FR 2820758 A1 20020816 FR 0101790 A 20010209 PROCEDE POUR PRODUIRE DES PROTEINES RECOMBINANTES, MARQUEES PAR AU MOINS UN ISOTOPE. L'invention se rapporte à un procédé pour produire des protéines recombinantes, marquées avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants. Des améliorations récentes dans le domaine de la spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont ouvert de nouveaux champs d'application dans l'analyse fonctionnelle et structurale de nouvelles protéines découvertes dans les différents projets de séquençage de génome. Les développements les plus récents en spectroscopie RMN biologique comprennent l'amélioration de la sensibilité par le procédé de détection TROSY (Pervushin et al., 1997), l'utilisation de nouvelles contraintes telles que celles obtenues par couplage dipolaire résiduel (Tjandra and Bax, 1997) et, enfin la mesure des constantes de couplage de liaisons hydrogène (Cordier et al, 1999). Mais tous ces procédés nécessitent la disponibilité d'un matériel biologique enrichi par des isotopes stables (tels que 2H, 15N, C). Pour marquer les protéines avec des isotopes 13C &commat; 15N, D, on utilise généralement des souches de bactéries modifiées génétiquement pour exprimer la protéine d'intérêt. Ces souches sont ensuite cultivées dans des milieux contenant la source de carbone marquée au 13C et/ou la source d'azote marquée au 15N (Le Master, 1994). La souche bactérienne la plus couramment utilisée est la bactérie Escherichia Coli (E. coli) (Muchmore et al., 1989). La levure méthylotrophe Pichia pastors a également été récemment utilisée pour produire en grande quantité des protéines recombinantes marquées au"C/N (Laroche et al., 1994-Wood and Komives, 1999). Bien que l'expression hétérologue reste une approche attrayante pour produire des protéines marquées, plusieurs biomolécules ont déjà été marquées dans leurs hôtes naturels. Des organismes, aussi variés que Tolypocladium inflatum (Senn et al. 1991), Trichoderma viride (Yee et al., 1996), Streptomyces nashvillensis (Ikeda et al., 1992) et des cyanobactéries, telles que la souche Synechocystis sp. PCC 6308 (Suarez et al., 1999), la souche Synechocystis sp. PCC 6803 (Lelong et al., 1995) et Spirulina maxima (Tropis et al., 1996) ont été cultivées dans des milieux auxquels on a ajouté des précurseurs marqués, et ont été capables de produire des protéines, des peptides ou de plus petites molécules, marquées, endogènes. En outre, les hydrolysats de cellules de cyanobactéries cultivées dans un milieu contenant des précurseurs marqués, sont également utilisés pour enrichir des milieux de culture destinés soit à E. coli (Brandner et al., 1999), soit aux Leuconostoc gelidum et aux Lactococcus Lactis (Sailer et al., 1993). Ces résultats montrent que les cyanobactéries, qui peuvent être uniformément marquées lorsque cultivées sur des milieux contenant des sels marqués, pourraient comme E. coli constituer un hôte de choix pour la production de protéines marquées pour la RMN. La disponibilité des outils génétiques, tels que les plasmides, les protocoles de sélection et les procédures de transformation, permet la modification génétique de plusieurs souches de cyanobactéries dans le but de produire des protéines recombinantes (Elhai and Wolk, 1988-Porter, 1988). Le document WO 97/07216 décrit un procédé pour produire des composés deutérés, tels que des protéines, à l'aide de cultures contenant notamment du deutérium. Ce procédé consiste à cultiver un organisme pouvant produire ces composés dans un milieu deutéré, ledit organisme ayant été modifié par des techniques de génie génétique, de manière à ce qu'il produise approximativement la même quantité de composés deutérés que les organismes non modifiés, mis en culture sur des milieux classiques sans isotopes. Malheureusement, un tel procédé ne permet pas la production de substances biochimiques, notamment des protéines, marquées avec plusieurs isotopes différents, en des pourcentages importants proches des 100%. Il est encore connu du document W097/18321 un procédé pour produire une protéine recombinante uniformément marquée avec un isotope stable. Ce procédé consiste à mettre en culture, la cellule ou l'organisme recombinant dans un milieu de culture qui comprend un substrat photosynthétique ou autotrophe marqué par un isotope stable, choisi parmi les composés contenant 15Nz, 13COz et 2H201 à récupérer les cellules ou microorganismes du milieu de culture, puis à isoler la protéine avant de déterminer sa structure par RMN. Aussi, il existe le besoin de disposer d'un procédé, moins onéreux que ceux existants jusque-là, pour produire des protéines recombinantes de natures différentes, solubles ou insolubles, marquées de façon uniforme et complète, par au moins un isotope stable ou non, à partir de cellules ou à partir de microorganismes recombinants, pouvant être autotrophes et/ou phototrophes selon les conditions opératoires dans lesquelles ils sont mis, ledit procédé pouvant éventuellement utiliser le même système d'expression de protéines. L'invention a donc pour objet un procédé destiné à produire des protéines recombinantes, solubles ou insolubles, marquées de façon uniforme et complète avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants. Ce procédé consiste à mettre en culture lesdites cellules recombinantes ou lesdits