FR 2815042 A1 20020412 FR 0012845 A 20001006 Utilisation d'une composition à activité antioxydante pour le conditionnement de cellules souches La présente demande a pour objet une nouvelle utilisation de compositions à activité antioxydante, pour le conditionnement de cellules souches. Les cellules souches sont des cellules appartenant à des répertoires diversifiés ces cellules étant multipotentes et douées de capacités d'autorenouvellement et plus précisément pouvant être totipotentes et de ce fait capables de donner naissance à un organisme entier, ou pluripotentes c'est à dire capables d'engendrer toutes les cellules de l'organisme à l'exception des trophoblastes placentaires. Ces dernières sont par exemple les cellules souches embryonnaires (ES) qui semblent pouvoir être maintenues in vitro dans un état indifférencié de façon quasi-indéfinie. Les cellules souches ont en général des intermédiaires dans la voie de la différenciation, des progéniteurs dont la capacité de prolifération est limitée et le potentiel de différenciation restreint. Les cellules souches des organismes adultes représentent également un potentiel tout à fait important dans la perspective de leur utilisation thérapeutique. A cet égard, les moyens décrits dans le cadre de l'invention peuvent être appliqués : - aux cellules souches du système nerveux central, capables de se différencier en cellules souches hématopoiétiques, neurones, astrocytes, oligodendrocytes, - aux cellules souches hématopoiétiques, en particulier aux hémangioblastes. Les cellules souches hématopoiétiques sont des cellules ayant in vivo, une capacité de reconstitution hématologique, aux cellules souches mésenchymateuses, capables de se différencier vers des entités variées incluant l'os, le cartilage, la graisse, les tendons, les muscles et le stroma médullaire, pour notamment se différencier en adipocytes, chondrocytes ou ostéocytes, les cellules souches musculaires, - cellules souches musculaires ou hépatiques ou cérébrales, obtenues à partir de cellules de la moelle osseuse. Toutes ces cellules souches constituent des cellules cibles intéressantes, notamment pour le transfert de gènes, dans le cadre de protocoles de thérapie génique. Cependant le transfert efficace de séquences nucléotidiques d'intérêt (désignées par le terme"gène"dans la suite) pose différents problèmes dont certains sont liés à la nécessité de maintenir ces cellules en culture, pendant un temps suffisant pour les manipuler en vue de leur utilisation ultérieure et notamment dans des conditions permettant ultérieurement le transfert de gènes de façon efficace, afin en particulier d'envisager leur implantation chez des patients. Ces cellules souches sont aussi des cibles intéressantes pour le maintien en culture des cellules, éventuellement de leur amplification et/ou de leur différenciation. La présente demande met en évidence que les cellules souches, et en particulier les cellules souches décrites plus haut, peuvent être conditionnées de façon à permettre leur culture pendant des durées suffisantes pour envisager le transfert de gènes d'intérêt, et/ou pour permettre leur amplification et/ou leur différenciation. En outre les moyens définis dans le cadre de l'invention peuvent conférer aux cellules conditionnées incorporant lesdits gènes par transformation, un avantage sélectif qui se manifeste i) au niveau du nombre de colonies cellulaires formées (CFU), et/ou ii) au niveau de la qualité (taille, nature) des cellules en culture. L'invention définit en particulier des conditions de culture des cellules souches favorables à la transduction efficace de ces cellules par des vecteurs portant des gènes d'intérêt, par exemple des vecteurs rétroviraux, des vecteurs lentiviraux des vecteurs tels que SV40 ou de tous vecteurs susceptibles de transformer ou de transduire des cellules souches. L'invention a donc pour objet, l'utilisation d'une composition à activité antioxydante, pour le conditionnement in vitro de cellules souches. L'expression"composition à activité antioxydante"définit des substances, utilisées seules ou en mélange, qui ont des propriétés antioxydantes au niveau des cellules eucaryotes. On observera que dans le cadre de l'invention, l'activité antioxydante est un critère de sélection des compositions utilisées, mais que les propriétés antioxydantes de ces compositions ne sont pas nécessairement les seules mises en oeuvre. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, une composition utilisable pour le conditionnement des cellules souches, comprend la Nacétylcystéine. En particulier, une telle composition est constituée par la Nacétylcystéine. D'autres compositions à activité antioxydante comprennent par exemple du Vastarel ou l'Amipostine, la vitamine C la vitamine D. Dans le cadre de l'invention, la composition à activité antioxydante est utilisée pour le conditionnement des cellules souches dans des conditions permettant le maintien en culture de ces cellules. Le maintien en culture, des cellules souches conditionnées selon l'invention doit être assuré pendant une durée suffisamment longue pour envisager leur utilisation en vue de l'implantation chez un patient, le cas échéant après transfert d'un gène d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la qualité des cellules conditionnées est également améliorée, de sorte qu'après transfert de gène, ces cellules présentent un avantage sélectif vis à vis des cellules non transformées. En particulier les inventeurs ont observés que les cellules souches hématopoiétiques conditionnées selon l'invention, transduites avec un vecteur portant un gène correcteur du gène déficient mis en évidence dans la maladie de Fanconi, montrent un avantage sélectif en culture, par rapport aux cellules non transduites. Les inventeurs ont en outre constaté que les cellules souches hématopoiétiques ainsi conditionnées, puis transduites au moyen de vecteurs portant un gène d'intérêt, peuvent également présenter une amélioration qualitative en taille et en nature (présence constatée de BFU-E et CFU-GEMM), par rapport à des cellules non transduites. A titre d'exemple, des cellules souches conditionnées selon l'invention peuvent avantageusement être maintenues en culture pendant une durée d'au moins 2 jours, de préférence d'environ 7 jours correspondant au temps de faisabilité clinique, et pour des besoins d'évaluation, pendant une durée d'au moins 30 jours, de préférence d'au moins 35 jours après transfert de gène. Les cellules transduites sont en effet évaluées en principe à j35 après la mise en culture, en vue de leur utilisation ultérieure. On constate que ces cellules conditionnées avec la composition à activité antioxydante sont capables de surmonter le blocage du cycle cellulaire induit par un traitement à la Mytomicine C (MMC) (10 nM-pendant 7 jours puis 100mM pendant 48heures). Les cellules souches conditionnées par une composition à activité antioxydante sont de préférence des cellules mises en culture en conditions d'hypoxie. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules souches sont ainsi conditionnées en vue de leur manipulation génétique, et en particulier par le transfert de gènes dans ces cellules. Tout type de gène peut être utilisé dès lors qu'il présente par exemple un intérêt thérapeutique. L'invention a donc aussi pour objet une méthode de traitement in vitro de cellules souches, comprenant une étape de conditionnement par une composition à activité antioxydante. La composition à activité antioxydante répond aux définitions données précédemment et est utilisée pour la réalisation de la méthode dans les conditions décrites ci-dessus. Dans le cadre de l'invention, la composition à activité antioxydante est apportée aux cellules souches dès la mise en culture des cellules et par exemple dès leur décongélation. La composition à activité antioxydante peut ensuite être apportée pendant toute la durée de la culture et en particulier lors de chaque renouvellement du milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition à activité antioxydante est ajoutée à la culture de cellules de façon telle que la concentration finale en composition à activité antioxydante est comprise entre 0,5 mM et 10 mM, de préférence entre 1 mM et 2 mM. Avantageusement, lorsque la composition à activité antioxydante est la N-acétylcystéine, la concentration finale de N-acétylcystéine dans la culture de cellules souches hématopoiétiques est d'environ 1 mM. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'utilisation ou la méthode décrites sont caractérisées en ce que les cellules souches sont des cellules souches primaires. S'agissant des cellules souches hématopoiétiques, on notera que les cellules souches primaires hématopoiétiques (ou CFU) sont des cellules multipotentes, caractérisées par leur capacité d'auto-renouvellement d'une part et leur capacité de reconstitution hématopoiétique. Elles sont caractérisées par des marqueurs tels que CD34 et CD38, étant soit CD34 positives et CD38 négatives pour la majorité d'entre elles, ou pour une petite fraction CD34 négative et AC133 positive. Les propriétés de ces cellules en font des candidats particulièrement intéressants dans le cadre de protocoles de transfert de gènes, in vitro ou in vivo, mais leur rareté et de ce fait les contraintes qui s'imposent à leur prélèvement chez des patients souffrant de déficit hématologique, renforcent la nécessité de les maintenir en culture dans des conditions permettant leur utilisation efficace. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'utilisation et la méthode décrites sont caractérisées en ce que les cellules souches telles que celles qui on été décrites précédemment sont des progéniteurs. Par rapport aux cellules souches primaires, les progéniteurs ont une capacité d'autorenouvellement plus faible et pour les progéniteurs hématopoiétiques, une capacité à ne restaurer qu'une partie de l'hématopoièse. Les progéniteurs hématopoiétiques, oligopotents, susceptibles d'être traités dans les conditions de l'invention, sont par exemple les progéniteurs lymphocytaires communs (CPL) ou les progéniteurs myéloïdes communs (CMP), ou des progéniteurs érythro/mégacayocytaires (MEPs) ou granulocytes/monocytes/macrophages (GMPs) des cellules présentatrices d'antigènes des cellules dendritiques, notamment des cellules de Langerhans. Alternativement, l'invention permet avantageusement le conditionnement de cellules souches qui sont des précurseurs et selon un mode de réaalisation particulier de l'invention, des précurseurs hématopoiétiques. Ces cellules sont orientées et n'ont plus de capacité d'auto-renouvellement. elles peuvent, par prolifération ou différenciation conduire aux cellules matures de leur lignée. Les cellules souches conditionnées selon l'invention peuvent être des cellules pathologiques. C'est notamment le cas des cellules souches hématopoiétiques prélevées chez des patients atteints de l'anémie de Fanconi, dont le conditionnement selon l'invention et la transduction par des vecteurs rétroviraux est décrite ci-après. Les cellules souches peuvent par exemple être prélevées à partir de la moelle des patients ou à partir du sang de cordon. Les cellules souches que l'on veut traiter selon l'invention peuvent à l'inverse être des cellules normales. Ces cellules peuvent cependant provenir d'un patient souffrant d'une pathologie affectant d'autres types cellulaires ou tissulaires, par exemple de patients souffrant de cancer, de maladies héréditaires du métabolisme, ou de déficits immunitaires ou par exemple du SIDA. Les inventeurs ont ainsi observé que des cellules souches hématopoiétiques d'une patiente souffrant de cancer du sein, ont pu être mises en culture après conditionnement au moyen de compositions à activité antioxydante dans des conditions améliorant leur viabilité et leur état. L'invention a aussi pour objet des cellules conditionnées par une composition à activité antioxydante répondant à l'une quelconque des définitions données ci-dessus, lesdites cellules étant des cellules souches, et en particulier des cellules souches primaires, des progéniteurs ou des précurseurs. Il s'agit avantageusement de cellules souches hématopoiétiques, et par exemple de cellules souches hématopoiétiques CD34+. Comme indiqué précédemment ces cellules peuvent être pathologiques ou normales. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, la composition à activité antioxydante est constituée par la N-acétylcystéine, dans les conditions de concentration décrites ci-dessus. L'invention concerne aussi un milieu de culture formulé pour le conditionnement de cellules souches, comprenant une composition ayant une activité antioxydante. Le milieu de culture répond, en ce qui concerne la composition à activité antioxydante, aux définitions qui ont été données cidessus. Le milieu de culture peut être préparé à partir de milieux disponibles, plus particulièrement de milieux sans sérum. A titre d'exemple on cite le milieu Cellgro SCGM. Dans la partie expérimentale qui suit, l'utilisation d'une composition à activité antioxydante constituée par la N-acétylcystéine est décrite dans le cadre de la transduction des cellules souches hématopoiétiques de patients atteints de l'anémie de Fanconi. Elle peut selon les mêmes modalité être mise en oeuvre dans d'autres pathologies induisant notamment un déficit médullaire. Les figures qui suivent illustrent : Figure 1 : constructions de vecteurs utilisées pour la transduction de cellules souches hématopoiétiques d'un patient atteint de l'anémie de Fanconi. Figures 2 à 5 : analyse de l'effet du conditionnement de cellules souches hématopoiétiques par la N-acétylcystéine (NAC) sur le titre cellulaire, de cellules transduites par le vecteur 4B3 portant le gène normal FANCA (figures 2 et 3), de cellules infectées avec C5 (vecteur FOCHA-neo-IRES-CD24) pendant 15 jours (figure 4) et sur la survie des particules rétrovirales (figures 5). Figure 6 : cellules non transduites formant des CFUs, conditionnées avec l'AMIPOSTINE (a), le VASTAREL (b) et la N-acétylcystéine (c). Exemples Problématique L'anémie de Fanconi : caractéristiques générales La maladie de Fanconi, le Xéroderma pigmentosum et l'Ataxie-télangiectasie constituent des maladies représentatives d'un groupe de maladies génétiques héréditaires rares caractérisées par une hypersensibilité aux agents capables d'altérer l'ADN ; ainsi qu'une prédisposition marquée au développement de proliférations malignes. Ces maladies ont été regroupées sous le terme plus général de MALADIES HEREDITAIRES DE LA REPARATION DE L'ADN. Plusieurs entités génétiques : huit groupes de complémentation Au moins huit groupes de complémentation distincts ont été identifiés sur la base d'expériences de fusion cellulaire FA-A à FA-E (Strathdee et al, Nat Genet 1992a ; 1 (3) : 196-8 ; Joenje et al., Human Genet 97 : 280-282 1996). La proportion de patients appartenant à chacun des groupes reste imprécise, mais FAA est très largement majoritaire (70%). Localisation de cinq gènes (sur huit)/Pathologie moléculaire Le premier pas a été franchi lors du clonage du gène FACC, localisé en 9q22.3, défectueux dans le groupe C de complémentation (Strathdee et colt., 1992 Nature : 356,763-767). L'identification des mutations du gène FAC a été utilisée pour identifier plus précisément la proportion des patients appartenant à ce groupe (Auerbach et colI. Cancer Genet Cytogenet 51 : 1-12,1991 ; Verlander et al., 1994 Am J of Hum Genet 1994 54 : 595-601/IFAR). Whitney et colI. (1995) ont localisé le gène de l'anémie de Fanconi groupe D (FA-D) sur le bras court du chromosome 3. Plus intéressante encore est la localisation contemporaine de la maladie de Fanconi-groupe de complémentation A sur le chromosome 16q24.3 (Pronk et al., Nature Genet. 1995 Nov 11 : 338-340). Cette localisation a représenté le premier pas vers le récent clonage positionnel du gène (Lo Ten Foe et al, Nat Genet ; 14 : 320-323 1996). Vers une Thérapie Génique de la Maladie de Fanconi La maladie de Fanconi a actuellement pour seul traitement efficace la greffe de moelle osseuse, dans la mesure où un donneur histocompatible est disponible. L'opportunité de développer une thérapie génique qui consiste à ajouter une copie normale du gène déficient dans les cellules souches hématopoiétiques représente un objectif d'intérêt majeur, accessible à moyen terme. Cette approche est susceptible de s'adresser à une majorité de malades. Un avantage sélectif in vivo des cellules génétiquement corrigées est attendu. Ce phénomène pourrait permettre une colonisation et une reconstitution sans nécessité de recourir à une myéloablation préalable. La prévention potentielle du syndrome myélodysplasique et de la leucémie devra être évaluée. En effet, le rétablissement d'une hématopoièse fonctionnelle pourrait prévenir la prolifération de clones précurseurs leucémiques porteurs d'altérations génétiques. Situation actuelle du sujet Des tentatives ont été entreprises antérieurement avec le gène FANCC par Liu et coll. (Walsh et al., C Blood 1994 ; 84 : 453-459 ; Liu et al, 1997 Hum Gene Therapy ; 8 : 1715-1730 & Human Gene Therapy ; 1999 10 : 2337-2346). Un essai clinique a été initié au NIH. Tandis que la mobilisation de cellules CD34+ s'est avérée possible, il n'existe aucune évidence à ce jour en faveur de la transduction de cellules hématopoiétiques à durée de vie prolongée. Des limitations d'ordre technologique ont probablement contribué à empêcher un succès clinique. Ces auteurs ont rapporté des données de correction phénotypique avec le gène FANCA. Le vecteur utilisé est le même que pour FANCC et les résultats limités à la transduction de cellules clonogénes, uniquement CFU-G ou CFUGM, sans CFU-E ni CFU-Mix (Fu et al, 1997 Blood ; 90 : 3296-3303). Les inventeurs se sont intéressés à la transduction des cellules avec une capacité de reconstitution hématopoiétique in vivo ; avec le gène FANCA et à des démonstrations préalables avec un gène marqueur au moyen du vecteur du laboratoire. Stratégie et Matériel et Méthodes La stratégie proposée repose sur le transfert rétroviral du gène FAA dans les cellules souches hématopoiétiques ; 10/construction d'un vecteur rétroviral dérivé du virus de Friend (figure 1), à partir des séquences et des vecteurs décrits dans la demande de brevet WO 95/01447, caractérisé par un tropisme hématopoiétique et une haute infectivité ; 20/manipulation génétique de précurseurs CD34+ selon des procédures adaptées à une mise en oeuvre clinique. Matériel & méthodes (cadre général ; état actuel des travaux = étape nOS) 1"/Construction rétrovirale 201 Génération de clones producteurs de hauts titres infectieux 301 Correction phénotypique de lignées Iymphoblastoides de patients FA-A et caractérisation des anomalies moléculaires dans un groupe sélectionné de patients FA-A. 4''/Transduction de progéniteurs hématopoiétiques CD34+ sélectionnés à partir de sang de cordon ombilical de sujets normaux ; en utilisant des procédures conformes à une utilisation clinique 501 Collection de progéniteurs hématopoiétiques CD34+ chez des patients FA-A. Les progéniteurs sont mis en culture en présence de N-acétylcystéine ajoutée pendant la culture de façon à obtenir une concentration finale de N- acétylcystéine de 1 mM. 601 Transduction de progéniteurs de patients FA-A et évaluation in vitro d'une amélioration fonctionnelle potentielle 7 /Reconstitution et/ou persistance à long terme de progéniteurs (normaux ou FAA) génétiquement manipulés dans les souris immunodéficientes 801 Correction phénotypique de cellules de patients FAA transduits avec le gène FAA et reconstitution et/ou persistance à long terme dans les souris immunodéficientes 901 Administration in vivo de particules virales dans les cellules souches hématopoiétiques au moyen d'un dispositif original 1001 Vérification des conditions et procédures de production de rétrovirus défectifs destinés à un usage clinique : mise en conformité avec la réglementation Caractérisation des anomalies moléculaires en vue de la sélection d'un groupe de patients FA-A susceptibles de bénéficier d'une intervention par thérapie génique Les mutations observées sont de nature très diverse (un total d'une centaine est décrit à ce jour), dispersées sur toute la longueur du gène, dont le cadre de lecture est de 4300 nucléotides environ, répartis en 43 exons sur 80 kb environ (lanzano et al, Genomics 1997 ; 41 : 309-314). L'étude initiale (Wijker et al. Eur J Hum Genet 1999 : 7 : 52-9) a pu mettre en évidence des mutations chez seulement 49% des patients (cohorte de 90 malades). Le spectre de mutation est très hétérogène, celui-ci comprenant des mutations ponctuelles (codon stop), des microdélétions, des insertions, des anomalie d'épissage, et une très grande proportion de délétions intragéniques importantes pouvant comprendre jusqu'à 30 des 43 exons du gène FANCA. La méthodologie initialement développée (screening par SSCP, puis séquençage) permettait difficilement de détecter l'ensemble de ce spectre mutation ne/. C'est pourquoi, un protocole original d'identification des mutations a été mis au point. Le test analyse (i) les délétions intragéniques : une PCR multiplex utilisant une combinaison d'amorces est initiée à partir de l'ADN génomique suivie d'une analyse quantitative de la fluorescence par comparaison avec des séquences natives ; et (ii) les mutations après RT-PCR à partir de l'ARN total, détectées par analyse en fluorescence du clivage chimique des mésappariements sur un séquenceur Abot. Cette approche, appliquée sur un échantillon de 26 lignées dérivées de patients FA-A, a mis en évidence au moins une mutation par lignée et 43 allèles mutants sur 52 possibles (Morgan et al. Am J Hum Genet, 1999 ; 65 : 1330-1341). 40% des allèles mutants sont de larges délétions intragéniques qui emportent jusqu'à 31 exons du gène. Ainsi, ce type de mutation pourrait être considéré comme le plus fréquent pour le gène FANCA. Plusieurs point communs de délétion sont relevés et il existe une corrélation significative entre le nombre de points de cassure détecté au niveau d'un intron et le nombre de répétitions Alu qu'il contient. Une recombinaison des séquences Alu pourrait ainsi jouer un rôle dans le mécanisme délétionnel. Des analyses d'éventuelles corrélations phénotype/génotype sont en cours. Correction phénotypique de lignées Iymphoblastoides et de fibroblastes primaires de patients FA-A Lignées Iymphoblastoides Cette étape nous a permis d'authentifier la transduction et l'amélioration fonctionnelle résultante, de cellules de patients plus faciles à cultiver in vitro que des cellules hématopoiétiques primaires. Les jeunes enfants sont ainsi dispensés de prélèvements itératifs de cellules rares et précieuses dont le prélèvement risquerait d'amputer le potentiel hématopoiétique. Une banque de cellules immortalisées a d'ores et déjà été constituée au niveau européen (EUFAR). Les cellules testées ont des mutations caractérisées du gène FANCA ; les cellules témoins comprennent des cellules avec des mutations caractérisées d'un autre gène responsable d'un groupe de complémentation indépendant : le gène FANCC et enfin, des cellules Iymphoblastoides normales dont la cinétique de croissance sert de référence. Les tests de correction reposent sur une analyse moléculaire des cellules génétiquement manipulées et la démonstration d'une amélioration fonctionnelle attribuable au transfert du gène sain. Des vecteurs contrôles véhiculant les gènes marqueurs sont utilisés en parallèle avec les vecteurs PANCA : T CD24. En effet, le cadre de lecture du gène FANCA a été taillé à façon afin de s'adapter aux caractéristiques du site de clonage optimisé, pour la transcription et la traduction du vecteur FOCHA (Cohen-Haguenauer et al, Hum Gene Ther 1998). L'une des constructions est bicistronique (FOCHA-FANCA-IRES-CD24) comportant l'ADNc du gène de Fanconi-A (FANCA) et une séquence IRES suivie de l'ADNc du gène codant pour l'antigène de surface CD24. Cet épitope permet une identification rapide des cellules après fixation à un anticorps antiCD24. Cette construction permet de réaliser très rapidement les étapes initiales de validation de l'expression du gène FANCA et des conséquences fonctionnelles résultantes. La seconde construction (FOCHA-FANCA) ne contient que l'ADNc FANCA à des fins de développements cliniques. Les constructions ont été séquencées ; intégralement pour les parties jonctionnelles en 5'et en 3', soit sur les deux tiers distaux ; une analyse en Fluorescence Activated Mismatch Analysis a été entreprise sur la totalité des cadres de lecture. Aucune incompatibilité avec la séquence canonique telle que dessinée, n'a pu être identifiée. Quelle que soit la construction utilisée (figure 1) (FOCHA-FANCA ou FOCHA-FANCA-IRES-CD24), un échantillon de cellules testées est transduit en parallèle avec le même vecteur transmettant un gène rapporteur. Il s'agit de FOCHA-GFP, véhiculant le gène de la Green Fluorescent Protein (EGFP-1) codant pour la protéine fluorescente verte, utilisée comme marqueur vital dont l'expression dans une cellule donnée peut être suivie dans le temps. L'autre construction utilisée est bicistronique : FOCHA-NEO-IRES-CD24. Les cellules transduites avec ce vecteur peuvent être à la fois repérées par l'expression de surface de l'antigène CD24 et soumises à une sélection pharmacologique par le G418 (généticineR). Cet outil constitue un excellent élément de référence, lors des expériences réalisées avec le vecteur bicistronique FOCHA-FANCA-IRES- CD24. Nous disposons de clones producteurs de pseudotypes amphotrope (A/ Récepteur Pit-2) et de pseudotype primate non-humain Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV/Récepteur Pit-1) à partir de lignées productrices d'origine humaine, TE-FLY dérivées de la cellule TE-671 (Cosset et al, 1995). Les surnageant contiennent de hauts titres avec les quatre vecteurs (entre 5x105 entre 5x106 cfu/ml pour les vecteurs FANCA ; et entre 5x107 à 108 cfu/ml pour les vecteurs véhiculant des gènes rapporteurs). Une première étape consiste à authentifier la transduction et étudier sa stabilité. Elle repose sur la conjonction de tests moléculaires, essentiellement PCR et RT-PCR, suivis de traduction in vitro à partir d'ADN ou d'ARN. Une combinaison judicieuse d'amorces de PCR dont les séquences sont données plus loin, spécifiques soit de séquences propres au vecteur rétroviral, soit du cadre de lecture FANCA, permet d'authentifier au niveau moléculaire la présence et l'expression du transgène. En outre, les mutations endogènes affectant la taille ou la stabilité de l'ARN ou de la protéine traduite, sont visualisées. Une seconde étape repose sur le suivi de l'expression de l'antigène CD24. Cet épitope permet une identification rapide des cellules après fixation à un anticorps anti-CD24 et/ou leur sélection : (i) analyse FACS, (ii) microscopie en fluorescence et confocale ; (iii) ou sélection sur colonnes après fixation (sandwich) sur des billes MACS (Miltenyi-Biotech). Une augmentation hautement significative du nombre des cellules exprimant le CD24 est observée après traitement à la Mitomycine C, puisque les cellules sont pratiquement toutes positives en immunofluorescence. L'étape cruciale correspond à la démonstration d'une correction phénotypique faisant appel à la normalisation des tests fonctionnels en présence de Mitomycine C (ou de Diépoxybutane) qui établissent le diagnostic de la maladie : 101 Cinétique de croissance des cellules génétiquement manipulées versus cellules témoins : (i) numération cellulaire ; (ii) mortalité cellulaire ; (iii) Cycle cellulaire (FACS), avec réversion du blocage massif en G2,48 heures après traitement unique par une dose massive de Mitomycine C (100 nM) ; 201 Analyse des cassures chromosomiques, après un traitement prolongé sur plusieurs semaines (6 semaines pour les lignées Iymphoblastoides), à doses modérées. Fibroblastes primaires (origine médullaire) de patients FA-A Des prélèvements de moelle osseuse ont été réalisés chez six patients FA. Dans chaque cas, des cultures de cellules adhérentes ont été mises en route et des fibroblastes primaires obtenus et amplifiés (culture ménagée en atmosphère hypoxique). Les cellules primaires ont l'avantage, outre de représenter un matériel humain non modifié par une immortalisation artificielle, d'être potentiellement plus sensibles aux effets de la correction phénotypique. Des modifications très manifestes de cinétique de croissance cellulaire ont été observées après infection par un clone FOCHA-FANCA-IRES-CD24. La croissance cellulaire en conditions normoxiques est rétablie. La mise en évidence d'une transduction effective et stable et de la fonctionnalité du transgène est confirmée par une approche en tous points similaire à celle décrite ci-dessus. En particulier, les cellules sont devenues résistantes à de très fortes doses de MMC. Cellules hématopoiétiques primaires de patients FA-A Ceci représente une étape délicate. En effet, les cellules des patients atteints d'Anémie de Fanconi sont caractérisées par un cycle cellulaire altéré. Cet élément ne fait qu'ajouter à la difficulté de recueil des progéniteurs hématopoiétiques d'une part ; et d'autre part à la difficulté technologique de transduction des cellules souches hématopoiétiques. Les données préliminaires des cytaphérèses qui ont été effectuées a minima et prudemment indiquent un rendement très modeste en cellules CD34+ après mobilisation chez les enfants atteints d'Anémie de Fanconi. Il nous est donc apparu indispensable d'avoir recours au prélèvement de moelle osseuse. Ces cellules ont été maintenues en culture avant toute transduction dans un milieu contenant de la N-acétylcystéine ajoutée dès le début de la mise en culture et pendant la durée de la culture, de sorte que la concentration finale de N-acétylcystéine est de 1mM. Des expériences préliminaires ont porté sur des échantillons médullaires prélevés chez des enfants aplasiques juste avant le conditionnement pour greffe de moëlle allogénique. Ces données sont encourageantes car dans ces conditions d'altération extrême de l'hématopoièse, les cultures cellulaires ont pu être maintenues pendant une quinzaine de jours, en hypoxie (5% 02). Même si ces cellules de moelle osseuse ont un potentiel clonogénique initial très faible (2-3 CFU pour 100 000 cellules), la transduction de cellules par un gène marqueur (GFP) est mesurable de l'ordre de 2-5% cellules infectées. L'amélioration du taux de transduction avec des vecteurs contrôles véhiculant des gènes rapporteurs a été permise par l'adaptation des conditions d'oxygénation, l'usage d'antioxydants tels que la N-acétylcystéine, l'utilisation d'un support fibronectine, la nature et la concentration des cytokines utilisées ; Les résultats récemment obtenus sur cinq patients montrent que : (i) nous avons pu rétablir la culture de cellules médullaires par rapport à des témoins ; l'avantage sélectif des cellules efficacement manipulées est manifeste ; (ii) si en l'absence de manipulation génétique, le nombre de CFUs après 10 jours en culture chute à zéro, nous avons pu obtenir, après transfert du gène normal, non seulement le maintien du nombre des colonies mais encore, une amélioration qualitative en taille et en nature avec apparition de colonies érythroides et de colonies mixtes. En parallèle, transduction de progéniteurs hématopoiétiques CD34+ de sujets normaux ; en utilisant des procédures conformes à une utilisation clinique Cette étape est destinée à démontrer un transfert efficace du gène FANCA et une expression résultante à long terme, dans les cellules souches hématopoiétiques humaines, suivant les procédures validées dans notre Laboratoire. Des expériences de reconstitution à long terme chez l'animal ont été pratiquées sur des souris NOD/SCID, avec les constructions véhiculant les gènes marqueurs soit GFP soit Néo-IRES-CD24, dont l'expression a pu être observée à 6 mois. Ceci constitue le meilleur modèle d'évaluation du comportement des cellules souches de patients explantées, modifiées génétiquement in vitro, puis réimplantées. L'absence d'interaction due à la présence de N-acétylcystéine sur la viabilité des particules vecteurs mises en oeuvre dans les expériences de transduction et sur l'infection des cellules cibles par ces particules est présenté sur les courbes constituant les figures 2 à 5. Ainsi, le conditionnement des cellules cibles avec la N-acétylcystéine ne perturbe pas la cinétique des particules vecteurs rétrovirales et n'affecte pas les titres cellulaires des cellules transduites. Les tableaux qui suivent présentent des résultats de numération des cellules souches hématopoiétiques à différents moments de la culture cellulaire, faisant apparaître l'amélioration de l'état des cellules en présence de Nacétylcystéine, cette amélioration étant observée à la fois pour les cellules souches hématopoiétiques transduites et pour les cellules souches hématopoiétiques non transduites, dès lors qu'elles sont conditionnées par la N-acétylcystéine. ouGOS PCR FANCONI (5' 3') RT-PCR (PTT) PTT FAA-S1 CGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG TCT CAA AGT GGA CGG CAT PTT FAA-ATG CGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG GCC GAC TCG TGG GTC CCG PTT FAA-S2 CGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG CGC TCC CTC CTC ACA GAC PPT Fi-53 CGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG TCC CAG GAG CAC TTC CTC PTT FAA-S3N CGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG GTC MC GCA CTG ATG GAT PTT FAT-AU GTC CCC AGC TGA TGA CAA AT PTT FAA-A2 AGC AGC TCC CTC TGT CTC TG PTT FAA-ASTOP (A3) TCA GAA GAG ATG AGG CTC CTG PTT FAA-S1J GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT G TCT CAA AGT GGA CGG CAT TGC PTT FAA-ATGJ GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT G GCC GAC TCG TGG GTC CCG PTT FAA-S2J GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT G CGC Tce CTC CTC ACA GAC TAC PPT FAA-S3 J GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT G TCC CAG GAG CAC TTC CTC TTT PTT FAA-S3NJ GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT G GTC AAC GCA CTG AS MUT TTC e PCR : ANTI 81 GAT CTG AAC TTC TCT ATT CTT G NS1 GAG AAA CTT CTG CTC CCA CG NSZ TTG ACC TCT GCT CTG GTG TG FW 150 ACTGGA ACT TCA AGT AACTCC RV 144 TTT CAC TGG AAT AAA TCT GCG RV 283 AGA GAG AGT GAG ACC ACG AAG JB 2195 CTG GTG GT A TTG Tm AGT CAG G FAA end ORF GCC TGG AGC TCA AGG GTC AGG G Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel ExpCFUasanssans sans sans Normoxie Normoxie Normoxie Hypoxie Numération Numération Numération Numération 11 Javier 8/07/99 J4 12/07/1999 J11 19/07/1999 J13 21/07/1999 1000x1 OE3 Testé 620 x 10E3 Ni 35 x10E3 NI 3. 7 x10E3 Aucune observée J7 15/07/1999 4B3 80x10E3 4B3 33x10E3 360 x 10E3 3B5 55 x 10E3 385 98 x 10E3 #2 Alex 16/09/99J8 24/09/1999 J12 28/09/2000J8 24/09/1999 1000x10E3 NI 27 x10E3 NI 35 x10E3 385 225 x10E &num;3 Alex 15/12/99 200 x 10E3 63 colonies pour 50x10E3 &num;4 Alex 18/01/00 200 x 10E3 #5 Javier 4/05/00 1000x1OE3 Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel #6 Javler 5/06/00 400x1OE3 . Glossaire Ni m non Transduit 4B3 a FOCHA-GFP 385 FOCHA-FANCA Prélèvement : des cellules ont été prélevées pour analyse : Bio Moléculaire/FACS IImmuno-fluorescence Vastarel = Trimétazidine du-chlorhydrate Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel avec Nac avec Nac avec Nac avec Nac avec Nac avec Nac Normoxie Normoxie Normoxie Hypoxie Hypoxie Hypoxie Numération Numération Numération Numération Numération Numération '1 Javier 8/07/99 1000x10E3 #2 Alex 16/09/99 J8 24/09/1999 J8 24/09/1999 1000x10E3 Ni 63x10E3N) 110x10E3 #3 Alex 15/12/99 J5 20/12/1999 J9 24/12/1999 J5 20/12/1999 J9 24/12/1999 200x10E3 N) 88x10E3N) 104x10E3N Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel #6 JavierjaJ16 J21 Prélèvement 5/06/00-- 5/06/00385 200x 10E3 3B5 256x 10E3 3B5 53x 10E3 400x1 OE3 4B3 180x 10E3 4B3 280x 10E3ND i j Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel Exp avec Nac avec Nac avec Nac Hypoxie Hypoxie Hypoxie Numération Numération Numération #1 Javier 1 oooX8/0oE39 9 ~. 8/07/99 1000x10E3 #2 Alex 16/09/99 1000x10E3 &num;3 Alex &num;3 Alex 15/12/99 200 x 10E3 #4 Alex 18/01/00 200 x 10E3 #5 Javier 4/05/00 1000x1 OE3 Cellules moelle osseuse avec et sans NAC e/ou Vastarel #6 Javler J31 Prélèvement J38 J42 Prélèvement 5/06/00 3B5 16x 10E3 3B5 32x 10E3 3B5 32x 10E3 400x1 OE3 NDNDND J50 1 3B5 11x 10E3 1 1 1 1 1 1 Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastare) g g gxir ~% tHasbrel pVasbr I pV tarel s &num;1 Javler ~ ~ ~ l ~ ~ I &verbar; l s/oilss ~.. ~ ~ I I ~ A. ~. A 11000x1OE3 ~ ~ ~ 8 ; ~ ~ j ~--l ExpVastaretVastare) Vastaret Vastaret Vastaret Vastarel M oxie oxie #1 Javier 3tion Numération 8/07/99 . ~ ~ I-s------1---- #2 Alex 8/07/99 1000X10E3. 1#2 Alex 6/09/99 1000X10E3 #3 Alex l 1511 2/991 ~ ~ ~ > ~ ~ 0. ~ 15/12/99 &num;4 Alex ~ ~ ~ ~ ~ l ~ &verbar; ~ 200 x 10E3 #4 Alex 18/01/oo 200 x 10E3 #5 Javier iio J16 #5Javtet-J10'J16"J23' l &num;5 Javler J J10-J16 Cellules moelle osseuse avec et sans NAC et/ou Vastarel 5/06/00385 J16 #6 Javier J8 J16 J21 Prélèvement J31 J38 J42 Prélèvement 5/06/00385 190X10E33B5 168xtOE33B5 38xOE3 3B5 9x10E3 3B5 16xOE3 3B5 MxOE3 400xE3 4B3 230x10E34B3 96x10E3NDNDMDND J50 3B5 5x10E3 385 5x 1 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une composition à activité antioxydante pour le conditionnement in vitro de cellules souches. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition à activité antioxydante comprend la N-acétylcystéine. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que le conditionnement des cellules souches est réalisé dans des conditions permettant le maintien des cellules en culture et/ou de leur amplification, et/ou de leur différenciation. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le conditionnement des cellules souches est réalisé dans des conditions permettant le transfert de gènes dans ces cellules. 5. Méthode de traitement in vitro de cellules souches, comprenant une étape de conditionnement desdites cellules avec une composition à activité antioxydante. 6. Méthode de traitement in vitro selon la revendication 5, caractérisée en ce que la composition à activité antioxydante comprend de la Nacétylcystéine. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, caractérisée en ce que la composition antioxydante est ajoutée au début de la mise en culture des cellules et optionnellement en cours de culture. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou méthode selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que la composition à activité antioxydante est apportée à une culture de cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale dans la culture de 0,5 à 10mM. 9. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des cellules souches primaires. 10. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des progéniteurs. 11. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des précurseurs. 12. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des cellules pathologiques. 13. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des cellules normales. 14. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules souches sont des cellules prélevées chez un patient atteint d'un cancer. 15. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que les cellules souches conditionnées avec une composition à activité antioxydante sont transformées par un vecteur portant une séquence nucléotidique d'intérêt. 16. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que les cellules souches conditionnées avec une composition à activité antioxydante sont des cellules souches choisies parmi les cellules souches hématopoiétiques, les hémangioblastes, les cellules souches du système nerveux central, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules souches musculaires, les cellules souches dérivées de la moelle osseuse, les cellules souches musculaires ou hépatiques dérivées de la moelle osseuse. 17. Cellules conditionnées par une composition à activité antioxydante, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules souches. 18. Cellules selon la revendication 17, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les cellules souches hématopoïétiques CD34+. 19. Cellules selon la revendication 17 ou la revendication 18, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les cellules souches primaires, les progéniteurs ou les précurseurs hématopoïétiques. 20. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisées en ce qu'elles sont de type pathologique. 21. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisées en ce qu'elles ont été prélevées chez un patient atteint de cancer. 22. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur portant un gène d'intérêt. 23. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisées en ce qu'elles sont transduites par un vecteur rétroviral, ou par un vecteur lentiviral. 24. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, caractérisées en ce que la composition antioxydante comprend de la Nacétylcystéine. 25. Cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, caractérisée en ce qu'elles sont choisies parmi les cellules souches hématopoiétiques, les hémangioblastes, les cellules souches du système nerveux central, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules souches musculaires, les cellules souches dérivées de la moelle osseuse, les cellules souches musculaires ou hépatiques dérivées de la moelle osseuse. 26. Milieu de culture formulé pour le conditionnement de cellules souches hématopoïétiques, comprenant une composition ayant une activité antioxydante. 27 Milieu selon la revendication 26 caractérisé en ce qu'il comprend de la N-acétylcystéine à une concentration finale dans la culture d'environ 0,5 à 10mM.