FR 2848570 A1 20040618 FR 0215695 A 20021212 Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) et plantes tolérantes aux herbicides la contenant [0001] La présente invention concerne une nouvelle cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes aux herbicides inhibiteurs de cette, en particulier des herbicides de la famille des acides phosphoniques, en particulier de la famille de la N-phophonométhylglycine. Etat de la technique [0002] Un des principaux problèmes de l'agriculture réside dans le contrôle du développement de plantes adventices indésirables, ou mauvaises herbes, dans les surfaces cultivées. Le développement des mauvaises herbes conduit à un affaiblissement des plantes cultivées et à une diminution des rendements de leur culture. Afin de lutter contre ces plantes indésirables, des herbicides sont employés, généralement par pulvérisation sur les cultures. De nombreux types d'herbicides existent, en particulier des herbicides sélectifs qui n'agissent que sur un groupe de plantes particulières sans affecter la plante cultivée. L'inconvénient des herbicides sélectifs est que leur spectre d'activité est généralement restreint, ce qui nécessite l'emploi d'autres herbicides sélectifs avec des spectres d'activité différents pour contrôler efficacement les plantes indésirables. La solution à cet inconvénient réside dans l'utilisation d'herbicides totaux capables d'agir sur toutes le plantes. Les herbicides totaux sont souvent des herbicides ayant pour cible des enzymes impliquées dans les voies métaboliques vitales des plantes, ce qui leur confère l'avantage d'avoir un large spectre d'activité sur des plantes d'origines phylogénétiques éloignées. Toutefois, de tels herbicides présentent également l'inconvénient majeur, lorsqu'ils sont appliqués sur des cultures pour éliminer les plantes indésirables, d'agir également sur les plantes cultivées. Cet inconvénient peut être pallié par l'utilisation de plantes cultivées tolérantes aux dits herbicides. De telles plantes sont généralement obtenues par génie génétique en introduisant dans leur génome un gène codant une enzyme de résistance audit herbicide de manière à ce qu'elles surexpriment ladite enzyme dans leurs tissus. L'EPSPS est une enzyme plastidiale impliquée dans la voie de biosynthèse du shikimate, conduisant à la synthèse des acides aminés aromatiques. L'EPSPS est connue pour être l'enzyme cible des herbicides de la famille des acides phosphoniques de type phophonométhylglycines. Les herbicides inhibiteurs de 5-énol pyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) sont bien connus comme étant des herbicides foliaires hautement efficaces. L'herbicide le plus connu de cette classe d'herbicide est le glyphosate [N-(phosphonométhyl)glycine]. On connaît également le sulfonate, ou la fosametine. Le glyphosate se caractérise par un manque de sélectivité pour les espèces cultivées et est par conséquent généralement utilisé dans des conditions dans lesquelles il n'y a aucun besoin de sélectivité, par exemple comme herbicide total. Afin de pallier le problème de sélectivité du glyphosate, des plantes tolérantes à cet herbicide ont été développées par transformation desdites plantes avec un gène codant pour une enzyme EPSPS tolérante au glyphosate. Des gènes codant pour des enzymes EPSPS tolérantes au glyphosate sont notamment décrits dans la demande de brevet EP 0837944. En particulier, du maïs et du soja tolérants au glyphosate sont commercialisés respectivement sous les marques Roundup-Ready CornTM et Roundup-Ready SoybeanTM. De cette manière, le glyphosate peut être appliqué sur les cultures sans affecter les plantes cultivées qui y ont été rendues tolérantes. La réussite de cette stratégie repose essentiellement sur la qualité et la quantité de l'expression de l'enzyme dans les tissus de la plante que l'on souhaite rendre tolérante. Ces paramètres de qualité et de quantité de l'expression sont contrôlés par les éléments régulateurs introduits dans la cassette d'expression avec la séquence d'acide nucléique codant pour ladite enzyme EPSPS. Les éléments régulateurs essentiels à une cassette d'expression sont la séquence de régulation promotrice et la séquence de régulation terminatrice. Les cassettes d'expression peuvent également contenir un peptide signal ou peptide de transit, ainsi qu'un élément activateur de transcription ou enhancer. Toutefois, l'élément régulateur contribuant le plus à la qualité et la quantité d'expression d'une protéine codée par une séquence d'acide nucléique dans une cassette d'expression est le promoteur. L'identification du promoteur approprié à l'expression d'une protéine donnée dépend donc largement de la nature de ladite protéine, et en particulier de la quantité et de la qualité