FR 2810986 A1 20020104 FR 0008436 A 20000629 PEPTIDES ANTIBACTERIENS ET ANTIFONGIQUES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT. La présente invention à pour objet de nouveaux peptides ayant des propriétés antibactériennes et antifongiques. L'invention concerne également la préparation de ces peptides et les compositions les contenant utilisables en agriculture et en thérapie humaine ou animale. La production de peptides antimicrobiens représente, chez une grande variété d'espèces animales et végétales, un mécanisme essentiel de défense immunitaire contre les infections. En particulier, les insectes présentent une résistance très efficace contre les bactéries et les champignons. Cette réponse repose pour une large part sur la synthèse rapide de plusieurs familles de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité. Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par l'injection d'une faible dose de bactéries. A ce jour, les peptides antimicrobiens d'insectes ont été surtout caractérisés à partir d'insectes ayant une métamorphose complète pendant le développement, par exemple les diptères, lépidoptères et coléoptères. Parmi les peptides antibactériens induits chez ces insectes, on peut distinguer les quatre groupes suivants : - Des peptides cationiques de 4 kDa, formant deux hélices a amphipathiques. Dans ce groupe, on classe en particulier les cécropines. - Des peptides cationiques riches en proline, de taille comprise entre 2 kDa et 4 kDa qui peuvent-être glycosylés, comme par exemple, la drosocine, la pyrrhocoricine, et les lébocines, ou non glycosylés comme par exemple, les apidaecines et les métalnikowines. - Plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaires de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme par exemple les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines et la coléoptéricine. - Des peptides comprenant des ponts disulfures intramoléculaires. Dans ce groupe, on classe les défensines d'insecte 4 kDa, 3 ponts disulfure), la drosomycine (4 kDa, 4 ponts disulfure) et la thanatine (2 kDa, 1 pont disulfure). Dans les séquences peptidiques rapportées ciaprès, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous. A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine Peu de travaux ont été entrepris à ce jour sur les insectes à métamorphose incomplète, en particulier les polynéoptères. Or il a précisément maintenant été isolé, à partir d'un insecte à métamorphose incomplète, le termite Pseudacanthotermes spiniger, un peptide, qui présente des caractéristiques remarquables ainsi que des propriétés antibactériennes et antifongiques. Ce peptide qui sera aussi désigné ci-après spinigérine répond à la formule ci-dessous aussi donnée en annexe sous le numéro ID NO :1. H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L Cette molécule, de taille réduite, ne comporte pas de résidus cystéine. La Demanderesse a étudié la conformation spatiale de la molécule et les mutations susceptibles d'être réalisées sur sa séquence de façon à augmenter ses propriétés bactéricides et/ou fongicides. La présente invention a donc pour objet un peptide de séquence (I) suivante : 1 y2 e3 4 5 - est un acide aminé hydrophobe, - 0 est un acide aminé chargé négativement ou de nature polaire/large, - a est un acide aminé choisi parmi la glycine, la sérine, l'alanine ou la thréonine, Les peptides de formules (I) présentent avantageusement une conformation en hélice alpha. Ainsi, ss,#, # et #sont choisis de façon à ce que lesdits peptides de formule (I) présentent une telle conformation. On entend par fragments de la séquence cidessus, un peptide constitués d'au moins 10 et de préférence d'au moins 20 acides aminés successifs de ladite séquence. A titre d'exemple de tels fragments, l'invention envisage plus particulièrement, un peptide de formule (I) ci-dessus dont un groupe de 1 à 4 acides aminés à l'une et/ou l'autre des extrémités N et/ou C terminales est supprimé. De tels peptides sont ceux dont un ou plusieurs des acides aminés ss1, 2, 63, P4 P5 06O>08P9 01O011 12 <>13 P 14 015 016 Pi7 018 019 P 20 021 022 On entend plus particulièrement par : - acide aminé basique, ceux choisis parmi l'arginine, la lysine ou l'histidine, - acide aminé hydrophobe, ceux choisis parmi la valine, la leucine, l'isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, la tyrosine, ou le tryptophane, - acide aminé chargé négativement ou de nature polaire/large, ceux choisis parmi l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'asparagine, ou la glutamine. Un exemple préféré de peptide selon l'invention est de séquence ID NO : 1 suivante : H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L ou un fragment de celle-ci comme défini précédemment, et plus particulièrement les séquences SEQ ID NO : 2,3, 4 ci-dessous : KKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL (SEQ ID NO : 2) HVDKKVADKVLLLKQLRIMRL (SEQ ID NO : 3) K K V A D K V L L L K Q L R I M R L ( SEQ ID NO : 4) Les peptides de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie génétique. L'invention concerne aussi des