FR 2807436 A1 20011012 FR 0004738 A 20000410 MÉTHODE D'OBTENTION DE FIBRES D'UN POLYPEPTIDE COLLAGÉNIQUE RECOIBINANT NON-HYDROXYLÉ, ET FIBRES DE POLYPEPTIDE COLLAGÉNIQUE RECOMBINANT NON-HYDROXYLÉ AINSI OBTENUES [DESCRIPTION] La présente invention concerne une méthode pour l'obtention de fibres d'un polypeptide collagénique, et plus particulièrement des fibres d'un polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé. Les polypeptides collagéniques constituent une grande famille de polymères structurants à base de chaînes polypeptidiques assemblées en hélices, soit en hétérotrimère, soit en homotrimère, qui sont présents ou produits dans un nombre important de cellules, par exemple animales, mammifères, humaines, de poisson ou encore de méduses. On dénombre aujourd'hui par exemple environ une vingtaine de types de collagène humain, chacun jouant un rôle particulier dans le corps humain. De manière générale, les méthodes d'obtention de fibres de collagène natif, par exemple d'origine bovine sont largement connues. Il est connu, par exemple, que dans des tissus animaux, le collagène de type I est présent sous forme de fibres dans les matrices extracellulaires, et que ces fibres peuvent être facilement reformées après extraction du collagène natif dans des conditions appropriées. Par exemple, la méthode classique de formation des fibres à partir de collagène natif en solution est de placer ce collagène natif en tampon phosphate à pH 7 additionné de sels (PBS) à 4 C, et de réaliser une remontée en température jusqu'à 35 C. Le collagène natif se polymérise en fibres striées qui peuvent être accumulées dans un culot par centrifugation. Ce qui caractérise ces polypeptides collagéniques, et ce que l'on a affirmé comme assurant la stabilité des hélices, voire des fibres de polypeptides collagéniques, est leur degré d'hydroxylation important, essentiellement au niveau des acides aminés d'hydroxyproline, dont une large partie de la chaîne polypeptidique est pourvue. Lorsqu'il s'agit de collagène recombinant, le polypeptide collagénique formé n'est a priori hydroxylé que si la production a lieu dans une cellule qui produit du collagène natif, car dans ce cas, la cellule produit également une enzyme de biosynthèse essentielle pour cette hydroxylation, à savoir la prolyl-4-hydroxylase. Ainsi, il a été démontré que certaines cellules recombinantes, ou modifiées génétiquement, et qui ne contenaient normalement pas de gène codant pour la production d'un collagène natif, ne pouvaient former de polypeptides collagéniques hydroxylés stables à des températures physiologiques (Berg, R.A et Prockrop, D.J, 1973) sans cette enzyme, qui assure l'hydroxylation des prolines positionnées en Yaa du triplet de la chaîne collagénique Gly-Xaa-Yaa de façon post-traductionnelle. On a ainsi entrepris, dans le cas de l'expression de la chaîne de collagène alpha I ou alpha II dans des cellules de Pichia ou d'un baculovirus, de faire co-exprimer un gène codant pour la prolyl-4-hydroxylase, ce qui permettrait d'obtenir du collagène recombinant trimérique hydroxylé. On a pu constaté que les approches connues ont consisté donc à rendre le polypeptide collagénique recombinant le plus conforme au collagène natif que possible, puisqu'on croyait que des polypeptides collagéniques recombinants non-hydroxylés ne pouvaient former des fibres de manière stable, leur permettant d'être transformées et ainsi servir de biomatériaux, comme le collagène natif. La demanderesse de la présente invention a toutefois pu éviter cette démarche fastidieuse, et de manière surprenante compte tenu des idées reçues en la matière, est parvenu à obtenir des fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, par la biais d'une méthode de production particulière. Les fibres obtenues par cette méthode peuvent ensuite être transformées par différents procédés, afin de donner des produits pouvant servir de biomatériaux semblables aux utilisations du collagène natif. Ainsi un objet de la présente demande est une méthode d'obtention de fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, caractérisée en ce que la fibrillogénèse s'effectue dans les conditions suivantes - une température comprise entre environ 4 C à environ 26 C ; - le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dilué dans un acide ; - le po lypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dialysé en dessous de la température physiologique habituelle du collagène natif correspondant est effectuée. Par ailleurs, un autre objet de la présente invention sont des fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, obtenues par la méthode précédente. De préférence, le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est d'origine végétale. D'autres polypeptides recombinants non-hydroxylés peuvent également être utilisés dans la méthode de la présente invention. De tels polypeptides recombinants peuvent par exemple, être produits par des cellules qui ne produisent normalement pas de collagène hydroxylé, par exemples des polypeptides collagéniques recombinants non-hydroxylés provenant de levures, telles que le Pichia pastoris, ou de cellules d'insectes, telles que les baculovirus, ou encore des cellules microbiennes comme l'Escherichia coli. De préférence, le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé d'origine végétale est obtenue par insertion d'une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour ledit polypeptide dans une plante, ou encore dans une cellule qui ne produit normalement pas de collagène. Les polypeptides collagéniques recombinants non-hydroxylés utilisés dans la méthode de la présente invention comportent de manière générale plusieurs chaînes, par exemple des chaînes alpha de collagène humain. Ces chaînes peuvent être de type différent, selon le polypeptide collagénique recombinant que l'on souhaite utiliser. Dans un mode d'exécution préféré de la présente invention, le polypeptide collagénique recombinant est un collagène comportant au moins une chaîne alpha I humaine. De manière plus préférée, le polypeptide collagénique recombinant est un collagène comportant au moins une chaîne alpha I humaine, et au moins une autre chaîne alpha humaine. Plus préférentiellement encore, le polypeptide collagénique r_ecombinant est un collagène comportant au moins trois chaînes alpha I humaines. Selon un mode d'exécution particulièrement préférée de la présente invention, le polypeptide est dilué dans un acide à une concentration de l'ordre de 200 gg/ml. Encore plus préférentiellement, l'acide est de l'acide acétique 0,1M. De manière préférée, la dialyse est effectuée à 4 C. De manière encore plus préférée, la dialyse est effectuée contre un tampon phosphate monopotassique sans ajout de sels. Dans un mode d'exécution particulièrement préféré, la dialyse est effectuée contre un tampon phosphate monopotassique 10 mM pH 7 pendant 12 heures. Un autre objet de la présente invention sont des fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé susceptibles d'être obtenues par fibrillogénèse effectuée dans les conditions suivantes - une température comprise entre environ 4 C à environ 26 C ; - le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dilué dans un acide - le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé dilué est dialysé en dessous de la température physiologie habituelle du collagène natif correspondant est effectuée. De préférence, les fibres peuvent être obtenues selon les modes d'exécution préférés décrits précédemment. Avantageusement et préférentiellement, les fibres formées après dialyse sont séparées par centrifugation. Dans ce cas, la centrifugation peut de manière préférée être effectuée à 20000G pendant 10 minutes. Selon un mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, les fibres présentent un diamètre variant entre environ 100 nm et environ 200 nm. D'autres objets de la présente invention sont des biomatériaux obtenus à partir de, ou à base de ces fibres, de préférence réticulées. Selon un mode d'exécution préféré, le biomatériau se présente sous forme d'éponge. Selon un autre mode d'exécution préféré, le biomatériau se présente sous forme de film ou de gel. De préférence, et selon l'application envisagée, ce film ou gel peut adherer ou non à des tissus humains. De manière encore plus préférée, le biomatériau se présente sous forme d'une structure tridimensionnel, de préférence sous forme de tube. Selon un mode d'exécution préféré, le biomatériau à base de, ou obtenu à partir des fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est associé, par collage, pistoletage, enduction, imprégnation, fusion ou extrusion à une structure prothétique. De telles structures sont connues de manière générale dans l'art antérieur, puisqu'on fait souvent recours au collagène pour recouvrir de telles structures prothétiques, par exemple pour éviter des adhésions postopératoires, ou pour assurer l'étanchéité de la structure vis-à-vis de l'écoulement de liquides corporels, par exemple la circulation sanguine. Ainsi, et de manière préférée, la structure prothétique est un tissu, tricoté ou non-tricoté, ou encore une prothèse vasculaire, et plus préférentiellement une prothèse endovasculaire, telle qu'un stent. La présente invention sera mieux comprise par rapport à la description détaillée d'un mode d'exécution préféré de l'invention, à partir d'un polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé obtenue à partir d'une cellule végétale recombinante ou transgénique. Cette description détaillée est donné à titre d'exemple seulement. Exemple Un polypeptide collagénique recombinant est extrait à partir de plantes de tabac transformés de façon stable par un ADNc codant pour la chaîne de collagène humain a1(I) délétée du N-propeptide. Le polypeptide collagénique utilisé est purifié et se présente sous forme de triple hélice [al(I)].. dont le domaine C-propeptide est clivé in planta. Le polypeptide collagénique recombinant est soluble dans l'acide acétique O,1M. Une analyse en acides aminés a montré que le polypeptide collagénique recombinant n'était pas hydroxylé au niveau des prolines entraînant une diminution de la température de dénaturation, de 30 C au lieu de 41,5 C pour un collagène témoin bovin. Dans les tissus, le collagène natif de type I est présent sous forme de fibres dans les matrices extracellulaires. La fibrillogénèse se fait par des expériences in vitro, l'observation en microscopie électronique permettant d'évaluer l'obtention ou non de fibres. La fibrillogénèse in vitro du polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé a été comparée à celle du collagène homotrimérique [a1(I))= bovin. De multiples essais de tampon, de température et de force ionique ont été testés. Les conditions de fibrillogénèse ont du en effet être modifiées pour l'application au polypeptide collagénique recombinant d'origine végétale qui n'est pas hydroxylé et montre une température de dénaturation de 30 C. Les températures excédant 28 à 30 C ont donc été exclues et des températures variant de 4 C à 26 C ont été choisies. Les tampons phosphate en présence de sels (PBS, Phosphate monopotassique 20 mm additionné ou non de 140 mM de sels), la variation du pH, neutre ou basique, et enfin la variation de la concentration de collagène en solution (200gg à 2mg/ml) n'ont pas permis d'obtenir des fibres avec le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, contrairement au collagène homotrimérique bovin, seul un réseau de fines fibrilles a été obtenues. En final, une seule série de conditions s'est avérée efficace pour la formation de fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé obtenu à partir de plantes transformées. Le polypeptide collagénique recombinant a été dilué à 200 #tg/ml dans de l'acide acétique 0,1 M, puis a été dialysé à 4 C contre un tampon phosphate monopotassique 10 mM pH 7 pendant 12 heures. Après centrifugation à 20000G pendant 10 minutes, les fibres formées ont pu être accumulées dans le culot, contrairement aux molécules en solution. Le culot obtenu a été repris dans un volume de tampon de dialyse 5 fois inférieur au volume du surnageant. Une fraction du surnageant et du culot a été déposée sur gel d'électrophorèse SDS-PAGE à 6% d'acry7.amide. Le gel a montré que le polypeptide collagénique recombinant, comme le collagène natif témoin homotrimérique bovin était présent majoritairement dans le culot., Après coloration négative, le polypeptide collagénique contenu dans le culot est observé en microscopie électronique à transmission. Avec le polypeptide collagénique recombinant nous avons observé la présence de fibres de diamètre variant entre 100 et 200 nm. Le collagène natif homotrimérique bovin dans ces conditions s'était polymérisé en fibrilles de 10 à 40 nm de diamètre, ces fibrilles n'étaient pas striées alors que ce collagène natif est capable de l'être dans d'autres conditions de force ionique plus élevée. Les fibres formées à partir du polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé ont été obtenues dans un tampon phosphate sans ajout de sels, alors que la présence de sels est importante pour obtenir des fibres striées in vitro à partir de collagènes naturels. Dans les conditions décrites ci-dessus, et sans vouloir être limité par une quelconque hypothèse, il semblerait que l'absence de sels aurait pour conséquence d'augmenter les interactions électrostatiques et de permettre la précipitation du polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé sous forme de fibres mais non striées. Stabilité du collagène Il est probable que le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé soit stabilisé par sa structure fibrillaire. La stabilité a été testée par digestion tryptique à différentes températures. Après une incubation de 20 minutes à une température donnée, le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé a été mis en présence de trypsine. La persistance d'une bande migrant au niveau d'une chaîne al(I) intacte pour déterminer la résistance, et ainsi la dénaturation, ou non du polypepti_de collagénique recombinant non-hydroxylé a été observée sur gel d'électrophorèse. La stabilité du polypeptide collagénique à 3"/ C, au cours du temps a également été testée. Réticulation Pour améliorer la stabilité du pol_ypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, celui-ci a été réticulé sous forme de fibres et testé à nouveau la température de dénaturation. Pour cela, il existe des agents de réticulation de différentes tailles (7,7A, 11,4A, etc.) qui ont été testés, par exemple le disuccinimide glutarate (DSG), qui est une molécule homobifonctionnelle de 7,7A. Ces agents réagissent sur des amines libres, notamment les lysines et l'extrémité N-terminale. La solution de polypeptide collagénique à réticules a été placée dans une solution d'acide acétique 0,01M à une concentration inférieure ou égale à 250 gg/ml. Cette solution a été diluée deux fois dans du tampon PBS concentré deux fois. Le pH a été ajusté jusqu'à neutralisation. Une solution d'agent de réticulation a été préparée à une concentration de 5 mM. Un volume de cette solution a été ajoutée à la solution de polypeptide collagénique recombinant à une concentration molaire de 50X celle du collagène. Le mélange a été incubé à 4 C pendant 5 à 20 minutes. La réaction a été arrêtée par ajout d'une solution de tris 0,1M final. La réticulation du polypeptide collagénique a été contrôlée par un gel d'électrophorèse en gradient d'acrylamide 3,5-5%. La conversion de la bande migrant au niveau de la chaîne a1 du collagène en une bande migrant à une taille de 300 kDa atteste de la réticulation du collagène. Agrégation plaquettaire Une propriété importante du collagène natif est sa capacité à induire l'agrégation des plaquettes, phénomène initiant l'hémostase in vivo. Cette propriété est largement exploitée lors de l'utilisation d'éponges hémostatiques à base de collagène. Cette propriété a été étudiée à l'aide d'un agrégomètre. Le principe est le suivant . la variation de densité optique (DO) au cours du temps (15 minutes) d'une préparation de plasma riche en plaquette (PRP), incubé à 37 C, est lue après ajout d'un agent agrégant. La référence est faite sur du plasma pauvre en plaquettes (PPP) qui correspond au 100% d'agrégation. L'agrégation des plaquettes est accompagnée d'une diminution de la D0, et est donnée en pourcentage. Le PRP est obtenu par centrifugation 25 minutes à 200 g de sang prélevé sur des volontaires sains et transféré dans des tubes en plastique contenant un anticoagulant (citrate de sodium). La référence (PPP) est obtenue par centrifugation du PRP 5 minutes à 2000g. Les collagènes fibrillaires sous forme moléculaire ne provoquent pas d'agrégation, ils doivent être sous forme de fibres. Le polypeptide collagénique a donc été préalablement dialysé à 4 C contre le tampon permettant la fibrillogénèse. Plusieurs paramètres ont été testés concentrations de collagènes (recombinant ou témoin), réticulation du collagène, températures d'agrégation. Formation de gels La formation d'un gel dense peut être effectuée rapidement en modifiant de façon instantanée le pH, la force ionique et la température. Pour cela, une solution de polypeptide collagénique à 1,5 à 3 mg/ ml dans l'acide acétique a été mélangée (1:1 vol/vol) avec du milieu de culture sans sérum concentré deux fois. Le pH a été ajusté rapidement avec de la soude jusqu'à neutralisation. Le mélange a été incubé à différentes températures, les conditions de pH ou de force ioniques ayant également été modifiées pour améliorer la formation du gel. Le gel obtenu a été préparé pour une observation en microscopie électronique à transmission. [REVENDICATIONS] 1) Méthode d'obtention de fibres d'un polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé, caractérisée en ce que la fibrillogénèse s'effectue dans les conditions suivantes - une température comprise entre environ 4 C à environ 26 C ; - 1e polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dilué dans un acide ; - 1e polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dialysé en dessous de la température physiologique habituelle du collagène natif correspondant. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est d'origine végétale. 3) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé d'origine végétale est obtenue par insertion d'une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour ledit polypeptide dans une plante. 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est un collagène comportant au moins une chaîne alpha I humaine. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce le polypeptide collagénique recombinant non- hydroxylé est un collagène comportant au moins une chaîne alpha I humaine, et au moins une autre chaîne alpha humaine. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce le polypeptide collagénique recombinant non- hydroxylé est un collagène comportant au moins trois chaînes alpha I humaines. 7) Méthode selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dilué dans un acide à 200 mg/ml. 8) Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'acide est de l'acide acétique 0,1M. 9) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la dialyse est effectuée à 4 C. 10) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la dialyse est effectuée contre un tampon phosphate monopotassique sans ajout de sels. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la dialyse est effectuée contre un tampon phosphate monopotassique 10 mM pH 7 pendant 12 heures. 12) Fibres de polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé susceptibles d'être obtenues par fibrillogénèse effectuée dans les conditions suivantes - une température comprise entre environ 4 C à environ 26 C ; - le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé est dilué dans un acide ; - le polypeptide collagénique recombinant non-hydroxylé dilué est dialysé en dessous de la température physiologique habituelle du collagène natif correspondant. 13) Fibres selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues selon les conditions spécifiées dans l'une quelconques des revendications 2 à 11. 14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou fibres selon l'une quelconque des revendications 12 à 13, cârâctérisée(s) en ce que les fibres formées après dialyse sont séparées par centrifugation. 15) Méthode ou fibres selon la revendication 14, caractérisée en ce que la centrifugation est effectuée à 20000G pendant 10 minutes. 16) Fibres de polypeptide collagénique selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elles présentent un diamètre variant entre environ 100 nm et environ 200 nm. 17) Biomatériau à base de fibres de polypeptide collagénique recombinant selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, dans lequel les fibres sont réticulées. 18) Biomatériau selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'éponge. 19) Biomatériau selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme de film ou de gel. 20) Biomatériau selon la revendication 19, caractérisé en ce que le film ou gel adhère à des tissus humains. 21) Biomatériau selon la revendication 19, caractérisé en ce que le film ou gel n'adhère pas à des tissus humains. 22) Biomatériau selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une structure tridimensionnel, de préférence sous forme de tube. 23) Biomatériau selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est associé, par collage, pistoletage, enduction, imprégnation, fusion ou extrusion à une structure prothétique. 24) Biomatériau selon la revendication 23, caratérisé en ce que la structure prothétique est un tissu, tricoté ou non-tricoté. 25) Biomatériau selon la revendication 23, caractérisé en ce que la structure prothétique est une prothèse vasculaire. 26) Biomatériau selon la revendication 23, caractérisé en ce que 1a structure prothétique est une prothèse endovasculaire, et de préférence un stent.