FR 2832154 A1 20030516 FR 0114549 A 20011109 OLIGONUCLEOTIDES INHIBITEURS ET LEUR UTILISATION POUR REPRIMER SPECIFIQUEMENT UN GENE. La présente invention concerne le domaine de l'investigation et du traitement génétiques de pathologies humaines, notamment les cancers ou les maladies infectieuses. Plus particulièrement, l'invention vise à offrir des moyens pour déterminer la fonction d'un gène ou d'une famille de gènes impliqués dans un processus cellulaire, et pour réprimer un gène nocif responsable d'une pathologie chez l'homme ou l'animal. L'invention se rapporte aux agents actifs pour la mise en oeuvre de ces méthodes et les compositions les contenant. On connaît dans l'art antérieur, des techniques d'oligonucléotides anti-sens permettant d'inhiber spécifiquement un gène dans les cellules de mammifères. Ces techniques sont basées sur l'introduction dans les cellules d'un court oligonucléotide d'ADN complémentaire du gène cible. Cet oligonucléotide induit la dégradation de l'ARN messager transcrit par le gène cible. Un autre mode d'action des anti-sens consiste à introduire dans la cellule un oligonucléotide d'ADN qui va former une triple hélice avec le gène cible. La formation de cette triple hélice réprime le gène soit en bloquant l'accès pour des protéines activatrices, soit dans des approches plus sophistiquées, en induisant la dégradation du gène. Aucune de ces approches ne semble s'appuyer sur un mécanisme cellulaire existant dans les cellules de mammifères, et elles se sont avérés peu efficaces. En effet, l'utilisation des anti-sens en clinique est réduite à quelques cas très rares, et il n'y a aucune utilisation possible des oligonucléotides formant triple hélice. La méthode de l'invention est basée sur l'interférence ARN désigné aussi RNA'inh ou RNAi ou encore co-suppression, qui a été mise en évidence dans les plantes. Chez les plantes, il a été observé que l'introduction d'un long ARN double brin, correspondant à un gène, induit la répression spécifique et efficace du gène ciblé. Le mécanisme de cette interférence comporte la dégradation de l'ARN double brin en courts duplex d'oligonucléotides de 20 à 22 nucléotides. Les Inventeurs ont maintenant montré que ce principe peut s'appliquer à des gènes de mammifères qui jouent un rôle important dans le contrôle du destin cellulaire. L'approche RNA'inh plus généralement dénommée selon l'invention oligonucléotides inhibiteurs ou ARNi s'appuie sur un mécanisme cellulaire dont l'importance est soulignée par son grand degré de conservation puisque ce mécanisme est conservé à travers les règnes et les espèces et a été montré non seulement chez la plante, mais aussi chez le vers Caenorhabditis Elegans et la levure et les mammifères, homme et souris. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont montré que cette approche est beaucoup plus efficace pour réprimer spécifiquement les gènes que les techniques envisagées dans l'art antérieur. En outre, elle réunit potentiellement les avantages des anti-sens et des anti-gènes. En effet, chez la plante, la co-suppression s'effectue au niveau post-transcriptionnel, sur l'ARN mature, mais aussi au niveau transcriptionnel, donc sur le gène lui-même. En effet, la répression se transmet de génération en génération et permettrait donc de réprimer un gène de façon prolongée voire définitive. L'invention à donc pour objet un oligonucléotide double brin caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences oligonucléotidiques complémentaires comprenant chacune à la même extrémité 3' ou 5'un à cinq nucléotides non appariés formant des bouts simples brins débordant de l'hybride, l'une desdites séquences oligonucléotidiques étant substantiellement complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène que l'on souhaite réprimer spécifiquement. Avantageusement les deux séquences oligonucléotidiques ont la même taille. Du fait de la loi d'appariement des bases, on désignera indistinctivement ci-après par oligonucléotide de l'invention, l'une ou l'autre des séquences de l'oligonucléotide double brin de l'invention qui est complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène qui peut donc être aussi simple ou double brin (s). On entend de façon générale par "oligonucléotide"un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de 5 à 50, nucléotides de type ribo-, désoxyribo-ou mixte. On préfère toutefois des oligoribonucléotides. En effet, les hybrides ARN-ARN sont plus stables que les hybrides ADN-ADN ou ADN-ARN et beaucoup plus stables que les acides nucléiques simples brins utilisés dans des stratégies anti-sens. La partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée et complémentaire de la séquence cible a de préférence une taille comprise entre 15 et 25 nucléotides et tout préférentiellement de 20 à 23 nucléotides. Les oligonucléotides doubles brins de l'invention comprennent de préférence à l'extrémité 3'de chaque brin de 1 à 5 nucléotides de préférence de 2 à 3 et tout préférentiellement 2 nucléotides débordant de l'hybride. Ces nucléotides débordant de l'hybride peuvent être ou non complémentaire de la séquence cible. Ainsi, dans une forme de réalisation particulière de l'invention, les nucléotides débordant de l'hybride sont des nucléotides quelconque par exemple des Thymines. On peut représenter un oligonucléotide double brin de l'invention de la façon suivante, où chaque tiret correspond à un nucléotide et où chaque brin comprend à son extrémité 3'deux thymines débordant de l'hydride : 5'-------------------TT3' 3'TT--------------------5' La séquence des oligonucléotides de l'invention est substantiellement complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène que l'on souhaite réprimer spécifiquement. Bien que l'on préfère des oligonucléotides parfaitement complémentaires de la séquence cible, on entend par substantiellement complémentaire, le fait que la séquence oligonucléotidique peut comprendre quelques nucléotides mutés par rapport à la séquence cible dès lors que les propriétés de répression du gène visé ne sont pas altérées. Ainsi, une séquence oligonucléotidique de l'invention peut comprendre de 1 à 3 nucléotides mutés. Ces nucléotides mutés peuvent donc être ceux débordant de l'hybride ou des nucléotides à l'intérieur de la séquence oligonucléotide. Ainsi un oligonucléotide de l'invention peut être un hybride parfait ou comprendre un ou plusieurs mismatch au sein du double brin. On préfère toutefois que la partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée soit parfaitement complémentaire de la séquence cible alors que les nucléotides débordant de l'hybride peuvent être quelconques et notamment des thymines. On entend ainsi également par parfaitement complémentaire le fait que l'oligonucléotide de l'invention soit complémentaire d'une séquence qui appartient à un ADN ou ARN d'un gène muté. Les oligonucléotides de l'invention peuvent permettre ainsi de discriminer entre la séquence du gène sauvage et du gène muté ce qui peut présenter un intérêt particulier tant dans l'analyse des gènes que dans les utilisations thérapeutiques des oligonucléotides de l'invention. Les oligonucléotides de l'invention sont généralement constitués de bases