FR 2853905 A1 20041022 FR 0304709 A 20030415 Indication du domaine technique: Les cellules dendritiques sont rares dans le sang. Elles sont spécialisées dans la présentation de l'antigène aux lymphocytes . On les dénomme : cellules présentatrices de l'antigène professionnelles. Elles sont actuellement utilisées entre autres comme un outil de vaccination anti-tumorale, dans différents essais cliniques nationaux ou internationaux. Ainsi l'idée consiste à les incuber avec un antigène tumoral connu ou un lysat de cellules tumorales, ou encore en présence de corps apoptotiques de cellules tumorales, avant de les injecter au patient, de façon à l'immuniser contre sa tumeur. Il existe plusieurs sortes de cellules dendritiques immunostimulantes. Parmi elles, on distingue classiquement les cellules dendritiques immatures et les cellules dendritiques matures. Les premières sont spécialisées dans la capture de l'Antigène, alors que les dernières sont spécialisées dans la présentation de l'Antigène et sont douées de capacité migratrice. Certains essais cliniques utilisent des cellules dendritiques immatures, avec l'idée qu'elles matureront in vivo ; d'autres utilisent des cellules dendritiques déjà matures. Les cellules dendritiques humaines représentent moins de 1 % des cellules mononucléées sanguines. De ce fait, des procédés ont été développés permettant de les produire à partir de cellules souches hématopoïétiques ( CD34+) ou d'autres dérivées du sang telles que les monocytes. Pour ce faire, selon les protocoles, des cytokines doivent être utilisées telles que GM-CSF, IL-4 , IL-13, IL-1, TNF ; SCF, IFN type 1 ou, FLT 3 ligand, pour induire la transformation des cellules initiales ( monocytes ou cellues CD34+) en cellules dendritiques. Un seul procédé à ce jour a été montré capable d'induire la transformation des monocytes en cellules dendritiques, celui-ci nécessite la culture des monocytes en présence de ionophore calcique pendant plusieurs jours . Indication de l'état de l'art Les cellules souches mésenchymateuses sont connues pour secréter bon nombre de cytokines, dont le GM-CSF et le SCF, Flt3-ligand , IL-1, et une variété d'interleukines, mais pas l'IL-4 ni l'IL-13. Elles expriment bon nombre de molécules d'adhésion et de récepteurs à différents facteurs de croissance. Enfin, elle produisent des protéines de la matrice extra-cellulaire. Grâce à ces propriétés , les cellules mésenchymateuses permettent le soutien nutritif et l'expansion des cellules souches hématopoïétiques ainsi que l'expansion de cellules leucémiques telles que celles provenant de la lignée myélo-monocytaire. Enfin, ces cellules souches sont capables de se différencier en diverses cellules tissulaires, tels que ostéoblastes, chondroblastes, myoblastes, fibroblastes, adipocytes, voire même neurones. Exposé de l'invention Du fait de leur capacité à secréter des cytokines connues pour induire la différenciation des monocytes ou des cellules CD34+ en cellules dendritiques et de leur expression de molécules d'adhésion, pour ce travail, nous avons eu l'idée d' utiliser les cellules souches mésenchymateuses comme source de cytokines naturelles et comme source d'échanges inter-cellulaires, afin d'obtenir la differenciation des monocytes humains en cellules dendritiques, sans besoin absolu de cytokines exogènes. Nous avons également eu l'idée d'entretenir ces cultures avec du surnageant de culture de cellules souches mésenchymateuses. Procédures générales de production de cellules dendritiques à partir de monocytes, et en présence de cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont obtenues à partir d'un prélèvement de moelle, ou à partir des filtres de perfusion de moelle, ou par tout autre moyen. Ces cellules sont initialement cultivées selon le procédé suivant : isolement par adhérence, milieu MEM alpha, en présence de sérum humain AB , ou de sérum de veau fetal., incubateur à 37 C, 5% C02. Après expansion, elles sont alors trypsinisées puis congelées ou utilisées pour le procédé. -Pour le procédé : les cellules mésenchymateuses