FR 2786502 A1 20000602 FR 9814995 A 19981127 PROCEDE DE PRODUCTION ET D'EXTRACTION IN SITU DE COMPOSES AROMATIQUES. La présente invention a pour objet des moyens de valorisation de résidus de distillation de produits de fermentation et en particulier un procédé Jour la production de composés d'intérêt économique à partir de ces résidus de distillation de produits de fermentation. Ce procédé de production comprend également des étapes adaptées à l'extraction de ces composés. L'invention concerne en particulier la valorisation des résidus de distillation de produits de fermentation issus de l'industrie agro-alimentaire. Dans le cadre de l'invention, ces résidus ou sous-produits sont utilisés :;omme substrats pour la culture de microorganismes capables de se développer et de produire des molécules d'intérêt économique ; ces composés sont en particulier des molécules à haute valeur ajoutée telles que des arômes, des colorants, des enzymes, des acides aminés, des lipides, des glucides, des produits biologiquement actifs dans le domaine thérapeutique, agro-alimentaire ou pour l'agriculture, etc. Le brevet FR 2 705 971 décrit un procédé de production de R-y- Jécalactone comprenant la culture de microorganismes du genre Sporidiobolus ou Fusurium dans un milieu de culture contenant un précurseur de la R-y- Jécalactone choisi parmi l'acide ricinoléique, l'acide lesquérolique ou les sels ou les esters avec des alcools en C1 à C3 de ces acides. L'extraction de la R-y- iécalactone produite est réalisée durant la culture, avec un solvant d'extraction ion miscible avec l'eau. Les inventeurs ont, dans le cadre de cette invention, observé que des produits résiduels de la distillation du vin, et en particulier du vin de Cognac ces produits résiduels étant désignés dans ce cas spécifique par l'expression 'vinasse"), sont susceptibles de constituer des substrats appropriés pour la culture de microorganismes, dans le but de produire des molécules d'intérêt économique. La présente demande de brevet a donc pour objet un procédé de préparation de composés d'intérêt économique à partir de substrats constitués par ou comprenant des résidus de distillation de produits de fermentation et 'utilisation de microorganismes pour la mise en oeuvre ce de procédé. La présente demande a également pour objet un procédé d'extraction des composés produits, ledit procédé étant avantageusement associé au procédé de production. Ainsi, les étapes d'extraction proposées selon 'invention peuvent suivre la ou les phases de production des composés ou être ntégrées à cette phase. Le cas échéant, les conditions choisies pour 'extraction sont déterminées en fonction de leur influence sur la production des composés, par exemple sur le rendement de production. Ainsi la demande concerne un procédé de préparation de composés j'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de : a) culture dans des conditions de fermentation aérobie, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits je fermentation, b) récupération des composés produits. En particulier, les produits obtenus peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membrannaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape de 'écupération des composés produits comprend une étape par laquelle le milieu constitué par la culture ci-dessus définie réalisée en phase aqueuse, est mis en contact avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption dans la phase lipidique, de tout ou partie des composés produits, le milieu en phase lipidique étant solide à température ambiante. L'invention propose à cet égard l'utilisation de milieux lipidiques comprenant ou constitués par des graisses végétales ou des mélanges de graisses végétales. A titre d'exemples, on citera l'huile de noix de coco hydrogénée (HNCH), le TTT constitué par un mélange de tripalmitine (40%) tristéarine (40%) et trioléine (20%). De façon générale, une graisse végétale adaptée pour la réalisation de l'invention a la propriété d'être inodore, faiblement oxydable notamment pour éviter la formation de l'odeur de "rance" et insoluble à basse température (inférieure à 0 C) dans l'éthanol. L'invention a mis en évidence qu'un système d'extraction approprié, est avantageusement fondé sur un équilibre de phases entre phase aqueuse et phase lipidique, afin d'améliorer à la fois la viabilité des microorganismes et la production de composés, en particulier d'arômes. Pour l'étape de culture, la fermentation peut être réalisée en milieu aérobie, anaérobie ou mixte. Selon un premier mode de réalisation du procédé, le substrat mis en oeuvre comprend un résidu de la distillation du vin et, à titre d'exemple, un résidu de la distillation du vin de Cognac ou d'Armagnac. Ce résidu est appelé "vinasse". Les vinasses sont le sous-produit liquide obtenu en sortie d'alambic après distillation du vin. L'élaboration du Cognac est réalisée sur lies et génère de gros volumes de vinasse : environ deux tiers du volume de vin distillé. Les vinasses ne contiennent plus d'alcool, et quasiment plus de composés aromatiques, ceux-ci étant passés dans le distillat. Elles contiennent cependant un certain nombre de substances, et notamment des quantités non négligeables d'acides organiques (7,55 à 10,05 g/l). La composition moyenne des vinasses de distillerie de Cognac est la suivante : pH 3,5 Matières solubles 1 g/l Matières dissoutes 30 g/l Cendres 3 g/l DCO 30 g/l DBO5 20 g/l Azote total 0,5 g/l P2O5 0,6-0,5 g/l K20 2-3 g/l CI 0,03 g/l Acide tartrique 5-6 g/l Acide succinique 0,5-1 g/l Acide lactique 2-3 g/l Acide citrique et malique 0,05 g/l Total 7,55-10,05 g/l La DCO est la Demande Chimique en Oxygène, c'est-à-dire la quantité d'oxygène nécessaire pour oxyder les matières organiques contenues dans les effluents. La DBO5 est la Demande Biologique en Oxygène nécessaire, pendant 5 jours, aux microorganismes contenus dans l'eau pour oxyder une partie des matières carbonées. L'acide tartrique des vinasses de distillerie de Cognac est sous forme de bitartrate de potassium (KHC4H406). Alternativement, selon un autre mode de réalisation de l'invention, le substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de fermentation de fruits, de betteraves, de canne à sucre, de céréales, notamment de malt, d'orge, de blé, de maïs ou de riz. A titre d'exemple, les résidus de distillation de produits de fermentation du jus de pomme sont les résidus de distillation du calvados, les résidus de distillation de produits de fermentation de la canne à sucre sont les résidus de distillation du rhum, etc. Les substrats ainsi définis, pris isolément ou en mélange, peuvent être utilisés pour produire différents composés tels que des composés odorants volatils (ou arômes), et de façon générale des protéines, des acides aminés, des lipides, des glucides, des nucléosides, des alcools ou des dérivés de ces composés. Les substrats décrits peuvent ainsi, en fonction du microorganisme choisi pour la mise en oeuvre du procédé, permettre la production de composés biologiquement actifs, entrant dans la composition d'insecticides, de pesticides, d'herbicides, de substances contrôlant la croissance végétale ou des principes actifs de médicaments. Les substrats définis dans le cadre de l'invention peuvent être adaptés pour la culture de microorganismes variés et en particulier de bactéries, de levures, ou de champignons. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé défini est caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins une levure du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes, dans des conditions de culture permettant la croissance de ladite souche S. odorus et la production d'arômes à partir d'un substrat comprenant de la vinasse. Sporobolomyces odorus est une souche de levure connue pour sa capacité à produire des arômes tels que la lactone, en particulier la ydécalactone. L'invention a donc pour objet un procédé pour la préparation d'arômes comprenant les étapes de a) culture dans des conditions de fermentation aérobie de Sporobolomyces odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température de la réaction étant compatible avec la croissance de S. odorus, b) récupération des arômes produits. Le procédé ainsi défini est avantageusement réalisé sous agitation entre 50 et 1000 rpm, de préférence entre 100 et 700 rpm et avec une aération de 0,10 à 10 vvm, de préférence de 0,10 à 5 vvm. La température de l'étape de culture peut varier selon la(les) souches de microorganismes utilisées. Pour Sporobolomyces odorus, la culture est effectuée à une température comprise entre 10 et 50 C, de préférence entre 20 et 40 C, avantageusement voisine de 24 C ; cette température est régulée pour être maintenue essentiellement constante. La récupération des arômes produits peut être réalisée en continu par extraction solide-liquide. Les arômes produits se trouvent essentiellement dissous dans le milieu de culture qui est une phase aqueuse. Leurs coefficients de partage étant plus favorables pour une phase lipidique, la séparation des arômes du milieu de fermentation peut être réalisée par extraction solide-liquide utilisant une huile solide à température ambiante (ou graisse végétale). Les arômes produits sont ainsi récupérés et concentrés dans l'huile solide dans laquelle ils sont absorbés. Il est aussi possible d'obtenir les arômes dans un alcoolat, c'est à dire, en solution dans de l'éthanol. Pour ce faire, l'huile solide contenant les composés odorants est solubilisée dans de l'éthanol. Le mélange est ensuite refroidi avantageusement entre-5 et -20 C par exemple dans de la glace fondante, pour séparer l'huile solide de l'alcoolat qui contient les arômes en solution. Ce dernier peut être ensuite distillé pour purifier les composés odorants. La graisse végétale peut être constituée par un mélange de graisses végétales. Le substrat utilisé peut être le cas échéant enrichi pour favoriser la croissance des souches de microorganismes et/ou pour favoriser la production des composés recherchés. Par exemple, on aura recours à un enrichissement en composés glucidiques et notamment en glucose. Le procédé peut également comprendre la mise en oeuvre, lors de l'étape de culture, d'un précurseur susceptible de favoriser la production des composés recherchés, en particulier d'un précurseur utilisé pour la bioconversion, par le(les) microorganisme (s) utilisé(s). Ainsi, selon le mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'étape de culture de Sporobolomyces odorus est réalisée en présence de substrats choisis et d'acide ricinoléique ou de dérivés d'acide ricinoléique, par exemple d'un ester, assimilables par le(les) microorganisme(s). De façon particulièrement intéressante, lorsque le substrat est la vinasse, le microorganisme choisi est S. odorus et le précurseur est un ester d'acide ricinoléique tel que le ricinoléate de méthyle. Les inventeurs ont observé que la mise en oeuvre du procédé conduit à un niveau de production des composés recherchés particulièrement élevé, lorsque l'incorporation du précurseur et en particulier du ricinoléate de méthyle dans le milieu de culture est réalisée sous forme fractionnée tout au long de l'étape de culture. Ce fractionnement permet d'augmenter la production de composés recherchés présents dans la phase aqueuse. Le cas échéant, ce fractionnement peut tenir compte d'étapes d'extraction des composés produits intercalées avec les apports en précurseurs. Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'un apport de précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle, dans le cadre de la réalisation du procédé, est avantageusement effectué précocement lors de l'étape de culture et de préférence dès la mise en culture, cet apport étant avantageusement reconduit en quantités, égales ou différentes, à différents moments ultérieurement au cours de l'étape de culture. Par exemple, l'apport en précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle peut être fractionné en quatre apports, lorsque la durée de la culture est par exemple voisine de 3 jours. Le procédé de l'invention est caractérisé dans un mode de réalisation particulier, en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % et 0,10 % (v/v), de préférence voisine de 0,03 % (v/v). La quantité de ricinoléate de méthyle introduite dans la culture peut être aménagée en fonction du résultat recherché. Avantageusement, la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est voisine de 0,07 % (v/v) jusqu'à l'obtention d'une quantité totale ajoutée comprise entre 0,1 % (v/v) et 5 % (v/v), avantageusement entre 0,03 et 0,7 % (v/v) en fin de culture. Pour la culture avec Sporobolomyces odorus, on optimisera les différents paramètres pour la réalisation du procédé en fonction de la quantité de composés que l'on cherche à produire et lorsque ces composés sont des arômes tels que la y-décalactone ; ces paramètres peuvent être choisis de façon à produire entre 50 mg/1 et 1 g/1, par exemple entre 50 mg/1 et 700 mg/l, notamment entre 50 mg/l et 150 mg/l de y-décalactone en phase aqueuse. De façon générale, la quantité totale et la quantité de chaque fraction de précurseur ajouté est déterminée en fonction de son influence sur la réaction de bioconversion, de la toxicité éventuelle des composés produits sur le développement des souches de micro-organismes et en fonction de la durée de l'étape de culture. Le procédé de l'invention est ainsi caractérisé en ce que l'étape de culture peut être réalisée pendant une durée variable et en particulier peut être conduite pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours, par exemple jusqu'à 10 jours, notamment une durée minimum de 24 h, en particulier une durée comprise entre 24 et 72 heures. Avantageusement, pour optimiser les paramètres de la réalisation du procédé, on utilise une densité cellulaire (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15. Avantageusement, la densité optique initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15 ou entre 5 et 10. D'autres composés peuvent encore être ajoutés au milieu de culture et en particulier on utilisera avantageusement des tensioactifs tels que le Tween 20# ou des antimoussants. Les inventeurs ont observé que la production d'arômes et notamment de y-décalactone est améliorée par l'apport de ces agents tensioactifs ou antimoussants et que la densité cellulaire initiale (biomasse initiale) influence cette amélioration et que la disponibilité du précurseur dans la phase aqueuse fait varier le niveau de production de la y-décalactone. Les microorganismes susceptibles d'être cultivés en présence des substrats de l'invention peuvent être variés et peuvent notamment être choisis parmi les souches suivantes, le cas échéant après recombinaison, capables de donner lieu à la production des composés identifiés ci-après : Souches Produits Sporobolomyces odorus arômes, colorants, biomasse Yarrowia lipolytica arômes, biomasse, polyols Saccharomyces cerevisiae biomasse, ergostérol (-> vitamine D) Candida guillermondii lipides Candida utilis acides aminés (ex. : lysine, méthionine...) Candida utilis propanediol Lenzites betulina arômes Penicillium chrysogenum antibiotiques Penicillium sp. analgésiques Penicillium citrinum anticholestérolémiques Aureobasidium pullulans polysaccharides (pullula ne, etc. ) Fusarium sp. antihypertenseurs Tolypocladium inflatum immunosurpresseurs Coriolus versicolor immunostimulants Beauveria bassiana insecticides et pesticides biologiques Puccinia chondrillinna herbicides biologiques Fusarium moniliforme substance de croissance végétale Cylindrocarpon radicicola stéroïdes Lactococcus lactis arômes Aspergillus enzymes Bacillus enzymes Pseudomonas putida vitamines Bacillus ammoniagenes nucléosides Bacillus pumilus antiinflamatoires Bacilllus cereus antifongiques Bacillus thuringiensis insecticides et pesticides biologiques Claviceps purpurea alcaloïdes Streptomyces diastaticus antidiabétiques Streptomyces platensis antitumoraux Streptomyces dimorphogenes inhibiteurs d'enzymes Streptomyces hygroscopicus antihelminthes, herbicides, antiviraux (agriculture) Streptomyces cinnamonensis anticoccidiens (agriculture) Arthrobotrys irregularis nématicides biologiques De façon avantageuse, pour la réalisation de l'invention, le substrat utilisé pour la culture des microorganismes est stérilisé par tout moyen approprié et par exemple en autoclave, préalablement à la mise en culture. Le cas échéant, le substrat peut être utilisé sans stérilisation préalable. Par ailleurs, l'étape de récupération des produits formés peut être conduite de toute manière appropriée et en particulier les produits obtenus peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membranaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives. La récupération des composés peut être effectuée à l'issue de l'étape de culture ou à plusieurs reprises, en interrompant l'étape de culture à des moments déterminés par exemple en fonction de la quantité produite de composés et notamment pour tenir compte de la toxicité des composés produits à l'égard des microorganismes du milieu de culture. Alternativement, la récupération peut être effectuée in situ, notamment lorsque les composés produits peuvent présenter un certain niveau de toxicité par rapport aux microorganismes utilisés. Selon l'un ou l'autre des moments de réalisation de l'extraction, cette dernière peut être réalisée dans le même compartiment que celui de la production, par exemple dans la même cuve, ou au contraire ces deux étapes peuvent être séparées spatialement. Le cas échéant, l'étape d'extraction réalisée en continu avec la production des composés, peut influencer le rendement de la réaction. Ainsi, lorsqu'un précurseur est utilisé, en fonction de son coefficient de partage et de sa concentration dans la phase lipidique, sa disponibilité dans la phase aqueuse peut être affectée, diminuant par conséquent son utilisation par le(les) microorganisme(s). L'extraction peut également favoriser la production des composés puisque l'extraction réalisée en continu ou de façon déterminée en alternance avec la production, diminue l'activité toxique éventuelle des composés produits vis à vis du (des) microorganisme (s) dumilieu de culture. Les variantes proposées, de l'étape de récupération des composés produits sont applicables a priori quelles que soient les conditions de réalisation de l'étape de culture nécessaire à la production des composés, en particulier quels que soient les microorganismes, substrats et/ou précurseurs mis en oeuvre. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'extraction des composés produits par absorption dans la graisse végétale, est suivie d'une séparation des composés, notamment des arômes produits au moyen d'un alcool. Avantageusement, un tel procédé comprend les étapes de 1) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96 à raison de 1V/10V, 2) barattage de la solution éthanolique à -20 C pendant une heure, 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé, par exemple par filtration. L'invention a aussi pour objet le procédé d'extraction d'arômes, mis en oeuvre indépendamment de l'étape de production des arômes. Ce procédé d'extraction comprend la mise en contact du milieu en phase aqueuse contenant les arômes, avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption de tout ou partie des arômes dans la phase lipidique, ce procédé étant caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est un milieu solide à température ambiante. Les conditions de réalisation de ce procédé générales et spécifiques, décrites dans les pages précédentes sont applicables dans le cadre de sa mise en oeuvre indépendamment des conditions de production des arômes. Les caractéristiques de l'invention sont également illustrées dans les exemples et les figures qui suivent : Légende des figures Figure 1A. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et la densité cellulaire (DO à 620 nm). Figure 1B. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et le volume de mycélium. Figure 2A. Etat de cultures de S. odorus âgées de 77 heures sur différents milieux à base de vinasse. Figure 2B. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur MT2-malt. Figure 2C. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur MV2-malt. Figure 3. Evolution de la production de biomasse dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée. Figure 4. Evolution de la production de lactone dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée. Figure 5. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur l'évolution de la production de biomasse. Figure 6. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur la production de lactone. Figure 7. Evolution de la production de biomasse en fonction de la nature du composé lipidique ajouté. Figure 8. Evolution de la production de lactone en fonction de la nature du composé lipidique ajouté. Figure 9. Cinétiques de croissance et de production de y-décalactone chez S. odorus après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le précurseur est ajouté à t = 0,24, 48 et 72 h à raison de 0,06 % (v/v). La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté. Figure 10. Croissance, production de y-décalactone et rendement de bioconversion par S. odorus cultivé après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le précurseur est ajouté à t = 0,24, 48 et 72 h à raison de 0,008 % (v/v). La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté. Figure 11. Croissance de Sporobolomyces odorus en fonction de la quantité de y-décalactone présente initialement dans le milieu. Figure 12. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la croissance de S. odorus. La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté. Figure 13. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la production de y-décalactone. La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté. Figure 14. Influence de la quantité de RM apportée sur la cinétique de croissance de S. odorus en présence de HNCH (5g/flacon). # apport de 4x 0,003% de RM # apport de 4x0,06% de RM A apport de 4x0,12% de RM x apport de 4x0,18% de RM # indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés. Figure 15. Influence d'apports supplémentaires de RM, de Tween 200 et de Struktolo sur les cinétiques de biomasse et de production de y-décalactone des cellules de S. odorus ensemencées à une densité initiale de 4 en présence de HNCH (5g/flacon) #6 apports de RM : Biomasse# 4 apports de RM : Biomasse#6 apports de RM - [g-décalactone] x 4 apports de RM : [g-décalactone]. indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés. Figure 16. Cinétiques de biomasse et de production de y-décalactone lors de la culture de S. odorus ensemencée à une densité initiale de 4 en présence de TTT (5 g/flacon). A Biomasse *[y-décalactone] indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés. A. Matériel et Méthodes I. LES SOUCHES 1.1LA SOUCHE DE SPOROBOLOMYCES ODORUS La souche de Sporobolomyces odorus utilisée est la souche déposée sous la référence CBS 2636. 1.2 LA SOUCHE DE LENZITES BETULINA La souche utilisée est la souche déposée sous la référence MIC 38. Il LES MILIEUX DE CULTURE ET DE CONSERVATION DE DIFFERENTS MICROORGANISMES 11.1 SPOROBOLOMYCES ODORUS 11.1.1- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE DES SPOROBOLOMYCES ODORUS Deux milieux de culture ont été testés, afin de déterminer lequel permet la meilleure production de y-décalactone. Ces milieux peuvent être utilisés comme milieux témoins pour le test des substrats. Le premier de ces milieux a la composition suivante (JOURDAIN, 1985) : - 30 g/l de glucose - 3,5 g/l de peptone - 1 g/l d'extrait de malt - 2g/l de KH2P04 -0,13g/l de CaCI2, 2H20 - 0,01 g/l de FeS04, 7H20 - 3 g/l de MgS04, 7H20 - H20 (milieu MT1) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV1 ) qsp 1 I. Le second milieu utilisé (FERON, 1996) est formulé comme suit : - 1 g/l de glucose - 0,5 g/l de bacto tryptone -1 g/l d'extrait de levure -1 g/l d'extrait de malt - 2 g/l de casamino acides - 2 g/l de KH2PO4 - 0,13 g/l de CaCI2, 2H20 - 0,01 g/l de FeS04, 7H20 - 3 g/l de MgS04, 7H20 - H20 (milieu MT2) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV2) qsp 1 I. Dans les deux cas, le pH a été ajusté à 6 à l'aide de soude 5 N, puis le milieu a été réparti à raison de 60 ml dans des erlenmeyers de 250 ml et autoclavé 20 minutes à 120 C. Au cours des cultures, réalisées en milieu liquide, la température a été maintenue à 24 C et l'agitation à 250 rpm (tours par minute). 11.1.2 - COMPOSITION DU MILIEU DE CONSERVATION DE SPOROBOLOMYCES ODORUS La souche de Sporobolomyces odorus a été conservée sur boite de pétri à 4 C. Dans ce cas, un milieu de type MT2 a été utilisé. 15 g/l d'agarose ont été ajoutés (JOURDAIN, 1985). Le milieu ainsi obtenu a été autoclavé 20 minutes à 120 C. Il.2 LENZITES BETULINA Il.2.1. MILIEU DE CULTURE DE LENZITES BETULINA Le milieu de culture utilisé pour ce champignon basidiomycète a la composition suivante (GALLOIS, 1990) : - 10 g/l de glucose - 0,5 g/l d'extrait de levure - 0,2 g/l de KH2PO4 - 0,032 g/l de CaCI2, 2H20 - H2O (LMT) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (LMV) qsp 1 I. Le pH a été ajusté à 4,8 à l'aide de soude 5 N dans le cas de LMV et de HCI 1 N dans le cas de LMT. Les cultures, réalisées en milieu liquide dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu, ont été placées à 24 C sous une agitation de 180 rpm. 11.2.2 - MILIEU DE CONSERVATION DE LENZITES BETULINA Lenzites betulina a été conservée à 4 C sur des boites de pétri contenant un milieu préparé de la façon suivante : - dissoudre 39 g/l de potato-dextrose agar, dans de l'eau - autoclaver la solution obtenue 20 minutes à 120 C - laisser refroidir jusqu'à 45-50 C - ajouter 14 ml/l d'acide tartrique à 10% - répartir le mélange dans des boîtes de pétri. III- EVALUATION DE LA BIOMASSE PRODUITE 111.1 - CAS DE SPOROBOLOMYCES ODORUS L'évolution de la quantité de biomasse produite au cours des cultures de cette levure a été suivie en mesurant la densité optique (DO) de la suspension cellulaire à 620 nm. Au spectrophotomètre, le 0 était réalisé avec un échantillon de milieu vierge. Alternativement, des mesures de matière sèche (MS) produite ont été réalisées. Pour cela, 30 ml d'une suspension cellulaire ont été prélevés et on a mesuré la DO. Après centrifugation 5 minutes à 2 000 g de cette suspension et élimination du surnageant, le culot a été placé dans une étuve à 37 C pendant 48 heures, puis pesé. La matière sèche correspondant à différentes valeurs de DO a été pesée afin de tracer la courbe MS=f (DO) à la figure 1A. Celle-ci permet de déterminer la quantité de biomasse correspondant à une DO donnée. 111.2 - CAS DES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX Dans le cas de ces champignons, les mycélia forment des "pelets" (pelotes) lorsqu'ils sont cultivés en milieu liquide agité. La biomasse produite a été évaluée en mesurant le poids de matière sèche (MS). Pour cela, un échantillon de culture ayant un volume donné a été centrifugé 5 minutes à 2000 g dans un tube gradué. A l'issue de cette centrifugation, le surnageant a été éliminé puis le volume (V) de mycélium obtenu mesuré. Ce culot a été placé à l'étuve à 37 C pendant 48 heures et pesé. Ces mesures ont permis de tracer la courbe MS=f (V) (figure1 B). Ainsi, on a pu déduire directement du volume de mycélia obtenu la quantité de biomasse sèche correspondante. IV - DOSAGE DES ELEMENTS CONTENUS DANS LES MILIEUX DE CULTURE IV.1. EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE DES COMPOSES VOLATILS PRESENTS DANS LA PHASE AQUEUSE Avant d'être dosés, les composés volatils odorants doivent être extraits du milieu. Pour cela, la méthode d'extraction liquide-liquide par un solvant organique a été utilisée avec le pentane (C5H12). Cette technique repose sur la ion miscibilité du solvant avec le milieu de culture qui est aqueux, et sur 'affinité supérieure qu'ont pour lui les molécules aromatiques. Ainsi, les composés volatils libres passent de la phase aqueuse à la phase organique. Afin de doser les composés volatils extraits, la technique dite du standard interne a été utilisée. Cette méthode est fondée sur l'utilisation de pentane contenant un composé aromatique pour réaliser l'extraction. Le composé choisi doit présenter les caractéristiques suivantes : - être ajouté à une concentration connue, - ne pas être présent dans le milieu dont on veut extraire les composés volatils produits par les microorganismes, - avoir un comportement chromatographique (temps de rétention, aire de pic...) proche du ou des composés à extraire. Dans le cas des dosages de la lactone produite par Sporobolomyces odorus, le standard interne utilisé était le géraniol, à une concentration de 30 mg/l. Le protocole suivi était le suivant : - centrifuger le milieu 5 minutes à 2 000 g afin d'en éliminer les cellules en suspension ou les "pelets" - remplir une fiole de 25 ml avec le surnageant obtenu précédemment - ajouter 1 ml de pentane contenant le standard interne, - agiter 1 minute afin de mettre les deux phases en contact et de permettre l'extraction des composés volatils de la phase aqueuse, - laisser les phases se séparer en les laissant environ 30 minutes dans de la glace, - prélever la phase organique et la mettre dans un tube Eppendorf. Afin je déstabiliser totalement l'émulsion, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter une goutte d'éthanol absolu au mélange. IV.2. - CONCENTRATION DES ECHANTILLONS Les premiers dosages des extraits organiques ont montré que les quantités de composés volatils présentes étaient insuffisantes pour permettre des mesures fiables. Afin de remédier à ce problème, les échantillons ont été concentrés environ 5 fois. Pour cela, un flux d'air sec à très faible débit a été utilisé. A son contact, le solvant, très volatil, s'est évaporé alors que les molécules odorantes se concentraient dans le volume restant. On considère que les composés produits par les microorganismes ne s'évaporent pas, ou bien qu'ils s'évaporent dans les mêmes proportions que le standard interne. IV.3 - DOSAGE DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE AQUEUSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) # Matériel Le chromatographe suivant a été utilisé : HEWLETT PACKARD HP 5890 Séries II, muni d'une colonne capillaire en silice fondue imprégnée de Carbowax 20M (polyéthylène glycol polymérisé) de 25 m de longueur et 0,25 mm de diamètre. Les chromatographies ont été réalisées dans les conditions décrites cidessous : - gaz vecteur : azote avec un débit de 75 ml/min - gaz de combustion : mélange air/hydrogène - température- de l'injecteur : 200 C - du détecteur : 250 C - du four -> initiale :40 C -> augmentation : 4 C/min -> finale : 200 C Le chromatographe est relié à un intégrateur de type HELWETT PACKARD HP 3394A, utilisé dans les conditions suivantes : - atténuation (ATT2A):0 - vitesse du papier (CHT SP): 0,5 cm/min - sensibilité (PK WD): 0,04 - discrimination (THRSH) : 0 # Principe de la quantification des composés à l'aide du standard interne La quantification des composés produits a été établie de la façon suivante : une CPG à partir d'une solution contenant 30 l/l de standard interne et 30 l/l du composé à doser a été réalisée : la lactone dans le cas des cultures de Sporobolomyces odorus. Ceci a permis de calculer le rapport existant entre les aires de pic des deux molécules sachant qu'elles sont présentes à la même concentration. Ainsi on obtient : Concentration composé x = (airecomposé x / airestandard interne)* coefficient de réponse où le coefficient de réponse (CR) a la valeur suivante : CR= 30ut/t*(airegtandard sterne à 30tj!//3"'Sconiposé x à 30 pl/1) B. Production de composés volatils odorants à partir de vinasse, en présence de S. Odorus et facultativement Ricinoleate De Methyle @ ETUDE DU COMPORTEMENT DE SPOROBOLOMYCES ODORUS SUR VINASSE Pour déterminer si la vinasse n'exerce pas une inhibition sur le développement ou le potentiel de bioproduction de la levure, on a fait croître S.odorus sur un milieu ayant la même composition que celui utilisé comme témoin (MT) mais en remplaçant l'eau, qui servait de solvant aux différents constituants, par de la vinasse concentrée trois fois et préalablement centrifugée afin d'éliminer les impuretés en suspension qu'elle contient. Après 72 heures de culture, la DO est de 12 (tableau 1), c'est-à-dire comparable à celle obtenue sur le milieu MT2. Ces résultats ajoutés au fait que la présence de y-décalactone a été détectée montrent que les éléments contenus dans la vinasse ne perturbent ni la croissance de la levure, ni la production de lactone. Tableau 1 : Production de biomasse de S. odorus après 72 heures de culture dans différentes conditions MV1 MV2 milieu MT1 MT2 MV1 MV2 pH=3,2 pH=3,2 DO 7,0 12,6 10,0 12,0 3,2 6,6 à 620 nm lactone +++ +++ ++ ++ -+ -+ 1. Evaluation de l'effet du pH de la vinasse sur le développement de la levure La vinasse ayant un pH très acide (environ 3,2) et tamponné, il faut une assez grande quantité de soude (environ 6 g/l) pour l'amener au pH optimal de la levure qui est de 6 (FERON, 1996). On a recherché si de telles quantités de soude ne perturbent pas le développement de la levure et si le pH initial du milieu à base de vinasse ne permettrait pas une croissance et une production satisfaisante. Pour cela une culture sur un milieu identique à celui précédemment décrit, sans ajustement de pH a été réalisée Sporobolomyces odorus se développe beaucoup moins bien (la DO était de 6,6), et surtout que la production de lactone se trouve très affectée (tableau 2). Ceci permet de dire qu'un pH de 3 ne permet ni un développement correct de la levure, ni le maintien de son potentiel de production de lactone par rapport aux essais réalisés sur vinasse à pH6. 2. Recherche d'un milieu standard optimal de développement de Sporobolomyces odorus A l'issue de ces premiers résultats, la composition du milieu utilisé a été optimisée pour déterminer si la vinasse pouvait servir de substrat pour la production de lactone. La formulation du milieu a été modifiée en éliminant certains composés : - milieu vinasse sans extrait de malt - milieu vinasse sans casamino acides - milieu vinasse sans glucose. Après 77 heures de culture, les productions de biomasse et de ydécalactone ont été évaluées (figure 2A). Ces mesures font apparaître que sans extrait de malt, la croissance de S. odorus est améliorée. En revanche, le fait d'éliminer les casamino acides du milieu ne semble avoir aucun effet sur le développement de la levure et sur la production de lactone puisque les résultats obtenus sont comparables à ceux observés sur le milieu MV2. Enfin, le fait de supprimer le glucose semble avoir un impact négatif sur la production de lactone, puisque celle-ci est considérablement diminuée. Le milieu sans malt peut donc être choisi comme milieu de référence (MT2-malt) pour réaliser des cinétiques de croissance, de production, d'évolution du pH et de la concentration en glucose et en lactone sur ce milieu contenant ou non de la vinasse (figures 2B et 2C). 3. Production de la y-décalactone sur de la vinasse non complémentée Après avoir mis en évidence que tous les éléments contenus dans le milieu vinasse standard ne sont pas indispensables au développement de la levure et à sa production de composés volatils, sa capacité à se développer et à produire sur de la vinasse non complémentée a été testée. Pour cela des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées sur de la vinasse pure et concentrée trois fois. Les résultats obtenus montrent que S. odorus est capable de se développer et de bioproduire dans ces conditions, c'est-à-dire sans aucun apport glucidique (figures 3 et 4). Au bout de 77 heures, les cultures atteignent une DO de 14,3. Cette DO permet d'affirmer que la levure se développe de manière satisfaisante, même si la DO reste inférieure à celle obtenue dans les conditions standards qui est de 18. En ce qui concerne la concentration de lactone, elle atteint respectivement 1,14 mg/l dans les conditions de référence et 1,02 mg/l sur de la vinasse non complémentée. Il semble donc que les éléments contenus dans la vinasse suffisent à la croissance de S. odorus et au maintien de sa capacité de production. Ainsi, aucun apport glucidique ne semble nécessaire à la production de lactone. Ces résultats sont contradictoires avec ceux précédemment présentés, mais ils seraient explicables par le fait qu'il devait y avoir, dans le milieu complémenté, des éléments susceptibles de limiter l'utilisation des acides organiques de la vinasse dans le métabolisme de synthèse des lactones, soit en réagissant avec eux, soit en favorisant par leur seule présence d'autres voies de synthèse. 4. Utilisation du potentiel endogène de Sporobo/omyces odorus à oxyder l'acide ricinoléique, intermédiaire métabolique de la synthèse de la ydécalactone Afin d'améliorer la production de composés aromatiques, nous avons voulu tester la voie de la bioconversion. Cette stratégie est basée sur la capacité de Sporobolomyces odorus à utiliser l'acide ricinoléique comme précurseur dans le métabolisme de synthèse de la y-décalactone. 4. 1. Impact, sur la production de lactone, d'une addition d'huile de ricin à la vinasse La principale source d'acide ricinoléique est l'huile de ricin dans laquelle il représente environ 90% des acides gras et se trouve majoritairement sous forme de triglycérides. Afin d'étudier l'impact de l'ajout d'huile de ricin sur la production de ydécalactone, nous avons réalisé les cultures suivantes : - vinasse + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin - vinasse + 5 g/l de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin - vinasse + 10 g/l de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin. Les résultats obtenus montrent que l'apport d'huile de ricin dans le milieu ne perturbe pas le développement de S. odorus puisque dans tous les cas, la DO atteinte au bout de 77 heures de culture est proche de 14 (figure 5). En revanche, la production de y-décalactone est considérablement améliorée : elle passe de 1,02 mg/l à 6,47 mg/l, soit 6 fois plus (figure 6). D'autre part, la production est légèrement accélérée sur les milieux complémentés en glucose mais les concentrations obtenues restent inférieures à celles atteintes sans glucose exogène (figure 6). Il semble donc qu'un apport glucidique ne soit pas nécessaire à une bioconversion efficace de l'acide ricinoléique contenu dans l'huile de ricin. 4. 2. Effet d'un apport de ricinoléate de méthyle sur la production de ydécalactone Une seconde possibilité consiste à utiliser du ricinoléate de méthyle, c'est-à-dire l'ester de l'acide ricinoléique. Afin de tester l'effet d'un apport de ricinoléate de méthyle à des cultures de S. odorus sur vinasse seule, 1 ml de ce précurseur a été ajouté à des suspensions cellulaires de 60 ml âgées de 24 heures. Le suivi de celles-ci a montré que si la production de biomasse est réduite (11,06 de DO au bout de 77 heures au lieu de 14,3 sur de la vinasse seule, figure 7) celle de ydécalactone est considérablement améliorée. En effet, au lieu d'une concentration finale, au bout de 77 heures, de 1,02 mg/l sur vinasse ou de 6,47 mg/l dans le cas où nous avions ajouté de l'huile de ricin, nous avons atteint des concentrations de 28,23 mg/l (figure 8). Ce résultat est explicable par le fait que l'enzyme lipolytique intervenant dans la dégradation des triglycérides n'est pas synthétisée de manière constitutive chez cette levure. Elle deviendrait donc rapidement limitante dans l'obtention d'acide ricinoléique libre à partir d'huile de ricin. L'ajout de ricinoléate de méthyle directement utilisable remédie à ce problème et permet d'améliorer les rendements de production de lactone. 5. Influence du facteur temps sur la production de y-décalactone Ces résultats étant fort intéressants, nous avons cherché à savoir si les concentrations obtenues seraient augmentées en laissant les cellules se développer pendant 144 heures. Il s'est avéré qu'au bout de 120 heures, le milieu renferme 36,78 mg/l de lactone et 72,24 mg/l au bout de 144 heures. Autrement dit, en 1,8 fois plus de temps, la production est multipliée par 2,5. Cette augmentation de la production coïncide avec l'arrêt de la croissance cellulaire qui se produit au bout de 72 à 77 heures de culture, et renforce l'hypothèse d'un découplage entre la production de lactone et celle de biomasse. 6. Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle ajoutée Afin d'optimiser la quantité de ricinoléate de méthyle apportée, nous avons réalisé des cultures auxquelles nous avons ajouté au bout de 24 heures soit 0,83 %, soit 1,66 %, soit 10 % (v/v) de ricinoléate de méthyle. Les résultats obtenus (tableau 3) montrent que c'est en apportant 0,83 % (v/v) de cet ester que l'on obtient la teneur la plus élevée en y-décalactone dans la phase aqueuse et ce sans que la production de biomasse ne soit affectée. Tableau 2 : Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle (RM) apporté à des cultures de 60 ml au bout de 24 heures. les mesures ont été faites après 77 heures de culture. Quantité de 0 ml 0,5 ml 1 ml 6 ml RM ajoutée DO à 620nm 8,74 8,00 7,94 8,98 Lactone 1,02 32,22 27,24 18,78 en mg/l L'exploitation du potentiel de bioconversion du ricinoléate de méthyle en y-décalactone, sur de la vinasse non complémentée, par Sporobolomyces odorus présente manifestement un intérêt. En effet, grâce à un apport de 1,66 % (v/v) de ce précurseur, des concentrations de l'ordre de 45 mg/l de composé odorant sont obtenus en 144 h de culture, dont 16,9 mg/l en 77 h, ce qui constituait une nette amélioration de la production. Sans addition de précurseur la levure ne produisait que 0,95 mg/l d'arôme après 77h de culture. Cette concentration était portée à 5,7 mg/l en présence de 1,66 % (v/v) d'huile de ricin exogène. De plus, il a été montré que la production de y-décalactone augmentait avec l'apport de précurseur. En effet, lorsque l'apport de RM était de 0,83 %, la concentration de lactone après 77 h de culture était de 15,1 mg/l et de 32,5 mg/l lorsque l'addition de précurseur était de 10,0 %. L'effet inverse était observé sur le rendement de bioconversion, lequel diminue avec la quantité ajoutée de RM. Ceci est dû à un accroissement de la quantité résiduelle de RM. 6. 1 Optimisation de l'apport de ricinoléate de méthyle 6.1.1. Effet d'un apport précoce de précurseur Dans les manipulations réalisées précédemment l'apport du précurseur était effectué après 24 h de culture. Les cellules devaient alors dans un premier temps adapter leur métabolisme à la bioconversion du RM. Afin de déterminer si la présence précoce du précurseur permet d'améliorer la production en limitant ce temps d'adaptation, un apport initial de RM a été réalisé. Tableau 3 : Influence d'un apport précoce et fractionné de RM sur la croissance et la production de y-décalactone par S. odorus après 77 heures de culture. Apport de RM Témoin 0,06 % à t = 0 h + (% v/v) 0,83 % à t = 24 h 0,83 % à t = 24 h Biomasse 8,0 8,4 (DO à 620 nm) [y-décalactone] 15,1 47,7 (mgll) Les résultats obtenus, présentés dans le tableau 3, démontrent qu'un ajout de 0,06 % (v/v) de RM au temps 0, suivi d'une deuxième addition 24 h plus tard de 0,83 % (v/v), a permis d'améliorer de façon significative la production de lactone par rapport au témoin. La concentration de y-décalactone est multipliée par 3 après 77 h de culture. 6.1.2 Effet d'un apport fractionné de précurseur A la suite des résultats précédents, l'optimisation du système a été entreprise en modifiant d'une part les quantités de RM ajoutées et d'autre part, les moments auxquels elles sont apportées au milieu de culture. Dans les expériences conduites, les additions de précurseur ont été réalisées aux instants t=0, 24,48 et 72 h. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 9. Leur analyse a montré que ce fractionnement ne modifiait pas la croissance de la levure par rapport à un témoin mais favorisait considérablement les quantités de lactone produites. Au bout de 144 h, 142,7 mg/l ont été obtenus au lieu de 44,7 mg/ 1 si l'ajout était fait en une seule fois. Cette stratégie a permis d'atteindre des concentrations de 285 mg/l d'arôme au bout de 216 h. De plus, ce mode d'apport du RM a permis de minimiser les quantités de précurseur nécessaires, et d'accroître la quantité de y-décalactone présente dans la phase aqueuse. 6.1.3- Recherche des quantités optimales de précurseur à apporter Dans l'optique de déterminer la concentration de RM qui permet d'atteindre une concentration maximale de y-décalactone dans la phase aqueuse, des quantités variables de RM ont été apportées de manière fractionnée aux temps t = 0,24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4 : Influence de la quantité de RM apportée sur la production de ydécalactone et le rendement de bioconversion par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture. Les apports de RM ont été effectués à t = 0,24, 48 et 72 h. Quantité de 0,008 0,016 0,032 0,060 0,067 0,083 0;170 précurseur ajoutée (% v/v) Total ajouté (% v/v) 0,033 0,066 0,132 0,240 0,268 0,322 0,680 [y-décalactone] (phase 59,7 102,0 111,0 96,8 84,2 93,5 53,5 aq. mg/l) Rendement apparent 19,5 17,5 9,1 4,4 3,5 3,1 0,8 de bioconversion (% mlm)* * (masse y-décalactone) phase aqueuse ---------------------------------------------------------- x 100 (masse RM) apportée Le tableau 4 montre que : - le rendement apparent de bioconversion diminue parallèlement à la teneur en ricinoléate de méthyle, - les quantités de lactone produites augmentent parallèlement à la quantité de ricinoléate de méthyle exogène. Au-delà de 0,032 % (v/v), la teneur en y-décalactone diminue. Ces évolutions peuvent être expliquées par : - l'extraction de la lactone du milieu de culture est favorisée par le RM, composé dans lequel elle est plus soluble que dans le milieu de culture, - le transfert du RM serait limité par une diminution de la surface d'échange due à sa coalescence qui augmente avec la quantité apportée, - la quantité de RM résiduelle augmente avec l'apport de RM, ce qui abaisse le rendement de bioconversion observé, - un effet toxique du RM qui augmente avec l'apport, - un défaut dans la composition de la vinasse. En effet, il suffirait d'une carence en un oligo-élément pour que la synthèse de la lactone soit bloquée. La validité de ces hypothèses a été vérifiée et fait l'objet des paragraphes à venir. 6.1.4 - Recherche du potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus Afin de déterminer avec quelle efficacité S. odorus est capable de bioconvertir le RM en y-décalactone, des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées en apportant des quantités de précurseur limitantes. En effet, dans ces conditions, il n'y a pas de RM résiduel en fin de culture, comme le montrent les analyses chromatographiques, ce qui permet de déterminer le rendement de bioconversion réel. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 10. Ils font apparaître que le rendement maximal obtenu était de 24%, alors que le rendement théorique est de 55 %. Il semble donc que tout le RM apporté ne soit pas utilisé uniquement pour la biosynthèse de y-décalactone, mais qu'il intervienne également dans d'autres métabolismes de la cellule. A ce stade, il apparaît que : - l'apport séquencé de RM est préférable à une addition unique pour la production de y-décalactone, - un apport de RM en début de culture est également favorable à la production de lactone, - le potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus est de, 24% dans les conditions de culture utilisées. 6. 2 - La y-décalactone est-elle toxique ? Afin de déterminer si la y-décalactone est toxique pour les cellules, des cinétiques de croissance de la levure sur un milieu vinasse contenant soit 50 mg/l, soit 250 mg/1 de lactone ont été réalisées (figure 11). La dose 50 mg/1 de composé odorant n'affectait pas la croissance de la levure pendant les 50 premières heures de culture. Au delà, un décalage était observé. En revanche, en présence de 250 mg/l de lactone, la croissance du microorganisme était significativement inférieure. En effet, la DO maximale atteinte était de 4 au lieu de 15 dans le témoin. Ce même phénomène a déjà été observé par Feron et col. (1996) qui ont déterminé que la dose compatible avec un taux de croissance non nul des cellules est comprise entre 100 et 200 mg/l. Ceci expliquerait en partie pourquoi des concentrations de 250 à 300 mg/l de lactone n'ont pas été dépassées dans les conditions expérimentales retenues. 6. 3 - Le transfert du RM est-il limitant ? Des cinétiques de croissance et de production de lactone sur un milieu vinasse ont été réalisées en faisant appel à un tensioactif, le Tween 20 #, connu pour ses propriétés dispersantes. Celui-ci a été mélangé au RM dans les proportions un tiers-deux tiers (v/v). La solution obtenue a été ajoutée à raison de 0,09 % (v/v) au milieu vinasse aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h. Les figures 12 et 13 illustrent la production de biomasse et de ydécalactone respectivement. En ce qui concerne la croissance, celle-ci n'était pas affectée au cours des 48 premières heures de culture par la présence de Tween 20 #. Au delà un palier a été obtenu alors que les cellules continuaient de croître en l'absence de ce tensioactif. La comparaison des concentrations de lactone mesurées dans la phase aqueuse avec et sans Tween 20 permet de mettre en évidence que la présence de cet élément augmente les quantités d'arôme présents dans cette phase : on mesure 220 mg/l de y-décalactone après 120 h de culture en présence de Tween 20 # et 135 mg/l dans le témoin, ce qui représente une augmentation de 63 %. 6. 4- La composition du milieu présente-t-elle des carences ? Afin de vérifier si le blocage de la synthèse de y-décalactone n'était pas dû à une carence en un ou plusieurs oligo-éléments, des cultures de 96 h sur des milieux ayant été complémentés ont été réalisées comme suit : milieu 0 : vinasse milieu 1 : vinasse ±0,01 g/l de FeS04 - 0,13 gll de CaCI2 - 3 g/l de MgS04 milieu 2 : vinasse + 1 g/l d'extrait de levure. A ces milieux, du ricinoléate de méthyle (4 fois 0,06 %) a été ajouté aux instants t = 0,24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont rassemblés dans le tableau 5. Leur observation suggère que la croissance et la production de lactone ne sont pas fondamentalement modifiées par les apports en sels et extraits de levure. Tableau 5 : Influence de la complémentation du milieu vinasse sur la croissance et la production de y-décalactone par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture. Milieu milieu 0 milieu 1 milieu 2 Biomasse 15,8 12,1 14,8 (D.O. à 620 nm) [y-décalactone] 96,1 104,0 114,0 (mg/l) A ce stade, il apparaît que : - la composition de la vinasse n'est pas un élément susceptible de limiter la production de y-décalactone, - l'effet toxique de la y-décalactone observé au delà de 250 mg/l pourrait être à l'origine de la limitation de sa production par S. odorus, - l'effet positif du Tween 20 # sur la réaction de bioconversion suggère que la dispersion du RM pourrait améliorer la quantité de y-décalactone présente dans la phase aqueuse. 7 - Exemple de production de y-décalactone par Sporobolomyces odorus à partir de vinasses et de ricinoléate de méthyle en fermenteur PREPARATION DU SUBSTRAT : Après dissolution par chauffage et agitation des sels précipités, les particules solides contenues dans la vinasse brute sont séparées par centrifugation. Le pH de la vinasse est ajusté à 6 avec du NaOH 5 M et de l'antimousse (Struktol#) est ajouté à raison 0,01 % (v/v). STERILISATION DU SUBSTRAT ET DU FERMENTEUR : Le substrat ainsi obtenu est introduit dans le fermenteur où il est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes sous 1,4 bars. CULTURE DISCONTINUE : Le fermenteur est ensemencé à une densité optique de 0,2 (lue à 620 nm) à partir d'une préculture. Du ricinoléate de méthyle stérile est ajouté à raison de 0,06 % (v/v) à différents temps après l'inititation de la culture, soit aux temps t = 0,24, 48 et 72 heures. La température est régulée à 24 C, l'agitation à 500 rpm et l'aération à 0,4 VVM. En variante, la culture peut être réalisée en continu. Les paramètres de la réaction peuvent varier selon les indications suivantes données à titre d'exemple : PARAMETRE INTERVALLE AVANTAGEUSEMENT Température 10-50 C 20-40 C Agitation 50-1000 rpm 100-700 rpm Agitation 0,10-10 VVM 0,10-5 WM Aération 0,01-20% (v/v) 0,01-20 % (v/v) C. Extraction in situ de la y-décalactone 1. 1. Choix du système d'extraction La concentartion de 250 mg/L de y-décalactone n'a pas été dépassée lors de la production sans extraction de cette molécule odorante par Sporobolomyces odorus développée sur vinasse. Ceci est lié à la toxicité qu'exerce cette molécule sur la levure au-delà de 150 mg/l. Afin d'éviter que cette concentration seuil soit atteinte au cours de la culture, il est nécessaire de l'extraire de la phase aqueuse au fur et à mesure de sa genèse. La ydécalactone étant lipophile, son extraction in situ est réalisable à l'aide de substances hydrophobes. Le précurseur utilisé dans la biosynthèse de y-décalactone, le ricinoléate de méthyle (RM), étant lui aussi liposoluble, il est extrait au même titre, que l'arôme naturel produit. Lorsque la substance d'extraction utilisée est une huile, il s'établit un équilibre entre les phases aqueuses et lipidique. Compte tenu de la consommation par les cellules, du RM dans la phase aqueuse, il se produit un transfert du précurseur de la phase lipidique vers la phase aqueuse. Les études suivantes ont été réalisées principalement en utilisant de l'huile de noix de coco hydrogénée (HNCH) et ponctuellement du TTT comme graisse solide pour l'extraction in situ de la y-décalactone. 1. 2. Etude de la dose de précurseur à apporter dans le cas de cultures réalisées en présence de HNCH Le RM étant lipidique, il se solubilise également dans l'HNCH. La quantité de précurseur présente dans la phase aqueuse dépend alors de son coefficient de partage entre les deux phases. Ce paramètre étant largement en faveur de la phase lipidique, seule une faible quantité du RM apportée reste dans la phase aqueuse et est donc disponible pour les cellules. Il est alors probable que le précurseur, devienne limitant à la synthèse de y-décalactone, et ce d'autant plus que les cellules ne sont plus soumises à la toxicité de cette molécule. Quatre cultures ont été réalisées, recevant respectivement : # 4 x 0,03 % (v/v) de RM # 4 x 0,06 % (v/v) de RM (témoin) # 4 x 0,12 % (v/v) de RM # 4 x 0,18 % (v/v) de RM Les apports de RM ont été réalisés aux temps t= 0,24, 48 et 72 heures. Ces cultures ont été effectuées dans des Erlenmeyers de 250 ml contenant 5 g de HNCH et 60 ml de vinasse ensemencé à une densité cellulaire initiale en levures de 0,2 unités de DO620 (densité optique mesurée à 620 nm). Les résultats obtenus (figure 14) montrent que la cinétique de croissance de la levure est identique, que les ajouts de RM soient de 4 x 0,03,0,06 ou 0,12 % (v/v). De plus, la vitesse de croissance est sensiblement la même, pour tous les essais durant les 75 premières heures de culture. Par contre, un apport de 4 x 0,18 % (v/v) de précurseur améliore nettement la croissance de S. odorus. Après 150 heures de culture, la DO620 atteint une valeur de 15 contre 8 seulement dans les autres cas. En ce qui concerne la production de y-décalactone (tableau 1), elle augmente avec la dose de précurseur ajoutée et atteint 980 mg/l au bout de 312 heures de culture avec un apport de 4 x 0,18 % (v/v). Cette concentration en lactone dépasse largement celle de 250 mg/l obtenue antérieurement en absence de HNCH. Tableau I. Production de y-décalactone par S. odorus en fonction de la quantité de RM apportée et en présence de HNCH (5g/flacon). Les mesures ont été réalisées après 312 heures de culture. Quantité de RM 4 x 0,03 % 4 x 0,06 % 4 x 0,12 % 4 x 0,18 % apportée [y-décalactone, 147 265 370 980 mg/l La graisse solide utilisée (huile de noix de coco hydrogénée) s'avère donc être un bon système d'extraction de la y-décalactone. En multipliant par 3 la dose de RM apportée, il permet d'augmenter d'un facteur 4 la concentration de 250 mg/l obtenue lors des cultures réalisées en l'absence de cette "graisse d'extraction". 1. 3. Influence d'un apport de Tween 20# ou de Struktol# en présence de HNCH. L'absorption du ricinoléate de méthyle dans la graisse d'extraction ayant été constatée lors du dosage chromatographique de la y-décalactone, il nous a paru intéressant d'essayer de limiter ce phénomène par l'apport d'adjuvants, tels qu'un tensio-actif à une concentration respectueuse de l'intégrité cellulaire, le Tween 200 , ou d'un antimousse, le Struktolo , pouvant agir également en tant que vecteur de solubilisation. Les expériences suivantes ont été réalisées : # 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM, # 4 apports de 0,18 % (v/v) de rM + 0,01 % (v/v) de Struktol , # 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01% (v/v) de Tween 20#. Le RM a été apporté (seul ou mélangé aux adjuvants) aux temps t=0, 24,48 et 72 heures. Dans l'optique d'augmenter la productivité de ce système mettant en oeuvre une extracdtion in situ de la y-décalactone, 2 séries d'essais ont été réalisées; l'une à une densité cellulaire initiale de 0,2 (témoin), l'autre à une densité cellulaire initiale de 4. Tableau Il. Influence d'un apport de Tween 20# [0,01 % (v/v)) ou de STruktol# [0,01 % (v/v)] lors de la culture de S. odorus en présence de HNCH (5g/flacon) aux densités cellulaires initiales de 0,2 et de 4. L'évaluation de la biomasse et de la production de y-décalactone a été réalisée après 312 heures de culture. Conditions de culture Biomasse initiale Paramètres Témoin Strukol# Tween 20# (DO à 620 nm) Biomasse finale 17,54 9,87 9,43 0,2 Production totale de y- 810 1400 1180 décalactone (mg/L) Biomasse finale 21,37 11,97 15,38 4 Production totale de y- 1110 990 1530 décalactone (mg/L) Les résultats obtenus (tableau Il) montrent que, quelle que soit la densité initiale d'ensemencement, l'apport des adjuvants diminue la concentration cellulaire atteinte après 312 heures de culture. La production totale de lactone (tableau Il), quant à elle, est améliorée par la présence de Struktol# et dans une moindre mesure par l'apport de Tween 20# lorsque la densité cellulaire initiale est de 0,2. L'influence de ces adjuvants sur la production totale de y-décalactone diffère dans les essais réalisés avec un ensemencement cellulaire de 4. En effet, dans ce dernier cas, la concentration en lactone obtenue en présence de Struktol# (990 mg/L) est inférieure à celle du témoin (1111 mg/L). Seul le Tween 20# permet dans les deux cas d'augmenter la quantité de lactone produite. Il apparaît donc que les conditions permettant la meilleure production totale de y-décalactone sont les suivantes : Densité cellulaire initiale de 4, Apports aux temps t= 0,24, 48 et 72 heures de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01 % (v/v) de Tween 20#. 1. 4. Influence d'apports supplémentaires de précurseur. Afin de vérifier si la disponiblité du précurseur dans la phase aqueuse est bien le facteur limitant à la synthèse de lactone au-delà de 150 heures, une culture de densité cellulaire initiale de 4 est initiée. Après inoculation, la suspension est additionnée de # 0,18% (v/v) de RM # 0,01 % (v/v) de Tween 20# et # 0,01 % (v/v) de Struktol. Ces apports sont réalisés aux temps t = 0,24, 48,72, 144 et 168 heures. Ces addititifs sont utilisés dans l'optique, d'une part, de limiter la production de mousse lors de la culture (Struktol#) et, d'autre part, pour optimiser le transfert du précurseur vers les cellules à travers la membrane cellulaire Tween 20#. Les résultats obtenus (figure 15) montrent que si la croissance de la biomasse n'est pas affectée par les deux apports supplémentaires de RM, il n'en est pas de même pour la productivité de y-décalactone. Cette dernière est de 5,3 mg/l/h au cours de 150 premières heures de culture, puis elle reprend avec une vitesse de 19 mg/l/h à la suite des nouveaux ajouts de précurseur et se poursuit jusqu'à t=216 heures. La productivité totale sur les 240 heures de culture est alors de 6,66 mg/l/h. L'hypothèse émise précédemment est donc vérifiée : le transfert du RM de la phase lipidique vers la phase aqueuse devient limitant pour la production de lactone au-delà de 150 heures. Enfin, un nouvel apport de RM et d'adjuvants après 144 heures relance la production de ydécalactone avec une vitesse environ 4 fois supérieure. A cet stade, il apparaît que : #L'apport conjoint de RM, de Tween 20 et de Struktolo permet d'atteindre une productivité totale de 5,3 mg/l/h au cours des 150 premières heures de culture, # La disponibilité du RM dans la phase aqueuse est rapidement limitante à la production de lactone. Une des solutions à ce problème pourrait consister en une séparation "spatiale" des étapes de conversion du RM et d'extraction de la lactone. 1. 5. Cinétique de production de y-décalactone en présence de TTT Outre l'huile de noix de coco hydrogénée, le mélange de graisses végétales TTT a été expérimenté comme système d'extraction in situ de la ydécalactone. A cet effet, une culture de densité cellulaire initiale de 4 pourvue en TTT (5g/flacon), est additionnée de 0,18 % (v/v) de RM, 0,01 % (v/v) de Tween 20# et de 0,01 (v/v) de Struktol#. Ces apports sont réalisés aux temps t = 0,24, 48, 72, 144 et 168 heures. Les résultats obtenus (figure 16) montrent que la croissance des levures s'arrête après 72 heures de culture. Au delà, un plateau s'établit autour d'une valeur de biomasse sensiblement égale à 11. En ce qui concerne la ydécalactone, sa vitesse de production est de 6 mg/l/h au cours de la phase de croissance. Elle continue d'augmenter ensuite et garde une valeur constante de 7,8 mg/l/h. BIBLIOGRAPHIE Lee S. J., Lin S. J. et Chou C.C. : of and production of y-décalactone by Sporobolomyces odorus in jar fermentor as affected by pH, aeration and fedbatch technique", Journal of fermentation and bioengineering, 82(1), 195-199 (1995). Feron G., Dufosse L., Pierrard E., Bonnarme P., Le Quere J.L., Spinnler H.E. : "Production, identification, and toxicity of y-décalactone and 4-hydroxydecanoic acid from Sporidiobolus spp", Applied and environmental microbiology, 62(8), 2826-2831 (1996). Jourdain N., Goli T., Jallajeas J.C. : Aroma components production by immobilized cells. In Topic and flavour research, Eds Berger R. G., Nitz S., Shreier P., 1-2 April, München, D, 427-441 (1985). Gallois A., Gross B., Langlois D.: Influence of culture conditions on production of flavour compounds by 29 lignolytic Basidiomyucetes. Mycol. Res., 94 (4), 494-504 (1990). Dufossé L. H. et al : Strategies to overcome toxicity during flavour production by micro-organisms : the case of y-décalactone from Sporidiobolus salmonicolor. International Symposium on Flavours and Sensory Related Aspects March 6-7, 1997. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de composés d'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de : a) culture dans des conditions de fermentation dans un milieu en phase aqueuse, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation, b) mise en contact du milieu constitué à l'étape a) avec un milieu en phase lipidique solide à température ambiante, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption dans la phase lipidique de tout ou partie des composés produits. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat comprend un résidu de la distillation du vin et en ce que le milieu en phase lipidique est une graisse végétale ou un mélange de graisses végétales. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le microorganisme est capable de produire des arômes. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microorganisme éventuellement recombiné est une bactérie, une levure ou un champignon et est par exemple choisi parmi Sporobolomyces odorus, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Candida guillermondii, Candida utilis, Candida utilis, Lenzites betulina, Penicillium chrysogenum, Penicillium sp., Penicillium citrinum, Aureobasidium pullulans, Fusarium sp., Tolypocladium inflatum, Coriolus versicolor, Beauveria bassiana, Puccinia chondrillinna, Fusarium moniliforme, Cylindrocarpon radicicola, Lactococcus lactis, Bacillus, Aspergillus, Pseudomonas putida, Bacillus ammoniagenes, Bacillus pumilus, Bacilllus cereus, Bacillus thuringiensis, Claviceps purpurea, Streptomyces diastaticus, Streptomyces platensis, Streptomyces dimorphogenes, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces cinnamonensis, Arthrobotrys irregularis. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins un microorganisme du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes et un substrat comprenant de la vinasse. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2, 3,4 ou 5 pour la préparation d'arômes, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée comme suit : culture dans des conditions de fermentation aérobie dans un milieu en phase aqueuse, de S. odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température étant comprise entre 10 C et 50 C, de préférence voisine de 24 C. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'un précurseur favorisant la synthèse des composés recherchés, par exemple en présence d'acide ricinoléique ou de dérivé d'acide ricinoléique tels que des sels d'acide ricinoléique assimilables par le(les) microorganisme (s). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 4 à caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée comme suit : culture de S. odorus dans un milieu en phase aqueuse en présence d'un substrat comprenant de la vinasse et du ricinoléate de méthyle, dans des conditions de fermentation aérobie, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7 et la température étant comprise entre 10 C et 50 C le ricinoléate de méthyle étant introduit dans le milieu de culture de façon fractionnée au cours de l'étape de culture, jusqu'à atteindre une quantité comprise entre 0,03 et 0,7 % (v/v) à la fin de l'étape de culture. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'un apport de ricinoléate de méthyle est effectué précocement dès la mise en culture, la quantité de ricinoléate de méthyle introduite lors de l'étape de culture étant fractionnée en au moins 4 apports. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % (v/v) 0,10 % (v/v). 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2, 3,4 à 10, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée sur une durée minimum de 24 heures. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la densité optique (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15, de façon particulièrement préférée autour de 4. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend un tensioactif. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique comprend une huile de noix de coco hydrogénée ou un mélange de type TTT. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des arômes absorbés dans le milieu en phase lipidique par extraction avec un alcool. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'extraction au moyen d'un alcool comprend les étapes de 1) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96 à raison de 1V/10V, 2) barattage de la solution éthanolique à -20 C pendant une heure, 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé, par exemple par filtration. 17. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse comprenant la mise en contact du milieu en phase aqueuse contenant les arômes, avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption de tout ou partie des arômes dans la phase lipidique, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est un milieu solide à température ambiante. 18. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse selon la revendication 17, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est une graisse végétale ou un mélange de graisses végétales, par exemple une huile de noix de coco hydrogénée ou un mélange de type TTT. 19. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des arômes absorbés dans le milieu en phase lipidique par extraction avec un alcool. 20. Procédé d'extraction selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'extraction au moyen d'un alcool comprend les étapes de 1) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96 à raison 1V/10V, 2) barattage de la solution éthanolique à -20 C pendant une heure, 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé par exemple par filtration. 21. Procédé d'extraction d'arômes selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre in situ de façon continue avec la production des arômes dans le milieu en phase aqueuse. 22. Procédé d'extraction d'arômes selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la production des arômes et l'extraction des arômes sont réalisées dans des compartiments séparés.