FR 2795516 A1 20001229 FR 9908349 A 19990628 La présente invention concerne un dispositif d'analyse et de comptage automatiques d'objets dans des milieux transparents ou translucides liquides, semi solides ou solides, et un procédé pour le pilotage et la gestion du dispositif et pour le traitement des données. Plus particulièrement, ce dispositif s'adresse aux laboratoires de recherche, par exemple en cancérologie et aux industries pharmaceutiques pratiquant l'analyse des sphéroïdes et la technique des essais clonogéniques. Les sphéroïdes sont des amas cellulaires sphériques dont la structure est proche de celle de micro-tumeurs. Ils constituent donc un modèle de choix en cancérologie pour les études radio et chimiothérapeutiques. Une étude de sensibilité consiste donc à mesurer le taux de survie des sphéroïdes ainsi que leur taille après le traitement. Pour que les informations soient précises et reproductibles, l'analyse doit s'effectuer sur le plus grand nombre possible de sphéroïdes. La technique des essais clonogéniques, une autre méthode d'évaluation de la sensibilité aux médicaments de chimiothérapie et aux radiations, consiste à compter des milliers de colonies qui se développent dans un milieu semi solide ou en fond de boîte. Ces deux techniques qui nécessitent une analyse microscopique, demandent donc beaucoup de temps et occasionnent une importante fatigue visuelle de l'opérateur. Les premiers buts de l'invention sont de proposer un dispositif d'analyse et de comptage dont la résolution est suffisante pour s'appliquer aux domaines précités, qui devra de plus être piloté par un ordinateur de manière à automatiser entièrement les protocoles d'analyses et de comptage. Pour réaliser ce pilotage, il est nécessaire de créer un logiciel approprié ; en effet, les dispositifs connus n'ont pas une résolution suffisante et/ou ne sont pas automatisés. Pour atteindre ces buts, la demanderesse a rencontré plusieurs problèmes. Tout d'abord, pour qu'un système de prise de vue balaye toute la surface de comptage comportant les échantillons, il faut réaliser un déplacement relatif entre prise de vue d'échantillon selon deux directions horizontales X et Y. Une première solution consisterait à rendre mobile la table portant l'échantillon mais cela entraînerait une surface de table très importante (neuf fois celle de la boîte contenant l'échantillon) et générerait des vibrations dans l'échantillon liquide. Pour pallier cet inconvénient, une autre solution consisterait à disposer sur une même table un groupe d'échantillons fixes (par exemple cent pour l'application aux sphéroïdes) avec un bras se déplaçant au dessus de chacun d'entre eux. Cette solution serait très encombrante. Pour pallier tous ces inconvénients, la demanderesse a choisi un compromis en séparant les deux mouvements, ainsi la boîte contenant l'échantillon est mobile selon une première direction horizontale X et le système de prise d'images est mobile selon une deuxième direction Y horizontale et perpendiculaire à X. Les vibrations de la boîte sont réduites et ne gênent pas l'acquisition des mesures, même sur des milieux liquides. Ces buts sont atteints par l'invention qui consiste en un dispositif analyseur d'objets dans des milieux liquides, semi-solides ou solides, du type comportant en combinaison - un automate passeur d'échantillons un système d'identification des échantillons, - un ensemble d'éclairage de l'échantillon, - un ensemble optique pour la prise d'image, - un module électronique de pilotage des ensembles précités, l'échantillon à analyser étant disposé dans une boîte disposée sur un support mobile de l'automate, dispositif caractérisé en ce que le support mobile déplace la boîte dans la zone d'éclairage selon une première direction horizontale et en ce que un mât portant l'ensemble optique se déplace selon une deuxième direction horizontale perpendiculaire à la première. La demanderesse a eu à résoudre encore un problème d'un autre ordre celui de l'éclairage car les échantillons à analyser présentent peu de contraste par rapport au fond ; ils peuvent être blancs et le contour des sphéroïdes n'est pas décelable par la prise de vue. Les systèmes d'éclairage à laser connus détruisent les cellules et ne peuvent convenir. Les traitements de contraste ou coloration connus ne peuvent être employés car ils peuvent modifier, voire détruire, les échantillons. Un système à verre dépoli ne donne pas satisfaction car il donne un aspect blanchâtre et sans relief aux cellules. Un système à éclairage direct ne peut convenir par absence de contraste et de relief. La demanderesse a eu l'idée, pour résoudre le probleme, a utiiiser ces boites à fond noir avec éclairage latéral permettant d'accentuer les contrastes nécessaires à la prise de vue sans détruire les échantillons. Ces buts sont atteints par un système d'éclairage comportant un générateur de lumière et une fibre optique de transport de la lumière débouchant latéralement dans une boîte à fond noir. Pour gérer automatiquement l'ensemble du dispositif et traiter les données, le procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes - étapes de configurations avec sauvegarde des réglages, - étapes d'analyse d'image comportant au moins l'analyse proprement dite - traitement des résultats De façon non limitative, les étapes d'analyse d'image comportent en outre une étape de séparation permettant d'activer ou non la séparation des objets accolés puis leur reconstruction. Si la séparation des objets accolés est activée, on effectue une extraction des composants connexes commençant par une extraction simple, suivie d'une érosion ultime déterminant le nombre d'objets composant la sous-image, suivie d'un épaississement pour retrouver l'image initiale avec des objets non accolés, suivie enfin d'une transformée de Hough pour reconstruire la partie manquante du sphéroïde. On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description qui suit faite en référence aux figures annexées suivantes # Figure 1 : vue latérale schématique d'un dispositif analyseur selon l'invention ; # Figure 2 : vue de face schématique d'un dispositif analyseur selon l'invention ; # Figure 3 : organigramme des fonctions d'un logiciel d'analyse de sphéroïdes selon l'invention. On se reporte d'abord aux figures 1 et 2 montrant le dispositif analyseur intégrant - un automate passeur d'échantillons (1), - un système d'identification des échantillons (non représenté) - un ensemble d'éclairage (3) de l'échantillon conçu spécifiquement pour des échantillons blancs solides ou semi solides - un ensemble optique (2) pour la prise d'images permettant une résolution de l'ordre de 5 Fim (voire meilleure). - Un ordinateur (4) comportant un logiciel de pilotage commandant le module électronique de pilotage (5) des ensembles précités, un logiciel d'analyse des images et de traitement des données. Un échantillon à analyser est contenu dans une boîte (6) (par exemple type standard P6/P96, boîtes de Pétri) disposée sur un support mobile (7) de l'automate (1 ). Le tapis (7) surélevé par rapport à un châssis (9) et actionné par un moteur (8) déplace la boîte (6) dans la zone d'éclairage selon une première direction (X). Les échantillons sont identifiés par tout système connu, par exemple par code barre ou autres ( par exemple... ). L'ensemble optique (2) se compose d'un capteur connu habituellement sous la dénomination de capteur CDD (10) et d'un macro zoom (11) permettant d'attendre une résolution de l'ordre de 5 j.Lm au moins. L'ensemble capteur (10) et zoom (11) est guidé verticalement le long d'un mât (12) par un moyen de fixation (13) réglable en hauteur par exemple au moyen de molettes (14). Le mât (12) est déplacé par un support mobile (15) entraîné par un moteur pas à pas (16) selon une deuxième direction horizontale (Y) perpendiculaire à la première direction horizontale (X). La combinaison des mouvements selon X et selon Y permet de balayer la totalité de la surface de la boîte contenant les échantillons. En option, on peut prévoir une ou deux tours de chargement (19) pour déposer les échantillons sur le support mobile (7). L'ensemble d'éclairage (3) est conçu spécifiquement pour apporter un contraste important aux objets contenus dans des échantillons de milieux transparents ou translucides ne devant pas être détruits ni modifiés par l'analyse. Selon l'invention, la lumière générée par le générateur de lumière (17) est amenée par une fibre optique (18) débouchant latéralement dans une boîte (6) à fond noir pour créer le contraste. L'éclairage latéral crée une lumière rasante visualisant les reliefs, répartie de façon homogène sur toute la surface de l'échantillon pour que la binarisation décrite plus loin soit homogène. Le module électronique (5) et son logiciel de pilotage sont à la portée de l'homme du métier; il pilote les moteurs et autres éléments du dispositif, en fonction des étapes du procédé ci-après. Le procédé pour l'analyse des échantillons, plus particulièrement des sphéroïdes, et pour le traitement des données a été spécifiquement conçu pour cette application ; il est de préférence automatisé par un logiciel correspondant. Son organigramme est représenté en figure 3 et il comporte trois groupes S d'étapes A : les étapes de configuration du procédé et de son logiciel Avant de procéder au comptage des sphéroïdes, il est nécessaire de configurer. Tous les réglages sont sauvegardés évitant ainsi le reconfiguration complète à chaque utilisation. Toutefois, il est recommandé d'effectuer la calibration avant chaque utilisation notamment pour prendre en compte les variations de lumière. A.1. configuration-caméras On choisi une caméra parmi celles connectées et gérées par le logiciel (par exemple quatre). Un commentaire particulier ainsi qu'un coefficient de calibration (renvoyé par la fonction de calibration) sont affectés à chaque caméra. A .2. configuration-calibrations Accessible par la configuration du choix de caméra. Un facteur de conversion permet d'établir une corrélation entre le nombre de pixels comptés et le diamètre réel de l'objet. Pour cela, trois calibres de tailles différentes (exemple : 200, 400, 600 pm) sont analysés trois fois. La droite de régression est alors calculée et la pente (donc le coefficient multiplicatif entre le nombre de pixels et le diamètre réel de l'objet) est automatiquement affichée dans la zone coefficient de la caméra choisie. Ce coefficient est affecté par la quantité de lumière, il semble donc nécessaire de calibrer le procédé à chaque utilisation. A.3. configuration-paramètrages Elimination du tableau de résultats des objets dont la taille est inférieure au seuil voulu. Exemple : si un diamètre de 20 #tm est entré, tous les objets dont le diamètre est inférieur à 20 #im ne seront pas pris en compte dans les résultats (bien qu'ils soient repérés puis comptés). Ceci permet de ne pas prendre en compte les débris cellulaires, cellules isolées, petits sphéroïdes, etc... A.4. configuration-histogramme Un histogramme permet de visualiser en temps réel la distribution de la population analysée. II est possible de donner les valeurs des bornes minimales et maximales ainsi que le pas. L'histogramme est réajustable à tout moment permettant ainsi de ne cibler qu'une population d'objets. L'axe des ordonnés est réajusté automatiquement en fonction du nombre d'objets comptés. B - Les étapes d'analyse d'image B.1. - l'analyse proprement dite L'analyse de l'image se déroule en plusieurs parties Acquisition L'acquisition d'une image se fait via la bibliothèque de la carte d'acquisition Matrox Météor (marque déposée) qui est une procédure d'acquisition propre au logiciel. L'image est alors convertie afin de ne pas dépendre d'une API propriétaire (Interface de Programmation d'Application appartenant à une société) et donc d'améliorer l'évolutivité et la conversion du logiciel sur d'autres plateformes. L'acquisition peut être simple ; elle permet de réaliser des acquisitions à la volée, ou série : elle permet de réaliser des acquisitions associées à un commentaire choisi parmi une pluralité (par exemple 10) stockés en mémoire. Binarisation C'est la conversion de l'image niveaux de gris en noir et blanc. Ceci implique de trouver automatiquement le seuil de binarisation optimal. II s'effectue en lissant l'histogramme de répartition des valeurs de gris de l'image afin d'identifier les deux pics de niveau de gris. Le premier maxima correspond aux valeurs sombres donc les pixels constituant le fond, le second pic est constitué des pixels des sphéroïdes donc clairs . Le seuil est choisi comme étant le minima entre ces deux pics. C'est-à-dire que les valeurs de niveau de gris inférieures à ce niveau prendront la valeur 0 (noir), les valeurs supérieures prendront la valeur 1 (blanc). L'image est alors uniquement constituée de pixels noirs (=0) et blanc (=1). Extraction simple L'image sur laquelle le logiciel travaille n'est pas debruitée par des filtres d'érosionldilation afin de ne pas altérer l'image. L'image est parcourue de manière à repérer les pixels blancs. Pour cela, chaque pixel est analysé successivement. Lorsqu'un pixel blanc (donc un éventuel sphéroïde) est reperé, il est placé dans une matrice de stockage avec les pixels adjacents de même couleur. L'image est donc décomposée en une succession de sous-images contenant chacune un objet qui sera traité de façon à déterminer sa surface et son périmètre. B.2. - la séparation Il s'agit d'un traitement spécial de l'image qui permet d'activer la séparation des objets accolés puis leur reconstruction par l'intermédiaire de la transformée de Hough. Si la séparation n'est pas activée, le logiciel passe directement au traitement des résultats. (voir C ci-après). Si la fonction séparation est activée, il faut passer à B3 B.3. - extraction des composants connexes II est possible d'activer cette fonction permettant de séparer les objets accolés. En contrepartie d'une meilleure précision dans les comptages, le temps de calcul se trouve allongé. Extraction Le traitement de l'image commence par une extraction simple retournant un ensemble de sous-images à traiter (voir ci-dessus). Erosion ultime L'érosion n'est pas utilisée ici dans le but d'éliminer le bruit de fond mais pour déterminer le nombre d'objets composant la sous-image. L'image est parcourue et le voisinage de chaque pixel est analysé, s'il a un voisin noir, il devient noir ; s'il n'a que des voisins blancs, il conserve sa valeur d'origine (noir=0, blanc=1). Mathématiquement, il s'agit d'un ET logique . L'opération est répétée n fois jusqu'à la disparition des composantes (on a alors une image noire). Le logiciel travaille sur la sous image n-1 et compte le nombre de pixels isolés restant, ce qui indique le nombre initial d'objets connexes. Les sous-images comportant un seul objet ne sont pas traitées et l'image d'origine est utilisée pour réaliser l'extraction. Seules les sous-images présentant des composantes connexes sont traitées ceci afin d'alléger le traitement de l'image. Epaississement Une dilatation est l'opération inverse de l'érosion et fonctionne selon le principe suivant : si un pixel à un voisin blanc, il devient blanc. S'il ne possède que des voisins noirs, il est conservé dans sa couleur d'origine. Mathématiquement, il s'agit d'un OU logique . L'épaississement permet en plus de dilater les composantes sans que les bords entrent de nouveau en contact grâce à un algorithme de détection de collisions. Les sous-images sélectionnées sont épaissies n-1 fois ce qui permet de retrouver l'image initiale avec des objets non accolés (contrairement à une dilatation). Transformée de Houah Cet ensemble de traitements et fonctions permet de reconstruire virtuellement la partie manquante du sphéroïde afin de déterminer les caractéristiques géométriques des objets extraits, et consiste en Extraction du contour La sous-image est parcourue, comme lors d'une extraction simple, pour en extraire les objets désormais séparés. Vote pour le centre Pour chacun des pixels constituant le pourtour de l'objet, la tangente est calculée par la méthode des moindres carrés. Celle-ci permet de trouver la droite perpendiculaire à la tangente passant par le pixel concerné. L'opération est répétée pour tous les points du pourtour de l'objet. L'ensemble des droites tracées permet d'identifier un ensemble de points dans la zone centrale de l'objet où la majorité des droites passent. Chacun des points identifiés peut prétendre être le centre. Voie pour le rayon Plusieurs centres par objet sont alors disponibles. Le meilleur rayon pour chaun des centres est recherché et seul le meilleur est retenu. Reconstruction Le rayon étant disponible, il est simple de calculer le diamètre, la surface, le périmètre et le volume estimé de chacune des composantes considérées. C - Traitement des résultats Une configuration préalable de la caméra est nécessaire (voir précédemment dans la description et voir aussi chemin (a) sur la figure 3). C.1. Calcul des résultats La surface réelle (extraction simple) ou calculée (reconstruction par extraction des composantes connexes) en pixels de chaque objet est convertie en gym. A partir de la surface sont calculés le diamètre, le périmètre et le volume. Les chemins préalables (b) et (c) sont nécessaires et déjà expliquées précédemment. C.2. - Affichage Les résultats sont affichés sous forme d'histogramme dont les paramètres ont déjà été paramétrés (chemin (d) figure 3). D - Sauvegarde-impression D.1. Impression L'impression des résultats est possible ainsi que la configuration de l'impression D.2. Sauvegarde La sauvegarde des tableaux de résultats s'effectue sur la totalité des données ou seulement sur les données utiles pour les sphéroïdes, ou les essais clonogéniques ceci dans un souci de simplification des résultats et d'économie de place. La sauvegarde s'effectue directement si l'acquisition n'était pas une acquisition simple. Dans le cas contraire (acquisition série), le logiciel retourne à la fonction d'analyse simple d'image. Dans toute la demande, on comprendra que le terme objet est synonyme de particules. REVENDICATIONS 1 1. Dispositif analyseur d'objets contenus dans des milieux liquides, semi-solides ou solides, du type comportant en combinaison - un automate passeur d'échantillons (1) - un système d'identification des échantillons, - un ensemble d'éclairage (3) de l'échantillon, - un ensemble optique (2) pour la prise d'image, - un module électronique de pilotage (5) des ensembles précités, l'échantillon à analyser étant disposé dans une boîte (6) disposée sur un support mobile (7) de l'automate (1), caractérisé en ce que le support mobile (7) déplace la boîte (6) dans la zone d'éclairage selon une première direction horizontale (X) et en ce que un mât (12) portant l'ensemble optique (2) se déplace selon une deuxième direction horizontale (Y) perpendiculaire à (X). 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support mobile (15) est entraîné par un moteur pas à pas. 3. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une tour de chargement. 4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'ensemble d'éclairage (3) est conçu spécifiquement pour apporter un contraste important aux objets contenus dans des échantillons blancs liquides semi-solides ou solides et en ce qu'il ne détruit pas les cellules de l'échantillon. 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'ensemble d'éclairage (3) comporte un générateur de lumière (17) et une fibre optique (18) de transport de la lumière débouchant latéralement dans une boîte (6) à fond noir. 6. Procédé pour l'analyse de milieux liquides, semi-solides ou solides, caractérisé en ce qu'il est conçu pour gérer un dispositif selon l'une des revendications 1 à 5 et caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes suivantes - étapes de configurations (A) avec sauvegarde des réglages, - étapes d'analyse d'image (B) comportant au moins l'analyse proprement dite (B1) - traitement des résultats (C) 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les étapes de configuration (A) comportent une étape de configuration-caméras (A1) dans laquelle un commentaire et un coefficient de calibration sont affectés à chaque caméra. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 à 7, caractérisé en ce que les étapes de calibration (A) comportent une étape de configuration-calibrations avec un facteur de conversion entre le nombre de pixels comptés et le diamètre réel de l'objet. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que les étapes de calibration (A) comportent une étape de configuration-paramètrages éliminant les objets dont la taille est inférieure à un seuil. 10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que les étapes de calibration (A) comportent une étape de configuration-histogramme réajustable à tout moment. 11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'analyse proprement dite (B1) se déroule en plusieurs parties : acquisition, binarisation, extraction. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'acquisition d'une image se fait via une procédure d'acquisition propre au logiciel puis est convertie. 13. Procédé selon l'une des revendications 11 à 12, caractérisé en ce que l'acquisition est choisie dans l'ensemble (acquisition simple, acquisition série). 14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que la binarisation convertit l'image niveaux de gris en noir et blanc, l'image étant alors uniquement constituée de pixels noirs et de pixels blancs. 15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que dans l'extraction simple, l'image est décomposée en une succession de sous images contenant chacune un objet qui sera traité de manière à déterminer sa surface et son périmètre. 16. Procédé selon l'une des revendications 6 à 15, caractérisé en ce que les étapes d'analyse d'image (B) comportent en outre une étape de séparation (B2) permettant d'activer ou non la séparation des objets accolés puis leur reconstruction. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que si la séparation des objets accolés est activée, on effectue une extraction des composants connexes (B3) commençant par une extraction simple, suivie d'une érosion ultime déterminant le nombre d'objets composant la sous-image, suivie d'un épaississement pour retrouver l'image initiale avec des objets non accolés, suivie enfin d'une transformée de Hough pour reconstruire la partie manquante du sphéroïde. 18. Procédé selon l'une des revendications 6 à 17, caractérisé en ce que le traitement des résultats (C) comporte une étape de calculs (C1) du diamètre, du périmètre et du volume suivie d'un affichage (C2). 19. Procédé selon l'une des revendications 6 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de sauvegarde-impression D avec retour à la fonction d'analyse simple d'image en cas d'acquisition série.