sont lavées, puis placées dans des puits ou des flasques fabriquées dans un plastique permettant l'adhérence Elles sont déposées aux concentrations suivantes 200 000 à 500 000 cellules dans 3 ml , dans un milieu RPMI 1640+ 10% sérum humain, puis placées à l'étuve à 37 C, 5% C02 . A Jl, donc le lendemain, les monocytes humains purifiés, selon le procédé désiré ( colonne magnétique de purification, élutriation...), ou non purifiés tels que ceux contenus dans un prélèvement ou concentré de cellules mononucléées sanguines, sont ajoutés dans les puits contenant les cellules souches mésenchymateuses. La concentration optimale des monocytes est de 5 Millions pour 200 000 à 500 000 cellules souches mésenchymateuses mais d'autres ratio de cellules souches mésenchymateuses/monocytes peuvent être utilisés, en dehors de l'échelle optimale. Le milieu de culture est le même : RPMI 1640 + 10% de sérum humain, ( selon article Eljaafari et al, Human Immunol, 1998), ou sérum de veau fétal. De plus, à Jl du TNF alpha humain recombinant est rajouté ou non à la concentration de 200 UI/ml. Mais de l'IL-4 recombinante humaine ou de l'IL-13, de l'IL-1, ou de l'IFNalpha, -beta, -gamma , ou toute autre cytokine peuvent être rajoutés comme supplément de culture, en sus des cellules mésenchymateuses. Les plaques alors placées à l'étuve 37 C, 5% C02. A J3 ou J4 le milieu est changé pour moitié. Pour ce faire, du surnageant de culture provenant de cellules mésenchymateuses cultivées en RPMI+ sérum humain ou sérum de veau fétal prélevé à 24 h ou à des temps autres que 24h est utilisé. Pour produire ce surnageant Les cellules mésenchymateuses sont cultivées à la concentration de 200 000 à 500 000 cellules/3 ml dans des puits ou plaques plastiques, en présence de RPMI 1640 et de sérum humain ou sérum de veau fétal. De nouveau, si le TNF alpha a été ajouté dès Jl, alors 200UI/ml de TNF alpha recombinant humain est rajouté au surnageant de culture de cellules mésenchymateuses , au moment du changement de milieu. De même si de l'IL-4 recombinante humaine ou de l'IL-13, de l'IL-1, ou de l'IFN-alpha, -beta, -gamma , ou toute autre cytokine a été rajoutée comme supplément de culture, en sus des cellules mésenchymateuses. Puis à J5 ou J6 , les cellules différenciées à partir des monocytes sont soit récupérées pour analyse phénotypique, afin de démontrer leur différenciation en dendritiques immatures, soit induites à maturer en présence d'un agent maturant , pour exemple ici le TNF alpha recombinant humain, ou d'un agent de maturation autre que le TNF alpha. Pour cette étape de maturation, les cellules recueillies sont centrifugées puis placées dans un milieu de culture ; RPMI 1640 + 10%sérum humain AB, ou sérum de veau fétal, à la concentration de 1 million de cellules dans 6 ml, en l'absence de cellules mésenchymateuses et en l'absence de surnageant de cellules mésenchymateuses. 200 UI/ml de TNF alpha est alors rajouté , ou un autre agent de maturation. Cette phase de maturation dure 2 jours dans une étuve à 37 C, et 5% de C02. Mais une maturation spontannée des cellules dendritiques, peut être obtenue, en l'absence de tout agent de maturation exogène, et ce en les maintenant en culture en présence de cellules souches mésenchymateuses plus longtemps que 5 ou 6 jours. Tests effectués pour attester de la transformation des monocytes en cellules dendritiques : AJ5 (ou J6 ) et à (J7 ou J8) Tests phénotypiques : immunofluorescence à l'aide d'anticorps marquant les molécules de surface, par cytométrie de flux. Les anticorps utilsés visent à marquer les monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules souches mésenchymateuses, Tests fonctionnels :capacité de stimulation allogénique, c'est à dire induction d'une réponse lymphocytaire T suite à la stimulation par les cellules dendritiques obtenues, par le procédé selon invention et provenant d'un donneur exprimant des molécules HLA différentes de cellles des lymphocytes T Résultats : Tests d'immunomarquage A J5 (ou J6) : Ces résultats sont en faveur d'une différenciation vers la cellule dendritique immature : en effet nous observons une perte quasi totale de l'expression de CD14 ( marqueur des monocytes), minime acquisition de CD16 , perte de CD64 et CD32,( marqueur de phagocytose : fonction plutôt macrophagique), augmentation de l'expression de HLA-DR , CD86 et CD80 ( marqueur de la capacité des cellules à activer des lymphocytes) . Ces résultats sont comparables à ceux obtenus en cultivant classiquement des monocytes en présence de GM-CSF et IL-4 ( contrôle de référence) pendant 6 jours, afin d'obtenir des cellules dendritiques immatures. Ainsi, pour exemple, nous obtenons, tableau 1 les résultats suivants : ( ceux-ci confirment des expériences précédentes, pour exemple celle jointe comme planches de dessin) -expression de CD14 : 3% selon le procédé selon invention versus 1% selon le procédé classique de référence -expression de CD16 : 10% versus 2% -expression de CD80 : 39% versus 4% -expression de CD86 : 86% versus 95% et avec une Intensité moyenne de fluorescence ( MFI) à 168, versus 127 pour la MFI du controle -expression de CD64 : 2% versus 0.3% -expression de CD32 : 11% versus 5% A noter que l'expression des marqueurs de cellules mésenchymateuses est négative : CD73 et CD90. De plus toutes les cellules recueillies expriment le marqueur CD45 , ce qui signifie qu'elles ne sont pas du type mésenchymateuse, car ces dernières sont CD45 négatives. A J7 (ou J8) : tableau 2 Obtention de cellules dendritiques matures sous l'effet du traitement pendant 2 jours par le TNF alpha seul. Ainsi, nous observons une -perte totale de l'expression de CD14 ( marqueur des monocytes) -augmentation de l'expression des molécules HLA-DR, CD86, CD54: marqueur de la capacité de présentation de l'antigène -perte quasi totale des Récepteur Fc : CD16, CD64 , CD32, marquant les capacités de phagocytose, - acquisition de la molécule CD83, marqueur spécifique des cellules dendritiques matures. En comparaison aux cellules dendritiques de référence, (cellules dendritiques matures obtenues a partir de monocytes cultivés en GM-CSF/IL-4 pendant 6 jours puis TNF alpha pendant 2 jours) : -expression de CD14 1% -expression de CD 16 12% versus 1% -expression de CD80 39% versus 19%, MFI à 54 versus 31 -expression de CD86 95% versus 99% MFI à 361 versus 223 -expression de CD64 2% versus 1% expression de CD32 6% versus 1% expression de CD83 17% versus 18%, MFI à 94 versus 55 expression de HLA-DR 98% , MFI à 1475 expression de CD54 95% versus 98% , MFI à 304 versus 144 Au total, les résultats de l'immunomarquage montrent que cellules obtenues par le procédé selon invention se sont autant, si ce n'est plus différenciées en cellules dendritiques immatures puis matures que les cellules dendritiques obtenues selon le procédé classique ( GM-CSF/IL-4/TNFalpha). Il est à signaler que l'absence de TNF alpha dès le début des cultures ( dès Jl) permet d'obtenir à J5 des cellules dendritiques intermédiaires entre les cellules dendritiques immatures et les monocytes ( car bien que le taux de molécules CD14 ait diminué à leur surface, cette molécule reste encore significativement présente. De plus, ces cellules expriment la molécule CD16 à des nivaux non négligeables ) Par contre lorsqu'un agent de maturation, tel que le TNF alpha est utilisé à J5 ( ou J6) pour induire la maturation, ces cellules intermédiaires se différencient en cellules dendritiques matures . Ainsi leur phénotype à J7 est très proche de celui des cellules dendritiques obtenues en présence de TNF alpha pendant toute la culture ( cf tableau 2) . Fonction de présentation de l'antigène A en juger par les tests de culture mixte lymphocytaire allogéniques, effectués à J7 ( ou J8) les fonctions de ces cellules sont tout à fait comparables à celles de cellules dendritiques matures obtenues classiquement en présence de GM-CSF, IL-4 ( 6 jours ) puis TNF alpha ( 2 jours) . ( cellules de référence) En effet, les résultats montrent une induction de prolifération par des lymphocytes T alloréactifs très similaire à celles des cellules de référence : Ainsi, quelles que soient les concentration de cellules dendritiques stimulantes utilisées la prolifération des lymphocytes T répondants est de : 54720 , versus 49800 coup par minutes (cpm), 39666, versus 30213 cpm,, 11383 versus 11787 cpm,, pour des ratios de cellules effectrices/cellulles dendritiques de 30/ 1,10/1 , et 1/1 CD45 CD54 HLA DR CD14 CD86 CD80 CD83 % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean J5 Monos + MSC 98 168 89 57 96 457 23 46 68 55 10 31 1 167 Monos + MSC+TNF 95 158 87 156 95 859 3 42 88 168 39 87 11 40 Monos GMIIL4 ( REF) 100 166 97 49 100 589 1 90 95 127 4 33 3 69 CD19 CD16 CD64 CD32 CD11c CD73 CD90 % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean J5 Monos + MSC 3 48 46 65 2 54 44 50 97 537 3 83 12 128 Monos + MSC+TNF 2 105 10 85 2 462 11 62 96 398 4 122 9 124 Monos GM/IL4 (REF) 0,1 62 2 55 0,3 58 5 34 100 387 0,1 158 1 412 Tableau 1 J7 CD45 CD54 HLA DR CD14 CD86 CD80 CD83 J7 % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean MonosGMIIL4/TNF J7( RE 99 95 98 144 ND ND ND ND 99 223 19 31 18 55 MSC+Monos+TNFJ3/5 J7 97 182 95 304 98 1475 1 247 95 361 39 54 17 94 MSC+Monos+TNF J7 88 165 74 225 93 995 3 66 92 256 65 99 9 129 J7 CD19 CD16 CD64 CD32 CD11c CD73 CD90 % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean % Mean MonosGM/IL4/TNF(REF 7 30 1 375 1 435 1 174 99 205 1 31 1 56 MSC+Monos+TNFJ3/5 J7 5 122 12 96 2 291 6 96 98 592 2 67 1 71 MSC+Monos+TNF J7 11 98 7 94 2 44 2 113 95 486 4 53 6 55 Tableau 2 REVENDICATIONS 1) Procédé de culture cellulaire permettant la différenciation des monocytes en cellules dendritiques, sans besoin absolu de cytokines exogènes, caractérisé : en ce que l'on met en présence des cellules souches mésenchymateuses humaines avec des monocytes, afin d'obtenir la différenciation des monocytes humains en cellules dendritiques, dans un milieu contenant du sérum humain ou du sérum de veau fétal . - en ce que l'on réalise l'entretien des cultures avec du surnageant de culture, provenant de cellules souches mésenchymateuses cultivées dans un milieu contenant du sérum humain à J3( ou J4), prélevé à 24 heures ou à des temps autres que 24 heures. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise des monocytes purifiés ( selon n'importe quel procédé) ou non purifiés, tel que ceux contenus dans un concentré de cellules mononucléées sanguines. 3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la concentration optimale des monocytes est de 5 Millions pour 200 000 à 500 000 cellules souches mésenchymateuses . 4) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on facilite cette différenciation des monocytes en cellules dendritiques grâce à l'adjonction de TNF alpha recombinant humain , à 200 UI/ml, dès le début des cultures, comme supplément de culture, en sus des cellules souches mésenchymateuses et du surnageant de culture des cellules souches mésenchymateuses. 5) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on rajoute de l'IL-4 recombinante humaine ou de l'IL-13, de l'IL-1, ou de l'IFN-alpha, -beta, -gamma , ou toute autre cytokine comme supplément de culture, en sus des cellules mésenchymateuses et du surnageant de culture de cellules mésenchymateuses pour faciliter la différenciation des monocytes humains en cellules dendritiques. 6) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on poursuit la culture des cellules dendritiques en induisant leur maturation, à J5 ou J6, en les exposant à un agent de maturation tel que le TNF alpha, à 200 UI/ml et ce en l'absence de cellules mésenchymateuses et de surnageant de culture de cellules mésenchymateuses. 7) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on poursuit la culture des cellules dendritiques en induisant leur maturation, à J5 ou J6, par un autre agent que le TNF alpha 8) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on obtient une maturation spontannée des cellules dendritiques en l'absence de tout agent de maturation exogène, et ce en les maintenant en culture en présence de cellules souches mésenchymateuses plus longtemps que 5 ou 6jours.