FR 2798669 A1 20010323 FR 9911683 A 19990917 SOUCHE DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII ET SON UTILISATION POUR LE CRIBLAGE DE PLASMIDES La présente invention est relative à l'introduction de plasmides dans Lactobacillus delbrueckii. La transformation de bactéries lactiques pour leur permettre d'exprimer des gènes d'intérêt, notamment dans le but d'améliorer les propriétés de ces bactéries dans le cadre de leurs utilisations agroalimentaires, ou de leur conférer la capacité de produire des substances d'intérêt thérapeutique, fait l'objet de nombreuses recherches. Cependant, les résultats obtenus varient largement selon l'espèce bactérienne concernée. Certaines espèces sont en effet dites réfractaires à la transformation, ce qui limite considérablement les possibilités d'introduction et d'expression d'ADN étranger. Parmi les bactéries lactiques réfractaires à la transformation, on mentionnera l'espèce Lactobacillus delbrueckii, qui comprend notamment les sous-espèces Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis, et Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii. Jusqu'à présent, les essais de transfert de gènes chez Lb. delbrueckii n'ont donné que peu de résultats ; seuls quelques plasmides capables de s'établir dans cette espèce ont été identifiés. LANGELLA et CHOPIN, [FEMS Microbiol. Lett., 51,149-52, (1989) ] ont décrit l'introduction par conjugaison d'ADN étranger (plasmide conjugatif pIP501 de Streptococcus agalactiae) chez Lb. delbruckii subsp. bulgaricus ; la Demande PCT WO 93/18164 décrit l'introduction par conjugaison chez Lb. delbruckii subsp. bulgaricus d'un plasmide mobilisable car portant le locus oriT de pIP501 ; la Demande EP 0603416 au nom de MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD décrit l'utilisation du plasmide conjugatif pAMP1 pour intégrer un gène hétérologue dans le chromosome de Lb. delbruckii. BOIZET et al. [Appl. Environ. Microbiol., 54, 3014-3018 (1984) ], ont décrit l'introduction d'ADN de bactériophages par transfection de protoplastes de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. Dans le cas de la transformation par de l'ADN plasmidique nu, la Demande EP 529088, au nom de MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD décrit un plasmide dénommé pBULl, originaire de la souche M-878 de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus et ses dérivés, utilisables pour transformer Lb. delbrueckii ; la Demande JP 5-176777 décrit l'obtention de transformants de Lb. delbrueckii par électroporation, en utilisant des plasmides dérivés de pBULl, ou du plasmide pSYE originaire de Lactococcus lactis ; l'électroporation est effectuée après une étape intermédiaire de culture de Lb. delbrueckii à 42 C pendant 2 à 3 heures dans un milieu LCMG dont le pH initial est compris entre 5 et 5,5 et contenant de l'acide formique (5 à 5,5 mg/ml). Cette étape est suivie de lavages et d'un traitement thermique à des températures variant de 0 à 50 C, pendant 10 minutes à 24 heures. SASAKI et al. [Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ; FEMS Microbiol. Rev. 12,8 (1993)], rapportent la transformation de la souche ATCC11842 et d'une souche dérivée de M-878 de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus selon la méthode décrite dans la Demande JP 5-176777 ; la fréquence de transformation dans ces conditions est de 1 à 10 transformants par g d'ADN plasmidique. Elle augmente jusqu'à 6 x 104 transformants par g d'ADN plasmidique lorsqu'un sous-clone de M-878 (nommé par la suite T-11), déficient dans un système de restriction, est utilisé. La transformation de cette souche (T-11) avec un plasmide dérivé de PSYE1 portant un gène d'aamylase est également décrite par SATOH et al. [Appl. Environ. Microbiol., 63,4593-4596, (1997) ]. L'identification d'autres plasmides utilisables pour transformer dans Lb. delbrueckii est entravée par le caractère réfractaire de cette espèce ; en effet, même dans le cas des plasmides capables de transformer Lb. delbrueckii qui sont mentionnés ci-dessus, le taux de transformation demeure généralement faible et la reproductibilité des résultats est irrégulière. Pour tester la capacité d'autres plasmides à se maintenir sous forme libre ou intégrée chez Lb. delbrueckii, il est donc souhaitable de disposer d'une souche transformable, et d'une procédure de préparation de cellules compétentes permettant de limiter les échecs dus au caractère réfractaire de Lb. delbrueckii. La présente invention s'est donc fixé pour but l'obtention de souches de Lb. delbrueckii plus facilement transformables, afin de les utiliser comme hôtes permettant la réplication et l'expression d'ADN étranger, ainsi que comme modèles, pour tester des plasmides dans le but de les utiliser ensuite pour transformer d'autres souches de Lb. delbrueckii, notamment des souches industrielles. Une seule souche de Lb. bulgaricus est actuellement connue pour permettre des taux de transformation élevés en utilisant de l'ADN plasmidique dont la préparation n'a pas été effectuée à partir de Lb. delbrueckii ; il s'agit de la souche mutante T-11 mentionnée ci-dessus, qui est déficiente dans un système de restriction/modification. Une telle souche ne constitue toutefois pas un bon modèle pour tester des plasmides destinés à être introduits dans des souches possédant un système de restriction/modification intact. Les Inventeurs sont parvenus à obtenir, à partir d'une souche représentative de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, la souche ATCC11842, une souche mutante dont les systèmes de restriction/modification apparaissent similaires à ceux de la souche sauvage ATCC11842 et qui peut être transformée beaucoup plus facilement et de manière plus reproductible que celle-ci. L'utilisation de cette souche mutante leur a permis d'identifier des plasmides potentiellement utilisables pour transformer Lb. delbrueckii. La présente invention a pour objet la souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, dénommée ci-après VI104, déposée selon le Traité de Budapest le 17 septembre 1999, sous le numéro 1-2316, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 25 rue du Docteur Roux, à Paris. La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de plasmides capables de transformer des bactéries de l'espèce Lb. delbrueckii, caractérisé en ce que l'on procède à l'électroporation de la souche VI104 en présence d'un plasmide à tester, et à la détection de bactéries transformées. Dans les bactéries transformées, le plasmide peut être présent sous forme libre, dans le cas d'un plasmide réplicatif, ou sous forme intégrée dans le cas d'un plasmide intégratif. Avantageusement, des copies dudit plasmide peuvent être récupérées à partir desdites bactéries transformées, afin d'être utilisées pour transformer VI104 ou d'autres souches de Lb. delbrueckii, notamment des souches dont les systèmes de restriction sont des barrières à la transformation. L'électroporation de la souche VI104 peut être effectuée selon les techniques connues de l'art antérieur pour l'électroporation de Lb. delbrueckii, par exemple celle décrite dans la Demande JP 5-176777. Cependant, les Inventeurs ont observé que l'on obtenait un meilleur rendement de transformation si l'on supprime l'étape intermédiaire de culture mise en #uvre dans cette méthode, et si l'électroporation est effectuée sur des cultures en début de phase stationnaire, et après un traitement thermique à 45 C entre 10 et 30 min. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un plasmide susceptible d'être sélectionné par le procédé ci-dessus, à l'exception du plasmide pBULl décrit dans la Demande EP 529088 et de ses dérivés, et du plasmide pSYE décrit dans la Demande JP 5- 176777 et de ses dérivés, pour transformer une bactérie de l'espèce Lb. delbrueckii. Selon un mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, ledit plasmide est choisi parmi : - le plasmide pWS58 et ses dérivés ; - le plasmide pLEM7 et ses dérivés ; - le plasmide pLPl et ses dérivés ; - le plasmide pLC2 et ses dérivés ; - le plasmide pGT633 et ses dérivés ; - le plasmide pWVOl et ses dérivés ; - le plasmide pSH71 et ses dérivés ; - les plasmides non-conjugatifs dérivés de pIP501 ; - les plasmides non-conjugatifs dérivés de pAMP1 - le plasmide intégratif pMCl et ses dérivés. On entend par plasmide dérivé d'un plasmide X tout plasmide pouvant être obtenu à partir dudit plasmide X par insertion et/ou délétion d'une séquence nucléotidique et/ou mutation(s) de la séquence initiale, à condition que ledit plasmide conserve des éléments fonctionnels permettant sa réplication chez Lb. delbrueckii. Ces éléments fonctionnels peuvent être identiques à ceux du plasmide initial, ou bien ils peuvent différer de ceux-ci par l'introduction de mutation(s), notamment de mutation(s) conduisant à une activité conditionnelle des fonctions de réplication et/ou de stabilité. Des plasmides dérivés d'un plasmide X peuvent aussi être obtenus, par exemple, par insertion dans ledit plasmide X d'une ou plusieurs séquences telles que des gènes d'intérêt que l'on souhaite exprimer dans la bactérie-hôte transformée par ledit plasmide, des lieurs multisite permettant l'insertion desdits gènes, des séquences de contrôle de la transcription et/ou de la traduction, des gènes rapporteurs, des marqueurs de sélection et notamment des marqueurs compatibles avec une utilisation alimentaire, des éléments mobiles, des fragments chromosomique(s) ou plasmidique(s), des séquences contrôlant le nombre de copies du plasmide. Ces séquences peuvent être insérées en supplément de séquences plasmidiques déjà présentes, ou en remplacement de certaines d'entre elles. Des plasmides dérivés utilisables comme vecteurs navettes peuvent également être construits par insertion de séquences permettant d'élargir le spectre d'hôte, notamment des séquences permettant la réplication et le maintien dans des bactéries hôtes appartenant à d'autres espèces. Les plasmides sélectionnés conformément à l'invention peuvent avantageusement être utilisés pour tester si une séquence nucléotidique donnée (gène, séquence de contrôle, élément mobile, etc. ) est fonctionnelle chez Lb. delbrueckii. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'utilisation de la souche VI104 pour la sélection de plasmides utilisables pour transformer d'autres souches de Lb. delbrueckii. EXEMPLE 1 : COMPARAISON DES PROPRIETES DE RESTRICTION/MODIFICATION DE LA SOUCHE VI104 ET DE LA SOUCHE MERE ATCC11842 Le tableau I ci-dessous montre que les souches ATCC11842 et VI104 restreignent de manière équivalente 3 phages (C5h2, C5, 11) propagés sur les souches CNRZ448 ou CNRZ327. TABLEAU ATCC11842 V1104 Souche propagatrice stock phage(souche) (pfu/ml) (pfu/ml) (pfu/ml) C5h2 (448) 7,OOE+06 1,OOE+07 2,50E+08 C5h2 (448) 1,OOE+07 1,20E+07 3,OOE+08 C5h2 (448) 7,70E+05 1,40E+06 4,OOE+07 C5 (448) 1,50E+03 1,10E+05 4,20E+07 11 (327) 4,50E+06 8,OOE+06 9,OOE+07 D'autre part, aucune restriction de la part de ATCC11842 ou de VI104 n'est observée pour les phages propagés sur ces souches, comme le montrent les résultats illustrés par le Tableau II ci-dessous. TABLEAU II ATCC11842 V1104 stock phage(souche) (pfu/ml) (pfu/ml) C5h2 (VI4) 2,OOE+03 5,OOE+02 C5h2 (VI104) 6,OOE+02 2,OOE+02 C5h2 (V14) 2,30E+03 3,OOE+02 C5h2 (VI104) 6,OOE+02 6,OOE+02 C5h2 (V14) 1,OOE+03 3,OOE+02 C5h2 (VI104) 9,OOE+03 7,70E+03 C5 (VI104) 2,OOE+04 2,OOE+04 11 (VI104) 1,90E+05 9,OOE+05 Ces résultats indiquent que les systèmes de restriction et de modification mis en jeu dans ces expériences sont comparables dans les deux souches ATCC11842 et VI104. EXEMPLE 2 : CONDITIONS DE CULTURE ET DE TRANSFORMATION Les bactéries VI104 sont cultivées en milieu MRS, 0,1% glycine (DIFCO) jusqu'en début de phase stationnaire. Elles sont ensuite centrifugées et lavées dans du tampon d'électroporation (0,4 M sucrose, 1 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, pH 6,0) et mises en suspension dans ce même tampon à une concentration correspondant à une D06oo d'environ 50. La suspension est incubée 20 min à 45 C puis refroidie sur de la glace. Une aliquote de 80 l de la suspension est mélangée avec l'ADN plasmidique (-1,5 g) et le mélange est transféré dans une cuve d'électroporation de 0,2 cm. L'électroporation est effectuée à 1 kV, 800 Q, et 25 F. Immédiatement après l'électroporation, le mélange est dilué dans 2 ml de milieu d'expression (0,2 M sucrose, 5% lait écrémé en poudre, 0,1% extrait de levure, 1% casaminoacides, 25 mM MgCl2) . Après incubation pendant 3 h à 37 C dans ce milieu, les cellules sont étalées sur des boites de milieu sélectif (MRS Agar avec 10 ug/ml d'érythromycine ou 10 ug/ml de chloramphénicol selon le marqueur de sélection porté par le plasmide à tester) ; les boites sont incubées en jarre d'anaérobiose à 37 C pendant 48 h, et les colonies résistantes à l'érythromycine ou au chloramphénicol sont sélectionnées pour confirmer la présence d'ADN plasmidique. EXEMPLE 3 : CRIBLAGE DE PLASMIDES FONCTIONNELS DANS LA SOUCHE VI104 La transformation de VI104 par différents types de plasmides a été effectuée selon le protocole décrit à l'exemple 2 ci-dessus. La présence de formes plasmidiques libres dans les transformants a été établie par extraction d'ADN total [FOUET et SONENSHEIN, J. Bacteriol., 172,835-44, (1990) ] et électrophorèse. En cas de plasmides à faible nombre de copies ou du vecteur intégratif, plus difficilement détectables, la présence de plasmide est confirmée par hybridation de SOUTHERN avec une sonde plasmidique. De l'ADN représentatif de celui utilisé pour la transformation est analysé en parallèle et permet de confirmer l'identité de taille des plasmides. Les résultats sont illustrés par les Figures 1 à 4 : Légendes des figures : Figure 1 : Résultats de l'analyse électrophorétique d'ADN total de transformants de L. bulgaricus VI104. L'ADN total a été préparé à partir des transformants de pJK650 (A), de pLEM415 (B) et de pGT633 (C). Dans chaque cas, les puits 1 et 2 correspondent, respectivement, à l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et à l'ADN total d'un transformant. Figure 2 : Résultats de l'analyse d'ADN total d'un transformant de L. bulgaricus VI104 par pULP8. Les puits 1 et 2 correspondent, respectivement, à l'analyse électrophorétique de l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et à l'ADN total d'un transformant. Les puits 4 et 5 correspondent, respectivement, à l'hybridation d'une sonde pULP8 contre l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et contre l'ADN total d'un transformant après digestions par l'enzyme EcoRI. Figure 3 : Résultats d'hybridation de l'ADN total des transformants de L. bulgaricus VI104 par pCU1882, pG+host4 ou pG+host9. A : L'ADN total a été préparé à partir des transformants de pCU1882. Les puits 1 et 3 contiennent l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et les puits 2 et 4 contiennent l'ADN total d'un transformant. L'ADN est sous forme native dans les puits 1 et 2, et digéré par l'enzyme SalI dans les puits 3 et 4. La sonde utilisée est pCU1882. B : L'ADN présenté correspond à pG+host9 (puits 1, 2,5 et 6) ou à pG+host4 (puits 3,4, 7 et 8) . Les puits 1,3, 5 et 7 contiennent l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et les puits 2,4, 6 et 8 correspondent à l'ADN total des transformants. L'ADN est sous forme native dans les puits 1 à 4, et digéré par l'enzyme EcoRI dans les puits 5 à 8. La sonde utilisée est pG+host9. Figure 4 : Résultats d'hybridation de l'ADN total de deux transformants de L. bulgaricus VI104 par pNZ12. Les puits 1 et 4 contiennent l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et les puits 2,3, 5 et 6 contiennent l'ADN total des transformants. L'ADN est sous forme native dans les puits 1 à 3, et digéré par l'enzyme Nco I dans les puits 4 à 6. La sonde utilisée est pNZ12. 1) Plasmide d'origine homologue. Le plasmide pJK650 (8,96 kb, KLEIN et al., System. Appl. Microbiol. 18,493-503, 1995) est un dérivé du plasmide pWS58 isolé d'une souche de Lb. delbrueckii subsp. lactis. Ce plasmide qui porte le gène de résistance à l'érythromycine de pE194 [HORINOUCHI et WEISBLUM, J. Bacteriol., 150,804-814, (1982) ], transforme la souche VI104. La présence de formes libres du plasmide dans les transformants indique que ce plasmide est réplicatif dans VI104 (Figure 1A). Après 20 générations en conditions non sélectives (MRS), 100% des cellules sont EryR, ce qui montre la stabilité de ce plasmide chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. 2) Plasmides d'origine hétérologue. Plasmides à réplication de type cercle roulant . Différents plasmides dérivés de réplicons cercle roulant ont été testés pour leur capacité à transformer et à se maintenir dans VI104. Aucun transformant n'a été observé avec les plasmides suivants : - pE194, plasmide naturellement EryR originaire de S. aureus [HORINOUCHI et WEISBLUM, 1982, publication précitée]. - pJK353 et pJK354, dérivés CmR (gène de résistance au chloramphénicol de pC194 [HORINOUCHI et WEISBLUM, J. Bacteriol., 150,815-825, (1982)]) de pLC2 de Lactobacillus curvatus LTH683 [KLEIN et al., Plasmid, 30, 14-29, (1993)]. Ces dérivés sont instables chez Lactobacillus casei et L. curvatus. Il est possible qu'ils le soient également chez Lb. delbrueckii ce qui pourrait expliquer l'absence de transformants observés. En revanche, des transformants ont été obtenus avec les plasmides suivants : - pLEM7 [FONS et: al., Plasmid, 37, 199-203, (1997)] naturellement EryR et son dérivé pLEM415 (Fig. 1B). - pULP8 (6,6 kb) et pULP9 (6,8 kb) [BRINGEL et al., Plasmid, 22,193-202, (1989)], dérivés EryR (gène de pVA891, [MACRINA et al., Gene, 25, 145-50, (1983) ] du plasmide pLPl de Lactobacillus plantarum [BOUIA et al., Plasmid, 22,185-192, (1989) ], donnent des transformants avec VI104. Les transformants de pULP9 n'ont pas été analysés plus avant. L'analyse de transformants de pULP8 (Fig. 2) n'a pas permis de visualiser de formes libres par coloration au bromure d'éthidium. Par contre ces formes libres sont détectées par hybridation avec une sonde radioactive spécifique de pULP8. Conjointement aux formes libres, des molécules de haut poids moléculaire [DABERT et al., J. Bacteriol., 174,173-178, (1992) ] sont aussi détectées. Elles résultent probablement de la multimérisation de pULP8. - Le plasmide pCU1882 (6,7 kb), dérivé CmR (gène de pC194) de pLC2 de L. curvatus LTH683 [KLEIN et al., 1993, publication précitée] a conduit à l'obtention de transformants CmR dans VI104. L'analyse des transformants n'a pas permis de visualiser de forme libre en coloration au bromure d'éthidium. Par contre des formes libres sont détectées par hybridation avec une sonde radioactive spécifique de pCU1882 (Fig. 3A). Conjointement à ces formes libres, des molécules de haut poids moléculaire sont détectées. - Le plasmide pGT633 (9,8 kb), isolé de Lactobacillus reuteri, est naturellement EryR [TANNOCK et al., Plasmid., 31,60-71, (1994)]. L'analyse des transformants a permis la détection de molécules libres à faible nombre de copies (Fig. 1C). - Les plasmides pG+host4 (également dénommé pVE6004 ; Demande PCT WO 93/18164 ) et pG+host9 [MAGUIN et al., J. Bacteriol., 178,931-935, (1996) ] sont des dérivés du plasmide pVE6002 (Demande PCT WO 93/18164) lui même dérivé du plasmide pWV01 de Lactococcus lactis [KOK et al., Appl. Environ. Microbiol., 48,726-731, (1984)]. Ces deux plasmides portent respectivement les gènes EryR de pE194 et de pAMP1 [SIMON et CHOPIN, Biochimie, 70,559-566, (1988)] et transforment tous les deux VI104. La présence de plasmide a été confirmée par l'analyse électrophorétique de l'ADN total des transformants (Fig. 3B). - pNZ12 et pNZ121, dérivés CmR (gène CmR de pC194) du plasmide pSH71 de L. lactis [DE VOS, FEMS Microbiol. Rev., 46,281-295, (1987) ] transforment VI104. L'analyse de transformants de chaque plasmide permet la détection de molécules libres. La Figure 4 illustre les résultats de l'analyse pour pNZ12. Plasmides à réplication thêta. LANGELLA et CHOPIN [1989, publication précitée] ont montré que le plasmide conjugatif pIP501 (30 kb, originaire de Streptococcus agalactiae) se réplique à très faible nombre de copies dans L. bulgaricus (CNRZ431). Du fait de la grande taille de ce plasmide, il n'est pas envisageable de l'utiliser pour électrotransformer VI104. Les Inventeurs ont testé un dérivé de pIP501 non-conjugatif et de plus petite taille : pGB305A (EryR, [LE CHATELIER et al., Plasmid, 29, 50-56, (1995)])Ce plasmide transforme VI104 et se retrouve sous forme libre détectable par analyse de l'ADN total. - pIL253 (EryR), est un dérivé non-conjugatif de pAMP1 [SIMON et CHOPIN, Biochimie, 70,559-566, (1988)]. Plusieurs transformants ont été obtenus avec VI104. L'analyse par PCR de transformants indique la présence du gène er de pAMss1 dans les cellules. L'analyse de l'ADN total de transformants n'a pas permis de visualiser les formes plasmidiques libres. Cependant, l'extraction d'ADN plasmidique permet de déceler du plasmide libre à très faible nombre de copies. Ces résultats indiquent que pIL253 a là capacité de se maintenir dans VI104, mais à très faible nombre de copies. Vecteur d'intégration site-spécifique. Le plasmide pMC1 contient le site d'attachement attP (chevauchant le gène tRNAser) et le gène de l'intégrase (int) du bactériophage mv4 de L. delbrueckii [DUPONT et al., J. Bacteriol., 177,586-595, (1995)]. Ce vecteur s'intègre dans le gène tRNAser d'une grande variété de bactéries lactiques telles que L. plantarum, L. casei, L. lactis, E. faecalis et Streptococcus pneumonia [AUVRAY et al., J. Bacteriol., 179,1837-1845, (1997)]. Avec VI104, des intégrants sont obtenus ; l'analyse structurale de leur ADN chromosomique montre que pMC1 s'intègre de manière spécifique au locus tRNAser dans VI104. Ces résultats montrent que divers types de plasmides réplicatifs (plasmides d'origine homologue, plasmides d'origine hétérologue à réplication cercle roulant, plasmides d'origine hétérologue à réplication thêta), ainsi qu'un vecteur intégratif peuvent transformer VI104. EXEMPLE 4 : TRANSFORMATION D'AUTRES SOUCHES DE L. DELBRUECKII. Les plasmides pJK650, pGB305A,et pLEM415, qui transforment VI104, ont également été utilisés pour transformer la souche ATCC11842 de L. delbrueckii subsp. bulgaricus et la souche CNRZ327 de L. delbrueckii subsp. lactis, selon le protocole décrit à l'exemple 2 cidessus. Dans ces conditions, des transformants de pJK650 sont obtenus avec les souches ATCC11842 et CNRZ327, des transformants de pLEM415 sont obtenus avec la souche CNRZ327, et des transformants de pGB305A sont obtenus avec la souche ATCC11842. REVENDICATIONS 1) Souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, dénommée VI104, déposée le 17 septembre 1999, sous le numéro 1-2316, auprès de la CNCM. 2) Procédé de criblage de plasmides capables de transformer des bactéries de l'espèce Lb. delbrueckii, caractérisé en ce que l'on procède à l'électroporation de la souche VI104 selon la revendication 1, en présence du plasmide à tester, et à la détection de bactéries transformées comprenant ledit plasmide. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la récupération de copies dudit plasmide à partir desdites bactéries. 4) Utilisation d'un plasmide susceptible d'être sélectionné par le procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3, à l'exception des plasmides pBULl et pSYEl, et de leur dérivés, pour transformer une bactérie de l'espèce Lb. delbrueckii. 5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit plasmide est choisi parmi : - le plasmide pWS58 et ses dérivés ; - le plasmide pLEM7 et ses dérivés ; - le plasmide pLPl et ses dérivés ; - le plasmide pLC2 et ses dérivés ; - le plasmide pGT633 et ses dérivés ; - le plasmide pWVOl et ses dérivés ; - le plasmide pSH71 et ses dérivés ; - les plasmides non-conjugatifs dérivés de pIP501 ; - le plasmide intégratif pMC1 et ses dérivés. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit plasmide est choisi parmi pJK650, pGB305A,et pLEM415.