FR 2897064 A1 20070810 FR 0601076 A 20060207 B0745FR 2897064 1 La présente invention concerne des nanoparticules comprenant un cœur de maghémite et une écorce de poly(oxyde d'éthylène), ainsi qu'un procédé pour leur préparation. Certains traitements médicaux impliquent l'injection de particules dans le sang d'un patient. Tel est le cas notamment pour des agents de contraste pour l'IRM. Il en sera de même à l'avenir pour les médiateurs pour hyperthermie magnétique. Les particules sont généralement injectées sous forme de dispersions colloïdales, et il est nécessaire que ces dispersions soient stables. Une dispersion peut être stabilisée soit par répulsion électrostatique, soit par répulsion stérique. Une dispersion stabilisée par répulsion électrostatique ne peut être utilisée pour une injection, car les particules chargées seraient éliminées immédiatement par le système immunitaire. En outre, l'oxyde de fer présente un point isoélectrique (valeur du pH pour laquelle la densité de charge de surface est nulle) de 7. Ainsi, dans les conditions de pH physiologique, les nanoparticules d'oxyde de fer ne son-: pas chargées et donc précipitent. Une dispersion stabilisée par répulsion stérique est obtenue notamment par greffage de macromolécules hydrophiles à la surface des particules. On connaît des particules d'oxyde de fer enrobées par une couche de polymère hydrophile, tel que le dextran. Ces particules sont utilisées pour l'IRM du foie ou des ganglions lymphatiques. Elles sont généralement désignées par (U)SPIO [(Ultrasmall)SuperParamagnetic Iron Oxide] et elles sont décrites notamment par Neuberger, et al. [J. Magn. Magn. Mat., 293 (2005) 483]. Elles sont préparées par coprécipitation de l'oxyde de fer directement dans une solution aqueuse du polymère préformé tel que décrit dans US-4,452,773. Dans ces matériaux, il n'existe pas de liaison covalente entre la maghémite et le polymère. L'enrobage de polymère est donc sensible aux phénomènes de désorption /déplétion. Pour améliorer la qualité de ces particules, il a été proposé de réticuler le dextran autour des nanoparticules (US-5,262,176) ou de réticuler le dextran grâce B0745FR 2 aux nanoparticules d'oxyde de fer préalablement modifiées en surface par un dérivé de type aminosilane (FR-2,855,315). Le principal inconvénient de ces procédés de l'art antérieur est le nombre d'étapes de la modification chimique et le fait que chaque étape de modification nécessite une étape de purification très longue, car essentiellement effectuée par dialyse. En outre, le dextran n'est pas très efficace pour limiter l'adsorption des protéines plasmatiques et donc allonger la demi-vie des nanoparticules. Il est connu que le poly(oxyde d'éthylène) POE est un agent de surface efficace pour augmenter la demi-vie plasma-tique de particules, notamment lorsqu'il est sous forme téléchélique, par exemple un polyéthylène glycol PEG. Cependant, le taux de greffage de POE à la surface des nano- particules est médiocre. En effet, l'encombrement stérique résultant des chaînes polymères autour d'une particule limite la quantité de polymère qui se fixe sur la particule du fait que l'accès aux sites actifs de la surface de la particule est limité. Par exemple, Butterworth et al., [Surf. A, 179, 93 (2001)], décrivent de telles particules pour lesquelles la teneur maximale en PEG est de 9% massique. En outre, Davis et al., [Coll Surf A : Physicochem. Eng. Aspects, 179 (2001) 93], décrivent le greffage sur des particules d'oxyde magnétique, de chaînes poly(oxyde d'éthy- lève) (POE) préformées et fonctionnalisées par un groupe organosilane. Cette technique présente les mêmes inconvénients que celle décrite par Butterworth précité. En outre, les chaînes préformées sont généralement obtenues par un procédé utilisant un catalyseur, et elles contiennent des résidus de ce catalyseur qui peuvent être toxiques pour des applications médicales des particules modifiées. Le but de la présente invention est de proposer un procédé plus simple et sans catalyseur pour greffer des macromolécules à la surface de nanoparticules de maghémite en obtenant un taux de greffage important, afin d'obtenir des nanoparticules qui ont un enrobage de polymère fixé par liaison covalente (donc de manière stable) sur un cœur de maghémite et qui sont exemptes de résidus toxiques. B0745FR En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un matériau constitué par une dispersion aqueuse de nanoparticules de maghémite enrobées par du poly(éthylène glycol) POE, ainsi que le matériau obtenu. Le procédé selon la présente invention consiste à polymériser l'oxyde d'éthylène en présence de nanoparticules de maghémite en dispersion aqueuse, et il est caractérisé en ce que la polymérisation est amorcée à partir de groupements réactifs R qui sont capables d'amorcer la polymérisation de l'oxyde d'éthylène sans addition de catalyseur, et qui sont fixés sur les nanoparticules de maghémite par l'intermédiaire d'un agent de couplage comprenant un groupement trialcoxysilyle et un ou plusieurs groupements R. Plus précisément, le procédé consiste à : • préparer une dispersion aqueuse de nanoparticules de maghémite ; • modifier les nanoparticules de maghémite en dispersion par un agent de couplage choisi parmi les trialcoxysila-20 nes portant au moins un groupement R ; • faire polymériser l'oxyde d'éthylène en présence des nanoparticules de maghémite silylées obtenues à l'étape précédente. Un agent de couplage utilisable dans le procédé de la 25 présente invention est un trialcoxysilane comprenant au moins un groupement R qui permet d'amorcer la polymérisation de l'oxyde d'éthylène. Le groupement R est de préférence un groupe hydroxyle ou un précurseur de groupe hydroxyle. Comme exemple de pré- 30 curseur de groupe hydroxyle, on peut citer le groupe époxyde. Les groupements alkyle d'un agent de couplage ont de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à 2 atomes de carbone. Les trois groupes alcoxy d'un 35 agent de couplage peuvent être identiques ou différents. La modification des nanoparticules de maghémite est effectuée dans un solvant aqueux ou dans un solvant organique. Lorsqu'un solvant organique anhydre est utilisé, B0745FR 4 il est choisi de préférence parmi les solvants aprotiques polaires, par exemple DMF. Lorsque le solvant n'est pas anhydre, il peut être choisi parmi les solvants protiques, par exemple l'éthanol. Comme exemple d'agent de couplage, on peut citer les composés du type hydroxysilane dans lesquels R est OH, par exemple l'hydroxyméthyltriéthoxysilane, le N-(hydroxyéthyl)-N-méthylaminopropyl-triméthoxysilane et le bis(2-hydroxyéthyl)-3-aminepropyl-triéthoxysilane. On peut en outre citer les composés du type glycidoxypropylsilane dans lesquels le substituant R est un groupe époxyde, par exemple le 3-(glycidoxypropyl)triméthoxysilane, le (3-glycidoxypropyl)- diméthyléthoxysilane, le (3-glycidoxypropyl)méthyldiéthoxy- silane, et le (3-glycidoxypropyl)méthyldiméthoxysilane. La dispersion de maghémite peut être préparée par des procédés décrits dans l'art antérieur. Par exemple un procédé tel que décrit par R. Massart (IEEE Transactions on Magnetics, Vol. MAG-17, N 2, mars 1981] consiste à préparer une solution aqueuse de FeCl3 et de FeC12 acidifiée par HC1, à ajouter cette solution à une solution aqueuse d'ammoniaque, à séparer sans lavage par centrifugation ou par décantation, le précipité formé. Ensuite, le précipité est : • soit mis en contact avec une solution aqueuse 25 d'hydroxyde de tétraméthylammonium, • soit mis en contact avec une solution aqueuse d'acide perchlorique, puis isolé par centrifugation. Les nanoparticules isolées sont ensuite redispersées dans l'eau, de préférence en quantité telle que la 30 concentration en nanoparticules de maghémite dans l'eau soit comprise entre 5 et 10% massique. Un autre procédé de préparation de nanoparticules de maghémite est. décrit par S. Mornet, et al. [J. Magn. Mat, 293 (2005) 1.27]. Il consiste 1) à faire précipiter des 35 nanoparticules de magnétite dans une solution aqueuse en ajoutant une solution aqueuse de FeCl2 acidifiée par HC1 à une solution aqueuse de FeCl3, puis en ajoutant de l'ammoniaque, sous agitation, 2) à éliminer le surnageant B0745FR après la formation du précipité, 3) à oxyder partiellement le précipité formé en maghémite par addition rapide d'acide nitrique, 4) à oxyder totalement par addition d'une solution de nitrate de fer à chaud, puis à laver le solide obtenu par des cycles centrifugation/redispersion, et 5) à peptiser par addition d'acide nitrique. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de modification des nanoparticules comprend les phases suivantes . • mélange sous agitation d'une dispersion aqueuse de maghémite et d'une solution d'agent de couplage, à une température comprise entre 20 et 100 C pendant une durée comprise entre 3 et 20 heures ; • extraction des nanoparticules par centrifugation ; • séchage sous vide dynamique à une température comprise entre 20 et 150 C pendant une durée comprise entre 3 et 24 heures. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de fixation de chaînes POE sur les nanoparticules modifiées par 20 l'agent de couplage est effectuée sous atmosphère inerte dans un solvant anhydre apolaire, et elle comprend les phases suivantes . • introduction dans un réacteur, d'un solvant apolaire anhydre et des nanoparticules de maghémite modifiées par 25 l'agent de couplage puis traitées pour les rendre anhydres ; • addition progressive d'oxyde d'éthylène sous vide partiel et sous agitation, le réacteur étant maintenu à une température de -35 C à -10 C, pendant une durée de 30 15 à 30 minutes ; • maintien du mélange réactionnel pendant une durée comprise entre 10 et 100 h à une température comprise entre 40 et 100 C (par exemple 90 C / 50 h) • extraction des nanoparticules par centrifugation et 35 lavage, puis dispersion dans l'eau. Le solvant apolaire anhydre est avantageusement le toluène. B0745FR Le matériau obtenu par le procédé de l'invention est une dispersion aqueuse d'agrégats de nanoparticules élémentaires, et il est caractérisé en ce que : • une nanoparticule élémentaire comprend un coeur de 5 maghémite et un enrobage de POE ; • le coeur de maghémite est constitué par un agrégat de nanoparticules de maghémite ayant un diamètre de 7 à 10 nm, mesuré par microscopie électronique à transmission ; 10 • le coeur de maghémite a un diamètre de 40 à 50 nm, mesuré par diffusion dynamique de la lumière ; • les agrégats de nanoparticules élémentaires ont un diamètre de 50 nm à 90 nm, mesuré par diffusion dynamique de la lumière ; 15 • le rapport en poids POE/maghémite des agrégats de nanoparticules élémentaires est de 80 à 850 mg/g correspondant à un rapport en poids POE/agrégats de 7 à 46% en poids. Une dispersion formant le matériau selon la présente 20 invention peut être utilisée avantageusement comme agent de contraste notamment pour l'IRM. La présente invention est expliquée plus en détail par l'exemple suivant, qui est donné à titre d'illustration et auquel l'invention n'est pas limitée. Exemple 25 Préparation d'une dispersion de maghémite Dans chacune des étapes du procédé de préparation de la dispersion de maghémite, l'eau utilisée est de l'eau ultra-pure de qualité HPLC, afin d'éviter la présence d'ions floculants. 30 Au cours d'une première étape, on forme un précipité de magnétite, selon le mode opératoire suivant. On prépare une solution aqueuse de FeCl3 en introduisant sous agitation (500 rpm) 10,87 g de FeCl3 (0,039 mol) dans un réacteur de 1 L muni d'une agitation mécanique et d'un reflux, et 35 contenant 435 mL d'eau à 80 C. Lorsque FeCl3 est totalement dissous, on ajoute une solution de 3,92 g de FeCl2 B0745FR (0,0195 mol) préalablement dissous dans 22 mL d'HCl 1,5 M, et on agite jusqu'à ce que la couleur soit uniforme. On augmente alors la vitesse d'agitation à 850 rpm et on ajoute très rapidement 45 mL d'ammoniaque au milieu réactionnel. Il se forme instantanément un précipité noir de magnétite. On laisse le milieu réactionnel sous agitation pendant 15 min, puis on l'extrait du réacteur et on laisse décanter dans un bécher placé sur une plaque magnétique. Ensuite, on élimine le surnageant par aspiration en enlevant le maximum de liquide, en maintenant les nanoparticules de magnétite obtenues à l'abri de l'air. Au cours d'une deuxième étape, on effectue une oxydation partielle de la magnétite en maghémite, et l'échange des contre-ions NH4+ par NO3- selon le mode opératoire sui- vaut. A température ambiante, ajouter 70 mL d'acide nitrique 2 M, agiter 2 à 3 min puis laisser décanter 10 min. Eliminer le surnageant. L'oxyde de fer se dissolvant dans ces conditions d'acidité, il faut réaliser cette étape le plus rapidement possible afin de limiter les pertes. Au cours d'une troisième étape, on effectue une oxydation totale, selon le mode opératoire suivant. On prépare une solution oxydante de nitrate de fer (0,33 M) en dissolvant 10 g de nitrate de fer dans 75 mL d'eau chauffée à 100 C. On verse la solution chaude sur la maghémite et la maintien à 100 C pendant 30 min. Ensuite on arrête le chauffage et on laisse refroidir et décanter. On lave le solide au cours de trois cycles de centrifugation-redispersion (8 400 tours.min-1, 2 min) dans l'acétone afin d'éliminer les ions chlorure et nitrate résiduels. Au cours d'une quatrième étape, on effectue une peptisation du solide, selon le mode opératoire suivant. On ajoute 50 mL d'acide nitrique 2 M au solide obtenu à la fin de l'étape précédente, on agite pendant 15 min puis on centrifuge. Après la centrifugation, on élmine le surnageant et on effectue à nouveau 3 lavages à l'acétone. Ensuite, on redisperse la maghémite dans 60 mL d'eau et on enlève les traces d'acétone au Rotovapor à 80 C, jusqu'au début de l'élimination d'eau. Ensuite on transvase le ferrofluide B0745FR obtenu dans un flacon de 60 mL et on complète avec de l'eau. On traite la dispersion pendant 3 minutes par une sonde à ultrasons pour désagréger au maximum les nanoparticules. Les caractéristiques de la dispersion de maghémite ainsi obtenue sont rassemblées dans le tableau I ci-dessous. Tableau I Paramètre Technique d'analyse Résultat Concentration en Dosage volumétrique 79 g/L maghémite Point isoélectrique Zêtamétrie 6, 5 Domaine de floculation Visuel 5 8400 tr.min-1) et l'excès de silane éliminé par cinq cycles de centrifugation-dispersion dans l'eau. La maghémite silylée est finalement séchée sous vide dynamique à 70 C pendant 24 heures, cette dernière étape provoquant la 5 formation de liaisons covalentes entre le silane et la maghémite. La quantité de silane immobilisé à la surface des nanoparticules de maghémite, déterminée par analyse thermogravimétrique, est de 0,5 mmol/g de maghémite. 10 Fixation de chaînes polymère On a introduit 0,5 g de maghémite modifiée dans un ballon de 500 mL et on a traité sous vide dynamique à 130 C pendant 3 heures. Ensuite, on a ajouté 160 mL de toluène sec sous courant d'azote et une ampoule contenant l'oxyde 15 d'éthylène (OE) liquéfié est fixée sur le ballon. La dispersion de maghémite dans le toluène est refroidie à l'aide d'un bain frcid (constitué par un mélange éthanol / isopropanol refroidi à l'azote liquide) afin de mettre le dis-positif sous vide statique à l'aide d'une pompe à palettes. 20 L'OE (10 mL, 0,2 mol) est alors ajouté progressivement, afin d'éviter les surpressions dans le dispositif, et le milieu réactionnel maintenu dans le bain froid est agité pendant 30 minutes. Ensuite, on chauffe à 50 C à l'aide d'un bain d'huile pendant 95 heures. Après réaction, la dispersion est centrifugée et le solide lavé alternativement 3 fois à l'eau, 3 fois au THF et 3 fois au méthanol. Les tubes de centrifugation sont chauffés par air chaud pour faciliter la redispersion du solide. Une partie du solide est ensuite dispersée dans l'eau et une autre partie est séchée sous vide dynamique à température ambiante pendant 24 heures. Les caractéristiques des nanocomposites obtenus sont rassemblées dans le tableau II ci-dessous. B0745FR 2897064 10 Tableau II Paramètre Technique d'analyse Résultat Teneur en polymère Thermogravimétrie 850 mg/g de maghémite Point isoélectrique Zêtamétrie aucun Domaine de floculation Visuel aucun Concentration en ions Cl-Spectrophotométrie visible Stable dans la gamme entraînant la floculation étudiée jusqu'à 1 M Taille des nanoparticules Diffusion dynamique de la 52 6 nm à pH 5 lumière Aimantation Magnétomètre à SQUID ! 26 emu/g à 5 000 Oe La figure 1 montre le comportement en fonction du pH d'une dispersion de maghémite non modifiée (partie supérieure a), et de la dispersion de maghémite modifiée par greffage de POE préparée dans le présent exemple (partie infé- 5 rieure b). Il apparaît que les nanoparticules de maghémite non modifiée floculent dans le domaine de pH de 7 à 9, alors que les nanoparticules modifiées restent stables. La figure 2 représente l'évolution du potentiel Zêta en fonction du pH de la dispersion de nanoparticules 10 modifiées [courbe a) pour la maghémite non traitée, courbe b) pour la maghémite greffée par le POE]. L'absence d'un point isoélectrique et la faible valeur du potentiel Zêta quel que soit le pH confirment le caractère stérique de la stabilisation. La valeur du potentiel est de -4,5 mV à pH 15 7,4, qui est le pH sanguin. La figure 3 représente la distribution moyenne en taille. La proportion M est donnée en ordonnée, la dimension d (en nm) est donnée en abscisse. La courbe a) correspond aux nanoparticules de maghémite non modifiée dispersées dans 20 l'eau distillée, à leur pH naturel, et donc stabilisées par voie électrostatique. La courbe b) correspond à la dispersion de maghémite modifiée obtenue dans le présent exemple. Il apparaît que les tailles restent faibles après greffage de POE. 25 La figure 4 représente l'aimantation en fonction du champ magnétique de la maghémite non modifiée (courbe matérialisée par ^), de la maghémite modifiée par le silane B0745FR (courbe matérialisée par •) et de la maghémite modifiée par le POE (courbe matérialisée par IL). Sur ces courbes, le champ magnétique C (en Oerstedt) est donné en abscisse, et l'aimantation A (emu/g) est donnée en ordonnée. L'absence d'hystérèse confirme que la maghémite modifiée par le POE possède un comportement superparamagnétique à température ambiante. Revendications 1. Procédé pour la préparation d'un matériau constitué par une dispersion aqueuse de nanoparticules de maghémite enrobées de poly(oxyde d'éthylène) POE, consistant 5 à polymériser l'oxyde d'éthylène en présence de 10 nanoparticules caractérisé en de groupements polymérisation catalyseur, et maghémite par de maghémite en dispersion aqueuse, ce que la polymérisation est amorcée à partir réactifs R qui sont capables d'amorcer la de l'oxyde d'éthylène sans addition de qui sont fixés sur les nanoparticules de l'intermédiaire d'un agent de couplage comprenant un groupement trialcoxysilyle et un ou plusieurs groupements R. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 15 ce qu'il consiste à : • préparer une dispersion aqueuse de nanoparticules de maghémite ; • modifier les nanoparticules de maghémite en dispersion par un agent de couplage choisi parmi les trialcoxysila-20 nes portant au moins un groupement R ; • faire polymériser l'oxyde d'éthylène en présence des nanoparticules de maghémite modifiées obtenues à l'étape précédente. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, 25 caractérisé en ce que l'agent de couplage est un trialcoxy- silane comprenant au moins un groupement R qui permet d'amorcer la polymérisation de l'oxyde d'éthylène. 4. Procédé sleon la revendication 3, caractérisé en ce que le groupement R est un groupe hydroxyle ou un 30 précurseur de groupe hydroxyle. 5. Prccédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que les groupements alkyle du trialcoxysilane ont de 1 à 4 atomes de carbone. B0745FR 2897064 13 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la modification des nanoparticules de maghémite est effectuée dans un solvant aqueux ou dans un solvant organique. 7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de modification des nanoparticules comprend les phases suivantes : • mélange sous agitation d'une dispersion aqueuse de maghémite et d'une solution d'agent de couplage, à une 10 température comprise entre 20 et 100 C pendant une durée comprise entre 3 et 20 heures ; • extraction des nanoparticules par centrifugation ; • séchage sous vide dynamique à une température comprise entre 20 et 150 C pendant une durée comprise entre 3 et 15 24 heures. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape de fixation de chaînes POE sur les nanoparticules modifiées par l'agent de couplage est effectuée sous atmosphère inerte dans un solvant anhydre 20 apolaire, et elle comprend les phases suivantes : • introduction dans un réacteur, d'un solvant apolaire anhydre et des nanoparticules de maghémite modifiées par l'agent de couplage puis traitées pour les rendre anhydres ; 25 • addition progressive d'oxyde d'éthylène sous vide partiel et sous agitation, le réacteur étant maintenu à une température de -35 C à -10 C, pendant une durée de 15 à 30 minutes ; • maintien du mélange réactionnel pendant une durée 30 comprise entre 10 et 100 h à une température comprise entre 40 et 100 C ; • extraction des nanoparticules par centrifugation et lavage, puis dispersion dans l'eau. 9. Matériau constitué par une dispersion aqueuse 35 d'agrégats de nanoparticules élémentaires, caractérisé en ce que . B0745FR 2897064 14 • une nanoparticule élémentaire comprend un coeur de maghémite et un enrobage de POE ; • le coeur de maghémite d'une nanoparticule élémentaire est constitué par un agrégat de nanoparticules d'oxyde de 5 fer ayant un diamètre de 7 à 10 nm, mesuré par microscopie électronique à transmission ; • le coeur de maghémite d'une nanoparticule élémentaire a un diamètre de 40 à 50 nm, mesuré par diffusion dynamique de la lumière ; • les agrégats de nanoparticules élémentaires ont un diamètre de 50 nm à 90 nm, mesuré par diffusion dynamique de lumière ; • le rapport en poids POE/maghémite des agrégats de nanoparticules élémentaires est de 80 à 850 mg/g correspondant à un rapport en poids POE/agrégats de 7 à 46% en poids. 10. Agent de contraste pour l'IRM, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau selon la revendication 9.