FR 2799549 A1 20010413 FR 9912715 A 19991012 PROCEDE DE DIAGNOSTIC DES PATHOLOGIES PROLIFÉRATIVES DES CELLULES MONONUCLÉÉES DU SANG. La présente invention concerne un procédé utilisant le facteur de croissance HARP pour détecter certaines cellules mononuclées du sang, et utile ainsi pour le diagnostic des pathologies prolifératives de ce type de cellules, comme par exemple les leucémies lymphoïdes chroniques. Les syndromes lymphoprolifératifs regroupent un ensemble de pathologies lymphoïdes diverses caractérisées par une augmentation du nombre de lymphocytes circulants ou par des anomalies morphologiques des lymphocytes pathologiques. La possibilité de thérapeutiques spécifiques pour certains types de syndromes lymphoprolifératifs impose impérativement un diagnostic précis que l'examen clinique ou l'étude cytologique ne permet pas toujours. Or, il n'existe pas à l'heure actuelle de marqueurs immunologiques spécifiques des différents syndromes lymphoprolifératifs. Le diagnostic reste bien souvent difficile à faire malgré les efforts de ces dernières années pour parvenir à une classification utilisable pour tous les cas. La démarche diagnostique repose donc sur l'analyse d'un ensemble de marqueurs dont certains ont prouvé leur pertinence dans la discrimination entre les deux grandes classes de syndromes lymphoprolifératifs que sont les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) et les lymphomes malins non hodgkiniens (LNH). Ces marqueurs sont les CD5, CD23, FMC7, CD22 et les immunoglobulines de surface. Le phénotypage immunologique caractéristique des LLC, dont beaucoup d'entre elles sont indolentes, (CD5+, CD23+, FMC7-, CD20 faible, CD22 faible, immunoglobulines de surface (Igs) faibles) les distingue d'un autre syndrome lymphoproliferatif B CD5+ beaucoup plus agressif, le LNH du manteau (CD5+, CD23-, FMC7+, CD20 fort, Igs fortes). La leucémie à tricholeucocyte présente quant à elle le phénotypique typique suivant : CD5-, CDllc fort, CD25+, CD103+, qui la différencie des autres hémopathies lymphoïdes B CD5- ainsi que du LNH splénique à lymphocytes villeux, qui lui est morphologiquement très proche. En outre, chez les patients porteurs de LLC, un immunophénotype peu typique peut être associé à une trisomie 12 ou à une morphologie des cellules mixtes (1) . Ces marqueurs ont finalement permis l'établissement de scores, somme de points attribués en fonction de leur expression, en perpétuelle observation (2). Malgré ces progrès et la confrontation avec les différents aspects, cliniques, cytologiques, histologiques et cytogénétiques, bien des cas restent encore litigieux. De nombreux travaux de recherche sont en cours pour découvrir de nouvelles molécules qui permettraient de mieux discriminer les LLC, qui sont les leucémies les plus fréquentes de notre monde occidental, des autres syndromes lymphoprolifératifs plus agressifs. On connaît dans l'art antérieur de nombreux facteurs de croissance angiogéniques comme les facteurs HARP, MK, FGF-1, FGF-2, VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HGF, HBEGF ou encore l'angiogenine. HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), aussi appelé PTN (Pleiotrophin) ou encore HB-GAM (heparin binding-growth associated molecule) constitue avec MK (Midkine) une famille de ces facteurs de croissance/différenciation structurellement apparentés qui se lient à l'héparine, présentant 50% d'homologie en acides aminés (3)(4). Le facteur de croissance HARP est un polypeptide de 168 acides aminés contenant un motif Nterminal hydrophobe de 32 acides aminés correspondant à un peptide signal. Sous sa forme mature, HARP est une protéine sécrétée de 136 (sous sa forme courte) ou 139 (sous sa forme longue) acides aminés dont le poids moléculaire apparent, déterminé en SDS-PAGE en conditions réductrices, est de 18 kDa. Initialement, HARP a été isolé à partir de cerveaux de rats nouveaux nés comme une molécule induisant in vitro une croissance neuritique (5) suggérant que ce polypeptide est impliqué dans la maturation des cellules neuronales (6). Plus tard, des études ont montré que ce polypeptide était aussi présent dans des tissus nonneuronaux, dont le c#ur (7), l'utérus (8), les cartilages (9) et les extraits d'os (10), démontrant que la fonction de HARP n'est pas limitée à une activité promotrice d'une croissance neuritique comme précédemment rapporté (5). HARP est capable de stimuler la croissance de cellules fibroblastiques, épithéliales et endothéliales in vitro (8)(9). Cette activité mitogène a été depuis confirmée par l'utilisation de protéines recombinantes produites à partir de