FR 2858177 A1 20050204 FR 0309231 A 20030728 UTILISATION DU PHÉNOMÈNE FRET, DÉTECTÉ PAR MPLSM, POUR LE SUIVI IN VIVO D'ÉVÈNEMENTS BIOLOGIQUES L'invention concerne l'utilisation de la technique FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) dans des applications in vivo, grâce à la détection de ce phénomène par MPLSM (MultiPhoton Laser Scanning Microscopy). Plus particulièrement, l'invention porte sur un organisme non humain qui exprime deux fluorophores capables d'un transfert d'énergie par FRET, liés entre-eux par une molécule permettant de suivre une activité biologique in vivo, par modification de l'émission fluorescente. D'une manière alternative, les deux fluorophores du FRET exprimés dans l'organisme non humain sont couplés chacun à une molécule, dont l'interaction in vivo entraîne une modification de l'émission fluorescente. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation des organismes précités pour le criblage d'activateurs ou d'inhibiteurs d'une activité biologique d'intérêt ou d'une interaction entre deux molécules. Le FRET est un phénomène physique selon lequel un transfert d'énergie s'effectue entre deux molécules fluorescentes dont les spectres (d'émission pour la donneuse et d'excitation pour l'accepteuse) se recouvrent, lorsqu'elles sont situées à proximité ( Le brevet WO 01/55452 utilise par exemple le FRET pour cribler des interactions protéine-protéine. Plus précisément, l'ADN codant une protéine d'intérêt est exprimé en phase avec l'une des protéines fluorescentes, alors qu'une banque de protéines est fusionnée à l'autre partenaire fluorescent. Les cellules ainsi transformées sont criblées par FRET et les protéines interagissant avec la protéine d'intérêt sont identifiées. Une autre application du FRET est décrite dans le brevet WO 01/42211où des changements dans le potentiel membranaire de cellules sont suivis grâce à l'introduction d'un premier composant dont la localisation membranaire dépend du potentiel à travers cette membrane et d'un deuxième composant capable de subir un transfert d'énergie. L'intérêt et les potentiels de l'utilisation in vivo du FRET ont déjà été évoqués dans la littérature, par exemple dans Hadjantonakis et al. (2). Cependant, ce document se contente de démontrer que des variants de GFP, en l'occurrence eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) et eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), pouvaient être exprimés d'une manière ubiquitaire dans des cellules souches, embryons ou souris adultes transgéniques et visualisés individuellement par leur émission fluorescente. Les moyens de détection des phénomènes de fluorescence sont variés : microscopie à fluorescence, fluorimètrie ou FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). Des efforts constants sont consacrés au développement de méthodes d'imagerie permettant l'investigation de processus moléculaires in vivo. Ainsi, le MPLSM (MultiPhoton Laser Scanning Microscopy) a ouvert de nouveaux horizons, grâce à sa résolution en profondeur et aux photo-dommages restreints. Cette technologie a été employée avec succès pour suivre l'expression de GFP à l'intérieur de glandes mammaires de souris transgéniques (3). Pour l'essentiel, cette technologie consiste à exciter un fluorophore donné avec 2 photons absorbés de façon quasi-simultanée, au lieu d'un seul photon comme réalisé classiquement. Cela implique l'utilisation de lasers pulsés émettant des photons à des longueurs d'onde infra-rouges, qui ont une capacité supérieure de pénétration dans les tissus. D'autre part, l'excitation se fait en un point, ce qui réduit considérablement les dommages causés dans la périphérie de la zone d'excitation. Avant la présente invention, l'utilisation du FRET pour des applications in vivo posait non seulement le problème de l'expression du système FRET recombinant, mais surtout celui de la détection et de l'exploitation du signal émis par un tel système. Pour la première fois, les inventeurs ont démontré que le signal émis par un système FRET exprimé in vivo pouvait être exploité d'une manière efficace et quantifiable par la technique non destructive du MPLSM. Ceci est d'autant plus remarquable qu'il ne s'agissait plus d'analyser à un moment donné une émission fluorescente donnée, mais de suivre, dans le temps et dans l'espace, un transfert d'énergie. L'identification de cette technologie adaptée pour exploiter le FRET in vivo donne tout son sens à l'obtention d'animaux transgéniques exprimant un système FRET recombinant et à leur utilisation dans l'évaluation de molécules thérapeutiques. Dès lors, l'invention porte sur un organisme non humain, caractérisé en ce qu'il exprime un système FRET constitué d'un donneur lié à un accepteur par une molécule, substrat d'une activité biologique, la présence de cette activité biologique entraînant une modification de l'émission fluorescente. D'une manière alternative, l'organisme non humain