FR 2814076 A1 20020322 FR 0012028 A 20000921 AGENT ANGIOGENIOUE ET SES UTILISATIONS La présente invention concerne des composés induisant l'angiogenèse et leurs applications, notamment dans le traitement de certaines pathologies vasculaires L'angiogenèse est un phénomène physiologique fondamental présent tout au long de la vie d'un individu et qui permet de maintenir l'intégrité structurale et fonctionnelle de l'organisme. L'angiogenèse apparaît en réponse à des stimuli locaux qui induisent une cascade d'événements conduisant à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Au cours d'une néovascularisation, les cellules endothéliales représentent l'élément central indispensable à la création de nouveaux vaisseaux. Leur développement et leur croissance sont régulés par des facteurs positifs (angiogéniques) et négatifs (angiostatiques). Au niveau des vaisseaux déjà formés, les cellules endothéliales sont à l'état quiscent. Cependant, en réponse à un stimulus angiogénique, ces cellules se mettent à proliférer et à migrer vers le lieu de création des nouveaux vaisseaux (augmentation de la locomotion) ce qui nécessite la création d'interactions avec les cellules environnantes et avec les éléments de la matrice extracellulaire. Chez l'adulte, l'angiogenèse est un processus clé des fonctions reproductrices (formation du corps jaune, formation du placenta, développement de l'endomètre) et surtout de la réparation tissulaire lors de traumatismes (cicatrisation) et d'ischémies. Il est donc évident que la stimulation de l'angiogenèse par l'administration de molécules exogènes représenterait un progrès important dans la thérapeutique de certaines affections telles que la réparation de plaies cutanées, osseuses, gastriques ou ophtalmiques, par exemple. Les perspectives d'utilisation clinique de tels médiateurs angiogéniques sont également ouvertes pour la régénération tissulaire in Situ de pathologies ischémiques ou pour l'endothélialisation de prothèses. Plusieurs facteurs angiogéniques, capables d'induire III vitro comme in vivo les étapes de l'angiogenèse ont été identifiés (angiogénine, angiopoïétine, interleukine 8 (IL-8), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factors (FGFs), transforming growth factor (TGF) a et P, hepatocyte growth factor (HGF), Plateled-derived endothelial growth factor (PDGF), tumor necrosis factor a (TNFa), vascular endothelial growth factors (VEGFs), placenta growth factor (PIGF). Tous ces facteurs, de nature protéique, font l'objet de recherches intenses sur leurs aptitudes à la réparation tissulaire chez l'homme. Les essais cliniques en phase 1 et II avec les VGEFs et les FGFs ont été débutés. En particulier, ces facteurs sont évalués pour leurs effets thérapeutiques sur les pathologies ischémiques aussi bien cardiaque que cérébrale. Les résultats actuels de ces essais montrent que quel que soit le mode d'administration de ces facteurs (perfusion des protéines recombinantes ou thérapie génique), ces derniers ne manifestent pas l'efficacité thérapeutique attendue (Ferrara N. Alitalo K., 1999 Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nature Med, 5.1359-1364). De nouvelles voies de néovascularisation tissulaire se dirigent actuellement vers des thérapies combinant plusieurs facteurs angiogéniques. La disponibilité des facteurs angiogéniques sous forme de recombinants a permis de montrer que leur application locale pouvait accélérer la guérison des plaies. Le produit qui semble le plus intéressant est le TGFss. Ses propriétés cicatrisantes sont solidement établies depuis plusieurs années et des essais cliniques sont en cours. En tout état de cause, la plupart de ces facteurs angiogéniques sont des protéines assez grosses qui ne peuvent être obtenues que par voie recombinante, ce qui par là même augmente le prix de revient du traitement. C'est pourquoi la présente invention concerne, pour ce type d'application, l'utilisation des tétrapeptides dont la synthèse chimique ne pose pas de problème et dont le prix de revient est assez bas En outre, l'utilisation de tétrapeptides présente, sur le plan industriel, un certain nombre d'avantages parmi lesquels, notamment, le fait qu'ils sont de manipulation plus aisée que des protéines. La présente invention concerne l'utilisation d'un composé de formule 1 RI AI A2 A3 '\ 1 t 1 1 N-CH-Xi-CH-X2-CH-X3-A4-R3 1 / R2 dans laquelle, AI est le radical correspondant à D-ou L-Ser, A2 est le radical correspondant à D-ou L-Asp ou Glu, A3 est le radical correspondant à D-ou L-Lys, Arg ou Orn, A4 est le radical correspondant à D-ou L-Pro, RI et R2 sont choisis indépendamment parmi H, CI-CI2-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, R4CO ou R4COO, R4 étant CI-CI2-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, parmi