FR 2865132 A1 20050722 FR 0451460 A 20040706 L'invention concerne l'utilisation de la diosmétine pour brunir la peau et lui conférer un teint bronzé, en vue de lui donner bonne mine, ou à des fins thérapeutiques, pour repigmenter la peau dépigmentée par exemple par Malassezia furfur, ou pour pigmenter les cheveux, en particulier dans le traitement et la prévention de la canitie. La couleur des cheveux et de la peau humaine est fonction de différents facteurs et notamment des saisons de l'année, de l'origine ethnique, du sexe et de l'âge. Elle est principalement déterminée par la concentration dans les kératinocytes de la mélanine produite par les mélanocytes. Les mélanocytes sont les cellules spécialisées qui, par l'intermédiaire d'organelles particuliers, les mélanosomes, synthétisent la mélanine. La synthèse de la mélanine ou mélanogénèse est particulièrement complexe et fait intervenir schématiquement les principales étapes suivantes: Tyrosine ---> Dopa ---> Dopaquinone ---> Dopachrome ---> Mélanine. La tyrosinase (monophénol dihydroxyl phénylalanine: oxygen oxydoreductase/EC 1,14,18,1) est l'enzyme essentielle intervenant dans cette suite de réactions. Elle catalyse notamment la réaction de transformation de la tyrosine en Dopa (dihydroxyphénylalanine) et la réaction de transformation de la Dopa en Dopaquinone. Dans l'épiderme, le mélanocyte est impliqué dans l'unité mélanique épidermique qui comporte un mélanocyte entouré d'environ 36 kératinocytes voisins. Tous les individus, sans distinction de phototype, ont approximativement le même nombre de mélanocytes pour une zone cutanée donnée. Les différences ethniques, en terme de pigmentation, ne sont pas dues au nombre de mélanocytes, mais aux propriétés de leurs mélanosomes. Les mélanosomes sont agrégés en complexes et sont de petites tailles. Ce sont des organelles hautement spécialisées dont l'unique fonction est la production de mélanine. Ils naissent du réticulum endoplasmique sous formes de vacuoles sphériques appelées prémélanosomes. Les prémélanosomes contiennent un substrat protéinique amorphe, mais pas d'enzymes mélanogènes. Au cours de la maturation du prémélanosome, le substrat amorphe s'organise en une structure fibrillaire orientée dans l'axe longitudinal du mélanosome. On distingue quatre stades du développement du mélanosome correspondant à l'intensité de la mélanisation. La mélanine est déposée uniformément sur le réseau fibrillaire interne du mélanosome et l'opacité de l'organelle augmente jusqu'à saturation. Au fur et à mesure que la mélanine est synthétisée dans les mélanosomes, ceux-ci se déplacent de la région périnucléaire vers l'extrémité des dendrites des mélanocytes. Par phagocytose, l'extrémité des dendrites est capturée par les kératinocytes, les membranes dégradées et les mélanosomes redistribués dans les kératinocytes. La mélanine est ainsi répartie dans l'épiderme, assurant son brunissement et sa protection. La mélanine, pigment naturel reconnu pour ses propriétés anti-radicalaires et absorbantes des rayonnements solaires, est un agent protecteur physiologique de la peau. Bien que le taux de mélanine varie d'une population à une autre, la quantité de tyrosinase ne varie pas significativement et le taux d'ARN messagers de la tyrosinase est identique dans des peaux blanches ou noires. Les variations dans la mélanogénèse sont donc dues à des variations soit de l'activité de la tyrosinase soit de la capacité des kératinocytes à phagocyter les mélanosomes. Pour ce qui est de la couleur des cheveux et des poils, elle repose notamment sur la présence en quantités et ratios variables de deux groupes de mélanines: les eumélanines (pigments bruns à noirs) et les phéomélanines (pigments rouges à jaunes). La pigmentation du chëveu et des poils requiert la présence de mélanocytes au niveau du bulbe du follicule pileux. Le follicule pileux est une invagination tubulaire de l'épiderme qui s'enfonce jusqu'aux couches profondes du derme. La partie inférieure, ou bulbe pileux, comporte elle-même une invagination dans laquelle se trouve la papille dermique. La partie intérieure du bulbe est une zone de prolifération cellulaire où se trouvent les précurseurs des cellules kératinisées constituant le cheveu. Les cellules en ascension issues de ces précurseurs se kératinisent progressivement dans la partie supérieure du bulbe, et cet ensemble de cellules kératinisées formera la tige pilaire. Les mélanocytes au niveau du bulbe du follicule pileux sont dans un état actif, c'est-à-dire qu'ils synthétisent de la mélanine. Ces pigments sont transmis aux kératinocytes destinés à former la tige pilaire, ce qui conduira à la pousse d'un cheveu ou d'un poil pigmenté. Il est admis que la canitie (blanchiment naturel des cheveux) est associée à une diminution de mélanine dans la tige pilaire. On sait que, dans la plupart des populations, l'obtention d'une coloration brune de la peau et le maintien d'une coloration constante de la chevelure sont des aspirations importantes. Il existe par ailleurs des maladies de la pigmentation comme par exemple le vitiligo qui est une maladie auto-immune se caractérisant par l'apparition sur la peau de plaques blanches liées à un défaut de pigmentation ou encore le pityriasis versicolor dû à la levure Malassezia furfur (taches pouvant être achromiantes d'emblée ou après exposition au soleil). Il serait ainsi particulièrement intéressant de disposer de nouveaux moyens pour faciliter et/ou améliorer la pigmentation de la peau et/ou des poils et/ou des cheveux dans le domaine de la dermatologie et de la cosmétique. Ces nouveaux moyens seraient notamment utiles pour prévenir et/ou limiter et/ou stopper le développement de la canitie et même maintenir la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs. De nombreuses solutions ont été proposées dans le domaine de la coloration artificielle par apport de colorants exogènes, tels que la DHA et les colorants capillaires, censés donner à la peau, respectivement aux cheveux, une coloration la plus proche possible de ce qu'elle est naturellement ou, dans le domaine de la coloration naturelle, par stimulation des voies naturelles de pigmentation, par exemple en utilisant des actifs stimulant la mélanogénèse avec ou sans action des UV, comme l'a-MSH ou ses dérivés ou les prostaglandines. Des composés appartenant à la famille des flavonoïdes à l'image de l'apigénine ou présents dans un extrait de plante Argania Spinesa comme un glycoside de lutéoline ont également été respectivement décrits dans P 09-263534 et US 2004/0047832 comme favorisant la mélanogénèse. Toutefois, un grand nombre de dérivés de flavones, y compris l'apigénine et la lutéoline, ont été par ailleurs décrits dans DE 197 42 025 comme agissant contre la pigmentation indésirable, par exemple le lentigo sénile. La présente invention résulte de l'observation inattendue par les inventeurs de l'aptitude de la diosmétine à agir comme agent propigmentant. La diosmétine est un flavonoïde appartenant à la classe des flavones. Elle possède la structure suivante: OMe OH HO OH O Certains de ses dérivés glycosylés ont déjà été décrits dans la demande FR-2 701 261 comme inhibiteurs de péroxydation lipidique utilisables notamment dans le traitement des affections vasculaires. Elle est aussi le principal constituant du médicament DAFLON qui est préconisé dans le traitement des troubles de la circulation veineuse (jambes lourdes, douleurs, impatiences) et dans le traitement des signes liés à la crise hémorroïdaire. La demande US 2003/0095959 divulgue une composition cosmétique complexe pouvant contenir à titre de composant capable de piéger des radicaux hydroxy, un flavonoïde. La diosmétine est l'un des flavonoïdes qui peut être mis en oeuvre dans cette application. Elle a aussi été décrite dans la demande US 2003/0105031 comme étant utile par voie topique, parmi une longue liste de flavonoïdes, dans le traitement des dermatoses inflammatoires (psoriasis, eczéma...). La demande de brevet WO 99/13856 concerne l'utilisation dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique d'au moins un extrait d'au moins un végétal du genre Chrysanthemum pour favoriser la pigmentation de la peau et/ou des cheveux. Par ailleurs, de la diosmétine a été identifiée dans certains extraits de plante du genre Chrysanthemum. La demanderesse a maintenant constaté de façon inattendue que la diosmétine en tant que telle est capable d'agir en tant qu'agent pigmentant. Par agent pigmentant , on entend un agent capable de favoriser la pigmentation; le terme pro-pigmentant peut également être utilisé à cette fin. De plus, on entend par activateur de la mélanogénèse , un agent favorisant la mélanogénèse qui est un type d'agent pigmentant. On parle aussi quelquefois alors de ses propriétés mélanotropes. L'invention a donc pour objet l'utilisation de la diosmétine, d'un de ses glycosides, d'un de ses sulfates, d'un extrait de plante contenant l'un d'eux ou de leurs mélanges, à titre d'agent pigmentant de la peau et/ou des poils et/ou des cheveux, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. L'invention a en outre pour objet une méthode de traitement cosmétique pour brunir la peau, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur la peau une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates ou un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. L'invention a en outre pour objet une méthode de traitement cosmétique pour favoriser la pigmentation des poils et/ou des cheveux, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur les poils et/ou les cheveux une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates ou un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. L'invention a en outre pour objet une méthode de traitement cosmétique pour brunir la peau et/ou favoriser la pigmentation du poil et/ou des cheveux, caractérisée en ce qu'elle consiste en l'administration orale d'une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates ou un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges. L'invention a enfin pour objet l'utilisation de la diosmétine, d'un de ses glycosides, d'un de ses sulfates, d'un extrait de plante contenant l'un d'eux ou de leurs mélanges pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou orale destinée à pigmenter la peau. Modes de mise en oeuvre de l'invention La diosmétine utilisable selon l'invention est disponible dans le commerce. Elle peut aussi être extraite de diverses plantes, à l'aide d'un solvant éthanolique contenant éventuellement de l'eau. D'une manière générale, toute méthode d'extraction connue de l'homme du métier peut être mise en oeuvre pour obtenir la diosmétine, à savoir utilisant l'eau ou les solvants hydroalcooliques. Parmi ces plantes, on peut citer les espèces suivantes: Elephantopus scaber, Origanum vulgare, Taraxacum siniam, Linaria vulgaris, Artemisia vulgaris, Zostera marina, Toddalia floribunda, Euphrasia officinalis, Scrophularia nodosa, Hieracium compositum, Arnica cernua, Arnica nevadensis, Arnica spathulata, Vernonia cinerea, Centranthus calcitrapa, Ferula lactipinna, Satureia obovata, Haplopappus canescens, Lupinus luteus, Lupinus angustifollius, Anthyllis vulneraria, Leptadenia reticulata, Valeriana spp., Digitalis spp. et Citrus limon. Les dérivés de diosmétine utilisables selon l'invention peuvent être des glycosides, ainsi que des sulfates. Parmi les glycosides de la diosmétine, on peut citer la diosmine, la néodiosmine et leurs mélanges, ou encore: - le 7-0-,-D-Ribofuranoside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Epichloe typhina ou de Phleum pratense), - le 7-O-p-D-Glucopyranoside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Galium spp,. de Cassia sp. et de Chrysanthemum sp) . - le 3'-O-p-D-Glucopyranoside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Cassia torosa), - le 7-0-(6-O-Malonyl-p-D-Glucopyranoside) de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Bryum capillare), - le 7-O-p-D-Glucuronopyranoside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Pedalium murex et de Majorana hortensis), - le 7-0-[p-D-Apiofuranosyl-(1e)-6-O-acétyle- p-D-glucopyranoside] de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Paullinia pinnata), - le 7-0-[a-L-Arabinofuranosyl-(1e6)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, également nommé Capreoside (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Salix caprea), - le 7-0-[p-L-Arabinofuranosyl-(1e6)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, également appelé salicapreoside (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Salix caprea), - le 7-0-[à L-Arabinofuranosyl-(1o6)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, également appelé palustroside (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait d'Asperula 30 sp., de Galium spp. ou de Vinca sp), - le 7-0-[p-D-Xylopyranosyl-(1@6)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Vicia truncatula ou de Daphne pseudomezereum), - le 7-0-[Xylosyl-(1@?)-glycoside] de diosmétine, (que l'on peut 5 notamment obtenir d'un extrait d'Anacyclus spp.), - le 7-0-[p-D-Glucopyranosyl-(102)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, également appelé 7-sophoroside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Glandularia binnatifida), le 7-0-[p-DGlucopyranosyl-(1g?)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, 10 (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Lupinus texensis ou de Carex sp), - le 7-0-[â L-Rhamnopyranosyl-(102)-p-D-glucopyranoside] de diosmétine, également appelé 7-néohesperidoside de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Citrus aurantium), et le 7-0-[a-L-Rhamnopyranosyl-( 1 02) [L-ramnopyranosyl-(1@6)]-p-Dglucopyranoside] de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Buddleja madagascariensis). Parmi les sulfates de la diosmétine, on peut citer: - le 7-Sulfate de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Zostera marina), le 3'-Sulfate de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Lachenalia unifolia), - le 3',7-Disulfate de diosmétine (que l'on peut notamment obtenir d'un extrait de Lachenalia unifolia), et leurs mélanges. On préfère utiliser dans le cadre de la présente invention la diosmine et/ou la néodiosmine. La diosmine peut être extraite de plantes et notamment des espèces choisies dans le groupe constitué par Pratia nummularia, Agathosma betulina, Toddalia floribunda, Teucrium chamaedrys, Scrophularia nodosa, Linaria haelava, Peucedanum japonicum, Mentha sp., Capsella bursa pastoris, Campanula patula, Teucrium montanum, Peucedanum japonicum, Campanula pyramidalis, Phyteuma campanuloides, Zanthoxylum avicennae et Diosma crenulata. La néodiosmine peut être extraite du Citrus aurantium. Des extraits de plantes contenant de la diosmétine ou ses dérivés précités peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. De tels extraits peuvent notamment être obtenus à partir des plantes citées ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent pigmentant, dont l'utilisation est l'objet de l'invention, est un activateur de la mélanogénèse. Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent pigmentant est au moins un glycoside de la diosmétine, ou encore est choisi parmi la diosmine, le néodiosmine et leurs mélanges. La diosmétine, ses glycosides, ses sulfates, les extraits de plantes contenant l'un d'eux ou encore leurs mélanges, peuvent être mis en oeuvre dans toute composition de forme galénique convenant à une application topique ou orale. Une telle composition peut ainsi être appliquée topiquement sur la peau (y compris le cuir chevelu) ou les cheveux ou être administrée oralement. Lorsqu'elle est appliquée sur la peau ou les cheveux, la composition contient un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et éventuellement avec ses phanères (cils, ongles, cheveux) et/ou les muqueuses. Ce milieu est avantageusement cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qu'il n'entraîne pas de démangeaisons, de picotements ou de rougeurs susceptibles de détourner l'utilisateur de la composition, et qu'il présente un aspect, une odeur et un toucher agréables. Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées dans le domaine cosmétique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (HIE) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/H/E ou H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions peuvent être préparées selon les méthodes usuelles. On préfère utiliser selon cette invention une composition sous la forme d'une émulsion huile-dans-eau. Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide, en particulier sous forme de stick. Elle peut être utilisée comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage pour la peau. La composition peut aussi être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, une composition de permanente (notamment une composition pour le premier temps d'une permanente), ou encore une lotion ou un gel antichute. De façon connue, la composition utilisée selon l'invention peut contenir également les adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les pigments, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine considéré, et par exemple de 0,01 à 20% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse ou dans les vésicules lipidiques. En tout état de cause, ces adjuvants, ainsi que leurs proportions, seront choisis de manière à ne pas nuire aux propriétés recherchées des composés selon l'invention. Lorsque la composition utilisée selon l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 80 % en poids, et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion peuvent être choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le coémulsionnant peuvent être présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition. Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles d'origine végétale (huile d'avocat, huile de soja), les huiles d'origine animale (lanoline), les huiles de synthèse (perhydrosqualène), les huiles siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (p erfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matières grasses des alcools gras (alcool cétylique), des acides gras, des cires (cire de carnauba, ozokérite). Comme émulsionnants et co-émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple les esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG-100, et les esters d'acide gras et de glycérine tels que le stéarate de glycéryle. Comme gélifiants / épaississants hydrophiles, on peut citer en particulier les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants / épaississants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, et la silice hydrophobe. Le pH des compositions selon l'invention est généralement compris entre 3 et 10 et, mieux encore entre 5 et 8. Lorsque la composition est destinée à l'application topique sur la peau ou les cheveux, la teneur en poids en diosmétine ou la teneur en un de ses glycosides ou en un de ses sulfates peut varier entre 0,0001 % et 10 % en poids, de préférence entre 0,01 et 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Lorsque la composition est destinée à l'administration orale, la teneur en poids en diosmétine ou la teneur en poids en un de ses glycosides ou en un de ses sulfates varie par exemple entre 0,0001 % et 0,05% en poids par rapport au poids total de la composition. D'une manière générale, la teneur en poids en composés selon l'invention dans la composition sera adaptée à l'administration d'une quantité de diosmétine ou dérivés allant de 4 à 600 mg par jour. La composition pourra prendre la forme de gélules, de capsules, de comprimés ou de solutions buvables, par exemple. Lorsque la diosmétine ou l'un de ses sulfates ou l'un de ses glycosides est 25 présente dans un extrait de plantes, la teneur en poids d'extrait de plante est choisie de telle sorte que la teneur en diosmétine ou l'un de ses sulfates ou l'un de ses glycosides se trouve dans les gammes exprimées ci-dessus. L'invention a également pour objet l'utilisation de la diosmétine, d'un de ses glycosides, d'un de ses sulfates, d'un extrait de plante contenant l'un d'eux ou de leurs 30 mélanges, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou orale destinée à lutter contre le vitiligo ou le pityriasis versicolor. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans en limiter la portée. Exemple 1: Démonstration de l'activité de la diosmétine dans un test d'induction à la tyrosinase Objectif Evaluer l'activité d'induction de la tyrosinase par la diosmétine. Mise en oeuvre La diosmétine est diluée dans le DMSO à une concentration de 5.10-3 M. Elle est testée à la concentration de 50 et 10 M dans un test d'induction de la tyrosinase sur mélanocytes humains néonataux. Principe L'expression de la tyrosinase est déterminée par la méthode du western blot après extraction protéique à partir de cellules stimulées en culture. Description du test Le test est réalisé sur mélanocytes en culture. Les mélanocytes sont stimulés 24h par le composé à évaluer. Une extraction protéique est ensuite réalisée, puis l'extrait protéique est analysé par la technique du western blot en condition dénaturante. La capacité du composé à tester d'induire l'expression de la tyrosinase est comparée à celle d'un inducteur de référence (a-msh ou forskoline) et à un contrôle négatif (absence d'inducteur). Résultats et conclusions La diosmétine présente la capacité d'induire la tyrosinase à 10 et 50!M. Exemple 2: Effet de la diosmine, de la néodiosmine et de la diosmétine sur l'activité tyrosinase MATERIELS ET METHODES 1. Produits à l'essai Tableau 1 Produit à Solution Dilution Concentrations testées l'essai (exprimée en % de la solution) Diosmine 3,2 mg de produit dilué Milieu de culture 1 %, 0, 5 % et 0,1 % dans 1050 l de DMSO à de la solution 0,01 % (3,05 mg/ml) Néodiosmine 2,6 mg de produit dilué Milieu de culture 1 %, 0,5 % et 0,1 % dans 855 l de DMSO de la solution (3,04 mg/ml) Diosmétine 2 mg de produit dilué Milieu de culture 1 %, 0,5% et 0,1 % dans 1330 l de DMSO de la solution (1,5 mg/ml) Référence Solution Dilution Concentration testée Acide Kojique 1 % poids/volume en Milieu de culture 0,04 % poids/volume (Sigma K3125) milieu de culture Méthylxanthine 3-Isobutyl 1 500 mM en DMSO Milieu de culture 200 M (IBMX, Sigma I7018) 2. Cellules et conditions de culture Cellules: Mélanocytes épidermiques humains normaux (NHEM), utilisés au 6eme passage. Culture: milieu melanocytes growth medium M2 plus compléments 15 (Promocell C-24300) + pénicilline 50 UUml/streptomycine 50 g/ml (Life technologies 15070063) 37 C, 5 % CO2. 3. Traitements et dosage de la tyrosinase Les mélanocytes (NHEM) ont été pré-cultivés en plaques 96 puits pendant 24 20 h, puis les cellules ont été traitées par les produits à l'essai et références, pendant 72 h. Les essais ont été réalisés en triplicata (3 puits par condition). La morphologie des cellules et la densité apparente des populations ont été relevées par observation microscopique à la fin du traitement et les observations ont été consignées dans les tableaux de résultats. Les tapis cellulaires ont été lavés en PBS, puis les cellules ont été lysées en 5 PBS/1 % Triton X-100. Les surnageants ont été transférés dans des plaques neuves pour le dosage. Le dosage de la tyrosinase a eu lieu contre une gamme de tyrosinase de champignon (Sigma T7755) utilisée après dilution en PBS/Triton X-100 et comprise entre 0,39 et 400 unités d'enzyme par millilitre. Le substrat de la réaction était la L-DOPA (Sigma D9628) utilisée à 1 mm final. La réaction a eu lieu pendant 30 minutes, à 37 C, puis l'absorbance des puits a été lue à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques thermostaté ThermoMax (Molecular Devices). Les données brutes ont été traitées sous le logiciel SoftMaxPro . 4. Traitement des données Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel PRISM (Graph Pad Software). Les comparaisons intergroupes ont été réalisées par analyse de variance (ANOVA) à l'aide du test de comparaison multiple de Dunnett. RÉSULTATS Les résultats des dosages de l'activité tyrosinase sont présentés dans les 25 tableaux 2 et 3. Tableau 2: Effet des traitements à la diosmine et la néodiomine sur l'activité tyrosinase de mélanocytes humains Traitement Concentration* Activité sd N % témoin p tyrosinase (unités/ml) Témoin - 79,48 3,88 6 100 - Acide Kojique 0,04 % 65,97 1,50 3 83 p Morpho: Morphologie cellulaire, observation des cellules +, 100 % deviabilité cellulaire apparente +/-, légère réduction de la population -, réduction nette de la population cellulaire, toxicité. morpho morpho + + + +/-+ + Exemple 3 MATERIELS ET METHODES 1. Produits à l'essai, référence Tableau 4 Produit à Solution Dilution Concentrations testées l'essai (exprimées en % de la solution) Diosmétine 2 mg de produit dilué dans 1330 l Milieu de 0,25 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % et de DMSO (1,5 mg/ml, solution culture 0,001 /o de la solution jaunâtre) % Référence Solution Dilution Concentration testée Acide Kojique 1 % poids/volume Milieu de culture 0,04 /o poids/volume (Sigma K3125) en milieu de % culture Methylxanthine 3-Isobutyl 1 500 mM en DMSO Milieu de culture 200 M (IBMX, sigma 17018) 2. La même méthodologie qu'à l'exemple 2 a été employée. Tableau 5: Effet du traitement à la diosmétine sur l'activité tyrosinase de mélanocytes humains Traitement Concentration* Activité tyrosinase sd N % p (unités/ml) témoin Témoin - 76,66 4,36 6 100 - Acide 0,04 % 65,87 4,09 3 86 p Exemple 4: Exemples de compositions Crème pro pigmentante - Diosmétine 5,00 g morpho + + + +/-+ + + + *La concentration des produits est exprimée en pourcentage de la solution Ceteareth 30 7,00 g Stéarate de glycéryle 2,00 g - Alcool cétylique 1,50 g Polydiméthylsiloxane 1,50 g Huile de paraffine 15,00 g - Glycérine codex pure 20,00 g Conservateurs q.s. - Eau déminéralisée qsp 100,00 g Lotion pour les cheveux Néodiosmine 0,50 g Tyrosine 1,00 g Propylène glycol 30,00 g - Alcool éthylique 40,50 g Eau qsp 100,00 g Lotion épaissie Diosmine 15,00 g - Kawaïne 2,00 g Hydroxypropylcellulose (Klucel G de la société Hercules) 3,50 g Alcool éthylique qsp 100,00 g REVENDICATIONS 1. Utilisation de la diosmétine, d'un de ses glycosides, d'un de ses sulfates ou d'un extrait de plante contenant l'un d'eux ou de leurs mélanges à titre d'agent pigmentant de la peau et/ou des poils et/ou des cheveux, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent pigmentant est un activateur de la mélanogénèse. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'agent 10 pigmentant est la diosmétine. 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait de plante est obtenu à partir d'une plante d'espèce choisie parmi: Elephantopus scaber, Origanum vulgare, Taraxacum siniam, Linaria vulgaris, Artemisia vulgaris, Zostera marina, Toddalia floribunda, Euphrasia officinalis, Scrophularia nodosa, Hieracium compositum, Arnica cernua, Arnica nevadensis, Arnica spathulata, Vernonia cinerea, Centranthus calcitrapa, Ferula lactipinna, Satureia obovata, Haplopappus canescens, Lupinus luteus, Lupinus angustifollius, Anthyllis vulneraria, Leptadenia reticulata, Valeriana spp., Digitalis spp., Citrus limon, Pratia nummularia, Agathosma betulina, Toddalia floribunda, Teucrium chamaedrys, Scrophularia nodosa, Linaria haelava, Peucedanum japonicum, Mentha sp., Capsella bursa-pastoris, Campanula patula, Teucrium montanum, Peucedanum japonicum, Campanula pyramidalis, Phyteuma campanuloides, zanthoxylum avicennae, Diosma crenulata et Citrus aurantium. 5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'agent pigmentant est au moins un glycoside de la diosmétine. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent pigmentant est choisi parmi la diosmine, le néodiosmine et leurs mélanges. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates, l'extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, est mis en oeuvre dans une composition cosmétique pour l'application topique comportant un véhicule cosmétiquement acceptable. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que la teneur en poids en diosmétine ou la teneur en poids en un de ses glycosides, en un de ses sulfates ou en leur mélanges dans la composition, varie entre 0, 0001 % et 10 % en poids, de préférence entre 0,01 et 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates, l'extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, est mis en oeuvre dans une composition cosmétique pour l'administration orale. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la teneur en poids en diosmétine ou la teneur en poids en un de ses glycosides, en un de ses sulfates ou leurs mélanges dans la composition, varie entre 0,0001% et 0,05 % en poids par rapport au poids total de la composition. 11. Méthode de traitement cosmétique pour brunir la peau, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur la peau une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates, un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. 12. Méthode de traitement cosmétique pour favoriser la pigmentation du poil et/ou des cheveux, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur les poils et/ou les cheveux une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates, un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges, l'extrait de plante ne provenant pas du genre Chrysanthemum. 13. Méthode de traitement cosmétique pour brunir la peau et/ou favoriser la pigmentation du poil et/ou des cheveux, caractérisée en ce qu'elle consiste en l'administration orale d'une composition cosmétique contenant de la diosmétine, un de ses glycosides, un de ses sulfates, un extrait de plante contenant l'un d'eux ou leurs mélanges. 14. Méthode de traitement cosmétique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que l'extrait de plante est obtenu à partir d'une plante d'espèce telle que décrite à la revendication 4. 15. Utilisation de la diosmétine, d'un de ses glycosides, d'un de ses sulfates, d'un extrait de plante contenant l'un d'eux ou de leurs mélanges pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou orale destinée à pigmenter la peau. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée à lutter contre le vitiligo ou le pityriasis versicolor. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que l'extrait de plante est obtenu à partir d'une plante d'espèce telle que décrite à la revendication 4.