FR 2810406 A1 20011221 FR 0007650 A 20000615 L'invention concerne un procédé de réduction de l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure dans un dosage par fluorescence par introduction dans ledit milieu de cryptates de terre rare peu sensibles à cette extinction de fluorescence. L'invention concerne également de nouveaux cryptâtes de terre rare peu sensibles à l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure. L'avancée des connaissances en biologie crée un besoin croissant pour des méthodes de diagnostic permettant de suivre ou de quantifier des biomolécules. Dans le même temps, on observe une désaffection vis à vis des marqueurs radioactifs qui sont généralement impliqués dans les méthodes de dosage de référence. D'une façon générale, on cherche actuellement à remplacer les traceurs radioactifs par d'autres marqueurs et principalement par des marqueurs fluorescents. L'utilisation de marqueurs fluorescents dans des conditions idéales permet d'obtenir des' sensibilités élevées théoriquement équivalentes à celles obtenu par les traceurs radioactifs. De nombreuses molécules fluorescentes utilisables comme traceurs dans ce type de dosages ont été précédemment décrites parmi lesquelles les complexes de terre rare possèdent des propriétés intéressantes. L'utilisation de complexes particuliers, les cryptates de terre rare, est décrite par exemple dans les demandes EP 0 180 492 et EP 0 321 353. Dans la pratique, les performances des traceurs fluorescents sont limitées, d'une part, par la présence d'un bruit de fond souvent élevé et, d'autre part, par le fait qu'ils sont généralement très sensibles aux changements dans leur environnement. Des petites modifications du pH, de la polarité, de la présence d'oxygène dissous, de la proximité d'atome lourds (iode par exemple) ou de groupes absorbants peuvent modifier leur rendement quantique (dans le sens d'une exaltation ou d'une extinction) ou déplacer la longueur d'onde de l'émission. Les problèmes inhérents aux méthodes d'analyse par mesure de la fluorescence sont répertoriés dans un article de revue (1. Hemmilâ, Clin. Chem. 31/3, 359-370 (1985)). Les problèmes inhérents au bruit de fond provenant de la fluorescence intrinsèque des protéines ainsi que des autre biomolécules présentes dans les échantillons biologiques peuvent être partiellement résolus par l'utilisation de marqueurs fluorescents formés par des complexes de terres rares (principalement l'Europium) qui permettent une sélection temporelle du signal spécifique. Les durées de vie particulièrement longues (0,1 ms à 1 ms environ) qui caractérisent les complexes d'Europium permettent, à l'aide d'une mesure en temps résolu, de s'affranchir du bruit de fond provenant, par exemple, des protéines sériques qui lui, est caractérisé par une durée de vie relativement courte (environ 4ns). L'utilisation de complexes particuliers, les cryptates de terre rare, est décrite par exemple dans les demandes EP 0 180 492 et EP 0 321 353. Un format de type homogène présente l'intérêt considérable de pouvoir suivre en temps réel la cinétique de formation d'un complexe immunologique, mais ne permet cependant pas de s'affranchir des interactions éventuellement défavorables entre le marqueur et les molécules présentent dans un milieu biologique (extinction de la fluorescence). Dans un milieu sérique, on peut obtenir une restauration des propriétés photophysiques, et notamment de la durée de vie, en ajoutant des ions fluorures au milieu comme décrit dans le brevet EP 0 539 435. Les problème des interférences dues aux molécules présentes dans le milieu de mesure n'est néanmoins complètement résolu par aucune de ces méthodes. En effet, une source importante de limitation de la sensibilité de la mesure par fluorescence est l'existence de processus d'extinction ( quenching ) dues à des molécules présentes dans le milieu capables d'inhiber la fluorescence de la molécule fluorescente utilisée comme marqueur dans le dosage. Dans le cas des complexes de terre rare, l'extinction peut résulter de mécanismes de transfert d'électrons par proximité, dans lesquels la molécule inhibitrice vient occuper les sites de coordination restés libres au sein du complexe. On peut en particulier citer les réactions red/ox intervenant entre la molécule fluorescente dans son état fondamental ou dans son état excité et des molécules présentes dans le milieu. Ces mécanismes sont susceptibles de faire vaner de façon non négligeable la fluorescence émise. L'inhibition de la fluorescence par des mécanismes mettant en jeu un transfert d'électrons et en général par des mécanismes d'extinction est un phénomène extrêmement gênant dans la pratique car les éléments inhibiteurs peuvent soit se trouver naturellement présents en tant que composants dans le milieu de mesure (par exemple l'acide urique dans le sérum) ou encore y être ajoutés comme additifs ou stabilisants pour le dosage. Ces inhibiteurs affectent fortement la fluorescence de la molécule marqueur. En particulier, dans le cas des réactions parasites red/ox le passage de l'état oxydé à l'état réduit d'un ion de terre rare par le biais d'un mécanisme red/ox entraîne une diminution de la durée de vie et une modification de spectre d'émission du complexe le contenant, de telle sorte que la sensibilité de la mesure est fortement affectée. On a maintenant trouvé de nouveaux cryptates de terre rare constitués d'un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique comprenant au moins un motif moléculaire constitué par une pyridine, qui présentent des propriétés photophysiques nouvelles et inattendues. On a également trouvé que ces propriétés avantageuses sont observées lorsque ce composé macropolycyclique comporte également un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé qui est substitué par un groupement donneur d'électrons. Une hypothèse de mécanisme à cet égard est que le remplacement d'un motif moléculaire présentant un encombrement stérique plus important par une pyridine réduit la cavité du macrocycle et influe sur l'équilibre red/ox de l'ion de terre rare en favorisant l'état oxydé de celui-ci. La présence d'un groupement donneur d'électrons est également susceptible d'influer sur le potentiel red/ox de l'ion terre rare. Les cryptates de terre rare selon l'invention présentent ainsi la propriété avantageuse d'être moins sensibles, comparativement aux cryptates correspondants ne comportant pas de motif pyridine et/ou de substitution par un groupement donneur d'électrons, au phénomène d'extinction de la fluorescence résultant d'une interaction avec des molécules présentes dans le milieu. Cette observation présente un grand intérêt puisqu'elle permet de réaliser des mesures de fluorescence dans des milieux biologiques sans utilisation