les substitutions il faut citer OH, NH2 ou COOH, XI et X2 sont des liaisons peptidiques ou pseudopeptidiques, X3 est CO ou CH2 et R3 est OH, NH2, C) C) 2-a ! coxy ou NH-X4-CH2-Z, X4 est un C1-C12-hydrocarbone normal ou ramifié, Z est H, OH, C02H ou CONH2, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables, pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement des pathologies pouvant bénéficier d'une induction de l'angiogenèse. Les peptides ou pseudopeptides correspondant à ces formules sont dérivés de la structure de base tétrapeptide Acétyl-Ser-Asp-Lys-Pro (AcSDKP), ces dérivés étant destinés notamment à augmenter l'activité angiogénique, diminuer les effets secondaires et/ou augmenter la durée de vie en milieu physiologique. La structure de base est une molécule qui a été isolée de la moelle osseuse de veau et dont les applications ont, jusqu'à présent, été liées à une fonction de blocage de la prolifération des cellules souches hématopoïétiques, décrite notamment dans WO 88/00594. Par radical correspondant à il faut entendre le radical A de la formule. NH2-CH (A)-COOH correspondant à l'acide aminé Ainsi, A est - CH20H pour Ser, - CH2COO pour Asp, - CH2-CH2-COOH pour Glu, -(CH2)3-NH-C(NH)NH2 pour Arg, - (CH2) 3-NH2 pour Orn et - (CH2) 4-NH2 pour Lys, pour l'acide aminé terminal A4, il s'agit soit de la structure : =N-CH (A)-CO- ou NH- (CH) A-CO- Par pseudopeptide on entend désigner des composés similaires aux peptides de référence mais dans lesquels une ou plusieurs liaisons peptidiques-C=ONH-ont été remplacées par une liaison équivalente à la liaison peptidique qui est appelée pseudopeptidique, soit-CH2-NH-,-CH2-S-,-CH2-0-,-CO-CH2-,-CH2-CO-, - CH2-CH2- représenté par (-CH2NH) par exemple. Parmi les radicaux RI et R2, on préférera tout particulièrement les radicaux H et (CI-C3)-alkyl-CO- notamment CH3CO ainsi que HOOC-CH2-CH2-CO- 0 De même, R4 est de préférence NH2, OH ou NHCH3 Parmi les composés, il faut citer CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-OH CH3CO-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-- (CH2N)-Pro-NH2 H-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH H-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-OH H-Ser-Asp-Lys-f- (CH2N)-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-- (CH2NH)-Lys-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-OH H-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-Lys-- (CH2N)-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-f- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 H-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2. Parmi les sels pharmaceutiquement acceptables, il faut citer notamment les sels avec des acides non organiques, chlorure, sulfate, phosphate, nitrate, chlorhydrate, mais également avec les acides organiques, notamment lactate, citrate par exemple, ainsi que les sels avec les bases Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que ce tétrapeptide ou des pseudopeptides apparentés de formule 1 étaient capables d'induire l'angiogenèse. Parmi les traitements de pathologies pouvant bénéficier d'une angiogenèse, il faut citer les pathologies vasculaires, notamment dans le traitement des ischémies. Ainsi, les composés selon la présente invention peuvent être utilisés notamment dans les cas suivants 1. induction de la formation de vaisseaux collatéraux dans le cas des pathologies ischémiques : - ischémie myocardique (maladie des artères coronaires, infarctus du myocarde), - ischémie périphérique (occlusion des artères périphériques), - ischémie cérébrales (maladies vasculaires cérébrales), 2. lésions des tissus : cicatrisations et réparations de fractures : - dermatologie : brûlures ou blessures, ulcères chroniques, - ophtalmologie : lésions cornéennes ou rétiniennes, - gastro-entérologie : ulcères gastroduodénaux, - chirurgie des os : réparations des tissus durs : os + cartilage, 3. régénération nerveuse, 4. chirurgie reconstructive, 5 endothélialisation des biomatériaux et d'implants vasculaires, 6. transplantation d'organes (par exemple les îlots de Langherans). La liste précédente ne constitue qu'une partie des applications possibles, notamment dans le cas de traitements combinés, une accélération de l'angiogenèse peut permettre d'accélérer la guérison. Les composés selon la présente invention sont également utiles dans les cultures ex vivo ou in vitro de tissus nécessitant une néovascularisation comme additif d'angiogenèse, par exemple, dans la culture de peau ou dans les enrobages de matériaux par des tissus. In vitro on a pu montrer que AcSDKP est capable de stimuler significativement la croissance des cellules endothéliales veineuses de cordons ombilicaux humains (HUVEC) et des cellules endothéliales provenant des capillaires de cerveaux bovins. ln vivo, l'activité angiogénique de AcSDKP a été testée sur le modèle expérimental de la membrane chorioallantoïde de l'embryon de poulet . Sur ce modèle, AcSDKP induit de façon importante la néovascularisation. D'autre part, une étude préliminaire réalisée sur des cellulaires médullaires a révélé que AcSDKP in vitro augmente l'adhérence de ces cellules sur différents composants de la matrice extracellulaire telles que la fibronectine, le collagène IV et la laminine. Des résultats comparables ont été obtenus dans une expérience préliminaire réalisée avec des cellules endothéliales humaines HUVEC. Il est bien établi que ces interactions entre des cellules endothéliales et la matrice extracellulaire sont déterminantes pour la néovascularisation et interviennent à différentes étapes de l'angiogenèse. En effet, la matrice extracellulaire influence la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires, ainsi que leur capacité à se différencier et à s'organiser en capillaires pour former de nouveaux vaisseaux fonctionnels adaptés à leur micro-environnement tissulaire. Les composés selon la présente invention peuvent être administrés sous une forme pharmaceutique appropriée, par exemple par voie orale, intraveineuse, transdermique, pulmonaire, sous-cutanée, nasale ou autres, avec les formes correspondantes, qu'il s'agisse de comprimés, de solutions injectables ou de pommades, de gels, notamment lorsque l'on souhaitera réaliser des compositions destinées à améliorer la cicatrisation. Dans les revascularisations, notamment dans le traitement des ischémies, on aura de préférence recours à des voies injectables et en particulier à des perfusions. Bien entendu, les composés selon la présente invention pourront être utilisés en combinaison avec d'autres principes actifs destinés éventuellement à traiter directement la pathologie lorsque l'angiogenèse ne constituera qu'une thérapie d'appoint à une thérapie principale, par exemple dans le traitement des ulcères gastroduodénaux. Pour ce qui concerne les doses d'administration, dans les modèles utilisés on a constaté que l'effet angiogénique passait par un maximum pour ensuite redécroître si on augmentait les doses administrées. Il faudra donc éventuellement adapter la dose d'administration au type de pathologie et au patient si cela est nécessaire. Les doses optimales d'administration se situent entre 10' et 10'"M et seront de préférence situées entre 10-6 est 10-8. Les composés selon la présente invention peuvent être synthétisés par des procédés de synthèse de type peptidique ou pseudopeptidique, notamment les procédés décrits dans WO 88/00594 qui décrit la synthèse du dérivé AcSDKP et dans le brevet WO 97/28183 qui décrit la synthèse de pseudopeptides apparentés à AcSDKP. EXEMPLE 1 Les essais suivants ont été réalisés avec le tétrapeptide AcSDKP, on a observé les résultats suivants : AcSDKP stimule significativement la croissance des cellules endothéliales provenant de capillaires de cerveaux bovins (BBC) et des cellules endothéliales veineuses de cordons ombilicaux humains (HUVEC). L'effet mitogène de AcSDKP se manifeste à des concentrations variant entre 10-6 et 10-11 M avec un maximum pour 10'"M. Les résultats de ces études sont rassemblés sur la figure 1. Une étude complémentaire réalisée sur de la moelle totale (contenant entre autre des cellules endothéliales) a montré que AcSDKP in vitro augmente l'adhérence des cellules de moelle sur divers composants de la matrice extracellulaire telles que la fibronectine, le collagène IV et la laminine. La concentration optimum de AcSDKP dans ce type de modèle se situe entre 10-6 et 10-8 M. Des résultats comparables ont été obtenus dans des expériences préliminaires réalisées sur cellules endothéliales humaines HUVEC. Il est bien établi que ces interactions entre les cellules endothéliales et la matrice extracellulaire sont déterminantes pour la néovascularisation et interviennent à différentes étapes de l'angiogenèse En effet, la matrice extracellulaire influence la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires, ainsi que leur capacité à se différencier et à s'organiser en capillaires pour former de nouveaux vaisseaux fonctionnels adaptés à leur micro-environnement tissulaire EXEMPLE 2 Les expériences suivantes ont été réalisées sur le modèle expérimental de la membrane chorioallantoide de l'embryon de poulet et sur ce modèle on a testé l'activité de AcSDKP. On a pu démontrer que AcSDKP induisait de façon significative la néovascularisation. L'augmentation de la densité de la vascularisation varie en fonction de la dose étudiée avec le maximum d'effet (17%) pour la concentration 10-8 M (figures 2 et 3). Les résultats d'une étude in vivo réalisée chez le rat montrent que AcSDKP induit également la néovascularisation chez les mammifères. Dans ces expériences, AcSDKP a été injecté dans le muscle abdominal chez le rat normal (traitement deux fois par jour pendant 5 jours). Une angiographie des parois abdominales réalisée chez l'animal sacrifié le jour 8 a révélé une vascularisation plus développée (augmentation significative du nombre des petits vaisseaux) chez des animaux traités avec AcSDKP à la dose 5 Ilglkglinjection (aucune modification significative de la vascularisation n'a été observée suite à l'administration de AcSDKP à la dose de 50 ug/kg/injection). la perte de l'activité angiogénique de AcSDKP liée avec l'augmentation de la dose administrée que l'on a observée aussi bien in vitro (cellules en culture) qu'in vivo (embryon de poulet et rat) reste en accord avec l'existence de la dose-réponse de AcSDKP précédemment décrite en cloche [ (Guignon M. Bonnet D, Lemoine F., Kobari L., Parmentier C., Mary JY, Najman A. (1990) Inhibition of human bone marrow progenitors by the synthetic tetrapeptide AcSDKP ; Exp. Hematol 18, 1112, Jackson JD, Yan Y., Ewel C., Talmage JE. (1996) Activity of Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (AcSDKP) on hematopoietic progenitors in short term and long-term murine bone marrow cultures. Exp. Hematol., 24, 475)]. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un composé de formule 1 RI AI A2 A3 '\ 1 1 1 N-CH-X,-CH-X2-CH-X3-A4-R3 1 R2 dans laquelle, AI est le radical correspondant à D-ou L-Ser, A2 est le radical correspondant à D-ou L-Asp ou Glu, A3 est le radical correspondant à D-ou L-Lys, Arg ou Orn, A4 est le radical correspondant à D-ou L-Pro, Ri et R2 sont choisis indépendamment parmi H, CI-C, 2-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, R4CO ou R4COO, R4 étant Ci-C) 2-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, parmi les substitutions il faut citer OH, NH2 ou COOH, XI et X2 sont des liaisons peptidiques ou pseudopeptidiques, X3 est CO ou CH2 et R3 est OH, NH2, CICi2-alcoxy ou NH-X4-CH2-Z, X4 est un Ci-CI2-hydrocarbone normal ou ramifié, Z est H, OH, C02H ou CONH2, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables, pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement des pathologies pouvant bénéficier d'une angiogenèse. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les pathologies en cause sont des pathologies vasculaires, notamment les ischémies. 3) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les pathologies en cause sont des pathologies impliquant une lésion des tissus, notamment la cicatrisation et la réparation de fractures. 4) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les pathologies en cause impliquent une régénération nerveuse, une chirurgie reconstructrice, une endothélialisation de matériaux ou une transplantation d'organes. 5) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé de formule 1 est un pseudopeptide dérivé d'un peptide AcSDKP. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi : CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-OH CH3CO-Ser-Asp-Lys-- (CH2N)-Pro-OH CH3CO-Ser-f- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-NH2 H-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH H-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-OH H-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-OH HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-OH H-Ser-T- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-- (CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-T- (CH2NH)-Lys-Pro-NH2 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-T- (CH2N)-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2 H-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2 CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 H-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3 HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2 7) Utilisation d'un composé de formule 1 Ri AI A2 A3 /N-CH-Xi-CH-X2-H-X3-A4-R3 1 R2 dans laquelle, AI est le radical correspondant à D-ou L-Ser, A2 est le radical correspondant à D-ou L-Asp ou Glu, A3 est le radical correspondant à D- ou L-Lys, Arg ou Orn, A4 est le radical correspondant à D-ou L-Pro, Ri et R2 sont choisis indépendamment parmi H, C1-C12-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, R4CO ou R4COO, R4 étant CI-CI2-alkyle substitué ou non, C7-C2o-arylalkyle substitué ou non, parmi les substitutions il faut citer OH, NH2 ou COOH, XI et X2 sont des liaisons peptidiques ou pseudopeptidiques, X3 est CO ou CH2 et R3 est OH, NH2, QC, 2-alcoxy ou NH-X4-CH2-Z, X4 est un C1-C12-hydrocarbone normal ou ramifié, Z est H, OH, CO2H ou CONH2, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables, à titre d'additif d'angiogenèse dans les cultures de tissus ex vivo ou in vitro.