FR 2831888 A1 20030509 FR 0114462 A 20011108 PROCEDE POUR GENERER L'EMPREINTE CATALYTIQUE IDIOSYNCRASIQUE D'UN ECHANTILLON ET LES SYSTEMES POUR SA MISE EN OEUVRE. La présente invention concerne un procédé permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. L'invention concerne aussi les systèmes pour la mise en oeuvre d'un tel procédé et leur utilisation. Un échantillon peut présenter des caractéristiques catalytiques diverses. Elles s'expriment par exemple par les différentes classes enzymatiques. On connaît dans l'art antérieur l'utilisation d'un même type de substrats permettant de révéler une enzyme donnée. On peut citer ceux concernant la détermination du meilleur substrat d'une protéase spécifique (PNAS 97 (14), 7754-7759 et Nature Biotechnology 28,187-193). Cette technique consiste à tester des banques de plusieurs milliers à plusieurs centaines de milliers de substrats uniquement de type peptide avec une protéase connue. Ceci est limité aux cas des protéases car les substrats protéiques sont synthétisés par chimie combinatoire. On peut citer aussi la détection de microorganismes (brevet US 4,603, 108 ; brevet EP 451 775 ; J. Clin. Microbiol (1982), 16 (3), 417-21). Ces techniques sont basées sur la détection d'enzymes pour identifier des microorganismes dont on connaît déjà les caractéristiques. La demande de brevet PCT publiée sous le No. W001/60986 concerne des estérases possédant une activité particulière. L'identification de ces estérases se fait par comparaison à des profils d'estérase de référence préalablement réalisés sur des substrats estérase. Il s'agit de rechercher la meilleure enzyme pour un type de substrat donné. Ces substrats correspondent uniquement à des fonctions ester. La présente invention a pour but de palier les inconvénients des techniques de l'art antérieur en offrant un procédé permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, c'est à dire sa carte d'identité spécifique. L'invention a donc pour objet un procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats ordonnés, - on capture les signaux générés après ladite mise en contact. Le procédé de l'invention est remarquable en ce que cette empreinte peut être obtenue sans connaître les activités catalytiques de l'échantillon. On entend par empreinte catalytique idiosyncrasique selon l'invention l'image ou la carte d'identité, individuelle des activités catalytiques. Cette empreinte est spécifique d'un échantillon. Elle est obtenue après la mise en contact dudit échantillon avec un ensemble de substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique combine les mesures effectuées sur différents substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique atteste de l'identité d'un échantillon sous la forme d'une représentation d'un échantillon ayant réagi avec un ensemble de substrats. On entend par idiosyncrasique la capacité individuelle d'un échantillon à réagir avec un ensemble de substrats. On entend par activité catalytique toute activité de l'échantillon susceptible de modifier un substrat. Cette activité peut correspondre par exemple à celle d'une ou plusieurs protéines, molécules d'ADN, molécules d'ARN ou un mélange de celles-ci. Avantageusement cette activité correspond à celle d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes. Ces activités peuvent être aussi celles de produits recombinants obtenus par génie génétique. Ces activités peuvent correspondre par exemple à des hydrolases, des oxydoréductases, des transférases, des lyases, des isomérases, des ligases. L'activité catalytique définie au sens de l'invention peut correspondre à un mélange d'activités, elle peut être connue ou inconnue. L'échantillon peut provenir de différentes origines. Il peut être par exemple chimique, biologique, microbiologique, animal, végétal, humain. Il peut provenir de tous types d'environnements et de prélèvements. L'échantillon peut être simple ou complexe, préparé à partir de techniques classiques d'extraction puis éventuellement purifié ou utilisé tel quel. Un substrat mis en oeuvre dans le procédé de l'invention est toute molécule comportant au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité catalytique et permettant la génération d'un signal. Les groupes fonctionnels correspondent à titre d'exemples non limitatifs : - groupe ester, adapté aux lipases, estérases, peptidases ; - groupe carbonate, adapté aux lipases, estérases, peptidases ; - groupe carbamate, adapté aux peptidases ; - groupe amide, adapté aux peptidases ; - groupe lactam, adapté aux peptidases, lactamases ; - groupe époxyde, adapté aux hydrolases, en particulier époxyde hydrolases ; - groupe phosphate, adapté aux phosphatases, phytases ; - groupe glycoside, adapté aux glycosidases ; - groupes éther, alcène, alcane, adaptés aux monoxygenases, hydroxylases ; - groupe alcool adapté