FR 2799342 A1 20010413 FR 9912797 A 19991012 PROCEDE D'AUGMENTATION DE BIOMASSE TRANSGÉNIQUE La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la quantité et de la qualité d'une biomasse transgénique, et sera plus particulièrement décrit et exemplifié par rapport au mais. Un frein au développement de l'expression de protéines L eC0J[[oi CldIl leo à usage thérapeutique dans des plantes est le temps incompressible nécessaire à l'obtention de la matière première végétale contenant la protéine recombinante. Ce problème est d' autant plus important chez certaines espèces comme le maïs que, d'une part le temps nécessaire à l'obtention des transformants primaires sont longs, et d'autre paît, les organes dans lesquels s' effectue l'expression de la protéine recombinante, en l'occurrence les graines, sont produits en faible quantité. L'utilisation de ce type de piaule nécessite donc des phases de multiplication préalables à l'extraction purification de la protéine recombinante produite. Ces phases sont préjudiciables à la dynamique des projets. L'objet de cette invention est d'augmenter la biomasse obtenue en première génération et donc de diminuer le nombre de phases de multiplication nécessaires à l'obtention d'une biomasse importante. Cela permettrait de raccourcir très significativement les délais des programmes de recherche et développement-, ainsi que d'obtenir, à relativement faible coût, une grande quantité de biomasse ou matière première végétale nécessaire également pour les analyses de conformité de la protéine recombinante d'intérêt. La multiplication des semences est un phénomène logarithmique : à chaque génération il y a multiplication du nombre de grains obtenus par environ cent (dans le cas des génotypes transformables dont la valeur agronomique est faible). Selon les techniques de croisement utilisées, back-cross ou autofécondation, une proportion variable des grains formés contiendra le gène d'intérêt. La demanderesse a trouvé que la solution à ce problème résidait en partie en l'augmentation du pool initial de semences avant multiplication sexuée, ce qui permet de gagner un cycle de multiplication et d'obtenir très rapidement une quantité de biomasse satisfaisante pour les expérimentations et ici production de protéines recombinantes dans les plantes du type précédemment décrit. Ainsi, un objet de la présente invention est un procédé d ' augmentai ion de biomasse végétale Lransgénique, ua-LcuLéi-L,7:;é en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (a) multiplier des cals de plante contenant au moins un événement de LLaliSi LUUai~ioli génétique d' intérêt et capables de régénération ; (b) optionnellement sélectionner les cals comportant au moins un événement de transformation génétique d'intérêt ; (c) régénérer des plantes transgéniques entières, dites transformants primaires, ou plantes TO, à partir desdits cals de plante ; (d) féconder lesdits transformants primaires avec du pollen non transgénique ; (e) récolter les grains obtenus, dits Tl, ayant intégré au moins un transgène d'intérêt ; (f) semer lesdits grains Tl transgéniques et féconder les plantes qui en résultent, soit par autofécondation, soit par fécondation libre ; et (g) récolter les grains T2. De préférence, le procédé précédemment comporte en outre une étape supplémentaire consistant à effectuer un tri phénotypique post-récolte des grains T2. De manière plus préférentielle, le tri est effectué sur des grains T2 provenant d'une plante utilisée uniquement comme femelle. Dans un mode d'exécution préféré de la présente invention, les grains T2 transgéniques présentent un phénotype coloré différent des grains non-transgéniques. De manière particulièrement préférée, les grains T2 provenant des plantes utilisées comme plantes mâles et comme plantes femelles sont récoltés indépendamment les uns des autres . De préférence, la plante est allogame, et plus prer-erenu-ieiiemenr encore la plante est le maïs. Dans un mode d'exécution préféré, les transformants primaires sont écimés ou castrés avant fécondation avec du pollen non-transgénique. Dans un autre mode d'exécution préféré, l'étape de multiplication consiste à réaliser quelques dizaines, et de préférence, une vingtaine de plantes copies comportant de chaque événement de transformation génétique. Par exemple, dans le cas du maïs, et pour obtenir des cals de maïs comportant un ou plusieurs L.cansgèlles, on peut utiliser Id technique de transformation du mais par agrobactérium, en passant par des embryons immatures. Cette technique passe par une phase de régénération donnant naissance à des transformants qu'il est possible de copier efficacement. Ce copiage, qui est relativement facile à réaliser, permet d'obtenir in vitro de jeunes plantes TO transformées strictement identiques vis-à-vis du transgène. Ces plantes isolées visuellement, sont avec une bonne fiabilité des copies de la plante initiale. La Surcharge de travail impliqué correspond au travail de clonage, à la culture en phytotron puis en serre de tous les clones, au contrôle, par exemple, par analyse moléculaire de l' identité des clones intéressants. Ces clonages peuvent être réalisés sur tous les transformants primaires, puis après crible biochimique par exemple, seuls seront maintenus les plus intéressants (plus forte expression conforme avec propreté des inserts). Selon encore un autre mode d'exécution préféré, les grains Tl transgéniques sont semés, cultivés et utilisés comme plantes mâles. De préférence, les grains Tl transgéniques sont semés en ligne en alternance, de préférence en 4-2 ou en 6-2, avec des plantes non transgéniques comme plantes femelles. Dans ce cas, et de manière plus préférée, les plantes transgéniques femelles sont mâles stériles. Selon une variante préférée du mode d'exécution précédent, les plantes non-transgéniques femelles sont castrées. Enfin, et préférentiellement, les plantes femelles possèdent; une haute valeur agronomique comparativement aux plantes mâles. La description détaillée suivante indique, à titre d'exemple non limitatif, les modes d'exécution préférés de la présente invention. Exemple La transformation génétique d'une plante nécessite l'intégration d'un transgène, la sélection des cellules transformée leur multiplication et leur différentiation en néoplantules. La technique de transformation génétique du maïs que ce soit par canon à particule ou par agrobactérium comme décrit par Y. Ishida et al (Nature Biotech volume14, une 1996, 745-749) passe par la multiplication de cals transformés ayant un potentiel de régénération. La première partie de l'invention consiste à amplifier le nombre de régénération obtenu à partir d'un événement de transformation génétique. Le biologiste cellulaire est capable de repérer, prélever et isoler chaque ensemble de cellules issu d'événements de transformation car capable de se développer sur un milieu sélectif (alors que les tissus non transformés ne sont pas capable de proliférer sur le milieu sélectif). Ultérieurement par des changements de milieux successifs comportant des balances phyto-hormonales adaptées des néoplantules génétiquement modifiées vont se développer. C'est à partir de l'observation de l'endroit précis de formation du cal transgénique que le biologiste l'identifie. Ce crible macroscopique ne permet pas de séparer deux événements de transformation génétique ayant eu lieu dans des cellules voisines. C'est pourquoi, afin de ne pas risquer d'avoir différents événements de transformation issus apparemment d'un même cal primaire, les biologistes ont l'habitude de mener à maturité seulement une à deux plantules par cal identifié. On peut vérifier si des plantes proviennent bien du même événement de transformation en réalisant une analyse moléculaire de leur ADN. En réalisant un Southern avec une ou des sondes dirigées contre le Lransgène, il est possible en choisissant judicieusement les enzymes de restriction de vérifier que le ou les transgènes sont bien insérés au même endroit. L'expérience montre qu'un biologiste cellulaire expérimenté effectue une bonne sélection des cals et que les régénérât ions réalisées à partir d'un même cal sont dans la très grande majorité des cas issues du même événement de transformation. Dès lors en rajoutant une ou deux repiquages supplémentaires pendant les phases classiques de multiplication de cals transgéniques, il devient possible d'augmenter le nombre de régénération obtenu à partir d'un événement de transformation. La surcharge de travail en biologie cellulaire est minime et l'allongement du protocole n'est que de trois semaines environ sur un procédé qui en dure habituellement en moyenne vingt-neuf. Des contrôles par Southern, comme décrit précédemment permettront de vérifier que toutes les plantes obtenues sont bien issues du même événement de transformation. Vis à vis du transgène se sont des copies, bien que par ailleurs des variations somaclonales puissent survenir. Il est raisonnable d'envisager produire ainsi une vingtaine de copies de chaque événement de transformation. Les techniques de transformation génétique des plantes utilisée en routine ne permettent pas de piloter totalement l'intégration du transgène : choix du site d'intégration, nombre de copies du transgène. Dès l'ors, il est d'usage de produire quelques dizaines de transformants primaires par construction moléculaire que l'on souhaite intégré dans le génome de la plante, et ceci de façon à pouvoir sélectionner les meilleurs transformant (par exemple, pour s'assurer de la présence uniquement des séquences souhaitées, ou encore d'une expression correcte). Classiquement ces plantules néoformées, baptisées transformant primaire, sont, après un court développement in vitro, acclimatées et menées à maturité en serre. Dans le cas du maïs, compte tenu d'une part des perturbations engendrées par la culture in vitro sur leur fertilité et, d'autre part, afin d'éviter tout mélange d'événement de transformation par le biais du pollen, les transformants primaires sont le plus souvent écimés (castrés) . La descendance des plants transgéniques est obtenue en fécondant les épis transgéniques au moyen de