FR 2794864 A1 20001215 FR 9907290 A 19990609 La présente invention est relative à une méthode de détection précoce des flavivirus, notamment du virus de la dengue et à ses applications. La dengue est une maladie tropicale aiguë fébrile dont le virus causal est un arbovirus, transmis par des moustiques. Les vecteurs de la maladie sont des moustiques du genre Aedes, notamment Aedes aegypti dont les gîtes larvaires sont le plus souvent domestiques et péridomestiques. Le virus responsable, isolé en 1951, a été classé en quatre types antigéniques différents (DENI, DEN2, DEN3 et DEN4). Il appartient à la famille des Flaviviridae, genre flavivirus. Plus de deux milliards d'habitants vivent dans les zones endémiques et le nombre d'individus infectés par le virus s'élèverait à plus de 60 millions par an. La dengue est notamment responsable de 200 000 hospitalisations et de plusieurs dizaines de milliers de décès annuels, des enfants, pour la plupart. Après une incubation de cinq à huit jours, le début des signes cliniques est généralement soudain et consiste en l'apparition de fièvre non différenciée (DF dengue fever) accompagnée de céphalées sévères, de lombalgies, de douleurs musculaires et articulaires ainsi que de frissons. Du troisième au cinquième jour de phase fébrile, peut apparaître une éruption maculo-papuleuse congestive durant trois à quatre jours (dengue classique). Dans sa forme sévère, l'infection peut aboutir à l'apparition d'un syndrome hémorragique (DHF ou dengue haemorrhagic fever), caractérisé par une perméabilité vasculaire accrue et un dérèglement de l'hémostase. Alors que dans la majorité des cas, l'évolution est généralement favorable en une semaine, l'issue de la maladie peut être fatale en cas de choc hypovolémique (DSS ou dengue shock syndrome). Ces complications sont généralement observées en présence d'une immunité pré-existante, acquise notamment lors d'une primo-infection par un virus hétérologue de la dengue (sérotype différent). En effet, deux types différents de réponse sérologique sont identifiés chez les sujets infectés par la dengue : les individus qui n'ont jamais eu une infection à flavivirus et n'ont pas été vaccinés contre un autre flavivirus (virus de la fièvre jaune, virus de l'encéphalite japonaise par exemple) vont présenter une réponse primaire, caractérisée par une apparition lente des anticorps spécifiques du virus responsable de l'infection ; les individus qui ont déjà eu une infection à flavivirus (autre sérotype de la dengue, par exemple) ou ont été vaccinés contre un autre flavivirus vont présenter une réponse secondaire, caractérisée par une apparition rapide des anticorps. L'agent infectieux est le virus de la dengue appartenant à la famille des Flaviviridae, à laquelle appartiennent également le virus de la fièvre jaune et celui de l'encéphalite japonaise (T.P. Monath et al., (1996) Flaviviruses in B.N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howly et al. (eds. ) " Fields Virology " Philadelphia : Lippincott Raven Press Publishers). Ces virus possèdent un ARN monocaténaire de polarité positive qui comprend 11000 nucléotides et qui code pour une polyprotéine d'environ 3400 acides aminés. Elle s'individualise en trois protéines de structure et sept protéines non structurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5, au cours de clivages co- et post-traductionnels par des protéases virales et cellulaires. La protéine non structurale NS1 a été identifiée pour la première fois en 1970 par P.K. Russel et al. (J. immunol., (1970), 105,838-845) et caractérisée en 1985 par G. W. Smith et al. (J Gen Virol., (1985), 66,559-571). Cette glycoprotéine hautement conservée dans la famille des flavivirus (T. P. Monath déjà cité), notamment dans les quatre sérotypes du virus de la dengue, existe sous une forme intracellulaire, et sous une forme extracellulaire. La forme intracellulaire interviendrait dans les phases précoces de la réplication du virus (J.M. Mackenzie et al., Virologv, (1996), 220,232-240). Avant d'être transportée vers la membrane plasmique, la protéine NS1 subit une dimérisation. Dans les cellules de mammifères, mais pas dans les cellules d'insectes, une partie de la protéine NS1 est libérée dans le milieu extracellulaire soit sous forme d'une protéine soluble, soit sous forme microparticulaire. Lorsqu'elle est sous forme soluble, la protéine existe sous forme d'un oligomère, notamment d'un pentamère ou d'un hexamère (Crooks A.J. et al. J Chrom. (1990), 502,59-68 et J Gen. Virol. (1994), 75,3453-3460). A l'heure actuelle le rôle de la protéine NS1n'est pas connu. Plusieurs études suggèrent un rôle de la protéine NS1dans la réponse immunitaire protectrice contre les infections à flavivirus. Des expériences réalisées avec les virus de la fièvre jaune, de la dengue, de l'encéphalite japonaise et de l'encéphalite à tique ont montré une protection contre une dose mortelle de virus homologue chez les animaux vaccinés à l'aide de la protéine NS1 sous-unitaire ou produite par des virus vecteurs, type vaccine ou adénovirus (Schlesinger et al. (1986), 60,1153-1155 ;. J. Gen. Viral., (1987), 68,853-857; Falgout et al. J Virol., (1990), 64, 4356-4363 ; Jacobs et al., J Virol., (1992), 66,2086-2095). L'immunisation passive de souris par des anticorps monoclonaux anti-NS a également permis d'obtenir un certain degré de protection (Schlesinger et al. J Immunol. (1985), 135, 2805-2809 ; Gould et al. J Gen. Virol., (1986), 67,591-595; Henchal et al. J Gen. Virol., (1988), 69,2101-2107). On ne connaît pas totalement le rôle des anticorps antiNSI dans la protection mais il se pourrait qu'elle soit associée à une lyse des cellules infectées (Schlesinger et al. Virology, (1993), 192,132-141). Les protéines NS1 à la surface des cellules infectées seraient reconnues par les anticorps fixant le complément. Il n'existe pas de traitement spécifique et les soins apportés au patient sont uniquement symptomatiques. Dans le cas de la dengue classique, le traitement repose sur l'administration d'antalgiques et d'antipyrétiques. Dans le cas de DHF, le traitement consiste en une perfusion pour compenser la fuite plasmatique, associée à la correction des troubles hydroélectriques et la relance de la diurèse. Il n'existe pas de vaccin commercialisé contre le virus de la dengue. En revanche des essais de protection par des souches atténuées des 4 sérotypes du virus de la dengue ont été effectués par N. Bhamarapravati et al. (Dengue and Dengue haemorrhagic fever (1997), 367-377) avec des résultats non satisfaisants. La prévention repose donc uniquement sur la lutte contre le vecteur. Cette lutte associe une destruction larvaire et des pulvérisations " adulticides ". En l'absence de vaccin, il est nécessaire de surveiller les épidémies et prévenir les complications précitées ; pour ce faire, des programmes de surveillance active ont notamment été mis en place par l'Organisation Mondiale de la Santé et comprennent essentiellement la surveillance des cas de fièvre et des insectes vecteurs et le dépistage sérologique et virologique des personnes présentant une fièvre et suspectées être infectées par le virus de la dengue. L'étiologie de la dengue est parfois délicate à affirmer lorsqu'un malade présente un syndrome fébrile indifférencié type " dengue-like " qui peut avoir comme origine un autre arbovirus, des virus provoquant des fièvres éruptives, la grippe, la leptospirose et même le paludisme. Seul un examen de laboratoire peut apporter le diagnostic. Il existe à l'heure actuelle plusieurs tests de diagnostic de la dengue. Toutefois, pour arriver à un résultat interprétable, il est nécessaire de combiner plusieurs méthodes : - l'isolement du virus, par des techniques de virologie classique, notamment par infection de cultures de cellules ou propagation en cerveau de souriceaux ou amplification par inoculation aux moustiques et examen par exemple par immunofluorescence. Ces méthodes ont l'inconvénient d'être très difficiles à mettre en #uvre et de dépendre de la précocité du prélèvement et de bonnes conditions de conservation ; de plus, les premiers résultats ne peuvent être obtenus en moins d'une semaine ; pour pallier ces inconvénients, on peut avoir recours à un test par RT/PCR (V. Deubel, L'eurobiologiste (1997), tome XXXI, 37-155) ; ce moyen n'est pas toujours fiable, ne peut pas être utilisé en routine dans les pays concernés par l'infection par le virus de la dengue pour des raisons de coût et d'équipement ; - les tests sérologiques ; le diagnostic sérologique le plus précoce consiste à rechercher des IgM par la technique MAC-ELISA (immunoglobulin M Antibody Capture Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Leur détection permet d'établir un diagnostic de probabilité d'infection par un flavivirus dès la défervescence de la fièvre ; la recherche des IgG nécessite deux prélèvements : l'un au début des signes cliniques, l'autre 10 à 28 jours après, de façon à mettre en évidence une conversion sérologique par réaction d'inhibition de l'hémagglutination (IHA) ou par ELISA. Il a également été proposé des tests immunologiques simples et peu chers, utilisables dans les pays à risque, qui mettent en #uvre, comme réactif immunologique spécifique des peptides dérivés de la protéine non structurale NS1 caractéristique des flavivirus. Ainsi, le brevet US 5 824 506 décrit une méthode utilisant des peptides dérivés de la protéine non structurale NS1, qui permet de détecter les anticorps induits par la présence du virus de la dengue ; toutefois les peptides sélectionnés reconnaissent essentiellement les échantillons obtenus à partir de sujets convalescents et reconnaissent également mieux les patients infectés pour la seconde fois que ceux infectés pour la première fois ; ces résultats décevants pourraient s'expliquer, soit par le fait que les titres en anticorps sont variables pendant la phase aiguë (phase clinique) de la maladie, soit par le fait que les peptides utilisés ne sont pas représentatifs des caractéristiques antigéniques de la protéine et donc conduisent à une mauvaise reconnaissance des anticorps recherchés. Dans tous les cas, seule la confirmation tardive d'une infection par un flavivirus peut être apportée. Pour résoudre ce problème, Andrew Falconar et son équipe (Report from the Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre Royal Children's Hospital, 1991) ont proposé de détecter la présence de la glycoprotéine non structurale NS1 elle-même. Ils ont mis au point un test ELISA de type double sandwich, dans lequel un sérum de lapin contenant des anticorps polyclonaux anti-NSI, utilisé comme anticorps de capture, est immobilisé sur une plaque de microtitration. L'antigène capturé est détecté à l'aide d'anticorps monoclonaux de souris dirigés soit contre le virus de type DEN2, soit spécifique de groupe ; la révélation de la formation du complexe antigène/anticorps est effectuée à l'aide d'IgG de chèvre anti-souris conjuguées à la peroxydase. Par cette méthode, les Auteurs ont montré qu'en utilisant de la protéine NS 1 dimérique purifiée ou dégradée comme standard, la sensibilité de détection du test est d'environ 4 ng/ml avec les anticorps monoclonaux DEN2 comme sonde de révélation et d'environ 60 ng/ml avec les anticorps monoclonaux de groupe. Toutefois, ce test ne permet de détecter la protéine NS1ni dans les cas d'infections primaires en phase aiguë ou convalescente, ni dans les infections secondaires en phase convalescente dans lesquelles il existe un titre élevé en anticorps anti-NS 1 ; les Auteurs en ont conclu que la protéine NS1 devait être présente en quantités importantes uniquement dans les cas d'infections secondaires et ce, de manière transitoire, pendant l'infection. Or, les Inventeurs ont mis au point un procédé de purification de la protéine NS1 d'un flavivirus sous forme hexamérique, ce qui leur a permis de sélectionner des anticorps spécifiques de cette protéine sous forme hexamérique, dimérique ou monomérique, ou d'un de ses fragments, et de montrer de manière surprenante que ces anticorps sont des outils de choix pour la mise en évidence des différentes formes de la protéine NS1 circulante dans le cadre d'une infection par un flavivirus, en particulier dans les phases précoces où la réponse en anticorps spécifiques est indétectable, notamment lors des infections primaires par le virus de la dengue. En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à une méthode de détection précoce d'une infection flavivirale, qui répond mieux aux besoins de la pratique que les procédés de l'état antérieur de la technique, c'est-à-dire un procédé qui soit fiable, rapide, peu coûteux et qui permet d'adapter à temps les soins médicaux et d'éviter des épidémies de grande envergure par la mise en #uvre d'actions anti-vectorielles rapides et massives. La présente invention a en conséquence pour objet une méthode de détection précoce d'une infection flavivirale, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la glycoprotéine non structurale NS1 d'un flavivirus dans un échantillon biologique, pendant la phase clinique de l'infection, par une méthode immunologique mettant en #uvre au moins deux anticorps identiques ou différents, - le premier anticorps ou anticorps de capture de la glycoprotéine NS1étant constitué par des anticorps choisis dans le groupe constitué par : - des anticorps polyclonaux préalablement sélectionnés par immunocapture sur la protéine NS 1 dudit flavivirus, de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées et - des mélanges d'anticorps monoclonaux anti-NSIpréalablement sélectionnés pour leur affinité pour la protéine NS1dudit flavivirus, de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, lesdits anticorps monoclonaux étant ensuite purifiés, - le deuxième anticorps ou anticorps de révélation étant choisi dans le groupe constitué par : - des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine NS 1 de même type que celle à détecter et - un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine NS 1 de même type que celle à détecter. Au sens de la présente invention, on entend par forme non dégradée de la protéine NS1d'un flavivirus, la protéine native ou un de ses fragments, sous forme hexamérique, dimérique ou monomérique, comportant au moins un épitope permettant l'immunocapture, notamment un des épitopes rassemblés dans le tableau 1 page 319 de l'article de A. K.I. Falconar et al., Arch ; Virol., (1994), 137. Au sens de la présente invention, on entend par anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre la protéine NS1 d'un flavivirus, des anticorps obtenus par immunisation d'un mammifère non humain, - soit par une protéine NS1 de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, - soit par un flavivirus vivant ou inactivé, lesdits anticorps polyclonaux étant sélectionnés pour leur affinité pour la protéine NS sous ses différentes formes et purifiés en une seule étape et lesdits anticorps monoclonaux étant sélectionnés pour leur affinité pour la protéine NS1 sous ses différentes formes puis purifiés par des techniques classiques, notamment par chromatographie d'affinité ou échange d'ions. De manière surprenante, l'utilisation, pour la détection de la protéine NS1dans un échantillon biologique, d'anticorps polyclonaux sélectionés et purifiés par immunocapture sur la protéine NS1 de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées ou d'anticorps monoclonaux préalablement sélectionnés pour leur réactivité vis-à-vis de la protéine NS1de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, et purifiés, en lieu et place d'un sérum total de lapin hyperimmunisé, permet d'améliorer de manière significative la sensibilité de la méthode et de mettre en évidence la protéine NS1 circulant dans le sang des malades, dès le stade précoce de l'infection, aussi bien lors d'une infection primaire que d'une infection secondaire. La méthode selon la présente invention possède un certain nombre d'avantages : - elle peut être mise en #uvre de manière précoce : la présence de la glycoprotéine NS1 est révélée lors de la phase clinique, avant que la réponse en anticorps ne soit détectable, - elle est sensible : on peut détecter jusqu'à moins de 2 ng de protéine/ml de sérum, ce qui permet de détecter la protéine NS1circulante dans la phase précoce des infections primaires, - elle est rapide : on peut obtenir une réponse dans la journée, - elle est relativement peu coûteuse et peut donc être utilisée dans les pays à risque, - elle permet de distinguer les personnes vaccinées des personnes infectées récemment par un flavivirus puisque la protéine NS1sera absente chez les personnes vaccinées chez lesquelles les anticoprs pourraient encore être décelables.. Selon un mode de mise en #uvre avantageux de ladite méthode l'infection flavivirale est une infection par le virus de la dengue. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, le premier anticorps est de préférence fixé sur un support solide convenable et le deuxième anticorps est éventuellement conjugué à un marqueur approprié. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de ladite méthode, lorsque le deuxième anticorps n'est pas conjugué à un marqueur, sa liaison à la protéine NS1 fixée sur le support solide est alors détectée par un troisième anticorps conjugué à un marqueur convenable, ledit troisième anticorps étant un anticorps classiquement utilisé, tel que par exemple une IgG dirigée contre le deuxième anticorps et produite notamment chez la chèvre, le porc ou l'âne. Parmi les marqueurs utilisés, on peut citer à titre d'exemple les marqueurs fluorescents, le système biotine/streptavidine, les marqueurs non isotopiques ou des enzymes, comme par exemple la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de ladite méthode, ledit troisième anticorps est conjugué à une enzyme. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de ladite méthode, - le premier anticorps ou anticorps de capture est constitué par des anticorps polyclonaux de souris, sélectionnés par immunocapture sur la protéine NS1 du virus de la dengue, ladite protéine étant sous forme hexamérique, et - le deuxième anticorps ou anticorps de détection de la présence de NS1 dans l'échantillon biologique à analyser, est constitué par des anticorps polyclonaux de lapin immunisé par de la protéine NS1 du virus de la dengue, ladite protéine étant sous forme hexamérique, la fixation dudit deuxième anticorps étant révélé par un troisième anticorps constitué par des anticorps, conjugués à la peroxydase et dirigés contre le deuxième anticorps. Selon un autre mode de mise en #uvre encore plus avantageux de ladite méthode, les anticorps polyclonaux de souris sont purifiés par immunocapture sur de la protéine NS1 hexamérique de dengue de sérotype 1. La présente invention a également pour objet un kit ou coffret de diagnostic d'une infection flavivirale, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un anticorps de capture et au moins un anticorps de révélation tels que définis précédemment, - au moins un contrôle positif constitué par la protéine NS1 d'un flavivirus et/ou de différents sérotypes selon le flavivirus, ladite protéine, étant sous forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, et - au moins un contrôle négatif constitué par un sérum humain normal. Selon un mode de réalisation avantageux du coffret de diagnostic selon l'invention, ladite protéine NS1sous ses différentes formes est obtenue à partir d'un surnageant de culture, soit de cellules de mammifères infectées, soit de cellules de mammifères transfectées par un plasmide recombiné, comportant le gène de la protéine NS 1 ou un fragment dudit gène ou un fragment du génome flaviviral, lesdits fragments étant aptes à exprimer la protéine NS 1. Selon un autre mode de réalisation avantageux du coffret de diagnostic selon l'invention, la protéine NS1est celle du virus de la dengue. Selon un autre mode de réalisation encore plus avantageux dudit coffret de diagnostic, le plasmide est le plasmide pCIneo-NS1.FGA qui a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2220, en date du 7 juin 1999. La présente invention a également pour objet un procédé de purification de la protéine NSI d'un flavivirus, sous forme hexamérique, à partir d'un surnageant de culture, soit de cellules de mammifères infectées, soit de cellules de mammifères transfectées par un plasmide recombiné, comportant le gène de la protéine NSId'un flavivirus ou un fragment dudit gène ou un fragment du génome flaviviral, lesdits fragments étant aptes à exprimer la protéine NS1, caractérisé en ce que l'on sépare la forme soluble de la protéine NS1de la forme microparticulaire de ladite protéine, - soit par traitement par un agent précipitant puis centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 10 000 g, - soit par centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 50 000 g, avant l'étape de purification réalisée par des techniques classiques, notamment par chromatographie d'affinité. Au sens de la présente invention, on entend par agent précipitant, un agent qui précipite spécifiquement les protéines microparticulaires ou débris cellulaires, comme par exemple le polyéthylèneglycol, ledit agent étant utilisé dans des conditions classiques qui permettent de séparer des protéines solubles et des protéines microparticulaires ou débris cellulaires. Dans un mode préféré de mise en #uvre dudit procédé de purification, la protéine hexamérique NS1 est celle du virus de la dengue. La présente invention a également pour objet une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un principe actif sélectionné dans le groupe constitué par : - la protéine NS1 d'un flavivirus, de forme hexamérique, éventuellement associée à d'autres protéines, - une séquence d'ADN codant pour ladite protéine NS 1 et - un système d'expression comprenant au moins un promoteur capable de faire exprimer chez l'hôte où elle est injectée, l'ADN codant pour la protéine NS 1 du flavivirus, ledit gène exprimant ladite protéine, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Des protocoles de vaccination utilisant des acides nucléiques sont notamment décrit dans la demande internationale WO 90/11092. Dans un mode préféré de réalisation de la composition immunogène selon la présente invention, la composition immunogène comprend au moins un mélange des protéines NS1de forme hexamérique correspondant aux différents sérotypes du virus de la dengue. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine NS1de forme hexamérique d'un flavivirus, pour la préparation d'une composition immunogène capable d'induire la production d'anticorps in vivo. Dans un mode préféré de ladite utilisation, la protéine NS 1 est celle du virus de la dengue, notamment de sérotype 1. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal anti-NS1 préalablement sélectionné pour sa réactivité vis-àvis de la protéine NS1de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, lesdits anticorps monoclonaux étant ensuite purifiés, et modifiés pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive. De manière avantageuse les modifications des anticorps sont notamment la sélection de fragments Fab ou l'humanisation des anticorps. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la protéine NS 1 de forme hexamérique dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, pour sélectionner in vitro des anticorps spécifiques de ladite protéine NS1. Dans un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, les anticorps sont des anticorps polyclonaux. Dans un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, les anticorps sont des anticorps monoclonaux. Dans un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, la protéine est la protéine NS 1 du virus de la dengue, notamment de sérotype 1. Les anticorps monoclonaux anti-NS1 sont avantageusement obtenus par fusion de cellules spléniques de souris immunisée par la protéine NS1de forme hexamérique avec des cellules myélomateuses appropriées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 représente la protéine NS 1 extracellulaire hexamérique purifiée obtenue après chromatographie d'exclusion (a) après chromatographie d'exclusion, la protéine est concentrée à 0,5 mg/ml par ultrafiltration et traitée par du diméthylsuberimidate (DMS) à 0,0,5, 5 et 50 mM. Les produit obtenus sont placés dans un tampon non réducteur de Laemmli, séparés sur un gel d'acrylamide de gradient 4 à 20 % et marqués au bleu de Coomassie. Un échantillon traité par du DMS 50 mM est chauffé pendant 3 min à 95 C avant électrophorèse pour dissocier les oligomères non covalents. (b) La protéine NS1purifiée est traitée pendant une nuit à 37 C par 0,5 % ou 1 % de n-octylglucoside (nOG) et éventuellement traitée par 25 mM de DMS pendant 1 heure. Les protéines sont séparées sans dénaturation à chaud sur un gel d'acrylamide de gradient 4 à 20 % et détectée par immunoblotting avec un anticorps monoclonal anti-NS 1 de la littérature ou tel que défini précédemment. - la figure 2 représente la séquence de la protéine NS 1 du virus de la dengue de sérotype 1 obtenue par le clone 4C de l'exemple 2 ci-après, ainsi que la séquence codante correspondante. - la figure 3 illustre les résultats obtenus par dosage de la protéine NS1 circulante par la méthode de détection par ELISA-capture chez des patients infectés préalablement par un virus de la dengue dont les sérums ont été prélevés lors des phases aiguës et convalescentes, ainsi que la comparaison avec les résultats obtenus par les techniques de l'art antérieur IHA (inhibition d'hémagglutination des sérotypes 1, 2,3 ou 4 du virus de la dengue) et MAC ELISA (immunoglobulin M Antibody Capture Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ; Dl correspond au sérotype 1 de la dengue ; D2 correspond au sérotype 2 de la dengue ; D3 correspond au sérotype 3 de la dengue et D4 correspond au sérotype 4 de la dengue ; ID = identité du malade ; 1 correspond au premier prélèvement en phase aiguë de la maladie 2 correspond au deuxième prélèvement en phase convalescente (effectuée 2 à 4 semaines après le premier) ; dans le test ELISA-capture, les valeurs sont exprimées en densité optique obtenues pour un même sérum dilué 10,30 ou 90 fois. - la figure 4 illustre la détection de la protéine NS1par le test ELISA-capture sur des sérums de patients infectés par le virus de la dengue de sérotype 1 de Guyane. Les chiffres indiqués représentent le nombre de patients répartis par catégorie (positivité ou négativité en ELISA-capture et positivité ou négativité en IgM). Exemple 1 : Purification de la protéine NSI du virus de la dengue, sérotype 1 1. Matériel et méthodes La protéine est produite sur cellules Véro infectées par le virus de la dengue, sérotype 1, souche FGA/89 (P. Després et al., Viral, (1993), 196,209-219), dans les conditions adaptées de la méthode décrite par A.K.I. Falconar et al., (J. Viral. Meth., (1990), 30,323-332). Le milieu de culture est récolté 5 jours après l'infection et centrifugé à 1500 g pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant de centrifugation est ramené à 20 mM Tris-HCI, 1 mM azide de sodium, concentré 6 fois par ultrafiltration à froid et les particules virales sont éliminées par une précipitation de 2 h à 4 C, à une concentration de 7,5 % en polyéthylèneglycol (PEG), suivie d'une centrifugation de 30 min. à 10 000 g. Le surnageant clarifié, contenant 7,5 % PEG est traité avec 0,05 % Tween 20 et 1 mg/ml d'aprotinine, puis passé sur une colonne d'immunoaffinité sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal anti-NS 1. La protéine est éluée selon la technique à la diéthylamine, telle que décrite dans Falconar et al., (précité), concentrée par ultrafiltration et la solution d'élution échangée par un tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 1 mM d'azide de sodium. 2. Résultats Les résultats sont illustrés dans la figure 1. La figure la montre que la protéine NS1est bien sous forme hexamérique. La proportion de forme hexamérique augmente avec une concentration croissante en DMS (figure la). La protéine de forme hexamérique extracellulaire NS1 peut être transformée en sous-unités dimériques en présence du détergent non ionique, n-octylglucoside (nOG) (figure lb). Après une nuit à 37 C en absence ou en présence de n-octylglucoside (nOG) et traitement par du DMS 25 mM, on observe, en l'absence de nOG, la présence de bandes correspondant au dimère, au tétramère et à l'hexamère et en présence de nOG, une dissociation partielle ou complète de l'hexamère en fonction de la concentratin en nOG (figure lb). Exemple 2 : de la protéine NS1 du virus de la dengue de sérotype 1 par des cellules Vero 1. Matériel et méthode Le plasmide pCIneo-NSl.FGA déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous le n 1-2220, en date du 7 juin 1999) contenant le gène de la protéine NS1comprenant le gène codant pour son peptide signal, précédé d'un codon d'initiation de la traduction et suivi d'un codon de terminaison de la traduction est introduit dans la bactérie compétente Escherichia coli (Epicurian SURE de Stratagène). Ce plasmide est amplifié en culture bactérienne et purifié selon la technique classique de préparation d'ADN plasmidique. L'ADN purifié est utilisé pour le séquençage de différents clones (la séquence du clone 4C est illustrée à la figure 2) et pour transfecter des cellules Véro à l'aide soit d'un mélange adéquat avec des liposomes cationiques, tel que le DOTAP (Boehringer-Mannheim), ou avec un agent non liposomal, tel que le FuGENE (Boehringer-Mannheim). Le FuGENE et l'ADN sont préincubés dans du milieu sans sérum pendant 15min puis le mélange est mis en contact avec un tapis cellulaire de cellules Vero pendant 24 h. Les cellules sont ensuite rincées à l'aide de PBS (phosphate saline buffer), fixées 20 min à température ambiante avec une solution de PBS contenant 3% de paraformaldéhyde, perméabilisées 5 min avec du PBS contenant 0,5% Triton X-100. La présence d'antigène NSI est alors révélée à l'aide d'anticorps spécifiques, reconnus par un anticorps conjugué marqué à la fluorescéine. 2. Résultats Il est possible de mettre ainsi en évidence par un signal fluorescent élevé, spécifique de l'antigène viral NS1, dans environ 20% des cellules transfectées. L'expression de NS1est ainsi démontrée et des lignées stables pourront être établies en présence de néomycine, marqueur de sélection des cellules transfectées. La figure 2 illustre la séquence de la protéine NS 1 du virus de la dengue de sérotype 1 ainsi obtenue ainsi que la séquence codante correspondante. Exemple 3 : Mise en #uvre de la technique ELISA-capture selon l'invention dans le cadre d'une infection par le virus de la dengue de sérotype 1 et comparaison avec les méthodes de l'état antérieur de la technique - 1 .Principe de la technique ELISA-capture L'antigène viral NS1 est capturé par des anticorps polyclonaux de souris monospécifiques préalablement purifiés par immunocapture sur la protéine NS hexamérique purifiée de dengue, sérotype 1. La présence de NS 1 est révélée par des anticorps de lapin immunisés par la protéine NS11 hexamérique purifiée, eux-mêmes reconnus par des anticorps conjugués à la peroxydase de raifort. 2. Matériel et méthodes - Purification d'anticorps polyclonaux de souris dirigés contre la protéine NS 1 a - Fixation de la protéine NSI sur membrane La protéine NS1 purifiée est fixée par adsorption sur une membrane de nylon amphotérique (Nytran, Schleicher & Schuell). La surface de la membrane est alors saturée par de l'albumine bovine présente à une concentration de 3 % dans une solution saline tamponnée par du phosphate (PBS : phosphate buffer saline ; 10 mM phosphate ; pH7,2 ; 150 mM NaCI). Après 2 rinçages dans du PBS, la membrane est traitée par du PBS contenant 0,25 % de glutaraldéhyde pendant 15 min. à température ambiante. Après 3 rinçages dans du PBS, la membrane est neutralisée par un tampon de 100 mM glycine, 3 % albumine bovine, rincée 2 fois dans du PBS puis conservée à 4 C dans du PBS avec de l'azide de sodium 1 mM. b - Purification des anticorps polyclonaux monospécifiques de souris, (anticorps de capture) [alpha]) production des ascites polyclonales : les cerveaux de souriceaux Swiss infectés par le virus de la dengue et moribonds sont broyés dans 9 ml de tampon PBS. Le produit est centrifugé 10 min à 10.000 g à 4 C. La suspension virale est injectée à des souris Swiss, selon le calendrier suivant : - JO : 0,5 ml d'antigène en sous-cutané dans la cuisse, - J3: 0,4 ml d'antigène et 0,1 ml d'adjuvant complet de Freund par voie intrapéritonéale, - J25 : 0,5 ml d'antigène par voie intrapéritonéale, - J26 : 0,5 ml d'ascite de souris TG180, et - J28 : 0,5 ml d'antigène par voie intrapéritonéale. Les ascites sont récoltées à J42. Après recueil des ascites, on laisse le coagulum se former pendant 1 heure à température ambiante puis on réalise une centrifugation pendant au moins 30 minutes à 1500 g. Le surnageant est laissé une nuit à 4 C. Le pH du surnageant est ajusté à 4,8 avec de l'acide acétique 2 M puis le surnageant est centrifugé de nouveau dans les mêmes conditions. Le pH du surnageant est alors amené à 7,0 - 7,2 par addition d'une solution de soude 2 N. Le surnageant peut être conservé à - 20 C. P) Ryn.flciiP.n#d.?.s...?fitiÇ.9.rPs..de [..souris ; spécifiques du yijrus de..la dengue de sérotype 1: La membrane est incubée pendant une heure à température ambiante dans un mélange d'ascites polyclonales dirigées contre les 4 sérotypes du virus de la dengue préparées comme décrit ci-dessus. Après 3 rinçages de la membrane dans du PBS, les anticorps fixés sur la protéine NS sont élués avec une solution de diéthylamine pH 11,4 (milieu Dubelco modifié par Iscove (Gibco) contenant 100 mM diéthylamine). Les anticorps sont concentrés par ultrafiltration et replacés dans un tampon PBS contenant de l'azide de sodium 1 mM. - Préparation d'anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine NS 1 (anticorps de révélation) : L'immunisation des lapins a été réalisée par 3 ou 4 injections successives de 30 g de protéine NS1 hexamérique purifiée selon la méthode de l'exemple 1, réalisées à J0, J7, J21 et éventuellement à J49 et suivies d'une saignée à blanc à J83. Le sérum est appauvri en anticorps anti-souris non spécifiques par incubation avec des billes de Sépharose portant un anticorps monoclonal décrit dans la littérature ou préparé comme décrit précédemment. - Procédé ELISA-capture a - Courbe étalon Pour chaque plaque ELISA-capture destinée à tester des sérums humains, une gamme étalon est réalisée à partir d'une solution de protéine NS1 purifiée selon la méthode décrite au point 1, dont la concentration initiale est de 0,5 pg/ml et diluée de 3 en 3. b - Détection de la protéine NS1 circulante lors de la phase aiguë : Les anticorps polyclonaux de souris purifiés obtenus selon la méthode décrite précédemment (anticorps de capture) sont fixés sur une plaque, dilués dans une solution de PBS et mis à incuber pendant une nuit à 4 C. Après 3 rinçages de 5 minutes avec une solution de PBS/Tween 0,05 %, la plaque est saturée avec un mélange de PBS, Tween 0,05 % et de lait 3 %, pendant 30 minutes à température ambiante. Après 3 rinçages avec une solution de PBS/ Tween 0,05 %, on dépose plusieurs dilutions des sérums à tester et on laisse réagir pendant une heure, toujours à température ambiante. Les dilutions au 1/10, au 1/30 et au 1/90 sont réalisées dans une solution de PBS / Tween 0,05 %. Après 3 rinçages, on ajoute le second anticorps spécifique de NS1 (anticorps de révélation obtenu au point 3 précédent), après l'avoir dilué dans un mélange de PBS/ Tween 0,05 % et de lait 3 %, et on laisse incuber pendant 45 minutes à 37 C. Après 3 rinçages, l'anticorps anti-IgG dirigé contre le deuxième anticorps et marqué à la peroxydase, ledit anticorps étant préparé dans des conditions classiques connues de l'homme du métier, est ajouté et l'incubation réalisée pendant 45 minutes à 37 C. Après 3 rinçages, on révèle pendant 10 minutes par une solution de TMB (3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine, Kierkegaard & Perry Lab). La réaction colorimétrique est arrêtée avec de l'acide sulfurique. c - Détermination de la fenêtre de détection Les prélèvements sont réalisés chez des patients infectés par le virus de la dengue de sérotype 1, entre JO, marquant l'apparition des signes cliniques (initialement une fièvre indifférenciée) et J66 correspondant à la fin de la phase convalescente. Sur les sérums de ces patients, on recherche la présence de NS1 circulante selon la méthode ELISA-capture décrite au point 4 et on compare le résultat obtenu avec la positivité en IgM spécifiques mesurée en MAC-ELISA, lorsque les données sont disponibles. 3. Résultats Ils sont illustrés dans les figures 3 et 4. a -Détection de la protéine NSI circulante lors de la phase aiguë : La technique ELISA-capture selon l'invention permet de détecter la présence de la protéine NS1dans la phase aiguë de la maladie et ce indépendamment du fait que les malades aient une infection primaire ou secondaire. Les résultats confirment que la présence de la protéine NS1 est transitoire, puisque dans les prélèvements réalisés en phase de convalescence, on ne détecte pas cette protéine (figure 3). 93 % des prélèvements en phase aiguë de la maladie, se révèle négatif par le test MAC ELISA, alors que 100 % des prélèvements réalisés en phase convalescente se révèle positif dans ce même test (figure 3). De la même façon, le test d'inhibition d'hémagglutination (IHA) ne permet pas de détecter l'infection par le virus de la dengue de sérotype 1 dans 80 % des cas en phase aiguë de la maladie mais ce test se révèle positif dans 100 % des prélèvements réalisés en phase convalescente (figure 3). b - Détermination de la fenêtre de détection Les résultats sont rassemblés dans la figure 4. Entre Jl et J6, la possibilité de détecter la protéine NS1 circulante oscille entre 83 % (à J2) et 100 % (à J5) des patients infectés. Au delà de J10, la protéine NS1circulante n'est plus détectée, alors que la réponse en anticorps devient prédominante. La détection de la protéine NS1 circulante ne semble pas dépendante de la présence d'IgM spécifiques qui apparaissent dans certains cas à J3 et culminent à partir de J5. Ainsi, la fenêtre de détection de l'antigène sérique NS1 par la technique ELISA- capture selon la présente invention se situe de préférence entre Jl et J6 après l'apparition des signes cliniques. REVENDICATIONS 1 ) Méthode de détection précoce d'une infection flavivirale, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la glycoprotéine non-structurale NS1 d'un flavivirus dans un échantillon biologique, pendant la phase clinique de l'infection, par une méthode immunologique mettant en oeuvre au moins deux anticorps identiques ou différents, - le premier anticorps ou anticorps de capture de la glycoprotéine NS1étant constitué par des anticorps choisis dans le groupe constitué par : - des anticorps polyclonaux préalablement sélectionnés par immunocapture sur la protéine NS 1 dudit flavivirus, de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées et - des mélanges d'anticorps monoclonaux anti-NSIpréalablement sélectionnés pour leur affinité pour la protéine NS1dudit flavivirus, de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, lesdits anticorps monoclonaux étant ensuite purifiés, - le deuxième anticorps ou anticorps de révélation étant choisi dans le groupe constitué par: - des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine NS 1 de même type que celle à détecter et - un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine NS 1 de même type que celle à détecter. 2 ) Méthode de détection selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'infection flavivirale est une infection par le virus de la dengue. 3 ) Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le premier anticorps est fixé sur un support solide convenable et le deuxième anticorps est éventuellement conjugué à un marqueur approprié. 4 ) Méthode de détection selon la revendications 3, caractérisée en ce que lorsque le deuxième anticorps n'est pas conjugué à un marqueur, sa liaison à la protéine NS 1 fixée sur le support solide, est alors détectée par un troisième anticorps conjugué à un marqueur convenable. 5 ) Méthode de détection selon la revendications 4, caractérisée en ce que le troisième anticorps est conjugué à une enzyme. 6 ) Méthode de détection selon la revendication 5, caractérisée en ce que : - le premier anticorps ou anticorps de capture est constitué par des anticorps polyclonaux de souris, sélectionnés par immunocapture sur la protéine NS1 du virus de la dengue, ladite protéine étant sous forme hexamérique, et - le deuxième anticorps ou anticorps de détection de la présence de NS1 dans l'échantillon biologique à analyser, est constitué par des anticorps polyclonaux de lapin immunisé par de la protéine NS1du virus de la dengue de sérotype 1, ladite protéine étant sous forme hexamérique, la fixation dudit deuxième anticorps étant révélé par un troisième anticorps constitué par des anticorps, conjugués à la peroxydase et dirigés contre le deuxième anticorps. 7 ) Coffret de diagnostic précoce d'une infection flavivirale, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un anticorps de capture et au moins un anticorps de révélation tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, - au moins un contrôle positif constitué par la protéine NS1d'un flavivirus et/ou de différents sérotypes selon le flavivirus, ladite protéine, étant sous forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, et - au moins un contrôle négatif constitué par un sérum humain normal. 8 ) Coffret de diagnostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite protéine NS1, sous ses différentes formes est obtenue à partir d'un surnageant de culture, soit de cellules de mammifères infectées, soit de cellules de mammifères transfectées par un plasmide recombiné, comportant le gène de la protéine NS1 d'un flavivirus ou un fragment dudit gène ou un fragment du génome flaviviral, lesdits fragments étant aptes à exprimer la protéine NS 1. 9 ) Coffret de diagnostic précoce d'une infection flavivirale selon l'une quelconque des revendications 7ou 8, caractérisé en ce que la protéine NS1est celle du virus de la dengue. 10 ) Coffret de diagnostic précoce d'une infection flavivirale selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit plasmide a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2220, en date du 7 juin 1999. 11 ) Procédé de purification de la protéine NS1 d'un flavivirus, sous forme hexamérique, à partir d'un surnageant de culture, soit de cellules de mammifères infectées, soit de cellules de mammifères transfectées par un plasmide recombiné, comportant le gène de la protéine NS1 ou un fragment dudit gène ou un fragment du génome flaviviral, lesdits fragments étant aptes à exprimer la protéine NS1, caractérisé en ce que l'on sépare la forme soluble de la protéine NS1de la forme microparticulaire de ladite protéine, - soit par traitement par un agent précipitant puis centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 10 000 g, - soit par centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 50 000 g, avant l'étape de purification. 12 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un principe actif sélectionné dans le groupe constitué par : - la protéine NS1 d'un flavivirus, de forme hexamérique, éventuellement associée à d'autres protéines, - une séquence d'ADN codant pour ladite protéine NS1et - un système d'expression comprenant au moins un promoteur capable de faire exprimer chez l'hôte où elle est injectée, l'ADN codant pour la protéine NS 1 du flavivirus, ledit gène exprimant ladite protéine, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13 ) Composition immunogène selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un mélange des protéines NS1de forme hexamérique correspondant aux différents sérotypes du virus de la dengue. 14 ) Utilisation de la protéine NS1 de forme hexamérique ou d'un de ses systèmes d'expression, pour la préparation d'une composition immunogènique, apte à induire la production d'anticorps in vivo. 15 ) Utilisation d'au moins un anticorps monoclonal anti-NSI préalablement sélectionné pour sa réactivité vis-à-vis de la protéine NS1 de forme hexamérique, dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, lesdits anticorps monoclonaux étant ensuite purifiés, et modifiés pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive. 16 ) Utilisation de la protéine NS1 de forme hexamérique dimérique ou monomérique, lesdites formes étant non dégradées, pour sélectionner in vitro des anticorps spécifiques anti-NS 1.