FR 2877675 A1 20060512 FR 0411874 A 20041108 1 2877675 Expression de gènes hétérologues de manière spécifique dans certains tissus d'animaux modèles transgéniques La présente invention concerne un vecteur susceptible de permettre l'expression de gènes hétérologues de manière spécifique dans certains tissus de modèles animaux transgéniques, les animaux modèles dans le génome desquels est intégré un tel vecteur et un procédé permettant l'expression tissus-spécifique d'un transgène dans un modèle d'animal transgénique. Le développement de modèles animaux permettant d'exprimer un transgène de manière tissus-spécifique est particulièrement difficile, nécessitant notamment l'identification de séquences régulatrices des promoteurs qui sont différents selon les tissus et les espèces animales. Dès lors que ces promoteurs seraient éventuellement identifiés, l'expression d'un même transgène dans différents tissus nécessite la réalisation d'autant de vecteurs d'expression tissus-spécifique du transgène que de promoteur, et d'autant de modèles animaux correspondants. De plus cette méthode permet de définir et contrôler le moment au quel le gène sera exprimé, ce qui aujourd'hui est très difficile à réaliser. Enfin, il est à ce jour très difficile de faire une expression transitoire contrôlée (off puis on puis off) sans parler de capacité à véritablement moduler l'expression des gènes. La présente invention permet de résoudre ces inconvénients (1) par la combinaison d'une part d'un transgène placé sous le contrôle d'un promoteur dont 1"expression est conditionnée par la mise en contact avec une recombinase et d'autre part un moyen d'expression tissus spécifique de la recombinase correspondante et également (2) par un système contrôlé par des recombinases permettant de retirer intégralement le trasngène et donc de l'éteindre définitivement. Elle permet également une grande souplesse d'utilisation avec une intégration aléatoire du transgène par des méthodes usuelles comme la micro-injection ou l'expression transitoire stable, mais également par KIN ( knock in ) ciblé dans des locus particuliers connus pour permettre une bonne expression du transgène, comme par exemple le locus HPRT ou le locus ROSA 26. La présente invention concerne donc d'abord un vecteur destiné à être intégré dans le génome de cellules animales, le dit vecteur, comprenant dans le sens 5'-3' les éléments fonctionnels suivants: 2 2877675 un premier site SR1 de reconnaissance d'une première recombinase RI une séquence de régulation promotrice s'exprimant dans les cellules animales un deuxième site SR2 de reconnaissance d'une deuxième recombinase R2 une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription, cette séquence contenant également préférentiellement un gène de sélection un troisième site SR3 de reconnaissance de la deuxième recombinase R2 un acide nucléique hétérologue codant pour une séquence d'intérêt un quatrième site SR4 de reconnaissance de la première recombinase R1. Les vecteurs selon l'invention sont constitués de séquences d'ADN et sont destinés à être insérés dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote. Par séquence d'ADN on entend selon l'invention une molécule d'ADN constituée par une séquence d'acides désoxyribonucléiques liés de manière covalente. Par cellule animale, on entend selon l'invention toute cellule d'origine animale, de préférence à l'exception de l'homme, plus particulièrement toutes cellules d'origine de mammifères, préférentiellement de mammifères rongeurs, plus préférentiellement de rat ou de souris. De manière préférentielle, les sites SRI et SR4 et les sites SR2 et SR3 sont identiques deux par deux. Ils sont avantageusement choisis parmi les sites Lox P, Lox P 20 modifié et FRT. Les combinaisons préférées de sites de reconnaissance sont rappelées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 SR1 SR2 SR3 SR4 Lox P FRT FRT Lox P Lox P modifié FRT FRT Lox P modifié F'RT Lox P Lox P FRT F'RT Lox P modifié Lox P modifié FRT En fonction des sites de reconnaissance choisis, les recombinases R1 et R2 sont choisies, indépendamment l'une de l'autre, parmi les recombinases suivantes: Cre ou FLP. Les sites de reconnaissance Lox P, Lox P modifié, FRT et les recombinases Cre et FLP correspondantes sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits 3 2877675 clans Kilby, et al. ((1993). Trends Genet 9, 413-21), Sauer, et Henderson ((1988). Proc Nat1 Acad Sci U S A 85, 516670), Gu et al. ((1994). Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998). Mol Hum Rep:rod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Schlake et Bode ((1994). Biochemistry 33, 12746-51). La mise en contact des séquences ci-dessus dans le génome des cellules transformées avec la recombinase R2 reconnue par les sites SR2 et SR3 permet d'éliminer la séquence d'arrêt de la transcription, et donc l'expression de la séquence d'intérêt sous le contrôle de la séquence de régulation promotrice. Dans le modèle selon l'invention, cette expression devient tissus-spécifique dès lors que la mise en contact est effectuée également de manière tissus-spécifique par un moyen approprié. La mise en contact des séquences ci-dessus dans le génome des cellules transformées avec la recombinase R1, avant ou après mise en contact avec la recombinase R2, permet d'éliminer le transgène en restaurant l'état génétique initial. Il est donc possible d'observer dans un animal selon l'invention le phénotype associé à l'expression tissus-spécifique d'un transgène pendant un temps donné, puis d'observer le phénotype après interruption de cette expression. Pour les séquences de régulation promotrices fonctionnelles dans les cellules animales, on citera notamment les séquences connues de l'homme du métier comme celles décrites dans Imhof et al. (J Biotechnol. (2002) 97, 275-85) et Chang et al. (Biochemistry. (1993) 32, 4263-1269). Ces promoteurs sont connus pour avoir des profils d'expression variés, généralement classés parmi les promoteurs forts ou faibles, ou encore ubiquitaires ou tissus spécifiques. L'homme du métier sera à même de choisir le promoteur qu'il entend employer selon l'étude qu'il entend réaliser. On citera en particulier des promoteurs dits forts décrit notamment dans Giamarchi C, et al (Oncogene. (1999) 18, 533-41), Piggins HD (Ann Med. (2002);34, :394-400), Fougerousse F,et al (Hum Mol Genet. (2000) 9, 165-73) et Singh N et al (J Mol Evol. (1998) 46, 639-48). On citera aussi les promoteurs dits "tissus spécifiques", comme les promoteurs 30 spécifiques des tissus musculaires doux, notamment décrits dans les publications ci-dessous: - Madsen CS, regan CP, Hungerford JE, White SL, Manabe I and Owens GK, Cire Res 1998, 82: 908-917. Smooth muscle-specific expression of the smooth muscle myosin 4 2877675 heavy chain gene in transgenic mite requires 5'flanking and first intronic DNA sequence. - Regan CP, manabe I and Owens GK, Circ Res 2000, 87: 363-369. Development of a smooth Muscle-targeted Cre recombinase mouse reveals novel insights regarding smoth 5 muscle myosin heavy chain promoter regulation. - Li L, Miano JM, Mercer B and Oison EN, J. Cell Bio 1996, 132: 849-859. Expression of the SM22a promoter in transgenic mice provides evidence for distinct transcriptional regulatory programs in vascular and visceral smooth muscle tells. - Imai T, Morita T, Shindo T, Nagai R, Yazaki Y, Kurihara h, Suematsu M and k:atayama S, Circ Res 2001, 89: 55-62. Vascular smooth muscle celldirected overexpression of heme oxygenase-1 elevates blood pressure through attenuation of nitric oxide-induced vasodilation in mice. On citera aussi le promoteur specifique Tau décrit dans Callahan C. and Thomas J (P.N.A.S., 1994, 91: p. 5972-6 Tau-13-galactosidase, an axontargeted fusion protein). Il devient donc possible, avec les moyens de la présente invention, de modifier le profil d'expression d'un promoteur donné, de manière à rendre tissus spécifique un promoteur ubiquitaire, ou encore en modifiant la spécificité d'un promoteur tissus spécifique. Par exemple, en combinant un promoteur tissus spécifique des cellules neuronales avec un système d'expression de la recombinase R2 limité à une zone du cerveau, on obtient une expression du transgène limitée aux cellules neuronales de la région d'intérêt. La même expérience réalisée avec un promoteur ubiquitaire conduirait à une expression dans l'ensemble des cellules de la région d'intérêt. Les séquences d'arrêt de la transcription dans les cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier. On citera notamment les séquences décrites notamment dans Proudfoot et al (Cell. (1991) 64,:671-4) et dans Beaudoing et al. (Genome Res. (2001) 11, 520-526). La séquence d'intérêt du vecteur selon l'invention est de préférence choisie parmi les séquences suivantes: Une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide, en 30 particulier une protéine d'intérêt, ou Une ou plusieurs séquences d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA ou s [RNA, et Leurs combinaisons. 2877675 De manière avantageuse, la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. On citera notamment ceux décrits dans Li, et al. ((1997). J Cell Biol 139, 129-44), Schneider-Maunoury et al. ((1993). Cell 75, 1199-214) et Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 266-70). De manière avantageuse, le RNA antisens ou interférent permet d'inhiber la traduction d'ARNm cibles, préférentiellement choisis parmi les gènes suivants: GPCR, récepteurs nucléaires, récepteurs membranaires, cytokines, canaux ionique, etc. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence d'acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription comprend également, en amont de ladite séquence d'arrêt, une séquence codant pour une protéine d'intérêt, par exemple la séquence codante d'un gène marqueur de sélection (Neomycine, Puromycine, etc.) ou d'un gène rapporteur (LacZ, GFP, RFP, etc.) ou encore d'un cDNA humain ou non, muté ou non codant pour gène d'intérêt (Westphal CH, Leder P., Curr Biol. 1997 Jul 1;7(7):530-3; Lovik M, Toxicology. 