FR 2850105 A1 20040723 FR 0300622 A 20030121 M O Y E N S POUR L A R E G U L A T I O N DE L'EXPRESSION D E S I S O F O R M E S H U M A I N E S D E L'ANT L'invention a pour objet des moyens pour la régulation de l'expression des isoformes humaines de l'ANT, plus particulièrement des duplex d'ARN interférants (ARNi) et leurs applications pour ladite régulation et les applications des ADNc codant pour les isoformes. Le translocateur nucléotidique à adénine (ANT) est la protéine la plus abondante de la membrane interne des mitochondries. L'ANT possède deux fonctions distinctes : c'est d'une part, le responsable du transport des nucléotides à adénine à travers la membrane mitochondriale interne (import de l'ADP pour la phosphorylation oxydative ; d'ATP vers le cytosol pour le métabolisme général). D'autre part, l'ANT joue un rôle essentiel lors de la phase mitochondriale de l'apoptose. En effet, l'ANT peut adopter une conformation de pore non-spécifique, ce qui conduit à la perméabilisation des membranes mitochondriales et au déclenchement de la mort cellulaire (Kroemer & Reed 2000). Les gènes codant pour les ANT ont été clonés dans un bon nombre d'espèces telles que la levure, diverses plantes, le b#uf, le rat, la souris et l'homme. Toutes ces espèces possèdent plusieurs isoformes, et la structure des gènes est hautement conservée avec une organisation en 4 exons séparés par 3 introns.L'ANT humain existe sous trois isoformes (ANT1, ANT2, et ANT3) codées par trois gènes nucléaires différents qui ont été clonés et séquences. L'ANT1 (chromosome 4) est principalement exprimé dans le c#ur et les muscles squelettiques. On connaît une maladie héréditaire chez l'homme liée à une mutation de l'ANT 1 (substitution de l'alanine 114 en proline). Il s'agit de l'ophthalmoplégie progressive externe (affection rare caractérisée par d'importantes délétions de l'ADN mitochondrial). L'ANT2 (chromosome X) est très faiblement exprimé dans les tissus matures. Les plus forts niveaux d'expression de l'ANT2 sont observés dans les cellules en prolifération telles que les myoblastes et les cellules tumorales. L'ANT2 est aussi spécifiquement trouvé dans les cellules tranformées par le virus SV40, ainsi que les lignées dépourvues d'ADN mitochondrial (rho ). L'ANT3 (région pseudoautosomale des chromosomes X et Y) est exprimé de façon ubiquitaire dans tous les tissus différentiés. L'apoptose est un processus de suicide cellulaire qui se déroule en trois phases : une phase pré-mitochondriale (hétérogène), une phase mitochondriale (décision de mort), et une phase de dégradation ( putréfaction de la cellule). L'ANT, une protéine insérée dans la membrane interne des mitochondries, a la capacité de former un pore qui change radicalement le rôle de la mitochondrie : lorsque l'ANT est dans son état de PORE OUVERT la mitochondrie devient un organe de destruction de la cellule. Les points suivants sont aujourd'hui établis : # Il est possible de tuer des cellules in vitro en induisant la fonction pore de l'ANT (Belzac, Jacotot et al., Cancer Res. 2001 Feb 15. 