FR 2822842 A1 20021004 FR 0104405 A 20010330 PROCEDE DE PREPARATION D'UN NEO-TISSU CARTILAGINEUX La présente invention concerne le domaine de la réparation des lésions cartilagineuses par mise en oeuvre d'un greffon. Elle concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un néo-tissu cartilagineux greffable. Le cartilage est un tissu d'origine mésenchymateuse constitué d'un faible pourcentage de chondrocytes réparties au sein d'une matrice extra-cellulaire dont elles assurent le renouvellement. Cette matrice est composée d'un réseau de fibres de collagène notamment de type Il et de glycosaminoglycanes associés à des protéines de structure pour former des protéoglycanes. L'ensemble par sa nature amphiphile et ses sites ioniques forme un gel physique assurant les propriétés viscoélastiques du tissu cartilagineux. Le tissu cartilagineux disparaît à l'age adulte sauf au niveau des articulations, où son rôle est d'assurer le mouvement des surfaces articulaires et de supporter des charges compressives importantes. Le cartilage articulaire n'est cependant pas capable de se régénérer spontanément. C'est pourquoi en cas de lésions cartilagineuses on a recours aux techniques de greffe, telles que la greffe en mosaïque ou la greffe de cellules autologues. La greffe en mosaïque consiste à effectuer des prélèvements d'os recouverts de cartilage dans des régions non portantes et à les greffer au niveau de la lésion. La greffe de cellules autologues consiste à effectuer un prélèvement de cartilage sain, à le soumettre à une digestion enzymatique afin de libérer les chondrocytes de la matrice extra cellulaire, à faire se multiplier les chondrocytes ex-vivo jusqu'à obtention d'un nombre suffisant de chondrocytes, lesquels sont ensuite réimplantés au niveau de la lésion cartilagineuse. Les chondrocytes se présentant sous forme d'une suspension cellulaire en milieu aqueux (dispersion dans un milieu liquide), il faut d'abord recouvrir la lésion préalablement débridée par une membrane faite de périoste suturé de façon étanche au bord du cartilage puis injecter dans la cavité ainsi créée la suspension (dispersion contenant la culture) de chondrocytes. Après un certain temps, ces cellules produisent une matrice extra-cellulaire qui n'a toutefois pas l'organisation tissulaire du cartilage articulaire normal. Il est à noter que le mode de multiplication des chondrocytes à implanter doit être déterminé en sorte d'éviter une dédifférenciation des cellules. En particulier si l'on fait proliférer des chondrocytes sur un support (polymère synthétique) comme celui du fond des boîtes de cultures cellulaires, les chondrocytes se dédifférencient en cellules fibroblastiques. Elles sont alors fusiformes au lieu d'être polygonales comme des chondrocytes et synthétisent du collagène au au lieu du collagène Il. On a déjà proposé, dans le document WO. 00/56251 de faire se multiplier des cellules, parmi lesquelles des chondrocytes humains, sur des billes de polysaccharides biodégradables et réticulées par des polyamines. Les polysaccharides sont choisis notamment parmi les composés suivants : dextrane, cellulose, arabinogalactane, pollulane et amylose. L'agent de réticulation est par exemple l'acide glutamique, la lysine, l'albumine ou la gélatine. Selon ce document, après avoir été mis en contact avec lesdites billes de polymère sous agitation mécanique, les chondrocytes se multiplient en gardant leur forme et leur phénotype, et synthétisent tout particulièrement du collagène Il. Après cette multiplication, les chondrocytes sont récupérés en digérant les billes de polysaccharides à l'aide d'enzymes spécifiques, par exemple la dextranase, qui n'altèrent pas les cellules chondrocytaires. Lesdites cellules sont ensuite détachées pour être incluses dans une matrice de chitosane. Pour ce faire des chondrocytes sont ajoutés à une solution acide de chitosane, puis le mélange est agité jusqu'à la formation d'une structure tridimensionnelle que l'on place dans une solution de soude 1N en sorte d'obtenir la précipitation du chitosane en quelques minutes. Après polymérisation la soude est rapidement éliminée puis le conglomérat polymérisé de chitosane et de cellules est mis en culture à 37 C, 5% de C02 pendant une durée