FR 2793651 A1 20001124 FR 9906434 A 19990518 SOLUTION AQUEUSE DE CONSERVATION DE TISSUS ET D'ORGANES. L'invention se rapporte à une solution aqueuse de conservation de tissus et d'organes. Par tissus , on désigne notamment mais de façon non limitative les veines, artères, valves, vaisseaux... . Par "solution de conservation d'organes", on désigne une solution aqueuse de conservation unique apte à conserver une multitude d'organes, et notamment, mais de façon non limitative, le foie, le coeur et le rein. Après avoir été prélevés chez le donneur, le ou les organes ou les tissus, sont soumis avant d'être greffés chez un receveur, à une période inévitable d'ischémie. Il s'ensuit que les liquides mis en oeuvre pour la conservation d'organes doivent remplir simultanément trois objectifs, à savoir # laver le greffon du sang résiduel, # refroidir l'organe, # assurer une prévention et une protection efficace contre les lésions provoquées par l'ischémie. La méthode de conservation d'organes la plus répandue est la conservation hypothermique statique. Cette méthode consiste à rincer l'organe prélevé avec une solution de conservation refroidie, puis à maintenir l'organe dans cette solution jusqu'au moment de la greffe ultérieure. Cependant, cette méthode assure la conservation des organes pour seulement une période limitée, cette période ne dépassant guère 24 heures pour le rein, 12 à 18 heures pour le foie et 4 à 6 heures pour le coeur. Les liquides de conservation d'organes proposés jusqu'alors présentent des compositions différentes en fonction des organes à conserver. Ainsi, sont préconisés pour la conservation du rein, le liquide EURO COLLINS commercialisé par FRESENIUS et le liquide BELZER-VIASPAN commercialisé par DUPONT. Concernant la conservation hépatique, celle-ci peut être assurée au moyen de la solution BELZER-VIASPAN précitée. Enfin, on a proposé pour la conservation de greffons cardiaques, le liquide SAINT THOMAS commercialisé par les Laboratoires AGUETTANT. Les compositions de chacun de ces liquides figurent dans le tableau 1 ci- après. Tableau 1 SAINT-THOMAS EURO COLLINS BELZER a gnose m 30 acto sonate m 100 Glutathlon (mM) Adénosine (mM) Allopurinol m 1 riEA (mM) Hydroxyéthyl amidon 0,25 MgSv4 (MM) a 2 4 m Z5 2 4 m Glucose (MM) 42 NaC03 (MM) l9`+ 1tL1 (mM) w 10 MgCl 6H220 (MM) 16 ProLidocaïne Cm-MT- 0,Z7 NaCl (mM) 14+i a 2 m Osmolanté (mOsm/Kg) 290 370 300 On note que la solution retenue pour la conservation cardiaque est du type extracellulaire (riche en sodium), autrement dit, que la solution de conservation pour la conservation du rein et du foie est du type intracellulaire (riche en potassium). Comme déjà dit, le principal inconvénient de ces solutions est de ne pouvoir être aptes à assurer la conservation de tous les organes. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est de fournir une solution susceptible d'assurer la conservation de tout organe, et notamment du foie, rein et coeur. Un autre objectif de l'invention est de préparer une solution qui soit apte non seulement à conserver les organes, mais également à conserver les tissus. Un autre objectif de l'invention est d'augmenter la durée et la qualité de la conservation. Pour résoudre ces problèmes, l'invention propose une solution aqueuse de conservation de tissus et d'organes. Cette solution se caractérise en ce qu'elle est du type extracellulaire et en ce qu'elle comprend des ions calcium (CaZ+) et une macromolécule de poids moléculaire supérieur à 20 000. Le Demandeur a constaté que de façon surprenante, la solution de type extracellulaire de l'invention permettait d'assurer non seulement la conservation du coeur et des tissus, mais également la conservation d'organes tels que le rein et le foie, pour lesquels étaient proposées jusqu'alors des solutions du type intracellulaires. Dans la suite de la description et dans les revendications, par solution du type extracellulaire, on désigne une solution comprenant une concentration en sodium (Na+) d'au moins 30 millimoles, avantageusement 125 millimoles. Pour une concentration inférieure à 30 millimoles, on obtient une solution cardioplégique. Pour assurer le redémarrage cardiaque dans le cas de la conservation du coeur, la concentration en ions Caz+ est comprise entre 0,1 et 2 millimoles, avantageusement 0,5 millimoles. Pour une concentration inférieure à 0,1 millimoles, on n'observe pas de redémarrage cardiaque. Pour une concentration supérieure à 2 millimoles, on perturbe le fonctionnement cardiaque. Comme déjà dit, pour éviter la formation d'oedèmes tissulaires et cellulaires, la macromolécule présente un poids moléculaire supérieur à 20 000 permettant de garantir la pression oncotique. Le Demandeur a en effet constaté que de façon surprenante, les macromolécules de haut poids moléculaire permettaient d'améliorer l'efficacité du liquide de conservation d'organes et de tissus. Dans le cas de la conservation rénale, il apparaît que ladite macromolécule améliore les fonctions glomérulaire et tubulaire et produit un effet diurétique. Dans une première forme de réalisation, la macromolécule est du polyéthylène glycol purifié. Dans la suite de la description et dans les revendications, par "polyéthylène glycol purifié", on désigne un polyéthylène glycol dialysé, c'est-à-dire une poudre de polyéthylène glycol exempte de toute molécule de poids moléculaire inférieur à 15000. Avantageusement, le polyéthylène glycol purifié a un poids moléculaire égal à 35 000. En pratique, la concentration en polyéthylène glycol de la solution de l'invention est comprise entre 0,01 et 5 millimoles, avantageusement 0,03 millimoles. Pour une concentration inférieure à 0,2 millimoles, on observe la formation d'oedèmes tissulaires et cellulaires. Pour une concentration supérieure à 5 millimoles, la viscosité de la solution n'est pas satisfaisante. Dans une autre forme de réalisation, la macromolécule est une molécule de dextran. Selon une autre caractéristique de l'invention, la solution aqueuse de conservation de l'invention comprend en outre un anion imperméant, un sucre, un agent stabilisant de membrane, une solution tampon, un agent antiradicalaire et une source d'énergie. Par ailleurs, pour obtenir une solution du type extracellulaire, le pH de la solution de l'invention est compris entre 6,5 et 8, avantageusement 7,4. Dans une forme de réalisation avantageuse, la solution aqueuse de conservation comprend en outre - de 20 à 40 millimoles de raffinose, - de 70 à 140 millimoles d'acide lactobionique, - de 1 à 10 millimoles de MgS04, - de 10 à 40 millimoles de KH2p04, - de 1 à 6 millimoles de Glutathion, - de 1 à 10 millimoles d'Adénosine, - de 1,5 à 5 millimoles d'Allopurinol. Dans une forme avantageuse, la solution aqueuse de conservation de l'invention comprend l'osmolarité de la solution finale étant égale à 300 millimoles par kilogramme. La solution de conservation de l'invention s'applique à la conservation hypothermique statique et est utilisée à une température comprise entre 2 et 10 C, avantageusement 4 C. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation ci-après. Exemple 1 Préparation de la solution aqueuse de conservation multi-organes de l'invention On prépare une solution aqueuse de conservation dont la composition est reproduite dans le tableau 2 suivant Tableau 2 Concentration (mM) a inose 30 acto sonate 100 Glutathion réduit s Adénosine 5 Allopurinol 1 PEU 1 v io (35000) 0, 0 29 MgJV4. /t120 J su i2a v4 a 2, 2 La préparation de la solution consiste à dissoudre l'ensemble des constituants dans une solution aqueuse, le pH de la solution obtenue étant ramené à 7,4. Exemple 2 On a comparé dans cet exemple les performances de la solution aqueuse de conservation de l'invention sur le rein et le foie au regard de la solution BELZER- VIASPAN commercialisée par DUPONT. Pour ce faire, les essais sont réalisés sur des organes isolés et perfusés selon des techniques connues. Pour l'essentiel, ces techniques consistent en l'isolement total ex-vivo de l'organe et en sa perfusion avec une solution artificielle du type KREPS Henseleit-bicarbonate enriche en substrat énergétique et contenant de l'albumine. On distingue dans cet exemple