FR 2808194 A1 20011102 FR 0005304 A 20000426 UTILISATION DE PARTICULES HYDROPHILES PORTANT OU NON DES LIGANDS IONIQUES POUR AMELIORER LES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES D'UNE SUBSTANCE AUTRE QU'UN ANTIGENE, ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES AINSI OBTENUES. La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique consistant à mélanger ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne le traitement et/ou la prévention des maladies comprenant un caractère immunogénique comme les cancers ou les infections. L'invention s'intéresse tout particulièrement une composition thérapeutique notamment vaccinale et à leur procédé de préparation. La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après "BVSMTM". Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No, 344 040. Il s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur : - un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers; - une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau; - une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides. Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux BVSM, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés. Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM, leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques. Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français). Ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT W094/20078. La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm. Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys. Acta (1997),1327,32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales. Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N 6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4). Il a aussi été montré qu'ils augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc.... Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport oligonucléotide / BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 %. La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM. L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N 6 pp 511-520). La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM permettent d'améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigène capable de moduler la réponse immunologique. Ces substances sont plus particulièrement : - des adjuvants capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - des cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, des immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies, et/ou du rejet de greffe, - des substances capables de modifier la balance Thl/Th2. On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base de leur expression d'antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules CD4+ sont généralement impliquées dans les fonctions helper . En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Ainsi, deux profils des lymphocytes T helper peuvent être définis : - d'une part, un profil Thl, qui caractérise une réponse à médiation cellulaire, avec l'induction de cytokines notamment d'IL2, d'IL7 et d'interféron gamma, la stimulation des CTL et l'induction d'anticorps de type IgG2a, et - d'autre part, un profil Th2, qui caractérise une réponse à médiation humorale, avec l'induction de cytokines notamment d'IL4, d'IL5 et d'IL10, et la présence d'anticorps de type IgGl et IgE. Les antigènes protéiques, dont la présentation par les cellules présentatrices d'antigènes (APC) est majoritairement faite par le CMH de classe II, induisent une réponse orientée vers les Th2. A l'inverse, l'ADN qui permet après transfection de présenter les antigènes directement sur les CMH de classe I, oriente la réponse immunitaire vers les Thl. Certains adjuvants sont connus pour orienter la réponse majoritairement vers Th1 ou Th2. Par exemple, les sels d'aluminium qui induisent une réponse sérique de type IgG1 sont considérés comme Th2 . A l' inverse des adjuvants comme les dérivés du lipid A (MPL) ou les dérivés du QuilA, qui induisent une réponse IgG2a et CTL, sont considérés comme Thl. Il serait donc utile de disposer de moyens permettant d'agir sur la balance Thl/Th2, ce que précisément se propose de réaliser la présente invention. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention montrent que le BVSM n'agit pas comme un adjuvant, car seul il n'induit pas d'activation du système immunitaire, mais comme un carrier permettant une meilleure pénétration et/ou une meilleure présentation de l'antigène aux cellules présentatrices. Ainsi, les résultats obtenus ont montré l'apport de BVSM sur le pouvoir adjuvant de la CTB, des MPL et des ODN. De façon surprenante, le pouvoir adjuvant est visualisé de manière différente : - sur la réponse IgG sérique, pour laquelle, une forte synergie, dans le cas de la CTB, ou une addition des réponses, dans le cas des ODN CpG, a été obtenue, - sur la réponse IgA, où une synergie est clairement démontrée pour les MPL, - sur la balance Thl/Th2, où même dans le cas d'une réponse quantitativement équivalente (IL2), on observe une différence qualitative de la réponse notamment dans la balance Igl/IgG2a qui reflète un différentiel dans la réponse cellulaire. L'invention a donc tout d'abord pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. Les particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles, ou BVSM, sont avantageusement des vecteurs du type comportant : - un noyau hydrophyle non liquide, constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lesquels sont greffés des ligands ioniques, - une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associés au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. De préférence, les ligands ioniques sont à charge positive, comme des ammoniums quaternaires, et la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol. Dans le procédé de l'invention, le rapport pondéral substance/ particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. Une première classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire comprend des protéines d'intérêt thérapeutique qui jouent un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Il s'agit plus particulièrement d'une cytokine ou d'une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le GCSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceuxci. Une seconde classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire, recouvrant partiellement la précédente, comprend les adjuvants. On entend par adjuvant, une molécule permettant d'amplifier, de réguler ou d'orienter la réponse immune spécifique d'un antigène. Ainsi, afin d'évaluer les propriétés des BVSM sur le pouvoir immunomodulateur de substances autres que des antigènes, diverses molécules appartenant aux principales catégories d'adjuvants ont été testées dans le cadre de la présente invention, comme des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci : des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l'alum, - des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci La substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie de préférence parmi : les adjuvants, capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - les cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, - les immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies et/ou du rejet de greffe, les substances capables de modifier la balance Thl/Th2. Parmi celles-ci, l'invention envisage plus particulièrement comme substance, dont on souhaite améliorer les propriétés immunomodulatrices, les cytokines qui stimulent l'activité des cellules immunitaires, et parmi celles-ci, l'IL2, l'ILll et le GM-CSF. En effet, les cytokines stimulent ou inhibent l'activité des cellules immunitaires . L'invention a aussi pour objet l'utilisation de particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des infections notamment virales, lesdites particules étant associée dans le médicament avec au moins une substance, autres qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire. Dans cette utilisation, la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique ou un adjuvant qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Comme indiqué précédemment, il s'agit dans cette utilisation de l'invention, d'une protéine d'intérêt thérapeutique qui est avantageusement une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci. Il peut aussi s'agir d'un adjuvant, avantageusement choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT ou un mélange de ceux-ci. Dans cette utilisation, l'invention s'intéresse au traitement des cancers du type non immunogénique ou faiblement immunogénique, et/ou au traitement des infections notamment virales comme le sida ou l'hépatite chronique où les immunomodulateurs ont été proposés en complément de traitements thérapeutiques pour activer la réponse immunitaire. Une composition pour la mise en #uvre de cette utilisation comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles dans lesquelles sont incorporées des protéines d'intérêt thérapeutique ou des adjuvants comme définis cidessus. Une telle composition ne comprend pas d'antigène. Le rapport pondéral substances (protéines d'intérêt ou adjuvant)/particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. L'invention se rapporte donc également à une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphile, et au moins une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou un adjuvant, la protéine d'intérêt thérapeutique et 1' adjuvant étant définis comme précédemment . L'invention concerne encore tout particulièrement l'utilisation de particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphile pour la préparation d'une composition vaccinale thérapeutique ou prophylactique, lesdites particules étant mélangées dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. Dans le cas d'une utilisation thérapeutique, l'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, mais aussi des cancers ayant un caractère immunogénique. L'invention concerne donc tout spécialement une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène ou un mélange d'antigènes, des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphile, et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. La substance capable de moduler la réponse immunologique à l'antigène présent dans la composition de l'invention est de préférence un adjuvant. Parmi ceux-ci, l'invention envisage des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci : - des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l'alum, - des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci. Comme indiqué précédemment, le rapport pondéral substance/particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. L'invention est tout particulièrement adaptée à la préparation de composition, plus particulièrement, pour l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre mode d'administration, par exemple parentérale, peut être envisagée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant (i) l'effet chez la souris du BVSM sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de différents adjuvants, et (ii) l'effet chez la souris de la co-administration de la formulation et de différents adjuvants sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent. Les différentes formules (adjuvant BVSM Ag) sont administrées à jO et 21 selon le schéma suivant : Contrôle PBS i. n. C : Contrôle naïf i. n. AS : Ag s. c. AN : Ag i. n. FA : Ag + BVSM i. n. Ax : Ag + Adj X i. n. FX : Ag + BVSM + Adj X i. n. L'immunogénicité est évaluée après le rappel, à j35 : - au niveau sérique, détection par ELISA des IgG spécifiques de chaque split monovalent - au niveau muqueux, détection par ELISA dans les sécrétions nasales et/ou vaginales des IgA spécifiques de chaque split monovalent. Il sera fait référence dans ce qui suit aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente l'analyse au Biacore (résonance plasmonique de surface) de l'association de la CTB avec les BVSM en fonction de la concentration en CTB. La figure 2 représente l'analyse au Biacore de l'association du MPL avec les BVSMTM en fonction de la concentration en MPL. La figure 3 représente l'inhibition de l'association du split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de CTB. La figure 4 représente l'inhibition de l'association de split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de MPL. La figure 5 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation de la CTB et des antigènes grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps la CTB puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B). La figure 6 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation du MPL et des antigènes de la grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps, le MPL puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B). La figure 7 représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non à la CTB. La figure 8 représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non au MPL. La figure 9 représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non aux oligonucléotides. I - Matériel et méthodes. 1) Matériel. Les animaux utilisés sont des souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) provenant du centre d'élevage Janvier (Route des Chênes-Sec - B. P.5 - Le Genest-Saint-Isle), sont acclimatées pendant 7 jours, à raison de 6 souris par cage avant le début de l'étude. 2) Produits. a) BVSMTM. Le BVSMTM utilisé est de type KY : QAE = 2 mEq DPPC/Cholesterol. Il correspond à un noyau polysaccharidique greffé par le glycidyl trimethylammonium et entouré d'une couche de DPPC/ Cholestérol. Ce type de vecteur est décrit dans EP 687 173 . b) Adjuvants. Les 4 adjuvants suivants ont été utilisés : - Sous-unité B de la choléra toxine (CTB) (réf. C9903, Sigma, St Quentin Fallavier, France). - Monophosphoryl, Lipide A (MPL) (réf. R-350, Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, MO). - IL-2 recombinante, Proleukin, activité 16,3. 106 U/mg (Chiron France, Suresnes, France). - Oligonucléotides ODN : 5TCCATGACGTTCCTGAC' (Eurogentec, Bruxelles, Belgique). c) Split Influenza trivalent. Une solution à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec 3 split #uf monovalents de chez Biochem Pharma (Canada). - le split #uf monovalent produit à partir de la souche B/Harbin 7/94. - le split #uf monovalent produit à partir de la souche A/Johannesburg 82/96. - le split #uf monovalent produit à partir de la souche A/Nanchang 933/95. Ces split sont constitués d'un mélange de protéines virales, notamment d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase. d) Formulation. - Formulation antigène + BVSMTM. Une formulation à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec les 3 split #uf monovalents ci-dessus afin d'obtenir un rapport d'HA/BVSM égal à 1/89 : 250 ug d'HA trivalente 22,25 mg de BVSM/ ml. Cette formulation est obtenue par mélange, à volume égal, de 3 formulations à 250 ug d'HA/ 22,25 mg de BVSMTM /ml, de chacun des split monovalents. - Formulation antigène + BVSMTM + adjuvant. A partir de la formulation antigène + BVSMTM, quatre autres formulations avec adjuvant ont été préparées. Ces formulations sont obtenues par dilution de la formulation trivalente à 250 ug d'HA/ ml en présence et par ajout d'adjuvant. La dilution permet d'ajuster la dose d'HA monovalente/ souris/ immunisation à 1,2 ug, soit 60 ug d'HA monovalente/ ml et d'ajouter l'adjuvant dans le volume utilisé pour diluer. e) Témoin. Trois types de témoins ont été préparés : - des témoins split trivalent, dénommés ciaprès AS et AN, préparés par mélange, à volume égal, de 3 solutions à 250 ug d'HA/ml de chacun des split monovalents, - des témoins split trivalent + adjuvant, - un contrôle naïf (PBS 0,22X). Selon la voie d'administration sous-cutanée (AS) ou intranasale (AN) la solution de split trivalent est respectivement préparée en Phosphate Buffered Saline ou en eau stérile. 3) Méthodes. a) Immunisation des souris. - Administrations. L'administration des formules (BVSM Adj Ag) est réalisée sans anesthésie soit par voie : . sous-cutanée : 100 l à la seringue de 1 ml au niveau dorsal pour les contrôles, nasale : 20 l (10 ul/narine) à la micropipette de 10 l pour les échantillons testés et les contrôles, Pour chaque groupe l'immunisation comprend deux administrations, à JO et J21 effectuées selon le même mode. - Prélèvement sanguin. Un prélèvement sanguin d'environ 0,3 ml est réalisé à la veine rétroorbitale à JO (contrôle) et J35. Après formation d'un caillot et centrifugation le sérum est congelé à -20 C jusqu'à utilisation. . Prélèvement des sécrétions nasales. Le lavage des cavités nasales est réalisé à l'aide de 500 l de tampon phosphate salin - BSA 1% introduit dans la trachée en direction des turbines nasales. L'opération est ainsi répétée 3 fois avec le même PBS- BSA 1%. Le prélèvement nasal est conservé dans un tube Eppendorf à -20 C. Les sécrétions nasales sont récupérées à J35. b) Analyse des prélèvements. L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par un test ELISA. Brièvement, les microplaques (Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) sont coatées par le vaccin de la grippe (100 ng de HA/puits dans un tampon carbonate, pH 9,6, 2h00 à 37 C). Après rinçage ( trois fois en tampon PBS-tween pH 7,6) puis saturation par 250 fil/puits d'une solution de PBS-BSA 3% (lhOO à 37 C), les gammes de sérums ou de sécrétions nasales sont incubées 1 heure à 37 C. et rincées de nouveau avec une solution de PBS-tween, pH 7,6. Après rinçage (trois fois) les anticorps sont détectés par des anti IgG murines (réf. A4416 Sigma) ou , anti IgA murines (réf. A4789 Sigma), couplés à la péroxydase. Après une dernière étape de rinçage (cinq fois), le substrat OPD est ajouté (réf. P8287, Sigma 1 pastille dans 5 ml de tampon de révélation + 50 l d' H202, 100 fil/puits). Après 30 minutes d'incubation à 37 C, l'acide chlorydrique 1N (réf. 30024-290, Prolabo) est ajouté (50ul/puits) et l'absorbance est mesurée à 490 nm. Les titres sont définis comme l'inverse de la dilution permettant d'obtenir une DO de 0,1. II - Exemple 1 Influence du mode de préparation des formulations BVSM/ Adjuvant/influenza. Afin d'évaluer le meilleur mode de préparation des formulations BVSM/ Adjuvant/ Influenza, l'association de split Influenza sur les BVSM est étudiée en présence d'adjuvant (CTB ou MPL) en utilisant la résonnance plasmonique de surface (RPS) Biacore X (Pharmacia Biosensor Inc.). Dans cette étude, 20 l d'une suspension de BVSM (50ug/ml en PBS 0,3 X) sont introduits sur des sensorchips hydrophobes (HPA, Biacore, BR-1000-30) à 5 l /min. La figure 1 montre le sensorgramme obtenu par association de la CTB et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en CTB ( 1) 2,5ug/ml ; 2) 25ug/ml ; 3) 250ug/ml en PBS 45mM ) (ce qui correspond à 0,3 X). La figure 2 montre le sensorgramme obtenu par association du MPL et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en MPL (1) l,56ug/ml ; 2) 3,125ug/ml ; 3) 6,25ug/ml ; 4) 12,5ug/ml ; 5) 25ug/ml ; 6) 50ug/ml en PBS 45mM). Dans les deux cas, CTB et MPL, les sensorgrammes obtenus confirment la capacité d'association des BVSM et des adjuvants. Le mode de préparation des formulations BVSM/Adjuvant/split Influenza est alors étudié. Deux méthodes sont utilisées : Dans la première, une solution d'adjuvant est introduite avant l'ajout du split Influenza. Dans la seconde, le split Influenza est introduit avant l'ajout de l'adjuvant. La figure 3 résume les résultats obtenus dans le cas d'un split B Harbin. Des quantités variables de CTB sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) Pas de CTB, 2) 2,5Mg/ml, 3) 25ug/ml, 4) 250ug/ml en PBS 45mM ). Le split monovalent B Harbin à 25ug/ml est ensuite déposé sur le BVSM adjuvante. On note clairement une inhibition de l'association du split sur le BVSM lorsque la CTB est ajoutée avant le split. De la même façon, la figure 4 résume les résultats obtenus dans le cas du MPL et d'un split B Harbin. Des quantités variables de MPL sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) l,56ug/ml ; 2) 3,12ug/ml ; 3) 6,25ug/ml ; 4) 12,5ug/ml ; 5) 25ug/ml ; 6) 50ug/ml en PBS 45 mM ). Le split à 25ug/ml est ensuite déposé sur les BVSM adjuvantes. Comme pour la CTB et proportionnellement à la quantité de MPL, il existe une inhibition de l'association du split sur les BVSM lorsque l'adjuvant est ajouté avant le split. La figure 5 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le cas de la CTB. En A, la CTB est ajoutée sur les BVSM immobilisés, puis le split monovalent est introduit. En B, le split monovalent est ajouté sur les BVSM immobilisés, on introduit ensuite la CTB. On constate que lorsque l'antigène est ajouté avant la CTB, il existe une diminution de cette association du split sur les BVSM. A l'inverse, lorsque la CTB est ajoutée après le split, le BVSM permet l'association d'une quantité supplémentaire de matériel correspondant à la CTB. Ainsi pour préserver le rôle du BVSM comme Antigen Carrier , il est important de maintenir un mode de préparation dans lequel la CTB est ajoutée sur les formulations BVSM/split. De la même façon, la figure 6 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le cas du MPL. En A, le MPL est ajouté avant le split. En B, c'est l'inverse. Lorsque l'antigène est ajouté avant le MPL, il n'existe pas de modification significative de l'association split/BVSM, mais le BVSM permet d'associer une quantité supplémentaire de matériel correspondant au MPL. Il semble donc possible de définir un mode de préparation des formulations adjuvantées dans lequel : - l'adjuvant est ajouté sur les formulations BVSM/antigène - le rôle du BVSM comme Antigen Carrier est préservé. III - Exemple 2: Effet de la CTB sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza. 1) Protocole. La formulation antigène + BVSMTM est préparée comme mentionné dans la partie Matériel et méthodes . Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions mais en absence de BVSMTM aboutissant à un Split trivalent à 250ug d'HA(83ug/souche)/ml. Une solution de CTB est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes. 36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisées en 6 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit précédemment. Le tableau 1 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe. Tableau 1 Code Groupe (nombre Route Formule administrée de souris) Quantité/ dose C Contrôle naïf i. n. 20 )il PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM AS Ag s.c. s.c. 3,6 g HA AN Ag i.n. i.n. 3,6 g HA FCTB Ag + BVSM + CTB i . n . 3 , 6 g HA + 320,4 g BVSM + 1 g CTB ACTB Ag + CTB i . n . 3,6 g HA + 1 g CTB Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales et leurs analyses comme indiqué dans la partie Matériel et méthodes . 2) Résultats. La figure 7 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris. Elle permet de comparer les résultats des formulations trivalentes contenant la CTB (F-CTB) à différents témoins. Ces témoins sont soit des témoins antigènes seuls, soit des témoins antigènes associés à la CTB, soit la formulation de référence (ratio HA/ BVSM : 1/89) . Ces résultats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang. De façon attendue, la formulation de référence (FA) induit un taux d'anticorps de type G équivalent au témoin antigène seul administré par voie sous cutanée (AS) et un taux plus élevé d'IgG que le témoin seul administré par voie nasale (AN) (22,4X). Les témoins antigènes associés à la CTB ( ACTB) administrés par voie nasale induisent des IgG nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation de 22,4X). Parallèlement ces formulations (Ag +CTB) (ACTB) induisent une forte immunité mucosale. La formulation associée à l'adjuvant CTB (FCTB) induit une réponse IgG spécifique nettement supérieure à la formulation de référence (FA) et à son témoin de référence (ACTB). Pour cet adjuvant, il existe une effet de synergie important entre la CTB et les BVSMTM ainsi, les taux d' IgG sérique obtenus sont multipliés par un facteur de 3,7 par rapport à la formulation de référence FA. A l'inverse, et en présence d'une activité adjuvante mucosale importante de la CTB, avec certainement un effet de saturation de la réponse biologique, il est difficile à ce stade de définir le potentiel de synergie de la réponse IgA pour ce type adjuvant et les BVSMTM. IV - Exemple 3: Effet du MPL sur la réponse immunologique des formulations BVSMTM/Influenza. 