1997 Apr 11;119(1):65-76. Revue; Elefanty AG & al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Sep 29;95(20):11897-902; Xian H, Gottlieb DI., Glia. 2004 Jul;47(1):88-101; Choo YS & al., Hum Mol Genet. 2004 Jul 15;13(14) :1407-20. Epub 2004 May 26; Matsuda I & al., Methods Mol Biol. 2004; 259:379-90). Les gènes codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans les cellules animales sont également bien connus de l'homme du métier. On citera notamment Yagi et al., (1990, PNAS, 87, 9918-22). Les gènes de sélection positive sont bien connus de l'homme du métier et sont préférentiellement des gènes de résistance à un antibiotique, tel les gènes de résistance à la kanamycine, qui permet également la résistance à la néomycine dans les cellules mammifères, résistance à l'hygromycine, à la zéocine, à la b]asticidine... La présente invention concerne également un procédé de transformation de cellules animales pour intégrer dans son génome la combinaison de vecteurs selon l'invention. Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Smithies et al. ((1985). Nature 317, 230-4) et Wong et al. ((1986). Somat Cell Mol Genet 12, 63-72). 6 2877675 De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27-31). La présente invention concerne aussi les cellules animales dans le génome 5 desquelles est intégré le vecteur selon l'invention, plus préférentiellement les cellules animales telles que définies précédemment Ces cellules selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par intégration de la combinaison de séquences par le procédé selon l'invention. Elles peuvent également comprendre des cellules obtenues par prélèvement sur des animaux obtenus à partir desdites cellules obtenues par le procédé selon l'invention. L'invention concerne également des embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon l'invention, ainsi que les animaux obtenus à partir de ces embryons et la descendance desdits animaux ayant conservé le vecteur selon l'invention. Les animaux selon l'invention sont définis précédemment à l'exception de l'homme, préférentiellement des mammifères plus préférentiellement des mammifères rongeurs, encore plus préférentiellement des rats ou des souris. Les méthodes de préparation d'animaux modèles sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997; WO 97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998; WO 99 37143), les bovins (Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature Biotechnol. 17, 456-461, 1999; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86-90, 2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) el: le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom). Les animaux modèles ainsi obtenus peuvent être employés de manière à permettre l'expression tissus spécifique de la séquence d'intérêt en permettant la mise en contact des séquences du vecteur selon l'invention défini ci-dessus dans les cellules transformées selon l'invention avec la recombinase R2 de manière tissus spécifique. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'un animal modèle exprimant une séquence d'intérêt hétérologue de manière tissus spécifique, ledit procédé comprenant la mise en contact des séquences du vecteur selon l'invention 7 2877675 défini ci-dessus dans les cellules des animaux transformés selon l'invention avec la recombinase R2 de manière tissus spécifique. Parmi les moyens permettant une telle mise en contact, on citera en particulier la délivrance de vecteurs viraux, virus ou rétro-virus, permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissus-spécifique, l'injection des recombinases de manière tissus spécifique ou encore le croisement des animaux selon l'invention avec des animaux modèles comprenant des éléments permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissus spécifique. L'expression de la recombinase R2 de manière tissus spécifique au moyen de vecteurs viraux peut être réalisée comme suit: Un virus d'expression de la recombinase d.'intérêt est préparé et purifié selon les méthodes classiques de préparation virales, bien connues de l'homme du métier. Le virus est alors injecté par stéréotaxie dans la région d.'intérêt, par exemple la région cérébrale d'intérêt. La dose de virus ainsi que le nombre d'injection sont des paramètres permettant d'obtenir un nombre de cellules hôtes excisées croissant ainsi qu'une diffusion géogrpahique accrue. L'utilisation de systèmes d'inhalation pour les poumons, d'injection IV pour le foie et les épithéliums et d'injection anaux pour le colon sont d'autres exemples de mode d'administration. Lorsque l'on dispose d'un modèle animal exprimant la recombinase R2 de manière tissus spécifique, il est possible d'obtenir un animal exprimant séquence d'intérêt de manière tissus spécifique par son croisement avec l'animal modèle selon l'invention. De tels modèles animaux exprimant une recombinase de manière tissus spécifique sont bien connus de l'homme du métier, décrits notamment dans Xu et al. ((1999). Nat Genet 22, 37-43), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120- 3), Kulkarni, et ai. ((1999). Cell 96, 329-39), Tsien et al. ((1996). Cell 87, 1327-38) et Harada, et al. ((1999). Embo J 18, 5931-42). L'utilisation des modèles selon l'invention permet ainsi de réaliser les études décrites ci-dessous. Dans le cadre d'un projet d'étude de Neurosciences, il est souhaitable d'obtenir l'expression d'un gène d'intérêt dans une zone particulière du cerveau (zone présentant une activité neuronale particulière). Très peu de promoteurs permettent une telle expression. Il est alors possible d'utiliser un promoteur spécifique des neurones d'intérêts (gabaergiques, serotoninergiques, etc.) dans le procédé selon l'invention. La 8 2877675 recombinase est alors apportée par stéréotaxie dans la zone souhaitée et au moment voulu. Une forte dose permettra d'affecter un plus grand nombre de cellules qu'une dose faible. La répétition des injections permettra d'accroître le nombre de cellules exprimant le gène d'intérêt. Dans un second temps il est possible par une nouvelle injection d'une seconde recombinase, de supprimer l'expression du gène d'intérêt. De part la maîtrise des techniques de stéréotaxie en Neurosciences, cette approche présente un énorme intérêt car elle ouvre aux chercheurs des possibilités techniques nouvelles sans nécessiter l'acquisition de nouvelles techniques au sein des laboratoires utilisateurs. Dans le cadre d'une étude de physiologie, il est parfois souhaité de faire exprimer de façon transitoire une hormone. En utilisant un promoteur foie spécifique à forte activité il est possible après expression de la recombinase 1 de produire et de mettre en circulation dans le sang l'hormone étudié. Le moment auquel l'hormone est produite ainsi que son taux de production sont contrôlés par l'intermédiaire des doses de recombinase apportées (concentration virale, répétition, etc.). L'expression une fois établie se maintient à un niveau constant dans le temps. En apportant la seconde recombinase il est alors possible, au moment désiré, de réduire voir de supprimer cette expression. Ce retour à la normal est définitif: L'importance des réponses exacerbées dans de nombreuses pathologies humaines en particulier immunitaire fait de ce système un outil essentiel. Une stratégie employée pour une expression tissus spécifique est décrite sur la figure 1. La figure 2 représente un vecteur pouvant être employé pour la mise en oeuvre de cette stratégie. 9 2877675 Revendications 11. Vecteur comprenant dans le sens 5'-3' les éléments fonctionnels suivants: un premier site SR1 de reconnaissance d'une première recombinase Rl - une séquence de régulation promotrice s'exprimant dans les cellules animales un deuxième site SR2 de reconnaissance d'une deuxième recombinase R2 une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription un troisième site SR3 de reconnaissance de la deuxième recombinase R2 un acide nucléique hétérologue codant pour une séquence d'intérêt un quatrième site SR4 de reconnaissance de la première recombinase R1. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sites SRI et SR4 et les sites SR2 et SR3 sont identiques deux par deux et sont avantageusement choisis parmi les sites Lox P, Lox P modifié et FRT. 3. Vecteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'intérêt est choisie parmi les séquences suivantes: - Une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide, en particulier une protéine d'intérêt, ou Une ou plusieurs séquences d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA ou siRNA, et Leurs combinaisons. 4. Vecteur selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. 5. Vecteur selon la revendication 3, caractérisée en ce que le RNA antisens ou interférent permet d'inhiber la traduction d'ARNm cibles. 6. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence d"acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription comprend également, en amont de ladite séquence d'arrêt, une séquence codant pour une protéine d'intérêt, par exemple la séquence codante d'un gène marqueur de sélection ou d'un gène rapporteur. 7. Cellules animales dans le génome desquelles est intégré le vecteur selon l'une des revendications 1 à 6. 2877675 8. Embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon la revendication 7, à ['exception de l'homme. 9. Animaux génétiquement modifiés obtenus à partir des embryons selon la revendication 8, à l'exception de l'homme. 10. Animaux selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les mammifères rongeurs, préférentiellement les rats ou les souris. ll. Procédé de préparation d'un animal modèle, à l'exception de l'homme, exprimant une séquence d'intérêt hétérologue de manière tissus spécifique, ledit procédé comprenant la mise en contact des séquences du vecteur défini selon l'une des revendications 1 à 6 dans les cellules d'un animal selon l'une des revendications 9 ou 10 avec une recombinase R2 de manière tissus spécifique.