FR 2775686 A1 19990910 FR 9802947 A 19980309 DESCRIPTION La présente invention se rapporte à des nouveaux lipides neutres extraits de la membrane cuticulaire de la baie de Vitis vinifera L. Ces lipides peuvent être utilisés dans une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique. Les lipides neutres, extraits à partir des baies entières et/ou à partir des peaux de raisin récupérées après pressurage des baies, sont constitués par les composés présents dans les cires épicuticulaires, les cires intracuticulaires et la cutine. On rappelle que la membrane cuticulaire constitue la structure la plus superficelle de la baie de Vitîs vinifera L. Elle forme un film protecteur sur les parois externes des cellules épidermiques des baies, limitant les pertes hydriques et contrôlant les échanges gazeux. La cuticule au sens large ou membrane cuticulaire de la baie de Vitis vinifera L. est constituée de différentes zones, respectivement - des cires épicuticulaires constituées pour l'essentiel d'acides gras libres et estérifiés (cérides), d'acides terpénoïques, principalement acide ursolique et oléariolique et dérivés glycosidiques, terpénols et leurs esters, d'alcools gras, d'aldéhydes, et d'hydrocarbures (paraffines, oléfines). - de la cuticule sensu stricto formée par la cutine, polymére insoluble d'esters d'acides gras hydroxylés et/ou époxylés (acides gras aliphatiques substitués) comprenant essentiellement 16 ou 18 atomes de carbone. - de la couche cuticulaire formée par de la cutine et des cires intracuticulaires (essentiellement acides gras libres et estérifiés, alcools gras, aldéhydes, hydrocarbures). Les cérides sont des esters de poids moléculaire élevé (C36 à C72), résultant de la combinaison entre un acide gras et un monoalcool. Les acides gras libres peuvent être normaux, hydroxylés et/ou éthyléniques, de série courte (C 12 à C 18) ou de série longue (C20 à C32). Les aldéhydes et les alcools primaires contiennent des composés de 22 à 32 atomes de carbone, les hydrocarbures contiennent des composés de 17 à 35 atomes de carbone, les alcools secondaires contiennent des composés de 21 à 33 atomes de carbone et les cétones contiennent des composés de 23 à 33 atomes de carbone. La composition des cires varie selon les cépages de Viiis vinifera et le stade de maturation de la baie de raisin. Au stade fin de maturation (vendange), les cires épicuticulaires renferment généralement de 20 à 80 % d'acides terpénoiques (acide oléanolique et/ou ursolique principalement et dérivés glycosidiques), de 2 à 30 % d'alcools, de 2 à 30 % de cérides, de 2 à 30 % d'acides gras libres, de 2 à 20 % d'aldéhydes, de 2 à 20 % d'hydrocarbures. Les cires intracuticulaires renferment de 2 à 40 % d'alcools, de 2 à 40 % de cérides, de 2 à 80 % d'acides gras libres, de 2 à 40 % d'aldéhydes, de 2 à 40 % d'hydrocarbures. Les principaux acides gras constituant la cutine de la baie de raisin sont l'acide 16 -hydroxyhexadécanoïque, L'acide (9, 16) -dihydroxyhexadécanoïque, L'acide (10, 16) -dihydroxyhexadécanoïque, L'acide 18 -hydroxyoctadécanoïque, L'acide 18 -hydroxyoctadécè-9-oïque, L'acide cis 9, 10 -époxy- 1 8-hydroxyoctadécanoïque et l'acide (9, 10, 18) -trihydroxyoctadécanoïque. Les cires cuticulaires (cires épicuticulaires et intracuticulaires) sont extraites dans des solvants organiques ou systèmes de solvants (chloroforme, dichlorométhane, éther éthylique, éther de pétrole, éthyl acétate, méthanol, liste non exaustive). A titre d'exemple, les cires épicuticulaires peuvent être extraites en partie dans un bain de chloroforme pendant 5 minutes, la plus grande partie des cires intracuticulaires peuvent être extraites à reflux dans du chloroforme pendant 24 heures. Des extractions en mélange (cires épi et intracuticulaires) peuvent être obtenues dans différents solvants organiques ou systèmes de solvants pour une durée d'extraction supérieure ou égale à 30 minutes (exemple, 1 heure dans un mélange dichlorométhane-méthanol 2:1, v/v). La cutine est récupérée sous une forme pure après extraction des cires épi- et intracuticulaires et après digestion des assises cellulaires sous-jacentes (cellules épidermiques) dans des tampons de macération. Les acides gras ou sels d'acides gras de la cutine peuvent être obtenus par hydrolyse chimique de la cutine. Les baies de raisin (Vitis vinifiera L.) peuvent constituer un matériel de choix pour l'extraction de composés d'intérêt pour les industries cosmétique, dermatologique et pharmaceutique. Ainsi, les peaux de raisin peuvent être récupérées en grande quantité après pressurage des baies. Actuellement, les peaux de raisin sont essentiellement utilisées pour l'alimentation animale. Concernant l'utilisation de baies entières, selon les régions viticoles, les récoltes dépassant les quotas autorisés (rendement en poids ou en volume par surface) sont soit achetées à un prix dérisoirement faible, soit tout simplement laissées par terre. Les baies de raisin ou les peaux de raisin peuvent donc s'avérer être un matériel bon marché. L'extraction des lipides neutres de la membrane cuticulaire présente un double intérêt; quantitatif (volumes pouvant être traités sont importants), et qualitatif (propriétés des composés lipidiques extractibles). Les applications des lipides neutres extraits des cires épicuticulaires, des cires intracuticulaires et les acides gras issus de l'hydrolyse de la cutine de la baie de raisin sont multiples au regard de leur propriétés physico-chimiques et/ou de leurs activités biologiques. Ainsi, et à titre d'exemples non limitatifs, la plupart des compositions cosmétiques et dermatologiques, et certaines compositions pharmaceutiques, contiennent à une concentration plus ou moins élevée, une phase grasse qui peut être constituée par une cire végétale. Cérides (esters d'acides gras), acides gras libres et alcools gras peuvent être utilisés en tant que produits de base (excipient) et comme agents émulsifiants, par exemple pour la formulation de crèmes, pommades, savons et stick à lèvres. Les hydrocarbures peuvent être exploités pour l'extraction de parfumes. Les acides ursolique et oléanolique et leurs dérivés glycosidiques possèdent notamment de nombreuses propriétés d'intérêt pharmacologique. Différentes publications font état de leurs effets hépatoprotecteurs, anti-inflammatoires, anti-radicalaires, anti-tumoraux, anti-hyperlipidémiques, anti-ulcéreux, anti-microbiens, hypoglycémiques ou anti-cariogéniques. Ces acides terpénoiques sont généralement extraits de plantes médicinales. Aucun de ces documents ne suggére ni ne décrit l'utilisation des acides terpénoiques et de leurs dérivés extraits à partir de la membrane cuticulaire de Vitis vinifera L. Aussi, I'invention concerne toute préparation cosmétique, dermatologique et pharmaceutique contenant les composés lipidiques (cires épicuticulaires, cires intracuticulaires, cutine) extraits à partir de la membrane cuticulaire de baies de raisin (baies entières ou peaux de raisin), et utilisés soit en mélange soit après purification. L'invention concerne également les procédés d'obtention des lipides extraits dans des solvants organiques tels que chloroforme, éthanol, éther éthylique, éther de pétrole, éthyl acétate, méthanol, dichlorométhane ou hexane, pour des temps d'extraction compris entre 1 minute et 24 heures, à des températures comprises entre OOC et 900C. L'invention a encore pour objet un procédé de séparation des acides terpénoiques et de leurs dérivés glycosidiques à partir d'un mélange lipidique brut par partition de phase selon la description développée dans l'exemple 5. Exemples Dans le paragraphe suivant, nous allons décrire des exemples traitant de l'extraction des cires épicuticulaires, des cires endocuticulaires et de la cutine, à partir de baies de raisin entière ou à partir des peaux de raisin récupérées après pressurage des baies, puis des techniques de séparation des composés lipidiques. De nombreuses variations (nature des solvants utilisés, temps d'extraction, méthodes de fractionnement ...) peuvent etre réalisées, ces exemples ne sont donc pas limitatifs. Exemple 1 Extraction des cires épicuticulaires et intracuticulaires à partir de baies de raisin entières. Les baies sont plongées successivement: - dans un bain d'éther de pétrole pendant 3 minutes (extraction principalement de la fraction acides terpénoiques), - dans un bain de chloroforme pendant 5 minutes (extraction de la plupart des autres constituants des cires épicuticulaires), - dans un mélange chloroforme-méthanol (2:1, v/v) pendant 1 heure (extraction des cires épicuticulaires résiduelles et des cires endocuticulaires). Exemple2 Extraction des cires épicuticulaires, des cires endocuticulaires et de la cutine à partir de peaux de raisin récupérées après pressurage des baies. - Les peaux de raisin sont portées à ébullition dans un tampon acide oxalique (0,4 %, p/v) oxalate d'ammonium (1,6 %, p/v) pour séparer les cuticules brutes des tissus sousjacents. - Macération des cuticules brutes pendant 18 heures dans un tampon acétate de sodium (100 mM,pH 4,5) contenant 0,5 % (p/v) de cellulases et 0,1 % (p/v) de pectinases. - Les cuticules sont récupérées et rinçées à l'eau. - Les cires épicuticulaires sont extraites au dichlorométhane pendant 10 minutes. - Les cuticules sont plongées dans un bain de méthanol pendant 30 minutes puis dans un mélange dichlorométhane-méthanol (2/1, v/v) pendant 30 minutes (extraction des cires épicuticulaires résiduelles et d'une partie des cires intracuticulaires). - Les cuticules sont extraites à reflux dans du dichlorométhane pendant 24 heures (extraction des cires intracuticulaires). Les résidus insolubles constituent la cutine pure. - La cutine est dépolymérisée par hydrolyse chimique. La cutine réduite en poudre est soumise à ébullition à reflux dans 300 ml d'une solution de potasse méthanolique à 3 % (p/v). Après 24 heures, le filtrat méthanolique est desséché. Le résidu sec, sels d'acides gras issus de la saponification, est repris dans de l'eau. Les acides gras peuvent être récupérés en acidifiant la solution par de l'acide chlorhydrique. Les acides gras libérés sont extraits à l'éther éthylique. Exemple3 Les peaux de raisin sont traitées directement après déshydratation. Les cires épi-et endocuticulaires sont extraites en mélange dans un système de solvants (dichlorométhane -méthanol) pendant 1 heure à 4"C. Exemple4 Les extraits récupérés peuvent être utilisés en mélange (extrait brut) ou séparanent Les différentes catégories lipidiques sont fractionnées sur gel de silice, par cristallisation sélective ou par partition de phase. Les composés lipidiques sont dissous dans de l'hexane et l'extrait est chromatographié sur colonne de silice. Les différents solvants d'élution sont: hexane, hexane-éther éthylique 99:1 (v/v), hexane-éther éthylique 95:5 (v/v), hexane-éther éthylique 95:5 (v/v), hexane-éther éthylique 50:50 (v/v), éther éthylique, chloroforme, méthanol. Les hydrocarbures sont retrouvés dans la fraction éluée avec le mélange hexane-éther éthylique 99:1 (v/v), les cérides dans la fraction hexane-éther éthylique 95:5 (v/v), les acides gras libres dans la fraction chloroforme. Exemple 5 La purification des acides terpénoïques peut être réalisée par partition de phase. La partition est basée sur les différences d'affinité des composés pour des solvants non miscibles plus ou moins polaires (hexane et méthanol). Dans une ampoule à décanter, on additionne 1 volume de méthanol à 2 volumes d'hexane contenant les cires épicuticulaires. Après agitation douce, I'extrait est mis à décanter jusqu'à la formation de deux phases. La phase supérieure (phase hexanique) est récupérée et lavée plusieurs fois avec du méthanol. La phase inférieure (phase méthanolique) est lavée plusieurs fois avec de l'hexane. On rassemble les phases contenant soit le méthanol soit l'hexane. La phase méthanolique est constituée par les composés les plus polaires des cires épicuticulaires, en l'occurence les acides terpénoiques. Par cette technique, les acides terpénoiques sont récupérés sous une forme pure à plus de 90 %. La phase hexanique est constituée par les autres composés des cires, et notamment par les alcools gras, acides gras et esters d'acides gras. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de lipides neutres extraits de la membrane cuticulaire de la baie de Vites vinifera L. caractérisé en ce que les lipides sont extraits par des solvants organiques, pour un temps d'extraction compris entre 1 minute et 24 heures, pour une température comprise entre OOC et 900C. 2) Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce que les solvants organiques utilisés consistent en chloroforme, dichlorométhane, éthanol, éther éthylique, éther de pétrole, éthyl acétate, hexane, méthanol. 3) Procédé de traitement des lipides neutres obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on sépare les acides terpénoiques (acide oléanolique, acide ursolique et dérivés glycosidiques) se trouvant dans le mélange brut de lipides neutres extraits, par partition de phase méthanol/hexane, les acides terpénoïques se retrouvant dans la phase méthanol. 4) Nouveaux lipides neutres extraits de la membrane cuticulaire de Vitis vinifera L., obtenus selon le procédé de l'une des revendications 1 à 3. 5) Utilisation des lipides neutres obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 pour la fabrication d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique en association avec un excipient cosmétiquement, dermatologiquement ou pharmaceutiquement acceptable. 6) Utilisation des acides obtenus dans la phase méthanolique (acide oléanolique, acide ursolique et dérivés glycosidiques) par le procédé selon la revendication 3, pour leurs effets hépatoprotecteurs, anti-inflammatoires, anti-radicalaires, anti-tumoraux, anti-hyperlipidémiques, anti-ulcéreux, anti-microbiens, hypoglycémiques, anti-cariogéniques. 7) Utilisation des alcools gras, acides gras et esters d'acides gras obtenus dans la phase hexanique par le procédé selon la revendication 3, comme phase grasse dans une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique.