FR 2850395 A1 20040730 FR 0300905 A 20030128 TRANSPOSASES D'ELEMENTS GENETIQUES MOBILES mariner MUTANTES, NON PHOSPHORYLABLES ET HYPERACTIVES La présente invention se rapporte au domaine de la biologie moléculaire relative aux éléments transposables. L'invention concerne plus particulièrement l'amélioration des propriétés des transposases naturelles d'éléments génétiques mobiles mariner, aux fins de leur utilisation en biotechnologies. La présente invention a pour objets des transposases mutantes, non phosphorylables, hyperactives, d'éléments génétiques mobiles mariner. L'invention concerne également des séquences nucléotidiques recombinantes codant de telles transposases. En outre, l'invention vise un procédé de production de ces transposases, ainsi que l'utilisation de ces dernières pour la transposition in vitro ou in vivo. Les éléments transposables (TE) ou éléments génétiques mobiles (EGM) sont des fragments d'ADN de petite taille, capables de se déplacer d'un site chromosomique à un autre (Renault et al., 1997). Ces fragments d'ADN sont caractérisés par des séquences répétées inversées (ITR) situées en positions 5' et 3' distales. Une enzyme codée par les TE euxmêmes, la transposase, catalyse le processus de transposition de ces derniers. Des TE ont été identifiés tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes (voir un ouvrage de référence dans ce domaine : Craig et al., 2002). Les TE sont répartis en deux classes d'après leur mécanisme de transposition. D'une part, les éléments de classe I, ou rétrotransposons, transposent via la transcription inverse d'un intermédiaire ARN. D'autre part, les éléments de classe Il transposent directement d'un site chromosomique à un autre, via un intermédiaire ADN, selon un mécanisme de type couper-coller . Chez les procaryotes, un grand nombre de TE ont été répertoriés à ce jour. L'on peut citer, par exemple, des séquences d'insertion telles que IS1, et des transposons, tel Tn5. Chez les eucaryotes, les éléments de classe Il comprennent cinq familles : P, PiggyBac, hAT, hélitron et Tc1-mariner. Les éléments génétiques mobiles mariner (ou MLE pour marinerlike elements ) constituent un grand groupe de TE de classe II, appartenant à la superfamille Tc1-mariner (Plasterk et al., 1999). La capacité des transposases de TE à mobiliser des fragments d'ADN plus ou moins longs, homologues ou hétérologues, comprenant des séquences d'intérêt, pour les insérer dans des acides nucléiques cibles, en particulier dans le chromosome d'un hôte, a été et est encore largement mise à profit dans le domaine des biotechnologies, notamment dans le domaine du génie génétique. Parmi les TE, les MLE présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation en biotechnologies, notamment en ingénierie génétique et génomique fonctionnelle. L'on peut par exemple citer de manière non limitative les propriétés suivantes : (i) Les MLE sont des transposons de petite taille, faciles à manipuler. (ii) Le mécanisme de transposition des MLE est simple. En effet, la transposase est capable de catalyser, à elle seule, toutes les étapes impliquées dans le processus de transposition des MLE. Elle est d'ailleurs nécessaire et suffisante pour assurer la mobilité des MLE en l'absence de facteurs de l'hôte (Lampe et al., 1996). (iii) Les MLE se caractérisent par une très large ubiquité chez les procaryotes et les eucaryotes. Le premier MLE, Dmmar1, également appelé Mos-1, a été découvert chez Drosophila mauritiana par Jacobson et Hartl (1985). Par la suite, de nombreux éléments apparentés ont été identifiés dans des génomes appartenant notamment à des bactéries, protozoaires, champignons, plantes, invertébrés, vertébrés à sang froid et mammifères. (iv) L'activité transpositionnelle des MLE est hautement spécifique, et ne stimule pas de mécanismes de résistance du génome de l'hôte, tels que des phénomènes d'interférences par méthylation [MIP ; Jeong et al. (2002) ; Martienssen et Colot (2001)] ou via des ARN [RNAi ; Ketting et al. (1999) ; Tabara et al. (1999) ]. Les événements de transposition peuvent être contrôlés par divers facteurs, tels la température et le pH. En conséquence, les applications potentielles des MLE en biotechnologies, notamment comme outils de recombinaison génétique, sont considérables. Néanmoins, l'efficacité de transposition des MLE naturels, comparée à celle d'autres TE, reste faible. En particulier, les MLE semblent moins actifs chez les eucaryotes que les autres EGM de classe II. En définitive, l'intérêt pratique des MLE naturels est demeuré jusqu'à présent limité, puisqu'il est important, pour l'industriel ou le chercheur, de disposer de transposases efficaces, de manière à réduire le nombre de manipulations, le coût et le temps nécessaires pour réaliser les transpositions recherchées. La présente invention permet précisément de satisfaire à ces exigences, en mettant à profit les avantages des transposases de MLE, tout en remédiant à leurs inconvénients. La présente invention met en évidence le fait que les transposases de MLE sont phosphorylées chez les eucaryotes, par le biais de modifications post-traductionnelles (voir Partie Expérimentale ci-après). Ces modifications post-traductionnelles ont deux effets : d'une part, elles réduisent l'affinité des transposases pour l'ADN ; et d'autre part, elles limitent l'activation conformationnelle de ces enzymes. Ceci se traduit finalement par une capacité moindre des transposases phosphorylées à catalyser la transposition chez les eucaryotes. Aussi, afin d'améliorer les propriétés transpositionnelles des transposases de MLE, l'invention vise-t-elle à supprimer, par mutagénèse ponctuelle, un ou plusieurs sites de phosphorylation de ces enzymes. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une transposase de MLE, mutante et hyperactive. Selon un premier mode de réalisation, une telle transposase présente au moins une mutation au niveau d'au moins un site de phosphorylation, ladite mutation rendant ledit site non phosphorylable in vivo. Une transposase mutante et hyperactive selon l'invention est donc au moins partiellement non phosphorylable. L'on désignera dans ce qui suit une telle transposase comme étant mutante, non phosphorylable et hyperactive . L'on entend ici par transposase hyperactive , une transposase dont l'efficacité de transposition chez les eucaryotes est accrue par un facteur supérieur ou égal à environ 25, de préférence supérieur ou égal à environ 50, de manière encore préférée supérieur ou égal à environ 100. En particulier, une transposase selon l'invention est hyperactive pour au moins une fonction parmi : la liaison spécifique et non spécifique à l'ADN, la dimérisation, le transfert des brins d'ADN, et les propriétés endonucléasiques et d'internalisation nucléaire (voir Figure 2 ci-après). Chacune des activités sus-citées est nécessaire, mais peut être limitante, lors de la mise en #uvre du processus de transposition. En particulier, chacune de ces activités est susceptible d'être régulée par des phosphorylations post-traductionnelles chez les eucaryotes. La liaison à l'ADN met en jeu trois mécanismes de reconnaissance de l'ADN par les transposases de MLE. Les transposases peuvent se lier à l'ADN par leur domaine N-terminal, soit de façon non spécifique (premier mécanisme), soit de façon spécifique via les ITR (deuxième mécanisme). Ces deux modes de liaison dépendent de l'état conformationnel du domaine N-terminal. Lorsque les transposases sont piégées dans le complexe synaptique, juste après l'excision du transposon (ce complexe comprenant un dimère de transposases liées par les ITR au transposon excisé), elles peuvent se lier à l'ADN selon un troisième mécanisme, pour reconnaître le site d'insertion dans l'ADN cible. Les transposases de MLE sont capables de s'auto-associer (propriétés de dimérisation dans le contexte de l'invention) selon deux processus. Elles peuvent se dimériser (homodimères) lorsqu'elles sont liées de façon spécifique à des ITR. Elles sont également capables de s'oligomériser (homodimères ou homooligomères) lorsqu'elles se trouvent sous une conformation inactive et/ou à forte concentration, lorsqu'elles ne sont pas liées à des ITR. Dans la transposase Mos-1, la position T88 (voir plus loin) a été proposée comme étant impliquée dans de la dimérisation (Zhang et al., 2001 ; données personnelles). L'activité de transfert des brins d'ADN est définie dans la littérature comme couvrant la capacité des transposases de MLE, qui sont des phosphoryl-transférases, à lier des fragments d'ADN, concomitamment à la coupure de ces derniers. Les propriétés endonucléasiques sont donc très étroitement liées à l'activité de transfert des brins d'ADN susvisée. Les activités de coupure présentées par les transposases de MLE sont de trois types : la coupure aux extrémités du transposon lors de l'excision, la linéarisation des intermédiaires d'excision circulaires et la coupure du site d'insertion dans l'ADN cible. Enfin, les transposases de MLE possèdent deux sites bipartites potentiels permettant une internalisation nucléaire. Les termes et expressions activité , fonction , activité biologique et fonction biologique sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Dans le cadre de l'invention, l'activité en cause est l'activité enzymatique d'une transposase ( activité transposase ou fonction transposase ). Selon le contexte, l'expression activité transposase peut désigner de manière générique l'ensemble des activités enzymatiques d'une transposase de MLE, telles que susmentionnées, ou une ou plusieurs de ces activités. En tous les cas, le sens à donner à cette expression sera déduit de manière claire et non ambiguë du contexte par l'homme du métier. Au sens de l'invention, une mutation est conforme à l'acception usuelle en biotechnologie. Ainsi, une mutation peut être une substitution, une addition ou une délétion d'une ou plusieurs bases dans une séquence nucléotidique, ou d'un ou plusieurs acides aminés dans une séquence protéique. De manière préférée, une mutation désigne, selon l'invention, une substitution d'une ou plusieurs bases dans une séquence nucléotidique, ou d'un ou plusieurs acides aminés dans une séquence protéique. Plus particulièrement, une mutation doit ici être entendue comme désignant une substitution d'au moins une base d'un codon d'une séquence nucléotidique codant une transposase de MLE, ladite substitution entraînant, lors de la traduction de la séquence nucléotidique en cause, l'incorporation d'un acide aminé différent (non phosphorylable) aux lieu et place de l'acide aminé natif (phosphorylable), dans la séquence protéique résultante. Dans le contexte de l'invention, les sites de phosphorylation peuvent notamment être des sites de phosphorylation par la protéine kinase AMPc, GMPc dépendante, ou par la protéine kinase C, ou encore par la caséine kinase II. Il peut en outre s'agir de sites de phosphorylation putatifs, correspondant alors à des motifs consensus connus de l'homme du métier (banques de motifs PROSITE : http://www.infobiogen.fr) tels que représentés sur la Figure 1 ci-après. En outre, les sites de phosphorylation visés par l'invention peuvent être conservés à travers au moins deux transposases de MLE. En ce cas, ils peuvent être mis en évidence par un alignement des séquences protéiques d'au moins deux transposases de MLE. L'une de ces séquences peut être, par exemple, celle de la transposase Mos-1 (voir l'alignement des séquences des transposases de MLE déposé auprès de la banque de données EMBL sous le numéro d'accès DS36877). Selon un deuxième mode de réalisation, une transposase conforme à l'invention présente au moins une mutation au niveau de chaque site de phosphorylation, ladite mutation rendant chaque site non phosphorylable in vivo. Selon un troisième mode de réalisation, une transposase objet de la présente invention est telle qu'au moins un résidu phosphorylable d'au moins un site de phosphorylation, est substitué par un résidu non phosphorylable. Selon un quatrième mode de réalisation, au moins un résidu phosphorylable de chaque site de phosphorylation d'une transposase conforme à l'invention est substitué par un résidu non phosphorylable. En particulier, dans les troisième et quatrième modes de réalisation ci-dessus, un résidu phosphorylable objet de la substitution est choisi parmi : une sérine, une thréonine, une tyrosine et une histidine. De préférence, un tel résidu phosphorylable est choisi parmi une sérine, une thréonine et une tyrosine. Selon un cinquième mode de réalisation, une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, objet de l'invention provient d'un MLE appartenant à la sous-famille mauritiana. Les MLE visés dans le cadre de la présente invention présentent entre eux des homologies de séquence d'au moins 50%, de préférence d'au moins 75%, de manière encore préférée d'au moins 80%, ou plus préférentiellement encore, d'au moins 90%. Alternativement, les MLE selon l'invention présentent entre eux des homologies de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 90%, de manière encore préférée d'au moins 95%, ou plus préférentiellement encore, d'au moins 98%. Ainsi, les MLE en question possèdent, sur toute leur longueur, au moins 50%, de préférence au moins 75%, de manière encore préférée au moins 80%, ou plus préférentiellement encore au moins 90% de bases identiques. Alternativement, les MLE possèdent, sur toute leur longueur, au moins 80%, de préférence au moins 90%, de manière encore préférée au moins 95% ou, plus préférentiellement encore, au moins 98%, de bases identiques. Les bases identiques peuvent être consécutives, en tout ou en partie seulement. Les MLE ainsi envisagés peuvent être de même longueur, ou d'une longueur différente si leurs séquences présentent, les unes par rapport aux autres, des délétions ou insertions d'une ou plusieurs bases. La sous-famille mauritiana rassemble les MLE dont les transposases sont codées par des séquences présentant, sur toute leur longueur ou aux niveaux des régions codant les domaines N- et Cterminaux uniquement, un niveau d'homologie suffisant, c'est-à-dire d'au moins 75%, pour être incluses dans la même lignée que les quatre séquences ci-dessous, lors d'études phylogénétiques effectuées en utilisant les méthodes de parcimonie et Neighbor-Joining sur un ensemble de données de 1000 sous-échantillonnages (1000 bootstrap ) [Voir Felsenstein (1993) et Augé-Gouillou étal. (2000) ] : - transposase Mos-1 (SEQ ID N 2, N d'accès EMBL : X78906) ; - tranposase Mdmar-1 de Mayetiola destructor (N d'accès EMBL : U24436) ; - transposase Btmar-1 de Bombus terrestris (séquence N 3 dans l'alignement N d'accès EMBL : DS36877) ; et - transposase Momar-1 de Metaseuilius occidentalis (N d'accès EMBLU12279). Selon un sixième mode de réalisation, une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, objet de l'invention provient du MLE mos-1. En particulier, dans une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, provenant du MLE mos-1, un ou plusieurs résidus phosphorylables parmi les résidus suivants (par référence à la séquence SEQ ID N 2) : T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; Y171 ; T181 ; T216 ; T255 ; et S305, sont substitués par des résidus non phosphorylables. De manière avantageuse, au moins le résidu phosphorylable T88 d'une telle transposase se trouve substitué par un résidu non phosphorylable. Selon un deuxième aspect, la présente invention a trait à une séquence nucléotidique recombinante codant une transposase telle que décrite supra. Une séquence nucléotidique ou un acide nucléique selon l'invention sont conformes à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN. Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique recombinante codant une transposase conforme à l'invention. De manière avantageuse, un tel vecteur recombinant permet l'expression de ladite séquence nucléotidique recombinante. Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une cellule hôte recombinante hébergeant au moins un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus. Dans la mesure où les MLE ne présentent, à ce jour, aucune restriction d'hôte, une cellule hôte recombinante selon l'invention peut être aussi bien d'origine eucaryote que procaryote. Il peut, par exemple et de manière non limitative, s'agir d'une cellule eucaryote provenant d'une levure, d'un champignon, d'une plante, d'un insecte (e.g., la drosophile), d'un rongeur ou d'un mammifère (e.g., le lapin). Alternativement, une cellule convenant à la mise en #uvre de l'invention peut provenir d'une bactérie (e.g., Escherichia coli). Selon un cinquième aspect, la présente invention vise un procédé de production d'une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, telle que décrite supra. Selon un premier mode de mise en #uvre, un procédé conforme à l'invention comprend au moins : a) le clonage de la séquence nucléotidique recombinante codant la transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, dans un vecteur d'expression ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique par ladite cellule hôte recombinante. L'ensemble des étapes mises en #uvre dans le cadre d'un tel procédé fait appel à des techniques classiques connues de l'homme du métier (voir par exemple, Sambrook et Russel, 2001). En particulier, le terme transformation est ici revêtu d'un sens générique en ce qu'il couvre également, outre la transformation au sens strict, la transduction par un vecteur viral et la transfection, autant de techniques de biologie moléculaire parfaitement usuelles pour l'homme du métier. Selon un deuxième mode de mise en #uvre, un tel procédé comprend en outre une étape préalable d'obtention de ladite séquence nucléotidique recombinante, par substitution, dans la séquence nucléotidique codant la transposase native correspondante, d'au moins un nucléotide d'un triplet ou codon codant un résidu phosphorylable, par un autre nucléotide, afin que le triplet résultant code un résidu non phosphorylable. Cette étape préalable relève des techniques de mutagénèse dirigée, connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994). Selon un troisième mode de réalisation du procédé objet de l'invention, une étape ultérieure de purification de ladite transposase est effectuée. De manière préférée, au sens de la présente invention, l'étape de purification susvisée consiste à purifier, par des méthodes conventionnelles usuelles pour l'homme du métier, la fraction protéique possédant l'activité enzymatique recherchée, et non l'enzyme elle-même. C'est précisément cette fraction protéique active ainsi purifiée que l'on appelle ici enzyme pure ou transposase pure . Selon cette définition, à l'issue de cette étape, la présence de substances contaminantes, y compris celle d'autres protéines, en quantité minoritaire n'est pas exclue, dès lors que l'activité transposase d'intérêt est préservée, et que seule cette activité est détectée. La détection de l'activité enzymatique d'intérêt peut être effectuée par des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994). Lors de la mise en #uvre d'un procédé tel que susvisé, la cellule hôte est choisie parmi des cellules de procaryotes, par exemple de bactéries, et des cellules d'eucaryotes, par exemple de levures, champignons, plantes, insectes et mammifères. Selon un sixième aspect, la présente invention concerne des utilisations d'au moins une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, telle que décrite supra, dans le domaine des biotechnologies. Selon un premier mode de réalisation, une telle transposase est utilisée pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible. Selon un deuxième mode de réalisation, une utilisation conforme à l'invention est effectuée aux fins de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte. La mise en #uvre d'une transposition in vitro ou in vivo relève des connaissances générales de l'homme du métier dans le domaine de l'invention (Ausubel et al., 1994 ; Craig et al., 2002). Un hôte est ici entendu comme pouvant être un organisme, eucaryote ou procaryote, ou un tissu d'un organisme, ou encore une cellule d'un organisme ou d'un tissu. Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention. Figure 1 : Séquence nucléotidique du transposon mos-1 (SEQ ID N 1) et séquence protéique de la transposase Mos-1 (SEQ ID N 2). Les sites putatifs de phosphorylation sont localisés de la manière suivante : - cadre simple :site putatif de phosphorylation par la protéine kinase AMPc, GMPc dépendante ; - cadre en pointillé : site putatif de phosphorylation par la protéine kinase C ; - cadre double : site putatif de phosphorylation par la caséine kinase II. Les résidus représentés en clair dans la séquence (QTQ ; positions 87 à 89 de la séquence protéique SEQ ID N 2) correspondent au site putatif de phosphorylation par la famille Les résidus cerclés sont les résidus Asp impliqués dans la triade catalytique caractéristique des transposases de MLE (D,D34-35[D/E]). Figure 2 : Schéma représentant la structure de la transposase de l'élément Mos-1. N-term : domaine N-terminal responsable de la liaison aux ITR ; C-term : domaine C-terminal responsable de la catalyse du transfert des brins d'ADN ; NLS : signal putatif de localisation nucléaire (ou internationalisation nucléaire) ; HTH : motif hélice-tour-hélice ; aa : acide aminé. Les nombres indiquent les positions des acides aminés. La triade catalytique caractéristique [D, D34 (D/E)] est signalée. Figure 3 : Représentation schématique du test de transposition. A) : bactérie co-transformée avec le vecteur d'expression codant la transposase (Tnp) et le vecteur rapporteur de la transposition. B) : Événement de transposition après induction du vecteur d'expression. C) : Détermination de la fréquence de transposition. Figure 4 : Dots d'ARNm pBadR-Tnp hybridés avec : - la sonde L27 (A) ; et - la sonde Tnp (B). Figure 5 : Graphique montrant la corrélation ARNm Tnp/Transposase en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pBadR. Figure 6 : Dots d'ARNm pKK-Tnp hybridés avec : - la sonde L27 (A) ; et - la sonde Tnp (B). Figure 7 : Graphique montrant la corrélation ARNm Tnp/Transposase en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pKK. Figure 8 : Photographie d'un gel de protéines SDS-PAGE 10% des extraits protéiques (A) et autoradiogramme d'un retard sur gel des transposases en présence d'ITR 3' (B). Piste 1 : Témoin pBadR Pistes 2 à 7 : Tnp issues du système pBadR-Tnp (2 :1 % glucose, 3 : contrôle, 4 : 0,001 % ara, 5 : 0,01 % ara, 6 : 0,1% ara, 7 : 1 % ara) Piste 8 : Témoin pKK Pistes 9 à 13 : Tnp issues du système pKK-Tnp (9 : contrôle, 10 : 0,5 mM IPTG, 11 : 1 mM IPTG, 12 : 3 mM IPTG,13 : 6 mM IPTG) M : marqueur de taille précoloré (P7708S, New England BioLabs) Figure 9 : Graphique représentant la fréquence de transposition et l'enrichissement en transposase, en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pBadR. Figure 10 : Graphique représentant la fréquence de transposition et l'enrichissement en transposase, en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pKK. Figure 11 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la MBP-Tnp produite en cellules d'insectes. Figure 12 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la Tnp eucaryote produite in vitro. Figure 13 : Autoradiogramme d'un gel SDS-Page 10% acrylamide des différentes synthèses in vitro en présence d 'ATP-y32P. 1 : sans ADN 2 : avec le vecteur pET-26b+ 3 : avec le vecteur pET-Tnp (300ng) Figure 14 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la MBP-Tnp déphosphorylée. Figure 15 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la Tnp produite in vitro et déphosphorylée. La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, illustre de manière non limitative l'invention. 1. Matériel et Méthodes 1.1Description des vecteurs utilisés : Le vecteur pBadR-Tnp (5,6 kb) permet l'expression de la transposase sous contrôle d'un promoteur faible, modulable, inductible à l'arabinose (Para) et réprimé en présence de glucose par l'intermédiaire de la protéine AraC (codée par ce vecteur). Le pBadR-Tnp porte un gène de résistance à l'ampicilline. Sa construction est détaillée au paragraphe 1. 2.1. ci-dessous. Le vecteur pKK-Tnp (5,6 kb) permet une expression forte de la transposase via un promoteur P/ac inductible à l'IPTG. Le promoteur n'est pas modulable et présente une fuite d'expression naturelle. Le pKK-Tnp porte également le gène de résistance à l'ampicilline. La construction du vecteur est présentée au paragraphe 1. 2.2. infra. Le pBC 3K3 est un plasmide donneur de pseudo mariner Mos-1 (Augé-Gouillou et al, 2001). Il contient le gène de résistance à la kanamycine OFF (c'est à dire sans promoteur) bordé par deux ITR 3'. Ainsi, seules les bactéries qui auront effectué la transposition du pseudotransposon en aval d'un promoteur (promoteur tagging ) seront sélectionnées sur boîtes LBkanamycine. Le vecteur porte un gène de résistance au chloramphénicol. Le pBS (3') porte l'ITR 3' cloné au site SmaI du pBS (Stratagene, La Jolla, Californie, Etats-Unis). Le pBS est identique au pBC, sauf qu'il porte un gène de résistance à l'ampicilline au lieu du chloramphénicol. Le vecteur pET-Tnp (6,4 kb) (Augé-Gouillou et al, 2001) code la transposase sous contrôle du promoteur T7 et possède un gène de résistance à la kanamycine. Ce vecteur a été utilisé comme source d'ADN pour la transcription/traduction in vitro en lysat de réticulocytes pour produire une transposase eucaryote. Des bactéries BL21, codant la T7 polymérase sous contrôle du P/ac inductible à l'IPTG, ont été transformées avec le pET-Tnp pour produire la transposase procaryote dans le test de phosphorylation décrit ci-dessous. Le vecteur pGEM@-T-Easy (Promega, Charbonnières, France) possède les amorces de séquençages Pu et pRev (Ausubel et al., 1994) et le gène de résistance à l'ampicilline. Il est conçu pour cloner des produits de PCR dans le gène LacZ, ce qui permet un criblage blanc / bleu des colonies bactériennes obtenues sur boite LBampicilline, en présence d'IPTG et de X-Gal. Il a été utilisé pour donner le pGEM-T (Tnp) (AugéGouillou et al, 2001) et le pGEM-T (L27) dont la construction est détaillée au paragraphe 1. 2.3. ci-dessous. 1.2 Construction des vecteurs : 1.2.1 Préparation de l'ADN des vecteurs Pour les différentes constructions, toutes les élutions d'ADN à partir d'un gel d'agarose ont été réalisées avec le kit Geneclean Il (BIO 101, UK). Toutes les minipréparations de plasmides à partir de culture bactérienne ont été effectuées avec le kit Wizard Plus Minipreps (Promega). 1.2.2 pBadR-Tnp : Le pBadR-Tnp a été obtenu à partir du pBad 18 en deux étapes : # Clonage du RBS (Ribosome Binding Site) Le clonage d'un RBS dans le pBad 18 reconstitue la séquence suivante : 5' GAAGGAGTAcccgggGATC 3' (SEQ ID N 3) Cette séquence correspond à un site consensus d'initiation de la traduction si le gène codant la transposase est cloné dans un site Smal (en minuscules). Le RBS a été acheté sous forme de deux oligonucléotides simples brins complémentaires non phosphorylés. L'appariement des deux brins reconstitue la séquence suivante : 5' AATTC GATATCGAAGGAGTAC 3' (SEQ ID N 4) 3' G CTATAGCTTCCT 5' (SEQ ID N 5) L'extrémité 5' sortante correspond à un site EcoRI, l'extrémité 3' sortante à un site Kpnl, permettant le clonage du RBS dans le pBad18. Cette séquence apporte également un site unique EcoRV (en italique) qui permet de contrôler le clonage. Les deux brins appariés ont été phosphorylés avec la T4 polynucléotide kinase (New England BioLabs, Beverly, MA, Etats-Unis). Le plasmide pBad 18 a été digéré par KpnI et EcoRI, puis déphosphorylé. Le RBS (15 ng) a ensuite été ligaturé au plasmide (25 ng) sur la nuit à 16 C en présence d'une T4 DNA ligase (Promega), afin d'obtenir le pBadR. Des bactéries compétentes E. coli MC1061 (souche dépourvue d'un transport actif de l'arabinose) ont été transformées avec le pBadR, sur boite LB (5 g NaCI, 5 g extrait de levure, 10 g de tryptone, 0,3 ml de NaOH 10N, qsp 1 L H20) /ampicilline (100 g/ml). Douze colonies résistantes à l'ampicilline ont été mises en culture pour extraire l'ADN plasmidique et analyser le plasmide par digestion EcoRV. Afin de vérifier quels étaient les plasmides qui avaient intégré un seul RBS, les ADN plasmidiques ont été séquences en utilisant le DNA sequencing kit de Perkin Elmer Biosystems (Courtaboeuf, France) et analysés sur un séquenceur automatique monolaser de type Licor (Science Tec, Parc d'innovations des Ulysses, France). Le plasmide contenant un RBS unique a ensuite été utilisé pour cloner le gène codant la transposase. # Clonage du gène codant la transposase : Le fragment codant la transposase (Tnp) a été préparé à partir du vecteur pGEM-T (Tnp) par digestion SnaBI/HindIII et élué sur gel 0,8% agarose (TAE 1X : 0,04M Tris-acétate, 1mM EDTA, pH 8). Le plasmide pBadR obtenu précédemment a été digéré par SmaI/HindIII. Après électrophorèse sur un gel d'agarose, l'ADN du plasmide a été élué, puis ligaturé avec le fragment codant la transposase de Mos-1 (dite Tnp dans cette partie expérimentale), à raison de 25 ng de fragment pour 25 ng de vecteur. Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli MC1061 qui ont ensuite été sélectionnées sur boîte LB-ampicilline (100 g/ml). 12 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour une extraction du plasmide. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion EcoRV/HindIII puis en électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer qu'ils avaient intégré le gène codant la transposase. 1.2.3 pKK-Tnp : Le fragment codant la transposase (Tnp) de mariner Mos-1 a été préparé à partir du pGEM-T (Tnp) par digestion NcoI/HindIII et élué sur gel. Il a été ligaturé avec le vecteur pKK-233-2 (Clontech, Ozyne, SaintQuentin-en-Yvelines, France), ouvert par les mêmes enzymes, à raison de 10 ng de vecteur pour 40 ng de fragment Tnp, pour donner le pKK-Tnp. Des bactéries MC1061 ont été transformées avec le vecteur d'expression pKK-Tnp, étalées sur boîte LB-ampicilline (100 g/ml), 50mM CaCl2 et placées à 42 C, pour limiter les effets cytotoxiques de la transposase. 6 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture dans les mêmes conditions pour extraire les plasmides. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion NcoI/HindIII sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer qu'ils avaient intégré le gène codant la transposase. 1.2.4 Clonage de la sonde L27 : La séquence du gène codant la protéine ribosomale L27 d'E. coli a été obtenue sur le site Infobiogen (www.infobiogen.fr). Les amorces SEQ ID N 6 et SEQ ID N 7, pour l'amplification du gène par réaction de polymérisation en chaîne ou PCR (pour Polymerase Chain Reaction ), ont été dessinées avec le logiciel OLIGOV2, puis commandées sous forme d'oligonucléotides simples brins. SEQ ID N 6 : 5'-ATGGCACATAAAAAGGCTG-3' SEQ ID N 7 : 5'-TTATTCAGCTTCGATGCT-3' Le gène L27 a été amplifié par la technique de PCR à partir d'ADN génomique d'E.coli. Les produits d'amplification ont été élués après électrophorèse sur gel d'agarose 0. 8%, puis ligaturés dans le vecteur pGEM#-T Easy avant d'être clonés. Des bactéries E.coli compétentes (DH5a) ont été transformées avec les mélanges de ligation, puis étalées sur boites LB-ampicilline (100 g/ml) contenant du X-Gal (2%) et de l'IPTG (1 mM). 2 clones blancs résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour extraire l'ADN plasmidique. Après contrôle du clonage par une digestion EcoRI et électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X), le plasmide a été séquence grâce au DNA sequencing kit (Perkin Elmer Biosystems) et analysé sur un séquenceur automatique monolaser de type Licor afin de vérifier la conservation de la séquence avant marquage. 1.2.5 Marquage des sondes L27 et Tnp : La sonde L27 a été marquée par PCR radioactive à partir de la matrice pGEM-T (L27) avec les amorces pU et pRev (qui encadrent le site de clonage [Ausubel et aL, 1994] ) en présence de d'ATP-y32P. La sonde marquée est séparée des dNTP libres par chromatographie d'exclusion par la taille sur colonne Sephadex G50 (TE 1X: 10mM tris pH 8, 1mM EDTA). La colonne a été lavée par fraction de 200 l et la sonde repérée au compteur MIP 10 (Eurisys Mesures, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). La sonde Tnp a été marquée par la technique de Random Priming , c'est à dire la synthèse d'ADN après appariement d'hexamères aléatoires. L'élongation a été effectuée avec le fragment de Klenow de la DNA polymérase en présence de d'ATP-y32P. La sonde a été éluée par chromatographie d'exclusion par la taille sur colonne Sephadex G50 (TE 1 X). 1. 3 Induction de bactéries contenant le vecteur codant la transposase Avec le pBadR-Tnp : Avec le pKK-Tnp : # 1 % de Glucose # Contrôle (sans IPTG) # Contrôle (0% glc, 0% ara) # 0,5 mM IPTG # 0,001 % arabinose # 1 mM IPTG # 0,01 % arabinose # 3 mM IPTG # 0,1% arabinose # 6 mM IPTG # 1 % arabinose Protocole d'induction : À partir d'une culture saturée de bactéries E. coli MC1061 contenant le vecteur d'intérêt (pBadR-Tnp ou pKK-Tnp), 50 ml de LB ont été ensemencés au 1/100 et mis en culture pendant 3h à 31 C sous agitation (250 rpm) en présence de 1% glucose (inhibiteur du Para) dans le cas du pBadR-Tnp. La culture a ensuite été centrifugée pendant 15 min à 3000 rpm et le culot a été repris dans 25 ml de LB, afin de le laver et d'éliminer le glucose. Les bactéries contenant le pKK-Tnp ont subi le même traitement. Les tubes d'induction (2,5ml LB contenant de l'arabinose ou de l'IPTG selon les conditions ci-dessus) ont été ensemencés volume à volume, et mis en culture pendant 3h à 31 C (volume final de 5 ml). Au bout de trois heures, on a effectué l'extraction des protéines et des ARNm. Le même protocole a été suivi pour les bactéries contenant les plasmides pBadR et pKK, afin de produire des ARN et des protéines dépourvues de Tnp (témoins négatifs). 1. 4 Dosage des ARNm 1.4. Extraction des ARN bactériens : L'extraction des ARNm a été réalisée à 4 C, en absence de RNase afin d'éviter leurs dégradations. Suite à l'induction, les cultures bactériennes ont été centrifugées 10 min, à 12 000g, à 4 C. Le surnageant a été éliminé, le culot repris dans 5ml de protoplasting buffer (15 mM Tris pH 8, 15% sucrose, 8 mM EDTA). 40 l de lysosyme (50 mg/ml) ont été ajoutés et le mélange a été incubé 15 min dans la glace. Après une centrifugation de 5 min à 6000g, à 4 C, puis élimination du surnageant, le culot a été repris dans 250 l de tampon de lyse (1,5% SDS, 1 mM citrate de sodium, 10 mM NaCI, 10 mM Tris pH 8). Après transfert du lysat dans des tubes de 1,5 ml, 7,5 l de DEPC ont été ajoutés ; les mélanges ont ensuite été incubés 5 min à 37 C. Les tubes ont été refroidis dans la glace et mélangés par inversion avec 1/2 volume d'une solution saturée en NaCI. Après une incubation dans la glace de 10 min, les tubes ont été centrifugés 10 min à 12 000g. Les surnageants ont été transférés dans des tubes de 1,5 ml, et les acides nucléiques ont été précipités avec 3 volumes d'éthanol (EtOH) 100% froid. Les tubes ont été placés pendant 30 min à -80 C ou à -20 C pendant 16h. Les tubes ont ensuite été centrifugés 15 min à 12000g, à 4 C. Les surnageants ont été éliminés, les culots lavés avec 500 l d'EtOH 70%, puis séchés. Les culots (repris dans 30 l H20 DEPC) ont été soumis à l'action de la Dnasel pendant 1 h30 à 37 C. Après une extraction phénol-chloroforme et précipitation, les culots d'ARN ont été lavés et séchés, puis repris dans 50 l d'H20 DEPC. On a contrôlé la qualité de l'extraction avec 5 l d'échantillon sur gel 0,8% agarose (TAE 1X). Les ARN extraits ont été conservés à -80 C. 1.4.2 Analyse des ARN : Les quantités d'ARN totaux ont été dosées à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence. Chaque extrait a été dilué au centième dans 500 l d'eau. On a mesuré l'absorbance à 260 nm (longueur d'onde d'absorption maximale des acides nucléiques) et à 280 nm (longueur d'onde d'absorption des acides aminés comme la tyrosine). Si le rapport des absorptions 260 nM sur 280 nM était compris entre 1,8 et 2,1 on pouvait quantifier la quantité totale d'ARNm extrait, à raison de 40 g pour une mesure d'absorbance à 260 nm dans 1 ml. Pour quantifier les ARNm de transposase, une quantité constante d'ARN totaux (qui a été calibrée à l'aide d'un témoin ARN, l'ARN codant la protéine ribosomale L27, dont la quantité ne variait pas au cours des expériences) a été déposée sur une membrane d'hybridation. Après fixation thermique (15 min à 80 C), la membrane a été pré-hybridée avec du tampon Church (7% SDS, 1 mM EDTA, 0,5 M NaP04 pH 7,2) afin de limiter des hybridations non-spécifiques par saturation de la membrane, pendant 1 h à 65 C. Hybridation avec la sonde contrôle L27 Le tampon de pré-hybridation a été remplacé par du tampon Church neuf auquel on a ajouté 6000 coups par minute (cpm) (au compteur MIP 10) de la sonde marquée L27. La membrane a été hybridée sur la nuit à 65 C. La membrane a ensuite été lavée 1 h avec un tampon 3X SSC (20X SSC : 3M NaCI, 0,3 M citrate de sodium) /0,1% SDS puis avec un tampon 1 X SSC/0,1% SDS. La présence des ARNm L27 a été détectée et quantifiée au Direct Imager (Packard, Etats-Unis) en cpm. Une quantité constante d'ARNm L27 pour chaque dépôt devait permettre de confirmer la quantité constante d'ARN totaux déposés. Dans le cas contraire, elle devait permettre de corriger les quantités d'ARNm Tnp. La membrane a ensuite été déshybridée par trois rinçages avec une solution 1% SDS portée à ébullition. La membrane a alors été de nouveau mise en pré-hybridation pendant 1 h à 65 C avant une nouvelle hybridation. Hybridation avec la sonde Tnp Le tampon de pré-hybridation a été remplacé par du tampon Church neuf auquel on a ajouté 6000 cpm de la sonde Tnp. La membrane a été hybridée sur la nuit à 65 C. La membrane a ensuite été rincée une heure avec un tampon 3X SSC/0,1% SDS puis avec un tampon 1X SSC/0,1% SDS. La présence des ARNm-Tnp a été détectée au Direct Imager : la quantité d'ARNm-Tnp présente dans les dépôts était exprimée en cpm. 1. 