FR 2803307 A1 20010706 FR 9916716 A 19991230 L'invention concerne l'obtention ex vivo de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1. Elle a plus particulièrement pour objets de tels lymphocytes et un procédé pour leur obtention par induction ex vivo de lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 dans un but immunoprophylactique ou thérapeutique vis-àvis d'infections provoquées par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite. Le contexte dans lequel se situe l'invention est explicité ci-après en référence avec l'infection par le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) qui mobilise de nombreux chercheurs depuis une quinzaine d'années, ce qui permet de disposer d'un volume important de données. L'infection par le VIH se caractérise par une hyperactivité chronique du système immunitaire qui contraste avec un déficit de nombreuses fonctions des cellules du système immunitaire. Idéalement, la vaccination contre le VIH doit permettre de transformer l'infection chronique en infection aiguë, ceci en amplifiant et en accélérant la réponse immunitaire naturelle. A ce jour, la recherche vaccinale sur le VIH s'est principalement orientée vers deux axes : d'une part, l'induction d'une réponse humorale médiée par des anticorps neutralisant le virus et, d'autre part, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire. Bien que des expériences de neutralisation aient permis d'observer des résultats positifs en termes de protection, l'utilisation exclusive d'anticorps neutralisants dans une optique vaccinale apparaît peu applicable en raison d'importantes limitations telles que la restriction à des isolats viraux minoritaires ainsi qu'une concentration d'anticorps requise très élevée. En revanche, les informations issues des recherches concernant les composantes cellulaires de la réponse immunitaire anti-VIH sont plus encourageantes. En effet, les données relatives à l'activité cytotoxique médiée par les lymphocytes T8 suppresseurs cytotoxiques qui expriment le marqueur CD8, appelés ci-après lymphocytes T CD8 [lymphocytes T cytotoxiques (Cytotoxic T Lymphocytes ou CTL)] révèlent une corrélation entre l'apparition de cette activité et le contrôle de l'infection virale. Des lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre des séquences dérivées de protéines virales apparaissent très rapidement lors de la réponse immune déclenchée par l'infection virale. D'une manière générale, ils jouent un rôle important en éliminant les cellules infectées par le virus dans les infections aiguës et en bloquant la réplication virale lors d'infections persistantes. Ces réponses cytotoxiques, tout comme l'induction d'anticorps neutralisants, sont étroitement associées aux réponses dites T auxiliaires connues sous la dénomination "T helper" (en abrégé TH) médiées par les lymphocytes T4 qui expriment le marqueur CD4, appelés ci-après lymphocytes T CD4. Ainsi, une augmentation de la réponse TH permet d'obtenir une réponse CTL optimale. En particulier, chez les individus qui contrôlent la virémie en l'absence d'une thérapie antivirale, de très fortes réponses prolifératives des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus sont observées. Dans tous les cas, il apparaît clairement établi qu'une nette réponse CD4 est indispensable pour l'obtention d'une réponse CD8 efficace. Ainsi, dans le cadre d'une approche vaccinale, il importe désormais de préciser la nature de la réponse CD4 obtenue. Une réponse de type TH1 (IFN-y, IL-2) ou de type TH2 (IL-4) n'a pas la même signification car l'on peut craindre que dans le deuxième cas, elle soit par exemple plus nuisible qu'utile à la vaccination, et l'ensemble des travaux réalisés jusqu'à présent démontrent clairement l'importance des cellules TH1 productrices d'IFN-[gamma] dans l' immunité protectrice anti-VIH. Mais l' orientation vers un type ou l'autre de réponse est très difficilement contrôlable après injection d'un antigène à un individu, en fonction du polymorphisme génétique exprimé par ce dernier. Sur la base de ces données relatives au VIH, les inventeurs se sont fixé pour buts de proposer des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est-àdire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux comme par exemple un virus, une bactérie ou un parasite et un procédé permettant d'induire ex vivo, de façon standardisée, de telles lignées. Ces buts sont atteints selon l'invention qui fournit un procédé d'induction ex vivo d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 