FR 2886945 A1 20061215 FR 0604960 A 20060523 DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est celui de la fabrication d'inocula bactériens destinés à l'agriculture et, plus particulièrement, la bactérisation de résidus de cultures au sol, de matières fertilisantes résiduelles (MRF) et/ou d'engrais organiques (EO) et/ou organo minéraux (EOM). Les secteurs industriels tels que la fermentation à l'état solide et/ou liquide, ainsi que la formulation et le conditionnement de matières fertilisantes sont concernés. ÉTAT DE LA TECHNIQUE La rusticité et la persistance active de bactéries favorisant la croissance des plantes (ou BFCP, ou encore PGPR en anglais; Bashan 1998), parfois appelée compétence édaphique et/ou saprophytique, voire, en anglais, fitness 1s in soli (Mirleau et a/. 2000), et le facteur clé pouvant déterminer la réussite d'un protocole d'inoculation (de bactérisation) de sols, de résidus de culture au sol, de racines, de semences et, dans le cadre de la présente invention, d'engrais organiques et organo - minéraux (EO/EOM). Or, cette rusticité est un phénomène mal compris étant donnée la complexité des processus biologiques qui la sous-tendent. Sa mise en évidence directe et positive à l'aide de techniques biomoléculaires, qui présupposent souvent le jeu et l'expression de mécanismes relativement simples, ne semble donc pas envisageable. Pourtant, l'importance agronomique et industrielle des BFCP demeure, et l'utilité des techniques pouvant en favoriser l'expression et/ou la sélection (obtention et rétention) est indéniable. Il est donc souhaitable de mettre à disposition une technique permettant de retenir au sein de cultures mères de bactéries telluriques (CMBT) les souches BFCP les plus rustiques et donc, en principe, les mieux adaptées à la vie dans les sols arables. Par ailleurs, le présent inventeur a mis au point une valorisation 3o agronomique et industrielle additionnelle de ces biomasses BFCP particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols (FR 06 00014 et FR 01 15542), ainsi qu'une méthode analytique simple capable de révéler la dominance et la survie de ce type de bactéries malgré la bactéricidité de l'environnement proximal aux EOM enrichis de sels minéraux fertilisants. La présente invention concerne donc une méthode de détermination du degré de bactéricidité de biosolides. La biofertilisation à l'aide d'EO/EOM bactérisés avec des BFCP Il serait avantageux de combiner l'épandage des engrais de démarrage P et des inocula BFCP. En effet, l'accumulation du phosphore en réaction avec i0 le calcium, le fer et/ou l'aluminium du sol est un phénomène marqué dans beaucoup de sols agricoles (Beauchemin et Simard 1999 Zhang et al. 1995; Giroux 2002; Pellerin 2003). Cette accumulation entraîne une augmentation de la charge polluante de ces sols, et représente donc un sérieux problème agroenvironnemental dans plusieurs cas (Khiari et al. 2000). De plus, les sols riches en phosphore peu ou pas solubles, tant en France qu'au Québec, répondent mal à la fertilisation - P (eg. Chabot et al. 1998; Craaq 2003). Ainsi, sur les sols ayant des indices (P/AI)M3 supérieurs à une certaine valeurs critique préétablie pour ce type de sol, la probabilité de réponse aux engrais phosphatés est généralement faible (eg. inférieure à 20% ; Craaq 2003). Dans des sols dit relativement riches en P, l'efficacité des engrais P est donc limitée bien que rien n'indique que le plein potentiel de rendement de la culture n'ait été atteint. La valorisation du P et plus particulièrement des engrais P sur ces sols est donc incomplète. En général, l'efficacité agronomique de la fertilisation P sur ces sols, forts répandus dans bon nombre de régions agricoles tempérées tant au Québec qu'en France (Beauchemin et Simard 1999), peut être partiellement améliorée à l'aide de deux techniques: - l'utilisation d'EOM (Khiari et Parent 2003; Allaire et Parent 2004) ; - la bactérisation de rhizosphères à l'aide de BFCP (Antoun et al. 1998; Chabot 30 et al. 1998; Rodriguez et Fraga 1999). Ces deux techniques souffrent, par contre, actuellement de plusieurs problèmes d'ordre technique qui limitent leur efficacité et donc leur déploiement et leur utilisation par l'agriculteur. L'efficacité agronomique des inocula BFCP est minée par: une insuffisance de carbone à proximité des racines (Lynch et Whipps 1990; Alden et al. 2001), une certaine bactériocidité de certains produits phytosanitaires et une compétence édaphique insuffisamment recherchée (Van Veen et al. 1997). L'efficacité agronomique des EOM, et surtout des EO, est limitée par une mauvaise efficacité pondérale étant donnée leur teneur en matière organique, soit de l'ordre de cinq à six fois leur teneur en P205 (Khiari et Parent 2003). L'invention propose de combiner ces deux stratégies. Il est aussi possible de surmonter ces limitations, notamment lors de i0 l'utilisation en tant qu'engrais de démarrage. Cependant, la valorisation des EOIEOM par bactérisation-BFCP a été à ce jour limitée du fait de certains freins technologiques, dont l'incompétence des souches BFCP utilisées à la vie dans les sols, notamment en présence de fortes osmolarités à proximité des engrais de démarrage, la difficulté d'obtenir à i> faibles coûts des formulations solides de celles-ci, et enfin les coûts relativement élevés associés au pelliculage de MRF ultimes. PRÉSENTATION DE L'INVENTION Problème technique Bien que les inocula BFCP et les EO/EOM existent séparément, il serait avantageux de les combiner en un seul produit afin d'en faciliter l'utilisation agronomique. Cependant, et à ce jour, cette combinaison a été impossible, d'une part, étant donnée l'absence de cellules BFCP rustiques et véritablement adaptées à la vie dans les sols et capables de résister à un certain stress osmotique, et, d'autre part, étant donnée l'indisponibilité d'inocula BFCP rustiques de ce type formulés à l'état solide et produits économiquement par fermentation à l'état solide. Des cellules BFCP véritablement telluriques et donc 3o suffisamment rustiques pour survivre au stress physico-chimique propre à une telle adjonction sont donc ici indispensables et bien adaptées à la vie dans les sols, mais aussi capables de mieux résister au stress physico-chimique en présence proximale des granules d'engrais minéraux et organo - minéraux. Solution technique La présente invention concerne une méthode de détermination du degré de bactéricidité de ces biosolides (eg. Tableau 1) utiles pour la fabrication d'EO/EOMI bactérisés par des bactéries favorisant la croissance des plantes 10 (BFCP) comprenant; - la mise en culture de pré - cultures de BFCP dans un milieu liquide en présence desdits biosolides, l'incubation à température ambiante, - la mesure de la densité optique (DO) du milieu à deux instants (DO1 et D02), - la bactéricidité desdits biosolides étant élevée lorsque la différence D02DO1 (aussi dite dt(28-3) , ou encore indice iMPS ) est faible ou inversement. - De préférence, lesdits biosolides sont choisis parmi ceux de type Envirogain, Lisox , la Poudrette, GSI et/ou Shoc . Avantages apportés L'invention consiste en une méthode analytique innovante permettant de confirmer l'expression des phénotypes rustiques de la part des BFCP candidates concernées. Cette méthode ne nécessite pas l'intervention de techniques biomoléculaires etlou bioinformatiques, techniques pour l'essentiel inappropriées pour la mise en évidence de phénotypes dont les bases génomiques et métaboliques sont vraisemblablement très complexes (eg. Rüberg et al. 2003), et donc difficilement réductibles et explicables via de simples mécanismes de transcription adnéique en protéomes. Cette méthode est ainsi avantageuse pour l'assurance et le contrôle de la qualité (AQCQ) et cela sans avoir à dépendre d'une caractérisation génétique et/ou biomoléculaire fine de la compétence édaphique. Tableau 1: Caractérisation des pré - mélanges biosolides (BS) / MAP / AZM, y compris un calcul de la contribution du MAP à l'osmolarité (stress osmotique; N-MAP/N-Total et P-MAP/P-Total). - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Origin du biosolide % Map M Map % N % P % K M PIN P/K %N/ %P / % N MAP / % P MAP org. MAP MAP N total / P total GSI - SLPt 0.0 0.00 3.70 3. 90 0. 52 64 1.05 7.50 37 20 0 0 GSI -SLPe 0.0 0.00 3.40 3.80 0.48 54 1.12 7.92 34 19 0 0 Shoc BM S.0251 0.0 0.00 1.00 2.08 1.60 81 2.08 1.31 10 10 0 0 Shoc BM s.0281 0.0 0.00 1.27 1.49 1.27 73 1.17 1.18 13 7 0 0 GSI -SLPt 4. 0 0.28 3.95 4.55 0.50 61 1.15 9.11 40 23 6 14 GSI - SLPe 4.0 0.28 3.66 4. 45 0.46 52 1.21 9.66 37 22 7 15 Shoc BM S.0251 4.0 0.28 1.36 2.80 1.53 78 2.06 1.83 14 14 27 26 Shoc BM s.0281 4.0 0.28 1.62 2.23 1.22 70 1. 38 1. 84 16 11 22 33 GSI - SLPt 7.7 0.58 4.18 5.14 0.48 59 1.23 10.70 42 26 12 24 GSI - SLPe 7.7 0.58 3.91 5.05 0.44 50 1.29 11.39 39 25 13 25 Shoc BM S. 0311 7.7 0.58 1.69 3.46 1.47 75 2.05 2.35 17 17 41 40 Shoc BM S. 0341 7.7 0.58 1.94 2.92 1.17 68 1.50 2.49 19 15 35 49 GSI - SLPt 14.3 1. 26 4.60 6. 20 0.45 55 1.35 13.91 46 31 20 37 GSI - SLPe 14.3 1.26 4.34 6. 11 0.41 46 1.41 14.86 43 31 22 38 Shoc BM S.0311 14.3 1.26 2.29 4.64 1.37 69 2.03 3. 40 23 23 56 55 Shoc BM S.0341 14.3 1.26 2.52 4.14 1.09 63 1.64 3.81 25 21 50 64 GSI - SLPt 25.0 2.88 5.28 7.93 0.39 48 1.50 20.32 53 40 30 51 GSI SLPe 25.0 2.88 5.05 7.85 0.36 41 1.55 21.81 51 39 33 52 Shoc BM S.0251 25. 0 2.88 3.25 6.56 1.20 61 2.02 5.49 33 33 69 68 Shoc BM s. 0281 25.0 2.88 3.45 6.12 0.95 55 1.77 6.44 35 31 63 76 Nous pouvons aussi remarquer que, selon l'invention, c'est surtout la proportion relative d'azote provenant du MAP, plutôt que celle du P, qui détermine le plus la bactéricidité du pré mélange (Tableau 2, Figure 1), ce qui est cohérent étant donnée la grande solubilité dans l'eau des nitrates et de l'ammonium. Tableau 2: Estimation de la dominance AZM selon l'indice dt28-3 (D02-D01) selon les divers types de biosolides (BS) évalués et la concentration en MAP des pré - mélanges BS / MAP / BFCP (cf. Figure 1). % de MAP dans le mélange Biosolide (BS... 3 6 12 25 Dt28-3 (dilution 1'9) GSI - Centri (BS 5)1 -0,429 -0,161 -0,127 0,052 -0,015 GSI - SLPt (BS6) 0,141 -0,056 -0,047 0,189 0,315 GSI - SLPe (BS7) -0,388 -0, 096 -0,151 0, 122 0,139 Shoc 25.1 (BS8) -0,326 -0,105 -0,092 0,063 0,155 Shoc 28.1 (BS9) -0,445 -0,256 -0,225 0,091 0,018 Moyenne -0,346 -0,135 -0, 128 0,103 0, 122 Note: 1 Les biosolides GSI Centri et GSI SLPe ont les même caractéristiques (Tableau 1), mais ont été formulés différemment. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS É Figure 1: Dominance des AZM selon l'indice iMPS (i.e. D02-D01) et en fonction de la concentration de d'azote (a) et de phosphore (b) provenant directement du MAP par rapport à la teneur totale en N et P (total) de la granule. Cette méthode analytique a aussi l'avantage de mettre en évidence l'effet des divers biosolides sur la sélection à l'avantage des AZM (rustiques) et aux dépens des azm (non rustiques) favorisant ainsi une dominance des AZM dans les mélanges biosolides / MAP, et donc aussi éventuellement aussi à proximité des granules EOMI in situ. Selon notre analyse, l'indice D02-D01 (ou dt28-3, ou iMPS Figure 1) croît régulièrement en fonction du stress osmotique conséquent à l'augmentation de la teneur en sels provenant directement du MAP (Tableau 3). Cette augmentation de l'iMPS est d'autant plus détectable que la teneur en matière organique (MO) des biosolides est faible; la faible teneur en MO laissant libre cours aux sels MAP d'agir sur la survie de cellules non rustiques à l'avantage des AZM qui le sont. Selon cette analyse, rapportée à la Figure 1, il est possible de distinguer clairement entre les biosolides plutôt faibles en MO, i.e. ici les biosolides GSI (cf. BS 5, 6 et 7), et ceux qui sont plutôt riches en MO, i.e. ici les biosolides dit Shoc (cf. BS 9 et 8). Cette mesure indirecte mais appropriée de la bactéricidité des mélanges biosolides / MAP sert à influencer io intelligemment le choix des biosolides à utiliser