FR 2896802 A1 20070803 FR 0650360 A 20060201 NOUVEAUX COMPOSÉS SILANES ET LEUR UTILISATION POUR FONCTIONNALISER DES SUPPORTS SOLIDES ET IMMOBILISER SUR CES SUPPORTS DES MOLÉCULES BIOLOGIQUES DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a trait à de nouveaux composés silanes utilisables pour fonctionnaliser des supports solides, à des supports fonctionnalisés par lesdits composés silanes et à leurs utilisations pour l'immobilisation de molécules biologiques, telles que des acides nucléiques, des polypeptides, des lipides, des carbohydrates et des hormones. Les supports porteurs de molécules biologiques immobilisées sont avantageusement utilisés pour la détection et la reconnaissance d'espèces biologiques, mais également d'autres applications, telles que la synthèse ou la modification chimique sur support. En ce qui concerne la détection et la reconnaissance d'espèces biologiques, il est essentiel de disposer de supports solides fonctionnalisés présentant les caractéristiques suivantes : - permettre l'immobilisation reproductible des molécules biologiques d'intérêt ; - permettre l'immobilisation des molécules biologiques d'intérêt de façon sensible, la sensibilité d'un support solide fonctionnalisé dépendant du taux d'immobilisation et de la méthode de détection d'un signal mais aussi du niveau du bruit fond ; -être réutilisables. L'immobilisation de molécules biologiques d'intérêt sur des supports solides s'effectue généralement en deux étapes : - une première étape de fonctionnalisation des supports qui consiste en une modification chimique de leur surface par greffage d'agents de couplage qui vont assurer la fixation des molécules biologiques sur le support ; une deuxième étape d'immobilisation consistant à établir une liaison covalente entre les molécules biologiques et les agents de couplage greffés sur le support. Les agents de couplage se greffent à la surface des supports par réaction avec des fonctions - OH ou hydrure du support et des fonctions réactives de l'agent, pour former de fortes interactions ioniques ou covalentes entre l'agent de couplage et le support et s'organisent à la surface du support généralement sous forme d'une monocouche dense et organisée à la surface, par exemple, par formation de liaisons du type Van der Waals entre les molécules d'agents de couplage greffées. Des agents de couplage pour fonctionnaliser des supports, en particulier des supports à base de silicium sont des organosilanes, comprenant au moins un groupe organique R apte à réagir avec une extrémité fonctionnelle des molécules à immobiliser et au moins un groupe X apte à réagir avec les fonctions -OH ou hydrure du support pour former une liaison iono- covalente voire covalente. Une fois les agents de couplage greffés et éventuellement organisés sous forme d'une monocouche à la surface du support, les molécules biologiques peuvent être greffés ou adsorbés par réaction avec une fonction terminale de l'agent de couplage greffé. Une fonction terminale particulièrement attractive est la fonction hydroxyle, en particulier hydroxyle primaire, et ce pour les raisons suivantes . - elle permet la formation d'une liaison covalente en réagissant avec un groupe approprié, par exemple un groupe phosphoramidite fixé sur la molécule biologique à immobiliser ; -elle permet la formation de liaisons non covalentes du type liaison hydrogène au contact d'une fonction -NH2, -OH, -SH située sur la molécules biologiques à immobiliser. La synthèse d'agents de couplage silylés porteurs d'une fonction alcool n'est pas envisageable, sans passer par une protection de cette fonction du fait de sa très haute réactivité notamment avec les groupements chlorosilanes, alcoxysilanes et hydrogénosilanes, protection qui est supprimée avec greffage de l'agent sur le support. Différentes techniques pour obtenir des agents de couplages silylés porteurs d'une fonction hydroxyle greffés à la surface d'un support ont été envisagés . - le greffage sur un support de silice d'un agent silylé porteur d'une fonction ester suivi d'un réduction de ladite fonction ester en alcool selon le schéma suivant : S1021 Si OR LiAlH4 SiO21 Si OH Si021 Si 1. B2H6/THF SiO21 Si OH Si021 if O/ OR SiO21 Si OH o - le greffage sur un support de silice d'un agent silylé porteur d'une fonction vinylique suivi d'une oxydation de ladite fonction vinylique en alcool selon le schéma suivant : 2.H202/NaOH le greffage sur un support de silice d'un agent silylé porteur d'une fonction carbonate suivi d'une transformation de la fonction carbonate en alcool par irradiation à une longueur d'onde donnée selon le schéma suivant : o - le greffage sur un support de silice d'un agent silylé porteur d'une fonction éther photolabile suivi d'une transformation de la fonction éther en alcool par irradiation à une longueur d'onde donnée selon le schéma suivant : 4 SiO21Si q-n-v OH L'ensemble des conditions opératoires nécessaires à la libération de la fonction -OH des agents après greffage mentionné ci-dessus sont des conditions agressives qui nuisent à l'intégrité du support. Il existe donc un véritable besoin pour des agents de couplage du type silane qui sont aptes à se greffer à la surface d'un support minéral et apte à libérer une fonction -OH après greffage dans des conditions qui ne nuisent pas à la nature du support. C'est sur la base de ce besoin que les inventeurs ont mis au point de nouveaux composés silanes qui présentent les avantages mentionnés ci- dessus. EXPOSÉ DE L'INVENTION Ainsi, l'invention a trait, selon un premier objet, à un composé silane répondant à la formule (I) suivante : A-E-X (I) dans laquelle : - X représente un groupe silylé apte à créer une liaison covalente après réaction avec les fonctions hydroxyle ou hydrure d'un support ; E représente un groupe espaceur organique ; - A représente un groupe apte à former une fonction -OH par hydrolyse acide, ladite fonction -OH après ladite hydrolyse étant liée de façon covalente à E. La transformation envisageable du groupe A en fonction -OH par simple hydrolyse acide est particulièrement intéressante, en ce sens que l'hydrolyse acide n'interfère pas sur la qualité, l'accessibilité et la reproductibilité des surfaces des supports, sur lesquels sont destinés à être greffés les composés silanes de l'invention. Selon l'invention, le groupe A est un groupe apte à former une fonction -OH par hydrolyse acide. En d'autres termes, le groupe A est un groupe protecteur d'une fonction -OH, lequel groupe s'hydrolyse en milieu acide pour libérer ladite fonction. Avantageusement, ce groupe est un groupe éther susceptible de libérer une fonction -OH par hydrolyse acide. Un tel groupe éther peut être avantageusement : - un groupe méthoxyméthyléther de formule suivante : CH3ùO CH2ùO 30 5 10 15 - un groupe t-butoxyméthyléther de formule suivante : CH3 H3C C O CH2ùO CH3 - un groupe 2-(triméthylsilyl)éthoxyméthyléther de formule suivante : CH3 1 H3C Si CH2ùCH2ùO CH2ùO CH3 - un groupe tétrahydropyranyléther de formule suivante : - un groupe 1-méthoxycyclohexyléther de formule suivante : -un groupe 4-méthoxytétrahydropyranyléther de formule suivante : un groupe 4-méthoxytétrahydrothiopyranyléther de formule suivante : un groupe 4méthoxytétrahydrothiopyranyléther S,S-dioxyde de formule suivante : 10 5 -un groupe 1-[(2-chloro-4-méthyl)phényl]-4-méthoxypipéridin-4-yléther de formule suivante : Cl H3C 10 - un groupe 1-[(2-fluorophényl)phényl]-4-méthoxypipéridin-4-yléther de formule suivante : - un groupe 1,4-dioxan-2-yléther ; - un groupe tétrahydrofuranyléther ; - un groupe 1-éthoxyéthyléther de formule 15 suivante : 10 15 CH3ùCH2ùO CH2ùCH2ùO - un groupe 1-(2-chloroéthoxy)éthyléther de formule suivante : CI CHZ CH2ùO CH2ùCH2ùO - un groupe 1-méthyl-1-méthoxyéthyléther de formule suivante : H3C C\ C H CH2ùO H3C - un groupe 1-méthyl-1-benzyloéthyléther de formule suivante : H3C C O CH3 C H CH2ùO H3C - un groupe t-butyléther de formule suivante : CH3 - un groupe allyléther de formule suivante : H2C CH CH2ùO - un groupe p-méthoxybenzyléther de formule suivante : H3C CH2ùO - un groupe p-halogénobenzyléther de formule suivante : CH2ùO dans laquelle X représente un atome d'halogène ; - un groupe triphénylméthyléther de formule suivante : 15 - un groupe triisopropylsilyléther de formule suivante :10 12 H3C\ CH3 CH H3C CHùSiù0 H3C/ CH H3C CH3 - un groupe diméthylisopropylsilyléther de formule suivante : CH3 H3C\ CHù1iù0 H3C/ ICH3 - un groupe diéthylisopropylsilyléther ; - un groupe méthoxyméthylcarbonate de formule 10 suivante : O H3C O CH2ùO/ O les traits de coupure indiquant l'endroit par lequel se fait la liaison avec le groupe E. Selon l'invention, le groupe E est un groupe espaceur organique, sa fonction essentielle étant de conférer des propriétés particulières au film résultant du greffage des composés silanes à la surface d'un support. Ce groupe E est généralement un groupe hydrocarboné, comprenant, par exemple, de 2 à 24 atomes de carbone, et comprenant éventuellement une ou 15 20 plusieurs insaturations et/ou un ou plusieurs groupes aromatiques et/ou un ou plusieurs hétéroatomes. A titres d'exemples, le groupe E peut être un groupe alkylène, c'est-à-dire un enchaînement du type -CH2-, comprenant, par exemple, de 8 à 24 atomes de carbone. Ce type de groupe confère aux composés silanes, une fois greffés sur un support, une capacité à interagir entre eux, par création d'interactions interchaînes et ainsi contribue à l'obtention de monocouches organisées. Le groupe E peut être un groupe fluoroalkylène comprenant de 3 à 24 atomes de carbone. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés permettant leur utilisation en chromatographie et en électrophorèse. Le groupe E peut être un groupe hydrocarboné comprenant une ou plusieurs insaturations, par exemple, du type acétylénique. Un exemple d'un tel groupe peut être un groupe alkylène tel que défini ci-dessus interrompu par une ou plusieurs insaturations acétyléniques. Lorsque le groupe E comporte au moins deux insaturations, il peut conférer aux composés silanes, une fois greffés sur un support, une capacité à se réticuler. Le groupe E peut être également un groupe hydrocarboné comprenant un ou plusieurs groupes aromatiques. On peut citer, par exemple, un groupe 30 comprenant des groupes aromatiques conjugués avec des groupes linéaires insaturés, tel qu'un groupe résultant de l'enchaînement d'un motif phénylène-vinylène ou phénylène-acétylène. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés optiques non linéaires. On peut citer, par exemple, un groupe comprenant des motifs pyrrole, thiophène. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés de conduction électronique. On peut citer, par exemple, un groupe comprenant un ou plusieurs aromatiques substitués par un ou plusieurs groupes hétéroatomiques, tel qu'un groupe comprenant un enchaînement de motifs quinones ou de motifs diazoïques. Ces groupes contribuent à conférer au film résultant du greffage des composés silanes les comprenant, des propriétés de photo/électroluminescence. Selon l'invention, X représente un groupe silylé permettant la fixation covalente du composé silane sur les fonctions hydroxyle ou hydrure d'un support, lequel support peut être, par exemple, un support solide en silicium, en ITO (oxyde d'indium et d'étain) ou en titane. Ce groupe X peut être par exemple un groupe trihalogénosilane (tel qu'un groupe trifluorosilane, un groupe trichlorosilane) ; un groupe trihydrogénosilane SiH3 ; un groupe trialcoxysilane -Si(OR)3 avec R représentant un groupe alkyle saturé en Cl à C6r linéaire ou ramifié, un groupe phényle (tel qu'un groupe triméthoxysilane, un groupe triéthoxysilane, un groupe triisopropoxysilane) ; un groupe triaminoalcoxyamine -Si (NR1R2) 3, avec les R1 et R2 représentant indépendamment un groupe alkyle saturé en cl à C6, linéaire ou ramifié, un groupe phényle ; un groupe organométallique (tel qu'un groupe organomagnésien, un groupe organolithien) ; un groupe hydrolysable. Des composés particuliers conformes à l'invention répondent aux formules (II), (III) et (IV) suivantes . SiH3 Les composés de l'invention peuvent être préparés par des méthodes classiques de synthèse 20 accessibles à un technicien spécialisé en synthèse organique. A titre d'exemple, les composés (II), (III) et (IV) peuvent être préparés selon le schéma réactionnel suivant : 25 16 HO CH2(OCH3)2 Acide p-toluènesulfonique LiBr \ ^ /(CH2)1` /Si(OMe)3 O O \ /\ /(CH2)lo ~Si(OEt)3 O O SiH3 Dans ce cas de figure, la fonction méthoxyméthyléther est synthétisée par réaction de l'undécénol avec le diméthoxyméthane (assurant à la fois la fonction de réactif et de solvant) en présence de quantités catalytiques de bromure de lithium et d'acide paratoluènesulfonique. Enfin, l'introduction d'un groupe silylé s'effectue par une réaction d'hydrosilylation en présence d'un catalyseur de Karstedt de formule Pt [Si (CH3) 2HC=CH2] 20. L'homme du métier adaptera ce schéma réactionnel en fonction des composés silanes qu'il souhaite obtenir. Comme mentionné précédemment, les composés silanes de l'invention sont susceptibles de se greffer à la surface d'un support, en raison de la présence du groupe X apte à réagir avec des fonctions hydroxyles ou hydrures (présentes sur le support) pour former des liaisons covalentes. Ainsi, l'invention a trait selon un second objet, à un procédé de fonctionnalisation d'un support solide comportant en surface des fonctions hydroxyle ou hydrure, comprenant une étape de mise en contact d'une solution comprenant au moins un composé silane tel que défini ci-dessus avec ledit support. Ce procédé peut comprendre préalablement un étape de traitement de la surface de support afin de créer sur ladite surface les fonctions hydroxyles ou hydrures nécessaires au greffage. Ainsi, pour un support en silicium du type 100 (par exemple, du type wafer), il est préférable, avant fonctionnalisation, de traiter celui-ci en le mettant en contact avec une solution de soude afin d'engendrer une réaction d'hydroxylation. Les supports pouvant être fonctionnalisés selon le procédé de l'invention peuvent être des supports organiques (par exemple en matériaux plastiques), des supports inorganiques, par exemple des supports en oxyde métallique (par exemple, silice et ses dérivés comme le verre, le quartz, oxyde d'indium et d'étain...), des supports métalliques (tel que des supports en titane) ou des supports en silicium, l'essentiel étant que ces supports soient susceptibles (éventuellement avec l'étape de traitement préalable mentionnée ci-dessus) de présenter des fonctions hydroxyles ou hydrures pour le greffage des composés silanes de l'invention. L'invention a également pour objet le support solide fonctionnalisé susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention. La présente invention a donc également pour objet un procédé d'immobilisation de molécules biologiques sur support solide fonctionnalisé comprenant les étapes suivantes : a) une étape de mise en oeuvre du procédé de fonctionnalisation tel que défini ci-dessus ; b) une étape de déprotection des fonctions - OH des composés silanes greffés par hydrolyse acide ; c) une étape de mise en contact du support obtenu à l'étape b) avec une solution comprenant la (les) molécule(s) biologique(s) à immobiliser, lesdites molécules biologiques comportant une extrémité apte à réagir avec les fonctions -OH des composés silanes greffés pour former une liaison covalente. Selon une alternative, la(les) molécule(s) biologique(s) à immobiliser peuvent être greffés non pas directement sur la fonction -OH déprotégée du composé silane mais sur une fonction différente introduite par réaction d'un composé la comprenant sur la fonction -OH déprotégée du composé silane. Dans ce cas, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'un support solide fonctionnalisé par la mise en oeuvre du procédé de fonctionnalisation tel que décrit ci-dessus ; b) une étape de déprotection des fonctions -OH des composés silanes greffés par hydrolyse acide ; cl) une étape de mise en contact du support obtenu en b) avec un composé apte à former une liaison covalente par réaction avec la fonction -OH des composés silanes et comprenant à l'issue de cette étape une extrémité réactive différente d'une fonction -OH ; c2) une étape mise en contact du support obtenu à l'étape cl) avec une solution comprenant la (les) molécule(s) biologique(s) à immobiliser, lesdites molécules biologiques comportant une extrémité apte à réagir avec ladite extrémité réactive pour former une liaison covalente. L'étape de déprotection peut se faire en soumettant le support greffé à une solution acide, par exemple, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique. Ces supports fonctionnalisés, une fois les fonctions -OH déprotégées, permettent l'immobilisation reproductible de molécules biologiques d'intérêt tout en limitant l'adsorption non spécifique de molécules. Ces supports fonctionnalisés peuvent en particulier être utilisés pour l'immobilisation, par fixation covalente, de molécules biologiques d'intérêt, telles que des acides nucléiques, des polypeptides (protéines, enzymes), des lipides, des carbohydrates ou des hormones. Au sens de la présente invention et dans ce qui suit, on entend par acides nucléiques aussi bien des oligonucléotides que des ADN ou des ARN, ou encore des acides nucléiques au squelette ou aux bases modifiées, tels que les acides nucléiques peptidiques (correspondant à l'acronyme PNA pour Peptide Nucleic Acids ) qui font intervenir des liaisons peptidiques à la place des liaisons phosphodiesters. Ainsi, pour greffer un acide nucléique sur le support, il peut être envisageable de greffer sur les fonctions -OH des composés silanes un composé comprenant un groupe phosphate, lequel groupe sera susceptible de réagir avec un nucléotide pour former une liaison phosphodiester, les nucléotides subséquents réagissant l'un sur l'autre pour forme le polynucléotide. Un composé approprié comprenant un groupe phosphate est le phosphoramidite-Cy3, qui agit également en tant que marqueur fluorescent. Une fois déprotégé, les composés silanes greffés présentent un caractère hydrophile. Ils peuvent aussi être utilisés pour assurer une fonction de rétention de composés hydrophiles, tels que les protéines. L'invention a également pour objet les supports solides obtenus en mettant en oeuvre le procédé d'immobilisation conforme à l'invention, c'est-à-dire les supports solides sur lesquels sont immobilisés par fixation covalente les molécules biologiques d'intérêt. Ces supports solides peuvent ainsi être utilisés comme outils d'analyse (par exemple, pour un diagnostic, un séquençage) ou comme outils de synthèse pour réaliser par exemple des revêtements. Les supports trouvent donc des applications dans de nombreux domaines, tels que la synthèse sur supports solides, la séparation et la purification de molécules (électrophorèse et chromatographie), les biocapteurs. L'utilisation de supports solides fonctionnalisés selon la présente invention permet d'immobiliser différents types de molécules biologiques et donc de préparer différents types de puces comme des puces à acides nucléiques telles que des puces à ADN, des puces à polypeptides telles que des puces à protéines. L'utilisation de supports solides modifiés selon la présente invention est particulièrement avantageuse pour la préparation de puces à ADN, à savoir de supports sur lesquels sont fixés, de façon covalente, des oligo- ou polynucléotides de séquences connues. De telles puces à ADN permettent, par hybridation des oligo- ou polynucléotides immobilisés sur le support avec des acides nucléiques ou des oligonucléotides cibles, de déterminer la séquence de ces molécules cibles et de suivre l'expression des gènes. La présente invention a donc pour objet