FR 2861304 A1 20050429 FR 0312417 A 20031023 MODULATEURS DES CANAUX CFTR L'invention concerne des compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies associées à un dysfonctionnement des canaux CFTR, telles que notamment mucoviscidose, asthme ou diarrhée. Ces compositions contiennent une molécule se présentant, à pH physiologique, sous la forme d'un zwittérion de formule : avec X = 0 ou S. La protéine CFTR ou cystic fibrosis transmembrane conductance regulator est une protéine trans-membranaire qui a été mise en évidence dans le cadre de la recherche du gène responsable de la mucoviscidose (ou fibrose kystique). Le canal CFTR apparaît être une des clefs de la régulation du transport d'ions chlorure dans les cellules épithéliales. Les épithéliums forment une barrièrecontinue entre l'environnement extérieur et le milieu interne tout en permettant le transport d'ions, de solutés et de macromolécules entre ces compartiments. L'absorption de Na+ et la sécrétion de Cl- sont des éléments majeurs de la fonction épithéliale. Les ions chlorure pénètrent dans la cellule épithéliale par la surface basolatérale par l'intennédiaire d'un co-transporteur sous forme (Na+, K+, 2 CI-) et en sortent en utilisant les canaux CFTR de la surface apicale [1]. Deux types de pathologie peuvent être associées à des dysfonctionnements opposés des canaux CFTR. Une inhibition du fonctionnement est responsable des problèmes liés à la mucoviscidose. Dans cette maladie, en raison de mutations génétiques, soit la protéine CFTR encodée n'est pas délivrée à la surface apicale, soit elle ne peut pas être activée, d'où une impossibilité pour les ions chlorure de sortir de la cellule épithéliale. Ce phénomène induit une absorption des ions sodium et se traduit par un épaississement du mucus, obstruant les voies respiratoires. Inversement, une suractivité du canal CFTR est à l' origine de diarrhées. L'élimination excessive de sel s'accompagne d'une perte d'eau, donc de problèmes liés à cette déshydratation. L'exaltation du fonctionnement des canaux CFTR peut être consécutive à la présence de toxines de bactéries telles que Escherichia coli ou V. cholerae. La protéine CFTR fait partie de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassettes). Elle est constituée de 1480 acides aminés [2,3, 4] composant deux parties homologues reliées entre elles par un domaine régulateur cytoplasmique (R). Chaque partie comporte six domaines transmembranaires (Ml à M6 et M7 à M 12) et un domaine de fixation de nucléotides (NBD-1 et NBD-2). Entre les domaines transmembranaires M7 et M8, sont présents deux sites N-glycosylés. Les douze domaines transmembranaires forment un canal dont l'activité est déterminée par la phosphorylation du domaine R ainsi que par l'hydrolyse de molécules d'ATP fixées dans les NBDs. Dans le cône extracellulaire sont présents anions et cations. La sélectivité de ce canal pour les anions serait principalement due à la présence d'un résidu arginine Arg-352 (R352) à l'extrémité du cône cytoplamisque. Le diamètre minimum de ce pore serait d'environ 5,3 Â. Cette taille a été déterminée à partir des anions les plus gros pénétrant dans la cellule. Toutefois, de manière transitoire, le canal pourrait se dilater jusqu'à 13 de diamètre. Les différents activateurs connus agissent de différentes manières. On peut citer entre autres trois modes d'action : - ceux qui agissent directement sur les NBD : la génistéine qui prolonge l'ouverture du canal ; le NS-004 ou les MPB (benzo[c]quinolizinium substitués) ; ceux qui agissent par augmentation de la quantité de l'AMP cyclique nécessaire à l'activation du domaine régulateur R : la forskoline qui active la biosynthèse de l'AMP cyclique ; la milrinone, supposée agir par son action inhibitrice de phosphodiestérases ; ceux qui inhibent les protéines phosphatases, enzymes qui régulent la fermeture du canal par déphosphorylation du domaine R, à savoir le bromotétramisol ou certaines xanthines: En ce qui concerne les inhibiteurs, leur mode d'action consiste généralement au blocage du pore empêchant ainsi les ions de passer à travers le canal [3]. On peut citer, entre autres, des acides carboxyliques, tels que IAA-94 (acide indanyloxyacétique), DPC (diphénylamine-2-carboxylate) et NPPB (5-nitro-2-(3-phénylpropylamino)benzoate), DIDS (acide 4,4'- diisothiocyanostylbène-2,2'-disulfonique) ou des sulfonylurées dont la glibenclamine fait partie : Ces molécules inhibent le canal CFTR à hautes concentrations et ne sont pas spécifiques de ces canaux. La concentration nécessaire pour inhiber 50% de l'activité du canal CFTR (IC50) par la lonidamine est de 58 M. Ces inhibiteurs agissent également sur les autres canaux chlorure et les canaux potassiques. En 2002, Ma et coll. rapportent une nouvelle classe d'inhibiteurs et de nouvelles familles d'activateurs possédant, toutes les deux, des activités très importantes par rapport à celles rapportées jusqu'alors [5, 6] : Les nouveaux inhibiteurs sont de type 2-thiooxo-4-thiazolidinone. Ils possèdent une activité spécifique pour CFTR. L'un d'entre eux, CFTRinh-172, présente une inhibition de 50% (IC50) pour une concentration de 0,2 M ainsi qu'une absence de toxicité à 7 jours chez la souris pour une injection de 10 mg/kg. Il présente ainsi des atouts nécessaires à une application thérapeutique. Une dose injectée chez la souris (250 g/kg) réduit les diarrhées provoquées par la toxine du choléra de plus de 90% pendant 6 heures. En ce qui concerne les nouveaux activateurs, ils ont été mis en évidence par screening d'une collection de 60 000 composés. Parmi eux, certains se sont avérés spécifiques de CFTR et particulièrement efficaces avec une concentration nécessaire pour obtenir 50 % de l'activité maximale (EC50) inférieure à 200 nM ainsi qu'une absence de toxicité sur cellules après 24h d'incubation. On peut noter, parmi ces dérivés, la présence de composés hétérocycliques tels que CFTRact-07 et CFTRact-14. Malgré l'apparition de ces molécules prometteuses et l'arsenal déjà en place, il existe un besoin réel de développer des molécules permettant de moduler le fonctionnement des canaux CFTR et présentant une spécificité, une efficacité et une absence de toxicité, adaptées à des applications thérapeutiques. Dans le cadre de l'invention, les Demandeurs ont mis en évidence que des molécules, se présentant à pH physiologique sous la forme d'un zwittérion de formule bien déterminée, possédaient une telle activité et de telles propriétés. Dès lors, l'invention concerne un composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule se présentant, à pH physiologique, sous la forme d'un zwittérion, de formule : avec X = O ou S. On entend par composition pharmaceutique une composition contenant au moins, à titre de principe(s) actif(s), une molécule selon l'invention en association avec un véhicule physiologiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée par voie orale (comprimés ou gélules), par voie parentérale (voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée) ou par voie aérienne. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention se caractérisent en ce qu'elles contiennent des quantités de principe(s) actif(s) adaptées à la posologie, en particulier à la masse des patients et au nombre de prises. Dans le cadre de l'invention, le terme "pH physiologique" fait référence au pH du corps de l'organisme à traiter, et plus particulièrement au pH à proximité du site d'action de la molécule selon l'invention, à savoir dans l'environnement du canal CFTR ciblé. En pratique, il s'agit de pH compris entre 5 et 9, préférentiellement entre 6 et 8, notamment à pH 7,4. La molécule selon l'invention se présente sous la forme d'un zwittérion audit pH. Un zwittérion est défini comme une entité qui porte à la fois une charge positive et une charge négative. Dans les conditions particulières de l'invention, la charge positive est portée par un atome d'azote (N+) alors que la charge négative est liée à la présence d' une fonction carboxylate, hydroxyle ou thiol déprotonée (0- ou S' ), les deux atomes portant ces charges opposées étant séparés par deux atomes de carbone. Si la molécule contenue dans la composition pharmaceutique selon l' invention se trouve sous la forme d'un zwittérion à pH physiologique, elle peut, en revanche être préparée et/ou délivrée sous une forme non- zwittérionique, en particulier sous une autre forme acido-basique. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention se caractérisent par leur activité biologique, en l'occurrence leur capacité à moduler le fonctionnement des canaux CFTR. On entend par canaux CFTR, à la fois le canal humain isolé mais aussi tous les variants comportant des mutations. Ceci comprend en particulier les protéines des autres espèces animales, mais aussi les protéines naturellement mutées. Une catégorie très importante de canaux CFTR humains mutés concerne les formes rencontrées dans la mucoviscidose, en particulier les mutants AF508 (délétion d'une phénylalanine en position 508) et G551D (remplacement d'un résidu glycine par un acide aspartique en position 551). Les molécules selon l'invention peuvent avoir un effet inhibiteur ou activateur sur les canaux chlorure CFTR. Leur action est spécifique de ce type de canaux, c'est à dire que ces molécules n'ont en revanche aucun ou peu d'effet sur l'activité des autres canaux à ions (autres canaux à chlorure, canaux potassiques, ...). Des activateurs auront un effet bénéfique sur les canaux mutés responsables de la mucoviscidose. Dans le cas de canaux non mutés, les molécules activatrices auront des propriétés bronchodilatatrices, bénéfiques dans le cas de nombreuses maladies respiratoires obstructives, telles que l' asthme. En revanche, les inhibiteurs seront exploités dans le cas de diarrhées, induites par exemple par le bacille responsable du choléra. Leur exploitation thérapeutique est garantie par la non toxicité des molécules constituant le principe actif des compositions pharmaceutiques selon l'invention. Une première famille de molécules formant le principe actif d'une composition pharmaceutique selon l'invention présente le motifsuivant : La charge positive est portée par la fonction imine alors que la charge négative est liée à la présence d'un groupe carboxylate. Le mode de synthèse de cette famille de molécules est décrit dans Routaboul et al. (2002) [7]. Ce document décrit spécifiquement la réaction entre deux molécules de méthylglyoxal et la 2-aminopyridine, ou l'adénine, ou l'adénosine , ou la 2'-désoxyadénosine, ou la 9-propyladénine, ou la cytosine ou l'acide polyadénylique (polyA). Une réaction analogue entre le méthylglyoxal et les résidus arginine des protéines a déjà été rapportée [8]. Ces adduits sont représentés ci-dessous : [alpha]-cétoaldéhyde + Adduits (composés de bis addition de l'aldéhyde, ou X (dérivés diazotés a-iminoacides cycliques) de X : dont les atomes de N sont séparés par un atome de C, ou amidines au sens large) méthylglyoxal + #OOC CH3 ' 2-aminopyridine 0 oH HN# R N OH CH3 avec R = H #OOC CH3 méthylglyoxal + # OH adénine H1| T" adénine HI-T -1 "--OH t 1 ;; -~.~ ~...'rl .~~,,,, u H3 2,i H -M-" z.,.. x H méthylglyoxal + #OOC CH3 adénosine # # #OH HN# # ti '.~ .,'Y ''iz , 1 J ' HO# N# #N OH OH méthylglyoxal + #OOC CH3 2'-désoxyadénosine # # #OH HN --L'I, I . f.. oH --L ! HO, N N OH #OOC CH3 méthylglyoxal + # # OH # # 9-propyladénine HN N N OH # # # CH3 #OOC CH3 méthylglyoxal + # #OH HN cytosine #N OH /...-1 -.....'... L CH3 #N# # O H #OOC CH3 méthylglyoxal + HNOH acide polyadénylique # #O N#N#OH (polyA) P # # # CH3 O# # N N O OH NH2 P N N# eOq 1## #OOC CH3 méthylglyoxal + HNG - 'OH arginine et ses dérivés R, # # OH (R) #N# #N# #CH3 Aucune activité biologique n'avait été rapportée pour ces molécules. Or, les Demandeurs ont constaté que les composés issus de ces différentes réactions présentaient une certaine activité vis à vis des canaux CFTR et que par conséquent, ces composés pouvaient être intégrés dans des compositions pharmaceutiques. Par ailleurs, les Demandeurs ont développé de nouvelles molécules sur la base de cette même réaction. Plus précisément, ces nouveaux adduits ont été obtenus par condensation de 2 molécules d'a-cétoaldéhyde possédant des atomes d'hydrogène énolisables sur une molécule possédant deux atomes d'azote séparés par un carbone capables de réagir avec l'a-cétoaldéhyde, en présence d'H20 et/ou d'un solvant organique tel que l'éthanol, à pH de 1 à 10 et à une température comprise entre 25 C et 80 C. Cette réaction donne naissance à des a-iminoacides, ayant la formule suivante à pH physiologique : avec RI, R2, R3 et R4 représentent des chaînes carbonées, substituées ou non, cycliques ou non, pouvant contenir des hétéroatomes. L'invention concerne donc l'ensemble des adduits, générés par cette réaction, à l'exception de ceux déjà décrits dans les références 7 et 8, ainsi que les compositions pharmaceutiques les intégrant en tant que principe actif. L'a-cétoaldéhyde impliqué dans cette réaction est préférentiellement le méthylglyoxal, l'éthylglyoxal, le benzylglyoxal ou un mélange de deux de ces a-cétoaldéhydes. Dans le cas d'un mélange, les 2 a-cétoaldéhydes distincts sont introduits dans le mélange réactionnel d'une manière simultanée ou séquentielle. La molécule sur laquelle se condensent les 2 molécules d'a-cétooaldéhyde est préférentiellement une base nucléique (adénine ou cytosine) ou ses dérivés (substitués tels que la 9-propyladénine, la 1-propylcytosine ou le polyA), la 2-aminopyridine ou ses dérivés (substitués, 2-amino-3-hydroxypyridine, aminopyrazine ou 1-aminoisoqtiinoléine), le 2-aminobenzothiazole ou la benzamidine. Préférentiellement, les nouveaux adduits selon l'invention ont la formule suivante : a-cétoaldéhyde Adduits (composés de bis addition de l'aldéhyde, ou + a-iminoacides cycliques) de X : X (dérivés diazotés dont les atomes de N sont séparés par un atome de C, ou amidines au sens large) méthylglyoxal + 2-amino-3- #OOC CH3 méthylpyridine # #OH (R=CH3) HN ou 2-amino-3- CH3 hydroxypyridine (R=OH) avec R = CH3 ou OH #OOC CH3 méthylglyoxal + # # #OH 9-allyadénine HN # OH lnéthylglyoxal -OOC CH3 méthylglyoxal + OOC CH3 OH 9-butyladénine HN# #OH méthylglyoxal 8 OOG GH3 9-(3-phényl HN##OH propyl) adénine N#N # OH f CH3 (jL/ ' 0 OOC CHg méthylglyoxal + HN#OH 3-propylcytosine HN# #OH #N #CH3 N0 #OOC CH3 méthylglyoxal + OH 1-aminoisoquinoléine Q #OOC CH3 méthylglyoxal + # # OH aminopyrazine HN # OH N CH3 N # néthylglyoxal Sooc C3 méthylglyoxal + # # OH 2-aminobenzothiazole HN # OH S N CH3 #OOC CH3 méthylglyoxal + HN# OH benzamidine ## N OH 1 CH3 H CH3 #OOC# #CH3 méthylglyoxal + ~~~ ~~~ ~~~~ OC CH3 oH 2-aminoperimidine h# j' HNNT H HN N CH3 éthylglyoxal + # # 2-aminopyridine HN # OH # # OH //'-.,.-H/ Il .......;:::-/ 1 Pour l'ensemble de ces molécules, connues ou nouvelles, il est à noter que les fonctions hydroxyles portées par les sucres (par exemple dans le cas des adduits de l'adénosine ou de la 2'-désoxyadénosine) peuvent être modifiées, notamment par acétylation. A titre d'exemple, les pKa du produit de la réaction entre le méthylglyoxal et la 2-aminopyridine ont été évalués par les Demandeurs, en solution aqueuse à 25 C : il est d'environ 2 pour la fonction acide carboxylique et d'environ 10 pour la fonction imine, ce qui confirme le caractère zwittérionique de la molécule à pH physiologique. Au cours de cette réaction, on observe la formation de quatre stéréoisomères, séparables sous forme de deux mélanges d'énantiomères, lorsque le dérivé aminé de départ n'est pas chiral. Si il est chiral, quatre diastéréoisomères sont formés et peuvent être isolés sous forme de deux mélanges. Les Demandeurs ont montré qu'au moins dans le cas des adduits de la 9propyladénine, l'activité biologique de chacun des diastéréréoisomères séparés (sous la forme de deux mélanges d'énantiomères) comparée à celle de leur mélange était sensiblement la même. Avantageusement, les molécules utilisées dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont les adduits obtenus à partir de 2 molécules de méthylglyoxal et de la 2-amino-3-hydroxypyridine, ou de l'adénine, ou de la 2'-désoxyadénosine, ou de la 9-allyladénine, ou de la 9-propyladénine, ou de la 3-propylcytosine ou de la 1-aminoisoquinoléine. Une seconde série de molécules est obtenue à partir de cette première famille de molécules, par une nouvelle réaction mise en évidence par les Demandeurs. Ces molécules nouvelles sont des dérivés de formule générale, à pH physiologique : avec X= O ou S, RI, R2, R3 et R4 représentent des chaînes carbonées, substituées ou non, cycliques ou non, pouvant contenir des hétéroatomes. La charge positive est portée par un atome d'azote tétravalent alors que la charge négative est liée à la fonction hydroxyle ou thiol déprotonée. Comme déjà dit, les molécules de la première famille sont obtenues par condensation de 2 molécules d'a-cétoaldéhyde possédant des atomes d'hydrogène énolisables sur une molécule possédant deux atomes d'azote séparés par un carbone capables de réagir avec l'a-cétoaldéhyde, en présence d'H20 et/ou d'un solvant organique tel que l'éthanol, à pH de 1 à 10 et à une température comprise entre 25 C et 80 C, donnant naissance à un aiminoacide : Pour obtenir les molécules de la seconde famille, l'a-iminoacide est chauffé entre 40 et 90 C dans une solution aqueuse de soude ou de potasse 1 à 2M, ce qui aboutit à une décarboxylation oxydante et à une déshydratation selon la réaction suivante : Cette seconde réaction peut également être réalisée en milieu basique organique, par exemple en présence d'éthanolate de sodium dans l'éthanol ou de propanolate de sodium dans le propanol. L'étape d'oxydation peut être spontanée à l'air ou être réalisée à l'aide d'un oxydant tel que la 2,3-dichloro- 5,6-dicyanoquinone. Dans le mode de réalisation où X=S, l'atome d'oxygène (0) est substitué par un atome de soufre (S). Dans une étape ultérieure éventuelle, on condense de nouvelles molécules, telles que le formaldéhyde, au niveau des résidus R3 et/ou R4. Ainsi, les adduits obtenus à partir du méthylglyoxal et de la 2-aminopyridine ont été traités dans ces conditions . Cette réaction a donné lieu à la formation du dérivé suivant : A titre d'exemple, le pKa de ce composé a été évalué à 4. Cela signifie qu'en solution aqueuse à pH 7, ce composé est principalement sous forme zwittérionique, ainsi que dans le cas de solutions très diluées, telles que celles utilisées pour les tests biologiques. Cette réaction, bien que non complète, a également lieu avec : - les adduits de la 1-aminoisoquinoléine : - les adduits du 2-aminobenzothiazole : - les adduits de la benzamidine : A partir des 4 composés ci-dessus, il est possible d'obtenir une nouvelle série de molécules : - par substitution de l'atome d'oxygène (0) par un atome de soufre (S), donnant naissance au composé soufré, selon la réaction suivante : Cette transformation s'effectue en deux étapes : une sulfonylation sur l'atome d'oxygène puis la substitution du groupement arylsulfonyle par réaction avec un ion hydrogénosulfure. - et/ou par condensation au niveau des groupements-CH3 situés de part et d'autre du groupement hydroxyle , par exemple avec le formaldéhyde : Les atomes d'hydrogènes des groupements méthyles sont en effet acides et peuvent être substitués par réaction avec des électrophiles en milieu basique. Les dérivés préférés selon l'invention incluent donc non seulement les 4 composés obtenus directement à partir des composés de la première famille, mais également les dérivés ayant un atome d'oxygène (0) substitué par un atome de soufre (S) et/ou possédant des groupements R3 et R4 modifiés, par exemple par réaction d'un ou deux des groupements méthyles avec le formaldéhyde. Par ailleurs, ces nouvelles molécules forment le principe actif d'une composition pharmaceutique selon l'invention, présentant le motifsuivant : avec X = O ou S. Avantageusement, les molécules de cette deuxième famille, contenues dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, ont une formule choisie dans le groupe comprenant : Enfin, il existe un certain nombre de molécules déjà connues en tant que telles et se présentant sous la forme d'un zwittérion de la formule revendiquée à pH physiologique, susceptible de posséder l'activité biologique selon l'invention. Une molécule répondant à cette définition est la 7-méthylguanosine, décrit entre autre dans le document Ermolinsky et ci[. [9] : Là encore, les fonctions hydroxyles portés par les sucres peuvent être modifiées, notamment par acétylation. A la connaissance des Demandeurs, les molécules répondant à une telle définition ne sont pas utilisées à des fins thérapeutiques. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de l'ensemble de ces molécules, caractérisées dans leur forme minimale par le fait qu'elles se présentent, à pH physiologique, sous la forme d'un zwittérion de formule : pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies associées à un dysfonctionnement des canaux CFTR, notamment la mucoviscidose, les maladies bronchostrictives, telles que l'asthme, ou la diarrhée. Les avantages qui découlent de la présente invention sont illustrés dans les exemples de réalisation présentés ci-dessous, à l'appui des figures annexées. Figure 1 : Effet des composés de l'invention (composé 1 à 4,6 à 7 et 9 à 10), à une concentration de 1 M, sur le récepteur CFTR surexprimé dans les cellules CHO-WT. La référence 100% d'activation correspond à l'activation observée en présence de 1 M de forskoline. Figure 2 : Courbes de détermination : A) des EC50 pour les composés activateurs (composés 9 et 10), établies en présence de 1 M de forskoline ; B) des IC50 pour les composés inhibiteurs (composés 1 à 4 et 6 à 7), établies en présence de 5 M de forskoline. I/ MATERIEL ET METHODES 1/ Synthèse des composés de la famille I (composés 1 à 5 et 9 à 10) : a- Procédure générale : Le principe de cette synthèse a été décrit pour l'essentiel dans Routaboul et al. (2002) [7]. Une 2-aminopyridine est dissoute dans la solution aqueuse commerciale de méthylglyoxal à 40%. Le mélange est chauffé à 50 C sous argon. Après évaporation sous pression réduite, le mélange des deux isomères est séparé du milieu réactionnel par chromatographie sur cartouche de phase inverse C18 en éluant avec de l'eau. Après évaporation du solvant, le mélange de diastéréoisomères est dissout dans un minimum de méthanol et précipité dans l'éther anhydre. Pour certains adduits, les diastéréoisomères sont séparés par chromatographie sur colonne de gel de silice (dépôt sec ; élution : gradient CH2CI2 / MeOH [9 : 1] à [7 : 3] ). Après évaporation du solvant sous pression réduite, ils sont dissous de l'eau et purifiés par une nouvelle chromatographie sur cartouche de phase inverse C18 (éluant: eau). Les composés se présentent sous forme de poudres blanches. b- Composé 1 : Adduits de la 2'-désoxyadénosine Le rendement de la réaction a été de 20% pour l'adduit majoritaire (150 mg ou 0,35 mmol) et de 7% pour l'adduit minoritaire (53 mg ou 0,12 mmol). c- Composé 2 : Adduits de la 3-propylcytosine Un mélange des adduits diastéréoisomères a été obtenu avec un rendement de 74% (73 mg ou 0,25 mmol). d- Composé 3 : Adduits de la 2-amino-3-hydroxypyridine Un mélange des adduits diastéréoisomères a été obtenu avec un rendement de 73% (77 mg ou 0,30 mmol). e- Composé 4 : Adduits de la 1-aminoisoquinoléine Le mélange des adduits diastéréoisomères précipite et est séparé du milieu réactionnel par filtration et lavage avec un minimum d'éther diéthylique anhydre. Il est obtenu avec un rendement de 82% (2,065 g ou 7,2 mmol). f- Composé 5 : Adduits de l'adénine Le rendement de la réaction a été de 46% pour l'adduit majoritaire (0,950 g ou 3,4 mmol) et de 20% pour l'adduit minoritaire (0,413 g ou 1,48 mmol). g- Composé 9 : Adduits de la 9-propyladénine Le rendement de la réaction a été de 24% pour l'adduit majoritaire (109 mg ou 0,34 mmol) et de 17% pour l'adduit minoritaire (76 mg ou 0,24 mmol). h- Composé 10 : Adduits de la 9-allyladénine Après séparation du milieu réactionnel sur cartouche de phase inverse C18, l'adduit majoritaire est isolé et cristallisé dans le propan-2-ol. On en obtient 390 mg ou 1,22 mmol, soit un rendement de 43%. 2/ Synthèse des composés de la famille II (composés 6 et 7) : a- Procédure générale : Les composés de la famille II sont obtenus à partir des composés de la famille I, par chauffage en milieu basique. b- Composé 6: Dérivé de la 2-aminopyridine 1 ère étape : Synthèse des adduits de la 2-aminopyridine 2ème étape : Synthèse du dérivé de la 2-aminopyridine Le mélange des diastéréoisomères (200 mg, 0,84 mmol) en solution dans de la soude (1 mol L-1, 25 mL) est chauffé à 70 C pendant 4,5 heures. Après refroidissement, la solution est neutralisée (pH 7,2) avec une solution d'acide chlorhydrique. Le produit est dessalé par filtration sur cartouche de phase inverse CI 8 (éluant eau puis méthanol) puis purifié par une nouvelle chromatographie sur cartouche de phase inverse. Après évaporation du solvant, le produit est obtenu sous forme d'un solide jaune (119 mg ; 0,68 mmol), avec un rendement de 81%. c- Composé 7: Dérivé de la 2-aminoisoquinoléine Le mélange des diastéréoisomères (150 mg, 0,52 mmol), décrit à la section 1-e (composé 4), en solution dans de la soude (1 mol L-1, 2 mL) est chauffé à 70 C pendant 5 heures. Après refroidissement, la solution est neutralisée (pH 7,2) avec une solution d'acide phosphorique. Après extraction au dichlorométhane (3 fois 10 mL) et évaporation du solvant, le résidu est chromatographié sur colonne de silice (dépôt : dichlorométhane, élution : mélange dichlorométhane / méthanol). Après évaporation du solvant, deux produits sont isolés : le dérivé attendu sous forme d'un solide jaune (8 mg, 0,04 mmol, 8 %) ainsi que la 2-aminoisoquinoléine (21 mg, 0,15 mmol, 28%) caractérisée par spectroscopie de RMN 1H et 13C. 3/ Obtention du composé 8 : Les informations nécessaires à l'obtention de la 7-méthylguanosine sont disponibles dans le document Ennolinsky et al. [9] . 4/ Cultures cellulaires : Des cellules CHO (lignée cellulaire Chinese Hamster Ovary) ont été transfectées de manière stable par un vecteur contenant le gène codant le récepteur CFTR sauvage (CHO-WT) ou un gène muté codant un récepteur dont le résidu glycine en position 551 est substitué par un acide aspartique (CHO-G551D). Les cellules ont été cultivées à 37 C en présence de 5% de C02 et maintenues dans du milieu MEM contenant 7% de sérum foetal bovin, 0. 5% d'antibiotiques (50UI/ml de pénicilline et 50ug/ml de streptomycine), ainsi que 100 M ou 20 M de méthotréxate. Les expériences ont également été réalisées sur des cellules Calu-3, une lignée cellulaire humaine pulmonaire qui exprime naturellement la protéine CFTR sauvage, cultivées comme décrit précédemment. 5/ Activité biologique des canaux CFTR : L'activité des canaux à ions chlorure a été évaluée grâce à la mesure de l'efflux d'iodure radioactif 125Isortant des cellules CHO transfectées. Toutes les expériences ont été réalisées par un système robotique (Perkin Elmer Life Sciences, Courtaboeuf, France). Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits afin de réaliser des expériences parallèles et d'effectuer une étude comparative. Au début de chaque expérience, les cellules ont été lavées avec du tampon d'efflux contenant (en mM) : 137 NaCl, 5.36 KC1, 0.8 MgCl2, 5. 5 glucose et 10 HEPES, pH 7. 4. Les cellules ont ensuite été incubées dans du tampon d'efflux contenant 1 M KI et 1 Ci Na125I/ml (NEN, Boston, MA) pendant 30 min à 37 C pour permettre au 125I d'atteindre l'équilibre. Les cellules ont ensuite été lavées avec du milieu d'efflux pour enlever le 125I extracellulaire. La perte de 125I intracellulaire a été déterminée en prélevant le milieu avec du tampon d'efflux chaque minute, pendant 11min. Les 4 premiers aliquotes -ont été utilisés pour établir une ligne basale stable dans le tampon d'efflux seul. La radioactivité résiduelle a été extraite à l'aide de NaOH 0.1N, et déterminée grâce à un compteur gamma Packard Cobra II (Perkin Elmer Life Sciences, Courtaboeuf, France). Les résultats représentent la moyenne la déviation standard (SD) de 4 expériences indépendantes. 6/ Test de cytotoxicité : Le test de toxicité au MTT est un test colorimétrique qui repose sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales à métaboliser le MTT (sel de tetrazolium jaune) en formazan (pourpre). L'absorbance, proportionnelle à la concentration de colorant converti, peut être alors mesurée par spectrophotométrie. Les cellules CHO sont mises à incubées sur des plaques 96 puits en présence de l'agent à tester pendant 2 h. 3 contrôles sont réalisés : 100%cellules vivantes : cellules sans agent ; 0% cellules vivantes : cellules laissées à l'air libre ; blanc : milieu sans cellule. Les cellules sont rincées avec du milieu RPMI sans rouge de phénol pour que la couleur du milieu n'interfère pas dans les mesures de l'absorbance. Puis, elles sont incubées pendant 4 h avec lOOul de solution de RPMI supplémentée en MTT (0,5mg/ml). Le milieu est alors éliminé, l'ajout de 100 l de DMSO permet de solubiliser le colorant converti (formazan). L'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm (pourpre) et à 630 nm (bruit de fond). Afin de s'affranchir du bruit de fond, le calcul suivant est effectué : DOréelle=DO570nin-DO630nm- Puis, les résultats sont normalisés par rapport aux contrôles (100% et 0% de cellules vivantes) et sont présentés sous forme de moyenne +/- SEM. 7/ Ajout d'agents pharmacologiques : les molécules de l'invention (composés 1 à 10) ainsi que des activateurs déjà connus des canaux CFTR (forskoline et génistéine) ont été ajoutés aux concentrations indiquées. II/ RESULTATS 1/Effet des composés testés sur l'activité des récepteurs CFTR : L'effet des différents composés synthétisés sur l'activité des canaux à chlorure CFTR a été testé sur des cellules CHO surexprimant le récepteur sauvage (CHO-WT). Un niveau d'activation 100% de référence a été choisi pour une activation en présence de 1 M de forskoline (Fsk). Les composés testés ont été ajoutés à une concentration de 1 M. Dans le cas d'une augmentation significative, le composé a été répertorié comme un activateur. Dans le cas d'une activation significativement inférieure à 100% en présence du composé, celui-ci a été répertorié comme un inhibiteur. Des exemples de diagramme obtenus sont illustrés à la figure 1. Afin d'affiner cette étude, les valeurs de IC50 pour les inhibiteurs et de EC50 pour les activateurs ont été déterminées. Le pourcentage d'activation est suivi en présence de concentrations croissantes du composé testé. Dans le cas des inhibiteurs, l'activation 100% a été obtenue en présence de forskoline 5 M. Dans le cas des activateurs, le pourcentage d'activation a été suivie en présence de forskoline 1 M. Des exemples de courbes effet/dose permettant de déterminer les valeurs EC50 et IC50 sont illustrés à la figure 2. L'ensemble des résultats obtenus pour les 10 composés testés est récapitulé dans le tableau 1 : Composé Formule Effet IC50 ou EC50 CHO-WT Calu3 H@C coo HN OH (2 diastéréo- N#N#OH isomères, # # N CH3 - 70. 8 ~ 93.3 ~ mélange des O# #N # #N# 1. 2 pM 1. 3 pM produits HO# maj oritaires) HO# #OOC CH3 H X/OH HN G .......1---- (2 diastéréo HN# #OH - 3. 4 ~ 2.3 ~ isomères) N CH3 1.2 nM 1.5 nM # N # O OOC CH3 H (2 diastéréo OH HNG) RNO isomères) Ho OH 4.4 nd CI~ 1.3 N #CH3 1. 3 M OOC CH3 H (2 diastéréo HN##OH isomères) # #OH 2. 5 nd ##N# #CH3 1.7 nM # H,C COO 5 # # #H HN OH (2 diastéréo il 1 5.7 ~ nd isomères) CH3 1.3 iM # # # CH3 CH3 6 #N CH3 - 5. 1 ~ nd # 1. 4 nM CH3 # # N O / lO f CH3 1 G.5 + nd ### 1. 5 nM eNN # # # 8 HO N N NH2 - 3. 5 ~ nd # O 1. 1 M OH OH HjC 9 H3O# @OO H adduit # # HN OH majoritaire 2, l 1,g majoritaire OH 1.3 2.1:t M 1.3 1.8:t M N # minoritaire # # # CH3 + 2. 9 ~ nd N N 1. 2 M # H3O COO (D HIII HN OH (2 # # + 7. 5 ~ nd N# OH diastéréo- #N #CH3 1. 7 M diastéréo- # # # + : activateur ; - : inhibiteur ; nd : non déterminé. Tableau I : Effet inhibiteur ou activateur des composés 1 à 10. Les résultats montrent que les effets observés, tant d'un point de vue qualitatif que quantitatif, sont conservés : - entre des cellules exprimant le récepteur sauvage (Calu3) et des cellules surexprimant cette même protéine dans une lignée cellulaire animale (CHO-WT), - pour le composé 9 de la première famille, entre les adduits majoritaire et minoritaire séparés et le mélange des 2 diastéréosiomères. Par ailleurs, on constate que la plupart des molécules présentent une activité inhibitrice de la protéine CFTR. Il est à noter que l'effet inhibiteur mesuré est généralement meilleur que celui des inhibiteurs jusqu'alors décrits dans la littérature. De même, les activateurs ont un effet significatif et pourront être exploités pour les effets bronchodilatateurs induits. Enfin, des tests parallèles menés sur d'autres canaux ioniques ont révélé que ces composés ne présentaient aucune ou peu d'activité envers ces canaux (résultats non montrés). Leur action sur les canaux CFTR est donc spécifique et ciblée, offrant à ce titre des potentiels thérapeutiques. 2/ Effet des composés testés sur la viabilité cellulaire : La toxicité des composés présentant l'activité biologique d'intérêt a été testée. Pour cela, des cellules CHO ont été incubées avec lesdits composés pendant une durée de 2 à 24 heures et à une concentration de 10 à 100 M. Leur toxicité a été estimée par mesure de la viabilité cellulaire, comparée à celle de cellules sans agent (100% de cellules vivantes) celle de cellules laissées à l'air libre (0% de cellules vivantes). Les résultats obtenus pour les composés 1 à 4, 6 à 7 et 9 à 10 de l'invention (non montrés) ont révélé qu'ils ne présentaient aucune cytotoxicité notable, quelles que soient la durée et la concentration d'incubation utilisées. Leur application thérapeutique est donc tout à fait envisageable. 3/ Effet des composés testés sur des récepteurs mutés ou en présence de différents composés pharmacologiques : Dans une étude plus détaillée, les Demandeurs se sont intéressés à l'effet d'un inhibiteur (composé 1) ou d'un activateur (composé 9), selon l'invention, sur le récepteur CFTR : - sur un récepteur sauvage (CHO-WT) ou sur un récepteur muté (CHO-G551D), rencontré dans certaines formes de mucoviscidose ; - en présence d'activateurs déjà connus, tels que la forskoline qui augmente la disponibilité en AMPc impliquée dans l'activation du domaine régulateur R, ou la génistéine qui agit directement sur les domaines du fixation des nucléotides et prolonge l'ouverture des canaux. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau II : Activateur Composé(s) ajoutées) CHO-WT CHO-G551D 1 M Fsk (activateur) activation pas d'effet 1 ,..,M Fsk +1)-LM composé 1 inhibition pas d'effet (inhibiteur) uM Fsk + uM composé . 1 .... ,, # 5 GIVI Fsk + 1 M composé inliibition pas d'effet (inhibiteur) 1 M Fsk + 1 M composé 9 activation pas d'effet (activateur) (potentialisation) 10 aM fsk+ 30 iiM génistéine .... l1lVI fsk+ 30 ,..,M génistéine activation activation 10 .iYI îsK+30 pNI génistéine inhibition inhibition + 1 M compose 1 (inhibiteur) 1tlO11 111 1tIon 10 jiMfsk+ 30 jiM génistéine activation activation 10 M compose M génistéine activation activation 1 M compose (activateur) Tableau II : Effets du composé 1 et du composé 9 sur l'activation de CFTR sauvage (CHO-WT) ou muté (CHO-G551D), en présence de divers activateurs. Ces expériences révèlent que: - le composé 1 antagonise efficacement l'action des activateurs forskoline et génistéine, et cela sur les récepteurs sauvages comme sur les récepteurs mutés ; - le composé 9 a un effet activateur sur le récepteur sauvage mais est incapable d'activer le récepteur muté G551D. En revanche, il est capable d'activer une autre forme mutée du récepteur, AF508 (résultats non montrés). BIBLIOGRAPHIE 1. Al-Awqati, Q. (2002). Alternative treatment for secretory diarrhea revealed in a new class of CFTR inhibitors. J Clin Invest 110, 1599-1601. 2. Akabas, M. H. (2000). Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Structure and function of an epithelial chloride channel. J Biol Chem 275, 3729- 3732. 3. Hume, J. R., Duan, D., Collier, M. L., Yamazaki, J., et Horowitz, B. (2000). Anion transport in heart. Physiol Rev 80, 31-81. 4. Sheppard, D. N., et Welsh, M. J. (1999). Structure and function of the CFTR chloride channel. Physiol Rev 79, S23-45. 5. Ma, T., Thiagarajah, J. R., Yang, H., Sonawane, N. D., Folli, C., Galietta, L. J., et Verkman, A. S. (2002a). Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by highthroughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest Il 0, 1651-1658. 6. Ma, T., Vetrivel, L., Yang, H., Pedemonte, N., Zegarra-Moran, O., Galietta, L. J., et Verkman, A. S. (2002b). High-affinity activators of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) chloride conductance identified by high-throughput screening. J Biol Chem 277,37235-37241. 7. Routaboul , C., Dumas, L., Gautier-Luneau, L, Vergne, J., Maurel, M. C., et D'écout, J. L. (2002). New stereoselective reaction of methylglyoxal with 2-aminopyridine and adenine derivatives: Formation of imino acid-nucleic base derivatives in water under mild conditions. Chem Commun, 1114-1115. 8. Oya, T., Hattori, N., Mizuno, Y., Miyata, S., Maeda, S., Osawa, T., et Uchida, K. (1999). Methylglyoxal modification of protein. Chemical and immunochemical characterization of methylglyoxal-arginine adducts. J Biol Chem 274, 18492-18502. 9. Ermolinsky, B., Efimtseva, E., Alexeev, C., Mikhailov, S., Balzarini, J., et De Clercq, E. (2003). Dinucleoside Monophosphates containing AZT and 1-methyladenosine or 7-methylguanosine. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 22 (5-8), 853-855.REVENDICATIONS 1/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule se présentant, à pH physiologique, sous la forme d'un zwittérion de formule : avec X = O ou S. 2/ Composition pharmaceutique selon la revendication. 1 caractérisée en ce que la molécule se présente sous la forme d'un zwittérion, contenu dans le motif suivant : 3/ Composition pharmaceutique selon la revendication 2 caractérisée en ce que la molécule a une formule choisie dans le groupe comprenant : 4/ Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que la molécule se présente sous la forme d'un zwittérion, contenu dans le motif suivant : 5/ Composition pharmaceutique selon la revendication 4 caractérisée en ce que la molécule a une formule choisie dans le groupe comprenant : 6/ Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que la molécule a la formule suivante : 7/ Utilisation de la composition pharmaceutique selon les revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies associées à un dysfonctionnement des canaux CFTR. 8/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les maladies sont choisies dans le groupe comprenant : la mucoviscidose, les maladies bronchostrictives, telles que l'asthme, ou la diarrhée. 9/ Adduit, se présentant sous la forme d'un zwittérion à pH physiologique, de formule générale : susceptible d'être obtenu selon la réaction : avec RI, R2, R3 et R4 représentent des chaînes carbonées, substituées ou non, cycliques ou non, pouvant contenir des hétéroatomes, et si R3=R4=CH3, c'est à dire si l'a-cétoaldéhyde est le méthylglyoxal, n'est pas la 2-aminopyridine, l'adénine, l'adénosine , la 2'-désoxyadénosine, la 9-propyladénine, la cytosine, l'acide polyadénylique (polyA), l'arginine ou ses dérivés. 10/ Dérivé, se présentant sous la forme d'un zwittérion à pH physiologique, de formule générale : avec X = O ou S, et RI, R2, R3 et R4 représentent des chaînes carbonées, substituées ou non, cycliques ou non, pouvant contenir des hétéroatomes. 11/ Dérivé selon la revendication 10 choisi dans le groupe comprenant : ou leurs dérivés ayant un atome d'oxygène (0) substitué par un atome de soufre (S), et/ou possédant des groupements R3 et R4 modifiés, par réaction d'un ou de deux des groupement méthyles avec le formaldéhyde. 12/ Procédé de préparation d'un dérivé objet de l'une des revendications 10 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - condensation de 2 molécules d'a-cétoaldéhyde possédant des atomes d'hydrogène énolisables sur une molécule possédant deux atomes d'azote séparés par un carbone capables de réagir avec l'acétoaldéhyde, donnant naissance à un a-iminoacide : - chauffage de l'a-iminoacide en milieu basique, aboutissant à une décarboxylation oxydante et une déshydratation selon la réaction suivante : - éventuellement, substitution de l'atome d'oxygène par un atome de soufre.