FR 2832066 A1 20030516 FR 0114729 A 20011114 COMPOSITIONS VACCINALES CONTRACEPTIVES COMPRENANT UN PEPTIDE OU UN ENSEMBLE DE PEPTIDES CODES PAR TOUT OU PARTIE DE L'EXON 1 D'UN RECEPTEUR DE LA FSH. La présente invention concerne une méthode de contraception immunologique de mammifères, tout particulièrement de mammifères mâles et bien-entendu de l'homme, basée sur l'inhibition de l'activité FSH. L'invention a aussi pour objet les compositions vaccinales contraceptives pour la mise en oeuvre de ladite méthode. La follitropine ou folliculostimuline, aussi désignée ci-après FSH, est une hormone protéique constituant le principal support de la différentiation et de la croissance des gamètes, spermatogenèse et folliculogenèse, chez les mammifères adultes. Les femmes qui ont accès à la contraception peuvent ressentir comme une contrainte la prise régulière de contraceptifs hormonaux qui présentent en outre parfois des effets secondaires. Il serait donc utile de leur offrir une méthode vaccinale ne nécessitant par exemple qu'une injection par an ou la pose d'un implant à effet prolongé. La demande de contraception chez les hommes est certainement beaucoup plus faible que chez les femmes, mais est en progression. Il serait cependant utile de disposer de méthodes alternatives aux moyens mécaniques ou chirurgicaux. Enfin des méthodes de contraception vaccinales offrent l'avantage de pouvoir être facilement diffusées à faible coût auprès des populations très peu médicalisées où le contrôle des naissance est une préoccupation. La plupart des stratégies à l'étude, notamment dans les laboratoires agréés par l'OMS, pour inhiber la FSH, notamment chez l'homme, sont basées sur la manipulation des taux d'androgènes. Ainsi, on utilise des analogues du GnRH, qui inhibent la sécrétion de LH et FSH au niveau central, pour obtenir une diminution de l'activité testiculaire et donc de la production d'androgènes. Mais, il est alors nécessaire de compenser cette diminution générale pour l'administration de dérivés de testostérone à longue durée de vie. Il a aussi été proposé dans l'art antérieur des méthodes contraceptives basées sur l'inhibition de l'action de la FSH grâce à l'action d'antagonistes de cette hormone, notamment des peptides. On peut citer à titre d'exemples de telles méthodes, la demande de brevet PCT publiée sous le No. WO 9529685. La mise en oeuvre de ces méthodes est limitée par le fait qu'il n'existe encore aucun agoniste ou antagoniste pharmacologique de l'hormone FSH. En effet, l'absence de connaissances sur la structure spatiale de son récepteur ou du complexe hormono-récepteur s'oppose à la conception de telles drogues. Les trois récepteurs des hormones hypophysaires glycoprotéiques (LH/hCG, TSH et FSH) forment une sousfamille de la superfamille des RCPG traversant sept fois la membrane. Leur particularité est de posséder un domaine extracellulaire important représentant environ la moitié de la molécule (350 résidus). Ces domaines sont le siège de la majorité des interactions fonctionnelles avec les ligands hormonaux. Les travaux de cartographie fonctionnelle n'ont concerné que deux récepteurs de la famille, le récepteur de la LH/CG et celui de la TSH. Aucune étude structure/fonction n'a été effectuée pour le récepteur de FSH. Les séquences de ces trois récepteurs présentent des homologies très importantes, les inventeurs ont donc supposé, dans le cadre de la présente invention, que leurs structures spatiales, encore inconnues, étaient superposables et donc que les aires d'interaction avec les hormones, elles-mêmes très homologues, étaient conservées. Les études structure/fonction ont montré qu'il existe au moins trois aires du domaine extracellulaire impliquées dans les interactions hormone-récepteur, dont une définie par les premiers acides aminés de la protéine mature, codés par l'exon I des gènes, une autre codée par l'exon 4, la troisième par l'exon 9. La comparaison des séquences des trois récepteurs de LH, TSH et FSH par alignement montre que la séquence N-terminale de la protéine codée par l'exon 1 est la seule région des domaines extracellulaires qui soit à la fois impliquée dans l'interaction avec les hormones et spécifique de chaque récepteur. Cette région ne présente aucune homologie de séquence primaire et constitue donc la seule cible qui permet d'interagir spécifiquement avec la fonction de l'une ou l'autre de ces hormones. De plus, en utilisant des peptides et des anticorps monoclonaux dirigés contre ces peptides, il a été montré que la moitié C-terminale de cette région codée par l'exon 1 n'inhibait que la liaison hormone-récepteur, alors que les résidus constituant la région codée par la jonction exon 1-exon 2 étaient impliqués également dans la transduction du message hormonal conduisant à la production d'AMPc. Les conséquences de cette observation sont très importantes pour la définition de cibles spécifiques sur les récepteurs et donc pour la conception future d'antagonistes et d'agonistes pharmacologiques des hormones de cette famille. En effet, la moitié C-terminale de la séquence codée par l'exon 1 constituerait une cible potentiellement"antagoniste", et la séquence codée par la jonction des exons 1 et 2 constituerait une cible potentiellement"agoniste". Cette hypothèse a été vérifiée in vitro par l'utilisation d'anticorps dirigés spécifiquement contre ces deux cibles. Les travaux d'immunisation réalisés avec des peptides codés par l'exon 1 du récepteur de la FSH sur la souris (J-J. Remy, et al., Journal of Reproductive Immunology, 32 (1996), 37-54) et la brebis (L. Abdennebi et al., Journal of Molecular Endocrinology (1999) 22, Apr 22 (2) : 151-159) ont démontré les effets antagonistes de la FSH de ces vaccins. La présente invention a donc pour but de fournir une nouvelle méthode de contraception immunologique et les compositions pour sa mise en oeuvre, basées sur l'utilisation d'un ensemble de peptides correspondant à tout ou partie de la séquence codée par l'exon 1 du récepteur de la FSH. Cet ensemble de peptides permet de mobiliser le système immunitaire contre le récepteur de l'hormone et ainsi d'inhiber de façon transitoire l'activité de l'hormone. La méthode et les compositions de l'invention sont remarquables en ce qu'elles permettent d'obtenir une stérilité temporaire, réversible et ré-inductible. En effet, l'inhibition complète de la spermatogenèse qui est obtenue ne modifie pas les concentrations de testostérone et donc n'affecte pas les fonctions essentielles qui dépendent des androgènes comme le comportement sexuel, la croissance musculaire et osseuse, ou l'immunité. En conséquence, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique contraceptive chez un mammifère mâle, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide de 5 à 25 de préférence 8 à 20 résidus d'acides aminés consécutifs d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère, ledit peptide étant capable d'induire une production d'anticorps en quantité suffisante pour entrer en compétition avec la FSH et inhiber la spermatogenèse chez un individu mâle. Plus particulièrement l'invention a pour objet une composition pharmaceutique contraceptive chez un mammifère mâle, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'un ensemble de peptides comprenant de 8 à 12 résidus d'acides aminés consécutifs d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère, ledit ensemble de peptides couvrant tout ou partie de ladite séquence et est constitué de façon à ce que chaque résidu d'acide aminé de ladite séquence soit compris dans au moins un peptide de l'ensemble, ledit ensemble étant capable d'induire une production d'anticorps en quantité suffisante pour entrer en compétition avec la FSH et inhiber la spermatogenèse chez un individu mâle. L'objectif chez l'homme est d'atteindre grâce à l'utilisation des compositions selon l'invention une diminution de la production de spermatozoïdes qui entraîne la stérilité, soit une production inférieure à 1 million de spermatozoïdes par ml. Toutefois, des variations individuelles importantes sont prévisibles comme celles que l'on a observées chez les singes mâles. Les peptides ci-dessus peuvent être définis par rapport à la séquence du récepteur de FSH d'un même mammifère que celui auquel la composition de l'invention est administrée pour inhiber la spermatogenèse, par exemple chez l'homme. La composition pharmaceutique contraceptive selon l'invention constitue une composition vaccinale à visée thérapeutique contre un antigène du soi. La présente invention offre donc un exemple remarquable d'application à l'homme d'une auto-immunité pour interférer avec une fonction physiologique. Or, de manière générale, l'auto-immunité est associée à des pathologies. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention montre qu'il est possible de mettre ce mécanisme pour un usage thérapeutique. Ce résultat est possible car la mise en oeuvre de l'ensemble de peptides selon l'invention constitue une immunisation : - contre un antigène membranaire et non circulant, qui ne présente pas de risques d'immunisations croisées, - avec des peptides correspondant à un antigène dont la fonction est unique et dont l'expression est faible et localisée dans un seul tissu, - qui n'entraîne pas de toxicité, seulement une réponse anticorps et qu'elle est totalement réversible. Parmi, les séquences peptidiques codées par l'exon 1 d'un récepteur de FSH, on peut citer : - La séquence peptidique codée par l'exon 1 du récepteur de la FSH humaine et du singe Macaca fascicularis (Minegishi, T., Nakamura, K., Takakura, Y., Ibuki, Y., Igarashi, M. and Minegishi, T., Cloning and sequencing of human FSH receptor cDNA published erratum appears in Biochem Biophys Res Commun 1994 Junl5 ; 201 (2) : 1057] Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (3), 1125-1130 (1991) : MALLLVSLLAFLSLGSGCHHRICHCSNRVFLCQESKVTEIPSDLPRN AIEL, représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1. - La séquence de l'exon 1 du récepteur de la FSH de rongeur et notamment de la souris : MALLLVSLLAFLGSGSGCHHWLCHCSNRVFLCQDSKVTEIPPDLPRN AIEL, représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2. La séquence du récepteur FSH humain n'apparaît dans les banques qu'en 1991. Le premier récepteur FSH cloné a été celui du rat. Ainsi, le brevet européen publié sous le No. 471 030 rapporte la séquence du récepteur FSH de rat. Cette séquence ne diffère de celle du récepteur FSH humain, au niveau de la partie C-terminale de 17 acides aminés codée par l'exon 1 défini ci-dessus, que de 1 acide aminé. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont concerné des singes Macaca radiata, dont le récepteur FSH n'est pas séquencé. Mais le gène du singe très proche Macaca fascicularis ne présente aucune différence avec le récepteur humain pour la région concernée définie ci-dessus. En conséquence, l'invention s'intéresse tout particulièrement à un ensemble de peptides issus du récepteur humain de la FSH ou même d'un mammifère proche de l'homme pour une utilisation de la composition chez l'homme. Les séquences données ci-dessus à titre d'exemple ne correspondent pas à ce qui est présent à l'extremité N-terminale de la protéine mature. En effet, l'expression du récepteur à la membrane des cellules se fait après élimination du peptide signal constitué des premiers acides aminés. En conséquence, le peptide ou les peptides de l'ensemble objet de la présente invention sont constitués de résidus d'acides aminés consécutifs de la séquence peptidique mature codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère. Il s'agit alors d'un peptide ou d'un ensemble de peptides couvrant la partie C-terminale de la séquence peptidique codée par ledit exon 1. Avantageusement, le peptide ou l'ensemble de peptides selon l'invention couvre la séquence peptidique de 17 acides aminés codée par la région de l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère précédant l'exon 2 dudit récepteur. En effet, seule cette région code pour une séquence peptidique mature qui constitue la cible immunologique des vaccins antagonistes car, au-delà de cette région, la séquence peut être agoniste comme indiqué précédemment. Comme indiqué précédemment, le choix des peptides utilisés dans les expériences effectuées dans le cadre de l'invention a été dirigé par des travaux de cartographie des régions importantes des récepteurs de LH et de TSH, les deux autres membres de cette famille de trois récepteurs : LH, TSH et FSH. Toutefois, aucune cartographie du récepteur de FSH n'a été réalisée en détail, c'est donc par alignement des trois séquences, en supposant que les structures des trois sont analogues qu'ont été choisis les peptides A, B et C pour le récepteur de FSH : Peptide A : SKVTEIPSDL (SEQ ID NO. 3) Peptide B : SDLPRNAIEL (SEQ ID NO. 4) Peptide C : RNAIELRFVL (SEQ ID NO. 5) Les travaux d'Abdennebi (Abdennebi et al., Journal of Molecular Endocrinology (1999) 22, Apr 22 (2) : 151-159) ont montré, in vitro, que les anticorps dirigés contre A et contre B sont bien des inhibiteurs de la liaison de l'hormone, donc jouent le rôle d'antagonistes de FSH. La fin de B correspond à la fin de ce qui est codé par l'exon 1 dans le gène. A et B couvrent donc la seconde moitié de la partie N-terminale codée par l'exon 1, soit : SKVTEIPSDL pour A et SDLPRNAIEL pour B. En ce qui concerne le peptide C, RNAIELRFVL, ses 4 derniers acides aminés RFVL font partie de ce qui est codé par l'exon 2 sur le gène. Les travaux d'Abdennebi ont montré également que, in vitro, les anticorps contre le peptide C ne sont pas inhibiteurs de la liaison de l'hormone, et peuvent au contraire activer le récepteur de FSH par eux-mêmes, ils sont donc agonistes. Afin d'avoir un effet antagoniste maximal, les Inventeurs ont défini un ensemble de peptides couvrant la partie C-terminale de 17 acides aminés du récepteur de la FSH codée par l'exon 1 dont le dernier acide aminé correspond à la jonction exonl-exon2, de séquence suivante (SEQ ID NO. 7) : SKVTEIPSDLPRNAIEL Cette séquence de 17 acides aminés est codée par la séquence suivante en nucléotides (SEQ ID NO. 6) : agc aag gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg La mise en oeuvre d'un mélange de séquences permet d'être le moins restrictif possible par rapport aux différents contrôles immunogénétiques de la réponse anticorps. Il existe également un contrôle sexe spécifique puisque les Inventeurs ont observé des réponses plus importantes chez les mâles que chez les femelles avec le mélange de trois peptides utilisé. Les combinaisons possibles de peptides sont nombreuses et dépendent du système de présentation. Toutefois, en considérant des longueurs de dix résidus adaptés au système phage ou aux peptides de synthèse couplés, on peut faire un mélange des 8 peptides possibles couvrant la séquence de 17 acides aminés considérée dans l'invention : SKVTEIPSDL (SEQ ID NO. 9) KVTEIPSDLP (SEQ ID NO. 11) VTEIPSDLPR (SEQ ID NO. 13) TEIPSDLPRN (SEQ ID NO. 15) EIPSDLPRNA (SEQ ID NO. 17) IPSDLPRNAI (SEQ ID NO. 19) PSDLPRNAIE (SEQ ID NO. 21) SDLPRNAIEL (SEQ ID NO. 23) Ces peptides sont codés respectivement par les oligonucléotides suivants : agc aag gtg aca gag att cct tct gac ctc (SEQ ID NO. 8) aag gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg (SEQ ID NO. 10) gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg agg (SEQ ID NO. 12) aca gag att cct tct gac ctc ccg agg aat (SEQ ID NO. 14) gag att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc (SEQ ID NO. 16) att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att (SEQ ID NO. 18) cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa (SEQ ID NO. 20) tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg (SEQ ID NO. 22) Les compositions de l'invention peuvent comprendre l'ensemble complet de peptides définis ci-dessus par rapport à la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH, mais elles peuvent aussi ne contenir qu'un sous-ensemble de 50% ou plus de cet ensemble dès lors que les peptides du sous-ensemble couvrent substantiellement toute la longueur d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH et de préférence la partie C-terminale de la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH. Dans la composition pharmaceutique contraceptive selon l'invention, tout ou partie des peptides de l'ensemble ou du sous-ensemble peut être présent en plus d'un exemplaire avantageusement en deux ou trois exemplaires. Un ensemble ou un sous-ensemble de peptides mis en oeuvre dans les compositions selon l'invention comprend plus de 5 peptides, de préférence plus de 10 peptides différents, selon la longueur de chacun desdits peptides. La longueur moyenne des peptides d'un ensemble ou d'un sous-ensemble est de préférence de l'ordre de 10 résidus d'acides