aux alcools déshydrogénases ; - groupe aldol adapté aux aldolases. Outre, les groupes fonctionnels ci-dessus définissant des activités catalytiques, chaque substrat peut comprendre un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel. Dans un mode de réalisation préféré, ces groupements chimiques sont constitués par des variations de substitution. La nature des variations sera préférentiellement d'ordre : - stérique, comme, par exemple, différents groupements alkyles ou aryles, ou - stéréochimique, ou encore - électronique, comme, par exemple, des groupes électrodonneurs ou électroattracteurs. Ainsi, des variations d'ordre stéréochimique permettent d'utiliser séparément chaque énantiomère d'une paire d'énantiomères, plus généralement chacun des stéréoisomères d'un groupe de stéréoisomères. Les substrats permettent en outre la génération d'un signal de manière directe ou indirecte. On entend par un signal direct tous signaux obtenus directement après mise en contact du substrat avec l'échantillon. On entend par signaux indirects tous signaux obtenus après une ou plusieurs réactions notamment chimiques après mise en contact du substrat avec l'échantillon. Les signaux émis sont fonction de la nature du substrat et/ou du système de détection choisi. Ils peuvent être de différents types notamment spectrophotométrique (absorbance ou fluorescence de lumière à une longueur d'onde donnée), électriques ou chimiques. On utilise préférentiellement des substrats de type chromogénique ou fluorogénique. Mais on peut aussi enregistrer le déroulement de la réaction sur un substrat quelconque par des senseurs externes appropriés, tel qu'une sonde thermométrique, un indicateur de pM, un senseur de produit de type protéine (anticorps anti-produit) ou chemosenseur synthétique, ou mesure couplée à des enzymes secondaires. On peut citer comme exemple l'alcool déshydrogénase pour détecter la formation d'éthanol par oxydation et formation de NADH ou par la détection directe du produit après séparation analytique (CE, HPLC, TLC). Les signaux sont mesurés par tous capteurs appropriés capables de mesurer les signaux générés comme par exemple un fluorimètre, un spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre, un thermomètre ou une sonde thermographique. L'empreinte catalytique idiosyncrasique générée est recueillie par un analyseur adapté à la reconnaissance des signaux. Avantageusement, les substrats sont tels que les signaux générés sont du même type. Ils peuvent être mesurés sur le même type de capteur. L'empreinte catalytique idiosyncrasique correspondant aux signaux générés peut être observée de manière directe ou de manière indirecte après traitement des valeurs brutes. Ce traitement sera envisagé en fonction des signaux analysés. Les substrats présentent avantageusement la caractéristique de réagir sur un temps de réaction court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement inférieur à 20 minutes. Cette caractéristique a l'avantage d'obtenir rapidement l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. Elle permet aussi une étude de son évolution au cours du temps. Cela facilite notamment les analyses en contrôle qualité. Les substrats mis en oeuvre dans le procédé de l'invention possèdent avantageusement chacun une réactivité spécifique pour un type d'activité catalytique donné. Ils sont peu ou pas sensibles à la dégradation ou aux activités non-spécifiques. De plus, lorsque des substrats stables sont utilisés, ils peuvent être conservés pendant de longues périodes. Le procédé de l'invention permet de suivre un échantillon dans le temps à travers son empreinte catalytique idiosyncrasique en utilisant des substrats à partir desquels plusieurs mesures pourront être effectuées. La visualisation de l'effet d'activités catalytiques sur un ensemble de substrats est reproductible. Les substrats décrits correspondent avantageusement à ceux décrits dans la demande de brevet internationale PCT/FR01/01686 et dans l'article de G. Klein et JL. Reymond, Helvetica Chimica Acta, vol. 82,1999. Ces substrats répondent aux formules (I) à (V) ci-dessous : dans lesquelles : - la liaison Cl-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique. - Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule-NRR, Ru est choisi parmi : un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène. - R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupement chimique comme défini précédemment. - Pi et P2, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène. - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 ou un groupe R11PO-, où Ru présente la même signification que précédemment, un groupe-SO2, un groupe -CHOR13 où Rl3 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiRR, où Ra et RIs, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe As02H-. - G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe amine de formule NRRoù R et R12 ont la même signification que précédemment. Ces substrats sont détectés après leur transformation chimique par un échantillon pour donner des produits qui vont être oxydés de manière chimique pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation telles que notamment une variation de type spectral ou une variation de solubilité. A titre d'exemple, la figure 2 représente un principe de détection de substrats fluorescents. Un second exemple de substrats utiles selon le procédé de l'invention comprend des substrats (S) dont la transformation en produit (P) peut être détectée en mesurant un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis-àvis d'un ion métallique. De tels substrats sont décrits dans la demande de brevet français No. 01/05574 et dans les articles de Jean-Louis Reymond et al. (G. Klein, D. Kaufmann, S. Schürch et JL. Reymond, Chem. Commun., 2001, 561-562 ; G. Klein et JL. Reymond, Angew. Chem., 2001,113, Nr. 9). Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant : ML (MP et/ou MS) + L où : S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. Il s'agit notamment de substrat spécifique comme des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants. P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants. L représente un détecteur chimique, aussi désigné sensor pM , correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort. Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre à un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant. ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L. MS représente le complexe métal-substrat. MP représente le complexe métal-produit. Lesdits complexes ML, MS et MP n'ont pas forcément une stochiométrie de 1/1. Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques : - entre le produit (P) et le détecteur chimique (L) lorsque le produit (P) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S), ou - entre le substrat (S) et le détecteur chimique (L), lorsque le substrat (S) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P). Une combinaison de différents substrats pourra être utilisée pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques. L'invention a aussi pour objet un ensemble de substrats permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention. Dans une mise en oeuvre de l'invention, on choisira des substrats possédant des groupes fonctionnels différents ou des groupements chimiques différents ou une combinaison de ces deux possibilités notamment des substrats possédant des groupements fonctionnels identiques et des groupement chimiques différents. Dans une autre mise en oeuvre, les substrats seront identiques. La mise en contact des substrats avec l'échantillon se fera alors dans des conditions réactionnelles différentes. Les conditions réactionnelles sont à titre d'exemple non limitatif au niveau du pH, de la température, de la durée d'incubation, de la concentration en substrat ou une quantité d'échantillon ou à un mélange de celles-ci. Ces conditions peuvent également correspondre à d'autres paramètres pouvant être pris à la fois de manière individuelle ou en combinaison. Ces conditions peuvent également correspondre à l'addition d'un ou plusieurs réactifs supplémentaires. Les substrats pourront également correspondre à une combinaison de substrats différents et identiques. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisée en utilisant des substrats capables de révéler différentes sous classes d'au moins une classe d'activité catalytique. A titre d'exemple, les substrats de type epoxyde, ester, carbonate, amide, cyano, lactame, carbamate, glycoside, halogénure d'alkyle, phosphate monoet diester, ether d'énol et ether d'alkyle peuvent permettre de révéler l'empreinte catalytique idiosyncrasique hydrolasique d'un échantillon. De même, les substrats de type éthanol, méthanol, isopropanol, butanol, glycérol, éthylène glycol, acide lactique, acide malique, acide citrique, acide formique, acide acétique, acide propionique, acide benzoique, benzaldéhyde, acétaldéhyde, propionaldéhyde peuvent permettre de révéler une empreinte catalytique idiosyncrasique deshydrogénasique d'un échantillon. Le nombre de substrats est avantageusement d'au plus 1000. Il est généralement de l'ordre de 1 à 200. Les substrats mis en oeuvre dans le procédé de l'invention peuvent être ordonnés sur un ou plusieurs supports, comme, par exemple sur une plaque de microtitration ou un microsystème. Ce support possédant des substrats peuvent constituer un système mis en oeuvre pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention. La réaction des substrats avec l'échantillon peut être suivie en temps réel ou en point final. Les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues peuvent être stockées de manière à créer des bases de données d'empreintes d'échantillons. L'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut correspondre à la combinaison de plusieurs empreintes obtenues selon différentes formes de mise en oeuvre ou au cours du temps. Le procédé de l'invention peut également comprendre après le recueil d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques des signaux générés par un échantillon, une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique. Cette analyse permet de caractériser ou d'effectuer un suivi de l'évolution de l'échantillon. Il n'est pas nécessaire de connaître exactement toutes les activités pour effectuer cette analyse. Le signal est fonction de la modification réalisée sur l'activité. Ainsi dans un échantillon, des activités catalytiques appartenant à une même classe vont pouvoir réagir sur les mêmes substrats avec une vitesse de réaction différente. Le signal généré sera différent. L'empreinte d'un échantillon est susceptible d'évoluer par exemple parce que l'échantillon a été mis en présence de contaminants ou parce que l'échantillon se dégrade ou s'altère au cours du temps. Pour le suivi d'évolution d'échantillon comme par exemple le contrôle qualité, on peut considérer le résultat obtenu en le comparant avec une empreinte faisant partie d'une base de données ou avec une empreinte effectuée avant ou après l'échantillon analysé. L'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue peut être superposée à une autre empreinte obtenue à titre d'exemple : - avec le même ensemble de substrats en présence d'un mélange d'échantillons ou d'un échantillon de référence. avec le même échantillon mais avec un ensemble de substrats différents. - avec le même ensemble de substrats révélés avec le même échantillon à un temps différent. - avec le même ensemble de substrats révélés avec le même échantillon prélevé à un temps différent. - avec le même ensemble de substrats révélés dans des conditions réactionnelles différentes. Cette comparaison d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques peut être effectuée par toutes techniques, notamment : - par comparaison visuelle des empreintes catalytique de modification ou signaux générés obtenus - par analyse graphique informatique. La modification d'une empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon est l'indicateur d'une variation ou d'une apparition ou d'une disparition d'une ou plusieurs activités catalytiques. L'utilisation du procédé de l'invention et de la superposition d'empreintes est tout à fait appropriée pour le suivi de procédés ou de produits mettant en oeuvre des activités catalytiques pour faire notamment du contrôle qualité. Le procédé de l'invention est aussi remarquable en ce qu'il peut être automatisé. En effet, une telle automatisation consiste en le traitement éventuellement informatique des résultats de transformation des substrats pour obtenir l'empreinte numérique catalytique . alosyncrasique caractéristique L'invention a aussi pour objet un système comprenant un support sur lequel sont ordonnés plusieurs substrats tels que définis précédemment, identiques ou différents permettant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention. Ce système peut comprendre, outre l'ensemble de substrats, un ou plusieurs accessoires suivants : - Un dispositif servant à commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - Des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon. Ces capteurs peuvent correspondre à titre d'exemple non limitatif à un fluorimètre, un spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre. - Un analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. L'empreinte sera par exemple stockée sous la forme d'une série de bits en échelle de gris. - Une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales. - Un analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire. Cet analyseur sera capable d'effectuer des tests statistiques connus de l'homme de métier permettant d'effectuer des analyses de différences et de similitudes entre l'empreinte nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire. Ces tests statistiques peuvent impliquer par exemple des tests de discordance ou de corrélation. Le système de l'invention peut être utilisé pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon. L'invention concerne alors également l'utilisation d'un système tel que défini précédemment pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon caractérisé en ce que : - on met en contact au moins un échantillon avec un ensemble de substrats ordonnés sur ledit système, comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'activité catalytique de l'échantillon, - on capture les signaux générés résultant de ladite mise en contact des substrats avec l'activité catalytique d'un échantillon. - On compare l'empreinte pour un échantillon à une autre empreinte établie. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. Ces exemples montrent que le procédé de l'invention permet d'obtenir les empreintes idiosyncrasiques d'un échantillon. Le mode de réalisation de ces exemples pourra être facilement appliqué à tout type d'échantillon. Dans ces exemples, il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels : - La figure 1 représente des exemples de formules de substrats fluorogéniques (figure la) et chromogéniques (figure lb) utiles selon l'invention. - La figure 2 représente un principe de détection des substrats fluorescents. - La figure 3 représente la cinétique du signal d'absorbance (OD, à A. = 405 nm) pour l'empreinte catalytique idiosyncrasique des signaux générés par un échantillon avec la grille de substrats chromogènes. - La figure 4a représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats fluorescents. La distribution des substrats a été donnée dans la figure la. Les différents échantillons testés par empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. La figure 4b représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats chromogéniques. La distribution des substrats a été donnée dans la figure Ib. Les différents échantillons testés par empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 1 A = Aspergillus niger lipase (ANL), B = Aspergillus niger lipase (ANL) lU/mg, C = Aspergillus oryzae lipase (AOL), D = Candida antartica lipase (CAL), E = Candida cylindracea lipase (CCL), F = Candida lipolytica lipase (CLL), G = hog pancreatic lipase (HPL), H = Mucor javanicus lipase (MJL) 2 A = Mucor miehei lipase (MML), B = Penicillium roquefort lipase (PRL), C = Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 40U/mg, D = Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 50U/mg, E = Pseudomonas fluorescens lipase (PFL), F = Rhizomucor miehei lipase (RML), G = Rhizopus arrhizus lipase (RAL), H = Rhizopus niveus lipase (RNL) 3 A = wheat germ lipase (WGL), B = Bacillus sp. esterase (BSE), C = Bacillus stearothermophilus esterase (BStE), D = Bacillus thermoglucosidasius esterase (BTE), E = Candida lipolytica esterase (CLE), F = hog liver esterase (HLE) 100J-lg/ml, G = hog liver esterase (HLE) 10J-lg/ml, H = horse liver esterase (HrLE) 4 A = Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) lO0J-lg/ml, B = Chromobacterium viscosum lipoprotein lipase (CVL), C = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (PSL) 1500U/mg, D = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (PSL) 50000U/mg, E = Pseudomonas sp. Type B lipoprotein lipase (PSBL), F = Mucor miehei esterase (MME), G = Saccharomyces cerevisiae esterase (SCE), H = Thermoanaerobium brockii esterase (TBE) 5 A = Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) 10J-lg/ml, B = Aspergillus melleus acylase I (AMA), C = Escherichia coli penicillin G acylase (PGA), D = Bacillus thermoproteolyticus thermolysin (The), E = porcine stomach mucosa pepsin (Pep), F = Clostridium histolyticum clostripain (Clos), G = Papaya latex papain (Pap), H = Electrophorus electricus acetylcholine esterase (AChE) 6 A = Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (REH), B = hog kidney acylase I (HKA), C = Bacillus licheniformis subtilisin (Sub), D = hog pancreas trypsin (Try), E = porcine pancreatic elastase (Ela), F = bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 37U/mg, G = bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 70U/mg, H = blank Exemple 1 : Empreintes catalytiques idiosyncrasiques d'échantillons. 1) Les différents substrats fluorescents et chromogéniques sont disposés dans les puits de plaques de microtitration respectivement selon la disposition de la figure la et lb, sous forme de 5 microlitres d'une solution stock à 2 mM dans le DMF/eau 50/50. La grille comprend des solutions des produits de référence qui serviront de contrôle positif dans la mesure. 2) On ajoute ensuite dans chaque puits une solution d'un échantillon prédiluée dans un tampon contenant l'agent révélateur (NaI04 1 mM, BSA 2mg/mL), et on suit la réaction en fonction du temps pendant 2 heures. La liste des échantillons testés est représentée sur la figure 5. Seules les données des 30 premières minutes sont nécessaires pour le calcul ultérieur des signaux générés pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques correspondantes. 3) Les empreintes sont obtenues de la manière suivante : a) Conversion des données de fluorescence ou d'absorbance à 405 nm en concentration d'umbélliférone ou nitrophénol selon courbes de calibrage. Une empreinte de réaction typique est exemplifiée à la figure 3. Conditions : 0.1 mg/mL d'échantillon enzymatique, 100 M substrat, 20 mM aq. borate pH 8.8, 2. 