microorganismes recombinants pouvant être autotrophes et/ou phototrophes sur un milieu de culture qui comprend au moins un isotope, à isoler lesdites cellules ou lesdits microorganismes cultivés, puis à purifier les protéines recombinantes à partir desdites cellules, desdits microorganisme ou du milieu de culture. Ce procédé est caractérisé en ce que lesdites cellules ou lesdits microorganismes sont mis en culture en milieu aérobie, en milieu anaérobie ou en fermentation, la culture en milieu aérobie et s'effectuant en présence de CO2 atmosphérique, la culture en milieu anaérobie et en fermentation s'effectuant en absence totale de CO2 atmosphérique pour un enrichissement en isotope 13C, et en présence d'un gaz, les cultures en anaérobie et en fermentation s'effectuant en régulant le pH, l'intensité d'une source de lumière visible et la durée d'exposition en continu des cellules ou des microorganismes à cette source de lumière. Le procédé selon l'invention présente l'avantage de réaliser un rendement de marquage supérieur ou égal à 90 % en isotopes, tels que 13e, 15N ou 2H, des protéines recombinantes, facilitant ainsi l'analyse de la structure tridimensionnelle des protéines, par le biais notamment de la spectroscopie RMN. En outre, le procédé de l'invention présente un coût financier environ dix fois plus faible que celui des procédés connus, qui utilisent notamment la souche E. coli, tout en procurant des résultats qualitatifs semblables. Par ailleurs, on peut appliquer très facilement dans le procédé de l'invention, le protocole de purification habituellement utilisé sur E. coli lorsque cette souche est utilisée dans la production de protéine recombinante. Enfin, la transposition, dans le procédé de l'invention, du système d'expression constitutif permettant d'obtenir l'accumulation de protéine pendant la croissance, présente aussi l'avantage de simplifier les étapes du procédé. En milieu anaérobie et en fermentation, le pH peut être régulé entre 7 et 10, la durée d'exposition à la lumière peut varier de 6 heures à 24 heures par jour pendant le temps de culture. La valeur de l'intensité de la source de lumière peut être inférieure à la valeur d'inhibition des cellules/microorganismes, cette valeur d'inhibition variant en fonction de la nature des cellules/microorganismes et de la nature de la source de lumière. Par exemple, la valeur de l'intensité de cette source de lumière peut varier de 33 micromoles photons/m2/s (2000 lux) à 140 micromoles photons/m2 /s (5000 lux). De préférence, le gaz est choisi parmi l'oxygène, l'hydrogène, l'azote, les gaz rares tels que l'argon. L'isotope peut être choisi parmi les composés comprenant 13C, 3C 2H 180 et leurs mélanges. Ces composés peuvent être NaHCO3, Na15NO3, D2O, 1CO2, l'ammoniaque marqué, les sels de sodium ou de potassium ou d'ammonium marqués au 13C, ou 15N et leurs mélanges. De préférence, le microorganisme est choisi parmi les microorganismes photosynthétiques recombinant modifié par l'ajout d'un plasmide replicatif ou par la modification de leur génome. Les organismes photosynthétiques peuvent être choisis parmi les algues procaryotes bleues, vertes ou rouges. L'algue peut être choisie parmi les cyanobactéries. Les cyanobactéries sont des êtres vivants du type photoautotrophes. La cyanobactérie peut notamment être la souche Anabaena sp. PCC 7120. La protéine recombinante peut être choisie parmi le domaine 23 kDa N-terminal de la gyrase B d'E. coli (dénommée ci-après GyrB (1-219)), la protéine de liaison au maltose d'E. coli. L'utilisation de composés non protonés pour fournir au microorganisme/cellule la source de carbone est un avantage lors de la production de protéine recombinante totalement perdeutérée. La souche Anabaena sp. PCC 7120 peut croître avec succès dans de l'eau lourde (D2O), et produire facilement des protéines recombinantes selon le procédé de l'invention. Le vecteur plasmidique peut être le vecteur d'expression de la souche Anabaena sp. PCC 7120, et de préférence le vecteur d'Anabaena pRL25C23K. Le procédé de l'invention a été testé en utilisant GyrB (1-219). La cellule ou le microorganisme peut être la souche Anabaena sp. PCC 7120 comprenant notamment le vecteur plasmidique pRL25C23K. L'invention va maintenant être décrite de façon plus détaillée et de façon non limitative à l'aide des dessins annexés, et dans lesquels : les figures 1A et 1B donnent respectivement une représentation schématique du vecteur d'expression, d'E. coli pBL23K et, du vecteur d'expression Anabaena pRL25C23K utilisé dans le procédé de l'invention ; - les figures 2A et 2B représentent le résultat d'une analyse comparative sur gel électrophorèse de l'expression de la protéine recombinante GyrB (1-219) selon le procédé de l'invention, obtenue dans les cellules d'E. coli (figure 2A), et dans les cellules d'Anabaena (figure 2B) ; - les figures 3A et 3B représentent le résultat d'une analyse comparative sur gel électrophorèse de la solubilité de la protéine recombinante GyrB (1-219) obtenue dans le procédé de l'invention dans les cellules d'E. coli (figure 3A), et dans les cellules d'Anabaena (figure 3B) ; - les figures 4A et 4B représentent les courbes de Densité Optique (700nm) en fonction des temps, lors d'une étude comparative, pour des cellules Anabaena en cours de croissance dans un milieu marqué et dans un milieu non marqué, à