exprime un système FRET constitué d'un donneur et d'un accepteur couplés chacun à une molécule, l'interaction entre ces deux molécules entraînant une modification de l'émission fluorescente. Dans la suite de la description et dans les revendications, on désigne par "système FRET", l'association d'au moins deux molécules fluorescentes, le spectre d'émission d'une des molécules (donneur) devant recouvrir le spectre d'excitation de la deuxième molécule (accepteur). Ainsi, lorsque la molécule donneuse est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie plus élevé. En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu sous différentes formes (chaleur...). Si cette molécule donneuse est dans une orientation optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être transférée à cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon, ni nécessité de collision entre les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la lumière à sa propre longueur d'onde d'émission. Lorsque l'énergie ne peut pas être absorbée par la molécule accepteuse, c'est la molécule donneuse qui émet de la fluorescence à sa longueur d'onde. Les molécules rapporteuses fluorogéniques peuvent être des molécules synthétiques obtenues par synthèse chimique ou des protéines possédant des propriétés de fluorescence. Dans un mode de réalisation avantageux, lesdites protéines correspondent à des protéines GFP mutées. La GFP (Green Fluorescent Protein) est une protéine de 27 kilodaltons, synthétisée par une méduse du Pacifique (Aequara Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress. La GFP garde ses propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une étude aisée de nombreux phénomènes. Certaines mutations de la GFP, au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore, ont permit d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres. En particulier, les protéines CFP (Cyan Fluorescent Protein) (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP (Yellow Fluorescent Protéine (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été isolées. Ces deux protéines peuvent être reliées par un phénomène de FRET. En effet, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (donneur) et le spectre d'excitation de YFP (accepteur). Dans la première forme de réalisation, le donneur et l'accepteur sont liés par une molécule. Une modification de cette molécule par une activité biologique (clivage, phosphorylation, fixation d'ions...) entraîne un repositionnement du donneur et de l'accepteur, se traduisant par une modification de l'émission fluorescente. La nouvelle configuration du système FRET peut soit générer un phénomène FRET, soit au contraire abolir ce phénomène et aboutir à une émission de fluorescence par le donneur. Dans la suite de la description et dans les revendications, on entend par le terme "molécule", aussi bien des petites molécules que des macromolécules, susceptibles de jouer un rôle biologique. Cette dénomination englobe en particulier les ions, les glucides, les acides gras, les acides aminés, les nucléotides, les polysaccharides, les lipides, les protéines et les acides nucléiques, cette liste étant non exhaustive. Dans la suite de la description et dans les revendications, on entend par "activité biologique" d'une molécule, sa capacité à reconnaître spécifiquement une autre molécule dite "substrat" et à exercer une modification sur ledit substrat. Ainsi, ladite activité biologique peut correspondre à la fixation d'un ion, entraînant un changement conformationnel. Par exemple, de nombreuses protéines sont capables de fixer le calcium au niveau de sites particuliers appelés "EF-hand". La modification confonnationnelle qui en résulte peut donc permettre de détecter la présence de cet ion. Par ailleurs, l'activité biologique peut correspondre à une activité enzymatique dont le substrat serait la cible de la protéine dite "enzyme". Avantageusement, ces enzymes sont impliquées dans la protéolyse (calpaines, caspases, protéasome, protéases virales), dans la phosphorylation (Mitogen Activated Protein kinases, titine-kinase, obscurine-kinases), ou dans la glycosylation (FukutinRelated Protein). Préférentiellement, l'enzyme est une protéase, le substrat correspondant à un site de clivage. Des protéases d'intérêt particulier dans le cadre de l'invention sont : les calpaines (Figure la), les protéases d'origine virale ou les caspases qui sont des protéases à cystéine médiant les processus morphologiques et biochimiques de l'apoptose, cette liste étant non exhaustive. Alternativement, l'enzyme appartient à la classe des kinases, par exemple la protéine kinase C (PKC). Ces enzymes sont capables de transférer un groupement phosphate au niveau d'un groupement-OH du substrat. La déphosphorylation peut être effectuée par des phosphatases. Les cascades de phosphorylation jouent un rôle prépondérant dans la signalisation intracellulaire. Dans le second mode de réalisation, l'accepteur et le donneur sont des entités séparées, chacun étant lié à une molécule d'intérêt susceptible d'interagir avec l'autre molécule. Si l'interaction entre les deux molécules a effectivement lieu, alors le donneur et l'accepteur sont susceptibles de se trouver à proximité dans une orientation optimale et ainsi, de donner lieu à un phénomène FRET. On désigne par "interaction entre deux molécules", le fait que ces molécules, en raison d'une affinité particulière, établissent entre elles des liaisons non covalentes de type ionique, hydrogène, ou Van der Walls. Ce type de liaison peut s'établir entre deux protéines (interactions protéine-protéine), entre un récepteur et son ligand, entre une enzyme et son substrat, ou par exemple entre la machinerie de transcription et l'ADN à transcrire, cette liste étant non exhaustive. Le FRET ainsi que l'exploitation de ce phénomène par le MPLSM peuvent s'appliquer à tout organisme non humain. D'une manière préférentielle, dans le cadre de l'invention, le FRET est exprimé dans des organismes pluricellulaires présentant des cellules différenciées en profondeur, se distinguant clairement des microorganismes. D'une manière préférentielle, l'organisme est un animal. En raison de leur capacité à servir de modèles pour de nombreux systèmes biologiques humains, les rongeurs constituent les animaux préférés selon l'invention, en particulier le rat et la souris. Dans un premier mode de réalisation, le système FRET tel que défini précédemment est synthétisé in vitro puis injecté en tant que tel dans l'organisme non humain. D'une manière alternative, c'est l'ADN codant le système FRET qui est injecté dans l'organisme. Dans ces deux modes de réalisation, l'expression est dite "transitoire" dans la mesure où elle ne perdure que pendant la durée de vie du produit du système FRET ou de l'ADN dans l'organisme. L'injection peut se faire par voie intramusculaire, intraveineuse, intrapariétale ou plus généralement par accès direct de l'organe cible. Selon l'invention, le système FRET est préférentiellement exprimé dans le foie, le muscle, le cerveau ou le c#ur. Dans un autre mode de réalisation, l'ADN codant le système FRET est transfecté dans l'organisme puis intégré de manière stable et héréditaire dans le génome de cet organisme. La construction contenant l'ADN recombinant est intégrée au niveau des cellules souches ou au niveau embryonnaire, puis un organisme est généré à partir de ces cellules. Les techniques d'obtention de souris transgéniques sont illustrées dans les revues de Picciotto et al. (4) et Babinet et al. (5). Dans le cas où deux constructions distinctes sont requises, il est préférable de croiser entre eux deux organismes transgéniques, chacun ayant intégré dans son génome une des constructions. Il est également possible d'obtenir un organisme transgénique ayant intégré une construction comportant les deux composants du système FRET en tandem, sur la même molécule d'ADN. Dans le cas où le système FRET est exprimé à partir d'un ADN, cet ADN est placé sous le contrôle d'un promoteur. Un tel promoteur peut permettre une expression ubiquitaire et permanente ou, au contraire, une expression ciblée dans certains tissus, par exemple ceux d'intérêt pour l'invention à savoir le cerveau, le muscle, le foie et le c#ur, ou encore conditionnelle. De tels promoteurs sont décrits dans la littérature (4,5). Des promoteurs préférés permettant une expression ubiquitaire sont : le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur du rous sarcoma virus (RSV) ou le promoteur du simian virus 40 (SV40), cette liste étant non exhaustive. Une expression ciblée dans le muscle peut être obtenue grâce au promoteur de l'alpha-actine, au promoteur de la desmine, au promoteur de la muscle creatine kinase (MCK) ou au promoteur synthétique C5-12 (6), cette liste étant non exhaustive. Par ailleurs, l'expression en phase du donneur et/ou de l'accepteur avec la molécule peut nécessiter la présence de linkers ou molécules de liaison. Des organismes tels que revendiqués ou même des êtres humains exprimant un système FRET tel que défini précédemment peuvent être utilisés pour déterminer la présence d'une activité biologique in vivo ou l'existence d'une interaction in vivo entre deux molécules, le FRET étant détecté avantageusement par MPLSM. Des conditions particulières, tant physiologiques que pathologiques, peuvent présenter un intérêt certain pour l'acquisition de connaissances et la compréhension de mécanismes in vivo : Ainsi, il est connu que l'activation des calpaines ubiquitaires participe à différentes pathologies. De ce fait, le suivi de l'activité calpaine dans le muscle lorsque l'organisme est sujet à cachexie, présente des blessures musculaires traumatiques ou des dystrophies musculaires, est intéressant. L'activité de la calpaine peut également être suivie dans le cerveau d'un organisme ayant subi un accident vasculaire cérébral, sujet à des maladies neurodégénératives ou présentant une blessure traumatique. Dans une autre application, le clivage par les caspases est observé dans des organismes se trouvant dans des conditions particulières de développement, dégénératives ou immunitaires, lorsque l'organisme est sujet à des crises d'épilepsie ou présente des tumeurs. D'une manière alternative, la phosphorylation et les interactions protéineprotéine sont analysées, par la méthode de la présente invention, dans un organisme présentant des tumeurs. Dans ce cadre, une molécule d'intérêt particulier est la protéine BRCA1. Selon un autre mode de réalisation, l'activité de protéases virales est suivie dans un organisme ayant été sujet à une infection virale. Par ailleurs, les organismes revendiqués ou des êtres humains exprimant des systèmes FRET définis dans la présente invention peuvent servir à cribler des activateurs ou des inhibiteurs d'une activité biologique in vivo ou d'une interaction in vivo entre deux molécules. Pour cela, le FRET émis par l'organisme est mesuré avant et après l'injection de la molécule testée. Une variation dans le FRET indique alors le potentiel inhibiteur ou activateur du composé injecté. Dans le cadre des exemples qui suivent, le système FRET a permis de suivre l'activité calpaine sur le site de clivage de l'a-fodrine. Il a révélé que la présence de calcium, corrélée à des conditions pathologiques diverses, induit cette activité protéasique (Figure 4). Ce dernier aspect de l'invention offre la possibilité de tester et d'évaluer de nombreuses molécules thérapeutiques dans des essais précliniques. La technique du MPLSM est appliquée sur l'organisme in vivo sans dommage conséquent. L'appareillage de microscopie peut en outre se présenter sous forme de miniature et ainsi permettre de suivre le comportement dudit organisme, librement et dans le temps (7). L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées. Figure 1 : Schéma du système FRET détectable in vivo par MPLSM. a/ Système FRET pour le suivi de l'activation de la calpaine. Le site de clivage de l'a-fodrine (1) par les calpaines ubiquitaires a été inséré entre eCFP et eYFP. En l'absence de calcium, les calpaines sont inactives et le phénomène FRET est généré par la protéine chimérique intacte. En présence de calcium (2), les calpaines ubiquitaires activées (3) clivent la construction, ce qui aboutit à la séparation des deux protéines fluorescentes et à la disparition du phénomène FRET. b/ Dispositif expérimental pour le MPLSM. (1) laser Titane/Saphir ; (2) unité de conditionnement du faisceau ; (3)incubateur ; (4) filtres ; (5) détecteur externe. Figure 2 : Détermination in vivo du passage spectral de la molécule donneuse par MPLSM. a/ Représentation en 3D du muscle tibial antérieur (TA) d'une souris exprimant eCFP, 100 coupes optiques espacées de 4 micromètres. Echelle : 100 micromètres. b/ Représentation en 2D (encart) et en 3D des intensités FRET (y) rapportées aux intensités eCFP (x) provenant d'un seul muscle exprimant eCFP, 36 coupes optiques espacées de 7 micromètres. Pour chaque intensité eCFP, les intensités FRET correspondantes ne varient pas en fonction de la profondeur d'image (P Figure 3 : Détection in vivo du FRET par MPLSM. a/ Western blot d'un muscle exprimant un système de détection de l'activité calpaine. La bande à 62 kDa correspond à la protéine fusion intacte. Aucun fragment protéolytique de taille 31 kDa n'est détecté. b/ Représentation en 3D de FRETEFF provenant d'un muscle exprimant un système de détection de l'activité calpaine au grossissement 10X. 50 coupes optiques espacées de 12 micromètres. Des coupes axiales (à gauche) et sagittales (à droite) sont présentées. L'histogramme représente le FRETEFF du muscle entier. Echelle : 100 micromètres. c/ Représentation en 3D du FRETEFF provenant d'un muscle exprimant un système de détection de l'activité calpaine au grossissement 20X-Zoom4.30 coupes optiques espacées de 5 micromètres. Des coupes axiales (à gauche) et sagittales (à droite) sont présentées. Comme au grossissement 10X, des valeurs de FRETEFF positives et homogènes sont observées. Echelle : 10 micromètres. Figure 4 : Visualisation in vivo par MPLSM de l'activation de la calpaine grâce à un indicateur FRET. a/ Représentation en 3D de FRETEFF provenant d'un muscle qui exprime un système de détection de l'activité calpaine après traitement avec calcium/ionomycine à un grossissement 20X. 55 coupes optiques espacées de 4 micromètres. Des coupes axiales (première colonne de gauche) et sagittales (deuxième colonne de gauche) sont présentées. Des histogrammes montrent les représentations de FRETEFF dans trois régions distinctes du muscle. Des valeurs variables de FRETEFF peuvent être observées entre ou à l'intérieur des fibres (flèches). Echelle : 100 micromètres. b/ Représentation en 3D de FRETEFF provenant d'un muscle exprimant un système de détection de l'activité calpaine après traitement avec calcium/ionomycine à un grossissement 20X. 26 coupes optiques espacées de 7 micromètres. Les représentations en 3D à des grossissements 80X sont montrées pour deux fibres avec des FRETEFF différents. 15 coupes optiques espacées de 8 micromètres. Echelles : (à droite) ou 100 (à gauche) micromètres. c/ Western blot d'un muscle exprimant un système de détection de l'activité calpaine après traitement avec calcium/ionomycine. La bande à 62 kDa correspond à la protéine fusion intacte. Un fragment protéolytique de taille 31 kDa est détecté, suite à l'activation de la calpaine ubiquitaire. 1) MATÉRIEL ET MÉTHODES 1. Plasmides d'expression Les plasmides peYFP et peCFP ont été fournis par Clontech (Palo Alto, CA). Le plasmide pTOM, qui contient eYFP et eCFP aux extrémités 5' et 3', respectivement, du site multiple de clonage a été obtenu après digestion de peYFP et peCFP par Xhol et Hpal et religation du fragment eCFP dans peYFP. Le plasmide pCalpain-sensor a été obtenu par digestion de pTOM par Bspel et BamHl et ligation des oligonucléotides suivants : 5'-P-CCGGAAGCGGCCAGCAGGAGGTGTATGGTGCGATGCCCAGGG ATGGCTCAGGG-3' et 5'-P-GATCCCCTGAGCCATCCCAGGGCATAGC ACCATACACCTCCTGCTGGCCGCTT-3', qui codent les linkers et le site de clivage de l'a-fodrine murine par les calpaines ubiquitaires. Les clones ont été séquencés à l'aide d'amorces spécifiques de pTOM par la méthode de terminaison des chaînes aux didésoxys à l'aide d'appareils Applied Biosystems. 2. Expériences in vitro La validation du FRET in vitro a été réalisée sur des cellules 911 fournies par l'American Type Culture Collection (Rockvill, MD) et sur des myoblastes primaires de souris obtenus comme décrit précédemment. Les cellules ont été transfectées avec le réactif de transfection FuGENE 6 (Roche Applied Science, Meylan, France) selon les instructions du fabricant. 3. Délivrance du plasmide in vivo et activation des calpaines ubiquitaires dans le muscle Afin d'éliminer les endotoxines, les plasmides pEYFP, pECFP et pCA ont été préparés à l'aide du kit EndoFree Megaprep (QUIAGEN, Hilden, Allemagne). Des souris C57B16 âgées de 8 à 10 semaines ont reçu des injections dans le muscle du tibia antérieur (TA) de 100 g de plasmide dans un volume final de 25 l. Immédiatement après injection dans le TA, des pulsations électriques transcutanées ont été appliquées à l'aide d'électrodes composées de support en acier inoxydable placé de chaque côté du membre postérieur. Des pulsations électriques avec des ondes de 82 ont été générées par un électropulsateur ECM-830 (BTX, San Diego, CA) avec un voltage en sortie de 200 V/cm, une durée de pulsation de 20 msec et une fréquence de pulsation de 2 Hz. L'activation de la calpaine a été induite par une injection intramusculaire d'une solution de concentrations 100 mM en CaCl2, 15 M en ionomycine, 7 % de sérum de veau foétal et 5 mM HEPES (pH 7,4) dans un volume final de 50 l. Afin de suivre la fluorescence, les souris ont été endormies pendant 5 heures sous anesthésie, avec une surveillance clinique par un vétérinaire toutes les 30 minutes. Toutes les expériences animales ont été menées dans le respect des lois et directives européennes et nationales. 4. Préparation des échantillons protéiques et Western-blot Les muscles TA ont été congelés dans de l'azote liquide, pulvérisés en poudre fine, puis rapidement solubilisés dans du tampon LDS NuPage (Invitrogen San Diego, CA) contenant des inhibiteurs de protéase (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail, Roche Applied Science). Après sonication et centrifugation à 12 000 g pendant 10 minutes à température ambiante, les surnageants ont été collectés et mélangés à du DTT 1mM. Des échantillons protéiques ont été soumis à une électrophorèse en SDS-PAGE, en utilisant des gels prémoulés avec des gradients d'acrylamide 4-12 % (NuPage system, Invitrogen), et électrotransférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été colorées avec du rouge Ponceau pour évaluer la qualité du transfert de protéine et testées avec des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre GFP (dilution 1 : 2000) de Medical and Biological Laboratories (Nagoya, Japon). Des anticorps secondaires anti-lapin (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) couplés à la péroxydase de raifort ont été utilisés à une dilution 1:5000. La révélation a été effectuée à l'aide du kit Super Signal Pico West kit (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). 