équivalents fonctionnels des peptides ci-dessus, dont les séquences d'acides aminés comprennent des délétions, des additions et/ou des modifications conservatives au niveau d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que ces délétions, additions et/ou modification ne modifient pas l'activité antimicrobienne du peptide dont elles sont issues, et par exemple pas la structure en hélice alpha. On peut citer notamment les modifications résultant des processus postraductionnels comme des glycosylation ou de la dégénérescence du code génétique, ou encore des modifications chimiques telles que l'amidation, l'acétylation, l'acylation, le couplage avec des lipides ou des sucres, le couplage avec des nucléotides, etc.... Les équivalents fonctionnels comprennent également des peptides de l'invention dont un ou plusieurs des acides aminés des acides aminés sont des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, la méthyllysine, la diméthyllysine et les acides aminés synthétiques, notamment l'ornithine, la norleucine, la cyclohexylalanine et les oméga-aminoacides. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétro-inversopeptides. L'invention a aussi pour objet l'utilisation des peptides ci-dessus ou d'analogues de ceux-ci, pour prévenir ou traiter une infection fongique ou bactérienne tant chez l'homme et l'animal que chez les plantes. L'invention a donc pour objet une composition, plus particulièrement antibactérienne ou antifongique, comprenant à titre d'agent actif au moins un peptide tel que défini précédemment, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable. Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition à titre pharmaceutique ou agronomique. L'invention concerne tout particulièrement les applications pharmaceutiques chez l'homme et l'animal de ces peptides et des compositions les contenant, mais elle s'intéresse aussi aux applications agronomiques. En effet, les peptides de l'invention sont utiles pour rendre des plantes résistantes contre des maladies notamment fongiques et bactériennes. Une première forme de mise en #uvre de cette application agronomique, consiste à appliquer sur les plantes une quantité efficace de peptide ou d'une composition les contenant. Une seconde forme de mise en oeuvre de cette application agronomique consiste à transformer des cellules végétales ou des plantes avec une séquence d'acide nucléique capable d'exprimer le peptide de l'invention de façon à conférer aux plantes une résistance aux maladies. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la purification et l'identification de la spinigérine, la synthèse de la spinigérine synthétique et son activité antibactérienne et antifongique. Exemple 1 : Matériels et Méthodes utilisés pour la purification et l'identification de la spinigérine. 1) Insectes. Toutes les expériences ont été réalisées avec des adultes essaimants désailés de l'espèce Pseudacanthotermes spiniger (Ordre des isoptères, famille des Termitidae, sous-famille des Macrotermitinae). Ces insectes proviennent d'un élevage réalisé à l'Unité Mixte de Recherche du CNRS développement, Communication chimique , Dijon. 2) Extraction des peptides. L'extraction des composés antimicrobiens a été réalisée à partir des insectes entiers qui ont été congelés dans l'azote liquide. Les termites (200) ont été réduits en fine poudre dans un mortier contenant de l'azote liquide. Les peptides ont été extraits à pH3 par 100 ml d'acide trifluoroacétique (TFA, 0,1%) contenant de l'aprotinine (10 g/ml concentration finale) comme inhibiteur de protéase et de la phénylthiourée (20 M concentration finale) comme inhibiteur de mélanisation. L'extraction a été réalisée dans un bain-marie à eau glacée avec agitation douce durant 30 minutes. Après centrifugation (14 000 x g durant 30 min à 6 C), le surnageant clarifié a été directement déposé sur une cartouche Sep-Pak C18 Vac (5g de phase, Waters) . La cartouche a été conditionnée au méthanol et équilibrée avec de l'eau acidifiée (0,05% TFA), les élutions ont été réalisées avec des solutions de 5%, 40% et 80% d'acétonitrile dans de l'eau contenant 0,05% TFA. La fraction éluée par la solution d'acétonitrile à 40% a été lyophilisée avant passage sur HPLC en phase inverse. 3) Purification des peptides par HPLC. - Etape 1 : La fraction Sep-Pak 40% a été soumise à une chromatographie en phase inverse sur colonne semi-préparative Aquapore RP-300 C18 (250 x 7 mm, BrownleeTM). Equilibrée avec une solution d' acétonitrile à 2% dans de l'eau acidifiée. Les fractions ont été séparées à l'aide d'un gradient linéaire de 2% à 60% d'acétonitrile dans de l'eau acidifiée en 120 min avec un débit de 1,3 ml/min. A l'issue de cette étape, on obtient plusieurs fractions représentées sur la figure 1 présentant une activité antimicrobienne sur les germes suivants : E. coli 363, Neurospora crassa, Micrococccus luteus. Les composés actifs des fractions Fl et F2 ont ensuite été caractérisées. - Etape 2 : La deuxième étape de purification a été réalisée sur colonne analytique Aquapore OD-300 (220 x 4,6 mm, BrownleeTM). L'élution a été