FR 2806910 A1 20011005 FR 0004212 A 20000403 La présente invention se rapporte à un procédé d'inactivation virale de toute solution hydro-alcoolique et notamment de dilutions homéopathiques. En homéopathie, les substances thérapeutiques les plus souvent utilisées sont des solutions plus ou moins diluées, qui sont les principes actifs des médicaments. Les dilutions homéopathiques sont réalisées le plus souvent par la méthode de Hahnemann. Elles sont effectuées dans un mélange hydro-alcoolique de titre approprié. Elles nécessitent de travailler en évitant toute souillure ou contamination de nature chimique ou particulaire, étant donné les doses infimes de principe actif le plus souvent mises en jeu. Parmi les matières premières utilisées en homéopathie, on fait appel à des substances d'origine animale (venin de serpent, venin d'abeille) et/ou d'origine biologique susceptibles d'être contaminées par des virus potentiellement pathogènes et dangereux pour les patients. Les infections virales sont un problème important de santé publique; elles sont liées à l'ingestion d'aliments ou de boissons contaminés, à l'environnement ou aux contacts entre les personnes. De nombreux procédés d'inactivation virale ont été mis en #uvre pour lutter contre de telles infections. Ainsi dans le cadre des collectivités (hôpitaux, écoles, maisons de retraites), afin d'éviter les épidémies de gastro-entérites dues aux virus de type Norwalk et Norwalk, Doultree J.C. et al. (Journal of Hospital Infection, 1999, 41, 51-57) ont montré que parmi les désinfectants classiquement utilisés, le glutaraldéhyde, les dérivés iodés et l'eau de javel étaient aptes à détruire le virus alors que les dérivés d'ammonium quaternaire, les détergents et l'éthanol à une concentration de 75% étaient sans effet. Ces auteurs ont également montré que la totale inactivation du virus n'est obtenue qu'après une heure de chauffage à 56 C et après 5 minutes à une température de 70 C. Dans le cas des dérivés sanguins d'origine humaine ou animale, qui sont utilisés à des fins thérapeutiques, prophylactiques ou de diagnostiques chez l'homme et qui présentent un risque élevé d'infection pour les patients (SIDA, hépatite-C, etc.), l'inactivation virale est fondamentale. Toutefois dans le cas de ces dérivés, les méthodes d'inactivation virale utilisées doivent permettre d'inactiver les virus potentiellement dangereux pour le patient tout en conservant les propriétés biologiques des dérivés sanguins, et la mise en ceuvre de tels procédés est toujours délicate. De plus l'ensemble des virus n'étant pas sensible aux mêmes agents, il est souvent nécessaire de combiner différentes techniques d'inactivation, ce qui complique la mise en #uvre des procédés. Parmi les différentes méthodes d'inactivation utilisées dans ce cadre, on peut notamment citer le chauffage des dérivés sanguins en solution aqueuse ou à l'état sec, le traitement de ces dérivés par des détergents et des solvants, éventuellement suivi d'un chauffage du produit à l'état sec. Compte tenu de la nécessité d'apporter une garantie de l'inactivation virale dans les préparations à usage homéopathique, la mise au point de nouveaux procédés adaptés, rapides et économiques permettant d'inactiver un grand nombre de virus s'avère nécessaire. Or les Inventeurs ont trouvé de manière surprenante qu'en chauffant de façon modérée les dilutions homéopathiques réalisées à partir d'un mélange d'eau et d'éthanol surchargées en virus, à des températures compatibles avec leur activité thérapeutique, on obtenait une inactivation du virus, du fait d'une synergie d'action entre l'éthanol présent dans ces dilutions et le chauffage maintenu pendant une durée suffisante. Aussi la présente invention a-t-elle pour objet un procédé d'inactivation virale de toute solution hydro- alcooolique et en particulier des dilutions homéopathiques, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de chauffage à une température comprise entre 39 C et 65 C 1 C, pendant au moins une heure, en présence d'éthanol de titre alcoolique compris entre 10 % v/v et 75% v/v. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dilutions homéopathiques sont choisies dans le groupe constitué par les dilutions Hahnemanniennes, les dilutions Korsakowiennes et les dilutions Millésimales. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la durée du chauffage est comprise entre au moins 1 heure et 24 heures. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, la température est comprise entre 39 C et 54 C 1 C. Le procédé selon l'invention est facile à mettre en oeuvre et permet d'inactiver des virus particulièrement résistants à tout traitement physico-chimique, notamment les virus de la famille des Parvoviridae, du genre Parvovirus, comme le virus minute de la souris (Minute virus Mi ce ou MVM). Les exemples 1 et 2 qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple 1 1.1 Matériel et méthode 1.1.1. Dilution homéopathique Du venin de serpent à la dilution 3 CH (3ème Dilution Centésimale Hahnemannienne) réalisée dans de l'éthanol à 40 % (v/v) a été utilisé comme matériel de départ. I1 est dénommé Lachesis 3CH. 1.1.2 Virus minute de la souris (MVM) Le virus minute de la souris appartient à la famille des Parvoviridae, genre Parvovirus. C'est un virus non enveloppé, de symétrie icosaédrique, de 18 à 26 nm de diamètre. Le génome est une molécule d'ADN simple brin, de polarité négative de 5 kb. Les Parvovirus sont très diversifiés, spécifiques d'espèces, mais certains d'entre eux traversent la barrière des espèces, de plus ils ont des propriétés physico-chimiques exceptionnelles. La majorité des Parvovirus sont des contaminants de rongeurs (rats, souris, hamsters) et des carnivores (chats, chiens etc.). Les tissus porteurs de Parvorivus sont principalement: le rein, le pancréas, le poumon, les tissus lymphoïdes, la moelle osseuse, les testicules. Ils peuvent donner des infections nombreuses et variées: diarrhées, entérites, hépatites... Ces virus présentent une grande résistance, aux hautes températures (60 à 80 C), à la déshydratation, aux variations de pH et aux traitements solvant/détergent. Aussi il est difficile d'inactiver ou d'éliminer ces virus dans les produits pendant ou après le processus de production pharmaceutique. Le MVM (souche prototype) est obtenu à partir du surnageant de culture de cellules A9 infectées. Après clarification à 3500 rpm (Sigma 3K2) pendant 15 minutes, les cellules sont collectées et remises en suspension dans du tampon PBS (8,0 g/1 NaCl, 1,44 g/1 Na2HP04, 2H20, 0,2 g/1 KCl, 0,2 g/1 KH2P04, pH=7,4), soniquées, clarifiées à 2500 rpm pendant 10 minutes, aliquotées et congelées à -75 C 5 C. Les surnageants sont concentrés par ultracentrifugation à 19 000 rpm pendant 15 heures (rotor Beckman R19). Le culot est remis en suspension en tampon PBS aliquoté et congelé à -75 C 5 C. Le titre est déterminé par la méthode des plages en agarose sur cellules A9. Le stock de virus utilisé a un titre de 5,2.107 unités formant plages par millilitre (UFP/ml). 1.1.3. Cellules il s'agit des cellules A9, (Deutsches Krebsforschungzentrum, Heidelberg) issues d'une lignée continue de fibroblastes de souris. Ces cellules sont cultivées en DMEM à 4,5 g/1 de glucose, 110 mg/1 de pyruvate de sodium et 1,1 g/1 de bicarbonate de sodium, additionné de 4 mM de glutamine et de 5% de sérum de veau f#tal. 1.1.4 .Préparation des échantillons surchargés en virus 100 ml de matériel de départ surchargé avec du MVM à la concentration finale de 1,72.106 unités formant plages par millilitre (UFP/ml) ont été préparés à température ambiante (16 C-26 C). 1.1.5. Incubation et titrage Après homogénéisation, un échantillon a été prélevé pour les contrôles positifs L1, L2 et L3. Le matériel de départ surchargé a été divisé en deux parties de 45 ml chacune. Chaque partie a été ensuite incubée soit à 39 C 1 C, soit à 54 C 1 C, sans agitation pendant 8 heures. Des prélèvements ont été réalisés après 1 heure, 3 heures et 8 heures d'incubation à raison de deux prélèvements par temps (A et B). Ceux-ci ont été immédiatement dilués en milieu de culture et ultracentrifugés à 95 000 rpm pendant 20 minutes à environ 4 C (rotor Beckman TLA 100.4). Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75 C 5 C jusqu'au titrage. Le temps zéro de l'expérience a été décompté dès que la température du matériel de départ surchargé a atteint la limite inférieure de la température testée. La température des expériences a été contrôlée et enregistrée à l'aide de sondes ou de thermomètres calibrés. Le facteur de réduction moyen appelé m(R) est obtenu en calculant la différence entre les logarithmes des titres moyens de chaque échantillon concerné. 1.1.6. Témoins V1: Stock de virus dilué en milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75 C 5 C jusqu'au titrage. V2: Stock de virus dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. V3: Stock de virus dilué en milieu de culture, laissé à température ambiante (16 C - 26 C) pendant la durée de l'expérience, puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L1: Matériel de départ surchargé dilué 50 fois en milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L2 : Matériel de départ surchargé dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L3: Matériel de départ surchargé, laissé à température ambiante (16 C - 26 C) pendant la durée de l'expérience puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. 1.2. Résultats 1.2.1. Témoins sans chauffage Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml). Le venin de serpent à la dilution 3CH (3e 'e Dilution Centésimale Hahnemannienne) réalisée dans l'éthanol à 40% v/v et ultracentrifugé n'a présenté aucune toxicité pour les cellules du titrage du MVM non dilué (témoin négatif N2). Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée au cours de l'ultracentrifugation du MVM surchargé, soit dans le milieu de culture (V2 comparé à V1), soit dans le matériel de départ (L2 comparé à L1). Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée lors de l'incubation à la température du laboratoire pendant la durée de l'expérience du MVM surchargé soit dans du milieu de culture (V3 comparé à V2), soit dans le matériel de départ (L3 comparé à L2). 1.2.2. Effet du chauffage en présence d'éthanol Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2 et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml). Les résultats obtenus montrent qu'un chauffage à 39 C 1'C en présence d' éthanol à 40% (v/v ) ne permet pas d'inactiver le MVM, même après 8 heures d'incubation. En revanche, le chauffage à 54 C 1 C dans les mêmes conditions a permis d'observer une inactivation progressive du virus MVM au cours du temps pour atteindre 2,77 log (prélèvement A) et 2,84 log (prélèvement B) après 8 heures. Tableau 2 Echantillon Titre infectieux (UFP l ml) Stock de virus dilué en milieu de culture et ultracentrifugé (PFU I ml) (3,46 + 1,02) 105 Stock de virus dilué dans le matériel de départ et ultracentrifugé Expérience A (2,66 + 0,80) 105 Expérience B (2,98 + 0,86) 105 Stock de virus dilué dans le matériel de départ incubé à 39 C + 1 C 54 C + 1 C pendant: 1 heure Expérience A Résultats non retenus (8,46 + 1,42) 105 Expérience B (2,46 + 0,38) 105 (8,84 + 2,32) 104 3 heures Expérience A (1,10 + 0,16) 105 (5,76 + 1,50) 103 Expérience B (1,55 + 0,39) 105 Résultats non retenus 8 heures Expérience A (3, 82+0,96) 104 (4.54 + 1,06) 102 Expérience B (8188 + 3,00) 104 (4,30 + 1,02) 102 Facteur de réduction moyen (m(R) et intervalle de confiance (Rmin 5 R _ Rmax) après 8 heures de chauffage en présenced'éthanol 40% (v/v) Expérience A 0,84 2,77 0,59:9 R:5 1 ,08 2,52 11:9 3.00 Expérience B 0,53 2,84 0,25 R 0,81 2,60:g R :g 3,07 Exemple 2 2.1. Matériel et méthode 2.1.1.Dilution homéopathique Du venin de serpent à la dilution 3DH (32 'e Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l'éthanol à 40% v/v, a été utilisé comme matériel de départ et dénommé Lachesis 3DH (lot n PA 482). 2.1.2. Virus Minute de la Souris (MVM) I1 est obtenu selon le mode opératoire décrit en 1.1.2. 2.1.3.Cellules Elles sont cultivées selon le mode opératoire décrit en 1.1.3. 2.1.4. Préparation des échantillons surchargés en virus L'expérience a été réalisée en double (Expériences A et B) à 54 C 1 C sur 6 temps de contact avec une dilution 3DH (3ème Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l'éthanol à 40% v/v de la souche Lachesis. Deux surcharges indépendantes ont été réalisées à température ambiante (16 C - 26 C) avec le virus MVM, de manière à avoir une concentration finale en MVM de 2,26.10' UFP/ml. La première surcharge a été utilisée pour les prélèvements aux temps 1 heure, 3 heures, 8 heures et 10 heures. La deuxième surcharge a été utilisée pour les prélèvements aux temps 1 heure, 16 heures et 20 heures. 2.1.5.Incubation et titrage Le matériel de départ surchargé a été incubé à 54 C 1 C, sans agitation, pendant 20 heures. Le temps zéro de l'expérience a débuté lorsque la température du matériel de départ surchargé a atteint la limite inférieure de la température testée. Des prélèvements ont été réalisés après 1 heure, 3 heures, 8 heures, 10 heures, 16 heures et 20 heures d'incubation. Ceux-ci ont été immédiatement refroidis, dilués en milieu de culture et ultracentrifugés à 95 000 rpm pendant 20 minutes à environ 4 C (rotor Beckman TLA 100.4). Les culots ont été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquotés et congelés à -75 C 5 C jusqu'au titrage. La température des expériences a été contrôlée et enregistrée à l'aide de sondes ou de thermomètres calibrés. Le facteur de réduction moyen appelé m (R) est obtenu en calculant la différence entre les logarithmes des titres moyens de chaque échantillon concerné. 2.1.6.Témoins V1: Stock de virus dilué en milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75 C 5 C jusqu'au titrage. V2: Stock de virus dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75 C 5 C jusqu'au titrage. V3: Stock de virus dilué en milieu de culture, laissé à température ambiante (16 C - 26 C) pendant la durée de l'expérience, puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. V4: Stock de virus dilué dans le milieu de culture chauffé à 54 C 1 C pendant 16 heures (V4 a) et 20 heures (V4 b), puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture , aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L1: Matériel de départ surchargé dilué 50 fois en milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L2: Matériel de départ surchargé dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. L3: Matériel de départ surchargé (2ème surcharge) laissé à la température ambiante pendant 16 heures (L3a) et 20 heures (L3b) puis ultracentrifugé comme précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75 C 5 C jusqu'au titrage. 2.2. Résultats 2.2.1 Témoins *Effet du matériel de départ sur 1'infectivité des virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée lorsque le virus était dilué dans le matériel de départ, Lachesis 3DH, (3ème Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l'éthanol à 40% v/v puis stocké à - 75 C 5 C jusqu'au titrage [L1 (3,16 0,44).10' comparé à V1 (3,64 0, 67) .10-'] . *Effet de l'ultracentrifugation sur 1'infectivité des virus Pour le virus MVM dilué en milieu de culture, aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée [V2 (3, 64 0, 67) . 10.' comparé à V1 ] . En revanche, une perte significative de particules infectieuses a été observée lorsque le virus dilué dans le matériel de départ a été ultracentrifugé. Cette perte de particules infectieuses est probablement due au matériel de départ et non aux conditions d'ultracentrifugation utilisées. Toutefois, cette perte de particules infectieuses ne sera pas prise en compte dans le calcul du facteur de réduction de l'étape. *Effet du chauffage à 54 C 1 C du virus en milieu de cul ture Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée après 20 heures de chauffage à 54 C 1 C du milieu de culture surchargé avec du MVM [V4 a (8,44 1,44) .106 comparé à V2] et [V4 b (9, 4 6 1, 52) .106 comparé à V2 ] *Effet de 1a durée de l'expérience sur 1'infectivité du virus dilué en matériel de départ Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée après 16 heures et 20 heures d'incubation à température ambiante du matériel de départ surchargé [L3a (3,04 0,86).106 comparé à L2 (1, 13 0, 17) .10D] et [L3b (1, 60 0, 31) .10c comparé à L21 . 2.2.2. Effet du chauffage en présence d'éthanol Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 3.A et 3.B et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml). Le chauffage à 540C 1'C de la dilution 3DH (3P" Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l'éthanol à 40% v/v de la souche La chesis permet l'inactivation du MVM de façon très significative après 20 heures. En effet, une perte de 2,90 log (Expérience A) et de 2,80 log (Expérience B) a été obtenue. Des résultats similaires ont été obtenus pour les 2 cinétiques réalisées. REVENDICATIONS 1. Procédé d'inactivation virale de toute solution hydro-alcoolique et notamment de toute dilution homéopathique réalisée en milieu hydro-alcoolique caractérisé en ce qu'on chauffe à une température comprise entre 39 C et 65 C 1 C, pendant au moins une heure, en présence d'éthanol de titre alcoolique compris entre 10% v/v et 75% v/v. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dilution homéopathique est choisie dans le groupe constitué par les dilutions Hahnemanniennes, les dilutions Korsakowiennes et les dilutions Millésimales. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la durée du chauffage est comprise entre au moins 1 et 24 heures. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la température est comprise entre 39 C et 54 C 1 C.