FR 2822156 A1 20020920 FR 0103619 A 20010316 OLIGONUCLEOTIDES POUR LA REGULATION DU GENE CODANT POUR LE TNFa ET/OU DE GENES SOUS SON CONTROLE ET LEURS APPLICATIONS L'invention a pour objet des oligonucléotides capables de réguler le gène codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha (TNFa en abrégé) et/ou de gènes sous son contrôle, et leurs applications en diagnostic, et en thérapeutique et comme outils de recherche. Le TNFa est une cytokine pro-inflammatoire qui module la croissance, la différenciation et la fonction d'un grand nombre de types cellulaires, d'où un large spectre d'activités biologiques. Il est impliqué dans la physiopathologie de nombreuses affections, en particulier les maladies inflammatoires chroniques, comme la polyarthrite rhumatoïde. En effet, le TNFa joue un rôle central dans l'inflammation synoviale et la destruction ostéo-cartilagineuse qui caractérise cette maladie où la pérennisation de l'inflammation est liée à un excès de production de cytokines pro-inflammatoires comme les interleukines 1 (3 (IL1R), 6 (IL6), et 8 (IL8). Le TNFa joue également un rôle central dans les pathologies immunitaires et tumorales et son action sur le système nerveux central est à l'origine de fièvre, d'anorexie et d'amaigrissement. Son inhibition spécifique constitue donc l'un des objectifs majeurs dans une perspective thérapeutique et pour la compréhension de la physiopathologie de ces affections. Une démonstration en a été fournie par les effets cliniques bénéfiques obtenus par l'administration d'anticorps monoclonaux chimériques anti-TNFa (1) ou de récepteurs solubles du TNFa chez des sujets atteints de polyarthrite rhumatoïde. Il a été également montré par des études expérimentales chez le rat que la neutralisation on l'inhibition de la production de TNFa conduisait à la diminution de la production de l'ILlp et par conséquent à celles de l'IL6 et de l'IL8 (2). Cependant, l'intérêt pratique de l'utilisation d'anticorps anti-TNFa ou de récepteurs solubles semble être limité dans le traitement au long cours de la polyarthrite rhumatoïde. Une autre approche consiste à inhiber l'expression du gène du TNFa à l'aide d'oligonucléotides en vue de thérapies géniques. On a ainsi rapporté l'élaboration d'oligonucléotides antisens capables de réduire la traduction du TNFa. A cet égard, divers travaux ont montré l'efficacité et la sélectivité d'oligonucléotides antisens dirigés contre les ARNm des cytokines, des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion, des enzymes de biosynthèse des médiateurs de l'inflammation (3) et (4). L'utilisation d'oligonucléotides formant des triples hélices a également montré son efficacité in vitro dans l'inhibition de l'expression des gènes, comme ceux codant pour les oncogènes humains c-myc, c-erbB, Ha-ras, HER-2/neu. Des oligonucléotides anti-gènes, permettant de réduire la transcription du gène codant pour TNFa, ont également été décrits (5). Dans d'autres travaux, les oligonucléotides ont été utilisés pour induire la coupure de l'acide nucléique cible (stratégie ribozyme), ou pour agir comme ligand compétitif d'une protéine vis-à-vis de sa cible naturelle d'acide nucléique (stratégie leurre). En s'autostructurant, un oligonucléotide peut également reconnaître spécifiquement une protéine par effet aptamère. Les recherches des inventeurs dans ce domaine ont porté sur l'élaboration d'oligonucléotides capables d'inhiber non seulement le gène codant pour le TNFa chez les Mammifères, y compris chez l'Homme, mais également de gènes sous son contrôle. Leurs travaux ont ainsi montré qu'en concevant des oligonucléotides de séquence déterminée, il était possible d'atteindre de tels résultats à très faible dose. Ainsi, sur des cellules en culture, des doses efficaces de tels oligonucléotides se situent dans une gamme de concentration de l'ordre du nanomolaire, alors que les doses rapportées dans l'art antérieur pour bloquer la production de TNFa sont de l'ordre du micromolaire. L'invention vise donc de nouveaux oligonucléotides pour inhiber la transcription du gène TNFa et de gènes sous son contrôle. Elle a également pour but les applications de ces oligonucléotides pour de telles inhibitions, en diagnostic, recherche et thérapeutique. Les oligonucléotides de l'invention sont capables'"de moduler directement ou indirectement l'expression des gènes codant pour le TNFa et/ou de gènes sous son contrôle. Ces oligonucléotides sont caractérisés en ce qu'ils comportent : - une partie constante-GGGGNGGG-, où N = T, A ou U, orientées de 5'vers 3'ou de 3'vers 5', complémentaire d'une séquence cible, - deux parties variables, situées de part et d'autre de la partie constante, conférant aux oligonucléotides une spécificité d'interaction directe ou indirecte avec une cible donnée, pour une espèce. Cette cible est constituée par une séquence d'acide deoxyribonucléique, ribonucléique, ou une protéine interagissant directement ou indirectement avec cette séquence. Il s'agit par exemple d'une cible située sur le brin codant ou non codant de l'ADN ou de l'ARN des organismes vivants, eucaryotes, procaryotes et des virus. Dans le cas de l'ADN des eucaryotes, nucléaire ou extranucléaire, la séquence cible peut être intronique, exonique ou chevaucher les deux types d'ADN. En variante, la cible est constituée par une double hélice d'acide nucléique comportant au minimum la séquence : 5'-CCCCGCCC-3', ou 3'-GGGGCGGG-5'. Si les interactions entre les oligonucléotides et la cible duplex font intervenir des liaisons hydrogène, ces dernières peuvent être de type Watson-Crick parfaites ou imparfaites, de type Hoogsteen ou inversées ou autres. Elles sont formées éventuellement avec l'un des brins ou les deux brins du duplex. Cette cible, dans le cas du gène humain codant pour le TNFa, est située dans le promoteur, en amont du codon d'initiation de la transcription et de la boîte TATA, et en position 563-570 de la séquence nucléotidique (numéro d'accession X02910 et X02159 de la Gene Bank) publiée par Nedwin et col. (6). Compte tenu du rôle de la boîte TATA dans le mécanisme transcriptionnel et de la distance entre la cible et cette boîte, l'interaction d'un oligonucléotide avec cette cible peut alors conduire à une réduction de la transcription. En effet, cette interaction des oligonucléotides avec la cible peut inhiber la fixation d'une protéine de régulation indispensable à l'expression du gène cible (facteur de transcription par exemple). Cette interaction peut également introduire des dommages irréversibles (coupures, cross-links) dans la molécule d'ADN, la rendant inapte, localement, pour l'expression génétique. Chez les autres mammifères et toujours dans le cas du gène codant pour le TNFa, cette cible est également retrouvée dans le promoteur en amont de la boîte TATA. Ainsi, chez les Muridae (par exemple chez Mus musculus BALB/c), cette cible est en position 934-941 de la séquence nucléotidique (numéro d'accession U68415 de la Gene Bank) publiée par Iraqi et Teale (7). Chez les Bovidea (par exemple chez Bos taurus), la cible est en position 1131-1138 de la séquence ayant pour numéro d'accession AF011926 de la Gene Bank. Chez les Hominidea (par exemple chez Pan troglodytes), la cible est en position 344- 351 de la séquence ayant pour numéro d'accession U42626 de la Gene Bank. Il est possible que les oligonucléotides de la présente invention n'interagissent pas directement avec la cible constituée par l'acide nucléique, mais avec une des protéines impliquées dans la reconnaissance de cette cible et/ou la régulation de la transcription du gène TNFa. La partie constante est complémentaire de la séquence cible, c'est-à-dire qu'une guanine de la séquence de l'oligonucléotide correspond à une cytosine de la séquence cible, et qu'une guanine de la séquence inversée de l'oligonucléotide correspond à une cytosine dans la séquence de la cible. Mais la cytosine, complémentaire de la guanine, est remplacée dans la séquence de l'oligonucléotide par une autre base pyrimidique, la thymine, ou par une base purique, l'adénine ou l'uracile. On notera que deux orientations sont possibles. La séquence des deux parties variables sera déterminée par la séquence du gène dont on souhaite moduler l'expression. Pour moduler l'expression du gène codant pour le TNFa chez les Hominidae, par exemple chez l'Homme ou le Chimpanzé, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences AAGAAA et AGGAGAG, situées, respectivement du côté 5'et du côté 3'dans le sens 5'-3', ou du côté 3'et du côté 5'dans le sens 3' Pour moduler l'expression du gène codant pour le TNFa chez les Muridae, par exemple chez le rat ou la souris, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences TCGAAAA et AGAAGG, situées, respectivement du côté 5'et du côté 3'dans le sens 5'-3', ou du côté 3'et du côté 5'dans le sens 3' Les oligonucléotides ainsi conçus peuvent également interagir non pas avec le gène TNFa mais avec des facteurs de transcription. En effet, la séquence AAGAAAGGGNGGGGGAGAG est par exemple reconnue par les facteurs de transcription GKLF (Gut-enriched Krueppel Like-Factor), le MZF1 (Myeloid Zinc Finger protein 1) ou le Spl (Stimulating protein 1). Le choix des deux parties variables complémentaires sur au moins 4 nucléotides donnera des oligonucléotides qui présenteront une structure dite"en épingle à cheveux". Dans ce cas, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences NNNNNNNCCCCAA et GGGGNNNNN situées respectivement du côté 5'et du côté 3'dans le sens 5'-3'ou du côté 3'"et du côté 5'dans le sens 3*5'de la partie constante. N peut être T, A, C, G ou U. Les oligonucléotides ainsi conçus interagiront avec les protéines cibles par reconnaissance structurale. De manière avantageuse, les oligonucléotides de l'invention comprennent de 8 à 30 nucléotides, de préférence de l'ordre de 20 nucléotides, notamment 21 nucléotides. Les oligonucléotides de l'invention peuvent comporter des modifications de leurs chaînes phosphodiester ou/et de groupements réactifs additionnels localisés à leurs extrémités. Ces modifications introduites dans les oligonucléotides ont pour but d'augmenter la résistance de ces molécules à la dégradation nucléolytique, et/ou de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, et/ou de permettre des réactions de dégradation/modification spécifiques des cibles ADN, et/ou d'accroître leur pénétration intracellulaire, et/ou d'améliorer la traversée des membranes biologiques. Les exemples suivants de modifications ou de substitutions sont donnés à titre illustratif et ne constituent pas une limitation à la présente invention. Les modifications ou substitutions incluent les N-alkylphosphoramidates, les phosphorothioates, les phosphotriesters, les méthylphosphonates, les courtes chaînes alkyl, les hétéroatomes, les ponts inter-sucres cycloalkyls ou hétérocycliques. Les liaisons phosphodiesters du squelette oligonucléotidique peuvent être remplacées par des liaisons 3'-5'phosphoramidates ou par des liaisons, les polyamides, les bases nucléiques sont alors liées directement ou indirectement à l'azote aza du polyamide. Les modifications ou substitutions peuvent également intervenir en position 2'des parties glucidiques des oligonucléotides, comprenant l'une des substitutions suivantes : OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3' OCH30 (CH2) nCH3, 0 (CH2) nNH2, 0 (CH2) nCH3, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, 0-alkyl, S-alkyl, N-alkyl, 0-alkenyl, S-alkényl, N-alkényl, SOCH3, S02CH3, ON02, N02, N3, NH2, hétérocycloalkyl, hétérocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, silyl substitué, un groupe ARN clivable, un groupe reporter, un groupe améliorant les propriétés pharmacocinétiques des oligonucléotides, un groupe améliorant les propriétés pharmacodynamiques des oligonucléotides ou d'autres substitutions ayant les même propriétés. Les modifications incluent également celles de type 2'-méthoxyéthoxy (2'-0CH2CH20CH3), 2'-méthoxy (2'-0-CH3) ou 2'propoxy (2'-O-CH2CH2CH3). Toutes les modifications en position 2'des sucres nucléiques énoncés précédemment peuvent avoir lieu en position 3'des sucres, en position 3'du nucléotide terminal ou 5'du nucléotide terminal. Les oligonucléotides peuvent également avoir des sucres mimiques, comme des cyclobutyls à la place des pentofuranosyls, des sucres dérivés du xylose, des sucres en conformation bloquée, des isomères de forme D-ou L-. La substitution ou la modification des bases nucléiques par des bases universelles (comme l'hypoxanthine) peut également avoir lieu. Les nucléotides peuvent être d'anomérie a au lieu du (3 comme dans les acides nucléiques naturels. Les parties lipophiles peuvent être greffées aux oligonucléotides de la présente invention. Ces substitutions ont pour but de modifier la charge et/ou l'hydrophilie des oligonucléotides afin d'augmenter le passage des membranes biologiques. Ces parties lipophiles incluent par exemple le cholestérol, un groupement cholestéryl, l'acide cholique, les thioéthers (hexyl-S-tritylthiol, par exemple), le thiocholestérol, les chaînes aliphatiques (dodécandiol ou des résidus undécyls, par exemple), des phospholipides (dihexadécyl-racglycéro-3-H-phosphonate, par exemple), des chaînes polyamines ou polyéthylène glycol, l'acide adamantane acétique, un groupement palmityl, un groupement octadécylamine ou hexylamino-carbonyl-oxycholestérol. Des groupements peuvent être substitués pour faciliter la détection des oligonucléotides. Des peptides peuvent être liés de façon covalente aux oligonucléotides de la présente invention pour aider à la reconnaissance d'organes, de tissus ou de types cellulaires. Toutes ces modifications ou substitutions peuvent évidemment être combinées entre elles. Elles peuvent concerner tous les nucléotides ou seulement certains d'entre eux. Les oligonucléotides de la présente invention peuvent être une partie d'un ADN ou d'un ARN circulaire ou circularisable. L'étude des oligonucléotides de l'invention a permis de mettre en évidence leur efficacité et leur spécificité pour moduler l'expression des gènes codant pour des produits exerçant des effets pathogènes chez les humains et les animaux, plus particulièrement du gène codant pour TNFa, ou de gènes sous son contrôle. L'invention vise donc des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un oligonucléotide tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions sont utilisables à titre curatif ou prophylactique. Le traitement d'un (e) patient (e) ayant besoin de ce type de thérapie repose sur l'administration d'une forme pharmaceutique de l'oligonucléotide à des doses comprises entre O, Olg et 100 g par kg de poids du (de la) patient (e). Le choix de la dose dépendra de l'âge du (de la) patiente, de la sévérité des atteintes et de la nature de la pathologie. La fréquence d'administration peut être de une ou plusieurs fois par jour, à une fois tous les vingt ans. Après le traitement, le (la) patient (e) est suivi (e) pour évaluer les améliorations intervenues dans son état pathologique et les symptômes. Compte tenu de ces observations, les doses pourront alors être augmentées dans le cas où le (la) patient (e) ne répond pas significativement au traitement, ou diminuées dans le cas inverse. Dans certains cas, il est préférable de traiter le (la) patient (e) avec les oligonucléotides de la présente invention en association avec les thérapies conventionnelles déjà existantes, afin d'augmenter l'efficacité du traitement. Après le succès du traitement, il est parfois nécessaire d'administrer au (à la) patient (e) des doses d'entretien, afin d'éviter la réapparition des symptômes et une rechute. Dans ce cas, les doses administrées seront comprises entre 0,01 ag et 100 g par kg de poids du (de la) patient (e) à des fréquences pouvant aller d'une à plusieurs fois par jour, jusqu'à une fois tous les 20 ans. Les voies d'administration de la préparation (ou formule) pharmaceutique des oligonucléotides de la présente invention varieront selon qu'un traitement local ou systémique est souhaité. Les administrations seront alors transmuqueuses (voie ophtalmique, voie vaginale, voie rectale, voie intranasale, voie pulmonaire, voie sublinguale) orales, cutanées ou parentérales. Les administrations parentérales peuvent être en épidurales, en intraveineuses (directe ou perfusion), en sous-cutanées, en intrapéritonéales, en intrathécales, en intracardiaques, en intramusculaires ou en intra-articulaires. La mise en forme galénique et le conditionnement que devront subir les oligonucléotides afin de constituer des médicaments dépendront des voies d'administration. Dans le cas des administrations transmuqueuses et cutanées par exemple, les oligonucléotides peuvent être administrés sous forme de lotions, de crèmes, de pommade, de gouttes, de suppositoires, de liquides, de poudres, en aérosol. Les oligonucléotides peuvent également être administrés à l'aide de dispositifs actifs (mécanique ou électrique) ou passifs. Les excipients seront des composants sans action pharmacologique mais nécessaires à la fabrication, à l'administration ou à la conservation des oligonucléotides de la présente invention. Dans le cas d'une administration orale, les oligonucléotides de la présente invention peuvent être administrés par exemple sous forme de poudre, de granule, de capsule, de cachet, de comprimé, gélule, de tablette ou de suspension en solution aqueuse ou non. Les administrations parentérales peuvent se faire sous forme de solution aqueuse stérile qui pourra contenir des tampons ou d'autres additifs. Des dispositifs actifs (mécaniques ou électrique) peuvent également être utilisés. Le dosage des préparations pharmaceutiques dépendra de la sévérité et de la réponse au traitement de la pathologie à traiter. Les doses optimales à administrer aux patient (e) s dépendront de l'activité pharmacologique des oligonucléotides. Cette activité est en général déterminée in vitro ou in vivo sur des modèles expérimentaux d'animaux par les doses efficaces 50 (des). Le modèle inflammatoire de polyarthrite expérimentale chez le rat par adjuvant complet de Freund (ACF) est un modèle largement utilisé pour l'évaluation de l'activité pharmacologique des médicaments anti-rhumastismaux. L'activité pharmacologique des oligonucléotides de la présente invention peut être ainsi évaluée dans ce modèle. Les paramètres qui seront pris en compte pour déterminer cette activité pharmacologique seront : - La fièvre ; - L'oedème des pattes postérieures ; - La fonction locomotrice ; - L'intégrité du cartilage, en analysant la biosynthèse des protéoglycannes et la dégradation de ces derniers dans le cartilage patellaire ; - La production de TNFa au niveau systémique et local. L'invention vise également l'utilisation des oligonucléotides définis ci-dessus comme outils pour la recherche et pour le diagnostic. Elle utilise ainsi une méthode de diagnostic où les oligonucléotides de la présente invention, inclus ou non dans un kit, sont utilisés pour rendre compte de l'accumulation associée à un processus pathologique d'un facteur transcriptionnel actif. Les processus physiologiques sont intimement liés à l'activité transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes. Cette transcription dite physiologique des gènes est quant à elle dépendante de l'équilibre entre l'état actif ou inactif d'un nombre restreint de facteurs transcriptionnels. Un processus pathologique est souvent associé à une augmentation ou une diminution du nombre de facteurs protéiques transcriptionnels actifs. Les oligonucléotides de la présente invention en solution ou sur un support fixe, simple brin ou double brin, couplés ou non à un traceur comme un fluorophore, un chromophore ou une enzyme, peuvent être utilisés pour quantifier un facteur transcriptionnel actif. On a ainsi rapporté qu'un oligonucléotide en solution couplé à un fluorophore nommé "Molecular Beacons"en interagissant avec une protéine produisait une fluorescence aisément quantifiable par les méthodes courantes de spectrofluorométrie (16). Il a également été rapporté qu'un oligonucléotide double brin fixé sur un support solide pouvait être utilisé pour quantifier l'interaction protéine-acide nucléique lors d'un criblage à haut débit (17). En recherche et en développement, les oligonucléotides de la présente invention, inclus ou non dans un kit, sont utilisés pour étudier des mécanismes physio-pathologiques au niveau cellulaire et/ou moléculaire. Ils peuvent être ainsi utilisés pour évaluer l'impact d'un certain nombre de molécules sur ces mêmes mécanismes physio-pathologiques. Entrent également dans le champ de protection de l'invention, les kits renfermant les oligonucléotides définis ci-dessus et les réactifs nécessaires pour la réalisation de recherches et de diagnostics. Dans ces kits, les oligonucléotides sont en solution ou sur un support, simple brin ou double brin, couplés ou non à un traceur, comme un fluorophore, un chromophore, ou une enzyme. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent avec référence aux figures 1 à 5, qui représentent, respectivement : - la figure 1 : l'effet de l'interféron-gamma (IFN) et du lipopolysaccharide (LPS) sur la production de TNFa dans les cellules THP-1. Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants l'écart type. ND, non détectable ; *, significativement différent des cellules sans traitement (p avec l'IFN (10 ng/ml) + LPS (10 fJ. g/ml). Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants I l'écart type. ND, non détectable ; *, significativement différent des cellules 2 h (p stimulées avec l'association LPS-IFN (10 ig/ml-10 ng/ml)."'Il s'agit de l'oligonucléotide 21T, qui comporte une partie constante orientée de 5'vers 3', contenant N = T ; et deux parties variables AAGAAA et AGGAGAG, situées respectivement du côté 5'et du côté 3'dans le sens 5'-3'Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants I l'écart type ; *, significativement différent des cellules contrôles (p Synthèse des oligonucléotides Les oligonucléotides sont synthétisés par voie chimique selon les méthodes classiques et en utilisant des équipements et appareillages existant sur le marché. Traitement des cellules humaines Les résultats rapportés dans les exemples ont été obtenus avec une lignée cellulaire humaine monocytaire car les monocytes constituent la source majeure de TNFa dans la réaction inflammatoire. Il s'agit de la lignée cellulaire THP-1 provenant d'un enfant de 1 an atteint d'une leucémie monocytaire aiguë. Cette lignée présente une morphologie monocytaire et se différencie en macrophage (8). Le lipopolysaccharide et l'interféron gamma qui constituent de puissants inducteurs de cytokines, ont été utilisés comme molécules inductrices. La lignée monocytaire humaine THP-1 (ECACC, Cerdic, France) est mise en culture dans du milieu RPMI 1640, supplémenté par 2 mM L-glutamine, 100 UI/ml pénicillin-e, 100 g/ml streptomycine, 0, 25 u. g/ml fungizone, 10% (v/v) de sérum de veau foetal décomplémenté à 56 C pendant 30 minutes (tous les produits proviennent de Life Technologies, France). Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37 C en atmosphère humide contenant 5% de COz. Pour les différentes expériences, les cellules sont mises en culture dans des plaques de 24 puits (Costar, France) à la densité de 106 cellules/puits. La production de TNFa est induite en traitant les cellules THP-1 avec un mélange de lipopolysaccharide (LPS) d'Escherichia coli 055 : B5 (Sigma, France) et d'interféron gamma humain (IFN ; Tebu, France). L'action en synergie de ces deux facteurs induit une surexpression du gène TNFa dans les cellules THP-1 (9). Les cellules sont déposées sous un volume de 0, 5 ml/puits de milieu de culture complet, incubées durant 18 heures à 37 C, puis on ajoute 0,5 ml de milieu complet contenant : - soit différentes concentrations (0, 1-10 u. g/ml) de LPS (le LPS est dissous dans du DMSO ; concentration finale 0, 1% v/v) ; - soit 10 ng/ml d'IFN (dissous dans le milieu) ; soit 10 ng/ml d'IFN en association avec différentes concentrations (0, 1-10 g/ml) de LPS. Après 18 heures d'incubation, les échantillons sont prélevés et centrifugés à 12 000 g durant 3 minutes. Les surnageants ainsi que les culots sont conservés séparément à- 80 C jusqu'à leurs utilisations respectives pour la détermination des teneurs en TNFa et pour la préparation des ARN. Les concentrations en TNFa sont déterminées par une méthode ELISA (Enzyme Immuno Sorbent Assay ; Biotrak, Amersham, France) de type sandwich. Le dosage a été utilisé selon les instructions du fournisseur en utilisant comme standard du TNFa humain. Les ARN totaux sont séparés à partir des culots cellulaires selon la méthode de Chomczynski et al. (10) à l'aide de la solution Triazol&commat; (Life Technologies, France). La synthèse des ARNm du TNFa est analysée par la méthode de transcription inverse, suivie d'une amplification en chaîne par polymérase. La séquence de l'amorce utilisée pour la transcription inverse est la suivante : RDT17 : 5'-GACTCGAGTCGACAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' La procédure pour obtenir le brin d'ADNc est la suivante (11) : ARN total..................................... 1 ig Amorce (20 uM)................................ 1 kl Eau ultra-pure stérile................ q. s. p. 20 al Le mélange est chauffé durant 10 minutes à 70 C, puis refroidi rapidement dans la glace pilée. A ce mélange sont ajoutées successivement les solutions suivantes (Life Technologies, France) : Tampon de transcription inverse............... 10 u. l dNTP (10 mM)................................. 2,5 l DTT (100 mM)................................... 5 u. l Inhibiteur de RNase............................ 1 u. l SuperScript Rnase H-transcriptase inverse..... ! u. l Eau ultra-pure stérile................. q. s. p. 50 J. ll La réaction de transcription inverse se déroule à 42 C pendant 2 heures. La réaction terminée, le mélange est dilué au 1/10 dans de l'eau ultra-pure stérile, puis conservé à -80 C. La réaction d'amplification a lieu dans le mélange réactionnel suivant : Tampon de réaction............................. 5 u. l dNTP (10 mM)................................... 1 gel Amorce en 3' (20 M)............................ 1 u. l Amorce en 5' (20 M)............................ 1 u. l MgCl2 (50 mM)................................ 1, 5 Al Solution de RT (ADNc).......................... 5 u. l Taq ADN polymérase (5 U/l).................. 0, 5 Al Eau ultra-pure stérile................. q. s. p. 50 Al La réaction d'amplification comprend trois étapes (11). Synthèse du deuxième brin d'ADNc : 94 C (dénaturation du double brin)........ 1 minute 60 C (hybridation des amorces)............ 1 minute 72 C (élongation)....................... 40 minutes Amplification de l'ADNc double brin (30 cycles) : 94C 1 minute 60 C (hybridation de l'amorce)............ 1 minute 72 C (élongation)......................... 1 minute Extension finale : 72C 10 minutes La conception des amorces pour le TNFa a été réalisée sur la base de la séquence de l'ARNm publiée (12). Les séquences des 2 amorces utilisées, sont les suivantes : TNF-F : 5'GGCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3' TNF-R : 5'TAGACCTGCCCAGACTCGGCAA-3' La conception des amorces pour la glycéraldéhyde 3phosphodésydrogénase (G3PDH), utilisée comme standard, a été déterminée sur la base de la séquence de l'ARNm publiée (13). Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes : HG3PDH-F : 5'-TATTGGGCGCCTGGTCACCAGG-3' HG3PDH-R : 5'-CTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3' L'amplification donne des produits ayant une taille de 933 pb pour la G3PDH, et 462 pb pour le TNFa. La spécificité de l'amplification a été vérifiée par la taille des produits obtenus et par séquençage des ADNc. Les produits d'amplification sont séparés sur un gel d'agarose 1% (p/v) sous un voltage constant. Le gel contient du bromure d'éthidium (0, 2 g/ml) (Life Technologies, France). La migration terminée, le gel est photographié sous U. V. (en transillumination) à l'aide d'une caméra CCD. La figure 1 donne les résultats de la stimulation de la production de TNFa. Les différentes concentrations de LPS n'ont aucun effet sur la production de TNFa dans les cellules THP-1. Par contre, l'addition de 10 ng/ml d'IFN aux trois concentrations de LPS, conduit à une augmentation dépendante de la dose de la production de TNFa. L'IFN tout seul provoque également une augmentation de la production du TNFa. Par contre, cette augmentation reste significativement inférieure à celle produite par l'association IFN-LPS. L'effet des différentes concentrations de LPS associé ou non à l'IFN sur l'expression du gène TNFa a également été étudié en mettant en oeuvre une méthode semi-quantitative, la transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne. L'expression du gène codant pour la G3PDH a été utilisée comme standard auquel les augmentations en expression du TNFa ont été rapportées. L'expression du gène codant pour la G3PDH est très peu sensible aux traitements par le LPS ou par les cytokines (14). Comme le montre la figure 2, le traitement des cellules THP-1 par le LPS provoque une légère augmentation de l'expression du gène TNFa. Le traitement par l'IFN tout seul provoque également une augmentation des ARNm du TNFa. L'association de l'IFN et du LPS conduit à une augmentation dépendante de la dose des ARNm. De plus, cette augmentation est supérieure à celle provoquée par le traitement par le LPS ou l'IFN seuls. D'autres travaux ont porté sur l'étude de la cinétique de production du TNFa par les cellules THP-1 stimulées. La figure 3 montre que le traitement des cellules THP-1 par l'association IFN-LPS (10 ng/ml IFN et 10 g/ml LPS) sur la production du TNFa provoque une augmentation dépendante du temps significative. Inhibition de la production de TNFa La transfection des cellules THP-1 est réalisée à l'aide de l'ExGen 500 (Euromedex, France) qui est un vecteur constitué par une association de polymères d'éthylèneimine (PEI) (15). Comme décrit précédemment, un million de cellules sont déposées par puits sous un volume de 0,5 ml de milieu de culture complet, incubées pendant 18 heures à 37 C et sous 5% de C02, puis 0,1 ml de solution de transfection est ajouté aux cellules, puis les cellules sont incubées pendant 4 heures à 37 C sous 5% de CO2. A la fin de cette période, 0,4 ml de solution de stimulation (10 ng/ml d'IFN + 10 ug/ml de LPS par puits dans du milieu de culture complet) est ajouté aux cellules, puis celles-ci sont incubées durant 18 heures à 37 C sous 5% de CO2. Après 18 heures d'incubation, les échantillons sont prélevés et centrifugés à 12 000 g durant 3 minutes. Les surnageants ainsi que les culots sont conservés séparément à - 80 C jusqu'à leurs utilisations respectives pour la détermination des teneurs en TNFa et la préparation des ARN. La solution de transfection est constituée par les oligonucléotides dilués aux concentrations désirées dans 0,05 ml d'une solution de NaCl 0,9% (p/v). D'autre part, 0,01 ml d'ExGen 500 est dilué dans 0,05 ml de la même solution de NaCl. Les 0,05 ml de solution de vecteur sont ajoutés aux 0,05 ml de la solution d'oligonucléotide. Le mélange est agité au vortex, centrifugé brièvement, puis incubé 15 minutes à température ambiante (temps nécessaire pour la formation du complexe oligonucléotide-vecteur). Dans un premier temps, on vérifie la pénétration de l'oligonucléotide dans les cellules THP-1, à l'aide d'un oligonucléotide 21T couplé à un label fluorescent (noté 21T*). Les résultats montrent que la transfection conduit à l'accumulation dans les cellules de l'oligonucléotide. L'étude de l'inhibition de la transcription du gène TNFa a été réalisée à l'aide de différentes concentrations de l'oligonucléotide 21T. Ces concentrations sont comprises entre 0,01 et 100 nM. La figure 4 montre l'effet de ces différentes concentrations sur la production du TNFa stimulée. Le PEI n'a aucun effet sur la production du TNFa. La stimulation des cellules THP-1 par l'association LPS-IFN provoque une augmentation significative de la production du TNFa. Cette augmentation est inhibée significativement par l'oligonucléotide aux concentrations de 0, 1 nM ; 1 nM ; 10 nM ; et 100 nM. L'expression des ARNm du TNFa a été étudiée par transcription inverse, puis amplification en chaîne par polymérase. Comme le montre la figure 5, le traitement des cellules THP-1 par l'association LPS-IFN provoque une augmentation des ARNm du TNFa, sans affecter l'expression du gène codant pour la G3PDH. Par contre, l'augmentation d'expression du gène TNFa induite par le LPS-IFN, est réduite de façon dépendante de la dose par l'oligonucléotide 21T aux concentrations de 1 nM, 10 nM et 100 nM. L'oligonucléotide 21T n'a aucun effet sur l'expression du gène codant pour la G3PDH. Afin de déterminer la spécificité de l'action de l'oligonucléotide sur la production stimulée du TNFa dans les cellules THP-1, un oligonucléotide témoin (21 mer de composition identique à 21T, mais de séquence différente) a été utilisé aux mêmes concentrations que le 21T sans aucun effet significatif sur la production stimulée de TNFa dans les cellules THP-1. De plus, les oligonucléotides 21T et le témoin aux concentrations utilisées, n'ont pas de toxicité cellulaire significative comme cela a été déterminé à l'aide de la méthode de largage dans le surnageant cellulaire de la lactate déshydrogénase. Références bibliographiques (1) Elliot MJ, Maini RN, Feldmann M, Kalden JR, Antoni C, Smolen JS, Leeb B, Breedveld FC, Macfarlane JD, Bijil H, Woody JN. Randomised double-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosis factor-a (CAC2) versus placebo in rheumatoid anthritis. Lancet 344,1105-1110, 1994. (2) Huizinga TWJ, Binkman BMN, Verweij CL. Regulation of tumor necrosis factor-a production : basic aspects and pharmacological modulation. J Rheumatol 23,416-419, 1996. (3) Hartmann G, Krug A, Moeller J, Murphy J, Albrecht R, Endres S. Specific suppression of human tumor necrosis factor- alpha synthesis by antisense oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6,291-299, 1996. (4) Braham AK, Smets P, Zalisz P. Sequence d'oligonucleotides anti-sens, anti-ARN messager du TNF alpha, procédé de préparation, application à titre de médicaments et compositions pharmaceutiques. Brevet européen EP 0 414 607 Bl, 1995. (5) Aggarwal BB, Rando RF, Hogan ME. Uses of triplex forming oligonucleotides for treatment of human diseases United States Patent, Patent number :'5, 650,316, 1997. (6) Nedwin GE, Naylor SL, Sakaguchi AY, Smith D, JarrettNedwin J, Pennica D, Goeddel DV, Gray PW. Human lymphotoxin and tumor necrosis factor genes : structure, homology and chromosomal localization. Nucleic Acids Res 13,6361-6373, 1985. (7) Iraqi F, Teale A. Cloning and sequencing of TNFa genes of three inbred mouse strains, Immunogenetics 45 (6), 459-461, 1997. (8) Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, Kobayayashi Y, Konno T, Tada K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer, 26, 171-176,1980. (9) Eperon S, Jungi TW. The use of human monocytoid lines as indicators of endotoxin. J Immunol Methods, 194,121-129, 1996. (10) Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 162, 156-159, 1987. (11) Abid A, Sabalovic N, Magdalou J. Expression and inducibility of UDP-glucuronosyltransferases 1-naphthol in human cultured hepatocytes and hepatocarcinoma cells lines. Life Sci, 60, 1943-1951, 1997. (12) Pennica D, Nedwin GE, Hayflick JS, Seeburg PH, Derynck R, Palladino MA, Kohr WJ, Agarwal BB Goeddel DV. Human tumour necrosis factor : precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature, 312, 724-729, 1984. (13) Arcari P, Martinelli R, Salvatore F. The complete sequence of full lenth cDNA for human liver glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase : evidence for multiple mRNA species. Nucleic Acids Res, 12,9179-9189, 1984. (14) Feng L, Xia Y, Garcia GE, Hwang D, Wilson CB, Involvement of reactive oxygene intermediates in cyclooxygenase-2 expression induced by interleukin-1, tumor necrosis factor-a, and lipopolysaccharide. J Clin Invest, 95, 1669-1675, 1995. (15) Boussif 0, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Schermant D, Demeneix B, Behr J-P. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo : Polyethylenimine. Proc Nati Acad Sci USA, 92,7297- 7301,1995. (16) Fang X, Li JJ, Tan W. Using molecular beacons to probe molecular interactions between lactate dehydrogenase and single-stranded DNA. Anal Biochem, 72,3280-3285, 2000. (17) Bulyk ML, Gentalen E, Lockhart DJ, Church GM. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nat Biotechnol, 17, 573-577, 1999. REVENDICATIONS 1. Oligonucléotides capables de moduler directement ou indirectement l'expression des gènes codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha ou TNFa et/ou de gènes sous le contrôle du TNFa, caractérisés en ce qu'ils comportent : - une partie constante-GGGGNGGG-, où N = T, A ou U, orientées de 5'vers 3'ou de 3'vers 5', complémentaires d'une séquence cible, - deux parties variables, situées de part et d'autre de la partie constante, conférant aux oligonucléotides une spécificité d'interaction directe ou indirecte avec une cible donnée, pour une espèce. 2. Oligonucléotides selon la revendication 1, caractérisés en ce que la cible est constituée par une séquence d'acide déoxyribonucléique, ribonucléique, ou une protéine interagissant directement ou indirectement avec cette séquence. 3. Oligonucléotides selon la revendication 2, caractérisés en ce que la cible est constituée par une double hélice 4. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que la cible, est située en amont de la boite TATA. 5. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que ladite cible est située en position 563-570 chez le gène humain codant pour TNFa, chez les Muridae, en position 934-941, chez les Bovidae, en position 1131-1138 et chez les Hominidae en position 344- 351. 6. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que chez les Hominidae, les parties variables répondent aux séquences AAGAAA et AGGAGAG et sont situées respectivement du côté 5'et du côté 3'dans le sens 5'-*3', ou du côté 3'et du côté 5' dans le sens 3' 7. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont modifiés au niveau de leur structure, de leurs sucres et/ou de leurs bases, et/ou qu'ils portent des groupements réactifs notamment à leurs extrémités variables. 8. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 8 à 30 nucléotides, de préférence de l'ordre de 20 nucléotides. 9. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9, pour le traitement des affections associées à une production augmentée de TNFa, comme par exemple, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, le choc septique, les rhumatismes inflammatoires, la sarcoïdose. 11. Kits comportant au moins un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ainsi que les réactifs pour la réalisation de recherches ou de diagnostics. 12. Kits selon la revendication 11, caractérisés en ce que le (s) oligonucléotide (s) est (sont) en solution ou est (sont) fixé (s) sur un support, simple brin ou double brin, le cas échéant couplé (s) à un traceur.