déterminée. Ainsi selon ce document WO. 00/56251, les chondrocytes mélangés avec le chitosane sont incorporés dans la structure tridimensionnelle du chitosane précipité, laquelle structure aurait une consistance ferme ressemblant à la texture du cartilage. Dans le document WO. 00/56251 est prévue une autre variante possible au niveau de la première étape de multiplication des chondrocytes à savoir de faire multiplier lesdites cellules sur un film de chitosane. Les deux autres étapes restent identiques, la seconde consistant à extraire les chondrocytes ainsi multipliés par digestion enzymatique par la collagénase ou par la trypsine et la troisième étape consistant à inclure lesdites chondrocytes dans une matrice tridimensionnelle de chitosane. Le chitosane est obtenu par désacétylation de la chitine, biopolymère le plus répandu dans la nature après la cellulose. La chitine peut être extraite de l'exosquelette de certains crustacés tels que le homard, le crabe ou de l'endosquelette de calamar, par exemple. La chitine et le chitosane sont constitués des deux mêmes unités monomères, le N-acétylD glucosamin et le D-glucosamine. Lorsque le polymère est fortement acétylé, c'est-à-dire lorsqu'il comprend plus de 60% de N-acétyl-D-glucosamine, il est appelé chitine. Tous deux sont biodégradables, biorésorbables et compatibles avec les tissus vivants. Le chitosane est connu pour avoir une activité biostimulante sur la reconstitution des tissus. Il est cependant généralement utilisé en association avec d'autres éléments. Par exemple dans le document WO. 96/02259, le chitosane est combiné avec un autre polysaccharide pour former un agent de stimulation de la régénération des tissus durs au niveau d'un site d'intégration d'un implant, par exemple en titane. Par exemple dans le document WO. 99/47186, le chitosane est réticulé avec un glycosaminoglycane pour constituer un environnement biochimique proche du tissu cartilagineux, stimulant la croissance cellulaire. Le procédé de la présente invention s'apparente au document WO. 00/56251 en ce qu'il met en oeuvre du chitosane qui n'est associé à aucun autre constituant. Cependant il s'en distingue par le fait qu'il ne nécessite pas trois opérations successives. Le procédé de la présente invention concerne la préparation d'un néo-tissu cartilagineux greffable. Il consiste : a) à mettre en culture des cellules chondrogéniques, qui sont soit des chondrocytes autologues soit des cellules précurseurs de chondrocytes préparés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes, b) à mettre lesdites cellules chondrogéniques en contact avec un hydrogel de chitosane dont les propriétés d'amphiphilie et le degré d'acétylation sont tels que lesdites cellules adhèrent naturellement à la surface extérieure dudit hydrogel, c) à recouvrir l'ensemble hydrogel/cellules ainsi obtenu par un milieu de culture et, d) à laisser se développer un néo-tissu cartilagineux au contact de l'hydrogel de chitosane pendant une durée minimale de deux semaines, en renouvelant fréquemment le milieu de culture. Ainsi, au contraire de ce qui est proposé dans le document WO. 00/56251, le processus d'amplification des cellules chondrogéniques se fait soit de façon spontanée en présence de l'hydrogel de chitosane, soit après amplification préalable dans les conditions classiques de culture à haute densité et la formation de la matrice extra-cellulaire se fait de façon simultanée, en présence de l'hydrogel de chitosane. L'adhésion naturelle des cellules à la surface extérieure de l'hydrogel de chitosane permet d'obtenir une très bonne répartition desdites cellules et évite la perte de cellules lors de l'opération, par exemple lorque celle-ci est réalisée dans des puits de culture. L'hydrogel de chitosane joue un rôle d'inducteur sur le phénotype des cellules chondrogéniques, lesquelles prolifèrent sans se dédifférencier. Il est à noter que les cellules chondrogéniques ne pénètrent pas directement à l'intérieur de l'hydrogel, celui-ci ayant une porosité insuffisante au regard de la taille desdites cellules. L'hydrogel de chitosane est progressivement métabolisé et/ou remplacé et/ou envahi par les protéines matricielles de type cartilage, qui sont néosynthétisées par les chondrocytes. Après au moins