FR 2840809 A1 20031219 FR 0307276 A 20030617 UTILISATION D'UNE FRACTION HYDROPHILE DE FRUIT DE Hippophae rhamnoides POUR LA PRÉVENTION ET LE TRAITEMENT DU DERME. La présente invention concerne l'utilisation d'une fraction hydrophile de fruit de Hippophae rhamnoides pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique pour la prévention ou le traitement du derme. La peau est principalement constituée de kératinocytes, cellules formant l'épiderme et de fibroblastes, cellules formant le derme. Ces cellules sont enfouies dans un réseau fibrillaire complexe constitué de macromolécules appelé Matrice Extra-Cellulaire (MEC). Ce réseau moléculaire est essentiellement développé au niveau du derme. La matrice extra-cellulaire dermique est principalement constituée de fibres de collagène et d'élastine mais aussi de protéoglycanes, fibronectine et autres protéines glycosylées. Elle joue un rôle important au niveau de diverses fonctions biologiques de la peau et, en plus d'en assurer son soutien physique, elle représente une aire d'échange et de communication permettant aux métabolites et aux facteurs de croissance de diffuser entre les cellules. L'intégrité de la matrice extra-cellulaire est en partie soumise à l'équilibre créé entre l'apport de molécules participant à sa synthèse et la dégradation de ces mêmes molécules. Les mécanismes de dégradations impliquent un grand nombre de molécules dont les métalloprotéinases matricielles (MMP), enzymes responsables de la dégradation des macromolécules de la matrice extra-cellulaire et de la jonction dermo-épidermique (JDE). L'équilibre enzymatique des métalloprotéinases matricielles est contrôlé naturellement par la présence d'inhibiteurs tissulaires de ces métalloprotéinases (TIMP). Mais le vieillissement et les agressions environnementales comme les rayonnements UV brisent l'équilibre en faveur des métalloprotéinases matricielles. Le vieillissement est un phénomène physiologique complexe et inéluctable. Celui-ci est associé à une diminution progressive de l'épaisseur du derme et à des perturbations au niveau de l'épiderme, altérant la cohésion cellulaire. Il entraîne donc d'importantes dégradations à tous les niveaux de la peau, les plus importantes étant situées au niveau du derme, de la jonction dermo- épidermique et de la couche basale de l'épiderme. Ainsi, la modification des fibres d'élastine, entraînant une perte d'élasticité et de tonicité du derme, est le premier signe du vieillissement dermique. Les facteurs induisant le vieillissement sont multiples : - les facteurs génétiques et les facteurs internes (condition physique, état hormonal...) induisent et modulent le vieillissement normal dit intrinsèque ou chronologique ; - les facteurs externes peuvent contribuer à l'accélérer (rayonnement UV, polluants, températures excessives...); il s'agit du vieillissement dit actinique. Les signes cutanés que l'on attribue au vieillissement sont en grande partie dus au vieillissement actinique qui cause le vieillissement prématuré de la peau. Le derme va donc subir des désordres importants. La matrice extra-cellulaire devient désorganisée et ces modifications conduisent à un relâchement du tissu qui se traduit par l'apparition de rides au niveau de l'épiderme. La jonction dermo-épidermique est aussi affectée car elle n'est plus soutenue par la matrice extra- cellulaire ; elle s'aplatit et entraîne une diminution de sa surface de jonction. Le collagène, qui représente le " ciment " du derme, donne à la peau solidité et résistance. Le vieillissement cutané est provoqué par une diminution de la synthèse de collagène, causant l'apparition de rides et ridules. De plus, l'appauvrissement du derme en acide hyaluronique, responsable de l'hydratation et du gonflement des tissus, provoque une perte de volume et d'hydratation de la peau. Le fruit de Hippophae rhamnoides est un akène enveloppé du calice persistant et charnu simulant une drupe ovoïde jaune orangé, et renferme une graine. De ce fruit est extrait un jus très énergétique riche en vitamine C, en acides organiques (essentiellement de l'acide malique), qui contient aussi des vitamines Bl, B3, P, des oligo-éléments, des protides et des glucides. Ce jus est riche en pulpe, et cette pulpe est source d'huile contenant des caroténoïdes (essentiellement du B-carotène), des tocophérols, des acides gras essentiels (acide linoléique et linolénique), de l'acide palmitoléique qui est un acide gras contenu dans le sébum, très rare dans le monde végétal, des stérols, des alcools triterpéniques et des alcools gras. Enfin, de la graine de Hippophae rhamnoides est extraite une huile, plus riche en acides gras essentiels que l'huile issue de la pulpe, mais dont la teneur en acide palmitoléique est faible. L'art antérieur connaît déjà de nombreuses propriétés des différentes fractions de fruit de Hippophae rhamnoides. Une étude a montré l'action photoprotectrice et anti-inflammatoire de l'huile de graine de Hippophae rhamnoides in vivo (A. Hiriscu et al, Farmacia, vol XXXI, nr, 1,1983, 39-43). Une autre étude a montré l'activité bactériostatique et cicatrisante en application topique (G. Neatmu et al Stud Cercet Biochim, 1982,25, 30-34, in Chem Abst., 1983,99, 478888e). Le brevet HU T068753 décrit l'utilisation de l'huile de pulpe du fruit dans le domaine cosmétique pour des protections solaires. Le brevet JP63145210A2 décrit l'utilisation de l'huile des graines ou de l'huile de la pulpe du fruit de Hippophaé rhamnoides, plus particulièrement l'utilisation d'une fraction lipidique de la graine et de la pulpe pour son activité anti-oxydante. Précisément, le document décrit que cette activité est due à la présence de tocophérols. Le brevet JP2212415 décrit une composition pour le bain contenant une solution extraite de fruit de Hippophaé rhamnoide. Cette solution est utilisée en raison de ses qualités de dispersion, d'embellissement de la peau et de la sensation agréable que provoque son utilisation sur la peau. La publication de L. Constantino (L. Constantino et al, Fitoterapia, vol LXV, 1,1994, 44-47) décrit l'étude du fruit de Hippophaé rhamnoides dans le but d'identifier des substances naturelles susceptibles de traiter les pathologies dues aux radicaux libres. Les propriétés antiradicalaires et antilipopéroxydantes de ce fruit sont dues aux polyphénols et aux anthocyanines présentes dans la phase méthanolique. De même, la publication de X. Gao (X. Gao et al, J. Agric Food Chem, 2000,48, 1485-1490) s'intéresse aux propriétés anticancéreuses du fruit de Hippophaé rhamnoides et a pour but d'optimiser leur utilisation dans des traitements anticancéreux. Ce document montre que la fraction hydrophile a de bonnes propriétés antiradicalaires. La Demanderesse a mis en évidence que la fraction hydrophile du fruit de Hippophaé rhamnoides est, de manière inattendue, capable d'inhiber les enzymes destructrices du derme, cause du vieillissement cutané ainsi que l'application en cosmétique d'une telle fraction. La Demanderesse a mis en évidence que la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est, de manière inattendue, capable d'inhiber l'expression excessive des métalloprotéases matricielles du derme, au niveau de la jonction dermo-épidermique et du derme profond en présence de stress. La Demanderesse a également mis en évidence que la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est capable de protéger les cellules dermiques et d'améliorer la viabilité et l'activité métabolique des cellules dermiques en condition de stress. L'étude a été réalisée sur cultures de fibroblastes en dosant deux métalloprotéases matricielles (MMP) distinctes présentes dans le surnageant de culture : - la MMP-1 (appelée aussi collagénase-1) : celle-ci agit au niveau du derme profond et dégrade les collagènes I et III - la MMP-2 (appelée aussi gélatinase A) est présente au niveau de la jonction dermo-épidermique et dégrade les collagènes IV et VII, ainsi que l'élastine. Les travaux de la Demanderesse ont montré que la fraction hydrophile du fruit de Hippophaé rhamnoides inhibe le relargage des MMP par des fibroblastes soumis à un stress UV. Cette inhibition est observée lorsque l'actif est ajouté à la culture cellulaire, aussi bien avant, que pendant ou après le stress UV. La fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides permet donc de rétablir l'équilibre enzymatique après un stress UV et donc de préserver la matrice extracellulaire d'une surproduction de métalloprotéases matricielles. Elle permet aussi d'assurer la cohésion cellulaire en protégeant le collagène VII qui forme les fibrilles d'ancrage épiderme-derme. Cette invention permet donc de lutter contre les effets