FR 2890660 A1 20070316 FR 0509287 A 20050912 PROCÉDÉ POUR L'ACCÉLÉRATION DES MUTATIONS SOMATIQUES ET SON APPLICATION EN PROTÉOMIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biologie, et plus spécialement le domaine de l'adaptation par mutation dirigée, spécifique au monde vivant. Elle concerne plus particulièrement l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro, et les applications que les perfectionnements d'une telle technique rendent désormais possibles. Dans une forme de réalisation particulière, l'invention concerne l'induction des mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. Sous un autre aspect, l'invention concerne l'induction de mutations sur des cellules immortalisées productrices d'anticorps, à savoir des 15 hybridomes de souris ou des hybridomes humains ou des lignées B humaines immortalisées par le virus Epstein-Barr (EBV). ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Pour simplifier, il est fait référence dans la suite au lymphome de 20 Burkitt BL2. Il faut cependant souligner que cela vise seulement à faciliter l'exposé de la technique concernée et du concept inventif revendiqué, sans pour autant limiter l'invention à cet égard. La lignée cellulaire du lymphome de Burkitt de type I BL2, présente les caractéristiques des cellules B centroblastiques. Cette lignée cellulaire est la plus proche contrepartie immortalisée des centroblastes des centres germinatifs. Son origine de centre germinatif a été confirmée par la présence de mutations somatiques dans les gènes VH d'immunoglobuline des lymphomes de Burkitt. L'homogénéité et la stabilité des cellules BL2 dans des cultures appropriées a été soulignée (Denépoux S. et al., Immunity, vol. 6, 35-46, 1997). Il a été proposé, en conformité avec le phénotype de centroblaste, de considérer que la BL2 résulte de la transformation d'un centroblaste de centre germinatif qui a subi plusieurs phases de mutations somatiques. On estime par ailleurs que les cellules B subissent une hypermutation au stade du centroblaste (Pascual V. et al., j. Exp. Med. 180, 329-339 (1994) . Le phénomène d'hypermutation des immunoglobulines a lieu dans les centres germinatifs, après stimulation d'une cellule B par un antigène Tdépendant. En particulier, Denépoux S. et al., (op. cité) ont établi que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation après agrégation de leur récepteur de surface et co-culture avec une cellule T-auxiliaire ou amplificatrice, après une semaine de culture. Il a été conclu dans cet article que c'est par des activations répétées des cellules BL2 que l'on peut augmenter la fréquence de mutation. Egalement ces auteurs ont souligné que les mutations induites in vitro sur la BL2 n'affectent pas la région constante de 1'IgM et ne font pas apparaître une sélection dirigée par un antigène. Egalement, Yélamos J. et al., Nature, vol. 376, pp. 225-229 (1995) ont relaté des expériences tendant à montrer que le fragment de gène V de 15 l'immunoglobuline n'est pas indispensable pour une hypermutation et que la construction de substrats de mutation artificiels pourrait s'en trouver simplifiée. La lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, peut ainsi être utilisée comme outil de mutagenèse ciblée pour altérer un gène d'intérêt. Malgré ces développements de la technique antérieure, on ne disposait pas de moyens efficaces pour étudier ces phénomènes et pour en retirer des résultats pratiques, en particulier à des fins de diagnostic et/ou de suivi, ainsi que de traitement des processus tumoraux, dans des conditions de praticité et de rapidité satisfaisantes. Il y avait donc un besoin pour des moyens permettant de réaliser des tests d'hypermutation somatique rapides et fiables. Il existait plus particulièrement un besoin pour des moyens permettant de disposer d'un modèle d'induction de mutations somatiques, applicable aux gènes V, mais également aux autres gènes susceptibles d'être impliqués dans un processus tumoral, notamment chez les humains, comme par exemple les gènes Bd-6 et Fas Ligand (FasL). La présente demanderesse a précédemment montré que la mutation des gènes d'immunoglobulines peut être induite par des signaux qui imitent le déclenchement des processus d'hypermutation des gènes d'immunoglobulines: stimulation par un anticorps anti-IgM, plus co-culture avec des cellules T auxiliaires, ou stimulation avec des anticorps anti-CD19 et anti-CD21 plus les anticorps anti-IgM biotinylés, qui peuvent ensuite être agrégés à l'aide de billes magnétiques couplées à la streptavidine. Les présents inventeurs ont également montré antérieurement qu'il était possible d'effectuer la recombinaison homologue dans cette lignée, alors que la mise en oeuvre de cette technique est habituellement restreinte aux lignées de type ES ("embryonic stem cells") ou à la lignée issue d'un lymphome aviaire, la DT40. RÉSUMÉ DE L'INVENTION On a maintenant trouvé un procédé pour l'induction de mutations somatiques dans lequel on accélère les dites mutations, notamment dans la lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, en exprimant des ADNc exprimant eux-mêmes des versions modifiées du gène AID (l'abréviation AID désigne la "activation-induced cytidine déaminase" ou cytidine déaminase induite par activation). On a pour ce faire mis au point des ADNc AID-modifiés, spécialement adaptés, qui font également partie de la présente invention. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Fig. 1 représente la séquence codante nucléotidique naturelle de l'AID humaine et le peptide codé par ladite séquence. Fig. 2 est une représentation des proportions respectives de séquences VH de la lignée BL2 présentant un nombre donné de mutations, 25 respectivement dans des cellules transfectées avec 1'AID sauvage et dans des cellules transfectées avec l'AID mutant (SEQ ID NO.1 selon la présente invention). DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Le gène AID (voir Fig. 1) est responsable de l'initiation du processus d'hypermutation par déamination des cytidines du gène V des immunoglobulines en uraciles, ce qui conduit à une réparation ou une réplication erronée de ces bases anormales dans l'ADN. L'AID est une protéine essentiellement cytoplasmique, qui doit être 35 ciblée dans le noyau d'une cellule pour y exercer son activité de déamination. Or, l'AID circule en permanence entre noyau et cytoplasme (voir, par exemple, S. Ito et al., PNAS, 17 février, 2004, vol. 101, No. 7, pp. 1975-1980), et sa localisation cytoplasmique résulte d'un export actif du noyau, effectué par la protéine CRM1 (voir, par exemple, K.M. McBride et al., J. Exp. Med., vol. 199, No. 9, 3 mai 2004, pp. 1235-1244). Celle-ci reconnaît un site consensus, présent dans la protéine AID. On a alors maintenant trouvé que l'on peut interrompre cet export et obtenir une localisation essentiellement nucléaire de la protéine AID en effectuant une mutagenèse de trois acides aminés hydrophobes de ce site consensus de la protéine AID, à savoir 1eu189, phe193 et 1eu196, en alanine. On a ainsi trouvé expérimentalement que la mutagenèse observée au locus des immunoglobulines est augmentée de 5 à 10 fois, de façon constitutive, par rapport au taux de mutation que l'on obtiendrait toutes choses égales par ailleurs avec les techniques connues rappelées plus haut. La séquence codante nucléotidique de l'AID humaine portant la mutation indiquée ci-dessus sur les positions appropriées est représentée, avec le peptide codé par ladite séquence, par la séquence SEQ ID NO.1, comportant les mutations des trois acides aminés 1eu189, phe193 et 1eu196 en alanine sur la séquence de l'AID. Cette mutagenèse, s'effectue selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. L'effet procuré p4ar le procédé selon l'invention est attesté par les résultats d'expériences (effectuées de manière traditionnelle, conforme à la pratique connue de l'homme du métier) résumés dans les schémas des Figs 25 2A-B annexées. On a ainsi trouvé que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation nettement accéléré sur leurs gènes d'immunoglobulines, contrairement aux données de la technique antérieure, selon lesquelles un processus comparable était long et fastidieux à mettre en oeuvre, ou nécessitant d'autres techniques pour atteindre une mutation quelque peu accélérée. Au surplus, le procédé selon l'invention procure une remarquable distribution du nombre des mutations obtenues (voir Fig. 2B). La fréquence de mutation (pour 100 paires de bases) s'est avérée être 35 de 0,22 % pour des cellules transfectées avec le gène d'AID mutant selon l'invention avec seulement les 3 acides aminés 189, 193 et 196 remplacés par l'alanine (soit SEQ ID NO.1), contre seulement 0,05 % pour des cellules transfectées avec l'AID humaine sauvage selon la séquence représentée sur la Fig. 1. Plus précisément, on a maintenant trouvé de manière inattendue que, avec pour modèle la cellule BL2, on peut réaliser in vitro dans des conditions de rapidité et d'efficacité très exceptionnelles, l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées en transfectant les cellules à faire muter avec au moins un gène AID mutant tel que décrit plus haut et 10 représenté par SEQ ID NO.1, avec dans le listage des séquences SEQ ID NO.2 représentant le peptide codé par ladite séquence. L'invention a ainsi pour premier objet un procédé pour l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro ou ex vivo, comportant (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d' un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine dans chaque cas. Selon une caractéristique, l'induction de mutations somatiques selon 20 l'invention est mise en oeuvre sur une durée d'au moins 7 jours, et plus préférablement sur une durée d'environ 8 jours. Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention ne comporte pas la mise en oeuvre de co-cultures avec des cellules d'un autre type cellulaire, notamment avec une cellule T. Selon une caractéristique particulière, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. L'invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé d'induction de mutations somatiques pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. Les modalités pratiques les plus appropriées pour l'utilisation du procédé d'accélération des mutations somatiques conformément à l'invention sont parfaitement connues de l'homme du métier, qui dispose à cet égard de moyens de routine et/ou d'essais pour l'ajustement des paramètres, en cas de besoin. Sous un premier aspect de l'invention, cette utilisation est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. Sous un autre aspect de l'invention, cette utilisation est appliquée à d'autres cellules immortalisées productrices d'anticorps, à savoir les hybridomes de souris ou les lignées B humaines immortalisées par le virus de l'Epstein-Barr (EBV). L'invention a ainsi également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour l'induction de mutations somatiques sur les gènes d'immunoglobulines de cellules immortalisées productrices d'anticorps, notamment celles choisies parmi les hybridomes de souris, les hybridomes humains et les lignées B humaines immortalisées par le virus Epstein-Barr. On utilise pour ce faire des techniques similaires à celles préconisées pour les lymphomes de Burkitt. Pour l'induction de mutations somatiques in vitro notamment sur la cellule BL2 conformément à l'invention, on procède en pratique par transfection de cellules, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. L'invention a également pour objet un kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques adcélérées tel que défini plus haut. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ce kit pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, 25 notamment par l'analyse des protéines. Dans une forme de réalisation, l'utilisation du kit selon l'invention comporte l'identification des modifications post-traductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. Selon une caractéristique de mise en oeuvre préférée, cette utilisation comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur ("enhancer" des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. Selon une forme de réalisation avantageuse, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. L'homme du métier est ainsi apte à concevoir, sur la base des indications ci-dessus et de ses connaissances propres, sans sortir du cadre de la présente invention, des systèmes de test analogues ou équivalents et des utilisations concrètes différentes, apparentées ou non à celles qui sont décrites ici. TABLEAU EXPLICITANT LA SÉQUENCE SEQ ID NO.: 1: 1/1 31/1.1 atg.gac 41c. etc t*tg atg aac pgg agg aa.g ttt ctt tac caa ttc aaa aat gtc cgc tgg,M 'D S L L _M N R R K F L Y Q F K N V R W 61/21 91/31 gct aaÉg ggt cgg. E5t gag. ïcc tac ctg tgc tac sgÉta gtg aag agg cgt'gac agt get aca A K G.R 1 2 H 1 ' Y L 'C Y FJ V K R R. D S A T 121/41 15 /51 tec ttt tca tg.g.q ttt ggt:tat ctt agé aat aag a,aç ggc tgc cap gtg gaâ ttg ctc S F S L E.F G Y L T N G C S V E L L 181/61 211/71 ttc ôta cgc.ta,e atcÉt 4ac.co.c aac ctc.tigt ctg.agg atc 'Etc acc gcg cgC etc tac ttc tgt gag gac cgc aag iT P 'N.L.H L R I F T. A R..L Y F C E D R K 361/12.1 391/131 get 447 C7cc gag ggg çtg agc;j bgg ctg c.ac o0c gcc ggg gtg caa ata gcc atc atg acc A E' P E G L ' lft 'R Z. .H R A G V Q I A I M T 421/141 451/15.1 ttc aaa gat tat ttt tac tgc tgg âat act ttt gta: gaa aac cac gaa aga act ttc aaa F K.D Y F Y C W N T F V E N ÉH E R T FÉ K 481/1. 511/171 gcc tgg gaa Éggg ct5 oâ.t'gaa 4at tca gtt c.gt ctc tcc aga c4g ctt cgg'cgc.atc -ctt A W É 'G L H E N S, V R L 'S.R Q L R R I L 541/181 ttg ccc ot.g tat gag gtt gat gac. L P L Y. E V.D 571/19a cga g.c gcâ 1t D A gça. A got,A. gga ctt tga G L * A ç.gt act R T REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro, caractérisé en ce qu'il comporte l'expression dans les cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient une localisation essentiellement nucléaire de la protéine AID en effectuant une mutagenèse de trois acides aminés hydrophobes du site consensus de la protéine AID, à savoir 1eu189, phe193 et 1eu196, en alanine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour la réalisation in vitro de l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées, on transfecte les cellules à faire muter avec un gène AID mutant représenté par SEQ ID NO.1. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes leu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur une durée d'au moins 7 jours, de 30 préférence sur une durée d'environ 8 jours. 6. Séquence codante nucléotidique de l'AID humaine mutée, caractérisée en ce qu'elle est représentée, avec le peptide codé par ladite séquence, par la séquence SEQ ID NO.1. 2890660 9 7. Utilisation de la séquence SEQ ID NO. 1 selon la revendication 6 pour l'induction in vitro de mutations somatiques dans des cellules appropriées, par transfection des cellules à faire muter avec un gène AID mutant représenté par SEQ ID NO.1. 8. Utilisation du procédé d'induction selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. 9. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. 10. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1-5 pour l'induction des mutations somatiques sur les gènes d'immunoglobulines de cellules immortalisées productrices d'anticorps, notamment celles choisies parmi les hybridomes de souris, les hybridomes humains et 11es lignées B humaines immortalisées par le virus Epstein- Barr (EBV). 11. Kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques accélérées comprenant au moins une séquence selon la revendication 6. 12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est utile pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, notamment par l'analyse des protéines. 13. Utilisation du kit selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification des modifications posttraductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant 5 le promoteur et l'activateur des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. 15. Utilisation selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. 16. ADNc, caractérisé en ce qu'il exprime un gène AID modifié dans 15 lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et leu196 de l'AID humaine par mutation en alanine.