FR 2892423 A1 20070427 FR 0510748 A 20051021 LIGNEES CELLULAIRES RECOMBINANTES POUR LA PRODUCTION STABLE ET A HAUT NIVEAU DE PROTEINES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES La présente invention se rapporte au domaine de la production stable et à haut niveau de protéines biologiquement actives à des fins aussi diverses que, par exemple, la recherche, les applications industrielles (notamment, pour l'industrie agro-alimentaire ou pharmaceutique) et médicales (pour la thérapie ou le diagnostic). Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de lignées cellulaires recombinantes particulières pour produire des protéines d'intérêt biologiquement actives de manière stable et à haut niveau. L'invention a également pour objets ces lignées cellulaires recombinantes, ainsi qu'un procédé de production stable et à haut niveau de protéines d'intérêt biologiquement actives, mettant en oeuvre de telles lignées cellulaires recombinantes. La voie de signalisation Wnt joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire, la différentiation de nombreux types de cellules, et l'oncogénèse (Peifer et Polakis, 2000). Les protéines Dickkopf (DKK) sont des inhibiteurs sécrétés de la voie Wnt (voir la demande internationale WO 00/12708 publiée le 09/03/00, sous la rubrique PRO1316). La protéine DKK-1 (WO 99/22000 publiée le 06/05/99) est capable d'induire la formation de la tête chez le Xénope en inhibant la signalisation Wnt (Glinka et al, 1998). On a également montré que DKK-1 était impliquée dans le développement des membres (Grotewold et al, 1999) et inhibait les transformations morphologiques induites par Wnt (Fedi et al, 1999). A ce jour, quatre protéines DKK ont été identifiées chez les mammifères : DKK-1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 (Krupnik et al, 1999). Les protéines DKK sont des cibles potentielles de choix pour le criblage des dysfonctionnements de la voie Wnt et la mise au point de moyens diagnostiques et thérapeutiques adaptés. A ce titre, ces protéines, et en particulier la protéine DKK-1, intéressent un grand nombre d'équipes scientifiques à travers le monde. Or, les travaux de recherche et développement conduits par ces équipes nécessitent, pour être menés à bien, de grandes quantités de protéine biologiquement active. C'est précisément afin de répondre à ce besoin que les Inventeurs ont cherché des moyens et procédés efficaces pour produire de grandes quantités de protéine DKK, notamment DKK-1, biologiquement active. Et les moyens et procédés proposés dans le cadre de la présente invention permettent pour la première fois de combler ce besoin de manière satisfaisante, notamment en termes de (i) simplicité et temps de mise en oeuvre, (ii) coût et (iii) efficacité. En réfléchissant aux moyens de résoudre le problème technique susmentionné, les Inventeurs ont découvert qu'il était possible de produire une protéine d'intérêt biologiquement active, notamment une protéine DKK telle que DKK-1, en utilisant des cellules recombinantes dérivées d'une lignée habituellement proposée dans le commerce pour réaliser des expériences de tranfection transitoire. En outre, les Inventeurs ont pu s'apercevoir que la production de protéines par ces cellules présentait l'avantage d'être aisée, stable dans le temps et à haut niveau. Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire recombinante dérivée de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F (commercialisée par Invitrogen) pour la production stable et à haut niveau d'une protéine d'intérêt biologiquement active. Par lignée cellulaire recombinante dérivée de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F , l'on entend ici une lignée cellulaire obtenue à partir de la lignée FreeStyleTM 293-F, en introduisant dans celle-ci, par des techniques classiques de biologie moléculaire, une séquence d'acide nucléique exogène codant pour la protéine d'intérêt que l'on souhaite produire. Par séquence d'acide nucléique exogène , l'on désigne ici une séquence qui n'est pas naturellement présente dans les cellules FreeStyleTM 293-F. Cette séquence peut être naturelle, synthétique ou recombinante. Elle peut correspondre à une séquence native ou modifiée, notamment par ajout et/ou suppression et/ou substitution d'une ou plusieurs bases. La séquence exogène peut être portée par un vecteur (ou plasmide) contenu dans les cellules, ou bien être intégrée au chromosome des cellules. Elle peut également