FR 2796079 A1 20010112 FR 9909036 A 19990707 1 2796079 SÉQUENCES NUCLÉIQUES DE DÉTECTION, D'IDENTIFICATION ET DE TYPAGE DES SOUCHES DE CHAMPIGNONS ET EN PARTICULIER DE L'ESPÈCE Aspergillus fumigatus Domaine Technique : La présente invention concerne la détection, l'identification et/ou la caractérisation infra- spécifique (typage) des champignons et en particulier de l'espèce Aspergillus fumigatus. Notamment, elle fournit des séquences nucléiques pouvant servir de sonde(s) ou de cible(s) pour la détection, l'identification et/ou le typage des souches de champignons d'importance médicale ou agro-alimentaire et en particulier de l'espèce Aspergillusfumigatus. Art antérieur : Conventionnellement, les champignons filamenteux et en particulier ceux du genre Aspergillus sont généralement identifiés d'après leurs caractéristiques morphologiques macroscopiques et microscopiques après culture sur différents milieux. La détection requière la mise en culture des échantillons (prélèvements) sur des milieux adaptés (eg: milieu de Czapeck, milieu au Malt, etc...). Cette culture nécessite environ 5 à 15 jours d'incubation. Après cette période l'identification à l'espèce d'Aspergillus fumigatus nécessite d'observer i) la couleur de l'avers et de l'envers de la culture et ii) les structures microscopiques de multiplication végétative qui sont formées d'un conidiophore lisse renflé en vésicule, couvert sur le tiers supérieur d'une seule rangée de phialides (Pitt, 1994, Journal ofMedical and Veterinary Mycology, 32,17-32). Ces caractéristiques sont retenues comme suffisantes pour identifier les membres de l'espèce A. fumigatus. Accessoirement la capacité du champignon filamenteux à croître à une température supérieure à 42 C confirme l'identification de l'espèce. Cette identification conventionnelle est longue et fastidieuse, elle repose sur des caractères difficiles à interpréter pour une personne n'ayant pas de notion avancée de mycologie. Les erreurs restent possibles par exemple dans le cas de cultures à pigmentation inhabituelle. De plus, cette identification conventionnelle ne permet pas de distinguer de manière fiable les individus au sein de l'espèce A. fumigatus (caractérisation infra-spécifique ou typage). Ces dernières années différentes méthodes moléculaires de détection et d'identification ont été publiées qui concernaient Aspergillus fumigatus. Ces méthodes étaient basées sur la détection d'ADN nucléaire ou d'ADN mitochondrial à l'aide de sondes nucléiques (fragments d'ADN) ou par amplification selon la méthode de polymérisation en chaîne (PCR) (Bretagne et al., 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33,1164-1168). Ces méthodes de détection et d'identification ne permettent pas généralement de différencier des groupes au sein de l'espèce Aspergillus fumigatus. Seule la sonde " clone # 3. 9 Afutl " (Girardin et al., 1994, Journal of Clinical Microbiology, 32,684-690 ; Neuveglise et al., 1996, Nucleic Acid Research, 8,1428-1434 ) conduit à la différenciation des individus au sein de cette espèce. Cependant la mise en #uvre de cette sonde est assez délicate et fastidieuse. Pour permettre une caractérisation infraspécifique des souches d'A. fumigatus il faut recourir à des méthodes de typage comme la méthode RAPD dont la reproductibilité est souvent médiocre ou à l'utilisation du polymorphisme des séquences de type microsatellite, etc... En résumé les méthodes disponibles pour la détection, l'identification et le typage des souches de champignons et en particulier de l'espèce A. fumigatus sont longues et fastidieuses ou ne permettent pas de combiner dans un essai rapide et fable détection-identification et caractérisation infra-spécifique des souches d'A. fumigatus. Par ailleurs, toute nouvelle séquence nucléique pouvant servir de sonde ou de cible pour procéder à la détection, à l'identification ou au typage des souches de champignons et notamment de l'espèce A. fumigatus, présente un intérêt évident pour une application dans le domaine du diagnostic médical ou agro-alimentaire. Dans la littérature il n'est pas proposé d'utiliser une région (séquences) bien localisée de l'ADN mitochondrial pour détecter-identifier voir caractériser au niveau infra-spécifique les champignons et en particulier A. fumigatus. Brève description de l'invention : Dans cet état de la technique, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir des séquences nucléiques spécifiques pour les champignons, et en particulier pour Aspergillusfumigatus, et présentes au niveau du génome mitochondrial des souches, pouvant servir de sondes et/ou de cibles pour la détection, l'identification et/ou la caractérisation infra-spécifique des souches notamment d'A. fumigatus. Ces séquences sont choisies dans une région bien définie de l'ADN mitochondrial. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des séquences nucléiques (AFM-RS1 : Aspergillus fumigatus mitochondrial repeated séquence 1 et SEQ ID : / (AFOS-1) : Aspergillus fumigatus optional séquence 1), qui permettent à la fois une détection spécifique et une identification infra-spécifique des souches d'A. fumigatus de manière performante, fiable et reproductible. Un autre objectif de la présente invention est que ces séquences nucléiques si elles sont utilisées comme sondes sont dirigées contre des séquences cibles de l'ADN mitochondrial d'A. fumigatus. Un autre objectif de la présente invention est d'utiliser ces séquences nucléiques comme cibles pour la détection et l'identification des souches d'A, fumigatus par exemple pour une détection par amplification moléculaire. Un autre objectif de la présente invention est d'utiliser ces séquences nucléiques pour réaliser des recombinaisons site spécifique, par exemple afin d'incorporer une séquence nucléotidique (eg : un gène) dans le génome mitochondrial par exemple d' A. fumigatus. Ces objectifs sont atteints par l'invention qui concerne, tout d'abord, des séquences nucléiques, utilisables comme sondes ou comme cibles, notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des champignons choisis parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie du fragment FI d'environ 5200 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisé en ce qu'elle est bornée par le gène de l'ARN de transfert ARNt- Met et par le gène de la cytochrome oxydase Coxl, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. Ces séquences nucléiques, notamment de détection, et d'identification spécifique et/ou infraspécifique des champignons et en particulier d'A. fumigatus sont caractérisés en ce qu'elles sont choisies parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie de la séquence du fragment d'environ 2500 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisée en ce qu'elle est localisée entre le gène de l'ARN de transfert ARNtMet et le gène de l'ARN de transfert ARNt -His, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. En outre, selon une réalisation préférée de l'invention, ces séquences nucléiques, notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des souches d'Aspergillus fumigatus, sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie de la séquence SEQ ID NO : 1/ (AFMBoxl) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire. Selon un premier mode de cette réalisation préférée, les dites séquences sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 2/ (AFM-RS1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. Selon un deuxième mode de cette réalisation préférée, ces séquences sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 3 / (AFOS-1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. L'invention concerne également un procédé de détection et d'identification des champignons caractérisés en ce qu'il consiste à mettre en #uvre comme sonde une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. Selon ce procédé : - on libère l'ADN total (ADNt) des souches à étudier - on soumet éventuellement cet ADNt à une digestion enzymatique, avec au moins une enzyme de restriction, - on dénature l'ADNt, éventuellement digéré, par exemple par traitement thermique, - on met en présence l'ADNt ainsi dénaturé, avec la sonde dotée d'au-moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation, - on élimine l'ADN et la sonde non hybridés, et on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur. L'invention vise par ailleurs une amorce nucléotidique, utilisable notamment pour la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou tout autre amplification (TMA, QB, etc...), caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence telle que définie ci-dessus. L'invention concerne enfin un réactif de détection/identification des champignons comprenant au moins une sonde correspondant aux séquences ou à l'amorce telles que définies ci-dessus. Description détaillée de l'invention : Il est donc du mérite des inventeurs cités dans la présente demande d'avoir pu isoler et caractériser un certain nombre de séquences d'acides nucléiques provenant du génome mitochondrial chez les champignons et en particulier chez l'espèce A. fumigatus et ayant une structure tout à fait particulière et qui " de facto " constituent de véritables marqueurs non seulement d'espèce mais qui permettent également la division infra-spécifique des espèces en sous groupes majeurs. Ces séquences sont situées au niveau de l'ADN mitochondrial entre le gène de l'ARN de transfert Met-ARNt et le gène de la cytochrome oxydase Coxl, par exemple chez A. fumigatus. En particulier, les inventeurs ont pu isoler et caractériser une séquence spécifique de toutes les souches d' A. fumigatus , la séquence SEQID NO : 2/(AFM-RS1) qui est présente dans le génome mitochondrial des souches de cette espèce et une séquence SEQIDNO:3 /(AFOS-1) qui est une séquence optionnelle présente uniquement chez les souches d'A.fumigatus du groupe haplotype I et qui constituent la séquence SEQ ID NO: 1/(AFM-Box1). Il relève également du mérite des inventeurs d'avoir proposé des outils génétiques ou apparentés constitués par les susdites séquences pour la détection et l'identification inter-espèce des champignons de l'espèce A. fumigatus. Il relève encore du mérite des inventeurs d'avoir montré que la séquence SEQ ID NO:/(AFOS-1) n'était présente que chez certaines souches de l'espèce A. fumigatus, situation très originale et inattendue, permettant ainsi la distinction infra-spécifique des souches au sein de cette espèce en haplotypes mitochondriaux différents. Il relève du mérite des inventeurs d'avoir imaginé d'utiliser cette particularité de la séquence SEQ ID, NO : 3/(AFOS-1) d'être présente ou absente, selon les souches, du génome mitochondrial d'A. fumigatus pour distinguer les souches entre elles à un niveau infra-spécifique par exemple en réalisant une amplification de la région bordante contenant SEQIDNO : 2 /(AFM-RS1) et/ou SEQ ID NO : 2/(AFM- RS1) et SEQIDNO: 3 /(AFOS-1). Enfin il relève du mérite des inventeurs d'avoir démontré que les séquences SEQIDNO:2(AFM- RS1) et SEQIDNO : 3/ (AFOS-1) étaient impliquées dans des phénomènes de recombinaison homologue site spécifique qui entraînent l'insertion et/ou la délétion de l'élément optionnel SEQIDNO:3/ (AFOS-1) compris entre deux séquences SEQ ID NO:2/(AFM-RS1). Cette démonstration implique qu'il est possible d'utiliser les séquences SEQ ID NO:2 (AFM-RS1) et/ou SEQIDNO : 3 (AFOS-1) pour réaliser des recombinaisons par exemple site spécifique, par exemple avec un vecteur de transformation incluant tout ou partie des séquences citées, pour transformer le génome mitochondrial par exemple d'A. fumigatus. A titre d'illustration et d'exemple nous pouvons présenter les résultats suivants qui ne sont pas limitatifs : Description des figures : # La figure 1 montre les profils d'hybridation selon Southern après digestion EcoRI de l'ADN total des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89 avec les sondes nucléiques : ADNmt purifié de la souche LML 03 (panel A), SEQ ID NO : 1 / (AFM-Boxl) (panel B) et SEQ ID NO:2/ (AFM-RS1) (panel C). # La figure 2 montre l'organisation et les cartes de restriction des fragments d'ADNmt F1 (5,148-pb) (panel A) et F2 (4,080-pb) (panel B) provenant respectivement des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89. # La figure 3 montre les profils d'amplification PCR obtenus avec la paire d'amorces AfT7/PaSp6 sur l'ADNt des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89. # La figure 4 montre les séquences de la région variable contenant SEQIDNO : 1 / (AFM-Boxl) délimitée par les amorces PatSp6/AfT7 pour les fragments FI (panel A) et F2 (panel B). # La figure 5 montre l'alignement des séquences répétées de 194-bp d'origine mitochondriale SEQID NO: 2 / (AFM-RSla), AFM-RSlb et AFM-RS1cappartenant respectivement aux souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89. La figure 6 montre les