FR 2827776 A1 20030131 FR 0109887 A 20010725 COMPOSITION COMPRENANT UN ANTI-INFLAMMATOIRE ENZYMATIQUE ET UN MUCOLYTIQUE La présente invention a pour objet une nouvelle composition remarquable en ce qu'elle contient en association, un anti-inflammatoire enzymatique et un composé mucolytique. La présente invention a également pour objet un procédé permettant la préparation de ladite composition. Les composés mucolytiques sont connus depuis longtemps pour leurs propriétés pharmacologiques intéressantes. Leur action mucolytique est souvent accompagnée d'une action mucokinétique qui en fait d'excellents expectorants. Ils sont utilisés dans le traitement des troubles de la sécrétion bronchique, notamment au cours des affections bronchiques, telles que les bronchites aiguës et les épisodes aigus des bronchopneumopathies chroniques, et dans le traitement de l'hypersécrétion bronchique. Par ailleurs, il est connu depuis longtemps que les amylases sont dotées de propriétés antiinflammatoires. Elles possèdent aussi des propriétés antibactériennes et antivirales qui ont été décelées plus récemment. En effet, grâce à leur activité amylolytique ces ferments sont capables de dégrader des fractions cellulosiques et amylacées pour les réduire à l'état de simples sucres. Le mécanisme par lequel l'alpha-amylase dégrade les composés polysaccharidiques en mono et disaccharides est une réaction d'hydrolyse où l'enzyme joue le rôle de catalyseur, provoquant la dégradation de la paroi cellulaire et de la membrane de nombreuses bactéries qui sont riches en hydrates de carbone. De la même manière, l'amylase dégrade les constituants glucidiques présents dans l'enveloppe cellulaire des particules virales. Les amylases sont aussi utilisées pour leurs propriétés anti-oedémateuses. Les affections des voies respiratoires se manifestent le plus souvent sous forme de plusieurs symptômes associés. En particulier, les troubles de la sécrétion du mucus bronchique peuvent favoriser ou au contraire être provoqués par une inflammation d'origine bactérienne ou virale. Or aucun des mucolytiques connus à ce jour n'est doté de propriété lui conférant une action anti-inflammatoire. Il est donc apparu intéressant d'associer aux effets expectorants des mucolytiques, les effets anti-inflammatoires, antibactériens et antiviraux de l'amylase. Des doses d'emploi optimales ont été déterminées. Il a été établi que cette association réalisée dans des proportions adéquates, assure une action complémentaire des composants, renforce l'efficacité du traitement et montre un effet bénéfique pour le malade. En outre un procédé de préparation de la composition selon l'invention a été mis au point. Ce procédé permet de réaliser le mélange des composants sous une forme prête à l'emploi en évitant les inconvénients inhérents à un tel mélange. En particulier, la fragilité des substances enzymatiques est bien connue et s'explique par leur dénaturation rapide dès que les conditions physico-chimiques, telles que le pH, la température, ou encore la présence de certaines substances, sont modifiées. Dans certaines conditions on observe une dénaturation rapide de l'enzyme après sa mise en solution. Un autre problème à résoudre était la solubilité relativement faible du composé mucolytique. Grâce au procédé mis au point, il est possible d'une part d'obtenir la dissolution complète du composé mucolytique et d'autre part de conserver une activité élevée de l'amylase. La composition selon l'invention contient un composé mucolytique choisi parmi les composés à la disposition de l'homme de l'art, tels que le chlorhydrate d'ambroxol, le chlorhydrate de bromhexine, la S-carboxyméthylcystéine, la N-acéthylcystéine, ou d'autres encore. De manière avantageuse, on utilisera le chlorhydrate d'ambroxol. Le chlorhydrate d'ambroxol est le composé de formule brute CI3HI9BrzCINzO, identifié selon la nomenclature internationale sous le nom de chlorhydrate de trans-4- [ (2-amino-3, 5dibromobenzyl) amino] cyclohexanol. Il se présente sous la forme d'une poudre cristalline blanche ou jaunâtre, ayant une teneur en substance active de 99,0 % à 101,0 %, et partiellement insoluble dans l'eau. Le chlorhydrate d'ambroxol est présent dans la composition selon l'invention à une concentration compatible avec le maintien de l'activité de l'amylase et qui apporte l'effet bénéfique recherché pour le patient. Les concentrations répondant à ces critères se situent dans un intervalle de 0,2 g à 0,6 g de chlorhydrate d'ambroxol pour 100 ml de composition, soit 0,2 à 0,6 % en poids. De manière préférée, on incorpore 0,3 g de chlorhydrate d'ambroxol dans 100 ml de ladite composition. Le produit décrit ci-dessus est communément commercialisé par les sociétés spécialisées dans les ingrédients pharmaceutiques. La composition selon l'invention contient également une enzyme à activité amylolytique. Cette enzyme est de préférence une (1, 4)-a-D-glucan-glucanohydrolase, communément appelée "alpha-amylase", ou "alfa-amylase" selon la Dénomination Commune Internationale préconisée par l'Organisation Mondiale de la Santé pour les substances pharmaceutiques. Le mécanisme par lequel l'alpha-amylase dégrade les composés polysaccharidiques est une réaction d'hydrolyse où l'enzyme joue le rôle de catalyseur. Celle-ci attaque au hasard les liaisons oc-(1, 4) de l'amidon libérant du glucose et du maltose (le maltose est un disaccharide composé de deux monomères glucoses). Les parois cellulaires sont endommagées par cette hydrolyse, ce qui conduit à une perte de virulence et à l'arrêt de la prolifération des agents infectieux dans l'organisme. Dans un mode de réalisation particulier, on utilise l'alpha-amylase sécrétée naturellement par un micro-organisme bactérien, de préférence par Bacillus amyloliquefaciens. Cette bactérie, reconnue comme espèce à part entière en 1987, était considérée antérieurement comme un représentant atypique de l'espèce Bacillus subtilis (Priest et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 37 : 69 1987). L'alpha-amylase produite naturellement par B. amyloliquefaciens est une protéine de 58 kDa, dont les dix premiers acides aminés, déterminés par séquençage sont : Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu L'alpha-amylase utilisée dans la composition selon l'invention peut être produite par tout procédé de culture microbiologique mettant en oeuvre un micro-organisme compétent pour la production et l'excrétion de ladite alpha-amylase, qu'il soit transformé par génie génétique ou non. De manière préférée, l'alpha-amylase bactérienne est obtenue par fermentation en réacteur de B. amyloliquefaciens. Les procédés de production d'enzymes par fermentation microbiologique et de purification sont bien connus de l'homme du métier et sont mis en oeuvre par des entreprises spécialisées dans le domaine correspondant. En particulier, l'alpha-amylase entrant dans la composition revendiquée est produite par un procédé la mettant à l'abri d'une contamination par l'E. S. B. (Encéphalopathie Spongiforme Bovine). En effet, aucune matière première utilisée dans l'ensemble du cycle de production (fermentation, extraction, finition) n'est d'origine bovine ou ovine. D'autre part, toutes les matières premières utilisées en fermentation (source de carbone et de protéines, azote, sel minéraux) sont stérilisés à 125 C pendant 30 minutes. L'alpha-amylase ainsi produite se présente comme une poudre fine de couleur crème à beige ne présentant aucune matière étrangère, soluble dans l'eau et conforme aux normes de qualité et de sécurité exigées pour les produits à usage pharmaceutique (absence de métaux, stérilité). Elle est commercialisée en France et dans de nombreux pays, par la Société Top Pharm (Revel, France). La quantité d'alpha-amylase incorporée à la composition est définie par son niveau d'activité enzymatique exprimée en unité internationale CEIP, notée"U. CEIP", la valeur d'une unité U. CEIP étant égale à 0,7143 unité de la pharmacopée européenne. Elle est comprise entre 20.000 et 30.000 U. CEIP pour 100 ml de composition, et est de préférence de 24.000 U. CEIP, pour 100 ml de composition. Dans la pratique du fait que les procédés microbiologiques de fermentation ne sont pas à l'abri de légères variations, on dose l'activité enzymatique de l'alpha-amylase en poudre avant la préparation de la composition et on calcule la quantité en poids qu'il faut incorporer à la composition, pour obtenir une activité définie. Ces valeurs sont contrôlées au moment de la préparation de la composition et vont décroître dans le temps par un phénomène naturel de dégradation de l'enzyme. Cependant cette décroissance est légère, de sorte que l'activité enzymatique au bout de trois ans sera encore au moins de 20.000 U. CEIP pour 100 ml de composition, avec une marge d'incertitude maximum de 5 %. L'activité amylolytique est mesurée à l'aide du kit"AmylaseTM"commercialisé par la société Sigma Diagnostics (USA) selon le protocole standard indiqué par le fabricant. Cette méthode offre l'avantage d'être très facile d'utilisation et d'avoir une bonne fiabilité. Elle fait l'objet d'une description détaillée dans l'exemple N05. L'unité d'activité selon la méthode Sigma, notée "A" est exprimée par gramme d'enzyme. Elle est reliée aux unités d'activité enzymatiques classiques par les relations : 11, 95 A = 1 Unité CEIP (unité internationale CEIP) = 0,7143 Unité de la Pharmacopée Européenne ou encore 1 Unité de la Pharmacopée Européenne = 16,737 A Aux principes actifs ainsi définis, sont ajoutés différentes substances utilisées pour la formulation des compositions à usage pharmaceutique. Un excipient peut être choisi parmi tout composé à la disposition de l'homme du métier, compatible avec une prise orale de la composition selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, un excipient conférant un goût sucré est ajouté, tel que le saccharose ou le glucose. Une composition dite"sans sucre"peut également être préparée en employant un excipient édulcorant succédané du sucre, comme le fructose ou l'Aspartame (R). De manière avantageuse, on incorpore 56 grammes de saccharose dans 100 ml de sirop. Un arôme peut être ajouté à la préparation. L'essence de mandarine est avantageusement utilisée du fait de son goût agréable pour le public adulte comme enfantin. Tout aromatisant autorisé parmi les produits à usage alimentaire peut également être employé. Un stabilisant tel que le glycérol peut être ajouté à la composition, à raison de 8 à 10 grammes pour 100 ml de composition, de préférence 9 grammes pour 100 ml. D'autres additifs autorisés peuvent également être utilisés dans la composition selon l'invention. Citons les parabens, tel que le parahydroxybenzoate de méthyle ou le parahydroxybenzoate de propyle, ou les anti-oxydants tel que l'acide citrique. La présente invention a pour objet un procédé de fabrication de la composition ci-avant décrite, permettant d'obtenir une dissolution complète des composants et d'éviter la dénaturation de l'amylase, consistant à - préparer une première solution aqueuse comprenant une enzyme amylolytique et éventuellement un agent sucrant ; - préparer une seconde solution aqueuse comprenant un composé mucolytique, et éventuellement au moins un des composés suivants : agent édulcorant, arôme, stabilisant, antioxydant, adjuvant de fabrication ; - ajouter ladite seconde solution à ladite première solution ; - ajuster le volume d'eau désiré et le pH. Les deux solutions doivent être préparées de préférence sous agitation jusqu'à dissolution complète des poudres, avec de l'eau purifiée. Le pH en fin de préparation doit être ajusté à environ 6, 4-6, 5. Quand la composition est homogène, elle peut être filtrée et transvasée dans des flacons de verre brun avant conditionnement final pour commercialisation. Pour ce qui concerne les autres paramètres mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention, la fabrication de la composition est réalisée conformément aux méthodes pratiquées usuellement et connues de l'homme de l'art. La composition selon l'invention est préconisée dans le traitement des pathologies du système respiratoire, comme les infections broncho-pulmonaires aiguës et chroniques, les bronche-pneumopathies chroniques, ainsi que les troubles affectant la sécrétion bronchique. Les exemples ci-après sont donnés à titre purement illustratif et non limitatif. EXEMPLE 1 Formule de la composition Cl : préparation de 100 ml de sirop Alpha-amylase 24 000 U. CEIP Chlorhydrate d'ambroxol 0, 30 g Saccharose 56,00 g Glycérol 9, 00g Essence de mandarine 0,50 g Parabens méthyl 0,09 g Parabens propyl 0,03 g Acide citrique qsp pH 6,4-6, 5 Eau purifiée qsp 100 ml EXEMPLE 2 Formule de la composition C2 : préparation d'un lot industriel de 600 litres Alpha-amylase 141 000 000 U. CEIP Chlorhydrate d'ambroxol 1, 8 kg Saccharose 336 kg Glycérol 54 kg Essence de mandarine 3 kg Parabens méthyl 0,54 kg Parabens propyl 0,18 kg Acide citrique qsp pH 6,4-6, 5 Eau purifiée qsp 600 litres EXEMPLE 3 Préparation d'un lot industriel : procédé de fabrication Pour la préparation d'un lot industriel, on pourra procéder selon le protocole particulier suivant. Dans une cuve de 5 000 litres, on prépare une première solution par dissolution sous agitation continue de 5,390 kg d'alpha-amylase (pour une activité de 222 648 U. CEIP), commercialisée par la Société Top Pharm (Revel, France) dans 300 litres d'eau purifiée. Une quantité de 2,800 kg de saccharose (Beghin Say, Neuilly sur Seine, France) et 300 litres d'eau purifiée sont ensuite ajoutés de manière concomitante et en poursuivant l'agitation. On prépare en même temps une seconde solution. Pour cela, on introduit dans une cuve de 1000 DE (DE=double épaisseur), 200 litres d'eau purifiée, dans laquelle on dissout sous agitation continue 4,5 kg de parahydroxybenzoate de méthyle (Lambert Rivière, Saint-André, France), 1,5 kg de parahydroxybenzoate de propyle ( (Lambert Rivière, Saint-André, France), 25 kg d'arôme de mandarine (SKW Biosystems, Isle sur la Sorgue, France), et 450 kg de glycérine (Brenntag Val de Loire, Saint Cyr en Val, France). Quand la solution est homogène, on ajoute 15 kg de chlorhydrate d'ambroxol commercialisé par INTERCHEMICAL (Paris, France) tout en poursuivant l'agitation et le remplissage jusqu'à solubilisation. Lorsque les deux solutions sont homogènes, la seconde solution est transvasée dans la cuve contenant la première solution et de l'eau purifiée est ajoutée pour ajuster le volume final à 5.000 litres. Le pH est ensuite ajusté à 6,4-6, 5 par ajout d'acide citrique monohydraté (Brenntag Val de Loire, Saint Cyr en Val, France). Quand la composition est homogène, elle est filtrée sur un filtre presse 40 plaques 300 SEITZ (TM), puis stockée dans des flacons en verre brun avant conditionnement final pour commercialisation. EXEMPLE 4 Étude de stabilité de la composition et influence du procédé de préparation Exemple 4.1 Préparation de la composition à partir d'un mélange des formes sèches Un mélange sec comprenant 24.000 U. CEIP d'alpha-amylase et 56 g de chlorhydrate d'ambroxol a été préparé de la manière suivante : l'alpha-amylase sous forme de poudre \ sèche est mélangée chlorhydrate d'ambroxol en poudre, puis le mélange est mis en solution dans de l'eau purifiée à des concentrations en chlorhydrate d'ambroxol de 0,2 g, 0,25 g et 0,3 g de pour 100 ml de sirop. La stabilité des solutions ainsi obtenues a été étudiée par mesure de l'activité enzymatique en fonction du temps. Un flacon sans chlorhydrate d'ambroxol (amylase seule) est préparé pour servir de témoin Les mesures d'activité enzymatique sont effectuées sur des échantillons prélevés dans chacun des quatre flacons (3 essais et 1 témoin) à t = 0 et t = 30 jours. La méthode de mesure utilisée est la méthode dite SIGMA, détaillée à l'exemple 5. Les flacons sont conservés à température ambiante à l'abri de la lumière pendant la durée de l'expérience. Les résultats sont exprimés en unité CEIP par ml, noté"U. CEIP/ml". Ils sont portés dans le Tableau 1. TABLEAU 1 Chlorhydrate\ temps 0 30 jours d'ambroxol \ 0, 20 g 131 7 0, 25 g 145 14 0, 30 g 140 20 Amylase seule 130 122 On constate que la composition sous forme sirop préparée à partir d'un mélange des composants sous forme de poudre sèche perd toute activité quelques jours après sa mise en solution. Exemple 4.2 Préparation de la composition à partir d'un mélange des formes dissoutes Une composition comprenant de l'alpha-amylase et du chlorhydrate d'ambroxol a été préparée de la manière suivante. Un premier sirop est préparé par mise en solution de 24 000 U. CEIP d'alpha-amylase et de 56 g de saccharose dans 100 ml d'eau purifiée. Un second sirop est préparé par mise en solution de chlorhydrate d'ambroxol. Puis les deux sirops sont mélangés. Des concentrations de 0,2 g, 0,25 g et 0,3 g de chlorhydrate d'ambroxol pour 100 ml de sirop, ont été testées. On ajuste le niveau par ajout d'eau purifiée. Un flacon sans chlorhydrate d'ambroxol est préparé pour servir de témoin. Les flacons sont conservés à températures ambiante à l'abri de la lumière. La stabilité des sirops ainsi obtenus a été étudiée en fonction du temps. Les mesures d'activité enzymatique sont effectuées sur des échantillons prélevés dans chacun des quatre flacons à t = 0, t = 30 jours, t = 3 mois et t = 6 mois. La méthode de mesure utilisée est la méthode dite SIGMA, détaillée à l'exemple 5. Les résultats sont exprimés en unité CEIP par ml, noté"U. CEIP/ml". Ils sont portés dans le Tableau 2. TABLEAU 2 Chlorhydrate\ temps 0 30 jours 3 mois 6 mois d'ambroxol \ 0, 20 g 157 152 141 146 0, 25 g 158 174 159 148 0, 30 g 136 154 141 137 Témoin 151 168 155 138 De manière inattendue, on constate que la composition obtenue par mélange des composés préalablement mis en solution permet de maintenir une activité normale de l'alpha-amylase. Il est ainsi démontré que le mode de préparation de la composition selon l'invention revêt une importance cruciale pour l'obtention d'un produit conservant toutes ses propriétés chimiques et thérapeutiques. EXEMPLE 5 Méthode de dosage de l'activité amylolytique par le réactif SIGMA Cette méthode a été choisie pour le suivi de l'activité enzymatique dans le temps, car elle offre l'avantage d'être très facile d'utilisation avec une bonne fiabilité. PRINCIPE : Le réactif Amylase', commercialisé par SIGMA Diagnostics (St. Louis, USA), utilise un p-nitrophénylglycoside comme substrat et plus particulièrement du 4, 6-éthylidène pnitrophénol a-D-maltoheptaoside (Ey-Gy-PNP). a-amylase 5Et-G7-PNP- > 2Et-G5 + 2G2-PNP + 2Et-G4 + 2G3-PNP + Et-G3 + G4-PNP a-glucosidase 2 G2-PNP + G3-PNP > 4 PNP + 10 Glucose / /- > suivi à 405 nm L'alpha-amylase hydrolyse Et-G7-PNP en G2, G3 et en fragments de G4-PNP. L'alphaglucosidase hydrolyse le G2PNP et le G3PNP pour former du p-nitrophénol (PNP) et du glucose. Cinq moles de substrat sont hydrolysées pour former 4 moles de p-nitrophénol, donnant un coefficient stoechiométrique de 1,25. Le p-nitrophénol absorbe la lumière à 405 nm, ainsi l'augmentation de l'absorbance à cette longueur d'onde est directement proportionnelle à l'activité alpha-amylase de l'échantillon. PROTOCOLE : 'Le réactif Amylasc* est préparé par addition de la quantité d'eau indiquée sur le flacon, * La longueur d'onde du spectromètre est réglée à 405 nm et la température à 30 ou 37 C, 'Dans une cuve spectrophotométrique, on ajoute 1 ml de réactif et 20 ml d'échantillon à doser, 'Incuber 2 minutes puis lire l'absorbance (initiale) - Lire l'absorbance 1 minute plus tard et 2 minutes plus (Al et A2) 'Calculer la pente AA par minute, puis l'activité selon la formule suivante : AA/min x Vr x 1000 x 1, 25 activité (U/l) = EPNPXVEXI' avec Vr : volume total dans la cuve = 1020 ul VE : volume de l'échantillon = 20 1 1 : largeur de la cuve = 1 cm e ? Np : coefficient d'extinction millimolaire du PNP soit : Activité amylase (U/l) à 37 C = AA/min x 7005 Activité amylase (U/l) à 30 C = AA/min x 7244 REVENDICATIONS 1. Composition pour le traitement des infections des voies respiratoires, comprenant au moins un composé mucolytique et une enzyme amylolytique. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite enzyme amylolytique est une alpha-amylase, de préférence d'origine bactérienne. 3. Composition selon une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ladite enzyme amylolytique est une protéine de 58 kDa, produite naturellement par Bacillus amyloliquefaciens (anciennement assimilé à B. subtilis). 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite enzyme amylolytique est présente à raison de 20.000 à 30.000 Unités CEIP, et de préférence 24.000 Unités CEIP, pour 100 ml de ladite composition. 5. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit composé mucolytique est choisi parmi : le chlorhydrate d'ambroxol, le chlorhydrate de bromhexine, la S-carboxyméthylcystéine, la N-acéthylcystéine. 6. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit composé mucolytique est le chlorhydrate d'ambroxol apporté à une teneur comprise entre 0,2 g et 0,6 g, de préférence 0,3 g, pour 100 ml de ladite composition. 7. Composition selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre au moins un des produits suivants : agent édulcorant, arôme, stabilisant, anti-oxydant, adjuvant de fabrication. 8. Composition selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ledit agent édulcorant est un succédané de sucre. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous une forme appropriée à l'administration orale, de préférence sous forme de sirop buvable. 10. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, consistant à 1 - préparer une première solution aqueuse comprenant ladite enzyme amylolytique et éventuellement un agent édulcorant ; - préparer une seconde solution aqueuse comprenant ledit composé mucolytique, et éventuellement au moins un des produits suivants : agent édulcorant, arôme, stabilisant, antioxydant, adjuvant de fabrication ; - ajouter ladite seconde solution à ladite première solution ; - ajuster le volume d'eau et le pH. Il. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite enzyme amylolytique est une alpha-amylase d'origine bactérienne et ledit composé mucolytique est le chlorhydrate d'ambroxol. 12. Utilisation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des infections bronchopulmonaires ou des pathologies affectant la sphère ORL et en particulier la sphère oropharyngée.