants. Mesure de l'activite phosphatase alcaline Pour mesurer 1'activite phosphatase alcaline, on melange 73 respectivement 100 l des echantillons avec ou sans 1'agent avec une solution (50 l) comprenant 4 mg/ml de phosphate de p-nitrophenyle et 50 l d'un tampon alcalin (Sigma, A9226), et on les met a reagir a 37 C pendant 15 minutes. Ensuite, on termine la reaction en ajoutant 50 l de NaOH IN aux echantillons, et on en determine les absorbances (a 405 nm). Ensuite, on ajoute encore aux echantillons 20 gl d'acide chlorhydrique concentre pour determiner les absorbances (a 405 nm). On designe la difference entre ces absorbances par valeur active absolue (indiquee comme valeur absolue >> dans le tableau) et on l'utilise comme un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans le groupe age de 4 semaines, on effectue cinq experiences et on realise trois essais par experience. Dans le groupe age de 8 semaines, on effectue trois experiences et on realise deux essais dans la premiere experience, deux essais dans la deuxieme experience et un essai dans la troisieme experience. On designe dans la presente description par valeur active absolue (designee par valeur relative dans le tableau) la valeur absolue de chaque echantillon divisee par la valeur absolue du temoin du milieu seul (valeur active absolue qui est determinee en utilisant le milieu comme temoin uniquement ajoute aux cellules de souris C3H l OT 1 /2 de la meme maniere). On utilise la valeur active relative comme un autre indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. Dans le present Exemple, 1'agent est determine comme etant capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) quand 1'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'une cellule de souris C3H1OT1/2 de plus de 1,5 fois en comparaison avec celle des cellules cultivees dans le milieu avec et sans 1'agent de la presente invention. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant la valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement d'un milieu produisant un agent de differenciation MEM est define comme 1. Dans le groupe des rats ages de 4 semaines, la valeur active relative augmente d'environ 4,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, jusqu'a environ 5,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, jusqu'a environ 5,4 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et jusqu'a 74 environ 4,9 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines. Dans le groupe des rats ages de 8 semaines, la valeur active relative augmente d'environ 2,9 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, jusqu'a environ 3,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, jusqu'a environ 3,8 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et jusqu'a environ 4,2 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (cf. Tableau 1, colonne superieure, et figures 2). Identification d 'un osteoblaste Coloration a la phosphatase alcaline (Dans le cas oil des chondrocytes capables d'hypertrophie sont ajoutes a un milieu produisant un agent de differenciation MEM) On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits (Becton Dickinson) une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 (a savoir 2,5 x 1054/puits) de cellules de souris C3HlOT1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). On inocule de maniere uniforme dans des hydroxyapatites une densite de 1 x 106 cellules/ml de cellules de souris C3H l OT 1 /2. Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute aux plaques et aux hydroxyapatites le surnageant de culture (1 ml) cultive avec des chondrocytes capables d'hypertrophie dans du milieu produisant un agent de differenciation MEM, et on lescultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. On fixe la culture cellulaire avec un tampon acetone a 60 %/acide citrique, on la lave a 1'eau distillee et on la trempe dans le melange de First Violet B et de Naphtol AS-MX A. la temperature ambiante dans 1'obscurite pendant 30 minutes pour la faire reagir, et ainsi on la colore. (Dans le cas oil des chondrocytes capables d'hypertrophie sont ajoutes a du milieu de croissance MEM) On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits (Becton Dickinson) une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 (a savoir 2,5 x 1054/puits) de cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). On inocule de maniere uniforme dans des hydroxyapatites une densite de 1 x 106 cellules/ml de cellules de souris C3H10T1/2. Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute aux plaques et aux hydroxyapatites le surnageant de culture (1 ml) cultive avec des chondrocytes capables d'hypertrophie dans du milieu de croissance MEM, et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. On fixe la culture cellulaire avec un tampon acetone a 60 %/acide citrique, on la lave a 1'eau distillee et on la trempe clans le melange de First Violet B et de Naphtol AS-MX a la temperature ambiante dans 1'obscurite pendant 30 minutes pour la faire reagir, et ainsi on la colore. Comme decrit ci-dessus, it est montre que 1'activite phosphatase alcaline (ALP), qui est l'un des marqueurs des osteoblastes, des cellules de souris C3H10T1/2 est accrue par un agent capable d'induire la differenciation en osteoblastes. En outre, it est egalement prouve que les cellules de C3H10T1/2 sont colorees de rouge apres 1'addition de 1'agent capable d'induire la differenciation en osteoblastes dans la coloration a la phosphatase alcaline de la cellule de C3H l OT 1 /2. Par consequent, 1'expression de la phosphatase alcaline est indiquee en utilisant le procede de coloration. En consequence, it est confirme que les cellules de C3H10T1/2 sont differenciees en osteoblastes (voir Tableau 1, colonne superieure, figure 2, figure 3A, colonne superieure, et figure 3B). En outre, on prepare le culot de cellules par le procede decrit cidessus et on le colore au bleu de toluidine acide et a la safranine O. En consequence, aucune metachromasie ne se manifeste et la coloration a la safranine est negative. Ainsi, it est confirme que les cellules ne sont pas des chondrocytes. Par consequent, it pourrait etre confirme que les cellules differenciees n'etaient pas des chondrocytes capables d'hypertrophie. Exemple Comparatif IA : Preparation et detection de 1'agent produit en cultivant un chondrocyte capable d 'hypertrophie derive du cartilage costal dans du milieu de croissance MEM On preleve des chondrocytes capables d'hypertrophie a partir du cartilage costal en utilisant un procede comme decrit dans 1'Exemple 1. On dilue les chondrocytes capables d'hypertrophie jusqu'a 4,104 cellules/cm2 dans du milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimum (MEM)) avec une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire, operation suivie d'une collecte dans le temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours) des surnageants du milieu. 76 On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits (Becton Dickinson) une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 (a savoir 2,5 x 104/puits) de cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. Pour evaluer l'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement du milieu de croissance MEM est define comme 1. Dans le groupe des rats ages de 4 semaines, la valeur active relative est d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,3 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines. Dans le groupe des rats ages de 8 semaines, la valeur active relative est d'environ 1,2 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 0,9 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (cf. Tableau 1, colonne du bas, et figures 2). I1 y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline des groupes des rats ages de 4 et 8 semaines entre 1'addition du surnageant de la culture cellulaire utilisant des milieux de croissance MEM et 1'addition du milieu de croissance MEM uniquement. Identification d 'un osteoblaste Coloration a la phosphatase alcaline On inocule dans des plaques 24 puits et des hydroxyapatites (milieu BME) des cellules de souris C3HlOT1/2 et on les cultive pendant 18 heures. Ensuite, on ajoute aux plaques et aux hydroxyapatites le surnageant de culture issu de chondrocytes capables d'hypertrophie cultive dans du milieu de croissance MEM, et on colore les cellules a la phosphatase alcaline au bout de 72 heures. Il est confirme que les cellules ne sont pas colorees en presence de phosphatase alcaline et n'ont pas 1'activite (voir la figure 3A, colonne du bas, et la figure 3D). Tableau 1. activite phosphatase alcaline dans le cas de 1'addition du surnageant de culture issu des chondrocytes capables d 'hypertrophie cultiv~s dans du milieu produisant un agent de differenciation MEM ou du milieu de croissance MEM Milieu produisant un agent de differenciation MEM (valeur moyenne) 0 jour 4 jours 1 2 3 semaine _ semaines semaines _ Valeur 1 4,1 5,1 5,4 4,9 relative Groupe Valeur 0,077 0,098 0,103 0,095 age de 4 absolue (addition du semaines surnageant) _ _ Valeur 0,023 0,023 0,024 0,023 0, 021 absolue (addition du milieu uniquement) Valeur 1 2,9 3,1 3,8 4,2 relative _ Groupe Valeur 0,065 0,066 0,077 0,079 age de 8 absolue semaines (addition du surnageant) Valeur 0,021 0,021 0,021 0,019 0,019 absolue (addition du milieu uniquement) Milieu de croissance MEM (valeur moyenne) 0 jour 4 fours 1 2 3 semaine semaines semaines Valeur 1 1,0 1,3 1,1 1,0 relative Groupe Valeur 0,020 0,023 0,027 0,024 age de 4 absolue semaines (addition du surnageant) Valeur 0,022 0,022 0,020 0,024 0,024 absolue (addition du milieu uniquement) Valeur 1 1,2 1,0 1,0 0,9 relative Groupe Valeur 0,023 0,021 0,019 0,017 age de 8 absolue semaines (addition du surnageant) Valeur 0,020 0,020 0,021 0,019 0,019 absolue (addition du milieu uniquement) Groupe age de 4 semaines : cinq experiences sont effectuees et 3 5 essais sont realises par experience. Groupe age de 8 semaines : trois experiences sont effectu&es. Deux essais sont realises dans la premiere experience, deux essais dans la deuxierne experience, et un essai clans la troisieme experience. En utilisant le procede decrit dans 1'Exemple 1, it est confirm& que 10 le surnageant de culture issu d'un chondrocyte capable d'hypertrophie qui est obtenu a partir du cartilage costal par la manipulation decrite cidessus, cultive dans un milieu de croissance MEM, n'exprime pas de marqueurs des ost&oblastes dans les cellules C3H1OT1/2. Conclusion de 1 'Exemple 1 et de 1 'Exemple comparatif IA 15 Quand on cultive des chondrocytes capables d'hypertrophie en utilisant un milieu produisant un agent de diff&renciation MEM, it est confirm& qu'est present 1'agent augmentant une activit& phosphatase 79 alcaline d'une cellule de souris C3H10T1/2, cellule non differenciee, et 1'agent est capable d'induire la differenciation en un osteoblaste. D'autre part, quand des chondrocytes capables d'hypertrophie sont cultives en utilisant du milieu de croissance MEM, it est confirme que 1'agent n'est pas present dans ce surnageant de culture. Cela montre qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produit 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste par culture dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM. Cet agent n'etait pas connu jusqu'a present. Par consequent, on pense que 1'existence de 1'agent est inattendue. En outre, les BMP connus jusqu'a present n'auraient pas pour effet d'induire la differenciation directement en osteoblastes comme decrit dans d'autres parties. Exemple comparatif 1B : preparation et detection de l 'agent produit par la culture de cellules de cartilage residuel de cartilage costal dans un 15 milieu produisant un agent de differenciation MEM Preparation de cellules de cartilage residuel de cartilage costal On sacrifie des rats males (Wistar) ages de 8 semaines a 1'aide de chloroforme. On rase la region thoracique de ces rats a 1'aide d'un rasoir et on les plonge en entier dans de 1'Hibitane (dilution 10x) pour les 20 desinfecter. On incise la region thoracique des rats et on en retire le cartilage costal sous asepsie. On preleve la region opaque du cartilage residuel a partir du cartilage costal. On sectionne le cartilage residuel et on l'incube dans trypsine/EDTA a 0,25 %/D-PBS (solution saline tamponnee au phosphate de Dulbecco) a 37 C pendant 1 heure sous 25 agitation. On lave ensuite les sections et on les preleve par centrifugation (170 x g pendant 3 min), operation suivie d'une incubation dans une solution de Collagenase (Invitrogen) a 0,2 %/D-PBS a 37 C pendant 2,5 heures, sous agitation. Apres les lavages et le prelevement par centrifugation (170 x g pendant 3 min), on incube les cellules dans une 30 solution de Dispase (Invitrogen) A. 0,2 %/(HAM + FBS a 10 %) dans un flacon agite jusqu'au lendemain a 37 C sous agitation. Eventuellement, on omet le traitement jusqu'au lendemain avec de la Dispase a 0,2 %. Le lendemain, on filtre la suspension cellulaire resultante et on lave et on preleve les cellules par centrifugation (170 x g pendant 3 min). On colore 35 les cellules au bleu de trypan et on les compte au microscope. On evalue les cellules en considerant que les cellules non colorees 80 sont des cellules vivantes et que les cellules colorees en bleu sont des cellules mortes. Identification de cellules de cartilage residuel depourvues de la capacite d 'hypertrophie derivees de cartilage costal En utilisant le procede decrit dans 1'Exemple 1, on determine si des chondrocytes capables d'hypertrophie sont presents dans les suspensions cellulaires obtenues en diluant des cellules de cartilage residuel derivees du cartilage costal. Aucune des hydroxyapatites n'est coloree par la phosphatase alcaline (cf. figures IC). Avec le bleu de toluidine, les hydroxyapatites presentent une coloration a points bleus, demontrant 1'existence des cellules (voir figures 1D). Ainsi, on conclut que les cellules de 1'hydroxyapatite ne presentent aucune activite phosphate alcaline, indiquant que des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont presents dans la suspension cellulaire utilisee dans le present Exemple comparatif. En detectant la localisation ou 1'expression de marqueurs de chondrocytes a ['aide du procede decrit dans 1'Exemple 1 et en examinant les cellules morphologiquement, it est determine que les cellules obtenues sont des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. Detection de l'agent produit par la culture de cellules de cartilage residuel prelevees du cartilage costal dans du milieu produisant un agent de differenciation MEM On dilue les cellules de cartilage residuel prelevees du cartilage costal jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2, clans un milieu produisant un agent de differenciation MEM (milieu essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS (serum bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire et on preleve le surnageant de chaque milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 81 % de CO2 A. 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon 5 additionne uniquement du milieu de croissance MEM est definie comme 1. La valeur active relative est d'environ 0,9 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (voir Tableau 2, colonne du haut, et figures 4). I1 y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline entre 1'addition du surnageant de la culture cellulaire utilisant du milieu produisant un agent de differenciation MEM et 1'addition du milieu produisant un agent de differenciation. MEM uniquement. I1 est confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas les marqueurs des osteoblastes dans les cellules de C3H10T1/2. Exemple comparatif 1 C : preparation et detection de 1 'agent produit par la culture de cellules de cartilage residuel derivees du cartilage costal dans un milieu de croissance MEM On preleve des cellules de cartilage residuel du cartilage costal en utilisant le procede decrit dans 1'Exemple comparatif 1B. On dilue les cellules residuelles jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2, dans du milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire et on preleve le surnageant du milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3HlOT1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement du milieu de croissance MEM est define comme 1. La valeur active relative est d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 0,9 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (voir Tableau 2, colonne du bas, et figures 4). Il y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline entre 1'addition du surnageant de la culture cellulaire utilisant des milieux de croissance MEM et 1'addition du milieu de croissance MEM uniquement (voir Tableau 2, colonne du bas, et les figures 4). Il est confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas de marqueur des osteoblastes dans les cellules de C3H1OT1/2. Tableau 2. activite phosphatase alcaline dans le cas de 1'addition du surnageant de culture issu de cellules de cartilage residuel derivees de cartilage costal cultive dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM ou un milieu de croissance MEM Milieu produisant un agent de differenciation MEM (valeur moyenne) Ojour 4jours 1 2 3 semaine semaines semaines Valeur 1 0,9 1,1 1,0 1,1 relative Groupe Valeur 0,014 0,015 0,015 0,014 age de 8 absolue semaines (addition du surnageant) Valeur 0,015 0,015 0,014 0,014 0,014 absolue (addition du milieu uniquement) 25 Milieu de croissance MEM (valeur moyenne) 0 j our 4 j ours 1 2 3 _ semaine semaines semaines Valeur 1 1,0 1,0 0,9 1,1 relative Groupe Valeur 0,014 0,012 0,012 0,012 age de 8 absolue (addition du semaines surnageant) Valeur 0,013 0,01:3 _ 0,011 0,011 absolue 0,012 (addition du milieu uniquement) Groupe age de 8 semaines : trois experiences sont effectuees. On effectue trois essais dans la premiere experience, un essai dans la deuxieme experience, et trois essais dans la troisieme experience. Conclusion de 1 'Exemple comparatif IB et de 1 'Exemple comparatif 1 C Il est confirme que les cellules de cartilage residuel depourvues de la capacite d'hypertrophie prelevees du cartilage costal ne produisent pas d'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste dans du milieu produisant un agent de differenciation MEM ou du milieu de croissance MEM. Exemple comparatif ID : preparation et detection de 1 'agent produit par la culture de chondrocytes derives de cartilage articulaire dans du 15 milieu produisant un agent de differenciation MEM Preparation de chondrocytes a partir d 'un cartilage articulaire On sacrifie des rats males (Wistar) ages de 8 semaines a 1'aide de chloroforme. On rase la region de 1'articulation du genou des rats a 1'aide d'un rasoir et on les plonge en entier dans de 1'Hibitane (dilution 10x) 20 pour les desinfecter. On incise les rats au niveau de la region de 1'articulation du genou et on en retire le cartilage articulaire sous asepsie. On sectionne le cartilage articulaire et on 1'agite dans une solution de trypsine-EDTA a 0,25 %/D-PBS a :37 C pendant 1 heure. On lave ensuite les sections et on les preleve par centrifugation (170 x g pendant 25 3 min), operation suivie d'une agitation dans une solution de Collagenase a 0,2 %/D-PBS a 37 C pendant 2,5 heures. Awes les lavages et le prelevement par centrifugation (170 x g pendant 3 min), on incube les cellules dans une solution de Dispase a 0,2 %/(HAM + FBS a 10 %) dans un flacon agite jusqu'au lendemain a 37 C sous agitation. Eventuellement, on omet le traitement jusqu'au lendemain avec de la Dispase a 0,2 %. Le lendemain, on filtre la suspension cellulaire resultante et on lave et on preleve les cellules par centrifugation (170 x g pendant 3 min). On colore les cellules au bleu de trypan et on les compte au microscope. On evalue les cellules en considerant que les cellules non colorees 10 sont des cellules vivantes et que les cellules colorees en bleu sont des cellules mortes. Identification des chondrocytes depourvus de la capacite d 'hypertrophie derives de cartilage articulaire En utilisant le procede decrit dans 1'Exemple 1, on determine si 15 des chondrocytes capables d'hypertrophie sont presents dans les suspensions cellulaires obtenues par la dilution des chondrocytes derives de cartilage articulaire. Aucune des hydroxyapatites n'est coloree avec la phosphatase alcaline (voir les figures 1E). Avec le bleu de toluidine, les hydroxyapatites presentent une coloration a points bleus, demontrant 20 1'existence des cellules (voir figures 1F). Ainsi, on conclut que les cellules de 1'hydroxyapatite ne presentent aucune activite phosphate alcaline, indiquant que des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont presents dans la suspension cellulaire utilisee dans le present Exemple comparatif. 25 En detectant la localisation ou 1'expression de marqueurs de chondrocytes a 1'aide du procede decrit dans 1'Exemple 1 et en examinant les cellules morphologiquement, it est determine que les cellules obtenues sont des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. 30 Detection de l 'agent produit par la culture de chondrocytes preleves du cartilage articulaire dans du milieu produisant un agent de differentiation MEM On dilue les chondrocytes preleves du cartilage articulaire jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2, dans du milieu produisant un agent de 35 differentiation MEM (milieu essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS (serum bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en /3-glycerophosphate, 50 gg/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire et on preleve le surnageant de chaque milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 j ours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3HIOT1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de l'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement du milieu de croissance MEM est definie comme 1. La valeur active relative est d'environ 1,4 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (voir Tableau 3, colonne du haut, et figures 5A). Il y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline entre 1'addition du surnageant de la culture cellulaire utilisant du milieu produisant un agent de differenciation MEM et 1'addition du milieu produisant un agent de differenciation MEM uniquement. II est confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas de marqueurs des osteoblastes dans les cellules de C3H 1 OT 1 /2. Exemple comparatif 1E : preparation et detection de l 'agent produit par 30 la culture de chondrocytes derives du cartilage articulaire dans du milieu de croissance MEM On preleve des chondrocytes du cartilage articulaire en utilisant le procede decrit dans 1'Exemple comparatif 1D. On dilue les chondrocytes jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2 dans du milieu de croissance MEM (milieu 35 essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml 86 d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire puis on preleve le surnageant du milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 j ours, 18 jours, 21 jours). On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement du milieu de croissance MEM est define comme 1. La valeur active relative est d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 1,0 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 1,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 1,2 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (voir Tableau 3, colonne du bas, et figures 5A). I1 y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de la culture cellulaire, qui sont cultives avec des chondrocytes issus de cartilage articulaire en utilisant du milieu de croissance MEM, et ceux additionnes uniquement du milieu de croissance MEM (voir Tableau 3, colonne du bas, et figure 5A). I1 est confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas de marqueurs des osteoblastes dans les cellules de C3HIOT1/2. Tableau 3. Activite phosphatase alcaline dans le cas de 1'addition du surnageant de culture issu de chondrocytes derives de cartilage articulaire cultive dans du milieu produisant un agent de differenciation MEM ou du milieu de croissance MEM Milieu produisant un agent de differenciation MEM (valeur moyenne) 0 jour 4 j ours 1 2 3 _ _ semaine_ semaines _ semaines Valeur 1 1,4 1,1 1,1 1,1 relative _ _ Valeur 0,020 0,019 0,019 0,020 Groupe absolue age de 8 (addition du semaines surnageant) Valeur 0,016 0,016 0,017 0,016 0,017 absolue (addition du milieu uniquement) Groupe age de 8 semaines : Six experiences sont effectuees. 5 Premiere experience : un essai, Deuxieme experience : un essai, Troisieme experience : trois essais, Quatrieme experience : deux essais, Cinquieme experience : un essai, Sixieme experience : un essai. Milieu de croissance MEM (valeur moyenne) 0 jour 4 jours 1 2 3 semaine semaines semaines Valeur 1 1,1 1,0 1,1 1,2 relative Groupe Valeur 0,019 0,017 0,017 0,019 age de 8 absolue semaines (addition du surnageant) Valeur 0,018 0,018 0,018 0,014 0,017 absolue (addition du milieu uniquement) Groupe age de 8 semaines : Cinq experiences sont effectuees. Premiere experience : deux essais, Deuxieme experience : deux essais, Troisieme experience : trois essais, Quatrieme experience : un essai, 15 Cinquieme experience : un essai. 10 Conclusion de l'Exemple comparatif 1D et de l'Exemple comparatif 1E I1 est confirme que les chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie, qui sont derives de cartilage articulaire, ne produisent pas d'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM ou un milieu de croissance MEM. Exemple 2 : Preparation et detection d 'un agent de regulation de la fonction cellulaire produit par la culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie derive de cartilage sternal dans le milieu produisant un agent de differenciation MEM Preparation d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir de cartilage sternal On sacrifie des rats males (Wistar) ages de huit semaines a 1'aide de chloroforme. On rase la region thoracique des rats a 1'aide d'un rasoir et on les plonge en entier dans de 1'Hibitane (dilution 10x) pour les desinfecter. On incise la region thoracique des rats et on retire sous asepsie la portion inferieure du cartilage sternal et 1'appendice xiphoide. On preleve les regions translucides du cartilage de la portion inferieure du cartilage sternal et de 1'appendice xiphoide. On sectionne les cartilages de croissance et on les incube dans une solution de trypsine-EDTA a 0,25 %/tampon phosphate salin de Dulbecco (D-PBS) a 37 C pendant 1 heure sous agitation. On lave ensuite les sections et on les preleve par centrifugation (170 x g pendant 3 min), operation suivie d'une incubation dans une solution de Collagenase (Invitrogen) a 0,2 %/D-PBS A. 37 C pendant 2,5 heures, sous agitation. Apres les lavages et le prelevement par centrifugation (170 x g pendant 3 min), on incube les cellules dans une solution de Dispase (Invitrogen) a 0,2 %/(HAM + FBS a 10 %) dans un flacon agite jusqu'au lendemain a 37 C sous agitation. Le lendemain, on filtre les suspensions cellulaires resultantes et on lave et on preleve les cellules par centrifugation (170 x g pendant 3 min). On colore les cellules au bleu de trypan et on les compte au microscope. On evalue les cellules en considerant que les cellules non colorees sont des cellules vivantes et que les cellules colorees en bleu sont des 35 cellules mortes. 89 Identification d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie On preleve eton identifie les chondrocytes capables d'hypertrophie en utilisant le procede decrit dans 1'Exemple 1. Detection d 'un agent produit par la culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie issu de cartilage sternal dans le milieu produisant un agent de differentiation MEM On dilue jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2 des chondrocytes capables d'hypertrophie issus de cartilage sternal, dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM (milieu essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS (serum bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 g/m1 d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). On cultive les suspensions cellulaires et on preleve les surnageants de chaque milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). On inocule de maniere unifonne dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3HlOT1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. On constate une augmentation de 1'activite phosphatase alcaline des echantillons additionnes du surnageant de culture de la culture cellulaire utilisant du milieu produisant un agent de differenciation MEM en comparaison avec ceux additionnes uniquement du milieu produisant un agent de differenciation MEM. Identification d 'un osteoblaste Il est confirme que le surnageant de culture obtenu comme decrit ci-dessus exprime des marqueurs d'osteoblaste dans les cellules de souris C3H10T1/2 en utilisant le meme mode operatoire que celui decrit dans 1'Exemple 1. Exemple comparatif 2 : Preparation d 'un agent produit par la culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie provenant de cartilage sternal dans le milieu de croissance MEM On preleve des chondrocytes capables d'hypertrophie du cartilage sternal en utilisant le procede decrit dans 1'Exemple comparatif 2. On 90 dilue jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2 les chondrocytes capables d'hypertrophie dans du milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimum), avec une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/m1 d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire puis on preleve le surnageant du milieu au cours du temps. On inocule de maniere uniforme dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3HlOT1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apt-es 1'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit dans 1'Exemple 1. II y a peu de difference en termes d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de la culture cellulaire utilisant du milieu de croissance MEM, et ceux additionnes uniquement du milieu de croissance MEM. Il est confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite cidessus n'exprime pas de marqueurs des osteoblastes dans les cellules de C3HlOT1/2. Conclusion de 1 'Exemple 2 et de 1 'Exemple comparatif 2A Quand on cultive des chondrocytes capables d'hypertrophie en utilisant un milieu produisant un agent de differenciation MEM, it est confirme qu'est present dans ce surnageant de culture 1'agent augmentant 1'activite phosphatase alcaline d'une cellule de souris C3H10T1/2 et capable d'induire la differenciation en un osteoblaste. D'autre part, quand des chondrocytes capables d'hypertrophie sont cultives en utilisant du milieu de croissance MEM, it est confirme que 1'agent n'est pas present dans ce surnageant de culture. Cela montre qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produit 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste par culture dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM. Exemple 3 : Preparation et detection d 'un agent de regulation de la fonction cellulaire produit par culture d'un chondrocyte capable d 'hypertrophie provenant de cartilage costal dans le milieu produisant un agent de differenciation HAM Detection d 'un agent produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie preleve de cartilage costal On dilue jusqu'a 4 x 104 cellules/cm2 les chondrocytes capables d'hypertrophie obtenus dans 1'Exemple 1 dans du milieu produisant un agent de differenciation HAM (milieu HAM avec une concentration finale de 10 % de FBS (serum bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en (3-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). On cultive la suspension cellulaire de maniere uniforme et on preleve les surnageants de chaque milieu au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). On inocule dans des plaques 24 puits des cellules de souris C3H10T1/2 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226). Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute 1 ml du surnageant de culture aux plaques et on les cultive dans un incubateur a 5 % de CO2 A. 37 C. Au bout de 72 heures, on mesure 1'activite phosphatase alcaline par le procede decrit clans 1'Exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline en utilisant une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne uniquement du milieu produisant un agent de differenciation HAM est definie comme 1. La valeur active relative est d'environ 1,2 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 4 jours, d'environ 2,3 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout d'une semaine, d'environ 3,1 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 2 semaines, et d'environ 2,2 fois quand on ajoute un surnageant de culture preleve au bout de 3 semaines (voir Tableau 3-2, colonne du haut, et figures 5B). Il est indique que 1'activite phosphatase alcaline (ALP), qui est l'un des marqueurs des osteoblastes, des cellules de C3H10T1/2 est augmentee par 1'agent capable d'induire la differenciation en un osteoblaste (Tableau 3-2 et Figure 5B). En outre, 1'expression de la phosphatase alcaline est indiquee en utilisant le procede de coloration a la phosphatase alcaline. En consequence, it est confirme que les cellules de C3H l OT 1 /2 sont differenciees en osteoblastes. Tableau 3-2. Activite phosphatase alcaline en cas d'addition du surnageant de culture de chondrocytes capables d'hypertrophie, cultives clans du milieu produisant un agent de differenciation HAM ou du milieu de croissance HAM Milieu produisant un agent de diff~renciation HAM (valeur moyenne) Jour 0 Jour 4 1 semaine 2 semaines 3 semaines Valeur relative 1 1,2 2,3 3,1 2,2 Valeur absolue 0, 015 0,018 0,033 0,047 0,037 (addition de surnageant) Valeur absolue 0,015 0,014 0,015 0,017 (addition de milieu uniquement) Trois experiences ont ete realisees. Trois essais ont ete realises par experience. Milieu de croissance HAM (valeur moyenne) Jour 0 Jour 4 1 semaine 2 semaines 3 semaines Valeur relative 1 1,0 0,9 1,2 1,2 Valeur absolue 0, 026 0,025 0,023 0,020 0,024 (addition de surnageant) Valeur absolue 0,026 0,024 0,021 0,023 (addition de milieu uniquement) Cinq experiences ont ete reali_sees. Premiere experience : trois essais ; deuxieme experience : trois essais ; troisieme experience : trois essais ; quatrieme experience : trois essais ; cinquieme experience : deux 15 essais. Exemple comparatif 3A : preparation et detection de 1'agent produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie, provenant du cartilage costal, dans un milieu de croissance H,4M 92 10 Des chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete preleves du cartilage des costal par le procede decrit dans 1'exemple 1. Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans du milieu de croissance HAM (milieu HAM avec une concentration finale de 10 % de serum de veau foetal, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et les surnageants de chaque milieu ont ete recueillis au cours du temps. Une cellule C3H10T1/2 de souris (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) a ete inoculee dans des plaques 24 puits. Dixhuit heures apres l'inoculation, on a ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les a cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. Pour evaluer 1'activite phosphatase alcaline au moyen d'une valeur active relative, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon auquel on avait ajoute seulement du milieu de croissance HAM a ete define en tant que 1. La valeur active relative etait d'environ 1,0 fois lorsqu'un surnageant de culture recueilli apres 4 jours a ete ajoute, d'environ 0,9 fois lorsqu'un surnageant de culture recueilli apres 1 semaine a ete ajoute, d'environ 1,2 fois lorsqu'un surnageant de culture recueilli apres 2 semaines a ete ajoute et d'environ 1,2 fois lorsqu'un surnageant de culture recueilli apres 3 semaines a ete ajoute (voir tableau 3-2, colonne inferieure et figures 5C). Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons auxquels on a ajoute le surnageant de la culture cellulaire dans du milieu de croissance HAM et ceux auxquels on a ajoute seulement du milieu de croissance HAM (voir tableau 3-2, colonne inferieure et figures 5C). Il a ete confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite plus haut n'a pas exprime de marqueurs d'osteoblastes de cellule C3H 1 OT 1 /2. 94 Conclusion de l'exemple 3 et de l'exemple comparatif 3A Lorsque des chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete cultives dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation, on a obtenu la confirmation qu'etait present dans ce surnageant de culture 1'agent augmentant 1'activite phosphatase alcaline d'une cellule C3HlOT1/2 de souris, cellule non differenciee, et capable d'induire la differenciation en osteoblaste. Par ailleurs, lorsque des chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete cultives dans du milieu de croissance HAM, on a obtenu la confirmation que n'etait pas present 1'agent dans ce surnageant de culture. On a observe qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produisait 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste par culture clans du milieu HAM produisant un agent de differenciation. Exemple comparatif 3B : Preparation et detection de 1'agent produit en cultivant des cellules de cartilage residuel, provenant du cartilage costal, dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation et du milieu de croissance HAM Les cellules de cartilage residuel sont prelevees du cartilage costal par le procede decrit dans 1'exemple comparatif 1B. Les cellules de cartilage residuel sont diluees A. 4 x 104 cellules/cm2 dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation (milieu HAM avec une concentration finale de 10 % de serum de veau foetal, 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 0-glycerophosphate, 50 gg/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B) et clans un milieu de croissance HAM (milieu HAM avec une concentration finale de 10 % de serum de veau foetal, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B) respectivement. Les suspensions cellulaires sont cultivees et les surnageants de chaque milieu sont recueillis au cours du temps. Des cellules C3H10T1/2 de souris (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) sont inoculees regulierement dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. I1 y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons auxquels on a ajoute le surnageant de la culture cellulaire dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation ou du milieu de croissance HAM, et ceux auxquels on a ajoute seulement du milieu HAM produisant un agent de differenciation ou seulement du milieu de croissance HAM. Il a ete confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite plus haut n'a pas exprime de marqueurs d'osteoblastes dans des cellules C3HlOT1/2 et ne differencie pas en osteoblastes. Il a ete confirme que les cellules de cartilage residuel provenant du cartilage costal ne produisent pas d'agent capable d'induire une differenciation d'une cellule non differenciee en osteoblaste dans du milieu HAM produisant un agent de differenciation ou du milieu de croissance HAM. Conclusion de l'exemple 1, de l'exemple 3, des exemples comparatifs IA-15 1E 3A et 3B Selon les exemples decrits ci-dessus, le chondrocyte capable d'hypertrophie produit 1agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en un osteoblaste, independamment du type de milieu de base inclus dans le milieu produisant un agent de differenciation. Le 20 chondrocyte capable d'hypertrophie ne produit pas 1agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en un osteoblaste quelque soit le milieu de croissance. De plus, les cellules de cartilage residuel et les cellules de cartilage articulaire incapables d'hypertrophie ne produisent pas 1agent amenant la cellule non differenciee A. se differencier en un 25 osteoblaste quelque soit le milieu. On suggere que 1agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en un osteoblaste est produit seulement par culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. De plus, comme le milieu de base inclus dans le milieu n'affecte pas la production de 1agent selon 30 la presente invention, on pense que n'importe quel milieu normalement utilise dans une culture cellulaire peut etre utilise dans le present procede. 96 Exemple 4 : Preparation et detection de l'agent regulant la fonction cellulaire, produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie d'origine humaine dans le milieu produisant un agent de differenciation MEM Detection de chondrocyte capable d'hypertrophie d'origine humaine Les chondrocytes capables d'hypertrophie provenant de tissu humain (par exemple polydactylie, tumeur, tissu cartilagineux fourni, et autres) sont obtenus aupres d'un organisme d'exploitation des ressources en tissus humains (organisation domestique telle que The Health Science Research Resources Bank ; Cell Bank, RIKEN BioResource Center Cell Bank, National Institute of Health Sciences ; The Institute of Development, Aging and Cancer at Tohoku University et autres, et des organismes strangers tels que IIAM, ATCC et autres, ainsi que de societes fournissant des cellules, comme Osiris). Les chondrocytes capables d'hypertrophie obtenus sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans du milieu produisant un agent de differenciation comprenant du milieu essentiel minimal, avec une concentration finale de 15 % de serum de veau foetal, 10 nM en dexamethasone, 10 mM en (3-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/m1 d'amphotericine B). Les suspensions cellulaires sont cultivees et les surnageants de chaque milieu ont ete recueillis au cours du temps. Les cellules souches mesenchymateuses humaines de recherche, obtenues aupres des organismes indiques ci-dessus, sont inoculees regulierement dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres l'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. I1 est demontre qu'une activite phosphatase alcaline (ALP), qui est Pun des marqueurs d'osteoblastes, de la cellule humaine non differenciee de recherche est accrue par un agent capable d'induire la differenciation en osteoblaste. De plus, on a la confirmation que la phosphatase alcaline est exprimee dans la coloration de la phosphatase alcaline. Par consequent, on a la confirmation que la cellule non differenciee se differencie en osteoblaste. Exemple comparatif 4A : Preparation et detection de l'agent produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie, d'origine humaine, dans du milieu de croissance comprenant du milieu essentiel minimal. Les chondrocytes capables d'hypertrophie, obtenus de la meme maniere que dans 1'exemple 4, sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans du milieu de croissance comprenant du milieu essentiel minimal, avec une concentration finale de 15 % de serum de veau foetal, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire est cultivee et suivie en recueillant le surnageant du milieu au cours du temps. La cellule humaine non differenciee de recherche est inoculee dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons auxquels on a ajoute le surnageant de la culture cellulaire dans du milieu de croissance MEM et ceux auxquels on a ajoute seulement du milieu de croissance MEM. Conclusion de l'exemple 4 et de l'exemple comparatif 4A Lorsque des chondrocytes capables d'hypertrophie d'origine humaine sont cultives dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM, on a la confirmation que 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en osteoblaste est produit. Par ailleurs, lorsque des chondrocytes capables d'hypertrophie d'origine humaine sont cultives dans un milieu de croissance MEM, on a la confirmation que 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en osteoblaste n'est pas produit. Exemple comparatif 4B :: Preparation et detection de l'agent produit en cultivant des chondrocytes incapables d'hypertrophie d'origine humaine dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM ou dans un milieu de croissance MEM Les chondrocytes incapables d'hypertrophie d'origine humaine sont obtenus aupres d'un organisme indique precedemment. Les chondrocytes sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM et dans un milieu de 98 croissance MEM respectivement. Les suspensions cellulaires sont cultivees et le surnageant de chaque milieu est respectivement recueilli au cours du temps. Les cellules humaines non differenciees de recherche sont inoculees dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive respectivement. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. Lorsque des chondrocytes incapables d'hypertrophie d'origine humaine sont cultives dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM et un milieu de croissance MEM, respectivement, les activites phosphatase alcaline sont a peine differentes. On a la confirmation que les chondrocytes INcapables d'hypertrophie d'origine humaine ne produisent pas un agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM ou dans un milieu de croissance MEM. Exemple 5 : Preparation et detection d'un agent regulant la fonction cellulaire, produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie d'origine humaine dans le milieu produisant un agent de differenciation MEM Les chondrocytes capables d'hypertrophie sont obtenus par le procede decrit dans 1'exemple 4. Les chondrocytes sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu produisant un agent de differenciation HAM. Les suspensions cellulaires sont cultivees et le surnageant de chaque milieu est recueilli au cours du temps. Les cellules humaines non differenciees de recherche sont inoculees dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive respectivement. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. On a la confirmation que les chondrocytes capables d'hypertrophie d'origine humaine produisent un agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste dans un milieu produisant un agent de differenciation HAM. Exemple comparatif 5A : Preparation et detection de l'agent produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie d'origine humaine dans 99 du milieu de croissance HAM Les chondrocytes capables d'hypertrophie d'origine humaine sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu de croissance HAM. Les suspensions cellulaires sont cultivees et le surnageant de chaque milieu est recueilli au cours du temps. Les cellules humaines non differenciees de recherche sont inoculees dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive. Apres 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline est mesuree par le procede decrit dans 1'exemple 1. On a la confirmation que les chondrocytes capables d'hypertrophie d'origine humaine ne produisent pas d'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule non differenciee en un osteoblaste dans un milieu de croissance HAM. Exemple comparatif 5B : Preparation et detection de l'agent produit en cultivant des chondrocytes incapables d'hypertrophie d'origine humaine dans du milieu produisant un agent de differenciation HAM et du milieu de croissance HAM Les chondrocytes incapables d'hypertrophie, obtenus de la meme maniere que celle qui est decrite dans 1'exemple comparatif 4B, sont dilues a 4 x 104 cellules/cm2, dans du milieu produisant un agent de differenciation HAM et dans du milieu de croissance HAM, respectivement. Les suspensions cellulaires sont cultivees et le surnageant de chaque milieu est respectivement recueilli au cours du temps. Les cellules humaines non differenciees de recherche sont inoculees dans des plaques 24 puits. Dix-huit heures apres 1'inoculation, on ajoute aux plaques 1 ml du surnageant de culture et on les cultive. Apres 72 heures, les activites phosphatase alcaline sont mesurees par le procede decrit dans 1'exemple 1. On a la confirmation que le surnageant de culture obtenu n'exprime pas de marqueurs d'osteoblastes dans des cellules non differenciees lorsqu'on ajoute aux chondrocytes incapables d'hypertrophie d'origine humaine le surnageant de culture cellulaire realisee dans un milieu produisant un agent de differenciation HAM ou un milieu de croissance HAM. Conclusion des exemples 4 et 5, des exemples comparatifs 4A-5B D'apres les exemples qui precedent, les chondrocytes capables 2894981 ioo d'hypertrophie d'origine humaine produisent 1agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en osteoblaste, independamment du type de milieu de base inclus dans le milieu produisant un agent de differenciation. Les chondrocytes capables d'hypertrophie ne produisent 5 pas d'agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en un osteoblaste dans un milieu de croissance quelconque. De plus, les chondrocytes incapables d'hypertrophie ne produisent pas d'agent amenant la cellule non differenciee a se differencier en un osteoblaste quelque soit le milieu. On suggere que 1agent amenant la cellule non 10 differenciee A. se differencier en un osteoblaste est produit seulement en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation. De plus, comme le milieu de base inclus dans le milieu n'affecte pas la production de 1agent selon la presente invention, on pense que n'importe quel milieu normalement 15 utilise clans une culture cellulaire peut etre utilise dans le present procede. Exemple 6 : Etudes pour savoir si oui ou non 1 'agent produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie est capable d 'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee, autre qu'une cellule 20 C31-110T1/2 de souris, en osteoblaste Chaque surnageant de culture a ete obtenu en cultivant des chondrocytes capables d'hypertrophie dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou un milieu de croissance MEM, en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Des cellules BALB/3T3, 25 des cellules 3T3-Swiss albinos et des cellules NIH3T3 ont ete utilisees comme cellules indifferenciees. Ces cellules ont ete inoculees dans des plaques a 24 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et incubees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C, respectivement. Au bout de 72 heures, 30 les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. La valeur d'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete definie comme etant de 1. Les valeurs des activites 35 phosphatase alcaline ont ete d'environ 5,9 fois dans des cellules BALB/3T3 (voir tableau 4 a gauche, et figure 6A), d'environ 13,8 fois 101 dans des cellules 3T3-Swiss albinos (voir tableau 4 au centre et figure 6A) et d'environ 5,4 fois dans des cellules NIH3T3 (voir tableau 4, a droite, et figure 6A), quand le sumageant de culture provenant des chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete ajoute. La valeur d'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement du milieu de croissance MEM a ete definie comme etant de 1. Les valeurs des activites phosphatase alcaline ont ete d'environ 1,3 fois dans des cellules BALB/3T3 (voir tableau 4, a gauche, et figure 6A), d'environ 1,1 fois clans des cellules 3T3-Swiss albinos (voir tableau 4 au centre et figure 6A) et d'environ 0,9 fois dans des cellules NIH3T3 (voir tableau 4, a droite, et figure 6A), quand le surnageant de culture provenant des chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu de croissance MEM a ete ajoute. Tableau 4 : Capacite a induire la differenciation osteoblastique a partir de cellules BALB/3T3, de cellules 3T3-Swiss albinos et de cellules NIH-3T3 BALB/3T3 3T3-Swiss Albinos NIH-3T3 Valeur Valeur Valeur Valeur Valeur Valeur relative absolue relative absolue relative absolue Surnageant de 5,9 0,107 13,8 0,174 5,4 0,097 differenciation GC Milieu de 1 0,018 1 0,013 1 0,018 differenciation seulement Surnageant de 1,3 0,021 1,1 0,013 0,9 0,016 croissance GC Milieu de 1 0,016 1 0,013 1 0,018 croissance seulement GC (ages de 4 semaines) : une experience a ete realisee. Trois essais ont ete realises. Surnageant de differenciation GC : surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie, cultives dans un 25 milieu produisant un agent de differenciation MEM 102 Surnageant de croissance GC : surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie, cultives dans un milieu de croissance MEM Milieu de differenciation seulement : un milieu produisant un 5 agent de differenciation MEM seul. Milieu de croissance seulement : un milieu de croissance MEM seul. Quand des chondrocytes capables d'hypertrophie sont cultives en utilisant un milieu produisant un agent de differenciation MEM, it a ete to confirme que c'est 1'agent augmentant les activites phosphatase alcaline des cellules 3T3-Swiss albinos, des cellules BALB/3T3 et des cellules NIH3T3 dans ce surnageant de culture. I1 a ete aussi confirme que ce sont les agents augmentant l'activite phosphatase alcaline de ces cellules indifferenciees en osteoblastes. D'autre part, quand des chondrocytes 15 capables d'hypertrophie sont cultives en utilisant un milieu de croissance MEM, it a ete confirme que ce n'est pas 1'agent dans ce surnageant de culture. Exemple comparatif 6 : Etudes pour savoir si oui ou non les composants existant dans le surnageant de culture des cellules de cartilage residuel 20 denuees de la capacite d 'hypertrophie sontcapables d 'induire la differenciation d 'une cellule indifferenciee, autre qu 'une cellule C3H1 OT1 /2 de Souris, en osteoblaste Chaque surnageant de culture a ete obtenu en cultivant des cellules de cartilage residuel denuees de la capacite d'hypertrophie dans un 25 milieu MEM produisant un agent de differenciation et un milieu de croissance MEM, en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple comparatif 1B. Des cellules BALB/3T3, des cellules 3T3-Swiss albinos et des cellules NIH3T3 ont ete utilisees comme cellules indifferenciees. Ces cellules ont ete inoculees dans des plaques a 24 30 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et incubees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C, respectivement. Au bout de 72 heures, les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. 35 La valeur d'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu MEM produisant un agent de 103 differenciation a ete definie comme etant de 1. Les valeurs des activites phosphatase alcaline ont ete d'environ 1,0 fois dans des cellules BALB/3T3 (voir tableau 5, a gauche, et figure 6A), d'environ 1,1 fois dans des cellules 3T3-Swiss albinos (voir tableau 5, au centre, et figure 6A) et d'environ 1,0 fois dans des cellules NIH3T3 (voir tableau 5, a droite, et figure 6A), quand le surnageant de culture provenant des cellules de cartilage residuel depourvues de la capacite d'hypertrophie cultivees dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete aj oute. La valeur d'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement du milieu de croissance MEM a ete definie comme etant de 1. Les valeurs des activites phosphatase alcaline ont ete d'environ 1, 3 fois dans des cellules BALB/3T3 (voir tableau 5, a gauche, et figure 6A), d'environ 0,9 fois dans des cellules 3T3-Swiss albinos (voir tableau 5, au centre, et figure 6A) et d'environ 1,0 fois dans des cellules NIH3T3 (voir tableau 5, a droite, et figure 6A), quand le surnageant de culture provenant des cellules de cartilage residuel denuees d'hypertrophie cultivees dans un milieu de croissance MEM a ete ajoute. Tableau 5 : Capacite a induire la differenciation en osteoblaste a partir de cellules BALB/3T3, de cellules 3T3-Swiss albinos et de cellules NIH-3T3 BALB/3T3 3T3-Swiss Albinos NIH-3T3 Valeur Valeur Valeur Valeur Valeur Valeur relative absolue relative absolue_ relative absolue Surnageant de 1,0 0,018 1,1 0,014 1,0 0,018 differenciation _ _ _RC Milieu de 1 0,018 1 0,013 1 0,018 differenciation seulement Surnageant de 1,3 0,020 0,9 0,012 1,0 0,019 croissance RC Milieu de 1 0,016 1 0,013 1 0,018 croissance seulement .04 RC (ages de 8 semaines) : une experience a ete realisee. Trois essais ont ete realises. Surnageant de differenciation RC : surnageant de culture 5 provenant de cellules de cartilage residuel cultivees dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM Surnageant de croissance RC : surnageant de culture provenant de cellules de cartilage residuel cultivees dans un milieu de croissance MEM 10 Milieu de differenciation seulement : un milieu produisant un agent de differenciation MEM seul. Milieu de croissance seulement : un milieu de croissance MEM seul. Quand des cellules de cartilage residuel depourvues de la capacite 15 d'hypertrophie ont ete cultivees en utilisant un milieu produisant un agent de differenciation MEM, it a ete confirme que les activites phosphatase alcaline ont un peu differe par rapport A. celles additionnees seulement d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation, dans des cellules 3T3-Swiss albinos, des cellules BALB/3T3 et des 20 cellules NIH3T3. Il a ete aussi confirme que ce n'etaient pas les agents capables d'induire la differenciation de ces cellules indifferenciees en osteoblastes. Il a ete aussi confirme que ce n'etait pas 1'agent dans ces surnageants de culture, quand des cellules de cartilage residuel denuees de capacite d'hypertrophie ont ete cultivees en utilisant un milieu de 25 croissance MEM. Exemple 7: Preparation et detection d 'un agent regulant la fonction cellulaire produit par culture d'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir du cartilage costal dans le milieu comprenant les composants de differenciation osteoblastique usuels 30 Les chondrocytes capables d'hypertrophie provenant de cartilage costal ont ete obtenus par le procede tel qu'il est decrit clans 1'exemple 1. Les chondrocytes ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimal (MEM) avec une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml 35 de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B) et ont ete encore additionnes de dexamethasone, de 13-glycerophosphate, d'acide 5 ascorbique ou d'une combinaison de ceux-ci comme composants de differenciation ost~oblastique usuels. Ces cellules ont ~t~ ensuite cultivees et le surnageant de chaque milieu a ~t~ collecte au cours du temps. Composant ajoute Concentration de chaque composant de differenciation osteoblastique ajoute Dex+(3GP+Asc Dex 10nM, PGP 10 mM, Asc 50 g/ml Dex Dex 10nM PGP PGP 10 mM Asc Asc 50 g/ml Dex+(3GP Dex 10nM, PGP 10 mM Dex+Asc Dex 10nM, Asc 50 gg/ml (3GP+Asc PGP 10 mM, Asc 50 g/ml Milieu de croissance Aucun composant de differenciation osteoblastique Dex : dexamethasone POP : 13-glycerophosphate Asc : acide ascorbique 10 Les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees, quand les cellules C3H10T1/2 murines (1,25 x 104 cellules/cm2) ont ete ajoutees avec 1 ml de chaque surnageant de culture et incubees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Le procede de mesure de 1'activite phosphatase alcaline a ete le meme que dans 1'exemple 1. Comme on le 15 voit dans le tableau suivant et la figure 6B, 1'activite phosphatase alcaline resultante a ete de 0,041 dans un milieu additionne d'un milieu produisant un agent de differenciation MEM (Dex+13GP+Asc) et de 0,044 dans un milieu additionne d'un milieu de croissance MEM contenant (3GP et Asc ((3GP+Asc). En outre, dans un milieu additionne 20 d'un milieu de croissance contenant un composant de differenciation osteoblastique usuel individuel, 1'activite phosphatase alcaline a ete de 0,016 dans le cas de Dex seul, 0,015 Bans le cas de 13GP seul, et 0,016 dans le cas de Asc. L'activite phosphatase alcaline a ete de 0,022 dans le cas d'un milieu de croissance contenant Dex et (3GP (Dex+(3GP), 0,017 25 dans le cas de Dex et Asc (Dex+Asc). Comme temoin, on a utilise le surnageant du milieu cultive avec des chondrocytes capables d'hypertrophie dans un milieu de croissance seulement. Donc, 1'activite phosphatase alcaline a ete de 0,014, quand des cellules C3HlOT1/25 106 murines ont ete additionnees de milieu. Les activites phosphatase alcaline ont ete de 0,016 et de 0,014, quand des cellules C3H1OT1/2 ont ete additionnees d'un milieu produisant un agent de differenciation MEM seulement et d'un milieu de croissance MEM seulement, respectivement. Effet des composants de differenciation osteoblastique usuels sur la production de 1'agent capable d 'induire la differenciation osteoblastique Moyenne Ecart type Dex+(3GP+Asc 0,041 0,008 Dex 0,016 0,004 (3GP 0,015 0,004 Asc 0,016 0,001 Dex+(3GP 0,022 0,004 Dex+Asc 0,017 0,002 [3GP+Asc 0,044 0,016 Milieu de croissance 0,014 0,002 Milieu de differenciation seulement 0,016 0,002 Milieu de croissance seulement 0,014 0,001 Dex : dexamethasone (3GP : (3-glycerophosphate Asc : acide ascorbique Milieu de differenciation seulement : un milieu de differenciation 15 MEM seul (c'est-a-dire un milieu qui n'a pas ete cultive pour les chondrocytes) Milieu de croissance seulement : un milieu de croissance MEM seul (c'est-a-dire un milieu qui n'a pas ete cultive pour les chondrocytes). 20 Quand un milieu de croissance MEM cultive avec des chondrocytes capables d'hypertrophie a ete additionne de chaque composant de differenciation osteoblastique usuel seul, 1'agent capable d'induire la differenciation des cellules indifferenciees en osteoblastes n'a pas ete produit. Quand le (3-glycerophosphate et 1'acide ascorbique 25 ont ete ajoutes, 1'agent capable d'induire la differenciation des cellules indifferenciees en osteoblastes a ete produit. I1 a ete confirme que la 107 production de 1'agent capable d'induire la differenciation des cellules indifferenciees en osteoblastes a ete renforcee, quand tous les elements, dexamethasone, P-glycerophosphate et acide ascorbique, ont ete ajoutes (c'est-a-dire un milieu produisant un agent de differenciation MEM). Exemple 8 : Etude concernant 1 'agent inclus dans un surnageant de culture obtenu par culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differentiation MEM En utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1, les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete cultives dans un milieu produisant un agent de differentiation MEM et les surnageants ont ete collectes au cours d'une dui-6e allant de 4 jours a 3 semaines. Les surnageants ont ete places dans un filtre centrifuge, soumis a une ultrafiltration centrifuge a 4 000 x g, 4 C pendant 30 minutes, dans des conditions appropriees a la separation d'une fraction de poids macromoleculaire et d'une fraction de faible poids moleculaire inferieur a 50 000, pour separer les surnageants contenant une fraction de poids macromoleculaire de 50 000 ou plus et une fraction de faible poids moleculaire. Les cellules C3HlOT1/2 murines (dans le milieu BME) ont ete ensuite inoculees dans des plaques a 24 puits (1,25 x 104 cellules/cm2) et des hydroxyapatites (1 x 106 cellules/ml). Dix-huit heures apres inoculation, les plaques et hydroxyapatites ont ete additionnees de 1 ml de la fraction de chaque surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C, respectivement. Au bout de 72 heures, les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par le procede tel que decrit dans 1'exemple 1. Quand la fraction de ses surnageants ayant un poids moleculaire superieur a 50 000 a ete ajoutee, les cellules C3HlOT1/2 murines inoculees dans les plaques a 24 puits et les hydroxyapatites ont ete colorees en rouge (voir figures 7A et 7B). Cela a indique que 1'agent capable d'augmenter 1'activite phosphatase alcaline etait present dans cette fraction de ses sumageants ayant un poids moleculaire superieur a 50 000. Quand la fraction de ses surnageants ayant un poids moleculaire inferieur a 50 000 a ete ajoutee, les cellules C3H10T1/2 inoculees dans les plaques de 24 puits et les hydroxyapatites n'ont pas ete colorees. L'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observee (voir figures 7C et 7D). 