FR 2857979 A1 20050128 FR 0309161 A 20030725 UTILISATION DU GENE SILVER POUR L'AUTHENTIFICATION DE L'ORIGINE RACIALE DES POPULATIONS ANIMALES ET DE LEURS PRODUITS DERIVES L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques correspondant au gène SILVER, encore désigné gène SI, et aux différentes formes allèliques de ce gène, ou correspondant à des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins. Depuis les récentes crises alimentaires en Europe, le consommateur veut être informé sur l'origine du produit : la notion de race est devenue déterminante pour les filières bovines de qualité, car elle est associée à un système d'élevage valorisant le terroir. Le cheptel bovin français compte plus de 20 millions de têtes réparties en une quarantaine de races qui ont généralement une origine régionale bien identifiée et une couleur de robe typique, héritée du travail des premiers éleveurs sélectionneurs aux 18ème et 19 me siècles. Dans le cas de la production de viande bovine de qualité, la race d'origine du produit est une composante déterminante du cahier des charges, que l'éleveur veut garantir au consommateur. Le nom de la race devient une marque mise en valeur par le distributeur (par exemple le label rouge Blason Prestige pour la race Limousine, le label rouge B#uf Gascon, ou l'AOC Maine-Anjou avec la race Rouge des Prés). Ainsi, les étiquettes des produits, 'label,' précisent l'origine, le cahier des charges, le type d'alimentation et la race, mais présentent aussi le produit sur pied avec une photographie, ce qui montre la valeur informative de l'aspect des animaux, dont la couleur est une composante majeure. Par ailleurs, la coloration de la robe a joué un rôle déterminant dans l'histoire des races bovines : alors qu'une race bovine présente une variabilité des performances et du génome, elle est précisément décrite et fixée pour sa couleur, qui devient donc un élément caractéristique de l'appartenance raciale d'un animal, et des produits qui en dérivent. La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs d'un gène majeur de la coloration chez les bovins, à savoir du gène SILVER, et du fait que le polymorphisme de ce gène chez les animaux est une caractéristique de l'appartenance raciale d'un animal. Deux allèles de ce gène ont été identifiés. Le premier, l'allèle si, propre à la race charolaise est causal (e) la coloration blanc crème de sa robe. Le deuxième, si] affecte la même région que l'allèle charolais et caractérise une autre race bovine, à savoir la race simmental. Si les marqueurs moléculaires anonymes comme les microsatellites permettent d'attribuer un animal à une race avec une probabilité élevée, ils ne permettent pas pour autant de garantir le respect de tous les critères définissant la race et s'avèrent très peu efficaces dans le cas d'échantillons provenant d'animaux croisés. En revanche, l'invention permet de garantir que les produits commercialisés respectent les critères attachés à la race, et en particulier son standard, attesté par la couleur de la robe. Par ailleurs, pour proposer un test moléculaire de traçabilité individuelle, il faudrait génotyper tous les animaux abattus, afin d'établir la correspondance entre le typage d'un échantillon de viande et le génotype d'un animal donné. Pour la traçabilité raciale, un seul typage est à réaliser pour être comparé au génotype de référence, caractéristique de la race. Le test de traçabilité raciale de la présente invention est plus simple à mettre en #uvre qu'un test de traçabilité individuelle. Dans ce contexte, l'invention permet aujourd'hui de donner aux éleveurs sélectionneurs de la race charolaise un moyen nouveau de garantir la traçabilité raciale de leurs animaux et de permettre, par les mêmes moyens, à tout opérateur économique, de vérifier la fiabilité de son fournisseur dans le cadre de ses accords contractuels, indépendamment d'un dispositif officiel de certification de produits. L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nuoléotidiques correspondant au gène SILVER, encore désigné gène SI, et aux différentes formes allèliques de ce gène, ou correspondant à des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de séquences nucléotidiques correspondant au gène SILVER bovin représenté par SEQ ID NO : 1, codant pour la protéine bovine SI représentée par SEQ ID NO : 2, et aux différentes formes allèliques de ce gène, ou correspondant à des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races bovines, ou de différents troupeaux bovins regroupant chacun plusieurs populations ou races bovines. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à une population ou race bovine particulière, ou à un troupeau bovin particulier, ou, au contraire, permettant de certifier l'exclusion de cet animal de cette population ou race, ou de ce troupeau particulier. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que les populations ou races bovines ou troupeaux bovins sont d'origine française. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée : - de la séquence nucléotidique correspondant à la forme allèlique si représentée par SEQ ID NO : 3, codant pour la protéine bovine si représentée par SEQ ID NO : 4, ou correspondant à des fragments de cette forme allèlique, ladite forme allèlique comprenant la mutation G93A par rapport au gène SI, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à la race charolaise, - de la séquence nucléotidique correspondant à la forme allèlique si] représentée par SEQ ID NO : 5, codant pour la protéine bovine si représentée par SEQ ID NO : 6, ou correspondant à des fragments de cette forme allèlique, ladite forme allèlique comprenant une délétion des trois nucléotides TTC situés aux positions 82,83 et 84 par rapport au gène SI, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à la race simmental, - de la séquence nucléotidique correspondant au gène SI bovin représenté par SEQ ID NO : 1, ou à des fragments de ce gène, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de certifier l'exclusion d'un animal de la race charolaise. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée, de fragments des séquences nucléotidiques correspondant aux formes allèliques SI, si, et si], représentées respectivement par SEQ ID NO : 1, 3, et 5, lesdits fragments étant choisis parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 desdites séquences. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, de fragments des séquences nucléotidiques correspondant aux formes allèliques SI, si, et si], lesdits fragments étant choisis parmi ceux de 294 nucléotides délimités par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 des séquences SEQ ID NO : 1 et 3, ces fragments étant représentés respectivement par les séquences SEQ ID NO : 7, et SEQ ID NO : 8, et le fragment de 291 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 299 de la séquence SEQ ID NO : 5, ce fragment étant représenté par la séquence SEQ ID NO : 9. L'invention a également pour objet l'utilisation d'amorces nucléotidiques permettant d'amplifier le nombre de copies du gène SILVER, ou des différentes formes allèliques de ce gène, ou des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'amorces nucléotidiques susmentionnées, sous forme de couples d'amorces 5'-3', ces couples étant tels que : - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce SIL10 représentée par la séquence SEQ ID NO : 10 suivante: 5' GTTGCTGGAAGGAAGAACAGGATGGATCTG 3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 10, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 10, avec tout ou partie de la séquence nucléotidique complémentaire des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 9 et 38 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et 5, - l'amorce 3'est choisie parmi l'amorce SIL8 représentée par la séquence SEQ ID NO : 11suivante : 5'CAGTCCCAAGTGCCTGAACACACATGCACC3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 11, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 11, avec tout ou partie des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 276 et 302 des séquences SEQ ID NO :1, 3, et par les nucléotides situés aux positions 273 et 299, de la séquence SEQ ID NO : 5. L'invention concerne également la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène SI bovin représenté par SEQ ID NO : 1, ou aux fragments suivants du gène SI : - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 1, - le fragment SEQ ID NO : 7 de 294 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 de la séquence SEQ ID NO : 1. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène si bovin représenté par SEQ ID NO : 3, ou aux fragments suivants du gène si : - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 3, - le fragment SEQ ID NO : 8 de 294 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 de la séquence SEQ ID NO : 3. L'invention concerne également la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène si] bovin représenté par SEQ ID NO : 5, ou aux fragments suivants du gène si] : - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 5, - le fragment SEQ ID NO : 9 de 291 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 299 de la séquence SEQ ID NO : 5. ' L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend : - la séquence nucléotidique SIL10 représentée par la séquence SEQ ID NO : 10 suivante : 5' GTTGCTGGAAGGAAGAACAGGATGGATCTG 3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 10, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 10, avec tout ou partie de la séquence nucléotidique complémentaire des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 9 et 38des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et 5, - la séquence nucléotidique SIL8 représentée par la séquence SEQ ID NO : 11 suivante : 5'CAGTCCCAAGTGCCTGAACACACATGCACC3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 11, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 11, avec tout ou partie des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 276 et 302 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et par les nucléotides situés aux positions 273 et 299, de la séquence SEQ ID NO : 5. L'invention concerne également les couples d'amorces, dont chacune des deux amorces comprend, indépendamment l'une de l'autre, environ 10 à environ 30 nucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont choisis de telle façon que l'une des deux séquences d'un couple d'amorces s'hybride avec une séquence d'environ 10 à environ 30 nucléotides comprise dans la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et environ 60 des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1, 3, et 5, tandis que l'autre séquence de ce même couple s'hybride avec une séquence d'environ 10 à environ 30 nucléotides comprise entre le nucléotide situé en position 94 et le dernier des nucléotides des séquences SEQ ID NO : 1,3, et 5. L'invention a plus particulièrement pour objet les couples d'amorces pour l'amplification génique tels que définis ci-dessus, caractérisés'en ce que : - l'une des amorces est choisie parmi les séquences comprenant la séquence SIL10 représentée par SEQ ID NO : 10, ou toute séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ladite amorce étant avantageusement marquée, notamment de manière radioactive ou fluorescente, - tandis