FR 2796385 A1 20010119 FR 9909245 A 19990716 La présente invention a pour objet une méthode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf et l'utilisation des anticorps ainsi obtenus en immunothérapie humaine ou vétérinaire et comme outil de diagnostic. F. Klemperer a observé pour la première fois que des poules immunisées transmettent les immunoglobulines (1-G) du sérum au jaune d'oeuf (Arch. Erp. Pathol. Pharnaacol. (1893), 31, 356-382). Les anticorps du jaune d'oeuf, appelés I-Y, sont considérés comme des analogues des I-G humaines mais présentent une structure très différente, notamment au niveau de la chaîne lourde (G. Camenish. et al. the FASEB Journal, (l999) 13, 81-88). La production d'anticorps dans le jaune d'oeuf, après immunisation par un antigène, présente plusieurs avantages, notamment - la quantité d'anticorps par jaune d'oeuf est de l'ordre de 10 mg/g alors qu'elle est de 35 mg/ml dans le sérum de lapin ; sachant qu'une poule pond par an environ 250 oeufs, alors après immunisation à 0, 2, 4 6, 22 et 28 semaines, on récupère au total 40 g d'anticorps, alors que chez le lapin on récupère seulement 1, 4 g après saignée de l'animal. Ainsi la quantité d'anticorps produits par poule est supérieur d'environ 30 fois à celle des anticorps contenus dans le sérum d'un lapin, (Natta H. Biosci, Biotech. Biocheni., (1993) 57, 450-454), - des anticorps contenus dans le jaune d'oeuf qui ne présentent pas de réactions croisées avec les IgG de mammifères, du fait de leurs différences de structures (Natta H., (référence citée) ; Liu S. S. Comp. Biochent. Physiol. (l999) 97B, 637-644), ce qui en fait un réactif de choix dans les tests d'immunodiagnostics, - un moyen non invasif de récolte des oeufs, et - des méthodes simples pour isoler les anticorps (Natta H. référence citée). Toutefois, cette technique est limitée par le fait qu'elle nécessite l'expression et la purification des protéines recombinantes utilisées comme agents immunogènes. En effet, l'expression des protéines recombinantes est un des facteurs limitants pour la production des anticorps spécifiques, car certaines protéines s'expriment mal, ou s'expriment sous une forme conformationnelle qui est différente de la protéine native ou s'expriment sous une forme insoluble qui ne peut pas être utilisée comme immunogène. L'existence de nombreux variants limite l'utilisation de ces anticorps comme outil de diagnostic. L'immunisation par l'ADN nu, en revanche, ne nécessite ni l'expression des protéines, ni leur purification, laquelle est parfois coûteuse et très difficile à réaliser. Elle permet de produire des anticorps qui ont un effet protecteur (Tang D. C. et al. Nature, (1992), 356, 152-l54) et induit une réponse immunitaire cellulaire caractérisée par la production de lymphocytes T, capables de reconnaître et de lyser les cellules infectées (Ulmer J. B. et al. ASM News (1996), 62, 476-479). En utilisant cette méthode, qui s'est révélée très prometteuse dans plusieurs modèles animaux d'infections causées par des vinas, des bactéries, des parasites ou des mycoplasmes (Lai W.C, et al. Critical Revieivs in Iinnaunology (1998), 18, 449-484), les Inventeurs ont montré récemment que l'immunisation de canards, par un vecteur exprimant la protéine d'enveloppe, protéine L, du virus de l'hépatite B de canard (DHBV), induit une réponse humorale forte, spécifique et de longue durée, qui est capable de neutraliser le virus et de protéger les canetons nouveaux-nés contre une infection virale (Rollier C. et al. Gastroenterology (1999), 116, 658-665). Toutefois cette méthode n'est pas adaptée pour produire des anticorps à l'échelle industrielle et les anticorps obtenus présentent des réactions croisées qui les rendent inutilisables chez l'homme en immunothérapie. Aussi, poursuivant leurs travaux, les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à une méthode de production d'anticorps qui pallient les inconvénients des méthodes existantes, c'est-à-dire à une méthode simple à mettre en oeuvre, rapide, peu coûteuse, et qui permette de produire, en grandes quantités, des anticorps spécifiques, susceptibles d'être utilisés en immunothérapie humaine ou vétérinaire, et également comme outil de diagnostic. La présente invention a en conséquence pour objet, une méthode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf caractérisée en ce qu'elle comprend - l'immunisation des aviaires par un ADN nu, - la collecte des neufs puis des jaunes d'oeufs, et - éventuellement la purification des anticorps produits dans les jaunes d'oeufs. Dans un mode particulier de réalisation de ladite méthode, l'immunisation est réalisée chez la poule ou la cane. Au sens de la présente invention, on entend par un ADN nu, aussi