FR 2833611 A1 20030620 FR 0116352 A 20011218 PROCÉDÉ POUR L'INDUCTION DE MUTATIONS SOMATIQUES ET SON APPLICATION EN PROTÉOMIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biologie, et plus spécialement le domaine de l'adaptation par mutation dirigée, spécifique au monde vivant. Elle concerne plus particulièrement l'induction de mutations somatiques in vitro, ainsi que les applications que les perfectionnements d'une telle technique rendent désormais possibles. Dans une forme de réalisation particulière, l'invention concerne l'induction des mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIOUE DE L'INVENTION Pour simplifier, il est fait référence dans la suite au lymphome de Burkitt BL2. Il faut cependant souligner que cela vise seulement à faciliter l'exposé de la technique concernée et du concept inventif revendiqué, sans pour autant limiter l'invention à cet égard. La lignée cellulaire du lymphome de Burkitt de type I BL2, présente les caractéristiques des cellules B centroblastiques. Cette lignée cellulaire est la plus proche contrepartie immortalisée des centroblastes des centres germinatifs. Son origine de centre germinatif a été confirmée par la présence de mutations somatiques dans les gènes VH d'immunoglobuline des lymphomes de Burkitt. L'homogénéité et la stabilité des cellules BL2 dans des cultures appropriées a été soulignée (Denépoux S. et al., Immunity, vol. 6, 35-46, 1997). Il a été proposé, en conformité avec le phénotype de centroblaste, de considérer que la BL2 résulte de la transformation d'un centroblaste de centre germinatif qui a subi plusieurs phases de mutations somatiques. On estime par ailleurs que les cellules B subissent une hypermutation au stade du centroblaste (Pascual V. et al., J. Exp. Med. 180,329-339 (1994). Le phénomène d'hypermutation des immunoglobulines a lieu dans les centres germinatifs, après stimulation d'une cellule B par un antigène Tdépendant. En particulier, Denépoux S. et al., (op. cité) ont établi que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation après agrégation de leur récepteur de surface et co-culture avec une cellule T-auxiliaire ou amplificatrice, après une semaine de culture. Il a été conclu dans cet article que c'est par des activations répétées des cellules BL2 que l'on peut augmenter la fréquence de mutation. Egalement ces auteurs ont souligné que les mutations induites in vitro sur la BL2 n'affectent pas la région constante de l'IgM et ne font pas apparaître une sélection dirigée par un antigène. Egalement, Yélamos J. et al., Nature, vol. 376, pp. 225-229 (1995) ont relaté des expériences tendant à montrer que le fragment de gène V de l'immunoglobuline n'est pas indispensable pour une hypermutation et que la construction de substrats de mutation artificiels pourrait s'en trouver simplifiée. Malgré ces développements, on ne dispose pas jusqu'ici de moyens efficaces pour étudier ces phénomènes et pour en retirer des résultats pratiques, en particulier à des fins de diagnostic et/ou de suivi, ainsi que de traitement des processus tumoraux, dans des conditions de praticité et de rapidité satisfaisantes. Il y avait donc un besoin pour des moyens permettant de réaliser des tests d'hypermutation somatique rapides et fiables. Il existait plus particulièrement un besoin pour des moyens permettant de disposer d'un modèle d'induction de mutations somatiques, applicable aux gènes V, mais également aux autres gènes susceptibles d'être impliqués dans un processus tumoral, notamment chez les humains, comme par exemple les gènes Bcl-6 et Fas Ligand (FasL). Or, on a maintenant trouvé que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation accéléré, contrairement aux données de la technique antérieure, selon lesquelles un processus comparable était long et fastidieux à mettre en oeuvre. Plus précisément, on a maintenant trouvé de manière inattendue que, avec pour modèle la cellule BL2, on peut réaliser in vitro dans des conditions de rapidité et d'efficacité exceptionnelles, l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées en ajoutant aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, au moins une combinaison ternaire des anticorps anti-CD19, antiCD21 et anti-IgM. L'invention a ainsi pour premier objet un procédé pour l'induction de mutations somatiques in vitro, comportant (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'au moins une combinaison ternaire des anticorps anti-CD19, anti-CD21 et anti-IgM, tandis que (2) lesdits anticorps anti-IgM sont biotinylés et sont soumis à une agrégation spécifique par la streptavidine couplée à un support, avantageusement à un support composé en totalité ou en partie par des billes magnétiques. Selon une caractéristique, l'induction de mutations somatiques selon l'invention est mise en oeuvre sur une courte durée, en pratique sur une durée de l'ordre de lh30 (une heure et demie). Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention ne comporte pas la mise en oeuvre de co-cultures avec des cellules d'un autre type cellulaire, notamment avec une cellule T. On a en effet constaté que le procédé préconisé selon l'invention, dans lequel est effectuée une agrégation spécifique d'anticorps anti-IgM biotinylés par la streptavidine couplée à un support tel que, de préférence, des billes magnétiques, ainsi qu'une combinaison d'au moins les trois anticorps antiCD19, anti-CD21 et anti-IgM, procure in vitro une mutation rapide de cellules cultivées en présence de ces anticorps, dans un temps très court qui n'a aucune mesure avec les durées indiquées pour l'obtention de mutations in vitro selon la technique antérieure. Selon une autre caractéristique, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. L'invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé d'induction de mutations somatiques pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. Selon une forme de réalisation, cette utilisation est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, le système selon l'invention est utilisé pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2 dans la phase GO/Gl. L'invention a également pour objet un kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques tel que défini plus haut. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ce kit pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, notamment par l'analyse des protéines. Dans une forme de réalisation, l'utilisation du kit selon l'invention comporte l'identification des modifications post-traductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. Selon une caractéristique de mise en oeuvre préférée, cette utilisation comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur (enhancer) des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. Selon une forme de réalisation avantageuse, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. Dans une autre forme de réalisation, la séquence à faire muter est intégrée par recombinaison homologue au locus des immunoglobulines (remplaçant tout ou partie du gène V d'un des deux loci réarrangés). L'invention est décrite ci-après en référence à un exemple de réalisation, qui est purement illustratif et qui vise à procurer à l'homme du métier des indications pratiques pour la réalisation de l'invention. Sur la base de ces indications et de ses connaissances propres, l'homme du métier est ainsi apte à concevoir, sans sortir du cadre de la présente invention, des systèmes de test analogues ou équivalents et des utilisations concrètes différentes, apparentées ou non à celles qui sont décrites ici. Pour l'induction de mutations somatiques in vitro sur la cellule BL2, on a procédé comme suit : Conditions de culture de la cellule BL2 On a fourni des cellules BL2 et on les a maintenues dans un milieu complet à raison de 105 cellules par ml, pendant 24 h à 370C et à 5% de C02. Le milieu de culture était du milieu RPMI 1640, complété avec 10% de FCS, ainsi que 100 U/ml (unités/ml) de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine. Stimulation On a lavé les cellules dans du milieu RPMI, pour enlever toute trace du sérum, par centrifugation à environ 1500 tours/min pendant 7 minutes, à une température comprise entre 4 et 10 C. On a repris les cellules BL2 dans du milieu RPMI à raison de 106 cellules pour 500 11. Dans un flacon de 15 ml, on a introduit 106 cellules dans de la glace, et on a ajouté : '20 jl d'anti-CD19 couplé à du FITC (fourni par Immunotech), '20 nul d'anti-CD21 couplé à la PE (fourni par Becton Dickinson) et '4 ni d'anti-IgM couplé à la biotine (fourni par Immunotech). Après agitation jusqu'à obtention d'un mélange homogène, on a placé celui-ci sur de la glace et on l'y a laissé pendant environ 20 minutes. On a ensuite lavé les cellules de ce mélange dans 10 ml de milieu RPMI (à 4 C), puis on a soumis à une centrifugation à 1500 tours/min pendant 7 min. On a repris les cellules ainsi lavées dans 500 ul de RPMI dans un tube d'Eppendorf (1,5 ml) et on a ajouté 20 ul de billes magnétiques commercialisées sous la dénomination Dynal auxquelles était couplée de la streptavidine. On a laissé le tube subir des retournements sur une roue à environ 4 C pendant 15 min. On a repris les cellules et les billes sur lesquelles ces cellules étaient fixées dans environ 4 ul de milieu complet additionné d'ADCM (procuré par le Centre de transfusion de Lyon, France), et on a ensuite distribué les cellules ainsi traitées sur une plaque de titrage comportant 24 puits pour culture cellulaire (à raison d'environ 2. 105 cellules par puits). On a laissé les cellules incuber pendant environ 1 heure 30 minutes à 37 C. On a ensuite repris la totalité du contenu d'un puits dans un tube d'Eppendorf de 1,5 ml et on a centrifugé pendant 10 min à 2000 tours/min. On a repris le produit de la centrifugation pour enlever le surnageant et plonger le culot de centrifugation dans l'azote liquide. Les mutations ont été testées dans l'ADN, par les techniques moléculaires classiques, connues et couramment pratiquées par l'homme du métier. L'analyse des résultats obtenus et de ceux des investigations menées en parallèle sur des gènes différents du VH, et/ou avec des cellules autres que la BL2, montre que l'on peut ainsi induire des mutations in vitro dans la cellule BL2 sur le gène VH réarrangé par stimulation d'un groupe de récepteurs de surface. En variante, on peut remplacer la séquence Ig, par exemple par une séquence procaryote, telle que le gène de résistance à la néomycine, et obtenir des mutations similaires avec la BL2. Il a ainsi pu être établir, selon l'invention, que : des mutations peuvent être induites en environ 1 h 30 min après stimulation par le récepteur à l'antigène et un groupe de co-récepteurs, en l'absence de co-culture avec des cellules T ; en moyenne un tiers environ des cellules subissent le mécanisme d'hypermutation ; la mutation induite selon l'invention a lieu en présence d'actinomycine D, qui inhibe totalement la transcription ; les mutations sont induites lorsque les cellules sont maintenues en GO/G1 par l'hydroxyurée ; les mutations sont également induites en environ 1 h 30 min lorsque les cellules sont préparées en phase GO/G1 par élutriation. Ces résultats vont à l'encontre des enseignements de la technique antérieure et ils montrent que le processus d'hypermutation peut avoir lieu en l'absence de transcription et de chromatide soeur. En pratique, on peut ainsi étudier en gel à deux dimensions la perte ou l'apparition de protéines, mais aussi leur modification post- traductionnelle. Par ailleurs, des mutations somatiques ainsi réalisées selon la présente invention ont pu être ré-induites dans des cellules appropriées, telles que le lymphome de Burkitt BL2, par stimulation des récepteurs de surface. Une stimulation de ce type se produit très vraisemblablement in vivo également. Le procédé et les moyens selon l'invention permettent d'aborder dans des conditions radicalement plus performantes et sûres les études et tests de détermination des phénomènes d'hypermutation des gènes, en particulier des gènes des immunoglobulines. Certains développements et certaines applications qui peuvent être visés grâce à la mise en oeuvre des moyens selon l'invention sont résumés ciaprès. Il est clair que cette énumération n'est pas limitative et que d'autres applications également peuvent être envisagées. A titre d'exemple, il est important que'on puisse déterminer selon l'invention, dans des conditions qui ne pouvaient être réalisées jusqu'ici, quels sont le rôle et l'importance de l'hypermutation somatique dans la transformation maligne des cellules B dans le centre germinatif. L'invention, en procurant un modèle unique de simplicité et de rapidité d'induction des mutations somatiques, a permis de montrer que le processus d'hypermutation peut avoir lieu en l'absence de transcription et de chromatide soeur. Elle procure également des moyens pour l'obtention de la signature hypermutation au niveau protéique et génique, avec comme visée de permettre de disposer d'un test simple, applicable en particulier aux lymphomes B humains. D'autres questions non résolues à ce jour sont notamment celle du mécanisme moléculaire de l'hypermutation et de l'éventuelle présence d'une polymérase hautement mutagène, ainsi que celle des cofacteurs présents. n faut en effet rappeler que les cofacteurs, c'est-à-dire les composants du mutasome qui permettent le ciblage du processus d'hypermutation sur les gènes VH et VL réarrangés à un stade précis de la réponse immune, ne sont pas connus. Le système de test selon l'invention procure des moyens fiables et rapides pour suivre la cinétique d'un tel processus d'hypermutation et pour que l'homme du métier, sur la base de ses connaissances propres et éclairé par la présente description, puisse réaliser des tests rapides et économiques notamment applicables aux lymphomes B humains. Encore un autre objet de la présente invention est ainsi un kit ou ensemble de moyens pour l'induction d'hypermutations et pour la réalisation de tests y relatifs, dans lequel le moyen pour l'induction d'une hypermutation rapide comporte une combinaison d'anticorps telle que décrite plus haut De manière plus générale, la présente invention procure des moyens permettant l'étude et le suivi des premières étapes moléculaires des processus de mutation somatique au niveau de l'ADN et des protéines. En bref, on peut ainsi, grâce aux moyens mis en oeuvre selon l'invention, modifier un gène par recombinaison homologue ou l'inactiver, par exemple dans la cellule BL2. La technique selon l'invention, ainsi rendue réalisable dans les cellules, notamment les cellules BL2, permet d'améliorer les propriétés mutatrices de ces cellules, mais également de tester le rôle que pourrait jouer telle ou telle molécule dans la physiologie des cellules B et des lymphomes de Burkitt. En mettant en oeuvre les moyens selon l'invention, on peut par conséquent, à titre d'exemples non limitatifs, obtenir la sur-expression de certains gènes dans la BL2 et améliorer ainsi les performances de cellule mutatrice de celle-ci, tandis que la transfection des molécules qui semblent impliquées dans le processus peut concerner, entre autres : AID, MSH2, MSH6 ou des enzymes de type RAD30A et/ou RAD30B. Ce système permet ainsi notamment d'identifier les mutations nécessaires pour améliorer les performances d'une protéine d'intérêt. Par exemple, dans le cas illustratif, et non limitatif, du gène codant pour l'insuline, mis dans une cassette promoteur-activateur transfectée dans la BL2, celle-ci peut produire de nombreuses molécules, parmi lesquelles celle ayant la meilleure performance va venir se fixer préférentiellement sur son substrat. Selon une alternative, ce gène peut être intégré par recombinaison homologue au locus des immunoglobulines (remplaçant tout ou partie du gène V d'un des deux loci réarrangés), et in devient alors à ce locus la cible des mutations somatiques. En procédant ensuite au séquençage du gène muté codant pour cette protéine préférentielle et à l'identification par des moyens connus des acides aminés modifiés qui ont permis cette amélioration de performance, on peut identifier très rapidement par le procédé selon l'invention les mutations qui permettent d'obtenir une insuline plus performante. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'induction de mutations somatiques in vitro, caractérisé en ce qu'il comporte (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'au moins une combinaison ternaire des anticorps anti-CD19, anti- CD21 et anti-IgM, tandis que (2) lesdits anticorps anti-IgM sont biotinylés et sont soumis à une agrégation spécifique par la streptavidine couplée à un support. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support est composé en totalité ou en partie par des billes magnétiques. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on opère en l'absence de co-culture avec un autre type cellulaire, notamment en l'absence de co-culture avec des cellules T. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise le lymphome de Burkitt BL2 pour les cellules à faire muter. 5. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'elle est destinée à l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle vise l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2 dans la phase GO/G1. 9. Kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour l'induction de mutations somatiques, qui comportent au moins une combinaison ternaire des anticorps anti- CD19, anti-CD21 et anti-IgM. 10. Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdits anticorps anti- IgM sont biotinylés et ont été soumis à une agrégation spécifique par la streptavidine couplée à un support, notamment à des billes magnétiques. 11. Kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 12. Utilisation du kit selon l'une des revendications 10 ou 11 pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, notamment par l'analyse des protéines. 13. Utilisation selon 12, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification des modifications post-traductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. 14. Utilisation selon 12, caractérisée en ce qu'elle comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur (enhancer) des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. 16. Utilisation selon l'une quelconques des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que, pour faire muter une séquence quelconque, on insère cette séquence par recombinaison homologue au locus des immunoglobulines, en remplacement de tout ou partie du gène V d'un des deux loci réarrangés.