du vieillissement actinique et peut être aussi un moyen de se protéger contre les effets néfastes du soleil, notamment les transformations structurales et fonctionnelles de la matrice extracellulaire, amplifiées lors de l'exposition à l'environnement et aux ultraviolets. Les travaux de la Demanderesse ont également montré que la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides inhibe l'activité de protéases (élastase et collagénase-1) et de la hyaluronidase, présentes dans le derme, confirmant le rôle de cet actif dans la protection du derme et dans la prévention du vieillissement actinique. Ainsi, l'effet de la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides, déjà connue pour être in vitro un inhibiteur de la production des radicaux libres, permet également d'inhiber certaines enzymes du derme. L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophaé rhamnoides pour la fabrication d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, pour la prévention ou le traitement du derme, en vue notamment d'allonger la durée de vie des cellules ou encore pour la prévention ou la lutte contre les effets du vieillissement et du photovieillissement liés à la dégradation du derme. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophaé rhamnoides pour la fabrication d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique destinées à prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et plus particulièrement ceux choisis parmi : la perte d'élasticité et la perte d'hydratation du derme, et la perte de la résistance cutanée. L'invention a également pour objet l'utilisation de ladite fraction d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophaé rhamnoides pour la fabrication d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique destinées à la prévention et la lutte contre les effets néfastes du soleil sur le derme. La Demanderesse a démontré que l'utilisation selon l'invention est basée sur la preuve qu'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est susceptible d'inhiber l'expression ou l'activité d'enzymes au niveau du derme, et notamment d'inhiber l'expression excessive des métalloprotéases matricielles du derme, au niveau de la jonction dermo-épidermique et du derme profond en condition de stress. La Demanderesse a aussi démontré qu'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est susceptible d'inhiber l'activité de protéases du derme, en particulier de l'élastase et de la collagénase-1. Une telle fraction est alors utilisée selon l'invention dans composition pour la prévention et/ou le traitement d'une perte d'élasticité et de résistance du derme. La Demanderesse a aussi démontré qu'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est susceptible d'inhiber l'activité de la hyaluronidase, Une telle fraction est alors utilisée selon l'invention dans une composition destinée à la prévention et/ou le traitement de la perte de la résistance cutanée et de la déshydratation. De préférence, la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est un pressurat, de préférence un pressurat dépulpé. Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, la fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides est un extrait aqueux. Avantageusement, la composition utilisée selon l'invention comprend en outre une fraction lipophile du fruit de Hippophae rhamnoides. On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description, faite ci-après à titre purement explicatif, d'un mode de réalisation de l'invention. La composition selon l'invention contient comme agent actif une fraction hydrophile de fruit de Hippophae rhamnoides. Cet agent actif est un inhibiteur d'enzymes contenues dans le derme. Ces enzymes sont notamment les protéases du derme (élastase et collagénase), et la hyaluronidase. Par fraction hydrophile, on entend un pressurat, obtenu par pressage de baies fraîches de fruit de Hippophae rhamnoides. Ce procédé d'obtention du pressurat ne nécessite aucune intervention de solvant. Les pressions utilisées pour obtenir ce pressurat sont des pressions standard. Ce pressurat peut être utilisé tel quel ou peut être concentré et séché. Le pressurat peut également être dépulpé par décantation, centrifugation ou par voie enzymatique, notamment à l'aide d'une pectine méthyl estérase. Ce pressurat dépulpé peut aussi être concentré et séché. En effet, la fraction hydrophile est active en elle-même et ne nécessite pas les composés contenus dans la pulpe pour être active et bénéfique pour la peau. La fraction hydrophile peut aussi être un extrait aqueux, obtenu par des techniques d'extraction comme la macération, la percolation ou l'extraction assistée par micro-ondes à partir de fruits frais ou secs. Ladite composition selon l'invention peut aussi comprendre une fraction lipophile de fruit de Hippophae rhamnoides, et ce de manière à compléter l'activité de ladite fraction hydrophile grâce à un apport de composés apolaires reconnus pour leurs propriétés anti-radicalaires (grâce aux tocophérols et aux caroténoïdes), d'amélioration de la capacité d'hydratation de l'épiderme (grâce aux acides gras essentiels), de stimulation du métabolisme des fibroblastes et amélioration de l'élasticité cutanée par l'apport d'insaponifiables et d'activité protectrice et apaisante (anti-inflammatoire) permettant de faire face aux agressions extérieures. La composition cosmétique dans laquelle la fraction hydrophile est couplée avec la fraction lipophile aura une action améliorée par cette activité anti-radicalaire. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une fraction hydrophile de fruit de Hippophaé rhamnoides, pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané, et plus particulièrement ceux choisis parmi : la perte d'élasticité et d'hydratation du derme, la perte de la résistance cutanée, la formation de rides et de ridules. En effet, cette fraction a une action inhibitrice sur des enzymes destructrices de la peau contenues dans le derme, et notamment sur la hyaluronidase, l'élastase, et la collagénase. En effet, la hyaluronidase intervient lors de phénomènes inflammatoires, d'agression physico-chimiques en déstructurant l'acide hyaluronique, constituant essentiel de la matrice extracellulaire intervenant dans l'hydratation et le gonflement des tissus. L'élastase intervient dans le processus de dégradation des fibres d'élastines qui s'opère au cours du temps. Son action provoque la perte d'élasticité du derme, ce qui est un signe de vieillissement. L'inhibition de ces deux enzymes aura pour conséquence le maintien de l'élastine et de l'acide hyaluronique dans le derme, et donc le maintien de la souplesse et de l'hydratation de la peau. La collagénase est une protéase qui détruit le collagène. Le collagène est une protéine de structure assurant la résistance et la souplesse de la peau. Le vieillissement cutané provoque une diminution de cette protéine dans la peau, et par là même l'apparition de rides et ridules. Ainsi, l'inhibition de la collagénase a pour effet un maintien du collagène dermique, et donc de la structure de la peau. L'invention sera mieux comprise, et ses avantages ressortiront mieux, à la lumière des exemples suivants, qui sont donnés à titre illustratif, et sans limitation. Exemple 1 : crème de jour anti-rides On prépare, de manière classique pour l'homme du métier, une crème de soin ayant la composition décrite ci-dessous. L'extrait C02 Argousier mentionné dans l'exemple est un extrait de baies séchées obtenu par extraction au C02 supercritique : c'est un extrait total qui regroupe la fraction lipidique de la pulpe et la fraction lipidique de la graine. Aqua QS100% Coco-caprylate-caprate 5.000% Butylène glycol 4.000% Dimethicone 4. 000% Propylène glycol 3.000% Glyceryl stearate&PEG-100 stearate 3.000% Glycerin 2.000% Glycerin searate 2.000% Stearyl alcohol 1.200% Butyrospermum parkii 1. 000% Cyclopentasiloxane and dimethiconol 1.000% Paraffinum liquidum 1.000% Jus d'argousier 0.500% Parfum 0.500% Preservatives 0.400% Ethyl linoleate 0.300% Xanthan gum 0.200% Retinyl palmitate 0.105% Tocopheryl acetate 0.100% Acrylates/C10-30 Alkyl acrylate crosspolymer 0.050% Tetrasodium EDTA 0.025% Sodium hydroxide 0.010% C02 Argousier 0.010% Ascorbyl palmitate 0.001% Exemple 2 : Crème de nuit On prépare, de manière classique pour l'homme du métier, une crème de soin ayant la composition cidessous. Aqua QS100% Zea mays & Triticum vulgare 6.000% Buxus chinensis 5.000% Glyceryl stearate 5. 000% Cyclopentasiloxane & Cyclohexasiloxane 3.000% Glycerin 3.000% Cetyl alcohol 2.000% PPG-2 Myristyl ether propionate 2.000% PEG-8 stearate 1.900% Jus d'argousier 1.500% PEG-100 stearate 1.500% Butylene glycol 1.100% Dimethicone 1.000% Glycine soja 1.000% Stearic acid 1.000% Ceteh-20 0.600% Exemple 3 : Activité anti-hyaluronidase d'un extrait de pressurât dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides a) Principe du dosage : Après un contact entre l'enzyme (hyaluronidase) et le substrat (acide hyaluronique) à 37 C, des sucres sont formés en milieu alcalin à partir des groupements N-acétyle glucosamine libérés lors de la réaction enzymatique. Ces sucres, en solution acide, sont ensuite transformés en dérivés furannes qui réagissent avec le p-diméthyle benzaldéhyde pour former un complexe coloré. Le taux de Nacétyle glucosamine libéré par unité de temps est une mesure de l'activité anti-hyaluronidase. b) Préparation des réactifs La hyaluronidase utilisée pour le dosage (réf. H 3 506 Sigma) est extraite de testicules de taureau. Son pH optimal est de 4 et sa température optimale de 37 C. Pour réaliser les expérimentations décrites dans cet exemple, on utilise un pressurat de fruit de Hippophae rhamnoides dépulpé par décantation, qui contient encore quelques résidus solides qui ont tendance à décanter dans le temps. On prépare 24 heures avant le jour de l'expérimentation la solution substrat qui est une solution d'acide hyaluronique 25 mg dans 10 ml de tampon acétate de sodium 9.103 M (solubilisée ensuite à 4 C sous agitation pendant 12 heures au moins). Le jour de l'expérimentation, on prépare : une solution enzymatique de hyaluronidase 22 mg dans 10 ml de tampon (conservée à 4 C), une solution de Borax 1,22 mg dans 5 ml de tampon (solubilisation par chauffage doux), une solution de p. diméthyl amino benzaldéhyde 10 g dans 100 ml d'un mélange acide acétique/acide chlorhydrique (88-12) et une solution d'héparine (inhibiteur de référence) : 0,135% dans du tampon pH4 (conservée à 4 C). Le mélange réactionnel est préparé dans des tubes à hémolyse et ce à 10 C. Chaque tube contient 1200 l de solution substrat d'acide hyaluronique, 450 \il de solution enzymatique de hyaluronidase, de 10 à 300 l de pressurat de fruit de Hippophaé rhamnoides dépulpé à tester et du tampon pH4 précédemment préparé (2250 l QSP). c) Mode opératoire On place les tubes dans un bain-marie à 37 C pendant 45 min. La réaction colorimétrique se déroule dans des tubes en verre sur 500 [il du mélange réactionnel. Puis on ajoute à froid dans chaque tube de 500 \il à 100 \il de la solution de Borax précédemment préparée. Les tubes sont placés au bain-marie à 100 C 3 min, puis refroidis. On ajoute enfin à froid sous agitation et à intervalles de temps réguliers (30 secondes) 3 ml de solution de 4 diméthyl benzaldéhyde. Après avoir laissé la coloration se développer à froid pendant 30 min, on lit toutes les 30 secondes chaque tube l'un après l'autre à 585 nm. d) Résultats : Les valeurs des CI 50 sont déduites à partir du volume de demi inhibition, mesuré graphiquement. CI50=C(%) x vol (ml)/vol total, le volume total du mélange réactionnel étant de 2250 L, soit 2,25 ml. - Pourcentage d'inhibition de 100 \il de pressurat dépulpé testé : 64,5%. - Calcul de l'activité de l'échantillon : L'activité de l'échantillon, exprimée en unité d'absorbance, est calculée par rapport à l'inhibiteur de référence : Activité hyaluronidase = CIso(référence)/ CI50 (essai) *100 Il y a bien inhibition de l'activité enzymatique en présence de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophaé rhamnoides. La CI 50 de l'extrait testé est de 3,55%. L'activité anti-hyaluronidase mesurée pour l'extrait est de 0,113 UA. L'extrait testé présente donc bien une activité inhibitrice de la hyaluronidase. Exemple 4 : Activité anti-élastase d'un extrait de pressurât dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides a) Principe L'activité anti-élastase est déterminée sur un substrat de synthèse spécifique et hydrosoluble : N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p.Nitroanilide. Le substrat réagit avec l'enzyme pour former un acylenzyme (intermédiaire réactionnel) et libérer le p. Nitroaniline qui absorbe à 386 nm. L'activité enzymatique est définie par rapport à la pente de la cinétique de libération du p. Nitroaniline. b) Réactifs La solution de substrat, qui contient 50 mg de N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p. Nitroanilide solubilisés dans 1 ml de N méthylpyrrolidone est diluée au 100ième dans du tampon Tris-HCl pour la réaction enzymatique. La solution d'élastase contient 56 unités/ml diluées dans du tampon. La solution élastatinale, qui sera utilisée comme référence (1 mg/ml) est diluée au 50ième pour la réaction enzymatique. c) Mode opératoire La solution témoin activité contient 2000 l de substrat, 1000 L de tampon et 10 l d'enzyme. La solution essais contient 2000 L de substrat, (1000 l - 30 [il d'une dilution de pressurat dépulpé à tester) de tampon et 10 L d'enzyme. Ainsi, le dosage est réalisé avec différentes dilutions de pressurat dépulpé à tester. d) Résultats Le pourcentage d'inhibition de 30 \iL d'une dilution au lOième de l'échantillon de pressurat dépulpé testé est de 20,9%. Il y a bien inhibition de l'activité enzymatique en présence de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides. La CI 50 de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophaé rhamnoides est de 22,6 mg/ml. Exemple 5 : activité anti-collagènase d'un extrait de pressurât dépulpé de fruit de Hippop hae rhamnoides. a) Principe L'activité de la collagènase est déterminée sur un substrat de synthèse, spécifique et hydrosoluble : p-Phénylazo - Benzyloxycarbonyl - L Propyl-L Leucyl - Glycyl - L Propyl - D Arginine. La collagènase scinde la molécule de substrat entre Leucyl et Glycyl, libérant ainsi : 4 Phénylazo Benzyloxycarbonyl - L Propyl - L Leucine (liposoluble, absorbe à 320 nm) et Glycyl - L Propyl - D Arginine, hydrosoluble. L'activité enzymatique est déterminée par rapport à la quantité de 4 Phénylazo - Benzyloxycarbonyl L Propyl - L Leucine libérée en un temps donné. b) Réactifs La collagènase utilisée est une collagènase 470 unités/ mg SIGMA C - 9891, dont 1 mg est solubilisé dans 1 ml de tampon. 10 mg du substrat de synthèse p-Phénylazo Benzyloxycarbonyl - L Propyl-L Leucyl - Glycyl - L Propyl - D Arginine SIGMA P - 8383 sont solubilisés par 20 ml de méthanol. Enfin, le témoin d'inhibition, la berberine, inhibiteur enzymatique de la collagènase, est préparé en en solublisant 15 mg de berberine 95% SIGMA B - 3412 dans 10 ml d'eau. c) Mode opératoire Le mélange réactionnel contient : - 2000 l de substrat, - 10 l à 50 l de pressurat dépulpé de baies de Hippophae rhamnoides à tester pour son activité inhibitrice de la collagènase (concentration massique connue), - 100 \il de collagènase. Le dosage est réalisé avec différents volumes de pressurat dépulpé. On prépare aussi un témoin "activité" dépourvu de substance à tester et donc dans lequel l'activité inhibitrice de collagènase sera nulle. Enfin, on prépare plusieurs solutions témoins "inhibition" qui contiendront, à la place du pressurat dépulpé à tester, différentes concentrations de solution de berberine. La densité optique de la phase organique est mesurée au spectrophotomètre à 320 nm. d) Résultats Le pourcentage d'inhibition de 10 \il de pressurat dépulpé à tester est de 29,1 %, et celui de 50 \il est de 87,5 %. Il y a bien inhibition de l'activité enzymatique en présence de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides. La CI 50 de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides est de 7,83 mg/ml. Exemple 6 : a) Principe On souhaite étudier le relargage des métalloprotéinases (MMPs) par des fibroblastes en culture lorsqu'ils sont soumis à des UV. L'effet recherché est soit protecteur, soit réparateur, soit "filtrant", soit complet par rapport aux UV. Le choix s'est porté sur les UVa car ce sont les principaux rayonnements les plus délétères qui atteignent ce type cellulaire au niveau de la peau. Un actif est mis en contact avec les cellules à différents moments de l'expérience afin de déterminer son action sur le relargage des MMPs. b) Mode opératoire Les fibroblastes sont ensemencés en plaque 24 puits à un fort taux, pour être à confluence lors de l'irradiation. On utilise 2 plaques par actif, une qui sera irradiée et l'autre qui servira à connaître l'action de l'actif sans les UVA. L'actif est mis à différents moments de la manipulation : - avant les UV(1) : recherche de l'effet protecteur - pendant les UV(2) : recherche de l'effet "filtrant" - après les UV (3) : recherche de l'effet réparateur - avant, pendant et après (4) : recherche de l'effet complet - sans actif (5) : témoin négatif L'expérience s'effectue sur 5 jours : - Le lundi matin, les cellules sont ensemencées, Le lundi soir et le mardi, les cellules sont traitées dans le milieu de culture normal pour les cas 1 et 4, Le mercredi matin, les plaques sont rincées avec de l'HBSS, puis les cellules sont traitées dans le milieu de culture sans sérum, pour les cas 2 et 4 juste avant l'irradiation, - Le milieu, toujours sans sérum, est changé après l'irradiation pour les traitements 3 et 4, Le jeudi soir, au bout de 30 heures d'incubation après les UV, les surnageants cellulaires sont récupérés, centrifugés. - Sur les plaques, on effectue un dosage MTT afin de connaître la viabilité cellulaire. - Sur les surnageants, les MMP 1 et 2 sont dosées via une technique ELISA. On obtient donc la concentration en MMP1 et MMP2 par rapport à la viabilité cellulaire. En parallèle, on regarde le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport à l'action des UV sans actif. c) Résultats 1) Effet du jus d'argousier sur l'induction des MMP1 et 2 par des fibroblastes humains normaux en condition de stress UVA (dosage ELISA) MMP1 (ng/unité cellulaire/mL) Traitement 0 20 J/cm2 % d'inhibition J/cm2 Avant stress UV 9 40 37 Pendant stress UV 5 40 37 Après stress UV 3 19 70 Sans traitement 7 63 0 MMP2 (ng/unité cellulaire/mL) Traitement 0 J/cm2 20 J/cm2 % d'inhibition Avant stress UV 44 124 33 Pendant stress UV 47 114 38 Après stress UV 48 113 39 Sans traitement 54 184 0 L'adjonction de jus d'argousier (concentration finale : 0,1%) dans le milieu de culture des fibroblastes humains, en conditionnement avant le stress UV, pendant et après celui-ci, inhibe significativement d'au moins 33 % la sécrétion des MMP1 et 2. Un effet particulièrement inhibiteur de 70 % est à noter concernant l'expression de la MMP1 des fibroblastes traités après le stress. 2) Effet du jus d'argousier sur la viabilité des fibroblastes humains normaux en condition de stress UVA (dosage colorimétrique de la viabilité au MTT) Traitement 0 J/cm2 20 J/cm2 Avant stress UV +18 % + 90 % Pendant stress- 6 % + 54 % Après stress UV - 7 % + 34 % Sans traitement 0 0 L'adjonction de jus d'argousier (concentration finale : 0,1%) dans le milieu de culture des fibroblastes humains, en conditionnement avant le stress UV, pendant et après celui-ci, permet d'augmenter globalement la viabilité des cellules après le stress. Un effet particulièrement protecteur est remarqué concernant le prétraitement (+ 90% de viabilité cellulaire) et probablement un effet filtre puisque l'adjonction seulement au moment de l'irradiation permet de protéger les cellules. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides pour la fabrication d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, pour la prévention ou le traitement du derme. 2) Utilisation selon la revendication 1 pour l'amélioration de la viabilité et l'activité métabolique des cellules dermiques. 3) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la prévention ou la lutte contre les effets du vieillissement et du photovieillissement liés à la dégradation du derme. 4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et plus particulièrement ceux choisis parmi : la perte d'élasticité et d'hydratation du derme, la perte de la résistance cutanée, la formation de rides. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la prévention et la lutte contre les effets néfastes du soleil sur le derme. 6) Utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la fabrication d'une composition destinée à inhiber l'expression excessive des métalloprotéases matricielles du derme, au niveau de la jonction dermo-épidermique et du derme profond. 7) Utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la fabrication d'une composition destinée à inhiber l'activité de protéases du derme, en particulier l'élastase et la collagénase-1. 8) Utilisation d'une fraction hydrophile du fruit de Hippophae rhamnoides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la fabrication d'une composition destinée à inhiber l'activité de la hyaluronidase. 9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite fraction hydrophile est un pressurat, de préférence un pressurat dépulpé. 10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite fraction hydrophile est un extrait aqueux. 11) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition comprend en outre une fraction lipophile du fruit de Hippophae rhamnoides.