profils d'hybridation en dot-blot obtenus avec les différentes sondes nucléiques : SEQIDN01 / (AFM-Boxl), 1263-pb (panel A), SEQIDNO:2/(AFOS-1), 875-pb (panel B) et SEQIDNO:3/ (AFM-RS1), 194-pb (panel C). I. Détection et caractérisation de deux haplotypes mitochondriaux chez Aspergillus fumigatus Nous avons analysé les polymorphismes de taille de restriction des génomes mitochondriaux de deux souches représentatives d'A. fumigatus qui présentaient des profils d'hybridation selon Southern différents (Fig. 1, panel A). Les échantillons d'ADNt (5 g) ont été digérés avec l'enzyme EcoRI. Les fragments de restriction ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,8% (m/v) à 40 V pendant 18h, et transférés sur membrane en nylon positivement chargée. La membrane à été sondée séparément avec environ 100 ng de chacune des sondes nucléiques marquées à la peroxydase, et les hybridations ont été révélées par chimioluminescence. L'ADN du phage lambda digéré par HindIII et EcoRi a servi de standard, et les tailles des fragments de restriction sont indiquées en Kilo-paires de bases (kpb). L'analyse d'hybridation selon Southern de l'ADNt dirigé par EcoRI à l'aide d'ADN mitochondrial clonés utilisés comme sondes démontrait une homologie de séquence pour les deux fragments de restriction, FI (5148-pb) et F2 (4080-pb) pour les profils respectifs des souches LML03 et CBS144-89 (Fig. 1, panels B et C). Les cartes de restriction et l'analyse de séquences des deux fragments d'ADNmt polymorphes révélaient la présence d'une séquence optionnelle de 1070-pb, SEQ ID NO : 3 / (AFOS-1) (A. fumigatus optional sequence-1) + SEQ ID NO : 2/ (AFM-RS1) au sein du génome mitochondrial de la souche LML03 par comparaison à la souche CBS144-89 (Fig. 2, panels A et B). L'élément additionnel, AFM- RS1+AFOS-1, délimité par les amorces AfT7 et PatSp6 est montré au-dessus de la carte de restriction du fragment FI. Les symboles pour les sites de restriction sont : B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; h, HinfI;ha,HaeIII;K,KpnI;P,PvuII;X,XbaI. L'utilisation d'une analyse informatique de comparaison de séquences a permis d'identifier et de placer sur chaque fragment FIet F2, le gène encodant la sous-unité 1 de la cytochrome oxydase (Coxl:El,exonl;Il,intronl;E2,exon2) ainsi que 2 gènes d'ARNt (His-ARNt et Met-ARNt) par homologie à la séquence d'ADNTt d'Aspergillus nidulans. La séquence SEQ ID NO : 3/ (AFOS-1) est encadrée par deux copies d'une séquence répétée riche en AT SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1 : A. fumigatus Mitochondrial Repeated Séquence 1 ) de 194-pb. Ces deux copies sont respectivement AFM-RS 1 a et AFM-RSlb. Parallèlement à cela, il s'est avéré que dans l'ADNmt de la souche CBS144-89(absence de la séquence optionnelle), seule une copie de SEQ ID NO : 2 (AFM-RS1), à savoir SEQ ID NO : 2 / AFM-RSs'était détectée. L'ensemble de la région est appelé SEQ ID NO : 1/ (AFM-Boxl). Cette région variable se trouvait insérée entre les gènes des ARN de transfert d'ARNt-Met et d'ARNt-His et en amont du gène Coxl. Les séquençages de FI (Fig. 2. A) et de F2 (Fig. 2. B) ont été effectués. La fig. 4. A montre la séquence FI comprenant : AFM-RSIa / AFOS-1/ AFM-RSlb. La fig. 4. B montre la séquence F2 et en particulier AFM-RS 1 c. Dans cette figure 4, les séquences sont numérotées à partir de l'amorce PatSp6. L'élément optionnel (AFOS-1+ AFM-RS1) appartenant au fragment F1s'étend de la position 242 à 1310. Les sites d'épissage sont indiqués par des flèches orientées vers le bas sur la base des homologies de séquences nucléotidiques entre les fragments FI et F2. Les séquences répétées riches en bases AT, SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1) (AFM-RSIa et AFM-RSlb), et AFM-RS1crespectivement sur les fragments FIet F2 sont encadrées. Les abréviations pour les enzymes de restriction sont : H, HindIII (626,1097); h, Hinfl (299, 305, 1323); M, MspI (311, 450); X, XbaI (263, 689). On a procédé à une comparaison des séquences AFM-RSIa, AFM-RSlb et AFM-RS1c. La figure 5 rend compte de cette comparaison. Les points indiquent que les nucléotides sont identiques à ceux retrouvés dans la séquence répétée AFM-RSIa. Les nucléotides spécifiques d'une séquence répétée sont indiqués en gras. Les chiffres entre parenthèses