FR 2810337 A1 20011221 FR 0007843 A 20000620 La présente invention concerne le développement de micro-organismes génétiquement modifiés, notamment de levures génétiquement modifiées, pouvant survivre dans un environnement digestif et y exprimer efficacement un ou plusieurs gènes d'intérêt. La forme galénique et le mode d'administration de ces micro-organismes sont également proposés. De plus, l'invention se rapporte à l'utilisation de systèmes digestifs artificiels simulant les fonctions gastro-intestinales de l'homme pour l'étude, le contrôle et la sélection des micro-organismes précités. L'invention porte également sur des applications directes de bioconversion in situ, en particulier dans la mise au point de traitements préventifs ou curatifs de pathologies, notamment de maladies liées au métabolisme des xénobiotiques. Les êtres vivants sont continuellement en contact avec des xénobiotiques, substances dites étrangères aux voies métaboliques normales de la cellule (médicaments, pesticides, polluants, additifs alimentaires, molécules naturelles de plantes...). Ces composés, souvent trop hydrophobes pour être éliminés directement par les reins ou dégradés par la bile, s'accumulent dans les lipides de l'organisme. Les enzymes du métabolisme des xénobiotiques (ou EMX) sont chargées de faciliter leur élimination en les rendant plus hydrophiles. Ces enzymes sont classées en trois catégories : - les enzymes de phase I (phase de fonctionnalisation) : le xénobiotique plus hydrophile par introduction de groupements polaires (le plus souvent par des réactions d'oxydation). Ce sont principalement les monooxygénases à cytochrome P450, hémoprotéines présentant un maximum d'absorption caractéristique aux environs de 450 nm, lorsqu'elles sont réduites et liées au monoxyde de carbone (Omura, 1964, 1993). Chez les mammifères, les P450 se situent majoritairement au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique lisse, principalement dans le foie, mais également dans les poumons et l'intestin, organes jouant un rôle dans le contrôle de l'entrée de nombreux xénobiotiques dans l'organisme. Chaque P450 fait partie d'un complexe multienzymatique où il est associé à deux systèmes de transport d'électrons à flavoprotéine, la NADPH-cytochrome P450 réductase et la NADH-cytochrome b5 réductase. Les P450 fonctionnent selon un cycle catalytique au cours duquel le fer passe par différents degrés d'oxydation, ce qui conduit à l'incorporation d'un atome d'oxygène dans le substrat R selon la réaction suivante (Guengerich, 1993) : RH + O2 + 2e- + 2H+ # ROH + H20 Les P450 possèdent des propriétés catalytiques originales puisque, contrairement à la majorité des enzymes, un P450 donné peut agir sur de nombreux substrats présentant des structures très différentes et, inversement, un même substrat peut être reconnu par différents P450 (Coon et al., 1992). Des facteurs endogènes (espèce, souche...), physiologiques (âge, sexe...), mais également des facteurs exogènes peuvent moduler l'activité des P450 (Guengerich, 1993), en agissant à différents niveaux : expression du gène, stabilisation de la protéine, modulation de l'activité. - les enzymes de phase II (phase de conjugaison) : les métabolites issus de la phase 1 encore plus hydrophiles (s'ils ne sont pas excrétés directement), par conjugaison à des molécules endogènes diverses (glutathion, glucuronide...). Ces enzymes sont présentes dans presque toutes les cellules de l'organisme, les principales étant la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH), l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT), la sulfotransférase, l'époxide hydrolase et la O-acétylase. - les enzymes de phase III (phase d'évacuation) : chargées d'éliminer des cellules les métabolites issus des réactions de détoxication (pompes transporteurs ABC, en particulier les pompes multidrug resistant MDR). Globalement, le métabolisme des xénobiotiques est considéré comme une voie de détoxication. Cependant les enzymes de phase 1 peuvent donner naissance à des métabolites plus réactifs que la molécule initiale, susceptibles de se lier aux protéines (provoquant des nécroses ou des maladies auto-immunes), aux acides nucléiques (responsables de mutagénèse ou de cancérogénèse) ou aux lipides (peroxydation lipidique). C'est le cas notamment lorsque les enzymes de phase II sont absentes ou d'activité trop faible. L'activité des EMX est déterminée génétiquement et hautement variable selon les individus (polymorphisme génétique). L'analyse moléculaire des corrélations existant entre gènes majeurs impliqués dans les processus de détoxication et de biotransformation, et pathologies fait actuellement l'objet de nombreux travaux de recherche. En effet, des anomalies dans les processus de détoxication et de biotransformation des composés exogènes ont clairement été identifiées chez des patients atteints de maladies dites multifactorielles (maladies combinant prédisposition génétique et rôle de facteurs environnementaux), très répandues à ce jour dans le monde, telles que différents cancers, diverses pathologies digestives, endométriose, bronchite chronique... Pour exemple, le risque de cancer des poumons induit par les hydrocarbures aromatiques polycycliques est augmenté d'environ 40 fois lorsque l'individu est déficient en GSTM1 (phénotype GSTM1 0/0) et possède un P450 1A1 à forte activité enzymatique (Raunio et al., 1995). De plus, selon des études épidémiologiques, les populations qui ont le plus grand risque de développer un cancer du côlon sont celles qui possèdent le phénotype métaboliseur rapide pour la NAT2 et le P4501A2 et qui sont exposées à des hauts niveaux d'amines hétérocycliques dans leur alimentation (Lang et al., 1994). Concernant le cancer du sein, des corrélations ont pu également être établies. Les femmes possédant une forme de P450 1A1hautement inductible voient leur risque d'avoir un cancer du sein augmenté. De même, le risque de cancer du sein est augmenté (x4) chez les femmes ménopausées, fumant modérément (présence d'amines aromatiques) et possédant un phénotype lent pour NAT2. Le groupe à risque pour le cancer de la vessie est représenté par les individus déficients en GSTM1 et NAT2 (Brockmoller et al., 1996). Une corrélation positive a été établie entre endométriose et femmes déficientes en GSTM 1, ainsi qu'avec le phénotype métaboliseur lent pour NAT2 (Baranova et al., 1999). L'alimentation est une des principales sources de xénobiotiques impliqués dans les maladies multifactorielles, d'où l'intérêt d'assurer la détoxication de ces xénobiotiques avant qu'ils n'exercent des effets négatifs sur les organes cibles. Ainsi, la présente invention concerne le développement d'un médicament vivant , micro-organismes génétiquement modifiés, et plus particulièrement les levures, exprimant dans l'environnement digestif un ou plusieurs gène(s) d'intérêt(s) permettant de corriger des dysfonctionnements du métabolisme des xénobiotiques, tels que ceux mentionnés ci-dessus. Ce ou ces gènes d'intérêt seront choisis après détermination des corrélations entre patrimoine génétique et présence de pathologie et après évaluation de la prévalence de cette pathologie. Outre la principale application de détoxication, deux autres objectifs de la présente invention sont décrits ci-dessous, à titre d'exemples. Le premier consiste à faire exprimer dans l'environnement digestif par lesdits microorganismes un gène d'intérêt codant pour une enzyme permettant l'activation in situ de pré-substance en substance active. L'administration d'un tel médicament vivant permettant de contrôler la bioconversion de pré-substance en substance active est tout particulièrement intéressante dans le cas où la substance active possède des effets secondaires indésirables et/ou est toxique à partir d'une certaine dose. Parmi ces applications, on peut citer la transformation de provitamines en vitamines. Le second consiste à faire produire dans l'environnement digestif par ces microorganismes un peptide ou un polypeptide actif, en particulier ayant des propriétés antigéniques. La production de tels peptides, en différents points du tractus digestif, aboutit à la mise au point de vaccins vivants permettant de contourner un certain nombre de difficultés rencontrées dans les méthodes classiques d'administration appartenant à l'état de la technique, telles les problèmes de dégradation. Fahl et al (WO 99/27953) ont construit des souches d'E.coli exprimant des enzymes de mammifères (P450 1A1, NADPH-cytochrome P450 réductase et GST) dont les gènes ont été insérés dans un plasmide. Ces constructions modèles sont réalisées dans le but de développer des souches bactériennes chimioprotectrices , en particulier des Lactobacilles, exprimant des enzymes de mammifères impliquées dans la détoxication de procarcinogènes et administrées dans l'environnement digestif afin de supplémenter le système de détoxication des cellules gastro-intestinales. Fahl et al. ne précisent pas la durée de survie des Lactobacilles génétiquement modifiés dans un environnement digestif et s'ils peuvent y exprimer efficacement un gène d'intérêt. Pour répondre à ces questions, nous avons mis en place des systèmes digestifs artificiels qui permettent d'étudier, d'adapter, de contrôler et de sélectionner des micro-organimes qui survivent au moins pendant un temps minimum et qui peuvent exprimer efficacement in situ (c'est-à-dire dans l'environnement digestif) un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt. Bien entendu, la durée de survie dépend des micro-organismes en question et de l'environnement digestif, mais on peut définir dans le cadre de l'invention ce paramètre comme étant supérieur à 6h dans l'estomacintestin grêle et 48H dans le côlon, c'est à dire la durée moyenne du transit dans ces compartiments digestifs chez l'homme. Parmi les micro-organismes