réalisée à l'aide d'un gradient biphasique d'acétonitrile dans l'eau acidifiée, de 2 à 18% durant 10 min et de 22 à 42 % durant 100 min avec un débit de 0,8 ml/min. - Etape 3 : La fraction contenant la molécule antimicrobienne a été purifiée à homogénéité en utilisant une colonne narrow bore C18 en phase inverse (Delta Pak HPIC18, 2x 150 mm, Waters'). La colonne a été équilibrée dans de l'eau acidifiée et développée avec le même gradient linéaire d'acétonitrile que celui décrit ci-dessus dans l'étape 2. Toutes les étapes de purification à température ambiante ont été réalisées sur un système Beckman Gold HPLC équipé d'un détecteur Beckman 168 photoarray. Pour les étapes de purification sous température contrôlée, un système HPLC all PEEK Waters (modèle de pompe Waters 626) attaché à un détecteur à absorbance variable (Waters 486) a été utilisé. Au cours des étapes de purification HPLC les molécules éluées de la colonne ont été détectées par leur absorbance à 225 nm. Les fractions ont été collectées manuellement, séchées sous vide (Speed-Vac, Savant) et reconstituées dans de l'eau MilliQ (MilliporeTM) avant analyse de l'activité antimicrobienne. 4) Analyse par spectrométrie de masse. Elle est réalisée selon la technique dite de mesure du temps de vol après désorption laser assistée par matrice (Technique MALDI TOF) en utilisant un spectromètre de masse Bruker (Bremen) BIFLEX. 5) Analyse des séquences. Les séquences des peptides sont analysées selon la méthode de séquençage par dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur Applied Biosystems 473A. 6) Identification des peptides de la fraction F1. Malgré la présence de deux composés peptidiques, la fraction purifiée active contre les souches microbiennes Eschericia coli, Micrococcus luteus et Neurospora crassa, a été soumise au séquençage. L'analyse des signaux PTH-acides aminés a mis en évidence deux séquences, l'une correspondant à une forme tronquée de l'autre dans sa partie N-terminale. Les masses moléculaires calculées à partir des séquences obtenues sont respectivement de 2649,4 et 3000,8 Da. Elles sont en accord avec les masses moléculaires mesurées par spectrométrie de masse MALDI-TOF de 2649,5 Da et 3000,7 Da confirmant que les séquences sont complètes. La molécule de masse moléculaire 2649,5 Da correspond à celle de 3000,7 Da dépourvue des trois résidus de l'extrémité amino-terminale du peptide. Le séquençage d'une fraction voisine (Fraction F2) contenant une molécule de masse moléculaire 2516,2 Da a permis de déterminer une troisième forme du peptide correspondant à la molécule de masse moléculaire 3000,7 Da dépourvue des quatre acides aminés carboxy-terminaux. L'ensemble de ces résultats est rapporté dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Numéro de Masse moléculaire Séquence en acides aminés la fraction (Da) Calculée/Mesurée F1 3000,8 / 3000,7 HVDKKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL 2649,4 / 2649,5 ---KKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL F2 2517,2/ 2516,7 HVDKKVADKVLLLKQLRIMRL---- Exemple 2 synthèse de la spinigérine synthétique. Les peptides selon l'invention peuvent également être obtenus selon un procédé synthèse chimique FMOC (Atherton and Sheppard R. C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis (IRL, Oxford, UK) . La synthèse chimique a été réalisées pour la spinigérine (HVDKKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL ). Le peptide obtenu présente les mêmes propriétés chromatographiques que la molécule native. La masse mesurée est identique à celle de la molécule native. La molécule synthétique présente la même activité antibactérienne que la molécule native sur la bactérie Micrococcus luteus. L'ensemble des tests antibactériens est réalisé avec la molécule synthétique. Cette molécule a des propriétés antibactériennes vis-à-vis des bactéries à Gram négatif et à Gram positif, des bactéries phytopathogènes et des champignons phytopathogènes. Exemple 3 détection des activités antimicrobiennes. La méthode a été utilisée pour la mise en évidence des molécules antimicrobiennes au cours des différentes étapes de purification, pour la détermination du spectre d'activité du peptide et pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) à laquelle le peptide a été actif. La CMI a été exprimée comme un intervalle de concentration [a] - [b] où [a] a été la concentration minimale où l'on observe un début de croissance et [b] la concentration pour laquelle aucune croissance n'a été observée. Des exemples de l'activité spécifique de la spinigérine vis-à-vis des champignons filamenteux et des levures, sont donnés dans les tableaux 2 et 3 ci-après. 