FR 2860005 A1 20050325 FR 0311146 A 20030923 METHODE DE DETECTION D'AGENTS BACTERIENS OU VIRAUX DE BIOTERRORISME La présente invention fournit une méthode de détection de la présence d'un agent bactérien ou viral à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en #uvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et d'un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif. La présente invention concerne également une trousse de diagnostic utile pour la mise en #uvre d'une méthode de détection selon l'invention. A la suite des cas d'anthrax inhalé en Floride en octobre 2001, les autorités sanitaires ont intensifié les programmes de préparation et prévention contre les agents de bioterrorisme. Le Center for Diseases Control and Prevention (CDC, Atlanta, USA, http://www.cdc.gov/) a dressé la liste des agents potentiels de bioterrorisme en différentes catégories de priorité A et B (Tableau 1). La détection de ces agents doit pouvoir être réalisée sur des prélèvements d'environnement comme des poudres, des prélèvements cliniques ou encore sur des bactéries ou des virus isolés en culture. La détection par biologie moléculaire d'agent infectieux est réalisable par la plupart des laboratoires, à condition qu'ils possèdent un équipement minimal pour mettre en #uvre ces techniques parce que ces techniques possèdent une étape initiale d'extraction des acides nucléiques qui rend ces agents non-infectieux. L'utilisation accrue des techniques de diagnostic moléculaire rend la détection des acides nucléiques d'agents de bioterrorisme accessible à la plupart des laboratoires de microbiologie clinique. Toutefois, les facteurs limitant à l'utilisation de ces techniques sont liés à la quasi impossibilité d'obtenir des témoins positifs, à l'impossibilité liée aux restrictions de diffusion des ces agents et à la diversité des niveaux d'équipement des laboratoires et l'impossibilité d'avoir des contrôles calibrés pour des déterminations quantitatives notamment par les techniques de type PCR. Parallèlement, l'extrême anxiété des populations vis-à-vis de ces agents, fait que les faux positifs par contamination (l'inconvénient majeur des techniques de PCR) sont ici particulièrement indésirables. Le principal problème pour étendre l'utilisation des techniques de détection moléculaire dans les laboratoires de microbiologie clinique, est d'avoir accès à des témoins positifs. La seule solution proposée à ce jour est que les laboratoires de référence fournissent aux autres l'ADN extrait des agents de bioterrorisme à rechercher. Cette solution présente, tout de même, certains inconvénients : elle pose le problème d'une large diffusion d'un ADN identique à celui des agents de bioterrorisme avec les dangers que cela comporte en terme de risque de détection de faux positifs, qui dans ce cas, risque d'entraîner de fausses alertes dans le public et au niveau des autorités de santé. Un certain nombre d'autres inconvénients limite la diffusion de ces techniques pour la détection des agents de bioterrorisme : (1) en raison des limitations liées à la circulation de ces agents, il est quasi impossible d'obtenir de l'ADN de ces bactéries pour étalonner les résultats dans le cadre de techniques qualitatives ou quantitatives. Or, dans certains cas comme la détection de spores d'anthrax, pour lesquelles le risque de forme pulmonaire apparaît avec des inoculums supérieurs à 105 spores, il est nécessaire de réaliser une détection quantitative. (2) dans le cas de prélèvements d'environnement suspects, plusieurs agents seront à rechercher, ce qui augmente d'autant les risques de contamination et le nombre de réactions à réaliser, (3) bien que de large diffusion, les techniques moléculaires utilisées par les différents laboratoires sont très hétérogènes. En matière de détection d'agents de bioterrorisme, outre la certitude du résultat et notamment l'absence de faux positifs, un autre problème principal est la rapidité du test de détection et sa possibilité de le mettre en #uvre sur des prélèvements de l'environnement aussi bien que des prélèvements cliniques. La présente invention consiste essentiellement à fournir comme témoin positif, un grand fragment synthétique, notamment intégré dans un plasmide d'Escherichia coli, groupant une pluralité de fragments d'ADN synthétiques spécifiques respectivement d'une pluralité d'agents de bioterrorisme et/ou agents confondants, de préférence au moins 4 et plus particulièrement de 4 à 8, lesdits fragments d'ADN synthétiques spécifiques étant modifiés par la substitution d'une partie de la séquence d'origine par une séquence d'ADN exogène qui contient un site de restriction non présent dans l'une quelconque des séquences spécifiques d'origine desdits agents de bioterrorisme ou agents confondants. Plus précisément, la présente invention fournit une méthode de détection de la présence d'un agent de bioterrorisme bactérien ou viral à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en oeuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif, caractérisée en ce que : a/- on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à # un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN de bioterrorisme, de préférence de 4 à 8, ou # un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN, de préférence de 4 à 8, comprenant au moins un agent bactérien ou viral à ADN de bioterrorisme et au moins un agent bactérien ou viral à ADN confondant, et b/- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif, un grand fragment d'ADN synthétique regroupant des deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants dudit groupe, ladite séquence spécifique de chaque dit agent bactérien ou viral étant modifiée par substitution d'une partie de la séquence authentique correspondante dudit agent bactérien ou viral par une séquence exogène comprenant une séquence correspondant à un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux du dit groupe, ladite séquence exogène étant de préférence de taille différente, de préférence encore supérieure à celle de ladite partie de séquence authentique remplacée. c/- on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : 1- on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et le cas échéant desdits agents confondants, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à savoir dans ledit grand premier fragment d'ADN synthétique, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée, 2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, en vérifiant si la séquence desdits amplifiats comprend une dite séquence exogène, et notamment donc le site de restriction de l'enzyme sus citée. Cette vérification peut se faire en comparant la taille et/ou la séquence des amplifiats provenant des échantillons témoins et échantillons à tester, ou des différences dans les températures des courbes de fusion sur les systèmes d'amplification en temps réel, ou en digérant les amplifiats par l'enzyme de restriction. De préférence, la taille de ladite partie de séquence authentique remplacée n'excède pas 10% de la taille de ladite séquence authentique, ceci dans le but que la séquence modifiée soit suffisamment différente de la séquence authentique pour pouvoir la différencier mais suffisamment semblable pour se comporter de la même façon lors des réactions d'amplification. En pratique, la taille de ladite partie de séquence authentique remplacée peut être de 5 à 20 nucléotides, la taille du site de clivage correspondant à un polynucléotides de 5 à 10 nucléotides. De même, de préférence encore, la différence de taille entre ladite séquence exogène et ladite partie de séquence authentique sera suffisante pour permettre la détection de cette différence de taille par la méthode employée et, en tout état de cause, n'excédera pas 10% de la plus grande. Ladite séquence exogène peut être plus petite mais de préférence sera plus grande que ladite partie de séquence authentique remplacée. Plus particulièrement, à l'étape 3-, on détecte les faux positifs après incubation des amplifiats provenant desdits échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN qu'elle contient, et ainsi détecter la présence de faux positifs, à savoir dans le cas où une digestion desdits deuxièmes fragments d'ADN intervient. On entend par "agent bactérien ou viral de bioterrorisme" les agents à génome ADN définis par le CDC comme agents de bioterrorisme de classes A et B, à savoir Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella sp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Kickettsia prowazekeii, Kickettsia rickettsii et le virus de la variole. On entend par "séquence spécifique", une séquence du génome de ladite bactérie ou virus qu'on ne retrouve dans aucun autre génome d'organisme vivant. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'#3'. On entend par "agent bactérien ou viral confondant", un agent bactérien ou viral dont les manifestations cliniques sont identiques ou similaires à celles dudit agent bactérien ou viral de bioterrorisme (du même dit groupe) auquel on se réfère. La méthode selon l'invention permet de disposer d'un témoin ou contrôle positif sans avoir à manipuler des échantillons dudit agent de bioterrorisme authentique, grâce à l'utilisation de fragments synthétiques d'ADN spécifiques dudit agent de bioterrorisme. La modification de la séquence du fragment synthétique spécifique dudit agent de bioterrorisme par une séquence exogène qui comporte un site de clivage d'une enzyme de restriction, permet la détection avec certitude des faux positifs par clivage des produits de PCR par l'enzyme sus citée, mais aussi par séquençage du fragment amplifié, ou par des propriétés différentes des amplifiats quand ils sont étudiés par électrophorèse en gel d'agarose, ou par l'aspect des courbes de fusion qu'ils génèrent dans les systèmes de PCR en temps réel. Il est possible aussi de détruire les contaminants éventuels de l'échantillon à tester par l'échantillon témoin avant la réaction d'amplification de type PCR par digestion par l'enzyme sus citée avant réalisation de la réaction de PCR. Enfin et surtout, le fait de regrouper une pluralité des fragments d'ADN synthétiques modifiés d'agents de bioterrorisme et/ou d'agents confondants, garantit la rapidité du test de détection en diminuant le nombre d'échantillons témoins à manipuler et en autorisant la réalisation de PCR dite "multiplex" n'utilisant qu'un seul témoin positif. L'invention fournit un procédé avantageux de détection permettant avec un seul témoin, et de préférence par la mise en #uvre d'une seule réaction d'amplification groupée réalisée dans les mêmes conditions, de détecter la présence rapide d'un agent de bioterrorisme choisi parmi une pluralité d'agents de bioterrorisme, en détectant les faux positifs éventuels provenant de l'échantillon de témoins positifs. En effet, dans un mode de réalisation avantageux, à l'étape 1-, on met en #uvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents bactériens ou viraux dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents bactériens ou viraux et lesdites amorces pouvant être mises en #uvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. Ce type de réaction simultanée est parfois dénommé "PCR multiplex". Ce mode de réalisation permet d'augmenter d'autant plus la rapidité du test de la méthode de détection conformément au but de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, on mettra en oeuvre une pluralité de réactions d'amplification PCR avec un seul jeu d'amorces spécifique d'un seul dit agent bactérien ou viral de bioterrorisme et le cas échéant d'agent confondant, et on réalisera lesdites réactions d'amplifications enzymatiques PCR les unes après les autres pour chaque dit agent de bioterrorisme et, le cas échéant, chaque dit agent confondant. Dans un mode de réalisation, avant de réaliser lesdites réactions d'amplifications enzymatiques de type PCR de l'étape 1-, on décontamine l'ADN à amplifier provenant des échantillons à tester en le mettant en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN contenus dans lesdits grands premiers fragments d'ADN du témoin positif qu'ils pourraient contenir suite à une contamination par l'échantillon d'ADN témoin positif. Dans ce mode de réalisation où l'on coupe les ADN provenant de contamination éventuelle par le témoin positif avant la réaction d'amplification PCR, il reste avantageux de maintenir la détection de la contamination éventuelle après la réaction d'amplification enzymatique PCR, conformément à l'étape 3- visée ci-dessus. En effet elle permet de détecter des contaminations éventuelles par le témoin positif, intervenues dans les échantillons des amorces ou des enzymes et tampons d'amplification mises en #uvre éventuellement. Cela concerne cependant surtout la contamination éventuelle des échantillons desdites amorces mises en #uvre à l'étape 1- et non pas uniquement sur les échantillons d'ADN à tester. Avantageusement, à l'étape 2-, ladite vérification est réalisée à l'aide d'une sonde de ladite séquence spécifique d'un dit agent bactérien ou viral et, le cas échéant, à l'aide d'une pluralité de sondes spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence 12 à 35, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter ou de la quantifier de façon spécifique. On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymerase amplifiera dans la réaction de PCR. Avantageusement encore, la séquence de la ou desdites sondes est complémentaire d'une partie de la ou desdites séquences spécifiques authentiques, ne se chevauchant pas avec ladite partie de la séquence authentique remplacée par ladite séquence exogène. La ou lesdites sondes permettent donc de détecter indifféremment lesdites séquences spécifiques authentiques et les séquences spécifiques modifiées contenues dans lesdits deuxièmes fragments. Ce mode de réalisation est avantageux car il permet de mettre en #uvre les mêmes sondes pour détecter les séquences spécifiques d'un dit agent bactérien ou viral et les séquences modifiées du témoin positif, de sorte que lesdites sondes peuvent être utilisées dans le cadre d'une méthode d'amplification PCR quantitative dans laquelle il est nécessaire de déterminer la quantité d'ADN de l'échantillon testé par rapport à un étalonnage de la quantité d'ADN de témoin positif amplifié. En effet, si les sondes se chevauchaient avec la séquence supprimée des séquences authentiques, elles permettraient de distinguer les séquences authentiques et les fragments provenant du témoin positif mais ne permettrait plus de réaliser une quantification puisque le témoin ne serait plus reconnu. Avantageusement encore, ladite séquence exogène comprend ledit polynucléotide correspondant au site de clivage spécifique de ladite enzyme de restriction, ledit polynucléotide étant encadré par des séquences flanquantes qu'on ne retrouve pas dans lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, lesdites séquences flanquantes comprenant n nucléotides et n étant un nombre entier de 3 à 10. De préférence lesdites séquences flanquantes permettent, de par leur composition, d'avoir une dite séquence exogène ayant un contenu en nucléotides G et C (G+C%) proche de 50%. Ce mode de réalisation permet d'augmenter la différence de taille entre lesdits deuxièmes fragments comprenant une séquence spécifique modifiée par la séquence exogène et les séquences spécifiques authentiques, de telle sorte qu 'à l'étape 3- il soit possible de différencier les faux positifs, après l'étape d'amplification enzymatique PCR, par une pluralité de techniques, à savoir aussi bien : - par digestion des échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction et vérification de la coupure éventuelle desdits deuxièmes fragments d'ADN provenant d'une contamination par l'ADN témoin que les échantillons à tester pourraient contenir, - par séquençage des produits d'amplification et comparaison des séquences par rapport à la séquence authentique, - par comparaison des courbes de fusion dans les systèmes de PCR en temps réel. - par comparaison des profils d'électrophorèse sur gel des produits d'amplification provenant de l'échantillon témoin et des échantillons à tester. Plus particulièrement, ledit polynucléotide correspondant audit site de clivage de l'enzyme de restriction qui fait partie de ladite séquence exogène, est positionné sensiblement au milieu de ladite séquence spécifique authentique dudit agent bactérien ou viral. Ceci permet de ménager une zone pour l'hybridation des sondes spécifiques tout en générant après digestion par l'enzyme de restriction, 2 morceaux d'ADN dont la taille est clairement différente (environ la moitié) de l'ADN non digéré. Selon une première variante de réalisation de la méthode de l'invention, on détecte la présence éventuelle d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux à ADN, consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis et un virus de la variole. Ce groupe d'agents de bioterrorisme correspond à tous les agents de bioterrorisme de classe A, ayant des génomes à ADN répertoriés par le CDC (Center for Diseases Control and Prevention). Les agents de classe A sont ceux déterminés par le CDC comme étant les plus dangereux, à savoir très pathogènes tout en étant relativement faciles à cultiver et donc les plus susceptibles d'être produits puis utilisés par des groupes terroristes. Les autres agents de bioterrorisme classés en classe A par le CDC sont des virus à ARN. Selon une seconde variante de réalisation de la méthode de détection de l'invention, on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent de bioterrorisme appartenant au groupe des bactéries Burkholderia mallei, Burkbolderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Brucella spp., Rickettsia prowazekeii et Rickettsia ricketsii. Il s'agit de la totalité des bactéries de bioterrorisme répertoriées par le CDC en classe B, tous les autres étant des virus à ARN. Cette classe B regroupe les agents considérés comme moins dangereux que ceux de classe A cités ci-dessus, en tant qu'il sont qu'ils ont un pouvoir pathogène moindre que les agents de classe A ou qu'ils sont moins faciles à manipuler. On comprend que les méthodes de détection des groupes d'agents bactériens de classe A ou B peuvent être mises en #uvre sur des échantillons prélevés de l'environnement, sur des prélèvements d'origine humaine ou sur des souches virales ou bactériennes isolées en culture. Selon une troisième variante, on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux, consistant dans le virus de la variole et les agents confondants avec le virus de la variole se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, à savoir le virus "Monkeypox", les virus du genre Orthopoxvirus, Herpes simplex 1 et 2 (HSV1 et HSV2), Varicellezona et la bactérie Rickettsia akari. Le virus de la variole est le seul agent de bioterrorisme se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, la méthode ci-dessus permet donc de détecter quel agent bactérien ou viral à fièvre éruptive vésiculaire est présent, notamment si l'agent de bioterrorisme (le virus de la variole) est responsable des manifestations cliniques observées ou s'il s'agit d'un autre agent qui en est responsable et de dire duquel il s'agit. Selon une quatrième variante, on détecte si ledit échantillon à tester de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant au groupe d'agents bactériens de bioterrorisme consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii et éventuellement d'agent de pneumonies très sévères comme celles du virus du SRAS. Ces bactéries appartiennent soit aux bactéries répertoriées en classe A ou B par le CDC mais ont en commun de donner des manifestations cliniques de pneumopathie sévère chez l'homme. Cette méthode permet donc de déterminer si un agent de bioterrorisme donnant des pneumopathie sévère est concerné dans le cas d'un patient présentant des manifestations cliniques similaires à celles d'une pneumopathie sévère. Dans les différentes variantes de réalisation mentionnées ci-dessus, avantageusement lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, à partir desquelles sont obtenus lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques spécifiques modifiés, ainsi que lesdits jeux d'amorces et, le cas échéant, dites sondes spécifiques desdits agents bactériens ou viraux, ont les séquences suivantes ainsi que leurs séquences inverses et séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 1 = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAG TCACAGACACTGTCTCATACACTACAGTAAGTACATCATCTGAAATTGTCACT ACTAAATCAAC-3' dans laquelle K représente G ou T, et S représente G ou C Ces différentes séquences correspondent aux différents variants connus du virus de la variole. - pour Bacillus anthracis : Seq n 2 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCA AGAAACAACTGCACGTATCA1 '1 '1'1 '1 'AATGGAAAAGTfAAATCTGGTAGAAAG GCGGATA-3' - pour Francisella tularensis : Seq n 3 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTAACAAGGACAATACTTGGGGTCCTCAAGATAGA ACTG-3' - pour Yersinia pestis : Seq n 4 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAG GAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTTCTATGCCATATAT TGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3' - pour Burkbolderia pseudomallei et B. mallei : Seq n 5 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCA GCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCGATGGTTG CGCAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3' - pour Chlamydia psittaci : Seq n 6 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATC TAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCT GACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3' - pour Coxiella burnetii : Seq n 7 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCGG CTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGGCAAATTAGAA GTCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3' - pour Brucella spp.: Seq n 8 = 5'-TGCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCC GTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGG TTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3' - pour Richettsia prowazekii : Seq n 9 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGT TCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTGATATAGGTA ACGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3' - pour Ricbettsia rickettsii : Seq n 10 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTAGCACGGCAGGTACCACTTTTAA TACAACAAATATAGTACTT-3' - pour le virus monkeypox : Seqn ll = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATAATACTATCTGG ATCTACACCAGAAACTATTTCTGA-3' - pour les virus appartenant au genre Orthopoxvirus: Seq n 12 = 5'-ACCAAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAAATCATTCACTGCTAAAGAT GCCGGTACTTATGTATG-3' - pour le virus de la varicelle-zona: Seq n 13 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACC TTTACAGTTGGAGGAAAACGTCTTTTTTTTGTGCGCTCTAACGTTCG AGAAAGTCTGCTG-3' - pour les virus herpes simplex 1 et 2: Seq n 14 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTT TGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAAC AAGCGCCTGGCCC-3' - pour Richettsia akari : Seq n 15 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCGGAAGCTCCACTTTCAGA ATTCAATTTTGCTGCACCGA-3' Dans les séquences Seq n 1 à 15 ci-dessus, les séquences de 12 nucléotides qui seront supprimées puis remplacées par la séquence exogène ont été soulignées. Lesdites séquences spécifiques mentionnées ci-dessus ont été déterminées en fonction des critères suivants : - ils appartiennent à des zones non polymorphiques c'est à dire communs au différents isolats d'une même espèce ou éventuellement à plusieurs espèces dans les cas de B. mallei et B. pseudomallei ou Brucella spp. - le taux d'homologie avec toutes autre séquence comprise dans Genbank, est inférieur à 25%, à l'exception des séquences d'agents appartenant au même genre pour lesquelles l'homologie est inférieure à 75%. Les exceptions sont les séquences choisies pour R. rickettsii qui possède 94% d'homologie avec Rickettsia mongolotimonae et R. prowazekii qui possède 90% d'homologie avec Rickettsia typhi. - lesdites séquences sont disponibles dans base de donnée Genbank. Il s'agit plus particulièrement de séquences choisies dans les gènes indiqués dans le tableau ci-après. Agent Gène cible n d'accès Genbank Bacillus anthracis pag AF065404 Yersinia pestis pla M27820 Francisella tularensis fopA AF097542 Brucella spp. omp19 L27997 Burkholderia mallei flic AF11790 Burkholderia pseudomallei U82287 Chlamydia psittaci ompA AF269265 Coxiella burnetii sodB M74242 Rickettsia prowazekii ompB AF161079 Rickettsia rickettsii ompA U83451 Rickettsia akari ompB AF123707 Variola virus hemagglutinin AF377893 Monkeypox virus Hemagglutinin AF375114 Virus du genre Orthopoxvirus Hemagglutinin AF377892 Varicella-Zona virus IE 62 X04370 transactivator Herpes simplex virus 1 and 2 DNA polymerase X14112 Dans un mode de réalisation particulier, lesdites séquences spécifiques ont été modifiés avec ladite séquence exogène suivante ou respectivement une séquence inverse ou leur séquence complémentaire : - Seq n 16 = 5'-ATTATAGCGGCCGCTTATTA-3' Cette séquence comprend ladite séquence du site de clivage de l'enzyme Not I de 8 nucléotides soulignée ci-dessus, encadrée par deux séquences flanquantes arbitraires de 6 nucléotides. Desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme, ont été obtenus par insertion de ladite séquence exogène en lieu et place des séquences supprimées de 12 nucléotides soulignées ci-dessus. Plus particulièrement encore, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants mentionnés ci-après, ont les séquences suivantes ainsi que respectivement les séquences inverses et séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 17 = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATC ATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTA TTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC-3' Dans laquelle K représente G ou T et S représente G ou C. - pour B .anthracis : Seq n 18 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGC AAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTA AAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATA-3' - pour F. tularensis : Seq n 19 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGTCCTCA AGATAGAACTG-3' - pour Y. pestis : Seq n 20 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAA GGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTATTATAGCGGCCG CTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3' - pour B. mallei et pseudomallei : Seq n 21 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACC AGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGC GGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3' - pour C. psittaci : Seq n 22 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAAT CTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGC TTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3' - pour C. burnetii : Seq n 23 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCG GCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCGG CCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3' - pour Brucella spp. : Seq n 24 = 5'-TGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGG GCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCG CTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3' - pour R. prowazekii : Seq n 25 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGG TTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCG GCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3' - pour R. rickettsii : Seq n 26 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACC ACTTTTAATACAACAAATATAGTACTT-3' - pour le virus monkeypox : Seq n 27 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCG CTTATTAGGATCTACACCRGAAACTATTTCTGA-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n 28 = 5'-ACCAAGGATAAARTATCWTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CTAAAGATGCCGGGTACTTATRTATG-3' - pour le virus de la varicelle-zona : Seq n 29 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACA GTTGGAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGA GAAAGTCTGCTG-3' - pour les virus herpes simplex 1 et 2: Seq n 30 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAG CGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT ACACCAACAAGCGCCTGGCCC-3' - pour R. akari : Seq n 31 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTAT TATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGA-3' En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis et le virus de la variole, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou respectivement la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n 32 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGACCAATTACTAATAAAGAAGA TCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATTAC ATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATACAGGCTCGAACTGGAG TGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGC CGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAATT TCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCT TATTAACTTGGGGTCCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAGCT TATACCGGAAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCT TTATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATTG-3' Cette séquence a été déposée dans Genbank sous le numéro d'accès : AY333963. De même, une souche de Escherichia coli portant un plasmide contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris - France, sous le numéro 13087. Ledit grand fragment regroupe les 4 dits deuxièmes fragments comprenant lesdites séquences spécifiques modifiées des 4 agents de bioterrorisme de classe A. En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour les bactéries Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Brucella spp., Rickettsia prowazekii et Rickettsia ricketsii, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou respectivement la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : -Seqn 33 = 5'-GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCAGC GCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGCGGCCGCTT ATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAACGAGCTCATGCATGCATATGCA TGCATGCGGATCCAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATCTAGAA AATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGAC AAATGGTCAATCACTGGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAAT AATCATTTCGGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATA GCGGCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTCTGCCCC GGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTC CTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCA GGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGTTCTATTCA GTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTG GTGTTAATGCTGCGTTACAACACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAA GTTACAAACTATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCT TATTAACCACTTTTAATACAACAAATATAGTACTTG-3' Cette séquence a été déposée dans Genbank sous le numéro d'accès : AY333965. De même, une souche de Escherichia coli portant un plasmide contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris - France, sous le numéro 13088. Ce grand fragment regroupe les 6 deuxièmes fragments d'ADN comprenant les séquences spécifiques modifiés de chacun des 7 agents de bioterrorisme de classe B visés ci-dessus (6 fragments pour 7 agents car un fragment est commun à B. mallei et B. pseudomallei). En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour le virus Monkeypox, les virus du genre Orthopoxvirus, Herpes simplex 1 et 2, varicelle-zona et la bactérie Rickettsia akari, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n 34 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGAACCAATTACTAATAAAGAAG ATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAAAGTAGATTATGAAGAAT ACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTAT AGCGGCCGCTTATTAGGATCTACACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACCAA GGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTACAA TTAATTATAGCGGCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGCAAT TAATTGGGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTGGAG GAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAAGTCTG CTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAGCGGCCGCTTA TTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCT GGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTCTTATGGCA GGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATTCAA TTTTGCTGCACCGAG- 3' Cette séquence a été déposée dans Genbanck sous le numéro d'accès AV'.:\C)hh T>a tY\Pn1P ll-np cnnrhp 1, Rc-rhoft4,;/'h1"/1 si mil r.,n....t-FJ11t- ± un nlFJctY'\1rL::. contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris - France, sous le numéro 13089. Ce dit grand fragment correspond au regroupement desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant lesdites séquences spécifiques des agents de bioterrorisme ou agents confondants à fièvre éruptive vésiculeuses visés ci-dessus. Dans les 3 séquences, n 32 à 34 ci-dessus, desdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés mentionnés ci-dessus, on retrouve lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant les séquences spécifiques modifiées de chacun desdits agents de bioterrorisme et/ou agents confondants, séparés par des séquences correspondant à des sites de clivage d'enzymes de restriction différents du site de clivage de la séquence exogène et ayant permis la construction desdits grands fragments par ligature des différents fragments comprenant des fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants. Pour les séquences spécifiques des 15 bactéries et virus mentionnés précédemment, dans un mode de réalisation aux étapes d'amplification enzymatique d'ADN, on utilise des jeux d'amorces choisis parmi les suivants ou respectivement les séquences inverse ou leurs séquences complémentaires en tant que de besoin : - pour Bacillus anthracis : Amorce 5' : Seq n 35 = 5'-AGGCTCGAACTGGAGTGAA-3' Amorce 3' :Seq n 36 = 5'-CCGCCTTTCTACCAGATTT-3' - pour Yersinia pestis : Amorce 5' : Seqn 37 = 5'-ATGGAGCTTATACCGGAAAC-3' Amorce 3' : Seq n 38 = 5'-GCGATACTGGCCTGCAAG-3' - pour Francisella tularensis : Amorce 5' : Seq n 39 = 5'-TAATAATTTCATTGCTCCTTTTG-3' Amorce 3' : Seq n 40 = 5'-TTCTATCTTGAGGACCCCAA-3' - pour Brucella spp. : Amorce 5' : Seq n 41 = 5'-CCGGTGAACTGGCTAATCT-3' Amorce 3' : Seq n 42 = 5'-TGAAGAATAGAGCGAGGCAA-3' - pour Burkholderia mallei/Pseudomallei : Amorce 5' : Seq n 43 = 5'-GACGCTGGCGCTGTCGA-3' Amorce 3' : Seq n 44 = 5'-CGGCTTGTTGACCGCGTT-3' - pour Cblamydia psittaci : Amorce 5' : Seq n 45 = 5'-ATTGCTTCGATTCAGATCAAC-3' Amorce 3' : Seq n 46 = 5'-ACCAGTGATTGACCATTTGT-3' - pour Coxiella burnetii : Amorce 5' : Seq n 47 = 5'-CTTTTTACCGACTCCGCAAA-3' Amorce 3' : Seq n 48 = 5'-ACGAGCGTTGACAGTGCTT-3' - pour Rickettsia prowazekii : Amorce 5' : Seq n 49 = 5'-GCTCTTATGAATAATAATGCTC-3' Amorce 3' : Seq n 50 = 5'-TGTTGTAACGCAGCATTAACA-3' - pour Rickettsia rickettsii : Amorce 5' : Seq n 51 = 5'-TTTGGTGGAGCTCATAAGTTA-3' Amorce 3' : Seq n 52 = 5'-GTACTATATTTGTTGTATTAAAAG-3' - pour Rickettsia akari : Amorce 5' : Seq n 53 = 5'-TTGGTGGGAATAATTGTAATGT-3' Amorce 3' : Seq n 54 = 5'-TGCAGCAAAATTGAATTCTG-3' - pour le virus de la variole : Amorce 5' : Seq n 55 = 5'-GACKTCSGGACCAATTACTA-3' Amorce 3' : Seq n 56 = 5'-TTGATTTAGTAGTGACAATTTCA-3' - pour le virus Monkeypox : Amorce 5' : Seq n 57 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTC-3' Amorce 3' : Seq n 58 = 5'-CAGAAATAGTTTCGACAATTTCA-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Amorce 5' : Seq n 59 = 5'-ACCAAGGATAAARTATCWTACG-3' Amorce 3' : Seq n 60 = 5'-ATAYATAAGTACCCGGCATCT-3' - pour le virus de la varicelle-zona : Amorce 5' : Seq n 61 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATC-3' Amorce 3' : Seqn 62 = 5'-CAGCAGACTTTCTCGAACG-3' - pour les virus Herpex simplex 1 et 2: Amorce 5' : Seqn 63 = 5'-CCGACCCGGAGAGGGAC-3' Amorce 3' : Seq n 64 = 5'-CCAGGCGCTTGTTGGTGT-3' Dans un mode de réalisation, à l'étape 2-, on utilise des sondes comprenant les séquences suivantes ou respectivement leurs séquences inverses ou séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 65 = 5'-AAGATCATACAGTCACAGACACTGT-3' - pour B. anthracis : Seq n 66 = 5'-TACCGCAAATTCAAGAAACAACTGC-3' - pour F. tularensis : Seq n 67 = 5'-TTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACT-3' - pour Y. pestis: Seq n 68 = 5'-AAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAA-3' - pour B. mallei/B. pseudomallei : Seq n 69 = 5'-AACCAGCGCGCTGTCCGCGAC-3' - pour C. psittaci : Seq n 70 = 5'-ATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTA-3' - pour C. burnetii: Seq n 71 = 5'-ATCATTTCGGCTCGGGATGGGC-3' - pour Brucella spp. : Seq n 72 = 5'-AATGGCAAGCAACTCGTCCTTTAC-3' - pour R. prowazekii : Seq n 73 = 5'-TGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGT-3' - pour R. rickettsii : Seq n 74 = 5'-TATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGAT-3' - pour R. akari : Seq n 75 = 5'-ACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAG-3' - pour le virus Monkeypox : Seq n 76 = 5'-TTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCG-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n 77 = 5'-TCCATACGATGATCTAGTTACAACTA-3' - pour le virus de la varicelle-zona : Seq n 78 = 5'-ATGCCACCTTTACAGTTGGAGGAA-3' - pour les virus Herpex simplex 1 et 2: Seq n 79 = 5'-ACCGCCGAACTGAGCAGACACC-3' Dans les séquences Seq n 1 à 79, les différents nucléotides, notamment K, S, R, W et Y, ont les significations conventionnelles, à savoir K représente G ou T, S représente G ou C, R représente A ou G, W représente A ou T et Y représente C ou T. Les séquences de sondes, identifiées ci-dessus, sont comprises dans la partie non modifiée d'ADN synthétique entre les séquences des amorces 5' et 3' respectives, mentionnées précédemment d'une part, donc en dehors de ladite séquence exogène. Ce mode de réalisation permet d'utiliser les mêmes sondes pour l'ADN du témoin positif et l'ADN authentique à rechercher dans les échantillons à tester et permet donc de les mettre en oeuvre dans le cadre d'une méthode PCR quantitative dans laquelle on quantifie l'ADN des échantillons à tester en référence à l'étalonnage réalisé sur l'ADN du témoin positif. Avantageusement encore, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés constitutifs de l'ADN de l'échantillon témoin, sont insérés dans un plasmide. Ce plasmide peut alors être exprimé dans une bactérie, notamment Echerichia coli, celle-ci produisant ladite séquence dont le nombre de copies produites est mesurable. Le fait de disposer d'un contrôle positif sous forme de plasmide permet de réaliser un étalonnage en vue d'une méthode d'amplification du type PCR quantitative. Cette caractéristique est importante car pour certains agents de bioterrorisme comme l'anthrax (Bacillus antbracis), seuls des inoculums importants (environ 105 spores) sont à l'origine des formes pulmonaires qui sont quasi constamment mortelles. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic, utile pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend des échantillons de témoins positifs comprenant un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et, le cas échéant, d'agents confondants tels que définis ci-dessus, - ainsi que de préférence desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents bactériens ou viraux selon l'invention tels que définis ci-dessus, et - de préférence encore le cas échéant, desdites sondes de l'invention telles que définies ci-dessus. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre, faite en référence à un listage de séquence. Pour permettre la détection des agents de bioterrorisme sans encourir les risques de faux positifs et pour atteindre les buts assignés, on a construit 3 plasmides (CatA, CatB et CatVEF) qui peuvent être utilisés comme témoins positifs. Deux sont dédiés à la détection des agents de Catégorie A et B du Centers for Disease Control and Prévention (CDC, Atlanta, USA), respectivement. On a aussi construit 1 plasmide destiné à être utilisés pour la détection d'agents responsables de fièvres éruptives vésiculeuses (ressemblant à la variole). Des séquences spécifiques de 4 à 6 bactéries ou virus ont été groupées dans ces plasmides. Une séquence exogène qui modifie la séquence native et introduit un site NotI, a été incorporée dans chaque séquence spécifique. Les mêmes amorces de PCR permettant l'amplification des séquences natives et des séquences modifiées, des plasmides ont été déterminées. De même, des sondes spécifiques de 18 agents inclus dans la liste des agents classés du CDC ou leurs agents confondants, ont été déterminées. Dans les plasmides, les séquences cibles sont modifiées par le remplacement de 12 nucléotides par une séquence exogène de 20 nucléotides qui comporte au centre un site NotI de 8 nucléotides. Cette modification autorise une pré-digestion par Notl afin d'éviter toute contamination par l'ADN des plasmides. De plus, quand un plasmide est utilisé comme témoin positif, l'ADN natif amplifié peut être différencié de l'ADN du plasmide témoin par : (1) un profil en électrophorèse distinct, (2) une digestion du produit amplifié par l'enzyme Notl, , (3) des courbes de fusions différentes dans les systèmes de PCR en temps réel, (4) la séquence des fragments amplifiés. Le choix des séquences cibles, les tests de sensibilité et spécificité, les tests de quantification et la différentiation avec les faux positifs sont décrites ci-après. I- Protocole expérimental 1. Choix des séquences cibles, des amorces et test de spécificité In silico Le choix des gènes cibles pour B. anthracis et Y. pestis a été fait selon des travaux déjà publiés. Pour les autres micro-organismes, les gènes cibles sont ceux pour lesquels plusieurs séquences d'un même gène étaient disponibles dans Genbank. Pour chaque espèce, les séquences ont été alignées à l'aide du CLUSTAL W sur le site du PBIL (http://www.npsapbil. ibcp.fr) ou CLUSTAL XI.81 sous Windows. Les séquences cibles ont été choisies dans les zones non polymorphiques. Les amorces ont été déterminées manuellement ou à l'aide du logiciel de CyberGene AB (http: //www.cybergene.se) afin d'avoir des amorces avec un Tm d'environ 58 C et un G + C % de moins de 50% qui sont des conditions assurant une PCR aisée, notamment une bonne séparation des brins d'ADN lors de la phase de séparation des 2 brins. Les séquences cibles et les amorces ont été comparées à la base de donnée Genbank database à l'aide du logiciel Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) afin d'assurer une bonne spécificité. Le seuil d'homologie pour le choix des séquences cibles a été fixé à Le tableau 1, ci-après, décrit les gènes et amorces utilisés pour l'amplification des agents de bioterrorisme et leurs agents confondants et leurs présences dans les différentes catégories de plasmides sont indiquées. 2. Principes des synthèses des inserts d'ADN synthétiques Les séquences à intégrer dans les plasmides ont été synthétisées séparément par un fabricant spécialisé (Eurogentec, Seraing, Belgium). Chaque séquence est spécifique d'un agent sauf celle de B. pseudomallei qui est déterminé pour reconnaître aussi B. mallei. Les séquences ont été organisées de la même façon dans toutes les constructions (voir tableau 2 ci-après) : (1) une séquence ATGCATGCATGC assurant la stabilisation de l'enzyme pendant l'étape de restriction (nommée séquence de stabilisation [Sseq]), (2) un hexanucléotide spécifique d'une enzyme de restriction utile pour l'assemblage des différentes séquences, (3) la séquence spécifique de l'agent à identifier incluant ses sites de fixation des 2 amorces aux extrémités, ainsi que la séquence exogène ATTATA-GCGGCCGCTTATTA, laquelle inclut le site NotI (en gras), (4) un second hexanucléotide correspondant à un site de restriction d'une enzyme différente de celle mentionnée en (2), (5) la même séquence de stabilisation qu'en (1) de 12 nucléotides communs. Ainsi, toutes les séquences avant ligation contiennent invariablement 56 nucléotides exogènes. Le tableau 2, ci-après, indique les inserts comprenant lesdits grands fragments des séquences n 47 à 49 incluant les séquences spécifiques originales parmi les Séq. n 1 à 15 mentionnées ci-dessus, avec en outre les éléments modifiés dans lesquelles sont distingués les éléments suivants : - les séquences de stabilisation destinées à optimiser l'activité des enzymes de restriction, ajoutées aux extrémités en vue de l'assemblage, écrites en minuscules, - les sites de clivages des enzymes de restriction d'assemblage aux extrémités, écrites aussi en lettres minuscules (les noms des enzymes sont indiqués dans le tableau 2), - les amorces spécifiques aux extrémités des fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents de bioterrorisme ou agents confondants, écrites en lettres majuscules, incluant la séquence exogène Seq. ID n 16 ajoutée, écrite en lettres minuscules, - les sondes de détection comprises entre les amorces en dehors de la zone de la séquence exogène, écrites en lettres capitales. Les bases en minuscules ne sont pas spécifiques de l'agent de bioterrorisme ou confondant, les bases en majuscules sont spécifiques. La liste des amorces 5' et 3' utilisées pour les différents agents correspond aux séquences Séq. n 50 à 79 mentionnées ci-dessus. La liste des séquences des sondes correspond aux séquences Séq. n 80 à 94 mentionnées ci-dessus. 3. Construction des plasmides Trois plasmides ont été construits, CatA pour les agents de catégorie A, CatB pour les agents de catégorie B et CatVEF pour les agents à fièvres éruptives vésiculeuses (Tableau 2). La construction du plasmide CatA, qui correspond aux 4 agents de catégorie A du CDC (virus de la variole [seql], Bacillus anthracis [seq2], Francisella tularensis [seq3], et Yersinia pestis [seq4]), est présentée comme exemple pour la construction. Une fois que les séquences simple brin d'ADN ont été synthétisées par le fournisseur, elles ont été assemblées en ADN double brins afin d'être intégrées dans les plasmides PGEM-T. Les étapes sont les suivantes (tableau 3 représenté en figure 1): a) amplification par PCR à l'aide d'amorces s'hybridant avec la séquence de stabilisation de chacune des 4 séquences (en gris et rouge du tableau 2). Les réactions de PCR sont réalisées dans 50 l avec lOmM TrisHC1 [pH 9.0], 1. 5 mM MgC12, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 200 M each dNTP, 0. 4 M de chaque amorce, 0.4 M de chaque ADN simple brin, et 1. 5 U de Taq ADN polymerase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Le cycle de PCR était 5 min à 95 C, à 35 cycles de 30 sec à 95 C, 30 sec à 55 C, et 1 min à 72 C suivis d'une extension finale de 7 min. à 72 C. b) Les produits de PCR sont purifiés sur colonnes QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et élués dans 50 l d'eau distillée RNAse free. Quand 2 ou plusieurs bandes sont observées après électrophorèse, la bande à la bonne taille est excisée et purifiée à l'aide du GenClean III Kit (Q-Bio-Gene, Carlsbad CA, USA). c) L'assemblage a été réalisé par paires, seql avec seq2 (résultant en seql-2), seq3 avec seq4 (résultant en seq3-4); ensuite seql-2 avec seq3-4 (résultant en seql-2-3-4). d) Des volumes égaux (10 l) de seql- et seq2- ADN double brin purifiés ont été incubés à 37 C en présence de Sac I. Le site Sac I est placé aux extrémités 3' et 5' de seql et seq2 respectivement. e) Le produit de la réaction est purifié sur colonne afin de retirer les fragments de 15n nucléotides correspondant aux séquences de stabilisation aux extrémité 5' et 3' afin d'éviter leur religation à leurs séquences complémentaires. f) Incubation une nuit à 4 C en présence de l'enzyme T4 ADN ligase. 10 l de la réaction est incubée avec la T4 ADN ligase (Roche, Basel, Switzerland). g) amplification par PCR utilisant les amorces externes selon les même conditions qu'en a) ci-dessus. h) purification sur colonne comme dans b) ci-dessus des produits de PCR . A ce stade, le produit le produit de PCR seql-2 peut être cloné dans le plasmide PGEM-T. i) La même procédure a été réalisée pour seq3 et seq4 j) à la fin, seql-2 et seq3-4 sont assemblées de la même façon (étapes a) à i)). Le produit final est cloné dans le plasmide PGEM-T qui comprend seql-2-3-4. A chaque étape d'assemblage, les produits ont été séquences pour vérifier l'absence de mutations dues soit à la Taq ADN polymerase ou à des évènements de recombinaison, délétion ou duplication pendant les différentes étapes de l'assemblage. Seuls les clones présentant 100 % d'homologie avec les constructions prévues in silico ont été utilisés pour l'assemblage. A la fin, la séquence finale des parties clonées dans les plasmides ont été séquencées pour vérifier que leur homologie est de 100% avec les séquence prévues in silico. Les séquences des plasmides sont 100% homologues aux séquences désignées in silico. Les séquences spécifiques des plasmides CatA, CatB et CatVEF, représentées au tableau 4 ci-après, ont été déposées dans Genbank sous les numéros : AY333963, AY333965, AY333966 respectivement. Les souches d'E. coli portant les plasmides CatA, CatB et CatVEF, ont été déposées dans la collection CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux - 75724 Paris cedex 15, France) sous les numéros 1-3087, 1-3088 et 1-3089 respectivement. 4. Extraction de l'ADN, amplification, séquençage et restriction Avant amplification, les ADN sont extraits des échantillons à tester. Toutes les extractions d'ADN ont été faites par l'utilisation de résine échangeuse d'ions et notamment du type chelex. Les suspensions d'ADN extraites ont été tamponnées avec du tampon 10X PCR sans MgCl2 afin d'obtenir une concentration finale de 0. 5X, et conservées à -20 C. L'extraction a aussi été testée sur des spores de B. anthracis afin de vérifier que l'extraction tue bien les spores. Une suspension en PBS d'une culture de 96h de B. anthracis a été préparée. 10 l de cette suspension ont été déposés sur une lame et colorés par une coloration de spores. Les spores, colorées en vert, ont été comptées. La suspension a ensuite été ajustée à une concentration en spore de 107/ml. Un aliquot a ensuite été soumis a une extraction puis inoculé sur une gélose au sang pour vérifier l'absence de pousse de B. anthracis. La même manipulation sans étape de chauffage a été réalisée comme contrôle. Les conditions d'amplification par PCR étaient les suivantes : Protocole classique à 35 cycles avec hybridation à 55 C (détaillé en section a) de l'assemblage des plasmides); (2) PCR dans l'appareil ABI 7000 (Perkin Elmer Applied Biosystem, Roche, USA). 10 l d'une dilution décimale d'ADN ont été combinées avec 50 pmol de chaque amorce et 10 pmol de sondes marquées au FAM-/ou VIC- (molécules fluorescentes appelées "reporter" et TAMRA- (molécule fluorescente appelée "quencher") dans un volume réactionnel de 50- l utilisant le TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Roche, USA). Les échantillons ont été soumis à 45 cycles d'amplification dans l'appareil ABI Prism 7000 Sequence Detection System instrument (PE Applied Biosystems) conformément aux recommandations du constructeur. Le ratio de positivité a été calculé avec un indice de confiance de 99. 9 à l'aide du logiciel PE 7000 Sequence Detection System. La quantification d'ADN a été calculée en générant une courbe standard. La digestion par NotI des produits de PCR a été réalisée pendant 1 heure à 37 C dans un volume de 20 l et le résultat observé dans un gel d'agarose à 3%. 5. Evaluation de la spécificité des amorces La spécificité de 13 paires d'amorces a été évaluée par (1) amplification croisée des 13 agents des catégories A/B et VEF dont les séquences ont été incorporées dans les plasmides, (2) amplification des bactéries ou des virus proches, (3) amplification des bactéries ou des virus fréquemment isolés ou détectés dans les laboratoires de microbiologie clinique. Les agents testés sont les suivants: (i) les 13 agents à détecter : C.burnetii, F. tularensis, R. rickettsi, R. akari, R. prowazeckii, Y. pestis, B. anthracis, C. psitacci, B. melitensis, Vaccinia virus, varicella-zoster virus, herpesvirus 1 et 2. En raison des limitations liées à la circulation des agents de bioterrorisme qui font l'objet du présent travail, le virus de la variole, du monkeypox, B. mallei et B. pseudomallei n'ont pu être testés (ii) 5 micro-organismes proches: Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Bacillus thurigiensis. (iii) 28 pathogènes humains fréquemment isolés: Corynebacterium groupe ANF, Nocardia asteroides, Shigella flexneri, Mycobacterium avium, Campylobacter jejuni, Streptococcus agalactiae, streptococcus pyogenes, Pseudomonas paucimobilis, Actinomyces viscosus, Shigella sonnei, Streptococcus bovis, Burkholderia cepacia, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Actinomyces meyerii, Fusobacterium nucleatum, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Haemophilus influence, Bacteroides fragilis, Salmonella enterica Typhi, Kingella kingae, Enterobacter aerogenes, Corynebacterium striatum, Bartonella quintana, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis. 6. Evaluation de la sensibilité des amorces Ces tests ont été réalisés dans l'appareil LightCycler (Roche) utilisant le protocole de détection par SYBRGreen recommandé par le fabricant sur des volumes finals de 20 l. 7. Décontamination utilisant la pré-digestion par NotI Afin de vérifier la possibilité de décontamination avant amplification, les extraits d'ADN ont été digérés par Notl. Une suspension d'ADN ajustée à une concentration 106 fois supérieure à celle de la limite de détection de la technique a été préparée à partir de chaque plasmide. Trois solutions ont ensuite été testées après extraction ou soumises à une restriction par NotI à 37 C pendant lh: il s'agissait de (1) l'ADN d'un plasmide seul simulant une contamination par le plasmide d'un prélèvement négatif, (2) l'ADN d'un plasmide seul mélangé avec l'ADN cible afin de mimer un prélèvement positif contaminé par l'ADN du plasmide, (3) l'ADN cible afin de mimer un prélèvement positif non contaminé. II- Résultats 1. Amplification des agents à détecter Les 13 séquences des agents de bioterrorisme à tester et les 15 séquences présentes dans les plasmides sont amplifiées de façon spécifique par les amorces désignées dans ce travail. Les amplifiats sont facilement différenciés des amplifiats de l'ADN natif par digestion par NotI, un profil de migration différent en gel d'agarose ainsi que l'aspect des courbes de fusion et le séquençage des fragments.2. 2. Tests de sensibilité Plasmide Micro organisme Nombre de molécules détectées Cat. A Smallpox virus 5-50 Cat. A Y. pestis 5-50 Cat. A B. anthracis 5 Cat. A F. tularensis 500 Cat. B Brucella sp. 65 Cat. B R. prowazeckii 65 Cat. B R. rickettsii 100 Cat. B B. malleilpseudomallei 65 Cat. B C. burnetii 6 Cat. B C. psitacci 65 Cat. VEF Smallpox virus 5 Cat. VEF Monkeypoxvirus 5-50 Cat. VEF Orthopoxvirus 5 Cat. VEF Varicella-zoster virus 5 Cat. VEF Herpesvirus 1/2 5-50 Cat. VEF R. akari 5 3. Tests de spécificité Parmi l'ensemble des réactions de PCR réalisées avec les 15 paires d'amorces avec les différents virus et bactéries contrôles ((ii) et (iii)), aucun n'a donné un produit d'amplification. 4. Pré-digestion par NotI Aucun amplifiat provenant des plasmides n'a été obtenu avec les suspensions d'ADN contaminées par l'ADN des plasmides. En revanche, la pré-digestion ne gène pas l'amplification de l'ADN natif. 5. Elimination des spores de B. anthracis par l'extraction par une résine Chelex@ Aucune colonie n'était visible sur les suspensions de spores traitées par la résine, en revanche, elles étaient visibles lors de la procédure sans ébullition, démontrant que la technique est efficace et que l'absence de croissance n'est pas due à la seule présence des billes de Chelex. 6. Discrimination sur les températures de fusion Au tableau 5, on représente la discrimination entre les amplicons obtenus à partir d'ADN natif (c'est à dire des agents bactériens ou viraux recherchés) et ceux générés à partir des plasmides CatA, Cat B et CatVEF sur la base de la taille des amplifiats (paires de bases) et de la température des courbes de fusions obtenues par PCR temps réel sur Light Cycler à 58 C. III- Conclusion La présente invention fournit des plasmides qui groupent plusieurs agents et qui assurent une parfaite discrimination de leur ADN avec celui de l'ADN de l'agent cible. Il est démontré que cette discrimination peut être réalisée à posteriori mais aussi à priori par pré-digestion des extraits d'ADN par NotI. Comme il est possible d'éviter les contaminations dues à l'ADN des agents de bioterrorisme par l'incorporation de dUTP dans les mix de PCR, un pré-traitement à l'Uracile N glycosylase combiné avec NotI doit assurer une réaction de PCR non contaminable. La seconde originalité de la stratégie est de combiner des agents de bioterrorisme dans les plasmides de façon logique. Les 2 premiers plasmides (CatA et CatB) sont destinés à être intégrés dans des réactions de détection à la recherche d'agents de classe A ou classe B dans des prélèvements humains ou d'environnement. L'autre plasmide (CatVEF) sont destinés à une utilisation pour des prélèvements humains. Il a été construit pour répondre à des questions spécifiques dans le cas d'un patient se présentant avec des manifestations cliniques compatibles avec celles dues à un agent de bioterrorisme. Le plasmide CatVEF a été défini pour être utilisé comme témoin positif dans les cas d'un prélèvement provenant d'un patient avec une fièvre éruptive ressemblant à la variole, mais le plasmide comporte aussi les séquences des agents qui présentent cliniquement les mêmes manifestations. Il est maintenant accepté que les techniques moléculaires sont les techniques de choix pour rechercher des agents de bioterrorisme à grande échelle. Les tests réalisés en PCR temps réel présentent l'avantage : (1) d'avoir une sensibilité supérieure, (2) d'avoir une spécificité supérieure et d'assurer une détection quantitative sur de grandes séries, (3) d'être moins facilement contaminables. L'utilisation de contrôles positifs ne risquant pas d'entraîner des faux positifs, permet l'accès à ces techniques à tous les laboratoires équipés. Il est enfin démontré que l'extraction par chelex assure une décontamination des prélèvements, notamment des très résistantes spores de B. anthracis. A la connaissance des inventeurs, il s'agit là de la première construction de plasmide qui propose des témoins positifs pour la détection d'agents de bioterrorisme sans avoir besoin d'utiliser de l'ADN natif de ces agents, et qui en plus, permet d'identifier facilement les faux positifs dus à des contaminants par les contrôles positifs. Ces plasmides où l'ADN qui en est extrait, est immédiatement utilisable par les laboratoires de microbiologie clinique possédant un équipement minimal pour réaliser des détections moléculaires. En raison du nombre très important de cibles moléculaires disponibles par les séquençages complets de génomes, les amorces et les fragments de séquences choisis dans ce travail sont évidemment remplaçables par d'autres. Tableau 1 Agent Plasmide Amorce 5' Amorce 3' Bactéries @ Bacillus antbracis CatA 5'- AGGCTCGAACTGGAGTGAA-3' 5'- CCGCCTTTCTACCAGATTT-3' Yersiniapestis CatA 5'- ATGGAGCTTATACCGGAAAC-3' 5'- GCGATACTGGCCTGCAAG-3' Francisella tularensis CatA 5'- TAATAATTTCATTGCTCCTTTTG-3' 5'- TTCTATCTTGAGGACCCCAA-3' Brucella spp. CatB 5'- CCGGTGAACTGGCTAATCT-3' 5'- TGAAGAATAGAGCGAGGCAA-3' Burkholderia mallei CatB 5'- GACGCTGGCGCTGTCGA-3' 5'- CGGCTTGTTGACCGCGTT-3' B. pseudomallei CatB Chlamydiapsittaci CatB 5'- ATTGCTTCGATTCAGATCAAC -3' 5'- ACCAGTGATTGACCATTTGT -3' Coxiella burnetii CatB 5'- CTTTTTACCGACTCCGCAAA -3' 5'- ACGAGCGTTGACAGTGCTT -3' Rickettsia prowazekii CatB 5'- GCTCTTATGAATAATAATGCTC -3' 5'- TGTTGTAACGCAGCATTAACA -3' Rickettsia rickettsii CatB 5'- TTTGGTGGAGCTCATAAGTTA -3' 5'-GTACTATATTTGTTGTATTAAAAG- 3' Rickettsia akari CatVEF 5'- TTGGTGGGAATAATTGTAATGT -3' 5'- TGCAGCAAAATTGAATTCTG -3' Virus Variole CatA, 5'- GACKTCSGGACCAATTACTA -3' 5'- TTGATTTAGTAGTGACAATTTCA-3' Monkeypox CatVEF 5'- AAAGTAGATTATGAAGAATACTC -3' 5'- CAGAAATAGTTTCGACAATTTCA-3' Virus du genre CatVEF 5'- ACCAAGGATAAARTATCWTACG -3' 5'- ATAYATAAGTACCCGGCATCT -3' Orthopoxvirus Varicelle CatVEF 5'- GGTTAAACGTTTGAATCCATC -3' 5'- CAGCAGACTTTCTCGAACG -3' Herpes simplex 1 CatVEF 5'- CCGACCCGGAGAGGGAC -3' 5'- CCAGGCGCTTGTTGGTGT -3' and Tableau 2 Agent Séquence Sites de restriction CatA plasmide~~~~~~~~~~~~~ Variole atgcatgcatgcggatccAAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACA Bam HI / Sac I CTAattata c cc cttattaCATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC a ctcat: cat cat c B. anthraczs atgcatgcatgcgagctcATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAa Sac I Sma I ttata c cc cttattaAAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATAccc at cat cat c F. tularensis atgcatgcatgccccgggGCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACTattatagçggçcgcttattaACT Sma I Eco RI TGGGGTCCTCAAGATAGAACTGgaattcatgcatgcatgc Y.pestis gaattcAATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAG Eco RI Bam HI CGCTTTattata c cc cttattaATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT atccat cat cat c CatB plasmide ~~~~~ B. naallea atgcatgcatgcggatccTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCAGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGC B. pseudomallet GAACGCCACGGCatttagçcgcttattaGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAACgagctcc Bam HI / Sac I C. pstttact atgcatgcacgagctcCAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTT Sac I Sma GGTGCAattata c cc cttattaGCTGACAAATGG1'CAATCACTGGTGAAGccc at cat: cat c C. burnetii atgcatgcatgccccgggGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCGGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAA Sma I Eco RI AGATAACAATGattata c cc cttattaTCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC aattcat cat cat c Brucella sp. gaattcTGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTT Eco RI Aat II ACGATattata c cc cttattaACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA ac tcat cat cat c R prowazeckit gacgtcATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTA Aat II Nae I TAATTACCGGTattata c cc cttattaGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA cc cat cat cat c 1. rickettsü atgcatgcatgcgccggcACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTattat Nae I Bam HI c cc cttattaACCACTTTTAATACAACAAATATAGTACTT atccat cat cat c Tableau 2 (suite) Agent Séquence Sites de restriction CatVEF plasmide~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Variole atgcatgcatgcggatccAAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACA Bam HI / Sac I CTAattata c cc cttattaCATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC a ctcat cat cat c Monkeypox atgcatgcatgcgagctcAAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACT Sac I Sma I ATAGACattata c cc cttattaGGATCTACACCRGAAACTATTTCTGAccc at cat cat c Virus du genre atgcatgcatgccccgggACCAAGGATAAARTATCWTACGATTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTACAATTA Orthopoxvirus attatagçggçcgcttattaCTAAAGATGCCGGGTACTTATRTATGgaattcatgcatgcatgc Sma I / Eco RI z~~~ Varicelle atgcatgcatgcgaattcGGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTGGAGGAAAACGTCTTattat Eco RI Aat II a c cc cttattaTCTAACGTTCGAGAAAGTCTGCTG ac tcat cat cat c Herpes simplex 1 cgacgtcCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCattatagçgccttattaTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCC &2 GCGCGCGTACACCAACAAGCGCCTGGCCCgccggc Aat II Nae R. akari gccggcATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGT Nae I Bam HI GCattata c cc cttattaTTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGA atccat cat cat c Tableau 4 Plasmide CatA (ADN) nnnnnnnnnnnnnn~plasmide- GA TCCAAGACTICCGGACCAATIACTAA TAAAGAA GATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATT ACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATACAGGCTCGAACTGG AGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCG GCCGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAA TTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCG CTTATTAACTTGGGGTCCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAG CTTATACCGGAAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCG CTTTATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATTG plasmide~nnnnnnn Plasmide CatB (ADN) nnnnnnnnnnnnnn~plasmide~GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTC GGCAACCAGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGC ATTATAGCGGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAA CGAGCTCATGCATGCATATGCATGCATGCGGATCCAAATTGCTTCG ATTCAGATCAACAAAATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTG TTGGTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGACAAATGGTCAATC ACTGGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCAT TTCGGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATA GCGGCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTC TGCCCCGGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGC AAGCAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTT GCCTCGCTCTATTCTTCAGGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAAT GCTCTTGCAGCTGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTA CCGGTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTA CAACACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTAT ATTGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAA CCACTTTTAATACAACAAATATAGTACTTG~plasmide~nnnnnnn Plasmide CatVEF (ADN) nnnnnnnnnnnnnn~plasmide- GA TCCAAGACTTCCGGAACCAA TTACTAA TAAAGA AGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTAT TACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAAAGTAGATTATGAAGA ATACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATT ATAGCGGCCGCTTATTAGGATCTACACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACC AAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTAC AATTAATTATAGCGGCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGC AATTAATTGGGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTG GAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAAGT CTGCTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAGCGGCCGC TTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCG CCTGGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTCTTATG GCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATT CAATTTTGCTGCACCGAG~plasmide~nnnnnnn Tableau 5 agent Nature de l'ADN Taille de Température de la courbe l'amplifiât de fusion ( C) B. anthracis Natif 93 79.00 ~ ~ Plasmide Cat.A 105 81.00 F. tularensis Natif 79 81.00 Plasmide Cat.A 91 79.00 Smallpox virus Natif 98 Non déterminé Plasmides Cat.A et 110 79.00 CatVEF Y. pestis Natif 97 82.00 Plasmide Cat.A 109 82.65 C. burnetii Natif 102 82.05 Plasmide Cat.B 114 82.65 B. melitensis Natif 97 86.75 Plasmide Cat.B 109 85.00 R, prowazeckii Natif 105 80.50 Plasmide Cat.B 117 81. 50 R. rickettsii Natif 95 80.00 Plasmide Cat.B 107 79.00 B. malleilpseudomallei Natif 101 Non déterminé Plasmide Cat.B 113 91.00 C. psitacci Natif 102 82.50 Plasmide Cat.B 114 81.50 Monkeypox virus Natif 100 Non déterminé Plasmide Cat.VEF 112 77. 75 Orthopoxvirus Natif 95 Non déterminé Plasmide Cat.VEF 107 77.00 Herpes Simplex virus Natif 83 88.00 and 2 Plasmide Cat.VEF 95 87. 75 Varicella-zoster virus Natif 90 81.00 Plasmide Cat.VEF 102 80.50 R. akari Natif 92 80.50 Plasmide Cat.VEF 104 79.25 REVENDICATIONS 1. Méthode de détection de la présence d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en #uvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et d'un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif, caractérisée en ce que : a/- on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à # un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN de bioterrorisme, de préférence de 4 à 8, ou # un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN, de préférence de 4 à 8, comprenant au moins un agent bactérien ou viral à ADN de bioterrorisme et au moins un agent bactérien ou viral à ADN confondant, et b/- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif, un grand premier fragment d'ADN synthétique regroupant des deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants dudit groupe, ladite séquence spécifique de chaque dit agent bactérien ou viral étant modifiée par substitution d'une partie de la séquence authentique correspondante dudit agent bactérien ou viral par une séquence exogène comprenant un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux du dit groupe, ladite séquence exogène étant de préférence de taille différente, de préférence supérieure à celle de ladite partie de séquence authentique remplacée. c/- on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : 1- on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et le cas échéant desdits agents confondants, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée, 2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, en vérifiant si la séquence desdits amplifiats comprend une dite séquence exogène. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape 3-, on détecte les faux positifs après incubation des amplifiats provenant desdits échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN qu'elle contient, et ainsi détecter la présence de faux positifs. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que, à l'étape 1-, on met en #uvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents bactériens ou viraux dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents bactériens ou viraux et lesdites amorces pouvant être mises en #uvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que, avant de réaliser lesdites réactions d'amplifications enzymatiques de type PCR de l'étape 1-, on décontamine l'ADN à amplifier provenant des échantillons à tester en le mettant en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN provenant desdits grands premiers fragments d'ADN du témoin positif qu'ils pourraient contenir suite à une contamination par l'échantillon d'ADN témoin positif. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'à l'étape 2-, ladite vérification est réalisée à l'aide d'une sonde de ladite séquence spécifique d'un dit agent bactérien ou viral et, le cas échéant, à l'aide d'une pluralité de sondes spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, des dits agents confondants. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la séquence de la ou desdites sondes est complémentaire d'une partie de la ou desdites séquences spécifiques authentiques, ne se chevauchant pas avec la partie de la séquence authentique remplacée par ladite séquence exogène. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite séquence exogène - comprend ledit polynucléotide correspondant au site de clivage spécifique de ladite enzyme de restriction, ledit polynucléotide étant encadré par des séquences flanquantes qu'on ne retrouve pas dans lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, lesdites séquences flanquantes comprenant n nucléotides et n étant un nombre entier de 3 à 10. 8. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polynucléotide de n nucléotides correspondant audit site de clivage de l'enzyme de restriction, est positionné sensiblement au milieu de ladite séquence spécifique authentique dudit agent bactérien ou viral. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte la présence éventuelle d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux à ADN, consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis et un virus de la variole. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent de bioterrorisme appartenant au groupe des bactéries Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Brucella spp., Rickettsia prowazekii et Rickettsia ricketsii. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux, consistant dans un virus de la variole et des agents confondants avec le virus de la variole se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, à savoir les virus Monkeypox, les virus du genre Orthopoxvirus, les virus herpes simplex 1 et2, le virus de la varicelle-zona et la bactérie Rickettsia akari. 12. Méthode selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, à partir desquelles sont obtenus lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques spécifiques modifiés, ainsi que lesdits jeux d'amorces et, le cas échéant, dites sondes spécifiques desdits agents bactériens ou viraux, ont les séquences suivantes du listage de séquences ainsi que les séquences inverses et séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 1 = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAG TCACAGACACTGTCTCATACACTACAGTAAGTACATCATCTGAAATTGTCACT ACTAAATCAAC-3' - pour Bacillus anthracis : -, r ~w.,..",,,-- Seq n 2 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCA AGAAACAACTGCACGTA TCA'l'l'l'l'l'AA TGGAAAAGATITAAATCTGGTAGAA AGGCGGATA-3' - pour Francisella tularensis : Seq n 3 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTAACAAGGACAATACTTGGGGTCCTCAAGATAGA ACTG-3' - pour Yersinia pestis : Seq n 4 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAG GAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTTCTATGCCATATAT TGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3' - pour Burkholderia pseudomallei et pour Burkholderia mallei : Seq n 5 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCA GCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCGATGGTTG CGCAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3' - pour Chlamydia psittaci : Seq n 6 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATC TAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCT GACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3' - pour Coxiella burnetii : Seq n 7 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCGG CTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGGCAAATTAGAA GTCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3' - pour Brucella spp.: Seq n 8 = 5'-TGCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCC GTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGG TTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3' - pour Rickettsia prowazekii : Seq n 9 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGT TCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTGATATAGGTA ACGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3' - pour Rickettsia rickettsii : Seq n 10 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTAGCACGGCAGGTACCACTTTTAA TACAACAAATATAGTACTT-3' - pour le virus monkeypox~: Seqn ll= 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATAATACTATCTGG ATCTACACCAGAAACTATTTCTGA-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus : Seq n 12 = 5'-ACCAAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAAATCATTCACTGCTAAAGAT GCCGGTACTTATGTATG-3' - pour le virus varicelle-zona : Seq n 13 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACC TTTACAGTTGGAGGAAAACGTCTTTTTTTTGTGCGCTCTAACGTTCG AGAAAGTCTGCTG-3' - pour les virus herpes simplex 1 et 2: Seq n 14 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTT TGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAAC AAGCGCCTGGCCC-3' - pour Rickettsia akari : Seq n 15 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCGGAAGCTCCACTTTCAGA ATTCAATTTTGCTGCACCGA-3' 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques ont été modifiés avec ladite séquence exogène suivante ou respectivement la séquence inverse ou séquence complémentaire : - Seq n 16 = 5'-ATTATAGCGGCCGCTTATTA-3' 14. Méthode selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants mentionnés ci-après, ont les séquences suivantes ou les séquences inverses ou séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 17= 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATC ATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTA TTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC-3' - pour Bacillus anthracis : Seq n 18 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGC AAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTA AAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATA-3' - pour Francisella tularensis : Seq n 19 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGTCCTCA AGATAGAACTG-3' - pour Yersinia pestis : Seq n 20 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAA GGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTATTATAGCGGCCG CTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3' - pour Burkholderia mallei/pseudomallei : Seq n 21 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACC AGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGC GGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3' - pour Chlamydia psittaci : Seq n 22 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAAT CTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGC TTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3' - pour Coxiella burnetii : Seq n 23 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCG GCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCGG CCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3' - pour Brucella spp. : Seq n 24 = 5'-TGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGG GCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCG CTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3' - pour Rickettsia prowazekii : Seq n 25 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGG TTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCG GCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3' - pour Rickettsia. rickettsii : Seq n 26 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACC ACTTTTAATACAACAAATATAGTACTT-3' - pour le virus monkeypox : Seq n 27 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCG CTTATTAGGATCTACACCRGAAACTATTTCTGA-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n 28 = 5'-ACCAAGGATAAARTATCWTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CTAAAGATGCCGGGTACTTATRTATG-3' - pour le virus varicelle-zona : seq n 29 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACA GTTGGAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGA AAGTCTGCTG-3' - pour les virus herpes simplex 1 et 2: seq n 30 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAG CGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT ACACCAACAAGCGCCTGGCCC-3' - pour Rickettsia. akari : Seq n 31 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTAT TATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGA-3' 15. Méthode selon les revendications 9 et 15, caractérisée en ce que ledit grand fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n 32 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGACCAATTACTAATAAAG AAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGC CGCTTATTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATAC AGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACT GCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAG AAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAAT ACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGT CCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAGCTTATACCGG AAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTT ATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT G-3' 16. Méthode selon les revendications 10 et 14, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n 33 = 5'-GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCG GCAACCAGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCAT TATAGCGGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAACG AGCTCATGCATGCATATGCATGCATGCGGATCCAAATTGCTTCGATT CAGATCAACAAAATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTG GTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACT GGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTC GGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCG GCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTCTGC CCCGGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAG CAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTTGCC TCGCTCTATTCTTCAGGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAATGCT CTTGCAGCTGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCG GTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAA CACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATATT GTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACCA CTTTTAATACAACAAATATAGTACTTG-3' 17. Méthode selon les revendications 11 et 14, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n 34 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGAACCAATTACTAATAA AGAAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCG GCCGCTTATTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAA AGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGAT AGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCGCTTATTAGGATCTAC ACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACCAAGGATAAAATATCTTACGA TTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCG GCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGCAATTAATTG GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTGGAG GAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAA GTCTGCTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATA GCGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCG TACACCAACAAGCGCCTGGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATT GTAATGTAACACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATT ATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGAG-3' 18. Méthode selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que, aux étapes d'amplification enzymatique d'ADN, on utilise les jeux d'amorces de séquences suivantes ou respectivement séquences inverses ou leurs séquences complémentaires en tant que de besoin: - pour Bacillus anthracis : Amorce 5' : Seq n 35 = 5'-AGGCTCGAACTGGAGTGAA-3' Amorce 3' : Seq n 36 = 5'-CCGCCTTTCTACCAGATTT-3' - pour Yersinia pestis : Amorce 5' : Seq n 37 = 5'-ATGGAGCTTATACCGGAAAC-3' Amorce 3' : Seqn 38 = 5'-GCGATACTGGCCTGCAAG-3' - pour Francisella tularensis : Amorce 5' : Seq n 39 = 5'-TAATAATTTCATTGCTCCTTTTG-3' Amorce 3' : Seq n 40 = 5'-TTCTATCTTGAGGACCCCAA-3' - pour Brucella spp. : Amorce 5' : Seq n 41 = 5'-CCGGTGAACTGGCTAATCT-3' Amorce 3' : Seq n 42 = 5'-TGAAGAATAGAGCGAGGCAA-3' - pour Burkholderia mallei/ Pseudomallei : Amorce 5' : Seq n 43 = 5'-GACGCTGGCGCTGTCGA-3' Amorce 3' : Seqn 44 = 5'-CGGCTTGTTGACCGCGTT-3' - pour Cblamydia psittaci : Amorce 5' : Seq n 45 = 5'-ATTGCTTCGATTCAGATCAAC-3' Amorce 3' : Seq n 46 = 5'-ACCAGTGATTGACCATTTGT-3' - pour Coxiella burnetii : Amorce 5' : Seqn 47 = 5'-CTTTTTACCGACTCCGCAAA-3' Amorce 3' : Seq n 48 = 5'-ACGAGCGTTGACAGTGCTT-3' - pour Rickettsia prowazekii : Amorce 5' : Seqn 49 = 5'-GCTCTTATGAATAATAATGCTC-3' Amorce 3' : Seq n 50= 5'-TGTTGTAACGCAGCATTAACA-3' - pour Rickettsia rickettsii : Amorce 5' : Seq n 51 5'-TTTGGTGGAGCTCATAAGTTA-3' Amorce 3' :Seq n 52 = 5'-GTACTATATTTGTTGTATTAAAAG-3' - pour Rickettsia akari : Amorce 5' : Seqn 53 = 5'-TTGGTGGGAATAATTGTAATGT-3' Amorce 3' : Seq n 54 = 5'-TGCAGCAAAATTGAATTCTG-3' - pour le virus de la variole : Amorce 5' : Seq n 55 = 5'-GACKTCSGGACCAATTACTA-3' Amorce 3' : Seq n 56 = 5'-TTGATTTAGTAGTGACAATTTCA-3' - pour le virus Monkeypox : Amorce 5' : Seq n 57 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTC-3' Amorce 3' : Seq n 58 = 5'-CAGAAATAGTTTCGACAATTTCA-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Amorce 5' : Seq n 59 = 5'-ACCAAGGATAAARTATCWTACG-3' Amorce 3' : Seq n 60 = 5'-ATAYATAAGTACCCGGCATCT-3' - pour le virus de la varicelle-zona : Amorce 5' : Seqn 61 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATC-3' Amorce 3' : Seq n 62 = 5'-CAGCAGACTTTCTCGAACG-3' - pour les virus Herpex simplex 1 et 2: Amorce 5' : Seq n 63 = 5'-CCGACCCGGAGAGGGAC-3' Amorce 3' :Seq n 64 = 5'-CCAGGCGCTTGTTGGTGT-3' 19. Méthode selon la revendication 12 ou 18, caractérisée en ce qu'à l'étape 2-, on utilise des sondes comprenant les séquences suivantes ou séquences inverses ou leurs séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n 65 = 5'-AAGATCATACAGTCACAGACACTGT-3' - pour Bacillus anthracis : Seq n 66 = 5'-TACCGCAAATTCAAGAAACAACTGC-3' - pour Francisella tularensis : Seq n 67 = 5'-TTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACT-3' - pour Yersinia pesti s : Seq n 68 = 5'-AAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAA-3' - pour Burkholderia mallei/B. pseudomallei : Seq n 69 = 5'-AACCAGCGCGCTGTCCGCGAC-3' - pour Coxiella psittaci : Seq n 70 = 5'-ATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTA-3' - pour Chlamydia burnetii: Seq n 71 = 5'-ATCATTTCGGCTCGGGATGGGC-3' - pour Brucella spp. : Seq n 72 = 5'-AATGGCAAGCAACTCGTCCTTTAC-3' - pour Rickettsia prowazekii : Seq n 73 = 5'-TGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGT-3' - pour Rickettsia rickettsii : Seq n 74 = 5'-TATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGAT-3' - pour Rickettsia akari : Seq n 75 = 5'-ACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAG-3' - pour le virus Monkeypox : Seq n 76 = 5'-TTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCG-3' - pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n 77 = 5'-TCCATACGATGATCTAGTTACAACTA-3' - pour le virus varicelle-zona : Seq n 78 = 5'-ATGCCACCTTTACAGTTGGAGGAA-3' - pour les virus herpes simplex 1 et 2: Seq n 79 = 5'-ACCGCCGAACTGAGCAGACACC-3' 20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que lesdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés constitutifs de l'ADN de l'échantillon témoin, sont insérés dans un plasmide. 21. Trousse de diagnostic utile pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des échantillons de témoins positifs comprenant un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et, le cas échéant, d'agents confondants tels que définis dans les revendications 1,3 et 9 à 12 et 14 à 17, - ainsi que de préférence desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents bactériens ou viraux tels que définis dans les revendications 1,3 et 18, et - de préférence encore le cas échéant, desdites sondes telles que définies dans les revendications 5,6 et 19, et - de préférence encore, une dite zone de restriction telle que définie dans les revendications 1,2, 4 et 13.