5. Dosage des protéines 1.5.1Extraction des protéines : Des bactéries ont subi le même protocole d'induction que celui utilisé pour les extractions d'ARNm. Les cultures ont été centrifugées 10 min à 12 000g à 4 C. Les culots bactériens ont été repris dans 500 L d'un tampon 20 mM Tris pH 9, 100m M NaCI, 1 mM DTT, et conservés à - 20 C sur la nuit. Après sonication (1 pulse de 30s à 25 W) et centrifugation à 10 000g, 4 C, pendant 15 min, les surnageants protéiques ont été prélevés puis quantifiés par un dosage de Bradford par rapport à une concentration d'albumine de sérum bovin (BSA). Après dosage, les extraits protéiques ont été conservés à -20 C. 1.5.2. Analyse des protéines en SDS-PAGE : Préparation des échantillons et électrophorèse: Une quantité constante (12 g) de protéines a été analysée. Un volume de tampon de charge a été ajouté à chaque extrait, l'ensemble a été dénaturé à 100 C pendant 5 min. Les échantillons ont été déposés dans un gel SDS-PAGE 10% acrylamide [375 mM Tris HCI pH 8,8, 0,1% SDS, 10 % acrylamide (30 : 0,8) ] 10%. Après une électrophorèse sur 16h à 50 V, le gel a été fixé dans une solution 2% H3P04-50% CHsOH sous agitation douce pendant 2 à 12h. Coloration du gel au bleu de Coomassie colloïdal Le gel a été lavé dans l'eau 3 fois 30 min. Cette étape a été répétée avec une solution 2% H3PO4. Le gel a ensuite été placé dans une solution 17% CH30H, 2% H3PO4 et 15% (NH4)2S04, pendant une heure. Le gel a alors été coloré sur la nuit dans une solution fraîche identique, à laquelle a été rajouté 0,2% de bleu de Coomassie colloïdal. Le gel coloré a été numérisé avec un scanner puis séché. 1.5.3. Analyse en retard sur gel de l'activité des transposases extraites Cette méthode permet de tester l'activité de liaison à l'ITR 3' (ITR optimisé pour la fixation de la Tnp) des protéines produites. L'ITR 3' a été isolé du plasmide pBS (3') par digestion EcoRI/XbaI, purifié sur un gel d'agarose NuSieve 2% (FMC products, Etats-Unis), élué et quantifié. 100 ng d'ITR 3' ont été marqués avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase en présence de dATP. Après une extraction phénolchloroforme et précipitation, le culot a été repris dans 40 l d'eau pour obtenir l'ITR à la concentration de 50 nM. 5 g d'extraits bruts ont été incubés, avec l'ITR 3' marqué, dans les conditions suivantes : 1 nM de sonde, 1 g d'ADN de sperme de saumon soniqué, 5 mM MgCl2, 5% glycérol, 20 mM Tris pH9, pendant 15 min dans la glace. Chaque échantillon a été déposé sur un gel 9% hydrolink (Long Ranger, TEBU, Le Perray en Yvelines, France) (TBE 0,25X: 22,25 mM Tris, 22,25 mM acide borique, 2,5 mM d'EDTA disodique dihydraté). Après électrophorèse et séchage du gel, le retard a été quantifié au Direct Imager (Packard). Une autoradiographie du gel a ensuite été effectuée. 1. 6. Test de transposition Conditions d'induction : Avec le pBadR-Tnp : Avec le pKK-Tnp : # 1 % de Glucose # Contrôle # Contrôle # 0,5 mM IPTG # 0,001 % arabinose # 1 mM IPTG # 0,01 % arabinose # 3 mM IPTG # 0,1 % arabinose # 6 mM IPTG # 1 % arabinose Le principe du test de transposition est illustré sur la figure 3. Des bactéries compétentes MC1061 ont été co-transformées avec le plasmide pBC 3K3 (porteur d'un pseudo-mariner rapporteur de la transposition et du gène de résistance au chloramphénicol) et avec le vecteur inductible codant la transposase pBadR-Tnp ou pKK-Tnp (porteur du gène de résistance à l'ampicilline) (Figure 3A). La sélection des bactéries a été effectuée sur ampicilline et chloramphénicol afin de vérifier la présence de deux plasmides. Une co-transformation a également été réalisée avec les plasmides témoins pBadR et pKK. Les bactéries E. coli MC1061, contenant le vecteur rapporteur pBC3K3 et celui codant la transposase, ont été mises en culture, à 42 C, dans 2,5 ml de LB-ampicilline (100 g/ml) chloramphénicol (20 g/ml) / 50 mM CaCl2 sur la nuit (conditions limitant l'activité de la transposase). La culture a été titrée sur boîte LB (10 l d'une dilution permettant un comptage correct), et sur boîte LB-kanamycine (100 g/ml) (50 l de la culture saturée). 2,5 ml de LB (contenant de l'arabinose ou de l'IPTG comme indiqué ci-dessus) ont été ensemencés au 1/100 et cultivés pendant 3h, à 31 C (température optimum de fonctionnement de la transposase) et sous agitation à 250 rpm (figure 3B). Après 3 heures d'induction, la culture a été étalée sur boîte LB (titration des bactéries) et sur boîte LB-kanamycine (énumération des événements de transposition) (figure 3C). Les boîtes ont été placées à 37 C sur la nuit. Le lendemain, on a compté les colonies sur les boîtes LB et LB-kanamycine, puis on a calculé la fréquence de transposition, égale au nombre total de bactéries résistantes à la kanamycine sur le nombre total de bactéries. 1. 7. Expériences de saturation de la liaison à l'équilibre : test de Scatchard Le principe de ce test est de déterminer l'affinité (Kd) de la transposase produite en système eucaryote pour l'ITR 3' (ligand), grâce à des expériences de saturation de la liaison à l'équilibre en retard sur gel. Les résultats sont représentés selon la méthode de Scatchard. Pour une quantité constante d'extraits protéiques, on a fait varier la quantité d'ITR 3' marqué dans une gamme de concentration encadrant le Kd. Après une incubation de 15 min dans la glace (réalisée dans des conditions identiques à celles des expériences de retard sur gel), les complexes ITRprotéines ont été déposés sur un gel natif 9% acrylamide (Long Ranger, TEBU) (TBE 0,25X). Après électrophorèse et séchage, le gel a été analysé au Direct Imager (Packard). La quantité d'ITR liée à la protéine et la quantité totale d'ITR ont été mesurées en coups par min (cpm). Pour déterminer le coefficient de dissociation (Kd) : La quantité totale d'ITR lié à la transposase (B) a été soustraite de la quantité totale d'ITR présente (T) pour donner la quantité d'ITR libre (F). Le rapport B/F exprimé en fonction des nM d'ITR liés (nM B) a donné une droite dont la pente est -1/Kd. Ce test a été effectué avec une protéine de fusion, la MBP-Tnp (donnée par le Dr S. Tourne) produite en cellules d'insectes grâce à un vecteur baculovirus et avec la transposase produite dans un système de transcription/traduction in vitro eucaryote (TNT@ T7 Quick Coupled Transcription/Translation System, Promega) avec le vecteur pET-Tnp. Ce test a également été effectué avec la Tnp et la MBP-Tnp (issues de cellules eucaryotes) ayant subi une déphosphorylation de 30 min à 30 C avec la phosphatase d'intestin de veau (CIP). 1. 8. Tests de phosphorylation 1.8.1. Test chez les procaryotes: À partir d'une pré-culture de bactéries BL21 contenant le vecteur pET-Tnp, 25 ml de LB ont été ensemencés au 1/100 en présence de phosphore inorganique (PiP33) pendant 3 h à 37 C. La synthèse de la transposase a ensuite été induite en présence de 1 mM IPTG pendant trois heures à 37 C. Les protéines extraites à partir de cette culture ont été analysées sur un gel SDS-PAGE 10%. Après une électrophorèse de 16 heures à 50V, le gel a été coloré au bleu de Coomassie colloïdal. Après séchage, le gel a été mis en cassette pour autoradiographie, afin de visualiser les protéines phosphorylées. 1.8.2. Test chez les eucaryotes: Le plasmide pET-Tnp a été utilisé dans un système de transcription/traduction in vitro eucaryote (lapin) (TNT@ T7 Quick Coupled Transcription/Translation System, Promega) pour permettre la synthèse de la transposase, identique à celle produite précédemment chez les procaryotes. Ce système permet la phosphorylation des protéines. L'éventuelle phosphorylation de la transposase devait être visualisée grâce à l'ajout d'ATP-[gamma]32P pendant la synthèse. 0,5 à 1 g de pET-Tnp ont été incubés pendant 90 min à 30 C avec 40 l de mix TNT en présence d'ATP-y32P. 5 l du mélange a été dénaturé avec un même volume de tampon de charge, puis déposé dans un gel SDS-PAGE 10% acrylamide. Après électrophorèse, le gel a été coloré au bleu de Coomassie colloïdal puis séché. On a autoradiographié le gel pour révéler la présence de la protéine phosphorylée. 2. Résultats Le transposon mariner Mos-1 présente une faible activité de transposition dans son hôte naturel (D. mauritiana), comparativement à l'élément P (Rubin et al, 1982). Pour pouvoir analyser toutes les étapes de la transposition de mariner Mos-1 dans un système plus simple que les cellules eucaryotes, un modèle d'étude en bactéries a été mis au point. Ce modèle a révélé que la transposition d'un élément Mos-1 porteur de deux ITR de type 3' était 10 000 fois plus efficace que celle d'un élément en configuration naturelle , c'est-à-dire porteur d'un ITR 5' et d'un ITR 3'. Cette différence est observée chez les procaryotes mais pas chez les eucaryotes, comme l'ont montré les travaux réalisés chez la drosophile par le Dr P. Atkinson (University California Riverside) et en cellules HeLa par le Dr S. Tourne (Université de Tours) (communications personnelles). Les résultats obtenus dans ce cadre sur les cellules eucaryotes ont révélé une très faible activité de transposition, avec les deux éléments mariner (3'/ 3' et 5' / 3'). Afin de comprendre pourquoi la transposase de mariner Mos-1 se comporte différemment en système procaryote, les étapes limitant l'activité de la transposase chez les eucaryotes ont été identifiées. Puis, les différences entre la transposase procaryote et eucaryote à l'origine de la réduction d'efficacité de la transposition lorsqu'elle est produite en système eucaryote ont été déterminées. Pour cela, deux étapes précoces de la transposition ont été testées: la production de protéine et la liaison à l'ITR. Enfin, un mode de régulation possible de la transposase de Mos-1, la phosphorylation a été testé. 2. 1. L'Inhibition de la transposition par surproduction de la transposase Lohe et Hartl (1996) ont montré que la fréquence de transposition diminue chez les eucaryotes lorsque la transposase de mariner Mos-1 est surexprimée. Ce phénomène a été appelé OPI pour Over Production Inhibition . Dans ce qui suit, l'on utilisera l'expression d'Inhibition par Surproduction (IPS). Dans une première série d'expériences, on a voulu savoir si la transposase produite en système bactérien était soumise à l'IPS. Pour cela, deux systèmes d'expression ont été utilisés afin d'analyser les variations de la fréquence de transposition de mariner Mos-1 en fonction de la quantité de transposase présente dans les bactéries. Le vecteur pBadR-Tnp est un système d'expression faible où la transposase est sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'arabinose (Para) et modulable, c'est-à-dire que la quantité de protéine produite est fonction de la quantité d'inducteur. Le pKK-Tnp est un système d'expression fort où la transposase est sous contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG (P/ac) et non modulable. 2.1.1. Corrélation niveau d'induction/quantité d'ARNm/quantité de transposase : Afin de valider les vecteurs d'expression, on s'est assuré que les quantités d'ARNm Tnp et de protéines Tnp étaient bien corrélées aux conditions d'induction. Le pBadR-Tnp a été cultivé en absence d'inducteur (niveau de contrôle), en présence de glucose (répresseur du Para) et avec une gamme de 0,001 % à 1 % d'arabinose (inducteur du Para). Le pKKTnp a été cultivé en absence d'inducteur (niveau de contrôle) et en présence d'une gamme de 0,5 mM à 6 mM IPTG (inducteur du P/ac). 1 ) Caractérisation des ARNm Après induction et extraction, les ARNm ont été hybridés avec une sonde contrôle de la protéine ribosomique L27 afin de calibrer les quantités d'ARN extraits dans les différentes conditions de culture, puis avec une sonde transposase afin de quantifier le taux d'ARNm-Tnp (figures 4 et 6) en cpm. Les quantités d'ARNm-Tnp détectées (converties en pourcentage par rapport à la quantité maximale détectée) sont représentées (axe des Y) en fonction des différentes conditions de culture (axe des X) sur les figures 5 et 7. Analyse du système d'expression pBadR-Tnp : Dans le système d'expression faible (pBadR), les ARNm transposase étaient absents chez les bactéries contenant le vecteur témoin pBadR. Ils étaient en revanche présents chez les bactéries contenant le vecteur d'expression pBadR-Tnp : les plus faibles quantités d'ARNm-Tnp ont été détectées en absence d'arabinose ou en présence de glucose, et de plus fortes quantités ont été observées à toutes les conditions d'induction avec une quantité maximale d'ARNm-Tnp pour 0,1% arabinose (figures 4 et 5). Ces résultats indiquaient que le promoteur Para n'était pas complètement réprimé par le glucose et qu'il présentait une fuite d'expression en absence de glucose/arabinose dans les conditions de culture ici décrites. La quantité d'ARNm codant la transposase suivait la gamme d'inducteur, sauf pour le point à 1 % arabinose. La corrélation entre la quantité d'ARNm-Tnp et les conditions d'induction dans le système pBadR a montré que ce système d'expression était en adéquation avec le fonctionnement connu du promoteur inductible à l'arabinose (Para). Seul le point d'induction à 1 % arabinose se traduisait par une diminution de la quantité d'ARNm de transposase. Cette différence pouvait être expliquée par la forte concentration d'arabinose utilisée pour l'induction, qui devait saturer voire inhiber le système d'induction. Un autre phénomène pouvait également expliquer ce résultat : une répression du système par diminution du nombre de copies du plasmide pBadR-Tnp en présence de forte concentration en arabinose. La présence d'ARNm-Tnp en condition glucose (répresseur du Para) a montré que le promoteur n'était pas totalement verrouillable, ce qui avait déjà été montré par Guzman et al. (1995). De plus, les bactéries ont été cultivées dans un milieu riche (LB) dont la composition exacte n'est pas connue (extraits de levure et tryptone), le milieu pouvait interagir avec le fonctionnement normal du promoteur, notamment vis-à-vis de l'expression du gène AraC codant pour le répresseur du Para. Analyse du système d'expression pKK-Tnp : Dans le système d'expression fort (pKK), les ARNm codant la transposase étaient absents chez les bactéries contenant le vecteur témoin pKK et présents pour les bactéries contenant le vecteur pKK-Tnp : faiblement en absence d'inducteur, fortement en présence d'IPTG. La quantité maximale était détectée dès 0,5mM IPTG (Figure 7). En système d'expression fort (pKK-Tnp), la quantité d'ARNm-Tnp synthétisée reflétait là encore le fonctionnement connu du promoteur P/ac inductible à l'IPTG. Ce promoteur, en absence d'inducteur, n'était pas totalement réprimé, ce qui se traduisait par une synthèse d'ARNm-Tnp (Figures 6 et 7). En revanche, en présence d'IPTG, le promoteur était actif, ce qui se traduisait par une forte expression : quelle que soit la concentration d'IPTG, la quantité d'ARNm-Tnp demeurait constante. 2) Analyse des protéines : Les protéines ont été obtenues dans les mêmes conditions que les ARN. Elles ont été analysées en SDS-PAGE (Figure 8A). L'image numérique du gel a permis de calculer le pourcentage de transposase dans les différents extraits grâce au logiciel Molecular Analyst (Biorad, Ivry sur Seine, France). Dans un même temps, l'activité de liaison à l'ITR 3' des transposases obtenues dans les différents extraits a été testée, par des expériences de retard sur gel (figure 8B). Les graphiques (Figures 9 et 10) représentent le pourcentage de transposase dans les extraits (quantités relatives) (axe des y) en fonction des différentes conditions d'induction (axe des x). Les taux d'ARNm Tnp y ont été replacés afin de corréler ARNm et protéine. Analyse du système d'expression pBadR-Tnp : Les protéines extraites des bactéries contenant le vecteur témoin pBadR ne contenaient pas de transposase comme le montre le gel de protéine (Figure 8A, piste 1) et l'analyse en retard sur gel (Figure 8B, piste 1). Les extraits obtenus à partir de bactéries contenant le vecteur pBadRTnp (Figure 8A, pistes 2 à 7) contenaient de très faibles quantités de transposase en absence d'inducteur (2,42 % de l'extrait brut, piste 3) ou en présence de glucose (1,04 % de l'extrait brut, piste 2). Les quantités obtenues en présence d'inducteur étaient légèrement plus élevées (2,62 % à 3,1 % de l'extrait brut, pistes 4 à 7). La figure 5 montre que la quantité de transposase était bien corrélée à la quantité d'ARNm Tnp, sauf pour le point d'induction le plus fort (1% arabinose) où la quantité de protéine augmentait alors que la quantité d'ARNm diminuait. Ceci pouvait être expliqué par l'accumulation, en début d'induction, des transposases synthétisées avant que la quantité d'ARNm ne soit régulée. L'analyse en retard sur gel (Figure 8B) montre qu'il n'y avait aucun retard détectable, même pour de fortes concentrations d'extraits bruts et pour de fortes quantités d'inducteur. Les quantités de transposases produites avec le vecteur d'expression pBadR-Tnp étaient donc très faibles, ce qui était en accord avec l'activité du promoteur inductible à l'arabinose, et pouvait donc expliquer l'absence de signal lors des expériences de retard sur gel. Seul le test de transposition (test biologique) pouvait permettre de confirmer ou non l'activité des transposases produites avec ce système. Analyse du système d'expression pKK-Tnp : Les protéines extraites des bactéries contenant le vecteur témoin pKK ne contenaient pas de transposase, comme l'indique le gel de protéine (piste 8 de la figure 8A) et l'analyse en retard sur gel (piste 8 de la figure 8B). Les extraits obtenus à partir de bactéries contenant le vecteur pKKTnp (figure 8A, piste 9 à 13) contenaient de faibles quantités de transposase en absence d'IPTG (2,37 % de l'extrait brut, piste 9) et de fortes quantités de transposase en présence d'IPTG (8,48 % à 10,25 % de l'extrait brut, piste 10 à13). La figure 7 montre le taux d'ARNm-Tnp synthétisé et de transposase produite en fonction des conditions d'induction : la quantité de Tnp produite présentait la même évolution que la quantité d'ARNm, la quantité minimum était obtenue en absence d'inducteur, le maximum quel que soit la quantité d'inducteur. L'activité de liaison à l'ITR était fortement détectée en retard sur gel lorsque la quantité de transposase était importante (pistes 10 à 13 de la figure 8B). La transposase de l'élément mariner Mos-1 produite en système pKK-Tnp semblait toujours active, quelles que soient les conditions d'induction (figure 8B). De fortes quantités de transposase ne semblaient donc pas affecter la capacité à se lier à l'ITR 3'. Ces premiers résultats permettaient de conclure à une corrélation quantités d'ARN-Tnp produits/quantité de transposases produites dans les deux systèmes d'expression. 