5. Appareillage de microscopie Le MPLSM est constitué d'une tête de balayage, radiance 2100 MP (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK), équipée avec un système laser Titanium-Saphir en mode fermé (Coherent Verdi-Mira, Palo Alto, CA), avec une largeur de pulsations de 100 fsec pompées à 5W, un taux de répétition de 76 MHz, qui a été réglé à 800 nm. La vérification en direct des paramètres d'excitation a été effectuée grâce à l'utilisation du système Bean Conditioning and Pockels Cell Units (Bio-Rad) qui permet de contrôler les longueurs de pulsation et d'atténuer les niveaux d'énergie sortants au-dessous d'une certaine valeur, de telle manière qu'aucun dommage ne soit observé au niveau des tissus (typiquement 10 à 46 MW, en fonction de la lentille de l'objectif). Les mesures d'énergie ont été effectuées comme si elles sortaient de l'objectif du microscope en utilisant un wattmètre de modèle Coherent LaseMate 33-0191. La fluorescence à deux photons a été détectée grâce à un détecteur descannant (Bio-Rad) après passage dans des filtres optiques. La double émission de eCFP et FRET a employée un miroir dichroïque DC550LP (Bio-Rad) avec deux filtres d'émission : HQ450/80 pour eCFP (Bio-Rad) et 545AF35 pour eYFP (Omega Optical, Brattleboro, VT). Quant au microscope, un appareil inversé Nikon TE 300 (Nikon Instech Co, Japon) avec des objectifs Nikon, dry CFI Plan APO, lOx, NA0.45 et dry CFI Plan APO, 20x, NA0.75 a été utilisé. Les animaux anesthésiés ont été conservés dans une chambre à température contrôlée du microscope (Soient scientific, Portsmouth, UK) à 37 C pendant toutes les expériences de multiphoton. 6. Analyse du FRET et logiciels Une analyse en direct a été réalisée dans ImageJ (National Health Institute - John Wayne) avec des plugiciels personnalisés. Pour les mesure de CFP et de FRET, des images à 16 bits ont été obtenues et importées dans ImageJ. DSBTCOEFF a été calculé comme un vecteur de 65 635 éléments et enregistré en une image à 16 bits 130x500. FRETEFF dans les images en 3D a été calculé selon l'équation FRETEFF = l-[Ida/(Ida+PFRET x (#dd / #aa) x Qd) ], en utilisant une procédure par lots qui ouvre séquentiellement les images disponibles de CFP et FRET pour chaque vue. Les images ainsi calculées ont été exportées vers le logiciel AMIRA (TGS Inc., San Diego, CA), permettant une représentation en 3D. II) RÉSULTATS 1. Détection de lafluorescence in vivo par MPLSM A titre de modèle pour analyser in vivo le FRET entre protéines fluorescentes, nous avons construit un système FRET pour suivre l'activité calpaine, contenant eCFP et eYFP fusionnés au site de clivage de l'a-fodrine par les calpaines ubiquitaires (Figure la). Une construction similaire avait été utilisée précédemment comme marqueur de l'activation des calpaines suite à une entrée de calcium dans des cellules dendritiques en culture (8). Nous avons d'abord validé la détection du FRET et la mise en évidence de l'activité des calpaines par le système de détection dans des cellules vivantes (résultats non montrés). Le muscle a été choisi comme tissu de référence puisque les calpaines participent à une grande variété de maladies musculaires dont la cachexie (9), les blessures musculaires (10) et les dystrophies (11). Les plasmides codant pour eCFP, eYFP et le site de clivage de la calpaine ont été exprimés dans les muscles du tibia antérieur de souris par injection intramusculaire suivie d'un électrotransfert. Six jours après la délivrance du plasmide, les souris ont été anesthésiées, la peau autour du tibia antérieur a été disséquée et une lame en glace a été positionnée sur le muscle exposé pour une observation microscopique (Figure lb). La fluorescence présente dans les muscles a été visualisée par MPLSM avec des coupes optiques consécutives permettant une représentation en 3D jusqu'à 200 m en profondeur (Figure 2a). Une variabilité dans le nombre de fibres transfectées et dans les intensités de fluorescence a été observée. Les muscles ne présentant pas, eux, de fluorescence ont été écartés. 2. Détermination in vivo des passages spectraux des donneurs et accepteurs par MPLSM L'analyse des données FRET nécessitent en premier lieu la correction des données brutes FRET, obtenues dans le filtre FRET, par les passages spectraux des fluorophores donneurs et accepteurs (notés DSBT et ASBT, respectivement). Une méthode simple pour leur estimation consiste à obtenir une représentation de monotransfection pour chaque fluorophore. Les rapports des intensités FRET sur les intensités du donneur ou de l'accepteur donnent les coefficients du DSBT et ASBT (notés DSBTCOEFF et ASBTCOEFF) qui, lorsqu'ils sont appliqués aux représentations du donneur ou de l'accepteur, donnent leur DSBT et ASBT respectifs. Dans les muscles exprimant eYFP (molécule acceptrice), aucun passage spectral dans le canal du FRET n'a été détecté par MPLSM pour une excitation à 800 nm, une longueur d'ondes définie précédemment comme optimale pour les expériences in vitro. De ce fait, l'ASBT n'a pas été pris en compte dans les calculs du FRET. Au contraire, un passage spectral a été détecté pour eCFP (molécule donneuse) dans le canal du FRET, dans le cas de muscles exprimant l'eCFP. Le point critique de l'exploitation du FRET in vivo était de vérifier que DSBTCOEFF pouvait être modélisé d'une manière fiable dans un organe vivant. Ainsi, il a été testé si ce coefficient pouvait être influencé d'une manière significative par les conditions expérimentales in vivo, par exemple la profondeur du tissu ou la variabilité entre animaux ou même entre différentes zones d'un organe considéré. Pour la validation de la pertinence des calculs de FRET, de l'organe aux niveaux sub-cellulaires, des images en 16 bits ont été enregistrées à des grossissements de 10X, 20X ou 20X-Zoom4 et avec plusieurs configurations de gain laser /détecteur (voir section MATÉRIEL ET MÉTHODES). Comme montré à la figure 2b qui représente des vues en 2D et en 3D de corrélations pixel à pixel entre des intensités FRET et eCFP, le DSBT n'a pas été influencé d'une manière significative par la profondeur du tissu (Tableau 1, n = 36 coupes optiques jusqu'à 250 micromètres, P Tableau 1 Variabilités en profondeur, topographiques et individuelles Intensités dans le filtre eCFP* Intensités dans le filtre FRET (moyennes) Variabilités profondeur** Variabilités topographiques e@ Variabilités en profondeur** m 0 ,.., # f.,,,, individuelles*** 10000 1730 330 1900 120 30000 6620 ~ 330 7300 ~ 630 50000 12900 330 14600 970 * Intensités allant de 0 à 65535. ** 36 coupes optiques à 250 m, P D'une manière similaire, comme montré dans la figure 2c, le DSBT n'a pas varié non plus significativement en fonction d'un animal considéré ou d'une région musculaire donnée (Tableau 1, n = 10 régions issues de 5 muscles provenant de 5 souris, P 3. Détection du FRET in vivo par MPLSM La précision FRET (PFRET), qui correspond au FRET effectivement présent dans l'échantillon, est obtenu en retranchant les DSBT et ASBT aux données brutes de FRET (12). Le PFRET est par la suite utilisé pour la détermination de l'efficacité FRET (FRETEFF) selon l'équation suivante : FRETEFF = l-[Ida/(Ida+PFRET x (#dd / #aa) x Qd) ], dans laquelle Ida est l'intensité du donneur en présence de l'accepteur, c'est-à-dire l'intensité eCFP dans les échantillons, #dd et #aa représentent les efficacités de la collecte dans les canaux de l'accepteur et du donneur et Qd le rendement quantique du fluorophore donneur. Le calcul du FRETEFF donne accès à des valeurs FRET quantitatives qui peuvent être comparées, quelles que soient les concentrations en fluorophores. Dans nos calculs, le PFRET n'a pas été corrigé par #dd, #aa et Qd puisque ces paramètres sont requis pour l'estimation de la distance entre les molécules donneuse et accepteuse, ce qui n'est pas nécessaire dans notre modèle (12). De plus, compte tenu de l'équimolarité de eCFP et eYFP, la correction de FRETEFF par la concentration de l'accepteur n'était pas nécessaire. Les mesures de FRET in vivo ont été réalisées sur les muscles exprimant la construction permettant de détecter l'activité calpaine, à l'aide du coefficient DSBTCOEFF déterminé précédemment. En parallèle, une analyse par western blot montre que le site de clivage de la calpaine n'a pas été clivé dans les conditions expérimentales (Fig. 3a) conformément aux observations antérieures qui rapportaient que les calpaines ubiquitaires sont principalement inactives dans le muscle (13). En accord, des valeurs moyennes positives de FRETEFF ont été observées (Fig. 3b et 3c). Ce résultat a pu être reproduit dans les différentes conditions de grossissement et de configurations de gain laser/détecteur testées. Nos calculs montrent également que le FRET positif détecté était homogène dans toute la longueur de la fibre musculaire (histogramme, Fig. 3b), bien qu'au niveau individuel, certaines molécules pouvaient présenter des niveaux de FRET variables générés par la flexibilité confonnationnelle du segment liant eCFP et eYFP. Une explication probable est que l'intensité en pixel correspond à une fluorescence moyenne générée par une population de molécules. 4. Suivi in vivo par MPLSM de l'activation de la calpaine grâce à un indicateur FRET Afin de mimer les conditions pathologiques caractérisées par une activation de la calpaine induite par un flux de calcium, une solution calcium/ionomycine a été injectée dans les muscles TA exprimant le système FRET permettant de suivre l'activité calpaine. Trente minutes après injection, une série de coupes optiques a été enregistrée à différents grossissements et en utilisant différents gains de laser/détecteur, comme décrit précédemment. Comme le montrent les figures 4a et 4b, une forte chute du FRETEFF dans certaines fibres (Flèche : Fig. 4a ; 1 et 2 : 4b) a été observée, en cohérence avec les analyses par Western blot qui montraient un clivage du site de la calpaine (Fig 4c). Au contraire, cette chute du FRET n'a pas été observée dans les muscles contrôle exprimant eCFP, ce qui indique que la variation n'était pas due à des effets aspécifiques de la solution injectée. La chute du FRET a été accompagnée par des altérations morphologiques profondes, probablement dues à une protéolyse par la calpaine des structures cytosquelettiques du muscle. Ceci démontre la possibilité de faire un