FR 2832727 A1 20030530 FR 0214112 A 20021108 PROCÉDÉ RAPIDE DE TRANSFORMATION DE CELLULES COMPÉTENTES La présente invention porte sur un procédé de transformation génique. Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé rapide de transformation de cellules compétentes. Les cellules hôtes après traitement préliminaire pour être plus perméables aux molécules d'ADN sont appelées cellules compétentes, et la technologie de distribution de molécules d'ADN dans le milieu environnant dans des cellules hôtes est appelée transformation. Compte tenu des récents développements du génie génétique, la production de cellules compétentes et la transformation de cellules compétentes sont très importantes. La technologie décrite ci-dessus peut être retracée dans Mandel, M. et Higa, A. (J. Mol. Biol. 53 :159- 162), qui ont publié un procédé de transformation chimique utilisant CaCl2. Après 30 années d'amélioration, le temps nécessaire pour la transformation est encore de 1,5 - 3,0 heures parce que les cellules hôtes sont lésées par un traitement chimique. Les cellules hôtes lésées nécessitent une étape de récupération. Dans l'étape de récupération, les cellules hôtes lésées sont cultivées dans un milieu nutritif pour leur permettre de récupérer leur fonction physiologique et la résistance aux médicaments. Ensuite, les cellules hôtes sont étalées sur un milieu sélectif pour trier les cellules hôtes transformées avec succès. Autrement, le rendement de transformation de plusieurs fois serait affecté. Récemment, un procédé de transformation rapide appelé électroporation a été développé. Bien que l'électroporation puisse distribuer une molécule d'ADN dans les cellules hôtes d'E. coli par courant transitoire, les cellules hôtes après le traitement par courant transitoire nécessitent encore une heure de récupération pour obtenir un rendement de transformation supérieur (Dower et al., 1988 Nucleic Acids Res. 16 :6127-6145). En 1988, Golub E.I. (Nucleic Acids Res. 16 :1641) a éqalement publié un procédé de transformation en une minute. Bien qu'une étape de récupération soit effectuée, le rendement de transformation n'est que de 104 - 105 colonies/g d'ADN plasmidique. La Figure unique du dessin annexé se rapporte à un appareil de transformation automatique pour un procédé de transformation rapide. C'est donc un objectif de la présente invention que de proposer un procédé rapide de transformation de cellules compétentes pour faire une économie de temps d'opération. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le procédé de transformation rapide comprend les étapes suivantes. Les cellules compétentes dans un récipient sont décongelées à la température ambiante ou dans un bain d'eau. Les ADN plasmidiques et les cellules compétentes sont mélangés ensemble dans le récipient, puis le mélange est soumis à un traitement de choc thermique pendant environ 0-180 secondes. Après étalement ( plating ) du mélange sur un milieu sélectif d'environ 0 C - 30 C par un outil d'étalement d'environ -90 C - 30 C, le mélange est cultivé sur le milieu sélectif afin d'obtenir des cellules compétentes. Dans un autre mode de réalisation préféré, une étape d'incubation des cellules compétentes dans un bain de glace peut être introduite entre l'étape de mélange et l'étape de chauffage pendant environ 0 - 90 minutes. Une autre étape d'incubation des cellules compétentes dans un bain de glace peut être introduite entre l'étape de chauffage et l'étape d'étalement pendant environ 0 - 60 minutes. Comme décrit ci-dessus, l'étape de récupération du procédé de transformation classique est omise, et les cellules transformées sont directement étalées sur un milieu sélectif à basse température par un outil d'étalement à basse température. Par conséquent, contrairement au temps de récupération classique nécessaire de 1,5 - 3,0 heures, le procédé selon la présente invention nécessite seulement plusieurs minutes, et le cas échéant aussi peu que plusieurs secondes. En plus du temps d'opération court, un autre avantage du procédé de transformation rapide est qu'un seul récipient peut être utilisé de l'étape de décongélation à l'étape d'étalement. Par conséquent, un appareil de transformation automatique peut être utilisé pour conduire le procédé de transformation rapide de cellules compétentes comme décrit ci-dessus. Dans le procédé de transformation rapide conduit par un appareil de transformation automatique, les cellules compétentes sont d'abord décongelées dans un récipient maintenu dans un premier réservoir à la température ambiante. Ensuite, les ADN plasmidiques sont introduits par pipettage dans le récipient pour se mélanger avec les cellules compétentes dans le récipient afin de former un mélange, à l'aide d'une micropipette. Ensuite, le récipient est transféré par un bras de robot dans un second réservoir chauffé par une unité de commande de température pendant environ 0-180 secondes, ce par quoi le mélange dans le récipient est soumis à un traitement de choc thermique. Une plaque remplie d'un milieu sélectif à environ 0 - 30 C et un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C sur le milieu sélectif sont fournis par une unité de chargement de plaques. L'outil d'étalement est déplacé sur le milieu sélectif pour étaler le mélange sur celui-ci par l'unité d'étalement. Finalement, le mélange est cultivé sur le milieu sélectif dans une unité d'incubation afin d'obtenir les