FR 2806303 A1 20010921 FR 0003430 A 20000317 Composés capables de se lier à des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette et leurs applications pour la fabrication de médicaments. L'invention concerne des composés capables de se lier à des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette. Elle vise plus spécialement leurs applications pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant des dysfonctionnements de ces protéines. Le cytosquelette est un réseau complexe (1) qui comprend les réseaux primaires de trois classes de filaments cytosquelettiques (microtubules, microfilaments, et filaments intermédiaires) auquel s'ajoute un réseau microtrabéculaire qui comprend la majorité des protéines associées aux microtubules, microfilaments et filaments intermédiaires. La protéine MAP2est un exemple caractéristique de composant de ce réseau : elle possède un domaine de liaison aux microtubules, mais également aux microfilaments (2,3) et aux filaments intermédiaires (4,5). Les microtubules sont des cylindres creux de 25 mm de diamètre externe dont la paroi est constituée de protofilaments, eux-mêmes formés par l'empilement de sous-unités globulaires a et (3 de tubuline (50 Kd). Aux hétérodimères de tubuline sont associées, de façon périodique, des protéines appelées MAPs (microtubule associated proteins) dont le rôle est de faciliter l'assemblage de la tubuline, mais aussi l'organisation et les fonctions du réseau microtubulaire. La tubuline présente une grande hétérogénéité. Elle comprend en effet de nombreuses isoformes provenant à la fois de l'expression de plusieurs gènes et de très nombreuses modifications post-traductionnelles (6). Les MAPs sont divisées en deux groupes à savoir, les MAPs "structurales" impliquées dans l'assemblage des tubulines et les MAPs "motrices" qui utilisent les microtubules comme rails pour assurer le mouvement de certaines molécules et organelles. Les MAPS structurales visées dans l'invention comprennent plusieurs familles de protéines à savoir, les protéines MAP1 A et B (350 Kd) codées par des gènes distincts, les protéines MAP2 A et B de haut poids moléculaire (300 Kd), les protéines MAP2 C et D de bas poids moléculaire (70 Kd environ), les protéines MAP3A et B (180 Kd) présentes dans les neurones jusqu'à 10 jours après la naissance, les protéines MAP4 A , B et C (215 à 240 Kd) ubiquitaires , à propriétés très voisines de celles de MAP2, les protéines Tau (50-67 Kd ou 110-120 Kd), les protéines STOP (145 Kd), molécules très stabilisantes des microtubules. Dans le neurone, les microtubules sont impliqués dans de nombreuses fonctions (la croissance neuritique, le maintien de morphologies complexes comme les arborisations dendritiques, le transport axonal de molécules diverses). Par exemple, les protéines MAP2 participent à l'arborisation dendritique, alors que les protéines tau sont essentielles pour la croissance axonale. On sait également que les différents isotypes de chaque MAP ont une localisation et des rôles spécifiques. MAP2 B augmente son expression du stade foetal au stade adulte. MAP2 A s'exprime seulement à partir d'un certain stade de développement. MAP2 C (2), qui s'exprime essentiellement dans les stades précoces de développement, est encore présente dans le bulbe olfactif (7) et dans les cellules photoréceptrices de la rétine (8) de l'adulte. MAP2 D est localisée au niveau de l'hippocampe dès le stade foetal (3). Les microfilaments sont des polymères constitués d'actine (43 Kd). Très abondants dans la région corticale de l'axone, on les trouve aussi dans la région centrale où ils participent à son architecture dynamique. Les filaments intermédiaires des neurones, polymères constitués par un triplet de protéines (68, 150, et 200 Kd), sont présents dans les neurones différenciés. Interconnectés avec les microfilaments et les microtubules, ils aident au maintien de l'architecture neuronale, les MAPS servant de pont entre les trois types de structures filamenteuses cytosquelettiques. Après avoir mis en évidence, une liaison saturable de haute affinité dans le cytosol de cerveau de rat (foetus et adulte jeune) avec des stéroïdes, les inventeurs ont constaté que des préparations hautement purifiées de MAP2 possédaient les mêmes caractéristiques de liaison. Des travaux in vitro des inventeurs ont également démontré une action spécifique de stéroïdes sur la polymérisation des structures du cytosquelette. Or, actuellement, on considère que les effets des stéroïdes s'exercent par l'intermédiaire de récepteurs solubles intracellulaires d'une autre classe protéique. Ces récepteurs ont été clonés et souvent classés comme "nucléaires" du fait de leur mode d'action en tant que facteurs de transcription au niveau du génome. Une série d'observations publiées au cours des 20 dernières années indique que des récepteurs pour des stéroïdes fonctionnent également au niveau de la membrane plasmique de cellules cibles, l'action des neurosteroides au niveau de récepteurs aes neurotransmeneurs en étant un exemple important. En mettant en évidence une interaction directe de stéroïdes, plus spécialement de la prégnènolone (PREG en abrégé), avec des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette, les inventeurs ont révélé un nouveau mécanisme d'action de ces composés, pouvant être avantageusement mis à profit pour intervenir sur toutes les fonctions impliquant les microtubules, filaments intermédiaires et microfilaments, y compris la croissance, la différenciation, la plasticité des neurones, la prévention et la réparation des affections et lésions neurodégénératives, et plus généralement tous les phénomènes de division cellulaire. De manière générale, ce nouveau mécanisme d'action concerne tout composé non toxique, capable de passer la barrière hémato-encéphalique, et capable de lier le même site que la PREG sur lesdites protéines, ou de déplacer la PREG, et d'exercer un effet sur l'assemblage et la stabilisation des microtubules. L'invention a donc pour but de fournir des composés capables de se lier aux protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette tels qu'identifiés par une méthode de criblage, comprenant la mise en contact de ces composés avec lesdites protéines, dans des conditions permettant l'établissement d'une liaison lorsque la protéine, MAP2 par exemple, est un récepteur pour le composé. L'invention vise tout particulièrement l'utilisation de tels composés pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant ces protéines. Les composés utilisables selon l'invention pour la fabrication de médicaments sont plus spécialement des hormones stéroïdes, (ce terme étant utilisé dans la description et les revendications pour couvrir leurs conjugués, comme les esters sulfates, ou les esters d'acides gras), leurs précurseurs, leurs métabolites, libres ou conjugués, ainsi que leurs analogues, stéroïdiens ou non stéroïdiens. Comme précurseur d'hormones stéroïdes, on citera en particulier la prégnènolone ou ses esters, notamment le sulfate de prégnènolone (PREGS), pour lesquels aucun récepteur intracellulaire n'a été identifié à ce jour. Les analogues sont des agents pharmaceutiques capables d'augmenter la formation des microtubules, de les stabiliser dans les conditions données dans les exemples en rapport avec PREG, d'entrer en compétition avec PREG pour la liaison à MAP2 et de passer la barrière hémato-encéphalique en demeurant si possible séquestrés dans le système nerveux (9,10,11). Ils comprennent des composés polycycliques, naturels ou énantiomériques, éventuellement en mélanges, leurs sulfates, ou leurs dérivés lipidiques. En tant que produits nouveaux, l'invention vise les produits d'addition et/ou de substitution élaborés à partir desdits composés d'une part et des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette d'autre part. L'invention vise notamment les produits de couplage stéroïdes - protéines associées - microtubules, en particulier, stéroïdes - MAP2, le cas échéant sous forme copolymérisée à la tubuline, ou stéroïdes - protéines tau sous forme copolymérisées à la tubuline. L'invention vise également l'utilisation de protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette comme récepteurs de composés tels que définis ci-dessus. L'action exercée par ces composés sur la polymérisation et la stabilisation des structures du cytosquelette, comme illustré dans les exemples, leur confère un grand intérêt pour fabriquer des médicaments. L'invention vise donc l'utilisation desdits composés pour fabriquer des médicaments capables de se lier spécifiquement à des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette à localisation cytoplasmique ou nucléaire pour le traitement de pathologies avec dysfonctionnement de ces protéines. Elle vise notamment l'utilisation desdits composés pour fabriquer des médicaments pour le traitement du système nerveux, système nerveux central ou système nerveux périphérique. De tels médicaments permettent notamment de stimuler la différenciation/maturation des neurones. L'invention vise en particulier la fabrication de médicaments administrables sous forme orale, en vue du traitement du système nerveux central, ou sous forme injectable, pour une administration par la voie générale ou in situ. D'autres formes d'administration