FR 2891552 A1 20070406 FR 0510175 A 20051005 La présente invention est relative à des baculovirus recombinants permettant l'expression de plusieurs gènes hétérologues, et à leurs utilisations, notamment pour la production de protéines devant subir des modifications post-traductionnelles (par exemple des glycoprotéines) ou la production de complexes protéiques. Parmi les systèmes d'expression eucaryotes, le système baculoviruscellules d'insectes est un des plus utilisés pour la production de protéines hétérologues. Sa mise en oeuvre est simple, rapide et peu coûteuse, et le taux de production de protéines est élevé. En général, les cellules d'insectes peuvent effectuer de manière satisfaisante une grande partie des modifications post-traductionnelles rencontrées dans les protéines de vertébrés. Toutefois, il existe des exceptions. A titre d'exemples, on citera la C-amidation, la ycarboxylation, et la N-glycosylation. Notamment, la N- glycosylation, qui est incomplète dans les cellules d'insectes, ne permet pas d'aboutir aux structures glycanniques de type complexe rencontrées dans un grand nombre des glycoprotéines de vertébrés (ALTMANN et al., Glycoconjugate J. 16: 109-123, 1999; MARCHAL et al., Glycobiol. 9(7) : 645-654, 1999; RESTELLI et BUTLER, Cell Engineering, vol.3: glycosylation, Kluwer Academic Publishers: 61-92, 2002). La synthèse du précurseur Glc3Man9GlcNAc2-P-PDol, le transfert en bloc sur la protéine naissante, et les premières étapes de maturation dans le réticulum endoplasmique, qui sont conservées dans toutes les cellules eucaryotes, ont lieu normalement dans les cellules d'insectes. Cependant, l'élongation des chaînes sucrées s'arrête au stade tri-mannose (Man3GlcNAc2Fuc), produisant des structures oligosaccharidiques dépourvues du galactose et de l'acide sialique habituellement présents à l'extrémité des structures glycannique de type complexe. Cette structure écourtée a été attribuée à l'absence ou la déficience des glycosyltransférases (galactosyltransférase, Nacétylglucosaminyltransférase et sialyltransférase) impliquées dans le greffage de ces sucres (ALTMANN et al., 1999, précité ; MARCHAL et al., 1999, précité ; RESTELLI et BUTLER, 2002, précité), ainsi qu'à l'hydrolyse de la forme GlcNAcMan3GlcNAc2Fuc par une N- acétylglucosaminidase présente dans un compartiment tardif de la voie de sécrétion chez certaines lignées de cellules d'insectes (ALTMANN et al., J. Biol. Chem. 270(29) : 17344-17349, 1995b). Cette N-glycosylation incomplète constitue une limitation à l'utilisation du système baculovirus-cellules d'insectes pour la production de certaines glycoprotéines, qui ne sont pleinement fonctionnelles que si elles comportent des N-glycannes de type complexe. Notamment, lorsqu'il s'agit de glycoprotéines destinées à un usage thérapeutique, l'absence de N-glycannes de type complexe risque de diminuer leur efficacité, voire d'induire des réponses immunitaires indésirables lors de leur utilisation. Pour améliorer la N-glycosylation dans les cellules d'insecte, il a été proposé d'exprimer dans celles-ci les glycosyltransférases manquantes ou déficientes. Le Brevet US 6,461,863 propose ainsi différentes constructions pour transformer des cellules d'insecte afin d'améliorer la N-glycosylation de protéines d'intérêt. Le principe de ces constructions est d'exprimer les enzymes intervenant dans la N-glycosylation sous contrôle d'un promoteur précoce de baculovirus, et d'exprimer la protéine d'intérêt à glycosyler sous contrôle d'un promoteur tardif de baculovirus. Le Brevet US 6,461,863 propose deux approches possibles pour exprimer les gènes de glycosyltransférases 30 dans les cellules transformées: l'expression transitoire: des gènes de glycosyltransférases, et notamment un gène de galactosyltransférase et un gène de sialyltransférase, placés chacun sous contrôle d'une copie du promoteur précoce de la protéine IE1, sont insérés dans un baculovirus, et exprimés lors de l'infection de la cellule hôte par celui-ci. Le gène de la protéine d'intérêt à glycosyler est placé sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de la protéine P10, soit dans le même baculovirus, soit dans un baculovirus différent; dans ce dernier cas, les deux baculovirus sont utilisés pour co-infecter les cellules-hôtes. l'expression stable: les gènes de glycosyltransférases, placés sous contrôle de copies du promoteur d'IEl, sont insérés dans l'ADN cellulaire, pour produire des lignées de cellules d'insectes transgéniques exprimant les glycosyltransférases. Ces lignées peuvent ensuite être utilisées comme cellules-hôtes pour des baculovirus recombinants exprimant le gène de la protéine d'intérêt à glycosyler, sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de celui de la protéine P10. Plusieurs publications décrivent des lignées de cellules d'insectes obtenues par cette deuxième approche: HOLLISTER et al.(Glycobiol. 8(5) : 473-880, 1998), et JARVIS et al. (Cur. Opin. Biotech. 9(5) : 528-533, 1998b) décrivent ainsi une lignée cellulaire dérivée de la lignée Sf9, dont le génome contient plusieurs copies d'une cassette d'expression contenant le gène de la (31.4 galactosyltransférase bovine sous contrôle du promoteur pIEl. AUMILLER et al. (Glycobiol. 13(6) . 497-507, 2003) décrivent une lignée cellulaire dérivée de Sf9, dans laquelle sont exprimées l'ensemble des enzymes nécessaires à l'obtention d'une glycoprotéine recombinante sialylée. En revanche, l'utilisation de baculovirus recombinants exprimant plusieurs gènes de glycosyltransférases a rencontré moins de succès, bien que cette approche soit plus flexible, et permette de s'affranchir de la nécessité d'utiliser des cellules hôtes transgéniques. CHANG et al. (J. Biotech. 102: 61-71, 2003) décrivent un baculovirus multirecombinant exprimant trois glycosyltransférases de mammifère, à savoir la G1cNAc transférase II, la (31.4 galactosyltransferase), et l'a2,6- sialyltransferase (a26ST), et une glycoprotéine, l'al- antitrypsine. Ces quatre gènes sont exprimés dans le vecteur pAcAB4 (BELYAEV et ROY, Nucleic Acids Res. 21: 1219-1223, 1993), qui contient 2 copies du promoteur de la polyédrine et 2 copies du promoteur de la P10. Ce baculovirus multirecombinant a permis d'obtenir une N-glycosylation correcte de l'al-antitrypsine uniquement dans les cellules d'une lignée particulière, la lignée Ea4, dérivée de Estigmena acrea, qui possède intrinsèquement une capacité de glycosylation plus complète que les lignées de cellules d'insectes classiques telles que Sf9 (OGONAH et al., Bio/Technol. 14: 197-202, 1996). Outre la production de protéines glycosylées, il a été proposé d'utiliser des baculovirus multi-recombinants pour produire conjointement des protéines participant à un complexe protéique. On citera par exemple l'expression de protéines constitutives du virus du Bluetongue (ROY et a1, Gene. 29, 119-129, 1997) ou celle de protéines constitutives des ARN polymérases cellulaires (ACKER et al., J Biol Chem. 272, 16815-21, 1997, ou KIMURA et ISHIHAMA, Nucleic Acids Res. 28, 952-959, 2000). Une des principales limitations à l'usage de baculovirus multirecombinants pour exprimer conjointement un ensemble de protéines provient du nombre relativement faible de promoteurs de baculovirus, convenant à l'expression de gènes hétérologues, qui sont disponibles. Pour y pallier, on utilise généralement plusieurs copies d'un même promoteur. Toutefois, ceci entraîne des risques d'instabilité du baculovirus multirecombinant. Diverses stratégies ont été proposées pour remédier à cette instabilité, par exemple la disposition tête-bêche des copies d'un même promoteur. Cependant ces solutions ne sont pas totalement efficaces, et paraissent même, dans certains cas, augmenter l'instabilité du baculovirus recombinant. Les Inventeurs ont maintenant entrepris d'obtenir des baculovirus recombinants, utilisables pour produire conjointement plusieurs protéines d'intérêt. Ils ont choisi comme modèle la production de protéines Nglycosylées, en exprimant des glycosyltransférases qui participent à la Nglycosylation. Pour contrôler l'expression de ces glycosyltransférases, les Inventeurs ont choisi d'utiliser, au lieu de copies d'un même promoteur de baculovirus, un promoteur différent pour chaque enzyme, qui ne soit ni un promoteur endogène du baculovirus d'origine, dans lequel sont insérées les cassettes d'expression desdites enzymes, ni un promoteur endogène de la cellule choisie comme cellule-hôte, et qui soit reconnu par l'ARN polymérase cellulaire de type II, afin que les glycosyltransférases soient exprimées sous contrôle de ces promoteurs à un stade précoce de l'infection virale. Ceci permet à ces glycosyltransférases d'être déjà présentes dans l'environnement cellulaire au moment de l'expression de la protéine à glycosyler, dont le gène est placé sous contrôle d'un promoteur tardif fort. La présente invention a pour objet un baculovirus recombinant résultant de l'insertion dans un baculovirus d'origine de cassettes d'expression permettant l'expression de protéines dans une cellule-hôte, caractérisé en ce qu'il comprend au moins; - une première cassette d'expression, comprenant un premier promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase I I de la cellule hôte; une seconde cassette d'expression, comprenant un second promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier promoteur. Selon un mode de réalisation préféré d'un baculovirus recombinant conforme à l'invention, il comprend en outre: - une troisième cassette d'expression, comprenant un troisième promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier et du second promoteur; Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit baculovirus recombinant comprend en outre. - une quatrième cassette d'expression, comprenant un quatrième promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier, du second et du troisième promoteur. Avantageusement, ledit baculovirus recombinant peut comprendre en outre une cinquième, voire une sixième, et le cas échéant une septième cassette d'expression, chacune d'entre elle comprenant un promoteur autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent des promoteurs des autres cassettes d'expression. La cellule-hôte peut être une cellule d'insecte, ou, le cas échéant, toute cellule animale permissive pour l'infection par un baculovirus, par exemple celles mentionnées dans l'article de revue de KOST et CONDREAY Trends in Biotechnology, 20: 173-180 (2002), ou dans la publication de CHENG et al., World J. Gastroenterol, 10: 1612-1618 (2004). Comme indiqué ci-dessus, des promoteurs utilisables pour la construction des cassettes d'expression contenues dans les baculovirus conformes à l'invention peuvent être choisis parmi tous les promoteurs, reconnus par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, autres que les promoteurs endogènes du baculovirus d'origine et les promoteurs endogènes de la cellule hôte. Il peut s'agir en particulier de promoteurs d'autres espèces que celle dont est issue la cellule hôte, ou bien de promoteurs précoces de virus capables d'infecter la cellule-hôte, par exemple, dans le cas d'une cellule d'insecte, de promoteurs de baculovirus (d'une espèce différente de celle du baculovirus d'origine), les densovirus, les iridovirus, les polydnavirus ou les entomopoxvirus. A titre d'exemples non-limitatifs, pour la construction de cassettes d'expression destinées à être insérées dans le baculovirus AcMNPV, pour être exprimées dans des cellules de Spodoptera frugiperda, on peut utiliser le promoteur gp67 du baculovirus d'Orgyia pseudotsugata (BLISSARD et al, Virol. 170(2) : 537-555, 1989; HILL et al, J. Gen. Virol. 75: 1811-1813, 1994), le promoteur du gène codant l'actine 3 de Bombyx mari (MOUNIER et al., Insect Biochem. 21: 293-301, 1991), le promoteur P9 du densovirus de Junonia caenia, (DUMAS et al., Virol. 191: 202-222, 1992) , le promoteur IEl de CfMNPV (baculovirus de Choristoneura fumiferana), ou de tout baculovirus autre qu'AcMNPV. Avantageusement, lesdites cassettes d'expression sont dispersées dans le génome du baculovirus, chacune desdites cassettes étant positionnée dans une région différente du génome viral, au lieu d'être groupées dans une ou deux régions du génome du baculovirus, comme dans le cas des baculovirus construits dans l'art antérieur. Les Inventeurs ont choisi des régions du génome viral, contenant des gènes non indispensables à la réplication du virus en culture cellulaire, de façon à cloner à leur place les gènes de chacune des glycosyltransférases. A titre d'exemples non-limitatifs de ces gènes non indispensables, on peut citer par exemple: le gène de l'EGT (Ecdysteroïde UDPglycosyltransferase) (O'REILLY et al., Science 245: 1110-1112, 1989), la région "chitinasecatepsine" (HAWTIN et al., Virol. 238: 243-253, 1997), la région codant pour la protéine pp34 (ZUIDEMA et al., Virol. 173(1) : 98-108, 1989), la région codant pour la protéine Pif 1 (GUTTIERREZ et al., J. Gen. Virol. 85: 331-341, 2004), le gène de la gp37 (JIANGUO et al., J. Gen. Virol. 