FR 2842823 A1 20040130 FR 0209426 A 20020725 Adénovirus modifiés pour le ciblage des lymphocytes B La présente invention concerne des adénovirus recombinants dont le tropisme a été modifié pour leur permettre d'infecter des lymphocytes B. Elle concerne également des méthodes pour la préparation de tels adénovirus, ainsi que leurs utilisations, notamment pour le transfert de séquences d'ADN dans les lymphocytes B in vitro, ex vivo ou in vivo, dans un but expérimental, industriel, vaccinal ou thérapeutique. L'invention décrit plus spécifiquement la modification du gène de la fibre de l'adénovirus dans le but de cibler les lymphocytes B, ainsi que d'autres modifications et/ou constructions permettant de conférer aux virus un caractère spécifique pour ces cellules. L'invention est caractérisée notamment par l'introduction dans la fibre de la séquence d'un peptide reconnaissant un récepteur exprimé à la surface des lymphocytes B. Les adénovirus sont très utilisés comme vecteurs de gènes. Ces virus possèdent en effet de nombreuses qualités comme une production facile à titre élevé, leur génome ne s'intègre pas dans le génome de la cellule hôte, on peut y introduire de grands inserts et ils peuvent infecter des cellules quiescentes et des cellules en division. Ces avantages font de ces virus des candidats intéressants dans le cadre du transfert de gène pour la thérapie génique ou pour des études expérimentales (transfert de gènes chez l'animal, production de cellules recombinantes, analyse d'expression de gènes, etc.). Il existe de multiples sérotypes d'adénovirus, infectant les humains ou les animaux. Les adénovirus actuellement utilisés sont majoritairement du sous-groupe C et du sérotype 2 et 5. On peut citer également des adénovirus canins ou bovins, ainsi que des adénovirus humains de sérotypes 7 ou 12, par exemple. Une limitation des vecteurs adénoviraux réside cependant dans le fait qu'ils infectent peu les cellules hématologiques. Or, dans le cadre d'un protocole de thérapie génique contre une pathologie impliquant des lymphocytes B, par exemple les pathologies tumorales comme les leucémies et les lymphomes, il est nécessaire de permettre leur infection de manière efficace. Ceci aussi bien dans le cas d'un protocole de thérapie génique in-vivo ou ex-vivo, d'immunothérapie ou d'une stratégie gène suicide. En outre, dans une approche de thérapie génique, il est important d'infecter les cellules cibles le plus efficacement tout en limitant la dissémination du virus dans les autres cellules (non-cibles). De plus un tel vecteur de gène peut être utilisé dans des approches expérimentales, par exemple pour transfecter efficacement des lymphocytes B dans l'optique de tester l'action de divers gènes ou promoteurs. La partie du virus qui est responsable de la reconnaissance du récepteur naturel, le CAR (Coxsackie-Adenovirus Receptor)(Bergelson et al., 1997) est une protéine de la capside, la fibre, et plus précisément, sa partie C-terminale appelée "le bouton" (Louis et al., 1994). Cette partie de la fibre est aussi responsable de l'amorçage de la trimérisation de la protéine (Hong and Engler 1996). Cette conformation est indispensable pour son interaction avec la base du penton et son incorporation à la capside. Pour modifier le tropisme de l'adénovirus, plusieurs stratégies ont été développées dans l'art antérieur. La première consiste en l'utilisation de composés bispécifiques. Ils sont formés d'une partie reconnaissant un domaine d'une protéine de la capside de l'adénovirus (la fibre, la base du penton ou l'hexon) et d'une partie qui peut interagir avec un récepteur cible. De cette manière des cellules ont été inféctées via le récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor) (Watkins et al., 1997) ou via le récepteur au FGF (Fibroblast Growth Factor) (Goldman et al., 1997). De nombreux autres composants membranaires ont ainsi été ciblés (Haisma et al., 1999 ; Kelly et al., 2000 ; Schneider et al., 2000 ; Yoon et al., 2000). Cette technique est efficace mais il est difficile de l'envisager dans un protocole de thérapie génique. En effet on se heurte à deux problèmes majeurs qui sont (i) la stabilité du composé bispécifique et (ii) l'utilisation d'un système à deux composants qui ne peuvent être produits que séparément, ce qui rend difficile la notion de reproductibilité indispensable pour les protocoles d'essais thérapeutiques. La seconde stratégie utilisée pour modifier le tropisme des adénovirus est de greffer sur la fibre, de manière génétique, un peptide permettant la reconnaissance d'un récepteur cellulaire. L'ajout de cette séquence peptidique ne doit pas gêner la trimérisation afin d'obtenir un assemblage correct du virus. De nombreux travaux ont été effectués dans ce sens, avec notamment l'utilisation d'une séquence poly-lysine (K7) ou d'une séquence RGD à l'extrémité C-terminale de la fibre (Wickham et al., 1997). Ces modifications permettent un assemblage correct du virus et une infection des cellules via l'interaction poly-lysine/héparanes sulfates ou RGD/intégrines de type [alpha]vss3-5. D'autres travaux ont été effectués sur l'insertion de séquence RGD dans la boucle HI, qui est présentée à la surface du bouton. De tels virus peuvent ainsi infecter un grand nombre de types cellulaires dans lesquels il entre naturellement avec une faible efficacité (Biermann et al., 2001 ; Cripe et al., 2001 ; Grill et al., 2001 ; Kasono et al., 1999 ; Nakamura et al., 2002 ; Vanderkwaak et al., 1999, W096/26281 ; W094/10323 ; W095/05201 ; W095/26412). Ces travaux montrent donc que l'ajout de peptides dans le bouton de la fibre ne gêne pas la conformation de celle-ci et permet de diriger l'infection vers un récepteur prédéterminé. Les modifications génétiques de la fibre décrites à ce jour permettent l'infection de types cellulaires qui ne sont pas des cibles naturelles. Cependant, le fait que les peptides utilisés (poly-lysine et RGD) reconnaissent des récepteurs qui sont fortement exprimés dans de nombreux types cellulaires ne fait qu'accroître le tropisme des adénovirus. En outre, aucun adénovirus ayant un tropisme préférentiel pour les lymphocytes B n'a été décrit dans l'art antérieur. La présente invention décrit la possibilité de modifier le tropisme naturel de l'adénovirus pour permettre une bonne infection des lymphocytes B, de préférence sans augmenter le spectre naturel de cellules hôtes de ce virus. Celui-ci est déjà très important car le récepteur naturel des adénovirus est présent à la surface d'un grand nombre de type cellulaire. La présente demande décrit maintenant la construction et la production de vecteurs adénoviraux capables d'infecter ces cellules, via un peptide bien défini reconnaissant un récepteur B spécifique. La présente demande décrit également des vecteurs adénoviraux recombinants présentant un tropisme modifié et restreint pour les lymphocytes B. Les lymphocytes B n'étant pas des cibles naturelles des adénovirus, la présente invention montre qu'il est possible de développer un outil de ciblage de ces cellules. Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans un adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. Un autre aspect de l'invention réside dans un procédé de préparation ou de production d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, ainsi que dans les outils et constructions utilisables à cet effet (vecteurs, gènes chimériques, cellules, etc.). Un autre aspect de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, et dans son utilisation pour le transfert de gènes dans les lymphocytes B, notamment pour le traitement de pathologies associées à un dysfonctionnement de ces cellules ou affectant ces cellules. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée au transfert de gènes dans les lymphocytes B in vivo, ex vivo ou in vitro. Un autre aspect de l'invention concerne une protéine de la fibre d'adénovirus modifiée comme défini ci-avant, tout acide nucléique codant une telle protéine, ainsi que leurs utilisations. L'invention se rapporte donc, de manière générale, à des adénovirus recombinants ayant un tropisme pour les lymphocytes B. Le terme adénovirus recombinant désigne, au sens de l'invention, une particule virale modifiée comprenant un génome viral contenu dans une capside. Les génomes adénoviraux sont des ADN linéaires doubles brins d'environ 36kb. Ils comportent deux régions terminales, les ITR (Inverted Terminal Repeat) qui sont les origines de réplication du génome viral et une séquence d'encapsidation (#). De plus, plusieurs régions (El à E4) dites précoces codent des éléments nécessaires à la transcription et la réplication du génome viral, et des régions dites tardives (Ll à L5) codent les protéines structurales du virus. Les génomes adénoviraux recombinants construits pour la thérapie génique sont délétés de (ou défectifs pour) Ela et/ou Elb de la région El, les produits de ces gènes étant indispensables pour la production virale. Cette délétion (ou ce caractère défectif) prévient une éventuelle dissémination du vecteur dans l'organisme. La séquence d'intérêt est généralement introduite à la place de cette région. Compte tenu de la forte immunogénicité de l'adénovirus et pour prévenir le risque d'émergence de formes RCA (Réplication Competent Adenovirus) d'autres génomes viraux délétés d'autres gènes ont été décrits. Ainsi des adénovirus recombinants défectifs pour les régions suivantes ::ElA;ElAetElBE1 et E3 ;E1et E4 (notamment ORF3 ou ORF6) ; Elet E2 ; Elet E2 et E3 ; Elet E2 et E4 ; Elet E3 et E4 ont été construits. Dans la même optique des génomes recombinants dépourvus de tous les gènes viraux et ne comprenant que les ITR, la séquence d'encapsidation et la séquence d'ADN d'intérêt ont aussi été décrits. Dans une variante particulière, les adénovirus recombinants de l'invention comportent un génome adénoviral recombinant comprenant deux régions terminales ITR, une séquence d'encapsidation (y) et une séquence d'ADN d'intérêt, dont le transfert ou l'expression dans un hôte déterminé est souhaité. De préférence, ils comportent un génome adénoviral défectif pour la région El au moins. Une caractéristique essentielle des adénovirus recombinants de l'invention réside dans la présence d'une fibre modifiée, qui confère à ces virus un tropisme particulier, et notamment la capacité d'infecter les lymphocytes B. Dans ce contexte, l'invention décrit maintenant la construction du gène codant une fibre chimérique comportant un peptide reconnaissant spécifiquement le récepteur CD21. Le récepteur CD21 est un marqueur de surface des lymphocytes B (Nemerow et al., 1989). La glycoprotéine CD21 (ou CR2) est le récepteur à l'EBV (Epstein Barr Virus), qui est aussi reconnue par le C3dg du complément. Afin de permettre une infection préférentielle des lymphocytes B, les inventeurs ont développé des adénovirus possédant, dans leur fibre, un peptide reconnaissant spécifiquement le récepteur CD21. Le peptide choisi a été défini sur la base de la séquence de la partie de la glycoprotéine GP350/220 (protéine de l'enveloppe de l'EBV) responsable de la reconnaissance du CD21. En 1987, la glycoprotéine GP350/220 de l'enveloppe de l'EBV a été définie comme étant responsable de la reconnaissance du récepteur CD21 (Nemerow et al., 1987 ; Tanner et al., 1987). De plus la comparaison de la séquence peptidique de cette protéine à celle du C3dg du complément a révélé deux régions de forte homologie : EDPGFFNVE pour la GP350/220 et EDPGKQLYNVE pour le C3dg, cette dernière étant responsable de la reconnaissance du C3dg au CD21 (Lambris et al., 1985). C'est ainsi que la région EDPGFFNVE a été définie comme étant responsable de la reconnaissance EBV/CD21. De plus, des expériences ont démontré que cette séquence peptidique était capable d'inhiber l'infection des lymphocytes B par ce virus (Nemerow et al., 1989). Différents peptides et différents emplacements dans la fibre ont été sélectionnés afin d'avoir une conformation optimale de la séquence d'intérêt à la surface de la fibre, et de permettre une bonne interaction avec le récepteur. Plus particulièrement, la fibre modifiée selon l'invention comporte un peptide ligand d'un récepteur CD21 comprenant la séquence GEDPGFFNVE ou une partie fonctionnelle de celle-ci. D'autre peptides de ciblage sont les peptides de séquences GEDPGFFNVEIP et GEDPGFFNVEIPEFP, qui ont été utilisés afin d'avoir une conformation optimale pour la reconnaissance du CD21. Les peptides de ciblage selon l'invention incluent tout peptide comprenant entre 7 et 20 acides aminés, de préférence entre 10 et 18, encore plus préférentiellement entre 11 et 17, d'origine synthétique, naturelle ou mixte, capable de lier le récepteur CD21 à la surface d'un lymphocyte B, de préférence de manière sélective. Le terme de manière sélective indique que la liaison au récepteur CD21 est plus affine que la liaison à d'autres marqueurs cellulaires, même si une telle liaison non-spécifique ne peut être totalement exclue. Le terme partie fonctionnelle désigne tout fragment d'une séquence définie ci-dessus, ou tout dérivé d'une telle séquence, conservant la faculté d'interagir de manière sélective avec un récepteur CD21. Le peptide de ciblage peut être introduit en différentes positions dans la fibre de l'adénovirus, soit en remplacement de séquences existantes, soit en supplément. De manière préférentielle, la séquence codant le peptide de ciblage est introduite à l'extrémité 3' du gène de la fibre (et le peptide de ciblage se trouve donc à l'extrémité C-terminale de la protéine de la fibre) ou dans la séquence de la boucle HI (la boucle HI étant comprise entre le 535ème et le 547ème résidu dans la séquence de la fibre de l'adénovirus de sérotype 5). Par ailleurs, le peptide de ciblage peut être lié directement à la protéine de la fibre, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'espacement. Une telle séquence est utilisée essentiellement lorsque le peptide de ciblage est introduit à l'extrémité Cterminale de la fibre. La séquence d'espacement n'affecte pas la fonctionnalité du peptide de ciblage et permet une meilleure flexibilité de celui-ci. A titre d'exemple, on peut citer notamment une séquence poly-lysine, (SG)i, dans laquelle i est un entier compris entre 1 et 7, etc. Une séquence d'espacement préférée est la séquence (Ser-Gly)5-Ser. Des constructions spécifiques selon l'invention sont des fibres modifiées à l'extrémité C-terminale par ajout d'un peptide de ciblage via une séquence d'espacement. La séquence de l'extrémité C-terminale de la fibre est par exemple la suivante : ---AQE-(SG)5-S-peptide de ciblage. Dans un mode de réalisation particulier, la fibre comporte en outre une (ou plusieurs) altération supplémentaire réduisant ou bloquant son interaction avec le récepteur CAR. De telles altérations peuvent comprendre par exemple des mutations dans la boucle DG du bouton de la fibre, ce qui n'altère pas la trimérisation mais réduit de manière significative l'interaction du virus avec son récepteur CAR (Kirby et al., 1999). Alternativement, le bouton de la fibre de l'adénovirus peut être remplacé par le domaine qui permet la trimérisation de la fibritine du bactériophage T4 (Krasnykh et al., 2001). Une autre altération possible consiste à remplacer le bouton de la fibre des sérotypes 2 et 5 (Had2, Had5) par le bouton de la fibre d'un adénovirus non Mastadenovirus. Une telle altération permet de restreindre le tropisme de l'adénovirus recombinant, et donc d'augmenter sa spécificité pour les lymphocytes B. Une telle spécificité est bien entendu particulièrement avantageuse pour une utilisation en thérapie génique car elle permet de réduire les doses à administrer. Ceci constitue un avantage important car l'adénovirus est très immunogène et peut induire une forte réaction immunitaire non désirable. Un tel échange a été effectué en utilisant le bouton de l'adénovirus BAV4 (Bovin AdenoVirus 4). Les virus ont été construits, amplifiés et purifiés et des premiers tests ont permis d'observer que l'adénovirus ainsi modifié infecte de manière réduite les cellules épithéliales humaines (d'un facteur 10-50). A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans une protéine de fibre d'adénovirus comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. Dans un mode préféré, la fibre comporte en outre une modification réduisant l'interaction avec le récepteur CAR. Un autre objet de l'invention réside dans un acide nucléique codant une protéine de fibre telle que définie ci-dessus. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, de préférence d'un ADN. Un autre objet de l'invention réside dans un vecteur comprenant un tel acide nucléique, ce vecteur pouvant être un plasmide, virus, phage, cosmide, etc. Les fibres modifiées peuvent être construites par génie génétique, selon des techniques connues de l'homme de l'art, comme par exemple par synthèse artificielle, clonage, ligation, clivage enzymatique, amplification, mutagénèse dirigée, jonction d'oligonucléotides, etc. Dans un mode de réalisation particulier, l'adénovirus selon l'invention est produit à partir d'un adénovirus de sérotype 2 ou 5. L'adénovirus recombinant comprenant la fibre modifiée peut être produit par différentes méthodes. Ainsi, le gène codant la fibre modifiée peut être introduit dans le génome adénoviral, ou introduit, sous forme intégrée ou extra-chromosomique, dans le génome de la cellule productrice des virus. Dans ce contexte, un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, comprenant (i) la construction d'un gène codant la fibre modifiée, en particulier codant la fibre dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21, (ii) l'introduction de ce gène dans un génome adénoviral, (iii) l'introduction du génome adénoviral dans une cellule d'encapsidation, (iv) l'amplification des virus et (v) la purification des virus produits. La cellule d'encapsidation utilisée peut être toute cellule permissive comportant ou exprimant les protéines adénovirales défectives du génome recombinant. Dans le cas d'un vecteur adénoviral défectif pour la région El, on utilise toute cellule exprimant la région El d'un adénovirus, comme les cellules 293, PER. C6, etc. Il est également possible d'utiliser des cellules co-transfectées avec un plasmide ou un virus helper apportant les fonctions nécessaires. Un autre objet de l'invention concerne une particule virale comprenant une fibre d'adénovirus telle que définie ci-dessus. Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans un lymphocyte B in vitro, ex vivo ou in vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des lymphocytes B avec un adénovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comportant une fibre modifiée comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant et un véhicule acceptable sur le plan pharmacologique. Le véhicule ou excipient peut être toute solution, suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique, comme notamment une solution isotonique, tamponnée, saline, etc. L'invention peut être utilisée pour le transfert et l'expression d'acides nucléiques d'intérêt dans les lymphocytes B, dans des approches expérimentales ou thérapeutiques. L'acide nucléique peut être un gène suicide, c'est-à-dire tout acide nucléique codant une protéine toxique pour la cellule, soit de manière directe, soit de manière conditionnelle (e. g., TK, cytosine désaminase, etc. ), un acide nucléique codant un facteur anti-tumoral, une cytokine, un antisens, un antigène, un marqueur, etc. (comme par exemple l'I12, 1112, l'ARN antisens anti bcr/abl). L'invention est utilisable dans le domaine thérapeutique, pour le traitement préventif ou curatif de pathologies impliquant ou affectant des lymphocytes B, comme des pathologies tumorales (leucémies, lymphomes, etc. ), des maladies immunitaires, inflammatoires, etc. D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures Figure 1 : de la dernière étape de construction des génomes viraux ayant un gène de fibre modifiée par recombinaison homologue chez E. coli (d'après Renaut, L et al, 2002). Figure 2 : navette permettant l'insertion des fibres modifiées par clonage moléculaire entre les sites MluI et Sali et la recombinaison homologue avec le vecteur pRECad. Figure 3 : du pRECad, sa digestion par SwaI libère le génome viral. Exemple 1. Construction de fibres chimériques comprenant un peptide de ciblage des lymphocytes B. 1. Sélection de peptides de ciblage Les peptides de ciblages choisis comprennent la séquence GEDPGFFNVE ou une partie fonctionnelle de celle-ci. Afin de vérifier que le peptide produit est capable de se fixer puis d'être intemalisé dans les lymphocytes B, son intemalisation dans différents types cellulaires a été testée, après marquage fluorescent des peptides par microscopie confocale. Les résultats obtenus démontrent que le peptide est capable de se fixer et d'être intemalisé dans les lymphocytes B. 2. Construction des gènes codant les fibres chimériques Afin d'effectuer les modifications de la fibre, le gène codant la fibre de l'adénovirus 2 (Had2) a été cloné dans le pBluescript-II-SK (Stratagene) entre les sites de restriction Notl et Sali. Une PCR a été effectuée sur le génome de l'Had2 avec les amorces 5'-AggAAAAAAgCggCCgCATgAAACgCgCCAgAC-3' en 5' et 5'AggAAAAAAggTCgACTTATATCgATTCCTgggCAATgTAg-3' en 3'. La deuxième amorce contient un site ClaI immédiatement avant le codon Stop. Les oligonucléotides 5'- CgggTTCAggATCCggAgAggATCCCgggTTTTTCAACgTTgAATgTTAACg-3' et 5'TCgACGTTAACATTCAACGTTGAAAAACCCGGGATCCTCTCCGGATCCTGAA CC-3' codant le peptide EBV court ont été introduits à l'extrémité 3' du gène de la fibre entre les sites ClaI et Sali. Une séquence d'espacement a également été introduite entre la séquence codant la fibre et celle codant le peptide EBV. Cette séquence permet de ne pas avoir d'encombrement et ainsi de garder une conformation optimale de la fibre et du peptide. L'extrémité C-terminale de la fibre a pour séquence AQE (SG)6EDPGFFNVEC. En ce qui concerne le peptide long, les amorces 5'AggAAAAAACgTCgACgTTAgAACgggAATTCgggAATTTCAACgTTgAAAAACC Cggg-3' et 5'-CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgAACCTCTAgTTACC-3' ont été utilisées. La première s'hybride avec l'extrémité 3' du gène de la fibre avec le peptide court et permet de rallonger ce dernier et la deuxième s'hybride au niveau du site MluI situé à 147 pb de l'extrémité 5'du gène de la fibre. Ce fragment de PCR a été cloné à la place du fragment MluI/SalI de la fibre sauvage clonée dans le pBs-sK. L'extrémité C-terminale de la fibre résultante a pour séquence AQE (SG)6EDPGFFNVEIPEFP. En ce qui concerne l'insertion des peptides au niveau de la boucle HI, des oligonucléotides ont été insérés dans un site SpeI situé à 1615 pb de l'extrémité 5' du gène de la fibre cloné dans le pBluescript-II-SK. Pour le peptide court, les oligonucléotides 5'-CTAgCggCgAAgATCCCgggTTTTTCAACgTTgAAATTC-3' et 5'CTAggAATTTCAACgTTgAAAAACCCgggATCTTCgCCg-3' ont été utilisés et pour le peptide long, les oligonucléotides 5'CTAgCggCgAAgATCCCgggTTTTTCAACgTTgAAATTCCCgAATTCC-3' et 5'CTAgggAATTCgggAATTTCAACgTTgAAAAACCCgggATCTTCgCCg-3' ont été utilisés. 3. Expression des Fibres chimériques et fonctionnalité Les gènes codant les fibres modifiées ont été transférés dans un plasmide qui contient en 5' du gène d'intérêt l'élément du bactériophage T7 permettant une transcription in vitro. Ainsi, afin de démontrer que les fibres modifiées sont capables de se trimériser, des synthèses in vitro ont été effectuées avec le kit de transcription/traduction in vitro de Promega et leurs produits séparés sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Exemple 2. Construction et Production d'adénovirus recombinant comportant une fibre chimérique comprenant un peptide de ciblage des lymphocytes B, et fonctionnalité Les gènes codant les fibres modifiées ont ensuite été clonés dans un vecteur navette pour permettre leur introduction dans un génome viral préalablement construit (Renaut et al., 2002b), à la place du gène codant la fibre sauvage. Cette étape a été effectuée par recombinaison homologue chez E. coli (Chartier et al., 1996). Le vecteur navette utilisé contient 5502 pb de l'extrémité droite du génome de l'Had5 qui ont été amplifiées avec les amorces 5'-TTgTATAAAAAgCgCggCCgCAACTACCTTGCCTACCACTC-3' qui s'hybride à 25690 pb dans le génome viral et l'amorce 5'TTgTATAAAAAgCgTCgACCCTCCCgTgTgTgACTCgCAg-3' qui s'hybride à 34322 pb dans ce même génome. Ce fragment a été amplifié à partir du pBHGl 1 (Graham et al., 1989) qui est un plasmide contenant tout le génome de l'Had5, dans la partie qui nous intéresse, un fragment de 3130 pb contenant la région E3 compris entre 27865 pb et 30995 pb avait été délété. Ce fragment a été cloné entre les sites NotI et XhoI dans le pBS-SK, et un site MluI, absent dans la fibre de l'Had5, a été ajouté avec les amorces complémentaires 5'CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgAACCTCTAgTTACC-3' et 5'ggTAACTAgAggTTCggATACgCgTAAAgAgAgTACCCCAggggg-3'. De même un site Sali a été inséré par mutagénèse à l'extrémité 3' du gène de la fibre, en amont du site d'addition du polyA de la région L5 à l'aide des amorces 5'- CTTACACTTTTTCATACATTgTCgACgAATAAAgAATCgTTTgTgTTATg-3' et 5'CATAACACAAACgATTCTTTATTCgTCgACAATgTATgAAAAAgTgTAAg-3'. A ce stade, les différents gènes codant les fibres modifiées ont été clonés dans le vecteur navette à la place du gène codant la fibre sauvage par MluI/SalI. Après une étape de recombinaison homologue chez E. coli, nous avons obtenu les génomes recombinants portant les gènes codant les fibres modifiées (figurel). Après digestion par SwaI, libérant ainsi des plasmides les génomes viraux, ceux-ci ont été introduits dans des cellules HEK293 (Graham et al., 1977) par lipofection. Ces cellules permettent la production de virus recombinants car elles expriment El ce qui permet une transcomplémentation puisque ce gène est délété dans les génomes des virus précédemment obtenus. Un adénovirus recombinant a ainsi été construit et produit. Les protéines apicales de la capside sont des fibres de l'Had2 avec, à leur extrémité C-terminale, le peptide de ciblage. Ce virus a été produit avec un titre équivalent à celui du virus portant la fibre sauvage (virus témoin), et, il infecte les cellules épithéliales avec la même efficacité que le virus témoin. Ces résultats démontrent que le fait d'avoir ajouté ce peptide ne gêne ni l'assemblage du virus, ni son trafic intracellulaire qui est important pour le transport de l'ADN viral et par conséquent du gène d'intérêt au noyau. Bibliographie Bergelson J. M., Cunningham J. A., Droguett G., Kurt-Jones E. A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M. S., Crowell R. L., and Finberg R. W., 1997. Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science 275, 1320-1323. Biermann V., Volpers C., Hussmann S., Stock A., Kewes H., Schiedner G., Herrmann A., and Kochanek S., 2001. Targeting of high-capacity adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12,1757-1769. Chartier C., Degryse E., Gantzer M., Dieterle A., Pavirani A., and Mehtali M., 1996. Efficient génération of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810. Cripe T. P., Dunphy E.J., Holub A. D., Saini A., Vasi N. H., Mahller Y. Y., Collins M.H., Snyder J. D., Krasnykh V., Curiel D. T., Wickham T. J., DeGregori J., Bergelson J.M., and Currier M.A., 2001. Fiber knob modifications overcome low, heterogeneous expression of the coxsackievirus-adenovirus receptor that limits adenovirus gene transfer and oncolysis for human rhabdomyosarcoma cells. Cancer Res. 61,2953-2960. Goldman C. K., Rogers B. E., Douglas J. T., Sosnowski B. A., Ying W., Siegal G.P., Baird A., Campain J.A., and Curiel D. T., 1997. Targeted gene delivery to Kaposi's sarcoma cells via the fibroblast growth factor receptor. Cancer Res. 57, 1447-1451. Graham F. L., Rudy J., and Brinkley P., 1989. Infectious circular DNA of human adenovirus type 5: régénération of viral DNA termini from molecules lacking terminal séquences. EMBO J. 8, 2077-2085. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., and Naim R., 1977. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-74. Grill J., Van Beusechem V. W., Van D., V, Dirven C.M., Leonhart A., Pherai D.S., Haisma H. J., Pinedo H. M., Curiel D. T., and Gerritsen W. R., 2001. Combined targeting of adenoviruses to integrins and epidermal growth factor receptors increases gene transfer into primary glioma cells and spheroids. Clin. Cancer Res. 7, 641-650. Haisma H. J., Pinedo H.M., vanRijswijk A., vanderMuelenMuileman I. , Sosnowski B. A., Ying W., vanBeusechem V. W., Tillman B. W., Gerritsen W. R., and Curiel D.T., 1999. Tumor-specific gene transfer via an adenoviral vector targeted to the pan- carcinoma antigen EpCAM. Gene Therapy. 6, 1469- 1474. Hong J.S. and Engler J. A., 1996. Domains required for assembly of adenovirus type 2 fiber trimers. J. Viral. 70, 7071-7078. Kasono K., Blackwell J. L., Douglas J. T., Dmitriev L, Strong T.V., Reynolds P., Kropf D. A., Carroll W. R., Peters G. E., Bucy R. P., Curiel D. T., and Krasnykh V., 1999. Selective gene delivery to head and neck cancer cells via an integrin targeted adenoviral vector. Clin. Cancer Res. 5, 2571-2579. Kelly F. J., Miller C. R., Buchsbaum D.J., Gomez-Navarro J., Bames M. N., Alvarez R. D., and Curiel D. T., 2000. Selectivity of TAG-72-targeted adenovirus gene transfer to primary ovarian carcinoma cells versus autologous mesothelial cells in vitro. Clin. Cancer Res. 6, 4323-4333. Kirby L, Davison E., Beavil A. J., Soh C. P.C., Wickham T. J., Roelvink P. W., Kovesdi I., Sutton B.J., and Santis G., 1999. Mutations in the DG loop of adenovirus type 5 fiber knob protein abolish high-affinity binding to its cellular receptor CAR. J. Viral. 73,9508-9514. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., and Curiel D.T., 2001. Genetic targeting of an adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin. J. Viral. 75, 4176-4183. Lambris J. D., Ganu V. S., Hirani S., and Muller-Eberhard H. J., 1985. Mapping of the C3d receptor (CR2) -binding site and a neoantigenic site in the C3d domain of the third component of complement. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82,4235-4239. Louis N., Fender P., Barge A., Kitts P., and Chroboczek J., 1994. Cell-binding domain of adenovirus serotype 2 fiber. J. Viral. 68,4104-4106. Nakamura T., Sato K., and Hamada H., 2002. Effective gene transfer to human melanomas via integrin-targeted adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13, 613-626. Nemerow G. R., Houghten R. A., Moore M. D., and Cooper N.R., 1989. Identification of an epitope in the major envelope protein of Epstein- Barr virus that mediates viral binding to the B lymphocyte EBV receptor (CR2). Cell 56, 369-377. Nemerow G. R., Mold C., Schwend V. K., Tollefson V., and Cooper N.R., 1987. Identification of gp350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein-Barr virus (EBV) to the EBV/C3d receptor of B cells : séquence homology of gp350 and C3 complement fragment C3d. J. Viral. 61,1416-1420. Renaut L., Bernard C., and D'Halluin J.C., 2002b. A rapid and easy method for production and selection ofrecombinant adenovirus genomes. J. Vira!. Methods 100, 121-131. Renaut L., Bernard C., and DHalluin J. C., 2002a. A rapid and easy method for production and selection of recombinant adenovirus genomes. J. Viral. Meth. 100,121- 131. Schneider H., Groves M., Muhle C., Reynolds P. N., Knight A., Themis M., Carvajal J., Scaravilli F., Curiel D.T., Fairweather N.F., and Coutelle C., 2000. Retargeting of adenoviral vectors to neurons using the H-c fragment of tetanus toxin. Gene Therapy. 7, 1584- 1592. Tanner J., Weis J., Fearon D., Whang Y., and Kieff E., 1987. Epstein-Barr virus gp350/220 binding to the B lymphocyte C3d receptor mediates adsorption, capping, and endocytosis. Cell 50, 203-213. Vanderkwaak T. J., Wang M., Gomez-Navarro J., Rancourt C., Dmitriev L, Krasnykh V., Barnes M., Siegal G. P., Alvarez R., and Curiel D. T., 1999. An advanced génération of adenoviral vectors selectively enhances gene transfer for ovarian cancer gene therapy approaches. Gynecol. Oncol. 74,227-234. Watkins S. J., Mesyanzhinov V. V., Kurochkina L. P., and Hawkins R.E. , 1997. The 'adenobody' approach to viral targeting: specific and enhanced adenoviral gene delivery. Gene Therapy. 4,1004-1012. Wickham T. J., Tzeng E., Shears L. L., Roelvink P. W., Li Y., Lee G. M., Brough D.E., Lizonova A., and Kovesdi L, 1997. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. J. Virol. 71,8221-8229. Yoon S. K., Mohr L., ORiordan C. R., Lachapelle A., Armentano D., and Wands J.R., 2000. Targeting a recombinant adenovirus vector to HCC cells using a bifunctional Fab-antibody conjugate. Biochem. Biophys. Res. Commun. 272, 497-504. REVENDICATIONS 1. Adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. 2. Adénovirus selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide de ciblage comprend la séquence GEDPGFFNVE, GEDPGFFNVEIP ou GEDPGFFNVEIPEFP, ou une partie fonctionnelle de celle-ci. 3. Adénovirus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide de ciblage est introduit à l'extrémité C-terminale de la fibre ou dans la séquence de la boucle HI. 4. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le peptide de ciblage est lié directement à la protéine de la fibre, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'espacement. 5. Adénovirus selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence d'espacement comprend une séquence d'acides aminés (SG)j dans laquelle i est un entier compris entre 1 et 7. 6. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fibre comporte en outre une (ou plusieurs) altération supplémentaire du bouton de la fibre réduisant ou bloquant son interaction avec le récepteur CAR. 7. Adénovirus selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'altération supplémentaire est choisie parmi une mutation dans la boucle DG du bouton de la fibre, le remplacement du bouton de la fibre par le domaine qui permet la trimérisation de la fibritine du bactériophage T4 et le remplacement du bouton de la fibre par le bouton de la fibre d'un adénovirus non Mastadenovirus. 8. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte un génome adénoviral recombinant comprenant deux régions terminales ITR, une séquence d'encapsidation (#) et une séquence d'ADN d'intérêt, dont le transfert ou l'expression dans un hôte déterminé est souhaité. 9. Adénovirus selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte un génome adénoviral défectif pour la région El. 10. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit à partir d'un adénovirus de sérotype 2 ou 5. 11. Procédé de production d'un adénovirus recombinant selon l'une des revendication 1 à 10, comprenant (i) la construction d'un gène codant la fibre dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21, (ii) l'introduction de ce gène dans un génome adénoviral, (iii) l'introduction du génome adénoviral dans une cellule d'encapsidation, (iv) l'amplification du virus et (v) la purification des virus produits. 12. Protéine de fibre d'adénovirus, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. 13. Protéine selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une modification du bouton de la fibre réduisant l'interaction avec le récepteur CAR. 14. Acide nucléique codant une protéine de fibre selon la revendication 12 ou 13. 15. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 14. 16. Méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans un lymphocyte B in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des lymphocytes B avec un adénovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comportant une fibre modifiée comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. 17. Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 10 et un véhicule acceptable sur le plan pharmacologique. 18. Utilisation d'un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 10 pour la préparation d'une composition destinée au transfert de gènes dans les lymphocytes B.