FR 2831170 A1 20030425 FR 0113492 A 20011019 La présente invention concerne des protéines chimériques clivables par la thrombine, notamment des protéines dérivées de la protéine C humaine, et leurs utilisations thérapeutiques. La protéine C (ci-après dénommée PC) est un facteur essentiel d'un mécanisme majeur de régulation de la coagulation, dénommé voie anticoagulante . La forme active de la PC (protéine C activée, ci-après dénommée PCa), est une sérine protéase qui associée à un autre cofacteur (la protéine S), dégrade deux facteurs de la cascade de la coagulation indispensables à la génération massive de thrombine : les facteurs Va et VIlla. La destruction de ces facteurs régule négativement la quantité de thrombine formée, aboutissant à un effet anti-coagulant. La PC est une glycoprotéine de 62000 Da, synthétisée dans le foie. Avant d'être sécrétée dans le plasma, sa chaîne polypeptidique subit plusieurs maturations post-traductionnelles pour devenir une pro-enzyme fonctionnelle. Ces maturations comprennent le clivage du préet du pro-peptide, la y-carboxylation des neuf premiers glutamates de la région amino-terminale, la ss-hydroxylation de l'aspartate en position 71, la glycosylation de 4 asparagines réparties le long de la séquence et l'excision 15 157 du doublet Lys 6-Arg &commat; séparant la chaîne légère (amino- terminale) de la chaîne lourde (carboxy-terminale), et aboutissent à la forme mature de la PC. En raison d'une excision incomplète du doublet Lys-Arg lors de la maturation par les cellules hépatiques, 10 à 20% de la PC plasmatique demeure sous forme monocaténaire. Cependant, la forme plasmatique majoritaire est constituée de deux chaînes polypeptidiques qui sont reliées par un pont disulfure. La chaîne légère de 21000 Da est composée de 155 acides aminés, comprenant un petit domaine portant les acides y-carboxyglutamiques qui est suivi de deux domaines de type Epidermal Growth Factor (EGF). La chaîne lourde de 41000 Da, est composée de 262 acides aminés et représente le futur domaine catalytique, classé dans la classe SA de la famille des sérine-protéases (SHEN et DAHLBACK, Handbook of proteolytic enzymes : Protein C. Barrett, A. J., Rawlings, N. D., Woessner J. F., eds. Academic Press, Orlando, FL. 1998). Comme la plupart des précurseurs de sérineprotéases, la PC est un zymogène dépourvu d'activité catalytique. Son activation résulte du clivage protéolytique de l'extrémité N-terminale de la chaîne lourde, libérant un peptide dit"d'activation"de 12 acides aminés La séquence polypeptidique de la chaîne lourde et de la chaîne légère de la forme mature de la PC est représentée sur la Figure 1, et dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1. Les principales régions de la PC sont indiquées sur la séquence de la Figure 1. La chaîne lourde est soulignée. Le doublet Lyse56- Arg est représenté en caractères gras. Le peptide d'activation est encadré. Pour localiser les résidus d'acides aminés par rapport à la séquence de la PC, différents systèmes de numérotation peuvent être utilisés, et notamment : - un système de numérotation par référence à la séquence déduite de l'ADNc de la PC (BECKMAN et al., Nucleic Acid. Res., 13, 5233-5247,1995) ; cette numérotation est représentée sur la Figure 1, au dessus de la séquence peptidique ; - un système de numérotation des résidus de la chaîne lourde de la PC par référence à la numérotation des résidus du domaine catalytique de la chymotrypsine (MATHERS et al., EMBO J., 15,6822-6831, 1996). Cette numérotation, généralement utilisée pour les sérine-protéases, est basée sur les similarités topologiques qui existent entre ces enzymes, ce qui facilite grandement leur comparaison. Cette numérotation est représentée en caractères italiques sur la Figure 1, sous la séquence peptidique. Par exemple, si la numérotation est faite par référence à la forme mature de la PC, les résidus Arg et Leu qui encadrent le site du clivage protéolytique donnant naissance à la PCa sont identifiés par les positions Arg et Leu"0 ; si la numérotation est faite par référence au domaine catalytique de la chymotrypsine, les mêmes résidus sont identifiés par les positions Arg et Leu. Un autre système de numérotation également utilisé se réfère au site de clivage protéolytique. Les positions des acides aminés sont indiquées par ordre croissant à partir de ce site de clivage. Les positions en amont du site sont identifiées par P, et les positions en aval du site par P'. Ainsi, dans le cas de la PC, P12 représente l'acide aminé N-terminal du peptide d'activation (le plus éloigné du site de clivage), et Pi l'acide aminé Cterminal du peptide d'activation ; Pi'représente l'acide aminé N-terminal de la PCa. L'activation de la PC résulte de son clivage par la thrombine complexée avec un cofacteur membranaire, la thrombomoduline, présent à la surface de l'endothélium vasculaire. En l'absence de thrombomoduline, l'activation de la PC par la thrombine est environ 1000 fois plus lente et ne génère qu'une quantité négligeable de PCa. Compte tenu de la section du vaisseau, la quantité de molécules de thrombomoduline par volume irrigué est beaucoup plus élevée dans la microcirculation que dans les vaisseaux de gros calibre. Il en résulte qu'en présence de thrombine, la génération de PCa est rapide dans la microcirculation, mais lente dans les vaisseaux de gros calibre. Le rôle physiologique de la voie anticoagulante est donc limité à la microcirculation. L'importance de la voie anticoagulante est soulignée par la gravité des déficits génétiques ou acquis en protéines participant à ce système : un déficit en PC, en protéine S ou une résistance du facteur Va à son inactivation par la PCa sont identifiables dans plus de 30% des accidents thrombotiques (AIACH et al., Seminars in Hematology, 34,205- 217,1997). Des souris transgéniques dont le gène de la PC a été inactivé (ALBERT et al. J Clin. Invest. 102 (8), 1481- 1488,1998) ou dont le gène de la thrombomoduline est nonfonctionnel (WEILER-GUETTLER et al., J. Clin. Invest., 101, 1983-1991,1998) présentent des anomalies de la coagulation, objectivées notamment par l'apparition de dépôts de fibrine dans différents organes. Différentes études ont montré que la PC possédait une activité biologique pléiotropique : non seulement antithrombotique (TAYLOR et al., J. Clin. Invest., 79,918- 925 1987 ; GRUBER et al., Blood, 73,639-642, 1989 ; Circulation, 82,578-585 1990 ; CHESEBRO et al., Circulation, 86, 111100-110, 1992 ; HANSON et al., J. Clin. Invest., 92, 2003-2012,1993 ; ARNLJOTS et al., Thromb. Haemost., 72,415- 420,1994 ; SAKAMOTO et al., Circulation, 90,427-432, 1994 ; JANG et al., Circulation, 92,3041-3050, 1995 ; KURZ et al., Blood, 89,534-540, 1997 ; GRESELE et al., J. Clin. Invest., 101,667-676, 1998 ; MIZUTANI et al., Blood., 95,3781-3787, 2000 ; BERNARD et al., N. Engl. J. Med., 344,699-709, 2001), mais aussi anti-inflammatoire (ESMON, Biochim. Biophys. Acta., 1477, 349-360, 2000), anti-apoptotique (JOYCE et al., J. Biol. Chem., 276, 11199-11203, 2001) et pro-fibrinolytique (COMP & ESMON., J. Clin. Invest., 68,1221-1228, 1981 ; REZAIE, J. Biol. Chem., 276,15567-15570, 2001). Ce spectre pharmacologique en fait un excellent candidat au traitement de la maladie hrombotique en général, puisque cette physiopathologie associe souvent au processus thrombotique une réaction inflammatoire, et parfois une mort cellulaire. En outre le mécanisme inductible d'activation de la PC en fait un antithrombotique autorégulé, dont l'action est ciblée sur le thrombus, limitant ainsi le risque hémorragique inhérent aux antithrombotiques conventionnels. L'administration de concentrés de PC s'est révélée bénéfique dans le traitement des déficits génétiques homozygotes en PC ainsi que des déficits acquis tels que les infections à méningocoques associés à un purpura fulminans (GERSON et al., Pediatrics, 91,418-422, 1993 ; OKAJIMA et al., Am. J. Hematol., 33,277-278, 1990 ; DREYFUS et al., N. Engl. J. Med., 325,1565-1568, 1991 ; MANCO-JHONSON & NUSS, Am. J. Hematol., 40,69-70, 1992 ; RINTALA et al., Lancet, 347,1767, 1996 ; SMITH et al., Lancet, 350,1590-1593, 1997 ; WHITE et al., Blood, 96,3719-3724, 2000). Cette thérapie substitutive permet de corriger les troubles associés à ces déficits par la reconstitution d'un stock de PC circulante. Toutefois, l'utilisation de concentrés de PC en tant que traitement antithrombotique dans le cas de thromboses artérielles ou veineuses des gros vaisseaux n'est pas envisageable. Comme mentionné ci-dessus, la quantité de thrombomoduline disponible constitue un facteur limitant ; même avec des concentrations saturantes en PC, l'activation de celle-ci demeure trop lente pour obtenir un effet thérapeutique adéquat. Pour étendre l'activité biologique de la voie anticoagulante de la PC à l'ensemble du territoire vasculaire, il a été proposé d'utiliser directement la PCa. Cette solution s'est révélée efficace (BERNARD et al., N. Engl. J. Med., 344,699-709, 2001), mais sa mise en oeuvre est limitée par la demi-vie très courte (environ 30 minutes) de la PCa dans la circulation. En effet, comme la plupart des sérine-protéases activées, la PCa est rapidement neutralisée par des inhibiteurs (serpines) présents dans le plasma. L'effet thérapeutique ne peut donc être obtenu qu'avec une perfusion en continu. Une des solutions envisagées pour pallier cette limitation consiste à effectuer des modifications de la PCa pour augmenter sa résistance aux inhibiteurs plasmatiques. Cependant un autre problème se pose du fait que l'utilisation de la PCa ne permet pas de bénéficier d'un avantage majeur de la PC, à savoir l'activation inductible par la présence de thrombine. Une PCa résistante aux inhibiteurs et dont il n'est pas possible de réguler la formation présente les inconvénients des antithrombotiques conventionnels, à savoir une action anticoagulante non limitée à la zone thrombotique, et le risque hémorragique potentiel qui en découle. Une autre approche qui a été proposée consiste à chercher à modifier la PC pour la rendre directement activable par la thrombine en l'absence de thrombomoduline, dans le but de permettre la formation de PCa au niveau de l'ensemble du thrombus, et non uniquement au voisinage immédiat de l'endothélium vasculaire. Ainsi, le Brevet US 5 453 373 décrit différents dérivés de PC : - le dérivé dénommé F167 résulte de la substitution du résidu Asp en position 167 de la forme mature de la PC (position P3 du peptide d'activation) par un résidu Phe ; ce dérivé est activé par la thrombine en l'absence de thrombomoduline avec une vitesse 12 fois supérieure à celle de la PC native ; - le dérivé dénommé LIN résulte de la substitution du résidu Asp en position 172 de la forme mature de la PC (position P3'par rapport au site de clivage protéolytique) par un résidu Asn ; ce dérivé est activé par la thrombine en l'absence de thrombomoduline avec une vitesse 4 fois supérieure à celle de la PC native ; - le dérivé dénommé FLIN résulte de la substitution du résidu Asp en position 167 de la forme mature de la PC par un résidu Phe, et du résidu Asp en position 172 de la forme mature de la PC par un résidu Asn ; ce dérivé est activé par la thrombine en l'absence de thrombomoduline avec une vitesse 30 fois supérieure à celle de la PC native ; - les dérivés dénommés Q313 et Q329 résultent respectivement de la substitution du résidu Asn en position 313 ou du résidu Asn en position 329 de la forme mature de la PC par un résidu Gln ; ces modifications ont été effectuées pour supprimer des sites de glycosylation au niveau de ces résidus Asn, afin d'augmenter l'activité anticoagulante de la PCa. Le dérivé Q313 est activé par la thrombine avec une vitesse 2 fois supérieure à celle de la PC native ; son activité anticoagulante est 1,8 fois supérieure à celle de la PCa ; Le dérivé Q329 est activé par la thrombine moins rapidement que la PC native ; - le dérivé dénommé Q3Q9 résulte de la substitution du résidu Asn en position 313 et du résidu Asn en position 329 de la forme mature de la PC par des résidus Gin ; ce dérivé est activé par la thrombine en l'absence de thrombomoduline avec une vitesse 3,3 fois supérieure à celle de la PC native. Les dérivés dénommés FLIN-Q313 et FLIN-Q3Q9 combinent ces différentes modifications ; ils sont respectivement activés par la thrombine seule, à une vitesse 61 fois et 84 fois supérieure à celle de la PC native. Ces vitesses d'activation demeurent toutefois très inférieures à celle de la PC native en présence de thrombomoduline. Les Inventeurs ont recherché d'autres modifications de la PC qui permettraient d'augmenter de manière plus importante la vitesse de son activation par la thrombine indépendamment de la thrombomoduline. Ils ont ainsi mis en évidence deux types de modifications favorables à une accélération de l'activation de la PC par la thrombine (dans des conditions physiologiques et en l'absence de thrombomoduline). En outre, la combinaison de ces modifications permet d'obtenir des PC modifiées dont l'activation en l'absence de thrombomoduline est jusqu'à 500 fois plus rapide que celle de la PC native dans les mêmes conditions, et produit des PCa modifiées dont la demi-vie plasmatique est plus longue que celle de la PCa native. Une première catégorie de modifications concerne le peptide d'activation : les Inventeurs ont constaté que le remplacement de ce peptide par les acides aminés Plo à Pi du fibrinopeptide A (FpA) du fibrinogène (numérotés par référence au site de clivage protéolytique) permettait d'obtenir une vitesse d'activation 40 fois supérieure à celle de la PC normale exprimée et caractérisée dans les mêmes conditions (en comparaison, le dérivé F167 décrit dans le Brevet US 5 453 373, qui porte une substitution Asp-Phe en position P3 du peptide d'activation, n'est activé par la thrombine que 12 fois plus vite que la PC native). Il apparaît donc que le remplacement par le FpA, ou par un peptide comprenant au moins les acides aminés Pro à Pi de celui-ci, du peptide d'activation natif d'un zymogène activable par thrombine permet d'augmenter la vitesse d'activation de ce zymogène. En outre, il apparaît possible de construire des protéines clivables par la thrombine, à partir de zymogènes activables par une autre sérine protéase, ou même de polypeptides quelconques, par addition à leur extrémité N-terminale d'au moins les acides aminés Pl', P2' et P3'd'un site de clivage par la thrombine, précédés par un peptide comprenant au moins les acides aminés Pic à Pi du fibrinopeptide A. Des acides aminés utilisables en positions Pl', P2'et P3'pour constituer un site permettant un clivage par la thrombine sont connus en eux-mêmes ; ils sont par exemple décrits par DAWSON et al. (J. Biol. Chem., 269, 15989-15992,1994), dans le Brevet US 5 688 664 ou par LE BONNIEC et al. (Biochemistry, 35,7114-7122, 1996). En revanche, alors qu'il était considéré dans l'art antérieur que la présence d'un résidu proline en position P2 du site de clivage était nécessaire à un clivage optimal pour la thrombine (cf. notamment DAWSON et al. et le Brevet US 5 688 664 précités), la présente invention fournit des protéines clivables par la thrombine dans lesquelles le résidu en position P2 est une valine. Il est supposé que ce résidu, ainsi que la phénylalanine en position Pg et le glutamate en position P6 du FpA permettraient l'utilisation d'un site supplémentaire de liaison sur la thrombine, non utilisé pour le clivage de la PC normale. La présente invention a pour objet une protéine chimérique clivable par la thrombine, comprenant à son extrémité N-terminale un peptide d'activation suivi des acides aminés Pl'-P2'-P3'd'un site de clivage par la thrombine, caractérisée en ce que ledit peptide d'activation est un fibrinopeptide A, ou une portion de celui-ci comprenant au moins les acides aminés Plo à Pi dudit fibrinopeptide A ; à l'exclusion d'une protéine chimérique dans laquelle Pi'-Ps'-P'représente la séquence Gly-Pro-Arg. La présente invention a pour objet une protéine chimérique comprenant une séquence clivable par la thrombine PlOP9P8PïP6P5PP3P2PlPl'P2'P3', caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence artificielle comprenant les acides aminés Pio à Pi du fibrinopeptide A et les acides aminés Pi'- P2'-P3'd'un site de clivage par la thrombine autre que celui de la chaîne alpha du fibrogène. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine chimérique est dérivée du zymogène d'une sérine-protéase par remplacement du peptide d'activation dudit zymogène par le fibrinopeptide A ou une portion de celui-ci comprenant au moins les acides aminés Plo à Pi dudit fibrinopeptide A. Avantageusement, ledit zymogène est la protéine C. Pour la réalisation de la présente invention, il peut être envisagé d'utiliser les acides aminés Plo à Pi du FpA de n'importe quelle espèce animale, la séquence du FpA étant très conservée d'une espèce à une autre, notamment en ce qui concerne la phénylalanine en position Pg, le glutamate en position P6, et la valine en position ? 2. Toutefois, pour l'obtention de protéines chimériques, par exemple de dérivés de protéine C, destinées à être utilisées en médecine humaine on préférera utiliser le FpA humain, ou le peptide séquence DFLAEGGGVR (SEQ ID NO : 2), correspondant aux acides aminés Pio à Pi du FpA humain. Ces peptides présentent en effet l'avantage d'être potentiellement peu immunogènes puisqu'ils sont naturellement exposés dans le fibrinogène circulant. Comme indiqué ci-dessus, de nombreuses séquences Pi'-P2'-P3''permettant un clivage par la thrombine sont connues en elles-mêmes ; il s'agit notamment des séquences Pl'-P2'-P3'des sites de clivage par la thrombine de protéines existant naturellement sous forme de zymogènes activables par la thrombine. Ces séquences, à l'exception de Gly-Pro-Arg, qui correspond à la séquence Pi'-Ps'-P du site de clivage par la thrombine de la chaîne alpha du fibrinogène, sont utilisables dans le cadre de la présente invention. Par exemple, pour l'obtention d'une protéine chimérique conforme à l'invention dérivée de la protéine C, la séquence Pl'-P2'-P3'peut être la séquence Leu-Ile-Asp, qui correspond à la séquence Pl'-P2'-P3'native de la protéine C. Avantageusement, on peut également utiliser une séquence P1'-P2'-P3'dans laquelle un ou plusieurs des résidus Pl', P2'ou P3'sont modifiés pour améliorer encore la vitesse d'activation par la thrombine. Différentes modifications influant sur l'activation par la thrombine sont décrites par exemple dans la publication de LE BONNIEC et al. (1996), citée plus haut. Les résidus Pi'à P3' (16 à 18 en numérotation chymotrypsique) constituent chez les sérine-protéases l'extrémité amino-terminale du domaine catalytique de l'enzyme active résultant du clivage. Ils sont bien conservés dans les sérineprotéases : la séquence consensus est Ile-Val-Gly. Notamment, les positions Pi'et P'sont presque systématiquement occupées par des résidus hydrophobes à chaînes latérales aliphatiques, qui développent des interactions hydrophobes jouant un rôle important dans la formation et la stabilisation du site catalytique de la sérine-protéase activée. Dans le cas de la PCa, le résidu 16 (Pi') et est une leucine, le résidu 17 (P2') une isoleucine, et le résidu 18 (P3') un aspartate. Cependant, la séquence optimale de clivage par la thrombine au niveau de ces résidus est Ser-Phe-Arg (en position Pi', P2'et P3', respectivement) c'est-à-dire une séquence très éloignée à la fois de la séquence consensus des sérine-protéases et de la séquence particulière de la PC, notamment du fait de la présence d'un résidu hydrophile (serine) en position Pi'. Dans ces conditions il apparaît probable que, notamment dans le cas de la PC, un gain d'affinité pour la thrombine augmentant la vitesse d'activation risquait d'être obtenu au détriment de la stabilité du domaine catalytique, et donc de l'activité de la PCa. Les Inventeurs ont toutefois construit des dérivés de la PC qui, en plus de porter la séquence du FpA en amont du site de clivage activateur, ont été modifiés pour introduire une alanine ou une sérine en position Pi'du site de clivage en remplacement de la leucine, et/ou une phénylalanine en position P2'en remplacement de l'isoleucine, et/ou une glycine en position Pen remplacement de l'aspartate. Ils ont ainsi constaté que ces mutations favorisent le clivage activateur de la PC par la thrombine, et qu'en outre les dérivés de PCa qui en résultent conservent une activité catalytique qui, bien que diminuée, est compatible avec une fonction physiologique normale ; de plus, cette diminution de l'activité catalytique est compensée par une augmentation de la demi-vie (jusqu'à 10 fois) par rapport à celle de la PCa normale. Cette augmentation de la demi-vie résulte d'une meilleure résistance aux inhibiteurs plasmatiques des sérines protéases, conférée par ces mutations. Selon un mode de réalisation préféré d'un dérivé de zymogène de sérine-protéase, et notamment d'un dérivé de protéine C conforme à l'invention, la séquence Pl'-P2'-P3' native dudit zymogène est modifiée par remplacement de l'acide aminé en position Pi'par une alanine ou une sérine, et/ou de l'acide aminé en position P2'par une phénylalanine, et/ou de l'acide aminé en position P3'par une glycine. Des dérivés préférés sont ceux dans lesquels l'acide aminé en position Pi'est remplacé par une alanine ou une sérine, et l'acide aminé en position P2'est remplacé par une phénylalanine. Parmi ceux-ci, des dérivés particulièrement préférés sont ceux dans lesquels l'acide aminé en position Pi'est remplacé par une alanine. Avantageusement, l'acide aminé en position P3'est en outre remplacé par une glycine. La présente invention a également pour objet tout dérivé de sérine-protéase, et en particulier tout dérivé de protéine C activée, pouvant être obtenu par clivage par la thrombine d'un dérivé de zymogène conforme à l'invention dans lequel un ou plusieurs des résidus Pi', P2'ou P3'du site de clivage a été modifié comme indiqué ci-dessus. Les dérivés de sérine-protéases conformes à l'invention présentent l'avantage d'être plus résistants aux serpines plasmatiques que les sérine-protéases natives correspondantes, et donc d'avoir une demi-vie plus longue. La mise en oeuvre de la présente invention permet ainsi : - d'obtenir le clivage par la thrombine de protéines qui ne constituent pas des substrats naturels de cette enzyme, ou d'accélérer le clivage de protéines qui ne sont naturellement clivées lentement par la thrombine ; il est ainsi possible notamment d'obtenir facilement et de manière peu coûteuse des protéines actives à partir de zymogènes, par simple clivage par la thrombine, qui est une enzyme bon marché, et facile à se procurer ; d'obtenir, en outre dans le cas ou l'on effectue la modification, comme indiqué ci-dessus, d'un ou plusieurs des résidus Pi', P2'ou P3'du site de clivage, des dérivés de sérine protéase résistants aux inhibiteurs, et donc possédant une demi-vie plasmatique plus longue. Ainsi, à titre d'exemple, dans le cas de la protéine C, la mise en oeuvre de la présente invention permet d'obtenir des dérivés de PC dont la vitesse d'activation par la thrombine en l'absence de thrombomoduline est très supérieure à celle des dérivés de PC de l'art antérieur. En outre elle permet de préparer, à partir de ces dérivés, de la PC activée en utilisant de la thrombine, alors que l'on utilise habituellement pour préparer la PCa à partir de la PC native, un activateur extrait de venin de serpent, dont le coût est très élevé. En ce qui concerne les dérivés de PCa pouvant être obtenus conformément à l'invention, leur activité relativement faible est compensée d'une part par la vitesse d'activation, et d'autre part par leur résistance importante aux serpines plasmatiques. Il en résulte un effet thérapeutique mieux ciblé et plus aisé à contrôler que celui de la PCa, ou des dérivés de PC de l'art antérieur. Optionnellement, on peut combiner les modifications spécifiques aux protéines chimériques ou à leur produits de clivage conformes à l'invention avec d'autres modifications concernant des domaines différents de la protéine choisie et pouvant permettre d'améliorer certaines de ses propriétés. Ainsi, dans le cas des dérivés de PC ou de PCa de la présente invention, on peut par exemple, si l'on souhaite obtenir un dérivé de PCa possédant une activité anticoagulante un peu plus importante, substituer les résidus Asn en positions 313 et 329 (par référence à la forme mature de la PC), comme décrit dans le Brevet US 5 453 373. La présente invention a également pour objet des molécules d'acide nucléique codant des protéines chimériques, et notamment des dérivés de PC selon l'invention. Ces molécules d'acide nucléique peuvent être obtenues par des méthodes classiques bien connues de l'Homme de l'Art, notamment par mutagenèse dirigée du gène codant pour la protéine native dont on souhaite permettre ou accélérer le clivage par la thrombine. La présente invention englobe également des couples d'amorces nucléotidiques utilisables pour l'obtention des molécules d'acide nucléique codant des dérivés de PC conformes à l'invention, et en particulier les couples d'amorces suivants : un couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 5 et 6. un couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 7 et 8. un couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 9 et 10. un couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : Il et 12. un couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 13 et 14. La présente invention englobe également les cassettes d'expression, dans lesquelles une molécule d'acide nucléique codant une protéine chimérique conforme à l'invention est associée à des éléments appropriés de contrôle de la transcription (notamment promoteur, et éventuellement terminateur) et éventuellement de la traduction, ainsi que les vecteurs recombinants dans lesquels est insérée une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. La présente invention a en outre pour objet des cellules-hôtes procaryotes ou eucaryotes génétiquement transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention. De préférence, pour l'expression et la production des protéines chimériques, et notamment des dérivés de PC conformes à l'invention, on choisira des cellules eucaryotes, en particulier des cellules de mammifères. La construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention, et la transformation des celluleshôtes peuvent être effectuées par les techniques classiques de biologie moléculaire. Les protéines chimériques, et notamment les dérivés de PC conformes à l'invention peuvent par exemple être obtenus par mise en culture de cellules génétiquement transformées conformes à l'invention et la récupération du dérivé exprimé par ladite cellule à partir de la culture. Ils peuvent ensuite, si nécessaire, être purifiés par des procédures classiques, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art, par exemple par précipitation fractionnée, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, électrophorèse, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, etc. En particulier, des méthodes habituelles de préparation et de purification de protéines recombinantes peuvent être utilisées pour la production des protéines chimériques conformes à l'invention. Par exemple, pour la production des dérivés de protéine C conformes à l'invention, on peut utiliser des méthodes telles que celles décrites dans le Brevet US 4 992 373, ou dans le Brevet US 4 981 952. La présente invention a également pour objet l'utilisation de protéines chimérique ou de leurs produits de clivage par la thrombine conformes à l'invention, et notamment des dérivés de PC et de PCa conformes à l'invention, ou des molécules d'acide nucléique codant pour ces dérivés, pour l'obtention de médicaments. Par exemple, des médicaments obtenus à partir de dérivés de PCT ou de PCa conformes à l'invention sont utilisables dans toutes les applications usuelles de la PC ou la PCa, et notamment comme antithrombotiques, antiinflammatoires et antiapoptotiques et profibrinolytiques, dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies impliquant une hypercoagulation. A titre d'exemple, on citera les thromboses veineuses ou artérielles, notamment les thromboses affectant les vaisseaux de gros calibre, l'infarctus du myocarde, la maladie thrombotique, l'embolie pulmonaire, la prévention des réocclusions coronariennes après une angioplastie ou une thrombolyse, ainsi que le traitement ou la prévention des anomalies de la coagulation des patients atteints d'anomalies génétiques affectant le gène de la PC ou celui de la thrombomoduline. Dans ce cadre, en particulier, des molécules d'acide nucléique selon l'invention peuvent être incorporées dans des médicaments utilisables en thérapie génique. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant au moins une protéine chimérique ou son produit de clivage par la thrombine, conformes à l'invention, et notamment au moins un dérivé de PC ou de PCa conforme à l'invention associé à un excipient approprié. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation et de caractérisation de dérivés de protéine C conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION DE VARIANTS DE LA PC. Les vecteurs destinés à l'expression des variants de la PC ont été construits en utilisant comme matériel de départ le vecteur pCI-néo-PC, qui exprime de la protéine C humaine normale après transfection dans des cellules de mammifères. L'ADNc de la PC a été isolé à partir de cellules de foie humain par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de type transcription inverse ; les méthodes utilisées pour le clonage de l'ADNc dans le vecteur pCI-neo (PROMEGA, Madison, USA) sont conformes à celles décrites dans la littérature (SAMBROOK et al., Molecular cloning, A laboratory manual (2ère édition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ; WHITE, PCR Protocols, Methods in Molecular Biology, Walker J. H. editors, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993). Mutagenèse dirigée du vecteur pCI-neo-PC. La mutagenèse dirigée du vecteur pCI-neo-PC pour préparer les vecteurs destinés à l'expression des analogues de la PC a été réalisée par une méthode dérivée de celle de JONES et al. (Nature, 344, 793-794, 1990). La modification de l'ADNc de la PC permettant d'introduire à la place du peptide d'activation la séquence du FpA a été obtenue en une seule étape de PCR, avec comme matrice le vecteur pCI-neo-PC, et comme amorces les couples d'oligonucléotides présentés dans le Tableau 1. TABLEAU I Séquence peptide Séquence Séquence amorces d'activation P1'-P3'bequence amorces DFLAEGGGVR LID Sens 5'-GACTTTCTAgCTgAAggAggAggCgTgCggCTCATTgA'I'gggAAgATgACC-3' (SEQ ID NO : 3) DFLAEGGGVR LID Antisens 5'-CACgCTCCTCCTTCAgCTAgAAAgTCTCgTTTCAggTgACTgCgCTTCTT-3' (SEQ ID NO : 4) DFLAEGGGVR LFG Sens 5'-GAAggAggAggCgTgCgCTCTTCggCgggAAgATgACCAggCg-3' (SEQ ID NO : 5) DFLAEGGGVR LFG Antisens 5'-CgCCTggTCATCTTCCCgCCgAAgAgCCgCACgCCTCCTTC-3' (SEQ ID NO : 6) DFLAEGGGVR SIG Sens 5'-gAAggAggAggCgTgCggTCCATTggCgggAAgATgACCAggCg-3' (SEQ ID NO : 7) DFLAEGGGVR SIG Antisens 5'-CgCCTggTCATCTTCCCgCCAATggACCgCACgCCTCCTCCTTC-3' (SEQ ID NO : 8) Sens 5'-gAAggAggAggCgTgCgggCCATTggCgggAAgATgACCAggCg-3' (SEQ ID NO : 9) DFLAEGGGVR AIG Antisens 5'-CgCCTggTCATCTTCCCgCCAATggCCCgCACgCCTCCTCCTTC-3' (SEQ ID NO : 10) DFLAEGGGVR LIG Sens 5'-GAAggAggAggCg'l'gCggCTCATTggCgggAAgATgACCAggCg-3' (SEQ ID NO : 11) DFLAEGGGVR LIG Antisens 5'-CgCCTggTCATCTTCCCgCCAATgAgCCgCACgCTCCTCCTTC-3' (SEQ ID NO : 12) ADTEDQE. LID Sens 5'-AgCgCAgTCACCTgAAACgACAAgTAgATCCgCggCTCAT-3' (SEQ ID NO : 13) #DTEDQED LID Antisens 5'-ATgAgCCgCggATCTACTTgTCgTTTCAggTgACTgCgCT-3' (SEQ ID NO : 14) Dans ce tableau, la première colonne indique la modification introduite dans le peptide d'activation : DFLAEGGGVR signifie que dans le dérivé préparé le peptide d'activation a été substitué par la séquence du fibrinopeptide A ; DTEDQED signifie que dans le dérivé préparé, les 7 premiers résidus du peptide d'activation normal ont été supprimés. Pour chaque mutagenèse la séquence du couple d'oligonucléotides utilisé (sens et anti-sens) est donnée dans la colonne de droite. La colonne centrale du tableau indique la séquence des acides amines Pl', ? 2' et ? 3' du site d'activation. La PCR est réalisée, dans un volume de 50 ul contenant 2,5 unités d'ADN polymérase Pfu (STRATAGENE ; Amsterdam Zuidoost, Hollande) dans le tampon préconisé par le fabricant :, un mélange équimolaire de chaque dNTP (0,5 mM), 125 ng de chaque amorce (sens et anti-sens, voir Tableau 1), et 50 ng de matrice. Les PCR sont réalisées à l'aide d'un DNA Thermal Cycler type 480 (PERKIN ELMER, Roissy, France). Chaque réaction comprend une étape initiale de dénaturation à 95 C pendant 5 min., suivie de 15 cycles identiques qui se composent chacun de trois phases successives (dénaturation, hybridation et élongation) de respectivement 30 sec à 95 C, 60 sec à 55 C ou 60 C, et 20 min. à 68 C. Pour la préparation du mutant DFLAEGGGVR ayant LID pour résidus Pl'-P3' (c'est-à-dire les résidus naturels), la température d'hybridation des amorces est de 600C. L'ADNc codant pour ce mutant est utilisé pour préparer les autres variants dont la séquence Pl'-P3'diffère de LID ; la température d'hybridation étant de 55 C. A l'issue de ces 15 cycles, le vecteur ayant servi de matrice est dégradé à 37 C pendant 60 min. par 10 unités d'endonucléase de restriction DpnI (NEW ENGLAND BIOLABS, OZYME, Saint-Quentin en Yvelines, France). La préparation du variant ADTEDQED est effectuée de la même façon, avec comme matrice de PCR, le vecteur pCI-neo-PC, contenant la séquence codant pour la PC normale. La température d'hybridation est de 55 C. Les variants en P1'-P3'du site d'activation du dérivé de la PC portant le FpA en place du peptide d'activation ont été obtenus de la même façon, avec comme matrice le vecteur pCI-neo-PC-FpA (portant la séquence FpA), et le couple d'oligonucléotides correspondant, comme indiqué dans le Tableau 1. Préparation des vecteurs dérivés de pCI-neo-PC. Des bactéries, souche DH5a (Dam+) sont rendues compétentes par lavage à 40C en 100 mM CaCl2 et conservées à - 80 C dans une solution de CaCl2 100 mM contenant 15% de glycérol. Un aliquote de bactéries compétentes (environ 106 dans 100 jj. l est transformé par 5 à 10 ul du produit de la PCR digéré par DpnI. Le mélange est incubé 30 minutes à 4 C, puis soumis à un choc thermique de 2 min. à 420C suivi d'une nouvelle incubation à 4 C pendant 2 min. Les bactéries sont ensuite incubées à 37 C pendant 60 min. en milieu LB (LUTHIA BERTONI BROTH, GIBCO BRL, LIFE TECHNOLOGY, Cergy Pontoise, France) sous agitation forte. Le milieu LB est décanté après centrifugation à 2000 tours/min. pendant 5 min., et les bactéries sont étalées sur gélose (1, 5% d'AGAR-SELECT en milieu LB contenant 100 ug/ml d'ampicilline). Les boîtes de Pétri sont incubées dans une étuve à 37 C pendant 36 heures pour que les bactéries ayant incorporé un plasmide leur permettant de résister à l'ampicilline développent des colonies. 6 à 12 colonies sont isolées et amplifiées pendant une nuit sous agitation forte, à 37 C, dans 5 ml de milieu LB contenant 100 ug/ml d'ampicilline. Le vecteur responsable de la résistance à l'ampicilline est purifié par la méthode dite de la"lyse par ébouillantation" (SAMBROOK et al., précité). Alternativement, pour la préparation de quantités plus importantes de plasmide, le"PLASMID MIDY KIT" (QIAGEN, Courtaboeuf, France), a été utilisé en suivant les instructions du fabricant. Séquençage des ADNc des variants de PC. La séquence de l'ADNc porté par les dérivés de pCI-néo-PC, a été contrôlée par une méthode dérivée de celle de SANGER et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,5463-5467, 1977), à l'aide d'un séquenceur ABI PRISM 377 (PERKIN ELMER, Roissy, France). Le kit de séquence"ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit"a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Dans cette méthode, l'élongation par PCR d'une amorce complémentaire de l'ADN à séquencer est stoppée par l'incorporation aléatoire d'un didéoxynucléotide marqué par un chromophore différent pour chaque base. Le séquençage de la totalité de l'ADNc des dérivés de la PC, a été réalisé à l'aide de 6 amorces réparties le long de la séquence de l'ADNc de la PC. EXEMPLE 2 : TRANSFECTION ET SELECTION DE CELLULES DE MAMMIFERES EXPRIMANT UN VARIANT DE LA PC. Transfection des cellules HEK293. La lignée cellulaire transfectée est une lignée de cellules épithéliales de rein humain, HEK293 (CRL-1573) de l'American Type Culture Collection. Ces cellules ont été transfectées avec les vecteurs dérivés de pCI-néo-PC par la méthode de coprécipitation au phosphate de calcium (SAMBROOK et al., précité). Brièvement, des cellules HEK293 sont cultivées en boîte de Pétri (diamètre 80 mm) à 37 C dans une atmosphère enrichie à 5% de C02, dans du milieu complet : Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamate, 5 U/ml de pénicilline, et 5 ug/ml de streptomycine (tous fournis par Gibco BRL). Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, 5 à 40 ug du vecteur à transfecter sont dilués dans 220 ul d'HO et ajoutés à 250 pi de tampon HEPES 50 mM pH 7,05 contenant 280 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 1,5 mM de Na2HP04 et 12 mM de dextrose (HBS,"Hepes Buffer Saline"). La coprécipitation de l'ADN est obtenue par l'ajout, goutte à goutte et sous agitation lente, de 31 11 de CaClz 2,5 M, suivie d'une incubation de 30 minutes à température ambiante. Les cellules sont rincées 2 fois en tampon phosphate, (PBS, GIBCO BRL), puis remises dans du milieu complet frais. Le précipité d'ADN est alors ajouté, et mis en contact avec les cellules HEK293 pendant 4 heures à 37 C. A l'issue de cette incubation, les cellules sont lavées par du PBS et remises en culture dans du milieu complet frais pendant 24 h. Les cellules sont alors détachées de la boîte de Pétri par une incubation de 5 minutes à 37 C en présence de 1,5 ml d'une solution de Trypsine-EDTA (GIBCO BRL). Les cellules sont ensuite réparties en 3 boîtes de Pétri et sélectionnées en milieu complet contenant 1 mg/ml de généticine (GIBCO BRL). Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 jours pendant 2 à 3 semaines, jusqu'à l'obtention de colonies. Une vingtaine de colonies sont isolées, transférées dans les puits (2 cm2) d'une plaque de culture à 24 puits, et remises en culture jusqu'à confluence, en milieu complet contenant l'agent de sélection. Chaque surnageant est alors testé par ELISA (voir ci-dessous) pour détecter la présence de dérivés de la PC. Les clones exprimant le mieux le dérivé de PC sont amplifiés et sécurisés par congélation dans l'azote liquide (chaque ampoule contenant environ 106 cellules dans 1 ml de sérum de veau mélangé à 10% (v/v) de DMSO). Identification des clones exprimant un variant la PC. L'identification des clones exprimant un dérivé de la PC et l'estimation de la quantité sécrétée ont été effectuées par ELISA. Un anticorps monoclonal, P7058, décrit par MILETICH et BROZE (J. Biol. Chem., 265,11397-11404, 1990) et commercialisé par SIGMA ALDRICH est utilisé. Cet anticorps est dilué en tampon NaHCOs 50 mM pH 9,6 et adsorbé pendant une nuit à 4 C (1 ug dans 100 pli par puits) sur une plaque de titration"MAXISORP" (NUNC, POLYLABO, Strasbourg, France). Les puits sont lavés 3 fois en TTBS (Tris 50 mM pH 7,5 contenant 150 mM NaCl et 0,5% (v/v) TWEEN 20), puis saturés pendant 1 heure à température ambiante par de la sérum albumine bovine en TTBS (5% (p/v) ; 100 11 par puits). Un aliquote de chaque surnageant à tester (100 ll dilué au 1/5 dans du milieu DMEM contenant 5 mM EDTA) est ajouté dans l'un des puits de la plaque de microtitration saturée et laissé à incuber pendant une heure à température ambiante. Les puits sont lavés 3 fois en TTBS, et un anticorps dirigé contre la PC, préparé chez un lapin et couplé à de la peroxydase (Dako, Glostrup, Danemark) est ajouté après dilution au 1/1000 en TTBS (100 ul par puits). Après une incubation de une heure à température ambiante, les puits sont de nouveau lavés 3 fois en tampon TTBS. La présence de PC liée au premier anticorps est révélée par l'activité peroxydase portée par le second anticorps par addition de 100 pi d'une solution d'OPD (acide citrique 0,1 M, phosphate disodique 0,1 M pH 5,0 contenant 0, 5% d'H202 (v/v) et 1 mg/ml d'orthophénylenediamine). Après 5 à 15 minutes, la réaction est arrêtée par l'addition de 100 ul de H2S04 0, 15 M, et le produit de la réaction catalysée par la peroxydase est quantifié en mesurant l'absorbance à 490 nm. EXEMPLE 3 : EXPRESSION ET PURIFICATION DES VARIANTS DE LA PC. Les cellules HEK293 transfectées sont cultivées en monocouche, dans une étuve à 37 OC sous atmosphère contrôlée contenant 5% de Cors, en milieu complet. Les clones issus de cellules HEK293 transfectées et qui sécrètent un variant de PC sont amplifiés par passages successifs dans des flasques de surface croissante (jusqu'à 300 cm2). Chaque flasque de 300 cm2 est alors utilisée pour inoculer deux bouteilles roulantes d'une surface de 850 cm2. Les bouteilles roulan m Les surnageant, récoltés après 2 à 6 jours (selon la densité de cellules) sont centrifugés 10 minutes à 5000 tours/min. pour éliminer les débris cellulaires. Les protéases éventuellement présentes dans le milieu de culture sont inhibées par l'addition de 5 mM d'EDTA et 10 mM de benzamidine, et le milieu est stocké à-20 C avant de purifier la protéine recombinante. Les variants de PC sont purifiés à partir des surnageants de culture par trois étapes de chromatographie. Deux litres de surnageant de culture sont tout d'abord concentrés par adsorption sur une résine échangeuse d'anions. Ces 2 litres de surnageant de culture sont préalablement dilués dans 4 litres de tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 5 mM d'EDTA et 10 mM de benzamidine afin d'abaisser la force ionique ; 4, 5 g de SEPHADEX QAE A50 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Upsala, Suède) sont alors ajoutés, et le mélange est mis sous agitation lente pendant 1 heure à température ambiante. Après sédimentation des billes de SEPHADEX dans une colonne de chromatographie, les protéines retenues (dont la PC) sont éluées par 0,5 M NaCl en tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 5 mM d'EDTA et 10 mM de benzamidine. La PC est ensuite purifiée par chromatographie d'immuno-affinité à l'aide de résines greffées par les anticorps monoclonaux (mab2) ou HPC4 (ROCHE DIAGNOSTIC, Meylan, France) qui reconnaît la séquence EDQVDPRLIDGK du peptide d'activation. Ces anticorps monoclonaux ont été couplés à du SEPHAROSE 4B activé au CNBr (environ 1 mg d'anticorps par ml de gel), selon les recommandations du fournisseur (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). La PC recombinante normale et son analogue dont le peptide d'activation est tronqué ont été purifiés à l'aide de la résine couplée à l'anticorps HPC4. Le chargement de la colonne d'affinité avec l'éluat de la résine QAE a été réalisé après avoir ramené la concentration en Ca2+ à 5 mM. La colonne a ensuite été lavée en tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 0,5 M de NaCl et 5 mM de Ca2+. L'élution de la PC recombinante est réalisée avec un tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 0,15 M de NaCl et 5 mM d'EDTA. Les analogues de la PC dans lesquels la séquence Pr P3'n'est plus DPRLID ont été purifiés à l'aide de la résine couplée à l'anticorps (mab2). Dans ce cas, après chargement de la colonne d'affinité avec l'éluat de la résine QAE, et un lavage en tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 0,5 M de NaCl et 5 mM d'EDTA, l'elution de la PC recombinante est faite par acidification en tampon glycine 0,1 M pH 2,7. Le pH de la fraction éluée est immédiatement rectifié à 7,5 en ajoutant du Tris 2 M pH 10. La dernière étape de purification est une nouvelle chromatographie échange d'ions qui a pour but de reconcentrer et dialyser l'éluat de la chromatographie d'affinité. Cet éluat est dilué au 1/3 dans un tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 50 mM NaCl puis adsorbé sur un gel FAST Q (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). Après lavage en tampon de dilution (10 fois le volume de la colonne) pour éliminer toute trace de glycine et d'EDTA, la PC est éluée par 0,5 M NaCl en tampon Tris 50 mM pH 7,5. La concentration de la PC est estimée par son absorbance à 280 nm, en utilisant un coefficient d'absorption molaire (eu,") de 1,45. La pureté de chaque analogue de PC est évaluée sur gel de polyacrylamide (12% contenant 0, 1% de SDS) après dénaturation et réduction des ponts disulfures par incubation en présence de 5% de ss-mercaptoéthanol. Les résultats de cette analyse sont illustrés par la Figure 2. Légende de la Figure 2 : Piste 1 : marqueurs de masse moléculaire. Piste 2 à 7 : 2 ig de variant Fpa-LID, ADTEDQED, Fpa-LFG, Fpa-SIG, Fpa-AIG et Fpa-LIG respectivement. Le poids moléculaire apparent (en kDa) est indiqué à gauche du gel. La position de la forme monocaténaire de la PC normale, ainsi que celles des chaînes lourde et légère de la PC normale sont indiquées à la droite du gel. Toutes les préparations de PC obtenues apparaissent pures en gel SDS, mais deux formes sont présentes. Une forme bicaténaire est majoritaire (70 à 90%) avec des masses moléculaires apparentes compatibles avec celles attendues pour les chaînes lourde et légère (41000 et 21000 Da, respectivement). Les 10 à 30% restant sont obtenues sous forme monocaténaire avec une masse moléculaire apparente de 62000 Da. Le pourcentage de forme monocaténaire ne semble pas dépendre de l'analogue considéré, mais plutôt du pool de surnageant de culture dont est issue la préparation, indépendamment de la nature de la mutation. Il est à noter toutefois qu'à l'issue de ce protocole de purification, une partie de la préparation de PC est obtenue sous forme activée (jusqu'à 50%). La forme activée n'étant pas distinguable du zymogène par analyse sur gel de polyacrylamide-SDS ce pourcentage est évalué par l'activité amidolytique de la préparation (voir ci-dessous). Le pourcentage de forme activée semble dépendre à la fois de l'analogue de PC considéré et du lot de la préparation considéré. Il est particulièrement élevé pour les analogues de la PC ayant en position Pi'du site d'activation une sérine ou une alanine en place de la leucine normale. Neutralisation des formes actives présentes dans les préparations de variants de la PC. Afin de mesurer avec précision la vitesse d'activation par la thrombine de chaque variant de PC, il est indispensable de neutraliser au préalable toute trace de PCa éventuellement présente dans la préparation. Cette neutralisation est réalisée par inhibition irréversible du site actif de la PCa. L'inhibiteur covalent utilisé est le D-Phe-Pro-Arg-CH3Cl (PPACK, CALBIOCHEM, St Cloud, France), qui se lie à l'His57 du système de stabilisation de charge. Pratiquement, 5 mM de PPACK sont ajoutés à la préparation de PC et le mélange est incubé une heure à température ambiante. Cette incubation est répétée deux fois, en rajoutant la même quantité de PPACK (frais). Le PPACK n'ayant pas réagi est alors éliminé par une chromatographie d'échange d'ion. La PC et la PCa inhibée (mais pas le PPACK libre) sont adsorbées sur une colonne RESSOURCE Q (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) après dilution (1/10, v/v) en tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 50 mM de NaCl. Avant élution par 1 M NaCl en tampon Tris 50 mM pH 7,5, la colonne est lavée par 20 fois son volume en tampon de dilution. Après traitement, le pourcentage de forme active est inférieur à 0,1% pour la plupart des préparations de PC, et ne dépasse pas 0,4% pour l'analogue de la PC dont le résidu en position Pi'est une sérine. La présence de PCa neutralisée n'interfère pas avec l'activation de la fraction zymogène par la thrombine. EXEMPLE 4 : CARACTERISATION DES VARIANTS DE LA PC. Détermination de la vitesse d'activation. Les constantes de vitesse d'activation par la thrombine des variants de la PC ont été déterminées en conditions de pseudo premier ordre. Pratiquement, la PC (1 uM) est incubée en présence de thrombine (10 à 50 nM, selon le variant de PC) en tampon cinétique (Tris 50 mM, pH 7,5 contenant 0,15 M NaCl, 0,2% PEG 8000 (p/v), 0,5 mg/ml de sérum albumine bovine, et 5 mM Cal2). Après des temps d'incubation variables, 200 unités d'hirudine sont ajoutées à un aliquote de 5 11 du mélange réactionnel (afin de stopper la réaction et neutraliser la thrombine). La quantité de PCa générée est alors estimée en mesurant la vitesse initiale d'hydrolyse de 200 pom de pyroGlu-Pro-Arg-pNA (S2366, Biogenic, Lattes, France). La variation de l'absorbance à 405 nm est enregistrée en fonction du temps à l'aide d'un lecteur de microplaque MR5000 (DYNEX, Guyancourt, France), et la concentration de PCa déduite par référence à une gamme étalon. La constante de vitesse de la réaction est alors estimée par régression non linéaire de la variation de la concentration en PCa en fonction du temps à l'aide d'une équation représentant une croissance exponentielle de premier ordre : PCa (t) =PC (1 - exp (-k t)) + Cte ; où PCa (t) représente la concentration en PCa au temps t ; PC, la concentration totale en PC (activable), et k, la constante de vitesse de premier ordre ; Cte est une constante qui est ajoutée pour tenir compte d'une éventuelle (petite) activité amidolytique présente au départ, avant addition de l'activateur (bruit de fond). Les valeurs de kon (constante de spécificité) sont calculées en faisant le rapport de k sur la concentration de l'activateur (la thrombine). Les valeurs obtenues (en M' s-l) sont résumées dans le Tableau II. Tableau Il k. n (M'\s") PC 3, 010' PC (+TM) 5, 100 QVDPRUD 6, 010' Fpa-LID ! 1 104 Fpa-LIG 1,6 104 Fpa-LFG2, 910" Fpa-AIG3, 010" Fpa-SIG 1, 6 100 La substitution du peptide d'activation de la PC par le fibrinopeptide A (variant Fpa-LID) augmente la valeur de la kon 40 fois. La substitution supplémentaire dans ce variant de l'aspartate P3'par une glycine (Fpa-LIG) n'augmente que peu la kon, mais si l'isoleucine en P2'est en plus substituée par une phénylalanine (Fpa-LFG), la valeur de kon devient 96 fois supérieure à celle de la PC normale. Enfin, lorsque la leucine en Pi'est remplacée par une alanine (Fpa-AIG) ou par une sérine (Fpa-SIG) la valeur de la kon devient respectivement 100 et 500 fois supérieure à celle de la PC normale, une valeur qui n'est pas si éloignée de celle de l'activation de la PC normale en présence de thrombomoduline (PC + TM). Activation préparative des variants de la PC. Pour les études fonctionnelles, la PC et ses dérivés ont été activés en quantités préparatives par un activateur isolé du venin de serpent Agkistrodon contortrix contortrix (PROTAC, KORDIA LEIDEN, Hollande). 9 unités de PROTAC sont couplées à un 1 ml de SEPHAROSE-NHS activé (HITRAP, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) en respectant les recommandations du fabricant. Un aliquote de 1 ml de PC (1 M) en tampon d'activation (Tris 50 mM pH 7,5 contenant 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, et 0,2% (p/v) PEG) est injecté dans la colonne greffée avec du PROTAC et équilibrée dans le même tampon. La colonne est fermée aux deux extrémités et l'incubation prolongée pendant 8 heures à température ambiante. La PC activée est éluée de la colonne en injectant 2 volumes de tampon d'activation. Alternativement, en particulier pour les dérivés de la PC qui sont rapidement activables par la thrombine, l'activation est faite sur une colonne de SEPHAROSE greffée avec de la thrombine humaine purifiée (1 mg/ml de gel). La préparation du gel et son utilisation sont faites dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus pour la colonne greffée avec du PROTAC. Les PCa sont ensuite reconcentrées par chromatographie d'échange d'ions sur une colonne MONO Q (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). L'éluat de la colonne HITRAP est dilué (1/10 ; v/v) en Tris 50 mM pH 7,5, chargé sur la colonne MONO Q et la PCa est éluée par 0,5 M NaCl en Tris 50 mM pH 7,5. Titration des variants de la PCa. La concentration en site actif des dérivés activés de la PCa est déterminée par titration à l'aide de PPACK, qui forme un complexe équimolaire covalent, avec la PCa. Des concentrations variables de PPACK, comprises entre 1 nM et 25 uM, sont incubées avec une quantité fixe de la PCa à titrer en tampon cinétique. Le mélange est incubé à température ambiante jusqu'à complétude de la réaction. Le temps d'incubation nécessaire dépend du dérivé de la PCa considéré et il faut s'assurer qu'une prolongation de l'incubation n'entraîne pas l'inhibition de molécules de PCa supplémentaire : trois heures d'incubation sont suffisantes pour la PCa normale, mais 18 heures sont préférables pour les dérivés de PCa ayant une sérine ou une alanine en position 16 ainsi que pour le dérivé ayant une phénylalanine en position 17. A l'issue de cette incubation, la concentration résiduelle de la PCa est estimée en mesurant la vitesse initiale d'hydrolyse de 200 juM de S2366. La variation de l'absorbance à 405 nm en fonction du temps (vus) est enregistrée à l'aide d'un lecteur de microplaque MR5000. La concentration effective de la PCa initialement présente (Et) est alors estimée par régression non linéaire de la dépendance de Vs en fonction de la concentration en PPACK ajouté à l'aide de l'équation dite "tight-binding inhibition" (CHA, 1975 ; WILLIAMS et MORRISON, 1979) : v. = (v./2 [E,]){[(K,+[PPACK]-[EJ)+4KJE,]r-(K+ [PPACK]- EJ} dans laquelle vo est la vitesse initiale d'hydrolyse du S2366 en absence d'inhibiteur, et Kl une constante d'inhibition apparente du complexe enzymeinhibiteur. Activité amidolytique des variants de la PCa. Afin de caractériser le site actif des variants de la PCa, les constantes kcat et KM ont été déterminées pour l'hydrolyse de deux substrats chromogéniques : le S2366 et le D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238, Biogenics, Lattes, France). Les hydrolyses sont réalisées en tampon cinétique contenant soit 5 mM CaCl2 soit 5 mM EDTA, à température ambiante. Des concentrations variables de substrat, comprises entre 50 et 3000 M, sont incubées avec une quantité fixe de PCa (10 nM à 50 nM selon le variant). La variation de l'absorbance à 405 nm en fonction du temps est enregistrée à l'aide d'un lecteur de microplaque MR5000, et la vitesse initiale d'hydrolyse est estimée par régression linéaire des absorbances correspondant au plus à 10% d'hydrolyse. Les constantes kcat et KM sont ensuite estimées par régression non linéaire de la variation de cette vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat, à l'aide de l'équation de Michaelis-Menten. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau III. Tah ! M ! ! ! H S2238Ca2+ kcat S-1 KM M kcat/KM(mM-1.s-1) PC-LID 28 440 63 Fpa-LiG 20 300 66 Fpa-LFG nd nd nd Fpa-AIG 10.8 747 14, 5 Fpa-SIG 4,6 2030 2,3 S2238 EDTA PC-LID 20 530 37 Fpa-LIG 19 530 35 Fpa-LFG nd nd nd Fpa-AIG nd nd nd Fpa-SIG 0, 49 275 1, 8 S2366Ca2+ kcat S-1 KM M kcat/KM(mM-1.s-1) PC-LID 42 380 108 Fpa-LiG 46 575 80 Fpa-LFG 25 > 3000 3 Fpa-AIG 53 2600 20 Fpa-SIG 13 > 3000 3 S2366 EDTA kcat S-1 KM M kcat/KM(mM-1.s-1) PC-LID 37 400 92 Fpa-LIG 36 490 73 Fpa-LFG 21 > 3000 Fpa-AIG 20 1690 12 Fpa-SIG 2, 2 2000 1, 1 Les formes actives des dérivés de la PC dont le résidu en Pl'est une alanine (Fpa-AIG) ou une sérine (FpaSIG), ainsi que le dérivé qui porte une phénylalanine en P2' (Fpa-LFG) présentent une diminution de leur activité amidolytique. ND : non déterminé. Pour le substrat S2366, en présence de Ca2+, la mutation de l'isoleucine en phénylalanine en position P2'provoque une augmentation de la KM supérieure à un facteur 8 et une diminution de la kcat de 1, 7 fois. La substitution de la leucine en position Pi'par une alanine ou une sérine entraîne une augmentation de la KM d'un facteur 7 et 8 respectivement. La kcat est diminuée d'un facteur 3 avec le variant portant une sérine en Pl'tandis que pour le variant portant une alanine, la kcat est du même ordre que celle déterminée avec la PCa. La dépendance au Ca2+ de la PCa sur l'hydrolyse de ces 2 substrats est conservée avec les différents variants de la PC : en présence d'EDTA la kcat/Kt1 est légèrement abaissée. La forme activée du variant Fpa-SIG est celle dont la constante de spécificité d'hydrolyse des substrats S2238 et S2366 est la plus abaissée. Détermination de la demi-vie plasmatique des variants de la PCa. La demi-vie des variants de la PCa a été comparée à celle de la PCa normale (PCa recombinante préparée dans les mêmes conditions ou PCa purifiée à partir de plasma humain). Pour estimer cette demi-vie, l'activité résiduelle des différentes PCa est mesurée après incubation pendant un temps variable dans du plasma normal rendu incoagulable par l'addition d'hirudine. Le mélange réactionnel se compose à 80% (v/v) d'un pool de plasmas normaux citratés et de PCa (50 à 200 nM selon le variant) en tampon Tris 50 mM pH 7,5 contenant 150 mM de NaCl, 0,5 mg/ml de sérum albumine bovine, et 80 U/ml d'hirudine. Après incubation, un aliquote du mélange plasma/PCa/hirudine (40 j. Ll) est ajouté à 160 ll de S2366 250 M, et la vitesse initiale d'hydrolyse du substrat est mesurée en enregistrant l'augmentation de l'absorbance à 405 nm sur un lecteur de microplaque MR5000. La demi-vie de chaque variant est alors estimée par régression non linéaire de la variation de l'activité résiduelle en fonction du temps à l'aide d'une équation représentant une décroissance exponentielle de premier ordre : A (t) =Ao exp' '"+ Cte ; où A ; o représente l'activité résiduelle de la PCa au temps t, Ao son activité initiale, et k la constante de vitesse premier ordre. La constante Cte est ajoutée pour tenir compte d'une éventuelle activité indépendante de celle du variant de PCa (bruit de fond). La demi-vie plasmatique est alors calculée en divisant ln (2) par k. Les valeurs obtenues (en min-l) sont résumées dans le Tableau IV. TaNpan ! \/ 1/2 vie (mm") PC-LI 0 26 Fpa-LIG 56 Fpa-LFG 184 PC-AIG 147 PC-SIG 270 Les demi-vies ont été déterminées en plasma citraré, en mesurant la décroissance de l'activité de PCa en fonction du temps. La demi-vie est 10 fois plus longue pour le variant de la PCa dont le résidu en Pl'en est une sérine et le résidu en Prune glycine (Fpa-SIG). La demi-vie plasmatique de la forme activée du variant Fpa-SIG est allongée d'un facteur 10 par rapport à la PCa normale. Tests de coagulation. Les activités anticoagulantes de la PCa et de ses dérivés, ont été déterminées en mesurant l'allongement du temps de céphaline avec activateur d'un pool de plasma normal citrate recalcifié, en présence de concentrations variables de PCa ou de l'un de ses dérivés (RICHARSON et al., Nature, 360,261-264, 1992). Ces tests sont réalisés en double sur un appareil ST4 (DIAGNOSTICA STAGO, Asnières, France). Les formes activées des PCa sont diluées dans un tampon Tris 50 mM pH 7, 5 contenant 0,15 M NaCl et 0,5 mg/ml de sérum albumine bovine. Pour chaque test, 50 pi d'une dilution de PCa, 50 pi du réactif"APTT" (ORGANON TECHNIKA, Fresnes, France) et 50 pi du pool de plasma citraté sont mélangés et incubés 3 minutes à 37 C. La coagulation est déclenchée par l'ajout de 50 pi de tampon de dilution contenant 25 mM de CaCl2. Le Tableau V représente l'activité anticoagulante des dérivés de la PCa, exprimée en pourcentage de l'activité anticoagulante de 1 nM de la PCa normale. Tableaux Activité anticoagulante (%) PCa 100 Fpa-LiG50 Fpa-LFG 8 Fpa-AIG 20 Fpa-SIG 6 Le pourcentage de l'activité anticoagulante est exprimé par rapport à la PCa normale qui sert de référence (100% correspond à l'activité anticoagulante de 1 nM de Pca). Pour chaque variant, la concentration nécessaire pour obtenir une activité anticoagulante équivalente à 1 nM de PCa a été estimée. L'activité anticoagulante du variant Fpa-AIG est par exemple de 20% de celle de la PCa normale (5 nM du variant sont nécessaires pour obtenir la même activité que 1 nM de PCa normale). L'activité anticoagulante du variant Fpa-SIG représente 6% de celle de la PCa normale. Analyse de la formation des complexes des variants actives Fpa-AIG et Fpa-SIG avec l'al-antitrypsine. La capacité des formes actives des variants FpaAIG et Fpa-SIG à former un complexe stable avec l'al-antitrypsine (CALBIOCHEM, France Biochem, Meudon, France) a été mise en évidence, en incubant les variants activées de la PC (5 uM) avec 40 uM d'al-antitrypsine, en tampon cinétique, pendant 5 h à 37 C. Le produit de la réaction a été analysé sur gel de polyacrylamide 10% en conditions dénaturantes. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Légende de la Figure 3 : Piste 1 : Fpa-AIG incubé 5 heures à 37 C en présence d'a1-anti trypsine, piste 2 : Fpa-AIG seul (2 rug). Piste 3 : Fpa-SIG incubé en présence d'a1-antitrypsine, piste 4 : Fpa-SIG seul. Piste 5 : PCa normale incubée en présence d'a1-anti trypsine, piste 6 : PCa normale, seule. Piste 7 au-antitrypsin seule. Tous les variants de la PCa forment un complexe covalent avec l'al-antitrypsine. La formation du complexe stable entre la PCa et t-antitrypsin se traduit par la formation d'une bande de haut poids moléculaire. Ce gel révèle que les variants de la PCa dont le domaine catalytique possède une alanine ou une sérine en position 16, sont capables de former un complexe stable avec l'al-antitrypsine à la concentration physiologique normale de la serpine. Conclusion. Effets de la modification du peptide d'activation de la PC. Dans le cas du dérivé de PC dans lequel 7 des 12 résidus du peptide d'activation (de Pis à P6 soit la séquence DTEDQED) ont été supprimés, la vitesse d'activation (dans des conditions physiologiques et en l'absence de thrombomoduline) est doublée par rapport à celle de la PC normale exprimée et caractérisée dans les mêmes conditions. Ceci montre que le peptide d'activation limite donc la capacité de la thrombine à cliver la PC : il constituerait l'une des barrières qui limitent son activation en l'absence de thrombomoduline. Dans le cas du dérivé de PC dans lequel les 12 résidus du peptide d'activation (de Pl2 à Pi, soit la séquence DTEDQEDQVDPR) ont été éliminés et remplacés par la séquence du FpA humain (de Plo à Pi, soit la séquence DFLAEGGGVR), la vitesse d'activation (dans des conditions physiologiques et en l'absence de thrombomoduline) est 40 fois supérieure à celle de la PC normale exprimée et caractérisée dans les mêmes conditions. Au total, la modification du peptide d'activation de la PC a permis d'atteindre une constante de vitesse d'activation de 2 x 10'M-1 s-1. Optimisation des résidus Pl'P2'et P3'du site d'activation de la PC. Les Inventeurs ont exprimé et caractérisé des variants de la PC qui, en plus de porter la séquence du FpA en amont du site de clivage activateur, ont été modifiés en positions 16,17 et/ou 18. En position 16, la leucine a été remplacée par une sérine ou une alanine ; en position 17, l'isoleucine substituée par une phénylalanine, et en position 18, l'aspartate par une glycine. Toutes ces mutations rapprochent plus ou moins le site d'activation de la PC de la séquence optimale de clivage pour la thrombine, et toutes effectivement augmentent la susceptibilité de chaque variant pour l'activateur. La différence est particulièrement spectaculaire avec le variant portant une sérine en 16 et une glycine en 18, puisque la valeur de la constante d'activation obtenue (1,6 x 105 W1 s') est du même ordre de grandeur que celle que l'on obtient pour la PC normale en présence de thrombomoduline (5 x 105 M' s ; Tableau II). Le gain par rapport au dérivé de la PC ne portant que le FpA en amont du site de clivage est avec ce mutant de plus de 10 fois. Ce gain provient surtout de la mutation L16S, puisque la contribution de la mutation D18G n'est que de 1,6 fois (Tableau II). Lorsque le résidu 16 est une alanine, le gain est d'environ 2 fois (par rapport au mutant portant le FpA et muté en D18G) ; un gain qui est similaire à celui que l'on obtient en substituant l'isoleucine en 17 par une phénylalanine. Cependant, excepté pour la mutation D18G, ces modifications ont (à des degrés divers) une conséquence délétère sur l'activité catalytique de la PCa. Lorsque le résidu 16 est une sérine, l'activité anticoagulante est 20 fois plus faible que pour la PCa normale, lorsque le résidu 16 est une alanine, l'activité anticoagulante est 5 fois plus faible, elle est 13 fois plus faible lorsque le résidu 17 est une phénylalanine. Cette perte (relative) d'activité est vraisemblablement le reflet d'une altération de la machinerie catalytique elle-même puisque la valeur de la constante de spécificité (kcac/Kn) pour un substrat chromogénique tel que le S2366 ou le S2238 est diminuée, dans des proportions similaires (27 fois lorsqu'une sérine est en position 16, 5 fois quand c'est une alanine, et 12 fois lorsque le résidu 17 est une phénylalanine). Il est concevable que la sérine, et dans une moindre mesure l'alanine, ne permettent pas de former en totalité les contacts nécessaires à une activation maximum de la machinerie catalytique : l'hydrophobicité de l'alanine étant inférieure aux autres résidus aliphatiques, valine, leucine, ou isoleucine, tandis que le résidu sérine est de nature hydrophile. L'hydrophobicité n'est par contre probablement pas à l'origine de la perte d'activité résultant de la mutation en position 17 puisque l'hydrophobicité d'une phénylalanine est comparable à celle d'une leucine. L'effet déstabilisant pourrait résulter d'un encombrement stérique, la chaîne latérale d'une phénylalanine étant plus volumineuse (190 A3) que celle d'une leucine (124 A3) ; alternativement, une répulsion pourrait naître entre la charge de Asp183 et celle, partielle, du noyau aromatique de la phénylalanine. Le défaut catalytique des mutants activés rapidement pose évidemment la question du gain effectif global consécutif à la mutation. A première vue, ce gain n'est pas favorable puisque l'augmentation de la vitesse d'activation semble entièrement perdue par le défaut d'activité : le rapport du gain en vitesse d'activation sur la perte d'activité catalytique est inférieur à un (10/20 et 2/5 pour sérine et alanine en position 16,2/13 pour une phénylalanine en position 17). Toutefois, ce défaut d'activité s'accompagne d'une relative résistance aux inhibiteurs plasmatiques, et par conséquent prolonge leur action. Ainsi, par rapport à la PCa normale, la demi-vie plasmatique du mutant portant une sérine en 16 est augmentée de 10 fois, celle du mutant portant une alanine de 5 à 6 fois, et celle du mutant portant une phénylalanine en 17 de 7 fois. Dans ces conditions, si le gain effectif global demeure inférieur à 1 pour le mutant avec phénylalanine en 17, et reste proche de zéro pour la mutation L16S, il devient largement favorable pour le mutant portant une alanine en 16. Au total, en dépit d'une activité catalytique diminuée, la vitesse d'activation et l'augmentation de la demi-vie plasmatique confèrent au mutant L16A un avantage considérable sur tous les autres dérivés de la PC décrits à ce jour. REVENDICATIONS 1) Protéine chimérique comprenant une séquence clivable par la thrombine P18P9PSPïP6PSP4P3P2P1Pl'P2'P3', caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence artificielle comprenant les acides aminés P10 à P, du fibrinopeptide A, et les acides aminés Pl'-P2'-P3'd'un site de clivage par la thrombine autre que celui de la chaîne alpha du fibrinogène. 2) Protéine chimérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est dérivée du zymogène d'une sérine-protéase par remplacement du peptide d'activation dudit zymogène par le fibrinopeptide A ou une portion de celui-ci comprenant au moins les acides aminés P10 à Pi dudit fibrinopeptide. 3) Protéine chimérique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit zymogène est la protéine C. 4) Protéine chimérique selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la séquence Pal'- P2'-P3'native dudit zymogène est en outre modifiée par remplacement de l'acide aminé en position Pi'par une alanine ou une sérine, et/ou de l'acide aminé en position P2'par une phénylalanine, et/ou de l'acide aminé en position P3'par une glycine. 5) Protéine chimérique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'acide aminé en position P2'est remplacé par une phénylalanine et l'acide aminé en position PI'est remplacé par une alanine ou une sérine. 6) Protéine chimérique selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'acide aminé en position P3'est remplacé par une glycine. 7) Dérivé de sérine-protéase susceptible d'être obtenu par clivage par la thrombine d'une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 4 à 6. 8) Dérivé de sérine protéase selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite sérine protéase est la protéine C activée (PCa). 9) Molécule d'acide nucléique codant pour une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 6. 10) Couple d'amorces d'amplification choisi parmi : - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 3 et 4. - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 5 et 6. - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 7 et 8. - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 9 et 10. - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 11 et 12. - le couple d'oligonucléotides défini par les séquences SEQ ID NO : 13 et 14. 11) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 9. 12) Cellule hôte génétiquement transformée par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 9. 13) Utilisation d'une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 6, ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 9 pour l'obtention d'un médicament. 14) Utilisation d'un dérivé de sérine protéase selon la revendication 7, pour l'obtention d'un médicament. 15) Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'on utilise une PC chimérique selon une quelconque des revendications 2 à 6, ou une molécule d'acide nucléique codant pour ladite PC chimérique, pour l'obtention d'un médicament anti-thrombotique. 16) Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'on utilise un dérivé de PCa selon la revendication 8 pour l'obtention d'un médicament antithrombotique. 17) Composition pharmaceutique comprenant au moins une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 6, ou un dérivé de sérine protéase selon une quelconque des revendications 7 ou 8, associé à un excipient approprié.