FR 2828406 A1 20030214 FR 0110573 A 20010808 La présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale bivalente Hépatite A/Fièvre typhoide (HA-Vi) stabilisée dans laquelle la valence Vi conserve son pouvoir immunogène pendant au moins 24 mois environ. L'hépatite A et la fièvre typhoïde sont deux maladies pour lesquelles on dispose déjà d'un vaccin. Elles se rencontrent toutes deux dans des régions du globe où les conditions d'hygiène sont loin d'être optimales. Dans la mesure où les agents infectieux respectifs ont en commun la même voie de transmission (voie orale-fécale) et dans la mesure où les zones endémiques de ses maladies se recouvrent largement, il apparaît intéressant des combiner les deux valences dans un même produit. En particulier, on comprendra aisément que, dans la gamme des vaccins du voyageur, une combinaison HA-Vi soit plus attractive que les deux vaccins monovalents HA et Vi devant être administrés séparément. Des études ont déjà été réalisées afin de vérifier que les valences HA et Vi étaient compatibles notamment en termes d'inocuité, de pouvoir immunogène et de stabilité. Ces études utilisent des combinaisons HA-Vi préparées à partir des vaccins monovalents existant déjà sur le marché ; elles sont essentiellement au nombre de deux : d'une part, les études conduites en combinant les monovalents Havrix (HA) et (Vi) produits par SmithKline Beecham Biologicals (Rixensart, Belgique) et d'autre part, les études conduites en combinant les monovalents Avaxim (HA) et Typhim Vi (Vi) produits par Aventis Pasteur (Lyon, France). Dans les deux séries d'études, le vaccin monovalent HA est constitué par du virus de l'hépatite A inactivé et adsorbé sur de l'hydroxyde d'aluminium. De même, le vaccin monovalent fièvre typhoïde est constitué par du polysaccharide de la capsule de Salmonella typhi qui reste non adjuvanté. Enfin, les combinaisons bivalentes sont produites de manière identique, en mélangeant simplement les vaccins monovalents correspondants (ces vaccins monovalents sont commercialisés sous forme liquide). Ainsi, une dose d'Avaxim et une dose de Typhim Vi sont mélangées ensemble pour donner une dose de la combinaison bivalente HA-Vi. Les deux séries d'études ont été réalisées avec des combinaisons constituées moins de vingt mois avant que soient mises en oeuvre les injections dans le cadre des essais cliniques. Ces études ont montrées que les combinaisons bivalentes étaient équivalentes aux monovalents correspondants notamment en termes de pouvoir immunogène. Ainsi, la combinaison bivalente de SmithKline Beecham Biologicals a satisfait aux exigences des autorités de Grande-Bretagne et a déjà reçue une autorisation de mise sur le marché dans ce pays. Cette autorisation a néanmoins pour contrainte une date de péremption établie à 12 mois après fabrication. Dans le domaine des vaccins, une date de péremption de 12 mois ne peut être considérée comme suffisante compte tenu notamment du temps nécessaire aux contrôles des lots avant distribution. Une date de péremption établie à 24, ou mieux encore de 36 mois, facilitent grandement la commercialisation des lots. Or, dans le cas des combinaisons HA-Vi, la demanderesse s'est aperçu que, au-delà de 16- 18 mois passée la date de fabrication, la valence Vi perdait progressivement son pouvoir immunogène et a émis une hypothèse sur l'origine de cette instabilité. En effet, les groupements 0-acétyla du polysaccharide Vi qui sont caractéristiques de l'immunogénicité du Vi, s'hydrolysent au cours du temps, surtout dans des conditions alcalines. Cette hydrolyse est tenue pour responsable de la diminution du pouvoir immunogène du polysaccharide Vi et elle serait due à l'adsorption du composant Vi sur l'hydroxyde d'aluminium qui est présent dans la combinaison bivalente en tant qu'adjuvant de la valence HA. La valence Vi s'adsorbe immédiatement sur le gel d'aluminium dès que les vaccins monovalents sont mélangés l'un à l'autre. Cette désorption entraîne le maintien du polysaccharides Vi dans un environnement alcalin. En effet, l'hydroxyde d'aluminium étant chargé positivement, attire les ions OH-du milieu ce qui occasionne une augmentation du pH dans le micro-environnement du gel d'aluminium où se trouve le Vi suite à son adsorption. L'hydrolyse des 0-acétyla quant à elle est un phénomène très lent dont les effets sont réellement perceptibles au bout de 16-18 mois environ. Non seulement la demanderesse a mis en évidence le problème de l'instabilité de la valence Vi au cours du temps, mais elle propose une solution qui consiste à rajouter dans la combinaison bivalente un composé qui empêche l'adsorption de la valence Vi sur le gel d'aluminium tout en maintenant la valence HA sous forme adjuvantée. De manière avantageuse, ce composé peut être un anion tel qu'un ion phosphate ou citrate. Dans son enseignement le plus général, l'invention porte donc sur une composition vaccinale comprenant au moins deux valences ; une première valence étant adsorbée sur de l'hydroxyde d'aluminium et une deuxième valence n'étant pas adsorbée sur l'hydroxyde aluminium grâce auquel la première valence est adjuvantée, en raison de la présence d'un composé additionnel venant empêcher l'adsorption de la deuxième valence sur l'hydroxyde d'aluminium, sans perturber l'adsorption de la première valence. Dans un cadre plus spécifique, l'invention a pour objet une composition vaccinale comprenant (i) la valence fièvre typhoide constituée par du polysaccharide Vi purifié ayant pour origine la capsule de Salmonella typhi et (ii) au moins une valence additionnelle adjuvantée par un composé d'aluminium ; composition dans laquelle la valence Vi n'est pas adsorbée sur le composé d'aluminium. Aux fins de la présente invention, la valence additionnelle peut être adjuvantée soit par précipitation avec le composé d'aluminium, soit par adsorption sur le composé d'aluminium. Ce composé d'aluminium peut être sélectionné parmi ceux connus sous le nom d'hydroxyde d'aluminium même si du point de vue chimique ils ne sont pas constitués exclusivement d'hydroxyde d'aluminium. Il peut aussi s'agir de composés d'aluminium mixtes tels que ceux désignés sous le nom d'aluminium hydroxy phosphate ou hydroxy sulfate. A titre d'illustration, on cite l'hydroxyde d'aluminium AlhydrogelTM commercialisé par la Société Superfos Biosector. Selon un mode de réalisation avantageux, l'adsorption de la valence Vi peut être empêchée par la présence d'un composé anionique à condition qu'il présente toutes les garanties de sécurité nécessaires pour une utilisation à des fins vaccinales ; ce composé peut être un phosphate, un citrate ou encore un carbonate. Il est également possible d'utiliser une combinaison de différents anions, par exemple une combinaison d'ions phosphate et citrate. A titre indicatif, on précise que les ions phosphate peuvent être notamment apportés par une solution contenant du phosphate monopotassique, du phosphate disodique et du chlorure de sodium. Ce composé doit être ajouté en quantité suffisante pour empêcher l'adsorption de la valence Vi tout en maintenant la valence HA sous forme adsorbée. Cette quantité dépend de divers facteurs parmi lesquels, la quantité et la nature de la valence additionnelle, son mode d'adjuvantation, la quantité et la nature du composé d'aluminium et la quantité de la valence Vi. L'homme de l'art dans le domaine des vaccins est tout à fait à même de prendre en compte ces contraintes afin de déterminer la quantité appropriée du composé empêchant l'adsorption de la valence Vi une fois que les autres facteurs ont été établis, de telle sorte que le composé d'aluminium soit saturé par les ions phosphate tout en maintenant la valence additionnelle adsorbée. Néanmoins, on précise que les vaccins du commerce contiennent de manière usuelle de 0,6 à 1,5 mg d'aluminium/ml. Dans les vaccins HepA du commerce, le gel d'alumine, présent aux doses conventionnelles (exprimé en quantité d'aluminium), se retrouve largement en excès par rapport à l'antigène HepA dans la mesure où les sites d'adsorption du gel d'alumine sont loin d'être saturés. Ainsi, en pratique, seule la quantité d'alumine apparaît comme déterminante pour établir la quantité de phosphate qui doit se trouver présente. Pour une composition selon l'invention contenant 0,3 mg d'aluminium sous forme d'hydroxyde d'aluminium et sous un volume de 0,5 ml, il convient de rajouter environ 20 mM d'ions phosphate. Si la dose d'hydroxyde d'aluminium est doublée sous ce même volume, il convient de rajouter deux fois plus d'ions phosphate, soit 40 mM. Mais pour une composition selon l'invention contenant 0,6 mg d'hydroxyde d'aluminium sous un volume de 1 ml, 20 mM d'ions phosphate suffisent. A titre d'illustration, on indique qu'un vaccin bivalent selon l'invention peut contenir sous un volume de 0,5 ml, (i) 160 unités d'antigène ou 1440 unités ELISA du virus de l'hépatite A inactivé adsorbées sur (ii) de l'hydroxyde d'aluminium contenant 0,3 mg d'aluminium ; (iii) 0,025 mg de polysaccharide Vi ; et (iv) 20 mM d'ions phosphate. Une composition selon l'invention est avantageusement sous forme liquide et une dose vaccinale est avantageusement formulée sous un volume compris entre 0,5 et 1 ml, bornes incluses. Une composition selon l'invention peut être réalisée : (i) en ajoutant des ions phosphate ou citrate à une préparation contenant une valence autre que la valence fièvre typhoïde adjuvantée par un composé d'aluminium ; et (ii) en mélangeant la préparation obtenue au point (i) à une préparation contenant la valence fièvre typhoïde. Exemple : Préparation d'une composition HA Vi selon l'invention A-Préparation du composant HA adsorbé 99 ml d'un lot de virus HA inactivé dont le titre antigénique est de 885 U ELISA/ml est mélangé à 5,94 ml de 2-phenoxy-éthanol à 25 %. L'homogénisation est poursuivie pendant 15 min puis la préparation est filtrée sur filtre Millipak 40 MPGL 04SH2. Après filtration on obtient 95 ml d'une préparation titrant à 835 U ELISA/ml. On ajoute à cette préparation 47, 5 ml d'un gel d'alumine contenant 3, 14 mg d'Aluminium/ i ml. On complète par 48 ml de PBS (tampon phosphate) 40mM. L'agitation est poursuivie une nuit à 5 C (18 hrs) afin que le composant HA s'adsorbe sur le gel d'alumine. Le pH est de 7, 28. B-Préparation d'une solution de polysaccharide Vi 10 fois concentrée Dans un flacon de 30 ml, contenant 16,64 mg de Vi (9,5 g% d'humidité résiduelle, soit 15,06 g de poids sec) on verse petit à petit 25,1 ml d'eau distillée préparée pour injection (ppi), sous agitation continue. On laisse l'agitation se poursuivre 24 hrs à 5 C afin d'obtenir la dissolution complète du polysaccharide. Cette préparation est filtrée sur filtre Millex 0,22 um GV SLGV 025. Le filtre est rincé avec 5 ml d'eau distillée ppi. Le volume final est donc de 30, 1 ml. C-Préparation du vaccin bivalent HAVi A 62 ml de la préparation obtenue au point A (HA), on ajoute 10,6 ml d'une solution de phosphate 94 mM, puis 8,1 ml de la préparation obtenue au point B (Vi). Le caractéristiques du vaccin ainsi obtenu sont les suivantes : Concentration finale en phosphate : 20 mM pH : 7,3 Osmolarité : 578 mosm/kg Cette préparation, appelée préparation P2, est ensuite répartie en dose de 0,5 ml. En parallèle on a aussi préparé deux autres compositions bivalentes P2'et P2"contenant non plus 20 mM de phosphate mais de manière respective, 10 et 40 mM de phosphate. Pour ce faire, on a rajouté 10,6 ml d'une solution de phosphate à 17,6 mM ou 246 mM selon l'espèce. Le comportement des composants HA et Vi dans les compositions P2, P2'et P2"a immédiatement été étudié en dosant ces composants par ELISA dans les compositions telles quelles ou après centrifugation. On a constaté qu'à 10 mM de phosphate, le HA restait adsorbé mais Vi s'adsorbait sur le gel d'alumine tandis qu'à 40 mM de phosphate le Vi ne s'adsorbait plus mais le HA se désorbait partiellement. A 20 mM de phosphate, les conditions recherchées sont remplies : le HA reste adsorbé tandis que le Vi ne s'adsorbe pas. Par la suite, la stabilité des doses P2 été étudiée à 5 C : 3 C pendant 30 mois. On a notamment évalué par ELISA, la capacité antigénique du polysaccharide Vi dans les doses vaccinales prises dans leur intégralité et dans le surnageant après centrifugation (le composant adsorbé sur le gel d'alumine sédimente avec le gel) ; cela permet en outre d'établir le pourcentage de Vi non adsorbé. L'ELISA est mis en oeuvre en méthode indirecte. L'antigène Vi à doser est pris en sandwich entre un anticorps anti-Vi tapissant le fond d'une plaque et un anticorps anti-Vi de souris. On rajoute un anticorps anti IgG de souris biotinylé puis le complexe streptavidine biotinylé couplée à la peroxydase du raifort. La réaction est révélée par ajout du substrat Ortho Phenylène diamine Dihydrochloride (OPD). La dégradation de l'OPD se traduit par une coloration brune orangée proportionnelle à la quantité d'antigène Vi. Son intensité est mesurée au spectrophotomètre. On a également mesuré la quantité des 0-acétyla du polysaccharide Vi présent dans le surnageant, après centrifugation. Les 0-acétyla sont titrés par une méthode colorimétrique utilisant l'hydroxylamine (Hestrin S. J. Biol. Chim. (1949) 180 : 249). L'hydroxylamine en milieu alcalin forme avec les esters un acide hydroxamique qui en présence de sel ferrique