FR 2833270 A1 20030613 FR 0115908 A 20011210 L'invention concerne un modèle récapitulant les phases successives du développement osseux humain en culture cellulaire. Plus précisément l'invention concerne notamment un système de culture de cellules ostéogéniques et chondrogéniques à partir d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropathie Neurogène (POAN), et un procédé de sélection de composés actifs sur la différenciation de cellules ostéogéniques. Les pathologies liées à la formation de l'os, l'un des constituants majeurs de l'organisme des vertébrés, sont nombreuses et souvent lourdes, et elles font l'objet de nombreuses études. Une part de ces études vise à l'élucidation et au contrôle des phénomènes mis en jeu dans l'ossification. L'objectif est alors le plus souvent de trouver une solution aux problèmes posés par les manques ou les insuffisances de la formation osseuse, par exemple lors de la réparation des fractures, ou de favoriser l'incorporation de greffons osseux, ou de biomatériaux, dans ou sur l'os existant, ou bien encore de favoriser l'ostéogenèse dans des sites où l'os manquerait. Une autre part s'intéresse aux maladies dégénératives atteignant le squelette, parmi lesquelles on peut citer, sans être exhaustif, l'ostéoarthrite, l'arthrose, et bien entendu l'ostéoporose. La dernière part de ces études prend une importance croissante. Elle concerne les processus anormaux de formation osseuse dans des sites de l'organisme où elle ne ZD devrait pas survenir. Les conséquences de telles affections peuvent être anodines, mais le plus souvent elles vont de la gêne fonctionnelle ou esthétique à la mort, comme dans la Fibro Dysplasie Ossifiante Progressive (1) (2) ("Maladie de l'homme de pierre"), en passant par différents types de troubles articulaires, vasculaires et nerveux. Un exemple de l'importance croissante de ces recherches peut être fourni par la découverte du rôle prédictif joué par la minéralisation de la plaque d'athérome dans le pronostic de l'athérosclérose. Il a été découvert que la plupart des gènes impliqués dans la formation osseuse étaient exprimés par les cellules de ces plaques (5) et que des cellules des vaisseaux étaient capables en culture de reproduire les différentes étapes de la formation osseuse in vitro (6). Dans ce contexte on s'intéresse tout particulièrement à l'étude et au contrôle du développement du tissu osseux. Aussi bien dans le développement que dans certaines pathologies caractérisées par des formations osseuses ectopiques, différentes étapes précèdent l'ossification proprement dite. La formation du squelette chez les vertébrés est le résultat d'une succession de phases dont on connaît la chronologie (7) et un bon nombre de marqueurs (8). Leurs caractéristiques en sont retrouvées dans des relations spatiales commodes à étudier dans la plaque de croissance épiphysaire, qui est le modèle animal de développement osseux le plus largement utilisé. Au cours du développement, tout commence par la condensation de cellules d'origine mésenchymateuse qui expriment le gène du facteur de transcription Cbfal (9) et une activité phosphatase alcaline. Ces cellules se différencient alors en cellules cartilagineuses. Dans les premières étapes de leur différenciation, ces cellules expriment le gène du collagène de type II, dont le transcrit est traduit en protéine qui s'assemble en dehors de la cellule et se combine à des protéoglycanes de haut poids moléculaire pour former la matrice extracellulaire du cartilage (8). Les agrégats de protéoglycane possèdent des glycosaminoglycanes qui sont hautement sulfurés. Puis ces cellules s'organisent en colonnes, et poursuivent leur différenciation en devenant des cellules hypertrophiques. Ces chondrocytes hypertrophiques qui expriment le gène du collagène de type X, dont le transcrit est traduit en protéine qui s'assemble en dehors de la cellule, expriment à nouveau celui de Cbfal, exhibent une activité phosphatase alcaline, et se trouvent au sein d'une matrice dont ils permettent la minéralisation. Ces chondrocytes hypertrophiques synthétisent alors le facteur de croissance vasculaire endothélial-VEGF-Vascular Endothelial Growth Factor, qui provoque une invasion du cartilage mature par des vaisseaux sanguins (11). Le cartilage est alors résorbé pour être remplacé d'une part par l'os, dont la matrice est synthétisée par les ostéoblastes et constituée principalement de collagène de type 1, et d'autre part par la moelle osseuse (7). Les ostéoblastes expriment le gène de Cbfal, ont une activité phosphatase alcaline, et expriment le gène de l'ostéocalcine. Dans le même temps, des cellules situées à la périphérie de l'ébauche cartilagineuse subissent une différenciation en cellules ostéoblastiques, qui Pour la plupart de tissus cartilagineux, les chondrocytes sont répartis de manière relativement étendue dans la matrice extra cellulaire ; la mitose se produit mais à un taux faible ; et, le tissu étant essentiellement non vascularisé, il est stable pendant longtemps. Aussi, lorsqu'il y a une altération du tissu, celui ci se répare lentement voir pas du tout. Dans les zones d'interface entre les cartilages et l'os, les chondrocytes continuent à mûrir poursuivant la voie endochondrale. Eventuellement, ils deviennent hypertrophiques, dégradent les agrégats de protéoglycane, et calcifient leur matrice. Ceci se produit à des vitesses variables, en fonction de la zone du tissu, de l'âge de l'animal, et de la présence de maladies ou d'une capacité anormale de différenciation. Lors du vieillissement, le cartilage devient plus mince dans la zone d'interface entre le cartilage articulaire et l'os subchondral. Dans le cas d'une ostéoarthrite ce phénomène est accéléré. Dans la phase de croissance, les os longs grandissent en longueur du fait d'une prolifération accrue de chondrocytes mais après cette prolifération les cellules entrent au stade hypertrophique de différenciation. Cette transition se produit plus rapidement notamment en cas de fracture ou d'une greffe osseuse. La plupart des facteurs de croissance connus utilisés pour le traitement du cartilage et de l'os sont utilisés pour leurs capacités à augmenter la formation osseuse soit par augmentation de la différenciation endochondrale soit directement en agissant sur les ostéoblastes. Ces facteurs de croissances ont de multiples effets. En particulier ils stimulent la différenciation des cellules mésenchymateuses. Par exemple le facteur de croissance TGF. beta peut induire la transformation in vitro ou in vivo des cellules mésenchymateuses en cellules du cartilage. Les BMPs induisent la différenciation des cellules mésenchymateuses en chondrocytes in vivo dans des tissus mésenchymateux qui normalement ne conduiraient pas à une formation d'une structure osseuse ou cartilagineuse. Les facteurs de croissance peuvent également stimuler la différenciation de cellules déjà engagées dans leur différenciation. Par exemple le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) ou le facteur bFGF n'affectent pas la différenciation des cellules mésenchymateuses en cellules du cartilage ou osseuses in vitro, mais in vivo ces facteurs stimulent l'expression de chondrocytes ou ostéoblastes matures calcifiant. Par exemple, les facteurs IGF, bFGF, TGF, BMP stimulent la différenciation de chondrocytes en cellules hypertrophiques. On comprend que l'action de tels facteurs de croissance est souhaitée pour stimuler la croissance osseuse, mais inversement néfaste dans le cas d'une croissance déjà excessive. Il est donc important de pouvoir identifier de façon précise les mécanismes d'action de tels facteurs, le stade auquel ils sont produits, leur mode d'action, et d'éventuels autres facteurs, pour le traitement de différentes maladies osseuses ou cartilagineuses. Des observations cliniques, combinées à des examens biologiques et physiologiques permettent une première approche de la physiologie et des pathologies, et des mécanismes mis en jeu. Cette approche doit être complétée d'analyses plus fines afin de découvrir les mécanismes cellulaires et moléculaires sur lesquels il pourrait être envisagé d'intervenir. Ces analyses requièrent des modèles. La majeure partie des résultats connus de l'homme du métier proviennent de modèles animaux, utilisés à toutes les phases du développement pré-et post-natal. Mais certaines des pathologies d'intérêt, ou des phénomènes qui les causent et/ou les accompagnent, ne sont pas observables chez l'animal, soit parce qu'ils ne s'y produisent pas, soit parce qu'on n'a pas encore trouvé le moyen de les y provoquer. Par ailleurs se pose le problème de l'interpolation à l'homme des résultats obtenus chez l'animal. Si ces modèles ont permis de découvrir les mécanismes mis en jeu, aussi bien aux niveaux biochimiques que génétiques, beaucoup reste à découvrir au sujet des régulations de ces mécanismes ; or, si les structures de la plupart des gènes impliqués sont voisines, c'est précisément au niveau des mécanismes de régulation de l'expression des gènes que subsistent les plus grandes différences entre l'homme et les autres espèces animales. Enfin, une opposition croissante à l'expérimentation animale se développant dans la plupart des pays, qu'elle s'exprime dans des textes réglementaires ou dans l'opinion publique, accentuera le besoin de recourir à des modèles alternatifs à l'expérimentation animale. On cherche donc à obtenir des cultures cellulaires, alternative à l'expérimentation animale. Celles-ci peuvent être menées soit à partir de lignées cellulaires, soit de cultures primaires ou issues de primaire. Les lignées cellulaires sont des lignées de cellules transformées, spontanément (cellules cancéreuses) ou artificiellement. Comme telles, elles présentent des différences notables dans la régulation de l'expression de leurs gènes. Les réponses aux différents agents