70: 2449-2459, 1989), le gène He65 (MILLER, Plenum Press, New York, 1997). Si l'on souhaite exprimer, dans une même cellule-hôte, différentes protéines à des moments différents, (par exemple, si l'on souhaite exprimer des enzymes intervenant dans la glycosylation, préalablement à la protéine d'intérêt à glycosyler) on peut utiliser un baculovirus conforme à l'invention exprimant les protéines dont on souhaite obtenir l'expression précocément en association avec un autre baculovirus exprimant la ou les protéine(s) dont on souhaite obtenir l'expression plus tardivement. Avantageusement, on peut aussi exprimer la ou les protéine(s) dont on souhaite obtenir l'expression plus tardivement dans un baculovirus conforme à l'invention. Dans ce cas celui-ci comprend en outre, pour l'expression de la(les)dite(s) protéine(s) d'intérêt, une ou plusieurs cassettes d'expression comprenant chacune un autre promoteur tardif fort de baculovirus, lesdits promoteurs étant avantageusement différents entre eux. Ces promoteurs tardifs forts peuvent être par exemple le promoteur de la polyédrine, le promoteur de la protéine p10, ou des promoteurs synthétiques ou recombinants, tels que, par exemple le promoteur synthétique décrit par WANG et al, (Gene 100: 131-137, 1991) ou le promoteur Syn décrit dans la Demande PCT WO/9520672. Les baculovirus conformes à l'invention peuvent être utilisés, par exemple pour la production conjointe de protéines impliquées dans une même voie enzymatique, par exemple de protéines impliquées dans un même ensemble de modifications post-traductionnelles ou posttranscriptionnelles, ou bien pour la production conjointe de sous- unités d'un même complexe protéique. A titre d'illustration, des baculovirus recombinants conformes à l'invention, utilisables pour la production de protéines recombinantes glycosylées peuvent comprendre. des cassettes d'expression de glycosyltransférases, chacune sous contrôle d'un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte: par exemple un baculovirus conforme à l'invention peut comprendre une cassette exprimant une (31-4 galactosyltransférase, une cassette exprimant une Nacétylglucosaminyltransférase I, une cassette exprimant une N-acétylglucosaminyltransférase II; - le cas échéant une ou plusieurs cassettes d'expression de la protéine à glycosyler, chacune sous contrôle d'un promoteur tardif fort. Par exemple, si la protéine à glycosyler est un anticorps, l'une des chaînes peut être exprimée sous contrôle du promoteur de la protéine plO, et l'autre sous contrôle du promoteur de la polyédrine. La présente invention a également pour objet des cellules-hôtes, infectées par un baculovirus recombinant conforme à l'invention. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser les outils classiques de clonage et d'expression de gènes d'intérêt les baculovirus, tels que ceux décrits par exemple dans BACULOVIRUS EXPRESSION 10 VECTORS: A LABORATORY MANUAL (O'REILLY et al., Freeman and Cie, New York, 1994), ainsi que dans un grand nombre de Brevets ou Demandes de Brevets, tels que, par exemple, la Demande EP 0 651 815, la Demande EP 0 638 647 ou la Demande PCT WO 95/20672. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de construction de baculovirus conformes à l'invention et d'utilisation de ces baculovirus pour l'expression de glycoprotéines fonctionnelles. EXEMPLE 1: SCHEMA GENERAL DE CONSTRUCTION DES BACULOVIRUS MULTIRECOMBINANTS EXPRIMANT 3 GLYCOSYLTRANSFERASES DIFFERENTES: Materiel biologique utilisé : 25 Cellules d'insecte: La lignée cellulaire utilisée est la lignée Sf9 (ATCC CRL-1711) obtenue à partir des ovaires de larve du lépidoptère Spodoptera frugiperda. Elle est cultivée à 28 C dans du milieu TC100 (Life Technologies) complémenté de 5% 30 de sérum de veau foetal (Perbio). Pour l'infection par les baculovirus, les cellules Sf9 en phase exponentielle de croissance sont infectées à une MOI (multiplicity of infection) de 5. Le milieu de culture est éliminé du tapis cellulaire et remplacé par l'inoculum viral. Celui-ci reste en contact avec les cellules pendant une heure, puis du milieu frais est ajouté. Les flacons sont incubés à 28 C pendant 3 à 5 jours. Pour récupérer les virus produits, la suspension cellulaire est centrifugée à 2000tr/min (Heraeus, Multifuge 3S-R) pendant 10 minutes et le surnageant viral est alors conservé à 4 C. Virus. Le baculovirus de départ choisi (dénommé Dsuf) est un baculovirus AcMNPV modifié par délétion du gène de la protéine P10 et de celui de la polyédrine (gène PH) remplacés respectivement par un site Sse8387I et un site Bsu36I. Ce baculovirus possède un phénotype OB- (ne forme pas de polyèdres dans les cellules infectées). Les sites Sse8387I et Bsu36I permettent une linéarisation de l'ADN pour une transfection ciblée. Cette technique permet d'obtenir un taux de recombinants (c'est-à-dire ayant bien intégré le ou les gènes exogènes) supérieur à 98% en une seule étape de purification par plages de lyse. Les régions du génome d'AcMNPV auxquelles il sera fait référence dans les exemples plus détaillés qui suivent se réfèrent à la carte du clone C6, séquencé par AYRES et al. (Virology, 202, 586-605, 1994). Principe de construction des baculovirus recombinants Des régions du génome viral non essentielles à la réplication du baculovirus en culture cellulaire (et autres que les gènes de la protéine P10 et de la polyédrine) ont été identifiées. C'est au niveau de ces régions (gènes cibles) que seront insérés les gènes des glycosyltransférases. Les glycosyltransférases ont été insérées l'une après l'autre dans le génome du baculovirus. Pour chaque glycotransférase le gène cible 30 choisi a été cloné dans un vecteur plasmidique bactérien pour obtenir un vecteur de transfert vide, destiné à recevoir une cassette d'expression, et permettant ensuite d'insérer, par recombinaison homologue, cette cassette d'expression dans le génome viral. Dans un premier temps on insère dans le vecteur de transfert vide une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la polyédrine sous le contrôle de son promoteur endogène (cassette prPH-PH). L'intégration de cette cassette d'expression dans le génome du baculovirus Dsuf au niveau du gène cible produit un baculovirus intermédiaire possédant un phénotype OB+ facilement identifiable au microscope photonique par la présence de polyèdres dans les cellules infectées. Parallèlement, on construit une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la glycosyltransférase que l'on souhaite insérer, sous contrôle du promoteur choisi. Cette cassette est ensuite insérée dans le vecteur de transfert vide. La recombinaison homologue entre le vecteur de transfert ainsi chargé et le génome du baculovirus intermédiaire entraine l'insertion de cette cassette à la place de la cassette prPH-PH. Le baculovirus recombinant ainsi obtenu a perdu le phénotype OB+ et peut ainsi être facilement identifié. EXEMPLE 2: CONSTRUCTION DES VECTEURS DE TRANSFERT VIDES Construction du vecteur de transfert pVT EGT. L'EGT (Ecdysteroïde UDP-glycosyltransferase) est une enzyme de 60KDa qui glycosyle la 20-hydroxyecdysone (hormone de mue chez l'insecte) et la rend inactive (pour revue voir O'REILLY, Insect Biochem. Mol. Biol. 25(5) : 541-550, 1995). Le gène de l'EGT est transcrit très tôt au cours de l'infection. Une activité transférase est détectée dans les cellules infectées et le surnageant de culture dès 3 heures après infection (O'REILLY et al., J. Virol. 