que l'autre amorce est choisie parmi les séquences comprenant la séquence SIL8 représentée par SEQ ID NO : 11, ou toute séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé d'identification de populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins, ledit procédé étant effectué à partir d'un échantillon biologique prélevé sur l'animal, notamment à partir de sperme, embryon, sang, lait, poils, carcasse, ou viande, ou autres produits dérivés de ces derniers, et permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance ou la non-appartenance de l'animal sur lequel a été prélevé ledit échantillon biologique à une population ou race de mammifères ruminants, ce procédé comprenant : - une étape d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SILVER, à savoir des allèles SI, et/ou si, et/ou si,, et/ou de fragments de ces formes allèliques, spécifiques d'une population ou race de mammifères ruminants déterminés, et susceptibles d'être présents dans ledit échantillon biologique, - une étape de détection desdites formes allèliques ou fragments de ces dernières. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'identification tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l'étape d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SILVER, ou des fragments de ces formes allèliques, est effectué à l'aide d'un couple d'amorces susmentionné. L'invention concerne plus particulièrement un procédé d'identification tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que : - la détection d'un génotype comprenant l'allèle si dans l'échantillon biologique étudié, permet de certifier que ledit échantillon provient d'un animal appartenant à la race charolaise ou ayant au moins un ascendant de race charolaise, - la détection d'un génotype comprenant l'allèle si1 dans l'échantillon biologique étudié, permet de certifier que ledit échantillon provient d'un animal appartenant à la race simmental ou ayant au moins un ascendant de race simméntal, - la détection d'un génotype comprenant l'allèle SI, permet de certifier que ledit échantillon ne provient pas d'un animal de la race charolaise. L'invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces susmentionné, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de la réaction d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SIL VER. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en évidence du gène SILVER bovin, et de ses formes allèliques si et si]. Légende des figures - Figure 1 : du gène SILVER Bovin. La région 5' UTR est de 29 pb. La région 3'UTR a une taille de 107 pb suivie d'une queue polyA. Le site de polyadénylation est souligné. La protéine Pmell7 bovine est formée de 649 acides aminés. Le peptide signal est formé par les 24 premiers acides aminés. L'allèle si charolais conduit à la substitution d'une G glycine (G) en position 22 par une arginine (R). - Figure 2 : génomique de la région codante du gène SILVER Bovin. Les amorces SIL10 et SIL9 qui ont permis de l'amplifier à partir de l'ADN génomique sont indiquées. Les différents exons sont en gras. Les coordonnées des exons au niveau de ce fragment d'ADN sont récapituléesdans le tableau 2. Les sites donneurs GT et les sites accepteurs AG de l'épissage sont en italiques. La mutation charolaise (substitution de la guanine par l'adénine) est en position 96 (premier exon). - Figure 3 : des séquences nucléotidiques des transcrits du gène SILVER charolais et du transcrit RPE1. Les différences entre les deux séquences sont indiquées en gras. Il s'agit de l'absence de 499 pb de la région 5'mais également des modifications (A1151C), ( CAG1458), (G1461A) et (C1864A). La mutation charolaise (G93A) est en position 93 (en gras et italique). Le codon d'initiation ATG de la traduction est en position 30 (en italiques) et le codon de terminaison (TGA) est en position 1977 (en italiques). - Figure 4 :comparaison de séquences peptidiques déduites du transcrit du gène SILVER charolais et de celle déduite du transcrit RPE1. Les différences entre les deux séquences sont en gras. Il s'agit de l'absence des 157 premiers acides aminés mais également des modifications Q4677, G478S, et A612E. La modification (en gras et italique) qui caractérise la race charolaise est en position 22 (G22R). I) Matériel et méthodes Extraction des ARNs totaux à partir des échantillons de peaux bovines L'extraction se pratique à partir d'un échantillon de peau de 2 cm2prélevé sur un individu bovin le plus rapidement possible après son abattage. La peau est rasée avec une lame de scalpel et débarrassée de sa couche adipeuse. L'échantillon est ensuite découpé en petits morceaux. L'extraction des ARNs est réalisée à l'aide du kit "RNeasy Maxi Kit" (Qiagen ; Référence : 75162) selon les recommandations du fournisseur. Les ARN totaux ainsi préparés sont utilisés pour la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc). Ils sont également utilisés dans la technique RACE-PCR pour disposer des régions 5' et 3' UTRs (régions non traduites) du transcrit du gène SILVER. Synthèse des ADNcs 5 g des ARN totaux des race charolaise et salers ont été rétro-transcrits à l'aide de la reverse transcriptase SuperScriptII (Invitrogen ; référence 18064-014), selon les recommandations du fournisseur. Les ADN complémentaires ainsi obtenus sont utilisés comme matrice pour obtenir en particulier la partie codante du gène SILVER. Obtention des extrémités 5' et 3' d'ADN complémentaire Le kit, SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech ; référence K1811-1) a été utilisé pour obtenir des ADN complémentaires ligaturés à des adaptateurs en 5' et en 3'. 5 g d'ARN totaux ont été utilisés selon les recommandations du fournisseur (Clontech). Purification de l'ADN génomique à partir des échantillons de sang 5 ml de sang prélevé sur EDTA, transféré dans un tube 50 ml (Nalgène) sont dilués avec 4 volumes de TE 20 :5(Tris 20 mM : ETDA 5 mM). L'échantillon est ensuite incubé 15 min sur glace pour que la lyse des hématies ait lieu. Après une centrifugation de 4000 tpm pendant 20 min à 4 C le surnageant est éliminé doucement. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans 15 ml de TE 20 : 5, suivi d'une centrifugation pendant 15 min à 4000 tpm et à 4 C. Deux lavages sont effectués (jusqu'à ce que le culot soit translucide). Le culot est ensuite repris dans '4 du volume de sang de départ avec du TE 20 : 5, auquel on rajoute du SDS (1% final) et de la protéinase K (200 g/ml final). Le mélange est incubé sous agitation (300 tpm) toute la nuit à 37 C. L'ADN est ensuite précipité par addition de 1/3 du volume en acétate d'ammonium 7,5 M et 2 volumes d'éthanol absolu froid. Le culot est ensuite lavé avec de l'éthanol à 70%, séché, et repris (100 ng/pl) dans de l'eau et conservé à 4 C. Amplifications par la technique PCR Les amplifications de fragments d'ADN comportent invariablement une phase de dénaturation, une phase d'hybridation et une phase d'élongation. Ce cycle est répété 35 fois et il est suivi d'une étape d'élongation de 7 min. La durée de chacune des phases ainsi que les amorces utilisées seront précisés pour chaque amplification. Purification de fragments d'ADN après séparation sur gel Cette technique d'élution est utilisée dans les cas où il s'avère nécessaire de séparer un fragment d'intérêt de l'ADN contaminant, comme par exemple pour la préparation d'un insert avant clonage. Pour cela, on a utilisé le kit QiaQuick Gel Extraction kit (Qiagen, référence 28706) selon les recommandations du fabricant. Technique de clonage Les inventeurs ont utilisé pour cloner les fragments d'ADN, deux types de vecteurs commerciaux (Invitrogen). Le vecteur pCR2.1-TOPO (référence K4500-01) pour le clonage de fragments d'ADN de taille inférieur à 2 kpb et le vecteur TOPO XL (référence K4750-20) pour le clonage de fragments de tailles supérieurs à 2 kpb. Le clonage s'effectue selon les recommandations du fournisseur. Séquençage de fragments d'ADN Les séquences de fragments d'ADN clonés sont déterminées selon le principe de la technique de Sanger à l'aide d'un séquenceur automatique (ABI Prism 310 Genetic Analyser, Perkin Elmer). Les réactions de séquençage sont menées grâce à l'utilisation d'une enzyme thermostable. Elles nécessitent environ 200 à 400 ng de matrice plasmidique, un mélange réactionnel commercial (Terminator Ready Mix, PRISM Ready Reaction Ampli Taq FS, Perkin Elmer) contenant les dNTPs, les ddNTPs, le MgUl2 et l'ADN polymérase (Taq FS) ainsi que 15 pmol d'amorce. Vingt-cinq cycles sont réalisés dans un volume final de 20 L : dénaturation à 96 C 10 s, hybridation de l'amorce à 55 C 5 s et élongation à 60 C 4 min. L'ADN néosynthétisé est précipité par 80 L d'isopropanol 75%, lavé par 250 L d'isopropanol 75% afin d'éliminer les réactifs non utilisés qui pourraient perturber la migration, séché puis repris dans 20 L de TSR avant d'être dénaturé par traitement thermique. II) Résultats Données expérimentales Isolement des régions 5' et 3' UTRs du gène SILVER de la race bovine charolaise Les régions 5' et 3' UTRs (régions non traduites du transcrit) du gène SILVER de la race charolaise ont été obtenues à l'aide de couples d'amorces (Fig. 1) (SIL1/UPM et SIL2/NUP) et (SIL3/UPM et SIL4/NUP) respectivement. Ces amorces ont été déduites à partir de régions conservées des gènes SILVER humain (ACC. AK092881) et murin (ACC. AK012808) disponibles dans les banques de données. Dans les deux cas une PCR dite nichée est nécessaire pour obtenir un produit d'amplification. 1,5 l d'ADNc couplé aux adaptateurs ont été utilisés comme matrice. Nous avons utilisé la polymérase Abgene (Référence AM-266-615) selon les recommandations du fournisseur. Les conditions PCR sont les suivantes : 94 C 2min, (94 C 30, 61 C 30sec, 72 C 1min) X 35 cycles, 72 C 7min. Obtention de la région 5'UTR Après une première amplification avec le couple d'amorce SIL1/UPM (UPM : 10X Universal Primer A Mix ; Clontech), une seconde PCR avec le couple d'amorces SIL2/NUP (NUP : Nested Universal Primer A ; Clontech) a été réalisée avec 1,5 ul de la première PCR dans les mêmes conditions d'amplification. L'amplifiat obtenu est ligaturé dans le vecteur pCR 2.1-TOPO et séquence. La séquence obtenue comporte (Fig. 1) la région 5'UTR de 29 pb et 236 pb de la région codante du gène SILVER. Obtention de la région 3'UTR La même procédure a été employée pour obtenir la région 3'UTR du gène en utilisant les couples d'amorces SIL3/UPM et SIL4/NUP en première et en deuxième PCR respectivement. L'amplifiât obtenu a été également ligaturé dans le vecteur pCR 2.1-TOPO et séquence. La séquence obtenue comporte les 27 dernières paires de bases de la région codante (Fig. 1) suivie de la région 3'UTR d'une taille de 107 pb et se termine par une queue poly(A). Isolement de la totalité de la partie codante du gène SILVER A partir des informations de séquence des régions 5' et 3' UTRs (Fig. 1) nous avons fait synthétiser trois amorces SIL5 (sens), SIL6 et SIL17 (anti-sens). Ces amorces ont été utilisées en première PCR (SIL5/SIL6) et en deuxième PCR (SIL5/SIL7) pour amplifier la totalité de la partie codante du gène SILVER à partir de l'ADNc des races charolaise et salers. 4 l de chacun des amplifiats (charolais et salers) ont été clonés séparément dans le vecteur TOPO XL (Invitrogen) et séquences. La figure 1 présente la totalité de la séquence obtenue pour la race charolaise. Découverte de l'allèle charolais La comparaison des séquences codantes du gène SILVER charolais et salers a révélé une seule différence : la substitution d'une guanine (Fig. 1) en position 64 chez le salers en une adénine chez le charolais. Nous avons désigné cet allèle du gène SILVER : si. Etablissement de la structure génomique de la partie codante du gène SIL VER Pour obtenir la totalité de l'information génétique contenant la partie codante du gène SILVER de la race charolaise, nous avons utilisé le couple d'amorces SIL5/SIL9 (Fig. 1). En utilisant une Taq polymerase (Expand Long Template PCR System, Roche, référence 1 681 834) qui permet d'amplifier des fragments d'ADN jusqu'à 20 kpb, nous avons obtenu un fragment d'ADN génomique charolais d'environ 8 kpb. Ce dernier a été cloné dans le vecteur TOPO XL (Invitrogen) et entièrement séquence. La figure 2 représente la structure exon/intron de la partie codante du gène SIL VER charolais. Génotypage de l'allèle si Pour l'étude de cette région, nous avons fait synthétiser une amorce (SIL8) dans la première région intronique (Fig. 2). En utilisant le couple d'amorce SIL10/SIL8, on obtient un fragment d'ADN génomique de 294 pb. Le séquençage direct de l'amplifiat nous renseigne immédiatement sur la situation de la mutation charolaise dans les autres races. Nous avons également analysé le cas de certains croisés dont l'un des parents est un individu charolais. Le tableau 1 ci-après présente les résultats du génotypage de allèle si et pour différentes races bovines. Races bovines Allèles du gène SILVER Nombre d'individus si/si SI/SI SI/si si/si] SI/si, testés si/si, Charolaise ± - - - 41 Limousine- ± - - 11 Blonde- ± - - 5 d'Aquitaine Salers- + - - - 8 Maine Anjou- ± - - 3 Montbéliarde- ± - - 3 Gasconne- ± - - 12 Aubrac- ± - - 10 Parthenaise- ± - - 3 Bazadaise- ± - - 6 Normande- ± - - 10 Blanc bleue- ± - - 6 Prim'Holstein - + - - - 1 Croises 4- - ± - 5 Charolaise 1 + Simmental 2- + 12 + française 5 + Tableau 1 : de l'allèle si et si] de différentes races bovines. L'allèle si est caractéristique de tous les individus de la race Charolaise. Cinq animaux croisés dont l'un des parents est charolais ont été également génotypes pour l'allèle si. Un des croisés est hétérozygote si/si]. Il porte l'allèle charolais si et l'allèle si]. L'allèle si] caractérise les individus d'origine Simmental. III) Analyse des données expérimentales Transcrit et produit du gène SIL VER bovin L'ARNm du gène SILVER bovin a une taille de 2086 pb. Les région 5' et 3' UTRs ont une taille de 29 pb et 107 pb respectivement (Fig.l). Le cadre de lecture ouvert a une taille de 1950 pb et code une protéine de 649 acides aminés avec un peptide signal de 24 acides aminés (Fig. 1). Structure génomique de la partie codante La partie codante du gène SILVER bovin comporte 11 exons et 10 introns (Fig.2). Les taille et la position des différents exons sont mentionnées dans le tableau 2 ci- après. Les sites donneurs (GT) et accepteurs (AG) de l'épissage sont parfaitement conservés. Exons Coordonnées au niveau Tailles codants Génomique Transcrit pb Exonl 22-97 30- 76 105 Exon2 2318-2428 106-216 111 Exon3 2574-2720 217-363 147 Exon4 3796-3930 364-498 135 Exon5 4307-4468 499-660 162 Exon6 4725-5405 661-1341 681 Exon7 6313-6429 1342-1458 117 Exon8 6673-6757 1459-1543 85 Exon9 6867-7072 1544-1749 206 ExonlO 7180-7267 1750-1837 88 Exonll 7890-8031 1838-1979 142 Tableau 2 : des exons codants au niveau génomique et au niveau du transcrit du gène SILVER Bovin. La position du premier nucléotide au niveau génomique correspond au premier nucléotide 5' de l'amorce SIL10 (Fig. 2). Au niveau du transcrit le premier nucléotide correspond au démarrage de la transcription (Fig. 1). Appartenance raciale de l'allèle si et la découverte d'un nouvel allèle L'analyse des données du génotypage (tableau 1) démontre que l'allèle si à l'état homozygote est rencontré uniquement pour les individus appartenant à la race charolaise. Les individus croisés de première génération dont l'un des parents est charolais sont également identifiables par leur génotype hétérozygote (si/SI). Un des croisés (tableau 1) que nous avons analysé présente le génotype suivant : si/si]. Il porte l'allèle charolais et un nouvel allèle si]. L'allèle si], se caractérise (Fig. 1) par la délétion de trois nucléotides T, T, et C en position 53,54 et 55 respectivement @ (AT53, AT54 et AC55). Les positions sont indiquées par rapport au premier nucléotide (adénine A) du démarrage de la traduction. Cette délétion engendre (Fig.l) la perte d'un acide aminé leucine en position 18 (ALI 8). Du fait de la position de cette délétion (adjacente à la mutation charolaise) en plus du rôle de l'acide aminé (leucine) dans l'efficacité de l'élimination du peptide signal, ce deuxième allèle du gène SILVER doit avoir un effet similaire à l'allèle charolais : une dilution de la couleur de la robe. Une des races, si non la seule qui possède un effet de dilution similaire à celui du charolais est la race Simmental. Génotypage de l'allèle si] Nous avons génotypé 12 individus appartenant à la race Simmental française. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. L'allèle si est rencontré dans la race simmental française à l'état homozygote (si/si]) et à l'état hétérozygote (si]/SI). L'allèle sauvage à l'état homozygote (SI/SI) est également rencontré. Homologies avec les données disponibles dans les banques 1. Données humaines et murines La protéine Silver bovine (nommée également Pmell7) présente 79% et 76% d'homologie avec ses homologues humain (ACC. AK092881) et murin (ACC. AK092881) respectivement. Il est à noter que l'acide aminé Glycine (G) qui se trouve substitué par une arginine (R) dans le cas de la race bovine charolaise (Fig.l) est conservé chez les autres bovins, l'homme et la souris. 2. Données bovines La comparaison de la séquence du transcrit du gène SILVER bovin avec les données disponibles dans les banques révèle la présence d'informations de séquences du gène SILVER bovin. Ces séquences sont de deux types : des ESTs (ACC : BM106313 ; AW352955 ; AW478070 ; BF604634 ; BF599555), mais également une séquence partielle (ACC : M81193) du transcrit du gène SILVER bovin. Cette séquence partielle a été publiée sous le nom de RPE1 (retinal pigment epithelium) en 1992 par Kim RY et Wistow GJ (The cDNA RPE1 and monoclonal antibody HMB-50 define gene products preferentially expressed in retinal pigment epthelium, Exp Eye Res 1992 Nov ; 55 (5) : 657-62). Elle a été isolée à partir de l'épithélium rétinien. La séquence RPE1 (Fig. 3) publiée par Kim et Wiston correspond probablement à une séquence partielle du transcrit du gène SILVER bovin ou à un isoforme du même gène, exprimé au niveau de la rétine. Il lui manque (Fig. 3) en effet 499 pb de la région 5', région où se trouve justement la mutation charolaise. La séquence diffère également de celle que nous avons identifié pour le gène SILVER par : la substitution de l'adénine en position 1151 par une cytosine (A1151C) ; la délétion du codon CAG en position 1458 (ACAG1458) ; la substitution de la guanine en position 1461 par une adénine (G1461A) et la substitution de la cytosine en position 1864 par une adénine (C1864A). Les positions sont citées par rapport au transcrit bovin charolais (Fig. 3). Ces différences au niveau de la séquence nucléotidique se traduisent par des modifications au niveau peptidique (Fig. 4). La délétion ACAG1458 conduit à la délétion de l'acide aminé glutamine en position 477 (AQ477) ; la substitution G1461A au remplacement de l'acide aminé glycine par l'acide aminé sérine en position 478 (G478S) et la substitution C1864A au changement de l'acide aminé alanine en position 612 par l'acide glutamique (A612E). La substitution A1151C est silencieuse. La position des acides aminés est citée par rapport à la séquence peptidique que nous avons déterminée (Fig. 4). III) Commentaire et Discussion La mutation si identifiée constitue le premier et unique marqueur moléculaire et génétique caractérisant une seule race bovine en l'occurrence la race charolaise à l'exclusion de toutes les autres races. Sa découverte résulte de l'analyse des données phénotypiques et moléculaires obtenues chez la souris et l'homme publiées par d'autres auteurs (Berson et al., Mol Biol Cell 2001 12(ll):3451-64 ; Raposo et al., J Cell Biol. 2001 Feb 19;152 (4):809-24 ; Kwon et al., Nucleic Acids Res. 1995 Jan 11, 23(1):154- 8 ; Kwon et al Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 15; 88(20):9228-32 ; Kim et al,. 1992, Exp Eye Res Nov ;55(5):657-62.). prend en compte les travaux concernant la structure des mélanosomes chez les bovins (Renieri et al., Pigment Cell Res. (1993), 6, 165-170). Elle est également basée sur une réévaluation des données de séquences murines, humaines et bovines disponibles dans les banques. Elle est aussi l'aboutissement d'un travail expérimental spécifique exploitant le génome des races bovines sélectionnées par les professionnels sur la base de leur phénotype de coloration de la robe. Le marqueur génétique, sujet de cette innovation, caractérise l'allèle du gène bovin SILVER (nommé également PMEL 17, GP100 ou ME20M). Le gène silver de la souris participe à la biogenèse du mélanosome et cela est également probable chez les autres mammifères. La mutation du gène bovin PMEL17 (SILVER) identifie ce dernier comme le gène de dilution, nommé ainsi précédemment sur la base des nombreuses observations découlant de l'analyse des phénotypes d'animaux croisés, l'un des parents étant un charolais de race pure (inscrit au Herd Book). L'allèle si charolais du gène PMEL17 est caractérisé par la substitution de la guanine en (Fig.l) position 64 par une adénine (G64A). Cette substitution modifie le codon GGG en position 22, spécifiant l'acide aminé glycine ou G, en un codon AGG spécifiant l'arginine ou R (le nucléotide n 1 correspond à l'adénine du codon de démarrage ATG qui spécifie la méthionine ou M ; 1). La mutation charolaise G64A affecte le peptide signal de la protéine PMEL 17, en un site essentiel pour sa maturation correcte dans le réticulum endoplasmique du mélanocyte. Ainsi, la protéine PMEL 17 incorrectement maturée ne peut plus s'engager dans la voie normale de son adressage au mélanosome via l'appareil de Golgi, organelle au sein duquel s'effectue la glycosylation. La PMEL 17 mutée ne peut donc pas atteindre finalement sous une forme correcte le mélanosome où sa fonction normale est de participer à la matrice sur laquelle s'effectue la polymérisation des mélanines et leur fixation. Le mélanosome charolais n'est donc pas ou très peu coloré, en raison du défaut structural ou de l'absence de la protéine PMEL17. A l'état homozygote, les deux allèles du gène SIL VER sont mutés, ce qui a pour conséquence que toutes les protéines PMEL17 sont inefficaces dans la polymérisation et le dépôt des mélanines. Ainsi la mutation G64A conduit à la formation de la couleur blanc crémeux , typique du bovin charolais. A l'état hétérozygote, un seul allèle est muté ce qui entraîne probablement que seule une moitié des protéines PMEL17 est inefficace. Le défaut partiel de la matrice du mélanosome se manifeste par une dilution de la couleur de l'animal croisé. Dans le cas du deuxième allèle si, il s'agit de la délétion de trois nucléotides (AT53, #T54 et AC55) dans la région codant le peptide signal. Cet allèle si] conduit précisément à la délétion d'un acide aminé hydrophobe (leucine). Du fait de la position de cette délétion (adjacente à la mutation charolaise) en plus du rôle de l'acide aminé (leucine) dans l'efficacité de l'élimination du peptide signal, ce deuxième allèle du gène SILVER aura un effet similaire à l'allèle charolais : une dilution de la couleur de la robe. Nous avons génotypé 12 individus de la race simmental française. 5 individus sont homozygotes si]/si, 5 autres sont hétérozygotes SI/si] et deux possèdent l'allèle sauvage à l'état homozygote (SI/SI). La race simmental a le même ancêtre commun datant du moyen age et dont le berceau se trouve dans la vallée de la rivière Simme en suisse, dans l'Oberland bernois (canton de Berne). L'hétérozygotie que présente la race simmental française n'est pas surprenante dans la mesure ou elle fait partie des races laitières en France qui sont très ouvertes sur l'extérieur, où la proportion de gènes étrangers atteint ou dépasse 75% (Boichard et al. 1996, INRA Prod. Anim., 9 (5), 323-335).. REVENDICATIONS 1. Utilisation de séquences nucléotidiques correspondant au gène SILVER, encore désigné gène SI, et aux différentes formes allèliques de ce gène, ou correspondant à des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins. 2. Utilisation selon la revendication 1, de séquences nucléotidiques correspondant au gène SILVER bovin représenté par SEQ ID NO : 1, codant pour la protéine bovine SI représentée par SEQ ID NO :2, et aux différentes formes allèliques de ce gène, ou correspondant à des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races bovines, ou de différents troupeaux bovins regroupant chacun plusieurs populations ou races bovines. 3. Utilisation de séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou 2, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à une population ou race bovine particulière, ou à un troupeau bovin particulier, ou, au contraire, permettant de certifier l'exclusion de cet animal de cette population ou race, ou de ce troupeau particulier. 4. Utilisation de séquences nucléotidiques selon l'une'des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les populations ou races bovines ou troupeaux bovins sont d'origine française. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4 : - de la séquence nucléotidique correspondant à la forme allèlique si représentée par SEQ ID NO : 3, codant pour la protéine bovine si représentée par SEQ ID NO : 4, ou à des fragments de cette forme allèlique comprenant la mutation G93A par rapport au gène SI, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à la race charolaise, - de la séquence nucléotidique correspondant à la forme allèlique si, représentée par SEQ ID NO : 5, codant pour la protéine bovine si] représentée par SEQ ID NO : 6, ou à des fragments de cette forme allèlique comprenant une délétion des trois nucléotides TTC situés aux positions 82,83 et 84 par rapport au gène SI, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance d'un animal à la race simmental, - de la séquence nucléotidique correspondant au gène SI bovin représenté par SEQ ID NO : 1, ou à des fragments de ce gène, pour la mise en oeuvre d'une méthode permettant de certifier l'exclusion d'un animal de la race charolaise. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, de fragments des séquences nucléotidiques correspondant aux formes allèliques SI, si, et si], représentées respectivement par SEQ ID NO : 1, 3, et 5, lesdits fragments étant choisis parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 desdites séquences. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, de fragments des séquences nucléotidiques correspondant aux formes allèliques SI, si, et si], lesdits fragments étant choisis parmi ceux de 294 nucléotides délimités par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 des séquences SEQ ID NO: 1 et 3, ces fragments étant représentés respectivement par les séquences SEQ ID NO : 7, et SEQ ID NO : 8, et le fragment de 291 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 299 de la séquence SEQ ID NO : 5, ce fragment étant représenté par la séquence SEQ ID NO : 9. 8. Utilisation d'amorces nucléotidiques permettant d'amplifier le nombre de copies du gène SILVER, ou des différentes formes allèliques de ce gène, ou des fragments de ce gène ou de ses différentes formes allèliques, tels que définis dans l'une des revendications 1 à 7, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification des différentes populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins. 9. Utilisation d'amorces nucléotidiques selon la revendication 8, sous forme de couples d'amorces 5'-3', ces couples étant tels que : - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce SIL10 représentée par la séquence SEQ ID NO : 10 suivante : 5' GTTGCTGGAAGGAAGAACAGGATGGATCTG 3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO :10, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 10, avec tout ou partie de la séquence nucléotidique complémentaire des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 9 et 38 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et 5, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce SIL8 représentée par la séquence SEQ ID NO : 11suivante : 5' CAGTCCCAAGTGCCTGAACACACATGCACC 3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 11, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 11, avec tout ou partie des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 276 et 302 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et par les nucléotides situés aux positions 273 et 299, de la séquence SEQ ID NO : 5. 10. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène SI bovin représenté par SEQ ID NO : 1, ou aux fragments suivants du gène SI: - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 1, - le fragment SEQ ID NO : 7 de 294 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 de la séquence SEQ ID NO : 1. 11. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène si bovin représenté par SEQ ID NO : 3, ou aux fragments suivants du gène si : - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 3, - le fragment SEQ ID NO ;8 de 294 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 302 de la séquence SEQ ID NO : 3. 12. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle correspond au gène si] bovin représenté par SEQ ID NO : 5, ou aux fragments suivants du gène si] : - tout fragment choisi parmi ceux d'environ 10 à 300 nucléotides contenant les nucléotides situés aux positions 82 à 93 de la séquence SEQ ID NO : 5, - le fragment SEQ ID NO : 9 de 291 nucléotides délimité par les nucléotides situés aux positions 9 et 299 de la séquence SEQ ID NO : 5. 13. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend : - la séquence nucléotidique SIL10 représentée par la séquence SEQ ID NO : 10 suivante : 5' GTTGCTGGAAGGAAGAACAGGATGGATCTG 3' ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 10, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 10, avec tout ou partie de la séquence nucléotidique complémentaire des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 9 et 38 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et 5, - la séquence nucléotidique SIL8 représentée par la séquence SEQ ID NO : 11 suivante : 5' CAGTCCCAAGTGCCTGAACACACATGCACC 3' @ ou toute séquence dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 11, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée s'hybridant, tout comme la séquence SEQ ID NO : 11, avec tout ou partie des séquences nucléotidiques délimitées par les nucléotides situés aux positions 276 et 302 des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et par les nucléotides situés aux positions 273 et 299, de la séquence SEQ ID NO : 5. 14. Couples d'amorces, dont chacune des deux amorces comprend, indépendamment l'une de l'autre, environ 10 à environ 30 nucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont choisis de telle façon que l'une des deux séquences d'un couple d'amorces s'hybride avec une séquence d'environ 10 à environ 30 nucléotides comprise dans la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et environ 60 des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1, 3, et 5, tandis que l'autre séquence de ce même couple s'hybride avec une séquence d'environ 10 à environ 30 nucléotides comprise entre le nucléotide situé en position 94 et le dernier des nucléotides des séquences SEQ ID NO : 1, 3, et 5. 15. Couples d'amorces pour l'amplification génique selon la revendication 14, caractérisé en ce que : - l'une des amorces est choisie parmi les séquences comprenant la séquence SIL10 représentée par SEQ ID NO : 10, ou toute séquence dérivée de cette dernière, selon la revendication 13, ladite amorce étant avantageusement marquée, notamment de manière radioactive ou fluorescente, - tandis que l'autre amorce est choisie parmi les séquences comprenant la séquence SIL8 représentée par SEQ ID NO : 11, ou toute séquence dérivée de cette dernière, selon la revendication 13. 16. Procédé d'identification de populations ou races des mammifères ruminants tels que les bovins, les ovins, et les caprins, ledit procédé étant effectué à partir d'un échantillon biologique prélevé sur l'animal, notamment à partir de sperme, embryon, sang, lait, poils, carcasse, ou viande, ou autres produits dérivés de ces derniers, et permettant de contrôler, voire de certifier, l'appartenance ou la non-appartenance de l'animal sur lequel a été prélevé ledit échantillon biologique à une population ou race de mammifères ruminants, ce procédé comprenant : - une étape d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SILVER, à savoir des allèles SI, et/ou si, et/ou si], et/ou de fragments de ces formes allèliques, spécifiques d'une population ou race de mammifères ruminants déterminés, et susceptibles d'être présents dans ledit échantillon biologique, - une étape de détection desdites formes allèliques ou fragments de ces dernières. 17. Procédé d'identification selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SILVER, ou des fragments de ces formes allèliques, est effectué à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 14 ou 15. 18. Procédé d'identification selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que : - la détection d'un génotype comprenant l'allèle si dans l'échantillon biologique étudié, permet de certifier que ledit échantillon provient d'un animal appartenant à la race charolaise ou ayant au moins un ascendant de race charolaise, - la détection d'un génotype comprenant l'allèle si] dans l'échantillon biologique étudié, permet de certifier que ledit échantillon provient d'un animal appartenant à la race simmental ou ayant au moins un ascendant de race simmental, - la détection d'un génotype comprenant l'allèle SI, permet de certifier que ledit échantillon ne provient pas d'un animal de la race charolaise. 19. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces selon la revendication 14 ou 15, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de la réaction d'amplification du nombre de copies des différentes formes allèliques du gène SILVER.