FR 2848564 A1 20040618 FR 0215865 A 20021213 SOUCHES BACTERIENNES DU GENRE EXIGUOBACTERIUM PROCEDE DE CULTURE ET APPLICATIONS L'invention a pour objet de nouvelles souches du genre Exiguobacterium. Elle vise également un procédé de culture de ces souches, ainsi que leurs applications industrielles. L'invention se rapporte plus particulièrement à des souches bactériennes telles qu'isolées d'échantillons provenant de systèmes hydrothermaux marins profonds. L'étude par les inventeurs des échantillons prélevés les a conduit à isoler une nouvelle espèce d'Exiguobacterium présentant des propriétés de grand intérêt dans divers domaines de l'industrie. L'invention a donc pour but de fournir des souches de cette nouvelle espèce. Elle vise également à fournir des protocoles de culture de ces souches précisant les conditions physicochimiques et la composition du milieu de culture qui permettent de produire favorablement des cellules et/ou certains métabolites, plus particulièrement du L(+) lactate. Selon un autre aspect, l'invention vise l'utilisation directe de ces souches ou celle de leurs métabolites dans divers domaines de l'industrie. Les souches bactériennes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles possèdent une séquence d'ADN dont au moins une partie est capable de s'hybrider avec de l'ADN génomique ou plasmidique de la souche déposée le 5 décembre 2002, sous le n 1-2962, à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 25 rue du Docteur Roux, 75015 PARIS. De manière avantageuse, au moins 70 % du génome des souches de l'invention est capable de s'hybrider avec l'ADN de la souche déposée. L'invention vise en particulier les souches bactériennes définies ci-dessus, caractérisées par la séquence SEQ ID N 1 de l'ARNr 16S : GCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCAGGAAGCCGTCTGAACCCTTCGGGGGGACGACGGTGGAATGA GCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTAAAGAACCTGCCCATAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAATACCGGAT GTGTCATCGG ACCGCATGGTCCGCTGATGAAAGGCGCTCCGGCGTCGCCCATGGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTT GGTGGGGTAA CGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGCAATGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGC GAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCA GGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGGAGGCTT GAGTATAGGA GAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG ACTCTTTGGC CTATAACTGACGCTGAGGCTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT ACGGTCGCAA GGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG CGAAGAACCT TACCAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACCTTCCCCTTCGGGGGCAGGGGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCC AGCATTnAGT TGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC TTATGAGTTG GGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAG CCGTTCTCAG TTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCG GTGAATACGT TCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCG TAAGGAGCCA GCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGA ou une séquence ayant une similitude avec SEQ ID N 1 supérieure à 97%. Selon un autre aspect, ces souches sont caractérisées en ce qu'elles sont thermotolérantes, saccharolytiques et amylolytiques et/ou qu'elles sont capables de produire du lactate. On notera que, de manière avantageuse, le lactate produit est à plus de 95 % du L (+) Par l'expression "thermotolérante", on entend des souches bactériennes capables de croître à des températures de l'ordre de 40 à 50 C, à un pH de 5,4 à 9,15, avec un optimum pour la croissance à 45 C, à un pH de 7 environ. L'invention vise plus particulièrement des souches du genre Exiguobacterium tel que montré par comparaison des séquences de l'ARN de la fraction 16 S des ribosomes. Ces souches sont encore caractérisées par le fait qu'elles ne réduisent pas le sulfate, le thiosulfate, le soufre, le sulfite. Les souches bactériennes de l'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont Gram positif. Selon encore une autre disposition, la teneur de l'ADN des souches bactériennes de l'invention en guanine plus cytosine est de l'ordre de 50 mole %. L'invention vise en particulier la souche bactérienne déposée à la C. N.C.M. le 05 décembre 2002 sous le n 1-2962. La référence d'identification de cette souche est 10C. Comme nom de désignation taxonomique, on utilisera Exiguobacterium lactigenes sp. nov. Les mutants des souches répondant aux définitions qui précèdent entrent également dans le cadre de l'invention dès lors qu'ils conservent au moins 70 % de capacité d'hybridation avec l'ADN génomique de la souche déposée. Conformément à l'invention, les souches bactériennes définies ci-dessus sont obtenues par culture dans des conditions anaérobies facultatives, à un pH de 5,4 à 9,15, à 37 C, dans un milieu de base comme défini ciaprès, contenant un sucre utilisable par ces souches comme source d'énergie. Les souches bactériennes de l'invention sont avantageusement utilisées dans des procédés de fermentation alimentaire. Leurs propriétés fermentaires et enzymatiques permettent d'y remplacer avantageusement et/ou de compléter celles attribuées aux bactéries lactiques utilisées habituellement. La capacité des souches de l'invention à fermenter une grande variété de sucres, notamment le D-glucose, le Dfructose, le D-galactose, le D-mannose, le mannitol, le Dribose, le D-saccharose et le DL-maltose et l'amidon constitue un atout important. Certains de ces sucres (glucose, fructose, saccharose) potentiellement utilisables comme substrats énergétiques sont, en effet, disponibles en grande quantité, notamment dans les jus fermentaires sucriers. La possibilité d'agir sur le métabolisme de ces souches en contrôlant les paramètres physico-chimiques du milieu de culture (pH, rapport sucres/peptides) élargit leur domaine d'application. Ainsi, il est possible par exemple d'orienter la fermentation vers la production de cellules et de métabolites cellulaires tels que des enzymes. L'invention vise donc également un procédé de production de métabolites, en particulier de L (+) caractérisé en ce qu'il comprend - la culture d'une souche bactérienne telle que définie ci-dessus, dans des conditions appropriées pour son développement et pour la production du métabolite recherché, - la récupération des métabolites produits, suivi de l'isolement du métabolite désiré et sa purification. L'acide lactique produit par les souches de l'invention est d'un grand intérêt car il est constitué à plus de 95 % par du L(+) lactate qui est assimilable par les organismes supérieurs alors que le D(-) lactate présente un caractère de toxicité. On le sépare de la culture, et on le concentre par exemple par évaporation, le cas échéant jusqu'à siccité. Les concentrés ou produits secs sont utilisés tels quels ou traités pour former des dérivés souhaités de l'acide lactique. Les applications de l'acide lactique ou de ses esters et autres dérivés concernent de nombreux domaines. L'acide lactique est ainsi utilisé dans l'industrie agro-alimentaire en l'incorporant dans des boissons, des bières, des produits laitiers tels que crème, fromage, beurre, des glaces ou encore des confitures. Comme tensio-actif, on l'utilisera avec avantage en panification et viennoiserie sous forme par exemple de lactyl mono- et diglycérides et de sodium stéaryl lactylate. Dans l'industrie pharmaceutique, le lactate de potassium peut constituer un substitut du chlorure de sodium particulièrement précieux dans les cas d'hypertension. Il est aussi utilisé pour ses propriétés de complexant, notamment avec le fer et le calcium pour traiter les carences. Enfin parmi les applications de l'acide lactique, de ses sels et dérivés dans l'industrie chimique, on citera son utilisation dans l'élaboration de résines plastiques, d'adhésifs, de pesticides, de textiles, ou encore dans des peintures, des diluants et des solvants, ou pour le traitement de surface de métaux. On soulignera son grand intérêt dans la chimie des polymères où il sert à fabriquer des polylactides et/ou des copolymères avec par exemple des oxydes de polyalkylène, des alcools polyvalents, de l'acide glycolique, des acides hydroxycarboxyliques, des copolymères d'éthylène et de propylène, des caoutchoucs butyliques ou des élastomères de polyuréthane thermoplastiques. A partir de ces polymères et/ou copolymères, divers articles peuvent être fabriqués en particulier pour l'emballage, des films à usages médicaux pour réaliser des pansements ou encore des matières d'enrobage pour sutures chirurgicales. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans la description qui suit, donnée à titre d'exemple, qui concerne la souche 10C mentionnée plus haut, déposée à la C. N.C.M. sous le n I- 2962. a. Protocole d'isolement de la souche 10C L'isolement a été effectué à partir d'échantillons de systèmes hydrothermaux profonds marins. Milieux et méthodes de culture On utilise un milieu de base contenant (pour 1 litre d'eau distillée) : 1g de NH4C1, 0,3g de KH2PO4, 0,3g de K2HP04,25g de NaCl, 0,2g de CaCl2, 0 ,lg de KC1, 3g de MgCl2, 0, 5g de CH3COONa, 0,5g de cystéine-HCl, O,lg d'extrait de levure (Difco Laboratories), 10ml d'une solution minérale de Balch (1), lmg de résazurine. Le pH est ajusté à 7,3 avec KOH 10M et le milieu est porté à ébullition sous un courant d'azote et refroidi jusqu'à la température ambiante. Les compositions de la solution minérale de Balch et de la solution d'oligoéléments de Balch sont les suivantes : Solution minérale de Balch KH2PO4 6 g NH4)2S04 6 g NaCl 12 g MgS04,7H20 2,6 g CaC12,2H20 0,16 g H20 distillée q. s.p. 1000 ml Solution d'oligo-éléments de Balch Acide nitriloacétique 1,5 g MnS04,2H20 0,5 g MgS04,7H20 3 g NaCl 1 g FeS04,7H20 0,1 g CoC12,6H20 0,1 g CaC12,2H20 0,1 g ZnCl2 0,1 g CuS04,5H20 0,01 g AlK(S04)2 0,01 g H3B03 0,01 g Na2Mo04 0,01 g H20 distillée q.s.p. 1000 ml Le pH du milieu de culture est ajusté à pH 7,3 avec KOH 10 M. Le milieu est ensuite porté à ébullition, puis refroidi jusqu'à la température ambiante et réparti sous un courant d'azote dans des tubes de Hungate, à raison de 5 ml par tube, et dans des flacons de sérum, à raison de 20ml sous courant d'azote et de gaz carbonique (80 :20 ;v/v). Après traitement à l'autoclave des récipients scellés à 110 C pendant 45 min, on ajoute Na2S, 9H20, Na2C03 et du glucose, à partir de solutions stériles, ce qui conduit, respectivement à des concentrations de 0,04%, 0,2% et 20mM. Pour initier l'enrichissement de la culture, on inocule un échantillon de 20ml de milieu, et on incube à 37 C. La culture est purifiée en utilisant la méthode des rolls tubes de Hungate avec un milieu solidifié avec 15g/1 d'agar. b. Description de la souche La souche 10C est une bactérie à Gram positif, non sporulante, anaérobie facultative , se présentant sous forme de bâtonnets , avec une croissance optimale à 45 C, à pH 7 et 0-2% de NaCl. Il s'agit d'une souche hétérotrophe qui requiert de l'extrait de levure pour fermenter les sucres. La température de croissance de la souche est de 12 à 50 C, à un pH de 5,4 à 9,1, et une concentration en NaCl entre 0 et 12%. On observe une croissance optimale à 45 C, à pH 7 et 0-2% de NaCl. Dans un milieu contenant des hydrates de carbone, notamment du glucose comme source d'énergie, on ajoutera avec avantage des peptides, par exemple des extraits de levure, pour favoriser la croissance. - propriétés métaboliques La fermentation de sucres conduit essentiellement à du (L+)lactate (environ 2 moles de lactate/mole de glucose fermenté). Dans des conditions de croissance adaptées, on observe la production de formate, acétate et éthanol. Caractères génétiques : La souche 10C est caractérisée par une teneur de l'ADN en guanine + cytosine de 50,4 mole%. La purification et l'extraction de l'ADN, l'amplification et le séquençage de l'ARNr 16S sont réalisés selon (2), (3) et (4). L'ADN a été isolé par chromatographie sur hydroxyapatite selon le procédé de Cashion et al (5). L'hybridation ADN-ADN a été effectuée comme décrit par De Ley et al (6), avec la modification décrite par Huss et al (7) et Escara et Hutton (8) en utilisant un spectrophotomètre modèle 2600 équipé d'un thermoprogramme 2527-R (Gilford Instrument Laboratories Inc., Oberlin, Ohio, EUA). La séquence de l'ARNr 16S correspond à SEQ ID N 1 donnée ci-dessus. c. Procédés de culture et applications 1- PRODUCTION DE BIOMASSE PAR FERMENTATION DE SUCRE On opère en milieu non renouvelé. La fermentation est régulée à un pH de 7 à l'aide d'une solution alcaline (soude par exemple) et à une température de 45 C. On utilise un milieu de culture répondant à la composition suivante : - Glucose à calculer - Extrait de levure/hydrolysat de protéines à calculer - NH4Cl 1 g/1 - NaCl 0,5 g/1 - KH2P04 0,3 g/1 - K2HP04 0,3 g/1 - MgC12,6H20 0,2 g/1 - KCl 0,1 g/1 - CaCl2 2H20 0,lg/l Les concentrations en sucre et en extraits de levure sont fonction de la concentration en cellules que l'on souhaite obtenir. Le sucre est autoclavé séparément du reste du milieu de culture, ainsi que certains sels minéraux qui forment un précipité lors de l'autoclavage. Ils sont ensuite ajoutés stérilement à l'autre partie du milieu de culture (extrait de levure + minéraux, autoclavés ensemble), puis le volume final est ajusté avec de l'eau distillée stérile. L'exemple ci-dessous permet de mieux comprendre le protocole de préparation des milieux : Exemple de préparation de 16 litres d'un milieu à 40 g/1 de saccharose et 3 g/1 d'extrait de levure : 1 Pesée et autoclavage Concentration Masse à peser Saccharose 40 g/1 640 g Dans env. 500 ml MgCl26H20 0,2 g/1 3,2 g d'eau distillée. CaC122H20 0,1 g/1 1,6 g Autoclavage 110 C, 20 à 30 min. Extrait de levure 3 g/1 48 g NH4C1 1 g/1 16 g KH2PO4 0,3 g/1 4,8 g Dans env. 15 1 d'eau K2HP04 0,3 g/1 4,8 g distillée. NaCl 0,5 g/1 8 g Autoclavage 121 C, 1h30. KC1 0,1 g/1 1,6 g NB : le sucre est autoclavé dans un faible volume de liquide et seulement 20 minutes à 110 C pour éviter l'hydrolyse du saccharose. Les sels de magnésium et de calcium sont autoclavés à part des autres sels et de l'extrait de levure afin d'éviter toute précipitation. 2 Assemblage : la solution à base de sucre est transférée dans les 15 litres de milieu contenant l'extrait de levure, puis de l'eau distillée stérile est ajoutée pour compléter jusqu'à 16 litres. Tous ces transferts se font stérilement, autour de la flamme d'un Bec Bunsen, au moyen d'une surpression d'azote appliquée dans le fût à vider pour pousser le liquide. 3 ) Homogénéisation : un flux d'azote N2 est mis à buller dans le milieu ainsi assemblé afin de mélanger tous les éléments et d'assurer l'anaérobiose. 2. Mode de fermentation Les études ont été réalisées en mode discontinu, ou batch, rendu continu par l'enchaînement des batchs. Il s'agit d'un système de "feed-harvest", ou "batchs répétés", qui se schématise par l'enchaînement séquentiel de trois étapes : remplissage du fermenteur par du milieu neuf, puis culture des bactéries en batch, puis vidange du moût de fermentation en laissant un pied de cuve pour l'inoculation du batch suivant, puis nouveau remplissage, etc. D'un point de vue pratique, l'avantage de ce système réside dans le fait que les phrases de nettoyage et de stérilisation du fermenteur entre deux batchs sont supprimées, et dans la possibilité d'automatisation du procédé. En effet, il est possible de programmer un automate qui déclenche les opérations de vidange et de remplissage selon la valeur de paramètres acquis en ligne par une unité de régulation. II. PRODUCTION DE BIOMASSE PAR FERMENTATION D'AMIDON Dans d'autres expérimentations, en utilisant un substrat d'amidon et le milieu tamponné défini ci-dessus (mais avec 10 g d'amidon par litre), on obtient une transformation de l'amidon donnant plus de 95% de L (+) et des traces de formiate. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1) Balch W. E. et al, 1979, Microbiol. Rev. 43,260-296, (2)Andrews K.T. & Patel B.K.C., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46,265-269, (3) Love C. A. et al, 1993, Syst. Appl. Microbiol. 16,244- 251, (4)Redburn A. C. & Patel B.K.C., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 113,81-86. (5) Cashion P., 1977, Anal. Biochem, 81 :461-466. (6) De Ley J, 1970, Eur. J. Biochem, 12 :133-142, (7) Huss V. A.R., 1983, J. Syst. Appl. Microbiol, 4 : 192, (8) Escara J. F., 1980, Biopolymers, 19 : 1315-1327. REVENDICATIONS 1/ Souches bactériennes, caractérisées en ce qu'elles possèdent une séquence d'ADN dont au moins une partie est capable de s'hybrider avec de l'ADN génomique ou plasmidique de la souche déposée le 5 décembre 2002, sous le n 1-2962, à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.). 2/ Souches bactériennes selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'au moins 70 % de leur génome est capable de s'hybrider avec l'ADN de la souche déposée. 3/ Souches bactériennes selon la revendication 1 ou 2, caractérisées par la séquence SEQ ID N 1 de l'ARNr 16S : GCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCAGGAAGCCGTCTGAACCCTTCGGGGGGACGACGGTGGAATGA GCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTAAAGAACCTGCCCATAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAATACCGGAT GTGTCATCGG ACCGCATGGTCCGCTGATGAAAGGCGCTCCGGCGTCGCCCATGGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTT GGTGGGGTAA CGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGCAATGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGC GAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCA GGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGGAGGCTT GAGTATAGGA GAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG ACTCTTTGGC CTATAACTGACGCTGAGGCTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT ACGGTCGCAA GGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG CGAAGAACCT TACCAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACCTTCCCCTTCGGGGGCAGGGGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCC AGCATTnAGT TGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC TTATGAGTTG GGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAG CCGTTCTCAG TTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCG GTGAATACGT TCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCG TAAGGAGCCA GCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGA ou une séquence ayant une similitude avec SEQ ID N 1 supérieure à 97%. 4/ Souches bactériennes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont thermotolérantes, saccharolytiques et amylolytiques et/ou capables de produire du L(+)lactate. 5/ Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées par des propriétés de croissance à des températures de l'ordre de 40 à 50 C, à un pH de 5,4 à 9,15, avec un optimum pour la croissance à 45 C, à un pH de 7 environ. 6/ Souches bactériennes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées par une teneur de leur ADN en guanine et cytosine de 50 mole% environ. 7/ Souche bactérienne déposée à la C.N.C.M. le 5 décembre 2002, sous le numéro 1-2962. 8/ Procédé de culture de souches bactériennes selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on opère dans des conditions anaérobies facultatives, à un pH de 5,4 à 9,15 environ, à 37 C, en particulier de 6,5 à 7,5, dans un milieu de base contenant un sucre utilisable par ces souches comme source d'énergie. 9/ Application des souches bactériennes selon l'une des revendications 1 à 7, dans des procédés de fermentation alimentaire. 10/ Procédé de production de métabolites tels que le L (+) caractérisé en ce qu'il comprend - la culture d'une souche bactérienne selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans des conditions appropriées pour son développement et pour la production du métabolite recherché, - la récupération des métabolites produits, l'isolement du métabolite désiré et sa purification.