préférés de l'invention, on peut citer les levures. En effet, au même titre que les bactéries visées par la demande de brevet précédemment citée, les levures sont des organismes présents dans l'alimentation animale et/ou humaine et des hôtes bien connus de l'environnement digestif. Certaines d'entre elles sont des organismes GRAS ou generally recognized as safe et sont utilisées depuis quelques années comme probiotiques. Leur facilité de production explique leur utilisation à grande échelle dans l'industrie alimentaire, par exemple dans les processus de fabrication de la bière et du pain ou comme additif dans l'alimentation animale et humaine. S cerevisiae est la plus connue et la plus exploitée commercialement. Aujourd'hui, S cerevisiae et S boulardii sont également utilisées dans l'industrie pharmaceutique comme médicaments (carbolevure et ultralevure# respectivement), principalement destinés au traitement des troubles secondaires à l'antibiothérapie tels que diarrhées, colites ou candidoses (Ligny G, 1975). De très nombreuses études réalisées chez l'animal et chez l'homme soulignent à la fois l'innocuité et l'impact positif de ces levures sur l'environnement digestif (antagonisme vis à vis des Candidas par exemple). Comparativement aux bactéries, l'utilisation de levures à des fins de médicaments vivants présente des avantages considérables : - Contrairement aux bactéries, les levures sont des organismes eucaryotes. L'intégration génomique de fragments hétérologues est facilement réalisable (recombinaison homologue hautement efficace) et aboutit à une construction plus stable que celle obtenue par insertion plasmidique, ce qui notamment limite les transferts potentiels du gêne d'intérêt à la flore endogène humaine. De plus, les levures présentent une organisation subcellulaire très voisine de celle des eucaryotes supérieurs et disposent de mécanismes de transport intracellulaire et de processing post-traductionnel indispensables à l'expression fonctionnelle et compartimentée de beaucoup de gènes hétérologues. Pour exemple, il a été montré qu'elles possèdent les critères nécessaires à la synthèse de P450 humains fonctionnels puisqu'un système d'adressage des protéines ("Signal Récognition Particule" ou SRP) permet la translocation du P450 synthétisé vers le réticulum endoplasmique, ce qui aboutit à une localisation intracellulaire et un repliement du P450 corrects (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1997). Les levures possèdent également un environnement membranaire lipidique permettant la stabilité du P450 et des protéines de transfert d'électrons (NADPH- cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) dans la membrane du réticulum endoplasmique, nécessaires à l'activité enzymatique du P450. - Les levures, bien caractérisées au niveau moléculaire (notamment S cerevisiae, entièrement séquencée depuis 1996-Goffeau et al.-), constituent un outil de base pour l'ingénierie génétique et les bioconversions in vitro dans des conditions de fermentation non seulement de laboratoire mais surtout à grande échelle (production industrielle). - Certaines levures telles que S cerevisiae possèdent la capacité de vivre en aérobie et en anaérobie, ce qui permet d'envisager l'utilisation de telles levures à tout niveau du tractus digestif. - D'autres avantages concernant la construction des levures recombinées sont également à souligner. En effet, les levures sont sélectionnées par auxotrophie et non sur la base d'une résistance à un antibiotique, ce qui évite d'être confronté aux problèmes liés à l'administration à l'homme d'organismes génétiquement modifiés possédant un gène de résistance à un antibiotique. De plus, l'insertion génomique du gène d'intérêt est facilitée par la propriété de recombinaison qu'ont certaines levures, dont S cerevisiae (Bellamine, 1996). Des souches de S cerevisiae ont été développées permettant l'expression de trois grands types de gènes intervenant dans les différentes phases du métabolisme des xénobiotiques : des gènes de cytochromes P450 humains (phase I), des gènes d'enzymes "d'environnement de phase I" (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5 par exemple) et des gènes de phase II. De telles souches ont été décrites par Pompon et al. (US 5,635,369 et EP 595 948). Dans le cadre de la présente invention, des souches de S cerevisiae ont été utilisées comme modèles d'étude. Elles expriment d'une part le P450 1A1 humain et la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure ou d'homme (respectivement souches W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl ), d'autre part le P450 73A1 de plante et la NADPHcytochrome P450 réductase de levure (souche W(R)pP73Al). Le P450 1A1 existe dans la majorité des espèces animales, y compris chez l'homme. La forme humaine a été isolée par Jaiswal et al. (1985). Il intervient dans le métabolisme des hydrocarbures aromatiques polycycliques, en particulier dans celui du benzo (a)pyrène, composé présent notamment dans la fumée de cigarettes et les produits de barbecue (Sims et al., 1974 ; Gautier et al., 1996a). Il est difficilement décelable dans le foie sans l'action d'un inducteur mais existe dans de nombreux tissus extra-hépatiques à l'état constitutif. Il est fortement inductible par des composés aromatiques polycycliques tels que le 3-méthylcholanthrène (3-MC), par des composés aromatiques halogénés tels que la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo -dioxine (TCDD) ou par des flavonoïdes comme la (3-naphtoflavone. Le P450 73A1 (activité cinnamate 4-hydroxylase ou CA4H) catalyse la première étape de la voie des phénylpropanoïdes chez les plantes supérieures en transformant l'acide trans-cinnamique en acide p-coumarique. Cette voie constitue le début de la synthèse des flavonoïdes (anti-oxydants). La survie des levures modèles , le maintien de leur activité après passage dans des systèmes digestifs artificiels et leur activité in situ ont été démontrés dans le cadre de la présente invention. De telles capacités de survie et d'activité enzymatique se révèlent être très importantes si l'on veut utiliser des micro-organismes vivants comme médicament. A ce titre, la méthode d'évaluation du devenir des micro-organismes médicaments dans l'environnement digestif humain est également un objet de la présente invention. Comme évoqué précédemment, l'un des principaux problèmes rencontrés dans la mise au point d'un médicament vivant réside dans sa sélection, dans l'évaluation de sa survie, de son activité et de son contrôle, au sein d'un environnement digestif. Pour contourner ces difficultés, la présente invention propose l'utilisation de systèmes digestifs artificiels reproduisant de la manière la plus fiable et la plus dynamique possible l'environnement digestif humain. Avantageux sur le plan technique, ces systèmes permettent le contrôle des principaux paramètres de la digestion et assurent la reproductibilité des conditions expérimentales, facteurs que l'on ne peut pas ou très difficilement maîtriser chez des animaux de laboratoire. De plus, ces systèmes permettent de réaliser des prélèvements à tout niveau du tractus digestif et de s'affranchir de toutes les contraintes d'éthique liées aux expérimentations animales ou humaines (molécules potentiellement toxiques). De tels systèmes donnent également la possibilité d'évaluer l'impact des micro-organismes génétiquement modifiés sur la flore endogène humaine (implantée dans le système digestif artificiel). Ainsi, les systèmes digestifs artificiels permettent de réaliser une sélection de microorganismes génétiquement modifiés, notamment de levures génétiquement modifiées, qui se sont non seulement adaptés à l'environnement digestif mais qui conservent une bonne capacité à exprimer un gène hétérologue d'intérêt. Tout système digestif artificiel reprenant les caractéristiques essentielles du système digestif humain peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Divers systèmes in vitro très simples (compartiments digestifs individualisés) ont été décrits. Leur utilisation est cependant limitée par la fragmentation des compartiments digestifs et l'absence de dynamisme. Il est donc avantageux d'utiliser le système digestif artificiel complet décrit dans WO 94/09895. Un autre avantage de la présente invention provient de la formulation spécifique du médicament vivant de sorte à protéger les micro-organismes et à cibler spécifiquement une action dans telle ou telle partie du système digestif. Les micro-organismes, et plus particulièrement les levures, devant être actifs au niveau du tractus gastro-intestinal, la voie d'administration est la voie orale ou rectale. Les micro-organismes recombinés doivent être administrés sous une forme galénique permettant à la fois de les véhiculer jusqu'à leur lieu d'action, de les maintenir dans un état actif et de les protéger de l'environnement extérieur. Les artifices ou procédés galéniques utilisés pour atteindre ces objectifs sont différents selon la sensibilité des micro-organismes à l'environnement digestif et selon les lieux où ils auront à réaliser leur activité (niveau du tractus gastro-intestinal). Parmi les procédés galéniques utilisés, on peut citer : la lyophilisation des micro-organismes et de leur milieu nutritif, l'encapsulation des micro-organismes ou l'enrobage du système galénique les renfermant à l'aide de polymères sensibles au pH ou possédant des propriétés mucoadhésives, le mélange avec des polymères présentant des propriétés muco-adhésives, la compression des micro-organismes en présence d'excipients possédant des propriétés muco-adhésives, leur incorporation dans des gels hydrophiles ou lipophiles. Les systèmes galéniques qui en résultent sont des formes monolithiques de type comprimés monocouche ou multicouches, de type capsule de gélatine (dure ou molle) ou des formes multiparticulaires de type microgranules ou microcapsules. Ces formes permettent une libération normale ou différée des micro-organismes au sein du tractus digestif. DESCRIPTION Micro organismes Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention se rapporte à des microorganismes comportant au moins un fragment d'ADN hétérologue comprenant un ou plusieurs gènes d'intérêt capables de s'exprimer dans l'environnement digestif. Avantageusement, lesdits micro-organismes sont également caractérisés en ce qu'ils peuvent survivre dans l'environnement digestif pendant au moins 6h, 10h, 12h ou 24h dans l'estomac et l'intestin grêle et/ou au moins 12h, 24h, 60h ou 72h dans le côlon. En effet, dans les systèmes digestifs artificiels décrits ci-après, on obtient des microorganismes dont le taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, de préférence 80% en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon. Ces mesures peuvent être aisément effectuées par dénombrement à partir d'échantillons facilement prélevables dans les systèmes digestifs artificiels, à tout moment de la digestion ou de la fermentation. Dans le cadre de l'invention, on choisit des levures, de préférence des levures sélectionnées parmi Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Schizosaccharomyces pombe et Klevuromyces lactis. On peut également choisir des bactéries telles que les lactobacillus décrites dans Fahl et al (WO 99/27953). Gènes d'intérêt On entend par gènes d'intérêt des gènes codant pour des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal (tel l'insuline), des peptides à intérêt thérapeutique (comme les anti-protéases, les facteurs de coagulation), des peptides à effet antibiotique, des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules, des enzymes ou tous peptides possédant des activités de bioconversion ou de biosynthèse, notamment des enzymes de détoxication. Dans le sens de l'invention, les termes polypeptides, peptides ou protéines pourront être employés indifféremment les uns des autres et ne constituent en aucun cas une limitation à une taille donnée. Les gènes d'intérêt seront choisis de préférence parmi les enzymes du métabolisme des xénobiotiques, à savoir des enzymes de phase 1 (P450 1A1, 1A2, 1B1, 2B6,2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 et 73A1), des enzymes d'environnement de phase 1 (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5), des enzymes de phase II telles que la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH), l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT), la sulfotransférase, l'epoxide hydrolase et la O-acétylase et des enzymes de phase III (pompes transporteurs ABC, en particulier les pompes multidrug resistant MDR). La glutathion S-transférase est une superfamille de gènes composée de 4 principales classes : alpha (GSTZ), mu (GSTM), pi (GSTP) et teta (GSTT). Ces enzymes jouent un rôle essentiel dans la résistance cellulaire contre la peroxidation lipidique, les dommages de l'ADN et l'alkylation des protéines causés par des espèces chimiques électrophiles. Elles catalysent la liaison de nombreux xénobiotiques électrophiles au glutathion et sont impliquées dans la détoxication des radicaux oxygénés. Les différentes classes de GST sont présentes en grandes quantités dans de nombreux tissus, avec une certaine spécificité de tissus selon la classe considérée. Les gènes codant pour ces différentes enzymes ont été localisés sur les chromosomes humains. Différents polymorphismes ont été mis en évidence, notamment concernant le gène codant pour la GSTM 1. En effet, trois allèles différents de GSTM1ont été identifiés: les allèles GSTM 1 A et GSTM 1 B codent pour des enzymes d'activité similaire alors que l'allèle GSTM10 code pour une enzyme non fonctionnelle. Dans la plupart des populations étudiées au niveau mondial, 35% à 50% des sujets sont homozygotes pour l'allèle GSTM10 et sont donc dépourvus de l'activité enzymatique correspondante. A cause de cette défaillance de leur système de détoxication, les individus de génotype GSTM10/0 sont considérés comme des individus à risque lorsqu'ils sont exposés à des niveaux élevés de cancérigènes et de produits chimiques toxiques. En effet, la déficience en GSTM1 est associée avec une augmentation du risque du cancer (principalement cancers des poumons et de la vessie) et de certaines maladies chroniques (endométriose, bronchite chronique...). Deux N-acétyltransférases (NAT1 et NAT2) ont été identifiées, catalysant des réactions de N-acétylation d'arylamines, ainsi que d'autres réactions de détoxication. Elles sont également impliquées dans le métabolisme de médicaments tels que les sulphonamides et dans les interactions médicamenteuses. Les variations existant dans l'activité des NAT correspondent à leur capacité à transférer l'acétate de l'acétyl coenzyme A au substrat. Seul le gène de NAT2 présente un polymorphisme permettant la différenciation entre acétylateur lent (SA) et acétylateur rapide (RA). Les études disponibles suggèrent que l'acétylation lente est plus un facteur de risque que l'acétylation rapide. En effet, le phénotype SA est considéré comme un facteur de risque pour le cancer de la vessie. De plus, les femmes ménopausées avec le phénotype SA ont 4 fois plus de risque de développer le cancer du sein que les femmes avec le phénotype RA. Construction de micro-organismes recombinés : par exemple les levures Des souches de S. cerevisiae ont été développées permettant l'expression de trois grands types de gènes intervenant dans les différentes phases du métabolisme des xénobiotiques. Dans ce cadre, une série de cassettes d'expression pour des gènes de mammifères (homme, souris, lapin) ou de plantes (topinambour par exemple) a été réalisée, cassettes portées par des vecteurs multi-copies autonomes ou intégrées dans l'ADN chromosomique des levures. Pour exemple, les P450 humains exprimés dans les levures sont les isoenzymes 1A1, 1A2, 2B6,2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 19A. Parallèlement, ont été développées des coexpressions de gènes de phase 1, d' environnement de phase I (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5 par exemple) et de phase II. L'efficacité de ces constructions a été démontrée. Pour exemple, les trois étapes de biotransformation du benzo (a)pyrène le P450 1A1, la NADPH-cytochrome P450 réductase et l'époxide hydrolase ont été reproduites chez la levure S cerevisiae : l'analyse des produits d'incubation du benzo(a)pyrène avec ces levures recombinées montre la formation de l'ensemble des métabolites attendus (Gautier et al., 1996b). De tels systèmes peuvent être utilisés comme modèle pour l'étude de certains aspects du métabolisme humain, comme aide à l'analyse de la toxicité des polluants et surtout comme outil de bioconversion. Il est possible, après conception de marqueurs de sélection et de contrôle de viabilité de types tout à fait originaux, de démontrer et contrôler la survie, et lorsque nécessaire la mort et l'élimination, de levures recombinantes fonctionnelles dans l'environnement digestif humain. Il est possible d'identifier et de créer par ingénierie moléculaire des structures de contrôle des gènes hétérologues (séquences promotrices en particulier), permettant une activité adaptée et modulable dans l'environnement digestif humain. A des fins d'expression du gène d'intérêt, on peut utiliser des promoteurs constitutifs ou inductibles, des promoteurs forts, des promoteurs actifs spécifiquement dans un segment du tractus digestif en conditions d'aérobie, de semi anaérobie ou d'anaérobie, des promoteurs régulables par une molécule introduite dans le milieu intestinal. Il est possible de développer une technologie d'ingénierie génétique respectant les critères indispensables pour une utilisation in vivo chez l'homme, en particulier l'absence de vecteurs mobilisables, l'absence de marqueurs de résistance aux antibiotiques, une stabilité génétique conditionnelle des fonctions hétérologues permettant leur destruction par un facteur chimique externe si nécessaire (interruption du traitement par exemple). Le fragment d'ADN hétérologue peut posséder en outre un marqueur génétique permettant la sélection ou la contre sélection ou un code bar génétique. Etude et sélection de micro-organismes recombinants par utilisation de systèmes digestifs artificiels Dans un second aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'étude, de contrôle, d'adaptation et/ou de sélection des micro-organismes recombinés décrits ci-dessus au moyen d'un système digestif artificiel. Par système digestif artificiel, on entend tout dispositif reprenant les caractéristiques essentielles du système digestif humain. On peut définir le système de digestion artificiel comme un dispositif réactionnel décrit dans WO 94/09895. Ce système est le modèle le plus complet au niveau mondial à l'heure actuelle. En effet, il possède l'ensemble des compartiments du système digestif (estomac, duodénum, jéjunum, iléon et côlon, figures 1 et 2 ci-après) et reproduit le plus fidèlement possible l'environnement digestif de l'homme ou de l'animal monogastrique. Il prend en compte les paramètres essentiels de la digestion tels que les mouvements péristaltiques, les variations de pH au niveau gastrique et intestinal, la vidange gastrique et le temps de transit intestinal, les sécrétions gastriques, biliaires et pancréatiques, l'absorption des produits de digestion et de fermentation, l'absorption de l'eau, la microflore fécale (Minekus et al., 1995 et 1999). Un pilotage informatique du système permet un contrôle des paramètres en continu. Ce système permet de mimer différentes situations, aussi bien physiologiques que pathologiques. Il présente nombre d'avantages en terme de reproductibilité, contrôle des conditions expérimentales (difficiles à maîtriser chez les animaux de laboratoire), standardisation, fiabilité, rapidité, possibilité de collecter des échantillons à tout niveau du tractus digestif, tout en limitant grand nombre de contraintes techniques et de problèmes d'acceptabilité (impossibilité de réaliser des expériences avec des molécules potentiellement toxiques chez l'homme). Concrètement, chaque compartiment est formé d'unités de verre contenant des parois internes flexibles. Un passage d'eau entre les parois flexibles et celles de verre permet de maintenir une température constante de 37 C et de mimer les mouvements péristaltiques (grâce à des variations de pression de l'eau). Les différents compartiments sont reliés entre eux par des valves péristaltiques, dont l'ouverture est pilotée par ordinateur (envoi ou non d'azote). Le passage du chyme d'un compartiment à un autre est contrôlé par la quantité de nourriture présente dans chaque compartiment (présence de capteurs de niveau). Une formule exponentielle est utilisée pour modéliser la vidange gastrique et iléale (Minekus et al., 1995) : f = 1-2-(t/t1/2)B; où f représente la fraction de repas délivrée, t1/2 le demi-temps de libération du repas, t le temps de libération du repas et B un paramètre décrivant l'allure de la courbe). Le volume du contenu digestif est enregistré continuellement par un capteur de pression et maintenu constant par absorption d'eau au travers de fibres de dialyse grâce à une pompe. L'estomac (TIMI) On choisit la quantité de nourriture à introduire dans l'estomac artificiel et la durée de la digestion (Minekus et al., 1995). La pepsine est délivrée en continu grâce à une pompe. Le pH est continuellement réajusté avec de l'HC1 ou de l'eau, de façon à suivre une courbe prédéterminée, établie selon des données in vivo. L'intestin grêle (TIMI) On programme l'intestin grêle artificiel pour simuler un temps de transit le plus proche possible de celui observé in vivo. Le pH est maintenu à des valeurs les plus physiologiques possibles par du NaHC03 (6,5 au niveau du duodénum, 6,8 au niveau du jéjumum et 7,2 au niveau de l'iléon). Au niveau du duodénum, des pompes apportent les enzymes pancréatiques (mélange de pré-enzymes qui seront activées par la trypsine) et les acides biliaires. L'absorption de l'eau et des produits de digestion est réalisée grâce à un système de dialyse fonctionnant avec des unités de fibres creuses, connectées au niveau du jéjunum et de l'iléon. Le côlon (TIM2) Dans sa forme de base, le côlon artificiel est constitué d'une boucle où circule cycliquement une flore fécale préalablement installée. Il a été vérifié que la composition et l'activité fermentaire de cette microflore fécale, issue de selles de donneurs volontaires et implantée dans le système digestif, étaient bien représentatives de celles de la flore colique humaine et que cette flore se maintenait stable et fonctionnelle au cours du temps (Minekus et al., 1999). Un flux d'azote permet de maintenir le système en anaérobie, condition contrôlée par un indicateur (solution de résazurine). Le milieu nutritionnel est stocké dans une unité de verre maintenue à 4 C où un influx d'azote permet son mélange permanent en anaérobie. Un ensemble de fibres de dialyse traversant tout le colon permet de mimer l'absorption de l'eau et des nutriments. Le pH est maintenu constant et ajusté à la valeur de 6,5 par une solution de NaOH (au lieu du bicarbonate in vivo). La production totale de gaz (comme le H2, le CO2 et le CH4) peut être déterminée par mesure de la quantité d'eau déplacée dans une bouteille de Mariotte. Les différents gaz, ainsi que les acides gras volatils produits (acétate, butyrate et propionate principalement), peuvent être analysés qualitativement et quantitativement par chromatographie en phase gazeuse. Dans une forme plus élaborée, le côlon artificiel est constitué de trois sous-unités simulant les trois parties, proximale, transverse et distale où siègent des activités fermentaires différentes (associées à des pH différents). Bien entendu, tout ou partie des systèmes digestifs artificiels précités peut être mise en #uvre dans le cadre de l'invention. Ainsi, l'invention a trait à un procédé d'étude et de contrôle de micro-organismes comprenant les étapes consistant à : a) ajouter les micro-organismes selon l'invention dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système tel que défini ci-dessus, c) incuber et procéder à un dénombrement des micro-organismes recombinés et/ou à un test de l'activité du ou des gènes d'intérêt après passage dans les systèmes digestifs ou in situ. Par exemple, cette étape peut comprendre un test PCR. Dans un autre mode de réalisation, le procédé peut comprendre les étapes consistant à : a) ajouter les micro-organismes selon l'invention dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système tel que défini ci-dessus, c) incuber et récupérer les micro-organismes survivants après passage dans le TIM 1 et/ou TIM2 ; - répéter éventuellement les étapes a) à c) jusqu'à l'obtention d'une population homogène de micro-organismes adaptés à l'environnement digestif et capables d'exprimer efficacement le ou les gènes d'intérêt. L'invention se rapporte également à des micro-organismes susceptibles d'être obtenus par le procédé évoqué ci-dessus. Ces micro-organismes peuvent se caractériser en ce que leur taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75% de préférence 80% en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon. De préférence, il s'agit de levures. La survie des micro-organismes peut être appréciée par dénombrement. La présence du ou des gènes d'intérêt peut être mise en évidence par techniques moléculaires (pour exemple Polymerase Chain Reaction). L'expression du ou des gènes d'intérêt peut être estimée par les techniques biochimiques telles que l'électrophorèse mono ou bidimentionnelle ou le Western Blot. L'activité des produits d'expression du ou des gènes d'intérêt est appréciée par des techniques spécifiques (pour exemple dosage d'activité enzymatique). Méthode d'administration des micro-organismes Des savoir-faire dans le domaine de la galénique et de la biopharmacie permettant d'optimiser l'administration des principes actifs par voie orale ont été développés. L'efficacité d'un médicament est conditionnée par sa biodisponibilité, c'est à dire la proportion de principe actif arrivant au niveau de la circulation générale, et selon quelle cinétique. L'un des buts de la formulation galénique est donc de réaliser une forme optimisée la mieux adaptée au traitement d'une maladie ou d'un syndrome déterminés, c'est à dire une forme présentant une administration aisée pour le patient et une bonne disponibilité. Pour les principes actifs classiques (origine et nature chimique définies), la voie orale constitue une des voies d'apport privilégiée, par son administration commode et son faible coût. Les principes actifs ainsi administrés pourront être absorbés tout au long du tractus gastro-intestinal. Ils subiront éventuellement à ce niveau différentes biodégradations sous l'action des enzymes, des sucs digestifs et des variations de pH. La fraction absorbée au niveau du tractus digestif pourra atteindre le site d'action après passage par le foie et métabolisation éventuelle. Contrairement, dans le cas des micro-organismes, ceux-ci ne seront pas absorbés par la muqueuse intestinale mais séjourneront au niveau du tractus un temps plus ou moins long afin d'exercer leur action au niveau de la cible définie. La forme galénique contenant les micro-organismes est une forme permettant de les amener intacts au niveau de la cible et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps défini plus ou moins long. Dans ces conditions, les techniques utilisées avec les principes actifs classiques pour assurer une libération prolongée s'appliquent aux micro-organismes après adaptation de la technologie et des paramètres opératoires. Toutes les précisions supplémentaires concernant ces formes galéniques sont disponibles dans EP 904021995 (formes galéniques améliorant la biodisponibilté), EP0542824 (formes muco-adhésives) et FR 9806958 (gel huileux et bigels). Ces différentes techniques ou procédés, ainsi que tout autre procédé de l'état de la technique d'enrobage et d'encapsulation, peuvent être appliqués aux micro-organismes de l'invention. Pour les substances sensibles à l'humidité atmosphérique ou celles sensibles à l'oxydation par l'oxygène de l'air ambiant, la protection est nécessaire pour la préparation des formes galéniques (gélules, comprimés) afin de garantir leur conservation et maintenir leur activité thérapeutique. L'enrobage permet par dépôt direct d'agent protecteur (résine, polymère) de protéger le principe actif. Dans le cas des micro-organismes, en particulier les levures, selon l'invention, l'enrobage a pour but de les isoler du milieu extérieur hostile afin de les protéger des agressions des enzymes, du pH et des sucs présents au niveau digestif. Le résultat de l'enrobage est l'obtention d'une sphère ou microsphère dont le diamètre est directement proportionnel à la quantité de produit d'enrobage utilisé et à la taille du produit à enrober à l'origine. Les paramètres opératoires, le matériel technique et les adjuvants utilisés pour réaliser cet enrobage sont des facteurs importants pour l'obtention de microsphères présentant des caractéristiques définies. L'enrobage est soit un polymère sensible au pH et se solubilisant à un pH donné du tractus gastro intestinal, soit un polymère englobant les éléments nutritifs nécessaires à la survie des micro-organismes, soit un produit mucoadhésif facilitant la mucoadhésion des micro-organismes au niveau du tractus gastro-intestinal, soit une association de ces différents composés. Le résultat obtenu est constitué de microsphères qui sont ensuite conditionnées en capsules dures ou molles. Ainsi, un autre aspect de l'invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant les micro-organismes définis ci-dessus se trouvant avantageusement sous une forme galénique adaptée à une administration orale ou rectale de sorte à les acheminer intacts au niveau du site cible du tractus digestif et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps donné. Dans cette composition pharmaceutique, les micro-organismes, en particulier les levures, peuvent être protégés par une composition associée ou recouverte par un enrobage et/ou une membrane du type résine et/ou de type polymère formant des sphères, microsphères, granules ou microgranules. De préférence, la composition se trouve sous la forme de gélules, de comprimés, ou de dragées. L'invention vise également un produit de combinaison comprenant les microorganismes décrits ci-dessus et une substance active ou un précurseur d'une substance active pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Ce produit se caractérise de préférence en ce que lesdit micro-organismes interagissent avec la substance active ou le précurseur. La substance active est destinée à favoriser l'action des micro-organismes recombinés (par exemple, il peut s'agir d'une substance favorisant la survie, la croissance ou l'activité des microorganismes) ou, à l'inverse, les micro-organismes agissent sur la substance active ou sur le précurseur. Conclusion Un autre aspect de l'invention se rapporte à l'utilisation de micro-organismes selon l'invention pour la préparation d'un médicament tel que des agents de détoxication, des agents de correction métabolique, des agents capables de modifier la flore intestinale, des agents capables d'augmenter la biodisponibilité d'une substance active ou de son précurseur et pour la préparation d'un médicament capable de fournir in situ des peptides actifs, des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal, des peptides à intérêt thérapeutique, des peptides à effet antibiotique ou des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules. Légendes Figures 1 et 2 : schématiques des systèmes digestifs artificiels. Figure 1 (estomac et intestin grêle artificiels ou TIM 1) Figure 2 (côlon artificiel ou TIM 2) Figure 3 : constructions génomiques et plasmidiques pour l'expression du gène du P450 1A1 humain et de la NADPH-cytochrome P450 réductase humaine (A) ou de levure (B) et pour l'expression du gène du P450 73A1 de topinambour et de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure (C). A- La souche obtenue est appelée W(hR)pHlAl. B- La souche obtenue est appelée W(R)pH1A1. C- La souche obtenue est appelée W(R)pP73A1. URA 3 : sauvage de l'orotate décarboxylase ; ADE 2 : gène sauvage de l'aminoimidazole ribonucléotide carboxylase ; ura 3 : muté de l'orotate décarboxylase ; Y red : P450 réductase de levure ; H red : P450 réductase humaine ; PGK phosphoglycérate kinase ; Y red ORF : séquence codante de la P450 réductase de levure ; H red ORF : séquence codante de la P450 réductase humaine ;H 1A1 ORF : séquence codante du P450 1A1 humain ; P 73A1 ORF : séquence codante du P450 73A1 de topinambour ; pro : promoteur ; ter : terminateur. Figure 4 : cinétique de libération des levures recombinantes W(hR)pHIAl et W(R)pHlAl en sortie d'iléon. Les résultats obtenus au cours de trois digestions dans le TIM1 sont présentés digestion par digestion (A) et moyennés (B). Les résultats sont exprimés en taux cumulés de levures survivantes retrouvées en sortie d'iléon par rapport au nombre de levures ingérées. Soit, pour chaque prélèvement (t = 120, t = 240 et t = 360 min) correspondant à un intervalle de temps de collecte des digestats (0-120 min, 120-240 min et 240-360 min), le nombre total de levures est énuméré et exprimé en pourcentage du nombre total de levures ingérées. Ces pourcentages sont ensuite cumulés au cours du temps. Le facteur de dilution dû au volume des sécrétions digestives est pris en compte dans les calculs. Figure 5 : suivi des levures recombinantes W(hR)pHlAl et W(R)pHlAl dans le côlon artificiel. Différents prélèvements ont été effectués afin de pouvoir réaliser un suivi des levures dans le TIM 2 : - à t = 0, on énumère le nombre de cellules par ml de suspension de levures recombinantes, avant introduction dans le côlon, - à t = Ofec : on énumère le nombre de cellules de levures endogènes par ml de contenu colique, avant ensemencement du côlon, - à t = 1, t = 12, t = 24, t = 36, t = 48 et t = 60h : on énumère le nombre de cellules de levures (recombinantes et endogènes) par ml de contenu colique prélevé dans le côlon. Les résultats obtenus sont exprimés en nombre de cellules par ml (échelle logarithmique) en prenant en compte le facteur de dilution dû au volume du contenu colique. Figure 6 : résultats des PCR réalisées sur les souches W(R)pHlAl et W(hR)pH1A1 avant passage dans les systèmes digestifs (A), à la sortie de l'intestin grêle (B) et du côlon (C) A : avant passage dans les systèmes digestifs (t =0min) B : à la sortie de l'intestin grêle (t = 120 min) C : à la sortie du côlon (t = 12h) Amorces (cf. Figure 3) 6+7' 3+4 1+7 1+8 5+2' 3+4 1+2 1+8 3+4 3+4 Taille des fragments (pb) 593 650 351 459 461 650 338 459 0 650 Souche W(R)pH1A1 W(hR)pH1A1 T 0 T = Témoin Figure 7 : cinétique de transformation de l'acide trans-cinnamique en acide pcoumarique dans les différents compartiments digestifs du TIM1, sous l'action de W(R)pP73Al. 7A : estomac ; 7B : duodénum ; 7C :jéjunum ; 7D : iléon. Les figures 7 représentent le rapport du nombre de mol d'acide p-coumarique sur le nombre de mol d'acide trans-cinnamique, présentes dans les différents compartiments du TIM 1 (estomac, duodénum, jéjunum et iléon) au cours de la digestion. Les temps de prélèvement sont indiqués à l'exemple 5 ci-après. Exemple 1 : La levure Saccharomyces cerevisiae comme système d'expression des P450 humains. S. cerevisiae a été le premier système utilisé pour l'expression d'un P450 de rat (Oeda et al., 1985). Depuis, elle a été largement utilisée comme système d'expression hétérologue dans de nombreux laboratoires. En particulier, l'équipe du Dr Denis Pompon l'a choisie comme modèle d'étude pour l'expression de P450 humains (isoenzymes 1A1, 1 A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3 A4, 3A5, 19A). Utiliser les levures comme hôte pour l'expression hétérologue de P450 présente de nombreux avantages. En effet, les levures possèdent les critères nécessaires à la synthèse de P450 humains fonctionnels (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1997). Elles présentent l'architecture intracellulaire et la majorité des modifications posttraductionnelles des cellules eucaryotes, ainsi qu'un système d'adressage des protéines ("Signal Récognition Particule" ou SRP) permettant la translocation du P450 synthétisé vers le réticulum endoplasmique, ce qui aboutit à une localisation intracellulaire et un repliement du P450 corrects. Les levures possèdent également un environnement membranaire lipidique permettant la stabilité du P450 et des protéines de transfert d'électrons (NADPH- cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) dans la membrane du réticulum endoplasmique, nécessaires à l'activité enzymatique du P450. L'introduction dans les levures de cassettes d'expression peut être menée de deux manières : sur plasmide ou par intégration génomique. En outre, les levures permettent de coexprimer de façon stable plusieurs ADN complémentaire (ADNc) différents et les techniques mises en oeuvre sont de faible coût et sans risque. La levure S.cerevisiae permet la caractérisation d'activités monooxygénases humaines (Urban et al., 1994a ; Gautier, 1994), à savoir : - l'étude de la spécificité de substrat dans un contexte exempt d'activité monooxygénase contaminante (S cerevisiae contient des P450 endogènes faiblement exprimés dont l'activité ne risque pas d'interférer avec celle du P450 humain), - l'étude de la diversité génétique et du polymorphisme enzymatique (possibilité d'exprimer des formes de P450 peu abondantes), - l'étude de la relation structure/ fonction par mutagénèse dirigée et par fabrication de protéines de fusion (recherche des acides aminés impliqués dans un aspect particulier de la fonction du P450 humain). Malgré les avantages précédemment énumérés, l'utilisation des levures comme système d'expression hétérologue (Urban et al., 1994a; Pompon et al., 1996) présente quelques limites : - les fractions subcellulaires sont difficiles à préparer à cause de la paroi très résistante des levures, - le niveau de la NADPH-cytochrome P450 réductase endogène est faible, ce qui limite l'activité du P450 exprimé, - les enzymes NADPH-cytochrome P450 réductases de levure et d'homme présentent une faible similarité de séquences (33%), ce qui diminue l'efficacité de couplage entre les P450 humains et la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure, - la production de P450 humains (entre 50 et 500 pmol de P450 par mg de protéines microsomales) est plus faible que chez la bactérie E coli (de l'ordre du nmol/mg) mais cet inconvénient est largement compensé du fait que, contrairement à la bactérie, les levures produisent des P450 fonctionnels. Afin de pallier au mieux à certaines de ces limites (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1995) différents systèmes d'expression ont été développés : - Les systèmes de première génération : de l'expression du P450 humain. Une cassette d'expression, insérée dans un plasmide, permet la production d'un P450 humain. Pour obtenir un niveau d'expression suffisant, les séquences 5' et 3' non codantes de l'ADNc ont été délétées avant insertion dans les levures. De plus, le promoteur fort GAL10-CYC1 (totalement réprimé par le glucose mais fortement inductible par le galactose) a été introduit dans le but de séparer la phase de croissance exponentielle, requise pour constituer la biomasse, de la phase d'expression. - Les systèmes de deuxième génération : de l'activité spécifique du P450 humain. Plusieurs types de modifications génomiques ont été réalisées pour augmenter l'activité spécifique du P450 de 10 à 100 fois celle obtenue avec les systèmes de première génération : - la construction d'une protéine de fusion entre le P450 humain et la NADPHcytochrome P450 réductase de levure, - la surexpression de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure, mise sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1, - la coexpression du cytochrome b5 humain et du P450 humain. La coexpression d'enzymes de phase II (comme l'époxide hydrolase) et du P450 humain a également permis de simuler des couplages métaboliques entre les enzymes de phase 1 et de phase II (Gautier et al., 1993). - Les systèmes de troisième génération : "humanisation" de l'environnement redox. Au niveau du génome, la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été remplacée par une réductase humaine, ce qui a provoqué une forte augmentation de l'activité spécifique du P450 humain x10 à 500 par rapport aux systèmes de première génération. Exemple 2: Obtention des souches de levures recombinantes W(hR)pHlAl, W(R)pHlAl et W(R)pP73Al La souche de S cerevisiae W(hR)pHlAl (figure 3A) dérive de la souche W (hR). deux souches W(R)pHlAl (figure 3B) et W(R)pP73Al (figure 3C) dérivent de la souche W(R). La construction des souches W (R) W (hR) été respectivement décrites par Truan et al. (1993) et Urban et al. (1993). Des modifications génomiques ont ainsi permis la construction des souches W (R) W (hR) partir de la souche de laboratoire W3031 B (signe sexuel MAT a), qui possède des mutations sur certains gènes (leu 2, his 3, trp 1, ura 3, ade 2), permettant ainsi sa sélection par auxotrophie. Souche W (R) : phase ouverte de lecture de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure (2072 pb) a été surexprimée par insertion du promoteur fort GAL10-CYC1 (480 pb) à la place du promoteur de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure. Le terminateur du gène de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été conservé. Souche W (hR) : phase ouverte de lecture de la NADPH-cytochrome P450 réductase humaine (2034 pb) a été insérée dans le génome de la levure à la place de celle de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure et placée sous le contrôle du promoteur fort GAL10-CYC1. Le terminateur du gène de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été conservé. Les deux souches W(hR)pHlAlet W(R)pHlAlrésultent respectivement de la transformation de W (hR) W (R) avecle plasmide pi Al. Le plasmide pi Al (Voir figure 3) résulte de l'insertion dans le plasmide pV60 de la séquence codant pour le P450 1A1 humain (1539 pb), placée entre le promoteur fort GAL10-CYC1 et le terminateur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK). Il contient le gène codant pour la ss-lactamase qui confère la résistance à l'ampicilline chez E coli. Ce plasmide peut se maintenir dans les levures grâce aux marqueurs d'auxotrophie URA 3 et ADE 2 qui complémentent les gènes correspondant déficients dans le génome des levures. L'addition du marqueur d'auxotrophie ADE 2 permet une meilleure stabilité du vecteur lorsque les levures transformées sont cultivées dans un milieu de culture devenant spontanément limitant en adénine à haute densité cellulaire. Le plasmide peut se multiplier dans les bactéries grâce à une origine de réplication d'E coli et dans les levures grâce à un fragment de l'origine de réplication du plasmide 2 . Transformation des deux souches W (hR) W (R) avecle plasmide p1A1 Le protocole de transformation des levures, adapté de Gietz et al. (1992), nécessite dans un premier temps de rendre les levures compétentes. A cet effet, les souches W (R) et W (hR) mises en culture dans du milieu YPGA (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et adénine 20 mg/1) jusqu'à atteindre une DO600nm entre 0,5 et 2. Après centrifugation (6000 g, 3 min, 20 C), le culot cellulaire est lavé deux fois avec 25 ml d'eau distillée stérile, puis une fois avec 2 ml de tampon Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, acétate de lithium 0,1 M. Le culot cellulaire est repris dans 1 ml de ce même tampon. Ensuite, afin de procéder à la transformation des levures, sont mélangés l'aliquot du vecteur transformant p1A1, 50 g d'ADN dénaturé de sperme de saumon, 100 (il des levures compétentes et 300 l d'une solution de PEG-4000 à 40% dans le tampon Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, acétate de lithium 0,1M. Le mélange est incubé 30 min à 28 C puis 15 min à 42 C. Après centrifugation (11000 g, 3 min, 20 C), le culot cellulaire est repris dans 100 l de liquide de Ringer. Les 100 l sont étalés sur du milieu SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids 1 g/1, tryptophane 20 mg/1 et agar 20g/l). Les boîtes sont incubées 2 à 3 jours à 30 C. De la même façon, la souche W(R)pP73Al résulte de la transformation de la souche W (R) avec le plasmide pV60 dans lequel le gène de la cinnamate 4-hydroxylase de topinambour ou P450 73A1 (plasmide appelé p73Al - cf. Figure 3) a été inséré (Urban et al., 1994b). Exemple 3 : Exemple de protocole de digestion dans les systèmes digestifs TIM1 et TIM2 (protocole modifié de WO 94/09895) A Digestion dans l'estomac et l'intestin grêle artificiels ou TIM 1 (voir figure 1) Le temps de digestion est programmé, selon le cas, à 240 ou à 360 minutes. Solutions utilisées pendant la digestion Différentes solutions simulant les sécrétions stomacales et intestinales sont préparées et conservées dans la glace pour celles contenant des enzymes. Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau déminéralisée. - les solutions simulant les sécrétions de l'estomac : * le jus gastrique : NaCl 53 mM, KC1 15 mM, CaCl2 1 mM et NaHC03 7mM, pH 4, auxquels on rajoute de la pepsine à raison de 588 U/ml, * de l'HCI 1M ou de l'eau afin que le pH suive dans l'estomac une courbe prédéterminée. - les solutions simulant les sécrétions de l'intestin grêle : * la solution de pancréatine à 7%, * la solution de bile à 4% (pour les 30 premières minutes de la digestion) et à 2% (pour le reste de la digestion), * la solution d'électrolytes 1X: NaCI 86 mM, KC1 8 mM et CaCl2 2 mM, * du NaHC03 1 M ou de la solution d'électrolytes IX afin de maintenir le pH à 6,5 au niveau du duodénum, à 6,8 au niveau du jéjunum et à 7,2 au niveau de l'iléon. Digestion Préalablement à l'aliment, sont introduits dans les différents compartiments du système digestif les résidus simulant ce qui reste en moyenne chez un individu à jeun : le résidu gastrique (jus gastrique ajusté à pH 2 et préincubé 15 min à 37 C), le résidu duodénal (bile 2%, pancréatine 1,75%, solution d'électrolytes 0,25X de l'intestin grêle et trypsine 7773 U/ml, préincubé 10 min à 37 C) et les résidus jéjunal et iléal (solution d'électrolytes IX de l'intestin grêle). Les fluides de dialyse pour le jéjunum (bile 1,55%, KCl 8 mM, NaCl 86 mM) et l'iléon (électrolytes IX) sont maintenus à 37 C pendant le temps de la digestion et circulent à un débit de 10 ml/min (fibres de dialyse : HG-400, seuil = 8000 Da). La souche de levure étudiée, remise en suspension dans 300 ml de lait demi-écrémé ou de milieu de culture YPL (yeast extract 10g/l, bactopeptone 10 g/1, galactose 20g/1), est introduite dans l'estomac. Les levures sont préparées comme décrit dans l'exemple 4. Cinétique Les solutions simulant les différentes sécrétions sont délivrées selon une cinétique préétablie en fonction des paramètres in vivo : * au niveau de l'estomac : le jus gastrique est délivré à un débit de 0,25 ml/min, l'HCl et l'eau sont introduits à un débit total de 0,25 ml/min. * au niveau du duodénum : les solutions de pancréatine à 7% est délivrée à un débit de 0,25 ml/min, la solution de bile (à 4 ou à 2%) à un débit de 0,5 ml/min, le NaHC03 1 M et la solution d'électrolytes IX à un débit total de 0,25 ml/min. * au niveau du jéjunum et de l'iléon : le NaHC03 1M est introduit à un débit de 0,25 ml/min, si nécessaire. Les courbes de vidange gastrique et iléale, modélisées par la formule f = 1-2-(t/t1/2)ss ont respectivement pour paramètres : t1/2 = 30 min ; B = 1 et tl/2 = 160 min ; ss = 1,6. B Fermentation dans le côlon artificiel ou TIM 2 (voir figure 2) Après une phase de stabilisation de la flore de 2 jours, la fermentation est maintenue 60 h pour l'expérience. Ensemencement du côlon Toutes les étapes de l'ensemencement sont réalisées sous flux d'azote. 200 g de fèces fraîches (issus de volontaires sains) sont mixés dans 200 ml de tampon phosphate 0,1 M à pH 6,5, préalablement autoclavé et placé sous flux d'azote pendant au minimum 2 h. Le mélange obtenu est filtré sur gaze stérile. Le filtrat est centrifugé (25000g, 30 min, 4 C). Le culot bactérien et le mucus sont repris dans du milieu de base (Ileum delivery medium) lui-même dilué 10 fois dans le tampon phosphate 0,1M. Environ 10g de rétentat de filtration sont ajoutés à cette solution bactérienne afin de l'enrichir en fibres. Le mélange est mixé à nouveau puis introduit dans le côlon à l'aide d'une seringue. Solutions utilisées pendant la fermentation Différentes solutions entrant dans la constitution du milieu nutritif de la flore fécale et de la solution de dialyse du côlon sont préparées, autoclavées 15 min à 120 C puis stockées à 4 C jusqu'à utilisation (sauf la solution de vitamines qui est stérilisée par filtration et stockée à -20 C). Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau déminéralisée. - une solution d'électrolytes 10 X : hème 0,1g/1, sels biliaires 0,5 g/1, cystéine 4 g/1, FeS04 0,05 g/1, CaCl24,5 g/1, MgS04 5 g/1, NaCl 4,5 g/1 et K2HP04 25 g/1, - une solution d'hydrates de carbone 20 X : pectine 12 g/1, xylane 12 g/1, arabinogalactane 12 g/1, amylopectine 12 g/1 et amidon 100 g/1, - une solution contenant des lipides et des protéines (TBC 40X) : 80 80 ml/1, bactopeptone 120 g/1 et caséine 120 g/1, - une solution de vitamines 10 X : 10 mg/1, biotine 20 mg/1, vitamine B 12 5 mg/1, pantothénate 100 mg/1, nicotinamide 50 mg/1, acide p-aminobenzoïque 50 mg/1 et thiamine 40 mg/1. Stabilisation de la flore et fermentation La solution de dialyse (solution d'électrolytes 1 X du côlon et solution de vitamines 0,01 X, pH 6,5) est mise à buller sous flux d'azote pendant toute une nuit. Elle est délivrée à un débit de 1 ml/min pendant toute la durée de la stabilisation et de la fermentation (fibres de dialyse : JFM M5ID X Flow). "L'ileum delivery medium" (solutions d'électrolytes 1 X du côlon, solution d'hydrates de carbone 10 X, TBC 10 X, solution de vitamines 0,01 X et mucus 20 g/1, pH 6,5), simulant le produit de la digestion issu de l'iléon, est introduit dans le côlon à raison de 3 ml par heure. La souche de levure étudiée, remise en suspension dans 5 ml d'eau distillée, est introduite dans le côlon, après stabilisation de la flore. Les levures sont préparées comme décrit dans l'exemple 4. Exemple 4 : Suivi des levures recombinantes W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl dans les systèmes digestifs artificiels Préparation des levures Les souches W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl sont mises en culture dans du milieu minimum SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids lg/1 et tryptophane 20 mg/1) jusqu'à une concentration de 106-107 cellules/ml. La culture est ensuite centrifugée dans des tubes en plastique stériles (5000 rpm, 10 min, 4 C). Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées dans 15 ml d'eau physiologique (NaCI 9 g/1). Après centrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 C), le surnageant est jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans l'aliment. Les levures sont introduites dans le TIM 1 remises en suspension dans 300 ml de lait demi-écrémé ou sont introduites dans le TIM2 remises en suspension dans 5 ml d'eau distillée. Dénombrement des levures - Prélèvement des échantillons dans TIM 1 : ml de l'aliment de départ (contenant les souches de levure) est prélevé avant introduction dans l'estomac (t = 0), puis 1 ml est prélevé aux temps 120,240 et 360 min dans les effluents iléaux collectés sur les intervalles de temps 0-120 min, 120-240 min, 240-360 min, - Prélèvement des échantillons dans TIM 2 : 1 ml du contenu colique est prélevé avant ensemencement du côlon (t = Ofec) ainsi qu'lml de la suspension de levures avant introduction dans le côlon (t = 0), puis 1 ml du contenu colique est prélevé toutes les 12 heures dans le côlon (t = 1, 12, 24, 36,48 et 60 h), - Culture des levures : les prélèvements sont dilués dans de l'eau physiologique et étalés sur du milieu SGI. De l'ampicilline (100 g/ml) est rajoutée dans le milieu afin d'éliminer les contaminants provenant du système digestif et/ou de la flore fécale, ainsi que de l'éthanol (3% v/v) afin de favoriser le développement des levures. - Dénombrement : le dénombrement des boîtes est réalisé après 2 à 3 jours d'incubation à 30 C. Résultats : Les expériences réalisées ont permis de démontrer la viabilité dans les systèmes digestifs artificiels des souches recombinées de S cerevisiae W(hR)pH1A1 et W(R)pHlAl introduites simultanément dans l'estomac ou dans le côlon. 50 % 18,9 (n=3) des levures recombinantes introduites dans l'estomac sont retrouvées en sortie d'iléon après 6 h de digestion (figure 4). Le taux de survie des levures dans le côlon apparaît plus faible puisque que l'on ne retrouve, après 12 h de fermentation, que 4% des levures introduites (n=1) (figure 5). Les causes de cette forte diminution du taux de survie dans le côlon restent indéterminées, d'autant plus, qu'après une heure de fermentation, la totalité des levures introduites était toujours présente dans le côlon. Deux hypothèses ont été avancées mettant en cause la compétition exercée par la flore fécale et les conditions de quasi anaérobiose régnant dans le côlon artificiel. Identification des levures par Polymerase Chain Reaction (PCR) La technique PCR a dû être optimisée pour le suivi des levures recombinantes dans l'environnement digestif. Les PCR peuvent être réalisées à partir de colonies isolées sur boîte de Pétri ou de levures remises en culture liquide. Dans le premier cas, on prélève une tête d'épingle d'une colonie que l'on remet en suspension dans 10 (il d'eau distillée avant de la faire bouillir 10 min. Dans le deuxième cas, la culture doit être en phase exponentielle de croissance (DO600nm comprise entre 0,5 et 2). Après centrifugation (10000g, 10 min, 4 C), le culot cellulaire est repris dans 50 l d'eau distillée et mis à bouillir 10 min. En culture liquide, les meilleurs résultats (en terme d'intensité des amplifiats et de reproductibilité des expériences) sont obtenus lorsque les levures sont en phase exponentielle de croissance (DO600nm de 0,5 à 2), alors que sur milieu solide le stade de croissance des levures ne semble pas influencer les résultats. Les amorces utilisées sont soit internes aux gènes (P450 1A1 et NADPH-cytochrome P450 réductases humaine ou de levure), soit situées à la fois sur le gène et son promoteur GAL10-CYC1 afin de vérifier la stabilité de celui-ci (figure 3). Elles sont choisies afin qu'elles s'hybrident le moins possible sur elles-mêmes, avec elles-mêmes et entre elles en utilisant le programme sur Internet à l'adresse suivante : http : //www. Williamstone.com/primers/calculator/calculator. cgi Les échantillons PCR contiennent du tampon PCR 1 X, du MgCl2 1,5 mM, les 4 dXTP 0,2 mM, les amorces 5' et 3' 0,5 Il M, la Taq polymérase 25 U/ml et la matrice d'ADN 0,06%. Le programme PCR utilisé est le suivant (30 cycles) : 5min 95 C, dénaturation 30s 95 C, amorçage 30s 51 C, synthèse d'ADN 2min 72 C et extension finale 10min 72 C. Après PCR, les échantillons sont mélangés à une solution stop (bleu de Bromophénol 0,25%, Ficoll 10% et SDS 1%) et déposés sur un gel à 1,5% d'Agarose contenant du BET 0,5 ug/ml. La migration est réalisée dans une cuve d'électrophorèse contenant du tampon Tris-base 40 mM, acide acétique glacial 20 mM, EDTA 1 mM, pendant 15 minutes à 100V. Après migration, l'ADN est visualisé sous UV. Résultats : Les souches de levures ont été identifiées par PCR à la fois en sortie de l'intestin grêle jusqu'à 6 h après leur introduction dans l'estomac et en sortie de côlon jusqu'à 48 H après leur introduction dans celui-ci (figure 6). Exemple 5 : Mesure de l'activité des levures recombinantes après passage dans le TIM1 (W(hR)pHlAl) et in situ (W(R)pP73Al). 1 Mesure de l'activité des levures recombinantes W(hR)pHlAl après passai! dans le TIM1 La souche W(hR)pHlAl est utilisée pour démontrer le maintien de l'activité des levures recombinantes après passage dans le TIM1. Le P450 1A1 possède l'activité éthoxyrésorufine-O-déethylase (EROD) et catalyse la transformation de la 7-éthoxyrésorufine en résorufine. Culture des levures Les levures sont mises en préculture 12h à 28 C, sous agitation, dans 30 ml de SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids 1 g/1 et tryptophane 20 mg/1). Puis, une culture de 48 h à 28 C, sous agitation, est réalisée dans 250 ml d'YPGE (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et éthanol 3%). Pendant les dernières 12h, l'induction du P450 1A1 est provoquée par ajout de galactose (25 ml d'une solution à 200 g/1). La culture de levures est alors soit utilisée telle quelle pour le dosage de l'EROD sur cellules, soit subit différents traitements afin de préparer des microsomes (Pompon et al., 1996). Teneur en P450 1A1 La teneur en P450 1A1a été mesurée sur des microsomes de la souche W(hR)pH1A1 après passage dans les systèmes digestifs . Pour cela, on utilise la méthode d'Omura et Sato (1964), basée sur la propriété qu'a l'hémoprotéine de présenter un maximum d'absorption aux environs de 450 nm quand elle est réduite et liée au monoxyde de carbone. La suspension de microsomes est reprise dans du tampon Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 afin d'obtenir une DO600nm d'environ 0,8, puis réduite par une pointe de spatule de dithionite de sodium. Le spectre d'absorption est enregistré avant et après barbotage de CO dans la suspension. La concentration en P450 1A1 (seul P450 détectable) est calculée d'après la loi de Beer-Lambert (E448 nm = 91 nM-1ch-1). Les protéines microsomales sont dosées avec le kit Protein Assay ESL (Boehringer Mannheim). Dosage de l'activité EROD L'activité enzymatique éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) est caractéristique du cytochrome P450 1A1. Elle est mesurée sur la souche W(hR)pHlAl, après passage dans les systèmes digestifs artificiels. Cette activité est dosée selon la méthode fluorimétrique décrite par Burke et al. (1985) qui mesure l'augmentation de fluorescence liée à la formation de résorufine, produit de déalkylation de la 7- éthoxyrésorufine. L'activité EROD est mesurée sur microsomes ou sur cellules à 24 C. Dans le premier cas, 1 ml de tampon Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4,5 l de NADPH (10 mg/ml) et 2 l d'une solution de 7-éthoxyrésorufine saturée dans l'éthanol sont mélangés. Après ajout des microsomes, l'augmentation de la fluorescence (#ex = 530 nm ; #em = 586 nm) est enregistrée. Dans le second cas, après centrifugation (11000 g, 30 s, 4 C) d'l ml de culture à une DO600nm de 3 minimum, le culot cellulaire est repris dans 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4. On enregistre l'augmentation de fluorescence (,ex = 530 nm ; #em = 586 nm) consécutive à l'ajout de 2 l d'une solution de 7-éthoxyrésorufine saturée dans l'éthanol. Résultats : La souche W(hR)pHlAl possède toujours l'activité EROD, caractéristique du P450 1A1, en sortie de l'intestin grêle et dans le côlon, que celle-ci soit dosée sur microsomes (environ 20 pmol de résorufine par ml de suspension microsomale et par minute) ou sur cellules (environ 5 pmol de résorufine par ml de culture et par minute). 2 Mesure de l'activité des levures recombinantes W(R)pP73Al in situ (dans TIM1) La souche de levure utilisée pour démontrer l'activité in situ est la souche W(R)pP73Al. Le P450 73A1 possède l'activité cinnamate 4-hydroxylase et catalyse la transformation de l'acide trans-cinnamique en acide p-coumarique. Préparation des levures Les levures sont mises en préculture 12h à 28 C, sous agitation, dans 30 ml de SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/1, bactocasamino acids 1 g/1 et tryptophane 20 mg/1). Puis, une culture de 48 h à 28 C, sous agitation, est réalisée dans 250 ml d'YPGE (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et éthanol 3%) jusqu'à atteindre une densité de 7-8x10 lev/ml. Pendant les dernières 12h, l'induction du CYP73A1 (gène codant pour le P45073A1) est provoquée par ajout de galactose (25 ml d'une solution à 200 g/1) jusqu'à atteindre une densité de 2x108 lev/ml. La culture est ensuite centrifugée dans des tubes en plastique stériles (5000 rpm, 10 min, 4 C). Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées dans 15 ml d'eau physiologique (NaCI 9 g/1). Après centrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 C), le surnageant est jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans l'aliment (300 ml de milieu YPL). Déroulement de la digestion Le substrat (l'acide trans-cinnamique) est introduit extemporanément dans l'estomac à la concentration de 670 M. La digestion est réalisée sur 240 minutes. Des prélèvements (1 ml) sont réalisés à différents niveaux du tractus digestif : dans l'aliment avant introduction dans le système, dans l'estomac au bout de 15,30 et 45 min de digestion, dans le duodénum au bout de 15,30, 45,60, 75 et 90 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 45,60, 90,120, 150 et 180 min de digestion, dans l'iléon au bout de 60,90, 120,180 et 240 min de digestion, dans les sorties cumulées sur 0-60 min, 60-120 min, 120-180 et 180-240 min à 60,120, 180 et 240 min et dans l'absorption cumulée sur 0-60,60-120, 120-180 et 180-240 à 60,120, 180 et 240 min. Traitement des échantillons 100 l d'acide trifluoroacétique (25% dans l'eau w/v) sont ajoutés à 1 ml d'échantillon pour arrêter la réaction. Après microcentrifugation (3 min, 10000 rpm, température ambiante), le surnageant est récupéré et filtré (0. 45 um). Les échantillons sont conservés à -20 C avant analyse. Analyse HPLC Après filtration, 10 l des échantillons sont injectés dans la colonne Merck Lichrospher 100 RP-18 (5 m, 12. 5 cm*4 mm). Un gradient entre 2 phases A et B est réalisé sur 34 min avec un débit de 1 ml par minute, comme décrit ci-dessous : Phase A : Eau 95, Méthanol 5 et acide acétique 0 1 (v/v), Phase B : Acétonitrile 95, Méthanol 5 et acide acétique 0 1 (v/v), 0-16 min: 90% A, 10% B, 16-18 min : gradient linéaire jusqu'à 80% A, 20% B, 18-32 min: 80% A, 20% B, 32-34 min : gradient linéaire jusqu'à 90% A, 10% B. La détection est réalisée par spectrophotométrie à 314 nm entre 0 et 16 min, puis à 280 nm entre 16 et 34 min Le temps de rétention des composés est de 6 0. 5 min pour l'acide p-coumarique et de 28 0. 5 min pour l'acide trans-cinnamique Résultats L'activité enzymatique cinnamate 4-hydroxylase a été détectée dans tous les compartiments digestifs du TIM 1 (estomac, duodénum, jéjunum et iléon) Les résultats sont présentés en figure 7. Le rapport mol d'acide p-coumarique/ mol d'acide trans-cinnamique augmente le long du tractus digestif, ce qui prouve que les levures recombinantes sont actives dans tous les compartiments du TIM 1 Si l'on réalise un bilan au bout de 4h de digestion - ont été introduits dans le TIM 1 . 9,6* 109 cellules de levures et 205,4 mol d'acide trans-cinnamique, - ont été retrouvés en fin de digestion (soit 240 minutes après le début de la digestion) : 8,9* 109 cellules de levures (en sortie de l'iléon), 53,6 mol d'acide p-coumarique (dans l'ensemble du système digestif) et 56,1 pmol d'acide trans-cinnamique REFERENCES - Baranova et al. Possible involvment of arylamine N-acétyltransferase 2, glutathion Stransferase Ml and Tl genes in the development of endometriosis. Hum. Mol. Reprod., 1999, 5-7. - Bellamine A. 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Micro-organismes comportant au moins un fragment d'ADN hétérologue comprenant un gène d'intérêt capable de s'exprimer dans l'environnement digestif, caractérisés en ce que son taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, de préférence 80% en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon 2 Micro-organismes selon la revendication 1 caractérisés en ce que le fragment d'ADN hétérologue est constitué d'une cassette d'expression comprenant au moins un gène d'intérêt, un promoteur et un terminateur. 3 Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'il s'agit de levures sélectionnées notamment parmi Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Hansenula anomala, Schizosaccharomyces. pomhe et Klevuromyces lactis. 3 Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt code pour un produit sélectionné parmi les peptides à intérêt vaccinal, les peptides à intérêt hormonal, les peptides à intérêt thérapeutique, les peptides à effet antibiotique, les peptides capables de piéger ou de complexer des molécules, des enzymes ou tout peptide possédant des activités de bioconversion ou de biosynthèse, notamment des enzymes de détoxication 5 Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt code pour une enzyme du métabolisme des xénobiotiques sélectionnée parmi les enzymes de phase 1 (P450 1A1, IA2, 1B1, 2B6,2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 et 73A1), les enzymes d'environnement de phase 1 (cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) et les enzymes de phase II telles que la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH) et l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT) 6 Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi les promoteurs constitutifs ou inductibles, les promoteurs forts, les promoteurs actifs spécifiquement dans un segment du tractus digestif en conditions d'aérobie, de semi anaérobie ou d'anaérobie, et les promoteurs régulables par une molécule introduite dans le milieu intestinal. 7. Procédé d'étude, de contrôle et/ou de sélection de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il met en #uvre un système digestif artificiel. 8. Procédé d'étude et/ou de contrôle selon la revendication 7 comprenant les étapes consistant à : a) ajouter un micro-organisme selon l'une des revendications 1 à 6 dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système digestif artificiel comprenant au moins un des compartiments, c) incuber et procéder à un dénombrement et/ou à un test de l'activité du gène d'intérêt après passage dans les systèmes digestifs ou in situ 9. Procédé de sélection selon la revendication 7 comprenant les étapes consistant à a) ajouter des micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 6 dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système digestif artificiel comprenant au moins un des compartiments, c) incuber et récupérer les micro-organismes survivants après passage dans ledit système ; d) répéter éventuellement les étapes a) à c) jusqu'à l'obtention d'une population homogène de micro-organismes adaptés à l'environnement digestif et capables d'exprimer efficacement le gène d'intérêt. 10 Micro-organisme obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 7 à 9 11. Micro-organisme selon la revendication 10 caractérisé en ce que son taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, de préférence 80% en sortie de l'iléum après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le colon. 12. Micro-organisme selon l'une des revendications 10 et 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure 13 Produit de combinaison comprenant un micro-organisme selon l'une des revendications 1 à 6 et 10 à 12 et une substance active ou un précurseur d'une substance active pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. 14 Produit selon la revendication 13 caractérisé en ce que le micro-organisme agit sur la substance active ou inversement. 15Composition pharmaceutique comprenant des micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 6 et 10 à 12 se trouvant sous une forme galénique adaptée à une administration par voie orale ou rectale de sorte à les acheminer intactes au niveau du site cible du tractus digestif et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps donné. 16 Composition pharmaceutique selon la revendication 15dans lequel les micro- organismes, en particulier les levures, sont protégés par un enrobage et/ou une membrane du type résine et/ou de type polymère formant des sphères, microsphères, granules ou microgranules 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle se trouve sous la forme de gélules, comprimés, ou dragées. 18. Utilisation de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 6 et 10 à 12 pour la préparation d'un médicament 19. Utilisation selon la revendication 18 pour la préparation d'agents de détoxication, d'agents de correction métabolique ou d'agents capables de modifier la flore intestinale. 20. Utilisation selon la revendication 18 pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la toxicité et/ou augmenter la biodisponibilité d'une substance active ou de son précurseur 21. Utilisation selon la revendication 18 pour la préparation d'un médicament capable de fournir in situ des peptides actifs, des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal, des peptides à intérêt thérapeutique, des peptides à effet antibiotique ou des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules