FR 2796953 A1 20010202 FR 9909862 A 19990729 Protéines recombinantes, et complexes moléculaires dérivés de ces protéines, analogues à des molécules impliquées dans les réponses immunitaires. L'invention se rapporte à des protéines recombinantes, et â des complexes moléculaires dérivés de ces protéines, analogues à des molécules impliquées dans les réponses immunitaires. Elle concerne également une méthode de production de telles molécules et de tels complexes, ainsi que leurs applications, en particulier pour le diagnostic et en thérapeutique. on connaît le rôle majeur, dans une réponse immunitaire, des molécules codées par le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). Ces molécules sont constituées de deux chaînes polypeptidiques : la chaîne lourde, et la chaîne légère. Les molécules du CMH sont exprimées à la surface des cellules présentatrices (cellules dendritiques, lymphocytes B, macrophages) sous la forme de complexes moléculaires avec des peptides antigéniques, eux-mêmes dérivés de protéines extracellulaires ou intracellulaires. La reconnaissance de ces complexes peptide/CMH par un récepteur spécifique exprimé à la surface des lymphocytes T est à l'origine de toute réponse immunitaire à médiation cellulaire. Les molécules du CMH appartiennent à deux classes distinctes : celles de classe I, qui sont reconnues par des lymphocytes T CD8+ (cellules T cytotoxiques) et celles de classes II qui sont reconnues par des lymphocytes T CD4+ (cellules T auxiliaires). Pour être utilisables comme sondes permettant de dénombrer et de mesurer la fréquence des lymphocytes T spécifiques d'un antigène donné, de telles molécules et complexes doivent être produits sous forme soluble. Ces mêmes molécules et complexes solubles peuvent être utilisés pour moduler les réponses immunes. La possibilité d'utiliser des molécules solubles du CMH pour détecter des lymphocytes T CD8+ a été démontrée pour la première fois par Altman et al en 1996 (1). Depuis cette date, de nombreuses équipes ont utilisé cette stratégie pour dénombrer et caractériser le phénotype de lymphocytes T CD8+ réagissant avec des peptides viraux, bactériens ou dérivés d'antigènes tumoraux. Toutefois, l'application de cette stratégie pour la détection de lymphocytes T CD4+ s'est révélée problématique. Dans la plupart des travaux publiés à ce jour, des systèmes d'expression bactériens ont été utilisés pour produire des molécules du CMH de classe I. Après incubation de ces molécules avec des peptides antigéniques, les complexes peptide/CMH ont été purifiés et obtenus sous forme de tétramères après incubation avec de la streptavidine. Cette dernière étape est rendue possible par l'addition à l'extrémité carboxy-terminale de la chaîne lourde du CMH d'un site de reconnaissance pour l'enzyme BirA, une enzyme bactérienne, qui est capable de catalyser l'addition d'une molécule de biotine. D'autres équipes ont choisi de produire des dimères de molécules du CMH de classe I en utilisant le squelette d'un anticorps. Dans ce cas, la chaîne lourde du CMH a été liée à la chaîne lourde d'une immunoglobuline (Ig en abrégé) et la P-2-microglobuline liée à la chaîne légère. Les régions Fc des chaînes lourdes s'associant par l'intermédiaire de ponts disulfures, les molécules produites sont des dimères de molécules du CMH. Pour des raisons techniques, la préparation de sondes moléculaires se fixant sélectivement aux lymphocytes T CD4+ s'est avérée beaucoup plus difficile, vraisemblablement à cause de l'instabilité intrinsèque des molécules du CMH de classe II. Des tétramères de molécules de classe II liées à un peptide antigénique, ou des dimères de ces molécules obtenus en utilisant le squelette d'un anticorps ont été produits. Le problème de la stabilité et de l'affinité des récepteurs de lymphocytes T CD4+ pour leur ligand est résolu, conformément à l'invention, par l'utilisation de constructions assurant la formation de dimères donnant des complexes multivalents grâce à l'utilisation de molécules comportant plusieurs sites de liaison pour certaines régions des dimères. De telles constructions sont envisageables aussi bien pour des molécules de CMH de classe I que pour celles de classe II. De manière avantageuse, de telles constructions sont suffisamment stables pour pouvoir être utilisées comme sondes moléculaires ouvrant ainsi un large champ d'application. Ces constructions sont également utilisables pour obtenir des analogues de récepteurs des cellules T capables de reconnaître spécifiquement de telles molécules. L'invention a donc pour but de fournir des molécules recombinantes et des complexes recombinants correspondants, dans lesquels ces molécules sont associées à des peptides antigéniques, de grande stabilité et de forte affinité pour leur ligand. Elle vise également leur production dans des cellules hôtes à l'aide de vecteurs d'expression appropriés. L'invention vise en outre les applications immunologiques de ces complexes comme sondes moléculaires. Les protéines recombinantes solubles selon l'invention sont constituées au minimum d'un dimère lui-même formé des chaînes a et P des molécules du CMH de classe I ou II. Ces dimères sont caractérisés en ce qu'ils comportent à l'extrémité carboxy-terminale de l'une ou des 2 chaînes, tout ou partie d'une région Fc d'une immunoglobuline. "Partie d'une région Fc" désigne un fragment correspondant à un fragment naturel, ou modifié par rapport à un tel fragment naturel, par substitution et/ou par délétion et/ou par mutation, mais capable de se lier à une protéine possédant des sites de liaison pour la région Fc, telle que la protéine A ou la protéine G. L'expression "capable de se lier" est illustrée par l'exemple 1C. La région Fc correspond plus spécialement à tout ou partie du domaine CHz et/ou CH3. Ce domaine peut être modifié par rapport au domaine naturel, mais doit être capable, conformément à l'invention, de se lier à une protéine du type protéine A ou G possédant plusieurs sites de liaison pour la région Fc d'une Ig. L'immunoglobuline comportant la région constante visée ci-dessus peut être une IgG, notamment les isotypes IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, une IgM, une IgA, une IgD ou une IgE. Les protéines de l'invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie des chaînes a ou (3 des molécules du CMH. De manière avantageuse, les chaînes a et (3 constituant le dimère comportent des glissières à leucine, ce qui favorise leur appariement. De telles glissières à leucine sont par exemple décrites par Scott et al (2) ou Kalandadze et al (3). L'invention vise en particulier les molécules recombinantes associées en plusieurs dimères et notamment en tétramères et tout spécialement en octamères. De telles molécules recombinantes sont complexées avec une protéine naturelle ou artificielle comportant plusieurs sites de liaison pour les régions constantes des immunoglobulines et permettant ainsi de créer des multimères de dimères. On citera à titre d'exemple la protéine A communément isolée à partir de Staphylococus aureus, ou encore la protéine G de Streptococus (groupe C), ou des multimères de récepteur des régions Fc obtenus par recombinaison génétique. Les molécules recombinantes telles que définies ci- dessus complexées à des peptides antigéniques constituent des analogues de CMH. I1 s'agit de protéines recombinantes soluble caractérisées en ce qu'elles sont liées de manière covalente ou non covalente à un peptide antigénique. L'invention vise de tels complexes, caractérisés en ce qu'ils comportent à l'extrémité - NHZ de la chaîne P, un peptide antigénique fixé par l'intermédiaire d'un bras flexible. Ce bras peut avoir une longueur variable et permet le positionnement du peptide antigénique dans le sillon formé par le ou chaque dimère. De telles fixations sont décrites par exemple par Kozono et al (4) et (5). Les molécules définies ci-dessus sont obtenues avantageusement selon les techniques décrites dans les Manuels de Biologie Moléculaire pour la préparation des gènes recombinants et leur expression dans des cellules eucaryotes ou procaryotes. On se référera ainsi par exemple aux ouvrages de Sambrook et al (6) ou de Ausubel et al (7). Les séquences nucléotidiques de l'invention possèdent un cadre de lecture correspondant à tout ou partie d'une protéine telle que définie ci-dessus. Les séquences codant pour les fragments recombinants constitutifs des molécules définies ci-dessus sont introduites dans des vecteurs d'expression. On utilise généralement autant de vecteurs d'expression que de fragments. Mais il est également possible, en variante, d'utiliser un même vecteur pour plusieurs fragments. Comme vecteurs d'expression, on utilisera avantageusement des plasmides et notamment des plasmides possédant un marqueur de sélection. Des résultats d'expression satisfaisants ont été ainsi obtenus avec des plasmides capables de se répliquer dans des bactéries et comportant, comme marqueur de sélection, un gène de résistance à un antibiotique. Les promoteurs seront choisis de manière à permettre l'expression du gène recombinant dans le système d'expression utilisé. On citera à titre d'exemple le promoteur reconnu par la polymérase du bactériophage T4 ou, lorsqu'on utilise comme système d'expression des cellules de Drosophile, le promoteur du gène de la métallothionéine. Comme systèmes d'expression eucaryote, on citera les systèmes baculovirus recombinants dans des cellules d'insecte, de cellules de Drosophile, des cellules de Hamster (lignée CHO) et des cellules de Singe (lignée COS). On peut également effectuer une expression dans des cellules de levure. Comme systèmes d'expression procaryote, les bactéries sont largement utilisées, en particulier E.coli. Les molécules recombinantes produites sont purifiées sur des colonnes d'immunoaffinité, notamment avec des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, spécifiques des molécules d'intérêt, ou encore avec des matériaux supports comme des billes, notamment des billes d'agarose. D'autres protocoles de purification peuvent être envisagés. En particulier, par exemple lorsque les molécules à purifier comportent 6 résidus histidine consécutifs, des billes d'agarose recouvertes de nickel peuvent être utilisées pour purifier les molécules. Les molécules purifiées obtenues sont alors mises à incuber avec les protéines possédant les sites de liaison pour la région Fc. Ces protéines sont avantageusement marquées aux fins de détection, par exemple par un fluorophore. Lorsque la molécule obtenue ne comporte pas de peptide antigénique, et qu'on souhaite disposer de complexes peptide antigénique/analogue de CMH, on la fait incuber avec ce peptide in vitro. L'étude des molécules recombinantes selon l'invention a permis de mettre en évidence leur grande stabilité et une forte affinité dans les essais de reconnaissance immunologique. L'invention fournit ainsi des outils de grand intérêt pour la modulation des processus immunologiques. Elle vise en particulier l'utilisation des complexes peptide antigénique/analogues de CMH de classe II pour dénombrer et/ou purifier les lymphocytes T réagissant avec un antigène donné et pour caractériser le phénotype de ces cellules, c'est-à-dire déterminer ou identifier les molécules qu'elles sécrètent ou qu'elles expriment à leur surface. Cette détection est réalisée sur un prélèvement effectué sur un patient. I1 peut s'agir d'un prélèvement sanguin, ou effectué sur des organes lymphoïdes secondaires, comme les ganglions lymphatiques, la rate, ou encore sur des tumeurs. Ces molécules peuvent avantageusement être utilisées pour dénombrer ou pour purifier ces cellules à partir de suspensions cellulaires comme décrit ci-dessus. Alternativement, elles peuvent être utilisées pour visualiser ces cellules sur des coupes cellulaires. I1 est ainsi possible de préciser le statut immunologique d'un individu. Cette application revêt un grand intérêt pour le développement de vaccins contre certains agents pathogènes ou de vaccins anti-tumoraux. on sait que pour juger de l'efficacité d'un vaccin, le meilleur moyen consiste à vacciner un grand nombre d'individus et à suivre le devenir de cette population lorsqu'elle est exposée à l'agent infectieux dans des conditions naturelles. Cette approche est toutefois difficile à cause notamment des coûts considérables qu'elle engendre, et de la difficulté de trouver suffisamment de volontaires. L'utilisation des complexes selon l'invention, en tant que sondes moléculaires se fixant sélectivement à des lymphocytes T CD4+ de spécificité donnée, permet de comparer rapidement l'efficacité de différentes préparations vaccinales et de déterminer le nombre et les intervalles optimaux entre les rappels. Dans une étude en pré-clinique, on inocule des individus avec des préparations vaccinales renfermant le ou les antigènes, puis on dénombre les cellules T présentes dans un prélèvement, réagissant avec des complexes selon l'invention. La réponse des individus permet d'apprécier la réaction vis-à-vis du peptide antigénique. Cette application peut être également mise en oeuvre comme moyens prédictifs quant à l'état d'un patient, en dénombrant et en déterminant le phénotype de cellules T autoréactives chez des malades à risques. L'invention permet ainsi de déterminer le stade d'avancement de la maladie chez des patients souffrant de maladies auto-immunes ou d'évaluer l'efficacité de certains traitements ou d'interventions thérapeutiques. L'invention vise également l'application desdits complexes multivalents définis ci-dessus dans le diagnostic et la mise au point de traitements de maladies auto-immunes. Un certain nombre de maladies auto-immunes sont dues à la mobilisation de lymphocytes T auto-réactifs qui provoquent la destruction des tissus de l'organisme. Dans certains cas, par exemple chez les diabétiques, le diagnostic de la maladie n'est effectué que tardivement lorsque les tissus sont déjà détruits. Pour empêcher la destruction des tissus, et bloquer le développement de la maladie, il est indispensable d'effectuer un diagnostic précoce. La possibilité de dénombrer, grâce à l'invention, les lymphocytes T auto-réactifs dans le sang des patients à risque constitue une avancée considérable. Prenant en compte que les lymphocytes T auto- réactifs jouent un rôle déterminant dans le développement des maladies auto-immunes, de très nombreuses stratégies thérapeutiques visent à éliminer ces lymphocytes, ou à les empêcher d'exercer leur pouvoir pathogène, on mesurera l'intérêt de pouvoir dénombrer grâce à l'invention les lymphocytes T auto-réactifs dans le sang des patients traités, de comparer l'efficacité de différents traitements, et d'adapter le traitement en fonction de la réponse du malade. Selon un autre aspect, l'invention vise l'application des complexes pour l'enrichissement en un type de cellules T donné. Cette application permet de disposer de grandes quantités de cellules T spécifiques d'un antigène donné in vitro à des fins de thérapie cellulaire. Ces cellules peuvent être en effet ré-inoculées à des patients à titre préventif ou curatif. On peut là encore dénombrer et déterminer, avant l'inoculation, le phénotype des cellules T complexées. L'invention vise encore l'application des molécules recombinantes multivalentes comme agents stimulants des cellules T. Ces molécules peuvent être inoculées à un individu pour stimuler l'expansion et/ou l'activation de cellules T spécifiques d'un antigène donné en l'absence de toute autre cellule, en particulier de cellules présentatrices. Cette utilisation est donc intéressante pour stimuler des réponses immunitaires insuffisantes par exemple vis-à-vis de complexes CMH/antigène tumoral. Dans le cas de maladies infectieuses, on inocule in vivo les molécules recombinantes, le cas échéant après une étape de propagation préalable ex vivo. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés, à titre purement illustratif, dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 5, qui représentent respectivement - la figure 1 représente la séquence de l'insert d'ADNc de la chaîne a du CMH, - la figure 2, la construction plasmidique contenant l'insert d'ADNc de la figure 1, - la figure 3, la séquence de l'insert d'ADNc de la chaîne du CMH, - la figure 4, la construction plasmidique contenant l'insert d'ADNc de la figure 3, - la figure 5, la construction plasmidique détaillée de la figure 4, et - la figure 6, un octamère peptide/CMH de classe II selon l'invention. Exemple 1 : Production de complexes peptide/CMH de type II 1. Construction des plasmides recombinants . Construction de l'ADNc codant pour la protéine recombinante IAaa/Fc (clone 461) et insertion dans un plasmide Cette construction est illustrée par la figure 1 qui donne la séquence d'ADNc, de la position 420 à 1940, et celle du peptide codé (437-1921) (SEQ ID N 1). L'ADNc comprend, ligués entre eux, successivement, les fragments codant pour le peptide signal dl IAd, IAda, un linker, une glissière à leucine acide, un linker, une région Hinge, la région CHz, puis la région CH3 de Fc. Cette construction est insérée dans le plasmide représenté sur la figure 2 et placée pour le contrôle d'un promoteur de métallothionéine inductible par CuS04. . Construction de l'ADNc codant pour la protéine recombinante LACK/I-A (3a/glissière à leucine (clone 268) et insertion dans un plasmide Cette construction est illustrée par la figure 3, qui donne la séquence d'ADNc, de la position 420 à 1370, et celle du peptide codé (440-1359) (SEQ ID N 2) L'ADNc comprend successivement les fragments, ligués entre eux, : codant pour une séquence leader, (31, un peptide LACK (158-73), un linker, un site thrombine, un linker, IApd (p1) IA(3d (P2). un linker, une glissière à leucine basique, un marqueur à motifs histidine. Cette construction est insérée dans le plasmide représenté sur la figure 4, et détaillé sur la figure 5. 2. Transfection des plasmides dans des cellules de Drosophile 3. Sélection des transmettants stables Les étapes 2 et 3 sont réalisées en opérant selon (6). 4. Production et purification des complexes A) Production On met en culture les cellules transfectées de Drosophile dans des flacons de 3 1, à 24 C, dans un milieu SFM Drosophile (GIBCO-BRL), supplémenté avec 1% de SVF (sérum de veau foetal). Lorsque la densité cellulaire atteint 5 x 106 cellules/ml, on induit la production de molécules LACK/IAd en ajoutant CUS04 à la concentration finale de 1 mM, puis on soumet le milieu à incubation durant 5 à 6 jours. On recueille les surnageants et, par centrifugation, on élimine les débris cellulaires (20 min, 10K, 4 C). Les surnageants sont ensuite transférés dans des tubes et à nouveau centrifugés. On concentre les surnageants 8 à 10 fois en utilisant un concentrateur PrepscaleR (Millipore, Inc.) On congèle à -70 C jusqu'à l'obtention de 500 ml de surnageants concentrés. B) Purification On décongèle les surnageants à 37 C. On centrifuge 15 min à 10K. Les surnageants sont ensuite transférés dans de nouveaux tubes et à nouveau centrifugés 15 min à 10 K. On les charge alors sur une colonne d'immunoaffinité MK-D6 (volume de lit 5 ml), équilibrée au préalable dans un tampon A de 20 mM de phosphate de sodium pH 7,0. La vitesse d'élution est de 10 à 20 ml/h. La colonne est lavée avec 30 ml de tampon A (6 fois le volume de lit) à 0,5 ml/min. Pour l'élution, on utilise 15 ml de CAPS 50 mM pH 11,5 en opérant par gravidité. On recueille 15 fractions de 1 ml chacune. Chaque fraction est neutralisée avec 300 u1 de phosphate de sodium (200 mM, pH 6,2). On ajoute immédiatement des inhibiteurs de protéase (CompleteR, Roche Diagnostics) dans chaque échantillon. On neutralise la colonne avec le tampon A. Pour éviter l'aggrégation des molécules de peptide/CMH, on effectue immédiatement une chromatographie par échange d'ions après l'élution. On détermine la concentration protéique de chaque fraction par électrophorèse en gel dénaturant. Les fractions positives sont rassemblées et chargées sur colonne échangeuse d'ions (Mono Q) (Pharmacia Biotech). On utilise un tampon B : Tris-HC1 20 mM, pH 8,0 et un tampon C : Tris-HC1 20 mM pH 8,0 + 1M NaCl. On opère selon les gradients suivants 0-5 min : 0% C; 5-20 min : 0-50% C ; 20-21 min 50-100% C ; 21-25 min : 100% C ; 25-26 min : 100% C ; 26-30 min . 0%C. Les molécules LACK/IAd éluent généralement à 30 36% en tampon C. On recueille les fractions correspondant au pic d'élution et on détermine la concentration protéique par électrophorèse en gel dénaturant. Les fractions positives sont rassemblées et dialysées à 4 C contre 2 1 de PBS, pH 7,4. On change le tampon de dialyse 2 fois en 24 h. La concentration en protéines est déterminée selon le test BCA (Biorad) . Les échantillons sont congelés à -70 C en petites fractions (8 Mg). Les rendements sont de l'ordre de 0,5 mg/1 de surnageant cellulaire. C. Production de complexes multivalents (figure 6) On prépare une solution de protéine A-couplée à un fluorophore constitué par Alexa 488R (sondes moléculaires # P-11047) à une concentration de 0,5 mg/ml dans PBS 1 X, pH 7,4. (Protéine A de Sigma) Des aliquotes de 100 Ml sont préparés et congelés à -20 C. Un aliquote de molécule peptide/CMH (8 iÀg) est décongelé et on ajoute 1,1 iÀl de protéine A couplée au fluorophore Alexa. On soumet le mélange à incubation à température ambiante pendant 30 min, puis on ajoute un mélange PBS/ASB (albumine de sérum bovin) 0,1 % pour un volume final de 50 pl. On ajoute 1 g1 de sérum de souris et on utilise directement le produit comme réactif de coloration. D- Cytoflurométrie de flux on purifie des cellules T à partir des ganglions lymphatiques d'une souris. On transfère 106 cellules dans un tube et on ajoute le réactif de coloration. Deux heures plus tard, les cellules sont lavées en tampon isotonique et analysées en cytofluorométrie de flux. La fréquence des cellules réagissant avec le réactif de coloration est déterminée par cette méthode. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1/ Altman et al, Science, volume 274, 4 octobre 1996. 2/ Scott et al, J. Exp. Med. 183:2087-2095, 1996. 3/ Kalandadze et al, J Biol Chem. 271 (33) 20156-62, 1996. 4/ Kozono et al, Nature. 369 : 151-153, 1994. 5/ Kozono et al, Immunity. 3: 187-196, 1995. 6/ Sambrook et al, Molecular Cloning second Edition (1989). 7/ Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Ed John Wiley and Sons, Inc., 1997. REVENDICATIONS 1/ Protéines recombinantes solubles, constituées au minimum d'un dimère lui-même formé des chaînes a et P des molécules du CMH de classe I ou II, caractérisées en ce qu'elles comportent à l'extrémité carboxy-terminale de l'une ou des 2 chaînes, tout ou partie d'une région Fc d'une immunoglobuline. 2/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie des chaînes a ou P des molécules du CMH. 3/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie du domaine CH, et/ou CH3 de la région Fc. 4/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que les chaînes qui constituent le dimère comportent des glissières à leucine. 5/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles sont associées en plusieurs dimères et notamment en tétramères ou en octamères. 6/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont complexées à des protéines naturelles ou artificielles, comportant plusieurs sites de liaison pour les régions constantes des immunoglobulines, telles que la protéine A, la protéine G, ou des multimères de récepteur des régions Fc obtenus par recombinaison génétique. 7/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont liées de manière covalente ou non covalente à un peptide antigénique. 8/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 7, caractérisées en ce que le peptide antigénique est fixé à l'extrémité amino-terminale de la chaîne P par l'intermédiaire d'un bras flexible. 9/ Séquences nucléotidiques possédant un cadre de lecture correspondant à tout ou partie d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10/ vecteurs d'expression, notamment plasmides, caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence selon la revendication 9. 11/ Cellules procaryotes ou eucaryotes porteuses d'au moins un vecteur selon la revendication 10. 12/ Utilisation des protéines selon la revendication 7 ou 8, pour dénombrer et/ou purifier les lymphocytes T réagissant avec un antigène donné et pour caractériser le phénotype de ces cellules. 13/ Utilisation selon la revendication 12, comme protéines immunostimulantes, notamment pour le développement de vaccins. 14/ Utilisation selon la revendication 12, comme moyen prédictif de l'état d'un patient pour dénombrer et déterminer le phénotype de cellules T autoréactives chez des malades à risques, ou à des fins thérapeutiques. 15/ Utilisation des protéines selon la revendication 7 ou 8, pour la purification et/ou l'enrichissement de lymphocytes T spécifiques d'un antigène donné, soit à partir de cultures cellulaires, soit à partir de prélèvements sur un patient. 16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisé en ce que les populations de lymphocytes T enrichies en un type de cellules T donné sont utilisées à des fins de thérapie cellulaire.