aminés. Les compositions de l'invention sont remarquables en ce que leur effet sur la spermatogenèse est temporaire. Cette réversibilité tient au fait qu'en l'absence de rappel, les taux d'anticorps compétitifs baissent et laissent agir à nouveau l'hormone qui ré-induit la formation de gamètes. Le ou les peptides des compositions de l'invention présentent généralement un caractère faiblement immunogène, ils sont donc avantageusement associés dans lesdites compositions avec un adjuvant. Avantageusement, l'adjuvant est constitué par un système de présentation des peptides. Un premier exemple de réalisation d'un tel système de présentation est constitué par un ou plusieurs vecteurs d'expression, comme un vecteur viral, comprenant une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant un ou plusieurs peptides identiques ou différents. Les peptides peuvent être exprimés sous forme de produits de fusion en un ou plusieurs exemplaires. L'invention a donc aussi pour objet ce (s) vecteur (s) d'expression ou un hôte ou un ensemble d'hôtes transformé (s) par ce (s) vecteur (s) d'expression et les compositions les comprenant. A titre d'exemples de vecteurs d'expression et d'hôtes, on peut citer les phages filamenteux, le récepteur des phages ou pili des bactéries E. coli mâles, ou tout autre microorganisme recombinable capable de présenter des peptides au système immunitaire et dont l'injection ou l'utilisation comme antigène est physiologiquement neutre ou bénéfique. Le système de phages utilisé chez le singe dans le cadre des travaux de l'invention est intéressant même pour une application humaine, car il est : - efficace, le phage est par lui-même un adjuvant, - très peu coûteux, et - sans effet secondaire ou toxique, puisque l'homme est immunisé contre ces phages. Mais tout système recombinant présentant plusieurs des avantages ci-dessus est utilisable dans le cadre de l'invention. Un second exemple de réalisation d'un tel système de présentation est constitué par une ou plusieurs substance (s) porteuse (s) associée (s) à un ou plusieurs exemplaire des peptides de l'ensemble ou du sous-ensemble. A titre d'exemples de molécules porteuses, on peut citer la multimérisation grâce à des supports synthétiques de type polylysines, la fusion avec des protéines (toxines), la microencapsulation des peptides dans des microsphères biodégradables, le couplage lipopeptidique, ou tout autre système synthétique qui favorise la réponse humorale contre les peptides sans entraîner de réactions cytotoxiques. Pour les préparations entièrement synthétiques, il existe de nombreuses possibilités par exemple le couplage à la toxine diphtérique ou tétanique plus un adjuvant clinique à base d'aluns. La composition de l'invention peut comprendre outre le peptide, l'ensemble ou le sous-ensemble de peptides, et avantageusement l'adjuvant, un ou plusieurs antigènes capables d'induire une réponse immunitaire pour vacciner contre des agents infectieux divers. Le ou les peptides des compositions de l'invention peuvent être issus d'une séquence peptidique de l'exon 1 d'un récepteur à la FSH d'une espèce différente ou de la même espèce de celle à laquelle est administrée la composition de l'invention. Ainsi, une composition pharmaceutique contraceptive pour l'homme peut comprendre un ensemble ou un sous-ensemble de peptides issus d'une séquence peptidique de l'exon 1 du récepteur à la FSH de singe. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'un peptide, d'un ensemble ou d'un sousensemble de peptides issus d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH, comme défini précédemment, pour la préparation d'un vaccin contraceptif destiné à être administré à un individu mâle d'une espèce différente de celle de ladite séquence peptidique codée par l'exon 1. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de l'étude qui suit concernant la contraception de singes mâles adultes par un vaccin antirécepteur de la FSH, et dans laquelle il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente l'immunité moyenne des singes mâles contre les vaccins peptidiques anti-récepteur de la FSH, mesurée à 2, 4,6 et 8 mois de la primoinjection. La figure 2 représente la mesure des taux moyens circulants de testostérone matinale et vespérale chez les singes mâles vaccinés. La figure 3 représente l'évolution de la production de spermatozoïdes. Phases de vaccination 1 et 2, rappels bimensuels. L'étude ci-dessous rapporte les travaux réalisés sur cinq singes mâles de l'espèce Macaca radiata qui ont été immunisés avec un mélange de trois phages recombinants exprimant à leur surface des décapeptides du domaine N-terminal du récepteur humain de la folliculostimuline (FSH). Pendant une première phase de vaccination de sept mois, des injections de rappel (3 à 5 mg d'antigène par injection sous-cutanée) ont été effectuées deux fois par mois. Les injections ont ensuite cessé pendant cinq mois, et repris avec la même fréquence (phase 2). Le niveau des réponses immunes contre les vecteurs phages a été suivi régulièrement pendant la phase 1, laissant apparaître des différences individuelles. L'analyse des taux de testostérone circulants dans le sérum des animaux vaccinés ne montre aucune influence des vaccins anti-RFSH, puisqu'ils suivent un rythme circadien régulier et identique tout au long de l'expérience, quels que soient la phase et le taux d'anticorps. La production de sperme est fortement inhibée par le vaccin pour quatre singes sur cinq, jusqu 1 à l'interruption totale. La durée et la vitesse d'inhibition est aussi variable selon les individus. Après l'arrêt du traitement, on observe la reprise de la spermatogenèse jusqu'à des taux contrôles avec des cinétiques variables. La ré-immunisation pour la phase 2 ré-induit la stérilité. Tous les mâles vaccinés ont été accouplés pendant une semaine avec trois femelles cycliques : aucune des quinze femelles n'a été fécondée pendant ces accouplements, alors qu'aucune modification du comportement sexuel n'a été notée. 