FR 2833011 A1 20030606 FR 0115623 A 20011204 La présente invention a pour objet une nouvelle protéine à activité inhibitrice de l'interleukine 6 (IL-6), les outils de génie génétique pour la produire, à savoir un 'ique pour la produire, à savoir un ADN recombinant, un vecteur d'expression portant cet ADN recombinant, les micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes contenant cet ADN recombinant, ainsi qu'un médicament, utile notamment comme agent anti-tumoral, contenant à titre de principe actif cette protéine. L'IL-6 appartient à la famille des cytokines. Cette glycoprotéine (SEQ ID NI 1) possède un peptide signal de 28 acides aminés qui est clivé à la sécrétion pour donner une protéine de 184 acides aminés (E. Sporeno et al., Blood, 1996, 11, 4510- 4519) est produite par une très large gamme de cellules normales ou transformées, par exemple, les lymphocytes T ou B, les monocytes, les macrophages, les fibroblastes... L'IL-6 est codée par un gène de 5 Kb constitué de 5 exons (SEQ ID NI 2) et localisé sur le chromosome 7 humain. L'épissage de l'ARNm de l'IL-6 a été étudié notamment par Kestler et al. Dans leur article, Blood 1995,86 (12), 4559-4567, l'épissage du deuxième exon de l'ARNm de l'IL-6 entraîne la déletion de l'adénine située au début du troisième exon de l'ARNm de l'IL-6. De plus, aucune activité inhibitrice de l'IL-6 n'est rapportée pour la protéine issue de la traduction de cet ARNm épissée. Or, il est intéressant de trouver des moyens pour moduler et en particulier, inhiber l'activité de l'IL-6, impliquée dans la prolifération des cellules tumorales notamment. La présente invention a pour objet une nouvelle protéine, nommée PAC3 qui présente la SEQ ID ? 3 et qui se comporte comme un inhibiteur de l'IL-6. En effet, il a été démontré que cette protéine correspondant en partie à la traduction de l'ARNm de l'IL-6 initiée à partir du deuxième ATG de l'exon 3 possède une activité inhibitrice de l'IL-6. L'invention a aussi pour objet les fragments peptidiques de la protéine selon l'invention résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité inihibitrice de l'IL-6. L'invention concerne en particulier les fragments peptidiques qui comprennent au moins la séquence en acides aminés SEQ ID NI 4 de la protéine selon l'invention, et en particulier le fragment peptidique correspondant à SEQ ID NI 4. La présente invention a également pour objet tout acide nucléique qui comprend ou est constitué par un enchaînement de nucléotides codant pour la protéine PAC3 selon l'invention ou pour l'un quelconque de ses fragments peptidiques tels que définis précédemment. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, de séquence hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Cet acide nucléique peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale... Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Avantageusement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent notamment être préparés par synthèse chimique et génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites, par exemple, dans SAMBROOK et al."Molecular Cloning : a Laboratory Manual"publié en 1989 par Cold Spring Harbor Press, NY, 2ème édition. Par exemple, la synthèse des séquences d'ADNc selon l'invention peut être effectuée par amplification des ARNm de cellules humaines à l'aide de la méthode PCR (de l'anglais"Polymerase Chain Reaction"), comme décrit, par exemple, par GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989) en utilisant des oligonucléotides synthétiques comme amorces, définis à partir de la séquence d'ADN SEQ ID ? 2 de l'IL-6. Des amorces appropriées pour la synthèse de la protéine PAC3 sont, par exemple les oligonucléotides suivants : - amorce 5' SEQ ID N07 : CCT TGG ATC CAT GGC TGA AAA AGA TGG crée un site de restriction BamHI en 5'du deuxième ATG du troisième exon du gène de l'IL-6 - amorce 3' SEQ ID N08 : GGG GAA TTC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGG TAC ATT TGC CGA AGC CCC rend silencieux le codon stop du gène de 1'IL-6 puis crée une queue de six histidines avec un codon stop et un site de restriction EcoRI sur le codon stop du gène de l'IL-6 Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut ensuite être clone selon les techniques décrites dans AUSUBEL et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New-York, 1989, Mises à jour jusqu'en 1997, chapter 3). Les protéines et fragments peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de : - culture d'un micro-organisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'un vecteur d'expression portant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention ; et - récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par le dit micro-organisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier. L'invention a également pour objet des micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être, par exemple, sous la forme d'un plasmide, cosmide ou phage, doit comporter, outre la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des micro-organismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du micro-organisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Comme