hormonaux, facteurs de croissance et cytokines sont particulièrement altérées. Se pose donc à nouveau un problème d'extrapolation des résultats. Les cultures primaires sont obtenues à partir des tissus par dissociation du tissu, ou par migration. Les cultures issues de primaire (secondaire, tertiaire, à n passages...) sont issues de la multiplication et du passage en cultures subséquentes des populations cellulaires initiales. Qu'elles utilisent des milieux totalement définis ou du commerce, les cultures cellulaires permettent un contrôle fin des paramètres expérimentaux. Mais les cultures de cellules animales ne résolvent pas le problème posé lors de l'interpolation des résultats à l'espèce humaine. Afin de pallier cet inconvénient, des cultures sont menées à partir de cellules humaines. Les cultures primaires ou issues de primaire chez l'homme sont, dans le domaine d'intérêt de l'invention, des cultures de cellules osseuses ou cartilagineuses obtenues le plus souvent lors de chirurgie orthopédique. Le plus souvent, les indications de ces chirurgies ont été posées suite à des maladies ou à des traumatismes. Il s'agit donc de cellules issues de tissu déjà osseux. De nombreux travaux ont démontré que ces cellules, cultivées sous les conditions appropriées, exprimaient, selon leur état de différenciation, tout ou partie des gènes impliqués dans l'ossification. Etant donné qu'il est pratiquement impossible, pour des raisons éthiques, d'obtenir des tissus normaux pré-osseux d'embryon ou de foetus humain, ou d'enfant, il n'existait donc pas chez l'humain de modèle de culture dont le point de départ se trouve réellement en amont de la formation osseuse proprement dite. Les inventeurs, afin de pallier les inconvénients de l'art antérieur, ont cherché à obtenir un modèle de développement osseux représentatif, en utilisant un système bien spécifique de culture de cellules ostéogéniques. A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect un système de culture de cellules osseuses, dans lequel les cellules osseuses mises en culture sont issues au moins en partie d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropie Neurogène (POAN). Selon un mode de réalisation, les cellules osseuses mises en culture sont des cellules d'ostéomes et de tissu conjonctif fibreux entourant l'ostéome. Selon une réalisation le système de culture comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation des ostéomes qui sont mis en culture. Par ensemble de cellules, on entend au moins une cellule, ces cellules ayant les mêmes caractéristiques essentielles en terme de développement et de différenciation osseuse, se développant par zones plus ou moins éparses et étendues dans le milieu de culture. Selon une variante, le système de culture comprend un ensemble de cellules osseuses, exprimant typiquement le collagène de type 1 et le Cbfal. On notera que les marqueurs d'un état de différenciation cités dans la description ne sont pas limitatifs, d'autres marqueurs associés à un stade de différenciation donné peuvent être identifiés et utilisés pour repérer ce stade dans le système de culture. Selon une réalisation le système de culture comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation du tissu fibreux qui est mis en culture. Selon une variante, le système de culture comprend un ensemble de chondrocytes non différenciés, exprimant le collagène de type II, un ensemble de cellules représentatives des premiers stades de la formation du cartilage et de la plaque de croissance, exprimant le Cbfal, un ensemble de chondrocytes hypertrophiques, exprimant le collagène de type X et le VEGF. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de détermination du stade de différenciation d'au moins un ensemble de cellules osseuses, comprenant une étape de mesure de l'expression d'au moins un facteur représentatif du stade de différenciation dudit ensemble dans le système de culture décrit précédemment Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de culture de cellules osseuses comprenant les étapes : - prélèvement d'un tissu de Para Ostéo Arthropie Neurogène (POAN) ; - mise en culture du prélèvement dans un milieu de culture approprié pour la différenciation de cellules du prélèvement, le cas échéant jusqu'à la formation de zones minéralisées. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de sélection de substances actives sur le développement et/ou la différenciation de cellules osseuses, à au moins un stade de différenciation, comprenant : La préparation d'un système de culture tel que décrit précédemment ; - L'addition d'au moins une substance testée au système de culture, à au moins un stade de différenciation des cellules mises en culture ; - La mesure de l'effet de la substance sur le développement et/ou la différenciation des cellules aux différents stades de différenciation. Selon une réalisation, on teste une seule substance à la fois, et le cas échéant des dérivés ou analogues de cette substance. Selon une autre réalisation, on teste plusieurs substances simultanément pour étudier des éventuels effets synergiques ou antagonistes sur un ou plusieurs stades de différenciation. Selon une réalisation la substance active est une substance régulatrice du développement et/ou de la différenciation des cellules cultivées. De telles substances seront selon une réalisation choisies parmi des hormones, des facteurs de croissance et morphogènes, des drogues antiinflammatoires. Selon une réalisation la substance active est une substance modulant l'expression de gènes à au moins un stade du développement osseux. De telles substances seront selon une réalisation choisies parmi des hormones, des facteurs de croissance et morphogènes, des drogues antiinflammatoires. Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation de cellules extraites d'un système de culture tel que décrit précédemment et/ou d'au moins une substance active décrite précédemment : - pour le traitement d'une pathologie du cartilage, d'un formation osseuse en excès, insuffisante ou anormale ; pour la reconstruction maxillaire et bucco-dentaire ; pour le traitement de maladies cardio-vasculaires impliquant une ossification des vaisseaux ; pour des greffes osseuses. D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit, illustrée par les figures : - Figure 1 : Plan de la culture, où : PAL = phosphatase alcaline en biochimie PROLIF = prolifération cellulaire MMPs = métalloprotéinases matricielles MINERALISATION = coloration Von Kossa PAL in situ = révélation cytochimique de l'activité PAL OCN = extraction de l'ostéocalcine matricielle COLLAGENES = extraction des collagènes matriciels SURNAGEANTS = prélèvement des surnageants - Figure 2 : Activité phosphatase alcaline (PAL) en spectrophotométrie : enveloppe conjonctive à gauche, ostéome à droite en picomole de pnitophénol formé/minute/cellule - Figure 3 : Activité PAL in situ, cellules de l'enveloppe conjonctive à droite, de l'ostéome à droite, en culture cellulaire. - Figure 4 : Formation de nodules minéralisés en culture : cellules d'ostéome, coloration de von Kossa. - Figure 5 : Formation de nodules minéralisés en culture : cellules de l'enveloppe conjonctive, coloration de von Kossa - Figure 6 : Gel sur lequel ont migré les produits de RT-PCR de culture secondaire de cellules de l'enveloppe fibreuse. Les pistes à l'extrême gauche et à l'extrême droite (1 et 7) sont celles qui portent les marqueurs de poids moléculaire en paires de bases. La piste 1 est celle de Cbfal, la 2 est celle de l'ostéocalcine, la 3 celle de la chaîne al du collagène de type II, la 4 celle de la chaîne al du collagène de type I, la 5 celle de la chaîne al du collagène de type X, la 6 celle de VEGF, la 7 celle de la phosphatase alcaline. Parmi les pathologies caractérisées par des formations ectopiques d'os, les inventeurs ont particulièrement étudié la Para-Ostéo-Arthropathie Neurogène (POAN). Les Para-Ostéo-Arthopathies sont des affections au cours desquelles des masses osseuses importantes se forment en regard ou autour des principales articulations (dans l'ordre de fréquence : hanche, genou, coude, épaule), dont elles peuvent bloquer le fonctionnement normal (13). Elles sont susceptibles également de provoquer des compressions des éléments vasculaires et nerveux. Une forme particulière de ces affections, les POAN, survient à la suite d'atteintes graves du système nerveux central. Compte tenu des données fournies par les observations cliniques de ces affections, ainsi que les observations qu'ils ont effectuées sur des préparations histologiques, les inventeurs ont formé l'hypothèse que les POAN récapitulaient les stades successifs de la formation du squelette telle qu'elle se produit lors du développement foetal puis embryonnaire. Pour tester cette hypothèse, ils ont extrait les ARNm des deux différents tissus : l'ostéome et le tissu conjonctif entourant l'ostéome. Les transcrits de différents marqueurs exprimés séquentiellement dans les différentes phases du développement y ont été retrouvés, à savoir : Collagène de type 1 Ostéocalcine (en quantité étonnamment importante) Collagène de type II Collagène de type X Cbfal VEGF Parallèlement à cette étude, des cultures secondaires de cellules issues de ces deux tissus ont été menées. Ces cultures ont été menées sur 45 ou 56 jours, dans des conditions permettant la minéralisation. Ces cultures finissent par former des nodules qui minéralisent comme indiqué par une coloration de Von Kossa. Par ailleurs, une activité phosphatase alcaline y est présente, présentant un pic à 45 jours de culture. Enfin, les différents marqueurs indiqués ci-dessus y ont été retrouvés. L'expression du gène du collagène X dans les cultures de cellules de tissu fibreux augmente avec le temps, avec un maximum au moment de la minéralisation. L'ensemble de ces éléments permet de conclure qu'un modèle complet du