systèmes d'expression eucaryote (9)(10)(11). HARP induit également in vitro la formation de pseudo-capillaires (10). In vivo, dans différents modèles tissulaires, la localisation de HARP est notamment associée aux cellules endothéliales des capillaires sanguins (11). A l'heure actuelle, les données concernant HARP suggèrent que ce polypeptide joue un rôle dans les mécanismes complexes impliqués dans l'angiogénèse et la néoangiogénèse tumorale. De nombreuses recherches ont été effectuées dans cette voie afin de déterminer l'implication de HARP dans la progression tumorale, notamment dans les tumeurs hormonodépendantes comme le sein ou la prostate. Des études relatives aux propriétés biologiques de HARP ont été effectuées par de nombreux laboratoires (4) et en dépit de résultats controversés, il apparaît admis que HARP, tout comme MK, est impliqué dans le contrôle de la prolifération cellulaire (4)(9)(12). De plus, il a été démontré que la protéine HARP humaine recombinante (hrHARP) purifiée est mitogénique pour les cellules endothéliales (9) (10) et exerce in vitro une activité angiogénique (10). HARP est donc connue et utilisée pour ses propriétés angiogéniques et neurotrophiques. La présence d'ARNm correspondant à la protéine HARP a été observée par les inventeurs dans les cellules des vaisseaux sanguins, à la fois dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses, mais aussi dans les cellules des muscles lisses des glandes mammaires humaines (11). Les données rapportant que HARP est un facteur de croissance angiogénique et qu'il est synthétisé et localisé dans les cellules endothéliales vasculaires ont conduit les inventeurs à travailler sur une fonction potentielle de HARP sur les cellules du sang. Ils ont donc recherché si HARP pouvait se fixer sur ces cellules du sang notamment les cellules mononucléées humaines du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées. Les inventeurs ont pu montrer que HARP se fixait spécifiquement sur les cellules B caractérisées par la présence du marqueur CD19. La présence de sites de fixation de HARP sur les cellules circulantes n'a jamais été décrite jusqu'à maintenant. A ce jour, les récepteurs de HARP sont très peu connus. La présence de site de liaison de très forte affinité (Kd = 600pM) avec HARP dans les cellules NIH 3T3 a déjà été rapporté (13). Ces sites de liaison de HARP ont aussi été retrouvés dans plusieurs types cellulaires, incluant les cellules de rein de rats, cellules de l'adénocarcinome mammaire d'homme, cellules du carcinome épidermique d'homme, cellules de l'hépatocarcinome humain, neuroblastes de souris, et cellules du phéochromocytome. Les inventeurs ont récemment montré que le facteur de croissance HARP, molécule connue comme facteur angiogénique et neurogénique, stimule la production de cytokines de l'inflammation (ILl, IL6, IL8, IFN gamma et TNF alpha) et augmente l'incorporation de thymidine tritiée par les cellules mononucléées du sang circulant de sujets normaux après 7 jours de culture, et ceci d'autant plus fortement que les cellules sont quiescentes au départ. C'est à la suite de ces constatations que les inventeurs se sont intéressés aux relations de cette molécule avec les cellules hématopoïétiques, et plus spécialement sur les lymphocytes de sujets normaux et de patients porteurs d'hémopathies malignes. Les inventeurs ont maintenant montré que HARP est capable de se fixer spécifiquement sur les cellules lymphocytaires B et permett ainsi le diagnostic des pathologies dans lesquelles ces cellules sont impliquées, et au cours desquelles le nombre de lymphocytes B est considérablement augmenté, comme les leucémies lymphoïdes chroniques. L'invention se rapporte donc à un procédé de détection des lymphocytes B comprenant les étapes suivantes : - la mise en contact d'un échantillon sanguin d'un sujet, ou d'une fraction de cet échantillon sanguin, avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP - la détection de la fixation à la surface des lymphocytes B du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP par tout moyen approprié. Un échantillon sanguin peut être prélevé sur des sujets sains ou sur des sujets atteints de pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang. Cet échantillon est mis en contact avec le polypeptide HARP dans des conditions favorisant la réaction de fixation du peptide. Dans le procédé de détection selon l'invention, l'échantillon sanguin peut être mis en contact avec : - le polypeptide HARP, c'est à dire une protéine dont la séquence en acides aminés répond à la séquence en acides aminés donnée dans la