être présente dans les cellules à raison d'une ou plusieurs copies. Dans le cas où les cellules en contiennent chacune plusieurs copies, ces copies peuvent être portées par un ou plusieurs vecteurs, ou par le chromosome. En tous les cas, la séquence exogène introduite dans les cellules de la lignée FreeStyleTM 293-F code pour une protéine fonctionnelle, c'est-à-dire que l'activité biologique de la protéine est préservée. Dans le contexte de la présente invention, les termes et expressions fonction ou fonction biologique ou activité ou activité biologique sont équivalents. De même, les formules protéine biologiquement active ou protéine active ou protéine fonctionnelle pourront être utilisées indifféremment dans ce qui suit. L'activité biologique de la protéine est préservée ou conservée ou maintenue Si elle correspond à celle de la protéine native. En d'autres termes, soit l'activité biologique de la protéine codée par la séquence d'acide nucléique exogène est identique à celle de la protéine native, soit la différence entre les deux activités n'est pas significative. La production de la protéine est considérée comme stable au sens de la présente invention lorsqu'elle est présente un niveau régulier, sensiblement constant sur une période d'au moins 15 jours, de préférence d'au moins un mois, de préférence encore d'au moins 1,5 mois, ou mieux, d'au moins 2 mois, d'au moins 2,5 mois, ou encore d'au moins 3 mois, voire sur des périodes plus longues encore. La production de la protéine est à haut niveau lorsqu'elle atteint des rendements d'au moins 2 mg de protéine par litre de milieu de culture, de préférence d'au moins 4 mg de protéine par litre de milieu de culture, de préférence encore d'au moins 6 mg de protéine par litre de milieu de culture, de manière encore préférée d'au moins 8 mg de protéine par litre de milieu de culture et mieux, d'au moins 10 mg de protéine par litre de milieu de culture, voire bien au-delà. Puisque les cellules FreeStyleTM 293-F se cultivent en suspension, il est facile pour l'homme du métier d'augmenter le volume et/ou le nombre des unités de production, notamment des bioréacteurs. C'est pourquoi, les moyens de la présente invention permettent avantageusement une production de la protéine à grande échelle. Les propriétés qualitatives et quantitatives de la production des protéines (notamment la stabilité et le rendement) pourront éventuellement dépendre, de manière plus ou moins notable, des conditions mises en oeuvre. Si nécessaire, l'homme du métier pourra sans difficulté adapter, à l'aide de simples tests de routine, les conditions de mise en oeuvre de la présente invention, par exemple à partir des informations rapportées dans les exemples ci-dessous, en fonction de la protéine qu'il souhaite produire. Selon un mode de réalisation, la protéine que l'on souhaite produire présente un intérêt industriel, médical et/ou pour la recherche. Selon un autre mode de réalisation, la protéine est une protéine mature. Par protéine mature , l'on désigne ici une protéine qui peut avoir subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles. Parmi les modifications post-traductionnelles, l'on peut notamment citer les glycosylations, les ponts disulfures, les acétylations, les amidations, les biotinylations, les carboxylations, les hydroxylations, les méthylations, les phosphorylations, les sulfatations. Les modifications post-traductionnelles sont bien connues de l'homme du métier. En tout état de cause, la protéine mature au sens de l'invention possède une activité biologique conforme à celle attendue (par exemple, d'après la littérature). Selon encore un autre mode de réalisation, la protéine d'intérêt à produire est la protéine DKK1. De préférence, il s'agit de la protéine DKK1 d'origine murine. Conformément aux exemples ci-dessous, la protéine DKK1 produite selon l'invention peut comprendre des séquences additionnelles, telles que des étiquettes V5 et/ou 6His, notamment utiles pour faciliter la détection et, le cas échéant, la purification de la protéine. La lignée cellulaire recombinante peut avantageusement être choisie parmi les lignées 1B9 et 3F8 (citées dans les exemples ci-après) respectivement déposées à la CNCM le 04/07/2005 sous les n 1-3472 et I-3473. Une lignée cellulaire recombinante préférée est la lignée 3F8 déposée à la CNCM le 04/07/2005 sous le n I-3473. Un deuxième aspect de la présente invention concerne une lignée cellulaire recombinante comme décrit plus haut. Une telle lignée cellulaire dérive de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F et est capable de produire, de manière stable et à haut niveau, une protéine d'intérêt biologiquement active. Selon un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire recombinante conforme à la présente invention est choisie parmi les lignées 1B9 et 3F8 respectivement déposées à la CNCM le 04/07/2005 sous les n I-3472 et 1-3473. Une lignée cellulaire recombinante préférée est la lignée 3F8 déposée à la CNCM le 04/07/2005 sous le n 1-3473. La présente invention s'intéresse également aux vecteurs d'expression des protéines d'intérêt qui seront, le cas échéant, contenus dans les cellules de la lignée recombinante dérivée des cellules FreeStyleTM 293-F. Un exemple de vecteur d'expression de la protéine DKK1 d'origine murine est le vecteur pSK-GW-032 décrit dans les exemples ci-dessous. Ce vecteur est contenu dans les lignées cellulaires recombinantes 1B9 et 3F8 respectivement déposées à la CNCM le 04/07/2005 sous les n I-3472 et I-3473. Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour la production stable et à haut niveau d'une protéine d'intérêt biologiquement active, ledit procédé comprenant au moins : a) la culture d'une lignée cellulaire recombinante comme décrit plus haut dans des conditions appropriées ; et b) la récupération de ladite protéine. La détermination des conditions de culture appropriées relève des connaissances générales de l'homme du métier, qui pourra en outre se référer aux suggestions du fabricant de la lignée FreeStyleTM 293-F. Selon un mode de réalisation, la culture de l'étape a) est précédée par au moins : i) la construction d'un vecteur d'expression de ladite protéine ; ii) la transformation de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F avec le vecteur préparé dans l'étape i). Les étapes i) et ii) font appel aux connaissances générales de l'homme du métier qui pourra, s'il le juge utile, s'inspirer des procédures expérimentales décrites dans les exemples qui suivent. Selon un autre mode de réalisation, la culture de l'étape a) est mise en oeuvre en suspension. Les suspensions cellulaires peuvent être réalisées d'après les méthodes classiques, par exemple en erlenmeyer, en fernbach, ou en bioréacteur, en mode continu ou discontinu. Selon encore un autre mode de réalisation, la culture de l'étape a) est mise en oeuvre dans un milieu dépourvu de sérum animal. Avantageusement, l'homme du métier choisira le milieu de culture commercial FreeStyleTM 293 Expression Medium (Gibco, # 12338-018). Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé objet de la présente invention comprend en outre une étape de purification de la protéine, cette purification n'altérant pas, ou pas de manière significative, l'activité biologique de la protéine. La purification peut être réalisée selon des méthodes conventionnelles telles que la purification sur colonne d'affinité au chélate de nickel, la chromatographie échangeuse d'ions (anionique ou cationique), la chromatographie sur colonne héparinesépharose, etc. Avantageusement, l'étape de purification ainsi mise en oeuvre permet d'obtenir une protéine pure à au moins 80% environ, de préférence au moins 85% environ, de préférence encore au moins 90% environ, de manière encore préférée au moins 95% environ, voire au-delà. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé objet de la présente invention est mis en oeuvre à grande échelle. Par à grande échelle , on entend désigner ici une capacité de production élevée par l'utilisation d'unités de production de grand volume et/ou en grand nombre. A titre purement indicatif, on peut considérer que la production est à grande échelle à partir du moment où l'on prépare, par exemple, au moins 100 litres de surnageant de culture (si plusieurs réacteurs sont utilisés, le volume de culture dans chacun d'eux peut être réduit de manière proportionnelle tout en demeurant sur une production à grande échelle ). Les figures suivantes sont destinées à illustrer, en relation avec les exemples ci-dessous, des modes de réalisation particuliers de la présente invention : Fig. 1A : Effet de l'addition d'héparine dans le milieu de culture sur la quantité de DKK1-V5-6His récoltée ( Dot Blot semi-quantitatif). A, B et C correspondent aux dépôts de 100 l de surnageant de culture des 3 clones différents exprimant DKK1-V5-6His. Fig. 1B: Analyse de l'expression dans différents clones cellulaires ( Dot blot ) Fig. 1C : Analyse de l'expression sur des milieux de culture concentrés SDS-PAGE 10 à 20 % avec coloration au bleu de coomassie Pistes 1 à 3 : BSA (0,2 ; 1 et 2 pg) Pistes 4 à 6 : cellules parentales 293-F, surnageant de culture concentré 12,5 fois (5, 10, 20 pl) Piste 7 : Seeblue MW (5 pl) Pistes 8 à 10 : clone 3F8, surnageant de culture concentré 12,5 fois (5, 10, 20 pl) Fiq. ID : Clarification des extraits bruts par filtration SDS-PAGE 10 à 20 % avec coloration au bleu de Coomassie 1 : Matériel de départ 2 : Filtration sur membrane de 0,8 pm (membrane Millex AA MCE) 3 : Filtration sur membrane de 0,45 pm (membrane Millex AV PVDF) 4 : Filtration sur membrane de 0,2 pm (membrane Millex AV PVDF) 5 : Deux filtrations successives sur membrane de 0,2 pm (membrane Millex GV Durapore). Fig. 1E : Clarification des extraits bruts par centrifugation A. Surnageants de culture cellulaire B. A clarifié par centrifugation à 16000 x g pendant 3 h C. B + tampon contenant 20 mM d'imidazole D. Culot de centrifugation (concentré 10 fois) E. Passage à travers la colonne de nickel MW. Standard de poids moléculaire Fiqure 2A : Analyse de la pureté de la protéine purifiée sur les fractions d'élution de la colonne chélate de nickel SDS-Page 10-20% avec coloration au bleu de coomassie MW. Standard de poids moléculaire Charge: 411I de chaque fraction Figure 2B : analyse de l'activité inhibitrice de DKK1-V5-6His sur la voie 25 métabolique de transduction Wnt Effet-dose de DKK1 sur L21 +1- Wnt3a Protéine DKK1-V5-6His : lot 1029- 123P (conservation à 4 C pendant 5 jours avant le test). Concentration estimée à 0,5 mg/ml. Dilution de la protéine dans milieu Opti DMEM. Concentration de protéine DKK1 30 exprimée en ng/ml final. Témoin : cellules non traitées avec Wnt mais exposées à diverses quantités de DKK1. Contrôle : cellules traitées par Wnt sans DKK1 Figure 3A : analyse de l'état d'oligomérisation de DKK1 par 5 chromatographie d'exclusion sur colonne Superdex 200 HR 10-30 (24 ml) Tampon : PBS. Injection : 250 pl du lot 1061-40P. Débit 0,4 ml/min P1 : pic1 ; P2 : pic2 ; P3 : pic3 Figure 3B : SDS-PAGE/bleu de Coomassie sur les fractions Dépôt : 20 gl de chaque fraction 10 Figure 3C : activité spécifique sur la voie Wnt Figure 4A : Analyse par Western Blotting de l'effet d'un traitement des cellules 3F8 à la tunicamycine sur la migration électrophorétique de la protéine DKK1-V5-6His Charge : 16 pl de surnageant de culture du clone 3F8 cultivé 15 pendant 24 h en présence de la quantité indiquée de tunicamycine. Figure 4B Etude de déglycosylation native 1 : aucun traitement 2 : incubation à 37 C sans enzyme de déglycosylation 20 3 : incubation avec PNGase 4 : incubation avec PNGase et neuraminidase : incubation avec neuraminidase D'autres aspects, modes de réalisation et avantages pourront 25 ressortir des exemples suivants, destinés à illustrer, sans aucune limitation, l'objet de la présente invention. 30 EXEMPLES Résumé des exemples expérimentaux La séquence de DKK1 murine a été clonée en amont de la séquence du peptide signal d'IgK pour la sécrétion par des cellules de mammifère et fusionnée à des étiquettes V5 et 6 His pour la détection et la purification. L'expression était placée sous le contrôle du promoteur constitutif pEF-1 alpha. Cette construction a été transfectée dans cinq lignées différentes de cellules de mammifère pour produire la protéine recombinante dans le milieu de culture. Des clones transfectés de manière stable ont été obtenus pour toutes ces lignées et les niveaux d'expression les plus élevés ont été observés à partir des clones obtenus avec la lignée de cellules FreeStyleTM 293-F disponible dans le commerce. Ces cellules peuvent être cultivées en suspension, ce qui permet une production à haut niveau facile, en bioréacteur (par lots ou par perfusion). Leur milieu de culture commercial est dépourvu de sérum animal, éliminant ainsi les problèmes de contamination potentiels et permettant une purification facile de la protéine par une procédure en une étape. Un niveau de production élevé peut être maintenu dans le temps sans difficulté, notamment pendant au moins 2 mois. La protéine DKK1 ainsi produite était mature, c'est-à-dire qu'elle présentait des modifications posttraductionnelles et qu'elle était hautement active dans des essais biologiques. I- Procédures expérimentales 1-1- Réactifs : Chlorhydrate de trizma (Sigma # T-3253), trizma base (Sigma # T-1503), NaCl (Fluka # 71376), acide tétra-acétique éthylène-diamine (EDTA, Sigma # E-5391), imidazole (Fluka # 56750), hexahydrate de sulfate de nickel (Fluka # 72280). 1-2- Vecteurs Vecteur pSK-GW-032 La séquence de Dkkl de souris dépourvue du peptide signal supposé (de l'aa3l jusqu'à l'extrémité) a été amplifiée à partir d'une banque d'ADNc en utilisant des amorces contenant les sites de restriction Hindlll et EcoRl. Le produit de PCR a tout d'abord été cloné dans le plasmide pSecTag-2C (Invitrogen) digéré par Hindlll/EcoRl. La séquence Igk-Dkkl (aa31-extrémité) en phase ainsi obtenue a ensuite été amplifiée en utilisant des amorces conçues pour permettre la recombinaison dans le plasmide d'entrée pDONR201 (Invitrogen). La séquence Igk-Dkkl (aa3lextrémité) a finalement été clonée par recombinaison dans le plasmide d'expression mammifère accepteur pEF-Dest 51 (Invitrogen). 1-3- Culture cellulaire : Toutes les cellules utilisées dans ces travaux étaient des lignées de cellules de mammifères disponibles dans le commerce : HEK-293 (ATCC CRL-1573), BHK-21 (ATCC CCL-10), CHO (ATCC CCL-61), cellules L (banque de cellules RIKEN) et cellules FreeStyleTM 293-F (Invitrogen #R790-07). Les cellules L ont été cultivées dans du DMEM (Gibco # 31053-028), les cellules CHO, dans du DMEM (Gibco # 31053-028)1F12 (HAM) (Gibco #21765-029), les cellules BHK dans du DMEM/F12 (sans rouge de phénol) (Gibco #21041-025) et les cellules HEK-293 dans du DMEM avec glucose à raison de 4,5 g/litre (Gibco # 041-01966). Tous ces milieux ont été complétés avec 5 % FBS (Sigma # F2442), 1 % pyruvate de sodium (BioWhittaker # BE13-115E), 1 % L-glutamine (BioWittaker # BE17-605E), 100 U/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine (BioWhittaker # DEI 7-602E). Les cellules FreeStyleTM 293-F ont été cultivées dans un milieu 30 d'expression FreeStyle 293 (Gibco # 12338-018) contenant 100 U/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine. De la blasticidine à 0,5 pg/ml (Invitrogen #R210-01) a été ajoutée pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable. De l'héparine (Sigma # H3149) a été ajoutée à 0,1 g/litre pour la production. 1-4-Obtention de cellules permettant une expression stable Différentes lignées de cellules de mammifères disponibles dans le commerce (HEK-293, BHK-21, CHO, cellules L et FreeStyleTM 293-F) ont été transfectées avec le vecteur pSK-GW-032. Des clones permettant une expression stable ont été obtenus pour chaque lignée cellulaire après sélection avec 10 pg/ml de blasticidine (Invitrogen, #R210-01). Après sélection à l'acide de blasticidine, un sous-clonage a été réalisé dans des plaques à 96 puits par dilution des cellules et l'expression de la protéine DKK1 a été évaluée pour tous les clones par analyse par buvardage ( Dot blot ). I-5- Production à haut niveau - Essai de perfusion Pour la production à haut niveau, le clone 3F8 (CNCM 1-3473) a été choisi. La production a été testée avec succès en utilisant 3 approches différentes : Erlenmeyer plastique en agitation dans un incubateur sous 8 % de CO2 (INFORS), bouteille de production de type CellSpin (Integra Biosciences) dans un incubateur sous 8% de CO2 et bioréacteur, soit en mode discontinu, soit en mode perfusion. 1-6- Blots : Pour le Western blot, une électrophorèse a été réalisée selon la méthode SDS-PAGE. Les protéines ont ensuite été transférées du gel sur une membrane PVDF (Biorad) en appliquant un courant de 45 mA constant toute la nuit dans une cellule de transfert (X cell Il Invitrogen) baignant dans du tampon de transfert Tris glycine (Invitrogen # LC 3675) . Pour les Dot blots , des filtres de nitrocellulose (Hybond ECL, Amersham # RPN 303D, 11 cm x 7,5 cm) ont été incubés avec du PBS avant dépôt de 100 pl de milieu conditionné par puits, puis chaque puits a été lavé à 3 reprises avec 200 pl de PBS. Dans les deux cas, la saturation des filtres était de 1 heure à température ambiante dans du PBS contenant 5 % de lait écrémé (Difco #232100) et 0,5 % Tween 20 (Fluka # 93773), suivie d'une incubation pendant la nuit à 4 C avec l'anticorps primaire (anti-tétra His (Qiagen # 34670) à 0,05 pg/ml final) dans le même tampon. Après 3 lavages pendant 15 min dans du PBS 1X + 0,2 % Tween 20 + 0,35 M NaCl, les filtres ont été incubés avec l'anticorps secondaire (IgG de mouton antisouris (Amersham # NA931V), dil. 1/2000) pendant 1 heure dans du PBS 1X + 5 % lait écrémé + 0,5% Tween 20 à température ambiante. Après 3 lavages pendant 15 min dans du PBS 1X + 0,2 % Tween 20 + 0,35 M NaCl, les dots ont été révélés en utilisant la solution ECL (Amersham # RPN 2132) et un phospho-imageur Fx. 1-7- Purification de la protéine Le milieu conditionné (MC) a été centrifugé à 500 x g pendant 10 min pour éliminer les débris cellulaires puis conservé à -20 C jusqu'à utilisation. Après décongélation, le tampon 10 X a été ajouté au MC pour obtenir 50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl et 20 mM imidazole en concentrations finales. La clarification de la solution a été effectuée par filtration sur membrane de 0,22 pm GP Express PLUS (Millipore # SCGPUO2RE) ou centrifugation à 8000 x g pendant 3 heures 30 à 4 C. Le milieu clarifié a ensuite été chargé à 5 ml/min (c'est-à-dire 56,6 cm/h) sur une colonne d'affinité de 50 ml (résine chélatante Sepharose Fast Flow (Amersham # 17-0575-02) chargée tout d'abord avec 0,5 M de solution d'hexahydrate de sulfate de nickel, puis équilibré dans un tampon A (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCI et 20 mM imidazole)). Après lavage complet dans le tampon A, l'élution a été réalisée en utilisant un gradient d'imidazole jusqu'à 250 mM. 1-8- Caractérisation de la protéine La technique classique (SDS-PAGE avec coloration au bleu de Coomassie) a été mise en pratique. Des expériences de déglycosylation ont été effectuées sur la protéine purifiée à l'aide de N-glycosydase (Roche #1365169) ou Neuraminidase (SIGMA # N8271) dans les conditions préconisées par les fournisseurs. L'existence d'une modification post-traductionnelle de type glycosylation a aussi été mise en évidence directement in vivo en traitant les cellules avec différentes concentrations de tunicamycine (SIGMA # T7765) pendant 24 heures. L'état d'oligomérisation de DKK1-V5-6His a été analysé par séparation sur chromatographie d'exclusion en utilisant une colonne Superdex HR 10-30 (Amersham BioScience #17-108801) équilibrée sous PBS. 1-9- Dosaqe de l'activité de la protéine DKK1 Des cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 24 puits à raison de 2 x 104 cellules/cm2 24 heures avant transfection, puis elles ont été transfectées de manière transitoire avec les constructions indiquées (1 pg d'ADN total) en utilisant le complexe ADN-lipide Fugene 6 (Boehringer Manheim) selon le protocole du fabricant. 16 heures après transfection, les cellules ont été lavées et cultivées dans un milieu contenant 2 % de sérum de veau foetal pendant encore 48 heures dans les conditions indiquées. L'activité luciférase a ensuite été déterminée dans les cellules. Les constructions exprimant TCF1 (300 ng/puits) ont été transfectées conjointement avec la TOPFLASH-luciférase (200 ng/puits). Pour évaluer l'efficacité de la transfection, 20 ng de pRL-TK (Promega) codant pour le gène de la luciférase Renfila en aval d'un promoteur minimal HSV-TK ont été systématiquement ajoutés au mélange de transfection. Les dosages de la luciférase ont été réalisés avec le kit d'essai Dual Luciferase (Promega) selon les instructions du fabricant. Tout d'abord, la luciférase de luciole a été dosée dans 10 pl de lysat cellulaire, puis l'activité de la luciférase Renifla a été déterminée. L'activité de la luciférase de luciole a été normalisée par rapport à l'activité de luciférase Renifla. Pour tester l'activité de la protéine DKK1 recombinante, les cellules transfectées ont été traitées avec la concentration indiquée en présence de milieu Wnt3a conditionné. Le milieu Wnt3a conditionné (Wnt3a-MC) a été préparé à partir de cellules L produisant Wnt-3a comme le décrivent Shibamoto et coll. (Shibamoto, 1998). Des témoins ont été réalisés avec Wnt3a en l'absence de protéine recombinante DKK1 ou avec les cellules en l'absence de protéines Wnt3a-MC et DKK1 recombinantes. II- Résultats Il-1- Obtention de cellules permettant une expression stable et production de la protéine Différentes lignées de cellules de mammifères disponibles dans le commerce (cellules HEK-293, BHK-21, CHO et cellules L) ont été transfectées avec le vecteur pSK-GW-032. Des clones permettant une expression stable ont été obtenus pour chaque lignée de cellules après sélection avec 10 pg/ml de blasticidine. Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats quant aux clones d'expression les plus intéressants. 30 TABLEAU1 Clones Clones Taux congelés positifs d'expression isolés le plus élevé Cellules HEK 15 3 0,25 mg/litre adhérentes BHK 19 12 0,25 mg/litre CHO 29 6 0,05 mg/litre Cellules L 38 20 2 mg/litre Cellules Cellules 293 F 10 mg/litre non adhérentes Pour estimer le niveau d'expression de chaque clone, une analyse par buvardage ( Dot Blot ) semi-quantitative a été effectuée avec la protéine GST-6His-RANK comme témoin pour des quantités bien définies de protéine et la révélation a été faite à l'aide de l'anticorps anti-tétra His largement utilisé (Qiagen). Lorsque le milieu de culture a été supplémenté avec de l'héparine à raison de 0,1 g/litre, le taux de récupération de protéine DKK1 dans le milieu de culture était supérieur d'un facteur 10 (Fig. 1A). Les taux d'expression obtenus pour ces clones étaient similaires à ceux généralement obtenus pour descellules de mammifère, entre 0,1 et 2 mg de protéine d'intérêt par litre de milieu conditionné, en fonction de la lignée cellulaire et du clone analysé (Fig. 1B, tableau 1). Ces taux d'expression n'étaient pas satisfaisants dans la mesure où l'objectif était de produire plus de 100 mg de protéine. De plus, ces cellules étaient des cellules adhérentes qui ne sont pas facilement utilisables pour la production à haut niveau. La protéine DKK1 a alors été exprimée dans une lignée de cellules rendue assez récemment disponible dans le commerce et capable de se développer en suspension : les cellules FreeStyleTM 293-F. Cette lignée cellulaire n'avait été décrite que pour des expériences de transfection transitoire. La transfection a été réalisée comme le décrivait le fabricant. Après sélection sous blasticidine, un sous-clonage a été réalisé dans des plaques de 96 puits par dilution des cellules. L'expression a été testée pour tous les clones résistants par analyse par buvardage. Six clones se sont avérés fortement positifs et ont été amplifiés. Le taux d'expression des deux meilleurs clones (1 B9 [CNCM 1-3472] et 3F8 [CNCM I-3473]) a été testé par SDS-PAGE/coloration au bleu de Coomassie et estimé entre 4 et 10 mg de protéine DKKI/litre de milieu conditionné, en fonction des conditions de culture (Fig. 1C). La production à haut niveau a été réalisée en utilisant différentes approches de culture [CellSpin (12 litres), bioréacteurs régulés soit en mode discontinu (10 litres), soit en mode de perfusion (50 litres)] avec des taux d'expression similaires. II est apparu que les cellules étaient très robustes (bonne viabilité pendant l'expérience de perfusion) et que l'expression était constante pendant au moins 2 mois (données non représentées). Il-2 - Purification de la protéine L'étiquette carboxy-terminale 6His a été utilisée pour purifier la protéine. Les surnageants cellulaires ont été recueillis par centrifugation à petite vitesse et tamponnés en ajoutant 50 mM Tris à pH 8,0. Pour réduire la liaison non spécifique des protéines contaminantes sur la colonne de chélate de nickel, 20 mM d'imidazole et 150 mM NaCl ont été ajoutés à cette solution. Une deuxième clarification a été réalisée pour éliminer tout le matériel insoluble par centrifugation à vitesse élevée ou par filtration. Une liaison non spécifique se produisait lorsqu'une membrane de 0,8 pm Millex AA MCE était utilisée. La protéine n'était pas adsorbée sur une membrane de 0,2 pm Millex GV Durapore ou une membrane de 0,22 pm GP Express PLUS (Fig. 1 D). Pendant la charge, une perte faible mais constante du nickel initialement fixé sur la résine a été observée. Ceci limitait la quantité totale de milieu qui pouvait être chargée sur la colonne à 120 volumes de colonne sans perte de la protéine DKK1-V5-6His dans l'écoulement (ici, 6 litres utilisés pour la colonne de 50 ml). Dans ces conditions, la protéine a toujours été éluée entre 90 et 100 mM d'imidazole. Il-3- Caractérisation de la protéine Le degré de pureté de la protéine atteingnait environ 90 % après l'étape de purification sur chélate de nickel comme l'a montré l'analyse SDS-PAGE avec coloration au bleu de Coomassie des fractions d'élution (Fig. 2A). Comme cela a déjà été décrit dans la littérature, la protéine DKK1 migrait selon un profil diffus à bandes multiples, caractéristique des protéines glycosylées. Tous les lots de protéine testés étaient biologiquement actifs comme l'ont montré les activités dose ù réponse satisfaisantes dans un essai cellulaire d'inhibition de la voie de transduction Wnt (Fig. 2B). Lorsque la protéine a été analysée en utilisant une colonne de chromatographie d'exclusion (résine Superdex 200), 3 pics distincts ont été observés par UV (280 