FR 2825374 A1 20021206 FR 0107276 A 20010601 Procédé électro-enzymatique par inhibition pour la détection de glycoalcaloïdes stéroïdiques La présente invention concerne de façon générale un procédé de détection de la présence de substances biologiques et plus particulièrement un procédé de détection de la présence de glycoalcaloïdes stéroïdiques dans un échantillon et leur dosage par l'intermédiaire d'un capteur électrochimique enzymatique, de type transistor à effet de champ ou autres. Les consommateurs sont de plus en plus soumis à des problèmes de santé publique dus à la distribution de produits impropres à la consommation. En effet, des produits alimentaires sont, chaque jour, retirés de la vente pour cause de contamination bactérienne. De nombreux élevages de bétail destinés à la consommation ont été détruits pour cause d'encéphalite spongiforme bovine ou de fièvre aphteuse. Ces problèmes sanitaires ont entraîné une prise de conscience générale de l'importance de se nourrir avec des aliments sains. De plus, cette prise de conscience est accentuée par l'inquiétude générée par le développement des organismes génétiquement modifiés (OGM). Aussi, la tendance actuelle est-elle d'utiliser des produits exempts de tout risque sanitaire, voire ayant des effets bénéfiques pour la santé. Pour obtenir des produits alimentaires de meilleure qualité, il est nécessaire de passer par une sélection et une vérification de ces produits. Ainsi, des contrôles qualité ont été mis en place pour les produits issus de l'industrie agroalimentaires. Il s'agit principalement de tests microbiologiques. Toutefois, on sait que certains produits naturels sont impropres à la consommation car ils contiennent des composés qui, à haute dose, représentent un risque important pour la santé. Aussi, est-il important de vérifier la composition en éléments toxiques de ces produits naturels et éliminer ceux qui représentent un risque potentiel. C'est dans cette optique qu'a été mise au point la présente invention. En effet, les glycoalcaloïdes stéroïdiques sont des composés considérés comme toxiques. Le groupe le plus important est constitué par les alcaloïdes Solanum qui sont présents dans de nombreuses espèces végétales de la famille des Solanacées, dont certaines sont utilisées en tant qu'aliments. C'est le cas par exemple de la pomme de terre, de la tomate ou encore de l'aubergine. Ces alcaloïdes sont des alkylamines basées sur un squelette cholestane comprenant 27 atomes de carbone. Parmi ces composés, certains se retrouvent plus fréquemment. C'est le cas par exemple de l'a- chaconine et de l'a-solanine, qui sont les composés les plus répandus dans les variétés commerciales de pommes de terre. Les effets à court terme des glycoalcaloïdes, 8 à 12 heures après ingestion, sont des troubles gastro-intestinaux et neurologiques, lorsque les doses sont comprises entre 2 et 5 mg/kg. Dans certains cas, la consommation de pommes de terre contenant des glycoalcaloïdes à forte concentration a été mortelle. Il est donc très important de pouvoir détecter et mesurer la quantité de glycoalcaloïdes présents naturellement dans des produits végétaux destinés à la consommation, mais également dans les fluides biologiques d'origine humaine afin de pouvoir mettre en évidence un potentiel empoisonnement. Il existe actuellement des méthodes de détection et de dosage des glycoalcaloïdes stéroïdiques pour le contrôle des lignées de plantes potagères telles que les pommes de terre ou les tomates, mais également des produits transformés destinés à l'alimentation et obtenus à partir de ces plantes potagères. Il s'agit principalement des méthodes chromatographiques, spectrophotométriques et immunologiques. Les techniques chromatographiques sont basées sur l'utilisation de la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC), de la chromatogrpahie liquide (LC) ou encore de la chromatographie en phase gazeuse (GC). Les techniques spectrophotométriques sont basées sur l'utilisation de la spectrométrie et la spectrophotométrie de masse, mais également sur la spectrophotométrie UV. Enfin, les techniques immunologiques consistent surtout en l'utilisation de test ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Certaines de ces techniques peuvent être combinées. Ainsi, une analyse par chromatographie en phase gazeuse peut être couplée à une analyse par spectrométrie de masse, afin d'affiner l'analyse. Toutefois, ces techniques sont lourdes et longues à mettre en oeuvre. Elles nécessitent de plus l'utilisation d'appareils de mesure qui sont extrêmement coûteux et donc qui rendent le coût de l'analyse élevé. Un autre inconvénient majeur est que certaines de ces techniques sont inadaptées pour l'analyse d'un grand nombre d'échantillons. Ainsi, une analyse en HPLC a une reproductibilité (Déviation Relative Standard) comprise entre 8 et 13 % pour une gamme de concentrations en glycoalcaloïdes comprise entre 12 et 260 mg/kg, ce qui limite considérablement leur intérêt. Par ailleurs, dans d'autres domaines de techniques analytiques, l'utilisation de biocapteurs a été largement décrit. Ainsi, A. M. Nyamsi Hendji et al. proposent, dans"Analytica Chimica Acta, 281 (1993) 3-11", l'utilisation de biocapteurs constitués par deux ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) de type pH-FET identiques, fonctionnant en mode différentiel (un capteur de mesure ENFET comportant une enzyme de type choline-estérase fixée à une membrane par réticulation et un capteur de référence REFET comportant la membrance sans enzyme) pour la détection de pesticides organophosphorés. L'analyse repose sur le principe de l'inhibition de l'activité enzymatique des choline-estérases par les pesticides organophosphorés. Les principales choline-estérases sont l'acétylcholine-estérase (AcChE) et la butyrylcholine-estérase (BuChE). Elles dégradent respectivement l'acétylcholine et la butyrylcholine. Cette dégradation entraîne la formation d'ions H+ selon les réactions suivantes : AcChE (1) Acétylcholine + H20- Choline + Acétate + H+ BuChE (2) Butyrylcholine + HsO- C/ ? o//ne + Butyrate + H+ La formation d'ions H+ modifie le pH du milieu réactionnel notamment au voisinage du capteur et entraîne ainsi une modification du champ dans le canal entre la source et le drain, ce qui se traduit par une modification de la tension de sortie. Cette tension de sortie est prise comme référence. Lorsque le milieu réactionnel contient des pesticides organophosphorés, ceux-ci inhibent l'activité des choline-estérases et ainsi la tension au niveau du capteur. Cette variation de tension permet alors de déterminer la concentration de pesticides dans l'échantillon. D'autres techniques utilisant des biocapteurs ont été décrites. S. V. Dzadevich et al. proposent, dans"Electroanalysis, 6 (1994) 752-758", d'utiliser des biocapteurs conductimétriques afin de mettre en évidence également la présence de pesticides organophosphorés. Cette technique repose également sur les propriétés d'inhibition des choline-estérases par ces pesticides. Le dispositif décrit est un dispositif à deux électrodes conductimétriques, une électrode de mesure portant une membrane sur laquelle est fixée l'enzyme et une électrode de référence sans enzyme. La présence dans le milieu réactionnel d'ions H+ interagit sur la valeur de la conductivité de la solution. En réalisant des mesures de conductivité, il est donc possible de déterminer la présence de pesticides organophosphorés. Un inconvénient de ces deux techniques est lié au fait que l'inhibition provoquée par les pesticides organophosphorés est quasi-irréversible. Il s'agit d'un inconvénient majeur quand on envisage leur utilisation pour effectuer un grand nombre d'analyses à un coût de revient faible. En effet, il faudrait changer les biocapteurs à chaque analyse, sous peine de voir les résultats faussés. Cet inconvénient explique, sans doute, et en partie, le fait que l'utilisation des biocapteurs pour la détection et le dosage des glycoalcaloïdes stéroïdiques n'a jamais été décrite. Le but de la présente invention est donc de pallier ces inconvénients en fournissant un procédé facile à mettre en oeuvre et ayant un faible coût de revient, permettant de détecter la présence de glycoalcaloïdes et de doser ces derniers dans un échantillon, ce procédé étant basé sur l'utilisation de capteurs électrochimiques. La présente invention concerne donc un procédé de détection et de dosage de glycoalcaloïdes stéroïdiques en milieu d'analyse liquide, qui consiste essentiellement à : - mettre en présence, dans une cellule de mesure contenant une solution tampon, au moins une enzyme de type choline-estérase fixée sur un capteur électrochimique enzymatique de mesure, au moins un substrat spécifique de l'enzyme, de manière à déclencher une réaction enzymatique entre cette enzyme