littérature (3,5, 8), - un fragment de HARP, soit une protéine ou un peptide capable de se fixer sur les lymphocytes B et dont la séquence en acides aminés répond à une partie de la séquence en acides aminés représentée en annexe sous le numéro SEQ ID N 1. - un dérivé de HARP, c'est à dire un peptide ou un polypeptide capable de se fixer sur les lymphocytes B et dont la séquence en acides aminés est proche de la séquence en acides aminés identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N 1. Par dérivé de HARP, on entend également une protéine capable de se fixer sur les lymphocytes B et comprenant une partie ou la totalité de la séquence en acides aminés répondant à la séquence en acides aminés représentée en annexe sous le numéro SEQ ID N 1 associée à un autre élément de nature protéique ou non protéique. Avantageusement, cet élément permet la détection de la fixation du dérivé de HARP sur les lymphocytes B. Cet élément peut par exemple être un élément radioactif, une séquence en acides aminés codant pour une enzyme dont un substrat chromogène peut aussi être ajouté dans le milieu de réaction. Une autre possibilité est, par exemple, l'association covalente de biotine à HARP, permettant la révélation de l'interaction HARP - lymphocytes B par l'ajout de streptavidine. Le procédé selon l'invention peut être appliqué en mettant en contact le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP avec un échantillon de sang total. Selon une autre possibilité de réalisation du procédé, une étape au cours de laquelle les cellules sanguines mononucléées sont séparées de l'échantillon de sang total est effectuée préalablement à la mise en contact des cellules avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre de telle façon que la fixation à la surface des cellules mononucléées du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée directement. La détection directe de la fixation de HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP peut être réalisée en utilisant, par exemple, le polypeptide HARP marqué radioactivement. Il est également possible d'utiliser le polypeptide HARP couplé à une enzyme ou à de la biotine, et dans ce cas la fixation de HARP aux lymphocytes B sera détectée par l'ajout d'un substrat chromogène correspondant ou de la streptavidine. Il est aussi possible de faire réagir un échantillon sanguin avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, puis un anticorps fluorescent reconnaissant spécifiquement le polypeptide HARP, le fragment ou le dérivé de HARP mis en #uvre dans la réaction. La fixation de l'anticorps anti-HARP sur les cellules peut ensuite être détectée par cytofluorimétrie en flux. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre de telle façon que la fixation à la surface des cellules mononucléées du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée indirectement. Dans l'une des mises en #uvre du procédé selon l'invention pour la détection indirecte de la fixation de HARP sur les lymphocytes B, un échantillon sanguin est mis en contact avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, puis est ajouté un anticorps fixant spécifiquement le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, enfin un anticorps fluorescent liant spécifiquement le premier anticorps est ajouté. La fixation de l'anticorps anti-anticorps sur les cellules peut ensuite être détectée par cytofluorimétrie en flux. L'invention a en particulier pour objet un procédé de diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang. Ce procédé est caractérisé en ce que l'on détecte les lymphocytes B dans un échantillon sanguin d'un patient puis en ce que l'on mesure le taux de fixation de HARP sur les lymphocytes B et l'on compare ce taux à une valeur témoin obtenue chez un sujet sain, de façon à associer une augmentation de fixation de HARP à une augmentation des lymphocytes B et à une pathologie proliférative des cellules mononucléées du sang. Selon l'une des applications possibles de l'invention, le facteur HARP est avantageusement utilisé pour le diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang, comme les leucémies lymphoïdes chroniques. Un autre aspect de l'invention concerne un élément des cellules mononucléées du sang permettant la fixation du facteur HARP sur lesdites cellules. Cet élément peut notamment être un récepteur liant, exclusivement ou non exclusivement, le facteur HARP. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente la fixation de HARP sur des PBMCs issus d'individus sains ou atteints de leucémie lymphoïde chronique. Les barres noires correspondent aux cellules issues d'individus sains donneur de sang, les barres blanches correspondent aux cellules issues de patients souffrant de leucémie lymphoïde chronique. La figure 2 représente les histogrammes de fluorescence biparamétriques conditionnés, obtenus à l'aide d'un cytomètre de flux sur la fenêtre d'acquisition des lymphocytes de sujets normaux, obtenue à partir d'un cytogramme représentant la taille cellulaire en fonction de la structure cellulaire. a =double marquage CD19-PE en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en absence de hrHARP. b =double marquage CD2-PC5 en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en absence de hrHARP. c= double marquage CD19-PE en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en présence de hrHARP. d= double marquage CD2-PC5 en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en présence de hr HARP. La figure 3 représente des histogrammes de fluorescence conditionnés sur des cellules lymphoïdes malignes (LLC) : en l'absence de HARP humain recombinant (hrHARP) (fig. 3a) et en présence de hrHARP (fig. 3b). Exemple 1 : Utilisation de HARP comme marqueur des lymphocytes des patients présentant une leucémie lymphoïde chronique. Les cellules mononucléées ont été isolées du sang périphérique de sujets normaux, donneurs de sang, ou de sujets porteurs d'hémopathies variées : 30 sujets atteints de LLC, 6 atteints de LNH B, 4 atteints de maladies de Sézary, 2 atteints de leucémies aiguës myéloïdes (LAM2 et LAM3) et 1 atteint de leucémie myéloïde chronique (LMC). Le sang a été prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les cellules mononucléées ont été séparées par gradient de Ficoll, comptées et ajustées à 106 cellules par ml. Le facteur de croissance HARP utilisé a été la protéine humaine recombinante HARP (hrHARP) de 139 acides aminés, fournie par le laboratoire CRRET (ESA CNRS 7053) à Créteil Université Paris 12 (France). L'anticorps anti-HARP (Immunoglobuline de chèvre anti-HARP humain) provient de la société R&D Systems Minneapolis (Minesota USA) a été utilisé à la dilution finale de 1/250. Un anticorps anti IgG de chèvre couplé au FITC (provenant de Caltag, Burlingame, CA, USA) à la dilution de 1/50 a été utilisé comme anticorps secondaire. Pour réaliser le contrôle négatif, l'anti-HARP a été remplacé par du sérum de chèvre (provenant de la société Jackson, West Grove, PE, USA) . D'autres anticorps ont été utilisés pour identifier les populations cellulaires : CD19-PE, CD2-PC5, CD10-FITC, CD45Ra-FITC, CD45Ro-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3FITC, CD16/56-PE, CD25-FITC (tous ces anticorps proviennent de la société Beckman Coulter-Immunotech, Hialeah, FL, USA) . Afin de mesurer le contenu endogène en facteur de croissance HARP des cellules circulantes, celles-ci ont été séparées sur ficoll puis lavées en PBS-0.1% BSA. Ces cellules ont été ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-HARP pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavées en PBS-0.1% BSA et remises en incubation avec l'anticorps secondaire pendant 30 minutes. Après lavage et fixation en formol 1% les cellules ont été analysées au cytofluorimètre XL (Beckman-Coulter Hialeah, FL, USA). Afin de rechercher le ou les sites de fixation cellulaire de HARP, les cellules mononucléées ont été préalablement incubées avec le HARP recombinant (hrHARP) à la concentration de 1 ug/ml pendant 1h à température ambiante, puis lavées, avant d'être marquées selon la technique précédente. L'effet de hrHARP sur des cellules mononucléées normales après 5 jours de culture a été étudié en atmosphère humide à 37 C enrichie avec 5% de C02, en l'absence et en présence de 1 ug/ml de hrHARP. Une fois lavées, les cellules ont été marquées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti CD19, CD2, CD4, CD8 ainsi qu'avec l'antiHARP. La lecture au cytofluorimètre a été réalisée à l'aide d'un rayon laser de 488 nm. Une fenêtre d'acquisition a été dessinée autour des lymphocytes sur un histogramme biparamétrique représentant la taille cellulaire selon un mode linéaire en fonction du logarithme de la granulométrie. Des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence en mode logarithmique en fonction du nombre de cellules ont été ainsi obtenus à partir de cette population de cellules sélectionnée. Les résultats ont été acquis en pourcentages de cellules Les cellules mononucléées ont été analysées positives pour l'anticorps concerné. Des histogrammes biparamétriques représentant l'expression de fluorescence de deux antigènes différents marqués par des fluorochromes différents ont permis d'analyser les doubles marquages CD19/HARP. Les résultats sur la recherche de la présence de HARP endogène ont été négatifs et aucune expression directe de HARP n'a pu être mise en évidence sur les lymphocytes des 10 sujets normaux testés, ni des cellules lymphoïdes et myéloïdes malignes testées, après séparation des cellules mononucléées sur gradient de ficoll. La recherche de sites de fixation cellulaire de HARP a permis de montrer que sur les lymphocytes B de sujets normaux une fixation HARP. Il est à noter que pour 2 sujets sur les 10 analysés, des cellules CD2 positives sont également capables de fixer hrHARP sans que l'on puisse faire une distinction entre les cellules T et NK Ainsi les histogrammes de fluorescence biparamétriques conditionnés sur la fenêtre d'acquisition des lymphocytes de sujets normaux obtenue à partir d'un cytogramme représentant la taille cellulaire en fonction de la structure cellulaire sont présentés dans la figure 2. Un double marquage au CD19-PE contre HARP-FITC (fig2a) et CD2-PC5 contre HARPFITC (fig.2b) en absence de rhHARP d'une part et les mêmes marquages fig. 2c et fig.2d en présence de hrHARP d'autre part montrent une fixation de HARP associée au CD19 chez les sujets sains. Chez les malades atteints de certaines LLC ou de certains LNH, il a été observé une fixation de HARP sur les lymphocytes. Ceci a été montré par des triples marquages entre un marqueur des cellules lymphoïdes B, le CD19, un marqueur pan T, le CD2 et le HARP. 100% des cellules lymphoïdes B fixent le HARP tandis que les cellules CD2 positives ne le fixent pas. En outre, il semblerait que les cellules exprimant le CD10 ne peuvent fixer le HARP dans nos conditions d'étude. Ces résultats sont présentés dans la figure 3, ce sont des histogrammes de fluorescence conditionnés sur des cellules lymphoïdes malignes : (fig. 3a) en l'absence de hrHARP et (fig.3b) en présence de hrHARP. Par ailleurs les cellules myéloïdes pathologiques des deux LAM et de la LMC ainsi que les cellules lymphomateuses de Sézary de phénotype T n'ont pas montré de fixation de hrHARP. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES : 1) DiGiuseppe JA, Borowitz MJ, Clinical utility of flow cytometry in the chronic lymphoid leukemias. Semin Oncol 1998, 25(1):6-10). 2) Matutes E. et al. The immunological profile of B-cell disorders and proposai of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia 1994, 8(10):1640-5). 3) Bohlen P and Kovesdi I. 1991. HBNF and MK, members of a novel gene family of heparin-binding proteins with potential roles in embryogenesis and brain function. Prog. Growth Factor Res. 3 : 143 4) Laaroubi K, Vacherot F, Delbe J, Caruelle D, Barritault D and Courty J. 1995. Biochemical and mitogenic properties of the heparin-binding growth factor HARP. Prog. Growth Factor Res. 6:25). 5) Rauvala H. 1989. 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REVENDICATIONS 1) Procédé de détection des lymphocytes B caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'un échantillon sanguin d'un sujet, ou d'une fraction de cet échantillon sanguin, avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP - la détection de la fixation à la surface des lymphocytes B du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP par tout moyen approprié. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP est mis en contact avec un échantillon de sang total. 3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle les cellules sanguines mononucléées sont séparées des autres composants de l'échantillon sanguin préalablement à la mise en contact desdites cellules avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fixation à la surface des cellules mononucléées du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée directement. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fixation à la surface des cellules mononucléées du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée indirectement. 6) Procédé de diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang caractérisé en ce que l'on détecte les lymphocytes B dans un échantillon sanguin d'un patient selon l'une des revendications 1 à 5 puis en ce que l'on mesure le taux de fixation de HARP sur les lymphocytes B et l'on compare ce taux à une valeur témoin obtenue chez un sujet sain, de façon à associer une augmentation de fixation de HARP à une augmentation des lymphocytes B et à une pathologie proliférative des cellules mononucléées du sang. 8) Utilisation du facteur HARP pour le diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang, comme les leucémies lymphoïdes chroniques.