cellules transformées. C'est encore un autre objectif de la présente invention que de proposer un procédé de transformation rapide effectué par un appareil de transformation automatique, comprenant les opérations consistant à : décongeler des cellules compétentes dans un récipient maintenu dans un premier réservoir à la température ambiante ; introduire par pipettage un ADN plasmidique dans le récipient pour être mélangé avec les cellules compétentes dans le récipient afin de former un mélange, à l'aide d'une micropipette ; transférer le récipient par un bras de robot dans un second réservoir chauffé par une unité de commande de température pendant environ 0 - 180 secondes, ce par quoi le mélange dans le récipient est soumis à un traitement de choc thermique ; se munir d'une plaque remplie d'un milieu sélectif à environ 0- 30 C par une unité de chargement de plaques ; se munir d'un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C sur le milieu sélectif par une unité d'étalement ; déplacer l'outil d'étalement sur le milieu sélectif pour étaler le mélange sur celui-ci par l'unité d'étalement ; et cultiver le mélange sur le milieu sélectif dans une unité d'incubation afin d'obtenir les cellules transformées. Il doit être entendu qu'à la fois la description générale précédente et la description détaillée suivante sont faites par des exemples, et sont destinées à fournir davantage d'explications de l'invention telle que revendiquée. L'étape de récupération d'un procédé de transformation classique est l'étape qui demande le plus de temps et est la plus malcommode. Dans l'étape de récupération, de nouveaux tubes avec des solutions de culture SOC ou LB sont nécessaires, puis les tubes avec la solution de culture et les cellules transformées nécessitent d'être incubés à 37 C sous agitation pendant au moins 1 - 2 heures. Si l'étape de récupération peut être omise ou le temps nécessaire pour l'étape de récupération peut être réduit, le procédé de transformation peut être largement simplifié. Dans un procédé de transformation classique, une étape de récupération de culture de cellules transformées, qui ont absorbé des ADS plasmidiques capables de résister aux antibiotiques, dans une solution de culture SOC ou LB à 37 C sous agitation pendant 1,0 - 2,0 heures, est habituellement effectuée avant un étalement et une étape sélective. Le but de l'étape de récupération est de laisser aux cellules transformées le temps d'exprimer la résistance aux antibiotiques des ADN plasmidiques absorbés. De ce fait, les cellules transformées peuvent survivre dans un milieu sélectif avec des antibiotiques dans l'étape sélective. Si le temps nécessaire pour l'étape de récupération est réduit, la lésion aux cellules hôtes pendant les étapes de décongélation, incubation dans un bain de glace et choc thermique, doit également être réduite pour amener les cellules transformées à développer une résistance aux antibiotiques plus rapidement. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le procédé de transformation rapide comprend les étapes suivantes. Les cellules compétentes dans un tube sont décongelées à la température ambiante ou dans un bain d'eau. Les ADN plasmidiques et les cellules compétentes sont mélangés ensemble dans le tube, puis le mélange est soumis à un traitement de choc thermique. Après étalement du mélange sur un milieu sélectif à basse température par un outil d'étalement à basse température, les cellules compétentes sont cultivées sur le milieu sélectif. Dans ce mode de réalisation préféré de la présente invention, les cellules transformées sont directement étalées sur le milieu sélectif à une basse température, et l'étape de récupération classique, qui est habituellement effectuée avant l'étalement et l'étape sélective, est omise. Par conséquent, les inconvénients du procédé de transformation classique, tels que les étapes multiples (tubes multiples) et la consommation de temps (environ 1,5 - 3,0 heures) sont surmontés par les avantages de la présente invention, tels qu'une courte durée (plusieurs secondes à plusieurs minutes) et l'utilisation d'un unique tube. D'une manière générale, les cellules compétentes sont stockées à -70 C. Avant mélange des ADN plasmidiques et des cellules compétentes, les cellules compétentes doivent d'abord être décongelées. Un procédé de décongélation des cellules compétentes consiste en l'incubation de celles-ci pendant environ 5 - 3 minutes dans un bain de glace pour une décongélation lente. Un procédé de décongélation rapide des cellules compétentes consiste à les faire incuber dans un bain d'eau pendant environ 5 secondes à 5 minutes. Les cellules compétentes peuvent être préparées par exemple à partir de diverses souches d'Escherichia coli (E. coli), telles que HB101, DH5[alpha], GM2929 XL1-Blue, TG1, BL21 et JM109 etc. E. coli est le microorganisme le plus largement appliqué. En particulier dans le domaine de la biologie moléculaire et du génie génétique, des variants d'E. coli sont des cellules hôtes obligatoires utilisées dans les laboratoires pour la production en série de différentes sortes d'ADN ou de protéines. Ensuite, les ADN plasmidiques et les cellules compétentes sont mélangés ensemble. Aucune condition de limitation spéciale n'est nécessaire pour les cellules compétentes. Les cellules compétentes peuvent être achetées auprès de différentes sources disponibles dans le commerce ou obtenues conformément à n'importe quelle technologie connue. Les ADN plasmidiques peuvent être obtenus à partir de n'importe quelles sources naturelles ou après recombinaison par génie génétique. On peut mélanger les cellules compétentes et les ADN plasmidiques soit en retournant doucement le tube avec les doigts, soit en agitant vivement le tube à l'aide d'un dispositif de secouage. Après avoir mélangé uniformément, le mélange des ADN plasmidiques et des cellules compétentes est incubé dans un bain d'eau à environ 36 - 48 C pour un traitement de choc thermique. Le temps nécessaire pour le traitement de choc thermique est, de préférence, d'environ 0 - 180 secondes et, de façon davantage préférée, d'environ 10 - 90 secondes. Ensuite, le mélange est étalé sur un milieu sélectif à basse température par un outil d'étalement à basse température. L'outil d'étalement peut être un outil classique, tel que les perles de verre ou une anse de verre. La température de l'outil d'étalement est, de préférence, d'environ -90 C à 30 C et, de façon davantage préférée, d'environ -20 C à 8 C. La température du milieu sélectif est, de préférence, d'environ 0 C à 30 C et, de façon davantage préférée, d'environ 0 C à 4 C. Finalement, les cellules compétentes sont cultivées sur le milieu sélectif. Un antibiotique est ajouté au milieu sélectif. On peut faire varier la quantité de l'antibiotique ajouté selon les besoins ou conformément aux techniques connues. Par exemple, la concentration d'un antibiotique, tel que l'ampicilline, peut être d'environ 25-100 g/ml. Conformément à un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, une étape d'incubation dans un bain de glace peut être introduite entre l'étape de mélange et l'étape de choc thermique. Autrement dit, après un mélange des ADN plasmidiques et des cellules compétentes, le mélange est incubé dans un bain de glace, puis soumis au traitement de choc thermique. Le temps d'incubation du mélange dans le bain de glace est, de préférence, d'environ 0 - 90 minutes et, de façon davantage préférée, d'environ 0 - 30 minutes. Une autre étape d'incubation dans un bain de glace peut être introduite entre le traitement de choc thermique et l'étape d'étalement. Le temps pour l'incubation du mélange dans le bain de glace est, de préférence, d'environ 0 - 60 minutes et, de façon davantage préférée, d'environ 0 - 30 minutes. Après une nouvelle étude détaillée, on pense que la description ci-dessus est suffisante pour permettre l'exécution de la présente invention. Les exemples spécifiques suivants doivent donc être considérés comme simplement illustratifs et non limitatifs du reste de la description de quelque manière que ce soit. PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES Les cellules compétentes de la présente invention ont été obtenues par les quatre méthodes chimiques suivantes. Les quatre méthodes chimiques sont CaCl2 (Mandel, M., et Higa A. 1970, J. Mol. Biol. 53:159-162), TB (Inoue H, 1990, Gène 96:23-28), TSS (Chung C. T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86 :2172-2175) et TFB (Hanahan D., 1983, J. Mol. Bio. 166 :557-580). La souche d'E. coli utilisée était DH5a, qui est couramment utilisée dans la recherche de biologie moléculaire. L'information génétique de la souche DH5a est F- (#80d lacZ#M15) # (lacZYA-argF) U169 supE44 hsdR17 (rk- mk+) recAl gyrA96 endAl thi-1 relAl deoR A'. Dans les modes opératoires de transformation, un clone de la souche DH5a a été inoculé dans une solution de culture LB et cultivé à environ 37 C pendant environ 16 heures. Les cellules de la souche DH5a ont ensuite été diluées par la solution de culture LB à une concentration d'environ 1/100 de la concentration initiale. La solution diluée des cellules de la souche DH5a a été divisée en quatre flacons et a été cultivée en continu dans la solution de culture LB jusqu'à ce que l'absorbance soit d'environ 0,2-0,6. Ensuite, les cellules compétentes ont été respectivement produites par les quatre méthodes chimiques décrites ci-dessus (Methods in Enzymology, 1991, 204 :63-113) et stockées à environ -70 C. LE RENDEMENT DU PROCÉDÉ DE TRANSFORMATION CLASSIQUE (EXEMPLE 1) Les cellules compétentes préparées par les quatre méthode chimiques telles que décrites dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES, ont été transformées par le plasmide pUC19. Les étapes et les temps d'opération sont présentés dans le Tableau 1. La concentration testée du plasmide pUC19 est de 10-4 ou 10-5 g/ L, et la quantité utilisée était de 1 L pour chaque fois. La quantité des cellules compétentes utilisée était de 100 l chaque fois. Une décongélation a été conduite conformément aux diverses méthodes de transformation décrites dans Methods in Enzymology, 1991, 204 :63-113. Comme présenté dans le Tableau 1, le temps nécessaire pour la méthode de transformation classique était d'environ 1,5 - 3,0 heures. Tableau 1 : Etapes et temps d'opération nécessaires des méthodes de transformation classiques (CaCl2, TSS, TB et TFB) Etape d'Opération Temps d'Opération Décongélation des cellules compétentes 5-30 minutes Addition et mélange des plasmides avec Environ 1 minute les cellules compétentes Incubation du mélange dans un bain de 10-30 minutes glace Traitement de choc thermique 0-2 minutes Incubation du mélange dans un bain de 2-15 minutes glace ~~~ ~~~~~~ ~~~~~ ~~~~ Addition de la solution de culture SOC 1-5 minutes ou LB Culture des cellules compétentes à 37 C 60-120 minutes sous agitation Étalement des cellules compétentes sur 3-10 secondes un milieu sélectif (LB + antibiotique*) à la température ambiante ou à 37 C * La concentration ajoutée de l'antibiotique est habituellement, par exemple, de 25-60 g/mL pour l'ampicilline. L'ampicilline à 40 g/mL dans le gel d'agarose LB, qui est indiquée par l'abréviation LBAp40, a été utilisée par la présente invention pour une série d'essais. Les rendements de transformation des cellules compétentes préparées par les quatre méthodes chimiques décrites ci-dessus sont énumérés dans le Tableau 2. Les résultats sont au même niveau que les résultats publiés dans la littérature pertinente. De ce fait, les cellules compétentes préparées dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES peuvent être utilisées pour tester le procédé de transformation de la présente invention. Tableau 2 : Les rendements de transformation des cellules compétentes préparées par les quatre méthodes chimiques décrites dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES Méthodes de préparation Rendement de transformation des cellules compétentes (clones transformés/ g de pUC19) CaCl2 5,8 x 107 TB 1,2 x 107 TSS 5,0 x 106 TFB 2,7 x 107 L'EFFET DE LA DUREE DE CHAQUE ETAPE (EXEMPLES 2-14) Etant donné que de nombreuses cellules compétentes chimiques commercialisées sont préparées par TFB modifié (résumé à partir des manuels d'instruction de cellules compétentes achetées auprès de Stratagene, Promega, Invitrogen et Life Technologies), les cellules compétentes préparées par TFB (désignées par l'abréviation cellules compétentes TFB) ont été utilisées dans les essais suivants. Les résultats des Exemples 2-14 ont montré l'effet de la durée de chaque étape sur le rendement de transformation (Tableau 3). Tableau 3 : L'effet de la durée d'opération pour chaque étape sur le rendement de transformation Exemple Incubation Choc Incubation Cultivé dans Étalement Rendement de du mélange thermique du mélange une solution sur un transformation dans un dans un bain dans un bain de culture milieu (nombre de glace (sec.) délace sous des perles transformés/g (min). agitation de verre de de pUC19) (min.) (min. ) 4 mm à la température ambiante (sec. ) 2 0 45 0 0 3-10 1,6 x 10 3 0 45 0 30 3-10 5,lX107 4 0 45 0 60 3-10 6,2 x 107 5 0 45 5 30 3-10 5,9 x 10 6 0 45 5 60 3 -10 4,2 X 167 7 30 45 15 30 3-10 4,9 x 107 8 30 45 15 60 3-10 7,2 x 107 9 30 45 15 30 3-10 5,0 x 10' 10 30 45 15 60 3-10 6,3 x 107 11 30 0 0 30 3-10 4,0 x 107 12 30 0 0 60 3-10 5,0 x 107 13 60 0 0 30 3-10 2,5 x 106 14 60 0 0 60 3-10 3,5 x 106 Le procédé de transformation est parti d'une décongélation rapide des cellules compétentes stockées dans un congélateur dans un bain d'eau à 25 C pendant environ 5- 20 secondes. Lorsque -1/4 des cellules compétentes sont à l'état décongelé, les ADN plasmidiques ont été ajoutés aux cellules compétentes. Ensuite, les ADN plasmidiques et les cellules compétentes ont été uniformément mélangés par les doigts en donnant des secousses vives au tube. Les étapes restantes sont énumérées dans le Tableau 3. De façon surprenante, le temps d'opération total du procédé de transformation, excepté l'étape d'étalement, peut être réduit à 45 secondes, comme présenté par l' Exemple 2 du Tableau 3. Les étapes de mise en place du mélange des ADN plasmidiques et des cellules compétentes sur la glace, qui est avant et après l'étape de choc thermique, et l'étape de culture dans le procédé de transformation, peuvent être omises. Le rendement de transformation de l'Exemple 2 est comparable à ceux des méthodes de transformation classiques dans le Tableau 2. L'EFFET DE LA TEMPÉRATURE DE L'OUTIL D'ÉTALEMENT ET DU MILIEU SÉLECTIF Les quatre sortes de cellules compétentes préparées par les méthodes chimiques décrites dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES, ont été transformées par le mode opératoire de l'Exemple 2. Cependant, l'outil d'étalement, perles de verre de 4 mm, de différentes températures et le milieu sélectif, LBAp40, à la température ambiante ou à 4 C, ont été utilisés pour tester l'effet de la température de l'outil d'étalement et du milieu sélectif. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Les résultats du Tableau 4 montrent que l'outil d'étalement et le milieu sélectif à basse température peut augmenter le rendement de transformation des cellules compétentes. 0 Tableau 4 : L'effet de la température de l'outil d'étalement et du milieu sélectif sur le rendement de transformation Tempéra- ~~~ Rendement de Transformation ture de (clones transformés/ g de pUC19) perles de verre LBAp40 à température ambiante LBAP40 à 4 C de 4 mm CaCl2* TB* TFB* CaCl2* TB* TSS* TFB* 30 C 4,0 x 104 1,0 x 106 1,4 x 107 8,0 X 104 1,6 x 106 3,5 x 107 8 C 2,2 x 105 1,3 x 106- 6,4 x 105 4,2 x 106 4 C 6,0 x 104 4,2 x 105 - 1,4 X 107 2,2 x 106 1,2 x 106 1,1 x 108 0 C 5,4 x 105 1,4 x 106- 8,4 x 106 4,8 x 106 -20 C 3,4 x 105 3,7 x 106 - 9,6 x 106 1,6 x 107 1,6 x 108 -80 C - - - - - - 4,6 x 107 * Les cellules compétentes sont respectivement préparées par les méthodes chimiques de CaCl2, TB, TSS et TFB. L'EFFET De LA DUREE DU TRAITEMENT DE CHOC THERMIQUE (EXEMPLES 5-22) Les quatre sortes de cellules compétentes préparées par les méthodes chimiques décrites dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES, ont été transformées par le mode opératoire de l'Exemple 2. Les perles de verre et le milieu LBAp40 étaient tous deux à 4 C. Cependant, on a fait varier la durée du traitement du choc thermique (bain d'eau à 42 C) pour tester l' effet de la durée du traitement de choc thermique. Les résultats sont présentés dans le Tableau 5. Tableau 5 : L'effet de la durée du traitement de choc thermique sur le rendement de transformation. Exemples Traitement de choc Rendement de Transformation thermique (clones transformés/ g (sec.) de pUC19) 15 0 4,0 x 107 16 10 1,4 x 108 17 25 1,7 x 108 18 45 1,3 x 108 19 60 1,2 x 108 20 90 1,4 x 108 21 120 9,6 x 107 22 180 4,0 x 107 Le Tableau 5 montre que le rendement de transformation sans le traitement de choc thermique (Exemple 15) est comparable à ceux avec traitement de choc thermique (Exemples 16-22). Le rendement de transformation du traitement de choc thermique est meilleur pour environ 10 - 90 secondes (Exemples 16-20). Par conséquent, à partir des résultats des Tableaux 3 et 5, même si la durée du traitement à froid et à chaud a été réduite et l'étape de récupération dans la solution de culture LB ou SOC a été omise, un résultat comparable ou même un meilleur résultat que celui de la méthode classique peut être obtenu. Les rendements de transformation sont proches de ceux sous le standard commercialisé. L'APPLICABILITÉ DU PROCÉDÉ DE TRANSFORMATION RAPIDE Les cellules compétentes ont été préparées par les méthodes TB et TFB décrites dans la section PRÉPARATION DE CELLULES COMPÉTENTES. Les souches utilisées d'E. Coli étaient DH5[alpha] et JM109, et les ADN plasmidiques utilisés étaient pUC19, pBR322 et pUC4K tels que présentés dans le Tableau 6. Tableau 6 : Données des plasmides pUC19, pBR322 et pUC4K Plasmide Masse Marqueur de Origine de Moléculaire (Kb) Sélection (Gène Réplication de Résistance aux Médicaments) pUC19 2,7 Apr Mutant pMBl pUC4K 4,0 AprKmr Mutant pMBl pBR322 4,3 AprTcr Mutant pMBl Les antibiotiques ajoutés au milieu sélectif étaient l'Ampicilline (Ap), la Kanamycine (Km), la Tétracycline (Tc), Ap/Km et Ap/Tc. L'outil d'étalement, les perles de verre, et le milieu sélectif utilisés étaient à 4 C. Les résultats sont présentés dans le Tableau 7. Le Tableau 7 montre que les rendements de transformation étaient supérieurs à 106 clones transformés/g de plasmide. De ce fait, le procédé de transformation rapide s'applique largement à diverses souches d'E. Coli, à divers plasmides et à divers milieux sélectifs. Tableau 7 : Applicabilité du procédé de transformation à différentes souches, différents plasmides et différents antibiotiques. Méthode de Rendement de transformation Préparation (clones transformés / g de plasmide) Souche des cellules Plasmide' Ap2 Km2 Tc2 Ap/km2 Ap/Tc2 compétentes pUC19 1,7 x 108 - TFB pBR322 3,8 x 107 - - - 1,2 x 107 pUC4K 1,7 x 108 3,2 x 107 - 1,1 x 107 DH5a pUC19 4,0 x 107 - - - - TB pBR322 5,0 x 106 - - - 3,0 x 106 pUC4K 4,0 x 107 - - 5,0 x 106 pUC19 5,2 x 107 - - TFB pBR322 7,0 x 107 4,0 x 107 - pUC4K 4,0 x 107 1,6 x 107 - - JM109 pUC19 1,0 x 107 TB pBR322 3,2 x 106 - 2,0 x 106 - pUC4K 7,2 x 106 1,0 X 106 - - 1. La quantité des plasmides utilisée était de 10-4 g/transformation. 2. Les concentrations des antibiotiques utilisés pour Ap, Km et Tc étaient de respectivement 40 g/ml, 25 g/ml et 12,5 g/ml. L'EFFET DE LA FORME DE L'OUTIL D'ÉTALEMENT Le rendement de transformation n'a pas été beaucoup affecté par l'utilisation de perles de verre ou d'une anse de verre en tant qu'outil d'étalement (les résultats ne sont pas présentés). Par conséquent, la forme de l'outil d'étalement n'a pas eu d'effet prononcé sur le rendement de transformation. L'APPLICATION PRATIQUE AUX CELLULES COMPÉTENTES YEA (EXEMPLES 23-39) Les cellules compétentes YEA (une souche dérivée de DH5cx qui a été préparée par la méthode TFB) de la Société Yeastern Biotech Co., Ltd. ont été transformées par la méthode de transformation classique (protocole de 2 heures). Le rendement de transformation était de 1 x 108 - 5 x 108 colonies transformées/g de plasmide pour les cellules compétentes YEA. Les cellules compétentes YEA ont également été transformées par le procédé de transformation rapide proposé par la présente invention. Les cellules compétentes YEA stockées dans le congélateur ont été soumises à une décongélation rapide dans un bain d'eau à 25 C pendant environ 5-20 secondes. Lorsque 1/2-1/4 des cellules compétentes sont à l'état décongelé, les ADN plasmidiques ont été ajoutés aux cellules compétentes. Puis, on a mélangé de façon uniforme le plasmide pUC19 et les cellules compétentes en donnant des secousses vives au tube. L'outil d'étalement, les perles de verre, et le milieu sélectif ont été stockés à 4 C. Les étapes restantes sont énumérées dans le Tableau 8. Les résultats expérimentaux présentés dans le Tableau 8 montrent que le temps nécessaire est réduit des 1,5-3,0 heures (Tableau 1) du procédé de transformation classique à moins d'1 minute (Exemples 23 et 29-31 du Tableau 8) du procédé de transformation rapide. Le rendement de transformation indiqué dans le Tableau 8 du procédé de transformation rapide peut atteindre 107 - 109 clones transformés par g de pUC19. Tableau 8 : Rendement de transformation des cellules compétentes YEA Incubation Choc Incubation Cultivées Rendement Exemple du mélange thermique du mélange en de dans un dans un dans un solution transformabain de bain bain de de tion glace d'eau à glace culture (clones (min. ) 42 C (min. ) SOC à transformé/ (sec. ) 37 C sous g de agitation pUC19) (min.) 23 0 0 0 0 8,0 x 107 24 5 0 0 0 4,0 x 107 25 15 0 0 0 5,2 X 107 26 30 0 0 0 1,7 x 108 27 60 0 0 0 9,5 x 107 28 90 0 0 0 9,0 x la 1 29 0 10 0 0 1,4 x 109 30 0 25 0 0 1,7 x 109 31 0 45 0 0 1,6 x 109 32 0 45 30 0 2,4 x 108 33 0 45 60 0 3,2 x 108 34 30 45 0 0 5,8 x 108 35 30 45 30 0 6,0 x 108 36 30 45 30 60 2,3 x 108 37 30 45 60 0 6,4 x 108 38 60 45 0 0 4,2 x 108 39 60 45 30 0 3,2 x 108 Tableau 9 : Applicabilité de la transformation rapide aux diverses souches d'E. coli Rende- Souches Type de Génome Remarques ment de Transformation 107-108 HB101 F-leuB6 proA2 recAl3 thi-1 ara-14 lac Y1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20 supE44 hsdS20 F(80d lacZAM15) A(lacZYA- Un hôte pour pUC et 108-1010 DH5[alpha] argF)U169 supE44 hsdR17 (rk- autres vecteurs de mk+)recA1 gyrA96 endAl thi-1 complémentation a. relAl deoR #- Elle est utile pour le clonage d'ADN Elle est devenue la souche mutante double dam dcm standard. Elle est déficiente F-dam-13::Tn9 dcm-6 hsdR2 pour la recombinaison 107-108 GM2929 recF143 galK2 galT22 ara-14 plasmidique et n'a pas lacY1 xyl-5 thi-1 tonA31 les systèmes de rpsL 136 hisG4 tsx-78 mtl-l restriction Mcr et glnV44 leuB6 rfbD McrA- Hsd. La souche se McrB- transforme bien avec l'ADN plasmidique. Elle est dérivée de GM2163. 108-1010 XL1- recAl endAl gyrA96 thi-1 Blue hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB laclqZA M15 TnlO (Tetr) ] 107-108 TG1 F', thi, A(lac-proAB) , Elle ne modifie pas ou hsdR4 (#5), supE44 ne restreint pas l'ADN (F':traD36, proAB+, laclq, transfecté et supporte lacZ#M15) la croissance de vecteurs portant des mutations ambre. 107-108 BL21 E. coli B F- dcm omp T mutations ambre. hsds (rB-mB-)gal 108-1010 JM109 F'traD36 proA+ proB+ laclq Elle est défectueuse #(lacZ)M15 # (lac-proAB) en synthèse de paroi supE44 hsdRl7 recAl gyrA96 cellulaire. Ce sont thi-1 endAl relA1 el4- A- des colonies mucoïdes et un hôte de transformation. C'est un hôte pour M13 et autres bactériophages ~~~~~~ ~~~~~~~ filamenteux. Des cellules compétentes d'autres souches d'E. coli ont également été préparées par le même procédé que celui par lequel les cellules compétentes YEA ont été préparées et ont également été transformées par le procédé de transformation rapide. Les rendements de transformation (énumérés dans le Tableau 9) , 107 - 1010 colonies transformées/ g de plasmide, atteignent également le standard du commerce, qui est également de 107 - 1010 colonies transformées/ g de plasmide. Le rendement de transformation indiqué dans le Tableau 9 peut être légèrement insuffisant par comparaison avec le niveau supérieur de clonage tel que les bibliothèques génomiques ou les bibliothèques d'ADNc mais il est suffisant pour le clonage général, tel que le sous-clonage ou le clonage TA, pour des expériences de biologie moléculaire. TRANSFORMATION RAPIDE AUTOMATIQUE En plus du temps d'opération court, un autre avantage du procédé de transformation rapide d'E. coli est qu'un seul tube peut être utilisé de l'étape de décongélation à l'étape d'étalement. Par conséquent, un grand nombre de transformations peut être effectué en même temps par le procédé de transformation rapide. Par exemple, 24,96, 384 ou même davantage de transformations peuvent être effectuées dans un dispositif en rangées. De plus, un appareil de transformation automatique peut être utilisé pour conduire le procédé de transformation rapide d'E. coli pour économiser du temps et des coûts en raison du fait que l'on n'a besoin que d'un seul tube dans le procédé de transformation rapide et que l'étape de récupération est omise. L'appareil de transformation automatique comprend, par exemple, une unité de commande de la température, une micropipette, un bras de robot, une unité de chargement de plaques, une unité d'étalement et une unité d'incubation. Une unité de commande de température est utilisée pour commander les différentes températures de différents réservoirs, tels que des blocs de bains secs pour maintenir des récipients contenant les plasmides et/ou les cellules compétentes, ou le milieu sélectif dans les étapes de décongélation, de choc thermique et de choc par le froid. Le récipient peut être par exemple un plaque multi-puits. Le bras de robot est utilisé pour transférer le récipient entre des réservoirs avec différentes températures. Une micropipette telle qu'une micropipette à multi-canaux est utilisée pour introduire par pipettage les ADN plasmidiques dans le récipient et les mélanger. La micropipette est également utilisée pour introduire par pipettage le mélange sur le milieu sélectif. Une unité de chargement de plaques est utilisée pour empiler et fournir les plaques remplies d'un milieu sélectif à environ 0-30 C. L'unité d'étalement est utilisée pour fournir et déplacer, tel que par un secouage horizontal ou orbital, l'outil d'étalement sur le milieu sélectif pour étaler uniformément le mélange sur le milieu sélectif. L'outil d'étalement peut être constitué, par exemple, par des perles de verre de 4 mm. Ensuite, le bras de robot peut retirer l'outil d'étalement sur le milieu sélectif après que l'étape d'étalement ait été effectuée. L'unité d'incubation est utilisée pour fournir une température appropriée telle qu'environ 37 C pour le développement des cellules compétentes sur les milieux sélectifs dans les plaques. Un mode de réalisation préféré est fourni ici. Chaque plaque avec environ 8-10 perles de verre et une plaque de collecte ayant de multiples puits, tels qu'environ 8-384 puits, est préparée. La plaque de collecte peut être, par exemple, une plaque ELISA. Les cellules compétentes stockées à environ -70 C sont ajoutées aux puits avec une quantité d'environ 10-200 /il/puits. La plaque de collecte est placée sur une base de distribution, et environ 0,1-20 fil d'ADN plasmidiques sont ajoutés à chaque puits. Ensuite, les cellules compétentes et les ADN plasmidiques sont complètement mélangés pour former un mélange par agitation dans un dispositif de secouage pendant 2-5 secondes ou pipettage du mélange dans les puits par montée et descente 2-3 fois avec une micropipette à multi-canaux. La plaque de collecte est transférée sur un dispositif de chauffage ou sur un bloc de bain sec par un bras de robot, puis la plaque de collecte est chauffée à environ 42 C pendant environ 0- 180 secondes afin d'effectuer le traitement de choc thermique. Les plaques remplies d'un milieu sélectif sont déplacées d'une unité de chargement de plaques à la base de distribution par le bras de robot. Les cellules transformées sont transférées par pipettage des puits au milieu sélectif par la micropipette à multi-canaux, et des perles de verre sont ajoutées au milieu sélectif par une unité d'étalement. L'unité d'étalement déplace les perles de verre sur le milieu sélectif pour étaler uniformément les cellules transformées sur celui-ci. Ensuite, le bras de robot incline les plaques pour déverser les perles de verre. Ensuite, les plaques sont placées dans une unité d'incubation à environ 37 C pendant 12 - 20 heures pour cultiver les cellules compétentes afin d'obtenir des cellules transformées. En raison de la combinaison de la transformation effectuée dans un dispositif en rangées avec l'appareil automatique, un grand nombre de transformations peut être automatiquement effectuée pour obtenir un grand nombre de diverses cellules transformées en même temps. LARGE GAMME D'APPLICATIONS DANS DES BACTÉRIES TRANSFORMÉES PAR MÉTHODE CHIMIQUE Etant donné que la plupart des cellules compétentes sont préparées par la méthode TFB modifiée telle qu'établie dans le manuel d'opération des Sociétés Stratagene, Invitrogen, Promega et Life Technologies, le procédé de transformation rapide peut être appliqué à la plupart des cellules compétentes du commerce. De plus, le temps d'opération peut être réduit d'environ 1,5-3,0 heures à plusieurs minutes ou à aussi peu que plusieurs secondes sans réduire le rendement de transformation lorsque le procédé de transformation rapide est appliqué. De plus, E. coli est Gram négatif et la préparation de la plupart des cellules compétentes de bactéries Gram négatif ou Gram positif est modifiée à partir de la méthode de transformation d'E. coli (Method In Enzymology 204 : 63-113, Method in Microbiology 21 : Par conséquent, le procédé de transformation rapide peut être appliqué à la transformation de cellules compétentes de bactéries Gram négatif ou Gram positif transformées par traitement chimique. Des exemples peuvent être trouvés dans Methods in Microbiology 21 : 79-128 . Les exemples énumérés comprennent Aerobacter aerogenes, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii, Bacillus brevis, Bacillus subtillus, Erwinia carotovora, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Pseudomonas aureginosa, Pseudomonas phaseolicola, Pseudomonas syringae, Proteus Vulgaris, Rhizobium meliloti, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus lactis, Streptomyces lividans et Xanthomonas campestris. La présente invention propose en outre un appareil de transformation automatique pour un procédé de transformation rapide, comprenant : des moyens de décongélation de cellules compétentes (10) dans un récipient (15) à la température ambiante ou dans un bain d'eau ; des moyens de mélange d'un ADN plasmidique et des cellules compétentes (20) dans le récipient (15) afin de former un mélange ; des moyens de chauffage du mélange (30) dans le récipient (15) pendant environ 0 - 180 secondes afin d'effectuer un choc thermique ; des moyens d'étalement du mélange sur un milieu sélectif (40) d'environ 0 C à 30 C par un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C ; et des moyens de culture du mélange sur le milieu sélectif (50) afin d'obtenir les cellules transformées. Les moyens ci-dessus sont obtenus facilement par des produits du commerce et pourraient être modifiés par l'homme du métier. La présente invention porte également sur les cellules transformées obtenues par les procédés selon l'invention. Il apparaîtra à l'évidence à l'homme du métier que diverses modifications et variantes peuvent être apportées à la structure de la présente invention sans s'écarter du domaine ou de l'esprit de l'invention. Compte tenu de ce qui vient d'être exposé, il est entendu que la présente invention couvre des modifications et des variantes de cette invention à la condition qu'elles tombent dans le domaine de définition des revendications annexées et de leurs équivalents. REVENDICATIONS 1 - Procédé de transformation rapide de cellules compétentes, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations consistant à : - décongeler des cellules compétentes dans un récipient à la température ambiante ou dans un bain d'eau ; - mélanger un ADN plasmidique et les cellules compétentes dans le récipient afin de former un mélange ; - chauffer le mélange dans le conteneur pendant environ 0 - 180 secondes afin d'effectuer un choc thermique ; - étaler le mélange sur un milieu sélectif d'environ 0 C à 30 C par un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C ; et - cultiver le mélange sur le milieu sélectif afin d'obtenir des cellules transformées. 2 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les étapes allant de la décongélation à l'étalement sont conduites dans le même récipient. 3 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'entre les étapes de mélange et de chauffage, il comprend en outre une étape d'incubation du mélange dans un bain de glace pendant environ 0 - 90 minutes. 4 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'entre les étapes de mélange et de chauffage, il comprend en outre une étape d'incubation du mélange dans un bain de glace pendant environ 0 - 30 minutes. 5 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'entre les étapes de chauffage et d'étalement, il comprend en outre une étape d'incubation du mélange dans un bain de glace pendant environ 0 - 60 minutes. 6 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'entre les étapes de chauffage et d'étalement, il comprend en outre une étape d'incubation du mélange dans un bain de glace pendant environ 0 - 30 minutes. 7 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'étape de décongélation est effectuée pendant environ 5 secondes à environ 5 minutes. 8 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'étape de décongélation est effectuée jusqu'à ce qu'environ 1/2 à 1/4 des cellules compétentes soient dans un état décongelé. 9 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ADN plasmidique comprend de l'ADN recombinant. 10 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le choc thermique est effectué à une température d'environ 36-48 C. 11 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le choc thermique est effectué pendant environ 10 - 90 secondes. 12 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la température de l'outil d'étalement est d'environ -20 C à 8 C. 13 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'outil d'étalement comprend des perles de verre ou une anse de verre. 14 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la température du milieu de sélection est d'environ 0-4 C. 15 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu de sélection comprend un milieu auquel on a ajouté un antibiotique. 16 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules compétentes sont préparées à partir de bactéries choisies dans le groupe constitué par Aerobacter aerogenes, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii, Bacillus brevis, Bacillus subtillus, Erwinia carotovora, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Pseudomonas aureginosa, Pseudomonas phaseolicola, Pseudomonas syringae, Proteus Vulgaris, Rhizobium meliloti, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus lactis, Streptomyces lividans et Xanthomonas campestris. 17 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules compétentes sont préparées à partir d'Escherichia coli. 18 - Procédé de transformation rapide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le procédé est effectué dans un dispositif en rangées par un appareil de transformation automatique. 19 - Cellule transformée obtenue par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 18. 20 - Procédé de transformation rapide de cellules compétentes, ledit procédé étant effectué par un appareil de transformation automatique, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations consistant à : décongeler les cellules compétentes dans un récipient maintenu dans un premier réservoir à la température ambiante ; introduire par pipettage un ADN plasmidique dans le récipient pour être mélangé avec les cellules compétentes dans le récipient afin de former un mélange, à l'aide d'une micropipette ; transférer le récipient à l'aide d'un bras de robot dans un second réservoir chauffé par une unité de commande de température pendant environ 0 - 180 secondes, ce par quoi le mélange dans le récipient est soumis à un traitement de choc thermique ; se munir d'une plaque remplie d'un milieu sélectif à environ 0-30 C par une unité de chargement de plaques ; se munir d'un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C sur le milieu sélectif par une unité d'étalement ; déplacer l'outil d'étalement sur le milieu sélectif pour étaler le mélange sur celui-ci par l'unité d'étalement ; et cultiver le mélange sur le milieu sélectif dans une unité d'incubation afin d'obtenir les cellules transformées. 21 - Appareil de transformation automatique pour un procédé de transformation rapide de cellules compétentes, caractérisé par le fait qu'il comprend : - des moyens de décongélation de cellules compétentes (10) dans un récipient (15) à la température ambiante ou dans un bain d'eau ; - des moyens de mélange d'un ADN plasmidique et des cellules compétentes (20) dans le récipient (15) afin de former un mélange ; - des moyens de chauffage du mélange (30) dans le récipient (15) pendant environ 0 - 180 secondes afin d'effectuer un choc thermique ; - des moyens d'étalement du mélange sur un milieu sélectif (40) d'environ 0 C à 30 C par un outil d'étalement d'environ -90 C à 30 C ; et - des moyens de culture du mélange sur le milieu sélectif (50) afin d'obtenir des cellules transformées.