FR 2801311 A1 20010525 FR 9914633 A 19991122 POLYPEPTIDES DERIVES DU RECEPTEUR NUCLEAIRE DE LA VITAMINE D, ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT DANS LE CADRE DU CRIBLAGE D'ANALOGUES DE LA VITAMINE D L'invention a pour objet des polypeptides dérivés du récepteur nucléaire de la vitamine D, les séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides, ainsi que l'utilisation de ces polypeptides notamment dans le cadre du criblage d'analogues synthétiques de la vitamine D, ou dans la mise au point de tests (par exemple double ou triple hybride,...) pour l'identification d'autres protéines (activateur, répresseur, ...) interagissant avec le récepteur de la vitamine D par l'utilisation de constructions contenant le polypeptide en fusion avec Gal4 par exemple, ou dans le cadre de l'analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre ces polypeptides et une molécule particulière par des techniques de cristallographie ou RMN. Le récepteur de la vitamine D (VDR) est un régulateur transcriptionnel dépendant du ligand, appartenant à la superfamille des récepteurs nucléaires (NRs) (Mangelsdorf et al., 1995). Les membres de cette famille possèdent la même structure modulaire avec un domaine de liaison à l'ADN (DBD) hautement conservé et un domaine de liaison au ligand (LBD) davantage variable (Mangelsdorf et al., 1995 ; Wurtz et al., 1996). Le VDR se lie à l'élément de réponse correspondant, de type DR3, dans la région promotrice des gènes cibles, sous forme d'hétérodimère avec le récepteur X de l'acide rétinoïque (RXR), ce qui conduit à l'activation ou à la répression de la transcription par l'intermédiaire d'une interaction avec les cofacteurs transcriptionnels et la machinerie transcriptionnelle basale (Deluca & Zierold, 1998). Les métabolites de la vitamine D sont utilisés, ou sont susceptibles d'être utilisés, dans des traitements variés dans le cadre de l'ostéodystrophie, l'ostéoporose, le psoriasis, le cancer et les maladies auto-immunes (Bouillon et al., 1995). L'hypercalcémie induite par la vitamine D (ou la, 25 - dihydroxyvitamine D3, ou 1,25(OH)2 D3) limite l'utilisation du ligand naturel dans ces applications cliniques, ce qui a conduit au développement d'analogues susceptibles de posséder des effets secondaires réduits. La séquence du LBD de hVDR est faiblement conservée en comparaison avec les séquences du récepteur de l'acide rétinoïque y humain (hRAR y) et du récepteur X de l'acide rétinoïque a humain (hRXRa) (respectivement 25 % et 17 % d'identité avec le hVDR). La présence d'un domaine d'insertion dans le LBD des VDR connectant les hélices Hl et H3, représente une caractéristique typique des VDR. La taille de cette région de connexion varie entre 72 à 81 résidus dans la famille des VDR, tandis qu'elle varie entre 15 à 25 résidus chez les autres récepteurs nucléaires. Il convient de souligner que dans ce qui suit la numérotation des acides aminés utilisée pour les séquences peptidiques des différents VDR, correspond à la numérotation des acides aminés du VDR humain. L'extension de cette numérotation aux autres séquences que celle du VDR humain peut se faire sans ambiguïté à partir de l'alignement donné sur la figure la ci-après. Le taux de conservation de séquence de ce domaine d'insertion est très faible (9 % d'identité entre les acides aminés 157-215 du hVDR). Cette région est accessible aux protéases, et contient un site de phosphorylation au niveau de la sérine en position 208, pour lequel aucun rôle fonctionnel n'a pu être défini. La présence de ce domaine pourrait expliquer les difficultés rencontrées jusqu'à présent pour cristalliser les LBD des VDR. En effet, ce domaine est faiblement structuré comme le montre les analyses de structure secondaire qui ne prédisent que quelques brins courts avec des statistiques assez faibles, et contient un pourcentage très élevé de résidus chargés négativement. Ces deux facteurs pourraient augmenter le nombre de conformères de cette boucle, affectant ainsi la stabilité de la protéine, et favorisant les contacts non spécifiques qui interfèrent avec les processus de cristallisation. La présente invention a pour but de fournir des polypeptides dérivés des récepteurs nucléaires de la vitamine D sous une forme soluble et pouvant être cristallisés. L'invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides dérivés, ainsi que des procédés de préparation desdits polypeptides dérivés par transformation de cellules appropriées avec lesdites séquences nucléotidiques. L'invention a également pour but de fournir de nouvelles méthodes de criblage de composés analogues de la vitamine D et/ou d'analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre ces polypeptides et une molécule particulière, lesdites méthodes étant effectuées à l'aide des polypeptides dérivés susmentionnés. L'invention a également pour but de fournir des kits pour la mise en #uvre des méthodes susmentionnées. L'invention sera illustrée à l'aide des figures suivantes : - Figure 1 : alignement des séquences peptidiques des VDR de différentes espèces (hVDR : VDR d'homo sapiens [humain] ; bVDR : VDR de bos taurus [bovin] ; gVDR : VDR de gallus gallus [poulet] ; rVDR : VDR de ratus norvegicus [rat] ; mVDR : VDR de mus musculus [souris] ; cVDR : VDR de cotumic japonica [caille japonaise]; xVDR : VDR de xenopus laevi [grenouille africaine]) avec les séquences du RXRa humain (hRXRa) et du RARy humain (hRARy). Les domaines d'insertion des VDR qui ont été supprimés sont ceux encadrés. b) conformation générale du domaine de liaison au ligand de hVDR; les hélices sont représentées par des cylindres et les feuillets (3 par des flèches. - Figure 2 : a) analyse de Scatchard de la liaison de 1,25(OH)2 D3 au LBD du hVDR sauvage (118-427; courbe en pointillé indiquée par des triangles) et au LBD du mutant dérivé du hVDR (118-427 # 165-215 ; courbe pleine indiquée par des losanges) ; la quantité de 1,25(OH)2 D3 marquée liée est indiquée en abscisse en nM, et le rapport B/U entre les LBD sauvage ou mutant liés (B) et non liés (U) est indiqué en ordonnée. b) activités CAT du hVDR sauvage et du hVDR mutant ; ces activités sont indiquées en ordonnée en pourcentage ; la colonne 1 correspond à l'activité CAT mesurée en absence de vitamine