nucléotidiques naturelles (A, T, G, C, U), mais peuvent aussi comprendre des nucléotides modifiés ou des nucléotides portant des groupements réactifs ou des agents de pontage ou agents intercalant pouvant réagir avec la séquence cible complémentaire à l'oligonucléotide. Les oligonucléotides de l'invention peuvent être préparés par les méthodes conventionnelles de synthèse chimique ou biologique des oligonucléotides. L'invention envisage aussi les oligonucléotides couplés à des substances favorisant ou permettant leur pénétration, le ciblage ou l'adressage dans les cellules, il peut s'agit de lipides, de protéines, polypeptides ou peptides. En effet, les oligonucléotides de l'invention sont destinés à être internalisés dans les cellules et avantageusement dans certains cas, jusque dans le noyau des cellules, où ils vont interagir avec des molécules d'acide nucléiques portant la séquence cible de l'oligonucléotide. Les oligonucléotides de l'invention sont utiles pour réprimer de manière très efficace et très spécifique un gène ou un ensemble de gènes impliqué dans le contrôle de la balance prolifération/différenciation et donc pour le traitement de nombreuses pathologies humaines comme les cancers. Ils constituent aussi un outil de recherche pour l'investigation et la compréhension de la fonction de gènes. L'invention à donc pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un oligonucléotide ou un ensemble de nucléotides différents et l'utilisation de ces oligonucléotides, seuls ou couplés à des substances de transport, comme médicament. Les oligonucléotides de l'invention et les compositions les contenant sont utiles pour le traitement ou la prévention des cancers et plus généralement des maladies oncologiques, en particulier celles dans lesquelles un gène muté ou transloqué s'exprime comme : PML-RAR, PLZF-RAR, BCR-Abl, Ras muté, p53 muté, WT1 muté, Récepteur androgène muté, récepteur oestrogène muté, récepteur somatostatine muté, récepteurs de facteurs de croissance mutés, ainsi que celles où une réactivation de l'activité enzymatique de la télomérase est observée. Les oligonucléotides de l'invention et les compositions les contenant sont aussi utiles pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses ou virales, en particulier le SIDA, les maladies infectieuses non conventionnelles, en particulier ESB et Kreutzfeld Jacob. Les oligonucléotides de l'invention et les compositions les contenant sont encore utiles pour le traitement ou la prévention des maladies liées à une hypervascularisation comme la dégénérescence maculaire liée à l'age, l'angiogénèse tumorale, les rétinopathies diabétiques, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde. Les oligonucléotides de l'invention peuvent être mis en oeuvre dans des applications ex vivo par exemple lors de greffe ou pour le traitement de certaines leucémies. Ainsi, les oligonucléotides peuvent être soit transfectés dans des cellules, notamment tumorales, qui seront ensuite injectées soit injectés dans les tissus par exemple des tumeurs déjà développées, par exemple par voie locale, systémique ou aérosols etc, avec agents de vectorisation éventuellement nécessaires. Les oligonucléotides seront utilisés à des concentrations suffisantes en fonction de l'application et de la forme d'administration utilisée avec des excipients pharmaceutiques appropriés. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de montrer que ces oligonucléotides sont particulièrement adaptés pour réprimer des gènes nocifs impliqués dans la cancérisation et tout particulièrement à ceux conduisant à la formation de protéine de fusion dans les cellules cancéreuses, comme la protéine de fusion PML-RAR. En conséquence, l'invention se rapporte tout particulièrement à des oligonucléotides dont la séquence est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène résultant d'une translocation chromosomique de façon à inhiber les effets de la protéine de fusion exprimée par ce gène. Le fait de cibler avec un oligonucléotide de l'invention, la jonction entre deux gènes, par exemple les deux gènes pml et rara, permet d'aboutir à l'inhibition spécifique de la protéine de fusion sans affecter le rôle biologique des protéines naturelles qui peuvent être codées par le second allèle. Cette forme de mise en oeuvre de l'invention englobe donc toutes les protéines de fusion impliquées dans la cancérogénèse, particulièrement les leucémies. Une liste non exhaustive des protéines de fusion qui peuvent être ciblées avec les oligonucléotides de l'invention est donnée dans le tableau des annexes A, B et C. Les formes réciproques si elles existent, ainsi que tous les variants des protéines de fusion citées en annexe constituent également des cibles de l'invention. L'invention concerne donc tout particulièrement, l'utilisation des oligonucléotides comme défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des maladies résultant de l'expression d'une protéine de fusion, tout particulièrement dans les cancers. Les thérapies anti-cancéreuses actuelles prennent pour cible les cellules cancéreuses, par différentes approches, prises isolément ou combinées entre elles (chimiothérapie, chirurgie, radiothérapie, immunothérapie). Les échecs thérapeutiques sont massivement dus soit à des cellules n'ayant pas été atteintes par le traitement soit, et majoritairement, à des cellules ayant muté en réponse au traitement. Cette capacité de mutation est grandement facilitée par l'instabilité génétique des cellules tumorales. L'inhibition de la vascularisation tumorale, privant les cellules d'oxygène et de nutriments, a depuis quelques années ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques en cancérologie. Cette stratégie, complémentaire des précédentes, prend pour cible la cellule endothéliale normale de l'hôte, génétiquement stable, et donc théoriquement peu susceptible de muter. De nombreux essais cliniques visant à inhiber l'angiogénèse tumorale par différentes approches sont en cours dans le monde. Cependant, les premiers résultats rapportés semblent assez décevants. Les Inventeurs ont démontré que des tumeurs sont capables de compenser les effets d'inhibiteurs de l'angiogénèse, en sélectionnant des sous-populations de cellules sécrétant de fortes concentrations de facteurs pro angiogéniques. Les tumeurs ne sont pas constituées de cellules homogènes quant à leur expression génique. Ceci est attesté par de très nombreuses études dans lesquelles des immunomarquages ont été réalisés pour une grande variété d'antigènes dans les tumeurs. Macroscopiquement, une tumeur est fréquemment composée de régions hautement vascularisées côtoyant des zones de nécrose ou au contraire avasculaires. Cette hétérogénéité tumorale favorise l'échappement des tumeurs aux traitements appliqués, quelle qu'en soit la nature. Plus la diversité de l'expression génique dans une tumeur est grande plus la probabilité qu'il existe au moins une cellule capable de résister à un agent anti-tumoral est en effet élevée. Il apparaît dès lors essentiel d'associer différentes stratégies afin de réduire tout d'abord l'hétérogénéité tumorale et d'éviter les phénomènes d'échappement. Les oligonucléotides de l'invention présentent plusieurs avantages par rapport aux agents chimiothérapeutiques classiques : - ils constituent des composés naturels, aucune réaction immunologique ou d'intolérance médicamenteuse n'est a priori à craindre. - Les expériences de transfections réalisées dans le cadre de l'invention montrent une bien meilleure pénétration des RNAi dans les cellules tumorales que celle obtenue avec des plasmides. Ce point est essentiel dans le cas de cellules tumorales qui sont généralement très difficiles à transfecter. - Les hybrides ARN-ARN sont plus stables que les hybrides ADN-ADN ou ADN-ARN et beaucoup plus stables que les acides nucléiques simples brins utilisés dans des stratégies anti-sens. - Il est aisé de mélanger plusieurs RNAi entre eux afin de prendre pour cibles plusieurs gènes cellulaires en même temps. Un traitement anti-cancéreux idéal doit entraîner la mort de la cellule tumorale tout en évitant les phénomènes de résistance. La mort cellulaire peut être obtenue par : - Induction de l'apoptose des cellules tumorales, - Induction de la sénescence, - Induction de la nécrose, - Induction de la différenciation. Ainsi, l'invention s'intéresse tout particulièrement à un oligonucléotide ou un ensemble d'oligonucléotides différents, comportant chacun une séquence oligonucléotidique complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène dont la répression induit l'apoptose, ou la sénescence, ou la nécrose, ou la différenciation des cellules tumorales ou plusieurs de ces phénomènes. L'induction de l'apoptose des cellules tumorales est basée sur le fait que la fonction de nombreux gènes cellulaires est de protéger les cellules de l'apoptose. La perte d'expression de ces gènes induite par RNAi permet donc le passage en apoptose. La mort cellulaire peut également être provoquée par la perte d'adhésion des cellules à la matrice (anoïkis). Cet effet peut être obtenue en perturbant la balance entre protéases et inhibiteurs de protéases dans les tumeurs et leur environnement stromal. Cette perturbation a par ailleurs pour effet de diminuer les capacités des cellules tumorales à envahir les tissus sains et à se métastaser. L'induction de la sénescence repose sur le fait que les cellules normales ne peuvent se diviser qu'un nombre limité de fois. Ce nombre est programmé, environ 50 divisions par exemple pour des fibroblastes embryonnaires, et"mesuré"par la longueur des télomères qui se raccourcit au fur et à mesure des divisions cellulaires. En deçà d'une certaine taille, les télomères ne sont plus fonctionnels et la cellule, incapable de se diviser, entre en sénescence. Dans les cellules germinales cependant, cette longueur est maintenue constante par l'action d'une enzyme, la télomérase. La télomérase est ré-exprimée dans de nombreux cancers, ce qui permet aux cellules tumorales de se multiplier indéfiniment. Un RNAi bloquant l'expression de la télomérase serait sans conséquence sur les cellules somatiques normales et devrait conduire les cellules tumorales vers la sénescence. Le blocage de la division cellulaire conduit également les cellules à la sénescence. Ce blocage peut être obtenu en inhibant des récepteurs cellulaires essentiels. Ces récepteurs peuvent appartenir suivant la nature de la cellule soit à la classe des récepteurs des facteurs de croissance (EGF, SST2, PDGF, FGF notamment), que ceux-ci soient ou non mutés, soit à celle des récepteurs nucléaires d'hormones (androgènes, oestrogènes notamment). L'induction de la nécrose résulte du besoin des cellules tumorales en oxygène et en nutriments. Initialement une tumeur assure son développement à partir des vaisseaux préexistants de l'hôte. Au-delà de 1 à 2 mm de diamètre, les cellules situées au centre de la tumeur se trouvent en hypoxie. Cette hypoxie, par l'intermédiaire d'une proline hydroxylase, entraîne la stabilisation du facteur de transcription Hif1a qui, en se fixant sur des séquences HRE dans les promoteurs de ses gènes cibles, déclenche la réaction hypoxique. Cette réaction conduit à l'activation d'une centaine de gènes permettant d'activer notamment la voie de la glycolyse anaérobie, la réponse au stress et l'angiogénèse. Ce dernier mécanisme active en particulier le gène du VEGF, principal facteur angiogénique tumoral. Ainsi des oligonucléotides selon l'invention bloquant par exemple l'expression du facteur de transcription Hifla ou par exemple celle du VEGF mettent les cellules tumorales dans l'incapacité à monter une réponse hypoxique ou angiogénique. L'angiogénèse est un mécanisme normalement réprimé chez l'adulte à l'exception du cycle menstruel (utérus ovaires). L'inhibition de ce mécanisme a donc peu de conséquences pour les tissus normaux. L'induction de la différenciation est basée sur le fait que dans certains cas, et notamment dans des leucémies, les cellules tumorales sont maintenues en état de prolifération par défaut de différenciation. C'est par exemple le cas dans de nombreuses leucémies ou une surexpression du gène suppresseur de tumeur WT1, sous sa forme sauvage ou sous diverses formes mutées maintient les cellules en division. C'est également le cas dans des leucémies ou une protéine de fusion anormale entre deux gènes est exprimée (voir l'exemple des leucémies à PMLRAR). D'une manière générale, les oligonucléotides de l'invention peuvent être complémentaires d'une séquence cible portant ou non une mutation. L'invention a donc tout particulièrement pour objet une association d'oligonucléotides comme définis précédemment complémentaire chacun d'une séquence cible différente pour traiter en même temps une tumeur par des approches différentes et complémentaires. En particulier, une telle association selon l'invention permet de réprimer un ensemble de gènes et de permettre une inhibition de l'angiogénèse tumorale ou de la réponse hypoxique des cellules avec une induction de la sénescence ou un blocage de la division ou de la migration cellulaire. De même, l'induction de la différenciation cellulaire peut être associée à l'induction de l'apoptose. Ainsi, l'invention concerne : - l'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un mélange d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de croissance ou un récepteur de facteur de croissance pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de cancers résultant de l'expression desdits facteurs de croissance comme l'angiogénèse tumorale. - L'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un récepteur d'un androgène ou oestrogène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des carcinomes prostatiques, mammaires ou ovariens. - L'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de transcription pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers capable de se développer dans des conditions de forte anoxie. - L'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant la télomérase ou un gène protecteur d'apoptose pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers. - L'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour une protéase ou un inhibiteur de protéase impliqué notamment dans l'invasion tumorale ou l'extravasation d'une cellule métastatique dans un tissu à distance de la tumeur primaire pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers. - L'utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène impliqué dans la capacité des cellules tumorales à se métastaser pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers. Comme indiqué précédemment, l'invention vise tout particulièrement, un ensemble d'oligonucléotides différents comme définis dans chacune des applications cidessus pour la préparation d'un médicament destiné à un traitement large des cancers ou de plusieurs pathologies en même temps. Les oligonucléotides de l'invention sont aussi utiles à des fins de recherche ou de diagnostic notamment in vitro. En effet, les RNA'inh peuvent être utilisés pour faire de la génétique reverse quelle qu'en soit l'échelle et l'application, en diagnostique ou à visée de recherche. Par exemple, ils peuvent être utilisés notamment pour : - identifier les molécules impliquées dans la prolifération des cellules normales ou cancéreuses, - identifier les molécules impliquées dans les voies de transduction des signaux, - identifier les molécules impliquées dans l'expression des gènes, - identifier les molécules impliquées dans la résistance des cellules tumorales aux drogues, - identifier les molécules impliquées dans la migration et la motilité cellulaire, - discriminer entre les molécules résultant d'un épissage alternatif, Pour cela, les RNA'inh correspondant aux messagers codant pour les molécules candidates, sous leur version normale ou mutée, ou pour l'ensemble des gènes d'un organisme, en particulier l'homme, peuvent être déposés dans des plaques avec l'agent de pénétration adéquat. Les cellules d'intérêt sont déposées dans les puits avec, suivant les cas, un vecteur reporter ou un autre produit nécessaire au test. La prolifération, la transduction du signal, la migration cellulaire, l'activité du gène, le relarguage des drogues ou tout autre phénomène, est mesuré avec les méthodes adéquates. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant : - Exemple 1 : inhibition de la protéine PMLRAR (X associée à la leucémie aiguë promyélocytaire (APL) résultant de la translocation t (15 ; 17) sur le chromosome 15, - Exemple 2 : inhibition de l'angiogénèse tumorale. - Exemple 3 : inhibition des récepteurs des androgènes dans des cellules de carcinome prostatique. - Exemple 4 : Inhibition de la réponse hypoxique. - Exemple 5 : inhibition de la protéine Suv39h dans des cellules myoblastiques ayant la capacité de se différencier en myotubes. Il est fait référence dans la description de la présente invention et des exemples ci-après aux annexes et figures en annexe dans lesquelles : Les annexes A, B et C sont une liste non exhaustive des protéines de fusion qui peuvent être ciblées avec les oligonucléotides de l'invention. Pour l'exemple 1 : La figure 1 est une représentation schématique des protéines RARa, PML et de la protéine de fusion associée, PML-RARa. La figure 2 montre l'effet d'un oligonucléotide de l'invention sur des cellules NB4. A : En absence d'électroporation des cellules NB4 et en absence de traitement par l'acide rétinoïque, le RAR (vert) montre un marquage microponctué uniforme. La protéine PML (rouge) possède également un marquage microponctué qui colocalise avec celui de RARa (overlay jaune). Cette colocalisation correspond à la protéine de fusion PML-RARa. En présence de 10-6 M d'acide rétinoïque, PML se relocalise dans des structures ponctiformes plus grosses appelées corps nucléaires. Le marquage rouge de ces structures n'est pas colocalisé avec celui de RARa, ce qui démontre la dégradation de la protéine de fusion en présence de forte concentration d'acide rétinoïque. B : Dans les cellules ayant reçu le RNA'inh contrôle, la localisation des protéines PML (rouge) et RARa (vert) est identique au marquage obtenu en absence d'acide rétinoïque. Le marquage jaune montre la présence de la protéine de fusion PML-RARa. Dans les cellules qui ont reçu le RNA'inh PML-RAR, PML (rouge) est relocalisée dans les corps nucléaires. L'absence de colocalisation (overlay) montre la dégradation de la protéine de fusion PML-RARa. La figure 3 représente des cellules NB4 électroporées avec l'oligonucléotide contrôle ou avec l'oligonucléotide PML-RAR. Quatre jours après l'électroporation, les cellules sont déposées sur lamelles, fixées et perméabilisées. La présence du marqueur Cd11c est détectée avec un anticorps spécifique et révélé en vert. Les images sont obtenues au microscope confocal. Pour l'exemple 2 : La figure 4 représente l'immunodétection du VEGF dans des cellules cJ4 ou LNCaP transfectées par le RNAi contrôle (gauche) ou le RNAi VEGF (droite). La figure 5 représente la quantification du VEGF dans le milieu conditionné des cellules cJ4 transfectées par le RNAi contrôle ou le RNAi VEGF, 4 et 6 jours après transfection. La figure 6 montre l'évolution du volume tumoral chez les souris injectées avec 106 cellules cj4 non transfectées, transfectées par le RNAi contrôle ou RNAi VEGF. La figure 7 montre l'aspect des tumeurs au jour 7 après injection des cellules. Pour l'exemple 3 : La figure 8 représente la mesure de l'activité d'un reporter 4xARE-luciferase au R1881 dans divers clones de la lignée LNCaP non transfectés ou transfectés par le RNAi contrôle ou le RNAi AR. Pour l'exemple 4 : La figure 9 représente la mesure de l'activité d'un reporter VEGF-Luciferase en réponse à l'hypoxie dans les cellules cJ4 non transfectées, transfectées par le RNAi contrôle ou par le RNAi AR. Pour l'exemple 5 : La figure 10 représente : a : Des cellules en croissance exponentielle ont été transfectées avec les RNA'inh indiqués et un PCMV-GFP. L'expression de Suv39h a été suivie par immunofluorescence. b : les cellules ont été transfectées avec un RNA'inh Suv39h couplé à la fluorescéine, et observées au microscope 18 h après. c : les cellules ont été transfectées comme en a, et la protéine Suv39h a été immunoprécipitée au moyen d'un anticorps spécifique et son activité histone méthyl transférase mesurée par une technique radioactive. d : et e : les cellules ont été transfectées comme en a, et le niveau de RNA messager Suv39h a été mesuré par RT PCR et analysé sur gel (d) et quantifié par rapport à un contrôle interne, la GAPDH. e : les cellules ont été transfectées comme en a, et la tubuline a a été marquée par immunofluorescence. EXEMPLE 1 : INHIBITION DE LA PROTEINE PML-RARa ASSOCIEE A LA LEUCEMIE AIGUË PROMYELOCYTAIRE (APL). I-Introduction. La leucémie aiguë promyélocytaire (APL) est due à la translocation t (15 ; 17) sur le chromosome 15. Chez les patients atteints, le récepteur de l'acide rétinoïque RARa (RARa) est fusionné à la protéine PML (promyel ocyti c leukemia protein) générant ainsi la protéine de fusion PML- RAR (X. Jusqu'à ce jour, cinq protéines de fusion mettant en jeu le RARa ont été identifiées. Tous ces types de leucémies impliquent le récepteur RARa et sont cliniquement similaires, ce qui suggère que la rupture de la voie de transduction de l'acide rétinoïque est cruciale dans la pathogenèse des leucémies APL. La protéine de fusion PML-RARa a gardé les domaines de liaison à l'ADN et à l'acide rétinoïque du RARa. Il a été montré que la protéine de fusion PML-RARa réprime l'expression des gènes cibles de l'acide rétinoïque et provoque ainsi le blocage de la différenciation des cellules promyélocytaires. Seule l'administration de doses pharmacologiques d'acide rétinoïque permet la levée de la répression transcriptionnelle exercée par PML-RARa et la reprise de la différenciation cellulaire. En outre, la portion protéique PML de la protéine de fusion pourrait également intervenir dans le mécanisme du blocage de la voie de transduction par l'acide rétinoïque. Dans la mesure où PML fonctionne comme un inhibiteur de croissance et un agent apoptotique et qu'elle est nécessaire pour l'expression de certains gènes induit par l'acide rétinoïque, l'effet dominant négatif de PML-RARa sur PML pourrait permettre aux cellules d'acquérir une capacité de croissance, une résistance à l'apoptose et un arrêt de la différenciation. Des études de biologie cellulaire sur PML ont montré que cette protéine possède une localisation particulière dans le noyau, dans des structures particulières appelées corps nucléaires. Il semble que le rôle de ces structures soit en relation directe avec le rôle antioncogène de PML. Dans les cellules malignes APL, la protéine PML-RARa provoque, par hétérodimérisation avec PML, la délocalisation de PML des corps nucléaires vers des structures microponctuées pouvant correspondre à des sites d'ancrage de PML-RARa sur la chromatine. Cette délocalisation pourrait bloquer la fonction pro-apoptotique de PML et son rôle dans la différenciation myéloïde. Plusieurs équipes ont montré que le traitement combiné à l'acide rétinoïque et à l'AS203 sur des lignées cellulaires qui expriment la protéine de fusion PML-RARa permet la dégradation des protéines de fusion en même temps qu'une relocalisation de PML sur les corps nucléaires. Cette réorganisation des corps nucléaires restaure les fonctions de PML et contribue à la reprise de la différenciation. Finalement, la protéine chimère PML-RARa aurait donc un double effet dominant négatif, sur RARa et sur PML, en permettant à la fois aux cellules d'échapper à l'apoptose et de bloquer la différenciation des promyélocytes ainsi transformés. Plus de 98% des patients atteints par la leucémie APL présentent la translocation t (15 ; 17) (q22 ; q21) qui conduit à la formation de gènes fusionnés PML-RARaet RARa-PML. Il existe deux sous-types de protéines de fusion PML-RARa, les fusions S (short) et L (Long). La forme longue de la protéine de fusion PML- RARa correspondant à une protéine de 955 acides aminés représente la forme majoritairement exprimée et a donc été prise comme modèle dans cette étude (Annexes A, B et C). Cette protéine comporte les acides aminés 1 à 552 de la protéine PML fusionnés avec les acides aminés 59 à 462 du récepteur a de l'acide rétinoïque (RARa). II-Préparation et administration des oligonucléotides. Deux oligonucléotides RNA complémentaires correspondant à la séquence de la jonction du gène de la protéine de fusion, soit 10 nucléotides du gène PML et 10 nucléotides du gène RARa ont été synthétisés (Figure 1). Ces oligonucléotides ont été hybridés et l'obtention de l'oligonucléotide double-brin a été vérifiée sur gel d'acrylamide. Les Séquences des oligonucléotides RNA'inh PMLRAR et contrôle utilisés (5'-3') sont données ci-dessous : PML-RAR : Fw : cggggaggcaccauugagacctt (SEQ ID NO. 1) Rev : ggucucaauggugccuccccgtt (SEQ ID NO. 2) Contrôle : Fw : gcucauucagccauugagacctt (SEQ ID NO. 3) Rev : ggucucaauggcugaaugagctt (SEQ ID NO. 4) Les oligonucléotides ont été introduits par électroporation (capacitance 960 l1F, voltage 250V, 5 millions de cellules) dans des cellules humaines NB4. Cette lignée cellulaire est issue de patients atteints d'APL, avec la translocation et contient la protéine de fusion PML-RARa. Après 48 heures, les cellules sont déposées sur lamelles, fixées, perméabilisées et les protéines PML et RARa sont révélées par des anticorps spécifiques anti-PML et anti RARa. La visualisation des protéines spécifiques est réalisée à l'aide d'un microscope confocal (Figure 2). III-Résultats. Les résultats donnés à la figure 2 démontrent qu'en présence de l'oligonucléotide RNA'inh PML-RAR, la protéine de fusion est dégradée. Cette dégradation est spécifique de l'oligonucléotide incorporé puisque la protéine de fusion n'est pas dégradée avec l'oligonucléotide contrôle. Dans la mesure où la protéine de fusion provoque un arrêt de la différenciation, nous avons testé l'effet des oligonucléotides sur la différenciation en utilisant le marqueur de la différenciation Cdllc. Il a été montré que Cdllc correspond à un marqueur tardif de la différenciation. Nous avons observé en immunofluorescence les cellules NB4 4 jours après l'électroporation avec les RNA'inh. En présence de l'oligonucléotide contrôle, le marquage correspondant à Cdllc (vert) est indétectable. En présence de l'oligonucléotide PML-RAR, le marquage spécifique de Cd11c est parfaitement détectable, ce qui montre que les cellules ont repris leur programme de différenciation. EXEMPLE 2 : INHIBITION DE L'ANGIOGENESE TUMORALE. I-Introduction. Le VEGF (vascular endothelial growth factor) est l'un des plus puissants facteurs angiogéniques identifiés. Ces facteurs sont surexprimés dans de nombreuses situations d'hypervascularisation pathologiques et notamment dans le développement tumoral. L'inhibition de cette angiogénèse permet de bloquer la croissance tumorale. Notre procédé a pour but d'inhiber l'angiogénèse tumorale en bloquant l'expression de l'un de ces facteurs angiogéniques et dans cet exemple celui du VEGF par les cellules tumorales. II-Préparation et administration des oligonucléotides. Deux oligonucléotides RNA, complémentaires d'une région de la séquence codante du VEGF humain, conservée chez le rat et la souris ont été synthétisés. Deux déoxynucléotides (TT) ont été ajoutés en 3' - Séquence des RNAi VEGF : 5'[AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA] RNA - TT [DNA] (SEQ ID NO. 5) 5'[UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 6) - Séquence des RNAi contrôle : 5'[CAUGUCAUGUGUCACAUCUC] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 7) 5'[GAGAUGUGACACAUGACAUg] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 8) Ces oligonucléotides ou des oligonucléotides contrôle, dont la séquence ne présente aucune homologie avec les séquences répertoriées dans les bases de données, ont été hybridés et transfectés en utilisant le kit polyfect (Qiagen) dans des cellules d'un fibrosarcome de rat (cJ4) ou dans les cellules humaines du carcinome prostatique LNCaP. III-Résultats. 1) Immunodétection du VEGF. 48h après transfection, une immunofluorescence indirecte a été réalisée pour détecter l'expression de la protéine dans les cellules. La figure 4 montre une inhibition massive de l'expression du VEGF. 2) Quantification du VEGF sécrété. Pour quantifier cet effet, un dosage du VEGF dans des cellules cJ4 transfectées en parallèle avec le RNAi contrôle ou avec le RNAi VEGF a été effectué par ELISA (quantikine, R & D). Les cellules ont été incubées 48h avant le dosage dans un milieu contenant 1% de sérum. Le dosage a été réalisé 4 jours et 6 jours après la transfection. Dans ces conditions, la figure 5 montre une inhibition de la sécrétion de VEGF de 85% à 4jours et de 75% à 6 jours dans les cellules transfectées avec le RNAi VEGF comparé à celles transfectées avec le RNAi contrôle. 3) Croissance tumorale in vivo. 3 jours après transfection, trois groupes de 4 souris nudes femelles de 4 semaines ont été injectés en sous cutané à raison de un million de cellules par souris : Le premier groupe a été injecté avec des cellules non transfectées, le second avec des cellules transfectées par le RNAi contrôle, le troisième par des cellules transfectées avec le RNAi VEGF. Aucune sélection des cellules transfectées n'a été effectuée avant l'injection. La croissance tumorale a été suivie en mesurant trois fois par semaine le volume des tumeurs. Les figures 6 et 7 ne montrent aucune différence significative entre les tailles des tumeurs des groupes A et B. Une très forte réduction du volume tumoral est observée dans le groupe C. EXEMPLE 3 : Inhibition des récepteurs des androgènes dans des cellules de carcinome prostatique. I-Introduction. Les carcinomes prostatiques sont la deuxième cause de mortalité par cancer pour les hommes dans les pays industrialisés. En France, ils sont la cause de plus de 9500 morts par an. Les cellules épithéliales prostatiques sont dépendantes des androgènes pour leur croissance. Les carcinomes prostatiques sont initialement androgénodépendants. Une castration chimique permet dans un premier temps de bloquer la croissance du carcinome. Cependant dans tous les cas, ces carcinomes deviennent androgénoindépendants et leur pronostic est alors très pessimiste. Cette androgéno-indépendance est le plus souvent due, suivant les individus, à une mutation du récepteur (lui conférant par exemple une réponse aux oestrogènes ou aux glucocorticoïdes) ou à une amplification du récepteur. La stratégie selon l'invention a pour but de bloquer à l'aide de RNAi l'expression du récepteur des androgènes dans les carcinomes. Pour traiter les carcinomes avant qu'ils ne soient devenus résistants ou ceux qui le sont devenus par amplification du récepteur sans mutation, nous utiliserons des RNAi homologues d'une région non mutée. Pour traiter spécifiquement les carcinomes prostatiques androgéno-résistants par mutation, un séquençage de l'ARNm codant pour le récepteur sera effectué dans les cellules du patient afin de concevoir une séquence spécifique de la mutation, permettant de traiter le patient sans conséquence pour les cellules normales. II-Préparation et administration des oligonucléotides. Deux oligonucléotides RNA, complémentaires d'une région de la séquence codante du récepteur androgène (AR) non muté humain, ont été synthétisés. Deux déoxynucléotides (TT) ont été ajoutés en 3'. - Séquence des RNAi AR 5'[GACUCAGCUGCCCCAUCCACG] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 9) 5'[CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 10) - Séquence des RNAi contrôle 5'[GAUAGCAAUGACGAAUGCGUA] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 11) 5'[UACGCAUUCGUCAUUGCUAUC] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 12) Plusieurs sous-clones de la lignée de carcinome prostatique humaine LNCaP ont été utilisés dans cette étude. La lignée originale est androgéno-sensible. Les cellules LN70, obtenue par passages répétés de la lignée LNCaP in vitro ont une diminution de leur réponse aux androgènes. Le clone LNS5, obtenu après passage des cellules chez l'animal, est androgéno-résistant. III-Résultats. Le niveau de réponse aux androgènes a été mesuré en transfectant les différents clones cellulaires avec un vecteur reporteur plaçant la séquence codante de la luciférase en aval d'un promoteur minimal flanqué de 4 répétitions de l'élément de réponse aux androgènes (4xARE). Après transfection, les cellules ont été incubées pendant 18h en absence de sérum et en présence d'un analogue métaboliquement stable de la dihydro testostérone, le R1881 (NEN). 1) Inhibition de la réponse aux androgènes. Nous avons mesuré l'effet de la cotransfection dans ces cellules du RNAi contrôle ou du RNAi AR sur la réponse aux androgènes des différents clones de la lignée LNCaP. La figure 8 montre une inhibition complète de la réponse aux androgènes dans les deux clones sensibles aux androgènes : LNCaP et LNCaP p70. Cette méthode ne permet de mesurer la réponse du clone LNS5, androgénorésistant au traitement par le RNAi AR. L'effet du traitement par les RNAi sur la croissance des cellules prostatiques, est quantifié à l'aide du kit WST1 (Roche) pour les différents clones androgéno-sensibles ou-résistants de la lignée LNCaP ainsi que d'autres cellules de carcinome prostatique androgénorésistant (cellules DU145 ou PC3) 2) Etude in vivo. Les cellules LNS5 ont été injectées chez des souris nudes mâles de 4 semaines en sous-cutané. L'objectif est d'injecter dans les tumeurs déjà développées des RNAi contre le récepteur androgène, seuls ou associés à des RNAi contre le VEGF, ce facteur de croissance étant surexprimé dans les carcinomes prostatiques humains, carcinomes dont la croissance est strictement dépendante de l'angiogénèse. EXEMPLE 4 : INHIBITION DE LA REPONSE HYPOXIQUE. I-Introduction. Certaines tumeurs sont capables de se développer dans des conditions de forte anoxie. On observe très fréquemment dans les tumeurs des régions très peu vascularisées. Cette faible sensibilité à l'hypoxie a deux conséquences : d'une part un traitement anti-angiogénique a peu de chances d'être efficace sur ces tumeurs ou ces sous populations tumorales. D'autre part, cette faible vascularisation rend difficile la délivrance de molécules thérapeutiques. Le facteur de transcription Rifla régule l'activité de plus de 100 gènes permettant la réponse hypoxique. L'inhibition de ce facteur de transcription dans les tumeurs hypoxiques a pour but de bloquer leur croissance. II-Préparation des oligonucléotides. - RNAi Hif1a 5' [UAUGUGACCAUGAGGAAAUGA] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 13) 5'[UCAUUUCCUCAUGGUCACAUG] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 14) - RNAi contrôle 5' [GAUAGCAAUGACGAAUGCGUA] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 15) 5' [UACGCAUUCGUCAUUGCUAUC] RNA-TT [DNA] (SEQ ID NO. 16) III-Résultats. 1) Inhibition de la réponse hypoxique sur des cellules cJ4. Le promoteur du VEGF contient un élément de réponse au facteur de transcription Hifl (x. Pour tester in vitro l'effet d'un RNAi dirigé contre Hifla, nous avons transfecté des cellules cJ4 avec un vecteur reporter VEGFluciférase, seul ou en association avec un RNAi Rifla ou contrôle. 24h après transfection, les cellules ont été incubées pendant 18h en milieu sans sérum, additionné ou non de chlorure de Cobalt 100 M afin de produire des conditions hypoxiques puis l'activité luciférase a été mesurée. La figure 9 montre une inhibition complète de l'induction de la réponse du promoteur VEGF à l'hypoxie a été observée lorsque les cellules sont transfectées avec le RNAi Rifla mais pas avec le RNAi contrôle. 2) Expérience in vivo. Des cellules du glioblastome C6, qui présentent la caractéristique de se développer dans des conditions hypoxiques ont été injectées en sous cutané chez des souris nudes. Les RNAi Hifla ou contrôle sont injectés dans les tumeurs. EXEMPLE 5 : INHIBITION DE LA PROTEINE SUV39H DANS DES CELLULES MYOBLASTIQUES AYANT LA CAPACITE DE SE DIFFERENCIER EN MYOTUBES. I-Introduction. La protéine suppresseur de tumeurs Rb joue un rôle central dans le contrôle de l'équilibre entre prolifération et différenciation cellulaires. Rb est un anti-oncogène muté dans approximativement 30% des cancers humains. Rb réprime la prolifération de manière transitoire dans les cellules"cyclantes", ou bien de manière irréversible dans les cellules différenciées. De plus, Rb active la différenciation terminale dans différents tissus. Pour bloquer la prolifération cellulaire Rb inhibe l'activité du facteur de transcription E2F, qui contrôle l'expression d'une famille de gènes importants pour l'entrée en phase S du cycle cellulaire. Pour cela, Rb recrute différentes enzymes de remodelage de la chromatine comme les histone désacetylases (HDACs) et l'histone méthyltransférase Suv39h nouvellement caractérisée. Chez les mammifères, Suv39h méthyle la lysine 9 de l'histone H3, une modification associée à la répression transcriptionnelle et au compartiment hétérochromatinien. Suv39h interagit physiquement et fonctionnellement avec Rb. Nous avons utilisé la technique de RNAi pour bloquer l'expression de la protéine Suv39h dans des cellules myoblastiques ayant la capacité de se différencier en myotubes. Le RNA'inh bloque l'expression de la protéine dans plus de 90% des cellules. Cette inhibition passe par la dégradation du RNA messager et est très spécifique de le protéine Suv39h (Figure 10). Nous montrons que Suv39h joue un rôle insoupçonné dans les deux processus de - la répression des gènes de la prolifération, et - l'activation des gènes de la différenciation. Ces résultats suggèrent l'implication de la protéine Suv39h dans des pathologies humaines liées à un déséquilibre entre la prolifération et la différenciation comme les cancers. II-Préparation des oligonucléotides. Suv39hl/2 Fw : uaccucuuugaccuggacuatt (SEQ ID NO. 17) Rev : uaguccaggucaaagagguatt (SEQ ID NO. 18) Contrôle Fw : caugucaugugucacaucuctt (SEQ ID NO. 19) Rev : gagaugugacacaugacaugtt (SEQ ID NO. 20) III-Résultats. Le RNA'inh SUV39h réprime l'expression de Suv 39h au niveau protéine et RNA dans plus de 90% des cellules sans inhiber d'autres protéines comme la tubulinea. Annexe A Maladie Protéine de fusion Translocation chromosomic Références cible APL (acute promyelocytic PML-RARalpha t (15 ; 17) (q22 ; q21) De The et al. Cell 1991, 66 : 675 leukaemia) PLZF-RARalpha t (ll ; 17) (q23 ; q21) Chen Z et al. EMBO J 1993,12 : 1161 NPM-RARalpha t (5 ; 17) (q32 ; ql2) Redner RL et al. Blood 1996,87 : 882 NuMA-RARalpha t (5 ; 17) (ql3 ; q21) Wells RA et al. Leukemia 1996,10 : 735 ST A T5beta/RARalpha Arnould C et al. Hum. Mol. Genet. 1999,8 : 1741 ALL (acute lymphoblasticTEL-AML1t (12 ; 21) (pl3 ; q22) leukaemia) BCR/ABL t (9 ; 22) (q34 ; qll) MLL/AF4 t (4 ; l l) (q21 ; q23) Domer PH et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 : 7884-8 ALL-translocation t (12 ; 21) (ql2 ; q22) CALM/AF10 t (10 ; ll) (pl2-pl3 ; ql4-q21) Dreyling MH et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,93 : 4804 ALL1/AF4 t (4 ; 11) Janssen JW et al. Blood 1994,84 : 3835 E2A/HLF t (17 ; 19) (q22 ; pl3) Hunger SP et al. Genes Dev 1992,6 : 1608 AML (acute myeloid leukemia) TLS/FUS-ERG t (16 ; 21) (pll ; q22) AML (M7) Ichikawa H et al. Cancer Res 1994,54 : 2865 MLL-AFI0 t (1 0 ; ll) (pl2-pl3 ; q23) Borkhardt A et al. Leukemia 1995,9 : 1796 MLL-ABI1 t (10 ; ll) Shibuya et al. Genes Chromosomes Cancer 2001, 32 : 1 HLXB9-ETV6 t (7 ; 12) (q36 ; pl3) Beverloo et al. Cancer Res 2001, 61 : 5374 MLL-ELL t (ll ; 19) (q23 ; pl3. 1) Rubnitz JE et al. Blood 1996,87 : 4804 CBFbeta/MYHll inv[16] Tobal K et al. Br J Haematol1995, 91 : 104 AMLl-MTG8 t (8 ; 21) Miyoshi et al. EMBO J 1993, 12 : 2715 TEL-TRKC t (12 ; 15) (pl3 ; q25) Eguch et al. Blood, 1999,93 : 1355 AML1/ETO t (8 ; 21) Kusec R et al. Leukemia, 1994,8 : 735 CALM/AF10 t (10 ; 11) (p12-p13 ; qI4-q21) Dreyling MH et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,93 : 4804 ETV6-BTL t (4 ; 12) (ql l-ql2 ; pl3). Cools et al. Blood 1999,94 : 1820 CBFbeta-SMMHC inv (16) (pl3 ; q22) Wijmenga C et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,93 : 1630 FUS/ERG t (16 ; 21) (pll ; q22) Panagopoulos 1 et al. Genes Chromosomes Cancer, 1994,11 : 256 DEK/CAN t (6 ; 9) (p23 ; q34). on Lindern M et al. Mol Cell Biol, 1992,12 : 1687 MLL-AF9 t (9 ; ll) (p22 ; q23) Super HJ et al. Blood, 1995,85 : 855 MLL-ENL (11 q23) Schreiner SA et al. Leukemia 1999,13 : 1525 MLL-AF4 t (4 ; ll) (q21 ; q23) Domer PH et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1993,90 : 7884 MLL-AF6 t (6 ; 11) (q27 ; 23) Tanabe S et al. Genes Chromosomes Cancer 1996,15 : 206 MLL-AF17 t (ll ; 17) (q23 ; q21) Prasad R et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1994,91 : 8107 MLL-AFX t (X ; l l) (ql3 ; q23). Borkhardt A et al. Oncogene 1997,14 : 195 MLL-AFlp So CW et al. Leukemia 2000,14 : 594 Annexe B MLL-AFlq t (l ; ll) (q21 ; q23) Busson-Le Coniat M et al. Leukemia 1999,13 : 302 MLL self So CW et al. Cancer Res 1997,57 : 117 MLL-CBP t (11 ; 16) (q23 ; pl3) Taki T et al. Blood 1997,89 : 3945 AML1-ETO t (8 ; 21) Erickson P et al. Blood 1992,80 : 1825 MDS/AML NPM-MLF1 t (3 ; 5) (q25. 1 ; q34) Yoneda-Kato N et al. Oncogene 1996,12 : 265 (myelodysplasia/acute myeloid leukemia) CML (chronic myelogenous Bcr-Abl/p210 Ben-Neriah Y et al. Science 1986, 233:212 leukemia) AMLl-MDS1-EVIl t (3 ; 21) (q26 ; q22) Fears S et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,93 : 1642 (AME) BpALL (cell acute TEL-AMLI t (12 ; 21) (pl3 ; q22) Golub TR et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1995,92 : 4917 lymphoblastic leukemia) MPD (myeloproliferative TEL-JAK2 t (9 ; 12) (p24 ; ql3) Lacronique et al. Science 1997,278 : 1309 disease) TEL-PDGFbetaR t (5 ; 12) (q33 ; pl3) Jousset C et al. EMBO J, 1997,16 : 69 TEL-TRKC t(12 ; 15) (pl3 ; q25) Eguch et al. Blood, 1999,93 : 1355 CMML (chronic involving PDGFbetaR t (5 ; 17) (q33 ; pl3) Magnusson et al. Blood 200198 : 2518 myelomonocytic leukemia) HIP1/PDGFbetaR t (5 ; 7) (q33 ; qll. 2) Ross TS et al. Blood 1998,91 : 4419 TEL/PDGFbetaR t (5 ; 12) (q33 ; pl3) Tomasson MH et al. Blood 1999,93 : 1707 MALT (gastric mucosa- API2-MALT1 t (ll ; 18) (q21 ; q21) Motegi M et al. Am J Pathol2000, 156 : 807 associated lymphoid tissue lymphoma) ALCL (anaplastic large cell NPM-ALK, t (2 ; 5) (p23 ; q35) Waggott W et al. Br 7 1995, 89 : 905 lymphoma) SU-DHL-1 t (2 ; 5) Siminovitch KA et al. Blood 1986, 67 : 391 ATIC-ALK inv (2) (p23q35) Colleoni GW et al. Am J Pathol 2000, 156 : 781 ALK-related t (2 ; 17) (p23 ; q25) Maes et al. Am J Pathol 2001, 158 : 2185 translocation MPD (myeloproliferative NUP98-HOXA9 t (7 ; 11) (pl5 ; p15) Nakamura T et al. Nat Genet 1996,12 : 154 disease) APP (amyloid precursor APP+ 1 (38-kDa) Hersberger et al. J Neurochem 2001 76 (5) : 1308-14 protein) in sporadic Alzheimer's disease (AD) or Down's syndrome Annexe C primary pleural monophasic SYT-SSX1 t (X ; 18) (pll. 2 ; qll. 2) Crew AJ et al. EMBO J 1995, 14 : 2333 synovial sarcomas (SS) SYT-SSX2 t (X ; 18) (pl1. 2 ; ql1. 2) Crew AJ et al. EMBO J 1995,14 : 2333 Dermatofi brosarcoma COLlA 1/PDGFB t (17 ; 22) O'Brien KP et al. Genes Chromosomes Cancer 1998, 23 : 187 protuberans (DP) rearrangement ARMS (pediatric alveolar EWS-FLII Athale et al. J Pediatr Hematol Oncol2001, 23 : 99 rhabdomyosarcoma) EWS-ERG t (l l ; 22) (q24 ; ql2) Sorensen PH et al. Nat Genet 1994,6 : 146 ESFT (Ewing sarcoma family PAX3-FKHR t (2 ; 13) (q35 ; ql4) Fredericks WJ et al. Mol ol Cell Biol 1995, 15 : 1522 of tumors) PAX7-FKHR t (1 ; 13) (p36 ; ql4) Barr FG et al. Hum Mol Genet 1996,5 : 15 DSRCT (desmoplastic small EWS-WTI t (11 : 22) (pl3 : ql2) Benjamin et al. Med Pediatr Oncol 1996 27 (5) : 434-9 round cell tumors) EWS/FI -1 t (l 1-22) (q24 ; qI2) Fidelia-Lambert et al. Hum Pathol 1999, 30 : 78 MM (multiple myeloma) IGH-MMSET t (4 ; 14) (pl6. 3 ; q32) Malgeri et al. Cancer Res 2000 60 : 4058 MPD (stem ceUFGFR1-CEP110t (8 ; 9) (pl2 ; q33) Guasch et al. Blood 2000 95 : 1788 myeloproliferative disorder) Ewing sarcoma (ES)-peripheral EWS-FEV t (2 ; 22) (ql3 ; q22, t (3 ; 18) Llombart-Bosch et al. Diagn Mol Pathol 2000, 9 : 137 primitive neuroectodermal (p21 ; q23) tumor (pPNET) EWS-FLII t (ll ; 22 ; 14) (q24 ; ql2 ; q11) Bonin G et al. Cancer Res 1993, 53 : 3655 EWS-ERG t (21 ; 22) (q22 ; ql2) Sorensen PH et al. Nat Genet. 1994,6 : 146 ETV6/CBFA2 t (12 ; 21) (pl2 ; q22) Fears S et al. Genes Chromosomes Cancer 1996, 17 : 127 MLS (myxoid liposarcomas) FUS/CHOP t (12 ; 16) (ql3 ; pll) Rabbitts TH et al. Nat Genet 1993,4 : 175 EWS/CHOP t(12;22;20)(q13;q12;q11) Zinszner H et al. Genes Dev 1994, 8:2513 REVENDICATIONS 1) Un oligonucléotide double brin caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences oligonucléotidiques de même taille comprenant chacune à la même extrémité 3'ou 5'un à cinq nucléotides non appariés formant des bouts simples brins débordant de l'hybride, l'une desdites séquences oligonucléotidiques étant substantiellement complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène que l'on souhaite réprimer spécifiquement. 2) Un oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué de ribonucléotides. 3) Un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la partie de la séquence oligonucléotidique qui est hybridée et complémentaire de la séquence cible présente une taille comprise entre 15 et 25 nucléotides et tout préférentiellement entre 20 et 23 nucléotides. 4) Un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente à chaque extrémités 3'des séquences oligonucléotidiques deux nucléotides débordant de l'hybride. 5) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la partie de la séquence oligonucléotidique hybridée est parfaitement complémentaire de la séquence cible et en ce que le (s) nucléotide (s) débordant de l'hybride ne sont pas complémentaires de la séquence cible. 6) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est couplé à une substance favorisant ou permettant sa pénétration, le ciblage ou l'adressage dans les cellules. 7) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène résultant d'une translocation chromosomique de façon à inhiber les effets de la protéine de fusion exprimée par ce gène. 8) Un oligonucléotide selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine de fusion est choisie dans le groupe comprenant Protéine de fusion cible, PML-RARalpha, PLZF-RARalpha, NPM-RARalpha, NuMARARalpha, STAT5beta/RARalpha, TEL-AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, ALL-translocation, CALM/AF10, ALL1/AF4, E2A/HLF, TLS/FUS-ERG, MLL-AF10, MLL-ABI1, HLXB9-ETV6, MLL-ELL, CBFbeta/MYH11, AML1-MTG8, TEL-TRKC, AML1/ETO, CALM/AF10, ETV6-BTL, CBFbeta-SMMHC, FUS/ERG, DEK/CAN, MLL-AF9, MLL-ENL, MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF17, MLL-AFX, MLL-AFlp, MLL-AFlq, MLL self, MLL-CBP, AML1-ETO, NPMMLF1, Bcr-Abl/p210, AML1-MDS1-EVI1, TEL-AML1, TEL-JAK2, TEL-PDGFbetaR, TEL-TRKC, PDGFbetaR, HIP1/PDGFbetaR, TEL/PDGFbetaR, API2-MALT1, NPM-ALK, SU-DHL-1, ATIC-ALK, COL1A1/PDGFB, EWS-FLII, EWS-ERG, PAX3-FKHR, PAX7-FKHR, EWS-WTI, EWS/FI-1, IGH-MMSET, FGFR1-CEP110, EWS-FEV, EWS-FLI1, EWS-ERG, ETV6/CBFA2, FUS/CHOP, EWS/CHOP. 9) Un oligonucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine de fusion est la protéine PML-RARa. 10) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que sa séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de croissance ou un récepteur d'un facteur de croissance. 11) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que sa séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un récepteur nucléaire d'hormone notamment androgène ou oestrogène. 12) Un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que sa séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de transcription. 13) Composition pharmaceutique pour être utilisée dans la recherche de la fonction de gène ou à des fins thérapeutiques ou diagnostiques, caractérisé en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14) Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif un oligonucléotide ou un ensemble d'oligonucléotides différents, comportant chacun une séquence oligonucléotidique complémentaire d'une séquence cible appartenant à une molécule d'ADN ou d'ARN messager d'un gène dont la répression induit l'apoptose, ou la sénescence, ou la nécrose, ou la différenciation des cellules tumorales. 15) Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif un ensemble d'oligonucléotides différents selon les revendications 10 à 12. 16) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des maladies résultant de l'expression d'au moins un gène nocif. 17) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de maladies résultant de l'expression d'une protéine de fusion. 18) Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que la protéine de fusion est PML- RARa. 19) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents selon la revendication 17 dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de croissance ou un récepteur de facteur de croissance pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de cancers résultant de l'expression desdits facteurs. 20) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un mélange d'oligonucléotides différents selon la revendication 17 dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un récepteur d'un androgène ou oestrogène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des carcinomes prostatiques, mammaires ou ovariens. 21) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un mélange d'oligonucléotides différents selon la revendication 17 dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant pour un facteur de transcription pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers capable de se développer dans des conditions de forte anoxie. 22) Utilisation d'un oligonucléotide ou d'un ensemble d'oligonucléotides différents selon la revendication 17 dont la séquence oligonucléotidique est complémentaire d'une séquence cible appartenant à un gène codant la télomérase ou un gène protecteur d'apoptose pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des cancers. 23) Utilisation d'un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 comme outil de recherche ou de diagnostic in vitro. 24) Utilisation selon la revendication 23, caractérisé en ce que lesdits outils sont mis en oeuvre dans des procédés de génétique reverse.