FR 2810045 A1 20011214 FR 0007304 A 20000607 PROCEDE D'OBTENTION DE POPULATIONS CELLULAIRES CARACTERISEES D'ORIGINE MUSCULAIRE ET UTILISATIONS La présente invention est relative à des populations cellulaires issues du tissu musculaire et leur utilisation dans la préparation de produits de thérapie cellulaire. Plus précisément, l'invention porte sur un procédé d'obtention de populations cellulaires et leur utilisation pour la reconstitution du système hématologique et immunologique, des tissus osseux, adipeux, cartilagineux, musculaires ou vasculaires. La thérapie cellulaire est une technique à fort potentiel pour le traitement de nombreuses pathologies. Le principe de la thérapie cellulaire repose sur la possibilité de reconstituer un tissu endommagé ou de restaurer une fonction biologique perdue ou altérée au sein d'un tissu, à partir de cellules spécifiques cultivées ex vivo et transplantées sur le tissu malade. Un autre intérêt de la thérapie cellulaire est la possibilité d'utiliser les cellules transplantées comme plate-forme de délivrance d'un produit biologiquement actif, si besoin après modification génétique des cellules avant transplantation. De nombreux essais de thérapie cellulaire sont décrits à partir de cultures primaires de différents types cellulaires. On peut citer les transplantations de cellules neuronales réalisées pour le traitement de la maladie de Huntington (1) ou la maladie de Parkinson (2), les transplantations de cellules d'ilôts de Langerhans réalisées pour le traitement du diabète (3), ou encore les transplantations de cellules myoblastiques réalisées pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne (4, 5, 6, 7) ou après modification génétique des cellules, pour le traitement du nanisme (8), de l'hémophilie (9) et de la maladie de Parkinson (10). La régénération du muscle squelettique est assurée par les cellules satellites qui sont des cellules myogéniques mononuclées situées sous la lame basale des fibres musculaires. A la suite d'une lésion, ces cellules quittent l'état de quiescence pour entrer dans une phase de prolifération active et prennent le nom de myoblastes. Par la suite, les myoblastes fusionnent pour former les myotubes. Des essais de transplantation de myoblastes ont été réalisés chez l'homme pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne et la dystrophie musculaire de Becker (4, 6, 7, 11). Si l'effet fonctionnel des transplantations décrites dans ces études reste limité, aucun effet secondaire n'a été rapporté en terme d'infection ou de carcinogenèse. Par ailleurs, l'utilisation de cellules myoblastiques dans le traitement des cardiopathies, et en particulier de l'insuffisance cardiaque terminale post-ischémique a été envisagée. En effet, contrairement au tissu musculaire, les tissus myocardiques sont dépourvus de cellules souches capables de former des cadiomyocytes et régénérer des tissus. Le seul traitement de l'insuffisance cardiaque terminale post-ischémique reste à l'heure actuelle, la transplantation cardiaque. Cependant, la pénurie de greffons entraîne une augmentation du nombre de décès. La transplantation de cellules issues de tissus musculaires dans le muscle cardiaque a donc été envisagée en tant qu'alternative à la transplantation cardiaque. Des études de transplantation de myoblastes dans le tissu infarci du myocarde ont été réalisées chez le rat, le lapin ou le chien (12, 13,14). Les résultats de ces études ont montré la faisabilité et une certaine efficacité fonctionnelle de telles transplantations. Des essais de greffes de cardiomyocytes f#taux dans un modèle d'insuffisance cardiaque d'origine iatrogène chez la souris ont aussi montré un certain bénéfice fonctionnel. Cependant, l'utilisation de cellules foetales pose, dans la perspective d'application clinique, de nombreux problèmes éthiques, immunologiques et d'approvisionnement cellulaire. L'utilisation d'une population de cellules myoblastiques issues du muscle squelettique constitue donc une alternative particulièrement intéressante pour la préparation de produit de thérapie cellulaire pour le traitement de l'insuffisance cardiaque terminale post-ischémique. L'un des types cellulaires les plus importants contenu dans le tissu musculaire est la cellule satellite, précurseur du myoblaste. C'est le type cellulaire qui a été utilisé dans les différentes études cliniques. Cependant, le tissu musculaire contient d'autres types cellulaires. En particulier, certaines cellules d'origine musculaire pourraient aussi être utilisées pour la reconstitution d'un potentiel hématopoïétique (15,16). Une étude in vitro a aussi démontré la présence dans le muscle humain de progéniteurs susceptibles de se différencier à long terme en tissus cartilagineux ou osseux (17). Des exemples de milieux permettant la différenciation en tissu adipeux, cartilagineux ou osseux sont décrits pour des cellules souches mésenchymateuses (22). En conséquence, compte tenu des propriétés de différenciation des cellules d'origine musculaire, l'utilisation de ces cellules en thérapie cellulaire apparaît intéressante pour le traitement de nombreuses lésions affectant les tissus du système hématologique et immunologique, les tissus osseux, adipeux, cartilagineux, musculaires ou vasculaires. Une des difficultés majeures de la thérapie cellulaire reste l'obtention d'une population de cellules suffisamment grande, homogène et dont le degré de différenciation est adapté à l'effet désiré. Des procédés de préparation cellulaire myoblastique et leur utilisation en thérapie cellulaire sont décrits dans l'état de la technique (4, 18,19, 20, 21). La majorité des procédés comprennent : - une étape de prélèvement des tissus musculaires par biopsie, - une étape d'éminçage, une étape de dissociation des fibres musculaires par action enzymatique, une étape de séparation des cellules individualisées par filtration, une étape de sélection des cellules myoblastiques par clonage ou par tri cellulaire. La sélection des cellules myoblastiques peut se faire par le clonage des cellules et la caractérisation ultérieure des clones obtenus par cytofluorimétrie puis sélection des cellules musculaires squelettiques exprimant l'antigène CD56 (7). Une méthode directe de tri des cellules myoblastiques exprimant l'antigène CD56 par cytofluorimétrie de flux et ses avantages pour l'obtention d'une culture pure de myoblastes sont décrits dans l'état de la technique (21). Les cellules conservées sont ensuite cultivées dans un milieu de culture modifié et spécialement adapté pour la culture des myoblastes (23). La présente invention résulte de l'observation que les cellules issues du tissu musculaire squelettique présentent un potentiel de régénération de nombreux tissus en fonction de leur degré de différenciation. L'invention proposée permet donc de fournir des populations cellulaires bien caractérisées d'origine musculaire, adaptées et spécialement préparées pour leur utilisation souhaitée en thérapie cellulaire. La présente invention fournit un procédé d'obtention d'une population cellulaire comprenant un type cellulaire dominant, à partir d'une biopsie de tissu musculaire, pour la préparation d'un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) prélèvement et éminçage d'une biopsie musculaire dans un milieu nutritif, b) dissociation enzymatique des fibres et des cellules musculaires et séparation des cellules individualisées par filtration, c) mise en culture des cellules d'origine musculaire ainsi obtenues dans un réacteur de culture de cellules adhérentes en présence d'un milieu de croissance et/ou de différenciation suivie le cas échéant d'une ou plusieurs phases d'expansion, d) identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques, e) choix du stade de culture pendant lequel le type cellulaire recherché est en proportion dominante dans la population de cellules, f) récolte d'une population de cellules au stade de culture choisi en e), g) le cas échéant, congélation des cellules prélevées à l'étape choisie pour la préparation du produit de thérapie cellulaire. Les termes population cellulaire ou population de cellules signifient toute population de cellules non pures, contenant en général un type cellulaire dominant et un ou plusieurs types cellulaires minoritaires. Le type cellulaire dominant est le type cellulaire dont la proportion dans la population de cellules est la plus élevée. Préférentiellement, un type cellulaire dominant est le type cellulaire dont la proportion dans la population de cellules dépasse 50%. Un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine comprend une solution isotonique dans laquelle les cellules sont resuspendues. Cette solution doit être exempte des composants toxiques présents dans les milieux de congélation. Un tel composant est, par exemple, le DMSO. La biopsie musculaire est réalisée par prélèvement de cubes de 2 à 4 cm de coté. A titre d'exemple, 3 grammes de tissu prélevé permettent d'obtenir après expansion entre 400 et 800 millions de cellules. Le tissu musculaire prélevé est un tissu musculaire squelettique, préférentiellement prélevé chez l'adulte, le jeune adulte, l'adolescent ou l'enfant Dans une forme de réalisation de l'invention, le tissu musculaire prélevé est un tissu musculaire squelettique foetal. L'éminçage consiste à découper la biopsie à l'aide de ciseaux fins en sections d'une taille de préférence inférieure à 0,5 mm placées dans un milieu de culture adapté. L'éminçage est essentiel pour permettre une dissociation enzymatique efficace. Les tissus musculaires sont constitués de fibres musculaires. Les cellules satellites sont situées sous la lame basale des fibres musculaires. L'étape de dissociation des fibres musculaires et de décollement des cellules satellites est donc une étape nécessaire pour leur isolement. L'étape de dissociation consiste en l'utilisation d'enzymes de digestion de la matrice extracellulaire, elle peut être complétée par une dissociation mécanique par aspiration et refoulement de la suspension au travers d'une pipette. Le choix des enzymes et leurs concentrations utilisées pour la dissociation des fibres musculaires et des cellules satellites de l'éminçat est guidé par l'étude de leur efficacité enzymatique, les critères recherchés sont une concentration d'enzyme la moins élevée possible et un temps d'incubation minimal pour une efficacité similaire. Le rendement en cellules obtenues après filtration dépend en partie de la qualité de l'étape de dissociation enzymatique. Des enzymes de digestion utilisables dans le procédé de l'invention seules ou en association sont par exemple : toutes les collagénases, incluant les types IA, S et H partiellement purifiées, ainsi que la forme purifiée commercialisée sous le nom de Libérase par Roche- Boehringer, les trypsines, de toutes origines, en solution dans des tampons contenant ou non de l'EDTA, les dispases (aussi connues sous le nom de protéases), la pronase, les élastases, ou encore, les hyaluronidases. De manière préférée, l'étape de dissociation se fait en deux temps ; une première incubation en présence de collagénase et une deuxième incubation en présence de trypsine. Lorsque la libérase est utilisée, des concentrations d'utilisation dans l'éminçat particulièrement efficaces se situent entre 0. 05 à 2 mg/ml. Le temps d'incubation à 37 C pour de telles concentrations étant choisi alors dans une gamme de temps s'étalant de 15 minutes à 2 heures. Après neutralisation de l'activité enzymatique, par addition de sérum de veau foetal, de sérum humain autologue, ou de sérum humain allologue provenant d'un groupe compatible, le produit de digestion est ensuite filtré sur tamis, sous pression de la gravité afin d'éliminer les fibres non dissociées et recueillir les cellules décollées des fibres musculaires. De manière préférée, une étape de filtration sera réalisée en deux temps : Une étape de filtration sur un tamis de 100 m, puis une seconde étape sur un tamis de 40 m. Les cellules recueillies après filtration sont transvasées dans un réacteur de culture en présence d'un milieu dont la composition permet leur croissance ou/et leur différenciation. La composition du milieu est choisie en fonction du type cellulaire dominant souhaité en fin de culture. Les milieux de culture utilisés contiennent un ou plusieurs facteurs de croissance et/ou de différenciation dont le rôle est de diriger les cellules progénitrices vers une voie de différenciation spécifique et de les faire proliférer. A titre d'exemple de facteurs de croissance, on peut citer les facteurs de croissance des fibroblastes, bFGF, aFGF, FGF6, le facteur de croissance des hépatocytes, HGF/SF, de l'épiderme, EGF et les différents facteurs caractérisés tels IGF-1, PDGF, LIF, VEGF, SCF, TGFb, TNFa, IL- 6, IL-15, NGF, la neuréguline, la thrombopoïétine et l'hormone de croissance. On peut les associer à différentes hormones ou molécules actives qui peuvent entrer dans la composition des milieux, telles que les glucocorticoïdes (naturels ou hémi-synthétiques, i.e. l'hydrocortisone, la dexaméthasone, la prednisolone ou la triamcinolone), les progéstagènes et dérivés (progestérone), les oestrogènes et dérivés (oestradiol), les androgène et dérivés (testostérone), les minéralocarticoïdes et dérivés (aldostérone), les hormones LH, LH-RH, FSH et TSH, les hormones thyroïdiennes T3, T4, l'acide rétinoïque et ses dérivés, la calcitonine, les prostaglandines E2 et F2/alpha ou l'hormone parathyroïdienne. Les cellules sont ensuite mises en culture dans un réacteur adapté pour la culture de cellules adhérentes. Afin de s'affranchir des contraintes de contrôles de la vitesse d'agitation, de sa régularité et de l'homogénéité des préparations, le réacteur de culture est de préférence statique. Il doit présenter une grande surface de culture par rapport aux supports classiques (boites de Pétri, flasques) de manière à récolter en quelques jours une population cellulaire importante. Un exemple d'un tel réacteur de culture est le dispositif de culture en plateaux (simple, double et/ou multi- étagé). Le dispositif de culture utilisé dans le procédé permet de plus l'échantillonnage des cellules de manière stérile afin de réaliser les prélèvements nécessaires à l'identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par analyse de marqueurs spécifiques. Il permet la vidange des milieux, le lavage et le décollement des cellules et enfin leur récolte de manière stérile. De manière préférée, des poches sont utilisées et des tubulures stériles spécialement adaptées relient les poches au réacteur pour permettre les transvasements des milieux ou la récolte des cellules. Ce dispositif permet ainsi de réaliser un grand nombre d'opérations en système clos. Selon la population cellulaire souhaitée, le nombre de jours de culture varie de 0 à 30 jours. La culture peut néanmoins être poursuivie par des techniques classiques d'expansion ou de perfusion pendant une durée pouvant atteindre plusieurs mois. Afin d'augmenter le nombre de cellules récoltées, une ou plusieurs phases d'expansion sont possibles. Les phases d'expansion comprennent une étape de décollement des cellules, de lavage des cellules et de remise en culture sur une plus grande surface de culture, les solutions et enzymes utilisées pour réaliser ces étapes étant bien connues de l'homme du métier. Une cinétique de différenciation est réalisée dans le procédé de l'invention par l'identification des types cellulaires présents dans les populations de cellules obtenues aux différents stades de la culture, Cette identification est réalisée à partir d'échantillons prélevés lors de la mise en culture, au cours de la culture et lors de la récolte des cellules. La caractérisation des populations cellulaires peut aussi porter sur une culture de cellules réalisée en parallèle à plus petite échelle mais dans des conditions identiques ou équivalentes en terme de milieu de culture, de dispositif et de procédé de réalisation des phases d'expansion. La caractérisation des populations cellulaires porte sur les cellules adhérentes ou les cellules présentes dans le surnageant. Les différents stades de la culture sont comptés en jours à partir du jour de mise en culture en réacteur jusqu'à l'apparition des premières cellules différenciées ou l'obtention d'un degré de confluence des cellules d'au moins 60%. La caractérisation des populations de cellules a pour fonction l'identification de l'ensemble des types cellulaires et de leurs proportions en fonction du stade de la culture. Elle permet en particulier de mettre en évidence les types cellulaires dominants en fonction du stade de la culture. Le procédé de l'invention propose ainsi un moyen de choisir une population cellulaire en fonction des caractéristiques des différents types cellulaires présents dans la population et de l'objectif de thérapie cellulaire recherché. Cette caractérisation est réalisée par l'analyse de marqueurs cellulaires par cytofluorimétrie de flux ou FACS, après marquage des antigènes de surfaces ou de tout antigène spécifique des différents types cellulaires à analyser. Dans le présent texte, le terme marqueurs cellulaires indique tout antigène cellulaire permettant d'apporter des informations à lui seul ou en combinaison avec d'autres marqueurs sur un type cellulaire. Tout type de marqueur cellulaire peut être utilisé par le procédé, le choix des marqueurs utilisés sera guidé par le choix des types cellulaires que l'on souhaite caractériser. Toute technique apte à caractériser un antigène cellulaire peut être mise en oeuvre dans le procédé de l'invention. On peut citer à titre d'exemple sans être limitatif, le Western Blot ou l'immunocytochimie. Les techniques permettant la caractérisation des ARN messagers codant lesdits antigènes sont utilisables de manière équivalente. Dans un mode de réalisation de l'invention, les marqueurs cellulaires analysés pour l'identification des types cellulaires sont spécifiquement choisis parmi les marqueurs suivants : CD10, CD13, CD15, CD16, CD34, CD38, CD40, CD44, CD45, CD56, CD71, CD80, CD117 ou encore les structures suivantes, CD138, HLA-Classe I, HLA-classe II, VLA3, VLA5, VLA6, ICAM-1, VCAM et la desmine. De manière préférée, les marqueurs CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD56 et CD117 et la desmine sont utilisés. La présence de ces marqueurs est identifiée par l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques. Le tableau 1, ci-après fourni dans la partie expérimentale, indique, pour chacun des marqueurs, les types cellulaires exprimant classiquement les antigènes correspondants. Il est à noter que ces marqueurs cellulaires ont été développés initialement pour la caractérisation du système immuno-hématologique. Une originalité de l'invention consiste en l'utilisation de ces marqueurs pour la caractérisation des cellules d'origine musculaire aux différentes étapes de la culture ou de l'expansion. Le procédé de l'invention est donc mis en #uvre grâce à l'analyse de marqueurs cellulaires non classiquement utilisés dans la caractérisation des cellules issues de tissus musculaires. Ces marqueurs cellulaires sont par exemple CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD45 et CD117. Il a été effectivement observé que la mise en #uvre du procédé de l'invention permet la mise en évidence d'une évolution au cours du temps du type cellulaire dominant présent dans la culture. De manière surprenante, aux stades précoces de la mise en culture des cellules de tissus musculaires et dans un milieu adapté pour la différenciation myoblastique, les populations majoritaires sont celles exprimant les marqueurs de cellules progénitrices de la moelle et des cellules du système lymphoblastoïde. Plus précisément, il a été observé à JO et J1, une majorité de cellules de phénotype CD34+/45- ainsi que la présence d'un type cellulaire minoritaire CD117+ dans la population de cellules non adhérentes. L'évolution est ensuite marquée par une augmentation croissante de la proportion de cellules CD15+ et/ou CD56+, et une diminution des populations CD34+. Néanmoins, le type cellulaire dominant reste CD34+ de JO à J5. Une transition progressive d'une population de type cellulaire dominant CD34+ à CD15+ puis d'une population de type cellulaire dominant CD15+ à CD56+ est observée. Par ailleurs, la proportion des types cellulaires CD13+, CD44+, CD71+ augmente avec le temps. Des populations minoritaires CD138+, HLA-Classe Il+ et CD38+ sont aussi observées. Au terme de la culture, le type cellulaire dominant est de phénotype CD56+, en particulier à partir du stade J5 jusqu'à la fin de la culture. Les cellules CD56+ expriment également CD10, CD13, CD44, la desmine, HLA-Classe I, CD44, VLA-3, VLA-5 et VLA-6. Ces marqueurs caractérisent les cellules myoblastiques. Un deuxième type cellulaire prépondérant est constitué de cellules exprimant CD15, CD10, CD13 et HLA-Classe I. Une population CD56-/CD15-/CD13+ est aussi présente en proportions variables constituant un troisième type cellulaire prépondérant. Dans cette population, une partie exprime la desmine et une partie ne l'exprime pas. Dans une forme de réalisation de l'invention, un type cellulaire recherché dans une population cellulaire est séparé après sélection du stade de culture pendant lequel le type cellulaire à sélectionner est dans l'état qualitatif ou quantitatif recherché, en particulier, après sélection du stade de culture pendant lequel le type cellulaire à séparer est dominant. La présence en proportion dominante des cellules à séparer facilite leur tri. L'invention fournit ainsi un procédé d'obtention d'une population cellulaire de degré de pureté élevé. On entend par population cellulaire de degré de pureté élevé, une population de cellules dans laquelle le type cellulaire dominant est en proportion supérieure à 50% dans la population cellulaire. L'obtention d'une population cellulaire de degré de pureté élevé peut se révéler nécessaire pour certaines utilisations en tant que produit de thérapie cellulaire. Il apparaît clairement que l'homme du métier pourra mettre en #uvre les différentes techniques proposées dans l'état de l'art pour faire un tri sélectif des dites cellules. A titre d'exemple, citons les techniques de tri par clonage, par cytofluorimétrie de flux ou encore par colonnes d'immunoaffinité ou immunomagnétiques utilisant des anticorps spécifiques des cellules en cause. Dans le procédé de l'invention, après arrêt de la culture au stade de culture choisi, un aliquot de cellules peut être prélevé et remis en culture séparément. Le milieu peut être le même ou de composition différente. Les milieux de culture sont choisis en fonction de la voie de différenciation souhaitée. Un exemple de milieu permettant la différenciation en myoblastes, en cellules endothéliales, en cellules musculaires lisses ou en myofibroblastes est le milieu MCDB 120 supplémenté par du sérum de veau foetal (23) qui comprend en particulier de la dexaméthasone et du bFGF. Un milieu de différenciation en tissus adipeux contient en particulier la dexaméthasone, l'isobutyl-methylxanthine, et le cas échéant, du sérum de veau foetal, l'indométhacine et l'insuline. Le maintien de la différenciation est obtenu dans un milieu contenant 10% de sérum de veau fcetal et l'insuline. Pour obtenir une différenciation en tissus cartilagineux, les cellules sont centrifugées en micromasses et cultivées dans du milieu sans sérum mais contenant du TGF-béta3. Un milieu de différenciation en tissus osseux contient de la dexaméthasone, du béta-glycérolphosphate, de l'ascorbate, et le cas échéant, du sérum de veau foetal. La récolte des cellules s'effectue au stade de culture choisi en fonction de la population cellulaire dont on souhaite l'obtention. Les cellules non adhérentes présentes dans le surnageant ou/et les cellules adhérentes peuvent être récoltées par ce procédé. Les populations de cellules présentes dans le surnageant et de cellules adhérentes peuvent être de composition différente. Par conséquent, le mode de récolte des cellules sera fonction de la population cellulaire recherchée. La récolte des cellules adhérentes s'effectue par dissociation enzymatique des cellules et décollement de la couche cellulaire par des techniques connues de l'homme de métier. La récolte des cellules non adhérentes se fait par aspiration. La mise en #uvre du procédé ci-dessus incluant l'établissement d'une cinétique de différenciation à partir de cellules issues de tissus musculaires permet l'obtention de populations cellulaires caractérisées pour la préparation d'un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine. Par conséquent, l'invention porte également sur les populations cellulaires susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. En particulier, aux stades précoces de culture des cellules, l'invention fournit une population cellulaire dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD34, spécifique des cellules souches. Lorsque seules les cellules non-adhérentes sont récoltées au stade précoce de culture, la population cellulaire comprend aussi un type cellulaire minoritaire de phénotype CD117+ Les cellules CD34+ sont des progéniteurs des systèmes hématopoïétiques, immunologiques, osseux, adipeux, cartilagineux, musculaires ou vasculaires (16, 17, 22). Le marqueur CD34+ est présent également dans certains types de cellules endothéliales des tissus vasculaires. Les cellules CD117 positives sont des progéniteurs des systèmes hématologiques et immunologiques mais pourraient également représenter des progéniteurs de nombreux autres types cellulaires (en particulier des mélanocytes). L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une population cellulaire d'origine musculaire dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD34, spécifique des cellules pluripotentes comme produit de thérapie cellulaire pour la reconstitution des tissus du système hématologique et immunologique ou des tissus osseux, adipeux, cartilagineux, musculaires ou vasculaires. Par la mise en #uvre du procédé décrit ci-dessus dans lequel le milieu de culture est adapté pour la différenciation myoblastique, l'invention fournit une population cellulaire dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD15 Ce type cellulaire apparaît être une forme transitoire au cours de la différenciation des cellules en myoblastes. L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une population cellulaire dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD15 dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour la reconstitution des tissus musculaires squelettiques, cardiaques et viscéraux et des tissus vasculaires. Enfin, par la mise en #uvre du procédé décrit ci-dessus et en utilisant un milieu de culture adapté pour la différenciation myoblastique, une forme de réalisation préférée de l'invention fournit une population cellulaire dont le type cellulaire dominant est constitué de cellules myoblastiques. Les cellules myoblastiques sont caractérisées par l'analyse de l'expression du marqueur CD56. Elles sont caractérisées de manière préférée par l'analyse de l'expression du marqueur CD56 en combinaison avec l'analyse des marqueurs CD10, CD13, CD44 et la desmine. L'analyse de l'expression de la desmine, protéine intracellulaire du cytosquelette spécifique des cellules myoblastiques et des cellules musculaires différenciées nécessite un protocole adapté de marquage et d'analyse par FACS, détaillé dans la partie expérimentale. La population cellulaire comprend en plus une population doublement négative CD56-/CD15-. L'invention porte enfin sur l'utilisation d'une population cellulaire dont le type cellulaire dominant est constitué de cellules myoblastiques dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour la reconstitution des tissus musculaires squelettiques, cardiaques et viscéraux et des tissus vasculaires. En particulier, l'invention porte sur l'utilisation d'une population de cellules obtenue selon les procédés décrits plus haut dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour le traitement de l'insuffisance cardiaque terminale post-ischémique ou toutes cardiopathies d'origine génétique, virale, médicamenteuse, infectieuse ou parasitaire. Elle porte aussi sur le traitement des pathologies vasculaires. En effet, la mise en #uvre du procédé permet l'obtention d'un grand nombre de cellules rapidement et les populations cellulaires obtenues ont l'avantage d'être homogènes, et donc particulièrement adaptées pour la préparation d'un produit de thérapie cellulaire. Le traitement des cardiopathies consiste en particulier à injecter à l'aide d'une aiguille une population de cellules, dont le type dominant a les caractéristiques de cellules myoblastiques, obtenue et préparée comme produit de thérapie cellulaire, directement dans le tissu myocardique (12) ou indirectement dans la circulation artérielle (24). L'insuffisance cardiaque est aujourd'hui prise en charge par traitement par des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACEI). Les expériences décrites ci-après indiquent un effet améliorant certain de la transplantation de cellules myoblastiques in situ dans la zone infarcie lorsque cette transplantation est réalisée concomitamment au traitement par l'ACEI. L'invention porte donc également sur l'utilisation de populations cellulaires d'origine musculaire obtenues selon les procédés décrits plus haut comme transplant pour potentialiser les traitements pharmacologiques des insuffisances cardiaques. La partie expérimentale du présent texte décrit la réalisation de transplantations de cellules d'origine musculaire autologues chez le rat démontrant la faisabilité de cette technique. En effet, les résultats montrent que la transplantation de ces cellules chez le rat améliore significativement les paramètres d'évaluation fonctionnelle démontrant par là la faisabilité de telles transplantations. Ils montrent aussi que l'amélioration de la fonction myocardique est liée au nombre de cellules greffées. La partie expérimentale décrit également les résultats obtenus chez le rat, lors de l'utilisation conjointe de cellules musculaires autologues et du traitement pharmacologique de l'insuffisance cardiaque. L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une population de cellules obtenue selon les procédés décrits plus haut comme produit de thérapie cellulaire pour le traitement des dystrophies musculaires innées ou acquises. Chez des patients dystrophiques, la transplantation de myoblastes permet la restauration de l'expression de la dystrophine (6). Elle consiste par exemple à injecter à l'aide d'une aiguille les cellules d'origine musculaire obtenues par un procédé de l'invention directement dans le muscle squelettique. Elle porte également sur l'utilisation d'une population de cellules capable de reconstituer des tissus musculaires, cartilagineux ou osseux pour le traitement des lésions musculaire et/ou articulaires et/ou ostéo- tendineuses d'origine traumatique. La dite population de cellules est préparée comme produit de thérapie cellulaire et injectée directement dans le tissu lésé. Au cours des phases de culture et d'expansion des cellules dans les procédés fournis par l'invention, une étape de modification génétique des cellules par transfection d'un acide nucléique hétérologue peut être réalisée. L'acide nucléique est choisi de manière à permettre l'expression d'un polypeptide ou d'une protéine dans les cellules transfectées. Les cellules transfectées sont ensuite transplantées et permettent la délivrance du polypeptide ou de la protéine exprimé à partir de l'acide nucléique hétérologue, le dit polypeptide ou protéine étant un produit biologiquement actif. L'invention porte ainsi sur l'utilisation d'une population de cellules comme produit de thérapie cellulaire en tant que plate-forme de délivrance d'un produit biologiquement actif. La partie expérimentale qui suit, illustre, sans en limiter la portée, la mise en #uvre du procédé de l'invention et son utilisation. Elle comprend trois parties : La première partie est un exemple de mise en #uvre du procédé permettant selon le stade de culture choisi l'obtention de populations cellulaires dont le type cellulaire dominant est CD34+, CD15+, CD56+ (myoblastique) ou doublement négatif CD56-/CD15-. Les résultats présentés en deuxième partie montrent l'efficacité de la technique de transplantation de cellules myoblastiques sur des tissus cardiaques infarcis chez le rat. Elle permet aussi de déterminer les critères requis pour une bonne efficacité. Le pharmacologue sait extrapoler les résultats obtenus sur les essais animaux à la mise au point des protocoles du traitement de l'homme. Enfin, une troisième partie présente les essais cliniques réalisés chez l'homme de transplantation de cellules d'origine musculaire pour la reconstitution de tissus myocardiques. PARTIE EXPERIMENTALE Légende des figures: Figure 1 : Graphe indiquant les valeurs de LVEF entre le groupe traité et le groupe contrôle. Figure 2 : Graphe indiquant les valeurs de LVEDV entre le groupe traité et le groupe contrôle. Figures 3A et 3B : Graphe indiquant les valeurs de LVEF à 1 mois (3A) et LVEF à 2 mois (3B) selon les catégories de risque. Figure 4 Régression linéaire présentant la corrélation entre l'amélioration fonctionnelle et le nombre de cellules injectées. A. PROCEDE D'OBTENTION DE POPULATIONS CELLULAIRES ISSUES DE TISSUS MUSCULAIRES SQUELETTIQUES A.1 Matériels, solutions et milieux utilisés Milieu A : Milieu MCDB120 (23) modifié : substitution de la L-Valine par de la D-Valine, élimination du rouge de phénol, élimination de la thymidine. Milieu B : Milieu A + 20% de sérum de veau foetal irradié + antibiotiques (à 100 UI/ ml pour la pénicilline et 100 g/ml pour la streptomycine). Milieu C : Milieu B + bFGF (10 ng/ml) + dexamethasone (1 m). Solution D : PBS Milieu E : Milieu A + bFGF (10 ng/ml) + dexamethasone (1 m) + sérumalbumine humaine stérile (0.5%). Solution F : Solution saline isotonique stérile 0. 9% NaCI. Solution G : Solution F + 4% de sérumalbumine humaine et 7. 5% de DMSO (diméthyl-sulfoxyde) final Le procédé d'obtention de populations cellulaires décrit ci-après comporte 6 étapes : # prélèvement et éminçage de la biopsie # dissociation enzymatique et séparation des cellules indivualisées par filtration # mise en culture des cellules et phases d'expansion des cultures # identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques # récolte des cellules # congélation des cellules et préparation du produit de thérapie cellulaire Dans le procédé, la centrifugation des cellules s'effectue à 160 g pendant 5 minutes. Le comptage des cellules et l'analyse des populations sont réalisés à l'aide d'un hémacytomètre de Neubauer. Dans les phases d'expansion, les cellules sont incubées à 37 C dans un incubateur air-C02 (95%-5%) saturé en humidité. L'observation des cellules se fait à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase. A. 2 Résultats A. 2.1 Prélèvement et éminçage de la biopsie Le prélèvement est réalisé au bloc opératoire, en milieu stérile, en système ouvert. Une biopsie d'environ 3 grammes de tissu musculaire squelettique est réalisée par l'équipe chirurgicale. La biopsie est ensuite découpée en petits cubes de 2 à 4 mm de côté, puis émincée à l'aide de ciseaux fins dans le milieu A. L'éminçat est placé dans une bouteille stérile contenant 25 ml de milieu A. A. 2.2 Dissociation enzymatique et séparation des cellules individualisées par filtration Le flacon contenant l'éminçat est centrifugé à température ambiante. Le surnageant est éliminé par aspiration Le poids de l'éminçat est obtenu par pesée sur une balance tarée à l'aide d'un flacon vide. L'éminçat est rincé avec 25 ml du milieu A. Après sédimentation des éminçats, le surnageant est éliminé par aspiration. Une solution de libérase (Roche-Boehringer) a été préparée selon les instructions du fabricant puis reconditionnée et congelée à la concentration de 10 mg/ml. La libérase est décongélée extemporanément puis ajoutée à l'éminçat à concentration de 0.1 mg/ml, sous un volume de 10 ml par gramme de tissu. La bouteille est placée à l'étuve à 37 C pour une durée de 60 minutes. La bouteille est agitée manuellement toutes les 10 minutes (diffusion de l'enzyme et dissociation mécanique douce). La suspension est ensuite centrifugée. Le surnageant est éliminé par aspiration à la pipette. Ce premier produit de digestion est ensuite incubé dans une solution de trypsine à 0.25%. On utilise 10 ml de solution enzymatique par gramme de tissu initial. La suspension est digérée durant 20 minutes à 37 C à l'étuve, avec agitation manuelle toutes les 5 minutes. Elle est ensuite aspirée et refoulée au travers d'une pipette de 25 ml. 10% de sérum de veau foetal irradié (Hyclone) est alors ajouté pour la neutralisation des activités enzymatiques. Le produit de digestion est filtré sur tamis de 100 m, puis de 40 m, sous pression de la gravité, afin de séparer les cellules dissociées des tissus résiduels. Un tamis par gramme de tissu est utilisé (Cell strainer de Falcon). Le filtrat est centrifugé à 300 g durant 5 minutes. Après élimination du surnageant, les culots sont lavés à l'aide du milieu B, puis centrifugés. Le surnageant est éliminé par aspiration. Le culot est ensuite repris dans 10 ml de milieu C. 100 l de volume est prélevé pour comptage. Une aliquote est réservée pour estimation de la viabilité par cytofluorimétrie (iodure de propidium). A. 2.3 Mise en culture des cellules et phases d'expansion des cultures Après déconditionnement, les cellules sont transvasées dans le dispositif de culture. Le dispositif de culture est un plateau de culture (Nunc Single Tray) d'une surface de 600 cm2. Le remplissage du plateau se fait par un orifice prévu à cet effet et obturé par un bouchon stérile à usage unique. Les cultures sont incubées à 37 C dans une enceinte saturée en humidité en atmosphère contrôlée air-C02 (95%-5%). Le lendemain de la mise en culture, un premier lavage est réalisé afin d'éliminer les cellules mortes et les débris musculaires. Une poche vide est connectée à l'un des deux orifices du dispositif de culture. Une poche contenant la solution D est connectée de la même façon à l'autre orifice. Le milieu est éliminé par gravité et remplacé par 50 ml de solution D. Le flacon est rincé par agitation manuelle douce. Le milieu est de nouveau éliminé par gravité. La poche contenant le milieu D est remplacée par une poche contenant 120 ml de milieu C qui sont ajoutés à la culture. Le milieu C est renouvelé au bout de 120 heures. L'expansion est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 60% à 70% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent (environ 8 jours après la mise en culture). Après vidange du milieu, les cellules sont lavées par agitation manuelle douce à l'aide de 50 ml de solution D. La solution D est vidangée puis 20 ml de solution de trypsine irradiée (0. 25%) sont ajoutés. Le flacon est mis à incuber 5 minutes à 37 C. Les cellules sont récoltées dans une poche de 40 ml. L'action de la trypsine est neutralisée par l'addition de 10% de sérum de veau foetal. Le sérum est injecté à l'intérieur de la poche à l'aide d'une seringue. Les cellules sont centrifugées. Le surnageant est éliminé par transvasement dans une autre poche de vidange, reliée par un connecteur stérile. Le culot est remis en suspension dans 30 ml de milieu C pour lavage des cellules puis les cellules sont centrifugées. Le surnageant est éliminé par transvasement dans une autre poche de vidange, reliée par un connecteur stérile. Le culot cellulaire est resuspendu dans 20 ml de milieu C. Un aliquot est prélevé pour numération et analyse des populations. La viabilité est estimée à l'aide d'un cytofluorimètre. Les cellules sont ensuite transférées dans une poche contenant 500 ml de milieu C, puis ensemencées dans deux unités double-plateaux (double-tray de Nunc) d'une surface totale de 1200 cm2. Les cellules sont mises à incuber Une troisième expansion est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 60% à 70% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent. Pour cette série d'expansions, les boîtes multi-étagées de 10 plateaux (multi-tray de Nunc) sont utilisées. Après vidange du milieu, les cellules sont lavées à l'aide de 100 ml de solution D. Le décollement de la couche cellulaire et la dissociation enzymatique des cellules sont réalisés après vidange de la solution de lavage par l'addition de 50 ml de trypsine irradiée (0. 25%) dans chaque plateau. Les préparations sont mises à incuber 5 minutes à 37 C. Les cellules sont récoltées dans une poche stérile de 500 ml. L'action de la trypsine est neutralisée par l'addition de 10% en volume de sérum de veau foetal ou de sérum autologue. Les cellules sont centrifugées et le surnageant est éliminé par connexion à une poche de vidange. Le culot cellulaire est resuspendu dans 50 ml de milieu C puis transféré dans un flacon contenant 1200 ml de milieu C par un connecteur stérile. Une boîte de culture de 10 plateaux multi-étagés (multi-tray de Nunc) est ensemencée avec 1100 ml de la préparation cellulaire. Le contrôle visuel de la croissance en plateaux multi-étagés est impossible. Par conséquent, une boite de culture Nunc stérile simple plateau (single-tray) est ensemencée aussi avec 110 ml de la préparation cellulaire. Ce dernier plateau permet un contrôle visuel quotidien de la culture et de l'état de confluence des cellules. Les cellules sont ensuite mises à incuber. La culture dure de 3 à 5 jours. La veille de la récolte des cellules, le milieu est éliminé par vidange dans une poche stérile et remplacé par un volume équivalent de milieu E. La récolte finale est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 90% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent. A. 2.4 identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques La caractérisation est basée sur l'analyse par cytofluorimétrie de flux (FACS). Des anticorps dirigés contre les antigènes humains de surface cellulaire suivants ont été utilisés : CD5, CD10, CD11, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD40, CD40- ligand, CD44, CD45, CD56, CD62, CD71, CD80, CD86, CD90, CD105, CD117, CD138. Des anticorps dirigés contre les structures antigéniques suivantes ont aussi été utilisés: CD138, HLA-Classe I, HLA-DR, ELAM, ICAM, LECAM, Stro-1, S-endo-1, VCAM, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6. L'analyse de l'expression de la desmine, protéine intracellulaire est réalisée de la manière suivante : Après mise en suspension dans du PBS, les cellules sont fixées et perméabilisées par l'addition de 10 volumes de méthanol à 4 C pendant 5 minutes, puis centrifugées. Après lavage du méthanol résiduel et centrifugation, les cellules sont reprises dans du PBS contenant l'anticorps dirigé contre la desmine (Dako, clone D33, 1/100) et incubées durant 15 minutes. Après lavage et centrifugation, les cellules sont incubées durant 15 minutes en présence de l'anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire, couplé à un fluorophore. Après lavage et centrifugation, les cellules sont analysées par FACS. Le tableau 1 ci-après présente les caractéristiques des marqueurs principaux utilisés et les types cellulaires correspondants (types cellulaires). CARACTERISTIQUES CLASSIQUES DES MARQUEURS UTILISES MARQUEUR TYPES CELLULAIRES CD10 lymphocytes préB neutrophiles CD13 monocytes, cellules myéloides CD15 monocytes, macrophages, granulocytes, éosinophiles CD16 NK, sous pop lymphocytes T, neutrophiles CD34 progéniteurs CD38 LT activités, cellule souche, sous pop. L T,B,NK CD40 lymphocytes T CD4+ activés CD44 Anti HCAM CD45 leucocytes CD56 NK, sous pop Lymphocytes T CD71 cellules proliférantes CD117 progéniteurs HLA CL1 antigène MHC classe 1 HLA CL2 antigène MHC classe 2 VLA3 lymphocytes B VLA5 lymphocytes T mémoire, monocytes, plaquettes VLA6 thymocytes, lymphocytes T mémoire, monocytes DESMINE cellules musculaires Tableau 1 : Présentation de certains marqueurs cellulaires utilisés dans le procédé et les types cellulaires les exprimant. L'analyse des populations cellulaires est réalisée aux différents stades de culture . - Au jour JO correspondant à la mise en culture de la population fraîchement préparée. Plusieurs séries ont été réalisées en flacons unitaires mis en culture parallèlement à l'unité simple plateau à JO, afin de pouvoir suivre quotidiennement l'évolution des cultures en prélevant un ou plusieurs flacons par jour. - Au jour 1 (J1), la fraction non adhérente (surnageant) et la fraction adhérente (obtenue par trypsination) ont été analysées indépendamment. De manière intéressante, il a été montré que ces deux fractions renferment des populations aux caractéristiques différentes. - De J2 à J9, les cellules adhérentes ont été analysées chaque jour afin de suivre l'évolution des populations au cours du temps. En parallèle, les cellules obtenues par production en masse ont été analysées à chaque étape d'expansion puis au moment de la récolte finale. Les résultats ont montré qu'à date de récolte équivalente, les caractéristiques obtenues dans les plateaux et les flacons indépendants sont identiques. Les données issues de l'identification des types cellulaires au cours de la cinétique de différenciation sont présentées dans les tableau 2A et 2B suivants et les caractéristiques essentielles sont décrites ci-après. Cinétique de différenciation (pourcentages) MARQUEURS JO J1 SN J1 J2 J3 CD34+ 38,5 (25-75) 77 (69-79) 39 (25-67) 74 (64-75) 74 (51-75) CD34- 61,5 (25-75) 23(20-30) 61 (33-75) 26 (25-30) 26 (25-49) CD34+CD10+ 14 (10-18) 27(25-29) 2,5 (2-3) 24(20-40) 11 (7-17) CD34+CD10- 25(23-31) 47 (40-54) 30,5 (24-37) 39 (36-54) 59 (44-63) CD34+CD45+ ND 0,5 (0-1) ND ND CD34+CD56+ 0 0 0 0,3 (0,3-0,3) 0,7 (0,4-2) CD34+DR+ 14 ND 21,5 (16-27) ND ND CD34+DR- 28 ND 12 (12-12) ND ND ~~~~~~~~~~~~~~~~ @ CD34+CD15+ ND ND ND ND ND CD56+ 4,7 (0-26) 4,4 (0,3-15) 1(0-5) 11 (7,7-20) 14 (12-35) CD15+ 1,5(0-6) 3(1,5-6) 3,6 (0,1-12) 20,5 (20-21) 25(24-33) CD56+CD15+ 0,02 (0-0,3) 0 0 4(4-4) 10 (6-14) CD13+ ND ND ND ND ND CD44+ 0 ND ND ND ND CD117+ 1,7 (0,16-1,7) ND 1,7(0,2-2) ND ND Tableau 2A : Identification des types cellulaires au cours du temps (en pourcentage dans la population cellulaire totale) des stades JO à J3 de la culture. MARQUEURS J4 J5 J6 J7 J8 CD34+ 56 (36-67) 35 (26-50) 23 (13-47) 2,7 (0,6-10) 1,7 (0,4-3,4) CD34- 44 (33-63) 65 (50-73) 76 (53-87) 97 (90-99) 98 (96-100) CD34+CD10+ 9 (8-22) 16,5 (3-34) 16,8 (0,6-33) 1,7 (0,2-2,7) 0,4 (0,2-7,6) CD34+CD10- 35 (27-59) 25 (15-35) 14 (14-14) 5,1 (0,4-9) 1,3 (0,2-7,6) CD34+CD45+ ND ND ND ND ND CD34+CD56+ 3 (1,5-6) 7,5 (1,5-12) 3 (0,1-12) 0,35 (0,2-0,6) 0,4 (0,4-2,1) CD34+DR+ ND ND ND ND ND CD34+DR- ND ND ND ND ND CD34+CD15+ ND ND ND ND ND CD56+ 34 (28-55) 61 (50-68) 73 (57-74) 64 (52-87) 68,4 (50,3-91) CD15+ 48 (46-48) 48 (47-63) 51 (29-64) 36 (20-55) 29 (12-54) CD56+CD15+ 19 (17-21) 13 (9-25) 10 (5-13) 3,6 (2,6-6) 1,4 (1-3) CD13+ ND ND 96 (76-97) 99 (94-99) 99 (96-99) CD44+ ND ND ND ND ND CD117+ ND ND ND ND ND Tableau 2B : Identification des types cellulaires au cours du temps (en pourcentage dans la population cellulaire totale) des stades J4 à J8 de la culture. A.2.4.1 Caractéristiques des préparations cellulaires à JO Le procédé permet d'obtenir 3x105 à 4X105 cellules par gramme de tissu. Les types cellulaires majoritaires sont CD34+. Les types cellulaires CD34+ sont CD34+/CD10+ à 14% ; à 25% ; CD34+/CD56+ à 0% ; CD34+/DR+ à 14% et CD34+/DR- à 28%. Les populations CD34+ sont CD45- en majorité. Des populations minoritaires expriment CD44, CD45, CD56, CD117, HLA-Classe Il. De manière surprenante, la caractérisation d'un nombre de cellules progénitrices important (en quantités absolue et relative dans la population) permet d'envisager, par une récolte des cellules à ce stade, leur utilisation comme produit de thérapie cellulaire pour la reconstitution de nombreux tissus, non seulement musculaires mais aussi hématopoïétiques, osseux, adipeux, cartilagineux ou vasculaires. A.2.4.2 Caractéristiques des préparations cellulaires adhérentes à J1 Une majorité de cellules est CD34+. La population se compose de CD34+/CD10+ (27%) et CD34+/CD10- (47%). CD13 apparaît. La préparation est négative pour CD117 et CD45. Les types cellulaires CD15+ et CD56+ sont minoritaires. A.2.4.3 Caractéristiques des préparations cellulaires présentes dans le surnageant à J1. Une proportion importante de cellules est CD34+. La population se compose essentiellement de CD34+/CD10-. Une population CD117+ ( A.2.4.4 Caractéristiques des évolutions des marqueurs au cours de la culture L'évolution est marquée par une augmentation croissante de la proportion de cellules CD15+ et/ou CD56+ et une diminution des populations CD34+ On peut observer au cours du temps la transition progressive d'une population de CD34+ à CD15+ puis d'une population de CD15+ à CD56+. La proportion des populations CD13+, CD44+, CD71+ augmente avec le temps. On observe des populations minoritaires CD138+, HLA-Classe Il+, CD38+. En fin d'expansion, on observe trois populations prépondérantes : CD56+, CD15+ et CD56-/CD15-. La population CD56+ exprime CD10, CD13, CD44, la desmine et HLA-Classe I. La population CD15+ exprime CD13, Classe 1 et partiellement CD10. Ces marqueurs sont spécifiques des cellules myoblastiques. Dans la population CD56-/CD15-, une fraction exprime la desmine et l'autre fraction ne l'exprime pas. Certains marqueurs sont exprimés plus faiblement et de façon variable : CD71, VLA3, VLA5, VLA6, CD16+ et CD40L. Les populations CD34+, CD38+, CD45+ et HLA- Classe Il+ ont disparu ou sont extrêmement minoritaires. A. 2.5 Récolte des cellules Le protocole suivant décrit la récolte des cellules au stade final pour l'obtention d'une population myoblastique majoritaire. Cependant, le protocole permet à l'homme du métier de le mettre en #uvre quelque soit le stade de différenciation choisi pour la récolte des cellules et ce, en fonction de la population cellulaire recherchée. Après vidange du milieu, les cellules sont lavées à l'aide de 500 ml de solution D (pour l'unité multi-plateaux) et 50 ml pour l'unité simple. La solution de lavage est vidangée et 200 ml de solution de trypsine irradiée (0. 25%) sont ajoutés pour l'unité multi-plateaux (20 ml pour l'unité simple). La préparation est mise à incuber 5 minutes à 37 C. Les cellules sont récoltées par vidange dans une poche de 500 ml. L'action de la trypsine est neutralisée par l'addition de 10% de sérum de veau foetal injecté par une seringue. Les cellules sont lavées de la manière suivante : les cellules sont centrifugées. Le surnageant est éliminé puis les cellules sont remises en suspension dans 300 ml de solution F puis centrifugées. Les surnageants sont éliminés. Deux autres étapes de lavages comme précédemment décrit sont réalisées. Ces lavages successifs ont pour but d'éliminer la trypsine, les protéines animales encore présentes et le bFGF recombinant. Au cours du troisième lavage, une aliquote est réservée pour le comptage cellulaire, l'estimation de la viabilité et de la qualité cellulaire, les contrôles de qualité microbiologique. A. 2.6 Préparation du produit de thérapie cellulaire Afin de permettre l'utilisation dans le temps des cellules ainsi préparées, il peut être avantageux de les congeler dans des conditions telles que la décongélation ultérieure permette une survie des cellules suffisante, de préférence supérieure à 90%. A titre d'exemple, les cellules sont suspendues dans le milieu de congélation (solution G) et transférées dans deux poches de congélation stériles, à une concentration comprise entre 107 et 2x107 cellules/ml. La congélation est réalisée à l'aide d'un dispositif (Digicool ou Nicool) assurant une descente progressive en température contrôlée. Les cellules sont stockées dans l'azote liquide jusqu'au moment de la décongélation. La décongélation des cellules est réalisée au bain-marie à 37 C. Les préparations cellulaires sont lavées deux fois à l'aide d'une solution saline isotonique. Les rinçages sont effectués par connexion stérile aux poches de solution isotonique et aux poches de vidange. Une aliquote est réservée pour l'estimation de la viabilité et de la qualité cellulaire. Après centrifugation, les cellules sont reprises dans un volume de solution isotonique à une concentration de 1.5x108 cellules/ml. Elles sont enfin aspirées dans une seringue de 10 ml. Les cellules sont prélevées pour l'injection dans des senngues stériles Le type d'aiguille utilisée pour l'injection dépend du tissu ciblé. Pour l'injection intramyocardique directe, une aiguille coudée à 90 de 25 à 30 gauge est spécifiquement utilisée. B. FACTEURS AFFECTANT LA FONCTIONNALITE DE LA TRANSPLANTATION DE CELLULES D'ORIGINE MUSCULAIRE AUTOLOGUES POUR LE TRAITEMENT DE MODELES D'ISCHEMIES MYOCARDIQUES B.1 Matériels et méthodes B.1.1 Modèle d'ischémie myocardique Des rats mâles Wistar, pesant 280 g ont été anesthésiés à la kétamine (50 mg/kg) et la xylasine (10 mg/kg) et ventilés par la trachée. Une thoracotomie a été réalisée. L'infarctus du myocarde est obtenu par ligature coronaire gauche en utilisant un fil de polypropylène 7/0. B.1.2 Tests de fonctionnalité Une semaine après l'infarctus du myocarde, et un ou deux mois après transplantation, la fonction ventriculaire gauche a été étudiée par échocardiographie bi-dimensionnelle (2D). Sous anesthésie générale à la kétamine (50 mg/kg) et la xylasine (10 mg/kg), les mesures 2D (et M-mode) sont réalisées avec un appareil commercial de 15MHz (15L8) linear-array transducer (Sequoia, Acuson Corp., Mountain View, CA, USA) autorisant une fréquence maximale de 160 Hz. Des vues parasternales longitudinales sont obtenues, de manière à ce que les valves mitrales et aortiques et l'apex puissent être correctement visualisées et ainsi enregistrées. Les mesures des longueurs (L) du grand axe du ventricule gauche et les tracés des zones endocardiaques (a) sont réalisées. Le volume en fin de diastole du ventricule gauche (LVEDV) et le volume en fin de systole du ventricule gauche (LVESV) ont été calculés avec la formule suivante : V = 8x A2 / (3 x 7t x L). Les fractions d'éjection du ventricule gauche (LVEF) sont ainsi calculées : LVEF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV. Toutes les mesures ont été faites à partir d'au moins trois battements et à l'aide de deux expérimentateurs traitant les différents groupes en aveugle. B.1.3 Culture des cellules Pendant la procédure d'infarctus du myocarde, les muscles antérieurs des tibiaux droit et gauche sont disséqués de manière à séparer le tendon et le tissu aponeurotique du tissu musculaire. Ils sont ensuite émincés, pesés et dissociés à l'aide d'enzymes en utilisant la collagénase IA (2 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) pendant une heure et la trypsine-EDTA (0.25%, GIBCO BRL, Gaithersbueg, MD, USA) pendant 20 minutes. Les cellules sont récoltées par sédimentation (7 min à 1200 rpm) et la réaction enzymatique est neutralisée par l'addition de 10% de sérum de veau foetal. Après passage sur un tamis de 100 m et centrifugation, le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues dans un milieu composé de F12(HAM) avec 20% de sérum de veau foetal, 1% (vol/vol) penicilline-streptomycine (10000 UI/ml-10000 g/ml, GIBCO BRL) et 5 ng/ml de bFGF (Sigma). L'ensemencement initial est réalisé en flacons de culture de 75 cm2 et les cellules sont incubées en air saturé en humidité à 5% de C02. Le jour de la transplantation, après 7 jours de culture et après évaluation fonctionnelle du niveau de base des fractions d'éjection ventriculaire par échocardiographie, les cellules ont été récoltées par trypsination, lavées et la viabilité a été testée. Un échantillon a été ensemencé sur des boîtes 12-puits dans 2.0 ml de milieu de culture pour comptage. Les cellules sont lavées dans le milieu d'injection (milieu de culture + BSA à 0. 5%, Fraction V) et gardées dans la glace avant transplantation. Les cellules sont centrifugées, resuspendues dans 150 l de milieu d'injection et administrées par voie sous-épicardique dans la zone infarcie. B.1.4 Transplantation des cellules dans la zone infarcie Quarante-quatre rats ont fait partie de cette étude et ont été divisés en deux groupes : Un groupe contrôle et un groupe traité. Tous les rats ont été réopérés une semaine après l'infarctus du myocarde, sous anesthésie générale et ventilation de la trachée. Tous les rats ont reçus 150 l de milieu d'injection administré dans la zone infarcie au moyen d'une aiguille 30 Gauge. Dans le groupe contrôle (n=23), les rats ont reçu le milieu d'injection seul. Le groupe traité (n=21) a reçu la suspension de cellules myogéniques cultivées. Dans chaque groupe, quatre catégories de risques ont été étudiées par rapport à la fraction d'éjection de base LVEF : 40% (n=16). Cette stratification permet d'obtenir des nombres homogènes d'animaux dans chaque sous-groupe afin de rendre les résultats statistiques plus précis. B.1.5 Etudes immuno- et histochimiques Un jour après transplantation, les cellules ensemencées en boite de 12-puits sont fixées au méthanol et refroidies à -20 C pendant 5 minutes. Le marquage non spécifique est neutralisé en utilisant un mélange de 5% de sérum de cheval (HS) et 5% de sérum de veau foetal dans du PBS pendant 20 minutes. Les cellules sont incubées avec un anticorps de souris dirigé contre la desmine (1/200 DAKO, A/S-Denmark) pendant 1 heure puis avec un anticorps anti-souris conjugué au marqueur Cy3 (1/200, Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) pendant une heure dans l'obscurité. Les cellules sont observées à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase et à illumination fluorescente. Plusieurs clichés ont été pris de manière aléatoire. La proportion de myoblastes est calculée en divisant le nombre de cellules positives à la desmine par le nombre total de cellules observées. Dans les trois mois qui suivent la dernière échocardiographie (soit 2 mois après transplantation), les rats sont sacrifiés par une surdose de ketamine et de xylasine. Les ventricules sont isolés et sont sectionnés en deux parties le long de leur axe longitudinal. Les deux parties sont mises dans l'isopentane et congelées à l'azote. De fines sections de 8 m sont préparées en utilisant un cryostat et des études classiques histologiques sont réalisées par coloration à l'hématoxyline et à l'éosine. B.1.6 Analyse statistique Toutes les données sont en moyenne à 1 SEM. Toutes les analyses ont été réalisées à l'aide du logiciel approprié (Statview 5. 0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Le seuil critique a pour les analyses a été choisi à p Les comparaisons des variables continues entre les groupes contrôle et traité et chaque catégorie de risque ont été réalisées à l'aide de l'analyse de variance (méthode ANOVA) suivi du test post hoc (Scheffé). Les études longitudinales comparant les données échocardiographiques pour chaque groupe, avant et un et deux mois après l'injection intramyoacardique ont été réalisées en utilisant le test d'appariement. Pour tester les relations entre le nombre de cellules injectées et la fonction cardiaque après transplantation, deux variables ont été créées : (LVEF à 1 mois/ LVEF) et (LVEF à 2 mois/LVEF). Le lien a été étudié par le calcul du F-ratio pour la régression ANOVA et le coefficient R2 ajusté pour les analyses de régression linéaire. De plus, la variabilité à l'intérieur de chaque groupe des tests échocardiographiques a été observée à partir de deux lots de mesures effectuées sur 10 rats choisis de manière aléatoire en utilisant une analyse de Bland et Altman. B.2 Résultats B.2.1 Caractérisation de la suspension injectée Sur 10000 cellules comptées le jour de la transplantation, 50% sont positives pour l'expression de la desmine. Le nombre de cellules injectées est de 3.500 000 500000 s'étalant de 700000 à 6.5x106. B.2.2 Test de fonctionnalité après transplantation des cellules d'origine musculaire Les paramètres échocardiographiques du niveau de base ne sont pas significativement différents entre les groupes. Au contraire, des différences majeures entre les groupes sont observées après la transplantation. Ainsi, dans le groupe traité, la fonction cardiaque est améliorée, comme cela est montré par comparaison de LVEF avec les groupes contrôles (Figure 1). A un mois après l'injection myocardique, des différences significatives sont observées entre les deux groupes (37.52 1. 92% contre 25.49 2.47%, p=0. 0005). Ce résultat est confirmé après 2 mois après l'injection (40. 92 2.17% contre 25.83 2.39%, p Cette amélioration de LVEF dans le groupe traité est essentiellement reliée à une plus petite augmentation de LVESV par rapport à la dilatation ventriculaire, représentée par la variable LVEDV, qui augmente de manière similaire dans les deux groupes (Figure 2). Les analyses longitudinales dans chaque groupe ont montré une amélioration substantielle de la fonction du ventricule gauche dans le groupe traité (Figure 3). Des différences significatives sont observées en comparant LVEF à un mois et LVEF à 2 mois à la variable LVEF du niveau de base. Les différences sont aussi significatives en comparant LVEF à un mois à LVEF à 2 mois. Tandis que LVEDV et LVESV sont augmentés à un mois en comparant aux valeurs de bases (p Dans le groupe contrôle, une importante diminution de LVEF avec une augmentation significative de LVEDV est déjà visible à un mois (p=0.0066 et p Quand la fonction cardiaque (LVEF) est analysée par catégories de risques selon les valeurs de bases LVEF, des différences sont observées entre les groupes contrôle et traité à un mois dans les deux sous-groupes intermédiaires 25-35% et 35-40%. Cette amélioration de LVEF est confirmée à 2 mois après injection dans les deux sous-groupes, mais de manière intéressante, un effet bénéfique est aussi observé, en comparant le groupe traité au groupe contrôle dans le groupe de risque Enfin, l'étude de régression montre un lien significatif entre le nombre de myoblastes greffés et les ratios LVEF à un mois (R2=0.675, p sont analysées par groupe de risque, l'impact du nombre de cellules injectées à 2 mois est aussi significatif dans les sous-groupes B.2.3 Effets cumulés de la transplantation des cellules d'origine musculaire et d'un traitement par un inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACEI) La prise en charge de l'insuffisance cardiaque consiste à l'heure actuelle en l'administration d'inhibiteurs d'ACE. Il était par conséquent intéressant d'étudier s'il pouvait exister une synergie entre la transplantation de cellules d'origine musculaire obtenues selon le procédé de l'invention et l'effet protecteur procuré par les inhibiteurs d'ACE. Un infarctus du myocarde a été réalisé chez 39 rats par ligature des artères coronaires. Un traitement au perindoprilat à 1 mg/kg par jour, un inhibiteur de l'ACE, a été initié immédiatement après l'infarctus et continué sans interruption jusqu'au sacrifice de l'animal. Une semaine après l'infarctus, les animaux ont été opérés à nouveau et sélectionnés de manière aléatoire pour recevoir une injection sous-épicardique de 150 l de milieu de culture seul (groupe contrôle, n=21) ou un volume équivalent contenant les cellules d'origine musculaire, soit environ 3x106 cellules cultivées à partir d'une biopsie de muscle de tibia antérieur et récoltées au moment de l'infarctus (groupe traité, n=18). La fonction ventriculaire gauche a été testée par échocardiographie un mois après la transplantation. Le niveau de base de la valeur de la fraction d'éjection est similaire entre les animaux contrôles (24 2%) et les animaux traités (28 1 %) (p = 0.11). Un mois après la transplantation, les valeurs des fractions d'éjection ont augmenté dans les deux groupes et sont de 32% 2% pour le contrôle et de 38% 2% pour le groupe traité. Cependant, on constate une plus forte augmentation chez le groupe traité (p Ces données montrent qu'il existe un effet additif de la transplantation de cellules d'origine musculaire et du traitement aux inhibiteurs d'ACE. C. ESSAIS CLINIQUES CHEZ L'HOMME DE TRANSPLANTATION DE CELLULES D'ORIGINE MUSCULAIRE POUR LA RECONSTITUTION DES TISSUS MYOCARDIQUES Des essais cliniques de transplantations des cellules d'origine musculaire préparés selon le procédé de l'invention ont été réalisés chez l'homme en vue de traiter l'insuffisance cardiaque. C. 1 Méthodes Les essais ont été réalisés chez 9 patients, dont, au moment de leur inclusion, leur âge était compris entre 18 et 75 ans. Ces patients ont tous fait l'objet d'indications cliniques de pontage aorto-coronaire avec possibilité technique de revascularisation chirurgicale. Leur fraction d'éjection globale ventriculaire gauche (mesurée par échocardiographie et/ou angiographie et/ou isotopes) était inférieure ou égale à 35%. Ils avait tous des antécédents d'infarctus myocardique transmural. Enfin, les patients avait une hypo ou akinésie segmentaire touchant deux segments contigus ou plus (en dehors d'un anévrisme), en rapport avec l'infarctus. L'activité métabolique résiduelle dans cette zone était inférieure à 50%, détectée à la tomographie par émission de positons (TEP) et il n'y avait pas d'augmentation de cinétique à l'échographie Dobutamine à faible dose (10 gamma/Kg/mn). Dix grammes de tissus autologues sont prélevés au niveau du vastus lateralis chez le patient. L'incision est réalisée à l'aplomb du vaste externe. Le protocole de mise en culture et d'expansion des cellules est celui décrit dans la partie A du présent texte. La culture cellulaire à injecter est ensuite déposé dans une cupule en inox stérile pour être aspirée dans une seringue de 1 ml. Un pontage coronaire est d'abord réalisé sous circulation extra-corporelle selon la technique habituelle. Après analyse de l'extension de l'infarctus et repérage des bords de la zone nécrosée, la suspension cellulaire d'environ 400 millions de cellules (1,5x108 cellules/ml) est injectée, dans et aux confins de la zone infarcie, à l'aide de la seringue de 1 ml. Plusieurs injections sont nécessaires pour déposer la totalité des cellules. Ce temps opératoire est réalisé sous circulation extra-corporelle et clampage. C. 2 Méthodes d'évaluations et résultats fonctionnels Ces essais ont permis de montrer la faisabilité et la sécurité de la technique chez l'homme Par ailleurs, des tests de fonctionnalité sont réalisés par la mesure de la fonction ventriculaire gauche (segmentaire et globale) et du remodelage ventriculaire, couplée à la mesure de l'activité cellulaire métabolique. Ces mesures sont obtenues par des méthodes ultrasoniques telles que l'échocardiographie Doppler usuelle (mesure des diamètres, volumes et fractions d'éjection ventriculaire gauche), le Doppler tissulaire dans la zone infarcie et l'échocardiographie Dobutamine pour la recherche d'ischémie et de viabilité. Elles sont aussi obtenues par des méthodes isotopiques telles que la Tomographie à Emission de Positons (captation du désoxyfluoroglucose dans la zone infarcie). Ces mesures sont réalisées en pré-opératoire et en post-opératoire au 1er mois 8 jours et au 3eme mois 8 jours Les différents indices sont comparés chez chaque patient avant et après chirurgie, par un test statistique. En particulier, les essais ont montré la possibilité d'obtenir le nombre de cellules souhaité dans un délai limité de 2 à 4 semaines Ils ont par ailleurs montré que le prélèvement, la préparation et la transplantation des cellules musculaires pouvaient être réalisés selon l'invention sans difficultés et complications pré, per ou post-chirurgicales. Enfin, ces essais ont permis de montrer une amélioration significative de la fonction ventriculaire gauche. En conclusion, les études présentées dans les parties B et C permettent d'apporter les différents résultats suivants : a) elles montrent que la transplantation des cellules d'origine musculaire améliore de manière significative la fonction ventriculaire gauche suite à un infarctus du myocarde, b) que l'amélioration est clairement dépendante du nombre de cellules injectées, c) que cette transplantation potentialise un traitement pharmacologique, notamment par une inhibition de l'ACE. d) Et enfin que le procédé de l'invention est adapté pour le traitement de l'insuffisance cardiaque chez l'homme. 1. Emerich, D. F. (1993). Cell transplantations of Huntington's disease. Cell transplantation 4 : 348. 2. Borlongan, C. V. and Sandberg, P. (1993). Microtransplantation of nigral dopamine neurons in a rat model of Parkinson's disease. Cell Transplantation 4 : 347. 3. Hering, B. J., Browatzki, C. C., Schultz, A., Bretzel, R. G. and Federlin, K.F. (1993). 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REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention d'une population cellulaire comprenant un type cellulaire dominant à partir d'une biopsie de tissu musculaire pour la préparation d'un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) prélèvement et éminçage d'une biopsie musculaire dans un milieu nutritif, b) dissociation enzymatique des fibres et cellules musculaires et séparation des cellules individualisées par filtration, c) mise en culture des cellules d'origine musculaire ainsi obtenues dans un réacteur de culture de cellules adhérentes en présence d'un milieu de croissance et/ou de différenciation suivie le cas échéant d'une ou plusieurs phases d'expansion, d) identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques, e) choix du stade de culture pendant lequel le type cellulaire recherché est en proportion dominante dans la population de cellules, f) récolte d'une population de cellules au stade de culture choisi en e), g) le cas échéant, congélation des cellules prélevées à l'étape choisie pour la préparation du produit de thérapie cellulaire. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel seules les cellules non adhérentes sont récoltées au stade de culture choisi en fonction de leur identification à l'étape d). 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel l'identification des types cellulaires est réalisée par l'analyse des antigènes de surface et/ou de marqueurs cellulaires. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel les antigènes ou marqueurs cellulaires analysés sont sélectionnés parmi les marqueurs CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD56, CD117 et la desmine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les étapes de culture de cellules sont réalisées dans un dispositif entièrement clos en plateaux simples, doubles et/ou multi-étagés. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le milieu de culture des cellules utilisé pour la cinétique de différenciation est choisi selon la voie de différenciation souhaitée parmi l'un des milieux suivants : - un milieu adapté pour la différenciation en cellules myoblastiques ; - un milieu adapté pour la différenciation en cellules endothéliales ; - un milieu adapté pour la différenciation en cellules musculaires lisses ; - un milieu adapté pour la différenciation en myofibroblastes ; et, - un milieu adapté pour la différenciation en cellules des tissus osseux, adipeux ou cartilagineux. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel, le milieu adapté pour la différenciation en cellules myoblastiques, endothéliales, mulculaires lisses ou en myofibroblates, contient de la dexaméthasone et du bFGF. 8. Procédé selon la revendication 6, dans lequel, le milieu adapté pour la différenciation en cellules des tissus osseux contient de la dexaméthasone, du béta-glycérolphosphate, de l'ascorbate et du sérum de veau foetal. 9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel, le milieu adapté pour la différenciation en cellules des tissus adipeux contient de la dexaméthasone, de l'isobutyl-methylxanthine, de l'indomethacine, du sérum de veau foetal et de l'insuline. 10. Procédé selon la revendication 6, dans lequel, le milieu adapté pour la différenciation en cellules des tissus cartilagineux est un milieu sans sérum contenant du TGF-béta3. 11. Procédé d'obtention d'une population cellulaire de degré de pureté élevé à partir d'une biopsie de tissu musculaire comme produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine comprenant a) la mise en #uvre du procédé d'obtention d'une population cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, b) la sélection de cellules d'un type cellulaire recherché de la population cellulaire obtenue à l'étape a), c) une ou plusieurs phase d'expansion des cellules sélectionnées en b), d) le cas échéant, la congélation de la population cellulaire obtenue. 12. Procédé d'obtention d'une population de cellules comprenant au moins un type cellulaire dominant exprimant le marqueur CD34, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et dans lequel le stade de culture choisi pour la récolte des cellules est compris entre le stade JO et le stade J5. 13. Procédé d'obtention d'une population de cellules comprenant un type cellulaire exprimant le marqueur CD117, ledit procédé comprenant la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et dans lequel les cellules non-adhérentes sont récoltées au stade de culture choisi entre le stade JO et le stade J1. 14. Procédé d'obtention d'une population de cellules comprenant un type cellulaire dominant exprimant le marqueur CD15, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que les cellules sont récoltées au stade de culture pendant lequel le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD15. 15. Procédé d'obtention d'une population de cellules comprenant au moins un type cellulaire dominant ayant les caractéristiques de cellules myoblastiques ou exprimant le marqueur CD56, par la mise en #uvre du procédé selon la revendication 7 et dans lequel le stade de culture choisi pour la récolte des cellules est après 5 jours de culture au moins. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les caractéristiques de cellules myoblastiques sont déterminées par l'analyse des marqueurs CD56, éventuellement les marqueurs CD10, CD13, CD44 et la desmine. 17. Population de cellules dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD34 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en #uvre du procédé selon la revendication 12. 18. Population de cellules dont le type cellulaire dominant exprime le marqueur CD15 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en #uvre du procédé selon la revendication 14. 19. Population de cellules dont un type cellulaire est caractérisé par l'absence de marqueur CD15 et de marqueur CD56 caractérisé en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 14 ou 15. 20. Population de cellules dont le type cellulaire dominant a les caractéristiques de cellules myoblastiques caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en #uvre du procédé selon l'une des revendications 15 à 16. 21. Utilisation d'une population de cellules obtenue selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire en tant que plate-forme de délivrance d'un produit biologiquement actif. 22. Utilisation d'une population de cellules selon l'une des revendications 17 à 18 dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour la reconstitution des tissus du système hématologique et immunologique ou des tissus osseux, adipeux, cartilagineux, musculaires ou vasculaires. 23. Utilisation d'une population de cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 20 dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire - pour le traitement des lésions musculaire et/ou articulaire et/ou ostéo-tendineuse d'origine traumatique, - pour la reconstitution de tissus musculaires squelettiques, cardiaques et lisses, - pour le traitement de l'insuffisance cardiaque terminale post- ischémique, - pour le traitement de cardiopathies d'origine génétique, virale, médicamenteuse, infectieuse ou parasitaire, - pour le traitement des dystrophies musculaires innées ou acquises, - pour le traitement des pathologies vasculaires. 24. Utilisation d'une population de cellules selon l'une quelconque des revendications 17 à 20 dans la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour potentialiser les traitements pharmacologiques des insuffisances cardiaques.