FR 2794996 A1 20001222 FR 9907844 A 19990621 La présente invention concerne un procédé de réduction de la concentration des substances pyrogènes et notamment des endotoxines dans les solutions de produits de contraste. Les endotoxines sont des lipopolysaccharides qui proviennent essentiellement de la membrane des bactéries gram négatives. Leur injection chez l'animal et chez l'homme est à l'origine de fièvre, de réaction inflammatoire et même parfois d'état de choc, et la quantité maximale pouvant être injectée est de 0,1 nglkg poids corporel. Certains procédés de fabrication, notamment lorsqu'ils impliquent des contacts prolongés en milieu aqueux non stérile, comme lors des chromatographies en phase liquide, favorisent le développement des bactéries et il est indispensable d'éliminer celles-ci ainsi que les endotoxines dérivées, parfois même avant le dernier stade de la fabrication des solutions injectables. Différentes méthodes d'élimination des endotoxines ont été proposées, dont une adsorption sur charbon actif ou sur un autre agent plus ou moins spécifique, un traitement par des résines échangeuses d'ions, ou une microfiltration suivie d'une ultrafiltration, de préférence tangentielle, ce qui évite un colmatage rapide des membranes par les impuretés et permet le traitement de solutions fortement contaminées. . II est clair qu'une limitation importante de ces techniques et particulièrement des filtrations se trouve dans la viscosité de la solution aqueuse, habituellement élevée pour les produits de contraste, ce qui impose de fortes dilutions et/ou des pressions importantes pour obtenir un débit convenable, mais d'autres caractéristiques physico-chimiques de la solution à traiter telles que son pH et la force ionique qui peuvent modifier l'état d'agrégation des endotoxines, comme décrit dans Journal of Parenteral Science & Technology 47(6) 285-288 (1993), ont aussi leur importance. En outre, dans le cas des produits de contraste de forte masse moléculaire, le choix de la membrane d'ultrafiltration, de son seuil de coupure est compliqué par le fait que les endotoxines peuvent avoir des tailles comparables aux produits de contraste fréquemment plus ou moins agrégés en solution aqueuse. On a maintenant trouvé que les endotoxines, même si elles se trouvent initialement à forte concentration dans la solution à purifier, étaient parfaitement retenues lors d'une ultrafiltration sur une membrane de masse moléculaire nominale de coupure de l'ordre de 100000 Daltons, si l'on opère en milieu hydroorganique. II est surprenant qu'en présence d'un tiers solvant le passage du produit de contraste à travers la membrane soit facilité, notamment par dissociation des éventuels agrégats du produit de contraste, et que les lipopolysaccharides issus des membranes bactériennes soient totalement retenus. Le procédé de l'invention pour la dépyrogénisation d'une solution aqueuse de produit de contraste comprend les étapes qui consistent à: 1.- effectuer une microfiltration de la solution pour éliminer les corps bactériens; 2.- effectuer une ultrafiltration, de préférence tangentielle et à volume sensiblement constant, sur une membrane de cellulose ou d'un dérivé de cellulose, de masse moléculaire nominale de coupure comprise entre 80 et 150 kDaltons, de la solution microfiltrée contenant 5 à 30% (vlv) d'un solvant organique miscible, choisi parmi l'acétonitrile et le dioxanne, pour retenir les endotoxines; 3.- éliminer le solvant organique et si nécessaire, concentrer la solution. En fonction du produit de contraste et de la nature de la membrane d'ultra- filtration, on peut remplacer l'acétonitrile ou le dioxanne par un autre solvant organique miscible à l'eau, tel que I'isopropanol. La microfiltration, première étape du procédé, permet d'éliminer les corps bactériens ou les autres impuretés de forte taille pour que la membrane ne soit pas colmatée rapidement. Celle-ci est effectuée de façon classique, par passage de la solution du produit de contraste à travers un filtre de 0,22 Nm, éventuellement précédée d'une filtration à travers un filtre de 1 Nm. La concentration de la solution à filtrer dépend du produit de contraste et sera choisie par le technicien pour obtenir une viscosité compatible avec l'appareillage utilisé; cette dilution peut être effectuée avec de l'eau et/ou éventuellement avec l'acétonitrile ou le dioxanne, nécessaire pour l'étape suivante, si le microfiltre n'est pas endommagé par ces solvants organiques. L'ultrafiltration sera effectuée, de préférence en mode tangentiel, notamment sur des membranes enroulées en spirale, présentées en cartouches, disponibles dans le commerce. On peut citer, notamment les membranes en cellulose régénérée, de la série PL, commercialisées par Millipore ou Sartorius . Elles peuvent être intégrées dans un dispositif support, tel que ceux proposés par Millipore sous la référence Pellicon -2, ou Labscale , ou par Filtron sous la référence Centrasette . Pour un rendement maximal, il est préférable de maintenir le volume du rétentat sensiblement constant pendant l'ultrafiltration, ou encore d'effectuer une diafiltration, en utilisant un mélange d'eau et de solvant en proportions sensiblement identiques à celle de la solution mise à ultrafiltrer. L'élimination du solvant et la concentration de la solution peuvent être réalisées par distillation sous pression réduite ou par ultrafiltration sur une membrane de seuil de coupure inférieur, par exemple voisin de 10 kDaltons, qui retient le produit de contraste. L'eau utilisée pour les dilutions est désionisée et apyrogène et le solvant est un solvant rigoureusement pur, de préférence redistillé avant emploi. Bien qu'il puisse être mis en oeuvre pour tout produit de contraste hydrosoluble, le procédé est particulièrement adapté à la dépyrogénisation des produits de contraste hydrosolubles, de forte masse ou grand volume moléculaire; ces derniers ne franchissent pas les parois des vaisseaux après administration intravasculaire pour se répartir dans l'interstitium et les tissus et ils sont dits produits "à rémanence vasculaire" (ou blood pool agents). Parmi les produits à rémanence vasculaire pour l'imagerie médicale par rayons X ou résonance magnétique que l'on peut purifier par le procédé de l'invention, on peut citer: - les dérivés iodés, non ioniques, décrits dans EP-A-648203, qui comportent au moins 10 noyaux phényles triiodés ou des dérivés de W096/09281, notamment celui de l'exemple 2, - les dendrimères iodés lorsqu'ils sont de génération suffisante, décrits dans W095/17748, - les dendrimères porteurs de chelates métalliques, décrits dans US 5,874,061 ou W093/06868, - des chelates à forte relaxivité, décrits dans W097/01359, notamment ceux des exemples 3 et 4 ou ceux décrits dans EP-A-922700. Pour les chelates, on préfère utiliser l'acétonitrile. Dans ce qui suit on décrit des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Exemple 1 : Purification du chelate de gadolinium du ligand de formule 1.- On dissout vers 43 C dans 5 litres d'eau désionisée apyrogène 360 g du produit obtenu selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 3 de EP-A-922700 dont les impuretés et produits intermédiaires résiduels, comme l'amine HZNR, ont été éliminées par une filtration simple sur noir de carbone d'une solution aqueuse suivie d'une chromatographie haute pression en phase liquide sur une colonne de gel de silice greffée (Lichrospher RP18-Merck). A température ambiante, la solution, de pH 3,7, est filtrée, sous légère pression d'azote, successivement sur 2 membranes de microfiltration classique, la première en fibre de verre ayant des pores de diamètre 1 Nm et la seconde en fluorure de polyvinylidène de 0,22 Nm (PVDF de Durapore ). 2.- La solution obtenue, à laquelle est ajouté 1,4 litre d'acétonitrile distillé, est ultrafiltrée sur une membrane de 0,2 m2 en cellulose régénérée, dont le seuil de coupure est de 100 kD, commercialisée par Millipore sous la référence PLCHK, dans un dispositif de filtration tangentielle Filtron . Lorsque le volume du rétentat atteint 2 litres, on passe en régime de diafiltration jusqu'à la fin d'introduction de 16 litres d'un mélange eau/acétonitrile (80I20 - v/v). 3.- Le filtrat est concentré jusqu'à 4 litres par ultrafiltration sur une membrane de 0,2 m2 en cellulose régénérée dont le seuil de coupure est 10 kD, puis lyophilisé. Le rendement de la purification est de 92%; le produit obtenu contient moins de 50 EU (unité endotoxine) par gramme, mesuré par la technique LAL, pour plus de 30.000 EUlgr dans le solide de départ. Exemple 2 : Purification du composé de formule 1.- On dissout vers 25 C dans 80 ml d'eau désionisée apyrogène, 5 g du produit obtenu comme dans l'exemple 1 de WO 96I09281 et on filtre la solution sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (0,22 Nm). 2.- On ajoute à la solution obtenue 20 ml de dioxanne-1,4 et on effectue l'ultrafiltration du liquide obtenu sur une membrane de 50 cm2 en cellulose régénérée dont le seuil de coupure est de 100 kD, dans un dispositif de filtration tangentielle Labscale . Lorsque le volume du rétentat atteint 20 ml, on passe en régime de diafiltration jusqu'à la fin d'introduction de 200 ml d'un mélange eau/dioxanne (80I20 - v/v). 3.- Après concentration du filtrat sous pression réduite, on obtient un produit contenant moins de 210 EU par gramme du composé, alors que le produit de départ contenait plus de 33.000 EU/g. Revendications 1.- Procédé d'élimination des substances pyrogènes de l'un des produits de contraste pour imagerie diagnostique par résonance magnétique ou par rayons X comprenant les étapes qui consistent à: 1. effectuer une microfiltration d'une solution aqueuse du produit de contraste pour éliminer les corps bactériens, 2. effectuer une ultrafiltration, pour retenir les endotoxines, sur une membrane de cellulose ou d'un dérivé de cellulose, de masse moléculaire nominale de coupure comprise entre 80 et 150 kD, de la solution microfiltrée comprenant de 5 à 30% vlv d'un solvant organique miscible choisi parmi l'acétonitrile et le dioxanne, 3. éliminer le solvant organique et, si nécessaire, concentrer la solution. 2.- Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'ultrafiltration est effectuée en mode tangentiel. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel l'ultrafiltration est de type diafiltration. 4.- Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'acétonitrile est introduit dans la solution aqueuse avant la microfiltration. 5.- Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le produit de contraste est à rémanence vasculaire. 6.- Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le produit de contraste est un composé iodé non ionique radioopaque. 7.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le produit de contraste est un chelate de métal paramagnétique. 8.- Procédé selon la revendication 7 dans lequel le solvant organique est l'acétonitrile.