FR 2854903 A1 20041119 FR 0305730 A 20030513 ~UTILISATION DES LOCI BAGE (B MELANOMA ANTIGENS) COMME MARQUEURS TUMORAUX La présente invention a pour objet l'utilisation des loci BAGE (B melanoma antigens), et plus particulièrement de fragments de ces loci, pour la mise en #uvre de méthodes de diagnostic des cancers. Les méthodes actuellement utilisées pour le diagnostic des tumeurs sont les suivantes : 1. Examen radiologique. Il permet d'identifier une masse tumorale, mais nécessite souvent un examen complémentaire des cellules afin de vérifier si la néoformation est néoplasique. 2. Examen cytologique/histologique. Cellules et/ou tissus sont analysés sur la base de critères morphologiques. L'analyse est faite en microscopie optique par un analyste expérimenté et ne peut pas être automatisé. 3. Présence/absence d'une protéine. Certaines protéines sont spécifiquement associées à une ou plusieurs tumeurs. 4. Expression d'un gène. L'expression d'un gène peut également avoir valeur prognostic et/ou diagnostic. Les protéines ou les gènes utilisés comme marqueurs tumoraux sont spécifiques d'une ou de quelques tumeurs. De plus, protéines et ARN sont moins stables que l'ADN qui est utilisé dans la méthode l'invention. Puisque toute méthode diagnostique est ni infaillible (faux positifs et faux négatifs), ni universelle, il est donc important de développer des nouveaux marqueurs tumoraux pour renforcer les protocoles déjà disponibles. Le gène BAGEI (B melanoma antigens 1) avait été isolé car il code pour un antigène tumoral (Boël et al., 1995). Récemment, les Inventeurs ont identifié et caractérisé des nouveaux membres de la famille des gènes BAGE (Ruault et al., 2002). Comme BAGE1, les nouveaux gènes BAGE sont exprimés uniquement dans les cellules cancéreuses et dans le testicule, alors qu'ils sont silencieux dans les autres tissus normaux. Les protéines et/ou les peptides codés par ces gènes pourraient être utilisés pour induire une réponse cellulaire spécifique (lymphocytes T cytolytiques) contre les tumeurs qui présentent ces antigènes à la surface cellulaire. Une demande internationale de brevet a été déposée au nom du CNRS (PCT/EP02/03811) pour protéger les nouveaux gènes BAGE. La présente invention découle de l'analyse par les inventeurs de la méthylation (présence de 5-méthylcytosine) de l'ADN de la région 5' des loci BAGE. L'analyse a été effectuée sur 8 tissus normaux et 23 tumeurs (13 mélanomes, 5 cancers de l'ovaire, 5 tumeurs de Wilms). Ils ont ainsi montré que les gènes BAGE sont hyperméthylés dans les tissus normaux et hypométhylés dans les tumeurs. La présente invention a donc principalement pour but l'utilisation des loci BAGE comme marqueurs tumoraux pour le diagnostic du cancer. La nouvelle méthode pour le diagnostic des tumeurs de la présente invention, est basée sur l'analyse de l'hypométhylation des loci BAGE. L'analyse est faite sur l'ensemble des loci BAGE, à savoir sur les gènes fonctionnels et sur les gènes tronqués. La procédure est nouvelle, le matériel biologique utilisé (l'ADN) est très stable et la méthode d'analyse peut être automatisée. Toutes les tumeurs analysées par les inventeurs ont présenté une hypométhylation des loci BAGE.. La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal caractérisées en ce qu'elle est effectuée par : - extraction de l'ADN total contenu dans les cellules de l'échantillon biologique prélevé à analyser, - suivie de la détermination du taux de méthylation en position 5 de l'anneau pyrimidine des desoxycytidines des doublets CpG (desoxycytidine suivie d'une desoxyguanidine sur le même brin d'ADN en direction 5' #3') compris : * dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13 issues des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total, * ou dans des fragments des séquences susmentionnées comprenant au moins un doublet CpG, * ou dans des séquences dérivées des séquences ou fragments susmentionnés, et ayant une homologie d'environ 90% avec ces derniers, et comprenant au moins un doublet CpG, lesdites séquences dérivées étant susceptibles d'hybrider avec les séquences ou fragments susmentionnés, notamment dans un tampon d'hybridation 5xSSPE à 55 C, - et comparaison du taux de méthylation des desoxycytidines dans les séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total de l'échantillon biologique à analyser, avec le taux de méthylation desdites desoxycytidines dans ces séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total d'un échantillon biologique sain non cancéreux, la détermination d'un taux de méthylation dans l'échantillon biologique analysé inférieur au taux de méthylation dans l'échantillon sain étant corrélable avec le diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal dont est issu l'échantillon biologique analysé. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes : - une étape de traitement de l'ADN extrait de l'échantillon biologique au bisulfite de sodium qui convertit les desoxycytidines non méthylées en desoxyuridines, sans modifier les desoxycytidines méthylées, - au moins une étape d'amplification à l'aide de couples d'amorces appropriés permettant l'amplification de toutes les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, notamment selon la technique PCR (Polymerase Chain Reaction), du nombre de copies des séquences issues de loci BAGE et correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou aux séquences dérivées ou fragments de ces séquences tels que définis ci-dessus, et dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées ont été transformés en desoxyuridines lors de l'étape précédente de traitement au bisulfite de sodium, ces desoxyuridines correspondant à des desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées correspondant aux desoxycytidines dans les copies de séquences ainsi obtenues, - une étape de mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées susmentionnées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou dans les fragments de ces séquences, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique. La présente invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend deux étapes d'amplification du nombre de copies de séquences SEQ ID NO : 1 à 13, dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées sont transformés en desoxyuridines puis en desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées sont transformées en desoxycytidines non méthylées, la première étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) et la deuxième étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant: amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO : 17) La présente invention concerne également une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou dans les séquences dérivées ou les fragments de ces séquences tels que définis ci-dessus, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, est effectuée selon l'une des méthodes suivantes : - clonage et/ou séquençage des séquences amplifiées, - ou par digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction reconnaissant dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou les séquences dérivées ou fragments susmentionnés, un site de restriction où se situe une desoxycytidine d'un ou plusieurs doublets CpG de référence, lesdites enzymes coupant, ou inversement ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets de référence susmentionnés, séparation des éventuels fragments de restriction obtenus, notamment par électrophorèse, mesure de la quantité de ces fragments, notamment par mesure de l'intensité des bandes d'électrophorèse correspondantes, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience par digestion à l'aide des mêmes enzymes des séquences SEQ ID NO : 1 à 13 méthylées de 0 à 100% avec un réactif de méthylation telle que la méthyltransférase CpG methylase M. SssI, - ou par traitement des séquences amplifiées avec un réactif de méthylation tel que M. SssI, qui permet donc la méthylation des desoxycytidines présentes dans les doublets CpG des séquences amplifiées et correspondant aux desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou les séquences dérivées ou fragments susmentionnés, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, suivie de la quantification desdites desoxycytidines ainsi méthylées à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine marqués, ou susceptibles d'être reconnus par un réactif marqué, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine en présence des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou des séquences dérivées ou fragments susmentionnés, méthylées de 0 à 100% à l'aide d'un réactif de méthylation tel que M. SssI. La présente invention a plus particulièrement pour objet une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, par la méthode de digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction, est effectuée à l'aide : - d'enzymes coupant les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telles que les enzymes choisies parmi les suivantes : . l'enzyme MboI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 407 à 410, et 736 à 439 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant respectivement la séquence entre les positions 406 et 407, et les positions 435 et 436, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 410 et 439, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185, * 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196, * 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ ID NO : 5, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185, * 370 à 373, 958 à 961, et 987 à 990 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant respectivement la séquence entre les positions 369 et 370, les positions 957 et 958, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 373, 961, et 990, * 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 8, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 240 à 205 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 201 et 202, le doublet CpG de référence étant situé à la position 205, * 13 à 16 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 12 et 13, le doublet CpG de référence étant situé à la position 16, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de Mbol dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés, . l'enzyme AclI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234, * 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234, * 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 212 à 217 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 213 et 214, le doublet CpG de référence étant situé à la position 214, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de AclI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés, - d'enzymes ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, mais coupant,lesdites séquences lorsque celles-ci contiennent une desoxythymidine en lieu et place d'une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement non méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telle que l'enzyme HphI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 501 à 505 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant la séquence entre les positions 513 et 514, le doublet CpG de référence étant situé à la position 503, * 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249, * 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 5, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249, * 1052 à 1056 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant la séquence entre les positions 1064 et 1065, le doublet CpG de référence étant situé à la position 1054, * 314 à 318 de la séquence SEQ ID NO : 9, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316, * 314 à 318 de la séquence SEQ ID NO :10, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316, * 267 à 271 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 279 et 280, le doublet CpG de référence étant situé à la position 269, * 10 à 14 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 18 et 19, le doublet CpG de référence étant situé à la position 12, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de HphI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme, et que la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés. L'invention concerne également les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences contenant au moins un doublet CpG. La présente invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences tels que définis ci-dessus, dans lesquelles les desoxycytidines n'appartenant pas à un doublet CpG sont remplacées par des desoxyuridines ou des desoxythymidines, et, le cas échéant, l'une au moins des desoxycytidines des doublets CpG est remplacée par un desoxyuridine ou une desoxythymidine. , L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques telles que définies ci- dessus, caractérisées en ce qu'aucune des desoxycytidines des doublets CpG n'est méthylée, ou en ce qu'au moins une jusqu'à la totalité des desoxycytidines des doublets CpG est méthylée. L'invention concerne également les couples d'amorces pour l'amplification des séquences nucléotidiques telles que définie ci-dessus, choisis parmi les suivants : amorce 5' : (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO :16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO : 17) L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, ou des couples d'amorces susmentionnés, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus. L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces susmentionné, et le cas échéant : - les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR, - du bisulfite de sodium, - des enzymes de restriction telles que MboI, Acll, ou HphI, - un réactif de méthylation tel que M. SssI, - une courbe étalon correspondant à 0% jusqu'à 100% de méthylation de l'une au moins des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, choisie en fonction du ou des couples d'amorces utilisés. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en évidence de l'hypométhylation des loci Bage dans les tumeurs. Matériels et Méthodes Extraction ADN génomique 1 Traitement de l'ADN au bisulfite de Na (Cm--C ; C-U) Amplification du locus d'intérêt par PCR (Cm-C ; U-T) te Frommer Cobra Nouvelle méthode A. Traitement au bisulfite de sodium L'ADN total a été extrait à partir de tissus selon des techniques standards et soumis à une réaction chimique avec le bisulfite de sodium qui convertit les cytosines en thymines, tout en laissant intactes les 5-méthylcytosines. La réaction de conversion avec le bisulfite de sodium a été effectuée comme décrit par Frommer et collaborateurs (1992). Brièvement, 500 ng d'ADN ont été dénaturés dans 111 l 0,3 M NaOH (en présence de 10 g ARNm de levure) à 42 C pendant 20 minutes. Pour la déamination des cytosines non-methylées et leur conversion en uracile, 1200 l d'une solution de bisulfite de sodium fraîchement préparée [541 g/1 (sigma, réactif de catégorie d'ACS) en 10 mM d'hydroquinone (sigma), pH 5 ] ont été ajoutés directement à l'ADN dénaturé. La réaction a été couverte avec 200 l de l'huile minérale (sigma, catégorie IRE) et incubée à 55 C pendant 4h dans l'obscurité. L'ADN a été dessalé en utilisant un kit de purification d'ADN (Promega Wizard Clean-Up) et élué avec 105 l 1 mM Tris/HCl pH 8,5. 100 l de cette solution d'ADN ont été traités par 0,3 M NaOH à 37 C pendant 30 minutes. Pour la neutralisation, l'acétate d'ammonium a été ajouté à une concentration finale de 3 M et l'ADN a été précipité avec l'éthanol, en utilisant 1 g d'ARNm de levure comme carrier. L'ADN a été dissout dans 100 l 10 mM Tris/HCl pH 8,5 et conservé à -20 C jusqu'à utilisation. Réaction de conversion des cytosines en uraciles. B. Amplification des loci BAGEpar PCR A partir de l'ADN traité au bisulfite de sodium, les inventeurs ont amplifié par PCR un fragment d'ADN d'environ 500 pb localisé dans la région 5' des loci BAGE. L'amplification par PCR a été effectuée avec deux réactions consécutives (Fig.l). La double PCR permet de produire plus d'ADN. Etant donnée que les séquences BAGE sont presque identiques (95- 99% identité de séquence nucléique), il est impossible d'amplifier spécifiquement un seul locus. Les amorces utilisées amplifient donc plusieurs loci BAGE à la fois. Les amorces utilisée pour la première réaction étaient BAGE.BS+32f (TttagaggaTTaggagaagggggagT) et BAGE.BS+1540r (AcctAccaAttAAcattAttActAacattA) ; les amorces utilisée pour la deuxième amplification étaient BAGE. BS+99f (gatggtggtggTaaTagagatggT) et BAGE.BS+1371r (ccttaAAcaAtAtaAaccctAataA). Les nucléotides résultant de la déamination des cytosines non-méthylées sont en majuscule. La réaction de PCR a été faite dans 50 l avec 25 ng de l'ADN génomique comme matrice (on ne considère pas la perte d'ADN pendant le traitement avec le bisulfite), 50 pmol de chaque amorce, 2. 5 U Taq- polymérase (Promega), le tampon standard fourni avec l'enzyme, 1,5 mM MgC12 et 200 M de chaque dNTP. 2. 5 \il du premier mélange de PCR ont été utilisés comme matrice pour le deuxième PCR. Les temps et les températures d'incubation étaient 94 C 2 minutes suivis de 5 cycles (94 C 1 minute, 55 C 2 minutes, 72 C 3 minutes), de 25 cycles (94 C 0. 5 minute, 55 C 2 minutes, 72 C 1.5 minute) et de 72 C 10 minutes. Les cytosines non méthylées, converties en uraciles par le bisulfite de sodium, sont transformées en thymines par la réaction de PCR. Les 5-méthylcytosines restent sous forme de cytosines. C. Analyse des cytosines et des Sméthylcytosines. Pour identifier les cytosines et les 5-méthyl cytosines présentes dans les fragments d'ADN amplifiés, les inventeurs ont utilisé deux méthodes différentes et une troisième est à l'étude. 1. Clonage et Séquençage (Frommer et al., 1992). Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) a été cloné dans un vecteur pCRII TOPO (Invitrogen) et transformé dans des cellules E. coli. Les bactéries transformées ont été utilisées directement comme matrice pour amplifier les inserts avec des amorces universelles (SP6 et T7). Les produits de PCR ont été séquences et les séquences obtenues ont été comparées à la séquence génomique des loci BAGE grâce au logiciel Methtools software, mis au point par l'un des inventeurs (Grunau, 2000). La comparaison avec les séquences génomiques connues a permis d'identifier dans les séquences clonées les cytosines, qui ont été converties en thymines, et les 5-méthylcytosines, qui restaient sous forme de cytosines. Cette méthode est très informative car (1) elle permet d'analyser la méthylation de l'ensemble des cytosines présentes dans la région amplifiée par PCR ; (2) elle permet d'analyser la méthylation de chaque locus BAGE de façon individuelle. 2. COBRA (Combined Bisulfite and Restriction enzyme Assay) (Xiong and Laird, 1997). Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) a été digéré avec 2 enzymes de restriction (MboI et HphI) et analysé par électrophorèse (Fig.2). Les produits de PCR sont purifiés. La concentration de l'ADN a été mesurée au spectrophotomètre (Eppendorf BioPhotometer). La taille et la qualité des produits de PCR ont été vérifiées par séparation sur un gel d'agarose 2% dans 0.5x TBE (Tris Borate EDTA) et visualisées avec le bromure d'ethidium. 700 ng de produit de PCR ont été incubés avec 2.5 U d'enzymes de restriction MboI (NEB) ou HphI (Fermentas) pendant 2 heures à 37 C dans 20 l. 20 l ont été chargés sur un gel d'agarose 2% dans 0.5x TBE et les fragments ont été séparés par l'électrophorèse. Les images ont été digitalisées avec un appareil-photo CCD et analysées avec le logiciel d'ImageQuant. Des ,mélanges définis de l'ADN méthylés avec SssI ont été utilisés comme standards pour obtenir une courbe étalon. Les sites de restriction des enzymes utilisées contiennent des cytosines qui, si elles ne sont pas méthylées, sont converties par le bisulfite de sodium en thymines (Fig. 3). La réaction enzymatique permet donc de distinguer entre 5méthylcytosine et cytosine. La méthode COBRA permet de mesurer la méthylation de l'ensemble des loci BAGE et permet d'analyser la méthylation d'une seule cytosine par enzyme de restriction. Ces cytosines ont été définies au préalable (grâce à la méthode séquençage et clonage) comme informatives de la méthylation de la région analysée. 3. Nouvelle méthode d'analyse de la méthylation des loci BAGEselon l'invention Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) est traité avec une enzyme M. SSSI méthyltransferase qui méthyle les cytosines contenues dans les doublets CpG. Dans l'ADN amplifié par PCR, les cytosines ont été converties en thymines alors que les 5methylcytosines sont sous formes des cytosines. Ces dernières sont re-méthylées par l'enzyme M. SSSI. L'ADN, fixé sur un support, est traité avec un anticorps commercial anti 5-méthylcytosine. Un deuxième anticorps permet de quantifier les 5-méthylcytosines présentes dans l'ADN grâce à une réaction colorimétrique (ELISA). L'ELISA est une méthode déjà très utilisée dans le milieu hospitalier. , Comme la méthode COBRA, cette nouvelle procédure permet d'analyser la méthylation de l'ensemble des loci BAGE mais ne permet pas de mésurer la méthylation individuelle de chaque locus. Par rapport à la méthode COBRA, elle a deux avantages : (1) elle permet d'analyser la méthylation de l'ensemble des cytosines présentes dans la région amplifiée par PCR. (2) elle est plus facile à utiliser, donc, plus adaptée à l'analyse de routine d'échantillons tumoraux. Résultats Analyse de la méthylation des loci BAGE sur des tissus normaux et cancéreux. Nous avons analysé la méthylation des loci BAGE dans 8 tissus normaux et 23 tumeurs (13 mélanomes, 5 cancers de l'ovaire, 5 tumeurs de Wilms) en utilisant la méthode COBRA. Notre travail montre que les loci BAGE sont hyperméthylés dans les tissus normaux et hypométhylés dans les tumeurs. Un seul tissu normal présente une hypométhylation des loci BAGE : le testicule. Ce résultat était attendu car le testicule est le seul tissu normal dans lequel les gènes BAGE sont exprimés. Par conséquent, le système de l'invention n'est pas adapté au diagnostic des tumeurs du testicule. Légende des figures. Fig. 1 : schématique de la séquence SEQ ID NO : 7 issue d'un locus BAGE et position des amorces (représentées par des flèches, non à l'échelle) utilisées pour amplifier le fragment d'ADN analysé. Fig. 2 : Représentation schématique des séquences SEQ ID NO : 1 à 13 issues des différents loci BAGE, et des sites de restriction diagnostiques (triangles). Fig. 3 : d'analyse combinée de restriction et bisulfite (COBRA) dans un locus BAGE : à gauche, séquence contenant la cytosine diagnostique (avant dernier nucléotide) avant conversion et, à droite, la même séquence après conversion au bisulfite de sodium (deux cas de figures selon si la cytosine est ou n'est pas méthylée). Les triangles indiquent le site de coupure de l'enzyme. Références. 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A.R. 12 : (1997). REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, à l'exception des tumeurs des testicules, caractérisée en ce qu'elle est effectuée par : - extraction de l'ADN total contenu dans les cellules de l'échantillon biologique prélevé à analyser, - suivie de la détermination du taux de méthylation en position 5 de l'anneau pyrimidine des desoxycytidines des doublets CpG (desoxycytidine suivie d'une desoxyguanidine sur le même brin d'ADN en direction 5' # 3') compris : * dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13 issues des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total, * ou dans des fragments des séquences susmentionnées comprenant au moins un doublet CpG, * ou dans des séquences dérivées des séquences ou fragments susmentionnés, et ayant une homologie d'environ 90% avec ces derniers, et comprenant au moins un doublet CpG, lesdites séquences dérivées étant susceptibles d'hybrider avec les séquences ou fragments susmentionnés, notamment dans un tampon d'hybridation 5xSSPE à 55 C, - et comparaison du taux de méthylation des desoxycytidines dans les séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total de l'échantillon biologique à analyser, avec le taux de méthylation desdites desoxycytidines dans ces séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total d'un échantillon biologique sain non cancéreux, la détermination d'un taux de méthylation dans l'échantillon biologique analysé inférieur au taux de méthylation dans l'échantillon sain étant corrélable avec le diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal dont est issu l'échantillon biologique analysé. 2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes : - une étape de traitement de l'ADN extrait de l'échantillon biologique au bisulfite de sodium qui convertit les desoxycytidines non méthylées en desoxyuridines, sans modifier les desoxycytidines méthylées, - au moins une étape d'amplification à l'aide de couples d'amorces appropriés permettant l'amplification de toutes les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, notamment selon la technique PCR (Polymerase Chain Reaction), du nombre de copies des séquences issues de loci BAGE et correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou aux séquences dérivées ou fragments de ces séquences tels que définis dans la revendication 1, et dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées ont été transformés en desoxyuridines lors de l'étape précédente de traitement au bisulfite de sodium, ces desoxyuridines correspondant à des desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées correspondant aux desoxycytidines dans les copies de séquences ainsi obtenues, - une étape de mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées susmentionnées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou dans les fragments de ces séquences, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique. 3. Méthode de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend deux étapes d'amplification du nombre de copies de séquences SEQ ID NO: 1 à 13, dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées sont transformés en desoxyuridines puis en desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées sont transformées en desoxycytidines non méthylées, la première étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) et la deuxième étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant: amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO : 17) 4. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou dans les séquences dérivées ou les fragments de ces séquences tels que définis dans la revendication 1, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, est effectuée selon l'une des méthodes suivantes : - clonage et/ou séquençage des séquences amplifiées, - ou par digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction reconnaissant dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou les séquences dérivées ou fragments susmentionnés, un site de restriction où se situe une desoxycytidine d'un ou plusieurs doublets CpG de référence, lesdites enzymes coupant, ou inversement ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets de référence susmentionnés, séparation des éventuels fragments de restriction obtenus, notamment par électrophorèse, mesure de la quantité de ces fragments, notamment par mesure de l'intensité des bandes d'électrophorèse correspondantes, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience par digestion à l'aide des mêmes enzymes des séquences SEQ ID NO : 1 à 13 méthylées de 0 à 100% avec un réactif de méthylation telle que la méthyltransférase CpG methylase M. SssI, - ou par traitement des séquences amplifiées avec un réactif de méthylation tel que M. SssI, qui permet donc la méthylation des desoxycytidines présentes dans les doublets CpG des séquences amplifiées et correspondant aux desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou les séquences dérivées ou fragments susmentionnés, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, suivie de la quantification desdites desoxycytidines ainsi méthylées à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine marqués, ou susceptibles d'être reconnus par un réactif marqué, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine en présence des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou des séquences dérivées ou fragments susmentionnés, méthylées de 0 à 100% à l'aide d'un réactif de méthylation tel que M. SssI. 5. Méthode de diagnostic selon la revendication 4,, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, par la méthode de digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction, est effectuée à l'aide - d'enzymes coupant les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telles que les enzymes choisies parmi les suivantes : . l'enzyme Mbol reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 407 à 410, et 736 à 439 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant respectivement la séquence entre les positions 406 et 407, et les positions 435 et 436, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 410 et 439, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185, * 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196, * 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ ID NO : 5, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185, * 370 à 373,958 à 961, et 987 à 990 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant respectivement la séquence entre les positions 369 et 370, les positions 957 et 958, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 373, 961, et 990, * 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 8, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 240 à 205 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 201 et 202, le doublet CpG de référence étant situé à la position 205, * 13 à 16 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 12 et 13, le doublet CpG de référence étant situé à la position 16, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de MboI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés, . l'enzyme AclI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234, * 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234, * 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 212 à 217 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 213 et 214, le doublet CpG de référence étant situé à la position 214, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de AclI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés, - d'enzymes ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, mais coupant lesdites séquences lorsque celles-ci contiennent une desoxythymidine en lieu et place d'une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement non méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telle que l'enzyme HphI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 501 à 505 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant la séquence entre les positions 513 et 514, le doublet CpG de référence étant situé à la position 503, * 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249, * 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 5, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249, * 1052 à 1056 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant la séquence entre les positions 1064 et 1065, le doublet CpG de référence étant situé à la position 1054, *314à318dela séquence SEQ ID NO : 9, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316, * 314 à 318 de la séquence SEQ ID NO : 10, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316, * 267 à 271 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 279 et 280, le doublet CpG de référence étant situé à la position 269, * 10 à 14 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 18 et 19, le doublet CpG de référence étant situé à la position 12, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de HphI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme, et que la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés. 6. Séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences contenant au moins un doublet CpG. 7. Séquences nucléotidiques correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences selon la revendication 6, dans lesquelles les desoxycytidines n'appartenant pas à un doublet CpG sont remplacées par des desoxyuridines ou des desoxythymidines, et, le cas échéant, l'une au moins des desoxycytidines des doublets CpG est remplacée par un desoxyuridine ou une desoxythymidine. 8. Séquences nucléotidiques selon la revendication 6 ou 7, caractérisées en ce qu'aucune des desoxycytidines des doublets CpG n'est méthylée, ou en ce qu'au moins une jusqu'à la totalité des desoxycytidines des doublets CpG est méthylée. 9. Couples d'amorces pour l'amplification des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 6 à 8, choisis parmi les suivants : , amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : (SEQ ID NO : 17) 10. Utilisation des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 6 à 8, ou des couples d'amorces selon la revendication 9, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 1 à 5. 11. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces selon la revendication 9, et le cas échéant : - les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR, - du bisulfite de sodium, - des enzymes de restriction telles que MboI, AclI, ou HphI, - un réactif de méthylation tel que M. SssI, - une courbe étalon correspondant à 0% jusqu'à 100% de méthylation de l'une au moins des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, choisie en fonction du ou des couples d'amorces utilisés.