64(3) . 1321-1328, 1990). Il a été montré que ce gène n'est pas indispensable à la réplication du virus en culture cellulaire (O'REILLY et MILLER, Science 245: 1110-1112, 1989). Il peut donc être utilisé comme région d'insertion d'un gène étranger. Le gène de l' EGT encadré des gènes lefl et Da26 est situé dans la région Pstl G d'AcMNPV. Le fragment Pstl-BamHI de 5000pb inclus dans la région Pstl G d'AcMNPV a été cloné dans un plasmide pUC19 (BIOLABS), pour donner le vecteur de transfert dénommé pVT EGT. Ce vecteur contient un site unique Xbal présent dans la séquence codante EGT. Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 1. Construction du vecteur de transfert pVT KitKat Le virus AcMNPV possède dans la région charnière EcoRI E EcoRI H une ORF de 966 pb qui code pour une protéase à cystéine, la catepsine (Kat) (SLACK et al.,J. Gen. Virol. 76: 1091-1098, 1995) et une seconde de 1 654 pb qui code pour une chitinase (Kit) (HAWTIN et al., Virol. 212: 673-685, 1995) positionnée sur le brin complémentaire. Les ATG initiateurs des deux gènes sont distants de 48 nucléotides. Ces gènes ne sont pas indispensables à la réplication du virus en culture cellulaire (HAWTIN et al., Virol. 238:243-253, 1997) Le fragment BstXI-XbaI du plasmide pHC79 E+ H (plasmide contenant la région EcoRI E et H de AcMNPV) a été cloné en XbaI-EcoRV dans un plasmide (pBlue Script II SK M13(+) commercialisé par STRATAGENE), pour donner le vecteur pBS KitKat. Le site unique XbaI de pBS KitKat a été éliminé préalablement à la délétion d'un fragment EcoNI- EcoRI de 1 170 pb incluant les deux régions 5' codantes des gènes Kit et Kat. Le fragment délété a été remplacé par un oligonucléotide de synthèse (séquence du brin sens: 5'-TGAAGGCGAGTCTAGAACCTG-3' (SEQ ID NO: 1) ; séquence du brin antisens: 5'-AATTCAGGTTCTAGACTCGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 2) contenant un site XbaI, pour donner le vecteur de transfert dénommé pVT KitKat. Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 2. Construction du vecteur de transfert pVT 34 La région codant pour la protéine pp34 est située dans la région EcoRI H du baculovirus. Cette protéine transcrite très tardivement a été décrite comme constituant de l'enveloppe des corps d'inclusion (polyèdres). La délétion de ce gène par insertion du gène rapporteur LacZ a montré que cette protéine n'était pas nécessaire à la formation de particules virales non incluses (ZUIDEMA et al., Virol. 173(1) : 98-108, 1989). Le fragment PstI-EcoRI contenu dans la région EcoRI H du baculovirus a été cloné dans un plasmide pUCl9. Du fait de sa taille importante (8 100 pb), le clonage a été réalisé en deux étapes. Le fragment Pstl-Sural de 4103 pb puis le fragment SmaI-EcoRI de 3998pb ont été introduits dans le plasmide pUC19 pour donner le plasmide nommé pUC 34. Les sites EcoRI et Pstl situés à l'extrémité de la séquence virale étant gênants pour la suite des clonages, le fragment Pstl-BglII de 97pb ainsi que le site EcoRI ont été délétés. Le vecteur généré est nommé pVT 34. Il contient naturellement un site unique Xbal qui permet le clonage de la cassette promoteur-gène PH. Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 3. EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA (31.4 GALACTOSYLTRANSFERASE (01,4GT) BOVINE, ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Clonage du promoteur gp67 Le promoteur de la glycoprotéine d'enveloppe gp67 du baculovirus d'Orgyia pseudotsugata a été choisi pour l'expression de la (31.4 galactosyltransférase. L'expression du gène de la gp67 est complexe, plusieurs types de transcrits sont observés, l'un de type précoce ((3) et les autres tardifs (y) (BLISSARD et ROHRMANN, Virol. 170(2) : 537-555, 1989; HILL et FAULKNER, J. Gen. Virol. 75: 1811-1813, 1994). Ce promoteur a été reconstitué à l'aide de quatre oligonucléotides de synthèse. L'ATG initiateur de la traduction de la gp67 a été muté en ATC avec création d'un site BglII. Chacun des oligonucléotides de synthèse a été cloné séparément dans un plasmide pBS, puis les fragments ont été rassemblés dans un même plasmide pBS en Sacl-Kpnl. Le promoteur ainsi reconstitué (SEQ ID NO: 3) est représenté sur la figure 4A. 5'-GAGCTCGCTAGCGAAGATAAGATATAAATTATCGCAAGATAAGGCGCACGTTGATTG GGTCACCCGAGTGTACGTTGATAAAGTCACGTGGGCACCCAACGCGTTGATAAGCATGGG TATATAAGGGCCTGCAGTGTTCTGGTAAATCAGTTGCACTGTGCTCTTCACAGGAACACT ACAAGACCTACAAGATCTTGAGAATTGTTGTATTTATTTTGCTTTGTGGGATCCATGCAT GCTAGC-3' Dans cette figure, les sites de restriction utilisés pour l'assemblage des fragments sont soulignés. La position de la mutation ATC-* ATG est encadrée. L'assemblage des fragments est schématisé sur la figure 4B. La fonctionnalité du promoteur a été vérifiée en introduisant le gène de la (3-galactosidase de E. coli en aval de celui-ci. Après délétion du LacZ du plasmide pBS, le gène de la (3-galactosidase a été inséré dans ce plasmide en aval du promoteur gp67. Des expériences de transfection et de transfection-infection de cellules Sf9 en culture ont été menées. L'activité enzymatique a été visualisée dans les cellules par incubation en présence de X-Gal. Ces expériences montrent que la quantité de cellules bleues n'excède pas 5% en cas de transfection simple alors qu'elle atteint 98% lorsque la transfection est complémentée par une infection par le virus sauvage (toutes les cellules bleues présentent aussi le phénotype OB+). Ces résultats démontrent que le promoteur gp67 synthétique est fonctionnel dans un environnement viral infectieux. Insertion de la P1.4 galactosyltransférase La p1.4 galactosyltransférase (UDP-galactose: ,Q-D-N-acétylglucosaminyl-protéine)6(1-4) transférase, EC 2.4.1.38) catalyse le transfert d'un résidu galactose à partir d'UDP-Gal sur un résidu G1cNAc. L'ADNc de la P1.4 galactosyltransférase bovine (D'AGOSTARO et al., Eur. J. Biol. 183(1) : 211-217, 1989: n d'accès X 14558)a été cloné dans un plasmide pBS en BamHI. Une seule modification de la séquence codant la (31.4 galactosyltransférase a été faite. Il s'agit de la délétion du site unique Bsu36I. Outre l'avantage d'une recombinaison facilitée par linéarisationdes ADN viraux et plasmidiques, la présence des sites uniques Sse8387I et Bsu36I dans le génome viral permet de marquer le virus. La délétion du site Bsu36I a été réalisée par PCR. La séquence d'origine 5'-ACCGCATGCCCTGAGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 4) contenant les sites SphI (en italique) et Bsu36I (en gras) a été remplacée par la séquence BGTfor 5'-ACCGCATGCCCTGAAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 5) codant les mêmes acides aminés. La seconde amorce dessinée est BGTbac 5'-CCTTGTGAGGAGGCATGC- 3'(SEQ ID NO: 6). Le fragment amplifié a été cloné dans un