FR 2892725 A1 20070504 FR 0553302 A 20051031 1 ACIDES POLYGLUTAMIQUES FONCTIONNALISES PAR DES DERIVES DE L'HISTIDINE ET DES GROUPEMENTS HYDROPHOBES ET LEURS APPLICATIONS NOTAMMENT THERAPEUTIQUES La présente invention concerne des nouveaux matériaux biodégradables à base de copolyaminoacides, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s) actif(s) (PA). L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides modifiés. Ces compositions peuvent être du type de celles permettant la vectorisation de PA et se présentant, de préférence, sous forme d'émulsions, de micelles, de particules, de gels, d'implants ou de films. Les PA considérés sont, avantageusement, des composés biologiquement actifs et qui peuvent être administrés à un organisme animal ou humain par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, buccale, etc. Les PA plus particulièrement, mais non limitativement, concernés par l'invention sont des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligo ou des polynucléotides, et des molécules organiques. Mais il peut aussi s'agir de produits cosmétiques ou de produits phytosanitaires, tels que des herbicides, des insecticides, des fongicides, etc. Dans le domaine de la vectorisation des principes actifs notamment médicamenteux, il existe un besoin, dans beaucoup de cas : • de les protéger contre la dégradation (hydrolyse, digestion enzymatique 25 etc..), • et/ou de contrôler leur vitesse de libération afin de maintenir un niveau thérapeutique sur une durée définie, soit • et/ou de les véhiculer (en les protégeant) au site d'action. 30 A ces fins, plusieurs types de polymères ont été étudiés et certains sont même disponibles commercialement. On peut citer, par exemple, les polymères du type polylactique, polylactique-glycolique, polyoxyéthylène-oxypropylène, polyaminoacide ou encore polysaccharide. Ces polymères constituent des matières premières permettant de fabriquer, par exemple, des implants massiques, des microparticules, des nanoparticules, des 35 vésicules, des micelles ou des gels. Outre le fait que ces polymères doivent être adaptés à la fabrication de tels systèmes, ils doivent également être biocompatibles, non-toxiques, non-immunogènes, économiques et ils doivent pouvoir être facilement éliminés du corps 2 et/ou être biodégradables. Sur ce dernier aspect, il est de surcroît essentiel que la biodégradation dans l'organisme génère des produits non-toxiques. A titre d'illustration de l'art antérieur concernant des polymères employés comme matières 5 premières pour la réalisation de systèmes de vectorisation de PA, divers brevets ou demandes de brevet ou articles scientifiques sont évoqués ci-après. Le brevet US-B-4,652,441 décrit des microcapsules de polylactide encapsulant l'hormone LH-RH. Ces microcapsules sont produites en préparant une émulsion eau-dans-huile-dans- 10 eau et comprennent une couche interne aqueuse contenant l'hormone, une substance (gélatine) fixant cette dernière, une couche huileuse de polylactide, ainsi qu'une couche externe aqueuse (alcool polyvinylique). La libération du PA peut se faire sur une période de plus de deux semaines après injection sous-cutanée. 15 Le brevet US-B-6,153,193 décrit des compositions à base de micelles de poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) amphiphiles, pour la vectorisation d'anti-cancéreux tel que l'adriamycine. Akiyoshi et al. (J. Controlled Release 1998, 54, 313-320) décrivent des pullulans qui sont 20 rendus hydrophobes par greffage de cholestérol et qui forment des nanoparticules dans l'eau. Ces nanoparticules aptes à se complexer de manière réversible avec l'insuline, forment des suspensions colloïdales stables. Le brevet US-B-4,351,337 décrit des copolyaminoacides amphiphiles, à base de leucine et 25 de glutamate, utilisables sous forme d'implants ou de microparticules pour la libération contrôlée de principes actifs. La libération de ces derniers peut se faire sur une durée très longue dépendant de la vitesse de dégradation du polymère. Le brevet US-B-4,888,398 décrit des polymères à base de polyglutamate ou polyaspartate, 30 et éventuellement polyleucine, avec des groupements pendants de type alkyloxycarbonylméthyle, placés de façon aléatoire sur la chaîne polyaminoacide. Ces polyaminoacides, greffés par des groupements latéraux e.g. méthoxycarbonylméthyle, sont utilisables sous forme d'implants biodégradables contenant un PA à libération prolongée. 35 Le brevet US-B-5,904,936 décrit des nanoparticules obtenues à partir d'un polymère bloc polyleucine-polyglutamate, aptes à former des suspensions colloïdales stables et capables de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les dénaturer. 3 Ces dernières peuvent ensuite être libérées in vivo de manière contrôlée, sur une longue période. Le brevet US-B-5,449,513 décrit des copolymères bloc amphiphiles comprenant un bloc polyoxyéthylène et un bloc polyaminoacide, par exemple poly(béta-benzyl-L-aspartate). Ces polymères polyoxyéthylène-polybenzylaspartate forment des micelles qui sont aptes à encapsuler des molécules actives hydrophobes telles que l'adryamicine ou l'indométhacine. La demande de brevet WO-A-99/61512 décrit des polylysines et des polyornithines fonctionnalisées par un groupe hydrophobe (acide palmitique relié à la polylysine ou ornithine) et un groupe hydrophile (polyoxyéthylène). Ces polymères, par exemple la polylysine greffée avec des chaînes polyoxyéthylène et palmitoyle forment, en présence de cholestérol, des vésicules capables d'encapsuler la doxorubicine ou l'ADN. Ces polymères à base de polylysines sont cationiques en milieu physiologique. Le brevet US-B-6,630,171 de la demanderesse, décrit des polymères blocs ou aléatoires poly(glutamate de sodium)-poly(glutamate de méthyle, d'éthyle, d'hexadécyle ou de dodécyle), aptes à former des suspensions colloïdales stables et capables de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les dénaturer. Ces dernières peuvent ensuite être libérées in vivo de manière contrôlée, sur une longue période. Ces copolyaminoacides linéaires amphiphiles sont modifiés par la présence d'une chaîne latérale alkyle hydrophobe. Ces groupements alkyles sont greffés de façon covalente sur le polymère via une fonction ester. Ces polymères sont anioniques en milieu physiologique. Dans le même domaine, la demanderesse a décrit dans plusieurs demandes de brevets, des polymères à base de polyglutamate (anioniques) avec des concepts apparentés. La demande WO-A-03/104303 décrit des polyaminoacides anioniques fonctionnalisés par 30 de l'alpha-tocophérol. La demande WO-A-2004/013206 décrit des polyaminoacides anioniques comportant des groupements hydrophobes et caractérisés en ce que ces groupements sont reliés au polymère par l'intermédiaire d'une rotule contenant deux fonctions amides, et plus 35 précisément via un espaceur de type lysine ou ornithine. 4 La demande WO-A-2004/060968 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par au moins un groupement oligoaminoacide à base de leucine et/ou isoleucine et/ou valine et/ou phénylalanine. L'article de W. C. Shen. Acid-sensitive dissociation between poly(lysine) and histaminemodified poly(glutamate) as a model for drug-releasing from carriers in endosomes. Biochim Biophys Acta 1034 (1):122-124, 1990, décrit un polyglutamate fonctionnalisé par 40% d'histamine. Cependant, aucun squelette polyglutamate hydrophobisé n'est décrit. De plus, le polymère développé précipite entre pH 4 et 5 et est soluble à pH physiologique. Seule l'application visant à former des complexes avec un polylysine sensible au pH est développée. Ces complexes sont basés sur des interactions électrostatiques. En effet, à pH physiologique, le complexe polyglutamatehistamineûpolylysine est formé alors qu'il se décompose à pH 4-5, valeur du pH dans l'endosome. Plus récemment, Kim et al. ont décrit des polyaspartates modifiés par des dérivés de l'imidazole et porteurs d'amines grasses (C18NH2), Controlled Release Society, 32th annual meeting, Miami, juin 2005, #254 et #361. Tout d'abord ces polymères sont basés sur des polyaspartates composés d'un mélange de forme alpha et bêta. De plus, dans la communication #254, l'histidine est greffée par la fonction acide ce qui conduit à obtenir un polymère présentant des amines en groupement pendant et donc à obtenir un polymère cationique et soluble à pH physiologique. Dans la communication #361, le greffon n'est pas un dérivé de l'histidine mais un dérivé de l'imidazole, le 1-(3-aminopropylimidazole). Quelques articles décrivent des polylysines fonctionnalisés par des dérivés de l'histidine. L'article de M. Bikram et al. Biodegradable Poly(ethylene glycol) -co-poly(L-lysine)-g- histidine Multiblock Copolymers for Nonviral Gene Delivery. Macromolecules 37:1903-1916, 2004 décrit le couplage de la N-diméthylhistidine sur un co-polyéthylèneglycolpolylysine par les amines pendantes de la lysine. Ces polymères sont employées dans des stratégies de thérapies géniques et servent donc à associer de l'ADN. Le rôle de l'histidine est de favoriser la transfection dans la cellule, cet acide aminé étant cationique dans l'endosome. La séparation polymère/ADN est donc facilitée par répulsion électrostatique dans l'endosome. Ces polymères sont cationiques à pH neutre. Ainsi, même si de très nombreuses solutions techniques sont développées et proposées dans l'art antérieur pour la vectorisation des principes actifs médicamenteux, la réponse à l'ensemble des exigences est difficile à obtenir et demeure perfectible. Plus spécifiquement, l'invention concerne des polyaminoacides biodégradables, transformables en nano- ou micro-particules colloïdales de vectorisation aptes à s'associer réversiblement à des principes actifs. Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir de nouveaux copolyaminoacides amphiphiles, linéaires ou branchés, dont la solubilité en phase aqueuse est dépendante du pH. Il est intéressant de développer des polymères 5 solubles à pH acide (pH Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères soient aptes à être utilisés pour la vectorisation de PA et permettent de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications du cahier des charges, à savoir notamment : o capacité : ^ à former aisément et économiquement des suspensions colloïdales aqueuses 15 stables, ^ à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs, ^ et à libérer ces principes actifs in vivo, o biocompatibilité, o biodégradabilité, 20 o stabilité à l'hydrolyse. Cet objectif, parmi d'autres, est atteint par la présente invention qui concerne des polyaminoacides comprenant des unités glutamiques, caractérisés en ce qu'au moins une partie de ces unités sont porteuses d'un dérivé de l'histidine et en ce qu'au moins une 25 partie de ces unités sont porteuses d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, les dérivés de l'histidine et les GH étant respectivement identiques ou différents entre eux. Chaque polyglutamate selon l'invention est donc fonctionnalisé par une multiplicité de dérivés de l'histidine et de groupements hydrophobes (GH), pendants et identiques ou 30 différents entre eux. Au sens de l'invention, le terme "multiplicité" signifie que le polyglutamate est fonctionnalisé par : * au moins 1 % de dérivés de l'histidine (% molaire par rapport aux acides 35 glutamiques) et jusqu'à 99%, * en moyenne, au moins deux GH pendants par molécule. Il est possible conformément à l'invention que le polyacide glutamique présente, en plus des GH pendants, des GH fixés sur au moins l'une des extrémités des chaînes de copolymère. 6 Suivant une modalité préférée de l'invention, ce polyglutamate comporte en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne copolymère. Le polyglutamate est également porteur de dérivés de l'histidine. Ces groupements sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point une nouvelle famille de polymères à base de polyglutamate et de dérivés de l'histidine sensible au pH , insoluble à pH physiologique et fonctionnalisés par une multiplicité de groupements hydrophobes et aptes à former des systèmes colloïdaux stables. La capacité de modifier la solubilité du polymère en fonction du pH peut s'avérer très efficace pour l'extension du temps de libération. Les polymères type PLAGA, également insolubles dans les conditions physiologiques permettent d'obtenir des durées de libération longues. L'avantage du système présenté tient à sa biodégradabilité. Ces nouveaux polymères se sont avérés être particulièrement bien adaptés pour la vectorisation des protéines. De plus, ils sont facilement dégradés, en présence d'enzymes, en catabolites/métabolites non toxiques (acides aminés). Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs principes actifs et les polyglutamates modifiés, signifient, en particulier, que le ou les principes actifs sont liés au(x) polyglutamate(s) notamment par une interaction hydrophobe, et/ou sont encapsulés par le ou les polyglutamates. Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont, e.g., des homopolymères d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique. Les dérivés d'histidine utilisables pour fonctionnaliser les unités glutamates sont identiques ou différents entre eux et correspondent à un éthyle substitué en position 1 par une amine et en position 2 par un noyau imidazole. D'autres substituants peuvent être présents sur ces deux positions. Ces dérivés peuvent être par exemple : l'éthylhistidine, la méthylhistidine, l'histidinol et l'histamine. Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides de l'invention comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère. 7 Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate (par exemple une chaîne principale û squelette-polyglutamate). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment: les unités "acide aminé" différentes de l'unité monomérique constitutive du polyglutamate , les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Le greffage des GH est explicité plus en détails ci-après dans la description du procédé d'obtention des polyaminoacides modifiés selon l'invention. Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone. Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe comprenant : • les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, • les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, • et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins 30 une insaturation et/ou au moins un hétéroatome. Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-, tri- ou tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule divalente, le greffon hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente confère au 35 greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est à dire que le greffon présente deux "pattes" GH. A titre d'exemple de rotule trivalente on peut citer, entre autres, des unités "acide aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple glycérol. FLAMEL 0 112 - FR 05 53302 8 Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes comprenant des GH bifides sont les dialkyles glycérol et les dialkyles glutamate. Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de groupements 5 choisis dans le groupe comprenant : 1'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'héxadécanol, l'octadécanol, 1'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol. De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention comprend des 10 unités d'alpha-L-glutamate et/ou d'alpha-L-glutamique acide. De manière plus préférée encore, les polyglutamates selon l'invention répondent à l'une des formules générales (I) suivantes: qD 15 GH I dans laquelle : 20 A représente indépendamment : Un groupement NHR dans laquelle R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à ClO ou ramifié en C3 à Cl0 ou un benzyle, Une unité acide aminé terminale liée par l'azote et dont la fonction(s) acide(s) est éventuellement modifiée par une amine ou un alcool 25 répondant aux définitions NHR et OR respectivement. FLAMEL 0112 --- FR 05 53302 9 Tel que modifié 03/04/06 ^ B est un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants: -0-, -NH-, -N-alkyle- (Cl à C5), un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), un diol, un triol, une diamine, une triamine, un aminoalcool ou un hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone, ^ D représente un H, un groupe acyle linéaire en C2 à C 10 ou ramifié en C3 à CIO, ou un pyroglutamate; ^ Les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi panai: • Les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • Les alkylaryles ou arylalkyle en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • Les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S); ^ Rl représente un H, l'éthanol amine liée par l'amine ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium ; - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine; ^ R2 représente un ester d'alkyl, d'éthyle de préférence, un ester de BGH, un groupe CH2OH (histidinol), ou H (histamine). ^ m, p et q sont des entiers positifs; 20 25 30 35 10 ^ (m)/(m+p+q) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 1 à 50 % molaire sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes; ^ (p)/(m+p+q) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements histidines et varie de 1 à 99 % molaire. ^ (m+p+q) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500; ^ (q)/(m+p+q) varie de 0 à 98 % molaire. De préférence, les groupements hydrophobes GH sont disposés de façon aléatoire. Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en motif hydrophobe des polyglutamates selon l'invention, soit compris entre 2 et 100 %, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes. Le rapport (p)/(m+p+q) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 99 % molaire de groupements contenant un noyau imidazole. De préférence, les polyaminoacides sont tels que, dans la formule I, p est compris entre 50 et 95, de préférence 60 et 90. De préférence, les polyaminoacides tels que décrits ci-dessus sont capables de précipiter à pH physiologique. Le rapport (q)/(m+p+q) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent contenir de 0 à environ 98 % molaire de fonctions carboxyliques, carboxylates ou hydroxy ethylglutamine. 30 Selon une autre caractéristique remarquable de l'invention, les polymères selon l'invention ont une masse molaire qui se situe entre 2. 000 et 200.000 g/mole, et de préférence entre 5.000 et 100 000 g/mole. Suivant une variante, les polyglutamates selon l'invention peuvent être porteurs d'au 35 moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à une unité glutamate.25 11 Naturellement, l'invention couvre également des mélanges de polyaminoacides modifiés tels que définis ci-dessus. De manière remarquable, les polyglutamates de l'invention sont susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes et le degré de polymérisation du polyglutamate. Les méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art. Pour plus de détails, on peut se référer, par exemple à ces quelques références particulièrement pertinentes : "Microspheres, Microcapsules and Liposomes ; vol 1. Preparation and chemical applications" Ed. R. Arshady, Citus Books 1999. ISBN : 0-9532187-1-6. "Sustained-Release Injectable Products" Ed. J. Senior et M. Radomsky, Interpharm Press 2000. ISBN : 1-57491-101-5. "Colloidal Drug Delivery Systems" Ed. J. Kreuter, Marcel Dekker, Inc. 1994. ISBN : 15 0-8247-9214-9. "Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology" Ed. D.L. Wise, Marcel Dekker, Inc. 2000. ISBN : 0-8247-0369-3. Ces polyglutamates modifiés par des dérivés histidine sont en outre extrêmement 20 intéressants du fait qu'ils se dispersent dans l'eau à pH inférieur à 5 (par exemple en présence d'acide) pour donner des solutions ou des suspensions colloïdales et qu'ils précipitent à pH physiologique (7,4) soit par ajout d'une base, soit par dispersion dans une solution à pH neutre. Une précipitation doit donc vraisemblablement se produire sur le site d'injection, lors d'une injection sous-cutanée. De plus, ces polyglutamates (sous forme de 25 particules ou non), peuvent encapsuler ou associer aisément des principes actifs tels que des protéines, peptides ou petites molécules. La mise en forme préférée est celle décrite dans le brevet US-B-6,630,171 de la demanderesse et qui consiste à disperser le copolymère dans l'eau et à incuber la solution en présence d'un principe actif (PA). Cette solution colloïdale de particules de vectorisation constituées des polyglutamates selon 30 l'invention, peut ensuite être filtrée sous 0,2 m puis directement injectée à un patient. Indépendamment du fait que la forme microparticulaire du polymère selon l'invention est préférée, les copolymères de l'invention, sous forme neutre ou ionisée, sont de façon plus générale, utilisables seuls ou dans une composition liquide, solide ou gel et dans un milieu 35 aqueux ou organique. Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques due polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO), selon le pH et la 12 composition. En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, la tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. De même, le noyau imidazole du dérivé histidine est soit neutre (C3H3N2) soit cationique (C3H4N2) selon le pH et la composition. Les copolymères de l'invention sont par exemple obtenus par des méthodes connues de l'homme de l'art. Tout d'abord, rappelons que pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrites, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCAGlu-0-Bz (Bz = Benzyle), car le groupement benzyle peut être sélectivement hydrolysé sans toucher d'autres fonctions chimiques des homopolymères ou du groupement hydrophobe. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate) et 20 poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. De préférence, on synthétise les copolymères de l'invention selon 2 voies. Dans la première; on greffe tout d'abord simultanément ou en séquence le dérivé histidine (par exemple l'éthyl histidine) et le groupement B-GH (par exemple la dodecylamine) sur un 25 poly(acide-L-glutamique). Cette réaction peut se faire dans un solvant tel que le DMF, le DMSO ou la NMP selon le schéma suivant. FLAMEL 0112 - FR 05 53302 13 0 A . N P D H // N N R2 ( NH O H A ,N p D HB-GH H N/J R2y NH2 Le poly(acide-L-glutamique) peut être synthétisé selon la voie décrite dans la demande de brevet FR-A-2 801 226. Dans le cas où le groupement HB-GH est lié via une fonction ester, il est plus aisé de greffer d'abord le groupement B-GH par une réaction de couplage classique en utilisant un carbodiimide avant de greffer le dérivé histidine. o A o D HB-GH Carbodiimide OOH N H O R2y O NH 0 H N lm- H pl v H Iq D O H La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment). Ces méthodes seront mieux comprises à travers la description des exemples. 14 Il doit être observé que le degré de polymérisation est défini par le rapport molaire de l'initiateur sur celle du monomère. Le couplage du greffon hydrophobe à GH avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que le 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que ladiméthylformamide (DMF), la N-méthyl pyrrolidone (NMP) ou la diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo- diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Les réactifs de couplage tels que les chloroformates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple l'ouvrage de Bodanszky Principles of Peptide Synthesis Springer Verlag 1984 pour des exemples d'agents de couplages). Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un acide aminé autre que celui du polymère sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art. Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate tel que défini ci-dessus et éventuellement au moins un principe actif, qui peut être thérapeutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire. Suivant une disposition intéressante de l'invention, le principe actif est associé au(x) 25 polyaminoacide(s) modifiés par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou que des) liaison(s) chimique(s) covalente(s). Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA aux polyaminoacides modifiés selon l'invention, sont décrites notamment dans le brevet US-B-6,630,171. Elles consistent à 30 incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide contenant des Particules de Vectorisation (PV), de manière à obtenir une suspension colloïdale de PV chargées en ou associées avec un ou plusieurs principe(s) actif(s) PA. Cette incorporation, qui conduit à un piégeage de PA par les PV, peut être réalisée de la manière suivante : • mise en solution aqueuse de PA, puis ajout des PV, soit sous forme de 35 suspension colloïdale, soit sous forme de PV isolées (lyophilisat ou précipité) ; • ou ajout de PA, soit en solution, soit à l'état pur ou préformulé, à une suspension colloïdale de particules PV, éventuellement préparée 15 extemporanément par la dispersion de PV sèches dans un solvant approprié, tel que l'eau. De préférence, le principe actif est une protéine, une glycoprotéine, une protéine liée à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol (de préférence PolyEthylèneGlycol (PEG) : "protéine-PEGylée"), un polysaccharide, un liposaccharide, un oligonucléotide, un polynucléotide ou un peptide. Selon une variante, le principe actif est une "petite" molécule organique hydrophobe, 10 hydrophile ou amphiphile. Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est notamment une petite molécule non protéinique. Comme exemples de PA susceptibles d'être associés aux polyaminoacides selon l'invention, qu'ils soient ou non sous forme de (nano ou micro)particules, on peut citer : 15 o les protéines telles que l'insuline, les interférons, les hormones de croissance, les interleukines, l'érythropoïétine ou les cytokines ; o les peptides tels que le leuprolide ou le cyclosporine ; o les petites molécules telles que celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ; 20 o et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre ou d'un film. Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition, chargée ou non en principe actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles polyaminoacides, dans une phase aqueuse. 30 Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme de solution dans un solvant biocompatible et peut être injectée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou dans une tumeur. La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut être 35 administrée par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale. 25 16 Il est également envisageable que la composition soit sous forme de solution dans un solvant ou un mélange de solvants biocompatibles, susceptible d'être injectée en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur. Selon un autre mode de réalisation, la composition peut éventuellement contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité (anti-oxydants) et/ou comme agent anti-microbiens. Ces excipients sont bien connus de l'homme de l'art (se référer à l'ouvrage : Injectable Drag Developement, P.K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver, Colorado 1999). Selon une autre variante, la composition selon l'invention est formulée de telle sorte qu'elle soit apte à former un dépôt sur le site d'injection. Le dépôt peut, par exemple, être au moins en partie provoqué par une protéine physiologique présente in-vivo. Selon une autre variante, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend des polyaminoacides sont tels que, dans la formule I, p est compris entre 50 et 95, de préférence 60 et 90. De préférence, cette composition est capable de précipiter à pH physiologique. L'invention vise aussi des compositions qui comprennent des polyaminoacides selon l'invention et des principes actifs qui sont susceptibles d'être utilisés pour la préparation : • de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol {par exemple PolyEthylèneGlycol (PEG), on parle alors de protéines "PEGylées"}, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ; • et/ou des nutriments ; • et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires. 35 Ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre au moins un homopolyaminoacide tel que défini ci-dessus et/ou la composition décrite ci-dessus. 25 30 17 L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer la composition telle que décrite dans le présent exposé, par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale. Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste essentiellement à mettre la composition telle que décrite supra sous forme de solution dans un solvant biocompatible puis à l'injecter en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt sur le site d'injection. L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en oeuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des polymères de l'invention, leur transformation en système de vectorisation de PA (suspension colloïdale aqueuse stable) et la démonstration de la capacité d'un tel système de s'associer à une protéine pour former des compositions pharmaceutiques. EXEMPLES : Exemple 1 : synthèse du polymère (1), pGluHisOEt T H NJ EtO,Cy OvNH P Jq D H O N O O ~T Indices et groupements : m = 11, p = 150, q = 59, T = D,L-alpha-tocophérol (T) 18 6 g d'un poly(acide glutamique) de degré de polymérisation (DP) 220 greffé à 5% de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 C dans 86 ml de DMF. A cette solution refroidie à 0 C, sont ajoutés 5,74 g d'isobutyl chloroformate puis 4,26 g de N-méthyl morpholine. Le milieu réactionnel est agité 15 minutes en maintenant la température à 0 C. En parallèle, 20,6 g du dichlorhydrate d'ester éthylique de l'histidine sont solubilisés dans 1,0 L de DMF. 22,5 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la solution obtenue est alors chauffée à 60 C pendant une heure puis refroidie à 0 C. On procède ensuite à l'ajout de la solution d'histidine à celle de polymère. Le milieu réactionnel est agité 5 minutes à 0 C puis 1 heure en laissant la température remonter à l'ambiante. Au bout de ce temps, le milieu réactionnel est tout d'abord quenché par ajout de 10 ml d'HC1 1N puis dilué dans 2,8 L d'eau à pH 2-3. Le pH final est ajusté à 3. La solution est ensuite concentrée à 600 ml sur un bâti de diafiltration puis lavée contre 10 volumes d'eau salée (0,9% NaCl) et 5 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée à 330 ml avec une concentration en polymère de 20 mg/ml, soit 50% de rendement. Le pourcentage d'ester d'histidine déterminé sur le polymère hydrolysé par RMN 1H dans D20 est de 68%. Le Mn (déterminé par GPC H2O/AcN 65/5) est de 11,3 kg/mol en équivalents POE. Exemple 2 : synthèse du polymère (2), pGluHis T H NJ OvNH P Jq D H O N O O ~T Indices et groupements : m = 11, p = 169, q = 40, T = D,L-alpha-tocophérol (T) 3,5 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5% de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 C dans 50 ml de DMF. A cette solution refroidie à 0 C, sont ajoutés 3,35 g d'isobutyl chloroformate puis 2,48 g de N-méthyl morpholine. Le milieu réactionnel est agité 15 minutes en maintenant la 19 température à 0 C. En parallèle, 8,6 g du dichlorhydrate d'histamine sont solubilisés dans 215 mL de DMF. 13,0 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la solution obtenue est chauffée à 40 C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 C. On procède ensuite à l'ajout de la solution d'histamine à celle de polymère. Le milieu réactionnel est agité 5 minutes à 0 C puis 1 heure en laissant la température remonter à l'ambiante. Au bout de ce temps, le milieu réactionnel est dilué dans 800 mL d'eau à pH 2-3. Le pH final est ajusté à 3. La solution est ensuite concentrée à 500 ml sur un bâti de diafiltration puis lavée contre 10 volumes d'eau salée (0,9% NaCl) et 5 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée à 230 ml avec une concentration en polymère de 13,7 mg/ml, soit 49% de rendement. Le pourcentage d'histamine déterminé sur le polymère hydrolysé par RMN 1H dans D2O est de 77%. Le Mn (déterminé par GPC H2O/AcN 65/35) est de 1,5 kg/mol en équivalents POE. Exemple comparatif 3 : le composé Cl non fonctionnalisé par un dérivé d'histidine Le composé comparatif Cl est le précurseur (sous sa forme anionique) du polyglutamate modifié par un dérivé de l'histidine, soit le polyglutamate de DP 220 greffé à 5% de façon statistique avec de la alpha-tocophérol racémique. Ce composé est obtenu par la méthode décrite dans la demande WO-A-03/104303. Exemple 4 : Étude de précipitation en fonction du pH Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont solubles aux pH inférieurs à environ 6 et précipitent lorsque le pH devient supérieur à 6, contrairement au composé Cl. Polymère pH 5 pH > 6 1 Soluble Insoluble 2 Soluble Insoluble Cl Insoluble Soluble n. d.: non déterminé Exemple 5 : Mesure de potentiel zéta Le potentiel zéta du polymère 1 a été mesuré à deux pH auxquels celui-ci est soluble : pH 4 et pH 8 pour confirmer la nature cationique à pH acide et anionique au dessus de pH 20 neutre. Les valeurs obtenues sont de +53 mV à pH 4 et de -37 mV à pH 8. En comparaison le polymère Cl a un potentiel zéta de -70 mV à pH neutre. Exemple 6 : Stabilisation d'une protéine thérapeutique : l'hGH Le polymère 1 est formulé avec de l'hormone de croissance humaine (hGH) dans les proportions suivantes : polymère 1 50 mg/g + hGH 5 mg/g, pH = 5. L'hGH a un point isoélectrique de 5,4 et est, en principe, insoluble à pH 5. Or la 10 formulation est limpide. La protéine est donc stabilisée en solution par le polymère 1. Cette formulation injectée dans une solution tamponnée à pH neutre (solution de PBS) précipite.5 REVENDICATIONS1. 2. 3. 4. 5. 6. 35 Polyaminoacides comprenant des unités glutamiques, caractérisés en ce qu'au moins une partie de ces unités sont porteuses d'un dérivé de l'histidine et en ce qu'au moins une partie de ces unités sont porteuses d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, les dérivés de l'histidine et les GH étant respectivement identiques ou différents entre eux. Polyaminoacides selon la revendication 1, caractérisés en ce que les dérivés de l'histidine sont greffés aux unités glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide. Polyaminoacides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'homopolymères d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique Polyaminoacides selon les revendications 1 à 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent des dérivés de l'histidine identiques ou différents entre eux et de préférence choisis parmi les groupements suivants: les esters d'histidine, la méthylhistidine, l'histidinol, l'histamine. Polyaminoacides selon les revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère. Polyaminoacides selon la revendication 5, caractérisés en ce que les groupements hydrophobes GH sont choisis dans le groupe comprenant : • les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, • les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, • et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome. 7. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'au moins l'un des groupements hydrophobes GH est obtenu par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe comprenant:FLAMEL 0112 - FR 05 53302 22 1'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'héxadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol. 8. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications, caractérisés en ce qu'ils répondent à l'une des formules générales (I) suivantes: H N; qD I dans laquelle : ^ A représente indépendamment : Un groupement NHR dans laquelle R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à Cl0 ou ramifié en C3 à C10 ou un benzyle, - Une unité acide aminé terminale liée par l'azote et dont la fonction(s) acide(s) est éventuellement modifié par une amine ou un alcool répondant aux définitions NHR et OR respectivement. B est un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants: -0-, -NH-, -N-alkyle- (Cl à C5), un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), un diol, un triol, une diamine, une triamine, un aminoalcool ou un hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone, C est un groupement mono, di ou trihydroxy(C1 à C6)alkyl, de préférence 1'hydroxyéthyle, l'hydroxy-propyle ou le trishydroxyméthylméthane. ^ D représente un H, un groupe acyle linéaire en C2 à Cl0 ou ramifié en C3 à Cl0, ou un pyroglutamate; ^ Les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi: 23 • Les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • Les alkylaryles ou arylalkyle en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • Les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S); ^ R1 représente un H, l'éthanol amine liée par l'amine ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium ; - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine; ^ R2 représente un ester d'alkyl, d'éthyle de préférence, un ester de BGH, un groupe CH2OH (histidinol), ou H (histamine). ^ m, p et q sont des entiers positifs; ^ (m)/(m+p+q) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 1 à 50 % molaire sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes; ^ (p)/(m+p+q) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements histidines et varie de 1 à 99 % molaire. ^ (m+p+q) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500; ^ (q)/(m+p+q) varie de 0 à 98 % molaire. 9. Polyaminoacides selon la revendication 8, caractérisés en ce que dans la formule I, p est compris entre 50 et 95, de préférence 60 et 90. 24 10. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications, caractérisés en ce que les groupements hydrophobes GH sont disposés de façon aléatoire. 11. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications, caractérisés en ce que leur masse molaire se situe entre 2.000 et 200.000 g/mole, et de préférence entre 5.000 et 100.000 g/mole. 12. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à une unité glutamate. 13. Composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate modifié par un dérivé d'histidine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un principe actif. 15. Composition, notamment selon la revendication 14, caractérisée en ce que le principe actif est associé au(x) polyglutamate(s) modifié(s) par un dérivé d'histidine par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou des) liaison(s) chimique(s) covalente(s). 16. Composition selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le principe actif est une protéine, une glycoprotéine, une protéine liée à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, un polysaccharide, un liposaccharide, un oligonucléotide, un polynucléotide ou un peptide. 17. Composition selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'elle peut être administrée par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale. 25 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'un gel, d'une solution, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'une poudre ou d'un film. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisée en ce qu'elle est une suspension colloïdale de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles de polyglutamate modifié par un dérivé d'histidine, dans une phase aqueuse. 21. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de solution dans un solvant biocompatible et en ce qu'elle peut être injectée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou dans une tumeur. 22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle est apte à former un dépôt sur le site d'injection. 23. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 22, caractérisée en ce qu'elle comprend des polyaminoacides selon la revendication 8. 24. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est capable de précipiter à pH physiologique. 25. Procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration 25 orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléo- 30 tides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ; et/ou des nutriments ; et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ; caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'un des polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et/ou la composition selon l'une quelconque des 35 revendications 13 à 24.20