deux semaines de culture, l'ensemble réalise un néo-tissu cartilagineux qui peut être greffé en l'état, l'hydrogel de chitosane qui sert transitoirement de support à ce néo-tissu cartilagineux étant en partie ou en totalité biodégradé. Le degré d'acétylation du chitosane, mis en oeuvre pour la préparation de l'hydrogel, est compris entre 30 et 70% ; de préférence celui-ci est compris entre 40 et 60%. Selon une première variante de réalisation, les cellules chondrogéniques sont mises en contact avec l'hydrogel de chitosane qui se présente sous la forme de petites particules de quelques millimètres. Selon une seconde variante de réalisation, les cellules chondrogéniques sont étalées sous forme d'au moins une nappe sur une couche ou entre au moins deux couches d'hydrogel de chitosane, chaque couche faisant de l'ordre de quelques millimètres d'épaisseur. Cette disposition particulière permet d'obtenir très facilement un néotissu cartilagineux de grande dimension, après totale disparition de l'hydrogel de chitosane. Le néo-tissu de cartilage formé notamment grâce au procédé de l'invention se caractérise en ce qu'il est constitué de rangées de cellules plus ou moins parallèles, présentant un gradient de maturation cellulaire orienté depuis une zone déterminée vers sa périphérie, la zone déterminée correspondant à la zone de jonction des cellules avec l'hydrogel de chitosane. Lorsque ce néo-tissu est analysé en histologie, son aspect morphologique est proche d'un tissu cartilagineux normal. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va être faite de plusieurs exemples de préparation d'un néo-tissu cartilagineux mettant en oeuvre comme support d'amplification un hydrogel de chitosane dont le degré d'acétylation est compris entre 40 et 60%. PIIRIFICATION DII CHITOSANE Le chitosane de référence utilisé est obtenu à partir d'endosquelettes de calamars. Il a un degré d'acétylation de 5, 2%. Il est tout d'abord purifié afin d'éliminer les particules non solubles, en mettant en oeuvre les étapes suivantes : mise en solution, filtration, précipitation, lavage et lyophilisation. Pour sa mise en solution, on prépare une solution de faible viscosité, avec une concentration de l'ordre de 0,5% en poids de chitosane dans une solution acide. Plus précisément l'acide acétique est mis en quantité stoechiométrique par rapport aux groupements amine du chitosane. La solution de polymère est filtrée par passages successifs sur des membranes de porosités décroissantes (1,2 ; 0,8 et 0,45 m) sous une pression maximale de 3 bars. Le polymère est précipité en remontant le pH de la solution par ajout d'une solution d'ammoniaque concentrée, sous agitation. Plusieurs opérations de lavage sont ensuite nécessaires pour diminuer le pH de la suspension en éliminant l'ammoniaque en excès. Après chaque lavage la suspension est centrifugée et le culot récupéré. Le lavage intervient jusqu'à stabilisation du pH de l'eau de lavage à une valeur qui est fonction du degré d'acétylation. La lyophilisation permet d'obtenir le chitosane sous forme solide. ACETYLATION DL l cHlTnsANE Le chitosane est ensuite réacétylé pour obtenir le degré d'acétylation désiré. Cette réacétylation est réalisée par réaction de la fonction amine avec l'anhydride acétique en milieu hydro-alcoolique. Le rapport entre le nombre des fonctions amines et le nombre de molécules d'anhydride présent en solution détermine le degré d'acétylation du chitosane produit. Pour un chitosane ayant un degré d'acétylation donné, on met en oeuvre une solution hydro-alcoolique qui comprend, outre le chitosane, de l'eau, du 1, 2-propanadiol et la quantité nécessaire d'acide acétique pour avoir une quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amines du chitosane. Dans un exemple précis de réalisation, la solution hydro-alcoolique comprenait 3g de chitosane, 323 g d'eau et de 272 g de 1,2propanadiol. Le mélange acétylant comprend l'anhydride acétique et du propanediol. Par exemple pour 62,38 g de propanediol, le mélange comprenait 1, 26ml d'anhydride acétique pour obtenir un degré d'acétylation du chitosane de 50% et 1, 62ml d'anhydride acétique pour obtenir un degré d'acétylation de 60%. FORMATION DE )'HYDRDGFI PHYStQIF DF CHITOSANF Cette formation nécessite le