induisant euxmêmes de manière efficace des lymphocytes T cytotoxiques, c'est-à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite, lequel procédé comprend essentiellement les étapes consistant à : a) prélever sur un donneur un échantillon biologique contenant des lymphocytes T ; b) isoler les lymphocytes T CD4+ à partir de l'échantillon prélevé à l'étape a) ; c) se procurer des cellules dendritiques isolées à partir du même échantillon ou d'un autre échantillon provenant du même donneur ; d) soumettre les lymphocytes T CD4+ isolés à l'étape b) à une réaction immunologique ou immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux présentant au moins un épitope T, de préférence un épitope T et un épitope B, en présence des cellules dendritiques de l'étape c) ; e) effectuer au moins une restimulation, de préférence de une à trois restimulations, dans les mêmes conditions que l'immunisation, en remplaçant éventuellement les cellules dendritiques par des cellules B du même donneur. On entend ici par "peptide d'une protéine de l'agent infectieux" un peptide dont la séquence est identique à celle de la fraction correspondante de ladite protéine ou est modifiée par apport d'une partie lipidique ou par induction d'une dégénérescence contrôlée chimiquement, dans une mesure telle que sa fonction soit maintenue, ou un mélange d'au moins deux peptides tels que définis ci-dessus. Ce procédé peut être mis en oeuvre sur tout échantillon biologique humain ou animal contenant des lymphocytes T. Il présente, a priori, un intérêt particulier dans ses applications à l'être humain. Dans ce cas, pour des raisons déontologiques et pratiques évidentes, l'échantillon biologique utilisé est de préférence le sang et, pour les applications de type immunoprophylactique ou thérapeutique, il s'agit de sang autologue. L'aptitude de ce procédé à induire des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 nécessaires à la génération de CTL a, comme le montrent les exemples décrits plus loin, été vérifiée sur différents agents pathogènes. Dans le cas particulier du VIH, les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 nécessaires à la génération de CTL peuvent être réinjectées dans des protocoles de thérapie cellulaire anti-VIH. Les patients traités peuvent être notamment des patients séropositifs en phase asymptomatique à taux de cellules T CD4 encore intact ou des patients en cours de renouvellement cellulaire sous thérapie antivirale à haute efficacité (Highly Active AntiRetroviral Therapy (HAART). En effet, chez ces derniers, si on constate une nette et rapide diminution de la virémie, le virus n'est pas éradiqué et malgré une restauration du taux de cellules T CD4 et de la réponse immunitaire globale (lutte contre les infections opportunistes associées), on n'observe pas de réapparition de la réponse TH1 spécifique contre le VIH, qui est nécessaire à l'élimination de ce dernier. Les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 obtenues ex vivo selon l'invention peuvent donc être utilisées en complément à une HAART, par exemple une trithérapie, pour la restauration du potentiel TH1. Il va de soi que pour des infections provoquées par d'autres agents infectieux, le protocole d'utilisation peut être différent. Les lignées peuvent notamment, dans certains cas, être utilisées seules, c'est-à-dire ne pas servir de complément à une thérapie, par exemple lorsqu'il s'agit d'effectuer la vaccination d'un sujet sain. Les exemples illustratifs qui suivent sont destinés à mieux expliquer l'invention. Exemple 1 : Préparation d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1, anti-VIH et résultats 1- Préparation. Dans cet exemple, l'inducteur est le peptide 56-68 de la protéine Nef (Négative Factor) de 27 kDa qui est une protéine de régulation du VIH décrite initialement comme ayant un effet inhibiteur sur la réplication virale in vitro. Le gène Nef est localisé en 3' du gène Env de VIH. Références : "The HIV Nef protein : facts and hypothèses", Guy, B. et al., Res . Virol., janv-fév. 1992, 143(1), 34-37 et "Virological and cellular physiological roles of HIV Nef protein", Venkatesan, S., Res. Virol. jan-fév 1992, 143(1), 38-42. La séquence de la protéine Nef est décrite dans : "Complete nucleotide sequence of AIDS virus, HTLV-III", Ratner, L. et al., Nature 1985,313, 277-284. La séquence du peptide 56-68 de la protéine Nef du VIH est Ac-AWLEAQEEEEVGF-CONH2 Ce peptide contient à la fois un épitope T et un épitope B. Références : "T helper cell epitopes of the human immunodeficiency virus (HIV-1) nef protein in rats and chimpanzees", Estaquier et al., Mol. Immunol. avril 1992, 29 (4), 489-99 et "Détermination of B-cell epitopes of nef HIV-1 protein : immunogenicity related to their structure", Estaquier et al., Mol. Immunol. nov 1992, 29(11), 1337-45. Le milieu biologique utilisé est le sang humain périphérique. Les échantillons (100 à 150 ml) répertoriés dans le tableau qui suit provenaient de différents donneurs typés pour les molécules de la classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), en particulier HLA-DR. Le sang total, dilué au demi dans du tampon phosphate (PBS) est déposé sur une solution pour gradient, spécifique de l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique humain, Ficoll-Paque Amersham Pharmacia Biotech (Suède), selon les recommandations du fabricant et l'anneau de cellules mononucléées est récupéré après centrifugation (400 g, 20 min, 20 C). Les monocytes sanguins CD14+ sont isolés par sélection positive (Système Macs, Milteny Biotech, Allemagne). Les cellules dendritiques sont ensuite obtenues par différenciation in vitro de ces cellules CD14+ mises en présence d'IL-4 (1000 U/ml) et de GM-CSF (800 U/ml) pendant cinq jours en milieu complet à 10 % de sérum de veau foetal (SVF). Les cellules CD14- sont de leur côté conservées en milieu complet à 10 % de sérum humain de groupe AB pendant également cinq jours. Au bout de ces cinq jours, les lymphocytes T CD4+ sont isolés par déplétion ou sélection négative (Système Macs, Milteny Biotech) à partir des cellules CD14obtenues précédemment. Les lymphocytes T CD4+ (1.106/ml) sont ensuite immunisés in vitro par le peptide 56-68 de la protéine Nef (50 g/ml) en présence des cellules dendritiques (DC) obtenues parallèlement (1.106 /ml). Les inventeurs ayant pu montrer que la congélation n'affecte pas la fonctionnalité des cellules dendritiques, les cellules dendritiques restantes sont congelées et utilisées pour la première restimulation par le peptide Nef 56-68 qui a lieu quinze jours après l'immunisation. Pour les restimulations ultérieures, les cellules dendriditiques sont en général remplacées, notamment au-delà de la deuxième restimulation, par les cellules B du donneur, isolées à partir du même prélèvement par déplétion des cellules CD4- en cellules CD8+ (Système Macs, Milteny Biotech). Toutefois, des cellules dendritiques congelées peuvent être utilisées dans toutes les restimulations, pour autant qu'on en ait des quantités suffisantes. Le schéma 1 qui suit résume les différentes étapes d'obtention, à partir du sang complet, des différentes cellules utilisées : cellules dendritiques, lymphocytes T CD4+ et cellules B. Schéma 1 Dans les essais récapitulés dans le tableau qui suit, l'obtention de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 se résume comme suit : Immunisation in vitro (I) Cellules CD4++ cellules dendritiques + peptide Culture : 15 jours 1ère Restimulation (1S) Cellules CD4++ cellules dendritiques + peptide Culture : 15 jours 2ème Restimulation (2S) Cellules CD4+ + cellules dendritiques ou B + peptide Culture : 15 jours 3ème Restimulation (3S) Cellules CD4+ + cellules B + peptide Culture : 15 jours 2- Résultats. La production de cytokines et l'induction d'anergie (non-réponse) ont été examinées. a) Production de cytokines. La production d'IFN-, d'IL-2, d'IL-4 et d'IL-5 a été recherchée dans les surnageants de culture des lymphocytes T CD4+ 24 h et 48 h après l'immunisation in vitro (I) et après les restimulations successives (1S, 2S et 3S) par le peptide 56-68 de la protéine Nef, en utilisant une méthode ELISA. Les résultats montrent clairement une orientation de type TH 1 de la réponse obtenue, avec des productions importantes d'IFN-y et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. b) Induction d'anergie. On constate, selon le cas, dès la deuxième ou la troisième restimulation par le peptide, une forte diminution, voire le plus souvent une disparition de la production d'IFN-Y et/ou d'IL-2. Il semble donc que la réponse optimale est obtenue après la deuxième présentation du peptide (1ère restimulation) et que des restimulations répétées ont tendance à anergiser les lymphocytes T CD4 préparés dans cet exemple. Dans ces conditions, la réinjection des cellules au patient doit avantageusement avoir lieu après l'incubation qui suit la 1ère restimulation, soit environ après un mois de culture. Il va de soi que pour un patient donné et un protocole donné différents facteurs peuvent intervenir dans l'obtention de la réponse optimale recherchée, en particulier en ce qui concerne le moment où elle intervient. Un suivi in vitro des résultats s'avère donc recommandé, voire nécessaire dans chaque cas. TABLEAU DES RESULTATS Essai Typage Nbre de Stades d'apparition d'une réponse restimun lations IL-4 IL-5 IL-2 IFN-y 1 DR1/ ? 5 Non Non I I 1S, 2S, 3S 2 DR4/DR13 3 Non Non I, 1S I, 1S, 2S 3 DR3/DR4 2 Non Non 1S Non 4 DR15/DR3 3 Non Non Non I, 1S, 2S, 3S 5 ? 1 Non Non Non~~~~~1~~~~ 6 DR13/DR8 1 Non Non I I, 1S 7 DR4/DR13 2 Non Non I I, 1S, 2S 8 DR4/DR7 1 Non Non I I, 1S 9 DR3/DR11 2 Non Non Non Non 10 DR15/DR4 3 Non Non 1S I, 1S 11 DR15/DR13 3 Non Non I, 1S, 3S I, 1S, 2S 12 DR7/DR9 2 Non Non Non I 1S, 2S 13 DR1/DR3 3 Non Non Non 1S 14 DR3/DR11 3 Non Non Non I, 1S Exemple 2 On procède comme dans l'exemple 1 en utilisant le peptide 190-211 de la Sm 28 GST, Glutathion S Transferase de 28 kDa du parasite Schistosoma mansoni, appelé Sm 28 GST 190-211 dont la séquence est : NH2-ENLLASSPRLAKYLSNRPATPF-COOH Après immunisation in vitro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type TH1 (avec des productions importantes d'IFN-y et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5) de la réponse obtenue, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. Exemple 3 On procède comme dans l'exemple 1 en utilisant le peptide 830-846 de la toxine tétanique. Ce peptide est appelé TT 830-846. Sa séquence est : Ac-QYIKANSKFIGITELKK-CONH2 Après immunisation in vitro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type TH1 (avec des productions importantes d'IFN-7 et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5) de la réponse obtenue, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. Exemple 4 On procède comme dans l'exemple 1 en utilisant le peptide 307-319 de l'hémaglutinine du virus Influenza. Ce peptide est appelé HA 307-319. Sa séquence est : Ac-PKYVKQNTLKLAT-CONH2 Après immunisation in vitro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type TH1 (avec des productions importantes d'IFN-y et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5) de la réponse obtenue, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. Les exemples 2 à 4 montrent que ce qui a été décrit en détail à propos du VIH peut être généralisé aux infections dues à d'autres virus, aux bactéries et aux parasites. REVENDICATIONS 1.- Lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est-à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite. 2. - Procédé d'induction ex vivo d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 selon la revendication 1, lequel procédé comprend essentiellement les étapes consistant à : a) prélever sur un donneur un échantillon biologique contenant des lymphocytes T ; b) isoler les lymphocytes T CD4+ à partir de l'échantillon prélevé à l'étape a) ; c) se procurer des cellules dendritiques isolées à partir du même échantillon ou d'un autre échantillon provenant du même donneur ; d) soumettre les lymphocytes T CD4+ isolés à l' étape b) à une réaction immunologique ou immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux présentant au moins un épitope T, de préférence un épitope T et un épitope B, en présence des cellules dendritiques de l'étape c) ; e) effectuer au moins une restimulation, de préférence de une à trois restimulations, dans les mêmes conditions que l'immunisation, en remplaçant éventuellement les cellules dendritiques par des cellules B du même donneur. 3. - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de préférence périphérique. 4. - Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'agent infectieux est le VIH. 5. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la protéine est une protéine de régulation du VIH. 6. - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le peptide est le peptide 56-68 de la protéine Nef de régulation du VIH. 7. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que les lymphocytes T CD4 sont cultivés avant la première restimulation et ensuite entre deux restimulations successives pendant environ quinze jours à chaque fois. 8.- Lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1 obtenus à partir du sang d'un donneur et induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est- à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite, pour le traitement immunoprophylactique ou thérapeutique dudit donneur. 9. - Lignée selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'agent infectieux est le VIH.