également une puce à acides nucléiques ou à polypeptides, obtenues par le procédé d'immobilisation de l'invention mentionné ci-dessus. L'invention va maintenant être décrite par rapport aux exemples donnés ci-dessous à titre illustratif et non limitatif.30 BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 illustre le spectre IR du 11-(méthoxyméthoxy)undécylsilane en solution (courbe a) dans le tricholoréthylène et après greffage (courbe b). La figure 2 est un graphique illustrant l'évolution de l'angle de contact d'un support en silicium greffé en fonction du temps d'immersion dans une solution d'acide chlorhydrique 12N lors de la déprotection de la fonction méthoxyméthoxy. La figure 3 illustre le spectre IR de la surface d'un support en silicium greffé par un composé silane de l'invention avant déprotection et après déprotection. 15 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS EXEMPLE 1 Cet exemple illustre la synthèse d'un silane conforme à l'invention : le 11- (méthoxyméthoxy)undécylsilane selon le schéma 20 réactionnel suivant : 10 23 HO Etape 1 \ ^ /(CH2)1O /Si(OMe)3 O O /(CH2)l o ~Si(OEt)3 O O SiH3 La fonction méthoxyméthyl éther est synthétisée par réaction de l'undécénol avec le diméthoxyméthane (réactif et solvant) en présence de quantités catalytiques de bromure de lithium et d'acide paratoluènesulfonique. L'incorporation du groupement silylé s'effectue par une réaction d'hydrosilylation en présence d'un catalyseur de Karstedt. a) Etape 1 : Synthèse du 11-(méthoxyméthoxy)undéc-1-ène 4 6 8 10 12 13 A une solution de undécénol (15g ; 17,65 mL ; 88 mmol) dissous dans 225 mL de diméthoxyméthane (12,9g ; 170 mmol ; 28,3 éq) sont additionnés du bromure de lithium (3,06g ; 35 mmol ; 0,4 éq) et de l'acide paratoluènesulfonique (1,67 g ; 8,8 mmol ; 0,1 éq). La réaction se déroule à température ambiante durant 12 heures. Après addition de 500 mL d'éther, le mélange réactionnel est lavé successivement avec de l'eau permutée (à deux reprises) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (pentane/éther : 97,5/12,5) pour donner un liquide jaunâtre. Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes . Masse : 16,26 g Rendement : 86% RMN 1H (200 MHz, CDC13) : 1,31 (12H ; m ; Hs 10) ; 1,57 (2H ; m ; H4) ; 2,03 (2H ; m ; H11) ; 3,37 (3H ; s ; H1) ; 3,52 (2H; t; H3; 3JH_H=6, 6 Hz) ; 4,62 (2H; s; H2) ; 4,96 (2H; m; H13) ; 5,82 (1H ; m ; H22) RMN 13C (200 MHz, CDC13) : 26,59 ; 29,30 ; 29,49 ; 29,80 (2C) ; 29,91 ; 30,12 ; 34,18 (C11) ; 55,37 (Cl) ; 68,20 (C3) ; 96,74 (C2) ; 114,47 (C13) ; 139,50 (C32) Spectrométrie de masse m/z (NBA) : 154 [M+H]±0-CH2OCH330 b) Etape 2 : Synthèse du 11-(méthoxyméthoxy) undécyltriméthoxysilane (II) 1 2 4 6 8 10 12 Le 11-(méthoxyméthoxy)undéc-1-ène (12,6 g ; 59 mmol) est mélangé avec du triméthoxysilane (95%) (9 ,65 g ; 10,1 mL ; 75 mmol ; 1,3 éq). Le catalyseur de Karstedt (0,14 g ; 0,15 mmol ; 0,0025 éq) est additionné très lentement. La réaction se déroule à température ambiante pendant 16 heures. Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner un liquide incolore ('ébullition : 125-130 C à une pression de 0,5 mbar). Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes : Masse : 14,08 g Rendement : 71% RMN 1H (200 MHz, CDC13) : 0,65 (2H ; m ; H13) ; 1,29 (16H ; m ; H5-12) ; 1,59 (2H ; m ; H4') ; 3,62 (3H ; s ; H1) ; 3,52 (2H; t; H3; 3JH_H=6, 5 Hz) ; 3,58 (9H; s; H34) 4,62 (2H; s; H2) RMN 13C (200 MHz, CDC13) : 9,44 (C13) ; 22,92 ; 26,55 ; 29,59; 29,78; 29,83 ; 29,92 (2C) ; 30,07 ; 33,46 ; 50,75 (3C ; C14) ; 55,33 (Cl) ; 68,18 (C3) ; 96,68 (C2) RMN Si (200 MHz, CDC13) : -41,31 (s) Etape 2' : Synthèse du 11-(méthoxyméthoxy)undécyltriéthoxysilane (III) 1 2 3 Le 11-(méthoxyméthoxy)undéc-1-ène (15,66 g ; 73 mmol) est mélangé avec du triéthoxysilane (97%) (19,94 g ; 22,4 mL ; 118 mmol ; 1,61 éq). Le catalyseur de Karstedt (0,18 g ; 0,19 mmol ; 0,0025 éq) est additionné très lentement. La réaction se déroule à température ambiante pendant 3 heures. Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner un liquide incolore ('ébullition : 105-110 C à une pression de 10-2 mbar). Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes Masse : 19,61 g Rendement : 71% RMN 1H (200 MHz, CDC13) : 0,64 (2H ; m ; H13) ; 1,24 (9H ; t ; H15 ; JH-H= 7,0 Hz) ; 1,27 (16H ; m ; H5-22) ; 1,60 (2H ; m ; H4) ; 3,37 (3H; s; H1) ; 3,53 (2H; t; H3 ; 3JH-H-6, 6 Hz) ; 3,82 (6H; q; H34 ; 3JH-H=7, 0 Hz) ; 4,63 (2H ; s ; H2) RMN 13C (200 MHz, CDC13) : 10,78 (C13) ; 18,67 (3C ; 5C) ; 23,14 ; 26,60; 29, 63; 29,83 ; 29,90; 29,98 (2C) ; 5 30, 14 ; 33,57; 55,42 (Cl) ; 58,65 (3C ; C14) ; 68,26 (C3) ; 96,77 (C2) RMN Si (200 MHz, CDC13) : -44,27 (s) Spectrométrie de masse m/z (NBA) : 379 [M+H]+ Etape 3 : Synthèse du 11-(méthoxyméthoxy)undécylsilane (IV) 4 6 8 10 12 SÎFi3 1 2 10 A une solution de LiAlH4 (3,5g ; 92 mmol ; 2 éq.) dans 500 mL d'éther anhydre et refroidi à 0 C, est additionné lentement une solution de 11- 15 (méthoxyméthoxy)undécyltriéthoxysilane (17,34 g ; 49 mmol) dissous dans 500 mL d'éther anhydre. La réaction se déroule à température ambiante et sous argon durant 48 heures. Le mélange réactionnel est filtré sur célite, puis concentré et repris au dichlorométhane. 20 Ensuite, la phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide chlorhydrique 1N (à deux reprises) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur du sulfate de magnésium anhydre, puis concentrée. Le résidu est purifié par distillation 25 pour donner un liquide incolore ('ébullition : 75-80 C à une pression de 10-2 mbar). Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes Masse : 8,46 g 30 Rendement : 75% RMN 1H (200 MHz, CDC13) : 0,75 (2H ; m ; H13) ; 1,24 (16H ; m; H5-12) ; 1,61 (2H ; m ; H4) ; 3,37 (3H ; s ; H1) ; 3,50 (3H; t; H34 ; 3JH_H=3, 9 Hz) ; 3,54 (2H; t; H3 ; 3JH_H=6, 5 Hz) ; 4,64 (2H; s; H2) RMN 13C (200 MHz, CDC13) : 6,30 (C13) ; 26,72 ; 26,75 ; 29, 64; 29,84; 29,88 ; 29,98 (2C) ; 30,15 ; 32,88 ; 55,40 (1C) ; 68,23 (C3) ; 96,76 (C2) RMN Si (200 MHz, CDC13) : -58,96 (s) Spectrométrie de masse m/z (NBA) : 245 [M+H]+ Exemple 2 Cet exemple illustre la silanisation d'un support en silicium par le composé silane préparé dans l'exemple 1. Préalablement, le support en silicium, recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 5000 Â d'épaisseur, est soumis à une hydroxylation par mise en contact avec une solution de soude 3,5 M pendant deux heures. Une solution comprenant le composé silane de l'exemple 1 à une concentration de 10-2M dans du trichloroéthylène anhydre est utilisée, et les réactions de silanisation sont effectuées à une température contrôlée de 2 C pendant 24 heures. La fonction méthoxyméthoxy est transformée en fonction OH lors d'une réaction de post-silanisation du support modifié par mise en contact avec une solution d'acide chlorhydrique 12N, tel que cela est illustré sur la figure 1. La figure 1 représente le spectre infrarouge du 11-(méthoxyméthoxy)undécylsilane en solution dans le trichloroéthylène et le spectre de la surface du support en silicium après silanisation. D'autres résultats expérimentaux figurent dans le tableau ci-dessous. Composé de l'exemple 1 Composé de l'exemple 1 en solution dans le greffé en surface du trichloroéthylène support Angle de contact - 75 +2 Rugosité (nm) - 0,18 Ellipsométrie (nm, - 2,2+0,1 n=1,45) ATR 2928 2926 vas (CH2),cm 1 2855 2854 vs (CH2), cm 1 2885 2885 Vas (CH3)CH2-O-cH3, cm' 2822 2823 Vs (CH3)cH2-O-cH3, Cm i 2149 2150 v (SiH), cm 1 Après silanisation, on observe en spectroscopie IR-ATR les bandes caractéristiques de l'hydrogénosilane de l'exemple 1 monofixé. La surface 15 du support ainsi modifié est relativement hydrophobe (angle de contact de 75 ) et la monocouche obtenue d'une épaisseur de 2,2 nm est homogène (rugosité de 0,18 nm). 20 EXEMPLE 3 Cet exemple illustre la déprotection de la fonction -OH du composé greffé à la surface du support, le suivi de cette réaction de déprotection étant réalisé soit par l'étude de l'évolution de l'angle de contact soit par spectroscopie IR par tranformée de Fourier ATR (FTIR-ATR). a) Etude de l'évolution de l'angle de contact Un suivi par angle de contact a été réalisé afin de démontrer la rapidité et l'efficacité du traitement de déprotection. Pour cela, le support en silicium fonctionnalisé par le composé silané porteur d'un groupe méthoxyméthoxy en extrémité de chaîne est plongé dans une solution d'HCl 12N. Après un rinçage à l'eau désionisée et au pentane sous ultrasons pendant quatre minutes, l'angle de contact est mesuré. La figure 2 illustre l'évolution de l'angle 20 de contact en fonction du temps de contact du support avec la solution d'HCl. Le tableau ci-dessous présente les résultats suivants. Temps de contact (en min) Angle de contact ( ) 0 75, 1 5 63 10 52, 9 15 54, 1 52,2 80 52, 1 30 Ces résultats montrent que la réaction de la solution d'acide chlorhydrique sur la surface entraîne une baisse de l'angle de contact d'environ 75 à environ 52 , ce qui confirme le remplacement de la fonction méthoxyméthoxy par une fonction -OH beaucoup plus hydrophile. Par ailleurs, il a été constaté que la réaction de déprotection est rapide. Après 5 minutes de réaction, la valeur a déjà baissé de 10 et au bout de 10 minutes de réaction, la surface est totalement déprotégée. Il est important de remarquer également que l'angle ne varie sensiblement plus, même après immersion pendant une longue durée dans cette solution agressive, ce qui atteste de la stabilité de la monocouche déposée. b) Suivi de la réaction de déprotection par FTIR-ATR Afin de confirmer les résultats obtenus dans le paragraphe précédent, un suivi par FTIR-ATR de la réaction de déprotection a été réalisé. La figure 3 illustre le spectre FTIR-ATR de . - la surface du support greffé par le composé silane non déprotégé après les lavages successifs avec de l'eau, du THF et le trichloroéthylène (courbe a) ; - la surface du support greffé par le composé silane déprotégé après traitement par la solution HC1 12N pendant 15 minutes et les lavages successifs avec de l'eau, du THF et le trichloroéthylène (courbe b). Sur la courbe a, il peut être constaté qu'il ne reste aucune trace des bandes caractéristiques d'eau et de THF (composés hydrophiles). Cette observation est tout à fait en accord avec la présence à la surface de la fonction méthoxyméthoxy hydrophobe, qui ne favorise pas la physisorption de ces solvants protiques. L'apparition minime des bandes va (CH2), vas (CH2), vas (SiH) peut s'expliquer par une légère réorganisation des chaînes à la surface. Par contre, une fois le traitement avec la solution HC1 12N effectué, on peut observer, sur la courbe b, l'apparition de bandes caractéristiques de l'eau et du THF, ce qui atteste d'une physisorption des ces solvants à la surface du support. Le changement de comportement de ces solvants protiques vis-à-vis de la surface du support après traitement nous montre que la déprotection des fonctions méthoxyméthoxy (fonctions hydrophobes) en fonctions -OH (fonctions hydrophiles) a bien eu lieu. C) Autres analyses D'autres mesures ont été effectuées (angle de contact, rugosité, épaisseur) et figurent dans le tableau ci-dessous. Composé de l'exemple 1 Composé de l'exemple 1 greffé sur le support greffé en surface et déprotégé Angle de contact 75 +2 52 +2 Rugosité (nm) 0,18 0,2 Ellipsométrie (nm, 2,2+0,1 1,8+0,1 n=1,45) ATR* 2926 2926 vas (CH2), cm 1 vs (CH2), cm 1 2854 2854 Vas (CH3)CH2-O-CH3, Cm 1 2885 ù Vs (CH3)CH2-O-CH39 Cm 1 2823 ù v (SiH), cm 1 2150 2150 Les analyses reportées ci-dessus indiquent que des rugosités de surface très faibles sont obtenues après la réaction de déprotection. Enfin, d'après les analyses effectuées en ellipsométrie en prenant l'indice de réfraction de 1,45, il est observé une légère diminution de l'épaisseur du film organique en surface de 2,2 à 1,8 nm, après l'étape de déprotection, ce qui s'explique par la transformation du groupe méthoxyméthoxy en groupe -OH. EXEMPLE 4 Cet exemple illustre une réaction de couplage d'un composé fluorophore avec le composé silane déprotégé greffé sur le support en silicium, préparé conformément à l'exemple 3. Le composé fluorophore est le Cy3 phosphoramidite et répond à la formule suivante : CN La réaction de couplage est réalisée dans l'acétonitrile, avec du tétrazole, à température ambiante pendant 10 minutes. Cette réaction de couplage est suivie d'une étape dite de capping en présence d'anhydride acétique et de N-méthylimidazole, pour bloquer les groupes -OH n'ayant pas réagi. Le composé phosphite obtenu par réaction avec le Cy3 phosphoramidite est ensuite oxydé, pour transformer le groupe phosphite en groupe phosphate et enfin une étape de détritylation est effectuée pour permettre au composé fluorophore d'être visible avec le scanner GenePix de la société Axon. Il apparaît sur l'image prise par le scanner que le composé fluorophore a bien été greffé sur le support par les biais des groupes -OH portés par les composés silanes greffés. EXEMPLE 5 Cet exemple illustre la synthèse d'un oligonucléotide comprenant 20 bases à partir d'un support greffé par des composés silanes conformes à l'invention. La fabrication de l'oligonucléotide est réalisée sur un synthétiseur EXPEDITE de chez Perkin Elmer suivant 20 cycles de synthèse et sur le support réalisé à l'exemple 4. A la fin des cycles, les bases exocycliques des nucléotides sont déprotégées par un traitement ammoniacal (solution NH4OH 40%) à 55 C pendant 30 minutes, qui permet également l'hydrolyse de la fonction cyanoéthoxyphosphate provenant du fluorophore Cy3 phosphoramidite. Ensuite, le support est mis en contact avec une solution comprenant un oligonucléotide complémentaire de celui synthéthisé conformément au mode opératoire décrit ci-dessus et comprenant le fluorophore Cy3 phosphoramidite à raison de 0,2 pM dans un tampon citrate salin de sodium, pendant 1 heure à 40 C. Les résultats de mesure de fluorescence montrent que les supports modifiés conformément à l'invention permettent la synthèse in-situ d'un oligonucléotide. EXEMPLE 6 Cet exemple illustre les propriétés de rétention de protéines par un support modifié conformément à l'invention (support de l'exemple 3). Un tissu biologique, par exemple, de nature cancéreuse, est apposé sur le support modifié pendant 30 secondes puis après rinçage et dépôt de la matrice, l'analyse par spectrométrie de masse (obtenue par un appareil Seldi-Toff vendu sous la dénomination ProteinChip System Series 4000 par la société Ciphergen) est réalisée directement sur la surface. 36 Le spectre obtenu montre la présence de pics que l'on peut affecter à des protéines présentant des affinités hydrophiles. REVENDICATIONS 1. Composé silane répondant à la formule (I) suivante : A-E-X (I) dans laquelle : - X représente un groupe silylé apte à créer une liaison covalente après réaction avec les fonctions hydroxyle ou hydrure d'un support ; E représente un groupe espaceur organique ; - A représente un groupe apte à former une fonction -OH par hydrolyse acide, ladite fonction -OH après ladite hydrolyse étant liée de façon covalente à E. 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel X représente un groupe trihalogénosilane ; un groupe trihydrogénosilane -SiH3 ; un groupe trialcoxysilane -Si(OR)3 avec R représentant un groupe alkyle saturé en Cl à C6r linéaire ou ramifié, un groupe phényle; un groupe triaminoalcoxyamine -Si (NR1R2) 3, avec les R1 et R2 représentant indépendamment un groupe alkyle saturé en Cl à C6, linéaire ou ramifié, un groupe phényle ; un groupe organométallique. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel E représente un groupe hydrocarboné, comprenant éventuellement une ou plusieursinsaturations et/ou un ou plusieurs groupes aromatiques et/ou un ou plusieurs hétéroatomes. 4. Composé selon la revendication 3, dans lequel le groupe hydrocarboné comprend de 2 à 24 atomes atomes de carbone. 5. Composé selon la revendication 4, dans lequel le groupe hydrocarboné est un groupe alkylène comprenant de 8 à 24 atomes de carbone. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel A est un groupe méthoxyméthyléther, t-butoxyméthyléther, 2-(triméthylsilyl)éthoxyméthyléther, tétrahydropyranyléther, 1-méthoxycyclohexyléther, 4- méthoxytétrahydropyranyléther, 4-méthoxytétrahydrothiopyranyléther, 4- méthoxytétrahydrothiopyranyléther S,S dioxyde, 1-[(2- chloro-4-méthyl)phényl]-4-méthoxypipéridin-4-yléther, 1-[(2-fluorophényl)phényl]-4-méthoxypipéridin-4-yléther, 1,4-dioxan-2-yléther, tétrahydrofuranyléther, 1-éthoxyéthyléther, 1-(2-chloroéthoxy)éthyléther, 1- méthyl-1-méthoxyéthyléther, 1-méthyl-1-benzyloéthyléther, t-butyléther, allyléther, pméthoxybenzyléther, p-halogénobenzyléther, triphénylméthyléther, triisopropylsilyléther, diméthylisopropylsilyléther, diéthylisopropylsilyléther ou méthoxyméthylcarbonate. 7. Composé de formule (II) suivante :. Composé de formule (III) suivante : (III) 3 9. Composé de formule (IV) suivante : SiH3 10. Procédé de fonctionnalisation d'un support solide comportant en surface des fonctions hydroxyle ou hydrure, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact d'une solution comprenant au moins un composé silane tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 avec ledit support. 11. Procédé selon la revendication 10, comprenant, avant l'étape de mise en contact, un étape de traitement de la surface du support afin de créer sur ladite surface les fonctions hydroxyles ou hydrures nécessaires au greffage. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel le support solide est un support organique ou un support inorganique. 39 313. Procédé selon la revendication 12, dans lequel le support inorganique est en en oxyde métallique, en métal ou en silicium. 14. Support solide susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 10 à 13. 10 15. Procédé d'immobilisation de molécules biologiques sur un support solide comprenant successivement : a) une étape de mise en oeuvre du procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 10 15 à 13 ; b) une étape de déprotection des fonctions - OH des composés silanes greffés par hydrolyse acide ; c) une étape de mise en contact du support obtenu à l'étape b) avec une solution 20 comprenant la (les) molécule(s) biologique(s) à immobiliser, lesdites molécules biologiques comportant une extrémité apte à réagir avec les fonctions -OH des composés silanes greffés pour former une liaison covalente. 25 16. Procédé d'immobilisation de molécules biologiques sur un support solide comprenant successivement : a) une étape de mise en oeuvre du procédé 30 tel que défini selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 ;5b) une étape de déprotection des fonctions - OH des composés silanes greffés par hydrolyse acide ; cl) une étape de mise en contact du support obtenu en b) avec un composé apte à former une liaison covalente par réaction avec la fonction -OH des composés silanes et comprenant à l'issue de cette étape une extrémité réactive différente d'une fonction -OH ; c2) une étape de mise en contact du support obtenu à l'étape cl) avec une solution comprenant la (les) molécule(s) biologique(s) à immobiliser, lesdites molécules biologiques comportant une extrémité apte à réagir avec ladite extrémité réactive pour former une liaison covalente. 17. Procédé d'immobilisation selon la revendication 15 ou 16, dans lequel la molécule biologique à immobiliser est choisie parmi les acides nucléiques, les polypeptides, les lipides, les carbohydrates ou les hormones. 18. Support solide susceptible d'être obtenu par un procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 15 à 17. 19. Support solide selon la revendication 18, dans lequel les molécules biologiques immobilisées sont des acides nucléiques ou des polypeptides et qu'il constitue une puce à acides nucléiques ou à polypeptides. 20 25 30