FR 2832636 A1 20030530 FR 0107429 A 20010607 BREVET D'INVENTION Titre :"UTILISATION D'UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE DANS LE TRAITEMENT ET/OU LA PREVENTION DES AFFECTIONS DE LA SURFACE OCULAIRE" Déposant co-inventeur : Dr Marie-Thérèse DROY-LEFAIX 2 Impasse des houx 60530 DIEUDONNE Tel. 03 44 26 66 03 Co-inventeur : Pr Christophe BAUDOUIN 7 Rue de l'Abreuvoir 92100 BOULOGNE Tel. 01 46 84 09 08 Objet de l'invention La présente invention concerne l'utilisation d'un collyre à base d'antioxydants (superoxydes dismutases ou acide alpha-lipoïque) avec ou sans vecteur dans un milieu pharmaceutiquement acceptable. La présente invention est destinée à traiter préventivement et curativement les affections de la surface oculaire pouvant entraîner les syndromes de l'oeil sec. Bilan de la natholosie des affections oculaires de surface La surface oculaire est la muqueuse de transition entre le milieu oculaire profond et le milieu extérieur. Il est nécessaire de maintenir l'intégrité de la cornée, hublot oculaire transparent ouvert 10 sur l'extérieur pour la transmission des images jusqu'à la rétine ; la perte de sa transparence étant synonyme de cécité, parfois définitive. H faut voir la surface oculaire comme une barrière anatomique et fonctionnelle, protégeant l'oeil des agresseurs extérieurs. Elle est formée par une triade, la cornée, le film lacrymal et la conjonctive. ( Hoang-Xuant T 1998, Pouliquen Y. 1991, Rigal D., 1993, Baudouin Ch. 1998) Par sa structure anatomique et la qualité de l'interface avec le film lacrymal, l'épithélium cornéen assure une fonction de barrière nécessaire à la protection des constituants cornéens sous jacents et du milieu endoculaire. Le film lacrymal est constitué de trois couches : une couche lipidique de 0,1 li d'épaisseur, une couche intermédiaire aqueuse de 7 et une couche profonde riche en mucus. Ce mucus, sécrété par les cellules caliciformes présentes au sein de l'épithélium conjonctival s'étale sur la surface oculaire. Il est en relation avec la membrane cytoplasmique apicale des cellules superficielles par l'intermédiaire du glycocalyx. Le film lacrymal agit par des propriétés physico-chimiques et immunologiques. Grâce au clignement, il va drainer et éliminer en permanence les micro-organismes, les corps étrangers et les cellules épithéliales desquamées présentes à la surface cornéenne en les enrobant dans le film muqueux du cul de sac conjonctival inférieur. Ce larmoiement bénéfique va contribuer à balayer et à assurer tout le nettoyage de la surface coméo-conjonctivale en empêchant l'adhérence de germes présents. Au rôle mécanique du flux lacrymal s'ajoute l'intervention du pH et de ses variations ainsi que celle de la température et de l'osmolarité des larmes. Les larmes participent activement aux moyens de défense non spécifiques de la cornée grâce à la présence de lactoferrine, de lysosyme et d'immunoglobulines. A ces moyens non spécifiques apportés par les larmes s'ajoutent les éléments spécifiques du tissu conjonctival. Le complexe mucus lacrymal, glycolipides et glycoprotéines des membranes plasmiques épithéliales conditionne la qualité de la surface cornéenne. En l'absence du film lacrymal, la surface épithéliale est hydrophobe et la phase aqueuse des larmes au lieu de s'étaler se dépose en gouttes. La mucine en diminuant la tension superficielle permet à la composante aqueuse des larmes de s'étaler et d'être adsorbée par la surface épithéliale, maintenant ainsi un film lacrymal stable entre chaque clignement. 15 Toute anomalie de la couche de mucus va compromettre la stabilité du film lacrymal et entraîner sa rupture pour former des taches sèches et ceci très rapidement après l'effet de resurfaçage du clignement. Les expansions apicales, comme les microvillosités, les microplis des cellules superficielles en augmentant l'adhésion du film lacrymal, concourent ainsi à une meilleure stabilité du film de larmes. L'altération de cette surface coméo-conjonctivale favorise l'adhésion bactérienne sur les surfaces épithéliales. Pour se protéger, la cornée dispose aussi de la conjonctive. La conjonctive est une membrane muqueuse vascularisée qui couvre la surface du globe et de la face postérieure des paupières supérieures et inférieures. Elle est responsable de la sécrétion de mucus essentielle pour la stabilité du film lacrymal et la transparence cornéenne. Elle joue un rôle de défense important et est richement vascularisée. Elle contient de nombreuses cellules immunocompétentes capables d'initier une réaction inflammatoire, d'y participer et de synthétiser des immunoglobulines. De plus, les caractéristiques morphologiques comme les microvillosités et biochimiques comme l'activité enzymatique des cellules épithéliales les rendent capables d'englober et de phagocyter des particules étrangères comme des virus. (Hoang-Xuan T. et al. 1998) Bilan de la pathologie des affections oculaires de surface En conséquence, la triade cornée-conjonctive-film lacrymal, qui représente un ensemble d'une extrême richesse physiologique, est susceptible de faire l'objet d'inflammation consécutive : - à l'agression de la surface oculaire par des agents environnementaux, - à une altération qualitative ou quantitative du film lacrymal (syndrome de l'oeil sec), - à une allergie, - à une infection chronique de la surface oculaire. Cette inflammation est à l'origine d'une libération de radicaux libres, espèces chimiques très réactives (Lemp MA. 1999, Savouré N. 1993) Ces radicaux libres provoquent une sécheresse de l'oeil par un effet direct sur le film de larmes et la cornée. Dans la pathologie de la surface oculaire, le stress oxydatif tient une place majeure par le biais des radicaux libres oxygénés, espèces hautement toxiques pour les muqueuses, en raison de leur forte teneur en acides gras polyinsaturés. Les radicaux libres sont des espèces chimiques ayant sur leur orbitale périphérique un électron non couplé, célibataire, leur conférant une grande instabilité comparée à la présence de deux électrons en périphérie (Pryor WA. 1986, Savouré N. 1993) Les radicaux primaires sont l'anion superoxyde (O2. -), point de départ des chaînes radicalaires à partir de l'oxygène moléculaire. La réduction de l'oxygène moléculaire (02) par gain d'un électron, aboutit à la libération d'un anion superoxyde (02.-), forme agressive de l'oxygène. Par réaction de dismutation, l'anion superoxyde (02.-) libère dans le milieu du peroxyde d'hydrogène (Hz Oz). Hz Oz est ensuite converti en radical hydroxyle (OH.), une espèce très réactive. Cette réaction nécessite la présence de métaux de transition comme le fer à l'état ferreux ou le cuivre. L'hémoglobine serait un grand pourvoyeur de fer ferrique dans l'oxydation radicalaire. Le monoxyde d'azote (NO.) est une molécule simple et un radical libre centré sur l'atome d'azote. H est formé in vivo par les NO synthases (NOS) constitutives mais dans certaines conditions pathologiques, une autre NOS peut être exprimée, il s'agit de la NOS inductible. En présence d'oxygène moléculaire (02) le monoxyde d'azote (NO.) forme le dioxyde d'azote (N02) lequel réagissant avec une molécule de (NO.) produit le trioxyde nitreux (N203). N02 et N203 sont qualifiées d'espèces réactives de l'azote, responsable du stress nitrosatif. Par ailleurs, l'anion superoxyde (02.-) peut réagir avec le monoxyde d'azote (N0.) pour former l'anion peroxynitrite (ONOO-) un oxydant puissant capable d'induire un stress oxydatif menant à l'oxydation de nombreuses cibles cellulaires (Beckman JS. and Koppenol WH. 1996, Squadrito GL. and Pryor WA. 1998). Les radicaux secondaires sont issus de la peroxydation lipidique membranaire des acides gras polyinsaturés (acide arachidonique par exemple) qui sont les cibles les plus sensibles. Cette peroxydation lipidique est une réaction en chaîne initiée par le radical hydroxyle (OH. ) avec la chaîne carbonée d'un acide gras polyinsaturé (L) formant ainsi un radical alkyle (L. ). En présence d'oxygène moléculaire (02), les radicaux alkyles (L. ) conduisent à la libération de radicaux peroxyles (ROO. ) et alcoyles (RO. ), au cours des réactions de propagation. La présence de métaux de transition comme le fer et le cuivre permet l'entretien de ces réactions de propagation. Ces peroxydes sont à l'origine d'une profonde désorganisation de l'architecture membranaire, avec de graves conséquences pour les interactions moléculaires (Fridovich 1. 1997). L'oxydation des protéines est principalement initiée par le radical hydroxyle (OH. ) mais dépend aussi de la présence d'anion superoxyde (02.-). Les attaques oxydatives sont dirigées sur les groupements latéraux ou sur le carbone asymétrique des acides aminés. La formation de groupements carbonyles par l'oxydation directe d'acides aminés est considérée comme une des modifications oxydatives majeures des protéines. Ces groupements carbonyles sont utilisés comme des marqueurs de l'oxydation des protéines (Dean RT et al. 1997). Les bases de l'ADN sont très sensibles à l'action d'oxydants biologiques. L'anion superoxyde (ou.