micro-organisme procaryote, on peut citer E. coli et comme eucaryote la levure Saccharomyces cerevisiae. A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules de singe COS, les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, les cellules d'insectes Sf9, la lignée de lymphome T humain Jurkat, etc., toutes étant répertoriées à l'ATCC. De manière avantageuse, on pourra utiliser un système mettant en oeuvre un vecteur de type baculovirus. Ce système permet de produire des protéines étrangères aux cellules (cellules Sf9) d'un insecte (Spodoptera Frngiperda) en utilisant une recombinaison in vivo entre un vecteur de transfert (plasmide) qui contient la séquence d'ADN étrangère, d'une part et d'autre part, le génome d'un virus. (O'Reilly, D., L. K. Miller, and V. A. Luckow. 1992. Baculovirus expression vectors : A Laboratory manual. W. H. Freeman and Compan, New York, Y.) L'invention a également pour objet les micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes cotransformées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence d'ADN codant pour la protéine selon l'invention, lesdits vecteurs d'expression contenant de plus des moyens utiles à leur expression, y compris dans le système double-hybride en levure. L'invention a également pour objet des animaux transgéniques exprimant un transgène de la protéine PAC3 ou d'un fragment peptidique selon l'invention. Ces animaux transgéniques pourront servir de modèles d'étude in vivo de la perturbation du cycle cellulaire et de la prolifération par l'absence ou la surexpression du gène de la protéine selon l'invention ou de formes tronquées ou mutées de cette protéine. Ces animaux transgéniques sont obtenus par des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que celles décrites dans Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, HOGAN B., BEDDINGTON R., COSTANTINI F. & LACY E. Cold Spring Harbor laboratory press, second edition, 1994. A titre d'animaux, on préfère les mammifères tels que la souris ou le rat. La présente invention a également pour objet les nouveaux anticorps dirigés contre la protéine selon l'invention et ses fragments peptidiques. Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus par le procédé bien connu de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256,495-497, 1975) ou des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux (Antibodies, a laboratory manual, E. Harlow & D. Lane, Cold Spring Harbor laboratory press, 1988). Les oligonucléotides antisens bloquant la transcription ou la traduction de la protéine de l'invention qui s'hybrident avec une séquence d'acides nucléiques telle que définie précédemment, constituent également un autre objet de la présente invention. Ces oligonucléotides antisens sont préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que celles décrites pas AUSUBEL et al. (Current Protocols in Molecular Biology, supra.) La protéine PAC3 et les fragments peptidiques selon l'invention sont particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique. Leur activité thérapeutique est liée plus particulièrement à leur aptitude à inhiber l'activité de l'IL-6. Ils seront en particulier utiles pour le traitement des maladies où il est nécessaire d'inhiber la prolifération des cellules tumorales bénignes ou malignes dont la croissance est stimulée par l'IL-6, ou d'induire la mort des cellules dont la survie est dépendante de la présence d'IL-6, ou encore d'inhiber la dissémination métastatique des cellules tumorales dont la dissémination est induite par l'IL-6, de manière autocrine, paracrine ou endocrine, notamment les lymphomes, leucémies, myélomes, carcinomes, sarcomes, chez les patients atteints de tumeurs malignes ; où il est nécessaire d'inhiber l'effet protecteur de l'IL-6 sur la mort des cellules tumorales induite par les agents cytotoxiques (chimiques, biologiques ou physiques) ou cytostatiques ; où il est nécessaire d'inhiber les propriétés proinflammatoires, cachectisantes et régulatrices de l'hématopoïèse de l'IL-6 résultant d'une production anormale de cette protéine, notamment les syndromes inflammatoires chroniques dysimmunitaire (polyarthrite, lupus érythémateux disséminé), dans les connectivites, dans les infections graves, par exemple de type viral ou bactérien, associées à une hyperproduction d'IL-6 dans des tumeurs bénignes ou malignes d'origine hématologique, épithéliale, conjonctive, par exemple ; où il est nécessaire d'inhiber les remaniements osseux, notamment l'ostéolyse, induits par l'IL-6, dans les maladies dégénératives, inflammatoires ou tumorales, par exemple ; où il est nécessaire d'inhiber les propriétés immunologiques de l'IL-6 (immunostimulantes ou 1 immunosuppressives) dans les situations cliniques où la dérégulation de la production d'IL-6 joue un rôle physiopathologique, notamment les syndromes dysimmunitaires, les maladies infectieuses et les affections néoplasiques de type leucémies, myélomes, carcinomes ou sarcomes. L'invention concerne également la protéine PAC3 et les fragments peptidiques selon l'invention pour leur utilisation en tant que médicament ainsi que les compositions pharmaceutiques contenant la protéine PAC3 ou un fragment peptidique selon l'invention, en association avec au moins un excipient pharmaceutique convenable. Ces compositions pharmaceutiques sont préparées selon les techniques classiques bien connues de l'homme de l'art. Les excipients pharmaceutiques sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, par exemple, administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, topique... A titre d'exemple, la protéine ou les fragments peptidiques selon l'invention peuvent être formulés sous forme injectable, en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables appropriés et dans un solvant physiologiquement acceptable tel que l'eau ou le sérum physiologique. Chaque dose unitaire peut contenir, par exemple, entre 10 et 500 mg de principe actif, afin d'obtenir l'effet thérapeutique ou prophylactique désiré. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de la protéine PAC3 et les fragments peptidiques selon l'invention pour la préparation de médicaments antitumoraux et en particulier destinés à prévenir ou traiter les maladies IL-6 dépendantes et en particulier les maladies ci-dessus mentionnées et plus particulièrement les lymphomes, leucémies, myélomes, carcinomes, sarcomes. L'invention va maintenant être décrite en détail à l'aide de l'exposé expérimental ci-après. Une grande partie des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme du métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (supra) ou dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (supra). La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des fig. 1 à 6 sur lesquelles : * la fig. 1 représente l'alignement des séquences obtenu à l'aide des amorces SEQ ID n 5 à n 16 sur le vecteur KAE15. 8. . la fig. 2 représente la carte du plasmide de transfert de la protéine PAC3, 'la fig. 3 représente le profil de chromatographie utilisé lors de la purification de la protéine PAC3, * la fig. 4A représente la protéine PAC3 révélée par colorimétrie argentique, 'la fig. 4B représente la caractérisation par Western blot de la protéine PAC3 détectée par un anticorps anti-histine et révélée par chimiluminescence, * la fig. 5 représente les résultats obtenus avec la protéine PAC3 sur l'inhibition de la prolifération des cellules U266, * la fig. 6 représente les résultats obtenus avec la protéine PAC3 sur la différenciation des progéniteurs CD34+. On décrira ci-après plus en détails, une méthode de production et de purification de la protéine PAC3 de SEQ ID n 3 ainsi que différents tests mettant en évidence son activité biologique. A-PRODUCTION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE PAC3 A. 1-Extraction de l'ARN A. 1. 1-Extraction de l'ARN Après culture jusqu'à 80 % de confluence de la lignée tumorale CLB-TUG (déposée à la CNCM Paris, France le 13 novembre 2001 sous le numéro 1-2749, cellule d'adenocarcinome de type fibroblastique établie à partir d'un ganglion cymphatique drainant une tumeur primaire d'adenocarcinome du rein d'un homme de 40 ans), le milieu de culture est éliminé, puis les cellules sont décollées par trypsination, pour former un culot sec de 106 cellules. Les cellules sont alors lavées trois fois en tampon de sel de phosphate (PBS). Le culot cellulaire est ensuite resuspendu dans 1 ml de solution de TRIzol (solution commerciale de Gibco) et incubé pendant 5 minutes à température ambiante. A la fin de cette incubation, 0,2 ml de chloroforme saturé en eau sont additionnés à cette suspension. Le tout est mélangé par agitation vigoureusement pendant 15 secondes, puis l'émulsion est incubée pendant 5 minutes à température ambiante. Les différentes phases sont séparées par une centrifugation de 15 minutes à 12 000 g et à 4 C. La phase aqueuse comprenant l'ARN est transférée dans un nouveau tube afin de précipiter l'ARN à l'aide de 0,5 ml d'isopropanol. Le mélange est incubé pendant 1 heure à-20 C, puis centrifugé pendant 15 minutes à 12 000 g à 4 C. Le culot d'ARN est lavé par 1 ml d'éthanol à 75 % puis centrifugé pendant 10 minutes à 12000 g et à 4 C. Après élimination de l'éthanol, le culot est solubilisé à une concentration de 1 mg. ml' dans une solution d'eau à 0, 1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC). A. 1. 2-P ! paration de l'acide désox A. 1. 2 - Préparation de l'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) Pour la synthèse de l'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc), le système "Expand Reverse Transcriptase"de Boerhinger Manheim (Boerhinger Manheim, Meylan, France) est utilisé selon les recommandations du fournisseur. 20 JlI d'une solution d'eau à 0, 1 % de DEPC contenant 1 Jlg d'ARN, 50 pM d'oligonucléotide (dT) 18 (Genset, Paris, France) sont dénaturés à 65 C pendant 10 minutes. Parallèlement, est préparée, dans un volume final de 20 p. l, une solution comprenant du tampon de l'Expand reverse IX, 10 mM de DTT, 1 mM de chacun des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 20 UI d'inhibiteur de Rnase et 50 UI d'Expand Reverse. Les deux solutions sont mélangées puis incubées pendant 60 minutes à 42 C. A. 2 - PCR (Polvrnerase Chain Reaction) A. 2. 1-Amorces de PCR Les couples d'amorces utilisées au cours des PCR sont les suivantes : Premier couple d'amorces : - amorce 5' SEQ ID NI 5 : GAG AAG CTT TAG CGG CCG CCC AGG AGC CCA GCT crée un site de restriction HinD III en 5'du premier ATG du gène de l'IL-6. - amorce 3' SEQ ID NI 6 : GAA TGC CCG GGA AAC TCG AGA ATC TGA GGT GCC C crée un site de restriction Sma 1 en 3'du codon stop du gène de l'IL-6. Deuxième couple d'amorces : - amorce 5' SEQ ID NI 7 : CCT TGG ATC CAT GGC TGA AAA AGA TGG crée un site de restriction BamHI en 5'du deuxième ATG du troisième exon du gène de l'IL-6. - amorce 3' SEQ ID NO 8 : GGG GAA TTC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGG TAC ATT TGC CGA AGC CCC rend silencieux le codon stop du gène de l'IL-6 puis crée une queue de six Histidines avec un codon stop et un site de restriction EcoR 1 sur le codon stop du gène de l'IL-6. Amorces de séquençage : SEQ ID NI 9 : AGC TAT GAA CTC CTT CTC C amorce de séquence à partir de la base 30 dans le sens de lecture du gène de l'IL-6. SEQ ID NI 10 : GTT CTG AAG AGG TGA GTG GC amorce de séquence à partir de la base 187 sur le brin complémentaire du gène de l'IL-6 épissé. SEQ ID ? 11 : AGG TAT ACC TAG AGT ACC TCC amorce de séquence à partir de la base 401 dans le sens de lecture du gène de l'IL-6. SEQ ID NI 12 : AAC TCG AGA ATC TGA GGT GC amorce de séquence à partir de la base 697 sur le brin complémentaire du gène de l'IL-6. SEQ ID NO 13 : TCG AGG TCG ACG GTA TC amorce de séquence s'hybride en 5'du site de clonages multiples du plasmide KS+. SEQ ID NI 14 : GCG AGA TCT TGA TCA CCT AG amorce de séquence s'hybride en 3'du site de clonages multiples du plasmide KS+. SEQ ID N 15 : GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C amorce de séquence s'hybride en 5'du site de clonages multiples du plasmide KS+. SEQ ID NI 16 : GCT TGT TCC TCA CTA CTC TC amorce de séquence à partir de la base 258 sur le brin complémentaire du gène de l'IL-6. A. 2. 2 - Amplification des ADNc par PCR 1 ag de solution d'ADNc à tester est ajouté à 25 1 d'une solution contenant 0,2 mM de dNTP (Promega, Lyon, France) et 300nM de chacune des deux amorces (SEQ ID NO 5 et NO 6) choisies. Extemporanément à la réaction PCR, 25 Jll d'une solution comprenant 100 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl (pH = 7,5), 0,5 % de Tween 20, 1, 5 mM de MgClz, 2, 6 U d'Expand Polymerase (Boehringer) sont alors additionnés aux 25 premiers il. Les cycles de PCR et les températures d'hybridation varient en fonction des amorces utilisées comme présenté au TABLEAU 1. TABLEAU 1 Amorces Concentration Cycles SEQ ID N 5 7,5 nm/ml 30 minutes à 94 C 30 minutes à 58 C SEQ ID NO 6 45 minutes à 72 C 35 cycles SEQ ID N 7 7, 5nm/ml 30 minutes à 94 C 30 minutes à 58 C SEQ ID NO 8 45 minutes à 72 C 35 cycles Chaque PCR débute par une dénaturation de 2 minutes à 94 C et finit par une élongation de 7 minutes à 72 C. Du quinzième au trente-cinquième cycle, le temps de l'élongation est augmenté de 20 secondes par cycle. La PCR est faite dans un appareil thermocycle Eppendorf gradient (Merck, Strasbourg, France). Les produits de réaction de PCR sont analysés sur un gel 1 % d'agarose en TBE (Tris bases 45mM, EDTA 10 mM). A. 2. 3-Purification des fragments PCR Les produits de PCR sont purifiés par Wizard de Promega, à partir d'un gel d'agarose 0, 1% en tampon TAE (Tris-HCl 40 mM, EDTA 1 mM). Après migration, les bandes intéressantes sans matériel contaminant sont prélevées à l'aide d'un scalpel stérile. Le gel contenant l'ADN est découpé sous U. V. Le morceau de gel est incubé pendant 5 minutes à 65 C dans 1 ml de solution de résine. Celle-ci est récoltée sur filtre, puis lavée par 2 ml d'isopropanol à 80 %. Après centrifugation (30 secondes à 12000 g), l'ADN purifié est hydraté par 40 ul d'eau, puis élué par centrifugation (30 secondes à 12 000 g). A. 2. 4-Clonage du produit PCR Après purification, les bandes PCR doivent être clonées dans un plasmide, afin de les amplifier, permettant ainsi de les séquencer et de les sous-loner dans différents plasmides d'expression. A l'aide de la PCR, deux sites de restriction (HinD III en 5' et Sma 1 en 3') permettant de cloner le fragment dans le site de clonage multiple du plasmide"Blue script"SK (Startagene, Ozyme, Montigny, France), ont été créés. 1 Jlg d'ADN est mis à digérer pendant 4 heures à 25 C dans une solution comprenant 50mM de K (C2H302), 20 mM de Tris (pH = 7,9), 10 mM de Mg (C2H302) 2, 1mM de DTT et 80 U d'enzyme Sma 1 (Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). 10 U d'enzyme HinD III sont alors ajoutés, et la solution est incubée pendant 12 heures à 37 C. Parallèlement 0, 5 ug de plasmide SK+ sont digérés de la même façon. Les produits de digestion sont purifiés avec le kit Compass (American Bioanalytical, Natick, USA). L'ADN est dilué dans 3 volumes d'une solution saline (fournie avec le kit) additionnée de 5 ul de matrice de silane. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, la solution est centrifugée (30 s. à 12000g). La résine culottée est lavée par 1 ml de solution de lavage (fournie avec le kit) qui est ensuite éliminée par deux centrifugations successives de 30 secondes à 12000 g. Après 5 minutes à température ambiante, la résine est resuspendue dans 12 Jll d'eau. Après incubation de 5 minutes à 65 C, la suspension est centrifugée pendant 1 minute à 12 000 g, afin de prélever le surnageant comprenant l'ADN. Le fragment digéré et purifié et le plasmide sont incubés dans une solution comprenant 50 mM de Tris (pH = 7,8), 10 mM de MgClz, 10 mM de DTT, 1 mM d'ATP, 50 mg. mr1 de BSA et 24000 U de T4 ligase (Biolabs). La solution est incubée pendant 16 heures à 4 C. La solution de ligation est ensuite transformée dans une bactérie compétente JM109 (Promega), afin d'obtenir une quantité de plasmide suffisante permettant le séquençage du produit PCR inséré dans le plasmide. A. 2. 5-Séquençage et analyse des séquences Le séquençage de l'insert est réalisé à l'aide d'un séquenceur automatique 373A Applied Biosystem (Roissy, FRANCE). Le principe du séquençage automatique repose sur la détermination par un laser d'une suite de bases fluorescentes incorporées dans des brins d'ADN néosynthétisés à partir de la séquence de référence par PCR. Par cette PCR, on synthétise à partir d'amorces choisies dans le TABLEAU 2 ciaprès en fonction de la séquence à analyser des brins d'ADN dans lesquels des bases fluorescentes sont incorporées lors de la synthèse du brin complémentaire. TABLEAU 2 Amorces Concentration Cycles SEQ ID ? 9 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 10 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 11 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 12 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 13 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 14 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 15 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles SEQ ID N 16 10 M 30 secondes à 96 C 30 secondes à 55 C 4 secondes à 68 C 35 cycles 1 gag de plasmide à tester préparé par midi-prép est ajouté à 20j. l1 d'une solution contenant du tampon Fs (Applied Biosystem, St Quentin en Yvelines, France) et 0, 5 1M d'une amorce de séquence (TABLEAU 2). Chaque PCR débute par une dénaturation de 3 min. à 96 C et finit par une élongation finale de 4 min. à 68 C. A l'aide du logiciel Vector NTI de la société Informa (Oxford, U. K. ), nous alignons l'ensemble des séquences obtenues par les différentes amorces à l'aide du logiciel Vector NTI de la société Informa (Oxford U. K. ), l'alignement de l'ensemble des séquences obtenues par les différentes amorces sur le plasmide KAE15.8 est effectué. Cet alignement permet de comparer les séquences entre elles et de les comparer par rapport à la séquence théorique attendue qui est ici nommée PCR IL-6 Epi. Le fait d'utiliser plusieurs amorces pour séquencer le même insert, nous permet de nous affranchir des erreurs de lecture du séquenceur automatique. On pourra se référencer aux fig. 1 et 2. Ce plasmide KAE15.8 va servir pour toutes les autres constructions plasmidiques. A. 3-Préparation des baculovirus Le système de production de virus utilisé est le Baculogolde transfection Kit (PharMingen, Becton Dickinson, Paris, France). La préparation de baculovirus est réalisée en deux temps : dans un premier temps, le vecteur de transfert est construit, puis dans un second temps, des virus sont obtenus par recombinaison homologue entre le vecteur de transfert et un baculovirus linéaire dans des cellules sf9. A. 3. 1-Préparation du vecteur de transfert Sur le plasmide KAE15.8 précédemment obtenu et séquencé, une PCR est réalisée à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO 5 et SEQ ID NI 6. La PCR, l'analyse des fragments et leur purification sont réalisées comme précédemment décrit. La digestion des fragments PCR purifiés et du plasmide de transfert pAcGP67-B est réalisée par les enzymes BamHI et EcoRI (biolab) pendant 4 heures à 37 C. La ligation de l'insert est identique à celle précédemment décrite. Les constructions plasmidiques sont ensuite transformées dans JM109 puis séquencées. Les vecteurs de transfert dont la séquence est correcte, sont amplifiés afin d'obtenir 1 mg de plasmide dépourvu d'endonucléase à l'aide du kit EndoFree plasmid Mega Kits de Qiagen. (Courtaboeuf, France) Ce lot de plasmide va servir pour la co-transfection du vecteur de transfert et du baculovirus linéaire dans les cellules Sf9. La carte de ce vecteur de transfert est présentée à la fig. 2. A. 3. 2-Préparation et sélection des virus Les baculovirus sont obtenus par co-transfection d'un vecteur de transfert et d'un baculovirus linéaire dans une cellule Sf9. Après recombinaison homologue, la cellule produit des virions réplicatifs produisant la protéine d'intérêt. A. 3. 2. 1- Co-transfection 2. 106 cellules Sf9 sont co-transfectées par 0, 5 ig de baculogold et 5 ig de vecteur de transfert par du sulfate de calcium. Après 4 heures d'incubation à 27 C, le milieu de transfection est remplacé par du milieu de culture SF900 II (Gibco) complémenté par 5% de sérum de veau nouveau né (Hyclone, Perbio, Bezon, France). Au bout de 5 jours d'incubation à 27 C, le surnageant de culture comprenant les virus est prélevé, afin de cloner ceux-ci par la technique de plaque assay. A. 3. 2. 2 - Clonage des particules virales par plaque assay Les particules virales sont clonées par sélection de plage de lyse en milieu gélifié. 7. 106 cellules Sf9 sont ensemencées en boite de culture de diamètre 100 mm. Une boite de culture est préparée par dilution du surnageant de culture contenant les particules virales. Une gamme de dilutions est réalisée de 10-1 à 10-6 suivant le titre viral de surnageant de culture. Les cellules sont incubées pendant 1 heure à 27 C avec la dilution, puis une solution à 2 % d'agarplaque (préparé en milieu de culture sans protéine) est coulée sur chaque boite de culture. Au bout de 10 minutes à température ambiante, l'ensemble de la boite se gélifie emprisonnant les cellules dans un milieu de culture à 1% d'agarplaque. L'ensemble est mis à incuber pendant 12 jours à 27 C. Le virus étant bloqué par l'agarplaque, celui-ci ne se développe plus que par contamination de cellule à cellule formant ainsi des plages de lyse cellulaire pouvant être lues à l'oeil nu. Si la dilution virale est suffisante, une plage de lyse correspond à un virus. Les plages de lyse sont prélevées à l'aide d'un cône de pipette, puis transférées dans 1 ml de milieu de culture, afin d'éluer les particules virales de l'agarose par une incubation de 12 heures à 4 C sous agitation. 300 p. l de cet éluat va infecter 5. 106 cellules en boîte de culture de diamètre 100 mm en 3 jours à 27 C. Le surnageant de culture est conservé à 4 C et les cellules sont lavées avec du PBS, culottées puis lysées, afin de contrôler, sur gel d'acrylamide SDS-page (Gibco), la production de la protéine d'intérêt par le virus. A. 3. 3-Caractérisation des virus par gel d'acrylamide SDS-page 2. 107 cellules sont lysées par 1 ml de tampon de lyse (10 mM Tris-HCl pH = 7,5 ; 130mM NaCl ; 1% Triton X-100 10 mM NaF ; 10 mM NaPi ; 10 mM NaPPi ; 1 0 gIml phenanthroline ; 10 p-g/ml aprotinine ; 10 ug/ml leupeptine ; 1 mM PMSF) pendant 45 minutes à 4 C. Le lysat est ensuite clarifié par une centrifugation de 45 minutes à 40 000 g. 30 1 de lysat sont dénaturés pendant 5 minutes à 95 C, en présence de tampon de charge (2,5 % SDS, 5 % ss-mercaptoéthanol, 1 mM Tris pH = 7,4, 1 mM EDTA, 20 % glycérol, 5 % de bleu de coomassie à 1 %). Les échantillons dénaturés font l'objet d'une électrophorèse de 2 heures à 120 V dans un gel SDS à 12 % d'acrylamide (Gibco). Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Fluorure de PolyVinyliDène de Millipor, Poly-labo, Strasbourg) par un transfert humide de 45 minutes à température ambiante à 0,350 A dans un tampon comprenant 25 mM de Tris-HCl, 192 mM de glycine, pH = 8,3. Pour les gels à 12 % d'acrylamide, 20 % de méthanol sont ajoutés à ce tampon. Les protéines transférées sont identifiées par l'intermédiaire de leur queue poly histidine, par un anticorps monoclonal anti-histidine directement couplé à une phosphatase alcaline (Invitrogen, Gibco, France). L'ensemble est ensuite visualisé par un procédé de chimiluminescence (Tropix, Perkin Elmer). A. 4-Production et purification de la protéine PAC3 A. 4. 1-Production Celle-ci est réalisée par infection de cellules Sf9 en suspension. 1 1 de milieu de culture SF900 II sérum free (Gibco) est ensemencé à l'aide de 2. 106 cellules. ml' et 1 ml de suspension virale à 108 pfu. mol-1. L'ensemble est mis à incuber pendant 4 jours à 27 C, sous agitation douce. A la fin de la culture les cellules sont culottées par une centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes et le surnageant est stocké à 4 C. A. 4. 2-Purification La première étape consiste à préparer l'échantillon afin qu'il puisse être compatible avec la colonne de chromatographie. Pour cela une première dialyse est réalisée contre 20 volumes de tampon phosphate 20mM pH = 7,4 à travers une membrane de dialyse dont le point de coupure est de 15 KDa. Au bout d'une nuit de dialyse à 4 C, sous agitation douce, le dialysat est prêt à être purifié sur colonne d'affinité HITrap chelating 5 ml de Phannacia. Cette colonne est composée de sépharose sur laquelle est greffée une pince pouvant chélater différents types de métaux bivalents. Dans cette purification la pince est chargée avec du cuivre, conférant ainsi une affinité pour des chaîne poly-histidine. A. 4. 2. 1-Chromatog'p'e , phie La colonne est montée sur le système de chromatographie HR de Biorad stabilisé à 4 C en chambre froide. Le débit de la colonne est limité à 1 ml. min'\ avec une pression maximum de 100 psi. Dans un premier temps la colonne est lavée et activée par un premier lavage par 5 volumes d'eau distillée, puis activée par 0,5 volume d'une solution de sulfate de cuivre à 100 mM. Le cuivre non fixé est éliminé par 10 volumes d'eau distillée. La colonne est stabilisée par 10 volumes de tampon phosphate 20 mM pH = 7,4, 1 M NaCl, 10 mM d'inmidasole. La purification se fait à l'aide de plusieurs passages successifs afin de ne pas saturer la colonne. Chaque passage débute par une stabilisation de la ligne de base des U. V. à 280 nm à l'aide de 2 volumes de tampon phosphate 20 mM pH=7,4, 1 M NaCl, 10 mM d'inmidasole, puis 4 volumes de dialysat sont injectés. Plusieurs lavages sont réalisés par 6 volumes de tampon phosphate 20 mM pH=7,4, 1 M NaCl, 10 mM d'inmidasole et 6 volumes de tampon phosphate 20 mM pH=7,4, 1 M NHC14. Les protéines sont éluées de la colonne à l'aide de 4 volumes d'un gradient linéaire de 0 % à 60 % d'un tampon phosphate 20 mM pH=7,4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA. A la fin de l'élution la colonne est lavée par 6 volumes de tampon phosphate 20 mM pH=7, 4, lMNHCLt. La colonne peut à ce stade être activée pour un nouveau passage. La fig. 3 représente le profil de chromatographie : la courbe a représente l'absorbance à 280nm des protéines, la courbe b représente la conductivité des solutions injectées, la courbe c le pourcentage de solution d'élution. Afin de pouvoir utiliser la protéine en culture cellulaire, l'éluat est dans un premier temps concentré à l'aide de centricon plus-20 (Amicon, Millipor, France) possédant une membrane de séparation à 10 Kda, puis dialysé contre 30 volumes de PBS sans Mg2+ et Ca2+ à travers une membrane de dialyse possédant un point de coupure de 15 Kda. Après une nuit de dialyse à 4 C, sous agitation douce, la protéine peut être concentrée à l'aide de centricon plus-20. La solution est ensuite conservée à-20 C. Une fraction de la protéine est déposée en double sur un gel à 12% d'acrylamide SDS-page et mise à migrer comme précédemment décrit. Une partie du gel est transférée sur membrane de PVDF afin de révéler les protéines par chimiluminescence à l'aide d'un anticorps anti-histidine l'autre partie est colorée à l'argent par un kit Bio-rad silver stain afin d'obtenir le panel complet des protéines présentes dans l'échantillon. La protéine PAC3 ainsi isolée et purifiée possède en C-terminal une queue poly- Histidine et est de séquence SEQ ID NO 3. On pourra se référer aux fig. 4A et 5B qui montrent la protéine PAC3 de poids 16KDa. B-ACTIVITE BIOLOGIQUE B. l-Inhibition de la prolifération de lignées tumorales pour lesquelles l'IL-6 exerce un effet mitogène B. l. l-Choix des lignées et évaluation de leur prolifération. Les cellules sont ensemencées à 2,5. 105 cellules. ml' en milieu RPMI 1640 (Gibco) complémenté par 2 mM de L-glutamine, 100 Us. milz de pénicilline et 100 U. mol-1 de streptomycine. 100 ul de cette suspension cellulaire sont"sevrés"24 heures à 37 C (5 % de CO2 en atmosphère humique) en plaque 96 puits. Après"sevrage", le milieu de culture est remplacé par la solution à tester diluée dans du milieu de culture (RPMI 1640 complémenté par 2 mM de L-glutamine, 100 UI. ml' de pénicilline, 100 U. mol-l de streptomycine et 20 % de sérum de veau nouveau né). L'ensemble est mis à incuber 24,48 ou 72 h (37 C à 5 % de C02 en atmosphère humique) suivant les conditions de manipulation. La prolifération cellulaire est déterminée par incorporation de thymidine tritiée. U266 est une lignée de myélome ; il est clairement établi que l'IL-6 dans ce modèle joue un rôle autocrine dans la prolifération et que la cellule exprime de grandes quantités de récepteurs gp 80 et gp 130 à sa surface cellulaire (contrairement aux lignées d'adénocarcinome du rein qui n'expriment pas gp 80 à leur surface). B. l. 2-Résultats B. 1. 2. 1-ctivité de la protéine PAC3 de SEO ID NV 3 sur la prolzfération de la lignée U266 Le contrôle négatif utilisé est une production de baculovirus codant pour une protéine non pertinente (une enzyme dégradant le catéchol ref pAcHLT-XylE"PACXylE"contrôle vector de Pharmigen) purifiée dans les mêmes conditions que la protéine PAC3 selon l'invention. La fig. 5A montre l'évolution du pourcentage d'inhibition, en fonction de la concentration protéique (c), de la prolifération de U266 sans activation, en présence de la protéine PAC3. La fig. 5B montre l'évolution du pourcentage d'inhibition, en fonction de la concentration protéique (c), de la prolifération de U266 avec activation par 1,26 pg/ml d'IL-6 en présence de la protéine PAC-3. La fig. 5C montre l'évolution du pourcentage d'inhibition, en fonction de la concentration protéique (c), de la prolifération de U266 avec activation par 12,6 pg/ml d'IL-6 en présence de la protéine PAC-3. Comme le montrent les graphiques présentés à la fig. 5A, 5B et 5C, avec la protéine PAC 3, une inhibition de la prolifération jusqu'à 25% par rapport au contrôle est obtenue. Le caractère limité de cette inhibition résulte probablement d'un mode de fonctionnement majoritairement intracrine de l'IL-6 dans cette lignée, n'impliquant pas les récepteurs de l'IL-6 exprimés à la surface cellulaire. Cependant la magnitude de cette inhibition induite spécifiquement par la protéine PAC3 selon l'invention est majorée lorsque les cellules sont cultivées en présence d'IL-6 exogène, atteignant 60% du niveau de prolifération observé en présence d'IL-6 exogène. Ceci confirme la capacité de la protéine PAC3 selon l'invention à bloquer significativement l'activité biologique de l'IL-6 notamment l'induction de la prolifération tumorale induite par cette IL-6 exogène. Au total, ces résultats indiquent que la protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 selon l'invention bloque la prolifération induite par l'IL-6 exogène de la lignée tumorale U266, en l'absence d'IL-6, mais surtout inhibe de manière majeure la prolifération de cette lignée induite par l'IL-6 exogène. Ces résultats confirment l'effet antagoniste de l'IL-6 de la protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 selon l'invention. B. 2-Différenciation des pro2éniteurs CD34+ B. 2. 