FR 2816411 A1 20020510 FR 0014143 A 20001103 MOYENS DE DETECTION DE LA TRANSFORMATION PATHOLOGIQUE DE LA PROTEINE APP ET LEURS APPLICATIONS L'invention se rapporte à des moyens de détection de la transformation pathologique de la protéine APP (pour Amyloïd Precursor Protein) dans des maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. Elle vise plus particulièrement une méthode de détection d'une telle transformation, les kits pour sa mise en oeuvre, ainsi que ses applications thérapeutiques et diagnostiques. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui conduit à la perte des fonctions intellectuelles et donc à l'installation progressive et irréversible d'une démence. L'avenir de cette maladie s'annonce redoutable avec le vieillissement de la population car le facteur de risque majeur est l'âge. 99% des formes observées sont non-familiales. Pour les formes familiales autosomiques dominantes, les mutations pathologiques sont observées sur le gène APP du chromosome 21, et sur les gènes PSIet PS2 (présénilines 1 et 2) qui se trouvent sur les chromosomes 14 et 1. Deux processus dégénératifs caractérisent la maladie d'Alzheimer. L'amyloïdogénèse, qui résulte d'un dysfonctionnement de la protéine APP, et la dégénérescence neurofibrillaire (DNF), qui correspond à l'accumulation de protéine tau dans les cellules nerveuses. Le dysfonctionnement de la protéine APP est à l'origine même de la pathologie Alzheimérienne, mais la cause précise de la dégénérescence et de la mort neuronale ne sont pas encore connues. Deux hypothèses ont été émises. Selon la première hypothèse, qui est la plus répandue, le produit de clivage de l'APP, le peptide A(3, de 39 à 43 résidus d'acides aminés, est neurotoxique et responsable de la réaction en chaîne de DNF. Selon la seconde hypothèse, la dégénérescence résulterait d'une perte ou d'un gain de fonction de l'APP, qui se traduirait parallèlement et secondairement par une accumulation du peptide Ap sous forme de plaques amyloïdes. La modélisation de l'amyloïdogénèse est possible grâce aux souris transgéniques avec les gènes mutés APP ou APP+PS1. Ces souris développent progressivement des plaques amyloïdes, mais on n'observe pas de DNF. Ces souris sont déjà utilisées par l'industrie pharmaceutique pour tester des molécules capables d'inhiber la formation du peptide Ass. La stratégie principale consiste à bloquer les enzymes responsables de la production du peptide Ass. Les enzymes de ce type connues à ce jour sont les secrétases ss et y (Réf. 1). Des molécules se fixant sur les dépôts amyloïdes sont également testées. Il s'agit de casseurs de structures ss (ss sheet breakers) ou anti- amyloïdes (2). La vaccination contre le peptide amyloïde est également en cours d'évaluation. A l'heure actuelle, aucune modification significative de la protéine APP dans le tissu humain affecté par la maladie d'Alzheimer n'a été découverte, autre que l'augmentation de la production du peptide Ass 1-42, l'augmentation du rapport Ass 1-42/1-40 et son agrégation sous forme de dépôts insolubles et de plaques amyloïdes. Une modification de la sécrétion de la partie N- terminale de l'APP, nommée sAPP, a également été signalée dans des essais in vitro (3). Les recherches menées par les inventeurs les ont amenés à observer des modifications significatives de la protéine APP qui ne sont pas liées à la détection des peptides Ass, et qui sont spécifiquement détectables dans le tissu humain Alzheimérisé et dans les modèles expérimentaux Ces modifications sont mises en évidence dans le tissu humain (système nerveux central, liquides périphériques) affecté par la maladie d'Alzheimer ainsi que dans d'autres pathologies neurodégénératives avec dysfonctionnement de l'APP. Des anomalies similaires sont retrouvées en grande quantité chez les souris transgéniques avec les mutations pathologiques sur l'APP ou APP mutée + préséniline 1 mutée, et absolument pas chez les souris normales ou transfectées avec une seule copie de gène normal humain de l'APP (wild type ou sans mutation). Les modifications significatives sont à la fois qualitatives et quantitatives et elles sont détectées en amont de la production du peptide Ap. L'invention vise donc l'utilisation de ces modifications comme marqueurs dans une méthode de détection de la transformation pathologique de APP, notamment dans un processus neurodégénératif. Elle vise l'application de ces marqueurs notamment pour le diagnostic et le suivi d'un processus neurodégénératif, la mise au point de modèles animaux et le criblage de médicaments efficaces contre de telles pathologies. L'invention vise également une méthode d'évaluation desdites pathologies comprenant la définition d'un indice établi par rapport à un référentiel. La méthode pour détecter, dans un échantillon à analyser, des modifications pathologiques de la protéine APP est caractérisée en ce qu'on utilise des marqueurs constitués par des fragments cataboliques de la partie carboxy terminale de l'APP, appelés ci-après fragments APP-Cter, spécifiquement modifiés dans les situations pathologiques neurodégénératives où l'APP participe à l'étiologie. Les études réalisées par les inventeurs ont montré que, de manière inattendue, les modifications concernant de tels fragments étaient directement liées aux dysfonctionnements de la protéine APP tels qu'observés dans les contextes pathologiques ci-dessus, notamment pour la maladie d'Alzheimer. On observera que les fragments en question sont des produits cataboliques de l'APP qui ont conservé la structure primaire de l'extrémité Cterminale de l'APP et seront donc reconnaissables, par un anticorps dirigé contre cette partie C-terminale de l'APP. Le terme "fragment" tel qu'utilisé dans la description et les revendications englobe donc les variants de charge et de point isoélectrique différents suite à des modifications post-traductionnelles, comme par exemple la phosphorylation et/ou la glycosylation, dans la mesure où ces variants sont reconnus par un anticorps anti-APP-C-ter comme décrit dans les exemples. Il s'agit notamment de fragments tels qu'identifiés par analyse biochimique d'un échantillon à analyser, par électrophorèse 1-D ou 2-D couplée à une immunoempreinte et révélation par un anticorps polyclonal ou monoclonal anti-APP-Cter, ou des anticorps monoclonaux anti-fragments APPCter. L'électrophorèse peut être mono et/ou bidimensionnelle. De tels fragments sont spécifiquement modifiés dans les tissus pathologiques. On note la diminution, voire la disparition de certains de ces fragments avec la progression du processus neurodégénératif. L'invention vise spécialement l'application de cette méthode au diagnostic du processus d'Alzheimérisation et, à ce titre, vise l'utilisation comme marqueurs de dysfonctionnements de l'APP, de 5 fragments majeurs qui sont modifiés au cours de l'Alzheimérisation, dont les poids moléculaires déterminés par électrophorèse monodimensionnelle (1-D) sont de 14,5 ; 12 ; et 9,5 kDa. Les variants qui disparaissent correspondent à la bande électrophorétique 1-D de 14,5 kDa, dédoublée en deux composantes de 15 kDa et 14,5 kDa en 2-D, avec des variants isoélectriques de points isoélectriques de 5,13 (représenté par 15/5,13) et 15/5,37 pour la composante de 15 kDa et de 14,5/5,64 et 14,5/5,95 pour l'autre composante. Il y a également disparition de fragments correspondant à la bande électrophorétique de 13,5 kDa qui est dédoublée en deux composantes de 13,5 et lé,7kDa, avec les variants isoélectriques 13,5/4,94 et 12,7/4,8 ; Des fragments d'intérêt sont également modifiés en phase précoce de la maladie d'Alzheimer. Ils correspondent aux variants électrophorétiques 15/4,55 ; 14/5,2 ; 14/5,37 ; 12,7/5,45 ; 12,7/5,64 ; 10,5/5,91 ; 12,7/6,05. Ces variants sont particulièrement informatifs dans la mesure où ce sont des marqueurs précoces. Les fragments qui apparaissent au cours de l'Alzheimérisation correspondent à la bande électrophorétique 1-D de 10,5 kDa, dédoublée en deux composantes de 11 kDa et 10,5 kDa en 2-D, avec des variants isoélectriques 11/4,94 ; et 10,5/7. 5 et le fragment de 9,5 kDa et de pI 5,77. De tels fragments ne sont modifiés que dans les tissus ou cellules dits alzheimérisés ou chez des animaux transgéniques portant un gène APP muté pour exprimer le pathologie d'Alzheimer, ou portant un gène non muté, mais exprimé en très grande quantité. On notera avec intérêt que ces différences de métabolisme de la protéine APP, par rapport à des témoins, sont observées dans les modèles cellulaires neuronaux (par exemple les cellules de neuroblastome comme la souche SKNSH SY5Y), mais également dans les cellules non neuronales, comme les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian). Les échantillons à analyser utilisés dans ladite méthode comprennent donc aussi bien des tissus ou des cellules neuronales, que des tissus ou des cellules non neuronales, par exemple les liquides biologiques comme le sang et tout ou partie de ses éléments figurés, ce qui facilite un diagnostic précoce ou l'évaluation de facteurs de risque chez un patient. Ces tissus sont avantageusement homogénéisés ou fractionnés, par exemple par centrifugation, en vue de leur mise en oeuvre dans la méthode de détection. La méthode ci-dessus s'applique également au diagnostic de pathologies neurodégénératives voisines de la maladie d'Alzheimer, comme la démence à corps de Lewy ou les angiopathies amyloïdes. La méthode de détection définie ci-dessus permet de définir un indice de transformation de la protéine APP en protéine pathologique. L'invention vise en particulier une méthode d'évaluation d'un processus pathologique neurodégénératif dans un échantillon à analyser, par analyse immuno-chimique, comme décrit dans les exemples, caractérisé en ce qu'on affecte un indice aux fragments identifiés dans l'échantillon étudié, par rapport à un référentiel où l'indice 0 (zéro) correspond à la détection dans le tissu sain et l'indice 100 (cent) dans le tissu pathologique, qu'il soit humain, de souris transgéniques avec des mutations APP pathologiques ou de modèles cellulaires transfectés. Un tel indice présente un avantage en diagnostic et en thérapeutique. Il permet de refléter rapidement l'état pathologique. La valeur de l'indice permet en effet de déterminer s'il existe un risque de développement de la maladie d'Alzheimer. L'obtention d'un indice élevé peut aider à conforter un diagnostic clinique. En outre, dans le cadre d'un traitement thérapeutique basé sur le métabolisme de l'APP ou sa correction, les modifications d'un tel indice permettront de suivre l'effet du traitement. Il constitue une référence permettant de comparer l'effet de différentes molécules contre la maladie d'Alzheimer ou autres pathologies neurodégénératives, une chute de l'indice démontrant l'intérêt thérapeutique des molécules testées. L'utilisation d'un tel indice présente également un intérêt pour disséquer les évènements étiologiques précoces responsables de la maladie, et aboutir à la découverte de nouvelles molécules efficaces, ainsi qu'au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. On notera également que cet indice peut être utilisé pour ralentir ou même pour induire une dégénérescence pour établir de nouveaux modèles expérimentaux. Cet indice peut aussi fournir des informations permettant de provoquer une dégénérescence ciblée dans le cadre d'actions thérapeutiques nécessitant de provoquer la disparition d'une population cellulaire précise. La méthode de détection selon l'invention est avantageusement utilisable pour établir et valider des modèles expérimentaux, cellules ou modèle animal de la maladie d'Alzheimer. Les modèles pertinents reproduiront les modifications des fragments APP-Cter tels qu'observés dans le tissu humain, comme décrit dans les exemples. Elle permet également d'aider à la mise en place d'essais thérapeutiques efficaces en améliorant la sélection des patients. Une autre application de grand intérêt concerne le criblage pharmacologique pour la sélection de médicaments efficaces contre les pathologies neurodégénératives de type Alzheimer. Ainsi, les molécules sélectionnées sont caractérisées en ce qu'elles sont capables de modifier le profil Alzheimer évoqué ci-dessus, en conduisant à une diminution voire à une disparition des marqueurs APP-Cter. L'invention permet ainsi de réaliser un criblage pharmacologique rapide et pertinent de molécules d'intérêt. L'invention vise également un kit de diagnostic de la transformation pathologique de APP, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre la région carboxy-terminale de l'APP et/ou un ou plusieurs anticorps monoclonaux anti-fragment carboxy-terminal de l'APP. Ces anticorps sont utilisables dans un dosage immuno-chimique par exemple en ELISA, Western blot, dot blot. Les kits selon l'invention renfermeront donc avantageusement les éléments nécessaires pour la réalisation de tels dosages. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, avec référence aux figures 1 à 10, qui représentent, respectivement, - les photos d'empreintes Western de . tissu cérébral humain (1-D) (figures 1A et 1B), . tissu cérébral humain (2-D) (figures 2A à 2C), . tissu cérébral de souris transgéniques (figures 3A et 3B), . tissus cérébral de souris (2-D) (figure 4), - une synthèse des profils 2-D de fragments APP-Cter dans les souris, le tissu cérébral humain et les lymphocytes humains (respectivement figures 5A, SB, 5C), - les photos d'empreintes Western de . lignées CHO transfectées (figure 6), . modèle cellulaire de type neuronal (figure 7), . lymphocytes humains (figure 8), - la caractérisation des fragments APP-Cter avec un anticorps polyclonal anti- Ap-N-terminal (figure 9), et - l'indice de transformation pathologique (figure 10). MATERIELS ET METHODES Anticorps Production de l'anticorps polyclonal APP-Cter-C17 Un anticorps polyclonal dirigé contre la partie carboxy-terminale de l'APP a été produit selon le protocole d'immunisation décrit par Vaitukaitis et al, (4). Des lapins New Zealand ont été immunisés avec un peptide comprenant les 17 derniers acides aminés de la séquence de l'APP humaine, correspondant à son extrémité carboxy-terminale. Le peptide a été couplé par covalence à l'ovalbumine. 200 g d'immunogène ont été injectés toutes les deux semaines. Avant l'injection, la solution d'immunogène a été complétée avec 1 volume d'adjuvant complet de Freund lors du 1er rappel et lors des rappels suivants, avec de l'adjuvant incomplet de Freund à la place de l'adjuvant complet. Le sang a été prélevé une semaine après la 4ème injection et une semaine après chaque injection suivante. Le sérum pur a été obtenu après coagulation du sang et centrifugation 10 min à 2000g. On a ajouté au sérum pur 1 volume de glycérol et on a conservé le mélange à -20 C. Purification de l'anticorps APP-Cter-C17 1 mg de peptide utilisé pour l'immunisation a été couplé à une matrice NHSFast Flow Sepharose (Amersham-Pharmacia Biotech) suivant les instructions du fabricant. On a mis en contact la matrice couplée avec 200 microgrammes de sérum pur dilué dans un volume de tampon de liaison 2X (50 mM Tris pH 8,0 ; 300 mM NaCI et 0,1 % (v/v) de Tween-20) et on a agité doucement jusqu'au lendemain à 4 C. On a fait passer la totalité des solutions sur une colonne PD-10. On a lavé la matrice avec 10 volumes de tampon de liaison. L'anticorps purifié a été élue avec 2 volumes de tampon acétate à pH 3,5. La concentration en protéine a été déterminée à l'aide du kit de quantification de protéine BCA de Pierce. Echantillons Echantillons de tissu cérébral humain et murin Les échantillons de tissu cérébral, obtenus après autopsie ou biopsie et conservés à -80 C, ont été disséqués à l'aide d'un atlas anatomique, puis homogénéisés avec un potter en Téflon@ dans 10 volumes de tampon de lyse 1D IX (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ; 4mM EDTA ; 5% (p/v) de SDS, 10 % (v/v) de glycérol, 2 % (v/v) de ss-mercaptoéthanol et 0,05% Bleu de Bromophénol) pour une analyse 1-D. Les échantillons ont été portés à 100 C pendant 10 minutes puis maintenus à -80 C jusqu'à leur utilisation. Pour une analyse 2-D, le tissu est homogénéisé dans un tampon Tris-HCl 10 mM pH 6,8, puis complémenté avec un volume de tampon 2-D 2X (14M urée ; 4M thiourée ; 0,4% Pharmalytes 3-10 (p/v) ; 8% (v/v) Triton X-100 ; 10 mM de dithiothréitol ; 0,1% Bleu de Bromophénol) et stocké à -80 C jusqu'à utilisation. Pour les échantillons de tissu cérébral de rongeur, le cerveau a été prélevé rapidement après la mort de l'animal et traité de la même manière que les échantillons humains. On a préparé des échantillons de tissu cérébral murin en suivant le même protocole que pour les échantillons de tissu cérébral humain. On a utilisé des échantillons de tissu cérébral de souris non transgéniques et de souris transgéniques avec le gène APP humain de type sauvage (APPwt) ou le gène humain APP muté aux codons 670 et 671 (APPsw). Cette mutation de l'APP est liée à une forme familiale de la maladie d'Alzheimer, appelée mutation suédoise(5). D'autres échantillons ont été également utilisés, comprenant des souris non transgéniques, et différentes lignées de souris transgéniques avec le gène APPwt et APPsw. On a également utilisé un échantillon de tissu cérébral murin qui correspondait à la souris transgénique développée par Hsiao K. et al.(6). Echantillons de tissu cérébral après fractionnement protéique Les échantillons de tissu cérébral ont été homogénéisés selon un ratio 1/10 (p/v) dans du tampon Tris-HCl 10 mM pH 6,8 puis centrifugés à 100 000 g pendant 1 heure à 4 C. Le surnageant (SI) a été conservé et le culot réhomogénéisé dans le même tampon complémenté avec 0,5 % (v/v) de Triton X- 100. Une étape supplémentaire de centrifugation a été effectuée dans les mêmes conditions. Les surnageants (SIet S2) et le culot ont été conservés à - 80 C jusqu'à leur utilisation. La fraction enrichie en fragments APP-Cter correspond à la fraction S2. Selon la technique biochimique utilisée, on a ajouté aux surnageants, au moment de l'utilisation, les tampons correspondants : volume de tampon de lyse 1-D 2X (100 mM Tris-HCl pH 6,8 ; 8mM EDTA ; 10% (p/v) de SDS ; 20 % (v/v) de glycérol ; 4 % (v/v) de P-mercaptoéthanol et 0,1% Bleu de Bromophénol) pour une étude par électrophorèse monodimensionnelle (1-D) ou 1 volume de tampon de lyse 2-D 2X (14M urée ; 4M thiourée ; 0,4% Pharmalytes 3-10 (p/v) ; 8% (v/v) Triton X-100 ; 10 mM de dithiothréitol ; 0,1% Bleu de Bromophénol) pour une étude par électrophorèse bidimensionnelle (2-D). Echantillons de cultures cellulaires CHO (hamster) ou SKNSH SY5Y (humain) Les cellules sont transfectées de manière stable avec le gène APP humain de type sauvage ou le gène APP humain portant la mutation suédoise. Le culot de cellules a été repris dans un tampon Tris-HCl lOmM pH 6,8 puis passé aux ultrasons. Avant utilisation, l'échantillon est complété avec 1 volume de tampon de lyse correspondant à l'expérience (1-D ou 2-D) 2X. Dans le cas d'une analyse 1-D, l'échantillon est porté 10 min à 100 C. Echantillons de globules blancs humains Préparation des globules blancs humains : millilitres de sang sont collectés dans des tubes EDTA (tétra-acétate d'éthylène diamine). On procède à une centrifugation à 4500 rpm (rotation par minute) pendant 15 minutes. Le plasma est éliminé. Le tube est rempli au deux tiers d'une solution de lyse des globules rouges (solution de lyse : NH4C03 0,91 mM et NH4Cl 0,132 mM). On agite délicatement le tube et il est placé au bain-marie réfrigéré à 5 C. On procède à une centrifugation à 4000 rpm pendant 15 minutes et le surnageant est éliminé. Le culot de globules blancs est rincé deux fois avec la solution de lyse suivant la même méthodologie. Le culot est ensuite égoutté et, il est soit utilisé dans les 24 heures, soit congelé à -20 C pour son transport ou son utilisation ultérieure. Le culot de globules blancs est repris dans un tampon Tris-HCl lOmM pH 6,8 puis passé aux ultrasons. Avant utilisation, l'échantillon est complété avec 1 volume de tampon de lyse 2X correspondant à l'expérience (1-D ou 2-D). Dans le cas d'une analyse 1-D, l'échantillon est porté 10 min à 100 C. Techniques Electrophorétiques Electrophorèse 1-D Les expériences ont été réalisés à l'aide du système d'électrophorèse Protean IIXi Cell (Biorad) selon les instructions du fabricant. Les électrophorèses 1-D ont été réalisées selon les protocoles décrits par Laemmli (7) pour la fabrication du gel et dans les conditions de migrations décrits par Schàgger et Von Jagow (8). Le gel de concentration contient 4% d'acrylamide et le gel de séparation utilisé contient 16,5% d'acrylamide. La migration se fait en tampon Tris-Tricine. Le programme de migration utilisé est le suivant : 1h à 30V constant puis 16h à 45mA . On a chargé une quantité équivalente de protéine dans chaque puit (environ 100 g/puit). Electrophorèse 2-D 1ère dimension La première dimension ou focalisation est réalisée à l'aide des bandelettes de gels pré-coulés nommées IPG-Strip couvrant un gradient de pH 3-10, selon les instructions du constructeur. Le matériel utilisé pour l'isoélectrofocalisation est le système IEF Protean Cell (Biorad) . Une quantité de 250 g de protéines est complétée avec du tampon de réhydratation IX (7M urée, 2M thiourée, 4% triton X100; 0,5% CHAPS ; % (p/v) de Pharmalytes pH 3-10; lOmM DTT ; 0,01% orange G) pour avoir 400 l à déposer. Les 400 l d'échantillons sont déposés sur les bandelettes placées dans l'appareil. On laisse réhydrater passivement 1 h puis activement lOh à 50V/bandelette puis on lance le programme selon les instructions du fabricant. Après la focalisation, les bandelettes sont utilisées ou conservées à - 80 C. 2ème dimension Avant utilisation, les bandelettes sont équilibrées pendant 30 minutes dans un tampon pour 1-D (50 mM Tris pH 6,8 ; 10 % (v/v) de glycérol ; 2 % (v/v) de ssmercaptoéthanol ; 2 % (p/v) de SDS ; 0. 05% (p/v) bleu de bromophénol) puis déposées sur le haut d'un gel de séparation pour 1-D de 16,5% acrylamide. On recouvre la bandelette avec une solution d'agarose 1% (p/v). La suite est identique à une simple électrophorèse 1-D. Transfert sur membrane et Immunoempreinte Transfert Le transfert a été effectué en utilisant le système de transfert semi-sec Pharmacia LKB multiphor en suivant les instructions du fabricant (Amersham-Pharmacia Biotech). Les protéines ont été transférées à 0,8 mA/cm2 sur une membrane de nitrocellulose Hybond ECL (PharmaciaAmersham). Immunoempreinte La membrane est incubée 60 min. dans du tampon (Tris 15 mM pH 8,0 ; NaCl 150 mM ; % (v/v) de Tween-20) contenant 5% (p/v) de lait écrémé puis lavée avec le même tampon exempt de lait contenant 0,1% de Tween-20 au lieu de 0,5%. La membrane est incubée, 2h à température ambiante ou 1 nuit à 4 C, avec l'anticorps APP-Cter-C17 dilué au 1/2000ème (v/v) final dans un tampon d'incubation (15 mM Tris pH 8,0,150 mM NaCl, 0,1% (v/v) de Tween-20 et 3 % (p/v) de lait écrémé). La membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans le tampon d'incubation exempt de lait. La membrane est ensuite incubée, lh à température ambiante, avec une immunoglobuline de chèvre anti-lapin couplée à la peroxydase de raifort, à une dilution finale de 1/4000ème (v/v) dans du tampon d'incubation exempt de lait. La membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans du tampon d'incubation exempt de lait et les polypeptides immunoréactifs sont révélés à l'aide du kit de chimiluminescence ECL# (Pharmacia-Amersham Biotech) selon les instructions du fabricant. RESULTATS Analyse 1-D du tissu cérébral humain Des échantillons de tissu cérébral humain, préparés comme décrit dans la méthodologie pour une analyse 1-D, ont été chargés et analysés. La séparation électrophorétique a eu lieu en condition Tris-Tricine comme décrit. Des marqueurs de poids moléculaires calibrés (Biorad) ont été déposés en parallèle afin de déterminer la masse moléculaire des fragments grâce au logiciel ImageMaster 1-D Elite (Amersham-Pharmacia Biotech). Un transfert des protéines séparées par électrophorèse et une immunoempreinte avec l'anticorps APP-Cter-C 17 ont été réalisés comme décrit. Les résultats sont représentés sur la figure 1, Al. Dans le tissu cérébral humain témoin, cinq bandes nommées A, B, C, D et E de masses moléculaires apparentes A 14,5 kDa ; B 13,5 kDa ; C 12 kDa ; D 10,5 kDa ; E 9,5 kDa sont révélées par l'anticorps polyclonal APP-Cter-C17. Elles sont détectées aussi bien dans la biopsie de tissu cérébral humain que dans le tissu cérébral post-mortem d'un sujet témoin (figure 1, A2 ; piste1: biopsie ; pistes 2 et 3 : Le délai post-mortem est indiqué en heure pour chacun des échantillons. On peut noter que le profil des fragments n'est pas modifié au cours du délai post-mortem. Les 5 fragments ne résultent donc pas d'une activité enzymatique catabolique pouvant se produire après la mort. La figure 1B représente l'analyse de la pathologie tau selon la classification de Delacourte et al, 1999 (figure 1, B1) et des fragments APP-Cter (figure 1, B2) chez un sujet témoin (Pistes 1 et 2) et deux patients atteints de la maladie d'Alzheimer (pistes 3 à 6). Deux régions cérébrales ont été étudiées: l'hippocampe (Hip, pistes 1,3 et 5) et le cortex occipital (Oc, pistes 2,4 et 6). On note une diminution des fragments APP-Cter au cours de la maladie. Cette disparition est corrélée à la sévérité de l'atteinte neurodégénérative. En effet, on peut noter que les fragments APP-Cter disparaissent (figure 1, B2) dans les régions touchées par la pathologie tau, visualisée par la présence du triplet de protéines tau pathologiques de 69, 64 et 60 kDa (figure 1, Bl) (Delacourte et al, (9)). Analyse 2-D du tissu cérébral humain L'échantillon de tissu cérébral humain utilisé pour l'analyse 2-D est la fraction S2 obtenue par fractionnement protéique comme indiqué dans le mode opératoire. Les résultats sur 3 patients sont présentés sur la figure 2 (A à C) - un patient témoin, sans lésions cérébrales de type Alzheimer (Stade 0 de Delacourte et al, (9)) (figure 2A) - un patient infraclinique, au stade 3 de Delacourte et al (9), mais avec une amyloïdogénèse bien développée (figure 2B) - un patient au tout début de la phase clinique de maladie d'Alzheimer, au stade 6 de Delacourte et al (9) (figure 2C). Les flèches indiquent les spots détectés par l'anticorps polyclonal APP-CterC17. Leurs masses moléculaires sont similaires à celles observées sur les immunoempreintes 1-D. Les points isoélectriques sont compris dans la gamme de pH de 4,5 à 7,5. On peut noter une modification de la répartition des spots au cours du développement de la maladie d'Alzheimer. Les patients à un stade plus avancé de la maladie d'Alzheimer n'ont pas pu être étudiés par cette approche, puisque les fragments ne sont plus détectables. Caractérisation des variants APP-Cter modifiés au cours de la maladie d'Alzheimer. Les variants APP-Cter détectés par analyse 2D sont représentés schématiquement (figure 5) sur une grille calibrée en deux dimensions, l'axe des Y représentant les masses moléculaires et l'axe des X les points isoélectriques. L'ensemble a été étalonné avec des témoins internes de masse moléculaire et de point isoélectrique. Les témoins de points isoélectriques sont la gamma-énolase (47/4,94), l'alpha-actine (42/5,29) et l' alpha-énolase (47/6,99). Les points isoélectriques à 5,54 et 8,05 sont des standards internes du tissu cérébral. Le schéma de la figure 5B représente la superposition des profils 2D des fragments APP-Cter détectés avec l'anticorps APP-Cter-C 17 dans le tissu cérébral humain d'un sujet témoin et de patients Alzheimer au stade infraclinique de la maladie et au début du stade clinique de la maladie d'Alzheimer (voir figure 2). Les spots, c'est à dire les différents variants isoélectriques de 2-D, observés à la fois dans le tissu sain et pathologique sont représentés par des cercles vides. Les spots spécifiques du tissu sain sont représentés par des cercles avec fond hachuré et ceux spécifiques du tissu Alzheimérisé par un fond noir. Les valeurs des masses moléculaires et des points isoélectriques des spots modifiés au cours de la pathologie Alzheimer sont reportés dans le tableau 1. Analyses 1-D du tissu cérébral murin Afin de mieux caractériser la spécificité du catabolisme de l'APP humain, les produits APP-Cter ont été analysés (de la même manière que dans le tissu cérébral humain) chez un rat et des souris non transgéniques mais également chez des souris transgéniques pour le gène de l'APP humain sauvage (APPwt) ou portant la mutation suédoise (APPsw). La figure 3A représente l'immunomarquage des fragments APP-Cter des souris témoins, et transgéniques, comparé au profil du tissu cérébral humain. Des dépôts identiques d'homogénats de tissu cérébral ont été déposés dans chaque puit d'électrophorèse. Les fragments APP-Cter ont été détectés avec l'anticorps polyclonal APP-Cter-C17. La piste 1 de la figure 3 correspond à l'analyse de la souris non transfectée (contrôle négatif), la piste 2 correspond à la souris avec une seule copie du gène humain APPwt, la piste 3 correspond à la souris transgénique avec le gène muté humain APPsw et la piste 4 correspond à du tissu cérébral humain témoin. Les flèches indiquent les masses moléculaires des bandes électrophorétiques détectées. On peut noter que les souris témoins ou avec une seule copie du gène APPwt synthétisent 4 fragments APP-Cter, tandis que les souris avec le gène APPsw et le tissu cérébral humain normal synthétisent 5 fragments APP-Cter, de masse moléculaire de 14,5 ; 12 ; et 9,5 kDa. Ces résultats ont été vérifiés sur 5 souris non transgéniques, 2 souris transgéniques avec le gène APP humain de type sauvage et 5 souris transgéniques avec le gène APPsw. On rapporte sur la figure 3B, piste 1 à 3, les résultats de l'immunoempreinte avec l'anticorps APP-Cter-C 17 sur différentes lignées de souris transgéniques APPsw (fig 3B piste 1 à 3) parmi lesquelles on trouve (piste 3) la lignée APPsw de référence décrite par Hsiao et al., (6). Les souris transgéniques APPsw possèdent dont systématiquement un profil particulier, tel que décrit ici. Analyse 2-D des fragments APP-Cter du tissu cérébral de souris On opère comme décrit pour le tissu cérébral humain (figure 4). Il est