FR 2809817 A1 20011207 FR 0007108 A 20000602 PROCEDE DE DETECTION DE PRESENCE D'UN LIQUIDE DANS UN MELANGE DESCRIPTION L'invention concerne un procédé de détection de présence d'un liquide dans un mélange. L'invention sera plus particulièrement décrite dans le cadre de la détection de présence d'un liquide, par exemple du sérum, introduit dans un mélange à suite d' opération de pipetage. Le pipetage d'un liquide est une opération consistant à remplir de liquide une pipette aspiration. Les opérations de pipetage se rencontrent, par exemple, en laboratoire pour introduire différents liquides dans des cellules de test communément appelées puits. liquide introduit dans les cellules de test doit alors être en quantité suffisante pour que les résultats des tests puissent être validés. Un défaut de pipetage peut présenter de graves inconvénients. C'est le cas, particulièrement, lorsque le liquide aspiré par pipetage est du sérum destiné à 1a réalisation de tests de dépistage de maladies tels que, par exemple, les tests de dépistage du cancer. La plupart des automates d'analyse ne comprennent pas de système de détection de défaut de pipetage. Les seuls dispositifs connus sont basés sur des mesures effectuées en cours de pipetage. Il peut s'agir de mesures de pression (mesure de la différence de pressions entre un pipetage'd'air et un pipetage de liquide) ou de mesures de suivi d'un signal de détection du liquide en cours de pipetage. Le brevet US 4 794 085 décrit un dispositif détection de défaut de pipetage de liquide qui met oeuvre des mesures de pression. Un tel dispositif nécessite l'utilisation de moyens spécifiques de mesure pression encombrants et difficiles à mettre en oeuvre. Par ailleurs, seul un décrochage du liquide en cours de pipetage peut être détecté. Un pipetage défectueux qui n'est pas dû à un décrochage n'est pas détectable. L'invention ne présente pas les inconvénients mentionnés ci-dessus. En effet, l'invention concerne un procédé de détection de présence d'un liquide dans un mélange, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - constitution d'un premier mélange ne contenant pas iquide à détecter, excitation du premier mélange par un signal lumineux longueur d'onde X, mesure d'un signal de fluorescence S1 issu du premier mélange pendant une durée At proche d'une durée de caractéristique du liquide à détecter, de façon à constituer une grandeur de référence Ro qui soit une fonction du signal mesuré S1, - constitution du mélange à partir de constituants identiques aux constituants qui composent le premier mélange et d'une quantité de liquide à détecter, - excitation du mélange par un signal lumineux de longueur d'onde - mesure d'un signal de fluorescence S11 issu du mélange pendant la durée At proche de la durée de vie 21 de façon à constituer une grandeur R qui soit une fonction du signal mesuré S11, - comparaison de la grandeur R à une quantité k x Ro. , Par durée At proche de la duree de vie i1, il faut entendre une durée suffisamment proche dans le temps de la durée 21 pour que, en présence de liquide dans -le mélange, le signal détecté traduise- sans ambiguïté cette présence. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la constitution du mélange est effectuée par introduction de la quantité liquide à détecter dans le premier mélange. Selon un deuxième mode réalisation de l'invention, la constitution du mélange est effectuée par mélange de la quantité de liquide à détecter et d'un second mélange sensiblement identique au premier mélange. Le mélange contenant le liquide à détecter peut être distribué dans N puits distincts, N étant un nombre entier. Avantageusement, les étapes de constitution du premier mélange, d'excitation du premier mélange, de mesure d'un signal de fluorescence issu du premier mélange et de calcul de la grandeur de référence Ro peuvent n'être effectuées que pour M échantillons, M étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et inférieur ou égal à alors que les étapes d'excitation du mélange, de mesure de signal de fluorescence issu du mélange, calcul de la grandeur R et de comparaison de R avec k x Ro sont effectuées pour chacun des N puits. Dans le cas où une opération de pipetage du liquide à détecter intervient dans la constitution du mélange, le procédé selon l'invention permet détecter les défauts de pipetage. Ainsi l'invention concerne-t-elle également un procédé de détection défaut de pipetage d'un liquide, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un procédé de détection de présence de liquide tel que le procédé selon l'invention mentionné ci-dessus. En outre, la présence du liquide peut être établie avec une grande précision. Il est non seulement possible d'effectuer une mesure qualitative (liquide présent : oui