et le substrat spécifique, puis un échantillon à analyser contenant éventuellement les glycoalcaloïdes stéroïdiques à doser, - mesurer un signal émis par le capteur électrochimique enzymatique de mesure, ce signal étant déclenché par la modification du milieu réactionnel au voisinage du capteur électrochimique enzymatique lors de la réaction enzymatique et pris comme signal de référence une fois stabilisé, - déterminer la présence éventuelle de gtycoa) ca ! oïdes stéroïdiques dans l'échantillon, en mesurant une variation éventuelle du signal de référence, cette variation découlant de l'inhibition de l'enzyme par les glycoalcaloïdes stéroïdiques, et - interpréter la variation du signal de manière à détecter la présence et déterminer la quantité de glycoalcaloïdes stéroïdiques contenu dans l'échantillon analysé. Une variante du présent procédé consiste à introduire l'échantillon à analyser dans la cellule de mesure, après la stabilisation du signal déterminant le signal de référence, ce dernier étant déclenché par la modification du milieu réactionnel au voisinage du capteur électrochimique enzymatique de mesure lors de la réaction enzymatique entre l'enzyme et le substrat spécifique. A titre de variante, le présent procédé comprend également une étape de lavage du capteur avec une solution tampon, après obtention du signal de référence et avant l'introduction de l'échantillon à doser. Le procédé selon l'invention peut avantageusement comprendre une étape intermédiaire consistant à mesurer et à déterminer un signal comme étant le signal de base, une fois le capteur introduit dans la cellule de mesure et avant l'introduction du substrat. Une autre variante du procédé selon l'invention consiste, dans une étape préalable, à étalonner le capteur électrochimique enzymatique de mesure, en introduisant des quantités connues de glycoalcaloïdes stéroïdiques et à mesurer les variations correspondantes du signal de référence. Selon l'invention, un capteur électrochimique enzymatique de mesure approprié est un capteur électrochimique enzymatique de type potentiométrique. Un autre capteur électrochimique enzymatique de mesure approprié est un capteur électrochimique enzymatique de type conductimétrique. Un autre capteur électrochimique enzymatique de mesure approprié est un capteur électrochimique enzymatique de type ampérométrique. Avantageusement, ce capteur électrochimique enzymatique de mesureselon l'invention, est constitué par au moins une paire d'électrodes. A titre de variante, un capteur électrochimique enzymatique de type potentiométrique peut être constitué par au moins un transistor à effet de champ, avantageusement de type ISFET. Avantageusement, le capteur électrochimique enzymatique de mesure comporte une membrane biologique sur laquelle est fixée ladite enzyme de type choline-estérase. Selon une variante, le procédé consiste à utiliser également un capteur électrochimique enzymatique de référence, identique au capteur électrochimique enzymatique de mesure, à la différence près qu'il ne comporte pas d'enzyme fixée sur la membrane biologique. L'enzyme de type choline-estérase est avantageusement choisie dans le groupe constitué par l'acétylcholine-estérase, la butyrylcholine-estérase et la cholineestérase. Le substrat spécifique de l'enzyme est avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acétylcholine, la butyrylcholine, la choline, la thiocholine ou un de leur dérivés et un mélange de ces composés. La demanderesse a déterminé que la concentration optimale en substrat spécifique est comprise entre 5 et 15 mM et préférentiellement entre 8 et 12 mM. Un autre objet de l'invention est un kit de détection et de dosage d'au moins un glycoalcaloïde stéroidique contenu dans un échantillon, par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ce kit comprend essentiellement : - une cellule de mesure - au moins un capteur électrochimique enzymatique sur lequel est fixée au moins une enzyme de type choline-estérase, - au moins une solution contenant au moins un substrat spécifique d'une enzyme de type choline-estérase, ce substrat étant en concentration déterminée, - une première solution tampon servant de milieu réactionnel, et - une deuxième solution tampon appropriée servant de solution de lavage du capteur électrochimique enzymatique, une fois l'analyse réalisée, permettant de décrocher les éventuels glycoalcaloïdes stéroïdiques fixés sur l'enzyme lors de l'analyse de l'échantillon, et rendant ainsi le capteur électrochimique enzymatique réutilisable. Selon une variante, le kit peut ne contenir qu'une seule solution tampon servant à la fois de milieu réactionnel et de solution de lavage. La ou les solutions tampons utilisées dans le kit sont préférentiellement des solutions tampon phosphate ayant un pH non dénaturant. Les exemples qui suivent permettront de mieux appréhender l'invention et font référence aux dessins dans lesquels : La figure 1 représente la courbe de détermination de la concentration optimale de butyrylcholine à mettre dans le milieu réactionnel, pour la détection des glycoalcaloïdes à l'aide de capteurs de type ISFET modifiés par la butyrylcholine- estérase. La figure 2 représente les courbes de calibration pour la détection de différents glycoalcaloïdes à l'aide de capteurs de type ISFET modifiés par la butyrylchol ine-estérase. La figure 3 représente les courbes de reproductibilité intra-capteur et intercapteur de la détection de a-chaconine à l'aide de capteurs de type ISFET, modifiés par la butyrylcholine-estérase avec des concentrations en a-chaconine de 1 uM et de 6 uM respectivement pour la réponse inter-capteur et la réponse intra-capteur. La figure 4 représente la courbe de l'évolution de la réponse du capteur conductimétrique couplé à la butyrylcholine-estérase en fonction du temps d'inhibition par 1uM d'a-solanine. La figure 5 représente les courbes de calibration pour la détection de glycoalcaloïdes à l'aide de capteurs conductimétriques couplés à la butyrylcholineestérase. La figure 6 représente les courbes de reproductibilité intra-capteur de la détection de glycoalcaloïde par des capteurs conductimétriques, modifiés par la butyrylcholine-estérase, avec des concentrations en a-chaconine et en en a-solanine de 1 et de 5 uM. Exemples Exemple 1 Dans l'exemple 1, sont décrites les conditions de fabrication et d'utilisation de biocapteurs potentiométriques sensibles aux glycoalcaloïdes stéroïdiques et utilisant des ISFET pH comme transducteurs et la butyrylcholine-estérase (BuChE) comme élément de reconnaissance. Les glycoalcaloïdes stéroïdiques utilisés sont l'achaconine, l'a-solanine et la solanidine. - Réactifs Les réactifs utilisés sont la butyrylcholine-estérase (BuChE), type EC 3.1. 1.8, provenant de sérum de cheval, l'albumine de sérum bovin (BSA), les solutions aqueuses à 25% de glutaraldéhyde (GA), le chlorure de butyrylcholine, l'a-solanine, l'a-chaconine et la solanidine. Ces réactifs sont de marque Sigma. - Transducteur L'élément sensible comporte deux ISFETs pH identiques dont la conception et le mode de fonctionnement sont décrits dans [Shul'ga, A. A., Netchiporouk, L. I., Sandrovsky, A. K., Abalov, A. A., Frolov, O. S., Kononenko, Yu. G., Maupas, H., Martelet, C. (1995) Sensors and Actuators B 30, 101-105. ]. Un ISFET pH comporte une membrane biologique active sur laquelle est fixée l'enzyme. Il s'agit de l'ISFET de mesure. L'autre ISFET comporte la même membrane biologique exempte d'enzyme et constitue l'ISFET de référence. La sensibilité au pH dans la gamme de pH de 2 à 10 est de 52-54 mV/pH. La tension de sortie différentielle entre l'ISFET de référence et l'ISFET de mesure est enregistré en mode cinétique et correspond au signal de sortie. - Immobilisation de l'enzyme Les membranes biologiques actives contenant la butyrylcholine-estérase sont formées à la surface des transducteurs par réticulation des enzymes et de la BSA à l'aide de vapeurs de glutaraldéhyde. Le processus classique consiste à préparer une solution de tampon phosphate (KPO-NaOH) pH 7,4, 5 % de butyrylcholineestérase, 5 % de sérum albumine bovine et 10 % de glycérol. La membrane est obtenue, tout d'abord, par dépôt d'une goutte de la solution précédente sur la partie sensible du capteur ISFET de mesure. Le capteur ISFET de référence est traité avec une solution tampon sans enzyme. Les capteurs sont ensuite exposés à des vapeurs de glutaraldéhyde pendant 30 minutes. Les capteurs ainsi préparés sont ensuite séchés à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Ils sont conservés avant utilisation dans du tampon phosphate à 20 mM à pH 7,4 ou à l'état sec. - Mesures Les mesures sont effectuées à la lumière, à la température ambiante (20- 23 ) dans une cellule de verre (volume 5 mi) remplie d'un tampon phosphate sodium 10 mM à pH 7, 5. Le capteur est immergé dans la solution testée laquelle est agitée vigoureusement. Après stabilisation du signal de base, une quantité connue de chlorure de butyrylcholine est ajoutée. La réponse cinétique (dU/dt) max du biocapteur est enregistrée en fonction de la concentration en analyte. Les ISFETs opèrent en mode courant de source et tension drain-source constants (ls= 500mA, Vds= 1V). Le substrat nu du circuit est utilisé comme électrode de quasi-référence. - Dosaqe des qlvcoalcaloïdes L'évaluation de l'inhibition de l'activité enzymatique par les glycoalcaloïdes, contenus dans des solutions tests, est évaluée à une concentration en excès de chlorure de butyrylcholine et comprend les étapes suivantes : 1. Stabilisation du biocapteur dans un tampon phosphate 5mM à pH 7,5 jusqu'à obtention d'une ligne de base stable. 2. Une concentration en excès de butyrylcholine est ajoutée dans la cellule de mesure. Le signal de sortie est mesuré en mode cinétique. La valeur maximale du signal de sortie est prise comme signal de référence de l'activité catalytique de l'enzyme immobilisée et servira de base pour l'évaluation ultérieure de l'effet inhibiteur du glycoalcaloïde cible. Le signal de référence correspondant à la tension de sortie maximale stabilisée est pris comme la valeur d'activité enzymatique égale à 100 %. 3. Après stabilisation et lavage du signal, le capteur est incubé pendant une durée de 5 minutes dans une solution test de glycoalcaloïde à doser. La solution test de glycoalcaloïde est en concentration connue en glycoalcaloïde, dissous dans la solution de tampon phosphate 10 mM pH 7,5. La réponse du biocapteur, en mode cinétique, est ensuite déterminée par rapport au signal de référence obtenu comme décrit en 2. En effet, le signal obtenu en présence de glycoalcaloïde est comparé au signal de référence, en déterminant le pourcentage d'activité enzymatique demeurante. Ce pourcentage d'activité résiduelle permet de déterminer la concentration en glycoalcaloïde par comparaison avec la courbe d'étalonnage. - Résultats La figure 1 montre le résultat de la détermination de la concentration optimale de butyrylcholine permettant d'obtenir un signal de référence optimal. On constate que la cette concentration est égale à 10 mM. La butyrylcholine est donc ajoutée dans le milieu réactionnel à une concentration en excès supérieure à 10 mM. La figure 2 montre des résultats d'inhibition, obtenus avec des solutions de glycoalcaloïdes (a-solanine, a-chaconine et solanidine) à différentes concentrations. On constate que, selon le glycoalcaloïde utilisé, la réponse est linéaire dans une gamme de concentration en glycoalcaloïdes utile comprise entre 0,5 et 100 M. La figure 3 montre le résultat d'un test de reproductibilité de mesure (déterminée selon les normes IUPAC), pour un capteur (intra-capteur) et une série de capteurs (inter-capteurs). Pour une série de 10 mesures, la déviation standard relative de la réponse intra-capteur est de 1% à une concentration en glycoalcaloïde (achaconine) de 6 LM, tandis que la déviation standard relative de la réponse intercapteurs est de 5% à une concentration en glycoalcaloïde (a-chaconine) de 1 LM. Le procédé de détection et de dosage de glycoalcaloïdes mettant en oeuvre des biocapteurs de type ISFET pH possède donc une très grande reproductibilité Exemple 2 Dans l'exemple 2, sont décrites les conditions de fabrication et d'utilisation de biocapteurs conductimétriques sensibles aux glycoalcaloïdes stéroïdiques, utilisant des microélectrodes et la butyrylcholine-estérase comme élément de reconnaissance. Les glycoalcaloïdes stéroïdiques utilisés sont l'a-chaconine, l'a-solanine et la solanidine. - Réactifs Les réactifs utilisés sont la butyrylcholine-estérase, type EC 3.1. 1.8, provenant de sérum de cheval, l'albumine de sérum bovin, les solutions aqueuses à 25% de glutaraldéhyde, le chlorure de butyrylcholine, l'a-solanine, l'a-chaconine et la solanidine. Ces réactifs sont de marque Sigma. - Electrodes Deux paires identiques d'électrodes interdigitées en or dont la conception et le mode de fonctionnement sont décrits dans [S. V. Dzadevich et al. Electroanalysis, 6 (1994) 752-758], sont utilisées. Une paire constitue les électrodes de mesure et l'autre paire constitue les électrodes de référence. - Immobilisation de l'enzyme Les membranes biologiques actives contenant la butyrylcholine-estérase sont formées sur la zone