FR 2828403 A1 20030214 FR 0110554 A 20010807 UTILISATION DE MOLECULES SOLUBLES HLA DE CLASSE 1 POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES UTILES POUR INHIBER L'ANGIOGENESE. La présente invention se rapporte au domaine de l'inhibition de l'angiogènese impliquée dans des nombreux syndromes prolifératifs pathologiques. L'invention se rapporte à l'utilisation de molécules solubles du Complexe Major d'Histocompatibilité (CMH) et tout particulièrement à l'utilisation de molécules solubles HLA de classe 1, comme HLA-Gs ou HLA-B7s, pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour inhiber l'angiogénèse, et donc destinées au traitement des pathologies angiogéniques impliquant des cellules endothéliales et en particulier pour enrayer leur prolifération tumorale. L'invention envisage également l'utilisation de ces molécules pour vectoriser des substances d'intérêt thérapeutique ou de diagnostic au niveau des cellules endothéliales impliquées dans un processus d'angiogénèse pathologique. L'invention se rapporte encore à la préparation d'anticorps dirigés contre ces molécules et aux compositions les contenant pour favoriser l'angiogénèse et traiter des pathologies nécessitant la prolifération des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales tapissent l'intérieur de tous les vaisseaux sanguins de l'organisme. Ces cellules ont un phénotype quiescent, elles ne prolifèrent quasiment pas, en effet seulement 0, 01% des cellules endothéliales sont engagées dans la division cellulaire à un moment donné. Le rôle physiologique des cellules endothéliales est très vaste, elles participent à des nombreux phénomènes vitaux pour l'organisme : coagulation sanguine, maintien de la pression artérielle, recrutement de cellules circulantes, synthèse de facteurs de croissance. Quand un territoire requiert un apport accru en oxygène et en nutriments il réagit en relarguant des facteurs solubles qui convertissent le phénotype des cellules endothéliales en un phénotype activé, et des facteurs mitogènes pour les cellules endothéliales de phénotype activé. Ces cellules endothéliales acquièrent enfin un phénotype angiogénique et deviennent capables d'effectuer le programme d'angiogénèse, c'est-à-dire le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau préexistant. Ce phénomène est normal et contrôlé lors d'une blessure ou dans la maturation du corps jaune de l'ovaire ; en revanche, il devient dangereux dans des situations pathologiques où l'angiogénèse n'est plus contrôlée, par exemple dans la rétinopathie diabétique, la polyarthrite et le développement tumoral. Le gène HLA-G de classe Ib, localisé sur la même région chromosomique que les autres gènes du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) de classe la (HLA-A,-B et-C) est caractérisé par des propriétés structurales dont certaines semblent uniques (Le Bouteiller and Blaschitz, 1999 ; Le Bouteiller et al., 1999). Quatre isoformes membranaires de HLA-G ont été décrites, elles sont dues à l'épissage alternatif d'un ou de deux exons codant pour les domaines externes de la molécule (Ishitani and Geraghty, 1992 ; Kirszenbaum et al., 1994). Seule l'isoforme longue contenant les trois domaines externes al, a2 et a3, semble avoir la capacité de s'exprimer de façon stable à la surface cellulaire (Mallet et al.,). Deux isoformes HLA-G solubles ont également été mises en évidence (Fujii et al., 1994), l'existence de telles isoformes étant due à la traduction de l'intron 4 et à la présence d'un codon stop à l'intérieur de cet intron, empêchant la traduction des domaines transmembranaires et cytoplasmiques. L'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques de HLA-G a permis de mettre en évidence l'expression de protéines HLA-G dans le placenta (Le Bouteiller and Blaschitz, 1999), le thymus (Mallet et al., 1999) et le sang périphérique (Puppo et al., 1999, Rebmann et al., 1999). La protéine HLA-G a été détectée dans différentes sous-populations cellulaires placentaires : le cytotrophoblaste extravilleux, certains macrophages présents dans les villosités chorioniques, et les cellules endothéliales des vaisseaux foetaux ainsi que les cellules de l'épithélium amniotique (Blaschitz et al., 1999 ; Hammer et al., 1997). Enfin, la protéine HLA-G soluble a été détectée dans le liquide amniotique ainsi que dans le sang périphérique de femmes enceintes (Fournel et al., 1999 ; Puppo et al., 1999 ; Rebmann et al., 1999 ; Fournel et al., 2000a). La présence de HLA-G dans le placenta suggère que cette molécule pourrait exercer un rôle favorisant le maintien de la gestation en prévenant un rejet du foetus par la mère (Le Bouteiller and Blaschitz, 1999 ; Le Bouteiller et al., 1999). La molécule HLA-G n'étant pas polymorphique, elle ne peut par elle même entraîner de réaction alloimmune maternelle anti-paternelle. Par cette absence de polymorphisme, la molécule HLA-G peut reconnaître les cellules T activées, indépendamment du T cell Receptor, via les molécules CD8, et induire l'apoptose de ces cellules in vitro (Fournel et al. 2000b). Les inventeurs se sont intéressés au mécanisme d'induction d'apoptose des cellules T CD8+ activées qui pourrait favoriser in vivo l'élimination locale dans la décidua, des cellules maternelles T CD8+ alloréactives. HLA-G soluble présent dans le sang maternel au cours de la gestation (Puppo et al., 1999 ; Rebmann et al., 1999) pourrait exercer le même effet et ainsi contribuer au maintien d'un état de tolérance envers HLA-G (Fournel et al., 2000b). La molécule HLA-G membranaire, présente sur les cellules du cytotrophoblaste extravilleux, peut être reconnue par des récepteurs NK de type inhibiteur (Lanier, 1998). Une telle reconnaissance peut soit inhiber la lyse par les cellules déciduales NK de ces cellules trophoblastiques (Loke and King, 1995), soit induire la sécrétion de cytokines particulières favorisant la gestation (Maejima et al., 1997). Il a aussi été envisagé que la molécule HLA-G soluble pourrait exercer un rôle modulateur de l'angiogenèse placentaire (Le Bouteiller and Blaschitz, 1999 ; Le Bouteiller et al., 1999). Ainsi, un certain nombre d'observations ont suggéré que cette molécule pourrait exercer une fonction stimulante pour les cellules endothéliales maternelles et/ou pour les cellules trophoblastiques : - HLA-G a été détecté par immunohistochimie sur coupes de placentas dans certaines cellules endothéliales (Blaschitz et al., 1997) à l'aide de certains anticorps anti-HLA-G, l'expression placentaire de HLA-G est fortement diminuée, voire absente, dans les placentas préeclamptiques (Hara et al., 1996), pathologie associée à un défaut de vascularisation (Taylor, 1997), les cellules endothéliales tapissant les artères spiralées maternelles présentes dans la décidua sont progressivement éliminées et remplacées par les cellules trophoblastiques endovasculaires, qui elles-mêmes expriment HLA-G au cours de la placentation (Proll et al., 1999). Les molécules HLA de classe I ont été décrites comme pouvant s'associer structurellement à certains récepteurs membranaires, y compris des récepteurs à l'insuline (Kittur et al., 1987) et récepteurs à EGF (Schreiber et al., 1984). Stagsted et al. (1990) avait aussi demontré que des peptides dérivés de molécules HLA de classe I pouvaient réguler la fonction des récepteurs à l'insuline. Cependant, à ce jour aucune description d'un quelconque rôle non immunologique de la forme soluble de HLA Gl n'a été rapporté et il n'existe non plus de données expérimentales démontrant la présence de récepteurs au HLAGs sur les cellules endothéliales. Aucun effet biologique du HLA-Gs sur ces cellules ou dans l'angiogénèse n'a été décrit. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont maintenant permis de mettre en évidence les effets de la molécule HLA-G soluble (HLA-Gs) sur la différenciation des cellules endothéliales et de comprendre certains aspects de son mécanisme d'action. Il a ainsi été identifié des nouvelles fonctions, non-immunologiques, de la molécule soluble HLAGls exercée sur des cellules endothéliales. Les inventeurs ont en effet démontré que des molécules HLA-Gls non classiques inhibent la prolifération, la migration des cellules endothéliales et la translocation à la surface membranaire des cellules endothéliales d'une molécule de reconnaissance des lymphocytes, l'ICAM-1. Il a notamment été montré que les molécules HLA-G et HLA-B7 solubles, aussi désignées HLA-Gs et HLA-B7s, sont capables d'inhiber la progression tumorale de xénogreffes de cellules d'adénocarcinome de la prostate humaine greffée chez la souris nude immunodéprimée. Plus particulièrement, la molécule HLA-Gls exerce cet effet anti-prolifératif sur des cellules endothéliales provenant de différentes espèces (Homme, boeuf, porc), ce qui suggère une fonction importante conservée chez différentes espèces de mammifères. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une molécule soluble HLA de classe 1 ou d'une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique codant pour une molécule soluble HLA de classe 1 pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à inhiber l'angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques. En effet, les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention, ont permis de montrer que les molécules solubles HLA de classe 1 sont capables d'inhiber ou de stimuler l'activité des récepteurs au VEGF. L'invention vise plus particulièrement les molécules HLA-G1s ou HLA-B7s, et les séquences polynucléotidiques codant pour celles-ci. Il est connu que la molécule HLA-Gs est une molécule non polymorphique, à l'inverse des molécules HLA de classe Ia, dites classiques, qui, elles, sont extrêmement polymorphiques et peuvent donc induire une alloréaction si elles sont injectées à des individus non HLA identiques. Ces caractéristiques de la molécules HLA-Gs la rendent particulièrement utile pour son utilisation dans le cadre de pathologies angiogéniques impliquant des anomalies de prolifération des cellules endothéliales. Toutefois, comme indiqué précédemment, deux isoformes HLA-G solubles ont également été mises en évidence, de telles isoformes constituent des molécules fonctionnellement équivalentes. Ainsi, l'invention concerne des dérivés des molécules soluble HLA de classe 1 présentant des propriétés anti-angiogéniques que l'homme du métier est à même de tester à partir des méthodes rapportées dans la partie expérimentale ci-après. Il peut s'agir de fragments, de forme tronquée, de séquences modifiées par délétion, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés. De même l'invention se rapporte à des séquences polynucléotidiques codant pour lesdits dérivés. Ces dérivés constituent des équivalents fonctionnels des molécules de l'invention que l'homme du métier est capable de préparer et de tester à partir de l'enseignement de la présente invention et de ses connaissances générales. Par contre, la présente invention ne concerne pas les anticorps anti-idiotypes des molécules soluble HLA de classe 1 ou de leurs dérivés. L'invention envisage à titre de substance actives utiles selon la présente invention, une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique codant une molécule soluble HLA de classe 1, ladite séquence étant placée sous le contrôle de séquences de régulation de son expression. Un telle molécule d'acide nucléique est un vecteur, comme par exemple un plasmide, un virus recombinant, une cellule transfectée par un vecteur d'expression plasmidique ou viral. Une telle molécule d'acide nucléique peut être utilisée dans des protocoles de thérapie génique ou de thérapie cellulaires consistant à administrer ladite molécule ou des cellules transformées par la dite molécule à un individu de façon à exprimer une molécule soluble HLA de classe 1 et ainsi inhiber l'angiogénèse. Les molécules solubles HLA de classe 1, et plus particulièrement celles décrites ci-dessus, sont particulièrement utiles pour traiter les pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogénèse. Ainsi, ces molécules sont particulièrement adaptées pour la préparation de médicaments capables de prévenir ou d'inhiber l'angiogénèse et donc la prolifération des cellules endothéliales. La molécule soluble HLA de classe 1 est associée dans les compositions selon l'invention avec tout véhicule pharmaceutiquement acceptable connu de l'homme du métier adapté au mode d'administration utilisé. Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent être administrées par voie systémique ou injection locale Elles comprennent une quantité adéquat d'agents actifs constitués d'au moins une molécule soluble HLA de classe I. A titre d'exemple de pathologies dont le traitement nécessite de prévenir ou d'inhiber l'angiogénèse, on peut citer le cancer, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, le rejet chronique de greffes comme la cornée ou le rein ou le rejet aigu observé dans les xénotransplantations, les angiomes, les angiosarcomes, en particulier la maladie de Castelman ou le sarcome de Kaposi. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence l'existence de récepteurs de la molécule HLA-Gls à la surface des cellules endothéliales. L'invention a donc aussi pour objet toutes molécules autres qu'un anticorps anti-idiotype capables de se fixer à la surface des cellules endothéliales grâce à ce récepteur. L'existence d'un tel récepteur permet aussi d'utiliser la molécule HLAGIs, ou ces dérivés, pour vectoriser des substances d'intérêt au niveau de sites angiognéiques. L'invention a donc pour objet l'utilisation de la molécule HLA-Gls seule ou associée à une substance d'intérêt pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques. Comme indiqué précédemment, il peut s'agir de la molécule HLA-Gls ou d'un dérivé de celle-ci. La substance d'intérêt peut être une substance chimique ou biologique active comme un médicament. On peut citer à titre d'exemple de tels médicaments : un anticorps anti-VEGF, un anticorps anti-VEGF R2, une toxine animale ou végétale, un composé radioactif, une drogue cytostatique ou cytolytique, un gène suicide ou une anti-sens. La substance d'intérêt peut être aussi une substance de diagnostic comme un traceur radioactif ou un produit de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique permettant de marquer les sites angiogéniques. L'invention concerne donc un composé constitué de la molécule HLA-G1s, ou d'un dérivé de celle-ci, couplé à une substance d'intérêt comme défini ci-dessus, ledit composé étant capable de se fixer aux cellules endothéliales par l'intermédiaire d'un récepteur. Ces composés de l'invention constituent donc un système de vectorisation de substances d'intérêt au niveau des cellules endothéliales impliquées dans des phénomènes angiogéniques particulièrement utiles pour traiter ou détecter les pathologies indiquées précédemment. Le couplage de la molécule HLA-Gls, ou d'un équivalent fonctionnel de celle-ci, avec la substance d'intérêt peut être réalisé par tout moyen de liaison clivable ou non clivable dans un milieu biologique comme par exemple : - un couplage par liaison covalente - une éaction d'oxydation aboutissant à la sustitution d'un atome d'hydrogene par un atome d'iode sur un noyau indole Ces composés de l'invention peuvent être aussi des protéines ou de gènes de fusion. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'anticorps dirigé contre les molécules solubles HLA de classe 1 pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour stimuler la prolifération des cellules endothéliales. Ces compositions selon l'invention sont particulièrement utiles pour le traitement de pathologies impliquant un excès de la prolifération des cellules endothéliales et nécessitant une inhibition de leur croissance. A titre d'exemple de pathologies dont le traitement nécessite la stimulation de l'angiogénèse, et une prolifération endothéliale, on peut citer la cicatrisation, la maturation du corps jaune de l'ovaire, la reperfusion des territoires ischémiés lors de thromboses vasculaires comme dans l'artérite des membres inférieurs et l'infarctus du myocarde. Les anticorps entrant dans ces compositions de l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et préparés selon les techniques bien connues de l'homme du métier à par des molécules solubles HLA de classe ou un équivalent fonctionnel de celles-ci. Les molécules solubles HLA de classe 1 mise en oeuvre dans le cadre de l'invention peuvent être préparées par des techniques classiques de purification comme décrites dans la partie expérimentale ci-après, mais aussi par génie génétique. Ainsi, les inventeurs ont produit la molécule HLA-Gls dans un système eucaryote humain, en particulier à partir de cellules humaines d'origine trophoblastique (lignée JAR, Fournel et al., 1999). Bien que les quantités de HLA-Gls produites par ce système restent limitées et que leur obtention s'effectue sur une durée relativement longue, les avantages de ce système de production sont les suivants : (i), la ss2m humaine est présente dans ces cellules et s'associe donc de façon non covalente naturelle à la chaîne lourde HLA-Gls ; (ii), les peptides qui se fixent dans la poche à peptides formée par les domaines externes al et a2 de HLA-G sont très probablement identiques à ceux présents in vivo sur les molécules HLA-G1 secrétées par les cellules du cytotrophoblaste extravilleux pendant la gestation et qui doivent moduler l'angiogenèse placentaire au niveau de la décidua ; (iii), la molécule HLA-Gls ainsi produite est naturellement glycosylée alors qu'elle ne le serait pas si un système procaryote ou cellules d'insectes avait été utilisé. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent rapportant les travaux qui ont conduit à l'identification du rôle des molécules HLA-Gs dans le processus de différenciation des cellules épithéliales. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - La Figure 1 rapporte les résultats de l'étude de liaison des facteurs aux récepteurs par un immunoessai par compétition. La figure 2 montre l'effet du temps d'incubation de HLA-Gs sur la phosphorylation de PLC-y. - La figure 3 montre l'effet de HLAGs sur la phosphorylation de PI3K. - La figure 4 montre l'effet de HLAGs sur la phosphorylation de MAPK 42/44. - La figure 5 illustre les effets inhibiteurs de la molécule de HLA-Gs sur la prolifération des cellules endothéliales en présence de VEGF. - La figure 6 illustre les effets de modulation de l'expression de ICAM-1 sur cellules HUVEC par cytométrie en flux. - La figure 7 montre les résultats des tests d'inhibition de l'action anti-chimiotactique de HLA GS ou HLA B7 par l'anticorps W6/32. - La figure 8 montre les effets des molécules HLA-Gs sur la croissance tumorale des cellules PC3 transfectées avec HLA-Gs. 1-Matériel et méthode. 1) Purification de la molécule HLA-G1 soluble (HLA-Gls). La molécule HLA-G1 soluble (HLA-Gls) a été purifiée dans le laboratoire INSERM U 395 à partir de surnageants de culture de cellules eucaryotes humaines HLA négatives, exprimant la ss2-microglobu1ine (ss2m), et transfectées (transfections stables) par du cDNA codant pour la chaîne lourde HLA-G1s (contenant l'intron 4) : cellules JAR d'origine trophoblastique ou cellules. 221 d'origine lymphoïde. Les étapes de purification sont les suivantes (Fournel et al., 1999) : - Passage des surnageants de culture sur colonnes d'immunoaffinité (anticorps W6/32 reconnaissant les chaînes lourdes HLA de classe I, y compris HLA-G, associées à la ss2m). Les molécules HLA-G1s fixées sur la colonne sont ensuite éluées avec un tampon glycine à pH basique et neutralisées. - La présence des molécules HLA-G1s dans les fractions d'élution est évaluée par Elisa (Fournel et al., 2000a). Les fractions positives en Elisa sont poolées, concentrées et analysées par SDS-PAGE ou western blots à l'aide d'anticorps anti-HLA-G. - La pureté de ces fractions est attestée par la présence d'une seule bande (37kDa) en western blot avec un anticorps spécifique de HLA-G et de deux bandes de 37et de 12-kDa en SDS-PAGE, correspondant aux chaînes lourdes HLA-G et légère ss2m, respectivement (Fournel et al., 1999). L'expression de HLA-Gs dans le milieu conditionné de clones de cellules PC3 transfectées par pcDNA1/HLA-Gs ou pcDNAl est mesurée par la même technique ELISA. 2) Facteurs de croissance utilisés. Le VEGF (isoforme de 165 acides aminés) (Hutchings, 2000) est produit dans le laboratoire GDR 1927 par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant le cDNA correspondant (Plouët et al., 1997). La iodation de VEGF et de HLA-Gs est effectuée selon la technique décrite précédemment. Le dosage du VEGF dans les milieux conditionnés de cellules PC3 est éffectué par radiorecepteur essai selon la technique décrite précédemment (Plouët, 1990). 3) Anticorps utilisés. Les anticorps utilisés sont les suivants : - anticorps de souris anti Pic gamma-1 (Upstate Biotechnology, cat 06-163) - Anticorps de souris anti P-tyr (Santa Cruz Biotechnology PY20 cat sc-508) - anticorps de lapin anti PI3K (Upstate Biotechnology, p85 cat 06-195) - anticorps de lapin anti-p erk 1/2 (New England Biolabs, cat 9101S) - anticorps de lapin anti erk 2 (Santa Cruz Biotechnology c-14 cat sc-154) - anticorps de souris anti-ICAM-1 (R & D systems CD54 cat BBA 3) 4) Cellules utilisées. Les milieux de culture et les sérums proviennent de la compagnie Life Technologies. Les cellules endothéliales de veines de cordon ombilical humain (HUVEC) sont cultivées sur plastique recouvert de gélatine diluée à 0. 2% dans du PBS. Les cellules sont cultivées en milieu endothélial SFM supplémenté par 50 unités/ml de pénicilline, 50 ug/ml de streptomycine, et 20% de sérum de veau foetal et maintenues dans une étuve à 10 % C02. Ces cultures sont entretenues avec du VEGF à 2 ng/ml ajouté au milieu tous les deux jours. (plouët, 1997) Les cellules endothéliales d'aorte bovine foetale (FBAE) sont cultivées sur plastique recouvert de gélatine diluée à 0. 2% dans du PBS. Les cellules sont cultivées en milieu DMEM-glutamax supplémenté par 50 unités/ml de pénicilline, 50 ug/ml de streptomycine, et 10% de sérum de veau nouveau-né et maintenues dans une étuve à 10 % C02. Ces cultures sont entretenues avec du VEGF à 2 ng/ml ajouté au milieu tous les deux jours et exhibent un phénotype angiogénique. 5) Cytométrie en flux. Des HUVEC sont mises en présence des modulateurs durant 2 heures à 370C en milieu sans sérum puis collectées par grattage et lavées 2 fois avec du PBSBSA 0.2 %. 500 000 cellules sont incubées avec 1 g d'anticorps anti-ICAM-1 dans un volume final de 50 ul. Les cellules sont alors incubés pendant 2 heures à 4 C, puis lavées 2 fois avec du PBS-BSA 0.2%. L'anticorps anti Fc de souris couplé au FITC est ensuite incubé pendant heure. 2 lavages en PBS-BSA 0.2% sont de nouveau réalisés puis les cellules sont analysés par cytomètrie en flux (FACSCAN, BECTON DICKINSON, Longueur d'onde 488 nm). 6) Expériences de liaison du HLA-Gs a ses récepteurs cellulaires. Des cellules HUVEC sont cultivées dans des plaques de 12 puits jusqu'à la subconfluence. Les plaques de cellules sont déposées sur de la glace et lavées trois fois avec du"binding buffer" (DMEM tamponné à pH 7,38 par de l'HEPES 20 mM, supplémenté de 0, 2 % de gélatine). Elles sont ensuite incubées pendant 3 heures à 40C avec une 1 ng/ml de VEGF ou de HLA-Gs iodé dans un volume final de 500ul. La liaison non spécifique du ligand iodé aux cellules est déterminée en présence d'un excès de VEGF ou HLA-Gs non iodé. Après l'incubation, les cellules sont lavées trois fois dans du"binding buffer"et puis lysées avec 500 pl de NaOH 0, 5M. La radioactivité retenue sur les cellules est mesurée au compteur gamma (Jonca, 1997). 7) Phosphorylations. Trois millions de cellules HUVEC préalablement déprivées en sérum sont incubées avec du HLA-Gs en présence ou absence de VEGF durant la période indiquée dans la figure) puis lavées 2 fois avec du PBS supplémenté d'inhibiteurs de phosphatases (lmM d'orthovanadate de sodium et de pyrophosphate de sodium) et d'inhibiteurs de protéases (2 ug/ml de chacun des inhibiteurs aprotinine, leupeptine, pepstatine, benzamidine et 0,5M d'EDTA). Les culots cellulaires sont alors lysés dans un tampon RIPA (0,1% SDS, 1% cacodylate, 1 mM EDTA, dans 10 mM de tampon phosphate, pH 7,4, supplémenté d'inhibiteurs de phosphatases et de protéases). Les lysats sont clarifiés par centrifugation puis le surnageant est préadsorbé sur des billes de protéine A sépharose (Pharmacia) 1 heure à 4 C. Après une centrifugation douce, le surnageant est incubé deux heures à 4 C avec 2 ug/ml de chacun des anticorps désignés dans la légende de la figure. Les complexes immuns sont adsorbés sur des billes de protéine A sépharose, lavés trois fois dans du tampon de lyse et élués dans du tampon d'échantillon SDS-PAGE. Les protéines éluées sont analysées sur un gel 8% (PLC gamma, PI3 kinase) ou 10% (MAP kinase) de polyacrylamide. le gel est électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose. La membrane est ensuite hybridée avec l'anticorps anti phosphotyrosine PY 20 (Santa Cruz Biotechnology PY20 cat sc-508) dilué au 1/200he puis avec un anticorps secondaire anti immunoglobulines de souris (1/10000) couplé à la peroxydase (Amersham Life Science). La révélation de l'activité enzymatique se fait par chemiluminescence avec un kit ECL (Amersham Life Science) (ortéga, 1997). 8) Mitogénicité. Les cellules FBAE ou HUVECsont ensemencées à faible densité (1000 cellules/cm2) dans des boîtes de 12 puits dont la surface a été préalablement tapissée de gélatine (Plouët, 1989). Les modulateurs sont ajoutés après adhésion des cellules au plastique de culture, et après 2 jours. Chaque condition est étudiée dans trois puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptés au cinquième jour. Le pourcentage d'inhibition est calculé comme le rapport (Ortéga, 1997) : (nombre de cellules de l'échantillon-nombre de cellules en absence de VEGF) / (nombre de cellules en présence de VEGF-nombre de cellules en absence de VEGF) 9) Croissance tumorale. Les cellules PC3 dérivées d'adénocarcinome prostatique ont été transfectées par le vecteur PCDNA contenant la séquence codante de HLA-Gs (Fournel et al., 1999) ou non (vecteur vide) par l'utilisation de lipofectamine précédemment décrite (Plouët, 1997). Les cellules ayant intégré l'ADNc de résistance à la généticine sont sélectionnées par 600 mg/ml de G418 ajoutés au milieu de culture. Les clones de cellules ont été prélevés par aspiration à l'aide d'une micropipette sous contrôle microscopique. Les cellules des foyers prélevés sont alors cultivées et divisées en plusieurs cultures. Chacun des clones cellulaires est incubé avec du milieu RPMI contenant 5 mg/ml d'insuline et de transferrine pendant 48 h et les facteurs HLA-Gs et VEGF dosés. Le screening des clones positifs secrétant HLA-Gs a été effectué par Elisa et cytométrie de flux intracellulaire à l'aide d'un panel d'anticorps anti-HLA-G spécifiques (Fournel et al., 2000a). Les cellules PC3-3 et PC3/Gsll, PC3/Gs15 et PC3/Gsl6 sont décollées des plastiques de culture à l'aide de trypsine-EDTA, homogénéisées, centifugées et mis en suspension dans du milieu de culture additionné de 10% de serum de veau foetal. iml correspondant à 3,5 millions de cellules, est injecté sous la peau du flanc droit de chaque souris. La viabilité de la suspension est vérifiée au préalable par coloration vitale au bleu trypan ; le colorant est exclu de plus de 99% des cellules. 6 groupes de 7 souris nude femelles agées de 6 semaines ont été implantées. Vingt jours plus tard, les mesures des tumeurs sont effectuées dans chaque groupe 2 fois par semaine par un opérateur ignorant l'allocation des souris dans chacun des 7 groupes. Au terme de ces études chez la souris nude, les animaux sont sacrifiés. Les tumeurs et certains organes sains (rein, foie, vessie) sont prélevés et conservés pour moitié dans du liquide de conservation (FAE : Formol 4%, Ethanol 40%, Acide Acétique 10%, H20 qsp 100%) et pour moitié sont congelés par imersion dans l'azote liquide après protection par l'iso-thiopentane. II-Résultats. La figure 1 illustre les résultats de l'étude de liaison des facteurs aux récepteurs par un immunoessai par compétition, dans lequel, des cellules HUVEC subconfluentes sont incubées en tampon de liaison à 40C avec 1 ng/ml de facteurs iodés ainsi qu'avec les facteurs non iodés. Après 4 heures, les cellules sont lavées 2 fois en PBS à 4 C. Les cellules sont lysées en 0, 2M NaOH et la radioactivité liée est mesurée dans un compteur gamma. La figure 2 montre l'effet du temps d'incubation de HLA-Gs sur la phosphorylation de PLC-y. Six millions HUVEC sont déprisées en sérum pendant 24 heures. Le HLA-Gs est ajouté pendant 10 ou 60 minutes. 120 ng/ml de VEGF est alors ajouté ou non pendant 15 minutes. Les cellules sont lavées 2 fois à 4 C avec du PBS en présence d'inhibiteurs de protéases et d'inhibiteurs de phosphatases. Les cellules sont collectées par grattage dans 5 ml de PBS et centrifugées à 400 g. Les culots cellulaires sont lysés dans un tampon RIPA à 4 C, préadsorbés sur des billes de protéine A sépharose 1 heure puis incubés deux heures à 4 C avec 2 ug/ml d'anticorps anti-PLC-y. Les complexes immuns sont adsorbés sur des billes de protéine A sépharose et lavés trois fois dans du tampon de lyse. Les surnageants sont élués, dénaturés et réduits dans du tampon échantillon contenant 50 mM de bêtamercaptoéthanol puis analysés sur un gel 8% de polyacrylamide. Le gel est électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose qui est ensuite déshydratée puis hybridée avec un anticorps monoclonal anti P-tyr puis révélée avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase. La révélation de l'activité enzymatique se fait par chimioluminescence avec un kit ECL La figure 3 montre l'effet de HLAGs sur la phosphorylation de PI3K. Six millions HUVEC sont déprivées en sérum pendant 24 heures. Le HLA-Gs est ajouté pendant 10 ou 60 minutes. 120 ng/ml de VEGF est alors ajouté ou non pendant 15 minutes. Les cellules sont lavées 2 fois à 40C avec du PBS en présence d'inhibiteurs de protéases et d'inhibiteurs de phosphatases. Les cellules sont collectées par grattage dans 5 ml de PBS et centrifugées à 400 g. Les culots cellulaires sont lysés dans un tampon RIPA à 40C puis dénaturés et réduits dans du tampon d'échantillon contenant 50 mM de bêta-mercaptoéthanol et analysés sur un gel 8% de polyacrylamide. Le gel est électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose qui est ensuite déshydratée puis hybridée avec un anticorps anti PI3 K puis révélée avec un anticorps secondaire anti IgG de lapin couplé à la peroxydase. La révélation de l'activité enzymatique se fait par chimioluminescence avec un kit ECL. La membrane est ensuite deshybridée et ré-hybridée avec un anticorps polyclonal dirigé contre PI3 K. La figure 4 montre l'effet de HLAGs sur la phosphorylation de MAPK 42/44. Un million HUVEC sont déprivées en sérum pendant 24 heures. Le HLA-Gs est ajouté pendant 10 ou 60 minutes. 120 ng/ml de VEGF est alors ajouté ou non pendant 15 minutes. Les cellules sont lavées 2 fois à 40C avec du PBS en présence d'inhibiteurs de protéases et d'inhibiteurs de phosphatases. Les cellules sont collectées par grattage dans 5 ml de PBS et centrifugées à 400 g. Les culots cellulaires sont lysés dans un tampon RIPA à 40C puis dénaturés et réduits dans du tampon d'échantillon contenant 50 mM de bêta- mercaptoéthanol et analysés sur un gel 8 % de polyacrylamide. Le gel est électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose qui est ensuite déshydratée puis hybridée avec un anticorps anti p erkl/2 puis révélée avec un anticorps secondaire anti IgG de lapin couplé à la peroxydase. La révélation de l'activité enzymatique se fait par chimioluminescence avec un kit ECL. La membrane est ensuite deshybridée et ré-hybridée avec un anticorps polyclonal dirigé contre erk 2. La figure 5 illustre les effets inhibiteurs de la molécule de HLA-Gs sur la prolifération des cellules endothéliales endotheliales en présence de VEGF. Les cellules FBAE sont ensemencées à faible densité (5000 cellules/puits) dans des boîtes de 12 puits. Des doses variables de HLA Gs ou HLA B7 sont ajoutées en présence ou absence de 2 ng/ml de VEGF après adhésion des cellules le premier et le troisième jour. Au cinquième jour, les cellules sont trypsinisées et comptées. Chaque puits est réalisé en triple. Le pourcentage d'inhibition est calculé comme décrit dans le texte. Cette expérience met en évidence que HLAGs et HLA B7 inhibent l'effet mitogène du VEGF sur un mode dépendant de la dose (IC50= 1 nM). En revanche la protéine de fusion HLA-Gs avec la b2 microglobuline (HLA-Gs monocaténaire) n'a pas d'effet sur la prolifération. Des résultats similaires ont été observés en utilisant des cellules HUVEC. Il a été suggéré (Bian, 98) que la dimérisation de molécules HLA de classe I transmembranaires induite par la ligation à l'aide de l'anticorps W6/32 stimulait la prolifération des cellules musculaires lisses. Pour déterminer si cette ligation existait aussi dans les cellules endothéliales, les cellules HUVEC ont été soumises à l'action de l'anticorps W6/32 en présence ou absence de HLA Gs ou HLA B7s. Il apparaît que W6/32 stimule la prolifération des cellules HUVEC et que cet effet est inhibé par ces 2 formes solubles de HLA de classe I. HLA Gs et HLA B7s inhibent la prolifération induite par l'anticorps W6/32. La figure 6 illustre les effets de modulation de l'expression de ICAM-1 sur cellules HUVEC par cytométrie en flux. Des cellules HUVEC sont mises en présence de HLAGs, HLAB-7 en présence ou absence de VEGF 2 heures à 37 C. 500 000 cellules collectées par grattage sont incubées 2 heures à 40C avec 2 /m1 d'anticorps anti-ICAM-1. Après lavage un anticorps anti Fc de souris couplé au FITC dilué 1/100 est ensuite incubé pendant une demi heure. Deux lavages en PBS-BSA 0,2% sont de nouveau réalisés puis les cellules sont analysés par cytomètrie en flux. La figure 7 illustre les effets de la molécule HLA-Gs sur la migration des cellules endothéliales. Cette expérience montre que les molécules HLA-Gs et HLA B7s n'ont pas d'effet sur la migration spontanée des cellules. En revanche un excès molaire de 4 fois seulement suffit à inhiber pratiquement totalement l'activité chimiotactique du VEGF. Il a été démontré (Figure 5) que la dimérisation de molécules HLA de classe I transmembranaires induite par la ligation à l'aide de l'anticorps W6/32 stimulait la prolifération des cellules HUVEC. Pour déterminer si cette ligation était aussi efficace sur les cellules FBAE, ces cellules ont été soumises à l'action de l'anticorps W6/32 en présence ou absence de HLA-Gs ou HLA B7s. Il apparaît que W6/32 stimule la migration des cellules FV et que cet effet est inhibé par ces 2 formes solubles de molécules HLA de classe I. La figure 7 montre en outre les résultats des tests d'inhibition de l'action anti-chimiotactique de HLA GS ou HLA B7 par l'anticorps W6/32. Les cellules FBAE sont ensemencées à forte densité (40 000 cellules/puits) dans des boîtes de 12 puits en présence de 2 ng/ml de VEGF. 2 jours après la confluence la prolifération cellulaire est arrêtée par le transfert en milieu ne contenant ni sérum ni VEGF pendant 24 heures. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche par grattage à l'aide d'une pointe mousse, les cellules rincées abondamment puis les modulateurs sont ajoutés. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. 24 heures après les cellules sont rincées avec du milieu DMEM, colorées au May GrunwaldGiemsa et les cellules ayant migré sont comptées dans 8 champs par condition. La figure 8 montre les effets des molecules HLA-Gs sur la croissance tumorale des cellules PC3 transfectées avec HLA-Gs. Six millions de cellules de PC3 transfectées par le vecteur contrôle (PC3-P3) ou le vecteur contenant la séquence codante de HLA Gs (clones PC3-Gsll, 15 et 16) sont innoculées à 7 souris nude. Au bout de 20 jours, le volume tumoral est mesuré 2 fois par semaine. Les mesures sont réalisées par un opérateur ignorant l'allocation des souris dans chacun des 4 groupes. Au 53 jours, les souris sont sacrifiées et la tumeur est pesée. Les temps de doublement ont été analysés par la cinétique de la prolifération de chacun des clones. La mesure ELISA anti-HLAGs a été réalisé avec l'anticorps 87G. L'analyse de la cinétique de prolifération des transfectants ne fait pas apparaître de différence significative entre les cellules transfectées avec le vecteur vide (temps de doublement de 30 heures) et les transfectants portant la séquence codante de HLA-Gs (temps de doublement de 32 heures), ni non plus de la synthèse de VEGF. Il apparaît donc que l'expression de HLA-Gs ne joue ni sur la viabilité ni sur le potentiel angiogénique de la cellule cancéreuse. En revanche l'analyse des milieux conditionnés démontre que leur activité de stimulation de la prolifération des cellules endothéliales est diminuée dans les transfectants portant la séquence du HLA-Gs. L'inoculation des transfectants à des souris nude fait apparaître des différences significatives entre les cellules transfectées avec le vecteur vide (temps de doublement de 50 heures) et les transfectants portant la séquence codante de HLA-Gs (diminution du volume tumoral de 40 %, 80 % et 98 % respectivement pour les clones 11, 15 et 16. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Bian H, Harris PE, Reed EF, Ligation of HLA class I molecules on smooth muscle cells with anti-HLA antibodies induces tyrosine phosphorylation, fibroblast growth factor receptor expression and cell proliferation. 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REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une molécule soluble HLA de classe 1 ou d'une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique codant pou une molécule soluble HLA de classe 1 pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à inhiber l'angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule soluble HLA de classe 1, est choisie parmi les molécules HLA-Gls ou HLA-B7s, ou un dérivé de celles-ci. 3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la molécule soluble HLA de classe 1 est choisie parmi la molécule HLA-Gls ou une isoforme de celle-ci. 4) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique codant une molécule soluble HLA de classe 1, ladite séquence étant placée sous le contrôle de séquences de régulation de son expression. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée au traitement des pathologies comprenant le cancer, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, le rejet chronique de greffes comme la cornée ou le rein ou le rejet aigu observé dans les xénotransplantations, les angiomes, les angiosarcomes, en particulier la maladie de Castelman ou le sarcome de Kaposi. 6) Utilisation de la molécule HLA-Gls associée à une substance d'intérêt pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques. 7) Composé constitué de la molécule HLA-Gls couplé à une substance d'intérêt, ledit composé étant capable de se fixer aux cellules endothéliales par l'intermédiaire d'un récepteur.