lien entre un phénotype et la détection d'un événement moléculaire. Dans nos expériences, une large gamme de valeurs FRETEFF a été obtenue (10 à 40 %, histogrammes, Fig. 4a, et grossissement 20X, Fig. 4b), indiquant qu'une mesure quantitative du FRET peut être réalisée in vivo avec ce système. La diminution du FRET faisant suite à l'activation des calpaines a été détectée d'une manière reproductible dans toutes les conditions testées (voir Fig. 4b pour des exemples avec un grossissement 20X ou 20X-Zoom4). D'une manière plus significative, des différences dans FRETEFF ont pu être détectées entre les régions d'une même fibre (flèche, Fig. 4a et fibre 1, Fig. 4b). Ces résultats indiquent que le FRET peut être suivi d'une manière efficace et quantitative au niveau sub-cellulaire. BIBLIOGRAPHIE (1) Pollock, B. A., Heim, R. (1999). "Using GFP in FRET-based applications". Trend Cell. Biol. 9(2):57-60. (2) Hadj antonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. (2002). "Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal". BMC Biotechnol. 2(1):11. (3) Ahmed, F., Wychoff, J., Lin, E. Y., Wand, W., Wang, Y., Hennighausen, L., Miyazaki, J., Jones, J., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Segall, J.E. (2002). "GFP expression in the mammary gland for imaging of mammary tumor cells in transgenic mice". Cancer Res. 62(24):7166-9. (4) Picciotto, M.R., Wickman, K. (1998). "Using knockout and transgenic mice to study neurophysiology and behavior". Physiol. Rev. 78(4). 1131-63, (5) Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. (2001). "Genome engineering via homologous recombination in mouse embryonic stem (ES) cells : an amazingly versatile tool for the study of mammalian biology ". An Acad Bras Cienc. 73(3).365-83. (6) Li, X., Eastman, E. M., Schwartz, R.J., Draghia-Akli, R. (1999). "Synthetic muscle promoters : activities exceeding naturally occurring regulatory sequences'. 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REVENDICATIONS 1/ Organisme non humain, caractérisé en ce qu'il exprime un système FRET. 2/ Organisme selon la revendication 1 caractérisé en ce que le système FRET est constitué d'un donneur lié à un accepteur par une molécule, substrat d'une activité biologique, la présence de cette activité biologique entraînant une modification de l'émission fluorescente. 3/ Organisme selon la revendication 1 caractérisé en ce que le système FRET est constitué d'un donneur et d'un accepteur couplés chacun à une molécule, l'interaction entre ces deux molécules entraînant une modification de l'émission fluorescente. 4/ Organisme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'organisme est un animal. 5/ Organisme selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'animal est une souris ou un rat. 6/ Organisme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le donneur FRET et l'accepteur FRET sont des protéines possédant des propriétés de fluorescence. 7/ Organisme selon la revendication 6, caractérisé en ce que le donneur FRET est eCFP et l'accepteur FRET est eYFP. 8/ Organisme selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'activité biologique est une activité enzymatique et le substrat correspond à la cible de l'enzyme. 9/ Organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'activité enzymatique suivie par FRET est l'activité d'une protéase. 10/ Organisme selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite protéase est une caspase. 11/ Organisme selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite protéase est une calpaine. 12/ Organisme selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite protéase est une protéase d'origine virale. 13/ Organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'activité enzymatique suivie par FRET est l'activité d'une kinase. 14/ Organisme selon la revendication 3, caractérisé en ce que les molécules couplées au donneur FRET et à l'accepteur FRET sont des protéines, le FRET permettant de détecter des interactions protéine-protéine. 15/ Organisme selon la revendication 3, caractérisé en ce que les molécules couplées au donneur FRET et à l'accepteur FRET correspondent à un récepteur et à son ligand potentiel, le FRET permettant de révéler l'existence d'une liaison récepteur-ligand. 16/ Organisme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il exprime le système FRET d'une manière transitoire, soit par injection directe du système FRET synthétisé in vitro, soit par injection de l'ADN codant le système FRET. 17/ Organisme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un organisme transgénique, transfecté par un ADN codant le système FRET. 18/ Organisme selon l'une des revendications 16 à 17, caractérisé en ce que le système FRET est exprimé spécifiquement dans le muscle, le cerveau, le foie ou le c#ur. 19/ Organisme selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la modification de l'émission fluorescente est détectée par MPLSM.