FR 2799466 A1 20010413 FR 9912629 A 19991011 La présente invention a pour objet des transporteurs d'oxygène à base d'hémoglobine ou de myoglobine, leur procédé de préparation et leur utilisation. Les produits à base d'hémoglobine (HBOC pour hemoglobin based oxygen carrier) ont depuis longtemps été proposés et testés comme altematurelle à la transfusion sanguine (R. M. Winslow in Hemoglobin-based Red Cell Substitutes, (1992) The John Hopkins Univ. Press, Baltimore). Initialement, l'hémoglobine (Hb) d'origine humaine s'est imposée à l'évidence, mais son utilisation en solution a vite posé des problèmes, liés aux propriétés intrinsèques de la molécule d'Hb, hors de son environnement physiologique, tels que néphrotoxicité et faible efficacité fonctionnelle (J. Pagnier et al. (1996), Médecine/Sciences, 12,1342-1350). En effet dans les globules rouges, le 2,3-diphosphoglycérate (DPG) stabilise la structure désoxygénée de faible affinité pour l'oxygène ; en revanche, hors des globules rouges, l'absence de DPG entraîne une augmentation de l'affinité de l'Hb humaine pour l'oxygène, ce qui limite la capacité de délivrance de l'oxygène aux tissus. L'absence du système enzymatique oxydo-réducteur intracellulaire (metHb réductase) entraîne une auto-oxydation irréversible avec formation de metHb non fonctionnelle et toxique. De plus on observe une dissociation du tétramère en dimères présentant une forte affinité pour l'oxygène et une vitesse d'auto-oxydation environ 20 fois supérieure à celle du tétramère (M. Marden et al. (1995) Transf. Clin. Biol., 6, 473-480). Des améliorations très nettes des propriétés de ces substituts ont été obtenues en modifiant chimiquement des Hb d'origine humaine (Hb humaine adulte ou HbA) ou d'origine bovine, pour les stabiliser sous forme tétramérique. Ainsi des Hb pontées (par exemple diaspirin cross-linked Hb, DCL-Hb, commercialisée sous le nom de HemAssistTM par la Société Baxter Healthcare Corp. ) ou des Hb polymérisées (par exemple l'Hb d'origine humaine polymérisée en présence de glutaraldéhyde, commercialisée sous le nom de PolyhemeTM par la Société Northfield Lab. Inc.) présentent une durée de vie plus longue, liée à l'augmentation de leur taille, et présentent une baisse de l'affinité pour l'oxygène qui entraîne une augmentation de la capacité de délivrance de l'oxygène aux tissus (J. Pagnier et al. déjà cité). Plus récemment des hémoglobines recombinantes ont été développées, en utilisant comme système d'expression, soit des micro-organismes (L. Kiger et al. (1998), Biochemistry, 37, 7328-7339 ; K. Nagai et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82,7252-7255), soit des mammifères comme le porc. Cependant la préparation de ces hémoglobines recombinantes est très complexe, du fait des nombreuses étapes de purification qu'elles nécessitent. De plus, bien que ces hémoglobines présentent une baisse d'affinité pour l'oxygène, celle-ci n'est pas suffisante pour autoriser leur application thérapeutique (J. Pagnier et al. déjà cité). Comme le souligne M. Marden et al. (1995, déjà cité), même avec une diminution de l'affinité pour l'oxygène et une stabilisation de la structure tétramérique, d'autres problèmes subsistent, notamment l'auto-oxydation trop rapide de l'Hb en solution, réaction qui aboutit à la formation de metHb inapte au transport de l'oxygène. Des effets secondaires ont également été rapportés, comme une vasoconstriction, qui serait liée à l'interaction entre l'Hb et le monoxyde d'azote (NO), messager pour la vasodilatation des cellules endothéliales, et la stimulation des réactions d'oxydation ou de la croissance bactérienne par le fer libre et l'hème, produits par la dégradation de la solution d'Hb (R. M. Winslow in Hemoglobin-based Red Cell Substitues, (1992) déjà cité ; J. R. Hess, Current Opinion in Hematology, (1996), 3, 492-497 ; W. Kaca et al., (1995), Biochemistry, 34,11176-11185 ; D. Su et al., (1997), Infection and Immunity, 65, 1258). Des protéines à base d'Hb et de myoglobine (Mb), dans lesquelles le fer (Fe) a été remplacé par du cobalt (Co), ont été particulièrement utiles pour comprendre les mécanismes de la fixation des ligands sur le tétramère et le rôle fonctionnel de l'hème (T. Yonetani et al. (J. Biol. Chem. (1974), 249,682-690). En effet le cobalt, présent naturellement dans la vitamine B12, au centre d'un anneau corrine semblable à celui de la porphyrine, présente l'avantage de ne pas être toxique, même à forte doses. Ces Co-Hb sont stables et présentent, comme l'Hb naturelle, des spectres d'absorption différents entre les échantillons équilibrés sous oxygène et sous azote (c'est à dire en l'absence d'oxygène) ; est ainsi possible de déterminer par spectrophotométrie, les fractions respectives de ces deux états de liaison (oxy et désoxy); T. Yonetani et al. (1974, référence citée) ont ainsi montré que le remplacement du Fe par du Co, diminue l'affinité pour l'oxygène par un facteur 50 pour Mb et par un facteur 12 pour Hb. Ces résultats indiquent que, dans des conditions physiologiques, au niveau des poumons, Co-HbA ne serait que partiellement saturée en oxygène et ne livrerait donc pas suffisamment d'oxygène. Toutefois, pour une même valeur d'affinité pour l'oxygène, la vitesse d'oxydation est plus faible d'un ordre de grandeur que celle de Hb naturelle. Ainsi, au bout de 8 heures, alors que l'HbA perd 20 % de sa capacité à livrer l'oxygène (M. Marden et al., (1995, déjà cité), les transporteurs d'oxygène à base de cobalt présentent une perte de seulement 4 %. Une dernière voie explorée dans l'ingénierie de substituts du sang, est celle des hémoprotéines qui présentent une forte affinité pour l'oxygène. De telles protéines se trouvent dans des organismes, qui vivent dans des milieux pauvres en oxygène, comme par exemple les nématodes, notamment chez l'Ascaris, ou les trématodes, notamment chez Paramphistomum epiclitum (Pe) et Gastrothylax crumenifer (Gc). Alors que T. E. Carver et al. (J. Biol. Chem. (1992), 267,14443- 14450) ont découvert que dans la myoglobine de baleine, une substitution de la leucine en position B10 par une phénylalanine, conduit à une augmentation de son affinité pour l'oxygène et à une diminution de sa vitesse d'oxydation, I. De Baere et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994), 91,1594-1597) ont montré que, chez l'Ascaris, on pouvait en revanche diminuer l'affinité de l'Hb en remplaçant la tyrosine en position B10, par une leucine ou une phénylalanine ; ces résultats suggèrent que le résidu en position B10 est impliqué dans le mécanisme moléculaire du contrôle de l'affinité de l'oxygène. Toutefois, bien que l'ingénierie génétique et les techniques de réticulation ou de polymérisation des Hb aient permis d'apporter des solutions à la régulation de l'affinité pour l'oxygène et à la stabilisation des tétramères, le contrôle de la vitesse d'oxydation des protéines n'est pas encore résolu. Il ressort de ce qui précède, ainsi que J. Pagnier et al. (référence citée) le rappellent, que, pour être utilisable comme transporteur d'oxygène, un substitut d'hémoglobine doit notamment répondre aux impératifs suivants : i) ne présenter ni toxicité, ni risques immunogènes ou infectieux, ii) avoir une capacité de transport de l'oxygène proche de celle du sang ; idéalement, un substitut du sang devrait avoir une affinité pour l'oxygène comprise entre 2660 et 3990 Pa (20 et 30 mm Hg). En effet, les Inventeurs ont montré, qu'avec une affinité plus faible que celle des globules rouges, qui est de l'ordre de 3990 Pa (30 mm Hg), une plus grande quantité d'oxygène peut être délivrée ; toutefois dans ce cas, le processus d'auto-oxydation conduisant à la forme non fonctionnelle, est accéléré (M. Marden et al. (1995) référence citée ; R. E. Brantley et al., (1993), J Biol. Chem., 268, 6995-7010). Aussi, une affinité de l'ordre de 2660 et 3990 Pa (20 et 30 mm Hg) serait un bon compromis entre ces deux paramètres. iii) être stable plusieurs mois, idéalement à la température ambiante. Or les Inventeurs ont découvert, de manière surprenante, qu'en combinant une apoglobine issue d'une hémoglobine à forte affinité pour l'oxygène et une porphyrine à base de cobalt (Co-porphyrine) possédant une faible affinité intrinsèque pour l'oxygène, on obtient un transporteur d'oxygène de moyenne affinité, c'est à dire présentant une capacité de transport de l'oxygène proche de celle du sang. Aussi, les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des transporteurs d'oxygène qui pallient les inconvénients des transporteurs existants et répondent mieux aux impératifs énoncés précédemment. La présente invention a en conséquence pour objet, des transporteurs d'oxygène à base d'hémoglobine ou de myoglobine, caractérisés en ce qu'ils comprennent une apoglobine issue d'une hémoglobine ou d'une myoglobine à forte affinité pour l'oxygène, associée à une métallo-porphyrine différente d'un hème. Au sens de la présente invention, on entend par hémoglobine ou myoglobine à forte affinité pour l'oxygène, une hémoprotéine pour laquelle la valeur de P50 (pression partielle d'oxygène à demi-saturation mesurée à 25 C) est inférieure à celle de l'HbA, qui est de 1862 Pa (14 mmHg) à 25 C en présence de 2,3-DPG. Au sens de la présente invention, on entend par porphyrine, les proto-, les meso-, les deutero et les hémato-porphyrines. Dans un mode de réalisation particulier de l'Invention, l'hémoglobine à forte affinité est choisie dans le groupe constitué par les Hbs naturelles, normales ou mutées, de nématodes ou de trématodes, les Hbs f#tales (HbF), naturelles ou mutées, d'origine humaine ou animale, les Hbs chimériques, notamment l'Hb # décrite par L. Kiger et al. (1998, déjà cité), les Hbs recombinantes mutées, notamment Ypsilanti, et les fragments de celles-ci. Au sens de la présente invention, on entend par fragment d'Hb à forte affinité, des fragments qui gardent une forte affinité pour l'oxygène, notamment les séquences tronquées ou modifiées chimiquement, par exemple par pontage ou addition de différents substituants, mais préservant la poche de la globine qui interagit avec le ligand. Dans un mode particulièrement avantageux de réalisation, les trématodes sont choisis dans le groupe constitué par le Paramphistomum epiclitum (Pe) et le Gastrothylax crumenifer (Gc). Dans un autre mode de réalisation particulier de l'Invention, la métallo-porphyrine comprend un métal choisi dans le groupe constitué par le cobalt, le manganèse, le cuivre, le zinc, le chrome et le nickel. Dans un mode particulièrement avantageux de réalisation, la métallo-porphyrine est une Co-porphyrine. Outre leur capacité à fixer l'oxygène qui est proche de celle de l'Hb humaine, les transporteurs d'oxygène selon l'invention présentent l'avantage de ne pas fixer le monoxyde de carbone. En effet la fixation du monoxyde de carbone sur une seule sous-unité du tétramère de l'Hb, empêche la transition de l'état oxygéné à l'état désoxygéné et diminue la capacité de l'Hb à délivrer l'oxygène. Les transporteurs d'oxygènes selon l'invention peuvent être utilisés comme substitut du sang, notamment chez des patients qui ne peuvent bénéficier d'une transfusion sanguine autologue, comme par exemple chez les patients anémiés ou porteurs d'un virus. Ils peuvent également être utilisés dans les situations où une oxygénation des tissus est nécessaire, notamment lors d'interventions chirurgicales (angioplasties...) ou pour limiter les conséquences des accidents vasculaires cérébraux. Enfin ces transporteurs d'oxygène peuvent être particulièrement utiles pour oxygéner les tumeurs afin de les rendre plus sensibles à la radiothérapie. La présente invention a également pour objet un procédé par échange de porphyrine, pour la préparation d'une hémoglobine ou d'une myoglobine contenant une métallo-porphyrine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'une hémoglobine ou d'une myoglobine comprenant une métallo-porphyrine choisie dans le groupe constitué par les Fe-porphyrine, les Co-porphyrine, les Mn-porphyrine, les Cu-porphyrine, les Ni-porphyrines, les Cr-porphyrines et les Zn-porphyrines, avec une métalloporphyrine présente en excès, dans un solvant à un pH compris entre 10 et 12, dans des conditions d'anaérobie, - l'addition d'un réducteur de métaux, - l'incubation pendant 10 à 30 minutes à ce pH élevé, - la neutralisation du milieu réactionnel à un pH compris entre 6 et 7 et éventuellement - une étape de purification. Les étapes de neutralisation du milieu réactionnel de purification font appel aux techniques classiques connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier dudit procédé, on réalise l'échange de la Fe-porphyrine d'une hémoglobine ou d'une myoglobine naturelle par une Co-porphyrine. Dans un mode encore plus avantageux de réalisation dudit procédé, on réalise l'échange à partir de l'hémoglobine de trématodes. Un tel procédé est très rapide, facile à mettre en oeuvre, économique et peut être utilisé même à partir de faibles quantités de produits. Un tel procédé est utilisable aussi bien pendant les étapes de recherche, notamment lorsqu'on utilise des mutants d'Hb qui sont souvent disponibles en faibles quantités, qu'au niveau industriel. De plus il permet de réaliser l'échange de porphyrine sans dénaturer les protéines. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples, illustrés par les figures dans lesquelles: - la figure 1 illustre les caractéristiques spectrales dans la bande de Soret de l'Hb humaine adulte naturelle (HbA) et après substitution du Fe par Co (Co-Hb). Le coefficient d'extinction molaire (s) est normalisé à partir des valeurs mesurées par T. Yonetani et al. (1974, déjà cité) pour Co-Hb et par O.W. Assendelft et al.(1975), Anal. Biochem. 69 43-48 pour HbA ; Co-Hb-O2 (#)et Fe-Hb-O2 (# représentent les formes liées à l'oxygène (formes oxygénées ou oxy) alors que Co-Hb (---) et Hb (----) correspondent aux formes non liées à l'oxygène (formes désoygénées ou désoxy). - la figure 2 illustre la relation entre l'affinité pour l'oxygène (P50) à 25 C exprimée en mm Hg et la constante de temps de la réaction d'autooxydation à 37 C en heure, pour différentes combinaisons de globine et de métallo-porphyrine (#) correspond à des mutants de myoglobine de baleine (Mb) comprenant une Fe-porphyrine : Mb correspond à la Mb naturelle, Mb-L29F correspond à la Mb où la leucine en position 29 a été remplacée par une phénylalanine, Mb-L29W correspond à la Mb où la leucine en position 29 a été remplacée par un tryptophane ; (0) correspond à des hémoglobines ou des myoglobines portant une Co-porphyrine : Hb correspond à l'hémoglobine humaine adulte, Lb correspond à l'hémoglobine de soja (leghemoglobin), Gc correspond à l'hémoglobine de Gastrothylax crumenifer et Pe correspond à l'hémoglobine de Paramphistomum epiclitum. EXEMPLE 1 : de Co-hémoglobines par le procédé d'échange de porphyrine selon l'invention 1.1Matériel et méthodes : 1.1.1. Préparation des hémoglobines : L'hémoglobine humaine adulte (HbA) est préparée à partir d'un hémolysat de donneurs sains non-fumeurs, par des techniques classiques connues de l'homme du métier. L'hémoglobine de soja (Lb) est préparée selon la technique décrite par C. A. Appleby et al., (1975), Biochemistry, 14, 4444-4450. L'hémoglobine de baleine (Mb) est purifiée selon la technique décrite par J.B. Wittenberg et al. (1981), Preparation of myoglobins in Methods in Enzymology, 76,29-42. Les hémoglobines de trématodes sont issues d'un élevage de buffles à Aligarth en Inde. Les hémoglobines monomériques sont purifiées selon la technique décrite par L. Kiger et al. (1998), Biophys. J 75 , 990-998. 1.1.2. r.r.1?':l.Q...QJ.l:l.tQ?~4.Ç. La Co-porphyrine de chez Porphyrin Product (Logan, UT) est dissoute dans une solution de soude 0,1 M. Des solutions à 200 M sont préparées dans une solution aqueuse de pyridine à 50 % et stockées à la température ambiante ou à 4 C. 1. 2. Echange de porphyrine : L'hémoglobine naturelle est dissoute dans une solution de CAPS (acide 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonique) 0,05 M ou dans un mélange de glycine-NaCI 0,1M et de soude 0,1M. La solution est désoxygénée sous argon et mélangée à la solution de Co-porphyrine en excès. On ajoute du dithionite de sodium pour réduire la Co-porphyrine et assurer les conditions anaérobies et on laisse incuber le milieu réactionnel pendant 10 à 30 minutes, à 4 C. En fin d'incubation, on neutralise le milieu réactionnel à pH 6-7 par addition d'une solution de phosphate de potassium 1 M. On purifie la protéine par chromatographie sur colonne G25 en éluant avec un tampon phosphate à pH 7, préalablement désoxygéné. La Co-Hb obtenue est réoxygénée et stockée à basse température. EXEMPLE 2 : de l'affinité pour l'oxygène des transporteurs d'oxygène selon l'invention et comparaison avec les transporteurs naturels 2.1. Matériel et méthodes : 2.1.1. Mesure de l'affinité pour l'oxygène : a) cas des hémoprotéines à haute affinité : Pour estimer l'affinité pour l'oxygène des hémoprotéines naturelles de Pe et de Gc, on utilise les paramètres cinétiques. L'affinité pour l'oxygène étant le rapport des vitesses d'association et de dissociation du ligand, on mesure les vitesses d'association par photolyse éclair (flash photolyse) et les vitesses de dissociation par une technique de mélange rapide des produits oxygénés avec le dithionite de sodium (stopped-flow). b) cas des hémoprotéines à faible et à moyenne affinité : On détermine le coefficient d'équilibre en mesurant le spectre d'absorption à différentes pressions partielles en oxygène à l'aide d'un tonomètre. Lorsque P50 est supérieure à 133 Pa (1 mmHg), on utilise un analyseur Hemox pour déterminer les courbes d'équilibre. 2. 2. Résultats : 2.2.1. Affinité :.p~our J'oxygène de ..différentes ~js~çompj.exées~soit~ à une Fe-porphyrine pu soit à une Co-porphyrine Les résultats sont donnés dans le tableau 1 qui suit. Tableau 1 P50 en mm Hg (en Pa) à 25 C Protéines Fer Cobalt Hb A + DPG 14 (1862) Hb A 5 (665) 125 (16625) Mb 0,5 (66,5) 50 (6650) Lb 0,06 (7,98) 30 (3990) Hb de Ascaris 0,002 (0,266)Hb de Gc 0,0015 (0,200) 20 (2660) Hb de Pe 0,0002 (0,0266) 2,5 (333) Les hémoglobines de trématodes présentent les affinités en oxygène les plus fortes, avec des P50 de 0,0015 (0,200) pour Gc et de 0,0002 mm Hg (0,0266) pour Pe, en accord avec les valeurs données par L. Kriger et a/.(1998, déjà cité). Cette forte affinité s'explique par une fixation de l'oxygène élevée et une vitesse de dissociation faible. La substitution de Fe par Co induit invariablement une diminution significative de l'affinité de l'oxygène, donc une augmentation de la valeur de P50, pour tous les types de globines testés. La forme Co-Gc possède une affinité pour l'oxygène, voisine de celle de l'HbA, en présence ou en absence de 2,3-DPG effecteur présent dans le globule rouge. La forme Co-Pe présente une affinité pour l'oxygène, voisine de celle de l'HbA en absence de 2,3-DPG. Ainsi, ces résultats montrent que l'on peut maintenir une affinité proche de celle de l'HbA en présence de 2,3-DPG, en combinant deux effets opposés, à savoir, la stabilisation de la liaison de l'oxygène à la globine par l'intermédiaire de liaisons hydrogène et le fait que l'affinité intrinsèque de la Co-porphyrine pour l'oxygène est plus faible que celle de la Fe-porphyrine (déstabilisation des la liaison oxygène). 2. 2.2. Caractéristiques spectrales dans la bande de Soret de l'Hb humaine adultenaturelle et après substitutiondu Fe par Co Les résultats sont illustrés dans la figure 1. Le processus d'oxydation est suivi par modification de l'absoprtion de l'échantillon en fonction du temps de la manière suivante : comme le spectre de la forme oxydée du cobalt (CO3+) est similaire à celui de la forme oxygénée (Coz±Oz), l'oxydation est suivie par l'amplitude de la différence spectrale entre les échantillons équilibrés sous oxygène pur et ceux équilibrés sous argon. Après oxydation, la Fe-Hb et la Co-Hb sont non fonctionnelles car aussi bien le fer que le cobalt, lorsqu'ils sont oxydés, ne fixent pas l'oxygène ; en conséquence la différence spectrale que l'on observe avec ou sans oxygène est directement proportionnelle à la fraction de métallo-porphyrine apte au transport d'oxygène. La substitution de Fe par Co produit un déplacement vers le rouge, de 415 nm à 425 nm, de la forme fixée à l'oxygène (forme oxy) et un déplacement vers le bleu, de 435 nm à 405nm, de la forme non fixée à l'oxygène (forme désoxy). 2. 2.3. Relation~entre~ l'affinité~pour~l'oxygèneà 25 C et laconstante de~ temps. de la !'t! g. - 5! gg9~Y.5!t!g.. ..n... ~pour~ différentes ~ q.1?1!:g.1!:.. 5! globine~etde métallo:porphyrine Les résultats sont donnés dans la figure 2. Ces résultats montrent que plus l'affinité est faible, plus le temps d'oxydation, donc la durée de vie de l'Hb sous sa forme apte à transporter l'oxygène, est faible. REVENDICATIONS 1. Transporteurs d'oxygène à base d'hémoglobine ou de myoglobine, caractérisés en ce qu'ils comprennent une apoglobine issue d'une hémoglobine ou d'une myoglobine à forte affinité pour l'oxygène associée à une métallo-porphyrine différente d'un hème. 2. Transporteurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'hémoglobine est choisie dans le groupe constitué par les Hbs naturelles, normales ou mutées, de nématodes ou de trématodes, les Hbs foetales (HbF), naturelles ou mutées, d'origine humaine ou animale, les Hbs chimériques, les Hbs recombinantes mutées, et les fragments de celles-ci . 3. Transporteurs selon la revendication 2, caractérisés en ce que les trématodes sont choisis dans le groupe constitué par le Paramphistomum epiclitum (Pe) et le Gastrothylax crumenifer (Gc). 4. Transporteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que la métallo-porphyrine comprend un métal choisi dans le groupe constitué par le cobalt, le manganèse, le cuivre, le zinc, le chrome et le nickel. 5. Transporteurs selon la revendication 4, caractérisés en ce que la métallo-porphyrine est une Co-porphyrine. 6. Utilisation des transporteurs d'oxygènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un médicament utile comme substitut du sang. 7. Procédé par échange de porphyrine, pour la préparation d'une hémoglobine ou d'une myoglobine contenant une métallo-porphyrine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'une hémoglobine ou d'une myoglobine comprenant une métallo-porphyrine choisie dans le groupe constitué par les Fe-porphyrine, les Co-porphyrine, les Mn-porphyrine, les Cu-porphyrine, les Ni-porphyrines, les Cr-porphyrines et les Zn-porphyrines, avec une métalloporphyrine présente en excès, dans un solvant à un pH compris entre 10 et 12, dans des conditions d'anaérobie, - l'addition d'un réducteur de métaux, - l'incubation pendant 10 à 30 minutes à ce pH élevé, - la neutralisation du milieu réactionnel à un pH compris entre 6 et 7 et éventuellement - une étape de purification. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on réalise l'échange de la Fe-porphyrine d'une hémoglobine ou d'une myoglobine naturelle par une Co-porphyrine.