FR 2786202 A1 20000526 FR 9814567 A 19981119 Méthode et kit d'identification d'espèces de Leishmania. L'invention a pour objet une méthode et un kit pour l'identification d'espèces de Leishmania. Les parasites protozoaires du genre Leishmania sont les agents pathogènes responsables de leishmanioses. Ces parasitoses sont largement répandues sur tous les continents à l'exclusion de l'Australie et de l'Antarctique. Pour l'année 1996, l'OMS a recencé 80 000 décès et 2 millions de nouveaux cas. La prévalence est de 3 800 000 personnes. Ces données amènent à classer les leishmanioses au 12ème rang dans les maladies. Les expressions de la maladie sont très disparates allant, chez l'homme, de la forme cutanée bénigne à la forme viscérale pouvant être mortelle. Cette diversité clinique existe également au niveau intra-espèce. Ce large spectre de symptômes rend difficile un diagnostic clinique précis et la prescription du traitement le plus efficace. On mesure donc l'importance des recherches sur ces parasites pour apporter des outils performants pour le diagnostic et les enquêtes épidémiologiques, et fournir les informations fiables en vue de l'élaboration de médicaments ou de vaccins appropriés. En particulier, l'identification génétique de l'espèce en cause apparaît fondamentale pour la formulation d'un pronostic et la prescription d'un traitement adapté pour une espèce précise. Le développement de nouveaux outils génétiques a permis d'affiner les techniques d'identification et d'utiliser ces nouvelles méthodes pour étudier l'épidémiologie moléculaire des maladies parasitaires. De nombreuses clés d'identification ont été décrites dans la littérature pour la plupart des taxons de Leishmania. Pour certains de ces taxons, la caractérisation de ces marqueurs a été réalisée sur un petit nombre de stocks, et bien souvent uniquement des stocks de référence. Dans d'autres cas, leur définition a été réalisée sans la prise en compte des différents taxons existants dans le genre Leishmania. Ces deux exemples montrent le problème posé quant à la validité de ces marqueurs diagnostics comme clé d'identification. Dans leur recherche de marqueurs pertinents pour identifier les espèces de Leishmania dans un isolat donné, les inventeurs ont utilisé les outils de la génétique évolutive sur un échantillon original de plus de 250 stocks et des souches de référence. En évaluant la validité de marqueurs de diagnostics déjà décrit et de nouveaux marqueurs, un nombre limité de marqueurs spécifiques a ainsi été défini. L'invention a donc pour but de fournir de tels moyens, à savoir une méthode et un kit, pour l'identification d'espèces de Leishmania d'un isolat permettant d'effectuer un diagnostic fiable et de mise en oeuvre aisée. La méthode d'identification d'espèces de Leishmania selon l'invention, qui comprend l'identification d'isoenzymes et/ou d'amplicons, respectivement d'extraits protéiques ou d'ADN de cultures de promastigotes provenant d'un isolat, est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'isoenzymes et/ou d'amorces d'amplification, discriminant pour la caractérisation d'un large éventail d'espèces de Leishmania. La méthode selon l'invention est plus spécialement caractérisée par l'utilisation d'un jeu d'isoenzymes comprenant la Glucose Phosphate Isomérase (GPI), Mannose Phosphate Isomérase (MPI), Nucléoside hydrolase, substrat désoxyinosine (NHD), Nucléoside hydrolase, substrat inosine (NHI), et Phosphoglucomutase (PGM), permettant de révéler 6 locus différents, et/ou d'un jeu de 2 amorces RAPD de séquence (A-10) GTGATCGCAG et (B-08) GTCCACACGG, cejeu comprenant en outre, le cas échéant, les amorces de séquence (B-10) CTGCTGGGAC ; (F-04) GGTGATCAGG ; (N-13) AGCGTCACTC ; (N-16) AAGCGACCTG ; (N-20) GGTGCTCCGT ; (R-07) ACTGGCCTGA et (U-12) TCACCAGCCA. Les enzymes ont été choisies en fonction non seulement de leur caractère discriminant mais également sur la base de leur facilité de réalisation et d'utilisation. En effet, par exemple, l'ACON et la 6PGD sont des enzymes fragiles qui requièrent des précautions spéciales à la conservation du matériel protéique, et supportent difficilement de nombreuses congélations et décongélations. D'autres enzymes, comme l'ALAT , la GOT et les PEP ont des conditions de révélations spéciales (voir Annexe 1-5). Ces exigences, entraînant d'importantes difficultés techniques, conduisent à ne pas considérer ces différents systèmes enzymatiques comme des marqueurs simples d'emploi. La sélection d'isoenzymes de l'invention permet d'effectuer une identification d'espèce pour un nouvel isolat en minimisant le plus possible le risque d'erreur. Les amorces RAPD retenues pour les différents taxons et groupes génétiques étudiés sont choisies en fonction de leur spécificité, mais également en fonction de leur facilité d'interprétation. On remarquera de plus qu'une même technique est utilisable pour toutes les amorces et toutes les Leishmania. L'invention vise en particulier l'utilisation des amorces GTGATCGCAG (A-10) et GTCCACACGG (B-08), qui sont suffisantes à elles seules pour identifier toutes les espèces de Leishmania. Selon un aspect avantageux la technique RAPD fournit des fragments d'ADN spécifiques pouvant être isolés et analysés par séquençage. Ils donnent donc la possibilité de synthétiser soit des sondes spécifiques, soit des amorces spécifiques pour l'élaboration de PCR- diagnostic. Leur séquençage permet de vérifier leur valeur en tant que marqueur synapomorphe. L'invention vise également des kits ou trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre d'une méthode d'identification telle que définie ci-dessus. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent : - un jeu de 5 enzymes et/ou un jeu d'au moins 2 des 9 amorces RAPD identifiées ci-dessus avec, le cas échéant, les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils électrophorétiques, et - une notice d'utilisation. De tels kits peuvent être aisément mis en oeuvre en routine au laboratoire, en permettant d'effectuer un processus rapide d'identification. L'invention fournit ainsi des clés d'identification fiables pour la caractérisation des Leishmania, basées sur l'utilisation de marqueurs spécifiques des taxons de Leishmania, procurant des bases pour le diagnostic et les enquêtes épidémiologiques, mais également pour l'élaboration de médicaments ou de vaccins. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés avec la description de modes de réalisation et d'application de l'invention. Exemple 1 Marqueurs diagnostics pour l'épidémiologie génétique des Leishmania On rapporte ci-après les résultats d'études par la technique isoenzymatique et par la technique RAPD, effectuées sur 297 stocks de Leishmania. 1 - Echantillons étudiés . Stocks de référence 43 stocks sont utilisés comme souches de référence. Il s'agit de stocks référencés par l'OMS ou déjà décrits et utilisés comme références dans la littérature. Dans le tableau 1, on donne la liste de ces stocks, l'hôte sur lequel ils ont été prélevés, le pays d'isolement et l'espèce à laquelle ils appartiennent. TABLEAU 1 Code OMS Hôte Pays Espèce MHOMiBO/84/LPZS9S* Homme Bolivie L eishmania (Viannia) braziliensis MHOM,BO/84r'LPZ440 Homme Bolivie L (V.) braziliensis MHOM/BR/75/M2903* Homme Brésil L (V.) braziliensis MHOMrBRl75/M2904* Homme Brésil L (V) brazihensis MHOM CO/83LEM469 Homme Colombie L (V.) braziliensis MHOM/BR/78/M5378* Homme Brésil L (V.) guyanensis MHOM'TG/84'TH66 Homme Guyane Française L (V.) guyanensis MHOM/FG/85/LEM669 Homme Guyane Française L (V) guyanensis MCHO,'FGr83ICAY A 116* Edenté Guyane Française L (V) guyanensis MHOM/SR/87/TRUUS4 Homme Surinam L (V) guyanensis MHOM/FG/85/HI97 Homme Guyane Française L. (V) guyanensis MHOMfPA/7liLS94* Homme Panama L. (V.) panamensis MCHO;PA/001755* Edenté Panama L. (V.) panamensis MHOM/BR/81/M6426* Homme Brésil L. (V. ) lainsoni MDAS/BR/78r'M5210 Edenté Brésil L. (V.) na iffi IHARCO/86/CL500 Lutzomyia hartmanni Colombie L. (V.) colombiensis MCHO/EC/82/'LSP 0 Edenté Equateur L. (V.) equatorensis MHOM,BR'72r'LTB012 Homme Brésil L. (Leishmania) amazonensis lFLArBR'671PH8* Lutzomyiajlaviscutellata Brésil L. (L) amazonensis MHOMiBR,,'73iM2269 Homme Brésil L. (L.) amazonensis ? ? ? L. (L) forattinii MNYCBZ/62r1vf379* Rongeur Belize L. (L.) mexicana MHOM/VE/S7/LU* Homme Venezuela L (L) pifanoi MHOM/MA/67/TTMAP263* Homme Maroc L (L) infantum MHOM 'TNl80iTPT Homme Tunisie L.(L.) infantum MHOM fBRi79/L 1 0 1* Homme Brésil L. (L) chagasi MHOM,MR/74/PP75* Homme Brésil L. (L) chagasi MHOM/ET/67!}ill3 Homme Ethiopie L. (L.) donovani MHOM/IN/61/L13 Homme Inde L (L.) donovani MHOM/ET/63/LRC-U33* Homme Ethiopie L. (L.) donovani MHOM7L/81/FRIEDLIN* Homme Israël L. (L) major MHOM/SA/00/MAJSCH* Homme Arabie Saoudite L (L) major MHOMr'SU/73/SASKH* Homme URSS L (L.) major MHOM/SU/74[K-27* Homme URSS L (L ) tropica MHOM/NI/89/XD09 Homme Nicaragua Hybride L. (V.) panamensislL (V.) braziliensis MHOM/NI/88/XD1 Homme Nicaragua Hybride L (V.) fJanamensislL (V.) braziliensis MHOM!NI/89/XD20 Homme Nicaragua Hybride L (V) panamensislL. (V.) braziliensis MORY/PA/68/GML3 Rongeur Panama L aristidesi MCOEfBR/74'M2674 Rongeur Brésil L. deanei MHOM/ETiOO/'LEMI09 Homme Ethiopie L. (L) aethiopica MCOE/PA/65/C8 Rongeur Panama L hertigi RT AR/SN/67/G 1 0* Reptile Sénégal Sauroleishmania tarentolae RLAT/KE/54/H.U 1433 Reptile Kenya S adleri . Stocks de populations naturelles 255 stocks en provenance du Pérou, de Bolivie, de l'Equateur et du pourtour méditerranéen ont été fournis (sans identification préalable, avec pour certains l'indication seulement de la forme clinique). 2. Techniques et méthodes d'analyse 2. 1. Culture de parasites in vitro et récolte des Leishmania. Les cultures portent sur la forme promastigote du parasite, c'est-à-dire la forme flagellée présente dans le tube digestif des phlébotomes. Les stocks parasitaires conservés vivants dans l'azote liquide (-180 C) sont décongelés à 37 C et cultivés sur un milieu biphasique, le "tobie's blood agar" (ingrédients : a) la gélose : Bacto-Tryptose# (Difco) 15,0 g ; NaCl 4,0 g ; Na3P04, 12H20 5, 0 g ; KC1 0,4 g ; Bacto-Agar (Difco) 15,0 g ; eau bidistillée qsp 1000 ml. (pH 7,6, ajusté avec HC1 ou NaOH 1N) ; b) sang de lapin citraté). Ce milieu est préparé dans des tubes Corning de 15 ml dans lesquels sont transvasés le contenu du stabilat dilué volume à volume avec du RPMI- 1640 + 20 % de sérum de veau foetal. Les cultures de promastigotes sont repiquées 3 jours plus tard dans un nouveau tube avec milieu "tobie" et dilué au avec du RPMI-1640 + 10 % de sérum de veau foetal. Lorsque la concentration en formes parasitaires est satisfaisante, les stocks sont transvasés, dans des flacons de culture de 25 cm2. La culture de masse est réalisée par addition progressive de milieu et transvasement dans des flacons de taille supérieure (75 cm2, puis 150 cm2). Les stocks sont récoltés en fin de croissance exponentielle. Les cultures de 150 à 200 ml sont centrifugées une première fois à 4 C dans des tubes Falcon@ de 15 ml à 6000g pendant 30 minutes. Les tubes peuvent être équilibrés avec du PBS IX (Phosphate Buffer saline : tampon phosphate 0,01M ; NaCl 0,015 M ; 7). Le surnageant est éliminé et le culot parasitaire est resuspendu dans 10 ml de PBS IX dans des tubes Falcon# de 15 ml. Le culot resuspendu est centrifugé une 2ème fois à 4 C à 6000g pendant 15 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot est de nouveau resuspendu dans 1 ml de PBS IX dans des tubes ependorfs de 1,65 ml, préalablement pesés. Les stocks sont alors centrifugés une 3ème fois à 4 C à 12000g pendant 15 minutes. Pour cette dernière étape, le surnageant est minutieusement éliminé, puis les culots sont pesés et conservés à -80 C. Pour la cryoconservation, un volume de 1 ml de culture en phase exponentielle est transvasé dans un tube de Nunc# de 2 ml auquel on ajoute 3 % de DMSO (diméthylsulfoxide). Les parasites sont alors conditionnés pour être stockés dans l'azote par une diminution progressive de la température jusqu'à -120 C (appareil à cryoconservation de Cryo-Rivoire). Une fois le cycle de congélation terminé les stocks sont transférés en azote liquide. 2.2 Technique isoenzymatique sur plaques d'acétate de cellulose . protocoles Les protocoles utilisés sont récapitulés par Ben Abderrazak et al, dans Methods Mol. Biol. 21:361-382 . Préparation des extraits enzymatiques A partir des culots de parasites congelés et conservés à -80 C, les cellules sont lysées avec une solution hypotonique stabilisatrice d'enzymes composée de : DTT 2mM, acide amino-caproïque 2mM, EDTA 2mM. Après 20 minutes dans la glace, le lysat est centrifugé à 12000g pendant 15 min à 4 C, puis le surnageant contenant les protéines est prélevé et aliquoté. Il constitue l'extrait enzymatique et sera conservé à -80 C. Les manipulations des extraits protéiques sont effectuées en permanence dans la glace pour éviter la dégradation des enzymes. . enzymes étudiées Les 5 systèmes enzymatiques suivants ont été retenus : Glucose Phosphate Isomérase (GPI), Mannose Phosphate Isomérase (MPI), Nucléoside hydrolase, substrat désoxyinosine (NHD), Nucléoside hydrolase, substrat inosine (NHI), et Phosphoglucomutase (PGM). Ces 5 systèmes permettent l'étude de 6 locus, NHI révélant 2 locus, désignés respectivement ci-après par Nhil (locus le plus rapide) et Nhi2 (locus le plus lent). . Préparation du support Le support utilisé est une plaque d'acétate de cellulose. Elle est constituée d'une face plastifiée sur laquelle l'acétate de cellulose est fixé (de tels supports sont commercialisés prêts à l'emploi chez Helena) . La plaque d'acétate est d'abord imbibée dans un tampon d'inhibition. Les gels sont alors très délicatement séchés et les extraits enzymatiques sont déposés avec un peigne. Le peigne est constitué de 12 dents permettant le dépôt de 0,3 /il d'extrait pour 12 stocks différents. Le nombre de dépôts est fonction de l'enzyme étudiée. Le matériel d'électrophorèse provient des laboratoires HELENA (Beaumont, Texas, USA). Les réactifs chimiques proviennent des laboratoires SIGMA (USA) . Les extraits enzymatiques sortis du congélateur à -80 C doivent être impérativement conservés dans la glace et dès les dépôts effectués, replacés à -80 C pour éviter la dégradation des enzymes. . électrophorèse Les conditions de migration des enzymes sont récapitulées dans le tableau 2 suivant : Tableau 2 Enzyme Tampon d'imbibition : Tampon de migration : Voltage Temps Nombre de .. GPI Il. d..S.b.aw ; 50 0 ?/ ............ ludç Shaw : ' 100 ..! 20Q ....: 2Q ....1 2 MPI j HR:5Q% HR: 100 % 200 ; 200 20 20 5 ##"NHp""i ..j..m..mA..h....7..%.m..l...mm.,g...h...J.9.Q..%m...i......:?:9.Q.nm.L....}Q......L....m.mmL.....m.... 111 de Shaw: 75 % 111 de Shaw : 100 % bzz 30 j PGM III de Shaw: 25 % III de Shaw: 100 % 200 j 26 ' Composition des tampons d'inhibition et de migration TamponHR(laboratoireHelena) Composition :Tris,Barbital,SodiumBarbital Préparation :3sachetsqsp2litresH20 pH =8,6 IIIdeShaw Composition :Tris,Versene,Borate0,5M Préparation : Tris 60,6g Versene40g Borate 6g H2O qsp1litre pHspontané=8 L'électrophorèse est réalisée dans une cuve constituée de deux compartiments externes et de deux compartiments internes. Les deux compartiments externes sont remplis avec 50 ml de tampon de migration. Ce tampon de migration est le même que le tampon d'imbibition, plus ou moins dilué. Il est donc fonction également de l'enzyme étudiée comme précisé ci-dessus. Des éponges réfrigérantes, préalablement placées à -20 C, sont disposées dans les deux compartiments internes. Le passage du champ électrique est assuré par des bandelettes de papier-filtre qui sont mises en contact avec le tampon de migration. Immédiatement après le dépôt des extraits enzymatiques, la plaque est placée dans la cuve à électrophorèse, face plastifiée vers le haut. Les enzymes étudiées étant chargées négativement, la ligne de dépôt est placée du côté de la cathode (-) de la cuve. Une plaque de verre est disposée sur le gel avant de fermer la cuve. Le voltage et le temps de migration dépendent du système enzymatique étudié comme précisé dans le tableau 2. . révélation Après la migration, les isoenzymes sont révélées par des procédés histochimiques spécifiques. Cette révélation s'effectue sur un milieu solide constitué de 10 ml d'agarose à 1,2 % mélangé à une quantité égale d'une solution de coloration spécifique de l'enzyme à révéler. Cette solution de coloration contient les substrats, les activateurs, les enzymes de liaison, les coenzymes, les colorants et les tampons nécessaires à l'activité catalytique spécifique de chaque enzyme. La solution de coloration est ajoutée à l'agarose à 1,2 % dans un bain-marie à 60 C. Le mélange est coulé dans une boîte de Pétri et refroidi à l'obscurité pour éviter les phénomènes d'oxydation dus à la lumière. En fin de migration, la plaque d'électrophorèse est déposée sur le gel d'agarose, face plastifiée vers le haut et placée dans une étuve à 37 C. La révélation est arrêtée en plongeant la plaque dans un bain d'acide acétique à 5 %, puis dans de l'eau. La plaque est séchée à l'air libre. Les précisions concernant les solutions de coloration sont données dans le tableau 3 ci-dessous. TABLEAU Enzyme Tampon de réaction Substrats Activateurs GPÏ 2,5 ml Tris HC1 1M pH7/ H?O qsp 10ml 10 mg de fructose-6-phosphate 250 ul MgCl? 1M MPI 2*5 ml Tris HC1 ÏM "pH/HO'qsp'ÏChmï 20*mg'demânJaosë-6-pho 250 jïi MgClj ÏM NHD Ï0mÏT"HCÏ'0'ÏM*pH8 10 mg de désoxyinsosine NHÏ ÏOmÏTris'HCÏ Ï0 mgd'inosïnë PGM 2jmï'f'n'sHCnM'pH87' 2''de'guc(e-ï-posphatë 25O'(xrMgCÏ;'ï'M Enzyme ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Enzymes de liaison Coenzyme ~~~~~~~~~~~~~~Colorants GPI UI de glucose 6-phosphate déshydrogénase lOOfit de NADP à 50 mg/ml 200t de NBT à 25 mg/ml + 1001 de PMS à 30 mg/ml MPI iOUÏ de glucose phos "'Ï fdë'iADP'f5 'iÏi'iiiii'ï" ."'"'i rdÏimT'"à"i5''mgïmï'+''ï rde'PM'S'iij(i'gïmï''''' '''NHÏ)'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''ïj''Ui'dë''antiiinë'o'ë"'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''"''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''2' i''dë''NBT''à25''m:gïmr+'i i"de'pM's"àj "m:gïmf'"'' NHÏ l'5'Wdexantoeoxyde 200JXÏ de NBT "à 25 mg/mï + ÏÔÔidePMS à30 mg/mï PGM 8 UÏ glucose 6-phosphate déshydrogénase lOOui de NADP à 50 mg/ml 200jiï"de NËT à ! 25 mg/ml "+ "ÏÔÔjïi'de'PMSÏ'iïïmg/mi* . Lecture et interprétation des profils Les zymogrammes sont lus locus par locus (lecture génotypique non allélique) . Les électromorphes sont répertoriés d'après leur vitesse de migration. La bande la plus rapide est notée 1, la deuxième plus rapide est notée 2, et ainsi de suite. Chaque stock est donc caractérisé par un ensemble de génotype unilocus. Tous les stocks apparaissant identiques entre eux pour les systèmes enzymatiques utilisés sont rangés, par définition, dans un même zymodème. 2. 3 - Technique d'amplification aléatoire de l'ADN: RAPD . Extraction de l'ADN L'ADN est purifié à partir des culots parasitaires. La préparation de l'ADN comporte les étapes a) à c) suivantes : a) - La lyse des cellules et digestion : Le culot parasitaire est repris dans un volume de 400 /il de tampon de lyse (TE pH = Tris-HCl 10 mM, EDTA mM) auquel est rajouté du SDS (dodécyl sulfate sodium) à final. Une première incubation est réalisée en présence de 200 g/ml de RNAse A à 37 C pendant deux heures. La seconde incubation est effectuée pendant une nuit en présence de 200 g/ml de protéinase . b) - Déprotéinisation : Les protéines sont éliminées par des extractions successives, de volume à volume, au phénol (deux fois) et au chloroforme/alcool isoamylique (24V/1V) (deux fois). Le phénol dénature et dissout les protéines. Le chloroforme dénature les lipides, et permet d'éliminer les traces de phénol. Après chaque extraction, la solution bien homogénéisée est centrifugée à 12000 g pendant mn à 4 C. La phase aqueuse contient l'ADN, la phase organique inférieure est jetée. c) - Précipitation de l'ADN : L'ADN extrait est précipité par l'acétate de sodium 3M à 1/10 du volume et 2,5 volumes d'éthanol absolu froid, pendant une heure à-80 C. On centrifuge la solution à 12000 g pendant 15 mn à froid. L'ADN est obtenu sous forme de culot. Trois lavages successifs à l'éthanol absolu froid à 70 permettent l'élimination des sels et du SDS. Le culot lavé est séché puis resuspendu dans un volume minimum d'eau stérile. La concentration et la pureté de l'ADN sont vérifiés par mesure de l'absorbance de l'ADN extrait. . amplification On opère selon Williams et al dans Nucleic Acids Res., 1990,18 (22) : 6531-6535. Réactifs et matériel : On utilise la Taq polymérase commercialisée par Boerhinger Mannhein. Le tampon de réaction est le suivant: Tris-HCl 100 mM pH 8,3; MgC12 (6H2O) 15 mM; KCl 500 mM ; gélatinemg/ml. Les amorces d'oligonucléotides sont constituées de 10 nucléotides, et ne contiennent aucun palindrome. Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes: Amorce Séquences A-10 GTGATCGCAG B-08 | GTÇCACACGG " B-ÏO | ÇIGÇTGGGAC F-b4 ! GGTG ATCÀGG ''"N-13"""'""""""" ""'''AGCGTCACTC""" N-ÏÎ5 1 GCGACCTG N-20 GGTGCTCCGT R-07 ACTGGCCTGA U-12 TCACCAGCCA . Préparation des milieux de réaction : Chaque amplification est réalisée avec un témoin négatif (sans ADN, mais avec tous les produits nécessaires à l'amplification). 20 ng d'ADN (2 /il d'une solution à 10 ng/ l) sont amplifiés dans un milieu réactionnel spécifique d'un volume final de 60 fil (Tampon spécifique de la Taq polymérase à 1X ; solution de dNTP à 100 nM, amorce à 200 nM) en présence de 15 mUI/ l de Taq polymérase. Les échantillons préparés sont placés dans le cycleur automatique. Cycles d'amplification : Les amplifications sont réalisées sur un thermocycleur PTC-100 à effet Peltier de la marque MJ Research inc. Le programme d'amplification est constitué de 45 cycles comportant trois séquences : . dénaturation de l'ADN (1 mn à 94 C) . appariement de l'amorce (1 mn à 36 C) . synthèse de l'ADN de nova (2 mn à 72 C) Les 45 cycles sont clôturés par un cycle d'élongation final de mn à 72 C. Au total, une amplification dure environ 5h30. . Révélation Les fragments d'ADN amplifiés sont séparés selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,6 dans le tampon de migration TAE (40 mM Tris- Acétate, mM EDTA). 25 ml de chaque amplification sont mélangés avec /il de bleu de charge (0,25 de bleu de bromophénol, 0,25 de xylol cyanol FF, 15 de Ficoll type 400 (Pharmacia) ), puis déposés dans un puits du gel. Les fragments amplifiés sont séparés à 3,2 volts par cm. Le gel est ensuite coloré dans un bain de TAE contenant du bromure d'éthidium (0,5 mg/ml). Les bandes d'ADN sont visualisées sous UV et le gel est photographié. . Lecture et interprétation des profils Les profils RAPD sont lus sur le même principe que les zymogrammes. Les bandes sont codées par un nombre, commençant par pour la plus lente (donc le fragment d'ADN le plus lourd). Chaque stock est caractérisé par un ensemble de profils correspondant aux différentes amorces utilisées. A/ Résultats obtenus avec les enzymes sélectionnées, à savoir GPI, MPI, NHI, NHD et PGM On rapporte dans le tableau ci-après le code des profils obtenus pour les différents taxons et groupes génétiques. La valeur "99" signifie "données manquantes" Tableau Taxon Gpi Moi A% L (L.) infantum 6 5 9 ou 10 11 L. (L.) major 2 3 5 ou (L) tropica 2 5 5 11 (L.) aethiopica 2-4-6 4-6 12 (L.) amazonensis 8 4 0 1 ou 1-3 11 ou 13 (L.) mexicana Il 4 6 7 3 4 ZL (V.) braziliensis 4~ 7 2 ou 4 ou 5 6 6 6 (V) peruviana 4~~~~8~~~~2 6 ou (V) panamensis 4 8 5 0 10 L. (V) guyanensis 4 8 5 6 10 L (V.) lansoni 4 4 1 2 6 6 Z..ypMak 3~~~~7~~~~2665 (V) naiffi 6~~~~7~~~~373~~~13 ~ L. sp Mik 5 5 2 6 1-3 L. colombiensis 4 99 99 equatorensis 4-5 6 2 4 5 5 aristidesi 7 7 8 1 11 deanei 10~~~~8~~~~8 0~~~t~~~~~~H ~ L. hertigi II 99 3~~6~~~7 tarentolae 1 1 4 S. adleri 1-2-7 B/ Résultats obtenus avec les amorces RAPD, à savoir A-10, B-08, B-10, F-04, N-13, N-16, N-20, R-07 et U-12 Une récapitulation des synapomorphies apportées par chacune des amorces utilisées est donnée dans le tableau suivant, (le signe X signigfie que l'amorce considérée révèle un fragment diagnostic pour le taxon ou le groupe génétique à l'étude ; NT signifie non testé). Tableau Taxon A-10 B-08 B-10 F-04 N-13 N-16 N-20 R-07 I U-l Complexe donovani X X X X Complexe mexicana X X X X ~~~~~ X X Complexe brazihensls XX Complexe gMyaMMM XXX~~~~~X~~~~~X~~~~~ L. (L) major X (V) brazlliensis ~~~~~ X ~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~ L. (V.) peruviana X L. (V) lainsoni X X X L sp. Mak NT NT NT NT NT NT NT C) Marqueurs génétiques associés à des critères cliniques et/ou épidémiologiques Comme déjà indiqué, les Leishmania présentent des profils cliniques et épidémiologiques très divers d'une espèce à l'autre, mais il existe également des variations au sein d'une même espèce. Les analyses isoenzymatiques et RAPD sur L. (V. ) peruviana, ont permis d'identifier deux populations géographiques en distinguant la population de L. (V.) peruviana du Nord des Andes de la population issue du Sud des Andes. Cette distinction en deux sous-populations (Nord, Sud) présente une apparente association avec les différences de pathogénicité déjà observées. Exemple Etude épidémiologique des Leishmania dans pays Sud-américains Cette étude est basée sur les données génétiques, phylogénétiques et la définition des unités discrètes de typage et porte sur 236 stocks de populations naturelles de Leishmania isolées au Pérou, en Equateur et en Bolivie. . échantillon péruvien Les stocks ont été analysés par la technique isoenzymatique sur plaque d'acétate et certains échantillons également étudiés par la technique RAPD, à l'aide des marqueurs spécifiques identifiés dans l'exemple Sur la base des résultats obtenus, de la comparaison des profils avec ceux des stocks de référence et de l'utilisation des marqueurs spécifiques dessus, chaque stock de l'échantillon a été associé à une espèce. Les résultats obtenus mettent en évidence la présence de espèces différentes de Leishmania au Pérou: L. (V.) peruviana, L. (V.) braziliensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) guyanensis/panamensis et: L. (V.) amazonensis. stocks sont caractérisés comme des hybrides entre les espèces L. (V.) peruviana et L. (V.) braziliensis. Deux stocks appartiennent à une nouvelle unité de typage discrète décrite, L. sp. Mak. Un stock révèle un mélange des espèces L. (V.) guyanensis/panamensis et L. (V.) Jbraziiensis. Les résultats obtenus permettent de confirmer ou réactualiser les données épidémiologiques des pays sudaméricains. Elle met en évidence la présence d'espèces dans des zones où elles n'avaient encore jamais été décrites : L. (V.) guyanensis sur la côte pacifique des vallées andines au Pérou, L. (V.) lainsoni en Bolivie, mais également la confirmation génétique de la présence de L. (L.) amazonensis dans les Yungas en Bolivie. De nouvelles entités génétiques sont identifiées. Le groupe L. sp. Mak est responsable de cas de leishmaniose cutanée humaine en Bolivie et au Pérou, et il présente un risque d'évolution en leishmaniose cutanéomuqueuse. L. sp. Mik est un parasite infectant les paresseux en Equateur. On constate que des espèces très différentes circulent dans un même foyer. Ces observations suggèrent que de nombreux cycles de transmission d'espèces différentes se chevauchent ou se côtoient, ce qui confirme l'existence de mélange d'espèces chez un même hôte. Cette étude met également en évidence des stocks à caractère hybride : au Pérou, des hybrides entre L. (V.) peruviana et L. (V.) braziliensis et en Equateur, entre L. (V.) guyanensis/panamensis et L. (V.) braziliensis. D'un point de vue clinique, les données obtenues montrent qu'en Bolivie L. (V.) braziliensis provoque dans une proportion d'un cas sur deux des formes cliniques cutanéomuqueuses graves. Ce résultat montre l'importance des problèmes de santé publique engendrés par la leishmaniose. Au Pérou, ce pourcentage est plus faible mais non négligeable. Cette étude démontre également qu'à part L. (V.) braziliensis, L. (V.) lainsoni ou le nouveau groupe L. sp. Mak peuvent provoquer des cas de leishmaniose cutanéo-muqueuse. REVENDICATIONS 1/ Méthode d'identification d'espèces de Leishmania, comprenant l'identification d'isoenzymes et/ou d'amplicons, respectivement d'extraits protéiques ou d'ADN de cultures de promastigotes provenant d'un isolât, caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'isoenzymes et/ou d'amorces d'amplification, discriminant pour la caractérisation d'un large éventail d'espèces de Leishmania. 2/ Méthode selon la revendication caractérisée par l'utilisation d'un jeu d'isoenzymes comprenant la Glucose Phosphate Isomérase (GPI) , Mannose Phosphate Isomérase (MPI) , Nucléoside hydrolase, substrat désoxyinosine (NHD) , Nucléoside hydrolase, substrat inosine (NHI) , et Phosphoglucomutase (PGM) , permettant de révéler locus différents et/ou d'un jeu de amorces RAPD de séquence (A-10) GTGATCGCAG et (B-08) GTCCACACGG, ce jeu comprenant en outre le cas échéant, des amorces de séquence (B-10) CTGCTGGGAC ; (F-04) GGTGATCAGG ; (N-13) AGCGTCACTC ; 16) AAGCGACCTG ; (N-20) GGTGCTCCGT ; ACTGGCCTGA et (U-12) TCACCAGCCA. 3/ Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on utilise, comme amorces RAPD, les amorces de séquence GTGATCGCAG (A-10), et GTCCACACGG (B-08). 4/ Kits de diagnostic pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une des revendications à 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent - un jeu de enzymes et/ou un jeu d'au moins des amorces RAPD tels que définis dans la revendication ou 3, avec, le cas échéant, les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils électrophorétiques, et - une notice d'utilisation.