FR 2799935 A1 20010427 FR 9913483 A 19991025 PROCEDE DE STIMULATION DES DEFENSFS NATURELLES DES PLANTS, UTILISATIONS ET COMPOSITIONS CORRESPONDANTES L'invention concerne un procédé de stimulation des défenses naturelles des plantes par la production par celles-ci de phytoalexines et de péroxydases sous l'action d'éliciteurs. L'invention concerne également l'utilisation desdits éliciteurs spéci fiques aux différentes cultures ainsi que les compositions correspondantes. Les recherches de moyens de protection des plantes contre les maladies étaient jusqu'à nos jours plutôt dirigés vers une lutte directe contre les pathogènes par l'utilisation de différents produits phytosani taires, la plante étant considérée comme un support plus qu'un être vivant pouvant se défendre. Malheureusement, l'utilisation de ces produits ne sont pas sans conséquence sur l'environnement et sur l'alimentation à cause des résidus subsistant dans la plante. Aujourd'hui, on s'intéresse davantage aux moyens de déclencher au sein de la plante elle même des réactions de défense efficaces ou celles existant déjà. La stimulation des défenses naturelles se traduit par le développement d'un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante une résistance immédiate et une présensibilisation grâce à laquelle elle devient capable de réagir plus efficacement à une nouvelle attaque. Cette présensibilisation est désignée par l'expression "résistance systématique acquise". On connait des produits appelés éliciteurs ou sensibilisateurs qui, mis au contact de la plante, sont capables de provoquer préventivement dans celle-ci, la résistance immédiate et la présensibilisation ou résistance systématique acquise dont il vient d'être question. On observe une stimulation très rapide de métabolismes secondaires qui conduisent par exemple : - à la production de phytoalexines (Chappel et al., Plant Physiology (1991) 97, 693-698): - à un renforcement de la paroi cellulaire (Glazener, Physiological Plant Pathology (1982) 20,11-25); - à la production de protéines de défense (Kim et al., Physiological Plant Pathology (1994) 45,195-209). Une autre possibilité d'induire cette résistance est de modifier le patrimoine génétique de la plante pour qu'elle produise elle même les composés responsables de la mise en place des mécanismes de défense (Schülein et al., brevet FR-9611262). Cette technologie est assez répandue de nos jours. Elle donne naissance à de nouvelles variétés appelées couramment "organismes génétiquement modifiés" (OGM). Pour l'instant, l'impact sur l'environnement et la sécurité alimentaire de ces OGM sont méconnus. Dans le souci d'abaisser les coûts de production agricole par la diminution de l'usage de produits phytosanitaires, le déposant s'est donné comme programme de recherche la découverte et la mise en exploi tation de nouveaux éliciteurs. I1 ressort de nombreuses recherches bibliographiques effectuées, que différents composés sont décrits comme éliciteurs. Ils sont d'origines chimiques, biochimiques, fongiques ou enzymatiques. Les éliciteurs chimiques De nombreux produits sont connus comme éliciteurs. En effet, outre les ions mercuriques, l'acide arachidonique, l'acide phosphoreux sont aussi connus comme stimulateurs des mécanismes naturels de défense des végétaux sensibles aux phycomycètes. Le cuivre sous la forme d'hydroxyde ou de sulfate des bouillies borde laises déclenche des réactions de défense de la vigne. De même le chlorure d'aluminium (AlC1,) déclenche la synthèse du resveratrol dans la vigne. De nombreux dérivés de l'acide salicylique ont été testés pour leur potentialité d'éliciteurs, les acides oxi-fulviques sont commercialisés comme éliciteurs sachant que les acides fulviques et humiques sont des macromolécules constituées de motifs monomères carboxy-phénoliques rappelant l'acide salicylique. Des tests en laboratoire ont été effectués sur des jeunes plants de melon et les résultats sont satisfaisants. Les éliciteurs biochimiques Des composés naturels tels que les oligosaccharides sont connus pour leur activité d'éliciteurs. En effet, le chitosan (dérivé de la chitine) polymère de 1,4-B-D-glycosamine est employé pour accroître la résistance de plantes au stress environne- mental et aux agents pathogènes. L'utilisation de fragments de polysaccharides de tout genre comme stimu lateurs de mécanisme de défense des plantes a ainsi fait l'objet de nombreuses expérimentations. Les éliciteurs fongiques Le brevet Fiedler et al., W0-8906687 est une référence incontournable pour ces genres d'éliciteurs. Dans celui-ci, les auteurs revendiquent le procédé d'accroître les activités enzymatiques responsables de la synthèse de colorants, alcaloides ou phytoalexines lorsque l'on met des micro-organismes et les bactéries inactivées, leurs fragments ou leurs excrétions contenant des éliciteurs en contact avec des cultures cellu laires de plantes. Une liste exhaustive de micro-organismes et de bactéries y est donnée; beaucoup n'y figurent pas y compris le trichoderma. De plus ils revendiquent la mise en contact de fragments de micro organismes ou bactéries avec des cultures cellulaires alors que le programme de recherche du déposant s'est orienté vers une composition pour application foliaire ou racinaire sur une plante entière. Les éliciteurs enzymatiques Par rapport aux composés chimiques, très peu d'enzymes sont utilisées comme éliciteurs. Les premiers travaux décrivent la synthèse de phyto- alexines, notamment du capsidiol par les cellules de plants de tabac lorsque l'on ajoute de la cellulase produite par du Trichoderma viride dans le milieu de culture. D'autres travaux ont confirmé cette découverte sur des cellules de pomme de terre ou de poivre. Par ailleurs, sur des cellules de vigne on observe la synthèse d'autres types de phytoalexines et notamment du resveratrol. Des découvertes similaires ont été faites lorsque l'on utilise de la xylanase produite par le Trichoderma viride. Tous les travaux en question ont été effectués in vitro, sur des suspensions de cellules de plantes. I1 n'a jamais été question d'appli cation ou de pulvérisation directe d'une composition à base de cellulase ou de toute autre enzyme de la classe des hydrolases sur des plantes pour déclencher des réactions de défense de la plante. Seules, des applications à base de compositions fongicides contenant des produits phytosanitaires connus en combinaison avec des enzymes chitinolytiques et glucanolytiques En effet, la présence de ces enzymes dans la composition augmente l'activité de ces fongicides car les chitanases sont connues pour dégrader la paroi des champignons constituée de chitine (polymère de N-acétyl- 1,4-B-D-glycosamine) et les glucanases quant à elles, sont capables d'hydrolyser des polymères de 1,3(4)-B-glucanes, constituants essentiels de la paroi de certains champignons. Elles agissent en synergie avec les chitinases pour dégrader les cellules des agents pathogènes et permettre aux fongicides d'agir plus efficacement. Dans ces applications, i1 n'est pas également question de stimulation des mécanismes naturels de défense des végétaux mais plutôt d'accroître l'efficacité de produits phytosanitaires déjà existants. A titre d'exemple, la production de cellulases et autres enzymes par le Trichoderma harzianum déposé par le déposant (PRE1 Institut Pasteur) peut se faire sur culture sur support solide ou en milieu liquide. Exemple n 1 : Production d'enzymes en milieu solide La souche de trichoderma harzianum A1, obtenue par sélection, est cultivée de façon industrielle, selon la technique de fermentation en milieu solide sur de la pulpe de betterave (source carbonnée). En effet, le trichoderma harzianum Al cultivé en boite de Pétri sur milieu potato-dextrose-agar (PDA) est inoculé à une concentration de 2.10 7 spores/g (de substrat sec) dans le milieu nutritif suivant : (NH4)2S04 : 4,85 g; urée : 1,20g; KH2P04 : 2,50g; pulpes de betterave : 80g et eau 100 ml. Le milieu de culture de départ est à pH 4,5. Après 3 jours d'incubation à la température de 28 C, le milieu contenant le mycélium du champignon et les substrats solides, est traité à la presse hydraulique (1 mn à 230 bars). Nous obtenons ainsi deux fractions - la fraction soluble (le jus) contenant les protéines solubles et les sels minéraux; - la fraction insoluble composée essentiellement de substrat non utilisé et du mycélium. La fraction soluble est centrifugée à 15000 RPM pendant 30 mn, à la température ambiante pour éliminer les particules solides. La phase liquide recueillie, est ensuite soumise à une microfiltration tangentielle sur une membrane de coupure à 30 kDa. Le mélange d'enzymes retenues sur la membrane est lyophilisé. Des dosages d'activités enzymatiques sont faits sur la fraction liquide issue de la centrifugation, les résultats suivants sont obtenus - Une activité cellulasique de 0,95 U par ml de solution a été trouvée. L'unité d'activité cellulasique est définie comme la quantité pouvant libérer un micromole de glucose de la cellulose en une heure à pH 5,0 et à la température de 37 C. - Une activité chitinasique de 0,017 U par ml de solution a été trouvée. L'unité d'activité chitinasique est définie comme la quantité pouvant libérer un mg de N-acetyl-D-glucosamine de cm-chitin-rbv pendant 48 heures à pH 6,0 et à la température de 25 C. - Une activité protéasique de 1,79 U par ml de solution a été trouvée. L'unité d'activité protéasique est définie comme étant la quantité pouvant hydrolyser de la caséine pour générer un micromole de tyrosine par mm à pH 7,5 et à la température de 37 C. - Une activité de 1,5 U de B-1,3-glucanase par ml de solution a été trouvée. L'unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité pouvant libérer un micromole de glucose par mm à partir de la laminarine 0,1% (W/w) à pH 6,7 et à la température de 30 C. Exemple n 2 : Production d'enzymes en milieu liquide Le Trichoderma harzianum A1 cultivé en boite de Pétri sur milieu PDA, est inoculé à une concentration de 107 spores par litre dans le milieu synthétique suivant . (NH4)2S04 1,00 g; urée 0,30g; Na2HP04 0,12g; MgS04 0,30g; CaC12 0,30g; sucrose 2,00g; solution d'oligo-éléments et de vitamines : 2 ml; eau distillée : 1000 ml. Le milieu de départ, à pH 5,6, est mis sous agitation à 200 rpm pendant 66 h à la température de 28 C. Après centrifugation à 15000 RPM pendant 30 mn, à la température ambiante pour éliminer les particules solides (mycélium...) la phase liquide recueillie est ensuite soumise à une microfiltration tangentielle sur une membrane de coupure à 30 kDa. Le mélange d'enzymes retenues sur la menbrane est lyophilisé. Des dosages d'activités cellulasiques, chitinasiques, protéasiques et de B-1,3-glucanasiques ont été réalisés et les résultats suivants sont obtenus : cellulase (5,64 U/ml), chitinase (0,2 U:ml), protéase (2 U/ml), B-1,3-glucanase (2,3 U/ml). Exemple n 3 Pour mettre en évidence les propriétés élicitrices des cellulases et des protéases, quelle que soit leur origine, sur les plantes, diverses expériences ont été réalisées sur différentes espèces végétales afin de mesurer l'induction de la résistance contre les agents pathogènes (melon, vigne, tomate, concombre...). Compte tenu de l'importance des peroxydase et des chinitases (enzymes endogènes aux plantes) dans la résistance des plantes (protéines liées à la pathogénèse), nous avons utilisé ces activités comme marqueur de la résistance. L'infiltration d'une solution de cellulase (à 5 U/ml) dans les feuilles des jeunes plants de melon agés de 15 jours, provoque l'augmentation de l'activité peroxydasique 5 fois supérieure à celle détectée dans les plans témoins infiltrés avec l'eau. Afin de doser les activités peroxy- dasiques, les feuilles sont broyées en milieu tampon tris-maléate pH 6. L'extrait est ensuite mis en présence de gaacol et de l'eau oxygénée et une réaction rapide se fait : le gaacol est transformé en tétra- gaïacol.L'apparition du tétragafacol dans le milieu, nous permet de calculer l'activité péroxydasique. Les dosages sont effectués dans ce même tampon en utilisant le gaacol comme substrat. Les résultats sont exprimés en QDO/mn/gMF. La pulvérisation sur les feuilles de cellulase associée à des mouillants provoque une augmentation d'activité peroxydasique et chitinasique 4 fois supérieure aux plants traités sans cellulase. Exemple n 4 Des résultats similaires sont obtenus à grande échelle sur plants développant le fruit en serre. Suite à une infiltration ou pulvérisation de cellulase, les plants de melons sont inoculés parle fusarium oxysporum fsp melonis. Parallèlement, les feuilles d'un lot de plantule ont été infiltrées ou pulvérisées avec de l'eau. Dix jours après l'inoculation, les symptômes apparaissent uniquement chez les plants inoculés traités avec de l'eau. Trois semaines après l'infection, les jeunes plants infectés se dessèchent et meurent. Les plants inoculés et traités avec la cellulase ne présentent pas de symptômes avant 6 semaines et continuent ensuite à se développer norma lement. Ces résultats expriment clairement le pouvoir d'éliciteur de la cellulase sur la résistance des plants de melon vis à vis du fusarium sp. Exemple n 5 En infiltrant ou pulvérisant de la cellulase sur les plants de melon, on observe un effet similaire de protection par rapport à l'oiodium. En effet, 5 jours après l'inoculation par Podium, les symptômes apparaissent sur les plants traités préalablement avec de l'eau, et jaunissent peu à peu. Les plants traités avec la cellulase ne présentent que peu ou pas de symptômes et continuent de se développer normalement 3 semaines après l'inoculation. Exemple n 6 L'infiltration et la pulvérisation de la cellulase sur les feuilles de vigne provoque également une forte augmentation d'activité peroxydasique. Le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend l'application foliaire, racinaire ou par injection d'au moins une protéine du type enzymatique appartenant aux cellulases, au B-1,3-glucanases, aux xylanases, aux galactanases, aux mannanases, aux chitinases ou du type peptide non enzymatique et en ce que l'une ou l'autre est produite à partir de tout micro-organisme fongique ou bactérien. La substance active du type peptide non enzymatique comprend des peptides dont le nombre d'acides animés est au moins égal à 2. Les protéines enzymatiques et peptides non enzymatiques sont obtenues à partir de tout type de champignon et plus particulièrement de champi gnons filamenteux choisis parmi les Trichoderma, les Penicillium et les Aspergilus. Les protéines en question sont utilisées incorporées à un support ou véhicule autorisé en agriculture des types mouillant et pénétrant. La composition précitée peut se présenter sous la forme liquide, notamment sous forme de solution aqueuse. Elle peut se présenter également sous la forme solide, notamment de poudres ou de granulés ou en enrobage de semences. Les protéines en question ont pour effet de réduire considérablement, lorsqu'elles sont appliquées - à la vigne, l'attaque de l'oidium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques; - aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des odiums, des tavelures, les monilioses, les maladies bactériennes; - aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des odiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses,des pyricula- rioses et des maladies bactériennes; - aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol et le colza, l'attaque des odiums, du Phoma, des maladies bactériennes; - aux plantes légumières, notamment les tomates, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des odiums, des mildious, des pythiacées (P hytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta, des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), les maladies bactériennes; - aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oidiums, maladies bactériennes. La composition selon l'invention se caractérise donc en ce qu'elle comporte - au moins une protéine du type enzymatique appartenant à la classe des hydrolases; - et/ou au moins une protéine du type peptide non enzymatique. REVENDICATIONS 1- Procédé de stimulation des défenses naturelles des plantes par la production par celles-ci de phytoalexines et de péroxydases sous l'action d'éliciteurs; caractérisé en ce qu'il comprend l'application foliaire, racinaire ou par injection auxdites plantes d'au moins une protéine du type enzyma tique appartenant aux cellulases, aux B-1,3-glucanases, aux xylanases, aux galactanases, aux mannanases, aux chitinases ou du type peptide non enzymatique et en ce que l'une ou l'autre est produite à partir de tout micro-organisme fongique ou bactérien. 2- Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance active du type peptide non enzymatique comprend des peptides dont le nombre d'acides animés est au moins égal à 2. 3- Procédé, selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les protéines enzymatiques et les peptides non enzymatiques sont obtenus à partir de tout type de champignon et plus particulièrement des champignons filamenteux choisis parmi les Trichoderma, les Penicillium et les Aspergilus. 4- Utilisation d'une protéine telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est incorporée à un support ou véhicule autorisé en agriculture des types mouillant et pénétrant. 5- Utilisatiôn d'une protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme liquide, notamment sous forme de solution aqueuse. Utilisation d'une protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme solide, notam ment de poudres ou de granulés ou en enrobage de semences. 7- Utilisation d'une protéine telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle a pour effet de réduire considérablement, lorsqu'elle est appliquée - à la vigne, l'attaque de Podium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques; -aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des odiums, des tavelures, des monilioses, des, maladies bactériennes; - aux céréales, notamment le blé, le mais et le riz, l'attaque des odiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses,des pyricula- rioses et des maladies bactériennes; - aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol et le colza, l'attaque des odiums, du Phoma, des maladies bactériennes; - aux plantes légumières, notamment les tomates, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des odiums, des mildious, des pythiacées (P hytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (R hizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta, des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes; - aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oidiums, maladies bactériennes. 8- Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et pour les utilisations selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une protéine du type enzymatique appartenant à la classe des hydrolases. 9 - Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et pour les utilisations selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 , caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une protéine du type peptide non enzymatique.