FR 2838969 A1 20031031 FR 0205458 A 20020430 PROCEDE DE STERILISATION PAR HAUTE PRESSION DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SOUS FORME MICRO OU NANODISPERSEE ET COMPOSITIONS AINSI OBTENUES L'invention concerne notamment un procédé de stérilisation par haute pression de compositions pharmaceutiques se présentant sous forme micro ou nanodispersée, et des compositions pharmaceutiques obtenues par un tel procédé. Par l'expression composition pharmaceutique se présentant sous forme micro ou nanodispersée, on entend une composition pharmaceutique comprenant des formes pharmaceutiques de petite taille qui contiennent au moins un principe actif et ont notamment l'intérêt de pouvoir être administrées par voie parentérale chez l'homme et/ou chez l'animal. Le principe actif est en suspension dans un solvant approprié. Au sein des formes pharmaceutiques de petite taille, on distingue les formes pharmaceutiques microdispersées et nanodispersées de la manière suivante. Les formes pharmaceutiques microdispersées ont une taille typiquement de l'ordre du m, comprise entre 0,2 et 20 m, et le plus fréquemment entre 1 et 10 m. Elles sont généralement à base de polymères biodégradables comme des copolymères de l'acide lactique et glycolique. On distingue notamment : - les particules microdispersées (ou microparticules) : le principe actif est prisonnier du réseau polymérique, les capsules microdispersées (ou microcapsules) : le principe actif est encapsulé . Des médicaments sous forme de microparticules sont commercialisés, tels que le Décapeptyl des laboratoires IPSEN Beaufour. Ce produit contient un peptide (Triptoréline) constitué de 10 acides aminés. Ce médicament est indiqué dans le traitement du cancer de la prostate. Il est présenté sous forme de microsphères lyophilisées à reconstituer dans un solvant physiologique afin d'être administré par voie sous-cutanée ou intra-musculaire. Les formes pharmaceutiques nanodispersées ont une taille typiquement de l'ordre du nm, typiquement de 50 à 500 nanomètres. On fait la distinction entre : les formes vésiculaires comme les liposomes : les liposomes sont des structures lamellaires constituées de phospholipides, et capables de véhiculer des principes actifs comme notamment des antibiotiques ou des anticancéreux. les formes particulaires nanodispersées à base de polymères : parmi celles-ci on distingue d'une part les nanocapsules, qui contiennent un compartiment interne huileux ou aqueux, et d'autre part les nanosphères, constituées par un réseau dense de polymères qui emprisonnent le principe actif. Les polymères biodégradables les plus fréquemment utilisés pour ces formes particulaires nanodispersées (ou nanoparticules) sont notamment des dérivés des acides polylactiques et polyglycoliques ou des dérivés des polycyanoacrylates d'alkyle. Ces formes nanodispersées peuvent encapsuler ou absorber un grand nombre de principes actifs comme des anticancéreux ou des antibiotiques. Comme pour les liposomes, leur petite taille (de l'ordre de 50 à 500 nm) autorise leur administration par voie intraveineuse. Lorsque l'on souhaite administrer par voie parentérale chez l'homme et chez l'animal ces formes microdispersées et nanodispersées, il est nécessaire de les stériliser. Jusqu'à présent, les méthodes de stérilisation utilisées couramment par l'industrie pharmaceutique ne sont pas totalement satisfaisantes. La plus connue est la stérilisation à la chaleur (120 C pendant 30 minutes). Ce type de procédé n'est pas indiqué pour les formes micro et nanodispersées, car il peut entraîner une déstructuration de la forme pharmaceutique et surtout une destruction des principes actifs thermosensibles généralement associés à ce type de forme (peptides, anticancéreux, antibiotiques). Un autre procédé est la filtration stérilisante. Pour soustraire aux suspensions et solutions les microorganismes, il faut utiliser des filtres d'une porosité inférieure à 0,22 micron suivant les recommandations de la Pharmacopée Européenne Illème Edition. Or, ce diamètre est incompatible avec la taille des microparticules (quelques microns): il provoque par effet mécanique la déstructuration des vésicules comme les liposomes ; quant aux formes particulaires nanodispersées, si la fixation du principe actif est réalisée en périphérie du vecteur, le principe de filtration peut causer une désorption du médicament. Le procédé de filtration stérilisante aboutit rapidement au colmatage des filtres. Ce procédé est inadapté dans le cas des suspensions visqueuses. Un autre procédé consiste à irradier avec des rayonnements gamma ou des flux d'électrons les formulations à stériliser. C'est le procédé qui est actuellement le plus souvent utilisé pour stériliser les microcapsules. Cette technique n'est cependant pas tout à fait satisfaisante. Elle peut altérer la structure des principes actifs fragiles, elle peut de la même façon provoquer une dégradation des polymères qui constituent ces formes pharmaceutiques. Les radiations peuvent entraîner une altération de l'intégrité des phospholipides constituant les liposomes. Pour des raisons environnementales, ce procédé est de moins en moins accepté par les autorités. Enfin, on peut envisager de réaliser la totalité du procédé de façon aseptique ce qui, sur le plan technique, représente de nombreuses contraintes entraînant des surcoût prohibitifs On connaît par ailleurs des procédés de stérilisation de milieux liquides qui font intervenir des hautes pressions, mais aucun n'est adapté à la stérilisation de compositions pharmaceutiques sous forme micro ou nano dispersées comprenant des principes actifs sensibles. Certains procédés prévoient de combiner les hautes pressions et les hautes températures. Ces procédés permettent de détruire les microorganismes tels que virus, bactéries et moisissures dans des liquides, mais dégradent les produits sensibles. Par exemple, la demande de brevet allemand DE-A-19 905 159 décrit un procédé pour la stérilisation de principes actifs médicamenteux à des pressions comprises entre 200 et 9000 MPa et à des températures comprises entre 25 et 200 C : de telles températures provoquent la dégradation de certains principes actifs fragiles. La mise en oeuvre de telles températures contrecarre les apports positifs des hautes pressions. Les inventeurs ont réussi à démontrer l'efficacité d'une technique de stérilisation à hautes pressions, pour des formes pharmaceutiques micro et nanodispersés qui, de façon surprenante pour l'homme de l'art, résistent à ce traitement. Ainsi, l'invention vise à pallier les inconvénients de l'art antérieur et à proposer un nouveau procédé de stérilisation pour ces différentes formes pharmaceutiques thermosensibles typiquement administrées par voie parentérale, qui permette d'obtenir des formes pharmaceutiques à la fois stériles conformément à la réglementation en vigueur, et non dégradées pour atteindre l'efficacité souhaitée du principe actif. A cet effet l'invention a pour objet selon un premier aspect un procédé de stérilisation sans dégradation de formes pharmaceutiques microdispersées ou nanodispersées d'une taille inférieure à 20 m comprenant au moins un principe actif sensible, utilisant des hautes pressions de l'ordre de 200 à 1000 MPa, de préférence de 300 à 800 MPa, et encore de préférence de 300 à 600 MPa. Par principe actif sensible, on entend des principes actifs qui subissent une baisse non souhaitée de leur activité thérapeutique lorsqu'ils sont soumis aux procédés de stérilisation de l'art antérieur, en particulier des traitements thermiques. L'homme du métier connaît ces principes sensibles, il s'agit typiquement de composés suivants : antibiotiques, anticancéreux, anticorps, protéines ou polypeptides, acides nucléiques, polysaccharides. Par exemple, les protéines subissent une modification de leur structure qui entraîne une modification de l'activité biologique. Selon un mode de réalisation préféré, la température de stérilisation est comprise entre 20 et 70 C, de préférence entre 20 et 50 C, et encore de préférence de l'ordre de 25 C (température ambiante), la durée de stérilisation est comprise entre 1 et 60 minutes, de préférence entre 5 et 30 minutes, un traitement pouvant être constitué de plusieurs cycles. Les formes microdispersées ont typiquement une taille comprise entre 0,2 et 20 m, de préférence entre 1 et 10 m. Selon une variante les formes microdispersées sont des microsphères d'un diamètre compris entre 1 et 10 m. Selon un autre variante ces formes microdispersées sont des vésicules à base de tensioactif amphiphiles de type sphérulites, de taille comprise entre 0,2 et 20 m. Les formes nanodispersées ont typiquement une taille comprise entre 50 et 500 nm. Selon une variante, les formes nanodispersées sont des nanosphères formant un réseau polymérique. Selon une autre variante, les formes nanodispersées sont des nanocapsules présentant une enveloppe polymérique enfermant un contenu huileux. Les formes nanodispersées sont typiquement à base de PHDCA, ou d'un copolymère PEG-PHDCA. D'autres polymères appropriés peuvent être utilisés. L'invention concerne selon un autre aspect une composition pharmaceutique microdispersée ou nanodispersée, non altérée et stérile, susceptible d'être obtenue par un procédé tel que décrit précédemment. On entend par une forme pharmaceutique stérile une telle forme stérile conformément à la réglementation : la Pharmacopée Européenne, IVème édition, impose une réduction de la contamination microbienne supérieure ou égale à 6 log. Et l'on entend par composition non altérée une composition comprenant des formes pharmaceutiques micro ou nano dispersées qui n'ont pas subi de dégradation lors du procédé de stérilisation, cette dégradation nuisant à l'efficacité thérapeutique recherchée. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont donc nouvelles en tant que telles par rapport à celles de l'art antérieur, ces dernières n'étant pas à la fois stériles et non altérées (caractéristiques morphométriques non modifiées). L'invention concerne également une telle composition pharmaceutique, en tant que médicament, notamment antibiotique ou anticancéreux. L'invention concerne également l'utilisation d'une telle composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament destiné à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse. D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples décrits ci-après. Exemple 1 : microsphères de Décapeptyl dont le diamètre est compris entre 1,0 et 10 microns. Des pressions stérilisantes comprises entre 300 et 800 MPa ont été appliquées sur les microsphères diluées dans du sérum physiologique (10 ml). Les microsphères utilisées étaient conditionnées dans des sachets souples en polyéthylène qui ont ensuite été immergés dans le liquide de l'enceinte stérilisante. La durée d'application de la pression variait de 5 à 30 minutes. L'aspect des microsphères a été évalué par microscopie optique avant et après traitement, ainsi que le taux de relargage du principe actif dans la solution ayant servi à suspendre les microsphères. Une fuite du principe actif indiquerait une perte de l'intégrité morphologique des microparticules. Le principe actif a été dosé par chromatographie liquide hautes performances. Pour réaliser cette mesure, les microsphères ont été centrifugées à basse vitesse et le principe actif a été dosé immédiatement dans le surnageant. Les résultats de ces essais sont repris dans le tableau suivant : Essai Pression Durée Aspect Notion de Dosage du principe MPa Minutes après le stérilité : actif dans le traitement Nb réduction surnageant Log avant après 1 300 5 Inchangé - * ilq ilq 2 300 30 Inchangé 3.37 ilq ilq 3 600 5 Inchangé- ilq ilq 4 600 30 Inchangé 8.05 ilq ilq 5 800 5 Inchangé - ilq ilq 6 800 30 Inchangé 8.00 ilq ilq *ilq : inférieur à la limite de quantification. La température de stérilisation était de l'ordre de 25 C. La composition obtenue était stérile pour des pressions appliquées supérieures à 300 MPa. En conclusion de ce test, on constate de façon surprenante que l'application de hautes pressions isostatiques stérilisantes allant jusqu'à 800 MPa pendant un durée allant jusqu'à 30 minutes n'altèrent pas la morphologie des microcapsules de Décapeptyl# et ne provoque pas de relargage du principe actif. Exemple 2 : vésicules mixtes Des vésicules à base de tensioactif amphiphiles commercialisées sous le nom de Sphérulites (décrites dans le brevet WO 01/45672 A2) chargées d'un colorant, l'amarante, ont été soumises sous formes de slurry à différents niveaux de pressions stérilisantes pendant trente minutes. Ces vésicules sont organisées en pelure d'oignons et présentent des tailles comprises entre 0,2 et 20 micromètres. Les Sphérulites utilisées étaient conditionnées dans des sachets souples en polyéthylène qui ont ensuite été immergées dans le liquide de l'enceinte stérilisante. Les paramètres suivants ont été mesurés : # Le taux d'encapsulation du colorant avant et après traitement par les pressions stérilisantes par dosage colorimétrique. # La distribution granulométrique avant et après traitement par diffusion laser. Les résultats sont présentés ci-dessous : Pressions Taux d'encapsulation MPa du colorant (%) 0 52 300 51 400 51 500 52 En conclusion, on constate que l'application de pressions stérilisantes à des vésicules comme les Sphérulites ne modifie pas leur distribution granulométrique et ne provoque pas de relargage de la molécule encapsulée, dans le cas présent l'Amarante. Des pressions de stérilisation de 300 MPa à 500 MPa ont été appliquées à la température ambiante pour une durée de traitement de 10 minutes. La composition obtenue était stérile au delà de 300 MPa. Exemple 3: formes nanodispersées constituées de polymères biodégradables de la classe des polyalkylcyanoacrylates. Ces formes nanodispersées (ou nanoparticules) peuvent se présenter soit : # sous la forme de nanosphères, dans ce cas il s'agit d'objets denses constitués par un réseau polymérique. # sous la forme de nanocapsules, dans ce cas il s'agit de capsule renfermant un contenu huileux circonscrit par une enveloppe polymèrique. Ces nanoparticules sont des vecteurs capables de véhiculer des médicaments dans l'organisme Plusieurs types de vecteurs ont été synthétisés : des nanosphères et des nanocapsules à base de polyhexadecylcyanoacrylate (PHDCA), des nanosphères et des nanocapsules à base d'un copolymère réalisé à partir de polyéthylène glycol et de polyhexadécylcyanoacrylate (PEG-PHDCA). Ces nanoparticules ont été obtenues par 2 méthodes de fabrication : nanodéposition et émulsion/évaporation de solvant. La synthèse de ces vecteurs est décrite en détail dans les articles suivants : - M.T. Peracchia et al Synthesis of a novel poly(MePEGcyanoacrylate-co-alkylcyanoacrylate)amphiphilic copolymer for nanoparticle technology. Macromolecules (1997), 30 ,846-851. - J Brigger et al Near infrared with principal component analysis as a novel analytical approach for nanoparticles technology. Pharm. Res (2000), 17,1124-1132. Les nanoparticules testées ont été traitées par les hautes pressions isostatiques stérilisantes décrites ci-après. Les vecteurs ont été conditionnés dans des sacs en polyamide souple thermosoudés. Les conditions de hautes pressions appliquées sont les suivantes : 200,300, 400 et 500 MPa pendant des plateaux de 10 et 30 minutes à température ambiante. Les contrôles suivants ont été réalisés sur les nanosphères avant et après les différents traitements précisés ci-dessus : Examen visuel # Sédimentation # Floculation # Agrégation # Couleur Mesure de la taille par diffusion quasi élastique d'un rayon laser avant le traitement, immédiatement après le traitement, sept et trente jours après le traitement afin de déterminer si le procédé de stérilisation entraîne une déstabilisation des suspensions de vecteur. Mesure du potentiel zeta qui est indicateur de la stabilité des suspensions mais aussi de leur état de surface. (Zeta Sizer 4, 7032 Multi 8 correlator, Malvern Instrument). Une analyse turbidimétrique avant et après le traitement en utilisant un spectrophotomètre UV/Visible à 400 nm (Perkin Elmer). Une analyse par spectrophotométrie infrarouge suivie d'un traitement du signal afin de détecter des modifications dans la composition chimique des polymères constituants les vecteurs (Brücker Vector 22) dans un domaine de longueur d'onde compris entre 4500 & 550 cm-1. Une analyse par microscopie électronique à balayage sur des échantillons préalablement lyophilisés afin de constater d'éventuelles modifications de la structure des nanosphères avant et après traitement par les hautes pressions. Les résultats de ces essais sont les suivants : Aspects Aucune modification visuelle n'a été constatée aussi bien sur les nanoparticules que les nanocapsules après les différents traitements (couleur, floculation, aggrégation, perte de la phase huileuse des nanocapsules). Mesure de la taille Nanoparticules PHDCA obtenues par nanoprécipitation Echantillon Fabrication J Stérilisation J Stérilisation J 0 7 30 Diamètre (nm) Diamètre (nm) Diamètre (nm) Témoin 97 100 98 200 MPa 10 min 98 97 500 MPa 30 min gg gg Nanoparticules PEG-PHDCA obtenues par nanoprécipitation Echantillon Fabrication J Stérilisation J 7 Stérilisation J 0 30 Diamètre (nm) Diamètre (nm) Diamètre (nm) Témoin 116 fil 123 200 MPa 10 min 112 123 500 MPa 30 min 11 122 Nanocapsules PHDCA Echantillon Fabrication J Stérilisation J Stérilisation J 0 7 30 Diamètre Diamètre (nm) Diamètre (nm) (nm) Témoin 153 157 157 200 MPa 10 min 157 161 500 MPa 30 min 159 162 Nanocapsules PEG-PHDCA Echantillon Fabrication J Stérilisation J Stérilisation J 0 7 30 Diamètre Diamètre (nm) Diamètre (nm) (nm) Témoin 189 195 212 200 MPa 10 min 195 203 500 MPa 30 min 195 209 On ne note aucune modification significative de la taille des nanosphères après les différents traitements à hautes pressions compris entre 200 MPa pendant 10 minutes et 500 MPa pendant 30 minutes, immédiatement après le traitement et jusqu'à un mois. Potentiel zéta Nanoparticules PHDCA obtenues par nanoprécipitation Echantillon Potentiel zêta SD Width (mV) (mV) Témoin -40,0 0,4 5,9 200 MPa 10 minutes -39,9 1,1 5,9 500 MPa 30 minutes -43,0 0,1 6,0 Nanoparticules PEG-PHDCA obtenues par nanoprécipitation Echantillon Potentiel zéta SD Width (mV) (mV) Témoin -27,1 0,8 5,9 200 MPa 10 minutes -30,2 0,1 5,9 500 MPa 30 minutes -30,8 0,9 5,9 Nanocapsules PHDCA Echantillon Potentiel zéta SD Width (mV) (mV) Témoin-48,7 0,7 6,6 200 MPa 10 minutes -52,5 0,2 6,0 500 MPa 30 minutes -54,7 0,1 5,8 Nanocapsules PEG-PHDCA Echantillon Potentiel zéta SD Width (mV) (mV) Témoin -40,2 0,4 6,1 200 MPa 10 minutes-40,9 0,5 5,9 500 MPa 30 minutes-41,3 0,5 5,8 Pour l'ensemble des nanoparticules testées aucune modification notable du potentiel zéta n'est observée après l'application des hautes pressions démontrant ainsi l'absence d'effet de cette technologie sur ce paramètre qui reflète une variation dans la stabilité des suspensions. Analyse turbidimétrique Le traitement par les hautes pressions ne modifie pas de façon détectable l'analyse de la turbidité des suspensions réalisée par spectrophotomètrie UV/Visible comme l'indique la figure ci-jointe. Aucune trace d'huile n'est détectable après traitement des nanocapsules témoignant ainsi de l'absence d'effet destructeur du traitement vis-à-vis de l'intégrité morphométrique de ce vecteur de médicament. Analyse par spectrophotométrie infrarouge Les spectres Infra rouge obtenus pour les différentes préparations de nanosphères sont superposables avant et après traitement par les hautes pressions. Ces résultats prouvent que le traitement n'altère pas la structure chimique des polymères constituant les nanosphères. Analyse par microscopie électronique à balayage. D'une façon générale, on n'observe pas de différence dans l'examen des clichés obtenus par microscopie électronique à balayage sur les échantillons de nanosphères lyophilisées avant et après traitement par les hautes pressions.. Les résultats de ces expériences démontrent que les hautes pressions isostatiques appliquées n'ont aucun effet sur la structure intime des nanoparticules, ce qui en fait une technique particulièrement appropriée comme moyen de stérilisation par rapport aux autres techniques disponibles. REVENDICATIONS 1. Procédé de stérilisation sans dégradation d'une composition pharmaceutique sous forme microdispersée ou nanodispersée comprenant au moins un principe actif sensible, caractérisé en ce qu'il utilise des hautes pressions de l'ordre de 200 à 1000 MPa, de préférence de 300 à 800 MPa. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la température de stérilisation est comprise entre 20 et 70 C, de préférence de 20 à 50 C, encore de préférence de l'ordre de 25 C, la durée de stérilisation est comprise 1 et 60 minutes, de préférence entre 5 et 30 minutes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que les formes microdispersées ont une taille comprise entre 0,1 et 20 m, de préférence entre 1 et 10 m. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les formes microdispersées sont des microsphères d'un diamètre compris entre 1 et 10 m. 5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les formes microdispersées sont des vésicules à base de tensioactif amphiphiles de type sphérulites, de taille comprise entre 0,2 et 20 m. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que les formes nanodispersées ont une taille comprise entre 50 et 500 nm. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les formes nanodispersées sont des liposomes. 8. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les formes nanodispersées sont des nanosphères formant un réseau polymérique. 9. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les formes nanodispersées sont des nanocapsules présentant une enveloppe polymérique enfermant un contenu huileux. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que les formes nanodispersées sont à base de PHDCA. 11. Procédé selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que les formes nanodispersées sont à base d'un copolymère PEG-PHDCA. 12. Procédé selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que la pression de stérilisation est comprise entre 300 et 600 MPa, la durée de stérilisation est comprise entre 10 et 30 minutes, la température est de l'ordre de 20 à 50 C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le principe actif sensible est choisi dans le groupe constitué par : les antibiotiques, les anticancéreux, les anticorps, les protéines ou polypeptides, les peptides, les acides nucléiques, les polysaccharides. 14. Composition pharmaceutique microdispersée ou nanodispersée, non altérée et stérile, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, en tant que médicament. 16. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon la revendication 15 pour la préparation d'un médicament destiné à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse.