FR 2836684 A1 20030905 FR 0202703 A 20020304 La présente invention est relative à des peptides ras mutés et à leur utilisation en immunothérapie. La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des pathologies virales ou cancéreuses. Son principe repose sur l'immunisation par des peptides reproduisant des épitopes T d'antigènes viraux ou tumoraux reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL), qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules exprimant ces antigènes à leur surface. On rappellera que les CTL ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) exprimées à la surface de différentes cellules. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) ont généralement 8 à 11 acides aminés, et sont reconnus par les cellules T CD8+, qui représentent la composante majeure de la réponse cytotoxique. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) ont généralement 13 à 18 acides aminés et sont reconnus par les cellules T CD4+. Des études effectuées sur des modèles animaux ont permis d'identifier des antigènes de rejet tumoral, dont un grand nombre sont des protéines mutées oncogènes (PREHN et al., J. Natl. Cancer Inst., 18, 769, 1998 ; DE PLAEN et al., PNAS, 85, 2274, 1988 ; DUBEY et al., J. Exp. Med., 185, 695, 1997). La présentation par des molécules du CMH des fragments mutés de ces protéines à la surface des cellules tumorales induit la destruction spécifique de celles-ci par les CTL et le rejet de la tumeur. Chez l'homme, les protéines mutées oncogènes apparaissent également comme des cibles particulièrement intéressantes pour l'immunothérapie anti-tumorale. Toutefois, ceci implique d'identifier les épitopes présentés à la surface des cellules tumorales et capables d'induire une réponse T cytotoxique. Parmi les oncogènes les plus fréquemment impliqués dans différents types de tumeurs, on citera les oncogènes ras (K-ras, H-ras et N-ras) qui résultent de mutations ponctuelles (substitution d'un seul acide aminé) des proto-oncogènes ras p21. Ces mutations interviennent essentiellement au codon 12, au codon 13, ou au codon 61 (BOS, Cancer Res., 49,4682, 1989 ; WEIJZEN et al., Leukemia, 13, 502,1999). Du fait du nombre limité de substitutions oncogéniques pouvant intervenir, des mutations ras présentes dans de nombreuses tumeurs identiques peuvent ainsi générer des épitopes tumoraux partagés, présentés par une fraction significative de tumeurs humaines (WEIJZEN et al., Leukemia, 13,502, 1999). Il a ainsi été proposé d'utiliser en immunothérapie anti-tumorale des peptides synthétiques reproduisant des épitopes ras mutés. Ainsi, la demande PCT WO 92/14756 propose l'utilisation de peptides reproduisant des épitopes ras mutés au codon 12 ou au codon 61. Toutefois ces épitopes sont présentés par le CMH II (DQ et DR), et induisent donc une réponse CD4+. Or, bien qu'il puisse être avantageux d'induire ce type de réponse, dans la mesure où les lymphocytes auxiliaires CD4+ permettent d'augmenter la réponse cytotoxique (WALTER et al., N. Engl. J. Medicine, 333, 1038, 1995), la réponse CD8+ demeure l'acteur essentiel de la cytotoxicité. En outre, des études récentes effectuées chez la souris suggèrent que l'immunisation avec des peptides présentés par le CMH II pourrait induire une stimulation de la croissance tumorale au lieu de la protection espérée (SIEGEL et al., J. Exp. Med., 191,1945, 2000). Plusieurs épitopes ras mutés aux positions 12,13 ou 61 ont sélectionnés sur la base de leur capacité d'ancrage à des molécules du CMH de classe I (VAN ELSAS et al., Int. J. Cancer, 61, 389, 1995 ; BERGMANN et al., Cell Immunol., 187, 103,1998 ; GOUTTEFANGEAS et al., Human Immunol., 55, 117, 1997). Les peptides ainsi sélectionnés peuvent stimuler la croissance de CTL spécifiques à partir de PBL in vitro. Mais ces CTL reconnaissent faiblement les cellules tumorales mutées, suggérant que l'expression endogène de ces épitopes est limitée (VAN ELSAS et al., Int. J. Cancer, 61, 389, 1995 ; ABRAMS et al., Cell Immunol., 182, 137, 1997 ; BERGMANN et al., Cell Immunol., 187,103, 1998), et qu'ils ne permettent donc pas l'élimination efficace des cellules tumorales par des CTL spécifiques, ce qui limite considérablement leur intérêt en immunothérapie. Il apparaît donc nécessaire de disposer d'autres épitopes ras mutés restreints au CMH I et présentés efficacement par une fraction significative de tumeurs humaines. Les Inventeurs ont maintenant identifié un épitope ras muté en position 61 par substitution d'une glutamine par une arginine (Q61R), et restreint au CMH I. Cet épitope, dénommé ci-après 55-64Q R est présenté efficacement par plusieurs lignées de mélanome HLA-A*0101+ exprimant un oncogène ras portant la mutation Q61R. Il est capable d'induire spécifiquement l'expansion de clones de lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) obtenus à partir de ces mélanomes. De plus, les cellules dendritiques chargées avec ce peptide stimulent de façon efficace des CTL spécifiques à partir de lymphocytes du sang périphérique (PBL) de donneurs sains HLA-A*0101, et ces CTL reconnaissent toutes les lignées de mélanomes HLA-A*0101 exprimant l'oncogène ras Q61R, et ne reconnaissent pas les cellules exprimant la protéine ras nonmutée. Le peptide 55-64Q61R ne possède pas une capacité d'ancrage supérieure à celle du peptide de type sauvage correspondant. L'affinité de liaison à HLA-A*0101 du peptide Q61R de type sauvage est similaire à celle du peptide 55-64Q61R. Cependant, même à concentrations élevées, ce peptide de type sauvage ne peut induire ni l'expansion de TIL spécifiques, ni celle de CTL spécifiques. Il apparaît donc que la substitution d'une glutamine par une arginine en position 61 crée un nouvel épitope présenté par HLA-A*0101. D'autres mutations de l'oncogène ras à la même position, et notamment la substitution de la glutamine par une proline, une lysine, une histidine ou une leucine, qui sont exprimées dans différentes formes de cancer, peuvent créer de la même manière de nouveaux épitopes T presentés par HLA-A*0101. En conséquence, la présente invention a pour objet un peptide ras muté immunogène présenté par le CMH I, choisi parmi les peptides suivants : ILDTAGREEY (SEQ ID NO : 1) ; ILDTAGPEEY (SEQ ID NO : 2) ; ILDTAGKEEY (SEQ ID NO : 3) ; ILDTAGHEEY (SEQ ID NO : 4) ; ILDTAGLEEY (SEQ ID NO : 5). Les peptides conformes à l'invention peuvent être utilisés pour l'obtention de médicaments, utilisables cs, utilisables notamment pour l'immunothérapie antitumorale, et en particulier pour le traitement de tumeurs exprimant une protéine K-ras, H-ras ou N-ras mutée par substitution de la glutamine en position 61 par une arginine, une proline, une lysine, une histidine ou une leucine. On citera notamment les mélanomes, ainsi que d'autres tumeurs dans lesquelles les mutations ras affectant le résidu 61 sont détectées avec une fréquence élevée, telles que les n vi mélanocytiques congénitaux (PAPP et al., Journal of Medical Genetics, 36, 610, 1999), les myélomes multiples (BEZIEAU et al., Hum. Mutat., 18,281, 2001), et les tumeurs de la thyroïde (ESAPA et al., Cinical Endocrinology, 50, 529, 1999). Ces peptides peuvent être en particulier utilisés pour le traitement de patients HLA-A*0101, ainsi que de patients HLA-B*1501. En effet, une analyse effectuée sur la banque de données BIMAS (http : //bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla bind ; PARKER et al., J. Immunol. 152, 163, 1994), montre que ces peptides ont un score de liaison identique pour ces deux allèles. La présente invention englobe également des compositions comprenant au moins un peptide ras muté conforme à l'invention. Avantageusement, il s'agit de compositions multiépitopiques, capables de générer une réponse CTL polyspécifique, et qui comprennent en outre un ou plusieurs autre (s) peptides immunogène (s). Ces peptides peuvent représenter des épitopes issus du même antigène, ou de deux ou plusieurs antigènes différents. Avantageusement, des compositions multi- épitopiques conformes à l'invention peuvent comprendre, pour être plus largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, un ou plusieurs