1) Détection de l'activité antibactérienne. Pour chaque souche de bactérie utilisée (Bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif), une colonnie isolée est mise en suspension dans 10 ml de milieu PB (Poor Broth, milieu Luria Bertani dépourvu d'extrait de levure) DIFCO et incubée à 30 C pendant une nuit sous agitation lente. Les suspensions de bactéries à tester sont ajustées à une densité optique à 600 nm de 0, 001 dans un milieu de culture frais. On dépose 10 l de chaque fraction dans des plaques de microtitration en présence de 100 l de la suspension bactérienne. Au bout de 24 heures d'incubation à 25 C, on évalue la croissance par la mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un lecteur de plaque de microtitration. Les bactéries sont les suivantes : - Gram positif : Bacillus megaterium, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes. - Gram négatif : Escherichia coli D22, Escherichia coli SBS 363, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa. La tableau 2 ci-dessous rapporte l'activité de la spinigérine contre les bactéries. Tableau 2 Bactéries Spinigérine CMI ( M) Bactéries à Gram positif Bacillus megaterium 0,8-1,5 Micrococcus luteus 0,8-1,5 Staphylococcus aureus ND* Bactéries à Gram négatif Escherichia coli D22 3-6 Escherichia coli SBS 363 3-6 Klebsiella pneumoniae 50-100 Salmonella typhimurium 3-6 Pseudomonas aeruginosa 50-100 *ND : activité non détectée jusqu'à une concentration de 100 M. 2) Test de détection d'activité contre les champignons filamenteux et contre la levure Candida albicans. - L'activité antifongique a été détectée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. Les spores des champignons à tester ont été mises en suspension dans un milieu de culture de type Pomme de terreGlucose . De préférence, on utilise 12 g de milieu Potato Dextrose Broth (Difco) pour 1 1 d'eau déminéralisée. Deux antibiotiques ont été rajoutés au milieu de culture : la tétracycline (concentration finale de 10 ug/ml) et la céfotaxime (100pg/ml). On dépose 10 ul de chaque fraction à analyser dans des plaques de microtitration en présence de 90 l de milieu de culture contenant les spores (à une concentration finale de 104 spores/ml). L'incubation a été réalisée en chambre humide à 30 C durant 48 heures. La croissance fongique a été observée au microscope photonique après 24 h et quantifiée après 48 heures par mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration. - Les différentes souches de levure ont été mises en incubation dans un milieu de culture de type Sabouraud et incubée à 30 C pendant 24 h sous agitation lente. L'échantillon à tester (10 l) a été déposé dans des puits de plaque de microtitration dans lesquels ont été ajoutés 90 l d'une culture diluée de levure dont la densité a été ajustée à DO 600 = 0,001. On évalue la croissance par la mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration. Les champignons filamenteux et levure qui ont été utilisé sont les suivants : Aspergillus fumigatus (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg) ; Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (mycothèque de l'Université Catholique de Leuven, Belgique) ; Neurospora crassa, Fusarium oxysporum, (mycothèque de la Société Clause, Paris) ; Candida albicans (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg). Le tableau 3 ci-dessous rapporte l'activité de la spinigérine contre les champignons. Tableau 3 champignons Spinigérine CMI ( M) Neurospora crassa 3-6 Fusarium culmorum 1,5-3 Nectria haematococca 0,4-0,8 Trichoderma viride 1,5-3 Candida albicans 3-6 REVENDICATIONS 1) Peptide de séquence (I): 1 02 63 4 5 z6 10 11 12 013 P 14 615 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une configuration en hélice alpha. 3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'un groupe de 1 à 4 acides aminés à l'une et/ou l'autre des extrémités N et/ou C terminales est supprimé. 4) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il répond à une des formules suivantes : 4 5 06 67 08 P9 1 02 e3 4 5 z6 67 08 9 010 11 012 13 P14 015 16 17 018 019 20 021 ( III) 4 5 06 67 08 59 10 011 012 013 514 e15 016 P17 18 019 20 021 ( IV) . 5) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les acides aminés basiques sont choisis parmi l'arginine, La lysine ou l'histidine. 6) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les acides aminés hydrophobes sont choisis parmi la valine, la leucine, l'isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, la tyrosine, ou le tryptophane. 7) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les acides aminés chargés négativement ou de nature polaire/large sont choisis parmi l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'asparagine, ou la glutamine. 8) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'une des séquences suivantes : H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L (SEQ ID NO : 1) K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L ( SEQ ID NO : 2) H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L ( SEQ ID NO : 3) K K V A D K V L L L K Q L R I M R L ( SEQ ID NO : 4) 9) Composition antibactérienne ou antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable. 10) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une composition pour le traitement ou la prévention d'une infection fongique ou bactérienne chez l'homme ou l'animal. 11) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une composition pour le traitement ou la prévention d'une infection fongique ou bactérienne chez les plantes.