entrent dans le cadre de l'invention, comme les solutions retard ou les pré-drogues avec conjugaison, par exemple, à un acide gras. Pour augmenter la biodisponibilité, il est également prévu, selon l'invention, d'utiliser les principes actifs sous forme de dérivés appropriés, tels que les esters d'acides gras. Dans ces applications, les médicaments fabriqués conformément à l'invention sont avantageusement utilisés en association avec des facteurs de croissance (NGF) et/ou des régulateurs cellulaires, comme l'interféron ou les cytokines. Des applications de grand intérêt comprennent la prévention ou le traitement d'affections telles que la maladie d'Alzheimer, les démences d'origine vasculaire, les conséquences de traumatismes et d'accidents vasculaires au niveau du système nerveux et les maladies neuro-dégénératives. L'invention vise également la fabrication de médicaments, à l'aide desdits composés, pour lutter contre le vieillissement des cellules nerveuses, ou de tout autre type cellulaire contenant des MAPs, comme les cellules épithéliales, les cellules thyroïdiennes, ou des glandes endocrines, stéroïdogènes notamment. Dans ces applications pour le traitement du système nerveux et du vieillissement des cellules, lesdits composés peuvent être utilisés en association avec des composés à effet stabilisateur du cytosquelette, tel que le Taxol et le Taxotère#. Dans la mesure où les deux types de molécules, composés stéroïdes ou analogues stéroïdiens ou non stéroïdiens, d'une part, Taxolo ou Taxotère 0 ou équivalent, d'autre part, ont un effet stabilisateur des microtubules, il est possible d'envisager un phénomène de synergie si les deux médicaments sont utilisés simultanément. Dans ce cas les doses des deux médicaments requises pour une bonne efficacité seront très inférieures à celles requises lorsque les médicaments sont données en monothérapie. Selon un autre aspect de grand intérêt de l'invention, les médicaments ci-dessus sont utilisables pour le traitement de cancers, en association avec des agents anticancéreux, et permettent de moduler l'effet de ces derniers, en particulier en cas de chimio-résistance. De telles associations avec des agents à tropisme microtubulaire sont en effet susceptibles de potentialiser les effets respectifs des produits. Dans ces différentes applications, les composés mis en oeuvre sont associés aux véhicules pharmacologiquement acceptables appropriés pour la forme galénique choisie. Les doses unitaires sont de l'ordre de 100 à 500 mg et les doses quotidiennes de l'ordre de 500 mg à 1 g pour une administration par voie générale, cette dose étant réduite pour une administration in situ. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans la description qui suit, avec référence aux figures 1 à 7, qui se rapportent, respectivement, - la figure 1, à la liaison à l'équilibre de PREG ['H] à du cytosol de cerveau foetal, - la figure 2, à la chromatographie de cytosol de cerveau foetal par FPLC sur colonne échangeuse d'ions Mono Q, - la figure 3, à la chromatographie des pics Mono Q par FPLC sur une colonne de gel filtration Superose 12, - la figure 4, à l'immunoblot du cytosol et des fractions de l'un des pics éluées des colonnes d'échange d'ions et de gel filtration, - la figure 5, la liaison à l'équilibre de PREG [3H] à MAP2 purifiée, complexée ou non à de la tubuline purifiée, - la figure 6, aux cinétiques d'assemblage de microtubules, et - la figure 7, à l'immunocytochimie de neurones de cerveau de rat foetal. 1 - Matériels et méthodes Animaux On utilise des rats Sprague-Dawley de l'élevage Janvier (Le Genest St Isle, France). Les rats sont soumis à une alternance lumière-obscurité de 12 h (lumières à 8 h) à 20 C et nourris à satiété. Les femelles pleines (le matin après l'accouplement est désigné par EO) sont hébergées dans l'animalerie au moins 7 jours avant le sacrifice à E18. On utilise aussi des mâles adultes de 60 à 70 jours. Les cerveaux de veau utilisés sont débarrassés de méninges et des gros vaisseaux sanguins. Ils sont conservés dans une solution saline isotonique glacée. Les animaux sont traités en conformité avec les dispositions de la Directive du Conseil de l'Union Européenne du 24 novembre 1986 (86/609/EEC). Matériels - Stéroïdes : La PREG [7- H] (22,5 Ci/mmole) utilisée est un produit commercialisé par NEN (Boston, MA, EUA). La progestérone, le sulfate de prégnènolone, la testostérone, la corticostérone, l'acétonide de triamcinolone, la 17a-OH PREG, la 17a-OH progestérone et le cholestérol sont des produits Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France) - Enzymes : La protéinase K (Merck, Darmstadt Allemagne) et