ainsi possible de caractériser les différents variants observés chez les souris Témoin (figure 4A), APPwt (figure 4B) et APPsw (figure 4C). On peut noter l'augmentation de l'expression des variants pour les souris APPsw et une modification du profil pour certains variants (figure 4). Les valeurs de masse moléculaire et de point isoélectrique sont reportées dans la figure 5A et le tableau 2. Analyse 1-D des modifications de l'APP humain dans des modèles cellulaires - modèles non neuronaux Des cellules CHO (Chinese Hamster ovarian), transfectées de façon stable avec le gène APP humain de type sauvage (APPwt) ou le gène APPsw, ont été analysés selon le protocole décrit. Les résultats de la figure 6 montrent les fragments APP-Cter des cellules CHO, comparativement au tissu cérébral de souris trangéniques avec le gène APPwt ou APPsw. Dans les cellules CHO APPwt ( figure 6 piste 3), 6 bandes de masses moléculaires apparentes 16 ; 13,5 ; 10,5 et 9,5 kDa sont détectées. Les bandes majeures sont les bandes à 16 ; 13,5 et 9,5 kDa. Dans les cellules CHO APPsw ( figure 6 piste 4), on observe une diminution du signal global surtout des fragments de 16 ; et 9,5 kDa. La comparaison avec les homogénats de tissu cérébral de souris transgénique APPwt (piste 1) et APPsw (piste 2) indique que les bandes détectées dans les CHO sont communes à celles du tissu cérébral, excepté pour la bande à 16 kDa. - Modèles neuronaux Des cellules de neuroblastome humain (SKNSH-SY5Y) transfectées, de façon stable, avec le gène APPsw ont été analysées comparativement à des cellules non transfectées. Les résultats sont représentés sur la figure 7. Dans les cellules non transfectées, le signal APP-Cter est très faible, voire inexistant (figure 7 : En revanche, 5 fragments sont parfaitement identifiables dans les cellules SKNSH non-différenciées, transfectées avec APPsw (figure 7 : APPsw) Analyse des fragments APP-Cter des globules blancs humains Des culots de globules blancs humains ont été préparés selon un protocole standard utilisé en laboratoire d'analyse (médical ou hospitalier). Ces culots ont été traités comme décrit et analysés par immunoempreintes avec l'anticorps APP-Cter-C17. Les résultats sont rapportés sur la figure 8A où les pistes 1 à 5 correspondent aux témoins et les pistes 6 à 11à des échantillons provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le sexe et l'âge sont mentionnés (figure 8A : sexe.âge). L'anticorps APP-Cter-C17 détecte trois fragments de masse moléculaire de 14 kDa, 10,5 kDa et 9,5 kDa. Une analyse 1-D comparative entre globules blancs de sujets témoins et de patients diagnostiqués maladie d'Alzheimer a permis de mettre en évidence (comme dans l'étude du tissu cérébral humain) une diminution des fragments APP-Cter dans les globules blancs des malades (pistes 6 à 11) par rapport aux globules blancs de témoins (pistes 1 à 5). Les variants des fragments APP-Cter des globules blancs ont également été analysés en 2-D (figure 8B). Les valeurs de masse moléculaire et de point isoélectrique de chaque spot détecté ont été rapportées sur la figure 5C et le tableau 2. Caractérisation des fragments APP-Cter avec différentes sondes immunologiques Un anticorps dirigé contre la partie N-terminale du peptide Ab permet de localiser le fragment de coupure de la béta-secrétase. Il s'agit de l'anticorps FCA18 (Ancolio et al, (3)). Le fragment 14 kDa des globules blancs est détecté par cet anticorps (figure 9), indiquant qu'il s'agit du fragment APP-Cter produit par la béta secrétase (figure 10B). Par ailleurs, l'interrogation des bases de données (SwissProt par exemple) indique que le fragment APP-Cter de masse moléculaire de 9,5 kDa (figure 9) et de point isoélectrique 6,99 correspond au fragment alpha secrétase, comme représenté dans la figure 10B. Les deux fragments APP-Cter majeurs des globules blancs qui sont modifiés au cours de la maladie d'Alzheimer ont donc été identifiés (figure 10B). Récapitulatif Des variants particulièrement informatifs pour la mise en #uvre de l'invention sont rapportés dans les tableaux récapitulatifs 1 à 3. Ces différents variants constituent des marqueurs de grand intérêt pour détecter les modifications pathologiques de l'APP, aussi bien dans les tissus neuronaux que dans des lymphocytes. La détection des fragments APP-Cter permet la définition d'un indice de transformation pathologique, applicable au tissu humain neuronal (figure 10A: tissu cérébral humain) ou non-neuronal (figure 10B: lymphocytes humains), ainsi qu'aux modèles expérimentaux, animaux (figure 10C: tissu cérébral de souris transgénique APPsw et wt) ou cellulaires, neuronaux (figure 10D: cellules de neuroblastome) ou non-neuronaux (cellules CHO). Cet indice varie de 0 (tissu sain) à 100% (tissu pathologique Alzheimérisé) (figure 10). Références 1. De Strooper B, Konig G (1999) Alzheimer's disease. A firm base for drug development [news] [comment]. Nature, 402,471-2. 2. Sigurdsson EM, Permanne B, Soto C, Wisniewski T, Frangione B (2000) In vivo reversal of amyloid-beta lesions in rat brain. J Neuropathol Exp Neurol, 59, 11-7. 3. Ancolio K, Dumanchin C, Barelli H, Warter JM, Brice A, Campion D, et al. (1999) Unusual phenotypic alteration of beta amyloid precursor protein (betaAPP) maturation by a new Val-715 --> Met betaAPP-770 mutation responsible for probable early-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 4119-24. 4. Vaitukaitis J, Robbins JB, Nieschlag E, Ross GT (1971) A method for producing spécifie antisera with small doses of immunogen. J Clin Endocrinol Metab, 33, 988-91. 5. Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur J, et al. (1996) Increased amyloid-beta42 (43) brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature, 383,710-3. 6. Hsiao K, Chapman P, Nilsen S, Eckman C, Harigaya Y, Younkin S, et al. (1996) Corrélative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science, 274, 99-102. 7. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-5. 8. Schagger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 166, 368-79. 9. Delacourte A, David JP, Sergeant N, Buee L, Wattez A, Vermersch P, et al. (1999) The biochemical pathway of neurofibrillary degeneration in aging and Alzheimer's disease, Neurology, 52,1158-65. TABLEAU 1/3 Fragments APP-Cter qui disparaissent dans l'Alzheimer Points isoélectriques APP-Cter Masse Moléculaire A 15,0 kDa 5,37 5,13 14,5 kDa 5,95 5,64 B 13,5 kDa 4,94 12,7 kDa 5,90 5,29 4,80 Fragments APP-Cter spécifiques à l'Alzheimer Points isoélectriques APP-Cter Masse Moléculaire 11,0 kDa 4,94 10,5 kDa 7,5 5,35 E 9,5 kDa 5,77 Fragments APP-Cter communs aux formes précliniques et à l'Alzheimer Points isoélectriques APP-Cter Masse Moléculaire A 15 kDa 4,55 B 14,0 kDa 5,37 5,2 C 12,7 kDa 5,64 5,45 D 10,5 kDa 6,05 5,91 Fragments APP-Cter des lymphocytes humains témoins ~~~ Points isoélectriques APP-Cter Masse Moléculaire A 14 kDa 5,45 4,85 C 12,0 kDa 5,64 4,96 D 10,5 kDa 5,77 10 kDa 6,25 E 9,5 kDa 6,99 Fragments APP-Cter des lymphocytes humains Alzheimer Points isoélectriques APP-Cter Masse Moléculaire A 14,5 kDa 5,45 Fragments APP-Cter des souris trangéniaues et différents des fragments APP-Cter endogènes Points isoélectriaues APP-Cter Masse Moléculaire 18 kDa 5,91 5,77 5,54 5,37 5,20 5,13 17,5 kDa 6,20 5,91 16 kDa 6,20 5,91 5,64 5,37 5,13 4,55 14,5 kDa 6,80 6,60 6,36 6,20 5,91 13,5 kDa 6,36 6,20 13,0 kDa 6,70 6,63 6,40 6,27 6,15 5,10 C 12,0 kDa 7,50 6,20 5,91 5,37 5,00 D 10,5 kDa 7,40 5,37 E 9,5 kDa 6,75 6,63 6,50 6,25 6,15 6,00 REVENDICATIONS 1/ Méthode pour détecter, dans un échantillon à analyser, des modifications pathologiques de la protéine APP, caractérisée en ce qu'on utilise des marqueurs constitués par des fragments cataboliques de la partie carboxyterminale de l'APP, fragments APP-Cter, spécifiquement modifiés dans les situtations neurodégénératives où l'APP participe à l'étiologie. 2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits fragments sont des produits cataboliques de l'APP ayant conservé la structure primaire de l'extrémité C-terminale de l'APP et leurs variants de charge et point isoélectrique différents. 3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la détection du processus d'Alzheimer et comprend l'utilisation comme marqueurs de dysfonctionnement de l'APP, de 5 fragments de 14,5 kDa, 13,5 kDa, 12,10,5 et 9,5 kDa et des isovariants d'isoélectrofocalisation constituant ces fragments, en particulier ceux qui sont modifiés au cours des situations pathologiques chez l'homme ou dans les modèles expérimentaux. 4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les échantillons à analyser utilisés dans ladite méthode comprennent des tissus ou des cellules neuronales, ou des tissus ou des cellules non neuronales, par exemple des liquides biologiques comme le sang et tout ou partie de ses éléments figurés. 5/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'on évalue le degré de la pathologie en affectant un indice aux fragments identifiés dans l'échantillon étudié, cet indice étant attribué par rapport à un référentiel où l'indice 0 (zéro) correspond à la détection dans le tissu sain et l'indice 100 (cent), dans le tissu pathologique. 6/ Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour établir et valider des modèles expérimentaux, cellules ou modèle animal, de la maladie d'Alzheimer. 7/ Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour le criblage pharmacologique de molécules efficaces contre les pathologies neurodégénératives du type Alzheimer. 8/ Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, au diagnostic de pathologies dégénératives de type Alzheimer sur le tissu humain et sur les modèles expérimentaux. 9/ Kit de diagnostic de la transformation pathologique de APP, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé contre la région carboxy-terminale de l'APP et/ou un ou plusieurs anticorps monoclonaux antifragment carboxy-terminal de l'APP. 10/ Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend les réactifs et matériels nécessaires pour réaliser des dosages immunochimiques par exemple ELISA, Western blot, ou dot blot.