FR 2826666 A1 20030103 FR 0108758 A 20010702 PROCEDE DE SELECTION D'AGENTS BIO-ACTIFS PAR COUPLAGE DE LUMINESCENCE ET SYSTÈME CELLULAIRE VIVANT POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE L'invention concerne un procédé de sélection d'agents bioactifs-notamment mais non exclusivement d'agents pharmacologiquement actifs pour l'homme ou l'animal-. L'invention s'étend à un système cellulaire vivant, à l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain et d'un élément non isolé d'un corps humain, adapté à la mise en oeuvre d'un tel procédé. Il existe actuellement des banques d'agents potentiellement bio-actifs (molécules générées par chimie combinatoire, substances d'origine naturelle...) privées ou publiques comprenant un très grand nombre d'agents dont l'activité biologique vis-à-vis de cibles prédéterminées doit pouvoir être testée pour la sélection (criblage) d'agents biologiquement actifs, notamment susceptibles de fournir de nouveaux médicaments. Dans ce but, il est nécessaire de disposer de moyens de criblage à haut débit. En particulier, dans les phases de développement des médicaments pour l'homme ou l'animal, chaque gain de temps représente un bénéfice substantiel. Or, pour la sélection des agents bio-actifs, on utilise en pratique deux étapes successives de criblage : une étape de criblage primaire effectuée à haut débit (jusqu'à 100 000 molécules par jour) de façon automatisée, basée sur l'affinité des agents potentiellement actifs avec la cible moléculaire identifiée ou supposée être à l'origine de l'effet biochimique recherché, et permettant donc la sélection d'agents biochimiquement actifs sur la cible ; et une étape de criblage secondaire (ou"mécanistique") visant à apporter le plus d'informations possibles sur l'activité biologique réelle des agents potentiellement actifs (effets cellulaires ou toxiques et mécanismes intracellulaires moléculaires sous-jacents), réalisée avec un faible débit (100 à 1000 molécules par jour) sur un modèle cellulaire exprimant la cible moléculaire, et permettant la sélection des agents bio-actifs parmi les agents biochimiquement actifs. La qualité des informations obtenues lors de cette étape de criblage secondaire influence directement les chances de succès des phases subséquentes d'essais précliniques et cliniques, extrêmement longues (5 à 7 ans) et coûteuses. L'amélioration de cette étape de criblage secondaire, tant du point de vue qualitatif que de sa durée, représente donc un enjeu majeur dans l'industrie pharmaceutique et vétérinaire, et plus généralement dans la recherche et le développement d'agents biologiquement actifs (agriculture,...). L'invention vise, de façon générale, à résoudre ce problème. WO 9507463 décrit une méthode permettant l'expression intracellulaire d'une protéine recombinante formée d'une protéine intracellulaire fusionnée à une GFP. Les GFP constituent une famille de protéines naturellement fluorescentes dont on sait qu'elles peuvent être couplées par fusion de gènes à d'autres polypeptides tels que des protéines solubles ou membranaires, sans affecter leur taux d'expression ni la formation du fluorophore. Dès lors, pour pallier les inconvénients des tests antérieurs de criblage secondaire (utilisation de radioéléments ; purification des ligands et/ou protéines cibles ; défauts de fiabilité ; faible contenu informatif des résultats...), il a été récemment proposé d'utiliser une protéine fluorescente, la GFP, ou l'un de ses variants ou fragments fluorescents, dans le cadre du criblage secondaire : - soit pour la détection de l'activité induite de certaines protéines spécifiques telles que la protéine kinase A (par exemple WO 9623898) en cultivant une cellule exprimant la protéine fusionnée avec la GFP, et par mesure des changements d'intensité de fluorescence, - soit pour la mesure quantitative de la redistribution d'une protéine de transduction intracellulaire fusionnée avec la GFP et par traitement et analyse d'image (WO 9845704), - soit pour la détection des interactions entre un récepteur membranaire marqué avec une GFP et son ligand marqué avec un groupement fluorescent photocomplémentaire par mesures quantitatives du transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) (WO 9855873), - soit pour la détection d'interactions entre deux peptides ou protéines en les marquant par des composants fluorescents et en mesurant le FRET (WO 9912033). Les tests tels que celui proposé par WO 9623898 ne sont pas réellement utilisables en pratique. En effet, les modifications d'intensité de fluorescence peuvent être très faibles, donc très difficiles à détecter et surtout impossibles à analyser. En effet, de part son principe même, fondé uniquement sur des observations des changements d'intensité globale de fluorescence, le test proposé ne fournit aucune information quant aux mécanismes intracellulaires moléculaires sous-jacents. Le test proposé par WO 9845704 présente aussi l'inconvénient de ne pouvoir être mis en oeuvre qu'à condition d'avoir identifié une protéine de transduction spécifique dont la redistribution dans la cellule est suffisamment importante pour pouvoir être mesurée par comparaison d'images de fluorescence. Il s'agit donc d'une méthode qui est limitée dans ses applications et nécessite une comparaison d'images soit subjective (par l'homme), soit complexe et coûteuse et de fiabilité imparfaite (analyse par traitement d'images). En particulier, avec une analyse d'images, il existe toujours une plage d'incertitude importante dans la discrimination qualitative d'une activation ou d'une absence d'activation. Ainsi, un tel procédé ne permet pas de fournir ou de comparer les concentrations minimales d'activation. Dès lors, l'analyse quantitative supposée être obtenue dans ce document n'est possible qu'avec les agents bio-actifs qui induisent une réponse cellulaire forte quantitativement (redistribution notable d'une protéine principalement entre cytoplasme ou noyau), mais ne permet pas de sélectionner des agents induisant des réponses cellulaires plus fines. Or, en pratique, compte tenu notamment de la complexité des mécanismes de transduction intracellulaires, il est rare que l'effet d'un agent bio-actif se traduise nécessairement par une redistribution d'une protéine spécifique suffisamment importante pour être détectée par comparaison d'images. WO 9855873 est quant à lui limité à la détection de l'interaction non covalente du ligand (agent à tester) avec le récepteur membranaire, mais ne permet pas d'expliciter la réponse cellulaire induite en terme de mécanisme intracellulaire moléculaire sous-jacent. Ainsi, ce test n'est pas applicable au criblage secondaire où la réponse cellulaire réelle doit être prise en compte pour minimiser les risques d'échecs lors des phases de développement subséquentes et obtenir des informations quantitatives sur l'efficacité des agents bio-actifs sur les cellules (seuils de concentrations, niveaux d'activation relatifs, réversibilité, spécificité de l'effet,...). En outre, les tests basés sur la détection d'interactions protéine-protéine tels que celui décrit par WO 9912033 supposent une connaissance préalable précise et fiable des mécanismes intracellulaires de la réponse aux agents bio-actifs pour corréler l'interaction à une activation ou une inhibition. Or, cette connaissance fait le plus souvent défaut et constitue justement le but du criblage secondaire. En outre, ces tests sont lourds et complexes à mettre en oeuvre car ils nécessitent une construction de plusieurs protéines de fusion, la co-transfection de ces constructions, la connaissance des deux protéines et de leurs interactions spécifiques. Ils sont aussi trop spécifiquement limités à des couples particuliers de protéines intracellulaires qui interagissent entre elles. Dans ce contexte, l'invention vise à permettre de réaliser une sélection d'agents bio-actifs à haut débit, de façon simple et économique, objectif fournissant des résultats de grande fiabilité et applicable dans de nombreuses applications distinctes, notamment pour le criblage secondaire. L'invention vise plus particulièrement à permettre l'obtention d'informations tant qualitatives (notamment sur les mécanismes intracellulaires moléculaires sous-jacents) que quantitatives précises et fiables pour la sélection des agents bio-actifs, y compris lorsque la réponse cellulaire se traduit par des modifications quantitativement faibles des concentrations ou des distributions de concentrations dans le cytoplasme. Dans tout le texte, on adopte la terminologie suivante : -"agent": tout composé ou groupe de composés reliés par tout type de liaison (covalente, ionique, complexation, interactions faibles...) de façon à être solidaires dans leur distribution spatiale, -"couplage de luminescence" : tout processus physique entre deux groupements photocomplémentaires, dépendant de leur distance relative, dans lequel une énergie lumineuse émise par l'un et/ou l'autre des deux groupements photocomplémentaires est modifiée selon que ces derniers sont proches l'un de l'autre d'une distance inférieure à une valeur critique (généralement comprise entre 1 et 10 nm), un couplage énergétique intervenant alors entre eux, ou lorsque ces groupements sont éloignés l'un de l'autre d'une distance supérieure à cette valeur critique ; il peut s'agir de transfert d'énergie de fluorescence par résonance ou FRET (LAKOVICZ JR, (1999), in Principles of Fluorescence Spectroscopy, Eds Kluwer Academic/Plenum Publishers, NewYork, pp 368-391), de transfert d'énergie de bioluminescence par résonance ou BRET (Angers S, Salahpour A, Joly E, Hilairet S, Chelsky D, Dennis M and Bouvier M, (2000), Proceeding of the National Academy of Science USA, 97,7, 3684-3689,"Détection of ss2-adrenergic receptor dimerization in living cells using Bioluminescence Resonance Energy Transfer"), -"agent associé à une membrane cellulaire" : tout agent comprenant au moins un ligand membranaire lipophile inséré dans au moins une couche lipidique d'une membrane cellulaire, ou comprenant au moins l'un des lipides d'origine naturelle d'une membrane cellulaire, -"spécifiquement recruté à la membrane cellulaire" : tout processus biologique et/ou chimique par lequel au moins une certaine quantité d'un agent est liée (après avoir été produite) au moins à certains agents associés à la membrane cellulaire ; au contraire, ledit agent n'est pas spécifiquement recruté à la membrane cellulaire, soit lorsque ladite quantité de l'agent n'est pas produite, soit lorsqu'elle ne se lie pas à des agents associés à la membrane cellulaire, -"marquage" et ses dérivés ("marquer", "marqué"...) : le fait de grouper en un agent unique, dit agent marqué, deux agents dont un au moins est adapté pour pouvoir être repéré dans l'espace ; le marquage peut être réalisé (par exemple par synthèse) directement, ou, au contraire, être réalisé indirectement par exemple par voie génétique en faisant exprimer l'agent marqué par des cellules transfectées avec une séquence nucléotidique appropriée, -"signal cellulaire" : toute modification (du métabolisme, de la croissance, d'une activité intracellulaire ou extracellulaire...) d'un système cellulaire vivant induite par un agent ou phénomène, -"système cellulaire vivant" : tout système ou milieu naturel ou artificiel contenant au moins une cellule vivante, -"luminophore": tout groupement jouant un rôle de donneur et/ou d'accepteur, émetteur et/ou absorbant, dans un couplage de luminescence, -"préserver au moins sensiblement les propriétés d'un système cellulaire vivant" : maintenir les fonctions vitales d'au moins une cellule vivante du système cellulaire vivant de façon suffisante pour permettre une réaction de la cellule pouvant être observée dans le cadre du mode de mesure choisi, -"propriété spécifiquement dépendante"d'un paramètre : le fait que la propriété dépende du paramètre et de lui seul. L'invention concerne un procédé de sélection d'agents, dits agents à tester, susceptibles d'être biologiquement actifs vis-à-vis d'un système cellulaire vivant en induisant un changement d'état biochimique d'un signal cellulaire à au moins deux états différents de la membrane cellulaire d'au moins une cellule vivante du système cellulaire vivant, dite cellule sensible, par utilisation d'un phénomène de couplage de luminescence entre au moins deux groupements photocomplémentaires, susceptible de générer et/ou de modifier au moins une émission lumineuse, dont au moins une propriété mesurable est spécifiquement dépendante de la distance séparant les groupements photocomplémentaires et est modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état, caractérisé en ce que : - on prépare un système cellulaire vivant contenant au moins une cellule sensible, - on introduit dans le système cellulaire ou on fait produire par le système cellulaire au moins un agent, dit agent intermédiaire marqué, choisi pour que, dans un premier état du signal cellulaire, cet agent intermédiaire marqué soit spécifiquement recruté à la membrane cellulaire d'au moins une cellule sensible, et pour que dans un deuxième état du signal cellulaire, cet agent intermédiaire marqué ne soit pas spécifiquement recruté par une membrane cellulaire de cellule sensible, ledit agent intermédiaire marqué étant marqué avec au moins l'un des groupements photocomplémentaires, dit premier luminophore, dans des conditions propres à préserver au moins sensiblement les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire, - on introduit dans le système cellulaire vivant au moins une composition d'au moins un composé, dit agent membranaire de couplage, apte à s'associer à une membrane cellulaire de cellule sensible et marqué avec au moins un groupement photocomplémentaire, dit deuxième luminophore, distinct du premier luminophore, et de telle sorte que les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire soient au moins sensiblement préservées et qu'au moins une propriété mesurable de l'émission lumineuse résultant du couplage de luminescence entre le premier et le deuxième luminophore soit sensiblement modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état, - on met le système cellulaire vivant ainsi préparé en présence d'une quantité de l'un des agents à tester, dit agent en test, on mesure au moins ladite propriété mesurable, et on détermine l'activité biologique de cette quantité de l'agent en test en fonction du résultat de cette mesure. L'invention part ainsi du constat selon lequel de nombreux mécanismes d'activation ou d'inhibition cellulaire correspondent à des signaux biocellulaires dont la localisation, la durée et le fonctionnement ne sont pas élucidés, malgré de nombreuses études, en raison de limitations technologiques actuelles, mais qui en fait sont liés à des évènements se produisant à la membrane cellulaire et qui correspondent ou peuvent correspondre à un recrutement ou non à la membrane cellulaire d'un agent spécifique, en quantités importantes ou faibles, à l'intérieur ou à l'extérieur des cellules. Ces évènements membranaires qui modifient l'état de la membrane cellulaire peuvent en particulier être de plusieurs natures. Il peut s'agir tout d'abord purement et simplement du recrutement d'un agent à la membrane cellulaire. Cet agent peut alors servir d'agent intermédiaire marqué. Tel est le cas par exemple lors des mécanismes intracellulaires d'activation d'un signal de transduction intracellulaire. Il peut s'agir aussi d'une activité enzymatique produite par la membrane cellulaire : activité kinase ou phosphatase (en général intracellulaire) ou activité protéase. Il peut s'agir encore d'une transconformation d'une protéine membranaire (par exemple dans le cas d'un récepteur activé par un ligand). Il peut s'agir aussi d'une interaction protéine-protéine ou protéine-lipide se produisant à la membrane cellulaire. Dans ces trois derniers cas d'évènements membranaires, l'agent intermédiaire marqué utilisé peut être un anticorps qui n'est pas naturellement natif, et on fait produire (notamment dans la cellule par transfection) cet anticorps qui est adapté pour reconnaître spécifiquement ledit événement membranaire et qui est marqué par le premier luminophore. Par exemple, dans le cas d'une activité kinase, on peut faire exprimer par la cellule, par voie génomique, un anticorps marqué avec le premier luminophore, cet anticorps étant choisi pour pouvoir reconnaître spécifiquement une protéine membranaire phosphorylée produite par l'activité kinase. Dans le cas de l'activité phosphatase, on choisit un anticorps marqué reconnaissant spécifiquement une protéine membranaire déphosphorylée produite par cette activité phosphatase. Dans le cas d'une transconformation, on choisit un anticorps marqué reconnaissant spécifiquement la protéine membranaire dans sa conformation modifiée. Dans le cas d'une interaction protéine-protéine ou protéine-lipide, on choisit un anticorps marqué reconnaissant spécifiquement cette interaction. Dans le cas d'une activité enzymatique protéase, on choisit en tant qu'agent intermédiaire marqué un peptide ou un polypeptide normalement associé à un agent membranaire et qui subit l'activité protéase (on détecte alors la dissociation du peptide ou polypeptide marqué par suppression ou modification de l'émission lumineuse qui est générée en l'absence d'activité protéase). Ainsi, à titre de mécanismes intracellulaires et de signaux cellulaires intracellulaires pouvant être impliqués dans un procédé selon l'invention, on peut citer plusieurs classes de récepteurs membranaires qui induisent un tel signal cellulaire : les récepteurs couplés aux protéines G ; les récepteurs à activité enzymatique de type tyrosine et sérine/thréonine kinases, ou tyrosine phosphatases ; les récepteurs sans activité enzymatique intrinsèque tels que les récepteurs aux cytokines associés aux protéines JAK ; les récepteurs à domaine TIR ou DD ; les récepteurs aux antigènes. A titre de mécanismes extracellulaires et de signaux cellulaires extracellulaires, on peut citer des protéines intégrales de la membrane plasmique, notamment les enzymes de la famille des ADAM ou encore la protéine prion. Les inventeurs ont ainsi déterminé d'une part, qu'il est possible d'incorporer dans la membrane cellulaire des agents membranaires de couplage, marqués par des groupements fluorescents, qui peuvent bénéficier de la dynamique latérale de la membrane cellulaire (en étant eux-mêmes soumis à cette dynamique) pour se répartir de façon homogène au sein de celle-ci et en une quantité qui simultanément soit assez faible pour ne pas affecter les propriétés fonctionnelles de la membrane cellulaire et de la cellule vivante, mais soit assez importante pour assurer la réalisation du couplage de luminescence lorsque l'agent intermédiaire marqué est recruté en tout endroit de la membrane cellulaire, quel que soit le site spécifique de translocation à la membrane cellulaire de cet agent intermédiaire marqué, et alors même que ce site n'est pas formé de l'un desdits agents membranaires de couplage. Ainsi, il est à noter que dans un procédé de l'invention, et contrairement à tous les procédés antérieurs décrits, le couplage de luminescence intervient entre l'agent intermédiaire marqué et un agent (agent membranaire de couplage) qui, en général, ne correspond pas à l'agent de la membrane cellulaire spécifiquement reconnu (protéine, agent de reconnaissance...) par l'agent intermédiaire marqué lors de son recrutement à la membrane cellulaire ni au récepteur membranaire responsable dudit signal dont le changement d'état est induit par l'agent à tester. Mais les inventeurs ont constaté que grâce au fait que l'invention met à profit la structure de mosaïque fluide de la membrane cellulaire, statistiquement, il se trouve toujours un agent membranaire de couplage à proximité de l'agent intermédiaire marqué recruté à la membrane cellulaire, et à une distance qui en pratique correspond à l'obtention du phénomène de couplage de luminescence tel que le FRET. On sait en effet qu'une émission de luminescence spécifique par couplage de luminescence se produit ou est modifiée lorsque : - (a) deux groupements photocomplémentaires sont proches dans l'espace (notamment de 1 à 10 nm) d'une distance inférieure ou égale à une valeur seuil prédéterminée (2 Ro, où Ro est le rayon de Forster dans le cas du FRET), - (b) le spectre d'émission de l'un des groupements photocomplémentaires, dit donneur, et le spectre d'absorption de l'autre groupement photocomplémentaire, dit accepteur, se recouvrent au moins en partie (Lakey et al 1991, J. Mol. Biol., 1218, pp 639-653). Egalement, les inventeurs ont mis en évidence qu'il existe des couples de luminophores compatibles d'une part, avec les agents membranaires (phospholipides), d'autre part, avec les agents intermédiaires (protéines naturelles ou anticorps). En particulier, on a trouvé des lipides pouvant porter un composé fluorescent compatible avec les membranes cellulaires naturelles (pouvant faire office d'agents membranaires de couplage) et réalisant un couplage de fluorescence par FRET avec une GFP et notamment avec la GFP naturelle. Avantageusement et selon l'invention, les premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie par résonance, notamment par transfert d'énergie de fluorescence par résonance FRET. Avantageusement et selon l'invention, l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - une protéine bioluminescente naturelle ou mutée, notamment de type luciférase, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipyg, la cyanine, le Nile Red&commat;, le Texas Red&commat;, les chélates de terres rares, les indo et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. Avantageusement et selon l'invention, l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire, notamment la protéine fluorescente verte GFP de la méduse Aequorea victoria. Avantageusement et selon l'invention, on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile choisi parmi les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les agents dérivés de ces composés. Ces ligands lipophiles peuvent en effet être marqués par un deuxième luminophore. Le deuxième luminophore peut lui-même constituer le ligand lipophile et donc l'agent membranaire de couplage. Avantageusement et selon l'invention, l'agent intermédiaire marqué est formé d'une protéine naturelle que l'on marque avec le premier luminophore. Avantageusement et selon l'invention, les agents à tester étant des agents susceptibles d'être actifs sur des récepteurs membranaires, on choisit, en tant qu'agent intermédiaire marqué, une protéine de transduction intracellulaire spécifique de l'état desdits récepteurs membranaires, ledit signal cellulaire étant un signal de transduction intracellulaire dont le premier état correspond au recrutement spécifique de la protéine de transduction à la membrane cellulaire, l'agent intermédiaire marqué étant formé de la protéine de transduction marquée par le premier luminophore, la protéine de transduction et le premier luminophore étant choisis pour que la protéine de transduction marquée présente au moins les fonctionnalités et le comportement de la protéine de transduction dans l'expression du signal de transduction intracellulaire par la (les) cellule (s) sensible (s). En particulier, le premier luminophore est adapté pour préserver au moins sensiblement la réponse et la sensibilité de la (des) cellule (s) sensible (s) vis-à-vis de la protéine de transduction. Avantageusement et selon l'invention, on réalise le marquage de la protéine de transduction par voie génétique en faisant exprimer par au moins une cellule sensible du système cellulaire vivant, une protéine de fusion formant la protéine de transduction marquée. Avantageusement et selon l'invention, on choisit la protéine de transduction parmi : - les protéines contenant des domaines (notamment les domaines PH ou FYVE) interagissant avec des lipides membranaires, - les protéines s'associant à la membrane plasmique par ancrage lipidique, notamment de type N-myristoylation, S-palmitoylation, S-prénylation, - les protéines associées directement ou indirectement aux récepteurs couplés aux protéines G, - les protéines associées directement ou indirectement aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine kinase intrinsèque, - les protéines STAT, - les protéines associées directement ou indirectement aux récepteurs à activité enzymatique sérine/thréonine kinase intrinsèque, - les protéines associées directement ou indirectement aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine phosphatase intrinsèque, - les protéines JAK associées aux récepteurs reconnaissant des cytokines correspondantes, - les protéines associées directement ou indirectement aux récepteurs à domaine TIR ou DD, - les protéines associées aux récepteurs reconnaissant des antigènes. Plus particulièrement, les tableaux 1 à 8 suivants donnent des exemples de protéines de transduction présentes dans l'espèce humaine et pouvant être marquées et utilisées à titre d'agent intermédiaire marqué dans un procédé selon l'invention. TABLEAU 1 PROTEINES A DOMAINE PH CENTAURINES CENTAURINE BETA2, CENTAURINE ALPHA2 DYNAMINES DYNAMINE 2, DYNAMINE 1 FACTEURS D'ECHANGE DES GEF STIMULE PAR APC, GEF-H1 (PCNA P40), LSC, NUCLEOTIDES GUANYLIQUES (dits GEF Pl15-RHOGEF, RHOGEF NON-OCOGENIQUE, pour GUANINE NUCLEOTIDE EXCHANGE RHO/RAC GEF (PROTEINE DE LA DYSPLASIE FACTORS ) FACIOGENITALE), RALGPS1A, RAS-GRF1 (CDC25), PROTEINE ACTIVATRICE DE TYPE RASGAP 1, PROTEINE ACTIVATRICE DE TYPE RASGAP 2, TIAM1, TIAM2, ARF-GEP (IOO), TRIO, KALIRINE, GRP1, CYTOHESINE 1, CYTOHESINE 2 (ARNO), CYTOHESINE 3 (ARN03), CYTOHESINE 4, DBL, LARG, VAV, VAV-2, VAV-3, COLLYBISTINE, ALPHA PIX, BETA PIX, P50COOL-1 HOMOLOGUES DE LA PROTEINE SON OF SOS-1, SOS-2 SEVENLESS (dite SOS) KINASES DE TYPE ARKBETA-ARK-1 (GRK2), BETA-ARK-2 (GRK3) ONCOGENES/PROTO-ONCOGENES DBL, ONCOGENE LBC (P47), P60TIM PHOSPHOLIPASES C (PLC) PLC-DELTA-1, PLC-GAMMA-1, PLC-GAMMA-2 PHOSPHOLIPASES D (PLD) PLD1, PLD2 PLECKSTRINES PLECKSTRINE, PLECKSTRINE 2, HOMOLOGUE DE LA PLECKSTRINE 2 PRODUITS DES GENES KIAA KIAA0006, KIAA0281, KIAA0351, KIAA0380, KIAA0400, KIAA0424, KIAA0571, KIAA0619, KIAA0763, KIAA0793, KIAA0902, KIAA0969, KIAA1099 PROTEINES ADAPTATRICES APPL, DAPP1, LNK, BAM32 (DAPP1), INTERSECTINE, CNK1 PROTEINES ASSOCIEES A LA KINASE DE RA70, SKAP55 SRK PROTEINES CONTENANT UN DOMAINE PH TAPP1, TAPP2 EN TANDEM PROTEINES CONTENANT UN DOMAINE PROTEINE DE SIGNAL SH2-B ALPHA, PROTEINE DE SH2 SIGNAL SH2-B BETA, PROTEINE DE SIGNAL SH2-B GAMMA PROTEINES DE LA MOELLE OSSEUSE (dites BM046, BM024 BM pour BONE MARROW ) PROTEINES DE LA SUPERFAMILLE DES KIF1B, KlF1A, KLP, KPL1, APS KINESINES PROTEINES DE TYPE GRB GRB7, GRB10, GRB14 PROTEINES KINASES C (PKCs) PKC MU, PKC NU PROTEINES KINASES (AUTRES) PROTEINE LIANT LE CDC42 BETA, KINASE DE RHO, P160ROCK, MAGUIN-1 PROTEINES LIANT L'ACTINE ANILLINE, PROTEINE ASSOCIEE AUX FILAMENTS D'ACTINE PROTEINES LIANT LE PHOSPHOINOSITOL PIP3-BP-1, PIP3-BP-2 3-PHOSPHATE (dites PIP3-BP pour PHOSPHOINOSITOL 3-PHOSPHATE BINDING PROTEINS ) PROTEINES LIANT LES PROTEINES DE GAB 1, GAB2, PROTEINE ADAPTATRICE ASSOCIEE A TYPE GRB GRB 10 (GRB-IR), PROTEINE ADAPTATRICE ASSOCIEE A GRB14, PROTEINE ADAPTATRICE ASSOCIEE A GRB7 (B47) PROTEINES LIANT LES GAP P62DOK, P22DOK (DEL) PROTEINES LIANT LES ANTIGENES (ABP) GOODPASTURE ABP, D26 PROTEINES SERINE-THREONINE KINASES PKB (C-AKT), PKB BETA, PKB GAMMA, PDKI PROTEINES SIMILAIRES DE L'OSBP PROTEINE SIMILAIRE DE L'OSBP 1, PROTEINE SIMILAIRE DE L'OSBP 4, PROTEINE SIMILAIRE DE L'OSBP 6, PROTEINE SIMILAIRE DE L'OSBP 7 PROTEINES TYROSINE KINASES BMX (KINASE DE LA MOELLE OSSEUSE LIEE A L'X), BTK (TYROSINE KINASE DE L'AGAMMAGLOBULINEMIE DE TYPE BRUTON, ITK, LYK, TEC PROTEINS ACTIVANT LES GTPASES (dites GAP 1 (PROTEINE LIANT L'INS P4), GAP 2 (GAP1M), GAP pour GTPASE-ACTIVATING NGAP, P120GAP (RASGAP), OLIGOPHRENINE 1, PROTEINS) PROTEINE DE TYPE OLIGOPHRENINE-1 PROTEINS PEPPPEPP1, PEPP2, PEPP3 SPECTRINES SPECTRINE BETA5, SPECTRINE BETA4 SIGMA1, SPECTRINE BETA4 SIGMA3, SPECTRINE BETA3, SPTBN1, SPECTRINE BETA4 SUBSTRATS DES RECEPTEURS DE IRS-1, IRS-2, IRS-4 L'INSULINE (dits IRS pour INSULIN RECEPTOR SUBSTRATES ) SYNTROPHINES SYNTROPHINE ALPHA1 (DJ1187J4. 5), SYNTROPHINE BETA1, SYNTROPHINE BETA2, SYNTROPHINE 4, SYNTROPHINE 5 AUTRES PROTEINES A DOMAINES PH CDEP, DUET, HAPI (DUO), MYOSINE X, PHRI, PROTEINE ADAPTATRICE ASSOCIEE A SRC, SWAP- 70, FAPP1, DEF-6, JBP, BRDG1, GAB2, GRB7V, SUBSTRAT DE LA KINASE BRK, PKD2 TABLEAU 2 PROTEINES SANS DOMAINE PH MAIS A DOMAINE FYVE, Cl OU C2 EFFECTEURS DE RAB RABIP4, RABENOSYNE-5 PROTEINES ASSOCIEES A SMAD SARA, HGS (HRS) PROTEINES CONTENANT UN DOUBLE DFCP 1, TAFF 1 DOMAINE FYVE PROTEINES PHOSPHATASES A DOUBLE FYVE-DSP2, FYVE-DSPIA, FYVE-DSPIB, FYVESPECIFICITE DSPIC PROTEINES KINASES C (PKC) PKC ALPHA, PKC BETAI, PKC BETA2, PKC GAMMA, PKC DELTA, PKC EPSILON, PKC ETA, PKC THETA, PKC ZETA, PKC IOTA AUTRES PROTEINES A DOMAINE FYVE EIP1, KIAA0305, ANKHZN AUTRES PROTEINES A DOMAINE Cl OU C2 N-CHIMAERINE ALPHA 1, N-CHIMAERINE ALPHA2, N-CHIMAERINE BETA1, N-CHIMAERINE BETA2, NEDD-4, PERFORINE 1 TABLEAU 3 PROTEINES SANS DOMAINE PH OU FYVE OU Cl OU C2 MAIS ASSOCIEES A LA MEMBRANE PLASMIQUE PAR ANCRAGE LIPIDIQUE PROTEINES N-MYRISTOYLEES MARCKS, MRP, SYNTHASE DE L'OXYDE NITRIQUE (ENOS), RECOVERINE, PP60SRC PROTEINES S-PALMITOYLEES GS ALPHA, GQ ALPHA, CHIC2 PROTEINES S-PRENYLEES DOCK180, RHO A TABLEAU 4 PROTEINES SANS DOMAINES PH OU FYVE OU Cl OU C2, SANS ANCRAGE MEMBRANAIRE MAIS ASSOCIEES DIRECTEMENT A DES RECEPTEURS MEMBRANAIRES PROTEINES ASSOCIEES AUX RECEPTEURS BETA ARRESTINE 1, BETA ARRESTINE 2, GRK1, COUPLES AUX PROTEINES G GRK4, GRK5, GRK6, DISHEVELLED, GBP PROTEINES ASSOCIEES AUX RECEPTEURS LCK, ZAP-70 (SYK), SHP-1 DES ANTIGENES PROTEINES CONTENANT DES DOMAINES FRS2 ALPHA, FRS2 BETA PTB PROTEINES CONTENANT DES DOMAINES GRB2, SHC, P85, SOCS-3, CBL SH2 PROTEINES CONTENANTS DES DD (pour TRADD, RIP, RAIDD, MYD88 DEATH DOMAIN ) PROTEINES SMAD (CO-MODULATRICES SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD8 DE LA TRANSCRIPTION) PROTEINES STAT (ACTIVATRICES DE LA STATI, STAT2, STAT3, STAT5 TRANSCRIPTION) PROTEINES TRAF TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TRAF6 PROTEINES TYROSINES PHOSPHATASES PTP1B TABLEAU 5 PROTEINES SANS DOMAINES PH OU FYVE OU Cl OU C2, SANS ANCRAGE MEMBRANAIRE MAIS ASSOCIEES INDIRECTEMENT AVEC DES RECEPTEURS MEMBRANAIRES CYSTEINES PROTEASES CASPASE-8 (FLICE), CASPASE-10, CASPASE-2 PHOSPHOLIPIDES KINASES POLO PHOSPHOLIPIDES PHOSPHATASESPTEN, SHIP PROTEINES CONTENANT DES DD (pour IRAK, IRAK2, IRAKM, MORT 1 (FADD) DEATH DOMAIN ) PROTEINES D'ECHAFFAUDAGE KSR PROTEINES KINASES A DOUBLE MEK1, MEK2 SPECIFICITE PROTEINES SERINE-THREONINE KINASES RAFT, A-RAF, B-RAF, ERK1, ERK2, TAK1 PROTEINES TYROSINE KINASES PYK2 PROTEINES ACTIVANT LES GTPASES (dites RGS8 GAP pour GTPASE-ACTIVATING PROTEINS) AUTRES TAB1, TAB2, FLIP TABLEAU 6 PROTEINES ASSOCIEES A LA MEMBRANE PLASMIQUE MAIS SELON UN MECANISME DIFFERENT DE CEUX DECRITS DANS LES TABLEAUX 1 A 5 FACTEURS D'ADP-RYBOSYLATIONARF5, ARF6 TRANSPORTEURS DE GLUCOSE GLUT-4 KINASEPAK1, PAK2 PROTEINE ASSOCIEE A LA MYELINE MBP TABLEAU 7 PROTEINES INTEGRALES DE LA MEMBRANE CONTENANT DES PEPTIDES LIBERES PAR PROTEOLYSE DANS LE MILIEU EXTRA-OU INTRACELLULAIRE FACTEURS DE COAGULATION PROTHROMBINE, FACTOR V, FACTOR VIII SUBSTRATS DES METALLOPROTEASES DE COLLAGENE DE TYPE IV, EPHRINE-A2 TYPE ADAM 10 SUBSTRATS DES METALLOPROTEASES DE ALPHA2-MACROGLOBULINE TYPE ADAM 12 SUBSTRATS DES TNF ALPHA, TNF DELTA, TGF ALPHA, L-SELECTINE, METALLOPROTEASES DE TYPE TNF-RI, TNF-RII, APP, IL-1RII, IL-6R, ERBB4, ACE, TACE TRANCE, NOTCH, HB-EGF AUTRES PRESENILINE, PROTEINE PRION, PRONEUREGULINE, FASL TABLEAU 8 PROTEINES ASSOCIEES A DES MEMBRANES INTRACELLULAIRES AUTRES QUE LA MEMBRANE PLASMIQUE PROTEINES TRANSLOQUEES VERS LA BAX, BCL-X(L), BAD, BID MEMBRANE MITOCHONDRIALE Avantageusement et selon l'invention, en variante, l'agent interm diaire n'est pas une prot ine de transduction, mais est une prot ine int grale de la membrane plasmique dont un fragment peut tre lib r sous l'action de prot ases. Plus particuli rement, le tableau 7 donne des exemples de telles prot ines pr sentes dans l'esp ce humaine. Avantageusement et selon l'invention, en variante, l'agent interm diaire est une prot ine intracellulaire qui peut tre transloqu e vers la membrane d'organites intracellulaires, notamment les mitochondries, le Golgi, le r ticulum endoplasmique. Plus particuli rement, le tableau 8 donne des exemples de telles prot ines pr sentes dans l'esp ce humaine. Dans une autre variante, avantageusement et selon l'invention, l'agent interm diaire marqu est form d'un anticorps non naturellement natif, marqu avec le premier luminophore et adapt pour reconna tre sp cifiquement-par couplage de type anticorps/antig ne-un agent, dit agent de reconnaissance, qui est produit et associ la membrane cellulaire dans un premier tat du signal cellulaire et qui n'est pas produit ou non associ la membrane cellulaire dans un deuxi me tat du signal cellulaire. Avantageusement et selon l'invention, l'agent de reconnaissance est un agent intracellulaire choisi parmi une prot ine phosphoryl e r sultant d'une activit kinase membranaire induite ; une prot ine d phosphoryl e r sultant d'une activit phosphatase membranaire induite ; une prot ine membranaire dans une conformation sp cifique au deuxi me tat du signal cellulaire ; une prot ine ou un groupe de prot ines li es par interaction prot inique membranaire induite ou un groupe d'au moins une prot ine et d'au moins un lipide li s par interaction prot ine-lipide membranaire induite. L'agent interm diaire marqu est un anticorps marqu qui est adapt l'agent de reconnaissance (qui porte ou constitue un groupe antig ne correspondant) et est de pr f rence produit dans le milieu intracellulaire par voie g n tique par la cellule sensible transfect e avec une s quence nucl otidique appropri e, tant produit dans le milieu intracellulaire de la cellule sensible. Quoiqu'il en soit, il est noter que dans un proc d selon l'invention, l'agent interm diaire marqu est g n ralement distinct de l'agent en test. Avantageusement et selon l'invention, le syst me cellulaire vivant comprend au moins une cellule sensible eucaryote vivante. Il peut s'agir de pr f rence d'une ou plusieurs cellule (s) de mammif re, notamment humaine (s). Le syst me cellulaire vivant peut tre un syst me isol d'un organisme, et comprend un milieu de culture artificiel incorporant au moins une cellule sensible vivante, en g n ral une pluralit de cellules sensibles vivantes. Le syst me cellulaire vivant peut ainsi tre au moins une partie d'un organisme pluricellulaire vivant, c'est- -dire une plante ou une partie de plante, ou un animal, ou une partie d'un animal non humain ou un l ment isol du corps humain (biopsies, chantillons sanguins...). L'invention s' tend un syst me cellulaire vivant, l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain ou d'un l ment non isol d'un corps humain, modifi pour la mise en oeuvre d'un proc d selon l'invention. L'invention concerne ainsi un syst me cellulaire vivant l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain ou d'un l ment non isol d'un corps humain, comprenant au moins une cellule vivante dont la membrane cellulaire incorpore au moins un compos , dit agent membranaire de couplage, marqu avec au moins un groupement, dit deuxi me luminophore, photocompl mentaire d'au moins un autre groupement photocompl mentaire, dit premier luminophore, distinct du deuxi me luminophore, dans un ph nom ne de couplage de luminescence susceptible de g n rer et/ou de modifier au moins une mission lumineuse dont au moins une propri t mesurable est sp cifiquement d pendante de la distance s parant les groupements photocompl mentaires, l'agent membranaire de couplage tant associ la membrane cellulaire en une quantit adapt e pour au moins sensiblement pr server les propri t s du syst me cellulaire vivant vis- -vis d'un signal cellulaire au moins deux tats diff rents de la membrane cellulaire d'au moins une cellule vivante, dite cellule sensible, du syst me cellulaire vivant, et pour qu'au moins une propri t mesurable de l' mission lumineuse r sultant du couplage de luminescence soit sensiblement modifi e lorsque le signal cellulaire change d' tat, le premier luminophore marquant au moins un agent, dit agent interm diaire marqu , adapt pour tre sp cifiquement recrut la membrane cellulaire d'au moins une cellule sensible dans un premier tat du signal cellulaire et pour ne pas tre sp cifiquement recrut par une membrane cellulaire de cellule sensible dans un deuxi me tat du signal cellulaire. Avantageusement, l'agent membranaire de couplage et l'agent interm diaire marqu sont conformes aux caract ristiques mentionn es cidessus en r f rence au proc d de s lection de l'invention. En particulier, avantageusement et selon l'invention, au moins une cellule sensible, dont la membrane cellulaire incorpore au moins un agent membranaire de couplage, contient une s quence d'ADN comprenant un g ne codant pour une prot ine, dite prot ine interm diaire, choisie pour tre sp cifiquement recrut e la membrane cellulaire de la (des) cellule (s) sensible (s) lorsque le signal cellulaire est dans un premier tat, et pour ne pas tre recrut e par la membrane cellulaire de la (des) cellule (s) sensible (s) lorsque le signal cellulaire est dans un deuxi me tat, fusionn avec au moins un g ne codant pour un premier luminophore, la fusion de ces g nes tant telle que : - lorsque le signal cellulaire est dans le premier tat, une prot ine de fusion, dite prot ine interm diaire marqu e, form e de la prot ine interm diaire et du premier luminophore est exprim e par la (les) cellule (s) sensible (s) et recrut e la membrane cellulaire, et fait office d'agent interm diaire marqu , - lorsque le signal cellulaire est dans le deuxi me tat, aucune prot ine interm diaire marqu e n'est recrut e par une membrane cellulaire de cellule sensible. Ladite prot ine interm diaire marqu e peut tre une prot ine de transduction marqu e ou un anticorps marqu . Avantageusement, dans un syst me cellulaire vivant conforme l'invention le premier et le deuxi me luminophore sont choisis comme mentionn ci-dessus en r f rence au proc d de s lection de l'invention. Avantageusement et selon l'invention, le syst me cellulaire comprend au moins une cellule sensible eucaryote vivante, notamment comme mentionn ci-dessus en r f rence au proc d de s lection de l'invention. L'invention concerne aussi un proc d de s lection et un syst me cellulaire vivant caract ris s en combinaison par tout ou partie des caract ristiques mentionn es ci-dessus ou ci-apr s. D'autres buts, caract ristiques et avantages de l'invention apparaissent la lecture des exemples qui suivent. Les figures 1 13 illustrent des r sultats obtenus dans les exemples. Exemple 1 : Couplage de Luminescence et Couples de Luminescence COUPLAGE DE LUMINESCENCE On nomme FRET (pour Fluorescence R sonance Energy Transfer), ou BRET (pour Bioluminescence R sonance Energy Transfer), les techniques bas es sur l'utilisation d'un m canisme de transfert non radiatif de fluorescence par couplage dipolaire entre deux mol cules appel es respectivement Donneur et Accepteur. Le FRET et le BRET sont souvent mis profit pour d terminer pr cis ment la distance entre les deux partenaires. Ces techniques s'appuient sur la th orie d velopp e par Frster en 1948 (V. Th. Frster, (1948), Ann. Phys., 2, 54-75. Zwischenmolekular energiewanderung und Fluoreszenz) et tirent profit de la forte d pendance de l'efficacit du transfert (E) vis vis de la distance entre les deux partenaires. En effet, l'efficacit du FRET, d termin e exp rimentalement comme une variation d'intensit de fluorescence de l'Accepteur et/ou du Donneur, d cro t tr s rapidement avec la distance (r) s parant le Donneur et l'Accepteur selon une fonction en l/r6. E- (Io-I)/Io-Ro'/ (Ro'+r') o, Io est l'intensit de fluorescence du Donneur lorsque le Donneur et l'Accepteur sont une distance infinie, o 1 est l'intensit de fluorescence du Donneur lorsque le Donneur et l'Accepteur sont une distance (r) et o Ro est une grandeur caract ristique du couple Donneur/Accepteur et qui correspond la distance pour laquelle l'efficacit de transfert de fluorescence est de 50% de sa valeur maximum. Au niveau membranaire, la d tection d'un signal de FRET sera d'autant meilleure que la valeur de Ra est lev e. Cette valeur, qui pourra th oriquement varier entre 15 et 120 , est calcul e de fa on th orique en utilisant la formule donn e par J. R. LAKOVICZ dans"Principles of Fluorescence Spectroscopy", Seconde dition, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 1999, 13, 368-391 : Ra (en ) = 9, 79 103. (K2. (j) D. J) O, K2 est le coefficient d'orientation des moments de transition d' mission du Donneur et d'absorption de l'Accepteur. La valeur de ce coefficient K2 est gale 2/3 lorsque le Donneur et l'Accepteur se distribuent de fa on isotrope. n est l'indice de r fraction du milieu utilis , O FD ( ) est la fluorescence du Donneur la longueur d'onde X en nm, ou SA (l) est le coefficient d'extinction mol culaire exprim en M-1. cm-1 la longueur d'onde X en nm. Dans cet exemple, diff rents couples Accepteur/Donneur ont t tudi s. Les propri t s spectroscopiques des partenaires (absorbance, coefficient d'extinction mol culaire, mission de fluorescence, rendement quantique, int grales de recouvrement) ont t analys es et les valeurs des rayons de Frster (Ro), caract ristiques des diff rents couples de luminescence ont t calcul es. Au sein de ces couples de luminescence, l'un des partenaires est soit une prot ine fluorescente pour le FRET, ou bien une prot ine bioluminescente pour le BRET, chacune manipul e avec les outils de la biologie mol culaire et produite dans la cellule vivante partir d'un acide nucl ique. Pour le FRET, il s'agira d'une Prot ine Fluorescente Verte, dite Green Fluorescent Protein (GFP) ou certains de ses divers mutants. Pour le BRET, il s'agira d'une Lucif rase. L'autre partenaire est une mol cule lipophile pouvant facilement tre ins r e de fa on stable et quantitative dans la membrane plasmique de cellules vivantes. Ce couple de luminescence Donneur/Accepteur est caract ris par le fait que la valeur th orique de son Ro est la plus lev e possible, ce qui signifie que : dans ce couple Donneur/Accepteur, le rendement quantique de fluorescence du Donneur est le plus proche possible de 1,0 ; dans ce couple Donneur/Accepteur, l'int grale de recouvrement (J) doit tre maximale entre le spectre d' mission du donneur et le spectre d'excitation de l'accepteur, ce qui signifie : - dans ce couple Donneur/Accepteur, le coefficient d'extinction mol culaire de l'accepteur doit tre le plus lev possible ; - dans ce couple Donneur/Accepteur, les longueurs d'ondes d' mission du Donneur et d'absorption de l'Accepteur doivent tre les plus lev es possibles ; - dans ce couple Donneur/Accepteur, les spectres d' mission de fluorescence du Donneur et de l'Accepteur doivent pr senter un recouvrement spectral minimal ; - dans ce couple Donneur/Accepteur, le coefficient d'extinction mol culaire de l'accepteur la longueur d'onde d'excitation du donneur doit tre le plus faible possible. Par ailleurs, dans ce couple Donneur/Accepteur : - la fluorescence du Donneur doit tre la plus stable possible vis- -vis de l'irradiation lumineuse ; - la longueur d'onde d'excitation du Donneur doit tre au moins sup rieure 360 nm et de pr f rence sup rieure ou gale 400 nm pour viter l'autofluorescence des cellules ; - l'Accepteur doit pr senter un rendement quantique suffisant pour que la variation de sa fluorescence au cours du FRET soit ais ment quantifiable. COUPLES DE LUMINESCENCE Plusieurs exemples concernant des couples Donneur/Accepteur d'int r t majeur sont d crits ci-dessous : 1-Cycle3-GFP (Donneur)/Lipide fluorescent (Accepteur) dans le cas de FRET La Cycle3-GFP La Cycle3-GFP est un mutant thermostable de la Prot ine Fluorescente Verte (GFP), commercialis e par la soci t Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France. C'est une prot ine de 238 acides amin s qui peut tre exprim e dans des cellules eucaryotes en conservant toutes ses propri t s de fluorescence. L' mission de la Cycle3-GFP se produit avec un maximum 508 nm avec un rendement quantique tr s lev de 79%, qui repr sente un avantage norme par rapport tous les autres mutants de la GFP. L'excitation de la Cycle3-GFP se produit entre 350 nm et 490 nm avec un maximum d'absorption 398 nm. Le coefficient d'extinction mol culaire de la Cycle3-GFP à 398 nm est de 25000 M-1. cm-l. Le décalage important entre la longueur d'onde d'excitation (ex = 398 nm) et la longueur d'onde d'émission (ex = 508 nm) permet une excellente séparation spectrale entre les spectres d'absorption de la Cycle3-GFP en tant que Donneur et de l'Accepteur lipidique, évitant ainsi l'excitation directe de l'Accepteur à la longueur d'onde d'excitation du Donneur. Enfin, la longueur d'onde d'excitation à 400 nm reste parfaitement supportée par les cellules vivantes, au contraire des illuminations plus énergétiques de l'ultraviolet nécessaires à l'excitation du mutant P4-3 (Y66H/Y145F, Protéine Fluorescente Bleue, (kexc = 380 nm et rendement quantique de fluorescence de 20%)). Parmi les Donneurs possibles de fluorescence au sein du couple Donneur/Accepteur, le mutant W7 (Protéine Fluorescente Cyan) excité à 433 nm et analysé à 475 nm présente un déplacement de Stokes faible de 42 nm et un rendement quantique de fluorescence faible de 24%. Les mutants du type EYFP (Protéine Fluorescente Jaune) excités à 513 nm et analysé à 527 nm présente un déplacement de Stokes très faible de 14 nm et un rendement quantique de fluorescence faible de 20%. Les performances des mutants ECFP et EYFP sont donc largement insuffisantes. En dernier lieu, la longueur d'onde d'excitation de la Cycle3-GFP à 400 nm correspond à une bande d'émission intense des lampes à vapeur de mercure couramment utilisées avec les microscopes à fluorescence. Partenaires de la Cycle3-GFP Divers candidats lipidiques fluorescents, potentiels partenaires de FRET avec la Cycle3-GFP sont présentés dans le Tableau 9. Ils ont été analysés selon la qualité du recouvrement spectral avec le spectre d'émission de la Cycle3-GFP. La valeur du Ro de ces différents candidats comme accepteur de FRET avec la Cycle3-GFP est donnée ainsi que la valeur du coefficient d'extinction moléculaire (s, M-1. cm-l) à la longueur d'onde d'excitation de la Cycle3-GFP. Se dégagent d'abord des composés dérivés de la rhodamine, commercialisés par Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas), et dont le calcul du Ro entre la Cycle3-GFP et le lipide fluorescent atteint des valeurs élevées, proches de 60 . Cependant, ces composés présentent un coefficient d'extinction moléculaire résiduel élevé (1800 à 5000 M-1. cm-l) à la longueur e à la longueur d'onde d'excitation de la Cycle3-GFP (400 nm). Sont ensuite présentés des composés de la famille des cyanines, de la fluorescéine, des Bodipyo, AlexaFluoro et NileRed#. Parmi ces composés, certains présentent une valeur résiduelle de coefficient d'extinction moléculaire à 400 nm encore importante. Dans cette catégorie sont rangés des composés du type : AlexaFluor#546 ou BodipyTMR-X, SE commercialisés par Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas) dont les valeurs de Ro sont de 58,3 et 8400il nm = 4264 M-l. cm-l et 4422 M-1. cm-l. Plus intéressants sont les composés dérivés de la fluorescéine, JOE, ou Bodipy558 commercialisés par Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas) dont les Ro sont de 59,7 et de 61,2 et les coefficients d'extinction moléculaire à 400 nm de 1266 M-1. cm' et de 563 M-1. cm' respectivement. A partir des données et des calculs présentés ci-dessus, la sonde lipophile la plus adaptée au FRET fait partie de la famille des cyanines, la dioctadécyl-l, 1'-tétraméthyl-3, 3,3', 3'-indocarbocyanine (DiI ; Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas, réfD-282)), pour laquelle le Ro est de 67,4 et le coefficient d'extinction moléculaire résiduel à 400 nm de 245 M-1. cm'\ TABLEAU 9 Rayon de #excDonneur Fôrster Accepteur Source Don/Acc g Acc à #exc Propriétés Référence Ro, en A du Donneur 6-JOE, SE Molecular Probes fluorophore greffable sur succinimidyle carboxy-6-Leiden, Pays-Bas 59.7 400nm lipide ou protéine Dichloro-4',5'-diméthoxy- C-6171 1266 M-1. cm-1 membranaires 2', 7'Carboxylate de fluorescéine Alexa Fluor&commat; 546 Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Ester Succinimidylique de Leiden, Pays-Bas 58.3 4264 M-l. cm-' lipide ou protéine l'acide Alexa Fluor&commat;546 A-10237 membranaires BODIPY# TMR-X, SE Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Ester Succinimidylique du Leiden, Pays-Bas 58.3 4422 M-l. cm-' lipide ou protéine BODIPY&commat;TMR-X D-6117 membranaires BODIPY&commat; 558/568, SE Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Ester Succinimidylique du Leiden, Pays-Bas 61.2 563 M-1.cm-1 lipide ou protéine BODIPY&commat; 558/568 D-2219 membranaires 400nm fluorophore greffable sur Cy3# Amersham Life 64.4 254 M-1. cm-1 lipide ou protéine Science, Inc membranaires Dil ; DilC18(3) Molecular Probes 400nm Dioctadécyl-1, 1'-tétraméthyl- Leiden, Pays-Bas 67.4 245 M-1.cm-1 Cation Lipophile 3,3, 3', 3'-indocarbocyanine D-282 0,05 15 Molecular Probes 400nm nile red Leiden, Pays-Bas 58.0 216 M-1. cm-1 Sonde lipophile N-1142 Non fluorescent dans l'eau R18 Molecular Probes 400nm Octadécyle rhodamine B Leiden, Pays-Bas 61.8 2317 M-1.cm-1 Cation Lipophile 0-246 Lissamine Molecular Probes 400nm Rhodamine B DHPE Leiden, Pays-Bas 54.1 1794 M-1.cm-1 Phospholipide membranaire L-1392 Rhodamine Red-X, SE Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Ester Succinimidylique de la Leiden, Pays-Bas 60,1 3587 M-1. cm-1 lipide ou protéine Rhodamine RedTM-X R-6160 membranaires Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur TAMRA-X, SE Leiden, Pays-Bas 60,4 3669 M-1.cm-1 lipide ou protéine Ester Succinimidylique du T-6105, C-2211, membranaires TAMRA-X C-6123, C-1171 TRITC Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Isothiocyanante de Leiden, Pays-Bas 61,5 4667M'\cm' lipide ou protéine T-490, T1391 Tétraméthyle Rhodamine T-1481, T-1480 membranaires 5 (6) -XRITC Molecular Probes 400nm fluorophore greffable sur Isothiocyanante de Leiden, Pays-Bas 43,2 4192 M-1. cm-1 lipide ou protéine 5 (et 6)-X-Rhodamine X-491 membranaires De plus, elle présente une affinité naturelle pour les membranes et permet le marquage membranaire de cellule par dispersion du produit dans le milieu de culture. Chargée positivement, elle aura une localisation privilégiée sur le feuillet interne de la membrane plasmique en réponse au potentiel transmembranaire. Par l'ensemble de ces propriétés, la sonde Dil est parfaitement adaptée à la mise en oeuvre de FRET sur cellules vivantes. Par ailleurs, des sondes fluorescentes, analogues de phospholipides, sont intéressantes pour leur capacité à résider longtemps sur le feuillet externe de la membrane plasmique et représentent des candidats de choix pour étudier des translocations entre la membrane plasmique et le milieu extracellulaires. A ce critère, répond pleinement la sonde Lissamine Rhodamine DHPE (Ro = 54,1 Â et E400 mu = 1794 M-1. cm-l). D'autres chromophores peuvent être avantageusement greffés sur des lipides naturellement présents dans la membrane par l'intermédiaire d'un groupement succinimidyle, par exemple : TAMRA, SE (Ro = 60, 4 Â et E400 nm = 3669 M' cm-l), RhodamineRedX, SE (Ro = 60, 1 Â et 8400 nu = 3587 M-1. cm-I), Cy3TM (Ro = 64, 4 Â et 8400 nom = 254 M' cm-'), ou par l'intermédiaire d'un groupement isothiocyanate : TRITC (Ro = 61, 5 Â et 8400 nom = 4667 M-1. cm-l). 2-DsRed Protéine (Donneur)/Lipide fluorescent (Accepteur) dans le cas de FRET (Accepteur DsRed Protéine Ces protéines fluorescentes rouges (dites DsRed proteins ) ont été décrites pour la première fois en 1999 (Matz MM, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML and Lukyanov SA, (1999), Nature Biotechnology, 17, 969-973. Fluorescent Proteins from nonbioluminescent Anthozoa Species) dans des organismes associés aux récifs coralliens. Elles sont maintenant distribuées par Clontech Laboratories Inc., Palo Alto CA (USA). L'une de ces protéines, drFP583, présente un spectre d'excitation à 558 nm et un spectre d'émission de fluorescence à 583 nm. A ce titre, elle représente un candidat potentiel de premier choix comme Donneur de fluorescence dans des expériences de FRET. De plus, les longueurs d'ondes élevées d'absorption et d'émission de fluorescence laissent entrevoir des valeurs élevées de Ro avec des sondes lipidiques membranaires du type Texas Rede. Cependant, le rendement quantique de la drFP583 décrite dans ce travail n'est que de 0, 23. Partenaires de la Protéine DsRed Les avantages à l'utilisation des GFP rouges résident dans leurs longueurs d'onde d'émission de fluorescence largement déplacées vers le rouge, favorisant des valeurs de Ro élevées. Cependant, en l'état actuel des connaissances, ces protéines semblent s'exprimer sous la forme de multimères dans des cellules ce qui représente un frein majeur à l'utilisation de ces protéines comme partenaire de FRET. De plus la cinétique de maturation de la DsRed à partir d'un analogue de GFP est lente et peut prendre plusieurs jours à température ambiante. L'intensité de la fluorescence de ces protéines n'est donc pas quantitative. Elles semblent donc difficilement utilisables aujourd'hui pour des analyses par FRET. Cependant, l'obtention future de telles protéines fluorescentes monomériques n'est pas à exclure. De telles protéines sont particulièrement adaptées à l'analyse de FRET avec un accepteur lipidique. En effet, avec un rendement quantique TABLEAU 10 Rayon de Förster X. XC Donneur Accepteur Source / Donneur / # Accepteur à Propriétés Référence Accepteur ^etc Ro, en A du Donneur Texas Red&commat; DHPE Lipide membranaire Molecular Probes Nd N- (Texas Red&commat;)-Leiden, Pays-Bas Rendement quantique de 1, 2-dihexadécanoyl- T-1395l'accepteur phosphatidyléthanolamine #fdonneur=0,29 Texas Red&commat;-X, SE Fluorophore greffable sur Molecular Probes Nd Lipide ou protéine Ester Succinimidylique du Leiden, Pays-Bas membranaires Texas Red&commat;-X T-6134 Rendement quantique de l'accepteur, #fdonneur = 0,29 3-Lipide fluorescent (Donneur) 1 EGFP (Accepteur) dans j/EGFP L le cas de FRET Compte tenu des propriétés de fluorescence de la EGFP (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto CA (USA)), avec un maximum d'absorption à 475 nm, une émission de fluorescence à 507 nm, un rendement quantique de 60% et un coefficient d'extinction moléculaire de 55000 M-1. cm-l à 475 nm, il apparaît intéressant de considérer la EGFP comme accepteur de FRET. Le Tableau 11 présente une sélection de lipides fluorescents qui ont été choisis pour la qualité du recouvrement spectral de leur émission de fluorescence avec l'absorption de la EGFP. La sonde DPH est un candidat Donneur très performant car son rendement quantique de fluorescence de 90% est particulièrement élevé. En parallèle, le rendement quantique élevé de l'Accepteur (EGFP) permet une bonne détection de l'apparition de la fluorescence de l'Accepteur dans l'expérience de FRET. Cette propriété représente un avantage important pour la caractérisation du mécanisme intime du FRET en permettant la mesure simultanée de la fluorescence du Donneur et de la fluorescence de l'Accepteur. Les sondes dérivées de l'acétyle-2-anthracène qui présentent des bandes intenses d'absorption à 360 nm, 380 nm et 400 nm et une émission de fluorescence dans les membranes à 460 nm peuvent être avantageusement intégrées dans les lipides membranaires par les voies métaboliques de la cellule vivante. TABLEAU 11 Rayon de exc Donneur Fôrster Donneur Source/Référence Don/Acc s Accepteur à Propriétés exc Ro, en du Donneur DPH Molecular Probes 360nm Sonde membranaire diphényl-1, 6- Leiden, Pays-Bas 49,2 1320 M-l. cm-l Non fluorescente dans l'eau hexatriène-1, 3,5 D-202 #facc=0,80 Prodan Molecular Probes 360nm Sonde membranaire Propionyle-6-méthyl Leiden, Pays-Bas nd 1320 M-'. cm-l amino-2-naptalène P-248 Laurdan Molecular Probes 360nm Sonde membranaire Dodecanoyl-6-Leiden, Pays-Bas nd 1320 M-l. em-' diméthyl amino-2-naptalène D-250 4 - Luciférase (Donneur) 1 Lipide fluorescent (Accepteur) dans le cas de BRET Deux candidats donneurs de luminescence sont les luciférases de Renilla renformis (BioSignal Packard, Montreal, Canada) et celle de Oplophorus gracilirostris (Shimomura et al (2000), FEBS Letters, 481, 19- 25), dont l'émission de lumière est induite, non par une excitation lumineuse, mais par la réaction chimique d'un substrat (coelentérazine) capable de traverser les membranes de cellules vivantes. L'intérêt majeur de ces luciférases est leur totale indépendance vis à vis d'une lumière excitatrice et vis à vis d'autres cofacteurs, autres que le substrat. En absence de substrat, la luciférase n'émet pas de photons et l'accepteur n'est pas excité. En revanche, en présence de substrat coelentérazine, la luciférase transfert son énergie à l'accepteur avec apparition de signal de fluorescence caractéristique du BRET. L'avantage du BRET réside dans son principe même, à savoir une génération ex nihilo de fluorescence qui sera aisément détectée, même à bas niveau, en l'absence de lumière excitatrice parasite. L'addition de substrat coelentérazine conduit à une émission lumineuse dans la zone de 460 à 490 nm dont le rendement quantique, défini par le nombre de photons émis par mole de substrat consommé, est de Partenaires de la Luciférase Trois lipides fluorescents ont été sélectionnés sur la base de la position de leurs spectres d'absorption et présentés dans le Tableau 12. Il s'agit d'une part d'un phospholipide dérivé du NBD (NBD-PE) et d'autre part des dérivés de sels de pyridinium hydrophobes. Les valeurs du Ro sont plus élevées avec la luciférase de Oplophorus gracilirostris en raison de son rendement quantique plus élevé. Un candidat accepteur, le DiA, présente, avec la luciférase de Oplophorus gracilirostris une valeur de Ro de 44, 7 qui permet d'envisager une application de BRET. Le DiA est un cation lipophile, qui se localise sur le feuillet interne des membranes plasmiques sous l'effet du potentiel membranaire. La fluorescence du DiA émise entre 500 nm et 550 nm sera d'autant plus facilement analysée du fait que la luciférase n'exige pas d'excitation lumineuse. TABLEAU 12 Rayon de Fôrster Donneur Accepteur Source/Référence Donneur/Propriétés Accepteur R0, en Luciférase de Molecular Probes Renilla di-8-Leiden, Pays-Bas 29,9 sel interne ANEPPS reniformis D-3167 Luciférase de Molecular Probes Aplophorus di-8-Leiden, Pays-Bas 41,2 sel interne ANEPPS gracilirostris D-3167 Luciférase de Molecular Probes Renilla DiA Leiden, Pays-Bas 32,5 Cation Lipophile Reniformis D-3883 Luciférase de Molecular Probes Aplophorus DiA Leiden, Pays-Bas 44,7 Cation Lipophile Gracilirostris D-3883 Luciférase de Molecular Probes Renilla NBD-PE Leiden, Pays-Bas 28,9 Phospholipide membranaire Reniformis N-360 Luciférase de Molecular Probes Aplophorus NBD-PE Leiden, Pays-Bas 38,9 Phospholipide membranaire Gracilirostris N-360 5-Utilisation de cryptâtes de métaux de transitions comme Donneurs du couple de FRET Récemment, ont été développés des complexes métalliques avec des Terres Rares (Europium, Terbium) présentant des propriétés de fluorescence adaptées au mécanisme de FRET. Ces complexes, pris comme Donneur dans les couples de FRET, ont une longue durée de vie d'état excité de fluorescence. Cet avantage permet de discriminer, sur une base temporelle, entre la fluorescence du cryptate et l'autofluorescence des cellules d'une part et entre la fluorescence du cryptate et la fluorescence résiduelle de l'Accepteur. L'article cité en référence décrit un couple Donneur/Accepteur (Cryptate d'Europium/Allophycocyanine) dont la valeur du Ro atteint 95 A. [Alpha-Bazin A, Bazin H, Préaudat M, Trinquet E and Mathis G, (2001), 21, 439-455. Rare Earth Cryptates and TRACE Technology as Tools for Probing Molecular Interactions in Biology. In New Trends in Fluorescence SpectroscopyApplications to Chemical and Life Sciences. B. Valeur and JC Brochon Eds, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New-York]. Dans le cadre de l'invention, le cryptate métallique greffé sur une protéine est le Donneur de fluorescence tandis que le rôle de l'Accepteur est tenu par un dérivé de la fluorescéine émettant de la fluorescence au-delà de 650 nm. Exemple n 2 : Mise en évidence de FRET entre la Cycle3GFP-Akt et des liposomes marqués au DiI-Recrutement de la Cycle3-GFP-Akt à la surface de liposome induit par l'interaction entre le domaine PH (Pleckstrin Homology) de la Cycle3-GFP-Akt et les PIP3 des liposomes Le but de cet exemple est de démontrer, sur un système modèle, un mécanisme de FRET entre un Donneur protéique (Cycle3-GFP-Akt) et un Accepteur lipidique (Dil) inséré dans la membrane lipidique de liposomes. Il renvoie directement aux exemples des Tableaux 1,2 et 8 ( Protéines à domaines PH , Protéines sans domaine PH mais avec domaine FYVE et Protéines associées à des membranes intracellulaires autres que la membrane plasmique . La protéine Akt est normalement soluble et son recrutement à la membrane plasmique est induit par des phospholipides acides présents dans la membrane, les phosphatidylinositol-3,4, 5-triphosphate (PIP3) selon un processus qui met en oeuvre des interactions spécifiques entre les têtes polaires des PIP3 et le domaine PH, homologue de la pleckstrine de l'Akt. Cet exemple permet de montrer que le FRET (variation de la fluorescence du Donneur) observé est dû spécifiquement à la présence de l'Accepteur lipidique (Dil) inséré dans la membrane, mais aussi au rapprochement dans l'espace du DiI et de la Cycle3-GFP-Akt induit par la présence des molécules de PIP3 à dans les liposomes. Il représente la base expérimentale fondamentale à la mise en oeuvre du procédé d'analyse du recrutement ou de la dissociation d'une protéine par rapport à la membrane plasmique de cellules vivantes. Par extension, cet exemple démontre les potentialités du procédé pour suivre le recrutement de protéines marquées sur d'autres systèmes membranaires que la membrane plasmique, à savoir, l'enveloppe nucléaire, le réticulum endoplasmique, le Golgi, les mitochondries (Tableau 8), les chloroplastes ou toutes vésicules des cellules eucaryotes ou encore la membrane plasmique des procaryotes. Construction du plasmide codant pour la protéine de fusion Cycle3-GFP-Akt L'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) codant pour la protéine Akt/PKBa est obtenu après avoir effectué une transcription inverse couplée à une réaction de polymérisation en chaîne (RTPCR) à partir d'acide ribonucléique (ARN) extraits des cellules MCF-7. Les cellules MCF-7 sont ensemencées dans des boites de culture de 60 cm2 à 1000000 de cellules par boite. Après 24 heures, les cellules sont lysées et les ARN extraits en utilisant le kit RNeasy mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, France réf. 74104). On prépare 1 zu d'ARN dilué dans de l'eau distillée, dépourvue de DNases et de RNases, à une concentration finale de 0, 2 fig/ml, la préparation est placée 10 minutes à 68 C puis transférée à 4 C (glace pillée). A partir de ces ARN, on synthétise des ADNc simples brins en réalisant une transcription en retour avec une amorce aléatoire. Pour cela, on ajoute aux ARN dilués de la RNasine (40 ui/ l ; Promega, Charbonnières, France), du dithiothréitol à une concentration finale de 10 mM, un mélange de nucléotides à une concentration finale de 0,5 mM, l'amorce aléatoire (Invitrogen Life technologies, Cergy Pontoise, France Réf. 48190-011) à une concentration finale de 5 jM et l'enzyme Transcriptase Inverse RT-M-MLV (Moloney Murine Leukemia virus, (Invitrogen Life technologies, Cergy Pontoise, France réf. 28025-013). On incube ce mélange réactionnel pendant 1 heure à 37 C. En utilisant deux amorces appropriées, on amplifie la séquence codante de la protéine Akt par la technique de PCR. On mélange les ADNc simples brins avec une solution de nucléotides à une concentration finale de 200 ju. M, les deux amorces à une concentration finale de 0, 5 uM et l'ADN polymérase qui est la DyNAzyme EUT&commat; (New England Biolabs, Beverly MA, USA, réf : F505S) à une concentration finale de 0, 02 Ul/lil, le tout est placé dans un tampon optimisé dilué dans de l'eau. Après une dénaturation initiale réalisée pendant 10 minutes à 94 C, les ADNc doubles brins sont amplifiés par une phase de dénaturation d'une minute à 94 C puis une phase d'hybridation d'une minute à 60 C et une phase d'élongation d'une minute à 72 C, cette opération est renouvelée 30 fois. A la fin des 30 cycles, on effectue une élongation terminale de 10 minutes à 72 C. Le produit PCR de 1515 paires de bases, correspondant à la séquence codante de la protéine Akt, est ligaturé dans le vecteur pcDNA3. 1/NT-GFP-TOPO (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France réf. K4810-01). On obtient alors une construction contenant un promoteur pCMV qui permet l'expression de la protéine de fusion Cycle3-GFPAkt où la protéine Akt est clonée en aval de la protéine Cycle3-GFP. La carte du plasmide codant pour la Cycle3-GFP-Akt est représentée sur la Figure 1. Cette construction a été vérifiée par analyse enzymatique et validée par une transfection transitoire dans des cellules Cos-7. Préparation de la Cycle3-GFP-Akt Des cellules Cos-7 (ECACC n 87021302), cultivées au 4ème passage, sont ensemencées stérilement à 600 000 cellules par boite de culture plastique de 20 cm2 (Nunclon#Delta). Le milieu de culture (5 ml par boite) est du DMEM dépourvu de rouge phénol (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France réf : 31053-028) complémenté avec 10% (v/v) de sérum de veau foetal (Sigma-Aldrich Chimie Sarl, Saint-Quentin Fallavier, France réf : F-7524), de la L-glutamine à une concentration de 2 mM, de la Pénicilline à une concentration de 100 UI/ml et de la Streptomycine à une concentration de 100 ug/ml. 24 heures après l'ensemencement, les cellules sont transfectées par le plasmide Cycle3-GFP-Akt en utilisant la LipofectAMINE2000 (Invitrogen Life Technolgies, Cergy Pontoise, France réf : 11668-019). Pour ce faire, on prépare 8 ig d'ADN plasmidique Cycle3-GFP-Akt dans 500 l de milieu DMEM dépourvu de rouge phénol et complémenté par de la L-glutamine à une concentration de 2 mM. On homogénéise par vortex et on incube ce mélange pendant 5 minutes à 20 C. Par ailleurs, on prépare 20 ; j. l de LipofectAMINE'2000 dans 500 ill de milieu DMEM dépourvu de rouge phénol et complémenté par de la L-glutamine à une concentration de 2 mM. On homogénéise par vortex et on incube ce mélange pendant 5 minutes à 20 C. On transfert la solution de LipofëctAMINE'2000 dans la solution d'ADN et on incube ce mélange pendant 20 minutes à 20 C. Pendant ce temps, on lave les cellules avec 3 ml de DMEM dépourvu de rouge phénol et complémenté par de la L-glutamine à une concentration de 2 mM puis on leur ajoute 4 ml de DMEM dépourvu de rouge phénol et complémenté par de la L-glutamine à une concentration de 2 mM. Enfin, on ajoute le mélange de transfection (1 ml) sur les cellules, on homogénéise et on incube les cellules pendant 4 heures à 37 C sous 5% de CO2. On élimine le milieu de transfection et le remplace par 5 ml de milieu DMEM sans rouge phénol, complémenté avec 10% de sérum de veau foetal, L-glutamine, pénicilline et streptomycine. Les cellules sont replacées dans l'incubateur à 37 C sous 5% de C02 pendant 24 heures. On élimine le milieu de culture des cellules Cos-7 par aspiration et on lave les cellules deux fois avec 1 ml de Tampon Phosphate Salin (PBS) et on reprend les cellules avec 0,5 ml de tampon HEPES 25 mM, EDTA 20 mM, pH 7, 4 contenant de l'orthovanadate 1 mM, Aprotinine 10 p. g, PMSF 0, 1 mM et Leupeptine 10 ! J. g. On gratte les cellules avec un racloir en plastique et on reprend la suspension de cellules dans un tube Eppendorf. Cette suspension est agitée vigoureusement au vortex pendant 5 secondes puis centrifugée 5 minutes à 4 C à une vitesse de 13000 tours par minute. Le surnageant résultant est analysé par spectrofluorimétrie (SPF- 50OC' ; Bioritech ; France). Le spectre d'émission de fluorescence est enregistré entre 420 nm et 700 nm (bande passante de 5 nm) sous excitation à 398 nm (bande passante de 7,5 nm). Le spectre d'excitation de fluorescence est obtenu par observation de la fluorescence émise à 510 nm (bande passante de 5 nm) pour une lumière d'excitation variant entre 300 nm et 495 nm (bande passante de 7,5 nm). Les spectres d'excitation et d'émission de fluorescence sont caractéristiques de la fluorescence de la Cycle3-GFP en solution. Préparation de liposomes EPC/Chol/PS/SM/PE/DiI/PIP 40/20/10/1 0/20/25/5 mole/mole On prépare des liposomes à partir d'un mélange de 4,4 mg de phosphatidylcholine de jaune d'oeuf (Fluka BioChemica, Saint Quentin Fallavier, France, réf : 61753), 2,4 mg de phosphatidyléthanolamine (Fluka BioChemica, Saint Quentin Fallavier, France, réf : 60647), 1,3 mg de cholestérol (Fluka BioChemica Saint Quentin Fallavier, France, réf : 26732), 1,2 mg de DL- a-dipalmitoyl-phosphatidyl-L-sérine (Sigma-Aldrich Chimie Sarl, Saint Quentin Fallavier, France, Réf : P-1902), 1, lmg de sphingomyéline (Sigma-Aldrich Chimie Sarl, Saint Quentin Fallavier, France, Réf : S-7004) et 57 mg d'HECAMEG (Vegatec, Villejuif, France) que l'on solubilise dans 1,8 ml de chloroforme et 0,2 ml de méthanol. Les lipides sont séchés dans un ballon sous évaporateur rotatif à 40 C puis repris dans 5 ml d'eau. A partir de cette solution mère, on prépare 3 tubes à hémolyse en verre contenant chacun 500 n. g de lipides (250 jell). On prépare aussi 2 mg de DiI (dioctadécyl-1, l'-tétraméthyl-3, 3,3', 3'- indocarbocyanine, Molecular Probes, Leiden, Pays-Bas, Réf : D-282) solubilisé dans 1 ml de diméthylformamide et 100 g de PIP3 (L-a-dipalmitoyl- phosphatidylinositol-3,4, 5-triphosphate, Calbiochem, Darmstadt, Allemagne, Réf : 524615) solubilisés dans 200 ul de Diméthyle Sulfoxyde (DMSO). Lipides DiI (2g/l) DMF PIP3 DMSO Essai 1 500 g 10 l 0 l 100 l 0 l Essai 2 500 g 10 l 0 l 0 l 100 l Essai 3 500 g 0 l 10 l 100 l 0 l Le pourcentage molaire, exprimé en mole de PIP3 par mole de lipides totaux est de 5% dans les essais 1 et 3 et de 0% dans l'essai 2. Le pourcentage molaire, exprimé en mole de Dil par mole de lipides totaux est de 2,5% dans les essais 1 et 2. On homogénéise les trois mélanges et on place les solutions dans des boudins de dialyse (Spectra/PorCE de seuil de coupure à 2000Da). On les place dans 1 litre d'eau distillée en présence de 3 grammes d'absorbant BioBeadsSM-2 (Bio-Rad Laboratoires, Marnes la Coquette, France) sous agitation magnétique à 4 C pendant 4 heures. On récupère ainsi les essais 1,2 et 3 dépourvus de détergent et contenant des liposomes. Mise en évidence du FRET Dans une cuve adaptée à la spectrométrie de fluorescence on dépose 300 III de tampon PBS et 60 l de la solution de Cycle3-GFP-Akt. On enregistre le spectre d'émission de fluorescence à l'aide d'un spectrofluorimètre SPF-500C# entre 430 nm et 700 nm (bande passante de 7,5 nm). La longueur d'onde d'excitation est de 398 nm (bande passante de 7,5 nm). On retranche à ce spectre la contribution à la fluorescence du tampon PBS enregistré dans les même conditions. Le spectre résultant, représenté en A sur la Figure 2, donne la valeur de la fluorescence exprimée en volts en fonction de la longueur d'onde exprimée en nm. On ajoute ensuite 5 111 de l'essai 1, on homogénéise le mélange et on enregistre le spectre de fluorescence dans les mêmes conditions que précédemment. On retranche la contribution du PBS à la fluorescence ainsi que la contribution à la fluorescence de 5 111 de liposomes de l'essai 1 mélangés avec 360 u. l de tampon. Le spectre résultant est représenté en B (Figure 2). On observe une diminution de 25% de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt en présence de 5 u. l (10 ug) de liposomes contenant le DiI et le PIP3. Cependant, l'observation directe des spectres A et B (Figure 2) ne permet pas de confirmer la spécificité du FRET. En effet, en raison de la valeur faible du rendement quantique de fluorescence de l'accepteur (5% Etant donnée la faiblesse de l'intensité de la fluorescence du Dil apparue sur le spectre D (Figure 3), il est possible que la diminution de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt soit due à du transfert radiatif de fluorescence dû au DiI. Les photons émis par la Cycle3-GFP-Akt seraient alors partiellement absorbés par le Dil conduisant à la diminution de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt sans qu'un rapprochement dans l'espace ne soit nécessaire entre la Cycle3-GFP-Akt et le DiI. Un tel phénomène de filtre interne dépendrait directement de la concentration en DiI. Afin d'exclure cette possibilité, on observe l'effet de l'addition successive de 5 J. l, 10 p. l et 15 Ill de liposomes de l'essai 1 sur la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt obtenue par excitation à 398 nm. Sur la Figure 4, les spectres F (0 ul), G (5 ul), H (10 1) et 1 (15 1) montrent une diminution de 30% de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt en présence de 5111 de l'essai 1, tandis que la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt reste constante pour des volumes supérieurs d'essai. Sur la Figure 5, sont représentées les valeurs, en volts, d'intensité de la fluorescence à 510 nm (losanges) et à 570 nm (disques pleins). On observe ainsi l'augmentation proportionnelle au volume d'essai 1 de la fluorescence du DiI à 570 nm par excitation à 398 nm et la stabilisation du signal de la Cycle3-GFP-Akt à 510 nm. L'inhibition de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt n'est donc pas proportionnelle à la concentration en DiI. Le phénomène observé est donc du FRET entre la Cycle3GFP-Akt et le Dil. Enfin, on montre que l'Essai 2 (liposomes sans PIP3) et l'Essai 3 (liposomes sans Dil) sont sans influence sur la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt dans les même conditions de concentration. On conclut que l'extinction partielle de la fluorescence de la Cycle3-GFP-Akt et l'apparition de la fluorescence du DiI sont dues à un transfert non radiatif de fluorescence (FRET) spécifiquement entre la Cycle3GFP-Akt et le Dil et que ce transfert est induit par le recrutement de la Cycle3GFP-Akt à la surface des liposomes contenant du Dil. Exemple n 3 : Mise en évidence du FRET entre le récepteur membranaire MOR-1 ( Mu Opioid Receptor-l ! couplé à la Cycle3GFP, exprimé dans des cellules Cos-7 en culture, et la sonde membranaire Dil Cet exemple permet de mettre en évidence, dans des cellules vivantes, l'existence d'un mécanisme de FRET entre un récepteur constitutivement membranaire de la famille des récepteurs couplés aux protéines G et couplé à la Cycle3-GFP et des lipides membranaires marqués avec la sonde fluorescente DiI. Le récepteur MOR-1 est une protéine constituée de 7 hélices ex hydrophobes qui lui assurent une localisation exclusivement transmembranaire. Cet exemple permet aussi d'appuyer les applications possibles données dans le Tableau 7, concernant des protéines intégrales de la membrane contenant des peptides susceptibles d'être libérés par protéolyse dans le milieu extra ou intracellulaire. On peut envisager de coupler la GFP au fragment libérable de la protéine intégrale. Dans ce cas, à partir d'un état initial dans lequel les deux partenaires fluorescents sont proches et présentent un FRET important, le clivage d'un fragment de la protéine membranaire conduit à un état final dans lequel le partenaire peptidique libéré dans le cytoplasme ou dans l'espace péricellulaire s'éloigne du partenaire lipidique membranaire et entraîne la disparition du FRET. Construction du plasmide (MOR-l-Cycle3-GFP) codant pour une protéine de fusion MOR-1-Cycle3-GFP L'ADNc codant pour la protéine MOR-1 a été obtenu après PCR à partir du plasmide pcDNAI/MOR-1 (don gracieux de Meunier JC, IPBS, Toulouse). Le produit PCR de 1212 paires de bases, correspondant à la séquence codante de la protéine MOR-1, est ligaturé dans le vecteur pcDNA/CT-GFPTOPO (Invitrogen K4820-01). La construction contient le gène de résistance à l'ampicilline, un promoteur pCMV (cytomegalovirus) qui permet l'expression de la protéine de fusion MOR-l-Cycle3-GFP où la protéine MOR-1 est clonée en amont de la protéine Cycle3-GFP. La carte du plasmide codant pour la MOR-l- Cycle3-GFP est représentée sur la Figure 6. Cette construction a été vérifiée par analyse enzymatique et validée par transfection transitoire dans des cellules Cos- 7. Mise en oeuvre des cellules Cos-7 et transfection par l'ADN (MOR-1-Cvcle3-GFP) On ensemence une boite de culture plastique de 20 cm2 de surface (NunclonDelta), qui a été préalablement garnie avec une lamelle en verre de taille 35 mm x 35 mm, avec 600000 cellules Cos-7 (ECACC n 87021302), cultivées au 4ème passage, dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 2.24 heures après l'ensemencement, les cellules sont transfectées par le plasmide MOR-l-Cycle3-GFP en utilisant la LipofectAMINE'2000 (Invitrogen Life Technolgies, Cergy Pontoise, France Réf : 11668-019) dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 2. Les cellules sont observées 24 heures après la fin de la transfection. Observation des cellules transfectées sous microscope à fluorescence Zeiss AXIOPLAN-Localisation membranaire du MOR-1-Cyc1e3- GFP On élimine, par aspiration, le milieu de culture des cellules Cos-7 cultivées sur lamelle de verre 35 mm x 35 mm et on lave les cellules deux fois avec 1 ml de PBS. La lamelle supportant les cellules est placée dans une chambre de Rose (Rose G, (1954), Tex. Rep. Biol. Med., 12, 1074-1083. A separable and multipurpose culture chamber), remplie de milieu de culture DMEM dépourvu de rouge phénol mais complémenté avec 10% (v/v) de sérum de veau foetal (SVF), de la L-glutamine, de la Pénicilline et de la Streptomycine et permettant l'observation microscopique sur plusieurs heures de cellules vivantes en culture ainsi que le renouvellement du milieu de culture. L'observation des cellules est réalisée au moyen d'un microscope à fluorescence droit (Zeiss Axioplan) équipé d'un objectif à immersion Gx40 et d'une caméra CCD. La longueur d'onde d'excitation est de 400 nm (filtre d'excitation 405DF40, Omega Optical Inc, Brattleboro, USA), la fluorescence est observée à 510 nm (filtre d'émission 510DF60, Omega Optical Inc, Brattleboro, USA) et la lumière excitatrice est éliminée par réflexion en deçà de 455 nm (filtre dichroïque 455DRLP, Omega Optical Inc., Brattleboro, USA). On observe des cellules Cos-7 présentant une fluorescence de type membranaire intense en accord avec les données de la littérature (Figure 7). Marquage des cellules dans la Chambre de Rose avec le Dil et caractérisation du marquage On démontre que les cellules Cos-7 transfectées avec le MOR-l-Cycle3-GFP peuvent être efficacement marquées par la sonde membranaire DiI sans affecter leur viabilité. Pour ce faire, les cellules Cos-7 observées précédemment sont conservées quelques minutes dans du milieu de culture. On prépare 5 ml de milieu DMEM dépourvu de rouge phénol et chauffé à 37 C. On ajoute 10 gl de SVF au milieu soit 0,2% (v/v). Le milieu DMEM/SVF 0,2% est maintenu à 37 C jusqu'à l'addition du marqueur membranaire fluorescent. On pèse 20 mg de Dil que l'on solubilise dans 2 ml de diméthylformamide. On prélève à l'aide d'une seringue de précision en verre 25 jl de la solution mère de DiI (250 J. g de Dil) que l'on injecte lentement (25 jl/minute) et sous vortex dans le milieu DMEM/SVF 0, 2% maintenu à 37 C. On obtient ainsi une solution limpide de Dil dans le milieu DMEM/SVF 0, 2% que l'on refroidit à 20 C dans un bain thermostaté. Le milieu de marquage équilibré à 20 C contenant la Dil est injecté en 1 minute dans la chambre de Rose contenant les cellules et maintenue à 20 C au moyen d'une seringue de 10 ml. Le milieu de marquage est laissé au contact des cellules pendant 10 minutes à 20 C puis est éliminé par lavage avec 5 ml de DMEM dépourvu de rouge phénol, puis avec 10 ml de tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. L'observation des cellules est réalisée au moyen d'un microscope à fluorescence droit (Zeiss Axioplan) équipé d'un objectif à immersion Gx40 et d'une caméra CCD. La longueur d'onde d'excitation est de 546 nm, la fluorescence est observée au-delà de 590 nm et la lumière excitatrice est éliminée par réflexion en deçà de 580 nm. Le marquage fluorescent membranaire est observé sur la Figure 8. Marquage, par la sonde fluorescente Dit des membranes plasmiques de cellules Cos-7 en culture transfectées par l'ADN MOR-l-Cycle3GFP et observation du FRET par spectroscopie de fluorescence Les cellules Cos-7 cultivées sur plastique sont reprises 36 heures après la transfection et lavées deux fois avec 1 ml de PBS. Les cellules sont décrochées de la boite par addition de 1 ml d'une solution de trypsine/ EDTA (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France Réf : 35400-019) diluée 10 fois dans du tampon Phosphate 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 et incubation pendant 10 minutes à 37 C. On ajoute 4 ml de milieu DMEM sans rouge phénol complémenté avec 10% de sérum de veau foetal et on finit de décoller les cellules par aspiration, refoulement successifs. On récupère la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. La suspension est centrifugée pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de rotation de 1500 tours par minute. Le surnageant est éliminé par aspiration et le culot est lavé 2 fois avec 2 ml de tampon PBS. Les cellules sont reprise dans 1 ml de tampon PBS et placées dans la cuve du spectrofluorimètre. La fluorescence des cellules est analysée entre 430 nm et 700 nm (bande passante 7,5 nm), sous excitation à 398 nm (bande passante 7,5 nm). On enregistre en parallèle et dans les mêmes conditions le spectre de fluorescence de cellules Cos-7 non transfectées et on calcule le spectre de différence représenté par la courbe J de la Figure 9. Les cellules transfectées avec MOR-l-Cycle3-GFP et les cellules non transfectées sont reprises dans la cuve de fluorescence, transvasées dans des tubes à centrifuger de 15 ml et centrifugées pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de rotation de 1500 tours par minute. On élimine le surnageant par aspiration et on ajoute 1 ml de milieu de marquage composé de 0,9 ml de milieu DMEM dépourvu de rouge phénol chauffé à 37 C, auquel on ajoute 100 ul d'une solution de BSA-FAF (Sérum Albumine Bovine Dépourvue d'Acides Gras, Sigma-Aldrich Chimie Sarl, Saint Quentin Fallavier, France, Réf : A-8806) à 1% dans du PBS. Le milieu DMEM/BSA est maintenu à 37 C jusqu'à l'addition du marqueur membranaire fluorescent. On pèse 20mg de Dil que l'on solubilise dans 2 ml de diméthylfbrmamide. On prélève à l'aide d'une seringue de précision en verre, 5 u, l de la solution mère de Dil (50 u. g de Dil) que l'on injecte lentement (5 il/minute) et sous vortex dans le milieu DMEM/BSA maintenu à 37 C. On obtient ainsi une solution limpide de Dil dans le milieu DMEM/BSA que l'on refroidi à 20 C dans un bain thermostaté. On incube les cellules dans le milieu de marquage pendant 10 minutes à 20 C sous agitation lente. On centrifuge les cellules pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de 1500 tours par minute, on élimine le surnageant par aspiration et on lave 2 fois les cellules avec 2 ml de PBS. Les cellules sont reprises dans 1 ml de PBS et analysées au spectrofluorimètre. La différence des spectres obtenus avec les cellules transfectées et les cellules non transfectées est représentée en K sur la Figure 9. On observe une forte diminution de la fluorescence de la MOR-l-Cycle3-GFP et une apparition simultanée d'un signal de fluorescence à 570 nm correspondant à l'apparition de FRET. Cette caractérisation sans ambiguïté du FRET entre une protéine transmembranaire marquée avec la Cycle3-GFP et un marqueur membranaire démontre les potentialités du procédé pour détecter l'apparition ou la disparition d'interactions entre deux partenaires fluorescents, dont l'un est un lipide membranaire et l'autre une protéine. Exemple n 4 : Mise en évidence de FRET entre la protéine Raf-CAAX couplée à la Cycle3-GFP (Cycle3-GFP-RafCAAX). exprimée dans des cellules en culture Cos-7, et la sonde membranaire Dil. Cet exemple a pour but d'étayer l'application du procédé au criblage de molécules présentant un effet sur la localisation de protéines cytosolubles mais interagissant avec la membrane plasmique par l'intermédiaire d'un ancrage lipidique dynamique. Il renvoie au Tableau 3 (Protéines sans domaine PH ou FYVE mais associées à la membrane plasmique par ancrage lipidique). La nature de cet ancrage peut être notamment une acylation (palmitoylation ou myristoylation) ou/et une isoprénylation (famésylation ou géranylgéranylation). La protéine Raf-l est majoritairement localisée dans le cytoplasme de la cellule en absence de stimulation. Le motif CAAX est une séquence de 20 acides aminés de la protéine K-Ras. Ce motif CAAX est un site de modification post-traductionnelle qui est reconnu par l'enzyme conduisant à la famésylation de la protéine et qui, en conjonction avec un site polybasique de 6 lysines, permet l'ancrage de K-Ras à la membrane. La protéine Cycle3-GFP- RafCAAX est constituée de la Cycle3-GFP fusionnée avec la protéine Raf-l et avec le motif CAAX. La construction de la Cycle3-GFP-RafCAAX conduit à l'expression d'une protéine Cycle3-GFP-Raf-l constitutivement localisée à la membrane plasmique des cellules, par l'intermédiaire d'un ancrage dynamique mettant enjeu un groupement isoprénoïde hydrophobe. Construction du plasmide codant pour une protéine de fusion Cyc1e3-GFP-RafCAAX L'ADNc codant pour la protéine RafCAAX est commercialisé par la société Clontech (Clontech Laboratories Inc) K6015-1 sous le nom pCMV-RafCAAX. zug de cet ADNc sont digérés de façon simultanée par les enzymes de restriction Xhol (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), à raison de 3 UI/ug d'ADN et BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) à raison de 3 UI/ug d'ADN, pendant 2 heures à 37 C, libérant un fragment de 2026 paires de bases qui correspond à la séquence codante de la protéine RafCAAX. Les extrémités 5'et 3'de ce fragment sont rendues bout franc par l'addition de la polymérase de Klenow (New England Biolabs, Beverly, MA, USA Réf : MS0210S), à raison de 1 UII/lg d'ADN pendant 30 minutes à 37 C en présence d'un mélange de nucléotides à une concentration finale de 33 u. M. Par ailleurs, le vecteur pcDNA3.1/NT-GFP (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France, Réf : K4810-01) est digéré par les enzymes de restriction Kpnl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) à raison de 3 UI/ug d'ADN et Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) à raison de 3 UI/ag d'ADN libérant un oligonucléotide de 70 paires de bases qui est remplacé par un oligonucléotide contenant 40 paires de bases appelé GFPK, permettant ultérieurement un clonage dans le même cadre de lecture des protéines GFP et RafCAAX. Ce vecteur GFPK est digéré par l'enzyme EcoRV (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) à raison de 3 UII/lg d'ADN, déphosphorylé par la phosphatase alcaline (1 UII/lg d'ADN) pendant 30 minutes à 37 C puis ligaturé en présence du fragment RafCAAX de 2026 paires de bases. Cette construction contient un promoteur pCMV (cytomégalovirus) qui permet l'expression de la protéine de fusion GFP-RafCAAX dans laquelle la protéine RafCAAX est clonée en aval de la protéine Cycle3-GFP. Cette construction a été vérifiée par analyse enzymatique et validée par transfection transitoire dans des cellules Cos-7. La carte du plasmide GFP-RafCAAX est représentée sur la Figure 10. Mise en oeuvre des cellules Cos-7 et transfection par l'ADN GFP-RafCAAX Cette étape est similaire de celle réalisée pour la transfection de l'ADN MOR-1-Cycle3-GFP et est décrite dans l'exemple 3. Les cellules sont observées 24 heures après la fin de la transfection. Visualisation de la localisation membranaire de la protéine GFP-RafCAAX On élimine, par aspiration, le milieu de culture des cellules et on les lave deux fois avec 1 ml de Tampon Phosphate Salin. La lamelle supportant les cellules est placée dans une chambre de Rose , remplie de milieu de culture DMEM dépourvu de rouge phénol mais complémenté avec 10% (v/v) de sérum de veau foetal, de la L-glutamine, de la Pénicilline et de la Streptomycine. L'observation des cellules est réalisée au moyen d'un microscope à fluorescence droit Axioplan (Carl Zeiss, LePecq, France) comme indiqué dans l'exemple 3. On observe des cellules Cos-7 présentant une fluorescence de type membranaire comme sur la Figure 11 alors que la fluorescence observée sur des cellules transfectées avec GFP-Raf, dépourvu de CAAX, reste exclusivement cytoplasmique. Marquage in vivo des cellules Cos-7 transfectées (GFPRafCAAX) avec le Dil On prépare 5 ml de milieu DMEM/SVF 0, 2%/DiI (250 g) comme décrit dans l'exemple 3. On injecte les 5 ml de milieu de marquage au moyen d'une seringue de 10 ml en 1 minute. Le milieu de marquage est laissé au contact des cellules pendant 10 minutes à 20 C puis est éliminé par lavage avec 5 ml de DMEM dépourvu de rouge phénol, puis avec 10 ml de tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Le marquage fluorescent membranaire est observé sur la Figure 12. Analyse quantitative du FRET entre la Cycle3-GFPRafCAAX et la sonde membranaire DiI par spectrofluorimétrie Des cellules Cos-7 cultivées dans deux boites de 20 cm2 de surface, transfectées ou non avec le plasmide GFP-RafCAAX sont décrochées de leur support par traitement à la trypsine/EDTA, puis marquées avec le Dil de la même façon que dans l'exemple 3 et placées dans une cuve de spectrofluorescence. La fluorescence des cellules transfectées est analysée entre 430 nm et 700 nm (bande passante de 7,5 nm), sous excitation à 398 nm (bande passante de 7,5 nm). On enregistre en parallèle et dans les mêmes conditions le spectre de fluorescence de cellules Cos-7 non transfectées. On calcule le spectre de différence entre les cellules transfectées et les cellules non transfectées (Figure 13, spectre L). Les cellules transfectées avec la Cycle3-GFP-RafCAAX et les cellules non transfectées sont transvasées dans des tubes de 15 ml et centrifugées pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de rotation de 1500 tours par minute. On élimine le surnageant par aspiration et on ajoute 1 ml de milieu de marquage composé obtenu selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 3. On incube les cellules dans le milieu de marquage pendant 10 minutes à 20 C sous agitation lente. On centrifuge les cellules pendant 5 minutes à 20 C à une vitesse de 1500 tours par minute, on élimine le surnageant par aspiration et on lave les cellules 2 fois avec 2 ml de Tampon Phosphate Salin. Les cellules transfectées et e les cellules non transfectées sont reprises dans 1 ml de PBS et analysées au spectrofluorimètre. On retranche au spectre de fluorescence des cellules transfectées, la contribution des cellules non transfectées (Figure 13, spectre M). On observe une forte diminution de la fluorescence de la Cycle3-GFP-RafCAAX en présence de Dil mais aussi l'apparition simultanée d'un signal caractéristique du Dil. La conjonction de la diminution de la fluorescence de la GFP avec l'apparition de la fluorescence du DiI est la preuve formelle de l'existence d'un FRET entre la protéine Cycle3-GFP-RafCAAX localisée à la membrane grâce à son motif famésyle et la sonde lipidique Dil, elle aussi localisée à la membrane. REVENDICATIONS 1/-Procédé de sélection d'agents, dits agents à tester, susceptibles d'être biologiquement actifs vis-à-vis d'un système cellulaire vivant en induisant un changement d'état biochimique d'un signal cellulaire à au moins deux états différents de la membrane cellulaire d'au moins une cellule vivante du système cellulaire vivant, dite cellule sensible, par utilisation d'un phénomène de couplage de luminescence entre au moins deux groupements photocomplémentaires, susceptible de générer et/ou de modifier au moins une émission lumineuse, dont au moins une propriété mesurable est spécifiquement dépendante de la distance séparant les groupements photocomplémentaires et est modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état, caractérisé en ce que : - on prépare un système cellulaire vivant contenant au moins une cellule sensible, - on introduit dans le système cellulaire ou on fait produire par le système cellulaire au moins un agent, dit agent intermédiaire marqué, choisi pour que, dans un premier état du signal cellulaire, cet agent intermédiaire marqué soit spécifiquement recruté à la membrane cellulaire d'au moins une cellule sensible, et pour que dans un deuxième état du signal cellulaire, cet agent intermédiaire marqué ne soit pas spécifiquement recruté par une membrane cellulaire de cellule sensible, ledit agent intermédiaire marqué étant marqué avec au moins l'un des groupements photocomplémentaires, dit premier luminophore, dans des conditions propres à préserver au moins sensiblement les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire, - on introduit dans le système cellulaire vivant au moins une composition d'au moins un composé, dit agent membranaire de couplage, apte à s'associer à une membrane cellulaire de cellule sensible et marqué avec au moins un groupement photocomplémentaire, dit deuxième luminophore, distinct du premier luminophore, et de telle sorte que les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis du signal cellulaire soient au moins sensiblement préservées et qu'au moins une propriété mesurable de l'émission lumineuse résultant du couplage de luminescence entre le premier et le deuxième luminophore soit sensiblement modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état, - on met le système cellulaire vivant ainsi préparé en présence d'une quantité de l'un des agents à tester, dit agent en test, on mesure au moins ladite propriété mesurable, et on détermine l'activité biologique de cette quantité de l'agent en test en fonction du résultat de cette mesure. 2/-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie par résonance. 3/-Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET). 4/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - une protéine bioluminescente naturelle ou mutée, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy&commat;, le Nile Red&commat;, le Texas Red&commat;, les chélates de terres rares, les indo et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. 5/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire. 6/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile choisi parmi les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les dérivés lipophiles de ces composés. 7/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est formé d'une protéine naturelle que l'on marque avec le premier luminophore. 8/-Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les agents à tester étant des agents susceptibles d'être actifs sur des récepteurs membranaires, on choisit, en tant qu'agent intermédiaire marqué, une protéine de transduction intracellulaire spécifique de l'état desdits récepteurs membranaires, ledit signal cellulaire étant un signal de transduction intracellulaire dont le premier état correspond au recrutement spécifique de la protéine de transduction à la membrane cellulaire, l'agent intermédiaire marqué étant formé de la protéine de transduction marquée par le premier luminophore, la protéine de transduction et le premier luminophore étant choisis pour que la protéine de transduction marquée présente au moins les fonctionnalités et le comportement de la protéine de transduction dans l'expression du signal de transduction intracellulaire par la (les) cellule (s) sensible (s). 9/-Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on réalise le marquage de la protéine de transduction par voie génétique en faisant exprimer par au moins une cellule sensible du système cellulaire vivant, une protéine de fusion formant la protéine de transduction marquée. 10/-Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on choisit la protéine de transduction parmi les protéines contenant des domaines (notamment les domaines PH ou FYVE) interagissant avec des lipides membranaires ; les protéines s'associant à la membrane plasmique par ancrage lipidique, notamment de type N-myristoylation, S-palmitoylation, S-prénylation ; les protéines associées aux récepteurs couplés aux protéines G ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine kinase intrinsèque ; les protéines STAT ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique sérine/thréonine kinase intrinsèque ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine phosphatase intrinsèque ; les protéines JAK associées aux récepteurs reconnaissant des cytokines correspondantes ; les protéines associées aux récepteurs à domaine TIR ou DD ; les protéines associées aux récepteurs reconnaissant des antigènes. 11/-Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est une protéine intégrale de la membrane plasmique dont un fragment peut être libéré sous l'action de protéases. 12/-Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est une protéine intracellulaire qui peut être transloquée vers la membrane d'organites intracellulaires. 13/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire marqué est formé d'un anticorps non naturellement natif, marqué avec le premier luminophore et adapté pour reconnaître spécifiquement un agent, dit agent de reconnaissance, qui est produit et associé à la membrane cellulaire dans un premier état du signal cellulaire et qui n'est pas produit ou non associé à la membrane cellulaire dans un deuxième état du signal cellulaire. 14/-Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine phosphorylée résultant d'une activité kinase membranaire induite. 15/-Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine déphosphorylée résultant d'une activité phosphatase membranaire induite. 16/-Procédé selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine membranaire dans une conformation spécifique au deuxième état du signal cellulaire. 17/-Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine ou un groupe de protéines liées par interaction protéinique membranaire induite ou un groupe d'au moins une protéine et d'au moins un lipide liés par interaction protéine-lipide membranaire induite. 18/-Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le système cellulaire vivant comprend au moins une cellule sensible eucaryote vivante. 19/-Système cellulaire vivant à l'exception d'un embryon humain, d'un corps humain ou d'un élément non isolé d'un corps humain, comprenant au moins une cellule vivante dont la membrane cellulaire incorpore au moins un composé, dit agent membranaire de couplage, marqué avec au moins un groupement, dit deuxième luminophore, photocomplémentaire d'au moins un autre groupement photocomplémentaire, dit premier luminophore, distinct du deuxième luminophore, dans un phénomène de couplage de luminescence susceptible de générer et/ou de modifier au moins une émission lumineuse dont au moins une propriété mesurable est spécifiquement dépendante de la distance séparant les groupements photocomplémentaires, l'agent membranaire de couplage étant associé à la membrane cellulaire en une quantité adaptée pour au moins sensiblement préserver les propriétés du système cellulaire vivant vis-à-vis d'un signal cellulaire à au moins deux états différents de la membrane cellulaire d'au moins une cellule vivante, dite cellule sensible, du système cellulaire vivant, et pour qu'au moins une propriété mesurable de l'émission lumineuse résultant du couplage de luminescence soit sensiblement modifiée lorsque le signal cellulaire change d'état, le premier luminophore marquant au moins un agent, dit agent intermédiaire marqué, adapté pour être spécifiquement recruté à la membrane cellulaire d'au moins une cellule sensible dans un premier état du signal cellulaire et pour ne pas être spécifiquement recruté par une membrane cellulaire de cellule sensible dans un deuxième état du signal cellulaire. 20/-Système cellulaire vivant selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'au moins une cellule sensible, dont la membrane cellulaire incorpore au moins un agent membranaire de couplage, contient une séquence d'ADN comprenant un gène codant pour une protéine, dite protéine intermédiaire, choisie pour être spécifiquement recrutée à la membrane cellulaire de la (des) cellule (s) sensible (s) lorsque le signal cellulaire est dans un premier état, et pour ne pas être recrutée par la membrane cellulaire de la (des) cellule (s) sensible (s) lorsque le signal cellulaire est dans un deuxième état, fusionné avec au moins un gène codant pour un premier luminophore, la fusion de ces gènes étant telle que : - lorsque le signal cellulaire est dans le premier état, une protéine de fusion, dite protéine intermédiaire marquée, formée de la protéine intermédiaire et du premier luminophore est exprimée par la (les) cellule (s) sensible (s) et recrutée à la membrane cellulaire, et fait office d'agent intermédiaire marqué, - lorsque le signal cellulaire est dans le deuxième état, aucune protéine intermédiaire marquée n'est recrutée par une membrane cellulaire de cellule sensible. 21/-Système selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que les premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie par résonance. 22/-Système selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que le premier et deuxième luminophores sont choisis pour réaliser un couplage de luminescence par transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET). 23/-Système selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est choisi parmi : - une molécule susceptible d'absorber la lumière émise par une protéine fluorescente, - une protéine fluorescente naturelle ou une protéine fluorescente mutée, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés d'une protéine fluorescente naturelle, cette protéine fluorescente mutée conservant la propriété de fluorescence, - une protéine bioluminescente naturelle ou mutée, - un fragment fluorescent issu d'une protéine fluorescente naturelle ou d'une protéine fluorescente mutée adapté pour présenter la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dont il est issu, - la fluorescéine, la rhodamine, le Bodipy&commat;, le Nile Red&commat;, le Texas Red&commat;, les chélates de terres rares, les indo et carbocyanines, le diphénylhexatriène, les dérivés aromatiques luminescents. 24/-Système selon l'une des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que l'un au moins des premier et deuxième luminophores est une protéine autofluorescente naturelle de cnidaire. 25/-Système selon l'une des revendications 19 à 24, caractérisé en ce qu'on utilise un agent membranaire de couplage comprenant un ligand lipophile choisi parmi les phospholipides, les acides gras, les glycérides, le cholestérol, les céramides, les amines grasses, les agents luminophores lipophiles ou les dérivés lipophiles de ces composés. 26/-Système selon l'une des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est formé d'une protéine naturelle que l'on marque avec le premier luminophore. 27/-Système selon la revendication 26, caractérisé en ce que les agents à tester étant des agents susceptibles d'être actifs sur des récepteurs membranaires, on choisit, en tant qu'agent intermédiaire marqué, une protéine de transduction intracellulaire spécifique de l'état desdits récepteurs membranaires, ledit signal cellulaire étant un signal de transduction intracellulaire dont le premier état correspond au recrutement spécifique de la protéine de transduction à la membrane cellulaire, l'agent intermédiaire marqué étant formé de la protéine de transduction marquée par le premier luminophore, la protéine de transduction et le premier luminophore étant choisis pour que la protéine de transduction marquée présente au moins les fonctionnalités et le comportement de la protéine de transduction dans l'expression du signal de transduction intracellulaire par la (les) cellule (s) sensible (s). 28/-Système selon la revendication 27, caractérisé en ce que la protéine de transduction est marquée par voie génétique en faisant exprimer par au moins une cellule sensible du système cellulaire vivant, une protéine de fusion formant la protéine de transduction marquée. 29/-Système selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que la protéine de transduction est choisie parmi les protéines contenant des domaines (notamment les domaines PH ou FYVE) interagissant avec des lipides membranaires ; les protéines s'associant à la membrane plasmique par ancrage lipidique, notamment de type N-myristoylation, Spalmitoylation, S-prénylation ; les protéines associées aux récepteurs couplés aux protéines G ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine kinase intrinsèque ; les protéines STAT ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique sérine/thréonine kinase intrinsèque ; les protéines associées aux récepteurs à activité enzymatique tyrosine phosphatase intrinsèque ; les protéines JAK associées aux récepteurs reconnaissant des cytokines correspondantes ; les protéines associées aux récepteurs à domaine TIR ou DD ; les protéines associées aux récepteurs reconnaissant des antigènes. 30/-Système selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est une protéine intégrale de la membrane plasmique dont un fragment peut être libéré sous l'action de protéases. 31/-Système selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire est une protéine intracellulaire qui peut être transloquée vers la membrane d'organites intracellulaire, notamment les mitochondries, le golgi, le réticulum endoplasmique. 32/-Système selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'agent intermédiaire marqué est formé d'un anticorps non naturellement natif, marqué avec le premier luminophore et adapté pour reconnaître spécifiquement un agent, dit agent de reconnaissance, qui est produit et associé à la membrane cellulaire dans un premier état du signal cellulaire et qui n'est pas produit ou non associé à la membrane cellulaire dans un deuxième état du signal cellulaire. 33/-Système selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine phosphorylée résultant d'une activité kinase membranaire induite. 34/-Système selon la revendication 32 caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine déphosphorylée résultant d'une activité phosphatase membranaire induite. 35/-Système selon la revendication 32, caractérisée en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine membranaire dans une conformation spécifique au deuxième état du signal cellulaire. 36/-Système selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance est une protéine ou un groupe de protéines liées par interaction protéinique membranaire induite ou un groupe d'au moins une protéine et d'au moins une protéine et d'au moins un lipide liés par interaction protéine-lipide membranaire induite. 37/-Système selon l'une des revendications 19 à 36 caractérisé en ce que le système cellulaire vivant comprend au moins une cellule sensible eucaryote vivante.