la Pronase (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) sont dissoutes à 1 mg/ml dans du tampon TNM contenant IOmM de Tris, 0,1 M de NaCI, 3mM de MgCl2 (pH 7,4). La déoxyribonucléase I et la ribonucléase A sont des produits Sigma-Aldrich et sont ajustés, respectivement, à 100 UI/ml et 5 UI/ml. La phospholipase A2 (Roche Molecular Biochemicals) est diluée à 20 UI/ml dans du TNM. - Anticorps : L'anticorps monoclonal anti-a-tubuline N-356 est un produit Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Allemagne). L'anticorps monoclonal 152 est un anticorps produit par l'un des inventeurs qui réagit spécifiquement avec une MAP2 de poids moléculaire élevé. Les différents anticorps sont dilués dans du PBS contenant 3% de BSA. Méthodes . Préparation du cytosol On récupère des cerveaux foetaux, dont on enlève les méninges et on les soumet à un rinçage avec un tampon d'homogénéisation à 4 C [lOmM de Tris-HCl, à pH 8,5 contenant 1,5 mM d'EDTA, ImM de dithiothréitol, 10% de glycérol, un mélange d'inhibiteurs de protéase Complète (Roche Molecular Biochemical), dit tampon TEDG] Les cerveaux de rats mâles adultes sont récupérés après perfusion avec du PBS contenant 2 UI/ml d'héparine. Les cerveaux sont pesés et homogénéisés avec 4 vol. de tampon d'homogénéisation, dans des homogénéiseurs Potter verre/TeflonR, et centrifugés à 800 g pendant 10 min. Le surnageant est alors centrifugé à 100 000 g pendant 1 h à 4 C. Les échantillons sont utilisés immédiatement pour les essais ou sont stockés dans de l'azote liquide jusqu'au moment de leur utilisation. Les concentrations en protéines sont déterminées à l'aide du kit Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Canada) avec de la BSA comme standard de référence. . Constantes de liaison à l'équilibre Juste avant l'essai de liaison, chaque échantillon est purifié avec une suspension de dextran-charbon et des prélèvements de 2 ml de surnageant (cytosol purifié) sont ajoutés dans une série de tubes contenant la PREG [3H] à raison de 1 à 500 nM, avec ou sans stéroïde non marqué en excès de 1000 fois. Les tubes sont mis à incuber à 45 C pendant 30 min. La séparation du stéroïde lié et du stéroïde libre a été réalisée sur une minicolonne de Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia Biotech). Le comptage de la radioactivité dans les flacons a été effectué dans un spectromètre à scintillation liquide avec correction de l'atténuation (Tri-carb 2100 TR , Packard). . Nature du composant liant la prégnènolone 1 ml de cytosol de cerveau est mis à incuber avec 0,2 ml d'une solution d'enzyme à 37 C pendant 30 min. On étudie l'activité de liaison des échantillons (0,2 ml) ayant subi le traitement enzymatique ou des échantillons témoins dilués avec le tampon seul. . Essais de compétition Dans les essais de compétition entre la prégnènolone et différents stéroïdes pour la liaison étudiée, on fait incuber 0,2 ml de cytosol avec 100 nM de PREG [3H] et un excès de 1, 10, 100 et 1000 fois en stéroïde non radioactif. . Chromatographie d'échange d'anions Le système FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) a été équipé d'une colonne échangeuse d'anions (5ml Econo-Pac High Q, Bio-Rad). La colonne a été équilibrée avec un tampon TEDG contenant 0,03% de CHAPS et 100 nM de PREG (tampon TEDGCP) à 4 C. Le cytosol (20 ml, 60 mg de protéine) est appliqué et élué à une vitesse de 1 ml/min avec le tampon TEDGCP pendant 20 min. On recueille des fractions de 2ml. On applique alors un gradient linéaire de NaCl dans TEDGCP pour atteindre une concentration de NaCl 1M après 30 min., suivi de l'application isocratique de NaCl 1 M dans un tampon TEDGCP. Les fractions appropriées sont réunies ; les sels sont éliminés par passage à travers des minicolonnes de dessalage Hi Trap (Amersham Pharmacia Biotech). - Gel filtration On équilibre la colonne Superose 12# (1 x 30 cm, Amersham Pharmacia Biotech) avec du tampon TEDGCP contenant 0,15 M de NaCl, à 4 C. Le débit est ajusté à 0,25 ml/min. et on recueille des fractions de 0,4 ml. - Contrôle de la purification des protéines A chaque étape de purification, on incube les fractions collectées avec la PREG [3H] 100 nM en l'absence ou avec un excès de 100 fois de PREG non radioactive. On détermine alors la liaison saturable. - Western blots Du cytosol brut et des échantillons partiellement purifiés (10 g de protéine) sont séparés par SDS-PAGE à 10%, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes sont bloquées par incubation dans 5% de lait écrémé contenant 0,1% de Tween 20#, ajouté à un tampon Tris (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8,8), pendant 1 h, à température ambiante. Tous les lavages sont effectués dans du tampon Tris contenant 0,1 % de Tween 20# (tampon TNT). Les membranes sont ensuite mises à incuber avec des anticorps anti-tubuline (1 : 2000), ou des anticorps monoclonaux anti-MAP2 (1 : 1000), à 4 C, pendant 14 h environ. L'incubation avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris [fragment F(ab')2], couplé à la peroxydase, 1/10000, (Pierce, Rockford, Ill., EUA) est réalisée dans un tampon TNT contenant 5% de lait, pendant 45 min., à température ambiante. Le signal est détecté par un système de chimioluminescence ECL (Amersham Pharmacia Biotech), avec un film Kodak Y-Omat, en suivant les instructions du fabricant. - Préparation des protéines de microtubules Les cerveaux de veau sont lavés 2 fois dans un tampon L (MES 0,1M, EGTA 1 mM, EDTA 0,1mM, MgCl21 mM, dithiothréitol 1 mM et PMSF 1 mM, pH 6,4). On prépare les microtubules à partir de cerveau de veau ou de cerveau de rat adulte ou foetal selon un procédé d'assemblage/ désassemblage, en fonction de la température, in vitro (12). La tubuline de veau est purifiée selon le protocole de Weingarten et al (13), mais l'étape utilisant la phosphocellulose est remplacée par une chromatographie sur colonne d'échange de cations (Fractogel Merck) (14). Les microtubules et la tubuline sont préparés dans le tampon L, supplémenté par 1 mM de GTP (tampon A). Les protéines tau et MAP2 sont purifiées selon le protocole de Fellous et al (12) par dénaturation des microtubules par la chaleur et gel filtration sur colonne, le Séphacryl 300# étant utilisé à la place de l'Ultrogel ACA 34. Les protéines tau sont ensuite encore purifiées selon la méthode de Lindwall et Cole (15). - Mesure de l'assemblage des microtubules Cet assemblage est mesuré en contrôlant les augmentations de turbidité avec un spectophotomètre UVICON (Kontron Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France). - Culture des neurones On procède à des cultures primaires de neurones de foetus El 7 selon El-Etr et al (16). Brièvement, cette méthode consiste à étaler les cellules dissociées (200 000 cellules/cm2) sur des lamelles de verre recouvertes de poly-1-ornithine et mises en culture dans un milieu complètement défini dans 5% de CO2 à 37 C. Les conditions de culture utilisées permettent d'obtenir une population neuronale pratiquement pure. 24 h après l'ensemencement, on ajoute de la prégnènolone 1 micromolaire (concentration finale d'éthanol 0,01 %) ou le solvant seul et on poursuit les cultures pendant 2 jours. Les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4%, puis congelées à -80 C. En temps utile, elles sont réhydratées par des passages de 5 min dans de l'éthanol à des concentrations de 100,90 et 70%. Après 2 lavages dans du PBS, pendant 5 min, les cellules sont incubées dans du PBS contenant 3% de BSA et 0,1% de Triton X100#, à température ambiante, pendant 1 h. Après 4 lavages dans du PBS, les cellules sont mises à incuber à 37 C pendant 1 h, puis à 4 C pendant environ 14 h, en présence soit d'anticorps monoclonal anti-a-tubuline dilué à 1/2000 ou d'anticorps monoclonal anti-MAP2 dilué à 1/1000 ou d'antisérum anti- double cortine dilué à 1/300. Après 3 lavages dans du PBS, on ajoute l'anticorps secondaire à température ambiante, pendant 45 min. Il 'agit soit d'IgG de lapin [fragment F(ab')2] anti-Ig de souris conjugué à de la biotine, dilué à 1/350 (Roche Molecular Biochemicals) ou d'IgG anti-lapin biotinylée, diluée à 1/300 (Boehringer). Après 3 lavages, le complexe d'amplification peroxydase-streptavidine (Dako, Danemark) est ajouté pendant 30 min à température ambiante. Les cellules sont lavées et le substrat AEC (amino-éthyl-carbazole, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) est déposé sur les cellules pendant 15 min. La réaction est arrêtée par addition d'eau distillée. Les cellules sont contre colorées avec de l'hématoxyline et montées sur Glycergel . - Microscopie électronique Après polymérisation des microtubules induite par MAP2 en l'absence ou en présence de la substance à tester, une partie aliquote de l'échantillon expérimental est déposée sur une grille hydrophile (300 mesh) revêtue de carbone. Les grilles sont traitées par une solution aqueuse d'acétate d'uranyle à 1 %. Les observations sont effectués avec un microscope électronique Philips CM12. - Analyses statistiques Les données de liaison à l'équilibre sont analysées avec le programme Mac Ligand, adapté de Munson et Rodbard (17). Les courbes sont tracées avec le logiciel kaléidograph TM 3.0 (Abelbeck software, Ritme Informatique, Paris). 2 - Résultats Sites de liaison de la prégnènolone dans le cerveau de rat. Les échantillons de cytosol (0,2 ml, 2,5 mg de protéine/ml), préalablement déstéroïdés par adsorption sur charbon/dextran, sont mis à incuber avec des concentrations croissantes en PREG [3H] dans un tampon TEDG à pH 8,5, à 40 C, pendant 30 min. Le stéroïde lié est séparé par gel filtration sur Séphadex LH20# à 0-4 C. Les constantes de liaison sont déterminées avec le programme Mac Ligand. La figure 1 représente un diagramme de Scatchard de la liaison spécifique. On observe une constante Kd de 31,0 0,8 nM et une concentration maximale des sites de liaison (Bmax) de 1,2 0,1 pmol/mg de protéine (moyenne erreur - type, n = 3). Pour étudier les effets d'enzymes hydrolytiques sur la liaison de la PREG [3H] , on a utilisé des échantillons de 1 ml de cytosol incubés avec 0,2ml d'une solution d'enzyme, à 37 C, pendant 30 min. Les résultats obtenus, exprimés en % de l'incubation témoin (cytosol dilué dans du tampon) sont rapportés dans le tableau 1 (moyenne écart - type (n-3)). TABLEAU 1 Enzyme Concentration/ml % de témoin Protéinase K 0,17 mg 42,2 7,5 Pronase 0,17 mg 40,5 5,7 Déoxyribonucléase 1 17 UI 99,4 12,7 Ribonucléase A 0,8 UI 82,4 9,2 Phospholipase A2 33 UI 85,0 7,3 On constate que les sites de liaison de la PREG [3H] sont détruits à raison d'environ 60% par la protéinase K et la Pronase . Au contraire, on n'observe pas d'effet significatif avec la DNAase, la RNAase et la phospholipase A2. Pour étudier la spécificité de la liaison de la PREG [3H] , différents stéroïdes ont été utilisés. On a déterminé les index de compétition relative en tant que rapports des concentrations du compétiteur (en dénominateur) versus PREG entraînant une diminution de 50% de la liaison spécifique de PREG [3H] x 100 (moyenne écart - type, n = 3). Les résultats sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Stéroïdes R.C.R 50 Prégnènolone 100 Sulfate de prégnènolone 78,8 7,0 Progestérone 72,1 17,7 A5- Prégnène-3p,20a-diol 68,4 15,3 3p-hydroxy-5a-prégnane 20-one 18,4 4,0 Testostérone 5,6 2,8 Déhydroépiandrostérone 4,3 2,6 Estrone 4,4 Corticostérone 2,8 Androstènediol 1,7 Estradiol 1,3 Acétonide de triamcinolone 1 17a-hydroxy-prégnènolone 0,85 17 a-hydroxy-progestérone 0,79 Sulfate de DHEA 0,045 Cholestérol 0,02 On constate que les meilleurs compétiteurs pour la liaison de PREG [3H] sont le sulfate de prégnènolone, la progestérone, et le A5-prégnène-3p, 20a-diol (20a-dihydro- prégnènolone). Un autre stéroïde, possédant une structure similaire à la PREG, à savoir la 3ss- hydroxy-5a-prégnane-20-one (5a-dihydro-PREG) se révèle également un compétiteur efficace, bien que 5 fois moins actif que PREG. Parmi les autres stéroïdes testés, la DHEA est un faible compétiteur et le sulfate de DHEA a un effet pratiquement négligeable. Les structures préférées sont des stéroïdes en C-21 avec un groupe cétone ou un groupe alcool en positions 3 et 20 et un cycle A ou B insaturé conférant une structure plus plane au squelette du stéroïde. D'autres essais réalisés avec des cerveaux de rat adulte donnent des résultats du même ordre, montrant que le cerveau contient un composant liant la PREG, avec des constantes de liaison similaires à celles du cerveau foetal (Kd = 50,7 nM, Bmax = 0,75 pmol/mg de protéine). Purification de la protéine de liaison du cytosol . Chromatographie sur colonne Mono Q# Les sites de liaison de la prégnènolone sont élues à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions Mono Q#. 60 mg de protéines cytosoliques dans un tampon TEDGCP sont chargés sur la colonne et élués avec un gradient de NaCl. On recueille des fractions de 2 ml. On rapporte sur la figure 2 la liaison saturable de PREG [3H] PREG (dpm x 10-4) (-e-) et la concentration de protéines (mg/ml) (--- f --- ) dans chaque fraction. Les fractions du pic A (fractions 17 à 19 : mg de protéine) et celles du pic B (fractions 23 à 25 : mg de protéine) sont réunies séparément. Les sels des 2 fractions sont éliminés et les fractions sont concentrées et soumises à une gel filtration. . Chromatographie sur Superose 12# Les pics A et B sont filtrés sur une colonne Superose 12# (élution avec le tampon TEDGCP contenant 0,15M de NaCl). On recueille des fractions de 0,4 ml. On mesure la liaison spécifique de PREG [3H] sur chaque fraction de la colonne calibrée avec des marqueurs de poids nucléaire. On rapporte les résultats obtenus sur la figure 3 qui donne, pour chaque fraction, la liaison saturable de PREG [3H] (-e-) en dpm x 10-4 et la concentration des protéines en mg/ml (---#---). On note la présence de 2 pics de 40-60 kDA (fraction A) et de plus de 440 kDa (fraction B). La présence d'un composant à très haut poids moléculaire suggère que la protéine de liaison du cytosol pourrait être une protéine de très haut moléculaire associée aux microtubules, qui sont des constituants majeurs du cytoplasme neuronal. Il convenait de vérifier la présence dans la fraction A de composants du système microtubulaire. A cet effet les pics de liaison de la PREG ont été soumis à une SDS-PAGE, suivie d'un immunoblot. On rapporte sur la figure 4 l'immunoblot du cytosol et des fractions du pic A éluées des colonnes d'échange d'ions et repassées sur colonne de gel filtration. La piste 1 correspond au cytosol brut ; la piste 2 à la fraction A Mono Q# ; la piste 3 à la fraction A soumise à une nouvelle chromotographie sur Superose 12 . 10 g de protéine sont déposés sur les pistes 1 et 2. La quantité de protéine dans la piste 3 est inférieure au seuil de détection. On constate que les protéines qui réagissent immunologiquement avec les anticorps anti-MAP2 et anti-tubuline (a et ss) ont été enrichies dans ces préparations partiellement purifiées, et ce en proportion compatible avec l'augmentation d'activité de liaison spécifique. Le faible poids moléculaire des polypeptides reconnus par les anticorps anti-MAP2 suggère que des cassures de la (des) protéine(s) MAP2 de 300 (ou 70) Kd se sont produites durant la purification de la protéine cytosolique. Liaison de PREG [3H] à des microtubules de cerveau de rat purifié. On a déterminé la liaison de la PREG [3H] aux microtubules préparés par des cycles de polymérisation/dépolymérisation. Les microtubules foetaux ont une constante Kd pour PREG [3H] de 42,9 nM et une Bmax de 3,7 pmol/mg de protéine, ce qui représente un enrichissement de 3 fois par rapport au cytosol de cerveau foetal. La spécificité du ligand apparaît inchangée [RCR : PREG(IOO) > PREGS (78,8) > PROG (72,1) Testostérone (5,6) > DHEA (4,3) >estradiol (1,3)]. Les microtubules adultes ont une constante Kd pour PREG [3H] de 54,8 nM et une Bmax de 3,4 pmol/mg de protéine, ce qui représente un enrichissement de 4,5 fois comparé au cytosol de cerveau adulte. Activités de liaison de la prégnènolone à MAP2, à la tubuline et à la protéine tau purifiées. On fait incuber de la tubuline de cerveau de veau purifiée (90 ug/ml), de la MAP2 (45 .tg/ml) ou de la protéine tau (25 ug/ml) avec PREG [3H] 100nM sans ou avec un excès de 1000 fois de PREG non radioactive. On constate que ni la tubuline, ni la protéine tau, ni l'IgG de lapin ne lient PREG [3H] d'une manière saturable. Au contraire, la fraction MAP2 montre des sites de liaison spécifiques qui augmentent lorsqu'on procède à une co-incubation avec de la tubuline. Les constantes de liaison à l'équilibre de MAP2 de veau purifiée sont les suivants : Kd=39,2 nM, Bmax = 16pmol/mg de MAP2 alors que celles des copolymères MAP2- tubuline sont : Kd=44,0 nM, Bmax=135pmol/mg de MAP2. Il apparaît donc que la liaison de MAP2 à la tubuline ne modifie par l'affinité de la PREG, mais augmente au contraire la concentration des sites de liaison de plus de 8 fois. Sur la figure 5, on rapporte les valeurs B/U en fonction de B en nM, (-0-) représentant la liaison à l'équilibre de MAP2de cerveau de veau purifiée et (-o-), la liaison à l'équilibre de MAP2 de cerveau de veau purifiée associée à de la tubuline purifiée de cerveau de veau (pour les détails expérimentaux, voir la figure 1). La concentration molaire des sites de liaison est de 14 nM et celle de MAP2, en se basant sur un PM moyen de 200 000, d'environ 200 nM. On constate donc que moins de 10% des molécules de MAP2 peuvent se lier à PREG [3H]. Le remplacement du tampon A par le tampon TEDG n'influe pas sur les constantes de liaison de la prégnènolone à l'équilibre. La spécificité de liaison des stéroïdes aux copolymères de MAP2-tubuline est très proche de celle des microtubules foetaux [RCR : PREG (100) > PREGS (91,5) > PROG (81,3) estradiol (3,2) > Testostérone et DHEA (2,3)]. Effets des stéroïdes sur les cinétiques d'assemblage des microtubules Les microtubules sont reconstitués in vitro avec de la tubuline purifiée (1 mg/ml) et MAP2 (0,05 mg/ml) dans du tampon A. L'augmentation d'absorbance est mesurée à 345 nm, à 37 C et enregistrée toutes les 30 sec. pendant 15 min. Les résultats sont donnés sur la figure 6. L'assemblage des microtubules est mesuré soit en l'absence de stéroïdes (-0-), soit en présence de 500 nM de stéroïde : PREG (-#-), progestérone (-X-), estradiol (-V-), soit en présence à la fois de PREG et de progestérone (-o-) ou de PREG et d'estradiol (-A-), chacun à une concentration de 500 nM. L'augmentation de l'absorbance à 345 nM montre que la PREG induit une forte augmentation à la fois de la vitesse et de l'étendue de l'assemblage de la tubuline. L'estradiol, qui ne se lie pas à MAP2, est inactif. Cependant, la progestérone, qui montre une affinité pour MAP2du même ordre que celle de la PREG, est également sans effet. Contrairement à l'estradiol, elle contrecarre l'effet stimulateur de la PREG sur l'assemblage des microtubules. Le sulfate de PREG a des effets semblables à celles de la progestérone. Analyse par microscopie électronique On a procédé à l'analyse des microtubules polymérisés en présence de PREG pour vérifier leur aspect. En présence de MAP2 de cerveau de veau, la tubuline de cerveau de veau s'assemble en microtubules d'apparence normale, c'est-à-dire caractérisés par une conformation remarquablement constante et un diamètre uniforme. La structure des microtubules reste complètement normale lorsque MAP2 induit la polymérisation de tubuline en présence de 500 nM de PREG. Effets de la prégnènolone sur les cultures neuronales On étudie les neurones de cerveau de rat foetaux par immunocytochimie après 3 jours de culture. Les résultats sont donnés sur la figure 7 où A, C, E correspondent à une culture témoin de 3 jours, B, D, F, à l'addition de prégnènolone 1 M les 2 derniers jours de culture. Dans A et B, on ajoute un anticorps monoclonal anti a-tubuline, dans C et D, un anticorps polyclonal anti-doublecortine et dans E et F, un anticorps monoclonal anti-MAP2. La coloration avec les anticorps monoclonaux anti-a tubuline ou anti-doublecortine ne montre aucune différence entre les cultures témoins et les cultures exposées à de la prégnènolone 1 M pendant 2 jours. Au contraire, l'exposition à la prégnènolone augmente l'immunomarquage de MAP2 des corps cellulaires et induit son extension aux neurites proches (voir les flèches). REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUES 1 - WOLOSEWICK, J.J. et PORTER, K. R. (1979). J Cell Biol 82, 114-139 2 - GRIFFITH, L. H. et POLLARD, T (1982) J. Biol Chem. 257,9143-9151 3 - CORREAS, L. et al J. (1990) Biochem. J, 269,61-64 4 - AAMODT, E. J. et WILLIAMS, J. R. R. C. 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Biochem. 107, 220-239 REVENDICATIONS 1/ Composés non toxiques, capables de passer la barrière hémato-encéphalique caractérisés en ce qu'ils sont capables de lier le même site que la prégnènolone sur les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette et de déplacer la prégnènolone liée à MAP2, ainsi que d'influer sur l'assemblage et la stabilisation des microtubules. 2/ Produits d'addition élaborés à partir des composés selon la revendication 1 ou de stéroïdes d'une part, et des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette d'autre part. 3/ Produits d'addition selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de stéroïdes - protéines associées - microtubules, notamment de stéroïdes - MAP2, le cas échéant sous forme copolymérisée à la tubuline, ou de stéroïdes - protéines tau sous forme copolymérisées à la tubuline. 4/ Utilisation de protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette comme récepteurs de stéroïdes ou de composés selon la revendication 1. 5/ Utilisation de stéroïdes ou de composés selon la revendication 1, pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette. 6/ Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le stéroïde est la prégnènolone ou son-sulfate. 7/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour le traitement du système nerveux, système nerveux central ou système nerveux périphérique. 8/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les médicaments se présentent sous forme orale en vue du traitement du système nerveux, ou sous forme injectable, pour une administration par la voie générale ou in situ, ou encore sous forme de solutions retard ou de pré-drogues avec conjugaison, par exemple, à un acide gras. 9/ Utilisation selon la revendication 7 ou 8 pour fabriquer des médicaments pour la prévention ou le traitement d'affections telles que la maladie d'Alzheimer, les démences d'origine vasculaire, les conséquences de traumatismes et d'accidents vasculaires au niveau du système nerveux et les maladies neuro-dégénératives. 10/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour lutter contre le viellissement des cellules nerveuses, ou de toute autre type cellulaire contenant des MAPs, comme les cellules épithéliales, les cellules thyroïdiennes, ou des glandes endocrines. 11/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 en association avec des composés à effet stabilisateur du cytosquelette, tel que le Taxol " . 12/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour le traitement de cancers, en association avec des agents anticancéreux.