ou non), mais également une mesure quantitative. Un autre avantage de l'invention consiste à pouvoir effectuer la détection du liquide à un moment quelconque après l'introduction du liquide dans mélange. D'autres caractéristiques et avantages l'invention apparaîtront à la lecture d'un mode de réalisation de l'invention fait en référence figures jointes parmi lesquelles - la figure 1 représente un organigramme d un premier mode de réalisation du procédé de détection selon l'invention, - la figure 2 représente un organigramme d'un deuxième mode de réalisation du procédé de détection selon l'invention, - la figure 3 représente un exemple de mode de réalisation de dispositif de mesure pour la mise #uvre du procédé de détection selon l'invention. Sur toutes les figures les mêmes repères désignent mêmes éléments. A titre d'exemple non limitatif, dans la suite description, le liquide dont la présence est à détecter est du sérum. De façon plus générale, l'invention concerne cependant tout type de liquide susceptible d'être détecté par une émission de fluorescence mesurée en temps résolu. La figure 1 représente un organigramme d'un premier mode de réalisation du procédé de détection présence de liquide selon l'invention. Le procédé selon le premier mode de réalisation 1 invention débute par une étape 1 de constitution d'un premier mélange. Le premier mélange ne contient pas de sérum. Le premier mélange comprend au moins un constituant Ci susceptible d'émettre un signal de fluorescence de longueur d'onde ;i sous l'action d'un signal d'excitation de longueur d'onde Une étape 2 d'excitation du premier mélange par signal lumineux de longueur d'onde X succède à l'étape 1. Sous l'action du signal lumineux de longueur d'onde un signal de fluorescence est alors émis par le constituants Ci du mélange. L'analyse du spectre temporel de désexcitation émission d'un signal de fluorescence d'un mélange de constituants montre que le signal émis à la suite d'une excitation impulsionnelle est la somme de signaux élémentaires, chaque signal élémentaire étant caractéristique d'un constituant Ci du mélange. Ainsi le signal de fluorescence F peut-il s'écrire F = E (Ai x exp ( -t / ii ) ) , où Ai et Ti sont respectivement l'amplitude et la durée de vie d'un signal élémentaire caractéristique du constituant Ci. Dans le cas de sérum, par exemple le signal de fluorescence vu à travers un système lecture par photomultiplicateur utilisé en comptage de photons est caractérisé par une durée de vie T1 de l'ordre de 5 gs. Une étape de mesure de fluorescence 3 succède à l'étape d'excitation 2. Un signal de fluorescence S1 est mesuré dans une fenêtre temporelle At de durée proche de la durée de vie caractéristique du signal à détecter. Dans le cas où le liquide à detecter est du sérum, la durée At est, par exemple, l'intervalle de temps (5 us, 20 us) compté à partir de l'instant d'excitation du mélange. Le signal ainsi mesuré permet de calculer, lors d'une étape de calcul , une grandeur de référence Ro. Selon une première variante procédé de l'invention, la grandeur de référence est égale au signal mesuré S1. Selon une deuxième variante, un deuxième signal de fluorescence S2 mesuré, durant l'étape 3, dans une fenêtre temporelle OT extérieure à la durée At. La fenêtre temporelle 4T peut, par exemple, être l'intervalle de temps ( us, 3000 us) compté à partir de l'instant d'excitation du mélange. La grandeur de référence Ro calculée à l'étape 4 alors égale au rapport du signal S1 sur le signal S2. Selon la deuxième variante du procédé l'invention, il vient donc Ro = S1 / S2 L'avantage qu'il y a à établir une grandeur Ro sous la forme d'un rapport des signaux S1 et apparaîtra ultérieurement (cf. étape 8). Une fois la mesure de fluorescence effectuée, sérum est introduit dans le premier mélange lors d'une étape 5. Une nouvelle étape 6 d'excitation du mélange à l'aide d'un signal de longueur d'onde a. succède l'étape et une nouvelle mesure de fluorescence (étape 7) succède à l'étape 6. Un signal de fluorescence est ainsi mesuré dans une fenêtre temporelle At telle que mentionnée ci-dessus. Le signal S11 est alors utilisé pour calculer, lors d'une étape 8, une grandeur R qui une fonction de la quantité de sérum présent dans le mélange. Selon la première variante du procédé de l'invention mentionnée ci-dessus, la grandeur R égale au signal mesuré S11. Selon la deuxième variante un deuxième signal S22 est mesuré lors de l'étape 7. Le signal S22 est mesuré dans une fenêtre temporelle AT telle que mentionnée ci-dessus. La grandeur R calculée à l'étape 8 est alors égale au rapport du signal S11 et du signal S22. Il vient donc R = S11 / S22 Le signal S11 est proportionnel à la quantité de sérum détecté. Le fait de diviser le signal S11 par le signal S22 permet avantageusement de normaliser la mesure S11 en tenant compte de l'absorbance optique du mélange induite par le sérum. La grandeur R est alors indépendante des caractéristiques d'absorbance du sérum et ne représente qu'un niveau relatif du signal sérique. Une comparaison entre la grandeur R et une grandeur égale à k x Ro est alors effectuée (étape 9). Si R est supérieur ou égal à k x Ro, alors la quantité de sérum introduite dans le mélange lors de l'étape 5 est considérée comme suffisante. Sinon, la quantité introduite est considérée comme insuffisante et une nouvelle introduction de sérum doit être effectuée (retour à l'étape 5). Le coefficient k peut avantageusement être choisi en tenant compte des fluctuations statistiques de R pour, par exemple, éviter les détections injustifiées. Dans le cas où eL Ro sont mesurés sensiblement au même instant d'un cycle d'incubation, le nombre k est un nombre supérieur a 1. Dans le où R et Ro sont mesurés à des instants sensiblement différents d'un cycle d'incubation, le nombre peut être inférieur à 1 du fait des fluctuations de signal en cours d'incubation. Dans certaines applications, le mélange de constituants à tester est distribué dans N puits distincts. Avantageusement, les étapes 2, 3 et 4 peuvent 'être effectuées que sur quelques uns, voire un seul, des N puits, alors que les étapes 5, 6, , 8 et 9 concernent l'ensemble des N puits. La figure 2 représente un organigramme deuxième mode- de réalisation du procédé de détection selon l'invention. Le deuxième mode de réalisation du procédé de 1 invention comprend également les étapes de constitution d'un premier mélange (1), d'excitation du premier mélange (2), de mesure d'un signal de fluorescence issu du premier mélange (3) et de calcul la grandeur de référence Ro (4) telles que décrites ci-dessus. Selon le deuxième mode de réalisation de l'invention, la constitution du mélange contenant le liquide à détecter (étape 10) n'est pas réalisée par introduction du liquide à détecter dans le premier mélange mais par mélange d'un second mélange sensiblement identique au premier mélange et de la quantité de liquide à détecter. Par second mélange sensiblement identique au premier mélange, il faut entendre un second mélange contenant les mêmes constituants que le premier mélange en quantités sensiblement identiques. Le mélange contenant le liquide à détecter peut être obtenu par pipetage des différents éléments qui le constituent. Une fois le mélange constitué, le procédé selon le deuxième mode de réalisation de l'invention comprend étapes successives d'excitation du mélange (étape 6), de mesure de fluorescence (étape 7) et de calcul de la grandeur R (étape 8). @La grandeur R est alors comparée à la grandeur Ro (étape 9). Si R est supérieur ou égal à k x Ro, alors la quantité de sérum présente dans le mélange constitué lors de l'étape 10 est considérée comme suffisante. Sinon, la quantité de sérum est considérée comme insuffisante et un nouveau mélange doit être constitué (retour à l'étape 10). Selon une variante du deuxième mode de réalisation l'invention, le premier mélange contient également liquide qui ne présente pas de caractéristiques de fluorescence à la longueur d'onde X. Ce liquide, neutre point de vue des caractéristiques de fluorescence, permet alors au premier mélange d'avoir volume global sensiblement identique au volume global du mélange contenant le liquide à détecter. Il alors possible d'assurer un réglage optimal du dispositif de mesure. De façon générale, l'invention trouve une application particulièrement avantageuse dans cas où les constituants du mélange autres que le liquide dont la présence est à détecter doivent, par ailleurs, être l'objet de mesures de fluorescence en temps résolu. Le dispositif qui permet de mettre en oeuvre les mesures de fluorescence ainsi prévues peut alors également être utilisé pour effectuer des mesures indiquant si la quantité de liquide présent dans le mélange est suffisante. Avantageusement, aucun dispositif supplémentaire propre à la détection du liquide n'est alors nécessaire. C'est le cas, par exemple, lors de la mise en oeuvre de bio-essais tels que, par exemple, des tests immunologiques utilisant des marqueurs de type fluorescent. Dans le cas de tests immunologiques fluorescents en phase homogène et en temps résolu tel que décrit dans le fascicule de brevet publié sous le N 0 539 477, le mélange de constituants comprend un conjugué donneur et un conjugué accepteur. Le conjugué donneur peut contenir une molécule biologiquement active marquée par un cryptate ou un chélate de terre rare mis en tampon et le conjugué accepteur peut contenir une molécule biologiquement active marquée par un composé fluorescent accepteur mis en tampon. A titre d'exemples non limitatifs, la molécule biologiquement active peut être choisie parmi un anticorps un antigène, un peptide, une protéine, un récepteur, un ligand, un acide nucléique, un nucléotide, ou une drogue et le composé fluorescent accepteur peut être choisi parmi les phycobiliprotéines fluorescentes (allophycocyanine, allophycocyanine B, C phycocyanine R phycocyanine) ou des molécules organiques fluorescentes. Les cryptates de terre rare utilisés pour ces bio- essais sont divulgués dans les fascicules de brevet européen déposés au nom de CIS BIO International et publiés sous les numéros EP 0 180 492, EP 0 321 3 et 0 601 113. Le dispositif décrit en figure 3 représente un dispositif de mesure de fluorescence pour la réalisation de bio-essais tels que ceux mentionnés ci- dessus. A ce titre, le dispositif décrit en figure 3 représente un exemple de mode de réalisation de dispositif de mesure de fluorescence en temps résolu pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention. A titre d'exemple non limitatif, dans la suite de la description, le conjugué donneur est un conjugué contenant un anticorps marqué au cryptate d'Europium mis en tampon et le conjugué accepteur est un conjugué contenant un anticorps marqué avec composé fluorescent accepteur. Le liquide introduit dans le mélange est du sérum. Le dispositif de la figure 3 comprend source laser azote 11 émettant une lumière de longueur d'onde 337 nm, une lentille de focalisation 12 associée à un filtre passe bande 13 centré autour de nm, un miroir dichroïque 14, un objectif collecteur 15, un diviseur de faisceau dichroïque 16, un filtre passe- bande 17 centré autour de 665 nm associé à une lentille de focalisation 18, un filtre passe-bande 19 centré autour de 620 nm associé à une lentille de focalisation un photomultiplicateur PMTA pour la détection de photons de longueur d'onde 665 nm, un photomultiplicateur PMTB pour la détection de photons longueur d'onde 620 nm et une cellule test 21 contenant le mélange à étudier (conjugué accepteur, conjugué donneur et sérum). Le miroir dichroïque 14 permet à la lumiere issue de la source laser 11 d'être dirigée, après focalisation (12) et filtrage (13), vers la cellule de test 21. Les constituants du mélange sont alors excités par la lumière qu'ils reçoivent. Un signal utile de fluorescence à la longueur d'onde 665 issu de l'accepteur est mesuré par le photomultiplicateur PMTA. Simultanément, un signal de fluorescence à la longueur d'onde 620 nm issu du cryptate d'Europium est mesuré par le photomultiplicateur PMTB. Le signal issu du cryptate d'Europium est utilisé comme signal de référence. Le résultat de la mesure présente sous forme d'un rapport entre le signal utile issu de l'accepteur et le signal de référence issu du cryptate d'Europium. Une absorption de l'énergie excitation ou de l'énergie d'émission peut alors donner un signal plus faible sans que le rapport ne soit modifié. Dans le cadre d'une mise en oeuvre procédé selon l'invention à l'aide d'un dispositif tel que décrit en figure 3, le signal d'excitation de longueur d'onde a, est signal de longueur d'onde 337 nm issu de la source laser 11, les signaux S1 et S11 mesurés pendant la durée At proche de la durée de vie T1 caractéristique du sérum sont des signaux dont la longueur d'onde est égale, indifféremment, à 620 nm ou à 665 nm et les signaux S2 et S22 mesurés pendant la durée OT extérieure à la durée At sont des signaux dont la longueur d'onde est égale, indifféremment, à 620 nm ou à 665 nm. Comme cela a été mentionné précédemment, le dispositif de mesure de fluorescence de la figure 3 s'applique à une gamme élargie de conjugués donneurs et accepteurs. Ainsi, la source laser 11 peut-elle être une source de lumière dont la longueur d'onde varie sensiblement entre 300 nm et 400 nm. De même, le signal de fluorescence issu du conjugué donneur peut avoir une longueur d'onde I,1 qui varie sensiblement entre 500 nm et 750 nm et le signal de fluorescence issu du conjugué accepteur une longueur d'onde X2 qui varie sensiblement entre 550 nm et 850 nm. Le procédé selon l'invention concerne donc egalement une mise en ouvre selon laquelle la longueur onde a, du signal d'excitation est sensiblement comprise, par exemple, entre 300 nm et 400 nm et longueurs d'onde des signaux de fluorescence Sl, S2, et S22 sont sensiblement comprises, par exemple, dans l'intervalle [500 nm, 750 nm] ou dans l'intervalle [550 nm, 850 nm]. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de présence d'un liquide dans mélange, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - constitution (1) d'un premier mélange ne contenant pas liquide à détecter, - excitation (2) du premier mélange par un signal lumineux de longueur d'onde @" - mesure (3) d'un signal de fluorescence S1 issu du premier mélange pendant une durée At proche d'une duree de vie i1 caractéristique du liquide à détecter, façon à constituer (4) une grandeur de référence Ro qui soit une fonction du signal mesuré S1, - constitution (5, 10) du mélange à partir de constituants identiques aux constituants qui composent le premier mélange et d'une quantité de liquide à détecter, - excitation (6) du mélange par un signal lumineux de longueur d'onde î,,, - mesure (7) d'un signal de fluorescence S11 issu mélange pendant la durée At proche de la durée de T1 de façon à constituer (8) une grandeur R qui soit une fonction du signal mesuré S11, - comparaison (9) de la grandeur R à une quantité k x Ro. . Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que la constitution du'mélange est effectuée par introduction (5) de la quantité de liquide à détecter dans le premier mélange. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'introduction (5) de la quantité de liquide à détecter est réalisée par pipetage. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que la constitution du mélange est obtenu par mélange (10) de la quantité de liquide à détecter et d' second mélange sensiblement identique au premier mélange. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en que le premier mélange contient un liquide qui ne présente pas de caractéristiques de fluorescence ' la longueur d'onde X de façon que le volume global du premier mélange soit sensiblement identique au volume global du mélange. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le premier mélange et le mélange contenant le liquide à détecter sont obtenus, chacun, par pipetage des éléments qui les constituent. . Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce le premier mélange comprend au moins un constituant Ci susceptible d'émettre un signal de fluorescence de longueur d'onde xi sous l'action d'un ignal d'excitation de longueur d'onde @. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé ce que les grandeurs Ro et R sont respectivement égales aux signaux S1 et S11 mesurés. 9. Procédé selon la revendication , caractérisé en ce que le premier mélange comprend moins deux constituants C1 et C2 associés aux longueurs d'onde respectives X1 et k2 et en ce que . signaux de fluorescence S1 et S11 sont des signaux dont la longueur d'onde est égale indifféremment à X1 ou X2. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la grandeur Ro est égale au rapport du signal fluorescence mesuré S1 et d'un signal de fluorescence S2 mesuré pendant une durée d'intégration AT extérieure à la durée At et en ce que la grandeur t égale au rapport du signal de fluorescence mesuré S11 et d'un signal de fluorescence S22 mesuré pendant la durée d'intégration OT. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le premier mélange comprend au moins deux constituants C1 et C2 associés aux longueurs d'onde respectives X1 et X2 et en ce que les signaux de fluorescence S1, S2, S11 et S22 sont des signaux dont la longueur d'onde est égale indifféremment à X1 ou X2. . Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'un premier constituant C1 est un conjugué contenant une molécule biologiquement active marquée par un cryptate ou un chélate de terre rare mis en tampon et un second constituant C2 est un conjugué contenant une molécule biologiquement active marquée par un composé fluorescent accepteur mis en tampon, la longueur d'onde étant sensiblement comprise entre 300nm et 400nm, la longueur d'onde X,1 sensiblement comprise entre 500= et 75 et la longueur d'onde %2 sensiblement comprise entre Onm et 850nm. . Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les molécules biologiquement actives sont choisies parmi les anticorps, antigènes, peptides, protéines, récepteurs, ligands, acides nucléiques, nucléotides, drogues, et en ce que le composé fluorescent accepteur est choisi parmi les phycobiliprotéines, (allophycocyanine, allophyco- cyanine B, C phycocyanine, ou R phycocyanine) des molécules organiques fluorescentes. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce le liquide à détecter est du sérum. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes de constitution (1) du premier mélange, d'excitation (2) du premier mélange et de mesure (3) d'un signal de fluorescence issu du premier mélange sont effectuées sur M échantillons, M étant un entier supérieur ou égal à 1, et en ce que le mélange constitué dans N puits distincts, N étant un entier supérieur ou égal à M, les étapes d'excitation du mélange et de mesure d'un signal de fluorescence issu mélange étant effectuées pour chacun des N puits. 16. Procédé de détection de défaut de pipetage un liquide, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 3, 6, 7 à 15.