FR 2816943 A1 20020524 FR 0015049 A 20001122 DERIVES DE LA BIOTINE, LEURS PROCEDES DE FABRICATION ET LEURS UTILISATIONS EN TANT QUE VECTEURS L'invention a pour objet des dérivés de la biotine, et leurs utilisations en tant que vecteurs, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de méthodes de détection d'interactions entre des composés biologiques. ainsi que dans des compositions pharmaceutiques. Les interactions petites molécules-grosses molécules ont un rôle important dans les processus biologiques. Elles incluent toutes les interacttons hgand-récepteur, ligand-protéine de CI transport, hormone-récepteur, enzyme-substrat, en/yme-mhibiteur... Leur mise en évidence ouvre la porte à la compréhension des mécanismes d'action des molécules physiologiques, et à la définition de nouvelles molécules utilisables en pharmacologie. La mise au point dans la levure de la méthode"double hybride" (Yang et al., Science, 257, 680-682,1992) a permis l'étude des interactions protéine-protéine ou peptide-protéine. Ce système met en jeu la protéine Gal4, qui est constituée de deux domaines fonctionnels indépendants : un domaine de fixation à l'ADN et un domaine transactivateur. Le complexe formé de ces deux domaines agit sur un promoteur du gène chimérique de fusion Gall-LacZ,"gène rapportcur"de l'interaction, et induit ainsi la biosynthèse de ss-galactosidase. Lorsque les domaines sont séparés, la transcription n'a pas lieu. Ainsi, le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 peut être fusionné à une protéine X, et la région transactivatrice de la transcription fusionnée à une protéine Y. Si X et Y ont la capacité de se lier, la proximité des deux domaines permet l'activation de la transcription du gène Gall-LacZ. Cependant, Si cette technique est efficace pour l'étude in vivo d'interactions peptide-protéine, elle ne permet pas de s'intéresser aux ligands non peptidiques. Un autre inconvénient de cette technique est l'outil biologique utilisé : les cellules eucaryotes des levures possèdent un noyau, où a lieu la transcription. Il faut donc que les protéines d'intérêt soient adressées dans le noyau. La biotine est une coenzyme, aussi appelée Vitamine H, synthétiséE par les plantes, les bactéries et certains champignons. Sa structure est la suivante : A l'intérieur des cellules, la biotine se lie à ses protéines porteuses de façon covalente par son extrémité COOH, et notamment à une protéine désignée BCCP (pour Biotin Carboxylase Carrier Protein), qui. chez E. coli, est la seule protéine acceptant de se lier à la biotine (sous l'action d'une ligase intracellulaire désignée Bir A). La BCCP se trouve ainsi biotinylée par formation d'une liaison amide entre la fonction COOH de la biotine (représentée ci-dessus), et le groupement NH2 d'un résidu lysme (situé à environ 34 à 35 résidus de l'extrémité carboxyterminale de la séquence en acides aminés de la BCCP). La protéine ainsi biotinylée a un rôle enzymatique dans les réactions de carboxylation/décarboxylation métaboliques. La présente invention découle de la découverte réalisée par les Inventeurs du fait que la biotine (ou dérivés) dont l'atome d'azote situé en position l' (NI') est substitué par un composé déterminé, permet d'intégrer ce composé à l'intérieur de cellules cibles, sans pour autant qu'il y ait : - d'une part, rupture de la liaison entre ledit composé déterminé et la biotine, - et, d'autre part, masquage du site de liaison (à savoir de la fonction COOH susmentionnée) de la biotine à la BCCP. Ainsi les Inventeurs ont mis en évidence un nouveau mode d'introduction de composés déterminés qui sont biotinylés (tout en conservant la propriété de la biotine de se lier à sa protéine porteuse, telle que la BCCP) à l'intérieur de cellules cibles, notamment de cellules bactériennes, avantageusement des cellules d'E. coli, ou des levures, ou des cellules de l'organisme humain ou animal (notamment des cellules CHO). L'invention a pour objet les dérivés de la biotine substitués en l'de formule générale (1) suivante 0 i-X1-rV wH (T) 7)-/--z J) 0 dans laquelle - RI représente un composé déterminé, - X1 représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle. et/ou un groupe-NH-, notamment une chaîne de formule HN- (CH2) n-0-CO- dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5, et comportant le cas échéant une ou des fonctions éther, amide et/ou amine. - Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, - R2 représente un atome d'hydrogène. ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formule (I) susmentionnée dans laquelle XI représente une chaîne de formule-HN- (CH2) n-0-CO dans laquelle n représente 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. Par composé déterminé, on entend dans ce qui précède et ce qui suit, toute molécule chimique d'origine synthétique ou naturelle, ou toute molécule biologique d'origine synthétique ou naturelle, protéinique ou non, et notamment toute molécule susmentionnée biologiquement active, et, le cas échéant, susceptible de posséder une action pharmacologique d'intérêt dans l'organisme humain ou animal. Il peut également s'agir non limitativement d'un composé fluorescent, d'un peptide ou d'un oligonucléotide. Des dérivés de la biotine de formule (I) particulièrement préférés, sont choisis parmi les suivants : les composés de formule (la) suivante : 0 Il ,, 0cC- 2CH- A f"T -- (CH-V N"H f)"J)" ( 1 Il lioa) 1"OR ',-s o dans laquelle : . RI représente un radical dérivé de l'hémisuccinate d'oestradiol de formule suivante 'X représente une chaine de formule-HN- (CH2) n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ouCH3, les composés de formule (rob) suivante dans laquelle . RI représente un radical dérivé de l'oestradiol de formule suivante XI représente une chaîne de formule-HN- (CH2) n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ou-CH3, - les composés de formule (le) suivante dans laquelle 'RI représente un radical dérivé de la N-acétyl-S-farnésyl-cystéine de formule suivante . XI représente une chaîne de formule HNCHn-O-CO dans laquelle n = 2 ou 4, y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-l ouCH3, les composés de formule (Id) suivante : dans laquelle . RI représente un radical dérivé de la N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine de formule sliivante. e ormule smvante. . Xl représente une chaîne de formule HN- (Cf-b) n-O-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ouCH3, les composés de formule (le) suivante, dans laquelle a RI représente un radical dérivé de l'acide oléique de formule suivante XI représente une chaîne de formule-KN- (CH2) n-0-CO- dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ou-CH3. L'invention concerne plus particulièrement encore les dérivés de la biotine de formule (1) décrits ci-dessus, dans laquelle R2 est un atome d'hydrogène. L'invention a également pour objet les dérivés de la biotine de formule (Il) décrits ci-après, et leur utilisation pour la préparation des dérivés de formule (I) susmentionnés, par couplage d'une fonction appropriée d'un composé déterminé (cette fonction étant, le cas échéant, préalablement greffée sur ledit composé déterminé) et la fonction R desdits dérivés de formule (Il), notamment selon l'une des méthodes de couplage décrite ciaprès. Les dérivés de la biotine de formule générale (Il) susmentionnés, répondent à la formule suivante. dans laquelle - R représente une fonction-COOH,-NH2,-N3, ou un atome d'halogène, - X représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, notamment une chaîne de formule- (CH2) n-0- CO dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5, - Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, - R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formule (Il) susmentionnée dans laquelle R est un atome d'halogène tel que 1 ou CI, X représente une chaîne de formule- (CHn-O-CO- dans laquelle n représente 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 est un groupe méthyle. Des dérivés de la biotine de formule (II) particulièrement préférés, sont ceux de formule :, suivantes : La synthèse des dérivés de la biotine de formule (I) et (H) susmentionnées est avantageusement effectuée selon le procédé comprenant les étapes suivantes : - traitement d'un dérivé de la biotine de formule suivante : dans laquelle Y est tel que défini ci-dessus, par un composé de formule R-OH. dans laquelle R2 représente un groupe protecteur tel que défini ci-dessus, notamment un groupe CH3, en présence d'une résine échangeuse d'ions. avantageusement à environ 70 C pendant environ 7 heures, ce qui conduit au composé de formule suivante : dans laquelle Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, - mise en présence de l'ester obtenu à l'étape précédente avec un composé de formule R-X-CI dans laquelle R est tel que défini ci-dessus, notamment R représente un atome d'halogène tel que Clou l, et X est tel que défini ci-dessus, notamment X représente une chaîne de formule- (CHn-O-. CO- dans laquelle n représente 2 ou 4, avantageusement à environ 6SoC pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ha) suivante : dans laquelle X, R et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur, te cas échéant. traitement du composé de formule (lia) susmentionnée dans laquelle R représente un atome d'halogène, par NaN3/NaI, avantageusement à environ 60 C pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (IIb), à savoir d'un composé de formule (Il) dans laquelle R représente N3, X et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur. le cas échéant, hydrogénation du composé de formule (IIb) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Il), à savoir d'un composé de formule (H) dans laquelle R représente NH2, X et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur, le cas échéant, couplage des composés de formules (IIa), (IIb), (lIe) susmentionnées avec un composé déterminé, à l'aide d'un réactif de couplage, tel que BOP/BOH en présence de triéthylamine, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (I) susmentionnée, notamment : couplage de i'hermsuccinate-17 de 16-oestradiol de formule SUivante au composé de formule (IIc0 ci-après dans laquelle n représente 2 ou 4, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (la) susmentionnée suivante : dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3. - couplage du 17-oestradiol-17carbonate de 1, 2,2, 2-tétrachloroéthyle de formule suivante : au composé de formule (IIc-1) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (Ib) susmentionnée suivante dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3, - couplage de la N-acétyl farnésylcystéine de formule suivante au composé de formule (ho-1) susmentionné ce qui conduit à l'obtentiou de composés de formule (Ic) susmentionnée suivante : dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3, - couplage de la N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine de formule suivante i I""s , , -/-- tiicOCI i, COOH COOI au composé de formule (IIc-l) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule ( ! d) susmentionnée suivante : dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3, - couplage de l'acide oléique de formule suivante au composé de formule (Ilc) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (le) susmentionnée suivante : dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3. - le cas échéant, déprotection des composés de formules (lIa), (1 b), (Ile), et de formule (1), à savoir de formules (la), (lob), (Ic), (Id) et (le) susmentionnées, notamment : . par traitement desdits composés avec une estérase, telle que l'estérase de foie de porc (PLE, pour Pig Liver Esterase), avantageusement a température ambiante pendant environ 10 jours, ou . par catalyse acide desdits composés, notamment par traitement à l'acide sulfurique à 65C pendant 24 heures, ce qui conduit à l'obtention des composés de formules (lia), (lib), (tic). et de formule (1), à savoir de formules (la), (lob), (lue), (Id) et (le) susmentionnées, dans lesquelles R2 = H. L'invention concerne l'utilisation de dérivés de la biotine de formule (Il) susmentionnée, en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles, lorsque ledit composé déterminé est lié au radical R desdits dérivés de formule (Il). L'invention concerne également l'utilisation des analogues de la biotine de formule (1), en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un'composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de dérivés de la biotine définis ci-dessus, dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, ou dans le cadre de la préparation de médicaments permettant l'introduction d'un composé déterminé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme. Ainsi, l'invention a pour but de fournir de nouvelles méthodes de détection d'interactions entre des composés biologiques, permettant d'étudier l'interaction entre d'une part un composé déterminé, protéinique ou non, et, d'autre part un composé protéinique ou non, testé pour sa capacité à intéragir avec ledit composé déterminé Par composé non protéinique. on entend tout composé ne pouvant pas être produit par un mécanisme de transcription d'un acide nucléique, par opposition à un composé protéinique susceptible d'être produit par un tel mécanisme. L'Invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de détection de protéines susceptibles d'interagir avec le radical RI (correspondant au composé déterminé) d'un dérivé de la biotine de formule (1) tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce qu'clic comprend : - la mise en présence dudit dérivé de la biotine de formule (1). avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : . une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et 'une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant une protéine susceptible d'interagir avec le radical RI susmentionné et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre la protéine susceptible d'interagir avec le radical RI dans ladite deuxième protéine de fusion, et le radical RI dudit dérivé de la biotines engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport dudit dérivé de la biotine à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison dudit dérivé de la biotine à la BCCP de ladite première protéine de fusion, - l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite protéine susceptible d'interagir avec le radical RI, et ledit radical RI. L'invention vise plus particulièrement l'application de la méthode susmentionnée à la détection de protéines susceptibles d'interagir avec un composé déterminé non protéinique, notamment dans le cadre du criblage d'une banque d'acides nucléiques codant pour des protéines susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé. Les différents acides nucléiques de ladite banque sont couplés avec la séquence d'ADN codant pour la deuxième protéine de révélation susmentionnée, et les séquences de fusion ainsi obtenues, placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription, sont utilisées pour transformer des cellules hôtes a l'aide d'un vecteur approprié. Les cellules hôtes dans lesquelles se produit une réaction témoignant d'une interaction entre la ou les protéines codées par un ou plusieurs acides nucléidiques susmentionnés, et le composé déterminé, sont isolées et les séquences en acides aminés desdites protéines sont analysées. L'invention a également pour objet toute méthode de détection de molécules, protéiniques ou non, encore désignées ci-après molécules testées, susceptibles d'interagir avec le radical RI d'un dérivé de la biotine de formule (I) tel que décrit ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en présence e d'un premier dérivé de la biote de formule (I) dans laquelle RI représente le composé déterminé avec lequel est susceptible d'interaglr une molécule testée, et c d'un deuxième dérivé de la biounc de formule (I) dans laquelle RI représente la molécule testée, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et a une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant la BCCP et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical RI du premier dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport des premier et deuxième dérivés de la biotine susmentionnés à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison desdits dérivés de la biotine aux BCCP desdites protéines de fusion, - l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical RI du premier dérivé de la biotine. Avantageusement, les méthodes de criblage décrites ci-dessus, sont appliquées à la détection d'interactions entre lesdites protéines ou molécules non protéiniques testées, et un composé déterminé non protéinique biologiquement actif, notamment un composé d'intérêt thérapeutique. De préférence, les deux protéines de révélation utilisées dans les méthodes de détection susmentionnées, sont choisies de telle façon que - la première protéine de révélation correspond à un domaine de liaison à l'ADN (tel que le domaine de liaison de GAL4 décrit dans l'article de M. Johnson et al.. A model for fungal gene regulator mechanism the GaI genes of Saccharomyces cerevisiae, Microbiologicul Re",,'invs. 51. 458-476, 1987), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à un domaine d'activation de la transcription d'un gène rapporteur (tel que le z domaine d'activation de GAL4 activant la transcription du gène codant la ssga ! actosidase, notamment la/ -GalHis3), de sorte que la détection du produit de transcription du gène rapporteur correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, ou - la première protéine de révélation correspond à un domaine de liaison à l'ADN (tel que le domaine de liaison de LexA décrit dans les articles suivants B. E. Markham et ai., Nucleotide sequence of the lexA gene of Escherichia coli K-12, Nucleic Acids Research, 9, 4149-4160, 1981 ; P. Oertel-Buchheit et al., Spacing requirements between LexA operator half-sites can be relaxed by fusing the LexA DNA binding domain with some alternative dimerization domains, J Mol Bio/., 229,1-7, 1993), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à un domaine de dimérisation (tel que le domaine de dimérisation de LexA), de sorte que l'absence de détection du produit de transcription d'un gène rapporteur (tel que le gène codant la fgalactosidase) correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, ou - la première protéine de révélation correspond à une première protéine fluorescente (telle que la GFP, pour Green Fluorescent Protein, décrite dans l'article de A. Crameri et al., Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling, Nature Biotechnology, 14,315-319, 1996 ; GFP : Mutant de Clontech, pGFPuv Bacterial Vector, GenBank Accession &num;U62636), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à une deuxième protéine fluorescente (telle que la BFP, pour Blue Fluorescent Protein, mutant de Clontech, pBBFP-Nl Vector, Catalog &num; 6069-1), les deux protéines fluorescentes étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ledit composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, engendre un processus de transfert de fluorescence, de sorte que la détection de la fluorescence caractéristique de la première protéine fluorescente à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième protéine fluorescente, correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée. De préférence, les cellules hôtes utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés susmentionnés, sont des cellules bactériennes. avantageusement des cellules de E coli, ou sont des levures, ou encore sont des cellules eucaryotes supérieures. Avantageusement, les composés de formule (1) définie ci-dessus, et plus particulièrement ceux de formules (la), (lob), (le), (Id), (le), utilisés dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés susmentionnés, sont des composés de formule (1) dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène. L'invention a également pour but de fournir de nouveaux composés pour la mise en oeuvre de telles méthodes de détection. A ce titre, l'invention a ainsi pour objet toute séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite ci-dessus,, notamment la BCCP d'escherichia Coli, Notamment, l'invention a plus particulièrement pour objet : - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine d'activation de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de dimérisation de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la GFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la BFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP. L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également les cellules hôtes, notamment de E. coli, transformées par un vecteur défini ci-dessus. L'invention a également pour objet toute protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite ci-dessus. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet : la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et la BCCP, -- la protéine de fusion entre le domaine d'activation de GAL4, et laBCCP, - la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de LexA, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine de dimérisation de LexA et la BCCP, - la protéine de fusion entre la GFP et la BCCP, - la protéine de fusion entre la BFPet la BCCP. L'invention concerne également les dérivés de la biotine de formule (I) susmentionnée, dans laquelle une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, est liée à la fonction carboxyle portée par Y. S'agissant des séquences nucléotidiques codant les protéines de fusion décrites dans les procédés susmentionnés, la partie de ces séquences codant la BCCP peut être remplacée par une séquence codant une autre protéine susceptible d'être reconnue par la biotine et de se lier à cette dernière dans le système d'hôte cellulaire utilisé. L'invention a également pour objet les trousses ou kits susceptibles d'être utilisés pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection tel que décrit ci-dessus de l'invention, comprenant - des cellules hôtes transformées avec des séquences nucléotidiques susmentionnées codant des protéines de fusion décrites ci-dessus, et/ou - des dérivés de la biotine tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement des dérivés susmentionnés de formule (II) sur le radical R desquels est susceptible d'être greffé le composé déterminé ou la molécule testée susmentionnés. L'invention a également pour objet les dérivés de la biotine de formule (1), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical RI représente un compose d'intérêt thérapeutique. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formules (la), (lob), (lu), (Id), (le) susmentionnées. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs dérivés de la biotine de formule (1), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical RI représente un composé d'intérêt thérapeutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention a également pour objet l'utilisation de dérivés de la biotine de formule (1), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical RI représente un composé d'intérêt thérapeutique, pour la préparation de médicaments permettant l'introduction dudit composé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme, lesdits médicaments étant destinés au traitement de pathologies contre lesquelles ledit composé d'intérêt thérapeutique est actif. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés de formules (la), (lob), (lu), (Id) et (le) susmentionnées pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer du sein, de l'athérome, de l'ostéoporose, ou utilisable dans le cadre de la cicatrisation. L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de composés de formule (le) susmentionnée, notamment du composé (10) décrit ci-après, en tant que régulateurs de la prolifération cellulaire, notamment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'athérome, ou utilisable en tant que cicatrisant. L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de composés de formule (Id) et (le) susmentionnées, notamment des composés (20) et (13) décrits ci-après, en tant qu'inhibiteurs de la prolifération cellulaire. notamment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers, tel que le cancer du sein. L'invention concerne également l'utilisation de composés biotinylés constitués de la biotine, ou de dérivés de cette dernière, dont l'atome d'azote en position l' (N l') est directement ou indirectement lié à un composé déterminé, en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles. Par dérivés de la biotine, on entend toute molécule dérivée par substitution d'un ou plusieurs autres atomes de la biotine que Nui', notamment par substitution du groupe carbonyle adjacent de l'atome NI'par un groupe-NH-, ou par substitution de l'atome de S par Se ou 0, et/ou dont la chaîne latérale de formule- (CH2) 4COOH est modifiée dans sa longueur et/ou par substitution. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit composé déterminé est directement lié à l'atome NI'par l'une de ses fonctions susceptibles de réagir avec l'atome NI'. Le cas échéant, ledit composé déterminé est modifié de manière à porter cette fonction capable de réagir avec l'atome d'hydrogène porté par NI'. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'atome d'azote NI'de la biotine, ou de dérivés de cette dernière, est substitué par une fonction susceptible de former une liaison covalente avec une fonction dudit composé déterminé, ce dernier étant le cas échéant modifié de manière à porter cette autre fonction. L'invention concerne également l'utilisation de la biotine, ou dérivés de la biotine, susmentionnés, dont l'atome d'azote N l'est directement ou indirectement substitué par un composé déterminé pour la mise en oeuvre de méthodes de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, et plus particulièrement de méthodes telles que décrites ci-dessus. L'invention a également pour objet l'utilisation de la biotine, ou dérivés de la biotine, susmentionnés, dont l'atome d'azote N l'est directement ou indirectement substitué par un composé déterminé d'intérêt thérapeutique, pour la préparation de médicaments permettant l'introduction dudit composé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme, lesdits médicaments étant destinés au traitement de pathologies contre lesquelles ledit composé d'intérêt thérapeutique est actif. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit des méthodes de préparation de dérivés de la biotine de l'invention, et de la construction de vecteurs et de cellules hôtes pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection selon l'invention d'interactions entre des composés non protéiniques, et des composés protéiniques ou non. I) Partie expérimentale-Synthèse Les composés utilisés proviennent de Sigma-Aldrich. d-biotin methyl ester (2). La d-biotin (1) (10 mmoles, 2,44g) est dissoute dans 75mol de méthanol anhydre. 2,6g de résine échangeuse d'ions Amberlite IR120, préalablement lavée avec de l'acide chlorhydrique 2N, rincée à l'eau jusqu'à neutralité puis séchée, sont ajoutés. La solution est portée à reflux (70 ) pendant 7 heures sous atmosphère inerte. Après retour à température ambiante, la résine est filtrée et rincée plusieurs fois avec du méthanol chaud. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 2g (rendement 79,5%) de produit (2) sous forme de poudre blanche. N-l'- (4-chloro-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (3). La d-biotin methyl ester (2) (Immole, 258mg) est dissoute dans 5ml de chloroforme anhydre chaud. 18mmoles (3, Ig, 2, 46ml) de 4-chlorobutyl chloroformate sont ajoutés et la solution est portée à reflux (65OC) pendant 4 jours. Après retour à température ambiante le chloroforme est évaporé sous pression réduite et la solution jaune obtenue ajoutée goutte à goutte dans 250ml d'éther de pétrole à 4 C. Le mélange est maintenu à 4OC pendant environ 15 minutes, jusqu'à apparition d'un précipité jaune pâle, qui est récupéré par filtration. Ce précipité est solubilisé dans 1 mol de dichlorométhane, et purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH : CH2Cl2, 3 : 97). On obtient 350mg (rendement 89, 5%) de produit (3) sous forme d'huile jaune épaisse. CCM sur silice : Rf= 0, 33 (MeOH : CH2CI2, 3 : 97). Analyse élémentaire pour Ct6H25ClN205S (392, 90) : calculé C 48. 91, H 6. 41, N 7, 13, 0 20, 36. Trouvé C 48,97, H 6,46, N 7.12, 020,36. N-l'- (2-Chloro-1-ethoxycarboRyl)-d-biotin methyl ester (3'). La d-biotin methyl ester (2) (1mmoles, 258mg) est dissoute dans 5m 1 de chloroforme anhydre chaud. 18mmoles (2,57g, 1, 86m1) de 2-chloroéthyl chloroformate sont ajoutés et la solution est portée à reflux (65 C) pendant 4 jours. Après retour à température ambiante, le chloroforme est évaporé sous pression réduite et la solution jaune obtenue ajoutée goutte à goutte dans 250m 1 d'éther de pétrole à 4 C. Le mélange est maintenu à 4 C pendant environ 15 minutes, jusqu'à apparition d'un précipité jaune pâle, qui est récupéré par filtration. Ce précipité est solubilisé dans ! mil de dichlorométhane, et purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOl-LCC) 3 : 97). On obtient 291rng (rendement 80%) de produit (3') sous forme d'huile jaune épaisse. CCM sur silice : Rf= 0, 33 (MeOH : CH2CI2, 3 : 97). N-1'-(4-azido-1-etoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (4). Immole (392mg) de (3) et 0 Immole (17mg) de NaI sont dissoutes dans 8m 1 d'acétone. La solution est rendue homogène par agitation. Smmoles (325mg) de NaN3 dissoutes dans 2ml d'eau sont ajoutées. La solution est portée à reflux (60 C) pendant 4 jours à l'abri de la lumière. Après retour à température ambiante, l'acétone est évaporée sous pression réduite et l'eau éliminée par lyophilisation. L'huile jaune obtenue est reprise dans 5ml de dichlorométhane. Un précipité blanc apparaît, qui est séparé de la solution par filtration. Le filtrat est récupéré et le dichlorométhane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH : CH2CI2, 4 : 96). On obtient 379mg (rendement 95%) de produit (4) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf= 0, 33 (MeOHHzCb, 3 : 97). Analyse élémentaire pour Cl6H2505S (399, 47) : calculé C 48. 11, H 6, 31, N 17, 53, 0 20, 03. Trouvé C 45, 03, H 6, 49, N 17, 29. N-l'- (2-azido-1-ethoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (4') Immole (364mg) de (3') et O. Immole (17mg) de Nal sont dissoutes dans 8ml d'acétone. La solution est rendue homogène par agitation. 5mmoles (325mg) de NaN3 dissoutes dans 2ml d'eau sont ajoutées. La solution est portée à reflux (60 C) pendant 4 jours à l'abri de la lumière. Après retour à température ambiante, l'acétone est évaporée sous pression réduite et l'eau éliminée par lyophilisation. L'huile jaune obtenue est reprise dans Sm 1 de dichlorométhane. Un précipité blanc apparaît, qui est séparé de la solution par filtration. Le filtrat est récupéré et le dichlorométhane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH : CH2CI2, 4 : 96). On obtient 289mg (rendement 78%) de produit (4') sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf 0, 33 (MeOH : CH2CI2, 3 : 97). N-l'- (4-amino-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5). 0, 75mmoles (300mg) de (4) sont dissoutes dans lOmI d'éthanol. 150mg de Pd/C sont ajoutés, et la solution est placée sous atmosphère de H2. Après 4 heures d'agitation à température ambiante, la solution est filtrée sur papier filtre, et le Pd/C rincé plusieurs fois au méthanol. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 210mg (rendement 75%) de produit (5) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf= 0 (MeOH : CH2CI2, 3 : 97). Chlorhydrate de (5) : le composé (5) est repris dans 3ml d'eau. De l'acide chlorhydrique est ajouté jusqu'à obtention d'un pH = 4. La solution est lyophilisée et le chlorhydrate obtenu sous forme de cristaux jaune pâle. Analyse élémentaire pour C16H28COsS (409, 93) : calculé C 46. 88, H 6, 88, N 10, 25. Trouvé C 47, 05, H 6, 95, N 10, 12. N-l'- (2-amino-l-ethoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5'). 0, 75mmoles (278mg) de (4') sont dissoutes dans 10mol d'éthanol. 150mg de Pd/C sont ajoutés, et la solution est placée sous atmosphère de H2. Après 4 heures d'agitation à température ambiante, la solution est filtrée sur papier filtre, et le Pd ! C rincé plusieurs fois au méthanol. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 181mg (rendement 70%) de produit (5') sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf= 0 (MeOH : CH2Ch, 3 : 97). N-l'- (4- (b-estradiol- 17- (succin- l-ate-4-amido))-I-butoxycarbonyl-d-biotin methyl ester (7). 54mmoles (20mg) de b-estradiol-1 7-hemisuccinate (6) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 8 Immoles (8, 9111) de N-méthylmorpholine, 108mmoles (47. 8mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl-N-oxytris (diméthylamino) phosphoflium) et 108mmoles (14, 6mg) de BOH (N-hydroxyberzotriazole). La solution est placée'sous atmosphère inerte. 108mmoles (40,3mg) de N-1'-(4-amino-#-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5) sont dissoutes dans 4ml de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 216mmoles (30, 4pal) de triéthylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de b-estradioll7-hemisuccinate, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10mI de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis i fois avec une solution aqueuse saturée en NaCH. La phase organique est ensuite séchée sur MgSO4, puis purifiée par Flash Chromatographie sur silice (meOH:CH2CI2, 5 : 95). La fraction de purification obtenue n'étant toujours pas pure, elle est purifiée par Chromatographie Liquide Haute Performance (colonne Ci 8, éluant acétonitrile/eau 95/5, débit Iml/min, détection en UV à 280nm). On obtient 19, 2mg (rendement 49%) de produit (7) sous forme d'huile jaune. N (4- (N-acetyl-S-farnesylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (9). 53,6mmoles (19,7mg) de N-acétyl-S-farnésyl cystéine (8) (synthétisée suivant la méthode de L. Zhang et P. Casey, The Journal of Biological Chemistry, vol269, N 23, pp15973-15976, 1994) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 80, 4mmoles (8, 8gel) de N-méthylmorpholine, 107,2mmoles (47,4mg) de BOP benzotriazolyl-Noxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate et 107,2 mmoles (14,5 mg) de BOH (N-hydroxybenzotriazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 107,2mmoles (40mg) de N-1' -(4-amino-1-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (S) sont dissoutes dans 41 de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 214,4mmoles (30ml) de triéthylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de N-acétyl-S-farnésyl cystéine, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est J évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCI. La phase organique est ensuite séchée sur MgSO4, puis purifiée par Flash Chromatographie sur silice (MeOH : CH2CI2, 5 : 95). La fraction de purification obtenue n'étant toujours pas pure elle est purifiée par Chromatographie Liquide Haute Performance (colonne C18, éluant acétonitrile/eau 50/50, débit 2ml/min, détection en UV à 220nm). On obtient 17mg (rendement 44%) de produit (9) sous forme d'huile jaune.. N-l'- (4- (N-acetyl-S-farnesylcysteinamido)- l-butoxycarbonyl)-d-biotin (10). 7mmoles (5mg) de (9) sont solubilisées dans 500ml d'éthanol. Cette solution est ajoutée à 4, 5ml d'une solution tampon KLH2 ? 04/Na2HP04 pH=8 contenant 70U de Pig Liver Esterase (IU d'enzyme déprotège Immole de substrat par minute à pH8 et 25C). La solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours, en ajoutant 70U de Pig Liver Esterase chaque jour. Le mélange réactionnel est acidifié à pH=3 avec une solution d'HCI à 0, 1 M, puis on réalise 3 extractions avec 5ml d'acétate d'éthyle. La solution organique est ensuite séchée sur MgS04 et l'acétate d'éthyle évaporé sous pression réduite. On obtient 0,8mg (rendement 16%) de produit (10) sous forme d'huile jaune. N-F- (4-oleylamido-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (12). 0, Immoles (28, 25mg) d'acide oléique (J sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 0, 15mmoles (16, 5 l) de N-méthylmorpholine, 0,2mmoles (88mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl-N-oxytris (diméthylamino) phosphonium) et 0,2mmoles (27mg) de BOH (N-hydroxybenzotriazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 0, 1 8mmo les (71 mg) de N-1'-(4-amino- 1 -butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5) sont dissoutes dans zip de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 0,4mmoles (56ml) de triéthylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution d'acide oléique, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur MgSO4. Le dichlorométhane est évaporé sous pression réduite et le résidu repris dans 5rnl d'éther diéthylique. On observe l'apparition d'un précipité blanc. qui est filtré sur bûchner. Le filtrat est récupéré, l'éther évaporé sous pression réduite et le résidu est purifié par Flash Chromatographie sur silice (MCOH : CH2Clz, 3 : 97). On obtient 35mg (rendement 54%) de produit (12) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice. Rf= 0,45 (MeOH : CH2CI2,8 : 92). HRMS (FAB+, MeOH) m/z : 638.41958 (638.42028 calc. Pour C34H59N3065, M±H) N-l'- (4-oleylamido-1-butoxycarbonyl)-d-biotin (13). Hydrolyse acide. A une solution de (12) (80 mg, 0.13 mmol) dans un mélange de 30 ml d'acétonitrile et 10 ml d'eau. Sont ajoutés 100 u. l de H2 SO4 2N. La solution résultante est agitée à 70 C pendant 48 heures. L'acétonitrile est évaporé et la phase aqueuse extraite 3 fois avec 10 ml de dichlorométhane. Les phases organiques combinées sont lavées 1 fois avec de l'eau saturée en NaCl, séchées (Na2S04) et concentrées sous pression réduite, pour obtenir 39 mg de (13) sous forme d'huile jaune (rendement 48 %). CCM sur silice : Rf= 0,25 (MeOH : CH2CI2, 8 : 92). HRSM (FAB+ MeOH) m/z : 646. 38715 (646.38658 cale. Pour CHO6S Mna+) 1 7/)-oestradiol-17 carbonate de 1, 2,2, 2-tétrachloroéthyle (15) 0. 37mmoles (10mg) de 17 ss-oestradiol (14) et0. 37mmoles (30 l) de pyridine anhydre sont dissoutes dans 3ml de tétrahydrofurane anhydre. Une solution contenant 0. 37mmoles (571) de chloroformate de 1, 2, 2, 2-tétrachloroéthyle dissoutes dans 2m 1 de tétrahydrofurane anhydre est ajoutée. Un précipité jaune apparaît immédiatement. La solution est mise sous agitation à température ambiante pendant 16 heures. Le précipité est filtré sur büchner et rincé par 2ml de tétrahydrofurane. Le filtrat est récupéré et le tétrahydrofurane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par Flash Chromatographie (MeOH : CH2CI2, 1 : 99). On obtient 25mg (rendement 14. 4%) de produit (15) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf 0. 49 (MeOH : CH2CI2, 1 : 99) N-1'-(4-(17ss-oestradioI-1 7-oxy-amido)-1-butoxycarbonyl)-d-biotine methyl ester (16) 41. 5moles (20mg) de 17ss-oestradol-17carbonate de 1,2, 2,2-tétrachloroéthyle (15) et 41. 5tUTtOies (15mg) de N-I'- (4-amino-1-butoxycarbonyl)-d-biotine méthyl ester (5) sont dissoutes dans 6ml de tétrahydrofurane et 100p1 d'eau. 41. 5 moles (3. 5/-Li) de pyridine sont ajoutées. Un précipité se forme immédiatement. La réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 48 heures. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est repris dans 5ml d'acétate d'éthyle. Cette solution est lavée 3 fois par 5ml d'eau, puis 1 fois par 5ml d'eau saturée en NaCI. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04. Après évaporation de l'acétate d'éthyle sous pression réduite, le résidu est purifié par Flash Chromatographie (MeOH : CH2CI2, 3 : 997). On obtient 6mg (rendement 21. 5%) de produit (16) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf 0. 30 (MeOH:CH2CI2, 5 : 95) N-l'- (4- (17 -oestradioI-17- (succin-l-ate-4-amido))- I-butoxycarbonyl) d-biotin (17) 5. 5 moles (40mg) de N-1'-(4-(17ss-oestradiol-17-(succin-1-ate-4-amido))-1 -butoxycarbonyl) d-biotine méthyl ester (7) sont dissoutes dans 15 ml d'un mélange acétonitrile/eau (2 : 1). Le pH de la solution est amené à 0.7 par ajout d'H2504 concentré. La solution est laissée sous agitation à 65 C pendant 24 heures. Elle est ensuite neutralisée par ajout de NaOH IN. L'acétonitrile est éliminé par évaporation sous pression réduite, et la phase aqueuse restante extraite plusieurs fois par 5m 1 d'acétate d'éthyle. On obtient 26mg (rendement 66%) de produit (17) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf 0. 14 (MeOH : CH2C, 8 : 92) N-l'- (4- (N-acetyI-S-geranylgéranylcystéinamido)- 1-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (19) 92 poles (40mg) de N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine (18) sont dissoutes dans 5m 1 de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 38poles (15. 2full) de N-méthylmorphoine, 92flmoles (40.7mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl-N-oxytris (diméthylamino) phosphonium) et 9211moles (12. 4mg) de BOH #-hydroxybenzotnazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 1 84 moles (68.6mg) de N-1'-(4-amino-1-butoxycarbonyi)-d-biotine methyl ester (5) sont dissoutes dans 4li1 de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 368flmoles (51. 3f. ! 1) de triéthylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de N-acétyl-S-géranylgéranyl- cystéine, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis purifiée par Flash Chromatographie (MeOH : CH2Cb, 3 : 97). On obtient 44.5 mg (rendement 70 %) de produit (19) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf= 0.56 (MeOH : CH2CI2, 4 : 96) N-l'- (4- (N-acétyl-S-geranylgéranylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-d-biotine (20) 50. 61moles (40mg) de N-l'- (4- (N-acétyl-S-géranylgéranylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-dbiotine méthyl ester (19) sont dissoutes dans 15 ml d'un mélange acétone/eau (2 : 1). Le pH de la solution est amené à 0.7 par ajout d'H2S04 2M. [-a solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours. Elle est ensuite neutralisée par ajout de NaOHIN. L'acétone est éliminée par évaporation sous pression réduite, et la phase aqueuse restante extraite plusieurs fois par 5m 1 de dichiorométhane. On obtient 31 mg (rendement 90%) de produit (20) sous forme d'huile jaune. CCM sur silice : Rf 0.30 (MeOH:CH2CI2, 4 : 96) N-1'-[ (4-n-butan-4-oic-amido)-1-butoxycarbonyl ]-d-biotin methyl ester (21). Une solution de 200 mg (0.54 mmol) de (5) et 108 mg (1. 08 mmol) d'anhydre succinique dans 5 ml de diméthylformamide est agitée à température ambiante pendant 24 heures. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite. 10 ml de dichlorométhane sont ajoutés au résidu et la solution est extraite 3 fois avec 10 ml d'eau et lavée 1 fois avec de l'eau saturée en NaCI. La phase organique est séchée (Na2SO4) et concentrée pour donner 71 mg de N-l'- [ (4-N-butan-4-oic-amido)-Ibutoxycarbony) J-d-biotin methy) ester sous forme d'huile jaune (rendement 28 %). CCM sur silice : RF=0. 73 (CH2CMeOH : acide acetique 85 : 14 : 1) HRMS (FAB+MeOH) m/z : 474. 19169 (474. 19101 cale. Pour C20H31N3bsS MH+) Les synthèses des composés CI) à (21), sont résumées dans le schéma suivant II) Clonage des gènes de fusion de la BCCP et des protéines de révélation Le gène de la BCCP a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir d'ADN génomique d'Escherichia coli. - fusion"domaine de liaison à l'ADN de GAL4-BCCP"te gène de la BCCP est inséré (sites Ncol/BamHI) dans le vecteur d'expression eucaryote pASI-CYH2, en fusion avec le gène correspondant au domaine de liaison a l'ADN de GAL4 (acides aminés 1 à 147 de GAL4). Le gène de fusion est sous le contrôle d'un promoteur constitutif. - fusion"domaine de liaison à l'ADN de LexA-BCCP" : le gène de la BCCP est inséré (sites Apal/BamHI) dans le vecteur d'expression procaryote pTTQ19CAT, en fusion avec le gène correspondant au domaine de liaison à l'ADN de LexA (acides aminés 1 à 81 de LexA) lui-même inséré par les sites Sphl/Apal. Le gène de fusion est sous le contrôle d'un promoteur ptac inductible à l'IPTG. Les séquences codant pour les protéines de fusion sont indiquées ci-après - domaine de liaison à l'ADN de GAL4-BCCP MK. LLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKSLKNNWECRYSPKTKRS PLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMIFKMDSLQDIKALLTGLFVQ DNVNKDAVTDRFASVETDMPLTLRQHRISATSSSEES-INKGQRQLTVSPEF MAYPYDVPDYASLGGHMDIRKIKKLIELVEESG1SELEISEGEESVRISRAA PAASFPVMQQAYAAPMMQQPAQSNAAAPATVPSMEAPAAAE1SGHIVRS PMVGTFYRTPSPDAKAFIEVGQKVNVGDTLC1VEAMKMMNQIEADKSGT VKAIL VESGQPVEFDEPL VVIEZGS - domaine de liaison à l'ADN de LexA-BCCP' ACQSVNGQATRGVZSHPZSHQPDRYAADACGNRAAFGVPFPKRGZ RTSEGAGTQRRYZNCFRRITRDSSVAGRGRRVAAGRSWARYSZDZKTDR AGZRIRHLRTGNFZRRRVSTHZPCSSCRKFPCDATSLRCTNDAAAS SIZRSR SGDRSFHGSASSSGNQWSHRTFPDGWYFLPHPKPGRKSVHRSGSESQRGR YPVHRZSHENDEPDRSGQIRYRESNSGRKWTTGRIZRAAGRHRVRI A=AlaC=Cys D=Asp E=Glu F=Phe G=Gly H = HisI=He K = Lys L = Leu M= Met N = Asn P=ProQ=G ! n R=Arg S=Ser T=Thr V=Va) W=TrpY=Tyr Partie expérimentale-test double-hybride dans la levure Une banque d'ADNc de cellules de placenta humain est mise en fusion avec le gène du domaine activateur de GAL4. Fragments de 500 à 1500 paires de bases clonés dans Pact2 en fusion avec GAL4-ad, commercialisée par Clontech. Le test double-hybride est développé suivant la méthode de Chang Bai et Stéphen J. Elledge, Methods in Enzymology, 283, ppI41-156, 1997. Les plasmides utilisés Sont des vecteurs d'expression eucaryote : pASl-CYH2-BCCP qui contient le gène de la Biotin Carboxylase Carrier Protein (BCCP) en fusion avec le gène du domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et le gène de l'auxotrophie vis-à-vis du tryptophane ; pACTII-RhoGDI3 qui contient le gène de RhoGDI3 en fusion avec le gène du domaine activateur de GAL4, et le gène de l'auxotrophie vis à vis de la leucine. La souche de levure Y190 (opérateur de GAL4-gène de la b-galactosidase, déficiente en tryptophane et leucine) est transformée par pASl-CYH2-BCCP et pACTII-RhoGD13. étalée sur boîte contenant du milieu un milieu déficient en Leu et Trp : SC Leu-Trp-et incubée 3 jours à 30 C. Les levures transformées sont cultivées sur milieu SC Leu-Trp-déficient en biotine pendant 24h à 30 C, puis sur milieu SC Leu-Trp-déficient en biotine et additionné de InM biotine-ligand pendant 6h à 30 C. Un test d'activité ss-galactosidase est effectué. IV. Applications industrielles Les dérivés de la biotine conformes à l'invention trouvent une application particulièrement intéressante dans les domaines suivants, non limitativement : Application A : Production de biotines bi-fonctionnelles fluorescentes utilisables comme marqueurs de protéines. d'ARN, d'ADN et commercialisables sous forme de kit de marquage fluorescent spécifique. qu Applications industrielles : ces produits s'adressent au marché de la recherche en biochimie, biologie moléculaire. Leur potentiel d'utilisation est varié, les principaux avantages étant suivants : - ils permettent une amélioration de la technologie biotine-avidine, qui trouve actuellement des domaines d'application multiples en recherche fondamentale et appliquée et utilise des biotines non fluorescentes. - les molécules de biotine fluorescentes peuvent être utilisées en remplacement des molécules radioactives, avec un bénéfice évident pour la sécurité des utilisateurs et les problèmes d'environnement. De plus, leur utilisation permettrait d'éviter les procédés longs et coûteux de stockage et décontamination des déchets radioactifs. - on peut envisager des applications nouvelles. comme le marquage de protéines in vivo, et l'utilisation simultanée de biotines couplées à différents groupements fluorescents, qui permettraient d'obtenir en même temps plusieurs informations sur les mécanismes moléculaires de la cellule. Application B : mise au point de dosage hormonaux in vivo (permettant le dosage d'une activité globale) commercialisables sous forme de kits prêts à l'emploi. Applications industrielles : les applications sont multiples : au niveau des laboratoires d'analyses médicales : pour le contrôle des taux hormonaux des individus. En effet, les taux d'hormones sont responsables de l'équilibre physiologique de l'individu, et il est important de pouvoir les doser à différentes occasions puberté, ménopause,. pour le traitement des cancers hormon- dépendants pour une utilisation optimale de l'oestrogéno-thérapie de substitution, pour le rééquilibrage hormonal des sportifs... - en contrôle qualité chez les vétérinaires pour déceler le taux on hormone des viandes (veau poulet...). - pour la détection chez les sportifs des produits dopants - dans l'industrie pharmaceutique pour la définition de nouveaux agonistes et antagonistes des hormones. I Application C i Couplage de molécules d'intérêt sur la biotine et association à des peptides permeats-pour des utilisations en tant que biovecteurs en fonction du peptides couplé, possibilité de transporter la molécule au niveau du cytoplasme ou du noyau des cellules. industrielles : le principal marché est ici celui de la thérapie génique, pour le transport des pro-drogues ou des adénovirus dans la cellule. Application D : Identification de cibles protéiques primaires (recherche des cibles de nouvelles molécules) et secondaires (détermination d'effets secondaires) des petites molécules non peptidiques chez Escherichia coll. Applications industrielles : elles se situent dans la recherche et le développement des médicaments. à deux niveaux distincts : - identification des cibles primaires et secondaires des molécules. Ceci est nécessaire pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments. - amélioration de l'efficacité des médicaments. Application E : Sélection d'anticorps catalytiques à partir d'une banque d'anti-corps (méthode du phage display ). Applications industrielles : elles sont multiples. On peut citer par exemple ; - en médecine pour la transformation de pro-drogues a des endroits précis de la cellule ou pour corriger des fonctions défectueuses des cellules. - dans l'industrie chimique : pour le recyclage des polymères par exemple. V. Application pharmaceutique Les composés selon l'invention peuvent être administrés dans des préparations pharmaceutiques à des doses comprises entre 0,1 mg à 10 mg par jour et par kilo de poids de la personne. REVENDICATIONS 1. Dérivés de la biotine de formule générale (I) suivante : dans laquelle RI représente un composé déterminé, XI représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, et/ou un groupe-NH-, notamment une chaîne de formule-HN (CH2) n-O-CO- dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5 et comportant le cas échéant une ou des fonctions ether, amide, eU ou amine. Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de là 5 atomes de carbone. 2. Dérivés de la biotine de formule (1) selon la revendication 2, choisis parmi les suivants - les composés de formule (la) suivante : dans laquelle . RI représente un radical dérivé de l'hémisuccinate d'oestradiol de formule suivante . XI représente une chaîne de formule HN- (CH2) n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représenteH ou CH3, - les composés de formule (Ib) suivante dans laquelle . RI représente un radical dérivé de l'oestradiol de formule suivante . XI représente une chaîne de formule HNCHn-O-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ou-Cl 13, les composés de formule (le) suivante //4," OR 0 dans laquelle o . RI représente un radical dérivé de la N-acétyl-S-farnésyl-cystéine de formule suivante XX-XXXS COCH3 co 1 XI représente une chaîne de formule-HN- (CH2J-O-CO- dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone. et R2 représente-H ou - CH3, -les composés de formule (Id) suivante dans laquelle . RI représente un radical dérivé de la N-acétyt-Sgéranytgéranytcystéine de formule suivante . X 1 représente une chaîne de formule-HN- (CH2) n-O-CO-dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ou - CH3, - les composés de formule (le) suivante, . RI représente un radical dérivé de l'acide oléique de formule suivante . XI représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-O-CO- dans laquelle n = 2 ou 4. Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente-H ou-CH3. 3. Dérivés de la biotine de formule générale (Il) suivante dans laquelle --N3, Ou un at0m (- d'halogène, R représente une fonction-COOH,-NH2,-N3, ou un atome d'halogène, X représente une chaîne carbonée de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, notamment une chaîne de formule- (CH2) n-0-CO dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, - R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone 4. Dérivés de la biotine de formule (II) selon la revendication 3, de formules suivantes : 5. Procédé de préparation de dérivés de la biotine selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant les étapes suivantes : - traitement d'un dérivé de la biotine de formule suivante dans laquelle Y est tel que défini dans la revendication 1 ou 3, par un composé de formule R2-OH dans laquelle R2 représente un groupe protecteur, en présence d'une résine échangeuse d'ions, avantageusement à environ 70 C pendant environ 7 heures, ce qui conduit au composé de formule suivante : dans laquelle Y et R2 sont tels que définis ci-dessus. - mise en présence de l'ester obtenu à l'étape précédente avec un composé de formule R-X-CI dans laquelle R est tel que défini dans la revendication 3. notamment R représente un atome d'halogène tel que Clou l, et X est tel que défini dans la revendication 3, notamment X représente une chaîne de formule- (CH-O-CO- dans taqueHe n représente 2 ou 4, avantageusement à environ 65OC pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ha) suivante dans laquelle X, R, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, - le cas échéant, traitement du composé de formule (fla) susmentionnée dans laquelle Ra représente un atome d'halogène, par NaN3/Nal, avantageusement à environ 60oC pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (lib), à savoir d'un composé de formule (Il) dans laquelle R représente N3, et X, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, - le cas échéant, hydrogénation du composé de formule (lib) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (lac), à savoir d'un composé de formule (II) dans laquelle R représente NH2, et X, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, - le cas échéant, couplage des composés de formules (na), (lIb), (lié) susmentionnées avec un composé déterminé, à l'aide d'un réactif de couplage, tel que BOPIBOH en présence de triéthylamine, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (1) dans laquelle RI, XI et Y sont tels que définis dans la revendication 1, et R est tel que défini ci-dessus. te cas échéant, déprotection des composés de formules (1} et (II), susmentionnées, notamment : a par traitement desdits composés avec une estérase, telle que l'estérase de foie de porc, à température ambiante pendant environ 10 jours, ou a par catalyse acide desdits composés. notamment par traitement à l'acide sulfurique à 6SoC pendant 24 heures, ce qui conduit à l'obtention des composés de formules (I) et (II) , susmentionnées, dans lesquelles R2 = H. 6. Utilisation de dérivés de la biotine selon la revendication 1 ou 2, en tant que vecteurs permettant l'introduction dudit composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles, dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, ou dans le cadre de la préparation de médicaments permettant l'introduction d'un composé déterminé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme. 7. Méthode de détection de protéines susceptibles d'interagir avec le radical RI d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en présence d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de. fusion comprenant une protéine susceptible d'interagir avec le radical RI susmentionné et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre la protéine susceptible d'interagir avec le radical RI dans ladite deuxième protéine de fusion, et le radical RI dudit dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport dudit dérivé de la biotine à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison dudit dérivé de la biotine à la BCCP de ladite première protéine de fusion, - l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une intéraction entre ladite protéine susceptible d'interagir avec le radical RI et ledit radical RI. 8. Méthode de détection de molécules, protéiniques ou non, testées pour leur capacité à interagir avec le radical RI d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2. caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en présence * d'un premier dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle Ri représente le composé déterminé avec lequel est susceptible d'interagir la molécule testée, et * d'un deuxième dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2. de formule (1) dans laquelle R représente la molécule testée, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : *une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et 'une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant la BCCP et une deuxième protéine de révélation, JU les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical RI du premier dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport des premier et deuxième dérivés de la biotine susmentionnés à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison desdits dérivés de la biotine aux BCCP desdites protéines de fusion, l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical RI du premier dérivé de la biotine. 9. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent un ou plusieurs dérivés de la biotine selon la revendication 1 ou 2, de formule (l) dans laquelle RI représente un composé d'intérêt thérapeutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. séquence nucléotidique codant une protéine de fusion comprenant la BCCP et une protéine de révélation pour la mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 7 ou 8. choisie parmi - ta séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP. - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine d'activation de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidîque contenant la séquence d'ADN codant le domaine de dimérisation de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la GFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la BFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP. 11. Vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique définie dans la revendication 10. 12. Cellules hôtes transformées par un vecteur défini dans la revendication 11. 13. Protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite Jl 13. Protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite dans la revendication 10, notamment la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine d'activation de GAM, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de LexA, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine de dimérisation de LexA et la BCCP, la protéine de fusion entre la GFP et la BCCP, la protéine de fusion entre la BFP et la BCCP. 14. Trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des cellules hôtes transformées selon la revendication 12, et/ou - des dérivés de la biotine selon la revendication 3 ou 4.