D (VD), de hVDR sauvage (sauvage) et de hVDR mutant (tronqué); la colonne 2 correspond à l'activité CAT mesurée en présence de VD, et en l'absence de hVDR sauvage et de hVDR mutant ; la colonne 3 correspond à l'activité CAT mesurée en présence de hVDR sauvage, et en l'absence de VD et de hVDR mutant ; la colonne 4 correspond à l'activité CAT mesurée en présence de VD et de hVDR sauvage, et en l'absence de hVDR mutant ; la colonne 5 correspond à l'activité CAT mesurée en présence de hVDR mutant, et en l'absence de VD et de hVDR sauvage ; la colonne 6 correspond à l'activité CAT mesurée en présence de hVDR mutant et de VD, et en l'absence de hVDR sauvage. - Figure 3 : a) représentation de la région du feuillet [3 de RARy, b) représentation de la région du feuillet p du VDR dans la même orientation que celle de RARy ci-dessus, c) représentation des interactions intramoléculaires de l'hélice H12 dans le VDR, d) interface entre le LBD du VDR et l'hélice H3n d'une molécule symétriquement reliée. - Figure 4 : a) schéma de 1,25(OH)2 D3, b) représentation schématique de la poche de liaison au ligand du hVDR, c) vitamine D dans sa densité électronique contourée à la , d) cavité du ligand. - Figure 5 : séquence peptidique du polypeptide correspondant à la séquence en acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 124 et 427 de la séquence peptidique du VDR d'origine humaine dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 sont supprimés. La présente invention a pour objet les polypeptides dérivés du récepteur nucléaire de la vitamine D chez l'homme ou les différentes espèces du règne animal possédant un tel récepteur, ledit récepteur nucléaire comprenant un domaine de liaison au ligand, ou LBD, ce LBD contenant un domaine d'insertion flexible, lesdits polypeptides dérivés étant caractérisés en ce qu'ils comprennent : - les séquences peptidiques desdits récepteurs nucléaires dans lesquelles : * le domaine d'insertion flexible du LBD est modifié par substitution ou suppression d'au moins environ 30 acides aminés, et de préférence d'au moins environ 40 acides aminés, ou de la totalité des acides aminés composant ce domaine d' insertion (à savoir environ 50 ~ 10 acides aminés), * et, le cas échéant, un ou plusieurs ou la totalité des acides aminés situés aux positions 1 à environ 125, notamment aux positions 1 à 117 ou 123, des séquences peptidiques desdits VDR, sont modifiés par substitution ou suppression, lesdits polypeptides dérivés possédant les caractéristiques suivantes : * les propriétés de liaison au ligand et de transactivation du LBD du récepteur de la vitamine D sont conservées, * ils sont stables, à savoir qu'ils peuvent être conservés, notamment dans NaCl 100 mM à pH 7 pendant au moins environ une semaine, sans que soit pour autant affectées les propriétés susmentionnées du LBD, par opposition au LBD non modifié qui est instable dans les conditions susmentionnées, * ils sont cristallisables dans des solvants aqueux, notamment à 4 C par la méthode de diffusion de vapeur à goutte suspendue, * et, ils sont solubles dans des solvants aqueux, - ou les séquences peptidiques dérivées des séquences peptidiques définies cidessus, notamment par suppression, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, lesdites séquences dérivées possédant les caractéristiques mentionnées cidessus desdits polypeptides dérivés. L'invention a plus particulièrement pour objet les polypeptides dérivés des VDR d' origine humaine ou animale tels que définis ci-dessus, lesdits polypeptides dérivés étant caractérisés en ce qu'ils comprennent les séquences peptidiques desdits récepteurs nucléaires dans lesquelles est supprimé le fragment peptidique délimité : - d'une part, par un acide aminé situé approximativement à l'une des positions 155 à 175 des séquences peptidiques des récepteurs nucléaires de la vitamine D d'origine humaine ou animale, notamment des séquences peptidiques des VDR représentées sur la figure la, et plus particulièrement par l'acide aminé situé à l'une des positions 159 à 168 de ces séquences, - et, d'autre part, par un acide aminé situé approximativement à l'une des positions 204 à 225 des séquences peptidiques des récepteurs nucléaires de la vitamine D d'origine humaine ou animale, notamment des séquences peptidiques des VDR représentées sur la figure la. L'invention concerne plus particulièrement les polypeptides dérivés tels que définis ci-dessus, lesdits polypeptides dérivés étant choisis parmi ceux comprenant : - la séquence en acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 118 et 427, ou aux positions 124 et 427 des séquences peptidiques des VDR d'origine humaine ou animale, notamment des séquences peptidiques des VDR représentées sur la figure la, et dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 desdites séquences peptidiques des VDR sont supprimés, - ou une séquence peptidique dérivée de la séquence en acides aminés susmentionnée, notamment par suppression, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée possédant les caractéristiques mentionnées cidessus dudit polypeptide dérivé. L'invention a plus particulièrement pour objet le polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, comprenant : - la séquence peptidique désignée hVDR (118-427 # 165-215) dont les acides aminés situés aux positions 1 à 259 correspondent à la séquence en acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 118 et 427 de la séquence peptidique du VDR d'origine humaine dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 sont supprimés, - ou la séquence peptidique SEQ ID NO : 1 délimitée par les acides aminés situés aux positions 7 et 259 de la séquence représentée sur la figure 5, et correspondant à la séquence en acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 124 et 427 de la séquence peptidique du VDR d'origine humaine dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 sont supprimés. L' invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus. A ce titre, l' invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant: - celle codant pour le polypeptide dérivé délimité par les acides aminés situés aux positions 118 et 427 de la séquence peptidique du VDR d'origine humaine dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 sont supprimés, cette séquence nucléotidique étant le cas échéant précédée par un codon ATG codant pour une méthionine, - celle codant pour le polypeptide dérivé délimité par les acides aminés situés aux positions 7 et 259 de la séquence peptidique représentée sur la figure 5, et correspondant au polypeptide dérivé délimité par les acides aminés situés aux positions 124 et 427 de la séquence peptidique du VDR d'origine humaine dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 sont supprimés, cette séquence nucléotidique étant le cas échéant précédée par un codon ATG codant pour une méthionine, - ou une séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour un polypeptide dérivé du hVDR tel que défini ci-dessus, - ou une séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, et codant pour une séquence peptidique dérivée des polypeptides dérivés du hVDR définis ci-dessus, et possédant les caractéristiques mentionnées ci-dessus desdits polypeptides dérivés. L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques recombinantes comprenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus en association avec les éléments nécessaires à la transcription de cette dernière séquence, notamment avec un promoteur et un terminateur de transcription. L' invention concerne également les vecteurs, notamment plasmides ou virus tels que les baculovirus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L' invention a également pour objet les cellules hôtes transformées par un vecteur susmentionné, lesdites cellules étant choisies notamment parmi les bactéries telles que E. coli, ou les cellules d'insectes susceptibles d'être infectées par un baculovirus. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - transformation de cellules à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini cidessus, - mise en culture des cellules ainsi transformées, et récupération dudit polypeptide produit par lesdites cellules, le cas échéant après purification. L' invention concerne également les polypeptides dérivés du récepteur nucléaire de la vitamine D tels que définis ci-dessus, liés à la vitamine D ou à un analogue de la vitamine D, notamment à tout ligand capable de se lier auxdits polypeptides avec une haute affinité, à savoir une affinité supérieure à environ 10-6 M. L' invention concerne également les polypeptides dérivés du récepteur nucléaire de la vitamine D tels que définis ci-dessus, le cas échéant liés à la vitamine D ou à un analogue de la vitamine D, et se présentant sous forme de cristaux. Avantageusement, les cristaux susmentionnés de la présente invention sont obtenus par diffusion de vapeur en présence notamment de sulfate d'ammonium en tant que précipitant, ou d'un autre agent précipitant. Avantageusement encore, les cristaux de l' invention sont utilisables dans le cadre de techniques de cristallographie aux rayons X. Les cristaux susmentionnés peuvent atteindre une résolution déterminée par cristallographie aux rayons X inférieure à 25 , qui fournit une information au niveau atomique de l'interaction entre une molécule cible et le récepteur. L'invention a plus particulièrement pour objet les cristaux de hVDR (118-427 A 165-215) complexé à 1,25 (OH)2D3), caractérisés en ce qu'ils appartiennent au groupe d'espace orthorhombique (P21 2121) avec a = 45.193 , b = 52.443 Â, c = 133.286 , &= ss = [gamma]= 90 . L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, pour la mise en #uvre d'une méthode de criblage d'analogues synthétiques de la vitamine D. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, pour la mise en #uvre d'une méthode de criblage d'analogues agonistes ou antagonistes de la vitamine D susceptibles d'être utilisés dans des compositions pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitement de pathologies cancéreuses, de l'ostéodystrophie, de l'ostéoporose, du psoriasis, des maladies autoimmunes. L'invention concerne également des procédés de criblage d'analogues de la vitamine D, ou de cofacteurs, comprenant les étapes suivantes : - mise en présence d'un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, avantageusement lié à un support solide, avec l'analogue ou cofacteur testé, l'un dudit polypeptide dérivé ou de l'analogue de la vitamine D étant avantageusement marqué, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique, - détection de l'éventuelle liaison entre ledit polypeptide dérivé et l'analogue testé par mesure du marqueur utilisé, notamment après rinçage du support utilisé lors de l'étape précédente. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, pour la mise en #uvre d'une méthode d'analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre ledit polypeptide et une molécule déterminée. A ce titre l' invention concerne plus particulièrement une méthode d' analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, et une molécule déterminée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - mise en présence d'un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, avec la molécule déterminée, - cristallisation du complexe formé entre ledit polypeptide dérivé et la molécule déterminée, notamment par diffusion de vapeur, et analyse tridimensionnelle dudit complexe notamment par remplacement moléculaire, - ou analyse tridimensionnelle dudit complexe en solution, notamment par RMN. L' invention concerne également l' application de la méthode d' analyse susmentionnée à la conception de composés susceptibles d'être des agonistes ou des antagonistes de la vitamine D tels que définis ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues agonistes ou antagonistes de la vitamine D tels qu'obtenus par mise en #uvre d'un procédé de criblage susmentionné, ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant ces analogues en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L' invention a également pour objet les kits (ou trousses) pour la mise en #uvre d'un procédé de criblage ou d'une méthode d'analyse susmentionnés, lesdits kits comprenant un polypeptide dérivé tel que défini ci-dessus, le cas échéant sous forme de cristaux susmentionnés, en association avec un ou plusieurs réactifs pour la mise en #uvre du procédé ou de la méthode susmentionnée. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation du polypeptide dérivé représenté sur la figure 5, et de l'analyse de la structure cristalline et des propriétés du polypeptide dérivé ainsi obtenu. Le polypeptide dérivé représenté sur la figure 5 (encore désigné mutant LBD VDR (résidus 118-427 # 165-215)), a été préparé sans son domaine d'insertion flexible en supprimant les résidus 165 à 215 de hVDR (Figure la) et en laissant une trentaine de résidus afin de connecter les hélices Hl et H3. Le mutant LBD VDR (résidus 118-427 A 165-215) a été surexprimé dans E. coli et purifié par chromatographie d'affinité et d'échange d'ions, et par filtration sur gel, selon la méthode décrite ci-après. A) Expression et purification du mutant LBD VDR 118-427 A 165-215 Le récepteur VDR muté (résidus 118-427 A 165-215) a été surproduit sous forme de peptide avec un tag hexahistidine. Le cDNA amplifié par PCR a été sous-cloné dans les sites NdeI-BamHI du vecteur pET15b (Novagen). Le plasmide a été ensuite amplifié dans les bactéries E. coli XL-1 Blue afin de contrôler la séquence et a été introduit dans les bactéries E. coli BL21DE3 pour la surexpression. Une préculture de 200 ml de LB avec 200 g ampicilline/ml est utilisée pour inoculer 6x 11 de LB contenant 200 g ampicilline/ml. Les cellules sont cultivées à 37 C jusqu'à une absorbance de 0. 6 puis l'expression de la protéine est induite par l'addition de 1 mM d'IPTG dans le milieu de culture durant 6h à 20 C. Les cellules sont culottées par ultracentrifugation et conservées à -80 C. Le culot cellulaire représentant 1 1 de culture est repris dans 25 ml de tampon contenant 20mM Tris pH8. 0, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 5% glycérol, 0.5 g/ml du cocktail d'inhibiteur de protéases, 1 mM de P-mercaptoéthanol et 1 mM de PMSF. La lyse des cellules s'effectue par sonication et l'extrait brut est obtenu par ultracentrifugation à 45 K pendant lh30. La purification s'effectue en trois étapes. L'extrait brut est dans premier temps chargé sur une colonne d'affinité métallique (Talon, Clonetech). Après lavage, la protéine est éluée avec un tampon contenant 20 mM Tris pH8. 0, 250 mM NaCl, 150 mM Imidazole et 5% glycérol. La protéine est ensuite concentrée sur Centriprep 30 et diluée avec 4 volumes de tampon 20 mM Tris ph7. 5, NaCl 50mM et DTT 5 mM. L'échantillon est ensuite chargé sur une colonne d'échange anionique Q15 (Sartorius) et élue par un gradient de NaCl (0#1M). Afin de couper le tag hexahistidine, la protéine est digérée par la thrombine (1 unité par mg de protéine) à 4 C pendant 12h en présence de CaC12 5mM. Finalement la protéine est chargée sur gel de filtration Superdex 75 16/60 (Pharmacia) équilibrée avec 10 mM Tris pH7. 0, 100 mM NaCl, 10 mM DTT et éluée avec ce même tampon. Le ligand est alors ajouté en excès et incubé avec la protéine à 4 C durant 12h. Le complexe est alors concentré sur Centricon 30 pour la cristallisation. La quantité de protéine purifiée est de 2 mg/1 de culture. La qualité et l'homogénéité de la protéine sont analysées par électrophorèse en condition dénaturante et native. La protéine est pure à plus de 95% et une bande unique est observée sur gel natif. La protéine est monomérique selon l'élution de la filtration sue gel et des mesures de diffusion de lumière. La concentration en protéine est mesurée par Bradford et par spectrophotométrie. L'échantillon est monodisperse selon les mesures de diffusion de lumière. B) Analyse et propriétés du VDR 118-427 A 165-215. La capacité de la protéine mutante à se lier à 1,25(OH)2D3 a été déterminée par la méthode de Scatchard en utilisant des extraits bruts de la protéine recombinante (Figure 2a : les analyses de Scatchard ont été effectuées sur Dextran/charbon; les extraits bruts de E. coli BL21 (DE3) exprimant hVDR sauvage ou mutant/ pET 15b, ont été dilués 1000 fois et incubés avec des quantités croissantes (3H-26,27, Amersham) 1,25(OH)2D3 dans Tris 20 mM, NaCl 250 mM, dithiothréitol (DTT) 5 mM, glycérol 10% pendant 16 heures à 4 C; après incubation, 25 l de Dextran/charbon (1,5%) ont été additionnés à 25 l du mélange de protéines ; 5 min les tubes ont été centrifugés à 13000 rpm pendant 5 min; les concentrations de ligand lié (B) ont été déterminées par comptage en scintillation liquide sur le surnageant ; les concentrations en ligand total ont été mesurées par comptage en scintillation liquide sur 15 l du mélange de protéines avant addition de Dextran/charbon; U représente le ligand non lié; chaque point représente la moyenne de trois valeurs; les résultats ont été analysés par la méthode non linéaire de moindre carré selon la méthode décrite par Claire et al., 1978 ; la courbe pleine et celle en pointillé correspondent respectivement aux résultats expérimentaux obtenus avec le polypeptide mutant dérivé et la protéine sauvage, avec les paramètres N = 0,073 + 0,006 nM, Kd = 0,37 ~ 0,05 nM, ss = 0,058 ~ 0,002 pour le polypeptide mutant dérivé, et N = 0,10 ~ 0,01 nM, Kd = 0,55 ~ 0,08 nM, p = 0,051 ~ 0,003 pour la protéine sauvage, avec N = nombre de sites, Kd = constante de dissociation, et (3 = liaison non spécifique; les expériences ont été répétés deux fois). Aucun changement significatif entre les constantes de dissociation des VDR du type sauvage et mutant n'a été observé, les valeurs étant similaires à celle décrites préalablement pour le récepteur entier (Bouillon et al., 1995). Afin de comparer les propriétés de transactivation des deux protéines, les LBD sauvages et mutants ont été fusionnées au domaine de liaison à l'ADN de l'activateur GAL4 de la levure. Les protéines chimériques ont été exprimées par transfection dans les cellules Cos, et la transactivation a été mesurée avec un rapporteur approprié répondant à GAL4. Les deux protéines présentent des propriétés de transactivation comparables dans ce système (Figure 2b : les LBD de VDR sauvage ou mutant ont été fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de l'activateur Gal4 (1-147) de la levure par clonage de l'ADNc dans les sites XhoI-BamHI du vecteur PXJ440 (Xiao et al., 1991); les cellules Cos ont été transfectées selon la méthode décrite par Xiao et al., 1991, avec les vecteurs (250 ng) contenant les LBD sauvage ou mutant de hVDR avec 2 g de gène rapporteur 17m5TATA-CAT et 2 g d'un recombinant de contrôle interne pCHUOlacZ (Pharmacia) exprimant la P-galactosidase complété à 20 g avec un ADN support; les cellules ont été traitées avec EtOH ou 1,25(OH)2D3 10-7M; les activités CAT, normalisées en unités égales de (3-galactosidase, sont exprimées par rapport à l'activité CAT (100%) induite par le VDR sauvage en présence de 1,25(OH)2D3). Par conséquent, la délétion du domaine d'insertion n'a pas d'effet majeur sur la liaison du ligand, la transactivation ou la dimérisation avec le LBD de RXRa. La suppression du domaine d'insertion flexible dans le LBD de VDR a conduit à une protéine davantage soluble, qui peut être cristallisée sous forme de complexe avec 1,25 (OH)2D3. Des cristaux ont pu être obtenus par des techniques de diffusion de vapeur en utilisant du sulfate d'ammonium en tant que précipitant. La structure du cristal a été résolue par une combinaison de remplacement moléculaire, en utilisant un modèle partiel de RARy (Renaud et al. 1995 ; Klaholz et al., 1998), et de remplacement isomorphe avec un dérivé du mercure. Les résultats obtenus sont résumés sur le tableau 1 ci-après. Tableau 1 Composé Dérivé naturel thiomersal groupe de données source de rayons X Hambourg BW7B Laboratoire longueur d'onde 0,8345 1,5418 résolution 20,0-1,8 20,0-2,9 Â reflexions uniques 29434 6404 complétude 97,4% 84,9% multiplicité 4,1 2,8 Rsyma 6,1% 9,8% dernière tranche de résolution 24%, 5,06, 93,3% 20,6%, 3,2, 71,4% nombre de sites 4 pouvoir de phasage (c/a) 1,33/1,72 facteur centrique R 53 % Affinement facteur R libre (10% des reflexions)b 21,4% facteur R 19,1% nombre d'atomes non hydrogène protéine 1994 ligand 30 molécules d'eau 166 Rmsd sur la longueur de liaison ( ) 0,004 Rmsd sur les angles de liaison ( ) 1,083 moyenne des facteurs B pour les atomes non hydrogène ( 2) protéine 31,,0 ligand 22,3 eau 45,6 (Tableau 1 : les expériences de cristallisation ont été effectuées à 4 C par la méthode de diffusion de vapeur à goutte suspendue; la protéine a été concentrée de 4 à 10 mg/ml; les cristaux de hVDR (118-427 A 165-215) complexés à 1,25 (OH)2D3 ont été obtenus en 4 jours à partir d'une solution contenant du sulfate d'ammonium 0,7 M, tampon Mes 50 mM pH6. 0, Tris 5mM, DTT 5mM équilibré contre un réservoir contenant du sulfate d'ammonium 1,4 M, Mes 0,1 M pH = 6.0; les cristaux appartiennent au groupe d'espace orthorhombique (P21 21 21) avec a = 45.193 , b = 52. 443 , c = 133.286 , a = p = y = 90 ; l'unité asymétrique contient un monomère ; le contenu en solvant des cristaux est de 48 %; le facteur B estimé par la méthode de Wilson est 29. Le dérivé à atome lourd a été obtenu en trempant les cristaux dans du Thiormesal (Ethyl mercurylthiosalicylate) pendant 4 jours; les résultats de diffusion aux rayons X des cristaux naturels ont été mesurés à 4 C sur la ligne de faisceau BW7B au synchrotron de Hambourg; les résultats ont été traités en utilisant les logiciels DENZO et SCALEPACK (Otwinoswski et al., 1997); les phases initiales ont été obtenues par remplacement moléculaire avec AMORE (Navaza et al., 1994), en utilisant le RARy comme modèle de départ ; modèle contient les hélices conservées Hl, H3-H5, H7- H10 (Figure la); la solution a une corrélation de 31 % et un facteur R de 53,6 % après remplacement de corps rigide AMORE ; par les phases obtenues à l'aide du dérivé mercuriel dont les données de diffraction ont été enregistrées sur un détecteur d'image bidimensionnelle Mar Research au laboratoire à 4 C; les sites dérivés ont été trouvés et affinés avec le logiciel SOLVE (Tervilliger et al., 1987). La carte obtenue par des phases combinées a été calculée à une résolution de 3 en utilisant une correction de solvant. L'affinement a été effectué avec le logiciel CNS (Brünger et al., 1998). Des cycles de construction du modèle avec le logiciel 0 (Jones et al., 1991) et une minimisation de moindre carré, suivi d'un affinement anisotropique individuel de facteur B ont conduit au modèle final. Tous les résultats entre 20 et 1,8 ont été inclus dans l'affinement sans seuils de coupure. Les molécules de solvant de la première couche d'hydratation ont été localisées avec le logiciel CNS sur une carte F0-Fc à 3 sigma. Les valeurs maximales de facteur B (40-50) correspondent aux résidus dans la boucle avant Hl, la jonction et les boucles H9-H10 et Hl 1-H12. La qualité du modèle fmal a été analysée par le logiciel PROCHECK (Laskowski et al., 1993). La distribution d'angle Ramachadran indique 92,4 % de conformations les plus favorables, et 7,6 % de conformations autorisées. Le modèle final contient 250 résidus, 166 molécules d'eau et une molécule de ligand. Aucune densité claire n'a été observée pour les deux premiers résidus Nterminaux et les quatre derniers résidus C-terminaux. Trois résidus additionnels, 375 à 377 dans la boucle H9-H10, n'ont pas été inclus dans raffinement en raison de la qualité modérée de la carte de densité électronique dans cette région. La topologie globale du LBD de VDR (figure lb) est similaire à celle des autres LBD de récepteurs nucléaires, avec 13 hélices prises en sandwich dans 3 couches et un feuillet (3 à trois brins. La nomenclature est fondée sur la structure de hRXRa (Bourguet et al., 1995). Le domaine reliant les hélices Hl et H3 contient deux petites hélices H2 et H3n. La nouvelle hélice H3n forme le fond de la structure et remplace la boucle Q dans la structure de RARy. La flexibilité intrinsèque des trois résidus glycine (162-164) situés à lajonction favorise une adaptation douce. Ce fragment de trois résidus est plutôt éloigné du ligand, et il est par conséquent peu probable qu'il joue un rôle dans la liaison au ligand. La structure VDR est plus proche de celle du RARy complexé à des agonistes. Les protéines se superposent avec un rmsd de 1,2 sur 179 résidus (seuil de coupure de 2,5 Â sur Cet), les régions exclues étant le peptide connectant Hl à H3, le brin ss2, l'hélice H6 et quelques boucles de connexion. La différence la plus notable se situe au niveau de la connexion entre les hélices Hl et H3, qui dans le RARy entoure le feuillet ss, et dans le VDR suit un chemin entre H3 et l'extrémité du feuillet ss, identique à celui de ERa (Brzozowski et al., 1997). Par conséquent, l'extrémité du feuillet (3 est déplacée vers l'extérieur et agrandit la cavité de liaison à la vitamine D (Figure 3a et 3b). Tous les brins P ont des résidus en contact avec le ligand. Dans le brin ss1, Trp 286, spécifique des récepteurs VDR, joue un rôle important dans le positionnement du ligand. Il fait partie d'un réseau de liaisons hydrogène impliquant Ser 275 qui est elle-même liée par liaison hydrogène à Gln 317 et au carbonyle de Met 272. L'extrémité du feuillet P est aussi stabilisée par des liaisons hydrogènes entre les groupes carbonyles de Glu 292 et Lys 294, et Arg 158 de la boucle de connexion entre les hélices H2 et H3n. L'hélice H12, dont le positionnement est important pour la liaison de coactivation et la transactivation, est en position agoniste (Figure 3c). L'hélice est stabilisée dans cette orientation par des contacts hydrophobes (Ile 268 de H5 et Phe 422 de H12) et interactions polaires. Dans ces dernières interactions sont engagées le pont conservé Lys 264-Glu420, et une liaison hydrogène entre Ser 235 de H3 et Thr 415. De plus, les groupes carbonyles de Met 412 et de Leu 414 de la boucle H11-H12 sont liés par liaison H à Arg 154 (extrémité de H12) qui fait lui-même des liaisons H avec Asp 232 (H3). Tous ces résidus sont conservés chez les récepteurs VDR. La mutagenèse dirigée des résidus Lys 264 et Glu 420 qui établissent le pont salin, a permis de révéler que ces mutations suppriment la transactivation dépendante du ligand, mais n'a pas d'effet sur la liaison au ligand, l'hétérodimérisation avec RXR ou la liaison à l'ADN (Nakajima et al., 1998). Un fort contact cristallin est observé entre l'hélice H3n et les hélices H3, H4 et H12 d'une molécule symétriquement reliée (Figure 3d). H3n mime les contacts du peptide SRC1 observés dans le complexe ternaire de PPAR (Nolte et al., 1998), bien qu'il ne contienne pas le motif LXXLL trouvé chez la plupart des coactivateurs. Cette hélice est ancrée par contacts polaires à travers des liaisons H entre la région Nterminale de H3n (Ser 216, Val 217 et Thr 218) et Glu 420 (H12). Au niveau de la région C-terminale de l'hélice H3n, Ser 222 est lié par liaison hydrogène à Lys 246 (extrémité de l'hélice H3). L'importance fonctionnelle de cette lysine a été démontrée par mutation en glycine qui affecte fortement la transactivation (Whitfield et al., 1995). Entre les résidus Lys 246 et Glu 420, une cavité hydrophobe est formée par les hélices H3, H4 et H12. Les résidus de l'hélice H3n (Val 217, Thr 218, Leu 219, Leu 221, et Ser 222) sont en contact par liaison van der Waals avec Ile 242 (H3), Ile 260 (H4), Leu 417 et Val 421 (H12). Cette observation montre que d'autres séquences que LXXLL doivent être prises en considération dans le cadre du processus de reconnaissance des récepteurs nucléaires. La structure du VDR lié à son ligand naturel a permis de résoudre nombre d'ambiguïtés et de questions concernant la conformation de la vitamine D active. La comparaison avec la structure cristallographique de la molécule libre de vitamine D (Suwinska et al., 1996) montre que les deux ligands ont une conformation identique pour les noyaux A, C et D (Figure 4a). La différence la plus appréciable est la géométrie non planaire du triène conjugué dans le complexe, qui résulte de la forme courbe du ligand nécessaire à sa fixation au récepteur. La poche de liaison au ligand est bordée de résidus hydrophobes prédominant (Figures 4b et 4c). Le ligand étendu englobe l'hélice H3 avec son noyau A (Figures 3b et 3c) orienté vers les extrémités C-terminales de l'hélice H5 et le groupe hydroxyle-25 proche des hélices H7 et H11. Le groupe méthyle 27 forme une faible interaction avec l'hélice H12 (Val 418). Les distances séparant les parties hydroxygle-25 des groupes hydroxyles du noyau A, 1-OH et 3-OH, sont de 13 et de 15,4 , respectivement. Dans le complexe, le noyau A adopte une conformation B en chaise avec les groupes 1-OH et 3-OH respectivement en orientations équatoriales et axiales. La partie hydroxyle en position 1 forme deux liaisons H avec Ser 237 (H3) et Arg 274 tandis que le groupe 3-OH forme deux liaisons H avec Ser 278 (H5) et Tyr 143 qui est conservé uniquement chez les mammifères. Arg 274 est compris dans un réseau serré de liaisons H avec des molécules d'eau et le carbonyle de Thr 142 à l'extrémité de Hl (Figure 4c). Le triène conjugué (Figure 4a), connectant les noyaux A et C est situé dans un canal hydrophobe pris en sandwich entre Ser 275 (boucle H5-P) et Trp 286 (ss1) sur l'un des côtés et Leu 233 (H3) sur l'autre côté. La liaison unique C6-C7 présente une conformation trans qui dévie de 30 % par rapport à la géométrie planaire. Cette déviation explique le manque d'activité biologique des analogues ayant une conformation trans ou cis de la liaison C6-C7 (Norman et al., 1997). De façon exclusive, des résidus hydrophobes entourent cette chaîne. Le groupe 25-hydroxyle est lié par liaison H à His 305 (boucle H6-H7) et His 397 (Hll) (Figure 4). Un réseau de liaison H autour des résidus histidine indique que His 305 et His 397 sont respectivement les accepteurs et donneurs de liaison H. Tous les résidus impliqués dans le réseau de liaison H à l'exception de Ser 306 sont conservés parmi les VDRs. Les mutants naturels que l'on trouve dans le rachitisme résistant à la vitamine D, Arg274Leu et His305Gln (Kristjansson et al., 1993), confirme le rôle critique pour la liaison au ligand de Arg 274 et His 305, impliqués respectivement dans l'ancrage de 1-OH et 25OH. Conformément au fait que le ligand 1,25 (OH) 2D3 est plus grand que l'estradiol, la progestérone et l'acide rétinoïque tout trans, la poche de liaison au ligand du VDR est plus grande (697 3) (Figure 4d) que celle du ER (369 3), du PR (427 3), du RARy (421 Â3). Toutefois, l'augmentation de taille n'est pas proportionnelle puisque 1,25 (OH)2D3 occupe seulement 56 % de la liaison au ligand du VDR, en comparaison aux 63 %, 67 % et 66 % calculés respectivement avec l'estradiol, la progestérone et l'acide rétinoïque tout trans. Le volume accessible de la cavité des VDR montre une expansion de la poche à proximité de la position 2 du noyau A, qui est occupée par deux molécules d'eau et représente 40 3. Cet espace additionnel pourrait recevoir le groupe méthyle massif du ligand synthétique 2a-méthyl 1,25 (OH)2D3 qui en effet présente une affinité de liaison 4 fois plus importante que le ligand naturel (Fujishima et al., 1998). De plus, l'espace additionnel autour de la chaîne aliphatique pourrait permettre le logement de différentes longueurs de chaîne. Plusieurs analogues de la vitamine D ont été montrés comme se comportant différemment du ligand naturel s'agissant de la transactivation et du recrutement de coactivateur (Takeyama et al., 1999 ; Rachez et al., 1998). Afin de comprendre cette spécificité, des études préliminaires du modelage du ligand ont été réalisées. Les ligands synthétiques possédant une chaîne aliphatique plutôt rigide en position 17, tel que MC 903 (22ène-26, 27 -cyclopropyl- la, 24S (OH) 2 D3) ou EB 1089 (22,24 diène - 24, 26, 27 tri-homo la, 25 (OH)2 D3) (une ou deux double liaisons respectivement), peuvent loger dans la poche de liaison avec seulement quelques ajustements mineurs de la géométrie de 1,25 (OH)2 D3. Les noyaux C et D doivent seulement être déplacés afin de loger les groupes méthyles en position 26 et 27 de EB 1089 ou le noyau cyclopropyle de MC 903. Pour les analogues 20-epi-l,25 (OH) 2 D3 et KH 1060, seuls les confonnères de faible énergie, avec une conformation gauche-anti autour de C20, peuvent se loger. Avec une telle géométrie, le groupe méthyle en C21 pointe dans la même cavité comme le ligand naturel, tandis que le reste de la chaîne, du à la combinaison de la conformation anti de C20-C22 et de l'épimérisation de C20, borde le côté opposé de la cavité de liaison. Cette variation de chemin conduit à différents contacts pour les deux épimères. La distance de la partie 1-hydroxyle jusqu'à la partie 25-hydroxyle est plus courte dans l'analogue 20-epi, de sorte que les chaînes longues, comme dans le cas de KH1060, peuvent loger. Les ligands avec une chaîne aliphatique plus longue adopte une conformation plus compacte et forment des contacts van der Waals additionnels avec la cavité de liaison qui peut ensuite stabiliser l'hélice en position H12 et/ou affecter des régions moins rigides de la poche de liaison comme la boucle H6-H7. Ces différents contacts avec une cavité de liaison plutôt rigide peuvent expliquer les différences dans les demi-vies et les activités transcriptionnelles. La structure de la vitamine D a fait l'objet de nombreuses études ces dix dernières années. La présente invention fournit pour la première fois une image de 1,25 (OH)2 D3 dans sa conformation active. Jusqu'à maintenant, la chaîne latérale naturelle de 1,25 (OH)2 D3 a été la cible principale des modifications chimiques en vue de découvrir de nouveaux ligands agonistes plus spécifiques. Le squelette composé des noyaux A à D n'a pas pu être modifié sans perte de la capacité de liaison au ligand. Les analogues auxquels manquent les noyaux entiers C et/ou D mais ayant un espacement normal des groupes hydroxyles peuvent faire des points de contact normaux à l'intérieur de la poche de liaison expliquant leur potentiel biologique normal (Verstuyf et al., 1998). Le complexe selon l'invention révèle l'arrangement tri-dimensionnel de la poche de liaison autour de 1,25 (OH)2 D3 et fournit de nouvelles perspectives pour la conception de squelettes originaux. Bibliographie Bouillon, R., Okamura, W. H. & Norman, A.W. Structure-function relationships in the vitamin D endocrine system. Endocr. Rev. 16, 200-257 (1995) Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H. & Moras, D. Crystal structure of the ligand-binding domain of the human nuclear receptor RXR-a. Nature 375, 377-382 (1995) Brünger, A.T. et al., Crystallography & NMR System ; a new software system for macromolecular structure détermination. Acta Cryst. D 54,905-921 (1998) Brzozowski, A.M. et al. 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Two mutations in the hormone binding domain of vitamin D receptor cause tissue resistance to la, 25 - dihydroxyvitamin D3. J. Clin. Invest. 92,12-16 (1993) Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S. & Thomton, J. M. PROCHECK : a program to check the stereochemical quality of protein structure coordinates. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993) Mangelsdorf, D.J. et al. The nuclear receptor superfamily : the second decade. Cell 83, 835-839 (1995) Nakajima, S., Yamagata, M., Sakai, N. & Ozono, K. Characterization of the activation function-2 domain of the human la, 25 - dihydroxyvitamin D3 receptor. Mol. Cell. Endocr. 139, 15-24 (1998) Navaza, J. Amore : an automated package for molecular replacement. Acta Cryst. A 50, 157-163 (1994) Norman et al. Comparison of 6-s-cis- and 6-s-trans-locked analogs of la, 25 dihydroxyvitamin D3 indicates that the 6-s-cis conformation is preferred for rapid nongenomic biological responses and that neither 6-s-cis- nor 6-s-trans- locked analogs are preferred for genomic biological responses. Mol. Endocr. 11,1518-1531 (1997) Nolte, R. T. et al. Ligand binding and co-activator assembly of the peroxisome proliferator-activated receptor-y. Nature 395,137-143 (1998) Otwinoswski, Z & Minor, W. Processing X-ray data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology 307-326 (1997) Rachez, C. et al. A novel protein complex that interacts with vitamin D3 receptor in a ligand-dependant manner and enhances VDR transactivation in a cell-free system. Genes & Dev. 12, 1787-1800 (1998) Renaud, J.P. et al.. Crystal structure of the ligand binding domain of the human nuclear receptor RARy complexed with all-trans retinoic acid. Nature 378, 681-689 (1995) Suwinska, K. & Kutner, A. 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Polypeptides dérivés du récepteur nucléaire de la vitamine D chez l'homme ou les différentes espèces du règne animal possédant un tel récepteur, ledit récepteur nucléaire comprenant un domaine de liaison au ligand, ou LBD, ce LBD contenant un domaine d' insertion flexible, lesdits polypeptides dérivés étant caractérisés en ce qu'ils comprennent : - les séquences peptidiques desdits récepteurs nucléaires dans lesquelles : * le domaine d' insertion flexible du LBD est modifié par substitution ou suppression d'au moins environ 30 acides aminés, et de préférence d'au moins environ 40 acides aminés, ou de la totalité des acides aminés composant ce domaine d' insertion, * et, le cas échéant, un ou plusieurs ou la totalité des acides aminés situés aux positions 1 à environ 125, notamment aux positions 1 à 117 ou 123, des séquences peptidiques desdits VDR, sont modifiés par substitution ou suppression, lesdits polypeptides dérivés possédant les caractéristiques suivantes : * les propriétés de liaison au ligand et de transactivation du LBD du récepteur de la vitamine D sont conservées, * ils sont stables, à savoir qu'ils peuvent être conservés, notamment dans du NaCl 100 mM à pH 7 pendant au moins environ une semaine, sans que soit pour autant affectées les propriétés susmentionnées du LBD, par opposition au LBD non modifié qui est instable dans les conditions susmentionnées, * ils sont cristallisables dans des solvants aqueux, notamment à 4 C par la méthode de diffusion de vapeur à goutte suspendue, * et, ils sont solubles dans des solvants aqueux, - ou les séquences peptidiques dérivées des séquences peptidiques définies cidessus, notamment par suppression, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, lesdites séquences dérivées possédant les caractéristiques mentionnées cidessus desdits polypeptides dérivés. 2. Polypeptides dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent les séquences peptidiques des récepteurs nucléaires de la vitamine D dans lesquelles est supprimé le fragment peptidique délimité : - d'une part, par un acide aminé situé approximativement à l'une des positions 155 à 175 des séquences peptidiques des récepteurs nucléaires de la vitamine D d' origine humaine ou animale, et plus particulièrement par l'acide aminé situé à l'une des positions 159 à 168 de ces séquences, - et, d'autre part, par un acide aminé situé approximativement à l'une des positions 204 à 225 des séquences peptidiques des récepteurs nucléaires de la vitamine D d'origine humaine ou animale. 3. Polypeptides dérivés selon la revendication 1 ou 2, lesdits polypeptides dérivés étant choisis parmi ceux comprenant : - la séquence en acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 118 et 427, ou aux positions 124 et 427 des séquences peptidiques des VDR d'origine humaine ou animale, et dans laquelle les résidus situés aux positions 165 à 215 desdites séquences peptidiques des VDR sont supprimés, - ou une séquence peptidique dérivée de la séquence en acides aminés susmentionnée, notamment par suppression, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée possédant les caractéristiques mentionnées dans la revendication 1 dudit polypeptide dérivé. 4. Polypeptide dérivé selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant la séquence peptidique SEQ ID NO : 1. 5. Cristaux comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, le cas échéant en association avec la vitamine D, ou un analogue agoniste ou antagoniste de la vitamine D. 6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, - ou une séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour un polypeptide dérivé du hVDR selon la revendication 4, - ou une séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, et codant pour une séquence peptidique dérivée des polypeptides dérivés du hVDR selon la revendication 4, et possédant les caractéristiques mentionnées dans la revendication 1 desdits polypeptides dérivés. 7. Séquence nucléotidique recombinante comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 6 en association avec les éléments nécessaires à la transcription de cette séquence, notamment avec un promoteur et un terminateur de transcription. 8. Vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 ou 7. 9. Cellules hôtes transformées par un vecteur selon la revendication 8, lesdites cellules étant choisies notamment parmi les bactéries telles que E. coli, ou les cellules d'insectes susceptibles d'être infectées par un baculovirus. 10. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - transformation de cellules à l'aide d'un vecteur recombinant selon la revendication 8, - mise en culture des cellules ainsi transformées, et récupération dudit polypeptide produit par lesdites cellules, le cas échéant après purification. 11. Utilisation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, ou de cristaux selon la revendication 5, pour la mise en #uvre d' une méthode de criblage d'analogues de la vitamine D. 12. Utilisation selon la revendication 11, pour la mise en #uvre d'une méthode de criblage d' analogues agonistes ou antagonistes de la vitamine D susceptibles d'être utilisés dans des compositions pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitement de pathologies cancéreuses, du psoriasis, des maladies auto-immunes, de l' ostéodystrophie ou de l'ostéoporose. 13. Méthode de criblage d'analogues de la vitamine D, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - mise en présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, ou de cristaux selon la revendication 5, avantageusement lié à un support solide, avec l' analogue testé, l'un dudit polypeptide ou de l' analogue de la vitamine D étant avantageusement marqué, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique, - détection de l' éventuelle liaison entre ledit polypeptide, ou lesdits cristaux, et l' analogue testé par mesure du marqueur utilisé, notamment après rinçage du support utilisé lors de l'étape précédente. 14. Utilisation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, ou de cristaux selon la revendication 5, pour la mise en #uvre d'une méthode d'analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre ledit polypeptide, ou lesdits cristaux, et une molécule déterminée. 15. Méthode d' analyse de la structure tridimensionnelle des complexes formés entre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, ou de cristaux selon la revendication 5, et une molécule déterminée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - mise en présence dudit polypeptide dérivé, ou desdits cristaux, avec la molécule déterminée, - cristallisation du complexe formé entre ledit polypeptide dérivé, ou lesdits cristaux, et la molécule déterminée, notamment par diffusion de vapeur, et analyse tridimensionnelle dudit complexe notamment par remplacement moléculaire, - ou analyse tridimensionnelle dudit complexe en phase soluble, notamment par RMN.