FR 2831890 A1 20030509 FR 0209551 A 20020726 UTILISATION DU GENE DE LA CBG COMME MARQUEUR GENETIQUE DE L'HYPERCORTISOLEMIE ET DES PATHOLOGIES ASSOCIEES. La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour la transcortine (ou CBG=corticosteroid binding globulin) comme marqueur génétique de l'hypercortisolémie constitutive et comme nouvelle cible thérapeutique de pathologies associées à l'hypercortisolémie. L'invention a pour application 1) la sélection des animaux d'élevage ayant une plus faible probabilité de développer une hypercortisolémie 2) le diagnostic génétique de patients susceptible de développer une hypercortisolémie. 3) le traitement de pathologies liées à l'hypercortisolémie constitutive. Sont décrites les méthodes d'identification des marqueurs génétiques de la transcortine et les méthodes de criblage génétique pour déterminer les individus susceptibles de développer une hypercortisolémie. Les hormones glucocorticoïdes, cortisol chez l'homme et le porc, corticostérone chez les rongeurs, sont impliquées dans de nombreux processus biologiques comme la néoglucogénèse, le métabolisme lipidique et protéique, l'action anti-inflammatoire et la croissance. Les glucocorticoïdes sont aussi un composant majeur des réponses de stress. Après exposition à un stress, le cortisol est rapidement libéré des glandes surrénales pour fournir l'énergie nécessaire à la réponse comportementale. Par rétrocontrôle négatif, le niveau de cortisol retourne à des valeurs de base lorsque ce stimulus est contrôlé par l'individu. Dans le cas contraire, comme dans les situations de stress chronique, les niveaux élevés et constants de cortisol sont fortement délétères pour l'organisme. Ainsi, le cortisol et l'axe corticotrope en général sont impliqués dans diverses pathologies dont l'obésité (Rosmond et al., 1998), la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes (Sternberg and Gold, 1997), le vieillissement (Lupien et al., 1998) ou la sensibilisation aux drogues d'abus (Piazza and Le Moal, 1998). Une importante variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est observée entre individus, ce qui influence la vulnérabilité individuelle aux pathologies citées ci-dessus. Cette variabilité est en partie d'origine génétique comme en témoignent plusieurs études de jumeaux portant sur la réactivité de l'axe corticotrope au stress et son activité circadienne (Meikle et al., 1988 ; Kirschbaum et al., 1992 ; Linkowski et al., 1993). De même, des différences fonctionnelles de l'axe corticotrope ont été mises en évidence entre diverses lignées consanguines de souris ou de rats (Armario et al., 1995 ; (Marissal-Arvy et al., 1999) ou entre races de porcs (Désautés et al., 1999). L'identification des gènes supportant cette variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est donc d'une grande importance pour la santé humaine et animale. Chez l'homme, des études d'association ont été menées entre des gènes régulateurs de l'axe corticotrope et des pathologies liées au dysfonctionnement de cet axe. Par exemple, des polymorphismes du récepteur aux glucocorticoïdes ont été trouvés associés à l'obésité abdominale (Buemann et al., 1997). Les Inventeurs se sont précisément intéressés à identifier ces gènes selon (i) des approches ne posant pas d'hypothèse de départ et utilisant la cartographie génétique de locus de traits quantitatifs ou QTL (Quantitative Trait Loci) sur modèles animaux (Moisan et al., 1996), et (ii) des approches gènes candidats basés sur la connaissance du rôle de ces gènes dans le fonctionnement de l'axe corticotrope (Marissal-Arvy et al., 2000). Ces deux stratégies ont été mises en oeuvre sur le gène codant pour la transcortine, et les travaux ayant conduit à la présente Invention ont concerné à la fois une analyse de QTL et de la fonction connue de ce gène. La transcortine ou CBG (corticosteroid-binding globulin) est une protéine de liaison plasmatique des hormones glucocorticoïdes qui a été étudiée pour son rôle de transporteur du cortisol et son influence sur la biodisponibilité de celui-ci. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence le rôle de la transcortine sur la production du cortisol et son implication dans la variabilité de la cortisolémie chez le porc. Ces résultats ont été obtenus suite aux travaux des Inventeurs sur la recherche des gènes influençant le fonctionnement de l'axe corticotrope chez le porc, et mettant en oeuvre la méthode de cartographie génétique de QTL sur un croisement de deux races porcines : Large White européen et Meishan chinois. Une forte liaison génétique a été trouvée entre les concentrations plasmatiques de cortisol des porcs et un locus du chromosome 7 porcin (Bidanel et al., 2000). Par cartographie comparée avec le génome humain, il s'est avéré maintenant que le gène de la transcortine se trouvait dans l'intervalle défini par l'analyse génétique : - le gène Cbg porcin se trouve effectivement dans la région du QTL (démontré par FISH et par cartographie sur hybrides irradiés), - l'analyse de liaison génétique faite avec la concentration plasmatique de transcortine (au lieu du cortisol) sur la même population F2 montre également une forte liaison avec le locus du chromosome 7, - la concentration de CBG est différente chez les deux races de porcs parentaux Large White et Meishan, - une mutation intéressante a été trouvée dans la région codante du gène Cbg chez le porc Meishan. Le gène Cbg constitue donc un candidat de position pour ce QTL chez le porc. Ces résultats de l'analyse de liaisons génétiques mettent en évidence, pour la première fois, une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la transcortine et la production de cortisol. Par ailleurs, le porc Meishan qui est hypercortisolémique est également obèse et montre un retard de croissance par rapport au Large White ce qui pourrait être une conséquence de ses taux élevés de cortisol. En faveur de cette hypothèse, une corrélation positive a été trouvée chez les individus F2 entre les taux de cortisol et l'épaisseur de lard dorsal. Cette relation a été retrouvée dans une population F2 Duroc x Large White entre cortisol urinaire, lard dorsal et proportion de viande maigre dans la carcasse (Mormède P. non publié). Suite à ces résultats une nouvelle analyse statistique a permis de mettre en évidence une liaison génétique entre l'épaisseur de lard dorsal et le locus du chromosome 7 dans la population de porcs F2 (Meishan x large White). La figure 5 illustre la liaison génétique entre l'épaisseur de lard dorsal et le QTL d'hypercortisolémie. Le gène cbg se trouve en position 1,35 Morgan du chromosome 7, au pic du second QTL présenté sur cette figure. Cortisolémie et dépôt de gras convergent donc vers ce locus contenant le gène de la transcortine. Le porc Meishan représente donc un excellent modèle pour l'étude de la variabilité génétique de l'axe corticotrope et ses conséquences physiopathologiques, pour l'obésité en particulier. Il convient en outre de rappeler que chez la souris, un locus génomique associé à l'obésité a été mis en évidence en 1995 par Warden (Warden et al., 1995). Avec les données actuelles sur le génome de la souris, il est possible de voir que la CBG est au pic de l'intervalle de confiance de ce QTL et constitue de nouveau dans ce modèle un bon candidat de position. Enfin, chez l'homme une relation inverse entre la concentration de CBG et l'hyperinsulinémie a été rapportée au cours de l'obésité, tandis que les diabétiques ont une CBG plus élevée (Fernandez-Real et al., 1999) (Fernandez-Real et al., 2000). Ces relations pourraient s'expliquer par l'effet inhibiteur de l'insuline sur la production hépatique de CBG (Crave et al., 1995). Des variants moléculaires de la transcortine chez l'homme ont été décrits dans la littérature (Van Baelen et al., 1982) (Smith et al., 1992) et dans deux études les patients ayant une mutation dans le gène de la transcortine sont obèses (Emptoz-Bonneton et al., 2000 ; Torpy et al, 2001) L'ensemble des données recueillies dans diverses espèces animales à partir de différentes approches, permet de considérer les variations de la CBG au cours de l'obésité comme un facteur important de la biodisponibilité du cortisol impliqué dans la physiopathologie de la maladie. Ces résultats sont remarquables car aucun marqueur de cortisolémie constitutive n'est disponible à ce jour. Un tel marqueur permet de déterminer à partir d'un échantillon de sang, et dès la naissance, la cortisolémie d'un individu. Cette cortisolémie va influencer la vulnérabilité à l'obésité, aux réactions auto-immunes et inflammatoires, la vitesse de croissance, le vieillissement, la toxicomanie. L'invention trouve donc des applications dans le domaine de la sélection d'animaux d'élevage, comme le porc, portant des allèles favorables du gène de la transcortine, ainsi que pour le diagnostic génétique chez l'homme de prédisposition à l'hypercortisolémie constitutive et ses conséquences pathologiques ci-dessus. Enfin, l'invention permet de disposer d'un nouvel outil de criblage de substances utiles pour traiter ces pathologies liées à un dysfonctionnement de l'axe corticotrope. L'invention a donc tout d'abord pour objet une méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie comprenant la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes. On entend par individus tant des sujets humains que des animaux. Avantageusement, lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3'ou 5'adjacente éloignée préférentiellement au plus de 100kb. A titre d'exemple, la séquence de l'ADNc du gène Cbg de porc et une séquence 5'adjacente de ce gène, qui sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 respectivement, peuvent être utilisées pour rechercher des marqueurs de l'hypercortisolémie. Ces marqueurs peuvent être obtenus à partir de clones génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou des séquences flanquantes, eux-mêmes obtenus à partir d'un criblage de banque d'ADN avec une sonde spécifique du gène Cbg comme décrit dans la partie 4) de la section Matériel et Méthodes. Ces marqueurs polymorphes peuvent être par exemple des microsatellites, des polymorphismes d'insertion/délétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP). Le séquençage d'un segment d'ADN couvrant le locus polymorphe permet de définir des amorces nucléotidiques permettant l'amplification spécifique dudit segment à partir d'ADN génomique total d'un individu. L'invention a donc également pour objet un marqueur polymorphe associé au phénotype d'hypercortisolémie constitué de tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique comprenant le gène Cbg ou les séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb. L'invention concerne également des amorces nucléotidiques flanquant le marqueur ci-dessus. De telles amorces comprennent de 5 à 50 de préférence de 10 à 30 nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb, flanquant un marqueur défini ci-dessus. L'invention se rapporte aussi à une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes. Une telle méthode comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu à partir de sang, de tissu ou de sperme, en général, l'ADN est purifié à partir des leucocytes obtenus d'un prélèvement sanguin selon les techniques classiques, puis ii) l'amplification du locus contenant le marqueur polymorphe par la réaction de polymérase en chaîne (ou PCR) à partir dudit ADN, à l'aide des amorces définies ci-dessus, et iii) la détection du ou des allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié. Selon le type de polymorphisme du marqueur, différentes techniques peuvent être utilisées : Pour les polymorphismes de longueur (microsatellites, insertion/délétion, RFLP) les allèles présents dans les ADN amplifiés des différents individus sont détectés par les techniques classiques d'électrophorèse, avantageusement précédées d'une digestion enzymatique pour les RFLP. Pour les mutations ponctuelles, polymorphismes de type SNP, les techniques utilisées incluent par exemple la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al, 1989 PNAS 86 : 2766-2770), la PCR allèle-spécifique (Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17,2427- 2448) ou le séquençage direct de l'ADN amplifié. La détection des allèles du marqueur chez un individu permet de prédire si celui-ci est plus susceptible de développer une hypercortisolémie. Un exemple d'une telle mutation ponctuelle dans le gène Cbg est décrit dans la figure 4 en annexe. La présente invention concerne également l'utilisation d'une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes pour la sélection ou contresélection d'animaux d'élevage, notamment de porcs, ayant une forte probabilité de développer une hypercortisolémie et un taux d'engraissement élevé. Les travaux de la Demanderesse ont permis la détection, à partir de la séquence des exons du gène Cbg chez les porcs FI et FO, les polymorphismes suivants : transition G # T correspondant à la position 133 de la SEQ ID NO. 1, transition C- T correspondant à la position 134 de la SEQ ID NO. 1, - transition T-C correspondant à la position 539 de la SEQ ID NO. 1, transition A- G correspondant à la position 620 de la SEQ ID NO. 1, transition G # A correspondant à la position 626 de la SEQ ID NO. 1, transition C- T correspondant à la position 859 de la SEQ ID NO. 1, transition C # T correspondant à la position 866 de la SEQ ID NO. 1, transition A- G correspondant à la position 882 de la SEQ ID NO. 1, transition G # C correspondant à la position 890 de la SEQ ID NO. 1, transition C- T correspondant à la position 960 de la SEQ ID NO. 1, transition G # A correspondant à la position 1008 de la SEQ ID NO. 1, - transition T C correspondant à la position 42 de la SEQ ID NO. 6, - transition C T correspondant à la position 49 de la SEQ ID NO. 6, - transition C T correspondant à la position 75 de la SEQ ID NO. 7. Les séquences SEQ ID NO. 6 et 7 dans la liste de séquences en annexe correspondant respectivement à la partie 5'et à la partie 3'de l'intron C du gène Cbg de porc. Par conséquent, la présente invention concerne l'utilisation d'une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes, dans laquelle les allèles du marqueur polymorphe tel que défini précédemment présente une des mutations décrites ci-dessus. L'invention vise également à offrir un kit pour la mise en oeuvre de la méthode ci-dessus permettant de tester les marqueurs génétiques de l'hypercortisolémie à partir d'un échantillon d'ADN. Un tel kit comprend une paire d'amorces nucléotidiques comme définies précédemment qui seront utilisées avec des réactifs d'amplification par PCR disponibles commercialement. Le kit peut aussi inclure des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs. L'invention se rapporte aussi à une méthode pour identifier des substances capables de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolémie. En effet, la protéine CBG, de type sauvage ou mutante, peut être utilisée pour un criblage in vitro de composés capables de modifier la liaison de la CBG au cortisol et/ou à la corticostérone. En conséquence, l'invention a pour objet une méthode d'identification de substances capables de moduler la fonction de la CBG consistant à mesurer par toute technique appropriée la liaison du composé à la CBG (sauvage ou mutante). Il peut s'agir d'une technique utilisant les méthodes de criblage à grande échelle décrites dans la littérature comme par exemple dans l'ouvrage High throughput screening : The discovery of Bioactive Substances , JP Delvin (Ed), Marcel Dekker Inc. New York (1997). L'activité de liaison entre la CBG et un composé actif peut par exemple être déterminée par un test de radio-liaison dans lequel la capacité de liaison et l'affinité des composés à tester sont estimés par leur capacité de déplacement de cortisol radioactif. La source de CBG est obtenue par exemple par transfection d'un vecteur contenant l'ADNc du gène Cbg dans des cellules en culture. La protéine étant sécrétée, le test de radioliaison peut-être réalisé sur le milieu de culture. Les composés entrant efficacement en compétition avec le cortisol seront sélectionnés. L'invention concerne également l'utilisation d'animaux surexprimant le gène Cbg ou exprimant un mutant de ce gène comme modèle d'étude pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et/ou pour cribler des composés capables de moduler l'expression de la CBG. De plus, l'invention concerne des animaux transgéniques dont le transgène contient une séquence d'acide nucléique contenu dans le gène Cbg ou les séquences 3'et 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100 kb. De préférence, les séquences choisies codent pour un polypeptide identique ou homologue à la protéine CBG. A titre d'exemple, ces animaux transgéniques sont obtenus par micro-injection dans des embryons de l'animal (par exemple souris, rat, porc) d'un acide nucléique contenant la séquence codante du gène Cbg (par exemple SEQ ID nOl) ainsi que des séquences régulatrices permettant sa sur-expression dans le tissu cible (dans ce cas le foie) comme il est classiquement d'usage pour cette technologie. Ces animaux peuvent être utilisés comme modèle technique pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et les pathologies associées à l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies. Ces animaux peuvent être utilisés pour cribler des composés capables de moduler la fonction de la CBG. Le criblage de composés peut être réalisés par l'administration à l'animal du composé à tester suivie de la mesure des altérations dans ledit animal de la fonction corticotrope par les méthodes classiques. La présente invention concerne également une méthode de criblage d'un composés capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolémie et par voie de conséquence de soigner les pathologies liées à cette hypercortisolémie comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes ou encore les pathologies du vieillissement ou la sensibilisation à l'abus de drogues. Cette méthode comprend la production de la protéine CBG à partir de cellules en culture, par exemple, les cellules HepG2 et le test dudit composé vis-à-vis de la production de ladite protéine. Avantageusement, ce criblage est un criblage à grande échelle. La présente invention concerne également une méthode de criblage d'un composé capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol caractérisée en ce qu'elle comprend le criblage in vivo sur un animal transgénique tel que décrit précédemment, d'un composé identifié in vitro selon la méthode de criblage ci-dessus. L'identification des marqueurs génétiques selon l'invention permet de disposer de nouveaux outils pour la réalisation de tests génétiques pour la CBG afin d'évaluer l'hypercortisolémie constitutive et par voie de conséquence la vulnérabilité aux pathologies indiquées précédemment et notamment l'obésité. Un tel test est également utile pour la contre-sélection d'animaux d'élevage montrant une hypercortisolémie constitutive. A titre d'exemple, une telle méthode comprend l'amplification par PCR d'une région de l'ADN de l'échantillon comprenant tout ou partie du gène Cbg puis l'analyse de cette région pour identifier la présence d'au moins une mutation responsable d'une hypercortisolémie et susceptible d'avoir été identifiée par la méthode décrite précédemment. L'invention se rapporte donc aussi à l'utilisation de la méthode ci-dessus pour le diagnostic d'une hypercortisolémie ou d'une prédisposition à une hypercortisolémie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus. L'invention se rapporte enfin à l'identification de composé agoniste ou antagoniste de la CBG et donc capable d'agir directement sur le taux de CBG ou sur son affinité pour le cortisol ce qui indirectement réduira le taux de corticostéroïdes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'identification de mutations dans le gène Cbg chez le porc et l'analyse de liaisons génétiques mettant en une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la CBG et la production de cortisol. Il sera fait référence aux figures en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente la localisation du gène Cbg de porc par cartographie sur hybrides irradiés. En A : Evolution du taux maximal de vraisemblance le long de Sscr 7 (en cM) pour les concentrations de cortisol plasmatique. En B : profil de cartographie par hybrides irradiés du chromosome 7 de porc. Les distances sont en cR7000. - la figure 2 représente la localisation du gène Cbg de porc à 7q26 par FISH. - La figure 3 représente l'analyse de liaison génétique des concentrations de CBG plasmatique sur 81 porcs F2. La figure 4 représente la détection de mutation dans la séquence génomique de Cbg. Les flèches indiquent le nucléotide pour lequel le porc Fl&num;9110045 et sa mère Meishan sont hétérozygote (T/G) alors que le père LW est homozygote (G/G). 1-Matériel et Méthodes. 1) Cartographie sur hybrides irradiés. Les réactions ont été réalisées indépendamment en double sur un panel ImpRH (Yerle et al., 1998). Les produits de PCR ont été analysés sur des gels d'agarose 2% en tampon IX TBE après coloration au bromure d'éthidium. Une troisième amplification a été effectuée sur les clones pour lesquels des résultats discordants avaient été obtenus. Les vecteurs des résultats d'amplification ont été soumis à la banque ImpRH (Milan et al. 2000). 2) Cartographie FISH. Les chromosomes en métaphase ont été obtenus à partir de cultures de lymphocytes de sang périphérique. Pour identifier les chromosomes, les métaphases ont été marquées en bandes G en utilisant une technique G-T-G avant hybridation, et les images des meilleures métaphases ont été prises avec une imprimante vidéo comme décrit antérieurement (Yerle et al., 1992). Les expériences d'hybridation in situ ont été réalisées conformément à Yerle et al. (Yerle et al., 1992). Avec quelques modifications (Sun et al., 1999). 3) Analyse de liaisons génétiques. La distribution des données selon une loi normale a d'abord été vérifiée. Les quatre caractères présentaient des distributions logarithmiques normales et les données ont été transformées en scores logarithmiques avant analyse. La cartographie QTL a été effectuée en utilisant des techniques de vraisemblance maximum multipoints. Un test statistique défini comme le rapport des vraisemblances sous les hypothèses de un (Hl) contre pas (HO) de QTL lié au jeu de marqueurs considéré a été calculé en chaque position (chaque cM) le long du chromosome. La carte de marqueur du chromosome 7 utilisée a été calculée à partir des génotypes de plus de 1100 porcs par Bidanel et al. (2000). Selon l'hypothèse Hl, un QTL avec un effet de substitution de gène pour chaque père et mère a été adapté aux données. D'autres détails sur les procédures de calcul de probabilités peuvent être trouvés dans Bidanel et al. (2000). Les estimations des effets moyens de substitution ont été calculées à chaque position avec le plus fort rapport de probabilité. Les seuils de signification le long des chromosomes ont été déterminés empiriquement en simulant les données en supposant un modèle infinitésimal et une distribution normale des performances. Un total de 50 000 simulations ont été réalisés pour chaque caractère. Le niveau de signification du test chromosomique Pc correspondant à un test de probabilité du génome entier Pg a été obtenu en utilisant la correction de Bonferroni, i. e. en tant que solution de : Pg = 1 (1-PC) 19, qui donne Pc = 0,0027 et 0,000054, respectivement, pour des niveaux significatifs (Pg = 0, 05) et très significatif (Knott et al., 1998). 4) Criblage de la banque d'ADN de BAC. Les clones BAC ont été isolés par criblage PCR trois dimensions d'une banque porcine de clones BAC comme décrit précédemment (Rogel-Gaillard et al., 1999). Le clone BAC 383F4 contenant la séquence CBG de porc a été cloné en utilisant une paire d'amorces établie à partir de la séquence de l'exon 2 de CBG humaine : FW : ACACCTGTCTTCTCTGGCTG (SEQ ID NO : 4) REV : ACAGGCTGAAGGCAAAGTC (SEQ ID NO : 5) Les PCR ont été réalisés sur 35 cycles de 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 56 C, 30 secondes à 72 C, dans un volume de réaction de 20 gl contenant 0,2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCl2 ; 8pM de chaque amorce, 2U de Taq DNA polymérase et de tampon de réaction (Perkin-Elmer, Roche). 5) Séquençage. Les réactions de séquences ont été réalisées avec le kit Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators (Perkin Elmer) sur un séquenceur automatique PE 970. La capacité de liaison de CBG et son affinité pour le cortisol ont été mesurées à 40C par un test de fixation en phase solide utilisant une colonne Concavalin A-Sepharose (Pugeat et al., 1984). La constante d'équilibre d'association (Ka) et la capacité de CBG pour le cortisol ont été calculées par une analyse de Scatchard utilisant bound comme la quantité de cortisol spécifiquement fixée aux glycoprotéines adsorbées sur le gel et free comme la concentration de cortisol dans la phase aqueuse. 7) Statistiques. Les matrices de corrélation et le test Student t ont été effectués en utilisant la version 5 du logiciel Statistic. II-Résultat. 1) La cartographie comparative permet de proposer le gène Cbg comme candidat au QTL d'hypercortisolémie. Goureau et al. (2000) ont décrit les correspondances des segments de chromosomes humains et porcins en utilisant une analyse de peinture chromosomique bi-directionnelle. Le QTL cortisol flanqué par les marqueurs S0101 et Sw764 a été localisé sur la région porcine 7q2. 4-7q2. 6. Parmi les gènes localisés sur la région hortologue humaine (Hsapl4q), le gène codant pour la CBG localisé en Hsapl4q32. 1 (Billingsley et al., 1993) a retenu l'attention. En effet 90% du cortisol plasmatique est fixé à la CBG qui est une glycoprotéine synthétisée par le foie. Puisque seulement le cortisol libre est actif, la CBG a un rôle majeur dans le bio-disponibilité du cortisol. Ainsi, le gène Cbg constitue un bon candidat fonctionnel pour ce QTL associé à des niveaux de cortisol. Puisque le gène Cbg avait été cloné chez l'homme, le singe, le mouton et la souris (Hammond et a 1., 1987 ; Hammond et al., 1994 ; Berdusco et al., 1993 ; Orava et al., 1994), il a été possible d'aligner les différentes séquences disponibles en utilisant le programme Multalin (Corpet, 1988) et de préparer des amorces oligonucléotidiques consensus à partir de l'exon 2 pour obtenir un fragment PCR de Cbg de porc. Après vérification de la forte homologie de la séquence du fragment PCR avec le gène Cbg d'autres espèces, les amorces ont été utilisées pour cartographier le gène Cbg de porc en utilisant un panel d'hybrides irradiés (Yerle et al., 1988). Comme montré sur la figure 1, il a alors été trouvé que le gène Cbg de porc se trouve entre les marqueurs S0101 et SW764 comme le QTL cortisol. Cette localisation chromosomique a été confirmée par hybridation in situ fluorescente (FISH). Tout d'abord une banque BAC génomique de porc a été criblée par PCR avec des amorces amplifiant l'exon 2 du gène Cbg de porc. Un clone de 150 kb, dénommé BAC 383F4, contenant la totalité de la séquence génomique du gène Cbg de porc a été obtenu. Ce clone BAC a été utilisé comme sonde pour cartographier le gène Cbg de porc par FISH sur un étalement de chromosomes en métaphase et, comme montré à la figure 2, il a été confirmé que le gène Cbg de porc se trouve en 7q26 du chromosome. 2) La capacité de liaison de la CBG est génétiquement liée aux marqueurs flanquant le QTL d'hypercortisolémie. La capacité de liaison de la CBG au cortisol a été mesurée dans le plasma de 81 porcs F2 à partir du croisement d'origine, tous descendants du porc FI &num;911045. Comme attendu, une forte corrélation a été trouvée entre cette mesure et le niveau de cortisol (r = 0,57). La liaison génétique entre cette nouvelle mesure phénotypique et les marqueurs Ssc7 a été évaluée. La figure 3 montre qu'une forte liaison génétique est détectée exactement dans la même région que pour le QTL cortisol. La probabilité maximale est même supérieure avec les valeurs CBG (p 3) La capacité de liaison de la CBG est différente entre les porcs LW et MS. Au niveau des protéines, la capacité de liaison au cortisol et la constante d'affinité de CBG ont été comparées entre les porcs LW et Meishan par des études de radio-liaison. Aucune différence d'affinité n'a été trouvée entre les 2 races de porc. Toutefois, comme le montre le tableau 1 ci-dessous, la capacité maximale de liaison était en moyenne 1.6 fois supérieure chez les porcs Meishan par rapport aux porcs LW (p Tableau 1 Large White Meishan t p n=12 n=12 (Student test) Bmax (nM/l 46, 89 4, 8374, 38 3, 996 001 de sang) 5,95 Kd (nM) 0,38 0, 05 0, 46 0, 05 1,038 4) Identification d'une mutation dans le gène Cbg. Le clone BAC 383F4 a permis d'identifier l'organisation génomique et la séquence du gène Cbg qui n'avait jamais été clonée auparavant. Comme dans les autres espèces, le gène Cbg de porc contient 5 exons avec un codon AUG dans l'exon 2. Au niveau des acides aminés, les Inventeurs ont trouvé 66% et 80% d'homologie entre la protéine CBG de porc et respectivement celles de l'humain et de mouton. Afin de rechercher des mutations, les exons et 900pb de la région du promoteur d'un animal FI, de son père LW et de sa mère Meishan ont été séquencés. Il a été considéré que ce porc FI (&num;911045) devait être hétérozygote au QTL puisqu'il y avait une différence significative dans les niveaux moyens de cortisol entre la progéniture qui avait reçu l'un ou l'autre allèle du marqueur S0101 flanquant le QTL. En conséquence, la mère Meishan devrait avoir au moins un allèle différent du père LW au niveau de la mutation en cause. Une mutation de ce type a été identifiée dans l'exon 2 du porc FI &num;9110045. En position +15 à partir du codon de départ ATG, cet animal est hétérozygote avec une mutation ponctuelle G- T sur un allèle (figure 4). Cette substitution G # T correspondant au codon 15, change une sérine en une isoleucine dans le peptide signal de la protéine CBG. Le test d'amplification par PCR a été optimisé avec les paramètres suivants : Amorce sens : 5'-CCCTGTATGCCTGTCTCCTC-3' Amorce antisens : 5'-CCTGCTCCAAGAACAAGTCC-3' Conditions PCR : lx tampon PCR (Promega), 1.5mM MgC12, 100 uM dNTP, 10 pmol de chaque amorce, 0.4 U Taq polymerase (Promega). Programme du thermocycleur : 1) 960C : 5 min 2) 920C : 30 s 3) 600C : 1 min 4) 720C : 30s 5) étape 2) 3) et 4) 34 fois 6) 72 C 2 min RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Armario, A., Gavalda, A., and Marti, J. (1995). Comparison of the behavioural and endocrine response to forced swimming stress in five inbred strains of rats. Psychoneuroendocrinology 20 : 879-890. - Berdusco, E. T., Hammond, G. L., Jacobs, R. A., Grolla, A., Akagi, K., Langlois, D., and Challis, J. R. (1993). 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REVENDICATIONS 1) Méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie caractérisée en ce qu'elle comprend la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3'ou 5'adjacente éloignée préférentiellement au plus de 100kb. 3) Un marqueur polymorphe responsable du phénotype d'hypercortisolémie constitué de tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique contenu dans le gène Cbg ou les séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb. 4) Un marqueur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant des microsatellites, des polymorphismes d'insertion/délétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP). 5) Une amorce nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5 à 50 de préférence de 10 à 30 nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb, flanquant un marqueur selon l'une des revendications 3 ou 4. 6) Méthode de criblage génétique pour identifier les individus susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées, à l'aide de marqueurs polymorphes, caractérisée en ce qu'elle comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu, puis ii) l'amplification du locus contenant un marqueur polymorphe selon l'une des revendications 3 ou 4 par PCR à partir dudit ADN, et iii) la détection du ou des allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié. 7) Un kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon la revendication 6, permettant de tester les marqueurs génétiques de l'hypercortisolémie à partir d'un échantillon d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces nucléotidiques selon la revendication 5, des réactifs de PCR, et éventuellement des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs. 8) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour le diagnostic d'une hypercortisolémie ou d'une prédisposition à une hypercortisolémie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus. 9) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour la sélection ou contre-sélection d'animaux d'élevage, plus particulièrement de porcs, ayant une forte probabilité de développer une hypercortisolémie et un taux d'engraissement élevé. 10) Utilisation de la méthode selon la revendication 6, dans laquelle les allèles du marqueur polymorphe selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 présentent une mutation choisie dans le groupe de mutations constitué par : - transition G T correspondant à la position 133 de la SEQ ID NO. 1, transition C- T correspondant à la position 134 de la SEQ ID NO. 1, transition T- C correspondant à la position 539 de la SEQ ID NO. 1, transition A- G correspondant à la position 620 de la SEQ ID NO. 1, - transition G-A correspondant à la position 626 de la SEQ ID NO. 1, transition C # T correspondant à la position 859 de la SEQ ID NO. 1, - transition C-T correspondant à la position 866 de la SEQ ID NO. 1, transition A- G correspondant à la position 882 de la SEQ ID NO. 1, transition G # C correspondant à la position 890 de la SEQ ID NO. 1, - transition C-T correspondant à la position 960 de la SEQ ID NO. 1, transition G # A correspondant à la position 1008 de la SEQ ID NO. 1, - transition T C correspondant à la position 42 de la SEQ ID NO. 6, - transition C T correspondant à la position 49 de la SEQ ID NO. 6, - transition C T correspondant à la position 75 de la SEQ ID NO. 7. 11) Animal transgénique dont le transgène contient une des séquences nucléiques de la revendication 3. 12) Animal transgénique surexprimant une des séquences parmi celles de la revendication 3 codant pour un polypeptide identique ou homologue à la protéine CBG. 13) Utilisation d'un animal transgénique selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, comme modèle technique pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et les pathologies associées à l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies. 14) Utilisation d'un animal transgénique selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, pour cribler des composés capables de moduler la fonction de la CBG. 15) Méthode de criblage d'un composés capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol caractérisée en ce qu'elle comprend la production de la protéine CBG à partir de cellules en culture, par exemple, les cellules HepG2 et en ce que l'on teste ledit composé vis-à-vis de la production de ladite protéine. 16) Méthode de criblage selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit criblage est un criblage à grande échelle.