5% v/v DMF, 26 C, 2 mg. mL-1 BSA, 1 mM NaIO4. Les vitesses déterminées à partir de ces courbes sont les suivantes : 17 209'300 pM. s-1, 16 130'800 pM. s-1, (S)-12a 31'800 pM. s-l, (Sub 25'500 pM. s-l, (R)-12a 25'000 pM. s-l, (R)-12b 22'000 pM. s-1, 15 4'000 pM. s-1, (R)-10 2'600 pM. s-1, (S)-10 2'300 pM. s-1, 14 1'600 pM. s-1, (S)-13 1'400 pM. s-l, (R) -13 1 r 300 pM. s-1. b) Détermination des vitesses maximum apparentes à partir de la pente maximum apparente dans l'empreinte de vitesse, qui se situe toujours avant 30 minutes de réaction (figure 3). c) Soustraction des vitesses enregistrées pour la mesure de référence sans échantillon dans les même conditions. d) Division de toutes les vitesses par la vitesse maximum observée dans la grille pour un échantillon donné. e) Coloration de la case correspondante au substrat en échelle de gris en proportion de la vitesse relative. 0 = blanc. Maximum = noir. La représentation de l'empreinte analysée, qui est nécessaire pour l'analyse visuelle, peut avantageusement prendre la forme d'une grille carrée ou rectangulaire ou chaque carré de la grille est teinté en échelle de gris en proportion de la valeur attribuée à un substrat donné de la série, variant de blanc (pas d'activité) à noir (activité maximum). L'empreinte catalytique idiosyncrasique des signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s. Nous avons vérifié que ces mesures sont reproductibles, à savoir que le même échantillon donne la même empreinte catalytique idiosyncrasique lorsque la mesure est répétée dans les mêmes conditions. 0.1 mg/mL d'échantillon, 2 mg/mL BSA (albumine de sérum de boeuf), 20 mM tampon borate pH 8.8, 0.1 mM de chaque substrat, 1 mM Nabi04 incubation 26 C. Pour les figures 4a et'b, 47 échantillons (voir figure 6) ont été testés. Les empreintes idiosyncrasiques correspondantes ont été obtenues (figures 4a et 4b). Elles illustrent la capacité individuelle de chaque échantillon à réagir avec un ensemble de substrats. Exemple 2 : Combinaison de substrats pouvant être utilisée pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. Les 148 substrats et 4 substrats témoins, dont les formules sont données dans la figures 5, ont été utilisés. Tous les substrats sont testés à la concentration de 0,1 mM, à pH 7,4, dans deux types de conditions : 1) en temps direct : échantillon (0.1 mg/mL), BSA (2 mg/mL), un tampon inorganique (phosphate, borate, ammonium carbonate) aqueux (10-100 mM) avec 7 2) en point final : a) incubation de l'échantillon (0.1 mg/mL) à un pH/température donné en tampon inorganique ; b) ajout de tampon stabiliseur pour obtenir un pH final entre 7 et 9, BSA (2 mg/mL), puis enregistrement du signal soit directement, soit après 20 min. Substrats A-F et contrôles K : ajout de NaI04 (1 mM). Substrats G : ajout de NAD+ (1 mM) et NADP+ (1 mM). Les signaux générés après la mise en contact de cet ensemble de substrats avec un échantillon seront fluorescents. Ces différents substrats permettent de révéler les classes d'enzymes suivantes : Lipases, estérases, protéases et amidases : AlA22, B1-B22, C1-C22, Dl-D22, E1-E4 - Phosphatases : A23-D23 - Sulfatases : A24-D24 - Uréases : A25-D25 - Argininases : A26-D26 - Déhalogénases : A27-D27 - Aldolases : A28-D28 sans NaI04 - Bayer-villigerases : A28-D28 avec lipase et NaIO4 - Ether-hydrolases : A29-D29, A30-D30 - Epoxyde hydrolases : F1-F4 - Alcool déshydrogénases : G1-G4 sans Nais4 avec NAD+/NADP+ - et hydroxylases : H1-H8 sans Nais4 - Glycosidases : J1-J8 sans NaIO4 Dans une autre forme de mise en oeuvre, on réalisera la même grille de substrats avec le paranitrophenol remplaçant la coumarine (Coum) comme groupe partant. Les signaux mesurés après la mise en contact des substrats avec l'échantillon seront chromogéniques. Exemple 3 : Empreinte idiosyncrasique en utilisant des substrats nécessitant la présence d'un senseur. L'idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisé par une grille de substrats non-chromogéniques ou non-fluorogéniques si la réaction peut être suivie de manière indirecte, par exemple à l'aide d'un senseur, tel qu'une sonde thermographique, ou un senseur pH ou pM. A titre d'exemple, on utilisera une grille composée d'esters pour obtenir l'empreinte d'échantillons de lipases et estérases en utilisant un indicateur pH pour la mesure. Une série de dérivés d'acides aminés tel que les N-acyl acides aminés (20 N-acétyl acide aminés L naturels + 20 N-acétyl acide aminés D correspondants) servira avantageusement pour obtenir l'idiosyncrasique d'échantillon contenant des acylases en suivant la réaction à l'aide d'un senseur pM. REVENDICATIONS 1) Procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats ordonnés, - on capture les signaux générés après ladite mise en contact. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque substrat comporte au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité catalytique d'un échantillon et permet la génération d'un signal de manière directe ou indirecte. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque substrat comprend un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les groupements chimiques capables de conférer au substrat une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel sont constitués par des variations de substitution. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les signaux générés par la mise en contact des substrats avec l'échantillon peuvent être mesurés sur le même type de capteur. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les signaux générés par la mise en contact des substrats avec l'échantillon sont de même type. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les substrats sont capables de réagir sur un temps de réaction court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement inférieur à 20 minutes. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les substrats sont peu ou pas sensibles à la dégradation ou aux activités non-spécifiques. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les activités catalytiques de l'échantillon sont inconnues. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'activité catalytique de l'échantillon correspond à au moins une enzyme ou un mélange d'enzymes. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les substrats sont choisis parmi ceux répondant à l'une des formules (I) à (V) suivantes : dans lesquelles : - la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique, - Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule-NRllR, Ru est choisi parmi : un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et Rl2 n'est pas un atome d'hydrogène, - R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupement chimique comme défini précédemment, - Pi et P2, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes Pi et P2 est un atome d'hydrogène, - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe-PORn ou un groupe RPO-, où Ru présente la même signification que précédemment, un groupe un groupe -CHOR13 où R représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe As02H-, - G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe amine de formule NRllR12 où Rll et R12 ont la même signification que précédemment, et en ce que lesdits substrats de formules (I) à (V) sont transformés par l'échantillon en des produits qui vont être oxydés pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce les substrats (S) sont choisis parmi ceux dont la transformation en produit (P) peut être détectée en mesurant un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis-à-vis d'un ion métallique, et en ce que la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) est effectuée en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant : ML Ob (MP et/ou MS) + L où : S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. Il s'agit notamment de substrat spécifique, comme l'acide phytique pour les phytases ou des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants. P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants. L représente un détecteur chimique, aussi désigné sensor pM , correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort. Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre à un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant. ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L. MS représente le complexe métal-substrat. MP représente le complexe métal-produit. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de substrats est avantageusement d'au plus 1000. 14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de substrats est de l'ordre de 1 à 200. 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, caractérisé en ce que les substrats possèdent des groupes fonctionnels différents. 16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 15, caractérisé en ce que les substrats possèdent des groupements chimiques différents. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que après la capture des signaux générés par un échantillon, on effectue une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite analyse consiste à caractériser ou à effectuer un suivi de l'évolution de l'échantillon. 19) Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que ladite analyse comprend la comparaison de l'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue avec une autre empreinte catalytique idiosyncrasique. 20) Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes au contrôle qualité. 21) Un ensemble de substrat comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 19. 22) Un système pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend un support sur lequel sont ordonnés plusieurs substrats tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 19 et un ou plusieurs accessoires suivants : - un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.