trois groupes différents # Groupe A : groupe contrôle directement perfusé avec la solution artificielle sans conservation préalable ; # Groupe B : organe conservé pendant une période d'ischémie de 24 heures à une température de 4 C dans une solution de conservation BELZER- VIASPAN avant re-perfusion avec la solution artificielle ; # Groupe C : organe conservé pendant une période de 24 heures d'ischémie à une température de 4 C dans la solution de conservation de l'invention. II Conservation hépatique Pour apprécier l'efficacité de la solution de conservation de l'invention sur la conservation hépatique, on a étudié les paramètres suivants a) Paramètres fonctionnels 1 - Variation du débit biliaire Le débit biliaire après greffe est un indice de bon fonctionnement du foie. Les débits biliaires ont été calculés après une période de conservation hypothermique de 24 heures. Les résultats figurent dans le tableau suivant (tableau 3). Pour le groupe A, le débit biliaire est stable pendant les deux heures de perfusion. Comme le montre le tableau, le débit biliaire est minimal pendant les 30 premières minutes de perfusion, puis augmente jusqu'à atteindre un maximum au bout de 60 minutes pour rester stable durant la deuxième heure de perfusion. On constate que le foie conservé dans la solution de l'invention (C) présente le débit biliaire le plus élevé (0,56). 2 - Excrétion du vert d'indocyanine dans la bile Le vert d'indocyanine en se fixant rapidement sur les protéines plasmatiques se distribue dans le volume vasculaire. Il est spécifiquement épuré par le foie et concentré dans la bile. La présence du vert d'indocyanine dans le foie dépend du débit de perfusion et son excrétion dépend du statut énergétique des hépatocytes. II s'ensuit que ce paramètre donne non seulement des informations sur l'intégrité des cellules endothéliales, mais également des informations sur l'intégrité des hépatocytes Le pourcentage d'excrétion du vert d'indocyanine dans la bile a été représenté dans le tableau suivant (tableau 4). Tableau 4 Excrétion u vert d'indocyanine dans la bile Moyenne 41 11 29 On constate que la clairance du vert d'indocyanine est plus faible pour la conservation du foie dans la solution B que dans la solution C de l'invention, qui apporte donc une amélioration significative. b) Paramètres biochimiques 1 - Variation d'activité des transaminases Les transaminases (ALAT et ASAT) sont des enzymes intracellulaires. Leur présence dans le perfusat témoigne d'une lyse cellulaire. Les résultats sont représentés dans le tableau ci-après (tableau 5). Tableau 5 Moyenne 30 min 4 13 Moyenne 60 min 5 i a 14 Moyenne 9u min y 25 i v Moyenne 1200 min 13 31 18 Moyenne 30 min 34 61 44 Moyenne 60 min 43 71 59 Moyenne 9u min 50 8o 67 73 Moyenne 1200 min 70 107 On constate que le foies perfusés avec la solution B de type intracellulaire libèrent plus d'ASAT et d'ALAT que les foies conservés dans la solution de l'invention de type extracellulaire (C). De plus, le remplacement de l'hydroxyéthylamidon de la solution B par le polyéthylène glycol entraîne une importante diminution de la lyse cellulaire. Enfin, on constate qu'il n'y a aucune différence de lyse cellulaire entre le foie perfusé par le liquide de conservation A par rapport au foie perfusé par le liquide ce conservation C. 2 - Variation d'activité des créatine kinases La créatine kinase (CK-BB) est une isoenzyme qui se trouve spécifiquement dans les cellules endothéliales. Sa libération dans le liquide de perfusion montre donc une lyse de ces cellules. Au cours de la conservation en ischémie froide, les cellules endothéliales subissent des lésions sévères. La perte de viabilité des cellules endothéliales n'a lieu qu'après perfusion et le taux de mort cellulaire dépend de la qualité de la conservation et donc, de la solution de conservation. Le temps 0 référencé dans le tableau ci-après (tableau 6) correspond à la remise en perfusion des greffons. Dans ces conditions, le liquide récupéré est le liquide de conservation gardé 24 heures dans le foie. L'activité CK-BB dosée est donc un marqueur de la lésion des cellules endothéliales subie pendant la période de conservation. On remarque que la solution C protège bien les cellules endothéliales. Tableau 6 Moyenne i u-CK titi 32 81 33 Moyenne i 3v-CK t513 i 40 34 Moyenne (CK UIIL/g) CK BB 0,004 0,022 0,022 II - Conservation du rein On a comparé l'efficacité du liquide de conservation de l'invention (solution C) par rapport au liquide BELZER-VIASPAN (solution B) et EU-RO COLLINS (solution D). Pour ce faire, on a étudié les paramètres suivants. a) Variation du débit urinaire Le débit urinaire après greffe témoigne du mauvais ou bon fonctionnement rénal. Les résultats sont représentés dans le tableau ci-après (tableau 7). Comme le montre le tableau, le débit urinaire des reins perfusés par le liquide A reste inférieur au débit urinaire des reins sans conservation préalable. En revanche, les reins conservés dans la solution de l'invention présentent le débit le plus important. b) Clairance de l'inuline Ce paramètre permet de mesurer la fonction glomérulaire du rein et donne des informations sur le débit de filtration glomérulaire. Les résultats sont représentés dans le tableau 8. Tableau 8 Clairance de l'inuline (lillmin/g) Moyenne et 512.43 f 109.8 49.42 . . Comme le montre ce tableau, la clairance de l'inuline est plus faible avec la conservation du greffon dans la solution B. En revanche, la solution C de l'invention présente une amélioration significative. c) Réabsorption de sodium Le taux de réabsorption de sodium permet de mesurer la fonction tubulaire rénale. Les résultats sont représentés dans le tableau 9 ci-après. Tableau 9 l'aux de réabsorption de sodium ("/o) oyenne et . . . . . 15.18 3.3 4:47 Comme le montre ce tableau, la réabsorption de sodium est plus faible pour les reins conservés avec la solution B que pour les reins conservés avec la solution C. Les avantages de l'invention ressortent bien de la description. On notera notamment la capacité du liquide de conservation de l'invention à conserver tout organe, que ce soit foie, coeur, rein ou autre. On note en outre l'amélioration des performances du liquide de l'invention sur les paramètres biochimiques et fonctionnels des organes perfusés par rapport aux liquides de conservation actuellement commercialisés. REVENDICATIONS 1/ Solution aqueuse de conservation de tissus et d'organes, caractérisée en ce qu'elle est du type extracellulaire et en ce qu'elle comprend des ions calcium (CaZ+) et une macromolécule de poids moléculaire supérieur à 20 000. 2/ Solution aqueuse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend des ions Na' à une concentration d'au moins 30 millimoles, avantageusement 125 millimoles. 3/ Solution aqueuse selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration en ion Caz+ est comprise entre 0,01 et 2 millimoles, avantageusement 0,5 millimole. 4/ Solution aqueuse de conservation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la macromolécule est du polyéthylène glycol (PEG) purifié. 5/ Solution aqueuse de conservation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polyéthylène glycol purifié présente un poids moléculaire égal à 35 000. 6/ Solution aqueuse de conservation selon la revendication 5, caractérisée en ce que la concentration de PEG dans la solution est comprise entre 0,01 et 5 millimoles, avantageusement 0,03 millimole. 7/ Solution aqueuse de conservation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anion imperméant, un sucre, un agent stabilisant de membrane, une solution tampon, un agent antiradicalaire et une source d'énergie. 8/ Solution aqueuse de conservation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre - de 20 à 40 millimoles de raffinose, - de 70 à 140 millimoles d'acide lactobionique, - de 1 à 10 millimoles de MgS04, - de 10 à 40 millimoles de KH2P04, - de 1 à 6 millimoles de Glutathion, - de 1 à 10 millimoles d'Adénosine, - de 1,5 à 5 millimoles d'Allopurinol. 9/ Solution aqueuse de conservation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend l'osmolarité de la solution finale étant égale à 300 millimoles par kilogramme.