FR 2812886 A1 20020215 FR 0010428 A 20000808 La présente invention est relative au dépistage d'un syndrome hépatique survenant chez l'adulte jeune et associant une microlithiase biliaire cholesté- rolique, une cholestase intra-hépatique et une ou plusieurs mutations du gène MDR3. La présente invention est également relative au traitement dudit syndrome. La lithiase biliaire cholestérolique est caractérisée par la présence de calculs de cholestérol ou de bilirubinate de calcium. La lithiase cholestérolique est la forme la plus fréquente de lithiase biliaire (80 %). Elle se caractérise par la formation de calculs de cholestérol dans la vésicule biliaire, due à un excès de cholestérol biliaire par rapport aux molécules solubilisantes que sont les acides biliaires et les phospholipides. Sa prévalence est estimée, tout âge confondu à 10 à 20 % de la population dans les pays industrialisés. La prévalence est plus grande chez la femme et augmente considérablement avec l'âge (40 % chez la femme après 60 ans). La lithiase vésiculaire peut être source de complications : cholécystite, cancer de la vésicule, migration de calculs dans le cholédoque, source d'angiocholite et de pancréatite. Le traitement de cette maladie repose principalement sur la chirurgie : cholécystectomie par laparotomie ou c#lioscopie, drainage biliaire avec extraction peropératoire ou perendoscopique des calculs cholédociens. Le traitement médical qui consiste en l'administration d'acide chénodésoxycholique et/ou d'acide ursodésoxycholique, est réservé aux formes de lithiases biliaires cholestéroliques vésiculaires non compliquées. Les cholestases biliaires chroniques sont caractérisées par un défaut de passage de la bile du foie vers les voies biliaires extra-hépatiques et l'intestin. Les causes et la physiopathologie sont variées (Poupon et al., 2000, J. Hepatol., 32,129-140). La plupart des cholestases biliaires chroniques peuvent évoluer vers une cirrhose biliaire et une insuffisance hépatocellulaire nécessitant une transplantation hépatique. Chez l'enfant par exemple, on observe une cholestase dans l'atrésie biliaire, dans le syndrome d'Alagille ou dans les cholestases intra-hépatiques familiales progressives (PFIC). De manière générale, on observe des anomalies génétiques dans ces différentes maladies. Les cholestases intra-hépatiques familiales (PFIC) sont des maladies récessives infantiles qui se caractérisent par des jaunisses intermittentes, une cholestase sévère et une cirrhose, dont l'issue est fatale au cours des dix premières années de la vie. Ces maladies se manifestent sous plusieurs formes cliniques, dont deux sont déterminées par des mutations présentes sur des gènes codant pour des transporteurs ABC. La maladie de Byler ou cholestase intra-hépatique familiale progressive de type 1, qui se caractérise par une cholestérolémie et une activité y-glutamyl transférase sérique normales, a été la première décrite. Elle est causée par la mutation du gène FIC1, une ATPase de type V, impliquée dans le transport des phospholipides, de la paroi externe vers la paroi interne de différentes membranes cellulaires. De manière plus précise, la PFIC de type 1 est caractérisée par des épisodes récurrents de jaunisse, un prurit sévère, une activité y-GT et des taux de cholestérol normaux, des concentrations élevées en acides biliaires sériques et des taux faibles en acides biliaires dans la bile. Le locus de la PFIC1 a été trouvé dans le chromosome 18q21-q22 ; cinq mutations ont été identifiées : une délétion, un exon supprimé et trois mutations faux-sens ; ces mutations faux-sens concernent des domaines hautement conservés dans les ATPases de type V (E. Jacquemin et al., J. Hepatol., 1999, 31, 377-381). La cholestase familiale de type 2 présente les mêmes manifestations cliniques que la maladie de Byler mais elle est causée par des mutations dans le gène FIC2, qui code pour le transporteur BSEP (Bile Salt Export Pump). Ce gène est l'homologue du gène murin SPGP dont le produit, exprimé exclusivement dans les hépatocytes, est impliqué dans le transport des sels biliaires. La PFIC de type 2 est caractérisée par un prurit sévère, une activité y-GT et un taux de cholestérol sérique normaux, des concentrations élevées en acides biliaires sériques et des taux très bas d'acides biliaires dans la bile. Le locus de la PIFC2 a été trouvé dans le chromosome 2q24 : 10 mutations été identifiées, incluant des délétions et des mutations faux-sens impliquant des domaines importants du transporteur BSEP (E. Jacquemin et al., J. Hepatol., 1999, 31, 377-381). Les malades atteints de cholestase intra-hépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3) présentent des mutations dans le gène MDR3. La PFIC de type 3 se distingue des autres PFIC en particulier par une activité y-glutamyl transférase sérique élevée. La famille MDR (Multi Drug Resistance) de transporteurs ABC est une famille multigénique de protéines homologues, dont certaines (MDR3) n'interviennent pas dans la résistance aux drogues et sont des transporteurs de phosphatidylcholine. Le gène MDR3, mis en évidence en 1993, est un translocateur de phospholipides. Exprimé dans l'hépatocyte, il assure la translocation de phospatidylcholine, entraînant ainsi la sécrétion de ce phospholipide dans la bile. Les souris chez lesquelles le gène équivalent à MDR3 a été invalidé mdr2 (-/-) présentent un défaut de sécrétion de phospholipides dans la bile, qui provoque des altérations physiologiques proches de celles de patients atteints de cholestase progressive intra-hépatique familiale de type 3. Deux patients atteints de cette maladie et portant des mutations sur les deux allèles de MDR3 ont été récemment décrits ; le profil histopathologique des deux patients est similaire à celui observé chez les souris mdr2 (-/-) (J. Marleen L. de Vree et al., PNAS, 1998, 95, 1, 282-287). De manière plus précise, au niveau histologique, une fibrose portale, une prolifération des canaux biliaires et la présence d'un infiltrat inflammatoire sont observés. En revanche, il n'est pas observé de microlithiase biliaire cholestérolique chez ces patients atteints de PIFC3 ou chez les souris mdr2 (-/-). Au niveau génique, chez le premier patient, une délétion homozygote de 7 pb a été observée, commençant à l'acide aminé 132, entraînant un décalage du cadre de lecture et introduisant un codon stop, 29 codons en aval ; le second patient est homozygote pour une mutation non-sens dans le codon 957 (C/T) qui introduit un codon stop (TGA) : cette mutation supprime un site de restriction TaqI. Dans une telle pathologie, des protéines tronquées, non actives, dans lesquelles au moins un motif ABC manque, sont exprimées. En outre, des mutations non-sens additionnelles et des mutations fauxsens, associées avec des taux très bas de phospholipides biliaires ont aussi été observées. Des cholestases n'apparaissant qu'à l'âge adulte ont également été observées ; dans de tels cas, on n'a pas observé de microlithiase (E. Jacquemin et al., The Lancet, 1999, 353, 210-211). De manière surprenante, les Inventeurs ont trouvé qu'il existe chez des adultes jeunes (20-40 ans), des pathologies qui se distinguent de la PFIC de type 3, qui sont déclenchées dans des situations telles que la grossesse, la prise d'hormones sexuelles, le jeûne prolongé, la nutrition parentérale prolongée, des interventions chirurgicales ou par des co-facteurs hépatotoxiques (obésité, diabète, prise de médicaments susceptibles de modifier la composition de la bile : fibrates ou diurétiques, en particulier) et dans lesquelles on observe en association : - une microlithiase biliaire cholestérolique - une cholestase intra-hépatique et - au moins une mutation du gène MDR3. Dans ce syndrome, on observe un défaut de phospholipides biliaires (anomalie de la sécrétion des phospholipides biliaires), limitant la solubilisation du cholestérol et entraînant la précipitation du cholestérol sous forme de microcalculs in situ au sein des petites voies biliaires et dans les formes extrêmes au sein de l'ensemble de l'arbre biliaire. Ces microcalculs peuvent être reconnus par l'examen ulstrasono- graphique du foie. La très forte diminution de la concentration en phospholipides biliaires et la présence des cristaux de cholestérol, associées à une mutation du gène MDR3, caractérisent ce syndrome. Le dépistage et la prévention de cette pathologie, distincte des PFIC de type 3, chez des sujets ayant des antécédents personnels ou familiaux de lithiase vésiculaire ou d'atteintes hépatiques inexpliquées (anomalies biologiques portant sur les tests de cholestase : augmentation de l'activité sérique des y-glutamyltranspeptidases, transaminases) sont cruciaux. En effet, 10 à 20 % des cholestases gravidiques pourraient en fait correspondre à ce syndrome et sa morbidité, dont les avortements à répétition, pourrait ainsi être évitée, dans le cas d'un bon dépistage et d'une prévention efficace. C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un test de dépistage de cette pathologie, qui se distingue de la cholestase intra-hépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3) tant cliniquement que biochimiquement, de manière à prévenir ses effets néfastes notamment chez la femme en état de procréer. La présente invention a pour objet un procédé de dépistage d'un syndrome hépatique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la détection, à partir d'un échantillon d'acide nucléique extrait de cellules mononucléées du sang périphérique, d'au moins une mutation hétérozygote du gène MDR3 et/ou d'une mutation homozygote n'abolissant pas l'expression de la protéine exprimée par ledit gène à activité de transporteur de la phosphatidylcholine, chez des sujets adultes associant une microlithiase biliaire cholestérolique et une cholestase intra-hépatique. Au sens de la présente invention, on entend par mutation n'abolissant pas l'expression de la protéine ayant une activité de transporteur de la phosphatidylcholine, aussi bien les mutations qui entraînent l'expression d'une protéine ayant une activité résiduelle de transporteur de la phosphatidylcholine que des mutations qui diminuent le taux d'expression de la protéine normale (mutation dans le promoteur par exemple). Ces différentes mutations n'induisent aucun symptôme hépato-biliaire chez l'enfant, mais l'apparition, chez l'adulte jeune, de symptômes associant une micro- lithiase biliaire cholestérolique et une cholestase intra-hépatique, induits par des facteurs additionnels liés à l'hôte et /ou à l'environnement. Conformément à l'invention, la dite mutation est de préférence située dans l'exon 6 et/ou dans l'exon 9 et/ou dans l'exon 12. Selon un mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé, il comprend la détection d'une mutation sélectionnée dans le groupe constitué par une mutation dans l'exon 6 au niveau du nucléotide 523, une mutation dans l'exon 9 au niveau du nucléotide 959 et une mutation dans l'exon 12 au niveau du nucléotide 1327. De manière plus précise, ledit procédé comprend la détection d'une mutation sélectionnée dans le groupe constitué par : - une mutation hétérozygote faux-sens dans l'exon 6 au niveau du nucléotide 523 : (ACG/GCG), conduisant à la mutation en acide aminé T175V ; cet acide aminé est situé dans une séquence d'acides aminés conservés, requise pour l'activité ATPase de la protéine MDR3, - une mutation homozygote faux-sens dans l'exon 9 : au niveau du nucléotide 959 : C/T (TCC/TTC), conduisant à la mutation en acide aminé S320F, qui se situe à l'extrémité du domaine transmembranaire 5 (TM5) et - une mutation hétérozygote dans l'exon 12 : insertion d'une adénine au niveau du nucléotide 1327 (1327insA) dans le premier domaine de liaison au nucléotide (NBD1) ; cette mutation entraîne un décalage dans le cadre de lecture au niveau du codon 443 et l'apparition d'un codon stop (nt 1339-1341), conduisant à l'expression d'une protéine tronquée de 446 acides aminés. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, il comprend : - une première étape d'amplification d'un fragment d'acide nucléique, dans lequel l'une au moins desdites mutations est susceptible d'être observée, à partir des acides nucléiques extraits de cellules mononucléées du sang périphérique, à l'aide d'au moins une amorce sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces représen- tées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:1à SEQ ID NO :13, et - une deuxième étape de détection de la présence d'au moins l'une desdites mutations, à partir du ou desdits fragments d'amplification obtenus. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre du procédé, la première étape d'amplification consiste en une amplification PCR directe d'au moins l'un des exons 6,9 et 12 de l'ADN génomique avec les amorces suivantes, localisées dans les régions introniques flanquantes : - amorces SEQ ID NO:1et SEQ ID NO:2, qui permettent d'amplifier un fragment de 321 pb couvrant l'exon 6, - amorces SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4, qui permettent d'amplifier un fragment de 210 pb couvrant l'exon 9, et - amorces SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6, qui permettent d'amplifier un fragment de 154 pb couvrant l'exon 12. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre du procédé, la première étape d'amplification consiste en une amplification RT-PCR des ARNm par deux PCR imbriquées, à l'aide de deux paires d'amorces, sélectionnées dans le groupe constitué par les paires suivantes : - Première paire : SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO:8 - Deuxième paire : . SEQ ID NO:9 et SEQ ID NO: 10 . SEQ ID NO:11et SEQ ID NO: 10 . SEQ ID N0:12 et SEQ ID NO:10 et . SEQ ID N0:13 et SEQ ID NO:10. De manière plus précise, pour la détection à partir de l'ARNm, le procédé selon l'invention comprend avantageusement : - une première amplification PCR d'un fragment de 2100 pb (fragment 1) correspondant aux exons 1 à 16 du gène MDR3 humain avec la paire d'amorces : 5'-CCTGCCAGACACGCGCGAGGTTC-3' (SEQ ID NO:7) et 5'-CTTCAAGTCCATCGGTTTCCACATC-3' (SEQ ID NO :8), et - une deuxième amplification du fragment 1 en utilisant différents couples d'amorces, aptes respectivement à amplifier, un fragment comprenant l'exon 6, un fragment comprenant l'exon 9 et un fragment comprenant l'exon 12. De manière encore plus précise : . - un fragment de 1746 pb (fragment 2) comprenant l'exon 6 est ampli- fié avec le couple d'amorces suivant : 5'-CCTTGTCGCTGCTAAATCC-3' (SEQ ID N0:9) et 5'-GGCTCTTCTGACACATTTGTG-3' (SEQ ID NO: 10) - un fragment de 1483 pb (fragment 3) comprenant l'exon 9 est ampli- fié avec le couple d'amorces suivant : 5-'GGAATTGGTGACAAGGTTGG-3' (SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 10. - un fragment de 1162 pb (fragment 4) comprenant l'exon 9 est amplifié avec le couple d'amorces suivant : 5'-GCTATTTCAGCAAACATTTCCATGG -3' (SEQ ID N0:12) et SEQ ID NO: 10 - un fragment de 823 pb (fragment 5) comprenant l'exon 12 est amplifié avec le couple d'amorces suivant : 5'-GCTAACGTCAAGATCTTGAAGG-3' (SEQ ID N0:13) et SEQ IDNO:10. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre du procédé, la deuxième étape de détection de la présence d'au moins l'une desdites mutations à partir du fragment amplifié, est réalisée selon le cas, par l'une des méthodes suivantes : -séquençage - restriction enzymatique ou - techniques de type PCR/PCR/LDR. Dans le cas où la mutation se traduit par l'apparition ou la disparition d'un site de restriction dans le fragment amplifié, les mutations sont détectées par digestion avec l'enzyme reconnaissant ledit site de restriction, par comparaison avec un témoin ne présentant pas ladite mutation. Par exemple : - digestion du fragment d'amplification de 210 pb, tel que défini ci- dessus avec l'enzyme Hinfl: la détection d'un fragment de 210 pb correspond à la présence de l'allèle sauvage, alors que la détection de deux fragments (142 pb et 48 pb) correspond à la présence de l'allèle muté. - digestion du fragment d'amplification de 210 pb tel que défini ci- dessus avec l'enzyme BamHI: la détection d'un fragment de 210 pb correspond à la présence de l'allèle muté et la détection de deux fragments correspond à la présence de l'allèle sauvage. Dans le cas où la mutation ne peut pas être détectée par digestion enzymatique, le fragment amplifié par PCR est séquence selon les techniques classiques ; à titre d'exemple on peut citer la technique des didésoxynucléotides. Dans le cas où la mutation à détecter correspond à l'insertion ou à la délétion d'une petite séquence, ladite mutation peut être détectée par des techniques de type PCR/PCR/LDR qui reposent sur la détection de la ligation d'amorces spécifiques d'allèle à l'aide d'une ligase thermostable (Favis et al., Nature Biotech., 2000,18, 561- 564). Un tel procédé peut avantageusement être mis en #uvre pour l'évaluation du risque d'apparition d'un syndrome associant une cholestase intrahépatique et une microlithiase biliaire cholestérolique dans les familles à risque de lithiase cholestérolique et/ou ayant des anomalies biologiques hépatiques inexpliquées. Lorsqu'une mutation, telle que définie ci-dessus, est détectée chez des sujets à risque, ledit procédé d'évaluation peut avantageusement comprendre en outre, la recherche de microcristaux intra-hépatiques de cholestérol, la mesure de l'index de saturation de la bile en cholestérol, la détermination du rapport cholestérol/phospholipides biliaires, le dosage des phospholipides biliaires et l'épreuve de charge à l'acide ursodésoxycholique. On peut considérer le diagnostic positif du syndrome précité lorsque l'on dépiste l'une des mutations précitées, associée à la présence de microlithiase biliaire, un taux très faible de phospholipides biliaires et à un indice de saturation de la bile en cholestérol supérieur à 1. La présente invention a également pour objet l'utilisation des diffé- rentes amorces telles que définies ci-dessus pour le dépistage d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3. La présente invention a également pour objet un kit pour le dépistage d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra- hépatique et au moins une mutation du gène MDR3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux amorces telles que définies ci-dessus, aptes à la détection d'une mutation du gène MDR3 humain, telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet un kit pour l'évaluation du risque d'apparition d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3, dans une population à risque, caractérisé en ce qu'il comprend outre les amorces aptes à la détection d'une mutation du gène MDR3 telles que définies ci-dessus, des réactifs pour doser le cholestérol et les phospholipides biliaires. De manière préférée, lesdits réactifs sont de réactifs enzymatiques. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation de l'acide ursodésoxycholique pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un syndrome hépatique associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intrahépatique et au moins une mutation du gène MDR3. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de ce qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 illustre la localisation des différentes mutations sur l'ADNc codant la protéine MDR3. Les exons (Ex) 6 à 12 sont représentés par des boîtes blanches, les boîtes noires correspondent aux domaines transmembranaires (TM) 2 à 6 et la boîte hachurée représente le domaine de fixation des nucléotides (NBD1). La localisation des différentes mutations est représentée par des flèches. ICL1correspond à la boucle intracellulaire de la protéine MDR3 indispensable à l'activité ATPase de cette protéine. Exemple 1 : Matériels et Méthodes 1- Caractéristiques des patients inclus dans l'étude Six patients ont été étudiés : cinq femmes (patients 1, 2,4, 5 et 6) et un homme (patient 3). Ils présentent : une cholestase intra-hépatique chronique, une lithiase biliaire de cholestérol, une microlithiase intra-hépatique attestée par échographie et une anomalie du gène mdr3 ; un traitement à l'acide ursodésoxycholique (AUDC) entraîne une disparition complète des symptômes et une normalisation des constantes enzy- matiques du foie. Chez les cinq femmes, ce syndrome est apparu lors de la grossesse ou après un traitement par contraceptifs oraux. L'analyse de la bile montre : une sursaturation en cholestérol, un taux de phospholipides bas et la présence de cristaux de cholestérol. 2 - Préparation de l'ADN et de l'ARN. Les cellules mononucléées du sang circulant sont isolées par centrifugation (Histopaque-1119, Sigma Diagnostics). L'ADN est extrait à partir de 5.106 lymphocytes à l'aide du kit QIAamp (Qiagen-GmbH, Allemagne). L'ARN total est extrait à partir de 5.106 cellules mononucléées du sang périphérique (kit Eurobio, les Ulis, France) conformément aux instructions du fabricant. Les concentrations en ARN et en ADN sont quantifiées par spectrophotométrie. 3- Amplification des transcrits du gène MDR par RT-PCR Une transcription inverse est réalisée dans un volume réactionnel de 20 l contenant 500 mM de dNTP, 10 mM de DTT, 0. 5 U.ml''de RNasine (Madison, Wi), 5 mM d'hexamères aléatoires et 10 g.ml-1 de transcriptase inverse (Gibco BRL, Bethesda, MD). Les extraits d'ARN sont chauffés pendant 5 minutes à 70 C et refroidis sur de la glace avant d'être ajoutés (1 g) au mélange réactionnel et incubés une heure à 37 C. L'ADNc obtenu (5 l, 0,25 g) est amplifié par la méthode PCR à l'aide d'amorces oligonucléotidiques synthétiques (Genosys, Cambridge, UK). Une première PCR, produisant le fragment 1 de 2100 pb est réalisée dans un milieu de réaction de 25 l contenant 10 mM de Tris-HCl pH 8. 3, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 0,001 % de gélatine, 0,05 U de Taq DNA polymérase, 350 M de chaque dNTP et 0,5 M de chaque amorce (sens et anti-sens) telle que définie dans le Tableau 1 ci-après : Tableau I: Séquence des amorces et taille des fragments obtenus par amplification RT-PCR du gène MDR3 Fragment Paires d'amorces PCR (5'+3') Position Position Taille du (Exon) produit (pb) 1 CCTGCCAGACACGCGCGAGGTTC -32-2078 (1-16) 2100 CTTCAAGTCCATCGGTTTCCACATC 2 CCTTGTCGCTGCTAAATCC 296-2041 (5-16) 1746 GGCTCTTCTGACACATTTGTG 3 GGAATTGGTGACAAGGTTGG 559-2041 (9-16) 1483 GGCTCTTCTGACACATTTGTG 4 GCTATTTCAGCAAACATTTCCATGG 880-2041 (9-16) 1162 GGCTCTTCTGACACATTTGTG 5 GCTAACGTCAAGATCTTGAAGG 1219-2041 (11-16) 823 GGCTCTTCTGACACATTTGTG 6 GAGGCCAACGCCTATGAG 1522-2041 (13-16) 520 GGCTCTTCTGACACATTTGTG La paire d'amorces pour l'amplification du fragment 1 a déjà été décrite (De Vree JM. et al., précité). L'amplification PCR primaire est réalisée dans les conditions suivantes : une étape de dénaturation initiale à 94 C pendant cinq minutes est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant trente secondes, une étape d'hybridation des amorces à 68 C pendant trente secondes et une étape d'extension à 72 C pendant deux minutes. Des PCR imbriquées produisant cinq fragments chevauchants (fragments 2, 3, 4, 5 et 6) sont réalisées en ajoutant 2 l du produit d'amplification de la PCR primaire à un mélange réactionnel de PCR secondaire (50 l). Le milieu de réaction est identique à celui décrit ci-dessus (pour les amorces, voir Tableau I). L'amplification PCR secondaire est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant cinq minutes est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant trente secondes, une étape d'hybridation des amorces à 60 C pendant trente secondes et une étape d'extension à 72 C pendant 90 secondes. Des contrôles négatifs sont réalisés sur des échantillons d'ARN amplifiés en l'absence de transcriptase inverse. Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 1,5 % contenant du bromure d'éthidium. Les fragments d'ADN amplifiés sont visualisés sous une lampe à ultraviolet. 4- Amplification PCR des exons 6, 7, 9 et 12 du gène MDR3 Les exons 6,9 et 12 sont amplifiés par PCR, en utilisant des amorces localisées dans les régions introniques flanquantes et en utilisant de l'ADN génomique comme matrice : # un fragment de 321 pb couvrant l'exon 6 est amplifié en utilisant les amorces suivantes : - amorce sens 5'-CTACTCAGGATTGGGTGCTGG-3' (SEQ ID NO :1) et - amorce anti-sens 5'-GCTAGAACATGGCTGCCAG-3' (SEQ ID NO :2) # un fragment de 210 pb couvrant l'exon 9 est amplifié en utilisant les amorces suivantes : - amorce sens 5'-CCCTCTCATTTTTCTGGTAG-3' (SEQ ID NO : 3) et - amorce anti-sens 5'-GTTAGGAGAACTACTTACTG-3' (SEQ ID NO :4). # un fragment de 154 pb couvrant l'exon 12 est amplifié en utilisant les amorces suivantes : - amorce sens 5'-CCTTACAGATCTTGAAGGGC-3' (SEQ ID NO : 5) et - amorce anti-sens 5'-GCTTGGTTCTTCCCACTTAC-3' (SEQ ID NO : 6). La réaction de PCR est réalisée dans un volume final de 50 l, en présence de 100 ng d'ADN génomique et de 1,5 mM de MgCl2. L'étape d'hybridation des amorces est réalisée à 60 C (exon 7), 50 C (exon 9) et 56 C (exon 12) et les autres étapes sont identiques à celles exposées ci-dessus pour l'ADNc à l'exception du nombre de cycles (30 au lieu de 35). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 2 % contenant du bromure d'éthidium. Les fragments d'ADN amplifiés sont visualisés sous une lampe à ultraviolet. 5- Analyse des mutations Les produits d'amplification sont séquences (kit au didésoxytermina- tor) conformément aux instructions du fabricant (Perkin-Elmer). Les réactions de séquençage sont réalisées dans un thermocycleur 9600 Perkin-Elmer en utilisant les mêmes amorces que pour l'amplification des exons (voir 4-). Les produits d'extension sont séparés des nucléotides non-incorporés et des amorces par centrifugation sur colonne (quick spin TM, Boehringer Mannheim) puis ils sont séchés et remis en suspen- sion dans 4 l de formamide déionisée contenant 50 mM d'EDTA pH8. Ensuite ces produits sont chauffés pendant 2 minutes à 90 C, transférés sur de la glace et chargés immédiatement sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 %. La migration se fait à 30 W pendant 12 h (séquenceur d'ADN automatisé modèle ABI 373 A). 6- Analyse de restriction Les fragments d'amplification de l'exon 9 sont digérés (15 l) pendant 6 heures à 37 C avec Hinf I ou BamH I (2 UI, Biolabs) et les fragments obtenus sont visualisés sur gels d'agarose à 2 %. 7- Composition de la bile Un microscope en lumière polarisée est utilisé pour détecter la présence de cristaux de cholestérol dans des échantillons de bile fraîche. La concentration en sels biliaires totaux est mesurée par une technique enzymatique mettant en #uvre de la 3a-hydroxystéroïde déshydrogénase (Enzabile, Nycomed, Oslo, Norvège). Le contenu en phospholipides totaux est déterminé par une méthode enzymatique en présence de phospholipase D et de choline oxydase. Le cholestérol est déterminé par une réaction enzymatique avec de la cholestérol-oxydase ou de la cholestérol-estérase. Les indices de saturation en cholestérol des échantillons de bile hépatique sont calculés à partir des tables critiques de Carey (J. Lipid Res., 1978, 19, 945-955). Exemple 2 : Résultats Les six patients précités ont été étudiés. 1- Morphologie et histopathologie L'ultrasonographie (US) permet de détecter de multiples calculs dans les conduits biliaires intra-hépatiques chez les six patients. Un échantillon de biopsie hépatique obtenu chez les patients 3 et 4, montre une inflammation portale modérée et une prolifération des canaux biliaires sans lésion desdits canaux. Une fibrose extensive est également observée chez le patient 4. Pour ce qui concerne le patient 3, de nombreux calculs biliaires visibles à la radio ont été extraits des canaux biliaires intra-hépatiques et extrahépatiques. L'analyse biochimique de ces calculs montre qu'ils sont constitués essentiellement de cholestérol. Une choliangographie a été réalisée chez le patient 5 et montre une cholangite sclérosante localisée, caractérisée par des conduits biliaires intra-hépatiques gauches irréguliers présentant une alternance de zones de sténose et des zones de dilatation sacculaire. 2- Composition de la bile hépatique La composition en lipides biliaires de la bile hépatique a été étudiée à partir de prélèvements obtenus par radioscopie du duodénum (patients 2 et 3) ou à partir du tube T (patients 5 et 6). Les résultats obtenus chez les patients non-traités ou sous traitement à l'AUDC sont présentés respectivement dans les tableaux II et III ci-dessous. Tableau II : Composition en lipides biliaires de la bile hépatique chez les patients non-traités. Paramètres mesurés Valeurs Cas 2 Cas 5 Cas 6 normales * Classes de lipides biliaires (moles %) Sels biliaires (BS) 72. 6 72. 1 57.3 94. 2 Phospholipides (PL) 20. 6 18. 7 25. 3 1.4 Cholestérol (CH) 7. 8 9. 1 17. 4 4. 5 Index de saturation Cholestérol 1.1 1.98 20.9 ND (ISC) Rapports lipidiques CH/PL 0. 38 0. 49 0. 70 3. 21 PL/BS 0. 29 0. 26 0. 44 0. 01 CH/BS 0.10 0. 13 0. 30 0. 05 Concentration en PL 15. 6 6. 39 1. 77 0.30 biliaires * Les valeurs normales sont issues de Lamont et al., (Progress in Liver Diseases, Boyer et al. Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphie, 1992, 165-191). Tableau III : Composition en lipides biliaires de la bile hépatique chez les patients sous traitement à l'AUDC Paramètres mesurés Valeurs Cas 5 Cas 6 normales* Classes de lipides biliaires (moles %) Sels biliaires (BS) 72. 6 47. 5 72 Phospholipides (PL) 20. 6 35. 7 19. 7 Cholestérol (CH) 7.8 16.8 8. 2 Index de saturation Cholestérol 1. 1 4. 0 1. 8 (ISC) Rapports lipidiques CH/PL 0. 38 0. 47 0.42 PUBS 0.29 0.75 0.27 CH/BS 0.10 0.35 0. 11 Concentration en PL biliaires 15. 6 7. 77 6.03 * Les valeurs normales sont issues de Lamont et al. (précité). L'analyse en microscopie des échantillons de bile montre la présence de nombreux cristaux de monohydrate de cholestérol. # Tous les échantillons de bile, fraîchement prélevés, issus de patients non-traités à l'AUDC présentent les trois caractéristiques suivantes : 1 ) un index de saturation en cholestérol (ISC) élevé, 2 ) un rapport cholestérol/phospholipides (CH/PL) élevé et 3 ) une faible ou une très faible concentration en phospholipides (PL), en comparaison avec les concentrations normales décrites (Lee et al., 1986, Gastroenterology, 90, 677-686 ; Lamont et al., précité). Chez le patient 5, l'augmentation importante du rapport cholestérol/sels biliaires (CH/BS) indique que l'hypersécrétion de cholestérol est responsable de l'augmentation de la saturation en cholestérol de la bile. Chez le patient 6, la diminution importante des rapports phospholipides/sels biliaires (PL/BS) et cholestérol/sels biliaires (CH/BS) indique que dans ce cas c'est une diminution de la sécrétion de sels biliaires qui est responsable de l'augmentation de la saturation en cholestérol de la bile. # Après traitement à l'AUDC, on observe une diminution importante de l'index de saturation en cholestérol (patients 5 et 6), liée à une augmentation de la concentration en phospholipides de la bile. En conséquence, on observe une diminution du rapport cholestérol/sels biliaires chez le patient 5, alors que les valeurs faibles des rapports cholestérol/sels biliaires et phospholipides/sels biliaires redeviennent normaux chez le patient 6. 3- Analyse des mutations du gène MDR3 La séquence des fragments 2,3, 4,5 et 6 obtenus par RT-PCR a été analysée et les mutations observées sont les suivantes : # Insertion Chez les patients 2, et 3, on détecte l'insertion d'un seul nucléotide en position 1327 de l'exon 12, sous la forme d'une mutation hétérozygote. Cette mutation entraîne une modification de la phase ouverte de lecture au niveau du codon 443 qui entraîne l'apparition d'un codon stop prématuré et la production d'une protéine tronquée de 446 acides aminés. # Mutation faux-sens Une mutation faux-sens au niveau du codon 320 de l'exon 9 (Ser320 (TCC) ->Phe32o (TTC), nucléotide 959 T->C) est présente à l'état homozygote dans des individus malades indépendants issus de familles non-consanguines (patients 1 et 4). En revanche, les individus non-malades de ces deux familles sont hétérozygotes pour cette substitution. Cette mutation n'est pas détectée sur chacun des allèles de 63 témoins indépendants (126 chromosomes) ce qui démontre que cette mutation ne correspond pas à un polymorphisme du gène MDR3. Une mutation faux-sens au niveau du codon 175 de l'exon 6 (Thr175 (ACG) ->Val175 (GCG), nucléotide 523 A->G) est présente à l'état hétérozygote chez le patient 5. Cette mutation n'est pas détectée sur chacun des allèles de 51 témoins indépendants (102 chromosomes) ce qui démontre que cette mutation ne correspond pas à un polymorphisme du gène MDR3. Le séquençage des fragments amplifiés à partir de l'ADN génomique confirment l'homozygotie des patients 1 et 4 pour la mutation S320F, l'hétérozygotie des patients 2 et 3 pour la mutation 1327insA et l'hétérozygotie du patient 5 pour la mutation T 175 V. La digestion des fragments amplifiés par des enzymes de restriction confirme la présence de la mutation S320F chez le patient 1 (transition T->C homozygote) et chez les membres de la même famille (transition T->C hétérozygote), ainsi que l'absence de cette mutation chez des individus normaux non-apparentés. Aucune mutation n'a été détectée dans les exons 6, 9 et 12 du patient 6, qui présente vraisemblablement une mutation au niveau du promoteur. REVENDICATIONS 1 ) Procédé de dépistage d'un syndrome hépatique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la détection, à partir d'un échantillon d'acide nucléique extrait de cellules mononucléées du sang périphérique, d'au moins une mutation hétérozygote du gène MDR3 et/ou d'une mutation homozygote n'abolissant pas l'expression de la protéine exprimée par ledit gène, à activité de transporteur de la phosphatidylcholine, chez des sujets adultes associant une microlithiase biliaire cholestérolique et une cholestase intra-hépatique. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite mutation est située dans l'exon 6 et/ou dans l'exon 9 et/ou dans l'exon 12. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ladite mutation est sélectionnée dans le groupe constitué par une mutation dans l'exon 6 au niveau du nucléotide 523, une mutation dans l'exon 9, au niveau du nucléotide 959 et une mutation dans l'exon 12 au niveau du nucléotide 1327. 4 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la mutation située au niveau du nucléotide 523 est une mutation hétérozygote faux-sens A/G (ACG/GCG), conduisant à la mutation en acide aminé T175V, la mutation située au niveau du nucléotide 959 est une mutation homozygote faux-sens C/T (TCC/TTC), conduisant à la mutation en acide aminé S320F et la mutation située au niveau du nucléotide 1327 correspond à l'insertion d'une adénine (1327insA). 5 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend : - une première étape d'amplification d'un fragment d'acide nucléique, dans lequel l'une au moins desdites mutations est susceptible d'être observée, à partir des acides nucléiques extraits de cellules mononucléées du sang périphérique, à l'aide d'au moins une amorce sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces présentant les séquences SEQ ID NO:à SEQ ID NO: 13 et - une deuxième étape de détection de la présence d'au moins l'une desdites mutations, à partir du ou desdits fragments d'amplification obtenus. 6 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la première étape d'amplification consiste en une amplification PCR directe d'au moins l'un des exons 6,9 et 12 de l'ADN génomique avec les amorces suivantes localisées dans les régions introniques flanquantes : - amorces SEQ ID NO:1et SEQ ID NO:2, qui permettent d'amplifier un fragment de 321pb couvrant l'exon 6, - amorces SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4, qui permettent d'amplifier un fragment de 210 pb couvrant l'exon 9, et - amorces SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6, qui permettent d'amplifier un fragment de 154 pb couvrant l'exon 12. 7 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la première étape d'amplification consiste en une amplification RT-PCR des ARNm par deux PCR imbriquées, à l'aide de deux paires d'amorces, sélectionnées dans le groupe constitué par les paires suivantes : - SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8 - SEQ ID NO:9 et SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO:11et SEQ ID NO:10 - SEQ ID N0:12 et SEQ ID NO:10 et - SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 10. 8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la deuxième étape de détection de la présence d'au moins l'une desdites mutations à partir du fragment amplifié, est réalisée selon le cas, par l'une des méthodes suivantes : séquençage, restriction enzymatique ou techniques de type PCR/PCR/LDR. 9 ) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de détection est effectuée par digestion du fragment d'amplification de 210 pb avec l'enzyme Hinf.I 10 ) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de détection est effectuée par digestion du fragment d'amplification de 210 pb avec l'enzyme BamHI. 11 ) Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour l'évaluation du risque d'apparition d'un syndrome associant une cholestase intra-hépatique et une micro lithiase biliaire cholestérolique dans les familles à risque de lithiase cholestérolique et/ou ayant des anomalies biologiques hépatiques inexpliquées. 12 ) Utilisation des amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1à SEQ ID N0:13 pour le dépistage d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3. 13 ) Kit pour le dépistage d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1à SEQ ID NO: 13. 14 ) Kit pour l'évaluation du risque d'apparition d'un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3 dans une population à risque, caractérisé en ce qu'il comprend outre deux amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ iD NO :1 à SEQ ID NO :13, des réactifs pour doser le cholestérol et les phospholipides biliaires. 15 ) Utilisation de l'acide ursodésoxycholique pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un syndrome associant une microlithiase biliaire cholestérolique, une cholestase intra-hépatique et au moins une mutation du gène MDR3.