61(4):1260-4). # Il est possible de protéger des cellules cardiaques ex vivo (c#ur reperfusé isolé) en bloquant la fonction pore de l'ANT (Di Lisa et al., J Biol Chem. 2000 Nov. 9) . # Il est possible de protéger des neurones in vivo de la mort consécutive à l'ischémie cérébrale en inhibant l'ANT (Cao et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2001 Apr. 21 (4) :321-333) . L'ANT est donc un point de contrôle majeur de l'apoptose et est régulé par des protéines endogènes comme le suppresseur de tumeur Bax (pro-apoptotique) et l'oncoprotéine Bcl-2 (antiapoptotique). L'ANT est aussi régulé par des protéines virales comme Vpr (pro-apoptotique issu du VIH) et vMIA (antiapoptotique issu du CMV). C'est donc une cible idéale pour lutter contre les dérégulations pathologiques de l'apoptose. Des données récentes ont révélé que l'ARN double-brin (ARNdb) induit l'extinction de l'expression de gènes dont la séquence est très homologue à la séquence de l'un des deux brins d'ARN du duplex. Ce phénomène, appelé interférence à ARN ou ARNi conduit à la dégradation des ARN messagers (Hammond et al., 2001, Sharp, 2001). Tuschl et coll. ont démontré que l'introduction dans des cellules de mammifères d'un duplex ARN de 21 nucléotides (small interfering RNA ou ARNsi) conduit à l'inhibition spécifique de l'expression génique (Elbashir et al., 2001). Après tranfection, les ARNsi agissent de pair avec des composants cellulaires (l'enzyme DICER et le complexe RISC) afin d'abolir l'expression du gène cible. Les inventeurs ont constaté qu'il était possible de réguler l'apoptose à des fins thérapeutiques en agissant sur le niveau d'expression des isoformes humaines de l'ANT de manière sélective. En particulier, il s'est avéré que des ARNi conçus à partir de régions définies de 21 nucléotides de la séquence codante de chaque isoforme de l'ANT a permis d'élaborer des ARNi duplex capables, après transfection, d'abolir sélectivement l'expression de chaque isoforme. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux produits qui associés à tout procédé de transfert d'acides nucléiques sont utilisables en thérapeutique humaine et animale. L'invention vise des ARNi capables d'inhiber sélectivement l'expression d'un isoforme de l'ANT, caractérisés en ce qu'il s'agit de duplex d'ARN, l'un des brins étant hautement homologue d'un fragment de l'ARNm codant pour ledit isoforme de l'ANT. Avantageusement, les ARNi de l'invention sont des ARNsi (ARN d'interférence de petite taille) de 18 à 25 nucléotides, plus particulièrement de 21 nucléotides. Des ARNi préférés sont choisis parmi les duplex avec des brins de séquences SEQ ID N l et SEQ ID N 2 ;SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 ; SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 : SEQ ID N l: 5'-acagaucagugcugagaagdTdT-3' SEQ ID N 2: 5'-cuucucagcacugaucugudTdT-3' SEQ ID N 3: 5'-gcagaucacugcagauaagdTdT-3' SEQ ID N 4: 5'-cuuaucugcagugaucugcdTdT-3' SEQ ID N 5: 5'-gggcaucguggacugcauudTdT-3' SEQ ID N 6: 5'-aaugcaguccacgaugcccdTdT-3' L'invention vise également des constructions contenant au moins un ARNi tel que défini ci-dessus ou des séquences d'ADN codant pour chacun des brins de ces ARNi. Dans un mode de réalisation de l'invention, la construction est caractérisée en ce que l'ARNi est associé à un vecteur facilitant son administration, son passage au travers de membranes, tissus ou de téguments biologiques, notamment membranes cytoplasmiques, membranes mitochondriales, membranes nucléaires, la peau, les muqueuses, les parois endothéliales, la barrière hémato-encéphalique, ainsi que sa biodisponibilité, stabilité et sa pharmacodistribution tel qu'un peptide, un liposome, des nanoparticules (nanosphères, nanotubes), un oligomère non naturel tels que des polymères d'urée. Dans un autre mode de réalisation, la construction est caractérisée en ce que l'ARNi est associé à un vecteur permettant le transfert d'acides nucléiques, tels que rétrovirus (Barton and Medzhitov, PNAS, 2002, vol. 99 (23) : p 14943-14945), transposons, adénovirus (Xia et al. ; Nature Bidech, 2002, Vol. 20, p1005-1010), plasmides (Brummelkamp et al., Cancel Call, 2002, p 243-247. L'invention vise en outre les compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un ARNi tel que défini ci-dessus, ou une construction telle que définie plus haut, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme inj ectable . D'autres formes de présentation sont adaptées à l'administration par voie orale, parentérale, rectale ou topique (Levis et al., Nature Genetics, 2002, vol. 32, p107- 108) . Les ARNi, constructions ou compositions pharmaceutiques tels que définis ci-dessus sont caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de réguler (induire ou inhiber) la perméabilisation des membranes mitochondriales et la mort cellulaire de type apoptotique, nécrotique, autophagique et mécanismes apparentés. Les compositions de l'invention permettent la régulation de l'expression des isoformes humaines de l'ANT et à ce titre sont particulièrement utiles pour le traitement de pathologies liées à des dérégulations de l'apoptose et des autres formes de mort cellulaire apparentées. L'invention concerne donc en partie l'utilisation des ARNsi-ANT1, ARNsi-ANT2, ANRsi-ANT3 pour induire/favoriser (ARNsi-ANT2) ou au contraire inhiber (ARNsi-ANT1 et/ou ARNsiANT3) la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (##m) et l'apoptose et la mort de type apoptotique, nécrotique, autophalgique, et mécanismes apparentés. L'invention concerne donc aussi l'utilisation des ADNc hANTl, hANT2, hANT3 pour induire/favoriser (ADNc hANTl et/ou ADNc hANT3) ou au contraire inhiber (CDNA hANT2) la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (##m) et l'apoptose. On cite en particulier leur application pour traiter un déficit d'apoptose, par exemple dans les différentes formes de cancer, les maladies auto-immunes, telles que lupus érythémateux disséminé, polyarthrites. Dans d'autres applications, ces compositions sont utilisées pour traiter un excès d'apoptose comme par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, Huntington)et les ischémies cérébrales et cardiaques. Par exemple, des ARNsi de l'ANT1 ou l'ANT3, ou encore de l'ADNc de l'ANT2 pourront être utilisés pour inhiber la mort neuronale dans des situations d'ischémies ou de pathologies neurodégénatives ou encore pour inhiber la mort de cardiomyocytes dans des situations ischémiques, ou la mort d'hépatocytes (infections virales, intoxications médicamenteuses). Par exemple, des ARNsi h-ANT2 et/ou des ADNc h-ANT1 ou h-ANT3 pourront être utilisés pour induire l'apoptose de cellules tumorales ou de lymphocytes autoréactifs. Lesdites compositions pharmaceutiques présentent également un grand intérêt pour le traitement des infections par HIV. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la suite de la description et en se référant aux figures 1 à 6 qui représentent respectivement : - Figure 1. Séquences complètes des ADNc codant pour les trois isoformes humaines de l'ANT isolés après RT/PCR à l'aide d'ARNs provenant de cellules 293T et HeLa. - Figure 2. L'expression des isoformes hANT1 et hANT3 induisent l'apoptose . Analyse en cytométrie de flux de cellules 293T, 24 heures après cotransfection d'l g de vecteur pIRES-2-eGFP avec 1 g de vecteur pcDNA3.1-hANT. La quantification de l'intensité du marqueur CMXRos est réalisée uniquement sur les cellules GFP positives. B. Analyse en cytométrie de flux de cellules 293T, 24,48 ou 72 heures après transfection avec 1 g de vecteur pIRES- 2-eGFP ou avec 1 g de chaque vecteur pIRES-eGFP-hANT. La quantification de l'intensité du marqueur CMXRos est réalisée uniquement sur les cellules GFP positives.. C. Analyse en cytométrie de flux de la fréquence de noyaux hypoploïdes sur des cellules 293T 24,48 ou 72h après transfection avec 1 g de vecteur pIRES-eGFP ou 1 g de chaque vecteur pIRES-eGFP-hANT. Figure 3. L'apoptose induite par l'expression de hANT1 et hANT3 est inhibée par ZVAD et Boc D mais pas par CsA. A. Analyse en cytométrie de flux de cellules 293T 48 après transfection avec 1 g de vecteur pIRES-2-eGFP ou avec 1 g de chaque vecteur pIRES-eGFP-hANT en présence ou en absence de 10 M de CsA. La quantification de l'intensité du marqueur CMXRos est réalisée uniquement sur les cellules GFP positives. B. Analyse en cytométrie de flux de cellules 293T 48 heures après transfection avec 1 g de vecteur pIRES-2-eGFP ou avec 1 g de chaque vecteur pIRES-eGFP-hANT en présence ou en absence de 100 M de ZVAD-fmk ou de 100 M de Boc D. La quantification de l'intensité du marqueur CMXRos est réalisée uniquement sur les cellules GFP positives. Figure 4. L'expression de Bcl2 inhibe l'apoptose induite par l'expression des isoformes hANT1 et hANT3. Des cellules HeLa Neo et Bcl2 sont transfectées avec 1 g de vecteur pIRES-2-eGFP ou avec 1 g de chaque vecteur pIRES-eGFP-hANT et après 72 heures l'intensité du marqueur CMXRos est analysée par cytométrie de flux sur les cellules GFP positives. Figure 5. Localisation subcellulaire des isoformes hANT1 et hANT2. Des cellules HeLa sont transfectées avec 1 g de vecteur pcDNA3.1V5-hANTl (A) ou avec 1 g de vecteur pcDNA3.1V5-hANT2 (B) puis fixées avec du paraformaldehyde. La colocalisation des protéines de fusion hANT-V5 avec la protéine mitochondriale COX est réalisée par une immunodétection de fluorescence de l'épitope V5 (fluorescence verte) et de la protéine COX (fluorescence rouge).L'image merge représente la superposition des fluorescences vertes et rouges montrant la colocalisation. - Figure 6. Inhibition spécifique de l'expression des isoformes humaines 1 et 2 de l'ANT via l'utilisation de siRNA spécifiques. (A) Des cellules HeLa sont co-transfectées avec d'une part un vecteur d'expresssion pcDNA3.1V5-hANTl et d'autre part des ARNsi spécifiques de l' hANT1 ou hANT2mut. (B) Des Celules HeLa sont co-transfectées avec d'une part un vecteur d'expresssion pcDNA3.1V5-hANT2 et d'autre part des ARNsi spécifiques de l' hANT2 ou hANT2mut. Après 24 heures après transfection, les cellules sont lysées et l'expression des isoformes de l'ANT est déterminée par Western-blot à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-V5. Cotransfections : Des cellules HeLa sont cultivées en plaque 6 puits en DMEM/Glutamax-I complémenté avec 10% de sérum de veau f#tal. Après 24 heures, les cellules sont transfectées en ajoutant 3 /il de lipofectamine 2000 (Invitrogen), 3 g d'ARNsi et 1 g de vecteur pcDNA3.1V5-hANTl ou 2 dans du DMEM sans sérum (volume final 500 fil) . Les cellules sont rincées 6 heures après la transfection et maintenues en culture pendant 24,48 ou 72 heures. Préparations des extraits cellulaires et Western : cellules sont resuspendues dans 100 fil de tampon de lyse (25 mM Tris-HCl, pH 7. 5, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X- 100,cocktail d'inhibiteurs de proteases) et centrifugées 10 minutes à 13 000 rpm à 4 C. 10 fil du surnageant est collecté pour réaliser un test Bradford. Les extraits sont ensuite analysés en gel SDS-PAGE après dénaturation 3 minutes à 100 C en présence de tampon SDS-Laemmli. Après transfert les protéines sont révélées avec un anticorps anti-V5 (1/5000, Invitrogen) . Clonage des isoformes humaines d'ANT et réalisation de vecteurs d'expression . De l'ARN total de cellules 293T et de cellules HeLa a été isolé (TRIZOL protocole) et utilisé dans des expériences de reverse transcription/amplification initiées avec une amorce de type oligodT. Des amorces spécifiques des isoformes humaines de l'ANT (hANT1, hANT2 et hANT3) ont été synthétisées à partir des séquences publiées dans GenBank afin d'amplifier spécifiquement l'ADNc complet de chacune des isoformes (Tablel). Ces produits ont été ensuite sous-clonés dans le vecteur pGEM-T après l'ajout d'un résidu dAdénosine à leurs extrémités. La séquence de chaque insert a été vérifiée (Figure 1). Les ADNcs codant pour les trois isoformes ont ensuite été clonés dans des vecteurs d'expression : pCDNA3.1 (version +, Invitrogen) et pIRES-2eGFP (Clontech) . Afin de générer des protéines de fusion avec l'épitope V5 correspondant aux trois isoformes, une approche d'amplification (Table 2) a permis de modifier les extrémités des ADNcs codant pour les trois isoformes (mutation du codon STOP et également ajout de séquences de reconnaissance d'enzymes de restrictions ) et de sous cloner ces produits dans le vecteur pcDNA3.1-V5 (versionA, Invitrogen). Les constructions finales ont été vérifiées par séquençage. Potentiel apoptotique des isoformes humaines de l'ANT : Les expériences de transfection ont été réalisées sur des cellules 293T en utilisant le vecteur pIRES-2-GFP vide comme control ou les vecteurs pIRES-2-eGFP contenant les séquences des ADNcs codant pour les trois isoformes de l'hANT. A un temps donné post-transfection les cellules ont été analysées par cytométrie de flux. Les résultats montrent que l'expression des isoformes hANT1 et hANT2 conduit à une dissipation du potentiel mitochondrial déclenchant ainsi l'apoptose alors que l'expression de l'isoforme hANT2 n'affecte pas l'intégrité mitochondriale (Figure 2). En utilisant une approche expérimentale similaire nous démontrons que l'apoptose liée à l'expression des isoformes hANTl et hANT3 est inhibée par des inhibiteurs des caspases (ZVAD et Boc D) (figure 3A) mais pas par la Cyclosporine A (CsA) (Figure 3B). Nous démontrons également, en utilisant des cellules HeLa surexprimant la protéine Bcl2 que cette dernière est capable d'inhiber l'apoptose induite par les isoformes hANT1 et hANT2 figure 4) Localisation subcellulaire des isoformes hANTl et hANT2 : Après transfection de cellules HeLa avec des constructions codant pour les protéines de fusion hANT1-V5 et hANT2-V5 nous avons réalisé un immunomarquage afin de déterminer la localisation subcellulaire de hANTl et hANT2. L'analyse de la localisation du signal obtenu avec un anticorps anti-V5 et le signal obtenu avec un anticorps dirigé contre COX (une protéine mitochondriale) met en évidence une localisation mitochondriale des isoformes hANT1 et2 (figure 5). Duplex ARNi des isoformes humaines de l'ANT Préparation des ARNi. Les ARNsi double-brins correspondant aux séquences d'ADNc ANT1 humaine (AAACAGATCAGTGCTGAGAAG, nucléotides 127-147), ANT2 humaine (AAGCAGATCACTGCAGATAAG, nucléotides 127-147), Ant2 humaine contenant quatre mutations (AAGCGGATCGCTACAAATAAG, nucléotides 127-147) et Ant3 humaine (AAGGGCATCGTGGACTGCATT, nucléotides 154-174) ont été conçues selon les recommandations de Elbashir et al. (2001). Les duplex ont été réalisés par Proligo (France). hANT1 (127-147) Séquence d'ADN: 