FR 2820424 A1 20020809 FR 0101499 A 20010205 L'invention a pour objet un procédé de purification de la protéine AlpA d'Helicobacter, qui possède les caractéristiques requises pour une mise en oeuvre à l'échelle industrielle. Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien qu'H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Helicobacter, Gastrospirillum hominis a également été décrite chez l'homme. Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100% de celle des pays en voie de développement ; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial. H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori. Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à Helicobacter. A ce jour, plusieurs protéines d'Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et parmi celles-ci, la lipoprotéine AlpA (Adhesin-like lipoprotein A) d'origine membranaire. AlpA et le gène codant pour cette dernière ont été initialement divulgués dans WO 96/41880. Il restait donc à mettre au point un procédé de production et de purification qui permette de réaliser des lots de qualité pharmaceutique. Ainsi, l'objectif principal de la présente invention est de fournir un procédé simple et robuste qui puisse être mis en oeuvre à l'échelle industrielle. Ce procédé doit notamment permettre de produire une quantité importante d'antigène sans avoir à réaliser des investissements coûteux. E. coli est par excellence la bactérie utilisée à titre d'organisme-hôte afin de produire toute sorte de protéines hétérologues par voie recombinante. Lorsque ces protéines ne sont pas solubles ou excrétées d'une manière ou d'une autre, elles peuvent s'accumuler sous forme de corps d'inclusion. Ces corps d'inclusion sont des corpuscules intra-cytoplasmiques propres à E. coli. L'apparition de ces corps d'inclusion est favorisée par un fort niveau d'expression (sur-expression). La purification des protéines recombinantes à partir des corps d'inclusion requiert notamment que ces corps d'inclusion soient solubilisés au préalable. Cette solubilisation est obtenue de manière usuelle avec un agent chaotropique (urée, guanidine) ou un détergent. La protéine recombinante rAlpA, délibérément produite sous forme non-lipidée dans E. coli, garde encore une forte hydrophobicité. Cette forte hydrophobicité intrinsèque rend sa purification difficile par des moyens conventionnels. De plus, la protéine rAlpA se trouve dans les corps d'inclusion d'E. coli et la présence d'un agent chaotropique à forte concentration est quasi obligatoire tout au long de la purification. Pour une solubilisation à pH neutre, la forte hydrophobicité d'AlpA nécessite une forte concentration de guanidine ; cet agent apparaît donc comme un facteur essentiel dans l'opération de solubilisation des corps d'inclusion. Néanmoins, cet agent qui supprime les interactions ioniques et hydrophobes, est habituellement peu utilisable pour la purification par chromatographie et devrait donc être éliminé. D'une manière générale, les chromatographies d'interactions hydrophobes (CIH) sont couramment utilisées afin de purifier des protéines ayant un caractère hydrophobe marqué. Mais, ainsi que mentionné précédemment, lorsqu'une telle protéine se présente dans un milieu à forte concentration de guanidine, l'usage de ce type de chromatographie devient très problématique car la présence de guanidine doit normalement empêche l'adsorption. En effet, un très grand nombre de protéines pouvant s'adsorber dans des conditions classiques sur un support de CIH seraient éluées à forte concentration de guanidine. Or, en ce qui concerne AlpA, on a maintenant trouvé qu'il existait une étroite fenêtre de concentration en guanidine qui permettait à la fois le maintien de AlpA sous forme soluble et son adsorption sur un support de CIH. Cette fenêtre est comprise entre environ 2,5 et 3,5 M. C'est pourquoi l'invention a pour objet un procédé de purification de la protéine adhésinelike A (AlpA) d'Hélicobacter e. g. H. pylori, selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 2,5 à 3,5 M de guanidine avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 3,5 à 4,5 M de guanidine. De préférence, la préparation mise en contact avec le matériel de chromatographie contient 3 M de guanidine et AlpA est éluée avec 4 M de guanidine à pH neutre (6-8 ; e. g. 6, 5- 7,5). Ainsi que mentionné précédemment, une préparation contenant AlpA en présence de guanidine peut être notamment issue d'un procédé de production selon lequel (a) on cultive une bactérie Gram-négative, notamment E. coli, capable d'exprimer AlpA sous forme recombinante, (b) on récupère les cellules bactériennes issues de la culture et on les lyse, (c) on récupère les corps d'inclusions contenus dans les cellules, on les lave et on les solubilise, et (d) de manière optionnelle, on précipite les corps d'inclusion, on élimine le surnageant et on solubilise le précipité. Plus de détails sont donnés ci-après. Les bactéries récoltées après culture sont tout d'abord lysées. La lyse cellulaire peut être réalisée de différentes manières, notamment par microfluidisation. Selon un mode particulier, on peut aussi traiter les cellules à la benzonase au cours de la lyse, afin que l'ADN d'E. coli soit digéré. Les corps d'inclusion sont alors soumis à des lavages successifs ; de préférence dans un tampon contenant une forte concentration de sel afin éliminer les acides nucléiques et de dissocier au mieux rAlpA des contaminants ; de manière appropriée, il peut s'agir d'un tampon sodique e. g. un tampon contenant du NaCI 0,5 M. Les corps d'inclusion sont finalement dissous dans de la guanidine fortement concentrée e. g. de la guanidine 5,5 à 6,5 M, de préférence 6 M. Selon un mode particulier, on préfère éliminer à ce stade une partie des protéines bactériennes contaminantes (e. g. provenant d'E. coli) en précipitant rAlpA de manière sélective par salting out au sulfate d'ammonium. De préférence, le sulfate d'ammonium est du sulfate d'ammonium 0,4 à 0,6 M, e. g. 0,5 M. Le précipité contenant rAlpA est solubilisé à nouveau dans de la guanidine fortement concentrée e. g. de la guanidine 5,5 à 6,5 M, de préférence 6 M. Afin de mettre en oeuvre une chromatographie d'interactions hydrophobes, la préparation est diluée au 1/2 puis chargée sur une colonne appropriée. La chromatographie d'interactions hydrophobes peut être mise en oeuvre de manière conventionnelle en utilisant des supports tels que le Sepharose (Pharmacia) et le FractogelTM (Merck) ou bien encore des supports équivalents à ces derniers tels que ceux trouvés chez Tosohaas ou Biorad. Le ligand peut être un butyl, octyl ou phenyl. La CIH permet notamment la séparation de la protéine AlpA de ses produits de dégradation. Selon un mode préféré, l'éluat issu de la CIH peut être concentré de différentes manières et notamment par ultrafiltration. Il convient aussi d'éliminer la guanidine qui est un produit toxique. A cette fin on peut mettre en oeuvre une étape de diafiltration e. g. de diafiltration tangentielle, contre plusieurs volumes d'éluat de tampon neutre contenant de l'urée de molarité supérieure ou égale à 4 M, de préférence supérieure ou égale à 6 M, de manière préférée de l'urée 8 M ; l'urée étant présente pour assurer le maintien de rAlpA sous forme soluble. Selon un mode avantageux, on utilise 6 à 10 volumes d'urée 7,5 à 8,5 M. Enfin, afin de parfaire la purification, on peut effectuer un polissage par chromatographie d'échanges d'ions, notamment par chromatographie échangeuse d'anions afin d'éliminer les contaminants résiduels provenant d'E. coli. Selon un mode approprié, cette dernière étape est réalisée en présence d'urée 8 M. La préparation de rAlpA issue de la diafiltration est alors appliquée sur du matériel de chromatographie échangeuse d'anions ; les contaminants sont adsorbés sur ce matériel tandis que rAlpA ne s'adsorbe pas et se retrouve dans le filtrat (aussi appelé éluat direct). La présence d'urée 8 M est indispensable pour les raisons suivantes : AlpA est une protéine chargée positivement (pI très élevé) et donc ne devrait pas normalement s'adsorber sur du matériel de chromatographie échangeuse d'anions. Mais son caractère hydrophobe est tellement marqué qu'elle s'adsorberait quand même si l'urée 8 M était absente de la préparation. A cet égard, l'invention concerne également un procédé de purification de AlpA selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et de l'urée 7, 5 à 8, 5 M, de préférence 8 M, avec du matériel de chromatographie échangeuse d'anions de telle sorte que les contaminants s'adsorbent sur ce matériel et (ii) on récupère AlpA dans le filtrat. La chromatographie échangeuse d'anions peut être mise en oeuvre de manière conventionnelle en utilisant des supports tels que le Sepharose (Pharmacia) et le Fractogel (Merck) ou bien encore des supports équivalents à ces derniers tels que ceux trouvés chez Tosohaas ou Biorad. Le ligand peut être une amine tertaire telle que du DEAE (diéthyleaminoéthyle) ou quaternaire telle que le Q (quaternaire, hydroxypropylediéthyleaminoéthyle) et le TMAE (triméthyleaminoéthyle). Un élément particulier du procédé de purification de rAlpA décrit dans son ensemble pourrait être généralisé à tout procédé de purification, quelque soit la protéine recombinante produite dans E. coli sous forme soluble ou sous forme de corps d'inclusion. Il s'agit de la précipitation de la protéine recombinante par le sulfate d'ammonium. Le sulfate d'ammonium est utilisé de manière conventionnelle pour fractionner par précipitation des protéines d'origine plasmatique ou cellulaire. Cependant il n'est pas connu que la précipitation par le sulfate d'ammonium puisse être mise en oeuvre afin de purifier des protéines recombinantes à partir de bactéries telles que E. coli. En outre, l'usage du sulfate d'ammonium à des fins de précipitation en présence d'agent chaotropique tel que l'urée ou la guanidine n'est pas non plus connu à ce jour. C'est pourquoi, sous un autre aspect, l'invention a également pour objet un procédé de purification d'une protéine recombinante à partir d'une culture bactérienne notamment d'E. coli, selon lequel (i) on lyse les cellules bactériennes, (ii) on récupère la fraction contenant la protéine recombinante, c'est-à-dire (a) les corps d'inclusion que l'on solubilise en présence d'une forte concentration d'agent chaotropique tel que l'urée ou la guanidine, ou de détergent, ou (b) le surnageant, (iii) on précipite sélectivement la protéine recombinante en ajoutant du sulfate d'ammonium, (iv) on élimine le surnageant et (v) on récupère le précipitât que l'on solubilise. Le procédé de purification de AlpA faisant l'objet de la présente invention permet dans sa globalité d'atteindre un degré de pureté sans précédent pour la protéine considérée ; en particulier compte tenu de l'importante quantité traitée au départ. C'est pourquoi l'invention concerne également : La protéine AlpA caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie. Le matériel restant autre que la forme monomérique est constitué de protéine AlpA sous forme multimérique. Le degré de pureté global étant supérieur ou égal à 99 %. Une préparation contenant au moins 5 g, de préférence au moins long, de manière tout à fait préférée au moins 15 g de la protéine AlpA ; celle-ci étant caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS- PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie. Bien évidemment cette préparation doit constituer un lot ; c'est-à-dire avoir été obtenue à partir d'une culture unique et mise en oeuvre singulière d'un procédé de purification. De manière alternative, on a également trouvé que les corps d'inclusion pouvaient être solubilisés en remplaçant la guanidine par de l'urée 7,5 à 8,5, de préférence 8 M dans un tampon à pH basique, de préférence supérieur ou égal à 10,5, e. g. à pH 11. De manière avantageuse on utilise un tampon phosphate. Une fois réalisée la solubilisation, on abaisse la molarité de l'urée entre 4,5 et 5,5 M e. g. 5 M ainsi que le pH, aux alentours de la neutralité e. g. à 7,5. Ceci peut être mis en oeuvre en diluant avec un tampon Tris. Puis on réalise une CIH dans laquelle AlpA est éluée en urée 7, 5 à 8, 5 M e. g. 8 M. C'est pourquoi l'invention a également pour objet un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) d'Hélicobacter selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 4,5 à 5,5 M d'urée avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 7,5 à 8,5 M d'urée. Exemple Système d'expression Un système d'expression inductible a été construit afin de produire la protéine AlpA