d'un adjuvant comme les ions fluorures. Les composés selon l'invention constituent donc de nouveaux marqueurs, qui peuvent être couplés à une molécule biologique ayant un rôle de reconnaissance et pouvant se lier à un partenaire, tout en conservant leurs propriétés de résistance à l'extinction. L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un procédé de réduction de l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure dans un dosage par fluorescence d'un analyte mettant en #uvre au moins un marqueur fluorescent caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de mesure un complexe macropolycyclique de terre rare, constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents #, # et #, sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux #, et @ comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé et au moins l'un des radicaux #, et qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyndine substituée une ou plusieurs fois, ou non substituée. Lorsque le composé macropolycyclique de formule (1) comprend un radical pyridine substituée, celle-ci peut l'être par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, tels que, par exemple, halogène, CN, ester carboxylique en Ci-Ce, OH, NH2, N02, -CH2NHCONH-aryle, -CH2NHCSNH-aryle, -NHCONH-(Cl-C6)alkyle, -NHCSNH-(C,-C4)alkyle, -NHCONH-aryle, -NHCSNH-aryle, pipéridinyl, -N-(C,C6)alkyl-carboxypypéridinyl, (C,-C4)alkylamno-alkylamine, alkyle en C1-C10, alcényle contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcynyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, cycloalkyle contenant 3 à 8 atomes de carbone, hydroxyalkyle contenant 1 à 5 atomes de carbone, alcoxy contenant 1 à 10 atomes de carbone, alcoxyalkyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcoxyalcoxyalkyle contenant 3 à 10 atomes de carbone, alcoxyalcoxy contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcényloxy contenant 2 à 10 atomes de carbone, alkylthio contenant 1à 10 atomes de carbone, alkylthioalkyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, acylamino contenant 1 à 7 atomes de carbone, acylaminoalkyle contenant 2 à 8 atomes de carbone, carbamoylalkyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, alkylaminocarbonylalkyle contenant 3 à 9 atomes de carbone, amino(Ci-C6)alkyle, amino(C1- C6)alkylcarboxamide, amino(Cl-C6)alkylcarboxamido(CI-C6)alkyle et carboxy(Ci- C10) alkyle. De préférence, une pyridine substituée comportera un ou 2 substituants. Des substituants préférés aux fins de l'invention sont par exemple les substituants amino(CrC6)alkyle, notamment aminométhyl ou aminoéthyl ; amino(C1- C6)alkylcarboxamide, notamment aminoéthylcarboxamide, phénylcarbamoyl ; phénylthiocarbamoyl ; nitrile ; pipéridinyl ; ester carboxylique en Ci-Ce, notamment méthylcarboxylate ou éthylcarboxylate ; amino(C1-C6)alkylcarboxamido(C1- C6)alkyle, notamment aminocaproylamidométhyl et aminocaproylamidoéthyl ou carboxy (C1-C10)alkyle. Par analyte , on entend dans la présente description toute substance ou groupe de substances, ainsi que ses ou leurs analogues, que l'on souhaite détecter et/ou déterminer. Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, les deux radicaux #, ou qui ne comportent pas ou ne sont pas essentiellement constitués par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé comprennent un radical pyridine substituée ou non substituée. Avantageusement, le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est substitué par un groupement donneur d'électrons. De préférence, le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, les bipyridines et les bisisoquinoléines, les bipyridines étant préférées. Selon un autre aspect préféré du procédé selon l'invention, le (ou les) motif (s) bypiridine(s) est (sont) substitué(s) par un groupement donneur d'électrons choisi en particulier parmi les groupements carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle. Lorsque le phényl est substitué, il peut l'être par un ou plusieurs substituants identiques ou différents choisis par exemple parmi sulfonate, carboxylate, méthylcarboxylate, N,N-diméthylamino, méthoxyéthylcarboxylate et carboxamide. Le groupement carboxylate est un groupement donneur d'électrons particulièrement préféré aux fins de l'invention. Par groupement carboxylate , on entend le couple -COOH/-COO : en effet, le complexe macrocyclique pourra comporter lors de sa synthèse un groupe acide carboxylique -COOH, celui-ci étant, lors de son utilisation dans le milieu de mesure, ionisé en groupement carboxylate -COO . Selon un aspect avantageux du procédé selon l'invention, le composé macropolycyclique est composé d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macrocyclique répondant à la formule (II) ci-après : dans laquelle : - le cycle de formule est le macrocycle bis-bipyndine de formule : -n=0,1ou2; - A est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ; - R1 est un groupe -COOR3 dans lequel R3 est l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien R1 est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A ; - R2 est l'hydrogène, un groupement donneur d'électrons, en particulier carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle, un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, sous réserve que l'un au plus des substituants R1 et R2 représente un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A et R1 et R2 ne représentent pas simultanément un groupe-CO-NH-YA ou -Y-A ; - Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs hétéroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à C8 ou parmi les groupes arylène en C6 à C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate. Dans la présente description, on désigne par groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique tout groupe fonctionnel capable de se lier par liaison covalente, directement ou après activation, avec au moins l'une des fonctions naturellement présentes ou artificiellement introduites sur ladite substance biologique. De telles fonctions sont notamment les fonctions NH2, COOH, SH ou OH. De tels groupes ainsi que les procédés d'activation sont décrits en détail par P. TIJSSEN dans Practice and Theory of Enzyme immunoassays Elsevier 1985. A titre d'exemples de groupes fonctionnels appropriés aux fins de l'invention, on peut citer notamment les groupes amino, thio, cyano, isocyano, isothiocyano, thiocyano, carboxyle, hydroxyle, maléimido, succinimido, mercapto, phénol, imidazole, aldéhyde, époxyde, halogénure, thionyle, sulfonyle, nitrobenzyle, carbonyl, triazo, anhydride, halogénoacétate, hydrazino, acridine, etc. Les groupes particulièrement préférés sont les groupes amino, thio et carboxy qui doivent être activés avant le couplage covalent avec la substance biologique ainsi que les groupes maléimido, succinimido et isothiocyanate, lesquels peuvent se lier directement avec la substance biologique. L'ion de terre rare complexé est de préférence l'europium. Dans la présente description, la notion de cryptate ainsi que la nomenclature des macrocycles et polycycles sont telles que définies par J.M. Lehn dans Struct. Bonding (Berlin), 16,1, 1973 et dans Acc. Chem. Res. 11, 49, (1978). Les abréviations suivantes ont été utilisées pour désigner les motifs moléculaires constitutifs des macro(poly)cycles : bipyridine 2,2' = bpy pyridine = Py 4-méthylisonicotinate = Py(C02Me) diéthylcarboxylate-4,4'-bipyndine-2,2' = bpy(C02Et)2 ditertiobutylcarboxylate-4,4'-bipyridine-2,2' = bpy(C02tbu)2 dicarboxylique acide-4,4'-bipyridine-2,2' bpy(C02H)2 diéthylcarboxylate-3,5-pyridine-2,2' = Py(C02Et)2 3,5-di[N-(2-ammoéthyl)-carboxamidy!]-pyndine = Py(NH2)2 3,5-di[N-(4-maléimidométhylcyclohexylcarboxamido-2-éthyl)-carboxamidyl]- pyndine = Py[CONH(CH2)2NHR4]2, dans lequel Les complexes macropolycycliques de terre rare particulièrement préférés aux fins de l'invention sont les cryptates d'europium [Eu3+C Py.Bpy(C02H)2.Bpy(C02H)] (exemple 4, b), [Eu3+C bpy(C02H)2.bpy(C02H)2.Py (NH2)2] (exemple 6) et [Eu3+C bpy(CO2H)2.bpy(C02H)2.Py(CONH(CH2NHR4 ] dans lequel Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, le complexe macrocyclique de terre rare est utilisé comme seul marqueur ou comme l'un des marqueurs dans le dosage. Avantageusement, le milieu de mesure est un milieu biologique, en particulier un milieu sérique. Les composés macro(poly)cycliques utilisables dans le procédé selon l'invention sont préparés selon des procédés connus. La préparation du macrocycle bipyridine passant par un intermédiaire tosylé est notamment décrite dans J. Org. Chem. 1983, 48, 4848 ; les analogues macrocycliques fonctionnalisés de type bpy.bpy.(R2)2 ont été obtenus suivant la même approche. D'une manière générale, les ligands macrobicycliques sont préparés selon les techniques décrites respectivement dans le brevet EP 0 321 353 et dans Helv. Chim. Acta, 1988, 71, 1042. Notamment, ces molécules ont été préparées par alkylation d'une diamine macrocyclique préformée dans un solvant polaire aprotique en présence d'un carbonate alcalin jouant le rôle de base et d'ion template. Les complexes macropolycycliques de terre rare utilisables selon l'invention peuvent être obtenus par les procédés classiques de préparation de complexes métalliques, qui consistent à faire réagir le composé complexant avec un composé donneur du cation à complexer. Par exemple, les complexes macropolycycliques peuvent être obtenus par réaction d'un composé donneur de cation de terre rare avec le composé macropolycyclique ayant les caractéristiques définies ci-dessus, chaque composé étant avantageusement en solution, de préférence dans le même solvant ou dans des solvants compatibles inertes vis-à-vis de la complexation. En générai, on utilise comme solvant l'acétonitrile ou le méthanol, en chauffant à reflux. Selon un aspect ultérieur, l'invention concerne également les complexes macropolycycliques de terre rare, constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents #, # et #, sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux #, # et # comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé, caractérisé en ce que : - soit au moins l'un des radicaux #, () et # qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ; - soit au moins l'un des radicaux #, et qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée et le ou les radicaux @ , ou # autres que celui-ci est substitué par un groupement donneur d'électrons. Le (s) substituant(s) du radical pyridine peuvent par exemple être choisis parmi halogène, CN, ester carboxylique en Ci-Ce, OH, NH2, N02, -CH2NHCONH- aryle, -CH2NHCSNH-aryle, -NHCONH-(CrC6)alkyle, -NHCSNH-(C,-C4)alkyle, -NHCONH-aryle, -NHCSNH-aryle, pipéridinyl, -N-(CrC6)alkyl-carboxypypéridinyl, (CrC4)alkylamino-alkylamine, alkyle en Cl-Clo, alcényle contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcynyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, cycloalkyle contenant 3 à 8 atomes de carbone, hydroxyalkyle contenant 1 à 5 atomes de carbone, alcoxy contenant 1 à 10 atomes de carbone, alcoxyalkyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcoxyalcoxyalkyle contenant 3 à 10 atomes de carbone, alcoxyalcoxy contenant 2 à 10 atomes de carbone, alcényloxy contenant 2 à 10 atomes de carbone, alkylthio contenant 1à 10 atomes de carbone, alkylthioalkyle contenant 2 à 10 atomes de carbone, acylamino contenant 1 à 7 atomes de carbone, acylaminoalkyle contenant 2 à 8 atomes de carbone, carbamoylalkyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, alkylaminocarbonylalkyle contenant 3 à 9 atomes de carbone, amino(CI-C6)alkyle, ammo(C1-Ca)alkylcarboxamide, amino(C1C6)aikytcarboxamido(CrC6)atky!e et carboxy(Ci-Clo)alkyle. De préférence, une pyridine substituée comportera un ou 2 substituants. Des substituants préférés aux fins de l'invention sont par exemple les substituants amino(C1-C6)alkyle, notamment aminométhyl ou aminoéthyl ; amino(Ci- C6)alkylcarboxamide, notamment aminoéthylcarboxamide, phénylcarbamoyl ; phénylthiocarbamoyl ; nitrile ; pipéridinyl ; ester carboxylique en Ci-Ce, notamment méthylcarboxylate ou éthylcarboxylate ; amino(Ci-C6)aiky)carboxamido(Ci- C6)alkyle, notamment aminocaproylamidométhyl et aminocaproylamidoéthyl ou carboxy (C1-C10)alkyle. De préférence, l'ion de terre rare complexé est l'europium. Avantageusement, les deux radicaux #, # ou # qui ne comportent pas ou ne sont pas essentiellement constitués par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé comprennent un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée. Selon un aspect préféré, le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et terphényle, l'azobenzène, l'azopyridine, les bipyridines et les bisisoquinoléines. Avantageusement, le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est un groupe bipyridine. De préférence, le (ou les) groupe (s) bipyridine(s) est (sont) substitué (s) un groupement donneur d'électrons choisi en particulier parmi les groupements carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényt substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle, le groupement carboxylate étant particulièrement avantageux. Lorsque le phényl est substitué, il peut l'être par un ou plusieurs substituants identiques ou différents choisis par exemple parmi sulfonate, carboxylate, méthylcarboxylate, N,N-diméthylamino, méthoxyéthylcarboxylate et carboxamide. L'invention concerne en particulier les complexes macropolycycliques constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à la formule Il : dans laquelle : - le cycle de formule est le macrocycle bis-bipyndine de formule : - n = 0, 1 ou 2 ; - Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à C2o contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs hétéroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe (s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à Ce ou parmi les groupes arylène en C6 à C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ; - A est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ; - R1 est un groupe -COOR3 dans lequel R3 est l'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien Ri est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A ; - R2 est l'hydrogène, un groupement donneur d'électrons, en particulier carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle, ou un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, sous réserve que l'un au plus des substituants Ri et R2 représente un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A et Ri et R2 ne représentent pas simultanément un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, et sous réserve que lorsque n = 0, R2 soit différent de l'hydrogène. Des complexes préférés sont ceux dans lesquels le composé macropolycyclique répond à la formule II dans laquelle : -n=0, - Y, A et Ri sont tels que définis ci-dessus, et - R2 est tel que défini ci-dessus et l'un des substituants R2 est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A. Des complexes particulièrement avantageux sont les cryptates d'europium [Eu3+C Py.Bpy(CO2H)2.Bpy(CO2H)2], [Eu3+C bpy(CO2H)2.bpy(CO2H)2.Py(NH2)2] et [Eu3+C bpy(C02H)2.bpy(C02H)2. Py(CONH(CH2)2NHR4]2 dans lequel Les complexes macropolycycliques de terre rare selon l'invention sont préparés par les procédés mentionnés plus haut. L'invention concerne également les conjugués fluorescents constitués par les complexes macropolycycliques de terre rare tel que définis ci-dessus, liés de manière covalente à l'un des membres d'un couple de molécules capables de se lier spécifiquement entre elles, en particulier un polypeptide, une protéine, un récepteur cellulaire, un antigène, un anticorps ou un acide nucléique. Selon un aspect ultérieur, l'invention concerne également l'utilisation d'un complexe macro polycyclique de terre rare tel que défini ci-dessus pour réduire l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure dans un dosage par fluorescence d'un analyte. L'invention est illustrée par les exemples ci-après, dans lesquels les techniques mises en #uvre pour la caractérisation et l'identification des composés sont les suivantes : Les points de fusion ont été déterminés à l'aide d'un appareil à point de fusion capillaire : électrothermal IA8103 ; ils ne sont pas corrigés. Les chromatographies sur couches minces (CCM) ont été réalisées sur des plaques Macherey-Nagel : AI2O3 (Polygram Alox N/UV254) et Si02 (Polygram SIL 6/UV254) contenant un indicateur fluorescent. Les chromatographies liquides (HPLC) ont été réalisées à l'aide d'un système chromatographique LKB composé des éléments suivants : microprocesseur 2152, pompe 2150, détecteur Uvicord 2158; colonne Merck 50734 Lichrosphes 100RP18; gradient appliqué [temps (mn)-débit/ml) proportion du solvant B (%) : 0-1-15 ; 5-1-15 ; 35-1-100] , solvant A = H20 à 1 % de TFA, solvant B = CH3CN. Les temps de rétention Tr sont exprimés en minutes. Les spectres de RMN ont été enregistrés à l'aide d'un appareil Brucker AC 250 [250 ( 1 H) ; 62,9 (13C)]. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm par rapport à la référence interne correspondante. Pour les mesures concernant le (1H) : CHC13 = 7,26 ; CH30H = 3,34 ; tBuOH = 1,36. Les symboles suivants ont été utilisés : s = singulet d = doublet t = triplet m = multiplet AB = système de couplage J = constante de couplage Pour les mesures concernant le carbone ( 13 C) : CHCI = 77,0, les symboles suivants ont été utilisés : Ct = carbone tertiaire ; Cq = carbone quaternaire. Les modes d'ionisation mis en #uvre pour les spectres de masse sont le FAB+ = fast atom bombardment en mode positif (matrice MNBA : métanitrobenzyl alcool ou thioglycérol) et l'impact électronique El. Les spectres d'absorption (UV-visible) ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin Elmer lambda15 à partir de solutions 10-5M. L'invention est illustrée par les exemples ci-après dans lesquels les abréviations suivantes sont utilisées : AIBN : azobisisobutyronitrile CCM : chromatographie sur couche mince HPLC . chromatographie liquide haute performance M A.. microanalyse NBS : N-bromosuccinimide P.F.. point de fusion RMN H : résonance magnétique nucléaire du proton RMN C : résonance magnétique nucléaire du carbone 13 S. M.spectre de masse SPDP : N-succmimidyl-3(2-pyridylthio)propionate Sulfo-SMCC = ester 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide de l'acide 4-(Nmaleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylique TFA : acide trifluoroacétique TMS : tetraméthylsilane Exemple 1 : Préparation du macrobicycle de formule (6) bpy.bpy.py(C02Me) L'alkylation de la diamine macrocyclique (5) par le dérivé dibromométhylé (4) conduit au composé (6) représenté ci-dessous. (6) a) Préparation du 4-Methyl-2,6-dibromométhylisonicotinate (4) La succession des réactions représentées ci-après permet d'isoler le composé (4). - 4-Cyano-2,6-diméthylpyridine (1) Les travaux de W.E. Feely et E. M. Beavers décrits dans J.Am.chem.Soc.,1959,81,4004 concernant la cyanation des sels d'amine oxyde permettent d'accéder au composé (1). - Acide-2,6-diméthylisonicotinique (2) Un mélange de 1 g (7,56 mmol) de (1) et de 5 ml d'acide sulfurique concentré est chauffé à 100 C pendant 5 heures. La solution résultante est ensuite refroidie par un bain de glace, amenée à pH 3,5 avec de la soude 10N puis concentrée à sec. L'extraction à l'éther pendant 48 heures (soxhlet) d'une partie du résidu obtenu fournit 50 mg d'acide 2,6-diméthylisonicotinique (2) destinés à l'analyse. Le brut de la réaction restant, non traité à l'éther, est utilisé tel quel dans la réaction d'estérification sans purification supplémentaire. RMN : 1 H (D20);référence interne tBuOH 1,29 ppm. 2,82 (s, 6H, CH3); 8,05 (s, 2H, Py). SM (El) 151 (M+, 100); 134 (M±OH, 7,2); 106 (M±C02H, 16,4) MA C8H9NO2 + 0,1 NaHS04 (163,16) Calculé : C 58,89 H 5,62 N 8,58 0 23,53 Obtenu : C 58,73 H 5,90 N 8,37 0 23,7 - 4-Méthyl-2,6-diméthylisomcotinate (3) Un mélange de 2 g d'acide 2,6-diméthylisonicotinique (2) (non purifié), de 100 ml de méthanol et de 1 ml d'acide sulfurique à 98% est chauffé à reflux pendant 24 heures. Après refroidissement, le milieu réactionnel est neutralisé par une solution saturée de NaHC03 puis extrait cinq fois par 60 ml de CHCI3. Les phases chloroformiques rassemblées sont alors séchées sur Na2S04 puis concentrées. Le solide résultant est ensuite extrait quatre fois par 50 ml d'éther puis la phase éthérée est concentrée. Une chromatographie sur alumine [gradient : cyclohexane-CH2Cl2 (50-50) à CH2CI2 pur], du résidu blanc obtenu, permet d'isoler 1 g de 4-Méthyl-2,6-diméthylisonicotinate (3). PF 45-47 C CCM : Rf : 0,3 [SiO2/CH2Cl2-MeOH (97-3) ] HPLC : Tr : 2,4 UV : CHCI3 : 290,6 nm (3650) RMN : 1 H CDCI3; référence interne TMS 2,59 (s, 6H, CH3); 3,93 (s, 3H, C02CH3); 7,51 (s, 2H, Py) 13C CDCI3; référence interne 77,0 ppm 24,5 (CH3); 52,5 (OCH3) ; 119,5 (Ct); 137,9, 158,9 (Cq); 166,1 (C=O). SM (El) 165 (M+, 24); 134 (M±OCH3, 13); 106 (M±C02Me) - 4-Méthyl-2,6-dibromométhylisonicotinate (4) Un mélange de 1,372 g (8,3 mmol) de (3), de 60 mg d'AIBN et de 2,866 g (16,1 mmol) de NBS dans 120 ml de CCl4 est chauffé à reflux, sous atmosphère d'azote et sous irradiation d'une lampe de 100 W, pendant 8 heures. Le milieu réactionnel est ensuite ramené à température ambiante puis lavé par 200 ml d'une solution saturée de NaHC03. Après soutirage de la phase inférieure (CCI4) ; la phase aqueuse est extraite 4 fois par 50 ml de CHCI3; les extraits organiques rassemblés sont par la suite lavés avec 100 ml d'H20, séchés (Na2S04) puis concentrés à sec. Une purification du résidu obtenu par chromatographie sur silice [gradient : cyclohexane-CH2C12 (80-20) à CH2CI2 pur] permet de séparer une première fraction du dérivé bromé (4), des espèces polybromées, d'un mélange d'isomères de dérivés dibromés symétnques et asymétriques et de l'espèce monobromée également formée. Afin de disposer d'une quantité plus importante de 2,6-dibromométhylisonicotinate de méthyle, le composé monobromé précédemment isolé [0,543 g (2,2 mmol)] est mélangé à 0,4 g (2,2 mmol) de NBS, 23 mg de AIBN et 50 ml de CCI4 puis est traité dans les conditions de bromation précédente pour donner une deuxième fraction de (4). Finalement, une purification par chromatographie sur silice [gradient : cyclohexane pur à cyclohexane-AcOEt (85-15) ] des mélanges d'isomères dibromés, isolés dans les deux réactions précédentes, fournit une dernière fraction de (4), soit au total 596 mg (22%). PF : 90-92 C CCM : Rf : 0,6 (SiO2/CH2Cl2) HPLC : Tr : 20',5 UV CHCI3: 290,8 nm (4270) ; 240,3 nm (3010) RMN : 1 H CDCI3; référence interne TMS 3,98 (s, 3H, CH3); 4,58 (s, 4H, CH2); 7,92 (s, 2H, Py) 13C CDCI3; référence interne 77,0 ppm 32,8 (CH2) ; 52,9 (OCH3); 122,2 (Ct); 139,8,157,9 (Cq) ; 164,7 (C=O). SM (El) 322,9 (M+, 15); 243,9 (M±Br, 100); 163 (M±2Br, 15,7). MA C9H9N02Br2 (322,98) Calculé : C 33,47 H 2,80 N 4,33 O 9,90 Obtenu : C 33,69 H 2,81 N 4,29 0 10,17 b) Préparation du cryptate alcalin [Na+# bpy.bpy.pyC02Me] Br - de formule (6). Un mélange de 0,2 g (0,508 mmol) de diamine macrocyclique bipyridine (5) (décrit dans J.Org.chem., 1983,48,4848) et de 0,376 g (5,08 mmol) de Li2CO3 dans 400 mi de CH3CN est chauffé 40 min à reflux sous atmosphère d'azote. A la suspension résultante, on additionne goutte à goutte (2 heures) une solution de 0,165 g (0,508 mmol) de 4-Méthyl-2,6-dibromométhylisonicotinate (4) dans 100 ml de CH3CN. En fin d'addition, l'agitation est maintenue dans les mêmes conditions 22 heures supplémentaires puis le milieu réactionnel est refroidi par un bain de glace. Par la suite, le carbonate est filtré et le filtrat évaporé à sec. Une chromatographie sur silice [gradient : CH2CI2 à 10% de MeOH] du résidu obtenu fournit 117,5 mg du composé (6) (35%). CCM : Rf : 0,4 [Al2O3/CHCl3-MeOH (90-10) ] HPLC : Tr : 4',1 UV : CHCI3 : 246 nm (27950) ; 291 nm (27410). RMN : 1 H (CDCI3); référence interne TMS. 3,94 (s, 3H, CH3); 4,00 (d, J = 15 Hz, AB, 4H, CH2); 4,08 (d, J = 14,7 Hz, AB, 4H, CH2); 4,09 (s, 4H, CH2); 7,39-7,42 (m, 4H, BPy); 7,77 (s, 2H, Py); 7,85-7,89 (m, 8H, BPy). 13C (CDCI3); référence interne 77 ppm. 52,9 (CH3, CO2Me); 59,4 (CH2) ; 59,5 (CH2); Ct (119,9; 122,1; 123,4 ; 138,8) Cq (139,2; 154,6; 158,5 ; 159,6); 165,3 (CO2Me). SM (FAB+): Matrice thioglycérol. 578,2 (Ugand-U++Na+, 100%); 556,2 (Ugand-U++H, 10%). Matrice thioglycérol + 1% TFA 578 (Ugand-U++Na+. 20%); 556,1 (Ugand-Li++H, 100%). MA : C33H29N702NaBr,3H20(712,53). Calculé : C 55,62 H 4,95 N 13,76 Obtenu : C 55,93 H 4,73 N 13,61 Exemple 2 : Préparation du cryptate d'europium [EU3+C bpy.bpy.pyCO2Me]Cr3 du ligand (6) de l'exemple (1). A 20,2 mg (2,84.10-5 mol) du macrobicycle (6) contenus dans 5 ml de méthanol anhydre on ajoute 11,8 mg de EuC13,6H20 (3,22.10-5 mol). Le mélange homogène résultant est porté à reflux sous atmosphère d'azote pendant 23 heures. Par la suite, l'addition à cette solution ramenée à température ambiante de 4 ml d'éther provoque la cristallisation de 14,2 mg (52%) du cryptate d'europium. HPLC : Tr : 14,1 UV H2O : 250 nm (18270) ; 309 nm (24400). SM (FAB+): Matrice nitrobenzylalcool 778 [(Eu3+C L+2Cl-)+, 40%]; 743 [(Eu2+C L+Cl-)+, 90%]; 707 [(Eu3+C L-2H)+, 100%] MA : C33H29N7O2EuCl3, 0,13 EuCI3, NaBr, 2 CH30H (1014,51) Calculé : C 41,43 H 3,67 N 9,66 Obtenu : C 41,23 H 3,95 N 9,63 Exemple 3 : Préparation du macrobicycle de formule (12) Py-BPY(C02Et)2-BPY(CO2Et)2 Ce composé est préparé suivant le schéma représenté ci-dessous. a) Préparation du macrocycle de formule (11 ) La séquence réactionnelle suivante conduit au macrocycle bpy. bpy diamine tétraester (11 ). -Macrocycle tosylé bpy. bpy tétraester (9) Un mélange de 5,5 g(12 mmot) de diméthyl-6,6'-dibromométhyl-2,2'bipyridine-4,4'-dicarboxylate (8) (décrit dans Helv.Chim.Acta, 1988,71,1042), 4,64 g de sel de sodium de la tosylamide fraîchement préparé (24 mmol) et 900 ml d'éthanol absolu est porté à reflux sous atmosphère d'azote pendant 26 heures. Cette suspension est par la suite refroidie 1 h par un bain de glace avant d'être filtrée. Le précipité isolé est ensuite lavé avec 700 ml d'eau, 500 ml d'éthanol et 20 ml de chloroforme pour donner 1,88 g (31,6%) de (9). CCM : Rf : 0,7 [Si02/CHCI3 - MeOH (99-1 )] HPLC : Tr : 36,1 SM (FAB)+: Matrice MNBA 991 (M+, 45%); 835 (L-Tos, 12%). MA C50H50012N6S2 NaBr. (1094) Calculé : C 54,89 H 4,6 N 7,68 S 5,86 Na 2,1 Obtenu : C 55,66 H 4,64 N 7,75 S 6,04 Na 3,19 Macrocycle Bpy. Bpy. tétraacide (10) Une solution de 0,15 g (0,15 mmol) du macrocycle tosylé (9) dans 1 ml de H2S04 concentré est chauffée 3 heures à 100 C sous atmosphère d'azote. Le mélange réactionnel est par la suite refroidi par un bain de glace, dilué par addition de 5 ml d'eau puis amené à pH = 3,0 par ajout de 7 ml de NaOH 5N. Le précipité formé est alors filtré, lavé abondamment à l'eau (50 ml) puis séché. Le macrocycle tétraacide (10) ainsi isolé (probablement sous forme de sel d'amine) est utilisé tel quel dans l'étape suivante. Macrocycle Bpy.Bpy.diamine tétraéthylester (11) Une suspension de 53 mg du composé (10) dans 100 ml d'éthanol absolu et 0,5 ml de H2S04 concentré est portée à reflux sous atmosphère d'azote pendant 28 heures. Par la suite la solution homogène résultante est successivement refroidie par un bain de glace, neutralisée avec une solution saturée de NaHC03 et traitée par 80 ml de CHC13 (4x20) pour donner 60 mg du composé (11) (quantitatif). CCM : Rf : 0,7 [Al2O3/CH2Cl2-MeOH (80-20) ] HPLC :Tr:17,2 UV : CHCI3 : 243,1 nm (24150); 303,2 nm (25210). RMN : 1 H (CDCI3); référence interne TMS. 1,44 (t, J = 7,0 Hz, 12H, CH3); 2,29 (s, large, NH); 4,17 (s, 8H, CH2) 4,39 (q, J = 6,9 Hz, 8H, CH2 ester); 7,43 (d, J = 1,4 Hz, 4H, BPy); 8,29 (d, J = 1,1 Hz, 4H, BPy). 13C (CDCI3); référence interne 77,0 ppm. 14,9 (CH3, C02CH2CH3); 56,8 (CH2); 62,3 (CO2ÇH2CH3); Ct (119; 122,5); Cq (138,9; 158,9; 161,4); 165,7 (CO2C2H5) SM (FAB+): Matrice thioglycérol 683 (M+, 100) MA C36H38N608, H20 (700,74) Calculé : C 61,7 H 5,75 N 11,99 Obtenu : C 62,2 H 6,01 N 11,48 b) Préparation du cryptate alcalin de formule (12) [Na+c Py.Bpy(CO2Et)2.Bpy(CO2Et)2]Br ' Un mélange de 180,7 mg (0,265mmol) de diamine macrocyclique (11) et de 195,5 mg (2,65 mmol) de Li2CO3 dans 360 ml de CH3CN anhydre est chauffé 35 min à reflux sous atmosphère d'azote. A la suspension résultante, on additionne lentement (5 heures) une solution de 70,7 mg (0,267 mmol) de 2,6-dibromométhylpyndine (7) [la préparation de ce composé a été décrite par Vogtle à partir de la lutidine : Synthesis, 1977, 273] dans 360 ml de CH3CN anhydre. Le reflux est maintenu 72 heures puis le milieu réactionnel refroidi par un bain de glace. Après filtration des carbonates insolubles, le filtrat est évaporé à sec. Le solide résiduel obtenu est chromatographié sur une colonne d'alumine avec CH2CI2-EtOH comme éluant (99-1 à 85-15) pour donner 78 mg de (12) (33%). CCM : Rf = 0,6 [Al2O3 / CHCI3-MeOH (90-10)] HPLC Tr = 20,8 UV : CHCI3 : 250 nm (24900) ; 316 nm (18900) RMN :H (CDCI3) ; référence interne TMS 1,45(t, J = 7,1 Hz, 12H, CH3) ; 4,07 (s, 4H, CH2) ;4,14 (d, J = 15,4 Hz, AB, 4H, CH2) ; 4,22 (d, J = 15,3 Hz, AB, 4H, CH2) ; 4,46 (q, J = 7Hz, 8H, CH2 ester) ; 7,27 (d, J = 7,7 Hz, 2H,Py) ; 7,66 (t, j = 7,7 Hz, 1 H, Py) ; 7,93(s, 4H, Bpy) ; 8,42(s, 4H, Bpy). 13C (CDCI3) ; référence interne 77ppm. 14,3 (CH3, C02Et) ; 59,4 (CH2) ; 59,5 (CH2) ; 62,5 (CH2, C02Et) ; Ct (119,3; 122,8; 123; 138,1); Cq (140,5 ; 155,1 ; 157,8 ; 160,1) ; 164,5 (C02Et). SM : (FAB+/ matrice NBA) 808,4 (ligand- Li++Na+,100%) ; 663,3(ligand+Na± 2CO2Et, 5%). MA : C43H43N7O8NaBr, CH2CI2 (972,68) Calculé : C 54,3 H 4,6 N 10 Obtenu : C 54,9 H 4,0 N 9,8 Exemple 4: Préparation du cryptate d'europium de formule 12bis [Eu3+# Py.Bpy(C02H)2.Bpy(CO2H)2] a) Préparation du complexe d'europium du ligand 12 de l'exemple 3 [Eu3+C PY-BPY(C02Et)2BPY(CO2Et)2] A 69 mg (7,7.10-5 mole) du cryptate de sodium (12) contenus dans 32 ml de CH3CN anhydre, on ajoute 33 mg (9.10-5mole) de EuC13.6H20. La suspension résultante est chauffée à reflux sous atmosphère d'azote pendant 27 heures ;après refroidissement le solvant est évaporé. Par la suite, une chromatographie en phase inverse du résidu obtenu permet d'isoler 25 mg du cryptate d'europium [Eu3+# 12] (25%). HPLC: Tr: 21 UV : EtOH / 330 nnm (21000) SM : (FAB+) matnce thioglycérol 1164,2 [(Eu 3+ C 12 +2CF3CO2)+,64% 1051,8 [Eu 3+ C 12 + CF3C02 + H) 100%] 937,4 [(Eu2+c 12 - 1 H) 35%] b) Préparation du cryptate acide de formule 12 bis A une solution aqueuse de 10 mg (7,83.10-6mole) de cryptate d'europium [Eu3+# 12], on ajoute 100 l d'une solution aqueuse de soude 1,6 M. Le mélange résultant est agité 2 heures à température ambiante puis évaporé à sec. La purification par chromatographie (phase inverse) avec un mélange H20 à 1% de TFA -CH3CN comme éluant, du résidu obtenu, fournit 8 mg (quantitatif) du cryptate d'europium de formule 12 bis Exemple 5 : préparation du macrobicycle pyridine diéthylester bisbipyridine tétratertiobutylester de formule (16) (16) a) Préparation du diéthyl-2,6-dibromométhyl-3,5-pyhdinecarboxylate de formule (14) Ce composé est synthétisé suivant une procédure classique de bromation radicalaire à partir de la diéthyl-2,6-diméthyl-3,5-pyridine carboxylate commerciale. Un mélange de 0,5 g (2 mmol) de diéthyl-2,6-diméthyl-3,5-pyridine carboxylate, de 0,89 g (5 mmol) de NBS et 4 mg d'AIBN dans 20 ml de tétrachlorure de carbone est chauffé à reflux durant deux heures sous irradiation d'une lampe visible de 100 W. Par la suite, la suspension est refroidie par un bain de glace puis filtrée afin d'éliminer le succinimide formé. Le filtrat est alors concentré à sec ;une chromatographie sur silice du résidu obtenu avec un mélange hexane-chloroforme comme éluant (gradient 50-50 à 30-70) fournit 195 mg de dérivé bromé de formule (14) (26%). CCM : Rf = 0,4 (Si02 / CH2CI2) HPLC: Tr = 25,5 UV : CHCI3 / 245 nm (9400) RMN :1H (CDCI3) ; référence interne TMS '1,45 (t, J = 7,0 Hz, 6H , CH3) ; 4,47 (q, J = 7,2 Hz, 4H CH2) ; 5 (s, 4H, CH2Br) ; 8,80 (s, 1H , Py). b) Préparation du macrocycle diamine bisbipyridine tétratertiobutylester de formule (15). Ce composé est synthétisé par simple transestérification à partir de tertiobutylate de lithium et du macrocycle (11) de l'exemple 3. Un mélange de 251 mg de macrocycle (11) (0,36 mmol), de 363 mg (4,5 mmol) de tertiobutylate de lithium, de 35 ml de toluène sec et de 35 ml de tertiobutanol sec est chauffé à 80 C sous courant d'azote pendant environ 3 heures. Après refroidissement, le tertiobutanol est éliminé par évaporation ; la phase organique résiduelle est dans un premier temps lavée à l'eau jusqu'à pH neutre (6x50 ml) puis successivement séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée à sec. Une chromatographie sur phase inverse du résidu obtenu avec CH3CN et H20 à 1 % de TFA comme éluants fournit 117 mg du macrocycle (15) (40%). HPLC: Tr = 22,4 UV : CHCI3 / 311nm (18000) ; 280 nm (8300) ; 268 nm (7200) RMN : 1 H (CDCI3) ; référence interne TMS 1,65 (s, 36H, CH3) ; 4,69 (s, 8H, CH2) ;7,97 (s, 4H, H bpy) ; 8,51 (s, 4H, Hbpy). SM : (ES) 796 (M+H). c) Préparation du cryptate alcalin de formule (16) [U+Cbpy(CO2tbu)2.bpy(CO2tbu)2.Py(CO2Et)2]Br' Un mélange de 25,3 mg (3,18.10-5mole) de macrocycle (15) et de 27 mg (3,65.10 mole) de Li2CO3 dans 25 ml de CH3CN anhydre est chauffé 15 min à reflux sous courant d'azote. A la suspension résultante, on additionne goutte à goutte en 10 min une solution de 12,7 mg (3,1.10mole) de diéthyl-2,6dibromométhyl-3,5-pyndine carboxylate (14) dans 12 ml de CH3CN anhydre. L'agitation est maintenue dans ces conditions 23 heures puis le milieu réactionnel refroidi par un bain de glace avant d'être filtré. Après évaporation à sec du filtrat, une chromatographie sur phase inverse du résidu obtenu fournit 12 mg (35%) de macrobicycle (16). HPLC : Tr = 28,5 SM : (ES) 1042,3 [ligand-Li±Br- (100%)] ; 1064,3 [ligand- Li±Br-+Na+ (30%)] Exemple (6) : Préparation du cryptate d'europium de formule (19) [Eu3+# bpy(CO2H)2.bpy(CO2H)2.Py(NH2>2] a) Préparation du complexe d'europium du ligand (16) de l'exemple (6) [Eu3+C bpy(C02tbu)2.bpy.