FR 2868951 A1 20051021 FR 0403926 A 20040415 2868951 1 L'invention concerne des compositions, en particulier des compositions pharmaceutiques, contenant des vésicules lamellaires incorporant des quantités importantes d'un principe actif peu soluble dans l'eau ainsi que des produits intermédiaires utiles pour leur préparation. L'invention concerne également un procédé utile pour la préparation de ces compositions ainsi qu'un procédé utile pour la préparation des produits intermédiaires. Problème technique L'encapsulation de principes actifs pharmaceutiques dans des vésicules lipidiques fait l'objet d'intenses recherches pour améliorer la délivrance de médicaments. Le but de cette approche est multiple, par exemple la protection du principe actif, vis à vis de conditions défavorables, ou l'amélioration de la biodisponibilité, que sa limitation soit due à une faible solubilité ou à une faible absorption au niveau de la membrane, ou encore la diminution des effets secondaires. Un autre domaine d'application de ces vésicules lipidiques est leur utilisation pour délivrer des antigènes dans une stratégie vaccinale, utilisant leurs propriétés adjuvantes de la réponse immunitaire. En général, afin d'améliorer la biodisponibilité du principe actif, il est préférable que celui-ci soit sous une forme solubilisée dans les vésicules lipidiques. Les voies d'administration de ces vésicules lipidiques sont les voies classiques de la pharmacie, principalement les voies injectables et orales, mais aussi les voies topiques et muqueuses. Beaucoup de principes actifs de la pharmacie, et en particulier ceux issus de la biochimie présentent des solubilités réduites, surtout en milieu aqueux. Même si ces principes actifs ont une activité spécifique forte, qui permet l'administration de doses réduites, les propriétés physico-chimiques de ces molécules empêchent souvent leur mise en forme pharmaceutique, en conduisant à des doses à administrer de volume trop important. 2868951 2 L'incorporation du principe actif dans une vésicule lipidique peut permettre de contourner cette difficulté liée à la solubilité, car les milieux amphiphiles sont souvent de bons solubilisants. Cependant il existe une difficulté technique à la mise en oeuvre de ces principes actifs peu solubles. Si l'actif est peu soluble dans la phase aqueuse, la quantité de principe actif incorporable dans les vésicules va être limitée par sa solubilité en milieu aqueux. C'est le cas des protéines membranaires par exemple, qui présentent une solubilité limitée en phase aqueuse. Souvent, ces composés biochimiques sont obtenus en solution très diluée dans l'eau, et il n'est pas possible de les isoler sous forme plus concentrée ou solide, du fait d'instabilités de conformation par exemple, qui risquent d'annihiler leur activité biologique. De plus, du fait de la viscosité des systèmes amphiphiles, la solubilisation directe d'une poudre du principe actif dans le mélange amphiphile peut prendre un temps trop long par rapport aux impératifs d'industrialisation. Il existe donc une difficulté technique à incorporer des quantités suffisantes, avec un rendement acceptable, de principes actifs peu solubles, dans les vésicules lipidiques. Par peu soluble, on entend dans ce document que la solubilité du principe actif dans l'eau n'est pas suffisante pour atteindre la dose cible par une méthode classique de préparation de vésicules lipidiques. Ainsi par exemple, si l'on veut apporter 10 mg de principe actif dans des vésicules incorporant 50% de phase aqueuse, sous un volume total inférieur à 1 mL, on voit qu'une solubilité supérieure à 20 mg/mL est nécessaire. Si l'on veut apporter 50 mg de principe actif dans les mêmes conditions il faut une solubilité de 50 mg/mL. La limitation liée à la solubilité peut aussi venir du souhait de limiter la quantité d'excipients, apportée avec le principe actif, indépendamment du volume total administré. C'est le cas de nombreux composés biologiques, souvent administrés à faibles doses, mais aussi très faiblement solubles. Un calcul simple montre que pour un principe actif, 2868951 3 dont la solubilité aqueuse est de 1 mg/mL dans l'eau, une méthode classique de préparation de vésicules lipidiques conduira à une quantité de 300 à 500 mg de lipides pour encapsuler 1 mg de principe actif. Ce rapport très supérieur à 100 entre les lipides et le principe actif est souvent considéré comme trop important, en particulier pour des administrations par injections ou répétées. Etat de l'art Les vésicules lipidiques les plus connues sont les liposomes. Ce sont des vésicules formées d'une ou plusieurs membranes lipidiques (bicouches à base de phospholipides ou d'autres lipides) entourant un coeur aqueux. La phase aqueuse est répartie d'une part dans le coeur aqueux et d'autre part dans les couches intermédiaires entre les membranes lipidiques. De nombreuses méthodes de préparation de liposomes ont été décrites, mais toutes font appel à un processus cinétique de formation spontanée des vésicules en dispersion dans une phase aqueuse contenant le principe actif à encapsuler. Une revue de ces méthodes peut être trouvée par exemple dans "Liposomes as Drug Carriers", par G. Gregoriadis, Wiley & Sons, New-York (1988). La plus simple à mettre en oeuvre au- laboratoire consiste à former, par évaporation d'une solution organique de lipides, un film à la surface d'un ballon de verre, et à reprendre ce film par la solution aqueuse du principe actif. Une étape de sonication permet d'obtenir les liposomes et d'affiner leur profil de taille. Une autre technique connue sous le nom de Technique REV qui est l'abréviation de "Reverse Phase Evaporation" (évaporation de phase inverse) fait appel à un solvant volatil immiscible avec l'eau, contenant les lipides en solution, qu'on injecte lentement sous agitation dans la solution aqueuse du principe actif. Les liposomes se forment lors d'une étape d'évaporation du solvant volatil. On peut en voir une description dans Szoka & Papahadjopoulos, P.N.A.S. 75 (1978), 4194. 2868951 4 Ces méthodes et leurs variantes permettent une encapsulation passive du principe actif, au cours de laquelle uniquement la proportion de principe actif piégée dans le volume aqueux des vésicules est encapsulée. Elles conduisent donc à des rendements d'encapsulation (ratio du principe actif encapsulé sur la totalité du principe actif mis en oeuvre) faibles, et à des taux de chargement (quantité de principe actif dans les vésicules, souvent exprimés par le rapport entre la masse de principe actif et la masse totale de la vésicule ou la masse de lipides) limités. Une amélioration du chargement des liposomes peut être obtenue en leur faisant subir des cycles de congélation/décongélation ou lyophilisation/hydratation afin d'enrichir la phase interne du liposome en principe actif. Par exemple Shew & Deamer (Biochim & Biophys Acta 816 (1985), 1-8) décrivent une méthode dans laquelle des liposomes formés par sonication sont dispersés dans une solution du principe actif et le mélange est séché sous un flux d'azote. Après redispersion en milieu aqueux, on obtient des liposomes de grande taille enrichis en principe actif par rapport aux liposomes initiaux. D'autres méthodes de chargement des liposomes sont basées sur la migration transmembranaire de solutés appliquée à des vésicules vides préformées. Cette méthode, ainsi qu'une bibliographie sur ses variantes est décrite dans US 5,393,530 de Bracco Int B.V. Elle est basée sur des différences de pression osmotique, éventuellement favorisée par un gradient de force ionique ou de pH, qui permettent la migration du soluté de l'extérieur vers l'intérieur de la vésicule. Ce type de méthode convient à des solutés spécifiques, en particulier aux électrolytes ou aux acides ou bases faibles, sur lesquels la force ionique ou le gradient de pH sont des facteurs efficaces de migration. Certaines de ces méthodes font appel à un solvant organique. C'est le cas de US 6,106,858 de Skye Pharma Inc, qui dissout d'une part les composants lipidiques dans un solvant organique non miscible à l'eau, 2868951 5 alors que le principe actif est dissous dans l'eau. L'osmolarité est ajustée de manière à contrôler le chargement des vésicules qui sont obtenues par une technique d'émulsion double dans un milieu continu formé d'un autre solvant organique non miscible à l'eau, suivie d'une étape d'évaporation des solvants organiques. D'autres références comme par exemple US 4,877,561 de Takeda Chemical Industries Ltd, font appel à des solvants organiques volatils miscibles à l'eau, pour former une phase gel homogène, entre l'eau, le principe actif, les lipides et le solvant organique. L'évaporation de ce dernier (plus volatil que l'eau) conduit à la formation des vésicules. Dans ces méthodes, le principe actif est solubilisé dans la phase aqueuse, et l'on comprend facilement que sa solubilité dans l'eau est un facteur limitant de la méthode. De plus, le contact de principes actifs fragiles comme certaines protéines avec des solvants organiques est très souvent préjudiciable au maintien de leur activité biologique. Une variante de ces méthodes utilisant un solvant organique est décrite dans US 6,156,337 de Oppérbas Holdings B.V. Dans ce document, une dispersion de liposomes vides préformés par une méthode classique dans une phase aqueuse comprenant le soluté à incorporer est additionnée d'un solvant organique polaire, de préférence du tertiobutanol, puis l'ensemble est lyophilisé. La réhydratation du solide ainsi obtenu au moment de l'administration permet de reconstituer les liposomes avec un taux de chargement amélioré. Le document montre cependant que les taux de chargement restent faibles, de l'ordre de 0.15% pour un antigène viral (HBV) et 0,25% pour un facteur de coagulation (F-VIII). Une autre classe de vésicules à base d'amphiphiles est constituée des vésicules lamellaires à structure en oignon uniforme du centre à la périphérie, obtenues par un procédé thermodynamique à partir de phases lamellaires cristal-liquide d'amphiphiles. Ces vésicules, plus 2868951 6 stables et de structure mieux définie que les liposomes sont décrites dans plusieurs documents, en particulier WO93/19735, WO95/18601 et WO97/00623, tous de Capsulis, en ce qui concerne leur préparation et leur utilisation pour encapsuler des principes actifs pharmaceutiques. Les applications de ces vésicules sont décrites dans les brevets WO99/16468 et WO 01/19335 pour les vaccins et WO 01/49264 pour l'administration orale de médicaments. Ces vésicules sont obtenues par cisaillement, éventuellement uniforme, d'une phase lamellaire cristal-liquide obtenue par mélange d'amphiphiles, d'un solvant polaire et d'un principe actif. Cette étape conduit à une phase de vésicules pures, sans milieu externe, constituée en fait de la phase lamellaire initiale organisée en grains sphériques. La dispersion dans un milieu aqueux, par exemple, conduit à une suspension aqueuse de vésicules ayant conservé leur structure lamellaire, et donc constituées d'un empilement concentrique de bicouches d'amphiphiles alternant avec des couches de solvant polaire et ce, du centre jusqu'à leur périphérie. Au contraire des liposomes, ces vésicules ne comportent pas de coeur aqueux ou, plus précisément, du fait de leur procédé d'obtention à partir d'une phase cristal-liquide lamellaire, il n'y a pas de domaine aqueux central de taille supérieure à l'épaisseur caractéristique des couches aqueuses concentriques. Le principe actif incorporé initialement dans la phase lamellaire fait partie intégrante de la structure de la vésicules, et vient se répartir soit dans la couche aqueuse s'il est hydrophile, soit dans la bicouche lipidique s'il est lipophile. Dans le cas où le principe actif est luimême amphiphile, il se comportera comme les amphiphiles formant la structure de la vésicule. Il se répartira au sein de la bicouche amphiphile, avec ses parties plus hydrophiles pointant au niveau des têtes polaires en surface de la bicouche. Dans le cas de composés macromoléculaires, on peut imaginer que la molécule s'étend sur plusieurs couches, ses parties lipophiles étant 2868951 7 enchâssées dans les bicouches lipidiques, et ses parties hydrophiles permettant la traversée des couches aqueuses. Du fait de leur mode d'obtention, à partir d'une phase lamellaire concentrée, et non pas en milieu dispersé, ces vésicules lamellaires à structure en oignon présentent un excellent rendement d'encapsulation, souvent proche de 100%. Ces vésicules lamellaires à structure en oignon, tout comme les liposomes, incorporent les principes actifs à l'état solubilisé. De ce fait l'incorporation du principe actif dans la phase lamellaire initiale doit permettre la solubilisation du principe actif. Dans le cas où le principe actif est soluble dans l'eau, il est simplement introduit dans la phase aqueuse préalablement à la formation de la phase lamellaire. Si le principe actif est soluble dans un solvant organique volatil, on peut le dissoudre préalablement dans ce solvant, puis incorporer la solution au mélange d'amphiphiles et enfin évaporer le solvant. Le mélange d'amphiphiles contenant le principe actif est ensuite utilisé pour préparer la phase lamellaire. Dans le cas où le principe actif est peu soluble dans l'eau, et où l'on ne souhaite pas utiliser un solvant organique, la capacité d'incorporation du principe actif sera limitée par la solubilité en milieu aqueux. C'est le cas des actifs biologiques tels que des peptides hydrophobes, des lipopeptides ou des protéines hydrophobes. C'est aussi le cas des principes actifs présentant une fonction acide ou base hors du domaine de pH où ils sont ionisés et donc solubles dans l'eau. En général on préfère éviter l'utilisation de- solvants organiques pour ces actifs biologiques, car ils risquent de dénaturer le principe actif. De plus leur utilisation pose de nombreux problèmes techniques, par exemple de manipulation lors de la fabrication à cause de leur toxicité ou de leur inflammabilité, mais aussi à cause des traces qui peuvent subsister dans le produit fini. 2868951 8 On peut aussi imaginer incorporer le principe actif sous forme de poudre dans la phase lamellaire préalablement formée. Ceci n'est pas toujours possible pour deux raisons. D'une part, les principes actifs mentionnés, et en particulier les protéines membranaires, ne peuvent pas toujours être obtenus sous forme solide, leur précipitation ou lyophilisation entraînant un changement de conformation préjudiciable à leur activité biologique. D'autre part, la solubilisation directe d'une poudre dans une phase lamellaire, en général assez visqueuse, peut prendre un temps long, incompatible avec les exigences technico- économiques d'une production industrielle. La demande internationale WO 01/45672 également au nom de la société Capsulis décrit des vésicules lamellaires présentant également une structure en oignon et contenant des quantités importantes, supérieures à 5% en poids par rapport au poids des composés amphiphiles, de polymères biologiques, en particulier d'ADN ou d'ARN. Toutefois, la technique décrite dans ce document qui passe par la formation d'une phase mixte structurée résultant de l'incorporation d'une macromolécule biologique dans une phase cristal-liquide d'amphiphiles, n'est rendue possible que du fait du pourcentage très important de polymères biologiques intégrés dans cette structure. En effet, cette structure mixte résulte en fait de l'imbrication de deux structures organisées, une structure organisée à longue distance de polymères biologiques, dont l'organisation est rendue possible par la forte concentration de ces polymères biologiques, et une structure cristalliquide constituée par les agents amphiphiles. De plus, la description de la structure des vésicules de cette demande fait clairement apparaître que la molécule biologique s'insère entre les couches d'amphiphiles, dans les couches d'eau interstitielles. Ainsi, le procédé décrit dans la demande internationale 30 WO 01/45672 qui présente l'avantage de permettre l'incorporation de 2868951 9 quantités très importantes (supérieures à 5% en poids par rapport aux agents amphiphiles) de polymères biologiques dans des vésicules lamellaires est limité aux concentrations très importantes nécessaires pour la réalisation de ces structures mixtes et à des structures dans lesquelles la macromolécule biologique est insérée dans les couches aqueuses de la structure des vésicules, ce qui serait difficile avec des macromolécules peu solubles dans l'eau. Par ailleurs, ces concentrations très importantes de principe actif biologique ne sont, dans bien des cas, pas recherchées alors qu'il y a une réelle difficulté, comme exposé précédemment pour introduire des charges importantes, bien qu'inférieures à ces valeurs, de produits peu solubles dans l'eau. Il existe donc une difficulté technique à l'incorporation de quantités relativement importantes de principes actifs peu solubles en phase aqueuse, en particulier de principes actifs d'origine biologique, dans des vésicules lipidiques. Solution proposée par l'invention: Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert qu'il était possible d'incorporer une quantité relativement importante de principes actifs réputés peu solubles dans des vésicules à structure lamellaire, en préparant dans une étape intermédiaire un mélange incorporant ces agents amphiphiles et le principe actif peu soluble et en préparant une phase lamellaire cristal- liquide à partir de ce mélange, puis en transformant cette phase lamellaire cristal-liquide en vésicules par application d'un cisaillement. Ainsi, la présente invention propose, selon un premier aspect, un procédé pour préparer ce mélange intermédiaire. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé pour préparer des vésicules lamellaires à partir de ce mélange. 2868951 10 Selon un troisième aspect, l'invention concerne, en tant que produits nouveaux, des mélanges obtenus en mettant en oeuvre le procédé qui fait l'objet du premier aspect de l'invention. Enfin, selon un dernier aspect, l'invention concerne, en tant que produits nouveaux, des vésicules multilamellaires obtenues en mettant en oeuvre le procédé faisant l'objet du deuxième aspect de la présente invention. Ainsi, selon sa caractéristique essentielle, le premier aspect de l'invention concerne un procédé pour préparer un mélange homogène contenant un agent amphiphile ou un mélange de plusieurs agents amphiphiles et au moins un principe actif dont l'un au moins est peu soluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a. Préparation d'une solution aqueuse contenant le ou lesdits principes actifs, b. Dispersion dudit agent amphiphile ou d'au moins un desdits agents amphiphiles, dans ladite solution, c. Elimination d'au moins une partie de l'eau, d. Ajout éventuel d'au moins un agent amphiphile complémentaire. Selon la caractéristique essentielle du deuxième aspect de l'invention, elle concerne un procédé de préparation d'une composition contenant des vésicules présentant une structure interne cristal-liquide lamellaire et contenant au moins un principe actif en leur sein, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: e. ajustement de la quàntité d'eau comprise dans le mélange homogène obtenu par le procédé qui fait l'objet du premier aspect de l'invention, de façon à lui conférer une structure de phase cristal-liquide lamellaire, 2868951 11 f. réarrangement de la phase cristal-liquide lamellaire en vésicules à structure interne cristalliquide lamellaire, par application d'un cisaillement. Selon le troisième aspect, l'invention concerne des mélanges susceptibles d'être obtenus par le procédé faisant l'objet du premier aspect de l'invention et contenant au moins 0.1% en poids d'au moins un principe actif peu soluble. Selon la caractéristique essentielle du dernier aspect de l'invention, elle concerne des compositions susceptibles d'être obtenues par le procédé faisant l'objet du deuxième aspect de l'invention et contenant un principe actif réputé peu soluble. Dans de telles compositions, le principe actif peu soluble se trouve inséré essentiellement dans les couches lipidiques de la structure lamellaire des vésicules. D'autres variantes et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit ainsi que dans les exemples. Le procédé complet de préparation des compositions contenant les vésicules, faisant l'objet du deuxième aspect de l'invention, passe par la préparation d'un mélange intermédiaire dont la préparation fait l'objet du premier aspect de l'invention. Ainsi, ce procédé complet passe par la formation d'un mélange intermédiaire qui incorpore de façon homogène le principe actif et les agents amphiphiles et utilise ce mélange homogène pour préparer une phase lamellaire cristal liquide. Comme exposé précédemment, le principe de préparation des compositions contenant des vésicules selon l'invention, de même que le procédé pour préparer le mélange homogène contenant au moins un agent amphiphile et au moins un principe actif s'avèrent intéressants dans le cas où l'un au moins de ces principes actifs est un principe actif peu soluble dans l'eau. 2868951 12 Par principe actif peu soluble dans l'eau au sens de la présente invention, on entend un principe actif dont la solubilité est inférieure à 50 mg/mL, de préférence inférieure à 20 mg/mL et de manière encore préférée inférieure à 10 mg/mL. L'invention s'intéresse essentiellement aux principes actifs de faible solubilité en milieu aqueux, telle que définie ci-dessus, présentant toutefois une certaine affinité pour les milieux amphiphiles. Ce sont donc des composés présentant dans -leur structure au moins une partie hydrophile. Il peut s'agir en particulier de composés contenant au moins une zone lipophile; c'est le cas particulier des protéines membranaires. Il peut également s'agir de composés présentant une queue lipidique. Ces composés peuvent être par eux-mêmes amphiphiles, et présenter une affinité à la fois pour les milieux aqueux et pour les milieux non aqueux. Ce ou ces principes actifs pourront être tous principes actifs d'origine biologique ou chimique. Par principes actifs d'origine biologique, on entend ceux obtenus par une méthode de fermentation ou d'expression génétique. Par principes actifs d'origine chimique, on entend ceux obtenus par synthèse chimique. A titre d'exemple, cette liste ne prétendant pas à l'exhaustivité, on peut citer: É Les peptides, É Les lipopeptides, obtenus par ajout d'une chaîne grasse sur un peptide, É Les polymères ionisables dans le domaine de pH où ils ne sont pas solubles, É Les protéines hydrophobes, en particulier les protéines membranaires et les protéines liposolubles, et d'une manière générale les protéines hors du domaine de pH où elles sont solubles dans l'eau, 2868951 13 É Les molécules organiques présentant des fonctions polaires non ioniques ou non ionisées dans les conditions d'emploi, et faiblement solubles en milieu aqueux, Comme exposé précédemment, le procédé de préparation du produit intermédiaire, mélange homogène contenant les amphiphiles et les principes actifs entrant dans les vésicules dont la préparation est visée dans le procédé complet qui fait l'objet du deuxième objet de la présente invention, comprend une première étape (a) de préparation d'une solution aqueuse contenant le ou lesdits principes actifs puis la dispersion lors de l'étape (b) du procédé du ou des agents amphiphiles dans la solution réalisée lors de l'étape (a). Dans la mesure où le procédé de l'invention présente un intérêt tout particulier dans le cadre des principes actifs peu solubles dans l'eau, la préparation de la solution lors de l'étape (a) nécessitera des quantités importantes d'eau. Selon une variante avantageuse du procédé, la solution réalisée lors de l'étape (a) est une solution saturée en au moins un desdits principes actifs. Le volume d'eau à utiliser est fonction de la quantité de principe actif que l'on souhaite incorporer. L'homme de l'art saura calculer ce volume, en fonction du titre de la solution saturée en principe actif. Plus faible est la solubilité du composé à incorporer, plus important sera le volume de solution à utiliser pour incorporer une quantité donnée. Par rapport à la quantité d'eau nécessaire pour la formation de la phase lamellaire préparée ultérieurement à partir du mélange intermédiaire, le volume de solution aqueuse utilisée dans cette étape peut être considérablement supérieur, plusieurs dizaines à plusieurs centaines de fois supérieur. La solution de principe actif préparée dans l'étape (a) peut contenir, outre le principe actif lui-même, différents additifs, en particulier 2868951 14 un tampon pour ajuster le pH, ou des conservateurs, ou des additifs permettant d'améliorer les performances des vésicules, comme leur stabilité physique ou chimique, ou leur étanchéité (capacité à limiter la fuite du principe actif). La dispersion préparée dans l'étape (b) peut être réalisée par tout moyen connu, et dans n'importe quel ordre. On peut, par exemple, ajouter la solution aqueuse sur l'agent ou les agents amphiphiles sous agitation. En général une agitation vigoureuse facilitera la dispersion. La dispersion peut se faire à température ambiante, ou à une autre température, soit plus basse, si par exemple le principe actif est sensible à la température et présente un risque de dégradation à température ambiante, soit plus haute, si cela peut faciliter la dispersion (en fluidifiant les composés amphiphiles par exemple). Si la formulation comprend plusieurs amphiphiles, la dispersion 15 peut se faire avec un seul d'entre eux ou directement avec l'ensemble des amphiphiles. Par souci de simplification il est préférable d'obtenir une dispersion contenant tous les composés de la formulation finale, mais ce n'est en aucun cas une obligation. Des additifs, en particulier des co-tensioactifs, des conservateurs ou des additifs à activité biologique comme des promoteurs d'absorption, peuvent être additionnés à ce stade du procédé directement dans la dispersion. Dans cette dispersion, les composés amphiphiles peuvent se trouver dans différents états connus de l'art antérieur, comme une dispersion de micelles, ou sous une forme plus structurée, par exemple sous forme d'une émulsion ou d'une microémulsion. Il faut cependant noter qu'il est préférable d'avoir une dispersion assez fluide, facile à manipuler, en particulier pour les étapes suivantes du procédé. 2868951 15 Dans l'étape (c), cette dispersion est évaporée, de manière à retirer au moins une partie de l'eau. On notera qu'il n'est pas indispensable de retirer la totalité de l'eau. Toutefois, cette possibilité peut être avantageuse, notamment à l'échelle du laboratoire. Par totalité de l'eau, on entend que quasiment toute l'eau présente est retirée, mais l'homme de l'art sait qu'il reste toujours, quelle que soit la méthode utilisée, une quantité d'eau résiduelle pouvant atteindre quelques pourcents. Cette étape d'évaporation peut être réalisée par tout moyen. Un simple évaporateur rotatif suffira pour une préparation de laboratoire. Si l'on veut améliorer le taux d'humidité résiduel, on peut utiliser une technique de lyophilisation. Cette technique de lyophilisation est préférée si le principe actif est sensible à la température, puisqu'elle permet de retirer la totalité de l'eau tout en effectuant toute l'opération à bassetempérature. Les conditions de lyophilisation ne sont pas critiques, et l'homme de l'art les adaptera en fonction de l'appareillage dont il dispose, et de ses contraintes techniques propres. Lorsque seulement une partie des agents amphiphiles utilisés pour la préparation ultérieure des vésicules a été introduite dans l'étape (b), on introduira les autres agents amphiphiles dans une étape (d) supplémentaire du procédé. Le mélange ci-après désigné par mélange intermédiaire, obtenu à l'issue de l'étape (c) lorsque tous les agents amphiphiles ont été introduits lors de l'étape (b) ou à l'issue de l'étape (d) lorsque seulement une partie des agents amphiphiles a été introduite dans l'étape (b), se présente sous une forme pâteuse ou solide suivant le degré d'élimination de l'eau dans l'étape (c). 2868951 16 Il s'agit d'un mélange dont la composition est homogène et dans lequel les agents amphiphiles et les principes actifs sont intimement mélangés. Ce mélange est en particulier sous forme solide lorsque l'élimination de l'eau est totale ou quasiment totale. Dans ce mélange, le principe actif est solubilisé au sein du mélange des agents amphiphiles. Une observation au microscope ne permet pas de déceler de présence notable de principe actif cristallisé. Ce mélange peut se présenter sous forme d'une poudre ou d'une pâte plus ou moins visqueuse. La consistance de ce mélange n'est pas critique pour la suite du procédé. Ce mélange peut éventuellement être stocké pour une utilisation ultérieure. Dans ce cas, il peut être nécessaire de le réfrigérer ou de le congeler, suivant la fragilité du principe actif qu'il contient. Il peut aussi être utilisé immédiatement pour l'étape suivante du procédé complet selon l'invention de préparation de la composition contenant les vésicules, sans être isolé du récipient d'évaporation ou de lyophilisation. Il peut être nécessaire de déterminer la teneur résiduelle en eau dans ce mélange intermédiaire. Les méthodes chimiques ou physico- chimiques de détermination de la teneur en eau sont connues et peuvent être utilisées indifféremment. Ce mélange intermédiaire est utilisé pour préparer une phase lamellaire cristal-liquide. Cette phase lamellaire est obtenue en ajustant la quantité d'eau contenue dans le mélange intermédiaire, de façon à former cette phase lamellaire. Cet ajustement peut résulter soit d'une addition d'eau au mélange intermédiaire si ce dernier contient moins d'eau que la quantité nécessaire pour la formation de la phase lamellaire soit d'une élimination supplémentaire d'eau si la quantité éliminée dans l'étape (c) du procédé de préparation du produit intermédiaire a laissé dans ce produit une 2868951 17 quantité d'eau supérieure à celle nécessaire pour la formation de la phase lamellaire cristal-liquide. La quantité d'eau à ajouter ou à éliminer pour réaliser cet ajustement est déterminée préalablement, par exemple par l'étude du diagramme de phase du système d'amphiphiles utilisés. La phase lamellaire est obtenue par mélange par tout moyen des composants. Quand la quantité d'eau résiduelle était égale ou supérieure à la quantité d'eau nécessaire à la formation de la phase lamellaire, ce mélange a pour fonction d'assurer l'homogénéité de l'ensemble des composants. A l'échelle du laboratoire ce mélange peut se faire par un agitateur magnétique ou mécanique, ou pour les très petites quantités par un mélange manuel à la spatule. Pour les plus grandes quantités un mélangeur industriel assurant une parfaite homogénéité du mélange est particulièrement 15 adapté. L'homme de l'art saura choisir le matériel le plus adapté en fonction de la viscosité des composants et du mélange final. Le mode opératoire du mélange n'est pas critique, car la phase lamellaire étant une phase à l'équilibre thermodynamique, sa formation ne 20 dépend pas de la méthode utilisée. Pour des raisons techniques et de rapidité de mise en oeuvre, lorsqu'on doit ajuster la formulation par addition d'eau on peut préférer ajouter lentement l'eau au mélange des agents amphiphiles et du principe actif de l'étape précédente, sous agitation. La phase lamellaire peut être caractérisée par sa texture en microscopie optique en lumière polarisée. Elle présente une biréfringence caractéristique avec une texture de défauts assez fine. L'observation en microscopie permet aussi de déceler une éventuelle inhomogénéité, et en particulier la présence de zones isotropes, révélatrices d'un excès d'eau. Elle permet aussi de vérifier que le principe actif n'a pas reprécipité. 2868951 18 Eventuellement une analyse en diffraction des rayons X aux petits angles permet de mettre en évidence la nature lamellaire cristalliquide de la phase. Cependant, suivant la formulation utilisée, le contraste de densité électronique peut être faible et ne pas conduire à une signature très caractéristique en diffraction des rayons X. La phase lamellaire doit être cisaillée pour obtenir la mise en forme de vésicules lamellaires. Ceci peut être obtenu par le procédé décrit dans WO93/19735, qui décrit une méthode de cisaillement homogène. Cependant, suivant la formulation adoptée, le cisaillement n'a pas besoin d'être homogène et la formation des vésicules est directement obtenue par le cisaillement appliqué pour ôbtenir la phase lamellaire. Cette étape de cisaillement est donc en général confondue avec l'étape précédente de mélange permettant d'obtenir la phase lamellaire. La caractérisation de cette phase peut se faire suivant les mêmes méthodes décrites précédemment. Cette phase contient donc une quantité de principe actif égale à la quantité qui était contenue dans la solution aqueuse initiale. Si le volume de la solution de principe actif utilisée lors de la première étape (a) du procédé est cent fois supérieur au volume de la partie aqueuse de la formulation finale, on comprend aisément qu'on a obtenu un enrichissement d'un facteur cent, par rapport à un procédé qui aurait consisté à préparer directement la phase lamellaire avec la solution saturée du principe actif. Les compositions obtenues à l'issue de l'étape (f) contiennent des amphiphiles, au moins un principe actif, des éventuels additifs et de l'eau. La proportion d'eau est en général comprise entre 10 et 90 %, de préférence entre 20 et 80 % et de manière encore préférée de 30 à 70 %. Suivant le type d'application envisagé, la phase obtenue à l'issue de l'étape (f) peut être utilisée directement, par exemple en tant que composition pharmaceutique. 2868951 19 Elle peut par exemple constituer une crème pour un usage topique. Dans d'autres cas, le produit obtenu à l'issue de l'étape (f) peut être utilisé dans une étape ultérieure (g) du procédé au cours de laquelle ce produit peut être soit conditionné, soit soumis à une étape de dispersion dans un milieu adéquat. Ainsi, par exemple, le produit obtenu à l'issue de l'étape (f) peut être conditionné en capsules molles ou en sachets pour une administration orale. Pour d'autres applications, il peut être nécessaire de disperser cette phase lamellaire de vésicules dans un milieu, en particulier un milieu pharmaceutique, adéquat. Cela peut être de l'eau pour injection par exemple. On obtient alors une suspension de vésicules lamellaires dans le milieu choisi. Les vésicules gardent leur structure interne lamellaire cristal- liquide et le principe actif reste incorporé en leur sein. Ces vésicules lamellaires peuvent être utilisées pour l'administration de médicaments ou de vaccins. Du fait de leur forte charge en principe actif, elles permettent de limiter le volume d'administration, ainsi que la quantité d'excipients apportée avec le principe actif. Dans le cas d'un vaccin par exemple comme le vaccin de la grippe, la protéine antigène utilisée est l'hémaglutinine HA. C'est une protéine faiblement soluble dans l'eau, à une concentration maximale de l'ordre de 250 pg/mL. La préparation de vésicules lamellaires selon la méthode décrite dans WO93/19735 ou dans WO 01/19335 conduirait à une charge de 100 pg de protéine par gramme de vésicules, on arrive avec la méthode de l'invention à une charge de 18,2 mg/g, soit une amélioration d'un facteur voisin de-180. Cela signifie que pour administrer 15 pg d'antigène, on n'apporte grâce à l'invention qu'environ 500 pg d'amphiphiles, alors qu'avec une méthode classique la formulation aurait apporté presque 40 mg d'amphiphiles. 2868951 20 Les agents amphiphiles utilisés selon la présente invention sont tous ceux classiquement utilisés pour la préparation de vésicules lamellaires à structure interne cristal-liquide, dites vésicules à structure en oignon. D'une façon générale, ces agents amphiphiles sont avantageusement choisis dans le groupe constitué : - des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des esters des acides gras en C6 à C30r saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) , - des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, - de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol, - des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) - des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés; linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol. A ces amphiphiles qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange, on peut éventuellement ajouter des co-tensioactifs afin d'améliorer la rigidité et/ou l'étanchéité des bicouches formant la vésicule. Parmi ces molécules, on peut citer: - le cholestérol et ses dérivés, en particulier les esters de 30 cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol 2868951 21 - les autres dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale communément appelés phytostérols (sitostérol, sigmastérol...) les céramides. La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de molécules amphiphiles. On utilise généralement au moins deux agents amphiphiles différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet de régler en continu les propriétés des bicouches et ainsi de contrôler l'apparition de l'instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires. Ainsi, on choisira avantageusement parmi les agents amphiphiles ci-dessus, deux agents amphiphiles présentant des propriétés relativement différentes, en particulier une balance hydrophile-lipophile (HLB) différente. Le premier agent amphiphile présentera avantageusement une balance hydrophile-lipophile comprise entre 1 et 6, de préférence entre 1 et 4, alors que le deuxième agent amphiphile aura une balance hydrophilelipophile supérieure à 3, de préférence supérieure à 4. Il est également possible d'ajouter des polymères naturels ou artificiels tels que des polysaccharides (alginate, chitosan, ...) afin de renforcer la solidité des vésicules. Ces polymères sont des additifs destinés à améliorer les performances des vésicules. Ils peuvent être ajoutés soit dans la phase aqueuse initiale ou dans l'eau ajoutée à l'étape d, s'ils sont hydrophiles, soit ajoutés en même temps que les amphiphiles (étape b) s'ils sont compatibles avec ces agents. L'invention concerne non seulement le procédé de fabrication du produit intermédiaire ainsi que des compositions contenant des vésicules lamellaires à structure interne cristal-liquide. 2868951 22 Elle concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les mélanges intermédiaires et des compositions tels qu'obtenus par les procédés décrits précédemment. Les mélanges intermédiaires, selon l'invention, contiennent au moins 0,1% en poids d'au moins un principe actif peu soluble dans l'eau, c'est à dire dont la solubilité est inférieure à 50 mg/mL et généralement inférieure à 20 mg/mL, de manière préférentielle inférieure à 10 mg/mL et plus particulièrement des produits peu solubles précisant au moins une partie lipophile tels que définie précédemment. Les vésicules nouvelles contenues dans les compositions de l'invention contiennent de 0,1 à 10% en poids, etc. de préférence de 0,1 à 5% en poids par rapport au poids sec de la composition d'un principe actif peu soluble dans l'eau tel que défini précédemment. Dans les compositions de l'invention, les vésicules ont gardé la structure lamellaire de la phase cristal-liquide dont elles sont issues, et présentent une forte charge en principe actif. Dans ces vésicules, le principe actif, de par sa nature lipophile ou amphiphile, et faiblement soluble dans l'eau est inséré majoritairement dans les couches d'amphiphiles. Ainsi, même à concentration identique en principe actif, les compositions de l'invention se distinguent structurellement de celles obtenues par le procédé décrit dans la demande internationale WO 01/45672 qui conduit à des vésicules dans lesquelles le principe actif est inclus dans les couches aqueuses. Le procédé de l'invention est intéressant lorsqu'on veut obtenir une charge utile la plus importante possible (rapport entre la masse de principe actif et le total des excipients le plus élevé possible). Le procédé complet de l'invention s'applique préférentiellement à des formulations contenant plus de 0,1% en masse de principe actif par rapport au poids total des vésicules. La limite supérieure de la proportion 2868951 23 de principe actif dans la formulation est fixée par l'ensemble des paramètres que constituent la solubilité aqueuse du principe actif, sa solubilité dans les amphiphiles et des considérations techniques telles que le volume maximal d'eau que l'on peut évaporer dans des conditions industrielles (qui incluent donc les notions de temps de manipulation et de rentabilité). Il est donc difficile de fixer une limite supérieure à la proportion de principe actif dans la formulation. L'expérience montre qu'une proportion de 10% de principe actif est rarement dépassée, et que la proportion de 5% est souvent une limite technique. Exemple: L'exemple 1 illustre la méthode de l'invention dans le cas d'une solution d'hémaglutinine du virus de la grippe. L'exemple 2 servant de contre-exemple montre que dans le cas d'une protéine très soluble dans l'eau, comme l'albumine de sérum humain (HSA), le procédé n'est pas utile et ne permet pas d'améliorer la charge en protéine par rapport à ce qui est obtenu à l'exemple comparatif 3 selon l'art antérieur. Exemple 1 (selon l'invention) Préparation d'une composition chargée en hématoglutinine de la grippe HA A partir d'une solution initiale à 248pg/mI en HA, on prépare une composition contenant des vésicules multilamellaires de telle façon que le rapport massique lipides/hématoglutinine soit dans les proportions de 35/1, en procédant comme exposé ci-dessous. 3ml de la solution de HA à 248pg/mI sont introduits dans un pot en verre à lyophiliser de 10mI. Y sont ajoutés 22.9mg de Phospholipon 90 (phosphatidylcholine purifiée de Phospholipid) et 3.2mg de Simulsol 2599 (Macrogol oléate de Seppic). L'homogénéisation de la suspension se fait 2868951 24 par agitation du mélange à température ambiante, qui est ensuite placé à 37 C pendant 1H et mélangé à nouveau au vortex. L'étape suivante consiste à lyophiliser cette suspension afin d'éliminer l'eau. Au mélange pâteux ainsi obtenu 14.lmg d'eau sont incorporés sous agitation douce, pour former les vésicules multilamellaires. Les vésicules ainsi formées sont chargées à 744pg de HA pour 26mg de lipides. Le rendement d'encapsulation est déterminé par une méthode SDS-PAGE (sel à 10%) en conditions dénaturantes et réductrices (SDS et mercaptoéthanol). L'évaluation du rendement se fait par comparaison avec une gamme étalon de la solution initiale. On trouve un rendement d'encapsulation voisin de 90% Exemple 2 (comparatif) Application du mode opératoire de l'invention à une protéine hydrosoluble, dHSA On prépare une composition contenant des vésicules multilamellaires présentant la composition suivante dans laquelle les 20 Dans un pot en verre à lyophiliser de 10mI contenant 3ml d'une solution aqueuse d'HSA à 666.7pg/mI sont ajoutés 24.4mg de Phosphatidylcholine et 1.7mg de Polysorbate 80. L'ensemble est placé sous agitation magnétique à 1000tr/min pendant 5min pour obtenir une proportions sont exprimées en pourcentages massiques. 57.8% Phosphatidylcholine (Phospholipon 90 de Phospholipids) Polysorbate 80 (Seppic) 4.0% HSA 4.8% Eau 33.4% 2868951 25 suspension homogène. Une deuxième étape consiste à éliminer l'eau par lyophilisation pour obtenir un prémixe composé des lipides et de I'HSA. Dans l'étape suivante sont ajoutés à ce prémixe 14.1 mg d'eau. La formation des vésicules multilamellaires est alors réalisée par mélange de ce système à la spatule. Afin de déterminer le rendement d'encapsulation de l'HSA, les vésicules ainsi formées sont dispersées à 6.7% dans de l'eau. Pour cela 587,65p1 d'eau sont incorporés lentement aux 42.2mg de vésicules précédemment préparés. Le rendement d'encapsulation est réalisé par dosage HPLC de la quantité d'HSA présente dans le milieu dispersant après séparation des vésicules. Pour le dosage, 500mg de dispersion ramenée à 0.1% d'HSA sont introduits dans une fiole jaugée de 5 ml. Après avoir complété à 5ml avec de l'eau, l'ensemble est homogénéisé au vortex. La séparation des sphérulites et du milieu de dispersion se fait par centrifugation pendant 1 heure à 4 C et 21400g. Dans ces conditions, le rendement d'encapsulation est déterminé à 10%. Exemple 3 (comparatif, Préparation de vésicules incorporant HSA via le protocole de fabrication classique Des vésicules dont la composition est donnée ci-après sont préparées suivant le protocole classique, soit en hydratant le mélange de tensioactifs 25 avec une solution d'HSA concentrée. Phosphatidylcholine (Phospholipon 90 de Phospholipids) 61% Polysorbate 80 (Seppic) 4.0% HSA 7% Eau 28% 2868951 26 Dans un tube eppendorf de 2ml sont introduits 305,1mg de Phospholipon 90 et 20.lmg de Polysorbate 80. L'ensemble est mélangé à la spatule puis 175.3pl d'une solution d'HSA à 200mg/ml sont incorporés pour former les vésicules. Le rendement d'encapsulation déterminé suivant les mêmes conditions que dans l'exemple 2 est alors de 66%. 27 REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer un mélange homogène contenant un agent amphiphile ou un mélange de plusieurs agents amphiphiles et au moins un principe actif dont l'un au moins est peu soluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a. Préparation d'une solution aqueuse contenant le ou lesdits principes actifs, b. Dispersion dudit agent amphiphile ou d'au moins un desdits agents amphiphiles, dans ladite solution, c. Elimination d'au moins une partie de l'eau, d. Ajout éventuel d'au moins un agent amphiphile complémentaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite 15 solution aqueuse est une solution saturée en au moins un desdits principes actifs. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit principe actif peu soluble dans l'eau présente une solubilité inférieure à 50 mg/mL, de préférence inférieure à 20 mg/mL, de préférence encore inférieure à 10 mg/mL. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit principe actif peu soluble dans l'eau contient en outre au moins une partie lipophile. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit principe actif peu soluble dans l'eau est choisi dans le groupe constitué : É des peptides, É des lipopeptides, obtenus par ajout d'une chaîne grasse sur un peptide, 2868951 28 É des polymères ionisables dans le domaine de pH où ils ne sont pas solubles, É des protéines hydrophobes, en particulier des protéines membranaires et des protéines liposolubles, et d'une manière générale des protéines hdrs du domaine de pH où elles sont solubles dans l'eau, É des molécules organiques présentant des fonctions polaires non ioniques ou non ionisées dans les conditions d'emploi, et faiblement solubles en milieu aqueux, 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ou lesdits agents amphiphiles sont choisis dans le groupe constitué : - des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des esters des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) , - des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés; linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol, - des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) - des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, 2868951 29 - de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite solution contient en outre, au moins un additif, choisi parmi les tampons destinés à ajuster le pH, les agents conservateurs et les additifs permettant d'améliorer les performances des vésicules, par exemple leur stabilité physique ou chimique ou leur étanchéité. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite dispersion contient en outre, au moins un additif choisi dans le groupe des agents co-tensioactifs, des conservateurs et des additifs à activité biologique, par exemple les promoteurs d'absorption. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le ou lesdits composés amphiphiles se trouvent à l'état de micelles, d'une émulsion ou d'une microémulsion au sein de ladite dispersion. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite élimination d'au moins une partie de l'eau est réalisée par évaporation. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite élimination d'au moins une partie de l'eau est réalisée par lyophilisation. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que ladite élimination de l'eau est totale. 13. Procédé de préparation d'une composition contenant des vésicules présentant une structure interne cristal-liquide lamellaire et contenant au moins un principe actif en leur sein, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: e. ajustement de la quantité d'eau comprise dans le mélange homogène obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 11, de 2868951 30 façon à ce qu'elle corresponde à la quantité nécessaire d'eau pour conférer audit mélange une structure de phase cristal-liquide lamellaire f. réarrangement de la phase cristal-liquide lamellaire en une phase de vésicules à structure interne cristal-liquide lamellaire, par application d'un cisaillement. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape (g) de conditionnement du produit obtenu à l'étape (f) ou de dispersion de ce produit dans un milieu adéquat. 15. Mélange susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il contient au moins 0,1 % en poids d'au moins un principe actif peu soluble tel que défini dans l'une des revendications 3 à 5. 16. Composition susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que lesdites vésicules contiennent au moins 0,1 % en poids d'un principe actif réputé peu soluble tel que défini dans l'une des revendications 3 à 5. 17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites vésicules contiennent de 0,1 à 10 % en poids d'un principe actif réputé peu soluble tel que défini dans l'une des revendications 3 à 5, de préférence de 0,1 à 5 % en poids. 18. Composition selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que ledit principe actif est majoritairement incorporé dans les couches d'amphiphiles desdites vésicules.