108 Conformement aux resultats, on a decouvert que les agents capables d'induire la differenciation des cellules C3H1OT1/2 murines en osteoblastes existaient dans la fraction ayant un poids moleculaire superieur a 50 000, qui etait la fraction du surnageant de culture cultive avec le chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu MEM produisant 1'agent de differenciation. Exemple 9 . Preparation et detection d 'un agent regulant la fonction cellulaire produit par culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir du cartilage costal de souris dans le milieu MEM produisant un agent de differenciation Preparation d 'un chondrocyte capable d'hypertrophie a partir du cartilage costal de souris Des souris agees de huit semaines (Balb/cA) ont etc etudices dans le present exemple. Les souris ont etc sacrifices en utilisant du chloroforme. Les poitrines des souris ont etc rasees en utilisant un rasoir et leurs corps entiers ont etc plonges dans de 1'Hibitane (dilution x 10) pour etre desinfectes. Les poitrines des souris ont etc incisees et les cartilages costaux ont etc retires sous asepsie. La region translucide du cartilage de croissance a etc pi-eel/6e dans la region limitrophe du cartilage costal. Le cartilage de croissance a etc sectionnc et incube dans la solution saline tamponnce au phosphate de Dulbecco (D-PBS)/ trypsine û EDTA a 0,25 % a 37 C pendant 1 heure sous agitation. Les sections ont etc ensuite lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) x 3 min) et puis incubees dans du collagenase a 0,2 % (Invitrogen)/D-PBS a 37 C pendant 2 heures et demie, sous agitation. Apres collecte par centrifugation ((170 x g) x 3 min), les cellules ont etc incubees dans Dispase a 0,2 % (Invitrogen)/ (HAM + 10 % de FBS) dans un flacon agite toute la nuit a 37 C sous agitation. Le jour suivant, la suspension de cellules resultante a etc filtree et les cellules ont etc lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) pendant 3 min). Les cellules ont etc colorees avec du bleu de trypan et comptces au microscope. Les cellules ont etc evaluces : les cellules non colorees ont etc considerees comme etant des cellules vivantes et les cellules colorees en bleu ont etc considerees comme etant des cellules mortes. Identification d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie Puisque les cellules obtenues dans 1'exemple 9 ont etc detcriorees 109 par les enzymes utilisees dans la separation cellulaire (par exemple trypsine, collagenase, et dispase), elles ont ete cultivees pour la recuperation. Les chondrocytes capables d'hypertrophie sont identifies en utilisant la localisation ou 1'expression de marqueurs chondrocytaires et leur hypertrophie morphologique au microscope. Localisation ou expression de marqueurs specifiques pour des chondrocytes capables d 'hypertrophie Une suspension cellulaire obtenue en utilisant le procede tel qu'il est decrit ci-dessus est traitee avec du dodecylsulfate de sodium (SDS). La solution traitee au SDS est soumise a electrophorese sur gel de polyacrylamide SDS. Le gel est ensuite transfers sur une membrane de transfert (transfert Western), mis a reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur chondrocytaire, et detects avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme comme la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase ou un marqueur fluorescent comme l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC), la phycoerythrine (PE), Texas Red, le 7-amino-4-methylcoumarine-3-acetate (AMCA) ou la rhodamine. Les cultures cellulaires obtenues en utilisant le procede tel qu'il est decrit ci-dessus sont fixees avec un tampon de formol neutre a 10 %, mises a reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur chondrocytaire, et detectees avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase ou un marqueur fluorescent comme FITC, PE, Texas Red, AMCA ou la rhodamine. La phosphatase alcaline peut etre detectee par coloration. Une culture cellulaire obtenue par la manipulation decrite ci-dessus a ete fixes avec un tampon d'acetone a 60 %/acide citrique, laves avec de 1'eau distillee et plongee dans le melange de First Violet B et Naphthol AS-MX a TA dans 1'obscurite pendant 30 minutes pour la reaction et ainsi coloree. Analyse histologique de la capacite d'hypertrophie dans des chondrocytes 5 x 105 cellules dans un milieu F12 de HAM sont centrifugees pour preparer un culot de cellules. Le culot est cultive pendant une duree predetermines. Les tailles des cellules avant et apres culture sont 110 comparees au microscope. Quand une hausse significative de taille est observee, les cellules sont determinees comme etant capables d'hypertrophie. Resultats Les cellules obtenues dans 1'exemple 9 expriment un marqueur chondrocytaire et sont determinees comme etant morphologiquement hypertrophiques. Cela montre que les cellules obtenues dans 1'exemple 9 sont des chondrocytes capables d'hypertrophie. Les cellules sont utilisees dans les experiences suivantes. Detection de 1 'agent produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie preleve sur le cartilage costal de souris Les chondrocytes capables d'hypertrophie obtenus grace a 1'exemple 9 ont ete dilues a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 gg/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete inoculee uniformement sur la plaque (Becton Dickinson) et cultivee dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C, puis le surnageant du milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, et 21 jours). Etudes pour savoir si oui ou non le surnageant de culture collecte est capable d 'induire la differenciation dune cellule indifferenciee en 25 osteoblaste Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules C3H10T1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits (Becton Dickinson, 2,5 x 104/puits). Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete 30 additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Dans le present exemple, 1'agent a ete determine comme etant capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase 35 alcaline, quand 1'agent est capable d'augmenter la valeur de l'activite phosphatase alcaline (ALP) des cellules C3H l OT 1 /2 murines de plus de 1 1,5 fois par rapport a celle des cellules cultivees dans le milieu avec ou sans 1'agent de la presente invention. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete definie comme etant de 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline a ete augmentee environ 3,1 fois (voir tableau 6, colonne superieure, et figure 8). Identification d 'un osteoblaste Comme decrit ci-dessus, it s'est avere que 1'activite phosphatase alcaline (ALP) qui est un des marqueurs osteoblastiques, d'une cellule C3H 10T 1 /2 a ete augmentee par un agent capable d'induire une differenciation en osteoblaste. En outre, it s'est avere aussi que les cellules C3HlOT1/2 ont ete colorees en rouge par 1'addition d'un agent capable d'induire une differenciation osteoblastique et incubees pendant 72 heures dans la phosphatase alcaline colorant les cellules C3H10T1/2. Par consequent, 1'expression de la phosphatase alcaline est aussi indiquee en utilisant le procede de la coloration. Comme resultat, la differenciation d'une cellule C3H10T'1/2 en osteoblaste a ete confirmee. Exemple comparatif 9A : Preparation et detection de 1 'agent produit en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie derive du cartilage costal murin dans un milieu de croissance MEM Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete preleves sur le cartilage costal murin en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 9. Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml. de streptomycine et 0,25 g/m1 d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant du milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules C3HlOT1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits (Becton Dickinson, 2,5 x 104/puits). Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, les activites 112 phosphatase alcaline ont etc mesurees par le procede tel qu'il est decrit dans l'exemple 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu de croissance MEM a etc definie comme etant de 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline a etc d'environ 1,6 fois (voir tableau 6, colonne inferieure, et figure 8). Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire utilisant un milieu de croissance MEM et ceux additionnes d'un milieu de croissance MEM seulement (voir figure 8). Identification d 'un osteoblaste Il a etc confirme que le surnageant de culture obtenu tel qu'il a etc decrit ci-dessus n'exprimait pas les marqueurs ostcoblastiques dans les cellules C3H1OT1/2, en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 9. Exemple comparatif 9B : Preparation et detection de 1 'agent produit en cultivant des cellules de cartilage residuel derive du cartilage costal murin dans un milieu MEMproduisant un agent de differenciation Preparation des cellules de cartilage residuel derive du cartilage costal Des souris males agees de huit semaines (Balb/cA) ont etc sacrifices en utilisant du chioroforme. Les poitrines des souris ont etc rasees en utilisant un rasoir et leurs corps entiers ont etc plonges dans de 1'Hibitane (dilution x 10) pour etre desinfectes. Les poitrines des souris ont etc incisces et les cartilages costaux ont etc retires sous asepsie. La region du cartilage residuel opaque a etc prelevee sur le cartilage costal. Le cartilage residuel a etc sectionne et incubc dans la solution saline tamponnee au phosphate de Dulbecco (D-PBS)/trypsine û EDTA a 0,25 % a 37 C pendant 1 heure sous agitation. Les sections ont etc lavees et collectees par centrifugation (170 x g pendant 3 min), puis incubees dans du collagenase a 0,2 % (Invitrogen)/D-PBS a 37 C pendant 2 heures et demie, sous agitation. Apres lavages et collecte par centrifugation (170 x g pendant 3 min:), les cellules ont etc incubees dans Dispase a 0,2 % (Invitrogen)/ (HAM + 10 % de FBS) dans un flacon agitc toute la nuit 37 C sous agitation. Le cas echeant, le traitement nocturne avec Dispase a 0,2 % a etc orris. Le jour suivant, la suspension de cellules resultante a etc filtree et les cellules ont etc lavees et 113 collectees par centrifugation (170 x g pendant 3 min). Les cellules ont ete colorees avec du bleu de trypan et comptees au microscope. Les cellules ont ete evaluees : les cellules non colorees ont ete considerees comme etant des cellules vivantes et les cellules colorees en bleu ont ete considerees comme etant des cellules mortes. Identification des chondrocytes depourvus de la capacite d 'hypertrophie derives du cartilage costal En detectant la localisation et 1'expression des marqueurs chondrocytaires en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 9, et en examinant morphologiquement les cellules, it a ete confirme que les cellules obtenues sont des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. Detection de 1 'agent produit en cultivant des cellules de cartilage residuel preleve sur du cartilage costal dans un milieu MEM produisant 15 un agent de differenciation Les cellules de cartilage residuel preleve sur le cartilage costal ont ete diluees a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 10 nM en 20 dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant de chaque milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 j ours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). 25 Des cellules C3H10T1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees dans des plaques a 24 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete 30 mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete definie comme etant de 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline a ete d'environ 0,8 fois (voir tableau 6, colonne superieure, et figure 8). 35 Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire en utilisant 114 un milieu MEM produisant un agent de differenciation et ceux additionnes d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation seulement (voir tableau 6, colonne superieure, et figure 8). Il a ete confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas de marqueurs osteoblastiques des cellules C3H1OT'1/2. Exemple comparatif 9C : Preparation et detection de /'agent produit en cultivant des cellules de cartilage residuel preleve sur le cartilage costal murin dans un milieu de croissance MEM Les cellules de cartilage residue] ont ete prelevees sur le cartilage costal en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple comparatif 9B. Les cellules residuelles ont ete diluees a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 100 U/ml de penicillin, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant de chaque milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Des cellules C3H1OT1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees dans des plaques a 24 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu de croissance MEM a ete define comme etant de 1. La valeur de l'activite phosphatase alcaline a ete d'environ 1,0 fois (voir tableau 6, colonne inferieure, et figure 8). Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire, qui ont ete cultives avec le cartilage residue] provenant du cartilage costal en utilisant un milieu de croissance MEM et ceux additionnes d'un milieu de croissance MEM seulement (voir tableau 6, colonne inferieure, et figure 8). Il a ete confirme que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprimait pas de marqueurs osteoblastiques des cellules C3HiOT1/2. 115 Tableau 6 : Comparaison des activites phosphatase alcaline additionnee de surnageant de culture provenant de chondrocytes derives de la souris, cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou dans un milieu de croissance MEM dans 1'exemple 9 et dans les exemples comparatifs 9A-9C Milieu MEM produisant un agent de differenciation (valeur moyenne) Valeur Valeur relative absolue Surnageant GC 3,1 0,038 Surnageant RC 0,8 0,011 Milieu de differenciation seulement 1 0,012 Milieu de croissance MEM (valeur moyenne) Valeur Valeur relative absolue Surnageant GC 1,6 0,021 Surnageant RC 1,0 0,013 Milieu de croissance seulement 1 0,014 Ages de 8 semaines : une experience a ete realisee. Deux essais ont ete realises. Surnageant GC : surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans le milieu indique Surnageant RC : surnageant de culture provenant de cellules de cartilage residuel cultivees dans le milieu indique Milieu de differenciation seulement : un milieu MEM produisant 20 un agent de differenciation seul Milieu de croissance seulement : un milieu de croissance MEM seul. Conclusion de 1 'exemple 9 et des exemples comparatifs 9A-9C Quand des chondrocytes capables d'hypertrophie, preleves sur le 25 cartilage costal murin, ont ete cultives en utilisant un milieu produisant un agent de differenciation MEM, it a ete confirme que c'est 1'agent augmentant 1'activite phosphatase alcaline d'une cellule C3H1OT1/2 murine et capable d'induire la differenciation en osteoblaste dans ce 116 surnageant de culture. D'autre part, quand des chondrocytes capablesd'hypertrophie ont ete cultives en utilisant un milieu de croissance MEM, it a ete confirme que ce n'etait pas 1'agent dans ce surnageant de culture. On a decouvert qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produisait 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste en cultivant dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation. I1 a ete confirme que le chondrocyte denue de la capacite d'hypertrophie, derive du cartilage costal de souris, ne produisait pas un agent capable d'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou dans un milieu de croissance MEM. Exemple 10 : Preparation et detection d 'un agent regulant la fonction cellulaire produit par culture d 'un chondrocyte capable d 'hypertrophie a partir du cartilage costal de lapin dans le milieu MEM produisant 1 'agent de differenciation Preparation de chondrocytes capables d 'hypertrophie a partir du cartilage costal de lapin Des lapins ages de huit semaines (blancs japonais) ont ete etudies dans le present exemple. Les lapins ont ete sacrifies en utilisant du chloroforme. Les poitrines des lapins ont ete rasees en utilisant un rasoir et leurs corps entiers ont ete plonges dans de 1'Hibitane (dilution x 10) pour titre desinfectes. Les poitrines des lapins ont ete incisees et les cartilages costaux ont ete retires sous asepsie. La region translucide du cartilage de croissance a ete prelevee dans la region limitrophe du cartilage costal. Le cartilage de croissance a ete sectionne et incube dans la solution saline tamponnee au phosphate de Dulbecco (D-PBS)/ trypsine û EDTA a 0,25 % a 37 C pendant 1 heure sous agitation. Les sections ont ete ensuite lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) x 3 min) et puis incubees dansdu collagenase a 0,2 % (Invitrogen)/ D-PBS a 37 C pendant 2 heures et demie, sous agitation. Apres collecte par centrifugation ((170 x g) x 3 min), les cellules ont ete incubees dans Dispase a 0,2 % (Invitrogen)/ (HAM + 10 % de FBS) dans un flacon agite toute la nuit a 37 C sous agitation. Le jour suivant, la suspension de cellules resultante a ete filtree et les cellules ont ete lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) pendant 3 min). Les cellules ont 117 ete colorees avec du bleu de trypan et comptees au microscope. Les cellules ont ete evaluees : les cellules non colorees ont ete considerees comme etant des cellules vivantes et les cellules colorees en bleu ont ete considerees comme etant des cellules mortes. Identification des chondrocytes capables d 'hypertrophie Puisque les cellules obtenues clans 1'exemple 10 ont ets deteriorees par les enzymes utilisees dans la separation cellulaire (par exemple trypsine, collagenase, et dispase), elles ont ste cultivees pour la recuperation. Les chondrocytes capables d'hypertrophie sont identifies en utilisant la localisation ou 1'expression de marqueurs chondrocytaires et leur hypertrophie morphologique au microscope. Localisation ou expression de marqueurs specifiques pour des chondrocytes capables d 'hypertrophie Une suspension cellulaire obtenue en utilisant le procede tel qu'il est decrit ci-dessus est traitee avec du dodecylsulfate de sodium (SDS). La solution traitee au SDS est soumise a electrophorese sur gel de polyacrylamide SDS. Le gel est ensuite transfers sur une membrane de transfert (transfert Western), mis a reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur chondrocytaire, et detects avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme comme la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase ou un marqueur fluorescent comme l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC), la phycoerythrine (PE), Texas Red, le 7-amino-4-methylcoumarine-3-acetate (AMCA) ou la rhodamine. Les cultures cellulaires obtenues en utilisant le procede tel qu'il est decrit ci-dessus sont fixees avec un tampon de formol neutre a 10 %, mises a reagir avec un anticorps primaire contre un marqueur chondrocytaire, et detectees avec un anticorps secondaire marque avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucosidase ou un marqueur fluorescent comme FITC, PE, Texas Red, AMCA ou la rhodamine. La phosphatase alcaline peut etre detectse par coloration. Une culture cellulaire obtenue par la manipulation decrite ci-dessus a ete fixes avec un tampon acetone a 60 %/acide citrique, lavee avec de 1'eau distillse et plongee dans le melange de First Violet B et Naphthol AS- MX a TA dans 1'obscurite pendant 30 minutes pour la reaction et ainsi 118 coloree. Analyse histologique de la capacite d 'hypertrophie dans des chondrocytes x 105 cellules dans un milieu F12 de HAM sont centrifugees 5 pour preparer un culot de cellules. Le culot est cultive pendant une duree predeterminee. Les tailles des cellules avant et apres culture sont comparees au microscope. Quand une hausse significative de taille est observee, les cellules sont determinees comme etant capables d'hypertrophie. Resultats Les cellules obtenues dans 1'exemple 10 expriment un marqueur chondrocytaire et sont determinees comme etant morphologiquement hypertrophiques. Cela montre que les cellules obtenues dans 1'exemple 10 sont des chondrocytes capables d'hypertrophie. Les cellules sont utilisees dans les experiences suivantes. Detection de 1'agent produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie preleve sur du cartilage costal de lapin Les chondrocytes capables d'hypertrophie obtenus dans 1'exemple 10 ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete inoculee uniformement dans la plaque (Becton Dickinson), cultivee dans un incubateur a 5 % de CO2 A. 37 C, et le surnageant de chaque milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Etudes pour savoir si oui ou non le surnageant de culture collecte 30 est capable d 'induire la differenciation d 'une cellule indifferenciee en osteoblaste Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules C3H10T1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits (Becton Dickinson, 35 2,5 x 104/puits). Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un 2894981 119 incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Dans le present exemple, 1'agent a ete determine comme etant capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline, 5 quand l'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) des cellules C3H10T1/2 murines de plus de 1,5 fois par rapport a celle des cellules cultivees dans le milieu avec ou sans 1'agent de la presente invention. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon 10 additionne seulement du milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete definie comme etant de 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline est accrue. Identification d 'un osteoblaste Comme decrit ci-dessus, it s'est avere que 1'activite phosphatase 15 alcaline (ALP), qui est un des marqueurs osteoblastiques, des cellules C3H10T1/2 a ete augmentee par un agent capable d'induire une differenciation en osteoblaste. En outre, it s'est avert aussi que des cellules C3HlOT1/2 se sont colorees en rouge apres 1'addition de 1'agent capable d'induire une differenciation en osteoblastes et incubation 20 pendant 72 heures dans la phosphatase alcaline colorant les cellules C3H10T1/2. Par consequent, 1'expression de la phosphatase alcaline est indiquee en utilisant le procede de la coloration. Donc, it a ete confirme que les cellules C3H10T1/2 se differenciaient en osteoblastes. Exemple comparatif 10A : Preparation et detection de 1 'agent produit en 25 cultivant un chondrocyte capable d 'hypertrophie derive du cartilage costal de lapin dans un milieu de croissance MEM Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete preleves sur le cartilage costal de lapin en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 10. Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 p g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et puis, le surnageant du milieu collecte au cours du temps (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules C3HlOT1/2 120 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits (Becton Dickinson, 2,5 x 104/puits). Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par le procede tel qu'il est decrit dans l'exemple 1. I1 y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire utilisant un milieu de croissance MEM et ceux additionnes d'un milieu de croissance MEM seulement. Identification d 'un osteoblaste I1 a ete confirme que le surnageant de culture obtenu tel que decrit ci-dessus n'exprimait pas de marqueurs osteoblastiques dans les cellules C3H10T1/2, en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 10. Exemple comparatif JOB : Preparation et detection de 1 'agent produit en cultivant des cellules de cartilage residuel derive du cartilage costal de lapin dans un milieu MEM produisant un agent de differentiation Preparation des cellules de cartilage residuel derive du cartilage costal Des lapins males ages de huit semaines (japonais blancs) ont ete sacrifies en utilisant du chloroforme. Les poitrines des lapins ont ete rasees en utilisant un rasoir et leurs corps entiers ont ete plonges dans de 1'Hibitane (dilution x 10) pour etre desinfectes. Les poitrines des lapins ont ete incisees et les cartilages costaux ont ete retires sous asepsie. La region du cartilage residuel opaque a ete prelevee sur le cartilage costal. Le cartilage residuel a ete sectionne et incube dans la solution saline tamponnee au phosphate de Dulbecco (D-PBS)/trypsine û EDTA a 0,25 % a 37 C pendant 1 heure sous agitation. Les sections ont ete ensuite lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) x 3 min), puis incubees dans du collagenase A. 0,2 % (Invitrogen)/D-PBS a 37 C pendant 2 heures et demie, sous agitation. Apres lavages et collecte par centrifugation ((170 x g) x 3 min), les cellules ont ete incubees dans Dispase a 0,2 % (Invitrogen)/(HAM + 10 % de FBS) dans un flacon agite toute la nuit a 37 C sous agitation. Le cas echeant, le traitement nocturne avec Dispase a 0,2 % a ete omis. Le jour suivant, la suspension 121 de cellules resultante a ete filtree et les cellules ont ete lavees et collectees par centrifugation ((170 x g) x 3 min). Les cellules ont ete colorees avec du bleu de trypan et comptees au microscope. Les cellules ont ete evaluees : les cellules non colorees ont ete 5 considerees comme etant des cellules vivantes et les cellules colorees en bleu ont ete considerees conime etant des cellules mortes. Identification des chondrocytes depourvus de la capacite d 'hypertrophie derives du cartilage costal En detectant la localisation ou 1'expression des marqueurs 10 chondrocytaires en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 10, et en examinant morphologiquement les cellules, it a ete confirme que les cellules obtenues sont des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. Detection de 1 'agent produit en cultivant des cellules de cartilage 15 residuel preleve sur du cartilage costal dans un milieu MEMproduisant un agent de differentiation Les cellules de cartilage residuel preleve sur le cartilage costal ont ete diluees a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differentiation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une 20 concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en (3-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 p.g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant de chaque milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 25 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Des cellules C3H10T1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ete inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un 30 incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Il y a peu de difference d'activite phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire utilisant un 35 milieu MEM produisant un agent de differentiation et ceux additionnes d'un milieu MEM produisant un agent de differentiation seulement. Il a 122 ete confirms que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite ci-dessus n'exprime pas de marqueurs osteoblastiques des cellules C3H10T1/2. Exemple comparatif 10C : Preparation et detection de 1 'agent produit en 5 cultivant des cellules de cartilage residuel pre/eve sur le cartilage costal dans un milieu de croissance MEM Les cellules de cartilage residuel ont ste prelevees sur le cartilage costal en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple comparatif 10B. Les cellules residuelles ont ete diluses a 4 x 104 10 cellules/cm2 dans un milieu de croissance MEM (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 100 U/ml de penicillin, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant du milieu a ete collects au cours du temps (4 jours, 7 jours, 15 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Des cellules C3H1OT1/2 murines (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, CCL-226) ont ste inoculees uniformement dans des plaques a 24 puits. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ste additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un 20 incubateur a 5 % de CO2 a 37 C. Au bout de 72 heures, 1'activits phosphatase alcaline a sts mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Il y a peu de difference d'activits phosphatase alcaline entre les echantillons additionnes du surnageant de culture cellulaire, qui ont ete 25 cultives avec le cartilage residuel provenant du cartilage costal en utilisant un milieu de croissance MEM, et ceux additionnes d'un milieu de croissance MEM seulement. Il a ete confirms que le surnageant de culture de la culture cellulaire obtenu par la manipulation decrite cidessus n'exprimait pas de marqueurs osteoblastiques des cellules 30 C3H1OT1/2. Conclusion de 1 'exemple 10 et des exemples comparatifs 10A10C Quand des chondrocytes capables d'hypertrophie, preleves sur le cartilage costal de lapin, ont ete cultives dans un milieu produisant un agent de differenciation MEM, it a et: confirms que, dans ce surnageant 35 de culture, c'etait 1'agent augmentant 1'activite phosphatase alcaline d'une cellule C3H1OT1/2 murine et capable d'induire la differenciation 3 en osteoblaste. D'autre part, quand des chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete cultives en utilisant un milieu de croissance MEM, it a ete confirme que ce n'etait pas 1'agent dans ce surnageant de culture. On a decouvert qu'un chondrocyte capable d'hypertrophie produisait 1'agent capable d'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste par culture dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation. Il a ete confirme que les chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie, derives du cartilage costal de lapin, ne produisaient pas un agent capable d'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste par culture dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou dans un milieu de croissance MEM. Exemple 11 : Etude de l'effet d'un milieu pour la culture de cellules indifferenciees sur la differenciation des cellules indifferenciees en 15 osteoblastes Les chondrocytes capables d'hypertrophie, les cellules de cartilage residuel depourvues de la capacite d'hypertrophie et les cellules de cartilage articulaire ont ete preleves en utilisant des procedes tels qu'ils sont decrits dans 1'exemple 1, 1'exemple comparatif 1B et 1'exemple 20 comparatif ID, respectivement. Les cellules ont ete diluees a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation et un milieu de croissance MEM, respectivement. La suspension cellulaire a ete cultivee dans un incubateur a 5% de CO2 a 37 C et chaque surnageant du milieu respectif a ete collecte au cours du temps 25 (4 jours, 7 jours, 11 jours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). La cellule de souris C3H10T1/2 a ete utilisee comme cellule indifferenciee. Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de ces cellules C3HlOT1/2 ont ete inoculees dans des plaques a 24 puits comprenant un milieu HAM et un milieu MEM. Dix-huit heures apres inoculation, les plaques ont ete 30 additionnees de 1 ml de surnageant de culture et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 A. 37 C, respectivement. Au bout de 72 heures, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree par le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. On a decouvert que 1'activite phosphatase alcaline resultante de 35 1'addition du surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie, cultives dans un milieu MEM produisant un agent de 124 differenciation, a ete de plus d'environ 6,7 fois celle resultant de 1'addition d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation seul, quand des cellules C3H10T1/2 ont ete cultivees clans un milieu HAM. La hausse de 1'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observee, quand le chondrocyte capable d'hypertrophie a ete cultive en utilisant un milieu de croissance MEM. La hausse de 1'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observee, quand le surnageant de culture a utilise un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou un milieu de croissance MEM, dans les cellules de cartilage residuel et les chondrocytes derives des to cellules de cartilage articulaire depourvues de la capacite d'hypertrophie, respectivement (voir tableau 7 et figure 9). On a decouvert que 1'activite phosphatase alcaline resultant de 1'addition du surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie, cultives dans un milieu MEM produisant un agent de 15 differenciation a ete de plus d'environ 10,8 fois celle resultant de 1'addition d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation seul, quand des cellules C3HlOT1/2 ont ete cultivees dans un milieu MEM. La hausse de 1'activite phosphatase alcaline n'a pas ete observee, quand le chondrocyte capable d'hypertrophie a ete cultive en utilisant un milieu 20 de croissance MEM. Les hausses de I'activite phosphatase alcaline n'ont pas ete observees, quand le surnageant de culture a utilise un milieu MEM produisant un agent de differenciation ou un milieu de croissance MEM, dans les cellules de cartilage residuel et les chondrocytes derives des cellules de cartilage articulaire depourvues de la capacite 25 d'hypertrophie, respectivement. On a decouvert que le milieu basique utilise dans la culture des cellules C3H10T1/2 n'affectait pas 1'induction de la differenciation des cellules C3H10T1/2 en osteoblastes (voir tableau 7 et figure 9). 5 125 Tableau 7 : Effet d'un milieu de culture pour la culture de cellules indiff~renci~es sur la differenciation des cellules indiff~renci~es en ost~oblastes Milieu HAM (valeur moyenne) Valeur relative Valeur absolue Surnageant de differenciation GC 6,7 0,058 Surnageant de croissance GC 1,1 0,010 Surnageant de differenciation RC 1, 2 0,011 Surnageant de croissance RC 1,1 0,010 Surnageant de differenciation AC 1,2 0,010 Surnageant de croissance AC 1,2 0,011 Milieu de differenciation seulement 1 0,009 Milieu de croissance seulement 1 0,009 Milieu MEM (valeur moyenne) Valeur relative Valeur absolue Surnageant de differenciation GC 10,8 0,085 Surnageant de croissance GC 1,3 0,015 Surnageant de differenciation RC 1,5 0,012 Surnageant de croissance RC 0, 7 0,008 Surnageant de differenciation AC 1,3 0,010 Surnageant de croissance AC 0,6 0,007 Milieu de differenciation seulement 1 0,008 Milieu de croissance seulement 1 0,011 10 GC (ages de 4 semaines) : une experience a ete realisee. Trois essais ont ete realises. RC (ages de 8 semaines) : une experience a ete realisee. Trois essais ont ete realises. AC (ages de 8 semaines) : une experience a ete realisee. Trois 15 essais ont ete realises. Surnageant de differenciation GC : surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation Surnageant de croissance GC : surnageant de culture provenant de 20 chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu de croissance MEM 126 Surnageant de differenciation RC : surnageant de culture provenant de cellules de cartilage residuel cultivees dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation Surnageant de croissance RC : surnageant de culture provenant de 5 cellules de cartilage residuel cultivees dans un milieu de croissance MEM Surnageant de differenciation AC : surnageant de culture provenant de cellules de cartilage articulaire cultivees dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation 10 Surnageant de croissance AC : surnageant de culture provenant de cellules de cartilage articulaire cultivees dans un milieu de croissance MEM Milieu de differenciation seulement : un milieu MEM produisant un agent de differenciation seul. 15 Milieu de croissance seulement : un milieu de croissance MEM seul. Exemple 12 : Degradation thermique d'un agent capable d'induire la differenciation d 'une cellule indifferenciee en osteoblaste ; 1 'agent est produit par un chondrocyte capable d 'hypertrophie 20 Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete preleves en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Les chondrocytes ont ete dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum de bovin foetal), 25 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 0-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 g/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant du milieu a ete collecte au cours du temps (4 jours, 7 j ours, 11 j ours, 14 jours, 18 jours, 21 jours). Le surnageant de culture a 30 ete chauffe pendant 3 minutes dans de 1'eau bouillante. Une densite de 1,25 x 104 cellules/cm2 de cellules C3H1OT1/2 murines ont ete cultivees dans le milieu BME. Dix-huit heures apres, les cellules ont ete additionnees de 1 ml de surnageant de culture non chauffe, de surnageant de culture chauffe et d'un milieu MEM 35 produisant un agent de differenciation seulement, respectivement. Au bout de 72 heures, les activites phosphatase alcaline ont ete mesurees par 127 le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline d'un echantillon additionne seulement d'un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete define comme etant de 1. La valeur de 1'activite phosphatase alcaline a ete d'environ 12,8 fois quand le surnageant de culture non chauffe provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete ajoute (voir tableau 8 et figure 10). En outre, la valeur de 1'activite phosphatase alcaline a diminue d'environ 1,6 fois, quand le surnageant de culture chauffe provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete ajoute (voir tableau 8 et figure 10). Conformement a ces resultats, it a ete confirme que 1'agent ayant la capacite d'induire la differenciation de cellules indifferenciees en osteobla.stes a ete degrade (inactive) par traitement thermique. L'agent etait present dans le surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation. Tableau 8 : Degradation thermique d'un agent capable d'induire la 20 differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste Activite ALP (valeur moyenne) Valeur relative Valeur absolue Chauff~ 1,6 0,014 Non traite 12,8 0,111 Surnageant de differenciation seulement 1 0,009 25 Ages de 4 semaines : une experience a ete realisee. Trois essais ont ete realises. Chauffe : surnageant de culture traite provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation 30 Non traite : surnageant de culture provenant de chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation Surnageant de differenciation seulement : un milieu MEM 128 produisant un agent de differenciation seul. Exemple 13: Effet de l'implantation sous-cutanee d'un materiau composite utilisant des chondrocytes capables d 'hypertrophie ayant la capacite de produire un agent capable d'induire la differenciation osteoblastique et echafaudage biocompatible Dans le present exemple, on a utilise des chondrocytes capables d'hypertrophie. Les chondrocytes sont prepares dans les exemples 1 A. 3 (rat), les exemples 4 a 5 (humain), 1'exemple 7 (rat), 1'exemple 9 (souris), et 1'exemple 10 (lapin). Les chondrocytes capables d'hypertrophie ont ete dillies a 1 x 106 cellules/ml dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation. Ces suspensions cellulaires sont inoculees uniformement dans de 1'hydroxyapatite, PuraMatrixTM (Becton Dickinson, numero de catalogue 354250, BD PuraMatrixTM hydrogel peptidique), du collagene (gel et eponge), de la gelatine (eponge), de 1'agarose, de 1'acide alginique, et MatrigelTM (Becton Dickinson), respectivement, et cultivees dans un incubateur a 5 % de CO2 a 37 C pendant 1 semaine. Des materiaux composites sont ainsi prepares. Ces materiaux composites sont implantes en sous-cutane dans des animaux syngeniques ou des animaux immunodeficients. Quatre semaines apres implantation, les animaux syngeniques ou les animaux immunodeficients sont sacrifies et les regions implantees sont retirees, fixees avec du formol tamponne neutre a 10 % et noyees dans la paraffine. L'echantillon est sectionne et colore avec HE pour evaluer 1'etat de la region implantee. L'osteogenese est observee dans tous les materiaux composites comprenant des chondrocytes capables d'hypertrophie, qui sont prepares pour avoir la capacite de produire l'agent capable d'induire la differenciation osteoblastique par culture dans un milieu MEM produisant l'agent de differenciation. Exemple comparatif A : Effet de l'implantation sous-cutanee d'un 30 materiau composite utilisant des chondrocytes depourvus de la capacite d 'hypertrophie et echafaudage biocompatible Des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont utilises. Les chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont prepares dans les exemples comparatifs 1B, ID, et 3B (rat), les exemples 35 comparatifs 4B et 5B (humain), 1'exemple comparatif 9B (souris), et 1'exemple comparatif 10B (lapin). Les chondrocytes depourvus de la 9 capacite d'hypertrophie sont dilues clans un milieu MEM produisant un agent de differenciation et un milieu de croissance MEM, respectivement, et les materiaux composites sont prepares en utilisant la meme maniere que celle decrite dans 1'exemple 13. Ces materiaux composites sont implantes en sous-cutane dans des animaux syngeniques ou des animaux immunodeficients. Quatre semaines apres implantation, les animaux syngeniques ou les animauximmunodeficients sont sacrifies et les regions implantees sont retirees, fixees avec du formol tamponne neutre a 10 % et noyees dans la paraffine. L'echantillon est sectionne et colore avec HE pour evaluer 1'etat de la region implantee. L'osteogenese n'est observee dans aucun des materiaux composites constitues d'echafaudages biocompatibles, quand des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont utilises. Exemple comparatif B : Effet de 1 'implantation sous-cutanee d 'un 15 echafaudage seul L'hydroxyapatite, PuraMatrixTM (Becton Dickinson, numero de catalogue 354250, BD PuraMatrixTM hydrogel peptidique), le collagene (gel et eponge), la gelatine (eponge), 1'agarose, 1'acide alginique, et MatrigelTM (Becton Dickinson), qui sont des echafaudages, 20 respectivement, sont implantes en sous-cutane chez des animaux syngeniques ou des animaux immunodeficients, seuls, en utilisant le procede decrit dans 1'exemple 13. Comme resultat, l'osteogenese n'est pas observee. Exemple 14: Effet de 1 'implantation sous-cutanee d 'un culot de 25 chondrocytes capables d 'hypertrophie ayant la capacite de produire un agent capable d 'induire la differenciation osteoblastique Preparation d'un culot de chondrocytes capables d'hypertrophie ayant la capacite de produire un agent capable d 'induire la differenciation osteoblastique 30 Dans le present exemple, on utilise des chondrocytes capables d'hypertrophie. Les chondrocytes ont ete prepares dans les exemples 1 a 3 (rat), les exemples 4 a 5 (humain), 1'exemple 7 (rat), 1'exemple 9 (souris), et 1'exemple 10 (lapin). Le milieu MEM produisant un agent de differenciation est additionne a ces cellules (5 x 105 cellules) a une 35 densite de cellules finale de 5 x 105 cellules/0,5 ml. Les suspensions cellulaires sont centrifugees (a 1000 t/min (170 x g) x 5 min) pour 130 preparer des culots de chondrocytes capables d'hypertrophie qui sont capables d'induire la differenciation osteoblastique. Ces culots de chondrocytes capables d'hypertrophie sont implantes en sous-cutane dans des animaux syngeniques ou des animaux immunodeficients. Quatre semaines apres implantation, les animaux syngeniques ou les animaux immunodeficients sont sacrifies et les regions implantees sont retirees, fixees avec du formol tamponne neutre a 10 % et noyees dans la paraffine. L'echantillon est sectionne et colore avec HE pour evaluer 1'etat de la region implantee. L'osteogenese a ete observee dans tous les culots de chondrocytes capables d'hypertrophie, qui ont la capacite de produire 1'agent capable d'induire la differenciation osteoblastique. Exemple comparatif A : Effet de l 'implantation sous-cutanee d 'un culot de chondrocytes depourvus de la capacite d 'hypertrophie On utilise des chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. Les chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont prepares dans les exemples comparatifs 1B, ID et 3B (rat), les exemples comparatifs 4B et 5B (humain), 1'exemple comparatif 9B (souris), et 1'exemple comparatif 10B (lapin). Le milieu MEM produisant un agent de differenciation et le milieu de croissance MEM sont ajoutes a ces cellules (5 x 105 cellules) a une densite de cellules finale de 5 x 105 cellules/0,5 ml, respectivement. Les suspensions cellulaires sont centrifugees (a 1000 t/min (170 x g) pendant 5 min) pour preparer des culots de chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie. Les culots de chondrocytes depourvus de la capacite d'hypertrophie sont implantes en sous-cutane dans des animaux syngeniques ou des animaux immunodeficients. Comme resultat, 1'osteogenese n'a pas ete observee. Exemple 15 : Relation entre un agent capable d'induire la 30 differenciation osteoblastique produit par des chondrocytes capables d 'hypertrophie, BMP et TGFfi Les chondrocytes capables d'hypertrophie preleves sur le cartilage costal ont ete collectes en utilisant le procede tel qu'il est decrit dans 1'exemple 1. Les chondrocytes ont et: dillies a 4 x 104 cellules/cm2 dans 35 un milieu MEM produisant un agent de differenciation (milieu essentiel minimal (MEM) ayant une concentration finale de 15 % de FBS (serum 131 de bovin foetal), 10 nM en dexamethasone, 10 mM en 13-glycerophosphate, 50 g/ml d'acide ascorbique, 100 U/ml de penicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 0,25 gg/ml d'amphotericine B). La suspension cellulaire a ete cultivee et le surnageant du milieu a ete collecte au cours du temps. En outre, le surnageant a ete soumis a 1'analyse suivante, et 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree. Dosage du TGF/3 Le dosage du TGF(3 a ete realise par un procede decrit dans Nagano, T. et al. : Effect of heat treatment on bioactivities of enamel matrix derivatives in human periodontal ligament (HPDL) cells. J. Periodont. Res., 39 : 249-256, 2004. Une densite de 5 x 104 cellules HPDL/puits ont ete inoculees dans des plaques a 96 puits et cultivees pendant 24 heures. Le milieu de culture a ete substitue par un milieu comprenant de la la, 25-dihydroxyvitamine D3 10 nM et un echantillon de test, et cultive pendant 96 heures, puis lave avec du PBS. Ensuite, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree. Specifiquement, le milieu de culture a reagi avec du phosphate de p-nitrophenyle 10 mM comme substrat dans un tampon acide chlorhydrique 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol 100 mM (pH 10,0) comprenant MgCl2 5 mM a 37 C pendant 10 minutes. L'absorbance a ete mesuree a 405 nm apt-es y avoir aj oute NaOH. L'absorbance a ete d'environ 0,1515, d'environ 0,2545 et d'environ 0,1242 (voir tableau 9 et figure 11A) quand le surnageant de culture provenant des chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete ajoute. Tableau 9 : activity du TGF(3 405 nm (DO) Ecart type 1 0,1515 0,01818 2 0,2545 0,00303 3 0,1242 0,03030 Dosage de la BMP Le dosage de la BMP a ete realise par un procede decrit dans Iwata, T., et al.: Noggin Blocks Osteoinductive activity of Porcine Enamel Extracts. J. Dent. Res., 81 : 387-391, 2002. Une densite de 5xl04 132 cellules ST2/puits ont ete inoculees dans des plaques a 96 puits et cultivees pendant 24 heures. Le milieu de culture a ete substitue par un milieu comprenant de 1'acide tout-trans retinoique 200 nM et un echantillon de test, et cultive pendant 72 heures, puis lave avec du PBS. Ensuite, 1'activite phosphatase alcaline a ete mesuree. Specifiquement, le milieu de culture a reagi avec du phosphate de p-nitrophenyle 10 mM comme substrat dans un tampon acide chlorhydrique 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol 100 mM (pH 10,0) comprenant MgC12 5 mM a 37 C pendant 8 minutes. L'absorbance a ete mesuree a 405 nm apres y avoir aj oute NaOH. L'absorbance a ete d'environ 0,0500, d'environ 0,0750 et d'environ 0,0750 (voir tableau 10 et figure 11B) quand le surnageant de culture provenant des chondrocytes capables d'hypertrophie cultives dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation a ete ajoute. Tableau 10 : activite de la BMP 405 nmADO) Ecart type 1 0,0500 0,0188 2 0,0750 0,0125 3 0,0750 0,0063 L'activite du TGF(3 a ete observee dans un milieu MEM produisant un agent de differenciation comprenant 1'agent de la presente invention. Par consequent, it a ete demontre que le TGF(3 etait present dans ce milieu produisant un agent de differenciation (voir figure 11A). D'autre part, une legere diminution de 1'activite de la BMP a ete aussi observee (voir figure 11B). La voie BMP est supprimee par la presence du TGF(3. Neanmoins, 1'activite phosphatase alcaline a ete augmentee dans le surnageant d'un milieu produisant 1'agent de differenciation contenant le TGFI3. Conformement a. ce resultat, on pense que la hausse de 1'activite phosphatase alcaline a ete induite par un agent de la presente invention, qui n'etait pas la BMP. Comme expose ci-dessus, la presente invention a ete illustree par des modes de realisation preferes de 1'invention. Cependant, la portee de la presente invention ne doit pas etre limitee par ces modes de realisation. On apprecie que la presente invention ne soit limitee que par 2894981 133 la portee des revendications. I1 est entendu que 1'homme du metier peut realiser des equivalents de l'invention selon la description de l'invention ou la connaissance technique commune dans Part. APPLICATION INDUSTRIELLE 5 La presente invention produit avec succes 1'agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes a partir d'une large gamme de cellules, y compris des lignees cellulaires conventionnelles et/ou des cellules non conventionnelles, en proposant un agent regulant la fonction cellulaire, produit par un chondrocyte capable d'hypertrophie. Le 10 chondrocyte capable d'hypertrophie est capable d'induire la differenciation d'une cellule indifferenciee en osteoblaste. Puisque cet agent n'est pas connu, 1'existence de 1'agent lui-meme est applicable industriellement. 4 REVENDICATIONS 1. Agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du P-glycerophosphate et de 1acide ascorbique. 2. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent est sepal-6 en une fraction de poids moleculaire superieur a 50 000, ou le surnageant de culture cultive dans le milieu produisant un agent de differenciation est place dans un filtre centrifuge, et est soumis a une ultrafiltration centrifuge de 4 000 x g, 4 C pendant 30 minutes dans des conditions adequates pour la separation d'une fraction de poids macromoleculaire et d'une fraction de faible poids moleculaire. 3. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent est capable d'induire la differenciation des osteoblastes a partir d'une cellule non differenciee. 4. Agent selon la revendication 3, caracterise en ce que la cellule non differenciee est une cellule qui n'est pas differenciee par du glucocorticoide, du f3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 5. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H10T1/2 qui est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle pour qu'elle soit superieure a plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans un milieu de base de Eagle sans 1'agent, ou l'activite phosphatase alcaline est determinee par les etapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 1 de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a ratite echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres 135 addition de 1'acide chlorhydrique concentre, ou la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. 6. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H10T1/2 quand la cellule C3HlOT1/2 est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle, ou 1'activite phosphatase alcaline est determinee par les etapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 l avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 gl de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 gl de NaOH 1 N sont ajoutes, pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance 20 1.11 supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, dans lequel la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. 7. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent est capable d'augmenter 1'expression d'une substance specifique aux osteoblastes choisie dans le groupe compose du collagene de type I, du proteoglycane osseux, de la phosphatase alcaline, de 1'osteocalcine, de la Gla-proteine matricielle, de 1'osteoglycine, de 1'osteopontine, de la proteine d'acide sialique osseuse, de 1'osteonectine et de la pleiotrophine. 8. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent a au moins une propriete choisie dans le groupe compose de la prevention de 1'induction de la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes et la prevention de 1'induction de 1'activite phosphatase alcaline dans les cellules non differenciees en chauffant pendant 3 minutes dans de 1'eau en ebullition. 9. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est derive d'un mammifere. 10. Agent selon la revendication 9, caracterise en ce que le mammifere est un humain, une souris, un rat ou un lapin. 11. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est une cellule prelevee a partir de la 136 region choisie dans le groupe compose de la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, de la ligne epiphysaire de 1'os long, de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des osselets, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et de la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. 12. Agent selon la revendication 9, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est une cellule capable 10 d'hypertrophie induite par differenciation. 13. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie exprime au moins un marqueur choisi dans le groupe compose du collagene de type X, de la phosphatase alcaline, de 1'osteonectine, du collagene de type II, du proteoglycane de 15 cartilage ou de ses composants, de 1'acide hyaluronique, du collagene de type IX, du collagene de type XI, ou de la chondromoduline. 14. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que la capacite d'hypertrophie du chondrocyte capable d'hypertrophie est discriminee par un changement morphologique. 20 15. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est determine comme etant capable d'hypertrophie quand une augmentation importante de sa taille est observee par preparation d'un culot de centrifugation des cellules par centrifugation d'un milieu de culture F12 de HAM comprenant 5 x 105 25 cellules, culture du culot de centrifugation pendant une periode predeterminee, et comparaison de la taille des cellules observee sous microscope avant la culture avec la taille apres leur culture. 16. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un 30 composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 17. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend a la fois du 13-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de 35 differenciation des osteoblastes conventionnels. 18. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le 137 milieu produisant un agent de differenciation comprend le milieu essentiel minimal (MEM) ou le milieu HAM en tant que composant du milieu de base. 19. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend le milieu essentiel minimal (MEM) en tant que composant de base, et du 1-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. 20. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que le 10 milieu produisant un agent de differenciation comprend en outre un composant serique. 21. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation est obtenu a partir 15 du surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. 22. Agent selon la revendication 1, caracterise en ce que 1'agent pouvant etre obtenu en cultivant un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation existe a 1'interieur du chondrocyte capable d'hypertrophie. 20 23. Composition comprenant l'agent selon la revendication 1. 24. Composition destinee a induire la differenciation des osteoblastes comprenant 1'agent selon la revendication 1. 25. Composition destinee a induire la differenciation des cellules non differenciees en osteoblastes comprenant 1'agent selon la 25 revendication 1. 26. Composition selon la revendication 23, caracterisee en ce que la composition comprend en outre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du (3-glycerophosphate et de 1'acide 30 ascorbique. 27. Composition selon la revendication 23, caracterisee en ce que la composition comprend en outre au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du R-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 35 28. Composition selon la revendication 23, caracterisee en ce que la composition comprend en outre a la fois du J3-glycerophosphate et 138 de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. 29. Procede de production d'une composition comprenant un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, caracterise en ce que le procede comprend la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, on le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 30. Procede de production selon la revendication 29, comprenant la recolte d'un surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. 31. Procede de production selon la revendication 30, 15 comprenant en outre 1'extraction a partir du surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. 32. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est derive d'un mammifere. 20 33. Procede de production selon la revendication 32, caracterise en ce que le mammifere est un humain, une souris, un rat ou un lapin. 34. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est une cellule prelevee a partir de la region choisie dans le groupe compose de la jonction 25 chondro-osseuse du cartilage costal, de la ligne epiphysaire de 1'os long, de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des osselets, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de fcetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et de la partie cartilagineuse d'une phase de 30 proliferation osseuse. 35. Procede de production selon la revendication 32, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est une cellule capable d'hypertrophie induite par differenciation. 36. Procede de production selon la revendication 29, caracterise 35 en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel 139 choisi dans le groupe compose du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 37. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend a la fois du (3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. 38. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend le milieu essentiel minimal (MEM) ou le milieu HAM en tant que composant du milieu de base. 39. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend le milieu essentiel minimal (MEM) en tant que composant de base, et du f3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique en tant que composants de differenciation des osteoblastes conventionnels. 40. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que le milieu produisant un agent de differenciation comprend en outre un composant serique. 41. Procede de production selon la revendication 29, caracterise 20 en ce que 1'agent capable d'induire la differenciation est secrete dans le surnageant du milieu produisant un agent de differenciation. 42. Procede de production selon la revendication 29, caracterise en ce que 1'agent capable d'induire la differenciation existe a 1'interieur du chondrocyte capable d'hypertrophie. 25 43. Procede de production d'un osteoblaste par induction pour differencier une cellule non differenciee en un osteoblaste, comprenant les etapes consistant a : A) inoculer la cellule non differenciee dans un echafaudage de culture ou un recipient de culture ; et 30 B) exposer la cellule non differenciee a 1'agent selon la revendication 1 en ajoutant une solution comprenant 1'agent selon la revendication 1 au milieu ou en echangeant le milieu avec un milieu comprenant l'agent, apres que la cellule non differenciee est stabilisee. 44. Procede selon la revendication 43, caracterise en ce que la 35 cellule non differenciee est derivee d'un mammifere. 45. Procede selon la revendication 44, caracterise en ce que le 140 mammifere est un humain, une souris, un rat ou un lapin. 46. Procede selon la revendication 43, caracterise en ce que le chondrocyte capable d'hypertrophie est une cellule prelevee a partir de la region choisie dans le groupe compose de la jonction chondro-osseuse du cartilage costal, de la ligne epiphysaire de 1'os long, de la ligne epiphysaire des vertebres, de la zone de proliferation du cartilage des osselets, du perichondre, du primordium osseux forme a partir de cartilage de foetus, de la region cicatricielle d'une fracture osseuse en voie de guerison, et de la partie cartilagineuse d'une phase de proliferation osseuse. 47. Procede selon la revendication 43, caracterise en ce que le milieu de culture de la cellule non differenciee est le milieu de base de Eagle (MBE), le milieu essentiel minimal (MEM), le milieu de Eagle modifie par Dulbecco (MEMD) ou le milieu HAM, ou une combinaison de ceux-ci. 48. Procede selon la revendication 43, caracterise en ce que la cellule non differenciee est choisie clans le groupe compose d'une cellule souche embryonnaire, d'une cellule souche germinale embryonnaire et d'une cellule souche tissulaire. 49. Procede selon la revendication 48, caracterise en ce que la cellule souche tissulaire est choisie dans le groupe compose d'une cellule souche mesenchytameuse, d'une cellule souche hematopoietique, d'une cellule souche vasculaire, d'une cellule souche hepatique, d'une cellule souche (commune) pancreatique, et d'une cellule souche neurale. 50. Procede selon la revendication 48, caracterise en ce que la cellule souche tissulaire est une cellule souche mesenchytameuse. 51. Procede selon la revendication 49, caracterise en ce que la cellule souche mesenchytameuse est une cellule souche derivee de la moelle osseuse. 52. Procede selon la revendication 49, caracterise en ce que la cellule souche mesenchytameuse est derivee du coussinet adipeux, du tissu synovial, du tissu musculaire, du sang peripherique, du tissu placentaire, du sang menstruel, ou du sang de cordon ombilical. 53. Procede selon la revendication 43, caracterise en ce que la cellule non differenciee est une cellule choisie dans le groupe compose d'une cellule C3HlOT1/2, d'une cellule ATDC5, d'une cellule 3T3- 141 Swiss albinos, d'une cellule BALB/3T3, et d'une cellule NIH3T3. 54. Procede selon la revendication 53, caracterise en ce que la cellule non differenciee est une cellule choisie dans le groupe compose d'une cellule C3H10T1/2, d'une cellule 3T3-Swiss albinos, d'une cellule BALB/3T3, et d'une cellule NIH3T3. 55. Osteoblaste qui est induit par contact avec un agent derive d'un chondrocyte capable d'hypertrophie. 56. Osteoblaste selon la revendication 55, caracterise en ce que 1'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H 10T 1 /2 qui est exposee a l'agent dans un milieu de base de Eagle pour qu'elle soit superieure A. plus d'environ une fois celle de la cellule cultivee dans un milieu de base de Eagle sans 1'agent, on 1'activite phosphatase alcaline est determines par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 p1 avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l d'un tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin A. la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1acide chlorhydrique concentre, dans lequel la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. 57. Osteoblaste selon la revendication 55, caracterise en ce que 1'agent est capable d'augmenter la valeur de 1'activite phosphatase alcaline (ALP) d'une cellule C3H10T 1/2 quand la cellule C3H10T1/2 est exposee a 1'agent dans un milieu de base de Eagle, oil 1'activite phosphatase alcaline est determinee par les stapes suivantes : A) la determination de deux absorbances a 405 nm, ou a un echantillon d'absorbance de 100 1.11 avec ou sans 1'agent, 50 l de phosphate de p-nitrophenyle a 4 mg/ml et 50 l de tampon alcalin (pH 10,3) sont ajoutes, respectivement, mis a reagir' a 37 C pendant 15 minutes, et 50 l de NaOH 1 N sont ajoutes pour mettre fin a la reaction, et a 1'autre echantillon d'absorbance, 20 l supplementaires d'acide chlorhydrique concentre sont ajoutes ; et 142 B) le calcul de la difference d'absorbance avant et apres addition de 1'acide chlorhydrique concentre, dans lequel la difference d'absorbance est un indicateur de 1'activite phosphatase alcaline. 58. Osteoblaste selon la revendication 55, caracterise en ce que 1'osteoblaste est derive d'une cellule non differenciee. 59. Procede de production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, caracterise en ce que le procede comprend la culture d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans un milieu produisant un agent de differenciation, oil le milieu produisant un agent de differenciation comprend au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticolde, du 13-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 60. Composition destinee a l'utilisation dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes, caracterisee en ce que la composition comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie. 61. Kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du f3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 62. Materiau composite destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et B) un echafaudage. 63. Materiau composite selon la revendication 62, caracterise en ce que 1'echafaudage comprend un materiau choisi dans le groupe compose du phosphate de calcium, du carbonate de calcium, de 1'alumine, de la zircone, du verre depose sur apatite-wollastonite, de la gelatine, du collagene, de la chitine, de la fibrine, de 1'acide hyaluronique, du melange matriciel extracellulaire, de la soie, de la cellulose, du dextrane, de 1'agarose, de la gelose, des polypeptides synthetiques, de 1'acide polylactique, de la polyleucine, de 1'acide alginique, de 1'acide polyglycolique, du polymethacrylate de methyle, du 143 polycyanoacrylate, du polyacrylonitrile, du polyurethane, du polypropylene, du polyethylene, du chlorure de polyvinyle, du copolymere ethylene/acetate de vinyle, du nylon et d'une combinaison de ceux-ci. 64. Materiau composite selon la revendication 62, caracterise en ce que 1'echafaudage est compose d'hydroxyapatite. 65. Kit destine a la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes comprenant : A) le materiau composite selon la revendication 64 ; et B) au moins un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoide, du P-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 66. Utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. 67. Utilisation d'un chondrocyte capable d'hypertrophie et d'un composant de differenciation des osteoblastes conventionnel dans la production d'un agent capable d'induire la differenciation des osteoblastes. 68. Composition destinee a augmenter ou a induire 1'osteogenese chez un organisme biologique, caracterisee en ce que la composition comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui a un potentiel d'induction de la differenciation des osteoblastes. 69. Materiau composite destine augmenter ou a induire l'osteogenese chez un organisme biologique, caracterise en ce que le materiau composite comprend : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme 30 biologique. 70. Kit destine a augmenter ou a induire l'osteogenese chez un organisme biologique comprenant : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie ; et B) au moins un composant de differenciation des 35 osteoblastes conventionnel choisi dans le groupe compose du glucocorticoIde, du /3-glycerophosphate et de 1'acide ascorbique. 2894981 144 71. Utilisation de : A) un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui est capable d'induire la differenciation des osteoblastes ; et B) un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme 5 biologique, dans la fabrication d'un implant ou d'un materiau destine a la reparation des os pour augmenter ou induire l'osteogenese chez un organisme biologique. 72. Procede destine a augmenter ou a induire 1'osteogenese chez 10 un organisme biologique, comprenant la localisation d'un materiau composite sur une region en ayant besoin, caracterise en ce que le materiau composite comprend un chondrocyte capable d'hypertrophie, qui a un potentiel d'induction de la differenciation des osteoblastes et un echafaudage qui est biocompatible avec 1'organisme biologique.