FR 2801899 A1 20010608 FR 9915146 A 19991201 L'invention concerne un dispositif de culture de cellules comprenant au moins un substrat de croissance pour les cellules, auquel est contigu sur au moins un côté un espace destiné à un milieu nutritif, qui peut être alimenté de préférence en continu en un milieu nutritif liquide, par des ouvertures d'entrée et de sortie. Il est généralement connu que des cellules peuvent être prélevées sur des tissus d'organes et amenées à accomplir une multiplication extracorporelle. Plusieurs types de cellules développent alors des propriétés qui manifestent une multiplication illimitée dans le temps (par division cellulaire permanente), et on les appelle lignées cellulaires permanentes. En revanche, des cellules fraîchement prélevées sur des tissus (provenant par exemple d'échantillons chirurgicaux ou de tissus d'organes d'animaux de laboratoire) ne présentent pas cette propriété la plupart du temps. Des cellules de ces cultures primaires ne se développent généralement pas, ou se développent peu de fois seulement, c'est-àdire qu'elles ne peuvent être maintenues en culture que pendant une courte période et en perdant la plupart de leurs capacités fonctionnelles initiales (anaplasie). L'adhérence de cellules à leur substrat de croissance, de même que la différenciation des cellules, dépendent principalement de la nature du substrat de croissance. L'introduction de substrats microporeux, le plus souvent de minces feuilles de divers matériaux organiques ou inorganiques (revêtus ou non d'une matrice formée de molécules extracellulaires) a conduit à une différenciation nettement meilleure des cellules en culture. Il en est ainsi en particulier pour des cellules (cellules épithéliales et endothéliales) qui croissent en formant des monocouches (monolayer). Les récipients de culture utilisés à cet effet sont le plus souvent des cylindres creux dont l'extrémité inférieure est fermée par une membrane microporeuse sur laquelle les cellules à cultiver sont déposées. Ces cylindres sont ensuite introduits dans un récipient de culture de dimensions appropriées, de telle sorte que l'alimentation des cellules ou des monocouches s'effectue des deux côtés, à savoir du côté apical ou du côté basolatéral (brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 608 342). Dans ces méthodes de culture, le milieu nutritif est remplacé à des intervalles déterminés, la culture s'effectuant dans des conditions dites statiques. Des substances élaborées par les cellules peuvent alors s'accumuler dans le milieu de culture et exercer une influence négative sur la croissance et la différenciation. Ce procédé a donc été perfectionné à diverses reprises. Ainsi, par exemple, des substrats microporeux peuvent être serrés dans une monture appropriée formée de deux bagues concentriques (porte-cellules) et les cellules peuvent être amenées à se développer sur la membrane. Ces porte-cellules sont ensuite transférées dans un récipient de culture qui permet l'écoulement continu apical et basolatéral séparé, à la périphérie et au travers de porte-cellules, de milieux de culture de compositions variées, ou d'un seul milieu nutritif pour un empilement de porte-cellules (brevet allemand N 39 23 279). Ces systèmes de culture de cellules sont de manipulation simple et permettent d'entretenir des cultures de cellules primaires dans des conditions statiques pendant de plus longues périodes de temps qu'avec des substrats microporeux ou des substrats synthétiques solides classiques. Mais ils présentent l'inconvénient de n'offrir aux porte-cellules que des chambres de culture ayant une très petite surface de croissance, d'environ 0,9 cm2. L'appareil de culture de cellules par irrigation et écoulement périphériques, dans lequel des porte-cellules peuvent être empilés en vue d'obtenir suffisamment de matière pour des analyses de biologie cellulaire et de biochimie, présente l'inconvénient d'une oxygénation insuffisante du milieu entre les portecellules. Les deux appareils présentent en outre des manques d'homogénéité du mélange lors du remplacement continu du milieu nutritif par irrigation et écoulement périphériques. Le but de l'invention est de réaliser un dispositif de culture de cellules qui permette la croissance de cellules pendant des périodes de temps prolongées dans des conditions qui correspondent le plus largement possible à la situation existant dans l'organisme intact. Ce résultat est obtenu conformément à l' invention par le fait que le dispositif de culture de cellules présente au moins un espace pouvant être rempli d'un gaz ou d'un mélange gazeux défini, qui se raccorde à la chambre contenant le milieu nutritif par l'intermédiaire d'une membrane étanche au liquide mais perméable au gaz. Cela permet d'entretenir, dans le milieu nutritif qui est en contact direct avec les cellules en culture, des pressions partielles (p) définies pour l'oxygène (02), l'azote (N2), le dioxyde de carbone (C02) ou d'autres gaz quelconques d'importance biologique ou toxicologique. Cela revêt une importance particulière, du fait que les appareils de culture de cellules utilisés à l'heure actuelle avec remplacement continu des milieux nutritifs n'assurent pas l'existence de pressions partielles identiques dans toutes les positions sur les cellules ou les couches de cellules, pour les gaz d'importance biologique déterminante tels que, par exemple, l'oxygène et le dioxyde de carbone. D'autres avantages et d'autres détails de l'invention ressortiront de la description des dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une représentation en coupe verticale schématique d'un exemple de réalisation d'une partie d'un dispositif de culture de cellules conforme à l'invention, la figure 2 est une représentation en vue de dessus correspondante, la figure 3 est une représentation en coupe verticale centrale d'une partie d'alimentation en gaz d'un dispositif de culture de cellules conforme à l'invention, la figure 4 représente cette partie d'alimentation en gaz, vue en plan de dessus, et la figure 5 est une représentation en coupe verticale schématique de l'assemblage de deux parties destinées à la culture de cellules et de trois parties d'alimentation en gaz d'un dispositif de culture de cellules conforme à l'invention. L'exemple représenté de réalisation du dispositif de culture de cellules conforme à l'invention est constitué d'une partie de culture de cellules (figures 1 et 2) et d'une partie d'alimentation en gaz (figures 3 et 4), qui peuvent être assemblées, par exemple, comme représenté sur la figure 5. La partie destinée à la culture de cellules (PCC) constitue une monture annulaire pour un substrat de croissance 1 microporeux qui assure un échange optimal de matière entre le milieu de culture des cellules (solution nutritive) et les cellules 2 (ici deux monocouches) et améliore donc la différenciation spéciale de cellules. L'amenée de milieux nutritifs dans la chambre supérieure 4a et l'évacuation des milieux nutritifs de la chambre inférieure 4b destinée à ce milieu dans la partie de culture de cellules PCC s'effectuent par des canaux 3 séparément pour chaque côté du substrat de croissance, les ouvertures d'entrée et de sortie étant conçues de manière à assurer un remplacement homogène des milieux, c'est-à-dire qu'il n'existe pas de zones de mélange inégal. Il est donc possible d'utiliser différents milieux nutritifs à la partie supérieure (apicale) et inférieure (basale) et de créer des conditions organotypiques de culture. La partie PCC de culture des cellules est séparée de la partie PG d'alimentation en gaz par une membrane 5 perméable au gaz mais imperméable aux milieux nutritifs, de préférence en PTFE. La partie PG d'alimentation en gaz est réalisée comme élément séparé, qui présente les mêmes dimensions cylindriques extérieures que la partie PCC de culture des cellules des figures 1 et 2. La partie d'alimentation en gaz de la figure 3 présente à chacune des parties supérieure et inférieure une membrane 5 perméable au gaz qui est fixée de façon étanche au gaz dans une monture 12. L'espace 13 rempli de gaz proprement dit se trouve entre les deux membranes 5 et il est alimenté, par l'intermédiaire de canaux verticaux 8 partant d'une réserve de gaz non représentée, par des conduits également non représentés, en le gaz voulu à la concentration voulue, ce gaz pouvant s' écouler par les canaux verticaux qui existent aussi dans la partie de culture des cellules se trouvant à l'alignement en dessous et au-dessus. Les substrats de croissance 1 pour les cellules 2 à cultiver sont facilement échangeables, si bien que les grandeurs de mesure biochimiques ou de biologie moléculaire qui sont nécessaires peuvent être établies de façon simple. La membrane 5 perméable au gaz peut également être remplacée de façon simple. La partie PG d'alimentation en gaz (comprenant les canaux verticaux 8 de passage du gaz) et la monture 12 pour la membrane 5 perméable au gaz sont rendues étanches vis-à-vis de la partie PCC au moyen de joints toriques 6. Les parties PG et PCC peuvent être empilées comme représenté sur la figure 5, ce qui permet la culture simultanée d'un nombre quelconque de substrats de cellules avec remplacement continu du milieu nutritif. L'assemblage est effectué dans la direction de la flèche 11, des vis non représentées s'engageant dans les alésages alignés 9 pouvant assembler par serrage toutes les parties. La surface du substrat individuel des cellules (substrat de croissance) s'élève ici à environ 5 cm2. Toutes les parties PG d'alimentation en gaz sont reliées entre elles par l'intermédiaire d'un canal 8, si bien qu'une seule amenée de gaz 14 et une seule ouverture 15 d'évacuation du gaz sont nécessaires. Des canaux latéraux 8a aboutissant aux espaces contenant le gaz partent du canal 8. L'étanchéité du canal d'écoulement du gaz entre les parties PG et PCC est également assurée au moyen de joints toriques 6. Les deux extrémités de l'appareil de culture de cellules sont fermées par les parties contenant le gaz, qui présentent une seule membrane perméable au gaz tournée vers la partie PCC. Le reste est fermé de façon étanche aux endroits désignés par 10. Etant donné que la distance entre la membrane 5 de la partie PG et le support de culture cellulaire (substrat de croissance 1) est très faible et que, par conséquent, le volume des compartiments apical et basolatéral à liquide (espaces 4a et 4b contenant le milieu nutritif) est très petit, un équilibre s'établit très rapidement entre les gaz dans la partie PG et les gaz dissous dans le milieu nutritif et est maintenu constant. Le dispositif de culture de cellules conforme à l'invention permet en outre de faire varier de façon simple les pressions partielles de gaz dans le milieu de culture ainsi que d'ajouter de façon simple au milieu nutritif des gaz pouvant exercer une influence sur la fonction des cellules (par exemple des anesthésiques gazeux ou du protoxyde d'azote). Les pressions partielles des gaz utilisés peuvent, en cas de besoin, être mesurées tant dans l'espace PG que dans l'espace PCC, notamment au moyen d'électrodes du commerce (02, électrodes de Clark, C02 ou NO). On peut prévoir à cet effet des ouvertures (non représentées) appropriées (rendues étanches par des joints toriques). Dans une forme appréciée de réalisation de la partie PCC, notamment dans la culture de cellules épithéliales et endothéliales ou dans la culture simultanée des deux cellules sur le même substrat, on dispose des deux côtés du substrat des cellules des électrodes d'injection de courant ainsi que des électrodes de mesure continue des différences de potentiels existants au travers des couches de cellules, qui résultent du transport vectoriel de particules chargées (le plus souvent des ions). L'injection de courant et la mesure de potentiel peuvent être effectuées avec des appareils du commerce conçus à cet effet. On peut déterminer, à partir des différences de potentiels qui varient lors de l'injection de courant, la résistance transépithéliale ou la conductivité électrique transépithéliale (conductivité ionique) de monocouches épithéliales et endothéliales (principe de la chambre de Ussing). Les parties PCC et PG sont fabriquées par exemple en polysulfone et peuvent être stérilisées au moyen d'un autoclave d'après les normes prescrites pour les instruments médicaux. Toutes les parties peuvent être avantageusement réutilisées, quoiqu'on puisse aussi concevoir des articles à usage unique. Pour réaliser l'étanchéité, on utilise des joints toriques en Viton ou en silicone. Comme substrats de croissance microporeux, on peut utiliser des feuilles disponibles dans le commerce, qui trouvent une application par exemple pour la fabrication de filtres à membrane. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation décrits. En particulier, la forme des espaces contenant le milieu nutritif et celle des espaces contenant le gaz, autrement dit les formes des parties correspondantes de culture des cellules et d'alimentation en gaz, peuvent s'écarter des formes représentées. L'invention peut aussi être utilisée dans son principe lorsqu'il s'agit de substrats de croissance alimentés d'un seul côté avec le milieu nutritif. Au lieu d'être effectué par des vis, l'empilement des parties PCC et PG peut aussi être effectué avec d'autres moyens de liaison, par exemple avec des pinces de serrage. Applications possibles du dispositif de culture des cellules selon la présente invention (dans ce qui suit, la chambre de Pfaller est désignée par l'abréviation PK) : # Culture de cellules d'êtres humains, d'animaux, de plantes et d'insectes ainsi qu'organes et parties d'organes de toutes espèces dans des conditions de culture statiques ainsi que dyna- miques (écoulement continu et pulsé de milieux de culture, de gaz et de liquides corporels). # Co-cultures de différentes cellules et/ou d'organes ou parties d'organes dans des condi- tions de culture statiques ainsi que dynamiques (écoulement continu et pulsé de milieux de culture, de gaz et de liquides corporels). # Co-cultures de différentes cellules et/ou d'organes ou parties d'organes dans des condi- tions de culture statiques ainsi que dynamiques (écoulement continu et pulsé de milieux de culture, de gaz et de liquides corporels) avec contact intercellulaire. # Co-cultures de différentes cellules et/ou d'organes ou parties d'organes dans des condi- tions de culture statiques ainsi que dynamiques (écoulement continu et pulsé de milieux de culture, de gaz et de liquides corporels) sans contact mutuel entre cellules (culture dans des chambres séparées, interactions cellulaires par l'intermédiaire d'un milieu conditionné). D'autrespossibilités d'utilisation du dispositif de culture de cellules conforme à l'invention comprennent le développement d'organes artificiels et/ou de leurs équivalents avec utilisation des cellules et/ou des organes ou parties d'organes mentionnés ci-dessus : # Cultures et/ou co-cultures d'astrocytes, de cellules gliales, de cellules épithéliales, de cellules de Schwann et de cellules nerveuses, ainsi que culture individuelle ou co-culture en vue d'études de la barrière hémato-encéphalique, de la conduction des stimuli, et en vue d'études de croissance. # Cultures et/ou co-cultures de cellules épi- théliales de la cornée avec cellules musculaires et/ou de fibroblastes, mélanocytes, cellules de Langerhans, cellules endothéliales et endo- théliales microvasculaires ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures de cellules endo- théliales avec cellules musculaires et/ou kéra- tinocytes, fibroblastes, mélanocytes, cellules de Langerhans, cellules endothéliales et endo- théliales microvasculaires ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures de kératinocytes, fibroblastes, mélanocytes, cellules de Langerhans, cellules dendritiques, endothéliales et endothéliales microvasculaires ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures de cellules épi- théliales pulmonaires avec kératinocytes, fibro- blastes, mélanocytes, cellules dendritiques, cellules endothéliales et endothéliales micro- vasculaires ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures de cellules épi- théliales gastro-intestinales avec cellules lymphatiques et/ou musculaires, fibroblastes, mélanocytes, cellules dendritiques, cellules endothéliales et endothéliales microvasculaires ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures d'hépatocytes avec fibroblastes, mélanocytes, cellules dendriti- ques, cellules endothéliales et endothéliales microvasculaires, cellules nerveuses, ainsi qu'autres cellules présentes dans le foie (cellules en étoile de Kupffer, etc.). # Cultures et/ou co-cultures de cellules épi- théliales rénales d'origine vasculaire et tubulaire avec cellules lymphatiques et/ou musculaires, fibroblastes, cellules dendriti- ques, endothéliales et endothéliales micro- vasculaires, ainsi que cellules nerveuses. # Cultures et/ou co-cultures de cellules épi- théliales lymphatiques avec cellules lymphati- ques et/ou cellules musculaires, fibroblastes, mélanocytes, cellules dendritiques, cellules endothéliales et endothéliales microvasculaires ainsi que cellules nerveuses. D'autres applications du dispositif de culture de cellules conforme à l'invention comprennent son utilisation avec des organes artificiels et/ou leurs équivalents en présence des cellules et/ou des organes ou parties d'organes mentionnés cidessus, et l'utilisation des organes et/ou équivalents d'organes artificiels développés en PK avec utilisation des cellules et/ou organes et parties d'organes indiqués ci-dessus : # Modèles de barrières hémato-encéphaliques # Modèles neuronaux (potentiels et conduction de stimuli) # Délivrance de médicaments # Contrôles de toxicité Action de la lumière, de la lumière ultraviolette, de l'irradiation par micro-ondes et ondes de plus hautes fréquences Etudes de migration des cellules Organes artificiels Echange gazeux Implants D'une manière plus générale, on rappelle que l'invention a trait à un dispositif de culture de cellules comprenant au moins un substrat de croissance pour les cellules, auquel est contigu sur au moins un côté un espace destiné à un milieu nutritif, qui peut être alimenté de préférence en continu en un milieu nutritif liquide, par des ouvertures d'entrée et de sortie, caractérisé en ce qu'il présente au moins un espace 13 pouvant être rempli d'un gaz ou d'un mélange de gaz défini, qui se raccorde à l'espace 4a, 4b contenant le milieu nutritif par l'intermédiaire d'une membrane 5 étanche aux liquides, mais perméable aux gaz. Selon des dispositions préférées, éventuellement combinées, le dispositif de culture de cellules est caractérisé en ce que il est prévu au moins une partie PCC destinée à la culture de cellules et au moins une partie PG d'alimentation en gaz séparée et pouvant entrer en liaison de façon réversible avec la partie PCC, cette dernière présentant au moins un substrat de croissance 1 et au moins un espace 4a, 4b contenant un milieu nutritif et la partie PG d'alimentation en gaz présentant l'espace 13 contenant le gaz et la membrane 5 perméable au gaz ; deux espaces 4a, 4b destinés à contenir un milieu nutritif, pouvant être alimentés séparément en milieu nutritif, sont contigus à chaque substrat de croissance 1, à savoir un espace apical et un espace basal ou basolatéral ; les deux espaces 4a, 4b contenant le milieu nutritif sont réalisés en une unique partie de culture de cellules PCC ; les parties de culture de cellules PCC et les parties d'alimentation en gaz PG peuvent être reliées en une pile en succession alternée, les parties intermédiaires d'alimentation en gaz présentant deux membranes perméables au gaz qui sont tournées chacune vers une partie contiguë de culture de cellules et les parties d'alimentation en gaz aux extrémités de la pile présentent d'un côté une membrane perméable au gaz et d'un côté une fermeture étanche ; les parties PCC de culture de cellules réalisées de préférence principalement en forme de cylindres creux et les parties d'alimentation en gaz PG réalisées également en forme principalement de cylindres creux ayant de préférence les mêmes rayons présentent des alésages alignés à axes parallèles, au moyen desquels ils peuvent être assemblés par serrage étanche par exemple au moyen de vis qui y sont insérées ; des joints toriques 6 sont prévus pour rendre étanches les parties de culture de cellules et d'alimentation en gaz ; la membrane 5 étanche aux liquides et perméable aux gaz est réalisée en polytétrafluoréthylène (PTFE) ; les parois des parties de culture de cellules et d'alimentation en gaz PCC, PG sont en matière plastique, de préférence en polysulfone ; l'espace ou les espaces 13 contenant un gaz peuvent être reliés avec au moins un récipient de réserve de gaz par l'intermédiaire de conduits pouvant être raccordés de préférence de façon réversible. REVENDICATIONS 1. Dispositif de culture de cellules comprenant au moins un substrat de croissance pour les cellules, auquel est contigu sur au moins un côté un espace destiné à un milieu nutritif, qui peut être alimenté de préférence en continu en un milieu nutritif liquide, par des ouvertures d'entrée et de sortie, caractérisé en ce qu'il présente au moins un espace (13) pouvant être rempli d'un gaz ou d'un mélange de gaz défini, qui se raccorde à l'espace (4a, 4b) contenant le milieu nutritif par l'intermédiaire d'une membrane (5) étanche aux liquides, mais perméable aux gaz. 2. Dispositif de culture de cellules suivant la revendication 1, caractérisé en ce que sont prévues au moins une partie (PCC) destinée à la culture de cellules et au moins une partie (PG) d'alimentation en gaz séparée et pouvant entrer en liaison de façon réversible avec la partie (PCC), cette dernière présentant au moins un substrat de croissance (1) et au moins un espace (4a, 4b) contenant un milieu nutritif et la partie (PG) d'alimentation en gaz présentant l'espace (13) contenant le gaz et la membrane (5) perméable au gaz. 3. Dispositif de culture de cellules suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que deux espaces (4a, 4b) destinés à contenir un milieu nutritif, pouvant être alimentés séparément en milieu nutritif, sont contigus à chaque substrat de croissance (1), à savoir un espace apical et un espace basal ou basolatéral. 4. Dispositif de culture de cellules suivant les revendications 2 et 3, caractérisé en ce que les deux espaces (4a, 4b) contenant le milieu nutritif sont réalisés en une unique partie de culture de cellules (PCC). 5. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les parties de culture de cellules (PCC) et les parties d'alimentation en gaz (PG) peuvent être reliées en une pile en succession alternée, les parties intermédiaires d'alimentation en gaz présentant deux membranes perméables au gaz qui sont tournées chacune vers une partie contiguë de culture de cellules et les parties d'alimentation en gaz aux extrémités de la pile présentent d'un côté une membrane perméable au gaz et d'un côté une fermeture étanche. 6. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les parties (PCC) de culture de cellules réalisées de préférence principalement en forme de cylindres creux et les parties d'alimentation en gaz (PG) réalisées également en forme principalement de cylindres creux ayant de préférence les mêmes rayons présentent des alésages alignés à axes parallèles, au moyen desquels ils peuvent être assemblés par serrage étanche par exemple au moyen de vis qui y sont insérées. 7. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que des joints toriques (6) sont prévus pour rendre étanches les parties de culture de cellules et d'alimentation en gaz. 8. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la membrane (5) étanche aux liquides et perméable aux gaz est réalisée en polytétrafluoréthylène (PTFE). 9. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les parois des parties de culture de cellules et d'alimentation en gaz (PCC, PG) sont en matière plastique, de préférence en polysulfone. 10. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'espace ou les espaces (13) contenant un gaz peuvent être reliés avec au moins un récipient de réserve de gaz par l'intermédiaire de conduits pouvant être raccordés de préférence de façon réversible. 11. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'un système de détection des pressions partielles des gaz utilisés, de préférence sous forme d'électrodes, est disposé dans l'espace contenant le milieu. 12. Dispositif de culture de cellules suivant l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que des électrodes pour l'injection d'un courant et des électrodes pour la mesure continue de différences de potentiels au travers de la couche ou des couches de cellules sont disposées sur au moins un côté du substrat de croissance.