souhaitée de l'expression de ladite protéine. A un promoteur donné est associée une quantité d'expression du produit codé par la séquence d'acide nucléique qu'il contrôle, ainsi qu'une qualité, notamment spatio-temporelle de cette expression. En outre, certains promoteurs sont constitutifs et d'autres inductibles. ] Une caractéristique importante pour un promoteur utilisé dans une cassette d'expression destinée à l'expression d'une enzyme EPSPS dans une plante est qu'il doit permettre une expression quantitative suffisante pour conférer une tolérance au glyphosate à tous les tissus de la plante susceptibles d'être atteints par cet herbicide. Le problème technique de la présente invention consiste à obtenir une cassette d'expression dont le promoteur est particulièrement adapté à l'expression quantitative et qualitative d'une enzyme EPSPS dans des plantes transformées, ladite cassette d'expression conférant alors une tolérance efficace aux dites plantes vis-à-vis d'un herbicide inhibiteur de cette enzyme, en particulier un herbicide de la famille des phophonométhylglycines, en particulier le glyphosate. Les promoteurspermettant un niveau d'expression élevé sont généralement des promoteurs de protéines fortement exprimées. Parmi les promoteurs les plus couramment utilisés répondant à ces critères, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (US 5,641,876). D'autres promoteurs s'expriment spécifiquement dans les cellules de certains tissus. De tels promoteurs sont en général des promoteurs régulant l'expression de protéines impliqués dans le fonctionnement d'un tissu ou d'un organe particulier. Chez les plantes, on connaît des promoteurs spécifiques de racines comme par exemple celui décrit dans la demande de brevet WO 00/29594, des promoteurs spécifiques des fleurs tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 98/22593, WO 99/15679 ou WO 99/43818, des promoteurs spécifiques des fruits, en particulier des graines comme ceux décrits dans les demandes de brevets WO 91/13993, WO 92/17580, WO 98/45460, WO 98/45461, ou WO 99/16890. Description [0011]La présente invention concerne une nouvelle cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription, liés entre-eux de manière opérationelle, une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence d'acide nucléique choisie parmi les séquences de régulation promotrice du virus de plante CsVMV (Cassava Vein Mosaic Virus). L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que leur fonctionnement soit coordonné et permette l'expression de la séquence codante. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'assurer l'expression de ladite séquence codante. La construction d'un gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Par "fonctionnels dans les cellules végétales et les plantes", on entend capables de fonctionner dans les cellules végétales et les plantes. Des séquences de régulation promotrices de CsVMV sont décrites dans la demande de brevet WO 97/48819 (dont le contenu est incorporé ici par référence), en particulier la séquence de régulation promotrice comprenant l'une des séquences nucléotidiques représentées par l'un des identificateurs de séquences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9,10, 11, 12,13, 14,15 ou 16 de la demande de brevet WO 97/48819, plus particulièrement la séquence d'acide nucléique représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 3 de la demande de brevet WO 97/48819. Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence de régulation promotrice de la cassette d'expression comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acides nucléiques X, Y et Z telles que définies respectivement par les SEQ ID NO: 1, 2 et 3 de la présente demande de brevet. ] Selon la présente invention, une séquence de régulation promotrice préférée pour la cassette d'expression est représentée par la SEQ ID NO: 4 de la présente demande de brevet. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, la séquence de régulation promotrice de la cassette d'expression comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acides nucléiques X, Y, Y et Z telles que définies précédemment. La séquence de régulation promotrice comprenant la duplication de la séquence d'acide nucléique Y sera appelée double CsVMV. De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique du double CsVMV est représentée par la SEQ ID NO: 5 de la présente demande de brevet. La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec les séquences d'acides nucléiques ci-dessus, les séquences homologues des séquences ci-dessus, et les fragments fonctionnels desdites séquences. Selon la présente invention, on entend par "séquence d'acide nucléique" une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin. Par "séquence capable de s'hybrider de manière sélective", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences définies par les séquences ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50 C-60 C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual). Par "homologue", on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence selon l'invention et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine de fusion. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10). Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395). Par "fragments", on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN selon l'invention, c'est-à-dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été supprimées mais qui conservent la fonction desdites séquences. Par EPSPS, on entend selon l'invention toute enzyme 5-énol pyruvyl shikimate-3phosphate synthase, native ou mutée, dont l'activité enzymatique consiste à synthétiser du 5-0- (1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimate à partir de phosphoenolpyruvate (PEP) et de 3phosphoshikimate (E.C. 2.5.1.19; Morell et al., 1967, J. Biol. Chem. 242,82-90). En particulier, ladite enzyme EPSPS peut provenir de tout type d'organisme. Une enzyme EPSPS selon l'invention possède également la propriété d'être tolérante vis-à-vis des herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier vis-à-vis du glyphosate. Des séquences codant pour des EPSPS naturellement tolérantes, ou employées comme telles, vis-à-vis des herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier du glyphosate, sont connus. A titre d'exemple, on peut citer la séquence du gène AroA de la bactérie Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221,370-371), la séquence du gène CP4 de la bactérie Agrobacterium sp. (WO 92/04449), ou les séquences des gènes codant l'EPSPS de Petunia (Shah et al., 1986, Science 233,478-481), de Tomate (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263,4280-4289), ou d'Eleusine (WO 01/66704). Des séquences codant pour des EPSPS rendues tolérantes au glyphosate par mutation sont également connus. A titre d'exemple, on peut citer les séquences des gènes codant des EPSPS mutées d'origine bactérienne (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260 (8), ou d'origine végétale (EP 0293358 ; et al., 1991, Plant Physiol. 96(S), Abstract 592 ; WO 91/04323 ; WO 92/06201 ; 0837944). Une séquence de gène codant une EPSPS végétale mutée préféré selon l'invention est celle codant l'EPSPS de maïs décrite dans la demande de brevet EP 0837944, comprenant une première mutation remplaçant l'acide aminé thréonine en position 102 par l'isoleucine, et une seconde mutation remplaçant l'acide aminé proline en position 106 par la sérine. En raison de la forte homologie de séquences entre les EPSPS, et plus particulièrement entre les EPSPS végétales, une EPSPS de riz portant les même mutations a également été décrite dans les demandes de brevets WO 00/66746 et WO 00/66747. D'une manière générale, toute EPSPS, et les gènes les codant, portant les mutations thréonine/isoleucine et proline/sérine décrites ci-dessus, quelque soit la position relative de ces acides aminés par rapport aux positions 102 et 106 de l'EPSPS de maïs, sont utilisables dans la présente invention. Pour l'application de ce principe, un homme du métier saura aisément retrouver les deux acides aminés à muter dans toute séquence d'EPSPS en employant les techniques standards d'alignement de séquences. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS comprise dans la cassette d'expression est une séquence codant pour une EPSPS mutée au niveau des acides aminés correspondant à la thréonine en position 102 et à la proline en position 106, lesdites positions étant relatives par rapport à la séquence d'EPSPS de maïs. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS comprise dans la cassette d'expression est une séquence codant pour une EPSPS mutée comprenant une isoleucine en position 102 et une sérine en position 106, lesdites positions étant relatives par rapport à la séquence d'EPSPS de maïs. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS comprise dans la cassette d'expression est une séquence codant pour l'EPSPS mutée de maïs comprenant une isoleucine en position 102 et une sérine en position 106. Parmi les séquences terminatrices pouvant être utilisées dans la cassette d'expression selon la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple la séquence terminatrice nos du gène codant la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11(2), 369-385), ou la séquence terminatrice d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. La cassette d'expression selon l'invention peut également comprendre une séquence d'adressage subcellulaire, codant un peptide signal ou un peptide de transit. Une telle séquence, située en amont ou en aval de la séquence d'acide nucléique codant pour l'EPSPS, permet de diriger ladite EPSPS de manière spécifique dans un compartiment cellulaire de l'organisme hôte. Par exemple, la cassette d'expression peut comprendre une séquence codant un peptide signal ou un peptide de transit permettant de diriger l'EPSPS vers un compartiment particulier du cytoplasme comme les mitochondries, les plastes, le réticulum endoplasmique ou les vacuoles. Le rôle de telles séquences est notamment décrit dans le numéro 38 de le revue Plant Molecular Biology (1998) consacré en grande partie aux transports des protéines dans les différents compartiments de la cellule végétale (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144 ; the nuclear pore complex pp 145-162 ; protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-207 ;multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209-221 ; protein import in plants pp 311-338). Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries. Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire qu'ils comprennent, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909. Selon l'invention, la cassette d'expression peut également comprendre d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription (enhancer), comme par exemple l'activateur de transcription du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed, ou du virus de la mosaïque du figwort (Figwort Mosaic Virus, US 5 994 521). La cassette d'expression selon l'invention peut aussi contenir des introns, en particulier des intron favorisant l'expression des gènes dans les plantes monocotylédones tels que l'intron 1 du gène de l'actine de riz décrit dans la demande de brevet WO 99/34005, ou l'intron adhl de maïs, ou dans les plantes dicotylédones comme l'intron histone d'Arabidopsis (EP 0850311). La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une casse' ,e d'expression selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte, en particulier d'une plante, et exprimer dans celui-ci une EPSPS. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une EPSPS. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci de la cassette d'expression selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus de la cassette d'expression selon l'invention, une autre cassette d'expression contenant un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte à transformer est une plante. Parmi les marqueurs de sélection utilisables, on peut citer des marqueur contenant des gènes de résistance aux antibiotiques tel que, par exemple, celui du gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gene 25 :179-188), mais également des marqueurs contenant des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18 :1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (EP 0837944) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, et WO 97/04103. ] La présente invention concerne également des cellules végétales transformées avec un vecteur tel que décrit ci-dessus. On entend par "cellule végétale transformée", une cellule végétale qui a incorporé dans son génome la cassette d'expression selon l'invention, et produit en conséquence une EPSPS. Pour obtenir les cellules végétales transformées selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues. Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules végétales à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules végétales ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules végétales ou les tissus végétaux par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de "biolistique" pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules végétales ou des tissus végétaux avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696 ; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3):315- 330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature des cellules végétales à transformer. La présente invention a également pour objet un procédé de production de plantes tolérantes aux herbicides inhibiteurs de l'EPSPS, en particulier aux herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier au glyphosate. Ce procédé consiste à régénérer des plantes transformées à partir des cellules végétales transformées décrites ci-dessus. Par ce procédé, les plantes transformées selon l'invention contiennent une cassette d'expression selon l'invention dans leur génome et expriment dans leurs tissus une EPSPS. La présente invention comprend donc des plantes transformées comprenant une cassette d'expression selon l'invention, des parties de ces plantes, et la descendance de ces plantes. On entend par "partie de ces plantes", tout organe de ces plantes, qu'il soit aérien ou souterrain. Les organes aériens sont les tiges, les feuilles, les fleurs. Les organes souterrains sont principalement les racines, mais ils peuvent également être des tubercules. Par "descendance", on entend principalement les graines contenant les embryons issus de la reproduction de ces plantes entreelles. Par extension, le terme "descendance" s'applique à toutes les graines formées à chaque nouvelle génération issue de croisements entre une plante et la plante transformée par le procédé selon l'invention. La présente invention a donc pour objet des plantes transformées dans le génome desquelles au moins une cassette d'expression selon l'invention est intégrée de manière stable. Les plantes ainsi transformées sont tolérantes aux herbicides inhibiteurs de l'EPSPS, en particulier aux herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier au glyphosate. Les plantes transformées selon l'invention incluent également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes ci-dessus, ainsi que les graines de telles plantes. Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre, en plus d'une cassette d'expression selon l'invention, au moins une autre cassette d'expression contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt. Parmi les polynucléotides codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer des polynucléotides codant une autre enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, ou le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567; WO 99/24585; WO 99/24586) pour la tolérance au isoxazoles. On peut également citer un polynucléotide codant pour une toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une toxine de la bactérie Bacillus thuringiensis (pour exemple, voir International Patent Application WO 98/40490). Peuvent également être contenus dans ces plantes d'autres polynucléotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866,778, ou un polynucléotide codant pour un peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et W099/91089. On peut également citer des polynucléotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552,306, US 5,614,313, et demandes de brevet WO 98/46763 et WO 98/46764, ou un polynucléotide codant pour une enzyme sérine acétyltransférase (SAT) tel que décrit dans les demandes de brevets WO 00/01833 et WO 00/36127. Les cassettes d'expression supplémentaires peuvent être intégrées au moyen du vecteur selon l'invention. Dans ce cas, le vecteur comprend la cassette d'expression selon l'invention et au moins une cassette d expression codant pour une autre protéine d'intérêt. Elles peuvent également être intégrées au moyen d'au moins un autre vecteur comprenant ladite cassette d'expression supplémentaire, selon les techniques usuelles définies ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant la cassette d'expression selon l'invention, l'autre portant une autre cassette d'expression codant pour au moins une autre protéine d'intérêt. Les plantes transformées selon l'invention peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones. De préférence, ces plantes sont des plantes d'intérêt agronomique. De manière avantageuse, les plantes monocotylédones sont le blé, le maïs, le riz. De manière avantageuse, les plantes dicotylédones sont le colza, le soja, le tabac, le coton. La présente invention concerne également un procédé de protection des plantes cultivées vis-à-vis des herbicides inhibiteurs de l'EPSPS, en particulier aux herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier au glyphosate, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé de traitement des plantes selon l'invention, caractérisé en ce que l'on traite lesdites plantes avec herbicide inhibiteur de l'EPSPS, en particulier un herbicide de la famille des phophonométhylglycines, en particulier le glyphosate. La présente invention concerne également un procédé de contrôle des plantes indésirables dans les cultures, caractérisé en ce que l'on cultive des plantes transformées comprenant une cassette d'expression selon l'invention, et que l'on traite lesdites plantes avec un herbicide inhibiteur de l'EPSPS, en particulier un herbicide de la famille des phophonométhylglycines, en particulier le glyphosate. La présente invention concerne également un procédé de culture de plantes transformées comprenant une cassette d'expression selon l'invention, caractérisé en ce qu'il consiste à planter des graines desdites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture desdites plantes, à appliquer sur ladite surface dudit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle lesdites graines ou lesdites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide. Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité herbicide, plus préférentiellement un herbicide inhibiteur de l'EPSPS, en particulier un herbicide de la famille des phophonométhylglycines, en particulier le glyphosate. ] Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. En particulier, et à moins qu'il n'en soit précisé autrement dans les exemples, toutes les techniques d'ADN recombinant employées sont mises en #uvre selon les protocoles standards décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, Nolan C. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), dans Sambrook and Russel (2001, Molecular cloning: A laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), dans Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current protocols, USA, Volumes 1 and 2), et dans Brown (1998, Molecular Biology LabFax, Second edition, Academic Press, UK). Des matériels et méthodes standards pour la biologie moléculaire des plantes sont décrits dans Croy R. D.D. (1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK). Des matériels et méthodes standards pour la PCR (Polymerase Chain Reaction) sont également décrits dans Dieffenbach and Dveksler (1995, PCR Primer : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) et dans McPherson et al. (2000, PCR - Basics : background to bench, First edition, Springer Verlag, Germany). Exemples Example 1: Clonage de la séquence du promoteur CsVMV dans le vecteur de clonage multiple pRD 254 Le plasmide pILTAB 357 fourni par The Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA), contient les éléments suivants dans un vecteur pBIN 19 (Clontech): - Promoter CsVMV (séquence décrite par SEQ ID NO: 4) - Site de clonage multiple - Terminateur NOS Trois régions ont été définies dans la séquence du promoteur CsVMV, dénommées CsVMV X, CsVMV Y, et CsVMV Z. - CsVMV X : de la position 10 à la position 227 (SEQ ID NO 1, longueur 218 bp) - CsVMV Y : de la position 228 à la position 394 (SEQ ID NO 2, longueur 167 bp) - CsVMV Z : de la position 397 à la position 522 (SEQ ID NO 3, longueur 126 bp) Dans la séquence originale du promoteur CsVMV, les régions X et Y sont adjacentes, et les régions Y et Z sont séparées par la séquence AT de 2 bp. Le vecteur de clonage pRD 254 correspond au vecteur commercial pBlueScript II SK (-) (Clontech) ayant subi une mutagenèse de manière à remplacer le site unique Sca 1 contenu dans le gène ApR gene par un site Pvu II. Les 532 bp contenues entre les sites Hind III et Xba 1 de pILTAB 357 ont été clonées dans le vecteur de clonage pRD 254 pour obtenir le plasmide pRD 257. Exemple 2 : Créationd'une cassette d'expression CsVMV-EPSPS Une cassette d'expression introduite dans un plasmide dénommé pSF29 a été mise au point. La cassette pSF29 comprend le promoteur CsVMV tel que décrit par l'identificateur de séquence SEQ ID NO-4, la séquence codant pour le peptide de transit optimisé (OTP) tel que décrit dans la demande de brevet EP 0508909, la séquence codant pour l'EPSPS de maïs comprenant les mutations thréonine102isoleucine et prolinel06sérine telle que décrite dans la demande de brevet EP 0837944, et le terminateur nos tel que décrit dans Bevan et al. (1983, Nucleic Acids Res. 11(2), 369-385). Exemple 3: Integration de la cassette d'expression dans un vecteur-T-DNA d'Agrobacterium Un plasmide navette est utilisé pour être recombiné dans le plasmide de type superbinaire pTVK 291 (Jun et al., 1987). La recombinaison entre les sites COS uniques présents sur les deux plasmides conduit à une molécule circulaire unique correspondant à la fusion des deux plasmides. La recombinaison entre pSF29 et le plasmide superbinaire pTVK 291 a été obtenue par croisement tri-parental avec DH5 alpha [pSF29], C2110 [pTVK 291], et la souche JC2073 (souche dite "helper"). Le plasmide résultant est dénommé pSFK29. La souche obtenue, C2110 [pSFK29] a été sélectionnée sur milieu LB contenant les 3 antibiotiques gentamycine, kanamycine et acide nalidixique. L'acide nalidixique permet la sélection de C2110 contre DH5 alpha ou JC2073; puisque C2110 contient une résistance chromosomique à l'acide nalidixique qui ne peut être transférée aux autres souches durant le croisement. L'association de la gentamycine et de la kanamycine permet la sélection des bactéries contenant pSF29 et pTVK 291. De plus, pSF29 ne peut se répliquer dans C2110, à moins d'avoir été recombiné avec pTVK 291, puisque C2110 contient l'origine de réplication RK2 supportée par pTVK 291, mais pas l'origine de réplication pBR 322 supportée par pSF29. Le plasmide recombinant a ensuite été transféré dans la souche d'Agrobacterium LBA 4404 par un deuxième croisement triparental. La souche résultante LBA 4404 [pSFK29] a été sélectionnée sur milieu AB (sélectif pour Agrobacterium) contenant de la kanamycine et de la gentamycine. Exemple 4 : Transformation de maïs par Agrobacterium tumefaciens avec une cassette d'expression CsVMV-EPSPS La transformation du maïs, Zea mays par Agrobacterium a été effectuée selon la méthode décrite dans Ishida, Y. et al., (1996, Nature Biotechnology, 14,745-750). La souche désarmée d'Agrobacterium tumef@iciens décrite à l'exemple 3 est co-cultivée avec des embryons immatures de maïs. Une sélection avec 0,88 mM de glyphosate est appliquée sur les embryons. Les événements de transformation obtenus à partir des cals résistants sont ensuite croisés en retour ("back-cross"), et leur descendance est testée pour la tolérance au glyphosate. Exemple 5 : de tolérance au glyphosate des événements de transformation 20 graines par événement obtenus ont été semées en serre en godets dans un terreau riche, et un traitement en post-émergence au stade 3 à 4 feuilles a été réalisé avec une dose de glyphosate correspondant à 4 kg/ha (soit 4kg de matière active pour 500 1) à l'aide d'une tour de traitement calibrée. Les événements survivant au traitement sont ensuite comptabilisés. Les résultats montrent que 90% des événements de transformation contenant la cassette d'expression CsVMV-EPSPS ont des plantes capables de tolérer une dose correspondant à 4 kg/ha de glyphosate. Une disparité dans le nombre de plantes tolérantes pour chaque événement testé est due au fait que ces événements sont hétérozygotes pour le trait (la cassette d'expression CsVMVEPSPS), ont un ou plusieurs loci d'intégration, et que certains événements de transformation, de par la position de l'insertion de la cassette, procurent une meilleure expression de l'EPSPS, donc une meilleure tolérance au glyphosate. Revendications 1- Cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription, liés entre-eux de manière fonctionnelle, une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS et une séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence d'acide nucléique choisie parmi les séquences de régulation promotrices du virus de plante CsVMV (Cassava Vein Mosaic Virus) 2- Cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acides nucléiques X, Y et Z telles que définies respectivement par les SEQ ID NO: 1, 2 et 3 3- Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice est représentée par la SEQ ID NO: 4 4- Cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice est représentée par la SEQ ID NO: 5 5- Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS est une séquence codant pour une EPSPS mutée au niveau des acides aminés correspondant à la thréonine en position 102 et à la proline en position 106, lesdites positions étant relatives par rapport à la séquence d'EPSPS de maïs. 6- Cassette d'expression selon la revendication 5, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS est la séquence codant pour une EPSPS mutée comprenant une isoleucine en position 102 et une sérine en position 106, lesdites positions étant relatives par rapport à la séquence d'EPSPS de maïs. 7- Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une EPSPS mutée est la séquence codant pour une EPSPS mutée de maïs comprenant une isoleucine en position 102 et une sérine en position 106 8- Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus un peptide de transit double comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale 9- Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation de cellules végétales ou de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 8 10- Cellules végétales transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 8 11- Plante transformée, caractérisée en ce qu'elle est comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 8 12- Graines de plante transformée selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon la revendication 8 13- Procédé de traitement des plantes selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on traite lesdites plantes a@ ec herbicide inhibiteur de l'EPSPS 14- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit herbicide inhibiteur de l'EPSPS est le glyphosate 15- Procédé de contrôle des plantes indésirables dans les cultures, caractérisé en ce que l'on cultive des plantes transformées selon la revendication 11, et que l'on traite lesdites plantes avec un herbicide inhibiteur de l'EPSPS 16- Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit herbicide inhibiteur de l'EPSPS est le glyphosate 17- Procédé de culture de plantes transformées selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il consiste à planter des graines desdites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture desdites plantes, à appliquer sur ladite surface dudit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle lesdites graines ou lesdites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.