FR 2892311 A1 20070427 FR 0511117 A 20051024 PANSEMENT POUR LA CICATRISATION DES PLAIES, ULCERES OU BRêLURES DES EPITHELIUMS, ENDOTHELIUMS OU MUQUEUSES. La présente invention concerne un produit de thérapie cellulaire, plus particulièrement destiné à la cicatrisation des plaies, ulcères, brûlures des épithéliums, endothéliums ou muqueuses. A l'heure actuelle, la cicatrisation qui vient d'être évoquée reste un problème associée à une morbidité importante. L'invention a précisément pour but de traiter les cas résistants à un traitement conventionnel et/ou pour lesquels on sait que la durée de réponse à ce traitement risque d'augmenter la morbidité et/ou la mortalité du patient à traiter. Dans un autre domaine qui est celui de l'ophtalmologie, il a déjà été démontré, dans le traitement des ulcères de cornées, qu'une greffe de membrane amniotique avait une efficacité thérapeutique importante du fait de la richesse en facteur de croissance de la membrane amniotique. L'évolution des techniques d'ingénierie cellulaire permet aujourd'hui de mettre à disposition les membranes amniotiques répondant à des critères stricts de sécurité et de qualité. Il a été estimé utile de rappeler que la membrane amniotique est un tissu situé à l'interface entre le placenta et le liquide amniotique. Elle comporte un stroma acellulaire et un épithélium monostratifié cubique reposant sur une membrane basale. La membrane amniotique est riche en collagène IV, laminine 1, laminine 5, fibronectine, collagène VII (qui sont des constituants des membranes basales) ainsi qu'en facteurs de croissance (EGF, TGF-alpha, KGF, HGF, bFGF, TGF-beta). Expérimentalement, la culture de kératocytes et de fibroblastes limbiques humains sur une membrane amniotique induit une suppression de l'expression du TGF-beta par ces cellules [Tseng et al, 1999]. En outre, elle inhibe leur différentiation myofibroblastique ainsi que la prolifération et l'apoptose [Pellegrini et al, 1997]. La membrane amniotique est prélevée sur un placenta obtenu au cours d'un accouchement par césarienne. Elle peut être obtenue après un accouchement par voie basse, mais dans ce dernier cas, le taux de contamination bactérienne et d'anomalie de structures histologiques interdit l'utilisation thérapeutique dans une très grande majorité des cas (supérieur à 75%). Les parturientes sont sélectionnées selon des critères spécifiques permettant d'assurer la sécurité thérapeutique du produit. Après le prélèvement du placenta, la membrane amniotique est séparée du placenta et conditionnée dans une solution stérile contenant des antibiotiques. Le chorion est ensuite détaché de la membrane amniotique. La membrane amniotique débarrassée du chorion est placée ensuite sur une membrane inerte de manière polarisée (face épithéliale vers le haut). La membrane amniotique est ou non découpée en fragments de taille variable et adaptable, et distribuée en frais en cas d'urgence vitale ou conservée par congélation dans un milieu approprié jusqu'à la greffe. Si tel est le cas, avant greffe, les membranes amniotiques sont décongelées. Les contrôles qualité comprennent au minimum des contrôles microbiologiques, histologiques et chez la donneuse, des contrôles biologiques au moment du prélèvement et après une période de quarantaine afin de sécuriser le produit. En cas d'utilisation sans cryopréservation, les contrôles biologiques de sécurisation ne peuvent être effectués. A l'heure actuelle, la greffe de membrane amniotique est principalement utilisée en ophtalmologie dans le traitement des pathologies inflammatoires de la cornée [De Roth, 1940; Tseng et al, 1997]. Il s'agit d'ulcères cornéens (aseptique, post-brûlure, post-infectieux ou iatrogène) ou de destructions sévères de la cornée (brûlure chimique, Lyell, Stevens-Johnson, pemphigoïde bulleuse) [Honovar et al, 2000]. En effet, au cours de ces pathologies, l'épithélium cornéen va progressivement être détruit au profit d'un épithélium de cicatrisation anormal de type conjonctival. Les phénomènes inflammatoires, chroniquement entretenus, vont aboutir à l'opacification du tissu cornéen qui va perdre sa transparence et donc sa fonctionnalité. La greffe de cornée classique (kératoplastie transfixiante) est vouée à l'échec dans la quasi totalité des cas car les phénomènes inflammatoires vont persister et faire obstacle à la cicatrisation [Holland et Schwartz, 1996; Tseng et al, 1998; Borderie et al, 1999]. Dans cette situation, la greffe de membrane amniotique a joué le rôle de membrane basale (car c'est un support acellulaire et surtout avasculaire) et va favoriser la cicatrisation épithéliale en limitant les phénomènes inflammatoires et en apportant des facteurs de croissance. En outre, la tolérance clinique de la greffe de membrane amniotique est excellente compte tenu de sa faible immunogénicité [Borderie et al, 2000]. La greffe de membrane amniotique peut être réalisée seule ou en association avec une greffe de cornée ou de cellules limbiques [Dua et Azuara-Blanco,1999; 2000], en cas d'ulcère cornéen perforé ou insuffisance limbique sévère constituée [Shimazaki et al, 1997; Tsai et al, 2000]. Techniquement, la greffe de membrane amniotique consiste à suturer un fragment de membrane amniotique sur la zone désépithélialisée par quelques points séparés. L'évolution va se faire vers l'intégration progressive de la membrane amniotique greffée au stroma sous-jacent. Elle sera ensuite recouverte par l'épithélium adjacent. Lee et Tseng [1997] rapportent les résultats obtenus sur 11 ulcères cornéens chroniques (évoluant depuis 17 semaines en moyenne) traités par greffe de membrane amniotique et suivis en moyenne 9 mois. 10 cicatrisations étaient obtenues après un délai moyen de 4 semaines et un cas était un échec. Dans l'étude de Tseng et al. [1998], 10 patients ayant une forme modérée d'insuffisance limbique ont été traités par greffe de membrane amniotique seule. L'acuité visuelle était améliorée dans tous les cas. Shimazaki et al. [1997] associaient greffe de membrane amniotique et greffe de limbe dans le même temps opératoire. Ils rapportaient 7 succès parmi 7 patients ayant une brûlure chimique ou thermique avec un suivi moyen de 12 mois. Mais l'utilisation des membranes amniotiques a déjà démontré son intérêt potentiel pour la cicatrisation en général, notamment en dermatologie, à la fin des années 1970, principalement dans le traitement des brûlures cutanées [Eldad et al, 1977, Thomson and Parks, 1981; Trelford et al, 1973]. Les membranes amniotiques étaient utilisées fraîches ou après un stockage à 4 C de 24 à 48 heures [Ganatra et Durram, 1996]. Cette technique utilisant des produits d'origine humaine est tombée en désuétude dans nos contrées mais elle est encore utilisée dans les pays en voie de développement. Récemment, un chirurgien indien [Subrahmanyam M, 1995] rapportait son expérience chez 16 patients sur 22 ayant bénéficié d'une greffe cutanée de 1 millimètre recouverte par une membrane amniotique. Chez 16 patients sur 22, la réépithélialisation complète est obtenue en 10 jours et la greffe restait stable. Pour les 6 autres patients, il s'agissait d'un échec primaire de la greffe de peau. La greffe de membrane amniotique a l'avantage d'apporter des facteurs de croissance qui n'existe pas dans le traitement de référence des brûlures, particulièrement dans les pays en émergence. De plus, l'évolution des techniques en ingénierie cellulaire et tissulaire nous permet aujourd'hui de mettre à disposition des membranes amniotiques répondant à des critères stricts de sécurité (en particulier microbiologique) et de qualité. En outre, la conservation des membranes amniotiques à -80 C pendant au moins un an a été validée. Pour en revenir au domaine de l'ophtalmologie, il a été déjà proposé de traiter les syndromes secs par hyposécrétion liés aux syndromes de Goujerot-Sjdgren, par supplémentation lacrymale, éventuellement associée à un traitement anti-inflammatoire local. Le sérum autologue permet l'apport de facteurs de croissance et de vitamines ayant un effet bénéfique sur la surface oculaire. Le syndrome sec oculaire correspond à une altération du film lacrymal, due soit à une évaporation excessive, soit à une diminution de la sécrétion lacrymale. Cette dernière catégorie regroupe des affections variées s'accompagnant parfois d'une infiltration inflammatoire de la glande lacrymale. Les possibilités thérapeutiques de la sécheresse oculaire reposent sur un certain nombre de principes : - Supprimer les facteurs aggravants (médicaments asséchants, tabac, mauvaise ergonomie des postes de travail), - Apporter des facteurs lubrifiants permettant de limiter le manque de larme (larmes artificielles, gels), - Limiter l'évacuation des larmes (lunettes à chambre humide, clous méatiques), - Traiter les réactions inflammatoires presque toujours associée (Anti-inflammatoires stéroïdiens et non stéroïdiens, Cyclosporine), - Traiter la surface oculaire par l'apport de facteurs spécifiques (facteurs de croissance, fibronectine, acide rétinoïque, membrane amniotique). L'administration de facteurs de croissance (EGF, FGF, NGF) permet d'entraîner une amélioration subjective mais également objective de la symptomatologie liée à la sécheresse oculaire. La production de facteurs de croissance recombinants, produit par génie génétique, n'étant