2.1.2. Corrélation quantités de transposases /fréquences de transposition : Le test de transposition a été réalisé dans les mêmes conditions que celles qui avaient permis l'obtention des protéines et des ARNm. La seule différence était la présence supplémentaire dans les souches bactériennes d'un vecteur rapporteur de la transposition (pBC 3K3). Ce test de transposition permettait de savoir si une augmentation de la quantité de transposase se traduisait par une diminution de la fréquence de transposition, comme on l'attendait si la transposase procaryote était soumise à l'IPS. Analyse du système d'expression pBadR-Tnp : L'analyse de la production de transposase a montré que la protéine était présente dans nos cultures, y compris en absence d'inducteur (arabinose) ou en présence de répresseur (glucose). La transposition débutait même en absence d'induction (figure 9, conditions glucose et contrôle). Cela confirmait que, même en faible quantité, la transposase possédait une forte activité. En effet, pour une quantité minimale de transposase (1,04 % de l'extrait brut en condition glucose), la fréquence de transposition était de 26.10-5. Pour un enrichissement en transposase de 2,62 % de l'extrait brut (point d'induction 0,001 % arabinose), la fréquence de transposition, de 68.10-5, était maximale, soit une faible augmentation d'un facteur 2,5. Pour les points d'induction de 0,01 % à 1 % arabinose, la fréquence de transposition demeurait à un plateau en dépit d'un faible enrichissement en transposase par rapport au point d'induction 0,001 % arabinose. Les expériences de transposition dans le système pBadR-Tnp indiquaient donc que la transposase même produite en faible quantité, était toujours active. De plus, la fréquence maximale de transposition était atteinte dès le premier point d'induction (0,001 % arabinose), puis atteignait un plateau pour les points d'induction suivants. L'Inhibition Par Surproduction (IPS) n'était donc pas observée dans le système pBadRTnp, ce qui semblait normal étant donné le peu de transposase produite. Analyse du système d'expression pKK-Tnp : L'analyse de la production de protéine a montré que la transposase était produite quelles que soient les conditions de culture (figure 7, pistes 9 à 13). La figure 10 représente la fréquence de transposition en fonction des conditions d'inductions. Les enrichissements en transposase ont été ajoutés afin de les corréler avec les fréquences de transposition. Pour une quantité minimale de transposase (en absence d'induction), la fréquence de transposition était de 8.10-5. La fréquence maximale de transposition était de 59.10-5 pour un enrichissement en transposase de 8,48 % (correspondant au premier point d'induction 0,5mM IPTG), puis atteignait un plateau pour des quantités de transposase variant de façon négligeable (8 à 10 % d'extraits bruts pour les points d'induction suivants). Ces résultats indiquaient donc une saturation du système de production dès le premier point d'induction, ce qui correspondait au fonctionnement du promoteur fort inductible à l'IPTG. Dans le système pKK-Tnp, le phénomène d'IPS n'était pas observé, malgré la présence de forts taux de transposase dans les extraits bruts. 2.1.3. Conclusion sur l'IPS : La quantité de transposase produite dans le système d'expression pBadR-Tnp était faible mais suffisante pour avoir une transposition efficace, même en absence d'inducteur. En système pKKTnp, la production de transposase représentait jusqu'à 10 % de protéine bactérienne et permettait une détection de son activité par un test biochimique (gel retard). Mais cette plus forte production ne se traduisait pas par une fréquence de transposition plus élevée par rapport au système pBadR. Dès le premier point d'induction (0,5 mM IPTG), la fréquence de transposition était maximale (59.10-5) et analogue à celle obtenue avec le pBadR-Tnp (68.10-5) pour le point d'induction 0,001 % arabinose. Cette fréquence stagnait pour les autres points d'induction. Contrairement au système eucaryote, l'ensemble de ces résultats semblait indiquer qu'en système procaryote, aucune inhibition par surproduction n'était détectée, ce qui devait se traduire par une chute de la fréquence de transposition. 2. 2. Affinité de la transposase pour l'ADN Il existait donc une première différence de comportement entre la transposase de l'élément mariner Mos-1 produite en système eucaryote et procaryote : l'IPS ne semblait intervenir que dans le système eucaryote. Dans le but de trouver d'autres niveaux de régulation possible de la transposition, la qualité de liaison entre l'extrémité 3' du transposon mariner Mos-1 (ITR 3') et la transposase a été testée. En effet, cette étape est la première mise en jeu lors du processus de transposition. Pour déterminer l'affinité de la transposase pour l'ITR (mesure de Kd), des expériences de saturation de la liaison à l'équilibre ont été réalisées et analysées en retard sur gel (figures 11 et 12, encadrés). Ces expériences ont été réalisées avec une quantité constante de transposase en présence d'une gamme de concentration de ligand (donc une gamme de concentration d'ITR 3'). Les résultats obtenus ont été représentés selon Scatchard. Dans ce type de représentation, le rapport de la quantité de ligand (ITR) lié sur la quantité de ligand libre (B/F) est exprimé en fonction de la concentration de ligand lié (nM B) et se visualise par une droite d'équation y = ax + b, où a = -1/Kd. Ces tests, déjà effectués sur la transposase produite en système procaryote, ont permis de calculer un coefficient de dissociation (Kd1) de 0,6 nM pour la liaison à l'ITR 3' (publication soumise). Un deuxième Kd (Kd2 = 10 nM) mesurait la liaison de l'ITR en tant que cible d'intégration. Le même type de test a été réalisé avec deux transposases mariner Mos- 1 produites en système eucaryote : la protéine de fusion MBP-Tnp donnée par le Dr S. Tourne (Tnp couplée avec une protéine permettant sa purification mais n'ayant pas d'impact sur son activité) produite en cellules d'insectes grâce à un système baculovirus et extraite du noyau des cellules, et la transposase produite en lysat de réticulocytes (lapin) grâce au kit TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega). La première expérience a été effectuée avec la MBP-Tnp dans les mêmes conditions que celles qui ont été réalisées avec la transposase d'origine bactérienne, c'est-à-dire pour une gamme de concentration d'ITR 3' de 0,05 nM à 10 nM. Les résultats ont montré que ces conditions n'étaient pas adaptées pour déterminer un Kd (la gamme de concentration de ligand devait " encadrer le Kd "), et donc que la protéine eucaryote se comportait différemment de la transposase procaryote. En conséquence, la gamme d' ITR 3' a été augmentée en se plaçant entre 2nM et 50nM. La figure 11 représente le rapport de sonde liée sur sonde libre (B/F) en fonction de la concentration de sondes liées (nM B), qui se traduisait par une seule droite dont la pente était-0,0256. Le Kd étant l'inverse de la pente, sa valeur était de 39 nM. Un autre Scatchard a été effectué dans les mêmes conditions avec la transposase produite à partir du pET-Tnp avec le système TNT@ permettant la transcription/traduction in vitro dans des lysats de réticulocyte de lapin. Le résultat obtenu (figure 12) a montré un profil identique à celui obtenu avec la transposase produite en cellules d'insectes et présentait un Kd unique de 74 nM. Ce résultat indiquait que la transposase produite in vitro en lysat de réticulocytes avait une affinité de liaison à l'ITR 3' similaire à une transposase produite in vivo en cellules d'insectes. Ce kit de synthèse in vitro permettait donc de produire une transposase ayant le même comportement que celle produite en cellules d'insectes. Avec les deux transposases eucaryotes, une réelle différence d'affinité pour l'ITR 3', d'environ un facteur 100, était observée : la transposase produite en bactéries possédait une forte affinité pour l'ITR 3', tandis que la transposase produite en cellules d'insectes ou en système eucaryote in vitro avait une affinité plus faible. 2. 3. Impact de la phosphorylation sur l'activité de la transposase Des différences de comportement de la transposase ont été mises en évidence selon qu'elle était produite en cellules procaryotes ou en cellules eucaryotes. Afin de déterminer l'origine de ces différences, des modifications post-traductionnelles suceptibles d'avoir un impact sur le comportement de la transposase ont été recherchées. Partant d'une hypothèse selon laquelle la transposase pouvait potentiellement subir, entre autres modifications post-traductionnelles, des phosphorylations, on a d'abord recherché si la transposase était phosphorylée lors de sa synthèse chez les eucaryotes et non phosphorylée chez les bactéries. En effet, les bactéries ne phosphorylent pas les protéines d'origine exogène. 2.3.1. Phosphorylation de la transposase chez les procaryotes et/ou eucaryotes ; Des bactéries contenant le vecteur pET-Tnp ont été mises en culture en présence de phosphore inorganique (PiP33) afin qu'il soit éventuellement intégré dans les protéines synthétisées. L'analyse en gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie colloïdal a révélé la présence d'une bande correspondant à la transposase pour les bactéries contenant le vecteur pET-Tnp. Une fois le gel séché, il a été autoradiographié pour vérifier l'absence de phosphorylation de la transposase chez les procaryotes. Pour étudier la phosphorylation en système eucaryote, le kit de transcription/traduction in vitro eucaryote a notamment été utilisé afin de produire une transposase à l'activité analogue à celle produite in vivo en cellule d'insectes. La production de la transposase avec le pET-Tnp, dans le lysat de réticulocytes, en présence de ATP-[gamma]32P se traduisait par l'apparition de bandes radiomarquées sur le gel de protéine (figure 13, piste 3), présentes également lorsque l'expérience était effectuée en absence d'ADN (figure 13, piste 1) ou avec le pET- 26b+ (figure 13, piste 2). Une bande radiomarquée, présente uniquement dans le cas de la production avec le pET-Tnp (piste 3 de la figure 13), était située à un PM d'environ 40kDa, similaire à celui de la transposase. Les résultats de ces deux expériences indiquaient que : la transposase n'était pas phosphorylée lorsqu'elle était produite en bactéries tandis qu'elle était phosphorylée lorsqu'elle était produite en cellules eucaryotes. 2. 3.2. Impact de la phosphorylation sur l'affinité de la transposase pour l'ADN Afin de savoir si la phosphorylation était impliquée dans la différence d'activité entre la transposase procaryote et eucaryote, les deux protéines produites en système eucaryote ont été déphosphorylées. Un test de Scatchard a alors été effectué avec une large gamme de ligand (0,05 à 25 nM d'ITR 3'), afin d'être sûr d'encadrer le ou les Kd. Les figures 14 et 15 présentent un profil similaire à celui obtenu avec la transposase produite en système procaryote, c'est-à-dire la présence de 2 droites, donc de 2 Kd différents. Avec la MBP-Tnp produite en cellules d'insectes et déphosphorylée (figure 14), le premier Kd (Kdi) était de 0,66 nM et le deuxième (Kd2) de 24,69 nM. Ces valeurs étaient analogues à celles qui avaient été obtenues avec la transposase procaryote (Kdi de 0,6 nM et Kd2 de 10 nM). Avec la transposase eucaryote produite in vitro (figure 15), le Kdi était de 1,3 nM et le Kd2 de 15,5 nM. Là encore, ces valeurs étaient dans la même gamme que celles obtenues avec la transposase procaryote . 2. 4 Impact d'une mutation rendant la transposase non phosphorylable en au moins un site, sur l'activité transpositionnelle de celle-ci. Conformément aux Résultats décrits dans le paragraphe 2. 2 supra, une transposase d'origine bactérienne est environ 100 fois plus efficace pour reconnaître les ITR et initier la transposition qu'une transposase d'origine eucaryote. Les phosphorylations post-traductionnelles affectent donc l'affinité de la transposase pour l'ADN (spécifique et non spécifique) et limitent l'activation conformationnelle de celle-ci. La liaison spécifique de chaque monomère de transposase sur chacune des deux ITR du transposon étant réduite d'un facteur 100 environ, la réduction d'efficacité de la transposition provoquée par la phosphorylation, au moins au niveau de la position T88, est évaluée comme étant d'un facteur environ égal au carré de 100. La mutation du résidu thréonine en position 88 en un résidu alanine non phosphorylable, selon une méthode de mutagénèse ponctuelle classique (Ausubel et al., 1994), paraît augmenter l'aptitude de la transposase ainsi mutée à catalyser la transposition et le transfert d'ADN, d'un facteur compris entre 100 et 10 000 environ, par rapport à celle d'une transposase native. REFERENCES Augé-Gouillou C et al. (2001) Mol. Genet. Genomics. 265 : 51-57 Lampe DJ. et al. (1996) EMBO J. 15 : 5470-5479 Plasterk RHA. et al. (1999) Trends in genetics 15 : 326-332 Renault S. et al. (1997) Virologie 1 : 133-144 Jacobson et Hartl (1985) Genetics 111 : 57-65 Craig et al. (2002) Mobile DNA II. ASM Press. Washington. USA Sambrook et Russel (2001) Molecular Cloning : a laboratory manual (3rd Ed. ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Guzman étal. (1995) J. Bacteriol 177 : 4121-4130 Lohe et Hartl (1996) Mol. Biol. Evol. 13 : 549-555 Rubin et Spradling (1982) Science 218 : 348-353Jeong et al. (2002) PNAS 99 : 1076-1081 Martienssen et Colot (2001) Science 293 : 1070-1074 Ketting et al. (1999) Cell 99 : 133-141 Tabara et al. (1999) Cell 99 : 123-132 Zhang et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29 : 3566-3575Felsenstein (1993) PHILIPS (Phylogeny Inference Package) version 3.5.c, University of Washington, Seatlle Augé-Gouillou et al. (2000) Mol. Gen. Genet. 264 : 514-520 Ausubel et al. (1994) In Janssen, K. (Ed) Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley & Sons, INC, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. REVENDICATIONS 1. Transposase mutante hyperactive d'un élément génétique mobile (EGM) mariner, présentant au moins une mutation au niveau d'au moins un résidu phosphorylable d'au moins un site de phosphorylation, ladite mutation rendant ledit site non phosphorylable in vivo, ledit résidu phosphorylable étant choisi parmi les résidus suivants de la séquence SEQ ID N 2: T24 ;S28 ; T42 ; T88 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; Y171 ; T181 ; T216 ; T255 ; et S305 ; ou parmi les résidus correspondants de la séquence d'une transposase d'EGM mariner alignée avec ladite séquence SEQ ID N 2. 2. Transposase selon la revendication 1, présentant au moins une mutation au niveau d'au moins un résidu phosphorylable de chaque site de phosphorylation, ladite mutation rendant chaque site non phosphorylable in vivo. 3. Transposase selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est substitué par un résidu non phosphorylable. 4. Transposase selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'au moins un résidu phosphorylable de chaque site de phosphorylation est substitué par un résidu non phosphorylable. 5. Transposase selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que lesdits résidus correspondants de ladite séquence d'une transposase d'EGM mariner alignée avec ladite séquence SEQ ID N 2 sont choisis parmi : une sérine, une thréonine, une tyrosine et une histidine. 6. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est hyperactive pour au moins une fonction parmi : la liaison spécifique et non spécifique à l'ADN, la dimérisation, le transfert des brins d'ADN, et les propriétés endonucléasiques et d'internalisation nucléaire. 7. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner appartient à la sous-famille mauritiana. 8. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner est mos-1. 9. Transposase selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est choisi parmi les résidus suivants (par référence à la séquence SEQ ID N 2) : T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S104 ; T135; S147 ; T154 ; S170 ; Y171 ; T181 ; T216 ; T255 ; et S305. 10. Transposase selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est T88. 11. Séquence nucléotidique recombinante codant une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 11. 13. Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il permet l'expression de ladite séquence nucléotidique recombinante. 14. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle héberge au moins un vecteur recombinant selon la revendication 12 ou 13. 15. Procédé de production d'une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage de la séquence nucléotidique recombinante codant ladite transposase dans un vecteur d'expression ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique par ladite cellule hôte recombinante. 16. Procédé selon la revendication 15, comprenant en outre une étape préalable d'obtention de ladite séquence nucléotidique recombinante, par substitution, dans la séquence nucléotidique codant la transposase native correspondante, d'au moins un nucléotide d'un triplet codant un résidu phosphorylable, par un autre nucléotide, afin que le triplet résultant code un résidu non phosphorylable. 17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ladite cellule hôte est choisie parmi les cellules de bactéries, levures, champignons, plantes, insectes et mammifères. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, comprenant en outre une étape ultérieure de purification de ladite transposase. 19. Utilisation d'au moins une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible. 20. Utilisation d'au moins une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné à permettre la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte.