FR 2834561 A1 20030711 FR 0200183 A 20020109 Procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment des liquides alimentaires La présente invention concerne un procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment des liquides alimentaires, tels que des boissons, contenant au moins un sucre fermentescible et/ou de l'éthanol. La détection d'eau ajoutée dans les jus de fruits et les vins se fait actuellement par analyse du rapport 180/160 de l'eau. En effet, ce rapport est plus élevé dans l'eau des plantes que dans l'eau de distribution, et une dilution entraîne un abaissement de ce rapport. La méthode d'analyse principale de ce paramètre par équilibration de l'eau avec du CO2 et analyse du gaz ainsi obtenu en Spectrométrie de Masse de Rapports Isotopiques (SMRI) a été publiée il y a plusieurs années et est devenue une méthode officielle du C. E. N. (Comité Européen de Normalisation) pour détecter la dilution des jus de fruits et de légumes. Des limites d'authenticité ont été définies pour les principaux fruits dans le code de pratique de l'A. I. J. N. (Association européenne des Industriels producteurs de Jus et de Nectars de fruits et de légumes). Cette même méthode a été adoptée dans le domaine des vins par l'O. I. V. (Organisation Internationale de la Vigne et du vin) et la Communauté Européenne (Resolution ENO 2/96-Watering : detection method. Bulletin de l'OIV, 1997. EC regulation nO 822/97, Official Journal of the European Community, 6/05/97). L'inconvénient de l'utilisation de ce seul paramètre est que la variabilité naturelle des valeurs observées dans les jus de fruits est importante et, par conséquent la limite de détection dépend en grande partie du rapport 180j160 initial de l'eau des fruits avant dilution : plus ce rapport initial est élevé et plus la quantité d'eau ajoutée non-détectable est importante. Des travaux récents (Houerou G., Kelly S. D., Dennis M. J., Determination of the Oxygen 18/Oxygen 16 isotope ratios of sugar citric acid and water from single strength orange juice. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 13,1257- 1262 (1999) ) ont montré l'intérêt d'utiliser en complément du paramètre ci-dessus les sucres de jus de fruit comme référence interne. Les auteurs ont montré que le rapport 180/160 des sucres est corrélé à celui de l'eau dans des jus d'orange authentiques et qu'un ajout d'eau exogène fait dévier significativement les résultats par rapport à cette corrélation, bien avant que l'on sorte des limites définies pour l'eau seule. Suite à une simulation mathématique, ils indiquent que 100 % des ajouts supérieurs ou égaux à 40 % d'eau exogène pourraient être détectés en utilisant cette nouvelle approche, alors que seulement 27 % des cas seraient détectés en utilisant uniquement l'analyse de l'eau. Toutefois, la mesure du rapport 180/160 des sucres est difficile à maîtriser de façon reproductible, principalement en raison de la difficulté à les isoler sous forme anhydre. Cette étape de lyophilisation est relativement aisée pour du saccharose pur, mais il est beaucoup plus difficile d'éliminer complètement l'eau dans le cas du glucose et surtout du fructose qui sont les deux autres sucres majeurs des fruits. Or, le fructose est souvent le sucre prédominant et le saccharose est absent chez un nombre significatif de fruits, ce qui réduit le champ d'application de la méthode. De plus, dans les fruits qui en contiennent, l'inversion du saccharose en monomères (glucose + fructose) induit un fractionnement isotopique, et il est donc impératif d'éviter cette réaction d'hydrolyse qui a tendance à se produire spontanément en milieu acide. En outre, il est difficile d'obtenir des conditions opératoires reproductibles, ce qui induit une dispersion importante des résultats entre laboratoires et même entre séries de mesures à l'intérieur d'un même laboratoire. Enfin, la préparation des échantillons (extraction de la fraction"sucres", séparation éventuelle des composés individuels, lyophilisation et manipulation ultérieure de ces composés hydroscopiques) est longue et fastidieuse, et n'a pas encore fait l'objet d'une méthode officielle. Un but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment des liquides alimentaires dont la mise en oeuvre permet l'obtention de résultats fiables et reproductibles. Un autre but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment dans des liquides alimentaires permettant de distinguer des purs jus et des jus à base de concentré. Un autre but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits dont la conception permet d'élargir le champ de produits analysables en s'appliquant notamment au lait et aux boissons alcoolisées, telles que le vin, à des produits animaux ou végétaux à usage alimentaire, pharmaceutique ou autre. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment dans des liquides alimentaires, tels que des boissons, contenant au moins un sucre fermentescible et/ou de l'éthanol, caractérisé en ce qu'on détermine, par spectrométrie de masse de rapports isotopiques, le rapport 1BO/160 de l'eau dit Reau18O/16O de l'échantillon, en ce qu'on détermine, par spectrométrie de masse de rapports isotopiques, le rapport 18O/16O dit Reth18O/16O de l'éthanol directement contenu dans l'échantillon ou obtenu par fermentation complète des sucres de l'échantillon en éthanol, en ce qu'on compare lesdits rapports Reau1BOj160 et RethO/160 ou les déviations isotopiques beau130 (0/00) de l'eau et #eth18O ( /oo) de l'éthanol calculées à partir desdits rapports pour vérifier respectivement l'équation (1) ou l'équation (2) : aReth1BO/160+b- : E E, ou òeau1BO (0/0) d'améliorer la détection d'eau ajoutée permet la mise en oeuvre d'un procédé aux résultats fiables et reproductibles applicable à un grand nombre de produits. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence à la figure unique qui représente le graphe de résultats obtenus à partir d'échantillons authentiques de jus d'oranges pressées en laboratoire, de jus d'oranges à base de concentrés et de pur jus d'orange. Comme mentionné ci-dessus, le procédé s'applique à tous les produits, notamment les liquides alimentaires contenant au moins un sucre fermentescible et/ou de l'éthanol. A titre d'exemple, il peut être cité les jus de fruits, le lait, les boissons alcoolisées, etc. Ce procédé comporte au moins une étape de détermination par spectrométrie de masse de rapports isotopiques du rapport 180p60 de l'eau, dit Reau180/160 de l'échantillon. Cette analyse du rapport 180p60 de l'eau peut s'effectuer notamment après préparation de l'échantillon par application de la méthode dite d'équilibration. Cette méthode, pour déterminer la valeur de la déviation 180 inclut la mise sous vide de petits flacons contenant l'échantillon, la mise en contact des échantillons aqueux avec un espace de tête de dioxyde de carbone et l'établissement d'un équilibre (ou équilibration) entre l'isotope 180 de l'eau, le dioxyde de carbone CO2 et l'acide carbonique H2C03. Du fait que la déviation isotopique 8180 ( /oo) de l'oxygène dans le CO2 ajouté à l'espace de tête est précisément connue, le rapport isotopique de l'eau de l'échantillon peut être calculé en mesurant le changement de la déviation isotopique 8180 ( /oo) du CO2 en espace de tête après équilibration. Un gaz de référence (C02 bouteille) est utilisé pour mesurer par comparaison le COs dans l'espace de tête équilibré. Ce gaz de référence est calibré par rapport au V. S. M. O. W. (Vienna Standard Mean Ocean Water). La déviation isotopique 6180 (0/00) de l'eau dite SeauO ( /oo) de l'échantillon est exprimée par rapport au standard international V. S. M. O. W. en utilisant la formule suivante ReauO/0-RvsMOW 0/0 SeauO ( /oo) ==--------------------x 1000 R 0 0 Le détail de cette méthode d'équilibration, bien connue à ceux versés dans cet art, est fourni par les documents suivants : 1. ENV 12141 Fruit and vegetable juices-Determination of the stable oxygen isotope ratio (180/160) of water from fruit juices-Method using Mass Spectrometry. October 1996. 2. Resolution ENO 2/96 - Watering : detection method. Bulletin de l'OIV, 1997. 3. EC regulation nO 822/97, Official Journal of the European Community, 6/05/97. D'autres méthodes auraient pu être mises en oeuvre pour mesurer le rapport isotopique 180p60 de l'eau. Ainsi, il aurait pu être procédé à une pyrolyse de l'eau contenue dans l'échantillon en vue de transformer cette eau en monoxyde de carbone avant de procéder à une mesure du monoxyde de carbone par spectrométrie de masse. Le procédé, objet de l'invention, comporte encore une étape de détermination, par spectrométrie de masse de rapports isotopiques, du rapport 180/160 dit Reth180/160 de l'éthanol. L'éthanol analysé peut être l'éthanol contenu dans l'échantillon (cas des vins secs). Dans le cas de sucres fermentescibles présents dans l'échantillon, on transforme par fermentation notamment à l'aide d'enzymes préalablement sélectionnées, de levures ou d'autres micro-organismes, ces sucres fermentescibles en éthanol. Bien évidemment, les micro-organismes utilisés sont sélectionnés pour éviter un fractionnement isotopique. La procédure employée pour la fermentation des sucres en éthanol est celle décrite pour l'application de la méthode SNIF-NMR (marque déposée) aux jus de fruits dans la publication AOAC Official Method 995. 17, Beet sugar in Fruit Juices, Site-Specific Natural Isotopic Fractionation-Nuclear Magnetic Resonance (SNIFNMR (marque déposée)) method, In AOAC Official Methods of analysis ; Patricia Cunniff (Ed.) ; AOAC international : Maryland, USA, 1996. L'éthanol, issu de la fermentation des sucres de l'échantillon ou directement contenu dans l'échantillon, est ensuite isolé par distillation à haut rendement pour éviter tout fractionnement isotopique. A nouveau, la procédure employée est celle décrite pour l'application de la méthode SNIF-NMR (marque déposée) aux jus de fruits, comme le précise le document précité. On élimine ensuite, par exemple sur tamis moléculaire, l'eau du distillat. Le tamis moléculaire utilisé est de type 3 angströms, en ce qui concerne les pores, le diamètre des billes étant de 2 mm. Pour cette étape, on procède comme suit : dans une fiole de 15 ml de diamètre 2,5 cm, on introduit du tamis moléculaire sur environ 1/3 de la hauteur. On verse le distillat obtenu lors de l'étape précédente jusqu'à ce qu'il couvre la surface de tamis et de telle sorte qu'il ne dépasse pas cette surface de plus de 2 mm. On laisse reposer ensuite 24 heures. Il peut alors être procédé à la détermination par spectrométrie de masse du rapport 180/160 de l'éthanol. La procédure utilisée pour cette mesure est similaire à celle décrite par Houerou G., Kelly S. D., Dennis M. J., Determination of the Oxygen 18/Oxygen 16 isotope ratios of sugar citric acid and water from single strength orange juice. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 13,1257-1262 (1999). Les échantillons sont sertis dans des capsules en argent. Un analyseur élémentaire pyrolyse l'éthanol en monoxyde de carbone (CO) à une température de 1060 C. Le monoxyde de carbone produit est entraîné par un flux d'hélium vers le spectromètre de masse qui permet de mesurer le rapport 180/160 à partir des masses 28 et 30 correspondant aux différentes formes isotopiques CO et CO. A nouveau, les résultats obtenus sont fournis sous forme de déviations isotopiques de l'échantillon et sont exprimés sur une échelle relative par rapport à une référence internationale, le V. S. M. O. W. La déviation isotopique de l'éthanol peut ainsi être exprimée comme suit : Reth O/0-RVSMOW 180/160 x 1000 SethO ( /oo) =---------------------x 1000 R 0 0 La méthode de calibration utilisée consiste en une pyrolyse du V. S. M. O. W. Pour permettre l'interprétation des résultats, plusieurs méthodes peuvent être appliquées. Une première méthode consiste à mémoriser dans une base de données, pour chaque échantillon authentique du type et éventuellement de l'origine du produit à analyser, le rapport isotopique de l'éthanol ou respectivement la déviation isotopique de l'éthanol, d'autre part le rapport isotopique de l'eau ou respectivement la déviation isotopique de l'eau, à déterminer par calcul l'équation (1) ou l'équation (2) et à vérifier l'équation (1) ou l'équation (2) à partir des données obtenues à partir du produit à analyser. Une autre méthode consiste, pour vérifier l'équation, à reporter sur un graphique, représentant en abscisse le rapport isotopique de l'éthanol ou respectivement la déviation isotopique de l'éthanol et en ordonnée le rapport isotopique de l'eau ou respectivement la déviation isotopique de l'eau, le point obtenu à partir des mesures de rapports isotopiques et éventuellement du calcul des déviations isotopiques du produit à analyser, à comparer le positionnement du point par rapport à une zone de confiance établie sur le graphique selon des critères statistiques par rapport à des échantillons authentiques correspondant au type et éventuellement à l'origine du produit à analyser et à conclure à un ajout d'eau exogène si le point est significativement en dessous de la zone. Un graphique obtenu à partir de différents échantillons est représenté à la figure unique. Dans cette figure, la droite tracée ou droite de régression représente les résultats obtenus à partir d'échantillons authentiques d'oranges de différentes origines pressées en laboratoire, les résultats obtenus à partir de chacun des échantillons étant représentés à chaque fois par un point. Une zone de confiance est ensuite établie par application d'une méthode mathématique statistique consistant en un calcul d'un intervalle de confiance à 95 % autour de la droite de régression. Cette méthode de calcul comporte un calcul de l'écart type s des écarts entre y estimé par le modèle et y observé ("erreur moyenne") et une définition de limites telles que y = ax + b +/-2s ou y = ax + b'+/-2s, 2s correspondant à E ou El des équations (1) ou (2). A partir des exemples d'échantillons retenus, la régression linéaire obtenue peut s'exprimer tel que suit : y = 0,8297 x-20, 938 2.1, 138 avec un coefficient de corrélation R = 0, 954. Cette équation pourrait être affinée en se limitant à un type et une origine de produits. Dans cette équation, y correspond à la déviation isotopique de l'eau tandis que x correspond à la déviation isotopique de l'éthanol. Le procédé a été appliqué sur des jus de fruits à base de concentré et sur des purs jus du marché. Les jus de fruits produits à base de concentré sont nettement en dehors de la zone de confiance. Les purs jus du marché peuvent, pour certains, être en dehors de la zone de confiance et démontrent alors l'apport d'eau exogène non déclaré dans ces purs jus. Le procédé ci-dessus va maintenant être appliqué à un échantillon de jus d'orange à analyser Exemple d'application : L'échantillon référencé 0131/0956 correspondant à un pur jus d'orange acheté dans le commerce est analysé comme suit : Une partie de l'échantillon (1.5 ml) est équilibrée avec du CO2 (comme décrit ci-dessus), puis le CO2 obtenu est analysé par Spectrométrie de Masse de Rapports Isotopiques en vue d'établir la déviation isotopique de l'oxygène 18 de l'eau par rapport au VSMOW (8180 eau). Une autre partie de l'échantillon (600 ml) est fermentée en éthanol à l'aide de levures jusqu'à disparition des sucres (comme décrit ci-dessus). L'éthanol ainsi obtenu est extrait de l'échantillon par distillation à haut rendement, puis l'eau résiduelle du distillat est éliminée par passage sur tamis moléculaire (comme décrit ci-dessus). L'éthanol pur ainsi obtenu est analysé par Spectrométrie de Masse de Rapports Isotopique en vue d'établir la déviation isotopique de l'oxygène 18 de l'éthanol par rapport au VSMOW (8180 éthanol). Les résultats sont les suivants : Ò180 eau (\VSMOW) = 1, 1 %0 Ò180 ethanol (\VSMOW) = 30, 5 a La déviation isotopique de l'oxygène 18 de l'eau seule est conforme aux valeurs guides de l'AIJN pour le jus d'orange (5180 eau > Oc). En revanche la relation entre la déviation isotopique de l'oxygène 18 de l'eau et celle de l'éthanol est atypique pour l'orange et indique une dilution ou en d'autres termes un ajout d'eau exogène au fruit. L'échantillon est donc jugé non-conforme à sa description. Cet échantillon est représenté sur la figure unique par un des carrés situés en dessous de la limite définie graphiquement. - Numériquement, on constate : 1.1 20, 938-2 x 1,138 (équation (2)). REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'eau ajoutée dans des produits, notamment des liquides alimentaires, tels que des boissons, contenant au moins un sucre fermentescible et/ou de l'éthanol, caractérisé en ce qu'on détermine, par spectrométrie de masse de rapports isotopiques, le rapport 180/160 de l'eau dit Reau80/0 de l'échantillon, en ce qu'on détermine, par spectrométrie de masse de rapports isotopiques, le rapport 180r60 dit Reth1BOj160 de l'éthanol directement contenu dans l'échantillon ou obtenu par fermentation complète des sucres de l'échantillon en éthanol, en ce qu'on compare lesdits rapports Reau180j160 et Reth18O/16O ou les déviations isotopiques beau0 ( /0o) de l'eau et #eth18O (#) de l'éthanol calculées à partir desdits rapports pour vérifier respectivement l'équation (1) ou l'équation (2) : aReth180j160+b-L 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en présence de sucres fermentescibles dans l'échantillon, on transforme par fermentation, à l'aide de micro-organismes, de levures ou d'enzymes, les sucres fermentescibles de l'échantillon en éthanol, en ce qu'on isole l'éthanol issu de la fermentation des sucres ou directement contenu dans l'échantillon par distillation à haut rendement, en ce qu'on élimine, de préférence sur tamis moléculaire, l'eau du distillat et en ce qu'on détermine, par spectrométrie de masse, le rapport 180/160 de l'éthanol. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on détermine le rapport Reau80/0 de l'eau après préparation de l'échantillon par application de la méthode dite d'équilibration. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour vérifier l'équation (1) ou respectivement l'équation (2), on reporte sur un graphique représentant en abscisse le rapport isotopique de l'éthanol ou respectivement la déviation isotopique de l'éthanol et en ordonnée le rapport isotopique de l'eau ou respectivement la déviation isotopique de l'eau, le point obtenu à partir des mesures de rapport isotopique et éventuellement du calcul des déviations isotopiques du produit à analyser, en ce qu'on compare le positionnement du point par rapport à une zone de confiance établie sur le graphique selon des critères statistiques par rapport à des échantillons authentiques et en ce que, si le point est en dessous de la zone, on conclut à l'ajout d'eau exogène. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour vérifier l'équation (1) ou respectivement l'équation (2), on mémorise dans une base de données, pour chaque échantillon authentique du type et éventuellement de l'origine du produit à analyser, d'une part le rapport isotopique de l'éthanol ou respectivement la déviation isotopique de l'éthanol, d'autre part le rapport isotopique de l'eau ou respectivement la déviation isotopique de l'eau, on détermine par calcul l'équation (1) ou l'équation (2) et on vérifie l'équation (1) ou l'équation (2) à partir des données obtenues à partir du produit à analyser.