pollen non transgénique. Compte tenu d'une part, des variétés de maïs utilisées pour réaliser la transformation génétique et, d'autre part, du stress qu'elles subissent in vitro, le nombre total de grain TO obtenu est le plus souvent compris entre 50 et 150. Dans le cas d'intégration monolocus du ou des transgènes, les plus fréquentes, seul 50 % des grains (dits Tl) formés sur les transformants primaires sont transgéniques. Ces grains peuvent alors être utilisés comme n'importe quelle semence. Si un des transgènes confère une résistance à un herbicide, il est facile au moyen de cet herbicide de sélectionner les plantules issues des grains transgéniques. Habituellement ces plantes sont soit auto-fécondées, soit laissées en fécondation libre pour obtenir les grains T2. Avec ce type de variété adapté à la culture in vitro, le taux de multiplication par génération est d'environ un facteur 100. Le fait d'avoir réalisé une vingtaine de copies de chaque événement de transformation, permet d'obtenir environ 1000 grains Tl transgénique par événement (au lieu de 50 en moyenne par la technique classique). Cela permet de disposer d'une masse pollinique suffisante pour envisager avec un minimum de travail de polliniser des pieds non Lransgéniques. C'est la deuxième partie de l'invention. La culture réalisée en plein champ, ou en serre, est menée comme une production classique d'hybrides de mars. Dans ce cas les pieds transgéniques sont utilisés comme mâles et semés en ligne en alternance (système 4-2 ou 6-2 le plus souvent) avec des pieds non transgéniques utilisés comme femelles. Ces plantes transgéniques sont idéalement mâles stériles, ce qui diminue le travail, sinon elles peuvent être castrées. Les plantes sont semées en ligne et non pas en mélange car il faut pouvoir traiter les pieds mâles avec un herbicide pour éliminer ceux qui n'ont pas hérité du transgène (50%). Par ailleurs le semis en ligne permet de gérer les précocité différentes des pieds mâles et femelles L'avantage de cette approche est double : la quantité de biomasse est très significativement augmentée par rapport à une culture sans pieds femelles. Deux expériences en champs nous ont permis de multiplier la biomasse d'un facteur 6 : cinq fois plus de biomasse a été récolté sur les pieds femelles que sur les pieds mâles. la qualité de la biomasse est bien meilleure car les pieds utilisés comme femelle sont des hybrides possédant une haute valeur ajoutée agronomique comparativement aux pieds mâles. Il est possible d'utiliser comme pieds femelles les hybrides de maïs qui sont ciblés pour l'utilisation de ces Lransgènes. On a donc dès la deuxième génération une biomasse d'une qualité bien plus proche de la biomasse industrielle future que si l'on avait travaillé uniquement avec les pieds mâles. Si la proportion de grain transgéniques récoltés sur les pieds mâles est de 75 % par les deux techniques (pieds transgéniques seuls, ou culture Lype hybride), seul 50% des grains récoltés sur les pieds femelles seront effectivement transgéniques. Afin d'y remédier nous suggérons d'associer au transgène d'intérêt un gène conférant un caractère phénotypique permettant un tri industriel post récolte. C'est la troisième partie de l'invention. Il est par exemple possible de modifier la coloration des grains de mais en jouant sur les enzymes responsables de la biosynthèse des pigments. Nous avons pour notre part vérifié qu'un tri industriel pouvait être réaliser efficacement et avec très peu de frais en mélangeant des maïs de coloration différentes. Après réglage, il est possible en un à deux passages sur des trieuses industrielles d'obtenir des Iota avec une pureté supérieure à 95%. Les tris, compte tenu des machines utilisées, peuvent être réalisées sans aucune difficulté et à très faible coût sur des productions de plusieurs tonnes de grains. La technique est alors la suivante, après une culture de type hybride, les pieds mâles et femelles peuvent récoltés indépendamment puis triés sur le caractère phénotypique. La production est alors entièrement transgénique. Le bilan est reporté au Tableau I, où l'on voit qu'il est possible grâce à cette innovation d'obtenir 65 fois plus de biomasse avec une qualité 1. 33 fois supérieure par rapport à la technique classique. L'expression "qualité" correspond ici à la proportion de grains transgéniques trouvée dans la biomasse récoltée. Ceci avec des surcoûts mineurs et un délai supplémentaire faible puisqu'il représente environ 3 semaines sur un total de 52 semaines (49 semaines sans l'innovation). Si l'on ne souhaite pas adjoindre au gène d'intérêt un gène conférant un phénotype particulier, il suffit de n'utiliser que les deux premiers volets de l'invention. Dans ce cas la biomasse obtenue esL 120 fois plus importante que par la technique classique, pour un 1/6 elle a la même qualité que part la technique classique (mais il y en a 20 fois plus), pour 5/6 la qualité est inférieur d'un tiers. Dans le Tableau I, les valeurs données sont des valeurs moyennes à prendre en relatifs pour comparer les deux techniques