FR 2840995 A1 20031219 FR 0207495 A 20020618 PROCEDE DE DENOMBREMENT DE PLAQUETTES EN PHASE SOLIDE. La présente invention se rapporte à un procédé de détection et/ou de comptage de plaquettes en phase solide. Dans le domaine de la transfusion sanguine, il a été montré que l'utilisation de dérivés plasmatiques ayant des taux de leucocytes et de plaquettes réduits permet de diminuer la fréquence de complications sévères liées à la transfusion sanguine, incluant l'apparition de réactions fébriles, la formation d'alloanticorps, la transmission de virus ou encore la maladie de CreutzfeldtJacob. Egalement les principaux vecteurs pour la transmission de l'agent causal de l'encéphalite spongiforme bovine (BSE) sont les leucocytes et les plaquettes et de ce fait la leucoréduction contribue à diminuer les risques potentiels lies à l'agent causal de la BSE. Ainsi, dans le but de sécuriser les traitements mettant en #uvre des tels dérivés sanguins, les organismes chargés de la sécurité desdits dérivés recommandent une réduction des concentrations de ces cellules, telle qu'une réduction de la concentration en leucocytes dans les concentrés plaquettaires, les concentrés de globules rouges et le plasma et une réduction de la concentration en plaquettes dans le plasma. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé sanguin tant le plasma, que le sang appauvri en cellules. Dès lors, il apparaît que la mise à disposition des établissements chargés de contrôler la sécurité des dérivés sanguins, mais aussi des laboratoires de recherche et des laboratoires cliniques qui ont besoin de procédés fiables et sensibles de détection et comptage de plaquettes dans lesdits dérivés sanguins, présente un intérêt majeur. A ce jour, il n'existe pas de méthode fiable permettant de détecter de faibles concentrations de plaquettes dans le plasma. Afin de résoudre ce problème, la demanderesse a mis en #uvre un procédé de dénombrement de plaquettes dans les produits sanguins présentant une grande sensibilité et réalisable dans des délais courts. Ce procédé est particulièrement bien adapté au dénombrement des plaquettes dans le plasma. Le procédé de dénombrement de plaquettes de l'invention comprend une détection en phase solide des plaquettes résiduelles sur une membrane et ne nécessite pas d'étape de concentration préalable. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de dénombrement de plaquettes éventuellement présentes dans un dérivé sanguin caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation d'un échantillon dudit dérivé sanguin avec un marqueur spécifique des plaquettes, b) la filtration de l'échantillon obtenu à l'étape (a) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les plaquettes, pour obtenir une préparation en phase solide des plaquettes marquées, éventuellement présentes dans ledit échantillon, c) l'analyse de la préparation en phase solide de l'étape (b), pour dénombrer les plaquettes marquées éventuellement présentes sur celle-ci. Par membrane non-autofluorescente, on entend toute membrane qui n'émet pas de fluorescence, ni par ellemême, ni en présence de fluorochromes, ni sous l'effet des excitations lumineuses de l'analyseur, de telle manière qu'elle n'interfère pas avec les mesures effectuées par l'analyseur. Par marqueur spécifique des plaquettes, on entend tout anticorps susceptible de se fixer sur les plaquettes ou tout marqueur des enzymes intra plaquettaires. Selon un mode de réalisation préféré, le marqueur de leucocytes utilisé à l'étape (a) du procédé de l'invention est un anticorps monoclonal spécifique des plaquettes choisi parmi un anticorps anti-CD41, un anticorps anti-CD36, un anticorps anti-CD9, un anticorps anti-CD42 ou un mélange de ceux-ci. Selon un mode préféré de mise en #uvre du procédé de l'invention, le marqueur des plaquettes utilisé à l'étape (a) est un anticorps spécifique des plaquettes marqué par conjugaison directe avec un fluorochrome. Lorsqu'un anticorps directement marqué est utilisé, la durée d'incubation entre l'échantillon et ledit marqueur à l'étape (a) peut être comprise entre 5 et 60 minutes, de préférence entre 10 et 30 minutes et tout préférentiellement elle est de 20 minutes. Selon un deuxième mode de réalisation préféré, l'anticorps spécifique de plaquettes utilisé à l'étape (a) est marqué indirectement par incubation avec un deuxième anticorps spécifique d'espèce conjugué avec un fluorochrome. De préférence, le fluorochrome est choisi parmi le groupe des fluorochromes excitables à une longueur d'onde de 488 nm et émettant à des longueurs d'onde comprises entre 500 et 530 nm , notamment la fluorescéine et ses dérivés ou à des longueurs d'onde comprises entre 540 et 570 nm, notamment la Phycoérythrine et dérivés. Dans ce dernier cas, la durée d'incubation entre l'échantillon préalablement incubé avec le premier anticorps spécifique des plaquettes et le deuxième anticorps marqué peut être comprise entre 5 et 60 minutes, de préférence entre 10 et 30 minutes et tout préférentiellement elle est de 20 minutes. Selon un troisième mode de réalisation, le marqueur spécifique des plaquettes utilisé à l'étape (a) est un substrat des enzymes intraplaquettaires de type ester fluorogénique révélant la présence des estérases par transformation de la molécule de base non fluorescente en une molécule fluorescente sous l'action de l'enzyme. Parmi les esters fluorogéniques, on peut citer la fluorescéine diacetate ou la carboxyfluorescéine diacetate et leurs dérivés (J-P Diaper et al., Journal of applied bacteriology, 1994,77, 221-228 ; J. Porter et al., Journal of applied bacteriology, 1995,79, 399-408). Lorsqu'un substrat estérasique est utilisé, l'échantillon est d'abord filtré puis le filtre ayant retenu les plaquettes est positionné sur une membrane imprégnée de substrat. La durée d'incubation entre l'échantillon et ledit marqueur à l'étape (a) peut être comprise entre 5 et 120minutes, de préférence entre 10 et 90 minutes et tout préférentiellement elle est de 15 minutes pour une température d'incubation de 33 C à 37 C et elle est de 60 minutes pour une température d'incubation de 28 C à 32 C. Selon un mode préféré de mise en #uvre du procédé de l'invention, la membrane non autofluorescente mise en #uvre à l'étape (b) est une membrane noire. La taille des pores de la membrane mise en #uvre à l'étape (b) peut-être comprise entre 0,05 m et 4 m, de préférence elle est comprise entre 0,1 m et 2 m et préférentiellement elle est de 0,4 m. Eventuellement, le procédé de l'invention peut comporter une étape supplémentaire de lavage, après la filtration de l'étape (b) par filtration sur celle-ci d'un volume de tampon. Ce lavage permet d'éliminer un éventuel bruit de fond sur la membrane provoqué par des traces du marqueur. L'analyse de la membrane à l'étape (b) du procédé peut être effectué au moyen d'un analyseur capable de détecter des évènements marqués en fluorescence et en particulier au moyen d'un analyseur laser à balayage. Le procédé de l'invention est particulièrement utile pour : - dénombrer les plaquettes lors des contrôles de qualité des plasmas destinés aux transfusions sanguines, - évaluer les taux de réduction des plaquettes pour des tests qui requièrent des plasmas complètement deplaquettés, tels que le dénombrement de microparticules ou certains tests d'exploration de l'hémostase et de la coagulation. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un procédé de dénombrement de plaquettes ci-dessus pour le contrôle de qualité des filtres de plaquettes et la supervision des banques de sang. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et de la figure 1 en annexe qui montre les résultats de la détection de plaquettes dans du plasma à partir de dilutions en série d'une suspension contenant des plaquettes ensemencées, obtenus avec la méthode de détection de l'invention. PARTIE EXPERIMENTALE- EXEMPLES I - DETECTION DES PLAQUETTES L'objet de cette étude est de déterminer la capacité du procédé de dénombrement de plaquettes en phase solide pour détecter de faibles nombres de plaquettes dans du plasma. I.1 Préparation du plasma. Le plasma est obtenu à partir d'un concentré plaquettaire appauvri en plaquettes, par centrifugation puis filtration sur un filtre de porosité 0,22 m, il est désigné ci-après FPPP ( Filtered Platelet Poor Plasma ou Plasma appauvri en plaquettes filtré). Ce plasma FPPP est également utilisé comme contrôle négatif. Des dilutions en série des plaquettes, sont préparées à partir de concentrés plaquettaires dans du FPPP. 1.1.1 Matériel - Des concentrés plaquettaires conservés à 20 C-24 C durant trois jours au maximum, issus de la préparation de couches leucoplaquettaires ou de plasmas riches en plaquettes. - Unités de filtration de porosité 0,22 m. - Centrifugeuse. 1.1.2 Méthode On procède à la préparation de plasma appauvri en plaquettes. - 10 millilitres de concentrés plaquettaires sont centrifugés durant 15 minutes à 3000 tours/minute. - Le plasma surnageant est transféré dans un autre tube et le culot est éliminé. - Le plasma surnageant ainsi récupéré est centrifugé durant 15 minutes à 3000 tours/minute. - Ce deuxième plasma surnageant est transféré dans un autre tube, il constitue le plasma pauvre en plaquettes ou PPP. - Ce plasma est filtré sur un filtre de porosité 0,22 m, pour obtenir le plasma pauvre en plaquettes filtré (FPPP). 1.2 Courbe de dilution des plaquettes dans le plasma. Des dilutions en série de plaquettes, obtenues à partir de concentrés plaquettaires sont préparées. 1.2 1 Matériel - Concentrés plaquettaires conservés à 20 C- 24 C durant trois jours au maximum et issus de couche leucoplaquettaire ou de plasma riche en plaquettes. - Du plasma filtré FPPP. - Anticorps anti-CD41 directement marqué avec de la phycoérythrine (anti-CD41-PE) à une concentration de 100 pg/mL. - Du tampon salin phosphaté (PBS) 10 mM pH 7,4 dans de l'eau distillée. - Des membranes filtre noires de porosité 0,4 m. 1.2 2 Méthode Dilutions en série : - On dilue 100 ul de concentré plaquettaire dans 900 ul de plasma filtré (dilution 10-1). - On dilue 100 ul de la dilution 10-1 avec 900 L de plasma filtré pour obtenir une dilution 10-2, et ainsi de suite jusqu'à l'obtention d'une dilution 10-6. Étape de marquage On incube 200 l de chaque dilution (10-1 à 10- 6) avec 20 l de l'anticorps anti-CD41-PE. On incube ce mélange durant 20 minutes à température ambiante. On ajoute 800 ul de PBS. On filtre 500 ul de la suspension plaquettaire sur une membrane filtre noire de porosité 0,4 m. 1.3. Résultats Après avoir filtré les suspensions plaquettaires sur la membrane, celle-ci est soumise à une analyse avec un analyseur à balayage laser tel qu'un cytomètre en phase solide. Tableau 1 Dénombrement des plaquettes avec le procédé de l'invention. Nombre de Nombre Nombre de plaquettes Nombre de pour 100liL plaquettes / mL pour lOOuL - d'échantillon de plasma Contrôle Négatif : 0 0 plasma filtré 0 0 Dilution plaquettes : 10- 3411 34 110 3 2847 28 470 Dilution plaquettes : 10- 597 5 970 4 371 3 710 Dilution plaquettes : 10- 33 330 32 320 Dilution plaquettes : 10- 3 30 6 9 90 Contrôle Positif : 2983 29 830 Plasma non filtré 3027 30 270 (*) Résultats issus d'une détection en doublet effectuée sur les mêmes dilutions de plaquettes. 1.4 Conclusion Des faibles concentrations en plaquettes dans du plasma peuvent être analysées, moins de dix plaquettes dans 100 l de plasma sont dénombrées avec la méthode de l'invention. Ces résultats confirment que cette méthode de dénombrement de plaquettes permet d'atteindre un seuil de détection inférieur à 10 plaquettes/ml en prenant au moins 1 millilitre de prise d'essai. II. Validation de la méthode de détection de plaquettes La validation de la méthode de détection de plaquettes est effectuée sur des échantillons réels, les analyses sont effectuées à partir de tubulures scellées avant et après leucoréduction. La leucoréduction effectuée par filtration des plasmas élimine également les plaquettes. II.1 Matériel - Deux tubulures scellées issues de la poche de plasma et correspondant aux échantillons A et B. Le volume des échantillons est inférieur à deux millilitres. - Anticorps anti-CD41 marqué à la phycoérythrine (anti-CD41-PE). - Tampon salin phosphaté (PBS), 10 mM pH 7,4. - Membranes noires de porosité 0,4 m. II.2 Méthode Chaque test inclut un contrôle négatif constitué par du plasma filtré sur un filtre de porosité 0,22 m, préparé comme décrit au paragraphe 1.1. Étape de marquage On ajoute 10 ul d'anticorps anti-CD41-PE à 100 l de l'échantillon (FPPP ou un échantillon frais), On incube le mélange durant 15 minutes à température ambiante On ajoute 200 l de tampon PBS On filtre 300 l de la suspension obtenue sur une membrane noire de porosité 0,4 m. II.3 Résultats Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous et illustrés sur la figure 1 en annexe. Tableau 2 Dénombrement des plaquettes à partir de 100 l d'échantillon. Résultats après validation (plaquettes /membrane soit dans 100 uL de plasma) Échantillon A avant leucoréduction 0 Plasma filtre 0. 22 m 0 avant leucoréduction > 104 Plasma non-filtré après leucoréduction 0 ~~~~~~~~~~~ Plasma non-filtré 1 avantleucoréduction Échantillon B Plasma filtre 0.22 m avant leucoréduction > 104 Plasma non-filtré > 10@ après leucoréduction 6 ~~~~ ~~~ Plasma non-filtré 12 Avant la leucoréduction, la concentration des plaquettes dans le plasma est supérieur à 105 cellules/ml. Après leucoréduction, un échantillon montre une concentration en plaquettes inférieure à 10 cellules/ml et l'autre une concentration moyenne en plaquettes de 90 cellules/ml, soit une réduction supérieure à 3 logs. On observe que des concentrations faibles en plaquettes peuvent être analysées par marquage avec l'anticorps anti CD-41. On peut détecter moins de 10 plaquettes dans 100 l de plasma soit moins de 100 plaquettes/ml. Il est possible de diminuer ce seuil de détection en augmentant le volume de prise d'essai. III. Conclusion III.1 Détection des plaquettes En tant que modèle de faisabilité, des plaquettes sont ensemencées dans du plasma filtré, marqué avec l'anticorps anti-CD41 marqué à la phycoérythrine et analysées. Une bonne linéarité est observée entre 10 et 104 plaquettes/ml avec l'analyseur à balayage laser et la validation au microscope. III.2 Détection des plaquettes dans des échantillons de plasmas leucoréduits. Des échantillons non leucoréduits montrent une concentration plaquettaire supérieure à 105 cellules/ml. Après leucoréduction, la concentration résiduelle en plaquettes est inférieure à 102 cellules/ml (3 104 cellules/poche) en fonction de l'échantillon. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté pour la détection et le dénombrement de faibles nombres de plaquettes (moins de 100 cellules/mL) dans des fluides biologiques. REVENDICATIONS 1) Procédé de dénombrement de plaquettes éventuellement présents dans un dérivé sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation d'un échantillon dudit dérivé sanguin avec un marqueur spécifique des plaquettes, b) la filtration de l'échantillon obtenu à l'étape (a) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les plaquettes, pour obtenir une préparation en phase solide des plaquettes marquées, éventuellement présentes dans ledit échantillon, c) l'analyse de la préparation en phase solide de l'étape (b), pour dénombrer les plaquettes marquées éventuellement présentes sur celle-ci. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur spécifique des plaquettes utilisé à l'étape (a) est choisi parmi le groupe comprenant : un anticorps anti-CD41, un anticorps antiCD36, un anticorps anti-CD9 et un anticorps anti-CD42 un mélange de ceux-ci. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps spécifique de plaquettes est marqué par conjugaison directe avec un fluorochrome. 4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps spécifique de plaquettes est marqué indirectement par incubation avec un deuxième anticorps spécifique d'espèce conjugué avec un fluorochrome. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le fluorochrome est choisi parmi le groupe des fluorochromes excitables à une longueur d'onde de 488 nm et émettant à des longueurs d'onde comprises entre 500 et 570 nm. 6) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur spécifique des plaquettes utilisé à l'étape (a) est un substrat fluorogénique des enzymes intraplaquettaires. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat fluorogénique des enzymes intraplaquettaires est un substrat estérasique. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendication précédentes, caractérisé en ce que la durée d'incubation entre l'échantillon et le marqueur spécifique des plaquettes à l'étape (b) est comprise entre 5 minutes et 60 minutes, de préférence entre 10 minutes et 30 minutes et tout préférentiellement elle est de 20 minutes. 9) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la durée de l'incubation entre les anticorps spécifiques de plaquettes et le deuxième anticorps spécifique d'espèce conjugué avec un fluorochrome est comprise entre 5 minutes et 60 minutes, de préférence entre 10 minutes et 30 minutes et tout préférentiellement elle est de 20 minutes. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la membrane non-autofluorescente mise en #uvre à l'étape (b) est une membrane noire. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille des pores de la membrane mise en #uvre à l'étape (b) est comprise entre 0,05um et 2 um, tout préférentiellement entre 0,1 m et 1 um et préférentiellement elle est de 0,4 m. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que après la filtration de l'étape (b) on effectue un lavage de la membrane par filtration d'un volume de tampon. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse de la préparation en phase solide à l'étape (c) est effectuée au moyen d'un analyseur à balayage laser. 14) Utilisation d'un procédé de dénombrement de plaquettes selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour le contrôle de qualité des préparations plasmatiques. 15) Utilisation d'un procédé de dénombrement de plaquettes selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour le contrôle de qualité des filtres de plaquettes et la supervision des banques de sang.