FR 2798137 A1 20010309 FR 9911314 A 19990907 APPAREIL GENERATEUR DE RADICAUX CHIMIQUES OXYGENES ET SES APPLICATIONS INDUSTRIELLES La présente invention concerne l'agencement et la mise en oeuvre d'un nouvel appareil de catalyse enzymatique comportant des oxydo-réductases immobilisées afin de produire un flux continu de radicaux et de substrats chimiques oxygénés aux compositions adaptees à des applications industrielles spécifiques. Les oxydo-réductases constituent un groupe d'enzymes largement répandues dans les organismes vivants où elles participent, de manière régulée, aux diverses réactions du métabolisme. Parmi ces enzymes, les peroxydases - et notamment la lactoperoxydase (E N 1.11,1.7) qui se révèle abondante à l'état naturel dans le lait de bovins - ont été largement étudiées au cours des dernières décennies en raison de leurs propriétés biologiques particulièrement intéressantes. La lactoperoxydase (L.P.), extraite industriellement à partir du lactosérum de fromagerie, s'est avérée constituer l'élément essentiel d'un puissant système antimicrobien naturel joue un rôle déterminant dans protection des jeunes mammifères nouveaux ' contre les infections microbiennes digestives néonatales. Ce système antimicrobien naturel comporte 3 composantes - une enzyme : la lactoperoxydase (L.P.) présente dans le lait à un taux moyen de 30Ngr millilitre, - un substrat oxydable : l'ion thiocyanate (SCN-) métabolite alimentaire secrété naturellement dans le lait à la concentration de 0,02 à 0,26 millimolaire, - un fournisseur d'oxygène : le peroxyde d'hydrogène (H202) produit à la fois de façon exogene par certaines bactéries intestinales et de façon endogène lors du métabolisme du glucose circulant sous l'action des glucose-oxydases cellulaires de l'animal. Dans ce système, en milieu liquide, la lactoperoxydase catalyse, aux dépens du peroxyde d'hydrogène, la production de radicaux oxygénés et de substrats oxydés à activité biocide selon la réaction suivante SCN" + H202 L. P. OSCN- + H20 Thiocyanate Oxythiocyanate OSCN- + H202 L. P. SCN" + H202 + 02 L'anion superoxyde 02 , produit ubiquiste, est un agent oxydant puissant qui conduit à la génération de nouveaux radicaux libres tels que les radicaux hydroxyle (OH"), hydroxyperoxyle (02H) trioxyde (.03) qui sont eux mêmes convertis en H202. L'oxythiocyanate OSCN" produit est en équilibre avec sa forme acide HOSCN. En présence de quantités de peroxyde d'hydrogène suffisantes, la réaction d'oxydation de l'ion thiocyanate se poursuit vers des dérives oxyacides encore plus oxydés selon reactions suivantes OSCN" + H202 L. P. 02- SCN" + H20 Oxythiocyanate + peroxyle (superoxythiocyanate) 02SCN" + H202 L. P. 03- SCN" + H20 Superoxythiocyanate (trioxythiocyanate) Les radicaux libres produits ainsi que les substrats oxydés interagissent fortement avec les composants biochimiques des membranes cellulaires microorganismes, désorganisent les transports de métabolites et inhibent les biosynthèses protéiques et nucléiques. Ainsi le système lactoperoxydase s'est révélé présenter des activités antimicrobiennes vis à vis de différents micro-organismes tels des bactéries (Staphylocoques, Listerias, Colibacilles, Salmonelles, Pseudomonas Mycoplasmes), des protozoaires (Cryptosporidies), des virus (Bactériophages) Ce système antimicrobien naturel a été repris comme modèle de préservation de conservation du lait et des produits fromagers. Ainsi différentes modalités d'applications, objets de brevets, ont été décrites au cours des dernières décennies l'une des plus simples consiste à ajouter, aux aliments à protéger, le système L.P. complet, préformé avec un substrat fournisseur de peroxyde, (peroxyde de magnésium exemple) ou avec un système enzymatique complémentaire producteur (glucose- glucose oxydase par exemple). L'application de ces formulations biocides intervient sous formes de bain, d'aspersion, de vaporisation ou de saupoudrage des produits à traiter et à protéger. modalités de mise en ceuvre nécessitent l'utilisation de quantités d'enzymes proportionnelles aux surfaces ou aux volumes des produits traités et se révèlent donc onéreuses et incompatibles avec les contraintes économiques du marché. Par ailleurs, la variabilité des différents paramètres environnementaux liés aux produits traités (pH, température, salinité, oxygénation,...) limitent fortement la mise en ceuvre pratique du système ainsi que son