FR 2850389 A1 20040730 FR 0300763 A 20030124 L'invention concerne de nouveaux copolymères cationiques, leur utilisation pour la vectorisation de biomolécules naturelles ou synthétiques, les complexes et/ou les systèmes particulaires comprenant lesdits copolymères cationiques et lesdites biomolécules, ainsi que des intermédiaires pour leur synthèse. L'utilisation de matériel génétique dans une stratégie thérapeutique ou prophylactique semble être une voie prometteuse depuis ces dix dernières années. Cependant, ce matériel génétique, qu'il s'agisse d'ADN, d'ARN et/ou de leurs fragments, est assez fragile, in vivo (dégradation par les nucléases), lors d'administrations directes par les voies classiques parentérales ou invasives connues des industries pharmaceutique et biotechnologique. Des niveaux de transfection satisfaisants sont obtenus uniquement lorsque l'administration du matériel génétique nu est réalisée à proximité des cellules cibles (par exemple injection d'ADN nu directement dans les tissus musculaires au contact des myoblastes). A ce constat, il faut ajouter que ces molécules, chargées négativement, ont des difficultés à franchir les diverses membranes cellulaires elles-mêmes étant chargées négativement. L'ensemble de ces obstacles aboutit à l'heure actuelle à une efficacité réduite de ces biomolécules naturelles ou synthétiques et il a ainsi pu être démontré qu'une très faible proportion de la masse totale du matériel administré parvenait effectivement à atteindre le compartiment cellulaire visé et à y exercer le rôle qui lui est assigné. Afin de remédier à ces problèmes, l'utilisation de vecteurs constitue une méthode de choix originale. Ces vecteurs se divisent principalement en deux catégories : (i) les vecteurs viraux, qui ont été les premiers testés, et (ii) les vecteurs synthétiques. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, les adénovirus et les virus associés aux adénovirus (AAV). Si de nombreux essais sont en cours avec des vecteurs d'origine virale, cette stratégie soulève toujours un doute quant à leur innocuité (M.D. Brown et al., Word Markets Series, Business Briefing, Pharmatech 2001, Word Markets Research Center Ltd Ed., 158-164). En effet, bien que pouvant assurer un taux de transfection élevé, certains vecteurs viraux peuvent provoquer de fortes réactions inflammatoires et immunitaires (activation des oncogènes), les administrations répétées de doses devenant alors impossibles. De plus, ces vecteurs ne peuvent transférer que des fragments d'ADN de taille limitée, ce qui interdit la transfection de gènes de grande taille. Par ailleurs, des difficultés de production, de contrôle qualité et de stockage sont rencontrées avec de tels vecteurs. Comme alternative aux vecteurs dérivés de virus, les chercheurs se sont orientés vers d'autres vecteurs purement synthétiques, que l'on peut classer en deux familles : les lipides cationiques et les polymères cationiques. Ces composés chargés positivement s'associent au matériel génétique chargé négativement par des interactions électrostatiques pour former des complexes dits "lipoplexes" ou "polyplexes" selon la nature du vecteur. La formation d'un complexe présentant des charges positives excédentaires favorise l'interaction avec les diverses membranes des cellules. Il existe une grande variété de lipides cationiques conduisant à des efficacités de transfection variables (A. Aissaoui et al., Curr. Drug Targets 2002,3, 1-16). Un des inconvénients majeurs de ces composés est sans aucun doute leur toxicité plus ou moins élevée. De même, le pouvoir transfectant de nombreux polymères cationiques a été évalué (S. C. De Smedt et al., Pharm. Research, 2000,17, 113-126 ; M. C. Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1999,16, 147-207). Parmi eux, on citera par exemple la polylysine, la polyéthylèneimine et certains dendrimères à motifs cationiques. Ces vecteurs synthétiques sont plus stables que les lipides cationiques et bénéficient d'une certaine facilité de production. Dans ce contexte, la présente invention a pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture de nouveaux vecteurs synthétiques. L'originalité de la présente invention réside en ce que ces vecteurs sont formés d'un copolymère associant deux types de monomères spécifiques, lesquels permettent selon la proportion relative de l'un par rapport à l'autre, d'obtenir soit des copolymères à tendance hydrosoluble, soit des copolymères à tendance organosoluble. Il est dès lors envisageable d'obtenir des structures de type polyplexe ou particulaire, dotées de propriétés spécifiques permettant, in vitro et in vivo, une vectorisation efficace des biomolécules naturelles ou synthétiques telles que ADN, ARN et/ou leurs fragments. L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un copolymère cationique formé à partir de deux types de monomères, à savoir : - au moins un monomère renfermant au moins une fonction amine protonable, et - au moins un monomère de type méthylidène malonate. Par "fonction amine protonable", on entend une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire qui peut être rendue cationique par ajout d'un proton. Selon un aspect préféré, l'invention concerne un copolymère cationique formé à partir de #au moins un monomère de formule (I) H2Cd l2 H2c= - Sp est un groupe espaceur tel que -(CH2)m- ou -(CH2)m-O-(CH2)1- ou n'existe pas ; - m et I, identiques ou différents, représentent un entier de 1 à 4 ; - Y est -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NH-, -C(O)-NH- ou NH-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement (C1-C6) alkyle linéaire ou ramifié substitué par au moins une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire, éventuellement protégée par un groupement protecteur ou sous forme protonée, et # au moins un monomère de type méthylidène malonate de formule (II) dans laquelle - A représente - R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe Cl-C6 alkyle linéaire ou ramifié ; - r = 1, 2, 3, 4 ou 5 ; De préférence, ledit copolymère selon l'invention comprend, exprimé en pourcentage molaire : - de 0,1 à 99,9%, de préférence de 1 à 99% d'au moins un monomère renfermant au moins une fonction amine protonable, et - de 0,1 à 99,9%, de préférence de 1 à 99% d'au moins un monomère de type méthylidène malonate. Selon une hypothèse de mécanisme, ledit monomère renfermant au moins une fonction amine protonable est susceptible d'assurer l'interaction avec du matériel biologique, par exemple, ADN, ARN et/ou leurs fragments, par l'intermédiaire de ses charges positives qui s'associent aux charges négatives du matériel biologique. Selon la proportion de monomère renfermant au moins une fonction protonable, lesdits copolymères présenteront des propriétés d'hydrosolubilité ou d'organosolubilité. Ainsi, une première famille de copolymères selon l'invention est constituée des copolymères comprenant, en pourcentage molaire, - de 1 à 50%, de préférence de 1 à 35%, de monomère (s) au moins une fonction amine protonable, et - de 50 à 99%, de préférence de 65 à 99%, de monomère (s) type méthylidène malonate. Lesdits copolymères possèdent avantageusement des propriétés d'organosolubilité leur permettant de former des nanoparticules ou des microparticules selon divers procédés qui permettront soit d'encapsuler, soit d'adsorber, voire même encapsuler et adsorber des biomolécules naturelles ou synthétiques telles que ADN, ARN et/ou leurs fragments. Lesdites nanoparticules ou microparticules associées auxdites biomolécules naturelles ou synthétiques représentent un objet de l'invention. Une autre famille de copolymères avantageux selon l'invention est constituée de copolymères comprenant, en pourcentage molaire, - de 50 à 99%, de préférence de 65 à 99% de monomère (s) au moins une fonction amine protonable, et - de 1 à 50%, de préférence de 1 à 35%, de monomère (s) type méthylidène malonate. Dans ce cas, lesdits copolymères possèdent avantageusement des propriétés d'hydrosolubilité et sont susceptibles de former des complexes avec des biomolécules naturelles ou synthétiques telles que ADN, ARN et/ou leurs fragments. Lesdits complexes représentent également un objet de l'invention. Des monomères protonables préférés renfermant au moins une fonction amine de formule (I) sont ceux dans lesquels - R1 = méthyle ; - n = 0 ou 1 ; - X est -C(0)-0-, -O-C(O)-, -C(O)-NH- ou-NH-C(O)- ; - Sp = (CH2)m , m étant égal à 0, 1 ou 2 ; - Y n'existe pas ; - R2 est un groupe aminométhyl, aminoéthyl, -CH(CH3)-NH2 ou -NH# CH# CH-CHjNH2 ! Des monomères de formule (I) particulièrement avantageux aux fins de l'invention sont les composés de formules (III), (IV) et (V) ci-dessous : Les composés de formule (III), (IV) et (V) sont des composés nouveaux qui représentent un objet ultérieur de l'invention. De manière générale, les monomères de formule (I) sont préparés par des procédés connus de l'homme du métier par couplage d'un dérivé méthacrylate, vinylique ou allylique, judicieusement fonctionnalisé, avec une molécule également fonctionnalisée portant une ou plusieurs fonction (s) amine(s)protégée(s) ou non. On peut par exemple condenser un résidu d'acide aminé dont la fonction amine terminale est protégée par un groupement protecteur avec un dérivé d'hydroxyéthylméthacrylate ou d'alcool allylique selon des méthodes connues, en présence, par exemple, de dicyclohexylcarbodiimide comme agent de couplage et de 4-diméthylaminopyridine, comme catalyseur, dans un solvant tel que le dichlorométhane. Les monomères de formule (I) peuvent comporter une ou plusieurs fonction (s) amine (s) protégée(s) ou non protégée(s). Lorsqu'ils renferment une ou plusieurs fonction (s) amine(s)protégée(s), celle(s)-ci n'est(ne sont) de préférence déprotégée (s) qu'àl'issue de la synthèse du copolymère afin de permettre d'utiliser différents types de procédés de polymérisation et d'assurer une meilleure réactivité des monomères dans une plus large variété de solvants. Lorsque la ou les fonction (s) amine (s) du groupe R2 est (sont) protégée(s) par un groupement protecteur, celui-ci est choisi parmi les groupements habituellement utilisés à cette fin, tels que par exemple le groupement tertio- butyloxycarbonyle. Le monomère de type méthylidène malonate particulièrement préféré dans le cadre de l'invention est un composé de formule (II) dans laquelle A représente un groupe -C(O)-O(CH2)n-C(O)-OR4, R3 = R4 = éthyle et n = 1, ou bien un groupe - C(O)-OR4 et R3 = R4 = propyle. Les monomères de formule (II) peuvent être préparés comme décrit dans le brevet EP 0 283 364. La structure des copolymères cationiques selon l'invention peut être de type statistique, à blocs ou greffée. L'invention concerne également l'utilisation des copolymères cationiques tels que définis ci-dessus pour la vectorisation de biomolécules naturelles ou synthétiques de préférence chargées négativement, en particulier de matière biologique, notamment de matériel génétique, tel que l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments (i.e. oligonucléotides anti-sens, aptamères, "small interfering" ARN...), de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. Par "biomolécule", on entend également de manière non limitative toute molécule ayant une activité biologique prophylactique ou thérapeutique, notamment un agent anti-infectieux, en particulier un agent antiseptique, antibiotique, antiviral, antiparasitaire ou antimitotique, notamment anticancéreux. L'invention concerne également les complexes et/ou les micro- ou nanoparticules comprenant lesdits copolymères cationiques et lesdites biomolécules, en particulier l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments. Lesdits complexes sont obtenus par mise en contact desdits copolymères cationiques et desdites biomolécules en solution. Les exemples ci-après illustrent non limitativement l'invention. Dans ces exemples, les abréviations suivantes sont utilisées : AIBN : a,a'-Azoisobutyronitrile BCA : Bicinchoninic Acid Solution t-Boc tertio-butyloxycarbonyle DCC : dicyclohexylcarbodiimide DMAP : 4-diméthylaminopyridine DMSO : diméthylsulfoxide DO : densité optique ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HEMA : hydroxyéthylméthacrylate I.p : indice de polymolécularité Me : méthyle MTT : (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide ; Thiazolyl blue) Mw : masse molaire moyenne en poids n.d : non déterminé Réf. : référence THF : tétrahydrofurane. 1 - Synthèse de monomères (I) comprenant une fonction amine protégée ou non Les dérivés d'acides aminés (Neosystem, Novabiochem) et autres réactifs (Aldrich, Merck, Fluka) ont été utilisés en l'état sauf indication précisant leur mode de purification. Les solvants ont été utilisés sans purification préalable sauf lorsque cela est expressément signifié. Les monomères sont caractérisés par chromatographie sur couche mince (ccm) réalisée avec des plaques revêtues de gel de silice 60F254 comme phase stationnaire. Les plaques de ccm ont été révélées successivement sous éclairage UV à une longueur d'onde de 254 nm puis par un chauffage à 100 C après pulvérisation d'une solution éthylique de ninhydrine à 1%. Selon les cas, les purifications des monomères ont été réalisées par précipitation, cristallisation ou chromatographie éclair. La pureté analytique des composés préparés a été contrôlée par l'obtention d'une seule tache en ccm pour deux systèmes d'éluants différents. Les systèmes d'éluants suivants ont été utilisés : A (acétate d'éthyle/éther de pétrole : 1/1 (v/v)) et B (méthanol/dichlorométhane: 5/95 (v/v)). La caractérisation a été effectuée par analyse spectroscopique (RMN du proton à 250 MHz) et les données RMN sont exprimées de la manière suivante : déplacement chimique (8) donné en ppm ; s singulet ; d doublet ; t triplet ; q quadruplet ; m multiplet ; la position (le domaine) et le nombre de protons sont précisés pour chaque raie de résonance. Exemple 1 : Chlorhydrate d'aminoéthylméthacrylate (HCI,AEMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; = -C(O)-O- ; Sp = CH2 ; Y n'existe pas ; R2 = CH2-NH3+, CI- Mode opératoire La molécule HCI,AEMA est obtenue par réaction d'un mélange équimolaire de chlorhydrate d'éthanolamine et de chlorure de méthacroyle, fraîchement distillé sous pression réduite (20 mm Hg). La synthèse se déroule à 90 C, pendant 5 h, en masse. Il est nécessaire d'ajouter de l'hydroquinone (0,3M à partir d'une solution à 0,7 g dans 100 ml de THF) pour éviter la polymérisation radicalaire du chlorure de méthacroyle ou du HCI,AEMA formé. Le produit attendu est extrait du mélange réactionnel par recristallisation dans du dichloroéthane. Rendement : 85% ; solide blanc ; 1H RMN (250 MHz ; D2O) : # 6,20 (d, 1H, CH) ; 5,70 (d, 1H, CH) ; 4,45 (t, 2H, CH2) ; 3,45 (t, 2H, CH2) ; 2,00 (s, 3H, CH3). Les autres monomères renferment une fonction amine protégée qui n'est déprotégée qu'à l'issue de la synthèse du polymère ou copolymère permettant ainsi une polymérisation ou une copolymérisation dans une plus grande variété de solvants communs à tous les monomères utilisés. Exemple 2 : tert-butyloxycarbonylaminoéthylméthacrylate (t-Boc-AEMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = CH2 ; Y n'existe pas ; R2 = CH2-NH-t-Boc a/ Synthèse du précurseur tert but Iooycarbonrlaminoéthanol (t-Boc- NHCH2CH2OH) Une solution de 10 mmoles de di-tert-butyldicarbonate (t-Boc2O) dans 30 ml de dioxane est ajoutée sur une période de 2 h à une solution de 30 mmoles d'aminoéthanol dissous dans 30 ml de dioxane. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation durant 22 h à température ambiante puis concentré. On ajoute alors 50 ml d'eau et la phase aqueuse est ensuite extraite par 3 x 50 ml de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange dichlorométhane/méthanol 95/5 (v/v). Rendement : 88% ; huile ; Rf (A) : 0,30, Rf (B) : 0,55 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 5,29 (m, 1H, NH) ; 3,56 (dd, 2H, J1 = 5,00 Hz, J2 = 11,70 Hz, CH2) ; 3,52 (m, 1H, OH) ; 3,17 (dd, 2H, Ji = 5,00 Hz, J2 = 10,50 Hz, CH2) ; 1,36 (s, 9H, t-Boc). b/ Synthèse du monomère A une solution de 10 mmoles d'aminoéthanol monoprotégé dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 12 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/4 (v/v). Rendement : 74% ; solide ; Rf (A) : 0,71, Rf (B) : 0,89 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 6,10 (s, 1H, CH) ; (s, 1H, CH) ; (m, 1H, NH) ; (t, J = 5,25 Hz, 2H, CH2) ; 3,42 (m, 2H, CH2) ; 1,42 (s, 9H, t-Boc). Exemple 3 : Ester d'hydroxyéthylméthacrylate de tertbutyloxycarbonylalanine (t- Boc-AlaEMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = - (CH2)2- ; Y = -O-C(O)- ; R2 = -CH(CH3)-NH-t-Boc A une solution de 10 mmoles de tertutyloxycarbonylalanine (t-Boc- AlaOH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles de HEMA. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/4 (v/v). Rendement : 85% ; solide blanc ; Rf (A) : 0,70, Rf (B) : 0,90 ; 'H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 6,07 (m, 1H, CH) ; 5,54 (m, 1H, CH) ; (d, 1H, J = 6,70 Hz, NH) ; 4,37 (m, 1H, CHa) ; 4,30 (m, 4H, CH2) ; 1,88 (m, 3H, CH3) ; (s, 9H, t-Boc). Exemple 4 : Ester d'hydroxyéthylméthacrylate de tert-butyloxycarbonylglycine (t- Boc-GlyEMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = - (CH2)2- ; Y = -O-C(O)- ; R2 = CH2-NH-t-Boc A une solution de 10 mmoles de tert-butyloxycarbonyle de glycine (t-Boc- GlyOH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles de HEMA. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 4/6 (v/v). Rendement : 91% ; huile jaune ; Rf (A) : 0,65, Rf(B) :0,84 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 6,07 (m, 1H, CH) ; (m, 1H, CH ) ; (d, 1H, J = 6,70 Hz, NH) ; 4,37 (m, 1H, CHa) ; 4,30 (m, 4H, CH2) ; 1,88 (m, 3H, CH3) ; 1,38 (s, 9H, t-Boc). Exemple 5 : Ester d'allyle de tert-butyloxycarbonylglycine (t-Boc-GlyOAII) Composé de formule (I) dans laquelle Rl = H ; n = 1 ; X = -O-C(O)- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH2-NH-t-Boc A une solution de 10 mmoles de tert-butyloxycarbonylglycine (t-Boc- GlyOH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'alcool allylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04, 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 5/5 (v/v). Rendement : 62% ; huile ; Rf (A) : 0,74, Rf(B) : 0,80 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 5,80 (m, 1H, CH) ; 5,28 (m, 2H, CH2) ; 5,02 (d, 1H, NH) ; (m, 2H, CH2); 3,92 (d, 1H, J = 5,70 Hz, CHa) ; 1,44 (s, 9H, t-Boc). Exemple 6 : tert-butyloxycarbonylaminoéthylméthacrylamide (t-Boc-AEMAA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-NH- ; Sp = CH2 ; Y n'existe pas ; R2 = -CH2-NH-t-Boc al Synthèse du précurseur tert-butyloxycarbonyldiaminoéthane (t-Boc-NH- CH2-CH2-NH2) 87 mmoles de diaminoéthane dissous dans 40 ml de dioxane sont additionnées goutte à goutte par l'intermédiaire d'une ampoule de coulée à une solution de 11 mmoles de di-tert butyldicarbonate (t-BOC20) dissous dans 40 ml de dioxane sous agitation. L'ajout se fait sur une durée d'environ 45 min. Le milieu réactionnel est laissé 15 h sous agitation à température ambiante. La phase organique est ensuite concentrée sous vide et reprise dans 50 ml d'eau. Le produit de réaction est extrait de la phase aqueuse par 3 lavages successifs avec, à chaque fois, 25 ml de dichlorométhane. L'ensemble des phases organiques est ensuite séché sur MgS04 et concentré sous pression réduite. Le produit est séché totalement avant analyse. Rendement : 72% ; solide ; Rf (A) : 0,11, Rf (B) : 0,27 ; 1H RMN (250 MHz ;CDCI3) : # 4,90 (s, 1H, NH) ; 3,15 (m, 2H, CH2) ; 2,75 (m, 2H, CH2) ; 1,45 (s, 9 H, t-Boc) ; 1,25 (s, 2H, NH2)- b/ Synthèse du monomère A une solution de 13 mmoles de tert-butyloxycarbonyldiaminoéthane (tBoc-NH-CH2-CH2-NH2) dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont ajoutées 16 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 4 mmoles de DMAP sont ajoutées. 16 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors additionnées goutte à goutte au milieu réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel est alors purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange dichlorométhane/isopropanol 9/1 (v/v). Rendement : 54% ; solide ; Rf (A) : 0,37, Rf(B) : 0,71 ; 1H RMN (250 MHz ;CDCI3) : # 6,65 (s, 1H, NH) ; (s, 1H, CH) ; 5,30 (m, 1H, J = 5,30 Hz, CH) ; (s, 1H, NH) ; 3,35 (m, 4H, CH2) ; 1,95 (m, 3H, CH3) ; 1,45 (s, 9H, t-Boc). II - Synthèse de monomères de formule (I) renfermant deux fonctions amine protégées La synthèse des monomères diaminés peut être par exemple effectuée à partir de trois molécules diaminées, à savoir la N,N'-di-tert- butyloxycarbonylornithine (t-BocOrn(Boc)OH), le 1,3-di-tertutyloxycarbonylamino 2-hydroxypropane et le 1,3-di-te/t-butyloxycarbonylamino 2-aminopropane. La purification des monomères ainsi que les méthodes de caractérisation de ces derniers sont effectuées dans les conditions mentionnées au point I ci-dessus pour les monomères comprenant une seule fonction amine. Exemple 7 : Méthacrylate de 1,3-di-terf butyloxycarbonylamino 2-hydroxypropane (di-t-Boc-APMA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = CH3 ; n = 0 ; = -C(O)-O- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CH2-NH-t-Boc)2 a/ Synthèse du précurseur L3-di-tett-butyloxycarbonvlamino 2- hydroxypropane 27 mmoles de 1,3-diamino 2-hydroxypropane sont mises en solution dans un mélange constitué de 50 ml de dioxane et 30 ml d'eau. A cette solution sont additionnées goutte à goutte 80 mmoles de di- tert-butyldicarbonate (t BocZO) solubilisées dans 50 ml de dioxane. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite puis extrait par 3 x 50 ml de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/1 (v/v). Rendement : 78% ; solide ; Rf (A) : 0,50, Rf(B) : 0,50 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 5,10 (m, 2H, NH) ; (m, 1H, CH) ; 3,63 (m, 1H, OH) ; 3,21 (m, 4H, CH2) ; 1,43 (s, 9H, t-Boc). b/ Synthèse du monomère HN\ A- -\/\O HN - 0\>,- 0 HN "Il/ -0 A une solution de 10 mmoles de 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 90% ; solide ; Rf (A) : 0,47, Rf(B) : 0,61 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 6,23 (m, 1H, CH); 5,82 (m, 1H, CH) ; 5,00 (m, 2H, NH) ; 4,84 (t, 1H, J = 5,20 Hz, CH) ; (m, 4H, CH2) ; 1,93 (s, 3H, CH3) ; 1,30 (s, 18H, t-Boc). Exemple 8 : Méthacrylamide de 1,3-di-tert butyloxycarbonylaminopropyle (di-t-Boc- APMAA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-NH- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CHz-NH-t Boc)2 a/ Synthèse du précurseur 1.3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2- aminopropane 56 mmoles de 1,3-diamino 2-hydroxypropane sont dissoutes dans 10 ml d'une solution aqueuse de soude 0,1M et 40 ml de dioxane. Au goutte à goutte sont ajoutées 123 mmoles de di-tert-butyldicarbonate (t-BOC20) dissous dans 40 ml de dioxane. L'ajout se fait sur une durée d'environ 45 min. Le milieu réactionnel est laissé 22 h sous agitation à température ambiante. Le mélange est ensuite concentré sous pression réduite, repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCl. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2-hydroxypropane obtenu (34 mmoles) est dissous dans 100 ml de dichlorométhane. 68 mmoles de chlorure de mésyle sont ajoutées. La solution est agitée à 0 C et 102 mmoles de triéthylamine sont ajoutées lentement au goutte à goutte via une ampoule de coulée. L'agitation est maintenue pendant 2 h à 0 C. Le milieu réactionnel passe d'incolore à brun orangé. 100 ml d'une solution 1M d'acide chlorhydrique sont ajoutés dans le mélange ainsi que 100 ml de dichlorométhane. La phase organique est lavée successivement par 100 ml d'une solution de NaHC03 saturée puis par 100 ml d'une solution saturée de NaCl. Elle est ensuite séchée sur MgS04, filtrée puis séchée sous vide. Le produit se présente alors sous la forme d'une poudre orangée. 33 mmoles de ce solide sont ensuite dissoutes dans 100 ml de diméthylformamide anhydre et 165 mmoles de NaN3 sont ajoutées. Le mélange est chauffé à 80 C sous agitation constante pour une nuit. Le milieu réactionnel est ensuite versé sur 300 ml d'eau distillée et extrait 2 fois par 200 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel est alors purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Ce dernier intermédiaire est alors hydrogéné dans le méthanol en utilisant 10% massique d'un mélange Pd/C. Après une nuit, l'hydrogénation est complète et le brut de synthèse est filtré sur Celite 545 (Fluka, Réf. 22140). Après évaporation du solvant organique, le produit de synthèse est séché sous vide. Rendement : 46% ; solide ; 1H RMN (250 MHz ;CDCI3) : 8 5,10 (s, 2H, 2 NH) ; (m, 4H, 2 CH2) ; 2,90 (m, 1H, CH) ; (s, 9H, t-Boc). b/ Synthèse du monomère @ A une solution de 10,3 mmoles de 1,3-di-tertbutyloxycarbonylamino 2- aminopropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 11 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors introduites goutte à goutte dans le milieu réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel est alors purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 5/5 (v/v). Rendement : 79% ; solide ; 1H RMN (250 MHz ;CDCl3) : # 6,10 (s, 1H, CH2) ; 5,50 (s, 1H, NH) ; 5,30 (s, 1H, CH2) ; 3,65 (m, 1H, CH) ; 3,40 - 3,20 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,95 (s, 3H, CH3) ; 1,45 (s, 9H, t-Boc). Exemple 9 : Synthèses des monomères de formules (III), (IV) et (V) Structure (III) : Ester d'hyd roxyéthyl méthacrylate de N,N'-di-tert- butyloxycarbonylornithine (t Boc-Orn(t Boc)EMA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = (CHz)z ; Y = -O-C(O)- ; R2 = CH(NH-f-Boc)-(CH2)3-NH-f-Boc a/ Synthèse du précurseur N,LN'-di-tert butrloxycarbonytornithine 0 0 HO y-0 (CH2)3 / \ // \s NH -7[ 20 mmoles de chlorhydrate de L(+)-Ornithine sont mises en solution dans un mélange constitué de 40 ml de dioxane, 20 ml d'eau et 20 ml d'une solution molaire de soude. La solution est placée sous agitation à 0 C et 44 mmoles de di- tert butyldicarbonate (-Boc2O) sont ajoutées. Après 30 min, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite puis est repris par 50 ml d'éther éthylique puis par 50 ml d'eau. Après lavage de la phase aqueuse, 50 ml d'acétate d'éthyle sont ajoutés, puis le mélange est acidifié à l'aide d'une solution 1M de KHS04 jusqu'à un pH = 2-3. La phase organique est alors isolée et conduit, après séchage sur MgS04, filtration et évaporation, à l'obtention d'un solide qui est caractérisé dans le système d'éluant suivant : chloroforme/méthanol/acide acétique dans les proportions 85/10/5 (v/v/v). Rendement : 20% ; solide ; Rf (A) : 0,32, Rf (B) : 0,44 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 7,88 (s, 1H, OH) ; 5,26 (d, 1H, NH) ; 4,82 (d, 1H, NH) ; (m, 1H, CH) ; (m, 2H, CH2) ; 1,68 (m, 2H, CH2) ; 1,50 (m, 2H, CH2) ; 1,42 (s, 18H, CH3). b/ Synthèse du monomère Me C == A une solution de 10 mmoles de di-tert-butyloxycarbonylornithine (t-Boc- Orn (Boc)OH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'hydroxyéthylméthacrylate. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont alors introduites goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 150 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 73% ; solide ; Rf (A) : 0,74, Rf (B) : 0,91 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 6,12 (m, 1H, CH) ; (m, 1H, CH) ; (d, 1H, J = 6,50 Hz, NH) ; (m, 1H, NH) ; 4,45 - 4,26 (m, 4H, CH2) ; 3,86 (m, 1H, CHa) ; 3,12 (m, 2H, CH2) ; 1,86 - 1,45 (m, 6H, CH2) ; 1,42 (s, 18H, t-Boc). Structure (IV) : Acrylate de 1,3-di-tert butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane (di-t-boc-APA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = H ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CHz-NH-t Boc)Z a/ Synthèse du précurseur 1.3-di-tert butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane Cette synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 7. b/ Synthèse du monomère Synthese , monomère HN a )-0 HN -/0 O HN Y a A une solution de 10 mmoles de 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide acrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors additionnées au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 90% ; solide ; Rf (A) : 0,71, Rf (B) : 0,86 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 6,33 (m, 1H, CH) ; 6,02 (m, 1H, CH) ; (m, 1H, CH) ; (m, 2H, NH) ; (t, 1H, J = 5,20 Hz, CH) ; 3,36 (m, 4H, CH2) ; 1,30 (s, 18H, t-Boc). Structure (V) : Vinyl acétate de 1,3 di-tert-butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane Composé de formule (I) dans laquelle Rl = H ; n = 1 ; X = -C(O)-O- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CHZ-NH-t Boc)2 a/ Synthèse du précurseur 1,3-di-tert butrlox ca rbonrlamino 2- hydroxypropane Cette synthèse est décrite dans l'exemple 7. b/ Synthèse du monomère 0)-0 HN AT -\o 0 HN c- 0 A une solution de 10 mmoles de di-tert-butyloxycarbonylamino 2hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide acétique vinylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de 4diméthylaminopyridine (DMAP) sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont alors additionnées goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 150 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 4/6 (v/v). Rendement 65% ; solide ; Rf(A) : 0,80, Rf(B) : 0,94 ; 1H RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 5,90 (m, 1H, CH) ; 5,14 (m, 2H, CH2) ; 5,03 (m, 2H, NH) ; 4,82 (t, 1H, J=5,00 Hz, CH) ; (m, 4H, CH2) ; 3,06 (m, 2H, CH2) ; 1,41 (s, 18H, Boc). III - Préparation des copolymères cationiques Dans les exemples qui suivent, on a utilisé comme monomère (II) le 1- éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonylméthylène-oxycarbonyléthène dénommé ci-après MM 2. 1.2. Les copolymères sont caractérisés par : - RMN du proton (1H RMN) Cette technique donne accès à la composition moyenne des chaînes de polymère. Les spectres sont réalisés dans 020 pour les copolymères hydrosolubles et dans CDCI3 pour les copolymères hydrophobes non solubles dans l'eau. L'absence de pics aux déplacements chimiques caractéristiques des monomères indique qu'il ne reste plus de monomères résiduels après synthèse. Dans le cas où les copolymères sont préparés à partir d'un ou plusieurs comonomère (s) de type (I) dont la(les) fonction (s) amine (s) est (sont) protégée(s) par un groupement protecteur t-Boc, une analyse RMN avant déprotection dans CDCI3 permet d'observer la présence d'un pic caractéristique du groupement protecteur t-Boc à # = 1,45 (s, 9H, 3CH3) ainsi que l'éventuelle présence de monomères résiduels (pas de pic correspondant aux protons de la double liaison aux alentours de 6 ppm). La composition finale moyenne du copolymère peut être donnée par le rapport entre l'intensité d'un pic caractéristique du(des) comonomère (s) de type (II) (8 = 1,30 (t, 6H, 2CH3) dans le cas du MM 2. 1.2) et l'intensité d'un pic caractéristique (8 = 1,45 (s, 9H, 3CH3)) du (des) comonomère (s) de type (I). Après déprotection, on observe la disparition du singulet caractéristique du groupement protecteur t-Boc, démontrant que l'étape de déprotection est totale. - Chromatographie d'exclusion stérique (SEC) Cette technique d'analyse réalisée sur les copolymères solubles dans le THF met généralement en évidence la présence d'un pic monomodal possédant toutefois une distribution assez large en masse molaire, mais parfois également la présence d'oligomères résiduels qui peuvent être éliminés par dialyse ou fractionnement. Les masses molaires indiquées dans la suite des exemples ont été déterminées en utilisant un détecteur réfractométrique et un étalonnage réalisé à partir d'une gamme polystyrène de faible indice de polymolécularité. a/ Cas des comonomères (1) dont la fonction amine est protégée Les copolymérisations radicalaires ont été réalisées dans des tubes à essai (procédé de type "batch"). La température des tubes est régulée au moyen d'un bain chauffant thermostaté et l'agitation est de type magnétique. Après avoir introduit dans le tube les monomères (généralement entre 4 et 6 mmoles) ainsi que le solvant de polymérisation, le plus souvent du THF bidistillé, le mélange réactionnel est dégazé par barbotage d'azote, sous forte agitation pendant 5 min. Le contenu du tube est alors amené progressivement à la température de décomposition de l'amorceur et ce dernier est ajouté rapidement le plus souvent sous forme d'une solution dans le solvant de polymérisation. La polymérisation est poursuivie pendant 15 à 24 h puis le solvant est évaporé sous pression réduite. L'acide chlorhydrique gazeux a été choisi à la fois, comme agent de déprotection permettant l'élimination du groupement protecteur t-Boc et comme agent de protonation de la fonction amine ainsi libérée. Il est obtenu par addition d'une solution d'acide chlorhydrique (12M) sur de l'acide sulfurique concentré. Les copolymères comportant les fonctions amines protégées sont solubilisés dans de l'acétate d'éthyle (30 ml) et sont placés sous un courant de HCI gazeux. Après quelques minutes, si les copolymères contiennent au moins 60% molaire de comonomère cationique, ces derniers précipitent dans l'acétate d'éthyle. Ce phénomène est caractéristique de la perte des groupements t-Boc qui assuraient jusqu'alors aux copolymères leur solubilité dans la plupart des solvants organiques (THF, éthers...). Les copolymères sont alors isolés par filtration, solubilisés dans un petit volume d'eau distillé (15 ml), puis lyophilisés. b/ Cas des comonomères cationiques sous forme protonée Les copolymères sont préparés selon le même procédé "batch" mais, cette fois, en utilisant comme solvant le diméthylformamide (DMF), solvant de polymérisation commun au MM 2. 1.2 et au comonomère cationique. La durée de copolymérisation est de 15 h. Les copolymères sont purifiés par précipitation dans un non solvant du monomère majoritaire (500 ml), à savoir l'eau pour des copolymères riches en MM 2. 1.2 et le THF pour les autres. c/ Synthèse des copolymères à blocs Des copolymères PMM 2.1.2-b-PDMAEMA (méthacrylate de diméthylaminoéthyle) ont été préparés selon un procédé de polymérisation anionique par transfert de groupe (GTP), sur une rampe à vide, procédé qui sera détaillé dans l'exemple 10 ci-après. Exemple 10 : Préparation de copolymères PMM 2.1.2-b-PDMAEMA Le monomère méthacrylate de diméthylaminoéthyle (DMAEMA) (99%, Acros) est distillé sur CaH2 juste avant utilisation. L'acide benzoïque (99%, Prolabo), l'hydroxyde de tétra-n-butylammonium (40% dans l'eau, Acros), le (1-méthoxy 2méthyl 1-propényloxy) triméthylsilane (MTS) (95%, Acros) sont utilisés sans purification supplémentaire. a/ Synthèse du catalyseur bibenzoate de tétra-n-butylammonium (TBABB ) Le bibenzoate de tétra-n-butylammonium est synthétisé selon un procédé décrit dans la littérature (Eur.Polym.J., 36, 1779-1793,2000). 1 g d'acide benzoïque (8,2 mmol) est ajouté à 8 ml d'une solution à 40% d'hydroxyde de tétra-n- butylammonium (12,3 mmol). Après 15 min d'agitation à 35 C, la solution aqueuse est extraite avec du dichlorométhane (3 x 20 ml). 1 g d'acide benzoïque (8,2 mmol) est ajouté à la phase organique qui est agitée pendant 5 min puis séchée sur MgS04. Après filtration puis évaporation du dichlorométhane sous pression réduite, le solide est recristallisé sous forme d'aiguilles blanches à partir d'un mélange THF/Et2O 1/1. On obtient 3,8 g de TBABB (7,8 mmol). b/ Polymérisation du DMAEMA La synthèse est effectuée sur une rampe à vide permettant de travailler sous atmosphère contrôlée. 10 mg de catalyseur TBABB (2% molaire par rapport à l'amorceur) sont introduits dans le réacteur tricol de polymérisation et séchés pendant 30 min sous vide. Après cryodistillation de 150 ml de THF, 200 l de MTS sont rajoutés sous azote dans le ballon à température ambiante. Après 15 min d'agitation, 5 g de DMAEMA sont introduits dans le réacteur par une seringue étanche à un débit de 1 ml/min. L'exothermie de la polymérisation est suivie au moyen d'une sonde thermique. 1 h 30 environ après le début de la polymérisation, un prélèvement est réalisé afin de déterminer par SEC la masse molaire du premier bloc de PDMAEMA. c/ Polymérisation du second bloc : synthèse du segment PMM 2.1.2 5 g de PDMAEMA sont synthétisés comme décrit précédemment. Après 1 h 30 de réaction, une quantité voulue de MM 2. 1.2 dégazé et dilué dans 5 ml de THF cryodistillé est introduite à 20 C au goutte à goutte dans le réacteur contenant la solution de PDMAEMA. La réaction est stoppée par 5 ml de méthanol après 1 h 30 de polymérisation. Le polymère obtenu est dénommé ci-après PMM 2.1.2-bPDMAEMA. d/ Purification du copolymère Le copolymère PMM 2.1.2-b-PDMAEMA est séparé de l'homopolymère de PDMAEMA résiduel par précipitations successives dans l'eau jusqu'à disparition totale de la composante PDMAEMA, l'efficacité de la purification étant contrôlée par SEC. Le rapport molaire des monomères MM 2. 1.2/DMAEMA dans le copolymère est accessible par 1H RMN sur le copolymère isolé par précipitation dans l'eau. Tableau 1 Référence 10a 10b Volume de DMAEMA (ml) 5,00 5 00 Masse de MM 2.1.2 (g) 4,00 2,50 Masse molaire (Mw) PMM 2.1.2-b-PDMAEMA 24. 800-4.100 21. 500-4.800 (g/mol) Exemple 11 : Préparation du copolymère statistique P(MM 2.1.2-r-HCI,AEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut dans la partie Ill-b. Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 1 (HCI,AEMA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 2 Référence lla llb 11e lld lie llf 11 llh Rapport molaire initial 10/90 30/70 40/60 50/50 15/85 15/85 15/85 15/85 MM 2.1.2/comonomère Masse totale des monomères 0,53 0,50 0,75 0,50 1,00 1,00 1,00 1,00 % massique 1,00 1,00 1,00 1,00 0,50 3,00 6,00 1,00 d'amorceur* Rapport molaire final n. d n. d n. d n.d 27/63 31/69 32/68 17/83 Mw (g/mol) n. d n. d n. d n. d 43. 000 32. 000 23. 000 50. 000 (I.p) @ (2,50) 1 (3,60) 1 (4,60) (2 la) * : par rapport à la somme des deux monomères Les polymérisations des essais a à d sont conduites dans le DMF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C pendant 15 h. Les polymérisations des essais e à h sont conduites dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C pendant 24 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de solvant et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous forme d'une solution dans 1 ml de solvant. Exemple 12 : Préparation du copolymère statistique P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut dans la partie III-a. Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 4 (t-Boc-GlyEMA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 3 Référence 12a 12b 12c 12d 12e 12f 12g Rapport molaire initial 20/80 Rapport molaire initial 90/10 80/20 70/30 60/40 50/50 35/65 20/80 MM 2.1.2/comonomère Masse totale des monomères (g) 1,14 1, 31 1, 53 1,83 1,12 1,16 1, 20 monomères massique 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 d'amorceur* Rapport molaire final 85/15 80/20 70/30 63/37 50/50 36/64 20/80 Mw (g/mol) n. d n. d n. d n. d 22. 800 29. 400 44. 000 (I.p) (3,50) (2,60) (2,00) Rendement global n.d n.d n. d 40 38 46 65 ( 0/0 , J** n.d n.d * : par rapport à la somme des deux monomères ** : rendement final après copolymérisation et étape de déprotection La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 15 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 13 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,AlaEMA) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 3 (t-Boc-AlaEMA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 4 Référence 13a 13b 13c 13d 13e 13f Rapport molaire initial 70/30 50/50 35/65 35/65 35/65 15/85 MM 2.1.2/comonomère 70/30 50/50 35/65 35/65 35/65 15/85 Masse totale des monomères (g) 1,10 1,15 1,20 1, 20 1, 20 1,30 % massique d'amorceur* 1100 1 00 0,50 1,00 3,00 1 00 Rapport molaire final 66/34 50/50 34/66 35/65 35/65 21/79 * :par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 15 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 14 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyOAII) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 5 (t-Boc-GlyOAII) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 5 Référence 14a 14b 14c 14d 14e Rapport molaire initial 30/70 30/70 30/70 50/50 75/25 MM 2.1.2/comonomère Masse totale des monomères 1,16 1,16 1,16 1,10 1,05 % massique d'amorceur* 0,50 1,00 5,00 1,00 1,00 Mw (g/mol) 7. 000 6. 500 5.700 7.700 6. 200 * : par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 15 h. Le mélange de monomères est dissous dans 2 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 15 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,diAPMA) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 7 (di-t-Boc-APMA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 6 Référence 15a 15b 15c 15d 15e Rapport molaire initial 70/30 30/70 40/60 10/90 10/90 MM 2.1.2/comonomère Masse totale des monomères 1,00 0,64 1,33 0,75 0,75 % massique d'amorceur* 5,00 5,00 1,00 2,00 5,00 Mw (g/mol) n. d n. d 5.600 n. d n. d * : par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 15 h. Le mélange de monomères est dissous dans 2 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 16 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,OrnEMA) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 9 (t-Boc-Orn(t-Boc)EMA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 7 Référence 16a 16b 16c Rapport molaire initial 80/20 20/80 10/90 MM 2.1.2/comonomère Masse totale des . 1,36 1,17 1,40 monomères (g) % massique d'amorceur* 5,00 5,00 5,00 * :par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 15 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 17 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,diAPMAA) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 8 (di-t-Boc-APMAA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 8 Référence 17a 17b Rapport molaire initial 15/85 25/75 MM 2.1.2 comonomère Masse totale des monomères (g) 1, 00 1, 00 monomères (g) 1,00 1,00 % massique d'amorceur* 1,00 1,00 Ra ort molaire final 30/70 47/53 Mw (g/mol) 7. 000 5. 500 (I.p) (1,90) (1,80) * : par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 24 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 18 : Préparation de P(MM 2.1.2-r-HCI,AEMAA) suivant le protocole décrit dans le paragraphe III-a Monomère de formule (I) : monomère de l'exemple 6 (t-Boc-AEMAA) Monomère de formule (II) : MM 2.1.2 Tableau 9 Référence 18a 18b 18c Rapport molaire initial 15/85 25/75 45/55 MM 2.1.2 comonomère Masse totale des monomères 1,00 1,00 1,00 monomères (g) % massique d'amorceur* 1,00 1,00 1,00 Ra ort molaire final 20/80 30/70 50/50 Mw (g/mol) 11. 700 12. 700 12. 800 (Le) 1 (1,90) (1,90) (2,00) * : par rapport à la somme des deux monomères La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 24 h. Le mélange de monomères est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans chaque milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. IV - Vectorisation de biomolécules à l'aide de copolymères cationiques Les copolymères précédemment définis ont permis d'envisager plusieurs cas de formulations de principes actifs, qu'il s'agisse de systèmes particulaires ou non. Dans le premier cas, les micro- ou nanoparticules sont définies comme des systèmes, de nature particulaire, et qui présentent une taille respectivement supérieure et inférieure au micron. On considère généralement que trois souscatégories de systèmes les définissent : 1. les micro- ou nanosphères, qui sont des systèmes matriciels (pleins), 2. les micro- ou nanocapsules qui sont des systèmes réservoirs (avec une membrane polymère délimitant un compartiment interne aqueux ou huileux, pouvant contenir le principe actif), 3. et enfin des systèmes intermédiaires matriciels à contenu aqueux ou huileux (selon la nature du principe actif), tels que ceux obtenus par un procédé d'émulsions multiples (PCT/FR 99/01005). Dans ce cas, le principe actif est dispersé dans la structure matricielle sphérique, dans des micro-domaines (micro-gouttelettes internes, aqueuses ou huileuses). De ces trois sous-catégories de systèmes particulaires peuvent être conçues diverses formulations, sans que cela soit limitatif : - des micro- ou nanoparticules adsorbant un principe actif - des micro- ou nanoparticules encapsulant un principe actif - des micro- ou nanoparticules encapsulant et adsorbant un ou plusieurs principes actifs. Dans le deuxième cas de figure, pour ce qui est des systèmes non particulaires, et sans que cela ne soit limitatif, nous avons considéré les complexes, définis comme le résultat de l'association intermoléculaire entre un principe actif anionique et un copolymère cationique tous deux hydrosolubles. Contrairement aux systèmes particulaires, où les copolymères généralement utilisés sont d'une nature organosoluble définie par la structure générale en le sens où la proportion molaire de monomère renfermant au moins une amine protonable est inférieure à environ 50%, les complexes font appel aux copolymères hydrosolubles (où la proportion molaire de monomère renfermant au moins une amine protonable est supérieure à environ 50%). Des deux cas de formulations générales précédemment définies, on peut aussi envisager d'autres systèmes particulaires plus complexes, associant lesdits systèmes particulaires et lesdits complexes. Ainsi, par exemple, et sans que cela soit limitatif, on peut citer : - des systèmes sous forme de micro- ou nanoparticules à la surface desquelles sont adsorbés des complexes, - des systèmes sous forme de micro- ou nanoparticules à l'intérieur desquelles sont encapsulés des complexes, - des systèmes sous forme de micro- ou nanoparticules à l'intérieur desquelles sont encapsulés des complexes, et présentant par ailleurs des complexes adsorbés en surface. Quelques exemples non limitatifs en sont donnés ci-après. Les systèmes particulaires ont été caractérisés de la manière suivante : - la taille des microparticules a été évaluée à l'aide d'un compteur Multisizer II (Beckman Coulter, France), - la taille des nanoparticules a été déterminée à l'aide d'un nanosizer N4 Plus (Beckman Coulter, France), - la charge de surface des particules (potentiel Zéta) a été déterminée à l'aide d'un zétasizer 4 (Malvern Instruments, France). Le plasmide pGreen-LanternT"'-1 (GFP, Life Technologies) a été produit et purifié par nos soins. Brièvement, des clones de bactéries recombinantes E.coli DH5a résistantes à l'ampicilline (préalablement étalées sur boîtes de Pétri contenant du milieu LB (Luria Bertani : 10 g/1, Yeast extract 5 g/1, NaCI 5 g/1) sont incubés environ 8 h à 37 C sous agitation en milieu LB contenant de l'ampicilline. Cette pré-culture est ensuite incubée une nuit à 37 C sous agitation dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Après centrifugation des cultures, les culots bactériens contenant les plasmides sont traités selon le protocole décrit par Qiagen, fournisseur des colonnes échangeuses d'ions (EndoFree Plasmid Giga, Qiagen GmbH, Allemagne) nécessaires à la purification des plasmides. L'intégrité du plasmide GFP produit a été analysée sur un gel d'agarose 1% Tris-Acétate-EDTA (TAE IX) avant et après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI, tandis que sa qualité (contamination protéique...) est analysée par l'évaluation du rapport DO260/DO280 et sa quantité déterminée par spectrophotométrie UV (260 nm). Exemple 19 : Encapsulation d'ADN plasmidique dans des microparticules cationiques (mélange de polymères à base de MM 2. 1.2 (PMM 2. 1.2) et de copolymères de P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) organosolubles) selon un procédé d'émulsions multiples 50 mg de PMM 2.1.2 (Mw N 20. 000 g/mol) additionnés de différentes quantités (en mg) de copolymère cationique P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) organosoluble (exemple 12) sont dissous dans 1,5 ml de dichlorométhane. On ajoute alors 150 pl d'une solution aqueuse à 3,33 mg/ml dans l'eau milliQ d'ADN plasmidique contenant 1% d'ADN préalablement marqué au 33P (kit NickTranslation, Réf. N5500, Amersham). Le tout est homogénéisé à l'aide d'un homogénéiseur de type Ultra-Turrax à 24. 000 rpm durant 3 min. L'émulsion ainsi obtenue est transférée dans 15 ml d'une solution aqueuse d'alcool polyvinylique à 2% (m/v), puis soumise à une nouvelle homogénéisation à 8. 000 rpm durant 2 min. L'évaporation du solvant est réalisée à température ambiante pendant une nuit, sous agitation mécanique (moteur Heidolph, pale hélice 4 bras) à une vitesse de 1. 400 rpm. Les microparticules sont recueillies après centrifugation à 4. 500 rpm pendant 10 min puis lavées 3 fois avec de l'eau distillée et chaque fois soumises à une nouvelle centrifugation. Après la dernière centrifugation, les microparticules sont remises en suspension dans un volume de 5 ml d'eau milliQ. Le diamètre moyen des microparticules est de 6 m. A chaque étape de lavage, un prélèvement de 100 l de surnageant est opéré pour déterminer la proportion d'ADN non encapsulé. La mesure est effectuée par comptage en scintillation liquide (scintillant = Hionic Fluor, compteur Beckman LS6000TA). Tableau 10 Rendement PMM 2.1.2 Réf. (mg) P(MM 2.1.2-r-GlyEMA) (mg) N/P * d'encapsulation (mg) (%) 19a 50 0 0 21,7 19b 50 1,14 composé 12d 2 38,3 19c 50 2,43 composé 12c 2 39,2 19d 50 3,72 composé 12b 2 37,2 * : N/P = rapport molaire azote/phosphate, l'azote provenant des fonctions cationiques du copolymère et le phosphate de l'ADN. Les résultats montrent que les rendements d'encapsulation d'ADN ((quantité d'ADN encapsulée/quantité d'ADN présente au départ) x 100) sont environ deux fois supérieurs lorsqu'on utilise un mélange PMM 2.1.2/copolymère cationique à un rapport N/P=2, et constants quel que soit le copolymère cationique utilisé, tant que l'on conserve ce rapport. L'addition de copolymère cationique organosoluble dans la structure particulaire à base de PMM 2. 1.2 permet donc de passer d'un taux d'encapsulation d'ADN de 2 pg/mg (2 mg d'ADN encapsulé par mg de particules) à 4 pg/mg pour un rapport de charge N/P = 2. Les résultats du tableau 11 ci-dessous montrent que le taux d'encapsulation d'ADN peut être significativement amélioré lorsque la proportion de copolymère cationique organosoluble augmente. Tableau 11 Réf. PMM 2.1.2 Composé 12c (mg) N/P Rendement Réf. (mg) Composé 12c (mg) N/P d'encapsulation (%) 19a 50 0 0 21,7 19c 50 2,43 2 39,2 19e 50 6,05 5 44,5 19f 50 12,10 10 56,0 Exemple 20 : Encapsulation de complexes d'ADN plasmidique dans des microparticules de PMM 2. 1.2 selon un procédé d'émulsions multiples On ajoute à la phase aqueuse interne un copolymère cationique hydrosoluble selon l'invention de manière à former un complexe avec l'ADN qui sera lui-même incorporé dans une microparticule de PMM 2.1.2. 50 mg de PMM 2.1.2 (Mw # 20. 000 g/mol) sont dissous dans 1,5 ml de dichlorométhane (ou d'acétate d'éthyle). Parallèlement, on prépare 150 l d'une solution aqueuse (eau milliQ) contenant différentes quantités de copolymère cationique hydrosoluble P(MM 2.1.2-r-HCI,AlaEMA) (exemple 13) et 250 g d'ADN plasmidique contenant 1% d'ADN préalablement marqué au 33P (kit NickTranslation, Réf. N5500, Amersham). Cette suspension aqueuse de complexe est ajoutée à la phase organique précédente contenant le PMM 2. 1.2. Le tout est homogénéisé à l'aide d'un homogénéiseur de type Ultra-Turrax à 13. 500 rpm durant 3 min. L'émulsion ainsi obtenue est transférée dans 15 ml d'une solution aqueuse d'alcool polyvinylique à 2% (m/v), puis soumise à une nouvelle homogénéisation à 8. 000 rpm durant 2 min. Les étapes d'évaporation, de lavages et de dosage sont conduites de manière identique à celles décrites dans l'exemple 19. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 12 ci-dessous. Tableau 12 PMM 2.1.2 Solvant organique .t.tt 2.1.2-j- Rendement R'f PMM2.1.2 Solvant organique P(MM 2.1.2-,.. N/P d'encapsulation Réf. (mg) utilisé HCI,AlaEMA) (mg) N/P d'encapsulation (mg) utilisé HCI,AIaEMA) (mg) (0/0) 20a 50 acétate d'éthyle 7,05 composé 13b 2 3,5 20b 50 acétate d'éthyle 5,40 composé 13c 2 8,1 20c 50 dichlorométhane 7,05 composé 13b 2 12,7 20d 50 dichlorométhane 5,40 composé 13c 2 16,8 20e 50 dichlorométhane 70,50 composé 13b 20 38,6 20f 50 dichlorométhane 54,00 composé 13c 20 35,2 Exemple 21 : Préparation de nanosphères cationiques pour l'adsorption de principes actifs hydrosolubles d'origine variée 50 mg de copolymère cationique organosoluble selon l'invention sont dissous dans 1,5 ml d'acétone ou un mélange acétone-éthanol. Une fois la solubilisation obtenue, on transfère cette solution au goutte à goutte dans 10 ml d'eau milliQ sous agitation magnétique modérée. On obtient dès lors une suspension homogène laiteuse qui est laissée sous agitation magnétique modérée durant 15 min additionnelles, soumise à évaporation rotative 30 min sous vide de manière à évaporer le solvant ou le mélange de solvant utilisé, puis mise à lyophiliser pendant 24 h. L'étude a été menée avec divers lots de copolymères organosolubles P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) (exemple 12) ou P(MM 2.1.2-b-DMAEMA) (exemple 10) comportant une proportion de fonctions cationiques plus ou moins importante par rapport au nombre d'unités MM 2.1.2. Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 13 et 14 ci-dessous. Tableau 13 : des caractéristiques de nanosphères formulées à partir de copolymères statistiques P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA). Polymère PMM 2.1.2 Composé Composé Composé ymere 12a 12b 12c Proportion molaire de HCI,GlyEMA (%) 10 20 30 Diamètre (nm) 250 146 141 147 Potentiel Zéta (mV) - 42,0 + 22,0 + 25,1 + 26,4 Le même type de résultat est obtenu avec tous les copolymères cationiques organosolubles à base de PMM 2.1.2, y compris les copolymères blocs comme le montrent les données suivantes relatives aux compositions P(MM 2.1.2b-DMAEMA). Tableau 14 : des caractéristiques de systèmes nanosphériques formulés à partir de copolymères blocs P(MM 2.1.2-b-DMAEMA). Polymère 10a 10b Composition P(MM 2.1.2-b-DMAEMA) P(MM 2.1.2-b-DMAEMA) molaire et Mw 86/14 82/18 associées (g/mol) 24. 800/4.100 21.500/4.800 Diamètre (nm) 217 198 Potentiel Zéta (MV) + 12,0 + 30,0 (mV) Exemple 22 : Adsorption d'ADN plasmidique sur des nanosphères à base de P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) L'adsorption du plasmide GFP sur les nanosphères préparées selon l'exemple 21 précédent, est réalisée par incubation d'une quantité déterminée (mg) de nanosphères lyophilisées avec une certaine quantité ( g) d'ADN dans un volume d'eau milliQ constant et égal à 2 ml, sous agitation magnétique modérée. Les capacités d'adsorption exprimées en g d'ADN adsorbé par mg de nanosphères sont estimées en dosant l'ADN non adsorbé et présent dans les surnageants après centrifugation à 15. 000 rpm durant 5 min. Connaissant la quantité de plasmide GFP initialement introduite, on évalue facilement la quantité d'ADN adsorbée. 1% d'ADN préalablement marqué au 33P (Nick-Translation, Réf. N5500, Amersham) a été incorporé à l'ADN initial, et la mesure est effectuée par comptage en scintillation liquide (scintillant = Hionic Fluor, compteur Beckman LS6000TA). Les cinétiques d'adsorption révèlent qu'un temps de 2 h est suffisant pour permettre une adsorption maximale à température ambiante. Tableau 15 Isothermes d'adsorption de l'ADN sur des nanosphères formulées à partir de P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA) Quantité d'ADN initiale 150 250 590 5.900 ( g) Quantité de nanosphères formulées 10 10 10 10 à partir du composé 12c (mg) ADN adsorbé ( g/mg 14,95 24,75 58,35 115,15 de nanosphères) Rendement 99,7 99,0 98,9 19,5 d'adsorption (%) Les résultats montrent que le tracé des isothermes d'adsorption révèle une saturation de la surface des nanosphères à un taux voisin de 100 -120 pg/mg de nanosphères. En-dessous de ce taux le rendement d'adsorption est de l'ordre de 100%. Les potentiels électrocinétiques (potentiels Zéta) ainsi que les diamètres des nanosphères avant et après adsorption ont été mesurés sur deux isothermes (590 et 5.900 pg/ml d'ADN initialement introduit, rapports N/P respectivement de 10 et de 1). Les résultats sont rapportés dans le tableau 16 ci-dessous. Tableau 16 Evolution du diamètre et de la charge de surface de nanosphères avant et après adsorption (sans lavages, N/P = 10 et 1) Avant adsorption Après adsorption Après adsorption Avant adsorption (N/P = 10) (N/P = 1) Diamètre (nm) 147 278 1.140 Potentiel Zéta (mV) + 25,90 + 3,20 - 56,30 Les résultats montrent qu'au rapport N/P = 10, l'adsorption saturante permet de conserver une charge de surface légèrement cationique et un diamètre encore nanométrique. Ceci n'est plus obtenu dès lors que l'adsorption est conduite à une isotherme correspondant à un rapport N/P = 1. On vérifie ainsi que la surface des nanosphères est saturée en ADN. L'évaluation des séries de copolymères cationiques d'une même famille révèle une excellente relation de proportionnalité entre charge de surface et capacité d'adsorption maximale et ce, qu'il s'agisse de copolymères statistiques à compositions variables (ex. P(MM 2.1.2-r-HCI,GlyEMA), exemple 12), ou de copolymères à blocs tels que les P(MM 2.1.2-b-DMAEMA) (exemple 10). Tableau 17 Evaluation de séries de copolymères statistiques et blocs pour l'adsorption d'ADN TA = Taux d'adsorption, exprimé en g d'ADN adsorbé par mg de nanosphères Diamètre moyen Potentiel Zêta Copolymères (nm) (mV) TA maximum nm) (mV Statistiques 12c 147,0 +26,0 90,0 12b 141,0 +25,0 77,0 12a 146,0 + 22,0 70,0 Blocs 10b 198,0 ~ 80,5 + 30 56,0 10a 216,7 5,1 +150 320 Les cinétiques de désorption en milieu PBS révèlent une tendance biphasique fonction du taux de charges cationiques impliqué, à savoir que plus le pourcentage molaire de comonomère cationique du copolymère utilisé est important, plus la libération est prolongée, comme le montre le graphe de la figure 1. In vitro, le suivi cinétique de l'action des nucléases permet de vérifier que de tels systèmes assurent une protection efficace de l'ADN tant que celui-ci reste adsorbé. V - Transfections géniques in vitro en présence de copolymères cationiques Plusieurs copolymères cationiques selon l'invention ont été testés en tant qu'agents de transfection. Les essais ont été réalisés par transfection de cellules BHK-21 (fibroblastes) et/ou SRDC (lignée de cellules dendritiques spléniques murines dont l'obtention est détaillée dans le paragraphe b/ ci-après) avec les plasmides pCMVp (7,2 kb) ou pCMV-Luc (7,1 kb), contenant les gènes rapporteurs codant respectivement pour les protéines -galactosidase et luciférase. Dans le cas du plasmide pCMVp, les cellules sont dans un premier temps transfectées avec les complexes à différents rapports N/P et l'efficacité de transfection est estimée 24 h plus tard à l'aide du substrat X-gal (SIGMA). Ces essais permettent de déterminer les rapports N/P les plus favorables en terme d'efficacité de transfection. De nouvelles expériences de transfection sont ensuite menées avec les meilleurs rapports N/P, l'estimation de l'efficacité de transfection est alors réalisée par mesure de l'activité 3-galactosidase et en parallèle, une estimation de la viabilité cellulaire est effectuée. Dans le cas du plasmide pCMV-Luc, les cellules sont également transfectées avec les complexes de rapports N/P variables. Pour tous ces rapports, l'estimation de l'efficacité de transfection est directement réalisée par mesure de l'activité luciférase. Une estimation de la viabilité cellulaire est conjointement menée. a/ Production des plasmides pCMVss (Clontech) et pCMV-Luc Les deux plasmides ont été produits selon un protocole identique à celui décrit dans le paragraphe IV pour la production du plasmide GFP. Le plasmide pCMV a été fourni par Clontech alors que le plasmide pCMV-Luc, non disponible dans le commerce, a nécessité une étape de construction moléculaire. Ainsi, il a été obtenu par insertion du gène Luc, codant pour la luciférase, dans le plasmide pCMV (Invitrogen), selon un protocole habituellement utilisé dans la littérature (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1987, Chapter 1). En pratique, la ligation du vecteur et de l'insert a en premier lieu été effectuée puis des bactéries compétentes ont été préparées et la transformation a été mise en #uvre (i.e. les bactéries ont été soumises à un choc thermique). L'intégrité des plasmides produits a été analysée sur un gel d'agarose 1% (TAE 1X) avant et après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI pour les deux plasmides (linéarisation des plasmides). La qualité des ADN (contamination protéique...) est analysée par l'évaluation du rapport DO260/DO280 et leur dosage est également effectué par spectrophotométrie UV (260 nm). b/ Culture cellulaire b.l/ Lignée BHK-21 La lignée BHK-21, issue de rein de hamster syrien (ATCC, CCL-10) est mise en culture en milieu BHK-21 (Gibco BRL) contenant 2% de tryptose phosphate, 1% de pénicilline/streptomycine et 5% de sérum de veau foetal (SVF). 24 h avant les expériences de transfection, les cellules sont réparties dans des puits de plaques de 24 puits sous 1 ml de milieu de culture, à raison de 7,5.104 cellules/puits. Les cellules sont mises en culture à 37 C dans une étuve contenant 5% de CO2 jusqu'à 60 à 70% de confluence. b.2/ Lignée de cellules dendritiques SRDC Des cellules dendritiques sont obtenues à partir des rates de 15 souris CBA/J (H2k) âgées de 8 semaines. Elles sont purifiées et mises en culture selon la procédure décrite par Iwasaki et Kelsall (J.Exp.Med., 190 (2), 229-239,1999) appliquée aux cellules dendritiques des plaques de Peyer. Après 1 mois de culture, certaines cellules représentant une très faible proportion cellulaire survivent et se mettent à proliférer. Ces cellules spontanément immortalisées sont cultivées en milieu IMDM complet : IMDM (Gibco BRL) complété avec 5% de sérum de veau foetal décomplémenté et filtré (filtre 0,22 m), 2 mM de L-glutamine (Gibco BRL), 50 M de -mercaptoéthanol (SIGMA), 100 unités/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine (SIGMA). Ces cellules immortalisées sont incubées à 4 C pendant 30 min avec des billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CDllc (clone N418) (MILTENYL BIOTECH), marqueur spécifique des cellules dendritiques. Les cellules exprimant l'antigène CDllc en surface sont sélectionnées sur des colonnes MACS (MILTENYL BIOTECH) à l'aide d'aimants et mises en culture dans du milieu IMDM complet, et clonées par deux dilutions successives à 0,1 cellule/puits dans des plaques de culture de 96 puits (CORNING). Dans ces conditions, 15 clones ont été obtenus. Les clones ont été analysés par cytométrie en flux pour vérifier l'expression du marqueur CDllc et rechercher l'expression d'autres marqueurs, tels que Mac-1, Mac-3, DEC205 (spécifique des cellules dendritiques). Les résultats de cette analyse ont abouti à la sélection d'un clone, dénommé ci-après SRDC. 24 h avant les expériences de transfection génique, les cellules SRDC sont réparties dans des puits de plaques à 6 puits sous 2 ml de milieu de culture, à raison de 7,5.105 cellules/puits. Les cellules sont mises en culture à 37 C dans une étuve contenant 5% de CO2. c/ Préparation des copolymères Les différents copolymères lyophilisés sont mis en solution dans un tampon HBS (Hepes Buffered Saline, contenant 150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) à une concentration de 2 mg/ml. Dans certains cas, une sonication de 3 à 5 min (300 UltraSonik, NEY) peut être nécessaire pour une dissolution complète. Les solutions sont ensuite stérilisées par filtration sur des filtres de porosité 0,22 m. d/ Protocole de transfection d.l/ Cellules BHK-21 Le milieu de transfection est un milieu Optimem 1 (Gibco BRL). Les complexes ADN/copolymères sont préparés par ajout de différentes quantités de copolymères à 1 g de plasmide. Selon le cas considéré, les solutions stocks de copolymères sont diluées en HBS pour obtenir des solutions de concentrations appropriées. La formation des complexes s'effectue en mélangeant et en incubant à température ambiante pendant 30 min, 125 l de solution de copolymère à différentes concentrations et 125 l de solution de plasmide pCMVp ou pCMV-Luc (20 g/ml) de manière à obtenir des rapports N/P variables. Ensuite, 100 l de la solution de complexe sont répartis sur les cellules mises en culture la veille et préalablement rincées avec du milieu Optimem 1, puis incubées avec 150 l d'Optimem 1. L'incubation est poursuivie pendant 4 h à 37 C (dans une étuve contenant 5% de CO2). Le milieu de transfection est ensuite éliminé et remplacé par 1 ml de milieu de culture complet. Les cellules sont à nouveau mises en culture pendant 24 h. Toutes les expériences de transfection sont réalisées en 2 séries identiques sur 2 plaques de 24 puits différentes, l'une permettant l'estimation de l'expression du gène rapporteur, l'autre étant réservée à la détermination des effets cytotoxiques des complexes. Sur chaque plaque, un puits de cellules est réservé au contrôle. Il s'agit de cellules BHK-21 ne subissant pas de transfection, elles sont uniquement au contact de milieu Optimem 1 et de milieu de culture complet. d. 2/ Cellules SRDC Le milieu de transfection est un milieu Optimem 1 (Gibco BRL). Les complexes ADN/copolymères sont préparés par ajout de différentes quantités de copolymères à 1,5 g de plasmide pCMV-Luc. Des essais de transfections avec des agents de transfection commerciaux Lipofectamine (Gibco BRL) et DOTAP (Boehringer Mannheim) ont été réalisés en parallèle en suivant les recommandations du fournisseur. Dans le cas du DOTAP, la formation du complexe est effectuée en milieu HBS au lieu du milieu Optimem 1. La formation des complexes ADN/copolymère cationique s'effectue en mélangeant et en incubant à température ambiante pendant 30 min, 100 l de solution de copolymère et 100 l de solution de plasmide. Le mélange (200 l) est réparti sur les cellules mises en culture la veille et préalablement rincées avec 1 ml de milieu Optimem 1, puis incubées avec 800 l d'Optimem 1. L'incubation est poursuivie pendant 4 h à 37 C (dans une étuve contenant 5% de COz). Le milieu de transfection est ensuite éliminé et remplacé par 2 ml de milieu de culture complet. Les cellules SRDC sont mises en culture dans ces conditions pendant 36 h. e/ Détermination qualitative de l'expression de la protéine ss-galactosidase 24 h après la transfection, une révélation de l'expression de l'enzyme ssgalactosidase (ss-gal) à l'aide du substrat X-gal (5-bromo 4-chloro 3-indolyl ss-Dgalactopyranoside) est effectuée sur les cellules transfectées. La coloration bleue des cellules met en évidence l'expression de la protéine (i-galactosidase. Les cellules de chaque puits sont lavées 2 fois avec 500 l de PBS 1X puis fixées avec 500 l d'un mélange de glutaraldéhyde et de formaldéhyde - respectivement à 0,2% et 2% (v/v) dans le PBS 1X (sans Ca2+ ni Mg2+) - pendant 15 min à température ambiante. La solution de fixation est ensuite éliminée et les cellules sont à nouveau rincées 2 fois avec du PBS 1X. 500 l par puits d'une solution de X-gal est mis au contact des cellules fixées. Cette solution de X-gal est une solution extemporanée, elle est composée de : 1 mg/ml de X-gal, 2 mM de MgCl2, 4 mM de K4Fe(CN)6, 3H20, 4 mM de K3Fe(CN)6 en milieu PBS 1X (sans Ca2+ ni Mg2+). Les cellules sont ensuite incubées à 37 C pendant 16 à 20 h puis la solution de révélation est remplacée par 500 l de PBS 1X. Les cellules exprimant une activité -galactosidase présentent une coloration bleue, elles sont visualisées sous microscope (Olympus, CK2). f/ Evaluation de la cytotoxicité des complexes copolymères cationiques/ADN et détermination quantitative des activités p-qatactosidase et luciférase Pour déterminer l'effet cytotoxique des complexes copolymères cationiques/ADN plasmidique, le nombre de cellules vivantes est évalué à l'aide d'un test colorimétrique MTT (T. Mosmann, J.Immunol.Meth., 1983, 65, 55-63). D'autre part, les kits "-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer" (Promega, Réf. E2000) et "GeneLux" (PerkinElmer, Réf. L002-100) sont utilisés respectivement pour les dosages de l'activité ss-galactosidase et de l'activité luciférase. f.l/ Test colorimétrique MTT 24 h après la transfection, le milieu de culture est remplacé par du milieu DMEM (sans SVF) (500 l par puits). 50 l de MTT à la concentration de 5 mg/ml (en PBS 1X), stérile (filtration sur filtre de porosité 0,22 m) sont ajoutés dans chaque puits pour atteindre une concentration finale de 0,5 mg MTT/ml. La plaque est incubée pendant 2 h à 37 C (5% de 002). Le "milieu MTT" est ensuite éliminé doucement et 200 l par puits de DMSO stérile (ACROS ORGANICS) sont déposés sur les cellules afin de dissoudre les cristaux de formazan formés. La plaque est agitée doucement pendant quelques minutes afin d'assurer la dissolution totale des cristaux de formazan. 50 l par puits sont prélevés et déposés dans les puits d'une plaque de 96 puits. La lecture de la DO s'effectue ensuite à 540 nm (utilisation d'un lecteur de plaques ELISA, Wallac VICTOR2). Une dilution des échantillons dans le DMSO ou dans l'eau distillée (1/4 ou 1/8) est souvent nécessaire afin d'observer des valeurs de DO proches de 1. Le pourcentage de cellules vivantes est calculé selon la formule : Cellules vivantes (%) = (DO540 (échantillon) / DO 540 (contrôle)) X 100 où DO 540 (échantillon) représente la mesure des cellules transfectées avec les différents complexes copolymères cationiques/ADN et DO 540 (contrôle) représente la mesure des cellules non transfectées ayant été uniquement au contact du milieu de transfection (Optimem 1) et du milieu complet de culture. La DO lue est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. f.2/ Dosage de l'activité enzymatique p-galactosidase Préparation des extraits cellulaires 24 h après la transfection, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS 1X (sans Mg2+ et Ca2+). Un millilitre de tampon de lyse "Reporter Lysis Buffer 1X" est déposé sur les cellules. Après 15 min d'incubation à température ambiante, le tampon et les débris cellulaires sont recueillis dans des tubes Eppendorf placés dans la glace. Les tubes sont ensuite passés au Vortex pendant 10 à 15 s puis centrifugés à 15. 000 rpm pendant 5 min à 4 C. Les surnageants sont alors récupérés. Le dosage de l'activité ss- gai dans les extraits cellulaires peut se faire directement, mais les surnageants peuvent également être stockés à - 70 C (pour une durée de 2 mois). Dosage de l'activité enzymatique de la p-gaiactosidase ("activité 5-gal") Ce dosage est basé sur un test colorimétrique en plaques de 96 puits mettant en #uvre le tampon "Assay 2X" contenant le substrat ONPG (onitrophenyl -D-galactopyranoside). L'activité ss-gal est exprimée en milliunités/puits. Par définition, 1 milliunité de ss-galactosidase hydrolyse 1 nanomole d'ONPG en o-nitrophénol et -D-galactose par minute à pH 7,5 et à 37 C. Parallèlement aux échantillons à doser, une gamme étalon ss-galactosidase est effectuée de 1 à 5 milliunités. Le test est réalisé en plaques de 96 puits de la façon suivante : 50 l d'extraits cellulaires décongelés, purs ou dilués dans du tampon "Reporter Lysis Buffer 1X", sont déposés au fond des puits. 50 l de tampon "Assay 2X" sont ajoutés, puis la plaque est agitée quelques secondes avant d'être incubée à 37 C jusqu'à l'apparition d'une faible coloration jaune (15 à 30 min). La réaction est stoppée par l'ajout de 150 l de carbonate de sodium 1M. Après agitation, la DO est évaluée à 420 nm à l'aide du lecteur de plaques ELISA, Wallac VICTOR2(PerkinElmer). f.3/ Détermination de l'activité luciférase Cas des cellules BHK-21 24 h après la transfection, le milieu de culture est éliminé. 100 l de tampon de lyse (1 X) sont ajoutés aux cellules. Après 5 min d'incubation à température ambiante, 20 l d'échantillon sont transférés dans une plaque de 96 puits noire à fond blanc (PerkinElmer, Réf. 1450-581). Dans chaque puits, 50 l de réactif luciférine puis 50 l d'ATP sont ajoutés. L'émission de lumière émise est mesurée à l'aide d'un luminomètre (Wallac VICTOR2), la durée d'une mesure étant fixée à 10 s. Les résultats sont exprimés en RLU ("Relative Light Unit") pour une prise d'essai de 20 l de lysat cellulaire. Afin d'exprimer ces résultats par rapport à la quantité de protéine extraite, un dosage BCA (SIGMA) est effectué. Cas des cellules SRDC 36 h après la transfection, le surnageant de culture est éliminé. Les cellules dendritiques adhérentes sont récupérées par grattage, lavées dans 1 ml de PBS puis centrifugées 5 min à 400 g. Après élimination des surnageants, le culot cellulaire est repris dans 150 l de tampon de lyse additionné de 150 l d'eau. Après 15 min d'incubation à température ambiante, 20 l d'échantillon sont transférés dans une plaque de 96 puits noire à fond blanc (PerkinElmer, Réf. 1450-581). Dans chaque puits, 50 l de réactif luciférine, puis 50 l d'ATP sont ajoutés. L'émission de lumière émise est mesurée à l'aide d'un luminomètre (Wallac VICTOR2), la durée d'une mesure étant fixée à 10 s. Les résultats sont exprimés en RLU ("Relative Light Unit") pour une prise d'essai de 20 l de lysat cellulaire. Les résultats sont comparés à un témoin négatif constitué de cellules SRDC incubées en présence de 1,5 g de plasmide pCMV-Luc. g/ Dosage protéique (BCA) Pour la détermination de la quantité de protéines présente dans les cellules BHK-21 lysées, préalablement transfectées avec différents complexes copolymères cationiques/plasmide pCMV-Luc, le kit "Bicinchoninic acid protein assay" (SIGMA, BCA-1) a été mis en oeuvre. Le dosage des échantillons a été effectué selon les instructions du fournisseur. h/ Résultats h.l/ Cellules BHK-21 Pour tous les essais de transfection de cellules BHK-21, un contrôle positif de transfection est systématiquement introduit. Ce dernier est constitué de cellules transfectées avec un complexe PEI/ADN, la PEI étant la polyéthylèneimine branchée 25 kDa (Aldrich). Ce polymère cationique est parfaitement décrit dans la littérature pour son pouvoir de transfection élevé (W. T. Godbey et al., J.Control.Release 1999, 60,149-160 ; A. Kichler et al., J. Gene Med. 2001,3, 135-144). Des expériences préliminaires de transfection avaient montré qu'avec un rapport N/P de 10, une efficacité de transfection élevée était obtenue. Dans le tableau 18 ci-dessous sont récapitulés les résultats obtenus avec les copolymères à base de AlaEMA préparés dans l'exemple 13. Tableau 18 agent de Quantité d'agent de Activité ss-gal Cellules transfection N/P transfection (Milliunités/puits) vivantes (%) ( g/puits) 13d 40 43,4 10,5 95 13f 55 45,8 0,9 95 PEI 10 1,3 62,8 71 Les tableaux suivants représentent l'activité luciférase et le pourcentage de cellules vivantes à différents rapports N/P, pour les copolymères des séries HCI,AEMA et HCI,AEMAA (exemples 11 et 18). Tableau 19 Agent de Quantité d'agent de RLU/mg de Cellules transfection N/P transfection protéines vivantes (%) ( g/puits) 11g 1 0,9 49.104 95 llg 2 1 7 4,2.106 94 llg 3 2,6 1,4.107 92 llg 4 3,4 2,7.106 83 11g 5 4,3 1,1.106 70 PEI 10 1 3 4,1.107 58 Tableau 20 Agent de Quantité d'agent de RLU/mg de Cellules N/Ptransfection transfection N/P transfection protéines vivantes (%) 11f 1 0,8 2,3.104 100 11f 2 1 6 6,7.106 100 11f 3 2,4 1,8.107 97 11f 4 3,2 1,3.107 89 11f 5 4,0 1,2.107 99 11f 6 4,8 9,2.106 80 PEI 10 1,3 2,5.108 56 Tableau 21 Agent de Quantité d'agent de RLU/mg de Cellules transfection N/P transfection protéines vivantes (%) ( g/puits) 11e 1 08 22.104 100 Ile 2 1,6 1,3.107 100 11e 3 2,4 1,5.107 100 11e 4 3,2 3,7.106 97 PEI 10 1,3 3,2.108 55 Tableau 22 Agent de Quantité d'agent de RLU/mg de Cellules transfection N/P transfection protéines vivantes ( g/puits) llh 1 0,6 23.105 96 llh 2 1,3 1 8.106 99 llh 3 1,9 3,2.105 81 llh 4 2,6 1,5.105 92 11h 5 3,2 1,4.105 87 llh 6 3,8 6,4.104 100 llh 7 4,4 7,9.104 77 llh 8 5,1 5,1.104 73 llh 9 5,7 58.104 84 PEI 10 1 3 3,2.107 55 Tableau 23 Agent de Quantité d'agent de RLU/mg de Cellules transfection N/P transfection protéines vivantes (%) ( g/puits) 18a 1 0,7 1 8.104 94 18a 2 1,3 5 0.106 91 18a 3 2,0 4,7.106 85 18a 4 2 7 1,9.106 84 PEI 10 1,3 1,3.108 60 En présence des copolymères cationiques, un nombre important de cellules est transfecté, démontrant que les copolymères cationiques à base de MM 2.1.2 sont des agents de transfection efficaces. De plus, certains copolymères sont très faiblement toxiques vis-à-vis des cellules pour les rapports N/P leur permettant d'assurer une transfection tout à fait satisfaisante, ce qui n'est pas le cas de la PEI pour laquelle seulement 57% des cellules demeurent en moyenne viables suite aux opérations de transfection. A toxicité égale (90 - 100% de cellules vivantes), il a été démontré (résultats non reportés) que le pouvoir de transfection des copolymères cationiques à base de MM 2. 1.2 était environ 100 fois supérieur à celui de la PEI. h.2/ Cellules SRDC Le tableau 24 récapitule les conditions de transfection mises en #uvre. Tableau 24 Quantité d'agent de Agent de N/P transfection transfection ( g/puits) llh 2,5 2,4 13d 40,0 65,0 Li ofectamine 17,0 30,0 DOTAP 1,4 5,0 Les résultats de transfection sont présentés sur la figure 2. Ils montrent que contrairement aux agents de transfection commerciaux, Lipofectamine et DOTAP, les copolymères testés sont capables de transfecter des cellules dendritiques, cellules réputées pour être difficilement transfectables. REVENDICATIONS 1. Copolymère cationique formé à partir de deux types de comonomères, à savoir : - au moins un comonomère renfermant au moins une fonction amine protonable, et - au moins un comonomère de type méthylidène malonate. 2. Copolymère selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est formé à partir de : # au moins un comonomère de formule (I) dans laquelle : - R1 est H ou un C1-C4 alkyle ; - n est zéro ou un ; - X est -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NH-,-C(0)-NH- ou -NH-C(O)- ; - Sp est un groupe espaceur tel que -(CH2)m- ou -(CH2)m-O-(CH2)l- ; ou n'existe pas ; - m et I, identiques ou différents, représentent un entier de 1 à 4 ; - Y est -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NH-,-C(O)-NH- ou -NH-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement (C1-C6) alkyle linéaire ou ramifié substitué par au moins une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire, éventuellement protégée par un groupement protecteur ou sous forme protonée, et # au moins un comonomère de type méthylidène malonate de formule (II) dans laquelle - A représente . un groupe - i-OR4 O ou - R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe C1-C6 alkyle linéaire ou ramifié ; - r = 1, 2, 3, 4 ou 5. 3. Copolymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le monomère de type méthylidène malonate est un composé de formule (II) dans laquelle A représente un groupe -C(O)-O(CH2)n-C(O)-OR4, R3 = R4 = éthyle et n = 1, ou bien un groupe -C(O)-OR4 et R3 = R4 = propyle. 4. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend, exprimé en pourcentage molaire : - de 0,1 à 99,9%, de préférence de 1 à 99%, de comonomère(s) renfermant au moins une fonction amine protonable, et - de 0,1 à 99,9%, de préférence de 1 à 99%, de comonomère (s) type méthylidène malonate. 5. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend, exprimé en pourcentage molaire : - de 1 à 50%, de préférence de 1 à 35% de comonomère (s) au moins une fonction amine protonable, et - de 50 à 99%, de préférence de 65 à 99% de comonomère (s) type méthylidène malonate. 6. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend, exprimé en pourcentage molaire : - de 50 à 99%, de préférence de 65 à 99% de comonomère (s) au moins une fonction amine protonable, et - de 1 à 50%, de préférence de 1 à 35% de comonomère (s) type méthylidène malonate. 7. Utilisation d'un copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la vectorisation d'au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite (lesdites) biomolécule(s) est (sont) constituée (s) de matériel génétique tel que de l'ADN, de l'ARN et/ou de leurs fragments (oligonucléotides), de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. 9. Complexe comprenant au moins un copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 6 et au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 10. Complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère selon la revendication 6. 11. Complexe selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ladite(lesdites) biomolécule(s) est (sont) constituée (s) de matériel génétique tel que l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments, de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. 12. Vecteur particulaire constitué d'une nanoparticule ou d'une microparticule formée essentiellement d'un copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et d'au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 13. Vecteur particulaire constitué d'une nanoparticule ou d'une microparticule formée essentiellement d'un copolymère selon la revendication 5 et d'au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 14. Vecteur particulaire selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une microsphère ou d'une nanosphère à la surface de laquelle est adsorbée au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement, ou un complexe tel que défini à la revendication 10. 15. Vecteur particulaire selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une microparticule ou d'une nanoparticule comprenant des cavités multiples, à l'intérieur desquelles est encapsulée au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement, ou un complexe tel que défini à la revendication 10 et/ou à la surface de laquelle est adsorbée au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement, ou un complexe tel que défini à la revendication 10. 16. Vecteur particulaire selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une microcapsule ou d'une nanocapsule à l'intérieur de laquelle est encapsulée au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement, ou un complexe tel que défini à la revendication 10 et/ou à la surface de laquelle est adsorbée au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement, ou un complexe tel que défini à la revendication 10. 17. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que ladite(lesdites) biomolécule(s) est (sont) constituée (s) de matériel génétique tel que l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments, de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. 18. Monomères de formule (I) répondant à l'une des formules (III), (IV) ou (V) suivantes :