5'-aaacagatcagtgctgagaag-3' (SEQ ID N 7) Duplex ARNi: 5'-acagaucagugcugagaagdTdT-3' (SEQ ID N 8) 5'-cuucucagcacugaucugudTdT-3' (SEQ ID N 9) hANT2(127-147) Séquence ADN: 5'-aagcagatcactgcagataag-3' (SEQ ID N 10) Duplex ARNi: 5'-gcagaucacugcagauaagdTdT-3' (SEQ ID N ll) 5'-cuuaucugcagugaucugcdTdT-3' (SEQ ID N 12) hANT2mut(127-147) Séquence ADN: 5'-aagcggatcgctacaaataag-3' (SEQ ID N 13) Duplex ARNi: 5'-gcggaucgcuacaaauaagdTdT-3' (SEQ ID N 14) 5'-cuuauuuguagcgauccgcdTdT-3' (SEQ ID N 15) hANT3 (154-174) Séquence ADN: 5'-aagggcatcgtggactgcatt-3' (SEQ ID N 16) Duplex ARNi: 5'-gggcaucguggacugcauudTdT-3' (SEQ ID N 17) 5'-aaugcaguccacgaugcccdTdT-3' (SEQ ID N 18) Dans les tableaux ci-après, on rapporte respectivement les séquences des amorces utilisées : - Tableau 1 : lors des expériences de RT/PCR afin de cloner l'ADNc codant pour les trois isoformes humaines de l'ANT. - Tableau 2 : pour la construction des vecteurs d'expression contenant les ADNcs codant pour les protéines de fusion hANT-V5. Références : Hammond, S. M., Caudy, A. A. and Hannon, G. J. (2001). Posttranscriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet, 2,110-119. Sharp, P.A. (2001) . RNA interference-2001. Genes Dev. 15,485- 490. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411,494-498. Amorce sens Amorce antisens hANTKSEQ ID N 22 et 23) 5'ATGGGTGATCACGCTTGGAGCTTCCTAAAG3' S'TTAGACATATTTfTTGATCTCATCATACAA3' hANT2(SEQ ID N 24 et 25) 5'ATGACAGATGCCGCTGTGTCCTTCGCCAAG3' 5'TTATGTGTACCTTCTTGATTTCATCATACAA3' hANT3(SEQ ID N 26 et 27) 5'ATGACGGAACAGGCCATCTCCTTCGCCAAA3' S'TTAGATCACCTTCTTGAGCTCGTCGTACAG3' Amorce sens Amorce antisens hANT1 5'TAAGGTACCATGGGTGATCACGCTTGGA3' (SEQ ID N 28 et 29) 5'ATCTCGAGGACATATTTTTTGATCTC3' hANT2 5'TAAGGTACCATGACAGATGCCGCTGTGT3' (SEQ ID N 30 et si) 5'ATCTCGAGTGTGTACTTCTTGATTTC3' hANT3 5'TAAGGTACCATGACGGAACAGGCCATCT3' (SEQ ID N 32 et 33) 5'ATCTCGTGGATCACCTTCTTGAGCTC3' REVENDICATIONS 1/ ARNi capable d'inhiber sélectivement l'expression d'une isoforme de l'ANT, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un duplex d'ARN, l'un des brins étant hautement homologue d'un fragment de l'ARNm codant pour une isoforme de l'ANT, les brins du duplex contenant de 18 à 25 nucléotides, plus particulièrement 21 nucléotides. 2/ ARNi selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6. 3/ Construction contenant au moins un ARNi selon la revendication 1 ou 2, ou des séquences d'ADN codant pour chacun des brins l'ARNi. 4/ Construction selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'ARNi est associé à un vecteur facilitant son administration, son passage au travers de membranes, tissus ou de téguments biologiques, notamment membranes cytoplasmiques, membranes mitochondriales, membranes nucléaires, la peau, les muqueuses, les parois endothéliales, la barrière hématoencéphalique, ainsi que sa biodisponibilité, sa stabilité et sa pharmacodistribution tel qu'un peptide, un liposome, des nanoparticules (nanosphères, nanotubes), un oligomère non naturel tels que des oligomères d'urée. 5/ Construction selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit de vecteurs permettant le transfert d'acides nucléiques, tels que rétrovirus, transposons, adénovirus, plasmides. 6/ Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un ARNi selon la revendication 1 ou 2, ou une construction selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 7/-Compositions pharmaceutiques, selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme injectable, ou administrable par voie orale, parentérale, rectale ou topique.