indiquent la position des séquences répétées sur chaque fragment FI etF2. Sur la base des résultats PCR ciblant cette région d'ADNmt polymorphe, de nombreuses souches d'A. fumigatus pouvaient être classées en deux groupes distincts appelés haplotype I (92%) et II (8%) selon la présence ou non de SEQ ID NO :3/ (AFOS-1) et de la deuxième copie de SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS 1), respectivement, dans cette région de l'ADN mitochondrial. L'amplification PCR a été réalisée à partir de 2,5 to 5 ng d'ADN total des souches indépendantes d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89 représentant respectivement les haplotypes d'ADNmt 1 et II. Les produits d'amplification ont été séparés par électrophorèse à 100 V pendant 2 h en gel d'agarose à 1% (m/v) en tampon TBE IX, révélés au bromure d'éthidium (0,5 g/ml) sous UV et photographiés. (R) : l'ADN du phage lambda digéré par HindIII et EcoRI qui e servi de standard ; tailles des fragments de restriction sont indiquées à gauche en kilo-paires de bases (kpb). (T) : témoin négatif (amplification sans échantillons d'ADN). La figure 3 présente les profils d'amplification PCR obtenus. Nos résultats démontraient que la séquence SEQ ID NO : 2/ (AFM-RSl) était impliquée dans un mécanisme de recombinaison homologue intramoléculaire entraînant soit la perte soit l'insertion de la séquence optionnelle SEQ ID NO : 3/ (AFOS-1) de 1070-pb avec duplication de la séquence SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1). Donc ces séquences peuvent être utilisées dans des réactions de recombinaison pour transformer par exemple l'ADN mitochondrial des champignons et en particulier de A. fumigatus. II. Spécificité d'espèce de la séquence répétée AFM-RS1 par hybridation en dot-blot Pour démontrer la spécificité de la séquence SEQ ID NO : 2 (AFM-RS1) ou de la séquence SEQ ID NO : 3 (AFOS-1), une hybridation en dot-blot par exemple était menée vis-à vis d'un nombre important d'ADN total de levures, champignons filamenteux, et bactéries. Les souches de référence appartenant à différentes espèces et leurs origines sont répertoriées dans le tableau I ci-dessous. @ Tableau I- Souches de levures, champignons filamenteux, et bactéries analysées par hybridation en dot-blot avec les sondes nucléiques : SES ID NO : (AFM-Boxl), SEQ ID NO: 3 (AFOS-1) et SEQ ID NO : 2(AFM-RS1). Espèces Désignation Coordonnées Espèces Désignation Coordonnées des souches(*) des souches!') Candida albicans ATCC 2091 AI Geotrichum penicillatum CBS 55.86 C11 Candida albicans sérotype A LML la A2 Kluyveromyces bulgaricus CBS 2762 T C12 Candida albicans sérotype B LML 1b A3 Kluyveromyces dobzanskii CBS 2104 D1 Candida albicans CIP 4872 A4 Kluyveromyces vickerhamii LML D2 Candida boidinii 34 F 1 A5 Kluyveromyces vanudenii CBS 4372 T D3 Candidaglabrata CBS 138 T A6 Rhodotorula rubra CBS 17 T D4 Candida glabrata Cg8 A7 Saccharomycesbayanus CBS 380 T D5 Candida guillermondii CBS 6021 T A8 Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 T D6 Kluyveromyces marxianus CBS 712 T A9 Saccharomyces cerevisiae 1369 D7 Kluyveromyces fragilis CBS 297 T A10 Saccharomyces cerevisiae 9763 D8 Candida kefyr CBS 607 T Ali Saccharomyces uvarum CBS 395 T D9 Issatchenkia orientalis CBS 5147 T A12 Trichosporon cutaneum IPP 654 D10 Candida krusei CBS 573 T B1 Yarrowia lipolytica CBS 6124 T D11 Candida krusei K31 B2 Zygosaccharomyces rouxii LML Z1 D12 Candida lambica CBS 1876 T B3 Penicillium camembertii LML Pe2 El Candida lusitaniae CBS 6936 T B4 Penicillium roquefortii LML PII E2 Candida lusitaniae LML 14 B5 Aspergillus fumigatus CBS 144-89 E3 Candida norvegensis LML Q243 B6 Aspergillus fumigatus LML 03 E4 Candida norvegensis LML Q244 B7 Aspergillus fumigatus LML 65 E5 Candida parakrusei LML 5201 B8 Aspergillus flavus LML A15 E6 Candida parapsilosis CBS 604 T B9 Aspergillus flavus LML S5 E7 Candidasake CBS 617 T B10 Aspergillus flavus LML S 19 E8 Candida tropicalis CBS 94 T B11 Brevibacterium oxydans LML 5640 E9 Candidavalida CBS 638 T B12 Rhodococcussp. LML RI E10 Candida zeylanoides IPP 207 C1 Gordona sp. LML 26 E11 Debaryomyces hansenii LML 1795 C2 Brevibacteriumlinens LML 631 E12 Geotrichum candidum CBS 772. 71 T C3 Brevibacterium casei B3 F1 Geotrichum candidum LML G7 C4 Escherichia coli JM109 F2 Geotrichum candidum LML G8 C5 Staphylococcus aureus LML S35 F3 Geotrichum candidum CBS 149. 26 C6 Nocardia astéroïdes IPP 1750-88 F4 Geotrichum candidum LML G 14 C7 Geotrichum candidum CBS 178. 53 C8 Geotrichum fermentans CBS 25. 29 C9 Geotrichum fermentons CBS 50.57 CIO (2) Abréviation : ATCC, American Type Culture Collection, Rockeville, Md.; CBS, Centraal Bureau Voor Schimmelcultures, Delft, The Ntherlands; IPP, Institut Pasteur, Paris, France; LML, Laboratoire de Mycologie de la Faculté de Pharmacie, Lyon, France. Condition opératoire de 1(hybridation en dot-blot avec les sondes d'ADNmt SEQ ID NO: 1/ (AFM-Boxl, 1263-pb), SEQ ID NO :3/ (AFOS-1, préhybridation ; hybridation : 16h (41 C); Lavages / rinçages : 7 min (2x); Exposition : 1 min 3 s. Environ 10 g d'ADNt extrait à partir de chaque souche étaient dénaturés, et fixés selon la technique de dot-blot sur une membrane de nylon utilisée ensuite pour les tests d'hybridation dans des conditions de faible stringence. L'utilisation du fragment FI (présence de la séquence SEQ ID NO: 3 / (AFOS-1) et SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1)) en tant que sonde nucléique marquée par exemple à la peroxydase avec le kit Amersham ECL direct dans les conditions recommandées par le fabricant montrait une hybridation de forte intensité avec les 3 souches d'A. fumigatus CBS 144-89, LML 03, et LML 65 de coordonnées respectives E3, E4, et E5 (Fig. 6, panel A). Cependant, une hybridation croisée était détectée avec plusieurs souches d'espèces différentes, en particulier avec Pénicillium camembertii LML Pe2 et E. coli JMM109. Dans les mêmes conditions de stringence, la séquence SEQ ID NO: 3 / (AFOS-1) utilisée comme sonde révélait une hybridation de très forte intensité uniquement pour les 2 souches d'A. fumigatus appartenant à l'haplotype I (LML 03 en E4, et LML 65 en E5) et aucun signal significatif n'apparaissait pour la souche CBS 144-89 en E3 (Fig. 6, panel B) ou les autres ADNt testés. Cette séquence était donc parfaitement spécifique des souches d'A. fumigatus d'haplotype I. En revanche, la sonde nucléique constituée par la séquence SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS 1) dans les mêmes conditions présentait un signal d'hybridation de forte intensité avec les 3 souches d'A. fumigatus (CBS 144-89 en E3, LML 03 en E4, et LML 65 en E5) et aucune hybridation croisée n'était décelée pour les autres espèces. Du fait de ses caractéristiques de taille (194-pb) et de spécificité d'espèce, la séquence répétée SEQ ID NO : 2/ (AFM-RS1) d'origine mitochondriale se révélait être un bon marqueur moléculaire d'identification des souches d'A. fumigatus. Alors que la séquence SEQ ID NO : 3/ (AFOS-1) était un marqueur exclusif des souches d'haplotype I. Les hybridations selon la méthode de Southern avec la séquence SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1) après digestion de l'ADNtotal (ADN nucléaire + ADN mitochondrial) de souches d'A. fumigatus avec par exemple l'enzyme de restriction EcoRI permettaient de distinguer également les haplotypes I et II (idem à Fig. 1) par le polymorphisme de taille des fragments de restriction hybridants avec SEQ ID NO : 2 (AFM-RS1). De même l'amplification par PCR avec les amorces PatSP6 (5'-ACCAGGGTCTTATCCACTC- 3') et AfT7 (5'-GAATTAGTATCCTCATCTTC-3') choisies par les inventeurs dans les régions localisées entre les gènes des ARN de transfert ARNt-Met et ARNt-His encadrant SEQ ID NO : 2/ (AFM-RS1) (Fig. 2) permettait d'une part de détecter et d'identifier l'espèce A. fumigatus par obtention d'un produit d'amplification et d'autre part de distinguer l'appartenance de la souche considérée à l'haplotype I ou à l'haplotype II en fonction de la taille du produit d'amplification de la région AFM- Boxlcontenant la séquence SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1) et/ou SEQ ID NO : 3 / (AFOS-1) (Fig. 3). Les amplifications étaient réalisées dans un mélange réactionnel de 50 l contenant 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgClz, 0,001 % (m/v) gélatine, 0,01 % Triton xlOO, 1 mM (de chaque) dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 10 pmol de chaque amorce (PatSp6 et AfT7) et 25 (il de la solution d'ADN échantillon (environ 2,5 à 5 ng) et 1,25 unités de Taq ADN polymérase. Les conditions d'amplification étaient les suivantes : dénaturation initiale 3 min à 90 C, puis 30 cycles comprenant 1 min à 60 C (hybridation des amorces), 2 min à 72 C (extension) et 0,5 min à 90 C (dénaturation). Après le dernier cycle une extension finale de 5 min à 70 C était menée. Les produits d'amplification étaient ensuite analysés par électrophorèse en gel d'agarose à 1-1,5 % (m/v). L'haplotype I était caractérisé par un fragment amplifié de 1380 pb environ et l'haplotype II (sans la séquence AFOS-1) par un fragment amplifié de 300 pb environ. Cette amplification par PCR avec les amorces sélectionnées de la région contenant la séquence AFM-RS permettait donc une détection-identification-caractérisation infra spécifique des souches d'A. fumigatus combinée et rapide puisque les résultats étaient obtenus en moins de 4 à 5 heures. Il sagit d'une amélioration très sensible par rapport aux méthodes de diagnostic disponibles pour la détection, l'identification et la caractérisation infra-spécifique des champignons, en particulier de d'A. fumigatus. Séquences : (1) Informations générales i) Déposants (Al) Nom : Foad CHAÏB (A2) Nom : Arnaud CARLOTTI (B1) Rue : 76 rue Longefer (B2) Rue : 204 avenue Felix Faure (CI) Ville : Lyon (C2) Ville : Lyon (D1) Code postal: 69008 (D2) Code postal : 69003 ii) Titre de l'invention : SÉQUENCES NUCLÉIQUES DE DÉTECTION, D'IDENTIFICATION ET DE TYPAGE DES SOUCHES DE CHAMPIGNONS ET EN PARTICULIER DE L'ESPÈCE Aspergillus fumigatus iii) Nombre de séquences : 3 iv) Forme déchiffrable par ordinateur : (A) type de support : disquette (B) Ordinateur : IBM PC compatible (C) Système d'exploitation : PC-DOS/MS-DOS (D) Logiciel : format genBank (2) Informations sur la séquence SEQ ID NO : 1 i) Caractéristiques de la séquence : (A) Longueur : 1263 paires de bases (B) Type : nucléotides (C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire ii) Type de molécule : ADN mitochondrial iii) hypothétique : non iv) Anti-sens : xi) Description de la séquence : SEQ ID NO : 1 LOCUS SEQ. AFM-Boxl 1263 BP DS-DNA BASE COUNT 531 A 112 C 154 G 466 T 0 OTHER URUjriN: ADN mltochondnal A. fumigatus 1 ATTTATTTAT TGGTTTACAA AATATATTAT CTAGTTTTAT AAATAATAAT TTATGATATT 61 GTTATATATT ATTAATATTT ATTTTTAGTA TATTATTAAT AATACTTTTA TTTATTTTAG 121 TTATTGATAG ACAAAAAGGT TATTCAGTTA AAATGAATAA CTTACCAAAT AATGATAATT 181 CTAAAAAAAG AAAAAGAAAA TCTGAAAATG GAAATTCTAG AAAAAAAGGA AAAGGAAAAT 241 CTGGAAATGG AGATTCTGAT TCTCCGGATA AAGATGGAGA TAAACCTAAA CCTATAACTA 301 AACCTAAATT ATTTTTACCT AAGAAAGATG AAGAAACTCA AGCATATGAA TGTTATATGA 361 AAAAGTATGA TACAAGTAAT AAAAAAAATG AACTTAGCCC TACCGGTACT AGGAAACAAG 421 TAAAGGATAC TTTTCCTAGT TTATACTCTG AATATAAAAA ACATAAACCA AATAATCCTG 481 ATTTAGAATG AGAAAACTTA CAGAGGTTTT TTTTTCTACA TGAGATAGAC AACCATTTGG 541 TAATAGATGT TATGCTGATA CTGATAGAGG TTTTGAGCAA GCTTGAGAGT ATATGAAAAT 601 AAGTTACATT GAATAGAGAT GGGACTTAGT AAAGGAAAAA CTCTAGAGGC TAGTGCTTTA 661 TGGAAAAAGG CTTTAAGTAA TGTCGATTTT ACAACTTATG AGAAATATAT CAAAATTCTT 721 GATAATGTAG TTAATAGAAG AGGTAGATAA TTATTATATG AAATAAGTAT ATTTTCATAT 781 ATTTATCATC CAACTAATTA ATTATTATAT AAAATTTATA CATATTAATA CTATTTATTA 841 TGTTTAATTT AAATTTAACT GACTAACTAA TTCAGAACAT AATATAATTT AATTAGTAAT 901 TAGTCATTTT TAGTTTAGAG TGAAATTTAA ATTTAATTGT AATTACTATT GAAATCTTAT 961 CTAAAAAAAA AATAAACAAT GGTCTATCAA TTAATTCAAT TTAATCCATT TCAATTAGTG 1021 TCACCTTCAC CTTGACCATT ATTTAGTAAA AGCTTATTAT TTTATAAAGA TTTATTTATA 1081 GGTTTACAAA ATATATTATC TAGTTTTATA AATAATAATT TATGATATTG TTATATATTA 1141 TTAATATTTA TTTTTAGTAT ATTATTAACA ATACTTTTAT TTATTTTAGT TATTGATAGG 1201 CAAAAAGGTT ATTCAGTTAA AATGAATAAC TTACCAAATA ATGAAAATTC TAAAAAAAGA 1261 AAA (2) Informations sur la séquence SEQ ID NO: 2 i) Caractéristiques de la séquence : (A) Longueur : 194 paires de bases (B) Type :nucléotides (C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire ii) Type de molécule : ADN mitochondrial iii) hypothétique : non iv) Anti-sens :non xi) Description de la séquence SEQ ID NO : 2 LOCUS SEQ.AFM-RS1 194 BP S-DNA BASE COUNT 82 A 9 C 15 G 88 T 0 OTHER ORIGIN ADN mitochondrial A. fumigatus 1 ATTTATTTAT TGGTTTACAA AATATATTAT CTAGTTTTAT AAATAATAAT TTATGATATT 61 GTTATATATT ATTAATATTT ATTTTTAGTA TATTATTAAT AATACTTTTA TTTATTTTAG 121 TTATTGATAG ACAAAAAGGT TATTCAGTTA AAATGAATAA CTTACCAAAT AATGATAATT 181 CTAAAAAAAG AAAA (2) Informations sur la séquence SEQ ID NO : 3 i) Caractéristiques de la séquence : (A) Longueur : 875 paires de bases (B) Type : nucléotides (C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire ii) Type de molécule : ADN mitochondrial iii) hypothétique : non iv) Anti-sens : xi) Description de la séquence : SEQ ID NO: 3 LOCUS SEQ.AFOS-1 875 BP DS-DNA BASE COUNT 366 A 93 C 123 G 293 T 0 OTHER ORIGIN ADN mitochondrial A. fumigatus 1 AGAAAATCTG AAAATGGAAA TTCTAGAAAA AAAGGAAAAG GAAAATCTGG AAATGGAGAT 61 TCTGATTCTC CGGATAAAGA TGGAGATAAA CCTAAACCTA TAACTAAACC TAAATTATTT 121 TTACCTAAGA AAGATGAAGA AACTCAAGCA TATGAATGTT ATATGAAAAA GTATGATACA 181 AGTAATAAAA AAAATGAACT TAGCCCTACC GGTACTAGGA AACAAGTAAA GGATACTTTT 241 CCTAGTTTAT ACTCTGAATA TAAAAAACAT AAACCAAATA ATCCTGATTT AGAATGAGAA 301 AACTTACAGA GGTTTTTTTT TCTACATGAG ATAGACAACC ATTTGGTAAT AGATGTTATG 361 CTGATACTGA TAGAGGTTTT GAGCAAGCTT GAGAGTATAT GAAAATAAGT TACATTGAAT 421 AGAGATGGGA CTTAGTAAAG GAAAAACTCT AGAGGCTAGT GCTTTATGGA AAAAGGCTTT 481 AAGTAATGTC GATTTTACAA CTTATGAGAA ATATATCAAA ATTCTTGATA ATGTAGTTAA 541 TAGAAGAGGT AGATAATTAT TATATGAAAT AAGTATATTT TCATATATTT ATCATCCAAC 601 TAATTAATTA TTATATAAAA TTTATACATA TTAATACTAT TTATTATGTT TAATTTAAAT 661 TTAACTGACT AACTAATTCA GAACATAATA TAATTTAATT AGTAATTAGT CATTTTTAGT 721 TTAGAGTGAA ATTTAAATTT AATTGTAATT ACTATTGAAA TCTTATCTAA AAAAAAAATA 781 AACAATGGTC TATCAATTAA TTCAATTTAA TCCATTTCAA TTAGTGTCAC CTTCACCTTG 841 ACCATTATTT AGTAAAAGCT TATTATTTTA TAAAG Revendications : 1- Séquences nucléiques, utilisables comme sondes ou comme cibles, notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des champignons choisis parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie du fragment F1 d'environ 5200 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisé en ce qu'elle est bornée par le gène de l'ARN de transfert ARNt- Met et pai le gène de la cytochrome oxydase Coxl, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. 2- Séquences nucléiques selon la revendication 1 notamment de détection, et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des champignons et en particulier d'A. fumigatus caractérisée en ce qu'elles sont choisies parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie de la séquence du fragment d'environ 2500 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisée en ce qu'elle est localisée entre le gène de l'ARN de transfert ARNtMet et le gène de l'ARN de transfert ARNt -His, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. 3- Séquences nucléiques selon les revendications 1 ou 2 notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des souches d'Aspergillus fumigatus, caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie de la séquence SEQ ID NO : 1/ (AFM-Boxl) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire. 4- Séquences nucléiques selon les revendications 1 à 3 caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 2 / (AFM-RS1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. 5- Séquences nucléiques selon au moins une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 3 / (AFOS-1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence. 6- Procédé de détection et d'identification des champignons caractérisés en ce qu'il consiste à mettre en #uvre comme sonde une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que - on libère l'ADN total (ADNt) des souches à étudier - on soumet éventuellement cet ADNt à une digestion enzymatique, avec au moins une enzyme de restriction, - on dénature l'ADNt, éventuellement digéré, par exemple par traitement thermique, - on met en présence l'ADNt ainsi dénaturé, avec la sonde dotée d'au-moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation, - on élimine l'ADN et la sonde non hybridés, et on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur. 8- Amorce nucléotidique, utilisable notamment pour la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou tout autre amplification (TMA, QB, etc...), caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 9- Réactif de détection/identification des champignons comprenant au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 8. 10- Procédé de recombinaison homologue mettant en #uvre une séquence selon les revendications 1 à 5 par exemple pour réaliser une transformation de l'ADN mitochondrial des champignons.