FR 2806796 A1 20010928 FR 0003700 A 20000323 UNSYSTÉMEPOLYVALENTPOURLESMESURESPHOTOMETRIQUESET SPECTROPHOTOMÉTRIQUES PARL'ANALYSED'IMAGE La présente invention cohcerne un dispositif conçus pour la réalisation des mesures photométriques et spectrophotométriq- -ues quantitatives en depandant sur l'analyse d'image à l'aide d'un logiciel et sans aucun filtre. Les appareils traditionnellement utilisés dans le même demaine sont plus ou moins complexes avec beaucoup de cercuits électroniques et de pièces optiques, cette complexité conduit à des problems considérables (sources de lumiére grilleés, cercuits électriques coupés, monochromateur déréglés etc...) ce que perturbe le travail et en plus ils sont coûteux et aussi bien leurs accessoires, ajoutons le coût des réparations, et le besoin de l'analyste d'avoir plus qu'un seul appareil pour satisfaire à toutes les natures du travail. Selon notre invention on peut éviter tous ces inconvénients en utilisant un système très simple qui comporte un ordinateur(1), un scanner optique couleurs(2), une imprimante(3), une caméra video(4) CCD couleurs, des lampes(5) U. V. 254 et 365 nm et le logiciel. Quand les mesures sont éfféctuées pour des bandes séparées par l'éléctrophorés (l'éléctrophorése des protéines seriques)le système agit ainsi comme un densitométre avec une seule longueur d'onde ou un seul filter. Dans le cas de mésurer la couleur des taches séparées par chromatographie sur couche mince (CCM) ou sur papier avec la possibilité de chercher la longueur d'onde de la maximume d'absorption d'une manière très rapide, le système agit ainsi comme un densitométre entre 400-800 nm, et à l'aide d'une lampe d'U. V à 254 nm on peut également, par notre invention, faire des mesures quantitatives pour des taches, qui apparaissent sombres sous U.V (254 nm), et séparées par C. C.M sur des plaques de silicagel (F60). En utilisant une lampe d'U. V à 365 nm on peut mésurer la fluoréscence des taches séparées qui fluoréscent à cette longueur d'onde. Cette utilisation des ces deux lampes d'U. V permet à cette invention d'agire comme un densitométre dans le visible de 400-800 nm, dans l'U. V à @ 254 nm, et pour la mésure de la fluoréscence des taches. Les images des chromatograme de la couche mince, du papier, des plaques d'éléctrophorese portantes des bandes ou des taches colorées sont aquises à l'aide d'une camera-video(4) ou un scanner (2). Les images des plaques portantes des taches détectées par l'U.V à 254 nm sont aquises soit par un scanner(2) dont la lampe de néon avec une lumiére blanche est remplacée par une autre spécialement fabriquée pour donner une lumiére dans l'U.V à 254 nm ou à 365 nm, soit par une camera-video(4). L'utilisation des tubes capillaires pour y remplire des solutions colorées ou contenantes des particules ou des solutions fluoréscentes, et en utilisant le scanner(2) ou la camera-video(4) pour l'aquisition de l'image, celà permet à l'invention d'agire comme un colorimétre, ou un spectrophotométre avec la possibilité de chercher le maximum d'absorption, ou comme un fluorimétre, facilitant ainsi la lécture photométrique des solutions, et des taches colorées, en particulier dans l'analyse des spots (spot test analysis), même dans le demaine de la géologie pour éxaminer les coupes des rochés, ou pour compter les particules dans les solutions. Selon la mode du travail et en simulant et remplassant le monochromateur utilisé dans les appareils traditionels par le logiciel on peut obtenir les suivants : # Densitométre pour l'éléctrophores des protéines sériques. # Colorimétre (aux filters...) . # Spectrophotométre de 400 à 800 nm. # Densitométre pour CCM et papier de 400 à 800 nm aussi bien à 254 nm et à 365 nm. # Fluorimétre à 365 nm. # Compteur des particules dans les solutions. # Examens des tous genres des taches (spot teste). # Dans la géologie. # Pour mésurer les tailles des particules des poudres. DESCRIPTION DE L'INVENTION A-QUELQUES NOTIONS DE BASE CONCENRNANTES LES MÉSURES SPECTROPHOTOMÉTRIQUES ET FLUORIMETRIQUES. Pour mésurer une couleur quelquonque on depend soit sur la transmission soit sur la réfléxion. Les resultas des mesures sont exprimés en pourcentage le blanc est a 100% et en applicant la loi de Lambert-Beer on calcule l'absorption exprimée en densité optique Do=log(Io/I),oû Io est l'intensité de la lumiére incidente qui passe dans un milieu transparent sans être absorbée, I représente la lumiére monochromatique après avoir traversé le milieu colorée, et avoir subit une absorption d'oû I#I0.Chaque couleur absorbe sa complémentaire, donc en applicant la même principe on peut simuler l'absorption optique physique, en la remplaçant par une calcule mathématique et en dependant sur les équations suivantes pour calculer les (tristimulus values) dans le visible 400-800 l'interval est de 10 nm. Pour chaque source lumineuse on a: P#:la reflexion spectrale. X"APjo.l Y"I\P"" z1", sont des valeures connues pour chaque source standarde. ## exprimé en nm. La calcule des coordonnés L,a,b d'une couleur est obtenue par les équations: L=116 (Y/Yo) 1/3 -16 a=500 [ (x/xo) ms ~ (Y/YO)1/3] b=200[(y/YO)1/3 - (Z/ZO)1/3] @ dans lesquelle xo,yo,zo sont les valeures tristimulus elles sont egales aux x0,y0,z0 de la source lumineuse.si yo=100, xo=98 et zo=118.1 . Donc la difference de couleur est calculée par l'équation: E= L 2 +(Aa ) 2 + (Ab) 2 1/2 On peut calculer l'absorption d'une surface blanche ou colorée quelconque par les équations suivantes: Ou : Bm,n:AE de chaque point (m,n) de la surface à mésurer dans les demenssions (mb, nb) du blanc. Xm,n:dE de chaque point (m,n) de la surface à mésurer dans les demenssions (mX, nX) de l'échantillon. dm,n:#E de chaque point (m, n) de la surface à mésurer dans les demenssions (md, nd) du standard. SB:La surface mesurée du blanc. SX:La surface mesurée de l'échantillon. SSd :La surface mesurée du standard. En applicant la loi de Lambert-Beer on a: Ax=log (SB/SX) Asd=log (SB/Sd) Ou Ax: l'absorption de l'échantillon. As: l'absorption du standard. Log(SB/SX)=LCx Log (SB/SSd) = LCsd Donc Ax=#LCx Asd=#LCsd AX/Asd LCx/ çLCsd Cela donne Ax/Asd=Cs/Csd d' oû Cs=Ax#Csd/Asd Ou: Cxest la quantité ou la concentration de l'échantillon. Cest la quantité ou la concentration du standard. En tenant compte des équations prècedantes et que chaque couleur est composée de trois couleurs essentielles rouge, vert et bleu ainsi sa complémentaire et de la loi de Lambert- Beer, on obtient les mesures des couleurs. Notre invention depend essentiellement sur un logiciel capable de simuler les phénomènes physiques qui interviennt dans les mesures optiques éxcutées par les appareils traditionnels. QUELQUES NOTIONS THÉORIQUES DE LA FLUORESCENCE MOLÉCULAIRE La fluoréscence est un phénomène d'émission optique qui résulte de l'irridation des molécules par une énérgie éléctromagnatique avec une longueur d'onde (#). Cette énérgie est absorbée par les molécules qui sont par la suite éxcitées à un niveaux vibrationel E1 qui est plus élévé, pour revenir après à l'état initial E0, les molécules rendent ainsi une partie de cette énérgie absorbée, sous forme d'une émission lumineuse (la fluoréscence) avec une longueur d'onde '# ou # Par conscéquence on peut considérer que en renversant mathématiquement le spêctre d'absorption, on obtient ainsi le spêctre de l'émission donc une mésure qualitative et quantitative de la fluoréscence. En principe la lumiére émise à la suite de l'éxcitation des molécules correspond dans certaines limites à la concentration ou à la quantité de la substance éxcitée, donc autant que la quantité de la substance est grande dans la tache séparée,autant que cette tache devient plus lumineuse (moins sombre) @ (couleur sombre cela dire une petite quantité, couleur moins sombre une quantité plus grande etc...) Donc une corréllation éxiste entre la lumiére émise et la quantité de la substance éxcitée F=h. c . La couleur d'un objet devient claire (lumineux) quant il est illuminé et plus foncée quand il est moins illuminé. En reposant sur ce principe on peut éstimer d'une manière bien précise la quantité (par rapport à un standard) d'une substance quelconque en mésurant l'intensité de sa couleur. B-APAREILLAGE La présente invention se constitue des pièces qui repondent aux fonctions demandées pour éxcuter une mésure phtométrique ou spectrophtométrique quelconque. Les fonctions sont les suivantes: 1. Aquisition de l'image (plaque d'éléctrophorése, CCM, papier, tubes capillaires etc...). 2. Lécture de l'image et calcule des résultats. 3. Avoire les résultats imprimés et les courbes tracées. donc les pièces sont : 1. Scanner commercial(2) ou selon d'autre mode une cammera video couleur(4) liés à un ordinateur(1). 2. Ordinateur qui doit avoir au minimum: # Unité centrale PCI. # Microprocesseur Pentium2 # RAM 32MGB. # Disque dure. # Lécture des dissquittes. # Clavier(10). # Souris(9). # Ecran(8). 3. Imprimante(3). 4. Un porte tubes capillaires(6) spéciallement conçu pour l'invention ou un plataux. 5. Logiciel. Les tubes capillaires utilisés sont des tubes en verre (comme ceux pour mésurer les heamatocrites). Un porte tubes (6) capillaires (bois,plastique,etc...) constitué d'une planche d'une couleur blanche avec des demenssions convenables pour contenir un nombre des canaux(13) qui sont gravés sur la planche(12) spécialement pour tenir les tubes capillaires(un plataux peut être utilisé). Deux couvercles(11) sont désignés pour couvrir une partie de chaque côté de la planche(12) pour fixer les tubes et les empêcher de tomber en renversant la planche(12) sur le scanner(2) lorsque de l'acquisition de l'image. Quand on couvre les deux côtés de la planche(12) par les deux couvercle-111) cela va laisser une surface(14) des tubes déscouvrte convenable pour l'acquisition de l'image. L'ordinateur(l): une partie du dispositif qui sert à analyser photométriquement l'image et stocker les résultats et les datas. L'imprimante(3) peut constituer une partie du dispositif pour imprimer les résultats numérique et tracer les pics et les courbes. Selon des modes particulières de réalisation. Le scanner(2) est remplacé par une boite noire(7) munie d'une camera-video(4) et deux lampes U. V 254 n. m ou deux autres à 365 n. m ou deux lampes du tungstène. La camera-vedeo(4) permet à l'utilisateur l'aquisition de l'image de l'échantillon (plaque éléctrophorése, CCM avec des taches co lorées), l'enregistrer et l'analyser). La lampe U. V 254 nm est utilisée pour révéler les taches séparées affin de les l'analyser en utilisant des plaques de silica gel F60 (les lampes d'U.V sont fabriquées par un artisant qui par ses moyens avait tranformé les lampes originales en lampes d'U.V). La lampe U. V 365 n. m est utilisée comme source d'énergie d'éxcitation pour révéler les taches séparées qui à cette longueur d'onde fluoréscent avec une couleur spécifique. Les lampes du tungstène sont utilisées dans la boite noire pour l'acquisition de l'image dans le visible. Le logiciel sert à analyser les images dans le visible de 400 à 800 n. m et il est programmé par les autheurs de la présente invention et reposé sur les équations déja mentionées. Le logiciel facilite le choix de la longueur d'onde , nécessaire à la mésure demandée par l'utilisateur et par concéquence de déterminer l'absorption. P.S. La mésure des produits séparés par CCM donnants des taches colorées et sombres sous U. V à 254 est effectuée selon leur capacité d'absorber la lumiére à cette longueur d'onde. C-LE LOGICIEL Un ordinateur(1) PC avec un microprocesseur Pentium sont utilisés, la language de la programmation etant C++ sous le système Windows 95 ou 98. L'image aquise à l'aide du scanner(2) ou de la cameravideo (4) est stokée dans le disque dûre . L'application de l'invention n'est pas impérativement liée à une modele d'ordinateur quelconque, ni à une langue de programmation précise ou à un certain scanner ou une certaine cammera-video, ajoutons que le logiciel peut être implanter dans un circuit imprimé. N'importe quel modele d'ordinateur avec un microprosseur Pentium et n'importe quelle langue de programmation, peutvent être utilisés, il est possible à une personne du metier ou un analyste à l'aide d'un logiciel convenable d'appliquer l'invention. Comment employer le logiciel: 1- Demarrer le programme, une liste apparait: File, Help. 2- Options : scanner(2) ou camera video(4) comme suivant: FileSelect Source,Boite de dialogue (Dialogue Box) apparait sur l'ecran(8) pour mettre l'option désirée. 3- Aquisition de l'image après avoir convenablement mise l'échantillon (plaque etc...)dans le scanner(2) avec une bonne resolution ou une bonne focalisation de la camera video(4) comme suivant:FileAquising Image. 4-choix de type de l'échantillon comme suivant: Mode Proteins Electrophoresis. #CCM. #Fluorescence. Solutions. #Particules in Solutions #Particules of powdre. #... d'autre types peuvent être ajouter à la liste précedente. Selon le choix la liste (Exampling) et la liste (Results) sont modifiées. On poursuit l'analyse d'image pour la plaque d'éléctrophorése des protéine comme suivant: 5- ExamplingBlank. Prendre à l'aide de la souris(9) un rectangle d'une surface libre (sans bandes ou sans couleur). 6- ExamplingSample. À l'aide de la souris(9) un rectangle de la surface contenante les bandes séparées. P.S Pour l'éléctrophorés des protéines sérique la longueur d'onde nécessaire à la mésure est dêja programmé dans le logiceil. 7- Result#scan les résultats numériques et graphiques apparaissent sur l'ecran(8) exprimés en pourcentage. 8-Imprimer les résultats :FilePrint.... MODE OPÉRATOIRE A- Mésure des bandes séparées par éléctrophorése: 1- Mettre la plaque de l'élécrophorése dans l'endroit convenable du scanner(2). 2- La resolution est à plus que 300 dpi. 3- Capter l'image et la transmetter à l'ordinateur(1). 4- Mésurer le blanc (surface de plaque non colorée ou libre des taches). 5- Analyser l'image des bandes séparées à l'aide du logiciel. 6- Les résultats apparaissent sur l'écran. 7- Imprimer les résultats à l'aide de l'imprimante(3). B- Mésure des solutions colorées 1- Remplir les solutions dans les tubes capillaires et les boucher par une pate. 2- Mettre les tubes dans les canaux(13) du boitier. 3- Capter l'image des tubes après les avoir placés sur le scanner(2). 4- Mésurer l'absorption du tube de la solution (blanc). 5- Analyser à l'aide du logiciel l'image des tubes dêja aquise. 6- Les résultats apparaissent sur l'ecran(8). 7- imprimer les résultats (si cela est necessaire). C- Mésure des taches séparées par CCM (colorées ou revelées par une reaction colorées). 1- A l'aide du scanner(2) capter l'image de la plaque avec les taches à analyser. 2- Prise d'une surface du fond de plaque sans tache comme blanc. 3- Prendre la même surface de la tache échantillon ou de la tache standarde. 4- Chercher la longueur d'onde de la maximum d'absorption. 5- Calcule des résultats. 6- imprimer les résultats et tracer les pics et les courbes. D- Mésure de la fluoréscence des taches ou des solutions fluoréscentes à 365 nm. 1- Mettre la plaque ou le porte tubes capillaire dans la boite noire(7) et allumer la lampe U.V 365 nm. 2- Focaliser la camera video(4) CCD et capter l'image. 3- Mésurer une surface de plaque sans taches ou du tube capillaire blanc. 4- Mésurer la même surface de la tache ou du tube inconnu ou du standard. 5- Chercher le maximum de la longueur d'onde de l'émission. 6- Calculer les résultats. 7- Imprimer les résultats et les courbes et pics. E- Mésure des taches séparées par CCM silicgel F60 détectées par U. V à 254 nm en utilisant la camera video(4) CCD. 1- Mettre la plaque de CCM silicagel (F60) dans la boite noire(7). 2- allumez la lampe U. V 254 nm. 3- Focaliser la camera video(4) CCD et capter l'image. 4- Mésurer une surface de plaque sans tache. 5- Mésurer la même surface de la tache de l'échantillon et du standard. 6- Calculer les résultats. 7- Imprimer les résultats et les pics et courbes. F- Mésure des taches séparées par CCM silicagel (F60) en utilisant le scanner(2) muni d'une lampe U. V 254. 1- Mettre la plaque de CCM silicagel à l'endroit convenable du scanner(2). 2- Capter l'image à une résolution (300 dpi). 3- Prendre une surface de plaque sans tache comme blanc. 4- Prendre la même surface de la tache (échantillon) et de la tache standarde. 5- Calculer les résultats. 6- imprimer les résultats, les pics et les courbes. G- Mésure et comptage des particules dans les solutions. 1- Homogeniser rigoureusement la solution à éxaminer. 2- Mettre sur une lame de microscope et à l'aide d'une micropipette, une prise d'essai de 10 l. 3- Mettre la lame après l'avoir couverte sur la microscope munie d'une camera-video(4) utilisant un grossissement 40x10. 4- Aquisition de l'image. 5- Mettre la longueur d'onde 650 nm. 5- Utiliser le logiciel pour effectuer la mésure demander. 6- Calculer les résultats. 7- Imprimer. P.S la même mode operatoire peut être suivie pour mésurer les tailles des particules d'une poudre en mettant une petite quantité (quelques ug) sur une lame de verre et en utilisant le scanner(2) pour capter l'image. REVENDICATIONS 1- Dispositif pour effectuer des mesures colorimétriques, photométriques et spectrophotométriques pour des taches et bandes colorées ou fluorescentes et également pour des solutions colorées ou fluorescentes, caractérisé en ce qu'il comporte un ordinateur(1) avec un logiciel en vue d'analyser l'image, lié à un scanner(2) destiné à l'acquisition de l'image et une imprimante(3) et un porte tubes capillaires(6) pour tenir les tubes. 2- Dispositif selon la revendication (1), caractérisé en ce que le scanner(2) est muni d'une lampe d'ultra violet à 365 nm utilisées comme source d'énergie pour réaliser le phénomène de la fluorescence lors de l'acquisition de l'image. 3- Dispositif selon la revendication (1), caractérisé en ce que le scanner(2) est muni d'une lampe d'ultra violet à 254 pour reveler certaines taches ou bandes lors de l'acquisition de l'image. 4- Dispositif selon la revendication (1), caractérisé en ce que un porte tubes(6), pour tenir les tubes capillaires contenants les solutions colorées à mesurer est sous forme d'une planche (12) (bois, plastique, plâtre...) gravée de canaux(13) de cavités tubulaires et repartis d'une façon régulière sur la planche(12) et munie de deux couvercles(11) désignés à couvrir une partie de la planche(12) de chaque côté d'une façon à fixer les tubes tout en laissant une surface libre(14) pour l'acquisition de l'image. 5- Utilisation du dispositif selon la revendication (1), pour effectuer la fonction de chercher la longueur d'onde de la maximum d'absorption entre 400 et 800 nm. 6- Utilisation du dispositif selon les revendications (1) et (2) , pour effectuer la fonction de chercher la longueur d'onde de la maximum de l'émission lors de la mesure de la fluorescence. 7- Utilisation du dispositif selon la revendication (1), pour effectuer les fonctions du densitomètre pour les mesures colorimétriques simultanées des plusieurs tâches ou bandes colorées. 8- Utilisation du dispositif selon la revendication (1) et (2), pour effectuer les fonctions du densitomètre pour les mesures simultanées de la fluorescence des plusieurs tâches ou bandes revelées sous ultra violette à 365 nm lors de l'acquisition de l'image par le scanner(2). 9- Utilisation du dispositif selon la revendication (1) et (3), pour effectuer les fonctions du densitomètre pour les mesures simultanées colorimétrique des certaines tâches ou bandes revelées sous ultra violette à 365 nm lors de l'acquisition de l'image par le scanner(2). 10- Utilisation du dispositif selon la revendication (1), pour effectuer le comptage des certaines particules (poudres et autres...) . 11- Utilisation du dispositif selon la revendication (1), pour mesurer les tailles des certaines particules (poudres et autres...) .