FR 2841474 A1 20040102 FR 0207959 A 20020626 I PROCEDE D'INACTIVATION DE MICROORGANISMES PAR APPLICATION DE HAUTES PRESSIONS L'invention concerne un procédé d'inactivation de microorganismes par application de hautes pressions à des produits, en particulier des produits pharmaceutiques. Les effets de la haute pression sur les microorganismes sont bien connus de l'homme du métier et cette technique de stérilisation est appliquée dans de nombreux domaines, notamment alimentaires, pharmaceutiques et médicaux. On a montré que des pressions de 300 MPa ou plus permettent de détruire ou d'inactiver des virus, des levures, des moisissures et des bactéries. Les formes bactériennes sporulées se montrent toutefois très résistantes à la chaleur, à la pression et à l'irradiation. Il a été constaté que l'on pouvait inactiver les spores bactériennes par une application combinée et continue de la chaleur et de la haute pression, par exemple pendant 3 heures à 600C sous une pression de 200 MPa. On a également proposé des traitements comprenant des cycles de pressurisation, avec une première phase à pression moyenne et à température moyenne et une seconde phase à pression élevée, qui sont répétés pendant des durées de quelques heures. La première phase à pression moyenne et température moyenne, par exemple 60 MPa et 50 C, induit une germination des spores qui les rend plus sensibles aux hautes pressions. Les travaux réalisés, décrits par exemple dans l'article " Inactivation des spores bactériennes par les hautes pressions hydrostatiques " de H. Delacour, C. Cléry, P. Masson et D. R. Vidal, Ann. Pharm. FR 2002, 60, pages 38 - 43, montrent également que l'élévation de la température, par exemple à 60 - 800C, favorise l'inactivation des spores bactériennes par les hautes pressions qui sont par exemple de 500 MPa, de très bons résultats étant obtenus avec des cycles de pressurisation de MPa et 500 MPa à une température de 50 ou 700C. Un inconvénient de cette technique est qu'elle ne peut être appliquée à des produits pharmaceutiques ou médicamenteux qui sont en général sensibles à la chaleur et dont les principes actifs seraient détruits en totalité ou en majeure partie par une exposition à des températures supérieures ou égales à 50'C environ. L'invention a notamment pour but d'apporter une solution simple, efficace et économique à ce problème. Elle propose, à cet effet, un procédé d'inactivation de microorganismes par application de hautes pressions à des produits, en particulier des produits pharmaceutiques, consistant à soumettre ces produits à des cycles répétés comprenant une première phase à pression moyenne et température moyenne et une seconde phase à pression élevée, caractérisé en ce que la première phase est réalisée à une température inférieure à 450C environ. De préférence, la température de la première phase est comprise entre 30 et 400C environ et, de façon encore plus préférée, cette température est de 370C environ. La pression appliquée aux microorganismes pendant cette première phase est comprise entre 1 et 50 MPa environ et, de façon préférée, entre 10 et 30 MPa environ. Cette gamme de températures et de pressions de la première phase du traitement cyclique de pressurisation favorise au mieux la germination des spores bactériennes et leur inactivation par exposition aux hautes pressions appliquées pendant la seconde phase. Des essais ont permis de constater que l'efficacité destructrice de ce traitement, définie par le logarithme à base 10 du rapport des nombres de microorganismes viables dans le produit avant traitement et après traitement respectivement, pouvait atteindre des valeurs très élevées compatibles avec les valeurs requises par la Pharmacopée. Contrairement à ce qui ressort des travaux antérieurs publiés sur ce sujet, il est, de façon surprenante, plus efficace que la température de la première phase du traitement cyclique de pressurisation soit réglée entre 35 et 400C environ alors que la technique connue prévoit des températures supérieures à 50 ou 60'C, la sélection de cette gamme de températures selon l'invention permettant d'inactiver de façon très satisfaisante les microorganismes et spores bactériennes d'un produit pharmaceutique ou médicamenteux sans modifier de façon sensible les principes actifs contenus dans ces produits. Selon d'autres caractéristiques de l'invention - la durée de la première phase est comprise entre 1 et 10 minutes environ et est de préférence d'environ 5 minutes, - la pression de la seconde phase est comprise entre 300 et 600 MPa environ et est de préférence de l'ordre de 500 MPa, - la durée de la seconde phase est sensiblement égale à celle de la première phase, - le nombre de cycles du traitement est compris entre 25 et 35 environ et est de préférence au moins égal à 30. Un tel traitement appliqué à la variété sporulée de Bacillus subtiles permet d'obtenir une efficacité destructrice de ce microorganisme supérieure à 6 dans l'échelle logarithmique à base 10. Les formes sporulées de Bacillus subtiles sont parmi les plus résistantes à ce type de traitement et peuvent servir de référence pour la vérification de l'efficacité d'un traitement de stérilisation, comme indiqué dans la note intitulée " Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies - High pressure processing " US Food and Drug Administration, Center of Food Safety and Applied Nutrition, Juin 2000. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels: - La Figure 1 représente schématiquement une courbe de survie des spores de Bacillus subtiles en fonction du nombre de cycles du traitement selon l'invention; - La Figure 2 représente des courbes de survie des spores de Bacillus subtiles après traitement selon l'invention et après un traitement du même type dont la première phase est réalisée à pression ambiante; - La Figure 3 représente également des courbes de survie des spores de Bacillus subtiles après des traitements cycliques dans lesquels on a modifié la durée et la pression de la première phase. L'efficacité du traitement selon l'invention a été vérifiée sur des spores de Bacillus subtiles en suspension dans un milieu liquide tel que de l'eau ou du tryptone sel. Le traitement selon l'invention comprenait une première phase d'application d'une pression de 20 MPa pendant une durée de 5 minutes à une température de 370C, cette première phase étant destinée à provoquer une germination des spores bactériennes. Cette première phase était répétée en alternance avec une seconde phase d'application d'une pression de 500 MPa pendant une durée de 5 minutes à une température de 370C, le nombre de cycles du traitement étant désigné par n. La Courbe I dans la Figure 1 représente l'efficacité destructrice définie par le logarithme à base 10 du rapport du nombre No de spores viables dans la suspension avant traitement et du nombre N de spores viables dans la suspension après traitement, en fonction du nombre de cycles n. On voit en Figure 1 que cette efficacité est voisine de 5 après 15 cycles et qu'elle atteint la valeur de 6,5 après 30 cycles. La valeur de 6,5 obtenue après 30 cycles de traitement à 370C est remarquablement élevée et est comparable aux meilleurs résultats obtenus dans la technique antérieure par exécution d'un traitement à des températures supérieures à 50'C, qui aurait pour effet de détruire complètement ou au moins en majeure partie les principes actifs de produits pharmaceutiques ou médicamenteux. La résistance élevée des spores de Bacillus subtiles au traitement par des hautes pressions et l'intérêt du traitement selon l'invention peuvent être bien appréciés si l'on rappelle que lorsqu'on soumet des spores de Bacillus subtiles en suspension à une pression de 500 Mpa pendant 6 heures à température ambiante, l'efficacité destructrice mesurée de ce traitement est inférieure à 1. En Figure 2, la Courbe I est identique à celle de la Figure 1 et la Courbe Il représente l'efficacité destructrice d'une variante du traitement selon l'invention, dans laquelle la première phase est réalisée à pression ambiante, les autres conditions de température, de pression et de durée n'étant pas modifiées. Le traitement de la Courbe Il comprend donc une première phase de germination à pression ambiante à une température de 370C pendant une durée de 5 minutes, alternant avec une seconde phase d'application d'une pression de 500 MPa à une température de 370C pendant 5 minutes. On voit qu'après 30 cycles, l'efficacité destructrice est de 5,4 environ et est donc inférieure à celle obtenue après le traitement correspondant à la Courbe I. Les courbes de la Figure 3 représentent les efficacités destructrices en fonction du nombre de cycles n, de variantes du traitement selon l'invention dans lesquelles: - la température des deux phases est de 280C (Courbe 1il), - la durée de la première phase est de 15 minutes et la température de 280C (Courbe IV), - la pression de la première phase est de 120 MPa et la température de 280C (Courbe V), les autres conditions étant les mêmes que celles du traitement correspondant à la Courbe I. On voit en Figure 3 que la diminution de la température se traduit par une diminution de l'efficacité destructrice, que l'augmentation de la durée de la première phase se traduit par une nouvelle diminution de cette efficacité destructrice, et que l'augmentation de la pression de la première phase a également un effet négatif sur l'efficacité destructrice. Les essais qui ont permis de tracer les courbes des Figures 1 à 3 ont été réalisés avec un appareillage du type décrit dans l'article " High Hydrostatic Pressure (HHP): An Alternative Method of Sterilization and Decontamination of Fragile Drugs? " de Rigaldie et ai., publié dans European Journal of Parenteral Sciences 2001, 6 (3), pages 73 à 77. D'autres essais ont permis de vérifier que le-traitement selon l'invention n'altérait pas de façon sensible les principes actifs des produits io pharmaceutiques ou médicamenteux. En particulier, on a soumis de l'insuline à un traitement correspondant à la Courbe 1, comprenant une première phase à une pression de 20 MPa, d'une durée de 5 minutes à une température de 370C et une seconde phase à une pression de 500 MPa d'une durée de 5 minutes à la température de 370C, le nombre de cycles du traitement étant de 30. L'intégrité physico- chimique de l'insuline avant et après traitement a été mesurée sur un appareil de chromotographie liquide (HPLC) équipé d'un détecteur à ultra- violet. Après 6 heures de traitement (30 cycles de pressurisationdépressurisation de 5 minutes chacun), la teneur en insuline de la solution était diminuée de 2%. L'efficacité destructrice du traitement sur des spores de Baccillus subtilis contenues dans la solution traitée a été de 6,5. Des essais analogues ont été réalisés sur une solution d'héparine dont l'intégrité physico-chimique a été mesurée avant et après traitement par électrophorèse capillaire. Les mesures effectuées sur l'héparine ne permettent pas de mettre en évidence une modification de sa structure physico-chimique à la suite du traitement. L'efficacité destructrice mesurée sur les spores de Baccilus subtilis contenues dans la solution d'héparine a été de 6,62. A titre de comparaison, lorsque ces solutions d'insuline et d'héparine sont soumises à un traitement de stérilisation par un autoclavage de 20 minutes à 1200C, l'insuline est détruite à 98% et l'héparine est totalement détruite. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'inactivation de microorganismes par application de hautes pressions à des produits, en particulier pharmaceutiques, consistant à soumettre ces produits à des cycles répétés comprenant une première phase à pression moyenne et température moyenne et une seconde phase à pression élevée, caractérisé en ce que la première phase est réalisée à une température inférieure à 450C environ. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température de la première phase est comprise entre 30 et 400C environ. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la température de la première phase est de 370C environ. 4/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les températures des deux phases sont identiques ou sensiblement identiques. / Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la pression de la première phase est comprise entre 1 et 50 MPa environ. 6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la pression de la première phase est comprise entre et 30 MPa environ. 7/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de la première phase est comprise entre 1 et 10 minutes environ. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la durée de la première phase est d'environ 5 minutes. 9/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la pression de la seconde phase est comprise entre 300 et 600 MPa environ. / Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la pression de la seconde phase est de 500 MPa environ. 11/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de la seconde phase est comprise entre 1 et 10 minutes environ. 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la durée de la seconde phase est de 5 minutes environ. 13/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de cycles auxquels sont soumis les produits est compris entre 25 et 35 environ. 14/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de cycles auxquels sont soumis les produits est de 30 environ.