FR 2828206 A1 20030207 FR 0110443 A 20010803 UTILISATION D'INHIBITEURS DES LYSYL OXYDASES POUR LA CULTURE CELLULAIRE ET LE GÉNIE TISSULAIRE L'invention a pour objet l'utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de cellules susceptibles d'être utilisées en thérapie tissulaire, ou cellulaire, ou en pharmacologie expérimentale. Les lysyl oxydases sont des amine oxydases qui induisent la réticulation des collagènes et de l'élastine en catalysant et qui catalysent la désamination oxydative de résidus lysyls et hydroxylysyls en a-aminoadipic-S-semialdéhyde correspondants (pour revue, SmithMango & Kagan, Matrix Biology 1998,16 : 387) : RCH2NH2 + 02 + H20-. RCHO + NH3 + H202. Les résidus aldéhydes formés vont subir une série de condensations spontanées avec d'autres fonctions aldéhydes ou amines non modifiées voisines, conduisant à des liaisons intra et inter-moléculaires. Ces condensations sont à l'origine des pontages intra et intermoléculaires des collagènes et de l'élastine. Parmi les inhibiteurs directs de l'activité LO, qui agissent sur le site actif de l'enzyme, le ssAPN en est le plus couramment utilisé (voir revue de H. M. Kagan Acta Tropica 77 (2000) 147-152). La réticulation dépendante des LO des collagènes et d'élastine est un paramètre essentiel de la formation des tissus et implants néosynthétisés in vitro : L'absence de réticulation ne permet pas la constitution de tissus résistants, trop de réticulation (ou une réticulation chimique inappropriée) entraînent une trop grande rigidité et une rétractation des tissus. La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que l'adjonction d'un inhibiteur spécifique des LO à des chondrocytes, cellules spécifiques du cartilage, permet d'annuler la dédifférenciation de ces cellules. En effet, le problème majeur de la formation d'implants de cartilage par les chondrocytes est que ceux-ci se dédifférencient, et perdent leur potentiel à fabriquer du collagène de cartilage (collagènes de type cartilage : II, IX, XI et X). Sans cet inhibiteur, les chondrocytes dédifférenciés synthétisent des types de collagènes anormaux dans le cartilage sain (I, III). L'adjonction temporaire de l'inhibiteur de LO a donc un effet important et réversible sur la formation du cartilage, dont les propriétés physiques spécifiques sont liées à la présence des collagènes qui le constituent. De plus, les Inventeurs ont également mis en évidence que l'adjonction du même inhibiteur des LO lors de la constitution d'un modèle de peau reconstruite se traduit aussi par un effet sur le phénotype des cellules. Les composants cellulaires du modèle testé de peau reconstruite sont des fibroblastes et des kératinocytes. Les fibroblastes synthétisent notamment les collagènes fibrillaires (type I et III) et l'élastine du derme, alors que les kératinocytes se différencient pour former toutes les couches de l'épidémie jusqu'à la couche cornée assurant la fonction de barrière. En présence de l'inhibiteur de LO, les propriétés de la peau reconstruite sont modifiées. On observe que l'absence de réticulation des collagènes permet une meilleure colonisation du support éponge par les fibroblastes et une augmentation de la formation de la matrice extracellulaire, ainsi qu'une diminution in vitro de la rétraction de la peau reconstruite. D'autre part, on observe une meilleure organisation de l'épiderme, avec une couche granuleuse très bien formée. L'adjonction temporaire d'inhibiteur des LO a donc un effet positif sur la gestion de la formation et l'organisation de la peau reconstruite en facilitant la préparation en grande quantité de ce matériel. A partir de biopsies de cartilage, et en présence d'inhibiteurs de LO, les Inventeurs ont démontré qu'il devient possible de multiplier des chondrocytes sur un support plastique en 2 dimensions en présence de sérum du donneur selon les conditions classiques, tout en obtenant la production d'une matrice extracellulaire dénuée de tout collagène anormal, même après 2 semaines de culture, et malgré une solubilisation accrue des collagènes synthétisés dans le milieu de culture (Fig 1,2). Une telle matrice voit sa fluidité diminuer au cours du temps de culture : on choisit le temps de culture optimal en fonction de la quantité de matrice produite et de sa fluidité recherchées. Il est alors inutile de recourir à l'emploi de support exogène dont, ultérieurement, le rejet ou une résorption défectueuse éventuelles annuleraient les propriétés favorables déjà obtenues. En l'absence de l'inhibiteur type de l'activité LO, le ssAPN, la matrice extracellulaire est très appauvrie en collagènes de type cartilage, et majoritairement constituée de collagènes de type I ainsi que, pour une faible part, de collagène de type III, c'est à dire de collagènes qui ne participent pas à l'élaboration du cartilage. De plus, la matrice présente une absence de fluidité incompatible avec le recours éventuel à des injections par seringue. L'expression de plusieurs isoformes de Lysyl oxydase (LOX et LOLI au moins) par les chondrocytes est manifeste, mais n'est pas modifiée par le traitement par le ssAPN (fig 3) qui n'inhibe que l'activité de l'Enzyme (tableau 1). L'adjonction de ssAPN, utilisée à différentes concentrations (entre 50 ou 200Ilg/ml), permet la formation de peaux reconstruites humaines dont la rétraction peut être diminuée in vitro. De plus, le ssAPN à 50 lig/ml améliore la colonisation de l'éponge par les fibroblastes et l'extension de la synthèse de la matrice extracellulaire. Il améliore aussi l'organisation de l'épiderme, avec une couche granuleuse très bien formée qui génère une couche cornée très structurée. Cet effet sur la différenciation de l'épiderme et la diminution de la rétraction réduisent la formation de feuillets qui se détachent et peuvent faciliter la préparation de peau reconstruite (fig 4). L'utilisation d'inhibiteurs de l'activité LO peut s'appliquer à toute culture de cellules aux fins d'obtenir tout implant tissulaire, puisque les collagènes et les LO sont des constituants et des intervenants ubiquitaires de tous les tissus animaux. Les conditions des cultures peuvent cependant varier en fonction des types cellulaires utilisés et des substrats ciblés. L'invention a pour objet l'utilisation d'inhibiteurs directs ou indirects des lysyl oxydases (LO), en tant qu'inhibiteurs de la dédifférenciation des cellules en culture in vitro, en vue du maintien quasiment constant du phénotype desdites cellules dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de ces dernières, et ce pendant la quasi totalité du temps de culture. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée, d'inhibiteurs directs des LO choisis parmi : A) les amines primaires réagissant avec le groupe carbonyle du site actif des LO, et plus particulièrement celles donnant, après liaison au carbonyle, un produit stabilisé par résonance, telles que les amines primaires suivantes : - l'éthylènediamine, - l'hydrazine, la phénylhydrazine, et leurs dérivés, le semicarbazide, et les dérivés de l'urée, - les aminonitriles, tels que le ss-aminopropionitrile (ss-APN), ou le 2- nitroéthy lamine, - les halo amines insaturées ou saturées, telles que la 2-bromo-éthylamine, 2chloroéthylamine, 2-trifluoroéthylamine, 3-bromopropylamine, les p-halobenzylamines, - la sélénohomocystéine lactone, B) les chélateurs de cuivre, pénétrant ou non les cellules en culture, C) les anticorps bloquant anti-LO, dirigés contre le site actif des LO. L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée, d'inhibiteurs indirects des LO choisis parmi : A) les composés bloquants les dérivés aldéhydes issus de la désamination oxydative des résidus lysyls et hydroxylysyls par les LO, tels que les thiolamines, notamment la Dpénicillamine, ou ses analogues tels que l'acide 2-amino-5-mercapto-5-méthylhexanoique, l'acide D-2-ammo-3-méthyl-3- ( (2-acétamidoéthyl) dithio) butanoïque, l'acide p-2-amino-3- méthyl-3- ( (2-ammoéthyl) dithio) butanoïque, le sulfinate de sodium-4- ( (p-l-diméthy 1-2- amino-2-carboxyéthyl) dithio) butane, le sulfanate de 2-acétamidoéthyl-2acétamidoéthanethiol, le trihydrate de sodium-4-mercaptobutanesulfinate. B) les composés inhibiteurs de la biosynthèse des LO tels que les antisens. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, d'inhibiteurs des LO choisis parmi le ss-APN et/ou la D-pénicillamine. L'invention concerne également l'utilisation d'inhibiteurs de LO tels que définis cidessus, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de toutes cellules d'origine humaine ou animale, notamment les cellules choisies parmi les chondrocytes des cartilages, les cellules de la cornée, les cellules de la peau (tels que les fibroblastes de derme, et kératinocytes de l'épiderme), les cellules endothéliales des vaisseaux, les ostéoblastes des os, les hépatocytes, les cellules rénales, les cellules musculaires, les cellules souches ou pluripotentes. L'invention a également pour objet l'utilisation d'inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de cellules, en vue de l'obtention de cellules susceptibles d'être utilisées en thérapie cellulaire, ou en pharmacologie expérimentale, notamment dans le cadre du criblage de médicaments. L'invention concerne également l'utilisation d'inhibiteurs de LO tels que définis cidessus, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de cellules en vue de l'obtention de tissus, tels que de la peau ou du cartilage, lesdits tissus étant susceptibles d'être utilisés en tant que greffons ou implants en thérapie tissulaire, ou en pharmacologie expérimentale, notamment dans le cadre du criblage de médicaments. L'invention a également pour objet tout milieu de culture cellulaire caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de culture in vitro de cellules telles que définies ci-dessus, au cours duquel le phénotype desdites cellules est maintenue à un stade identique à celui ou se trouvaient initialement lesdites cellules lors de leur mise en culture, ledit procédé comprenant la mise en culture desdites cellules dans un milieu approprié contenant un ou plusieurs inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus. L'invention a également pour. objet un procédé de préparation de cellules, ou d'implants cellulaires, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en oeuvre d'un procédé de culture in vitro de cellules tel que défini cidessus, - le cas échéant, une ou plusieurs étapes de lavage des cellules en culture à l'aide d'une solution tampon appropriée, afin d'éliminer en tout ou partie le ou les inhibiteurs de LO utilisés, - le cas échéant une étape de digestion enzymatique de la matière extracellulaire susceptible de s'être formée, à l'aide d'enzymes appropriées, - le cas échéant une étape de récupération des cellules mises en culture. L'invention concerne également un procédé de préparation in vitro de tissus ou d'implants tissulaires, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en oeuvre d'un procédé de culture in vitro de cellules tel que défini cidessus, jusqu'à la formation d'une matrice extracellulaire suffisante pour constituer une trame tissulaire, - le cas échéant, une ou plusieurs étapes de lavage des tissus en culture à l'aide d'une solution tampon appropriée, afin d'éliminer en tout ou partie le ou les inhibiteurs de LO utilisés, - le cas échéant une étape de récupération des tissus en culture. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation in vitro de tissus tel que défini ci-dessus, appliqué à la néosynthèse d'implants de cartilage lorsque ledit procédé est effectué à partir de chondrocytes, ou à la préparation de substitut cutanés lorsque ledit procédé est effectué à partir de fibroblastes et/ou de kératinocytes. L'invention concerne également un procédé de criblage de molécules d'intérêt pharmacologique, notamment de médicaments, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en oeuvre d'un procédé de culture in vitro de cellules tel que défini cidessus, le cas échéant jusqu'à la formation d'une matrice extracellulaire suffisante pour constituer une trame tissulaire, - le cas échéant, une ou plusieurs étapes de lavage des tissus en culture à l'aide d'une solution tampon appropriée, afin d'éliminer en tout ou partie le ou les inhibiteurs de LO utilisés, - une étape de mise en présence de la molécule testée avec les cellules ou tissus obtenus lors des étapes précédentes, - la détection de l'éventuel effet de ladite molécule sur les cellules ou les tissus susmentionnés. L'invention a également pour objet les cellules ou implants cellulaires tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils contiennent des inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus, le cas échéant à l'état de traces. L'invention concerne également les tissus ou implants tissulaires à base de cellules telles que définies ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils contiennent des inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus, le cas échéant à l'état de traces. L'invention a plus particulièrement pour objet les cellules ou implants cellulaires, ou tissus ou implants tissulaires susmentionnés, tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus. L'invention concerne également les implants de cartilage comprenant une matrice extracellulaire essentiellement exempte de collagènes normalement absents du cartilage sain (à savoir les collagènes 1 et III), et comprenant la totalité des collagènes spécifiques du cartilage (à savoir les collagènes II, IX, XI, et le cas échéant X). L'invention a plus particulièrement pour objet les implants de cartilage susmentionnés, caractérisés en ce qu'ils contiennent des inhibiteurs de LO tels que définis ci-dessus, le cas échéant à l'état de traces. L'invention a plus particulièrement pour objet encore les implants de cartilage susmentionnés, tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus. L'invention concerne également les implants de chondrocytes, dont le phénotype initial, de type cartilage, a été maintenu pendant la phase préliminaire de multiplication cellulaire in vitro. L'invention sera davantage détaillée à l'aide de la description qui suit des utilisations possibles des inhibiteurs de LO. La fabrication d'implants tissulaires en Génie Tissulaire en général doit surmonter un obstacle majeur : éviter de produire un tissu anormal présentant des propriétés physicochimiques incompatibles avec l'usage envisagé. La culture des cellules in vitro en vue de leur multiplication et de leur production d'une matrice extracellulaire s'accompagne malheureusement d'une altération de leur phénotype biochimique qui est plus ou moins profond suivant le type de culture de cellules. La culture de chondrocytes a été jusqu'alors, de ce point de vue, toujours accompagnée de cette altération phénotypique. Les solutions proposées jusqu'alors pour les cultures de chondrocytes ont consisté à ajouter (ou retrancher parfois) des facteurs solubles à la culture (hormones, vitamines, facteurs cellulaires essentiellement), que celle ci soit effectuée sur support plastique plan ou dans un support en trois dimensions de diverses natures (éponges de collagènes plus ou moins réticulées associés à divers constituants, céramiques etc.). La production de peau reconstruite est fondée sur l'interaction de fibroblastes et de kératinocytes placés dans des conditions particulières. Les interventions permettant d'améliorer cette production sont limitées et mal définies, souvent sur une base empirique. Plusieurs nutriments s'avèrent ainsi indispensables et ont été ajoutés aux conditions de culture. Le traitement au ssAPN présente la singularité de s'adresser aux deux types cellulaires. La méthode de la présente invention s'applique à tout type de culture en Génie Tissulaire. Elle consiste à agir sur l'état physique de la matrice extracellulaire synthétisée par les cellules en culture afin de moduler les signaux que celle ci envoie aux cellules, via divers récepteurs cellulaires, et ainsi de réguler l'état de différenciation des cellules isolées à partir de biopsies. L'inhibition de la LO (notamment par le ssAPN) a été jusqu'alors utilisée dans le cadre de procédés de production de collagènes, pour inhiber la réticulation des collagènes sécrétés par les cellules et améliorer ainsi les conditions de leur solubilisation. Un tel inhibiteur est, pour cette raison, classiquement reconnu pour altérer la matrice extracellulaire et n'a été jusqu'alors utilisé que dans trois circonstances : - la production de collagènes non réticulés facilement extractibles, - l'étude fondamentale du mécanisme d'action de la LO, - contribuer à inhiber les pontages excessifs des collagènes dans certaines pathologies fibrosantes. En dehors de ces trois domaines, l'inhibition de l'activité LO est apparue jusqu'alors comme une gêne, non comme un avantage. Les principaux avantages de la présente invention sont les suivants. Le ssAPN, l'inhibiteur type de l'activité LO, est un amino-nitrile. Ce composé, très bon marché, n'a jusqu'alors jamais été utilisé pour maintenir le phénotype des cellules en culture. Non toxique aux doses employées pour les cellules en culture, son action peut néanmoins atteindre d'autres cellules au sein d'un organisme : il ne peut à ce titre être utilisé sans risques à des fins thérapeutiques, nécessairement ciblées. Son élimination des cultures avant leur utilisation comme implant est aisée par lavages successifs pour épuiser la culture en ssAPN. Les autres inhibiteurs spécifiques de l'activité LO pourraient utilement être comparés quant à leur niveau de tolérance in vivo dans un tel modèle. L'efficacité du ssAPN à la concentration classique de 50). lg/ml a été totale après 2 semaines de culture où, en son absence, la dédifférenciation des chondrocytes était devenue maximale. Cette concentration est utilisable pour le traitement des peaux reconstruites. L'arrêt du traitement par le ssAPN permet alors de restaurer l'activité des LO qui sont sécrétées en continu (voire plus exprimées en présence de ssAPN) par les cellules et présentent une durée d'activité limitée dans le temps. Bien que l'inhibition des LO par le ssAPN soit irréversible, l'élimination du ssAPN, par lavages et arrêt du traitement, permet de restaurer in vitro au moment choisi l'activité de cette enzyme. La réticulation souhaitée des fibrilles de collagènes et d'élastine, substrats des LOs, peut ainsi être programmée. La méthode de la présente invention s'applique à tout type de culture en Génie Tissulaire, c'est à dire : - tout type de support : le plus simple comme le support plastique des boîtes de culture, ou le plus sophistiqué comme certains modèles de culture en trois dimensions. - tout type de cellules en vue d'implants tissulaires divers (cartilage, os, peau, cornée, vaisseaux sanguins, etc). Le traitement décrit peut être utilisé pour deux types d'implantations : a) suspension de chondrocytes multipliés in vitro. De plus, le traitement préalable de la culture par le ssAPN améliore le rendement d'isolement des cellules viables par trypsination. b) matrice cartilagineuse riche en chondrocytes et de viscosité définie. Dans le cas de cartilages articulaires lésés ou nécrosés localement (hanche en particulier), il peut être souhaitable de recourir à des injections d'une matrice riche en chondrocytes non dédifférenciés. La fluidité du tapis cellulaire est fonction de la durée de la culture et peut donc être aisément choisie par le chirurgien en fonction des besoins. Cet avantage est bien sûr généralisable à toute autre situation rencontrée en Génie tissulaire. Les tapis cellulaires ainsi obtenus après un temps donné de contact avec un inhibiteur de LO peuvent également servir de support d'étude en pharmaco-toxicologie. 1. Descriptif détaillé 1.1.) Matériel et Méthodes Modèle de culture de chondrocytes : a) Le modèle expérimental de culture de chondrocytes est celui de la culture sur plastique en deux dimensions de chondrocytes embryonnaires de poulet. L'état embryonnaire des cellules permet un haut niveau de synthèse des collagènes, contrairement aux chondrocytes adultes. Le sternum de poulet d'où sont issus les chondrocytes permet d'obtenir deux sous populations pures de chondrocytes capables ou non de s'hypertrophier ultérieurement (respectivement, les chondrocytes de la partie craniale ou caudale du sternum). Les biopsies de cartilage bovin ou humain ne permettent pas cette distinction. Les résultats qui sont décrits distinguent toujours la sous-population des chondrocytes étudiés. Les cultures avec antibiotiques L-glutamine 4 mM, et 25 g/ml ascorbate (facteur nécessaire à la stabilité des unités en triple hélice de collagènes sécrétés) sont poursuivies pendant 2 semaines en présence ou en absence de 10% sérum, remplacé éventuellement par l'insuline 100 ng/ml, et de 50 ! lg/ml ssAPN. L'absence de sérum nécessite l'adjonction d'agents protecteurs (1 mM cystéine et 1 mM pyruvate). Un jour avant prélèvements, 10 ! lui de 14C Proline sont ajoutés aux cultures dont les tapis ou les milieux seront ensuite pepsins (0.2 mg pepsine/ml/pH 4/24 hrs) et soumis à l'analyse électrophorétique (SDS PAGE en gradient de 4,5 à 15% d'acrylamide) puis fluorographique. Les fluorogrames révèleront alors les seules bandes protéiniques pepsino-résistantes, essentiellement les collagènes et des lipocalines (protéines de transport lipidique). La position connue de ces bandes permet de signer la dédifférenciation des cellules par l'apparition de la chaine a2 1 du collagène 1 ZD associée à la baisse de synthèse des collagènes de type cartilage. L'activité Lysyl oxydase a été dosée avec 300.000 dpm d'élastine marquée sur la Lysine, substrat de l'enzyme (Shackelton et Hulmes Anal. Biochem. (1990) 185 : 359-362). La détermination de la présence de Lysyl oxydases dans les cultures de chondrocytes est effectuée selon les méthodes classiques d'immuno-décoration des supports où ont été transférées les bandes séparées des protéines extraites à partir des milieux de culture ou des tapis cellulaires correspondants. Modèle de culture de peau reconstruite : Le procédé permettant la formation de la peau reconstruite est celui décrit dans le brevet français 87 08252 du 15 juin 1987. Le support du modèle de peau reconstruite est constitué d'un substrat dermique (SD) à base de collagène-glycosaminoglycanne réticulé par du chitosane selon la technique publiée par Duplan-Perrat et al (J Invest Dermatol2000 114 : 365). Des fibroblastes sont ensemencés à l'intérieur du SD pour obtenir un derme équivalent. La peau reconstruite (PR) est obtenue par ensemencement des kératinocytes après 15 jours (J15) de culture en derme équivalent. Les fibroblastes dermiques sont obtenus à partir d'explants de prépuces humains après séparation dermo-épidermique et cultivés en monocouche en milieu DMEM (Sigma) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, de L-glutamine 4 mM, d'EGF (Austral Biologie) à 10 ng/ml, de pénicilline à 100 UI/ml, de gentamicine à 100 ug/ml et d'amphotéricine Bal u. g/ml. Les kératinocytes sont issus d'un prélèvement de biopsie de peau humaine après séparation dermo-épidermique par trypsination. Les cellules sont ensemencées sur des couches nourricières (fibroblastes irradiés) et cultivées en en DMEM et HAM F12 à 30% supplémenté en sérum de veau foetal à 10%, d'EGF à 10 ng/ml, d'hydrocortisone à 1,6 ng/ml, d'umuline à 0,12 UI/ml, de cholératoxine à 0,1 nM, de triiodothyronine à 0, 2 u. M, d'adénine à 24 u. g/ml, de L-Glutamine à 4 mM, de pénicilline à 100 UI/ml, de gentamicine à 100 p. g/ml et d'amphotéricine Bal u. g/ml. Un mélange à base de collagène bovin de type I et III (72%), de glycosaminoglycanne (8%) réticulé par du chitosane (20%) est coulé dans des plaques 6 puits. Les substrats dermiques ainsi obtenus sont ensuite congelés à-80 C et lyophilisés. Les fibroblastes sont ensemencés dans le substrat dermique réhydraté et stérilisé à raison de 250 000 cellules par 2 cm2. Des kératinocytes sont ensemencés après 15 jours (J15) avec une densité de 200 000 à 2 250 000 cellulesl cm2. Les peaux reconstruites sont cultivées 8 jours de façon immergée, dans le milieu décrit précédemment supplémenté de 50f ! g/m1 de vitamine C. Ensuite les peaux reconstruites sont élevées à l'interface air liquide en utilisant un milieu de culture simplifié à base de DMEM, supplémenté en sérum de veau foetal, d'EGF, d'hydrocortisone, d'umuline, de L-glutamine, de pénicilline, de gentamicine, et d'amphotéricine B, et d'acide ascorbique, aux concentrations décrites ci-dessus. Les peaux reconstruites sont cultivées jusqu'à J60. Des prélèvements sont réalisés à J30 et J60 pour les différentes analyses. Utilisation de l'inhibiteur de Lysyl oxydases : Le ssAPN (50f ! g/ml) est ajouté dès l'ensemencement, au milieu de culture renouvelé tous les 2 jours et fourni aux cultures de chondrocytes comme à celles de fibroblastes puis de kératinocytes lors de la formation de la peau reconstruite. La concentration de 50f ! g/ml n'est pas toxique pour les cellules et n'affecte pas sensiblement la multiplication cellulaire. Des concentrations plus élevées de 200f ! g/ml s'avèrent avoir peu d'effet sur la viabilité et la multiplication des fibroblastes et des kératinocytes en cultures isolées. 1.2.) Résultats Des anticorps spécifiques de diverses enzymes de la famille lysyl oxydase ont permis d'identifier pour la première fois ces différentes isoformes dans les chondrocytes, tant par immuno-décoration après séparation électrophorétique que par immuno-marquage de tapis cellulaires observé au microscope à fluorescence. Une activité lysyl oxydase spécifique a aussi, pour la première fois, été démontrée dans les milieux de culture des chondrocytes (tableau I). Les anticorps anti LO ont aussi permis de détecter ces isofbrmes dans la peau reconstruite. Des résultats ont mis en évidence une forte expression des LOX (figure 4), LOXL1 et LOXL2 au niveau du derme, de l'épiderme et de la jonction dermo-épidermique. L'observation d'une expression de ces isoformes de LO dans des kératinocytes est tout à fait originale à ce niveau, où il n'y a synthèse ni de collagène ni d'élastine. Régulation du phénotype "cartilage" des chondrocytes : En présence de sérum, avec lequel les taux de multiplication et de synthèse protéiques sont optimaux, les chondrocytes étudiés se dédifférencient nettement après la première semaine de culture, en accord avec les données de la littérature. L'adjonction de PAPN pendant toute la culture supprime toute dédifférenciation, comme l'atteste l'absence de la chaine collagénique a21 sur les fluorogrammes. De même, le ssAPN supprime également les altérations morphologiques observées par ailleurs dès les premiers jours dans les cultures non traitées où sont bien visibles des cellules de forme fibroblastique. En l'absence de sérum, les chondrocytes adhèrent bien sur le support plastique mais s'étalent très difficilement, voire pas du tout pour les chondrocytes caudaux. La présence d'un anabolisant des chondrocytes, comme l'insuline, augmentent quelque peu les taux de synthèse, n'induisent pas de dédifférenciation biochimique avec ou sans ssAPN, mais laissent apparaître une altération morphologique en l'absence de ssAPN (Fig. 1). La présence de sérum dans le milieu de culture est donc néanmoins souhaitable pour obtenir un taux élevé de multiplication et de synthèses, le ssAPN supprimant l'altération du phénotype biochimique et morphologique. c) Les cultures de chondrocytes ainsi traitées mais étudiées entre le 2ème et le Sème jour ont montré la présence de collagènes normaux aussi bien dans le tapis cellulaire que dans le milieu de culture. Néanmoins, le ssAPN a permis l'apparition normale de collagène X par les chondrocytes hypertrophiques : la baisse de cette synthèse, en l'absence de ssAPN, est connue pour précéder la synthèse de collagène I, marqueur de dédifférenciation (fig 2). Ces collagènes, tous de type cartilage, sembleraient donc bien acquérir, sous l'effet de pontages dépendants de LO, une structure qui progressivement contribuerait à l'envoie de signaux aux chondrocytes, à l'origine de l'altération du phénotype biochimique en culture in vitro. d) Il restait à prouver l'origine de cette inhibition de dédifférenciation par le ssAPN. Les cultures en présence de ssAPN ne modifient en rien la synthèse et la sécrétion de ces LO (Fig 3). Le ssAPN n'agit donc bien que sur l'activité amine oxydase de l'enzyme, et non sur sa sécrétion. Régulation de la formation de la peau reconstruite : k Lors de la formation de la peau reconstruite, l'adjonction de ssAPN au moment de l'ensemencement des fibroblastes (et lors de l'addition des kératinocytes) se traduit par plusieurs effets (figure 4) : Au niveau du derme et de l'échantillon en général, un effet important pour les greffes serait la réduction possible de la rétraction induite par la réticulation des collagènes. L'organisation globale histologique du derme et de la jonction dermo-épidermique (JDE) n'est pas affectée. La colonisation de l'éponge par les fibroblastes est plus importante, ce qui se traduit par la synthèse de plus de matrice extracellulaire. L'expression de LOX persiste, avec même une intensification de son expression au niveau de la JDE. Il faut cependant noter une localisation plus diffuse de la tropoélastine immunodétectée, dont l'expression est augmentée. Le traitement avec 5û/-lg/ml de ssAPN pendant 35 jours ne modifie pas fondamentalement la stratification des kératinocytes dans l'épiderme. Dans la peau normale et dans notre modèle de peau reconstruite, les kératinocytes de la couche basale représentent les cellules souches. L'évolution de leur phénotype concomitant et leur migration vers les couches externes de l'épiderme vont permettre la formation de la couche cornée. Cette couche cornée est indispensable au modèle car elle assure la fonction de barrière de la peau. Sa formation doit être cependant contrôlée afin de pouvoir permettre la synthèse d'échantillons de peau suffisamment important. L'apport temporaire de ssAPN semble ralentir l'évolution du phénotype initial des kératinocytes, avec une stratification caractéristique en couches basale, supra-basale, granuleuse et cornée. Légendes des figures Fig 1 : Effet de l'activité Lysyl oxydase sur la dédifférenciation de chondrocytes après 2 semaines de culture en deux dimensions sur plastique 4 millions de chondrocytes de la partie craniale du sternum de poulet embryonnaire ont été ensemencés par boite de Petri de 35 mm de diamètre (P35) en milieu DMEM avec ou sans serum10% (remplacé par insuline 100ng/ml) avec ou sans ssAPN (50 plg/ml). Les milieux de culture avec 25 jj.lg/ml d'ascorbate sont changés tous les deux jours. Les collagènes neosynthétisés marqués à la Proline 14C pendant les dernières 24 heures sont isolés après pepsination classique des milieux de culture conditionnés puis soumis à SDS PAGE, sans conditions réductrices, et fluorographie. Observations : - en présence de sérum, fortement anabolisant, la dédifférenciation biochimique des chondrocytes (collagène 1 sécrété, arrêt de synthèse de collagène X) est totalement inhibée sous l'action du ssAPN qui augmente la proportion de collagène X spécifique de ces chondrocytes hypertrophiques. De même, le ssAPN préserve l'hypertrophie et la morphologie non étalée caractéristiques de ces chondriomes. - en l'absence de sérum, les chondrocytes adhèrent au plastique des boites mais ne s'étalent pas. Après 15 jours de culture, l'absence de ssAPN ne génère que la seule altération morphologique, mais la croissance cellulaire reste dans l'ensemble ralentie malgré la présence d'insuline. Fig 2 : Effet de l'activité Lysyl oxydase sur la dédifférenciation de chondrocytes après 3 jours de culture, en présence de sérum, en deux dimensions sur plastique L'étude fluorographique décrite pour la figure 1 a portée ici sur les tapis et milieux de culture pepsins Observations : Seule la présence de ssAPN permet l'expression normale de collagène X (bandes inférieures des fluorogrammes) par les chondrocytes hypertrophiques (craniaux) identifié dans les milieux et les tapis cellulaires. L'inhibition de la synthèse de collagène X est connue pour précéder l'apparition de collagène I par les chondrocytes en cours de dédifférenciation, qui s'initie donc aux premiers jours de culture alors que les collagènes anormaux n'ont pas encore été synthétisés. Fig 3 : Immunodécoration par anticorps anti LOX, LOXL1, d'extraits de tapis cellulaires et de milieu de culture de chondrocytes soumis à SDS PAGE puis transfert sur membrane de nitro cellulose. Le jour qui précède les prélèvements, le tapis cellulaire est lavé trois fois par du milieu sans serum. Le milieu est alors changé pour 24 heures par du milieu complet sans serum. Au 60 ou 140 jour de culture les milieux sont prélevés et précipités classiquement par TCA 10% final/4 C/30 mn. Les culots de centrifugation sont rincés à l'acétone puis solubilisés dans un 50 p. l de tampon d'électrophorèse. Les tapis cellulaires rincés sont lysées 2h/4 C (300). Ll/P35) dans le mélange urée 8M, Nonidet 0,5%, phosphate de sodium disodique 16 mM pH 8 et inhibiteurs de protéases. La concentration d'urée est amenée à 4M avant centrifugation de la suspension. Les surnageant sont précipité par TCA puis traités comme pour les milieux correspondants. Après séparation par SDS PAGE et transfert par Western Blot, les bandes proteiniques sont analysées par immunodécoration à l'aide d'anticorps anti-LOX et anti-LOXLI polyclonaux de lapin, puis d'un 20 anticorps anti lapin marqué à la phosphatase alcaline avant révélation au réactif NBT/BCIP (Roche Diagnostic GmBH, Manheim, Germany). Observations : 1) La LOX et la LOXL1 sont exprimées par les chondrocytes cultivés dans les conditions décrites pour le dosage d'activité enzymatique. Les Lysyl oxydases accumulées dans les tapis après 1 à 2 semaines peuvent être mises en évidence, à l'inverse des milieux de culture de seulement 24 hrs. 2) La présence de ssAPN ne modifie pas l'expression des molécules de Lysyl oxydases, seule l'activité enzymatique est inhibée comme le montre le tableau I. Fig 4 : Ananlyse immunohistochimique de la peau reconstruite avec et sans ssAPN 1 et 2 : coloration Témoin à l'hématoxyline sans 10 anticorps. 3 à 6 : immunodétection de la LOX par un 20 anticorps marqué à la peroxydase en absence (1,3, 5) ou en présence (2,4, 6) de ssAPN Les colorations brun sombre marquent la présence de l'antigène LOX et sont absentes des coupes Témoin. Après 35 jours de formation, la peau reconstruite est constituée d'un derme déposé sur l'éponge de collagène-glycosaminoglycanne-chitosane, et d'un épiderme formé par les kératinocytes. Au niveau du derme, le traitement au ssAPN permet une colonisation plus importante de l'éponge par les fibroblastes, ce qui se traduit par une synthèse accrue de matrice extracellulaire (1 et 2). L'expression de LOX apparaît plus intense. Au niveau de l'épiderme, le stratification générale est retrouvée, mais le traitement au ssAPN fait apparaître une ligne granuleuse plus intense. L'expression de LOX est également augmentée. TABLEAU 1 Activités Lysyl oxydase recueillie dans les tapis cellulaires de chondrocytes en culture sur plastique. Deux populations de chondrocytes de sternum d'embryon de poulet (hypertrophiques dans la partie craniale, synthétisant du collagène X, et non hypertrophiques dans la partie caudale) Ensemencement : 4 millions cellules/Pétri 35mm (P35). Culture + 25/-lg/ml ascorbate, + 1 mM pyruvate, : ! = 10% FCS, : ! = 1 mM cys. 24 hrs avant la colle, milieu sans serum (1,5 ml) le tapis cellulaire est lavé par le milieu sans sérum + cys. Des aliqo milieu de culture après 24 hrs sont concentrés 10 fois puis soumis au dosage de l'activité oxydase avec différents lots de substrat élastine tritiée. dpm -ssAPN dpm+ssAPN activité / P 35 expérience 1 (substrat n 1) (culture-FCS, + cys) jour 3 chondrocytes caudaux 930 674 1925 (milieu de 15% P35) 1002 718 experience 2 (substrat n 2) (culture +FCS,-cys) jour 7 chondrocytes caudaux 8158 5296 10232 (milieu de 25% P35) 8464 6210 chondrocytes craniaux 10932 5800 4553 (milieu de 100 % P35) 10510 6536 LO aortique purifiée standard 8544 4340/ 8810 4762 jour 13 chondrocytes caudaux 5016 4344 861 (milieu de 75% P35) 5322 4702 chondrocytes craniaux 5038 4580 840 (milieu de 100% P35) 5840 4618 Conclusions : Des activités lysyl oxydase (inhibées par le ssAPN et dosées par la production d'eau tritiée) sont sécrétées dans les milieux de culture. L'activité spécifique recueillie dans les milieux est plus forte au 70 jour de culture qu'au 130 jour. La matrice extracellulaire étant plus riche en substrats collagèniques naturels de l'activité Lysyl oxydase au 13 jour de culture, elle retiendrait donc l'enzyme dans le tapis cellulaire. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'inhibiteurs directs ou indirects des lysyl oxydases (LO), en tant qu'inhibiteurs de la dédifférenciation des cellules en culture in vitro, en vue du maintien d'un phénotype constant desdites cellules dans le cadre de la mise en oeuvre de procédé de culture in vitro de ces dernières, et ce pendant la totalité du temps de culture. 2. Utilisation selon la revendication 1, d'inhibiteurs directs des LO choisis parmi : A) les amines primaires réagissant avec le groupe carbonyle du site actif des LO, et plus particulièrement celles donnant, après liaison au carbonyle, un produit stabilisé par résonnance, telles que les amines primaires suivantes : - l'éthylènediamine, - l'hydrazine, la phénylhydrazine, et leurs dérivés, le semicarbazide, et de dérivés de l'urée, - les aminonitriles, tels quele ss-aminopropionitrile (ss-APN), ou le 2-nitroéthylamine, - les haloamines, insaturées ou saturées, telles que la 2-bromo-éthylamine, 2chloroéthilamine, 2-trifluoroéthylamine, 3-bromopropylamine, les 8-halobenzylamines, et les composés halogénés insaturés, - la sélénohomocystéine lactone, B) les chélateurs de cuivre, pénétrant ou non les cellules en culture, C) les anticorps bloquant anti-LO, dirigés contre le site actif des LO. 3. Utilisation selon la revendication 1, d'inhibiteurs indirects des LO choisis parmi : A) les composés bloquants les dérivés aldéhydes issus de la désamination oxydative des résidus lysyls et hydroxylysyls par les LO, tels que les thiolamines, notamment la Dpénicillamine, ou ses analogues tels que l'acide 2-amino-5-mercapto-5-méthylhexanoique, l'acide D-2-amino-3-méthyl-3- ( (2-acétamidoéthyl) dithio) butanoïque, l'acide p-2-amino-3méthyl-3- ( (2-aminoéthyl) dithio) butanoïque, le sulfinate de sodium-4- ( (p-l-diméthyl-2amino-2-carboxyéthyl) dithio) butane, le sulfanate de 2-acétamidoéthyl-2acétamidoéthanethiol, le trihydrate de sodium-4-mercaptobutanesulfinate. B) les composés inhibiteurs de la biosynthèse des LO tels que les antisens. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'inhibiteurs des LO choisis parmi le ss-APN et/ou la D-pénicillamine. 5. Utilisation d'inhibiteurs de LO selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de toutes cellules d'origine humaine ou animale, notamment les cellules choisies parmi les chondrocytes des cartilages, les cellules de la cornée, les cellules de la peau (tels que les fibroblastes de derme, et kératinocytes de l'épiderme), les cellules endothéliales des vaisseaux, les ostéoblastes des os, les hépatocytes, les cellules rénales, les cellules musculaires, les cellules souches ou pluripotentes. 6. Utilisation d'inhibiteurs de LO selon l'une des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de cellules, en vue de l'obtention de cellules susceptibles d'être utilisées en thérapie cellulaire, ou en pharmacologie expérimentale, notamment dans le cadre du criblage de médicaments. 7. Utilisation d'inhibiteurs de LO selon l'une des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre de procédés de culture in vitro de cellules en vue de l'obtention de tissus, tels que de la peau ou de cartilage, lesdits tissus étant susceptibles d'être utilisés en tant que greffons ou implants en thérapie tissulaire, ou en pharmacologie expérimentale, notamment dans le cadre du criblage de médicaments. 8. Milieu de culture cellulaire caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs inhibiteurs de LO tels que définis dans l'une des revendications 1 à 4. 9. Procédé de culture in vitro de cellules telles que définies dans la revendication 5, au cours duquel le phénotype desdites cellules est maintenue à un stade identique à celui ou se trouvaient initialement lesdites cellules lors de leur mise en culture, ledit procédé comprenant la mise en culture desdites cellules dans un milieu approprié contenant un ou plusieurs inhibiteurs de LO définis dans l'une des revendications 1 à 4. 10. Procédé de préparation de cellules, ou d'implants cellulaires, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en oeuvre d'un procédé de culture in vitro de cellules selon la revendication 9, - le cas échéant, une ou plusieurs étapes de lavage des cellules en culture à l'aide d'une solution tampon appropriée, afin d'éliminer en tout ou partie le ou les inhibiteurs de LO utilisés, - le cas échéant une étape de digestion enzymatique de la matière extracellulaire susceptible de s'être formée, à l'aide d'enzymes appropriées, - le cas échéant une étape de récupération des cellules mises en culture. 11. Procédé de préparation in vitro de tissus ou d'implants tissulaires, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en oeuvre d'un procédé de culture in vitro de cellules selon la revendication 9, jusqu'à la formation d'une matrice extracellulaire suffisante pour constituer une trame tissulaire, - le cas échéant, une ou plusieurs étapes de lavage des tissus en culture à l'aide d'une solution tampon appropriée, afin d'éliminer en tout ou partie le ou les inhibiteurs de LO utilisés, - le cas échéant une étape de récupération des tissus en culture. 12. Procédé de préparation in vitro de tissus selon la revendication l l, appliqué à la néosynthèse d'implants de cartilage lorsque ledit procédé est effectué à partir de 1 chondrocytes, ou à la préparation de substitut cutanés lorsque ledit procédé est effectué à partir de fibroblastes et/ou de kératinocytes.