FR 2894595 A1 20070615 FR 0553785 A 20051208 METHODE POUR IDENTIFIER UN COMPOSÉ COSMÉTIQUEMENT ACTIF CAPABLE D'AGIR SUR LES PRÉ-ADIPOCYTES La présente invention concerne le domaine cosmétique et, plus particulièrement, vise à fournir une méthode d'identification de composés cosmétiquement actifs en utilisant leur capacité à agir sur les pré-adipocytes. Les propriétés de nombreux ingrédients cosmétiques dits "actifs" sont évaluées par des méthodes scientifiques in vivo ou in vitro. L'objet de l'invention est de décrire une méthode qui permet de comprendre facilement l'effet d'un "actif" cosmétique. L'efficacité des produits finis cosmétiques amincissants est évaluée globalement par des tests qui ont pour but d'apprécier l'aspect de la peau ou de la silhouette. Ceci permet de rester conforme à la définition du produit cosmétique (directive UE 76/768 modifiée) mais limite considérablement l'originalité de la communication produit. La communication sur l'efficacité des "actifs" amincissants est libre. Des actions physiologiques ou biologiques ont été décrites telles que l'inhibition d'enzymes impliquées dans la lipogenèse, le blocage de sites récepteurs d'hormones induisant la lipogenèse ou la stimulation de l'expression d'enzymes impliquées dans la lipolyse. La Demanderesse a mis au point une méthode permettant d'identifier des composés capables d'agir sur les pré-adipocytes et susceptibles d'être utiles en cosmétique. Les adipocytes utilisent le glucose comme source d'énergie et comme source de carbone pour la synthèse de novo d'acides gras et la lipogenèse. Un actif cosmétique inhibant les enzymes impliquées dans cette synthèse tels que l'acétyl coenzyme A carboxylase ou la glyceraldéhyde 3 phosphate deshydrogénase présenterait un intérêt majoré si l'explication de son activité était facilement compréhensible. Ainsi, la présente invention concerne une méthode pour identifier un composé capable d'agir sur les pré-adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en culture de pré-adipocytes jusqu'à au moins 80% de confluence, appelée phase de prolifération, b) la mise en contact d'un premier échantillon de ladite culture avec un milieu sucré apte à induire la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes, c) la mise en contact d'un second échantillon de ladite culture avec un milieu n'induisant pas la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes, d) la mise en contact d'un troisième échantillon de ladite culture avec un milieu sucré apte à induire la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes et le composé à tester, e) la mesure de la quantité de lipides produite et/ou de la différenciation des pré-adipocytes dans chaque échantillon de façon à identifier l'action du composé à tester sur la lipogenèse et/ou la différenciation des préadipocytes. L'homme du métier connaît différents types de milieux de culture susceptibles d'être utilisés pour la culture des pré-adipocytes lors de l'étape (a) de la méthode de l'invention ci-après désignés par milieu de base . A titre d'exemples, peuvent être cités des milieux synthétiques commerciaux tels que le Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). A ces différents milieux de base, peuvent être ajoutés différents composés comme de la glutamine, des antibiotiques et des antifongiques tels que pénicilline, streptomycine, amphotéricine B ou un mélange de ceux-ci, des facteurs de croissance cellulaires apportés individuellement et du sérum comme du sérum de veau foetal. De façon préférée, le milieu de base dans le cadre de la présente invention contient de l'ordre de 8,3 mM de glucose, soit 1,5 g/1 de glucose. Dans l'étape (a) de la méthode selon l'invention, sont mis en oeuvre des pré-adipocytes. L'homme du métier connaît la définition de pré-adipocytes telle que celle donnée dans le brevet WO 00/44882 à savoir cellules qui peuvent être isolées dans une fraction vasculaire stromale préparée à partir de tissus adipeux . Les pré-adipocytes de tout mammifère peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention tels que des préadipocytes humains, porcins, équins, murins, de rat, ovins, bovins, etc... Ces pré-adipocytes peuvent être soit des lignées cellulaires commerciales ou non, soit issues de cultures primaires. De façon préférée, les pré-adipocytes mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont des pré-adipocytes humains normaux. Les pré-adipocytes à l'étape (a) de la méthode selon l'invention sont mis en culture à une densité comprise entre 20000 et 60000 cellules par cm2, de préférence entre 25000 et 50000 cellules par cm2 et, de façon plus particulièrement préférée, entre 28000 et 47000 cellules par cm2. La confluence des pré-adipocytes peut être appréciée par visualisation des cultures cellulaires au microscope. L'étape (a) de la méthode selon l'invention est terminée lorsque les pré-adipocytes ont atteint au moins 80% de confluence ; plus particulièrement, au moins 85% de confluence et, de préférence, au moins 90% de confluence. De façon encore plus préférée, l'étape (a) de la méthode selon l'invention est terminée lorsque les pré-adipocytes ont atteint une confluence comprise entre 95 et 100%. Le temps nécessaire pour atteindre la confluence désirée est notamment fonction de la densité des pré-adipocytes lors de la mise en culture. Ce temps peut varier de un à plusieurs jours. Lors des étapes (b), (c) et (d) de la méthode selon l'invention, le milieu de culture des pré-adipocytes en adipocytes mis en oeuvre est identique à un milieu de prolifération tel que celui décrit pour l'étape (a) dans lequel sont ajoutés ou non une quantité variable de sucre et des agents induisant la différenciation des préadipocytes en adipocytes comme de l'insuline, de la dexaméthasone, de l'indométhacine et/ou de l'isobutylméthylxanthine. La culture des adipocytes et des pré-adipocytes dans les étapes (b) et (d) est réalisée dans un milieu sucré identique ou différent. De façon préférée, les milieux sucrés mis en oeuvre aux étapes (b) et (d) de la présente invention sont identiques. Dans le cadre de la présente invention, on entend par milieu sucré , un milieu contenant un ou plusieurs sucres. Plus particulièrement, un milieu sucré dans le cadre de la présente invention est un milieu contenant du glucose. Ainsi, le milieu de culture utilisé dans la culture des adipocytes et des pré-adipocytes des étapes (b) et (d) est un milieu de culture dont la concentration en glucose est comprise entre 2,7 et 5,5 g/1 de glucose (ou entre 15 et 30,6 mM) et, de préférence, comprise entre 3 et 5,5 g/1 de glucose (ou entre 16,7 et 30,6 mM) et, de façon plus préférée, comprise entre 4,5 et 5,5 g/1 de glucose (ou entre 25 et 30,6 mM). A l'étape (c) du procédé selon l'invention, le milieu de culture n'est pas ou faiblement additionné de sucre et, plus particulièrement, de glucose. Ainsi, le milieu de culture utilisé dans la culture des adipocytes et des pré-adipocytes de l'étape (c) est un milieu de culture qui présente une concentration en glucose comprise entre 0,9 et 2 g/1 (ou entre 5 et 11,1 mM) et, de manière préférée, entre 1,5 et 2 g/1 (entre 8, 3 et 11,1 mM). La solution initiale de glucose est avantageusement filtrée sur 0,22 }gym avant intégration au milieu définitif en faisant varier sa concentration finale de 0 à 25 mM. Un milieu de différenciation mis en oeuvre aux étapes (b), (c) et (d) particulièrement préféré est le suivant . milieu de base (8,3 mM de glucose) qsp 100 ml sérum de veau foetal 10% L-glutamine 1% Insuline 10pg/l Dexamethasone 1pM Indométhacine 200pM Isobutylméthylxanthine 500pM Pénicilline-streptomycine 1% Glucose (Sigma G7021) 0-25mM 25 30 Par composé à tester dans le cadre de la présente invention, on entend toute molécule chimique synthétique ou naturelle, protéines, des glucides, concentration du composé à différenciation à l'étape (d) comme des peptides, des des lipides, etc.... La tester ajouté au milieu de est comprise entre 0,00001 et 80%, plus particulièrement comprise entre 0,0001 façon préférée comprise entre 0,0005 et 60%. A l'étape (e) de la méthode selon l'invention, sont mesurées, dans chaque échantillon, la quantité de lipides produite et/ou la différenciation des pré- et 70%, de adipocytes tester sur adipocytes. techniques et/ou la de façon à identifier l'action du composé à la lipogenese et/ou la différenciation des pre- L'homme du métier connaît différentes pour mesurer la quantité de lipides produite différenciation des pré-adipocytes. différenciation des pré-adipocytes en adipocytes peut mesurée par des techniques utilisant des caractéristiques La être 25 30 biochimiques ou morphologiques des pré-adipocytes et/ou des adipocytes comme des marqueurs protéiques spécifiques des pré-adipocytes ou des adipocytes, les dépôts lipidiques, etc.... Parmi les techniques connues de l'homme du métier, le test "adipored" Cambrex, réf. PT-7009 permet d'évaluer la quantité de lipides produit par les cellules au cours de la culture et la transformation des préadipocytes en adipocytes matures grâce au NileRed, colorant spécifique des triglycérides. La transformation des préadipocytes en adipocytes est bien décrite notamment dans le brevet WO 00/44882. A l'étape (e) de la méthode selon l'invention, une diminution de la quantité de lipides produite et, plus particulièrement, une diminution des triglycérides produits et/ou une diminution de la différenciation des préadipocytes dans l'échantillon contenant le composé à tester (étape (d)) comparé à l'échantillon qui en est dépourvu (étape (b)) ou comparé à l'échantillon qui en est dépourvu et dont la quantité de sucre est faible (étape (c)), permettra d'identifier le composé à tester comme un composé capable de diminuer la lipogenèse et/ou la différenciation des pré-adipocytes. Le composé à tester capable d'agir sur les préadipocytes en présentant une action sur la lipogenèse et/ou la différenciation des pré-adipocytes est un composé cosmétiquement actif et, plus particulièrement, lorsque cette action est une diminution de la lipogenèse et/ou de 15 la différenciation des pré-adipocytes comparable à la situation observée à l'étape (c), il s'agit d'un amincissant. Ainsi, l'objet de l'invention est de montrer 20 une similitude d'effet entre une diminution de la concentration en glucose du milieu de culture des adipocytes ou pré-adipocytes et l'addition d'un "actif" amincissant doué de propriétés inhibitrices des enzymes impliquées dans la lipogenèse ajouté à un milieu de culture 25 sucré tel que défini dans la présente invention i.e. entre 4,5 et 5,5 g/1 de glucose (ou entre 25 et 30,6 mM). L'efficacité de 1"'actif" peut alors facilement être comprise comme une diminution virtuelle de la quantité de glucose exploitable. 30 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'effet d'un extrait de l'algue unicellulaire10 chromulina ochromoïdes (chrysophycées) et d'un extrait café vert sur une culture de pré-adipocytes. 1. Effet d'un extrait de l'algue unicellulaire chromulina ochromoïdes (chrysophycées). I.1. Conditions de culture. Des pré-adipocytes humains normaux CAMBREX ref PT-5020 (ampoule à 106 cellules/ml) et ref PT-5001 (ampoule à 4.106 cellules/ml) ont été placés dans le milieu de culture normal de prolifération pendant trois jours. A ce stade, les cellules sont à confluence et le milieu est renouvelé par un milieu de différenciation avec ou sans extrait de l'algue unicellulaire chromulina ochromoïdes (chrysophycées). Ce dernier est le milieu de prolifération de base supplémenté de 10pg/mL pour l'insuline, 1pM pour la dexaméthasone, 200pM pour l'indométhacine et 500pM pour l'isobutyl-methylxanthine. Au bout des 14, 17 et 21ème jours (respectivement 11, 14 et 18ème jours du processus de différenciation), le taux de triglycérides est mesuré, proportionnel à la maturation des adipocytes. I.2. Extrait de l'algue unicellulaire chromulina ochromoïdes (chrysophycées). L'extrait de l'algue chromulina ochromoïdes est préparé à partir d'une culture de cette algue dans un milieu à base d'eau de mer présentant une salinité comprise entre 2 et 70 g/l. L'algue est récoltée lorsque sa concentration dans ledit milieu de culture est comprise entre 5.104 et 106 cellules par ml et subie une centrifugation. I.3. Résultats et conclusion. A la concentration de 25 mM de glucose, la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est normale et la production de lipides évaluée par fluorescence est de 3455, 4580 et 5775 RFU aux 11, 14 et 18ème jour de différenciation. Par exemple, à la concentration de 8,3 mM de glucose, la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est diminuée de 46, 61 et 52% et la production de lipides évaluée par fluorescence est de 1868, 1777 et 2756 RFU. A la concentration de 25 mM de glucose et addition d'un extrait de l'algue unicellulaire chromulina ochromoïdes (chrysophycées) à 0,01%, la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est réduite de 19, 23 et 29% après 11, 14 et 18j de contact respectivement. Cette expérience permet de communiquer à l'extrait de l'algue unicellulaire chromulina ochromoïdes (chrysophycées) un effet similaire à celui d'une réduction d'environ 20% du sucre disponible à J14 (20% correspond au ratio calculé sur la base qui considère le maximum de sucre à 25mM). Sachant que la corrélation entre le taux de sucre et le pourcentage d'inhibition du phénomène suit un modèle linéaire décroissant. II. Effet d'un extrait de café vert. II.1. Conditions de culture. Des pré-adipocytes humains normaux CAMBREX ref PT-5020 (ampoule à 106 cellules/ml) et ref PT-5001 (ampoule à 4.106 cellules/ml) ont été placés dans le milieu de culture normal de prolifération pendant trois jours. A ce stade, les cellules sont à confluence et le milieu est renouvelé par un milieu de différenciation avec ou sans extrait de café vert. Ce dernier est le milieu de prolifération de base supplémenté de 10pg/mL pour l'insuline, 1pM pour la dexaméthasone, 200pM pour l'indométhacine et 500pM pour l'isobutyl-methylxanthine. Au bout des 14, 17 et 21ème jours (respectivement 11, 14 et 18ème jours du processus de différenciation), le taux de triglycérides est mesuré, proportionnel à la maturation des adipocytes. II.2. Extrait de café vert. L'extrait de café vert riche en acides chlorogéniques utilisé dans le cadre de la présente invention est obtenu à partir de grains de café non torréfié et décaféiné. Une première étape sert à extraire les acides chlorogéniques (extraction méthanol/eau). Une deuxième partie sert à purifier les acides chlorogéniques (à l'aide d'acetate d'ethyle). II.3. Résultats et conclusion. A la concentration de 25 mM de glucose, la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est normale et la production de lipides évaluée par fluorescence est de 3455, 4580 et 5775 RFU aux 11, 14 et 18ème jour de différenciation. Par exemple, à la concentration de 8,3 mM de glucose, la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est diminuée de 46, 61 et 52% et la production de lipides évaluée par fluorescence est de 1868, 1777 et 2756 RFU. A la concentration de 25 mM de glucose et addition de 4,10-4% p/v d'un extrait de café vert la transformation des pré-adipocytes en adipocytes est réduite de 37 et 40 % après 11 et 14 jours de contact. Cette expérience permet de communiquer à l'extrait de café vert un effet similaire à celui d'une réduction d'environ 42 % de sucre disponible à J14, sachant que la corrélation entre le taux de sucre et le pourcentage d'inhibition du phénomène suit un modèle linéaire décroissant.5 REVENDICATIONS 1. Méthode pour identifier un composé capable d'agir sur les pré-adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend étapes suivantes : a) la mise en culture de pré-adipocytes jusqu'à au moins 80% de confluence, appelée phase de prolifération, b) la mise en contact d'un premier échantillon de ladite culture avec un milieu sucré apte à induire la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes, c) la mise en contact d'un second échantillon de ladite culture avec un milieu n'induisant pas la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes, d) la mise en contact d'un troisième échantillon de ladite culture avec un milieu sucré et le composé à tester, e) la mesure de la quantité de lipides produite et/ou de la différenciation des pré-adipocytes dans chaque échantillon de façon à identifier l'action du composé à tester sur la lipogenèse et/ou la différenciation des préadipocytes. 2. Méthode d'identification selon la revendication 1, caractérisée en ce que le milieu sucré des étapes (b) et (d) contient du glucose. 3. Méthode d'identification selon la revendication 2, caractérisée en ce que la concentration en glucose est comprise entre 2,7 et 5,5 g/1 de glucose (ou entre 15 et 30,6 mM). 4. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le milieu de culture de l'étape (c) présente uneconcentration en glucose comprise entre 0,9 et 2 g/1 (ou entre 5 et 11,1 mM). 5. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdits pré-adipocytes sont des pré-adipocytes humains normaux. 6. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé à tester est ajouté au milieu sucré à une concentration comprise entre 0,00001 et 80%. 7. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé à tester capable d'agir sur les préadipocytes est un composé cosmétiquement actif. 8. Méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé à tester capable d'agir sur les préadipocytes est un amincissant.