FR 2837835 A1 20031003 FR 0204037 A 20020329 La présente invention a pour objet une souche non pathogène capable de stimuler le système immunitaire. Elle concerne également un vaccin vivant recombinant pour l'immunisation par voie muqueuse de bactéries de l'espèce Bacillus subtilis et plus particulièrement d'un vaccin vivant recombinant contre Helicobacterpylori. Les surfaces muqueuses sont prédominantes dans les tractus gastro-intestinal, urogénital et respiratoire, et fournissent des portes d'entrées pour les pathogènes. L'immunité des muqueuses est importante pour une protection à long terme et forme la première ligne de défense contre les pathogènes transmis via cette voie. Bien que la plupart des infections commencent au niveau des sites muqueux, la plupart des vaccins induisent des anticorps circulants qui n'agissent pas nécessairement sur ces sites. L'induction de l'immunité au niveau des muqueuses pourrait prévenir l'invasion de l'hôte par les micro-organismes pathogènes. De plus, ce type d'immunisation permet d'envisager la construction de vaccins thérapeutiques contre les pathogènes de la muqueuse, en particulier contre les agents responsables d'infections chroniques, telles que l'infection à Helicobacterpylori. Helicobacter pylori, également désigné par l'expression H. pylori est une bactérie à Gram-, que l'on trouve principalement à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme. L'infection par H. pylori est un risque majeur pour le développement de maladies gastro-duodénales comme l'ulcère, le cancer ou le lymphome du tissu lymphoïde des muqueuses (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). De plus, l'infection à H. pylori a été classée en 1994 comme carcinogène de type I par le Centre International de Recherche sur le Cancer. C'est l'une des infections bactériennes humaines les plus répandues sur terre, touchant de 20 % à plus de 90 % de la population en fonction de la zone géographique considérée. Les conséquences pathologiques de l'infection dépendent de l'interaction complexe entre la bactérie et l'hôte. A l'heure actuelle, il n'est pas encore possible de prédire chez un porteur asymptomatique si l'infection aura des conséquences pathologiques ou non. On dispose aujourd'hui de traitements efficaces basés généralement sur l'utilisation de deux antibiotiques et d'un inhibiteur de la pompe à proton (triple thérapie). Toutefois la prescription de traitements antibiotiques a créé une forte pression de sélection sur cette espèce. En raison de sa grande adaptabilité, H. pylori, espèce initialement sensible à de nombreux antibiotiques, a acquis une résistance à certains des antibiotiques, et notamment a les plus utiles pour son éradication. Actuellement, la résistance aux antibiotiques de H. pylori constitue la principale cause d'échec des traitements d'éradication. Il convient donc de développer d'autres stratégies pour éliminer la bactérie, en limiter sa croissance ou prévenir sa colonisation. La vaccination constitue la stratégie, la plus prometteuse, pour la lutte contre l'infection a H. pylori. La recherche d'un vaccin contre H. pylori a débuté en 1990, dès qu'il a été suggéré que l'uréase était un candidat utile pour fabriquer un vaccin contre H. pylori. de H. pylori. L'uréase de H. pylori est une métalloenzyme, contenant du nickel, qui catabolise l'urée présente dans l'estomac, protégeant ainsi la bactérie d'un environnement trop acide. L'enzyme active a une structure hexapolymérique et est constituée de deux sous-unités, UreA et UreB, liées à deux ions Ni2+. Les gènes codant l'uréase sont organisés en deux opérons : le premier, ureAB contient les gènes qui codent les deux sousunités structurales, le second ureEFGH codant des protéines accessoires qui incorporent le nickel dans le site actif de l'uréase. Cette enzyme est constitutive chez H. pylori et est impliquée non seulement dans la neutralisation du micro-environnement acide entourant la bactérie, mais aussi joue un rôle dans le métabolisme de la bactérie en lui fournissant une source d'azote, et donc, participe à la synthèse des acides aminés. Elle présente les caractéristiques requises pour un "bon" antigèneprotecteur : elle est présente sous sa forme active dans pratiquement tous les isolats étudiés, elle est abondante, en partie à la surface de la bactérie et en partie au niveau intracellulaire et elle induit une immunité protectrice chez les animaux de laboratoire. Depuis 1994, il a été clairement démontré, chez les souris, que l'administration de l'uréase purifiée ou recombinante, notamment les sous-unités UreB ou UreAB en présence d'adjuvants muqueux puissants comme la toxine cholérique (CT) ou la toxine labile d'E coli (LT) protégeaient les souris contre l'infection par H. pylori. Depuis ces découvertes, l'uréase constitue l'antigène vaccinal de référence. A ce titre, il a été à la base de la grande majorité des études expérimentales visant à définir la formulation, la voie d'administration et la posologie d'immunisation prophylactique et thérapeutique optimale dans un modèle de protection. Comme dans le développement de tout vaccin, plusieurs options sont a priori possibles pour un vaccin contre l'infection à H. pylori : les vaccins à base de bactéries pathogènes atténuées ou inactivées, les vaccins à base de vecteurs vivants, les vaccins à ADN, ou les vaccins sousunitaires, formulés ou non, en présence d'adjuvant. L'approche du développement d'un vaccin atténué n'a pas reçu beaucoup d'attention jusqu'à présent, en particulier parce que le génome de H. pylori présente une grande plasticité et que la probabilité de reversions des souches de H. pylori atténuées est assez forte. L'approche de vaccins à base de bactéries entières inactivées demeure une possibilité, mais elle se heurte à plusieurs problèmes liés notamment à la fabrication et à la réglementation. Les vaccins sous-unitaires sont constitués de protéines recombinantes et, dans le cas présent, emploient comme antigène l'uréase de H. pylori et comme adjuvants la toxine cholérique (CT) ou la toxine thermolabile d'E coli (LT). Ils ont été très largement étudiés dans de nombreux modèles animaux. Cependant, les adjuvants CT et LT, qui sont très efficaces chez la souris ne sont pas inoffensifs chez l'homme. L'utilisation chez l'homme de CT sous sa forme native dans le cadre d'une immunisation orale n'est pas concevable, car elle est très toxique. L'utilisation de LT comme adjuvant est aussi peu admissible, car les essais cliniques menés sur des volontaires ont montré l'apparition de plusieurs effets secondaires à la suite de ce type d'immunisation, notamment des diarrhées graves. Des vaccins à base d'ADN ont été étudiés par plusieurs équipes qui ont construit des plasmides codant pour ure 5 et ure A [Quentin-Millet et al, 1999 (La lettre de L'infec. XIV : S16-S21) ; Sutton et Lee, 2000 (Aliment. Pharmacol. Ther. 14 : 1107-1118);Sutton, 2001 (Vaccine. 19 : 2286-90) ]. Cependant, les niveaux de protection atteints sont souvent variables d'une expérience à l'autre et ne sont pas meilleurs qu'avec le vaccin sous-unitaire constitué de l'uréase et de la LT [Corthésy-Theulaz et al, 1996 (Gastroenterology 110 : A889); Quentin-Millet et al, 1999 (La lettre de L'infec. XIV : S16-S21)]. Récemment, des résultats très prometteurs de vaccination prophylactique ont été obtenus avec un vaccin ADN codant pour deux "heat shock" protéines, A et B, de H. pylori (pcDNA3.1-hspA et hspB). Ce vaccin a été capable d'induire une immunité protectrice systémique et mucosale. Cette dernière est très importante dans l'élimination de l'infection, et la protection contre la réinfection, par H. pylori. L'emploi de vecteurs vivants qui expriment l'antigène d'intérêt représente une voie prometteuse pour le développement de vaccins, en particulier pour l'immunisation par voie mucosale. Parmi les vecteurs disponibles, les salmonelles, en particulier S. typhimurium et 5. typhi, ont montré leur efficacité à protéger les souris contre une infection à H. pylori. Cependant, des études cliniques bien menées s'imposent (Angelakopoulos, 2000, Infect Immun. 68:2135-41. Parmi les vecteurs qui sont capables d'induire une réponse cellulaire, des poliovirus exprimant UreA et UreB ont été étudiés pour leur capacité à induire une protection [Novak et al, 1999 (Vaccine 17:2384- 91) ; Quentin-Millet et al, 1999 (La lettre de L'infec. XIV : S16-S21.)]. Cependant, les résultats obtenus avec ces constructions chez les souris sont assez contradictoires. Afin d'éviter l'utilisation de vecteurs vivants pathogènes atténués, la construction d'une souche de Lactococcus lactis exprimant UreB a été proposée (Lee et al, 2001, Vaccine 19 :3927-35.) pour une vaccination mucosale contre H. pylori. L'expression de UreB par le vecteur pTREXl a permis l'accumulation intracellulaire de cet antigène à un taux d'environ 6,25 % des protéines cellulaires solubles. Les essais d'immunisation prophylactique sur le modèle de souris ont démontré que la construction proposée est capable d'induire la réponse immunitaire systémique à l'UreB, mais n'est pas capable de protéger les animaux contre l'infection. Les Demandeurs ont découvert une souche non pathogène capable de stimuler le système immunitaire. Les Demandeurs ont également préparé un vaccin vivant recombinant utile pour lutter contre l'infection provoquée par H. pylori. Ainsi, l'invention a pour objet une souche probiotique de Bacillus subtilis particulière, la souche CU1 qui a été isolée par les Demandeurs par screening parmi les souches de Bacillus subtilis. Cette souche, qui a été déposée à la Collection Nationale de cultures de micro-organismes de l'Institut Pasteur à Paris sous le numéro 1-2745, le 25 octobre 2001, a un effet adjuvant sur la muqueuse gastrointestinale. En effet, la souche B. subtilis CU1 est capable d'activer la production de l'IFN-y et de l'IL-12, ce qui est très important pour son utilisation comme adjuvant biologique et pour délivrer l'antigène spécifique lors d'immunisation au niveau de la muqueuse. L'invention a également pour objet un vaccin vivant recombinant contre Helicobacterpylori, qui est constitué de la souche CUl transformée à l'aide d'un plasmide contenant le gène ureB codant pour la protéine UreB par les techniques de génie génétique bien connues de l'homme du métier. Cette souche transformée sera dénommée ci-après "souche CUreI". Le gène ureB est un des gènes de l'uréase qui a été isolé et décrit par Labigne et al. 1991 (J. Bacteriol. 173 : 1920-1931). Ce gène ureB ainsi que les gènes ureA, ureCet ureD mis en évidence par la même équipe de chercheurs ont été localisés sur un fragment de 34 kb du chromosome de H. pylori et associés à une région de 4,2 kb présente dans ce fragment. La séquence du gène ureB est la séquence SEQ ID N 1 : ctagaaaa tgctaaagag ttgagccaag ctcactttat tagctggttt agaagtgact tctttgccat ccacgaacac atggtaagtt tcaggattga cttcaatgtg agcggtagtg tcattgaatt gcatgtcttt tttagtgatg tttctgcaat ttttaaccgg caacacttgt ctttcaagcc ctaattcttc tttaatgcct ttgtcataag ccgcttgaga cacaaaagtg atgtttgcat cgtatttagc tttaccatgg tgagcgaaca tttctctgta ataaaccggt tgtggggtag ggatagaagc gttcgcatcg cccatttggc ttaacgcaat gaatccgcct ttgatgatca tgttgggttt cacgccaaag aatgctggac tccacaatac caagtcagcc actttgccca cttctacaga acctacatac tcgctaatcc catgagcgat cgctgggtta atggtgtatt tagacaagta gcgtttgatc ctgaagttgt cgttatcgcc tttttcttct ttcaagcggc caaattcttt tttgtttttg tcagctgttt gccaagtcct agtgataact tcacccacac gacccatcgc ttgagagtca gaactggtga ttgagaaaat ccccatgtca tgcaaagtgt cttcagccgc aatggtttga gggcggatcc ttgaatcagc gaactggaca tcttctttaa tgcttttatc caagtggtgg cacaccatga gcatgtccat gtgttcggct tctgtattca cagtgaaagg gatagtgggg ttagtggaag cgggtaggat gttgtgttca ccggccactt taataatgtc aggagcgtgt ccgccaccag cgccttcagt gtggaaagtg tgcatagtgc gtccggcaat agctgccata gtgtcttcca cgcaaccggc ttcattcaaa gtgtctgtgt ggatagcgac ttgcacatcg tatttgtccg caacgtctaa cgcatgattg attgcagaag gagtggtgcc ccagtcttcg tggattttaa agccaatcgc accggcttca atttgatccg ctaagctcgc gtcgttagaa gcgttacctt tagctaagaa acctaagttc atagaatatt cttcagccgc tctgagcatc cattttaagt ttcttctacc tggagtgata gtagtcgcat tagtgccatc agcaggaccg gttccgccac caatcatggt tgttacaccg cttgcaaaag ctgtagggat ttgttggggt gaaatgaagt ggatgtgtgt gtcaatacca ccagccgtta cgattaagcc ttcaccagct agcgcttcag tagcaggacc cacgctaaga ttgtttttaa cgccatcttg catgtctttg ttaccgcctt taccaatgcc agcgattttg ccgtctttaa taccaatatc cgctttataa ataccggtgt aatccacgat taaagcgtta gtgatgatca aatccagttc ttctttgcta gggttgttgg attggctcat gccttctctt agggttttac cgccaccgaa tttaagctct tcgccataaa tggtgtagtc atgttctact tcagcgatca aatctgtatc gcccaatctc actttatcgc ctgtggtagg gccatacata gaaacatatt cttttctgct aatctttttc at Pour transformer la souche Bacillus subtilis CU1 selon l'invention avec le gène ureB, le gène ureB d'une souche d'Helicobacter pylori productrice d'uréase a d'abord été amplifié par la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) bien connue de l'homme du métier en utilisant les amorces ureB dir et ureB rev ayant les séquences SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3, définies ci-après. La séquence de l'amorce ureB dir est la séquence SEQ ID N 2 : 5' - ggggcgtcgacatgaaaaagattagcaga - 3' La séquence de l'amorce ureB rev est la séquence SEQ ID N 3 : 5' - ggggcgtcgactcactttattggctggtt - 3' Les amorces ureB dir et ureB rev ci-dessus ont été choisies sur la base de la séquence du gène ureB de H. pylori décrite par LABIGNE et al. 1991 (J. Bactériol. 173 : 1920-1931), à savoir la souche H. pylori déposée à l'ATCC sous le n 700824. Le gène ureB ainsi amplifié est ensuite cloné dans un plasmide approprié, lequel sert à transformer de manière classique la souche Bacillus subtilis CU1. Le plasmide qui convient aux fins de l'invention doit être un plasmide capable de se répliquer chez B. subtilis. Un exemple de plasmide approprié aux fins de l'invention est le plasmide pPLSP, qui est dérivé du plasmide pPL 608 (ATCC 37108). Le plasmide pPLSP contient le gène de résistance à la kanamycine (Kmr), le promoteur et le peptide signal de l'a-amylase de B, amyloliquiefaciens. La carte de restriction de ce plasmide est représentée sur la figure 1 sur laquelle : PS = peptide signal ; SC2 = site de clivage du peptide signal ; Pamy = promoteur de l'a-amylase de B. amyloquefaciens ORi = origine de B. subtilis La souche recombinante CUreI peut être utilisée comme vaccin thérapeutique pour lutter contre les infections par Helicobacter pylori. Ainsi, l'invention a également pour objet le vaccin constitué de la souche CUreI définie ci-dessus. L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples et figures ci-après. I. Matériels et méthodes A- Souches bactériennes On a fait pousser des souches de Bacillus utilisées sur milieu Mueller Hinton (BioMérieux, Marcy de l'Etoile, France) en aérobiose à 30 C pendant 24 h. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation (5000 x g, 10 min) et lavées trois fois avec de l'eau physiologique stérile (NaCI, 0. 15 M). Un dénombrement bactérien a ensuite été effectué. On a fait pousser Escherichia coli sur le milieu Luria et Bertani [Peptone trypsique : 10g/1, Extrait de levure : 5 g/1, NaCI : 5 g/], en aérobiose à 37 C pendant 18h. B - Plasmides Le plasmide pPLPS dérive du plasmide pPL 608 (ATCC 37108). Ce plasmide contient le gène de résistance à la kanamicine (Kmr), le promoteur et le peptide signal du gène de l'a-amylase de B. amyloliquiefaciens, après lequel se trouve le site de clonage Sali. C - Amplification du gène ures par PCR La technique de PCR repose sur la spécificité de l'hybridation entre les amorces oligonucléotidiques et leurs séquences cibles sur l'ADN matriciel. Les séquences nucléotidiques des amorces utilisées sont les suivantes : UreB dir : ID N 2 5' - ggggcgtcgacatgaaaaagattagcaga - 3' UreB rev : SEQ ID N 3 5' - ggggcgtcgactcactttattggctggtt - 3' En gras est représenté le site Sali dans la séquence de l'amorce. Les amorces UreB dir et UreB rev ci-dessus ont été choisies sur la base de la séquence du gène ureB de H. pylori SS1 décrite par Labigne et al. 1991. (J. Bacteriol. 173 : 1920-1031). D - Purification, digestion et clonage de produits d'amplification. Purification Après PCR, les produits d'amplification ont été purifiés sur les colonnes du kit QIAquick PCR Purification (Qiagen), selon les recommandations du fournisseur. Digestion enzymatique Les enzymes de restriction utilisées au cours du clonage du gène ureB ont été fournies par Promega. Le plasmide pPLPS, ainsi que les fragments amplifiés du gène ureB ont été digérés par l'endonucléase Sali selon le protocole proposé par le fournisseur. 25 l du mélange réactionnel contiennent : 10 000 U de Sa! I, 2. 5 l de tampon 10X de l'enzyme, 1 g de l'ADN approprié et de l'eau MilliQ pour ajuster à un volume final de 25 l. La digestion a été réalisée pendant 3 h à 37 C, L'ADN digéré a été analysé sur gel d'agarose. Ensuite les produits de digestion ont subi une précipitation avec 2 volumes d'éthanol et 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M (pH 4,8). Clonage des produits d'amplification La ligation entre le fragment de l'ADN amplifié et le vecteur pPLPS, préalablement digéré par l'endonucléase Sali, a été réalisée grâce à l'ADN ligase du phage T4 d'E coli (PROMEGA, France). Les réactions de ligation ont été menées pendant 18h à 16 C, dans un volume réactionnel final de 10 l. La réaction a été réalisée dans le tampon d'activité de l'enzyme, recommandé par le fournisseur. La ligase a ensuite été inactivée par incubation à 65 C pendant 5 min. E - Transformation de souches de B. subtilis, Préparation des cellules compétentes Une ou deux colonies de B, subtilis CU1, cultivées sur LB agar (Peptone trypsique : 10 g/1, Extrait de levure : 5 g/1, NaCI : 5 g/1, agar bactériologique : 15 g/1) durant 18 h à 37 C, ont été inoculées dans un tube à essai contenant 2 ml du milieu LB liquide et incubées 3 h à 37 C sous agitation de 220 tpm. Ensuite, 5 ml du milieu MNGE (K2HP04 : 9,85 g/1, KH2P04 : 5,52 g/1, citrate trisodique : 0,92g/1, glucose : 20 g/1 ; tryptophane : 50 mg/l, citrate d'ammonium ferrique : 11 mg/l, Glutamate de potassium : 2 g/1, MgS04 : 0,74 g/1) ont été ensemencés avec 0,25 ml de la culture obtenue, et incubés 3 h à 37 C sous agitation de 220 tpm. La suspension des bactéries obtenue constituait les cellules compétentes qui ont été utilisées pour la transformation. Transformation 300 l de cellules compétentes, ont été mélangées avec de l'ADN plasmidique (0. 2 à 1 g) et incubées 30 min à 37 C sous une agitation de 220 tpm. Ensuite 100 l du milieu LB ont été ajoutés et le mélange a été incubé 40 min dans les mêmes conditions. Ensuite les cellules ont été étalées sur milieu LB gelosé supplémenté avec de la kanamycine (50 pg/ml) et cultivées en aérobiose à 37 C pendant 24-48 h. La sélection des transformants a été effectuée par criblage par PCR, avec les amorces appropriées mentionnées ci-dessus. F - Séquence de l'ADN Après clonage, les séquences du gène ureB et des parties adjacentes au site de clonage du plasmide pPLPS ont été comparées avec celles du départ. Le séquençage de l'ADN plasmidique a été réalisée par la société Génome Express (Grenoble, France) en utilisant le kit Taq Dye Deoxy terminator cycle séquence (Perkin-Elmer, Foster City, Calif., USA) et le protocole recommandé par le fournisseur. Les réactions de séquençage ont été analysées dans le séquenceur automatique 373A (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA). G - Immunodétection des protéines séparées sur SDS-PAGE (WESTERN-BLOT). Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose Les protéines sont séparées par électrophorèse en fonction de leur taille en gel de polyacrylamide, dans les conditions dénaturantes décrites précédemment. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell PROTRAN BA83, 0. 2 pm) par electrotransfert en phase liquide dans un tampon approprié [Tris: 25 mM; Glycine: 192 mM; méthanol 20% (v/v) ], en utilisant le système Mini Trans-Blot Transfer Cell (BioRad), à voltage constant 80 V, durant 1 heure. Le transfert des protéines est contrôlé par la coloration de la membrane au Rouge Ponceau. H - Expérimentation in vivo chez la souris. Animaux L'ensemble des expérimentations ont été effectuées sur des souris de souche BALB/c femelles, âgées de 6-8 semaines. Des lots homogènes d'animaux ont été constitués. Chaque lot, constitué de 15 animaux, a reçu un traitement approprié. Modèle murin de l'infection à H. pylori La souche de H. pyloriSS1 (J99), ATCC n 700824 adaptée à la colonisation des souris, a été utilisée dans notre étude. Selon le type d'expérience (immunisation thérapeutique ou prophylactique) les animaux ont été infectés avant (3 semaines) ou après (5 semaines) l'immunisation. La suspension de la souche H. pylori SS1 (environ 108 UFC/dose) a été administrée par voie orale chez les souris, trois fois durant une semaine avec des intervalles de deux jours. Traitement Immunisation prophylactique Les animaux de cinq lots ont subi une immunisation orale prophylactique durant 14 jours selon le protocole présenté dans le Tableau I, figurant dans la partie II intitulée Résultats . Cinq semaines après la dernière immunisation tous les lots (à l'exception du lot Témoin non infecté ) ont été infectés, par voie orale, par la souche de H. pylori SS1, selon le protocole décrit ci-dessus. Les animaux ont été sacrifiés par dislocation cérébrale quatre semaines après la fin de l'inoculation de H. pylori. La présence de H. pylori a été recherchée dans les biopsies de l'estomac par les tests suivants : test à l'uréase, PCR (amorces HS1 et HS2), et culture sur milieu sélectif de H. pylori. HS1: SEQ ID N 4 5'- AACGATGAAGCTTCTAGCTTGCTAG -3' HS2: SEQ ID N 5 5'- GTGCTTATTCGTTAGATACCGTGTCAT -3' Immunisation thérapeutique Les animaux de cinq lots ont été infectés par voie orale, par la souche H. pylori SS1, selon le protocole décrit précédemment. Trois semaines après la dernière administration de H. pylori, ces animaux ont subi une immunisation orale thérapeutique durant 14 jours selon le protocole d'immunisation présenté au Tableau I. Les animaux ont été sacrifiés par dislocation cérébrale quatre semaines après la dernière immunisation. La présence de H. pyloria été recherchée dans les biopsies de l'estomac par les tests suivantes : à l'urease, kit ELISA HspA sur selles (Méridiane) et examen microscopique. Les groupes d'animaux utilisés dans la présente étude sont décris en détail ci-après : Groupe "Témoin non infecté" (TNI). Ce lot a été traité par une solution physiologique en même temps que les autres animaux expérimentaux ont été immunisés ou infectés. Groupe "Témoin d'infection" (TI). Ces animaux ont été infectés par H. pylori SS1 (avant ou après l'immunisation orale selon le type d'expérience). Au cours des immunisations ils ont reçu la solution physiologique, selon le protocole d'immunisation présenté dans le Tableau I. Groupe immunisé par un Sonicat de H. pylori (SHP) et la toxine cholérique (CT) ,, (SHP+CT). Au cours de l'immunisation (Tableau I) chaque dose administrée oralement contenait 200 g de SHP et 5 g de CT. Ces animaux ont été infectés par H. pylori SS1 avant ou après leur immunisation orale (thérapeutique ou prophylactique). Groupe immunisé par B. subtilis CU1 recombinant qui exprime l'antigène Ure B de H. pylori , (Bs CUre1). Le protocole d'immunisation utilisé est décrit dans le Tableau I. Chaque dose contenait environ 109 UFC de B. subtilis CUre1 recombinant. Les animaux ont été infectés par H. pylori SS1 avant ou après leur immunisation orale (thérapeutique ou prophylactique). Groupe immunisé par B. subtilis CU1 (CU1). Le plan d'immunisation est également présenté dans le Tableau I. Chaque dose contenait environ 109 UFC de B. subtilis CU1. Ces animaux ont été infectés par H. pylori SS1 avant ou après leur immunisation orale (thérapeutique ou prophylactique). II. RESULTATS A - Clonage du gène ureB de H, pylori chez B. subtilis Le gène ureB de H. pylori a été amplifié par PCR en utilisant les amorces UreB dir et UreB rev ayant respectivement les séquences SEQ ID N 2 et N 3. Chacune de ces amorces contient à son extrémité 5' le site de restriction Sal I, afin de permettre la réalisation de la construction plasmidique d'expression/sécrétion de Ure B chez B, subtilis. Ainsi, on dispose du gène sous la forme d'un fragment de restriction permettant son insertion dans un plasmide de B. subtilis, le plasmide pPLPS, en fusion avec le peptide signal de l'a-amylase de B. amyloliquiefaciens. Ce plasmide est un dérivé du plasmide pPL608 (ATCC 37108) obtenu à partir de ce dernier par insertion du promoteur d'a-amylase de B. amyloliquefaciens ayant la séquence SEQ ID N 6 et du peptide signal d'a-amylase de B. amyloliquefaciens ayant la séquence SEQ ID N 7 selon les méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. La carte de restriction de ce plasmide est représentée sur la figure 1. SEQ ID N 6 : gaa ttc ata agg aat aaa ggg ggg ttg tta tta ttt tac tga tat gta aaa tat aat tca tat aag aaa atg aga ggg aga gga aac SEQ ID N 7 : atg att caa aaa cga aag cgg aca gtt tcg ttc aga ctt gtg ctt atg tgc acg ctg tta ttt gtc agt ttg ccg att aca aaa aca tca gcc Ce type de plasmide a été utilisé avec succès pour l'expression hétérologue de différents gènes provenant des organismes pro- et eucaryotes. La stratégie de clonage du gène ureB de H. pylori est résumée sur la figure 1 sur laquelle : Pamy = promoteur d'a-amylase de B, amyloliquefaciens; PS = peptide signal d'a-amylase de B, amyloliquefaciens; SC2 = site de clivage du peptide signal ; La séquence GTCGAC a été rajoutée pour créer le site de clonage Sal I. Dans un premier temps, la souche B. subtilis 168 Marbourg (ATCC 23857) a été transformée par le mélange de ligation obtenu cidessus. Cette souche a été choisie pour faciliter les manipulations génétiques, car elle présente un bon taux de transformation (approximativement 104 transformants (Kmr) par g d'ADN). Le criblage des transformants obtenu a été effectué par amplification directe à partir des colonies du gène ureB avec les amorces UreB dir et UreB rev. Approximativement 10 % des colonies obtenues se sont révélées positives pour la présence de l'ureB. L'analyse du sens de l'insertion a été effectuée par l'amplification de la séquence peptide signal de l'a-amylase et le gène ureB inséré avec les amorces PS dir et UreB rev. Parmi les clones sélectionnés, seulement 30 % ont porté l'insert dans le "bon sens". Un de ces plasmides a été sélectionné et dénommé plasmide "pPLUreB" et séquence partiellement au niveau de la séquence du gène inséré (gène ureB) et des parties de jonction. Aucun changement dans la séquence de ces domaines n'a été observé. Ensuite, la souche probiotique B. subtilis CU1 a été transformée par le plasmide pPLUreB. Le taux de transformation de cette souche par la méthode employée est plus bas que pour la souche B. subtilis 168, seulement 0,14x102 transformants par g d'ADN ont été obtenus. Des expériences préliminaires ont été effectuées par la méthode d'électroporation mais une augmentation significative du taux de transformation pour cette souche n'a pas été obtenue. Tous les clones analysés après la transformation de B. subtilis CU1 avec le plasmide pPLUreB possèdent le gène ureB (vérification par amplification du gène par PCR). Une extraction du plasmide suivie d'une carte de restriction ont été aussi effectuées pour plusieurs clones. Un de ces clones a été sélectionné et la souche obtenue a été dénommée B. subtilis CUrel. Expression de l'antigène Ure B de H. pylorichez B. subtilis CUre1 Afin de déterminer si le plasmide pPLUreB pouvait exprimer et sécréter l'antigène protecteur UreB, une analyse par SDS-PAGE suivie d'un Western blot en utilisant les anticorps polyclonaux anti-UreB a été réalisée sur un extrait protéique cellulaire ainsi que sur le surnageant de culture correspondant (après 18 h de croissance à 30 C) de la souche B. subtilis CUrel. Comme témoin négatif, le surnageant et l'extrait protéique cellulaire de B. subtilis non recombinant ont été utilisés. Comme témoin positif, un extrait protéique de H. pylori SS1 a été utilisé. Une bande immunoréactive d'une taille d'environ 66 KDa a été détectée dans le surnageant de B. subtilis CUrel et dans l'extrait protéique cellulaire. De plus, une autre bande ayant une taille légèrement supérieure, environ 70 kDa, a été détectée dans l'extrait protéique cellulaire, ce qui correspond probablement à la forme UreB couplée avec le peptide signal. De plus, deux bandes faiblement immunoréactives d'une taille de = 45 et # 21 kDa ont été détectées dans les deux fractions analysées de la souche B. subtilis CUrel. Elles correspondent probablement aux produits de digestion de Ure B par les protéases, et notamment les exoprotéases de B. subtilis. Il est bien connu que la plupart des souches de B, subtilis possèdent de fortes activités protéasiques (Simonen et Palva 1993, Microbiol Rev. 57:109-37). La souche utilisée pour exprimer le gène ureB (B. subtilisCUl) possède par contre une faible activité protéasique. Etude du pouvoir immunostimulateur de la souche CUI. Dans le but de développer un vaccin recombinant vivant contre H. pylori, une bactérie porteuse de l'antigène, qui possède des propriétés d'adjuvant (stimulation du système immunitaire), est un atout très important. Pour cela, il a été nécessaire d'analyser plus précisément cet effet immunomodulateur et d'identifier les mécanismes impliqués au niveau du système immunitaire. Dans un premier temps, certaines souches du genre Bacillus pouvant être intéressantes pour la construction du vaccin ont été caractérisées physiologiquement et génétiquement. L'activation des macrophages intrapéritonéaux de souris a été mesurée par le dosage des nitrites produits comme résultat de la stimulation de la Nitrite Synthetase II (NOS-II) par les souches bactériennes. Les résultats obtenus (figure 2) montrent que certaines des bactéries probiotiques testées stimulent la production de monoxyde d'azote par les macrophages quand elles se trouvent en co-culture avec des cellules péritonéales. Le monoxyde d'azote joue un rôle important dans les défenses immunitaires par son action microstatique et microbicide. Parmi les souches testées, nous avons observé que la souche B. subtilis CUl induit la plus grande stimulation. Par comparaison, la souche 168 de B. subtilis (souche type, dont le génome a été séquence) n'induit qu'une réponse très limitée. En raison de la haute réponse immunostimulatrice produite par B. subtilis CU1, cette souche a été choisie pour étudier les mécanismes responsables de cette activité. La souche de B. subtilis CUlstimule la production d'interféron endogène in vivo des souris (BALB/c) (figure 3). Les Demandeurs ont aussi montré que l'activation de NOS-II sur les macrophages est indirecte et due à une stimulation de la production des cytokines qui conduisent à une réponse de type Thl. En effet, B. subtilis CU1 stimule la production d'Interleukine 12 par les macrophages et la production d'Interferon y par les lymphocytes intrapéritonéaux qui, à son tour, stimule la NOS-II synthétase des macrophages (figure 4). Evaluation de l'effet de la vaccination prophylactique avec la souche B. subtilis CUrel contre l'infection à H. pylori (modèle souris). L'immunisation prophylactique des souris BALB/c par la souche probiotique recombinante B. subtilis 22-3FU a été réalisée selon le plan présenté dans le tableau 1 ci-après : TABLEAU 1 : Protocole d'immunisation Jour d'immunisation le,jour 3e jour Séjour 7e jour 10e jour 12e jour 14e jour Nom de groupe TNI -1 - - - TI - - - - - - SHP+CT +2 - - ± - + Bs CUrel + + + + + + + CU1 + + + + + + + Remarques -1 Les animaux ont reçu seulement la solution physiologique par voie orale ; +2 Les animaux ont reçu le traitement approprié. Pour établir le protocole d'immunisation avec la souche B. subtilis CUre1, il a été considéré que leur transit dans l'organisme de la souris dure environ trois jours. Cinq semaines après l'immunisation, les animaux ont été infectés par la souche H. pylori SS1. La détection de H. pylori sur les biopsies de l'estomac a été effectuée quatre semaines après l'inoculation des bactéries pathogènes. Elle a été réalisée par trois méthodes différentes : test à l'uréase, détection par PCR et culture. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après. Tableau II. Effet de la vaccination prophylactique avec la souche B. subtilis CUre1 contre l'infection à H. pylori. Pourcentage des animaux non infectés par H. pylori Nom du groupe Test à l'uréase Culture PCR HS1/HS2 TNI 100 % 100 % 75 % TI 0% 19% 0% SHP+CT 75 % 75 % 68 % BsCUrel 81 % 75 % 75 % BsCU1 31 % 37 % 25 % La souche vaccinale recombinante B. subtilis CUrel de l'invention protège 75 à 81 % des animaux. La protection obtenue est comparable à celle obtenue par le procédé de vaccination admise classiquement avec SHP+CT. Il convient de noter que le traitement prophylactique par la souche probiotique B. subtilis CU1 protège environ 31 à 37 % des animaux. Cette protection est probablement due à l'activité immunomodulatrice. Evaluation de l'effet de la vaccination thérapeutique avec la souche B. subtilis CUrel contre l'infection à H. pylori (modèle souris). L'immunisation thérapeutique des souris BALB/c (préalablement infectées par H. pylori SS1) avec la souche probiotique recombinante B. subtilis CUrel a été réalisée selon le plan indiqué au tableau I. La détection de H. pylori a été effectuée quatre semaines après la dernière immunisation par trois méthodes différentes : test à l'uréase, microscopie d'un frottis de biopsie de l'estomac et détection d'un antigène spécifique à H. pylori dans les selles par le kit ELISA HspA. Dans cette expérience, le test de détection de H. pylori par PCR n'a pas été utilisé, en raison des problèmes de spécificité qu'il présente. En revanche, nous avons préféré utiliser le test de détection immunologique kit ELISA HspA beaucoup plus spécifique. De même, à la place du test de détection bactériologique (très lourd et pas très sensible), une observation microscopique des frottis de l'estomac a été réalisée. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-après. Tableau III. Effet de la vaccination thérapeutique avec la souche B. subtilisCUrel contre l'infection à H. pylori. Pourcentage des animaux non infectés par H. pylori Nom du groupe Test à l'uréase Test ELISA Microscopie d'animaux Hsp A TNI 100 % 94 % 100 % TI 0 % 0% 0% SHP+CT 75 % 75 % 75 % BsCUrel 81 % 87 % 87 % BSCU1 31 % 37 % 37 % La souche vaccinale construite B, subtilis CUrel protège 81 à 87 % des animaux. La protection obtenue est plus élevée que celle obtenue avec le protocole de vaccination admis classiquement avec SHP+CT (environ 75 %). Le taux de protection des animaux traités par la souche probiotique B. subtilis CUl est de 31 à 37 %. La protection apportée par la souche probiotique est probablement due non seulement à son activité immunomodulatrice, mais aussi à la production des molécules antibiotiques in vivo. Revendications 1- Souche Bacillus subtilis CU1 déposée à la Collection de Culture de Micro-organismes de l'Institut Pasteur à Paris sous le n I-2745 le 25 octobre 2001. 2- Utilisation de la souche Bacillus subtilis CUl ou ses fractions selon la revendication 1 comme agent immunomodulateur du système immunitaire. 3- Adjuvant vivant pour immunisation mucosale, caractérisé en ce qu'il comprend la souche Bacillus subtilis CU1 selon la revendication 1. 4- Vaccin recombinant vivant contre H. pylori caractérisé en ce qu'il contient la souche Bacillus subtilis CU1, contenant le gêne ureB de H. pylori ayant la séquence SEQ ID N 1.