développement osseux est obtenu grâce à ces cultures. Les cultures de cellules du tissu fibreux seraient un mélange de populations de cellules cartilagineuses aux différents stades de maturation, qui, avec le temps de culture, verrait les moins différenciées continuer leur cycle de maturation vers les chondrocytes hypertrophiques, comme le montre l'augmentation de l'expression du gène de collagène de type X. En effet ces cellules en culture expriment le collagène de type II, caractéristique des chondrocytes-cellules cartilagineuses-non différenciées, ainsi que le Cbfal, facteur de transcription spécifique des premiers stades de la formation du cartilage de la plaque de croissance. Elles expriment également les facteurs de transcription du collagène de type X et du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), caractéristiques des chondrocytes hypertrophiques (cellules cartilagineuses terminalement différenciées dont l'apparition précède la formation de l'os, et qui se trouvent au sein d'une matrice minéralisée). Les cultures de cellules issues de l'ostéome représentent un mélange de populations cellulaires dans lesquelles on trouve des cellules cartilagineuses et une majorité de cellules ostéoblastiques. Ces cellules expriment en effet le gène du collagène de type I, caractéristique de l'os, ainsi que de Cbfal, facteur de transcription des ostéoblastes. Elles exhibent par ailleurs un activité phosphatase alcaline et forment en culture des nodules minéralisés. Il s'agit donc bien d'un modèle de développement osseux. Matériel et méthodes. Les spécimens utilisés proviennent des chirurgies d'exérèse des ostéomes matures. Ce sont des fragments de l'ostéome et du tissu conjonctif plus ou moins fibreux enrobant la partie minéralisée des POAN. Les spécimens de tissu sont dès leur excision placés dans un milieu de transport (Hank's Balanced Salt Solution) à 4 C. La mise en culture des explants survient deux à trois heures après la collecte des spécimens. Les fragments de tissus sont coupés en morceaux de 1 à 2 mm de côté, placés dans des boites de culture 6 puits, à raison de 20-25 morceaux par puits, et recouverts chacun d'une goutte d'une goutte de sérum foetal de veau, puis placés dans un incubateur en atmosphère humide, à 37 C et 5% C02, pendant une heure, afin de permettre une bonne adhésion des explants au fond de la boite de culture. Puis les explants sont recouverts du milieu de culture destiné aux explants, à savoir DMEM + 20% SVF + pénicilline/streptomycine. Le milieu de culture est changé deux fois par semaine. Lorsque les cellules issues des explants ont recouvert le fond du puits de culture, les explants sont retirés, les cellules sont décollées à l'aide de trypsine, comptées, et ensemencées dans des boites de culture de 24 puits à raison de 2000 cellules par puits dans un milieu dit"de minéralisation"constitué de DMEM, 10% SVF, béta glycérophosphate, L acide ascorbique, pénicilline/streptomycine. Le milieu de culture est changé deux fois par semaine. À 10 jours, 20 jours, 30 jours, et 44 ou 55 jours, le milieu de culture dit"de minéralisation"est remplacé pour 24 heures par du DMEM sans sérum foetal de veau, et à la fin de ces 24 heures, différentes opérations sont réalisées dans les différents puits de culture (figure 1). Dans certains puits, les cellules sont comptées, puis lysées, le lysat centrifugé, , puis lysées, le lysat centrifugé, le surnageant congelé, décongelé, et l'activité phosphatase alcaline mesurée en spectrophotométrie à 405 nanomètres grâce à la réaction au p-nitrophénol phosphate. Sur d'autres puits sont effectués soit un marquage cytochimique de l'activité phosphatase alcaline à l'aide de napthol phosphate et de Fast Blue BB, soit une coloration de Von Kossa identifiant les zones minéralisées. Dans d'autres puits encore, les ARN messagers sont extraits à l'aide de Trizol (1 ml par puits de boîte de 24 puits). Ceux-ci subissent alors une reverse transcription, puis les produits de cette transcription sont amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR-Polymerase Chain Reaction) à l'aide des amorces (primers) appropriées à chacun des marqueurs précités. Activité phosphatase alcaline Les cellules sont lysées à l'aide d'un tampon Tris 10mM, ImM MgCh, 20llM ZnCL, 0,02% (v/v) NaN3, 0,1% Triton X100, le lysat centrifugé, le surnageant congelé, décongelé, et l'activité phosphatase alcaline mesurée sur le surnageant en spectrophotométrie à 405 nanomètres grâce à la réaction au p-nitrophénol phosphate. A cet effet, une quantité de surnageant correspondant à 5000 cellules est incubée 10 minutes à 37 C en présence de p-nitro-phényl-phosphate (pnPP, Sigma) dans un tampon AMP (2-amino-2-méthyl-1-propanol) 0,5M pH 10 enrichi en MgC12 2mM. (Sabobkar, A., et al., 1994, A rapid, quantitative assay for measuring alkaline phosphatase activity in osteoblastic cells in vitro, Bone Miner 27 ; 57-67). La réaction est conduite dans des microplaques 96 puits et la densité optique du produit de la réaction est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre Microplate Reader Model 550 BioRad. Les résultats sont exprimés en pmoles de pnPP hydolysées par minute et par cellule. L'étude des cinétiques d'inactivation de l'enzyme par la chaleur et le lévamizole permet de vérifier qu'il s'agit bien de l'isoforme de l'enzyme que l'on doit trouver dans les tissus osseux (15) (Nefussi, J. R., et al., 1985, Mineralization in vitro of matrix formed by osteoblasts isolated by collagenase digestion Differentiation 2P ; 7-7). Un marquage cytochimique de l'activité phosphatase alcaline est réalisé sur les puits fixés à 11 jours, 21 jours et 31 jours, à l'aide du kit Sigma 85L1 (réaction au napthol phosphate en présence de Fast Blue BB). Minéralisation La présence de minéralisation à la fin de la culture (45 ou 56 jours) est révélée grâce à une coloration de Von Kossa (application d'une solution acqueuse de nitrate d'argent à 5% une demi heure à l'abri de la lumière, rinçage à l'eau distillée, puis exposition aux UV jusqu'à l'apparition de la coloration brun-noir caractéristique). Biologie moléculaire Extraction des ARN totaux à partir de cellules Les cellules de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome sont récupérées dans 1 ml de TRIzol Reagent (Gibco BRL). Puis deux cents Ill de chloroforme sont ajoutés. Le tout est agité pendant 15 secondes et mis à incuber à température ambiante pendant 2 à 3 minutes. Après centrifugation (15 minutes, 4 C, 12000g), l'ADN et les protéines restent dans la phase inférieure et les ARN sont contenus dans la phase aqueuse supérieure. Cette phase est délicatement reprise, traitée par 0.5 ml d'isopropanol 100% et mise à précipiter (10 minutes, 4 C, 12000g), ce culot est décanté, séché (bain à sec 65 C) et resuspendu dans 15 à 20 u. I d'eau stérile. La qualité et la pureté des ARN sont contrôlées par électrophorèse sur gel d'agarose 0.7% et leur concentration est estimée par la densité optique mesurée par spectrophotométrie (260 nm). Extraction des ARN totaux à partir du tissu L'enveloppe conjonctive de l'ostéome est congelée dans de l'azote liquide. Ce tissu est broyé en fine poudre (Cryobroyeur à azote liquide, Certi Prep 6750) et 50-100 mg de poudre sont homogénéises dans 1 ml de TRIzol Reagent (Polytron). Après centrifugation de cet homogénat à 12000g pendant 10 minutes à 4 C, les échantillons sont traités selon le protocole extraction des ARN totaux à partir de cellules à l'exception près que la précipitation des ARN s'effectue dans 0.25 ml d'isopropanol et 0.25 ml d'une solution 0.8 M de sodium citrate et 1.2 M de NaCI. RT-PCR L'expression des ARNm de l'ostéocalcine, du collagène de type I, de type II et de type X, de Cbfal-osf2 et du VEGF est estimée grâce à une amplification en chaîne par une Taq ADN polymérase (Gibco BRL) après transcription inverse. Les ARNm sont trancrits en ADN complémentaire par action d'une trancriptase inverse (M-MLV, Gibco BRL) en présence d'oligonucléotides poly-dT dans un volume final de 18 uL Trois u. I de la solution contenant l'ADN complémentaire sont amplifiés par action d'une Taq ADN polymérase avec des amorces spécifiques des gènes de l'ostéocalcine, du collagène de type II et de type X, de Cbfal/osf2 et du VEGF. ostéocalcine, amorce sens : 5'-GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG-3', amorce antisens : 5'-GGGAAGAGGAAAGAAGGGTG-3' ; phosphatase alcaline, amorce sens : 5'-TGGGAGATGGGATGGGTGTC-3', amorce antisens : 5'-GGGTCAAGGGTCAGGAGTTC-3' ; collagène de type I, amorce sens : 5'-CACCCACCGACCAAGAAACC-3', amorce antisens : 5'-ATCCAAACCACTGAAACCTC-3' ; collagène de type II, amorce sens : 5'-TGGAGACTGGCGAGACTTGC-3', amorce antisens : 5'-AATGATGGGGAGGCGTGAGG-3' ; collagène de type X, amorce sens : 5'-GACACATTCTTCATTCCCT-3' ; amorce antisens 5'-CCATTTTCACCTCTTTTTTCC-3' ; Cbfal, amorce sens : 5'-CTTCATTCGCCTCACAAACA-3', amorce antisens : 5'-TGATGCCATAGTCCCTCCTT-3' ; VEGF, amorce sens : 5'-CCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3', amorce antisens : 5'-CTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3'). Le milieu d'amplification contient 10 mM de dNTP, du tampon PCR IX (10 mM de Tris HCI, pH8. 3,50 mM KCI), 1.5 mM de MgC12 et 1.25 U de Taq DNA polymérase (Gibco BRL). Les échantillons sont incubés dans un thermocycleur (icycler, BIO RAD). Une étude préliminaire a permis de déterminer la quantité d'ARN transcrite pour obtenir un signal sur gel soit 500 ng d'ARN. Chaque cycle d'amplification est composé de 30 secondes de dénaturation à 95 C, d'une minute d'hybridation des amorces à 55 C pour les collagènes de type II et X et Cbfal/osf2 et 60 C pour l'ostéocalcine et le VEGF, et d'une minute à 72 C pour l'amplification. Les fragments amplifiés sont séparés par une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et visualisés après incubation dans du bromure d'éthidium. La luminescence du bromure d'éthidium, qui correspond à l'amplification de chaque gène spécifique, est intégrée par le Gel Doc 1000 system (BIO RAD) et est exprimée par nombre de pixels. RESULTATS Les cellules issues des deux types de tissus prolifèrent en culture, puis finissent par former des condensations cellulaires. Ces condensations, en forme de nodule dans les cultures d'ostéome, davantage polymorphes dans les cultures de l'enveloppe de l'ostéome, minéralisent à partir de 45 jours de culture. Une activité phosphatase alcaline est présente dans les cultures et est révélée aussi bien par marquage de cette activité in situ que par mesure en spectrophotométrie. Il est à noter que la minéralisation, qui s'effectue au sein des nodules formés par les cellules dans les cultures d'ostéome, prend une forme composite dans les cultures d'enveloppe : elle est par endroits diffuse, bien que forte, et apparaît également au sein de nodules cellulaires qui semblent isolés de la couche cellulaire environnante. Les transcrits cités plus haut comme marqueurs des différents tissus retrouvés dans le processus d'ossification sont retrouvés aussi bien dans les cultures primaires que dans les cultures issues de primaires Le modèle obtenu par les inventeurs présente de nombreux avantages. Ce modèle permet l'étude fondamentale du développement osseux, ainsi que des interactions cellulaires et tissulaires qui le contrôlent. Il permet d'aborder enfin directement chez l'homme l'étude des éléments qui président à la détermination des cellules dans la voie de la formation du cartilage, puis de l'os, afin de maîtriser les processus de formation osseuse et cartilagineuse par des voies nouvelles et, à l'inverse, d'empêcher les formations indésirables. Ce modèle permet d'évaluer l'effet de toute substance sur l'expression des gènes de chacune des phases du développement osseux, et sur les éléments qui en orchestrent la régulation, et d'identifier et de contrôler les processus régulateurs du développement osseux. Cet enjeu apparaît comme encore plus important au moment où élargissant son horizon au delà de la traumatologie, la médecine considère comme un objectif maintenant possible le traitement curatif des maladies ostéoarticulaires dégénératives et des anomalies génétiques du développement osseux embryonnaire ou post embryonnaire. L'intérêt émergent pour les maladies orphelines telles que la terrible Dysplasie Ossifiante Progressive souligne la volonté de la recherche de pénétrer le plus en amont possible des phénomènes observés. La maîtrise du modèle permet d'effectuer la mise au point de traitements pour diverses maladies ou anomalies, qu'il s'agisse d'influer : sur les formations osseuses en excès : trop d'os : ankyloses, réparations osseuses vicieuses, Para-Osteo-Arthropathies Neurogènes (POAN) ; sur les insuffisances de formation osseuse : manque d'os , chirurgie des prothèses et complications post-opératoires afférentes ; sur les pathologies touchant le cartilage ; sur les reconstructions maxillaires et bucco-dentaire ; sur un grand nombre d'affections voisines, impliquant des formations osseuses anormales : - d'origine traumatique - d'origine génétique (maladie de l'homme de pierre) - associées à diverses maladies générales d'origine infectieuse (tétanos, poliomyélite et autres infections) sur certaines maladies cardio-vasculaires qui présentent une ossification des artères, telles que celles trouvées dans les cas d'athérosclérose, première cause de mortalité dans les pays développés. De plus, la culture de cellules issues de POA permet d'obtenir des cellules osseuses stables utilisables pour les applications ci-dessus. En effet, les différentes formes d'ossifications hétérotopiques, et plus particulièrement parmi celles-ci les POA constituent les seules circonstances où l'os obtenu se maintient quelles que soient les conditions : toutes les formes d'os obtenues par induction, par exemple à l'aide de protéine morphogénique osseuse-BMP, Bone Morphogenetic Proteinrecombinante sont résorbées dans le temps dès que disparaît l'agent inducteur ou le stimulus mécanique approprié. Le modèle développé par les inventeurs permet en outre de mieux comprendre les processus permettant le maintien de l'os obtenu, et d'obtenir la prévention, ou l'arrêt des maladies osseuses dégénératives. Comme indiqué plus haut, la progression séquentielle des étapes inclut la prolifération des cellules, leur hypertrophie, l'invasion vasculaire, la mort cellulaire des chondrocytes hypertrophiques (ou leur transdifférenciation), la minéralisation de la matrice extracellulaire, et le remplacement du cartilage par l'os et la moelle. Ainsi, les chondrocytes représentent une part importante de l'ossification enchondrale. La morphogenèse du cartilage est le point clé du développement de l'os du squelette, et de la plupart des formations osseuses ectopiques, mais malheureusement le phénotype cartilagineux est éphémère dans les épiphyses, et sauf à envisager de prélever un fragment de membre chez un embryon ou une jeune enfant, ou encore un cal de fracture chez un adulte, ce qui est éthiquement inconcevable, ces phénomènes ne peuvent être étudiés chez l'homme. Dans les POA, une part des tissus apparaît "figée"aux différentes étapes du développement osseux. Le modèle permet ainsi l'étude des mécanismes qui contrôlent la progression de la maturation des tissus. Il est possible désormais par exemple d'étudier la possibilité d'empêcher le remplacement du cartilage par de l'os, comme dans l'arthrose, ou bien encore de bloquer la voie de différenciation des cellules vasculaires dans les plaques d'athérome. De plus les résultats obtenus permettent de généraliser l'étude des phénomènes mis en jeu à d'autres modèles pathologiques, notamment ceux liés aux vaisseaux. Les observations déjà effectuées permettent de postuler l'existence d'une étroite relation entre les phénomènes étudiés et un développement particulier de la micro circulation. On peut ainsi disposer d'un modèle supplémentaire dédié à l'étude de processus mis en jeu dans la vascularisation. Les études effectuées sur le cartilage ont en effet depuis longtemps fourni des résultats importants concernant le contrôle de l'angiogenèse. Compte tenu du lien étroit entre l'athérosclérose et la formation osseuse, le modèle obtenu sera également utile pour ces études. Le modèle sera également utile pour étudier chez l'homme le lien des pathologies sources du modèle obtenu avec les lésions du système nerveux central permet d'étudier les relations entre le développement osseux et le développement du système nerveux. De telles études dans des modèles animaux ont montré que des neuromédiateurs étaient capables d'exercer des actions variées sur la formation osseuse. Bibliographie 1) KAPLAN F. S., GANNON F. H., HAHN G. V., WOLLNER N., PRAUNER R. Pseudomalignant heterotopic ossification, Clin. Orthop. Rel. Res. 1998 ; 346 : 134-140 2) COHEN R. B., HAHN G. V., TABAS J. A., PEEPERS J., LEVITZ C. I., SANDO A., SANDO N., ZASLOFF M., KAPLAN F. S, The natural history of heterotopic ossification in patients who have ibrodysplasia Ossificans Progressiva, J. 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Système de culture selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation des ostéomes mis en culture. 4. Système de culture selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de cellules osseuses, exprimant le collagène de type I, et un ensemble de cellules ostéoblastiques, exprimant le Cbfal. 5. Système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation du tissu fibreux mis en culture. 6. Système de culture selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend : un ensemble de chondrocytes non différenciés exprimant le collagène de type II ; un ensemble de cellules représentatives des premiers stades de la formation du cartilage et de la plaque de croissance, exprimant le Cbfal ; un ensemble de chondrocytes hypertrophiques, exprimant le collagène de type X et le VEGF. 7. Procédé de détermination du stade de différenciation d'au moins un ensemble de cellules osseuses du système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'il comprend une étape de mesure de l'expression d'au moins un facteur représentatif du stade de différenciation dudit ensemble. 8. Procédé de culture in vitro de cellules osseuses caractérisée en ce qu'il comprend l'étape de mise en culture d'un tissu osseux atteint de Para Ostéo Arthropie Neurogène (POAN) préalablement prélevé, dans un milieu de culture approprié pour la différenciation de cellules du prélèvement, le cas échéant jusqu'à la formation de zones minéralisées. 9. Procédé de sélection de substances actives sur l'activité de cellules osseuses caractérisé en ce qu'il comprend : la préparation d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ; l'addition d'au moins une substance testée au système de culture, à au moins un stade de différenciation des cellules mises en culture ; la mesure de l'effet de la substance sur le développement et/ou la différenciation des cellules aux différents stades de différenciation. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la substance est une substance régulatrice du développement et/ou de la différenciation des cellules cultivées. Il. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la substance est une substance modulant l'expression de gènes à au moins un stade du développement osseux. 12. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie du cartilage, d'un formation osseuse en excès, insuffisante ou anormale. 13. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné à la reconstruction maxillaire et bucco-dentaire. 14. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies cardio-vasculaires impliquant une ossification des vaisseaux. 15. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies nécessitant une greffe osseuse.