FR 2831819 A1 20030509 FR 0114463 A 20011108 UTILISATION D'OLIGOSACCHARIDES DANS DES COMPOSITIONS COSMETIQUES OU DERMATOLOGIQUES POUR STIMULER L'ADHESION DE KERATINOCYTES SUR LES PROTEINES MAJEURES DE LA JONCTION DERMO-EPIDERMIQUE. La présente invention a pour objet de nouvelles compositions cosmétiques pour le soin de la peau dans un but anti-âge. Plus particulièrement l'invention se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un mélange d'oligosaccharides, de type oligogalacturonides obtenus par hydrolyse enzymatique d'une pectine, en vue de stimuler l'adhésion de kératinocytes sur des protéines de la jonction dermo- épidermique (laminine V et collagène IV). La membrane basale de la peau ou jonction dermo-épidermique (JDE) correspond à la zone comprise anatomiquement entre les cellules basales de l'épiderme et les couches les plus superficielles du derme. C'est une zone d'adhérence entre l'épiderme et le derme, assurant le contrôle de la filtration de petites molécules et le maintien des cellules adjacentes (Damour O., M. C. Martini, et P. Rousselle, Oct. 1998, Le vieillissement cutané, Ed. Flash Media). La JDE comprend des complexes d'attachement spécifiques, les hémidesmosomes dont la fonction est d'assurer le lien entre les kératinocytes basaux de l'épiderme et la membrane basale sous-jacente (Kelly, 1966, J. Cell. Biol., 28 : 51-73). La JDE joue un rôle très important tant sur le plan mécanique puisqu'elle permet l'ancrage solide de l'épiderme, que sur le plan biologique puisqu'elle intervient dans la signalisation cellulaire par le biais de récepteurs de la famille des intégrines. Les intégrines sont des glycoprotéines transmembranaires situées sur la partie basale du kératinocyte en contact avec la JDE. Elles possèdent une partie extracellulaire permettant une reconnaissance avec des protéines caractéristiques de la JDE. Parmi les composants de la JDE, on peut citer deux protéines qui jouent un rôle fondamental au sein de la JDE : - la laminine V, qui est une protéine constitutive des hémidesmosomes, et - le collagène IV. Ces protéines, par le biais de récepteurs membranaires, les intégrines a6ss4 pour la laminine V, et les intégrines a2ss1 pour le collagène IV) permettent : - l'adhésion des kératinocytes basaux au support selon une orientation bien définie, - la transmission de signaux du derme vers l'épiderme comme des signaux de prolifération, différenciation des kératinocytes. Ces intégrines sont ainsi de véritables zones de dialogue entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule et bien au-delà de la couche basale, elles contribuent, en favorisant l'adhésion cellulaire, à une meilleure communication entre les deux compartiments principaux de la peau, le derme et l'épiderme. Au cours du vieillissement cutané, on observe un aplanissement et un amincissement de la (JDE). Les propriétés d'adhérence de l'épiderme sont amoindries en raison d'une diminution de l'expression des intégrines spécifiquement impliquées dans l'adhésion des kératinocytes basaux (Levarlet et al., 1998, J. Invest. Dermatol., 3 : 172-9). Toutes ces modifications aboutissent à une diminution de la communication entre les différents compartiments contribuant probablement à une désorganisation dermo-épidermique. Même si tous les mécanismes n'ont pas été élucidés, tout porte à penser qu'une augmentation de l'adhérence des cellules, notamment sur la JDE, permet de rétablir une meilleure communication dermo-épidermique. Le but de la présente invention est précisément d'offrir des moyens permettant d'augmenter spécifiquement l'adhérence des kératinocytes basaux aux deux protéines majeures de la JDE, que sont la laminine V et le collagène IV de façon à palier les dérèglement de communication entre le derme et l'épiderme au cours du vieillissement cutané. Ce but est atteint grâce à des compositions cosmétiques ou dermatologiques pour le soin de la peau, et plus particulièrement utile pour lutter contre le vieillissement de la peau, comprenant à titre d'agent actif des oligogalacturonides. L'application de la composition selon l'invention favorise l'adhésion des cellules aux deux protéines de la JDE grâce à une meilleure disponibilité des récepteurs a6 ss 4 pour la laminine V, et a2 ss 1 pour le collagène IV. La composition selon l'invention serait capable d'induire une activation de ces récepteurs grâce à un changement de conformation. Les oligogalacturonides des compositions selon l'invention présentent de préférence un degré de polymérisation compris entre 1 et 5. Les oligogalacturonides des compositions selon l'invention sont peu ou méthylés ou estérifiés. Les compositions cosmétiques de l'invention comprennent, en équivalent sec par rapport au poids total de la composition, de 0,01 à 5 % et de préférence 0,5 % d'oligogalacturonides. Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent comprendre outre les oligogalacturonides d'autres substances actives, et plus particulièrement des extraits de plantes. A titre d'exemples de tels extraits, on peut citer : - Un extrait d'igname (dioscorea) à teneur garantie en diosgénine ou diosgénine pure. Il peut s'agir d'un extrait contenant 15 % de diosgénine ou une solution de diosgénine pure. - du bêta carotène pur ou dilué sous forme de suspension dans une huile, notamment, une dilution à 30%. Les compositions selon l'invention peuvent encore comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connu et classique dans les compositions cosmétiques et dermatologiques tels que, à titre d'exemple et de façon non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des agents absorbeurs de sébum, des vitamines, etc.... Grâce à ces connaissances en matière de cosmétiques, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter aux compositions de l'invention et en quelles quantités en fonction des propriétés recherchées. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie sans autre restriction galénique que l'application sur la peau du visage ou du le corps. De façon avantageuse, les compositions selon l'invention se présentent sous la forme d'un gel, d'une crème, d'une émulsion, d'un lait, d'un spray, etc.... Avantageusement, les oligogalacturonides des compositions selon l'invention sont obtenus par hydrolyse enzymatique d'une pectine. La pectine est constituée d'une chaîne principale appelée acide pectique comprenant un enchaînement de sucres type acide galacturonique. Les sucres constitutifs peuvent être méthylés ou estérifiés, et la proportion des sucres transformés est caractéristique d'une espèce végétale. La chaîne principale est parfois interrompue par l'insertion d'une chaîne latérale de sucres neutre type rhamnose ou glucose. Les oligogalacturonides, autrefois désignés oligosaccharines, ont été décrits comme de véritables hormones végétales (Darvill et al., Glycobiology, vol 2, n 3, ppl81-198, 1992). Ils peuvent être préparés par hydrolyse de la pectine et la taille ou degré de polymérisation des oligogalacturonides est fonction des conditions de la réaction d'hydrolyse. La Demanderesse a maintenant mis au point un procédé de préparation d'oligogalacturonides permettant d'obtenir un produit industriel efficace comme agent cosmétique. De nombreuses pectines sont disponibles dans le commerce en grande quantité et de qualité variable. Souvent il s'agit de pectines standardisées qui sont fréquemment additionnées de sucres afin de permettre une homogénéisation des viscosités entre les lots. En effet, la première utilisation de ces pectines est liée à leurs propriétés gélifiantes et comme agent de viscosité. De préférence, les oligogalacturonides mis en oeuvre dans les compositions de l'invention sont préparés par hydrolyse de pectine présentant un degré de méthylation et d'estérification faible afin d'être le plus proche possible de l'acide polygalacturonique. A titre d'exemple d'une telle pectine, on peut citer les pectines type HERBSTREITH et FOX Classic AU 910 issue de pomme (pectine type HB AU). Les enzymes utilisées pour l'hydrolyse de pectine sont de type industriel fréquemment utilisées dans l'industrie de fabrication des jus de fruits. Il s'agit de cocktails d'enzymes conçus pour couper les pectines membranaires et ainsi permettre une meilleure extraction des jus de fruits par la fragilisation des structures avant pressage. Elles permettent également de clarifier les jus dans lequel un trouble, souvent lié aux pectines, n'est pas souhaitable. A titre d'exemple d'une telle enzyme, ont peut citer celle commercialisée par la société LYVEN Clarification granulé. Le coktail enzymatique comprend des pectinases ayant principalement des activités polygalacturonase, méthyl estérase et polygalacturonase lyase. Un procédé préféré de préparation d'oligogalacturonides selon l'invention comprend les étapes suivantes : - l'hydrolyse d'une solution de pectine à une concentration de 0,1 à 10 % et de préférence à 1%, à un pH de l'ordre de 4,5 par addition à la dite solution de pectine, d'une solution d'enzyme comprenant de 10 à 1000 et de préférence 100 unités polygalacturonase, pour obtenir dans la solution finale de 1 à 10 et de préférence 4 unités pectinase ; - l'arrêt de l'hydrolyse ; - la séparation des polymères de haut poids moléculaire et la récupération des oligogalacturonides. Avantageusement, l'hydrolyse est effectuée à 500C pendant 2 heures puis stoppée par chauffage à 700C pendant 1 heure ou 1000C pendant 5 minutes. Après refroidissement, les polymères de haut poids moléculaire sont précipités par ajout de HCl IN puis éliminés par centrifugation par exemple à 5000 g pendant 30 minutes ou par filtration. Le pH du surnageant est réajusté en final à une valeur comprise entre 6 et 8, par exemple de l'ordre de 6,9. L'invention a aussi pour objet l'utilisation en cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, d'oligogalacturonides comme définis ci-dessus, comme agent stimulant l'adhérence des kératinocytes basaux aux deux protéines majeures de la JDE, que sont la laminine V et le collagène IV, et destinée à palier les dérèglement de communication entre le derme et l'épiderme au cours du vieillissement cutané. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation d'oligogalacturonides et leur utilisation comme agent cosmétique. l - Préparation des oligogalacturonides. 1) Mode opératoire. Pectine : mise en solution de 0,1 à 10 % (1% de pectine HB AU910). Le pH est ajusté à 4,5 de préférence avec une solution d'acide acétique Enzyme : Il est préparé une solution correspondant à 10 à 1000, de préférence 100 unités polygalacturonase. La solution enzymatique est ajoutée dans la solution de pectine afin d'obtenir en final de 1 à 10 de préférence 4 unités pectinase. L'hydrolyse est effectuée à 50 C pendant 2 heures puis stoppée par chauffage à 70 C pendant 1 heure ou 100 C pendant 5 minutes. Après refroidissement, les polymères de haut poids moléculaire sont précipités par ajout de HCl IN puis éliminés par centrifugation par exemple à 5000 g pendant 30 minutes ou par filtration. Le pH du surnageant est réajusté en final à une valeur comprise entre 6 et 8, par exemple de l'ordre de 6,9. Les oligogalacturonides formés sont avantageusement atomisés ou lyophilisés en final afin de permettre une meilleure conservation et des manipulations plus aisées. 2) Analyse des oligogalacturonides formés par HPLC. Une technique d'analyse permettant d'obtenir le profil chromatographique des oligogalacturonides formés a été mise au point. Colonne : TSK gel DEAE 5-PW (TOSOHAAS) Eluant : CH3COONH4 1M/H20 en gradient d'élution. Débit phase mobile : lml/min Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL ; ALTECH). Température du four : 130 C. Débit d'azote : 4, OSLPM (standard liter per min) : conditions standards pour H20 en tant que solvant. Le choix du gradient est rapporté dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Temps en min % A (CH3COONH4 1M) zu (H20) 0 10 90 1 30 70 3 30 70 30 50 50 45 50 50 On observe une répartition des oligomères de taille (dp : degré de polymérisation) de 1 à 5. L'absence de standard ne permet pas de doser les oligomères de dp 4 et 5 mais il est possible de doser les oligomères les plus courts. Si on procède selon les conditions décrites à l'hydrolyse d'une solution de pectine de concentration 10 g/l, la concentration totale en acide mono, di et trigalacturonique est d'environ 4,5 g/l en final, donc environ 45 % en poids de la pectine mise en solution. II-Effets des oligogalacturonides sur l'adhésion des kératinocytes humains à la laminine V et au collagène IV. 1) Matériel et méthodes. a) Culture des kératinocytes en milieu défini. Le milieu de culture utilisé a été le milieu défini pour culture de kératinocytes 154 (+additif HKGS) fabriqué par Cascade Inc. (USA) et commercialisé par Tébu (France) contenant 0,2mM de CaCI2, pH 7,2 à 7,4. Les kératinocytes sont obtenus selon la technique décrite par Boyce et Ham (Boyce ST, Ham RG, J invest. Dermatol., 1983,81, 33s-40s). Des morceaux de peau issus de prépuce humain (circoncision) sont traités de manière à en isoler les kératinocytes humains basaux. 3. 104 cellules vivantes sont ensuite ensemencées par cm2 sur des boîtes pour culture de tissus de 25 cm2 (Corning, Polylabo, France). Les kératinocytes sont cultivés à 37 C dans un incubateur à C02 (5% deC02, 95% d'air et 98ù d'humidité). Le milieu est changé tous les deux jours. La sub-culture a lieu quand les cellules atteignent la sub-confluence. Le tapis cellulaire est alors rincé avec du PBS, puis les cellules sont trypsinées en utilisant la technique classique de trypsination (Trypsine-EDTA (0,05-0, 02%) à 37 C). Les cellules sont alors ensemencées dans des boîtes de culture de 75 cm2. La congélation des cellules, 3 à 5 millions par ampoule, est réalisée dans le milieu de culture utilisé, en présence de 10% de Diméthyl sulfoxyde (DMSO) et 20 % de sérum de veau sous un volume de 1 ml. b) Analyse quantitative de l'adhérence cellulaire par un test colorimétrique. - Préparation des substrats d'adhérence. Afin d'établir la concentration idéale des protéines d'adhérence qui seront utilisées ultérieurement, une dose-réponse pour chacun des substrats d'adhésion a été effectuée. Le collagène IV (Becton Dickinson, France), la fibronectine (Becton Dickinson, France) et la laminine5, purifiée au laboratoire (Pousselle P. et al J. cell. biol., 1991 114 (3) ; 567-576) sont utilisés au cours de nos expériences. Une gamme de 7 concentrations décroissantes est réalisée par dilution successive dans de l'eau distillée, à partir d'une solution de départ à 10 jig/ml. Ces solutions sont immédiatement distribuées sur des plaques de culture 96 puits (Costar, Dutscher, Brumath, France) à raison de 100 gag par puit. Les plaques sont ensuite placées à +4 C pendant 16 à 18 heures. Les solutions sont ensuite enlevées par retournement des plaques et chaque puits est saturé par une solution aqueuse de SAB 1% (3 puits supplémentaires sans substrat ont subi le même traitement et ont servi de blanc). - Test d'adhérence cellulaire. Les cellules sont trypsinées comme décrit précédemment, puis suspendues dans du milieu 154 sans additifs (3 X 105 cellules/ml) puis ensemencées en passage 2 dans des plaques multipuits de 100 l/puits. - Evaluation du test d'adhérence cellulaire. Après ensemencement des cellules, les plaques multipuits sont placées dans un incubateur à 37 C pendant une durée de 45 minutes en présence ou en absence du mélange d'oligogalacturonides à différentes concentrations non cytotoxiques dans le milieu de culture. Un contrôle positif est réalisé en parallèle (chlorure de manganèse (0. 5mM)) afin de valider l'expérience. Après l'incubation, les cellules sont observées au microscope contraste de phase afin de vérifier que le test s'est correctement déroulé. L'étalement caractéristique des kératinocytes sur la laminine 5 (Rousselle P. and Aumilley M., J cell biol., 1994 125 (1) 205-214) a été pris en compte. Après rinçage, les cellules restantes, adhérentes au substrat, sont fixées à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 1% dans du PBS, pendant 15 minutes. Après élimination du fixateur, les cellules sont colorées avec une solution de crystal violet dilué à 1% dans de l'eau distillée pendant 30 minutes. Après d'importants rinçages à l'eau, les cellules sont perméabilisées par une solution de triton à 0, 02% pendant 15 minutes, afin de solubiliser le crystal violet. La lecture de l'absorbance est effectuée à 570 nm, à l'aide d'un lecteur de plaques ELISA. Chaque point expérimental est réalisé en trois exemplaires. La valeur du blanc représente la moyenne de l'absorbance des 3 puits témoins (BSA). Celle-ci est soustraite à chacune des valeurs de densité optique obtenues pour les points expérimentaux. On a ensuite calculé les moyennes des trois valeurs d'absorbances pour chacune des tripliquettes. 2) Résultats. a) Etude de l'adhésion de keratinocytes humains normaux sur la laminine V. Le chlorure de Manganèse (0,5 mM) est utilisé comme contrôle positif pour l'adhésion des cellules au substrat. Le résultat d'adhérence obtenu avec les cellules sans actif et sans contrôle positif est fixé arbitrairement à 100%. L'actif identifié ici constitue la solution de référence Oligosaccharides Type oligo G04 (non lyophilisé) Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Laminine 5 % SD Laminine 5 % SD 3 g/ml 1,5 fig/ml Cellules seules 100 Cellules seules 100 Mn Cl 2 97 6,4 Mn Cl 2 109 5,1 Solvant 101 0,96 Solvant 107 7,9 Actif 5% 103 0,16 Actif 5% 119 1,4 1% 116 14 1% 100 7,5 0, 01% 105 7,2 0,01% 105 7,5 Le mélange a induit une augmentation de 116% sur la laminine V à la concentration de 1% b) Etude de l'adhesion de keratinocytes humains normaux sur le collagène IV. Le chlorure de Manganèse (0,5 mM) est utilisé comme contrôle positif pour l'adhésion des cellules au substrat. Le résultat d'adhérence obtenu avec les cellules sans actif et sans contrôle positif est fixé arbitrairement à 100%. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Collagène IV % SD Collagène IV % SD 20). Lg/ml 10). Lg/ml Cellules seules 100 Cellules seules 100 Mn Cl 2 357 29 Mn Cl 2 280 10 Solvant 105 2, 3 Solvant 90 3 Actif 5% 84 4,7 Actif 5% 66 6 1% 126 17 1% 90 15 0, 01% 101 5,9 0,01% 80 2, 5 Le mélange a induit une augmentation de 126% sur le collagène IV à la concentration de 1% III-Incorporation dans une formule cosmétique. En équivalent sec, les oligogalacturonides peuvent être incorporés de la dose de 0,01 à 5 %, de préférence à une dose de 0,5 % 1) Exemple de composition sous forme d'émulsion. Eau QSP Oligogalacturonides dp 1 à 5 (matière 0, 01% à 5 % sèche) Mélange de Conservateurs 1, 5% Propylèneglycol 5, 00% Gomme xanthane 0, 30% Copolymère acrylique/acrylate 0, 50% Acide stéarique 100 OE** 3, 00% Stéarate de sorbitan 2, 00% Sorbitan laurate 20 OE 3, 00% Alcool Cétylstéarique 1, 50% Cire d'abeille 1, 00% Huile de germe de blé 5, 00% Diméthicone 2, 00% Cyclométhicone 5, 00% Gel de polyarcriamide 2, 00% Parfum 0, 10% ** acide stéarique avec 100 moles d'OE 2) Exemple de composition sous forme de crème. Eau QSP Oligogalacturonides dp 1 à 5 (matière 0,001% à 0,1% sèche) Gomme xanthane 0,30% Séquestrant (par ex. EDTA) 0,05% Conservateurs 1, 50% Acide C18 2, 50% Acide C16 2,50% Trilaurine 1,00% Beurre de Karité 3,00% Acétate de topophérol 0,05% ss-bisabolol 0,05% Huile végétale (germe de blé) 5,00% Diméthéticone 3, 00% Acide polyacrilique 0,30% TEA (Triéthanolamine) 1,50% Parfum 0,10% 3) Exemple de composition sous forme de lotion. Oligogalacturonides dp 1 à 5 (matière 0,001 à 0, 1% sèche) Eau QSP Agent séquestrant 0, 05% Propylèneglycol 2, 00% Mélange Conservateurs 1, 5% Alcool 5 à 50% Alcool oléique 20 OE 1, 00% Parfum 0, 05% REVENDICATIONS 1) Composition cosmétique ou dermatologique pour le soin de la peau, et plus particulièrement pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend des oligogalacturonides. 2) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les oligogalacturonides présentent un degré de polymérisation compris entre 1 et 5. 3) Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend, en équivalent sec par rapport au poids total de la composition, de 0,01 à 5 % et de préférence 0,5 % d'oligogalacturonides. 4) Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les oligogalacturonides sont obtenus par hydrolyse enzymatique d'une pectine, ladite hydrolyse étant réalisée par un coktail enzymatique comprenant des pectinases ayant principalement des activités polygalacturonase, méthyl estérase et polygalacturonase lyase. 5) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que oligogalacturonides sont obtenus selon le procédé comprenant les étapes suivantes : - l'hydrolyse d'une solution de pectine comme à une concentration de 0,1 à 10 % et de préférence à 1%, à un pH de l'ordre de 4,5 par addition à la dite solution de pectine, d'une solution d'enzyme comprenant de 10 à 1000 et de préférence 100 unités polygalacturonase, pour obtenir dans la solution finale de 1 à 10 et de préférence 4 unités pectinase ; - l'arrêt de l'hydrolyse ; - la séparation des polymères de haut poids moléculaire et la récupération des oligogalacturonides. 6) Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'hydrolyse de la solution de pectine est réalisée avec une solution d'enzyme comprenant des pectinases ayant principalement des activités polygalacturonase, méthyl estérase et polygalacturonase lyase. 7) Composition selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que l'hydrolyse est effectuée à 500C pendant 2 heures puis stoppée par chauffage à 700C pendant 1 heure ou 1000C pendant 5 minutes. 8) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que après refroidissement, les polymères de haut poids moléculaire sont précipités par ajout de HCl IN puis éliminés par centrifugation par exemple à 5000 g pendant 30 minutes ou par filtration, et en ce que le pH du surnageant est réajusté en final à une valeur comprise entre 6 et 8, par exemple de l'ordre de 6,9.