-) peut oxyder l'ADN par le biais de la formation du radical hydroxyle (OH. ) en présence de fer. (Henle ES et Linn S. 1997). En conséquence, une libération accrue de radicaux libres altère la qualité des larmes en dégradant les protéines sériques comme l'albumine, le lysosyme, la lactoferrine, les immunoglobulines et les glycoprotéines du mucus. Les radicaux libres ont ainsi des effets délétères sur les cellules de la cornée et de la conjonctive, allant de la présence d'érosions à de sévères ulcérations, très invalidantes. Les facteurs environnementaux sont des sources permanentes d'attaque de la surface oculaire. Dans ce domaine, les bactéries, les virus, les corps étrangers, la forte évaporation des larmes par un long travail sur ordinateur, les polluants atmosphériques des brouillards photochimiques sont de grands pourvoyeurs de radicaux libres (Droy-Lefaix MT et Colmant F. 2001, sous-presse) Des dizaines de milliers de patients se plaignent chaque année de leurs effets délétères sur la surface oculaire. Ainsi plus de 10 millions de personnes aux USA, 15 % de la population âgée de 120 plus de 65 ans souffrent de l'agression de la surface oculaire. Sur le plan clinique, la sécheresse oculaire est responsable de sensations souvent négligées de fatigue oculaire, d'un simple besoin de clignement, de sensations de picotements, de corps étrangers, jusqu'à des sensations plus sévères de brûlures, de douleurs, et en cas d'apparition de kératites superficielles douloureuses, de déficits visuels par l'épithéliopathie induite, et d'opacification cornéenne. La sévérité de la sécheresse permet de distinguer en pratique clinique : les syndromes secs simples provoqués par les facteurs environnementaux, favorisés par un terrain sous-jacent comme la ménopause et aggravés par un environnement agressif (Azzuro1o A. et al. 1995). - La maladie chronique de la surface oculaire, la kératoconjonctivite sèche où la souffrance cellulaire chronique aboutit à de véritables cercles vicieux pathogéniques souvent inextricables. Dans les affections de la surface oculaire, les deux grands développements physiopathologiques sont la composante immuno-inflammatoire de l'atteinte oculaire et les phénomènes apoptotiques induits à la fois par l'inflammation et certains collyres substitutifs ( Sullivan DA. et al. 1999). Malgré sa symptomatologie souvent intense, son film lacrymal instable et parfois sa kératite, l'oeil sec reste un oeil blanc bien différent des yeux rouges des conjonctivites chroniques. Cependant l'inflammation chronique est toujours omniprésente dans l'oeil sec, que ce soit une inflammation primaire comme dans le syndrome auto-immun de Gougerot-Sjögren ou secondaire à la kératite sèche, ou associée à une allergie oculaire, à une infection virale, à une blépharite ou une rosacée, ou une inflammation iatrogène. Le syndrome de Gougerot-Sjögren est une des formes les plus caractéristiques de sécheresse inflammatoire. Il touche non seulement la glande lacrymale principale et aboutit à sa fibrose, mais également l'ensemble de la surface conjonctivale qui baigne dans un milieu riche en nédiateurs inflammatoires. L'activation locale du système immunitaire entraîne une infiltration de la conjonctive par des cellules inflammatoires et modifie le métabolisme des cellules épithéliales. Celles-ci vont exprimer des marqueurs immunitaires, sécréter des cytokines et des radicaux libres. C'est cette inflammation généralisée qui fait la gravité du syndrome de GougerotSjôgren (Jones DT et al. 1998). L'induction d'un syndrome sec par une kérato-conjonctivite virale ou dans les suites d'une conjonctivite aiguë ou subaiguë est fréquente. Ces affections entraînent une perte parfois définitive des cellules à mucus de la surface conjonctivale même après un traitement par des collyres, les patients se plaignent de symptômes traînants, proches des sensations ressenties lors de la maladie initiale. Ils croient que la maladie n'a pas été soignée alors qu'il s'agit d'une sécheresse secondaire, souvent aggravée par des traitements agressifs permanents, qui enferment les patients dans un cercle vicieux. Des infections chroniques sont de même fréquemment responsables d'une sécheresse oculaire sévère, d'autant plus difficile à traiter que les signes infectieux sont peu spécifiques, cachés ou méconnus (Hoang-Xuant T et al. 1998) Les blépharites et la rosacée oculaire sont également des causes fréquentes de sécheresse oculaire qualitative, avec des composantes infectieuses et inflammatoires. Ces affections entraînent un dysfonctionnement des glandes de Meibonius qui perturbe la composition de la phase lipidique du film lacrymal et augmente le taux d'évaporation des larmes. Ces phénomènes se manifestent cliniquement par un raccourcissement du BUT (résistance à l'étirement des larmes) et entraînent une hyperosmolarité épithéliale. Ces dysfonctionnements meibomiens, se traduisent par une souffrance cellulaire, une rupture des jonctions intercellulaires, une perte des cellules caliciformes et probablement un déficit de sécrétion du mucus par les cellules conjonctivales (Toda I. et al. 1995). Une sécheresse banale s'observe par atrophie dégénérative des glandes lacrymales, traitée par des collyres substitutifs, incapables de soulager les patients. Là où s'accumulent les collyres irritants, particulièrement dans l'aire de la fente palpébrale ou nasale inférieure, un effet toxique peut être observé. Chez les patients présentant des glaucomes à angle ouvert ou secondaires, l'utilisation dans les collyres de conservateurs comme le chlorure de benzalkonium, ammoniums quaternaires. Ces conservateurs présentent aussi un degré significatif de toxicité passant par production de radicaux libres. il s'en suit une réduction de la résistance à l'étirement des larmes, une toxicité directe pour les cellules épithéliales, avec des érosions épithéliales et une réaction inflammatoire. D faut savoir que la demi-vie du benzalkonium est de 20 heures et qu'il persiste des taux significatifs de conservateurs 168 heures après instillation d'une seule goutte (De Saint Jean et al. 1999). En conséquence, qu'elle soit primitive ou secondaire, la réaction inflammatoire est une composante essentielle des syndromes de l'oeil sec. H est donc nécessaire de mettre au point des traitements adaptés au syndrome de l'oeil sec et d'une manière beaucoup plus générale aux affections de la surface oculaire. Buts de l'invention La présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un véhicule pharmaceutique et une quantité suffisante d'un composé actif choisi parmi des antioxydants, la superoxyde dismutase (SOD) ou l'acide alpha-lipoïque avec ou sans vecteur phannacologiquement acceptable. La présente invention vise à fournir un nouveau procédé thérapeutique pour lutter contre la formation de peroxydes lipidiques engendrés par les nombreux agresseurs de la surface oculaire. La présente invention pourra être utilisée pour : une exposition aux agents environnementaux comme les brouillards photochimiques des villes (ozone, oxydes d'azote, dioxyde sulfureux, composés organiques volatils, particules de diesel. - une exposition prolongée à un écran d'ordinateur, de télévision, d'un moniteur vidéo - l'utilisation de lentilles de contact une exposition à de l'eau salée ou de l'eau chlorée - une exposition aux ultraviolets (UVs A, B, C), aux rayons X, aux rayons y, au rayonnement radioactif. une exposition à des agents environnementaux comme les bactéries, les virus, les champignons. une altération de la surface oculaire choisie dans le svndrome de Gougerot-Siôsren. les blépharites, la rosacée oculaire. une exposition à des allergènes associée à une réaction inflammatoire et à une dégradation de la surface oculaire Eléments caractéristiques de l'invention La présente invention concerne l'utilisation d'une composition à base d'antioxydants, composés actifs mentionnés ci-dessous. Superoxydes dismutases (SODs) Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne les superoxydes dismutases (SODs), La SOD est l'une des trois principales enzymes anti-oxydantes avec la catalase et la glutathion peroxydase de l'organisme (Fridovich I. 1986). Les superoxydes-dismutases ou SODs, sont des métallo-enzymes antioxydantes découvertes en 1969 par Mc Cord et Fridovich, capables de catalyser la réaction de dismutation de l'anion superoxyde (02. J en peroxyde d'hydrogène (H202) et en oxygène en milieu aqueux selon la réaction suivante qui nécessite la présence de fer. (2) Fe2+ + H202 Fe3+ + OH. (réaction de Fenton) Les SODs endogènes ont pour rôle d'assurer la protection des cellules et des espaces extracellulaires contre une agression par les anions superoxydes (02.-) A l'état normal, les taux de SODs comme l'activité spécifique de l'enzyme sont relativement constants pour un même tissu chez un même individu en bonne santé (Michelson AM. 1987). Dans les cas de stress oxydatif en raison de la forte production radicalaire et de la peroxydation lipidique qui en découle, les taux de SODs sont modifiés. Des états pathologiques comme des inflammations aiguës ou chroniques, les maladies auto-immunes témoignent de la disparition des qualités adaptatives des SODs. Des taux très bas de SODs ont été rapportés dans ce type de pathologie. Trois types de SODs endogènes sont à l'heure actuelle décrites, les Cu/Zn SODs habituellement localisées dans le cytosol des cellules eucaryotes, dans le fluide extracellulaire des mammifères et chez certaines bactéries, les Mn/SODs chez les procaryotes ou dans les mitochondries et les Fe/SODs contenant du fer, localisées dans les bactéries anaérobies et les procaryotes. Parmi les SODs décrites ci-dessus, en raison de leur forte présence à l'état naturel dans les cellules oculaires de surface, la présente invention s'intéressera aux Cu/Zn SODs. Les Cu/Zn SODs sont des enzymes d'un poids moléculaire de 32 kd. Elles sont composées de deux sous-unités contenant chacune un atome de cuivre et de zinc, liés de manière non covalente. (Keller GA et a1. 1991) Les SODs exogènes existent sous forme native, d'extraction humaine (protéine homologue), animales ou végétales (protéines hétérologues), ou sous forme recombinant. Pour permettre un allongement de leur temps de demi-vie et une meilleure distribution au niveau cellulaire, il est parfois intéressant de les vectoriser, sans toutefois intervenir dans leurs propriétés 10 pharmacologiques. Dans différents tests d'inhibition de l'inflammation, les SODs hétérologues s'avèrent présenter une activité anti-inflammatoire significativement plus élevée que les homologues (Baret A. et al. 1984) Ces SODs hétérologues qui ont une faible incidence de nature immunologique, n'induisent pas de réaction proinflammatoire et protègent les cellules de la dégénérescence en inhibant la formation des radicaux libres oxygénés. Par conséquent, la présente invention propose en raison des effets positifs de la SOD d'utiliser cet antioxydant seul ou en présence d'un véhicule pharmaceutiquement dans le traitement des affections de la surface oculaire. La présente invention intéresse : les SODs extractives (Cu/Zn SOD de blé, Cu/ZN SOD de melon, Cu/ZN SOD de tomate, Cu/Zn SOD bovine) - les SODs recombinantes (Cu/Zn SOD de blé, Cu/ZN SOD de melon, Cu/ZN SOD de tomate, Cu/Zn SOD bovine, Cu/Zn SOD humaine. La sélection se fera en comparant leurs activités sur les altérations de la surface oculaire induites par les différents agresseurs de la surface oculaire. Si l'activité des SODs nécessite une augmentation du temps de demi-vie au niveau de la surface oculaire une vectorisation sera envisagée, visant à améliorer l'activité dismutasique et l'effet immuno-redox au niveau de la surface oculaire. Acide ilpha-lippïque Dans un deuxième mode de réalisation la présente invention s'intéresse à l'acide a1pha-lipoïque. L'acide alpha-lipoïque (LA), découvert en 1937 et caractérisé chimiquement par Lester Reed en 1951 est un antioxydant synthétisé par le corps humain, mais aussi présent en petites quantités dans les pommes de terre, les épinards et la viande rouge. Chez l'homme, comme les autres antioxydants, sa production décline avec l'âge. H comporte une chaîne de huit carbones et un hétérocycle à deux atomes de soufre voisins. Il est rapidement absorbé par les cellules et transformé en dihydrolipoate (DHLA), extrêmement réducteur. Ce dernier possède deux fonctions sulfurées lui permettant de donner très faiclement un ou deux atomes d'hydrogène. LeLA/DHLApeut : - Piéger les radicaux libres (radical hydroxyl OH., acide hypocloreux HCLO, l'oxygène singulet'02. - Chélater les métaux (complexes stables avec Cu 2+, Mn 2+ et Zn2+) - Régénérer les formes oxydées des vitamines E, C, du glutathion et de la thioredoxine. En sa présence, on note dans les cellules une augmentation du glutathion. -Inhiber l'expression des gènes (facteur NF-KB au cours d'une réponse inflammatoire). Le DHLA protège aussi des effets délétères de l'ischémie-reperfusion en inhibant l'activité de la xanthine oxydase, enzyme qui libère de l'anion superoxyde (Prenn JH et al. 1990, 1992, Scheer B. et Zimmer. 1993, Serbinova E. et a ;. 1992) Effets des composés actifs de la présente invention. SOD et acide atpha-Hpoïaue sur les affections de la surface oculaire Etudes in vitro Dans un premier temps, différentes concentrations des composés actifs de l'invention (Cu/Zn SOD, acide alpha-lipoïque) sont testées au moyen de différentes techniques d'exploration de la surface oculaire, en étroite complémentarité avec la recherche clinique. Evaluation des radicaux libres oxygénés Les tests sont réalisés par microtitration cytofluorométrique en lumière froide. Cette nouvelle technique permet en épurant l'énergie calorifique du système d'illumination (infra-rouge et effet Joule) d'obtenir un bruit de fond très faible et donc d'avoir un bon rapport signal/bruit et une bonne sensibilité. Elle associe la reproductibilité des méthodes en microplaques à la sensibilité des méthodes cytométriques, avec un spectre de détection très large (280-870 mn). La microplaque est scannée par un pinceau de lumière de longueur d'onde définie qui illumine chaque puits de culture durant moins de 0,3 seconde, ce qui limite tout phénomène d'extinction des sondes. Test à la dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA) Des cellules cornéennes et/ou conjonctivales d'origine humaine en culture sont exposées à divers agents environnementaux pour induire la libération de radicaux libres. Les composés actifs de l'invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha-1ipoïque) sont testés à différentes concentrations sur ce modèle. La présence de radicaux libres dans le milieu du culture est évaluée par le test à la DCFHDA (Molecular Probes, eugene, OR, USA) en fluorométrie (, exc. =490nm - Àém. = 535nm, 1 = 4V). La sonde fluorogène devient fluorescente lorsqu'elle se lie au peroxyde d'hydrogène. La solution de DCFH-DA uitlisée est une solution à 20uM dans du milieu essentiel minimum moddifié de Dulbecco (DMEM). Les cultures sont ensuite placées pendant 20minutes dans du DMEM contenant la sonde puis elles sont extraites afin de mesurer la production de peroxyde d'hydrogène, la mesure est faite directement sur les cellules dans des plaques de 96 puits (Debbasch C. et al. 2000). Les résultats montrent avec les composés actifs testés (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque), selon un effet dose, une diminution significative des effets délétères des radicaux libres sur les cellules cornéennes et/ou conjonctivales, les protégeant des dommages membranaires et des phénomènes de l'apoptose. Test à l'hvdroéthidine Des cellules cornéennes et conjonctivales d'origine humaine en culture, exposées à divers agents agresseurs pour induire la libération de radicaux libres sont traitées ou non par les composés actifs de la présente invention (Cu/ZN SOD ou acide lipoïque) à différentes concentrations. L'hydroéthidine (Molecular Probes) est une sonde fluorogène, oxydée en cation éthidium en présence d'anion superoxyde. Cette sonde devient fluorescente lorsqu'elle se lie à l'anion superoxyde (lexc. = 490nm - Àém. = 600nm, 1 = 6V). La solution d'hydroéthidine utilisée est une solution à 5uM. Les cultures cellulaires est placée pendant 10 minutes dans du DMEM contenant la sonde puis les cellules sont extraites afin de mesurer la production d'anion superoxyde. La mesure est faite dans des microplaques de 96 puits. Les analyses sont ainsi réalisées sur 5000 cellules par puits, chaque mesure étant répétées six fois. Les résultats sont exprimés en unités de fluorescence. Les valeurs moyennes de fluorescence sont calculées dans chaque groupe et comparées par un test U non paramétrique de Mann-Whitney. Les résultats observés confirment ceux notés avec le test DCFH-DA. En présence des composés actifs (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) selon un effet dose, on observe une réduction significative de la production d'anion superoxyde ainsi que de la dégénérescence cellulaire liée à la peroxydation lipidique des membranes. Effets sur le chlorure de benzalkonium Mise en évidence sur des cellules conjonctivales d'origine humaine en culture d'un effet protecteur des produits de l'invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) sur la nécrose induite par des conservateurs comme les ammoniums quaternaires (chlorure de benzalkonium) responsables de la production de radicaux libres. Les ammoniums quaternaires reconnus pour induire une sécheresse oculaire qualitative ont en effet des propriétés détergentes qui modifient la phase lipidique du film lacrymal et accélèrent son évaporation. Ils altèrent les microvillosités épithéliales et s'opposent ainsi à l'accrochage du mucus concourant à une instabilité supplémentaire du film lacrymal. A faible concentration (0,004 %) ils réduisent le break-up time et entraînent une toxicité directe des cellules superficielles avec des érosions épithéliales, pouvant aller selon la concentration de dégénérescence apoptotique à une véritable nécrose (Baudouin et al. 1991, De SAINT JEAN M et al. 1999). Selon un effet dose, les composés actifs de l'invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) réduisent significativement la toxicité du chlorure de benzalkonium sur les cellules conjonctivales en culture. En inhibant la production d'espèces radicalaires par ce détergent, les composés actifs de l'invention réduisent les érosions épithéliales. Etudes in vivo Dans un deuxième temps, chez l'animal les composés actifs de l'invention seront testés pour vérifier leurs effets préventifs et ou curatifs sur des affections oculaires de surface à l'origine des syndromes de l'oeil sec. Chez l'animal la rétention des antioxydants sur la surface oculaire sera étudiée pour permettre de voir si une vectorisation est à envisager pour améliorer le devenir des produits en utilisation humaine. La présente invention outre son utilisation chez l'homme sera aussi utilisée dans le domaine vétérinaire. REFERENCES AZZAROLO A. BJERRUM K., MAVES CA., et a1. - Hypophysectomy-induced regression of female rat lacrimal glands : Partial restoration and maintenance by dihydrotestosterone and prolactin. Invest. Ophtalmol. Vis Sci, 1995,36, 216-226 BARET A., JADOT G., MICHELSSON AM. - Phannacokinetic and anti-inflammatory properties in the rat of superoxide dismutases (Cu-SODs and MnSOD) from various species. Biochem. Pharmacol. 1984.33, 2755-2760. BAUDOUIN C., HAOUAT N., BRIGNOLE F., BAYLE J., GASTAUD P.. - Immunopatho1ogica1 findings in conjunctival cells using immunofluorescence staining of impression cytology specimens. British J. of Ophtalmology, 1992,76, 545-549 BECKMAN J. S, KOPPENOL W. H.-Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite : The good, the bad, and the ugly. Am. J. Physiol. 1996,271, C1424-C1437 DEAN R. R, FU. S., STOCKER R., DAVIES M. J.-Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem. J. 1997, 324, 1-18 DEBBASCH C., PISELLA PJ., RAT P., WARNET JM., BAUDOUIN Ch. Evaluation de la production radicalaire sur empreintes conjonctivales de patients traités au long cours par des collyres antiglaucomateux ou porteurs de lentilles de contact. J. Fr. Ophtalmol. 2000,23, 3 ? 239-244 DE SAINT JEAN M., BRIGNOLE F., BRINGUIER AF., et al. -Effects of benza1konium chloride on growth and survival of Chang conjunctival cells. Invest. Ophtalmol. Vis Sci 1999,40, 2199- 2212 DROY-LEFAIX MT., COLMANT F. - Pol1ution, radicaux libres et oeil. Les Séminaires Ophtalmologiques d'Ipsen, tome 12, Royaumont. Y. Chrsisten, M ; Doly, MT Droy-Lefaix, eds, IRVINN, Paris, 2001, sous-presse HOANG-XUAN T., BAUDOUIN CH., CREUZOT-GARCHER C., HANNOUCHE D., KANTELIP B., ROBIN H.-Inflammation chronique de la conjonctive. Bulletin des Sociétés d'Ophtalmologie de France. Rapport annuel. Numéro spécial 1998 HENLE E. S, LINN S.-Formation, prevention and repair of DNA damage by iron-hydrogen peroxide. J. Biol.. Chem.. 1997,272, 19095-19098 FRIDOVICH I.-Superoxide dismutase. Adv. Enzymol. 1986,58, 61-97 FRIDOVICH I.-Superoxide anion radical zu superoxide dismutases and related matters. J. Biol. Chem. 1997,272, 20313-20316 JONES DT. MONROY D ;, JI Z ; et al. Alterations of ocular surface gene expression in Sjôgren's syndrome. Adv. Exp. Med. Bio1. 1998,438 ; 533-536 KELLER GA., WARNER T., STEIMER K., HALLEWELL R.-Cu/Zn superoxide dismutase is a peroxisomal enzyme in human fibroblasts and hepatoma cells. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 7381-7385 LEMP MA.-Report of the national eye institute/industry workshop on clinical trials in dry eyes. CLAO J. 1995,21 : 221-232 MICHELSON AM. - medica1 aspects of superoxide dismutase. Life Chemistry Reports. Harwood. Academic Publishers 1987,6, 1-142 POULIQUEN Y.-Atlas d'histologie et d'ultrastructure du globe oculaire. Masson, Paris, 1969, 1-7 PRENN JH., PERUCHE B., KARKOUTLY C., ROSSBERG C., MENNEL HD., KRIEGLSTEIN J. Dihydrolipoic acid protects neurons against ischemic/hypoxic damage. In : Krieglstein J ;, Operpichller H., Eds. Pharmacology of cerebral ischemia. Stuttgart : Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft GmbH, 1990, 357-362 PRENN JH., KARKOUTLY C., NUGLISCH J., PERUCHE B., KRIEGLSTEIN J. Dihydrolipoate reduces neuronal injury after cerebral ischemia. J. Cereb Blood Flow metab 1992,12, 78-87 PRYOR W. A.-Oxy-radicals and related species : their formation, lifetimes, and reactions. Annu. Rev. Physio1. 1986,48, 657-667 REED LJ, DEBUSK BG, GUNSALUS IC et a1. - Crystalline alpha-lipoic acid : a catalytic agent associatedwithpyruvate deshydrogenase. Science 1951,114, 93-94 RIGAL D. -L'épithé1ium cornéen. Masson, Paris, 1991. SAVOURE N.-Les radicaux libres. Allergie Immunologie, 1993,25, 404-440 SCHEERR B., ZIMMER G. Dihydrolipoic acid prevents hypoxic/reoxygenation and peroxidative damage in rat heart mitochondria. Arch Biochem Biophys 1993,302, 385-390 SERBINOVA E., KHWAJA S., REZNICK AZ., PACKER L. Lipoic acid protects against ischemiareperfusion injury in the isolated perfused Langendorff heart. Free Rad Res Commun 1992,17, 49- 58 SQUADRITO G. L, PRYOR W. A. - Oxidative chemistry of nitric oxide : the roles of superoxide, peroxynitrrite and carbon dioxide. Free Radie. Biol. Med. 1998,25, 434-456 SULLIVAN DA., KRENZER KL., SUKKIVAN BD., BAZZINOTI TOLLS D. TODA I., DANA MR.-Does androgen insufficiently cause lacrimal gland inflammation and aqueous tear deficiency ? Invest. Ophtalmol. Vis Sci. 1999,40, 1261-1265. TODA I., SHIMAZAKI J., TSUBOTA K.-Dry eye with only decreased tear break up time is sometimes associated with allergie conjunctivitis. Ophtalmology 1995,102, 302-3 REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une composition pharmaceutique pour traiter les affections oculaires de surface pouvant entraîner une sécheresse de l'oeil dans lesquelles le stress oxydatif par le biais des radicaux libres oxygénés tient une place majeure. 2) Utilisation d'une composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient un antioxydant. 3) Composition selon les revendications (1) et (2) caractérisée en ce que l'antioxydant est une superoxyde dismutase (SOD), sélectionnée dans le groupe des Cu/Zn SODs humaines, animales ou végétales. 4) Composition selon la revendication (3), caractérisée en ce que ladite Cu/Zn SOD est une Cu/Zn SOD sélectionnée de préférence dans les Cu/Zn SODs d'extraction végétales de blé, de melon ou de tomate, les SODs animales ou humaines. 5) Composition selon les revendications (1) et (2) caractérisée en ce que l'antioxydant est l'acide alpha-lipoïque. 6) Composition selon l'une quelconque des revendications (4) ou (5) caractérisée en ce quelle contient de plus des excipients pharmaceutiquement acceptables favorisant sa vectorisation. 7) Utilisation de cette composition selon les revendications (1) à (6), caractérisée en ce que lesdites affections oculaires de surface sont provoquées par la libération accrue de radicaux libres oxygénés à l'origine d'une peroxydation lipidique. 8) Utilisation de cette composition selon la revendication (7) caractérisée par le fait que cette libération de radicaux libres altère la qualité des larmes et a des effets délétères sur les cellules de la cornée. 9) Utilisation de cette composition selon la revendication (8) pour une exposition à des agents environnementaux comme l'ozone, les oxydes d'azote, le dioxyde sulfureux, composés organiques volatils, les particules libérées par les moteurs diesel.. 10) Utilisation selon la revendication (8) pour une exposition prolongée à un écran d'ordinateur, à un écran de télévision ou à un moniteur vidéo. 11) Utilisation selon la revendication (8), pour l'utilisation de lentilles de contact. 12) Utilisation selon la revendication (8), pour une exposition, à de l'eau salée et/ou à une exposition, à de l'eau chlorée. 13) Utilisation selon la revendication (8) pour une exposition aux ultraviolets (UVs A, B, C), aux rayons X, aux rayons y, au rayonnement radioactif. 14) Utilisation selon la revendication (8) pour une exposition à des agents environnementaux comme les bactéries, les virus, les champignons. 15) Utilisation selon la revendication (8) pour une altération de la surface oculaire dans le syndrome de Gougerot-Sjôgren, les blépharites, la rosacée oculaire et toutes les formes de sécheresse oculaire. 16) Utilisation selon la revendication (8) pour une exposition à des allergènes associée à une réaction inflammatoire et à une dégradation de la surface oculaire. 17) Utilisation de la composition antioxydante (4) ou (5) pour le traitement des affections oculaires de surface pour la fabrication d'un collyre chez l'homme et en vétérinaire en en ce qu'il contient un composé actif choisi, SOD ou acide a1pha-lipoïque, un éventuel composé augmentant son temps de demi-vie au niveau de la surface oculaire et un véhicule ophtalmologiquement acceptable.