la fois en condition aérobie (figure 4A), et en condition anaérobie (figure 4B) ; - la figure 5 représente le spectre RMN HeteroNuclear Single Quantum Corrélation (HSQC) 15N de la protéine GyrB (1-219) marquée au 13C/15N obtenue en condition aérobie ; - la figure 6 représente la région méthyl du spectre RMN HSQC de la protéine GyrB (1-219) marquée au 13C obtenue en condition anaérobie ; - les figures 7A et 7B représentent le spectre RMN HNCA de la même région constituée de 14 acides aminés pour la protéine GyrB (1-219) marquée chez E. coli (figure 7A) et chez Anabaena sp. PCC 7120 (figure 7B). Dans cette description plus détaillée de l'invention, on démontre que le domaine N-terminal de la protéine Gyr B de E. coli peut être surexprimé aussi bien dans la souche Anabaena sp. PCC 7120 que dans la souche E. coli XL1-Blue, et que les spectres RMN sont comparables. Matériels et méthodes utilisés dans la mise en oeuvre de l'invention. 1) Cellules hôtes, vecteurs et produits chimiques La souche Anabaena sp. PCC 7120 est utilisée pour toutes les expériences d'expression dans le système d'expression cyanobactérien. La souche E. coli XLl-Blue (Stratagene, LaJolla, USA) est utilisée comme hôte pour le clonage et l'expression dans les cellules d'E. coli. On utilise la souche d'E. coli J53 contenant le plasmide conjugatif RP4, et la souche E. co-H HB101 contenant le plasmide pRL623 pour la conjugaison dans les cellules Anabaena. Ces différentes souches ainsi que le vecteur navette E. coli/Anabaena pRL25C ont été mis en évidence par le Dr. P. Wolk (Wolk et al., 1988) Les composés marqués suivants : NalsNO, et NaHCO3 ont été obtenus auprès de la Société ISOTEC Inc. (Miamisburg, OH, USA) ou du Groupe EURISO-TOP S. A.-CEA (Saint-Aubin, France). Les milieux marqués 13C et 15N Martek9 C-N pour le marquage de E. coli ont été obtenus auprès de la Société Martek Corp. (Columbia, MD, USA). 2) Construction du vecteur d'expression d'E. coli pBL23K Le vecteur d'expression pBL23K est obtenu à partir du vecteur pF90-Y5 (Brino et al, 1998). Le vecteur pF90-Y5 contient le gène codant pour le domaine N-terminal 43 kDa de la gyrase B d'E. coli. La séquence du domaine N-terminal 24 kDa est obtenue par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les deux amorces ADN 5'-ATGTCGAATTCTTATGACTCC-3'et ADN simple brin 5'-CGCGAAGCTTTTATTAGCCTTCATAGTGGAAGTGGTC-3', et le plasmide parent pF90-Y5 comme matrice. Le fragment amplifié est réinséré dans le plasmide parent pF90-Y5, auparavant digéré avec deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), de façon à extraire la région codant pour le domaine N-terminal 43kDa. On obtient alors le plasmide pBL23K représenté sur la figure 1A. 3) Construction du vecteur d'expression de la souche Anabaena sp. PCC 7120 Le plasmide pRL25C (Wolk et al., 1988) est linéarisé avec les enzymes de restriction NotI et BamHI, puis incubé avec l'enzyme Klenow (vendue par New England Biolabs) pour générer des extrémités à bouts francs. Le plasmide pBL23K est digéré avec l'enzyme de restriction Hind III, puis traité avec l'enzyme Klenow. Le vecteur linéarisé par Hind III est ensuite digéré avec l'enzyme de restriction SspI. Le fragment SspI/Hind III codant le promoteur tac, et la région codant GyrB (1-219) est ligué avec le grand fragment de restriction NotI-BamHI du plasmide pRL25C pour donner le vecteur d'expression pRL25C23K représenté sur la figure 1B. 4) Transformation de la souche Anabaena sp. PCC 7120 Le vecteur plasmide pRL25C23K est transféré dans E. coli HB101 contenant le plasmide pRL623 qui fournit la fonction du gène trans-action mob (Elhai and Wolk, 1988) nécessaire à la conjugaison. Le plasmide pRL623 code aussi 3 méthylases qui protègent l'ADN plasmidique de la restriction par les enzymes cyanobactériennes. Le plasmide pRL25C23K est ensuite transféré par conjugaison de la souche E. coli HB101 pRL623 vers la souche Anabaena sp. PCC 7120, comme décrit par Elhai et Wolk (1988), excepté que la conjugaison est réalisée directement sur l'agar sans l'utilisation d'aucun filtre. Après 24 heures d'incubation à 30 C et sous une intensité de lumière de 33 micromoles photons/m2/s (2000 lux), on ajoute la néomycine sous l'agar à une concentration finale de 100 g/ml. On poursuit l'incubation jusqu'à ce que les transformants soient visibles à l'oeil nu. 5) Expression et marquage au 13C/15N de GyrB (1-219) chez anabaena sp. PCC 7120 On fait pousser des cultures d'Anabaena sp. PCC 7120 contenant le plasmide pRL25C23K dans un milieu BG-11 (Castenholtz, 1988) contenant lg/1 de NaHCO3 et 300g/ml de néomycine. Les cultures sont incubées à 30 C en les agitant à 150 tours/minute sous une intensité de lumière de 33 micromoles photons/m2/s (2000 lux) dans un incubateur orbital illuminé SANYO (Fisher Scientific S. A., Elancourt, France). La croissance cellulaire est suivie quotidiennement en mesurant la densité optique à 700 nm (DO,,,). Pour le double marquage au"C/N, on inocule les cellules Anabaena à DO, = 0, 2 dans un milieu BG-11 contenant lg/1 de NaH13CO3, 1,5g/l de Nal5N03 dans un erlenmeyer sous agitation, et on les fait pousser jusqu'à ce que la densité optique à 700 nm atteigne la valeur numérique 2. L'expérience de marquage optimisée au 13C est réalisée, comme expliqué précédemment, avec seulement NaH13 C03 comme substrat marqué, et on fait pousser la culture dans un flacon sous flux constant d'azote gazeux, qualité U (Air Liquid, Strasbourg, France). On ajuste le pH de la culture à 7,5 toutes les douze heures. Dans ce cas, on récolte les cellules à une D0o=0, 5. 6) Fermentation de Anabaena sp. PCC 7120 exprimant la protéine GyrB (1-219) On réalise la fermentation dans un fermenteur de deux litres, équipé de capteurs de température, de CO2, de O2 et d'une sonde pH. Le fermenteur est illuminé avec une source de lumière visible ayant une intensité de 140 micromoles photons/m2/s (5000 lux). La culture est réalisée sous un flux constant d'argon. On maintient le pH à 8 et la température à 28OC. Pendant la fermentation, on agite la culture à 100 tours/minute. La fermentation est réalisée sur deux litres de cultures. Deux litres de BG 11 contenant lg/1 NaH13CO3 et lg/1 de Nal5NO, sont inoculés à une DO700= 0,2 avec la souche Anabaena contenant le plasmide pRL 25C23K. On contrôle les concentrations en nitrate et en carbonate dans le milieu de culture pendant toute la fermentation. On ajoute à la culture environ lg de bicarbonate de sodium marqué lorsque la concentration mesurée est de l'ordre de 0,1 g/1. On suit la croissance cellulaire en mesurant la densité optique à 700 nm deux fois par jour. On contrôle l'expression continue de GyrB (1-219) dans ces conditions par l'analyse des extraits cellulaires totaux par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). On arrête la fermentation lorsque la culture atteint la phase stationnaire à D0700=2, 1. Les cellules sont alors récupérées par centrifugation, puis sont conservées à une température d'environ-20 C. 7) Purification de GyrB (1-219) issue des cellules Anabaena On met à nouveau en suspension les cellules exprimant GyrB (1-219) dans un tampon A (contenant 50mM Tris-HCl, 10 % glycérol, 10mM ss-mercaptoéthanol, lmM EDTA, pH=8), à D0o=50, puis elles subissent deux sonications pendant deux minutes sur un appareil"Branson Sonifier 450" (vendue par la Société Branson Ultrasonic, Danbury, CT, USA). Après sonication, les cellules sont passées dans la presse de French pour achever le broyage cellulaire. On centrifuge le lysat résultant pendant vingt minutes à 12000 tours/minute pour extraire les débris cellulaires, on filtre ensuite au travers d'un filtre à 0, 22 ; jm (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), puis on charge le filtrat sur une colonne de Sépharose couplée à la novobiocine (Staudenbauer and Orr, 1981) préalablement équilibrée dans le tampon A. La colonne est ensuite lavée avec le tampon A contenant 0,5 mol/1 KCl, puis avec le tampon A contenant 1 mol/1 KCl. La protéine liée est éluée avec un tampon A contenant 5 mol/1 d'urée. Les fractions à 5 mol/1 d'urée contenant GyrB (1-219) dénaturée sont collectées et mélangées, puis diluées à 0,5 mg/ml avec le tampon A contenant 5 mol/1 d'urée. La protéine initialement dénaturée est repliée par dialyse, initialement contre le tampon A, et ensuite contre le tampon A contenant 25mM KCl. Après dix minutes de centrifugation à 12 000 tours/minute de la solution dialysée, le surnageant est chargé sur une colonne Q-Sépharose Fast Flow (Amersham-Pharmacia, Uppsala, Sweden) équilibrée dans le même tampon : TpA 25mM KCl. La GyrB (1-219) est éluée avec un gradient linéaire de 25 à 400 mM KCl. Enfin, on concentre la protéine par ultrafiltration sur MacroseplOK (Pall Filtron Corp, NorthBorough, MA, USA) puis sur Centricon-10 (Sartorius, Palaiseau, France). On conserve la protéine purifiée à une température d'environ 4 C après une dialyse finale contre 10 mM de phosphate de sodium à pH = 7. 8) Analyse par Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et immunoempreinte Les extraits cellulaires totaux correspondent au culot de cellules resuspendu dans du TpA à une DOo = 2 pour E. coli et à une D0700 = 10 pour Anabaena. Pour obtenir les fractions solubles et insolubles, ces extraits cellulaires sont broyés à la presse de French puis centrifugés 10 minutes à 10000 tours/min. La fraction soluble correspond au surnageant et la fraction insoluble au culot. Des quantités identiques de fractions solubles et insolubles sont ensuite analysées sur SDS-PAGE. La description qui suit expose de façon plus détaillée, mais non limitative, la méthodologie et les résultats expérimentaux obtenus, basés sur les figures annexées. Comme le montre la figure 1A, le plasmide pBL23K est obtenu en remplaçant le gène codant pour le fragment N-terminal 43kDa de la GyrB dans le plasmide pF90Y5 par la séquence ADN codant la gyrase B (1-219), tel qu'indiqué précédemment. L'expression du domaine GyrB (1-219) est sous le contrôle du promoteur tac. Le gène répresseur lac (lac Iq) qui produit le répresseur, et le promoteur tac sont également représentés. Le terminateur de transcription rrnBTlT2 est placé en aval du gène de la GyrB (1-219). L'origine de réplication de ColEl (ColEl) permet le maintien du plasmide dans E. col !. Amp'correspond au gène de résistance de l'ampicilline. Comme le montre la figure 1B, la cassette d'expression pour GyrB (1-219) est transférée du plasmide pBL23K vers pRL25C, tel qu'indiqué précédemment. L'expression de GyrB (1-219) est également sous le contrôle du promoteur tac. Le plasmide pRL25C23K est un vecteur navette dans E. colilanabaena, et contient l'origine de la réplication de ColEl (ColEl ori), l'origine ColEl de conjugaison pour le transfert du plasmide de E. coli vers Anabaena (bom), l'origine pDUl de réplication pour la réplication dans les cellules d'Anabaena (Wolk et al, 1984), et le gène de résistance de la néomycine, Néon. Le protocole pour obtenir les résultats comparatifs des figures 2A et 2B est le suivant. Les cellules XL1-Blue porteuses du plasmide pBL23K sont induites avec ImM d'IPTG. Les extraits cellulaires totaux sont analysés sur gel d'électrophorèse SDS-PAGE. Les extraits cellulaires totaux des cellules Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K exprimant de façon constitutive la gyrase GyrB (1-219) ont également migrés en parallèle sur le gel. Après électrophorèse, les protéines sont soit colorées avec le colorant bleu de Coomassie (figure 2A), soit transférées sur une membrane en nylon (figure 2B) et détectées avec l'anticorps monoclonal 2F12, comme indiqué précédemment. Les pistes 1, 2,3, 4 d'électrophorèse des figures 2A et 2B correspondent aux dépôts suivants : - Piste 1 : 20 jl d'extrait total de cellules d'une culture XL1-Blue non induites, porteuses de pBL23K ; - Piste 2 : 20 J. l d'extrait total de cellules d'une culture de XL1-Blue porteuses de pBL23K, induite pendant deux heures ; - Piste 3 : 20 Lil d'extrait total de cellules d'une culture de cellules Anabaena de type sauvage ; - Piste 4 : 20 jl d'extrait total de cellules d'une culture d'Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K ; - M : est le marqueur de faible poids moléculaire (Amersham Pharmacia). La flèche, sur les figures 2A et 2B, indique la bande correspondant à la gyrase GyrB (1-219). Sur les figures 3A et 3B, on analyse, par le biais des techniques sur gel électrophorèse SDS-PAGE et d'immunoempreinte, telles que décrites ci-dessus, les fractions solubles et insolubles issues de cellules E. coli XL1-Blue induites porteuses du plasmide pBL23K, et celles issues des cellules Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K. Les pistes 1 et 2 de du gel SDS PAGE des figures 3A et 3B, correspondent aux dépôt suivants : - Piste 1 : 20 l de fraction soluble - Piste 2 : 20 cl de fraction insoluble ; - M : marqueur de faible poids moléculaire. Les courbes de la figure 4A, sont obtenues à l'issue du mode expérimental suivant : Les cellules Anabaena exprimant la GyrB (1-219) sont mises en culture, soit sur un milieu BG-11 non marqué, soit sur un milieu BG-11 contenant NaH13CO3 et Nal5N03. La croissance est analysée en suivant chaque jour la D07oonm. Sur la figure 4A, obtenue lorsque la croissance est réalisée dans un erlenmeyer sous agitation dans des conditions atmosphériques, la courbe 1 représente la croissance dans un milieu BG-11 non marqué, et la courbe 2, celle dans un milieu BG-11 contenant NaH13CO3 et Na 15NO3. Ce graphique comprend en outre les pistes obtenues sur gel électrophorèse SDS-PAGE, coloré avec le colorant bleu de Coomassie et, qui montre l'expression de GyrB (1-219) dans les cellules Anabaena cultivées dans un milieu BG-11 marqué au 13C/15N ou non. Les pistes 1,2 et 3 d'électrophorèse sur gel d'acrylamide de cette figure 4A correspondent aux dépôts suivants : - Piste 1 : Marqueur de faible poids moléculaire (Amersham Pharmacia) ; - Piste 2 : Extrait total de cellules à partir d'une culture réalisée dans un milieu BG-11 non marqué ; - Piste 3 : Extrait total de cellules à partir d'une culture réalisée dans un milieu BG-11 additionné de NaH13CO3 et de NaNO3. La flèche indique la bande correspondant à GyrB (1-219). Les courbes de la figure 4B sont obtenues avec des conditions de culture sous azote gazeux. Les cultures sont ventilées avec de l'azote gazeux. La courbe 3 représente l'évolution de la DO700 en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 non marqué et, avec une régulation du pH. La courbe 4 représente la DO, co en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 contenant NaH13CO3 et, avec une régulation du pH. La courbe 5 représente la D0700 en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 non marqué et, sans aucune régulation du pH. Cette figure 4B montre de plus (voir SPS PAGE) les niveaux d'expression de la GyrB (1-219) obtenus lorsque les cellules sont cultivées en condition atmosphériques ou sous azote gazeux. Les pistes 1, 2 et 3 d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide de cette figure 4B correspondent aux éléments suivants : - Piste 1 : Marqueurs de faible poids moléculaire ; - Piste 2 : Extrait total de cellules cultivées en erlenmeyer sous agitation en condition atmosphérique, cultivées dans un milieu BG-11 non marqué ; - Piste 3 : Extrait total de cellules cultivées dans un flacon ventilé avec de l'azote dans un milieu BG-11 marqué au 13C Au vu des éléments techniques exposés précédemment, on peut noter que l'expression de la GyrB (1-219), à la fois dans les cellules E. coli et Anabaena est réalisée sous le contrôle du promoteur tac. Chez E. coli, l'expression de GyrB (1-219) est réalisée en utilisant la souche XL1-Blue porteuse du vecteur pBL23K (figure 1A). Ce vecteur contient aussi bien le promoteur tac que le répresseur lac (lacis) qui réprime ce promoteur pendant la croissance. L'expression de GyrB (1-219) est induite par l'ajout de l'inducteur : l'isopropyl-ss-thiogalactopyranoside (IPTG). Dans les cellules Anabaena, l'expression du fragment GyrB (1-219) est réalisée en utilisant le vecteur d'expression navette d'E. coli/Anabaena, à savoir pRL25C23K (figure 1B), dans la souche PCC 7120. Dans ce cas, l'absence du répresseur lac conduit à l'expression constitutive de GyrB (1-219) à partir du promoteur tac. L'expression produite dans chaque souche est analysée par électrophorèse SDS-PAGE et par immunoempreinte. Comme le montrent les pistes 1 et 2 de la figure 2A, la comparaison des extraits cellulaires totaux obtenus à partir de cellules XLI Blue porteuses du vesteur pBL23K non induites et induites montrent la présence d'une protéine supplémentaire d'environ 28kDa, dans les extraits de cellules induites à l'IPTG. Sur les pistes 3 et 4 de la figure 2A, la comparaison de l'extrait de cellules Anabaena de type sauvage avec les cellules Anabaena porteuses de pRL25C23K, révèle également la présence d'une protéine supplémentaire d'environ 28kDa dans les cellules porteuses du vecteur d'expression pRL 25C23K. L'analyse de ces extraits par immunoempreinte (figure 2B) montre que cette protéine est reconnue par l'anticorps monoclonal 2F12 dirigé contre la sous-unité gyrase B d'E. coli. Ceci confirme donc l'expression de GyrB (1-219), à la fois dans les cellules d'E. coli et dans celles d'Anabaena. Selon les pistes 1 et 2 de la figure 2A, on peut, dans les extraits d'E. coli, aussi détecter une autre protéine d'environ 80 kDa qui correspond à la protéine gyrase B endogène. Par ailleurs, pour caractériser la GyrB (1-219) produite dans chaque hôte, on a effectué une analyse des fractions insolubles et solubles, des extraits E. coli et Anabaena contenant GyrB (1-219). Les pistes 1 et 2 des figures 3A et 3B montrent que la protéine est présente exclusivement dans la fraction soluble, à la fois dans les cellules d'E. coli et dans celles d'Anabaena. On a effectué des essais de liaison de GyrB (1-219) à la novobiocine, qui est connue pour lier et inhiber Gyr B, pour tester l'activité de la protéine exprimée chez E. coli et chez Anabaena. Des fractions solubles obtenues à partir de chaque souche sont chargées sur une colonne de novobiocineSépharose (Staudenhauer and Orr, 1981). La protéine liée pure, est récupérée après élution avec un tampon dénaturant contenant 5M d'urée (TpA 5Murée). Dans la mesure où le domaine N-terminal 24kDa de la gyrase B fixe la novobiocine, ces résultats suggèrent que la GyrB (1-219) est correctement repliée dans le cytoplasme des cellules E. coli et dans celui des cellules Anabaena sp. PCC 7120. Les rendements de GyrB (1-219), surexprimée dans ces conditions, sont d'environ log/1 avec E. coli lors d'une croissance dans le milieu Martek 9-U, et 15 mg/1 avec Anabaena sp. PCC 7120 lors d'une croissance dans le milieu BG-11. Ces données montrent que Anabaena sp. PCC 7120 est capable, tout comme E. coli, d'exprimer avec des rendements élevés, la GyrB (1-219) soluble dans son cytoplasme. - Marquage double au 13C/N de la protéine N-terminal 24kDa dans Anabaena sp PCC7120 dans des conditions en aérobie La présence de NaH13CO3 et de Nal5NO, marqués n'a aucun effet sur la croissance cellulaire, ni sur le rendement d'expression de GyrB (1-219), comme le montre l'analyse des extraits totaux cellulaires à partir des cultures correspondantes (voir figure 4A SDS-PAGE). Une culture de 1,5 litres est ensuite réalisée pour préparer des quantités suffisantes de protéine marquée pour l'analyse RMN. On purifie 9mg de GyrB (1-219) marquée au 13C/15N pure, puis on les analyse en spectroscopie RMN. La figure 5 montre le spectre HSQC 15N-H de cet échantillon. Ce spectre, qui peut être considéré comme une empreinte digitale de la structure de la protéine, est similaire à celui obtenu à partir de l'échantillon E. coli (données non représentées). Le niveau d'enrichissement isotopique est examiné par spectrométrie de masse et par RMN. Dans un échantillon marqué uniformément, on suppose que tous les pics méthyl du spectre de corrélation hétéronuclaires 13C se voient nettement sous forme de doublets, grâce au couplage homonucléaire"C-"C (Jcc = 30HZ). Dans le spectre RMN HSQC l3C-H enregistré sur ce premier échantillon, on a observé que la plupart des pics méthyl résonne sous forme de triplets, indiquant dans ce cas que le marquage des 12C au 13 C n'est pas uniforme. Le rapport (R) de la surface située au-dessous de la ligne centrale, ainsi que les lignes de doublets donnent une estimation du taux P de marquage. Ce taux est estimé se trouver entre 20 % et 30 %. Ces résultats sont en bonne harmonie avec ceux issus de la spectrométrie de masse, dans l'hypothèse où le taux de marquage à l'azote 15N est égale à 90 %. - Production de GyrB (1-219) marquée uniformément au 13C dans Anabaena sp. PCC 7120 dans des conditions anaérobies Puisque NaHCO3 est l'unique source de carbone dans le milieu de culture, l'hypothèse a été faite selon laquelle le carbone C12 assimilé par les cellules Anabaena proviendrait probablement du CO2 atmosphérique dissous. En effet, la Ribulose Biophosphate Carboxylase/Oxygénase (RubisCo), qui est l'enzyme principale responsable de la fixation de CO2 chez Anabaena, est capable de discriminer entre 13CO2 et"CO2 (Kaplan et al, 1995) et d'utiliser préférentiellement le 12CO,. Pour tester cette possibilité, on réalise le marquage au 13C de cultures Anabaena en croissance dans des flacons en verre ventilés uniquement avec de l'azote gazeux. Les courbes de croissance de la figure 4B montrent une croissance plus réduite en présence d'aération par l'azote, comparée à une croissance en condition atmosphérique, probablement parce que les transferts de lumière sont moins efficaces dans un grand flacon. On peut par ailleurs noter une sensibilité supérieure au pH élevé, qui conduit à la mort cellulaire en absence de régulation du pH. On effectue alors une régulation du pH deux fois par jour, permettant aux cellules de croître jusqu'à ce qu'on atteigne une D0700 = 0, 7. On évalue le niveau d'incorporation isotopique dans ces conditions en anaérobie en produisant 7mg de GyrB (1-219), à partir de 2,5 litres de culture d'Anabaena. La protéine est ensuite analysée par spectroscopie RMN et par spectrométrie de masse. La figure 6 montre la région méthyl du spectre RMN HSQC 13C-'H enregistré en utilisant cet échantillon. Comme on peut le voir sur la figure 6, la structure en doublet des pics de corrélation qui est due aux couplages homonucléaire lJcc témoigne du marquage uniforme en 13C. Les pics qui sont marqués d'une étoile sont attribués aux quatre groupements méthyl des résidus de méthionine présent dans la séquence de la protéine GyrB (1-219). La plupart des pics de corrélation 13C-lH s'affiche comme des doublets purs. Ceci indique un niveau d'enrichissement en carbone supérieur à 90 %. On constate que ce taux de marquage est uniforme le long de la séquence, dans la mesure où tous les Ca et les Css résonnent, respectivement, comme des triplets et comme des quadruplets. Ce résultat est confirmé par l'analyse en spectrométrie de masse ES de cet échantillon, qui montre une différence de masse de 994 Da entre les échantillons marqués et les non-marqués (respectivement de 25 067 Da et 24 073 Da). Ceci correspond à un niveau d'enrichissement de 94 % en 13C. Dans la mesure où ceci a pu être reproduit deux fois avec deux préparations différentes de GyrB (1-219) marquée au 13C, on peut conclure que l'absence de 12cl&commat; atmosphérique est la condition préalable au marquage uniforme en 13C de la protéine recombinante dans les cellules Anabaena, en utilisant NaHl3C03 comme source unique de carbone. - Production de GyrB (1-219) marquée au 13C/N par fermentation De façon à optimiser la croissance de GyrB (1-219) en conditions anaérobie, on fait pousser les cellules Anabaena exprimant la protéine recombinante dans un fermenteur de deux litres. Pour obtenir une croissance jusqu'à une DO,,, = 2, le pH est maintenu à 8 avec une exposition à la lumière adéquate. On utilise de l'argon, à la place de l'azote, dans la mesure où les cellules Anabaena sont également capables de fixer l'azote gazeux lorsque l'azote organique devient limitant dans le milieu de culture. L'analyse SDS-PAGE des extraits cellulaires totaux échantillonnés pendant la fermentation, montre que GyrB (1-219) est exprimée de façon continue pendant toute la croissance (données non représentées). Dans ces conditions, on constate que le rendement en GyrB (1-219) dans le fermenteur est équivalent à celui obtenu dans des erlenmeyers sous agitation en condition atmosphérique. En partant de cellules issues de la fermentation, on purifie 9mg de GyrB (1-219) marquée au C/N, puis on les analyse par RMN. Le spectre RMN HNCA de cet échantillon est comparé à celui de GyrB (1-219) marquée au 13C/N dans E. coli. Comme le montrent les figures 7A et 7B, on constate que le spectre (régions issues des résidus 188 à 198) obtenu avec GyrB (1-219) produit dans les cellules Anabaena est identique à celui obtenu avec GyrB (1-219) marquée dans les cellules E. coli. Ces résultats indiquent que la protéine GyrB (1-219) produite dans Anabaena, dans les conditions exposées précédemment, est totalement marquée avec les atomes 13C et 15N. En outre, ceci présente l'avantage que ce marquage avec Anabaena a un coût de revient dix fois moins cher qu'avec E. coli. En conclusion de cette étude, on peut noter que la protéine est produite avec un rendement élevé sous forme soluble et repliée dans le cytoplasme des cellules Anabaena, montrant ainsi que les capacités d'expression hétérologue de cette souche sont comparables à celles d'E. coli. On utilise dans cette invention un système d'expression constitutif qui permet l'accumulation de la protéine pendant la croissance. 1 De plus, les protocoles de purification peuvent facilement être transférés des extraits de cellules d'E. coli vers ceux d'Anabaena, bien que la composition en protéine des cellules Anabaena est très différente de celle d'E. coli, puisque les cellules Anabaena comprennent toutes les protéines pigmentées impliquées dans les photosystèmes I et II. Le marquage de la protéine recombinante est réalisé en cultivant les cellules Anabaena exprimant GyrB (1-219) cellulaire dans un milieu contenant les substrats marqués. L'analyse de la protéine marquée, par spectroscopie RMN et spectrométrie de masse, montre qu'un taux de marquage élevé peut être atteint en utilisant le système d'expression Anabaena. Bien que l'enrichissement isotopique supérieur à 90 % peut être facilement obtenu pour l'isotope 15 N, l'enrichissement en isotope 13C nécessite la croissance des cyanobactéries sous des conditions atmosphériques contrôlées. En effet, la présence de CO2 atmosphérique dissous dans le milieu de culture diminue de façon importante le pourcentage d'enrichissement isotopique. Dans la présente invention, la ventilation du milieu de culture à l'azote gazeux ou à l'argon permet d'atteindre un enrichissement allant jusqu'à 94 % en 13C. Par ailleurs, le procédé de l'invention présente un coût financier nettement inférieur à ceux connus jusqu'ici. Cette réduction est due à la possibilité conférée aux cyanobactéries de pouvoir à la fois pousser naturellement sur un milieu pauvre en nutriments et, de pouvoir utiliser la lumière comme source d'énergie. Un inconvénient à ce système d'expression Anabaena est le temps de reproduction qui est d'environ 24 heures, alors qu'E. coli se divise en environ 30 minutes, et par conséquent augmente la durée de réalisation du procédé de l'invention. Mais un tel inconvénient peut être réduit avec un contrôle efficace des conditions de croissance, et en particulier en fournissant une exposition à la lumière des cyanobactéries optimale. Ceci peut notamment être réalisé à l'aide d'un fermenteur permettant une irradiation lumineuse uniforme pour optimiser la vitesse de croissance cellulaire. Enfin, en utilisant le même système d'expression constitutif, la protéine de liaison au maltose d'E. coli a été également été produite sous une forme soluble dans le cytoplasme d'Anabaena, à des niveaux comparables à ceux obtenus dans E. coli. Ces résultats suggèrent que les protéines solubles, qui sont surexprimées dans E. coli, peuvent aussi être surexprimées dans les cellules Anabaena, et par conséquent marquées à faible coût, faisant d'Anabaena un hôte privilégié pour le marquage de protéines recombinantes. De plus, la nature non-protonée de la source de carbone (CO2) est un grand avantage lorsqu'on considère la production de protéine totalement deutérée. En effet, la souche Anabaena sp. PCC 7120 peut être adaptée avec succès pour croître dans un milieu enrichi en D20, qui peut comprendre jusqu'à 97% de D2O. Selon le procédé de l'invention, on peut aussi produire des protéines recombinantes en surexprimant la lacperméase d'E. coli dans la cellule Anabaena sp. PCC 7120, de façon à favoriser l'entrée d'IPTG présent dans le milieu de culture, et par conséquent de mieux réguler l'expression à partir du promoteur tac en présence du répresseur lac. Ceci a d'autant plus d'intérêt lorsque la protéine recombinante présente des propriétés toxiques pour la cellule. La présence d'IPTG en quantité variable permet de varier la quantité de protéine accumulée dans la biomasse, du fait de la variation de l'expression. REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire des protéines recombinantes, marquées de façon uniforme et complète avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants pouvant être autotrophes et/ou phototrophes, ledit procédé consistant à mettre en culture lesdites cellules ou lesdits microorganismes sur un milieu de culture qui comprend au moins un isotope, à isoler lesdites cellules ou lesdits microorganismes cultivés, puis à purifier les protéines recombinantes à partir desdites cellules, desdits microorganismes ou du milieu de culture, caractérisé en ce que lesdites cellules ou lesdits microorganismes sont mis en culture en milieu aérobie, en milieu anaérobie ou en fermentation, la culture en milieu aérobie s'effectuant en présence de Co, atmosphérique, la culture en milieu anaérobie et en fermentation s'effectuant en absence totale de eo2 atmosphérique pour un enrichissement en isotope 13C, et en présence d'un gaz, les cultures en anaérobie et en fermentation s'effectuant en régulant le pH, l'intensité d'une source de lumière visible et la durée d'exposition en continu des cellules ou des microorganismes à cette source de lumière. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur du pH va de 7 à 10. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur de l'intensité de la source de lumière est inférieure à la valeur d'inhibition des cellules/microorganismes, et la durée d'exposition à la lumière varie de 6 heures à 24 heures par jour pendant le temps de la culture. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gaz est choisi parmi l'oxygène, hydrogène, l'azote, les gaz inertes tel que l'argon. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'isotope est choisi parmi les composés comprenant 13C, 15N, 2H 180 et leurs mélanges. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 5, caractérisé en ce que les composés sont choisis parmi NaHCC, NaNO03, D2O, l'ammoniaque marquée, 13eo2, les sels de sodium, ou de potassium ou d'ammonium marqués au 13C et au 15N et leurs mélanges. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi les microorganismes photosynthétiques recombinant modifiés par l'ajout d'un plasmide réplicatif ou par la modification de leur génome. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme photosynthétique est choisi parmi les algues procaryotes bleues, vertes ou rouges. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'algue est choisie parmi les cyanobactéries. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cyanobactérie est la souche Anabaena sp. PCC 7120. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine recombinante est choisie parmi la gyrase B (1-219), la protéine de liaison au maltose d'E. coli. 12. Procédé selon la revendication 1 ou 10, caractérisé en ce que la cellule ou le microorganisme comprend le vecteur plasmidique d'Anabaena pRL 25C23K.