FR 2859733 A1 20050318 FR 0310789 A 20030915 La présente invention a pour objet un procédé de criblage cellulaire de composés aptes à moduler l'activité des ubiquitine hydrolases et ses applications. Chez l'ensemble des cellules eucaryotes, la modification covalente des protéines par ubiquitination est désormais reconnue comme assurant une fonction régulatrice dans une myriade de procédés cellulaires. Le rôle le mieux connu de l'ubiquitination est de cibler les protéines vers le protéasome 26S, un complexe rassemblant diverses activités protéolytiques, qui reconnaît les protéines modifiées par l'addition d'un polymère d'ubiquitine, et les dégrade. Plus récemment, des fonctions non protéolytiques ont été associées à l'ubiquitination, telles que le ciblage des protéines modifiées vers différents compartiments cellulaires, le contrôle allostérique d'activités enzymatiques ou le recrutement sélectif d'un activateur transcriptionnel à l'ADN. Les mécanismes permettant à l'ubiquitination d'aboutir à une telle variété de réponses sont mal compris à l'heure actuelle (Weissman (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2,169-178). L'ubiquitination d'une protéine substrat est réalisée en trois étapes. L'ubiquitine, qui est un polypeptide composé de 76 acides aminés, est préalablement activée grâce à la formation d'une liaison thioester avec une enzyme spécifique, nommée enzyme d'activation ou El. Cette liaison est ensuite transférée sur un résidu cystéine spécifique d'une seconde enzyme, appelée enzyme de conjugaison ou E2. Finalement une ubiquitine ligase ou E3, facilite la reconnaissance de la protéine substrat par l'enzyme E2, ou transfère directement l'ubiquitine activée sur la protéine substrat. Dans certains cas, l'ubiquitination d'une protéine peut faire appel à une 4ème enzyme, ou E4, qui selon les cas, peut être nécessaire à l'allongement de la chaîne de poly-ubiquitine formée sur la protéine substrat (Hochstrasser (1996) Annu. Rev. Genet., 30, 405-439 ; Hershko and Ciechanover (1998) Annu. Rev. Biochem., 67, 425-479). Alors que l'enzyme El est commun à toutes les voies d'ubiquitination, la sélectivité du mécanisme d'ubiquitination repose en grande partie sur l'ubiquitine ligase E3 qui interagit à la fois avec E2 et la protéine substrat. Le contrôle de l'interaction établie entre l'E3 et la protéine substrat est en grande partie à la base du contrôle de l'ubiquitination d'une protéine substrat. Les ubiquitine-ligases E3 se répartissent en deux grandes classes selon qu'elles possèdent un domaine protéique HECT ou un domaine protéique RING . Le domaine HECT forme une liaison thioester catalytique essentielle avec l'ubiquitine alors que le domaine RING fournit en fait un site d'arrimage à l'enzyme E2 qui fournit l'activité catalytique (Pickart (2001), Molec. Cell, 8,499-504). Parmi la classe des ubiquitine ligases RING , il existe une sous-famille particulièrement importante, qui regroupe des enzymes dénommées complexes SCF dont les fonctions cellulaires sont très diversifiées. Les ubiquitine ligases de la famille SCF ont été identifiées chez la levure Saccharomyces cerevisiae (Patton et al. (1998) Trends Genet., 14, 236-43) et retrouvées ensuite chez l'ensemble des organismes eucaryotes, champignons, plantes, insectes et mammifères. Les ubiquitine ligases SCF sont des édifices enzymatiques muti-protéiques qui sont construits autour d'un c#ur catalytique invariant composé de la protéine adaptatrice Skpl, de la protéine architecturale Cdc53 (dénommée Cullin chez les organismes métazoaires) et de la protéine Rbxl(encore dénommée Roc1ou Hrtl) qui comprend un domaine RING qui interagit dans la plupart des cas avec une E2 spécifique appelée Cdc34. Ce c#ur catalytique invariant s'associe avec l'un des membres d'une large famille de protéines adaptatrices appelées protéines à boite F . Les protéines à boite F ont une structure bipartite. Elles comportent un motif protéique d'environ 40 acides aminés appelé boite F qui leur permet d'interagir avec le c#ur catalytique des complexes SCF via la protéine Skpl et un domaine C-terminal responsable de la reconnaissance de la protéine substrat et qui peut-être constitué de la répétition de motifs WD40 ou LLR ; par exemple (Deshaies (1999) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 15, 435-467). Chez la levure S. cerevisiae, bien que plus de 17 protéines contenant une boite F aient été identifiées au sein du génome grâce à la présence de ce motif protéique particulier, seules trois ubiquitine ligases SCF ont été caractérisées et étudiées en détail chez cet organisme, à savoir les complexes SCFCdc4, SCFMet30 et SCFGrrl. Chacun de ces complexes est capable de reconnaître et d'ubiquitiner une ou plusieurs protéines substrats particulières. Ainsi le complexe SCFCdc4 a pour substrat Sicl et Farl, deux inhibiteurs de la kinase cycline-dépendante Cdc28. Le complexe SCF " reconnaît les cyclines de phases Gl, Cln1 et Cln2 (Skowyra et al. (1997) Cell 91, 209-219 ; Verma et al. (1997) Mol. Biol. Cell., 8, 1427-1437; Patton et al. (1998) Trends Genet., 14, 236-43). Le complexe SCFMet30 a été caractérisé et le rôle de cette E3 dans la régulation du métabolisme des acides aminés soufrés et le contrôle de la transition Gl/S du cycle cellulaire a été démontré (Patton et al. (1998) Genes Dev. 12, 692-705 ; Patton et al. (2000) EMBO J., 19, 1613-1624). Le substrat principal du complexe SCFMet30 est l'activateur transcriptionnel Met4 (Rouillon et al. (2000) EMBO J., 19, 282-294). Ainsi la protéine Met30 a été identifiée comme un facteur impliqué dans la régulation transcriptionnelle négative des gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) et composés soufrés organiques comme la Sadénosylméthionine (SAM) et le glutathion. Chez la levure S. cerevisiae, cette voie métabolique rassemble environ 25 gènes (les gènes MET) dont l'expression est pour la plupart strictement co-régulée (Thomas et Surdin-Kerjan (1997), Microbiological and Molecular Reviews, 61, 503-532). Chez l'homme le métabolisme des acides aminés soufrés est largement différent de celui rencontré chez la levure car contrairement à ce micro-organisme, l'homme n'est pas capable d'assimiler le soufre inorganique et sa croissance requiert donc un apport alimentaire en soufre organique. Des études antérieures ont permis de montrer que l'expression des gènes MET chez la levure est contrôlée par un activateur transcriptionnel unique, le facteur Met4. L'activateur Met4 agit au sein de complexes multiprotéiques. En effet Met4 contient un domaine d'activation de la transcription mais son recrutement à l'ADN requiert l'intervention des co-facteurs Cbfl, Met28, Met31 et Met32 (Kuras et al. (1996) EMBO J., 16, 2441-2451; Blaiseau et Thomas (1998) EMBO J., 17, 6327-6336). Selon les gènes MET, différentes combinaison de ces co-facteurs sont employées pour recruter Met4 à l'ADN : ainsi un complexe comprenant les facteurs Met4, Met28 et Cbfl est assemblé sur la séquence 5' TCACGTG 3' présente en amont du gène MET16 alors que des complexes comprenant les protéines Met4, Met28 Met31 et/ou Met32 se forment sur le motif 5' AAACTGTG3' présent en amont des gènes MET3 et MET28. Pour tous ces complexes, l'activation transcriptionnelle dépend entièrement de Met4 qui est le seul, parmi les facteurs ainsi assemblés en amont des gènes MET, à posséder des capacités intrinsèques d'activation de la transcription (Kuras et Thomas (1995), Mol. Cell. Biol., 15, 6526-6534 ; Blaiseau et Thomas (1998) EMBO J., 17,6327-6336) Des études successives ont permis de démontrer que selon les conditions environnementales, l'ubiquitination du facteur Met4 par le complexe SCFMet30 régule son activité par des mécanismes différents. Lorsque les cellules de levure, cultivées en milieu minimum, sont exposées à de fortes concentration de méthionine, Met4 est alors ubiquitiné par le complexe SCFMet30 et dégradé de manière rapide par le protéasome (Rouillon et al. (2000) EMBO J., 19,282-294). Par contraste, lorsque les cellules sont cultivées en milieu riche, qui contient de nombreuses et différentes molécules soufrées, Met4 est ubiquitiné par le complexe SCFMet30 mais il n'est pas dégradé par le protéasome. De façon remarquable, Met4 ainsi ubiquitiné, bien que localisé dans le noyau, est exclu des promoteurs d'un certain nombre de gènes, notamment les gènes MET3, METl4, MET76, MET10 et MET25. Cette exclusion explique que la transcription de ces différents gènes ne soit pas, ou très peu, activée lorsque les cellules de levure sont cultivées en milieu riche. Il est à noter que dans ces mêmes conditions de croissance, Met4 ubiquitiné est toujours capable de se lier à la région amont des gènes SAM1 et SAM2 qui codent les SAM synthétases, enzymes catalysant la conversion de méthionine en SAM. Ainsi, ces études démontraient pour la première fois comment l'ubiquitination pouvait être employée par une cellule pour permettre à un activateur transcriptionnel de discriminer et de réguler de manière différentielle deux sous-ensembles de gènes cibles (Kuras et al., (2002) Mol. Cell, 10, 69-80). Des travaux publiés au cours de l'année 2002 ont montré que, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, le métabolisme des acides aminés soufrés était régulé par un autre signal environnemental, la présence de cadmium extracellulaire (Fauchon et al. (2002), Molec. Cell, 9,713-723). Le cadmium est un métal hautement toxique chez l'ensemble des cellules eucaryotes et notamment chez l'homme. La majeure partie des connaissances acquises à ce jour sur les bases de la toxicité cellulaire et sur les mécanismes mis en place chez les cellules eucaryotes pour contrer les effets délétère du cadmium l'ont été grâce aux travaux de génétique et de biologie moléculaire menés chez la levure S. cerevisiae. La détoxification du cadmium implique sa chélation par le glutathion, tripeptide de séquence glutamate-cystéine-glycine. Le chélate glutathion-cadmium est ensuite exporté vers la vacuole, cette séquestration protégeant la cellule. La détoxification efficace du cadmium requiert une augmentation de la synthèse de glutathion, c'est-à-dire un accroissement significatif de l'assimilation du sulfate et de synthèse de cystéine (Fauchon et al., (2002), Mol. Cell, 9,713-723). La présente invention trouve son fondement dans la découverte de nouveaux mécanismes de régulation de l'activateur transcriptionnel Met4. Les auteurs ont en effet découvert deux nouveaux modes de contrôle du niveau d'ubiquitination du facteur Met4. Ces deux nouveaux mécanismes de régulation de l'activateur Met 4 sont activés par les cellules de levure lorsqu'elles sont exposées à des concentrations toxiques de cadmium. L'analyse moléculaire de la régulation de l'activité du facteur transcriptionnel Met4 par le cadmium a permis de démontrer, de manière inattendue, que les mécanismes moléculaires soutenant cette réponse au cadmium impliquent à la fois, l'inhibition de l'activité de l'ubiquitine ligase SCFMet30 et l'activation d'un mécanisme de dé-ubiquitination du facteur Met4. L'implication d'un mécanisme de déubiquitination a pu être démontrée en utilisant notamment une souche de levure exprimant le facteur Met4 de manière conditionnelle. En employant une telle souche, une activation des gènes MET a été mise en évidence en réponse à une exposition au cadmium en absence de néosynthèse de Met4. Dans ces conditions, seule l'hydrolyse des chaînes de polyubiquitine covalement liées au facteur Met4 préalablement à l'exposition au cadmium permet l'activation des gènes MET. Le dysfonctionnement de la voie ubiquitine-protéasome, voie de dégradation des protéines, a été établi dans de nombreuses pathologies de natures extrêmement diverses, notamment les cancers, les maladies génétiques, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les syndromes inflammatoires et les infections virales. Ainsi, on sait que toute mutation présente sur les protéines cibles autour des sites de phosphorylation, abolit la reconnaissance des protéines mutées par les complexes SCF et conduit leur stabilisation. Il a été démontré récemment, que de telles mutations qui affectent la p-caténine et interdisent sa destruction, sont impliquées dans la transformation tumorale dans de nombreux tissus (cancer du colon, mélanome, hépatocarcinome, etc. ). A l'opposé, la dégradation excessive de la p-caténine dans les neurones a été mise en cause dans le maladie d'Alzheimer, et est impliquée dans la mort neuronale par apoptose qui survient dans cette pathologie. Aussi la recherche de molécules, aptes à agir sur les pathologies liées à un dysfonctionnement de la cascade de l'ubiquitine et de la dégradation du protéasome, notamment des anticancéreux, des agents anti-inflammatoires et des agents antiviraux (Maniatis T. (1999), Genes & Dev, 13, 505-510 ;Kondo et Kaelin (2001), Exp. Cell Res. 264, 117-125; Cassidy et al., (2000), Am. J. Med. Genet. 97, 136-146 ; Schwartz et Ciechanover (1999) Annu. Rev. Med., 50, 54-57 ; Landsbury et Brice (2002), Curr. Opin. Cell Biol., 14,653-660 ; Sakamoto (2002), Mol. Genet. Metab., 77, 44-56 ;Glass (2003) Nat. Cell Biol. 5, 87-90 ; F. Margottin et al., (1990), Médecine et Sciences, 15,1008-1014) s'avère hautement souhaitable. Différents procédés de criblage de composés actifs sur la cascade de l'ubiquitine et la dégradation du protéasome ont été proposés et mettent en #uvre, un couple ubiquitine-ligase/substrat spécifique, de préférence d'origine humaine, dans lequel le substrat est une protéine régulatrice d'un processus cellulaire dont la dégradation excessive ou l'absence de dégradation par la voie ubiquitine-protéasome est directement impliquée dans la pathologie à traiter : - la Demande Internationale PCT WO 97/12962 décrit, pour cibler des agents anticancéreux, un procédé qui met en #uvre une ubiquitine-ligase E3 contenant une région C-terminal homologue au domaine catalytique de la protéine E6-AP (famille HECT : h-publ, h-pub2, h-pub3, s-publ) capable d'ubiquitinyler spécifiquement une protéine régulatrice du cycle cellulaire telle que la tyrosine phosphatase cdc 25 ou le suppresseur de tumeur p53, - la Demande Internationale PCT WO 99/04033 et le brevet américain US n 5,932,425, pour cibler des substances aptes à traiter des désordres caractérisés par une augmentation de l'activité transcriptionnelle du facteur NF-kB (maladies autoimmunes, états inflammatoires, cachexies, SIDA), décrivent un procédé qui met également en #uvre une ubiquitine-ligase humaine de la famille HECT (RSC ou KIAAN), capable d'ubiquitinyler spécifiquement la protéine IkB qui forme un complexe cytoplasmatique inactif avec le facteur de transciption ubiquitaire NF-kB, qui régule la réponse immunitaire et inflammatoire, - la Demande Internationale PCT WO 99/38969 décrit un procédé qui met en #uvre une protéine à boîte F (protéine (3-TrCP humaine) qui se lie à la protéine virale Vpu, pour cibler des agents anti-VIH. Vpu qui sert d'intermédiaire dans le ciblage des récepteurs cellulaires CD4 vers la voie de dégradation ubiquitine-protéasome participe ainsi à la diminution du nombre de lymphocytes T CD4+ fonctionnels responsable de l'immunodéficience liée à l'infection par le VIH. De manière générale, dans ces différents procédés, qui mettent en #uvre des systèmes d'origine humaine, il existe un lien direct entre la pathologie à traiter et les protéines dont la modulation de la dégradation est recherchée. - La Demande Internationale WO 01/40499 décrit un procédé de criblage cellulaire d'agents aptes à moduler l'activité des complexes SCFMet30 impliquant une séquence hybride comprenant une séquence codant pour une protéine MET4 fusionnée avec une séquence codant pour un marqueur. L'existence d'un mécanisme de contrôle de l'activité du facteur Met4 par un mécanisme d'hydrolyse des chaînes de polyubiquitine lui ayant été attachées, établit pour la première fois un lien direct entre les ubiquitine hydrolases codées par le génome de Saccharomyces cerevisiae et le facteur transcriptionnel Met4. Les ubiquitine hydrolases, encore dénommées dé-ubiquitinases ou dé-ubiquitine protéases ont été classées en deux catégories fonctionnelles : les ubiquitines carboxy-terminale hydrolases (UCHs) d'une part et les ubiquitine processing protéases (USPs ou UBPs) d'autre part. Les ubiquitine hydrolases de la famille UBP ont comme fonction générale de cliver les chaînes de polyubiquitine conjuguées à des protéines substrats et elles présentent entre elles d'importantes conservations de séquences, partageant notamment des motifs protéiques extrêmement conservés appelés Boites Cys et Boites His (Chunk et Baek (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 633-640 ; Wilkinson (2000), Semin. Cell, Dev. Biol., 11, 141-148). Le génome de la levure contient 17 gènes codant pour des ubiquitinehydrolases, nommées Ubpl à Ubpl6 et Yuhl (Baker et al., (1992), J. Biol Chem., 267, 23364-23375 ; Papa and Hochstrasser (1993), Nature, 366,313-319 ; Amerik et al. (2000) Biol. Chem. 381,981-992). Les ubiquitine hydrolases Ubpl à Ubpl6 font partie de la famille des UBPs alors que Yuhl est l'unique membre de la famille des UCHs codé par le génome de la levure. Aucunes des 16 UBPs de la levure ni l'unique UCH ne sont des enzymes essentielles pour le maintien de la vitalité des cellules de levure. Cependant, quelques phénotypes particuliers ont été associés à l'inactivation de certains des gènes spécifiant les UBPs de levure (Americk et al. (2000), Biol. Chem., 381,981-992). Ainsi les ubiquitine hydrolases Ubp3 et UbplO de Saccharomyces cerevisiae ont-elles été associées aux mécanismes de silencing chromosomique, mécanisme durant lequel ces enzymes agissent vraisemblablement en interaction avec le facteur Sir4 (Moazed et Johnson (1996), Cell 86, 667-677 ; Kahana et Gottschling (1999), Mol. Cell. Biol., 19,6608-6620). De même des phénotypes spécifiques ont pu être observés chez des cellules de mammifères surexprimant certaines UBPs (Chunk et Baek (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun., 266,633-640). L'ensemble de ces résultats suggère donc que les ubiquitine hydrolases doivent posséder une certaine spécificité de substrat mais également qu'il doit exister une certaine redondance fonctionnelle entre ces différentes enzymes. L'ensemble des résultats obtenus sur la voie ubiquitine protéasome des cellules eucaryotes montre donc que deux grandes familles d'enzymes, les ubiquitine ligases et les ubiquitine hydrolases jouent un rôle majeur dans la régulation de cette voie de dégradation contrôlée des protéines. De par leur fonction intrinsèquement antagoniste, chacune de ces deux familles d'enzymes participe à la régulation fine de ce processus biologique essentiel à l'homéostasie cellulaire. Tirant partie de l'extrême conservation des mécanismes impliqués dans le contrôle de l'ubiquitination des protéines chez l'ensemble des cellules eucaryotes , la présente invention propose un procédé de criblage de composés aptes à agir sur les pathologies liées au dysfonctionnement des mécanismes d'ubiquitination chez l'homme et plus particulièrement au dysfonctionnement de la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines, en utilisant des propriétés des mécanismes d'ubiquitination d'une manière qui n'avait jamais été envisagée jusqu'alors. La sélection d'une protéine substrat de la voie ubiquitine de modification des protéines, dont le niveau d'ubiquitination n'est pas directement impliquée dans les pathologies à traiter, permet de disposer d'outils de criblage très performants, qui présentent l'avantage d'être rapides et fiables. La présente invention a pour objet un procédé de criblage cellulaire de composés aptes à moduler l'activité des ubiquitine hydrolases, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) la culture en milieu riche d'une souche de levure modifiée, comportant a) une séquence hybride comportant une séquence codant pour une protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, exprimée sous le contrôle d'un promoteur actif chez la levure et répressible ; b) la copie endogène inactivée du gène MET4 située sur le bras gauche du chromosome 14 de la levure ; c) un système transcriptionnel rapporteur comprenant un promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique, contrôlant l'expression d'une protéine hybride comportant ou non une séquence d'adressage au noyau et un marqueur approprié ; (ii) le transfert de la culture dans un milieu riche et pendant une durée permettant l'expression de la protéine Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique ; (iii) Le transfert de la culture décrite ci-dessus dans un milieu riche ne permettant pas l'expression de la protéine Met4 fusionnée ou non à un peptide antigénique ; (iv) 30 minutes au moins après le transfert de la culture dans un milieu riche ne permettant pas l'expression de la protéine Met4 fusionnée ou non à un peptide antigénique, la mise en contact de la souche de levure ainsi cultivée avec un composé à tester ; (v) L'addition subséquente de cadmium à des concentrations comprises entre 0. 01 mM et 10 mM ; (vi) La détermination du niveau d'expression de la protéine hybride exprimée à partir d'un promoteur MET après l'addition de cadmium, soit par visualisation/quantification de la protéine hybride, soit par la mesure du taux d'expression de l'ARN messager correspondant. Avantageusement, la souche de la levure est S. Cerevisiae. Dans un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, le promoteur permettant l'expression de la protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, peut être choisi dans le groupe constitué des promoteurs répressibles des gènes GALl, GAL10, PHO5 ou LEU2 de la levure Scerevisiae. Dans un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, le peptide anti-génique pouvant être fusionné à la protéine Met4 exprimée sous le contrôle d'un promoteur actif chez la levure et répressible peut être choisi dans le groupe constitué des motifs anti-géniques hémagglutinine (Ha), Myc, Flag, poly-histidine. Dans un mode de mise en #uvre particulièrement avantageux, la séquence hybride comportant une séquence codant pour une protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, exprimée sous le contrôle d'un promoteur actif chez la levure et répressible est employée pour inactiver, par remplacement de gène, la copie sauvage du gène Met4. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, le promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique et contrôlant l'expression d'une protéine hybride est choisi parmi les promoteurs des gènes MET3, METIO, METl4, METl6, MET25 ou MET28 de la levure S cerevisiae. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, le marqueur utilisé pour la construction de la protéine hybride est choisi dans le groupe constitué par : les protéines à fluorescence intrinsèque comme par exemple la protéine à fluorescence verte (Green Fluorescent Protein, GFP) ; les protéines à activité enzymatique mesurable, et notamment celles à activité mesurable par une méthode de chemiluminescence telle que la luciférase, les peptides antigéniques, comme par exemple le motif anti-génique hémagglutinine Ha, les gènes rapporteurs dont l'activité est mesurable par une méthode colorimétrique, comme par exemple le gène XylE codant la catéchol oxydase de Pseudomonas putida et le gène LacZ codant la p-galactosidase d'Escherichia coli, et les gènes métaboliques, dont l'activité est mesurable par un test de croissance, notamment les gènes HIS3, URA3, TRP1 et LEU2 de la levure S.cerevisiae, HIS5 et TRP1 de la levure Kluveromyces lactii. Dans un autre mode de mise en #uvre avantageux des procédés selon l'invention, la souche de levure comporte une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, (Vidal M. et al., (1999), Trends in Biotechnol., 17, 374- 381 ;Nourani et al. (1997) Mol. Cell Biol., 20,7881-7892). Au sens de la présente invention, on entend par milieu riche un milieu de culture de levure contenant au moins 0. 5 % d'extrait de levure (Yeast Extract) et au moins 0. 5 % de bacto-peptone. De façon avantageuse, à l'étape (ii), la durée pendant laquelle la culture est maintenue dans un milieu riche est de 1 à 10 heures. De façon avantageuse, à l'étape (iv), la détermination de niveau d'expression de la protéine hybride exprimée à partir d'un promoteur MET se fait entre 30 et 200 minutes après l'addition de cadmium, encore plus préférentiellement entre 40 et 160 minutes. Avantageusement, le cadmium est employé sous forme de sel, de façon préférentielle sous forme de sel de sulfate ou de sel d'acétate. Pour la mise en #uvre des procédés selon l'invention, on peut utiliser des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure S.cerevisiae décrite par Bailis et Rothstein, (1990), Genetics, 126,535-547, ou tout autre souche caractérisée de ladite levure. En particulier, on peut utiliser les souches suivantes : W303 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201239, W303-1A enregistrée à l'ATCC sous le numéro 208352, W303-1B enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201238, K700 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201741, FF18773 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201566. La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène a été réalisée en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl R. H. et al., (Curr. Genet., (1989), 16,339-346). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation, dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman F. et al. (in Methods in Yeast Genetics : a Laboratory Manual, (1979), Cold Spring harbor, N. Y.), et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein R. (Methods in Enzymology, (1991), 194, 281- 301. Conformément à l'invention, les levures peuvent être transformées par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y. ) et Ausubel F. M. et al., (Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2000), Jhon Wiley and Sons Inc, N.Y.) Conformément à l'invention, l'activité du système transcriptionnel rapporteur comprenant un promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique est mesuré, selon la protéine hybride utilisée, par des techniques connues elles-mêmes, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre soit grâce à un microscope, des techniques colorimétriques, enzymatiques, immunologiques ou de sélection sur un milieu de croissance approprié. Conformément à l'invention, l'activité ubiquitine hydrolase vis-à-vis des chaînes d'ubiquitine fixées sur la protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, est visualisable, après répression de l'expression de la séquence hybride contenant Met4 et addition de cadmium au milieu riche de culture,grâce au marqueur présent dans la protéine hybride exprimée sous le contrôle d'un promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique : lorsque le marqueur présent dans la protéine hybride est une protéine à fluorescence intrinsèque, alors l'activité ubiquitine hydrolase est déterminée en visualisant et quantifiant la fluorescence émise par la protéine hybride ; lorsque le marqueur présent est un peptide antigénique, alors l'activité ubiquitine hydrolase est visualisée par des techniques immunologiques telles que des techniques de transfert de protéines (Western Blotting), des techniques ELISA ou des techniques d'immunoprécipitation (Harlow E. et al., (1988), Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.) ; lorsque le marqueur présent est le produit du gène XylE de P. putida, alors l'activité ubiquitine hydrolase est visualisée par vaporisation sur les cellules de levure, de catéchol à une concentration comprise entre 50 mM et 1M et en mesurant l'apparition d'une coloration jaune caractéristique de l'oxydation du catéchol (Worsay M. J. et al. (1975), J. Bacteriol., 124,7-13) ; lorsque le marqueur présent est le produit du gène LacZ d'E. coli, alors l'activité ubiquitine hydrolase est visualisée en mesurant l'apparition d'une coloration bleue, sur un milieu contenant le substrat colorigénique X-GaI (Sambrook J., (1989), référence citée) ; le marqueur présent est le produit du gène HIS3 de S. cerevisiae, alors l'activité ubiquitine hydrolase est visualisée en faisant croître les cellules de levure sur un milieu contenant de l'aminotriazole à des concentrations de 10 mM à 1 M. Du fait de la très grand similitude existant entre les ubiquitine hydrolases codées par le génome de la levure S. cerevisiae et les ubiquitine hydrolases codées par le génome humain, la dé-ubiquitination du facteur transcriptionnel Met4 observée chez des cellules de levure cultivées en milieu riche et exposées au cadmium, peut servir de modèle pour cribler des produits ou des molécules pour leur capacité à moduler l'activité de voies de signalisation humaines impliquant l'activité d'ubiquitine hydrolases et plus spécifiquement les voies de signalisation impliquant la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines. Ainsi, le procédé de criblage selon la présente invention, permettant de visualiser l'activité des ubiquitine hydrolases vis à vis du facteur transcriptionnel Met4, substrat de la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines, est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies liées aux dysfonctionnements de la voie ubiquitine protéasome chez l'homme tels que les cancers, les maladies génétiques, les maladies neuro-dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer , les syndromes inflammatoires, les infections fongiques, bactériennes et virales. Parmi les principaux avantages des procédés décrits dans la présente invention, on peut ainsi citer : - la simplicité : l'induction de l'activité des ubiquitine hydrolases vis-àvis du facteur Met4 est réalisée simplement en additionnant du cadmium dans le milieu de croissance, et lorsque le marqueur présent dans la protéine hybride est une protéine à fluorescence intrinsèque telle que la GFP, l'activité des ubiquitine hydrolases est visualisée directement par l'observation et la quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. - la rapidité de développement : les techniques de génétique et de génétique inverse, les procédés de biologie moléculaire développés pour cet organisme, assurent une mise en oeuvre rapide des souches indicatrices ; - la stabilité des souches indicatrices : les techniques d'intégration au locus et de remplacement de gènes permet la construction de souches indicatrices contenant des séquences hybrides et exprimant des protéines hybrides à partir des chromosomes de la levure. Ces souches sont donc génétiquement stables et peuvent être propagées et conservées indéfiniment ; - la rapidité de croissance et de criblage : la levure est un microorganisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, les procédés mis en oeuvre dans la présente invention font appel à des cultures réalisées en milieu riche dans lequel la croissance de la levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui autorise l'obtention de cellules modifiées pour un nombre important de criblages ; - le faible coût : la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage et la caractérisation sont peu onéreux ; - l'automatisation des procédés : la levure est un microorganisme dont la culture, réalisée en faible volume, à température basse, en atmosphère classique, est tout particulièrement propice à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage. Le procédé de criblage selon l'invention peut notamment servir à sélectionner et caractériser des agents actifs comme des anticancéreux, antiinflammatoires, anti-viraux ou des agents actifs dans des maladies génétiques, des maladies neuro-dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer, des syndromes inflammatoires, des infections fongiques, bactériennes ou virales. Au sens de la présente invention, on entend par composé ou agent, toute molécule issue des procédés de synthèse ou de ressources naturelles. La présente invention a également pour objet, l'utilisation de composés sélectionnés par le procédé selon la présente invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'au moins une maladie liée à des troubles de la modification des protéines par ubiquitination ou de la voie ubiquitine protéasome de dégradation des protéines, telles que les cancers, les maladies génétiques, les maladies neuro-dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer , les syndromes inflammatoires, les infections fungiques, bactériennes ou virales. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples, illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre l'influence de l'addition de cadmium à une concentration de 1 mM dans le milieu riche de culture sur la transcription des gènes cibles de l'activateur Met4 (A) en absence d'Egta ; les cellules de la souche W303-1A (Mata, ade2, his3, leu2, trpl, ura3, canl) sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 3 % de glucose pendant au moins 3 heures. Au temps t= 0, du cadmium à la concentration finale de 1 mM est ajouté au milieu de culture et les ARNs totaux sont extraits juste avant et 10,20, 40 et 60 minutes après l'addition de cadmium. Les ARNs sont analysés par la technique de Northern Blotting en utilisant des sondes radio marquées spécifiques des gènes MET3, MET10, METl4, METl6, MET25 et ACTINE. (B) en présence d'Egta : les cellules de levure W303-1A sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 3 % de glucose pendant au moins 3 heures. Au temps t= 0, du cadmium à la concentration finale de 1 mM et de l'Egta à la concentration finale de 1 mM sont ajoutés au milieu de culture et les ARNS totaux sont extraits et analysés par Northern comme en (A) ; (C) les cellules de la souche W303-1A (indiquée MET4) et CC849-8A (Mata, his3, leu2, trpl, ura3, met4 ::TRP1) (indiquée met4#) sont cultivées, exposées au cadmium et les ARN extraits comme en (A). La souche CC849-8A n'exprime plus de protéine Met4 en raison de l'inactivation de la copie chromosomique du gène MET4. - la figure 2 illustre la spécificité de l'effet du cadmium sur la transcription des gènes cibles de l'activateur Met4 comparé à d'autres métaux divalents. Les cellules de la souche W303-1A sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 3 % de glucose pendant au moins 3 heures, puis est ajouté au milieu de culture soit du cadmium (Cd2+, à la concentration finale de 1 mM), soit du cuivre (Cu2+, à la concentration finale de 1 mM), soit du Zinc (Zn2+, à la concentration finale de 1 mM), soit du cobalt (Co2+, à la concentration finale de 2 mM), soit du mercure (Hg2+, à la concentration finale de 0,3 M), soit du manganèse (Mn2+, à la concentration finale de 0,5 mM), soit de l'argent (Ag2+, à la concentration finale de 30 M). Les cultures sont poursuivies pendant 60 minutes à l'issue desquelles les ARNs totaux sont extraits et (A) analysés par la technique de Northern blotting à l'aide de sondes spécifiques des gènes MET3, MET16, MET25 et ACTINE (B) analysés par la technique de reverse-transcription suivie d'une amplification génique en temps réel (real-time RT-PCR) grâce à un appareil LightCyler (Roche). Dans les deux cas, les ARNs totaux sont extraits juste avant l'addition de cadmium afin de servir de témoins. - la figure 3 illustre les modifications que subit la protéine Met4 suite à l'exposition au cadmium de cellules de levure cultivées en milieu riche. (A) en absence d'Egta ; les cellules de la souche CD233 (Mata, ade2, his3, leu2, trp1, ura3, met4::HA3 MET4) comprenant, en remplacement de la copie sauvage du gène MET4, un gène fusion exprimant la protéine Met4 fusionnée à 3 copies du motif antigénique hémagglutinine (HA3Met4) sous le contrôle du promoteur Met4, sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 3 % de glucose pendant au moins 3 heures. Au temps t= 0, du cadmium (Cd2+) à la concentration finale de 1 mM est ajouté au milieu de culture et les protéines totales sont préparées juste avant et 10,20, 40 et 60 minutes après l'addition de cadmium, selon le protocole décrit par Kuras et al., Mol. Cell (2002), 10,69-80. Les protéines sont ensuite analysées par la technique de Western Blotting à l'aide d'anti-corps reconnaissant spécifiquement le motif antigénique Ha (indiqué par HA3Met4 ) et des anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthétase de levure (indiquée par LysRS ) (B) en présence d'Egta : cellules de la souche CD233 (Mata, ade2, his3, leu2, trpl, ura3, met4::HA3MET4) sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 3 % de glucose pendant au moins 3 heures. Au temps t= 0, du cadmium (Cd2+) à la concentration finale de 1 mM et de l'Egta à la concentration finale de 1 mM sont ajoutés et les protéines totales sont extraites et analysées comme en (A). - la figure 4 illustre l'effet du cadmium sur la transcription des gènes cibles de Met4 en absence de néosynthèse de Met4. (A) schéma récapitulant le protocole de croissance de la souche CC932-6D employée et en particulier les différents milieux successivement utilisés. Les cellules de la souche CC932-6D (Mata, his3, leu2, ura3, met4::GALl-MET4) qui comporte, en remplacement de la copie sauvage du gène MET4, un gène fusion exprimant la protéine Met4 sauvage exprimée à partir du promoteur GAL1, sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 2 % de raffinose pendant 8 heures ; l'expression de la protéine Met4 est induite en cultivant les cellules en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bactopeptone et 2 % de galactose pendant 90 minutes ; la synthèse de la protéine Met4 est alors stoppée en transférant les cellules dans un milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 2 % de glucose. (B) 60 minutes après le transfert des cellules dans un milieu riche contenant du glucose, du cadmium à la concentration finale de 1 mM est ajouté et la culture est poursuivie pendant 60 minutes. Les ARNs totaux sont extraits au moment du transfert en milieu contenant du glucose, 30, 60 (temps ou le cadmium est ajouté), 80,100 et 120 minutes après le transfert en milieu glucose et analysés par la technique de Northern blotting à l'aide de sondes spécifiques des gènes MET3, MET16, MET25 et ACTINE. (C) la culture et les ARNs sont traités et analysés comme en (B) mais sans addition de cadmium au milieu de culture. - la figure 5 illustre l'effet du cadmium sur les formes ubiquitylées de la protéine Met4. Les cellules de la souche CC932-6D (Mata, his3, leu2, ura3, met4::GAL1MET4) qui comporte, en remplacement de la copie sauvage du gène MET4, un gène fusion exprimant la protéine Met4 sauvage exprimée à partir du promoteur GAL1, sont cultivées en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 2 % de raffinose pendant 8 heures ; l'expression de la protéine Met4 est induite en cultivant les cellules en milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 2 % de galactose pendant 90 minutes ; la synthèse de la protéine Met4 est alors stoppée en transférant les cellules dans un milieu riche contenant 0. 5 % d'extrait de levure, 0. 5 % de bacto-peptone et 2 % de glucose. (B) 60 minutes après le transfert des cellules dans un milieu riche contenant du glucose, du cadmium à la concentration finale de 1 mM est ajouté et la culture est poursuivie pendant 60 minutes. Les protéines sont ensuite analysées par la technique de d'immunoprécipitation en immunoprécipitant spécifiquement la protéine Met4 à l'aide d'anti-corps reconnaissant spécifiquement la protéine Met4. Les flèches indiquent les formes ubiquitylées de haut poids moléculaires de Met4 qui disparaissent spécifiquement suite à l'addition de cadmium au milieu de croissance, en absence d'Egta. REVENDICATIONS 1. Procédé de criblage cellulaire de composés aptes à moduler l'activité des ubiquitine hydrolases caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) la culture en milieu riche d'une souche de levure modifiée, comportant a) une séquence hybride comportant une séquence codant pour une protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, exprimée sous le contrôle d'un promoteur actif chez la levure et répressible ; b) la copie endogène inactivée du gène MET4 située sur le bras gauche du chromosome 14 de la levure ; c) un système transcriptionnel rapporteur comprenant un promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 fusionné ou non à un peptide antigénique, contrôlant l'expression d'une protéine hybride comportant ou non une séquence d'adressage au noyau et un marqueur approprié ; (ii) le transfert de la culture dans un milieu riche et pendant une durée permettant l'expression de la protéine Met4 fusionnée ou non à un peptide antigénique ; (iii) Le transfert de la culture décrite ci-dessus dans un milieu riche ne permettant pas l'expression de la protéine Met4 fusionnée ou non à un peptide antigénique ; (iv) 30 minutes au moins après le transfert de la culture dans un milieu riche ne permettant pas l'expression de la protéine Met4, la mise en contact de la souche de levure ainsi cultivée avec un composé à tester ; (v) L'addition subséquente de cadmium à des concentrations comprises entre 0.01mM et 10 mM ; (vi) La détermination du niveau d'expression de la protéine hybride exprimée à partir d'un promoteur MET après l'addition de cadmium, soit par visualisation/quantification de la protéine hybride, soit par la mesure du taux d'expression de l'ARN messager correspondant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure est S. cerevisiae. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le promoteur permettant l'expression de la protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique est choisi dans le groupe constitué des promoteurs répressibles des gènes GALl, GALlO, PH05 ou LEU2 de la levure S.cerevisiae. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le peptide anti-génique pouvant être fusionné à la protéine Met4 est choisi dans le groupe constitué des motifs anti-géniques hémagglutinine (Ha), Myc, Flag, poly-histidine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence hybride comportant une séquence codant pour une protéine Met4, fusionnée ou non à un peptide antigénique, exprimée sous le contrôle d'un promoteur actif chez la levure et répressible est employée pour inactiver, par remplacement de gène, la copie sauvage du gène Met4. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le promoteur de levure activé par le facteur transcriptionnel Met4 et contrôlant l'expression d'une protéine hybride est choisi parmi les promoteurs des gènes MET3, MET10, METl4, MET16, MET25 ou MET28 de la levure S. cerevisiae. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marqueur utilisé pour la construction de la protéine hybride est choisi dans le groupe constitué par : les protéines à fluorescence intrinsèque ; les protéines à activité enzymatique mesurable ; les peptides antigéniques ; les gènes rapporteurs dont l'activité est mesurable par une méthode colorimétrique ; les gènes métaboliques, dont l'activité est mesurable par un test de croissance. 8. Procédé selon la revendications précédente, caractérisé en ce que le marqueur utilisé pour la construction de la protéine hybride est choisi dans le groupe constitué par : la protéine à fluorescence verte (Green Fluorescent Protein, GFP); la luciférase ; le motif anti-génique hémagglutinine Ha ; le gène XylE codant la catéchol oxydase de Pseudomonas putida et le gène LacZ codant la p-galactosidase d'Escherichia coli; les gènes HIS3, URA3, TRPI et LEU2 de la levure S. cerevisiae, HIS5 et TRPI de la levure Kluveromyces lactii. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure comporte une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu riche est un milieu de culture de levure contenant au moins 0. 5 % d'extrait de levure et au moins 0. 5 % de bacto-peptone. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que à l'étape (ii), la durée pendant laquelle la culture est maintenue dans le milieu riche est de 1 à 10 heures. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que à l'étape (vi), la détermination du niveau d'expression de la protéine hybride exprimée à partir d'un promoteur MET se fait entre 30 et 200 minutes après l'addition de cadmium, encore plus préférentiellement entre 40 et 60 minutes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le cadmium est employé sous forme de sel de sulfate ou de sel d'acétate. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise une souche de levure sélectionnée parmi : W303 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201239, W303-1A enregistrée à l'ATCC sous le numéro 208352, W303-1B enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201238, K700 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201741, FF18773 enregistrée à l'ATCC sous le numéro 201566. 15. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour cribler des composés aptes à agir sur les pathologies liées aux dysfonctionnements de la voie ubiquitine protéasome chez l'homme tels que les cancers, les maladies génétiques, les maladies neuro-dégénératives, les syndromes inflammatoires, les infections fongiques, bactériennes et virales.