1) Protocole. Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche)/de split Influenza. Une solution de MPL est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes. 36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 6 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie Matériel et méthodes . Le tableau 2 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe. Tableau 2 Code Groupe Route Formule administrée (nombre de souris) Quantité/dose C Contrôle naïf (6) i.n. 20 l PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM AS Ag s.c. s.c. 3,6 g HA AN Ag i.n. i.n. 3, 6 HA FMPL Ag + BVSM + MPL i . n . 3 , 6 g HA + 320,4 g BVSM + 5 g MPL AMPL Ag + MPL i.n. 3 g HA + 5 g MPL Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme décrit dans la partie méthodes. L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par test ELISA. 2) Résultats. La figure 8 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrés avec les formulations adjuvantées par le MPL. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang. Les split influenza virus associés au BVSM ou au MPL administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une forte immunité mucosale. La formulation associée à l'adjuvant MPL induit une réponse IgG spécifique similaire à la formulation de référence. A l'inverse, pour cet adjuvant il existe un effet de synergie important entre le MPL et les BVSMTM. Ainsi les taux d'IgA obtenus sont multipliés par un facteur de 2. 7 par rapport à la formulation de réf. (Ag/BVSM) (FA). Ainsi, à l'inverse de la réponse IgG, un fort potentiel de synergie entre la MPL et les BVSM peut être démontré pour la réponse mucosale. V - Exemple 4 : des Oligonucleotides sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza. 1) Protocole. Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche)/de split Influenza Une solution d'oligonucléotide (ODN) est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes. 42 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 7 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie Matériel et méthodes . Le tableau 3 résume le traitement de chaque groupe. Tableau 3 Code Groupe Route Formule administrée (nombre de souris) Quantité/dose C Contrôle naïf i. n. 20 l PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM AS Ag s.c. s.c. 3,6 g HA AN Ag i.n. i.n. 3,6 g HA FODN Ag + BVSM + ODN i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM + 1 g ODN1 AODN Ag + ODN i.n. 3 , 6 g HA + 1 g ODN1 Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme indiqué dans la partie méthode. L'analyse des sérums et des sécrétions nasales est réalisée par test ELISA comme décrit précédemment. 2) Résultats. La figure 9 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées avec les formulations adjuvantées par les oligonucléotides. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang. Les split influenza virus associé au BVSMTM ou aux ODN administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevée que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une forte immunité mucosale. La formulation associée à l'adjuvant ODN induit une réponse IgG supérieure à la formulation de référence et à son témoin de référence (Ag + ODN). Pour cet adjuvant, il semble exister une additivité des réponses, les titres IgG obtenus pour la formulation étant égaux à la somme des réponses obtenues pour l'antigène + ODN1 (AoDN1) et pour la formulation de référence (Ag + BVSM) (FA). VI - Exemple 5 : de la balance IgG2a/IgGl par adjuvantation des formulations BVSM/Influenza. 1) Protocole. Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche)/ de split Influenza. A partir de la formulation trivalente, trois formulations adjuvantées sont obtenues: BVSM /Ag/CTB: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de CTB. BVSMTM /Ag/IL2: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution d'IL-2 recombinante BVSMTM /Ag/MPL: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de MPL 54 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l' étude) sont divisés en 9 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement et les prélèvements sont réalisés comme décrit dans la partie Matériel et méthodes . Le tableau 4 ci-dessous récapitule ces traitements. Tableau 4 Code Groupe Route Formule administrée (nombre de souris) Quantité/dose C Contrôle naïf i. n. 20 {il PBS 80 mOsm/kg FA Ag + BVSM i.n. 3 , 6 fig HA + 320,4 g BVSM AS Ag s.c. s.c. 3, 6 g HA Fera Ag + BVSM + CTB i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM ~~~~~~~~~~ + 1 g CTB ACTB Ag + CTB i . n . 3 , 6 g HA + 1 g CTB FMPL Ag + BVSM + MPL i . n . 3 , 6 g HA + 320,4 g BVSM + 5 g MPL AMPL Ag + MPL ( 6 ) i . n . 3 g HA + 5 g MPL FIL Ag + BVSM + IL-2 i.n. 3,6 g HA + 320,4 g BVSM + 0,613 g IL-2 AIL Ag + IL-2 i.n. 3 , 6 g HA + 0,613 g IL-2 L'analyse des sérums est réalisée par test ELISA tel que décrit précédemment, en utilisant soit un anti IgG2a murine, soit un anti IgGl murine. 2) Résultats. Le tableau 5 ci-dessous résume les résultats obtenus en terme de sous-type de gamma globuline (IgG2a et IgGl) des différentes formulations BVSMTM/influenza adjuvantées et des contrôles correspondants après administration nasale. Par rapport à l'antigène libre administré par voie sous-cutanée, la formulation BVSM/influenza administrée par voie nasale induit une modeste augmentation de production IgG2a spécifique. Par comparaison l'adjonction de la CTB à la formulation Ag/BVSMTM induit une nette augmentation de la production Ig2a (multiplication par 5. 4 de l'index Ig2a/Igl versus Ag S.c). Il est important de noter que cette modification de la balance Thl/Th2 n'est pas prévisible à partir des résultats obtenus par l'association de la CTB aux antigènes. En effet, dans ce groupe contrôle, il existe un abaissement de l'index Ig2a/IgGl. Tableau 5 Route IgG2A IgGl Index Ratio versus IgG2a/IgGl Ag s.c. Contrôle naïf i.n. 0 0 0 0,0 Ag s.c. s.c. 157 23355 6,7 1,0 Ag i.n. i.n. 0 9793 0,0 0,0 Ag+BVSM i.n. 572 65699 8,7 1,3 Ag+CTB i.n. 87 44771 1,9 0,3 Ag+BVSM+CTB i.n. 2506 68877 36,4 5,4 Ag+MPL i.n. 143 3003 47,6 7,1 Ag+BVSM+MPL i.n. 101 10561 9,6 1,4 Ag+IL-2 i.n. 0 3234 0,0 0,0 Ag+BVSM+IL-2 i.n. 26 24952 1,0 0,2 A l'inverse, le MPL qui lorsqu'il est associé au split influenza favorise la production IgG2a (index 47.6 versus 6. 7 pour les Ag s. c) n'entraîne qu'une modification mineure de la balance Thl/Th2 après association avec les formulation Ag/BVSM. Finalement, l'association IL2 aux formulations Ag/BVSM permettent de modifier la balance Thl/Th2 comme nous pouvons le visualiser sur l'abaissement de l'index IgG2a/Igl. Ainsi, même en absence de modification quantitative de la réponse immunologique l'association d'adjuvant aux formulations Antigène/BVSM permet d'induire une modification qualitative de la réponse immunologique. Cette association devrait permettre par un choix correct de l'adjuvant utilisé d'adapter la balance Thl/Th2 à la stratégie vaccinale proposée. REVENDICATIONS 1) Procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport pondéral substance/particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un adjuvant. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT ou un mélange de ceux-ci. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une substances capable de modifier la balance Thl/Th2. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un immunosupresseur. 9) Utilisation de particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des maladies virales, lesdites particules étant associées dans le médicament avec au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire. 10) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire ou un adjuvant, ou un mélange de ceux-ci. 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci. 12) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, ou un mélange de ceux-ci. 13) Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles, et au moins une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou un adjuvant, ou un mélange de ceux-ci. 14) Composition thérapeutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci. 15) Composition thérapeutique selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT ou un mélange de ceux-ci. 16) Utilisation de particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphile pour la préparation d'une composition vaccinale, lesdites particules étant mélangées dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. 17) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant. 18) Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci. 19) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, pour la préparation d'une composition vaccinale destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, ou des cancers. 20) Composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène ou un mélange d'antigènes, des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphile, et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. 21) Composition vaccinale selon la revendication 20, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant. 22) Composition vaccinale selon la revendication 21, caractérisée en ce l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci.