FR 2886943 A1 20061215 FR 0505935 A 20050610 Méthode de sélection de protéines stables dans des conditions physico- chimiques non standard. Introduction. La présente invention relève du domaine de la biologie moléculaire et plus particulièrement de l'évolution dirigée des protéines. Le marché annuel des enzymes industrielles et de spécialité est estimé à plusieurs milliards d'euros. Moins de 30 enzymes comptent pour plus de 90% des enzymes industrielles utilisées. La grande majorité est cependant fragile et peu résistante dans les conditions d'usage industriel, d'où la recherche d'enzymes de substitution plus robustes (température, pH, pression). Les enzymes interviennent en complément ou en substitution de méthodes chimiques classiques plus lourdes de manière à rendre ces procédés plus précis et moins coûteux et afin de limiter les externalités négatives sur l'environnement. Beaucoup de ces procédés n'ont pas lieu à pH neutre, température ambiante et pression atmosphérique. Le procédé suivant l'invention permet de rendre des enzymes compatibles avec une utilisation dans des procédés à haute température (50 C à 110 C) ou à basse température (-5 C à 15 C) et/ou d'augmenter leur stabilité à des pH extrêmes ou à haute pression ou en présence d'une concentration en NaCl ou KC1 élevée, ou en encore dans des solvants divers. Dans un autre domaine, les protéines et anticorps thérapeutiques constituent une part importante et croissante du marché des médicaments. Un enjeu central, dans l'amélioration d'hormones, enzymes, anticorps ou autres protéines thérapeutiques, est d'augmenter leur stabilité in vivo. En effet, si une protéine thérapeutique est rapidement dégradée dans l'organisme, il est plus délicat de réguler la quantité active à un moment donné et il devient nécessaire d'augmenter la fréquence d'administration, ce qui a un coût et une incidence importante sur le confort d'utilisation pour le patient. Le procédé suivant l'invention, parce qu'il permet de sélectionner des protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard, peut permettre indirectement d'augmenter la stabilité in vivo de protéines thérapeutiques. Le cas des hautes températures et des protéines thermostables constitue un cas important de conditions physico-chimiques non standard. Les protéines et peptides thermostables naturels sont issus de micro- organismes poussant à des températures extrêmes. Les micro-organismes thermophiles comprennent notamment: Bacillus stearothermophilus (qui vit à une température pouvant atteindre Tmax 60 C), Thermus aquaticus (Tmax 70 C) et Thermus thermophilus (Tmax 80 C), et les hyper-thermophiles comme Thermotoga maritime (Tmax 90 C) et Aquifex pyrophilus (Tmax 95 C). La capacité de ces organismes à pousser à des températures élevées implique que leurs enzymes et protéines sont stables et actives à ces températures (Moreno R et al. Applied and Environmental Microbiology. 2004; 71:591-93). Ces organismes sont potentiellement sources de diverses enzymes d'intérêt industriel (Vieille C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001; 65: 1 43; Sterner R et al. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2001. 36:39 106; Pantazaki AA et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002; 58:1 12; Niehaus F. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999; 51:711 29). L'exemple le plus connu d'utilisation de protéines issues d'organismes extrêmophile est le cas des enzymes ADN polymérases thermostables en biologie moléculaire. Grâce à la polymérase thermostable de Thermus aquaticus (la Taq polymerase), la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), qui a révolutionné la biologie moléculaire, a pu être inventée. Depuis, des polymérases thermostables issues d'autres organismes thermophiles, comme la Pfu polymerase ou la Vent polymerase, ont été produites et commercialisées. En recombinant in vitro les séquences de diverses polymérases thermostables et en utilisant une méthode de sélection spécifique pour ces polymérases, une équipe a pu créer de nouvelles polymérases thermostables, à la thermostabilité élevée, moins sensibles à des inhibiteurs courants ou encore capables d'incorporer des nucléotides non standard (Ghadessy FJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 201; 98: 4552-7; Ghadessy FJ et al. Nat Biotechnol. 2004; 22:755-9). Un autre exemple d'utilisation d'enzyme important issu d'un extrêmophile est le cas de cellulases tirées d'alkaliphiles utilisées comme agent de dégradation de la cellulose dans 30 les détergents (par exemple, la cellulase 103, vendue par Genencor depuis 1997). Plus généralement, et sans que la liste d Utiliser directement des bactéries ou archéobactéries extrêmophiles pour isoler des protéines stables et/ou actives dans des conditions physicochimiques non standard peut donc être efficace. Une telle approche est toutefois rarement possible dans le cas des enzymes issues d'eucaryotes, champignons, levures, plantes ou mammifères: on recense peu d'extrêmophiles eucaryotes (voir néanmoins http://www.nhm.ac. uk/zoology/extreme.html). Il faut alors partir d'une enzyme standard puis l'améliorer, par évolution dirigée, pour la rendre stable et/ou active dans des conditions physico-chimiques non standard. Cette approche d'évolution dirigée de protéines stables dans des conditions physicochimiques non standard n'est pas limitée aux protéines issues d'eucaryotes, qui sont généralement mésophiles, mais est également intéressante pour toutes les protéines issues d'organismes procaryotes courants, eux aussi mésophiles. Malgré tous les progrès de la biologie moderne, il demeure en effet difficile de déterminer les relations entre la séquence d'une protéine et sa fonction. Il est notamment peu aisé, en pratique, de prévoir précisément quelles mutations permettront de rendre stable une protéine dans des conditions physico-chimiques non standard. L'approche de choix, dans ce contexte où la conception rationnelle est peu opérante, est l'évolution moléculaire dirigée. S'inspirant de l'évolution naturelle Darwinienne, l'évolution dirigée en reproduit, en laboratoire, les principales étapes: obtention d'une diversité génétique, expression des protéines correspondantes puis tri des produits adaptés à des conditions données. Ainsi, l'évolution dirigée commence par obtenir une diversité de gènes puis les exprime, trie les gènes codant des protéines améliorées par rapport à un critère d'intérêt. Plusieurs types de méthodes génériques sont disponibles pour créer de la diversité en modifiant la séquence d'un gène initial: la mutagenèse aléatoire (Leung DW et al. Technique. 1989; 1:11-15; Cadwell RC et al. PCR Methods Appl. 1992; 2:28-33), la mutagenèse dirigée (Kunkel TA et al. J. Methods Enzymol. 1991; 204:125-39; Lacks et al. Methods Enzymol. 1980; 65:138; US2004253729), la mutagenèse massive (WO0216606), la mutagenèse par élongation (Matsuura T et al. Nat. Biotechnol. 1999; 17:58 61). D'autres méthodes permettent de créer de la diversité en mélangeant entre elles les séquences de plusieurs gènes: recombinaison in vitro par DNA Shuffling (Stemmer WPC. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 91:10747 51; Stemmer WPC. Nature. 1994; 370: 389-91; US5,605,793; US 5,830,721; US 6, 506,603), StEP (US6,153,410; US6,177,263; Zhao et al. Nat. Biotechnol. 1998; 16:258-61; Aguinaldo AM et al. Methods Mol. Biol. 2003; 231:105-10), recombinaison in vitro circulaire (demande de brevet FR 0503364 déposée par Biométhodes). Un troisième type de méthode permet enfin d'avoir directement accès à la diversité naturelle sans cultiver les organismes correspondants: le metagénome (Streitt WR et al. Curr Opin Biotechnol. 2004; 15:285-90; Daniel R et al. Curr Opin Biotechnol. 2004; 15:199-204). Toutes ces méthodes d'obtention de diversité sont utiles dans le cadre de la génération, par le procédé selon l'invention, de protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard selon l'invention. On notera que, dans certains cas, les données empiriques et les résultats des modèles limités existants sur les relations séquence-structure- stabilité des protéines, peuvent être intégrés dans le cadre d'une stratégie de mutagenèse. Par exemple, la comparaison des séquences et des structures de protéines avec celles de leurs homologues thermostables montre souvent des différences au niveau des boucles de surface, de la fréquence de résidus hydrophobes avec des chaînes latérales branchées, de la fréquence d'acides aminés chargés ou de la fréquence de ponts disulfures et il est possible d'intégrer ce type de résultat au moment du choix des cibles de la mutagenèse et du type de substitution à opérer. Après l'obtention de diversité au niveau des polynucléotides codant, la deuxième étape de l'évolution dirigée, le tri, a lieu au niveau de leurs produits protéiques et peut se faire suivant deux modalités: le criblage (ou screening, notamment le criblage haut-débit ou high-throughput screening ) et la sélection. Le criblage consiste à trier, une par une, les protéines et les gènes correspondant sur la base d'un test réalisé typiquement dans des puits de microplaques à 96, 384 ou 1536 puits. Suivant le degré d'automatisation, on peut ainsi trier de l'ordre de 103 à 105 variants par jour. Les méthodes dites de sélection sont plus proches de la sélection naturelle, en ce qu'elles trient en masse , en parallèle, tous les variants répondant à un critère donné, et les isolent de la majorité des variants, non améliorés. On peut ainsi trier de l'ordre de 106 et jusqu'à 1013 variants simultanément. On voit aisément que, lorsqu'elles sont disponibles, les méthodes de sélection permettent de trier beaucoup plus facilement une diversité beaucoup plus grande que les méthodes de criblage. Des méthodes de sélection comme le phage display ou le ribosome display, sont disponibles lorsque le critère d'intérêt est l'affinité de la protéine pour un ligand donné, et ont été employées avec succès dans le domaine des anticorps. Ces méthodes ont pu être adaptées à des cas de sélection pour l'activité enzymatique ou la stabilité dans des conditions standard (Amstutz P et al. J. Am. Chem. Soc. 2002; 124:9396-9403; Jung S et al. J. Mol. Biol. 1999; 294:163-180.5). Toutefois, dans le domaine de la stabilité et de l'activité dans des conditions physico-chimiques non standard, les méthodes de criblage restent prépondérantes et on ne dispose pas de méthode de sélection universelle, indépendante de la fonction de la protéine d'intérêt. Comme on vient de le voir, ces méthodes de criblage sont de mise en oeuvre assez lourde, nécessitant une mécanisation assez importante et ayant un coût élevé, pour des tailles de banques limitées. Disposer d'une méthode universelle de sélection de protéines stables dans des conditions physicochimiques non standard permettrait ainsi un saut qualitatif dans le domaine de l'évolution dirigée des protéines, et notamment des enzymes industrielles, des protéines thérapeutiques, des biocapteurs et du diagnostic. L'application d'une telle méthode, conjointement aux méthodes de création de diversité génétique existantes, permettrait l'obtention d'un grand nombre de nouvelles protéines très diverses, d'intérêt industriel ou thérapeutique majeur par évolution dirigée. C'est 6 précisément l'objet du procédé selon l'invention. Résumé de l'invention. Le procédé selon l'invention est une méthode de sélection de protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard (température, pression, pH, osmolarité, salinité, solvant, ....) caractérisé par l'expression, dans un micro-organisme extrêmophile, de variants de la protéine d'intérêt sous forme de protéine de fusion avec une protéine rapporteur H stable dans les conditions non standard considérées jouant le rôle de marqueur de sélection. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de sélection de protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard caractérisé en ce qu'une banque de variants d'une protéine d'intérêt est exprimée dans un micro-organisme extrêmophile sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine rapporteur stable dans lesdites conditions physico-chimiques non standard, et en ce que, si un ou plusieurs variants stables de la protéine d'intérêt sont sélectionnés à partir des micro-organismes dans lesquels la protéine rapporteur est active. De préférence, le micro-organisme extrêmophile présente une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: thermophile, hyper-thermophile, osmophile, halophile, psychrophile, alkalophile, acidophile, piezophile, radiophile, et metallophile. Le micro-organisme extrêmophile peut être une bactérie, une archéo-bactérie, ou un eucaryote extrêmophile. Dans un mode de réalisation préféré, le micro-organisme est sélectionné parmi les microorganismes thermophiles ou hyper-thermophiles suivant: Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritime ou Aquifex pyrophilus. De préférence, la protéine rapporteur stable est une protéine dont l'expression correcte permet la survie du micro-organisme et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par survie du microorganisme. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine rapporteur est une protéine conférant la résistance à un antibiotique. Par exemple, la protéine rapporteur peut être une version thermostable d'une protéine de résistance à la kanamycine ou à la bléomycine. Dans un mode de réalisation alternatif, la protéine rapporteur est un marqueur d'auxotrophie. Dans un autre mode de réalisation, la protéine rapporteur est une protéine dont l'expression correcte conduit directement ou indirectement à la transformation d'un substrat en un produit, le produit et le substrat différant par leurs couleurs, et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée sur la base de la couleur des microorganismes. Par exemple, la protéine rapporteur peut être une version stable dans des conditions physico-chimiques non standard de la bétagalactosidase. Dans un mode de réalisation supplémentaire, la protéine rapporteur est fluorescente ou luminescente et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par détection de la fluorescence ou luminescence. La protéine rapporteur peut ne pas être fluorescente ou luminescente dans les conditions physico-chimiques non standard où elle est produite mais devenir fluorescente lorsqu'on la place dans des conditions physico-chimiques standard. De préférence, la protéine rapporteur est la GFP (green fluorescent protein) ou un variant de la GFP. Dans un mode de réalisation préféré, la sélection est effectuée en utilisant un FACS. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine d'intérêt peut être située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. Dans un mode de réalisation alternatif, la protéine d'intérêt est située en C-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. Facultativement, la protéine de fusion comprend un espaceur peptidique. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être générée par une technique de mutagenèse connue de l'homme du métier, de préférence sélectionnée parmi le groupe suivant: la technologie Massive Mutagenesis , la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse à saturation, la mutagenèse par élongation, et la mutagenèse in vivo, une méthode de recombinaison génétique in vivo ou in vitro, ou une combinaison de celles-ci. Dans un mode de réalisation préféré, elle est créée par la technologie Massive Mutagenesis. Dans un mode de réalisation préféré alternatif, elle est créée par recombinaison in vitro circulaire de plusieurs gènes naturels ou synthétiques codant la protéine d'intérêt. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut également être créée par clonage direct d'acides nucléiques tirés d'une source environnementale par utilisation des techniques du metagénome. Dans un mode de réalisation préféré, le micro-organisme est thermophile ou hyper- thermophile, la protéine rapporteur est une protéine thermostable conférant la résistance à un antibiotique, la protéine d'intérêt est située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion, et la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis . La présente invention concerne les protéines ayant une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard sélectionnées selon le procédé de la présente invention. Notamment, sont considérés les enzymes, anticorps, hormones, cytokines ou autres protéines thérapeutiques sélectionnées selon le procédé de la présente invention et qui présentent une stabilité in vivo accrue. La présente invention concerne également une protéine de fusion telle que décrite dans la présente invention. En particulier, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt ou un variant de celle-ci et une version thermostable d'une protéine conférant la résistance à un antibiotique. De préférence, la protéine conférant la résistance à un antibiotique est la kanamycine nucleotidyltransférase ou la protéine de résistance à la bléomycine. L'invention concerne en outre un acide nucléique ou vecteur d'expression codant une protéine de fusion selon la présente invention. Description détaillée de l'invention. Le procédé selon l'invention permet la sélection, au sein d'un ensemble de variants d'une protéine d'intérêt, de variants présentant une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard. Ces conditions physico-chimiques non standard ou extrêmes sont ici définies par: une température élevée (50 C à 110 C), une faible température (-5 C à 15 C), un milieu acide (pH 0-5) ou alcalin (pH 9-14), une pression supérieure à plusieurs dizaines de fois la pression atmosphérique, un milieu riche en sel ([NaCl]>l M; [KC1]> 1 M, ...), un solvant aqueux organique ou non aqueux, ou toutes autres conditions qui ne sont pas rencontrées de manière standard lorsqu'on cultive des micro-organismes classiques au laboratoire. Par exemple, Escherichia coli ne pousse pas dans ces conditions non standard. Cette stabilité dans des milieux plus ou moins extrêmes peut être intéressante et recherchée en soi. Dans de nombreux cas, la sélection pour une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard pourra en outre conduire indirectement à améliorer les caractéristiques de la protéine dans des conditions standard. Le procédé selon l'invention permet donc l'amélioration de la stabilité, au sens large, de protéines. Plus précisément, partant d'un gène Go codant la protéine d'intérêt Po que l'on souhaite améliorer, le procédé selon l'invention comprend les trois étapes suivantes: a) A partir du gène d'intérêt Go, préparation d'une banque de variants Gi codant les variants protéiques Pi (où i=1, 2.. . N avec N compris entre 10 et 1010) dans un vecteur de telle sorte que des protéines Pi soient exprimées avec une protéine rapporteur H sous la forme de protéines de fusion Pi-H. b) transformation de la banque de vecteurs obtenue lors de l'étape a) dans un organisme extrêmophile et expression des protéines de fusion Pi-H dans des conditions physico-chimiques non standard données, qui sont compatibles avec les conditions de vie de l'organisme extrêmophile. c) sélection, sur la base de l'activité de H, de clones exprimant la protéine de fusion Pi-H correctement. Dans un premier mode de réalisation, la préparation de la banque de variants de l'étape a) comprend les étapes suivantes: on prépare une construction ou un vecteur comprenant le gène Go codant la protéine d'intérêt Po et la séquence codant une protéine rapporteur H sous forme d'une protéine de fusion P0-H, puis la banque de variants Gi (où i=1, 2... N avec N compris entre 10 et 1010) est généré à partir de cette construction ou de ce vecteur. Dans un mode de réalisation alternatif, la préparation de la banque de variants de l'étape a) comprend les étapes suivantes: construction d'une banque de variants Gi (où i=1, 2... N avec N compris entre 10 et 1010), puis les gènes Gi codant les variants protéiques Pi (i=1, 2... N) sont clonés dans un vecteur de telle sorte que des protéines Pi soient exprimées avec une protéine rapporteur H, stable dans des conditions physico- chimiques non standard, sous la forme de protéines de fusion PiH. Dans un mode de réalisation particulier, le critère d'amélioration retenu est la thermostabilité, l'extrêmophile est un thermophile et, partant d'un gène Go codant la protéine Po qu'on souhaite améliorer, le procédé selon l'invention est caractérisé par la succession des trois étapes suivantes: a) A partir du gène d'intérêt Go, préparation d'une banque de variants Gi codant les variants protéiques Pi (où i=1, 2... N avec N compris entre 10 et 1010) dans un vecteur de telle sorte que des protéines Pi soient exprimées avec une protéine rapporteur H sous la forme de protéines de fusion P,-H.b) transformation de la banque de vecteurs obtenue lors de l'étape a) dans un organisme thermophile et expression à haute température des protéines de fusion Pi-H. c) sélection, sur la base de l'activité de H à haute température, de clones exprimant la protéine de fusion Pi-H correctement. Une approche relativement similaire est décrite dans la littérature dans le cas de l'amélioration de la solubilité des protéines insolubles: dans ces exemples, des banques de mutants sont fusionnés en phase avec la GFP, et les mutants ayant acquis une certaine solubilité sont sélectionnés sur le critère de leur fluorescence plus importante (brevets américains 6,867, 042 et 6,448,087; demandes de brevets américains 20030138843 et 20040078148). La présente invention diffère de façon importante en ce que l'on ne recherche pas ici une amélioration de la solubilité des protéines, mais une amélioration de la stabilité dans des conditions extrêmes. A ce titre, les hôtes de sélection utilisés sont des organismes extrêmophiles qui ne sont pas mentionnés dans les documents cités précédemment. En outre, la méthode nécessite la conception de vecteurs navettes adaptés aux organismes extrêmophiles, mais de préférence également adaptés à un organisme standard comme E. coli. Le gène de fusion doit correspondre aux conditions non standard choisies. Ainsi, le gène rapporteur H doit être stable dans les conditions physico-chimiques non standard considérés. En effet, le procédé selon l'invention s'applique à l'amélioration de critères divers, comme la thermostabilité, la stabilité à basse température, la stabilité à des pH extrêmes ou encore la stabilité en présence de concentrations élevées de sel. Si optimiser une protéine pour qu'elle soit stable et/ou active dans une de ces conditions peut conduire à améliorer sa solubilité, l'inverse n'est en général pas vrai. Ainsi, de nombreuses protéines sont exprimées très facilement de manière hétérologue chez E. Coli et sont donc très solubles sans pour autant être stables dans des conditions physico-chimiques non standard, notamment sans être thermostables. Par ailleurs, les effets sur la séquence d'une amélioration de l'activité à basse température et à haute température sont évidemment différents. On peut encore illustrer cette différence en considérant le cas de protéines qui sont très thermostables, mais peu solubles (voir par exemple: Linden A. et al. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000 Jan 14;737(1-2):253-9). Une analyse des déterminants structuraux de la thermostabilité montre en fait que celle-ci est liée à une meilleure solubilité mais également à une conformation plus compacte (Gromiha MM et al. Biophys Chem. 1999; 82:51-67). Le détail des mécanismes assurant le couplage entre la stabilité des deux partenaires d'une protéine de fusion n'est pas bien élucidé. Néanmoins, il a été observé que lorsqu'on fusionne une protéine d'intérêt à une protéine rapporteur, la conformation de l'une et de l'autre sont liées, avec généralement un ordre: une conformation correcte de la protéine située du côté COOH est dépendante d'une conformation également correcte de la protéine localisée à l'extrémité NH2. Ces effets de conformation lors de la synthèse sont parfois décrits sous le terme de nucléation . Dans des cas plus rares, cependant, c'est l'inverse qui est observé si bien qu'une approche empirique consistant à tester les deux orientations est nécessaire pour déterminer le sens de la causalité. Les protéines Pl stables dans des conditions physico-chimiques non standard sélectionnées peuvent, en même temps qu'elles ont augmenté leur stabilité avoir diminué leur activité (au sens d'activité enzymatique, ou d'affinité, dans le cas des anticorps, par exemple). Parfois, on souhaite obtenir des protéines qui sont non seulement stables mais également actives dans des conditions physico-chimiques non standard. Dans ce cas, en aval de la méthode générique de sélection pour la stabilité offerte par le procédé selon l'invention, un criblage (ou une sélection) secondaire des clones améliorés sur le critère de leur activité est nécessaire. Lorsque, dans des conditions physico-chimiques non standard données, une protéine P; n'est pas stable, la protéine de fusion Pi- H ne sera pas stable. En sélectionnant, au sein de la banque celles des protéines de fusion Pi-H qui correspondent à une protéine H stable, (ou, suivant les cas, actives) le procédé selon l'invention permet de sélectionner les protéines Pi stables dans ces conditions physico-chimiques non standard données. La première contrainte évidente pour la protéine H est qu'elle doit être stable dans les conditions de sélection. Par exemple, si on veut sélectionner une protéine Pi stable à 80 C, il faut que la protéine H soit elle-même stable à une température de 80 C ou plus. Pour que la protéine thermostable II puisse jouer son rôle de marqueur de sélection, il est en outre nécessaire qu'on puisse de manière simple isoler des clones exprimant correctement cette protéine au sein de clones qui ne l'expriment pas. La solution la plus simple est une sélection par survie: lorsque la protéine H est active, l'organisme extrêmophile dans lequel a lieu la sélection survit, dans le cas contraire, il meurt. Si la protéine Pi est stable dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, alors la protéine de fusion Pi- H s'exprime correctement à l'étape b), ce qui permet à H d'être active et aux cellules de survivre. De sorte qu'à l'étape c), la sélection consiste simplement à récupérer les cellules ayant poussé. Une méthode simple dans ce contexte est d'utiliser une protéine de résistance à un antibiotique. Lors de l'étape c), la sélection s'effectue en faisant pousser, en milieu liquide ou en milieu solide, les cellules du micro-organisme extrêmophile utilisé en présence de l'antibiotique correspondant. Seules les cellules exprimant correctement, dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, le gène de résistance à cet antibiotique pousseront. Par exemple, si la propriété recherchée est la thermostabilité, un antibiotique pour lequel l'existence de variants thermostables de l'enzyme de résistance a été rapportée est la kanamycine. La kanamycine est un antibiotique peu coûteux et couramment utilisé dans les laboratoires de recherche. Il s'agit d'un bactéricide puissant, agissant indépendamment de la densité bactérienne, et ayant un effet à la fois très intense et très rapide in vitro. La kanamycine nucleotidyltransférase (KNTase) est une enzyme permettant aux bactéries de résister à l'antibiotique. Cette enzyme a été isolée à partir de Staphylococcus aureus. Elle catalyse le transfert d'un nucléoside monophosphate d'un nucléotide vers le groupement hydroxyle en 4' de la kanamycine. Ceci a pour effet de neutraliser l'effet de l'antibiotique. Il existe différents mutants de l'enzyme permettant la résistance qui sont stables et actives à des températures allant jusqu'à plus de 70 C (Liao HH Enzyme Microb. Technol. 1993; 15:286-92; Sakon J et al. Biochemistry. 1993; 32: 11977-84; Liao HH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83:576-580). Les séquences nucléotidique et en acides aminés d'une kanamycine nucleotidyltransférase thermosatble sont par exemple les séquences décrites dans SEQ ID Nos 1 et 2. D'autres gènes de résistance à la kanamycine thermostables ont également été décrits (Hoseki J et al. J. Biochem. 1999; 126:951-6). On notera que la kanamycine elle-même est stable à ces températures élevées. Les variants d'une protéine d'intérêt qui sont thermostables et sont fusionnés à la KNTase thermostable permettent à l'organisme thermophile de survivre à haute température en présence de kanamycine. A l'inverse, des variants non thermostables de la protéine d'intérêt empêchent à la KNTase thermostable d'être exprimée correctement et l'organisme thermophile meurt. Cette sélection directe par survie est remarquable en ce qu'on obtient une discrimination très nette entre les différents variants de la protéine, ce qui permet la sélection directe des clones exprimant les variants thermostables de la protéine d'intérêt. Il est aujourd'hui possible de fabriquer d'autres protéines conférant la résistance à un antibiotique à des micro-organismes (bactéries ou archéobactéries) extrêmophiles, et en particulier thermophiles. Par exemple, en faisant évoluer la protéine équivalente chez la bactérie mésophile Streptoalloteichus hindustanus, un groupe vient récemment d'obtenir une protéine conférant la résistance à la bléomycine à la bactérie thermophile Thermus thermophilus HB27 (Brouns et al. J. Biol. Chem. 2005; 280:11422-31). Les séquences nucléotidique et en acides aminés d'une protéine conférant la résistance à la bléomycine thermostable sont par exemple les séquences décrites dans SEQ ID Nos 3 et 4. Par des méthodes de sélection évidentes pour l'homme du métier, il est plus généralement possible de fabriquer des protéines conférant la résistance à un antibiotique à des organismes extrêmophiles variés. On clone par exemple une banque de mutants du gène de résistance qu'on veut adapter aux conditions de vie extrêmes de l'organisme d'intérêt, on transforme le micro-organisme extrêmophile avec cette banque et les cellules de ce micro-organisme qui pousseront en présence de l'antibiotique seront porteuses de variants stables et actifs dans les conditions de vie de cet organisme. Par exemple, l'article de Brouns et collaborateurs (Brouns et al. supra) illustre une méthode simple permettant d'obtenir, par évolution dirigée, un gène conférant la résistance à haute température à un antibiotique. Il est ainsi possible d'obtenir de manière simple une gamme de protéines H grâce à laquelle le procédé suivant l'invention permettra de sélectionner des protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard variées. Dans un mode de réalisation particulier, alternativement à l'utilisation d'antibiotiques, la sélection par survie est réalisée en utilisant des souches auxotrophes. Ces souches ont été modifiées par délétion d'un gène, la délétion étant létale. En complémentant ces souches avec un vecteur porteur du marqueur d'auxotrophie, les souches qui expriment correctement ce gène survivent. Le marqueur d'auxotrophie permet de complémenter le gène supprimé et de permettre à la cellule de survivre. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé suivant l'invention utilise ce principe et un vecteur exprimant en fusion le marqueur d'auxotrophie et la banque de variants de gènes codant la protéine d'intérêt que l'on souhaite améliorer sera utilisé. Ainsi, si la protéine de fusion est correctement exprimée, elle complémente le gène supprimé et de permettre à la cellule de survivre lorsque celle-ci est cultivée sur un milieu non complémentant. Dans le cas contraire, la cellule est incapble de survivre. La sélection peut être effectuée en utilisant un critère autre que la survie. Tout système de protéine rapporteur stable dans des conditions physico-chimiques non standard connu de l'homme du métier peut être utilisé. Dans un mode de réalisation, la protéine H est un mutant stable dans des conditions physico-chimiques non standard d'une protéine qui est fluorescente ou luminescente, par exemple la GFP (green fluorescent protein). Plusieurs mutants supportant des températures un peu plus élevées que la GFP sauvage sont aujourd'hui disponibles, et possèdent des caractéristiques spectrales variées (voir par exemple: Siemering KR et al. Curr Biol. 1996; 6:1653-63). Concernant la stabilité aux pH extrêmes, une dénaturation à pH acide (pH 2) mais réversible lorsqu'on neutralise le milieu (pH 7) a été observée pour l'Enhanced GFP (Malik A et al. Anal Biochem. 2005;340:252-8). Des variants GFP ou d'autres protéines fluorescentes ou luminescentes ou des enzymes dont le produit est fluorescent qui sont stables et/ou actives dans des conditions physicochimiques non standard peuvent de manière analogue être utilisés dans le procédé suivant l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine rapporteur est stable et éventuellement fluorescente dans les conditions physico- chimiques non standard choisies et elle est fluorescente ou luminescente dans des conditions standard. Notamment, la protéine rapporteur utilisée peut ne pas être fluorescente ou luminescente dans les conditions physico-chimiques non standard où elle est produite mais elle devient fluorescente lorsqu'on la place dans des conditions physico-chimiques standard. Par exemple, elle peut être produite à haute température, subir une dénaturation réversible et retrouver une conformation la rendant fluorescente ou luminescente lorsqu'elle est placée à température ambiante. Les cellules contenant des protéines Pi stables dans des conditions physico-chimiques non-standard expriment correctement la protéine de fusion Pi- H et ces cellules fluorescent lorsqu'elles sont excitées à une longueur d'onde adaptée. Ces cellules peuvent ensuite être triées de manière simple et rapide, dans des conditions standard (notamment: à température ambiante) en utilisant un FACS ( fluorescence activated cell sorter ). Il est à noter que, dans ce mode de réalisation, il n'est absolument pas nécessaire, pour que la sélection ait lieu correctement, que la protéine fluoresce dans les conditions physico-chimiques non standard dans lesquelles pousse l'organisme extrêmophile choisi et dans lesquelles la protéine de fusion Pi- H est exprimée. Il suffit, en effet, que la protéine rapporteur soit stable, ou au pire subisse une dénaturation réversible, dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, puisque c'est son activité dans des conditions standard (notamment: à température ambiante) qui permettra ensuite la sélection. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules de micro-organismes extrêmophiles exprimant les protéines de fusion Pi- H sont cultivées sur milieu solide et la sélection se fait simplement en prélevant les colonies fluorescentes ou luminescentes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la protéine H est une protéine qui, directement ou indirectement, conduit à la transformation d'un substrat en un produit coloré. La sélection a alors lieu de préférence sur milieu solide en prélevant les colonies de la couleur du produit coloré. La protéine rapporteur est de préférence un variant stable de la béta-galactosidase. Une autre protéine rapporteur thermostable utilisable dans la présente invention est l'esterase thermostable de A. acidocaldarius (Agafonov DE et al. FEBS Lett. 2005;579:2082-86.). Cet article décrit en outre un test permettant de détecter facilement cette protéine. Il est probable que de nombreuses autres protéines pouvant être utilisées comme marqueur de sélection chez des organismes extrêmophiles vont être fabriquées dans les années qui viennent. Le procédé suivant l'invention n'est pas dépendant d'une protéine H particulière. Quelle que soit la nature de la protéine H, lorsqu'on construit le gène codant la protéine de fusion Pi-H, un certain nombre de règles classiques sont à respecter. Ainsi, la liaison entre le gène d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur doit se faire sans interrompre la phase de lecture. Il est également nécessaire de prendre soin aux contraintes stériques de l'une et l'autre protéine. En effet, il est possible que la fusion de la protéine d'intérêt et de la protéine rapporteur empêche l'une ou l'autre d'adopter sa conformation naturelle. Sa structure en serait modifiée, et son activité annulée. Afin d'éviter ce possible écueil, il est généralement souhaitable d'introduire une séquence codant un peptide de liaison ( linker ) entre le gène codant pour la protéine d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur. Ce peptide de liaison a en général une structure la plus neutre possible (ie: généralement sans aucun motif de structure secondaire), et ne présente pas en lui-même d'activité particulière. Il est typiquement composé de 8 ou 9 acides aminés neutres qui ne doivent pas influer sur la structure des protéines et ne doivent pas être la cible des protéases. Il est préférable qu'il soit flexible et hydrophile (Sieber V. Methods Mol Biol. 2003; 230:45-55; US6,448,087). Les acides aminés formant le peptide de liaison sont de préférence sélectionnés dans la groupe consistant en Gly, Ser, Ala, Val et Thr. De manière classique, les peptides de liaison sont souvent formés par un motif du type (Gly4-Ser)X, avec x = 3 par exemple. Le fragment codant le peptide de liaison doit bien entendu être introduit de telle sorte que la phase de lecture soit conservée sur l'ensemble constitué par la protéine d'intérêt, le peptide de liaison, et la protéine rapporteur. A priori, deux constructions sont possibles pour la protéine de fusion Pi- H: soit Pi est située en N-terminal et H en C- terminal, soit c'est l'inverse. Généralement, la construction avec Pi en amont est préférée. Dans un mode de réalisation alternatif, la construction inversée (H en amont) est utilisée. Dans un aspect particulier, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt ou un variant de celle-ci et une protéine rapporteur stable dans des conditions physicochimiques non standard, ainsi qu'un acide nucléique ou un vecteur codant cette protéine de fusion. De préférence, les conditions physicochimiques non standard considérées sont la thermostabilité. Ainsi, la protéine rapporteur est thermostable. De préférence, la protéine rapporteur est une protéine de résistance à un antibiotique stable dans des conditions physicochimiques non standard, et en particulier une protéine de résistance à un antibiotique thermostable. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, la protéine rapporteur thermostable est la kanamycine nucleotidyltransférase ou la protéine de résistance à la bléomycine. Le vecteur portant la séquence codant la protéine de fusion selon la présente invention comprend tous les éléments nécessaires à son expression dans le micro-organisme hôte extrêmophile choisi. Il peut également comprendre des éléments permettant une expression dans des organimes standard. Il comprend bien entendu les éléments nécessaires à la reproduction du vecteur (par ex., origine de réplication). Le vecteur est de préférence un plasmide. Le choix de l'organisme extrêmophile utilisé pour l'expression à l'étape b) et la sélection à l'étape c) dépend de la condition physico-chimique non standard choisie, de la facilité avec laquelle on peut transformer et faire pousser les cellules de ce micro-organisme et de la capacité de la machinerie cellulaire de ce micro-organisme à exprimer correctement la protéine H et les fusions Pi-H. Peuvent notamment être utilisés avec profit: des thermophiles (qui vivent à une température comprise entre 60 C et 80 C), des hyper-thermophiles (qui vivent à une température supérieure à 80 C), des psychrophiles (qui vivent à une température inférieure à 15 C), des halophiles (qui vivent avec des concentrations élevées en sel, par exemple 4M NaCl ou 3M KC1), des alkaliphiles (qui vivent à des pH supérieurs à 9), des acidophiles (qui vivent des pH inférieurs à 3), des piezophiles (qui vivent à des pressions allant jusqu'à environ 11OMPa), des metallophiles (qui vivent en présence de concentrations élevées de métaux), des radiophiles (qui vivent en présence de niveaux élevés de radiation), des microaerophiles (qui vivent malgré de très faibles teneurs en oxygène). Par exemple, et sans que cette liste ne soit exhaustive, l'organisme extrêmophile peut être sélectionné parmi la liste suivante: -Thermus sp (numéro d'accessions ATCC: 27737; 31674; 43814; 43815; 27978); - Thermus aquaticus Brock and Freeze (numéro d'accessions ATCC: 25104; 25105; 31558) ; Thermus thermophilus Oshima and Imahori (numéro d'accessions ATCC: 27634); - Thermus filiformis Hudson et al. (numéro d'accessions ATCC: 43280) ; - Themococus sp (numéro d'accessions ATCC: 55659) ; Alicyclobacillus acidocaldarius (numéro d'accessions ATCC: 27009) ; Sulfolobus solfataricus Zillig et al. (numéro d'accessions ATCC: 35091; 35092) ; 15 et - Haloferax mediterranei (numéro d'accessions ATCC: 33500) Dans un mode de réalisation préféré, le micro-organisme est thermophile et de préférence est Thermus thermophilus ou Thermus aquaticus. Comme on vient de le voir, ces mêmes organismes peuvent également être une source intéressante de protéines H. Un problème important peut se poser, en fonction de la séquence de la protéine Po de départ: celui du biais de codon. En effet, les organismes extrêmophiles ont un profil d'utilisation des codons très différent de celui des cellules non extrêmophiles, d'où est généralement issue la protéine Po. En fonction de données concernant l'expression hétérologue de Po dans l'organisme extrêmophile choisi, il est possible que cette différence dans les profils d'utilisation des codons empêche la bonne expression des fusions Pi- H à l'étape b). Il est alors nécessaire de modifier la séquence du gène codant po à l'intérieur du vecteur d'expression avant l'étape a) de manière à modifier l'utilisation des codons pour la rendre compatible avec l'expression dans l'organisme extrêmophile choisi aux étapes b) et c) . A l'issue de la sélection, il peut être à nouveau nécessaire de modifier la séquence du gène codant la protéine P; améliorée (rendue stable) de manière à permettre son expression dans l'organisme mésophile choisi in fine pour la production. Par exemple, si la protéine d'origine est tirée d'un mammifère et si l'organisme utilisé pour la sélection est une bactérie thermophile, on peut modifier d'abord les codons du gène correspondant pour permettre une sélection dans un thermophile puis modifier à nouveau la séquence du hit obtenu à l'issue de l'évolution moléculaire pour permettre la production de la protéine améliorée dans un hôte de production classique, Pischia pastoris par exemple. Dans un mode de réalisation préféré, on ne modifie qu'une fois, au départ, la séquence de Po de manière à ce qu'elle puisse être exprimée convenablement à la fois dans l'organisme extrêmophile utilisé pour la sélection et dans l'organisme utilisé ensuite pour la production des variants améliorés. On utilise alors un ensemble d'isocodons (codons synonymes, c'est-à-dire codant pour le même acide aminé) consensus qui évite de faire appel à des codons très peu utilisés dans les organismes choisis. Le problème des différences de profil d'utilisation des codons est bien connu aujourd'hui par l'homme du métier et on y est confronté, avec un degré de gravité plus ou moins important, dans pratiquement tous les cas d'expression hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, les problèmes liés aux différences de profil d'utilisation des codons peuvent être résolus en réécrivant, par mutagenèse dirigée, avant l'étape a), un petit nombre (typiquement: 1-20) de codons particulièrement pénalisants pour l'expression de Po (et des banques créées à partir de Po) dans l'organisme extrêmophile choisi pour la sélection. Dans un autre mode de réalisation, ces problèmes sont résolus en resynthétisant 25 entièrement le gène codant la protéine Po en concatémérisant des oligonucléotides. Le calcul de grandeurs comme le CAI (Codon Adaptation Index; Sharp PM et al. Nucleic Acids Res. 1987; 15:1281-95), et l'utilisation de logiciels dédiés peut guider la démarche conduisant au choix des éléments de séquence à modifier ou de la séquence à synthétiser. De fait, pour certaines protéines Po, et suivant la protéine 17 utilisée, l'expression de la banque Pi-H dans un micro-organisme extrêmophile aura naturellement lieu à un niveau suffisant pour la sélection de sorte qu'aucune réédition de codons ne sera nécessaire. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être préparée soit avant la fusion avec la protéine rapporteur soit après cette fusion. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, la méthode comprend dans un premier temps la préparation du vecteur portant la séquence codant la protéine de fusion comprenant la protéine d'intérêt et la protéine rapporteur, puis la génération de la banque de variants de la protéine d'intérêt. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être générée par une technique de mutagenèse. Dans un mode de réalisation préféré, la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis . Elle peut également être créée par une technologie de mutagenèse et notamment: la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse à saturation, la mutagenèse par élongation, la mutagenèse in vivo. Dans un mode de réalisation alternatif, elle peut être générée par une méthode de recombinaison génétique in vivo ou in vitro. De préférence, elle est créée à partir de la recombinaison in vitro circulaire (Demande de brevet FR0503364 déposée par Biométhodes) de plusieurs gènes naturels ou synthétiques codant des versions thermostables ou non de cette protéine. Cependant, elle peut également être créée à partir de la recombinaison de plusieurs gènes naturels ou synthétiques codant des versions thermostables ou non de cette protéine par une technologie de recombinaison et notamment: le DNA-Shuffling, le StEP, la recombinaison in vivo. Dans un autre mode de réalisation alternatif, la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par clonage direct d'acides nucléiques tirés d'une source environnementale par utilisation des techniques du metagénome. L'approche metagénomique utilisée peut être de type fonctionnelle, ou de type séquence-dépendant, ou de type SIGEX. Mode de réalisation 1: Mutagenèse et sélection par survie d'un thermophile à haute température. Dans un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation de la mutagenèse, de la sélection par survie (figure 5) et par la succession des étapes suivantes: a) Clonage du gène codant la protéine d'intérêt Po dans un vecteur plasmidique contenant, outre toutes les séquences nécessaires à sa propre réplication, et à son expression dans un organisme thermophile, un gène codant une protéine H conférant la résistance à un antibiotique à haute température. Le plasmide porte en outre une origine de réplication chez E. Coli et un gène de résistance à un antibiotique classique chez E. Coli. Le gène codant Po est cloné en phase avec le gène codant H, de manière à obtenir une protéine de fusion Po- H, soit en 5', soit en 3' (ce qui correspond aux deux orientations possibles de la protéine de fusion). De préférence, on insère une séquence codant un espaceur peptidique entre la protéine d'intérêt Po et la protéine rapporteur thermostable H afin que les deux protéines soient distantes l'une de l'autre et puissent se replier sans interférer (figures 1 et 2). b) Génération, par utilisation d'un procédé de mutagenèse et en utilisant E. Coli, d'une banque de mutants P; (i = 1,2...N où N est compris entre 1000 et 101). (figures 3 et 4) c) Transformation de la banque obtenue à l'étape b) dans un micro-organisme thermophile. d) Culture, pendant 30 minutes à 3 jours, de préférence 3 heures à 24 heures, en milieu liquide ou solide (figure 5) ou figure 6)), à haute température (préférentiellement: 50 à 100 C) des cellules du microorganisme thermophile, en présence de l'antibiotique thermostable. e) Préparation de l'ADN plasmidique de la culture. Cet ADN est enrichi en gènes codant des variants thermostables de la protéine d'intérêt Po. Dans un mode de réalisation particulier, la séquence du gène codant la protéine d'intérêt 30 Po est modifiée avant l'étape a), en substituant des isocodons adaptés. Dans un mode de réalisation particulier, d'autres substitutions d'isocodons sont également introduites après l'étape e) à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisit pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de mutagenèse utilisée est la technologie Massive Mutagenesis. Dans un autre mode de réalisation, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la méthode de recombinaison utilisée n'est pas la recombinaison circulaire in vitro mais la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée ou la mutagenèse par élongation (Matsuura T et al. Nat Biotechnol. 1999; 17:58-61). Des adaptations sont en particulier nécessaires dans le cas où la méthode de mutagenèse utilisée n'opère pas sur de l'ADN circulaire mais sur de l'ADN linéaire. Il est à noter que si l'on sous-clone dans un vecteur qui comporte déjà le gène codant la protéine Po, on risque d'obtenir des faux positifs (plasmides religués sans insert). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la mutagenèse est effectuée in vivo, par utilisation de souches mutatrices. Dans un mode de réalisation particulier, la banque de variants est créée à l'étape b) non pas chez E. Coli, mais directement dans un organisme thermophile. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique ne code pas pour la kanamycine nucleotidyltransférase, mais une autre protéine active à haute température H conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermostable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie à haute température est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais en faisant appel à une souche auxotrophe. Mode de réalisation 2: Recombinaison et sélection par survie d'un thermophile à haute température. Dans un second mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation de la recombinaison, de la sélection par survie (figure 5) et par la succession des étapes suivantes: a) Choix de 2 à 100 (préférentiellement 2 à 10) organismes non thermophiles ou thermophiles dont les génomes codent différents variants d'une protéine d'intérêt Po. Ces variants diffèrent par leur activité et par leur thermostabilité. Ce mode de réalisation permet de recombiner les gènes correspondants puis de sélectionner les nouveaux gènes ainsi créés de manière à améliorer l'activité à température élevée de la protéine d'intérêt. b) Clonage des gènes codant les 2 à 100 (préférentiellement 2 à 10) protéines Pi, tous dans le même vecteur plasmidique, qui contient, outre les éléments nécessaires à sa propre réplication dans un thermophile (ou un hyper-thermophile) et chez E. Coli et un gène de résistance à l'ampicilline permettant la sélection de clones transformants, un gène codant une protéine rapporteur H active à haute température qui confère la résistance à un antibiotique, lui-même stable à haute température. Les gènes codant Pi sont clonés en phase avec H, de manière à obtenir des protéines de fusion Pi-H. De préférence, les gènes codant les Pi sont tous placés en 5' par rapport au gène codant. Alternativement, ils peuvent être placés tous en 3' (ce qui correspond aux deux orientations possibles de la protéine de fusion). De préférence, on insère en outre une séquence codant un espaceur peptidique entre la protéine d'intérêt Pi et la protéine rapporteur H afin que les deux protéines soient distantes l'une de l'autre et puissent se replier sans interférer. c) Recombinaison, par un procédé de recombinaison génétique (ie: in vivo ou in vitro, homologue ou séquence-indépendant, aléatoire ou dirigé), desgènes Pi qui conduit à l'obtention d'une banque. d) Transformation de la banque obtenue à l'étape c) dans un microorganisme thermophile. e) Mise en culture, pendant 30 minutes à 3 jours, de préférence 3 heures à 24 heures, en milieu liquide ou solide, à haute température (préférentiellement: 50 à 100 C) des cellules de micro-organisme thermophile utilisé, en présence d'une concentration adaptée d'antibiotique thermostable. e) Préparation de l'ADN plasmidique de la culture de l'étape e). Cet ADN est enrichi en gènes codant des variants thermostables de la protéine d'intérêt Po. Dans un mode de réalisation particulier, la séquence des gènes codant la protéine Pi est modifiée après l'étape a) et avant l'étape b), par des mutations synonymes appropriées introduites par mutagenèse dirigée ou par resynthèse du gène pour s'adapter à l'utilisation des codons dans le micro-organisme thermophile choisi. Dans un mode de réalisation particulier, d'autres mutations synonymes appropriées sont également introduites à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisi pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation particulier, la recombinaison est effectuée en utilisant le procédé de recombinaison in vitro circulaire (Demande de brevet FR 0503364 déposée 20 par Biométhodes). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la méthode de recombinaison utilisée n'est pas la recombinaison circulaire in vitro mais le DNA Shuffling (Stemmer WP. Nature. 1994;370:389-91), le StEP (Zhao H. Methods Enzymol. 2004;388:42-9) ou toute autre méthode de recombinaison homologue ou séquence-indépendante adaptée. Des adaptations sont en particulier nécessaires dans le cas où la méthode de recombinaison utilisée n'opère pas sur de l'ADN circulaire mais sur de l'ADN linéaire. Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la recombinaison est effectuée in vivo. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique code pour une autre protéine active 5 H à haute température conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermostable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais 10 en faisant appel à une souche auxotrophe. Mode de réalisation 3: Metagenome et sélection par survie d'un thermophile à haute température. Dans un troisième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par 15 l'utilisation de techniques dite du metagenome et par la succession des étapes suivantes: a) Choix d'une source environnementale d'ADN, par exemple, et sans évidemment que cette liste puisse être considérée comme limitative, l'eau de mer et notamment l'eau des dorsales océaniques, le sol, et notamment la rhizosphère, l'air, la glace de l'antartique, ... b) A partir de l'ADN extrait de cette source environnementale, clonage direct par la technique du metagénome (Streit WR et al. Curr Opin Biotechnol. 2004;15:285-90; Daniels R Curr Opin Biotechnol. 2004; 15:199204), selon la technique du criblage séquence-dépendant, du criblage fonctionnel ou encore du SIGEX ( substrate-induced gene-expression screening ; Yun J et al. Microb Cell Fact. 2005; 4:8) d'un nombre indéterminé de variants Pl d'une protéine d'intérêt Po dans un même vecteur plasmidique, contenant, outre tous les éléments nécessaires à sa propre réplication et à l'expression (dans un thermophile ou un hyperthermophile et aussi dans un mésophile), d'un gène codant une protéine rapporteur thermostable H qui confère la résistance à un antibiotique (lui-même thermostable). Les gènes codant P; sont clonés en phase avec H, de manière à obtenir une protéine de fusion Pi-H. Une banque est obtenue. Soit les gènes codant les Pi sont tous placés en 5' par rapport au gène codant, soit ils sont placés tous en 3' (ce qui correspond aux deux orientations possibles de la protéine de fusion). De préférence, on insère en outre une séquence codant un espaceur peptidique entre la protéine d'intérêt Pi et la protéine thermostable H afin que les deux protéines soient distantes l'une de l'autre et puissent se replier sans interférer. c) Transformation de la banque obtenue à l'étape b) dans le microorganisme 5 thermophile de sélection. d) Mise en culture, pendant 30 minutes à 3 jours, de préférence 3 heures à 24 heures, en milieu liquide ou solide, à haute température (préférentiellement: 50 à 100 C) des cellules du micro-organisme thermophile de sélection, en présence d'une concentration adaptée d'antibiotique thermostable. e) Préparation de l'ADN plasmidique de la culture. Par rapport à la banque initiale, cet ADN est enrichi en gènes codant des protéines P, thermostables. Dans un mode de réalisation particulier, des mutations synonymes appropriées sont introduites à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisi pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans 20 l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique code pour une autre protéine H active à haute température conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermostable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais 30 en faisant appel à une souche auxotrophe. Mode de réalisation 4: Criblage par FACS Dans un quatrième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation d'une protéine H fluorescente qui est stable dans des conditions physico- chimiques non standard. Il n'est pas nécessaire que cette protéine soit fluorescente dans ces conditions mais il faut qu'elle puisse être produite dans ces conditions puis être active lorsqu'on la replace dans des conditions standard. Le tri a lieu en utilisant la cytométrie de flux et un FACS (fluorescence activated cell sorter; figure 8). Ce mode de réalisation relève plus du criblage haut-débit que de la sélection, puisque les cellules sont triées une par une. Le débit est plus limité que dans le cas de la sélection sur un critère de survie (typiquement 102 à 104 cellules triées par seconde, soit la possibilité de cribler au mieux des banques de l'ordre de 10' variants en une heure). Dans ce quatrième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la succession des étapes suivantes: a) Construction d'une banque de plasmides contenant tous les éléments nécessaires à leur réplication et à l'expression (chez un extrêmophile ainsi que chez le mésophile éventuellement utilisé pour la génération de diversité au départ ou la production de la protéine améliorée à la fin), permettant la sélection de transformants, et contenant une séquence codant une protéine de fusion P;- H, où Pi est un variant de la protéine d'intérêt (ces variants étant obtenus par une technique de mutagenèse, de recombinaison ou encore par les techniques du metagenome) et où H est une protéine fluorescente ou luminescente (par exemple, la GFP ou un variant de la GFP) . Préférentiellement la protéine de fusion intègre un espaceur peptidique adapté. Il est fondamental que la protéine H utilisée soit non seulement stable à haute température mais puisse être produite par expression à haute température dans un organisme thermophile (figure 1). b) Transformation d'un organisme extrêmophile par une banque de plasmides (figures 3 et 4). c) Expression dans des conditions physico-chimiques non standard (par exemple, suivant l'extrêmophile choisi, à une température de 75 C, ou à une concentration de 3M en NaCl, ou à pH 2) de la banque. d) Tri, à basse température (préférentiellement, de 5 C à 45 C) et par utilisation d'un FACS, ou d'un FACS miniaturisé ( FACS), ou encore de nombreux itFACS utilisés sur un mode parallèle, des cellules de l'organisme extrêmophile. On récupère la fraction des cellules qui émettent, lorsqu'elles sont excitées à une longueur d'onde appropriée, une fluorescence mesurée au-dessus d'un seuil déterminé empiriquement (par exemple, on récupère les 0.1% de cellules qui fluorescent le plus). e) Préparation de l'ADN plasmidique de ces cellules. Par rapport à la banque initiale, cet ADN est enrichi en gènes codant des protéines thermostables. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise, par mutagenèse dirigée ou par synthèse de gènes, les substitutions d'isocodons nécessaires à une bonne expression hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, la sélection n'a pas lieu par FACS, mais par lecture de la fluorescence de colonies cultivées sur support solide puis prélèvement et repiquage des colonies présentant une fluorescence élevée (figure 7). Exemples. Exemple 1: Exemple de plasmide. Un plasmide pouvant être utilisé dans le procédé selon l'invention comporte, dans un ordre approprié, et de façon à ce qu'une phase de lecture unique soit respectée, les éléments suivants: a) une origine de réplication dans un extrêmophile (utilisé pour la sélection), et éventuellement une autre origine de réplication dans un mésophile (éventuellement utilisé pour l'obtention de diversité génétique ou pour la production de la protéine améliorée). b) un ou plusieurs promoteurs, éventuellement un ou plusieurs promoteurs qui permet(ent) une expression conditionnelle; c) un gène de résistance à l'ampicilline ou à un autre antibiotique classique, sous contrôle d'un promoteur adapté, qui permet la sélection de transformants chez E. coli ou tout autre système classique adapté (par exemple, si on utilise des levures, ce gène est de préférence un marqueur d'auxotrophie); d) un gène codant une protéine rapporteur stable dans des conditions physicochimiques non standard et éventuellement active dans ces conditions; e) facultativement, une portion de séquence codant un peptide de liaison d'une dizaine 10 d'acides aminés; f) un gène codant la protéine d'intérêt ou un variant de celle-ci. Exemple 2: Amélioration de la thermostabilité d'une phytase. Augmenter la thermostabilité de phytases bactériennes permet de répondre à un enjeu économique et environnemental majeur dans le domaine de l'alimentation animale. La phytase d'Escherichia coli (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8), catalyse le clivage de l'acide phytique, la forme majeure de stockage du phosphore dans les graines de plantes, avec libération d'un phosphomonoester. Le phosphore présent dans l'acide phytique n'est pratiquement pas utilisable par les animaux monogastriques comme les porcs et la volaille. Aussi, supplémenter l'alimentation de ces animaux avec une phytase augmente la valeur nutritionnelle de l'alimentation fournie. En réduisant le besoin de suppléments en phosphate inorganique dans l'alimentation animale, les phytases aident aussi à préserver l'environnement. Les procédés impliqués dans la fabrication des granulés ou autres aliments pour animaux font très généralement intervenir des étapes à haute température (typiquement: une phase courte de 1 seconde à trois minutes, à 80 C ou plus). Il est donc nécessaire de disposer d'une phytase qui est stable à ces hautes températures, tout en étant active à la température du corps si on veut pouvoir l'incorporer dans l'alimentation animale. a) Le gène PhyA codant la phytase d'Escherichia coli est cloné en phase avec le gène codant la kanamycine nucléotidyltransférase thermostable et un gène de résistance à l'ampicilline (non thermostable). Une séquence codant un peptide de liaison d'une dizaine d'acides aminés est insérée entre les deux gènes. b) En utilisant des oligonucléotides adaptés, on applique la technique de mutagenèse site-dirigé haut-débit Massive Mutagenesis au plasmide contenant la construction de l'étape a) pour contruire une banque de variants du gène PhyA. c) On transforme un organisme thermophile (Thermus thermophilus), avec le plasmide contenant la banque de variants du gène PhyA obtenue à l'étape b) . d) On cultive, pendant plusieurs heures, à une température de 70 C, l'organisme 10 thermophile en présence d'une concentration adaptée de kanamycine. e) On prépare l'ADN plasmidique des cellules cultivées à l'étape d) . f) On transforme E. Coli avec cet ADN plasmidique et on étale sur une boîte de pétri 15 contenant de l'ampicilline. g) Après avoir laissé pousser une nuit, on repique dans une dizaine de boîtes à 96 puits des colonies individuelles prélevées sur la boîte de pétri de l'étape f). h) On se place dans des conditions permettant l'expression de la phytase dans E. Coli. i) On lyse les cellules bactériennes. j) On utilise un test adapté pour cribler rapidement les clones exprimant une phytase 25 qui, en plus d'avoir acquis de la thermostabilité, est active à basse température (37 C). Dans un mode de réalisation particulier, l'activité phytase est mesurée directement dans le surnageant de culture. Pour cela, 20 L de surnageant de culture sont incubés avec 200 L d'une solution de phytate de sodium (10g/L dans du tampon acétate de sodium 250mM - CaC12 1mM - pH5, 5) à 37 C pendant des temps variables (de 15min à 18h). A t=0 et à la fin de la réaction, 50 L de la réaction sont prélevés et mélangés à 50 L de TCA 20% pour arrêter la réaction. L'activité phytase est estimée par le dosage des phosphates libérés dans le milieu réactionnel. Ce dosage s'effectue par ajout de 100 L d'un mélange 4:1 de molybdate d'ammonium 12mM:sulfate de fer 380mM. Après 30min d'incubation à 20 C (température ambiante), la DO est mesurée à 620nm. Le facteur d'augmentation du signal est calculé par le rapport (DO finale) / (DO initiale). Exemple 3: Amélioration de la résistance aux pH extrêmes d'une cellulase. Les cellulases peuvent être utilisées dans la conversion de biomasse mais aussi dans divers procédés industriels, dont l'agroalimentaire, le textile, la lessive, le papier. En vue de l'utiliser dans plusieurs de ces procédés, on souhaiterait disposer d'une cellulase possédant une activité spécifique élevée à des pH neutres ou alcalins (pH 6 à pH 11). Des auteurs ont récemment décrit l'obtention, par évolution dirigée, d'un variant d'une cellulase, l'endoglucanase III (EG III) issu de Trichoderma reesei (Wang T et al. Biomol Eng. 2005; 22: 89-94) ayant un optimum de pH (5.4) augmenté de 0.6 unités par rapport à l'enzyme sauvage. On cherche à aller plus loin dans cette amélioration. Dans le cas d'une cellobiohydrolase de la famille 7 des glycosyl hydrolases (Ce17), des auteurs ont mis en évidence une corrélation très claire entre thermostabilité et activité à pH alcalins (Boer H et al. Eur. J. Biochem. 2003; 270: 841-848). a) Le gène Ce17 codant la cellulase Ce17 de Trichoderma ressei est cloné en phase avec le gène codant la kanamycine nucléotidyltransférase thermostable. Une séquence codant un peptide de liaison d'une dizaine d'acides aminés est insérée entre les deux gènes. b) En utilisant des oligonucléotides adaptés, on applique la technique de mutagenèse site-dirigé haut-débit Massive Mutagenesis au plasmide contenant la construction de l'étape a) pour contruire une banque de variants du gène Ce17. c) On transforme un organisme thermophile (Thermus thermophilus) avec le plasmide contenant la banque obtenue à l'étape b). d) On cultive, pendant plusieurs heures, à une température de 70 C, l'organisme thermophile en présence d'une concentration adaptée de kanamycine. e) On prépare l'ADN plasmidique des cellules cultivées à l'étape d) . f) On coupe les plasmides obtenus autour du gène d'intérêt et sous-clone l'insert dans un plasmide permettant son expression par E. coli. Ce plasmide comporte un gène de résistance à la tétracycline. g) On transforme E. coli avec cet ADN plasmidique et on étale sur une boîte de pétri contenant de la tétracycline. h) Après avoir laissé pousser une nuit, on repique dans une dizaine de boîtes à 96 puits des colonies individuelles prélevées sur la boîte de pétri de l'étape f) i) On se place dans des conditions permettant l'expression de la cellulase dans E. Coli. j) On lyse les cellules bactériennes. k) On utilise un test adapté pour cribler rapidement les cellulases ayant une activité spécifique importante à un pH alcalin. Exemple 4: Amélioration de la stabilité in vivo d'une cytokine. a) On part du gène IL7, qui code une cytokine présentant un potentiel en tant que protéine thérapeutique pour l'homme et dont on voudrait améliorer la stabilité in vivo dans l'organisme humain. Ce gène est totalement synthétisé (par la méthode de la PCR chevauchante en assemblant de long oligonucléotides d'une centaine de base synthétisés chimiquement) en modifiant la séquence du gène humain de manière à obtenir des substitutions d'isocodons qui permettent sa bonne expression chez Thermus thermophilus et chez E. coli. Ce gène resynthétisé est cloné en phase avec le gène codant la kanamycine nucléotidyltransférase thermostable. Une séquence codant un peptide de liaison d'une dizaine d'acides aminés est insérée entre les deux gènes. b) En utilisant des oligonucléotides adaptés, on applique la technique de mutagenèse site-dirigé haut-débit Massive Mutagenesis au plasmide contenant la construction de l'étape a) pour contruire une banque de variants du gène IL7. c) On transforme un organisme thermophile (Thermus thermophilus), avec le plasmide contenant la banque obtenue à l'étape b). d) On cultive, pendant plusieurs heures, à une température de 70 C, l'organisme thermophile en présence d'une concentration adaptée de kanamycine. e) On prépare l'ADN plasmidique des cellules cultivées à l'étape d). f) On transforme E. coli avec cet ADN plasmidique et on étale sur une boîte de pétri contenant de l'ampicilline. g) Après avoir laissé pousser une nuit, on repique dans une dizaine de boîtes à 96 puits des colonies individuelles prélevées sur la boîte de pétri de l'étape f) h) On se place dans des conditions permettant l'expression de la cytokine dans E. Coli. i) On lyse les cellules bactériennes. j) On utilise un test adapté pour cribler rapidement les clones exprimant une cytokine ayant une activité spécifique importante à 37 C. k) Un criblage secondaire, sur un nombre réduits de clones sélectionnés à l'étape i) est effectué sur le critère de la demi-vie plasmatique de la cytokine. Exemple 5: Création d'une enzyme halotolérante en utilisant un halophile. a) On part d'une banque de variants d'un gène codant une enzyme issue d'un organisme mésophile, qui est active en milieu aqueux mais très peu ou pas active dans un solvant organique dans lequel on voudrait pouvoir l'utiliser. Une façon indirecte d'y parvenir est d'améliorer la tolérance au sel de cette enzyme. Cette banque de gène est clonée en phase avec un plasmide qui permet de l'exprimer sous forme d'une protéine de fusion avec protéine rapporteur conférant la résistance à un antibiotique, cette protéine rapporteur étant stable et active dans les conditions de vie de l'halophile. Le plasmide comporte en outre une origine de réplication chez E. Coli et un gène de résistance à l'ampicilline chez E. Coli. b) On transforme l'organisme halophile par la construction de l'étape a) et on met en culture, dans les conditions de vie de l'halophile (donc: en présence d'une quantité 2886943 34 importante voire saturante d'un ou plusieurs sels), l'organisme halophile, en présence de l'antibiotique et dans des conditions permettant l'expression de la banque de protéines de fusion. On peut utiliser un milieu solide ou un milieu liquide. c) On prépare l'ADN plasmidique des clones ayant poussé. d) On transforme E. coli avec cet ADN plasmidique et on étale sur une boîte de pétri contenant de l'ampicilline. e) Après avoir laissé pousser une nuit, on repique dans une dizaine de boîtes à 96 puits des colonies individuelles prélevées sur la boîte de pétri de l'étape d) f) On se place dans des conditions permettant l'expression de l'enzyme dans E. Coli. 15 g) On lyse les cellules bactériennes. h) On utilise un test adapté pour cribler rapidement les clones exprimant une enzyme active dans le solvant organique d'intérêt. Légendes des figures. Dans toutes les figures, la séquence codant la protéine de fusion Pi-H est représentée de telle sorte que Pi est en amont. Ceci correspond à la configuration préférée. Dans un mode de réalisation particulier, l'orientation contraire, avec H en amont est utilisée. Eventuellement, une séquence codant un espaceur peptidique d'une dizaine d'acides aminés est insérée entre la séquence codant Pi et la séquence codant Pi; pour simplifier cette séquence n'est pas représentée. Figure 1: exemple de plasmide pouvant être utilisé. Cas où la diversité génétique de la banque qui sera soumise à sélection est créée après le clonage du gène d'intérêt (par exemple, par la technique Massive Mutagenesis). 1. Promoteur d'expression dans l'hôte extrêmophile; 2. Promoteur d'expression dans E. coli; 3. Origine de réplication de l'hôte extrêmophile; 4. Origine de réplication de E. coli. Figure 2: exemple de plasmide pouvant être utilisé. Cas où la banque de variants du gène d'intérêt est directement clonée avant la sélection par le procédé selon l'invention. Cette banque est créée, par exemple, par recombinaison in vitro, par une technique du metagenome, ou par la technique Massive Mutagenesis. 1. Promoteur d'expression dans l'hôte extrêmophile; 2. Promoteur d'expression dans E. coli; 3. Origine de réplication de l'hôte extrêmophile; 4. Origine de réplication de E. coli. Figure 3: mutagenèse dirigée sur le gène de la protéine d'intérêt puis insertion dans un plasmide d'expression en fusion avec le gène de la protéine rapporteur. Figure 4: insertion du gène de la protéine d'intérêt en fusion avec le gène de la protéine rapporteur puis mutagenèse dirigée sur le gène de la protéine d'intérêt, par exemple par la technique Massive Mutagenesis aboutissant à une banque de variants de la protéine d'intérêt dans un vecteur d'expression de tel sorte que la protéine soit exprimée sous forme d'une protéine de fusion avec la protéine rapporteur. Figure 5: transformation de bactéries extrêmophiles compétentes par la banque de variants contenant le gène muté de la protéine d'intérêt en fusion avec le gène de la protéine rapporteur (par exemple: un gène de résistance à un antibiotique) puis sélection sur milieu sélectif solide. Figure 6: transformation de bactéries extrêmophiles compétentes par la banque de variants contenant le gène muté de la protéine d'intérêt en fusion avec le gène de la protéine rapporteur puis sélection en milieu sélectif liquide. Figure 7: transformation de bactéries compétentes extrêmophiles avec la banque de variants contenant le gène muté de la protéine d'intérêt en fusion avec le gène de la protéine rapporteur puis visualisation de la protéine rapporteur en milieu solide. Figure 8: transformation de bactéries compétentes par la banque de variants contenant le gène muté de la protéine d'intérêt en fusion avec le gène de la protéine rapporteur puis tri par FACS (fluorescence activated cell sorter). Revendications. 1- Procédé de sélection de protéines stables dans des conditions physicochimiques non standard caractérisé en ce qu'une banque de variants d'une protéine d'intérêt est exprimée dans un micro-organisme extrêmophile sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine rapporteur stable dans lesdites conditions physico-chimiques non standard, et en ce qu'un ou plusieurs variants stables de la protéine d'intérêt sont sélectionnés à partir des micro-organismes dans lesquels la protéine rapporteur est active. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme extrêmophile présente une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: thermophile, hyper-thermophile, osmophile, halophile, psychrophile, alkalophile, acidophile, piezophile, radiophile, et metallophile. 3- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micro-organisme extrêmophile est une bactérie, une archéo-bactérie, ou un eucaryote extrêmophile. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micro-organisme est sélectionné parmi les microorganismes thermophiles ou hyperthermophiles suivant: Thermus aquatiicus, Therinu.sÉ thermophilus, Thermotoga maritime ou Aguifex pyrophilus. 5- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine rapporteur stable est une protéine dont l'expression correcte permet la survie du micro-organisme et en ce que la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par survie du micro-organisme. 6- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est une protéine conférant la résistance à un antibiotique. 7- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est une version thermostable d'une protéine de résistance à la kanamycine ou à la bléomycine. 8- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la 5 protéine rapporteur est un marqueur d'auxotrophie. 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est une protéine dont l'expression correcte conduit directement ou indirectement à la transformation d'un substrat en un produit, le produit et le substrat différant par leurs couleurs, et en ce que la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée sur la base de la couleur des micro-organismes. 10- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est une version stable dans des conditions physico-chimiques non standard de la béta-15 galactosidase. 11- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est fluorescente ou luminescente et en ce que la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par détection de la fluorescence ou luminescence. 12- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine rapporteur n'est pas fluorescente ou luminescente dans les conditions physico-chimiques non standard où elle est produite mais devient fluorescente lorsqu'on la place dans des conditions physico-chimiques standard. 13- Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la protéine rapporteur est la GFP (green fluorescent protein) ou un variant de la GFP. 14- Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que la sélection est effectuée en utilisant un FACS. 15- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine de fusion comprend un espaceur peptidique. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. 17- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est située en C-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. 18- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque de variants de la protéine d'intérêt est générée par une technique de mutagenèse quelconque, de préférence sélectionnée parmi le groupe suivant: la technologie Massive Mutagenesis, la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse à saturation, la mutagenèse par élongation, et la mutagenèse in vivo, une méthode de recombinaison génétique in vivo ou in vitro, ou une combinaison de celles-ci. 19- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis . 20- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par recombinaison in vitro circulaire de plusieurs gènes naturels ou synthétiques codant la protéine d'intérêt. 21- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par clonage direct d'acides nucléiques tirés d'une source environnementale par utilisation des techniques du metagénome. 22- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 4, 6, 16 et 19, caractérisé en ce que le micro-organisme est thermophile ou hyperthermophile, la protéine rapporteur est une protéine thermostable conférant la résistance à un antibiotique, la protéine d'intérêt est située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion, et la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis"'.