efficacité locale en raison d'une dégradation rapide de peroxydase libre utile. Pour pallier ces difficultés, des formulations différentes, des compositions diverses et méthodes d'applications nouvelles ont été proposées au cours de dernières annees. Le brevet américain N 5389369 décrit un système bactéricide basé sur le contact d'une haloperoxydase avec les micro-organismes en présence de peroxyde d'hydrogène, chlore ou de brome et d'acides aminés. Les differentes composantes sont préparées et stockées séparément jusqu'à leur mélange en solution au moment de l'emploi. Le brevet n W96/38548 décrit des compositions de peroxydases et méthodes pour produire des solutions désinfectantes et stérilisantes stockées containers anaérobies pressurisés et activables par l'oxygène de l'air au moment de l'emploi. Le brevet n W97/15661 décrit une substance micro poreuse qui emprisonne sélectivement les virus et les micro-organismes pathogènes du sang pour les soumettre à une activité biocide de proximité générée par un système oxydatif lié à la substance micro poreuse. A la différence des précédentes inventions, la présente invention, objet de la demande de brevet, concerne un nouvel appareil à enzymes immobilisées permettant de produire de manière pratique et en quantité élevée, à partir de différentes compositions chimiques prédéterminées, un flux concentré et continu de radicaux libres oxygénés et de substrats oxydés, en phase liquide ou vapeur, utilisables à distance pour le lavage, la décontamination, l'aseptisation de différents produits alimentaires, dont l'eau, et de matériels industriels ainsi que pour la détoxication et l'assainissement des fluides pollués en génie de l'environnement. Selon un premier mode non exclusif de réalisation de l'invention, l'appareil (figure1) est constitué d'une enceinte close, par exemple une cuve cylindrique(2), métallique (acier inoxydable, aluminium, alliages divers...) ou en matériau synthétique (polymères plastiques) ou en verre, dotée d'au moins un orifice de chargement(1) et/ou d'un orifice d'évacuation(4) et dont les parois intérieures sont recouvertes d'une membrane(3) en nylon porteuse d'enzymes immobilisées en mélange, telle que beta-galactosidase, glucose-oxydase et lactoperoxydase. Le mélange enzymatique retenu est générateur, à partir du lactose, de peroxyde d'hydrogène (H202) selon la réaction globale suivante Lactose p.Galactosidase. G alactose +glucose Glucose Oxydase gluconolactone+H202 > 1111 La préparation de la membrane porteuse d'enzymes peut se réaliser par adsorption simple de la solution d'enzymes comme suit On utilise une membrane hydrophile, en nylon 6,6, de la société PALL-France (St Germain en Laye) de dimensions: 30 x 30 cm. Trois solutions différentes d'enzymes sont préparées en tampon 50mM citrate- phosphate stérile à pH 7,5 - Une solution à 3 mgr/ml de betagalactosidase fongique (E.C. n 3.2.1.23)10U.1./mg.grade VIII. de SIGMA - St Louis Etats Unis : la betagalactosidase catalyse la scission de la molécule de lactose en glucose, oxygène et eau. - Une solution à 3 mgr/ml de glucose-oxydase fongique (E.C. n 1.1.3.4)20U.1./mg.grade II. de SIGMA : cette oxydo-reductase, en présence d'oxygène, hydrolyse le glucose en D.glucono-lactone et en peroxyde d'hydrogène. - Une solution à 3 mgr/ml de lactoperoxydase bovine (E.C. 1.11.1.7)40U.1./mg.grade II. de SIGMA : la lactoperoxydase en présence peroxyde d'hydrogène catalyse l'oxydation des thiocyanates, des sulfites et nitrites éventuellement présents en solution. Les trois solutions précédentes sont mélangées, à parties égales, en une solution finale dans laquelle est immergée la membrane nylon (à raison de 30 ml de solution par membrane de 30x30 cm) qui adsorbe environ 80 Ng de protéines enzymatiques centimètre carré après contact de 15 mn à température ambiante. La membrane est ensuite rincée par 3 fois 100 ml de tampon phosphate pH 7,5 puis saturée par immersion dans 100 ml d'une solution stérile de caséine bovine à 2% tampon phosphate, pH 7,5, pendant 15 mn à température ambiante. Après un nouveau rinçage avec fois 100 ml de tampon phosphate, la membrane est égouttée puis séchée à - sous vide et stockée à 4 C, en atmosphère déshydratée jusqu'à son insertion definitive par fixation mécanique ou par collage sur les parois internes de la cuve (Figure n 1). L'introduction d'un volume donné d'un mélange de laits de vache, préchauffé à , active le système enzymatique par le lactose endogène et entraîne l'oxydation catalytique thiocyanate de sodium (NaSCN) ou de potassium (KSCN) présent naturellement dans le lait. La production d'oxythiocyanate (OSCN-) antimicrobien permet de pratiquer une auto-aseptisation continue et décroissante du lait au cours son refroidissement et de son stockage dans la cuve. Ce mode réalisation de l'invention permet d'obtenir une conservation prolongee du lait de 7 jours en moyenne à 10 C (cf. résultats tableau 1 de l'expérimentation bactériologique effectuée lors de la mise en application de l'appareil). L'appareillage ainsi constitué peut être utilisé à répétition, sur plusieurs lots successifs de lait, pendant plusieurs semaines. Il est aisément régénérable par renouvellement des membranes. Cet ensemble de caractéristiques le rend compatible avec une utilisation pratique, répétitive et peu coûteuse, ce qui en fait un dispositif efficace pour traiter, aseptiser et stabiliser des aliments liquides tels que laits et produits laitiers, jus de fruits et boissons en vue d'une conservation prolongée compatible avec une sécurité alimentaire renforcée. Une autre application industrielle, selon l'invention, consiste à utiliser des fragments carrés de 1 cm x 1 cm d'une membrane PALL de nylon préactivée type immunodyne ABC. La fixation de la solution d'enzyme de type peroxydase la membrane s'effectue par contact direct entre la solution enzymatique et la membrane avec création d'une liaison chimique covalente stable. La membrane ainsi obtenue peroxydases immobilisées, peut servir à revêtir, en partie ou en totalité, par fixation collage les parois internes de différents récipients et emballages alimentaires, carton, en métal, en verre, en plastique ou en matériaux composites, tels que les emballages de lait thermisé (ou pasteurisé ou stérilisé), les bouteilles et flacons de jus de fruits et de vins, les sachets utilisés pour les fruits et légumes frais ou en 4'm' gamme. Ces différents aliments (laits, jus de fruits, vins) sont riches en eau, en composés chimiques naturels fournisseurs d'oxygène (glucose, lactose, xanthine,...) et en substrats oxydables endogènes (thiocyanate SCN-), mis en contact avec la membrane lors du remplissage du récipient, induisent une activation catalytique de radicaux libres oxygénés tels que l'anion superoxyde 02 et trioxyde 03, le radical hydroxyle OH et hydroperoxyle H02, oxythiocyanate OSCN, le superoxythiocyanate 02SCN, le trioxythiocyanate 03SCN,... qui participent à une auto-aseptisation continue qui conduit à une durée de conservation accrue des aliments. Ainsi, ce mode de réalisation, selon l'invention, permet d'élaborer et de fabriquer emballages biocides actifs constitués soit de papiers et de cartons (cellulose), soit fibres (nylon, verre, carbone), soit de films organiques ou synthétiques (nylon, polyéthylène, polypropylène, polysulfones, polyamides, polyvinyle ... ), soit tissus naturels ou synthétiques, soit de matériaux métalliques (aluminium) destinés contenir et à protéger divers produits biologiques sensibles tels que des aliments d'origines animales (laits, fromages, viandes et produits carnés, ovoproduits, poissons,...) et vegétales (fruits et légumes, feuilles, graines et semences,... )contre les attaques et les degradations bactériennes de surface conduisant ainsi à des durées de conservations prolongées propices à une commercialisation dans le temps et l'espace. Selon un second mode non exclusif de réalisation de l'invention, l'appareil est agencé selon le format d'un module plan de microfiltration (Figure 2) comportant une entrée (1) et une sortie (5) et constitué d'un empilement successif et alterné de plaques metailiques (2) porte-membranes (3) et de plaques métalliques séparatrices collectrices serrées entre les deux plateaux terminaux d'une presse. Les faces des plaques comportent des rainures facilitant la turbulence des fluides, sur les plaques (2) porte- membranes et la collecte du filtrat sur les plaques collectrices (4). Les membranes utilisées dans l'appareil peuvent être, de façon préférée mais non exclusive, des membranes de microfiltration, en nylon hydrophile, de porosité 5N, préalablement activées de type Immunodyne ABC-Pall France. Tableau n 1 Evolutïon de la flore bactérienne dans le lait conservé 10 c. Temps (jcur) Staphylocoque Colibacille .F.U. /ml C.F.U. /ml lait témoin lait traité lait témoin lait traité 1 10.4 10.25 10,5 10.a 10.5 10.2 10- '5 10. 2,5 10. 5,5 10.' 10. 6 10.1 3 4 10.6 0. 10.5'3 10,1 10.68 0. 10#'a`# 6 10.i 0. 10.7 0. 7 10_ 7 10.1 10. 7 0. La fixation d'une oxydoréductase d'origine végétale telle que la peroxydase radis noir (Horse Radish Peroxydase) (E.C. n 1.11.1.7)grade VI.300U.I.Img - SIGMA ou la peroxydase de soja (E. C n 1.11.1.7) est effectuée comme décrit précédemment, par le dépôt de 30 ml d'une solution tamponnée stérile d'enzyme à 1 mglml sur une membrane Immunodyne de section 30 x 30 cm, un temps de contact de 15 mn à température ambiante. Après lavage, saturation à la caséine et rinçage, les membranes porteuses de peroxydase sont intercalées entre une plaque porte membrane et une plaque collectrice. Les membranes sont définitivement fixées sur les plaques par rapprochement et pression des plaques terminales du filtre presse. L'alimentation du module plan s'effectue par l'introduction continue sous pression à 0,5 bar, d'une solution aqueuse froide (10 C) de formulation suivante 1) Méta Bisulfite de sodium (Na2S205) : 1 gr ou Bisulfite de Sodium (NaHS03) ou Hydrosufite de Sodium (Na2S204) Acide peracétique (CH3C03H) : 2 gr Eau q.s.p.(H20), 1000 ml Les sulfites (bisulfite NaHS03, métabisulfite Na2S205) sont connus depuis longtemps comme agents antimicrobiens utilisés dans la fabrication des vins et la conservation fruits et légumes frais. L'oxydation par la peroxydase (HRP) immobilisée, métabisulfite en présence d'acide peracétique fournisseur de peroxyde d'hydrogène, est génératrice de radicaux libres tels que le trioxyde de soufre S03--, et son dérivé acide HS03-", ainsi que de peroxyde d'hydrogène H202. Le titrage du peroxyde d'hydrogène produit s'effectue avec le sulfate cerique en présence de feroïne. Le titrage des radicaux oxydés de soufre est réalisé selon la méthode décrite par Mottley et Col1.1982 Mol. Pharmacol.22:732-737. Le flux de filtrat issu du module contient du peroxyde d'hydrogène et des ions sulfites oxydés aux activités biocides marquées in vitro. En effet, un volume de 1 ml d'une suspension bactérienne de Staphylocoque à 108C.F.U.Imi mélangé à 1 ml du aqueux sortant du module, pendant 5 mn à 10 C, est complètement inactivé. résultat identique est obtenu selon les mêmes modalités expérimentales sur une culture d'une souche de Colibacille à 5 x 108 C.F.U./mI. L'appareillage objet de l'invention, d'utilisation simple, permet de générer des de radicaux oxygénés en solution aux activités biocides synergiques et renforcées, a des doses plus faibles que celles nécessaires habituellement pour les sulfites utilisés seuls. Les effets biocides observés, après expérimentation microbiologique selon la norme AFNOR, sont bactéricides (Staphylocoque, Lactobacille, Listeria, Colibacille Pseudomonas,...) virucides (Bactériophages) à de faibles concentrations de radicaux oxygénés : 400 p.p pour les sulfites et 200 p.p.m. Pour H202 D'une manière préférentielle, non exclusive, les flux de radicaux oxygénés obtenus selon ce deuxième mode de réalisation sont appliqués au lavage et à désinfection des fruits et légumes frais (dont la 4" gamme), des tisanes, des céréales, des champignons ainsi qu'à la décontamination et à la protection sanitaire des surfaces de carcasses et des produits carnés d'abattoirs. A titre d'exemple non limitatif, le lavage et la décontamination de salades de gamme s'effectuent à raison de 2 douches, successives, des végétaux pendant 5 mn a 10 C, avec 5 volumes d'une solution aqueuse à 2% de radicaux oxydes pour 1 volume de végétaux qui permettent d'obtenir une réduction de 4 à 5 log en moyenne de la population des contaminants bactériens résidants (Pseudomonas 105 CFUIml) ou expérimentaux (Listeria 105 CFUIml) par rapport aux salades témoins non traitées. Une variante de ce deuxième mode de réalisation de l'appareil est également indiquée de manière non limitative dans le cadre de l'invention. Elle consiste à fixer sur des surfaces carrées égales de 30cm de côté de membrane Immunodyne ABC. Pall (5 N) - Une première solution en tampon citrate-phosphate 50 mM, pH 7,5à 1 mg/ml de peroxydase végétale de raifort (Horse Radish Peroxydase) (E.C.n 1.11.1.7)- grade VI-300 U.I.Img SIGMA - Une deuxième solution à 2 mg/ml de nitrate-réductase bactérienne (E.C.n 1.9.6.1)-50 U.I.Img-SIGMA soit - Une troisième solution d'oxyde nitrique synthetase animale (E.C.n 1.14.13.39)- SIGMA à 2 mgll. Les modalités d'immobilisation enzymes sur la membrane sont identiques à celles décrites précédemment. La premiere partie du module plan est constituée d'une première série de plaques porteuses de membranes à nitrate réductases bactériennes, la deuxième partie est constituée de plaques porteuses de membranes à oxyde nitrique synthetases d'origine animale, la troisieme partie terminale est constituée de plaques porteuses de membranes à peroxydases végétales. Le module plan est alimenté de façon continue par une pompe injectant, en entrée de l'appareil, sous une pression de 0,2 bar, une solution spécifique de substrats, de formulation suivante Métabisulfite de sodium (Na2S205) 1 gr Nitrite de sodium (NaN02) 1gr ou Nitrite de potassium (KNOZ) Arginine 1 gr Acide peracetique (CH4C03) 1gr Eau q.s.p. 1000 ml Le filtrat sortant du module est constitué d'eau, de peroxyde d'hydrogène H202 et de différents radicaux azotés et soufrés oxydés par les peroxydases tels que L'ion nitrite (N021 l'oxyde nitrique le thoxyde dinitré (N203), le dioxyde nitré (N02), le peroxynitrite (0N00), l'hydroperoxynitrite (ONH02) L'ion sulfite (S02-), l'oxyde soufre (S0-), le dioxyde de soufre (S02), le trioxyde de soufre (S03) et acide (HS03) Le mélange de ces différents composés, présente des activités antimicrobiennes instantanées et élevées contre des populations de micro-organismes tels que des virus (herpès, pox, grippes, retrovirus enterovirus, hépatite...), des bactéries (staphylocoques, streptocoques, listeries colibacilles, pseudomonas, legionella, bacillus, ... ), des fungi (champignons et moisissures), des protozoaires (amibes, cryatosporidies,... ). Les applications industrielles de l'appareil, selon l'invention, concernent la production de grandes quantités de solutions antiseptiques utilisables pour le nettoyage, le lavage et la désinfection de matériels, de machines, des outils, des textiles, des récipients, des tuyauteries, des équipements et des locaux (sols et murs) utilisés notamment et non exclusivement dans les filières de production agroalimentaires et dans les services hospitaliers II convient de souligner que différentes configurations possibles de modules de filtration tels que module tubulaire, module à fibres creuses, module spirale et cartouche peuvent être avantageusement retenues, dans le cadre de l'invention, pour recevoir membranes à enzymes immobilisées, et constituer ainsi des appareils, selon l'invention, spécialement adaptés à différentes contraintes de débit spécifiques des diverses applications industrielles citées. De meure, les membranes utilisables dans le module plan peuvent être constituées différents matériaux dont les caractéristiques essentielles sont leurs aptitudes spécifiques à fixer soit par adsorption électrostatique, soit par affinité, soit liaison chimique, diverses protéines à activité biologique telles que les enzymes exemple. Ainsi, selon les modalités spécifiques des applications industrielles concernées, membranes à enzymes fixées entrant dans la composition et la réalisation l'appareillage selon l'invention pourront avantageusement être constituées d'acétate de cellulose, de polysulfones, de polyamides, de copolymères acryliques, de polymères en polyéthylène ou en polypropylène, ou en polyoléfine, de polymères aromatiques, de céramique, de silice, de carbone, de tissus naturels ou synthétiques. De même les diverses enzymes fixées dans l'appareil selon l'invention sont avantageusement choisies, selon des applications industrielles spécifiques, parmi - des enzymes d'origine végétale telles que par exemple la peroxydase du radis noir (E.C. n 1.11.1.7), ou de soja, la nitrate oxydo-réductase-NADPH (E. n 1.6.6.1) de céréales,... - enzymes d'origine fongique telles que par exemple la glucose oxydase C. n .1.1.3.4), la catalase (E.C.n 1.11.1.6), la beta-galactosidase (E.C.n 3.2.1.23) et la nitrate oxydo-reductase-NADPH. (E.C. n 1.6.6.2.) d'aspergillus... - des enzymes d'origine bactérienne telles que par exemple la NADH- Peroxydase (E.C. n 11.1.1) d'Enterococcus, la NADPH oxydo-reductase (E.C.n 1.6.99.3.) de Vibrio, la nitrate réductase (E.C.n 1.9.6.1) de colibacille, l'oxydase lactique dismutase (E.C.n 1.1.3.2) de pédiococcus, la superoxyde dismutase ((E.C.n 1.15.1.1.) de colibacille, la peroxydase d'Arthromyces, (E.C. n 1.11.1.1.), la beta-galactosidase (E.C.n 3.2.1.23.) de colibacille - enzymes d'origine animale telles que par exemple la xanthine-oxydase (E n 1.1.3.22) du lait, la lactoperoxydase (E.C. .11.1.7.) du lait, la myeloperoxydase leucocytaire (E.C.n 1.11.1.7.), l'oxyde nitrique synthetase n 1.14.13.39) des tissus nerveux, la superoxyde dismutase n 1.15.1.1.) d'erythrocytes, la sulfite oxydase (E.C.n 1.8.3.1) d'hepatocytes... Un troisième mode (figure 3) de réalisation non exclusive l'invention concerne une enceinte cylindrique (3), métallique ou synthétique, dotée d'un orifice à chaque extrémité (1) et (4), et dont le volume intérieur de 5 litres, par exemple, est rempli de sphères (2) de latex ou de billes d'acrylique-oxirane ou de silice ou de polystyrène ou de matériaux composites sur lesquelles sont fixées, par liaison covalente, les oxydoréductases seules ou associées à d'autres enzymes d'interêt choisies pour une application industrielle prédéterminée. La préparation et la mise ceuvre de billes de verre porteuses d'enzymes sont décrites, ci-après, à titre d'exemple non limitatif et conduisant à un appareil disposant de la plus grande surface réactive possible pour un volume donné. Un volume de 5 litres de billes de verre non poreuses de 30N de diamètre moyen (Corning-USA) sont lavées dans de l'eau distillée portée à à raison de 10 volumes d'eau pour 1 volume de billes. Les billes sont égouttées puis immergées dans 5 litres d'une solution à 10% d'aluminate de sodium, pendant heures à 65 C. Les billes sont alors lavées à nouveau en eau distillée, égouttées puis mises en suspension et agitées pendant 30 mn à 25 C dans 5 litres d'une solution aqueuse de polyethylèneimine (solution à 100 mgr - pH 10). Après un nouveau lavage en tampon phosphate pH 7,4, les billes sont remises en suspension par agitation douce dans 5 litres d'une solution à 5% de glutaraldéhyde pendant 3 heures. Les billes sont ensuite lavées, puis incubées à nouveau 24 heures dans une solution aqueuse de polyéthylèneimïne à 50 mgrh - pH 7,0 additionnée de 2 gr de NaBH3CN. Après un dernier lavage en tampon phosphate ( volumes de tampon pour 1 volume de billes) et égouttage, les billes sont immergées dans 5 litres d'une solution tamponnée (tampon 50mM citrate pH 7,5) d'un mélange à parties égales de nitrate-réductase bactérienne (E.C.nO".9.6.1).50U.I./mg-SIGMA solution à 1 mgll et de phosphatase acide végétale ( E.C.n 3.1.3.2) type IV 10U.I.Img-SIGMA- en solution à 5 mg/mi. L'immobilisation des enzymes est obtenue par une agitation douce billes dans la solution (60 mn à température ambiante) suivie d'une addition dans solution de glutaraldéhyde à la concentration finale de 1 % et d'une nouvelle incubation supplémentaire d'une heure. Les billes ainsi activées, sont lavées à l'eau tamponnée (tampon citrate 0,50 mM pH 7,5) puis introduites et incarcérées dans l'enceinte cylindrique. Les orifices du récipient sont reliés respectivement à un tuyau d'alimentation et à un tuyau d'évacuation. L'application industrielle de ce type d'appareillage, selon l'invention, intervient en genie de l'environnement, dans les traitements de détoxications des eaux polluées par nitrates et les phosphates. L'introduction des eaux polluées dans l'appareil, entraîne, à température de 10 C, une dégradation enzymatique et une hydrolyse continue nitrates et des phosphates., en solution selon les réactions N03 Nitrate réductase N02 Nitrate réductase 10 NO P04 Phos hatas P03 Phosphatas P02 Phosphatase, PO Une première variation de ce troisième mode de réalisation de l'appareil consiste a charger le volume intérieur de l'enceinte par des billes de verre, préparées et activées comme indiquée précédemment et porteuses, à leur surface, de peroxydase végétale de radis noir (E.C. n 111.1.7)grade VI.300U.I./mg - SIGMA L'appareil ainsi obtenu est destiné aux traitements des eaux brutes ou à la régénération et à la décontamination des eaux usées. Pour ce faire, l'appareillage, objet de l'invention, est utilisé en circuit relié à des installations préexistantes d'une chaîne de traitement des eaux, en aval par exemple, des dispositifs à rayonnement ultraviolet ou à la suite des dispositifs d'ozonation. L'association, de manière consécutive, de l'appareil, selon l'invention, à ces installations conduit à une production accélérée de radicaux libres oxygénés et à une oxydation catalytique des micropolluants organiques et métalliques. Le flux d'eau sortant de l'appareil peut être relié à un dispositif au charbon actif qui fixe et retient les composés organiques résiduels et les oxydes métalliques. Ainsi, l'appareil, selon l'invention, utilisé pour le traitement d'eaux naturelles polluées par des pesticides agricoles tels que l'atrazine et la simazine permet d'obtenir une oxydation radicalaire efficace de ces polluants ainsi que leur diminution notable dans l'eau. Les résultats obtenus indiquent qu'un seul traitement habituel eaux à l'ozone 3mn à 4 mgr/I) permet de réduire la teneur initiale d'atrazine 50%. L'utilisation associée consécutive de l'appareil, selon l'invention conduit à une réduction de de l'atrazine pour une dose d'ozone égale à 1 mgr/I et un rapport H202103=0,4g/g. De même l'appareil ci-dessus peut être utilisé indépendamment et de manière unitaire pour l'aseptisation des eaux de consommation. Pour ce faire, l'appareil est alimenté par l'eau à traiter, préalablement additionnée de permanganate potassium (Mn04K) en solution à 1 %, ou d'hypochlorite de soude NaOCI en solution aqueuse à 0,5 p.p.m. radicaux générés (oxypermanganate, acide hypochloreux HOCI,...) induisent réaction oxydative et un blanchiment des substrats organiques contenus dans les effluents liquides et dans les boues de décantation des eaux usées. Par ailleurs une autre application possible comporte l'utilisation du permanganate de pc;assium (Mn04K), entrant dans l'appareil, en solution aqueuse à une concentration comprise entre 5 et 10%. Le flux sortant, riche en oxypermanganate, est appliqué par aspersion sur des déchets organiques solides graisseux de stations d'épuration et en provoque la dégradation par oxydation accélérée. De même l'appareil ci-dessus est avantageusement utilisé pour oxyder les composés aromatiques volatils et les composés minéraux présents dans fumées et les gaz industriels. Ce type d'application consiste à injecter les fumées et les gaz polluants dans l'enceinte et à les faire diffuser et barboter au travers de la solution aqueuse de radicaux oxygénés. L'oxydation obtenue est fonction du débit retenu et conduit à la dégradation et à la diminution partielle ou totale des composés aromatiques et minéraux présents. Ce troisième mode de réalisation de l'appareil, objet de l'invention, peut également faire appel, en fonction des applications industrielles choisies, à des supports enzymatiques solides tels que les gels de polysaccharides activés (agarose, sépharose, dextran, cellulose, amidon,... ) ou les gels de silice. REVENDICATIONS 1) Appareil de catalyse enzymatique caractérisé par une enceinte close comportant au moins un orifice de chargement et dont les surfaces internes intrinsèques et contenues, sont recouvertes d'enzymes d'oxydo-réduction immobilisées par adsorption, ou liaison chimique covalente stable. 2) Appareil selon revendication 1 caractérisé par le fait que les surfaces internes intrinsèques contenues, porteuses d'oxydo-réductases immobilisées, sont constituées de différents matériaux, seuls ou associés, selon différents formats, tels que par exemple et de façon non limitative - des membranes (en acetate de cellulose, en polysulfones, en polyamides, on polyvinyle, en copolymères acrylique, en nylon, en tissus naturel ou synthétiques, en polyéthylène, en polyolefine, en polypropylène, en polymères aromatiques, en silice, en carbone, en céramiques,...) disposées en module plan, en module tubulaire, en module à fibres creuses, en modules à spirale, en cartouche de filtration - des billes ou des particules d'agarose, de cellulose, d'acrylamide, de polystyrène, de latex, de verre, d'oxirane acrylique, métal (acier inoxydable) - des fibres de nylon, de verre, de métal (acier inoxydable) - des parois spécifiques de l'enceinte, en verre, en polymères plastiques ou en métal (acier inoxydable, aluminium, ... ). 3) Appareil selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que les enzymes immobilisées, appartiennent à une seule ou à plusieurs espèces moléculaires différentes associées au groupe des oxydo-réductases, citées en exemple ci-après de façon non limitative - des enzymes d'origine végétale telles que par exemple la peroxydase du radis noir .C. n 1.11.1.7), ou de soja, la nitrate oxydo-réductase-NADPH (E.C. n 1.6 .1) de céréales,... - des enzymes d'origine fongique telles que par exemple la glucose oxydase (E. C.n .1.1.3.4), la catalase (E.C.n 1.11.1.6), la beta-galactosidase (E.C.n 3.2.1.23) et la nitrate oxydo-reductase-NADPH. (E.C. n 1.6.6.2.) d'aspergillus... - des enzymes d'origine bactérienne telles que par exemple la NADH- Peroxydase (E.C. n 11.1.1) d'Enterococcus, la NADPH oxydo-reductase (E.C.n 1.6.99.3.) de Vibrio, la nitrate réductase (E.C.n 1.9.6.1) de colibacille, l'oxydase lactique dismutase (E.C.n 1.1.3.2) de pédiococcus, la superoxyde dismutase ((E.C.n 1.15.1.1.) de colibacille, la peroxydase d'Arthromyces, (E.C. n 1.11.1.1.), la beta-galactosidase (E.C.n 3.2.1.23.) de colibacille - des enzymes d'origine animale telles que par exemple la xanthine-oxydase (E.C.n 1.1.3.22) du lait, la lactoperoxydase (E.C.n 1.11.1.7.) du lait, la myeloperoxydase leucocytaire (E.C.n 1.11.1.7.), l'oxyde nitrique synthetase (E.C.n 1.14.13.39) des tissus nerveux, la superoxyde dismutase (E.C.n 1.15.1.1.) d'erythrocytes, la sulfite oxydase (E.C.n 1 3.1) d'hépatocytes... Dispositif caractérisé par le fait qu'il comprend l'appareil selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 dont la mise en ceuvre comporte l'introduction dans l'enceinte en phase liquide ou gazeuse, de un ou plusieurs fournisseurs d'oxygène associés tels que par exemple et de façon non limitative - le glucose, le lactose, la xanthine, le peroxyde d'hydrogène, le peroxyde de magnésium, le permanganate de potassium, l'acide peracétique,.. Dispositif selon la revendication 4 caractérisé par. le fait que sa mise en oeuvre comporte l'introduction dans l'enceinte d'un ou plusieurs substrats enzymatiques associés tels que par exemple et de façon non limitative ; du thiocyanate de sodium (NaSCN) ou de potassium (KSCN), du bisulfite de sodium (NaHS03), de l'hydrosulfite de sodium (Na2S204) et du métabisulfite de sodium (Na2S20s), des nitrites de sodium (NaN02) ou de potassium (KN02), de l'hypochlorite de sodium (NaOCI) Dispositif selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé par le fait que sa mise en oeuvre produit des radicaux libres oxygénés seuls ou mélange tels que par exemple et de façon non limitative - L'anion superoxyde 02 et trioxyde 03 - Le radical hydroxyle OH - Le radical hydroperoxyle H02 - Le peroxyde d'hydrogène H202 - L'oxyde nitrique NO, le trioxyde dinitré N203, le dioxyde nitré N02 - Le peroxynitrite ONOO - L'hydroperoxynitrite ONHO2 - L'oxythiocyanate OSCN- - superoxythiocyanate 02SCN - trioxythiocyanate 03SCN - dioxyde de soufre S02 - trioxyde de soufre S03 et son acide HS03 - L'acide hypochloreux HOCI 7) Radicaux libres oxygénés et substrats oxydés obtenus selon l'une des revendications 4, 5 ou 6 caractérisés par le fait qu'ils présentent, seuls ou en mélange synergique in vitro , en flux liquides ou gazeux fortes activités biocides contre les virus, les bactéries, les spores, les fungi et protozoaires 8) Utilisation de l'appareil selon l'une des revendications 1, ou 3 et/ou du dispositif selon l'une des revendications 4, 5 ou 6, caractérisée par le fait qu'elle est mise en oeuvre dans diverses applications industrielles telles que par exemple, et à titre non limitatif pour - Traiter, aseptiser et stabiliser des aliments liquides tels que laits et produits laitiers, jus de fruits et boissons, pour une conservation prolongée et une meilleure sécurité alimentaire - Produire de grandes quantités de solutions biocides utilisables pour le nettoyage, le lavage et la désinfection des matériels, machines, des outils, des textiles, des récipients, des tuyauteries et locaux des établissements industriels notamment agroalimentaires et hospitaliers, - Produire des solutions de lavage antiseptiques pour les traitements de décontamination de surface des produits alimentaires tels que fruits et légumes, feuilles et tisanes, champignons, céréales et graines, carcasses et produits d'abattoirs, - Pratiquer un traitement oxydatif intensif et un blanchiment des eaux usées et des effluents liquides industriels ainsi que des boues de décantation - Appliquer un traitement oxydatif pour la dégradation accélerée des déchets organiques et graisseux des stations d'épuration et pour désodorisation des rejets gazeux et des fumées industrielles, - Participer au traitement de détoxication et d'aseptisation de grandes quantités d'eaux de boisson pour la consommation animale et humaine - Elaborer et fabriquer des emballages biocides actifs destinés à une conservation prolongée d'aliments frais, de produits biologiques sensibles, de grains et de semences enrobées.