Quantité nombre de grains de maïs. Qualité proportion comparée de grains transgéniques. En terme de background ou héritage génétique, les hybrides produisent des grains beaucoup plus proche des systèmes industriels que les pieds transgéniques mâles. TABLEAU I Génération Technique classique Technique selon l'invention Différence entre les deux techniques Différence entre ces deux pour cette génération techniques pour les deux générations cumulées T1 @ Nombre de grams de mais Nombre de grams de mais - Quantité X 20 produits : 100 produits 2000 Qualité X 1 Proportion de grains Proportion de grams Délai. plus 3 à 4 semaines transgéniques 50% transgéniques: 50% Poids total de grains : 30 g Poids total de grains : 600 g Délai' 29 semaines Délai 32-33 semaines Option @ Autofécondation des pieds - Utilisation des pieds Quantité X 6 Quantité XI 20 paon transgéniques p ar transgéniques pour féconder Qualité : X 0 66 (pour les 5/6 Qualité X 0 66 (pour les 5/6 Pas de tri ost récolte eux-mêmes en plus d'eux mêmes des supplémentaires sinon qualité supplémentaires sinon qualité post reco Biomasse multipliée par 100 hybrides mâles stériles non équivalente) équivalente) T2 après élimination des non transgéniques utilisés comme Délai pas de différence Délai plus 3 à 4 semaines transgéniques pieds femelles Nombre de grains de maïs Biomasse multipliée par 100 sur produits - 5 000 les pieds mâles après Proportion de grains élimination des non transgéniques 75% transgéniques Poids total de grains : 1.5 kg Biomasse multipliée par 500 sur Délai 20 semaines les pieds femelles Nombre de grains de mais produits 100 000 pieds mâles 500 000 pieds femelles Proportion de grains transgéniques: 75% pieds mâles, 50 % pieds femelles Poids total de grams 180 kg Délai 20 semaines / Idem mais dans ce cas les grains non - Quanttté X 3 25 Quantité: X 65 Option transgéniques sont éimunés post Quahté : X 1 33 Qualité - X 1 33 Tri post récolte Nombre de grains . Délai - pas de différence Délai . plus 3 à 4 semaines Tri post récolte Nombre de grains de mais \ne . 75 000 pieds mâles 250 000 avec utilisation de marqueurs pieds femelles phenotypiqucs associés au transgène Proportion de grains d'intérêt transgéniques: 100% pieds mâles et femelles T2 Poids total de grains : 97. 5 kg Délai supplémentaire 1 jour [REVENDICATIONS] 1) Procédé d'augmentation de biomasse végétale transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (a) multiplier des cals de plante contenant au moins un événement de transformation génétique d'intérêt et capables de régénération ; (b) optionnellement sélectionner les cals comportant au moins un événement de transformation génétique d'intérêt ; (c) régénérer des plantes transgéniques entières, dites transformants primaires, ou plantes TO, à partir desdits cals de plante ; (d) féconder lesdits transformants primaires avec du pollen non transgénique ; (e) récolter les grains obtenus, dits Tl, ayant intégré au moins un transgène d'intérêt ; (f) semer lesdits grains Tl transgéniques et féconder les plantes qui en résultent, soit par autofécondation, soit par féconda Lion libre ; eL (g) récolter les grains T2. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'il comporte en outre une étape supplémentaire consistant à effectuer un tri phénotypique post-récolte des grains T2. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tri est effectué sur des grains T2 provenant d'une plante utilisée uniquement comme femelle. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les grains T2 transgéniques présentent un phénotype coloré différent des grains non-transgéniques. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les grains T2 provenant des plantes utilisées comme plantes mâles et comme plantes femelles sont récoltés indépendamment les uns des autres. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la plante est allogame. 7) Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la plante esL le mais. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les transformants primaires sont écimés ou castrés avant fécondation avec du pollen non-transgénique. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape de multiplication consiste à réaliser quelques dizaines, et de préférence, une vingtaine de plantes copies comportant de chaque événement de transformation génétique. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les grains Tl transgéniques sont semés, cultivés eL utilisés comme plantes mâles. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les grains Tl transgéniques sont semés en ligne en alternance, de préférence en 4-2 ou en 6-2, avec des plantes non transgéniques comme plantes femelles. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les plantes non-transgéniques femelles sont mâles stériles. 13) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les plantes non-transgéniques femelles sont castrées. 14) Procédé selon l'une quelconques des revendications 11 à 13 précédentes, caractérisé en ce que les plantes femelles possèdent une haute valeur agronomique comparativement aux plantes mâles.