bien un ADN codant pour un antigène ou une protéine approprié et cloné dans un vecteur, notamment dans un plasmide, que les fragments linéaires d'ADN qui expriment un gène eucaryote ou procaryote, notamment les LEEs (Linear Expression Elements) tels que ceux décrits par Sykes K.F. et al. (Nature Biotechnologv (l999), 17, 355-359). Pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, l'ADN peut être injecté soit par voie intradermique, soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse, soit par voie orale, soit par voie intramuconasale. L'ADN peut être injecté sous toutes formes connues de l'homme du métier, notamment en solution saline, sous forme de complexes avec des lipides, sous forme d'aérosol, adsorbé sur des billes d'or ou encapsulé dans des microparticules. Au sens de la présente invention, l'ADN utilisé code pour un antigène d'intérêt, notamment pour des protéines d'eucaryotes ou de procaryotes. Parmi les ADN codant pour des protéines eucaryotes, on peut notamment citer les ADN codant pour des antigènes exprimés par des cellules tumorales, l'insuline, les agents allergènes, les toxines, les venins et les facteurs de croissance. Parmi les ADN codant pour des protéines procaryotes, on peut citer les ADN codant pour - les protéines d'origine virale, notamment les protéines du VIH (virus de l'immunodéficience humaine), de la grippe, du virus de la rage, des rotavirus, des hépatites B, C, D et E, du cytomégalovinis humain, des virus de l'herpès, du virus de la dengue, du virus de la polio, du virus de la rougeole, du HTLV I (Human T-cell Leukemia Virus), du NDV (Newcastle Disease Virus), du virus Ebola, des papillomavirus et du virus de Sendai, - les protéines d'origine bactérienne, notamment les protéines de Mycobacterium tuberculosis et bovis, de Salmonella typbi, de Clostridium telarni, de schistosome, et de lvfycoplasf@ra pislmonis, - les protéines de protozoaires, notamment les protéines de Plasmodium Yolli (agent de la malaria) ou de Leishmania ou de Toxoplasnaa Gardii. La méthode selon l'invention permet de préparer rapidement et en grandes quantités, des anticorps spécifiques de différents antigènes et de leurs variants qui â l'heure actuelle ne peuvent être détectés. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps obtenu par la méthode selon l'invention, ledit anticorps étant éventuellement associé â une substance appropriée, pour la préparation d'un réactif immunologique susceptible d'être utilisé pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi de maladies, chez l'homme et chez l'animal. Parmi les dites maladies, on peut citer notamment les maladies infectieuses, les cancers et les allergies. La présente invention a également pour objet une méthode de dépistage, de diagnostic et/ou de suivi d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, consistant à détecter la présence d'un antigène éventuellement présent dans un échantillon biologique, notamment dans le sang, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre au moins un anticorps approprié produit conformément à l'invention. Dans le cadre de ladite méthode, lorsque l'antigène est présent dans l'échantillon biologique à contrôler, il se lie alors à l'anticorps et ladite liaison est révélée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier, notamment par RIA, EIA, ELISA, ou par des techniques d'immunoflurorescence et d'immunoélectromieroscopie. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse de diagnostic pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi d'une maladie, caractérisé en ce qu'il utilise au moins un anticorps obtenu selon la méthode conforme à l'invention, des réactifs appropriés et des moyens pour détecter la formation de la liaison antigène- anticorps. La présente invention a également pour objet l'utilisation des jaunes d'oeufs, ou de fractions de jaunes d'oeufs contenant les anticorps produits conformément à l'invention ou des anticorps purifiés produits conformément à l'invention, pour la préparation d'un médicament. Dans un mode particulier de mise en oeuvre de cette utilisation, le médicament est utile en immunothérapie. Dans un mode encore plus particulier de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à être administré par voie orale, éventuellement en tant qu'additif alimentaire, pour l'immunisation passive contre les virus pathogènes entériques, notamment les rotavirus, ou contre les infections buccales. Dans un autre mode encore plus particulier de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à traiter une infection choisie dans le groupe constitué par les infections d'origines virales, bactériennes et celles dues aux protozoaires. Dans un autre mode de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à traiter une maladie choisie parmi les cancers et les allergies. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles - la figure 1 illustre 1a cinétique de la réponse humorale chez 3 canes, après immunisation par le plasmide pCI-preS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1. La détection des anticorps anti-preS a été réalisée par un test ELISA direct selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. Les flèches indiquent les injections d'ADN réalisées 4, 7, 10 et 28 semaines après la naissance (-x première cane, deuxième cane, (-O-) troisième cane. - la figure 2 illustre l'évolution du titre moyen en anticorps anti-preS soit dans le jaune d'oeuf de canes immunisées avec le plasmide vide pCI selon la méthode décrite dans l'exemple 1 (-O-), soit dans le sérum de canes immunisées avec le plasmide pCI-preS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1 (-x), soit dans des jaunes d'oeufs de canes immunisées avec le plasmide pCI-preS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1 Les résultats sont exprimés en moyenne s.e.m. (n=3). La détection des anticorps anti-preS a été réalisée par un test ELISA direct, selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. La flèche indique l'injection d'ADN. - la figure 3 illustre la spécificité des anticorps (IgY) purifiés obtenus conformément à la méthode selon l'invention. Les protéines de sérum infecté par le DHBV (DHBV +) et de sérum non infecté (DHBV -) ont été révélées par imrnunoblotting avec (A) un antisérum de lapin polyclonal anti-DHBpreS, (B) un sérum de canes immunisées par pCI-preS/S, (C) des Igy d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI-preS/S et (D) des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par le plasmide vide pCI. p36 correspond à la protéine L du DHBV. - la figure 4 illustre la neutralisation in vitro de l'infectivité du DHBV par du sérum de canes ou par des anticorps (IgY) des jaunes d'oeufs de canes. Des cultures primaires d'hépatocytes de canes sont infectées par un inoculum de DHBV pré-incubé avec du sérum ou des I-Y selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 2. La libération des particules virales est quantifiée dans le milieu de culture par une méthode d'hybridation quantitative moléculaire (dot blot hybridization). Les résultats sont exprimés en moyenne s.e.m. (n=2). pré-incubation avec du tampon phosphate, pré-incubation avec du sérum de cane témoin immunisée avec le plasmide vide pCI, (- + ) pré-incubation avec des I-Y témoins, pré-incubation avec du sérum de canes immunisées par le plasmide pCI-preS/S, (--x--) pré-incubation avec des IgY d'oeufs de canes immunisées par le plasmide pCI preS/S. EXEMPLE 1 : Production d'anticorps dans le jaune d'oeuf après immunisation par ADN 1.1 Matériel et méthodes l.1.1. Préparation_du_plasmide Le fragment d'ADN du DHBV codant pour le gène preS/S (nucléotides 801-178S) est cloné par PCR dans le site Not I du site multiple de liaison (polylinker) du vecteur pCI (Promega, Charbonnières, France) permettant d'obtenir le plasmide pCI-preS/S. Ce plasmide pCI-preS/S et le plasmide pCI (témoin négatif) sont introduits dans Escherichia colï et les ADN sont purifiés par chromatographie échangeuse d'anions sur des colonnes Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés par mesure de la densité optique à 260 nm avec marquage au bromure d'éthidium. 1.1.2. Immunisation des canes Un groupe de canes est immunisé par injection intramusculaire dans le quadriceps antérieur droit, de 100 pg de plasmide pCI-preS/ S codant pour la protéine L du DHBV, en solution dans du NaCI à 0,9 %, un autre groupe recevant dans les mêmes conditions le plasmide pCI. Les injections d'ADN sont réalisées, aux semaines 4, 7, 10 et 28 après la naissance, à raison de 100 #tg d'ADN par injection pour les semaines 4,7 et 10 et 200 #tg d'ADN par injection pour la semaine 28. 1.1.3. Purification_des_anticorp_s Les anticorps sont extraits et purifiés à partir de chaque jaune d'oeuf en utilisant le kit EGGstract (Promega) en suivant les instructions du fournisseur. 1.1.4. Dosage_des_antiçorps_par ELISA Les anticorps anti-preS sont détectés par un test ELISA direct utilisant des plaques de microtitration recouvertes de polypeptide DHBpreS, bloquées, lavées et révélées par la méthode décrite par S. Chassot et al. (Yïrology, (1994), 200, 72-78). Le titre final est considéré comme l'inverse de la plus haute dilution de sérum q u 1 donne une densité optique supérieure à 'SD au dessus du signal moyen des témoins. 1.2. Résultats 1.2.1. Production d'anticorps dans- 1e_ sérum-: Les résultats sont illustrés dans la figure 1. La cinétique de la réponse humorale, dans le sérum de trois canes, montre que l'immunisation par un ADN nu induit un titre élevé en anticorps anti-preS dans le sérum de l'ordre de 3200 à 14 000 en moyenne par prélèvement de sang. La quantité d'anticorps atteint son maximum dès la première injection d'ADN, puis on observe un plateau qui se maintient jusqu'à 40 semaines après la naissance. En revanche chez des canes immunisées par le plasmide pCI, on n'observe pas la production d'anticorps (données non montrées). 1.2.2. Productïoti_d'anticorps dans le_ jaune d'oeuf Les résultats sont illustrés dans la figure 2. Le titre en anticorps par oruf est de 3200 à 6400 et ce, pour tous les veufs récoltés pendant les six semaines. La quantité d'anticorps purifiés par oeuf récolté est d'environ 60 à 100 mg et ce, sans variation importante d'un oeuf à l'autre. Pendant les 6 semaines consécutives de l'expérience, on n'observe pas de diminution du titre en anticorps, ni dans le sérum, ni dans les jaunes d'oeufs pondus dans les semaines qui suivent l'injection d'ADN et ce, même en l'absence d'une nouvelle injection d'ADN. Lorsqu'on récolte un neuf par semaine et par animal, la quantité totale d'anticorps produits pendant les 6 semaines est de 360 à 600 mg par animal, et ce de manière non invasive. Sachant qu'une cane pond un #uf par jour, lorsqu'on récolte tous les veufs pondus par un animal, la quantité totale d'anticorps produits pendant les 6 semaines est de 2,5 à 4,2 g par animal. Aucune production d'anticorps n'est détectée dans les jaunes d'oeufs de canes non immunisées. EXEMPLE 2 : Spécificité des anticorps présents dans les jaunes d'aeufs. 2.1. Matériel et méthodes 2.l.1. Immunoblotting ------------------ Les particules de DHBV sont préparées par ultracentrifugation de sérum de canes présentant une virémie élevée et les particules servant de témoins négatifs sont préparées par ultracentrifugation de sérum de canes non infectées. Les protéines de foie de canes infectées ou non par le DHBV sont extraites selon la technique décrite par S. Chassot et al. (Virolop: (1993), 192, 217 223). Le procédé est celui décrit par Borel C. et al. (Virology (1998), 242, 90-98) et utilise soit un antiserum de lapin polyclonal anti-DHBpreS (l :1000), soit un sérum de canes immunisées par pCI-preS/S, soit des I-Y d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI-preS/S, soit des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI. Après lavage, les filtres sont incubés avec des conjugués de peroxydase G et d'immunoglobulines anti-lapin, anti-souris ou anti-canard et la réaction est mesurée par chimiluminescence (kit Amersham, Courtaboeuf, Les Ullis France). 2.2. Résultats Ils sont illustrés à la figure 3. Les anticorps IgY produits dans les jaunes d'oeufs après immunisation par pCI-preS/S reconnaissent la protéine d'enveloppe du DHBV, protéine L, d'un poids moléculaire de 36 kDa. présentes dans les particules concentrées dérivées du sérum (Figure 3C). Le profil d'immunoblotting est comparable à celui obtenu avec le sérum de canes préalablement immunisées par le plasmide pCI-preS/ S (Figure 3B), ou avec le sérum de lapin immunisé par la protéine recombinante d'enveloppe du DHBV (Figure 3A). Après immunisation par le plasmide pCI, on n'observe pas de réactivité avec la protéine d'enveloppe du DHBV (Figure 3D). EXEMPLE 3: Mesure in vitro du pouvoir neutralisant des anticorps produits dans les jaunes d'oeufs 3.1. Matériel et méthodes 3.1.1. Virus L'inoculum viral est préparé à partir d'un pool de sérum de canetons qui ont été transfectés par le DHBV cloné et séquencé par Mandart E. et al. (J. Virol. (1984), 49, 782-792) et quantifié en équivalents génome du virus (vge) par hybridation moléculaire quantitative (dot blot hybridization) comme décrit par S. Borel (1998) (référence citée). 3.l.2. Mesure du pouvoir neutralisant in vitro -------------------------------------- Le test de neutralisation est réalisé selon la méthode décrite par Rollier C. et al. (1999) (référence citée). Des cultures primaires d'hépatocytes de canards, obtenus par perfusion du foie, en deux étapes, par de la collagènase, selon la technique décrite par C. Borel et al. (l998) (référence citée), sont infectées avec du sérum positif au DHBV (2 x 10 a vge/puits) préalablement incubé pendant une nuit à la température ambiante, soit en présence de sérum de canes immunisées (1:l0), soit en présence de tampon phosphate. La libération des particules virales est suivie pendant 8 jours par hybridation quantitative moléculaire. L'aire sous la courbe des taux de DHBV dans les surnageants reflètent la sécrétion virale totale. La neutralisation est effective lorsque la diminution de la sécrétion virale totale est d'au moins50 %. 3.2. Résultats Ils sont illustrés dans la figure 4. Dans les cultures primaires d'hépatocytes de canard infectés par l'inoculum de DHBV pré-incubé avec du tampon phosphate, on observe une quantité importante de virus libéré. La pré-incubation de l'inoculum avec du sérum de canes témoins ou avec des IgY de jaunes d'oeufs de canes immunisées par le plasmide pCI, ne modifie pas la sécrétion virale. En revanche après une pré-incubation de l'inoculum avec du sérum de canes immunisées par le plasmide pCI-preS/S, ou avec des IgY de jaunes d'oeufs de canes immunisées par le plasmide pCI-preS/S, on observe respectivement une diminution de 96 % et 99 % de la libération des virions dans le milieu. EXEMPLE 4: Mesure in vivo du pouvoir protecteur des anticorps produits dans les jaunes d'oeufs 4.1. Matériel et méthodes Des oeufs fécondés de canes immunisées soit par le plasmide vide pCI, soit par le plasmide pCI-preS/S sont incubés jusqu'à l'éclosion. Deux jours après leur naissance, on inocule aux canetons le DHBV et on mesure la réponse humorale et la virémie pendant 17 jours. 4.2. Résultats Ils sont illustrés dans le tableau I qui suit Tableau 1 Immunisation des N du caneton Titre en anticorps à Virémie (10' vge/ml)a canes la naissance pCI 927 0 118 928 0 5468 929. 0 191 930 0 7726 931 0 335 932 0 2361 pCI-preS/S 772 12800 0 773 6400 0 777 6400 0 778 6400 0 923 6400 0 926 6400 0 la virémie est mesurée par hybridation quantitative et représente la quantité totale de virions libérés pendant la période de suivi. Tous les canetons nés de canes immunisées par pCI-preS/S et qui ont un titre en anticorps anti-preS >_ 6400 sont protégés contre une épreuve virulante par le DHBV avec un titre élevé (tableau 1, 2'ème ligne). En revanche, tous les canetons nés de canes immunisées par pCI ont été infectés (tableau 1, l'ère ligne). L'ensemble de ces résultats montrent que la méthode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf par immunisation à l'ADN nu codant pour un antigène approprié, conformément à l'invention, est facile à mettre en eeuvre et permet de produire en grandes quantités, dans les neufs, des anticorps spécifiques de cet antigène et de ses variants et qui présentent un fort pouvoir neutralisant et sont hautement protecteurs. REVENDICATIONS 1. Méthode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf caractérisée en ce qu'elle comprend - l'immunisation des aviaires par un ADN nu, - la collecte des oeufs puis des jaunes d'oeufs, et -éventuellement la purification des anticorps produits dans les jaunes d'# u fs. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'immunisation est réalisée chez la poule ou la cane. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'immunisation est réalisée par un plasmide codant pour un antigène ou une protéine choisis parmi les antigènes et les protéines d'origine procaryotes et eucaryotes. 4. Utilisation d'au moins un anticorps obtenu par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit anticorps étant éventuellement associé à une substance appropriée, pour la préparation d'un réactif immunologique susceptible d'être mis en oeuvre pour le dépistage, le d 1 iagnostic et/ou le suivi de maladies chez l'homme ou chez l'animal. 5. Méthode de dépistage, de diagnostic et/ou de suivi d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, consistant à détecter la présence d'un antigène dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle met en présence ledit échantillon avec au moins un anticorps approprié produit par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 6. Kit ou trousse de diagnostic pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins un anticorps obtenu par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, des réactifs appropriés et des moyens pour détecter la formation de liaison antigène- anticorps. 7. Utilisation des jaunes d'oeufs, ou de fractions de jaunes d'oeufs contenant les anticorps produits par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou des anticorps purifiés produits par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament utile en médecine humaine ou vétérinaire. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le médicament est utile en immunothérapie. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le médicament est destiné à l'immunisation passive contre les agents pathogènes entériques ou les infections buccales, chez l'homme ou chez l'animal. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le médicament est apte à traiter une infection choisie dans le groupe constitué par les infections virales, bactériennes et les infections dues aux protozoaires. 11. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le médicament est apte à traiter les maladies choisies dans le groupe comprenant les cancers et les allergies.