nm) avec des temps de rétention compatibles avec des agrégats, des complexes de poids moléculaire élevés et la forme monomère (Fig. 3A). Ce résultat a été confirmé avec plusieurs préparations différentes. L'analyse par SDS-PAGE avec coloration au bleu de Coomassie a montré que l'essentiel de la protéine était élué avec un temps de rétention correspondant à celui des multimères et des monomères (Fig. 3B). Une légère différence a pu être constatée dans la composition des bandes entre ces deux pics. Les formes multimères et monomères des protéines ont été testées pour déterminer leur capacité d'inhibition de la voie Wnt. Elles présentaient la même activité (Fig. 3C). La protéine était bien glycosylée, comme le montre un décalage net de la migration sur SDS-PAGE de la protéine obtenue à partir de cellules 3F8 traitées à la tunicamicyne, un inhibiteur de la glycosylation (Fig. 4A). La viabilité des cellules (76 %) et la concentration cellulaire (4,45 x 105 cellules/ml) étaient réduites par rapport à celles des cellules non traitées (88 %, 8 x 105 cellules/ml) pour le traitement à la dose la plus élevée (100 ng/ml). Le type de glycosylation a été étudié en utilisant la protéine purifiée. Le traitement par PNGase a induit un décalage de toutes les bandes discrètes visualisées par SDS-PAGE/bleu de Coomassie, montrant clairement la présence de N-glycosylation (Fig. 4B). Néanmoins, le profil était toujours à bandes multiples, indiquant que la protéine restait hétérogène. Un décalage de la protéine a également été observé lorsqu'elle a été incubée avec la neuraminidase seule, montrant la présence d'acides sialiques à l'extrémité de la chaîne glucidique. Le cotraitement par PNGase et neuraminidase a entraîné un décalage plus important des bandes mais l'aspect restait hétérogène et il n'y avait pas de différence après des traitements plus longs (Fig. 4B). II a semblé que les acides sialiques étaient éliminés même après l'action de la PNGase, montrant que l'enzyme était partiellement active ou qu'il existait plusieurs sites de glycosylation dans la protéine. Le traitement par 0-glycosydase n'a pas entraîné de décalage de la protéine. REFERENCES Peifer et Polakis 2000. Science 287 :1606-1609 Glinka et al, 1998. Nature 391 :357-362 Grotewold et al, 1999. Mech. Dev. 89 :151-153 Fedi et al, 1999. J. Biol. Chem. 274 :19465-19472 Krupnik et al, 1999. Gene 238 :301-313 Shibamoto et al, 1998. Genes to Cells 3 : 659-67010 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une lignée cellulaire recombinante dérivée de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F pour la production stable et à haut niveau d'une protéine d'intérêt biologiquement active. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite production est stable sur une période d'au moins 15 jours, de préférence d'au moins un mois, de préférence encore d'au moins 2,5 mois. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite production est d'au moins 2 mg de protéines par litre de milieu de culture, de préférence d'au moins 6 mg de protéines par litre de milieu de culture, de préférence encore d'au moins 10 mg de protéines par litre de milieu de culture. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine présente un intérêt industriel, médical et/ou pour la recherche. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite protéine est une protéine mature. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 25 caractérisée en ce que ladite protéine est DKK1, de préférence d'origine murine. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite lignée cellulaire recombinante est choisie parmi les lignées 1B9 et 3F8, 30 respectivement déposées à la CNCM le 04/07/2005 sous les n 1- 3472 et 1-3473.20 8. Lignée cellulaire recombinante dérivée de la lignée de cellules de mammifère FreeStyleTM 293-F capable de produire, de manière stable et à haut niveau, une protéine d'intérêt biologiquement active. 9. Lignée cellulaire selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les lignées 1B9 et 3F8, respectivement déposées à la CNCM le 04/07/2005 sous les n 1-3472 et l-3473. 10 10. Procédé pour la production stable et à haut niveau d'une protéine d'intérêt biologiquement active, comprenant au moins : a) la culture d'une lignée cellulaire recombinante selon la revendication 8 ou 9 dans des conditions appropriées ; et b) la récupération de ladite protéine. 15 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à grande échelle.5