sensible des électrodes par réticulation de l'enzyme et de la BSA à l'aide de vapeurs de glutaraldéhyde. Le processus classique consiste à préparer une solution de butyrylcholine-estérase et une solution de BSA dans du tampon phosphate (KH2P04 - NaOH) 20 mM pH 7, 4 avec une concentration en enzyme et en BSA variant de 50 à 100 g/t. Les solutions sont ensuite mélangées dans un rapport de 1 : 1. La membrane est obtenue, tout d'abord, par dépôt d'une goutte de la solution précédente sur la partie sensible des électrodes de mesure. Les électrodes de référence sont traitées avec une solution tampon dans laquelle l'enzyme a été remplaceée par de la BSA. Les capteurs sont ensuite exposés aux vapeurs de glutaraldéhyde pendant 30 minutes. - Mesures Des mesures de conductivité sont effectuées en appliquant à chaque paire d'électrodes une tension alternative de faible amplitude (10 kHz, 10mV d'amplitude), fourni par un générateur d'onde Enertec 4431 (Schlumberger). Le signal de sortie différentiel entre les électrodes de référence et les électrodes de mesure est alimenté par un amplificateur différentiel à faible bruit et est analysé grâce à un amplificateur de type Stanford Research System SR510 alimenté par un signal de référence provenant d'un oscillateur interne. Le signal est ensuite enregistré grâce à une enregistreur graphique Servotrace (Sefram). - Dosaqe des qlvcoalcaloïdes Les mesures sont réalisées à température ambiante dans une cellule ouverte, remplie d'une solution de tampon phosphate 5 mM à pH 7,4, agitée vigoureusement. L'évaluation de l'inhibition de l'activité enzymatique par les glycoalcaloïdes est effectuée à une concentration déterminée de chlorure de butyrylcholine et comprend les étapes suivantes : 1. Stabilisation du biocapteur dans un tampon phosphate 5mM à pH 7,4 jusqu'à obtention d'une ligne de base stable. 2. La butyrylcholine est ajoutée dans la cellule de mesure jusqu'à une concentration finale fixe de 8 mM. Le signal de sortie est mesuré en mode cinétique. La valeur maximale du signal de sortie est prise comme signal de référence de l'activité catalytique de l'enzyme immobilisée et servira de base pour l'évaluation ultérieure de l'effet inhibiteur du glycoalcaloïde cible. En effet, le signal de référence correspond à une actitvité enzymatique de 100 %. 3. Après lavage, le capteur est incubé pendant une durée de 10 à 60 minutes dans une solution test de glycoalcaloïde à doser. La réponse du biocapteur, en mode cinétique, est ensuite déterminée par rapport au signal de référence obtenu comme décrit en 2. En effet, le signal obtenu en présence de glycoalcaloïde est comparé au signal de référence, en déterminant le pourcentage d'activité enzymatique demeurante. Ce pourcentage d'activité résiduelle permet de déterminer la concentration en glycoalcaloïde par comparaison avec la courbe d'étalonnage. - Résultats L'évolution de la réponse du capteur conductimétrique couplé à la butyrylcholine-estérase en fonction du temps d'inhibition par une solution de 1 uM d'asolanine est représentée à la figure 4. Cette mesure permet d'optimiser le temps d'analyse et la sensibilité. On constate que la réponse du capteur évolue peu durant les 25 premières minutes, à une concentration fixe d'inhibiteur. On peut donc en conclure que les mesures peuvent être réalisées pendant cette durée sans risque de voir les résultats faussés par une évolution de la réponse indépendante de la concentration en inhibiteur. La figure 5 montre des résultats d'inhibition obtenus avec des solutions de glycoalcaloïdes (a-solanine, a-chaconine et solanidine) à différentes concentrations. On constate que, selon le glycoalcaloïde utilisé, la réponse est linéaire dans la gamme de concentration utile de 0,2 à 100 M. La figure 6 montre un exemple de reproductibilité de mesures (déterminée selon les normes IUPAC) avec l'utilisation d'un capteur conductimétrique. On constate que, sur une série de dix mesures, la déviation standard relative de la réponse varie de 1% à 5% selon le glycoalcaloïde utilisé et la concentration à laquelle il est utilisé. Ces résultats permettent donc de déduire que le procédé de détection et de dosage des glycoalcaloïdes mettant en oeuvre des capteurs conductimétriques permet d'obtenir des résultats très reproductibles. D'autres types de biocapteurs peuvent être également utilisés dans le procédé selon l'invention. Ainsi, il est également possible d'utiliser des capteurs de type ampérométrique. Ces capteurs peuvent être constitués par des électrodes ou microélectrodes ampérométriques. Toutefois, la détection ampérométrique des glycoalcaloïdes nécessite une étape intermédiaire de transformation des produits d'hydrolyse par la choline-estérase. En effet, l'acétylcholine, la butyrylcholine, la thiocholine ou bien la choline sont des espèces non-électroactives. Leur détection ampérométrique est donc impossible. Cette étape de transformation est réalisée avec de la choline-oxydase (ChOx) : ChOx ChOx (3) Choline + 2 02 + H20 o Betaine aldehyde o Betaine + 2 H202 La choline oxydase (ChOx) permet la transformation spécifique de la choline, et la production d'eau oxygénée dont la détection est réalisable par oxydation anodique à un potentiel supérieur à +0,8 V/AglAgCI ; le courant généré étant proportionnel à la concentration en substrat : La présence de glycoalcaloïdes entraîne l'inhibition de l'activité de la choline-estérase. Il se produit donc une diminution de la concentration en choline, par conséquent une diminution de la concentration en eau oxygénée et donc une diminution de la quantité d'électrons formés. La diminution du signal causé par l'inhibition de choline-estérase correspondante est donc proportionnelle à la quantité de glycoalcaloïdes présents dans l'échantillon. Au vu des résultats obtenus, l'utilisation des biocapteurs pour la détection et le dosage des glycoalcaloïdes revêt un intérêt certain. En effet, contrairement aux techniques actuellement utilisées, la mise en oeuvre de ce procédé est rapide. Ainsi, le temps total nécessaire à une analyse est inférieur à 10 minutes. De plus, le système est automatisable. Le procédé est fiable puisque la déviation standard relative est de 1 % pour les réponses intra-capteur et inférieure à 5 % pour les réponses inter-capteurs. Ce procédé est sensible puisque les limites de détection sont inférieures ou, à tout le moins, égales aux techniques utilisées jusqu'à présent. En effet, elle peut être estimée à 0,5 mg/kg pour la chaconine et à 2 mg/kg pour la solanine. Enfin, contrairement aux techniques de détection d'analytes tels que les pesticides organophosphorés, utilisant les biocapteurs électrochimiques enzymatiques, l'inhibition enzymatique est, dans le cas présent, réversible. Ainsi, le biocapteur peut être réutilisé un grand nombre de fois (au moins 500), après un simple lavage avec un tampon adéquat, tel qu'un tampon phosphate, sans perte significative d'activité sur une durée d'au moins un mois. En effet, l'impossibilité de réutiliser les biocapteurs après une analyse a, sans nul doute, contribué à faire naître des préjugés quant à l'utilisation des biocapteurs en analyse et donc des réticences sur leur développement dans ce type d'applications. Le procédé de détection des glycoalcaloïdes proposé, basé sur le biocapteur électrochimique enzymatique, peut être utilisé dans de très nombreux secteurs tels que l'agriculture et l'agroalimentaire, l'environnement, la santé en particulier pour : Contrôler le taux de glycoalcaloïdes dans les lignes d'alimentation animales, dans les productions agricoles pour être certain de ne pas dépasser les teneurs recommandées par la réglementation, Contrôler les taux de toxiques en conserverie alimentaire, Optimiser les conditions de culture et les traitements post-récolte pour minimiser le taux d'alcaloïdes, Contrôler les techniques permettant d'introduire ou de développer des alcaloïdes possédant des propriétés insecticides, fongicides ou anti-microbiennes, Permettre des suivis systématiques du caractère embryotoxique et tératogène des alcaloïdes de manière à établir des standards en matière de toxicologie et de sûreté des aliments. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et de dosage de glycoalcaloïdes stéroïdiques en milieu d'analyse liquide, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à : - mettre en présence, dans une cellule de mesure contenant une solution tampon, au moins une enzyme de type choline-estérase fixée sur un capteur électrochimique enzymatique de mesure, au moins un substrat spécifique de l'enzyme, de manière à déclencher une réaction enzymatique entre ladite enzyme et ledit substrat spécifique, puis un échantillon à analyser contenant éventuellement les glycoalcaloïdes stéroidiques à doser, - mesurer un signal émis par ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure, ledit signal étant déclenché par la modification du milieu réactionnel au voisinage du capteur électrochimique enzymatique lors de ladite réaction enzymatique et pris comme signal de référence une fois stabilisé, - déterminer la présence éventuelle de glycoalcaloïdes stéroïdiques dans ledit échantillon liquide, en mesurant une variation éventuelle du signal de référence, cette variation découlant de l'inhibition de l'enzyme par lesdits glycoalcaloïdes stéroïdiques, et - interpréter la variation du signal de manière à détecter la présence et déterminer la quantité de glycoalcaloïdes stéroïdiques contenu dans l'échantillon analysé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon à analyser est introduit dans la cellule de mesure, après la stabilisation du signal déterminant le signal de référence, ce dernier étant déclenché par la modification du milieu réactionnel au voisinage du capteur électrochimique enzymatique de mesure, lors de ladite réaction enzymatique entre ladite enzyme et ledit substrat spécifique. 3. Procède selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape de lavage du capteur avec une solution tampon, après obtention du signal de référence et avant l'introduction de l'échantillon à doser. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape intermédiaire de mesure et de détermination d'un signal de base, une fois le capteur introduit dans la cellule de mesure et avant l'introduction du subtrat. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce ce qu'il comprend une étape préalable consistant à étalonner le capteur électrochimique enzymatique de mesure, en introduisant des quantités connues de glycoalcaloïdes stéroïdiques et à mesurer les variations correspondantes du signal de référence. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inhibition de ladite enzyme de type choline-estérase par les glycoalcaloïdes stéroïdiques est une inhibition réversible. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure est de type potentiométrique. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure est de type conductimétrique. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure est de type ampérométrique. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure est constitué par au moins une paire d'électrodes. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit capteur électrochimique enzymatique de mesure est constitué par au moins un transistor à effet de champ. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le capteur électrochimique enzymatique de mesure comporte une membrane biologique sur laquelle est fixée ladite enzyme de type choline-estérase. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser également un capteur électrochimique enzymatique de référence, identique audit capteur électrochimique enzymatique de mesure à la différence près qu'il ne comporte pas d'enzyme fixée sur la membrane biologique. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite enzyme de type choline-estérase est choisie dans le groupe constitué par l'acétylcholine-estérase, la butyrylcholine-estérase etlou la choline-estérase. 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit substrat spécifique est choisi dans le groupe constitué par l'acétylcholine, la butyrylcholine, la choline ou un de leur dérivés et un mélange de ces composés. 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration optimale en substrat spécifique est comprise entre 5 et 15 mM, préférentiellement entre 8 et 12 mM. 17. Kit de détection et de dosage d'au moins un glycoalcaloïde stéroïdique contenu dans un échantillon, par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait qu'il comprend essentiellement : - une cellule de mesure, - au moins un capteur électrochimique enzymatique sur lequel est fixée au moins une enzyme de type choline-estérase, - au moins une solution contenant au moins un substrat spécifique d'une enzyme de type choline-estérase, ledit substrat étant en concentration déterminée, - une première solution tampon servant de milieu réactionnel, et - une deuxième solution tampon appropriée servant de solution de lavage du capteur électrochimique enzymatique, une fois l'analyse réalisée, permettant de décrocher les éventuels gtycoatca ! oïdes stéroïdiques fixés sur l'enzyme lors de l'analyse dudit échantillon, et rendant ledit capteur électrochimique enzymatique ainsi réutilisable.