d'Helicobacter pylori dans E. coli. Le vecteur que l'on a utilisé est dérivé du plasmide pET28c (Novagen). Ce vecteur comprend : - une cassette d'expression sous le contrôle du promoteur du bactériophage T7, - un polylinker destiné au clonage des gènes d'intérêt en aval du promoteur, - un terminateur de transcription dérivé aussi du bactériophage T7, et - un gène de résistance à la Kanamycine. Le promoteur est régulé positivement en présence de la T7 RNA polymérase. Aux fins d'expression, différentes souches d'E. coli modifiées génétiquement peuvent être utilisées, parmi lesquelles les souches BL21 # DE3 (Studier, F. W. et al 1990 Meth. Enzymol 185, 60-69.). Ces souches contiennent le gène codant pour la RNA polymérase du phage T7 sous le contrôle du promoteur lac UV5, inductible par addition d'IPTG. De plus, la souche BL21DE3 est déficiente pour les activités protéasiques OmpT et Lon. Un fragment d'ADN de 1, 6 Kb contenant la séquence codant pour la protéine AlpA mature a été obtenu par amplification PCR en utilisant la souche d'Helicobacter pylori X47-2 (ORV 2001) en tant que source d'ADN. Les sites de restriction NcoI et Âhol utilisés pour le clonage, sont inclus respectivement dans les amorces PCR 5' (HP3 Nco C-) et 3'HP3 (Xho). Le site de lipidation [codon Cysteine (TGC codon)] a été remplacé par un codon d'initiation ATG (Met). Le fragment amplifié par PCR a été d'abord cloné dans le vecteur navette Topo TA (Invitrogen), puis transféré dans pET28c en utilisant les sites M'ol et Ho !. Les conditions d'amplification par PCR étaient comme suit : 97OC/30 s ; 55OC/1 min ; 72OC/50 s ; Vent DNA polymerase-25 cycles. Amorce 5' : 5'CATGCCATGGCTAGCATAAGTTATGCCGAA 3' Amorce3' : 5'CCCTCGAGCCTTTCTTAGAATGAATACCCATA3' Les sites NcoI et Xhol sont indiqués en italiques et les codons d'initiation ATG et de terminaison TAA (brin opposé) sont en caractères gras soulignés. Préculture et Culture Des erlens de 2 litres contenant chacun 500 mL de milieu Luria Broth (LB) 2X modifié (peptone remplacée par extrait de levure 30 g/L) et complémenté avec de la kanamycine 50 lig/mL, sont inoculés avec 500 gL d'un lot de semence E. coli BL21DE3/pMHp3. 1 et sont incubés pendant 15-18 hrs à 37 C sous agitation 175 rpm. Cette préculture sert à ensemencer un fermenteur de 30 L (B Braun) contenant le milieu SKYE 4 (pour un litre : extrait de levure 40 g ; MgCh 1 M 3 ml ; K2S04 530 mg ; NaCI 1 g ; K2HPO4 844 g) complémenté avec du monohydrate de glucose 44 g/L et de la kanamycine 50 ug/mL. L'inoculum correspond à 5 % du volume total. Les paramètres de culture sont les suivants : pH : 7, 00 ; régulation H3PO4 10% et NH40H 28% ; température : 37 C ; agitation initiale : 200 rpm ; débit d'air initial : 1 111 de culture/minute ; P02 : 30%, régulation (1) agitation 200 rpm à 700 rpm (2) débit d'air 20% à 60% (3) débit 02 0% à 100%. La culture est poursuivie pendant plus de 3 hrs. Lorsque la DO à 600 nm est comprise entre 25 et 35, on induit l'expression de AlpA par addition du volume d'IPTG (à 200 mM) nécessaire pour obtenir une concentration finale égale à 1 mM. Après 2 hrs d'induction, la culture est immédiatement refroidie. Les cellules sont récoltées par centrifugation 20 min à 7 000 g et les culots stockés à - 35OC. Préparation des corps d'inclusion Mise en suspension des germes et traitement du culot humide Cinq cent grammes de culot cellulaire (poids humide) (correspondant à environ 5 L de culture) sont décongelés une nuit à 5 3 C et mis en suspension dans du tampon Tris 50 mM pH 8.0 préalablement refroidi à 5 3 C à raison de 7. mL de tampon par g de culot de cellules soit 3.75 L pour 500 g. Le volume prévisionnel de cette suspension est de 4. 25 L. Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax pendant 2 à 3 cycles de 30 à 60 sec. et à une température maintenue à 5 3 C dans un bain glacé. On prépare de manière extemporanée une solution de benzonase à 2. 5 UIlJlL à partir d'une solution mère à 250 UI/liL conservée à - 20oC, soit 20 L + 1980 uL de tampon Tris 50 mM pH 8. 0. Puis on ajoute de 1700 gL de cette solution dans 42. 