pour la constitution éventuelle des EOMI prototypes. Nous avons donc évalué une gamme de mélanges biosolides I MAP I BFCP pour leurs degrés de bactéricidité selon l'indice dt28-3 (ou D02-D01) . Tel qu'attendu, le titre cellulaire est inversement proportionnel à la concentration en MAP. Mieux, les titres cellulaires AZM résistent beaucoup mieux à ces stresses osmotiques que les titres cellulaires azm (voir les rapport AZMIazm auTableau 3). Tableau 3: Titres cellulaires AZM et azm et indices de dominance AZM, dit iMPS, ou dt28-3 , pour diverses préparations granulaires d'EOMI selon leur teneur en MAP et leur concentration en N et P par rapport à la celle du MAP; deux modes de séchage et consolidation des granules ont été essayés. iMPS (dt28-3) Préparation (21C - 56h) % MAP %P / MAP azm AZM AZM/azm dt28t3 BS 8 (Shoc 25.1) 20.8 27 0.1 20 200 0.155 BS 9 (Shoc 28.1) 21.2 27 0. 08 50 625 0.018 BS 9 (Shoc 28.1) 21.6 26 0.06 40 667 0.018 BS 7 (GSI SLP écorce) 21.6 34 0.04 44 1100 0.315 BS 6 (GSI SLP tourbe) 21.6 33 0.04 43 1075 0.139 BS 6 (GSI SLP tourbe) 24.1 35 0.05 45 900 0.139 Préparation (60C - 1 h) % MAP %P / MAF iMPS (dt28-3) AZM/azm dt28-t3 azm AZM BS 8 (Shoc 25.1) 20.8 27 0.07 19 271 0.210 BS 9 (Shoc 28.1) 21.2 27 0. 05 45 900 0.026 BS 9 (Shoc 28.1) 21.6 26 0.05 39 780 0.021 BS 7 (GSI SLP écorce) 21.6 34 0.03 38 1267 0.363 BS 6 (GSI SLP tourbe) 21.6 33 0.03 40 1333 0. 173 BS 6 (GSI SLP tourbe) 24.1 35 0.04 39 975 0.151 Références Alden, L., R. Demoling et E Baath. 2001. Rapid method of determining factors limiting bacteria growth in soif. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1830-1838. Allaire, S.E. et L-É. Parent. 2004. Physical properties of granular organic-based fertilisers, Part 1: static properties. Biosystems Engineering 87: 79-87. Antoun, H., C. J. Beauchamp; N. Goussard; R. Chabot et R. Lalande. 1998. Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: effect on radishes (Raphanus sativus L.). Plant and Soil. 204: 57-67. Bashan, Y. 1998. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture. Biotechnol. Adv. 16: 729-770. Beauchemin, S. et R.R. Simard. 1999. Degré de saturation en P du sol: revue de quelques indices et de leur utilité pour la gestion du P au Québec, Canada. Can. J. Soil. Sci. 79: 615-625. Chabot, R. C.J. Beauchamp, J.W. Kloepper et H. Antoun. 1998. 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Méthode de détermination du degré de bactéricidité de biosolides constitués de mélanges organo-minéraux comprenant des sels minéraux fertilisants et utilisés pour la fabrication d'EOIEOM bactérisés par des bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) comprenant: la mise en culture de pré - cultures de BFCP dans un milieu liquide en présence desdits biosolides, l'incubation à température ambiante, la mesure de la densité optique (DO) du milieu à deux instants (DO1 et D02), la bactéricidité desdits biosolides étant élevée lorsque la différence (D02DO1) est faible ou inversement. 2. Méthode de détermination du degré de bactéricidité selon la revendication 1 caractérisée en ce que les pré - cultures de BFCP sont réalisées dans des biosolides aux quels a été ajouté une quantité de sels minéral fertilisant. 3. Méthode de détermination du degré de bactéricidité selon la revendication 1 caractérisée en ce que la température ambiante est entre 4 et 32 degrés C, plus préférentiellement entre 10 et 27 degrés C, et plus particulièrement aux environs de 22 degrés C. 4. Méthode de détermination du degré de bactéricidité selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'établissement de DO1 et D02 sont suffisamment espacés dans le temps pour laisser apparaître une D02 détectable dans milieux de culture microbiens établis. 5. Méthode de détermination du degré de bactéricidité selon la revendication 1 caractérisée en ce que DO1 est établit dès le 3ième jours post inoculation (pi) du milieu liquide et D02 au 42'è' jpi, plus préférentiellement au 35ième jpi, et plus particulièrement au 28ième jpi