FR 2795963 A1 20010112 FR 9909044 A 19990708 Polynucléotide Immunostimulant. L'invention est relative au domaine de l'immunomodulation, et plus particulièrement, à l'utilisation d'immunomodulateur pour adjuver des vaccins, notamment des vaccins à usage humain. On connaît, selon l'art antérieur, des oligonucléotides ayant une activité immunomodulatrice. Ainsi, la demande EP 0 468 520 divulgue des polynucléotides ayant une activité immunostimulatrice, dont la séquence d'enchaînement des nucléotides est un palindrome. Selon la demande WO 96I02555, les oligonucléotides capables d'agir sur des cellules du système immunitaire doivent comprendre une séquence nucléotidique répondant à la formule suivante 5' X, XZ C G X3 X4 3' dans laquelle C et G sont non-méthyles, X,, Xz, X3 et X4 sont des nucléotides et le trinucléotide GCG n'est pas présent à proximité des extrémités 5' et 3'. Cependant, bien que de nombreux oligonucléotides aient été décrits dans l'art antérieur, comme ayant des propriétés immunomodulatrices, il reste nécessaire de rechercher de nouveaux produits capables d'induire chez l'homme une immunostimulation, notamment pour leur utilisation à des fins d'adjuvants de vaccins. A cette fin, la présente invention a pour objet l'utilisation de polynucléotides comprenant au moins une séquence nucléotidique dont le motif est 5' G C T A G A T G T T A G C G T 3' pour la fabrication d'un médicament. Selon une caractéristique, un tel médicament est destiné à être administré à l'homme. En effet, bien qu'un tel oligonucléotide ait été utilisé comme contrôle négatif dans des tests d'immunostimulation décrits dans la demande WO 96l02555 précédemment citée,on a remarqué que, de façon très surprenante, de tels polynucléotides étaient capables d'être stimulateurs vis à vis de cellules du système immunitaire humain. Selon une caractéristique particulière, l'invention a pour objet l'utilisation de tels polynucléotides pour la fabrication de vaccins. De tels polynucléotides permettent en effet au système immunitaire d'obtenir une réponse humorale supérieure à celle obtenue lors de l'administration d'antigènes seuls, ainsi qu'une réponse cellulaire. L'invention a également pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, au moins un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique dont le motif est5'GCTAGATGTTAGCGT 3'. Selon une caractéristique particulière, la composition vaccinale selon l'invention est à usage humain. Par oligonucléotide au sens de l'invention, on entend un oligonucléotide ayant de 15 à 100 nucléotides. Cet oligonucléotide est de préférence simple brin. II peut s'agir d'un oligodesoxyribonucléotide ou d'un oligoribonucléotide. Cependant, on a obtenu de particulièrement bons résultats avec des oligodesoxyribonucléotides. Les oligonucléotides selon l'invention comprennent au moins une séquence nucléotidique dont le motif est le suivant : 5' G C T A G A T G T T A G C G T 3'. Ils peuvent contenir en 5' ou en 3' d'autres nucléotides, sans qu'il soit nécessaire qu'ils possèdent un des motifs décrits comme nécessaires dans la demande de l'art antérieur WO 96I02555. Les oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester ou, afin d'être plus stables, sous forme de phosphorothioates ou d'hybrides phosphodiester l phosphorothioates. Bien qu'il soit possible d'utiliser des oligonucléotides provenant de sources d'acides nucléiques existantes tel que l'ADN génomique ou le cADN, on préfère utiliser des oligonucléotides de synthèse. Ainsi, il est possible d'élaborer des oligonucléotides sur support solide en utilisant la méthode (3- cyano éthyl phosphoramidite (Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H. Tetrahedon Letters 22, 1859 - 1862 (1981)) pour l'assemblage 3'-5', étape suivie d'un traitement à température ambiante au moyen d'une solution de NH40H à 33% qui permet de libérer l'oligonucléotide du support; ensuite, un nouveau traitement à 55 C pendant 6 heures avec la solution de NH40H permet l'élimination des groupements protecteurs des base, puis on procède à une précipitation en éthanol en présence d'acétate de sodium 0,3 M non ajusté en pH (0,3 M en final) et enfin, à une précipitation par 4 volumes d'éthanol à 80% suivi d'un séchage avant de procéder à une reprise par de l'eau pure. Les oligonucléotides de type phosphorothioates ont un des atomes d'Oxygène composant le groupement Phosphate qui est remplacé par un atome de Soufre. Leur synthèse peut être effectuée comme précédemment décrit, sauf à remplacer la solution iode I eau I pyridine tétrahydrofurane qui est utilisée lors de l'étape d'oxydation nécessaire à la synthèse des liaisons phosphodiester par une solution TETD (tétraethylthiuram disuifide) apportant les ions sulfates permettant de produire le groupement phosphorothioate. On peut également envisager d'autres modifications des liaisons phosphodiesters, des bases ou des sucres, pour modifier les propriétés des oligonucléotides utilisés, et notamment pour accroître leur stabilité. II est possible également de modifier les polynucléotides afin de leur adjoindre des groupements fonctionnels tels que NH2-, COOH, SH-,...etc, dans leur partie terminale notamment. Contrairement à ce qui a été décrit dans l'art antérieur, et de façon inattendue, de tels oligonucléotides se sont révélés capables d'avoir un effet immunostimulant, en particulier sur des cellules humaines, alors que leur séquence de base, d'une part ne présentait pas de symétrie inversée (condition considérée essentielle dans la demande EP 0 468 520), et d'autre part ne répondait pas à la formule 5' X, X2 C G X3 X4 3' divulguée dans la demande WO 96I02555. La mise en évidence de l'activité immunostimulante des oligonucléotides selon l'invention a été réalisée sur des cellules humaines, en particulier sur des celllules mononucléaires du sang périphérique. Les tests effectués l'ont été sur la population totale de lymphocytes du sang périphérique. Grâce à des tests d'incorporation de thymidine tritiée, il a été montré que les polynucléotides selon l'invention induisent la prolifération de lymphocytes B humains. Les tests d'expression du marqueur d'activation CD25 ont montré que les polynucléotides selon l'invention activent les lymphocytes B humains. De plus, les polynucléotides selon l'invention se sont montrés capables d'induire la sécrétion de cytokines par les cellules mononucléaires sanguines périphériques. Ces propriétés qu'ont les oligonucléotides selon l'invention d'activer des cellules du système immunitaire est d'un intérêt particulier dans le domaine des vaccins, où ils peuvent être utilisés comme adjuvants. Leur activité a d'ailleurs été évaluée in vivo (mais cette fois, dans le modèle murin), en association notamment avec un vaccin contre la grippe. Les tests réalisés ont montré que la réponse humorale obtenue pour un vaccin grippe auquel étaient ajoutés des oligonucléotides selon l'invention, était nettement supérieure à la réponse obtenue lors de l'administration du vaccin grippe seul de plus, les oligonucléotides selon l'invention ont montré qu'ils pouvaient induire une réponse cytotoxique spécifique de l'hémagglutinine. Les exemples qui suivent illustrent, de façon plus détaillée, des modes de réalisation de la présente invention. Exemple 1 On prépare des oligonucléotides grâce à une automate synthétiseur fourni par Applied Biosystems qui met en oeuvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation. Cette étape d'oxydation est réalisée au moyen d'une solution iode I eau I tétrahydrofurane I acétonitrile pour obtenir une liaison phosphodiester et au moyen d'une solution tétraethylthiuram l acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate.On réalise alors un traitement à température ambiante au moyen d'une solution de NH40H à 33% qui permet de libérer l'oligonucléotide du support; puis un nouveau traitement à 55 C pendant 6 heures avec la solution de NH40H permettant l'élimination des groupements protecteurs des base. Ensuite, on procède à une précipitation en éthanol en présence d'acétate de sodium 0,3M non ajusté en pH (0,3 M en final). On précipite par 4 volumes d'éthanol, on rince avec de l'éthanol ,puis on sèche les oligonucléotides et enfin, on les reprend dans de l'eau pure. On fabrique ainsi l'oligonucléotide 1 a(S) dont la séquence , déjà divulguée dans la demande de brevet W096/02555 est reproduite ci-après: Cet oligonucléotide possède des liaisons de type phosphorothioate sur toute sa longueur. De même, on prépare l'oligonucléotide 3Db(S), dont la séquence , reproduite ci-après, est également divulguée dans la demande de brevet W096102555: 5' GAGAACGCTCGACCTTCGAT 3' Cet oligonucléotide possède également des liaisons de type phosphorothiate sur toute sa longueur. Exemple 2 : Test de lymphoprolifération On procède à des tests de prolifération des splénocytes murins ou des lymphocytes humains Les lymphocytes humains proviennent du sang périphérique d'un donneur, et sont obtenus par centrifugation sur un gradient de Ficoll d'un prélèvement sanguin du donneur. Les cellules spléniques proviennent de rates de souris Balblc non immunisées. Après isolement, les cellules sont ajustées à 2.106 cellules I ml dans du milieu de culture RPMI 1640 supplémenté en Sérum de Veau Foetal à 10% ainsi qu'en Glutamine, Streptomycine et Pénicilline (et en (3 Mercaptoéthanol dans le cas des cellules murines). Les cellules sont distribuées en plaques 96 puits (fond rond) sous 100 NI, soit 2.105 cellules par puits. On ajoute ensuite 100 NI de solution contenant l'oligonucléotide à tester , afin d'obtenir une concentration finale de 2pM. Les cellules sont incubées pendant 72 heures dans le cas les cellules humaines et 48 heures lorsqu'il s'agit de cellules murines à 37 C et en atmosphère à 5% de C02. La Thymidine tritiée (Amersham TRK 120) est diluée dans du milieu de culture puis distribuée dans les plaques à raison de 1 NCi par puits sous 50 NI. Après 7 à 8 heures d'incubation à l'étuve (5%C02, 37 C), les plaques peuvent être congelées à -80 C et traitées plus tard. A l'aide du "Harvester", on récolte le contenu des puits sur des plaques Unifilter GFIC et on réalise 6 lavages en eau distillée puis un lavage en éthanol 70% afin de précipiter l'ADN. Après séchage des plaques, 25 NI de liquide scintillant (Microscint-40, Packard) sont distribués dans chaque puits et permettent de quantifier la radioactivité (rayonnements émis par le tritium) en mesurant le nombre de coups I minute (cpm) émis par chaque puits sur le compteur Top Count (Packard). Les résultats obtenus sont représentés à la Figure I pour les cellules humaines et à la Figure II pour les cellules murines. On remarque que l'oligonucléotide selon l'invention permet, dans le cas des lymphocytes humains, d'obtenir un nombre de cpm nettement supérieur à celui obtenu lorsque les cellules ont été incubées en présence de milieu dépourvu d'oligonucléotides. Par contre, dans le cas des cellules murines, on remarque que l'oligonucléotide est inopérant. Exemple 3 : Test d'activation des lymphocytes Le test est effectué à partir de lymphocytes isolés d 'un donneur ou de splénocytes de souris comme décrit à l'exemple précédent, et ajustés à 2.10s cellules/ml dans le même milieu de culture. Les cellules sont ensuite distribuées en plaques 12 puits sous un volume de 2 ml, soit 4.1011 cellules I puits. On ajoute dans chaque puits une quantité d'oligonucléotides à tester préparées à l'exemple 1 (1 oligonucléotide l puits) suffisante pour obtenir une concentration finale de 2 pM. Puis les cellules sont incubées à 37 C , en atmosphère à 5% de C02 pendant 72 heures dans le cas des cellules humaines et pendant 48 heures dans le cas des cellules murines. Les cellules sont ensuite doublement marquées au moyen de CD 19 et de CD25 (qui sont respectivement des marqueurs des lymphocytes B et du récepteur d'IL2) puis analysées sur FACScan. Les résultats obtenus sont illustrés sur les figures III et IV qui représentent pour chaque oligonucléotide testé, le pourcentage de cellules B (CD19+) qui expriment le marqueur CD25. La Figure III illustre les résultats obtenus sur cellules humaines alors que la Figure IV illustre les résultats obtenus sur cellules murines. Ces résultats confirment les résultats de prolifération obtenus à l'exemple 2: l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'induire in vitro la prolifération et l'activation des lymphocytes B humains, alors qu'il est inopérant vis-à-vis des lymphocytes de souris. Exemple 4 Mesure de l'activité adjuvante in vivo. L'activité adjuvante des oligonucléotides selon l'invention est évaluée dans le modèle grippe chez des souris Balblc. Les souris (3 par groupe testé ) sont immunisées par voie sous-cutanée à JO et J21. La dose injectée est composée de 500 Ng de l'oligonucléotide à tester, tel que préparé à l'exemple 1, en association avec le vaccin grippe NIB 16, ce qui représente une quantité d'Hémagglutinine A de 5 Ng, sous un volume de 200 à 300N1. Le groupe de contrôle positif est constitué par 2 souris recevant 200 Ng d'un adjuvant de l'art antérieur en association avec du vaccin grippe, comprenant 5 Ng de HA, alors que le groupe de contrôle négatif (1seule souris) ne reçoit que du vaccin grippe en quantité telle que cela représente 5 Ng de HA. Des prélèvements de sérum sont effectués à J0, J15 et J35 afin d'évaluer la réponse humorale (IgG1 et IgG2a). Les animaux sont sacrifiés à J35 afin de récupérer les splénocytes pour évaluer la réponse cellulaire. Les dosages en anticorps anti-HA sont réalisés par test ELISA. Les résultats obtenus sont illustrés aux figures V à VIII qui indiquent, pour chacune des compositions administrées, la quantité d'IgG qui est exprimée en Unités Arbitraires. Les Figures V et VI illustrent les résultats obtenus respectivement en IgG1 et en IgG2a lors de la réponse primaire, alors que les Figures VII et VIII illustrent les résultats obtenus pour la réponse secondaire On remarque que l'oligonucléotide selon l'invention permet d'obtenir une réponse en IgG2a nettement supérieure à celle obtenue lors de l'administration du vaccin seul; cet effet adjuvant est d'autant plus important si l'on considère la réponse secondaire. Par contre, la réponse en IgG1 n'est pas particulièrement augmentée par rapport à la réponse obtenue avec le vaccin seul. Afin de mettre en évidence l'activité des cellules T cytotoxiques, les cellules spléniques des souris immunisées sont incubées dans un rapport de 3 effectrices I 2 stimulantes (avec une concentration cellulaire de 2,5.106 cellules/ml final) pendant 5 jours à 37 C et 5% de C02. Lors de cette étape de stimulation in vitro, les cellules stimulantes utilisées sont des cellules spléniques de souris syngéniques naïves, préalablement infectées in vitro par du virus grippe (150 HAU pour 106 cellules pendant 3h). Une étape de stimulation secondaire est réalisée grâce à des cellules de même type que pour la stimulation primaire mais traitées cette fois à la mitomycine C afin de stopper leur prolifération. Les cellules effectrices sont mises en culture dans un rapport de 1 cellule effectrice pour 4 cellules stimulantes, puis on ajoute à la culture 10 unités/ml d'IL-2 recombinante murine. L'activité cytotoxique des CTL est mise en évidence à l'aide d'un test de relarguage de chrome (CRT) classique, 5 jours après la deuxième stimulation,. Pour cela, on utilise comme cellules cibles des cellules P815 (mastocytome) incubées avec le peptide grippe HA (20Ng1106 cellules) afin de mesurer la lyse spécifique. Ces cellules cibles sont ensuite marquées au "Cr (200NCi1106 cellules), puis mises en contact pendant 4h avec les cellules effectrices dans un rapport de 100 cellules effectrices pour 1 cellule cible. Une mesure de la radioactivité relarguée dans le surnageant de culture est alors effectuée sur un compteur P (TopCount). Pour chaque cible, on mesure en outre le relarguage spontané et le relarguage total. Le premier ne prend en compte que la lyse spontanée des cellules cibles en l'absence des effectrices, tandis que le second exprime la quantité maximale de 5'Cr libéré par les cellules cibles après leur lyse complète. Le % de lyse est donné par la formule (Comptage de l'essai - Relarguage Spontané) x100 (Relarguage Total - Relarguage Spontané) Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure IX où l'on voit que le pourcentage de lyse obtenu avec l'oligonucléotide selon l'invention est équivalent à celui obtenu avec un adjuvant classique ou à celui obtenu avec un oligonucléotide immunostimulant selon l'art antérieur. L'augmentation de la réponse cellulaire observée, combinée à l'augmentation de la production d'Ig2a conduit à la conclusion que l'oligonucléotide selon l'invention est d'un intérêt particulier lorsque l'on souhaite induire une réponse de type Th 1. Revendications. 1. Utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique dont le motif est 5' G C T A G A T G T T A G C G T 3' pour la fabrication d'un médicament. 2. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré à l'homme. 3. Utilisation selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est un vaccin. 4. Composition vaccinale, comprenant au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, au moins un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique dont le motif est 5' G C T A G A T G T TAGCGT 3'. 5. Composition vaccinale selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est à usage humain. 6. Utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique dont le motif est 5'G C T A G A T G T T A G C G T 3', en tant qu'adjuvant vaccinal humain.