FR 2801900 A1 20010608 FR 9915303 A 19991203 Méthode de production de cellules animales adhérentes Méthode de production de cellules animales adhérentes La présente invention se rapporte à une méthode de production de cellules animales adhérentes dans un milieu de culture dépourvu de sérum d'origine animale en vue de la fabrication de vaccins ainsi qu'à l'utilisation d'une molécule de polivinylpyrrolidone (PVP). État de la technique Les milieux de culture sont généralement constitués d'un milieu de base, qui contient les éléments nutritifs essentiels au développement des cellules, complémenté par du sérum sanguin, le plus souvent du sérum de veau du donneur ou du sérum de veau foetal.. Des milieux de culture dépourvus en sérum d'origine animale ont été rapportés pour induire la prolifération de cellules non adhérentes en suspension, notamment la culture de lignées d'hybridomes (Kovar and Franek, Biotechnol. Lett. 9 :259-264 Murakami H., in Growth of cells hormonally defined media ( G. Sato et al., eds), Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York, p. 711-715 (1982) ; Brevet JP 63084487). On sait que les milieux de culture dépourvus en sérum d'origine animale sont inadaptés pour la culture de cellules adhérentes (Kovar J., In vitro Cell. Dev. Biol. 25 :395-396 (1989)). L'attachement des cellules adhérentes à un support nécessite des facteurs d'attachement apportés par le milieu de culture tels que la fibronectine, la vitronectine, la laminine, le collagène ( Koller M. R. and Papoutsakis E. T., Bioprocess. Technol. 20 :61-110 (1995). Ces facteurs d'attachement sont présents essentiellement dans le sérum d'origine animale (Hayman E., et al., Exp. Cell. Res. vol. 160 : 245 (1985). La demande WO 88/00967 décrit un procédé de culture de cellules adhérentes mammaliennes dans un biogénérateur comprenant une étape de culture dans un milieu contenant du sérum pour favoriser l'attachement des cellules à un support et permettre la prolifération des cellules jusqu'à une concentration désirée suivie d'une étape dans laquelle le milieu de culture est éliminé puis remplacé par un milieu dépourvu de sérum, contenant par ailleurs du polyvinylpyrrolidone, du polyéthylène glycol ou un polymère constitué d'un ou plusieurs groupes oxyde pour protéger les cellules adhérentes en réduisant le drainage filmogène autour des cellules. Ce procédé sert à la production de molécules recombinantes par les cellules Il n'est pas mentionné qu'une PVP agit sur la prolifération cellulaire. La demande FR 2 635 008 décrit un milieu de culture défini, dépourvu de sérum, contenant par ailleurs une PVP ayant un poids moléculaire de 40KD (PVP 40) à une concentration d'au moins 3% dans le milieu, pour favoriser la production d'interleukine 2 dans le surnageant de culture par une lignée CHO adhérente recombinante cultivée sur des microporteurs placés dans un réacteur soumis à une agitation mécanique. Il est aussi clairement indiqué qu'un milieu de culture avec du PVP 40 n'est pas meilleur que le même milieu sans PVP 40 pour assurer la croissance de cette lignée ( Page 7 lignes 15 à 25, page 8 lignes 5 à 8) La demande WO 98/24883 décrit la composition d'un milieu de culture exempt de sérum, contenant un composé stéroïdien et accessoirement du PLURONIC F68 comme agent surfactant et une PVP de 10KD (PVP 10) comme agent détoxifiant, pour favoriser la croissance de lignées adhérentes, comme la lignée Vero placée dans un environnement statique, c'est à dire un environnement dans lequel la lignée n'est pas soumise au flux d'agitation du milieu de culture. La présence de stérols dans le milieu de culture est indispensable pour observer une croissance cellulaire. Selon l'enseignement de l'art antérieur, on peut raisonnablement douter qu'un milieu sans sérum contenant du PVP puisse assurer l'expansion de lignées adhérentes lorsqu'elles sont placées dans un milieu de culture régulièrement agité, un environnement souvent rencontré lors de la production de cellules en grande quantité ou à grande échelle. En effet, la demande FR 2 635 008 montre qu'une PVP utilisée comme substitut du sérum n'augmente pas la multiplication de cellules adhérentes à des microporteurs soumis à une agitation ambiante régulière. L'article de Gyun M. et al., Hybridoma, Vol 8 : 639- 645, précise par ailleurs que le sérum est indispensable lorsque le milieu de culture est régulièrement agité ( page 639) Il existe un besoin dans le domaine de la culture de cellules de trouver un substitut au sérum d'origine animale car son utilisation est très contraignante. En tant que produit d'origine biologique, le sérum fait l'objet de contraintes réglementaires très strictes d'utilisation pour éviter la transmission de virus animaux à l'homme. De plus, les composants du sérum ne sont pas tous très bien identifiés et sont en quantité variable d'un lot à l'autre d'où la nécessité de contrôler les lots au niveau de leur activité biologique et plus particulièrement leur action sur la croissance cellulaire de façon à sélectionner que les meilleurs. La présence d'une grande quantité de protéines dans le sérum peut aussi compliquer singulièrement les méthodes d'isolement et de purification des composants cellulaires et dérivés des cellules comme les virus. Il existe également un besoin de trouver un milieu de culture exempt de sérum qui favorise la croissance de cellules dans un milieu régulièrement agité, un environnement généralement rencontré lors de la production de grandes quantités de cellules. L'agitation mécanique ou médiée par un flux gazeux est en effet une condition nécessaire pour la production en grande quantité de cellules car elle favorise l'apport de nutriments mais elle a l'inconvénient de fragiliser les cellules à cause des forces de cisaillement qu'elle engendre. L'objet de la présente invention pallie ces besoins en proposant une nouvelle méthode de production d'une classe de cellules animales ou humaines particulières. Résumé de l'invention A cet effet, la présente invention concerne tout d'abord l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen entre 20KD et 360KD dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale, pour augmenter la prolifération de cellules animales ou humaines non recombinantes adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. Elle concerne également l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen entre 20KD et 360KD dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale, dans laquelle l'index de prolifération des cellules dans ce milieu est supérieur à 1,5. Elle concerne aussi l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen entre 20KD et 360KD dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale, dans laquelle la polyvinylpyrrolidone diminue la mortalité de cellules animales ou humaines adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. Elle concerne aussi l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone pour favoriser l'adhésion cellulaire. De façon particulière, l'invention concerne aussi l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone non réticulée. De façon particulière, l'invention concerne aussi l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone dans un milieu de culture qui a une composition chimiquement définie. Dans un autre aspect, l'invention relate une polyvinylpyrrolidone qui a un poids moléculaire moyen de 40 KD. Selon un autre aspect, l'invention relate du pourcentage de polyvinylpyrrolidone dans le milieu de culture qui est compris entre 0,01% et 2%. D'une façon plus spécifique, le pourcentage de polyvinylpyrrolidone dans le milieu de culture est de 0,1%. L'invention concerne également l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone pour la production de cellules humaines ou animales adhérentes non recombinantes en mode batch, feed batch ou par perfusion continue. L'invention concerne également l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone pour la production de cellules humaines ou animales adhérentes non recombinantes destinées à la production d'agents infectieux à cycle de reproduction intracellulaire strict. Dans un aspect particulier, l'agent infectieux est un virus. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone pour la production de cellules humaines ou animales adhérentes non recombinantes destinées à la fabrication de compositions antigéniques comprenant tout ou partie des dites cellules. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production en grande quantité de cellules animales ou humaines adhérentes non recombinantes en vue de la production de virus à usage vaccinal comprenant les étapes suivantes, (i) l'ensemencement d'un bio-générateur avec une suspension de cellules et des microporteurs dans un milieu de culture contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD comme substitut du sérum d'origine animale, (ii) la multiplication des cellules sous agitation pendant au maximum 7 jours dans le même milieu de culture d'ensemencement, (iii) la récolte des cellules à partir des microporteurs. Dans un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention les microporteurs sont constitués d'une matrice de dextran (Cytodex1). Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production de virus selon lequel l'étape d'infection est réalisée en infectant des cellules animales ou humaines au moyen d'un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale mais contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD. Enfin l'invention concerne un procédé de production de virus selon lequel les étapes d'infection des cellules animales ou humaines et de récolte des virus se font dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale mais contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD. Contre toute attente, une PVP de 20KD à 360KD, et préférentiellement une PVP de 40KD dans un milieu de culture exempt de sérum peut assurer avec une efficacité comparable à celle d'un milieu avec sérum, la croissance de cellules adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. D'une façon plus surprenante une PVP de 10 KD testée sur les mêmes cellules et utilisée dans les mêmes conditions n'a pas d'effet significatif sur la croissance alors que la demande WO 98/24883 relate un milieu de culture défini contenant une PVP de 10 KD, des composés stéroïdiens en présence de surfactants pour favoriser la croissance de lignées adhérentes placées dans un environnement statique. Bien que l'insuline soit nécessaire au milieu de culture selon l'invention, d'une façon très surprenante, une PVP selon l'invention ne requiert pas la présence, dans le milieu de culture, d'un ou plusieurs composés stéroïdiens ni de la présence d'hormones d'origine animale comme les hormones thyroïdiennes, les hormones surrénaliennes, l'hormone de croissance pour exercer son effet positif sur la croissance cellulaire. Il n'est pas non plus nécessaire d'ajouter au milieu de culture défini des transporteurs de métabolites d'origine animale comme l'albumine, la transferrine ou la céruléoplasmine ou même des facteurs d'attachement comme le collagène, la laminine ou la fibronectine. Enfin, d'une façon inattendue, la mortalité cellulaire observée avec un milieu de culture selon les conditions de l'invention est plus faible que celle constatée avec un milieu contenant du sérum. Cet effet particulier de l'invention peut être avantageusement mis à profit pour la production de cellules destinées à la production de virus et/ou d'agents parasitaires. Description détaillée de l'invention Dans le contexte de la présente invention, différents termes employés sont ciaprès définis: " Par Polyvinylpyrrolidone ou PVP" on entend un enchaînement du monomère de 1-vinyl-2-pyrrolidone obtenu par couplage chimique avec une combinaison de catalyseurs de façon à obtenir un polymère du monomère. Lorsque l'enchaînement est linéaire et ne possède pas de ramifications on considère que la polyvinylpyrrolidone est non réticulée.. "Par milieu de culture ayant une composition chimiquement définie" on entend un milieu comprenant un nombre défini de composants bien caractérisés sur le plan moléculaire et utilisés à des concentrations également bien déterminées. Un milieu de culture contenant du sérum d'origine animale n'est donc pas un milieu de culture chimiquement défini. "Par milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale" on entend un milieu de culture ne contenant pas de sérum ou de produits extraits de sérums animaux et notamment ceux provenant de mammifères, d'oiseaux, de poissons ou de crustacés . Le milieu de culture, quant à lui peut être chimiquement défini ou chimiquement non défini dans la mesure ou il peut contenir également des extraits de micro-organismes, de levures ou de champignons ou même de végétaux qui ne sont pas bien caractérisés sur le plan chimique. Par "cellules adhérentes" on entend des cellules établies en lignées ou des cellules issues directement de l'extraction de tissus animaux ou humains sains ou tumoraux qui ont besoin d'un support solide pour se multiplier et se développer normalement. Une caractéristique essentielle des cellules adhérentes est de former une couche unicellulaire uniforme sur leur support du au phénomène d'inhibition de contact. On exclut donc de fait les cellules poussant en suspension, notamment les lignées d'hybridomes. Les lignées adhérentes peuvent être issues de cultures primaires de cellules saines ou tumorales mais également peuvent être obtenues par transformation de cellules à l'aide d'agents immortalisants. Les lignées adhérentes utilisées peuvent être mortelles (durée de vie limitée) ou immortelles (durée de vie illimitée). Par "flux d'agitation du milieu" on entend un milieu de culture agité mécaniquement et/ou sous l'action d'un courant gazeux. Par "index de prolifération " on entend le rapport entre le nombre maximal de cellules obtenues par ml de milieu de culture contenant une PVP comme substitut du sérum et le nombre maximal de cellules obtenues par ml du même milieu de culture mais dépourvu de PVP, étant entendu que les cellules et les conditions de culture testées, hormis les milieux de culture, sont identiques. Une valeur de l'index de prolifération > à 1+ 2# (# étant l'incertitude sur la numération cellulaire exprimée en %) signifie que le milieu contenant une PVP augmente la prolifération des cellules. Par "mode batch" on entend un mode de culture en milieu fermé sans apport d'éléments nutritionnels additionnels, ni dispositif d' élimination des déchets toxiques qui se sont accumulés pendant la durée de la culture. Par "mode fed-batch" on entend un mode de culture en milieu semifermé avec au moins un apport ponctuel d'éléments nutritionnels additionnels pendant la durée de la culture mais ce mode de culture ne comprend pas de dispositif d'élimination des déchets toxiques qui se sont accumulés. Par "mode continu" on entend un mode de culture dans lequel du milieu de culture neuf est constamment apporté pour remplacer dans le même temps une quantité équivalente de milieu usagé qui est éliminé. Par "mode continu sous perfusion" on entend un mode de culture en continue dans lequel il existe un dispositif supplémentaire qui retient les cellules. Par "bio-générateur" on entend une cuve de culture, généralement en inox, de volume supérieur à 2 Litres, comprenant un système d'agitation et éventuellement un dispositif d'injection d'un courant gazeux de C02 et/ou d'Oxygène. Il est équipé de sondes mesurant les paramètres internes du biogénérateur comme le pH, l'oxygène dissous, la température, la pression de la cuve ou certains paramètres physico-chimiques de la culture (comme la consommation en glucose, de glutamine ou la production de lactates et d'ions ammoniums). Les sondes de pH, d'oxygène et de température sont reliées à un bio-processeur qui assure en permanence la régulation de ces paramètres au moyen d'injection de C02, celle de la teneur en oxygène au moyen d'un balayage d'air en surface et d'une injection d'oxygène en profondeur et celle de la température à l'aide d'un cryostat. Par "microporteurs" on entend des microbilles sphériques de 100 à 200um de diamètre, poreuses ou non, dont la densité est très légèrement supérieure à celle du milieu de culture et recouvertes d'une matrice électrostatique adhésive. Les microporteurs sont maintenus en suspension par agitation mécanique. Par " étape d'infection" on entend le temps de contact nécessaire pour qu'une suspension virale ou un agent à cycle de reproduction intra-cellulaire strict préparée dans un milieu de culture qualifié de milieu d'infection, puisse pénétrer dans la cellule. Par " étape de propagation" on entend le temps nécessaire pour qu'un virus ou un agent à cycle de reproduction intra-cellulaire strict puisse effectuer son cycle de reproduction complet dans la cellule et qu'il soit produit sous forme mature. L'étape de propagation se fait dans un milieu de culture qualifié de milieu de propagation. Selon les virus, les formes matures restent intracellulaires, comme l'agent de la varicelle. Dans ce cas la récolte du virus se fait au moyen de la lyse des cellules infectées. Dans d'autres cas, les formes matures sont extra cellulaires et peuvent réinfecter d'autres cellules restées indemnes en réinitialisant de nouveaux cycles de reproduction intra-cellulaire. Dans ce cas, la récolte du virus peut se faire en une seule fois par prélèvement du milieu de propagation à la fin de l'étape de propagation ou à intervalles réguliers pendant lesquels le milieu de propagation prélevé est remplacé par du milieu neuf et ce jusqu'à l'épuisement du cycle de reproduction intra-cellulaire. L'invention vise donc l'utilisation d'une polyvinylpyrrolidone, préférentiellement non réticulée d'un poids moléculaire moyen compris entre 20KD et 360 KD (PVP), et plus particulièrement une PVP d'un poids moléculaire moyen de 40KD, dans un milieu de culture sans sérum d'origine animale pour favoriser la multiplication de cellules animales ou humaines adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. L'effet optimal sur la prolifération des cellules adhérentes comme par exemple sur des cellules d'embryons de poulets, sur des lignées murines comme la lignée 3T3, NTCT, WEHI, sur des lignées de hamster comme la lignée BHK ou CHO, sur des lignées canines comme la lignée MDCK ou des cellules primaires de rein de chien, sur des lignées porcines comme la lignée PK15, sur des lignées simiennes comme la lignée Vero, LLC-MK2, FRHL2 ou sur des lignées humaines comme la lignée MRC5, Hela, ECV ou A 431 ou des lignées de mélanomes comme la lignée A 375 est obtenu lorsqu'une PVP est utilisée à une concentration dans le milieu de culture entre 0,01% et 2% (Poids/Volume), de préférence à une concentration de 0,1%. On peut utiliser également une PVP, non plus définie au moyen de son poids moléculaire uniquement mais en fonction de sa valeur K qui prend en compte non seulement le poids moléculaire moyen d'une PVP mais également les variations de poids moléculaire de part et d'autre de la valeur moyenne. Pour le calcul de la valeur K on se réfère à l'équation telle que définie dans l'article Cryobiology, 8,453- 464 (1971): La valeur K est calculée à partir de la viscosité relative d'une solution à 1 % de PVP selon la formule Log # rel/C= 75K02/ (1+1.5 K0C) + Ko K= 1000 Ko C représente la concentration en grammes de PVP pour 100 ml de milieu. # rel est la viscosité de la solution comparée à celle du solvant. Une PVP selon l'invention aura une valeur K compris entre 18 et 60 mais préférentiellement entre 26 et 35. Le milieu