(C02tbu)2.Py(C02Et)2 A une solution de 17,1 mg (1,51.10-5mole) de cryptate de lithium (16) dans 10 ml d'acétonitrile anhydre, on ajoute 12,8 mg (3,5.10-5 mole) de EuCl3.6H2O. Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à reflux sous courant d'azote pendant 3 heures. Après refroidissement, le solvant est évaporé et le résidu obtenu (m = 27,6 mg) utilisé tel quel dans l'étape suivante. b) Préparation du cryptate d'europium acide [Eu3+C bpy(CO2H)2.bpy(CO2H)2.Py(CO2Et)2](CF3CO2")3 Cette réaction consiste à hydrolyser sélectivement les esters tertiobutyliques portés par les sous unités bipyridines par traitement par l'acide trifluoroacétique pur. 27,6 mg du résidu obtenu dans le paragraphe a) de l'exemple 6 sont solubilisés dans 14 ml d'acide trifluoroacétique. La solution homogène résultante est agitée 4 heures à température ambiante puis concentré à sec par évaporation sous vide de l'acide. Une chromatographie sur phase inverse avec un mélange H20 à 1% de TFA -CH3CN comme éluants fournit 10,4 mg du cryptate d'europium [Eu3+Cbpy(CO2H)2.bpy(CO2H)2.Py(CO2Et)2](CF3CO2")3 HPLC : Tr = 13,7 UV : MeOH / 324,6 nm (16000) ; 337 nm (13300) c) Préparation du cryptate d'europium de formule (19) A une solution de 10 mg (8,03.10mole) de cryptate d'europium [Eu3+# bpy(C02H)2-bpy(CO2H)2,PY(CO2Et)2] dans 2 ml de MeOH anhydre on additionne en 5 min, en refroidissant par un bain de glace et sous courant d'azote, une solution de 300 l d'éthylène diamine (4,45.10-3mole) dans 300 l de MeOH anhydre. Par la suite, la température du milieu est ramenée progressivement à 20 C puis l'agitation poursuivie 2,5 heures dans ces conditions. Après évaporation du solvant une chromatographie en phase inverse du résidu résultant avec un mélange H20 à 1% de TFA -CH3CN comme éluants fournit 5,5 mg de cryptate (19) (45%). UV : MeOH / 325 nm (17000) Exemple 7 : Préparation du cryptate d'europium de formule (20) Ce composé est préparé selon le schéma représenté ci-dessous. A une solution, refroidie par un bain de glace, de 0,2 mg (1,28.10-7 mole) de composé (19) dans 200 /il de tampon phosphate 0,1M, pH = 7,0 on ajoute goutte à goutte en 45 min une solution de 195 g (4,45.10-7 mole) de suifoSMCC dans 168 NI de tampon phosphate. En fin d'addition, la température du milieu est ramenée à 20-25 C et la réaction est poursuivie dans ces conditions pendant 3 heures. Par la suite, une purification directe par chromatographie en phase inverse avec un mélange H20 à 1 % de TFA-CH3CN comme éluant permet d'isoler 100 pg de cryptate (20) (50%). Exemple 8 : Couplage du composé de formule (20) à la protéine a) Activation de la protéine 3,14 mg (4,43 mg /ml) d'anticorps (free PSA, cloneA455, CIS bio international, France) sont activés 30 min à température ambiante, en tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,0, par ajout de 26,2 /il d'une solution éthanolique de SPDP à 2 mg/ ml (rapport molaire initial réactif-protéine : 8). A la fin de ce temps, on génère la formation de fonctions thiols (SH) par ajout au milieu réactionnel de 37 l d'une solution de dithiothréitol (DTT) à 61,7 mg / ml dans du tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,0 et en incubant 15 min à température ambiante ; par la suite, le mélange est purifié sur une colonne Séphadex G25 HR10-10 avec comme éluant le tampon utilisé au cours de l'activation. b) Couplage de la protéine activée et du cryptate de formule (20) A 386 l d'une solution d'anticorps A455 (1,2 mg/ ml en tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,0) activé selon la procédure décrite au paragraphe a) de l'exemple 8 on additionne 55 l d'une solution à 1 mg/ ml dans le même tampon de cryptate de formule (20) puis on incube 20 heures à 4 C ; à la fin de ce temps, le mélange réactionnel est purifié sur une colonne Séphadex G25 HR10-30 avec comme éluant le tampon de la réaction de couplage. Des mesures d'absorbances du conjugué anticorps-cryptate à 280 nm et 325 nm donnent un taux de marquage de 8,0 et un rendement de 80%. Exemple 9: Mise en évidence de la faible sensibilité à l'extinction des cryptâtes pyridiniques des exemples 2,4(b), 6 (c), 7, 8 dans le sérum. Les déterminations ci-dessous ont été effectuées avec un spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS50. Les mesures de durées de vie de fluorescence des cryptates testés ont été réalisées suivant la procédure décrite dans le brevet EP 0 601 113. Les composés ont été testés dans un tampon phosphate 0,1 M pH = 7,0 et en sérum de veau nouveau-né (SVNN). Les solutions de mesure de concentration en cryptate d'environ 10-6M/1 ont été préparées par dilution au 1/100 de la solution mère soit par le tampon seul soit par un mélange 2/3 de tampon 1/3 de sérum. Les cryptates pyridiniques des exemples 2,4(b), 6 (c), 7 et 8 ont été testés en comparaison avec le cryptate trisbipyridine diamine (KNH2) et le cryptate pyridine-bispyridine [Eu3+Cpy.Bpy.Bpy] dont les préparations ont été décrites respectivement dans le brevet EP 0 321 353 et dans Helv. Chim. Acta 1988,71, 1042. Les formules de ces deux molécules sont données ci-après : 3+ Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 3Complexes testés # Tampon PO4 # sérum (ms) Extinction (ms) 1-( #-sérum) # PO43KNH2 0,6 0,15 75 % Exemple 2 macrobicycle 6 1,06 0,80 25 % Exemple 4 (b) macrobicycle 12 1,03 0,90 13 % Exemple 6 macrobicycle 19 1,03 0,90 13 % Exemple 7 macrobicycle 20 1,01 0,89 12 % Exemple 8 conjugué anticorps o,95 0,86 9,5 % cryptate [Eu3+ CBpy.Bpy.py] 0,66 0,54 18 % Ces résultats montrent que dans une structure cryptate trisbipyridine, la substitution d'un motif bipyridine par un motif pyndine a pour effet de diminuer l'extinction de fluorescence due au sérum. Ces résultats mettent également en évidence que la présence de groupements carboxylates sur les motifs bipyridines influe favorablement sur la diminution de l'extinction. REVENDICATIONS 1. Procédé de réduction de l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure dans un dosage par fluorescence d'un analyte mettant en #uvre au moins un marqueur fluorescent caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de mesure un complexe macropolycyclique de terre rare, constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents #, # et #, sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux A, et # comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé et au moins l'un des radicaux #, ()et # qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux radicaux A , B ou C qui ne comportent pas ou ne sont pas essentiellement constitués par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé comprennent un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est substitué par un groupement donneur d'électrons. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, les bipyridines et les bisisoquinoléines. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est un groupe bipyridine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le (ou les) groupe (s) bypiridine(s) est (sont) substitué(s) par un groupement donneur d'électrons choisi en particulier parmi les groupements carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (Ci-C4)alkyle. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le (ou les) motif (s) bipyridine(s) est (sont) substitué (s) parun groupement carboxylate. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le complexe macropolycyclique est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à la formule Il : dans laquelle : - le cycle de formule est le macrocycle bis-bipyridine de formule : - n = 0, 1 ou 2 ; - A est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ; - R1 est un groupe -COOR3 dans lequel R3 est l'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien R1 est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A ; - R2 est l'hydrogène, un groupement donneur d'électrons, en particulier carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(AJk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle, un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, sous réserve que l'un au plus des substituants R1 et R2 représente un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A et Ri et R2 ne représentent pas simultanément un groupe -CO-NH-YA ou -Y-A ; - Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs hétéroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe (s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à C8 ou parmi les groupes arylène en C6 à C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'ion terre rare complexé est l'europium. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9, caractérisé en ce que le complexe macropolycyclique de terre rare est choisi parmi les cryptates d'europium [Eu3'C py.bPY(C02H)2.bPY(CO2H)2], [Eu3+C bpy(C02H)2.bPY(CO2H)2.py(NH2)2] et [Eu3+C bpy(C02H)2.bpy(C02H)2. py(CONH(CH2)2NHR4]2 dans lequel 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit complexe macropolycyclique de terre rare est utilisé comme seul marqueur ou comme l'un des marqueurs dans le dosage. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le milieu de mesure est un milieu biologique, en particulier un milieu sérique. 13. Complexe macropolycyclique de terre rare, constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents #, et , sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux #, et # comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé, caractérisé en ce que : - soit au moins l'un des radicaux #, et qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ; - soit au moins l'un des radicaux #, et # qui ne comporte pas ou n'est pas essentiellement constitué par ledit motif moléculaire comprend un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée et le ou les radicaux@ , # ou autres que celui-ci est substitué par un groupement donneur d'électrons. 14. Complexe selon la revendications 13, caractérisé en ce que l'ion terre rare complexé est l'europium. 15. Complexe selon les revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que les deux radicaux #, # ou # qui ne comportent pas ou ne sont pas essentiellement constitués par un motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé comprennent un radical pyridine substituée une ou plusieurs fois ou non substituée. 16. Complexe selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, les bipyridines et les bisisoquinoléines. 17. Complexe selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé est un groupe bipyridine. 18. Complexe selon la revendication 17, caractérisé en ce que le (ou les) groupe (s) bipyridine(s) est (sont) substitué (s) parun groupement donneur d'électrons choisi en particulier parmi les groupements carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, 0-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényt substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle. 19. Complexe selon les revendications 17 ou 18 caractérisé en ce que le (ou les) motif (s) bipyridine (s) est (sont) substitué (s) parun groupement carboxylate. 20. Complexe selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à la formule Il : dans laquelle : - le cycle de formule est le macrocycle bis-bipyndine de formule : - n = 0,1 ou 2 ; - Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs hétéroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe (s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à Ce ou parmi les groupes arylène en C6 à C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ; - A est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ; - R1 est un groupe-COOR3 dans lequel R3 est l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien R1 est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A ; - R2 est l'hydrogène, un groupement donneur d'électrons, en particulier carboxylate, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2, -C(Alk)3, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ; Alk étant un groupe (Ci-C4)alkyle, -NHCOAlk, phényl substitué ou non substitué ;Alk étant un groupe (C1-C4)alkyle, ou un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, sous réserve que l'un au plus des substituants R1 et R2 représente un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A et Ri et R2 ne représentent pas simultanément un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A, et sous réserve que lorsque n = 0, R2 soit différent de l'hydrogène. 21. Complexe selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à la formule Il dans laquelle : - n = 0, - Y, A et R1 sont tels que définis dans la revendication 20, et - R2 est tel que défini dans la revendication 20 et l'un des substituants R2 est un groupe -CO-NH-Y-A ou -Y-A. 22. Complexe selon les revendications 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les cryptates d'europium [Eu3+C Py.Bpy(C02H)2.BPY(CO2H)2], [Eu3+C bpy(C02H)2.bpy(CO2H)2.Py(NH2)2] et [Eu3+C bpy(C02H)2.bpy(C02H)2. Py(CONH(CH2)2NHR4], dans lequel 23. Conjugué fluorescent, constitué par un complexe selon l'une quelconque des revendications 13 à 22 lié de manière covalente à l'un des membres d'un couple de molécules capables de se lier spécifiquement entre elles, en particulier un polypeptide, une protéine, un récepteur cellulaire, un antigène, un anticorps ou un acide nucléique. 24. Utilisation d'un complexe macropolycyclique selon l'une quelconque des revendications 13 à 22 pour réduire l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure dans un dosage par fluorescence d'un analyte.