peptides présentés par des molécules du CMH I autres que HLAA*0101 ou HLA-B*1501. Des compositions conformes à l'invention peuvent notamment comprendre un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un peptide immunogène conforme à l'invention. Dans le cas d'une composition multiépitopique, ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'au moins un autre épitope immunogène. Des polypeptides chimériques conformes à l'invention peuvent être facilement obtenus par des méthodes connues en elles-mêmes, et notamment par les techniques classiques de l'ADN recombinant. La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant pour un peptide ras muté ou pour un polypeptide chimérique conforme à l'invention, ainsi qu'un vecteur d'acide nucléique contenant ledit polynucléotide. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide ras muté, d'une composition, d'un polypeptide chimérique ou d'un polynucléotide conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament anti-tumoral. On peut par exemple, injecter au patient à traiter un peptide ras muté, un polypeptide chimérique, une composition multiépitopique, conforme à l'invention éventuellement associés à un adjuvant approprié. On peut également utiliser un peptide ras muté conforme à l'invention pour charger in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles, notamment des cellules dendritiques HLA-A*0101 ou HLA-B*1501 afin d'induire la prolifération de CTL anti-tumeurs, comme décrit par exemple par BAKKER et al. (Cancer Res., 55, 5330-5334,1995) ou VAN ELSAS et al. (Eur. J. Immunol., 26,1683-1689, 1996). Les cellules présentatrices de l'antigène chargées de la sorte font également partie de l'objet de la présente invention. Les polynucléotides conformes à l'invention de préférence intégrés dans des vecteurs d'acide nucléique, notamment des vecteurs viraux tels que des adénovirus, peuvent également être administrés par injection au patient à traiter. Ils peuvent également être utilisés pour transfecter in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles, notamment des cellules dendritiques, qui sont ensuite injectées au patient, comme décrit par exemple par KAPLAN et al. (J. Immunol., 163 (2), 699-707,1999) ou KIM et al. (Annals of Surgical Oncology, 5 (1), 64-76, 1998). Ces cellules présentatrices de l'antigène transfectées font également partie de l'objet de la présente invention. Des peptides ras mutés conformes à l'invention peuvent également être utilisés pour réaliser le tri spécifique des CTL de patients porteurs de ces mutations. Des peptides ras mutés conformes à l'invention peuvent être complexés à des molécules du CMH dans cette optique. Ces CTL ainsi isolés peuvent ensuite être amplifiés in vitro et réinjectés en grand nombre (de l'ordre du milliard) au patient. La présente invention a également pour objet des compositions thérapeutiques comprenant, en tant que principe actif, un peptide ras muté, une composition multiépitopique, un polypeptide chimérique, un polynucléotide, ou une cellule présentatrice de l'antigène conforme à l'invention. Les compositions thérapeutiques conformes à l'invention peuvent comprendre en outre les excipients usuels, ainsi que des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l'administration du principe actif, de le stabiliser, d'augmenter son immunogénicité, etc. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les propriétés de peptides ras mutés conformes à l'invention utilisables en immunothérapie, par la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : ANTIGENICITE DU PEPTIDE RAS MUTE 55-64Q61R Les peptides ras de type sauvage 55-64WT (ILDTAGQEEY) et les décamères mutés 55-64Q61R (ILDTAGREEY), 55-64Q61K (ILDTAGKEEY), 52-61 Q61R (LLDILDTAGR) et le peptide MAGE-3 (EVDPIGHLY) ont été obtenus auprès de SYNT : EM (Nîmes, France). La pureté ( > 85%) est contrôlée par chromatographie liquide à haut rendement en phase inverse. Les peptides sont lyophilisés, puis dissous dans du DMSO à 10 mg/ml et stockés à-80 C. L'antigénicité du peptide 55-64Q61R et celle de son analogue de type sauvage (55-64wT) 1 sont évaluées en testant la capacité de ces peptides à induire la croissance de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques par stimulation in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par des cellules dendritiques (DC) pulsées avec ces peptides. Les lymphocytes CD8+ sont obtenus à partir des PBMC d'un donneur HLA-A*0101 par tri négatif des cellules T CD4+ sur billes magnétiques (MILTENY BIOTECH, France). Les cellules dendritiques sont préparées à partir de PBMC adhérentes mises en culture pendant 7 jours dans des plaques de culture à 6 puits contenant du milieu de culture RPMI additionné de sérum de veau foetal 10%, 50 ng/ml de GMCSF (SIGMA) et 50 ng/ml d'IL-4 (SIGMA). A J+7, la maturation des cellules dendritiques est induite pendant 2 jours dans un milieu de culture RPMI additionné de sérum de veau foetal 10%, 10 ng/ml de TNF-a (SIGMA) et 100 g/ml de Poly-IC (SIGMA). A J+9, les cellules dendritiques matures sont incubées pendant 2 heures avec 5 g/ml de peptide ras 55-64Q61R ou de peptide ras 55-64et ; elles sont ensuite lavées pour éliminer les peptides libres. Les cellules dendritiques pulsées avec le peptide ras 55-64Q61R ou le peptide ras 55-64et sont utilisées pour stimuler les lymphocytes CD8+ (3. 107 cellules). 3 stimulations sont effectuées à une semaine d'intervalle. Chaque puits de culture est testé pour la présence de CTL spécifiques du peptide. Dans ce but, 7 jours après la dernière stimulation, des 2. 106 cellules BM36.1 (cellules déficientes en transporteur TAP et exprimant HLA-A*0101 (KELLY et al., Nature, 355, 641, 1992) préalablement incubées à 37 C pendant 12 heures dans du RPMI additionné de 100 jn. M de peptide N-ras 55-64WT ou 55-64Q61R, 1 M de ss2 microglobuline, et lavées dans du PBS, sont ajoutées dans chaque puits. La réponse CTL spécifique à la stimulation par le peptide N-ras de type sauvage ou muté est mesurée par dosage de l'interféron y (IFN-y), comme décrit par LABARRIERE et al. (Int. J. Cancer, 78,209, 1998). Deux des cinq puits de culture stimulés avec le peptide ras présentent une prolifération de CTL spécifique du peptide (0,3 et 0, 5% de cellules réactives par puits), alors qu'aucune prolifération n'est observée dans les puits WT stimulés avec le peptide 55-64. EXEMPLE 2 : PROPRIETES D'UN CLONE DE LYMPHOCYTES T INDUIT PAR LE PEPTIDE 55-64Q61R Des clones lymphocytaires ont été obtenus par dilution limite à partir des cellules du puits de culture contenant 0,5% de cellules T réactives. La capacité des cellules T issues de l'un de ces clones à lyser des cellules BM36.1 présentant le peptide 55- -61R 64Q61R ou le peptide 55-64IT est évaluée selon un dosage standard de libération du 51Cr (HERIN et al., Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987). Des cellules BM36.1 marquées avec du 51Cr (Na251Cr04, ORIS, Gif-sur-Yvette, France). Les cellules sont ensuite pulsées pendant 1 heure à 370C avec 10 M de peptide 55-64ut ou de peptide 55-64Q61RI et lavées. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 5. 103 cellules T du clone à tester pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et le pourcentage de 5'cor libéré est évalué. On observe une lyse importante des cellules Q61R BM36. 1 pulsées avec le peptide ras muté 55-64Q61R. En revanche, la lyse des cellules BM36.1 pulsées avec le peptide ras de type sauvage est très faible. La spécificité de ce clone vis-à-vis de cellules exprimant HLA-A*0101 et la protéine sauvage ou la protéine Nras portant la mutation Q61R est évaluée sur des cellules COS transfectées, ou sur des cellules de mélanome HLA-A*0101, exprimant ou non la mutation Q61R. Pour la transfection des cellules COS, un ADNc de 334 pb codant pour un fragment de la protéine N-ras de type sauvage est obtenu par amplification PCR, à partir d'ADNc complet de la protéine N-ras sauvage. Un ADNc codant pour un fragment de la protéine N-ras muté à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine est obtenu par m mutagenèse dirigée. L'ADNc sauvage ou muté est inséré dans le vecteur pcDNA3 et amplifié dans la souche bactérienne E. coli TOP 10 F' (INVITROGEN, référence C2020-03). Un ADNc codant pour la molécule HLA-A*0101 est introduit dans le vecteur pcDNA 3.1 (INVITROGEN, référence CV790-20). Des cellules COS sont co-transfectées avec ces constructions comme décrit ci-après : Des cellules COS-7, (RICHARD et al., J. Exp. Med., 178,489, 1993) sont cultivées dans le milieu DMEM (BIOWHITTAKER) contenant du sérum de veau foetal 10%, 100 U/ml de pénicilline, 100 ptg/ml de streptomycine (SIGMA, St Louis, USA) et 2 mM de glutamine-L (SIGMA, St Louis, USA). 16/5. 103 cellules COS sont co-transfectées avec 100 ng d'un mélange du vecteur pcDNA 3.1 exprimant HLA-A*0101 et d'un vecteur pcDNA3 exprimant la protéine N-ras sauvage ou mutée, par le procédé chloroquine-dextrane-DEAE (RICHARD et al., J. Exp. Med., 178,489, 1993 ; SEED et a., PNAS, 84, 3365, 1987, ). Les détails de cette méthode sont décrits par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125,1997). La stimulation des cellules T est mesurée par dosage du TNF (DE PLAEN et al., Methods, 12,125, 1997 ; LABARRIERE et al., Int. J. Cancer, 78,209, 1998). 2. 103 à 104 cellules du clone T testé sont ajoutées à 3. 104 cellules COS, 48'heures après transfection, ou à 3. 104 cellules de mélanome. Les surnageants de culture sont récupérés 6 heures plus tard et leur contenu en TNF est déterminé en mesurant leur effet cytotoxique sur le clone 13 du fibrosarcome murin WEHI 164 (BRICHARD et al., J. Exp. Med., 178, 489,1993) par dosage colorimétrique MTT. Les résultats obtenus avec les cellules cos transfectées sont présentés dans la Figure la. En abscisse, peptides ras de type sauvage ou mutés à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine. En ordonnée, concentration de TNF en pg/ml Les résultats montrent que les cellules T du clone sont fortement stimulées par les cellules exprimant la protéine N-ras Q61R, alors qu'on n'observe qu'une faible stimulation avec la protéine N-ras sauvage. Les résultats obtenus avec les cellules de mélanome sont présentés dans la Figure 1b : En abscisse, lignées cellulaires de mélanome exprimant la mutation ras Q61R (M6, M90, MEL4) ou non (M36, M1OS, M106, M122, M38, MV1). En ordonnée, concentration de TNF en pg/ml Ces résultats montrent que parmi les lignées de mélanome HLA-A*0101, seules celles exprimant la mutation Q61R (lignées M6, M90 et MEL4) stimulent une réponse des cellules T du clone. REVENDICATIONS 1) Peptide ras muté immunogène présenté par le CMH I, choisi parmi les peptides suivants : ILDTAGREEY (SEQ ID NO : 1) ; ILDTAGPEEY (SEQ ID NO : 2) ; ILDTAGKEEY (SEQ ID NO : 3) ; ILDTAGHEEY (SEQ ID NO : 4) ; ILDTAGLEEY (SEQ ID'NO : 5). 2) Composition comprenant au moins un peptide ras muté selon la revendication 1. 3) Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs autre (s) peptide (s) immunogène (s). 4) Polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un peptide ras muté selon la revendication 1. 5) Polypeptide chimérique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs copies d'un ou plusieurs autre (s) épitope (s) immunogène (s). 6) Polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique selon une quelconque des revendications 4 ou 5. 7) Utilisation d'un peptide selon la revendication 1, pour l'obtention d'un médicament. 8) Utilisation d'une composition selon une quelconque des revendications 2 ou 3, pour l'obtention d'un médicament. 9) Utilisation d'un polypeptide chimérique selon une quelconque des revendications 4 ou 5 pour l'obtention d'un médicament. 10) Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 6 pour l'obtention d'un médicament. 11) Utilisation selon une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement immunothérapique de tumeurs exprimant une protéine K-ras, H-ras ou N-ras mutée par substitution de la glutamine en position 61 par une arginine, une proline, une lysine, une histidine ou une leucine. 12) Utilisation selon une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement immunothérapique de tumeurs chez un patient HLA-A*0101, ou HLA-B*1501.