5 ml de MgCl2 à 100 mM. La totalité de cette préparation est versée dans la suspension de germes. Le mélange est incubé à 5 BoC sous agitation magnétique au moins 30 minutes. Rupture des cellules Les cellules ainsi homogénéisées sont cassées à l'aide d'un désintégrateur de cellules PANDA à une pression fixée à 1000 bars, avec 3 cycles de cassage et à une température ne dépassant pas 15OC, à l'aide du système de refroidissement (cryostat réglé à +5OC). Le rapport DO avant cassage/DO après le dernier cassage doit être 4. 5. Lavages des corps d'inclusion La suspension des corps d'inclusions après 3 cycles de cassage est centrifugée à 10 000 g pendant 30 min. à 5 3 C pour éliminer des contaminants (ADN, ARN et lipopolysaccharides...). Après centrifugation, le culot est récupéré puis remis en suspension dans 4.25 L de tampon phosphate sodique 50 mM, NaCl 0.5 M pH 7.0 refroidi à 5 3 C. La concentration protéique est d'environ 8 girl. La suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax dans un bain glacé de façon à maintenir la suspension à 5 3 C puis laissée sous agitation magnétique 30 min à 5 3 C. La suspension ainsi lavée est centrifugée à 10 000 g pendant 30 min à 5 3 C. L'opération de lavage est renouvelée deux fois. On obtient ainsi environ 110g de corps d'inclusion lavés soit environ 0,3 g de protéines par gramme de corps d'inclusion lavés. Le stockage est possible à - 20OC. Purification à partir des corps d'inclusion Solubilisation des corps d'inclusion Les corps d'inclusions sont ensuite solubilisés dans du tampon Tris 50 mM, Guanidine 6 M pH 7.5. La concentration protéique finale à obtenir est de 20 g/L. Le volume de tampon à ajouter est donc d'environ 1,65 L. Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax à 16 000 rpm puis sous agitation magnétique jusqu'à complète solubilisation, à une température maintenue à 22 3 C. Le mélange est centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes à 22 3 C minutes afin de clarifier la solution ; puis la solution est filtrée stérilement sur Spiral Cap 0. 8/0. 2 gm. Le volume du surnageant filtré est d'environ 1.6 L Précipitation au sulfate d'ammonium Le surnageant est dilué de moitié avec une solution de sulfate d'ammonium 1 M, Tris 50 mM pH 7.5 sous agitation magnétique. La solution ainsi obtenue est ajoutée en 30 minutes à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit lent et régulier pour obtenir une solution à 10 g/L de protéines contenant 0.5 M de (Nt-Ds S04 en finale. On laisse sous agitation magnétique pendant 30 minutes à 22 3 C. Puis l'incubation est poursuivie sans agitation une nuit (15 heures) à température du laboratoire pour permettre un mûrissement du précipité. Le lendemain matin, le mélange est centrifugé 30 min à 10000 g à 22 3 C. Le précipité est recueilli puis solubilisé à 10 g/L de protéines avec du tampon Tris 50 mM, Guanidine 6 M pH 7.5 sous agitation magnétique (Le volume prévisionnel après solubilisation est voisin de 3.2 L). Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax à 16 000 rpm puis sous agitation magnétique jusqu'à complète solubilisation, à une température maintenue à 22 3 C. Chromatographie d'interaction hydrophobe Cette suspension est ensuite diluée au 1/2 par addition de tampon Tris 50 mM, NaCI 1. 4 M pH 7.5 sous agitation magnétique. Ce tampon est ajouté en 30 minutes à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit lent et régulier pour obtenir une solution à 5 g/L de protéines contenant du Tris 50 mM, NaCI 0. 7 M, Guanidine 3 M pH 7. 5 en finale. On laisse sous agitation magnétique pendant 15 minutes à 22 3 C. Le mélange est centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes à 22 3 C minutes afin de clarifier la solution ; puis elle est filtrée stérilement sur Supor Cap 0. 8/0. 2 um. Le volume du surnageant filtré est d'environ 6 L. La colonne utilisée possède les caractéristiques suivantes : Colonne (Hi Prep butyl Sepharose FF Pharmacia-Amersham) de diamètre 20 cm et surface 314 cm2 ; Hauteur de gel voisine de 26 cm ; Volume de gel voisin de 8 L respectant la capacité de 3. 2 g de protéines/mL de gel. La colonne est préparée comme suit : Le gel est lavé puis équilibré à un débit voisin de 60 mLlcm2. h (19 L/h) avec (i) 5 volumes de colonne d'eau ultrafiltrée, puis avec (ii) 3 volumes de colonne de tampon Tris 50 mM, Guanidine 3 M, NaCl 0. 7 M pH 7. 5. Les valeurs de conductivité et de pH du tampon en sortie de colonne doivent correspondre aux spécifications d'utilisation suivantes : Conductivité à 20 C = 135 ms/cm 15%, et (ii) pH = 7.5 0. 3, La chromatographie est mise en oeuvre comme suit : La colonne est chargée par injection du filtrat (correspondant à 22-25 g de protéines totales) à un débit voisin de 60 mL/cm. h (19 Lah). La colonne est ensuite rincée avec du tampon Tris 50 mM, Guanidine 3 M, NaCl 0. 7 M pH 7. 5 à un débit voisin de 90 mL/cm2. h (28 Llh) jusqu'au retour à la ligne de base (2 volumes de colonne). AlpA est ensuite éluée en tampon Tris 50 mM, Guanidine 4 M pH 7. 5 à un débit de 90 mL/cm. h (28 Llh) jusqu'au retour à la ligne de base (1 volume de colonne). Le volume d'éluat est d'environ 8 L. Concentration et diafiltration sur 30 kDa Le module d'ultrafiltration est préparé comme suit : On utilise 4 cassettes d'ultrafiltration en polyéthersulfone de seuil de coupure 30 kDa, chacune de surface voisine de 5000 cm2 (soit une surface totale de 20 000 cm2), pour concentrer environ 20 g de protéines. Ces cassettes sont lavées avec NaOH 0.5 N pendant 1 heure puis rincées avec de l'eau ultrafiltrée. Elles sont ensuite équilibrées avec du tampon Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7. 5 pendant 5 min à l'aide d'une pompe de débit voisin de 80 L/h. L'éluat rAlpA est concentré en tampon Tris 50 mM, Guanidine 4 M pH 7.5, autour de 5 g/L en protéines (facteur de concentration # 2.5). Les conditions de l'ultrafiltration sont les suivantes : (i) pression d'entrée voisine de 1 bar, et (ii) débit de l'ultrafiltrat de moitié celui moitié du rétentat. Le volume de l'éluat concentré est d'environ 3.5 L. L'éluat rAlpA concentré est diafiltré contre 10 volumes de Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7.5 (35 L) dans les mêmes conditions que la concentration, à un débit d'environ 30 L/h, jusqu'à obtenir : (i) une conductivité à 20 C du rétentat voisine de 2.8 mS/cm 15% correspondant à la conductivité du tampon urée 8 M ; et (ii) une concentration protéique voisine de 5 g/L après 2 rinçages finaux successifs de l'ultrafiltre par le tampon de diafiltration. Le volume de l'éluat concentré diafiltré est d'environ 3.7 L. Chromatographie d'échanges d'ions La colonne utilisée possède les caractéristiques suivantes : Colonne (EMD TMAE Merck) de diamètre 7 cm et de surface 38.5 cm2 ; Hauteur de gel voisine à 18 cm ; Volume de gel voisin de 700 mL. La colonne de chromatographie est préparée comme suit : Le gel est lavé puis équilibré à un débit voisin de 4 L/h avec (i) 5 volumes de colonne d'eau ultrafiltrée, puis avec (ii) 3 volumes de colonne de tampon Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7.5 pH 7. 5. Les valeurs de conductivité et de pH du tampon en sortie de colonne doivent correspondre aux spécifications d'utilisation suivantes : Conductivité à 20 C = 2.8 ms/cm 15%, et (ii) pH=7. 50. 3, La chromatographie est mise en oeuvre comme suit La colonne est chargée par injection de l'éluat diafiltré P11 correspondant à 15-17 g de protéines totales, à un débit de 100 mL/cm. h (4 L/h) puis rincée avec du tampon Tris 50 mM, Urée 8 M, pH 7.5, même débit, jusqu'au retour à la ligne de base (6 volumes de colonne). Le filtrat ainsi collecté (environ 4 L) contient la protéine rAlpA pure à 90 5% en l'absence d'endotoxines. Filtration stérile 0. 2 pm et stockage du produitfinal vrac L'éluat rAlpA purifié est filtré sur filtre type Supor Cap 100 0. 8/0. 2 um de surface 1000 cm2 sous hotte à flux laminaire. Le volume du vrac concentré filtré stérile est d'environ 4 L. Le degré de pureté du lot de AlpA ainsi obtenu est évalué de manière conventionnelle par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie, comme étant supérieur à 90 %. Le rendement global est estimé à 50 % environ. Revendications 1. Un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) d'Hélicobacter selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 2,5 à 3,5 M de guanidine avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 3,5 à 4,5 M de guanidine. 2. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel la préparation mise en oeuvre au point (i) contient 3 M de guanidine. 3. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel la solution mise en oeuvre au point (ii) contient 4 M de guanidine. 4. Un procédé selon la revendication 1,2 ou 3, dans lequel la préparation mise en oeuvre au point (i) est une préparation issue de la culture d'une bactérie Gram-négative, notamment E. coli, capable d'exprimer AlpA sous forme recombinante. 5. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel la préparation mise en oeuvre au point (i) est obtenue après rupture des cellules bactériennes, lavage et solubilisation des corps d'inclusion. 6. Un procédé selon la revendication 5, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion est réalisée en 5,5 à 6,5 M de guanidine. 7. Un procédé selon la revendication 6, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion est réalisée en 6 M de guanidine. 8. Un procédé selon la revendication 5,6 ou 7, dans lequel la préparation mise en oeuvre au point (i) est obtenue après rupture des cellules bactériennes, lavages et solubilisation des corps d'inclusion, précipitation au sulfate d'ammonium des corps d'inclusion solubilisés et solubilisation du précipité. 9. Un procédé selon la revendication 8, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion et/ou du précipité est réalisée en 5, 5 à 6, 5 M de guanidine. 10. Un procédé selon la revendication 9, dans lequel la solubilisation du précipité est réalisée en 6 M de guanidine. 11. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel le matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes comprend (i) un support qui est le Sepharose ou le Fractogel et (ii) un ligand qui est du butyl, de l'octyl ou du phényl. 12. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel AlpA obtenue après l'élution mise en oeuvre au point (ii) est mise en 7,5 à 8,5 M d'urée puis purifiée sur un matériel de chromatographie d'échanges d'ions. 13. Un procédé selon la revendication 12, dans lequel la mise d'AlpA en urée est effectuée par diafiltration de l'éluat obtenu au point (ii), et optionnellement concentré, contre 6 à 10 volume d'urée 7,5 à 8,5 M. 14. Un procédé selon la revendication 12 ou 13, dans lequel AlpA obtenue après l'élution mise en oeuvre au point (ii) est mise en urée 8 M. 15. Un procédé selon l'une des revendications 11 à 14, dans lequel le matériel de chromatographie d'échanges d'ions comprend (i) un support qui est le Sepharose ou le FractogelTM et (ii) un ligand qui est une amine tertaire ou quaternaire. 16. Un procédé de purification de AlpA selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et de l'urée 7,5 à 8,5 M, de préférence 8 M, avec du matériel de chromatographie échangeuse d'anions de telle sorte que les contaminants s'adsorbent sur ce matériel et (ii) on récupère AlpA dans le filtrat. 17. Un procédé de purification d'une protéine recombinante à partir d'une culture bactérienne notamment d'E. coli, selon lequel (i) on lyse les cellules bactériennes, (ii) on récupère la fraction contenant la protéine recombinante, ladite traction étant soit (a) les corps d'inclusion que l'on solubilise en présence d'une forte concentration d'agent chaotropique tel que l'urée ou la guanidine, ou un détergent, soit (b) le surnageant, (iii) on précipite sélectivement la protéine recombinante en ajoutant du sulfate d'ammonium, (iv) on élimine le surnageant et (v) on récupère le précipitât que l'on solubilise. 18. Un procédé selon la revendication 17, dans lequel on récupère les corps d'inclusion en présence de guanidine. 19. Un procédé selon la revendication 17 ou 18, dans lequel le sulfate d'ammonium est ajouté à la concentration de 0,4 à 0,6 M. 20. Un procédé selon la revendication 19, dans lequel le sulfate d'ammonium est ajouté à la concentration de 0,5 M. 21. Un procédé selon l'une des revendications 17 à 20, dans lequel la protéine recombinante est purifiée à partir de 5 L au moins de culture bactérienne (au moins 500 g de culot de cellules humide). 22. La protéine AlpA caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie. 23. Une préparation contenant au moins 5 g de la protéine AlpA ; celle-ci étant caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie.