FR 2838453 A1 20031017 FR 0204537 A 20020411 PROCEDE DE SELECTION D'AGENTS BIO-ACTIFS PAR DETECTION D'UNE VARIATION INDUITE DE LA CONCENTRATION INTRACELLULAIRE D'AMPc D'UNE CELLULE VIVANTE SENSIBLE. L'invention concerne un procédé de sélection d'agents biologiquement actifs dont l'activité se traduit par une modulation de la voie de transduction du signal AMPc/PKA. L'invention s'étend à un système cellulaire vivant-notamment à l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain et d'un élément non isolé d'un corps humain-, adapté à la mise en #uvre d'un tel procédé. Dans l'industrie pharmaceutique, le développement d'un nouveau médicament passe par une étape clé : recherche d'agents biologiquement actifs. Ces agents sont recherchés pour leur capacité à interagir et à activer des cibles cellulaires impliquées dans de nombreuses fonctions physiologiques de l'organisme. Il existe actuellement de nombreuses banques d'agents potentiellement bio-actifs (molécules générées par la chimie combinatoire ou parallèle, substances d'origine naturelle...) privées ou publiques comprenant un très grand nombre d'agents dont l'activité biologique vis-à-vis de cellules sensibles doit pouvoir être testée. Au niveau cellulaire, lorsqu'une cible de type récepteur membranaire est activée, une cascade de réactions intracellulaires, appelée transduction du signal, est induite. L'information reçue par le récepteur est alors transférée de la membrane plasmique vers le cytoplasme suivant une voie de transduction du signal particulière dont la nature peut varier suivant celle du récepteur, celle de la cellule et/ou celle du stimulus appliqué sur la cellule. Parmi les différentes voies de transduction du signal, la voie de transduction de l'AMPc/PKA est une des cascades de signalisation intracellulaires majeures. Typiquement, la transduction du signal AMPc/PKA débute lorsqu'un ligand se lie à un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) et favorise son isomérisation vers une conformation active. Dans cet état actif le récepteur peut interagir et stimuler une protéine G. Deux de ces protéines, appelées Gs et Gi ("s" pour stimulateur et "i" pour inhibiteur), modulent le taux de synthèse de l'AMPc (AMP cyclique ou 3',5'-adénosine monophosphate) en stimulant ou en inhibant l'activité d'une enzyme membranaire, l'adénylyl cyclase. La concentration intracellulaire en AMPc est également dépendante de son taux de dégradation régulé par des enzymes nommées phosphodiestérases. L'augmentation de la concentration intracellulaire de l'AMPc conduit à l'activation de différentes cibles, appelées effecteurs, qui sont soit spécifiques de l'AMPc, telles que la protéine kinase A (PKA) et l'échangeur protéique activé directement par l'AMPc (Epac) ou sélective dans le cas du canal ionique dont l'activité dépend de nucléotides cycliques ("CNG channel"). En activant ces cibles, l'AMPc modifie certaines propriétés de réponses cellulaires très variées comme le potentiel de membrane et la prolifération ou la différenciation cellulaires. La voie AMPc/PKA est une voie de transduction intracellulaire majeure impliquée dans plus de 30% des cibles des agents bio-actifs. La détection ou le dosage de l'activité de la voie de transduction AMPc/PKA étant donc nécessaire pour le criblage d'agents bioactifs, plusieurs méthodes reposant sur les propriétés structurelles et fonctionnelles de la PKA, cible spécifique de l'AMPc, ont été proposées. La PKA est une holoenzyme tétramérique, constituée d'une sous-unité régulatrice dimérique et de deux sous-unités catalytiques monomériques. Dans des conditions de concentration intracellulaire d'AMPc basale, la fonction de la sous-unité régulatrice est de lier la sous-unité catalytique afin de l'inactiver. En revanche, lorsque la concentration intracellulaire de l'AMPc augmente, la sous-unité régulatrice joue le rôle de récepteur intracellulaire de l'AMPc. La liaison de ce dernier sur la sous-unité régulatrice entraîne le changement de conformation de cette dernière permettant la dissociation des sous-unités catalytiques. Une méthode proposée pour détecter le changement d'état de la PKA, exploite le principe de "transfert d'énergie de fluorescence par résonance" ou FRET. Ce principe repose sur un processus physique, dépendant de la distance, par lequel l'énergie est transmise de manière non radiative d'un chromophore excité, le donneur, à un autre chromophore, l'accepteur, par interaction dipôle-dipôle. Une première méthode proposée utilisant le FRET (Adams S. R. et al., 1991, Nature, 349,694-697) consiste à micro-injecter, dans les cellules, des sous-unités catalytiques de la PKA marquées avec la fluorescéine et les sous-unités régulatrices marquées avec la rhodamine. L'activation de la PKA conduit à la dissociation des différentes sous-unités, éliminant ainsi le transfert d'énergie, et donc le phénomène de FRET. La micro-injection des sous-unités dans les cellules, étape hautement invasive pour ces dernières, délicate, longue et coûteuse à réaliser, est un inconvénient majeur de cette technique. Une deuxième méthode, inspirée de la précédente, (Zaccolo M. et al., 2000, Nature Cell Biology, 2,25-29) a alors été proposée pour pallier les problèmes de purification et de micro-injection des sous-unités de la PKA. Cette méthode consiste à produire des cellules transfectées exprimant deux protéines de fusion : une sous-unité régulatrice couplée à une protéine fluorescente, et une sous-unité catalytique couplée à une protéine fluorescente photocomplémentaire de la précédente. Toujours en utilisant la propriété de FRET, WO 00/49183 et WO 00/75332, proposent de ne faire exprimer qu'une protéine recombinée, la sous-unité régulatrice de la PKA. Celle-ci est marquée au moyen de deux protéines fluorescentes complémentaires, présentes de part et d'autre du domaine de fixation de l'AMPc. La fixation de l'AMPc sur la sous-unité régulatrice modifie la conformation de celle-ci et donc la distance séparant les deux protéines fluorescentes complémentaires, induisant ainsi une variation de FRET. Les tests précédents utilisant le phénomène de FRET, basés sur la propriété fonctionnelle et structurelle de la PKA ne sont pas réellement utilisables en pratique, sauf à mettre en #uvre des moyens d'analyse d'images lourds et coûteux et fournissant des résultats d'une fiabilité imparfaite (car liés à une interprétation subjective). En effet, la modification d'intensité de fluorescence reflète des modulations de distance entre les groupements fluorescents complémentaires pouvant être très faibles, donc très difficiles à détecter et surtout impossibles à analyser. Ceci est d'autant plus vrai pour les tests proposés par WO 00/49183 et WO 00/75332. Une autre méthode proposée pour détecter l'activité de la PKA vise à exploiter le phénomène de redistribution (réarrangement spatial) de divers composants protéiques au sein de la cellule en fonction du stimulus appliqué sur celle-ci. Il est ainsi possible, en suivant la distribution au sein de la cellule d'une protéine donnée, de connaître l'état d'activation de celle-ci. Ainsi, WO 98/45704 propose une méthode de criblage d'agents bio-actifs susceptibles de provoquer l'activation d'une protéine bien définie en fabriquant un système cellulaire dans lequel ladite protéine est fusionnée à une protéine fluorescente de type GFP. Les agents bio-actifs capables d'induire l'activité de ces protéines, engendrent au contact de telles cellules transfectées une redistribution de la fluorescence, redistribution observable en microscopie de fluorescence. WO 98/45704 propose également d'appliquer cette méthode à la PKA. Pour cela, des cellules exprimant une sous-unité catalytique fluorescente de la PKA ont été proposées. A faible concentration d'AMPc intracellulaire, la fluorescence dans le cytoplasme de ces cellules serait plus ou moins organisée en agrégats, alors qu'à forte concentration d'AMPc, elle serait davantage dispersée au sein du cytoplasme. L'AMPc est produit par l'adénylyl cyclase au niveau de la membrane plasmique puis diffuse dans le cytoplasme où il rencontre soit la PKA, sa cible, soit une phosphodiestérase qui le rend inactif par dégradation. Il existe donc un gradient négatif de concentration en AMPc à partir de son site de synthèse membranaire. Or, WO 98/45704 détecte des variations de la fluorescence de la PKA présente dans le cytoplasme, donc nécessairement à distance importante de la source de synthèse d'AMPc. Il s'ensuit que cette méthode de détection reste peu sensible en pratique, en particulier pour le criblage de ligands extracellulaires. Ce type de test se trouve donc très limité dans ses applications. La présente invention se propose de fournir un procédé de sélection d'agents bio-actifs-notamment mais non exclusivement d'agents pharmacologiquement actifs pour l'homme ou l'animal- dont l'activité se manifeste vis-à-vis d'une cellule sensible, par une variation intracellulaire d'AMPc. L'invention vise aussi à proposer un procédé de sélection adapté aux besoins d'un criblage sensible et à haut débit, c'est-à-dire capable de fournir rapidement des résultats sensibles, objectifs, fiables, d'analyse facile et rapide. L'invention s'étend à un système cellulaire adapté à la mise en #uvre d'un tel procédé de sélection ainsi qu'à un procédé d'obtention d'un tel système cellulaire. L'invention s'étend également aux différents "outils" génétiques-notamment séquences d'ADN et vecteurs nucléiques- permettant la réalisation d'un tel système cellulaire. L'invention concerne donc un procédé de sélection d'agents, dits agents à tester, susceptibles d'être biologiquement actifs vis-à-vis d'un système cellulaire vivant en induisant ou en inhibant une synthèse intracellulaire d'AMPc lorsqu'ils sont en présence d'au moins une cellule sensible d'un système cellulaire vivant, dans lequel : - on prépare un système cellulaire comprenant au moins une cellule vivante sensible exprimant au moins une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, . ladite protéine recombinée étant, en l'absence d'une synthèse induite d'AMPc, dans un premier état, dit état complexé, où elle forme un complexe, dit complexe RC, comprenant au moins une unité R comportant au moins un site de liaison de l'AMPc, et au moins une unité C, distincte d'une unité R, . ladite protéine recombinée étant, en présence d'une synthèse induite d'AMPc, dans un deuxième état, dit état dissocié, où les unités R et C sont dissociées et où au moins une unité R fixe l'AMPc, - on met en présence ledit système cellulaire avec une quantité d'au moins un agent à tester, - on détecte l'état, complexé ou dissocié, de ladite protéine recombinée, caractérisé en ce que : - au moins l'une des unités, dite unité de translocation, présente une séquence protéique comprenant un motif d'adressage membranaire adapté pour induire une translocation membranaire d'au moins une partie de ladite unité et pour préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former à la membrane un complexe en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, - au moins une autre unité, dite unité marquée, distincte d'une unité de translocation, présente un groupement, dit groupement de détection, adapté pour : ' préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, et ' permettre la détection de l'état de la protéine recombinée à l'aide d'un signal de détection qui, à la membrane, est sensiblement différent selon l'absence ou la présence de synthèse induite d'AMPc. La présente invention propose ainsi de forcer le recrutement de la PKA à la membrane plasmique afin de : - rapprocher la PKA de la source de synthèse membranaire de l'AMPc et par conséquent augmenter la sensibilité de la détection de l'AMPc, - localiser la PKA dans un compartiment intracellulaire (la membrane plasmique) favorable pour une observation fiable, simple, rapide. L'invention concerne aussi un système cellulaire vivant -notamment à l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain ou d'un élément non isolé du corps humain-, contenant au moins une cellule vivante exprimant au moins une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, telle que mentionnée ci-dessus. Avantageusement et selon l'invention, la séquence d'adressage membranaire contient un motif de modification posttransductionnelle CAAX où C désigne un résidu cystéine, A un résidu d'acide aminé aliphatique et X un résidu d'acide aminé ne possédant pas de charge. La séquence d'adressage membranaire contient, outre le motif CAAX, une séquence d'une quinzaine d'acides aminés. Initialement ces séquences d'adressage membranaire ont été mises en évidence chez les protéines de la famille Ras. Les protéines Ras sont des petites protéines G monomériques localisées à la membrane plasmique. Elles jouent un rôle clé dans les systèmes de transduction du signal intracellulaire impliqués dans la régulation de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Dans la cellule, le motif CAAX est reconnu par une enzyme, de la famille des isoprényl-transférases, conduisant à la farnésylation ou la géranylgéranylation du résidu cystéine puis au clivage protéolytique des résidus AAX terminaux. L'ensemble de ces modifications est nécessaire pour l'ancrage des protéines Ras à la membrane plasmique. A titre d'exemples non limitatifs de séquences d'adressage membranaire contenant un motif de modification post-traductionnelle CAAX pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention, on peut tout d'abord citer les trois gènes ras découverts chez l'homme (Lowy D. R. et Willumsen B.M., 1993, Ann. Rev. Bioch., 62, 851-891) : H-Ras (Harvey), K-Ras (Kirsten) et N-Ras (neuroblastoma). L'expression du gène K-Ras peut conduire par épissage alternatif des exons 4A et 4B à la production de deux protéines nommées K-Ras 4A et K-Ras 4B. Toutes les protéines Ras possèdent dans leur partie carboxylterminale une séquence d'adressage à la membrane plasmique d'une vingtaine d'acides aminés incluant un enchaînement de quatre acides aminés C-A-A-X. Selon l'invention, pour forcer la localisation de ladite protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA à la membrane plasmique, le cadre de lecture du gène codant, soit pour une unité R soit pour une unité C, a été fusionné avec une séquence d'adressage contenant un motif CAAX. Avantageusement, une séquence d'adressage membranaire conforme à l'invention peut correspondre aux extrémités carboxyl-terminales de la protéine H-Ras, telle que la séquence KLNPPDESGPGCMSCKCVLS (SEQ ID N 1) ; de la protéine K-Ras 4A, telle que la séquence KISKEEKTPGCVKIKKCIIM (SEQ ID N 2) ; de la protéine K-Ras 4B, telle que la séquence MSKDGKKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID N 3) ; de la protéine N-Ras, telle que la séquence KLNSSDDGTQGCMGLPCVVM (SEQ ID N 4). D'autres séquences d'adressage membranaire peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention, par exemple, des séquences comprenant les séquences précédemment citées ou des séquences provenant de l'extrémité carboxyl-terminale de protéines Ras, autres que des protéines Ras humaines, notamment de rat, de souris, de poulet, de xénope, de cochon, de drosophile, de nématode, de neurospora, de levure, de champignon, de poisson rouge (Lowy D. R. et Willumsen B. M., 1993, Ann. Rev. Bioch., 62, 851-991). Avantageusement et selon l'invention, le groupement de détection de l'unité marquée est un groupement luminophore choisi parmi : - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle-notamment de type luciférase- ou une protéine bioluminescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, la cyanine, le Nile Red@, Texas Red@, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyanines, le diphénylhéxatriène, les dérivés aromatiques luminescents. Avantageusement et selon l'invention, le groupement protéique luminophore est la Cycle3-GFP, un mutant thermostable de la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria. Il s'agit d'une protéine de 238 acides aminés qui peut être exprimée dans des cellules eucaryotes en conservant toutes ses propriétés de fluorescence. L'excitation de la Cycle3-GFP se produit entre 350 nm et 490 nm avec un maximum d'absorption à 398 nm et son émission de fluorescence se produit avec un maximum à 508 nm. Une protéine recombinée multimérique selon l'invention, en l'absence de synthèse induite d'AMPc, se trouve donc dans un état complexé, localisée à la membrane plasmique de façon constitutive par l'intermédiaire d'une unité de translocation selon l'invention. La dissociation de ce complexe provoquée lors d'une synthèse induite d'AMPc peut être suivie sur des cellules vivantes grâce à la propriété de fluorescence de la Cycle3-GFP de l'unité marquée. En terme de fluorescence, l'augmentation du taux intracellulaire d'AMPc se traduit par un déplacement de la fluorescence de la membrane plasmique vers le cytoplasme. De façon réciproque, ce procédé permet également l'observation d'une diminution du taux intracellulaire d'AMPc qui se traduit alors par un déplacement de la fluorescence du cytoplasme vers la membrane plasmique. La distinction entre le marquage par luminescence d'une membrane et celui du cytoplasme est suffisamment prononcée pour permettre une détection objective et fiable de l'état de la protéine par une simple observation en microscopie de fluorescence. Avantageusement et selon l'invention, l'unité de translocation est l'unité R, et l'unité marquée est l'unité C. Selon une variante préférée de l'invention, la détection de l'état de la protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA se fait par détection d'une émission ou d'une extinction lumineuse du couplage de luminescence entre deux groupements luminescents complémentaires, en exploitant le principe de FRET. Selon une autre variante, ladite détection peut également se faire en exploitant le principe de BRET (transfert de bioluminescence par résonance). Pour ce faire, on introduit dans les cellules sensibles au moins un agent, dit agent membranaire de couplage, apte à s'associer à la membrane plasmique, et marqué avec au moins un groupement luminescent, dit deuxième luminophore, distinct du groupement luminescent porté par l'unité marquée, dit premier luminophore. Conformément à cette variante de l'invention, ces deux luminophores sont photocomplémentaires de sorte que l'unité marquée et l'agent membranaire de couplage créent entre eux un phénomène de couplage de luminescence. Pour la mise en #uvre de cette variante de réalisation, les inventeurs ont déterminé d'une part, qu'il est possible d'incorporer dans la membrane cellulaire des agents membranaires de couplage, marqué par des groupements luminescents, qui peuvent bénéficier de la dynamique latérale de la membrane cellulaire (en étant eux-même soumis à cette dynamique) pour se répartir de façon homogène au sein de celle-ci et en une quantité qui simultanément soit assez faible pour ne pas affecter les propriétés fonctionnelles de la membrane cellulaire et de la cellule vivante, mais soit assez importante pour assurer la réalisation du couplage de luminescence lorsque l'unité marquée est recrutée à tout endroit de la membrane cellulaire. Les inventeurs ont constaté que grâce au fait que l'invention met à profit la versatilité des composants membranaires décrite dans le modèle des membranes dit "mosaïque fluide", (Singer S.J. et Nicolson G. L., 1972, Science, 175, 720-731), statistiquement, il se trouve toujours un agent membranaire de couplage à proximité de l'unité de translocation, et ainsi donc également à proximité de l'unité marquée lorsque celle-ci est recrutée à la membrane, et à une distance de celle-ci qui en pratique correspond à l'obtention du couplage de luminescence tel que le FRET ou le BRET. On sait en effet qu'une émission de luminescence spécifique par couplage de luminescence se produit ou est modifiée lorsque : - (a) deux groupements photocomplémentaires sont proches dans l'espace (notamment de 1 à 10 nm) d'une distance inférieure ou égale à une valeur seuil prédéterminée (2 Ro, où Ro est le rayon de Forster dans le cas du FRET), - (b) le spectre d'émission de l'un des groupements photocomplémentaires, dit donneur, et le spectre d'absorption de l'autre groupement photocomplémentaire, dit accepteur, se recouvrent au moins en partie (Lakey et al., 1991, J. Mol. Biol., 1218, 639-653). Egalement, les inventeurs ont mis en évidence qu'il existe des couples de luminophores compatibles avec les agents membranaires (phospholipides). En particulier, on a trouvé des lipides pouvant porter un composé fluorescent compatible avec les membranes cellulaires naturelles (pouvant faire office d'agents membranaires de couplage) et réalisant un couplage de fluorescence par FRET avec une GFP et notamment avec la GFP naturelle. Avantageusement et selon l'invention, les premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie par résonance, notamment par FRET. Avantageusement et selon l'invention, l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle-notamment de type luciférase- ou une protéine bioluminescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, la cyanine, le Nile Red@, le Texas Red@, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. Avantageusement et selon l'invention, l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire, notamment la protéine fluorescente verte GFP de la méduse Aequorea victoria. Avantageusement et selon l'invention, on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile qui peut être marqué par le deuxième luminophore. A titre de ligands lipophiles, on peut citer les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les agents dérivés de ces composés. Un agent luminophore lipophile peut constituer à lui seul, un agent membranaire de couplage. Avantageusement et selon l'invention, ladite protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA est une protéine de type PKA recombinée ; les unités R et C correspondent respectivement aux sous-unités régulatrice et catalytique de la PKA, recombinées. On notera que les séquences des sous-unités régulatrices et catalytiques peuvent être des séquences aussi bien homologues qu'orthologues de la PKA, c'est-à-dire des séquences qui proviennent ou non d'une même espèce. Avantageusement et selon l'invention, l'unité de translocation est une unité régulatrice recombinée issue de la fusion par voie génétique : - d'au moins une partie de la séquence protéique d'une sous- unité régulatrice choisie parmi les isoformes : RIa, Riz3, RIla, Riiez, - et d'une séquence d'adressage membranaire. Plus particulièrement, le tableau 1 donne quelques exemples, non limitatifs, d'isoformes de sous-unités régulatrices présentes dans l'espèce humaine, mais également dans de nombreuses autres espèces, pouvant être utilisées pour l'obtention d'une unité de translocation selon l'invention. TABLEAU 1 ESPECE BASE DE TYPE REFERENCES DONNEES ISOFORME HOMO SAPIENS SWISSPROT RIa ID KAPO~HUMAN AC P10644 PIR RII[alpha] ID OKHUR2 AC S03885 PIR Riss ID OKHUR1 AC JH0392 PIR RIIss ID OKHUR2 AC A40915 BOVIN SWISSPROT RIa ID KAPO~BOVIN AC P00514 SWISSPROT RII[alpha] ID KAP2~BOVIN AC P00515 PIR RIIss ID OKBOR2 AC A36528 COCHON PIR RIa ID OKPGIR AC S00083 RAT PIR RI[alpha] ID OKRT1R AC A26910 SWISSPROT RIss ID KAP1~RAT AC P81377 PIR RII[alpha] ID OKRT2R AC A28325 SWISSPROT RIIss ID KAP3~RAT AC P12369 SOURIS PIR RII[alpha] ID OKMS2R AC B28325 PIR RIss ID OKMSR1 AC A30205 DROSOPHILE SWISSPROT RI ID KAPR~DROME AC P16905 SPTREMBL RII ID Q9NB 18 AC Q9NB18 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9C196 Aspergillus niger AC Q9C196 CHAMPIGNON GENPEPT ID AF401202 Aspergillus fumigatus AC AF401202 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9HEP7 Blumeria graminis AC Q9HEP7 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9XTM6 Eu lotes octocarinatus AC Q9XTM6 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9CIC2 Glomerella lagenarium AC Q9C1C2 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~BLAEM Blastocladiella emersonii AC P31320 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~COLTR Colletotrichum trifolii AC 042794 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~EMENI Emericella nidulans AC 059922 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~MAGGR Magnaporthe grisea AC 014448 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~NEUCR Neurospora crassa AC Q01386 CHAMPIGNON SWISSPROT RII ID KAPR~STRPU Strongylocentrotus purpuratus AC Q26619 CHAMPIGNON SWISSPROT ID KAPR~USTMA Ustilago maydis AC P49605 LEVURE SWISSPROT ID KAPR~YEAST Saccharomyces cerevisiae AC P07278 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9P8K6 Mucor rouxii AC Q9P8K6 LEVURE SPTREMBL ID Q9HEW1 Candida albicans AC Q9HEW1 LEVURE PIR ID OKBYRC Saccharomyces cerevisiae AC A25868 Aplysia californica PIR RI ID OKGAR1 AC JH0590 Caenorhabditis elegans PIR RI ID OKKW1R AC A35076 Avantageusement, une umte ae transiocation coniorme a l'invention peut avoir pour séquence protéique SEQ ID N 5, et être codée par une séquence nucléique telle que SEQ ID N 6. Ces différentes isoformes de la PKA forment une famille structurellement et fonctionnellement homogène de protéines. Bien que codées par des gènes distincts, les sous-unités régulatrices de la PKA sont homologues pour une espèce donnée. Les sous-unités RIa et RIss comme RII[alpha] et RII(3 présentent entre elles de fortes similarités de séquence en acides aminés respectivement 81% et 68% d'identité. D'un point de vue phylogénétique, les sous-unités régulatrices orthologues sont très conservées et en conséquence présentent, chez les eucaryotes supérieurs, de fortes similarités de séquences en acides aminés de 87% à 98% d'identité (Tasken K. K. et al., 1997, Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research, 31,191- 204). Les sous-unités régulatrices RIa et RIIa sont exprimées de façon ubiquitaire dans les cellules animales. La proportion relative de chacune peut cependant varier d'un type cellulaire à un autre. L'expression des sous-unités régulatrices RIss et RIIss, quant à elle, est plutôt spécifique du type tissulaire. Par exemple, RIIss est exprimée dans le tissu neuronal, dans les cellules de la granulosa et des testicules, et dans les cellules rénales. Les sous-unités régulatrices de la PKA (aussi bien d'humain, de rat, de souris, de bovin) comprennent un motif de 17 résidus d'acide aminé : GSFGELAL[IM]Y[GN]TPRAAT (équivalent aux séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10), les crochets signifiant qu'il s'agit de l'un ou l'autre acide aminé. On note par ailleurs que les isoformes de la PKA forment une famille fonctionnellement homogène et redondante. La preuve de cette redondance repose sur la mise en évidence, dans la plupart des études, de l'aptitude des isoformes de la PKA de se compenser fonctionnellement les unes aux autres lors de la perte de l'une d'entre elles. Par exemple, des études récentes ont montré que lorsqu'un gène codant pour l'une des sous-unités régulatrices était invalidé, le taux d'autres sous-unités régulatrices augmentait de façon à compenser cette perte (Amieux P. S. et al., 1997, The Journal Biological Chemistry, 272,3993-3998). Cette augmentation peut être observée dans le système nerveux de souris dont le gène codant pour RI(3 a été invalidé mais également dans le système nerveux et le tissu adipeux de souris dont RIIss a été invalidé (Brandon E. P. et al., 1997, Current Opinion in Neurobiology, 7,397- 403). Les différentes isoformes homologues (intra-espèce) et orthologues (inter-espèce) de la PKA étant fonctionnellement homogènes, on peut donc avantageusement les utiliser indifféremment, pour mettre en #uvre l' invention. La région amino-terminale (résidus 1 à 140) des sous-unités régulatrices est riche en résidus hydrophobes et en acides aminés chargés. La fonction majeure de cette région est d'assurer l'interaction entre les deux protomères de la sous-unité régulatrice dimérique. Le domaine de dimérisation est restreint à un petit segment d'au moins 40 acides aminés. Les sous-unités régulatrices possèdent, dans leur moitié amino-terminale, le domaine de liaison à la sous-unité catalytique que l'on qualifie couramment de "hinge région" (région charnière). Cette région est constituée d'une séquence d'acides aminés similaire à celle des substrats de la sous-unité catalytique. Outre le domaine de dimérisation et le domaine d'interaction avec la sous-unité catalytique, les sous-unités régulatrices possèdent dans leur partie carboxyl-terminale deux domaines de liaison de l'AMPc en tandem. Ces deux domaines se distinguent par la cinétique de liaison de l'AMPc. On différencie ainsi le site A, ou site de liaison rapide, et le site B, ou site de liaison lent. Avantageusement et selon l'invention, l'unité marquée est une séquence protéique comprenant au moins une partie de la séquence d'une sous-unité catalytique choisie parmi les isoformes Ca, Css et Cy, marquée par un groupement de détection. Plus particulièrement, le tableau 2 donne des exemples d'isoformes de sous-unités catalytiques présentes dans l'espèce humaine, mais également dans d'autres espèces, qui peuvent être utilisées en vue d'obtenir une unité marquée selon l'invention. TABLEAU 2 ESPECE BASE DE TYPE REFERENCES DONNEES ISOFORME HOMO SAPIENS PIR Ca ID OKHU2C AC S01404 PIR Css ID OKHUCB AC A34724 SWISSPROT C[gamma] ID KAPG~HUMAN AC P22612 MACAQUE SWISSPROT C[gamma] ID KAPG~MACMU AC 062846 BOVIN PIR Ca ID OKB02C AC S27159 PIR Css1 ID OKBOB1 AC A253345 SWISSPROT Css2 ID KAPI~BOVIN AC P24256 COCHON PIR Ca ID S00085 AC S00085 SWISSPROT Cp ID KAPB~PIG AC P05383 CHIEN SPTREMBL ID Q16933 AC Q16933 RAT PIR Ca ID OKRT2C AC S16240 PIR Css ID OKRTCB AC JQ1139 SOURIS PIR Ca ID KAPA~MOUSE AC P05132 PIR Css ID KAPB~MOUSE AC P05206 DROSOPHILE PIR ID C31751 AC C31751 HAMSTER PIR Ca ID OKHYCA AC B40384 CHAMPIGNON SPTREMBL ID P87077 Aspergillus niger AC P87077 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9HGU6 Blumeria graminis AC Q9HGU6 CHAMPIGNON SPTREMBL ID 097114 Amblyomma americanum AC 097114 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9UUS9 Erysiphe graminis AC Q9UUS9 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q12741 Blastocladiella emersonii AC Q12741 CHAMPIGNON SPTREMBL ID 042793 Colletotrichum trifolii AC 042793 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9P472 Emericella nidulans AC Q9P472 CHAMPIGNON SPTREMBL ID Q9P466 Neurospora crassa AC Q9P466 LEVURE SPTREMBL ID Q9HEWO Candida albicans AC Q9HEW0 LEVURE SWISSPROT ID KAPA~YEAST Saccharomyces cerevisiae AC P06244 SWISSPROT ID KAPB~YEAST AC P06245 Aplysia californica SPTREMBL ID Q16958 AC Q16958 Dictyostelium discoidum SWISSPROT ID KAPC~DICDI AC P34099 Oryctolagus cuniculus GENPEPT Ca ID AF367428-1 AC AF367428 La forme Ca est exprimée de façon constitutive dans la plupart des cellules, alors que Css et Cy ne sont exprimées que dans certains types de tissus. Des travaux récents ont révélé l'existence de variants d'épissage pour les formes Ca humaine (Ca2), Cp bovine (Cp2) et C(3 murine (C[32, Ce3). Toutes les sous-unités catalytiques possèdent un noyau catalytique commun à toutes les protéines kinases. La majorité des sites fonctionnels nécessaires pour la catalyse sont situés dans ce noyau. On trouve dans la partie amino-terminale un site de liaison à l'ATP et dans la partie carboxyl-terminale un site de liaison peptidique. Toutes les sous-unités catalytiques exceptés les variants d'épissage possèdent à leur extrémité amino-terminale un site de myristoylation. Ce site de modification post-transductionnelle semble être impliqué dans la stabilisation de la structure secondaire de la sous-unité catalytique. Avantageusement, un système cellulaire selon l'invention est obtenu par transfection d'une cellule sensible au moyen de séquences d'ADN codant pour l'unité de translocation et l'unité marquée selon l'invention. Toutefois, en variante, rien n'empêche d'obtenir un tel système en micro-injectant lesdites unités directement dans au moins une cellule sensible. L'invention s'étend ainsi à un procédé d'obtention d'une cellule sensible transfectée exprimant au moins une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, - ladite protéine recombinée étant, en l'absence de synthèse induite d'AMPc, dans un premier état, dit état complexé, où il forme un complexe, dit complexe RC, comprenant au moins une unité R comportant au moins un site de liaison de l'AMPc, et au moins une unité C, distincte d'une unité R, - ladite protéine recombinée étant, en présence de synthèse induite d'AMPc, dans un deuxième état, dit état dissocié, où les unités R et C sont dissociées et où R fixe l'AMPc, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - transfecter une cellule sensible avec un vecteur dit premier vecteur, contenant une cassette d'expression comprenant une séquence nucléique codant pour l'une des unités, dite unité de translocation, dont la séquence protéique comprend un motif d'adressage membranaire adapté pour induire une translocation membranaire d'au moins une partie de ladite unité et pour préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former à la membrane un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, - transfecter ladite cellule avec un vecteur, dit deuxième vecteur, contenant une cassette d'expression codant pour une autre unité, dite unité marquée, distincte d'une unité de translocation, et dont la séquence protéique présente un groupement, dit groupement de détection, adapté pour : # préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, et ' permettre la détection de l'état de la protéine recombinée à l'aide d'un signal de détection qui, à la membrane, est sensiblement différent selon l'absence ou la présence de synthèse induite d'AMPc. Les méthodes permettant l'expression d'un transgène dans une cellule hôte sont aujourd'hui très variées et bien connues en soi (Sambrook J., Fritsch E. F. et Maniatis T. - Molecular Cloning - Cold Spring Harbor Laboratory Press - 1989). De manière schématique, selon l' invention, chaque séquence nucléique, codant pour l'unité R ou pour l'unité C, est insérée dans une construction nucléique appelée cassette d'expression, dans laquelle ladite séquence nucléique est liée de manière opérante à des éléments permettant son expression-notamment sa régulation-. Parmi ces éléments, on peut citer notamment les promoteurs, les activateurs et les terminateurs de transcription. De nombreuses séquences d'expression-notamment de régulation- sont actuellement connues. Leur choix sera notamment apprécié selon le niveau d'expression souhaité du transgène, et la nature de la cellule à transfecter. La cassette d'expression est insérée dans un vecteur nucléotidique, tel qu'un plasmide, qui peut en outre comprendre un gène marqueur permettant de sélectionner une cellule transfectée d'une cellule qui ne contient pas l'ADN étranger transfecté. Les vecteurs ainsi construits sont utilisables pour la transfection, ou plutôt la co-transfection de cellules hôtes, selon toute technique également connue en elle-même. On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gène par micro-injection, infiltration sous vide, électroporation, choc thermique, bombardement par canon à particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt. On peut citer aussi des méthodes de transfert indirect, dans lesquelles les premier et deuxième vecteurs sont transférés, préférentiellement séparément dans des parasites cellulaires tels que bactéries et virus susceptibles d'infecter les cellules hôtes en permettant l'intégration de l'ADN étranger dans le génome de ces dernières. L'invention s'étend également en tant que produit nouveau à une protéine recombinée de séquence protéique SEQ ID N 5 ; ladite protéine recombinée étant susceptible d'être exprimée au niveau de la membrane plasmique d'une cellule, de fixer l'AMPc, de se lier à une sous-unité catalytique de la PKA lorsqu'elle ne fixe pas d'AMPc et de se dissocier de ladite sous-unité catalytique lorsqu'elle fixe l'AMPc. Avantageusement et selon l'invention, une telle protéine recombinée comprend la séquence protéique SEQ ID N 5 ou la séquence protéique SEQ ID N 5 clivée de ces résidus V-L-S carboxyl-terminaux. Une telle protéine peut être codée, de manière non limitative compte tenu de la dégénérescence du code génétique, par une séquence nucléique comprenant la séquence SEQ ID N 6. L'invention s'étend enfin à une séquence nucléique SEQ ID N 6 codant pour une protéine recombinée selon l'invention. L'invention concerne aussi un procédé de sélection d'agents bio-actifs, un système cellulaire, un procédé d'obtention d'une cellule sensible exprimant une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, une protéine recombinée et une séquence nucléique codant pour cette dernière, caractérisés, en combinaison, par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus ou ci-après. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles : - la figure 1 représente la carte de restriction du vecteur d'expression petl ld/RIIa contenant une séquence codant pour l'isoforme RII[alpha] de souris, - la figure 2 représente la carte de restriction du vecteur d'expression petlld/RIIa-CAAX contenant une séquence codant pour la protéine de fusion RIIa-CAAX, - la figure 3 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pcDNA3.1, - la figure 4 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pcDNA3.1/RIIa permettant l'expression de l'isoforme RII[alpha], - la figure 5 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pcDNA3.1/RII[alpha]-CAAX permettant l'expression de la protéine de fusion RIIa-CAAX, - la figure 6 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pCMV-PKA contenant une séquence codant pour une sous-unité catalytique de la PKA (isoforme Ca), - la figure 7 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pcDNA3.1/NTGFP-K, - la figure 8 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pcDNA3.1/GFP-Ca permettant l'expression de la protéine de fusion GFP-Ca, - les figures 9a, 9b, 9c, 1 la, llb, 11c, 11d, 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f, 14a et 14b sont des vues photographiques en microscopie de fluorescence de cellules HEK 293 transfectées. - les figures 10a, lOb, 11e, 13a et 13b sont des vues photographiques de membrane de nitrocellulose résultant de la détection protéique par Western Blotting, - les figures 13a' et 13b' sont des représentations graphiques de l'intensité des détections protéiques obtenues par Western Blotting. EXEMPLE 1 : . Construction des vecteurs d'expression pcDNA3.1/RIIa (figure 4) et pcDNA3.1/RIIa-CAAX (figure 5) : Le fragment de restriction SmaI-EcoRI codant pour les deux derniers acides aminés de la protéine RII[alpha] et la séquence d'adressage à la membrane plasmique a été construit par hybridation de deux oligonuléotides sens et anti-sens (synthétisés et commercialisés par la société MWG BIOTECH France). Ce fragment de restriction a été ensuite cloné dans le vecteur petlld/RIIa (Yuhan Wang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,2446- 2450) ouvert par digestion par les enzymes de restriction Smal et EcoRI pour donner le vecteur d'expression pet11d/RII[alpha]-CAAX. Les fragments de restriction NcoI-EcoRI contenant les séquences codant pour les protéines RII[alpha] et RIIa-CAAX sont obtenus respectivement à partir des vecteurs d'expression petlld/RIIa (figure 1) et petl ld/RIIa-CAAX (figure 2) par digestion par l'enzyme de restriction NcoI et traitement par l' enzyme de modification (fragment klenow de la polymérase I), suivi d'une digestion par l'enzyme de restriction EcoRI. Ces fragments sont ensuite sous-clonés dans le vecteur pcDNA3. 1 (figure 3) (commercialisé sous la référence V790-20 par la société INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, France) préalablement digéré par l'enzyme de restriction BamHI et traité par l'enzyme de modification (fragment klenow de la polymérase I), suivi d'une digestion par l'enzyme de restriction EcoRI pour donner les vecteurs d'expression pcDNA3.1/RIIa (figure 4) et pcDNA3.1/RIIa-CAAX (figure 5). . Construction du vecteur d'expression pcDNA3.1/GFP-Ca (figure 8) : Le fragment de restriction XhoI-HindIII correspondant au cadre de lecture de la sous-unité catalytique de la PKA est obtenu par digestion par les enzymes de restriction XhoI et HindIII et par traitement par l'enzyme de modification (fragment klenow de la polymérase I), à partir du vecteur d'expression pCMV-PKA (figure 6) (commercialisé sous la référence K6005-1 par la société CLONTECH LABORATORIES Inc., France). Ce fragment est ensuite sous-cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3.1/NTGFP-K (figure 7) ouvert par digestion par l'enzyme de restriction EcoRV pour donner le vecteur d'expression pcDNA3.1/GFP-Ca (figure 8). Le vecteur pcDNA3.1/NTGFP-K correspond au vecteur pcDNA3.1/NT-GFP (commercialisé par la société INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, France, sous la référence K4810-01), dans lequel a été substitué le site multiple de clonage. EXEMPLE 2 : Obtention d'une cellule vivante exprimant les protéines codées par les constructions de l'exemple 1. . Culture cellulaire et transfection : La lignée cellulaire HEK 293 ( Human Embryonic Kidney 293) a été établie à partir de cellules primaires embryonnaires de rein humain transformées par l'adénovirus de type 5. Ce sont des cellules adhérentes de type fibroblastique. Les HEK 293 sont maintenues en culture dans un milieu complet : le DMEM NUT MIX F12 (commercialisé sous la référence 31 331-028 par la société INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, France) complémenté avec 10% de sérum de veau f#tal (SVF), de la L-glutamine (2 mM), de la pénicilline (100 UI/ml) et de la streptomycine (100 g/ml). Les cellules HEK 293 cultivées à 80% de confluence sont transfectées avec les différentes constructions décrites ci-dessus en utilisant la Polyfect (QIAGEN, France, Réf 301107). L'ADN plasmidique est dilué dans du milieu DMEM NUT MIX F 12 non complémenté. Après avoir additionné la Polyfect, ce mélange ADN/milieu/Polyfect est incubé 10 minutes à température ambiante. La proportion des différents agents en fonction de la surface des boites de culture est présentée au Tableau 3. Pendant ce temps d'incubation, le milieu de culture des cellules ensemencées la veille est remplacé par du milieu complet. Après les 10 minutes d'incubation, du milieu complet est ajouté au mélange ADN/milieu/Polyfect. Ce mélange de transfection est alors ajouté sur les cellules et homogénéisé. Les cellules sont incubées 24 heures à 37 C en présence de 5% de CO2. TABLEAU 3 Volume de Type de Surface Volume de Volume Volume de milieu boite de des DNA milieu non Polyfect milieu complet à culture boites ( g) complémenté ((il) complet à ajouter au (cm2) (en (il) ajouter aux mélange cellules (ml) ADN/Polyfect (ml) P35 10 2 100 20 1,5 0,6 Plaque 6 puits P60 20 4 150 40 3,0 1 P100 60 8 300 80 7,0 1 . Vérification de l'expression des protéines RII[alpha], RII[alpha]- CAAX et GFP-Ca : L'expression des protéines RII[alpha], RIIa-CAAX et GFP-Ca est vérifiée dans le système cellulaire HEK 293 par des techniques d'épifluorescence et de Western Blotting. - Epifluorescence : Les cellules HEK 293 cultivées sur lamelles dans des boites de 10 cm2 sont transfectées par le pcDNA3.1/RIIa, le pcDNA3.1/RIIa-CAAX ou lepcDNA3.1/GFP-Ca. Après 24 heures, les cellules transfectées avec le pcDNA3.1/RIIa ou le pcDNA3.1/RIIa-CAAX sont fixées 20 minutes à 4 C par la paraformaldéhyde 4%, puis perméabilisées par le méthanol 10 minutes à -20 C et par le triton X100 0,5% (commercialisé par la société EUROMEDEX, France) 5 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite incubées 1 heure à température ambiante avec l'anticorps polyclonal anti-RIIa de lapin (commercialisé pr la société TEBU, FRANCE sous la référence PKA2areg(M- 20):SC-909) à une dilution de 1/1000 dans du PBS ( Phosphate Buffer Saline , commercialisé par la société EUROMEDEX, France) complémenté avec 1% de SVF, puis incubées 45 minutes à température ambiante avec un anticorps couplé à une molécule fluorochrome et dirigé contre des Immunoglobulines G (IgG) de lapin à une dilution de 1/200 dans du PBS complémenté par 1% de SVF. Après 24 heures, les cellules transfectées par le pcDNA3.1/GFP-Ca sont fixées par la paraformaldéhyde 4%. Les cellules sont ensuite observées au moyen d'un microscope à fluorescence droit Axioplan équipé d'un objectif à immersion Gx40 et d'une caméra CCD. La longueur d'onde d'excitation est de 400 nm, la fluorescence est observée à 510 nm. Les cellules transfectées par le pcDNA3.1/RIIa-CAAX présentent un marquage membranaire (figure 9a) alors que le marquage observé sur les cellules transfectées avec le pcDNA3.1/RIIa, dépourvu de la séquence d'adressage à la membrane plasmique, reste exclusivement cytoplasmique (figure 9b). Les cellules transfectées par le pcDNA3.1/GFP-Ca montrent une fluorescence cytoplasmique et nucléaire (Figure 9c). - Western Blotting (WB) : Des cellules HEK 293 cultivées dans des boites de culture de 60 cm2 sont transfectées par le pcDNA3.1/RIIa, le pcDNA3.1/RIIa-CAAX ou le pcDNA3.1/GFP-Ca. 24 heures après, les cellules sont lavées deux fois avec 10 ml de PBS, puis reprises à 4 C dans un tampon de lyse complémenté en inhibiteurs de protéases et de phosphatases, dit LB+, contenant 50 mM Tris HCl pH 7,4 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES), 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0,5% triton X100, 0,28 mM CHF02S, 1 mM NaV04, 10 g/ml leupeptine, 10 g/ml aprotinine (EUROMEDEX, France). Après une centrifugation (5 minutes à 17 800 g), la concentration en protéines du surnageant est estimée par la méthode de Bradford (selon le protocole proposé par la société BIO-RAD LABORATORIES, France) en référence à une courbe étalon de BSA ( Bovine Sérum Albumin ), décrite par la société ROCHE DIAGNOSTICS CORP, France. Les extraits protéiques totaux (100 g), repris dans du LSB 1X (Laemmi Sample Buffer, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ème édition, volume 3,1989), sont dénaturés 5 minutes à 95 C. Les échantillons sont déposés sur gel SDS-PAGE ( Sodium dodecyl sulfate, polyacrylamide gel electrophoresis ) à 8% d'acrylamide. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose, saturée par incubation à 4 C, toute la nuit, dans une solution de TBST (Tris Buffer Saline complémenté par 0,25% de Tween, commercialisé par la société EUROMEDEX, France) contenant 5% de lait (Régilait, France). Les membranes sont ensuite lavées 3 fois 5 minutes dans du TBST, puis incubées 2 heures à température ambiante avec les anticorps primaires (anticorps anti-RIIa, dilution 1/500 ou anticorps polyclonal anti-GFP, dilution 1/400). Après 3 lavages de 5 minutes dans du TBST, les membranes sont incubées 45 minutes avec l'anticorps secondaire (anticorps anti-IgG de lapin couplé à la péroxydase du raifort, dilution 1/5000). L'hydrolyse de substrats par la péroxydase s'accompagne de la formation de composés luminescents détectables sur films photographiques selon le protocole ECLTM de la société AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, France. On observe une bande de 51 kDa reconnue par l' anticorps anti-RIIa dans les extraits protéiques obtenus à partir des cellules transfectées par le pcDNA3.1/RIIa ou le pcDNA3.1/RIIa-CAAX (figure 10a). Cette bande qui peut correspondre à RII[alpha] ou RIIa-CAAX n'est pas détectée dans les extraits protéiques de cellules non transfectées (NT). De plus dans le cas de RIIa-CAAX, on détecte un retard de mobilité électrophorétique pouvant témoigner de la présence de la séquence d'adressage à la membrane plasmique (figure 10a). L'anticorps anti-RIIa reconnaît également une protéine de poids moléculaire apparent de 49 kDa dans les extraits protéiques de cellules transfectées ou non. Ceci peut s'expliquer par la présence dans les extraits de la sous-unité régulatrice RII[alpha] endogène (figure 10a). On observe une bande de 60 kDa qui est reconnue par l'anticorps dirigé contre la GFP dans les extraits protéiques de cellules transfectées avec le vecteur pcDNA3.1/GFP-Ca. Cette bande qui correspond à GFP-Ca est absente dans les extraits protéiques obtenus à partir de cellules non transfectées (figure 10b). . Co-localisation RIIa-CAAX et GFP-Ca : Des expériences de co-localisation ont été réalisées afin d'apporter des arguments sur la formation d'un complexe protéique entre les sous-unités régulatrice et catalytique de la PKA à la membrane plasmique. Des cellules sont cotransfectées avec le pcDNA3.1/RIIa et le pcDNA3.1/GFP-Ca ou avec le pcDNA3.1/RIIa-CAAX et le pcDNA3.1/GFPCa et observées au moyen d'un microscope à fluorescence droit. Les résultats sont présentés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Immunofluorescence indirecte Observation GFP-Ca Vecteurs transfectés avec l'anticorps Filtre FITC ou Anti -RIIa (1/1000) Filtre Ex:400nm Em:510nm Observation filtre Rhodamine pcDNA3.1/RIIa+ Marquage exclusivement Marquage exclusivement pcDNA3.1/GFP-Ca cytoplasmique cytoplasmique Co-localisation avec GFP-Ca Co-localisation avec RII[alpha] pcDNA3.1/RII3035-CAAX Marquage membranaire. Marquage membranaire. + pcDNA3.1/GFP-Ca Co-localisation avec GFP-Ca Co-localisation avec RIIa-CAAX Les protéines RII[alpha], RIIa-CAAX, détectées avec l' anticorps dirigé contre RII[alpha], co-localisent bien avec la GFP-Ca (figures 1 la, llb, 11c et 1 ld). La localisation forcée à la membrane plasmique de la protéine RIIa-CAAX entraîne donc la relocalisation de la GFP-Ca au niveau de la membrane plasmique, cette relocalisation n'étant pas observée dans le cas où les cellules sont cotranfectées avec la RII[alpha] dépourvue de la séquence d'adressage à la membrane plasmique. . Interaction RIIa-CAAX /GFP-Ca : Afin de confirmer l'interaction entre les protéines RIIaCAAX et GFP-Ca, des expériences d'immunoprécipitation (IP) sont réalisées. Pour cela des extraits protéiques totaux sont préparés à partir de cellules HEK 293 transfectées avec le pcDNA3.1/RIIa, le pcDNA3.1/RIIa-CAAX ou le pcDNA3.1/GFP-Ca, ou à partir de cellules HEK 293 cotransfectées avec le pcDNA3.1/RIIa et le pcDNA3.1/GFP-Ca ou le pcDNA3.1/RII[alpha]-CAAX et le pcDNA3.1/GFP-Ca. 1 mg d'extrait protéique est ensuite incubé dans 1 ml de LB+ en présence de 20 l de billes A/G-Agarose couplées de façon covalente à l'anticorps monoclonal de souris dirigé contre la protéine GFP (ROCHE DIAGNOSTICS Corp, France, réf. 1814460) pendant 3 heures à 4 C sous agitation. Après trois lavages par 1 ml de LB+, les échantillons sont repris dans 50 l de LSB IX et déposés sur gel SDS-PAGE à 8% d'acrylamide et soumis à un Western blotting (WB) anti-RIIa. Après immunoprécipitation avec l'anticorps dirigé contre la GFP, l'anticorps anti-RIIa reconnaît un bande de 51kDa dans les extraits protéiques obtenus à partir des cellules exprimant les protéines RII[alpha] et GFP-Ca ou à partir des cellules exprimant les protéines RIIa-CAAX et GFP-Ca (figure 1 le). Cette bande de 51 kDa qui peut correspondre à RIIa ou RIIa-CAAX est absente dans les extraits protéiques de cellules non transfectées ou de cellules exprimant uniquement l'une des protéines (RIIa, RIIa-CAAX ou GFP-Ca). Les protéines RIIa et RIIa-CAAX sont donc capables d'interagir avec la protéine GFP-Ca. Cependant cette expérience ne nous permet pas de déterminer si cette interaction est directe ou indirecte. Connaissant la structure de la PKA, il est tout à fait légitime de penser que cette interaction est directe. L'ajout de la séquence d'adressage à la membrane plasmique à la sousunité régulatrice RIIa et la fusion de la GFP à la sous-unité catalytique Ca ne semble donc en aucun cas perturber la formation d'un complexe protéique entre la sous-unité régulatrice et les sous-unités catalytiques. EXEMPLE 3: Effet d'agents activant la voie de transduction de l'AMPc/PKA. . Observation de l'activation de la voie AMPc/PKA sur des cellules HEK 293 fixées exprimant les protéines RIIa-CAAX et GFP-Ca : Les résultats précédents montrent que les protéines RIIaCAAX et GFP-Ca sont capables de s'associer pour former une PKA localisée à la membrane plasmique. Afin de déterminer si cette PKA est fonctionnelle, des expériences d'induction de la voie AMPc/PKA sont réalisées en traitant les cellules par la forskoline et la toxine du choléra. La forskoline agit directement sur l'adenylyl cyclase et entraîne son activation. La toxine du choléra catalyse l'ADP-ribosylation de la protéine Gs et conduit à son activation constitutive. Dans les deux cas le traitement conduit à l'augmentation du taux de synthèse de l'AMPc et par conséquent à l'augmentation du taux intracellulaire de l'AMPc. L'AMPc se lie sur les sous-unités régulatrices et entraîne de façon concomitante la dissociation des protéines GFP-Ca et leur libération dans le cytoplasme, évènements pouvant être suivis respectivement par détection en Western blotting de la sous-unité RIIa-CAAX après immunoprécipitation avec l'anticorps antiGFP et par observation au microscope à fluorescence. Les cellules HEK 293 sont cotransfectées avec les plasmides pcDNA3.1/RIIa-CAAX et pcDNA3.1/GFP-Ca. Après 24 heures d'incubation, le milieu de transfection est aspiré et remplacé par du DMEM NUT MIX F 12 non complémenté contenant de la forskoline à une concentration finale de 10 M ou de la toxine du choléra à 1 g/ml. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C en présence de 5% de CO2 pendant des temps variables. Après 2 lavages au PBS les cellules sont soit fixées par la paraformaldéhyde 4% puis observées au moyen d'un microscope à fluorescence, soit lysées pour obtenir des extraits protéiques afin de réaliser une immunoprécipitation avec l'anticorps anti-GFP suivi d'un Western blotting avec l'anticorps dirigé contre la protéine RII[alpha]. Le rapport RIIa-CAAX/GFP-Ca est ensuite calculé en rapportant la quantité de protéines RIIa-CAAX détectées avec l'anticorps anti-RIIa après immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal anti-GFP à la quantité de protéines GFP-Ca immunoprécipitées dans l'extrait protéique total (détecté avec un anticorps polyclonal anti-GFP). Les cellules exprimant RIIa-CAAX et GFP-Ca traitées à la forskoline (figure 12a) pendant 15 minutes ou à la toxine du choléra (figure 12c) pendant 1 heure présentent un marquage cytoplasmique alors que les cellules non traitées présentent un marquage membranaire (figure 12b et 12d). Par ailleurs, le rapport RIIa-CAAX/GFP-Ca met en évidence une réduction d'un facteur 3,5 de la quantité de protéines RIIa-CAAX qui co-immunoprécipitent avec les protéines GFP-Ca pour les cellules traitées à la forskoline pendant 15 minutes (figure 13a et 13a') par rapport aux cellules non traitées (NT). De la même façon, une réduction d'un facteur 2,5 de la quantité de protéines RIIa-CAAX qui coimmunoprécipitent avec les protéines GFP-Ca est observée pour les cellules traitées avec la toxine du choléra pendant 1 heure (figures 13b et 13b') par rapport aux cellules non traitées. Cette diminution du rapport RIIa-CAAX/GFP- Ca reflète la dissociation des sous-unités RIIa-CAAX et GFP-Ca en réponse à une augmentation du taux intracellulaire d'AMPc. L'augmentation du taux intracellulaire d'AMPc induite par les traitements à la forskoline ou à la toxine du choléra entraîne l'activation de la PKA localisée de manière constitutive à la membrane et par conséquent la dissociation et la libération dans le cytoplasme des sous-unités catalytiques fusionnées à la GFP. . Observation de l'activation de la voie de l'AMPc/PKA dans des cellules HEK 293 en culture exprimant les protéines RIIa-CAAX et GFP-Ca : - Transfection : Pour cette expérience, les cellules HEK 293 sont cotransfectées avec les vecteurs d'expression pcDNA3.1/RII[alpha]-CAAX et pcDNA3.1/GFP-Ca en utilisant la lipofectAMINE 2000 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, réf :11668-019). 7,5 g de pcDNA3.1/RIIa-CAAX plus 7,5 g de pcDNA3.1/GFP-Ca sont dilués dans 455 l de DMEM NUT MIX F12 non complémenté. Après avoir additionné 30 l de solution R+ (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES) ce mélange ADN/milieu/ R+ est incubé 15 minutes à température ambiante. Par ailleurs, on dilue 60 l de lipofectAMINE 2000 dans 440 l de DMEM NUT MIX F12 non complémenté. On transfère ensuite la solution de lipofectAMINE 2000 dans le mélange ADN/milieu/R+ et on incube ce mélange 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps d'incubation, les cellules cultivées dans des boites de culture de 60 cm2 sont lavées deux fois avec 3 ml de DMEM NUT MIX F12 non complémenté. Enfin, on ajoute le mélange de transfection (1 ml) sur les cellules, on homogénéise et on incube les cellules pendant 4 heures à 37 C en présence de 5% de C02. Les cellules sont alors décrochées dans le milieu de transfection par tapotement de la boite et transférées dans un tube à centrifuger de 15 ml. La suspension cellulaire est centrifugée pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de rotation de 409 g. Le surnageant est éliminé par aspiration et le culot de cellules est repris par 6 ml de DMEM NUT MIX F12 complémenté. On ajoute ensuite 1 ml de suspension cellulaire dans des boites de culture plastiques de 20 cm2 dans lesquelles ont été préalablement déposées des lamelles de 35 mm x 35mm recouverte d'un film fin de polyD-lysine (SIGMA, France) et contenant 3 ml de DMEM NUT MIX F12 complémenté. Les cellules sont incubées 20 heures à 37 C en présence de 5% de CO2. Le milieu de culture est aspiré, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS et pré-équilibrées dans le tampon Krebs Ringer, KRH (5mM KCL, 1,25 mM MgS04, 125 mM NaCl, 25 mM Hepes pH 7,4,8mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 0,1% BSA), 15 minutes à 37 C en présence de 5% de CO2. - Mise en place de la chambre de Rose : La lamelle supportant les cellules est placée dans une chambre de Rose (Rose G. 1954, Tex. Rep. Biol. Med., 12,1074-1083, remplie de tampon KRH et permettant l'observation microscopique sur plusieurs heures de cellules vivantes en culture ainsi que le renouvellement du milieu de culture. A ce stade de l'expérience une première observation au microscope à fluorescence est effectuée. On observe des cellules HEK 293 présentant une fluorescence intense de type membranaire en accord avec les observations réalisées sur cellules fixées (figure 14a). - Induction de la voie AMPc/PKA par la forskoline : Le milieu est remplacé par du KRH contenant de la forskoline à une concentration finale de 10 M et les cellules sont à nouveau observées au microscope à fluorescence avec les filtres permettant de visualiser la GFP (Excitation 400 nm, Emission 510 nm). La plupart des cellules qui expriment les protéines RII[alpha]- CAAX et GFP-Ca présentent un marquage exclusivement cytoplasmique (figure 14b). A la différence des expériences réalisées sur des cellules fixées, l'effet de la forskoline est observable à 2 minutes de traitement. EXEMPLE 4 : Effet d'agent (l'isoprotérénol) activant une cible thérapeutique (le récepteur ss2 adrénergique) connue pour moduler la voie de transduction de l'AMPc/PKA. Des cellules HEK 293 exprimant naturellement le récepteur ss2 adrénergique (Schmitt J.M. et Stork P. J.S., 2000 - Journal of Biological Chemistry, 275,25342-25350), un récepteur couplé aux protéines G, sont cotransfectées avec les plasmides pcDNA3.1/RIIa-CAAX et pcDNA3.1/GFPCa. Après 24 heures d'incubation, le milieu de transfection est aspiré et remplacé par du DMEM NUT MIX F12 contenant de l'isoprotérénol, un agoniste du récepteur ss2 adrénergique, à une concentration finale de 10-8 M. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C en présence de 5% de CO2 pendant des temps variables. Après 2 lavages au PBS les cellules sont fixées par la paraformaldéhyde 4% puis observées au moyen d'un microscope à fluorescence. Les cellules exprimant RIIa-CAAX et GFP-Ca, traitées à l'isoprotérénol pendant 2 minutes présentent un marquage cytoplasmique (figure 12e) alors que les cellules non traitées (NT) présentent un marquage membranaire (figure 12f). Cette expérience montre que l'invention permet de cribler des agents biologiquement actifs sur une cible thérapeutique donnée. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de sélection d'agents, dits agents à tester, susceptibles d'être biologiquement actifs vis-à-vis d'un système cellulaire vivant en induisant ou en inhibant une synthèse intracellulaire d'AMPc lorsqu'ils sont en présence d'au moins une cellule sensible d'un système cellulaire vivant, dans lequel : - on prépare un système cellulaire comprenant au moins une cellule vivante sensible exprimant au moins une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, ' ladite protéine recombinée étant, en l'absence de synthèse induite d'AMPc, dans un premier état, dit état complexé, où elle forme un complexe, dit complexe RC, comprenant au moins une unité R comportant au moins un site de liaison de l'AMPc, et au moins une unité C, distincte d'une unité R, # ladite protéine recombinée étant, en présence de synthèse induite d'AMPc, dans un deuxième état, dit état dissocié, où les unités R et C sont dissociées et où au moins une unité R fixe l'AMPc, - on met en présence ledit système cellulaire avec une quantité d'au moins un agent à tester, - on détecte l'état, complexé ou dissocié, de ladite protéine recombinée, caractérisé en ce que : - au moins l'une des unités, dite unité de translocation, présente une séquence protéique comprenant un motif d'adressage membranaire présentant un motif de modification post-traductionnelle CAAX adapté pour induire une translocation membranaire d'au moins une partie de ladite unité et pour préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former à la membrane un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, - au moins une autre unité, dite unité marquée, distincte d'une unité de translocation, présente un groupement, dit groupement de détection, adapté pour : . préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, et ' permettre la détection de l'état de la protéine à l'aide d'un signal de détection qui, à la membrane, est différent selon l'absence ou la présence de synthèse induite d'AMPc. 2/ - Procédé de sélection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le motif d'adressage membranaire de l'unité de translocation provient de l'extrémité C-terminale d'une protéine de type Ras. 3/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le motif d'adressage comprend au moins une partie d'une séquence d'amino-acides choisie parmi : SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4. 4/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupement de détection de l'unité marquée est un groupement luminophore choisi parmi : - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle ou mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, la cyanine, le Nile Red@, Texas Red@, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyamines, le diphénylhexatriène les dérivés aromatiques luminescents. 5/ - Procédé de sélection selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'unité de translocation est l'unité R et l'unité marquée est l'unité C. 6/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'état, complexé ou dissocié, de la protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA se fait par la détection, respectivement, d'une émission ou d'une extinction lumineuse du couplage de luminescence entre deux groupements luminescents complémentaires, en exploitant le principe de FRET ou BRET. 7/ - Procédé de sélection selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on introduit dans le système cellulaire, une composition d'au moins un composé, dit agent membranaire de couplage, apte à s'associer à la membrane plasmique de cellule sensible et marqué avec au moins un groupement photocomplémentaire, dit deuxième luminophore, distinct du groupement luminescent porté par l'unité marquée, dit premier luminophore complémentaire du deuxième luminophore, et de telle sorte que les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire soient au moins sensiblement préservées, et qu'au moins une propriété mesurable de l'émission lumineuse entre le premier et le deuxième luminophores soit sensiblement modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état. 8/ - Procédé de sélection selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée, adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle-notamment de type luciférase- ou une protéine bioluminescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, le Nile Red#, le Texas Red#, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. 9/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire. 10/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile choisi parmi les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les dérivés lipophiles de ces composés. 11/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA est une PKA recombinée ; les unités R et C correspondent respectivement aux sous-unités régulatrice et catalytique de la PKA recombinée. 12/ - Procédé de sélection selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'unité de translocation est une sous-unité régulatrice recombinée issue de la fusion par voie génétique : - d'au moins une partie de la séquence protéique d'une sous-unité régulatrice choisie parmi les isoformes : RIa, RIss, RII[alpha], RIIss. - et d'une séquence d'adressage membranaire. 13/ - Procédé de sélection selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'unité de translocation a pour séquence protéique SEQ ID N 5. 14/ - Procédé de sélection selon les revendications 12 ou 14, caractérisé en ce que l'unité de translocation est codée par la séquence nucléique SEQ ID N 6. 15/ - Procédé de sélection selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que l'unité marquée est une séquence protéique comprenant au moins une partie de la séquence d'une sous-unité catalytique choisie parmi les isoformes : Ca, Css et Cy, marquée par un groupement de détection. 16/ - Système cellulaire vivant à l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain ou d'un élément non isolé du corps humain, contenant au moins une cellule vivante exprimant au moins une protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA, - ladite protéine recombinée étant, en l'absence de synthèse induite d'AMPc, dans un premier état, dit état complexé, où elle forme un complexe, dit complexe RC, comprenant au moins une unité R comportant au moins un site de liaison de l'AMPc, et au moins une unité C, distincte d'une unité R, - ladite protéine recombinée étant, en présence de synthèse induite d'AMPc, dans un deuxième état, dit état dissocié, où les unités R et C sont dissociées et où au moins une unité R fixe l'AMPc, caractérisé en ce que : - au moins l'une des unités, dite unité de translocation, présente une séquence protéique comprenant un motif d'adressage membranaire présentant un motif de modification post-traductionnelle CAAX adapté pour induire une translocation membranaire d'au moins une partie de ladite unité et pour préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former à la membrane un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, - au moins une autre unité, dite unité marquée, distincte d'une unité de translocation, présente un groupement, dit groupement de détection, adapté pour : préserver l'aptitude de la protéine recombinée à former un complexe RC en l'absence de synthèse induite d'AMPc, et à se dissocier en présence de synthèse induite d'AMPc, et # permettre la détection de l'état de la protéine à l'aide d'un signal de détection qui, à la membrane, est différent selon l'absence ou la présence de synthèse induite d'AMPc. 17/ - Système cellulaire selon la revendication 16, caractérisé en ce que le motif d'adressage membranaire de l'unité de translocation provient de l'extrémité C-terminale d'une protéine de type Ras. 18/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le motif d'adressage comprend au moins une partie d'une séquence d'amino-acides choisie parmi : SEQ ID N l, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4. 19/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que le groupement de détection de l'unité marquée est un groupement luminophore choisi parmi : - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée, adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle-notamment de type luciférase- ou une protéine bioluminescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, la cyanine, le Nile Red@, Texas Red@, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyamines, le diphénylhexatriène les dérivés aromatiques luminescents. 20/ - Système cellulaire selon les revendications 16 à 19, caractérisé en ce que l'unité de translocation est l'unité R et l'unité marquée est l'unité C. 21/ - Système de sélection selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisé en ce que l'état, complexé ou dissocié, de la protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA se fait par la détection, respectivement, d'une émission ou d'une extinction lumineuse du couplage de luminescence entre deux groupements luminescents complémentaires, en exploitant le principe de FRET ou BRET. 22/ - Système cellulaire selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé, dit agent membranaire de couplage, associé à la membrane plasmique et marqué avec au moins un groupement photocomplémentaire, dit deuxième luminophore, distinct du groupement luminescent porté par l'unité marquée, dit premier luminophore complémentaire du deuxième luminophore, et de telle sorte que les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire soient au moins sensiblement préservées, et qu'au moins une propriété mesurable de l'émission lumineuse entre le premier et le deuxième luminophores soit sensiblement modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état. 23/ - Système cellulaire selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée, adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - une protéine bioluminescente naturelle ou une protéine bioluminescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine naturelle, cette protéine bioluminescente mutée conservant la propriété de bioluminescence, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy, le Nile Red, le Texas Red, les chélates de terres rares, les indo- et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. 24/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire. 25/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile choisi parmi les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les dérivés lipophiles de ces composés. 26/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 16 à 25, caractérisé en ce que ladite protéine recombinée multimérique spécifique de la voie de transduction AMPc/PKA est une PKA recombinée ; les unités R et C correspondent respectivement aux sous-unités régulatrice et catalytique de la PKA recombinée. 27/ - Système cellulaire selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'unité de translocation est une sous-unité régulatrice recombinée issue de la fusion par voie génétique : - d'au moins une partie de la séquence protéique d'une sous-unité régulatrice choisie parmi les isoformes : RIa, RIss RII[alpha] et RIIss, - et d'une séquence d'adressage membranaire. 28/ - Système cellulaire selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'unité de translocation à pour séquence protéique SEQ ID N 5. 29/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que l'unité de translocation est codée par la séquence nucléique SEQ ID N 6. 30/ - Système cellulaire selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que l'unité marquée est une séquence protéique comprenant au moins une partie de la séquence d'une sous-unité catalytique choisie parmi les isoformes : Ca, Cp et Cy, marquée d'un groupement de détection.