de culture de base dans lequel est incorporé une PVP selon l'invention peut être du milieu MEM, MEM-a, DMEM, RPMI, ISCOVE, Ham F12, HAM F10 , M199, L15, 6M, NCTC109, milieu de fischer, de Waymouth, milieu Néphros (milieu défini produit par Biowhittaker), milieu VPSFM (milieu défini produit par Life Technologies), milieu de Williams ou des mélanges de ces milieux de base. Ces milieux de base peuvent être enrichis en fonction des besoins des cellules, en facteurs nutritifs additionnels comme par exemple en sucres tels que le glucose, en acides aminés tels que la glutamine, d'un cocktail d'acides aminés non essentiels ( Life technologies) ou d'acides aminés essentiels, de peptides et plus particulièrement de peptides d'origine végétale, en acides ou sels d'acides tels que le pyruvate de sodium, sels d'EDTA, dérivés d'acide citrique ou plus généralement de dérivés d'acides impliqués dans le cycle de Krebs, en alcools comme l'éthanol, en amino-alcools comme l'éthanolamine, en vitamines, en agents anti-oxydants comme le gluthation, en acides gras à chaînes saturées ou insaturées comme l'acide linoléique, l'acide arachidonique, l'acide oléique ou l'acide palmitique, en lipides ou lipopeptides mais également en phospholipides tels que les lécithines et de façon préférentielle les lécithines d'origine végétale ou en précurseurs de ceux-ci. L'ajout de solutions tampons à base d'Hépès ou de bicarbonates pourra s'avérer nécessaire pour certaines cultures cellulaires fragiles ou produisant de grandes quantités de C02, ou éventuellement pour tamponner des milieux de cultures fortement complémentés en acides. D'une façon générale on veillera à respecter un pH du milieu de culture compris entre 6 et 8, le plus souvent entre 7 et 8 et plus spécifiquement entre 7,2 et 7,5. On veillera également à respecter l'isotonicité du milieu de culture. En fonction des besoins particuliers de certains types de cellules, on peut mettre avantageusement à profit l'objet de l'invention en ajoutant au milieu de culture des dérivés stéroïdiens comme le cortisol, des facteurs de croissance d'origine synthétique ou recombinante, tels que, par exemple, des cytokines, l'hormone de croissance (Growth hormone), les IGFs (insulin growth factor), l'EGF (epidermal growth factor), le FGF (Fibroblast growth factor), PDGF ( platelet derivated growth factor), des facteurs d'attachement tels que le collagène recombinant mais ces facteurs ne sont pas absolument nécessaires pour réaliser l'invention. Même si préférentiellement on utilise une PVP dans un milieu de culture chimiquement défini, certaines cultures cellulaires, notamment les cultures primaires obtenues à partir d'explants d'organes peuvent nécessiter des compléments de culture à base d'extraits bactériens, de levures ou même de végétaux. Il est bien entendu que l'énoncé des additifs n'est qu'indicatif mais ne saurait en aucun cas être considéré comme restrictif pour l'homme de métier voulant reproduire l'objet de l'invention. Un autre aspect de l'invention concerne les différents procédés de culture utilisables pour assurer la croissance des cellules adhérentes à l'aide d'un milieu de culture conforme à l'invention. D'une façon générale, les cultures de cellules adhérentes à l'aide d'un milieu de culture selon l'invention, peuvent être effectuées sans nécessairement renouveler une partie du milieu et/ou sans nécessairement ajouter des composés nutritifs additionnels au milieu lorsque la durée de la culture n'excède pas 7 jours. Elles peuvent également être effectuées selon le mode Fed-batch qui consiste à rajouter de façon ponctuelle par exemple des acides aminés comme la sérine ou des lipides, selon le mode de culture en continue ou par perfusion. Les dispositifs de culture permettant une agitation du milieu de culture comprennent les flacons roulants, les flacons de type "spinners", les bio-générateurs. Les supports de culture peuvent être constitués par les parois des flacons eux-mêmes sans être nécessairement traités par des agents adhésifs particuliers, ou des microporteurs qui accroissent considérablement la surface disponible aux cellules adhérentes sans toutefois augmenter de façon importante le volume de milieu de culture nécessaire. Néanmoins ce type de support requiert à la fois une agitation constante et généralement une bonne aération du milieu de culture. On peut mettre à profit l'usage des microporteurs dans les flacons roulants, les flacons de type spinners ou les bio-générateurs. Les microporteurs peuvent être, selon les types cellulaires utilisés, constitués d'une matrice de dextran substituée par des groupements N, N diethylaminoéthyle (Cytodex1 et Cytodex2), ou éventuellement par des facteurs d'attachement d'origine synthétique ou recombinante comme la poly D lysine, le collagène recombinant ou le peptide RGD constitué de l'enchaînement d'arginine, de glycine et d'acide aspartique. Les microporteurs peuvent être aussi en polystyrène, en verre, en cellulose ou en polyacrylamide. Ils sont généralement utilisés à une concentration entre 1 g/litre et 100g/litre de milieu de culture selon l'invention mais de façon préférentielle à une concentration entre 3g/litre à 30g/litre dans le cas de l'utilisation de microporteurs de type Cytodex1. En utilisant ces différents procédés de culture, on constate qu'un milieu de culture soumis à une agitation, exempt de sérum, contenant du PVP selon les conditions de l'invention est capable d'assurer la prolifération de cellules adhérentes avec un rendement similaire voire meilleur que celui obtenu avec un milieu contenant du sérum, favorise également l'adhésion des cellules à leur support et diminue très fortement la mortalité cellulaire. D'une façon surprenante, la mortalité cellulaire constatée avec un milieu de culture selon les conditions de l'invention est plus faible que celle constatée avec un milieu contenant du sérum. Cette caractéristique intéressante du PVP utilisé dans les conditions de l'invention, qui est de diminuer fortement la mortalité cellulaire, est tout particulièrement recherchée lorsque les cellules sont destinées à une utilisation secondaire notamment pour la production d'agents infectieux à cycle de reproduction intra-cellulaire stricte incluant les virus et parasites intra-cellulaires comme ceux responsable du paludisme ou de la toxoplasmose et est tout particulièrement mise à profit pour la production de virus servant à la fabrication de vaccins viraux humains ou vétérinaires, par exemple des virus vivants comme les virus de la rougeole, de la rubéole, des oreillons, de la grippe, de la varicelle ou des virus tués comme celui de la polio, de la rage, de la fièvre jaune, de l'hépatite. En effet, l'absence d'effet inhibiteur du PVP sur la pénétration d'agents infectieux à l'intérieur des cellules en complément de la très faible mortalité cellulaire observée dans la population cellulaire destinée à être infectée par l'agent infectieux, permettent d'optimiser le rendement de la production d'agents infectieux car il n'y a plus d'impasse dans le cycle de reproduction dudit agent du fait que les cellules ont toutes conservé leur intégrité métabolique. Un autre avantage d'une très faible mortalité dans la population cellulaire est de fournir une population parfaitement homogène très recherchée également lorsque cette population est destinée à la fabrication de compositions antigéniques comprenant les cellules elles-mêmes ou des extraits desdites cellules. Ceci est particulièrement intéressant pour la fabrication de vaccins anti-cancéreux obtenus à partir de cellules cancéreuses ou des extraits de celles-ci, notamment de lignées cancéreuses comme par exemple des lignées de mélanomes, de carcinomes du poumon, de cancer du sein, de l'ovaire ou du colon. Exemple 1 : étude de la croissance d'une population de cellules Vero cultivées dans un bio-générateur à l'aide de milieux de culture chimiquement définis contenant une PVP. 1A- Caractéristiques de la lignée Vero utilisée La souche utilisée est issue de l'American Type Culture Collection (ATCC) référencée sous le code ATCC ccIVERO F 1415 , passage 124. Une banque cellulaire de travail au 137ème passage de cette souche a été constituée. Les cellules Vero sont cultivées par passages successifs à partir de la banque de travail en milieu de culture additionné de sérum de veau jusqu'au 140ème passage. Elles subissent ensuite 2 à 3 passages dans l'un ou l'autre des deux milieux définis sans sérum suivant: le premier étant constitué à parties égales de milieu E de williams et de milieu Néphros, le second étant constitué à parties égales du milieu VPSFM et du milieu E de Williams, ces passages supplémentaires étant réalisés de façon à disposer d'une quantité suffisante de cellules pour ensemencer un biogénérateur, un spinner ou des flacons roulants. 1 B- Milieux de culture et réactifs utilisés Préparation des milieux de culture de base chimiquement définis Toutes les solutions préparées sont filtrées sur une unité Millex 0. 22 m (Millipore) afin de les stériliser. # Milieu E de Williams (voir annexe1) - Mélange en poudre Williams E (Gibco) 1 sachet dont les composants exprimés en grammes sont présentés dans la Figure 1 - NaHC03 (Merck) 2,20 g - Gentamicine (Unicet) 50 mg - H20 ultrafiltrée QSP1 # # Milieu Néphros (Biowhittaker) : milieu prêt à l'emploi Ajout extemporané de : - Glutamine 200 mM 10 ml/l - Néomycine 1 ml/l # Milieu VPSFM (Life Technologies) prêt à l'emploi Formules et préparations des solutions et tampons utilisés en culture # PBS sans Ca2+ ni Mg2+ - Solution 10 x c (Gibco) 10 ml - H20 ultrafiltrée QSP 11 * Tampon Citrate - NaCI 8,00 g - KCI 0,20 g - Na2HP04, 2H2O 1,25g - KH2P04 0,20 g - Citrate trisodique, 2H20 7,40g - H20 ultrafiltrée QSP 1# # Trypsine Sigma à 2.5% - Trypsine recristallisée 2 x (Sigma) 25,00 g - NaCI (Merck) 9,00 g - H20 ultrafiltrée QSP 1 I Le tampon citrate et la trypsine Sigma préparés en interne ont été filtrés sur cartouche Millipack 0. 22 m (Millipore). Le PBS a été filtré sur membrane 0. 22 m (Sartorius). Solution d'inhibiteur trypsique de Soja à 1 mg par litre - Inhibiteur trypsique de soja (Boehringer) 20 mg - Milieu E de Williams de base 20 ml Cette solution peut être utilisée extemporanément ou conservée à - 20 C deux à trois semaines. 1 C- Solution mère de PVP à 10% (PoidsNolume) On dissout 50g de PVP 40KD ( Sigma- ref 97H0571) ou 50g de PVP 360KD (Sigma-ref P5288) dans 500ml d'eau ultra filtrée suivie d'une filtration stérilisante sur unité Millex 0,22um (Millipore). La solution mère ainsi préparée est conservée à +4 C et ajoutée en quantité adéquate au milieu de culture au moment de l'emploi en fonction des concentrations finales de PVP désirées. 1 D- Description du bio-générateur et du Spinner Biogénérateurs de 3 litres Ils sont constitués d'une cuve en inox à fond rond munie d'un système d'agitation constitué d'une pale delta. Ils sont équipés de sondes pH, pression en 02, de température et reliés à un pupitre BP 2.10 IM (PMC) qui assure en continu la régulation des différents paramètres au moyen d'injection de C02, celle de la teneur en oxygène dissout par un balayage d'air en surface et d'une injection d'oxygène en profondeur. La température est régulée à l'aide d'un cryostat RM6 Lauda qui maintient la culture à 37 C grâce à une double enveloppe dans laquelle l'eau du cryostat passe en circuit fermé. Pour certains essais (perfusion) d'autres systèmes ont été utilisés. Un système de perfusion a été mis en place (Applikon Biosep ADI 1015) faisant intervenir une chambre de résonance à ultrasons permettant d'éliminer du milieu usagé tout en relargant les microporteurs dans le biogénérateur. Ce système nécessite l'utilisation de 2 pompes, une pompe de recirculation (Masterflex console drive, model 7518-02) et une pompe à deux têtes Minipulse 2 (Gilson), pour l'alimentation et le rejet du biogénérateur. Le tout est géré par une unité Applikon Biosep ADI 1015 régulant la puissance et la fréquence du système et contrôlant la pompe de recirculation et la chambre de résonance. Spinner de 250 ml (Integra Biosciences) Ils sont en verre avec deux bouchons à chaque extrémité. Le système d'agitation nécessite un agitateur magnétique. Le système dans le spinner est constitué de 2 tiges lisses et rondes contenant un barreau aimanté. La rotation est assurée par un plateau magnétique Cellspin (Integra Biosciences). La mesure des paramètres se fait manuellement. pH mètre Le pH des milieux après préparation et en cours de culture est contrôlé avec un pH mètre (PHM 220) Minissis 5000 Tacussel électronique. 1 E- Culture des cellules Vero en Bio-générateur de 3 litres (ou en Spinner de 250ml) sur microporteurs de type Cytodex1 Des billes de cytodex1 (Pharmacia) sont hydratées pendant 24 heures à raison de 1g de billes pour 50ml environ de tampon phosphate (0,1M, pH= 7,4) suivi de 5 à 10 lavages dans le même tampon jusqu'à ce que le pH du tampon redevienne normal. Les billes sont ensuite stérilisées pendant 1 heure à 121 C sous 1,5-2 bars. Juste avant utilisation les microporteurs sont rincés 2 fois avec le milieu devant être utilisé pour la culture cellulaire avant d'être placés dans un Spinner ou un Bio-générateur à raison de 3g/ litre de milieu. Les cellules Vero prêtes à l'emploi sont ensemencées à raison de 30 à 50 x 103 cellules par cm2 de surface cultivable . Le volume final de milieu correspond au volume recommandé pour le système de culture utilisé (3 litres pour un Bio-générateur, 200 ml pour un Spinner de 250 ml). Selon les cas, le milieu de culture utilisé est constitué du mélange à parties égales du milieu Nephros (Biowhittaker) et du milieu E de Williams auquel est ajouté du PVP 40KD à la concentration finale de 0,1% ou du mélange à parties égales du milieu VPSFM (Life Technology) et du milieu E de Williams auquel est ajouté du PVP 40KD à la concentration finale de 0,1% ou enfin un milieu de culture de référence pour la culture des cellules Vero constitué d'une base ISCOVE auquel est ajouté du sérum de veau donneur à la concentration finale de 4%. L'agitation mécanique du milieu est fixée à environ 30 tours/minutes. Dans le bio-générateur, l'aération de surface est faite par un mélange d'air à 5% de C02 tandis que l'oxygénation est faite en profondeur de façon à avoir au minimum une quantité d'oxygène dissous équivalente environ à 10% dans le milieu. La Culture peut être maintenue dans ces conditions pendant 5 à 7 jours sans changement ou apport de milieu que ce soit en Spinner ou en Bio-générateur. 1 F- Etude des paramètres métaboliques de la culture Le suivi des nutriments essentiels et métabolites est assuré par un système d'analyse Nova Biomedical (Bio Profile 200) mesurant le pH, l'osmolarité du milieu, et les taux de glutamine, de glucose, de glutamate, de lactate, d'ammoniaque et de certains ions tels que le Ca2+, le K+ et le Na+. Cet analyseur nécessite un échantillon de surnageant de milieu de 500 l. Les composés les plus intéressants à suivre sont d'une part le glucose et la glutamine, sources d'énergie de la cellule et d'autre part leurs produits de dégradation que sont le lactate et l'ammoniaque. La mesure de ces éléments permet de contrôler l'état cellulaire de la culture. 1 G- Etude de la croissance cellulaire La croissance cellulaire est évaluée quotidiennement au moyen du nombre de cellules fixées sur les billes par la technique de coloration des noyaux selon la méthode de Sanford K. et al (J. Nat. Cancer Inst., vo1.11, 773- 795 (1951)) et de Van Wezel A. (Microcarrier culture of animal cells. Tissue culture : methods and applications, Kruse P.F. et Patterson M. K., Eds, Académie Press, New York, 372-377 (1973)) Dans un tube de 15 ml, on introduit 5 ml d'un prélèvement homogène d'une culture en biogénérateur ou spinner. Après décantation des billes et élimination du surnageant , les billes colonisées par les cellules sont rincées 2 fois avec un tampon phosphate. Sur le culot du dernier rinçage on rajoute 5ml d'une solution de cristal violet à 0,1%. Au bout d'une incubation de 45 minutes à 37 C, l'acide citrique contenu dans le cristal violet a libéré et coloré tous les noyaux des cellules. La suspension de noyaux est alors homogénéisée par agitation puis les noyaux énumérés sur lame de Fuchs-Rosenthal . Le nombre de noyaux reflète le nombre de cellules fixées sur les microporteurs qui est rapporté au nombre de cellules par ml de milieu. L'incertitude sur la mesure est de +/- 10%. Les résultats des numérations cellulaires exprimées en nombre de cellules/ml sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Tableau 1 Prélèvement N/W NIW+PVP VPSFMIW VPSFMIW ISCOVE +PVP +SVF JO 675000* 675000 405000 405000 405000 J1 307810 1562500 533000 781250 573000 J2 646875 2375000 997000 ND 1430000 J3 868750 3250000 1390000 2006250 1740000 J4 1765625 2906250 1670000 2162500 1950000 J5 1187500 2468750 1800000 1993750 2330000 J6 1023440 2046875 1610000 1887500 1920000 Légendes : JO, J1, J2, J3, J4, J5, J6 représentent les temps de prélèvements pour numération des cellules, le temps JO correspondant à la concentration cellulaire dans le milieu après ensemencement des cellules dans le Bio-générateur, J1 le temps après 24 heures de culture, J2 le temps 48 heures, J3 le temps 72 heures, J4 le temps 96 heures, J5 le temps 120 heures, J6 le temps 144 heures. * : nombre de cellules/ml N/W: Milieu de Néphros (Biowhittaker)/Williams N/W+PVP: Milieu de Néphros (Biowhittaker)/Williams additionné de PVP 40KD à 0,1% VPSFM/W: Milieu VPSFM (Life Technology)/ Williams VPSFM/W+PVP: Milieu VPSFM (Life Technology)/ Williams additionné de PVP 40KD à 0,1% ISCOVE+SVD: Milieu Iscove additionné de 4% de sérum de veau donneur. ND : Non déterminé Conclusions : Bien que les conditions opératoires et les concentrations cellulaires d'ensemencement soient identiques le milieu N/W+PVP augmente la prolifération des cellules Vero et permet d'atteindre des concentrations cellulaires maximales significativement plus importantes que celles obtenues avec le milieu N/W seul (3 25000 à J3 versus 1 765625 à J4). L'index de prolifération constaté avec le milieu N/W +PVP est de 1,84 et est très nettement au dessus de 1,2 (1 +2X0,1 (10% étant l'incertitude sur la mesure précisée dans les conditions expérimentales). On observe également la même tendance avec le milieu VPSFM/W dans lequel le PVP accélère également la croissance cellulaire (l'index de prolifération est de 1,201) . L'action du PVP sur la croissance cellulaire des cellules adhérentes n'est donc pas dépendante du milieu utilisé . De plus le PVP 40 agit d'une façon similaire au Sérum de veau puisque les concentrations cellulaires optimales qui peuvent être atteintes sont équivalentes. Les résultats obtenus avec du PVP 360KD à la concentration finale de 0,5% dans le milieu de culture sont similaires à ceux du PVP 40. Par contre un milieu contenant du PVP 10KD à la concentration finale de 0,1% dans le milieu de culture n'a pas d'effet positif sur la croissance cellulaire. Exemple 2 : Etude de l'action du PVP sur la mortalité cellulaire Les conditions opératoires de l'étude sont identiques à celles développées aux paragraphes 1A à 1 F. La mortalité cellulaire est évaluée quotidiennement au moyen du nombre de cellules mortes ou de la mesure de la LDH (lactate deshydrogénase) retrouvée dans le milieu de culture. La mortalité cellulaire est évaluée au moyen d'une coloration au bleu trypan. A partir d'un prélèvement quotidien de 1 ml de la culture cellulaire on rajoute 1 ml de bleu trypan à 10%. Les cellules mortes qui prennent le colorant sont comptées à l'aide d'une cellule de Fuchs-Rosenthal. L'incertitude sur la mesure est de +/- 10%. Les résultats de mortalité cellulaire, exprimés en nombre de cellules/ml, sont indiqués dans le tableau 2. L'évaluation de la mortalité cellulaire peut être également faite au moyen de la mesure de la lactate deshydrogénase dans le surnageant de culture. En effet, il a été montré qu'une évaluation de la mortalité cellulaire au cours de la fermentation dans les bio-réacteurs peut être réalisée par la mesure de la LDH re larguée dans le surnageant de culture. Un prélèvement quotidien de 0,5 ml est centrifugé à 800tours/minute pendant 5 minutes pour éliminer les cellules. Il est alors incubé avec le mélange de réactifs du kit (Cytoxicity Detection kit (LDH), Boehringer Mannheim, Cat. No 1644 793) selon la procédure décrite dans le coffret. Une augmentation de la mortalité cellulaire ou des lésions membranaires entraîne une augmentation de l'activité LDH se traduisant par une augmentation de la densité optique (ou de coloration) dans l'essai utilisé. Le dosage est réalisé en plaques 96 puits (Evergreen Scientific) à fond plat avec un couvercle de polystyrène non traité. Dans 2 puits on dépose 200 l du surnageant à doser ou des dilutions de celui-ci. On rajoute 100 l de réactif du coffret par puits. Après une incubation de 10 minutes à 37 C dans une étuve sèche on bloque la réaction enzymatique par 50 l d'HCI 1 N. La densité optique (DO) est mesurée à 490nm au moyen d'un lecteur de microplaques (Molecular devices Emax). La précision de la mesure est +/- 10%. Plus la DO est élevée et plus la mortalité cellulaire est importante. Les résultats comparatifs entre les différents milieux testés, exprimés en D.O. de l'échantillon testé, sont regroupés dans le tableau 3. Tableau 2 Prélèvement N/W+PVP VPSFM/W VPSFMIW ISCOVE +PVP +SVF JO N.D. N.D. N.D. N.D. J1 19063 51250 J2 23125 48440 J3 35313 52810 J4 16875 42500 J5 61560 74690 N.D. : non déterminé Tableau 3 Prélèvement N/W+PVP VPSFM/W VPSFMIW ISCOVE +PVP +SVF JO N.D. N.D. N.D. N.D. J1 0,027 0,110 0,028 0,055 J2 0,028 0,230 N.D. 0,073 J3 0,065 0,390 0,066 0,153 J4 0,112 0,510 0,115 0,155 J5 0,140 0,600 0,226 0,268 N.D. : non déterminé Conclusions: Tandis que les résultats obtenus avec des milieux sans sérum ou avec sérum montrent une mortalité cellulaire fluctuant entre 104 et 105 cellules mortes/ml en fonction des temps de prélèvement, ceux obtenus avec des milieux définis additionnés de PVP montrent une diminution très significative de la mortalité cellulaire. Les résultats de mesure de l'activité LDH dans les surnageants de culture montrent également une activité plus faible dans les surnageants de culture provenant de milieux contenant une PVP que ceux n'ayant pas de PVP. On peut noter également que l'activité LDH est plus élevée dans les surnageants de culture issus d'un milieu à base de sérum que celle présente dans des milieux contenant une PVP. Ces résultats corrèlent donc avec ceux de la mortalité cellulaire. On peut donc conclure que les milieux de culture contenant une PVP diminuent très sensiblement la mortalité cellulaire et que cette action est plus importante que celle obtenue avec un milieu à base de sérum de veau. Exemple 3 : Étude de l'action du PVP sur l'adhésion des cellules à leur support Les conditions opératoires de l'étude sont identiques à celles développées aux paragraphes 1A à 1 F. Pour évaluer l'effet d'une PVP sur l'adhésion des cellules on détermine le nombre de cellules qui se son fixées sur le support 4 heures après l'ensemencement du Bio-générateur ou du Spinner selon la technique développée au paragraphe 1G. On considère qu'au bout de 4 heures, les cellules Vero sont toujours dans la même phase de leur cycle cellulaire, ce qui signifie que le nombre de noyaux énumérés correspond au nombre de cellules attachées. L'incertitude sur la mesure est de +/- 10%. Les résultats exprimés en nombre de cellules/ml sont regroupés dans le tableau ci-dessous. Tableau 4 Prélèvement N/W N/W+PVP VPSFM/W VPSFM/W +PVP 0 675000* 675000 405000 405000 4h 453125 787500 394000 439250 Conclusions: Ces résultats montrent clairement que la concentration cellulaire est plus importante au bout de 4 heures lorsque les milieux dépourvus en sérum contiennent une PVP. Exemple 4 : Rôle d'une PVP sur la croissance, l'adhésion et la mortalité des cellules Vero cultivées en flacons roulants. Les cellules Vero telles que décrites dans le paragraphe 1A sont ensemencées dans des flacons roulants de 300ml (Ref: Falcon 3007) à raison de 30000 à 50000 cellules par cm2 de support. Différents milieux de culture définis et non définis exempts de sérum d'origine animale mais contenant une PVP 40KD à 0,1% ont été testés dont ceux décrits dans le paragraphe 1A. Une PVP de 100KD à 0,5% ainsi qu'une PVP de 360KD à 0,05% ont été également testés en utilisant les mêmes milieux de culture. Les flacons roulants contenant les cellules Vero ainsi que les différents milieux de culture mentionnés sont ensuite placés sur des rouleaux dont la vitesse de rotation se situe entre 0.1 tours/mn et 0.5 tours/mn. 4 heures après l'ensemencement des flacons, puis quotidiennement pendant 6 jours, on réalise sur ces flacons roulants une étude de la croissance et de l'adhésion des cellules aux parois du flacon après avoir enlevé le milieu de culture, lavé les flacons avec un tampon phosphate et décollé les cellules avec de la trypsine à 2,5 % (Sigma) diluée au 1/5000 dans un tampon citrate. La numération des cellules se fait à l'aide du bleu trypan. L'étude de la mortalité des cellules a été suivie également sur une période de 5 jours à partir de la mesure de la LDH dans le surnageant de culture. Les résultats de ces études corroborent ceux décrits dans les exemples précédents et indiquent qu'on peut utiliser une PVP ayant des poids moléculaires moyens assez différents mais toutefois supérieurs à 10 KD et dans une large gamme de concentration dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale pour favoriser la prolifération et l'attachement de cellules adhérentes et diminuer très sensiblement la mortalité cellulaire. Exemple 5 : Rôle d'une PVP sur la croissance, l'adhésion et la mortalité des cellules MRC5 cultivées en flacons roulants. Les cellules MRC5 ( Ref: NIBSC (pdl8)) utilisées entre le 20ème et 50ème passage sont ensemencées dans des flacons roulants de 300ml (Ref: Falcon 3007) à raison de 50000 cellules par cm2 de support. Différents milieux de culture définis exempts de sérum d'origine animale mais contenant une PVP 40KD à 0,1 % ont été testés dont ceux décrits dans le paragraphe 1A. Une PVP de 100KD à 0,1% ainsi qu'une PVP de 360KD à 0,05% ont été également testés en utilisant les mêmes milieux de culture. Les flacons roulants contenant les cellules MRC5 ainsi que les différents milieux de culture mentionnés sont ensuite placés sur des rouleaux dont la vitesse de rotation se situe entre 0.1 tours/mn et 0.5 tours/mn. 4 heures après l'ensemencement des flacons, puis quotidiennement pendant 4 jours, on réalise sur ces flacons roulants une étude de la croissance et de l'adhésion des cellules aux parois du flacon après avoir enlevé le milieu de culture, lavé les flacons avec un tampon phosphate et décollé les cellules avec de la trypsine à 2,5 % (Sigma) diluée au 1/5000 dans un tampon citrate. La numération des cellules se fait à l'aide du bleu trypan. L'étude de la mortalité des cellules a été suivie également sur une période de 4 jours à partir de la mesure de la LDH dans le surnageant de culture. Les résultats de ces études correspondent à ceux obtenus avec les cellules Vero et montrent que les effets d'une PVP sur la croissance, la mortalité et l'adhésion cellulaire ne sont pas limités à un seul type cellulaire. Exemple 6 : Influence d'une PVP sur la production de virus polio à partir des cellules Vero infectées 6A- Culture des cellules Les cellules Vero sont cultivées pendant 4 jours sur support plastique dans le milieu de culture défini Nephros(Biowittaker)/Williams additionné ou non de PVP 40KD à 0,1 %. 6B- Infection des cellules Le milieu de culture est ensuite retiré, puis les cellules infectées avec une souche de polio type 3 (sabin VERO 27/09/96 ayant un titre de 109 DICC50/ml) à une multiplicité d'infection de 0,1. Les milieux d'infection et de propagation virale utilisés sont le milieu Nephros (Biowittaker)/ Williams E additionné ou non de PVP 40KD à 0,1 %. On réalise quotidiennement des prélèvements de surnageant de culture (pour mesure de l'activité virale du virus polio sur cellules HEP2) que l'on remplace par une quantité équivalente de milieu neuf identique et qui correspond au milieu de propagation virale utilisé. Ces récoltes se poursuivent jusqu'à la 7ème récolte (R1 à R7) correspondant à la destruction complète de la nappe cellulaire. Le tableau ci-dessous résume les résultats des récoltes effectuées. Les valeurs des titres viraux obtenus sont exprimés en log 10 de la dose infectieuse virale qui induit dans 50% des cas un effet cytotoxique sur la lignée HEP2 (CCID) Tableau 5 Tableau récapitulatif des titres en virus polio type3 selon les récoltes et les milieux de culture utilisés pour la culture des cellules Vero. Milieu R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 N/W+PVP 4,2 5 6,6 5,9 5 5 4,4 N/W 4 5 5 5,5 4,5 4,3 3,8 Conclusions: L'ajout de PVP 40KD à 0,1% au milieu chimiquement défini Néphros williams choisi à titre d'exemple augmente fortement la production de virus polio type 3 par comparaison avec un milieu Néphros williams sans PVP. La présence d'une PVP dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale lors des étapes d'infection et/ou de propagation virale, augmente la production de virus par les cellules infectées. Revendications 1. Utilisation d'une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen entre 20KD et 360KD dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale, pour augmenter la prolifération de cellules animales ou humaines non recombinantes adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. 2. Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle l'index de prolifération des cellules dans ce milieu est supérieur à 1,5. 3. Utilisation polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen entre 20KD et 360KD dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale pour diminuer la mortalité de cellules animales ou humaines adhérentes soumises à un flux d'agitation du milieu. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle la polyvinylpyrrolidone favorise également l'adhésion cellulaire. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle la polyvinylpyrrolidone est non réticulée. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle le milieu de culture a une composition chimiquement définie. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle la polyvinylpyrrolidone a un poids moléculaire moyen de 40 KD. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle le pourcentage de polyvinylpyrrolidone dans le milieu de culture est compris entre 0,01 % et 2%. 9. Utilisation selon la revendication 8 dans laquelle le pourcentage de polyvinylpyrrolidone dans le milieu de culture est de 0,1%. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9 pour la production de cellules humaines ou animales adhérentes non recombinantes en mode batch, feed batch ou par perfusion continue. 11. Utilisation selon la revendication 10 dans laquelle les cellules sont destinées à la production d'agents infectieux à cycle de reproduction intracellulaire strict. 12. Utilisation selon la revendication 11 dans laquelle l'agent infectieux est un virus. 13. Utilisation selon la revendication 10 dans laquelle les cellules sont destinées à la fabrication de compositions antigéniques comprenant tout ou partie des dites cellules. 14. Procédé de production en grande quantité de cellules animales ou humaines non recombinantes adhérentes en vue de la production de virus à usage vaccinal comprenant les étapes suivantes, (i) l'ensemencement d'un bio-générateur avec une suspension de cellules et des microporteurs dans un milieu de culture contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD comme substitut du sérum d'origine animale, (ii) la multiplication des cellules sous agitation pendant au maximum 7 jours dans le même milieu de culture d'ensemencement, (iii) la récolte des cellules à partir des microporteurs. 15. Procédé selon la revendication 14 selon lequel les microporteurs sont constitués par une matrice de dextran (Cytodex1 ). 16. Procédé de production de virus dans lequel l'étape d'infection est réalisée en infectant des cellules animales ou humaines au moyen d'une suspension virale diluée dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale mais contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD. 17. Procédé de production de virus selon la revendication 16 dans lequel les étapes de propagation et de récolte du virus se font dans un milieu de culture dépourvu en sérum d'origine animale mais contenant une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire moyen compris entre 20 KD et 360 KD.