1-Matériel et méthodes. 1) Animaux. Les expériences ont été effectuées sur des singes Macaques (Macaca radiata) adultes des deux sexes (10 mâles et 10 femelles). Cinq singes de chaque sexe ont été vaccinés, les dix autres ayant servi de témoins. Tous les animaux utilisés sont issus de l'élevage interne de l'Institut Indien des Sciences de Bangalore. Ils sont donc régulièrement suivis par un personnel spécialisé, dont un vétérinaire chargé de contrôler l'absence de pathologies infectieuses et parasitaires. Avant d'être recrutés dans le protocole, tous les animaux ont été testés pour les paramètres endocrines et pour leur fertilité. Pour les femelles, les taux de 17 bêta-oestradiol et de progestérone ont été dosés sur une durée d'au moins trois cycles. Pour les mâles, la production de spermatozoïdes, ainsi que le rythme et la régularité des variations circadiennes de testostérone ont été mesurés. Des mesures de poids et de volume testiculaire ont également été effectuées. Des observations des comportements sociaux et sexuels des animaux immuns et témoins ont été réalisées sur toute la durée de l'expérience. 2) Construction de phages recombinants présentant à leur surface des fragments du récepteur de la FSH. Les vecteurs utilisés sont des phages filamenteux recombinants de type fd. Ces vecteurs ont été conçus pour la construction de banques de séquences peptidiques aléatoires, permettant de sélectionner et/ou d'identifier des peptides se liant avec une forte affinité à des cibles diverses (anticorps, récepteurs, enzymes, etc...). Ces phages sont composés d'un ADN circulaire d'environ 10 kilobases entourés d'une dizaine de protéines. Deux de ces protéines, p3 et p8, peuvent présenter des insertions de tailles variables sans affecter la physiologie du phage. La protéine p3 est présente en cinq exemplaires à une extrémité du phage et peut porter des protéines étrangères de taille importante (plus de 50 kilodaltons) ; jusqu'à 20% des 2300 protéines p8 (codée par le gène VIII) qui forment le"manteau"du phage peuvent accepter des peptides d'une dizaine d'acides aminés à leur extrémité N-terminale. Le vecteur f88-4 contient deux gènes VIII, le gène sauvage et un gène synthétique recombinable, inséré entre le signal de packaging et un gène permettant la résistance à la tétracycline (Smith, 1988, Virology 167,156-165). Des oligonucléotides synthétiques double-brins codant pour les décapeptides de séquences suivantes ont été préparés : SKVTEIPSDL (SEQ ID NO. 9) KVTEIPSDLP (SEQ ID NO. 11) VTEIPSDLPR (SEQ ID NO. 13) TEIPSDLPRN (SEQ ID NO. 15) EIPSDLPRNA (SEQ ID NO. 17) IPSDLPRNAI (SEQ ID NO. 19) PSDLPRNAIE (SEQ ID NO. 21) SDLPRNAIEL (SEQ ID NO. 23) Ces oligonucléotides répondent aux séquences suivantes : agc aag gtg aca gag att cet tct gac ctc (SEQ ID NO. 8) aag gtg aca gag att cet tct gac ctc ccg (SEQ ID NO. 10) gtg aca gag att cet tct gac ctc ccg agg (SEQ ID NO. 12) aca gag att cet tct gac ctc ccg agg aat (SEQ ID NO. 14) gag att cet tct gac ctc ccg agg aat gcc (SEQ ID NO. 16) att cet tct gac ctc ccg agg aat gcc att (SEQ ID NO. 18) cet tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa (SEQ ID NO. 20) tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg (SEQ ID NO. 22) Ces oligonucléotides sont insérés dans le gène VIII de synthèse grâce à deux sites de restriction HindIII et PstI. Après ligation, l'ADN est introduit par électroporation dans la souche de bactéries MC1061 femelle, souche dans laquelle se fera également la production des particules. Les phages recombinants sont identifiés et caractérisés par séquençage des gènes VIII hybrides. 3) Production des phages hybrides pour les vaccinations. Les phages f88-4 ne tuent pas leur hôte bactérien ; d'autre part, les particules produites dans le milieu ne sont infectieuses que pour les bactéries"mâles", exprimant leur récepteur ou pili. Une colonie de bactérie MC1061 contenant l'ADN du phage hybride est mise en culture pendant 18 heures dans un milieu LB ou NZY contenant 40 lig/ml de tétracycline. Le milieu contenant les particules de phages est séparé des bactéries par deux cycles de centrifugation. Les phages sont ensuite précipités à froid par le PEG, et concentrés par centrifugation. Les rendements, variables selon les peptides greffés, peuvent atteindre 100 mg par litre de culture. Les phages sont repris dans une solution injectable avant d'être stérilisés par chauffage à 700C pendant 15 minutes. De plus, leur ADN est détruit par une exposition aux rayons ultraviolets qui les rend incapables d'infection et de réplication. 4) Protocoles d'immunisations et immunité. Pour les injections chez les animaux, les doses injectées ont été déterminées d'après les premières expériences menées chez la souris. Les phages sont mis en suspension dans un volume de PBS ou une émulsion composée d'un volume de PBS et d'un volume d'adjuvant de Freund, compatibles avec le mode d'injection et la taille de l'animal. Chez la souris, des volumes de 0,05 ml à 0,1 ml avaient été injectés en mode sous-cutané ou intrapéritonéal. Chez le singe, des volumes dix fois supérieurs ont été injectés par voie sous-cutanée. Les mêmes rapports ont été conservés pour les concentrations (ou le nombre de particules) de phages injectés : de 0,1 mg chez la souris, entre 1 et 5 mg chez les singes, sauf pour la primoinjection (15 mg). La fréquence des rappels a été ajustée en fonction des espèces. Chez la souris, les cinétiques de production d'anticorps sont connues pour de nombreux antigènes. Un seul rappel effectué trois semaines après la primoinjection était en général suffisant pour obtenir des titres élevés d'anticorps. Chez le singe, aucune expérience préliminaire de vaccination n'ayant été possible, faute d'animaux disponibles, un protocole de rappels fréquents (à deux semaines d'intervalle) avec des faibles doses d'antigène (lmg ou 5 mg/injection) a été choisi dans l'espoir de maintenir des titres anticorps constants. Après une primoinjection de 15 mg (adjuvant complet de Freund) par singe par voie sous-cutanée, quinze injections de rappel (3 mg de phages dans l'adjuvant incomplet de Freund) ont été effectuées sur une durée de huit mois (Phase de vaccination 1). Les jours de rappel, deux échantillons sanguins ont été prélevés à douze heures d'intervalle (matin et soir). Les injections ont été interrompues pendant cinq mois, mais pas les prélèvements de sang. Les injections ont repris ensuite sans modification des doses ni des intervalles pendant au moins quatre mois (Phase de vaccination 2) : 14/10/1999 : Primoinjection (15 mg), puis rappels deux fois par mois pour la phase de vaccination 1. 29/05/2000 : Dernier rappel et interruption de la vaccination. 10/11/2000 : Reprise des rappels deux fois par mois pour la phase de vaccination 2. Le degré d'immunisation des animaux a été suivi par le dosage des anticorps circulants dirigés contre les vecteurs phages. Des travaux préliminaires ont établi que l'immunité contre le vecteur est une mesure proportionnelle de l'immunité contre le peptide exposé par le phage et contre le récepteur. Des techniques d'ELISA directes ou indirectes ont été employées, selon que les phages aient été adsorbés par le plastique des microplaques de 96 puits, ou qu'ils aient été liés par des anticorps anti-phages M13 préalablement adsorbés. Plusieurs dilutions de sérum (volumes de 0, 1 ml dans du PBS additionné de BSA à 1%) ont été incubés pendant une heure à 37 C dans les puits recouverts de phages. Après trois lavages des puits au PBS sans BSA, des anticorps anti-espèces biotinylés et une solution de streptavidine couplée à la peroxydase (dilutions au 1/1000ème) ont été incubés pendant une heure à 37 C. Après lavage des puits, un substrat coloré de la peroxydase a permis la mesure d'une densité optique relative, et le calcul d'un titre anticorps pour chaque antisérum. Plusieurs contrôles ont été effectués pour chaque essai pour la mesure des bruits de fond : sérum d'animaux non immuns, absence de sérum dans les puits et absence d'anticorps secondaires. 4) Paramètres endocrines. Les taux de testostérone, d'oestradiol et de progestérone circulant dans le sérum des animaux ont été évalués en utilisant des essais radioimmunologiques (RIA) spécifiques. La testostérone matinale et vespérale a été dosée à intervalles réguliers pour tous les singes mâles dès après le début du traitement vaccinal. Les dosages d'oestradiol et de progestérone chez les femelles ont permis de mesurer la durée des cycles ovariens, la durée moyenne des cycles chez la femelle Macaca radiata étant identique à celui de la femme. 5) Spermatogenèse, études de fertilité et de comportement. Des échantillons de sperme ont été obtenus toutes les deux semaines pendant les 14 mois de l'expérience par électroéjaculation. L'évaluation de la production en spermatozoïdes par éjaculat a été effectuée par une méthode d'examen microscopique selon le protocole préconisé par l'OMS. Pour tester la fertilité des singes mâles vaccinés ou non vaccinés, les femelles partenaires présentant un cycle régulier, ont été suivies pour la production d'oestradiol tous les jours entre les jours 7 et 10 du cycle. Une femelle avec un taux d'oestradiol circulant au moins égal à 250 pg/ml (jour 7,8, 9 ou 10 du cycle) est mise en couple avec un mâle du jour 10 au jour 16 du cycle menstruel. La fécondation et la grossesse est ensuite suivie par le dosage quotidien de la progestérone jusqu'au jour 30, puis, par la suite, par échographie. Le nombre d'accouplements (libido et comportement sexuel) a été évalué pour quelques couples par l'utilisation de caméras vidéo, ces singes ayant un comportement sexuel perturbé (inhibé) par la présence humaine. II-Résultats. 1) Immunité. Les animaux ont été immunisés contre des phages dont environ 20% des protéines de surface présentent un décapeptide du récepteur de FSH comme défini précédemment. Pour des raisons techniques (indisponibilité des peptides, non reproductibilité des Elisas anti-peptides) la mesure de la proportion d'anticorps effectivement dirigés contre le peptide de récepteur présenté à la surface du phage est impossible en routine. De même, la proportion d'anticorps efficaces, c'est-à-dire ayant une activité antagoniste en se liant au récepteur, ne pourra s'évaluer que dans un système cellulaire recombinant in vitro, comme décrit par Abdennebi et al. (Journal of Molecular Endocrinology (1999) 22, Apr 22 (2) : 151-159), après purification par chromatographie d'affinité de la fraction d'immunoglobuline présente dans les antisérums. La mesure des titres anticorps est donc relative. Par exemple, la dilution d'antisérum qui donnera, dans un essai Elisa standardisé, une valeur de densité optique arbitrairement choisie. Compte tenu de l'échelle des valeurs de D. O. dans ce test (de 0,1 à 1), on peut choisir la valeur 0,4. Les mesures de titres n'ont pas encore été effectuées systématiquement, animal par animal, sur toute la durée de l'expérience. Toutefois des résultats sont disponibles pour la première phase d'immunisation de huit mois des cinq singes mâles, pendant laquelle deux rappels par mois ont été effectués. Comme le montre la figure 1 en annexe, à deux, quatre, six et huit mois de la primoinjection, les dilutions nécessaires (entre 1/8000 et 1/10000) à l'obtention d'une densité optique de 0,4 ne sont pas différentes en moyenne. Les analyses individuelles révèlent toutefois des différences significatives entre les cinq animaux. Par exemple le singe 590, présente à trois mois un titre antiphage apparent de 1/16000, alors qu'au même moment, le singe 550 a un titre de 1/5000. L'objectif étant que l'immunité produise une baisse de la spermatogenèse suffisante pour rendre les animaux stériles, l'analyse des titres anticorps ne peut se faire que par rapport à l'effet physiologique obtenu. 2) Testostérone. Le maintien d'un niveau physiologique d'androgènes est un critère absolument essentiel pour valider une méthode contraceptive mâle. Pour les mâles de cette espèce de singes, on observe une variation quotidienne très régulière des valeurs de testostéronémie avec des valeurs moyennes de 3 à 5 ng/ml le matin et de 12 à 20 ng/ml le soir (difference p 3) Comportements. Les observations réalisées au cours de l'expérience, notamment lors des accouplements par vidéocaméra ont montré que le traitement ne modifie pas les comportements sexuels des animaux. Aucune modification d'attitude ou de comportement particuliers, vis-à-vis des autres singes ou de l'homme, n'a été notée par le personnel soignant les singes pendant les 15 mois de l'expérience. D'autre part, la prise alimentaire et la croissance pondérale n'ont pas été modifiées par le vaccin. 4) Spermatogenèse. La production de gamètes des cinq singes est inhibée par la vaccination anti-R-RFSH. Les cinq mâles sélectionnés pour la vaccination produisaient avant la primoinjection entre 187 et 584 millions de spermatozoïdes (spz) par éjaculat. L'analyse individuelle (Tableau 1) montre que la spermatogenèse du singe No. 567, qui produisait les taux les plus importants de spermatozoïdes, n'a pas été totalement réduite. D'après des études antérieures, on peut considérer que pour les mâles de cette espèce, la stérilité est obtenue pour une production inférieure à 40 millions de spermatozoïdes /éjaculat. Celle des quatre autres mâles a été complètement inhibée pendant des périodes variables selon les individus (taux Les variations individuelles concernent surtout la vitesse d'inhibition de la spermatogenèse par le vaccin. La contraception (taux Pour évaluer le temps nécessaire à la reprise de la spermatogenèse, les immunisations ont été interrompues après sept mois de rappels. Des taux supérieurs à 40 millions sont réobtenus en un temps très court, soit deux semaines à un mois, pour les quatre singes inhibés. Toutefois, pour le singe 590, dont la production de spermatozoïdes a été inhibée pendant la durée la plus longue, le retour à des taux préimmuns ( > 300 millions) n'est pas atteint sur la durée de la phase d'interruption (cinq mois et demi). Les animaux ont été ré-immunisés pour la phase de vaccination 2. La figure 3 en annexe montre l'évolution de la production de spermatozoïdes lors des phases de 1 et 2. En moyenne, les rappels ré-induisent rapidement une inhibition de la production de spermatozoïdes. Il est prévu d'interrompre à nouveau les rappels après cette phase 2, et de ré-accoupler les animaux. Le tableau 1 ci-dessous rapporte les effets des vaccins anti-récepteur de la FSH sur la production de spermatozoïdes (millions par éjaculat) pour cinq singes mâles. Les dates en gras correspondent aux périodes d'interruption des rappels. Primoinjection le 14 octobre, jour 0. Tableau 1 Dates Jours NO 550 ? 567 ? 590 NO 6 16 NO 618 7 cet-7 196 187 334 224 193 14 oct 0 199 584 350 300 240 29 cet 15 210 420 390 310 190 13 nov 30 300 350 25 125 90 13 nov 30 300 350 25 125 90 28 nov 45 390 507 1 154 31 13 dec 60 80 480 1 69 40 28 dec 75 110 80 1 n 0 12 jan 90 131 n 1 0 n 26 jan 105 n 254 1 1 n 10 fev 120 1 362 n 0 10 25 fev 135 1 260 n 0 5 11 mar 150 0 256 45 30 0 26 mar 165 n 389 34 10 0 10 avr 180 n 290 20 20 0 25 avr 195 17 370 1 28 69 9 mai 210 12 264 1 18 40 24 mai 225 29 144 11 50 45 8 juin 240 81 258 n 87 116 23 juin 255 82 89 91 373 244 8 jui 270 36 133 50 185 176 23 jui 285 132 87 136 387 445 7 aout 300 146 237 40 355 195 22 aout 315 136 477 n 243 268 6 sep 330 145 162 n 56 144 21 sep 345 112 721 n 58 169 6 oct 360 63 352 54 44 79 210ct 375 94 545 74 52 122 5 nov 390 21 212 38 33 140 20 nov 405 26 780 44 n 72 5 dec 420 21 332 11 66 122 5) Etudes de fertilité. Les cinq mâles vaccinés et cinq mâles contrôles ont été accouplés avec des femelles cycliques selon la même procédure. Les femelles ont été suivies par dosage quotidien de l'oestradiol pendant les jours 7 à 10 du cycle. Si les concentrations atteignaient 250 pg/ml, les femelles étaient considérées comme ovulantes et fertiles. Chaque couple a cohabité une semaine, soit du jours 10 au jour 16 inclus du cycle. Des prélèvements sont ensuite effectués pour suivre la production de progestérone du jour 16 au jour 30. Chaque mâle a été accouplé avec trois femelles différentes pendant la phase 1 de vaccination, au moment de la plus faible production de spermatozoïdes. Les résultats sont résumés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Male NI Femelle NI Femelle Femelle NO (cycle) NO (cycle) (cycle) Contrôles : 604 82 Enceinte 9 Enceinte 36 Enceinte 605 4033 Enceinte 97 Enceinte 47 Enceinte 617 95 Enceinte 6 Enceinte 38 Enceinte 619 35 Enceinte 60 Enceinte 93 Enceinte 625 28 Enceinte 96 Enceinte 55 Enceinte Vaccinés : 550 3 30 11 27 15 28 Jours Jours Jours 567 21 22 3 27 25 32 Jours Jours Jours 590 25 30 26 24 18 28 Jours Jours Jours 616 18 28 14 28 35 29 Jours Jours Jours 618 87 31 16 30 21 25 Jours Jours Jours Comme le montre le tableau 2, aucune des quinze femelles accouplées avec des mâles vaccinés n'a été fécondée, alors que celles accouplées dans les mêmes conditions avec des mâles non vaccinés ont conçu, ce qui indique que tous les mâles, même le NO 567, dont la spermatogenèse n'a pas été totalement inhibée, ont été stérilisés par le traitement vaccinal. REVENDICATIONS 1) Composition pharmaceutique contraceptive chez un mammifère mâle, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide de 5 à 25 de préférence 8 à 20 résidus d'acides aminés consécutifs d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère, ledit peptide étant capable d'induire une production d'anticorps en quantité suffisante pour entrer en compétition avec la FSH et inhiber la spermatogénèse chez un individu mâle. 2) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'un ensemble de peptides comprenant de 8 à 12 résidus d'acides aminés consécutifs d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère, ledit ensemble de peptides couvrant ladite séquence peptidique et est constitué de façon à ce que chaque résidu d'acide aminé de la séquence peptidique soit compris dans au moins un peptide de l'ensemble, ledit ensemble étant capable d'induire une production d'anticorps en quantité suffisante pour entrer en compétition avec la FSH et inhiber la spermatogenèse chez un individu mâle. 3) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère est une séquence peptidique mature. 4) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH est la partie C-terminale de la séquence peptidique codée par ledit exon 1. 5) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH est la séquence peptidique de 17 acides aminés codée par la région de l'exon 1 d'un récepteur de FSH de mammifère précédent l'exon 2 dudit récepteur. 6) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur de FSH est la séquence peptidique suivante : SKVTEIPSDLPRNAIEL représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID NO. 7. 7) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de l'ensemble des peptides de séquences suivants : SKVTEIPSDL (SEQ ID NO. 9) KVTEIPSDLP (SEQ ID NO. 11) VTEIPSDLPR (SEQ ID NO. 13) TEIPSDLPRN (SEQ ID NO. 15) EIPSDLPRNA (SEQ ID NO. 17) IPSDLPRNAI (SEQ ID NO. 19) PSDLPRNAIE (SEQ ID NO. 21) SDLPRNAIEL (SEQ ID NO. 23) 8) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend l'ensemble des peptides. 9) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend un sous-ensemble de 50% ou plus de l'ensemble des peptides dès lors que les peptides du sous-ensemble couvrent substantiellement toute la longueur d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH. 10) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que tout ou partie des peptides de l'ensemble ou du sous-ensemble est présent en plus d'un exemplaire avantageusement en deux ou trois exemplaires. 11) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que l'ensemble ou le sous-ensemble de peptides comprend plus de 5 peptides, de préférence plus de 10 peptides différents, selon la longueur de chacun desdits peptides. 12) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisée en ce que la longueur moyenne des peptides d'un ensemble ou d'un sous-ensemble est de préférence de l'ordre de 10 résidus d'acides aminés. 13) Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit récepteur de FSH est le récepteur de FSH humain. 14) Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés dans ladite composition avec un adjuvant. 15) Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'adjuvant est constitué par un système de présentation du ou des peptides. 16) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que le système de présentation des peptides est constitué par un ou plusieurs vecteurs d'expression comprenant chacun une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant un ou plusieurs peptides identiques ou différents. 17) Un vecteur d'expression ou un ensemble de vecteurs d'expression comprenant des séquences polynucléotidiques codant un ou plusieurs exemplaires des peptides de l'ensemble ou du sous-ensemble défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 13. 18) Un hôte ou un ensemble d'hôtes transformé (s) par un vecteur ou un ensemble de vecteurs selon la revendication 17. 19) Une composition pharmaceutique comprenant un vecteur ou un ensemble de vecteurs selon la revendication 17 ou un hôte ou un ensemble d'hôtes selon la revendication 18. 20) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que le système de présentation du ou des peptides est constitué par une ou plusieurs substance (s) porteuse (s) identiques ou différentes associée (s) à un ou plusieurs exemplaire du ou des peptides. 21) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou 19 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs antigènes capables d'induire une réponse immunitaire pour vacciner contre des agents infectieux divers. 22) Utilisation d'un peptide, d'un ensemble ou d'un sous-ensemble de peptides, comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour la préparation d'un vaccin contraceptif destiné à être administrée à un individu mâle.