FR 2822071 A1 20020920 FR 0103518 A 20010315 UTILISATION D'UNE FRACTION MEMBRANAIRE DE BACTERIES A GRAM NEGATIF POUR INDUIRE LA MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES La présente invention concerne l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques et ainsi favoriser le développement d'une réponse immune spécifique. Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156,25 & Cella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9, 10). Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoidcs. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis l'intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les organes tels que le poumon, le foie et l'intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation. Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des cellules dendritiques de molécules impliquées dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe 1/11), la production de cytokines proinflammatoires (IL-6) et de chemokines (telles que TNF (x, IL-8, MCP-1 et MIP-la) et perdent leur capacité à processer l'antigène. Les chemokines recrutent des cellules inflammatoires et favorisent l'initiation d'une réponse immune. En particulier, I'IL-8, le MCP-1 et le MIP-l ex attirent non seulement des cellules inflammatoires mais également des lymphocytes T naïfs et mémoires. Ainsi, les cellules dendritiques en sécrétant des chemokines augmentent leurs chances d'entrer en contact avec les lymphocytes T. Les cytokines proinflammatoires vont également agir en activant directement les CD. Ces cellules dendritiques matures présentent les antigènes aux lymphocytes T et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules. Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer l'antigène. Dans les zones thymo-dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétées immunostimulatrices et vont donc activer de façon très efficace les lymphocytes T naïfs circulants. La fraction membranaire de K. pneumoniae 1145 entre dans la composition d'une préparation pharmaceutique prévenant la survenue et la récidive d'infections respiratoires d'origine bactérienne et utilisée chez l'homme depuis 20 ans. A ce titre, il existe un recul de non toxicité du produit. Dans la demande FR9903154 il a été montré que la FMKp ou l'un de ses constituants majeurs, la protéine de membrane externe OmpA, dénommée P40 était capable d'induire la production notamment par les monocytes de TNF-a et d'IL-12, cytokines impliquées dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Dans la demande FR9903153, il a été montré que la ladite fraction membranaire FMKp associée à un antigène avait non seulement la capacité de réorienter la réponse cytokinique vers un profil Thl/Th2 et ce quel que soit le mode d'administration desdites fractions membranaires. Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence qu'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae induit la maturation des cellules dendritiques humaines permettant ainsi le développement d'une réponse lymphocytaire T spécifique. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la maturation des cellules dendritiques Par fraction membranaire de bactérie, on entend désigner dans la présente invention toute fraction ou extrait membranaire purifié ou partiellement purifié obtenu à partir d'une culture de ladite bactérie et dont le procédé de préparation comprend au moins une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation de la fraction contenant les membranes desdites bactéries du Iysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire comprend au moins des protéoglycanes membranaires. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire peut aussi être définie comme un une fraction comprenant au moins des protéines membranaires associées aux LPS (lipopolysaccharides), connus de l'homme du métier. Le titre en protéoglycane des fractions membranaires selon l'invention est représenté par la somme des teneurs en galactose et en protéines, est de préférence compris : - pour le galactose : entre 1,2 g/l et 3,4 g/l ; - pour les protéines : entre 7,5 g/l et 14,9 g/l. De manière plus préférée, ce titre sera : - pour le galactose : entre 1,8 g/l et 2,6 g/l ; - pour les protéines : entre 9,3 g/1 et 11, 7 g/l. Les fractions membranaires selon l'invention sont susceptibles d'être obtenues par les procédés décrits ci après ou par tout autre procédé équivalent, notamment ceux décrits dans les demandes de brevet FR9903154 et FR9903153. Ces fractions membranaires pourront être utilisées à des concentrations de 0,1 à 100, préférentiellement de 1 à 50, et plus préférentiellement de 1 à 20 microgrammes par millilitre de milieu de culture. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les bactéries à gram négatif sont choisies parmi les bactéries de genre Klebsiella et préférentiellement d'espèce pneumoniae. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les fractions membranaires selon l'invention peuvent servir à favoriser la maturation des cellules dendritiques in vitro, les cellules matures pouvant ensuite être réinjectées in vivo. Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ce médicament peut servir à favoriser la génération et la maturation des cellules dendritiques in vitro, après mise en contact avec un agent biologique. Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'une fraction membranaire selon l'invention et en outre d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament. Ce dernier pourra par exemple augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique. Cet agent biologique peut être choisi parmi les acides nucléiques, les protéines, les lipides, les lipopeptides ou les polysaccharides. Il peut être plus particulièrement choisi parmi les antigènes vaccinants et/ou les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons. Plus préférentiellement, l'agent biologique est un antigène tumoral. Au sens de la présente invention, un antigène tumoral est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T CD8+) ou comme la séquence nucléique codant pour de tels protéines, peptides ou épitopes. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (ou EpCAM), SIOO (malignant melanoma-associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e. g., PSA and PSMA), et p2lras. L'agent biologique peut encore être choisi parmi un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Au sens de la présente invention on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d'obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible L'utilisation de cellules hétérologues permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients. Les cellules tumorales peuvent être obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées telles qu'elles ou être mises en culture avant d'être Iysées. Un lysat cellulaire peut être défini au sens de la présente invention comme un mélange d'antigènes intra-cellulaires et/ou membranaires, préférentiellement intra et membranaires. Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-être obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de cellules tumorales. Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation. On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine. du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra être utilisée afin d'obtenir un lysat. Les cellules dendritiques sont ainsi modifiées en utilisant ces antigènes ou hsats cellulaires de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux. Ainsi, ledit médicament pourra être injecté en même temps que les cellules dendritiques ou de façon préférée ledit médicament pourra être mis en oeuvre in vitro, afin de favoriser la maturation des cellules dendritiques avant de les réinjecter aux patients. L'administration d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif en même temps que l'antigène permettra d'augmenter la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques et par là même l'efficacité du traitement thérapeutique. Ainsi, grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques en présence d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif pourront être utilisées pour générer des réponses CTL anticancéreuscs (Nestle F. O. et al., 1998, Nat. Med., 4,328-332). Cette approche, dénommée"ex vivo" consiste donc à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) en présence d'une fraction membranaire de bactéries a gram négatif et à réimplanter ces cellules chez le patient. Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer la fraction membranaire de bactéries à gram négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. Une autre approche selon l'invention consiste à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et notamment avec un gène codant pour un antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, ou pour un antigène tumoral, tels que ceux décrits ci-dessus, et/ou avec un gène codant pour une cytokine ou un facteur de croissance, tels que ceux décrits ci-dessous, et de mettre les cellules dendritiques, avant et/ou pendant et/ou après la transfection, en présence d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46,82-87). Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer la fraction membranaire de bactéries à gram négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. De telles approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F. J. et al., 1996, Nat. Med., 2,52-58). Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre une cytokine ou u) i facteur de croissance, notamment l'interféron alpha ou gamma, le TNFa, le GM-CSF, l'1L- 2, l'IL-12, l'IL-4, l'IL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple l'hsp70, 1'hsp90, l'hsp96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire, et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation. L'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif avec au moins un agent biologique associé au TNF alpha peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes 1 Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant ! e MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour Heat labile enterotoxin entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT, ou des protéines membranaires bactériennes telle,, que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun. 60, 1992, 4977- 4983), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol. 146, 1991, 793-798) ou Pols du Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis. 175, 1997, 364-372), et préférentiellement une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella, protéine majeure de ! a membrane externe baptisée P40, présentant une activité adjuvante pour des antigènes sousunitaires peptidiques (WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J. Biochem 255 , 1998,446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol. 73,1999, 5637-5645). Le médicament selon l'invention peut encore comprendre un milieu pharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitue d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose etlotl de glycérol. Le médicament selon l'invention peut en outre être véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, il peut être véhicule sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules Le médicament ou l'association d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif-agent biologique pourra aussi se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhesl\e emplâtre, patch . Le médicament selon l'invention pourra être utilisé notamment pour le traitement - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associées au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus par exemple le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasiten et levures), - des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau dz da prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, de la remise, par exemple Comme décrit ci dessus, l'invention concerne particulièrement l'immunothérapie cellulaire utilisant des vaccins anti-cancéreux et anti-infectieux en particulier, en générant // vitro des cellules dendritiques autologues, en y introduisant un antigène tumoral et en les réinjectant après une étape de lavage facultative. L'exposition des cellules dendritiques/// vitro à la fraction membranaire de bactéries à gram négatif permettra d'augmenter 18 1 maturation des cellules dendritiques et donc d'augmenter l'efficacité du vaccin. Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation d'une fi action membranaire de bactéries à gram négatif, et plus particulièrement de la traction membranaire de Klebsiella pneumoniae pour la préparation d'un médicament pour augmenter la réponse immunologique vis-à-vis d'un agent biologique tel que défini ci dessus. Ce médicament peut être un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale-comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par une levure ou un parasite La présente invention concerne encore l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particulièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la pfu tatc du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les kératinomes et les carcinomes. En effet, dans les cancers de la peau tels que les mélanomes et les kératinomes, les cellules cancéreuses sont en contact direct avec les cellules de Langerhans, situees dans l'épiderme, l'utilisation selon la présente invention par application cutanée permet d'agir directement, localement sur les cellules de Langerhans. Ainsi, le médicament selon l'invention pourra être appliqué au niveau de la peau notamment par voie cutanée, souscutanée, transdermique, intra-épidermique ou au niveau des muqueuses, il agit alors de façon systémique par la maturation des cellules dendritiques et localement par la matmation des cellules de Langerhans. Comme décrit ci dessus le traitement de ces cancers, peut aussi être envisage en injectant des cellules dendritiques autologues, et notamment des cellules dendritiques autologues qui ont été modifiées afin d'exprimer des antigènes tumoraux. La maturation des cellules dendritiques sera assurée par la fraction membranaire de bactéries à gram négatif L'invention a encore pour objet un dispositif pour la maturation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprenant au moins la fraction membranalre de bactéries à gram négatif. Ce kit pourra être adapté pour la maturation des cellules dendritiques in \ itro et pourra être utilisé par exemple dans les laboratoires de recherche. Ce kit peut contenu en outre de la fraction membranaire de bactéries à gram négatif des cellules dendntlques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures. tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines !) pourra ainsi comprendre par exemple différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles tels que par exemple des anticorps et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention de maturation des cellules dendritiques. Un kit selon l'invention pourra aussi être adapté à la mise en oeuvre de a methode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Ce kit peut contenir en outre de la fraction membranaire de bactéries à gram négatif des cellules dendritiques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la methode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Le cas échéant il pourra encore contenir des antigène hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'im cntion sans aucunement en limiter la portée. Ces exemples démontrent l'action d'une ft action membranaire de bactéries à gram négatif sur les cellules dendritiques la ffacDon membranaire de bactéries à gram négatif induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur confère de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrice d'antigène. Dans ces exemples, on se référera à la figure 1 annexée qui illustre le fait que i) La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit l'expression de) a molécule CD83, augmente l'expression CD86 ainsi que la production d'IL-8. Les résultats d'analyse par FACS des molécules de surface sont exprimés en MM (moyenne d'intensité de fluorescence) et sont représentatifs d'une expérience parmi 3 Concernant CD83 et CD86, les résultats sont également exprimés en pourcentage de cellules positives. Les résultats du dosage d'IL-8 sont exprimés en ng/ml et sont e\primés en moyenne : s. d. de 4 expériences. ii) : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia augmente les propriétés costimulatrices des lymphocytes T (voir 4ème colonne MLR). Des CD immatures ont été ou non traitées pendant 24 heures avec de a fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia ou du LPS. Puis elles ont été irradiées et cultivées avec des lymphocytes T allogénique de 2 donneurs différents. La prolifération des lymphocytes T a été mesurée au bout de 5 jours. Les résultats sont exprimés en coup par minute (cpm) et représente la moyenne de 5 valeurs et sont représentatif d'une expenence parmi 3. EXEMPLES Exemple 1 : Obtention d'une fraction membranaire de K. pneumoniae Après décongélation à + 4 C pendant 48 h minimum, 1 kg de cellules sèches de K. pneumoniae est remis en suspension à 5 % cellules sèches. La DNase est ajoutée à 5 mg/1. On procède ensuite au broyage en boucle au Manton Gaulin pendant 30 min puis à une clarification sur SHARPLES à 50 1/h, suivie d'une précipitation à l'acide acétique à pH = 4,2 + 0,1 pendant 30 min. Le culot est éliminé (SHARPLES à 25 lih) et le surnageant est neutralisé, dilué à 2 fois le volume initial avec de l'eau osmosée Une dialyse à volume constant est alors effectuée sur PUF 100 jusqu'à 800 #cm, sui\)le d'une concentration de la suspension membranaire (SM) ainsi obtenue, à Il 1/kg de cellules sèches. On procède alors à l'autoclavage de la SM à + 121 C durant 35 min quel'on peut conserver à + 4 C pendant 6 semaines. Caractéristiques de la fraction membranaire obtenue : Par définition, le titre en protéoglycanne, est égal à la somme des teneurs en galactose et en protéines. - Galactose : en moyenne 2,2 g/1 - Protéines : en moyenne 10,5 g/l Exemple 2 : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia augmente l'expression de CD 83 A. Méthodologie A. 1. Génération in vitro de CD humaines immatures. Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes rotes du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité@l. 077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède). Les cellules du sang sont centrifugees a 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPM I 1640 (Life technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive ein utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACSTM ; Miltenyi Biotex Bcfgiscti Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant Les CMN sont incubées pendant 20 minutes à 4 C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, ta colonne n'est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectes par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluorometre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taillegranulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%. Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 5x106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé pat la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de \eau foetal (chauffage à 56 C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/m) de pellicilliiie et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (\ ! unc. Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humain recombmant (R & D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 5 à 7 jours de culture (37 C\ 5 'o COp en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie Brievement. une aliquote de la suspension cellulaire est prélevée. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumme bovme et 0, 01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits a fond conique (Nunc) à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 m] de tampon FACS Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CDIa humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué révélé par un anticops anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) Apo es 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 (J de tampon fACS puis sont remises en suspension dans 200 ! de ce même tampon. L'analyse de F expression de CDIA versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendrrtlqucs immatutes caractérisées par une expression de la molécules CDIA (intensité moyenne de fluorescence (IMF) > 100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisées A. 2. Analyse par cytofluorométrie de l'expression des marqueurs de différenciation induite par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae sur des cellules dendritiques humaines. Les cellules dendritiques immatures ont été collectées, lavées puis remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 u ! dans des plaques de culture 96 puits à fond plat (Costar, Cabridge, USA) Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de 10 microgrammes, 20 microgrammes et 50 microgrammes par millilitre de milieu final 24 heures après stimulation, l'expression des molécules CD83 et CD86 est é\a) uce pm cytofluorométrie à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques marqués a la fluoresceme (Becton Dickinson). Les anticorps isotypiques contrôles utilisés proviennent de Becton Dickinson. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 2xl05 cellules dans un \volume de 50 u. I de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté un anticorps Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 u.) de tampon r-\CS puis sont remises en suspension dans 200 J. de ce même tampon. L'analyse de F expression des marqueurs de surface est évaluée par FACS. B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente l'expression par les cellules dendritiques immatures de molécules de surface impliquées dans l'activation des lymphocytes T - Comme cela a été préalablement démontré la majorité de la population de cellules dendritiques immatures n'exprime pas de CD83. La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae induit l'expression de la molécule de costimulation. - La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente aussi expression d'auttes molécules impliqués dans l'activation des lymphocytes T, telle que CD86 Exemple III. : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit l'expression d'IL-8 par les CD A. Méthodologie : Des cellules dendritiques humaines immatures ont été générées comme deckt dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 ml dans des plaques de culture 96 puits à fond plat. Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de 10 microgrammes et 50 microgrammes par millilitre de milieu de culture et après 24 heures de culture, les surnageants de culture sont centrifugés à 10000 rpm pendant 15 minutes à 4 C et l'IL-8 est dosée à l'aide de kits de dosage commercial type ELISA (R & D Systems) selon les instructions du fabncant B. Résultats : Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que a fi action mcmbianaxc de Klebsiella pneumoniae induit l'expression d'IL-8. Il peut ainsi être conclu que les f) actions membranaires de bactéries à gram négatif activent les cellules dendritiques imuiatmc'. Exemple IV. La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente les propriétés costimulatrices des cellules dendritiques A. Méthodologie : A. 1. Réaction lymphocytaire mixte. Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées connue décrit dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont lavées en miiieu RP\H [ô40 puis remises en culture dans le milieu complet à la concentration de 2, 5\) 0 ccHutes'puits dans une plaque de culture 6 puits (5 ml/puits). Les cellules ne sont pas ttimutces ou sont stimulées en présence de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de 10 microgrammes et 50 microgrammes ou 10 ng/ml L S Apres 24 heures de culture, les cellules sont collectées et lavées trois fois en milieu RP\'H) 640 1 es cellules sont ensuite irradiées à 3000 rad. Les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique ont été préparés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton. Brièvement, les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de Ficoll-H\paquc comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules mononucléées sont remises en suspension dans du milieu complet à la concentration de 200x106 cellules/ml et mélangees a\ec) mi d'une suspension à 50% d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France) La suspension cellulaire est incubée à 4 C pendant une nuit. Après remise en suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque () 500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes cellules sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules ainsi isolées est évaluée par cytofluorométrie à)'aide d'un anticorps anti-CD3 humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) La pureté est > 95%. Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de ethme complet à la concentration de 2, 5x10 cellules/ml. Les cellules dendritiques activées et irradiées sont mises en culture a la concentration de 104 cellules/200 microlitres dans une plaque de culture 96 pu) ts en présence ou non de 5x104 lymphocytes allogéniques. Après 5 jou) s de cuitme ! a prolifération des cellules T est évaluée par mesure de l'incorporation de thmidine tnt) ee ('H-Thy) (Amersham, Amersham, Royaume Uni). Brièvement, 0 25 mCi de H-Thy sont ajoutés dans chaque puits de culture. L'incorporation de 3H-Thv est mesurée par un compteur à scintillation liquide (Packard Instruments, Australie) Les résultats sont présentés en coups par minute (cpm). Les réactions lymphocytaires mixtes sont réalisées avec les lymphocytes T provenant de deux donneurs sains différents B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que les cellules dendritiques stimulées par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae présentent une capacite accrue à fournir des signaux de costimulation aux lymphocytes T et mduisent une prolifération de lymphocytes T plus importante que les CD non stimulées REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatff, cl préférentiellement de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques. 2. Utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, et préférentiellement de Klebsiella Pneumonia pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la maturation des cellules dendritiques. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la génération et la maturation des cellules dendritiques est effectuée in vitro 4. Utilisation selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que la genoation et la maturation des cellules dendritiques est effectuée in vitro, les celïules mâtures etant ensuite réinjectées in vivo. 5. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 4 et en outre d'au moms un agent biologique pour la fabrication d'un médicament. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactérie, de virus, de levure, de paiasite, de champignon tes antigènes tumoraux, et les lysats de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. 7. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que) cs cellules dendritiques sont transfectées ex vivo avec un gène codant pour un antigène et'ou une cytokine ou un facteur de croissance. 8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que le médicament contient en outre une cytokine ou un facteur de croissance, préferentteHement l'interféron alpha ou gamma, le TNFa, le GM-CSF, l'IL-2, l'IL-4,)' ! L-6 et H-18 ou une HSP. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour) a fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'o'igine \nale bactérienne, fongique ou provoquée par une levure, ou un parasite 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour lutter contre un virus choisi parmi le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers. 12. Utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'un cancer parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, les kératinomes et les carcinomes. 13. Kit pour la maturation des cellules dendritiques caractérisé en ce qu'il contient au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, et préférentiellement de Klebsiella Pneumonia. 14. Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient en outre des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues.