FR 2797184 A1 20010209 FR 9910151 A 19990802 PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF ANTI-CHUTE DES CHEVEUX, PRINCIPE ACTIF OBTENU, COMPOSITION ET PROCEDE DE LUTTE CONTRE LA CHUTE DES CHEVEUX La présente invention concerne un procédé d'extraction d'un principe actif anti-chute des cheveux et le principe actif obtenu. L'invention couvre aussi la composition obtenue et le procédé de lutte contre la chute des cheveux. Le problème de la chute des cheveux et plus généralement les troubles capillaires est devenu un centre d'intérêt pour le domaine de la cosmétique car il est apparu que ce problème pouvait être en partie solutionné par des traitements, notamment celui qui utilise le présent principe actif. En effet, le cycle pilaire est complexe et présente plusieurs phases essentielles - anagène : c'est la phase la plus longue qui correspond à la croissance du cheveu qui elle-même se décompose en plusieurs stades. Elle dure sensiblement de trois à cinq ans et constitue l'état de la majorité des follicules pileux. Cette phase correspond à une activité métabolique intense au niveau du bulbe. L'activité mitotique est également très importante. Cette phase est terminée lorsque le cheveu émerge du cuir chevelu de façon visible. - catagène : c'est la phase de régression du follicule du cheveu, les cellules se kératinisent et l'activité mitotique cesse, le follicule ne fabrique plus de cheveux. - télogène : le cheveu est ancré dans le follicule et continu de croître jusqu'à sa chute. De ce fait, le follicule ne rentre plus dans la phase anagène et ne fabrique plus de cheveux, c'est le début de l'alopécie. II convient d'agir sur la phase anagène du cycle pilaire, c'est à dire sur la croissance du cheveu pour lutter contre l'alopécie et c'est le but de la présente invention. Le principe actif selon la présente invention agit ainsi et plus particulièrement sur deux facteurs importants de contrôle du cycle pilaire, à savoir le système vasculaire et le système cellulaire. Le principe actif selon la présente invention joue deux premiers rôles - celui d'un vasodilatateur permettant d'activer la microcirculation au niveau du bulbe pileux, ce qui permet d'apporter les agents nutritifs nécessaires, et - celui de stimulateur de l'activité mitotique par un apport en peptides glutaminés et en oligo-éléments. Le principe actif selon la présente invention stimule aussi les mécanismes de synthèse protéique pour favoriser la maturation kératinique. En outre, on a constaté aussi que le principe actif selon la présente invention présentait un effet inhibiteur vis à vis de la 5a-réductase , enzyme qui catalyse l'hydroxylation de la testostérone en 5a-dihydrotestostérone, métabolite présentant une activité androgénique importante et régule le métabolisme de la glande sébacée. Selon la présente invention, le procédé d'extraction d'un principe actif en vue d'une action anti-chute se caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes - broyage des graines de Lupinus Albus de manière à obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 500,um, - solubilisation de cette poudre dans une solution aqueuse d'au moins 25% en poids, - hydrolyse enzymatique jusqu'à libérer le principe actif, - filtration pour séparer les phases soluble et insoluble, - purification et concentration multiples et successives de la fraction active, et - filtration stérilisante sur membrane afin de limiter la présence de micro organismes, de flore mésophile totale, de levures, et de moisissures. Quant au principe actif obtenu par ce procédé, il se caractérise en ce qu'il comprend - taux de matières sèches supérieur à 50 g/1, notamment compris entre 50 et 500 g//, et plus particulièrement compris entre 100 et 300 g//. - pH compris entre 2,0 et 10,0, notamment compris entre 5,0 et 9,0, et plus particulièrement compris entre 6,5 et 7,5 - taux de protéines supérieur à 50 g/1, notamment compris entre 50 et 300 g// et plus particulièrement entre 80 et 200g/1, et - fractions protéiques suivantes - acide glutamique au moins 20% en m/m, - aspartique au moins 10%, et - arginine au moins 10%. L'invention est maintenant décrite selon une succession d'essais et de tests montrant les résultats obtenus. Les différentes figures annexées montrent - figure 1, chromatogramme obtenu par filtration moléculaire F.P.L.C, (fast protein liquid chromatography), - figure 2, diagramme de l'activation de la synthèse protéique comparée, - figure 3, diagramme du taux de prolifération comparé, - figure 4, diagramme des variations de densités capillaires, - figure 5, diagramme des variations des rapports anagène/télogène, - figure 6, diagramme des variations de la microcirculation cutanée, - figure 7, diagramme des variations de l'effet inhibiteur de la 5oc- réductase. I/ Procédé d'extraction Le procédé selon la présente invention utilise comme produit de base de la poudre micronisée de lupin blanc doux (Lupinus Albus). Le lupin blanc doux est une plante de la famille des papilionacées qui fabrique des graines de grande taille, riches en protéines, généralement utilisées pour des applications tout autres que celles de la cosmétique puisque ces graines sont couramment utilisées pour l'alimentation du bétail. La variété utilisée dans le cas de la présente invention est plus particulièrement la graine de lupin blanc doux et cette définition de lupin blanc doux doit être considérée pour la suite de la description comme comprenant toute espèce de lupin exempte d'alcaloïdes, toxiques. Les graines utilisées pour l'obtention d'un principe actif anti-chute des cheveux sont d'abord décortiquées pour en retirer l'enveloppe puis broyées et micronisées pour obtenir une poudre ayant une très fine granulométrie, de l'ordre de 500 Nm et de préférence inférieure, ce qui augmente d'autant la surface de contact et assure ainsi une obtention plus aisée du principe actif recherché. Cette farine est solubilisée dans une préparation aqueuse à raison d'au moins 25% en poids. II est possible de porter cette solution en température pour permettre une meilleure solubilisation. Ainsi, l'hydrolyse enzymatique de cette solution est réalisée à un pH compris entre 8,0 et 10,0 et à une température supérieure à 40 C. La solution d'hydrolyse est ensuite filtrée en sorte de séparer les phases soluble et insoluble. La solution est ensuite purifiée et concentrée plusieurs fois successivement afin de sélectionner la fraction active recherchée. Cette solution pourrait être déshydratée ou lyophilisée. La dernière phase du procédé est une filtration stérilisante sur membrane à 0,22 ,um afin de limiter la présence de micro-organismes, de flore mésophile pour arriver à un taux inférieur à 100 germes/g, de levures, et de moisissures. II/ Caractérisation du principe actif Le principe actif issu de ce procédé se caractérise par les données suivantes 1 / taux de matière sèche supérieur à 50 g/1, de 50 à 500 g/1 plus particulièrement entre 100 et 300 g/1. Ce taux est obtenu par passage à l'étuve à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant. 2/ pH compris entre 2 et 10, notamment entre 5 et 9, plus particulièrement entre 6,5 et 7,5. Cette valeur est obtenue par la méthode potentiométrique. 3/ taux de protéines supérieur à 50 g/1, notamment entre 50 et 300 g/1, plus particulièrement compris entre 80 et 200 g/1, Ce taux est obtenu par la méthode de Biuret. La figure 1 montre le chromatogramme obtenu par filtration moléculaire F.P.L.C, (fast protein liquid chromatography). Les fractions protéiques de ce principe actif sont établies ainsi - acide glutamique, au moins 20%, - aspartique, au moins 10%, et - arginine, au moins 10%. 4/ le dosage en vitamines a donné les résultats suivants - Vitamine B3 : supérieur à 2 000 Ng/ml - Vitamine B5 : supérieur à 2 000 pg/ml. 5/ Le dosage en oligo-éléments a donné les résultats suivants - Zinc : supérieur à 1 OOO/ig/ml, - Cuivre : supérieur à 1 500g/ml, - Fer : supérieur à 1 OOONg/ml. 11l/ Effets du principe actif pour la lutte contre la chute des cheveux 1 / Effet sur l'activité métabolique Ce test permet de mesurer la capacité de synthèse protéique. Ce test est conduit sur des kératinocytes, ce qui permet ensuite d'extrapoler sur le potentiel de renouvellement cellulaire des kératinocytes du follicule pileux. La principe actif est additionnée au milieu de culture des kératinocytes. La teneur en protéines des suspensions cellulaires est déterminée par la méthode de BRADFORD. Les essais sont menés avec un échantillon témoin et deux pourcentages de principe actif 0,5% et 1 %. On note sur la figure 2 que l'activité protéique est augmentée dans les deux cas, de 25 et 38% respectivement, l'augmentation étant très significative entre absence et présence de principe actif, l'augmentation par le doublement de la quantité de principe actif ne conduit pas nécessairement à un doublement de l'activité mais on enregistre néanmoins une poursuite de l'augmentation, ce qui prouve une certaine proportionnalité entre la quantité et l'augmentation de l'activité. 2/ Effet sur l'activité mitotique des cellules Une étude de prolifération cellulaire de kératinocytes est réalisée. La numération des kératinocytes en culture, avant et 48 heures après le traitement par le principe actif selon la présente invention, permet de déterminer l'influence de ce principe actif sur le développement des cellules. Le dénombrement est réalisé avec une cellule de Malassez. Les essais sont menés au moins en double et des échantillons sont traités avec trois concentrations de principe actif, 0,05%, 0,12% et 0,25%. Les résultats sont regroupés sur le diagramme de la figure 3. On note une forte augmentation dès la présence d'une très faible quantité de principe actif et l'effet de prolifération présente une corrélation proportionnelle avec l'augmentation de la quantité. 3/ Evaluation de l'effet anti-chute Ce test permet d'évaluer l'action du principe actif sur le ralentissement de la chute excessive des cheveux. La méthode utilisée est celle du phototrichogramme, qui est une étude macrophotographique standardisée. La densité capillaire pour un sujet indemne d'alopécie est de 200 à 400 cheveux/cm2, chez un sujet atteint de calvitie, cette densité diminue à 80 cheveu X/CM2. II convient de déterminer le rapport de cheveux en phase anagène et en phase télogène A/T qui est de 4 à 5 normalement et de 1,5 pour un cuir chevelu franchement pathologique. L'analyse et le comptage des cheveux s'effectue sur une zone donnée, prise en macrophotographie, ce qui permet de déterminer la densité capillaire initiale. Cette zone est photographiée à nouveau 2 jours après traitement pour déterminer les cheveux ayant grandis donc le nombre de cheveux au stade anagène. Ensuite les comptages sont effectués périodiquement pendant 86 jours. On constate sur la figure 4 que le diagramme montre une augmentation de la densité capillaire au cours du temps. On constate sur la figure 5 que le rapport A/T a augmenté pour se stabiliser. Après douze semaines de traitement, il y a une stabilisation de la densité capillaire et une augmentation du rapport A/T, ce qui montre un ralentissement significatif de la chute excessive des cheveux. 4/ Effet sur la microcirculation Cette étude in vivo met en évidence l'effet vasodilatateur du principe actif. La microcirculation cutanée est évaluée par la mesure de la conductivité thermique sur une zone déterminée, en l'occurrence les golfes temporaux de sujets, ceci contre placebo. Le moyen utilisé est un capteur thermique spécifique de l'hématron. Les mesures sont effectuées à tp, tl heure t2 heures et t4 heures après traitement. Un des golfes temporaux est traité avec de l'eau distillée et l'autre avec le principe actif selon la présente invention. On constate sur le diagramme obtenu que les variations sont importantes et très sensible déjà au bout d'une heure mais on constate que cet effet se prolonge et s'intensifie au cours du temps. 5/ Effet inhibiteur de la 5a-réductase Le but est de vérifier que le principe actif selon la présente invention permet aussi de bénéficier d'un effet inhibiteur vis à vis de la biotransformation de la testostérone. Le test a été mené sur des fibroblastes humains et le produit de référence est le finastéride, principe actif connu des comprimés CHIBRO- PROSCAR des laboratoires MERCK SHAR & DOHME CHIBRET. La testostérone utilisée est pour une part marquée. Les cellules ont été soumises à une pré-incubation dans les milieux de culture en présence du produit de référence ou du principe actif selon la présente invention. Après ajout du substrat, c'est à dire la testostérone, à la concentration de 10-6 M dont 4. 10-$ M radiomarquées, les cellules sont incubées pendant une journée. Des cultures témoins sont réalisées en parallèle et les essais sont réalisés en triple. Après incubation, les cellules sont soniquées et une partie des homogénats est conservée pour le dosage des protéines cellulaires. Les homogénats sont extraits au dichlorométhane et après évaporation, les résidus secs sont repris au méthanol. Les dépôts sont effectués sur des plaques de silice, le solvant de migration est un mélange dichlorométhane/éther. Les plaques avec des éléments radiomarqués sont lues avec un analyseur de radioactivité et les éléments standards sont traités à l'acide sulfurique diluée et chauffé à 100 C. Le dosage des protéines cellulaires est réalisé par la méthode de BRADFORD. Les résultats sont exprimés en Ng de protéine par puits de culture. Un tel principe actif peut avantageusement être associé à une forme galénique adaptée tel que crème, lotion ou émulsion avec des excipients connus. Il est recommandé de prévoir des compositions ayant au moins 15% de principe actif. REVENDICATIONS 1 . Procédé d'obtention d'un principe actif en vue de limiter la chute des cheveux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - broyage des graines de Lupinus Albus de manière à obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 500 pm, - solubilisation de cette poudre dans une solution aqueuse d'au moins 25% en poids, - hydrolyse enzymatique jusqu'à libérer le principe actif, - filtration pour séparer les phases soluble et insoluble, - purification et concentration multiples et successives de la fraction active, et - filtration stérilisante sur membrane afin de limiter la présence de micro organismes, de flore mésophile totale, de levures, et de moisissures. 2. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend - taux de matières sèches supérieur à 50 g/l, notamment compris entre 50 et 500 g/1, et plus particulièrement compris entre 100 et 300 g//. - pH compris entre 2,0 et 10,0, notamment compris entre 5,0 et 9,0, et plus particulièrement compris entre 6,5 et 7,5 - taux de protéines supérieur à 50 g/l, notamment compris entre 50 et 300 g/1 et plus particulièrement entre 80 et 200g/1, et - fractions protéiques suivantes - acide glutamique au moins 20%, - aspartique au moins 10%, et - arginine au moins 10%. 3. Principe actif selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les oligo-éléments dans les proportions suivantes - Zinc : supérieur à 1 000 Ngll, - Cuivre : supérieur à 1 500 Ng/I, et - Fer : supérieur à 1 000 Ngll. 4. Principe actif selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend les vitamines suivantes dans les proportions suivantes - Vitamine 83 : supérieur à 2 000 Ng/ml - Vitamine B5 : supérieur à 2 000 ,ug/ml. 5. Composition cosmétique pour limiter la chute des cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins pour une part le principe actif selon une des revendications 2, 3 ou 4, associé à toute forme galénique adaptée. 6. Procédé pour lutter contre la chute des cheveux, caractérisé en ce que l'on dispose sur les cheveux une composition cosmétique selon la revendication 5 à raison d'au moins 15 % de principe actif.