FR 2802214 A1 20010615 FR 9915515 A 19991209 DESCRIPTION La présente invention concerne la mise en évidence d'enzymes de type hydrolase, en particulier d'osidase, d'estérase ou de peptidase, par l'utilisation de substrats chromogènes efficaces. Depuis de très nombreuses années, on utilise des substrats particuliers pour permettre la détermination de la présence ou de l'absence d'activités enzymatiques caractéristiques de micro-organismes. Par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un genre de micro-organismes ou de différencier des souches et/ou des espèces d'un genre microbien donné. Les substrats synthétiques d'enzymes sont constitués de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, ci-après appelée partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Ces substrats particuliers peuvent être fluorescents ou chromogènes. En fait, c'est la seconde partie marqueur ou le produit de sa réaction avec un ou plusieurs autres composés, voir demande de brevet PCT/FR99/00781 déposée au nom de la demanderesse, qui est fluorescente ou chromogène, lorsqu'elle n'est plus associée à la première partie cible. Dans le cas présent, il s'agit de substrats chromogènes à base d'Alizarines qui, sous cette forme de substrats, sont généralement légèrement colorés. Néanmoins, la coloration due à la partie marqueur est renforcée et/ou modifiée par l'hydrolyse et donc la séparation de la partie cible par rapport à ladite partie marqueur. Préférentiellement, la présence d'un révélateur, tel qu'un sel de métal, un pH alcalin, améliore encore les caractéristiques colorées du produit obtenu. La capacité des Alizarines à former des chélates métalliques colorés a été trouvée durant le dix-neuvième siècle. Dès 1826, quand les Alizarines ont été pour la première fois isolées à partir de la plante Rubia tinctorum, leur propriété de matière colorante a été utilisée dans la teinture des vêtements. La synthèse globale des Alizarines a été décrite par Graebe et Liebermann en 1869. La même année, W. H. Perkin a élargi le nombre d'Alizarines qui peuvent être synthétisées, en proposant différents substituants sur les positions R3, R4, R5, R6, R7 et R8 du noyau Anthracène ci-après : Les Alizarines ne sont pas des colorants per se mais forment des pigments insolubles avec des oxydes métalliques. Par exemple lorsque la position R3 est substituée par un groupement sulfonique, la chélation avec un sel d'Aluminium donne une couleur rouge écarlate éclatante, alors que la chélation avec un sel de Chrome donne un rouge Bordeaux. Autre exemple, les 3-Nitroalizarine et 4-Nitroalizarine donnent des chélates de différentes colorations enfonction des sels métalliques qui leur sont associées. L'intérêt suscité par les Alizarines dans la teinture est en grande partie dû à la stabilité des chélates métalliques, ainsi formés, que ce soit aux savons, aux acides et aux hydroxydes de métal alcalin. Parmi les dérivés d'Alizarine qui peuvent être aisément synthétisés, on note qu'à partir de 3-Nitroalizarine et 4-Nitroalizarine, on obtient des 3-Aminoalizarine et 4-Aminoalizarine. La 4-Aminoalizarine est représentée ci-dessous : Cette molécule est particulièrement intéressante car elle donne une couleur pourpre en présence d'Aluminium. De plus, elle sert comme point de départ pour la synthèse, au moyen d'une réaction de Skraup bien connue de l'homme du métier, des Alizarines quinolines, dont un exemple, l'Alizarine a-quinoline de couleur verte, est représenté ci-après : Les réactions de substitution et de cyclisation permettent d'obtenir un large éventail d'Alizarines modifiées ayant différentes propriétés. L'état de la technique montre également que des applications biologiques et biomédicales existent déjà. En raison de la promptitude avec laquelle réagissent les Hydroxyanthraquinones en présence de chélates, celles-ci ont trouvées une application préférentielle comme tests de détection de la présence ou de l'absence de métaux dans des échantillons biologiques. Toutefois, aucune information n'a, à ce jour, mis en évidence l'utilisation qui peut être faite des Alizarines ou des dérivés Anthraquinoïdes comme substrats de détection d'une activité enzymatique. Ceci nécessite donc une synthèse de substrats où l'on fixe au moins une partie cible sur l'Alizarine. Ces substrats ont l'avantage de ne pas réagir en présence des ions métalliques, à partir du moment où l'hydrolyse en deux parties, marqueur et cible, n'a pas eu lieu. Pourtant la formation de chélates insolubles présente de substantiels avantages, qui sont les suivants : # grande sensibilité, même à faible concentration, d'où peu de quantité de substrat nécessaire, # couleur du produit de l'hydrolyse facilement adaptable aux besoins de l'application, de par la composition du milieu réactionnel et notamment les cations polyvalents (dont la définition sera donnée dans les points particuliers à la fin de la description) et/ou le pH utilisé(s), # synthèse aisée et faible quantité de substrat nécessaire (due à la grande sensibilité évoquée plus haut), ce qui diminue les coûts de fabrication, # diffusion de la coloration très faible, ce qui permet d'isoler et de différencier facilement les colonies, et # faible inhibition car on utilise une faible quantité de substrat (due à la grande sensibilité évoquée plus haut). Des dérivés d'Alizarine ont donc été synthétisés, principalement associés à des glycosides, par l'intermédiaire d'une méthode assez classique, dite de Koenigs-Knorr (Koenigs, W. and Knorr, E., Ber., 34,957, 1901). D'autres dérivés sont associés à des esters à courtes chaînes d'acides gras, et des esters d'acides phosphorique ou sulfurique. A ce jour, les substrats utilisés sont, par exemple le 5-Bromo-4-chloro-3- indolyl-/3-D-galactoside, qui font ultérieurement l'objet d'une étude comparative avec un des substrats selon l'invention, l'Alizarine-/i-D-galactoside. Conformément à la présente invention, les substrats selon l'invention sont sensiblement plus efficaces que ceux décrit par l'état de la technique. Ainsi, ils détectent un plus grand nombre d'espèces et/ou souches de micro-organismes pour une même activité enzymatique étudiée. A cet effet, la présente invention concerne un substrat chromogène permettant de détecter la présence d'une activité enzymatique, de formule générale : dans laquelle : - R, est une partie cible ou H et R2 est une partie cible ou H, au moins l'un des R, et R2 étant une partie cible, - R3 est H, S03H, Cl, Br, F, I, N02, NH2, NR9R10, Acylamino, Aminoaryl ou Aminoacylamino du type NHCOX, avec X égal à Alkyl, Aryl et Aralkyl ou un résidu d'acide a-aminé, tel que l'Alanine, - R4 est H, S03H, Cl, Br, F, I, N02, NH2, NR9R10, OH, Acylamino, Aminoaryl ou Aminoacylamino du type NHCOX, avec X égal à Alkyl, Aryl, Aralkyl ou un résidu d'acide a-aminé, tel que l'Alanine, - selon une variante, R3 et R4 sont reliés l'un à l'autre pour former un cycle à au moins cinq côtés, et préférentiellement à six côtés, - R5, R6, R7 et Rg sont chacun constitués d'un des atomes ou groupements d'atomes suivants : H, halogène, particulièrement Cl ou Br, OH, S03H, Alkyl ou Alkoxy, et - R9 et R10 sont constitués indépendamment de Méthyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl ou constituent l'un, R9 ou R10, un cycle (Pipéridine, Pyrrolidine, Morpholine, etc. ) et l'autre, R10 ou Rg, un atome d'Hydrogène. Dans un cas particulier où le substrat ci-dessus est hydrolysé, la partie marqueur est constituée d'Alizarine, qui comporte deux groupements Hydroxyles en positions 1 et 2. Cette molécule a pour autre nom le 1,2-Dihydroxyanthraquinone-p-D-galactoside, dont la formule générale, associée à une partie cible constituée par du galactose, est la suivante : Le produit de son hydrolyse par une ss-galactosidase forme un chélate en présence d'un sel de fer qui est le suivant : Préférentiellement, R, est H et R2 est la partie cible. Plus précisément, la partie cible est constituée par l'une des molécules suivantes : - un Glycoside, constitué par des unités mono-, di- et/ou polysaccharides, liés en a ou ss à la fonction Hydroxyle, - un acide a-aminé ou un peptide, - un acide organique, tel que -O-CO-(CH2)n-CH3, avec n compris entre 0 et 20, ou - un Sulfate, un Phosphate, un Pyrosulfate, un Pyrophosphate ou un Phosphodiester. Dans un cas particulier, R3 et R4 sont constitués et reliés l'un à l'autre par une chaîne en C3N, substituée ou non, avec préférentiellement N adjacent de R3 ou de R4, afin de former un cycle à six côtés. Selon un premier mode d'utilisation d'un substrat, tel que décrit ci-dessus pour permettre de détecter la présence d'une activité enzymatique, il consiste : - à mettre au moins un substrat, dont la partie cible est en relation avec l'activité enzymatique à détecter, en présence d'un échantillon suspecté de contenir au moins un micro-organisme ayant une telle activité enzymatique, et d'au moins un cation, et - à observer la formation d'un chélate insoluble et coloré. Préférentiellement, le substrat est mis en présence d'au moins un cation approprié par rapport à la partie marqueur libérée par l'activité enzymatique. Toujours préférentiellement, un cation, qui peut être utilisé pour former un chélate insoluble, est constitué par : Fe2+, Al3+, Manz, S n 2+ ou Cu2+. Selon un second mode d'utilisation d'un substrat, décrit plus haut pour permettre de détecter la présence d'une activité enzymatique, il consiste : - à mettre au moins un substrat, dont la partie cible est en relation avec l'activité enzymatique à détecter, en présence d'un échantillon suspecté de contenir au moins un micro-organisme ayant une telle activité enzymatique, dans un milieu réactionnel ayant un pH approprié, et - à observer la formation d'une coloration. Selon un mode d'utilisation préférentiel, les utilisations ci-dessus incluent une étape intermédiaire consistant à laisser pousser le ou les micro-organismes sur un milieu de culture contenant le ou les substrats. Si l'on souhaite détecter une activité enzymatique glycosidase, on utilise, entre autres, comme partie cible : # Glucose, # Galactose, # Mannose, # Xylose, # Acide glucuronique, ou # N-acétylglucosamine. Si l'on souhaite détecter une activité enzymatique phosphatase, on utilise, entre autres, comme partie cible, l'Acide phosphorique ou un dérivé substitué. Si l'on souhaite détecter une activité enzymatique sulfatase, on utilise, entre autres, comme partie cible, l'Acide sulfurique ou un dérivé substitué. Si l'on souhaite détecter une activité enzymatique lipase ou phospholipase ou estérase, on utilise, entre autres, comme partie cible : * un acide gras, saturé ou non, ou un dérivé substitué, # l'Acide acétique ou un dérivé substitué, # l'Acide butyrique ou un dérivé substitué, # l'Acide octanoïque ou un dérivé substitué, ou . un groupement phosphate estérifié, tel que l'inositol-1-phosphate. L'invention concerne également une composition permettant la détection d'au moins une souche et/ou une espèce de micro-organismes qui comprend au moins un substrat, tel que défini ci-dessus, et un milieu de culture. Dans le cas où la composition comporte au moins deux substrats, les produits, après réaction, sont de couleurs différentes permettant de différencier différentes activités enzymatiques révélées d'au moins une souche et/ou une espèce de microorganismes. Préférentiellement, la composition est constituée par un milieu solide, tel qu'une gélose, ou par un milieu liquide. Toujours préférentiellement, la concentration du substrat est comprise entre 10 et 500 mg/1, préférentiellement entre 30 et 150 mg/1, et encore plus préférentiellement est de 50 mg/1. La présente invention concerne donc un nouveau substrat faiblement coloré initialement qui prend une coloration particulière en présence, d'une part, d'un microorganisme ou d'une enzyme dont on veut détecter la présence, d'autre part et éventuellement, d'un cation. L'invention concerne également les utilisations qui peuvent être faites de ce substrat, ainsi qu'une composition contenant ce substrat. La présence de cations est particulièrement intéressante, néanmoins il est possible de s'en passer ; dans ce cas, on peut préférentiellement utiliser une composition ayant un pH alcalin. Il est également possible de cumuler les deux conditions, c'est-à-dire la présence de cations et un pH alcalin. Lorsque le cation utilisé varie, les colonies de micro-organismes testées donnent des colorations différentes. Ces cations, tels que Fer, Manganèse, Etain et Aluminium, sont utilisés à très faibles concentrations afin d'éviter ou de minimiser l'inhibition due à des ions libres présents dans l'échantillon testé. Cependant des concentrations plus élevées de certains ions métalliques donne une inhibition sélective qui peut être utilisée pour sélectionner des espèces microbiennes particulières, ce qui constitue un avantage supplémentaire. SYNTHESE DES SUBSTRATS : 1 ) Synthèse de l'Alizarine-2-j!-D-glucoside : Selon Robertson et al. (J. Chem. Soc. (1930), 1136 et (1933), 1167), l'Alizarine est glycosylée spécifiquement au niveau du groupement Hydroxyle en position 2, même s'il est possible d'effectuer cette fixation sur la position 1. Néanmoins, la couplage en position 2 est plus aisée. Ce substrat est préparé en utilisant la méthode décrite par Robertson (1933) mais modifiée. Un échantillon de 6 g d'Alizarine est suspendu dans 70 ml d'Acétone et mélangé avec 70 ml d'Hydroxyde de Potassium à 0,28 mol/1 afin de former un sel. A ceci est associé un mélange de 40 ml contenant dans un rapport 1:1de l'Ether et de l'Acétone, contenant 6,6 g d'Acéto-bromo-glucose. On agite environ 14 heures. On ajoute ensuite 7 ml d'Hydroxyde de potassium à 1,25 mol/1, suivi de l'ajout de 15 ml à 0,6 mol/1 Acéto-bromo-glucose dans l'Acétone. Le prémélange est encore agité une dizaine d'heures. L'Ether et l'Acétone sont retirés sous pression réduite et le pH est ramené à environ 5,5 par addition d'Acide acétique glacé. Le mélange et l'Alizarine n'ayant pas réagi sont filtrés puis lavés à l'eau, pour ensuite être séchés toute la nuit à 50 C. On obtient ainsi un solide jaune qui est mis en suspension dans 70 ml d'Acide acétique glacé et reflué pendant 5 minutes. Ceci permet de refroidir puis de filtrer et enfin de laver à l'Acide acétique. Le filtrat est ensuite mis de côté pendant une heure et séparé de l'Alizarine restante. Cette procédure est répétée à 10 C afin d'obtenir un filtrat jaune foncé. Ce que l'on obtient est séché et dissous dans 200 ml de Méthane dichlorique et on ajoute ensuite 2 ml de Triéthylamine. Un Oxyde d'Aluminium est prémélangé dans la solution jusqu'à ce qu'un échantillon test montre qu'il ne reste pas d'Alizarine par chromatographie sur couche mince (CCM). L'Oxyde d'Aluminium est retiré et la solution restante est évaporée par mise en rotation afin de produire un solide jaune. Ce solide est recristallisé à partir d'Ethanol chaud en présence de quelques gouttes d'Acide acétique pour obtenir 2,02 g de Tétraacétyl-glucoside d'Alizarine. Une quantité de 1,1 g du Tétraacétyl-gucoside d'Alizarine est remis en suspension dans 60 ml d'Ethanol, on y ajoute 30 ml d'Hydroxyde de Sodium aqueux à 0,125 mol/1 pour produire une solution rouge. Cet état est maintenu pendant 10 minutes à 65 C puis refroidi à 0 C. Le sel de Sodium de l'Alizarine glycosylée rouge est ensuite retiré par filtration à vide, lavé avec l'Ether puis séché. Ce procédé permet d'obtenir 0,9 g de sel de Sodium d'Alizarine-2-p-D-glucoside. On peut purifier ce produit selon des techniques connue de l'homme du métier pour obtenir de l'Alizarine-2--D-glucoside. 2 ) Synthèse de l'Alizarine-2--D-galactoside : Ce substrat est également préparé en utilisant la méthode décrite par Robertson (1933) mais modifiée. Un échantillon de 6 g d'Alizarine est suspendu dans 70 ml d'Acétone et mélangé avec 70 ml d'Hydroxyde de Potassium à 0,28 mol/1 afin de former un sel. A ceci est associé un mélange de 40 ml contenant dans un rapport 1:11 de l'Ether et de l'Acétone, contenant 6,6 g d'Acéto-bromo-galactose. On agite environ 14 heures. On ajoute ensuite 7 ml d'Hydroxyde de Potassium à 1,25 mol/1, suivi de l'ajout de 15 ml à 0,6 mol/1 d'Acéto-bromo-galactoside dans l'Acétone. Le prémélange est encore agité une dizaine d'heures. L'Ether et l'Acétone sont retirés sous pression réduite et le pH est ramené à environ 5,5 par addition d'Acide acétique glacé. Le mélange et l'Alizarine n'ayant pas réagi sont filtrés puis lavés à l'eau, pour ensuite être séchés toute la nuit à 50 C. Ce que l'on obtient est dissous dans 200 ml de Méthane dichlorique et on ajoute ensuite 2 ml de Triéthylamine. Un Oxyde d'Aluminium est ajouté dans la solution jusqu'à ce qu'un échantillon test montre qu'il ne reste pas d'Alizarine par CCM. L'Oxyde d'Aluminium est retiré et la solution restante est évaporée par mise en rotation afin de produire un solide jaune. Ce solide est recristallisé à partir d'Ethanol chaud en présence de quelques gouttes d'Acide acétique pour obtenir 1,96 g de Tétraacétylgalactoside d'Alizarine. Une quantité de 1,1 g de Tétraacétyl-galactoside d'Alizarine est remis en suspension dans 60 ml d'Ethanol, on y ajoute 30 ml d'Hydroxyde de Sodium aqueux à 0,125 mol/1 pour produire une solution rouge. Cet état est maintenu pendant 10 minutes à 65 C puis refroidi à 0 C. Le sel de Sodium de l'Alizarine glycosylée rouge est ensuite retiré par filtration à vide, lavé avec l'Ether puis séché. Ce procédé permet d'obtenir 0,86 g de sel de Sodium d'Alizarine-2-p-D-galactoside sous forme de poudre rouge microcristalline. 3 ) Synthèse de la Alizarine-2-acétate : Ce substrat est préparé par une technique bien connue de l'homme du métier. Deux grammes d'Alizarine sont dissous dans 5 ml de Pyridine et traités par un mélange de 2,5 ml d'Anhydride acétique et 5 ml de Pyridine. Après 16 heures à température ambiante, la solution jaune est versée dans 100 ml d'Acide chlorhydrique contenant de la glace. Le précipité d'Acétate est retiré par filtration aspirante et lavé à l'eau. La recristallisation d'Acétone aqueux permet d'obtenir 1,4 g de Alizarine-2-acétate sous la forme de cristaux jaunes. 4 ) Synthèse de la Alizarine-2-sulfate : Ce substrat est préparé par chauffage de 2,4 g d'Alizarine, soit 10 mmol, dans 10 ml de Pyridine contenant 4 g d'un complexe Pyridine-trioxyde de sulfure. Après 2 heures à 60 C, la Pyridine est reprise sous une pression réduite. L'Ester de sulfate est cristallisé, comme le sel de Potassium, par ajout méticuleux d'une Potasse méthanolique à un pH de 9. Le sel de Potassium se forme graduellement et est repris par filtration aspirante et lavage par un Ether pour donner 1,2 g d'une poudre microcristalline blanche, l'Alizariner2-sulfate. APPLICATIONS De nombreuses applications sont possibles : 1. Détection et localisation d'espèces microbiennes spécifiques dans un milieu solide ou sur membrane. 2. Détection d'activités enzymatiques en solution à partir d'extraits tissulaires ou cellulaires, ou à partir de suspension de cellules d'eucaryotes ou de procaryotes. 3. Identification d'organismes en fonction de la présence d'activités enzymatiques. 4. Visualisation et localisation d'une réaction spécifique entre antigène et anticorps, telle que la technique de l'ELISA. On peut par exemple utiliser de l'Alizarine-p- galactoside ou de l'Alizarine-phosphate pour des technologies destinées à révéler les activités p-galactosidase ou phosphatase alcaline comme enzymes indicatrices. Dans ce cas, les substrats enzymatiques sont utilisés tout d'abord dans des réactions de détection où une activité enzymatique (notamment la phosphatase alcaline ou la ss- galactosidase) est mise en jeu, comme les réactions de détection d'anticorps ou d'antigène avec un format type ELISA, par exemple Les immunodosages de la théorie à la pratique coordonné par Y. Barbier, aux éditions de l'ACOMEN, Lyon, pages 109 à 133 (1988) ; ou encore dans la détection d'acides nucléiques, par exemple DNA probes 2eme édition, Keller G. H., Manak, M. M., Stockton press, sections 5 à 9 (1993). 5. Techniques de biologie moléculaire où il y a lieu de démontrer la présence d'un gène par exemple de la p-galactosidase et son utilisation Molecular cloning a laboratory manual 2ème édition, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, sections 16. 56 et section 1. 85 (1989). 6. Techniques histochimique, cytochimique ou à cytométrie de flux. L'utilisation de tels substrats en relation avec des activités enzymatiques spécifiques a des applications dans le diagnostic médical et dans d'autres domaines, comme l'analyse de l'eau, de l'environnement, des aliments, etc. 7. Révélation d'enzymes sur des profils de gels polyacrylamides ou autres matériaux utilisés pour effectuer des électrophorèses ou d'autres méthodes de séparation. EXEMPLES Exemple 1 : Influence de la concentration de l'Alizarine-2-fi-D-galactoside sur la révélation de l'activité ss-galactosidase de micro-organismes sur milieu gélifié. Dans le milieu ci-après, base Columbia à une concentration de 46,37 g/1, a été ajouté soit du Alizarine-2-p-D-galactoside à 0,01 g/1, 0,03 g/1, 0,05 g/1 et 0,08 g/1 en présence de Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/1, soit du 6-Chloro-3-indolyl-p-D-galactoside à 0,2 g/1 sans Citrate de Fer Ammoniacal. Ces quatre milieux ont été répartis en boîte de Pétri à raison de 20 ml de milieu par boîte. Des micro-organismes ont été ensemencés sur ce milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18,24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous : Temps 6.Chloro-3-indolyl--D-galactoside Alizarine-2--D-galactoside Souches à 0,2 g/l à à 0,01 g/l d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 18 H rose 3,5 pourpre 0,3 115 24 H rose 3,5 pourpre 0,3 48 H rose 3,5 pourpre 0,5 Klebsiella pneumoniae 18 H- - 023 24 H - 48 H rose 0,3Enterococcus faecalis 18 H - - pourpre 0,3 117 24 H - - pourpre 0,6 48 H - - pourpre 0,6 Serratia marcescens 18 H rose 0,3- - 042 24 H rose 0,8- 48 H rose 3,5 pourpre 0,3 Proteus vulgaris 18 H - - 087 24 H 48 H Morganella morganii 18 H - - - 060 24 H 48 H - Alizarine-2-p-D-galactoside Souches Temps à 0,03 g/l à 0,05 g/l à 0,08 g/1 d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 18 H pourpre 2,7 pourpre 3,5 pourpre 4 115 24 H pourpre 2,7 pourpre 3,5 pourpre 4 48 H pourpre 3 pourpre 3,5 pourpre 4 Klebsiellapneumoniae 18 H pourpre 0,3 pourpre 0,8 pourpre 1,5 023 24 H pourpre 0,3 pourpre 1 pourpre 1,5 48 H pourpre 0,5 pourpre 1 pourpre 1,7 Enterococcus,faecalis 18 H pourpre 2,7 pourpre 4 pourpre 4 117 24 H pourpre 3 pourpre 4 pourpre 4 48 H pourpre 3,5 pourpre 4 pourpre 4 Serratia marcescens 18 H pourpre 0,5 pourpre 1 pourpre 2 042 24 H pourpre 1 pourpre 2,5 pourpre 2,5 48 H pourpre 1,7 pourpre 3 pourpre 3,5 Proteus vulgaris 18 H - - 087 24 H 48 H Morganella morganii 18 H 060 24 H 48 H Tableau 1 : de la concentration du substrat sur la révélation de l'activité ss-galactosidase de micro-organismes sur milieu gélifié. Le symbole - signifie, dans ce tableau 1, une absence de coloration. Les souches ainsi testées, n'ayant que des résultats négatifs, font office de contrôle négatif. D'après ce tableau 1, il est possible de remarquer que les intensités obtenues avec le Alizarine-2-p-D-galactoside dès 0,03 g/1 sont quasiment équivalentes à celles observées avec le 6-Chloro-3-indolyl-p-D-galactoside, dont la concentration est environ sept fois supérieure. La concentration en Alizarine-2-p-D-galactoside permettant d'obtenir des intensités de coloration intéressantes est comprise entre 0,03 g/1 et 0,08 g/1 préférentiellement 0,05 g/1. Les substrats à base d'Alizarine sont donc plus sensibles que les substrats à base d' Indoxyl. Exemple 2 : de l'activité fl-galactosidase de micro-organismes sur milieu gélifié - Utilisation du Alizarine-2-g-D-galactoside. Un milieu gélifié comprenant du Alizarine-2--D-galactoside est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée avec 50 mg de Alizarine-2-i-D-galactoside, 500 mg de Citrate de Fer Ammoniacal et 30 mg d'Isopropyl--D-thiogalactoside pour faciliter l'induction de l'activité P-galactosidase. L'agar est stérilisé par autoclavage à 116 C pendant 10 min. Le milieu est refroidi lentement à 55 C avant d'être réparti dans des boîtes de Pétri de 20 ml. Ce milieu est comparé à un milieu solide préparé de la même façon et contenant 46,37 g d'agar Columbia avec 80 mg de 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside et 30 mg d'Isopropyl-p-D-thiogalactoside. Trois cent soixante-sept souches (367) différentes ont été collectées à partir d'échantillons cliniques et environnementaux et identifiés par la galerie API (marque déposée) 20E (BioMérieux, France) comme méthode de référence. Les souches sont cultivées sur un milieu Columbia agar à 37 C pendant 24 heures puis un inoculum d'environ 108 organismes/ml (équivalent à un standard McFarland de 0,5) est réalisé pour chaque souche. En utilisant un inoculateur Denley, 1 microlitre de chaque suspension est inoculée sur une boite de chacun des milieux : le milieu contenant du Alizarine-2-p-D-galactoside préparé ci-dessus et le milieu contenant le 5-Bromo-4- chloro-3-indolyl-p-D-galactoside. Toutes les boîtes sont incubées à 37 C pendant 18 heures. Après incubation, les colonies formées sont examinées visuellement. Sur le milieu contenant le Alizarine-2-(3-D-galactoside les colonies présentant une activité P-galactosidase sont de couleur Pourpre et sur le milieu contenant le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-p-D-galactoside, elles sont de couleur Turquoise. Toute souche présentant une de ces deux couleurs est considérée comme positive pour l'activité P-galactosidase avec le substrat correspondant. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-après. Nombre de souches 5-Bromo-4-chloro- Espèces testées pour Alizarine-2-p- 3-indolyl -2-pl'espèce D-galactoside D-galactoside Acinetobacter spp. 53 0 0 Aeromonas caviae 7 86 86 Aeromonas hydrophila 3 100 100 Citrobacter diversus 9 89 89 Citrobacter freundii 16 100 100 Enterobacter aerogenes 9 100 100 Enterobacter agglomerans 1 100 100 Enterobacter cloacae 21 100 100 Escherichia coli 41 95 95 Escherichia hermannii 1 100 100 Hafnia alvei 10 80 80 Klebsiella oxytoca 13 100 100 Klebsiella ozaenae 3 100 67 Klebsiella pneumoniae 19 100 100 Morganella morganii 12 0 0 Proteus mirabilis 16 0 0 Proteus penneri 1 0 0 Proteus vulgaris 4 0 0 Providencia alcalifaciens 3 0 0 Providencia rettgeri 3 0 0 Providencia stuartii 10 0 0 Salmonella spp. 64 0 0 Serratia odorifera 1 100 100 Serratia spp. 14 86 79 Shigella boydii 1 0 0 Shigella dysenteriae 2 Shigella dysenteriae 2 0 0 Shigella sonnei 10 100 100 Shigella sonnei 100 Vibrio cholerae 100 100 Yersinia enterocolitica 14 64 29 Yersinia pseudotuberculosis 3 67 0 Tableau 2 : de l'activité ss-galactosidase de micro-organismes sur milieu gélifié contenant du Alizarine-2-i-D-galactoside Les chiffres présents dans les colonnes associées à l'Alizarine-2-p-D-galactosidc et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactoside correspondent aux pourcentages de souches positives. La grande majorité des souches, c'est-à-dire 96,5 %, a une réactivité identique, soit positive soit négative, pour les deux substrats. Huit souches n'hydrolysent que le Alizarine-2-i-D-galactoside. Or ces huit souches ont une activité p-galactosidase du fait de la détection d'une fluorescence en présence du substrat 4-Méthylumbelliféryl-(3-D-galactoside. Ce tableau montre donc une bonne efficacité du substrat comme indicateur de l'activité p-galactosidase avec une sensibilité supérieure à celle observée avec le substrat de référence le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -ss-D-galactoside. Ces substrats sont donc très sensibles et utilisables à faible concentration. Exemple 3 : de différents sels de métaux sur la coloration de la partie marqueur. Dans le milieu, base Columbia (46,37 g/1) et Alizarine-2-p-D-glucoside (50 mg/1), ont été ajoutés à la concentration de 50 mg/1 soit du Chlorure de Manganèse, soit du Citrate de Fer Ammoniacal, soit du Chlorure d'Etain, soit du Sulfate d'Aluminium. Un milieu témoin sans sel de métaux a aussi été étudié. Ces différents milieux ont été répartis après passage à autoclave en boîtes de Pétri à raison de 20 ml de milieu par boîte. Des micro-organismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Il convient de noter que les valeurs d'intensité sont données arbitrairement, elles n'ont pour but que de permettre de comparer les intensités d'une souches à l'autre. Ceci est également vrai pour les exemples qui suivent. De même, les souches testées issues de la collection de la demanderesse, comportent un numéro interne à cette collection. Cette numérotation interne est également utilisée dans certains des exemples qui seront exposés par la suite. Temps Témoin Chlorure de Manganèse Citrate de Fer Souches d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Couleur Intensité Listeria monocytogenes 24 H pourpre 2 pourpre 2,7 pourpre 4 023 48 H pourpre 2 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria monocytogenes 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 079 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria monocytogenes 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 081 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria ivanovii 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 018 48 H pourpre 2,3 pourpre 2. 7 pourpre 4 Listeria ivanovii 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 020 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria ivanovii 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 032 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 Listeria innocua 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 036 48 H pourpre 2,7 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria innocua 24 H pourpre 2 pourpre 2,3 pourpre 4 029 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 Listeria innocua 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 077 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 Listeria seeligen 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 011 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria welshimeri 24 H pourpre 2,3 pourpre 2,3 pourpre 4 023 48 H pourpre 2,3 pourpre 2,7 pourpre 4 Listeria grayi 24 H pourpre 2 pourpre 2 pourpre 4 078 48 H pourpre 2,3 pourpre 2 pourpre 4 Temps Chlorure d'Etain Sulfate d'Aluminium Souches d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Listeria monocytogenes 24 H orange 3 rouge 4 023 48 H orange 4 rouge 4 Listeria monocytogenes 24 H orange 3 5 rouge 4 079 48 H orange 4 rouge 4 Listeria monocytogenes 24 H orange 3 rouge 4 081 48 H orange 4 rouge 4 Listeria ivanovii 24 H orange 3 rouge 4 018 48 H orange 4 rouge 4 Listeria ivanovii 24 H orange 3 rouge 4 020 48 H orange 4 rouge 4 Listeria ivanovii 24 H orange 3 rouge 4 032 48 H orange 4 rouge 4 Listeria innocua 24 H orange 3 rouge 4 036 48 H orange 4 rouge 4 Listeria innocua 24 H orange 3 rouge 4 029 48 H orange 4 rouge 4 Listeria innocua 24 H orange 3 rouge 4 077 48 H orange 4 rouge 4 Listeria seeligeri 24 H orange 3 rouge 4 011 48 H orange 4 rouge 4 Listeria welshimen 24 H orange 3 rouge 4 023 48 H orange 4 rouge 4 Listeria grayi 24 H orange 3 rouge 4 078 48 H orange 4 rouge 4 Tableau 3 : de différents sels de métaux sur la coloration de la partie marqueur Suivant le sel de métal testé la couleur obtenue après hydrolyse du substrat est différente. Il est aussi possible d'observer une coloration même en absence de sels de métaux (milieu témoin). Cependant l'intensité de la coloration obtenue est inférieure à celle observée, par exemple avec le sel de Fer, sel qui ne modifie pas la couleur. Ceci peut permettre d'adapter la couleur et son intensité en fonction des besoins (association avec d'autres substrats enzymatiques, indicateurs de pH). Exemple 4 : Influence du pH sur la révélation de la 8-D-galactosidase en présence de Alizarine-2-13-D-galactoside. Dans dix-huit tubes contenant 5 ml d'eau osmosée à pH 7 ont été ajoutés de l'Alizarine-2-B-D-galactoside à 0,05 g/1, du Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/1 dans la moitié des tubes et 5 l de ss-galactosidase (EC 3.2.1.23 Sigma) dans chaque tube. Ces dix-huit tubes ont été incubés à 37 C pendant 4 H. Après incubation, la coloration obtenue est rose pâle pour les tubes ne contenant pas de Citrate de Fer Ammoniacal et rose plus intense pour les tubes contenant du Citrate de Fer Ammoniacal. Enfin, ces différents tubes ont été ajustés à différents pH (2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10) à 24 C. Les colorations obtenues après ajustement sont présentées dans le tableau 4 ci-après. pH Tubes ne contenant pas de Fer Tubes contenant du Fer pH 2 Jaune Jaune pH 3 Jaune Jaune pH 4 Jaune Jaune pH 5 Jaune - Orangé Jaune - Rose pH 6 Rose - Orangé Rose pH 7 Rose - Orangé Rose pH 8 Rose Pourpre pH 9 Pourpre Pourpre pH 10 Mauve Mauve Tableau 4 : du pH sur la révélation de la B-D-galactosidase en présence de 2-Alizarine-B-D-galactoside La couleur varie en fonction du pH. En général, elle est jaune à pH acide et rose à pourpre à pH alcalin. Ceci peut permettre d'adapter la couleur en fonction des besoins ou de mettre en évidence plusieurs métabolismes (hydrolyse enzymatique et variation de pH). Ceci prouve également qu'il est possible d'utiliser une large palette de pH. Exemple 5 : d'un substrat à base d'Alizarine avec un autre substrat enzymatique dans un milieu gélosé - Détection d'au moins deux activités enzymatiques différentes Le milieu suivant : * base Columbia à une concentration de 46,37 g/1, #Alizarine-2-f-D-glucoside à 0,05 g/1, # Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/l, # 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactoside à 0,05 g/1, et # Isopropyl-p-D-thiogalactoside à 30 mg/1 pour faciliter l'induction de l'activité p-galactosidase, a été réparti en boîtes de Pétri à raison de 20 ml de milieu par boîte. Des microorganismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous : Alizarine-2-p-Glucoside et Souches Temps 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactoside d'Incubation Couleur Intensité Escherichia coli 24 H Turquoise 3.5 115 48 H Turquoise 4 Escherichia coli 24 H Turquoise 3. 5 206 48 H Turquoise 4 Citrobacterfreundii 24 H Turquoise 3. 5 136 48 H Turquoise 3. 5 Enterococcus faecalis 24 H Pourpre 4 117 48 H Pourpre 4 Enterococcus faecalis 24 H Pourpre 4 066 48 H Pourpre 4 Enterococcus faecium 24 H Pourpre 4 039 48 H Pourpre 4 Klebsiella pneumoniae 24 H Bleu Mauve 4 023 48 H Bleu Mauve 4 Enterobacter cloaecae 24 H Bleu Mauve 4 059 48 H Bleu Mauve 4 Citrobacter koseri 24 H Bleu Mauve 4 002 48 H Bleu Mauve 4 Morganella morganii 24 H- 035 48 H- Pseudomonas aeruginosa 24 H- 054 48 H- Proteu mirabilis 248 H- - 154 48 H Tableau 5 : Association de deux substrats, l' Alizarine-2-li-D-glucoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside Le symbole - signifie, dans ce tableau 5, une absence de coloration. Les souches ainsi testées, n'ayant que des résultats négatifs, font office de contrôle négatif. Il est possible grâce à l'association de ces deux substrats de détecter quatre groupes de micro-organismes différents : * le premier, présentant une coloration Turquoise, correspond aux espèces ne possédant que l'activité P-galactosidase, * le deuxième, présentant une coloration Pourpre, correspond aux espèces ne possédant que l'activité ss-glucosidase, * le troisième groupe présentant un mélange des deux colorations précédentes, c'est à dire variant du Bleu au Mauve correspond aux espèces possédant les deux activités enzymatiques détectées, et * le quatrième groupe, incolore, correspond aux espèces ne possédant aucune des deux activités précédemment citées. Il est donc possible avec ces substrats à base d'Alizarine d'associer d'autres substrats enzymatiques afin de différencier un ou plusieurs groupes de microorganismes en fonction des activités biochimiques présentes chez ces microorganismes. Exemple 6 : Révélation de l'activité ss-glucosidase de micro-organismes en milieu liquide - Utilisation du Alizarine-2-j3-D-glucoside. Dans une cupule de galerie type API (marque déposée, bioMérieux, France), 3 l d'un mélange de Alizarine-2-p-D-glucoside à 0,12 g/1 et de Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/1 ont été déposés puis séchés. Une cupule témoin, contenant du 6-Chloro-3-indolyl-p-D-glucoside à la concentration finale de 0,4 g/1, a été réalisée. Ces deux cupules ont alors été inoculées avec 50 l d'une base Columbia sans agar et 100 l d'une suspension bactérienne à 2 McFarland. Après 4 et 24 heures d'incubation à 37 C, la coloration obtenue dans la cupule a été notée. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous : Souches Temps Couleur observée avec Couleur observée avec 6- d'incubation Alizarine-2-p-D-glucoside Chloro-3-indolyl--D-glucoside Listeria monocytogenes 4 H Pourpre Rose 022 24 H Pourpre Rose Listeria ivanovii 4 H Pourpre Rose 018 24 H Pourpre Rose Listeria innocua 4 H Pourpre Rose 036 24 H Pourpre Rose Listeria seeligeri 4 H Pourpre 080 24 H Pourpre Rose Bacillus thuringiensis 4 H 072 24 H Pourpre Klebsiella pneumoniae 4 H Pourpre Rose 023 24 H Pourpre Rose Staphylococcus aureus 4 H 062 24H - - Enterococcus faecium 4 H Pourpre Rose 009 24 H Pourpre Rose Tableau 6 : Révélation de l'activité ss-glucosidase de micro-organismes en milieu liquide contenant du Alizarine-2-f3-D-glucoside. Le symbole - signifie, dans ce tableau 6, une absence de coloration. Les souches ainsi testées, n'ayant que des résultats négatifs, font office de contrôle négatif. Le substrat à base d'Alizarine permet de détecter une activité pour sept (7) espèces sur huit (8) testées, alors que le 6-Chloro-3-indolyl-P-D-glucoside ne permet de détecter une activité que pour six (6) de ces espèces. D'autre part, pour deux souches (Bacillus thuringiensis et Listeria seeligeri) l'activité est détectée plus précocement avec le substrat à base d'Alizarine. Ces substrats sont donc, d'une part, utilisables en milieu liquide et, d'autre part, plus sensibles que les substrats à base d'Indoxyl. Exemple 7 : de l'Alizarine-1-ss-D-glucoside et de l'Alizarine- 2--D-glucoside en milieu solide. Dans le milieu, contenant base Columbia à une concentration de 46,37 g/l, a été ajouté soit * de l'Alizarine-2-ss-D-glucoside à 0,05 g/1 et du Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/1, * de l'Alizarine-1-ss-D-glucoside à 0,05 g/1 ou 0,1 g/1 et, pour ces deux concentrations, du Citrate de Fer Ammoniacal à 0,05 g/1, * du 6-Chloro-3-indolyl-p-D-glucoside à 0,15 g/1 sans Citrate de Fer Ammoniacal. Ces quatre milieux ont été répartis en boîtes de Pétri à raison de 20 ml de milieu par boîte. Des micro-organismes ont été ensemencés sur ce milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18, 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous : Temps 6-Chloro-3-indolyl-p-D-glucoside 2 -Alizarine-p-D-glucoside Souches d'Incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 18 H 24 H - 115 48 H - - Citrobacter koseri 18 H Rose 0. 5 Mauve 2 24 H Rose 1 Mauve 3 059 48 H Rose 2 Mauve 3.5 Enterococcusfaecalis 18 H Rose 1.5 Pourpre 3. 5 24 H Rose 2 Pourpre 4 117 48 H Rose 2.5 Pourpre 4 Klebsiella 18 H Rose 2 Pourpre 3.5 pneumoniae 24 H Rose 2. 5 Pourpre 4 023 48 H Rose 3 Pourpre 4 Proteus mirabilis 18 H - - 24 H - - 008 48 H Staphylococcus 18 H epidermidis 24 H 024 48 H - - Temps 1 -Alizarinc-p-D-glucoside à 0.05 g/1 1-Alizarine-p-D-glucoside à 0.1 g/1 Souches d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia 18 H coli 24 H - - 115 48 H - - Citrobacter 18 H Mauve 1.5 Mauve 2.5 koseri 24 H Mauve 2 Mauve 3 059 48 H Mauve 2.5 Mauve 4 Enterococcus 18 H Pourpre 3. 5 Pourpre 3. 5 faecalis 24 H Pourpre 4 Pourpre 4 117 48 H Pourpre 4 Pourpre 4 Klebsiella 18 H Pourpre 2.5 Pourpre 3 pneumoniae 24 H Pourpre 3 Pourpre 4 023 48 H Pourpre 3.5 Pourpre 4 Proteus 18 H - - - mirabilis 24 H- 008 48 H- - Staphylococcus 18 H epidermidis 24 H 024 48 H - - Tableau 7 : Comparaison de l'Alizarine-1-ss-D-glucoside et de l'Alizarine-2- ss-D-glucoside en milieu solide Le symbole - dans ce tableau 7 signifie une absence de coloration. Les souches ainsi testées, n'ayant que des résultats négatifs, font office de contrôle négatif. A la même concentration 0,05 g/l, les deux substrats ne permettent pas d'obtenir les mêmes intensités de coloration pour deux (2) souches sur trois (3) présentant une activité. L'Alizarine-2-ss-D-glucoside est légèrement plus sensible que l'Alizarine- 1-p-D-glucoside. Mais à 0,1 g/1 l'Alizarine-1-p-D-glucoside permet d'obtenir des intensités de coloration supérieures à celles observées avec l'Alizarine- 2-p-D-glucoside. D'après ce tableau il est aussi possible de remarquer que les intensités obtenues avec l'Alizarine-1-p-D-glucoside à 0,05 g/1 sont, pour toutes les souches testées, supérieures à celles observées avec le 6-Chloro-3-indolyl--D-glucoside dont la concentration est trois fois supérieure à celle de l'Alizarine-1-ss-D-glucoside. Les substrats à base d'Alizarine sont donc plus sensibles que les substrats à base d'Indoxyl. Le choix entre l'Alizarine-1-p-D-glucoside et l'Alizarine-2--D-glucoside pourra être dicté par d'autres critères, tels que le coût de synthèse, la spécificité dans l'application, la stabilité, etc. POINTS PARTICULIERS Une méthode de visualisation et donc d'identification d'espèces bactériennes, en colonies, s'effectue sur un milieu à base d'agar par incorporation d'au moins un substrat tel que synthétisé ci-dessus en présence de faibles quantités d'au moins un cation idoine. Les colonies révélées forment alors des entités très colorées (rouge, pourpre, bleu, etc. ) selon le choix du substrat et du cation qui y est associé. Lorsque ce ratio entre le substrat et le cation existe, il est compris entre 1/100 et 100/1, préférentiellement entre 1/10 et 10/1, et encore plus préférentiellement entre 1/2 et 2/1. Dans certaines conditions, la présence d'un substrat de SO3H en R3 permet d'éviter les problèmes d'instabilité et d'insolubilité liés à ce type de substrats. Par cations polyvalents , il faut comprendre cations métalliques multivalents, de forme Xn+, avec n = 2,3 ou 4. Les métaux utilisables sont : Mg, Al, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Sr, Zr, Sn, Sb, Ba, La, Hf, ainsi que les lanthanides Ce, Sm, Eu, Gd et Tb. REVENDICATIONS 1. Substrat chromogène permettant de détecter la présence d'une activité enzymatique, de formule générale : dans laquelle : - R1 est une partie cible ou H et R2 est une partie cible ou H, au moins l'un des R, et R2 étant une partie cible, - R3 est H, S03H, Cl, Br, F, I, N02, NH2, NR9R10, Acylamino, Aminoaryl ou Aminoacylamino du type NHCOX, avec X égal à Alkyl, Aryl Aralkyl ou un résidu d'acide a-aminé, tel que l'Alanine, - R4 est H, S03H, Cl, Br, F, I, N02, NH2, NR9R10, OH, Acylamino, Aminoaryl ou Aminoacylamino du type NHCOX, avec X égal à Alkyl, Aryl, Aralkyl ou un résidu d'acide a-aminé, tel que l'Alanine, - selon une variante, R3 et R4 sont reliés l'un à l'autre pour former un cycle à au moins cinq côtés, et préférentiellement à six côtés, - R5, R6, R7 et R8 sont chacun constitués d'un des atomes ou groupements d'atomes suivants : H, Halogène, particulièrement Cl ou Br, OH, S03H, Alkyl ou Alkoxy, et - R9 et R10 sont constitués indépendamment de Méthyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl ou constituent l'un, R9 ou R10, un cycle (Pipéridine, Pyrrolidine, Morpholine, etc. ) et l'autre, R10 ou R9, un atome d'Hydrogène. 2. Substrat, selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R, est H et R2 est une partie cible. 3. Substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la partie cible est constituée par l'une des molécules suivantes : - un Glycoside, constitué par des unités mono-, di- et/ou polysaccharides, liés en a ou ss à la fonction Hydroxyle, - un acide a-aminé ou un peptide, - un acide organique, tel que -O-CO-(CH2)n-CH3, avec n compris entre 0 et 20, ou - un Sulfate, un Phosphate, un Pyrosulfate, un Pyrophosphate ou un Phosphodiester. 4. Substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que R3 et R4 sont constitués et reliés l'un à l'autre par une chaîne en C3N, substituée ou non, avec préférentiellement N adjacent de R3 ou de R4, afin de former un cycle à six côtés. 5. Utilisation d'un substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour permettre de détecter la présence d'une activité enzymatique, caractérisée en ce quelle consiste : - à mettre au moins un substrat, dont la partie cible est en relation avec l'activité enzymatique à détecter, en présence d'un échantillon suspecté de contenir au moins un micro-organisme ayant une telle activité enzymatique, et d'au moins un cation, et - à observer la formation d'un chélate insoluble et coloré. 6. Utilisation, selon la revendication 5, caractérisée en ce que le substrat est mis en présence d'au moins un cation approprié par rapport à la partie marqueur libérée par l'activité enzymatique. 7. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'un cation, qui peut être utilisé pour former un chélate insoluble, est constitué par : Fe2+, Al3+, Mn2+, Sn2+ ou Cu2+. 8. Utilisation d'un substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour permettre de détecter la présence d'une activité enzymatique, ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle consiste : - à mettre au moins un substrat, dont la partie cible est en relation avec l'activité enzymatique à détecter, en présence d'un échantillon suspecté de contenir au moins un micro-organisme ayant une telle activité enzymatique, dans un milieu réactionnel ayant un pH approprié, et - à observer la formation d'une coloration. 9. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 8, caractérisée en ce qu'elle consiste à effectuer une étape intermédiaire consistant à laisser pousser le ou les micro-organismes sur un milieu de culture contenant le ou les substrats. 10. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que l'on détecte une activité enzymatique glycosidase en utilisant, entre autres, comme partie cible : # Glucose, # Galactose, # Mannose, # Xylose, # Acide glucuronique, ou # N-Acétylglucosamine. 11. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que l'on détecte une activité enzymatique phosphatase en utilisant comme partie cible , entre autres, l'Acide phosphorique ou un dérivé substitué. 12. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que l'on détecte une activité enzymatique sulfatase en utilisant comme partie cible, entre autres, l'Acide sulfurique ou un dérivé substitué. 13. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que l'on détecte une activité enzymatique lipase, phospholipase ou estérase en utilisant comme partie cible, entre autres : * un acide gras, saturé ou non, ou un dérivé substitué, # l'Acide acétique ou un dérivé substitué, # l'Acide butyrique ou un dérivé substitué, # l'Acide octanoïque ou un dérivé substitué, ou . un groupement Phosphate estérifié, tel que l'Inositol- 1 -phosphate. 14. Composition permettant la détection d'au moins une souche et/ou une espèce de micro-organismes qui comprend au moins un substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et un milieu de culture. 15. Composition, selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'elle comporte au moins deux substrats, les substrats, après réaction, sont de couleurs différentes permettant de différencier différentes activités enzymatiques révélées d'au moins une souche et/ou une espèce de micro-organismes. 16. Composition, selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par un milieu de culture gélifié ou solide. 17. Composition, selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée par le fait que la concentration du substrat est comprise entre 10 et 500 mg/1, préférentiellement entre 30 et 150 mg/1, et encore plus préférentiellement est de 50 mg/1.