FR 2793258 A1 20001110 FR 9905771 A 19990506 La présente invention concerne un procédé de multiplication du virus de l'hépatite C dans des systèmes cellulaires compatibles avec la production d'antigènes et utilisables pour le diagnostic et la mise au point d'un vaccin contre l'hépatite C. Le domaine technique de l'invention est celui des cultures cellulaires permettant la réplication du virus de l'hépatite C. L'hépatite virale de type C a longtemps été décrite comme hépatite non-A non-B avant que le virus ne soit identifié comme tel en 1989. L'hépatite virale chronique de type C est désormais reconnue comme un problème majeur de santé publique. L'Organisation mondiale de la santé a estimé à 170 millions le nombre de personnes atteintes dans le monde. Bien que les symptômes initiaux comme les nausées, l'asthénie et l'ictère modéré soient peu spectaculaires, la maladie est surtout caractérisée par une évolution chronique vers la cirrhose hépatique et l'hépatocarcinome. Même si la biologie moléculaire et des études sérologiques ont permis de caractériser le virus de l'hépatite C, l'obtention d'une réplication virale sur culture cellulaire reste un moyen d'étude indispensable de la réplication du pathogène. Etant donné l'intérêt majeur de l'établissement d'un système permissif permettant l'étude du virus de l'hépatite C et la mise au point éventuelle d'un vaccin, de nombreuses recherches ont été menées dans cet objectif. Ainsi, plusieurs systèmes cellulaires ont été décrits permettant la multiplication du virus de l'hépatite C depuis sa récente caractérisation par des techniques de clonage dont les résultats et les applications sont divulgués dans le brevet européen EP 0318216 sur les vaccins et diagnostics de l'hépatite non-A non-B. Il est précisé, sans que soit apportée aucune donnée technique permettant de prouver le succès de la réplication virale, que les techniques standards de culture des flavivirus pourraient être appliquées au virus de l'hépatite C. De plus, la technique classique, connue de l'homme du métier, de sélection de souches atténuées y est suggérée par l'utilisation de passages successifs sur des cultures de tissu et/ou sur des modèles animaux. Le brevet WO 94/25064 décrit les méthodes traditionnelles de culture cellulaire in vitro appliquées au virus de l'hépatite C. Le virus utilisé provient de sérum ou de plasma de chimpanzés infectés et nécessite, par conséquent, une étape adaptative animale intermédiaire. Lors de la première infection, le virus est inoculé à différents types cellulaires provenant de reins ou /de foies de mammifères tels que le singe et la souris. L'incubation des cellules infectées est effectuée dans des conditions de température, de taux de CO2 et de sérum de veau f#tal traditionnellement utilisées pour ce type de cellules. Les infections successives sont réalisées en inoculant des cellules infectées à des cultures de cellules saines et non à partir de virus libéré dans le surnageant. Il n'y a pas de passages réalisés au sens classique qui consiste à utiliser du virus libéré des cellules. Avec l'utilisation de cellules infectées comme inoculum, l'étude du cycle viral et le criblage de substances antivirales sont impossibles. Le brevet W096/24662 décrit la réplication du virus de l'hépatite C dans des cellules de rein de singe de type Vero. Il est décrit trois passages successifs réalisés à 37 C par inoculation des extraits cellulaires. L'incubation des cellules à 37 C ne permet pas une survie cellulaire supérieure à 24 jours. Il n'y a pas persistance de la réplication du virus au-delà de trois passages. Le but de l'invention est de remédier aux inconvénients ci-dessus en proposant un procédé de multiplication du virus de l'hépatite C dans des systèmes cellulaires originaux compatibles avec la production d'antigènes et utilisables pour le diagnostic, la mise au point d'un vaccin contre l'hépatite C à faible coût ainsi que le criblage de substances antivirales. Un autre but de l'invention est d'obtenir des souches du virus de l'hépatite C adaptées en culture cellulaire permettant de le produire en grande quantité. Pour ce faire, l'invention a pour objet un procédé de culture cellulaire du virus de l'hépatite C comprenant les étapes suivantes : a. inoculation d'une souche de virus aux cellules pendant un temps suffisant pour permettre l'adsorption du virus, b. élimination de l'inoculum par lavage des cellules, c. incubation des cellules dans des conditions compatibles à leur survie et à la multiplication du virus, d. récolte du virus dans les extraits cellulaires et/ou dans les surnageants de culture, ce procédé étant caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température inférieure à 33 C, dans une atmosphère contenant de 0 à 3 % de C02 et en présence de 0 à 2 % de sérum de veau f#tal. On utilise pour ce faire une lignée cellulaire provenant d'invertébrés, d'insectes, d'arthropodes, de moustiques, en particulier de moustiques du genre Aedes et, de préférence, une lignée cellulaire provenant du moustique Aedes pseudoscutellaris de type AP61. Lorsqu'on utilise ce type de lignée, l'étape d'incubation est effectuée à une température de 28 C, dans une atmosphère contenant 0% de CO2 et en présence de 2 % de sérum de veau foetal. Le procédé objet de l'invention peut également être mis en #uvre avec une lignée cellulaire Vero provenant de reins de singe. Avec cette lignée cellulaire, l'étape d'incubation est effectuée, de préférence, à une température de 31,5 C, dans une atmosphère contenant un taux inférieur à 3% de C02 et en absence de sérum de veau foetal. Selon un mode de réalisation préférentiel et dans le but d 'effectuer des passages successifs, l'étape d'inoculation est réalisée à partir d'une souche de virus récoltée au cours de l'étape d) du procédé objet de l'invention. La souche du virus de l'hépatite C ainsi obtenue est adaptée en culture cellulaire. De préférence, après l'étape d) du procédé, la présence du virus de l'hépatite C est mesurée par la technique de la transcription inverse suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne qualitative et/ou quantitative ou par la technique de révélation immunochimique de protéines virales. Le procédé selon l'invention présente l'avantage de produire des virus infectieux en grande quantité et à faible coût. La possibilité de cultiver efficacement le virus de l'hépatite C in vitro dans des cultures cellulaires constitue un outil précieux pour l'étude des mécanismes de réplication virale, pour le développement de tests immunologiques et de traitements antiviraux. De plus, l'utilisation d'une basse température au cours de la phase d'incubation entraîne une diminution du métabolisme cellulaire des cellules Vero, permet une survie cellulaire plus longue et une réplication complète du virus de l'hépatite C. L'utilisation du virus libéré dans le surnageant comme inoculum pour les passages successifs présente un double avantage. Elle constitue la preuve d'une réplication complète du virus cultivé qui conserve ses propriétés infectieuses. De plus, elle présente l'avantage de simplifier les procédures de purification pour la production d'un vaccin, par exemple. Ainsi, elle permet d'envisager une production en masse du virus de l'hépatite C facilitée et moins coûteuse. L'adaptation du virus en culture cellulaire peut entraîner aussi une diminution, voire une disparition, de sa pathogénicité permettant la sélection de souches atténuées communément utilisées dans le développement de vaccins animaux et humains. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description détaillée, non limitative, ci-dessous. Exemple 1 :Multiplication du virus de l'hépatite C dans les cellules AP 61 au cours de plusieurs passages successifs. La souche virale utilisée est la souche GR 416 prélevée chez un donneur de sang. Ce plasma contient 5 x 105 équivalents copies virales par ml et le virus est de génotype lb. Les cellules sont cultivées à 28 C dans le milieu L15 de Leibovitz commercialisé par la Société Sigma sous la dénomination Milieu Leibovitz L15 Sigma L5520, en présence de 10 % de sérum de veau f#tal et de 10% de tryptose. Après infection, les cellules sont maintenues à 28 C dans le milieu L15 en présence de 2% de sérum de veau f#tal et de 2% de tryptose. Les cellules sont inoculées par le plasma à raison de 50 l pour 106 cellules. Après 2 heures d'incubation, l'inoculum est éliminé, les cellules sont lavées 4 fois et sont incubées dans les conditions décrites précédemment avec renouvellement du milieu tous les 7 jours. Des prélèvements de surnageants et de cellules sont réalisés régulièrement pour analyse par transcription inverse (RT) et polymérisation en chaîne (PCR) et conservés à -80 C. L'ARN est extrait par passage sur colonne de gel de silice commercialisé sous la marque QuiaAmp par la société Quiagen. La transcription inverse (RT) est réalisée en présence de l'amorce NCR2 (ATA CCG ACG TGC ACG GTC TAC GAG ACC T région 5' non codante). L'ADNc est ensuite amplifié par la technique de polymérisation en chaîne (PCR) en présence de l'amorce NCR2 et de l'amorce NCR3 (CCA CCA TGA ATC ACT CCC CTG T région 5' non codante). L'ADNc amplifié subit une électrophorèse en gel d'agarose et est transféré par capillarité sur une membrane en nylon. Il est hybridé par une sonde radioactive (sonde NCR4 : CAC TCG CAA GCA CCC TAT CAG GAG T région 5' non codante) et révélé par autoradiographie. Une autre méthode d'amplification consiste à réaliser une double PCR à partir des amorces 1CH (GGT GCA CGG TCT ACG AGA CCT C) et 2 CH (AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA) pour la première PCR, et 1TS (GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT) et 4CH (ATG GCG TTA GTA TGA GTG) pour la deuxième amplification. Le fragment de 170 pb est visualisé par migration sur gel d'agarose en présence de bromure d'éthidium. Le seuil de sensibilité de 103 copies virales par ml est vérifié par amplification concomitante d'un témoin positif d'extraction titré commercialisé sous la marque Accurun. Un témoin négatif consistant en une extraction de cellules non infectées de la plaque de culture est systématiquement intégré. Les cellules d'un passage, récoltées et conservées à -80 C, sont utilisées pour réaliser le passage suivant. Elles sont congelées et décongelées 2 fois, la suspension est alors centrifugée à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires et le surnageant est inoculé à une nouvelle culture. Des prélèvements de cellules et de surnageants de culture sont alors réalisés régulièrement et servent à nouveau pour un passage ultérieur et ainsi de suite. Le génome viral est détecté par la transcription inverse suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) sur les cellules AP 61 immédiatement après l'infection (JO). Il n'est plus détecté à J+4 alors qu'il est de nouveau détecté à J+7, J+14, J+21 et J+28 comme on peut l'observer dans le tableau I. Les cellules récoltées au jour J+28 au cours du premier passage sont congelées et décongelées 2 fois et le surnageant de l'extrait cellulaire est utilisé pour réaliser le deuxième passage. L'ARN viral n'est détecté qu'à J+28 au cours du deuxième passage. Le troisième passage est réalisé après inoculation d'une culture de cellules avec l'extrait cellulaire J+28 du deuxième passage. L'ARN viral est détecté à J+14, J+21 et J+28 au cours de ce passage. Le quatrième passage est réalisé après inoculation d'une culture de cellules avec l'extrait cellulaire du troisième passage prélevé à J+21. L'ARN viral est détecté à J+14, J+21 et J+28. Le caractère infectieux du virus de l'hépatite C (VHC) de tous les prélèvements est d'autre part déterminé par inoculation de ces échantillons à des cellules AP61, incubation à 28 C pendant au moins 21 jours et détection de l'ARN viral par RT-PCR. TABLEAU I . Détection de l'ARN du virus de l'hépatite C et du virus infectieux dans les cellules AP 61 infectées par la souche GR 416 au cours des passages successifs. Détection (+) ou non (-) de l'ARN Passages viral par RT-PCR(1) ou présence du virus infectieux(2) aux jours postinfection J+7 J+14 J+21 J+28 1er passage + + + + (a) 2ème - - - + passage (b) 3ème - + + + passage 4 eme - + + + passage (d) (a) inoculum : plasma GR 416 (b) inoculum : extrait cellulaire du premier passage prélevé à J+28 (c) inoculum : extrait cellulaire du deuxième passage prélevé à J+28 (d) inoculum : extrait cellulaire du troisième passage prélevé à J+21 (1) La RT-PCR est réalisée selon la technique décrite précédemment (2) La présence du virus infectieux est révélée par inoculation du prélèvement à des cellules AP 61 et détection de l'ARN viral par RT-PCR. Des passages sont également réalisés par inoculation du surnageant de culture de cellules AP61 infectées par le VHC. Le tableau II montre les résultats obtenus au cours de quatre passages. La détection de l'ARN viral par RT-PCR au cours du quatrième passage met en évidence le caractère infectieux du virus produit au cours des trois passages précédents. TABLEAU II : Détection de l'ARN du virus de l'hépatite C et du virus infectieux dans le surnageant de culture des cellules AP 61 infectées par la souche GR 416 au cours des passages successifs. Détection (+) ou non (-) de l'ARN Passages viral par RT-PCR(1) ou présence du virus infectieux(2) aux jours postinfection J+7 J+14 J+21 J+28 1er passage + (a) 2ème eme passage (b) 3ème eme -passage (c) 4ème eme - - + + passage (d) (a) inoculum : GR 416 (b) inoculum : du premier passage prélevé à J+28 (c) inoculum : du deuxième passage prélevé à J+28 (d) inoculum : du troisième passage prélevé à J+28 (1) La RT-PCR est réalisée selon la technique décrite précédemment (2) La présence du virus infectieux est révélée par inoculation du prélèvement à des cellules Vero et détection de l'ARN viral par RT-PCR. ino Exemple 2 : Multiplication du VHC dans les cellules Vero au cours de plusieurs passages successifs. La souche utilisée est la souche GR 416 prélevée chez un donneur de sang. Ce plasma contient 5 x 105 équivalents copies virales par ml et le virus est de génotype lb. Les cellules sont cultivées à 37 C dans le milieu M199 commercialisé par la Société Sigma sous la dénomination Milieu 199 10x Sigma M0650, en présence de 5 % de sérum de veau f#tal dans une atmosphère contenant 5% de C02. Après infection, les cellules sont maintenues à 31,5 C dans le milieu M199 sans sérum de veau f#tal. Les cellules sont inoculées par le plasma à raison de 50 l pour 106 cellules. Après 2 heures d'incubation l'inoculum est éliminé, les cellules sont lavées 4 fois et sont incubées dans les conditions décrites précédemment avec renouvellement du milieu tous les 7 jours. Des prélèvements de surnageants et de cellules sont réalisés régulièrement pour analyse en RT-PCR et conservés à -80 C. L'ARN est extrait par passage sur colonne de gel de silice commercialisé sous la marque QuiaAmp par la société Quiagen. La transcription inverse est réalisée en présence de l'amorce NCR2 (ATA CCG ACG TGC ACG GTC TAC GAG ACC T région 5' non codante). L'ADNc est ensuite amplifié par la technique de polymérisation en chaîne en présence de l'amorce NCR2 et de l'amorce NCR3 (CCA CCA TGA ATC ACT CCC CTG T région 5' non codante). L'ADNc amplifié subit une électrophorèse en gel d'agarose et est transféré par capillarité sur une membrane en nylon. Il est hybridé par une sonde radioactive (sonde NCR4 : CAC TCG CAA GCA CCC TAT CAG GAG T région 5' non codante) et révélé par autoradiographie. Une autre méthode d'amplification consiste à réaliser une double PCR à partir des amorces 1CH (GGT GCA CGG TCT ACG AGA CCT C) et 2 CH (AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA) pour la première PCR, et 1TS (GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT) et 4CH (ATG GCG TTA GTA TGA GTG) pour la deuxième amplification. Le fragment de 170 pb est visualisé par migration sur gel d'agarose en présence de bromure d'éthidium. Le seuil de sensibilité de 103 copies virales par ml est vérifié par amplification concomitante d'un témoin positif d'extraction titré commercialisé sous la marque Accurun. Un témoin négatif consistant en une extraction de cellules non infectées de la plaque de culture est systématiquement intégré. Les cellules d'un passage, récoltées et conservées à -80 C, sont utilisées pour réaliser le passage suivant. Elles sont congelées et décongelées 2 fois, la suspension est alors centrifugée à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires et le surnageant est inoculé à une nouvelle culture. Des prélèvements de cellules et de surnageants de culture sont alors réalisés régulièrement et servent à nouveau pour un passage ultérieur et ainsi de suite. Le génome viral est détecté par RT-PCR sur les cellules Vero immédiatement après l'infection (JO). Il n'est plus détecté à J+4, alors qu'il est de nouveau détecté à J+7, J+14 et J+28 (Tableau III). Les cellules récoltées au jour J+28 au cours du premier passage sont congelées et décongelées 2 fois et le surnageant de l'extrait cellulaire est utilisé pour réaliser le deuxième passage. L'ARN viral n'est détecté au cours du deuxième passage qu'à J+28. Au cours du troisième passage, réalisé après inoculation d'une culture de cellules avec l'extrait cellulaire J+28 du deuxième passage, l'ARN viral n'est également détecté qu'à J+28. Le quatrième passage est réalisé après inoculation d'une culture cellulaire avec l'extrait cellulaire J+28. L'ARN viral est détecté à J+7, J+14, J+21 et J+28 au cours du quatrième passage. Le cinquième passage est réalisé en inoculant les cellules Vero avec l'extrait cellulaire prélevé à J+28 au cours du quatrième passage. L'ARN viral est détecté à J+7, J+14, J+21 et J+28. Le sixième passage est réalisé en inoculant les cellules avec l'extrait cellulaire prélevé à J+14 du cinquième passage. L'ARN viral est détecté à J+7, J+14 et J+21. Le caractère infectieux du VHC de tous les prélèvements est déterminé d'autre part par inoculation de ces échantillons à des cellules Vero, incubation à 31,5 C pendant au moins 21 jours et détection de l'ARN viral par RT-PCR. TABLEAU III : Détection de l'ARN du virus de l'hépatite C et du virus infectieux dans les cellules Vero infectées par la souche GR 416 au cours des passages successifs Détection (+) ou non (-) de l'ARN Passages viral par RT-PCR(1) ou présence du virus infectieux(2) aux jours postinfection J+7 J+14 J+21 J+28 1er passage + + + (a) 2ème passage (b) 3ème - - passage (c) 4ème + + + + passage (d) 5ème + eme + + + passage (e) 6ème + + ± passage (f) (a) inoculum : plasma GR 416 (b) inoculum : extrait cellulaire du premier passage prélevé à J+28 (c) inoculum : extrait cellulaire du deuxième passage prélevé à J+28 (d) inoculum : extrait cellulaire du troisième passage prélevé à J+28 (e) inoculum : extrait cellulaire du quatrième passage prélevé à J+28 (f) inoculum : extrait cellulaire du cinquième passage prélevé à J+14 (1) La RT-PCR est réalisée selon la technique décrite précédemment (2) La présence du virus infectieux est révélée par inoculation du prélèvement à des cellules Vero et détection de l'ARN viral par RT-PCR. Des passages sont également réalisés par inoculation du surnageant de culture de cellules Vero infectées par le VHC. Le tableau IV montre les résultats obtenus au cours de quatre passages successifs. La détection de l'ARN viral par RT-PCR au cours du sixième passage met en évidence le caractère infectieux du virus produit au cours des trois passages précédents. TABLEAU IV : Détection de l'ARN du virus de l'hépatite C et du virus infectieux dans le surnageant de culture des cellules Vero infectées par la souche GR 416 au cours des passages successifs. Détection (+) ou non (-) de l'ARN Passages viral par RT-PCR(1) ou présence du virus infectieux ( 2) aux jours postinfection J+7 J+14 J+21 J+28 3ème - - - + passage (a) 4ème + + passage (b) Sème eme passage (c) 6ème + eme - passage (d) (a) inoculum : surnageant du deuxième passage prélevé à J+28 (b) inoculum : surnageant du troisième passage prélevé à J+28 (c) inoculum : surnageant du quatrième passage prélevé à J+14 (d) inoculum : surnageant du cinquième passage prélevé à J+14 (1) La RT-PCR est réalisée selon la technique décrite précédemment (2) La présence du virus infectieux est révélée par inoculation du prélèvement à des cellules Vero et détection de l'ARN viral par RT-PCR. L'adaptation du VHC au cours de passages successifs dans les cellules AP61 et/ou dans les cellules Vero entraîne une augmentation de la quantité de virus produit et une diminution de la durée du cycle viral. Les cellules AP61 et Vero constituent des systèmes cellulaires permettant d'étudier le cycle viral, la production des différentes protéines virales et le criblage de substances antivirales actives sur le VHC. Elles sont utilisables pour la production d'antigène viral pour le diagnostic et de virus pour la mise au point d'un vaccin. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture cellulaire du virus de l'hépatite C comprenant les étapes suivantes : a. inoculation d'une souche de virus aux cellules pendant un temps suffisant pour permettre l'adsorption du virus, b. élimination de l'inoculum par lavage des cellules, c. incubation des cellules dans des conditions compatibles à leur survie et à la multiplication du virus, d. récolte du virus dans les extraits cellulaires et/ou dans les surnageants de culture, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température inférieure à 33 C, dans une atmosphère contenant de 0 à 3 % de C02 et en présence de 0 à 2 % de sérum de veau f#tal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une lignée cellulaire provenant d'invertébrés, d'insectes, d'arthropodes, de moustiques, de moustiques du genre Aedes. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une lignée cellulaire provenant de moustiques Aedes pseudoscutellaris de type AP61. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température de 28 C, dans une atmosphère contenant 0% de CO2 et en présence de 2 % de sérum de veau f#tal. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce on utilise une lignée cellulaire Vero provenant de reins de singe. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température de 31,5 C, dans une atmosphère contenant un taux inférieur à 3% de C02 et en absence de sérum de veau foetal. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'inoculation est effectuée à partir d'une souche de virus récoltée au cours de l'étape d. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence du virus de l'hépatite C est mesurée par la technique de la transcription inverse suivie d'un réaction de polymérisation en chaîne qualitative et/ou quantitative. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence du virus de l'hépatite C est mesurée par la technique de révélation immunochimique de protéines virales.