plasmide pUC en Sphl et séquencé. Le fragment muté a été réintégré dans le plasmide d'origine pBS (31,4GT en Sphl-Ncol. Construction du vecteur de transfert chargé pVT EGT-prgp67-01, 4GT Le plasmide pBS promoteur gp67 synthétique a été digéré par Nhel. Le promoteur gp67 ainsi libéré a été inséré dans le vecteur de transfert pVT EGT au site unique Xbal. Le sens d'insertion a été vérifié. Il est identique à celui du gène EGT. Le gène de la (31.4 galactosyltransférase a été cloné en aval du promoteur gp67 dans le vecteur de transfert pVT EGT en BamHI. Le sens d'insertion du gène a été contrôlé. EXEMPLE 4: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA NACETYLGLUCOSAMINYLTRANFERASE I (GNTI) ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Construction du plasmide pUC Ad20. Ce plasmide intermédiaire permet l'insertion rapide des différents promoteurs et des gènes GNTI et II avant leur transfert dans leur vecteur respectif. Une séquence contenant de multiples sites de clonage a été reconstituée par oligonucléotides de synthèse chevauchants et insérée dans un plasmide pUCl9. Ce polylinker (SEQ ID NO: 7) du plasmide pUC Ad20, est représenté ci-après, et schématisé sur la figure 5 A. 5'AGCTTGTCTAGACGAAGCGCTATTAGATCTACTCTCGAGATACAATTGCTAGAATTC AAACCCGGGTACATGCATAATTCCGGATTAGTTAACATCGCTAGCCTGCAATTC-3' Identification et clonage du promoteur et du stop du gène actine 3 de Bombyx mori. Le promoteur du gène codant pour l'actine 3 de Bombyx mori (MOUNIER et al. , Insect Biochem. 21: 293-301, 1991) est reconnu par la polymérase II cellulaire. Un fragment de ce promoteur (prA3) de 1534 pb (SEQ ID NO: 8) a été cloné dans le plasmide pUC Ad20 en SmaI-EcoRI (figure 5 A). 2891552 16 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGGTACCACCACCCTGCCTATTTCTGCCGTGAA GCAGTAATGCGTTTCGGTTTGAAGAGTGGGGCGGCCGTGGTACTGAGACCTTAGAACTCATATCTG AAGGTGGGTGGCACATTTACGTTGTAGATGTCTATGGGCTCCAGTAACCACTTAACATCAGGTGGG CTGTGAGCTCTTACACCCATCTACGCAATAAAAAATTAAAAATAAATATGTTTGAAGTCCGTAACA TAGATTCCGTATTTTTACAGTTGTTTTTCACGTTTTTCATTTCTTCACCGACAATGGAAAATAATC ACACACAAATACACTGTATAGTAACAACGAGCAGAGCCGATTTTGGAGTTTCGATAAAGCGAGGCT ACCAAGAATGCGGCAGATAAGATTTACGTACATTCAAGAGTCGCTGATAACAACTTTTACCTCTCA AATTGCCCACAGTGCGATCACAAGAAACATAGACGAACGGATCTGTGCGCAACGAGCCGCTACGAT ATCATTATCATACAGATTTTTATCTTTTCATCTAGCTTCAGTTAGTGATGCTTTCTGATCTCTTCA TAATTATAATTAAAAAGAATAAATTATCTAGTAATATAGTTCTACTACGGTACACGAATTTTGAGA TTAATTAACCGGATTTTCTGGGTTATGATTTACATCGGTACAGAATCTAGTGAAAGCACGTCGAGT GAAATTCTATGAAACTTCGGCGGGAGTCGGGGAGAGGTTACAAGCGACCGCGAGGTGCCGCTAACT TAATCAGTTATCAAGGCATCGCCTTATCAAAAGATGCGAGCTGATAGCGTGCGCGTTACCATATAT GGTGACAAAAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATT GTGATAACGGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGA ACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAA AATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCC CTTTACCTTTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGT GTTACGTTACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAA.AAAAACATTTTTCGG AATTTAGTGTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATT TCAAAGTGTCCACTCGCATCGATCA.ATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTA TACAGTTTTCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATG TATGGAATGAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGA CGAAGAAGTTGCCGCGTTGG-3' De la même manière, un stop de transcription, le stop A3 (StA3) de 459 pb (SEQ ID NO: 9) 5'GGATCCGTCGAGTAAAACGAACGGAATGTTGTTGTTGCCGTTTTTTTTTTGACAAAGATTTT TATTTATTAAAGTTACTAACCCCAAAACTTTTTAATAAAATAAATTTATATACCGGTATAATAACT GACGTTTTTCACTTGCTGTCCCCGCTCCCGACTAACAGTACGTCGTGTGCACCGAAATTACCGATT TCGTACACCGTTTGAGACAGTTACGCTAGGAGCACAAATCTCCCAGCTGCATACCGTTGTTTACTG CAGTCTTTAATTGGAATGCGAGTCGTTGACCGCTTAATACGAAACATTCTAAAATTCGCATCGTAA CGCCATTAAAAATGCAAAGGAAACTGGTTCTGTACTTTCTACCTTTCAAAAGATCTGATTCACCAA ATTAATTTTATGCGGACTCACTAATTCCGTAGAAATCTGTGTTCGTTAATAATGAATCAGAGGTAC C-3 a été inséré aux sites BglII-Eco47III du plasmide pUC Ad20. Le promoteur prA3 contient une région régulatrice de type silencer de 800 pb. Une digestion par Alul-EcoRI a permis de l'éliminer, pour obtenir la construction AsA3 (SEQ ID NO: 10). 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGATAGCGTGCGCGTTACCATATATGGTGACAA AAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAAC GGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGAACAGTGCG CATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGA AAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCCCTTTACCT TTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGTGTTACGTT ACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAAAAAAACATTTTTCGGAATTTAGT GTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATTTCAAAGTG TCCACTCGCATCGATCAATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTATACAGTTT TCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATGTATGGAAT GAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGACGAAGAAG TTGCCGCGTTGG-3' Insertion de la GNTI L'ADNc de l'UDP-G1cNAc: a-3-Dmannoside P1,2-N-acéty1glucosaminyltransférase I humaine (GNTI; EC 2.4.1. 101; HULL et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176: 608-615, 1991; n d'accès: M61829), a été cloné dans un plasmide pGEM5Z-f contenant le gène de la GNT-I (plasmide ATCC 79003). Du fait de l'absence de sites de clonage appropriés de part et d'autre de la séquence, les régions 5' et 3' codantes ont été modifiées par PCR avec des amorces 25 contenant les sites de restriction permettant un clonage rapide dans un plasmide pUC, puis dans le vecteur de transfert approprié. En outre, le codon stop UAG a été changé en UAA, le codon UAG n'étant pas toujours reconnu comme codon stop en cellule de lépidoptère. L'amorce sens GI1: 5'-CGATGAATTCCAATTGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGCTTG-3' (SEQ ID NO: 11) et l'amorce anti-sens GI2: 5'CTGAGGATCCTCTTGGGCCAGGCGAATCACTTC-3' (SEQ ID NO: 12) permettent l'amplification de la région 5' codante du gène GNTI et le clonage de ce fragment dans un pUC19 en EcoRI-BamHI. L'amorce sens GI3. 35 5'-CGATGGATCCCTGAGATCTCAAGAACGATGACC-3' (SEQ ID NO: 13); et l'amorce antisens GI4: 5'-GTCAAAGCTTCTCGAGCAGGTGTTAATTCCAGCTAGGATC-3'(SEQ ID NO: 14) permettent l'amplification d'un fragment correspondant à la région 3' codante du gène GNTI et son clonage aux sites BamHI-HindIII dans le plasmide pUC19 chargé de la séquence 5'-GNTI. Le plasmide obtenu a été vérifié par séquençage (Eurogentec, Belgique). Le fragment SmaI-Bg1II de GNTI partie centrale du gène est ensuite extrait du plasmide d'origine pGEM52f-GNTI, purifié par électrophorèse puis réintroduit dans le plasmide pUC19 contenant les fragments 5' et 3' codants. Le gène GNTI reconstitué a une taille de 1342 pb. Le gène de la N-acétylglucosaminyltransférase I a été cloné entre le promoteur A3 et le stop A3 dans le plasmide pUC Ad20 aux sites Munl-XhoI, pour donner le plasmide pUC Ad20 GNTI. Les différentes étapes de cette construction sont schématisées sur la Figure 5. Construction du vecteur de transfert chargé pVT KitKat-GNTI La cassette de 2482 pb (680+460+1342) constituée du promoteur AsA3 suivi du gène GNTI et du stop A3 a été introduite dans le vecteur de transfert pVT KitKat au site unique XbaI. EXEMPLE 5: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA NACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE II (GNTII) ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Identification et clonage du promoteur P9 Le promoteur P9, issu du densovirus de Junonia caenia, permet la transcription des protéines de capside du densovirus (DUMAS et al., Virol. 191: 202-222, 1992). Il est reconnu par l'ARN polymérase II cellulaire. Le fragment BstEII-PvuII a été isolé du plasmide pBRJAS (GIRAUD, Thèse de doctorat, Université des Sciences de Marseille, 1991), et cloné dans un plasmide pUC en HinclI. Ce fragment (SEQ ID NO: 15) 5'GGTGACCTTGACCTTTGACCTTCTATATGACCTTGACCTACTTCTGTGACCTTCTGGTCTACT GACCTTTGACCTTCTGAGCTGATGTCTACTGACCTGATGATGGAGAGGATCCGAAGACCTTGGAGC TGAAGGTGGAACACAGGACCTGATGTTAGTGAAGGACAGCAATAGTGTGCGAGTGAGATAGCACTA TAGCAACTGTTAGAGCGAGATAGCAATATGAGTAAAAGAGATAGCATGCAAACAAACCTTGAGATA ATTTATGCGCATTTTATTATCTTGTTATTGTGACCTCGTTTGACCGGCAAACTCGCGTCGAGGCTG GGCCGTGTGCAAAACAGGATGTGGCTGGCCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCT ATTTTTAGTCAGTATGTCTTTCTACACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGAC-3' est représenté sur la figure 6A. Dans le but de muter l'ATG initiateur, le fragment BalIPstI a été échangé par un fragment reconstitué à partir d'oligonucléotides de synthèse. Ce fragment (SEQ ID NO: 16): 5'CCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCTATTTTTAGTCAGTACTTCTTTCTAC ACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGACCTGCA-3' est représenté sur la Figure 6B, qui schématise les différentes étapes de la construction du vecteur pUCprP9 15 ATG*, contenant ce promoteur. Analyse fonctionnelle du promoteur Comme décrit précédemment, le gène LacZ a été introduit sous contrôle du promoteur P9 pour vérifier la fonctionnalité du promoteur. Des expériences de transfection de cellules Sf9 avec le plasmide pUCprP9-0Gal montre que le promoteur est reconnu par la polymérase cellulaire puisque plus de 50% de cellules présentent une coloration bleue après trois jours de transfection. Ces résultats montrent que le promoteur P9 est fonctionnel. Insertion de la GNTII Le gène humain de la Nacétylglucosaminyltransférase II (GNTII; EC 2.4.1.143; TAN, Eur. J. Biochem. 231(2) : 317-328, 1995; n d'accession NM_ 002408) est cloné dans un plasmide pGEM52-f. Pour les mêmes raisons que pour GNTI, le gène a été resynthétisé par PCR avec les amorces suivantes: GII1; 5'CAGCGAATTCTCCGGAATGAGGTTCCGCATCTACAAACGGAAGGTGC-3' (SEQ ID NO: 17) GII2 5'-CTGAGGATCCGTTCAGCTGGTACACCAGGGAC-3' (SEQ ID NO: 18). Le fragment obtenu, correspondant à la région 5' du gène, a été cloné aux sites EcoRI-BamHI du plasmide pUC. Les amorces GII3: 5'CTGAGGATCCCCTCAAATTCCTAGGATCTTTCATGC-3' (SEQ ID NO: 19); 5 et GII4 5'GTCCAAGCTTGGTTAACCTGTGACTTTCACTGCAGCCTTCTGTAAC-3' (SEQ ID NO: 20) ont permis l'amplification d'un fragment correspondant à la région 3' du gène. Il a été cloné aux sites BamHI-HindIII du plasmide pUC contenant déjà le fragment 5'-GNTII. Le fragment KpnI-AvrII de GNTII, correspondant partie centrale du gène a ensuite été extrait du plasmide d'origine pGEM52f-GNTII pour être réintroduit dans le plasmide pUC contenant les fragments 5' et 3' du gène. Le plasmide pUC GNTII ainsi obtenu contient le gène complet de la GNTII (1352 pb). Une autre modification apportée au gène de la GNTII, est la mutation du site Bsu36I présent dans le 20 fragment BclI-SalI (169 pb) par PCR. La séquence d'origine: 5'-GTCAAGCTTGATCAGACCCTGAGGAATGTAG-3' (SEQ ID NO: 21) contenant les sites Hindlll (souligné), BclI (encadré) et Bsu36I (en gras) a été remplacée par la séquence ForBsGII: 5'GTCAAGCTTGATCAGACCCTGCGTAATGTAG-3' (SEQ ID NO: 22) Cette dernière séquence a été utilisée comme amorce sens pour la PCR avec l'amorce anti- sens BacBsGII: 5'-GGCGATCAGCTGATTGATCTC-3' (SEQ ID NO: 23) Le fragment amplifié a été cloné dans un plasmide pUC en Hindlll-Sall et séquencé. Le fragment muté a été réintégré dans le plasmide d'origine pUC GNTII en Bcll-Sall. Enfin, le gène de la N- acétylglucosaminyltransférase II a été cloné en aval du promoteur P9 dans le pUC Ad20GNT-I aux sites AccIII-HpaI. Les étapes de cette construction sont schématisées sur la Figure 7. Construction du vecteur de transfert chargé pVT34 GNTII Le fragment XbaINheI de 1 800pb de pUC Ad20 contenant le promoteur P9 et le gène de la GNTII a été inséré au site unique XbaI dans le pVT34 pour obtenir le vecteur pVT34-GNTII. EXEMPLE 6: CONSTRUCTION DE BACULOVIRUS RECOMBINANT EXPRIMANT DE 1 A 3 GLYCOSYLTRANSFERASES. Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGT-PH Une cassette PrPH-PH (séquence codant pour la polyédrine sous le contrôle de son promoteur endogène) a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT EGT, pour donner le vecteur pVT EGT-PH. La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT EGT-PH et l'ADN du virus Dsuf permet d'obtenir le virus recombinant AcEGT-PH de phénotype OB+. Obtention du baculovirus recombinant AcEGT-01,4GT Le virus recombinant possédant le gène de la (31, 4GT a été obtenu par cotransfection de cellules Sf9 avec l'ADN du virus AcEGT-PH et le vecteur de transfert chargé pVT EGT-prgp67-P1,4GT. Le virus recombinant obtenu a perdu le phénotype OB+. Ce virus est dénommé A cEGT-(3l,4GT. Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGT-(31,4GTKitKat-PH Une cassette PrPH-PH a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT KitKat, pour donner le vecteur de transfert pVT KitKat-PH. La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT KitKat-PH et l'ADN du virus recombinant AcEGT- (31,4GT permet d'obtenir le virus intermédiaire AcEGT-(31,4GTKitKat-PH, de phénotype OB+. Obtention du baculovirus recombinant AcEGT-01,4GT-KitKat-GNTI Ce virus recombinant est obtenu par 35 cotransfection de cellules Sf9 avec le vecteur de transfert chargé pVT KitKat-GNTI et l'ADN du virus AcEGT-(31, 4GT- KitKat-PH. Le virus recombinant obtenu, de phénotype OB-est dénommé AcEGT-(314GT-KitKat-GNTI. Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGTJ31,4GT-KitKatGNTI-pp34-PH Une cassette PrPH-PH a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT 34, pour donner le vecteur de transfert pVT 34- PH. La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT 34-PH et l'ADN du virus recombinant AcEGT-1314GT-KitKat-GNTI permet d'obtenir le 10 virus intermédiaire AcEGT-(31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH, de phénotype OB+. Construction du baculovirus recombinant final DsuG Des cellules Sf9 ont été transfectées avec le vecteur de transfert chargé pVT34-GNTII et l'ADN viral AcEGT-(31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH. Le virus recombinant obtenu, de phénotype OB-, a été nommé DsuG. Deux clones du virus DsuG, dénommés 8563 et 8567 ont été retenus pour la suite des expérimentations. L'insertion des gènes des glycosyltransférases dans le génome viral a été vérifiée par digestion de l'ADN viral par les enzymes de restriction EcoRI, BamHI, Hindlll et PstI, et comparaison du profil électrophorétique obtenu avec celui du virus d'origine DsuF, ainsi que par détection de la présence des trois gènes à l'aide de sondes froides marquées à la digoxygénine. EXEMPLE 7: PRODUCTION ET GLYCOSYLATION D'UN ANTICORPS RECOMBINANT. L'anticorps choisi pour tester la glycosylation est un anticorps humain anti-(32 microglobuline (anti-(3MG). Un baculovirus exprimant cet anticorps a été construit par recombinaison entre le baculovirus DsuG et des vecteurs de transfert chargés avec les chaînes lourdes et légères de l'anticorps anti-13MG. La séquence codant pour la chaîne légère a été clonée en aval du promoteur PH dans le vecteur de transfert pGMAc116T. Le vecteur pGMAc116T résulte de l'insertion du fragment EcoRI I de 5073 pb d'AcMNPV dans un plasmide pUC, suivie de la délétion partielle de la séquence codant pour la polyédrine. Ce vecteur contient un site unique BglII et un site unique Kpnl permettant le clonage sous contrôle transcriptionnel du promoteur PH. Quant à la séquence codant pour la chaîne lourde, elle a été clonée en aval du promoteur P10 dans le vecteur de transfert p119. Le vecteur p119 résulte de l'insertion dans un plasmide pUC d'un fragment HindIII-EcoRI de 3430pb situé dans les régions EcoRI S, X et P d'AcMNPV, suivie de la délétion partielle de la séquence codant pour la protéine P10. Ce vecteur contient un site unique BglII et un site unique HindIII permettant le clonage sous contrôle transcriptionnel du promoteur P10. Des cellules Sf9 ont été cotransfectées avec de l'ADN du virus DsuG, ou de l'ADN du virus DsuF, utilisé à titre de témoin, et les vecteurs de transfert pGmAcll6T et p119 chargés respectivement avec la séquence codant pour la chaîne légère et la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps anti-(3MG. Les baculovirus recombinants résultants expriment la chaîne lourde de l'anticorps anti-PMG sous contrôle du promoteur plO, et la chaîne légère sous contrôle du promoteur PH. I - Cinétique d'expression des gènes codant pour les glycosyltransférases et les chaînes de l'anticorps anti-(3MG. Afin de vérifier la présence de transcrits spécifiques des différentes glycosyltransférases, et de suivre le profil d'expression temporelle des différents promoteurs utilisés, l'analyse de l'apparition des transcrits des différentes enzymes dans des cellules Sf9 infectées par les baculovirus recombinants a été effectuée par RT-PCR. Les cellules infectées sont collectées par centrifugation à basse vitesse (2000 rpm, 10min), à différents temps après infection. Chaque point de la cinétique a été réalisé en double. Le temps 0 correspond à l'addition du milieu de culture frais sur le tapis cellulaire après une heure d'adsorption de l'inoculum viral. Après extraction des ARN totaux par le Trizol (Life Technologie) à partir des culots cellulaires (1 ml de Trizol pour un culot de 107 cellules Sf9 infectées), et quantification à 260 nm (spectrophotomètre Beckmann DU530), une quantité correspondant à 2 pg d'ARN total a été soumise à la transcriptase inverse. Les amorces utilisées pour la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) correspondant au messager recherché, sont l'amorce GI4 pour le gène GNTI et l'amorce GII4 pour le gène GNTII, celles-ci ayant servi pour l'amplification de la région 3' des gènes. Pour la synthèse de l'ADNc (31,4GT, on utilise l'amorce B14B de séquence 5'CATTGGGATGAGGTCCACAT-3'(SEQ ID NO: 24). Les échantillons ont été incubés 5 min à 93 C (inactivation de la transcriptase inverse) puis soumis à une PCR. Les amorces utilisées sont: (i) pour GNTI, GI3 et GI4, (ii) pour GNTII, GI13 et GII4 et (iii) pour (31,4GT, les amorces B14B et BGTfor. L'analyse sur gel d'agarose de 25 pl de produit PCR révèle la présence de fragments d'amplification aux tailles attendues. Pour chaque expérience, les fragments d'ADN amplifiés ont été révélés avec une sonde spécifique marquée à la digoxygénine. Ces sondes ont été préparées à partir des plasmides d'origine (pUC GLATI, pUC GNTII ou pBS (31,4GT respectivement). La matrice utilisée pour la réalisation du témoin positif (T+) correspond à l'ADN du plasmide contenant le gène à caractériser. Les témoins négatifs (T-) ont été obtenus à partir d'ARN totaux préparés 48 heures post-infection mais non soumis à la transcription inverse. D'autres témoins ont été insérés dans chaque expérience. Il s'agit d'ARN totaux issus de cellules Sf9 non infectées (S) ou infectées avec le virus sauvage DsuF pendant 8 heures (F8) et 48 heures (F48) et traités avec les amorces utilisées pour l'expérience. Expression des glycosyltransférases: Les Figures 8A, 8B et 8C illustrent respectivement l'activité transcriptionnelle des gènes GNTI, GNTII, et (31,4GT au cours du temps. Les échantillons 2 à 72 correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuG B3003 entre 2 et 72 heures p.i. Les échantillons F8 et F48 sont des témoins négatifs. Ils correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuF après 8 heures (F8) et 48 heures (F48) p.i. L'échantillon S correspond à un témoin cellules non infectées. SL est le marqueur ADN de taille (Smart Ladder, Eurogentec) Expression de GNTI Des fragments d'amplification de 430 pb révélés avec la sonde marquée à la digoxygénine pUC GNTI sont observés dès 2 heures après infection et jusqu'à 48 heures (le point 72 heures n'a pas été effectué dans cette expérience) alors qu'aucun produit d'amplification n'est obtenu dans les témoins négatifs F8 et F48. Le marquage du témoin positif T+ confirme que ces produits correspondent à l'amplification de la région 3' du gène GNTI. Le témoin négatif T- permet de confirmer que les échantillons ne présentent aucune trace d'ADN contaminant. Expression de GNTII On observe l'amplification par RT PCR d'un fragment de 255 pb à partir d'ARN totaux extraits après 2 heures d'infection et jusqu'à 72 heures. La révélation avec une sonde pUC GNTII confirme que ces produits d'amplification sont bien issus d'ARN GNTII. Expression de 01, 4GT Le même type de résultat est obtenu avec la sonde. Des produits d'amplification de 380 pb révélant la présence de transcrit (31,4GT sont observés dès 2 heures post-infection et jusqu'à 72 heures. L'hybridation avec la sonde pBS (31,4GT permet de confirmer que ces produits d'amplification sont issus d'ARN de (31,4GT Que ce soit pour l'étude des transcrits (31,4GT, GNTI ou GNTII, la présence de transcrits est décelée très tôt dans l'infection. Ces résultats confirment que les promoteurs A3, P9 et gp67 sont bien fonctionnels en cellules Sf9 infectées par un baculovirus, et notamment qu'ils sont actifs à des stades précoces de l'infection. Expression des chaînes légère et lourde de l'anticorps D'après la littérature, les promoteurs très tardifs PH et P10 sont activés entre 12 à 18 heures post-infection (ROHEL et FAULKNER, J. Gen. Virol. 50: 739-747, 1984). Afin de vérifier que les transcrits GNTI, GNTII et P1,4GT apparaissaient bien avant les chaînes y et K des anticorps, de nouvelles RT PCR ont été réalisées sur les mêmes préparations d'ARN totaux avec des amorces spécifiques Bac 116TCK: 5'-CAGATTTCAACTGCTCATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 25) et For 116TVL: 5'-CCGGATTATTCATACCGTC-3' (SEQ ID NO: 26) pour l'amplification de la séquence insérée dans la région PH et les amorces Bac 119CG1: 5'-GAGGTGCTCTTGGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 27) et For 119VH: 5'CAGCTTTTGGACGGTTTGC-3' (SEQ ID NO: 28) pour l'amplification de la séquence insérée dans la région P10. Les résultats sont présentés dans la figure 9. Les échantillons 2 à 72 correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuG B3003 entre 2 et 72 heures p.i. Les échantillons F8 et F48 sont des témoins négatifs. Ils correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuF après 8 heures (F8) et 48 heures (F48) p.i. L'échantillon S correspond à un témoin cellules non infectées. SL est le marqueur ADN de taille (Smart Ladder, Eurogentec) Ces résultats montrent que les premiers transcrits chaînes légères et chaînes lourdes n'apparaissent qu'à partir de 12 heures p.i et 4 heures p.i respectivement. II- Production et caractérisation des anticorps recombinants Des cellules Sf9 (densité de 500 000 cellules/ml) ont été infectées en bouteille roulante par le virus DsuF ou le virus DsuG à une MOI de 2 PFU/cellule (2 X 400 ml) dans du milieu sans sérum. Après 5 jours d'infection, les surnageants de culture ont été collectés et les anticorps purifiés sur protéine A Sépharose (Amersham). Deux lots d'anticorps ont été purifiés (i) l'un correspondant à un clone viral obtenu après recombinaison avec de l'ADN du virus DsuF: clone B1601 (anticorps mannosylé ) et (ii) l'autre correspondant à un clone issu de la recombinaison avec de l'ADN de virus DsuG: clone B3003 (anticorps galactosylé ). Caractérisation des anticorps Analyse de la glycosylation de la chaîne lourde de l'anticorps Les chaînes yl et K des anticorps B1601, B3003 et d'une IgGl de référence (Sigma) sont séparées sur gel SDS PAGE 10% en conditions dénaturantes. Après transfert sur membrane de nitrocellulose, on effectue un marquage soit avec la lectine ConA (Canavalia ensiformis Agglutinin), spécifique des résidus mannosyl, soit avec la lectine RCAl20 (Riccinus communis Agglutinin), spécifique des résidus galactosyl. Ce marquage est effectué selon le protocole suivant: la membrane est saturée dans un bain de Polyvinylpyrolidone K30 (Aldrich) à 2% dans le tampon TBS (Tris-HC1 50mM, NaCl 0,15M, pH 7,5) pendant 2 heures. Deux lavages de 5 minutes dans le tampon TBS suivi d'un lavage dans le tampon 1 (TBS + 1mM MgC12, 1mM MnC12, 1mM CaC12, pH 7,5) sont effectués avant une incubation d'une heure de la lectine couplée à la digoxygénine et diluée dans le tampon 1 à lpg/ml (RCAl20, ConA, SNA (Roche) cf tableau cidessous pour leur spécificité). Après trois lavages de 5 minutes, un nouveau blocage des sites non spécifiques est entrepris avec une solution de Blocking Reagent (Roche) à 0,5% dans le TBS. Une incubation d'une heure en présence du fragment Fab anti-digoxygénine couplé à la phosphatase alcaline (Roche) est effectuée suivie d'une série de trois lavages et d'une pré-incubation de 5 minutes dans le tampon 2 (Tris-HC1 0, 1M; MgC12 50mM; NaCl 0,1M, pH 9,5). La révélation s'effectue sous agitation, par action d'une solution de 50pl de NBT (75 mg 4-Nitro blue Tretrazolium chloride/ml diméthylformamide) et de 37,5 pl de X-phosphate (50 mg de 5-bromo-4-chloro-3indolyl-phosphate/ml diméthylformamide) dans 10ml de tampon 2. Les résultats sont illustrés par la figure 10: (1) : IgGl de référence; (2) anticorps B1601 (3) anticorps B3003; A: Marquage à la RCAl20 des résidus terminaux (3 galactosyl greffés sur l'Asp297 de la région Fc des IgGl. B: Marquage à la ConA des résidus manosyl greffés sur l'Asp297 de la région Fc des IgGl. Ces résultats montrent que le marquage à la lectine RCAl20 de la chaîne lourde de chaque anticorps permet de détecter la présence de résidus galactosyl terminaux uniquement sur l'anticorps B3003 et sur l'IgGl de référence, alors que le marquage par la lectine ConA, spécifique des résidus mannosyl, a été observé sur les trois anticorps. REVENDICATIONS 1) Baculovirus recombinant résultant de l'insertion dans un baculovirus d'origine de cassettes d'expression permettant l'expression de protéines dans une cellule-hôte, caractérisé en ce qu'il comprend au moins; - une première cassette d'expression, comprenant un premier promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte; - une seconde cassette d'expression, comprenant un second promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier promoteur. 2) Baculovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend en outre: - une troisième cassette d'expression, comprenant un troisième promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier et du second promoteur; 3) Baculovirus recombinant selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs cassettes d'expression supplémentaires, chacune desdites cassettes comprenant un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, lesdits promoteurs étant tous différents entre eux. 4) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que chacune desdites cassettes d'expression est positionnée dans une région différente du génome viral contenant des gènes non indispensables à la réplication du virus en culture cellulaire. 5) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une cassette d'expression comprenant un promoteur tardif fort de baculovirus. 6) Baculovirus recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs autres cassette(s) d'expression comprenant chacune un promoteur tardif fort de baculovirus, lesdits promoteurs étant différents entre eux. 7) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 3 cassettes d'expression, permettant l'expression de 3 glycosyltransférases différentes. 8) Cellule hôte infectée par un baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Utilisation d'un baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 7, ou une cellule hôte selon la revendication 8 pour la production de glycoprotéines. 10