FR 2801609 A1 20010601 FR 9915032 A 19991129 La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, plus particulièrement un procédé d'obtention d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon. L'invention est également relative aux acides nucléiques ou aux collections d'acides nucléiques obtenus selon le procédé et leur application à la synthèse de nouveaux composés, notamment de nouveaux composés d'intérêt thérapeutique. L'invention a également pour objet les moyens nouveaux mis en oeuvre dans le procédé d'obtention d'acides nucléiques ci-dessus, tels que de nouveaux vecteurs et des nouveaux procédés de préparation de tels vecteurs ou encore des cellules hôtes recombinantes comprenant un acide nucléique de l'invention. L'invention concerne encore des procédés pour détecter un acide nucléique d'intérêt au sein d'une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé ci-dessus, ainsi que les acides nucléiques détectés par un tel procédé et les polypeptides codés par de tels acides nucléiques. L'invention a également trait à des acides nucléiques obtenus et détectés selon les procédés ci-dessus, en particulier des acides nucléiques codant pour une enzyme participant à la voie de biosynthèse d'antibiotiques tels que les ss-lactames, les aminoglycosides, les nucléotides hétérocycliques ou encore des polykétides ainsi que l'enzyme codée par ces acides nucléiques, les polykétides produits grâce à l'expression de ces acides nucléiques et enfin des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide produit grâce à l'expression de tels acides nucléiques. Depuis la découverte de la production de la streptomycine par les actinomycètes, la recherche de nouveaux composés d'intérêt thérapeutique, et tout particulièrement de nouveaux antibiotiques, a eu recours de manière accrue à des méthodes de criblage des métabolites produits par les micro-organismes du sol. De telles méthodes consistent principalement à isoler les organismes de la microflore tellurique, à les cultiver sur des milieux nutritifs spécialement adaptés puis à détecter une activité pharmacologique dans les produits retrouvés dans les surnageants de culture ou dans les lysats cellulaires ayant, le cas échéant, subi au préalable une ou plusieurs étapes de séparation et/ou de purification. Ainsi, les méthodes d'isolement et de culture in vitro des organismes constituant la microflore tellurique ont permis, à la date d'aujourd'hui, de caractériser environ 40.000 molécules, dont environ la moitié présente une activité biologique. Des produits majeurs ont été caractérisés selon de telles méthodes de culture in vitro, tels que des antibiotiques (pénicilline, érythromycine, actinomycine, tétracycline, céphalosporine), des anticancéreux, des anticholestérolémiants ou encore des pesticides. Les produits d'intérêt thérapeutique d'origine microbienne connus à ce jour proviennent majoritairement (environ 70%) du groupe des actinomycètes et plus particulièrement du genre Streptomyces. Toutefois, d'autres composés thérapeutiques, tels que les teicoplanines, la gentamycine et les spinosines, ont été isolés à partir de microorganismes de genres plus difficiles à cultiver tels que Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Nocardia, Streptosporangium, Kitasatosporia ou encore Saccharomonospora. Mais la pratique illustre le fait que la caractérisation de nouveaux produits naturels synthétisés par les organismes de la microflore du sol est restée limitée, en partie du fait que l'étape de culture in vitro aboutit le plus souvent à une sélection d'organismes déjà connus antérieurement. Les méthodes de séparation et de culture in vitro des organismes telluriques en vue d'identifier de nouveaux composés d'intérêt présentent donc de nombreuses limites. Chez les actinomycètes, par exemple, le taux de redécouverte d'antibiotiques déjà connus antérieurement est d'environ 99%. En effet, des techniques de microscopie en fluorescence ont permis de dénombrer plus de 1010 cellules bactériennes dans 1g de sol, alors que seulement 0,1à 1 % de ces bactéries peuvent être isolées après ensemencement sur des milieux de culture. A l'aide de techniques de cinétique de réassociation d'ADN, il a pu être montré qu'entre 12. 000 et 18. 000 espèces bactériennes peuvent être contenues dans 1g de sol, alors qu'à ce jour, seuls 5000 microorganismes non eucaryotes ont été décrits, tout habitat confondu. Des études d'écologie moléculaire ont permis d'amplifier et cloner de nombreuses séquences nouvelles d'ADNr 16S à partir d'ADN de l'environnement. Les résultats de ces études ont conduit à tripler le nombre de divisions bactériennes caractérisées antérieurement. A la date d'aujourd'hui, les bactéries sont subdivisées en 40 divisions, certaines d'entre elles n'étant constituées que par des bactéries ne pouvant être cultivées. Ces derniers résultats témoignent de l'ampleur de la biodiversité microbienne restée inexploitée à ce jour. Des travaux récents ont tenté de surmonter les nombreux obstacles à l'accès à la biodiversité de la microflore du sol, dont notamment l'étape de culture in vitro préalable à l'isolement et la caractérisation de composés d'intérêt industriel, surtout d'intérêt thérapeutique. Des méthodes ont ainsi été mises au point qui incluent une étape d'extraction de l'ADN des organismes telluriques, le cas échéant après un isolement préalable des organismes contenus dans les échantillons de sol. L'ADN ainsi extrait, après lyse des cellules bactériennes sans étape préalable de culture in vitro, est cloné dans des vecteurs utilisés pour transfecter des organismes hôtes, afin de constituer des banques d'ADN provenant de bactéries du sol. Ces banques de clones recombinants sont utilisées pour détecter la présence de gènes codant pour des composés d'intérêt thérapeutique ou alternativement pour détecter la production de composés d'intérêt thérapeutique par ces clones recombinants. Toutefois, les méthodes d'accès direct à l'ADN de la microflore du sol, décrites dans l'état de la technique présentent des inconvénients lors de la mise en oeuvre de chacune des étapes décrites ci-dessus, de nature à affecter considérablement la quantité et la qualité du matériel génétique obtenu et exploitable. L'état de la technique concernant chacune des étapes de construction de banques d'ADN provenant d'échantillons de sol est détaillé ci-après, ainsi que les inconvénients techniques identifiés par le demandeur et qui ont été surmontés selon la présente invention. 1. Etape d'extraction de l'ADN à partir d'un échantillon du sol. 1. 1 Extraction directe d'ADN de l'environnement. Il s'agit pour l'essentiel d'un procédé mettant en oeuvre des techniques d'extraction d'ADN réalisées directement sur l'échantillon dans l'environnement, le plus souvent après une lyse in situ préalable des organismes de l'échantillon. De telles techniques ont été mises en oeuvre sur des échantillons provenant de milieux aquatiques, que ce soit d'eau douce ou marine. Elles comprennent une première étape de concentration préalable des cellules présentes librement ou sous forme de particules, consistant en général en une filtration de grands volumes d'eau sur différents dispositifs de filtration, par exemple filtration classique sur membrane, filtration tangentielle ou rotationnelle ou encore ultrafiltration. La taille des pores est comprise entre 0,22 et 0,45 mm et nécessite souvent une préfiltration dans le but d'éviter des colmatages dus au traitement de grands volumes. Dans un second temps, les cellules récoltées sont lysées directement sur les filtres dans des petits volumes de solutions, par traitement enzymatique et/ou chimique. Cette technique est par exemple illustrée par les travaux de STEIN et al. , 1996, Journal of Bacteriology, Vol.178 (3): 591-599 qui décrit le clonage de gènes codant pour de l'ADN ribosomal et pour un facteur d'élongation de la transcription (EF 2) à partir d'Archaebactéries du plancton marin. Des techniques d'extraction directe d'ADN à partir d'échantillons de sol ou de sédiment ont été également décrites, basées sur des protocoles de lyse physique, chimique ou enzymatique réalisée in situ. Par exemple, le brevet US N 5,824,485 (Chromaxome Corporation) décrit une lyse chimique des bactéries directement sur l'échantillon prélevé par addition d'un tampon de lyse chaud à base d'isothiocyanate de guanidium. La demande Internationale n WO 99/20.799 (WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION) décrit une étape de lyse des bactéries in situ à l'aide d'un tampon d'extraction contenant une protéase et du SDS. D'autres techniques ont également été utilisées telles que la réalisation de plusieurs cycles de congélation-décongélation de l'échantillon puis pressage de l'échantillon décongelé à haute pression. Ont été également utilisées des techniques de lyse des bactéries à l'aide d'une succession d'étapes de sonication, de chauffage par micro-ondes et de chocs thermiques (PICARD et al. (1992). Toutefois, les techniques d'extraction directe d'ADN de l'état de la technique décrites ci-dessus ont une efficacité très variable du point de vue quantitatif et qualitatif. Ainsi, les traitements chimiques ou enzymatiques in situ de l'échantillon ont le désavantage de ne lyser que certaines catégories de micro-organismes du fait de la résistance sélective des différents microorganismes indigènes à l'étape de lyse en raison de leur morphologie hétérogène. Ainsi, les bactéries à Gram-positif résistent à un traitement à chaud au détergent SDS alors que la quasi-totalité des cellules à Gramnégatif sont lysées . En outre, certains des protocoles d'extraction directe décrits cidessus favorisent l'adsorption des acides nucléiques extraits sur les particules minérales de l'échantillon, réduisant ainsi significativement la quantité d'ADN accessible. Par ailleurs, si certains protocoles de l'état de la technique divulguent une étape de traitement mécanique pour lyser les microorganismes de l'échantillon prélevé, une telle étape de lyse mécanique est systématiquement effectuée en milieu liquide dans un tampon d'extraction, ce qui ne permet pas une bonne homogénéisation de l'échantillon de départ sous la forme de particules fines permettant une accessibilité maximale à la diversité des organismes présents dans l'échantillon. Des essais de broyage ont également été effectués sur échantillon de sol brut à l'aide de billes de verre, mais la quantité d'ADN extrait était faible. Il a été observé selon l'invention qu'une première étape de lyse mécanique in situ en milieu liquide avait des effets négatifs sur la quantité d'ADN susceptible d'être extrait. La quantité d'ADN directement utilisable pour le clonage dans des vecteurs recombinants est également tributaire des étapes de purification subséquentes à son extraction. Dans l'état de la technique, l'ADN extrait est ensuite purifié, par exemple par l'utilisation de polyvinylpolypyrrolidone, par une précipitation en présence d'acétate d'ammonium ou de potassium, par des centrifugations sur gradient de chlorure de césium, ou encore des techniques chromatographiques, notamment sur support d'hydroxyapatite, sur colonne échangeuse d'ions ou encore tamisage moléculaire ou par des techniques d'électrophorèse sur gel d'agarose. Les techniques de purification d'ADN décrites antérieurement, surtout lorsque celles-ci sont combinées avec les techniques d'extraction d'ADN de l'environnement précitées, sont susceptibles de conduire à une co-purification de l'ADN avec des composés inhibiteurs provenant de l'échantillon initial qui sont difficiles à éliminer. La co-extraction de composés inhibiteurs avec l'ADN nécessite la multiplication du nombre d'étapes de purification ce qui conduit à des pertes importantes de l'ADN initialement extrait et réduit simultanément la diversité du matériel génétique initialement contenu dans l'échantillon, ainsi que sa quantité. Un autre but de l'invention a été de surmonter les inconvénients des protocoles de purification antérieurs et de mettre au point une étape de purification d'ADN permettant de maintenir de manière optimale la diversité de l'ADN de l'échantillon initial, d'une part, et, de favoriser quantitativement son obtention, d'autre part. Tout particulièrement, les améliorations qualitatives et quantitatives à la purification d'ADN sont maximales lorsqu'elles font appel à une combinaison d'un procédé d'extraction direct de l'ADN selon l'invention et d'un procédé de purification ultérieur, comme cela sera décrit ci-après. 1. 2. Extraction indirecte d'ADN de l'environnement. De telles techniques ont recours à une première étape de séparation des différents organismes de la microflore tellurique des autres constituants de l'échantillon de départ, préalablement à l'étape d'extraction de l'ADN proprement dite. Dans l'état de la technique, la séparation préalable d'une fraction microbienne d'un échantillon de sol comprend le plus souvent une dispersion physique de l'échantillon par broyage de ce dernier en milieu liquide, par exemple en utilisant des dispositifs du type Waring Blender ou encore un mortier. Il a également été décrit des dispersions chimiques, par exemple sur des résines échangeuses d'ions ou encore des dispersions à l'aide de détergents non spécifiques tels que le déoxycholate de sodium ou du polyéthylène glycol. Quel que soit le mode de dispersion, l'échantillon solide doit être mis en suspension dans de l'eau, du tampon phosphate ou une solution saline. L'étape de dispersion physique ou chimique peut être suivie d'une centrifugation sur gradient de densité permettant la séparation des cellules contenues dans l'échantillon et des particules de ce dernier, étant entendu que les bactéries ont des densités inférieures à celles de la plupart des particules du sol. L'étape de dispersion physique peut aussi être suivie alternativement d'une étape de centrifugation à faible vitesse ou encore une étape d'élutriation cellulaire. L'ADN peut ensuite être extrait des cellules séparées par toutes les méthodes de lyse disponibles et être purifié par de nombreuses méthodes, y compris les méthodes de purification décrites au paragraphe 1. 1 précédent. Notamment, l'inclusion des cellules dans de l'agarose à bas point de fusion peut être réalisée afin de ménager la lyse. Toutefois, les méthodes décrites dans l'état de la technique connues du demandeur ne donnent pas satisfaction du fait de la présence, dans les fractions contenant l'ADN extrait, de constituants indésirables de l'échantillon de départ ayant une influence significative sur la qualité et la quantité d'ADN final. La présente invention se propose de résoudre les difficultés techniques rencontrées dans les procédés de l'art antérieur comme cela sera décrit ci-après. 2. Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait. Lorsque l'on désire construire une banque d'ADN à partir d'un échantillon de l'environnement, en particulier à partir d'un échantillon de sol, il est avantageux de vérifier la qualité et la diversité de la source d'ADN extrait et purifié préalablement à son insertion dans des vecteurs appropriés. L'objectif d'une telle caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié est d'obtenir des profils représentant les proportions des différents taxons bactériens présents dans cet extrait d'ADN. La caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié permet de déterminer si des artefacts ont été introduits lors de la mise en oeuvre des différentes étapes d'extraction et de purification et, le cas échéant, si la diversité d'origine de l'ADN extrait et purifié est représentative de la diversité microbienne présente initialement dans l'échantillon, notamment dans l'échantillon de sol. A la connaissance du demandeur, il est recouru dans l'état de la technique à des procédés d'hybridation quantitative mettant en oeuvre des sondes oligonucléotidiques spécifiques de différents groupes bactériens, appliqués directement à l'ADN extrait de l'environnement. Malheureusement, une telle approche est peu sensible et ne permet pas de détecter des genres ou des groupes taxonomiques présents en faible abondance. L'état de la technique décrit aussi des procédés de PCR quantitative, telle que la MPN-PCR ou encore la PCR quantitative par compétition. Toutefois, ces techniques présentent d'importants inconvénients. Ainsi, la MPN-PCR est d'une utilisation complexe du fait de la multiplication des dilutions et des répétitions qui la rend inappropriée pour un grand nombre d'échantillons ou de couples d'amorces. Par ailleurs, la PCR quantitative par compétition est d'une mise en oeuvre difficile du fait de la nécessité de construire un compétiteur spécifique à l'ADN cible qui, en outre, n'induit pas de biais ou d'artefacts dans la compétition proprement dite. Il est ainsi proposé selon l'invention un procédé de précriblage d'une banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement qui est à la fois rapide, simple et fiable et permet de tester la qualité de l'ADN préalablement extrait et purifié et de déterminer ainsi l'intérêt de construire une banque de clones préparés à partir de cet ADN purifié de départ. 3. Vecteurs pour le clonage de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement. De nombreux vecteurs ont déjà été décrits dans l'état de la technique afin de cloner de l'ADN préalablement extrait d'un échantillon de l'environnement. Ainsi, selon la description de la demande internationale n WO 99/20.799, peuvent être utilisés des vecteurs viraux, des phages, des plasmides, des phagemides, des cosmides, des phosmides, des vecteurs du type BAC (chromosome artificiel bactérien) ou encore le bactériophage P1, des vecteurs de type PAC (chromosome artificiel basé sur le bactériophage P1), des vecteurs du type YAC (chromosome artificiel de levure), des plasmides de levure ou tout autre vecteur capable de maintenir et d'exprimer de manière stable un ADN génomique. L'exemple 1 de la demande PCT n WO 99/20.799 décrit la construction d'une banque d'ADN génomique par clonage dans un vecteur du type BAC. A la connaissance du demandeur, aucune banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement n'avait encore été effectivement réalisée avec des vecteurs de type conjugatif, une telle technique étant rendue pour la première fois accessible et reproductible par l'homme du métier grâce à l'enseignement de la présente invention. 4. Hôtes cellulaires Dans l'état de la technique, de nombreuses cellules hôtes ont été décrites comme pouvant être utilisées afin d'héberger les vecteurs contenant les inserts d'ADN provenant de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement. Ainsi, la demande PCT N WO 99/20.799 cite de nombreux hôtes cellulaires appropriés, tels que Escherichia coli, en particulier la souche DH 10B ou encore la souche 294 (ATCC 31446, la souche E. coli B, E. Coli X 1776 (ATCC N 31 537), E.coli DH5 a et E.coli W3110 (ATCC n 27.325). Cette demande PCT cite également d'autres cellules hôtes appropriées telles que Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Schigella ou encore des souches du type bacillus telles que B. subtilis et B. licheniformis ainsi que les bactéries du genre Pseudomonas, Streptomyces ou Actinomyces. Le brevet US N 5,824,485 cite en particulier la souche de Streptomyces lividans TK66 ou encore des cellules de levure telles que celles de Saccharomyces pombe. 5. Caractérisation de gènes d'intérêt dans des banques d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement. La demande PCT N WO 99/20.799 décrit une identification du phénotype de différents clones appartenant à la banque d'ADN de B. cereus, respectivement un clone produisant de l'hémolysine, un clone hydrolysant l'esculine ou encore un clone produisant un pigment orange. Des techniques de mutagenèse basées sur l'utilisation d'un transposon codant pour l'enzyme pho A ont permis subséquemment d'isoler des clones mutés et de caractériser les séquences responsables des phénotypes observés. L'article de STEIN et al. (1996) précité décrit l'utilisation d'amorces spécifiques de l'ADN ribosomal afin d'amplifier l'ADN inséré dans les vecteurs hébergés par certains clones d'une banque d'ADN génomique d'Archaebactéries de plancton marin et l'identification de plusieurs séquences codantes dans l'ADN ainsi amplifié. L'article de BORSCHERT S. et al., (1992) décrit le criblage d'une banque d'ADN génomique de Bacillus subtilis à l'aide de couples d'amorces hybridant avec des régions conservées de peptide synthétases connues afin d'identifier un ou plusieurs gènes correspondant dans le génome de Bacillus subtilis. Cette technique a permis de détecter un fragment d'ADN chromosomique d'environ 26 kb portant une partie de l'opéron de biosynthèse de la surfactine. L'article de KAH-TONG S. et al.(1997) décrit le criblage d'une banque d'ADN provenant du sol à l'aide d'amorces hybridant avec des séquences conservées de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse des polykétides de type Il et montre l'identification, au sein de cette banque d'ADN, de séquences apparentées au gène PKS-p. Cet article décrit aussi la construction de cassettes d'expression hybrides dans lesquelles la séquence de la sous-unité PKS-, retrouvée naturellement dans l'opéron responsable de la biosynthèse des polykétides, a été remplacée par différentes séquences apparentées retrouvées dans la banque d'ADN. De même, l'article de HONG-FU et al. , (1995) décrit la construction de cassettes d'expression contenant les différentes phases de lecture ouverte de l'opéron responsable de la biosynthèse des polykétides, les différentes cassettes d'expression ayant été construites artificiellement en combinant les phases de lecture ouverte qui ne sont pas retrouvées ensemble naturellement dans le génome de Streptomyces coelicolor. Cet article montre que la combinaison, dans les cassettes d'expression artificielles, de cadres de lecture ouvert originaires de différentes souches bactériennes permet la production de polykétides ayant différentes caractéristiques structurales et des activités antibiotiques plus ou moins grandes vis-à-vis de Bacillus subtilis et Bacillus cereus. Les polykétides font partie d'une grande famille de produits naturels de structure variable et possédant une grande diversité d'activités biologiques. Font partie des polykétides par exemple, les tétracyclines et l'érythromycine (antibiotiques), le FK506 (immunosuppresseur), la doxorubicine (agent anti-cancéreux), la monensine (un agent coccidiostatique) ainsi que l'avermectine (un agent antiparasitaire). Ces molécules sont synthétisées grâce à des enzymes multifonctionnelles appelées polykétides synthases, qui catalysent des cycles de condensation répétés entre des acyl thioesters (en général des acétyl, propionyl, malonyl ou méthylmalonyl thioesters). Chaque cycle de condensation aboutit à la formation, sur une chaîne croissante carbonée, d'un groupe ss-kéto qui peut ensuite subir, le cas échéant, une ou plusieurs séries d'étapes réductrices. Compte-tenu de l'intérêt clinique important des polykétides, leur mécanisme commun de biosynthèse ainsi que le haut degré de conservation observé entre les groupes de gènes codant pour les polykétides synthases, il s'est développé un intérêt accru pour le développement de nouveaux polykétides par génie génétique. De nouveaux polykétides artificiels ont ainsi été produits par génie génétique, tels que la méderrhodine A ou la dihydrogranatirhodine. La grande majorité des molécules nouvelles de polykétides obtenues par génie génétique sont très différentes, du point de vue structural, des polykétides correspondants naturels. De l'état de la technique, il ressort ainsi qu'il existe un besoin d'obtention de nouveaux polykétides d'intérêt et tout particulièrement de polykétides d'intérêt thérapeutique présentant notamment, par rapport à leurs homologues naturels, un niveau accru d'activité antibiotique ou encore un spectre d'activité antibiotique différent, soit plus large que celui des polykétides connus, soit au contraire plus sélectif. Ce besoin est, comme cela sera décrit ci-après, en partie comblé selon la présente invention. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention concerne tout d'abord un procédé pour la construction de banques d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement, un tel échantillon pouvant être indifféremment un milieu aquatique (eau douce ou marine), un échantillon de sol (couche superficielle du sol, sous-sol ou sédiments), ou encore un échantillon d'organismes eucaryotes contenant une microflore associée, tel que par exemple un échantillon provenant de plantes, d'insectes ou encore d'organismes marins et possédant une microflore associée. La mise au point d'un procédé de construction d'une banque d'ADN d'un échantillon de l'environnement, et tout particulièrement d'un échantillon de sol, comprend des étapes critiques dont la mise en oeuvre doit être nécessairement optimisée pour l'obtention d'une banque d'ADN dont le contenu en acides nucléiques d'intérêt répond aux objectifs initialement fixés. Une première étape critique consiste en l'extraction et la purification ultérieure des acides nucléiques contenus initialement dans l'échantillon, c'est-à-dire principalement des acides nucléiques contenus dans les divers organismes composant la microflore de cet échantillon. La qualité de la purification de l'ADN extrait est déterminante sur le résultat obtenu. Une seconde étape importante d'un procédé de construction d'une banque d'acides nucléiques provenant d'un échantillon de l'environnement est l'évaluation de la diversité génétique des acides nucléiques extraits et purifiés. La mise au point d'une étape de réalisation simple et fiable de pré-criblage de l'ADN extrait et purifié afin de vérifier qu'il rend compte, au moins partiellement, de la diversité phylogénétique des organismes présents initialement dans l'échantillon de départ, permet en effet de déterminer l'intérêt ou non d'utiliser la source initiale d'ADN extrait et purifié pour la construction de la banque d'acides nucléiques proprement dite ou au contraire de ne pas poursuivre la construction de la banque d'acides nucléiques du fait d'artefacts trop importants introduits au moment de l'extraction et de la purification des acides nucléiques. Il a en outre été identifié selon l'invention que la qualité des inserts introduits dans les vecteurs pour construire la banque est déterminante. Il a ainsi été déterminé que l'utilisation d'enzymes de restriction pour cliver l'ADN extrait et purifié à partir de l'échantillon de l'environnement était de nature à introduire des artefacts ou " biais " dans la structure des inserts obtenus. En effet, l'ADN extrait du sol ou d'autres environnements, provenant en très grande majorité d'organismes non cultivables, est composé de molécules dont le taux de bases G et C est par définition inconnu et de plus variable en fonction de l'origine de ces organismes Une troisième étape critique est l'insertion des acides nucléiques extraits et purifiés dans des vecteurs capables d'intégrer des acides nucléiques de longueur choisie, d'une part, et, d'autre part, d'en permettre la transfection ou encore l'intégration dans le génome dans des hôtes cellulaires déterminés ainsi que, le cas échéant, d'en permettre l'expression dans de tels hôtes cellulaires. Constituent des vecteurs d'intérêt, les vecteurs capables d'intégrer des acides nucléiques de grande taille, c'est-à-dire de taille supérieure à 100 kb lorsque l'objectif poursuivi consiste en un clonage et en une identification d'un opéron complet capable de diriger une voie complète de biosynthèse d'un composé d'intérêt industriel, en particulier d'un composé d'intérêt pharmaceutique ou agronomique. DEFINITIONS Au sens de la présente invention, on entend par " acides nucléiques ", " polynucléotides " et " oligonucléotides " aussi bien des séquences d'ADN, d'ARN, que des séquences hybrides ARN/ADN de plus de 2 nucléotides, indifféremment sous la forme simple brin ou double brin. Le terme " banque " ou " collection " est utilisé dans la présente description en référence indifféremment à un ensemble d'acides nucléiques extraits et, le cas échéant purifiés, provenant d'un échantillon de l'environnement, à un ensemble de vecteurs recombinants, chacun des vecteurs recombinants de l'ensemble comprenant un acide nucléique provenant de l'ensemble d'acides nucléiques extraits et, le cas échéant purifiés précités, ainsi qu'à un ensemble de cellules hôtes recombinantes comprenant un ou plusieurs acides nucléiques provenant de l'ensemble des acides nucléiques extraits et, le cas échéant, purifiés précités, lesdits acides nucléiques étant soient portés par un ou plusieurs vecteurs recombinants, soit intégrés dans le génome desdites cellules hôtes recombinantes. On désigne par " échantillon de l'environnement " indifféremment un échantillon d'origine aquatique, par exemple d'eau douce ou saline, ou un échantillon tellurique provenant de la couche superficielle d'un sol, de sédiments ou encore de couches inférieures du sol (sous-sol), ainsi que des échantillons d'organismes eucaryotes, le cas échéant multicellulaires, d'origine végétale, provenant d'organismes marins ou encore d'insectes et possédant une microflore associée, cette microflore associée constituant des organismes d'intérêt. On entend par " opéron " selon l'invention, un ensemble de cadres ouverts de lecture dont la transcription et/ou la traduction est co- régulée par un ensemble unique de signaux de régulation de la transcription et/ou de la traduction. Selon l'invention, un opéron peut également comprendre lesdits signaux de régulation de la transcription et/ou de la traduction. Par " voie métabolique " aux fins de l'invention ou encore " voie de biosynthèse " on entend un ensemble de réactions biochimiques anaboliques ou cataboliques réalisant la conversion d'une première espèce chimique en une seconde espèce chimique. Par exemple, une voie de biosynthèse d'un antibiotique est constituée de l'ensemble des réactions biochimiques convertissant des métabolites primaires en produits intermédiaires des antibiotiques, puis subséquemment en antibiotiques. Par séquence de régulation placée " en phase " (en anglais operably linked) par rapport à une séquence nucléotidique dont l'expression est recherchée, on signifie que la ou les séquences de régulation de la transcription sont localisées, par rapport à la séquence nucléotidique d'intérêt dont l'expression est recherchée, de manière à permettre l'expression de ladite séquence d'intérêt, la régulation de la dite expression étant dépendante de facteurs interagissant avec les séquences nucléotidiques régulatrices. Selon une autre terminologie, on peut dire également que la séquence nucléotidique d'intérêt dont l'expression est recherchée est placée " sous le contrôle " des séquences nucléotidiques régulatrices de la transcription. Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide présent à l'état naturel dans un organisme (virus, bactérie, champignon, levure, plante ou animal) n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé de son environnement naturel ou le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'organisme, est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeure néanmoins à l'état isolé, du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusif de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polypeptide ou un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur. Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1. 4.9 de Mars 1996, BLAST 2. 0.4. de Février 1998 et BLAST 2. 0.6. de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402).Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible. EXTRACTION ET PURIFICATION D'ACIDES NUCLEIQUES PROVENANT D'UN ECHANTILLON DE L'ENVIRONNEMENT. 1. Extraction directe d'acides nucléiques Il a été montré selon la présente invention que, pour l'obtention d'une banque d'acides nucléiques provenant d'organismes contenus dans un échantillon du sol, il était important de créer des conditions dans lesquelles, d'une part, les différents organismes de l'échantillon sont rendus accessibles aux étapes ultérieures d'extraction des acides nucléiques et, d'autre part, que l'étape initiale de traitement de l'échantillon de sol permette une lyse mécanique maximale des organismes de l'échantillon de nature à rendre directement accessibles les acides nucléiques de ces organismes, principalement l'ADN génomique et plasmidique, aux tampons utilisés pour les étapes ultérieures d'extraction. Il a été ainsi démontré selon l'invention qu'une accessibilité maximale des acides nucléiques provenant des micro-organismes d'un échantillon du sol était atteinte par un broyage poussé et à sec de l'échantillon de sol préalablement séché afin d'obtenir des microparticules. Le demandeur a ainsi déterminé que le séchage de l'échantillon de sol préalable à tout traitement ultérieur provoque une diminution significative de la cohésion de l'échantillon de sol brut et favorise en conséquence sa désagrégation ultérieure sous la forme de micro-particules, lorsqu'un traitement par broyage approprié est opéré. De manière surprenante, le demandeur a montré que des microparticules d'échantillons de sol sec réunissaient des propriétés physicochimiques favorables à l'extraction d'une quantité optimale d'acides nucléiques qui, dans leur nature, pouvaient être représentatifs de la diversité génétique des organismes présents initialement dans l'échantillon de sol de départ. Il a été montré en particulier que le procédé d'extraction directe d'acides nucléiques selon l'invention permettait l'extraction d'ADN provenant de micro-organismes rares, tels certains Streptomyces rares ou des micro-organismes sporulés. Par " micro-particules " de l'échantillon de sol aux fins de la présente invention, on entend des particules dérivées de l'échantillon ayant une taille moyenne d'environ 50 m, c'est à dire comprise en moyenne entre 45 et 55 m/. Selon l'invention, les micro-particules sont obtenues à partir d'échantillons de sol préalablement séchés ou dessiqués puis broyés jusqu'à l'obtention de micro-particules de taille moyenne comprise entre 2 m et 50 m, avant remise en suspension dans un milieu tampon liquide des micro-particules obtenus. Un tel milieu tampon liquide peut consister en un tampon d'extraction d'acides nucléiques, en particulier un tampon d'extraction d'ADN conventionnel bien connu de l'homme du métier. Le broyage de l'échantillon de sol en micro-particules a pour double fonction de lyser mécaniquement la majorité des organismes présents dans l'échantillon de sol initial et de rendre accessibles les organismes non lysés par ce traitement mécanique à des étapes facultatives ultérieures de lyse chimique et/ou enzymatique. Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, ledit procédé comprenant une première étape (I-(a)) d'obtention de micro-particules par broyage de l'échantillon de sol préalablement séché ou dessiqué, puis mise en suspension des micro-particules dans un milieu tampon liquide. De manière tout à fait préférée, l'étape de broyage est réalisée à l'aide d'un dispositif à billes d'agate ou de tungstène ou encore à l'aide d'un dispositif à anneaux de tungstène. Ces dispositifs sont préférés car la dureté de matériaux comme l'agate ou le tungstène facilite significativement l'obtention des micro-particules de la taille spécifiée cidessus. Pour cette raison, on ne choisira pas préférentiellement, voire on évitera, un recours à un dispositif de broyage à billes de verre, qui s'est révélé beaucoup moins efficace. Le séchage ou la classification de l'échantillon de sol peut-être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, l'échantillon de sol brut peut être séché à température ambiante pendant une durée de 24 à 48 heures. Comme indiqué précédemment, le milieu tampon liquide peut consister en un milieu d'extraction de l'ADN présent dans les microparticules. On utilisera de manière tout à fait préférée un tampon d'extraction désigné TENP contenant respectivement 50 mM tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCI et 1% (poids/volume) de polyvinylpolypyrrolidone, à pH 9,0. Le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol est en outre caractérisé en ce que l'étape d'obtention de micro-particules par broyage de l'échantillon de sol préalablement séché ou dessiqué est suivie d'une étape I-(b) d'extraction des acides nucléiques présents dans les micro-particules. Il est constant que l'extraction des acides nucléiques est accompagnée d'une co-extraction de composés et/ou de constituants du sol indésirables nécessitant la purification ultérieure des acides nucléiques extraits, une telle étape de purification ultérieure devant être à la fois suffisamment sélective pour permettre l'élimination des composés et/ou constituants du sol indésirables et d'un rendement suffisant pour entraîner une perte faible en quantité de l'ADN préalablement extrait. Il a été montré selon l'invention qu'une étape de purification de l'ADN extrait des micro-particules de l'échantillon de sol répondant aux critères de sélectivité et de rendement définis ci-dessus, comprend un traitement de l'ADN extrait par une combinaison de deux étapes successives de chromatographie, respectivement une chromatographie sur tamis moléculaire et une chromatographie d'échange d'anions. Selon une autre caractéristique du procédé ci-dessus, l'étape 1- (b) d'extraction des acides nucléiques est suivie d'une étape I-(c) de purification des acides nucléiques extraits à l'aide des deux étapes de chromatographie suivantes: - passage de la solution contenant les acides nucléiques sur un tamis moléculaire, puis récupération des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques; - passage des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques sur un support de chromatographie d'échange d'anions, puis récupération des fractions d'élution contenant les acides nucléiques. La nature et l'ordre des étapes de chromatographie ci-dessus sont essentiels à une bonne sélectivité et un excellent rendement de l'étape de purification de l'ADN préalablement extrait des micro-particules de l'échantillon du sol préalablement séché ou dessiqué. De manière très avantageuse, le support chromatographique du type " tamis moléculaire " de l'étape de purification d'acides nucléiques cidessus consiste en un support chromatographique de type Sephacryl# S400 HR ou un support chromatographique de caractéristiques équivalentes. De manière tout à fait préférée, le support chromatographique d'échange d'anions utilisé lors de la seconde étape de purification de l'ADN extrait est un support de type Elutip d, ou un support chromatographique de caractéristiques équivalentes. En combinant les étapes I-(a) d'obtention de micro-particules de l'échantillon de sol sec, I-(b) d'extraction des acides nucléiques présents dans les micro-particules et I-(c) de purification par les étapes chromatographiques décrites ci-dessus, il a été possible selon l'invention d'extraire directement l'ADN du sol sans purification préalable des cellules des organismes contenus initialement dans l'échantillon, tout en évitant la co-extraction de contaminants du sol, tels que par exemple les acides humiques qui est observée avec les procédés de l'état de la technique. Les contaminants, tels que les acides humiques affectent sévèrement les analyses et les utilisations subséquentes des acides nucléiques dont la purification est recherchée. Selon le procédé ci-dessus, il est en outre possible d'accéder aux acides nucléiques contenus dans les organismes qui n'ont pas été lysés mécaniquement au cours de l'étape I-(a) d'obtention de microparticules de l'échantillon de sol, dans le but d'obtenir une collection quasi-exhaustive de la diversité génétique des acides nucléiques présents initialement dans l'échantillon de sol. Ainsi, les micro-particules de l'échantillon de sol peuvent faire l'objet d'étapes ultérieures de traitement de lyse chimique, enzymatique ou physique, ou encore d'une combinaison de traitements chimiques, enzymatiques ou physiques. Selon un premier aspect, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol selon l'invention, peut être en outre caractérisé en ce que l'étape I-(a) est suivie des étapes suivantes: # traitement de la suspension de sol dans un milieu tampon liquide par sonication; # extraction et récupération des acides nucléiques. De manière préférée, on aura recours, pour un traitement par sonication, à un dispositif de type à micro-pointe en titane, tel que le dispositif 600 W Vibracell Ultrasonicator commercialisé par la Société Bioblock ou encore un sonicateur de type Cup Horn. De manière tout à fait préférée, l'étape de sonication est réalisée à une puissance de 15 W pendant une durée de 7 à 10 min et comprend des cycles successifs de sonication, la sonication proprement dite étant réalisée pendant 50% de la durée de chaque cycle. Selon un second aspect, le procédé ci-dessus peut être en outre caractérisé en ce que l'étape I-(a) est suivie des étapes suivantes: # traitement de la suspension de sol dans un milieu tampon liquide par sonication; # incubation de la suspension à 37 C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase; # addition de SDS avant centrifugation et précipitation des acides nucléiques; # récupération des acides nucléiques précipités. De préférence, l'étape d'incubation en présence de lysozyme et d'achromopeptidase sera réalisée à une concentration finale de 0,3 mg/ml de chacune des deux enzymes, préférentiellement pendant 30 minutes à 37 C. De manière préférée, le SDS sera utilisé à une concentration finale de 1% et pendant un temps d'incubation de 1 heure à la température de 60 C avant centrifugation et précipitation. Selon un troisième aspect, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol ci-dessus est en outre caractérisé en ce que l'étape I-(a) est suivie des étapes suivantes : - homogénéisation de la suspension de sol avec une étape de mixage violent (vortex) suivie d'une étape de simple agitation; - congélation de la suspension homogène suivie d'une décongélation ; - traitement par sonication de la suspension après décongélation; - incubation de la suspension à 37 C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase; - addition de SDS avant centrifugation et précipitation des acides nucléiques; - récupération des acides nucléiques. De manière préférée, les suspensions de micro-particules de sol sont passées au vortex puis homogénéisées par une agitation douce sur un agitateur à rotation circulaire pendant une durée de deux heures avant d'être congelées à -20 C. Préférentiellement, les suspensions sont à nouveau agitées violemment par vortex pendant 10 minutes, après décongélation et avant l'étape de sonication. Il va sans dire que les acides nucléiques extraits par les modes de réalisation du procédé d'extraction directe d'acides nucléiques décrit cidessus sont préférentiellement purifiés selon l'étape de purification constituée d'un premier passage sur tamis moléculaire puis un passage subséquent des fractions d'élution obtenues à l'issue de la chromatographie sur tamis moléculaire sur un support chromatographique d'échange d'anions. 2. Extraction indirecte des acides nucléiques Selon un second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, selon l'invention, ledit échantillon de l'environnement subit un premier traitement de nature à permettre la séparation des organismes, contenus dans cet échantillon, des autres macro-constituants de l'échantillon. Ce second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention favorise l'obtention d'acides nucléiques de grande taille, qui sont pratiquement impossibles à obtenir selon le premier mode de réalisation du procédé selon l'invention décrit ci-dessus, l'étape de lyse mécanique opérée pour l'obtention des micro-particules ayant également pour effet de casser physiquement les acides nucléiques de l'échantillon de sol ou des acides nucléiques contenus dans les organismes de l'échantillon de sol. L'obtention d'acides nucléiques de grande taille a été recherchée par le demandeur dans le but d'isoler et de caractériser les acides nucléiques comprenant, au moins partiellement, l'ensemble des séquences codantes appartenant à un même opéron capable de diriger la biosynthèse d'un composé d'intérêt industriel. De manière préférée, on obtient, en mettant en oeuvre le second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol selon l'invention , des acides nucléiques ayant une taille supérieure à 100 kb, de préférence supérieure à 200,250 ou 300 kb, et de manière tout à fait préférée d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 400,500 ou encore 600 kb. Ce second mode de réalisation d'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement selon l'invention est constitué d'une combinaison de quatre étapes successives destinées à l'obtention des acides nucléiques ayant les caractéristiques décrites ci-dessus. Lorsque l'échantillon de l'environnement est un échantillon de sol, il a été montré selon l'invention qu'une première étape d'obtention d'une suspension par dispersion de l'échantillon de sol en milieu liquide favorisait l'accessibilité des organismes contenus dans l'échantillon sans provoquer de lyse mécanique significative des cellules. La première étape d'obtention d'une dispersion de l'échantillon de sol ci-dessus rend accessibles les organismes de l'échantillon au milieu extérieur et permet également une dissociation partielle des organismes de l'échantillon et des macro-constituants. Elle rend ainsi possible une séparation ultérieure des organismes contenus initialement dans l'échantillon des autres constituants de ce dernier. Lorsque l'échantillon de l'environnement provient par exemple de végétaux, d'organismes marins ou d'insectes, un traitement préalable par broyage est nécessaire afin de rendre les organismes de la microflore associée accessible aux étapes ultérieures du procédé. Ainsi, le présent procédé comprend une étape de séparation des organismes des autres constituants minéraux et/ou organiques obtenus précédemment par une centrifugation sur un gradient de densité. Les organismes ainsi séparés sont ensuite soumis à une étape de lyse puis d'extraction des acides nucléiques . L'étape de centrifugation sur un gradient de densité a, de manière surprenante, permis de séparer les cellules d'organismes des particules de sol contenues dans la suspension de l'échantillon. On aurait en effet pu s'attendre à ce qu'une proportion des cellules soient entraînées avec les macro-particules au sein de la phase de gradient. En outre, il n'avait jamais été démontré jusqu'à présent qu'une centrifugation sur gradient de densité d'un échantillon de sol permettait de retrouver, à l'interface phase aqueuse/gradient, une population d'organismes représentative de la diversité des organismes présents dans l'échantillon de départ, du fait que ces organismes sont de volume, densité et forme extrêmement variables. On pouvait raisonnablement supposer qu'ils seraient retrouvés indifféremment au sein de la phase aqueuse, à l'interface phase aqueuse/gradient de densité et également au sein du gradient de densité lui-même. Ainsi, l'homme du métier pouvait s'attendre à ce que des organismes présentant des densités plus faibles ou plus grandes que la densité du gradient de densité utilisé (densité du gradient de densité comprise entre 1,2 et 1,5 g/ml , préférentiellement 1,3 g/ml) ne pouvait être récupérés, ce qui aurait eu pour effet d'introduire un biais dans la représentativité des organismes effectivement séparés et, par voie de conséquence, également dans la diversité des acides nucléiques extraits. En outre, dans un mode de réalisation particulier du procédé, une étape de germination des spores, en particulier d'actinomycètes, est réalisée, ce qui a pour effet d'accroître de manière significative la quantité d'ADN d'actinomycètes récupérée. La dernière étape consiste en une étape de purification des acides nucléiques ainsi extraits sur un gradient de chlorure de césium. De manière surprenante, la purification des acides nucléiques sur le gradient de chlorure de césium permet une élimination substantielle, voire complète, des substances composant le gradient de densité. Cette caractéristique est déterminante en ce qui concerne l'utilisation ultérieure des acides nucléiques purifiés car le gradient de densité est connu comme un puissant inhibiteur enzymatique, capable le cas échéant d'inhiber l'activité catalytique des enzymes utilisées pour préparer l'insertion des acides nucléiques extraits dans des vecteurs. Selon ce second mode de réalisation, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement contenant des organismes selon l'invention comprend la succession d'étapes suivantes: (i) obtention d'une suspension par dispersion de l'échantillon de l'environnement en milieu liquide puis homogénéisation de la suspension obtenue par agitation douce; (ii) séparation des organismes des autres constituants minéraux et/ou organiques de la suspension homogène obtenue à l'étape (i) par centrifugation sur un gradient de densité; (iii) lyse des microorganismes séparés à l'étape (ii) et extraction des acides nucléiques ; (iv) purification des acides nucléiques sur un gradient de chlorure de césium . Préférentiellement, la suspension de l'échantillon de sol est obtenue par dispersion de cet échantillon par broyage à l'aide d'un dispositif de type Waring Blender ou un dispositif de caractéristiques équivalentes. De manière tout à fait préférée, la suspension d'échantillon est obtenue après trois broyages successifs d'une durée d'une minute chacun dans un dispositif de type Waring Blender. De préférence, l'échantillon broyé sera refroidi dans la glace entre chacun des broyages. De manière préférée, les organismes sont ensuite séparés des particules du sol par centrifugation sur un coussin de densité du type " Nycodenz ", commercialisé par la Société Nycomed Pharma AS. (Oslo , Norvège). Les conditions préférées de centrifugation sont de 10.000g pendant 40 minutes à 4 C, avantageusement dans un rotor à godets mobiles du type " rotor TST 28.38 " commercialisé par la Société KONTRON. L'anneau d'organismes localisé, après centrifugation, à l'interphase de la phase supérieure aqueuse et de la phase inférieure de Nycodenz est alors prélevé et lavé par centrifugation avant reprise du culot cellulaire dans un tampon approprié. L'étape (iii) de lyse des organismes séparés à l'étape (ii) décrite ci-dessus peut être réalisée de toute manière connue de l'homme du métier. Avantageusement, les cellules sont lysées dans une solution Tris 10 mM-EDTA 100mM à pH 8. 0 en présence de lysozyme et d'achromopeptidase, avantageusement pendant une heure à 37 C. L'extraction proprement dite de l'ADN peut être avantageusement réalisée par addition d'une solution de lauryl sarcosyl (1% du poids final de la solution) en présence de protéinase K et incubation de la solution finale à 37 C pendant 30 minutes. Les acides nucléiques extraits à l'étape (iii) sont ensuite purifiés sur un gradient de chlorure de césium. Préférentiellement, l'étape de purification des acides nucléiques sur un gradient de chlorure de césium est réalisée par centrifugation à 35.000 tours/minute pendant 36 heures, par exemple sur un rotor du type Kontron 65.13. Selon un aspect particulier du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention, lesdits acides nucléiques sont constitués majoritairement, sinon exclusivement, de molécules d'ADN. Selon un autre aspect, les acides nucléiques peuvent être récupérés après inclusion des organismes, séparés sur un gradient de densité, dans un bloc d'agarose et lyse, par exemple chimique et/ou enzymatique, des organismes inclus dans le bloc d'agarose. Un autre objet de l'invention consiste en une collection d'acides nucléiques constitués des acides nucléiques obtenus à l'étape II-(iv) du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention ou encore obtenue à l'étape (c) ou une étape ultérieure du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention. L'invention est encore relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il est contenu dans une collection d'acides nucléiques telle que définie ci-dessus. Selon un premier aspect, un tel acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant au moins un opéron, ou une partie d'un opéron. De manière tout à fait préférée, un tel opéron code pour la totalité ou une partie d'une voie métabolique. L'exemple 9 décrit la construction d'une banque d'ADN génomique à partir d'une souche de Streptomyces alboniger et son clonage respectivement dans les cosmides navettes pOS7001 et pOS700R. Il a été montré selon l'invention que dans la banque d'ADN réalisée dans le vecteur intégratif pOS7001 neuf clones contiennent des séquences nucléotidiques appartenant à l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine. De même, il a pu être identifié au sein de la banque d'ADN réalisée dans le vecteur réplicatif pOS 700R douze clones contenant des séquences nucléotidiques de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine. En particulier, certains cosmides intégratifs et replicatifs des banques réalisées présentent, après digestion par les endonucléases de restriction ClaI et EcoRV, un fragment d'une taille de 12 kb susceptible de contenir la totalité des séquences de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine. Ainsi, selon un autre aspect, un acide nucléique selon l'invention contient, au moins en partie, des séquences nucléotidiques de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromicyne. L'exemple 2 ci-après décrit la construction d'une banque d'ADN selon un procédé conforme à la présente invention dans un vecteur pBluescript SK- à partir d'un sol contaminé par du lindane. Les vecteurs recombinants ont été transfectés dans des cellules d'Escherichia coli DH10B puis les cellules transformées ont été cultivées dans un milieu de culture approprié en présence de lindane. Un criblage des clones de cellules transformées de la banque a permis de montrer que, sur 10.000 clones criblés, 35 d'entre eux présentaient un phénotype de dégradation du lindane . La présence du gène linA chez ces clones a pu être confirmée par amplification PCR grâce à des amorces spécifiques de ce gène. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention concerne également un acide nucléique contenant une séquence nucléotidique de la voie métabolique provoquant la biodégradation du lindane. Il est donc clairement démontré, comme décrit plus haut, qu'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention ainsi qu'un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants contenant les acides nucléiques constitutifs de la collection d'acides nucléiques précités était tout à fait apte à l'isolement et à la caractérisation de séquences nucléotidiques incluses dans un opéron. Une démonstration supplémentaire de l'aptitude d'un procédé selon l'invention à l'identification de séquences nucléotidiques codantes impliquées dans une voie de biosynthèse régulée sous la forme d'un opéron est en outre décrite plus loin: il s'agit du clonage et de la caractérisation de séquences codant pour des polykétides synthases impliquées dans la voie de biosynthèse des polykétides, qui appartiennent à une famille de molécules dont certains représentants sont d'un intérêt thérapeutique majeur, en particulier antibiotique. La présente invention a donc en outre pour objet un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la totalité d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide. Selon un premier aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est d'origine procaryote. Selon un second aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention provient d'une bactérie ou d'un virus. Selon un troisième aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est d'origine eucaryote. En particulier, un tel acide nucléique est caractérisé en ce qu'il provient d'un champignon, d'une levure, d'une plante ou d'un animal. CARACTERISATION MOLECULAIRE DE LA COLLECTION D'ACIDES NUCLEIQUES EXTRAITS DU SOL. Afin de surmonter les nombreux inconvénients techniques des méthodes de caractérisation des banques d'ADN extraits et purifiés à partir d'un échantillon de l'environnement qui ont été décrits dans la partie de la description relative à l'état de la technique, le demandeur a mis au point un procédé simple et fiable permettant de caractériser qualitativement et semi-quantitativement les acides nucléiques obtenus à l'issue du procédé décrit ci-dessus. Le procédé selon l'invention consiste ainsi à amplifier universellement un fragment de 700 pb localisé à l'intérieur d'une séquence d'ADN ribosomal de type 16 S, puis d'hybrider l'ADN amplifié avec une sonde oligonucléotidique de spécificité variable et enfin de comparer l'intensité d'hybridation de l'échantillon par rapport à une gamme étalon externe d'ADN de séquence ou d'origine connue. L'amplification préalable à l'hybridation avec la sonde oligonucléotidique permet de quantifier des genres ou des espèces de micro-organismes peu abondants. De plus, l'amplification par des amorces universelles permet, lors de l'hybridation, d'utiliser une large série de sondes oligonucléotidiques. Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques, et tout particulièrement d'une collection d'acides nucléiques provenant d'un échantillon de l'environnement, préférentiellement d'un échantillon du sol, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: - mise en contact des acides nucléiques de la collection d'acides nucléiques à tester avec un couple d'amorces oligonucléotidiques hybridant à toute séquence d'ADN ribosomal 16 S bactérien; - réalisation d'au moins trois cycles d'amplification ; - détection des acides nucléiques amplifiés à l'aide d'une sonde oligonucléotidique ou d'une pluralité de sondes oligonucléotidiques, chaque sonde hybridant spécifiquement avec une séquence d'ADN ribosomal 16 S commune à un règne, un ordre, une sous-classe ou un genre bactérien; - le cas échéant, comparaison des résultats de l'étape de détection précédente avec les résultats de détection, à l'aide de la sonde ou de la pluralité de sondes d'acides nucléiques de séquence connue constituant une gamme étalon. De manière préférée, un premier couple d'amorces hybridant avec des régions universellement conservées du gène de l'ARN ribosomal 16 S est constitué respectivement des amorces FGPS 612 (SEQ ID N 12) et FGPS 669 (SEQ ID N 13). Un second mode de réalisation d'un couple d'amorces préféré selon l'invention est constitué du couple d'amorces universelles 63 f (SEQ ID N 22) et 1387r (SEQ ID N 23). Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques d'une collection d'acides nucléiques, l'étape d'amplification à l'aide d'un couple d'amorces universelles peut être réalisée sur une collection de vecteurs recombinants dans chacun desquels a été inséré un acide nucléique de la collection d'acides nucléiques considérée, préalablement à l'étape d'hybridation avec les sondes oligonucléotidiques spécifiques d'un règne, d'un ordre, d'une sous-classe ou d'un genre bactérien particulier. Un tel procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques contenus dans une collection est tout particulièrement applicable aux collections d'acides nucléiques obtenus conformément à l'enseignement de la présente description. Ainsi, l'exemple 3 détaille un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes comprenant une étape d'extraction indirecte d'ADN par dispersion d'un échantillon du sol préalablement à la séparation des cellules sur gradient de Nycodenz, lyse des cellules puis purification de l'ADN sur gradient de chlorure de césium. La collection d'acides nucléiques ainsi obtenue a été utilisée telle quelle ou sous la forme d'inserts dans des vecteurs de type cosmide dans un procédé d'amplification à l'aide des amorces universelles de l'ADNr 16 S précitées, puis les ADN amplifiés ont été soumis à une étape de détection à l'aide de sondes oligonucléotidiques de séquences SEQ ID N 14 à SEQ ID N 21 qui sont présentées dans le tableau 4. Les résultats montrent qu'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention permet d'accéder à l'ADN de plus de 14% de la microflore tellurique totale, soit 2 x 108 cellules par gramme de sol, alors que la microflore totale cultivable ne représente qu'à peine 2% de la population microbienne totale. Afin de déterminer la diversité phylogénétique d'une collection d'acides nucléiques préparés conformément à l'invention, 47 séquences du gène ARNr 16S ont été isolées et séquencées. Ces séquences correspondent respectivement aux séquences nucléotidiques SEQ ID N 60 à SEQ ID N 106. Les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID N 60 à SEQ ID N 106 font également partie de l'invention, ainsi que les acides nucléiques possédant au moins 99 %, préférentiellement 99,5% ou 99,8% d'identité en acides nucléiques avec les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID N 60 à SEQ ID N 106. De telles séquences peuvent être utilisées notamment en tant que sondes pour cribler des clones d'une banque d'ADN et identifier ainsi ceux , parmi les clones de la banque, qui contiennent de telles séquences, ces séquences étant suceptibles d'être à proximité de séquences codantes d'intérêt, telles que des séquences codant pour des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de métabolites antibiotiques, par exemple des polykétides. La comparaison des séquences d'ARNr 16S à partir d'une banque d'ADN réalisée conformément à l'invention avec les séquences répertoriées dans la base données RDP (Maidak B.L., Cole J. R., Parker C. T., Garrity G.M., Larsen N., Li B., Lilburn T. G., McCaughey, M. J., Olsen G.J., Overbeek R., Pramanik S., Schmidt T.M., Tiedje J. M., Woese C. R. (1999) " A new projet of the RDP (Ribosomal Database Project) " Nucleic Acids Research Vol. 27 : 171-173) ont permis de déterminer que les acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques selon l'invention proviennent d'a-protéobactéries, de -protéobactéries, de 8protéobactéries, de y-protéobactéries, d'actinomycètes ainsi que d'un genre apparenté à acidobactérium. Ces résultats, présentés dans le tableau 7 ainsi que par l'arbre phylogénétique de la figure 7 rendent compte de la grande diversité phylogénétique des acides nucléiques contenus dans une banque d'ADN préparée conformément au procédé selon l'invention. VECTEURS DE CLONAGE ET/OU D'EXPRESSION Chacun des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques préparés conformément à l'invention peut être inséré dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. A cette fin, tous types de vecteurs connus de l'état de la technique peuvent être utilisés, tels que des vecteurs viraux , des phages, des plasmides, des phagemides, des cosmides, des phosmides, des vecteurs de type BAC, des bactériophages P1 , des vecteurs de type BAC, des vecteurs de type YAC, des plasmides de levure ou encore tout autre vecteur connu de l'état de la technique par l'homme du métier. On aura avantageusement recours selon l'invention à des vecteurs permettant une expression stable des acides nucléiques d'une banque d'ADN. A cette fin, de tels vecteurs incluent préférentiellement des séquences de régulation de la transcription qui sont localisées en phase (" operably linked ") avec l'insert génomique de manière à permettre l'initiation et/ou la régulation de l'expression d'au moins une partie dudit insert d'ADN. Il résulte de ce qui précède, que l'invention concerne encore un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants caractérisé en ce que les acides nucléiques obtenus à l'étape Il-(iv) ou à l'étape I-(c) ou toute autre étape ultérieure d'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention sont insérés dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. Préalablement à leur insertion dans un vecteur de clonage et/ou d'expression, les acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être séparés en fonction de leur taille, par exemple par électrophorèse sur un gel d'agarose, le cas échéant après digestion à l'aide d'une endonucléase de restriction. Selon un autre aspect, la taille moyenne des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention peut être rendue d'une taille sensiblement uniforme par la mise en oeuvre d'une étape de rupture physique préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression. Une telle étape de rupture physique ou mécanique des acides nucléiques peut consister en des passages successifs de ces derniers, en solution, dans un canal métallique d'environ 0,4 mm de diamètre, par exemple le canal d'une aiguille de seringue ayant un tel diamètre. La taille moyenne des acides nucléiques peut dans ce cas être comprise entre 30 et 40 kb de longueur. La construction des vecteurs préférés selon l'invention est shématisée dans les figures 25 (cosmide intégrarif conjugatif) et 26 (BAC intégratif ). Des vecteurs de clonage et/ou d'expression pouvant être avantageusement utilisés aux fins d'insertion des acides nucléiques contenus dans une collection ou banque d'ADN selon l'invention sont notamment les vecteurs décrits dans le brevet européen N EP-0 350 341 et dans le brevet US N 5 688 689, de tels vecteurs étant spécialement adaptés à la transformation de souches d'actinomycètes. De tels vecteurs contiennent, outre une séquence d'ADN de l'insert, une séquence d'attachement att ainsi qu'une séquence d'ADN codant pour une intégrase (séquence int) fonctionnelle dans les souches d'actinomycètes. Toutefois, il a été observé selon l'invention que certains vecteurs de clonage et/ou d'expression présentaient des inconvénients et que leur capacité fonctionnelle théorique n'était pas atteinte dans la pratique. Ainsi, il est apparu que le système d'intégration contenu dans des vecteurs de l'état de la technique, et notamment dans les vecteurs décrits dans le brevet européen n EP 0 350 41 ne permettait pas en réalité une bonne intégration de l'insert d'ADN de la banque au sein du chromosome bactérien. Partant de l'hypothèse que les déficits fonctionnels d'intégration de tels vecteurs au sein du chromosome bactérien étaient dus à un défaut dans l'expression du gène de l'intégrase présent dans ces vecteurs, le demandeur a tout d'abord cherché à augmenter l'expression du gène de l'intégrase en substituant au promoteur de la transcription initial un promoteur de la transcription susceptible d'augmenter significativement le nombre de transcrits de l'intégrase. Les résultats ont été décevants et la fonction d'intégration au chromosome de ces vecteurs n'a pas été améliorée. De manière surprenante, il a été montré selon l'invention que les difficultés d'expression de l'intégrase contenues dans cette famille de vecteurs intégratifs ne se situait pas au niveau de la quantité d'expression des transcrits, mais au niveau de leur stabilité. Selon une seconde hypothèse, le demandeur a pu montrer que le défaut de stabilité des transcrits de l'intégrase était causé par des déficits dans la terminaison de la transcription de l'ARN messager correspondant. Le demandeur a alors inséré un site terminateur placé en aval de la séquence codant pour l'intégrase du vecteur de manière à obtenir un ARN messager de taille déterminée. L'insertion d'un signal de terminaison additionnel en aval de la séquence nucléotidique codant pour l'intégrase du vecteur a permis l'obtention d'une famille de vecteurs intégratifs de type cosmide et de type BAC . Préférentiellement, le site terminateur est placé en aval du site d'attachement att. En outre, le demandeur a mis au point de nouveaux vecteurs conjugatifs et de nouveaux vecteurs réplicatifs du type cosmide et de nouveaux vecteurs conjugatifs de type BAC qui peuvent avantageusement être utilisés pour l'insertion des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques préparés selon le procédé de l'invention. Lorsque l'insertion de fragments d'ADN de taille moyenne est recherchée, on utilise préférentiellement des vecteurs du type cosmide, capables de recevoir des inserts ayant une taille maximale d'environ 50 kb. De tels vecteurs cosmidiques sont tout particulièrement adaptés pour l'insertion d'acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé de l'invention comprenant une première étape d'extraction directe d'ADN par lyse mécanique des organismes contenus dans l'échantillon de sol initial. Lorsque l'insertion d'acides nucléiques de grande taille, en particulier d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 100 kb, voire supérieure à 200, 300, 400,500 ou 600 kb est recherchée, on aura alors recours préférentiellement à des vecteurs du type BAC capables de recevoir des inserts d'ADN d'une telle taille. De tels vecteurs de type BAC sont tout particulièrement adaptés pour l'insertion des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques obtenus conformément au procédé selon l'invention dans lequel la première étape est constituée d'une extraction indirecte de l'ADN par séparation préalable des organismes contenus dans l'échantillon de sol initial et élimination des macro-constituants dudit échantillon de sol. En particulier, des vecteurs du type BAC sont avantageusement mis en oeuvre pour l'insertion d'acides nucléiques de grande taille contenant, au moins partiellement, la séquence nucléotidique d'un opéron. Ainsi, le procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression selon l'invention est en outre caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type plasmide. Selon un autre aspect, un tel procédé est caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type cosmide. Selon un premier aspect, il peut s'agir d'un cosmide réplicatif chez E.coli et intégratif chez Streptomyces. Un vecteur cosmidique tout à fait préféré répondant à une telle définition est le cosmide pOS7001 décrit à l'exemple 3. Selon encore un autre aspect, le vecteur cosmidique est conjugatif et intégratif chez Streptomyces. De manière générale, des vecteurs conjugatifs de type cosmide ou de type BAC, qui comprennent dans leurs séquences nucléotidiques un motif reconnu par la machinerie enzymatique cellulaire appelé " origine de conjugaison " sont utilisés chaque fois que l'on veut éviter un recours à des techniques de transformation lourdes et peu automatisables. Par exemple, la transfection de vecteurs initialement hébergés par des cellules de E.coli dans des cellules de Streptomyces nécessite classiquement une étape de récupération du vecteur recombinant contenu dans les cellules de Escherichia coli, et sa purification préalable à l'étape de transformation de protoplastes de Streptomyces. Il est communément admis qu'une transfection d'un ensemble de 1000 clones de Escherichia coli dans Streptomyces requiert l'obtention d'environ 8000 clones pour que chaque clone de E. coli ait une chance d'être représenté. A l'inverse, une étape de transfection par conjugaison d'un vecteur hébergé par E.coli vers des cellules de Streptomyces nécessite le même nombre de clones de chacun des micro-organismes, l'étape de conjugaison ayant lieu " clone à clone " et ne comprenant en outre pas les difficultés techniques liées à l'étape de transfert de matériel génétique par transformation de protoplastes, par exemple en présence de polyéthylène glycol. Afin d'optimiser la construction de banque d'ADN chez Streptomyces, il a été mis au point selon l'invention, de nouveaux vecteurs conjugatifs de type cosmide et de type BAC de nature à permettre une efficacité maximale de l'étape de conjugaison. Notamment, les nouveaux vecteurs conjugatifs selon l'invention ont été construits en plaçant un gène marqueur de sélection à l'extrémité de l'ADN du vecteur qui est transféré à la bactérie réceptrice en dernier lieu.Ce perfectionnement aux vecteurs conjugatifs de l'état de la technique permet de ne sélectionner positivement que les bactéries réceptrices ayant reçu la totalité de l'ADN du vecteur et, en conséquence, la totalité de l'ADN de l'insert d'intérêt. Un cosmide conjugatif et intégratif chez Streptomyces préféré selon l'invention est le cosmide pOSV303 décrit à l'exemple 5. Selon un autre aspect, un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants selon l'invention est mis en oeuvre à l'aide d'un cosmide réplicatif à la fois chez E.coli et chez Streptomyces. Un tel cosmide est avantageusement le cosmide pOS 700R décrit à l'exemple 6. Selon encore un autre aspect, le procédé ci-dessus peut être mis en oeuvre avec un cosmide réplicatif chez E. coli et Streptomyces et conjugatif chez Streptomyces. Un tel cosmide réplicatif et conjugatif peut être obtenu à partir d'un cosmide réplicatif conforme à l'invention, par l'insertion d'une origine de transfert appropriée, telle que RK2, comme décrit à l'exemple 5 pour la construction du vecteur pOSV303. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants selon l'invention, on a recours à un vecteur de clonage et/ou d'expression de type BAC. * Selon un premier aspect, le vecteur du type BAC est intégratif et conjugatif chez Streptomyces. De manière tout à fait préférée, un tel vecteur BAC intégratif et conjugatif chez Streptomyces est le vecteur BAC pOSV 403 décrit à l'exemple 8. L'invention a en outre pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs recombinants suivants : a) un vecteur comprenant un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention; b) un vecteur tel qu'obtenu selon un procédé éliminant tout recours à l'action d'une endonucléase de restriction sur le fragment d'ADN à insérer, tel que décrit précédemment. De manière tout à fait préférée, l'invention est également relative à un vecteur choisi parmi les vecteurs suivants: - le cosmide pOS7001; - le cosmide pOSV303; - le cosmide pOS700R; - le vecteur BAC pOSV403; L'invention est en outre relative à une collection de vecteurs recombinants tels qu'obtenus selon l'un quelconque des procédés selon l'invention. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention. Les techniques conventionnelles d'insertion d'ADN au sein d'un vecteur afin de préparer un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant font classiquement appel à une première étape au cours de laquelle une endonucléase de restriction est incubée à la fois avec l'ADN à insérer et avec le vecteur récepteur créant ainsi des extrémités compatibles entre l'ADN à insérer et l'ADN du vecteur permettant l'assemblage des deux ADN avant une étape de ligation finale permettant l'obtention du vecteur recombinant. Toutefois, une telle technique conventionnelle présente des inconvénients notables, tout particulièrement lorsque est recherchée l'insertion d'acides nucléiques de grande taille dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. En effet, l'action préalable d'une enzyme de restriction sur les fragments d'ADN destinés à être insérés dans un vecteur est susceptible de réduire notablement la taille de cet ADN préalablement à son insertion dans le vecteur. Il va sans dire qu'une réduction significative de la taille de l'ADN préalablement à son insertion sur un vecteur est une situation particulièrement défavorable lorsqu'est recherché le clonage de fragments d'ADN de grande taille susceptible de contenir l'ensemble des séquences codantes et, le cas échéant, également des séquences régulatrices, d'un opéron dont l'expression constitue une voie de biosynthèse complète d'un métabolite d'intérêt industriel, et tout particulièrement d'un composé d'intérêt thérapeutique. Pour remédier aux inconvénients des techniques de l'art antérieur, il a été mis au point selon l'invention deux procédés de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression qui ne nécessitent pas le recours à une endonucléase de restriction sur l'ADN à insérer préalablement à son introduction au sein du vecteur. De tels procédés sont en conséquence tout à fait adaptés au clonage de longs fragments d'ADN susceptibles de contenir, au moins partiellement, l'ensemble des séquences codantes et, le cas échéant, également des séquences régulatrices, d'un opéron complet responsable d'une voie de biosynthèse. Selon un premier aspect, un procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que l'insertion d'un acide nucléique dans le vecteur de clonage et/ou d'expression, comprend les étapes suivantes: - ouvrir le vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi, à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée; - ajouter un premier acide nucléique homopolymérique à l'extrémité 3' libre du vecteur ouvert; - ajouter un second acide nucléique homopolymérique, de séquence complémentaire au premier acide nucléique homopolymérique, à l'extrémité 3' libre de l'acide nucléique à insérer dans le vecteur ; - assembler l'acide nucléique du vecteur et l'acide nucléique par hybridation du premier et du second acide nucléique homopolymérique de séquences complémentaires l'une de l'autre; - refermer le vecteur par ligation. Un tel procédé est décrit aux exemples 10 et 13 ci-après. De manière avantageuse, le procédé ci-dessus peut comporter les caractéristiques suivantes, isolément ou en combinaison: - le premier acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(A) ou poly(T); - le second acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(T) ou poly(A). De manière tout à fait préférée, les acides nucléiques homopolymériques ont une longueur comprise entre 25 et 100 bases nucléotidiques, préférentiellement entre 25 et 70 bases nucléotidiques. Le procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression décrit ci-dessus est particulièrement adapté à la construction de banques d'ADN dans des vecteurs de type BAC. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation d'un vecteur recombinant décrit ci-dessus, ledit procédé est en outre caractérisé en ce que la taille de l'acide nucléique à insérer est d'au moins 100 kb, et préférentiellement d'au moins 200,300, 400,500 ou 600 kb. Un tel procédé de préparation est donc particulièrement adapté à l'insertion des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé de l'invention. Afin de permettre l'insertion de fragments d'ADN de grande taille dans des vecteurs de clonage et/ou d'expression, il a été mis au point selon l'invention, un second procédé ayant permis d'éliminer tout recours à l'action d'une endonucléase de restriction sur l'ADN destiné à être inséré au sein du vecteur. Un tel procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape d'insertion d'un acide nucléique dans ledit vecteur de clonage et/ou d'expression comprend les étapes suivantes: - création de bouts francs sur les extrémités de l'acide nucléique de la collection par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes; - ouverture du vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée; - adition d'adaptateurs oligonucléotidiques complémentaires ; - création de bouts francs aux extrémités de l'acide nucléique du vecteur par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes, puis déphosphorylation des extrémités 5' afin de prévenir une recircularisation du vecteur; - insertion de l'acide nucléique de la collection dans le vecteur par ligation. De manière préférée, l'élimination des séquences 3' sortantes est réalisée à l'aide d'une exonucléase, telle que l'enzyme de Klenow. De manière préférée, le remplissage des séquences 5' sortantes est réalisé à l'aide d'une polymérase, et de manière tout à fait préférée de la T4 polymérase, en présence des quatre nucléotides triphosphates. Un procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes tel que décrit ci-dessus est particulièrement adapté à la construction de banques d'ADN à partir de vecteurs de type cosmide. Un tel procédé d'obtention de vecteurs recombinants est décrit à l'exemple 12. Dans un mode particulier de préparation d'un vecteur recombinant selon l'invention, des oligonucléotides comprenant un ou plusieurs sites de restriction rares sont ajoutés sur le vecteur au niveau du site de clonage de l'ADN à insérer, conformément à l'enseignement de l'exemple 10. Cet ajout d'oligonucléotides facilite la récupération ultérieure des inserts sans clivage de ces derniers. CELLULES HOTES Bien que tout type de cellules hôtes puisse être utilisé pour la transfection ou la transformation avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, notamment une cellule hôte procaryote ou eucaryote, on utilisera de préférence des cellules hôtes dont les caractères physiologiques, biochimiques et génétiques sont bien caractérisés, facilement cultivables à grande échelle et dont les conditions de culture pour la production de métabolites soient bien connues. De manière préférentielle, la cellule hôte réceptrice d'un acide nucléique ou d'un vecteur recombinant selon l'invention est phylogénétiquement proche des organismes donneurs contenus initialement dans l'échantillon de l'environnement desquels les acides nucléiques sont originaires. De manière tout à fait préférée, une cellule hôte selon l'invention doit posséder un usage des codons similaire, ou du moins proche, des organismes donneurs présents initialement dans l'échantillon de l'environnement, tout particulièrement de l'échantillon de sol. La taille des fragments d'ADN susceptible de porter les séquences nucléotidiques d'intérêt recherchées peut être variable. Ainsi, des enzymes codées par des gènes de taille moyenne de 1 kb pourront être exprimées à partir d'inserts de petite taille alors que l'expression de métabolites secondaires nécessiteront le maintien dans l'organisme hôte de fragments de taille bien supérieure, par exemple de 40 kb à plus de 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb ou 600 kb. Ainsi, les cellules hôtes de Escherichia coli constituent un choix privilégié pour le clonage de grands fragments d'ADN. De manière tout à fait préférée, on aura recours à l'utilisation de la souche de Escherichia coli désignée DH10B et décrite par Shizuya et al; (1992) pour laquelle des protocoles de clonage dans des vecteurs BAC ont été optimisés. Toutefois, d'autres souches de Escherichia coli peuvent être avantageusement utilisées pour la construction d'une banque d'ADN selon l'invention, telles que les souches E.coli Sure, E.coli DH5 a, ou encore E.coli 294 (ATCC N 31446). En outre, la construction d'une banque d'ADN par transfection de cellules de E.coli avec des vecteurs recombinants selon l'invention est également possible, l'expression de gènes de divers procaryotes tels que Bacillus, Thermotoga, Corynebacterium, Lactobacillus ou Clostridium ayant été décrite dans la demande PCT N WO 99/20799. De manière générale, des cellules hôtes de E.coli peuvent dans tous les cas constituer des hôtes transitoires dans lesquels des vecteurs recombinants selon l'invention pourront être maintenus avec une grande efficacité, le matériel génétique pouvant être facilement manipulé et archivé et façon stable. Dans le but d'exprimer la plus grande diversité moléculaire possible, d'autres hôtes cellulaires pourront être également avantageusement mis en oeuvre tels que des cellules de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Myxococcus, Aspergillus nidulans ou encore Neurospora crassa. Il a en outre été montré selon la présente invention, que des cellules de Streptomyces lividans peuvent être utilisées avec succès et constituent des systèmes d'expression complémentaires à Escherichia coli. Streptomyces lividans constitue un modèle pour l'étude de la génétique des Streptomyces et a également été utilisé comme hôte d'expression hétérologue de nombreux métabolites secondaires. Streptomyces lividans, possède en commun avec d'autres actinomycètes tels que Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, ainsi que Streptomyces griseochromogenes, les molécules précurseurs et les systèmes de régulation nécessaires à l'expression de tout ou partie des voies de biosynthèses complexes, telles que par exemple la voie de biosynthèse des polykétides ou encore la voie de biosynthèse des polypeptides non ribosomiques représentant des classes de molécules de structures très diverses. Streptomyces lividans présente également l'avantage d'accepter l'ADN étranger avec des efficacités de transformation élevées. Ainsi, l'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'invention, constitutif d'une collection d'acides nucléiques préparée selon un procédé conforme à l'invention, ou encore une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que défini précédemment. Selon un premier aspect, il peut s'agir d'une cellule hôte recombinante d'origine procaryote ou eucaryote. Avantageusement, une cellule recombinante selon l'invention est une bactérie, et de manière tout à fait préférée une bactérie choisie parmi E.coli et Streptomyces. Selon un autre aspect, une cellule hôte recombinante selon l'invention est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure ou encore d'un champignon filamenteux. L'invention a également trait à une collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutive de la collection comprenant un acide nucléique provenant d'une collection d'acides nucléiques réalisée conformément à un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes tel que décrit ci-dessus. L'invention est également relative à une collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un vecteur recombinant selon l'invention. En raison de la grande taille des inserts il est nécessaire d'avoir une efficacité maximale de transformation. Dans ce but, une souche réceptrice de Streptomyces lividans exprimant l'intégrase de pSAM2 de façon constitutive afin de favoriser l'intégration site-spécifique du vecteur est préférée. Pour cela, le gène int sous contrôle d'un promoteur fort est intégré dans le chromosome. La surproduction d'intégrase n'induit pas de phénomènes d'excision (Raynal étal., 1998). La production d'un nouveau métabolite à partir de l'insert pourrait être toxique pour Streptomyces si l'insert ne contient pas de gènes de résistance à l'antibiotique produit ou si ce gène est peu ou pas exprimé. La capacité des différents gènes permettant à Streptomyces ambofaciens de résister à l'antibiotique qu'il produit est étudiée (Gourmelen et al., 1998; Pernodet et al., 1999). Certains de ces gènes codent des transporteurs de type ABC susceptibles de conférer un large spectre de résistance. Ces gènes peuvent être introduits et surexprimés dans la souche hôte de Streptomyces lividans. A l'inverse, une souche hypersensible aux antibiotiques peut être utilisée (Pernodet et al., 1996), afin de détecter dans la banque la présence de gènes de résistance. En effet, chez les micro-organismes producteurs d'antibiotique, ces gènes de résistance sont souvent associés aux gènes de la voie de biosynthèse de l'antibiotique. La sélection de clones résistants peut permettre d'effectuer simplement un premier tri avant les tests plus complexes de détection d'un nouveau métabolite produit par le clone. ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE NOUVELLES SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES POLYKETIDES SYNTHASES. Selon l'invention, une collection de cellules hôtes recombinantes a été obtenue après transfection des cellules hôtes par une collection de vecteurs recombinants contenant chacun un insert d'acide nucléique provenant d'une collection d'acides nucléiques préparée conformément au procédé selon l'invention. Plus précisément, les fragments d'ADN obtenus selon le procédé de l'invention dans lequel il est mis en oeuvre une étape d'extraction indirecte d'ADN des organismes contenus dans l'échantillon de sol ont été tout d'abord clonés dans le cosmide intégratif pOS7001. L'étape d'insertion des fragments d'ADN dans le cosmide intégratif pOS7001 a été réalisée selon le procédé de l'invention dans lequel des queues de polynucléotides homopolymériques poly(A) et poly(T) ont été ajoutées à l'extrémité 3' respectivement de l'acide nucléique du vecteur et des fragments d'ADN à insérer. Les vecteurs recombinants ainsi construits ont été encapsidés dans des têtes de phage lambda et les phages obtenus ont été utilisés pour infecter des cellules de E. coli selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Une banque d'environ 5000 clones de Escherichia coli a été obtenue. Cette banque de clones a été criblée avec des couples d'amorces spécifiques d'une séquence nucléotidique codant pour une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des polykétides, l'enzyme PKS de type I, aussi désignée ss-kétoacyl synthase . On rappelle ici que les polykétides constituent une classe chimique d'une grande diversité structurale comprenant un nombre important de molécules d'intérêt pharmaceutique tels que la tylosine, la monensine, la vermectine, l'érythromycine, la doxorubicine ou encore le FK506. Les polykétides sont synthétisés par condensation de molécules d'acétate sous l'action d'enzymes appelées polykétide synthases (PKSs). Il existe deux types de polykétide synthases. Les polykétide synthases de type Il sont impliquées en général dans la synthèse des antibiotiques aromatiques polycycliques et catalysent la condensation d'unités acétate de façon itérative. Les polykétide synthases de type I sont impliquées dans la synthèse des polykétides macrocycliques ou macrolides et constituent des enzymes modulaires multifonctionnelles. Compte-tenu de leur intérêt thérapeutique, il existe un besoin dans l'état de la technique d'isoler et de caractériser de nouvelles polykétides synthases qui peuvent être utilisées pour la production de nouveaux composés pharmaceutiques, notamment de nouveaux composés pharmaceutiques à activité antibiotique. Le criblage de la banque de clones recombinants décrite cidessus à l'aide d'amorces PCR amplifiant sélectivement des séquences nucléotidiques codant pour des polykétide synthases de type # a permis d'identifier des clones recombinants contenant des inserts d'ADN comprenant une séquence nucléotidique codant pour de nouvelles polykétide synthases. Les séquences nucléotidiques codant pour ces nouvelles polykétides synthases sont référencées comme les séquences SEQ ID N 33 à SEQ ID N 44. Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour une nouvelle polykétide synthase I, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 34 à SEQ ID N 44. De préférence, un tel acide nucléique se présente sous une forme isolée et/ou purifiée. L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide comprenant l'une des séquences SEQ ID N 34 à SEQ ID N 44 . L'invention a également trait à une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique choisi parmi les polynucléotides comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 34 à SEQ ID N 44 ainsi qu'à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant dans lequel est inséré un polynucléotide comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 34 à SEQ ID N 44. Avantageusement, les vecteurs recombinants contenant un insert d'ADN codant pour une nouvelle polykétide synthase de type 1 selon l'invention sont des vecteurs de clonage et d'expression. De préférence, une cellule hôte recombinante telle que décrite cidessus est une bactérie, une levure ou encore un champignon filamenteux. Les séquences en acides aminés de nouvelles polykétide synthases provenant d'organismes contenus dans un échantillon de sol ont été déduites des séquences nucléotidiques SEQ ID N 34 à SEQ ID N 44 ci-dessus. Il s'agit des polypeptides comprenant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 48 à SEQ ID N 59. L'invention concerne encore de nouvelles polykétides synthases comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N 48 à SEQ ID N 59. On a aussi extrait et amplifié selon l'invention de l'ADN génomique provenant de souches bactériennes pures, telles que Streptomyces coelicolor (ATCC N 101.478), Streptomyces ambofaciens (NRRL N 2.420), Streptomyces lactamandurans (ATCC N 27.382), Streptomyces rimosus (ATCC N 109.610), Bacillus subtilis (ATCC N 6633) ou encore Bacillus lichenifornis et Saccharopolyspora erythrea. Une amplification par PCR de l'ADN de chacune des souches bactériennes décrites ci-dessus a été effectuée à l'aide des couples d'amorces spécifiques des séquences nucléiques de polykétide synthase de type 1. De nouveaux gènes de polykétide synthases de type # bactériennes ont ainsi pu être isolés et caractérisés. Il s'agit des séquences nucléiques de séquences SEQ ID N 30 à SEQ ID N 32. L'invention a donc en outre pour objet des séquences nucléotidiques codant pour de nouvelles polykétides synthases de type # choisies parmi les polynucléotides comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 30 à SEQ ID N 32. Font également partie de l'invention des vecteurs recombinants comprenant les séquences nucléotidiques codant pour de nouvelles polykétides synthases de type # définies ci-dessus. L'invention concerne aussi des cellules hôtes recombinantes caractérisées en ce qu'elles contiennent un acide nucléique codant pour une nouvelle polykétide synthase de type 1 comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 30 à SEQ ID N 32 ainsi que des cellules hôtes recombinantes comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. L'invention a également pour objet des polypeptides codés par des séquences comprenant les acides nucléiques SEQ ID N 30 à 32, et plus précisément des polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N 47 à SEQ ID N 50. L'invention a en outre pour objet un procédé de production d'une polykétide synthase de type 1 selon l'invention, ledit procédé de production comprenant les étapes suivantes: - obtention d'une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique codant pour une polykétide synthase de type 1 comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 33 à SEQ ID N 44 et SEQ ID N 30 à SEQ ID N 32; - culture des cellules hôtes recombinantes dans un milieu de culture approprié ; - récupération et, le cas échéant, purification de la polykétide synthase de type I à partir du surnageant de culture ou du lysat cellulaire. Les nouvelles polykétide synthases de type 1 obtenues selon le procédé décrit ci-dessus peuvent être caractérisées par fixation sur une colonne de chromatographie d'immuno-affinité sur laquelle des anticorps reconnaissant ces polykétides synthases ont été préalablement immobilisés. Les polykétide synthases de type # selon l'invention, et plus particulièrement les polykétide synthases recombinantes décrites cidessus peuvent être aussi purifiées par des techniques de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), telles que par exemple des techniques de chromatographie en phase inverse ou de chromatographie d'échanges d'anions ou de cations, bien connues de l'homme du métier. Les polykétide synthases, recombinantes ou non recombinantes, selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation d'anticorps. Selon un autre aspect, l'invention a donc encore pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement une polykétide synthase de type # selon l'invention ou un fragment peptidique d'une telle polykétide synthase. Les anticorps selon l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux . Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir de cellules d'hybridome selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN C. (1975), Nature, Vol.256:495. Les anticorps polyclonaux peuvent être préparés par immunisation d'un mammifère, en particulier des souris, des rats ou des lapins avec une polykétide synthase de type 1 selon l'invention, le cas échéant en présence d'un composé adjuvant de l'immunité, tels que l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, l'hydroxyde d'aluminium ou encore un composé de la famille des muramyl peptides. Constituent également des " anticorps " au sens de la présente invention, les fragments d'anticorps tels que les fragments Fab, Fab', F(ab')2, ou encore les fragments d'anticorps simple chaîne contenant la partie variable (ScFv) décrits par MARTINEAU et al. (1998) J. Mol. Biol., Vol.280 (1):117-127 ou encore dans le brevet US 4,946,778, ainsi que les anticorps humanisés décrits par REINMANN KA et al. (1997), AIDS Res. Hum. Retroviruses, vol. 13(11):933-943 ou par LEGER O. J et al. (1997), Hum. Antibodies, vol.8 (1): 3-16. Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles notamment dans des tests immunologiques qualitatifs ou quantitatifs visant, soit à simplement détecter la présence d'une polykétide synthase de type 1 selon l'invention, soit à quantifier la quantité de cette polykétide synthase, par exemple dans le surnageant de culture ou le lysat cellulaire d'une souche bactérienne susceptible de produire une telle enzyme. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de détection d'une polykétide synthase de type # selon l'invention ou un fragment peptidique de cette enzyme, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact un anticorps selon l'invention avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé. L'invention est également relative à un kit ou nécessaire de détection d'une polykétide synthase de type I selon l'invention dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon l'invention; b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps éventuellement formé. Un anticorps dirigé contre une polykétide synthase de type # selon l'invention peut être marqué à l'aide d'un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, selon des procédés bien connus de l'homme du métier. Le criblage d'une banque d'ADN selon l'invention à l'aide d'une paire d'amorces hybridant avec des séquences cibles dont la présence est recherchée, telles que des séquences de la voie de biosynthèse de la puromycine, des séquences du gène linA impliquées dans la biodégradation du lindane ou encore des séquences codant pour des polykétides synthases de type # ont été détaillées ci-avant. L'invention a donc pour objet un procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structuralement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec un couple d'amorces hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec la séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée ; - réaliser au moins trois cycles d'amplification ; - détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié. Pour les conditions d'amplification appropriées en fonction des séquences cibles recherchées, l'homme du métier pourra se référer avantageusement aux exemples ci-dessous. Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un procédé de détection d'un acide nucléique, de séquences nucléotidiques déterminées, ou de séquences nucléotidiques structurellement apparentées à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec une sonde hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec une séquence nucléotidique structurellement apparentée à la séquence nucléotidique déterminée ; - détecter l'hybride éventuellement formé entre la sonde et les acides nucléiques compris dans les vecteurs de la collection. Pour effectuer le criblage d'une banque d'ADN selon l'invention en vue de détecter la présence d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide capable de dégrader le lindane, on a détecté les clones recombinants d'intérêt par leur phénotype correspondant à leur capacité à dégrader le lindane. Dans ce but, les clones isolés et/ou des ensembles de clones de la banque d'ADN préparée ont été mis en culture dans un milieu de culture en présence de lindane et la dégradation du lindane a été observée par la formation d'un halo trouble dans l'environnement immédiat des cellules. L'invention concerne aussi un procédé pour identifier la production d'un composé d'intérêt par une ou plusieurs cellules hôtes recombinantes dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules recombinantes cultivées. L'invention a en outre pour objet un procédé pour sélectionner une cellule hôte recombinante produisant un composé d'intérêt dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées; - sélection des cellules hôtes recombinantes produisant le composé d'intérêt. L'invention concerne encore un procédé pour la production d'un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - cultiver une cellule hôte recombinante sélectionnée selon le procédé décrit ci-dessus; - récupérer et, le cas échéant, purifier, le composé produit par ladite cellule hôte recombinante. L'invention est également relative à un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé ci-dessus décrit. Un composé d'intérêt selon l'invention peut consister en un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 33 à 44 et SEQ ID N 30 à 32. L'invention concerne encore une composition comprenant un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 33 à SEQ ID N 44 et SEQ ID N 30 à SEQ ID N 32. Un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique ci-dessus est préférentiellement le produit de l'activité de plusieurs séquences codantes incluses au sein d'un opéron fonctionnel dont les produits de traduction sont les différentes enzymes nécessaires à la synthèse d'un polykétide, l'une des séquences ci-dessus étant comprise et exprimée dans ledit opéron. Un tel opéron comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention codant pour une polykétide synthase peut être construit par exemple selon l'enseignement de Borchert et al. (1992). L'invention est encore relative à une composition pharmaceutique comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide selon l'invention, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible. De telles compositions pharmaceutiques seront avantageusement adaptées pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une quantité d'un polykétide synthétisé par une polykétide synthase de type 1 selon l'invention allant de1ug/kg par jour à 10 mg/kg par jour, de préférence au moins 0,01 mg/kg par jour et de manière tout à fait préférée entre 0,01 et 1 mg/kg par jour. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être indifféremment administrées par voie orale, rectale, parentérale, intraveineuse, sous-cutanée ou encore intradermique. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un polykétide obtenu grâce à l'expression d'une polykétide synthase de type 1 selon l'invention pour la fabrication d'un médicament, en particulier d'un médicament à activité antibiotique. L'invention sera en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après. La figure 1 illustre le schéma des différentes étapes de lyse effectuées selon les protocoles 1,2, 3n 4a, 4b, 5a, et 5b décrits à l'exemple 1. La Figure 2 illustre une. électrophorèse sur gel d'agarose 0. 8% des ADN extraits à partir de 300 mg du sol n 3 (Côte St André) après différents traitements de lyse (protocoles 1 à 5, cf. Fig. 1). M : marqueur de poids moléculaire de phage lambda La Figure 3 illustre la proportion de différents genres d'actinomycètes cultivés à la suite des traitements 1 à 5 (cf. Fig. 1). Le nombre d'ufc (unité formant colonie) a été déterminé sur un milieu sélectif pour ce groupe de bactéries. Un nombre total d'environ 400 colonies a été analysé. La Figure 4 illustre la. récupération d'ADN de phage lambda digéré par Hindlll additionné dans les sols à différentes concentrations avant (G) ou après (G*) broyage. Les traitements T (chocs thermiques) et S (sonication) sont des traitements additionnels de lyse. La quantification a été réalisée par analyse au phospho-imageur après hybridation en dotblot. Un échantillon de chaque sol a été utilisé pour chaque concentration de phage lambda ajouté. Les caractéristiques des sol sont reproduites dans le tableau 1. Les échantillons correspondant à 10 et 15 g d'ADN ajouté n'ont pas été traités. La Figure 5 illustre l'amplification par PCR des ADN extraits à partir de sol n 3 selon les protocoles 1,2, 3, 5a et 5b. Les amorces FGPS 122 et FGPS 350 (tableau 2) ont été utilisés afin de cibler Streptosporangium spp. indigènes. Les extraits d'ADN ont été utilisés non dilués ou dilués au 1/10ème et 1/100ème . M : marqueur de poids moléculaires 123 pb ( Gibco BRL), C : d'amplification sans ADN. La Figure 6 illustre les quantités d'ADN extrait après inoculation de spores (a) ou de mycélium (b) de S. lividans OS48. 3 inoculés dans les sols à différentes concentrations. La quantités de mycélium ajoutée dans le sol correspond au nombre de spores inoculées dans le milieu de germination. Environ 50% des spores ont germé, le nombre de cellules ou de génomes contenues dans les hyphes des spores germées n'a pas été déterminé. Les quantités de spores et de mycélium inoculées ne sont donc pas directement comparables. Le protocole d'extraction a été mené selon le protocole 6 (cf. section matériel et méthodes). Le symbole (') indique que de l'ARN a été inclus dans le tampon d'extraction. L'ADN cible a été amplifié par PCR avec les amorces FGPS 516 et FGPS 517, la quantification a été réalisée par phosphoimageur après hybridation en dot blot en utilisant le sonde FGPS 518. Un échantillon de chaque sol a été utilisé pour chaque concentration d'hyphes ou de spores. Les caractéristiques des sols sont décrites dans le tableau 1. La figure 7 représente l'arbre phylogénétique obtenu par l'algorithme de Neighbour Joining , positionnant les séquences d'ADNr 16S contenues dans la banque d'ADN du sol, par rapport à des bactéries de références cultivées. En grisé:.les séquences issues des pools de clones de la banque. Les valeurs de bootstrap sont indiquées au niveau des noeuds, après rééchantillonnage de 100 répétitions. La barre d'échelle indique le nombre de substitutions par site. Le numéro d'accès des séquences dans la base de données Genbank est indiqué entre parenthèses. La figure 8 représente un schéma du vecteur pOSint 1. La figure 9 représente un schéma du vecteur pWED1. La figure 10 représente un schéma du vecteur pWE15 (ATCC N 37503). La figure 11 représente un schéma du vecteur pOS 7001. La figure 12 représente un schéma du vecteur pOSV010. La figure 13 représente le fragment contenant un site " cos inséré dans le plasmide pOSV010 au cours de la construction du vecteur pOSV 303. La figure 14 représente un schéma du vecteur pOSV 303. La figure 15 représente un schéma du vecteur pE116. La figure 16 représente un schéma du vecteur pOS 700 R. La figure 17 représente un schéma du vecteur pOSV 001. La figure 18 représente le schéma du vecteur pOSV 002. La figure 19 représente un schéma du vecteur pOSV 014. La figure 20 représente un schéma du vecteur pBAC 11. La figure 21 représente un schéma du vecteur pOSV 403. La figure 22 représente les gels d'électrophorèse d'ADN de la banque après digestion par les enzymes BamHl et Oral des clones positifs de la banque criblée avec les oligonucléotides PKS-I. La figure 23 illustre la production de puromycine par les recombinants de S. lividans comparée à la production de la souche sauvage S. alboniger. La Figure 24 illustre Alignement de PKSs du sol avec les sites actifs conservés d'autres PKSs. Les références pour chaque peptide sont indiquées. Les domaines béta-kétoacyl synthase ont été alignés en utilisant le programme PILEUP de GCG (Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Group, Madison, Wisc). La Figure 25 illustre la construction d'un cosmide intégratif conjugatif. La Figure 26 illustre la construction d'un BAC intégratif conjugatif. EXEMPLES : EXEMPLE 1 : de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, comprenant une étape d'extraction directe d'ADN à partir de l'échantillon de sol. 1. MATERIEL ET METHODES 1. 1 SOLS : Les caractéristiques des six sols utilisés dans cette étude sont listées dans le tableau 1. La teneur en argile et en matière organique va respectivement de 9 à 47% et de 1,7 à 4,7%, le pH variant de 4,3 à 5,8. Des échantillons de sol ont été collectés à partir de la couche superficielle de 5 à 10 cm de profondeur. Toutes les racines visibles ont été éliminées et les sols ont été conservés à 4 C pendant quelques jours si nécessaire, après quoi ils ont été séchés pendant 24 heures à la température ambiante et tamisés (taille moyenne de maille 2 mm) avant d'être conservés jusqu'à plusieurs mois à 4 C. 1. 2 SOUCHES BACTERIENNES ET CONDITIONS DE CULTURE: L'ADN extracellulaire ainsi que les souches bactériennes fournissant des cellules végétatives, des spores ou des hyphae, utilisées pour innoculer les échantillons de sol, ont été choisies de telle sorte que leur présence puisse être suivie spécifiquement. Afin d'obtenir de grandes quantités d'ADN extracellulaire, la souche lysogénique de E.coli 1192 Hfr P4X (metB), contenant le phage lambda C1857 Sam7, a été cultivée sur milieu Luria-Bertani (LB) pendant deux heures à 30 C, puis 30 minutes à 40 C, puis 3 heures à 37 C. L'ADN du phage lambda a été extrait selon la technique décrite par SAMBROOK J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. La souche avirulente de Bacillus anthracis (STERNE 7700) a été utilisée comme inoculum de cellules bactériennes. Bacillus anthracis a été multiplié sur un bouillon de culture de type " trypticase soy broth " (TSB) (Biomérieux, Lyon, France) pendant environ 6 heures, en vérifiant que la D06oo soit maintenue en dessous de 0,6. Ces conditions permettent le développement des cellules végétatives sans formation de spores (Patra étal., (1996), FEMS Immunol. Medical Microbiology, vol. 15:223-231.). Les spores de Streptomyces lividans OS48. 3 (CLERC-BARDIN et al. non publié) ont été éliminées mécaniquement des cultures de l'organisme sur un milieu R2YE (HOPWOOD et al., (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual. The John Innes Foundation , Norwich ,United Kingdom). Les hyphae de S.lividans OS48. 3 ont été obtenus à partir des spores en pré-germination, car l'on s'attendait à ce que l'utilisation de hyphae courtes minimise la rupture et la perte subséquente d'ADN. Les spores ont été mises en suspension dans du tampon TES (Acide N-Tris [hydroxyméthyl]méthyl-2-aminoéthanesulfonique ; SigmaAldrich Chimie, France) (0.05M; pH 8) (Holben WE et al., (1988), APPL. Environ. Microbiol. vol.54:703-711, puis ont été soumises à un choc thermique (50 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement sous un courant d'eau froide puis ajoutées à un volume égal de milieu de prégermination (extrait de levure 1 %, casaminoacides 1 % CaCl2 0,01 M). La solution a été incubée à 37 C sur un agitateur. La proportion de spores germées a été estimée à environ 50%, en accord avec les résultats de HOPWOOD et al. (1985). Après centrifugation, les culots ont été resuspendus dans du tampon TES, ajoutés à 3% de milieu TSB, et incubés à 37 C jusqu'à l'obtention d'une D045o de 0,15 (HOPWOOD et al. , (1985)). Streptomyces hygroscopicus SWN 736 et Streptosporangium fragile AC1296 (Institute Pushino, Moscou) ont été cultivés selon des techniques décrites par HICKEY et TRESNER (1952). L'ADN des spores et des hyphae de S. Lividans a été extrait à partir des cultures pures selon le protocole de lyse 6 décrit ci-dessous (excepté qu'aucun broyage n'a été réalisé), tandis que les spores de S. hygroscopicus et de S. fragile ont été extraites par lyse chimique/enzymatique (Hintermann étal., 1981). 1. 3 CHOIX DU TAMPON D'EXTRACTION : tampon TENP (50 mM Tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1% pds/vol de polyvinylpolypyrrolidone développé par PICARD (1992) a été utilisé. Des tampons similaires ont été ultérieurement utilisés par d'autres auteurs (CLEGG et al., 1997 ; KUSKE et al., 1998 ; ZHOU et al., 1996). Le Tris et l'EDTA protègent l'ADN de l'activité nucléase, le NaCI apporte un effet dispersant et la PVPP absorbe les acides humiques et les autres composés phénoliques (HOLBEN et al. (1988) ; PICARD et al., (1992). Dans cette étude, l'efficacité d'extraction de ce tampon a été évaluée à différents pH (6,0 - 10,0) en utilisant 20 sols différents ayant une gamme de pH de 5,8 à 8,3 et une teneur en matière organique entre 0,2 et 6,3%. Ces vingt sols (les autres caractéristiques ne sont pas indiquées) ont été utilisés uniquement dans cette expérience. La quantité d'ADN a été déterminée de manière colorimétrique comme décrit par RICHARD (1974), et détaillé ci-après. 1. 4 PROTOCOLE DE LYSE IN SITU ET D'EXTRACTION D'ADN : Plusieurs protocoles utilisant un nombre croissant d'étapes ont été testés afin d'évaluer l'efficacité de différentes techniques pour lyser les microbes du sol in situ. Pour ces expériences, la microflore indigène du sol a été ciblée dans six sols. Des expériences additionnelles ont été conduites afin d'étudier les effets des traitements de lyse sur l'ADN libéré, en analysant les quantités et la qualité d'ADN récupéré provenant d'un ADN de phage lambda préalablement additionné aux sols. Une fois qu'un protocole optimisé (désigné protocole 6) a été développé, ce protocole a été utilisé pour quantifier l'ADN provenant d'Actinomycètes indigènes et d'ADN provenant de bactéries Grampositives inoculées dans les sols sélectionnés. Dans tous les cas, les échantillons de sol ont été séchés et passés au tamis comme décrit cidessus. Après broyage, 0,5 ml de tampon TENP ont été ajoutés à 200 mg poids sec de sol excepté pour le protocole 1 dans lequel le tampon a été ajouté à un sol non broyé). Pour les divers traitements de lyse (voir ci-dessous), les suspensions de sol ont été passées au Vortex pendant dix minutes et centrifugées (4000 g pendant cinq minutes), après quoi une fraction aliquote (25 l) du surnageant a été analysée par électrophorèse sur gel (0,8% d'agarose). Une autre fraction aliquote du surnageant représentant un volume connu, généralement 350 l, a été précipitée avec de l'isopropanol. Cinq fractions aliquotes (représentant de l'ADN dérivé de 1 g de sol) ont été réunies et resuspendues dans 100 l d'un tampon TE stérile (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) avant purification (protocole D, voir cidessous) et quantification, soit par hybridation (Dot Blot) de l'ADN total, soit par hybridation (Dot Blot) des produits d'amplification PCR (voir cidessous). Les signaux d'hybridation ont été quantifiés par imagerie par phosphorescence (technique de " phospho-imaging " voir ci-dessous). 1. 5 EVALUATION DES METHODES DE LYSE CELLULAIRE IN SITU: La qualité et la quantité de l'ADN extrait après un nombre croissant d'étapes de traitement de lyse (protocole 2-5b) ont été comparées à celles de l'ADN extracellulaire obtenu après lavage du sol avec un tampon d'extraction (protocole 1; voir aussi figure 1). Protocole 1 : Pas de traitement de lyse. Le tampon TENP a été ajouté à un sol non broyé, une étape d'extraction d'ADN a été réalisée comme décrit ci-dessus. Protocole 2. Broyage du sol suivi d'une extraction d'ADN. Deux types de dispositifs différents ont été utilisés pour le broyage du sol. Afin de comparer leur efficacité respective, 5g de sol sec ont été broyés pendant 30 secondes dans un broyeur contenant des anneaux de tungstène, ou pendant des temps variés jusqu'à 60 minutes dans un broyeur de sol contenant un mortier et des billes en agate (20 mm de diamètre). Le tampon TENP est ensuite ajouté et l'ADN est extrait comme décrit ci-dessus. Les résultats d'électrophorèse sur gel ont montré qu'un broyage de 40 minutes en utilisant des billes en agate étaient nécessaires afin d'obtenir des quantités d'ADN extraits équivalentes à celles obtenues après 30 secondes de broyage en utilisant des anneaux de tungstène. La distribution de taille des fragments d'ADN est similaire quelle que soit la méthode employée. Ainsi, ces traitements ont été considérés comme équivalents et celui qui sera utilisé dans les protocoles décrits ci-dessous ne sera en conséquence pas spécifié. Dans les protocoles 3 à 5, l'efficacité de plusieurs autres traitements de lyse ultérieure au broyage du sol a été testée, soit séparément, soit dans différentes combinaisons. Protocole 3 : Ce protocole est identique au protocole 2 , sauf qu'il comprend une étape d'homogénéisation à l'aide d'un mixeur de type Ultraturrax (Janker et Kunkel, IKA Labortechnik, Allemagne) réglé à la moitié de la vitesse maximale pendant 5 minutes. PROTOCOLES 4a et 4b: Ces protocoles sont identiques au protocole 3 à l'exception d'une étape additionnelle de sonication. Deux types de dispositifs sonicateurs ont été comparés : un sonicateur à micropointe de titane (600W Vibracell Ultrasonicator, Bioblock, Illkirch, France) (Protocole 4a) et un sonicateur de type Cup Horn (protocole 4b). La micropointe Vibracell produisant des ultrasons est en contact direct avec la solution de sol. En ce qui concerne le dispositif de type Cup Horn, la solution de sol est conservée dans des tubes qui sont placés dans un bain d'eau à travers lequel passent les ultrasons. Des expériences préliminaires ont été réalisées afin de déterminer les conditions optimales pour les deux sonicateurs (résultats non présentés). Le meilleur compromis, en terme de quantité d'ADN extrait et de taille de fragments, consiste en une sonication avec la micropointe de titane et le sonicateur de type Cup Horn respectivement pendant 7 et 10 minutes, en réglant la puissance à 15 W et avec des cycles actifs à 50%. Protocoles 5a et 5b: Après sonication avec une micropointe de titane ou un dispositif de type Cup Horn (respectivement protocoles 4a et 4b) du lysozyme et de l'achromopeptidase ont été ajoutés, chacune des enzymes à une concentration finale de 0,3 mg/ml. Les suspensions de sol ont été incubées pendant 30 minutes à 37 C, après quoi du lauryl sulfate à une concentration finale de 1 % a été ajouté, puis des suspensions ont été incubées pendant 1 heure à 60 C avant centrifugation et précipitation comme décrit ci-dessus. En plus des protocoles décrits ci-dessus, l'effet de la sonication (Cup Horn, voir protocole 4b) et de chocs thermiques (30 secondes dans l'azote liquide suivi de trois minutes dans l'eau bouillante, les traitements étant répétés trois fois ) sur l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll préalablement ajouté au sol ont été examinés (voir ci-après). Des chocs thermiques ont été suggérés dans l'état de la technique comme des moyens de lyse cellulaire in situ (PICARD et al. (1992)).. Cependant, du fait qu'un tel traitement a un effet préjudiciable sur l'ADN libre (voir la section résultats) il n'a pas été inclus dans les protocoles décrits ci-dessus. PROTOCOLE OPTIMISE Après évaluation des différents traitements de lyse, un protocole optimisé a été défini, désigné protocole 6. Le protocole 6 est identique au protocole 5b excepté que, avant la sonication, les suspensions de sol sont soumises à un traitement par Vortex puis agitées par rotation sur une roue pendant deux heures avant d'être congelées à - 20 C. Après décongélation, les suspensions de sol sont passées au Vortex pendant 10 minutes avant sonication. Le protocole 6 a été utilisé dans les expériences dans lesquelles les sols ont été ensemencés avec des cellules bactériennes ainsi que dans les expériences dans lesquelles les actinomycètes indigènes ont été quantifiés (voir ci-dessous). 1. 6 COMPTAGE AU MICROSCOPE: L'efficacité du broyage du sol comme méthode pour lyser des cellules bactériennes a été examinée au microscope. 5g de sol brut séché ont été mélangés dans un dispositif de type Waring Blender avec 50 ml d'eau stérilisée ultrapure pendant 1,5 minutes; simultanément, 1g (poids sec) de sol broyé (protocole n 2) a été mis en suspension dans 10 ml par agitation pendant 10 minutes. Les suspensions de salant fait l'objet de dilutions en séries et de l'acridine orange a été ajoutée à une concentration finale de 0,001%. Après 2 minutes, les suspensions ont été filtrées à travers une membrane de marque NUCLEOPORE de type 0,2 m black. Chaque filtre a été rinçé avec de l'eau stérile lysée, traitée avec 1 ml d'isopropanol pendant 1 minute afin de fixer les cellules bactériennes, puis rincé de nouveau. Les cellules bactériennes ont été comptées à l'aide d'un microscope a épifluorescence du type Zeiss Universal avec un objectif 100x. Pour chacun des types de sol, trois filtres ont été comptés, et au moins 200 cellules ont été comptées sur chacun des filtres. 1. 7 NUMERATION DES ACTINOMYCETES CULTIVABLES ET NOMBRE TOTAL D'UNITES FORMANT COLONIES (CFU) : Les actinomycètes ayant survécu aux traitements de lyse (protocoles 1-5) ont été examinés spécifiquement avec le sol n 3 (Côte Saint André, voir tableau 1). Après une dilution de 10 fois d'une solution d'extrait de levure (6% poids/volume) et de SDS (0,05%) afin d'induire la germination (Hayakawa et al. (1988)), les suspensions de sol ont été diluées en séries dans de l'eau stérile, incubées à 40 C pendant 20 minutes et ensemencées sur du milieu HV (HAYAKAWA et al., 1987). Le milieu HV a été additionné de actidione (50 mg/l) et de nystatine (50 mg/ml). Les colonies d'actinomycètes ont été comptées après incubation pendant 15 jours à 28 C. Au total, environ 400 colonies ont été examinées. L'identification a été réalisée sur la base des caractéristiques morphologiques macro-et microscopiques ainsi que sur l'analyse de la teneur en acide diaminopimélique des isolats (SHIRLING et al., 1966); STANECK et al., 1974; WILLIAMS état.,1993). La quantité totale de bactéries cultivables (CFU totales) a été également déterminée pour chacun des protocoles de lyse 1 à 5. Les suspensions de sol ont été diluées en série et ensemencées en triple sur un milieu agar Bennett (WAKSMAN et al., 1961) additionné de nystatine et d'actidione (chacune à 50 mg/l). Chaque boîte de Pétri a été couverte d'un filtre de nitrate de cellulose (Millipore) et incubée pendant trois jours à 28 C. Après la numération des colonies sur les membranes, les filtres ont été retirées et les boîtes de Pétri ont été à nouveau incubées pendant 7 jours à 28 C puis comptées à nouveau. 1. 8 RECUPERATION DE L'ADN DE PHAGE LAMBDA AJOUTE AUX SOLS : L'ADN de phage lambda a été digéré avec Hindlll, extrait par un mélange de phénol-chloroforme, précipité puis resuspendu dans de l'eau stérile ultrapure selon des protocoles standard (SAMBROOK et al., 1989). Des dilutions correspondant respectivement à 0,2,5, 5,7,5, 10 et 15 g d'ADN/g de poids sec de sol ont été préparées dans des volumes de 60 pl. Ces dilutions d'ADN ont été ajoutées à des lots de 5g de sol sec qui ont été subséquemment vigoureusement mélangés par vortex pendant 5 minutes avant broyage. L'ADN de phage lambda a aussi été ajouté à un sol avant broyage à des concentrations correspondant à 0, 10 et 15 g d'ADN/g de poids sec du sol. Après broyage, le tampon d'extraction est ajouté et l'ADN est extrait selon le protocole 2(voir ci-dessus). 1. 9 SATURATION DES SITES D'ADSORPTION AVEC DE L'ARN : de déterminer si la saturation des sites d'adsorption d'acides nucléiques des colloïdes du sol pouvait augmenter le taux de récupération de l'ADN, le terreau sablonneux (sol n 4) et le sol argileux (sol n 5) ont été incubés avec une solution d'ARN avant tout autre traitement. De l'ARN commercial de Saccharomyces cerevisiae (BOHRINGER MANNHEIM, MEYLAN, France) a été dilué dans du tampon phosphate (pH 7,1) et ajouté aux échantillons de sol sec et tamisés (2 ml/g de sol) à des concentrations finales de 20,50 et 100 mg d'ARN/g de poids sec du sol. Les tubes contenant les suspensions de sol ont été agités par rotation pendant deux heures à température ambiante. Après centrifugation, les culots de sol ont été séchés au four (50 C) pendant la nuit. L'ADN de phage lambda a ensuite été ajouté aux sols (0,20 ou 50 g/g de poids sec du sol) afin de simuler le sort de l'ADN libéré après lyse cellulaire. L'ADN a été extrait selon le protocole n 2. Il a été déterminé par la suite qu'un effet identique de l'addition d'ARN sur la récupération d'ADN pouvait être atteint en ajoutant l'ARN directement au tampon d'extraction. Cette procédure simplifiée a été utilisée pour le sol argileux n 5 dans les expériences dans lesquelles les micro-organismes ont été inoculés dans les sols. L'ARN a ensuite été ajouté à une concentration correspondant à 50 mg d'ARN/g de poids sec du sol. 1. 10 DETERMINATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DE L'EFFICACITE DES PROTOCOLES D'EXTRACTION : qualité de l'ADN (absence de dégradation) a été estimée sur la base de la taille des fragments d'ADN ou de la position relative des bandes de migration d'ADN après électrophorèse d'une fraction aliquote d'une solution d'ADN sur un gel d'agarose à 0,8%. L'intensité de fluorescence a permis une estimation semiquantitative des rendements d'extraction. Une autre fraction aliquote a été utilisée pour des déterminations quantitatives de la teneur en ADN par hybridation (Dot Blot) et analyse au phospho-Imager. Le protocole d'hybridation sur tache a été décrit par SIMONET et al. (1990). Les membranes d'hybridation (GeneScreen plus, Life Science Products, Boston, Etats-Unis d'Amérique) ont été préhybridées pendant au moins 2 heures dans 20 ml d'une solution contenant 6 ml de 20 x SSC, 1 ml de solution de DENHARDT's, 1 ml de SDS à 10% et 5 mg d'ADN de sperme de saumon. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit dans la même solution en présence d'une sonde marquée préalablement à deux lavages des membranes dans un tampon SSC 2 x pendant 5 minutes à température ambiante, puis un troisième lavage dans du tampon SSC 2 x, SDS 0,1% et un quatrième lavage dans du tampon SSC 1 x, SDS 0,1% pendant 30 minutes à la température d'hybridation. Les signaux d'hybridation ont été quantifiés avec un système d'imagerie radioanalytique BIORAD (Molecular Analyst Software, BIORAD, Ivry S/Seine, France). Afin de quantifier la quantité totale d'ADN dérivée de la microflore indigène, les différents sols ont été extraits selon les protocoles n 1 à 5. L'ADN non amplifié a été appliqué sur les membranes de Dot Blot et hybridé en utilisant la sonde universelle FGPS431 (tableau 2). Cette sonde, qui hybride aux positions 1392-1406 du gène de l'ADNr 16S de E.coli (Amann et al. (1995)) a été marquée à ses extrémités avec un ATP[alpha]32P en utilisant une polynucléotide kinase T4(BOEHRINGER MANNHEIM, Melan, France). Une courbe de calibration a été préparée à partir de l'ADN de E.coli DH5a. La conversion des calculs aux bactéries du sol a nécessité une simplification, partant de l'hypothèse que le nombre de copies moyen (rrn) est de 7, comme pour E.coli. L'ADN de phage lambda digéré par Hindlll a été utilisé pour quantifier la récupération de l'ADN extracellulaire. Des extraits non amplifiés à partir de sols, auxquels de l'ADN de phage lambda avait été ajouté, ont été hybridés avec de l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll marqué au hasard en utilisant le fragment Klenow (Bôehringer Mannheim, Melan, France). Les quantités d'ADN ont été calculées par interpolation à partir d'une courbe de calibration préparée avec l'ADN purifié. La quantité totale d'ADN extrait à partir des sols n 1, 2,3, 4 et 6 selon le protocole n 2 (broyage) a également été quantifiée de manière colorimétrique selon la technique décrite par RICHARD (1974). Brièvement, de l'ADN a été mélangé avec du HClO4 concentré (la concentration finale de HC104 était de 1,5 N). On a mélangé 2,5 volumes de cette solution avec 1,5 volumes de DPA (diphénylamine, Sigma-Aldrich, France) et laissé incuber le mélange à la température ambiante pendant 18 heures, préalablement à la détermination de la DO à 600 nn. Les extraits d'ADN du sol ont été quantifiés par rapport à une courbe standard réalisée par l'ADN extrait à partir de E.coli DH5[alpha] selon les protocoles standards (SAMBROOK et al., (1989)). 1. 11 DEVELOPPEMENT D'UNE TECHNIQUE DE QUANTIFICATION D'ADN EN UTILISANT L'AMPLIFICATION PCR ET L'HYBRIDATION: Pour les amplifications par PCR, de l'ADN polymérase Taq (Appligene Oncor, France) a été utilisé selon les instructions du fabricant. Le programme PCR utilisé pour toutes les amplifications est le suivant : dénaturation initiale pendant 3 minutes à 95 C, puis 35 cycles consistant en 1 minute à 95 C, 1 minute à 55 C et 1 minute à 72 C, suivie par une extension finale à 72 C pendant 3 minutes. L'ADN isolé et purifié à partir de Streptosporangium fragile a été utilisé comme témoin à des concentrations allant de 100 fg à 100 ng. Afin d'amplifier spécifiquement l'ADN de ce genre bactérien, on a choisi les amorces FGPS122 et FGPS350 (tableau 2), complémentaires à une partie de l'ADNr 16S, après alignement des séquences d'ADNr 16S d'actynomycètes. Leur spécificité a été testée sur une collection de souches d'actynomycètes (Streptomycès, Streptosporangium et d'autres genres fortement apparentés) Les produits de PCR ont été hybridés avec la sonde oligonucléotidique FGPS643 (tableau 2). Afin de simuler le niveau de pureté obtenu en routine avec de l'ADN extrait à partir du sol, des témoins d'ADN pur de S. fragile ont été mélangés avec les extraits de sol obtenus après des traitements selon les protocoles de lyse 4b et 5b puis purifiés selon le protocole D. Avant utilisation, les extraits de sol ont été traités avec de la DNase (une unité de DNase/ml, GIBCO BRL) pendant 30 minutes à température ambiante. La DNase a ensuite été inactivée par chauffage à 65 C pendant 10 minutes. Une vérification de l'inactivation a été réalisée par PCR. Les concentrations d'acides humiques ont été mesurées par spectrophotométrie (D028onm) contre une courbe standard d'acides humiques commerciaux (Sigma). Des solutions de sol traitées à la Dnase non diluées, diluées 10x et diluées x 100 ont été mélangées de 100. fg à 100ng d'ADN de S. fragile avant l'amplification par PCR. Dans une autre série d'expériences, les concentrations croissantes d'ADN de Streptomyces hygroscopicus de (100 pg à 1 g) ont été ajoutées à l'ADN de S. fragile afin de simuler la présence d'ADN non-cible et son influence sur le procédé PCR. 1. 12 PURIFICATION DES EXTRAITS D'ADN BRUT : méthodes de purification d'ADN ont été comparées. L'ADN a été extrait à partir de 1g (poids sec de sol selon le protocole 4a et remis en suspension dans 100 l de tampon TE8 (50 mM Tris, 20 mM (EDTA, pH 8,0). Protocole A Elution à travers deux colonnes successives Elutip d (SCHLEICHER et SCHUELL, Dassel, Allemagne) (PICARD et al., (1992)). Protocole B: Elution à travers une colonne SEPHACRYL S200 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) suivie d'une élution à travers une colonne Elutip d (NESME et al. (1995)). Protocole C : Séparation à l'aide d'un système aqueux à deux phases avec 17,9% (poids/poids) de PEG 8000 (Merck, Darmstadt, Allemagne) et 14,3% (poids/poids) de (NH4)2SO4(ZASLAVSKY,(1995)). Après un mélange vigoureux au vortex, les deux phases ont été laissées à température ambiante pour leur séparation. 1 ml de chacune des phases a été transféré dans un autre tube, mélangé avec 100 l de l'échantillon et laissé à 4 C pendant une nuit pour permettre la séparation. La phase inférieure a été dialysée pendant une heure à travers une membrane Millipore en présence d'un excès d'un tampon TE 7,5 (10 mM Tris, 1 mM EDTA à pH 7,5 et 1 M Mg Cl2) afin d'éliminer les sels en excès. Protocole D : Elution à travers une colonne de type Microspin Sephacryl S400 HR (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) , suivie d'une élution à travers une colonne de type Elutip d. Chaque protocole est terminé par une étape de précipitation à l'éthanol, et l'ADN est remis en suspension dans 10 l de tampon TE 7,5. L'efficacité des protocoles de purification a été vérifiée par amplification PCR de fractions aliquotes non diluées des solutions d'ADN et de fractions aliquotes diluées 10 et x 100 fois, en utilisant des protocoles standard (voir ci-dessous). 1. 13 RECUPERATION DE L'ADN A PARTIR DE MICROORGANISMES INNOCULES: Les cellules, spores et hyphae ont été lavées deux fois et dénombrées par comptage sur plaque ou comptage microscopique direct. Des lots de 5g de sol sec et tamisé (sols n 2, 3 et 5) ont été inoculés avec 100 l d'une suspension de spores et d'hyphae de S. lividans à des concentrations correspondant à 0,103, 105, 107 et 109 spores/g de poids sec de sol, ou avec des cellules végétatives de B.anthracis à des concentrations correspondant à 0,107 et 109 cellules par gramme de poids sec du sol. Les quantités de hyphae de S. lividans ont été calculées sur la base du nombre de spores desquelles elles sont originaires. Après addition des suspensions bactériennes, les échantillons de sol sont mélangés vigoureusement par vortex pendant 5 minutes avant broyage. L'ADN est extrait selon le protocole n 6 (voir ci-dessous). L'amplification PCR suivie d'une hybridation sur tache (Dot Blot) et imagerie par phosphorescence (phospho-imaging) a été utilisée afin de quantifier les quantités d'ADN récupérées à partir des cellules, des spores et du mycélium bactérien inoculé dans les sols. L'extraction d'ADN a été réalisée selon le protocole de lyse n 6. L'amplification PCR et l'hybridation ont été réalisées comme décrit cidessus. Les amorces et les sondes sont ciblées sur des régions chromosomiques localisées en dehors de la région 16S, et sont hautement spécifiques des organismes respectifs, de manière à éviter des signaux de bruit de fond. Pour les sols ensemencés avec B. anthracis, les amorces R499 et R500 ont été utilisées (Patra et al. (1996)) et les produits d'amplification ont été hybridés avec la sonde oligonucléotidique C501 (tableau 2). Pour les sols ensemencés avec S. lividans , les réactions PCR ont été réalisées en utilisant les amorces FGPS516 et FGPS517, et les produits d'amplification ont été hybridés avec la sonde oligonucléotidique FGPS518 (tableau 2). La région amplifiée est une partie de la cassette construite spécifiquement pour obtenir la souche OS48.3 (CLERC-BARDIN et al., non publié). Les comptes de calibration ont été dans tous les cas obtenus en utilisant l'ADN purifié de l'organisme cible. 2. RESULTATS 2. 1 CHOIX DU TAMPON D'EXTRACTION: 20 sols différents ont été utilisés afin de déterminer le pH optimal du tampon d'extraction d'ADN. Pour tous les sols, le rendement en ADN augmente avec les pH croissants du tampon. Le rendement pour chaque pH (+/- sd), calculé comme le pourcentage de la valeur la plus haute pour chacun des sols, est le suivant : pH 6,0 : 31+/- 13; pH 7,0 : 43+/- 16 ; pH 8,0 : 60+/- 14 ; pH 9,0 : 82 +/- 12 ; pH 10,0: 98 +/- 3. Pour 16 des 20 sols, le rendement le plus élevé a été obtenu à pH 10,0, alors que pour les quatre autres sols le plus haut rendement a été obtenu à pH 9,0. Cependant, à pH 10,0, des quantités plus grandes de matériel humique ont été libérées, comparées à pH 9,0 (résultats non présentés). En conséquence, le pH 9,0 a été choisi pour toutes les expériences présentées ci-dessous. 2. 2 EFFICACITE DES PROTOCOLES D'EXTRACTION D'ADN : L'ADNtotal des organismes indigènes du sol a été extrait et quantifié de manière à évaluer l'efficacité de nombreux protocoles de lyse cellulaire in situ. Des échantillons des sols 1-6 (tableau 1) ont été traités selon les protocoles n 1 à 5 décrits dans la section Matériel et Méthodes (figure 1). Après l'extraction d'ADN, les suspensions de sols ont été précipitées avec de l'isopropanol, et des fractions aliquotes des culots remis en suspension ont été analysées par électrophorèse sur gel , dans une première étape, afin d'estimer la qualité et la quantité de l'ADN libéré. Cependant, la couleur de l'extrait d'ADN devenait de plus en plus sombre au fur et à mesure du nombre croissant d'étapes de lyse, du fait de la co-extraction de composés, tels que les acides humiques, avec l'ADN. Certains de ces extraits bruts de couleur sombre ne migrent pas de la manière attendue dans les gels d'agarose. En conséquence, les solutions d'ADN brut ont été purifiées (protocole B) avant quantification. Les électrophorèses sur gel des solutions purifiées obtenues après les différents traitements de lyse sont exemplifiées sur le sol n 3 (figure 2). Une comparaison visuelle au rayonnement ultra-violet des intensités de l'ADN coloré a permis une estimation semi-quantitative de l'efficacité des traitements. De plus, la présence de profils de migration de tailles multiples de fragments (bandes discrètes) d'ADN et la disparition des fragments longs indique qu'une dégradation de l'ADN a eu lieu. Aucun ADN n'a pu être extrait du sol argileux n 5. * Une quantification plus précise de l'ADN de tous les sols, extrait selon les protocoles n 1 à 5, a été réalisée par hybridation sur tache (Dot Blot) sans étape d'amplification PCR préalable et en utilisant une sonde oligonucléotidique complémentaire d'une séquence hautement conservée de la région d'ADNr 16S (sonde FGPS 431, tableau 2). L'ADN a été détecté dans les extraits de tous les sols après chacune des différentes étapes de lyse, à l'exception du sol argileux n 5. Les résultats concordent avec les estimations réalisées après gel d'électrophorèse. Afin de comparer avec une méthode indépendante pour la quantification, l'ADN extrait selon le protocole n 2 (tous les sols sauf le sol n 5) a été également quantifié en utilisant une méthode colorimétrique de détection de l'ADN (RICHARD, 1974). On a trouvé une bonne corrélation (r = 0,88) entre l'ADN quantifié en utilisant cette technique colorimétrique et les résultats obtenus par hybridation de type Dot Blot/radio-imagerie, confirmant l'hypothèse selon laquelle le nombre de copies moyen des bactéries du sol (rrn) est de 7. L'hybridation (Dot Blot) a montré que les quantités d'ADN extracellulaires, comme déterminé par extraction sans traitement de lyse (protocole n 1), allait de 4ug/g pour le sol acide (n 6) à 36 g/g pour le sol n 3 (tableau 3). Le broyage du sol (protocole n 2 ) a augmenté les quantités d'ADN extrait à partir de tous les sols (p.ex. 26 g/g de sol) pour le sol n 6 et 59 g/g de sol (pour le sol n 3) (tableau 3 ; figure 2). Pour les deux traitements de broyage (voir la section Matériel et Méthodes) la migration discrète d'ADN a été détectée sur les gels d'agarose, indiquant que les molécules d'ADN ont été partiellement dégradées (figure 2). La taille des fragments d'ADN est comprise entre 20 et 0,2 kb. L'intensité de bande des fragments les plus petits est très faible, indiquant que la majeure partie des fragments ont une taille bien supérieure à 1 kb. Le protocole n 3 comprend une étape d'homogénéisation dans un dispositif mixeur de type Ultraturax après l'addition du tampon d'extraction aux échantillons de sol. Cette étape conduit à une augmentation des quantités d'ADN extrait, comme déterminé par hybridation sur tache (Dot Blot) pour deux des sols (le terreau sablonneux n 3 et le sol acide n 6), alors que les deux sols riches en matière organique (sols n 1 et n 2) ont conduit à l'obtention de quantités plus faibles d'ADN. Les protocoles n 4a et n 4b ont permis d'évaluer l'influence de deux types de sonication sur les rendements en ADN à partir de sols préalablement broyés et homogénéisés . La sonication n'a pas eu d'effet positif sur le rendement en ADN, comparé au protocole n 3, excepté pour le sol n 6. Toutefois, l'efficacité de lyse des deux types de sonicateur diffèrent. Pour les sols n 2, 3 et 4, les quantités d'ADN extraits les plus grandes ont été obtenues en utilisant la micropointe de titane (tableau 3 ; 2), alors que pour les sols n 1 et n 6, le rendement en ADN était supérieur en utilisant le dispositif Cup Horn. Des résultats contradictoires ont été également obtenus lorsque l'on a ajouté une étape de lyse enzymatique/chimique (protocoles n 5a et 5b) après l'étape de sonication : certains cas, les quantités d'ADN extraites ont été plus grandes que celles récupérées selon les protocoles n 4a et 4b, alors que dans d'autres cas les rendements étaient moindres (tableau 3). 2. 3 COMPTAGE DIRECT DES MICRO-ORGANISMES: Des comptes au microscope du nombre total de cellules bactériennes après coloration à l'acridine orange ont été réalisés pour tous les sols, avant et après broyage. Avant broyage, le nombre de bactéries par gramme de poids sec du sol allait de 1,4 x 109 (+/- 0,4) dans le sol tropical n 5 à 10 x 109 (+/- 0,7) dans le sol provenant de la Côte Saint-André (sol n 3) (tableau 1). Après broyage, les nombres de cellules ont été respectivement de 45, 74, 75, 54, 34 et 75% des valeurs initiales pour les sols n 1 à 6. 2. 4 NUMERATION DES ACTINOMYCETES CULTIVABLES APPARTENANT A DIFFERENTS GENRES : modification dans les populations d'actinomycètes dans le sol n 3 a été remarquée après les différents traitements de lyse (figure 3). Par exemple, les colonies de Streptomyces sp. dominaient la flore viable d'actinomycètes lorsqu'aucun traitement de lyse n'est appliqué (protocole n 1), et représentaient 65% du nombre total de colonies identifiées. Après broyage, le pourcentage de colonies de Streptomyces a diminué pour atteindre 51%, alors que la proportion de colonies appartenant au genre Micromonospora a augmenté de 14% à 41%. La lyse chimique/enzymatique (protocoles 5a et 5b) est apparue comme particulièrement efficace pour la lyse des streptomycètes. Lorsque tous les traitements de lyse ont été appliqués, y compris une lyse chimique/enzymatique (protocoles 5a et 5b), la microflore d'actinomycètes, qui comprenait encore plus de 106 CFU/g de sol, était dominée par les espèces appartenant au genre Micromonospora, alors qu'aucune ou très peu de colonies de Streptomyces ont été récupérées. Les organismes appartenant aux genres tels que Streptosporangium, Actinomadura, Microbispora, Dactilosporangium et Actinoplanes sont apparus sur les plaques en faible nombre (2-8% du nombre total de colonies identifiées) après broyage, homogénéisation avec le dispositif Ultraturrax, et sonication, mais étaient généralement absents lorsque ces traitements étaient combinés avec une lyse chimique/enzymatique. Le nombre total de bactéries cultivables restant après chaque traitement de lyse (protocoles 2 à 5) a été aussi recherché pour le sol n 4. Les résultats indiquent que le nombre de bactéries cultivables ne décroît pas avec l'intensité des traitements de lyse (environ 2 x 106 CFU/g de sol dans tous les cas, et également lorsqu'un traitement n'est appliqué, tel que selon le protocole n 1). L'obtention de ces faibles valeurs de CFU est probablement due au fait que du sol sec a été utilisé et que seules les bactéries les plus résistantes se sont multipliées sur les plaques. Le nombre d'actinomycètes formant colonies était généralement plus grand que celui des CFU total (toutes les bactéries) du fait qu'une étape de germination de spores, comprise dans le protocole de détection des actynomycètes, manquait lors du contrôle des bactéries totales 2. 5 RECUPERATION DE L'ADN DU PHAGE LAMBDA AJOUTE: Le but de ces expériences était d'estimer de quelle manière des traitements de lyse successifs pouvaient affecter la récupération d'ADN nu , et si ces traitements successifs de lyse contribuaient à sa dégradation. L'ADN pouvait être soit une fraction d'ADN extracellulaire libérée à partir d'organismes déjà morts, qui peuvent persister dans le sol pendant des mois (WARD et al., 1990), soit de l'ADN libéré à partir d'organismes lysés facilement pendant les premières étapes du traitement. Afin de simuler cette situation, de l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll a été ajouté, à diverses concentrations, aux sols avant et après broyage. En plus du broyage, une combinaison des autres traitements de lyse a été testée, y compris la sonication (dispositif Cup Horn, voir protocole n 4b) et des chocs thermiques (voir la section Matériel et Méthodes). Après extraction, des fractions aliquotes qui devraient théoriquement contenir de 25 à 150 ng d'ADN de phage lambda ont été analysées par électrophorèse sur gel. Aucun fragment d'ADN spécifique du phage lambda n'a pu être observé lorsque l'ADN a été inoculé dans les échantillons de sol préalablement au broyage, indépendamment de la dose ou du type de sol. Lorsque l'ADN a été ajouté après broyage, et extrait sans étape de traitement de lyse additionnelle, les profils spécifiques d'ADN de phage lambda ont été détectés dans les extraits de quatre des cinq sols testés. Dans tous ces cas, une relation directe de cause à effet a été obtenue entre la quantité d'ADN ajoutée et l'intensité des signaux sur les gels d'agarose. Les intensités des signaux étaient, cependant, inférieures aux intensités de signaux attendues si on les compare à celles des standards moléculaires. De plus, la bande à 23 kb était absente dans plusieurs cas, indiquant que les longs fragments étaient préférentiellement adsorbés aux particules du sol, ou étaient plus sensibles à la dégradation, comparés aux fragments courts. Aucune bande n'a été détectée dans les échantillons de sol tropical n 5 qui est caractérisé par une très haute teneur en argile (tableau 1). Pour une quantification plus précise, la récupération d'ADN a été déterminée sur un dispositif d'imagerie par phosphorescence (phosphoimager) après hybridation en tache (Dot Blot). Selon cette technique, l'ADN a été détecté dans tous les échantillons, y compris ceux qui avaient été inoculés avant broyage, à l'exception du sol n 5 dans lequel aucun ADN n'a pu être détecté. Dans tous les autres sols, la quantité d'ADN extrait augmente avec l'augmentation de taille de l'inoculum (figures 4a-d). Cependant, les récupérations d'ADN de phage lambda étaient faibles. Lorsque le broyage était le seul traitement de lyse appliqué, les récupérations étaient comprises entre 0,6 et 5,9% de l'ADN ajouté lorsque celui-ci était ajouté avant broyage, et de 3,6 à 24% de l'ADN ajouté lorsque ce dernier était ajouté après broyage. Les plus hauts niveaux de récupération ont été obtenus à partir du sol n 2. L'électrophorèse sur gel de fractions aliquotes d'échantillons traités par choc thermique et sonication n'a permis d'observer des bandes d'ADN dans aucun des échantillons, y compris l'essai dans lequel l'ADN avait été ajouté après broyage. Les expériences d'hybridation en tache (Dot Blot) ont confirmé ces résultats. Les signaux d'hybridation obtenus à partir de suspensions de sol qui ont été traitées par chocs thermiques et sonication ont été, tout au plus, faibles. L'échantillon présentant la plus forte quantité d'ADN (15 g d'ADN/g de poids sec du sol) était le seul pour lequel le signal obtenu était sensiblement différent du niveau du bruit de fond. Aucune différence,( ou de faibles différences) n'a été observée entre les échantillons traités par choc thermique et ceux traités par chocs thermiques et sonication, indiquant que les chocs thermiques ont un effet préjudiciable sur l'ADN. Les récupérations les meilleures ont été observées pour le sol n 2, qui a la plus forte teneur en matière organique (tableau 1), alors qu'aucun ADN n'a été récupéré à partir du sol argileux n 5. Des expériences additionnelles ont été réalisées avec des échantillons non broyés de sols n 4 et n 5, qui ont été ensemencés avec 20 et 50 g d'ADN de phage lambda par gramme de sol. Les échantillons ont été extraits immédiatement ou après une période d'incubation d'une heure à 28 C, puis les extraits d'ADN ont été purifiés et analysés par électrophorèse sur gel. L'incubation du sol n 4 pendant une heure après l'inoculation n'a pas conduit à des profils qualitativement ou quantitativement différents de ceux obtenus sans incubation ou de ceux observés antérieurement lorsque l'ADN avait ajouté après broyage. Ces résultats indiquent que la dégradation enzymatique par les nucléases du sol ne seraient pas impliquée dans le faible taux de récupération d'ADN. De plus, l'absence d'étape de broyage ne permet pas une augmentation de la récupération de l'ADN à partir du sol n 5, indiquant que les modifications de structure du sol dûes au broyage n'augmentent pas significativement l'adsorption des acides nucléiques sur les colloïdes. 2. 6 SATURATION DES SITES D'ADSORPTION AVEC L'ARN : plupart des profils obtenus sur les gels d'agarose ne diffèrent pas significativement des profils précédents dans lesquels le traitement d'ARN n'a pas été effectué. Par exemple, aucune bande n'a été détectée à partir du sol riche en argile n 5, indépendamment des concentrations d'ARN et des concentrations d'ADN de phage lambda utilisées. De plus, les bandes spécifiques d'ADN de phage lambda digérées par Hindlll restaient indétectables dans le terreau sablonneux traité par l'ARN (sol n 4) lorsque l'ARN est ajouté avant le broyage. L'intensité des bandes obtenues à partir d'échantillons ensemencés avec l'ADN après broyage augmente avec la concentration d'ARN, indiquant que le traitement pourrait avoir un effet positif. Cependant, les résultats après hybridation et analyse par imagerie à phosphorescence n'ont pas confirmé les résultats de l'électrophorèse. Par exemple, l'effet positif du traitement d'ARN sur la récupération d'ADN à partir du terreau argileux, lorsque l'ADN a été ajouté après broyage, n'apparaît pas clairement. D'un autre côté, un effet positif de l'ARN a été trouvé pour le sol riche en argile (n 5) lorsque l'ADN a été ajouté après broyage. Bien que les signaux d'hybridation pour les échantillons contrôle ne diffèrent pas des niveaux de bruit de fond, des quantités significatives d'ADN ont été libérées à partir des échantillons traités par l'ARN, et les signaux ont augmenté avec la quantité d'ADN ajoutée ainsi qu'avec la concentration d'ARN. Cependant, même pour la plus forte concentration d'ARN (100 mg/g de poids de sol sec) le taux de récupération n'a jamais dépassé 3%. 2. 7 PURIFICATION DES EXTRAITS BRUTS D'ADN: Des quatre protocoles testés, la meilleure amplification des extraits d'ADN non dilués (1 l d'extrait dans 50 l de mélange PCR) a été observée après l'élution à travers des colonnes de type Microspin S400 suivie d'une élution à travers une colonne de type Elutip d, comme le montre l'électrophorèse sur gel des produits PCR. L'ADN purifié par le système aqueux double phase (protocole C) a donné des quantités plus faibles de produits PCR après amplification à partir d'extrait d'ADN non dilué. Aucun produit d'amplification n'a pu être obtenu à partir des extraits non dilués après amplification à la suite de la mise en oeuvre des protocoles A ou B. En conséquence, le protocole B (voir section Matériels et Méthodes) a été utilisé pour toutes les expériences dans lesquelles les amplifications PCR et/ou les hybridations sur tâche (Dot Blot) ont été réalisées. 2. 8 QUANTIFICATION PAR PCR ET HYBRIDATION: La première étape était de déterminer si les quantités de produit PCR étaient proportionnelles au nombre de molécules d'ADN cibles initialement présentes dans le tube réactionnel. De l'ADN de Streptosporangium fragile a été utilisé comme cible (voir section Matériels et Méthodes). Les amorces utilisées ont été les amorces FGPS122 et FGPS350 (tableau 2). L'électrophorèse sur gel des produits PCR a montré que l'intensité de bande augmente avec l'accroissement de la concentration des cibles. Les produits PCR ont été hybridés avec la sonde oligonucléotidique FGPS643 (tableau 2), et les signaux ont été quantifiés par imagerie par phosphorescence (phospho-imaging). On a trouvé une bonne corrélation (r2= 0,98) entre le log[nombre de cibles] et le log[intensité du signal d'hybridation]. On a ensuite recherché si l'efficacité de l'amplification PCR était affectée par les acides humiques et l'ADN non cible. Lorsqu'on l'analyse par électrophorèse sur gel, l'intensité accrue des bandes des produits PCR, correspondant aux différentes quantités d'ADN cible, était conservée lorsque l'amplification était réalisée avec des solutions d'ADN auxquelles on avait ajouté des extraits de sol traités à la DNase, contenant des acides humides à des concentrations allant jusqu'à 8ng dans le mélange PCR d'un volume de 50 l. Avec 20 ng d'acide humique dans le mélange PCR, les bandes correspondant aux faibles niveaux d'ADN cible ont disparu, et à des concentrations d'acide humique de 80 ng et à des concentrations supérieures, aucune bande n'était visible . Les quantités variées d'ADN cible de S.fragile ont permis de fournir les quantités attendues de produit PCR lorsque, avant amplification, l'ADN de S. fragile a été mélangé avec de l'ADN de Streptomyces hygroscopicus et ajouté au mélange PCR de 50 l dans une gamme de 100 pg à 1 g afin de simuler l'ADN non-cible libéré à partir de la microflore du sol. 2. 9 QUANTIFICATION DES ACTINOMYCETES INDIGENE DU SOL APRES DIFFERENTS TRAITEMENTS DE LYSE : Ona appliqué le protocole de purification D suivi d'une amplification par PCR comme décrit ci-dessus afin de quantifier les actinomycètes appartenant au genre Streptosporangium dans le sol n 3 après extraction conformément aux protocoles n 1, 2,3, 5a et 5b (figure 5). Après broyage, (protocole n 2) la quantité d'ADN cible provenant de cet actinomycète a été estimée par hybridation (Dot Blot) et radioimagerie comme étant de 2,5 +/- 1,3 ng/g de poids de sol sec. Si l'on postule que le contenu en ADN est de 10 fg par cellule, comme pour Streptomyces (Gladek et al. 1984), cette valeur correspond à approximativement 2,5 x 105 génomes. Des valeurs similaires ont été obtenues après les autres traitements de lyse (respectivement 2,6 +/-1,1 et 1,8 +/- 1,3 ng d'ADN/g de sol sec en utilisant respectivement les protocoles 3 et 4b). 2. 10 EFFICACITE DE LA RECUPARATION D'ADN A PARTIR DE SOLS PREALABLEMENT INOCULES AVEC DES BACTERIES: Trois sols (n 2, 3 et 5) ont été inoculés avec des spores ou des hyphae de Streptomyces lividans à différentes concentrations (voir section Matériel et Méthodes). Les quantités de mycélium ajoutées au sol (figure 6b) correspondent au nombre de spores inoculées dans le milieu de germination. Approximativement 50% de ces spores ont germé. Le nombre exact de cellules dans les hyphae des spores germinées n'a pas été déterminé. En conséquence, les quantités de spores et de mycélium ensemencées dans les sols ne sont pas directement comparables. Pour chaque échantillon de sol, le protocole d'extraction n 6, la méthode de purification D, et l'amplification PCR combinée avec l'hybridation sur tache (Dot Blot) et l'imagerie par phosphorescence (phospho-imaging) ont été utilisés pour dénombrer les ADNs cibles spécifiques qui avaient été libérés. L'ADN extrait peut être clairement distingué du bruit de fond seulement lorsque le nombre de spores ajoutées dépasse 105 pour les sols n 3 et n 5 et 107 pour le sol n 2 (figure 6a). Lorsque le mycélium est ajouté, l'ADN extrait peut être détecté au-delà d'une quantité correspondant à 103 spores/g de sol pour les sols n 2 et n 3, et au-delà de 107 spores/g pour le sol n 5 (figure b). Au-dessus du niveau de détection, le signal d'hybridation augmente avec des quantités croissantes des cellules inoculées. Pour l'inoculum de spores, une augmentation de 100 fois dans le nombre de cellules ensemencées conduit à une augmentation de presque 100 du rendement d'ADN. Cette augmentation est clairement inférieure lorsque les hyphae sont inoculées, particulièrement dans les sols n 2 et n 3 (figure 6). Au contraire, les résultats obtenus lorsque l'ADN de phage lambda a été utilisé comme inoculum, l'ADN a également été récupéré à partir du sol riche en argile (n 5) lorsque les cellules bactériennes ont été utilisées comme inoculum. Cependant, pour ce dernier aussi, le traitement par l'ARN a augmenté la récupération d'ADN de Streptomyces à partir de ce sol à la fois pour les spores et le mycélium (figure 6). Le fait d'ensemencer des sols avec des cellules végétatives de Bacillus anthracis a fourni des taux de récupération similaires à ceux obtenus pour Streptomyces. De plus, les taux de récupération d'ADN à partir du sol n 5 ont augmenté après traitement par l'ARN également pour cet inoculum. Exemple 2: Construction d'une banque d'ADN de faible poids moléculaire ( Le lindane est un pesticide organochloré, récalcitrant à la dégradation et persistant dans l'environnement. En aérobie, sa biodégradation est catalysée par une déhydrochlorinase, codée par le gène linA, permettant de transformer le lindane en 1,2,4-trichlorobenzène. Le gène linA n'a été identifié que parmi deux souches isolées du sol : Sphingomonas paucimobilis, isolé au Japon (Seeno et Wada 1989, Imai et al 1991, Nagata et al 1993) et Rhodanobacter lindaniclasticus isolé en France (Thomas et al 1996, Nalin et al 1999). Pourtant le potentiel de dégradation du lindane, mis en évidence par dosage des ions chlorures libérés et amplification par PCR du gène linA à partir de sols ayant été en contact ou non avec du lindane, semble être répandu plus largement dans l'environnement (BiesiekierskaGalguen, 1997). 1. Extraction directe d'ADN de sol Les sols secs sont broyé pendant 10 minutes dans un broyeur à force centrifuge Restch équipé 6 billes de tungstène. 10 grammes de sol broyé sont mis en suspension dans 50 ml de tampon TENP pH 9 (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaCI 100 mM, polyvinylpolypirrolidone 1% w/v), et homogénéisés au vortex pendant 10 min. Après centrifugation de 5 minutes, 4000 g à 4 C, le surnageant est précipité à l'acétate de sodium (3M, pH 5. 2) et à l'isopropanol, pour être repris dans du tampon TE stérile (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). L'ADN extrait est ensuite purifié sur colonne de tamisage moléculaire S400 (Pharmacia) et sur colonne échangeuse d'ions Elutip d (Schleicher et Schuell), selon les instructions des fabricants, puis conservé dans du TE. 2. Construction de la banque d'ADN extrait du sol dans le vecteur pBluescript SK- Le vecteur pBluescript SK- et l'ADN extrait du sol sont chacuns digérés par les enzymes Hindlll et BamHI (Roche), à raison de 10 unités d'enzymes pour 1 g d'ADN (incubation 2 heures à 37 C). Les ADN sont ensuite ligués par action de la T4 DNA ligase (Roche), une nuit à 15 C, à raison d'une unité d'enzyme pour 300 ng d'ADN (environ 200 ng d'ADN insert et 100 ng de vecteur digéré). Les cellules d'Escherichia coli électrocompétentes, ElectroMAX DH10B TM (Gibco BRL) sont transformées par le mélange de ligation (2 NI) par électroporation (25 F, 200 et 500 #, 2,5 kV) (Biorad Gene Pulser). Après une heure d'incubation dans le milieu LB, les cellules transformées sont diluées de façon à obtenir environ 100 colonies par boîte puis sont étalées sur milieu LB (10 g/l Tryptone, 5 g/l extrait de levure, 5 g/ NaCI) additionné d'Ampiciline (100 mg/l), de y-HCH (500 mg/l), de X-gal 60 mg/l (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactoside), et d'IPTG 40 mg/l (isopropylthio-ss-D-galactoside), et incubées une nuit à 37 C. Le y- hexachlorocyclohexane (Merck-Schuchardt) étant insoluble dans l'eau, une solution à 50 g/l est préparée dans du DMSO (dimethyl sulfoxyde) (Sigma). Une banque de 10 000 clones a ainsi été obtenue. 3.Clonage et expression du gène linA Le criblage de la banque s'effectue par visualisation d'un halo de dégradation du lindane autour de la colonie (le lindane précipitant dans les milieux de culture). Sur 10 000 clones criblés, 35 présentaient ainsi une activité de dégradation du lindane. La présence du gène linA chez ces clones a pu être confirmée par PCR grâce à des amorces spécifiques, décrites par Thomas et al (1996). Des digestions réalisées sur les inserts ainsi que sur les produits d'amplification ont montré des profils identiques entre tous les clones criblés et le témoin de référence, R. lindaniclasticus. Les clones portant le gène linA présentaient également un insert de même taille (environ 4 kb). Il ainsi pu être démontré que l'ADN du sol pouvait être cloné et exprimé chez un hôte hétérologue : E. coli, et que des gènes issus d'une microflore difficilement cultivable pouvaient être exprimés. Des banques réalisées à partir de digestion partielle d'ADN extrait du sol par des enzymes de restriction telles que Sau3AI sont donc aussi envisageables. EXEMPLE 3: Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol, comprenant une étape d'extraction indirecte de l'ADN. 1. MATERIEL ET METHODES. 1. 1 Extraction de la fraction bactérienne du sol. 5g de sol sont dispersés dans 50 ml de NaCI 0. 8% stérile, par broyage au Waring Blender pendant 3 x 1 minute, avec refroidissement dans la glace entre chaque broyage. les cellules bactériennes sont alors séparées des particules du sol par centrifugation sur un coussin de densité de Nycodenz (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvège). Dans un tube à centrifugation, 11,6 ml d'une solution de Nycodenz de densité de 1. 3 g.ml-1 (8g de Nycodenz suspendu dans 10 ml d'eau stérile) sont placés en dessous de 25 ml de la suspension de sol précédemment obtenue. Après centrifugation à 10. 000 g dans un rotor à godets mobiles (rotor TST 28. 38, Kontron) pendant 40 minutes à 4 C, l'anneau cellulaire, se situant à l'interphase de la phase aqueuse et de la phase Nycodenz, est prélevé, lavé dans 25 ml d'eau stérile et centrifugé à 10. 000 g pendant 20 minutes. Le culot cellulaire est ensuite repris dans une solution Tris 10 mM ; EDTA 100 mMn pH 8.0. Préalablement à la dispersion du sol au Waring Blender, une étape d'enrichissement du sol dans une solution d'extrait de levure peut être incluse afin de permettre notamment la germination des spores bactériennes du sol. 5 g de sol sont alors incubés dans 50 ml d'une solution stérile de NaCI 0. 8% - extrait de levure 6%, pendant 30 minutes à 40 C. L'extrait de levure est éliminé par centrifugation à 5000 rpm pendant 10 minutes afin d'éviter la formation de mousse durant le broyage. 1. 2 Lyse des cellules bactériennes du sol. - Lyse des cellules en milieu liquide et purification sur gradient de chlorure de césium. Les cellules sont lysées dans une solution Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 8. 0 contenant 5 mg/ml-1 de lysozyme et 0.5 mg/ml-1 d'achromopeptidase pendant 1 heure à 37 C . Une solution de lauryl sarcosyl (1% final) et de protéinase K (2 mg/ml-1) est ensuite ajoutée et incubée à 37 C pendant 30 minutes. La solution d'ADN est alors purifiée sur un gradient de densité de chlorure de césium par centrifugation à 35 000 rpm pendant 36 heures sur un rotor Kontron 65. 13. Le gradient de chlorure de césium employé est un gradient à 1g/ml de CsCI, possédant un indice de réfraction de 1,3860 (Sambrook et al., 1989). - Lyse des cellules après inclusion dans un bloc d'agarose. Les cellules sont mélangées à un volume égal d'agarose à 1.5% (poids/volume) Seaplaque (Agarose Seaplaque FMC Products. TEBU, Le Perray en Yvelines, France). à bas point de fusion et coulées dans un bloc de 100 l. Les blocs sont ensuite incubés dans une solution de lyse : EDTA 250 mM, saccharose 10.3%, lysozyme 5 mg/ml-1 et achromopeptidase 0. 5 mg/ml-1 à 37 C pendant 3 heures. Les blocs sont alors lavés dans une solution de Tris 10 mM - EDTA 500 mM et incubés une nuit à 37 C dans de l'EDTA 500 mM contenant 1 mg.ml-1 de protéinase K et du lauryl sarcosyl 1%. Après plusieurs lavages dans du Tris-EDTA, les blocs sont conservés dans de l'EDTA 500 mM. La qualité des ADN ainsi extraits est contrôlée par électrophorèse en champs pulsés. La quantité d'ADN extrait a été évaluée sur gel d'électrophorèse par rapport à une gamme étalon d'ADN de thymus de veau. 1. 3 Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol. Les ADN extraits du sol sont caractérisés par hybridation PCR, méthode qui consiste à amplifier dans un premier temps les ADNs à l'aide d'amorces situées sur des régions universellement conservées du gène de l'ARNr16S, puis à hybrider les ADNs amplifiés avec différentes sondes oligonucléotidiques de spécificité connue (tableau 4), dans le but de quantifier l'intensité du signal d'hybridation par rapport à une gamme étalon externe d'ADN génomique. Les ADN extraits du sol ainsi que les ADN génomiques extraits de cultures pures sont amplifiés avec les amorces FGPS 612-669 (tableau 1) dans les conditions standard d'amplification par PCR. Les produits d'amplification sont ensuite dénaturés par un volume égal de NaOH 1 N, déposés sur une membrane de Nylon (GeneScreen Plus, Life Science Products) et hybridés avec une sonde oligonucléotidique marquée à son extrémité par du g32P ATP par action de la T4 polynucléotide kinase. Après préhybridation de la membrane dans une solution de 20 ml contenant 6 ml de SSC 20X, 1 ml de solution de Denhardt, 1 ml de SDS 10% et 5 mg d'ADN hétérologue de sperme de saumon, les hybridations sont conduites durant une nuit à la température définie par la sonde. Les membranes sont lavées deux fois dans du SSC 2X pendant 5 minutes à température ambiante, puis une fois dans du SSC 2X SDS 0,1% et une seconde fois dans du SSC 1X, SDS 0,1% pendant 30 minutes à la température d'hybridation. Les signaux d'hybridation sont quantifiés à l'aide du logiciel Molecular Analyst (Biorad, Ivry sur Seine, France) et les quantités d'ADN sont estimées par interpolation des courbes étalons obtenues à partir des ADN génomiques. 2. RESULTATS ET DISCUSSION 2. 1 Extraction et lyse de la fraction bactérienne du sol. La séparation des cellules microbiennes des particules du sol, préalablement à l'extraction de l'ADN, est une alternative présentant de nombreux avantages par rapport aux méthodes d'extraction directe de l'ADN dans le sol. En effet, l'extraction de la fraction microbienne limite la contamination de l'extrait d'ADN par de l'ADN extracellulaire présent librement dans le sol ou par de l'ADN d'origine eucaryote. Mais surtout, l'ADN extrait de la fraction microbienne du sol présente des fragments de plus longue taille et une meilleure intégrité que l'ADN extrait par lyse directe JACOBSON et RASMUSSEN (1992). De plus, la séparation des particules de sol permet d'éviter une contamination de l'extrait d'ADN par des composés humiques et phénoliques, composés pouvant, par la suite, nuire gravement aux efficacités de clonage. Une des étapes déterminantes pour l'extraction des cellules du sol est la dispersion de l'échantillon de sol afin de dissocier les cellules adhérant à la surface ou à l'intérieur des agrégats de particules de sol. Trois cycles de broyage successifs d'une minute chacun permettent d'obtenir une meilleure efficacité d'extraction des cellules ainsi qu'une plus grande quantité d'ADN récupéré, par rapport à un unique cycle de broyage d'une minute 30. Le tableau 5 rapporte les efficacités d'extraction obtenues après centrifugation sur gradient de Nycodenz , sur la microflore totale viable (dénombrée par microscopie après coloration à l'acridine orange), sur la microflore totale cultivable (dénombrée sur milieu solide Trypticase-Soja 10%), et sur la microflore d'actinomycètes cultivables sur milieu HV agar (après incubation à 40 C dans une solution d'extrait de levure 6%-SDS 0,05% afin de provoquer la germination des sprores). D'autre part, l'ADN extrait a été quantifié soit après une lyse des cellules en milieu liquide (sans purification sur gradient de chlorure de césium) soit après une lyse des cellules incluses dans un bloc d'agarose (après digestion de l'agarose par une b-agarase). Les résultats montrent que plus de 14% de la microflore tellurique totale est récupéré par cette méthode (soit 2 108 cellules par gramme de sol), et que la microflore totale cultivable ne représente qu'à peine 2% de la population microbienne totale. D'autre part, la quantité d'ADN extrait des cellules est de 330 ng par gramme de sol sec. En estimant le contenu d'ADN par cellule microbienne du sol entre 1. 6 et 2. 4 fg, et compte tenu de la quantité de cellules extraites (2 108 cellules par gramme de sol), on peut estimer que la quasi-totalité des cellules ont été lysées et qu'ainsi la lyse n'apporte pas d'important biais à cette approche. Les électrophorèses en champs pulsés ont montré que l'ADN du sol extrait après gradient de Nycodenz et de CsCI pouvait atteindre une taille de 150 kb et que la lyse en bloc d'agarose permettait d'extraire des fragments supérieurs à 600kb. Ces résultats confirment l'intérêt de cette approche indépendante de la culture pour la construction de banques d'ADN de l'environnement, en se présentant comme une alternative aux méthodes directes d'extraction d'ADN. 2. 2 Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol. Le but de la caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol est d'obtenir des profils représentant les proportions des différents taxons bactériens présents dans l'extrait d'ADN. Il s'agissait également de connaître les biais d'extraction induits par la séparation préalable de la réaction cellulaire du sol, en comparaison avec une méthode d'extraction directe faute de visualisation directe de la diversité microbienne présente dans les sols. En effet, peu d'informations ont été rassemblées sur l'extraction des cellules sur gradient de Nycodenz en fonction de leur structure morphologique (diamètre des cellules, formes filamenteuses ou sporulées). Les méthodes jusqu'ici en place étaient basées sur des: - hybridations quantitatives utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques à différents groupes bactériens, appliqués directement d'ADN extrait de l'environnement Malheureusement, cette approche n'est pas très sensible et ne permet pas de détecter des genres ou des groupes taxonomiques présents en faible abondance AMANN (1995). - PCR quantitatives telles que la MPN-PCR (Most Probable Number) SYKES et al. (1992) ou la PCR quantitative par compétition DIVIACCO et al. (1993). Les inconvénients respectifs de chacune de ces approches sont (i) la lourdeur d'utilisation du fait de la multiplication des dilutions et des répétitions qui rend la technique inappropriée pour un grand nombre d'échantillons ou de couples d'amorces, et (ii) la nécessité de construire un compétiteur spécifique à l'ADN cible et n'induisant pas de biais dans la compétition. La méthode mise en place selon la présente invention consiste à amplifier universellement un fragment de 700 pb à l'intérieur de la séquence d'ADNr 16S, à hybrider cet amplifiat avec une sonde oligonucléotidique de spécificité variable (au niveau du règne, de l'ordre, de la sous classe ou du genre) et à comparer l'intensité d'hybridation de l'échantillon par rapport à une gamme étalon externe. L'amplification préalable à l'hybridation permet de quantifier des genres ou des espèces de micro-organismes peu abondants. De plus, l'amplification par des amorces universelles permet, lors de l'hybridation, d'utiliser une large série de sondes oligonucléotidiques. Elle permet de comparer entre eux différents modes de lyse (extraction directe ou indirecte) sur des groupes taxonomiques bien définis. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 6. Ils montrent des profils similaires entre les deux méthodes d'extraction (directe et indirecte). Ainsi, il apparaît que l'extraction préalable de la fraction microbienne tellurique n'introduit pas de réels biais parmi les taxons testés. La seule différence significative entre les deux approches d'extraction semblerait être la plus grande abondance de séquences d'ADNr appartenant aux y protéobactéries dans l'extrait par la méthode d'extraction indirecte. De plus, un effet significatif de l'incubation de l'échantillon de sol dans une solution d'extrait de levure est observé sur les populations sporulées du sol (Gram+, bas pourcentage de GC et Actinomycètes). Cette étape provoque la germination des spores, et permet d'une part certainement une meilleure récupération de ce type de cellules et d'autre part une plus grande efficacité de la lyse sur des cellules en germination. Cette approche permet une analyse semi-quantitative, ciblée sur les principaux taxons définis à partir de micro-organismes cultivés et habituellement retrouvés dans les sols. Seuls des outils moléculaires permettent d'estimer l'importance des différents taxons, les méthodes de mise en culture étant trop restrictives et dépendantes de la spécificité du milieu utilisé. Les résultats montrent qu'une grande part de la population microbienne n'est pas représentée dans les groupes phylogénétiques décrits, mettant ainsi en évidence l'existence de nouveaux groupes composés de micro-organismes non cultivés jusqu'à présent, ou non cultivables. Ainsi, de nouvelles sondes peuvent être définies à partir de séquences déterminées à partir d'ADN extrait du sol (nouveaux phylums composés de micro-organismes non cultivés, LUDWIG et al. (1997) afin d'obtenir une image plus exacte de la composition de l'extrait d'ADN. Exemple 4 : - CONSTRUCTION DU COSMIDE POS 7001 Caractéristiques de POS 7001: Réplicatif chez E. coli Intégratif chez Streptomyces Sélectionnable chez E. coli AmpR, HygroR et Streptomyces HygroR Les propriétés du cosmide permettent d'insérer de grands fragments d'ADN entre 30 et 40kb. Il comprend 1 - Le promoteur inductible tipA de Streptomyces lividans 2 - Le système d'intégration spécifique de l'élément pSAM2 3 - Le gène de résistance à l'hygromycine 4- le cosmide pWED1, dérivé de pWED15 1) - Le promoteur inductible du gène tip A de S. lividans Le gène tipA code une protéine de 19 KD dont la transcription est induite par l'antibiotique thiostrepton ou nosiheptide. Le promoteur de tipA est bien régulé: induction en phase exponentielle et en phase stationnaire (200X) Murakami T, Holt TG, Thompson CJ. J. Bacteriol 1989 ; 171 : 1459-66 2) - Le gène de résistance à l'hygromycine - Hygromycine : produit par S. hygroscopicus - Le gène de résistance code une phosphotransfèrase (hph) - Le gène utilisé provient d'une cassette construite par Blondelet et al dans laquelle le gène hyg est sous contrôle de son propre promoteur et du promoteur plac inductible par l'IPTG Blondelet-Rouault et al ; . Gene 1997 ;190 :315-7 3) - Le système d'intégration site-spécifique L'élément pSAM2 s'intègre dans le chromosome par un mécanisme d'intégration site-spécifique. La recombinaison a lieu entre deux séquences identiques de 58 pb présentes sur le plasmide (attp) et sur le chromosome (attB). Le gène int, situé à proximité du site attP, est impliqué dans l'intégration site-spécifique de pSAM2, et son produit présente des similitudes avec les intégrases des bactériophages tempérés d'entérobactéries. Il a été démontré qu'un fragment de pSAM2 ne contenant que le site d'attachement attP ainsi que le gène int était capable de s'intégrer de la même manière que l'élément entier. Voir brevet français n 88 06638 du 18/05/1988, ainsi que Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42). 4) - Construction du cosmide pOS7001 Etape 1/ Le promoteur TipA a été isolé du plasmide pPM927 (Smokvina et al. Gene 1990 ; 94 :53-9 ) sur un fragment Hindlll-BamHl de 700 paires de bases et cloné dans le vecteur pUC18 (Yannish-Perron et al., 1985) digéré par Hindlll/BamHI Etape 2/ Ce fragment Hindlll-BamHl a ultérieurement été transféré de pUC18 à pUC19 (Yannish-Perron et al., 1985). Etape 3/ Un insert BamHI-BamHI de 1500 paires de bases portant le gène int et le site attP de pSAM2 a été isolé du plasmide pOSint1, représenté à la Figure 8, (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42) et cloné au site BamHl du vecteur précédent (pUC19/TipA), dans l'orientation permettant de mettre le gène int sous contrôle du promoteur TipA. Etape 4/ Le site BamHl situé en 5' du gène int a été supprimé par digestion partielle BamHl puis traitement par l'enzyme Klenow. Un fragment Hindlll-BamHl portant TipA-int-attP a ainsi été isolé de pUC19 et transféré dans pBR322 Hindlll/BamHI. Etape 5/ La cassette Hygromycine isolée de pHP45Qhyg (BlondeletRouault et al., 1997) sur un fragment Hindlll-Hindlll a été clonée au site Hindlll situé en amont du promoteur TipA. Etape 6/ Le site Hindlll situé entre la cassette QHyg et le promoteur TipA a été supprimé par traitement Klenow après digestion partielle Hindlll. Etape7/ Le plasmide obtenu à l'issue de l'étape précédente permet d'isoler un fragment unique HindlII-BamHI, portant tous les éléments QHyg/TipA/int attP, qui a été cloné après traitement Klenow au site EcoRV du cosmide pWED1. Le cosmide pWED1, représenté à la Figure 9, dérive du cosmide pWE15, représenté à la Figure 10 (Wahl GM, et al.. Proc Natl Acad Sci U S A 1987 84 :2160-4) pardélétion d'un fragment Hpal-Hpal portant le gène Neomycine et l'origine SV40. Une carte du vecteur pOS 7001 est représentée à la Figure 11. Exemple 5 : Construction du cosmide conjugatif et intégratif chez Streptomyces, le vecteur pOSV 303. Etant donné que l'empaquetage sélectionne les clones ayant une taille supérieure à 30kb, seuls 10 à 15% des clones ne contiennent pas d'insert, il n'est donc pas vraiment nécessaire d'avoir un système de sélection des recombinants, ce qui permet de construire un vecteur plus petit. Construction : Etape 1 : le vecteur pOSV001 Clonage d'un fragment Pstl-Pstl de 800 paires de bases portant l'origine de transfert OriT du réplicon RK2 (Guiney et al., 1983), dans le plasmide pUC19 ouvert par Pstl. Cette étape de clonage permet d'obtenir un vecteur transférable de E. coli à Streptomyces par conjugaison. La carte du vecteur pOSV 001 est représentée à la Figure 17. Etape 2 : le vecteur pOSV002 Insertion du marqueur Hygromycine (cassette hyg), et sélectionnable chez Streptomyces, de sorte que le gène conférant la résistance à l'hygromycine soit transféré en dernier ce qui permet de s'assurer du transfert complet du BAC avec l'insert d'ADN du sol. Clonage de la cassette Hygromycine isolée de pHP45Qhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll portant le gène de résistance à l'Hygromycine.. Ce fragment est cloné au site Pstl (position 201) du vecteur pOSV001. Ce site Pstl a été choisi, compte tenu du sens du transfert, pour que le marqueur Hygro soit le dernier transféré lors de la conjugaison. Les extrémités Pstl et Hindlll sont rendues compatibles après traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymérase permettant de générer des "bouts francs". L'orientation du fragment Qhyg est déterminée en fin de construction. La carte du vecteur pOSV002 est représentée à la Figure 18. Etape 3 : le vecteur pOSV010 Le fragment Xbal-Hindlll isolé du plasmide pOSV002 et contenant le marqueur de résistance à l'hygromycine et l'origine de transfert est cloné dans le plasmide pOSint1 digéré par Xbal et Hindlll. L'orientaion des sites est telle que le marqueur hygromycine sera toujours transféré en dernier. Le plasmide pOSint1, représenté à la Figure 8, a été décrit dans l'article de Raynal et al.( Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42). Cette construction permet l'expression de l'intégrase chez E. coli et chez Streptomyces. Etape 4 : insertion du site " cos Le principe est d'insérer un site " cos " dans le plasmide pOSV010 permettant l'empaquetage dans le plasmide pOSV010, représenté à la Figure 12. L'obtention du fragment " cos " est représentée à la Figure 13. Ce fragment est obtenu par PCR. A partir d'un fragment portant les extrémités cohésives (cos) de # (bactériophage lambda ou cosmide pHC79), une amplification par PCR est réalisée à l'aide des oligonucléotides correspondant aux séquences -50/+130 par rapport au site cos. Ces oligonucléotides contiennent en outre les sites de clonage Nsil, compatible Pstl, Xhol, compatible Sali, EcoRV, " bout franc ". L'addition des sites rares Swal et Pacl permet d'isoler et/ou de cartographier l'insert cloné. Le fragment PCR est borné par un site Pstl à l'extrémité 5' et par un site Hindi à l'extrémité 3', permettant le clonage dans le vecteur pOSV010 (Figure 12) prélablement digéré par les enzymes Nsil et EcoRV, provoquant la délétion du répresseur laclq. La carte du vecteur pOSV303 est représentée sur la Figure 14. Le vecteur pOSV303, contient des sites de clonage tels que le site Nsil, compatible Pstl, le site Xhol, compatible Sali ou encore le site EcoRV pour l'obtention de " bouts francs ". Exemple 6 : - Construction du cosmide réplicatif navette E. coliStreptomyces pOS700R. Les fragments du plasmide pEI16 (Volff et al., 1996) représenté à la Figure 15 ont été isolés et traités par Klenow. Ces fragments contiennent les séquences nécessaires à la replication et à la stabilité provenant du plasmide SCP2. Ces deux fragment sont insérés séparément dans le site EcoRV du cosmide pWED1 conduisant à 2 clones différents. La cassette Hygromycine isolée de pHP45Qhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll a été clonée au site Hindlll des cosmides pWED1 contenant l'insert ScP2 sous forme de fragments Pstl-EcoRI ou Xbal. Elle confère une résistance à l'Hygromycine sélectionnable à la fois chez E. coli et chez Streptomyces. Transformation de S. lividans et détermination de l'efficacité de transformation. Il est apparu que le cosmide contenant l'insert Xbal était moins stable que celui contenant le fragment Pstl EcoRI. C'est donc ce dernier qui a été retenu sous le nom de pOS700R. La carte du vecteur pOS 700R est représentée sur la Figure 16. Exemple 7 : Efficacité de transformation des vecteurs intégratifs (pOS7001) et réplicatifs Possibilités Rendre la souche de S. lividans résistante au thiostrepton par intégration du plasmide pT01 portant le marqueur de résistance au thiostrepton Préparation de protoplastes à partir de S. lividans cultivée en présence de thiostrepton Avec le vecteur pOS7001, l'efficacité de transformation est d'environ 3000 transformants par g d'ADN. Avec le vecteur pOS700R, l'efficacité de transformation est d'environ 30 000 transformants par g d'ADN. Exemple 8: Construction d'un vecteur BAC intégratif chez Streptomyces et conjugatif Caractéristiques: Réplicatif chez E. coli Transférable par conjugaison de E. coli aux Streptomyces Intégratif chez Streptomyces Sélectionnable chez E. coli et Streptomyces Capable d'insérer de grands fragments d'ADN ; il faut souligner qu'il est nécessaire de disposer d'ADN du sol dont la taille est comprise entre 100 et 300kb et non contaminé par des petits fragments. En effet les petits fragments sont très préférentiellement intégrés. Doté d'un crible permettant de sélectionner les plasmides portant un insert. Ce crible permet en éliminant les vecteurs refermés sur eux même et non digérés de travailler avec un rapport plus élevé entre vecteur et DNA à insérer ce qui permet d'avoir une meilleure efficacité de clonage pour constituer des banques. Construction : Etape 1 : le vecteur pOSV001 Clonage d'un fragment Pstl-Pstl de 800 paires de bases portant l'origine de transfert OriT du réplicon RK2 (Guiney et al., 1983), dans le plasmide pUC19 ouvert par Pstl. Cette étape de clonage permet d'obtenir un vecteur transférable de E. coli à Streptomyces par conjugaison. La carte du vecteur pOSV 001 est représentée à la Figure 17. Etape 2 : le vecteur pOSV002 Insertion du marqueur Hygromycine (cassette Qhyg), et sélectionnable chez Streptomyces, de sorte que le gène conférant la résistance à l'hygromycine soit transféré en dernier ce qui permet de s'assurer du transfert complet du BAC avec l'insert d'ADN du sol. Clonage de la cassette Hygromycine isolée de pHP45Qhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll portant le gène de résistance à l'Hygromycine.. Ce fragment est cloné au site Pstl (position 201) du vecteur pOSV001. Ce site Pstl a été choisi, compte tenu du sens du transfert, pour que le marqueur Hygro soit le dernier transféré lors de la conjugaison. Les extrémités Pstl et Hindlll sont rendues compatibles après traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymérase permettant de générer des "bouts francs". L'orientation du fragment Qhyg est déterminée en fin de construction. La carte du vecteur pOSV002 est représentée à la Figure 18. Etape 3 : le vecteur pOSV010 Le fragment Xbal-Hindlll isolé du plasmide pOSV002 et contenant le marqueur de résistance à l'hygromycine et l'origine de transfert est cloné dans le plasmide pOSint1 digéré par Xbal et Hindlll. L'orientation des sites est telle que le marqueur hygromycine sera toujours transféré en dernier. Le plasmide pOSint1, représenté à la Figure 8, a été décrit dans l'article de Raynal et al.( Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42). Cette construction permet l'expression de l'intégrase chez E. coli et chez Streptomyces. Etape 4 : le vecteur pOSV014 Addition d'une "cassette" permettant à terme de sélectionner dans la construction finale les plasmides ayant insérés de l'ADN étranger. Cette "cassette" porte le gène codant pour le répresseur CI du phage # et le gène conférant la résistance à la tétracycline. Ce gène porte dans sa région 5' non codante la séquence cible du répresseur. L'insertion d'ADN dans le site Hindlll situé dans la séquence codante de CI conduit à la non production du répresseur et donc à l'expression de la résistance à la tétracycline. Elle est portée par le plasmide pUN99 décrit dans l'article : Nilsson et al . (Nucleic Acids Res 1983, 11:8019-30) Un fragment Pvull-Hindlll isolé de pOSV010 et contenant les séquences Int, attP, Hygro et oriT est cloné au site Mscl de pUN99 . La carte du vecteur pOSV014 est représentée sur la Figure 19. Etape 5 : le vecteur pOSV 403, vacteur BAC intégratif et conjugatif Cette dernière étape de clonage dans pBAC11(représenté à la Figure. 20) permet de conférer au plasmide final des caractéristiques de BAC (Bacterial Artificial Chromosome), en particulier l'aptitude à accepter des inserts d'ADN de très grande taille. Le fragment Pstl-Pstl du vecteur pOSV014 portant l'ensemble des éléments et fonctions décrits précédemment est cloné dans le pasmide pBAC11 (pBeloBAC11) digéré par Notl. Les extrémités sont rendues compatibles pat traitement avec l'enzyme de Klenow. La carte du vecteur pOSV403 est représentée sur la Figure 21. Le schéma de la Figure 21 indique l'orientation retenue. Etape 6 : Le vecteur pOSV403 contient les sites Hindlll et Nsil. Le site Nsil est assez rare chez Streptomyces et présente l'avantage d'être compatible avec Pstl. En revanche, le site Pstl est fréquent chez Streptomyces et peut être utilisé pour effectuer des digestions partielles. Les clones recombinants portant un insert cloné dans le répresseur CI, et donc inactivant ce répresseur deviennent résistants à la tétracycline. Etant donné que les BACs ne sont présents qu'à raison d'une copie par cellule, il faut sélectionner les clones recombinants avec une dose plus faible de tétracycline que la dose habituelle de 20 g/ml, par exemple avec une dose de 5 g/ml. Dans ces conditions il n'y a aucun bruit de fond. Il est aussi possible d'utiliser un système développé et commercialisé par la société InVitrogen, dans lequel l'insertion d'ADN dans le vecteur inactive un inhibiteur de la gyrase dont l'expression est toxique pour E. coli. Le fragment est préférentiellement isolé à partir du vecteur pZErO-2 (http://www.invitrogen.com/). Exemple 9 : Construction d'une banque de S. alboniger dans les 2 cosmides intégratif (pOS7001) et replicatif (pOS700R) 1) - Construction de la Banque Pour évaluer l'efficacité du système de clonage, la voie de biosynthèse de la puromycine de Streptomyces alboniger, a été clonée dans les deux cosmides navettes pOS7001 et pOS700R. Les gènes de la voie de biosynthèse de la puromycine sont portés par un fragment d'ADN BamHI d'environ 15 Kb. L'ADN génomique de Streptomyces alboniger a été isolé. 90% de cet ADN possède un poids moléculaire compris entre 20 et 150 Kb, déterminé par électrophorèse en champ pulsé. Les deux cosmides ont été digérés par l'enzyme BamHl (site unique de clonage). Les conditions de digestion partielle BamHl de l'ADN génomique ont été déterminées (50 g d'ADN et 12 unités d'enzyme, 5 minutes de digestion). Après vérification de la taille par électrophorèse en gel d'agarose, l'ADN partiellement digéré a été introduit dans les vecteurs. Dans la ligation, 15 g d'ADN génomique + 2 g du vecteur intégratif ou 5 g du vecteur réplicatif ont été utilisés. Chaque mélange de ligation a été utilisé pour l'encapsidation in vitro de l'ADN dans les têtes de bactériophage lambda. Les mélanges d'encapsidation (0,5ml) ont été titrés (Vecteur intégratif pOS7001 = 7,5 x 105 cosmides/ml, Vecteur réplicatif= 5 x 104 cosmides/ml). Les cosmides ont été utilisés pour transfecter E. coli et générer ainsi deux banques d'environ 25000 clones résistant à l'ampicilline. L'ADN de l'ensemble de ces clones a été isolé et quantifié. Pour tester les banques, plusieurs clones ont été choisis, l'ADN purifié et a été digéré par BamHl, afin de vérifier la présence et la taille des inserts. Les clones testés contiennent entre 20 et 35 Kb d'insert de S. alboniger. 2) - Identification des clones contenant la voie de biosynthèse de la puromycine Les clones susceptibles de contenir la voie complète de biosynthèse de la puromycine ont été identifiés par hybridation avec une sonde correspondant au gène de résistance à la puromycine, le gène pac de 1,1 kb. (Lacalle et al. Gene 1989;79, 375-80 ) Banque faite dans le Vecteur Intégratif pOS 7001: Parmi 2000 clones analysés, 9 clones ont hybridé avec la sonde et ils contiennent des inserts d'environ 40 kb. Banque faite dans le Vecteur replicatif pOS 700R: Parmi 2000 clones analysés, 12 clones ont hybridé avec la sonde ; ils contiennent des inserts d'environ 40 kb. En utilisant les données publiées par Tercero et al. (J Biol Chem. 1996; 271,1579-90), les clones contenant la totalité de la voie de biosynthèse ont été identifiés, après hybridation avec des sondes appropriées. Certains cosmides intégratifs et replicatifs présentent après digestion Clal-EcoRV un fragment de 12360 paires de bases, ce qui laisse supposer un insert contenant la totalité de la voie de biosynthèse de la puromycine. 4) - Vérification de la production de puromycine par les clones résistants (Rhône-Poulenc). a) Matériels et Méthodes Souches et conditions de culture : Trois clones résistants ont été sélectionnés pour vérifier la production de puromycine. Ils correspondent aux recombinants de S. lividans contenant un insert dans le vecteur intégratif pOS7001 (G 20) ou un insert dans le vecteur réplicatif (G21 et G22). Des souches de référence ont été utilisées pour s'assurer que les milieux de culture utilisés permettaient cette production. Il s'agit de la souche sauvage S. alboniger ATCC 12461, productrice de puromycine et de la souche recombinante S. lividans contenant le cluster complet de la puromycine cloné dans le plasmide pRCP11(Lacalle et al, 1992, the EMBO journal, 11, 785-792) (G23). Les souches sont ensemencés dans un milieu de culture dont la composition est la suivante : Peptone bactériologique Organotechnie 5 g/l de milieu final Extrait de levure Springer 5 Extrait de viande Liebig 5 Glucose Prolabo 15 CaC03 (1) Prolabo 3 NaCI Prolabo 5 Agar (2) Difco 1 (1) Les 3g de carbonate sont mélangés à 200ml d'eau distillée puis stérilisés à part. L'addition se faisant après stérilisation. (2) L'agar est préalablement fondu dans 100ml d'eau distillée avant d'être ajouté aux autres ingrédients du milieu pH ajusté à 7,2 avant stérilisation stérilisation 25 minutes à 121 C 50 g/l d'hygromycine et 5 g/l de thiostrepton sont ajoutés au milieu après stérilisation de façon à maintenir une pression de sélection des clones contenant un insert grâce au gène marqueur présent sur le vecteur ( le gène de résistance au thiostrepton étant porté par le plasmide pRCP11). 50 ml de milieu de culture liquide, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensemencés avec 2 ml de suspension aqueuse de spores et de mycelium de chacune des souches. Les cultures sont incubées pendant 4 jours à 28 C avec une agitation de 220 trs/mn.50 ml de milieux de production, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensuite ensemencés avec 2 ml de ces pré-cultures. Le milieu de production utilisé est un milieu industriel optimisé pour la production de pristinamycine (milieu RPR 201). Les cultures sont incubées à 28 C, avec une agitation de 220trs/mn. Après différents temps d'incubation, un erlenmeyer de chaque culture est amené à pH 11 puis extrait par 2 fois 1 volume de dichlorométhane. La phase organique est concentrée à sec sous pression réduite, puis l'extrait est repris par 10 l de méthanol. 100 l de la solution méthanolique sont analysés en CLHP munie d'un détecteur à barrette de diodes dans un système gradient eau-acétonitrile 0,05% TFA VA/ sur colonne C18 pour la détection de la puromycine. b) Résultats Les analyses HPLC comparatives à partir des cultures des différentes souches montrent la production de puromycine dans la culture de la souche sauvage à partir de 24 h d'incubation. Une production, bien que plus faible, est aussi nettement détectée à partir de 48 h dans la culture du clone G20 contenant le cosmide pOS7001 (figure 23). La puromycine a également été détecté à l'état de trace dans le clone G23 contenant l'opéron complet codant pour le composé dans le plasmide pRCP11. Néanmoins, aucune production n'a été observée dans les cultures des clones G21 et G22 contenant le cosmide pOS700R. Les résultats sont reportés sur la Figure 23. c) Conclusions Les résultats obtenus permettent de démontrer l'efficacité du système de clonage développé dans le cosmide pOS7001 pour exprimer chez un hôte hétérologue tel que S. lividans une voie de biosynthèse complète sous le contrôle de séquences régulatrices qui lui sont propres. D'autre part, ces données valident également le criblage des banques obtenues sur la base de la résistance des clones à la puromycine puisqu'il a conduit à identifier parmi un petit nombre de clones, un recombinant capable d'exprimer la voie de biosynthèse associée au gène de résistance. L'absence de production de puromycine chez les autres clones peut probablement s"expliquer par le clonage d'une partie seulement de l'opéron contenant le gène de résistance mais dépourvue de certaines séquences de régulation, transduction ou transcription nécessaires à la synthèse du composé. EXEMPLE 10 : - CLONAGE D'ADN DU SOLDANS DES VECTEURS 1) - Préparation de l'ADN du sol à cloner Les différents fragments d'ADN doivent être purifiées selon leur destination : Cosmides La taille des molécules doit être comprise entre 30 et 40kb. Or , l'ADN extrait du sol est hétérogène en taille et comprend des molécules atteignant 200 ou 300kb. Afin d'homogénéiser les tailles, l'ADN est cassé mécaniquement par passage de la solution à travers une aiguille de 0,4mm de diamètre. Les fragments d'une taille voisine de 30kb ne sont pas affectés par ces passages répétés à travers une aiguille et il n'est donc pas nécessaire de faire une séparation par la taille surtout que l'empaquetage dans les particules élimine automatiquement les inserts courts. BACs Préparation de l'ADN L'ADN du sol est séparé par electrophorèse en champ pulsé (type CHEF) dans des conditions telles que les fragments compris entre 100 et 300kb sont concentrés dans une bande d'environ 5mm. Ceci est obtenu en réalisant la migration dans un gel à 0,7% d'agarose normal ou 1% d'agarose à bas point de fusion avec un temps de pulsation de 100 secondes pendant 20 heures et à une température de 10 C. Récupération de l'ADN Deux méthodes sont utilisées, leur choix dépend de la taille des molécules que l'on veut isoler, soit jusqu'à 150kb soit au dessus. - Jusqu'à 150kb La porosité d'un gel à 0,7% d'agarose permet la sortie de l'ADN par électroélution à condition d'absence totale de bromure d'ethidium. Cet ADN est ensuite manipulé avec des instruments de pipetage à orifice agrandi et hydrophobe pour éviter la fragmentation mécanique des molécules. - Entre 100 et 300kb La bande contenant les fragments d'une taille entre 100 et 300kb est découpée. Pour la migration un gel d'agarose à 1% et à bas point de fusion est utilisé. Cette propriété permet de fondre le gel à une température supportable pour l'ADN de 65 C et de le digérer ensuite par l'agarase (Agarase commercialisée par la société Boehringer) à une température de 45 C suivant les prescriptions du fournisseur. 2) - Utilisation des cosmides intégratifs pOS7001 et replicatifs pOS700R Construction par queues polyA polyT Principe Un vecteur cosmide, ouvert à un site de clonage quelconque, est modifié aux extrémités 3' en ajoutant un polynucléotide monotone. D'autre part, l'ADN à cloner est modifié aux extrémités 3' en ajoutant un polynucléotide monotone pouvant s'apparier au précédent. L'association vecteur-fragment à cloner se fait par ces polynucléotides et la séquence cos du vecteur permet l'empaquetage in vitro de l'ADN dans des capsides de phage Lamda. Préparation du vecteur Le vecteur utilisé est un vecteur autoréplicatif chez E. coli et intégratif chez Streptomyces. Pour E. coli, la sélection se fait sur la résistance à l'ampicilline et pour Streptomyces, elle se fait sur la résistance à l'hygromycine . Le cosmide est ouvert à l'un des 2 sites possibles (BamHl ou Hindlll) et les extrémités 3' sont rallongées par du polyA avec de la terminale transférase dans les conditions où le fournisseur de l'enzyme prévoit l'addition de 50 à 100 nucléotides. Préparation de l'ADN à insérer. Les extrémités 3' de l'ADN sont rallongées par du polyT avec de la terminale transférase dans les conditions fournissant un allongement comparable à celui du vecteur. Dans les conditions expérimentales décrites par le fabricant les queues polyA polyT sont longues de 30 à 70 bases Assemblage des molécules et encapsidation in vitro. Pour l'assemblage des molécules, on mélange une molécule de vecteur pour une molécule d'ADN inséré. La concentration de l'ADN en masse est de 500 g.ml-1. Le mélange est encapsidé et l'efficacité de transfection dépend de la souche utilisée comme réceptrice et de l'ADN inséré : nulle avec l'ADN test et la souche DH5a, l'efficacité est comparable pour les souches SURE et DH10B ; à l'extraction le rendement en ADN est cependant plus élevé avec la souche DH10B. Construction par déphosphorylation L'ADN du sol est mis en bouts francs par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes. Cette opération est faite avec : enzyme de Klenow, T4 polymérase, les 4 nucléotides triphosphates. Le vecteur cosmidique est digéré par BamHI, puis traité par l'enzyme de Klenow pour le rendre bout franc puis déphosphorylé pour éviter qu'il ne se referme sur lui même. Après ligation, le mélange est encapsidé et transfecté comme précédemment décrit. 3) - Utilisation des pBAC Principe. Le plasmide pBAC conjugatif et intégratif possède les sites Hindlll et Nsil comme sites de clonage L'insertion d'une séquence d'ADN à ces sites inactive le répresseur CI du phage Lambda qui contrôle l'expression du gène de la résistance à la tétracycline. L'inactivation du répresseur rend donc la cellule résistante à cet antibiotique (5 g.ml-1). Le clonage à ces sites est facilité par la modification du vecteur et la préparation de l'ADN à cloner. Préparation du vecteur. Exemple Hindlll Pour que le vecteur ne se referme pas sur lui-même, le site Hind III est modifié : la première base (A) est remise en place pour former une séquence 5' sortante, qui ne peut pas s'apparier avec ses semblables. L'opération est effectuée par l'enzyme de Klenow en présence de dATP. Le succès de l'opération est vérifié en effectuant une ligation du vecteur sur lui-même avant et après traitement à l'enzyme de Klenow. A quantité d'ADN testé identique, on obtient 3000 clones avant traitement et 60 après traitement. Préparation de l'ADN (taille comprise entre 100 et 300kb). Mise en bouts francs de l'ADN. L'ADN est mis en bouts francs par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes. Cette opération est faites avec : enzyme de Klenow, T4 polymérase, les 4 nucléotides triphosphates. Préparation des extrémités.Exemple Hindlll L'addition de l'ADN sur le vecteur se fait au moyen d'oligo-nucléotides reconnaissant la séquence Hindlll modifiée du vecteur. Ils contiennent des sites de restriction rares pour permettre les clonages ultérieurs (Swal ; Notl). cette technique est dérivée de celle de : Elledge SJ, Mulligan JT, Ramer SW, Spottswood M, Davis RW. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Mar 1;88(5):1731-5 Deux oligonucléotides complémentaires sont utilisés : Oligo 1 : 5'-GCTTATTTAAATATTAATGCGGCCGCCCGGG-3' (SEQ ID N 25) Oligo 2 : 5'-CCCGGGCGGCCGCATTAATATTTAAATA-3' (SEQ ID N 26) Ils sont phosphorylés en 5' par la polynucléotide kinase de T4 en présence d'ATP, après leur hybridation. Cette étape de phosphorylation peut être éliminée en utilisant les oligo-nucléotides déjà phosphorylés. La ligation de cet adaptateur double brin avec l'ADN à insérer dans un vecteur est faite par la ligase de T4 en présence d'un très grand excès d'adaptateur (1000 molécules d'adaptateur pour une molécule d'ADN à insérer), en 15 heures à 14 C. L'excès d'adaptateur est éliminé par électrophorèse sur un gel d'agarose et les molécules d'intérêt sont récupérées du gel par hydrolyse de celui-ci par de l'agarase ou par électroélution. Ligation vecteur- ADN . La ligation se fait à 14 C sur 15 heures avec 10 molécules de vecteur pour une molécule d'insert. Transformation. La souche réceptrice est la souche DH10B. La transformation se fait par électroporation. Pour exprimer la résistance à la tétracycline, les transformants sont incubés à 37 C pendant 1 heure en milieu sans antibiotique. La sélection des clones se fait par culture pendant une nuit , sur milieu gélosé LB additionné de tétracycline à 5 g.ml-1. Exemple 11 : CONJUGAISON CLONE A CLONE ENTRE E. COLI ET STREPTOMYCES CONJUGAISON ENTRE E coLI SOUCHE S17.1 CONTENANT PPM803 ET STREPTOMYCES LIVIDANS TK 21 Introduction Il est possible d'effectuer des conjugaisons entre E. coli et Streptomyces (Mazodier et al, 1989). L'adaptation de cette méthode en développant une technique dite en goutte où l'on mélange 10 l d'une culture de E. coli contenant un vecteur recombinant à une goutte de S. lividans récepteur consiste à réaliser une transformation de clone à clone en s'assurant qu'à la fin de l'opération toute la banque construite dans E. coli est introduite dans S. lividans. Une transformation en vrac amènerait obligatoirement à une multiplication des clones de Streptomyces transformants afin d'être pratiquement sûr que la banque dans E. coli est complètement représentée dans S. lividans. De plus cette méthode est facilement automatisable. Essais préliminaires Conjugaison entre E. coli souche S17. 1 contenant le vecteur pOSV303 et S. lividans TK21. Dans ces conditions, on mélange 6 x 106cellules de E. coli avec 2 x 106 spores pré-germées de S. lividans dans un volume final de 20 l. Mise au point de la méthode Il est connu que l'ADN extrait de certains actinomycètes est modifié et de ce fait ne peut être introduit dans certaines souches de E. coli sans qu'il soit restreint. La souche de E. coli DH10B qui accepte ces ADN n'est pas capable de transférer à Streptomyces un plasmide ne contenant que oriT, et il est donc nécessaire d'en construire une. Il faudrait y introduire par intégration dans le chromosome un dérivé de RP4 capable de fournir en trans toutes les fonctions nécessaires pour assurer le transfert des clones recombinants contenant l'origine de transfert oriT. Exemple 12 : Construction d'une banque cosmidique dans E, coli et Streptomyces lividans : Clonage de l'ADN du sol L'objectif est la construction d'une librairie d'ADN de grande taille issue de l'environnement, sans étape préalable de culture.des microorganismes, dans le but d'accéder aux gènes métaboliques de bactéries (ou de tout autre organisme) que l'on ne sait pas cultiver dans des conditions standard de laboratoire. La procédure décrite a été utilisée pour générer une banque d'ADN dans Escherichia coli utilisant le cosmide navette E. coli-S. lividans pOS7001 et de l'ADN extrait et purifié de la fraction bactérienne d'un sol . Cette dernière méthode permet d'obtenir de l'ADN d'une grande pureté et d'une taille moyenne de 40 kb. Aussi, afin d'éviter pour le clonage une digestion partielle de l'ADN extrait, a été adoptée une stratégie alternative basée sur l'utilisation de l'enzyme terminale tranférase qui permet d'ajouter des queues de polynucléotides aux extrémités 3' de l'ADN et du vecteur. 5 g d'ADN ont été extraits de 60 mg de sol de " la Côte Saint André " selon le protocole décrit à l'exemple 3 et traités avec de la terminale transférase (Pharmacia) pour rallonger les extrémités 3' avec un polynucléotide monotone (poly T) (Exemple 10). Le cosmide intégratif pOS7001 est préparé selon le protocole B1, Orsay. Après une étape classique de purification en présence de phénol/chloroforme, l'ADN et le vecteur sont assemblés en mélangeant une molécule de vecteur et une molécule d'ADN inséré. Le mélange est ensuite encapsidé dans les têtes de bactériophages lambda (kit Amersham) qui servent à transfecter E. coli DH10B. Les cellules transfectées sont ensuite ensemencées sur milieu LB agar en présence d'ampicilline pour sélection des recombinants résistants à cet antibiotique. Une banque d'environ 5000 clones d'E. coli résistants à l'ampicilline a été obtenue Chaque clone a été ensemencé en milieu LB ou TB + ampicilline dans un puits de microplaque (96 puits) et conservé à -80 C . La séquence aux sites d'insertions des fragments du sol dans le vecteur, pOS7001, générés pendant la construction de la banque a été analysée. Pour cela 17 cosmides de la banques ont été purifié et séquence avec une amorce, seq. 5' CCGCGAATTCTCATGTTTGACCG 3', qui hybride entre les site BamHl et le site de clonage Hindlll présente dans le vecteur. Les séquences obtenues ont permis d'estimer que la longueur des queues homopolymériques aux points de jonctions est très variable, entre 13 et 60 poly-dA/dT. Au-delà des queues, les séquences des fragments du sol ainsi générées possèdent un pourcentage en G+C entre 53 et 70 %. Des pourcentages si élevés étaient inattendus, mais des résultas similaires ont été déjà reportés sur des préparation brut d'ADN à partir de sol (Chatzinotas A. étal., 1998). Une stratégie de " pooling " de 48 ou 96 clones à été utilisée pour l'analyse de la richesse microbienne et métabolique. L'ADN cosmidique extrait à partir de ces " pools " de clones à été utilisé ensuite pour réaliser des expériences de PCR ou d'hybridation. Exemple 13 : Diversité de l'ADN ribosomique 16S au sein de l'ADN cloné. a) Matériels et méthodes Les cosmides de la banque sont extraits à partir de pools de clones par lyse alcaline puis sont purifiés sur gradient de chlorure de césium, afin de prélever la bande d'ADN cosmidique sous forme superenroulée et dans le but d'éliminer tout ADN chromosomique d'Escherichia coli pouvant interférer dans l'étude. Après linéarisation des cosmides par action de la nucléase S1 (50 unités, 30 minutes à 37 C), les séquences d'ADNr 16S contenues dans les pools de clones sont amplifiées dans les conditions standard d'amplification, à partir des amorces universelles 63f (5'CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3') et 1387r (5'GGGCGGWGTGTACAAGGC-3') définies par MARCHESI et al.(1998). Les produits d'amplification d'environ 1.5 kilobases sont purifiés à partir du kit Qiaquik gel extraction (Qiagen) puis directement clonés dans le vecteur pCR Il (Invitrogen) chez Escherichia coli TOP10, selon les instructions du fabricant. L'insert est alors amplifié à l'aide des amorces M13 Forward et M13 reverse spécifiques au site de clonage du vecteur pCR II. Les produits d'amplification de taille attendue (environ 1,7 kb) sont analysés par RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) à l'aide des enzymes Cfol, Mspl et BstUI (0,1 unités) afin de sélectionner les clones à séquencer. Les profils de restriction obtenus sont séparés sur gel d'agarose Métaphore 2. 5% (FMC Products) contenant 0,4 mg de bromure d'éthidium parmi. Les séquences d'ADNr 16S sont alors déterminées directement en utilisant les produits PCR purifiés par le kit " Qiaquick gel extraction " à l'aide des amorces de séquençage définies par Normand (1995). Les analyses phylogénétiques sont obtenues en comparant les séquences avec les séquences d'ADNr 16S procaryotes rassemblées dans la base de données Ribosomal Database Project (RDP), version 7,0 MAIDAK et al.(1999) grâce au programme SIMILARITY MATCH, permettant d'obtenir les valeurs de similarité par rapport aux séquences de la base de données. b) Résultats Pour déterminer la diversité phylogénétique représentée dans la banque, 47 séquences du gène ARNr16S ont été isolées à partir de pools de 288 clones et ont été séquencées dans leur quasi-totalité. Les résultats sont rapportés dans le tableau 7. L'analyse des séquences par interrogations des bases de données révèle que la majorité des séquences (>61%) présentent des pourcentages de similarité inférieurs ou égaux à 95% avec des espèces bactériennes identifiées (tableau 7). Sur les 47 séquences analysées, 28 séquences ont pour plus proches voisins des bactéries non cultivées, dont les séquences ont été directement issues d'ADN extrait de l'environnement. La majorité de ces séquences présentent par ailleurs des pourcentages de similarité très faibles (88-95%), 17 séquences sur 28 diffèrent ainsi de plus de 5% par rapport à leurs voisins les plus proches. Parmi les séquences pouvant être classées dans un groupe phylétique, une majorité de séquences appartiennent à la sous classe a des protéobactéries (18 séquences avec un pourcentage de similarité compris entre 89 et 99%). Un second groupe de séquences est représenté par la sous classe g des protéobactéries, comprenant 9 séquences dont les pourcentages de similarité varient entre 84 et 99%). Les groupes des b-protéobactéries, d-protéobactéries, firmicutes à bas G+C% et à haut G+C% comprennent respectivement 1,4, 3 et 5 séquences. Seule une séquence n'a pu être classée au sein des grands groupes taxonomiques bactériens définis: la séquence a22.1 (19), son plus proche voisin Aerothermobacter marianas (avec une similarité de 89%) étant lui même une souche isolée de l'environnement marin et non classifiée à l'heure actuelle.Enfin, 6 séquences peuvent être classées au sein du groupe des Acidobacteriuml Holophaga. Ce groupe présente la particularité de n'être représenté que par deux bactéries cultivées Acidobacterium capsulatum et Holophaga foetida, l'ensemble de ce groupe étant composé par des bactéries dont seul le gène ARNr16S a été détecté par amplification et clonage à partir d'ADN extrait d'échantillon de l'environnement (principalement de sol), Ludwig et al (1997). Les faibles valeurs de similarité entre les différentes séquences composant ce groupe laisse présager une grande hétérogénéité et diversité au sein de ce groupe. * L'ensemble des résultats est représenté sur le tableau 7. Ces résultats montrent que les séquences contenues dans la banque cosmidique proviendraient de micro-organismes non seulement diversifiés phylogénétiquement mais surtout de micro-organismes n'ayant jamais été isolés jusqu'à ce jour. Les résultats du séquençage des ADN amplifiés ont permis d'établir un arbre phylogénétique des organismes présents dans l'échantillon de sol dont les séquences caractérisées sont originaires. L'arbre phylogénétique représenté à la figure 7 a été réalisé à partir de l'alignement des séquences par le logiciel MASE (Faulner et Jurak, 1988) etcorrigé par la méthode des 2 paramètres de Kimura (1980), et à l'aide de l'algorithme Neighbour Joining (Saitou et Nei 1987). L'analyse phylogénétique a permis de comparer les séquences ADNr 16S clonées dans la banque d'ADN du sol, avec les séquences d'ADNr 16S procaryotes rassemblées dans les bases de données Ribosomal Database Project (RDP), (version 7. 0, programme SIMILARITY-MATCH, Maidak et al 1999), et dans la base GenBank grâce au logicel BLAST 2.0 (Atschul et al, 1997). Exemple 14 : Présélection génétique de la banque pour l'évaluation de la richesse métabolique Pour caractériser la banque obtenue en terme de diversité métabolique et identifier les clones contenant des inserts portant des gènes pouvant être impliqués dans des voies de biosynthèse, il a été développé selon l'invention des techniques de criblage génétique basées sur des méthodes PCR afin de détecter et d'identifier des gènes PKS de type I. 1 Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture S. coelicolor ATCC101478, S. ambofaciens NRRL2420, S. lactamandurans ATCC27382, S. rimosus ATCC109610, B. Subtilis ATCC6633 et B. licheniformis THE1856 (collection RPR) ont été utilisés comme sources d'ADN pour les expériences de PCR. S. lividans TK24 est la souche hôte utilisée pour le cosmide navette POS1700. Pour la préparation d'ADN génomique, de suspensions de spores, de protoplastes et pour la transformation de S. lividans, on a suivi les protocoles standard décrits dans Hopwood et al.(1986). Escherichia coli Top10 (INVITROGEN) a été utilisé comme hôte pour le clonage des produits PCR et E. coli Sure (STRATAGENE) a été utilisé comme hôte pour le cosmide navette pOS7001. Les conditions de culture de E. coli, la préparation de plasmides, la digestion de l'ADN, l'électrophorèse sur gel d'agarose ont été realisées suivant les procédures standard (Sambroock et al., 1996). 2. Amorces PCR: Les couples d'amorces a1-a2 et b1-b2 ont été définis par l'equipe de N. Bamas-Jacques et leur utilisation a été optimisée pour le criblage de l'ADN des souches pures et de la banque du sol pour la recherche de gènes codant PKSI) Tableau 8 :Amorces PCR homologues aux gènes PKSI utilisées pour le criblage de la banque.. a1 (+) 5' CCSCAGSAGCGCSTSTTSCTSGA 3' a2 (-) 5' GTSCCSGTSCCGTGSGTSTCSA 3' b1 5' CCSCAGSAGCGCSTSCTSCTSGA 3' b2 5' GTSCCSGTSCCGTGSGCCTCSA 3' Conditions d'amplification : Pour la recherche de PKS I à partir de l'ADN de souches pures, le mélange d'amplification contenait : dans un volume final de 50 l, entre 50 et 150 ng d'ADN génomique, 200 M de dNTP, 5mM de MgCl2 final, 7% de DMSO, tampon 1x Appligene, 0,4 M de chaque primer et 2,5U de Taq Polymerase Appligène. Les conditions d'amplification utilisées sont : dénaturation à 95 C pendant 2 minutes, hybridation à 65 C pendant 1 minute, élongation à 72 C pendant 1 minute, pour le premier cycle, suivi par 30 cycles où la température est diminuée jusqu'à 58 C comme décrit dans K. Seow et al., 1997. L'étape d'extension finale s'effectue à 72 C pendant 10 minutes. Pour la recherche de PKS I à partir de l'ADN de la banque, les conditions PCR sont les mêmes que ci-dessus pour le couple a1-a2 en utilisant entre 100 et 500 ng de cosmide extrait de pools de 48 clones. Pour le couple d'amorces b1-b2 , 500ng de cosmides issus de pools de 96 clones ont été utilisés. Le mélange d'amplification contenait 200 M de dNTP, 2,5mM de MgCl2 final, 7% de DMSO, tampon 1x Quiagen, 0,4 M de chaque primer et 2,5U de Taq polymerase Hot-start (Qiagen). Les conditions d'amplification utilisées sont: dénaturation 15' à 95 C suivie par 30 cycles : 1' de dénaturation à 95 C + 1' d'hybridation à 65 C pour le premier cycle et 62 C pour les autres cycles, 1' d'élongation à 72 C, étape d'extension finale de 10' à 72 C. L'identification des clones positifs à partir des pools de 48 ou 96 clones est effectuée à partir des répliques des microplaques mères correspondantes sur milieu solide ou toute autre méthode standard de réplication. 3 Sous-clonage et séquençage Les produits PCR des clones identifiés ont été séquences selon le protocole suivant : Les fragments sont purifiés sur gel d'agarose (Gel Extraction Kit ( Qiagen))et clones dans E.coli TOP 10 (Invitrogen) à l'aide du kit TOPO TA cloning kit (Invitrogen). L'ADN plasmidique de sous-clones est extrait par lyse alcaline sur un Biorobot (Qiagen) et dialysé durant 2 h sur membrane VS 0,025pm (Millipore). Les échantillons sont séquences avec les amorces M13 " Universal " et " Reverse " sur le séquenceur ABI 377 96( PERKIN ELMER). 4) Résultats Définition et validation des amorces PCR Deux régions très conservées de PKS du type 1 d'actinomycètes, comprenant le site actif de l'enzyme, ont été ciblées pour l'amplification de gènes homologues avec des amorces dégénérées. Ces deux régions correspondent aux séquences PQQR (L)(L)LE VE(A)HGTGT respectivement. Des amorces (tableau 8) ont été testées avec l'ADN de souches productrices ou non de macrolides: Streptomyces coelicolor, Streptomyces ambofaciens, producteur de spiramycine, et Saccharopolyspora erythraea, producteur de l'erythromycine. Quelles que soient les amorces utilisées, des bandes représentant des fragments d'environ 700 pb et correspondant à la longueur du fragment attendu, ont été obtenues avec toutes les souches. Ces résultats démontrent la spécificité des amorces a et b pour les gènes PKS 1 de souches productrices ou de gènes silencieux chez S. coelicolor. Le séquençage des produits PCR obtenus avec le couple d'amorces a1-a2 a permis d'identifier, à partir de la souche S. ambofaciens, la séquence d'un gène KS déjà décrite (Demande de brevet européen n EP0791656) comme appartenant à la voie de biosynthèse du planténolide, précurseur macrolidique de la spiramycine, et deux séquences jamais décrites, Stramb 9 et Stramb12, (voir liste séquences). En ce qui concerne, S. erythraea, la méthode de criblage a permis l'identification d'une séquence de KS (sacery17) identique à celle du KS du module 1 déjà publiée dans Genebank (Numéro d'accès M63677), codant pour la synthétase 1 (DEBS1) du 6- deoxyérythronolide B. Une autre séquence non corrélée à la voie de biosynthèse de l'érythromycine a été identifiée et il s'agit de la séquence SEQ ID N 32. Conclusion Une méthode pour analyser la présence de gènes codant pour les PKS du type # par PCR à partir de différents micro-organismes a été mise au point. La structure très conservée du domaine de la keto-synthétase du type # a permis de réaliser une méthode PCR basée sur l'utilisation d'amorces dégénérées biaisées en GC pour le choix des codons. Cette approche montre la possibilité d'identifier des gènes ou clusters impliqués dans la voie de biosynthèse des polyketides du type I. Le clonage de ces gènes permet la création d'une collection qui pourra ensuite être utilisés pour construire des hybrides polyketides. Le même principe peut être appliqué à d'autres classes d'antibiotiques. Les résultats obtenus ici montrent aussi la présence de gènes pouvant appartenir à des clusters silencieux (SEQ ID N 30 à 32). La présence de clusters silencieux a été déjà documentée dans S. lividans et leurs expressions sont déclenchées par des régulateurs spécifiques ou pleiotropiques (Horinouchi et al. ;Umeyama et al. 1996) . Ces résultats suggèrent que la détection de gènes appartenant à des voies dites silencieuses codent en réalité pour des enzymes actives capable de diriger, en association avec les autres enzymes spécifiques de la voie, les étapes enzymatiques nécessaires pour la synthèse des métabolites secondaires. Criblage de la banque Le criblage a été effectué dans les conditions décrites dans la section Matériels et Méthodes en utilisant les couples d'amorces validées à partir de souches productrices. En présence du couple d'amorces a1-a2 , la taille des produits PCR obtenus à partir de l'ADN cosmidique extrait de pools de 48 ou 96 clones était d'environ 700 bp, donc en accord avec les résultats attendus. L'intensité des bandes obtenues était variable, mais une seule bande d'amplification était présente pour chaque pool d'ADN cible. Dans ces conditions, 8 groupes d'ADN cible ont été détectés, correspondant à 9 clones positifs après déréplication. Le criblage effectué avec le second couple d'amorces, b1-b2, a donné des résultats d'amplification moins spécifiques puisque de nombreuses bandes satellites étaient observées à côté de la bande de 700 bp. Néanmoins, 9 groupes d'ADN cible ont été détectés, correspondant à 14 clones positifs après déréplication à partir de ces clones positifs, l'ADN a été extrait pour les étapes de séquençage et de transformation de .S. lividans. Analyse des cosmides La digestion des cosmides identifiés par PCR avec l'enzyme Dral, reconnaissant un site riche en AT, libère un fragment supérieur à 23 kb (figure 22). Ceci suggère que la méthode PCR cible préférentiellement l'ADN du sol contenant un haut pourcentage en G+C. Ce résultat est la conséquence de la dégénérescence des amorces utilisées, biaisées en GC pour le choix des codons. Les inserts, comme attendu dans le cas de cosmides, ont une taille supérieure à 23 kb, sauf dans un cas ( clone a9B12), ce qui pourrait traduire une certaine instabilité des cosmides. D'autre part, parmi tous les clones sélectionnés, seulement deux d'entre eux, GS.F1 et GS.G11, ont montré le même profil de restriction indiquant un faible taux de redondance dans la banque. Les cosmides sélectionnés ont été transférés dans Streptomyces lividans par transformation de protoplastes en présence de PEG 1000. L'efficacité de transformation varie entre 30 et 1000 transformants par g d'ADN cosmidique utilisé. Séquençage et analyse phylogénétique des gènes PKS 1 du sol La méthode de PCR mise à point sur les souches pures a été utilisée comme décrite sur les cosmides de la banque et 24 clones ont ainsi été identifiés. Les produits de PCR d'environ 700 bp obtenus à partir de l'ADN de deux pools (48 clones) et de 8 clones uniques, ont été clonés, après purification sur gel d'agarose , et séquences. Cela a permis l'identification de 11 séquences. L'alignement des séquences protéiques déduites PKSs 1 du sol avec d'autres PKSs # présentes dans différents micro-organismes (figure 24) montre la présence d'une région très conservée qui correspond à la région consensus du site active de la b-kétoacyl synthétase. L'analyse des séquences obtenues avec la méthode " Codonpreference " (Gribskov et al., 1984 ; Bibb et al., 1984) a révélé la présence d'un fort biais dans l'usage des codons riches en G+C dans une seule phase de lecture. Les protéines déduites selon cette phase de lecture montrent une forte similarité avec des KSs du type 1 connus ( programme Blast). En particulier, la similarité entre les séquences de KSs du sol et des KSs du cluster de l'érythromycine est d'environ 53%. Après déréplication d'un pool et identification du clone unique, la séquence du produit PCR obtenu à partir de ce clone est identique à celle du pool ce qui confirme la fiabilité de la méthode utilisée. L'analyse de la séquence du produit PCR d'un clone a permis l'identification probable de 3 gènes KSI différents. Une de ces séquences (SEQ ID N 34) a une similarité de 98,7% avec la séquence d'un autre pool, suggérant qu'elles codent pour la même enzyme. Les deux autres séquences sont différentes mais fortement homologues. Ici, il est décrit pour la première fois le clonage et l'identification dans une banque d'ADN du sol de voies de biosynthèse de métabolites secondaires contenant des gènes codant des KS du type I. Le pourcentage élevé en G+C des séquences du sol suggère qu'elles puissent dériver de génomes ayant un usage des codons similaire à ceux d'actinomycètes. Même si les données disponibles dans la littérature sont réduites, on sait que les gènes codant des PKS du type I sont très diversifiés de par leur organisation physique dans le génome, la taille et le nombre de modules contenus dans chaque gène. La présence de plusieurs domaines provenant d'un seul clone est une confirmation de leur appartenance à des clusters de polyketides assymétriques. Dans un seul cas, deux clones semblent former un contigue puisqu'ils partagent la même séquence pour le domaine KS. La taille des régions génétiques impliquées dans la synthèse des PKSI varie entre quelques kb pour la pénicilline à environ 120 kb pour la rapamycine. La dimension des inserts cosmidiques peut donc ne pas être suffisante pour l'expression des clusters les plus complexes. Des gènes codant pour des PKSs I, capables de travailler de façon itérative comme les PKS Il et de contrôler la synthèse de polykétides aromatiques, ont été décrits (Jae-Hyuk et al., 1995). L'étude des clusters des PKSs 1 du sol pourrait apporter encore des nouveautés dans ce domaine. J2 au cc Su w c t- "S CD =. -O "M cara micr ava g- E C cl *N d or o j3 ation des prélèvement s différentes expérie ation à l'acridine ora o Loc dan la c@ Numéro Origine Texture Quantité (%) de Matière pH Nombre de Nombre de sable Limon Argile organique cellules avant cellules après (g/kg de sol broyage broyage' sec) a(x109/g poids (x109/g poids ~~~~~ ~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ sol sec sol sec 1 Australie Argile sablonneuse 62 22 16 49,7 5,8 6,5 (0,9) 2,9 (1,3) 2 Peyrat le Châ- Argile sablonneuse 61 26 13 48,2 4,9 7,3 (0,6) 5,4(0,8)teau,France 3 Côte St-André, Terreau sablonneux 50 41 9 40,6 5,6 10,0 (0,7) France 4 Chazay d'Azergue, Terreau sablonneux 34 47 19 13,9 5,8 7,8(1,1) 4,2 (0,6) France argileux 5 Guadeloupe,France Argile 27 26 47 17,0 4,8 1,4 (0,4) 0,5 (0,1) 6 Dombes,France Terreau sablonneux 20 67 13 30,3 4,3 7,5(0,5) 5,6(0,9) Argileux re parenthèses. (1) ation standard .0 '(1) "C n=3 ; m ation PCR et !E li a c - 'C'IS # 10 ABLI isées datio = -0 0 m 0 ZT3 so - Amorce ou sonde Cible a) Séquence (5' à 3') Référence n FGPS431 sonde Universelle (1392-1406) ACGGGCGGTGTGT(A/G)C Amann et al., 1995 FGPS122 amorce Bactéries (6-27) GGAGAGTTTGATCATGGCTCAG Amann et al , 1995 FGPS350 amorce Streptosporangium (616-635) CCTGGAGTTAAGCCCCCAAGC Cette étude FGPS643 sonde Streptosporangium (122-142) GTGAGTAACCTGCCCC (T/C)GACT étude R499 amorce Bacillus anthracis TTAATTCACTTGCAACTGATGGG Patra et al., 1996 R500 amorce Bacillus anthracis AACGATAGCTCCTACATTTGGAG Patra et al., 1996 C501 sonde Bacillus anthracis TTGCTGATACGGTATAGAACCTGGC Patra et al., 1996 FGPS516 amorce S. lividans OS48.3 TCCAGATCCTTGACCCGCAG Cette étude FGPS517 amorce S lividans OS48.3 CACGACATTGCACTCCACCG Cette étude FGPS518 sonde S. lividans Os48.3 CCGTGAGCCGGATCAG Cette étude norces et ocalisées ). 1 i fi) M @s, les ont pa on pu 0 .52 m ra c-l -c" eses. s res st dé -0) aren nist en ; es en é ë- "5 #~ -CD U M l'ARNr 16S de E ces chromosomi cassette conten cr -CD (0 .(D c- 11 Q) 1 1 -I J U (6 (0 '0 emen iation 5b #> i -0 -f-I -0 ,d) u> ,j " h 0 -0 . 0 15 -≈ ! 1 - II ; n : e n@ #! -0 O ns .0) - E N 1. Australie 17+/-2 52+/- 2 32+/-5 16+/-3 33+/- 2 59+/-1 27+/-0 2. Peyrat 29+/-2 58+/-1 40+/-2 29+/-2 18+/3 56+/-1 15+/-1 3.Côte St-André 36+/-7 60+/-6 148+/-10 94+/-7 38+/-6 73+/-5 47+/-6 4. Chazay 9 16 ND 32 15 15 70 6. Dombes 4+/- 2 26+/-3 43+/-1 61+/- 66+/-1 160+/-7 102+/- 5 GPS43 que/ .Q"" iver un + 0 1); x + r tâche avec tion Ultratura (CH); 5a: Cr CI) idation @ogéné Cup Ho E 0 ..0 oc -C 0 en '7 L- U C3 c en v. O Q) C'0 en cenc I (G); + H+ C i D..cu::2: 0 Q) 0 0).- fication par imagerie de 2). In traitement ; 2:broyage H + sonication Microtip tique. Voir aussi figure Non déterminé. :J:J cuZ C CD " + p a Qua@ (table b1: Au 4a: G c ND : sation I 0 (J 0 3 s la raits C A-J qe m 0 bleau lisées s ADN -0 Amorces et sondes moléculair Cible Séquence (5' - 3') Position a (amorce ou sonde) FGPS 612 Eubactéries (amorce) C(C/T)AACT(T/C/A)CGTGCCAGCAGCC 506 - 525 FGPS 669 Eubactéries (amorce) GACGTC(A/G)TCCCC(A/C)CCTTCCTC 1174 - 1194 FGPS 618 Eubactéries (sonde) ATGG(T/C)TGTCGTCAGCTCG 1056 - 1073 FGPS 614 a-Protéobactéries (sonde) GTGTAGAGGTGAAATTCGTAG 683 - 703 FGPS 615 b-Protéobactéries (sonde) CGGTGGATGATGTGGATT 939 - 956 FGPS 616 g-Protéobactéries (sonde) AGGTTAAAACTCAAATGA 900 - 917 FGPS 621 Gram plus à bas GC% (sonde) ATACGTAGGTGGCAAGCG 532 - 549 FGPS 617 Actinomycètes (sonde) GCCGGGGTCAACTCGGAGG 1159 - 1149 FGPS 680 Streptomycètes (sonde) TGAGTCCCCA(A/C/T)C(T/A)CCCCG 1132 - 1149 FGPS 619 Streptosporangium (sonde) GCTTGGGGCTTAACTCCAGG 609 - 628 ia col (1) -c RNr16S d'Esc a) c: gè JU t- :3 a : position s ADN extra %, 'a d Mi-.Q) - 111 2 +* N ci ent de N ne solut ation su xtrait = 0) N M M 2: -IIS S 5 g S 3 1*5-=: bactérien chantillon persion et ries extraite =5 t! 0 **#> C 3 lif CI) s o (0 Effi Microflore totale Microflore cultivable Actinomycètes Lyse directe Lyse en bloc bactéries/g sol sec cfu /g sol sec cultivables d'agarose d,e cfu/g sol sec ng ADN/ g sol ng ADN/ g sol sec sec Sans incubation Suspension de sol 1 3 109 (~ 0 1) 6.9 106 (~ 0 2) 8 6 106 (~ 1 2) Extrait cellulaire 1.9 108 (~ 0. 2) 4.1 106 (~ 1.5) 2.5 106 (~ 0 7) 333 (~ 35) 221 (~ 70) Efficacité d'extraction 15% 59% 38% Avec incubation dans extrait de levure 6% Suspension de sol 1 2 109( 0. 1) 7.6 107(~ 1.1) 6.6 107(~0.4) Extrait cellulaire 1 6 108( 0 3) 5.3 106(~ 14) 3. 7 106(~ 0.7) 344 (~ 30) 341 (~ 67) Efficacité d'extraction 13% 7% 5% ure e > CD "5 U Z uti S a I I 1 I -(0 -CD r ra ion a 1 (0 a5 w (C e - # CL -JE U o .U U7 (0,(D oloratio ase-Soj gar, apr@ e sur ge . z (6 U) # (D ombrer DS 0,0@ quantité quantifi@ (D G) m m o # CD ' ' a e on avec la 03 "C nal d'hyb O) , et g nomycètes " 00%. "C 0 #c E 3-505 Me .0.....0)"" J--Q)(/)- .::; 0 ,ft O- -0) 1! des es P prod '0 a> .2 w "2 B 0) r risa asse so S Ca so a- b- g- Gram+ Protéobactérie Protéobactérie Protéobactérie bas GC% Actinomycètes Streptomycètes s s s Extraction directe a 7.7 % (1.4) 5.3 % ( 0.5) 3.3 % ( 0.9) 3.1 % (~ 1.7) 14.7 % (0.6) 0.8 % (0.1) Extraction indirecte Lyse + CsCI 10.9% (1.4) 6.4% (1.4) 14.3% (1.4) 7.9% (1.4) 8.5% (1.4) 3.0% (1.4) Lyse en bloc 2.9% (1.4) 5.4 % (~ 1.4) 11.1 %(1.4) 8.0% (1.4) 11.3% (1.4) 2.6% (1.4) Lyse en bloc 6.3% (1.4) 7.5% (1.4) 17.0% (1.4) 18.1 %(1.4) 19.4% (1.4) 4.6% (1.4) + incubation YE crit dans article Frostega >CD ctio (0 .4#1 X (U fuge (protoco cn gstene, à force c -ë i~r , ex ns JE vs m LU m 0) >- banque cosmidique tu c s o 0 Tableau 7 : Nr16S contenu Q U) quenc -0 (0 Q) '0 Diver N pool Voisin identifié % de Voisin le plus proche % de (clone n le plus proche similarité (classification, référence) similarité a-Protéobactéries a24. 1 (2) Azospirillum brasilense 97.7% a4-a6-a7 (7) Azospirillum brasilense 95.4% a4-a6-a7 (23) Azospirillum brasilense 88. 9% Str L-87 (a-proteobactérie)' 89. 8% a52-a53-a5 (15) Azospirillum lipoferum 97.6% a49-a50-a51 (22) Agrobacterium tumefaciens 95.0% Clone JN15d (non publié) 95.5% a49-a50-a51 (11) Rhizobium sp 99.7% a4-a6-a7 (14) Rhizobium sp 99.7% a30-a31-a32 (7) Bradyrhizobium japonicum 99.4% a19-a20-a26 (5) Bradyrhizobium genosp 93 3% Clone DA122 (non publié) 95.9% a37-a38-a39 (6) Mesorhizobium sp. 98.9 % a19-a20-a26 (9) Bradyrhizobium sp 90.2% CloneS-26(aProtéobactérie)2 95.9% a46-a47-a48 (14) Phyllobacterium rubiacearum 97.6 % ns l'a *0 e 1) 16S contenues ique ::s Z 0 0 E LEAU 7 ( @ces d'AI @que cos mI:l: c4 TA Diversité des séque la b N pool Voisin identifié % de Voisin le plus proche % de (clone n ) le plus proche similarité (classification, référence) similarité a49-a50-a51 (1) Caulobacter henricii 97. 0% a1-a2-a3 (13) Caulobacter sp 96.3% a52-a53-a5 (8) Mesorhyzobium mediterraneum 92.1% Clone DA122 (non publié) 94. 8% a34-a35-a36 (3) Rhodobium orientis 91. 8% Clone (non publié) 95.1% a1-a2-a3 (4) Sphingomonas sp. 94. 7% Clone PAD23 (non publié) 95.1% a8-a9-a10 (13) Sphingomonas sp. 94.0% [gamma]-Protéobactéries a40-a41-a42 (13) Pseudomonas sp 98. 9% clone G26(g-Protéobactérie)3 99. 7% a15-a16-a17 (12) Lysobacter antibioticus 94. 4% clone vadinHA77(g-Protéo) 93. 6% a15-a16-a17 (5) Xanthomonas sp 93. 4% clone vadinHA77(g-Protéo)4 94. 6% a19-a20-a26 (13) Luteimonas mephitis 92. 9% Souche rJ15 (non publié) 93. 5% a46-a47-a48 (6) Methylobacter whittenburyi 88. 3% soil clone S-43(g-Protéo) 2 88.9 % a11-a12-a13 (11) Methylobacterwhittenburyi 88. 3% soil clone S-43(g-Protéo) 88. 9% ns ra *0 ) contenues de C-4 CI) = (1) (t) CX I: T3 ;:] c E 0 rn S 0 M 03 0 (0 T s séq la -0 Diversité N pool Voisin identifié % de Voisin le plus proche % de (clone n le plus proche similarité (classification, référence) similarité a34-a35-a36 (5) Methylococcus capsulatus 84.9% soil clone S-12 (d-Protéo) 85 6% a43-a44-a45 (10) Legionella birminghamensis 88.9% a8-a9-a10 (2) Lamprocystis roseopersicina 87. 5% Clone 2-100C14 (non publié) 95.1% p-Protéobactéries a27-a28-a29 (5) Rhodocyclus tenuis 90. 2% Clone OPB37 (b-protéo)5 91% 8-Protéobactéries a8-a9-a10 (18) Nannocystis exedens 92.0% a11-a12-a13 (5) Geobacter sulfurreducens 91.5% a27-a28-a29 (8) Desulfoacinum infernum 88. 4% Clone S-31 (d-Protéo) 89. 1 % a40-a41-a42 (6) Desulfivibrio aminophilus 85. 3% Clone S-34 (d-Protéo) 2 86.2% G+ bas GC% a23.1 Kurthia zopfii 97. 3% a25.1 Kurthia zopfii 97.2% a18.1 (22) Kurthia gipsonii 94.4% G+ bas GC% non identifié RS19 (non publié) 94.8% s la banque cosmidiq EAU 7 (suite 6S contenue bzz u.1 ^ IJI Diversité des séquences Actinomycètes a33. 1 Cellulomonas sp 99.5% a 14.7 Streptosporangium longisporum 99. 8% a 21.7 Arthrobater polychromogenes 99.2% non identifié RSW1 (non publié) a8-a9-a10 (7) Arthrobacter oxydans 983% actinomycète non identifié RSW1 (non publié) 98. 5% a27-a28-a29 (3) Arthrobacter oxydans 98.9% actinomycète non identifié RSW1 (non publié) 99.3% Acidobacterium ? a43-a44-a45 (4) Holophaga foetida 87.3% Clone 32-10 (Acidobacterium phylum)6 95.0% a27-a28-a29 (12) Desulfuromonas acetexigens 88. 8% Clone Sva0515 (Acidobacterium phylum)6 91.0% a37-a38-a39 (12) Desulfuromonas palmitatis 90. 3% Clone Sva0515 (Acidobacterium phylum)6 91. 5% a37-a38-a39 (14) Halothermothrix orenii 87.5% Clone ii3-7 93. 3% (Acidobacterium phylum)6 93.3% a8-a9-a10(9) Pelobacter carbinolicus 865% Clone ii3-15 92.6% (Acidobacterium phylum)6 92.6% a34-a35-a36(10) Nitrococcus mobilis 90.6% clone RB43 Hum) 6 93.7% (Acidobacterium phylum)6 93.7% Non classifié a22.1(19) Aerothermobacter marianas 89. 1% Eubacterie non identifiée (non publié) 93.4% 98 en s# . N '0 (D erson et al (1996 - 4Godon et al (19 CL en 0) 1,'c' (6 GONZALEZ et al (1996) - Zhou et TABLEAU 9 : SéquencesDésignation SEQ ID N Sondes et amorces FGPS431 1 FGPS122 2 FGPS350 3 FGPS643 (T) 4 FGPS643 (C) 5 R499 R500 7 C501 8 FGPS516 FGPS517 10 FGPS518 11 FGPS612 12 FGPS669 13 FGPS618 14 FGPS614 15 FGPS615 16 FGPS616 17 FGPS621 18 FGPS617 19 FGPS680 20 FGPS619 21 63f 22 1387r 23 Oligo-1 (Exemple 10) 24 Oligo-2 (Exemple 10) 25 A1 26 A2 27 B1 28 B2 29 Acides nucléiques PKS-I Amb9 30 Amb12 31 Ery19 32 A9b12 33 A23G1 1-1 34 A26G1 1-2 35 A26G1-10 36 TABLEAU 9 (suite 1):Séquences Désignation SEQ ID N A35 E4-16 37 A49F1-32 38 A17d2-3 39 A53F11-13 40 A53F11-14 41 A22A 2-11 42 A36E8-1 43 A52E8-2 44 Séquences d'acides aminés PKS-I Amb9 45 Amb12 46 Ery19 47 A9b12 48 A23G1 1-1 49 A26G1 1-2 50 A26G1-10 51 A35 E4-16 52 A49F1-32 53 A17d2-3 54 A53F11-13 55 A53F11-14 56 A22A 2-11 57 A36E8-1 58 A52E8-2 59 Séquences ADNr 16S a24.1(2), 60 a4. a6.a7 (7) 61 a52.a53.a5(15) 62 a49.a50.a51(11) 63 a4.a6.a7(14) 64 a30.a31.a32(7) 65 a37.a38.a39 6) 66 a46.a47.a48 (14) 67 a49.a50.a51(1) 68 a52.a53.a5(8) 69 a8.a9.a10(13) 70 a1.a2.a3(13) 71 a43.a44.a45(10) 72 a27.a28.a29 5) 73 TABLEAU 9 (suite 2):Séquences Désignation SEQ ID N a23.1 74 a25. 1 75 a18.1(22) 76 a33. 1 77 a14.7 78 a21.7 79 a8.a9.a10(7) 80 a8.a9.a10(18) 81 a27.a28.a29 3 82 a34.a35.a36 5 83 a22.1(19) 84 a11.a12.a13(5) 85 a19.a20.a26 9 86 a40.a41.a42(6) 87 a27.a28.a29 8 88 a27.a28.a29(12) 89 a37.a38.a39 12) 90 a46.a47.a48(6) 91 a11.a12.a13(11) 92 a15.a16.a17(12) 93 a15.a16.a17(5) 94 a19.a20.a26(13) 95 a37.a38.a39(14) 96 a8.a9.a10(9 97 a19.a20.a26(5) 98 a43.a44.a45(4 99 a1.a2.a3(4) 100 a4.a6.a7(23) 101 a49.a50.a51 22 102 a8.a9.a10(2) 103 a34.a35.a36 3) 104 a34.a35.a36 10 105 a40.a41.a42 13 106 REFERENCES # Amann, R. L, W. Ludwig, and K.-H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ détection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:143-169. # Atschul S. F., Madden T.L., Schâffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) " Gapped BLAST and PSI-BLAST : a nex generation of protein databses search programs " Nucleic Acid Researchs Vol 25 : 3389-3404 # Atschul SF étal., 1990, J. Mol Biol, 215 : 403-410. # Bakken, L. R. 1985. Separation and purification of bacteria from soil. Appl. Environ. Microbiol. 49 :1482-1487. # Bibb MJ, Findlay PR, Johnson MW, The relationship between base composition and codon usage in bacterial genes and its use for the simple and reliable identification of protein-coding sequences., Gene 30 : 1-3, 157-66, Oct, 1984. # Biesiekierska-Galguen M. (1997) "Atténuation biologique de contaminants xénobiotiques dans le sol - modèle lindane " Diplôme de DEA National de Toxicologie, Université Claude Bernard Lyon I. # Blondelet-Rouault MH, Weiser J, Lebrihi A, Branny P, Pernodet JL. Institut de Genetique et Microbiologie, URA CNRS 2225, Universite Paris XI, Orsay, France. Gene 1997 May 6;190(2):315-7 # Borchert S étal., 1992, Microbiology Letters, 92 : 175-180' Boccard, F., Smokvina, T. Pernodet, J. L. Friedmann, A. & Guerineau M. (1989) . The integrated conjugative plasmid pSAM2 of Streptomyces ambofaciens is related to temperature bacteriophages. Embo J 8,973-80 # Chatzinotas A., Sandaa R-A., Schônhuber W., Amanna R., Daae F.L., Torsvik V., Zeyer J., Hahn D. (1998) " Analysis of broad-scale differences in microbial community composition of two pristine forest soils " Systematic and Applied Microbiology Vol 21 : 579-587 # Clegg, C. D., K. Ritz, and B. S. Griffiths. 1997. Direct ectraction of microbial community DNA from humified upland soils. Lett. Appl. Microbiol. 25 :30-33. # Clerc-Bardin, S., J. -L. Pernodet, A. Frostegârd, and P. Simonet. Development of a conditional suicide system for a Streptomyces lividans strain and its use to investigate conjugative transfer in soil. Submitted. # Elledge SJ, Mulligan JT, Ramer SW, Spottswood M, Davis RW. Department of Biochemistry, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Mar 1;88(5):1731-5 # Engelen, B., K. Meinken, F. Von Wintzingerode, H. Heuer, H.-P. Malkomes, and H. Backhaus. 1998. Monitoring impact of a pesticide treatment on bacterial soil communities by metabolic and genetic fingerprinting in addition to conventional testing procedures. Appl. Environ. Microbiol. 64 :2814-2821. # Farrelly, V., F. A. Rainey, and E. Stackebrandt. 1995. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl. Environ. Microbiol. 61:2798-2801. # Faulkner D. V., Jurka J. (1988) " Multiple Aligned Sequence Editor (MASE) " Trends in Biochemical Sciences Vol 13 : 321-322 #Frostegard, A., Tunlid, A., and Bààth, E. 1991. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of différent organic content. J. Microbiol. Meth. 14:151-163. #Giddings, G. 1998. The release of genetically engineered microorganisms and viruses into the environment. New Phytol. 140 :173-184. #Gladek, A., and J. Zakrzewska. 1984. Genome size of Streptomyces. FEMS Microbiol. Lett. 24 :73-76. #Gribskov M, Devereux J, Burgess RR, The codon préférence plot: graphie analysis of protein coding séquences and prediction of gene expression., Nucleic Acids Res 12 : 1Pt 2, 539-49, Jan 11,1984. .Guiney et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA, (12) : 3595-3598. # Gourmelen, A. Biondelet-Rouault, M. H. & Pernodet, J. L. (1998). Characterization of a glycosyl transferase inactivating macrolides, encoded by gimA from Streptomyces ambofaciens, Antimicrob Agents Chemother 42, 2612-9. # Hayakawa, M., and H. Nonomura. 1987. Humic acid-vitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomycetes. J. Ferment. Technol. 65 :501-509. # Hayakawa, M., Ishizawa K., and H. Nonomura. 1988. Distribution of rare actinomycetes in Japanese soils. J. Ferment. Technol. 66 :367-373. # Hickey, R. J., and H. D. Tresner. 1952. A cobalt containing medium for sporulation of Streptomyces species. J. Bacteriol. 64 :891-892. # Hintermann, G., R., Crameri, Kieser, T., and R. Hütter. 1981. Restriction analysis of the Streptomyces glaucescens genome by agarose gel electrophoresis. Arch. Microbiol. 130 :218-222. # Holben, W. E., J. K. Jansson, B. K. Chelm, and J. M. Tiedje. 1988. DNA probe method for the détection of spécifie microorganisms in the soil bacterial community. Appl. Environ. Microbiol. 54 :703-711. # Hong Fu et al., 1995, Molecular diversity, 1 : 121-124 # Hopwood DA, Bibb M J, Chater K F, Kieser T., Bruton C. J., Kieser H. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. and Scrempf H. 1985. Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, U.K. # Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D. J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of streptomyces - a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom. # Horinouchi S., Malpartida F., Hopwood D. et Beppu T., Mol. Gen. Genet. (1989) 215 :355-357. # Imai R., Nagata Y., Fukuda M., Takagi M., Yano K. (1991) " Molecular cloning of a Pseudomonas paucimobilis gene encoding a 17-kilodalton plypeptide that eliminates HCI molecules from ?-Hexachlorocyclohexane " Journal of Bacteriology Vol 17 ", No21 : 6811-6819 # Jacobsen, C. S., and O. F. Rasmussen. 1992. Development and application of a new method to extract bacterial DNA from soil based on séparation of bacteria from soil with cation-exchange resin. Appl. Environ. Microbiol. 58 :2458-2462. Jae-Hyuk Y.U. and Léonard T.J.,1995. Sterigmetscytin biosynthesis in Aspergilus nidulans requires a ... type I polyketide synthase. J. Bacteriol, (August) : 4792-4800. # Ka, J. O., W. E. Holben, and J. M. Tiedje. 1994. Analysis of compétition in soil among 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60 :1121-1128. # Kah-Tong S et al., 1997, J Bacteriol, G179(23) : 7360-7368 # Kimura M. (1980) " A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide séquences Journal of Molecular Evolution Vol 16 : 111-120 # Kuske, C. R., K. L. Banton, D. L. Adorada, P. C. Stark, K. K. Hill, and P. J. Jackson. 1998. Small-scale DNA sample preparation method for field PCR détection of microbial cells and spores in soil. Appl. Environ. Microbiol. 64 :2463-2472. # Lacalle RA, Pulido D, Vara J, Zalacain M, Jimenez A. Centro de Biologia Molecular (CSIC-UAM), Universidad Autonoma, Canto Blanco, Madrid, Spain. Gene 1989 Jul 15;79(2):375-80 # Lee, S.-Y., J. Bollinger, D. Bezdicek, and A. Ogram. 1996. Estimation of the abundance of an uncultured soil bacterial strain by a competitive quantitative PCR method. Appl. Environ. Microbiol. 62 :3787-3793. # Leff, L. G., J. R. Dana, J. V. McArthur, and L. J. Shimkets. 1995. Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments. Appl. Environ. Microbiol. 61:1141-1143. # Liesack, W., and E. Stackebrandt. 1992. Occurrence of novel groups of the domain Bacteria as revealed by analysis of genetic material isolated from an Australian terrestrial environment. J. Bacteriol. 174 :5072-5078. # Liesack, W., P. H. Janssen, F. A. Rainey, N. L. Ward-Rainey, and E. Stackebrandt. 1997. Microbial diversity is soil: the need for a combined approach using molecular and cultivation techniques. In J. D. Van Elsas, J. T. Trevors, and E. M. H. Wellington (ed.), Modern soil microbiology, Marcel Dekker, Inc., New York. (p 375-439) # Lorentz, M. G., and W. Wackernagel. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Reviews 58 :563-602. # Maidak B. L., Cole J.R., Parker C.T., Garrity G. M., Larsen N., Li B., Lilburn T. G., McCaughey M.J., Olsen G. J., Overbeek R., Pramanik S., Schmidt T. M., Tiedje J. M., Woese C. R. (1999) " A new project of the RDP (Ribosomal Database Project) " Nucleic Acids Research Vol 27 : 171-173 . Mazodier P. et al., 1989, J. Bacteriol., 171(6) : 3583-3585. . More, M. I., J. B. Herrick, M. C. Silva, W. C. Ghiorse, and E. L. Madsen. 1994. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60 :1572-1580. # Murakami T, Holt TG, Thompson CJ, Unité de Génie Microbiologique, Institut Pasteur, Paris, France. J. Bacteriol 1989 Mar; 171 (3): 1459-66 #Nagata Y., Hatta T., Imai R., Kimbara K., Fukuda M., Yano K., Takagi M. (1993) " Purification and characterization of ?-Hexachlorocyclohexane (?-HCH)dehydrochlorinase (LinA) from Pseudomonas paucimobilis " Bioscience, Biotechnology and Biochemistry Vol 57 No 9 : 1582-1583 # Nalin R., Simonet P., Vogel T. M., Normand P. (1999) " Rhodanobacter lindaniclasticus gen. nov., sp., nov., a lindane-degrading bacterium " International Journal of Systematic Bacteriology Vol 49 : 19-23 # Nesme, X., C. Picard, and P. Simonet. 1995. Spécifie DNA séquences for détection of soil bacteria. ln J. T. Trevors, and J. D. van Elsas (ed.), Nucleic acids in the environment, methods and application. Springer Lab Manual. (p 111-139) # Nilsson B, Uhlen M, Josephson S, Gatenbeck S, Philipson L. Nucleic Acids Res 1983 Nov 25;11 (22):8019-30 # Normand P. et al., 1995, Océanis, 21(1) : 31-56 #Ogram, A. V., M. L. Mathot, J. B. Harsh., J. Boyle, and C. A. Pettigrew, JR. 1994. Effects of DNA polymer length on its adsorption to soils. Appl. Environ. Microbiol. 60 :393-396. #Ogram, A., G. S. Sayler, and T. Barkay. 1987. The extraction and purification of microbial DNA from sediments. J. Microbiol. Methods 7:57- 66. #Olsen, R. A., and Bakken, L. R. 1987. Viability of soil bacteria: optimization of the plate-counting technique. Microb. Ecol. 13 :59-74. #Paget, E., L. Jocteur Monrozier, and P. Simonet. 1992. Adsorption of DNA on clay minerais: protection against DNasel and influence on gene transfer. FEMS Microbiol. Lett. 97 :31-40. *Patra, G., P. Sylvestre, V. Ramisse, J. Thérasse, and J. -L. Guesdon. 1996. Isolation of a spécifie chromosomic DNA séquence of Bacillus anthrasis and its possible use in diagnosis. FEMS Immunol. Medical Microbiology 15 :223-231. # Pernodet J.L. Fish, S. Blondelet-Rouault, M.H. & Cundliffe, E. (1996). The macrolide-lincosamide-streptogramin B résistance phenotypes characterized by using a specifically deleted, antibiotic-sensitive strain of Streptomyces lividans. Antimicrob Agents Chemother 40, 581, 5. # Pernodet J.L. , Gourmelen, A., Blondelet-Rouault, M.H. & Cundliffe, E. (1999). Dispensable ribosomal résistance to spiramycin conferred by srmA in the spiramycin producer Streptomyces ambofaciens. 145,2355- 64. .Picard, C., C. Ponsonnet, X. Nesme, and P. Simonet. 1992. Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58 :2717-2722. #Preud'homme, J., Belloc, A., Charpentié, Y., and Tarridec, P. 1965. Un antibiotique formé de deux groupes de composants à synergie d'action : la pristinamycine C. R. Acad. Sci. 260 :1309-1312. #Priemé, A., J. I. B. Sitaula, A. K. Klemedtsson, and L. R. Bakken. 1996. Extraction of methane-oxidizing bacteria from soil particles. FEMS Microbiol. Ecol. 21 : 59-68. 'Presser, J. 1994. Molecular marker systems for détection of genetically engineered micro-organisms in the environment. Microbiol. 140 :5-17. # Raynal A, Tuphile K, Gerbaud C, Luther T, Guérineau M, Pernodet JL ; Laboratoire de Biologie et Génétique Moleculaire, Institut de Génétique et Microbiologie, URA CNRS 2225, Université Paris-Sud, Orsay, France. Mol Microbiol 1998 Apr;28(2):333-42 # Raynald A. Tuphile, K. Gerbaud, C., Luther, T. Guerineau, M. & PERNODET, J. L. (1998). Structure of the chromosomal insertion site for pSAM2 : functional analysis in Escherichia coli. Mol. Microbiol 28,333-42. # Richard, G. M. 1974. Modifications of the diphenylamine reaction giving increased sensitivity and simplicity in the estimation of DNA. Analytical Biochem. 57:369-376. # Romanowski, G., M. G. Lorentz, and W. Wackernagel. 1993. Use of polymerase chain reaction and electroporation of Escherichia coli to monitor the persistence of extracellular plasmid DNA introduced into natural soils. Appl. Environ. Microbiol. 59 :3438-3446. # Saitou N., Nei M. (1987) " The Neighbour-Joining method : a new method for reconstructing phylogentic trees " Molecular and Biological Evolution Vol 2 : 112-118 # Sambrook J., Fritsch E. F. et Maniatis T. 1996. Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd ed. Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Sring Harbor, N.Y. #Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. # Senoo K ., Wada H. (1989) " Isolation and identification of an aerobic ? - HCH-decomposing bacterium from soil " Soil Science, Plant Nutrition Vol 35, No 1 : 79-87.# Sezonov, G., Blanc, V., Bamas-Jacques, N., Friedmann, A. Pernodet, J. L. & Guerineau, M.(1997). Complete conversion of antibiotic precursor to pristinamycin IIA by overexpression of Streptomyces pristinae biosynthetic genes. Nat Biotechnol 15,349-53. ' Shirling, E. B., and D. Gottlieb. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340. Shizuga et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 8794-8797.# Siefert, J. L., and G. E. Fox. 1998. Phylogenetic mapping of bacterial morphology. Microbiology 144 :2803-2808. # Simonet, P., P. Normand, A. Moiroud, and R. Bardin. 1990. Identification of Frankia strains in nodules by hybridization of polymerase chain reaction products with strain-specific oligonucleotide probes. Arch. Microbiol. 153 :235-240. # Smalla, K., N. Cresswell, L. Mendonca-Hagler, A. Wolters, and D. J. van Elsas. 1993. Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplification. J. Appl. Bacteriol. 74:78-85. # Smit, E., P. Leeflang, and K. Wernars. 1997. Detection of shifts in microbial community structure and diversity in soil caused by copper contamination using amplified ribosomal DNA restriction analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 23 :249-261. # Smokvina T, Mazodier P, Boccard F, Thompson CJ, Guerineau M. Laboratoire de Biologie et Genetique Moleculaire, Universite Paris-Sud, Orsay, France. Gene 1990 Sep 28;94(1):53-9 # Smolvina, T., Mazodier, P. Boccard, F. Thompson, C. J. & Guerineau, M. (1990). Construction of a series of pSAM2-based integrative vectors for use in actinomycetes. Gene 94,53-9. # Stackebrandt, E. 1988. Phylogenetic relationships vs. phenotypic diversity : how to achieve a phylogenetic classification system of the eubacteria. Can. J. Microbiol. 34 :552-556. # Staneck, J. L., and G. D. Roberts. 1974. Simplified approach to identification of aerobic Actinomycetes by thin-layer chromatography. Appl. Microbiol. 28 :226-231. # Stapleton, R. D., S. Ripp, L. Jimenez, S. Cheol-Koh, J. T. Fleming, I. R. Gregory, and G. S. Sayler. 1998. Nucleic acid analytical approaches in bioremediation : assessment and characterization. J. Microbiol. Methods 32:165-178. # Steffan, R. J., J. Goksoyr, A. K. Bej, and R. Atlas. 1988. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54 :2908-2915. # Tebbe, C. C., and W. Vahjen. 1993. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in détection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Appl. Environ. Microbiol. 59:2657-2665. # Tercero JA, Espinosa JC, Lacalle RA, Jimenez A . Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, Madrid, Spain. J Biol Chem 1996 Jan 19;271(3):1579-90 # Thomas J-C., Berger F., Jacquier M., Bernillon D., Baud-Grasset F., Truffaut N., Normand P., Vogel T .M., Simonet P. (1996) " Isolation and Characterisation of a novel ?-Hexachlorocyclohexane-degrading bacterium " Journal of Bacteriology Vol 178, No20 : 6049-6055 #Torsvik, V. L. 1980. Isolation of bacterial DNA from soil. Soil Biol. Biochem. 12:15-21. # Torsvik, V., R. Sorheim, and J. Goksoyr. 1996. Total bacterial diversity in soil and sediment communities - a review. J. Ind. Microbiol. 17 :170- 178. # Tsai, Y.-L., and B. Oison. 1991. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 57:1070-1074. # Umeyama T., Tanabe Y., Aigle B. D. et Horinuochi S., FEMS (1996) 144 :177-184. # Van Elsas, J. D., G. F. Duarte, A. S. Rosado, and K. Smalla. 1998. Microbiological and molecular biological methods for monitoring microbial inoculants and their effects in the soil environment. J. Microbiol. Methods 32:133-154. #Van Elsas, J. D., V. Mântynen, and A. C. Wolters. 1997. Soil DNA extraction and assessment of the fate of Mycobacterium chlorophenolicum strain PCP-1 in différent soils by 16S ribosomal RNA gene séquence based most-probable-number PCR and immunofluorescence. Biol. Fert. Soils 24:188-195. # Volff JN et al., 1996, Mol. Microbiol., 21(5) : 1037-1047. # Volossiouk, T., E. J. Robb, and R. N. Nazar. 1995. Direct DNA extraction for PCR-mediated assays. Appl. Environ. Microbiol. 61:3972- 3976. . Wahl GM, Lewis KA, Ruiz JC, Rothenberg B, Zhao J, Evans GA. Proc Natl Acad Sci U S A 1987 Apr;84(8):2160-4 # Waksman, S. A. 1961. Williams and Wilkins (ed.) The actinomycetes. Classification, identification and description of genera and species.Vol 2. Baltimore. # Ward, D. M., R. Weller, and M. M. Bateson. 1990.16S rRNA séquences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community. Nature 344:63-65. # Widmer, F., R. J. Seidler, and L. S. Watrud. 1996. Sensitive détection of transgenic plant marker gene persistence in soil microcosms. Mol. Ecol. 5 :603-613. # Williams, S. T., R. Locci, A. Beswick, D. I. Kurtbôke, V. D. Kuznetsov, F. J. Le Monnier, P. F. Long, K. A. Maycroft, R. A. Palma, B. Petrolini, S. Quaroni, J. I. Todd, and M. West. 1993. Detection and identification of novel actinomycetes. Res. Microbiol. 144 :653-656. # Wilson, I. G. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63 :3741-3751. #Woese, C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221-271. Yannish-Perron et al., 1985 , Gene, 33(1) : 103-119. #Zaslavsky, B. Y. 1995. Separation of biomolecules, p. 503-667. ln Aqueous two-phase partitioning. Boris Y. Zaslavsky (ed.) Physical Chemistry and Bioanalytical Applications, Marcel Dekker, Inc., New York. # Zhou, J., M. A. Bruns, and J. M. Tiedje. 1996. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62 :316-322. LISTE DE SEQUENCES Rhône Poulenc Rorer S.A. Procédé d'obtention d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol, acides nucléiques ainsi obtenus et leur application à la synthèse de composés Banque d'ADN du sol - RPR S.A. 106 PatentIn Ver. 2.1 1 15 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:sonde FGPS431 variation (14) Base A remplacée par G 1 acgggcggtg tgtac 15 2 22 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce FGPS122 2 ggagagtttg atcatggctc ag 22 3 20 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce FGPS350 3 cctggagtta agccccaagc 20 4 24 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:sonde FGPS643 variation (20) T remplacée par C 4 gtgagtnnna acctgcccct gact 24 5 21 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:sonde FGPS643-2 5 gtgagtaacc tgcccccgac t 21 6 23 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce R499 6 ttaattcact tgcaactgat ggg 23 7 23 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce R500 7 aacgatagct cctacatttg gag 23 8 25 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:sonde C501 8 ttgctgatac ggtatagaac ctggc 25 9 20 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce FGPS516 9 tccagatcct tgacccgcag 20 10 20 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce FGPS517 10 cacgacattg cactccaccg 20 11 16 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:sonde FGPS518 11 ccgtgagccg gatcag 16 12 20 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS612 variation (2) Base C remplacée par T variation (7) Base T remplacée par C variation (7) Base T remplacée par A 12 ccaacttcgt gccagcagcc 20 13 21 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS669 variation (7) Base A remplacée par G variation (13) Base A remplacée par C 13 gacgtcatcc ccaccttcct c 21 14 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS618 variation (5) Base T remplacée par C 14 atggttgtcg tcagctcg 18 15 21 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS614 15 gtgtagaagt gaaattcgat t 21 16 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS615 16 cggtggatga tgtggatt 18 17 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS616 17 aggttaaaac tcaaatga 18 18 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS621 18 atacgtaggt ggcaagcg 18 19 19 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS617 19 gccggggtca actcggagg 19 20 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS680 variation (11) Base A remplacée par C variation (11) Base A remplacée par T variation (13) Base T remplacée par A 20 tgagtcccca actccccg 18 21 20 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:FGPS619 21 gcttggggct taactccagg 20 22 21 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce 63f 22 caggcctaac acatgcaagt c 21 23 18 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce 1387r 23 gggcggngtg tacaaggc 18 24 30 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:oligo-1 24 gcttatttaa atattaagcg gccgcccggg 30 25 28 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:oligo-2 25 cccgggcggc cgcattaata tttaaata 28 26 23 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce al 26 ccncagnagc gcntnttnct nga 23 27 22 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce a2 27 gtnccngtnc cgtgngtntc na 22 28 23 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce bl 28 ccncagnagc gcntnctnct nga 23 29 22 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:amorce b2 29 gtnccngtnc cgtgngcctc na 22 30 672 ADN Streptomyces ambofaciens 30 ccccagcagc acgtgttcct cgagacggtg tgggagacct tcgaatccgc cggagtggac 60 ccgcgcgcgg tacgcggtcg ttccgtcggg atgttcgtcg gcaccaacgg acaggactac 120 ccggtggtgt tggccggatc cgccgacgag ggcctggacg cccacgcggc caccggtaac 180 gcggcggcgg tgctgtccgg ccgggtctcg tacgccttcg gcctggaagg gccggcggtc 240 accgtcgaca cggcgtgttc gtcgtcgctg gtggcccttc acctggccgc gcaggcgctg 300 cggcgcggcg agtgcgatct ggcactcgcc ggcggtgtgt cggagatgtc caccgaggcg 360 gcgttcaccg agttcgcccg gcagggcggc ctggccgacg acggccgctg caaggccttc 420 tcggccgacg ccgacggcac gggctggggc gagggcgtcg gcgtcctgct ggtggagcgg 480 ctggcggacg cccgccgcaa cgggcaccgg gccctcgcgc tggtacgggg cagcgcggtc 540 aaccaggacg gcgcctccaa cggtctgacg gcacccaacg gcccgtccca gcagcgagtc 600 atccggcagg cactggcgga cgcccggctg tcgccgtcgg aggtcgacgc ggtcgagacc 660 cacggcaccg gc 672 31 665 ADN Streptomyces ambofaciens 31 ccccagcagc gcgtgttcct ggaagcgtcc tgggaggcgg tcgagcgggc aggcatcgac 60 atgcgcaccc tgcgcggtgg acgcaccggc gtcttcgccg gcgtgatgta ccacgactac 120 ccgtcggtgg tcgaccccga agcgctcgac ggctacctgg gcacggccaa cgccggcagc 180 gttctctccg gccgcatcgc ctacaccttc gggcttcagg gaccggcggt caccgtggac 240 acggcctgct cctcgtccct ggtggcgctg cacctcgccg cccaggcgct gcccgccggc 300 gagtgcgaac tcgccctggt cggtggggtc acggtcatgt ccggcccgat gatgttcgcg 360 ggcttcggcc tggaagacgg ctctgccgcc gacggccgct gcaaggcgtt cgccgccgcc 420 gccgacggca ccggctgggg cgagggtgtc ggtgtgctgc tggtggagcg gctgtcggac 480 gcccggcgcc acgggcaccg ggtgctggcc gtggtgcgcg gtagcgcggt caaccaggac 540 ggtgcctccg gcggcctcac cgcccccaac ggacctgccc agcagcgcgt catccgtcag 600 gccctggcga gcgcggcact cgtaccggcc gaggtcgacg cggtcgagac ccacggcacc 660 gggac 665 32 671 ADN Saccharopolyspora erythraea 32 ccgcaggagc gcgtgttcct ggaactcgct tgggaagcac ttgataacgc gggcatcgca 60 ccgcacagcc tcagggacag ccggacgggc gtgttcttcg gagctatgtg gcacggctac 120 gcgcagttcg cagccggagc cgtcgaccgc atcacccagc acaccgcgac cgggcacgac 180 ctgagcatca tcccggccag gatcgcctac ttcctgggct tgcgcggccc ggacatgacc 240 ctgaacaccg cgtgctcatc ggctttggtg gccatgcacc aggcacgcca aagcatcctg 300 ctgggcgaat cctcggtcgc cttggtcggc gggatcagct tgttggtcgc gctggacagc 360 atggtcgcca tgtcgcggtt cggagcgatg gccccggacg gccggtgcaa ggcattcgac 420 tctcgcgcga acggctacgt gcgcggcgaa ggcggcggtg tcgtggtgct caaaccgctg 480 tcgcgcgctc tggccgatgg caacccggtc tactgcgtcc tgcgcggcag cgcggtcaac 540 aacgacggct tcagcaatgg ccttaccgcg ccgagcccgg cggcgcagga gcaggtactg 600 cgcgacgcct acgccaacgc cggggtcgat ccggcacagg tcgactacgt cgagacccac 660 gggaccggca c 671 33 686 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 33 ccgcaggagc gcgtgttcct cgagtcgtgc tgggaggcgc tggagcatgc tggatacgat 60 actgcacgct accccggccg catcgggctg tgggccggcg cgggcttcaa cagctacctc 120 ctgaccaatc tcatgaacaa ccgcgccttt ttagagagcg tgggcatgta ccagatcttt 180 ctgagcaacg acaaggactt catcgccacc cgcacggctt acaagttaaa cctgcgcggt 240 ccggcgatgg ccgtcggcac cgcctgttcc acatcgctgg tggcggttca cgaagcttgc 300 caggcgctgc ggctgggcga gtgtgacatg gcactggccg gtgctgcgtc tgtcagcacg 360 cccctccggg agggctacct ctaccaggaa ggcatgatta tgagccgtga cggcgtctgc 420 cgcccgtttg acgccgacgc cgatggcacg gtgctgggca atggcgtggc ggtcgtggtg 480 ctcaagcggc tggacgaagc gctccgggac ggtgacacgg tctacgccgt gattcgtggc 540 acggcggtca acaacgacgg ctctgtcaag atcgggttca cggcgcccag cgccgagggg 600 cagagccggg tcgtgcggga cgccctgcgg gcggccgcgg tcccggcgga gagcgtgacc 660 tacgtcgaca cgcacggcac cggcac 686 34 689 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 34 ccccagcagc gcctgttcct cgagtgcgcg tgggaagcga tggagaacgc gggatatgcg 60 gcgcgaagct ataagggttc gatcggcgtt ttcgcgggat gcggcgtcaa tacctacctg 120 ctgaacaacc tcgccaccgc ggagccgttc gatttctcac gcccctccgc gtaccagctg 180 ctgacggcca acgacaagga tttcctggcc acgcgtgtct cttacaagct gaacctccgc 240 gggcccagcc tgacggttca gacggcgtgc tccacctcgc tggtgtcggt ggtgatggca 300 tgcgagagct tgcagcgcgg cgcctcggac attgccttgg ccgggggagt tgccatcaat 360 gttccgcagt ccgtggggta cctgcaccag ccgggcatga tcctgtcgcc cgacgggcgc 420 tgccgcgcct tcgatgagtc cgctcaaggc acggtgccgg gcaacggcgc gggtgtggtc 480 gtcctcaagc gcttgagccg cgctctggcc gatggcgaca cgatctacgc cgtcattcgc 540 ggagcggcta ttaataatga tggcgccgag cgcatggggt ttaccgctcc aggtgtggac 600 ggtcagacgc gattgattcg gcgcactcaa gagatggcgg gcgtgaagcc ggagtccatc 660 ggctacatgg acacccacgg caccggcac 689 35 671 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 35 ccgcagcagc gcctcttcct cgaggtggca tgggaagctt tggagcgtgc gggtcggccg 60 cccgacagtc tcgcgggcag cgacaccgga gtgttcatcg ggatcagcac cgacgactac 120 agccggctga aacctaccga tccggcgctc attgacgcct ataccggtac cggaaccgcg 180 ttcagcactg ccgccggacg gatctcctat ctgctggggt tgcagggacc gaacttcccc 240 gtcgacacgg cgtgctcttc ctcactcgtg gcggttcatc tggcgtgccg cagcttgcag 300 tcgcgagagt gcagcatggc gctggccggc ggcgtgaacc tgattctggc gccggaaagc 360 acgatctact tctgccgcct gcgggccatg gcggccgatg gccgttgcaa aagtttcgct 420 gcctccgccg acggttacgg ccgcggcgag ggatgcggaa tgctggtgct gaagcggctg 480 tccgatgcga cgcgtgacgg cgatcgtatt ctggcgctga ttcgcggatc ggccgtcaac 540 cacggcggcc gcagcaacgg cctcacggcg ccgaacggtc cggcgcagga agccgtgatt 600 cgggcggcgc tcaagaacgc cggcatggcc cccgccgatg tcgattacgt ggacacccac 660 ggcaccggca c 671 36 758 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 36 ccgcaggagc gcgtcttcct cgaacgcatt gacggtttcg atgcggaatt cttcggcatc 60 tccccccgcg aagctctgaa catggatccg cagcagcggc tgctgctgga agtgtgctgg 120 gaagcggcag aggacgccgg catctctccc ggccctctgg cgggcagcgc gaccggcgtc 180 tttgccggct cctgcgccca ggacttcgga ctgtttcagt acgccgaccc tgcccgcatc 240 ggagcttggt cgggttccgg cgtggcgcat agcatgttgg ccaatcgcat ctcctatctg 300 ctcgacctgc gcggtccgag catggcggtc gatacggcct gctcctccgc gctcgtcgcc 360 gtccatctgg cttgccaaag cctgcgccgg cgcgaatgcg atgcggcatt cgccggcgga 420 gtgaacttga tcctgactcc cgagggcatg atcgctttgt cgaaggctcg catgttggcg 480 cccgacggac gctgcaagac gttcgacgcc gcagccgacg gttatgtgcg cggcgagggc 540 tgcggcatcg tgctgctgaa gcggctctcc gatgcgctgg ccgatggcga tgccatctgt 600 gcagtcatcc gcggctcggc aatcaatcag gacggacgga gcaatggcat cacggcgccg 660 aatctgcagg cgcagaaggc ggtcctgcaa gaggcggtgg ccaacgcgca catcgatcca 720 tcccacgtat cgttgatcga cacgcacggc accggcac 758 37 704 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 37 ccgcagcagc gcgtgttcct cgagtgcgcc tgggaggcgg tggaaagcgc gggctacgat 60 cccgaaaaat atcccggcct gatcggagtt ttcgccgggg ccagcatcaa cagctatttc 120 ctttataacc tcgcgcacaa ccgggaattc gtcgcccgca tggcggggga gtaccaagtg 180 ggcgagtacc agacgatcct cggaaacgac aaggactacc tccccactcg cgtctcctac 240 aaattgaacc tgcgcggccc cagcctggcc gtgcagtccg cctgctcgac cggcctcgtc 300 gccgtttgtc aggccattca aaatctgcag acttatcagt gcgatatggc cctcgcgggc 360 ggcatctcga tttcgtttcc gcaaaagcgc gactaccgct tcaccgacga aggaatggtc 420 tctcgcgacg gtcactgccg cccgttcgac gccagcgcgc aaggcacggt cttcggcaac 480 ggggccggcg tcgtcctgat gaaaagattg gccgacgcag tgaccgatcg ggacacgatc 540 ctcgccgtga ttaggggcgc tgccgtgaac aacgacggcg gcgtcaaaat gggttacacg 600 gcgcccagtg ccgaaggtca ggcggaggcc atcaccctgg ccctcgcgct cgctggcgtc 660 agcccggaga ccatcacttg catggacacc cacggcaccg gcac 704 38 680 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 38 ccccagcagc gcgtgttcct cgaatgcgcc tgggcggcgc tggagcgccg ccggatatca 60 gggcgacacc ttccacggtg tccatcggcg gtctatgcct caagcggctt taacacctat 120 cttctgaacc tgcatgccaa tgccgcggtg cgccaatcga tcagcccgtt tgaactgttc 180 gtcgccaacg acaaggattt tctggcgacg cgcacggctt acaagctcaa tctgcgcggc 240 ccggccatga cagtgcagac ggcctgctcc tcatcgttgg ttgccgttca tgtcgccgcg 300 caaagcctcc tagcgggcga atgcgatatt gcgctcgcgg gcggcatcac ggtttcccgt 360 tcgcatggat atgtggcgcg cgaaggtgga atattgtctc ctgacgggca ttgccgggcg 420 ttcgatgcgg atgccggcgg aaccgttcca ggcagcggcg tcggcgttgt cgtgctcaag 480 cgtctcgaag atgcgcttgc agacggcgat acgatcgacg ccgtcatcat cggttcggcc 540 atcaacaatg atggcgcgct gaaggcgagc tttaccgcac cgcaggtgga cagccaggcc 600 ttggtcatca gcgaggccca tgcagctgcc ggaatatcgg ccgattccat cggttatatg 660 gacacccacg gcaccgggac 680 39 671 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 39 ccgcagcagc gcctcttcct cgagctcacc tgggaagcgc tggaagatgc cggcatcccg 60 ccgtccacga ttgccggcac gaatgtcggc gttttcatgg gcgcgtcgca ggctgactac 120 ggccacaagt tcttcagcga ccacgccgtc gcggattccc atttcgccac cggcacctcg 180 ctggcggtcg tcgccaatcg catttcctac atctacgacc tgcgcggccc aagcctcact 240 gtagacacgg cgtgctcgtc gtcgctcgtc gcgctgcatc aggcggtgga agcgctccgc 300 tcggggcgga tcgaaacagc cattgtcggc ggcattaacg ttatcgccag cccggcgtcc 360 ttcatcgcct tctcgcaggc ctcgatgctg tcgccgacgg ggttgtgcca ggctttctcc 420 gccaaggccg atggctttgt ccgcggcgag ggcggcacgg ttttcgtcct gcgcaaggcg 480 gcgcatgcgc atggcagccg caacccggtg cgcgggctca ttctcgccac cgacgtcaat 540 tccgacgggc gtaccaacgg catctcgctg ccatcggccg aagcgcagga agtcctcctg 600 caacgcgtct attcacgcgc atcgatcgat ccgaaccgcc tggctttcgt cgacacccac 660 gggaccggca c 671 40 764 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 40 ccgcagcagc gcgtgttcct cgacggcatc gaccggttcg atccgcgtca cttcgcgatc 60 acgccgcgcg aggcgatcag catggacccg cagcagcggc tcctgctcga ggtcacgtgg 120 gaagcgctgg agcgcgccgg cgtggcgccc gatcgcctga ccggatccga caccggcgtc 180 ttcatcggca tcagcaccaa cgactacggc cagatcctgc tgcgcgcctc ggaccagatc 240 gatccgggga tgtacttcgg caccggcaac ctgttgaacg cggcggcggg acgcctctcg 300 tacgtcctcg gccgcaggg tccgagcatg gcggtcgaca ccgcatgtcc gtcgtcgctg 360 gtggcgattc atctcgcgtg tcagagcctg cgcaaccgcg agtgccgcat ggcgctcgcc 420 ggcggcgcca acctggtgct cgtcccggaa gtgacggtca actgctgccg cgccaagatg 480 ctcgcgcctg acgggcgctg caagacgttc gacgccgcgg cggacggcta cgtccgcggc 540 gaaggggccg cggtgatcgt gctgaagcgg ctctccgacg cgctggcgga cggcgatccg 600 atcgtcgcgc tgatccgcgg atccgcggtc aatcaggacg gccgcagcgg cggcttcacc 660 gcgccgaacg aactggcgca gcaggcggtg atccggaccg cgctcgcggc agcgggcgtc 720 gccgcgtccg acatcggcta cgtggacacg cacggcaccg ggac 764 41 763 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 41 ccgcagcagc gcgtgttcct cgacggcatc gaccgcttcg atccgcagtt tttcgggatc 60 gcgccgcgcg aagcggccgg catcgatccg cagcagcggc tgctgctcga gacgacgtgg 120 gaagcgctgg aagacgccgg gacgtcgccg gaaaagctgc agggaacccc ggccggcgtg 180 ttcgtcggca tcaacagcat cgactacgcg acgctgcagc tgcagaactg cgatctggcc 240 agcatcgacg cctattcgct ctccggcagc gcgcacagca tcgcggccgg gcggctcgcc 300 tacgtgctcg gcctgcaggg gccggcgatg gcggtcgaca ccgcctgctc gtcgtcgctg 360 gtcgcgatcc acctggcgtg ccagagcctg cgcaacgacg actgccgcgt cgccgtggcc 420 ggcggcgtgc acgtcacgct gacgccgatc aacatggtcg tgttctcgaa gctgcgcatg 480 ctggcggcgg acggcaagtg caagacgttc gacggccgcg gcgacggatt cgtcgaaggc 540 gagggctgcg cggtcatcgt cctcaagcgg ttgtcgcacg cgcttgccga caaggatcgg 600 atcctcgcgc tggtgcgcgg ttcggcggtc aaccaggacg gcgcgagcag cggtctcacc 660 gcgccgaacg gtccggcgca ggaagcggtc atccgcgcgg cgttgaagcg ggccggcgtg 720 cagccggcgg aggtcggcta cgtggacacc cacggcaccg gca 763 42 668 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 42 ccgcaggagc gcgtgctgct ggaatcctcg tggcatgcgc tggaagacgc cggctatgcc 60 ggcgaaagca tcgccggcgc gcgctgcggc gtgtacatgg gcttcaacgg cggcgactac 120 ggcgacctgc tgtacggcca gccgtcgctg ccgccgcacg cgatgtgggg caacgccgcc 180 tcggtgctgt cggcgcgcat cgcctattac ctggacctgc aaggcccggc gatcaccctc 240 gacaccgcct gttcgagctc gttggtcgcg gtgcatctgg cctgccaggg gctgtggacc 300 ggcgagaccg atctggccct ggccggcggc gtgtggatcc agtgcacgcc cggattcctg 360 atctcctcca gccgcgccgg catgctctcg ccgaccggcc agtgccgcgc gttcggcgcc 420 ggcgccgacg gcttcgtgcc gtccgaaggc gtcggcgtgg tcgtgctcaa gcgcctgcag 480 gacgcgctcg acgccggcga ccacatntac ggcgtgatcc gcggcagcgc gatcaaccag 540 gacggcgcca gcaacggcat caccgcgccg agcgccgccg cccaggagcg cttgcagcgc 600 cacgtctacg acagcttcgg catcgacgcc tcgcgcctgc agatgatcga ggcccacggc 660 accggcac 668 43 671 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : :organisme du sol 43 ccgcaggagc gcgtgctgct ggaggtgact tgggaggcac tcgaagacgc cggccaagac 60 gtggaccgtc tggccgggcg gcccgtcggc gtcttcgtcg ggatctcgtc gaacgattac 120 ggccagcttc agaacggcga cccggccgac gtggacgcct acgtcggcac cggtaacgcg 180 ctgagcatcg ccgccaaccg actcagctac acgtttgact ttcgcggccc gagtctggcg 240 gtggacacgg cgtgctcgtc ttcactcgtc gcgatccatc tcgcctgcca gagcgttcgc 300 cgcggtgaag cggaactcgc cgtcgcggcc ggcgtcaact tgattctgac ccccggcctg 360 acggtgaatt tcacccgcgc cggcatgatg gcgcctgacg gccggtgcaa gacgttcgac 420 gcggccgcca acggctacgt gcgcggcgaa ggcgccggcg tcgtcgtgct caagccgctg 480 gcccaggcta tcgccgacgg cgacccgatc tacgcgatcg tccgtggcag cgccgtcaac 540 caggacggcc gttccaacgg cctcaccgcc ccgaaccgac aggcccaaga ggtcgtgctg 600 cgggccgcgt atcgtgacgc gggcatcagc ccggccgatg tcgacgccgt cgaggcccac 660 ggcaccggca c 671 44 707 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 44 ccccagcagc gcgtgttcct cgaggacgcg actgaggtcg acgtggatgc gctttcagac 60 ggcgaagacg tcgtgatcgc cggcatcatg cagcacatcg aggaggccgg catccactcg 120 ggcgattcat cgtgcgtgct tccgccggtc gacatcccgc cgaaggcgct gcagacgatc 180 cgcgatcaca cgttcaagct cgcgcgcgcg ttgaaggtca tcggcctgat gaacgtgcag 240 tacgcgattc agcgcgacaa ggtctacgtg attgaggtaa accctagggc ttctcgaact 300 gtcccgtatg tctcgaaggc gacaggcgtg ccgctggcga aggtcgcgtc acgcttgatg 360 accggacgca aactgcacga gctgttgccg gaaggggtcg agcgcggctg gatcaccacc 420 gcgggcgaga atttctacgt gaagtcgccg gtcttcccgt ggggtaagtt cccgggcgtt 480 gacactgtgc tcgggccgga gatgaaatcg accggcgaag tcatgggcgt cgccgacaac 540 ttcggcgagg ccttcgccaa ggcacagatc gccgccggca catacctgcc gaccgaaggt 600 accgtcttca tctcggtcaa cgaccgtgac aaaggcaacg tcattcagct ggcgcagcgt 660 ttctccgaac tcggtttcgg cattgtcgac acgcacggca ccgggac 707 45 225 PRT Streptomyces ambofaciens 45 Pro Gln Gln His Val Phe Leu Glu Thr Val Trp Glu Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Ala Gly Val Asp Pro Arg Ala Val Arg Gly Arg Ser Val Gly Met Phe 20 25 30 Val Gly Thr Asn Gly Gln Asp Tyr Pro Val Val Leu Ala Gly Ser Ala 35 40 45 Asp Glu Gly Leu Asp Ala His Ala Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala Val 50 55 60 Leu Ser Gly Arg Val Ser Tyr Ala Phe Gly Leu Glu Gly Pro Ala Val 65 70 " 75 80 Thr Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Leu His Leu Ala 85 90 95 Ala Gln Ala Leu Arg Arg Gly Glu Cys Asp Leu Ala Leu Ala Gly Gly 100 105 110 Val Ser Glu Met Ser Thr Glu Ala Ala Phe Thr Glu Phe Ala Arg Gln 115 120 125 Gly Gly Leu Ala Asp Asp Gly Arg Cys Lys Ala Phe Ser Ala Asp Ala 130 135 140 Asp Gly Thr Gly Trp Gly Glu Gly Val Gly Val Leu Leu Val Glu Arg 145 150 155 160 Leu Ala Asp Ala Arg Arg Asn Gly His Arg Ala Leu Ala Leu Val Arg 165 170 175 Gly Ser Ala Val Asn Gln Asp Gly Ala Ser Asn Gly Leu Thr Ala Pro 180 185 190 Asn Gly Pro Ser Gln Gln Arg Val Ile Arg Gln Ala Leu Ala Asp Ala 195 200 205 Arg Leu Ser Pro Ser Glu Val Asp Ala Val Glu Thr His Gly Thr Gly 210 215 220 Thr 225 46 207 PRT Streptomyces ambofaciens 46 Ala Ser Trp Glu Ala Val Glu Arg Ala Gly Ile Asp Met Arg Thr Leu 1 5 5 10 15 Arg Gly Gly Arg Thr Gly Val Phe Ala Gly Val Met Tyr His Asp Tyr 20 25 30 Pro Ser Val Val Asp Pro Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Leu Gly Thr Ala 35 40 45 Asn Ala Gly Ser Val Leu Ser Gly Arg Ile Ala Tyr Thr Phe Gly Leu 50 55 60 Gln Gly Pro Ala Val Thr Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val 65 70 75 80 Ala Leu His Leu Ala Ala Gln Ala Leu Pro Ala Gly Glu Cys Glu Leu 85 90 95 Ala Leu Val Gly Gly Val Thr Val Met Ser Gly Pro Met Met Phe Ala 100 105 110 Gly Phe Gly Leu Glu Asp Gly Ser Ala Ala Asp Gly Arg Cys Lys Ala 115 120 125 Phe Ala Ala Ala Ala Asp Gly Thr Gly Trp Gly Glu Gly Val Gly Val 130 135 140 Leu Leu Val Glu Arg Leu Ser Asp Ala Arg Arg His Gly His Arg Val 145 150 155 160 Leu Ala Val Val Arg Gly Ser Ala Val Asn Gln Asp Gly Ala Ser Gly 165 170 175 Gly Leu Thr Ala Pro Asn Gly Pro Ala Gln gln Arg Val Ile Arg Gln 180 185 190 Ala Leu Ala Ser Ala Ala Leu Val Pro Ala Glu Val Asp Ala Val 195 200 205 47 223 PRT Saccharopolyspora erythraea 47 Pro Gln Glu Arg Val Phe Leu Glu Leu Ala Trp Glu Ala Leu Asp Asn 1 5 10 15 Ala Gly Ile Ala Pro His Ser Leu Arg Asp Ser Arg Thr Gly Val Phe 20 25 30 Phe Gly Ala Met Trp His Gly Tyr Ala Gln Phe Ala Ala Gly Ala Val 35 40 45 Asp Arg Ile Thr Gln His Thr Ala Thr Gly His Asp Leu Ser Ile Ile 50 55 60 Pro Ala Arg Ile Ala Tyr Phe Leu Gly Leu Arg Gly Pro Asp Met Thr 65 70 75 80 Leu Asn Thr Ala Cys Ser Ser Ala Leu Val Ala Met His Gln Ala Arg 85 90 95 Gln Ser Ile Leu Leu Gly Glu Ser Ser Val Ala Leu Val Gly Gly Ile 100 105 110 Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ser Met Val Ala Met Ser Arg Phe Gly 115 120 125 Ala Met Ala Pro Asp Gly Arg Cys Lys Ala Phe Asp Ser Arg Ala Asn 130 135 140 Gly Tyr Val Arg Gly Glu Gly Gly Gly Val Val Val Leu Lys Pro Leu 145 150 155 160 Ser Arg Ala Leu Ala Asp Gly Asn Pro Val Tyr Cys Val Leu Arg Gly 165 170 175 Ser Ala Val Asn Asn Asp Gly Phe Ser Asn Gly Leu Thr Ala Pro Ser 180 185 190 Pro Ala Ala Gln Glu Gln Val Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Asn Ala Gly 195 200 205 Val Asp Pro Ala Gln Val Asp Tyr Val Glu Thr His Gly Thr Gly 210 215 220 48 211 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 48 Ser Cys Trp Glu Ala Leu Glu His Ala Gly Tyr Asp Thr Ala Arg Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Arg Ile Gly Leu Trp Ala Gly Ala Gly Phe Asn Ser Tyr Leu 20 25 30 Leu Thr Asn Leu Met Asn Asn Arg Ala Phe Leu Glu Ser Val Gly Met 35 40 45 Tyr Gln Ile Phe Leu Ser Asn Asp Lys Asp Phe Ile Ala Thr Arg Thr 50 55 60 Ala Tyr Lys Leu Asn Leu Arg Gly Pro Ala Met Ala Val Gly Thr Ala 65 70 75 80 Cys Ser Thr Ser Leu Val Ala Val His Glu Ala Cys Gln Ala Leu Arg 85 90 95 Leu Gly Glu Cys Asp Met Ala Leu Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Thr 100 105 110 Pro Leu Arg Glu Gly Tyr Leu Tyr Gln Glu Gly Met Ile Met Ser Arg 115 120 125 Asp Gly Val Cys Arg Pro Phe Asp Ala Asp Ala Asp Gly Thr Val Leu 130 135 140 Gly Asn Gly Val Ala Val Val Val Leu Lys Arg Leu Asp Glu Ala Leu 145 150 155 160 Arg Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Val Ile Arg Gly Thr Ala Val Asn 165 170 175 Asn Asp Gly Ser Val Lys Ile Gly Phe Thr Ala Pro Ser Ala Glu Gly 180 185 190 Gln Ser Arg Val Val Arg Asp Ala Leu Arg Ala Ala Ala Val Pro Ala 195 200 205 Glu Ser Val 210 49 229 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 49 Pro Gln Gln Arg Leu Phe Leu Glu Cys Ala Trp Glu Ala Met Glu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Ser Tyr Lys Gly Ser Ile Gly Val Phe Ala 20 25 30 Gly Cys Gly Val Asn Thr Tyr Leu Leu Asn Asn Leu Ala Thr Ala Glu 35 40 45 Pro Phe Asp Phe Ser Arg Pro Ser Ala Tyr Gln Leu Leu Thr Ala Asn 50 55 60 Asp Lys Asp Phe Leu Ala Thr Arg Val Ser Tyr Lys Leu Asn Leu Arg 65 70 75 80 Gly Pro Ser Leu Thr Val Gln Thr Ala Cys Ser Thr Ser Leu Val Ser 85 90 95 Val Val Met Ala Cys Glu Ser Leu Gln Arg Gly Ala Ser Asp Ile Ala 100 105 110 Leu Ala Gly Gly Val Ala Ile Asn Val Pro Gln Ser Val Gly Tyr Leu 115 120 125 His Gln Pro Gly Met Ile Leu Ser Pro Asp Gly Arg Cys Arg Ala Phe 130 135 140 Asp Glu Ser Ala Gln Gly Thr Val Pro Gly Asn Gly Ala Gly Val Val 145 150 155 160 Val Leu Lys Arg Leu Ser Arg Ala Leu Ala Asp Gly Asp Thr Ile Tyr 165 170 175 Ala Val Ile Arg Gly Ala Ala Ile Asn Asn Asp Gly Ala Glu Arg Met 180 185 190 Gly Phe Thr Ala Pro Gly Val Asp Gly Gln Thr Arg Leu Ile Arg Arg 195 200 205 Thr Gln Glu Met Ala Gly Val Lys Pro Glu Ser Ile Gly Tyr Met Asp 210 215 220 Thr His Gly Thr Gly 225 50 223 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 50 Pro Gln Gln Arg Leu Phe Leu Glu Val Ala Trp Glu Ala Leu Glu Arg 1 5 10 15 Ala Gly Arg Pro Pro Asp Ser Leu Ala Gly Ser Asp Thr Gly Val Phe 20 25 30 Ile Gly Ile Ser Thr Asp Asp Tyr Ser Arg Leu Lys Pro Thr Asp Pro 35 40 45 Ala Leu Ile Asp Ala Tyr Thr Gly Thr Gly Thr Ala Phe Ser Thr Ala 50 55 60 Ala Gly Arg Ile Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Gln Gly Pro Asn Phe Pro 65 70 75 80 Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Val His Leu Ala Cys 85 90 95 Arg Ser Leu Gln Ser Arg Glu Cys Ser Met Ala Leu Ala Gly Gly Val 100 105 110 Asn Leu Ile Leu Ala Pro Glu Ser Thr Ile Tyr Phe Cys Arg Leu Arg 115 120 125 Ala Met Ala Ala Asp Gly Arg Cys Lys Ser Phe Ala Ala Ser Ala Asp 130 135 140 Gly Tyr Gly Arg Gly Glu Gly Cys Gly Met Leu Val Leu Lys Arg Leu 145 150 155 160 Ser Asp Ala Thr Arg Asp Gly Asp Arg Ile Leu Ala Leu Ile Arg Gly 165 170 175 Ser Ala Val Asn His Gly Gly Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ala Pro Asn 180 185 190 Gly Pro Ala Gln Glu Ala Val Ile Arg Ala Ala Leu Lys Asn Ala Gly 195 200 205 Met Ala Pro Ala Asp Val Asp Tyr Val Asp Thr His Gly Thr Gly 210 215 220 51 252 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 51 Pro Gln Glu Arg Val Phe Leu Glu Arg Ile Asp Gly Phe Asp Ala Glu 1 5 10 15 Phe Phe Gly Ile Ser Pro Arg Glu Ala Leu Asn Met Asp Pro Gln Gln 20 25 30 Arg Leu Leu Leu Glu Val Cys Trp Glu Ala Ala Glu Asp Ala Gly Ile 35 40 45 Ser Pro Gly Pro Leu Ala Gly Ser Ala Thr Gly Val Phe Ala Gly Ser 50 55 60 Cys Ala Gin Asp Phe Gly Leu Phe Gln Tyr Ala Asp Pro Ala Arg Ile 65 70 75 80 Gly Ala Trp Ser Gly Ser Gly Val Ala His Ser Met Leu Ala Asn Arg 85 90 95 Ile Ser Tyr Leu Leu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Met Ala Val Asp Thr 100 105 110 Ala Cys Ser Ser Ala Leu Val Ala Val His Leu Ala Cys Gln Ser Leu 115 120 125 Arg Arg Arg Glu Cys Asp Ala Ala Phe Ala Gly Gly Val Asn Leu Ile 130 135 140 Leu Thr Pro Glu Gly Met Ile Ala Leu Ser Lys Ala Arg Met Leu Ala 145 150 155 160 Pro Asp Gly Arg Cys Lys Thr Phe Asp Ala Ala Ala Asp Gly Tyr Val 165 170 175 Arg Gly Glu Gly Cys Gly Ile Val Leu Leu Lys Arg Leu Ser Asp Ala 180 185 190 Leu Ala Asp Gly Asp Ala Ile Cys Ala Val Ile Arg Gly Ser Ala Ile 195 200 205 Asn Gln Asp Gly Arg Ser Asn Gly Ile Thr Ala Pro Asn Leu Gln Ala 210 215 220 Gln Lys Ala Val Leu Gln Glu Ala Val Ala Asn Ala His Ile Asp Pro 225 230 235 240 Ser His Val Ser Leu Ile Asp Thr His Gly Thr Gly 245 250 52 234 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence : organisme du sol 52 Pro Gln Gln Arg Val Phe Leu Glu Cys Ala Trp Glu Ala Val Glu Ser 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Asp Pro Glu Lys Tyr Pro Gly Leu Ile Gly Val Phe Ala 20 25 30 Gly Ala Ser Ile Asn Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Leu Ala His Asn Arg 35 40 45 Glu Phe Val Ala Arg Met Ala Gly Glu Tyr Gln Val Gly Glu Tyr Gln 50 55 60 Thr Ile Leu Gly Asn Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Thr Arg Val Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Asn Leu Arg Gly Pro Ser Leu Ala Val Gln Ser Ala Cys Ser 85 90 95 Thr Gly Leu Val Ala Val Cys Gln Ala Ile Gln Asn Leu Gln Thr Tyr 100 105 110 Gln Cys Asp Met Ala Leu Ala Gly Gly Ile Ser Ile Ser Phe Pro Gln 115 120 " 125 Lys Arg Asp Tyr Arg Phe Thr Asp Glu Gly Met Val Ser Arg Asp Gly 130 135 140 His Cys Arg Pro Phe Asp Ala Ser Ala Gln Gly Thr Val Phe Gly Asn 145 150 155 160 Gly Ala Gly Val Val Leu Met Lys Arg Leu Ala Asp Ala Val Thr Asp 165 170 175 Arg Asp Thr Ile Leu Ala Val Ile Arg Gly Ala Ala Val Asn Asn Asp 180 185 190 Gly Gly Val Lys Met Gly Tyr Thr Ala Pro Ser Ala Glu Gly Gln Ala 195 200 205 Glu Ala Ile Thr Leu Ala Leu Ala Leu Ala Gly Val Ser Pro Glu Thr 210 215 220 Ile Thr Cys Met Asp Thr His Gly Thr Gly 225 230 53 226 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence : organisme du sol 53 Pro Gln Gln Arg Val Phe Leu Glu Cys Ala Trp Ala Ala Leu Glu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ile Ser Gly Arg His Leu Pro Arg Cys Pro Ser Ala Val Tyr 20 25 30 Ala Ser Ser Gly Phe Asn Thr Tyr Leu Leu Asn Leu His Ala Asn Ala 35 40 45 Ala Val Arg Gln Ser Ile Ser Pro Phe Glu Leu Phe Val Ala Asn Asp 50 55 60 Lys Asp Phe Leu Ala Thr Arg Thr Ala Tyr Lys Leu Asn Leu Arg Gly 65 70 75 80 Pro Ala Met Thr Val Gln Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Val 85 90 95 His Val Ala Ala Gln Ser Leu Leu Ala Gly Glu Cys Asp Ile Ala Leu 100 105 110 Ala Gly Gly Ile Thr Val Ser Arg Ser His Gly Tyr Val Ala Arg Glu 115 120 125 Gly Gly Ile Leu Ser Pro Asp Gly His Cys Arg Ala Phe Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gly Gly Thr Val Pro Gly Ser Gly Val Gly Val Val Val Leu Lys 145 150 155 160 Arg Leu Glu Asp Ala Leu Ala Asp Gly Asp Thr Ile Asp Ala Val Ile 165 170 175 Ile Gly Ser Ala Ile Asn Asn Asp Gly Ala Leu Lys Ala Ser Phe Thr 180 185 190 Ala Pro Gln Val Asp Ser Gln Ala Leu Val Ile Ser Glu Ala His Ala 195 200 205 Ala Ala Gly Ile Ser Ala Asp Ser Ile Gly Tyr Met Asp Thr His Gly 210 215 220 Thr Gly 225 54 223 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 54 Pro Gln Gln Arg Leu Phe Leu Glu Leu Thr Trp Glu Ala Leu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Gly Ile Pro Pro Ser Thr Ile Ala Gly Thr Asn Val Gly Val Phe 20 25 30 Met Gly Ala Ser Gln Ala Asp Tyr Gly His Lys Phe Phe Ser Asp His 35 40 45 Ala Val Ala Asp Ser His Phe Ala Thr Gly Thr Ser Leu Ala Val Val 50 55 60 Ala Asn Arg Ile Ser Tyr Ile Tyr Asp Leu Arg Gly Pro Ser Leu Thr 65 70 75 80 Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Leu His Gln Ala Val 85 90 95 Glu Ala Leu Arg Ser Gly Arg Ile Glu Thr Ala Ile Val Gly Gly Ile 100 105 110 Asn Val Ile Ala Ser Pro Ala Ser Phe Ile Ala Phe Ser Gln Ala Ser 115 120 125 Met Leu Ser Pro Thr Gly Leu Cys Gln Ala Phe Ser Ala Lys Ala Asp 130 135 140 Gly Phe Val Arg Gly Glu Gly Gly Thr Val Phe Val Leu Arg Lys Ala 145 150 155 160 Ala His Ala His Gly Ser Arg Asn Pro Val Arg Gly Leu Ile LeuAla 165 170 175 Thr Asp Val Asn Ser Asp Gly Arg Thr Asn Gly Ile Ser Leu Pro Ser 180 185 190 Ala Glu Ala Gln Glu Val Leu Leu Gln Arg Val Tyr Ser Arg Ala Ser 195 200 205 Ile Asp Pro Asn Arg Leu Ala Phe Val Asp Thr His Gly Thr Gly 210 215 220 55 254 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 55 Pro Gln Gln Arg Val Phe Leu Asp Gly Ile Asp Arg Phe Asp Pro Arg 1 5 10 15 His Phe Ala Ile Thr Pro Arg Glu Ala Ile Ser Met Asp Pro Gln Gln 20 25 30 Arg Leu Leu Leu Glu Val Thr Trp Glu Ala Leu Glu Arg Ala Gly Val 35 40 45 Ala Pro Asp Arg Leu Thr Gly Ser Asp Thr Gly Val Phe Ile Gly Ile 50 55 60 Ser Thr Asn Asp Tyr Gly Gln Ile Leu Leu Arg Ala Ser Asp Gln Ile 65 70 75 80 Asp Pro Gly Met Tyr Phe Gly Thr Gly Asn Leu Leu Asn Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Arg Leu Ser Tyr Val Leu Gly Leu Gln Gly Pro Ser Met Ala Val 100 105 110 Asp Thr Ala Cys Pro Ser Ser Leu Val Ala Ile His Leu Ala Cys Gln 115 120 125 Ser Leu Arg Asn Arg Glu Cys Arg Met Ala Leu Ala Gly Gly Ala Asn 130 135 140 Leu Val Leu Val Pro Glu Val Thr Val Asn Cys Cys Arg Ala Lys Met 145 150 155 160 Leu Ala Pro Asp Gly Arg Cys Lys Thr Phe Asp Ala Ala Ala Asp Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Gly Glu Gly Ala Ala Val Ile Val Leu Lys Arg Leu Ser 180 185 190 Asp Ala Leu Ala Asp Gly Asp Pro Ile Val Ala Leu Ile Arg Gly Ser 195 200 205 Ala Val Asn Gln Asp Gly Arg Ser Gly Gly Phe Thr Ala Pro Asn Glu 210 215 220 Leu Ala Gln Gln Ala Val Ile Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val 225 230 235 240 Ala Ala Ser Asp Ile Gly Tyr Val Asp Thr His Gly Thr Gly 245 250 56 254 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 56 Pro Gln Gln Arg Val Phe Leu Asp Gly Ile Asp Arg Phe Asp Pro Gln 1 5 10 15 Phe Phe Gly Ile Ala Pro Arg Glu Ala Ala Gly Ile Asp Pro Gln Gln 20 25 30 Arg Leu Leu Leu Glu Thr Thr Trp Glu Ala Leu Glu Asp Ala Gly Thr 35 40 45 Ser Pro Glu Lys Leu Gin Gly Thr Pro Ala Gly Val Phe Val Gly Ile 50 55 60 Asn Ser Ile Asp Tyr Ala Thr Leu Gln Leu Gln Asn Cys Asp Leu Ala 65 70 75 80 Ser Ile Asp Ala Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Ala His Ser Ile Ala Ala 85 90 95 Gly Arg Leu Ala Tyr Val Leu Gly Leu Gin Gly Pro Ala Met Ala Val 100 105 110 Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Ile His Leu Ala Cys Gln 115 120 125 Ser Leu Arg Asn Asp Asp Cys Arg Val Ala Val Ala Gly Gly Val His 130 135 140 Val Thr Leu Thr Pro Ile Asn Met Val Val Phe Ser Lys Leu Arg Met 145 150 155 160 Leu Ala Ala Asp Gly Lys Cys Lys Thr Phe Asp Gly Arg Gly Asp Gly 165 170 175 Phe Val Glu Gly Glu Gly Cys Ala Val Ile Val Leu Lys Arg Leu Ser 180 185 190 His Ala Leu Ala Asp Lys Asp Arg Ile Leu Ala Leu Val Arg Gly Ser 195 200 205 Ala Val Asn Gln Asp Gly Ala Ser Ser Gly Leu Thr Ala Pro Asn Gly 210 215 220 Pro Ala Gln Glu Ala Val Ile Arg Ala Ala Leu Lys Arg Ala Gly Val 225 230 235 240 Gln Pro Ala Glu Val Gly Tyr Val Asp Thr His Gly Thr Gly 245 250 57 222 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 57 Pro Gln Glu Arg Val Leu Leu Glu Ser Ser Trp His Ala Leu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ala Gly Glu Ser Ile Ala Gly Ala Arg Cys Gly Val Tyr 20 25 30 Met Gly Phe Asn Gly Gly Asp Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Gly Gin Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Pro His Ala Met Trp Gly Asn Ala Ala Ser Val Leu Ser 50 55 ' 60 Ala Arg Ile Ala Tyr Tyr Leu Asp Leu Gln Gly Pro Ala Ile Thr Leu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Led Val Ala Val His Leu Ala Cys Gln 85 90 95 Gly Leu Trp Thr Gly Glu Thr Asp Leu Ala Leu Ala Gly Gly Val Trp 100 105 110 Ile Gln Cys Thr Pro Gly Phe Leu Ile Ser Ser Ser Arg Ala Gly Met 115 120 125 Leu Ser Pro Thr Gly Gln Cys Arg Ala Phe Gly Ala Gly Ala Asp Gly 130 135 140 Phe Val Pro Ser Glu Gly Val Gly Val Val Val Leu Lys Arg Leu Gln 145 150 155 160 Asp Ala Leu Asp Ala Gly Asp His Xaa Tyr Gly Val Ile Arg Gly Ser 165 170 175 Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ala Ser Asn Gly Ile Thr Ala Pro Ser Ala 180 185 190 Ala Ala Gln Glu Arg Leu Gln Arg His Val Tyr Asp Ser Phe Gly Ile 195 200 205 Asp Ala Ser Arg Leu Gln Met Ile Glu Ala His Gly Thr Gly 210 " 215 220 58 223 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence organisme du sol 58 Pro Gln Glu Arg Val Leu Leu Glu Val Thr Trp Glu Ala Leu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Gly Gln Asp Val Asp Arg Leu Ala Gly Arg Pro Val Gly Val Phe 20 25 30 Val Gly Ile Ser Ser Asn Asp Tyr Gly Gln Leu Gln Asn Gly Asp Pro 35 40 45 Ala Asp Val Asp Ala Tyr Val Gly Thr Gly Asn Ala Leu Ser Ile Ala 50 55 " 60 Ala Asn Arg Leu Ser Tyr Thr Phe Asp Phe Arg Gly Pro Ser Leu Ala 65 70 75 80 Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Ile His Leu Ala Cys 85 90 95 Gin Ser Val Arg Arg Gly Glu Ala Glu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val 100 105 110 Asn Leu Ile Leu Thr Pro Gly Leu Thr Val Asn Phe Thr Arg Ala Gly 115 120 125 Met Met Ala Pro Asp Gly Arg Cys Lys Thr Phe Asp Ala Ala Ala Asn 130 135 140 Gly Tyr Val Arg Gly Glu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Lys Pro Leu 145 150 155 160 Ala Gin Ala Ile Ala Asp Gly Asp Pro Ile Tyr Ala Ile Val Arg Gly 165 170 175 Ser Ala Val Asn Gin Asp Gly Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ala Pro Asn 180 185 190 Arg Gln Ala Gin Glu Val Val Leu Arg Ala Ala Tyr Arg Asp Ala Gly 195 200 205 Ile Ser Pro Ala Asp Val Asp Ala Val Glu Ala His Gly Thr Gly 210 215 220 59 235 PRT Organime Inconnu Origine de la séquence :organisme du sol 59 Pro Gln Gin Arg Val Phe Leu Glu Asp Ala Thr Glu Val Asp Val Asp 1 5 10 15 Ala Leu Ser Asp Gly Glu Asp Val Val Ile Ala Gly Ile Met Gin His 20 25 30 Ile Glu Glu Ala Gly Ile His Ser Gly Asp Ser Ser Cys Val Leu Pro 35 40 45 Pro Val Asp Ile Pro Pro Lys Ala Leu Gln Thr Ile Arg Asp His Thr 50 55 60 Phe Lys Leu Ala Arg Ala Leu Lys Val Ile Gly Leu Met Asn Val Gin 65 70 75 80 Tyr Ala Ile Gin Arg Asp Lys Val Tyr Val Ile Glu Val Asn Pro Arg 85 90 95 Ala Ser Arg Thr Val Pro Tyr Val Ser Lys Ala Thr Gly Val Pro Leu 100 105 110 Ala Lys Val Ala Ser Arg Leu Met Thr Gly Arg Lys Leu His Glu Leu 115 120 125 Leu Pro Glu Gly Val Glu Arg Gly Trp Ile Thr Thr Ala Gly Glu Asn 130 135 140 Phe Tyr Val Lys Ser Pro Val Phe Pro Trc Gly Lys Phe Pro Gly Val 145 150 155 160 Asp Thr Val Leu Gly Pro Glu Met Lys Ser Thr Gly Glu Val Met Gly 165 170 175 Val Ala * Asp Asn Phe Gly Glu Ala Phe Ala Lys Ala Gln Ile Ala Ala 180 185 190 Gly Thr Tyr Leu Pro Thr Glu Gly Thr Val Phe Ile Ser Val Asn Asp 195 200 205 Arg Asp Lys Gly Asn Val Ile Gln Leu Ala Gln Arg Phe Ser Glu Leu 210 215 220 Gly Phe Gly Ile Val Asp Thr His Gly Thr Gly 225 230 235 60 1269 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 60 taacaggaag aagcttgctt ctttgctgac gagtggcgga cgggtgagta acacgtggga 60 acctgcctta tggttcggga taacgtctgg aaacggacgc taacaccgga tgtgcccttc 120 gggggaaagt ttacgccatg agaggggccc gcgtccgatt aggtagttgg tggggtaatg 180 gcccaccaag ccgacgatcg gtagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctgggactga 240 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggggcaacc 300 ctgatccagc aatgccgcgt gagtgatgaa ggcctaggg ttgtaaagct ctttcgcacg 360 cgacgatgat gacggtagcg tgagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca gcagccgcgg 420 taatacgaag ggggcgagcg ttgttcggaa ttactgggcg taaagggcgc gtaggcggcc 480 cgatcagtca gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttga tactgtcggg 540 cttgagttcc ggagaggatg gtggaattcc cagtgtagag gtgaaattcg tagatattgg 600 gaagaacacc ggtggcgaag gcggccatct ggacggacac tgacgctgag gcgcgaaagc 660 gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctaga 720 cgctggggtg catgcacttc ggtgtcgccg ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt 780 acggccgcaa ggttaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 840 tggtttaatt cgaagcaacg cgcagaacct taccaaccct tgacatgtcc attgccggtc 900 cgagagattg gaccttcagt tcggctggat ggaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 960 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctac cgccagttgc 1020 catcattcag ttgggcactc tggtggaact gccggtgaca agccggagga aggcggggat 1080 gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggtt gggctacaca cgtgctacaa tagcggtgac 1140 agtgggacgc gaagtcgcaa gatggagcaa atccccaaaa gccgtctcag ttcggattgc 1200 actctgcaac tcgggtgcat gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg 1260 gtgaatacg 1269 61 1500 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 61 ttttaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggccctct 60 agatgcatgc tcgagcggcc gccagtgtga tggatatctg cagaattcgc ccttcaggcc 120 taacacatgc aagtcgaacg agggcttcgg ccctagtggc gcacgggtga gtaacacgtg 180 ggaacctgcc ttatggttcg ggataacgc tggaaacgga cgctaacacc ggatgtgccc 240 ttcgggggaa agtttacgcc argagagggg cccgcgtccg attaggtagt tggtggggta 300 atggcccacc aagccgacga tcggtagctg gtctgagagg atgatcagcc acactgggac 360 tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggggca 420 accctgatcc agcaatgccg cgtgagtgat gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcgc 480 acgcgacgat gatgacggta gcgtgagaag aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg 540 cggtaatacg aagggggcga gcgttgttcg gaattactgg gcgtaaaggg cgcgtaggcg 600 gcccgatcag tcagatgtga aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatt tgatactgtc 660 gggcttgagt tccggagagg atggtggaat tcccagtgta gaggtgaaat tcgtagatat 720 tgggaagaac accggtggcg aaggcggcca tctggacgga cactgacgct gaggcgcgaa 780 agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgct 840 agacgctggg gtgcatgcac ttcggtgtcg ccgctaacgc attaagcatt ccgcctgggg 900 agtacggccg caaggttaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 960 atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa ccttaccaac ccttgacatg tccattgccg 1020 gtccgagaga ttggaccttc agttcggctg gatggaacac aggtgctgca tggctgtcgt 1080 cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc taccgccagt 1140 tgccatcatt cagttgggca ctctggtgga actgccggtg acaagccgga ggaaggcggg 1200 gatgacgtca agtcctcatg gcccttagg gttgggctac acacgtgcta caatggcggt 1260 gacagtggga cgcgaagtcg caagatggag caaatcccca aaagccgtct cagttcggat 1320 tgcactctgc aactcgggtg catgaagtg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc 1380 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccaag ggcgaattcc agcacactgg 1440 cggccgttac tagtggatcc gagctcggta ccaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 1500 62 1366 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 62 acgacggcca gtgaattgta atacgactca ctatagggcg aattgggccc tctagatgca 60 tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt cgcccttcag gcctaacaca 120 tgcaagtcga acgaaggctt cggccttagt ggcgcacggg tgagtaacac gtgggaacct 180 gcctttcggt tcggaataac gtctggaaac ggacgctaac accggatacg cccttcgggg 240 gaaagttcac gccgagagag gggcccgcgc cggattaggt agttggtgag gtaatggctc 300 accaagcctt cgatccgtag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 360 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 420 tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt cgcacgcgac 480 gatgatgacg gtagcgtgag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 540 acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggcctgct 600 tagtcagaag tgaaagcccc gggctcaacc tgggaatagc ttttgatact ggcaggcttg 660 agttccggag aggatggtgg aattcccag gtagaggtga aattcgtaga tattgggaag 720 aacaccggtg gcgaaggcgg ccatctggac ggacactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg 780 ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt: ccacgccgta aacgatgaat gctagacgtc 840 ggggtgcatg cacttcggtg tcgccgctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg 900 ccgcaaggtt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 960 ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc aacccttgac atgtccatta tgggcttcag 1020 agatgaggtc cttcagttcg gctgggtgga acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1080 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctaccgt cagttgccat 1140 cattcagttg ggcactctgg tggaaccgcc ggtgacaagc cggaggaagg cggggatgac 1200 gtcaagtcct catggccctt atgggttggg ctacacacgt gctacaatgg cggtgacagt 1260 gggaagcgaa gtcgcgagat ggagcaaatc cccaaaagcc gtctcagttc ggatcgcact 1320 ctgcaactcg agtgcgtgaa gttggaatcg ctagtaatcg cggatc 1366 63 1360 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 63 acagctatga ccatgattac gccaagcttg gtaccgagct cggatccact agtaacggcc 60 gccagtgtgc tggaattcgc ccttcaggcc taacacatgc aagtcgaacg ccccgcaagg 120 ggagtggcag acgggtgagt aacgcgtggg aacataccct ttcctgcgga atagctccgg 180 gaaactggaa ttaataccgc atacgcccta cgggggaaag atttatcggg gaaggattgg 240 cccgcgttgg attagctagt tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tccatagctg 300 gtctgagagg atgatcagcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc 360 agcagtgggg aatattggac aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgagtgat 420 gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcac cggagaagat aatgacggta tccggagaag 480 aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta gtgttgttcg 540 gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg gatatttaag tcaggggtga aatcccagag 600 ctcaactctg gaactgcctt tgatactggg tatcttgagt atggaagagg taagtggaat 660 tccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tcggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720 actggtccat tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgtt agccgtcggg cagtatactg ttcggtggcg 840 cagctaacgc attaaacatt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa 960 ccttaccagc tcttgacatt cggggtttgg gcagtggaga cattgtcct cagttaggct 1020 ggccccagaa caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgcg tcgtgagag ttgggttaag 1080 tcccgcaacg agcgcaaccc tcgcccttag ttgccagcat ttagttgggc actctaaggg 1140 gactgccggt gataagccga gaggaaggtg gggacgacgt caagtcctca tggcccttac 1200 gggctgggct acacacgtgc tacaatggtg gtgacagtgg gcagcgagac agcgatgtcg 1260 agctaatctc caaaagccat ctcagttcgg attgcactct gcaaccgag tgcatgaagt 1320 tggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg tgcggtgaat 1360 64 1288 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 64 tccaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttggt accgagctcg gatccactag 60 taacggccgc cagtgtgctg gaattcgccc ttcaggccta acacaLgcaa gtcgagcgcc 120 ccgcaagggg agcggcagac gggtgagtaa cgcgtgggaa tctacccatc cctacggaac 180 aactccggga aactggagct aataccgtat acgccctttg ggggaaagat ttatcgggga 240 tggatgagcc cgcgttggat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc 300 catagctggt ctgagaggat gatcagccac attgggactg agacacggcc caaactccta 360 cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccatgcccgc 420 gtgagtgatg aaggtcttag gattgtaaag ctctttcacc ggagaagata atgacggtat 480 ccggagaaga agccccggct aactttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta 540 gcgttgttcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcç gatatttaag tcaggggtga 600 aatcccagag ctcaactctg gaactgcctt tgatactggg tatcttgagt atggaagagg 660 taagtggaat tgcgagtgta gaggtgaaat tcgtagata tcgcaggaac accagtggcg 720 aaggcggctt actggtccat tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgtt agccgtcggc aagtttactt 840 gtcggtggcg cagctaacgc attaaacatt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960 acgcgcagaa ccttaccagc ccttgacatg cccggacagc tacagagatg tagtgttccc 1020 ttcggggacc gggacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc ccttagttgc cagcattcag ttgggcactc 1140 taaggggact gccggtgata agccgagagg aagtgggga-- gacgtcaagt cctnatggcc 1200 cttacgggct gggctacaca cgtgctacaa tgggtggtga cagtgggcag cgaaggaacg 1260 atcccgagct aatctccaaa agccatct 1288 65 1386 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 65 cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggccct ctagatgcat 60 gctcgagcgg ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc gcccttcagg cctaacacat 120 gcaagtcgag cgggcgtagc aatacgtcag cggcagacgg gtgagtaacg cgtgggaaca 180 taccttttgg ttcggaacaa cacagggaaa cttgtgctaa taccggataa gcccttacgg 240 ggaaagattt atcgccgaaa gattggcccg cgtctgata gctagttggt agggtaatgg 300 cctaccaagg cgacgatcag tagctggtct gagaggatga tcagccacat tgggactgag 360 acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgcaagcc 420 tgatccagcc atgccgcgtg agtgatgaag gccctaggg,: tgtaaagctc ttttgtgcgg 480 gaagataatg acggtaccgc aagaataagc cccggctaac ttcgtgccag càgccgcggt 540 aatacgaagg gggctagcgt tgctcggaat cactgggcg-: aaagggtgcg taggcgggtc 600 tttaagtcag gggtgaaatc ctggagctca actccagaac tgcctttgat actgaagatc 660 ttgagttcgg gagaggtgag tggaactgcg agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgc 720 aagaacacca gtgggcgaag gcggctcact ggcccgatac tgacgctgag gcacgaaagc 780 gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgccagc 840 cgttagtggg tttactcact agtggcgcag ctaacgctt aagcattccg cctggggagt 900 acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 960 tggtttaatt cgacgcaacg cgcagaacct taccagccc tgacatgtcc aggaccggtc 1020 gcagagatgt gaccttctct tcggagcctg gagcacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc 1080 tcgtgtcg=g agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccccgtc cttagttgct 1140 accatttagt tgagcactct aaggagactg ccggtgataa gccgcgagga aggtggggat 1200 gacgtcaagt cctcatggcc cttacgggct gggctacaca cgtgctacaa tggcggtgac 1260 aatgggacgc taaggggcaa cccttcgcaa atctcaaaaa gcccgtctca gttcggattg 1320 ggctctgcaa ctcgagccca tgaagttgga atcgctagta atcgtggatc agcacgccac 1380 ggtgaa 1386 66 1223 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 66 agcggcagag ggtgagtaac gcgtgggaat ctacccatct ctacggaaca actccgggaa 60 actggagcta ataccgtata cgtccttcgg gagaaagatt tatcggagat ggatgagccc 120 gcgttggatt agctagttgg tggggtaatg gcctaccaag gcgacgatcc atagctggtc 180 tgagaggatg atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 240 agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ccgatccagc catgccgcgt gagtgatgaa 300 ggccctaggg ttgtaaagct ctttcaacgg tgaggataat gacggtaacc gtagaagaag 360 ccccggctaa cttcgrgcca gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg ttgttcggaa 420 ttactgggcg taaagcgcac gtaggcggac tattaagtca ggggtgaaat cccggggctc 480 aaccccggaa ctgcctttga tactggtagt ctcgagtccg gaagaggtga gtggaattcc 540 gagtgtagag gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag gcggctcact 600 ggtccggtac tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 660 tagtccacgc cgtaaacgat ggaagctagc cgttggcaag tttacttgtc ggtggcgcag 720 ctaacgcatt aagcttcccg cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt 780 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgcagaacct 840 taccagccct tgacatcccg gtcgcggtta ccagagatgg tatccttcag ttcggctgga 900 ccggtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 960 cgcaacgagc gcaaccctcg cccttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggggac 1020 tgccggtgat aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg 1080 ctgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagaccgc gaggtcgagc 1140 taatctccaa aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg 1200 aatcgctagt aatcgcggat cag 1223 67 1237 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 67 cccgcagggg agtggcagag ggtgagtaac gcgtgggaat ctaccctttt ctacggaaca 60 actgagggaa acttcagcta ataccgtata cggccgagag gcgaaagatt tatcggagaa 120 ggatgagccc gcgttggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatcc 180 atagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 240 gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt 300 gagtgatgaa ggccctaggg ttgtaaagct ctttcaccgg tgaagataat gacggtaacc 360 ggagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg 420 ttgttcggat ttactgggcg taaagcgcac gtaggcggac tattaagtca ggggtgaaat 480 cccggggctc aaccccggaa ctgcctttga tactggtagt cttgagttcg aaagaggtga 540 gtggaattcc gagtgtagag gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag 600 gcggctcact ggctcgatac tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 660 gataccctgg tagtccacgc cgtaaactat gagagctagg cgtcgggcag tatactgttc 720 ggtggcgcag ctaacgcatt aagctcttcg cccggggagt acggtcgcaa gattaaaact 780 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 840 cgcagaacct taccagccct tgacatcccg atcgcggtta ccagagatgg tatccttcag 900 ttaggctgga tcggtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 960 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg cccttagttg ccatcattca gttgggcact 1020 ctaaggggac tgccggtgat aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg 1080 cccttacggg ctgggctaca cacgtgctac aatggtggcg acagtgggca gcgagaccgc 1140 gaggtcgagc taatctccaa aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc 1200 atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatg 1237 68 1346 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 68 acgacgggcc agtgaattgt aatacgactc actatagggc gaattgggcc ctctagatgc 60 atgctcgagc ggccgccagt gtgatggata tccgcagaat tcgcccttca ggcctaacac 120 atgcaagtcg aacggatccc ttcggattag tggcggacgg gtgagtaaca cgcgggaacg 180 tgccctttgg ttcggaacaa ctcagggaaa cttgagctaa taccggataa gcctttcgag 240 ggaaagattt atcgccattg gagcggcccg cgtaggatta gctagttggt gaggtaaaag 300 ctcaccaagg cgacgatccc tagctggtct gagaggatga tcagccacat tgggactgag 360 acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtggggaatc ttgcgcaatg ggcgaaagcc 420 tgacgcagcc atgccgcgtg aatgatgaag gtcttaggat tgtaaaattc tttcaccggg 480 gacgataatg acggtacccg gagaagaagc cccggctaac ttcgtgccag cagccgcggt 540 aatacgaagg gggctagcgt tgctcggaat tactgggcgt aaagggagcg taggcggata 600 gtttagtcag aggtgaaagc ccagggctca accttggaat tgcctttgat actggctatc 660 ttgagtacgg aagaggtatg tggaactccg agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg 720 aagaacacca gtggcgaagg cgacatactg gtccgttact gacgctgagg ctcgaaagcg 780 tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg agtgctagtt 840 gtcggcatgc atgcatgtcg gtggcgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900 cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960 ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accacctttt gacatgcccg gaccgctcca 1020 gagatggagc tttcccttcg gggactggga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgctatt agttgccatc 1140 aggtttggct gggcactcta ataggaccgc cggtggtaag ccggaggaag gtggggatga 1200 cgtcaagtcc tcatggccct tacaaggtgg gctacacacg tgctacaatg gcgactacag 1260 agggctgcaa tcccgcgagg gggagccaat ccctaaaagt cgtctcagtt cggattgcac 1320 tctgcaactc gagtgcatga agttgg 1346 69 1500 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 69 acagctatga ccatgattac gccaagcttg gtaccgagct cggatccact agtaacggcc 60 gccagtgtgc tggaattcgc ccttcaggcc taacacatgc aagtcgaacg ccgtagcaat 120 acggagtggc agacgggtga gtaacacgtg ggaacgtgcc ctttggttcg gaacaacaca 180 gggaaacttg tgctaatacc gaataagccc ttacggggaa agattatcg ccaaaggatc 240 ggcccgcgtc tgattagcta gttggtgggg taacggccca ccaaggctac gatcagtagc 300 tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 360 gcagcagtta ggaatcttgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg 420 atgaaggcct tagggttgta aagctctttc agcggggaag ataatgacgg tacccgcaga 480 agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggraata cgaagggggc tagcgttgct 540 cggaatcact gggcgtaaag cgcacgtagg cggatcttta agtcaggggt gaaatcctgg 600 agctcaactc cagaactgcc tttgatactg gggatctcga gtccggaaga ggtgagtgga 660 actccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720 tcactggtcc ggtactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccgtaa acgatggatg ctagccgttg gcgggtttac tcgtcagtgg 840 cgcagctaac gcattaagca tcccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt caattcgaag caacgcgcag 960 aaccttacca gcccttgaca tgtcccgtat ggacttcaga gatgaggtcc ttcagttcgg 1020 ctggcgggaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080 agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt agttgccatc atttagttgg gcactctaag 1140 gggactgccg gtgataagcc gcgaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt 1200 acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg cggtgacagt gggacgcaat ggagcaatcc 1260 tgcgcaaatc tcaaaaagcc gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa 1320 gtcggaatcg ctagtaatcg cagatcagca cgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc caagggcgaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg 1440 catctagagg gcccaattcg ccctatagtg agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt 1500 70 1113 ADN Organimè Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 70 gagctaatac cgtataatga cttcggtcca aagatttatc gcctgaggat gagcccgcgt 60 cggattagct agttggtagg gtaaaagcct accaaggcga cgatccgtag ctggtctgag 120 aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 180 gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc 240 ttagggttgt aaagctcttt tacccgggaa gataatgact gtaccgggag aataagcccc 300 ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggaggggg ctagcgttgt tcggaattac 360 tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggctttgt aagttagagg tgaaagcccg gggctcaact 420 ccggaattgc ctttaagact gcatcgctcg aattgtggag aggtaagtgg aattccgagt 480 gtagaggtga aattcgtaga tattcggaag aacaccagtg gcgaaggcga cttactggac 540 acatattgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 600 ccacgccgta aacgatgatg actagctgtc ggggcgctta gcgtttcggt ggcgcagcta 660 acgcgttaag tcatccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaactcaaa gaaattgacg 720 ggggcctgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc 780 agcgtttgac atgccaggac ggtttccaga gatggattcc ttcccttacg ggacctggac 840 acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 900 gagcgcaacc ctcgtcttta gttgctacca tttagttgag cactctagag aaactgccgg 960 tgataagccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca tggcccttac gcgctgggct 1020 acacacgtgc tacaatggcg gtgacaacgg gcagcaaact cgcgagagtg agcaaatccc 1080 gaaaagccgt ctcagttcgg attgttctct gca 1113 71 1225 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 71 ggagcggcgg acgggtgagt aacgcgtggg aacgtgccct ttggtacgga acaactgagg 60 gaaacttcag ctaataccgt atgtgccctt cgggggaaag atttatcgcc attggagcgg 120 cccgcgttgg attaggtagt tggtggggta aaggcctacc aagcctacga tccatagctg 180 gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 240 agcagtaggg aatcttgcgc aatgggcgaa agcctgacgc agccatgccg cgtgtatgat 300 gaaggtctta ggattgtaaa atactttcac cggggaagat aatgacggta cccggagaag 360 aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta gcgttgctcg 420 gaattactgg gcgtaaaggg cgcgtaggcg gatatttaag tcgggggtga aagcccaggg 480 ctcaaccctg gaattgcctt cgatactgga tatcttgagt tcgggagagg tgagtggaat 540 gccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tcggcggaac accagtggcg aaggcgactc 600 actggcccga tactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 660 tggtagtcca cgctgtaaac gatgagtgct agttgtcggc atgcatgcat gtcggtgacg 720 cagctaacgc attaagcactccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagga 780 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa 840 ccttaccacc ttttgacatg ccctgatcgc tggagagatc cagttttccc ttcggggaca 900 gggacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 960 gcaacgagcg caaccctcgc cattagttgc catcattaag ttgggcactc taatgggacc 1020 gccggtggta agccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttacggggt 1080 gggctacaca cgtgctacaa tggcgactac agagggttgc aaacctgcga aggggagcta 1140 atccctaaaa gtcgtctcag ttcggattgc actctgcaac tcgagtgcat gaagtcggaa 1200 tcgctagtaa tcgcggatca gcatg 1225 72 1286 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 72 atgattagta gcaatactaa tcgatgacga gcggcggacg ggtgagtaat acgtaggaac 60 ctgcccttaa gcgggggata actaagggaa actttagcta ataccgcata aactcgagag 120 agaaaagctg cagcaatgtg gcacttgagg aggggcctgc gtcagattag ctagttggtg 180 aggtaatagc tcaccaaggc gatgatctgt aactggtctg agaggacgac cagtcacact 240 gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300 gggcaaccct gatccagcga tgccgcgtgg gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagccct 360 ttaggtcggg aagaaggtta gtagaggaaa tgctattaac ttgacggtac cgacagaata 420 agcaccggca aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag agggtgcgag cgttaatcgg 480 atttactggg cgtaaagggc gcgtaggcgg tgagatgtgt gtgatgtgaa agccccaggc 540 tcaacctggg aagtgcatcg caaactgtct gactggagta tatgagaggg tggcggaatt 600 tccggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc ggaaggaacg tcgatggcga aggcagccac 660 ctggcataat actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggat cgaacaggat tagataccct 720 ggtagtccac gctgtaaact atgagtacta gatgttggta ggggaaccta tcggtatcga 780 agctaacgcg ataagtattc cgcctgggaa gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaatgaa 840 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac 900 cttacctacc cttgacatcc tgagaatctg gcttagtagc tggagtgccg aaaggagctc 960 agagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020 taacgagcgc aacccttgcc cttagttgcc atcatttagt tggggactct aaggggaccg 1080 ccagtgatga actggaggaa ggcggggacg acgtcaagtc atcatggcct ttatgggtag 1140 ggccacacac gtgctacaat ggggcgtacg gagggtcgca aacccgcgag ggggagctaa 1200 tctcataaag cgtctcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagttggaa 1260 tcgctagtaa tcgcgaatca gcattg 1286 73 1288 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : :Organisme du sol 73 cggggcaacc ctggcggcga gcggcgaacg ggtgagtaat gcatcggaac gtgtcctctt 60 gtgggggata accagtcgaa agactggcta ataccgcatg agatcgaaag atgaaagcag 120 gggaccgcaa ggccttgcgc gagaggagca gccgatgccg gattagctag ttggtggggt 180 aaaagcctac caaggcgacg atccgtagct ggtctgagag gacgaccagc cacactggga 240 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga cagtgggggc 300 aaccctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcactttcg 360 gacggaacga aatcgcgcga gttaatagtt cgcgtggatg acggtaccgt aagaagaagc 420 accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt taatcggaat 480 tactgggcgt aaagtgtgcg caggcggctt cgcaagtcga gtgtgaaatc cccgagctta 540 acttgggaat tgcgctcgaa actacggagc cggagtgtgg cagaggaagg tggaattcca 600 cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacaccg atggcgaagg cggccttctg 660 ggccaacact gacgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 720 agtccacgcc ctaaacgatg atgactagtt gttggaggag ttaaatcctt tagtaacgca 780 gctaacgcgt gaagtcatcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat 840 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggatgat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaaaaacc 900 ttacctaccc ttgacatgct aggaacgctg cagaaatgta gcggtgcccg aaagggaacc 960 tagacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgrgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020 gcaacgagcg caacccctgc cattagttgc tacattcagt tgagcactct aatgggactg 1080 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttatgggtag 1140 ggctacacac gtcatacaat ggcgcgtaca gagggttgcc aacccgcgag ggggagccaa 1200 tcccagaaag cgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccca tgaagtcgga 1260 atcgctagta atcgcggatc agcatgtc 1288 74 600 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 74 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 60 agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggcttaac cgtggagggt 120 cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccaag tgtagcggtg 180 aaatgcgtag agatttggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgcaactga 240 cgctgaggcg cgaaagcatg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 300 aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 360 agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc 420 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 480 gacatcccga tgancgctct agagatagag ttttcccttc ggggacattg gtgacaggtg 540 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 600 75 601 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence Organisée du sol 75 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 60 agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggcttaac cgtggagggt 120 cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccaag tgtagcggtg 180 aaatgcgtag agatttggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgcaactga 240 cgctgaggcg cgaaagcatg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 300 aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgagct aacgcattaa 360 gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg 420 cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 480 acatcccgat gacgctctag agatagagtt ttcccttcgg ggacattggt gacaggtggt 540 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcacc 600 c " 601 76 1236 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 76 tgccctgtag acggggataa cttcgggaaa ccggagctaa taccggataa tcctcttccc 60 cacatgggga agagttgaaa ggcgctttcg cgtcactaca ggatgggccc gcggtgcatt 120 agctagttgg tagggtaacg gcctaccaag gcgacgatgc atagccgacc tgagagggtg 180 atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 240 cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga 300 tcgtaaaact ctgttgtaag ggaagaacca gtacgtcagg caatggacgt accttgacgg 360 taccttatta gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 420 aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg tggtttctta agtctgatgt 480 gaaagcccac ggcttaaccg tggagggtca ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga 540 ggaaagtgga attccaagtg tagcggcgaa atgcgtagag atttggagga acaccagtgg 600 cgaaggcgac tttctggtct gcaactgacg ctgaggcgcg aaagcatggg gagcaaacag 660 gattagatac cctggtagtc catgctgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc 720 gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt 780 tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 840 agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcccgatg atcgctctgg agatagagtt 900 ttcccttcgg ggacattggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 960 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttaatctt agttgccatc atttagttgg 1020 gcactctaag gtgactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1080 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag agtcgctaac 1140 tcgcgagagt atgctaatct catagaaccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1200 cctacatgaa gccggaatcg ctagtaatcg cggatc 1236 77 815 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 77 caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc gcgtctgctg 60 tgaaaactcg aggctcaacc tcgggcttgc agtgggtacg ggcagactag agtgcggtag 120 gggtgactgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcaggagg aacaccgatg 180 gcgaaggcag gtcactgggc cgcaactgac gctgaggagc gaaagcatgg ggagcgaaca 240 ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgttgggc actaggtgtg gggctcattc 300 cacgagttcc gtgccgcagc aaacgcatta agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag 360 gcttaaaact caaagaaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg cggattaatt 420 cgatgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac cggaaacttc cagagatggt 480 tgccccgcaa ggtcggtgta caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgaagat 540 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgtcctat gttgccagca cgtgatggtg 600 gggactcata ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 660 catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa gggctgcgat 720 accgcaaggt ggagcgaatc ccaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc 780 gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcaga 815 78 826 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 78 tcgtaggtgg cttgtcacgt cgggtgtgaa agcttggggc ttaactccag gtctgcattc 60 gatacgggct ggctagaggt aggtagggga gaacggaatt cctggtgtag cggtgaaatg 120 cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcggttct ctgggcctta cctgacgctg 180 aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg 240 ttgggcgcta ggtgtgggga ccttccacgg tttccgcgcc gtagctaacg cattaagcgc 300 cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 360 agcggcggag catgttgctt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat 420 cgcccggaaa gcttcagaga tggagccctc ttcggactgg gtgacaggtg gtgcatggct 480 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc 540 aatgttgcca gcaacatcct tcggggtggt tggggactca ttggagactg ccggggtcaa 600 ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcaaac 660 atgctacaat ggccggtaca gagggttgcg ataccgcaag gtggagcgaa tccctaaaag 720 ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa 780 tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtac 826 79 799 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 79 cgtaggcggt ttgtcgcgtc tgccgtgaaa gtccggggct caactccgga tctgcggtgg 60 gtacgggcag actagagtga tgtaggggag actggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc 120 gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa ggcaggtctc tgggcattaa ctgacgctga 180 ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt 240 tgggcactag gtgtggggga cattccacgt tttccgcgcc gtagctaacg cattaagtgc 300 cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 360 agcggcggag catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat 420 gaaccggaaa cacctggaaa caggtgcccc gcttgcggtc ggtttacagg tggtgcatgg 480 ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgt 540 tctatgttgc cagcgcgtta tggcggggac tcataggaga ctgccggggt caactcggag 600 gaaggtgggg acgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc ttgggcttca cgcatgctac 660 aatggccggt acaaagggtt gcgatactgt gaggtggagc taatcccaaa aagccggtct 720 cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga 780 tcagcaacgc tgcggtgaa 799 80 1250 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 80 tgccagcttg ctggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgagta acctgccctt 60 aactctggga taagcctggg aaactgggtc taatgccgga tatgactcct catcgcatgg 120 tggggggtgg aaagcttttt gtggttttgg atggactcgc ggcctatcag cttgttggtg 180 aggtaatggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact 240 gggactgaga cacggcccag acttctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 300 gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct 360 ttcagtaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg 420 ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagag 480 ctcgtaggcg gtttgtcgcg tctgccgtga aagtccgggg ctcaactccg gatctgcggt 540 gggtacgggc agactagagt gatgtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat 600 gcgcagatat caggaggaac accgatggcg aaggcaggtc tctgggcatt aactgacgct 660 gaggagcgaa agcatgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac 720 gttgggcact aggtgtgggg gacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt 780 gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 840 caagcggcgg agcatgcgga ttaattcga-- gcaacgcgag gaaccttacc aaggcttgac 900 atgaaccgga aatacctgga aacaggtgcc ccgcttgcgg tcggtttaca ggtggtgcat 960 ggttgccgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1020 gttctatgtt gccagcgcgt tatggcgggg actcatagga gactgccggg gtcaactcgg 1080 aggaaggtgg ggacgacgtc aaatcatcat gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct 1140 acaatggccg gtacaaaggg ttgcgatact gtgaggtgga gctaatccca aaaagccggt 1200 ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct 1250 81 1210 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence .-Organisme du sol 81 cgctaatacc ggatacggcg cgagagtctr cggactttcg cgagaaagat tcgcaaggat 60 cactgaggga cgagcctgcg gcccatcagc tagttggtga ggtaagagct caccaaggct 120 aagacgggta gctggtctga gaggatgatc agccacactg gaactgagac acggtccaga 180 ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcgcaatggg cgaaagcctg acgcagccac 240 gccgcgtgag cgatgagggc cttcgggtcg caaagctctg tggggagaga cgaataaggc 300 cggtgaagag tcggccttga cggtatctcc ttagcaagca ccggctaact ccgtgccagc 360 agccgcggta atacggaggg tgcaaacgtt gctcggaatc attgggcgta aagcgcacgt 420 aggcggcgtg ataagttggg tgtgaaagcc ctgggctcaa cccaggaagt gcattcaaaa 480 ctgtcacgct tgaatctcgg agggggtcag agaattcccg gtgtagaggt gaaattcgta 540 gatatcggga ggaataccag tggcgaaggc gctggcctgg acgaagattg acgctgaggt 600 gcgaaagcgc ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccgcgctg taaacgatga 660 gtgctagacg ggggaggtat tgaccccttc gctgccgaag ctaacgcgtt aagcactccg 720 cctggggagt acggtcgcaa gactaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 780 gtggagcatg tggtttaatt cgacgcaacg cgcaaaacct tacctgggtt aaatccgccg 840 gaacctggct gaaaggctgg ggtgccctcc ggggaatcgg tgagaaggtg ctgcatggct 900 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctatcg 960 tcagttgcca acattaaggt gggaactctg gcgagactgc cggtctaaac cggaggaagg 1020 tggggacgac gtcaagtcct catggccctt atgcccaggg ctacacacgt gctacaatgg 1080 ctggtacaat gagccgcaaa accgcgaggt caagctaatc tcaaaaaacc agtctcagtt 1140 cggatcggag tctgcaactc gactccgtga agctggaatc gctagtaatc gaagatcagc 1200 acgctttcgg 1210 82 1272 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : :Organisme du sol 82 gatgccagct tgctggtgga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtgag taacctgccc 60 ttaactctgg gataagcctg ggaaactggg tctaataccg gatatgactc ctcatcgcat 120 ggtggggggt ggaaagcttt ttgtggtttt ggatggactc gcggcctatc agcttgttgg 180 tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggtg accggccaca 240 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 300 gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 360 ctttcagtag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 420 tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag 480 agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgccgt gaaagtccgg ggctcaactc cggatctgcg 540 gtgggtacgg gcagactaga gtgatgtagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa 600 atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcagg tctctgggca ttaactgacg 660 ctgaggaacg aaagcatggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa 720 acgttgggca ctaggtgtgg gggacattcc acgttttccg cgccgtagct aacgcattaa 780 gtgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840 cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 900 acatgaaccg gaaatacctg gaaacaggtg ccccgcttgc ggtcggttta caggtggtgc 960 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1020 tcgttctatg ttgccagcgc gttatggcgg ggactcatag gagactgccg gggtcaactc 1080 ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc ttcacgcatg 1140 ctacaatggc cggtacaaag ggttgcgata ctgtgaggtg gagctgatcc caaaaagccg 1200 gtcccagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg 1260 cagatcagca ac 1272 83 1247 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 83 tgtttagtag caatactaaa tgatgacgag cggcggacgg gtgaggaaca cgtaggaacc 60 tgcccaagag agggggacaa ccaagggaaa ctttggctaa taccgcataa tctctacgga 120 gaaaagttgc ccgtaagggt ggcgcttttg gaggggcctg cgtccgatta gttagttggt 180 gaggtaatag ctcaccaaga ctgtgatcgg taactggtct gagaggacga ccagtcacac 240 tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatc ttggacaatg 300 ggggcaaccc tgatccagcg atgccgcgtg ggtgaagaag gccttcgggt tgtaaagccc 360 tttaggcggg gaagaaggat atgggatgaa taagcctgta ttttgacggt acccgcagaa 420 taagcaccgg caaactctgt gccagcagcc gcggtaatac agagggtgcg agcgttaatc 480 ggatttactg ggcgtaaagg gcgcgtaggc ggttgtgtga gtgtgatgtg aaagccccgg 540 gctcaacctg ggaagtgcat cgcaaacgac acaactggag tatatgagag ggtggcggaa 600 tttccggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tcggaaggaa cgtcgatggc gaaggcagcc 660 acctggcata atactggcgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720 ctggtagtca cgcccgtaaa cgatgagaac tagatgttgg agggggaacc cttcagtatc 780 gaagctaacg cgataagttc tccgcctggg aagtacagtc gcaagactga aactcaaaag 840 aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga 900 accttacctg cccttgacat cctgcgaatc ttgccgagag gtgagagtgc cgcagggagc 960 gcagagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgagatgttg ggttaagtcc 1020 cgtaacgagc gcaacccttg tccttagttg ccatcattta gttggggact ctaaggagac 1080 cgccggtgat gaaccggagg aaggcgggga cgacgtcaag tcatcatggc ctttatgggt 1140 agggctacac acgtgctaca atggggcgta cagagggtcg ccaacccgcg agggggagcc 1200 aatctcttaa agcgtctcgt agtccggart ggagtctgca actcgac 1247 84 1292 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 84 ggctcgcaag agcaaccggc gaacgggtgc gtaacacgtg aacaacctgc cctcgtgtgg 60 gggatagccg ggctaacgcc cgggtaatac cgcatacgtt ctctctgggg agtcctgggg 120 agaggaaagc tccggcgcac ggggaggggt tcgcggccta tcagctagtt ggcggggtaa 180 tggcccacca aggcgacgac gggtagctgg tctgagagga tggccagcca cattgggact 240 gagagacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atcttgcgca atggccgaaa 300 ggctgacgca gcgacgccgc gtgtgggagg acgcctttcg gggtgtaaac cactgttgcc 360 cgggacgaac agcctctttc gagaggtctg acggtaccgg gtgaggaagc accggctaac 420 tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcgagcgt tgtccggaat cattgggcgt 480 aaagggcgcg taggtggccc ggtcagttcg tggtgaaagc gcggggctca accctgcgtc 540 ggccatgaat actgccgcgg ctggagcact gtagaggcag gcggaattcc gggtgtagcg 600 gtggaatgcg tagagatccg gaagaacacc ggtggcgaag gcggcctgct gggcagtagc 660 tgacactgag gcgcgacagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720 cgtaaacgat gggcactagg cgcttggggg agcgaccccc cgagggccgg cgctaacgca 780 ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttacctagg 900 cttgacatac acgggaaacc ggtcagaaac ggccggccct cttcggagcc cgtgcacagg 960 tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1020 caacccctgt ctctagttgc cagcgcgtca tggcggggac tctagagaga ctgccggtgc 1080 caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg tccttacgtc tagggctaca 1140 cacgtgctac aatggcgggg acagagggtc gcgagccggc aacggcaagc caatcccgta 1200 aaccccgcct cagttcggat tgtcgtctgc aactcgacgg catgaagctg gaatcgctag 1260 taatcgtgga tcagctacgc cacggtgaat ac 1292 85 1300 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : :Organisme du sol 85 tcccttcggg agcaagtaca gcggcgaacg ggtgagtaac acgtaggtaa cctaccctgg 60 agactgggat aacctgccga aaggcgggct aataccagat aagaccacga gggctgcggc 120 ccttggggca aaaggtggcc tctacttgta agctaccact ccgggatggg cctgcgcgcc 180 attagctagt tggcggggta acggcccacc aaggcagaga tggctagctg gtctgagagg 240 atggccagcc acacagggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300 aatattgcgc aatgggcgaa agcctgacgc agcgacgccg cgtgggtgat gaaggccttc 360 gggtcgtaaa gccctgtcaa gagggacgaa accttgtcga cctaacacgt cggcaacctg 420 acggtacctc tgaaggaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 480 gtgcgagcgt tgttcggaat tactgggcgt aaagcgcgtg taggcggcct cttcagtctg 540 gtgtgaaagc ccggggctca accccggaag tgcattggat actgggaggc tggagtaccg 600 gagaggaggg tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgt agatatcagg aggaacacct 660 gtggcgaagg cggccctctg gacggatact gacgctgaga cgcgaaagcg tggggagcaa 720 acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg ggcactaggt gttcggggta 780 ttgaccccct gagtgccgca gctaacgcat taagtgcccc gcctggggaa tacggccgca 840 aggttaaaac tcaaaggaat gacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900 tcgacgcaac gcgaagaacc ttacctgggc tagacaacat cggacagcct cagaaatgag 960 gtctccccgc aaggggccgg tggttcaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctgtc tctagttgct accattcagt 1080 tgagcactct agagagactg cccngtgtta aacgggagga aggtggggac gacgtcaagt 1140 cctcatggcc cttatgtcca gggctacaca cgtgctacaa tgggcgatac aaagggctgc 1200 gaacccgcga ggggaagcca atcccaaaaa gtcgctctca gttcggattg gagtctgcaa 1260 ctcgactcca tgaaggcgga atcgctagta atcgcggatc 1300 86 1186 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 86 caatgggcag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggaatg tacctttcgg tgcggaacaa 60 ctcagggaaa cttgagctaa tgccgcatac gcccttacgg ggaaagattt atcgccgaaa 120 gatcagcccg cgttggatta gctagttggt gaggtaatgg cccaccaagg cgacgatcca 180 tagctggttt gagagaacga ccagcctcac tgggactgag acacggccca gactcctacg 240 ggaggcagca gttgggaatc ttggacaatg ggggaaaccc tgatccagcc atgccgcgtg 300 agtgatgaag gccttcgggt tgtaaaactc tttcgacggg gacgataatg acggtacccg 360 tagaagaagc tccggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gggctagcgt 420 tgttcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg caggcggcta tccaagtcag tggtgaaagc 480 ccggagctca actccggaat tgccattgaa actgtttagc ttgagtacga gagaggtgag 540 tggaataccc agtgtagagg tgaaattcgt agatattggg tagaacaccg gtggcgaagg 600 cggctcactg gctcgtaact gacgctcagg cacgacagcg tggggatcaa acaggattag 660 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg aacgctagcc gttggatagc ttgctattca 720 gtggcgcagc taacgcatta agcgttccgc ctggggagta cggccgcaag gttgagactc 780 agaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gacgcaacgc 840 gcagaacctt accagggttt gacatcctgt gctcgccggt gaaagccggt tttcccgcaa 900 gggacgcaga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 960 agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccttt agttgccatc attcagttgg gcactctaga 1020 gggaccgccg gcgacaagcc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcccc atggccctta 1080 caccctgggc tacacacgtg ctacaatggc ggtgacagtg ggcacgagct cgcgagagtc 1140 agctaatccc aaaaaaccgt cccagttcag attgcactct gcaact 1186 87 1454 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 87 cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggccct ctagatgcat 60 gctcgagcgg ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc gcccttcagg cctaacacat 120 gcaagtcgag cgagaaaggg cgcttcggcg cctgagtaca gcggcgcacg ggtgcgtaac 180 acgtgggcaa tctgtccttg agatggggat aacccagcga aagttgggct aataccgaat 240 aagactacag gaggcaactc ccgtggttaa agggtgctct ctgcggggag catgcgcttg 300 aggaggagcc cgcggcctat cagctagttg gtagggtcac ggcctaccaa ggcgaagacg 360 ggtagctggt ctgagaggat gaccagccac acggggactg agacacggcc ccgactccta 420 cgggaggcag cagtggggaa tattgggcaa tgggggaaac cctgacccag cgacgccgcg 480 tgggtgatga aggccttcgg gtcgtaaagc cctgtcgggc ggaacgaagg ttctcacggc 540 aaatagccgt gagaggtgac ggtaccgccg aaggaagcac cggccaactc cgtgccagca 600 gccgcggtaa gacggagggt gcaagcgttg ctcggaatca ctgggcgtaa agggtgcgta 660 ggcggtctcg caagtctggc gtgaaagccc aaggctcagc cttggaagtg cgctcgaaac 720 tgcgaggctg gagtgccgga ggggagagtg gaattcccgg tgtagcggtg aaatgcgtag 780 agatcgggag gaataccggt ggcgaaagcg actctctgga cggcaactga cgctgaggca 840 cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgga 900 cactaggtgt cgggggtatc cactccctcg gtgccgccgc taacgcagta agtgtcccgc 960 ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 1020 tggagcatgt ggttcaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatctggc 1080 gaatctctgg gaaaccagag agtgcccgca ggggagcgcc aagacaggtg ctgcatggct 1140 gtcgtcagct cgtgccgtga ggtgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttaccc 1200 ttagttgccc ccgggtcaag ccgtggcact ccaagggaac tgcccgtgtt aagcgggagg 1260 aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ctttatatcc agggctacac acgtgctaca 1320 atggctggga canagcgtgg ccaacgcgcg agcgggagct aatcgcaaaa ccccagcctc 1380 agttcggatc ggagtctgca actcgactcc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1440 cagcatgccg cggt 1454 88 1307 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 88 cccttcgggg agcgagtaca gcggcgaacg ggtgagtaac acgtaggtaa cctaccctgg 60 tgactgggat aacttgccga aaggcgggct aataccagat aagaccacga gggctgcggc 120 ctttggggta aaagatggcc tctgcttgca tgctatcacg ccgggatggg cctgcgcgcc 180 attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcagaga tggctagctg gtctgagagg 240 atggccagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300 aatattgcgc aatgggcgaa agcctgacgc agcgacgccg cgtgggtgat gaaggccttc 360 gggtcgtaaa gccctgtcaa gagggacgaa acctcgccga cccaatacgt cggcgacctg 420 acggtacctc tgaaggaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 480 gtgcaagcgt tgttcggaat cactgggcgt aaagcgcgtg taggcggcct tcttagtctg 540 gtgtgaaagc ccggggctca accccggaag agcattggat actggaaggc tggagtaccg 600 gagaggaggg tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgt agatatcagg aggaacaccg 660 gtggcgaagg cggccctctg gacggatact gacgctgaga cgcgacagcg tggggagcaa 720 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg ggtactaggt gttcggggta 780 ttgaccccct gagtgccgca gctaacgcat taagtacccc gcctggggac tacggccgca 840 aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900 tcgacgcaac gcgaagaacc ttacctgggc tagacaacac tggacagccc cagaaatggg 960 gtcttcccgc aagggactgg tggttcaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctgtc tctagttgct accattaagt 1080 tgagcactct agagagactg cccgtgttaa acgggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc 1140 ctcatggccc ttatgtccag ggctacacac gtgctacaat ggacagtaca aagggctgcg 1200 aacccgtgag ggggagccaa tcccaaaaag ctgttctcag ttcggattgg agtctgcaac 1260 tcgactccat gaaggcggaa tcgctagtaa tcgcggaca gcatgcc 1307 89 1305 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 89 gggagcaatc cccaagtaga gcggcgaacg ggtgagtaac gcgtgggtaa tctgcctccg 60 agtggggaac aacatcggga aactggtgct aataccgcat aacatcgttg ggtcttcgga 120 tctgacgatc aaagccgggg accgcaaggc ctggcgcttg gagaggagcc cgcgtccgat 180 tagctagttg gtggggtaat ggcccaccaa ggcttcgatc ggtagccggc ctgagagggc 240 ggacggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300 tttttcgcaa tgggcgaaag cctgacgaag caacgccgcg tggaggatga gggccttcgg 360 gtcgtaaact cctgtcgacc gggacgaaag taggatggcc taatacgccg atctattgac 420 tgtaccggtg gaggaagcca cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagaggtg 480 gcaagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agggcgcgta ggcggcttgg tcagtcccgt 540 gtgaaatccc tcggctcaac tgaggaactg cacgggaaac tgcctggctt gagttcggga 600 gagggaagtg gaattccggg tgtagcggtg aaatgcgtag atatccggag gaacaccggt 660 ggcgaaggcg gcttcctgga ccgacactga cgctgaggcg cgaaagctag gggagcaaac 720gggattagat accccggtag tcctagctgt aaacgatgag tgctgggtgt agggggtatc 780 aaccccccct gtgccgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag 840 gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggttcaattc 900 gacgcaacgc gaagaacctt accggggttt gaactgtacg ggacagctct agagatagag 960 tcttccttcg ggacccgtac agaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgcctcct gttgccatca ggtaaagctg 1080 ggcactctgg agagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct 1140 catggccttt atgccccggg ctacacacgt gctacaatgg ccggtacaaa gggtcgcaaa 1200 accgcgaggt ggagctaatc ccaaaaagcc ggtcccagtt cggattgcag tctgcaactc 1260 gactgcatga agttggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgcc 1305 90 1299 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 90 gggctttcgg gtcctgagta aagtggcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgacct 60 cgagtgtgga ataacctggc gaaagccggg ctaataccgc atgacgtctt cgggtcttcg 120 gacttgagga ccaaaggtgg cgagctttga gcgctgtcgc tcgagaaggg gcctgcgtcc 180 cattagctag ttggtgggg gatggcctac caaggcgacg atgggtagcc gggctgagag 240 gctgtccggc cacactggaa ccgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300 gaatcttgcg caatggggga aaccctgacg caacgacgcc gcgtgggcga tgaaggcctt 360 cgggtcgtaa agccctgtcg agcgggacga accgtgcgag ctctaacata gctcgtgcct 420 gacggtaccg ctagaggaag ccccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 480 ggggctagcg ttattcggaa ttattgggcg taaagggcgt gtaggcggct ctgtgtgtcc 540 catgtgaaag ccctcggctc aaccggggaa ctgcatggga aactgcggag cttgagtccg 600 ggagaggtga gtggaattcc cagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattgg gaggaacacc 660 agtggcgaag gcggctcac ggaccggtac tgacgctgag acgcgaaagc caggggagca 720 aacgggatta gataccccgg tagtcctggc tgtaaacgat gagcacttgg tgtggcgggt 780 atcgacccct gccgtgctga agctaacgca ttaagtgctc cgcctgggga gtacggccgc 840 aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggttcaa 900 ttcgacgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgaactgc aggtgacagc ccctgaaagg 960 gggtcttcct tcgggacacc tgtagaggtg ccgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctactc ctagttgcca gcggctcggc 1080 cgggaactct agggggaccg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140 ctcatggcct ttatgtccag ggctacacac gtgctacaac ggacggtaca aagggctgcg 1200 aaggcgcgag ccggagccaa tcccaaaaag ccgttctcca gtgcggattg cagtctgcaa 1260 ctcgactgca tgaaggtgga atcgctagta atcgcggat 1299 91 1296 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 91 atgtctggta gcaataccag atgatggcaa gtggcggacg ggtgagtaat acgtagggat 60 ctgcccagaa gagggggaca acccggggaa actcgggcta ataccgcata ctattctgag 120 gaagaaagct tggcgcaagc caggcgcttt tggaggaacc tacgtccgat tagctagttg 180 gtgaggtaaa ggctcaccaa ggcagagatc ggtagctggt ctgagaggat gaccagccac 240 actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 300 tgggggcaac cctgatccag cgatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc 360 actttagttg gggaagaagt aatgtttttt aaLagagagc attgttgacg gtacccaaag 420 aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa 480 tcggagttac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggtgttgc aagtgagatg tgaaatccct 540 gggcttaacc taggaaccgc attttagact gcaatgctag agtacagtag agggtagtgg 600 aatttccggt gtagcggtga aatgcgtaga gatcggaagg aacaccagtg gcgaaggcga 660 ctacctggac tgacactgac gctgaggcgc gagagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 720 ccctggtagt ccacgctgta aacgatgaga actagatgtt ggtgcgcgcg agcgcacaag 780 tatcgaagct aacgcgataa gttctccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 840 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg 900 aggaacctta cctacccttg acatccacag aatttgatag agatatcgaa gtgccgaaag 960 gaactgtgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgagat gttgggttaa 1020 gtcccgtaac gagcgcaacc cttatcctta gttgccaaca cgtaatggtg gggactctaa 1080 ggagactgcc ggtgaagaac cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catggccttt 1140 atgggtaggg ctacacacgt gctacaatgg ggcgtacaga gggttgccaa cctgcgaagg 1200 ggagccaatc ccggaaagcg cctcgtagtc cagattgaag tctgcaactc gacttcatga 1260 agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga acgtcc 1296 92 1250 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 92 gtctggtagc aataccagat gatggcaagt ggcggacggg tgagtaatac gtagggatct 60 gcccagaaga gggggacaac ccggggaaac tcgggctaat accgcatact attctgagga 120 aaaaagcttg gcgcaagcca ggcgcttttg gaggaaccta cgtccgatta gctagttggt 180 gaggtaaagg ctcaccaagg cagagatcgg tagctggtct gagaggatga ccagccacac 240 tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg 300 ggggcaaccc tgatccagcg atgccgcgtg tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac 360 tttagttggg gaagaagtaa tgttttttaa tagagagcat tgttgacggt acccaaagaa 420 taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac agagggtgca agcgttaatc 480 ggagttactg ggcgtaaagg gcgcgtaggc ggtgttgcaa gtgagatgtg aaatccctgg 540 gcttaaccta ggaaccgcat tttagactgc aatgctagag tacagtagag ggtagtggaa 600 tttccggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tcggaaggaa caccagtggc gaaggcgact 660 acctggactg acactgacgc tgaggcgcga gagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 720 ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgagaac tagatgttgg tgcgcgcgag cgcacaagta 780 tcgaagctaa cgcgataagt tctccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa 840 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 900 gaaccttacc tacccttgac atccacagaa tttgatagag atatcgaagt gccgaaagga 960 actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgagatgt tgggttaagt 1020 cccgtaacgg gcgcaaccct tatccttagt tgccaacacg taatggtggg gactctaagg 1080 agactgccgg tgaagaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcctttat 1140 gggtagggct acacacgtgc tacaatgggg cgtacagagg gttgccaacc tgcgaagggg 1200 agccaatccc ggaaagcgcc tcgtagtcca gattgaagtc tgcaactcga 1250 93 1545 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 93 ccaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttggta ccgagctcgg atccactagt 60 aacggccgcc agtgtgctgg aattcgccct tcaggcctaa cacatgcaag tcgaacggca 120 gcacagggga gcttgctccc tgggtggcga gtggcggacg ggtgaggaat acatcggaat 180 ctgcccagtc gtgggggata acctcgggaa accgggacta ataccgcata cgaccttagg 240 gtgaaagcgg aggaccgcaa ggcttcgcgc gattggatga gccgatgtcg gattagcttg 300 ttggcggggt aacggcccac caaggcgacg atccgtagct ggtctgagag gatgatcagc 360 cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 420 caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga agaaggcctt cgggttgtaa 480 agctcttttg tccggaaaga aaagctttcg gttaataccc ggaagtcctg acggtaccgg 540 aagaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gtgcaagcgt 600 tactcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg taggtggttt gttaagtctg atgtgaaagc 660 cctgggctca acctgggaat tgcactggat actggcaggc tagagtgcgg tagaggatgg 720 cggaattccc ggtgtagcag tgaaatgcgt agagatcggg aggaacatct gtggcgaagg 780 cggccatctg gaccagcact gacactgagg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag 840 ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg cgaactggat gttgggagca actaggctct 900 cagtatcgaa gctaacgcgt taagttcgcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 960 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat gtggtttaat tcgatgcaac 1020 gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatcca cggaacttac cagagatggt ttggtgcctt 1080 cggnaaccgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1140 taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca gcacgtaatg gtgggaactc 1200 taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc 1260 cttacggcca gggctacaca cgtactacaa tggtcggtac agagggttgc aaagccgcga 1320 ggtagagcca atcccagaaa accgatccca gtccggatcg aagtctgcaa ctcgacttcg 1380 tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agaatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1440 ttgtacacac cgcccaaggg cgaattctgc agatatccat cacactggcg gccgctcgag 1500 catgcatcta gagggcccaa ttcgccctat agtgagtcgt attac 1545 94 1549 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 94 ttttaaaccg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggccctct 60 agatgcatgc tcgagcggcc gccagtgtga tggatatctg cagaattcgc ccttcaggcc 120 taacacatgc aagtcgagcg gcagcgcggg gcaacctggc ggcgagcggc ggacgggtga 180 ggaatgcatc ggaatctacc ctgtcgtggg ggataacgta gggaaactta cgctaatacc 240 gcatacgacc gagaggtgaa agtgggggac cgcaaggcct cacgcgatag gatgagccga 300 tgccggatta gctagttggt gaggtaaagg ctcaccaagg cgacgatccg tagctggtct 360 gagaggatga tcagccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca 420 gtggggaata ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag 480 gccttcgggt tgtaaagcac ttttgttcgg gaagaaatcg tgcgggttaa tacccagtac 540 ggatgacggt accgaaagaa taagcaccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac 600 gaagggtgca agcgttactc ggaatcactg ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggttggttaa 660 gtctgctgtg aaagccctgg gctcaacctg ggaactgcag tggatactgg ccagctagag 720 tgtgatagag gatggtggaa ttcccggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tcgggaggaa 780 caccagtggc gaaggcggcc atctggatca acactgacgc tgaggcacga aagcgtgggg 840 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgcgaac tggacgttgg 900 gagcaacttg gctctcagtg tcgaagctaa cgcgctaagt tcgccgcctg gggagtacgg 960 tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agtatgtggt 1020 ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atccacggaa cttaccagag 1080 atggtttggt gccttcggaa ccgtgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1140 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtccttagtt gccagcacgt 1200 aatggtggga actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1260 aagtcatcat ggcccttacg gccagggcta cacacgtact acaatggtcg gtacaagagg 1320 gttgcaaagc ccgcgaggta gagccaatcc cagaaaaccc gatcccagtc ccggatcgaa 1380 gtctgcaact cgacttcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag aatgccgcgg 1440 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccaagggcg aattccagca cactggcggc 1500 cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttggcgta atcatggtc 1549 95 1276 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 95 ctggcggcga gcggcggacg ggtgaggaat acatcggaat ctacccagtc gtgggggata 60 acgtagggaa acttacgcta ataccgcata cgacctgagg gtgaaagcag gggatcgcaa 120 gaccttgcgc gattggatga gccgatgcc gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac 180 caaggcgacg atcggtagct ggtctgagag ggtgatcagc cacactggaa ctgagacacg 240 gtccagactc ctacgggagg cagcagggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc 300 cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg ttcgggaaga 360 aatcttccga gttaatacct cgggaggatg acggtaccgg aagaataagc accggctaac 420 ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gtgcaagcgt tactcggaat tactgggcgt 480 aaagcgtgcg taggtggttc gttaagctg ccgtgaaagc cccgggctca acctgggaat 540 tgcggtggat actggcggac tagagtgcgg tagagggtgg tggaattccc ggtgtagcag 600 tgaaatgcgt agagatcggg aggaacact gtggcgaagc ggccacctgg accagcactg 660 acactgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccc 720 taaacgatgc gaactggacg ttgggagcaa ctaggctctc agtgtcgaag ctaacgcgtt 780 aagttcgccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 840 cgcacaagcg gtggagtgtg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggcct 900 tgacatccac ggaatccttt agagatagag gagtgccttc gggaaccgtg agacaggtgc 960 tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcggag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020 cccttgtcct tagttgccag cgcgtaatgg cgggaactct aaggagactg ccggtgacaa 1080 accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacggccag ggctacacac 1140 gtactacaat ggtggggaca gagggtcgcg aagccgcgag gtggagccaa tcccagaaac 1200 cccatcctag tccggatcgg agtctgcaac tcgactccgt gaagtcggaa tcgctagtaa 1260 tcgcggtcag catgcc 1276 96 1306 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 96 cagggatcag tagagtggca aacggggag taacgcgtgg gcgacctacc ttcgagtggg 60 ggataacctt ccgaaaggag ggctaaacc gcatgacatc ccgtgtttgg atacacggac 120 atcaaagccg gggatcgcaa gacctggcgc ttggagaggg gcccgcgtcc gattagctag 180 ttggtgaggt cacggctcac caaggcccg atcggtatcc ggcctgagag ggcggacgga 240 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattgttcg 300 caatgggcgc aagcctgacg acgcaacgcc gcgtggagga tgaagacctt cgggtcgtaa 360 actcctttcg accgagatga agacccçccg gcctaatacg ccggcggatt gacagtatcg 420 agggaagaag ccccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacgggg ggggcaagcg 480 ttgttcggaa ttactgggcg taaagggttc gtaggtggct cgctaagtca gacgtgaaat 540 ccctcagctc aactggggaa ctgcgtctga gactggcaag cttgagtgca ggagaggaac 600 gcggaattcc aggtgtagcg gtgaaagcg tagatatctg gaggaacacc ggtggcgaag 660 gcggcgttct ggactgcaac tgacactgag gaacgaaagc taggggagca aacgggatta 720 gataccccgg tagtcctagc cctaaacgat gaatgcttgg tgtggcgggt atcgatccct 780 gccgtgccgc agttaacgcg ataagcatc cgcctgggga gtacggtcgc aaggctgaaa 840 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggttcaa ttcgacgcaa 900 cgcgaagaac cttacctagg ctcgaagtgc agatgaccat cggtgaaagc cgactttcgc 960 aagaacatct gtagaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtttc ctgttgccat caggttaagc tgggcactct 1080 ggagagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc agcatggcct 1140 ttatgtctag ggctacacac gtgctacaat ggccggtaca aagcgctgca aacccgcgag 1200 ggtgagccaa tcgcagaaag ccggtctcag ttcggatagc aggctgcaac tcgcctgctt 1260 gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaat 1306 97 1300 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 97 cccgcagggt gagtagatgg caaacgggtg agtaacacgt gggtgacctg cctcagagtg 60 ggggataacg acccgaaagg gtcgctaata ccgcataaca tcctgtcttt ggatagacgg 120 agatcaaagc cggggatcgc aagacctggc gcttagagag gggcccgcgg ccgattagct 180 agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatcggtat ccggcctgag agggcggacg 240 gacacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaattgtt 300 cgcaatgggc gcaagcctga cgacgcaacg ccgcgtggag gatgaagatc ttcgggtcgt 360 aaactccttt cgatcgggaa gaacgccrct ggtgtgaaca ccatcagagg gtgacggtac 420 cgagagaaga agccccggct aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag ggggggcaag 480 cgttgttcgg aattactggg cgtaaagggc tcgtaggcgg ccggctaagt ccgacgtgaa 540 atccccaggc ttaacctggg aactgcgtcg gatactggcg ggcttgaatc cgggagaggg 600 atgcggaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagatatc tggaggaaca ccggtggcga 660 aggcggcatc ctggaccggt attgacgctg aatagcgaaa gccaggggag caaacgggat 720 tagatacccc ggtagtcctg gccctaaacg atgaatgttt ggtgtggcgg gtatcgatcc 780 ctgccgtgcc gaagctaacg cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaaggctga 840 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttc aattcgacgc 900 aacgcgaaga accttaccca ggctcgaacg gcattggaca tccggcgaaa gccggctccc 960 gcaagggccg atgtcgaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020 ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc cgctgttgcc atcacgttat ggtgggcact 1080 ctgcggagac tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcagcatggc 1140 ctttatgtct ggggctacac acgtgctaca atggccggta caaaccgttg cgatctcgca 1200 agagtgagct aatcggagaa agccggtctc agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc 1260 atgaagttgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg 1300 98 1233 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 98 acggagcggc agacgggaga gtaacacgtg ggaacgtgcc ctttggttcg gaacaacaca 60 gggaaacttg tgctaatacc ggataagccc ttacggggaa agatttatcg ccaaaggatc 120 ggcccgcgtc tgattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatcagtagc 180 tggtctgaga ggatgatcag cctcactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 240 gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc cgcgtggatg 300 atgaaggccc tagggttgta aagtcctttc ggcggggaag ataatgacgg tacccgcaga 360 agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgct 420 cggaatcact gggcngtaaa gcgcacgtag gcggcttttt aagtcagggg tgaaatcctg 480 gagctcaact ccagaactgc ctttgatact gagaagcttg agtccgggag aggtgagtgg 540 aactgcgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcgcaag aacaccagtg gcgaaggcgg 600 ctcactggcc cggtactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 660 ccctggtagt ccacgctgta aacgatggat gctagccgtt gtcgggttta ctcgtcagtg 720 gcgcagctaa cgcattaagc atcccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 780 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt tcaattcgaa gcaacgcgca 840 gaaccttacc agcccttgac atgtcccgta tgagtaccag agatggaact cttcagttcg 900 gctggcggga acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 960 aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccat catttagttg ggcactctaa 1020 ggggactgcc ggtgataagc cgcgaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct 1080 tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gcggtgacag tgggatgcag aggggtaacc 1140 ccgagcaaat ctcaaaaagc cgtctcagtt cggattgtgc tctgcaactc gagcacatga 1200 agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc acg 1233 99 1304 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 99 cgaaatcccg cagggatcag tagagtggca aacgggtgag taacacgtgg gtgacctgcc 60 ttcgagtggg ggataacgtc ccgaaaggga cgctaatacc gcatgacatc ctgctcttga 120 acgagtggag atcaaagctg gggatcgcaa gacctagcgc tcaaagaggg gcccgcgcct 180 gattagctag ttggtggggt aacggctcac caaggcgacg atcagtatcc ggcctgagag 240 ggcggacgga cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300 gaattgttcg caatgggcgc aagcctgacg acgcaacgcc gcgtggagga tgaagatctt 360 cgggtcgtaa actcctttcg atcgagacga acggcctccg ggtgaacaat ccggaggagt 420 gacggtaccg agagaagaag ccccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacgggg 480 ggggcaagcg ttgttcggaa ttactgggcg taaagggctc gtaggcggcc aactaagtca 540 gacgtgaaat ccctcggctt aaccggggaa ctgcgtctga tactggatgg ctagaggttg 600 ggagagggat gcggaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagatatctg gaggaacacc 660 ggtggcgaag gcggcatcct ggaccaattc tgacgctgag gagcgaaagc caggggagca 720 aacgggatta gataccccgg tagtcctggc cctaaacgat gaatgcttgg tgtggcgggt 780 atcgatccct gccgtgccga agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc 840 aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggttcaa 900 ttcgacgcaa cgcgaagaac cttacccagg cttgaacagc gagtgaccac tcctgaaaag 960 gagcttccgc aaggacactc gtagaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtttg ctgttgccat cacgttatgg 1080 tgggcactct gcaaagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140 agcatggcct ttatgtctgg ggctacacac gtgctacaat ggccggtaca aaccgtcgca 1200 aaaccgtaag gtcgagctaa tcggagaaag ccggtctcag ttcggatcgt cggctgcaac 1260 tcgccggcgt gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcac 1304 100 1197 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 100 tctagtggcg cacgggtgcg taacgcgtgg gaatctgccc ttgggttcgg gataacagtt 60 ggaaacgact gctaataccg gatgatgtct tcggaccaaa gatttatcgc ccagggatga 120 gcccgcgtcg gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg atccgtagct 180 ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 240 cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagcaatgcc gcgtgagtga 300 tgaaggcctt agggttgtaa agctcttttg cccgggatga taatgacagt accgggagaa 360 taagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct agcgttgttc 420 ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggcttgtaa gttagaggtg aaagcccgga 480 gctcaactcc ggaactgcct ttaagactgc atcgcttgaa cgtcggagag gtaagtggaa 540 ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaagaa caccagtggc gaaggcgact 600 tactggacga ctgttgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 660 ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgatgac tagctgtcgg ggctcatgga gtttcggtgg 720 cgcagctaac gcgttaagtc atccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag 780 aaattgacgg gggcctgcac aagcggtgga gcagtggtt taattcgaag caacgcgcag 840 aaccttacca gcgtttgaca tggtaggacg gtttccagag atggattcct tcccttacgg 900 gacctacaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 960 tcccgcaacg agcgcaaccc tcgtcttag ttgctaccat ttagttgggc actctaaaga 1020 aactgccggt gataagccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg 1080 cgctgggcta cacacgtgct acaatggcgg tgacagtggg cagcaaactc gcgagagtga 1140 gcaaatcccc aaaaaccgtc tcagttcgga ttgttctctg caactcgaga gcatgaa 1197 101 1352 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence .-Organisme du sol 101 cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac taagggcga attgggccct ctagatgcat 60 gctcgagcgg ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc gcccttcagg cctaacacat 120 gcaagtcgca cgagaaaggg cttcggcccc ggacagtgg cgcacgggtg agtaacacgt 180 aggcaatctc ccccgagtg gtggataacc ttccgaaagg agggctaata cagcatgaga 240 ccacgagctc gcagagcttg tggccaaagc ggacctcttc ttgaaagttc gcgcttgagg 300 atgagcctgc ggcccatcag ctagttggta gggtaatggc ctaccaaggc taagacgggt 360 agctggtctg agaggacgga cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg 420 gaggcagcag tggggaatct tgcgcaatgg acgaaagtct gacgcagcga cgccgcgtga 480 gcgatgaagg ccttcgggtt gtaaagctct gtggggagag acgaataagg tgcagctaat 540 acctgcatcg atgacggtat ctccttagca agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc 600 ggtaagacag agggtgcaaa cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc gtgtaggcgg 660 ctgtgtaagt cgggcgtgaa atcccatggc tcaaccatgg aagtgcaccc gaaactgcgt 720 agctagagtc ctggagagga aggtggaatg cttggtgtag aggtgaaatt cgtagatatc 780 aagcggaaca ccggtggcga agcggccttc tggacagtga ctgacgctga gacgcgaaag 840 cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag 900 acgctggggt gcatgcactt cggtgtcgcc gctaacgcat taagcattcc gcctggggag 960 tacggccgca aggttaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 1020 gtggtttaat tcgaagcaac gcgcaaacct taccaaccct tgacatgtcc attgccggtc 1080 cgagagattg gaccttcagt tcggctggat ggaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1140 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctac cgccagttgc 1200 catcattcag ttgggcactc tggtggaact gccggtgaca agccggagga agcggggatg 1260 acgtcaagtc ctcatggccc ttatgggttg ggctacacac gtgctacaat ggcggtgaca 1320 gtgggacgcg aagccaaga tggacaaatc cc 1352 102 1361 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : Organisme du sol 102 aacagctatg accatgatta cgccaagctt ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc 60 cgccagtgtg ctggaattcg cccttcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggatccttcg 120 ggattagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggaacgtgc cctttggttc ggaacaactc 180 agggaaactt gagctaatac cggataagcc tttcgaggga aagatttatc gccattggag 240 cggcccgcgt aggattagct agttggtgag gtaaaagctc accaaggcga cgatccttag 300 ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga 360 ggcagcagtg gggaatcttg cgcaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt 420 gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccggagaa gataatgacg gtatccggag 480 aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt 540 tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt aagtcagggg tgaaatccca 600 gagctcaact ctggaactgc ctttgatact gggtatcttg agtatggaag aggtaagtgg 660 aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg 720 cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc gggcagtata ctgttcggtg 840 gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca 960 gaaccttacc agctcttgac attcggggtt tgggcagtgg agacattgtc cttcagttag 1020 gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag catttagttg ggcactctaa 1140 ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct 1200 tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag tgggcagcga gacagcgatg 1260 tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcat ctgcaactcg agtgcatgaa 1320 gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca tgctgcggtg a 1361 103 1300 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence : :Organisme du sol 103 catgtttagt agcaatacta aatgatgacg agcggcggac gggtgaggaa cacgtaggaa 60 cctgcccaag agagggggac aaccaaggga aactttggct aataccgcat aatctctacg 120 gagaaaagtt gcccgtaagg gtggcgcttt tggaggggcc tgcgtccgat tagttagttg 180 gtgaggtaat agctcaccaa gactgtgatc ggtaactggt ctgagaggac gaccagtcac 240 actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tcttggacaa 300 tgggggcaac cctgatccag cgatgccgcg tgggtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc 360 cctttaggcg gggaagaagg atatgggatg aataagcctg tattttgacg gtacccgcag 420 aataagcacc ggcaaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg cgagcgttaa 480 tcggatttac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggttgtgt gagtgtgatg tgaaagcccc 540 gggctcaacc tgggaagtgc atcgcaaacg acacaactgg agtatatgag agggtggcgg 600 aatttccggt gtagcggtga aatgcgtaga gatcggaagg aacgtcgatg gcgaaggcag 660 ccacctggca taatactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 720 ccctggtagt ccacgccgtaaacgatgaga actagatgtt ggagggggaa cccttcagta 780 tcgaagctaa cgcgataagt tctccgcctg ggaagtacag tcgcaagact gaaactcaaa 840 agaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 900 gaaccttacc Lacccttgac atcctgcgaa tcttgccgag aggtgagagt gccgcaagga 960 gcgcagagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgagatgt tgggttaagt 1020 cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt tgccatcatt tagttgggga ctctaaggag 1080 accgccggtg atgaaccgga ggaaggcggg gacgacgtca agtcatcatg gcctttatgg 1140 gtagggctac acacgtgcta caatggggcg tacagagggt cgccaacccg cgagggggag 1200 ccaatctctt aaagcgtctc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc 1260 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcagtg ccgcggtgaa 1300 104 1250 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 104 tgtagcaata catcagtggc agacgggtga gtaacacgtg ggaaccttcc tcgttgtacg 60 ggacaactca gggaaacttg agctaatacc gtatacgtcc gagaggagaa agatttatcg 120 caatgagacg ggcccgcgtc ggattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgac 180 gatccgtagc tgatctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact 240 cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc 300 cgcgtgagtg aagaaggcct tagggttgta aagctctttt gccagggacg ataatgacgg 360 tacctgagaa taagccccgg caaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct 420 agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc gggtcgttaa gtcaggggtg 480 aaatcccgga gctcaactcc ggaactgcct ttgatactgg cgaccttgag gctggaagag 540 gttagtggaa ttcccagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttgggaagaa caccagtggc 600 gaaggcggct aactggtcca gatctgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 660 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa ctatgggtgc tagctgtcag cgggcttgct 720 cgttggtggc gcagctaacg cattaagcac cccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 780 aacttaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 840 aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat cccgatcgcg gacaccagag atggagtcct 900 tcagttcggc tggatcggag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 960 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccttta gttgccatca tttagttggg 1020 cactctaaag ggactgccgg tgataagccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca 1080 tggcccttac gggttgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacaatgg gcagctactt 1140 cgcaaggaga agctaatccc aaaaagccgt ctcagttcag attgcactct gcaactcggg 1200 tgcatgaagt tggaatcgct agtaatcgct aatcagcagg tagcggtgaa 1250 105 1302 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 105 ggcttcggct ccccggtaga gggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa tctgcctttg 60 ggtggggaat aacccttcga aagaggggct aataccgcat aacgcagcgg caccgaatgg 120 tgacagttgt taaagtgggg gatcgcaaga cctcacgcct gaagaggagc ccgcgcccga 180 ttagctagtt ggtgcggtaa tggcgtacca aggcggcgat cggtagccgg cctgagaggg 240 cggacggcca cactggcact gagagacggg ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300 attttgggca atgggcgcaa gcctgaccca gcaacgccgc gtgaaggacg aaatccctct 360 gggatgtaaa cttcgaaagt tggggaagaa atccgtgtga ggataatgca cacgggatga 420 cggtacccaa cgtaagcccc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg 480 caagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggtacgac aagtctggag 540 tgaaagcccg gggctcaacc ccggaatgtc tttggaaact gtcgaacttg agtgcggaag 600 aggcatctgg aattcccagt gtagcggtga aatgcgtaga tattgggaag aacacctgag 660 gcgaaggcgg gatgctgggc cgacactgac gctgaggcgc gaaagccagg ggagcgaacg 720 ggattagata ccccggtagt cctggcccta aacgatggat acttggtgtg tggggttctc 780 gaagtccccg cgtgccggag caacgcggt aagtatcccg cctggggagt acggtcgcaa 840 ggctgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg tggttcaatt 900 cgacgcaacg cgaagaacct tacctgggtt aaatcctacc tcgtcgcctc agagatgagg 960 tttcccttcg ggggaggtag gacggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgaggt 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttaccacta gttgccagcg gttcggccgg 1080 gcactctatt gggactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140 atggccttta tgtccagggc tacacacgtg ctacaatggc cggaacaaag cgcagcaaac 1200 ccgcgagggg gagccaatcg caaaaatccg gtctcagttc ggattggagt ctgcaactcg 1260 actccatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tg 1302 106 1281 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 106 tgcttctctt gagagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg 60 gataacgttc ggaaacggac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc 120 ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc 180 tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact ggaactgaga 240 cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct 300 gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttgga 360 aggaagggca gtaaattaat actttgctgt tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc 420 taactctgtg ccagcagccg cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 480 gcgtaaagcg cgcgtaggtg gtttgttaag ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg 540 gaactgcatt caaaactgac tgactagagt atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta 600 gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctggactaa 660 tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 720 cgccgtaaac gatgtcaact agccgttgga agccttgagc ttttagtggc gcagctaacg 780 cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgagggg 840 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900 gccttgacat ccaatgaact ttctagagat agattggtgc cttcgggaac attgagacag 960 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc 1020 gcaacccttg tccttagtta ccagcacgac atggtgggca ctctaaggag actgccggtg 1080 acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac 1140 acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccac 1200 aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta 1260 gtaatcgcga atcagaaatg t 1281 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, ledit procédé comprenant la succession d'étapes suivante : (a) Obtention de micro-particules par broyage d'un échantillon de sol préalablement séché ou dessiqué , puis mise en suspension des micro-particules dans un milieu tampon liquide ; et (b) extraction des acides nucléiques présents dans les micro-particules ; et (c) - passage de la solution contenant les acides nucléiques sur un tamis moléculaire, puis récupération des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques et passage des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques sur un support de chromatographie d'échange d'anions, puis récupération des fractions d'élution contenant les acides nucléiques purifiés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape I-(a) est suivie des étapes complémentaires de : - traitement des micro-particules en suspension dans un milieu tampon liquide par sonication et - extraction et récupération des acides nucléiques. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape I-(a) est suivie des étapes complémentaires suivantes : - traitement des micro-particules en suspension dans un milieu tampon liquide par sonication ; - incubation de la suspension à 37 C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase ; - addition de SDS - récupération des acides nucléiques. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape -(a) est suivie des étapes complémentaires suivantes : - homogénéisation des micro-particules à l'aide d'une étape de mixage violent (vortex) suivie d'une étape de simple agitation ; - congélation de la suspension homogène suivie d'une décongélation ; - traitement par sonication de la suspension après décongélation ; - incubation de la suspension à 37 C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase ; - addition de SDS; - centrifugation et précipitation des acides nucléiques ; et - récupération des acides nucléiques. 5 .Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les acides nucléiques sont des molécules d'ADN. 6. Procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants, caractérisé en ce que les acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 5 sont insérés dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont séparés en fonction de leur taille préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la taille moyenne des acides nucléiques est rendue sensiblement uniforme par rupture physique, préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type plasmide. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type cosmide. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif chez E. coli et intégratif chez Streptomyces. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS7001. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide conjugatif et intégratif chez Streptomyces. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOSV303. 15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif à la fois chez E. coli et chez Streptomyces. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS 700R. 17. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif chez E. coli et Streptomyces et conjugatif chez Streptomyces. 18. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type BAC. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur BAC intégratif et conjugatif chez Streptomyces. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur BAC pOSV403. 21. Collection d'acides nucléiques constituée des acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 22. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il est contenu dans la collection d'acides nucléiques selon le revendication 21. 23. Acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant au moins un opéron, ou une partie d'un opéron. 24. Acide nucléique selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'opéron code pour la totalité ou une partie d'une voie métabolique. 25. Acide nucléique selon la revendication 24, caractérisé en ce que la voie métabolique est la voie de synthèse des polykétides. 26 Acide nucléique selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides comprenant les séquences SEQ ID N 30 à 44. 27. Acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend la totalité d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide 28. Acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce qu'il est d'origine procaryote. 29. Acide nucléique selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il provient d'une bactérie ou d'un virus. 30. Acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 24 et 27, caractérisé en ce qu'il est d'origine eucaryote. 31. Acide nucléique selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il provient d'un champignon, d'une levure, d'une plante ou d'un animal. 32. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 26 à 31; 33. Vecteur selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS 7001. 34. Vecteur selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOSV303. 35. Vecteur selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS 700R. 36. Vecteur selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur BAC pOSV403. 37. Collection de vecteurs recombinants tels qu'obtenus selon le procédé de l'une des revendications 6 à 20. 38. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il est contenu dans la collection de vecteurs recombinants selon la revendication 37. 39 Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 31 ou un vecteur recombinant selon la revendication 38. 40. Cellule hôte recombinante selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule procaryote ou eucaryote. 41. Cellule hôte recombinante selon la revendication 40, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie. 42. Cellule hôte recombinante selon la revendication 41, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie choisie parmi E. coli et Streptomyces. 43. Cellule hôte recombinante selon la revendication 40, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure ou d'un champignon filamenteux. 44. Collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un acide nucléique de la collection d'acides nucléiques selon la revendication 21. 45. Collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un vecteur recombinant selon l'une des revendications 32 ou 38. 46. Procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec un couple d'amorces hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec la séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée ; - réaliser au moins trois cycles d'amplification ; - détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.. 47. Procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec une sonde hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec une séquence nucléotidique structurellement apparentée à la séquence nucléotidique déterminée ; - détecter l'hybride éventuellement formé entre la sonde et les acides nucléiques compris dans les vecteurs de la collection. 48. Procédé pour identifier la production d'un composé d'intérêt par une ou plusieurs cellules hôtes recombinantes dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées. 49 Procédé pour sélectionner une cellule hôte recombinante produisant un composé d'intérêt dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées. - sélection des cellules hôtes recombinantes produisant le composé d'intérêt. 50. Procédé pour la production d'un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - cultiver d'une cellule hôte recombinante sélectionnée selon le procédé de la revendication 49; - récupérer et, le cas échéant, purifier, le composé produit par ladite cellule hôte recombinante. 51. Composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé de la revendication 50. 52. Composé selon la revendication 51, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polykétide. 53. Polykétide caractérisé en ce qu'il est produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 30 à 44. 54. 'Composition comprenant un polykétide selon la revendication 52 ou 53. 55.Composition pharmaceutique comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide selon la revendication 52 ou 53, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.