FR 2812634 A1 20020208 FR 0010218 A 20000802 Utilisation de composés aromatiques polycycliques pour fabriquer des médicaments capables d'inhiber la télomérase L'invention a pour objet l'utilisation de composés aromatiques polycycliques pour fabriquer des médicaments présentant des propriétés inhibitrices de la télomérase et utilisables, en particulier, pour le traitement de cancers. L'ADN des télomères chez l'homme est essentiellement constitué par un double brin et contient des motifs répétés TTAGGG/CCCTAA. Les extrémités sont en revanche monobrins avec une région 3' riche en motifs G. Cet ADN monobrin peut adopter une structure à 4 brins impliquant des G-quartets comme illustré sur la figure 1, ou peut former une boucle en T. Du point de vue biologique, la télomérase permet l'ajout de ces séquences d'ADN répétées à l'extrémité du télomère, lors de la division cellulaire. Par cette action, la télomérase rend la cellule immortelle. En effet, en l'absence de cette activité enzymatique, la cellule perd à chaque division 100 à 150 bases, ce qui la rend rapidement sénescente. Lors de l'apparition de cellules cancéreuses à division rapide, il s'est avéré que ces cellules présentaient des télomères maintenus à une longueur stable au cours de la division cellulaire. Dans ces cellules cancéreuses, il est apparu que la télomérase était fortement activée et qu'elle permettait l'addition de motifs répétés de séquences télomériques à la fin du télomère et permettait donc la conservation de la longueur du télomère dans les cellules cancéreuses. Plus de 85 % des cellules cancéreuses présentent des tests positifs à la présence de télomérase alors que l'immense majorité des cellules somatiques ne présentent pas cette caractéristique. Ainsi la télomérase est une cible très convoitée pour traiter les cellules cancéreuses. La première approche évidente pour bloquer la télomérase a consisté à utiliser des structures nucléotidiques (Chen. et -al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (7), 2635-2639).Parmi les composés non nucléotidiques qui ont été utilisés dans l'art antérieur, on peut citer les diaminoanthraquinones (Sun et al. J. Med. Chem. 40 (14), ou les diethyloxadicarbocyanines (Wheelhouse R. T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1998 (120) La demande WO 99/40087 décrit l'utilisation de composés capables d'interagir avec les structures G-quadruplexes évoquées plus haut. Il s'agit des composés pérylènes et des carbocyanines contenant au moins sept cycles dont deux hétérocycles. Les travaux des inventeurs ont montré que, de façon surprenante, des composés aromatiques à structure planaire en forme de croissant à savoir des dibenzophénanthrolines, dont certains sont connus pour leur effet stabilisateur de triplex, permettaient d'obtenir un résultat au moins équivalent avec des structures beaucoup moins compliquées du point de vue chimique. Le développement de ces travaux a permis également d'élaborer de nouveaux composés aromatiques de ce type capables eux aussi de se fixer à la structure G quadruplex et présentant donc une activité inhibitrice des télomérases. Selon l'un de ses aspects, l'invention vise donc l'utilisation de composés de dibenzophénantrolines pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase. Elle a également pour but, selon un autre aspect, de fournir de nouvelles dibenzophénantrolines et leur utilisation comme principe actifde médicaments. L'utilisation de composés aromatiques capables de se lier à des structures Gquadruplex pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase selon l'invention est caractérisée en ce que lesdits composés répondent à la formule (I) dans laquelle - RI, R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un radical-CH2-NH-(-CH2)2-CH3, -CH2-NH- (CH2)3- N (CH3)2, -CH2-NH- (CH2)2pipéridine,-CH2-NH-(CH2)3- pipéridine, et - Z représente CH ou N, chaque composé comportant deux azotes sur les 4 positions "Z". L'invention vise en particulier l'utilisation du composé de formule (II) ou de formule (III) Les composés de formule (I) utilisés, selon l'invention, comme principes actifs de médicaments sont caractérisés en ce qu'ils sont capables d'augmenter la température de fusion (Tm) du G-quadruplex de 2 à 12 C à une concentration de 1 M. Cette augmentation de Tm a été corrélée à celle de leur effet anti-télomérase, in vitro. On observera avec intérêt que les valeurs de IC50 de ces composés sont avantageusement inférieures à 3 M et même à 1 M pour nombre d'entre eux. Compte tenu des applications thérapeutiques visées, il est intéressant de noter que les composés de formule (I) présentent en outre des constantes de dissociation de l'ordre de 10-8 et se lient donc très fortement aux structures G-quadruplexes alors que les constantes de dissociation des ligands de quadruplex connus à ce jour sont de l'ordre de 10-6 à 10-5 M. Selon un autre aspect, l'invention vise en outre, en tant que nouveaux produits, les composés aromatiques polycycliques de formule (IV) dans laquelle R2 et R3 sont identiques et représentent-CH2-NH-(CH2)3- N(CH3)2, ou -CH2-NH-(CH2)2- N (CH3)2, ou-CH2-NH-(CH2)2- pipéridine. L'étude de ces produits, selon les tests rapportés dans les exemples, a montré qu'ils sont capables de stabiliser les structures G-quadruplexes des télomères et sont utilisables en conséquence pour l'élaboration de médicaments à effet anti-télomérase, en particulier de médicaments anti-tumoraux. L'invention vise donc également des compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins l'un de ces nouveaux composés en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte. Les médicaments selon l'invention ou fabriqués selon l'invention présentent un intérêt tout particulier pour le traitement de cancers. Ils sont élaborés sous des formes appropriées pour le mode d'administration souhaité pour ce type de traitement. Il s'agit le plus généralement de formes pour une administration par voie orale, nasale, buccale injectable, parentérale, rectale, vaginale ou topique. Pour l'administration par voie orale, on formule les compositions de médicaments pour obtenir, de manière classique, des comprimés, dragées, pilules, gélules, capsules et analogues. La posologie par unité de prise sera adaptée par l'homme du métier pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Pour l'administration par voie injectable, on prépare des solutions stériles ou stérilisables administrables par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire ou parentérale. Ces solutions renferment la quantité requise, pour l'effet souhaité, de principe actif. Ces administrations peuvent être effectuées en 1 ou plusieurs prises. Les autres formes d'administration sont avantageusement préparées selon les formulations galéniques habituelles. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent , respectivement, - la figure 1A, une structure G-quartet et la figure 1B un quadruplex intramoléculaire, - la figure 2, les formules chimiques de dibenzophénantrolines testées comme ligands de G- quartets, - la figure 3A, l'inhibition de la télomérase par des diphénantrolines selon l'invention et la figure 3B, la corrélation de cette inhibition avec la stabilisation de G-quartet. Matériels et méthodes Oligonucléotides Tous les oligonucléotides, modifiés ou non, ont été synthétisés par Eurogentec S.A., Seraing, Belgique. Pour les études de fluorescence, on attache une molécule de fluorésceine à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide utilisé, et une molécule de la tétraméthylrhodamine à son extrémité 3'. La concentration des échantillons est vérifiée par spectrophotométrie, en enregistrant le spectre d'absorbance entre 220 et 700 nm et en utilisant le coefficient d'extinction molaire communiqué par le fournisseur. Dibenzophénantrolines La synthèse des composés de 1 à 6 a été effectuée comme décrit par Baudoin et al dans Chemistry : a european journal 4,1504-1508 (1998). Le composé 7, à savoir la 6-[2-(pipéridin- 1-yl)éthyl)arninométhyl]dibenzo[b,j]4,7]phénanthroline a été synthétisée selon le protocole décrit pour les composés 2 et 3 par Baudoin et al, J. Org. Chem. 62,5458-5470 (1997). Tampons Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon cacodylate de sodium 10 mM pH 7,6 contenant 0,1 M de chlorure de lithium (ou de chlorure de sodium). L'absence de contamination fluorescente dans le tampon a été préalablement vérifiée. L'oligonucléotide fluorescent est ajouté à la concentration finale de 0,2 M. Méthode FRET L'identification de ligands de G-quartets a été réalisée par fluorescence selon la méthode FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer), qui correspond à une interaction de résonance dipôle-dipôle entre deux molécules proches l'une de l'autre, dont l'une, le donneur, transfère son énergie d'excitation à l'autre molécule, ou accepteur. La formation d'une structure G-quartet intramoléculaire doit rapprocher suffisamment les 2 chromophores pour pouvoir observer un transfert d'énergie. Etudes de fluorescence Toutes les mesures de fluorescence ont été effectuées sur un appareil Spex Fluorolog DM1B, en utilisant une largeur de raie d'excitation de 1,8 nm et une largeur de raie d'émission de 4,5 nm. Les échantillons sont placés dans une cuvette en quartz micro de 0,2 x 1 cm. La température de l'échantillon est contrôlée par un bain-marie extérieur. L'oligonucléotide seul a été analysé à 20,30, 40, 50, 60,70 et 80 C. Les spectres d'émission sont enregistrés en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 470 nm. Les spectres d'excitation sont enregistrés en utilisant soit 515 nm, soit 588 nm comme longueur d'onde d'émission. Les spectres sont corrigés de la réponse de l'instrument par des courbes de référence. Une extinction importante (80-90 %) de la fluorescence de la fluoresceine à température ambiante est observée, en accord avec un repli intramoléculaire de l'oligonucléotide à 20 C sous forme d'un G- quadruplex, ce qui induit une juxtaposition de ses extrémités 5' et 3', respectivement liées à la fluorescéine et à la tétraméthylrhodamine (tamra en abrégé). Cette juxtaposition entraîne un phénomène déjà décrit, d'extinction de fluorescence du donneur par FRET, et une émission sensibilisée de l'accepteur. Tm en fluorescence Une solution stock d'oligonucléotide à la concentration en brin de 0,2 M dans un tampon 0,1M LiCI 10 mM cacodylate pH 7,6 est préalablement préparée, chauffée brièvement à 90 C et refroidie lentement à 20 C, puis distribuée par aliquotes de 600 l dans les cuves de fluorescence. 3 l d'eau (pour le contrôle) ou 3 (il du produit à tester (stock à 200 M, concentration finale 1 M) sont alors ajoutés et mélangés. Les échantillons sont alors laissés à incuber pendant au moins 1 heure à 20 C avant chaque mesure. L'utilisation de temps d'incubation plus longs (jusqu'à 24 heures) n'a pas d'influence sur le résultat obtenu. Chaque expérience ne permet que la mesure d'un seul échantillon. Celui-ci est d'abord incubé à une température initiale de 20 C, porté à 80 C en 40 minutes, laissé 5 minutes à 80 C, puis refroidi à 20 C en 62 minutes. Durant ce temps, la fluorescence est mesurée simultanément à deux longueurs d'onde d'émission (515 nm et 588 nm) en utilisant 470 nm comme longueur d'onde d'excitation. Une mesure est effectuée toutes les 30 secondes. La température du bain-marie est enregistrée en parallèle, et le profil de fluorescence en fonction de la température est reconstitué à partir de ces valeurs. Les profils de fluorescence sont ensuite normalisés entre 20 C et 80 C, et la température pour laquelle l'intensité d'émission à 515 nm est la moyenne de celles à haute et basse température est appelée Tm. Dans ces conditions, le Tm de l'échantillon de référence sans addition de produit est de 44 C dans un tampon de chlorure de lithium. Cette température est portée à plus de 55 C dans le tampon de chlorure de sodium. L'addition d'un composé stabilisant le G-quadruplex induit une augmentation du Tm. Cette augmentation est jugée significative si elle est supérieure à 3 C. L'activité biologique anti-télomérase est déterminée par le protocole expérimental suivant : Préparation de l'extrait enrichi en activité télomérase humaine La lignée de leucémie HL60 a est obtenue auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules sont cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 contenant, L-Glutamine à 2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 g/ml, gentamycine 50 g/ml et additionnées de 10 % de sérum f#tal de veau inactivé par la chaleur. Une aliquote de 10 cellules est centrifugée à 3000xG et le surnageant écarté. Le culot de cellules est re-suspendu par plusieurs pipetages successifs dans 200 l de tampon de lyse contenant CHAPS 0. 5 %, Tris-HCl pH 7,5 10 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM, ssmercaptoethanol 5 mM, PMSF 0.1mM et glycérol 10 % et est conservé dans la glace pendant 30 minutes. Le lysat est centrifugé à 16 OOOxG pendant 20 minutes à 4 C et 160 l de surnageant est récupéré. Le dosage des protéines de l'extrait est effectué par la méthode de Bradford. l'extrait est conservé à -80 C. Dosage de l'activité télomérase L'inhibition de l'activité télomérase est déterminée par un protocole d'extension de l'oligonucléotide TS ( 5' AATCGTTCGAGCAGAGTT 3' ), en présence d'un extrait cellulaire enrichi en activité télomérase et des composés qui sont ajoutés à différentes concentrations (10, 1, 0,1et 0,1ug/ml). La réaction d'extension est suivie d'une amplification PCR des produits d'extension à l'aide des oligonucléotides TS et CXext (5' GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA 3'). Le milieu réactionnel est préparé selon la composition suivante : Tris HC1 pH 8,3 20 mM MgCl2 1,5 mM Tween 20 0,005 % (P/V) EGTA 1 mM dATP 50 M dGTP 50 M dCTP 50 uM dTTP 50 M Oligonucléotide TS 2 ug/ml Oligonucléotide CXext 2 ug/ml Sérum Albumine bovine 0,1mg/ml Taq DNA polymérase 1 U/ml alpha 32P dCTP (3000 Ci/mmole) 0. 5 l Extrait télomérase 200 ng sous un volume de 10 l Produit à tester ou solvant sous un volume de 5 l Eau bi-distillée QD 50 Fil Les oligonucléotides sont obtenus auprès d'Eurogentec (Belgique) et sont conservés à - 20 C à une concentration stock de 1 mg/ml dans de l'eau distillée. Les échantillons réactionnels sont assemblés dans des tubes à PCR de 0.2 ml et une goutte d'huile de paraffine est déposée sur chacune des réactions de l'expérience avant la fermeture des tubes. Les échantillons réactionnels sont ensuite incubés dans un appareil à PCR de type Cetus 4800 selon les conditions de températures suivantes : 15 minutes à 30 C, 1 minute à 90 C, suivis de 30 cycles de, 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 50 C, et 1 minute 30 secondes à 72 C, suivis d'un cycle final de 2 minutes à 72 C. Pour chacun des échantillons, une aliquote de 10 l est pipettée sous la couche d'huile et mélangée avec 5 ul d'un tampon de dépôt contenant : TBE 3X glycérol 32 % (P/V) Bleu de bromophénol 0.03 % Xylène cyanol 0.03 % Les échantillons sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'acrylamide 12 % dans un tampon TBE IX pendant 1 heure sous une tension de 200 volts, à l'aide d'un système d'électrophorèse Novex. Les gels d'acrylamide sont ensuite séchés sur une feuille de papier whatmann 3 MM à 80 C pendant 1 heure, analysés et quantifiés Pour chaque concentration de composé testée, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la réaction et calculés à partir du contrôle enzymatique non traité et de l'échantillon sans enzyme (blanc) selon la formule suivante : (Valeur Composé - valeur blanc/ Valeur contrôle enzymatique - valeur blanc) x 100. La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la réaction télomérase (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'inhibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée. On considère qu'un composé est actif en tant qu'agent anti-télomérase lorsque la quantité inhibant 50 % de la réaction télomérase est notamment inférieure à 5 M. Ligands G-4 spécifiques Dans les essais dont les résultats rapportés ci-après, on a utilisé deux oligonucléotides de séquences SEQ ID N 1et SEQ ID N 2, substitués en 5' par un groupe fluorescéine (fluo en abrégé) et en 3' par un groupe tamra, répondant aux séquences suivantes : fluo-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-tamra, fluo-TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-tamra 7 composés de dibenzophénantrolines ont été testés. Leurs formules sont données sur la figure 2. On compare les composés 1 à 7 à une concentration en colorant de 1 M. Les résultats sont résumés dans le tableau 1. Composés ATmG4(FRET) IC50 Télomérase #Tm triplex 1 M colorant ( M) 15 M colorant 1 11,5 0,3 20 2 5,5 1,45 37 3 9,5 0,75 44 4 11,5 1,0 18 5 12,5 0,5 7 6 10 0,9 16 7 2,5 2,0 n.d. a) valeurs déduites des observations rapportées par Baudoin et al dans Chemistry cité ci-dessus. Ces résultats confirment la liaison des composés de dibenzophénantrolines à l'ADN quadruplex. Dans des conditions identiques, la tétra [N-méthylpyridyl] porphyrine et une dianthraquinone 2,6-disubstituée donnent des stabilisations d'environ 4 C. Ces valeurs de #Tm sont significativement plus faibles que celles obtenues avec la plupart des ligands de dibenzophénanthrolines. On observera en particulier que la #Tm du ligand 5 est de +12,5 C. L'effet de ATm a été comparé à l'efficacité d'inhibition de la télomérase. On a réalisé un essai TRAP (Telomerase Repeat Amplicfication Protocol) sur les composés ~la 7 dans des conditions identiques, en opérant selon Krupp et al Nucleic Acids Res. 25,919-921 (1997). Comme source de télomérase, on a utilisé un lysat de cellules HL60. Le mélange réactionnel TRAP a été ajouté directement au mélange de composé et d'extrait de télomérase. Une amplification par PCR comme décrit ci-dessus a ensuite été effectuée. Les produits d'élongation de la télomérase ont été mis à migrer sur un gel de polyacrylamide à 12% en conditions non dénaturantes. La figure 3A se rapporte à l'inhibition in vitro de la télomérase par les composés 1 et 2, où B correspond à des tests sans extraits nucléaires et E, en présence d'extraits nucléaires télomérase-actifs. Les composés 1 et 2 ont été testés à 3 concentrations différentes: 0,1, 1 et 10 M, de la droite vers la gauche). La figure 3B donne la corrélation entre l'inhibition de la télomérase in vitro (axe Y, exprimée en concentration nécessaire pour obtenir une inhibition de 50% de l'activité télomérase dans un essai standard TRAP et la stabilisation G4 (axe X, exprimée en ATm de l'oligonucléotide avec SEQ ID N 1). Les résultats correspondent à une moyenne d'au moins 2 expériences indépendantes. L'examen de la figure 3A montre, en ce qui concerne tout particulièrement le composé 1, que des concentrations croissantes conduisent à la disparition des bandes de plus faible mobilité, correspondant aux produits d'élongation de la télomérase. On constate que le composé 2 inhibe également la télomérase. Les résultats donnés dans le tableau 1 sont illustrés par la figure 3B qui montre le rapport entre l'efficacité de l'inhibition de la télomérase et ATm. On constate que les composés qui inhibent efficacement la télomérase in vitro, tout spécialement les composés 1, 3, 4, 5 et 6, stabilisent tous la structure G-quartet de plus de 9 C. Les composés 2 et 7 présentent des valeurs de IC50, respectivement de 1,4 et 2 M. Effet antiprolifératif de composés de dibenzophénantrolines Des cellules de lignées cancéreuses sont mises à incuber pendant 3 jours en présence de différentes concentrations du composé 1. La cytotoxicité du composé 1, le plus actif sur la télomérase, a été testée sur la lignée tumorale humaine humaine HeLa. Ces cellules sont cultivées dans un Milieu MEM (Life technologies) comprenant 10% de sérum de veau fétal décomplémenté, de la glutamine, des acides aminés non essentiels (1%) et des antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Le ligand est dilué au milieu culture après adhésion des cellules sur des plaques 96 puits (2500 cellules par puits). Le nombre de cellules est estimé par le kit "Cell titer 96 Aqueous One Solution Cell prolifération Assay" de Promega. Chaque mesure a été effectuée en quadruplicate. Les cellules sont laissées en présence du composé pendant 1 à 4 jours, puis comptées. L'IC50 mesurée pour le composé 1 est de 0,5 micromolaire sur les cellules HeLa mises en présence du composé 1 pendant 24 heures. Une mortalité de 100 % est observée pour des concentrations de 5 micromolaires ou plus. La toxicité du produit 1 est renforcée lorsque les cellules sont incubées pendant 96 heures en sa présence (100 % de mortalité à 0.5 micromolaires). REVENDICATIONS 1. Utilisation de composés aromatiques capables de se lier à des structures G-quadruplex pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase, caractérisée en ce que lesdits composés répondent à la formule (I) dans laquelle - R1, R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un radical -CH2-NH-(-CH2)2- CH3, -CH2-NH-(CH2)3- N (CH3)2, -CH2-NH-(CH2)2pipéridine,-CH2-NH-(CH2)3- pipéridine, et - Z représente CH ou N, chaque composé comportant deux azotes sur les positions "Z". 2. Utilisation selon la revendication 1 d'un dérivé de formule (II) ou de formule III 3. Nouvelle dibenzophénanthrolines, caractérisées en ce qu'elles répondent à la formule (IV) dans laquelle R1et R3 sont identiques et représentent -CH2-NH-(CH2)3- N(CH3)2, ou -CH2-NH-(CH2)2- N (CH3)2, ou -CH2-NH-(CH2)2- pipéridine. 4. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renfermrnt une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un de composé selon la revendication 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte. 5. Utilisation de composés de formule 1 selon la revendication 1, pour fabriquer des médicaments pour une administration par voie orale, nasale, buccale, injectable, parentérale, rectale, vaginale ou topique.