FR 2798143 A1 20010309 FR 9911235 A 19990908 L'invention concerne un dispositif capable d'effectuer le séquencage rapide et complet de polynucléotides, en particulier l'Acide Désoxyribonucléique (ADN) et l'Acide Ribonucléique (ARN), en utilisant une molécule de lecture capable de se déplacer le long du polynucléotide et d'émettre des signaux modulés par le type de nucléotide présent en regard. L'ADN (Figure 1) est l'élément fondamental des chromosomes de chaque cellule (1). II est constitué d'une longue molécule (l0cm environ) en forme de double hélice composée d'une succession de bases de 4 types (Adénine, Thymine, Guanine, Cytosine) faisant façe à des bases complémentaires (Thymine-Adénine et Cytosine-Guanine). L'ordonnancement des bases (3a, 3b..3n) définit le code génétique (2). En fonction de gènes répresseurs sensibles à divers paramètres physico- chimiques (Figure 2), certaines parties de l'ADN (1) sont dupliquées en ARN (Acide RiboNucléique) messager (4) qui est transféré aux ribosomes (5). Ceux-ci analysent séquentiellement ces brins d'ARN afin de synthétiser des protéines (7) en fonction des codes lus sur l'ARN. Cette synthèse s'effectue par assemblage d'acides aminés (6), chacun étant sélectionné par une combinaison précise de 3 bases. On connaît de nombreux systèmes pour analyser ces polynucléotides, ADN ou ARN. La plupart reposent sur l'hybridation de séquences de bases de synthèse associées à un marqueur (photo luminescence par exemple), avec un brin d'ADN ou d'ARN à tester. La parfaite coincidence des deux est reconnue par une plus forte luminescence que lorsque les séquences de synthèse ne coincident pas. On arrive ainsi, par de multiples essais, à connaître un nombre important de séquences d'ADN. Mais la méthode reste très lourde et prend beaucoup de temps. De plus, pour obtenir un signal perceptible, on doit reproduire à un grand nombre d'exemplaires la séquence à tester (procédé appelé PCR ). La présente invention permet de simplifier considérablement les étapes d'analyse et surtout d'obtenir en un temps relativement court tout le code d'un brin d'ADN, aussi long soit-il. L'invention présente également les moyens d'analyser directement une solution comprenant plusieurs chromosomes différents. Pour effectuer l'analyse séquentielle de ces polynucléotides, le dispositif de lecture séquentielle de polynucléotides utilise une molécule de lecture se déplaçant le long du polynucléotide, en y associant un moteur (17) lié à des éléments (15) assurant l'attraction et/ou la répulsion et le déplacement, moteur commandé par un récepteur de signaux de synchronisation (16), et un émetteur (18 & 19) modulé par le ou les types de nucléotides situés à sa proximité (20). La molécule de lecture, nommée ci-dessous "lecteur", est associée à un ou plusieurs excitateurs, et à un ou plusieurs détecteurs, eux-mêmes associés à un équipement informatique chargé de piloter le système et de traiter les informations reçues. Un ensemble d'injecteurs de réactifs permet avantageusement d'automatiser diverses étapes. Pour simplifier la lecture, le terme polynucléotides est remplacé par le terme ADN , même si d'autres formes de polynucléotides sont bien sûr sous- entendues. Le LECTEUR est formé d'une molécule originale ayant les caractéristiques suivantes - Elle se place spontanément en un endroit précis du polynucléotide (figure 3): Cette fonction est importante pour obtenir une synchronisation initiale parfaite des lectures simultanées de plusieurs centaines ou milliers d'ADN identiques. Un élément de reconnaissance (9) de séquence et/ou de géométrie particulière de l'ADN (appelé généralement une sonde), se positionne en face de la séquence recherchée par hybridation (8) et place ainsi le lecteur (10) dans une position déterminée (11). Cette position peut être située de préférence près de l'extrémité du brin, ou même au niveau du télomére du chromosome. Une sonde capable de se fixer sur 1 seul type de chromosome est un avantage supplémentaire dans la mesure où il permet d'appliquer la lecture simultanément sur un mélange de brins d'ADN différents sans séparation préalable. Ce type de sonde capable de se fixer sur une séquence particulière d'ADN fait aujourd'hui partie des outils courants en ingénierie génétique. Alternativement, une sonde capable de se positionner sur une partie d'ADN ayant des caractéristiques mécaniques ou physiques serait également capable de placer le lecteur à une position de référence. Après positionnement correct du lecteur, l'élément de reconnaissance autorise le fonctionnement du reste de la molécule. L'élément de reconnaissance peut alors soit se détacher spontanément de l'ADN ou se couper du reste du lecteur ou encore se désactiver spontanément ou sous l'effet d'une commande spécifique (physique, chimique, électrochimique...). Dans tous les cas, le lecteur est positionné et libre de se déplacer le long du brin d'ADN. Dans le troisième cas, il est possible de replacer le lecteur à sa position de départ en le réactivant. En fin de lecture du brin, par le fait que le lecteur reste bloqué sur sa dernière position ou sur une séquence pré-définie par exemple, ou sous l'effet d'une commande spécifique, l'élément de reconnaissance et le lecteur se désactivent complètement. En introduisant successivement des lecteurs capables de se fixer sélectivement sur l'un, puis l'autre brin d'ADN et ainsi de suite, il est ainsi possible d'analyser tous les chromosomes d'un même lot de cellules. - Elle se déplace le long du brin d'ADN (Figure 4) : elle comporte pour cela un moteur 12) associé à des bras d'accrochage capables de faire avancer le lecteur d'un ou plusieurs crans dans un sens prédéfini le long de la chaîne d'ADN (1) à chaque commande de synchronisation (ou éventuellement spontanément mais en perdant alors la synchronisation entre plusieurs lectures effectuées simultanément par plusieurs lecteurs). Le cran est défini comme étant l'unité de codage de l'ADN, c'est à dire une base de celui-ci. Le déplacement se fait à la manière d'un moteur linéaire, par un enchaînement de déplacements de charges au sein de la molécule ou de mouvements de ses bras. Une commande d'avance venant d'un élément physique externe permet une synchronisation parfaite de nombreuses lectures effectuées sur des milliers de chromosomes simultanément, celle-ci étant avantageuse pour d'obtenir un signal de lecture de puissance suffisante (cf. Site de lecture). On peut par exemple utiliser une commande lumineuse (14) sous la forme d'une impulsion laser très brève reçue sur une molécule photo-réceptrice (13) attachée au lecteur. Sous l'effet de l'énergie absorbée, l'enchaînement des séquences s'enclenche automatiquement et le lecteur avance (ou recule) d'un (ou plusieurs) cran(s). D'autres méthodes de commandes peuvent être proposées: suite d'impulsions lumineuses de différentes énergies -dont l'ordre permet de faire avancer ou faire reculer le lecteur-, impulsion(s) magnétique(s) suffisante(s) pour exciter une molécule comprenant un ou plusieurs atomes sensibles aux champs magnétique ou aux champs électriques... toutefois moins facile â mettre en aeuvre du fait de l'anisotropie du récepteur magnétique associée aux positions aléatoires des molécules au sein de la solution. L'énergie développée par le moteur peut provenir complètement du photon reçu, et/ou de la consommation de molécules énergétiques (par exemple l'AdénosineTriPhosphate) présentes dans le milieu. II faut noter que la mécanique même du moteur linéaire capable de lire une molécule d'ARN existe dans les ribosomes. Le moteur du lecteur peut s'en inspirer en remplaçant (ou modifiant) l'élément de déclenchement par une molécule photo-réceptrice. - Elle comporte un ou plusieurs site(s) de lecture de la ou des bases situées en vis à vis associé â un émetteur d'informations (Figure 5). Ce(s) site(s) (18), placé en regard de la molécule d'ADN (1), voit sa structure spatiale ou ses charges électriques modifiées par la présence de la(les) base(s). Cette modification module un paramètre de l'émetteur d'informations (19) : à chaque lecture, le site envoie ainsi une information (21) spécifique de la(s) base(s) présente(s). Si la lecture s'effectue base par base -ou paire de bases complémentaires par paire de bases complémentaire si la molécule d'ADN est complète-, la modulation comporte au minimum 4 niveaux correspondant aux 4 bases possibles (une cinquième ou + permettant éventuellement de détecter une base anormale ou tout autre constituant prévu ou imprévu, ou simplement de signaler la fin de la lecture du brin d'ADN). Pour une lecture 2 bases par 2 bases, il faut un minimum de 16 niveaux, et pour n bases, 4 niveaux. La modulation peut utiliser un des nombreux procédés connus : elle peut, par exemple, modifier la longueur d'onde d'un photon émis à chaque avancement : une partie de l'énergie de la commande (20) utilisée pour faire avancer le moteur linéaire, par exemple un photon reçu par la molécule photo réceptrice (16) est utilisée directement ou indirectement pour activer le site de lecture. Celui-ci émet alors un photon avant, pendant ou après le déplacement. La modulation peut également s'appliquer au délai d'émission du photon après la commande. Un complément d'énergie peut être puisé par consommation d'ATP ou de toute(s) autre(s) molécule(s) présente(s) au sein de la solution. La combinaison d'un délai variable de réponse et modulation de la longueur d'onde émise est intéressante pour effectuer une analyse de plusieurs brins d'ADN simultanément (Analyse séquentielle multiple). En effet, si l'on utilise une molécule dont le délai de réponse est ajusté pour chaque type de séquence de reconnaissance, on a la possibilité de mixer les molécules de plusieurs types: chacune se fixe sur son brin d'ADN correspondant et émet son signal sans qu'il se mélange aux autres. L'analyse des réponses après chaque impulsion permet de qualifier ce que chaque type de molécule a vu. Prenons un exemple # La molécule Ll se fixe sélectivement sur le bout du brin ADN1. Son délai de réponse est de 100ns. # La molécule L2 se fixe sélectivement sur le bout du brin ADN2. Son délai de réponse est de 200ns. # La molécule L3 se fixe sélectivement sur le bout du brin ADN3. Son délai de réponse est de 300ns. # La molécule L8 se fixe sélectivement sur le bout du brin ADN8. Son délai de réponse est de 800ns. Toutes ces molécules ont un site de lecture identique réémettant sur 4 longueurs d'onde en fonction des bases lues. Prenons une solution contenant un mélange d'ADN1, ADN2, ADN3...ADN8. Mélangeons la avec un ensemble de molécules L1,12, 13 ... L8. A chaque impulsion (22), mesurons le signal reçu sur les photodétecteurs (Figure 6) Un traitement électronique classique permet de démultiplexer ces informations en fonction du temps et récupérer ainsi les données relatives à chaque ADN (23a, 23b..23h) et trouver la base analysée en comparant leur longueur d'onde (en ordonnée) aux niveaux de références correspondant à chaque type de base (24a, 24b, ...24d). Ce procédé simplifie et accélère l'analyse en réduisant le nombre d'étapes nécessaires et en n'utilisant qu'une seule ou quelques solutions à mélanger aux brins d'ADN. - Elle peut être associée â une molécule capable de séparer les deux brins d'ADN du chromosome. Cette séparation peut être nécessaire pour que le site de lecture soit bien placé par rapport aux bases lues. Une séparation locale au niveau du lecteur - des deux brins d'ADN peut être préférable à une séparation initiale complète des brins pour optimiser l'analyse et simplifier la préparation. L'EXCITATEUR (Figure 7) est chargé d'envoyer une ou plusieurs commandes à l'ensemble des lecteurs présents dans la solution d'analyse. # commande d'avance du moteur (éventuellement recul) # commande de lecture (éventuellement combinée à la précédente) # éventuellement commande de reset de lecture, afin de replacer le lecteur dans sa position de référence. Cette commande est utile dans le cas où l'on désire confirmer une anomalie majeure présente dans un gène. La confirmation peut cependant être également obtenue en injectant une nouvelle dose du lecteur spécifique à ce brin. Dans le cas d'une excitation laser, l'excitateur est constitué d'un laser (29) associé à un pilote électronique (27) lui permettant d'envoyer des impulsions très brèves, de durée et de longueur d'onde adaptées au lecteur. La commande de Reset peut être réalisée soit par une impulsion de durée différente, soit par une émission sur une autre longueur d'onde. La fréquence des impulsions doit être de préférence élevée afin de réaliser une lecture du code en un temps très court : avec des cycles de lus, un brin d'ADN de 100 millions de bases est lu en 100 secondes. Un cycle de 50ns permet de lire le même brin en 5s... Le DETECTEUR (32) est chargé de récupérer les informations émises par les lecteurs. Dans le cas d'émissions de photons, il peut être constitué d'une ou plusieurs cellules photoélectriques très sensibles ou avantageusement de photomultiplicateurs, placés autour de la solution d'analyse, et de telle manière qu'ils évitent d'être directement soumis au rayonnement laser de synchronisation : chaque photon émis à ainsi un pourcentage de chances important (10 à 50% environ) d'être intercepté par un capteur. Pour s'assurer une lecture très fiable, il suffit alors d'avoir au minimum quelques dizaines, ou mieux, quelques milliers de brins d'ADN identiques dans la solution d'analyse : la multitude de photons avec leurs directions aléatoires permet d'obtenir un signal important à chaque cycle, même si 90% des photons sont perdus. Le dispositif peut tolérer quelques erreurs de synchronisations. Un ensemble d'INJECTEURS de lecteurs (30) permet d'automatiser la lecture d'un ensemble connu de chromosomes. Chaque injecteur contient un lecteur capable de se fixer sélectivement sur un des chromosomes (ou brin d'ADN-ARN) présents dans la solution (31). Un agitateur assure la répartition des lecteurs dans la solution. Pour éviter qu'un surplus de lecteurs ne provoque une double lecture (ces derniers vont se fixer sur la séquence prévue dès que les lecteurs actifs la laisseront accessible), un inhibiteur des lecteurs libres doit être ajouté après chaque injection de lecteur, à moins de s'assurer que le nombre de lecteurs injectés reste toujours inférieur au nombre de chromosomes présents. Dans le cas de lecteurs ayant des délais de réponse variables en fonction du type de séquence, le nombre d'injecteurs peut être extrêmement réduit (une seul si le nombre de délais de réponse égale le nombre de brins d'ADN différents). L'EQUIPEMENT INFORMATIQUE est chargé de piloter les injecteurs, l'excitateur, de traiter les informations reçues, et d'assurer l'interface Homme - Machine. Sa structure peut être basée sur un ordinateur assez puissant (25) associé à une interface électronique chargée des opérations spécifiques (excitation - lecture). L'interface (27 et 29) reçoit des commandes de lecture, reset... et envoit à l'ordinateur le résultat de une ou plusieurs lectures successives. Le programme de l'ordinateur effectue alors une reconnaissance des séquences de bases, et une vérification de la constitution de ces molécules afin d'obtenir idéalement une carte génétique complète du(des) chromosomes) analysé(s), ou du moins un rapport complet. Des analyses plus sophistiquées peuvent bien sûr s'effectuer sur cette carte génétique afin de reconnaître toute anomalie ou caractéristique particulière du code génétique, l'efficacité des gènes répresseurs, et l'expression des gênes. En associant les points cités ci-dessus, le dispositf décrit par l'invention permet d'effectuer l'analyse de chromosomes de la façon suivante - récupération de quelques milliers de cellules sur l'individu, l'animal ou l'échantillon par frottis d'une muqueuse par exemple. - Mise en solution de ces cellules et préparation des chromosomes (éclatement des membranes pour les disperser, séparation des chromosomes allèles et éventuellement séparation des brins et isolement des autres constituants cellulaires. Si les délais de réponses sont fixes et les longueurs d'onde modulées par les bases - ou inversement - Injection du premier lecteur capable de se fixer sur le début d'un des chromosomes ou d'un brin d'ADN. - Suite d'activations et de lectures des données pour déplacer le lecteur le long de la chaîne d'ADN et récupérer le code génétique du chromosome. Le lecteur se désactive complètement en fin de lecture. - Injection du deuxième lecteur capable de se fixer sur un second chromosome. - Lecture du code génétique de ce second chromosome. - Injection du n"' lecteur se plaçant sur le dernier chromosome. - Lecture du code génétique du dernier chromosome. Si les délais de réponses sont variables etr les longueurs d'ondes modulées par les bases (ou inversement) - injection du mélange de lecteurs qui se fixent chacun sur leur chromosome ou brin d'ADN. - Lecture séquentielle et simultannée des codes de l'ensemble des chromosomes. Puis, dans les deux cas - Traitement des données recueillies afin d'établir un code génétique complet. - Evaluation, comparaison des données... afin d'obtenir le résultat d'analyse souhaité... Le dispositif décrit ci-dessus ne peut lire directement une paire de chromosomes, tels qu'ils sont au sein de la cellule. En effet, chaque paire de chromosome contient le chromosome du père et celui de la mère de l'individu. principe de lecture énoncé conduit à une lecture correcte tant que les deux chromosomes sont identiques, mais donne des valeurs erronées lorsqu'ils comportent des segments différents, ce qui arrive fréquement. Or la séparation des deux chromosomes est une opération techniquement délicate, même s existe aujourd'hui diverses méthodes. Pour l'éviter, l'invention propose de traiter les données fournies par une suite de mesures répétitives des mêmes nucléotides, chacune étant incomplète du fait de l'aléa de chaque émission de photon, afin de retrouver l'ensemble des données après corrélation et combinaison logique de ces mesures. L'exemple suivant indique la marche suivie - dans une solution contenant une paire de chromosomes. - injection d'un seul lecteur dans la solution de chromosomes : elle se fixe sur l'un des chromosomes. - commande, réception (très sensible/photomultiplicateur) et lecture des données: le nombre de photons est réduit (1 seul émis à chaque impulsion et souvent absorbé ailleurs que par le capteur) et le code est très incomplet, avec, par exemple, 1 réponse pour 10 impulsions envoyées. La réponse est stockée. - réitération du processus quelques centaines de fois : à chaque fois, le lecteur (éventuellement le même s'il peut être reactivé) se fixe sur un des chromosomes et envoie un code très incomplet qui est stocké. Par comparaison, corrélation et calcul, l'ordinateur reconnaît sans difficulté les réponses propres à chaque chromosome, les associe et retrouve le code complet de chacun. Si quelques séquences sont incomplètes, l'ordinateur relance le processus jusqu'à obtenir le complément. Dans les enregistrements ci-dessous, les cycles ayant donné une réponse sont représentés par un chiffre (1 à 4) et les cycles sans réponse (photon perdu) par un point d'interrogation. enregistrement 1 : ????1????3???4???????2????3????1?3??2???4?????1????.. enregistrement 2 : ??3???4????3?4???2?1????1???4??1???3???1???2??1??3?.. enregistrement 3 : ?4???3???2?1??3?????4??2??1???3??????2??2??????3???.. enregistrement 4 : ???????2???3????4?????3??2?3?????3???1???3???2??1??.. enregistrement 5 : ??2??3??1???4????1??43???????2???1???2?1???4???3?2?.. Par comparaison de cycles identiques, il apparaît que les enregistrements 1,2 et 4 proviennent du même chromosome et que les enregistrements 3 et 5 d'un autre chromosome. Par addition de ces quelques enregistrements, on trouve déjà un code plus complet pour chaque chromosome 1+2+4 : ??3?1?42?3?3?4??42?1?23?12334??1?3?321?133?2?21?13... 3+5 ?42??3??12?14?3??1??43?2??1??23??1???2?12??4???3?2...... En associant des lecteurs de différents types avec des délais de réponse différents, l'opération s'effectue simultanément sur plusieurs chromosomes. REVENDICATIONS 1- Dispositif de lecture séquentielle de polynucléotides utilisant une molécule de lecture se déplaçant le long du polynucléotide, associant un moteur (17) lié à des éléments (15) assurant l'attraction et/ou la répulsion et le déplacement, moteur commandé par un récepteur de signaux de synchronisation (16), et un émetteur (18 & 19) modulé par le ou les types de nucléotides situés à sa proximité (20). 2.- Dispositif selon la revendication 1 associé à une sonde (9) capable de placer la molécule de lecture (10) dans une position déterminée du polynucléotide. 3.- Dispositif selon la revendication 2 dans lequel le moteur ou l'émetteur ne fonctionne que si la sonde est parfaitement placée. 4 - Dispositif selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel le récepteur de synchronisation (16) est constitué d'une molécule photo-réceptrice. 5 - Dispositif selon la revendication 1, 2, 3 ou 4, dans lequel l'émetteur (19) est un générateur de photons dont la longueur d'onde est modulée par le ou les types de nucléotides situés à sa proximité. 6 - Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le délai entre la commande de synchronisation et l'émission du photon est dépendant du type de sonde chargée de placer la molécule, délai choisi de façon à pouvoir mixer plusieurs molécules de délais différents pour éviter les interactions au niveau des capteurs lors de lectures simultanées de plusieurs polynucléotides différents. 7 - Dispositif selon la revendication 1, 2, 3 ou 4 dans lequel l'émetteur est un générateur de photons dont le délai d'émission après la commande de synchronisation est modulée par le ou les types de nucléotides situés à sa proximité. 8 - Dispositif selon la revendication 7, dans lequel la longueur d'onde de l'émission est dépendante du type de sonde chargée de placer 1a molécule, longueur d'onde choisie de façon à pouvoir mixer plusieurs molécules de longueurs d'ondes différentes pour éviter les interactions au niveau des capteurs lors de lectures simultanées de plusieurs polynucléotides différents. 9 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la molécule se désactive lorsqu'elle atteint la fin du polynucléotide à lire. 10 - Dispositif selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, dans lequel la molécule peut être détachée et replacée à sa position initiale par une commande spécifique. 11- Dispositif selon la revendication 10, dans lequel la commande spécifique est une impulsion lumineuse, reçue par une molécule photo-réceptrice. 12 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes" dans lequel la molécule comporte un élément capable de séparer localement les deux brins de polynucléotides constituant le chromosome. 13 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, associant une commande de synchronisation produite à l'aide d'un laser (29). 14 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, utilisant des cellules photoélectriques ou des photomultiplicateurs (32) pour détecter les photons émis par les émetteurs des molécules de lecture. 15 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, associant un ensemble d'injecteurs (30), contenant chacun une solution composée d'un ou plusieurs type de molécules capable(s) de s'associer chacune avec un chromosome ou un brin de polynucléotide particulier. 16 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, associant un ensemble informatique (25) et des interfaces spécifiques (27 & 28) pour commander l'avance des molécules et traiter les informations reçues. 17 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le traitement des données se fait à partir d'un suite de mesures répétitives des mêmes nucléotides, chacune étant incomplète du fait de l'aléa de chaque émission de photon, afin de retrouver l'ensemble des données après corrélation et combinaison logique de ces mesures.