FR 2814070 A1 20020322 FR 0011973 A 20000920 PROCEDE D'EXTRACTION D'UN PRINCIPE ACTIF A BASE DE MAL VA SYL VESTRIS, PRINCIPE ACTIF OBTENU ET TRAITEMENT COSMETIQUE L'UTILISANT La présente invention concerne un procédé d'extraction d'un principe actif à base de MAL SYLVESTRES ainsi que le principe actif obtenu. Ce principe actif est plus particulièrement utilisé pour un traitement cosmétique. Compte tenu des rythmes de vie et des agressions permanentes de la peau par des agents extérieurs, compte tenu des règles alimentaires et du stress quasi continu, il est souhaitable de pallier à certaines carences. De plus, la durée de vie augmente et il est demandé par les consommateurs des produits susceptibles de limiter la dégénérescence et de favoriser la stimulation de prolifération de cellules jeunes tout en influant simultanément sur l'ensemble des paramètres sensibles de la peau. A cet effet, le titulaire a constaté de façon surprenante que la MAL VA SYLVESTRIS qui est une plante bien connue pour des applications ornementales, pour des tisanes émollientes ou encore pour la fabrication d'un actif présente des propriétés permettant d'atteindre les buts fixés dans le préambule. La présente invention est décrite en délai ! ci-après avec des figures annexées qui regroupent les différents résultats obtenus sous forme de tableaux regroupant : - figure 1, les effets du principe actif selon la présente invention sur la prolifération cellulaire, figure 2, les effets de ce même principe actif sur l'activité métabolique, - figures 3A et 3B, les effets du principe actif sur la synthèse des protéines de structure, - figures 4A et 4B, les effets du principe actif sur la synthèse des protéoglycannes, - figure 5, les effets du principe actif sur la synthèse des facteurs de croissance, - figure 6, les effets sur l'effet barrière de la peau, et - figure 7, les effets du principe actif sur les rides. PROCEDE D'EXTRACTION Le principe actif selon la présente invention est obtenu à partir du protocole d'extraction suivant : - solubilisation dans de l'eau à raison de 5 à 25% en volume de feuilles de MAL VA SYL VESTRIS séchées réduites en poudre, - chauffage entre 30 et 80oC, - durée de chauffage et de solubilisation compnse entre 20 min et 4 heures, - séparation des phases solubles et insolubles par décantation et/ou centrifugation et/ou filtration, - filtration en vue de sélectionner la fraction active, - concentration en fraction active de la solution, et - filtration stérilisante. CARACTERISTIQUES DU PRINCIPE ACTIF OBTENU Le principe actif issu de ce procédé se caractérise par la composition suivante et par les caractéristiques suivantes : 1/Matière sèche : Le taux de matière sèche est supérieur à 5g/l, notamment compris entre 5 et 1wog/1 et plus particulièrement entre 10 et 50 g/1. Cette plage est déterminée par passage à l'étuve à 105"C Jusqu'à obtention d'un poids constant. 2/pH : La valeur du pH est comprise entre 4, 0 et 10, 0 plus particulièrement entre 5,0 et 7,0 obtenue par la méthode potentiométrique, à température ambiante. 3/Teneur en sucres totaux : La teneur en sucres totaux est obtenue par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M & al, (1956) Analytical Chemistry, 28, NI 3, p350-356). En présence de phénol et d'acide sulfurique concentré, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. Après refroidissement, la Densité Optique est lue au spectrophotomètre à 490 nm. Une courbe test est établie avec une gamme étalon d'une combinaison de 1/3 de mannose, 1/3 de glucose et 1/3 de galactose, avec des concentrations de 25 à 100 gll. Les valeurs du taux de sucre sont lues sur la courbe directement et dans le cas du principe actif de la présente invention, on obtient des valeurs de sucres totaux comprises entre 5 et 50 gll, plus particulièrement entre 5 et 20g/l. 4/Acides galacturoniques La teneur en acides galacturoniques est obtenue par la méthode suivante (New methad for quantitative determinatian of uranie aeids, B/umenkrantz N and Asbae-Hansen G, Ana/ytiea/Biaehemistry 54, 484-489 (7973)) : En présence d'une solution acide de Borax et d'une solution basique de 3 pheny-phenol, les acides galacturonlques donnent un composé coloré. La densité est lue au spectrophotomètre à 520 nm. Une courbe test est établie avec une gamme étalon d'acides galacturoniques avec des concentrations de 1 mgll à 100 mg/1. 1 Les valeurs du taux d'acides galacturoniques sont lues sur la courbe directement et dans le cas du principe actif de l'invention, on obtient des valeurs comprises entre 0,1 et 10 g/l, plus particulièrement entre 0,5 et 5 g/l. 5/Stabilité Le principe actif est stable à la température jusqu'à 80oC. Le principe actif est également stable dans un mélange éthanol/eau jusqu'à des concentrations de 40 % en volume d'éthanol. EFFETS DU PRINCIPE ACTIF OBTENU : 1/Effets sur la prolifération cellulaire : L'étude est effectuée in vitro afin d'évaluer les capacités du principe actif à favonser l'activité prolifératrice sur des cellules, en l'occurrence des kératinocytes humains, au cours de leur vieillissement. On Incube des kératinocytes pendant 3 à 7 jours en présence du principe actif extrait de MAL SYLVESTRIS à raison de 2% en concentration. On teste ensuite les cellules au cours de leur vieillissement du 2eme passage (P2) au 5'""passage (P5). Les capacités à favoriser l'activité prolifératrice est estimée par dénombrement cellulaire. Les résultats de ces essais sont regroupés dans le tableau de la figure 1 qui montre que l'activité est non seulement restaurée mais également favorisée puisque les rapports comparés à un échantillon témoin sont tous positifs et atteignent 40%. 2/Effets sur l'activité métabolique : Afin dévaluer l'activité du principe actif sur le métabolisme cellulaire, on mesure la capacité de synthèse des protéines totales sur un modèle de kératinocytes humains en cours de vieillissement cutané, c'est-à-dire des kératinocytes humains ayant subi les réplications successives de P2 à P5, et provenant de deux donneurs d'âges différents. On mesure alors le taux de protéines cellulaires totales par une méthode adaptée, notamment la méthode BCA (PIERCE-USA). Le tableau récapitulatif de la figure 2 montre que la synthèse du taux de protéines est tout à fait notable. Le taux de protéines synthétisées en présence de 2% du principe actif selon la présente invention est positif et atteint 18% au quatrième passage et encore 14% au cinquième. Le phénomène est observé aussi bien sur des cellules jeunes que sur des cellules de donneur plus âgé. 3/Effets sur la synthèse des protéines de structure Pour la peau, il est en effet important de renforcer l'effet barrière et de lui conserver une bonne hydratation et l'on sait que les protéines de structure kératinocytaires sont en partie responsables de cet effet barrière. Les trois protéines majeures sont : la Profilaggrine, - l'involucnne, et - la Loricrine. L'étude consiste à évaluer les effets du principe actif sur la synthèse de ces protéines, plus particulièrement à 4% de principe actif. Les ARN totaux sont extraits. Après transcription inverse des ARN, cette évaluation consiste à calculer les rapports des intensités de bandes correspondant à chacune des protéines par rapport à la {;-actinie témoin. On mesure les intensités des bandes obtenues sur des gels adaptés et on exprime cette intensité en pourcentage d'ARNm de chaque protéine par rapport au témoin. Les résultats sont regroupés dans les tableaux 3A et 3B qui montrent respectivement l'un la moyenne des résultats obtenus lors des troisième et cinquième passages et l'autre les résultats obtenus sur des kératinocytes provenant de deux donneurs différents l'un jeune et l'autre plus âgé. On constate que le principe actif agit sur la synthèse des protéines de structure y compris sur des cellules vieillissantes. 1 4/Effets sur la stimulation de la synthèse des protéoglycannes : L'étude porte plus particulièrement sur deux protéoglycannes : la Décorine : localisé dans la matrice, - le Perlécan : protéoglycanne majoritaire de la membrane basale. On opère comme dans le cas des protéines de structure par une transcription Inverse et une extraction des ARN totaux. Les résultats sont regroupés dans les tableaux 4A et 4B. De nouveau, on constate que les effets du principe actif s'exercent sur les cellules jeunes mais aussi sur les cellules vieillissantes. 5/Effets sur la synthèse des facteurs de croissance : Un des facteurs de croissance mitogènes naturels des kératinocytes est le ss. FGF. Il est donc utile de vérifier l'action du principe actif sur ce facteur de croissance. A cet effet, on effectue un dosage du taux de ss. FGF par la méthode ELISA à l'aide d'un test du commerce, notamment celui commercialisé sous la dénomination Quantikine, DFB 50 de la société R & D Systems. Des kératinocytes sont placés pendant 48 heures dans un milieu contenant le principe actif selon la présente invention, dosé à 2%. Les cellules sont ensuite récupérées dans un tampon d'extraction. Le dosage est réalisé sur le surnageant cellulaire. Le tableau de la figure 5 montre les résultats obtenus qui confirment l'action du principe actif sur la synthèse kéranocytaire de ss. FGF avec une action plus prépondérante sur les cellules jeunes. 6/Rôle sur l'effet barrière de la peau : La perte insensible en eau est un bon paramètre pour déterminer si la régulation des échanges d'eau entre la peau et l'extérieur est correcte. Si la peau est lésée, l'eau migre plus facilement vers l'extérieur, ce qui augmente la perte en eau. On peut mesurer cette perte en eau en déterminant le gradient de pression de la couche de vapeur d'eau qui entoure la peau. Il faut amplifier le phénomène pour permettre une mesure significative du différentiel entre le témoin et la zone traitée car les quantités globales de perte d'eau sont extrêmement faibles. Un tel amplificateur connu est le Lauryl Sulfate de Sodium. Les valeurs de perte d'eau sont exprimées en g/m2/h. Les variations en pourcentage par rapport à la zone placebo sont regroupées dans le tableau de la figure 6, sachant que l'étude a porté sur un ensemble de volontaires, que le principe actif était formulé à 3% dans une crème et que l'application était biquotidienne pendant 14 jours. On constate une diminution significative de la perte d'eau de 22%, ce qui confirme l'effet barrière de la peau et permet de lutter contre la sécheresse. 7/Rôle anti-rides La quantification in vivo sur volontaires de l'efficacité anti-rides du principe actif de la présente invention a été évaluée dans une formule cosmétique contenant 3 % de principe actif. On effectue une prise d'empreintes au niveau des pattes d'oie avant et après le traitement biquotidien pendant 28 jours contre placebo. Le test statistique utilisé est le test de Student sur données appariées. Les résultats sont analysés en ce qui concerne les paramètres suivants : complexité, profondeur maximale et volume des rides. Ces résultats sont présentés dans le tableau de la figure 7. On constate une diminution significative de chacun des paramètres complexité, profondeur maximale et volume des rides. A titre d'exemples non limitatifs, on indique ci-après des produits ou compositions cosmétiques comprenant le principe actif de la présente invention seul ou associé à au moins un autre principe actif. Exemple 1 - Huile d'amande douce : 3% - Huile de silicone : 2% - Lanol 1688 : 15% - Montanov : 5% -Sepigel 305 : 0,3% -Principe actif selon la présente invention : 5% - Conservateur : 0,5% - Eau : quantité suffisante pour 100 Exemple 2 : - Lanol 1688 : 3% - Sepigel 305 : 3% - Principe actif selon la présente invention : 3% - Conservateur : 0,5% - Eau : quantité suffisante pour 100 Exemple 3 : - Montanov 202 : 3% - Lanol 99 : 2% -Lanol 1688 : 10% -Sepigel 305 : 3% -Principe actif selon la présente invention : 3% - Conservateur : 0,5% -Eau : quantité suffisante pour 100 Exemple 4 : Montanov 202 : 1,5% - Lanol 2681 : 3% - Lanol 99 : 2% - huile silicone dc 345 : 1% -glycérol : 2% - Sepigel 501 : 2% - éthanol : 7% - Principe actif selon la présente invention : 3% - Conservateur : 0,5% Eau : quantité suffisante pour 100 De façon préférentielle, le traitement cosmétique adapté pour la lutte contre le vieillissement de la peau, mettant en oeuvre le principe actif selon la présente invention consiste en des applications biquotidiennes à raison de 0, 1% à 10% de principe actif dans une forme galénique donnée, pendant une période préférentielle de 28 jours. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un principe actif en vue d'une utilisation pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du protocole d'extraction suivant : - solubilisation dans de l'eau à raison de 5 à 25% en volume de feuilles de MAL VA SYL VESTRIS, - chauffage entre 30 et 80oC, - durée de chauffage et de solubilisation comprise entre 20 min et 4 heures, - séparation des phases solubles et insolubles par décantation et/ou centrifugation, - filtration en vue de sélectionner la fraction active, - concentration en fraction active de la solution, et - filtration stérilisante. 2. Principe actif selon la revendication 1, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matière sèche supérieur à 5 gll, notamment compris entre 5 et 100 g/l, plus particulièrement entre 10 et 50 gll, - pH compris entre 4,0 et 10,0, plus particulièrement entre 5,0 et 7,0, - teneur en sucres totaux comprise entre 5 et 50 gll, plus particulièrement entre 5 et 20 gll, et - acides galacturoniques compris entre 0,1 et 10 g/l, plus particulièrement entre 0,5 et 5 g/I 3. Composition cosmétique en vue de stimuler la synthèse des protéoglycannes, pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce que l'on associe le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0,1 et 10% avec toute forme galénique. 4. Composition cosmétique en vue de stimuler les facteurs de croissance mitogènes naturels, pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce que l'on associe le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0, 1 et 10% avec toute forme galénique adaptée. 5. Composition cosmétique en vue de stimuler la synthèse des protéines de structure, pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce que l'on associe le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0,1 et 10% avec toute forme galénique adaptée. 6. Composition cosmétique en vue de stimuler l'activité métabolique cellulaire, pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce que l'on associe le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0,1 et 10% avec toute forme galénique adaptée. 7. Composition cosmétique en vue de renforcer l'effet barrière de la peau, pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisée en ce que l'on associe le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0,1 et 10% avec toute forme galénique adaptée. 8. Traitement cosmétique de la peau en vue de lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisé en ce que l'on applique sur la peau le principe actif selon la revendication 2 à raison d'un taux compris entre 0,1 et 10% avec toute forme galénique adaptée.