donne une coloration marron dont l'intensité est mesurée au spectrophotomètre à 540 nm. On a mené en parallèle une étude identique avec une préparation dite préparation PI, préparée de la même manière que P2, à la seule différence que l'on ne rajoute pas de phosphate au moment de la constitution du vaccin bivalent. Dans ce cas, le composant Vi s'adsorbe immédiatement sur le gel d'alumine et afin de réaliser son dosage après centrifugation, comme pour P2, il convient de le désorber au préalable. Cette désorption est obtenue par modification du pH et de la force ionique du milieu. Après centrifugation, le gel d'alumine est mis en contact avec une solution de citrate trisodique 150 mM pendant 6 hrs à 37 C. Puis on centrifuge pour recueillir le surnageant dans lequel se retrouve le composant Vi. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-après. Tableau 1 5 C TO 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois 18 mois 24 mois 30 mois Vi dans le vaccin Vi ELISA P2 23, 6 25, 5 21, 7 21, 3 18, 5 23, 7 24, 3 26, 5 entier (g/dose) Pl 24, 4 23, 3 22, 2 19, 8 17, 9 20, 5 18, 6 19, 3 Vi dans le surnageant Vi ELISA P2 24, 3 26 23, 1 21, 8 17, 9 25 21, 9 25, 8 après centrifugation (g/dose) Pl 21 16, 9 16, 5 15, 4 12 14, 7 21, 8 15, 7 O-acétyls P2 0, 127 0, 148 0, 116 0, 117 0, 130 0, 134 0, 095 0, 143 (mole/dose) Pl 0, 081 0, 056 0, 055 0, 055 0, 061 0, 057 0, 090 0, 054 Polysaccharides P2 32, 5 30, 5 27, 6 31 30, 4 29, 1 31, 7 29, 3 (Jlg/dose) Pl 20, 8 22 15, 6 16, 2 18, 5 16, 5 17 18, 4 % de désorption du Vi dans Pl 86% 72% 74% 78% 67% 72% 63% 81, 6% La stabilité de la formulation P2 a aussi été étudiée à 250C : 2 C pendant 6 mois et à 370C 3 C pendant 3 mois. Les résultats sont présentés dans les Tableaux II et Ill ci-après. Tableau II 250C TO 1 mois 3 mois 6 mois Vi dans le vaccin Vi ELISA P2 23, 6 23, 6 21, 7 20, 6 entier ( g/dose) P1 24,4 19,6 11,3 7,4 Vi dans le surnageant Vi ELISA P2 24, 3 25, 5 22, 6 20, 1 après centrifugation ( g/dose) P1 21 15 10, 3 6,3 O-acétyls P2 0,127 0,130 0,103 0, 137 ( mol/dose) P1 0,081 0,053 0,041 0, 029 Polysaccharides P2 32, 5 31, 6 25, 5 27,2 ( g/dose) P1 20,8 17,3 10,3 6,3 % de désorption du Vi dans Pl 86% 77% 91% zu Tableau III 370C TO 1 mois 3 mois Vi dans le vaccin Vi ELISA P2 23, 6 24, 1 21 entier ( g/dose) P1 24,4 12,7 5,6 Vi dans le surnageant Vi ELISA P2 24, 3 25, 5 21, 1 après centrifugation ( g/dose) P1 21 9, 9 4, 7 O-acétyls P2 0,127 0,143 0, 104 ( mole/dose) P1 0,081 0,050 0,026 Polysaccharides P2 32, 5 36 22, 5 ( g/dose) P1 20,8 15,4 9,9 % de désorption du Vi dans P1 86% 78% 84% Revendications 1. Une composition vaccinale comprenant (i) la valence fièvre typhoide constituée par du polysaccharide Vi purifié ayant pour origine la capsule de Salmonella typhi et (ii) au moins une valence additionnelle adjuvantée par un composé d'aluminium ; composition dans laquelle la valence Vi n'est pas adsorbée sur le composé d'aluminium. 2. Une composition vaccinale selon la revendication 1, qui comprend des ions phosphate ou des ions citrate. 3. Une composition vaccinale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la valence additionnelle est adjuvantée par un composé d'aluminium qui est de l'aluminium hydroxide ou de l'aluminium hydroxy phosphate. 4. Une composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la valence additionnelle est adjuvantée par adsorption sur un composé d'aluminium. 5. Une composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la valence additionnelle est la valence hépatite A. 6. Une composition vaccinale selon la revendication 5, dans laquelle la valence hépatite A est constituée par du virus de l'hépatite A inactivé. 7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle la valence Vi reste complètement active en termes d'immunogénicité pendant au moins 24 mois. 8. Une composition selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle la valence fièvre typhoïde est remplacée par une autre valence constituée par un polysaccharide comportant des résidus 0-acétyla provenant d'un organisme pathogène. 9. Un procédé de fabrication d'une composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 5, selon lequel : (iii) on ajoute des ions phosphate ou citrate à une préparation contenant une valence autre que la valence fièvre typhoïde adjuvantée par un composé d'aluminium ; et (iv) on mélange la préparation obtenue au point (i) à une préparation contenant la valence fièvre typhoid. i