passage d'un état liquide à un état de gel. Ce passage correspond à une situation antérieure (état liquide) où les interactions hydrophiles dominent à une situation postérieure (état d'hydrogel) où les interactions hydrophobes deviennent suffisamment fortes pour qu'il n'y ait plus dissolution sans toutefois être assez fortes pour provoquer la complète précipitation du polymère. Le mode de préparation préféré, selon l'invention, part d'une solution initiale de chitosane. Si nécessaire, selon le degré d'acétylation, il s'agira d'une solution acide, le c hitosane étant mis en solution dans de l'acide chlorhydrique en quantité stoechiométrique avec les groupements amines du chitosane. Après dissolution complète du chitosane, un certain volume de 1,2 propandiol est ajouté goutte à goutte à la solution qui est ensuite dégazée sous vide pendant une durée d'environ une heure. La solution est ensuite versée dans un récipient permettant d'avoir un grand rapport surface libre sur volume et est mise en étuve à 45 C pendant le temps nécessaire à sa prise en gel. Ainsi la formation de l'hydrogel de chitosane est obtenue par un processus physico-chimique. Pour obtenir un hydrogel qui ne soit pas soluble dans l'eau à des pH de l'ordre de 6 ou 7, on réalise une neutralisation de l'hydrogel ainsi obtenu par passage pendant environ une heure en milieu basique, par exemple de la soude 0,1 molaire. La diminution du nombre de charges positives dues à l'augmentation du pH favorise les interactions hydrophobes et donc la stabilité du gel. On procède ensuite à un lavage de l'hydrogel pour éliminer l'alcool et obtenir un pH d'environ 7. C'est cet hydrogel de chitosane, lavé, qui sera mis en oeuvre pour la mise en culture des cellules chondrogéniques. Il est à noter que la prise en gel correspond à un rapport solution aqueuse/1-2 propandiol déterminé, rapport qui dépend du degré d'acétylation du chitosane. De plus, la gélification s'accompagnant d'une perte en eau, il importe que les conditions opératoires favorisent cette évaporation de l'eau. Plusieurs types de récipients peuvent être utilisés lors de la gélification, que ce soit des boîtes de pétri, des boîtes multi-puits ou encore des inserts spécialement conçus pour être logés dans les puits de boîtes multi-puits. Par exemple on met en oeuvre une plaque de 24 puits équipés d'inserts, chaque insert étant constitué d'un cône en plastique dont le fond est formé d'une membrane perméable au liquide de nutrition et qui est agencé pour être déposé dans chaque puits sans en toucher le fond. MISF FN (III TI IRE Les cellules chondrogéniques peuvent être des chondrocytes autologues ou des cellules précurseurs de chondrocytes préparées, in vitro, à partir de cellules souches pluripotentes. Quel que soit le récipient utilisé pour la formation de l'hydrogel, l'hydrogel obtenu se présente sous la forme d'un bloc visco-élastique et translucide, dont la capacité et la résistance dépendent notamment de la concentration en chitosane de la solution initiale. De préférence, cette concentration est de 0,5 à 4%. Pour la mise en culture des cellules chondrogéniques, il est tout d'abord nécessaire d'augmenter la surface de mise en contact entre l'hydrogel de chitosane et lesdites cellules. Pour cela selon une première variante, le bloc d'hydrogel de chitosane est découpé en petits fragments dont les dimensions extérieures sont de l'ordre de quelques millimètres. Ces fragments sont disposés dans les puits d'une plaque multi-puits ou éventuellement dans les inserts équipant une telle plaque. Les cellules chondrogéniques sont introduites sous forme de suspension et mélangées délicatement aux fragments d'hydrogel. L'ensemble est recouvert d'un milieu de culture approprié. On constate que les cellules chondrogéniques adhèrent spontanément à la surface extérieure des fragments d'hydrogel et ne tombent pas dans le fond des puits. La mise en culture est effectué en mettant les plaques ainsi garnies dans une atmosphère de 10% de C02 à 37 C. Le milieu de nutrition est renouvelé deux fois par semaine. La culture se poursuit pendant un temps variable qui peut aller de 2 à 6 semaines selon la taille souhaitée pour le néo-tissu cartilagineux qui se forme au contact de l'hydrogel de chitosane. il faut choisir une proportion ou ratio : nombre de cellules/fragment de l'hydrogel de chitosane de façon à éviter le plus possible que certaines cellules ne tombent au fond du puits. Dans un exemple précis de réalisation, on a placé 5. 105 cellules chondrogéniques pour une trentaine de fragments d'hydrogel de chitosane par insert ou 1 à 3. 106 cellules chondrogéniques pour une centaine de fragments d'hydrogel de chitosane par puits, non équipé d'insert. Le degré d'acétylation, compris entre 30 et 70%, mais de préférence entre 40 et 60% induit des conditions d'amphiphilie optimales favorables à l'établissement d'un environnement propice à la synthèse du néo-tissu cartilagineux. En effet, en augmentant le degré d'acétylation, on contribue à renforcer les interactions hydrophobes dues aux fonctions N-acétamides. Simultanément, on accroît aussi la cationicité des sites amine résiduels, renforçant par là- même leur caractère hydrophile et leur aptitude à créer des interactions électrostatiques. Toutes ces conditions sont favorables à l'établissement d'interactions avec les protéoglycanes de la matrice extracellulaire néo-formés par les cellules chondrogéniques. De plus les conditions de pH, de l'ordre de 7 sont favorables à l'action d'enzymes, par exemple le Iysosyme, secrété par les chondrocytes et permettant la dégradation par hydrolyse de liaisons glycosuriques constituant la chaîne du chitosane. Dans les conditions indiquées ci-dessus, les chondrocytes se multiplient et synthétisent simultanément une matrice importante qui s'accumule autour des cellules et remplace ou recouvre progressivement l'hydrogel de chitosane. Il est d'ailleurs possible de suivre la formation de ce néo-tissu cartilagineux en fonction du temps de culture. Au stade précoce de la culture, les cellules chondrogéniques adhèrent à l'hydrogel sans jamais le pénétrer, elles secrètent des protéines matricielles du type collagène et protéoglycanes qui s'accumulent autour des cellules et qui forment une couche plus dense le long de l'hydrogel, entre les cellules et l'hydrogel qui conserve son aspect initial. Lorsque la culture se poursuit, notamment pendant de quatre à six semaines, les cellules chondrogéniques se multiplient à partir des cellules bordant l'hydrogel et les protéines matricielles continuent à s'accumuler. La structure de l'hydrogel se modifie, devenant de plus lâche et prenant progressivement des colorations qui sont spécifiques des protéines collagéniques et des protéo-glycanes. On obtient en fin de culture un bloc de tissu néo-formé constitué de plusieurs colonies de cellules organisées en rangées plus ou moins parallèles et présentant un gradient de maturation cellulaire qui est orienté depuis la zone de jonction des cellules avec l'hydrogel vers sa périphérie. En analysant ce bloc de néo-tissu en histologie, on constate que son aspect morphologique est proche d'un tissu cartilagineux normal. Une analyse moléculaire par RT-PCR a été réalisée après cinq semaines de culture, pour l'expression des collagènes 1 et Il, agrécane, biglycane et décorine. Les ARN messagers de collagène Il, d'agrécane, de biglycane et de décorine sont exprimés alors que ceux du collagène J ne sont pas détectables. Au niveau protéique, la synthèse de protéoglycane a été étudiée après incorporation du soufre 35. Les protéoglycanes ont été extraits du néo-tissu par le chlorure de guanidine 4M, purifiés et analysés par chromatographie sur colonne de sépharose 2B. Les profils d'élution obtenus montrent que les cellules ont synthétisé et secrété des protéo-glycanes qui se sont regroupés dans la matrice sous formre d'agrégats de haut poids moléculaire, avec un profil similaire à ceux synthétisés et sécrétés in vivo. Selon une seconde variante de réalisation, les cellules chondrogéniques ont été étalées, sous forme de nappe, entre des couches d'hydrogel, chaque couche ayant une épaisseur de l'ordre de quelques millimètres. Par exemple quatre nappes de cellules ont été étalées en combinaison avec trois couches d'hydrogel, à savoir deux nappes respectivement sur les faces extérieures de la première et de la troisième couche d'hydrogel et deux nappes prises en sandwich entre respectivement la première et la seconde couche et la seconde et troisième couche d'hydrogel. La mise en culture des cellules a été réalisée dans les mêmes conditions que ci-dessus et on a procédé aux mêmes constatations en ce qui concerne la formation d'un néo-tissu cartilagineux. Les colonies cellulaires qui se sont formés soit à partir des cellules en contact avec la face extérieure de la première et de la troisième couche d'hydrogel soit à partir des cellules étalées entre deux couches d'hydrogel présentent tous un gradient morphologique similaire à celui qui a été décrit ci-dessus. Les couches d'hydrogel, intercalées entre les nappes de cellules, ont disparu et sont remplacées par une structure fibrillaire très alcyanophile dont l'épaisseur correspond environ à la superposition de deux à trois couches de cellules. On comprend que cette dernière variante mettant en oeuvre une superposition de couches d'hydrogel de chitosane et de cellules chondrogéniques permet d'obtenir très facilement un néo-tissu cartilagineux de plus grande dimension. Quelle que soit la variante mise en oeuvre, le néo-tissu cartilagineux qui est obtenu selon le procédé de l'invention est apte à être greffé en l'état pour la réparation des lésions cartilagineuses, méniscales ou de disques intervertébraux notamment des lésions de tailles importantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un néo-tissu cartilagineux greffable caractérisé en ce qu'il consiste : a) à mettre en culture des cellules chondrogéniques, qui sont soit des chondrocytes autologues soit des cellules précurseurs de chondrocytes préparées in vitro à partir de cellules souches pluripotentes, b) à mettre lesdites cellules chondrogéniques en contact avec un hydrogel de chitosane dont les propriétés d'amphiphilie et le degré d'acétylation sont tels que lesdites cellules adhèrent naturellement à la surface extérieure dudit hydrogel, c) à recouvrir l'ensemble hydrogel/cellules ainsi obtenu par un milieu de culture et, d) à laisser se développer un néo-tissu cartilagineux au contact de l'hydrogel de chitosane pendant une durée minimale de deux semaines, en renouvelant fréquemment le milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'hydrogel de chitosane a un degré d'acétylation compris entre 40 et 70%, de préférence entre 40 et 60%. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que l'hydrogel de chitosane est préparé en mettant en oeuvre) les étapes suivantes : - on ajoute à une solution de chitosane une quantité déterminée de 1,2 propandiol, quantité qui est fonction du degré d'acétylation du chitosane, - on dégaze sous vide, - on verse la solution dégazée dans un récipient permettant d'avoir un grand rapport surface libre sur volume que l'on place en étuve à 45 C jusqu'à la prise en gel, -on neutralise et on lave l'hydrogel de chitosane obtenu. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la mise en contact des cellules chondrogéniques avec l'hydrogel de chitosane se fait en mélangeant lesdites cellules en suspension avec des fragments d'hydrogel de chitosane dont les dimensions font de l'ordre de quelques millimètres 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la mise en contact des cellules chondrogéniques avec les fragments d'hydrogel de chitosane se faisant dans un puits, la proportion du nombre de cellules par rapport aux fragments d'hydrogel est déterminée de façon à éviter le plus possible que certaines cellules ne tombent au fond du puits. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la mise en contact des cellules chondrogéniques avec l'hydrogel de chitosane se fait en étalant les cellules sous forme de nappe sur l'hydrogel de chitosane se présentant sous la forme de couche de quelques millimètres d'épaisseur. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les cellules chondrogéniques sont étalées sous forme de plusieurs nappes en contact avec plusieurs couches d'hydrogel de chitosane. 8. Néo-tissu cartilagineux greffable, obtenu par le procédé de l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué de rangées de cellules plus ou moins parallèles, présentant un gradient de maturation cellulaire orienté depuis une zone déterminée vers sa périphérie, la zone déterminée correspondant notamment à la zone de jonction des cellules avec l'hydrogel de chitosane.