actuellement pas possible, les auteurs se sont tournés vers le sérum autologue. Celui-ci permet d'apporter des facteurs de croissance, des facteurs vitaminés ayant des effets bénéfiques sur la surface oculaire. Le sérum autologue s'est avéré efficace pour le traitement des syndromes secs graves liés aux syndromes de Gougerot-Sjôgren, aux GVH (rejet du greffon contre l'Hôte) ou pour traiter certaines kératites épithéliales d'origine trophique. Si le traitement est souvent efficace, se posent certains problèmes : les risques de contamination, la concentration du sérum autologue et surtout l'absence de réglementation pour cette thérapeutique nécessitant une collaboration étroite entre les Etablissements de Transfusion Sanguine, dispensateurs du produit et les ophtalmologistes. Toutefois, l'efficacité de ce traitement, tant pour traiter les sécheresses oculaires graves que les défauts de cicatrisation épithéliale, en font une arme incontournable des anomalies de la surface oculaire. Récemment, une étude rapporte l'intérêt de l'utilisation du sérum issu de sang placentaire comme alternative thérapeutique au sérum autologue. Le sérum issu de sang placentaire peut être utilisé en complément de la greffe de membrane amniotique pour accélérer le processus de cicatrisation, ou seul (bain) dans certaines pathologies résistantes à tous traitements conventionnels [Vajpayee RB et al, 2003]. Partant de l'enseignement de l'art antérieur qui vient d'être rapporté ci-dessus en matière d'ophtalmologie, et selon une première phase de la démarche inventive ayant conduit à l'invention, il a été estimé intéressant d'utiliser, de manière nouvelle et inventive, du sérum issu du sang placentaire en complément de la greffe de membrane amniotique pour accélérer le processus de cicatrisation dans certaines pathologies résistantes à tout traitement conventionnel dans le domaine de la dermatologie, le traitement des plaies, ulcères, brûlures, etc.30 Il a également été estimé utile de rappeler l'état de l'art actuel pour résoudre précisément le problème des ulcères cutanés. L'ulcère de jambe se définit comme une perte de substance cutanée évoluant vers la chronicité, sans tendance spontanée vers la guérison. Il s'agit le plus souvent d'une complication d'une maladie vasculaire sous-jacente. L'ulcère de jambe représente une des maladies chroniques les plus fréquentes dans les pays développés. L'analyse de 13 études épidémiologiques publiées entre 1983 et 1997, [Begaud, 2002] retrouve une prévalence dans la population générale qui varie de 0,1 à 0,8% selon les études [Nelzen et al, 1996; Moffat et al, 1992]. En France, cette pathologie est susceptible d'atteindre 60 000 à 180 000 malades. La caractéristique de l'ulcère réside en son absence de tendance spontanée à la cicatrisation. Les données issues de l'étude de Begaud [2002] indiquent que le délai moyen avant cicatrisation est de 13 mois, sachant que dans 9,55% des cas il peut dépasser 5 ans. L'étude de Gelfand et al [2002] sur des ulcères veineux de 189 mm2, retrouve une médiane de guérison à 3 mois. Selon l'expérience du service de Dermatologie de Besançon, le délai moyen de cicatrisation des ulcères est de 6 mois, sachant que 10% de ces plaies cicatrisent en 1 mois. La présence d'ulcère de jambe altère incontestablement la qualité de vie des patients [Franks et al, 2003]. En effet, cette pathologie occasionne des douleurs importantes, une baisse de l'activité ainsi que des contraintes importantes liées à la présence et à la réalisation des pansements. L'ulcère de jambe est une pathologie grave. En effet, sa survenue double le taux de mortalité chez les patients porteurs par rapport aux sujets de même sexe et de même âge indemnes de cette pathologie [Hansson et al, 1987]. Le retentissement socio-économique des ulcères de jambe est très important. Leur coût en France est estimé entre 126 et 882 millions d'euros par an [Begaud, 2002] et aux Etats-Unis de 0,75 à 1 milliard de dollars par an. De plus, l'enquête du Collège des enseignants de Dermatologie de France retrouve que la pathologie veineuse est à la source de 14% des hospitalisations dans les CHU et 26% des hospitalisations dans les CHG [Troyer-Claudle et al, 1996]. Dans l'expérience bisontine, l'ulcère de jambe est un motif très fréquent d'hospitalisation correspondant sur les PMSI de 1999 et 2000 à environ 4000 journées d'hospitalisation par an dans le service de Dermatologie. Le traitement de l'ulcère de jambe comprend le traitement étiologique et le traitement local de l'ulcère. Ce dernier est réalisé par une infirmière tous les 2 à 5 jours. Le traitement étiologique est essentiel. En effet, en améliorant la qualité hémodynamique du flux artério-veineux, il favorise l'évolution vers la guérison et la prévention des récidives. Outre des mesures d'hygiène de vie (lutte contre la surcharge pondérale, activité physique, arrêt du tabac), il doit prendre en charge, le cas échéant, une maladie systémique sous-jacente (diabète, hyperlipidémie). Le traitement étiologique doit également prendre en charge une pathologie variqueuse (chirurgie veineuse, contention élastique, sclérothérapie, veinotoniques...) et/ou artérielle (vasodilatateurs, gestes de revascularisation...) associée (s) à l'ulcère. Après un nettoyage de l'ulcère par irrigation au sérum physiologique ou à l'eau, la détersion de l'ulcère a pour but de débarrasser la plaie des débris nécrotiques. La détersion mécanique, souvent sous couvert d'une anesthésie locale (XylocaineR, EmlaR), est réalisée à l'aide d'un bistouri, d'une curette de ciseaux ou d'hydrojetR. Celle-ci est poursuivie par une détersion chimique avec hydrogels ou alginates ou enzymes protéolytiques ou poudres absorbantes. Après détersion, trois types de produit peuvent être utilisés pour assurer le bourgeonnement cutané et la cicatrisation les hydrocellulaires, les hydrocolloïdes et les pansements gras. Une greffe cutanée peut être proposée en complément pour accélérer la cicatrisation. La présente invention a pour but d'apporter de très nettes améliorations dans le traitement des ulcères cutanés, avec un coût moindre et une plus grande efficacité par rapport à l'art antérieur, qui serait exportable dans les pays en émergence et qui remplacerait, dans certains cas de greffes, la peau de cadavre qui est très immunogène et pas toujours aisée à prélever. A cet effet, elle concerne un produit de thérapie cellulaire, plus particulièrement destiné à la cicatrisation des plaies, ulcères, brûlures des épithéliums, endothéliums ou muqueuses, notamment dans le traitement des ulcères de jambes mais aussi dans les brûlures cutanées et surtout dans les complications cutanées graves post-allogreffe de cellules souches hématopoïétiques pour lesquelles le recours à l'autogreffe ou l'allogreffe cutanée est impossible.. Ce produit se caractérise en ce qu'il se présente sous la forme d'un pansement composé : - d'une membrane amniotique, en provenance d'une donneuse, à appliquer sur la plaie à traiter en vue de réaliser une greffe, et recouverte par : - une composant inerte humidifiable par : - un sérum extrait du sang placentaire d'une même donneuse ou pas, le pansement ainsi obtenu par l'association de la membrane amniotique et du sérum, produits issus tous trois de la bio-ingénierie, ayant chacun des propriétés cicatrisantes par la présence de facteurs de croissance ou des caractéristiques intrinsèques ayant pour effet d'accélérer et d'améliorer la cicatrisation de la plaie à traiter. De tels pansements cicatrisants ainsi réalisés, c'est-à-dire associant membrane amniotique et sérum de sang placentaire, pourront être présentés selon des tailles variables. Après mise en place de ce pansement, il pourra être ré-humidifié à l'aide de sérum de sang placentaire selon l'observation. Il est à noter que, préalablement à leur mise en oeuvre, la membrane amniotique et le sérum placentaire sont cryoconservés. Egalement, préalablement à leur mise en oeuvre, la membrane amniotique et/ou le sérum placentaire ont bénéficié de traitement permettant l'atténuation ou l'inactivation de contamination microbiologiquement éventuelle, y compris les agents transmissibles non conventionnels Le sang placentaire est prélevé à partir du placenta lors de l'accouchement de la donneuse. Préalablement à leur mise en oeuvre, la membrane amniotique et/ou le sérum placentaire ont bénéficié de traitement permettant la sélection d'une partie de la population, leur expansion, leur intégration par un gène ou tout autre procédé de transformation aboutissant à la modification des caractéristiques initiales qualitatif ou quantitatif des cellules souches du produit initial. L'invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre, et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniques possibles. Cette description donnée à titre d'exemple non limitatif, fera mieux comprendre comment l'invention peut être réalisée en référence au dessin annexé sur lequel: La figure 1 représente les différents composants d'un pansement cicatrisant selon l'invention. La figure 2 représente un pansement cicatrisant constitué. Selon la figure 1, le pansement cicatrisant 1 selon l'invention est composé : - d'une membrane amniotique 2, en provenance d'une donneuse, à appliquer sur la plaie à traiter en vue de réaliser une greffe, et recouverte par : - une composant inerte 3 humidifiable par : - un sérum 4 extrait du sang placentaire d'une même donneuse ou pas. Selon le procédé pour la réalisation du pansement 1 selon l'invention, le sérum 4 issu du sang placentaire est mis en oeuvre selon les étapes suivantes : Prélèvement de sang placentaire y Extraction du sérum Dilution Y Conditionnement en aliquot de taille variable Utilisation en frais y Congélation Selon le même procédé pour la réalisation du pansement 1 selon l'invention, la membrane amniotique 5 est mise en oeuvre de la manière suivante : (Prélèvement de membrane amniotique Lavage de la membrane v Séparation amnios / chorion Déposé l'amnios face choriale contre un composant inerte éliminable Selon le procédé pour la réalisation du pansement 1 proprement dit, après les préparations du sérum 4 et de la membrane amniotique 2 telles que précitées, les étapes suivantes sont réalisées : - disposition de la membrane amniotique 2, - disposition d'un nouveau composant inerte mouillable 3 sur la face amniotique 2a de la membrane 2, opposée à la face choriale 2b laissée libre pour être mise en contact avec la plaie au moment de l'utilisation du pansement 1, -humidification du composant inerte 3 par le sérum placentaire 4, -réhydratation du pansement 1 ainsi obtenu par le sérum 4, selon l'observation.10 REVENDICATIONS 1. Produit de thérapie cellulaire, plus particulièrement destiné à la cicatrisation des plaies, ulcères, brûlures des épithéliums, endothéliums ou muqueuses, notamment dans les traitements cutanés, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un pansement (1) composé : - d'une membrane amniotique (2), en provenance d'une donneuse, à appliquer sur la plaie à traiter en vue de réaliser une greffe, et recouverte par : - une composant inerte (3) humidifiable par : - un sérum (4) extrait du sang placentaire d'une même donneuse ou pas, le pansement (1) ainsi obtenu par l'association de la membrane amniotique (2) et du sérum (4), produits issus tous deux de la bio-ingénierie, ayant chacun des propriétés cicatrisantes par la présence de facteurs de croissance ou des caractéristiques intrinsèques ayant pour effet d'accélérer et d'améliorer la cicatrisation de la plaie à traiter. 2. Produit de thérapie cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à leur mise en oeuvre, la membrane amniotique (2) et/ou le sérum placentaire (4) ont bénéficié de traitement permettant l'atténuation ou l'inactivation decontamination microbiologiquement éventuelle (y compris les agents transmissibles non conventionnels). 3. Produit de thérapie cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à leur mise en œuvre, la membrane amniotique (2) et/ou le sérum placentaire (4) ont bénéficié de traitement permettant la sélection d'une partie de la population, leur expansion, leur intégration par un gène ou tout autre procédé de transformation aboutissant à la modification des caractéristiques initiales qualitatif ou quantitatif des cellules souches du produit initial. 4. Produit de thérapie cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à leur mise en oeuvre, la membrane amniotique (2) et le sérum placentaire (4) sont cryoconservés. 5. Procédé pour la réalisation d'un pansement selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le sérum (4) issu du sang placentaire est mis en œuvre selon les étapes suivantes : -prélèvement de sang placentaire, -extraction du sérum, -dilution, -conditionnement en aliquot de taille variable, et -utilisation en frais ou congélation. 6. Procédé pour la réalisation d'un pansement (1) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la membrane amniotique est mise en oeuvre de la manière suivante : -prélèvement de membrane amniotique, - lavage de la membrane, - séparation de l'amnios et du chorion, - dépôt de l'amnios face choriale contre un composé inerte éliminable, -trempage dans une solution de rinçage, -conditionnement en fragments de taille variable, et -utilisation en frais ou congélation. 7. Procédé pour la réalisation d'un pansement selon l'une des revendications 1 à 4 et selon les revendications 5 et 6 de procédé, caractérisé en ce qu'il est réalisé selon les étapes suivantes : 20 -disposition de la membrane amniotique (2), - disposition d'un nouveau composant inerte mouillable (3) sur la face amniotique (2a) de la membrane (2), opposée à la face choriale (2b) laissée libre pour être mise en contact avec la 25 plaie au moment de l'utilisation du pansement (1), -humidification du composant inerte (3) par le sérum placentaire (4), -réhydratation du pansement (1) ainsi obtenu par 30 le sérum (4), selon l'observation.15