FR 2819524 A1 20020719 FR 0100658 A 20010118 r La présente invention concerne une méthode de détection et d'analyse de différence de compositions entre deux populations d'acides nucléiques, notamment pour étudier l'expression différentielle entre deux populations de cellules, l'une d'entre elles étant soumise à un stimulus. Le séquençage complet du génome humain permet de disposer de données extrêmement complètes sur la structure de l'information génétique présente chez l'homme. Toutefois, cette information brute ne permet pas, à partir des séquences listées dans les bases de données, de connaître les profils d'expression dans différents types cellulaires, ou en réponse à un stimulus (par exemple la prise d'un médicament). Il peut aussi être intéressant de comparer le niveau d'expression des différents gènes par exemple entre une cellule cancéreuse et une cellule saine. Par ailleurs, il peut être intéressant de pouvoir obtenir un résultat global sur l'expression différentielle de certains gènes en une seule opération, lorsque les cellules étudiées sont soumises à différentes conditions (par exemple une évolution dans le temps après mise en contact avec un composé), ou sur plusieurs types cellulaires à la fois. On veut alors effectuer une étude en multiplex. Il est évident que les résultats sont toujours obtenus en comparaison avec des témoins pour lesquels la seule différence est qu'ils ne sont pas soumis au stimulus étudié. La pharmacogénomique est une discipline née des données obtenues grâce à la séquence du génome humain, qui a pour objet de pouvoir prévoir les réponses aux différents médicaments, de définir les polymorphismes pouvant exister entre les individus, afin de définir au mieux le traitement à apporter pour une pathologie donnée chez un patient donné. Afin d'étudier l'expression différentielle de gènes entre deux cellules, une méthode parmi les plus utilisées est la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) à partir de l'ARN messager (ARNm) de chacune des cellules, en marquant ledit ADNc de façon différente selon sa provenance (par exemple avec un fluorophore vert pour la cellule 1, et un fluorophore rouge pour la cellule 2). r On effectue alors une étude d'hybridation sur des sondes fixées sur un support (le plus souvent une puce à ADN), lesdites sondes étant en excès par rapport à la quantité d'ADNc étudiée. On peut effectuer une seule réaction d'hybridation en mélangeant les deux échantillons portant des marqueurs discernables, ou effectuer deux réactions sur deux supports identiques. A l'issue de la réaction, on compare les taux de fluorescence obtenue pour chaque sonde. On peut alors en déduire la différence de quantité d'ADNc entre les deux cellules, qui est alors corrélée avec la différence d'ARNm initiale. Une autre méthode qui a été développée consiste en la méthode CGH (pour Comparative Genomic Hybridization ). Dans ce cas, les sondes utilisées ne sont pas en excès, et l'hybridation des ADNc marqués par des fluorescences différentes s'effectue donc en compétition sur lesdites sondes. Ainsi, la partition de la fluorescence observée sur le support reflète la partition des deux ADNc dans la solution d'hybridation. On corrèle de nouveau cette valeur au taux de représentation des ADN dans l'échantillon. Toutefois, un désavantage de ces méthodes est qu'elles nécessitent le marquage des deux échantillons et se trouvent ainsi soumises aux fluctuations induites par la reverse transcription. Il y a risque d'interprétation de ces variations comme résultant d'expressions différentielles. De plus, il est toujours délicat de corréler réellement la quantité d'ADNc à la quantité d'ARNm initial. En effet, la réaction de transcription inverse est relativement peu reproductible (taux de variation de l'ordre d'environ 15 %), et il est connu que certaines séquences sont difficiles à obtenir par cette réaction. Ainsi, un des désavantages des méthodes précédemment décrites est qu'elles demandent d'effectuer deux réactions de transcription inverse (pour chacun des deux échantillons). Une autre méthode pour l'étude de l'expression différentielle est l'analyse par Northern Blot, où l'on étudie l'intensité d'hybridation d'une sonde marquée sur une population d'ARNm. Toutefois, cette méthode nécessite de connaître préalablement les ARNm dont on veut étudier la variation d'expression. Elle est donc difficilement utilisable pour des études à grande échelle. r On peut aussi utiliser la cytométrie de flux, afin d'étudier la présence de la protéine produite par l'ARNm, par exemple avec un anticorps reconnaissant ladite protéine. La présente invention a pour objet une nouvelle méthode permettant notamment d'étudier l'expression différentielle entre deux cellules ou types cellulaires, permettant une lecture simplifiée (un seul type de marquage utilisé), plus ou moins binaire, c'est-à-dire qu'un signal positif indique que le gène correspondant audit signal est exprimé dans la cellule test, alors qu'il ne l'est pas dans l'autre cellule. La méthode selon l'invention permet aussi une étude en multiplex, qui est avantageuse pour une mise en oeuvre à grande échelle. En effet, l'utilisation du multiplex donne des résultats rapides, qui permettent d'identifier aisément certains gènes apparaissant au cours du traitement (par exemple si on étudie la réponse à un médicament), et de définir ainsi aisément les sondes à utiliser ultérieurement pour l'analyse plus détaillée des échantillons. Ceci permet notamment d'effectuer une économie importante dans le nombre de sondes à utiliser pour les études de pharmacogénomique (environ 10 % du nombre actuellement utilisé). Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de mise en évidence de la différence de composition entre deux populations d'acides nucléiques simple brin (test T, et écran E), comportant les étapes consistant à : a) synthétiser un brin d'acide nucléique complémentaire à partir de la population T d'acides nucléiques simple brin, b) séparer ledit brin d'acide nucléique complémentaire obtenu à l'étape a) en deux fractions égales 1 et II, c) étudier l'hybridation de la fraction 1 à des sondes d'acide nucléique, d) mettre en contact la fraction II avec la population E d'acides nucléiques simple brin, antérieurement ou de façon concomitante, à son hybridation aux mêmes sondes d'acides nucléiques définies à l'étape c), e) comparer les résultats d'hybridation obtenues pour les deux fractions 1 et II dans les étapes c) et d). r La méthode développée selon la présente invention peut être résumée comme étant une Hybridation Différentielle par Compétition. Il est évident que les populations d'acides nucléiques simple brin peuvent être de toutes sortes. Ainsi, et dans un premier mode de mise en oeuvre préféré lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ARN, ledit brin complémentaire obtenu à l'étape a) étant un ADN complémentaire. Cet ADNc est obtenu par des méthodes classiques de transcription inverse, bien connues de l'homme du métier. Il est intéressant de noter que le rendement de la transcription inverse est relativement faible et que les ADNc obtenus représentent en masse 10- 15 % de la masse des ARN dont ils sont issus. Dans un second mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ADN simple brin, ledit brin complémentaire étant un ADN. Cet ADN peut être obtenu par extension à partir d'une amorce s'hybridant sur l'ADN source, notamment avec des ADN polymérases telles le fragment de Klenow, ou la Taq Polymérase. Ces techniques sont également bien connues de l'homme du métier. Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ADN simple brin, et ledit brin complémentaire de l'étape b) est un ARN, obtenu notamment grâce à une ARN polymérase. Il peut être avantageux d'optimiser les conditions de synthèse dudit brin complémentaire de l'étape a), afin d'obtenir des fragments d'environ 300 à 500 paires de bases (pb). On peut donc optimiser le choix des amorces, par exemple en utilisant des héxa-nucléotides aléatoires et en en ajustant la concentration, ou encore limiter le temps d'action de l'enzyme, avec utilisation éventuelle d'amorces spécifiques, ou faire varier les températures de réaction. On peut aussi choisir le type d'enzyme utilisé pour obtenir les fragments de taille recherchée. Le tampon utilisé (notamment la salinité) est également un paramètre pouvant être variable. De façon générale, l'homme du métier connaît la façon de faire varier ces paramètres pour obtenir le but recherché. Cette taille préférée des brins complémentaires permet d'optimiser l'hybridation desdits brins sur toute leur longueur avec les acides nucléiques simple brins dont ils sont issus. Il est également possible d'utiliser des nucléotides modifiés lors de la réaction d'élongation et de synthèse du brin complémentaire, et que celui-ci présente ainsi des modifications dans son squelette (par exemple des phosphorothioate, méthyl-phosphonate, ou qu'il soit un PNA, pour Peptid Nucleic Acid ) ou à ses extrémités. Afin de faciliter la détection des hybridations dudit acide nucléique complémentaire sur les sondes, il est avantageux que celui-ci présente un marqueur permettant son traçage. Un tel marqueur peut être fluorescent, luminescent, ou de préférence radioactif. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32p, le P, le S, le H ou le 11. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Ledit marqueur est introduit de préférence lors de la synthèse dudit acide nucléique complémentaire, en utilisant par exemple des amorces marquées ou des nucléotides marqués. La détection est particulièrement simplifiée lorsque les sondes sont immobilisées sur un support solide. De préférence, ce support permet leur identification d'après leurs coordonnées. Un support particulièrement adapté est une puce à ADN, qui permet de déposer un nombre extrêmement de sondes en même temps. On peut également utiliser des billes marquées chacune de façon individuelle en fonction de la sonde qu'elle porte, la lecture se faisant notamment par télémétrie en fonction de l'événement d'hybridation. Afin que le brin complémentaire puisse s'hybrider aux sondes, il est nécessaire que celles-ci aient une polarité inverse de celui-ci, c'est-à-dire lui soient complémentaires. Il est alors important de noter que les sondes ont alors la même polarité que l'acide nucléique simple brin dont est issu le brin complémentaire, celui-ci ne pouvant alors pas s'hybrider aux sondes. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode selon l'invention, les sondes sont présentes en excès par rapport à la population des acides nucléiques, qui leur sont complémentaires. r------------------------------. Lors de l'étape d'hybridation entre le brin complémentaire et les acides nucléiques de la population E (étape d), on peut utiliser une quantité d'acides nucléiques simple brin de la population E utilisée égale à la quantité d'acides nucléiques simple brin de la population T utilisée dans l'étape a), pour la synthèse du brin complémentaire. Alternativement, il est possible d'utiliser une quantité d'acides nucléiques de la population E supérieure à la quantité d'acides nucléiques de la population T utilisée dans l'étape a), de préférence dans un ratio compris entre 2/1 et 50/1. Ce ratio est de préférence compris entre 5/1 et 20/1, de façon plus préférée environ égal à 10/1. Dans un mode de mise en oeuvre spécifique de l'invention, l'hybridation de la fraction II du brin complémentaire est effectuée sur les sondes de manière concomitante à sa mise en contact avec la population E d'acides nucléiques simple brin. Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on effectue l'hybridation de la fraction II sur les sondes postérieurement à sa mise en contact avec la population E d'acides nucléiques simple brin. Ces deux modes de mise en oeuvre sont indifféremment préférés, chacun possédant des avantages spécifiques, ainsi qu'il sera discuté plus bas. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, lesdites populations d'acides nucléiques simple brins sont des ARNm issus de deux populations de cellules (culture cellulaire, biopsie), l'une d'entre elles ayant éventuellement été soumise à un stimulus. Ces deux populations sont appelées population A et population B. Il s'agit en effet de pouvoir étudier l'expression différentielle des gènes entre ces deux populations de cellules. Ces deux populations de cellules peuvent être notamment issues soient de cultures cellulaires, soit de biopsies chez un patient. Ceci peut être notamment particulièrement utile lorsque l'on étudie par exemple la réponse à un traitement anti-cancéreux. Il n'est pas nécessaire que les deux populations de cellules soient du même type cellulaire, on peut ainsi observer les gènes spécifiquement exprimés dans un certain type cellulaire (par exemple un neurone par rapport à une cellule gliale, ou un lymphocyte T CD4, par rapport à un lymphocyte T CD8...). r L'une des deux populations de cellules peut aussi avoir été soumise à un ou plusieurs stimulus, comme par exemple la mise en contact avec un composé (notamment un médicament, ou une toxine, un antigène), ou un micro-organisme (notamment une bactérie, un virus ou un fongus), ou des variations physicochimiques de son milieu, (notamment hyperthermie, altération du pH physiologique, irradiation après d'un composé absorbant le rayonnement émis) ce qui permet de détecter les différences d'expression en présence ou non du stimulus. Ainsi qu'il sera démontré précisément plus loin, la méthode selon l'invention permet de détecter les gènes sur-exprimés dans la population T, ou qui ne sont pas présents dans la population E. Ainsi, afin de pouvoir obtenir une photographie complète du schéma d'expression différentielle, il est donc avantageux d'utiliser, dans un premier temps, la population de cellules A comme source de population T d'ARNm, (le procédé permettant la détection des ARNm sur-exprimés dans A par rapport à B), et dans un deuxième temps, la population de cellules B comme source de population T d'ARNm, (le procédé permettant la détection des ARNm sous-exprimés dans A par rapport à B). Il est à noter que la méthode selon l'invention n'implique pas nécessairement la purification des ARNm issus de la population E avant l'étape d'hybridation avec la fraction II du brin complémentaire. Dans certains cas particuliers, il est possible que certains ARNm de la population E s'hybrident avec les sondes, bien que celles-ci soient à priori de même polarité . En effet, il est possible que certaines parties de la séquence de l'ARNm soient malgré tout partiellement complémentaires à certaines sondes, les conditions de réaction permettant leur hybridation. L'homme du métier connaît les techniques pour faire varier les conditions d'hybridation, et les rendre notamment plus ou moins stringentes (variation de la température, de la salinité...). Ceci ne devrait normalement pas poser de problème dans la mesure où l'ARNm de la population E ne porte pas de marquage. Toutefois il est aussi possible qu'un autre fragment dudit ARNm de la population E soit également complémentaire d'un brin complémentaire obtenu à l'étape a) du procédé selon l'invention, ledit brin étant marqué. Ce risque de faux positif est largement diminué par un traitement avec la RNase H sur la fraction II mise en contact avec la r population E, qui digère alors l'ARNm dans le duplex ARN-ADN et libère donc l'ADNc marqué. Il est à noter que la méthode selon l'invention permet une étude en multiplex de plusieurs conditions, ainsi qu'il sera vu plus bas. Ainsi, le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre sur une population T qui consiste en un mélange d'acides nucléiques présentant tous une propriété commune, et une population E consistant également en un mélange d'acides nucléiques présentant tous une propriété commune. Le terme propriété commune signifie par exemple que les acides nucléiques des populations sont issus de cellules ayant toutes été confrontées au même stimulus. On peut notamment étudier en une seule opération la réponse de plusieurs types cellulaires à un médicament, à divers moments après addition dudit médicament. Ainsi que discuté plus haut, ceci permet d'avoir une idée très rapide des gènes différentiellement exprimés et de définir les sondes qui devront être utilisées pour une analyse plus précise. Il est donc clair que la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un procédé selon l'invention pour la détermination de l'action d'un composé ou d'un micro-organisme sur une population cellulaire, pour des études pharmacogénomiques, ou pour juger de la réponse d'un patient à un traitement (par exemple le cancer, avant ou après traitement à partir d'une biopsie). DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Hybridation de référence, permettant de décrire la population des ADNc issus de l'échantillon biologique traité. Les séquences décrites dans le tableau 1 sont représentées ici par les sondes correspondantes (rectangles foncés), fixées sur le support solide (rectangle gris foncé). Les molécules d'ADNc sont représentées sous forme de rectangles gris clair. Figure 2 : Hybridation après compétition concomitante avec une quantité égale d'ARN écran. L'effet écran du compétiteur a inhibé, au moins partiellement, l'hybridation des séquences communes entre l'échantillon analysé et le témoin. Figure 3 : Hybridation après compétition concomitante avec un excès d'ARN écran. Ici l'effet de l'inhibition est accentué grâce à l'utilisation d'un excès de r compétiteur. Par contre les signaux correspondant à des séquences présentes uniquement dans l'échantillon analysé ne sont pas affectés. Figure 4 : Schéma comparatif résumant les différentes conditions des figures 1 à 3. Figure 5 : Comparaison de l'hybridation directe et de l'hybridation après compétition antérieure avec une quantité égale d'ARN écran. La pré incubation de la SHC (Solution d'Hybridation en Compétition) permet d'obtenir un effet de compétition accentué, malgré l'utilisation d'une faible quantité de compétiteur. Les exemples ci-dessous servent à expliciter l'invention et ne sont pas limitatifs. L'homme du métier sait notamment préparer de l'ADNc marqué à partir d'ARNm extrait de cellules, déterminer les conditions d'hybridation optimales entre deux brins d'acide nucléique, effectuer une lecture de la liaison d'un acide nucléique sur une sonde fixée sur un support... DEFINITIONS et PRINCIPE Array : sondes d'acides nucléiques immobilisées sur un support solide suivant un motif permettant leur identification d'après leurs coordonnées. Population test : la population d'acides nucléiques analysés ; dans la majorité des cas les molécules portent des marqueurs permettant leur traçage (population T). Population écran : la population d'acides nucléiques de référence ; dans la majorité des cas les molécules ne sont pas marquées (population E). Hybridation en phase mixte : réaction d'hybridation faisant intervenir les sondes de l'array. Hybridation en phase liquide : réaction d'hybridation faisant intervenir les acides nucléiques en solution. Soit une population d'ARNm extraits d'un échantillon biologique ayant subi un traitement dont on désire analyser les conséquences en termes d'induction de l'expression des gènes. La transcription inverse de ces ARNm donne une population d'ADNc, qui peuvent être marqués durant cette phase de synthèse. Ce sont les ADNc qui constituent la population test. L'échantillon biologique dont ils sont issus peut-être simple, ou le résultat du mélange de plusieurs échantillons simples. r Le degré de complexité qu'il est possible d'obtenir en fonction de la sensibilité offerte par le type de marquage utilisé et les conséquences en termes de sensibilité de détection d'une séquence particulière seront discutés ci-dessous. Soit une population d'ARNm extraits d'un échantillon biologique n'ayant pas subi de traitement particulier. Cette population sert de référence pour l'analyse de la population test. Il s'agit de la population écran. Ces ARNm peuvent être utilisés sans être extraits de l'ensemble des ARN de l'échantillon biologique. La population écran ne porte pas de marquage. Elle peut être issue d'un échantillon biologique simple ou complexe. Le degré de complexion que l'on peut atteindre sans compromettre les propriétés de la population test que l'on souhaite étudier est limité par le degré de sensibilité que l'on désire obtenir. On peut considérer que ces deux populations ne différent pas seulement pour la nature des acides nucléiques qui les composent, ADNc pour la population test et ARN pour la population écran, mais également pour leur polarité, sens pour la population écran et antisens pour la population test, puisque la population T est le résultat d'une transcription inverse d'une population de même nature que la population E. Ainsi, les acides nucléiques d'une population correspondant à un locus particulier peuvent s'hybrider à acides nucléiques correspondant au même locus, de l'autre population. Cette propriété est utilisée pour créer une compétition entre la population écran et les sondes disposées sur l'array, pour la capture des molécules marquées de la population test. EXEMPLES Exemple 1 : compétition concomitante avec ajout d'une quantité d'ARN de la population E égale à la quantité d'ARN utilisé pour la synthèse du brin complémentaire L'ADNc correspondant à la population test est synthétisé en y incorporant le marqueur de choix. L'ARN correspondant à la population écran est extrait. Les arrays utilisés pour l'analyse sont préparés de façon adéquate pour recevoir les ADNc marqués. Cette préparation n'a rien de particulier, elle consiste essentiellement à une réhydratation du support et la saturation des sites de fixation non spécifique sur le support solide, pour éviter le bruit de fond que généreraient les molécules marqués en s'y fixant. Cette méthode est connue de l'homme du métier. r La population test est séparée en deux partie égales, diluée dans du tampon d'hybridation. Une des parties sera utilisée telle quelle (SHD pour Solution d'Hybridation Directe). L'autre partie reçoit la population écran (SHC pour Solution d'Hybridation en Compétition). La population écran est utilisée en excès. En effet, si l'on utilise une masse d'ARN égale à celle utilisée pour la synthèse de l'ADNc le rapport obtenu est favorable, à cause du faible rendement de la reverse transcriptase. Le rapport entre la masse d'ARN utilisée pour la synthèse de l'ADNc et la masse d'ARN écran est noté ici par R. Ainsi, dans cet exemple, R = 1. Un array est hybridé avec la SHD et pour obtenir les signaux permettant la quantification relative des espèces moléculaires qui composent la population des ADNc. Un autre array est hybridé avec la SHC et sert à l'obtention de signaux permettant la quantification relative des espèces moléculaires de la population qui restent réactifs malgré la présence des ARN utilisés en écran. Considérons les populations décrites ci-dessous. Témoin non Échantillon ARN écran ARN écran traité traité 10%) (iso) (excès) 0 0 séq 1 0 0 0 0 séq2 10000 10000 100000 séq3 10000 10000 100000 séq4 4 10000 10000 100000 séq5 ~~ 100000 00 2 ~ séq5 100000 100000 1000000 séq6'100000 100000 1000 100000 1000000 séq8 0 O Ö A6q9 Hm 0--s 0~X a O, > O sep7 or 10 sé 8 0 0 0 Tableau 1 : Populations moléculaires et leurs compositions Les séquences no 9 et 10 ne sont représentées que dans l'échantillon traité, il s'agit des molécules qui vont nous indiquer l'activation des gènes correspondants. Ici, la référence est la population moléculaire issue de cellules non traitées, ce qui permet d'obtenir les résultats d'induction d'expression de gènes par le traitement. L'ADNc est issu de l'échantillon traité. r Si l'on utilise comme référence la population moléculaire issue de cellules 1 traitées, on obtient alors les données concernant la répression de l'expression des 1 gènes suivant le traitement. Dans le cas de l'hybridation utilisant la SHD, on aura : SHD SHD ADNc Disponible (rendement pour hybrider 10%) sur l'array séq1 0 0 séq2 0 0 séq3 1000 1000 séq4 10000 10000 séq5 0 0 | séq6 1000 1000 séq7 10000 10000 séq8 0 0 séq9 1000 1000 séq10 10000 10000 Tableau II : Hybridation directe, en absence de compétiteur. Ceci est également illustré sur la figure 1. Pour la simplicité de la démonstration à ce niveau, on peut assimiler le nombre des molécules disponibles pour l'hybridation aux signaux obtenus. En réalité il y a proportionnalité entre les deux paramètres, qui dans les conditions d'utilisations des arrays, elle est simple et directe. Les signaux obtenus ici serviront de référence ; ils donnent en fait un descriptif de la population de l'ADNc. Ainsi que vu plus haut, on peut faire l'hypothèse d'un rendement de la transcriptase reverse de 10 %, indépendant de la nature de la séquence. Donc, si l'on considère maintenant le cas de l'hybridation avec la SHC obtenue par l'addition d'ARN de masse égale à celle utilisée pour la synthèse de l'ADNc, on obtient les résultats du tableau III, et de la figure 2. r--------------------------------------------------SHC (iso) ADN disponible rapport (rendement ARN écran pour hybrider signaux 10%) (iso) sur l'array (SHD/SHC) séq1 0 00nd séq2 0 10000 0 nd séq3 1000 10000 0 0 illui 500 ( sé800 0 nd séq6 1000 100000 0 0 séq7 1 OOOC 1 OOOOC &verbar; O séq8 O O &verbar; nd séq969 23 i ('k C C t0O jt vSa- E X C > ''~ iOOÒt W iX Tableau III : Hybridation en compétition, ARN competiteur egaFa celui qui a permis la synthèse de l'ADNc On remarque ainsi que l'ADNc disponible pour l'hybridation est affecté par la présence du compétiteur, qui en s'hybridant sur lui l'empêche de venir se fixer sur la sonde correspondante. Les rapports des signaux obtenus ici, avec ceux de la SHD, figurent dans la dernière colonne. Bien entendu l'absence de compétiteur fait que ce rapport est égal à l'unité pour les séquences 9 et 10 qui n'étaient pas exprimées dans la population non traitée. Les séquences communes entre les deux échantillons sont affectées. Si l'on considère maintenant en particulier le cas de la séquence 4, la disponibilité pour l'hybridation est de 5000, malgré le fait qu'il y a égalité entre le nombre de molécules dans l'ADNc et l'ARN écran. Ceci indique que la compétition se fait en même temps que l'hybridation sur l'array. il a en effet été considéré pour l'exemple que les vitesses d'hybridations sont dentiques, ce qui en réalité n'est pas le cas. En fait l'avantage est pour les hybridations en solution et donc pour l'épuisement de l'ADNc par l'ARN écran. Le résultat obtenu n'est que semi-quantitatif. Des rapports SHD/SDC inférieurs à 1 indiquent qu'il y a compétition mais ne permettent pas de la quantifier, sans données sur (i) l'efficacité de la transcription inverse et (ii) des rapports exacts entre populations d'ARNm qui sont contenus dans les ARN utilisés. r Exemple 2 : compétition concomitante avec ajout d'une quantité d'ARN de la population E supérieure à la quantité d'ARN utilisé pour la synthèse du brin 1 complémentaire Le déséquilibre observé dans l'exemple 1 peut être renforcé en utilisant une masse d'ARN supérieure à celle utilisée pour la synthèse de la population test, c'est-à-dire avec un rapport R > 1. On obtient alors les résultats suivants, avec R = 10 : SHC(excès) ADNc Disponible rapport (rendement ARN écran pour hybrider signaux 10%) (excès) sur l'array (SHD/SHC) séq1 0 0 0 Nd séq100 0 Nd séq3 1000 100000 0 0 séq5 0 1000000 0 Nd séq6 1000 1000000 0 0 séq7 10000 1 1000000 0 0 séq8 I 0 0 Nd séq9 1000 0 1000 1 séq10 10000 0 10000 1 Tableau III : Hybridation en compétition, ARN compétiteur en excès L'excès d'ARN écran a ici effacé le signal obtenu de la séquence 4, mais ne peut toujours pas affecter les signaux correspondant aux séquences 9 et 10, qui apparaîtront identiques entre les deux expériences (SHD et SHC) quel que soit cet excès. Ceci permet donc d'obtenir des données non ambiguës sur les gènes exprimées dans l'échantillon test, qui ne l'étaient pas dans l'échantillon de référence. La figure 3 permet de schématiser les résultats obtenus pour cet exemple d'application, la figure 4 résumant les résultats des exemples 1 et 2. Exemple 3 : compétition antérieure à l'hybridation avec ajout d'une quantité d'ARN de la population E égale à la quantité d'ARN utilisé pour la synthèse du brin complémentaire r Le protocole suivi est quasiment identique au protocole suivi précédemment, la seule variation intervenant après la préparation des solutions d'hybridation. Ici en fait, la SHC est incubée dans les conditions permettant l'hybridation de l'ARN écran sur l'ADNc, avant d'être mise au contact de l'array. La durée de l'incubation est calculée en fonction du rapport des vitesses d'hybridation en phase mixte et liquide. Il s'agit en fait d'épuiser l'ADNc avant de le présenter aux sondes qui composent l'array. Ainsi, si le rapport des vitesses est de dix et que le temps d'hybridation de la SHD de 24 h, la pré incubation de la SDC sera de (24/10) 2,4 h. L'effet de compétition est alors amplifié et pour une hybridation en condition iso (même quantité d'ARN E qu'utilisé pour la synthèse du brin complémentaire) on aura : SHC iso disponible ADNc pour rapport (rendement ARN écran hybrider sur signaux 10%) ( ! so) J'array (SHD/SHC) séq1 0 0 0 nd sé1 0 0 0 nd séq2 0 10000 0 nd séq3 1000 10000 0 0 séq4 10000 100000 0 0 séq5 0 100000 0 0 séq6 1000 100000 0 0 séq7 10000 100000 0 0 séq8 0 0 0 nd séq9 1000 0 1000 1 séq10 10000 0 100000 1 Tableau IV : Hybridation en compétition, ARN compétiteur iso, pré hybridation Là encore les signaux des séquences 9 et 10 ne sont pas affectés. En revanche, le signal correspondant à la séquence 4 est nettement affaibli. Ceci est dû à l'hybridation de l'ADNc correspondant sur les ARN de la population écran durant la phase de pré incubation. Cette variante permet en fait de minimiser la quantité d'ARN écran à utiliser. Ceci peut être intéressant lorsque l'on désire économiser le matériel (par exemple ARN écran provenant d'une biopsie donc en très petite quantité), ou si l'on veut éviter l'utilisation de solutions d'acides nucléiques trop concentrés, car ces r solutions peuvent entraîner des altérations de leurs propriétés d'hybridation, par des phénomènes tels que la formation de réseaux d'hybridation. La figure 5 schématise les résultats obtenus pour cette variante de mise en oeuvre. En conclusion, pour décrire l'action du traitement en termes d'inhibition et d'induction de l'expression des gènes quatre hybridations sur des arrays sont nécessaires. Elles doivent être comparées deux à deux et dans chaque comparaison une même population d'ADNc marquée, séparée en deux échantillons identiques est utilisée. Ceci diminue les problèmes souvent rencontrés dus à des variations de la transcription inverse. Exemple 4 : en multiplex La puissance du système décrit ci-dessus est multipliée par la possibilité d'utiliser des populations d'ARN issues de plusieurs échantillons biologiques qui partagent des caractéristiques communes. Un cas concret peut être considéré. On peut rechercher les gènes dont l'expression est induite par l'action d'un médicament dans une série de lignées cellulaires, notée CI, C2,..., Cn. On se limite, dans cet exemple à 5 types cellulaires. Le médicament est administré dans chaque cas à une dose biologiquement significative, par exemple l'IC50 (dans les conditions de travail) et les échantillons sont prélevés à divers moments après l'addition du médicament dans la culture traitée, par exemple six temps, TO, Tel,..., T6. Les prélèvements d'échantillons sont réalisés en parallèle pour les cultures qui servent de référence et qui n'ont pas été mises en contact avec reçue le médicament. r---------------------------------------------------------- : On dispose ainsi d'une série d'échantillons : 1 C1 C2 C3 C4 C5 t1 nef traitée réf traitée réf traitée réf traitée Réf Traitée t2 t3 t4 t5 t6 Les échantillons gris foncé peuvent être mélangés pour former l'ARN de référence, ceux en gris clair pour former l'ARN échantillon. L'ARN écran est fourni par la référence. En une seule expérience, utilisant un seul produit marqué (l'ADNc), on peut analyser en parallèle une grande série de conditions (ici pour les cinq lignées cellulaires, n=30). La sensibilité de détection peut être affectée. Ainsi, plus le nombre de conditions est grand, plus chaque échantillon est dilué dans la population d'ARN finale. Il est donc possible que des séquences qui étaient proches du seuil de détection dans le cas d'analyse d'un échantillon unique puissent disparaître. Cet effet peut être minimisé par l'utilisation de quantités d'ADNc plus importantes et en réalisant des hybridations plus longues sur l'array. Les compensations que l'on peut apporter viennent de l'augmentation de la quantité d'ADNc, de la pré-hybridation de compétition et de la durée d'hybridation. Il est important de noter que cette approche permet d'identifier rapidement les composants qui apparaissent à cause du traitement, mais ne permet pas d'identifier dans quelle lignée et/ou à quel temps ceci a lieu. Son utilisation permet de connaître les sondes que nous devrons utiliser par la suite pour analyser les divers échantillons de façon détaillée. Et son intérêt réside à l'économie réalisée en nombre de sondes utilisées (environ 10 % dans les systèmes que nous connaissons jusqu'à aujourd'hui). Il sera d'autant plus important que la collection de sondes initialement utilisée sera importante. La schématisation de l'exemple donné ci-dessus est relativement lourde. Le schéma ci-dessous résume les résultats pour deux lignées et deux temps, et est plus simple à visualiser . Deux niveaux d'expression ont été considérés : 0 et 1000. La dernière colonne concerne les signaux attendus. En souligné sont donnés les signaux négatifs , correspondant à des inhibitions d'expression qui ne seront mises en évidence que lors de l'hybridation symétrique. Le calcul est effectué en supposant que les quantités d'ADNc et d'ARN écran utilisés seront augmentées proportionnellement au degré de multiplexage. Malgré le fait que ce ne sera pas le cas, les proportions seront maintenues. Le taux de sondes à maintenir est ici exagéré du fait que ne sont pas présentées les séquences qui seraient maintenues en taux de transcription entre les deux populations. somme somme Lignée C1 C1 C2 C2 C1 C1 C2 C2 référence traitées Temps t1 t2 t1 t2 t1 t2 t1 t2 Condition réf réf réf réf raitée traitée raitée raitée séq1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 séq2 0 0 0 0 0 0 1000 1000 0 2000 2000 séq3 0 0 0 0 1000 1000 0 0 0 2000 2000 séq4 0 0 0 0 1000 1000 1000 1000 0 4000 4000 séq5 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 1000 1000 séq6 0 0 0 0 0 1000 0 0 0 0 1000 1000 séq70 0 0 0 0 1000 0 0 0 1000 1000 séq8 0 0 0 0 1000 0 0 0 0 1000 100 séq9 0 0 0 0 0 1000 0 1000 0 2000 2000 séq10 0 0 0 0 1000 0 1000 0 0 2000 2000 séq11 0 0 0 0 1000 0 0 1000 0 2000 2000 séq12 0 0 0 0 0 1000 1000 0 0 2000 2000 séq13 0 1000 1000 0 0 0 0 0 2000 0 2000 séq14 0 0 0 0 0 0 1000 1000 0 2000 2000 séq15 0 0 1000 1000 1000 1000 0 0 2000 2000 @ séq16 1000 1000 0 0 1000 1000 1000 1000 2000 4000 2000 séq17 1000 1000 1000 1000 0 0 1000 0 4000 1000 3000 séq18 0 0 1000 0 0 0 0 1000 1000 1000 0 séq19 0 0 0 1000 0 1000 0 0 1000 1000 0 séq20 0 1000 0 0 1000 0 0 0 1000 1000 0 séq21 1000 0 0 0 0 10000 1000 1000 2000 1000 séq 22 0 1000 0 1000 1000 0 1000 0 2000 2000 0 séq23 1000 0 1000 0 1000 0 0 1000 2000 2000 0 séq24 1000 0 0 1000 0 1000 1000 0 2000 2000 0 séq22 0 10000 1000 10000 10000 2000 séq23 1000010000 100000 1000 2000 séq24 10000010000 1000 10000 2000 FRevendications 1 r 1. Procédé de mise en évidence de la différence de composition entre deux populations d'acides nucléiques simple brin (test T, et écran E), comportant les étapes consistant à : a) synthétiser un brin d'acide nucléique complémentaire à partir de la population T d'acides nucléiques simple brin, b) séparer ledit brin d'acide nucléique complémentaire obtenu à l'étape a) en deux fractions égales 1 et II, c) étudier l'hybridation de la fraction 1 à des sondes d'acide nucléique, d) mettre en contact la fraction II aux mêmes sondes avec la population E d'acides nucléiques simple brin, antérieurement ou de façon concomitante à son hybridation auxdites sondes d'acides nucléiques définies à l'étape c), e) comparer les résultats d'hybridation obtenues pour les deux fractions 1 et II dans les étapes c) et d). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ARN, ledit brin complémentaire étant un ADN complémentaire. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ADN simple brin, ledit brin complémentaire étant un ADN. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites populations d'acides nucléiques simple brin sont des ADN simple brin, ledit brin complémentaire étant un ARN. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les conditions utilisées pour la synthèse dudit brin complémentaire sont choisies pour obtenir des fragments d'environ 300 à 500 pb. r 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit acide nucléique complémentaire présente des modifications dans son squelette. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérise en ce que edit acide nucléique complémentaire présente un marqueur permettant son traçage. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites sondes sont immobilisées sur un support solide. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les sondes sont présentes en excès par rapport à la population des acides nucléiques. 10. Procédé selon l'une des revendication 1 à 9, caractérisé en ce que la quantité de population E d'acides nucléiques simple brin utilisée est égale à la quantité de population T d'acides nucléiques simple brin utilisée dans l'étape a). 11. Procédé selon la revendication 1 à 9, caractérisé en ce que la quantité de population E d'acides nucléiques simple brin utilisée est supérieure à la quantité de population T d'acides nucléiques simple brin utilisée dans l'étape a), dans un ratio compris entre 2/1 et 5011. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on effectue l'hybridation de la fraction II sur les sondes de manière concomitante à sa mise en contact avec la population E d'acides nucléiques simple brin. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on effectue l'hybridation de la fraction II sur les sondes postérieurement à sa mise en contact avec la population E d'acides nucléiques simple brin. 14. Procédé selon l'une des revendications 1,2, 5 à 13, caractérisé en ce que lesdites populations d'acides nucléiques simple brins sont des ARNm issus de deux populations différentes de cellules. r 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les ARNm issus de la population E ne sont pas purifiés avant l'étape d'hybridation avec la fraction II. 16. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 5 à 15, caractérisé en ce que l'on effectue un traitement avec la RNase H sur la fraction Il mise en contact avec la population E. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la population T consiste en un mélange d'acides nucléiques présentant tous une propriété commune, et la population E consiste également en un mélange d'acides nucléiques présentant tous une propriété commune. 18. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 17 pour la détermination de l'action d'un composé ou d'un micro-organisme sur une population cellulaire, pour des études pharmacogénomiques, ou pour juger de la réponse d'un patient à un traitement.