FR 2894478 A1 20070615 FR 0512650 A 20051208 1- DESCRIPTION DE L'INVENTION DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'utilisation de l'isoquinoline carboxamide et de ses dérivés comme inhibiteur de virulence bactérienne en remplacement ou en complément d'antibiotiques pour le traitement de pathologies infectieuses chez l'homme, l'animal ou le végétal. L'invention a pour objet l'utilisation pour le traitement des infections bactériennes du (1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinolinecarboxamide de formule : O Il CH3 20 Et des molécules apparentées de formule générale : 25 R4 30 R2 35 Dans lesquelles R1 représente un carbone ou un azote lié ou non à un radical Méthyle ù CH3 Ethyle ù CH2 ùCH3 Propyle ù CH2 ùCH2ùCH3 Butyle ù CH2 ùCH2ùCH2ùCH3 40 Ou a une chaîne carbonée renfermant jusqu'à 7 carbones R2 représente une fonction alcool ùOH, cétone =0, acide carboxylique ùCOOH, amide ùCONH2 , aldéhyde ùCOùH ou les groupements suivants : N" ou N ou CH3 CH3 ou CH3 R3 représente un hydrogène, un chlore, un phényl ou les groupements suivants : CH3 Cl ou 25 avec R' correspondant à une chaîne carbonée saturée ou insaturée 30 renfermant jusqu'à 8 carbones R4 représente un hydrogène, un oxygène, une fonction alcool ùOH, cétone =0, acide carboxylique ùCOOH, amide ùCONH2 , aldéhyde ùCOùH R5 représente un carbone ou un azote 35 40 45 CONTEXTE De par leur adaptabilité et leur capacité de transfert de gènes les bactéries ont développé de multiples stratégies de résistance aux antibiotiques et l'augmentation croissante des phénomènes de résistance multiple remet en cause le principe même de l'antibiothérapie comme traitement de choix des infections bactériennes. Des molécules telles que les furanones, capables d'inhiber les mécanismes de communication bactérienne (quorum-sensing) ainsi que la croissance des micro-organismes ont été proposées comme nouveaux agents thérapeutiques (J. Infect. Dis. 191:1881-8, 2005). Toutefois, ces molécules présentent une forte cytotoxicité tant sur les bactéries que sur les cellules eucaryotes et leur activité cancérogène en limite fortement l'intérêt (Environ. Mol. Mutagen. 43:217-25, 2004). La recherche de modulateurs de virulence basée sur l'identification de sites de liaison impliqués dans la communication bactérienne présente cependant un grand intérêt en raison du principe même de cette approche. En effet, l'expression des facteurs de virulence par les bactéries étant essentiellement contrôlée par le quorum-sensing (Environ. Microbiol. Z:459-71, 2005), une perturbation de la communication bactérienne serait à même d'inhiber la virulence des micro-organismes, laissant ainsi à l'organisme hôte la possibilité d'éliminer sans risque ces agents infectieux. D'autre part, alors que les bactéries peuvent en fonction de leur patrimoine génétique développer un arsenal complexe de stratégies destinées à éliminer, inactiver, détruire ou rendre obsolètes des molécules antibiotiques qui ne sont en fait que des xénobiotiques par rapport à elles, il est évident qu'elles rencontreraient des difficultés considérables à changer leurs propres mécanismes de communication d'où une réduction notable de la probabilité d'émergence de formes résistantes. 30 35 EXPOSE DE L'INVENTION Pour l'ensemble des essais réalisés, l'isoquinoline carboxamide (IC) a été utilisée à la concentration finale de 10"5 M. La molécule, disponible commercialement, a été obtenue auprès de Sigma-Aldrich (38297 Saint Quentin Fallavier). Les tests ont été réalisés sur la souche bactérienne Pseudomonas fluorescens MF37, mutant spontané rifampicine résistant de la souche psychrotrophe MFO issue du lait (FEMSMicrobiol. Lett. 122:13-8, 1994). L'effet de l'IC sur la croissance de P. fluorescens MF37 a été étudié en triplicate en milieu BNO à 28 C. Que l'IC soit administré en début ou en cours de phase exponentielle de croissance, la molécule n'affecte ni la cinétique de croissance de la bactérie, ni son temps de génération moyen dans les conditions expérimentales choisies (61,3 4,9 min pendant la phase exponentielle de croissance). L'effet de l'IC sur la mobilité de P. fluorescens MF37 a été évalué en triplicate par mesure de la migration des bactéries en gélose molle GNO contenant 0.3% d'Agar après inoculation par piqûre au centre de la boite. Les boîtes ont été incubées à 28 C et le diamètre de l'auréole de croissance mesuré sur une période de 26 heures. La pré-exposition des bactéries à l'IC pendant 24 h ne modifie pas leur mobilité par rapport à un contrôle réalisé dans les mêmes conditions. L'effet de l'IC sur la virulence de P. fluorescens MF37 a été étudié in-vitro sur des cellules gliales de rats en culture primaire. Les cellules gliales, obtenues par dispersion mécanique à partir de cerveaux de rats nouveaux nés (agés de 1 à 2 jours), sont ensemencées à la concentration de 105 cellules/puit (boites 24 puits). Les cellules sont cultivées sur une lamelle de verre recouverte de poly-lysine dans un milieu DMEM/Ham's F12 (2:1) complémenté par 10% de SVF, 2 mM de glutamine, 0.001% d'insuline, 5 mM d'HEPES, 0.3% de glucose et 1% de solution antibiotique-antimycotique. Parallèlement, une culture de bactéries (P. fluorescens MF37) en milieu BNO à 28 C et sous agitation à 180 rpm est séparée en 2 sous cultures en fin de phase exponentielle de croissance bactérienne. Chaque sous culture est incubée pendant 24h à 28 C en l'absence (Témoin) ou en présence (Essai) d'IC 10-5 M. Les bactéries sont alors centrifugées, rincées et resuspendues à la concentration finale de 106 UFC/ml dans du milieu de culture pour cellules gliales préparé en l'absence d'antibiotiques. Cette suspension bactérienne est alors utilisée pour les test de virulence. Le milieu de cellules gliales en culture (J8 à J12) est éliminé par aspiration et remplacé par 1 ml de suspension bactérienne préparée comme décrit précédemment à partir de bactéries exposées ou non à l'IC. Les cellules gliales sont alors incubées 24h en présence des bactéries. Cette durée d'incubation a été montrée comme nécessaire pour l'accumulation et le dosage des marqueurs de mort cellulaire (Res. Microbiol. 155:39-46, 2004) La virulence des bactéries a été déterminée par 2 techniques : Le dosage des ions nitrites issus du monoxyde d'azote (NO) libéré par les cellules gliales en réponse l'activation ou l'induction des NOsynthases au cours de l'infection bactérienne (Microbiol. Res. 159: 355-363, 2004). Ce dosage est considéré comme un indicateur de mort cellulaire par apoptose (Microbial. Pathogen. 35: 95-106, 2003) Le dosage de la lactate deshydrogénase (LDH), enzyme cytosolique stable, libéré par les cellules gliales lors de la destabilisation de leur membrane cytoplasmique. Ce dosage réalisé à l'aide d'un kit commercial est considéré comme indicateur de mort cellulaire par nécrose. Comme le montre la figure 1/4 l'IC induit une réduction très hautement significative (P L'effet de l'IC sur la capacité des bactéries à induire une mort cellulaire par nécrose a été étudié dans les mêmes conditions expérimentales par dosage de la LDH libérée par les cellules cibles suite à la désorganisation de la membrane cytoplasmique. Ce travail réalisé comme précédemment sur 5 expériences indépendantes montre que l'IC n'a pas d'effet significatif sur l'activité nécrosante des bactéries (Figure 2/4). La virulence bactérienne étant étroitement liée à la capacité des bactéries à adhérer (Microbiol Mol Biol Rev. 61:136-69,1997), l'effet de l'IC sur la capacité d'adhésion de P. fluorescens MF37 a été étudié en utilisant des lames de verre comme substrat. Les bactéries, prélevées en début de phase stationnaire de croissance, sont ensemencées une DO580 initiale de 0.08 dans un milieu minimum citrate contenant ou non l'IC et supplémenté en fer (Fe SO4 7mg/1). Cette solution bactérienne est incubées à 28 C sous une agitation de 180 rpm jusqu'à obtention d'une concentration de 108 UFC.mFFI. Les bactéries sont collectées par centrifugation à 6500 tr.min-1, 28 C pendant 10 min. Le surnageant de culture est éliminé et le culot bactérien est rincé 2 fois avec de l'eau physiologique stérile. La suspension bactérienne est reconstituée à une concentration finale de 108 UFC dans de l'eau physiologique stérile. Les lames de verres sont mises en contact avec la solution bactérienne par submersion et incubées 2h à 28 C. En fin d'incubation les lames sont rincées 3 fois par de l'eau physiologique stérile puis les bactéries sont colorées par de l'acridine orange (10 min, 0,01% dans l'eau physiologique stérile). Les bactéries adsorbées sur le verre sont alors photographiées et comptées. Les valeurs obtenues sont le résultat du comptages d'un minimum de 10 champs obtenus sur 5 expériences indépendantes. Comme le montre la figure 3/4, l'IC induit une augmentation très significative (168 69 %, P La recherche du site de liaison potentiel de l'IC sur P. fluorescens a été entreprise sur la base de l'activité pharmacologique connue de l'IC chez les cellules eucaryotes. Dans ces cellules l'IC se lie à la sous-unité 18kDa (ou isoquinoline binding protein, IBP) des récepteurs de type périphériques pour les benzodiazépines (PBR). Une comparaison par le logiciel BLAST (http://www.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) entre les séquences nucléotidiques ou protéiques de l'IBP et le génome de la bactérie Pseudomonas fluorescens PFO, dont le génome a été entièrement cloné n'a pas permis de révéler des degrés d'homologie significatifs. Toutefois, une protéine homologue de l'IBP a été identifiée chez la bactérie Rhodobacter sphaeroïdes (J. Biol. Chem. 270:21167-175, 1995). La séquence de cette protéine périplasmique, nommée TspO (réf. CAB38741) a été comparée aux séquences de toutes les protéines codées chez P. fluorescens PFO. La protéine TspO présente 46% d'identité, 63% d'homologie et 3% de gaps avec une seule protéine de PFO, référencée ZP 00085778.1. L'alignement de la séquence protéique de TspO et de l'IBP a montré que la position de la lysine36 est conservée chez PFO (lysine"), que le tryptophane39 est remplacé chez PFO par un autre acide aminé aromatique (phénylalanine36) et que la position du tryptophane44 est conservée chez PFO (tryptophane41). Ces acides aminés sont situés dans la boucle 1 périplasmique de TspO et ont été montrés comme indispensables pour la liaison de l'IC à cette protéine (J. Biol. Chem. 275:5657-67, 2000). La protéine homologue de TspO a été clonée et séquencée chez la bactérie modèle utilisée dans cette étude, Pseudomonas fluorescens MF37. Les séquences nucléotidiques et protéiques de P. fluorescens MF37 (séquences naturelles non revendiquées au titre de brevet selon la législation européenne) ont été comparées avec celle de tous les procaryotes dont le génome a été partiellement ou complètement séquencé. Des protéines présentant une homologie significative avec la protéine TspO de P. fluorescens MF37 ont été trouvées chez les espèces suivantes : Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif 1 Arthrobacter sp. FB24 Acidiphilium rubrum Bacillus anthracis str. Ames Agrobacterium tumefaciens str. C58 Bacillus anthracis str'Ames Ancestor' Bradyrhizobium japonicum USDA 110 Bacillus anthracis str Sterne Candidatus Pelagibacter ubique HTCC 1062 Bacillus anthracis str. A2012 Chlorobium limicola DSM 245 Bacillus cereus ATCC 10987 Chlorobium phaeobacteroides BS1 Bacillus cereus ATCC 14579 Chlorobium phaeobacteroides DSM 266 Bacillus cereus G9241 Chlorobium tepidum TLS Bacillus licheniformis ATCC 14580 Chromohalobacter salexigens DSM 3043 Bacillus licheniformis DSM 13 Erythrobacter litoralis HTCC2594 Bacillus subtilis Francisella tularensis subsp. tularensis Schu 4 Bacillus subtilis subsp. Subtilis Gluconobacter oxydans 621 H Bacillus thuringiensis serovar israelensis ATCC 35646 Jannaschia sp. CCS1 Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 Legionella pneumophila str. Lens Brevibacterium linens Legionella pneumophila str. Paris Brevibacterium linens BL2 Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 Clostridium perfringens str. 13 Nitrosomonas eutropha C71 Corynebacterium efficiens YS-314 Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 Enterococcus faecalis V583 Parachlamydia sp. UWE25 Enterococcus faecium DO Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1 Heliobacillus mobilis Polaromonas sp. JS666 Lactobacillus plantarum WCFS1 Prosthecochloris aestuarii DSM 271 Lactococcus lactis subsp. lactis 111403 Prosthecochloris vibrioformis DSM 265 Lactococcus lactis subsp. cremoris sk11 Proteobacterium eBAC 000-60DO4 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 Proteobacterium eBACred25DO5 Staphylococcus haemolyticus JCSC 1435 Pseudomonas fluorescens PfO-1 Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola 1448A Pseudomonas syringae pv. syringae B728a Pseudomonas syringae pv. Tomato str. DC3000 Cyanobactéries Rhodobacter capsulatus Anabaena variabilis ATCC 29413 Rhodobacter sphaeroides Crocosphaera watsonii WH 8501 Rhodopseudomonas palustris CGA009 Fremyella diplosiphon Rhodospirillum rubrum Nostoc punctiforme PCC 73102 Rubrivivax gelatinosus PM1 (Rhodopseudomonas) Nostoc sp. PCC7120 Sinorhizobium meliloti Synechocystis sp. PCC 6803 Sinorhizobium meliloti 1021 Trichodesmium erythraeum IMS 101 Sphingopyxis alaskensis RB2256 Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306 Xanthomonas campestris pv. campestris str. 8004 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC 103315 Ces espèces seraient donc susceptibles de voir leur virulence modulée par 1'IC comme dans le cas de P. fluorescens MF37. Parmi ces espèces on peut relever plusieurs pathogènes responsables d'infections: -Bactéries à Gram positif Infections humaines, animales etlou végétales 1 Arthrobacter sp. Infections urinaires et de la peau, sang, otites, liquide amniotique, cervicites, ostéomyélites Bacillus anthracis Anthrax Bacillus cereus Infections de surface, respiratoires, méningées, septicémie, toxi-infections alimentaires Bacillus licheniformis infections oculaires, plus rarement septicémies Bacillus subtilis Endocardites, pneumonies, septicémies, infections oculaires, toxi-infections alimentaires Bacillus thuringiensis Endocardites, septicémies, abcès, infections oculaires Clostridium acetobutylicum Botulisme Clostridium perfringens Gastro-entérite. Entérite nécrosante. Enterococcus faecalis Infections nosocomiales Enterococcus faecium Infections nosocomiales Staphylococcus haemolyticus Suppurations, infections urinaires, septicémies Bactéries à Gram négatif Francisella tularensis Tularémie Legionella pneumophila Légionellose Novosphingobium aromaticivorans Cirrhose biliaire primaire Parachlamydia Pneumopathie communautaire (agent émergent) Pseudomonas fluorescens Infections opportunistes de surface, respiratoires, urinaires, septicémie Pseudomonas syringae Infection de végétaux (légumineuses) Xanthomonas axonopodis Infection de végétaux (agrumes) Xanthomonas campestris Infection de végétaux (crucifères) Xanthomonas oryzae Infection de végétaux (riz) Dans les infections provoquées par ces germes l'IC pourrait donc s'avérer un traitement de complément ou de substitution à l'antibiothérapie. On remarque l'absence dans cette liste de Pseudomonas aeruginosa, germe opportuniste couramment impliqué dans les infections nosocomiale, alors que le génome de cette bactérie a été complètement séquencé. Cette absence ne permet pas d'exclure définitivement la présence d'une protéine fonctionnellement homologue à TspO mais dont la structure présenterait une trop faible homologie pour pouvoir être détectée par des études de bio-informatique. Les auteurs de la présente invention souhaitent donc étendre l'utilisation potentielle de l'IC au traitement d'infections provoquées par d'autres germes, soit : Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, Burkholderia mallei et pseudomallei et Helicobacter pylori Des études réalisées à l'aide d'un dérivé N-methyl-3H de l'IC (émetteur a) ont permis de révéler une liaison de l'IC à des bactéries mortes (P. fluorescens tuées par sonication ou par exposition au toluène) avec une affinité proche de la nanomole confirmant ainsi une liaison à haute affinité de 1'IC sur une protéine réceptrice, soit TspO comme le suggère l'ensemble des informations exposées. Le ligand naturel pour la protéine TspO n'a pas encore été identifié à ce jour. Si on considère un effet de l'IC par interférence avec un mécanisme de communication de type quorum-sensing il faut noter que l'IC présente une homologie structurale non négligeable avec un des médiateurs du quorum sensing désigné sous le nom de pseudomonas quinolone signal (PQS (Figure 4/4) Un autre intérêt majeur de l'utilisation de l'IC comme inhibiteur de virulence est lié à 15 la démonstration de sa faible toxicité sur les cellules humaines comme le montrent des essais réalisés sur des lignées myéloïdes (Leuk. Res. 26:91-106, 2002) La présente invention a par conséquent pour objet l'utilisation de 1'IC et des molécules décrites en pages 1 et 2 comme inhibiteur de virulence pour la préparation de produits 20 destinés à traiter les infections provoquées par les bactéries citées en pages 7 et 8. Ces molécules peuvent être utilisées seules ou en combinaison avec des antibiotiques pour traiter des humains, animaux ou végétaux souffrant d'infections causées par ces bactéries. 25 On peut appliquer ces molécules sous toute forme d'administration qui convienne à l'utilisation en médecine humaine, vétérinaire ou phytosanitaire et par conséquent la portée de la présente invention s'étend également à des compositions comprenant un composé suivant la présente invention adapté à l'usage en médecine humaine, vétérinaire ou phytosanitaire. On 30 peut présenter des compositions de ce genre en vue de leur utilisation de manière classique en ayant recours à un ou plusieurs excipients ou véhicules appropriés. Les compositions de l'invention englobent celles qui se trouvent sous une forme spécialement prévue pour utilisation parentérale, orale, rectale, topique, ophtalmique, nasale, génito-urinaire ou par implantation. 35 lo On peut présenter les composés conformes à l'invention en vue de leur emploi en médecine vétérinaire ou humaine par injection, et on peut les mettre sous forme de doses unitaires, les introduire dans des ampoules ou autres récipient adaptés pour des doses unitaires ou dans des récipients qui en contiennent des doses multiples , au besoin avec un conservateur additionnel. Les compositions destinées à l'injection peuvent se présenter sous la forme de suspensions, solution dans des véhicules non aqueux ou aqueux, forme micronisée ou en association à une cyclodextrine ou des tensio-actifs non ioniques, cationiques ou anioniques, classiques seuls ou en combinaison. On peut aussi présenter les composés conformes à l'invention en tant que compléments inclus dans des aliments ou délivrés en suppléments alimentaires ou dans l'eau (boisson ou eau de bassin) de mammifères, amphibiens, poissons ou crustacés. De même ces composés peuvent être présentés sous forme de poudres, liquides, émulsions à usage phytosanitaire.15 REVENDICATIONS 1) Utilisation du 1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide et des dérivés pour la préparation de produits destinés à agir en tant 5 qu'inhibiteurs de virulence bactérienne 2) Utilisation du 1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide et des dérivés indiqués ou d'un mélange de ceux-ci, pour la fabrication de spécialités à usage médical humain destinées à traiter des infections bactériennes 3) Utilisation selon la revendication 2 dans laquelle la ou lesdites molécules sont combinées 10 à des molécules à activité antibiotique 4) Utilisation du 1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide et des dérivés indiqués, ou d'un mélange de ceux-ci, pour la fabrication de médicaments à usage vétérinaire destinés à traiter des infections bactériennes 5) Utilisation selon la revendication 4 dans laquelle la ou lesdites molécules sont combinées 15 à des molécules à activité antibiotique 6) Utilisation du 1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide et des dérivés indiqués, ou d'un mélange de ceux-ci, pour la fabrication de compléments alimentaires à usage animal destinés à prévenir ou traiter des infections bactériennes 20 7) Utilisation selon la revendication 6 dans laquelle la ou lesdites molécules sont combinées à des molécules à activité antibiotique 8) Utilisation du 1-(2-chlorophenyl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide et des dérivés indiqués, ou d'un mélange de ceux-ci, pour la fabrication de produits phytosanitaires destinés à prévenir ou traiter des infections bactériennes 25 9) Utilisation selon la revendication 8 dans laquelle la ou lesdites molécules sont combinées à des molécules à activité antibiotique 30