1-Méthodes Des prélèvements de sang de cordon ombilical sont dilués au 1/2 en PBS, puis déposés sur une solution de ficoll de densité 1,077 afin de séparer par centrifugation en fonction de la densité les différents constituants du prélèvement. Les cellules mononucléées se situant à l'interface, celles-ci sont ponctionnées du ficoll afin de purifier les CD34+ par sélection positive. La purification débute par un marquage à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-CD34 (anticorps monoclonal IgGl de souris Coulter, Marseille, France), puis par un second anticorps monoclonal de chèvre anti-F (ab') 2 de souris (Macs, Tebu, Paris, France) couplé à une bille magnétique. Le complexe formé est purifié sur une colonne magnétique. Après purification, les progéniteurs CD34+ sont cultivés de JO à J6 en présence de RPMI 1640 classique complémenté de TNFa (2,5 ng/ml), GM-CSF (lOOng/ml), SCF (25ng/ml) et du sérum AB+ humain (2%) (EFS, Lyon, France). A J6, les CD34+ sont lavés 3 fois en PBS pour éliminer le sérum AB+, puis cultivés en présence de TNFa (2,5 ng/ml), GM-CSF (100 ng/ml) et différentes concentrations de solution à tester. A J12, les cellules sont numérées et lavées, puis mises à incuber en présence d'anticorps fluorescent 20 min. à 4 C. Après l'incubation les cellules sont lavées 3 fois en PBS puis analysées par cytométrie en flux. B. 2. 2-Résultats La protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 selon l'invention exerce deux types d'activités sur la différenciation des progéniteurs CD34+ en cellules dendritiques et en présence de GM-CSF et TNF a : 'la première est une action inhibitrice de l'effet de l'IL-6 sur l'expression de marqueurs membranaires de différenciation des DC notamment du CD 14, 'la seconde correspond à un blocage partiel par la protéine PAC3 de SEQ ID ? 2 de l'acquisition de CDla par les cellules en cours de différenciation. En effet, comme le montrent les résultats présentés à la fig. 6 le maintien de l'expression du CD 14 par l'IL-6 ou IL-6 combiné avec le M-CSF est inhibée en présence de la protéine PAC3 de SEQ ID NI 3. Il en est de même pour l'inhibition de l'expression de CD86 induite par IL-6 ou par la combinaison IL-6 et MCSF, qui est partiellement restaurée en présence de la protéine PAC3 de SEQ ID NO 3. Ces résultats confirment l'action inhibitrice de la protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 sur l'activité biologique de l'IL-6, dans un modèle pertinent en pathologie clinique chez l'homme, qui est le blocage par l'IL-6 de la différenciation des DC à partir de progéniteurs CD34+. La protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 affecte donc la différenciation des cellules dendritiques, orientant leur engagement vers une sous-population exprimant de manière plus faible le marqueur CDla. La protéine PAC3 de SEQ ID ? 3 bloque en outre les effets immunosuppresseurs de l'IL-6 dans ce modèle, notamment sa capacité à inhiber la différenciation normale des cellules dendritiques. B. 3-Conclusions La protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 est ainsi capable de bloquer spécifiquement la prolifération induite par l'IL-6 de lignées cellulaires tumorales, de la lignée de myélome U266. La protéine PAC3 de SEQ ID NI 3 bloque également la capacité de l'IL-6 à inhiber la différenciation des cellules dendritiques in vitro. REVENDICATIONS 1-Protéine PAC3 à activité inhibitrice de l'IL-6, caractérisée en ce qu'elle 1 consiste en la SEQ ID NI 3. 2-Fragments peptidiques de la protéine selon la revendication 1, résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité inhibitrice de l'IL-6. 1 3-Fragments peptidiques selon la revendication 2, qui comprennent au moins la séquence en acides aminés SEQ ID NI 4 de la protéine selon la revendication 1. 4-Séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine PAC3 ou un des fragments peptidiques selon la revendication 1,2 ou 3. 5-Protéine PAC3 ou fragments peptidiques selon la revendication 1,2 ou 3, pour leur utilisation en tant que médicament. 6-Composition pharmaceutique contenant la protéine PAC3 ou un fragment peptidique selon la revendication 1,2 ou 3, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable convenable. 7-Utilisation de la protéine PAC3 ou d'un fragment peptidique selon la revendication 1,2 ou 3, pour la fabrication d'un médicament destiné à inhiber l'activité de l'IL-6. 8-Utilisation selon la revendication 7, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les lymphomes, leucémies, myélomes, carcinomes, sarcomes. 9-Oligonucléotides antisens bloquant la transcription ou la traduction de la protéine PAC3 ou des fragments peptidiques, tels que définis à la 1, 2 ou 3, qui 1 s'hybrident avec une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 4. 10-Animaux transgéniques, à l'exclusion de l'homme, exprimant un transgène de la protéine PAC3 ou des fragments peptidiques selon la revendications 1,2 ou 3. 11-Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 4 et les moyens nécessaires à son expression. 12-Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 11.