FR 2777909 A1 19991029 FR 9805197 A 19980424 Utilisation de séquences d'ADN de structure triplex pour le transfert de séquences de nucléotides dans des cellules. Vecteurs recombinants contenant ces séquences triplex. La présente demande a pour objet l'utilisation de séquences d'ADN susceptibles de présenter une structure triplex (à trois brins), pour le transfert de séquences de nucléotides dans des cellules, ainsi que des vecteurs recombinants contenant ces séquences triplex. L'invention a donc pour objet la définition et la fourniture de nouveaux moyens susceptibles d'être mis en oeuvre par exemple dans le cadre de protocoles de thérapie génique, ces moyens comprenant l'élaboration de nouveaux vecteurs susceptibles de transférer une séquence de nucléotides, et en particulier une séquence d'intérêt thérapeutique, dans des cellules cibles du corps humain ou animal. Une limitation importante des approches de thérapie génique connues jusqu'à ce jour, réside dans la vectorisation du gène d'intérêt thérapeutique. Les vecteurs rétroviraux dérivés d'oncovirus, principalement du MoMLV, ont été largement utilisés pour le transfert de gène. Leur application est grandement limitée par le fait que les oncovirus ne s'intègrent que dans des cellules cibles en division active. Au contraire, les lentivirus ont la capacité unique, parmi les rétrovirus, d'infecter des cellules différenciées, non mitotiques, et représentent des candidats viraux intéressants pour le développement de nouveaux vecteurs. Tout en conservant les avantages d'un vecteur oncoviral (absence d'immunogénicité, intégration stable), les lentivirus pourraient permettre la transduction in vivo de tissus différenciés non mitotiques (cerveau, muscle, foie, poumon...) et trouver ainsi un champ d'applications considérable en thérapie génique. Différentes tentatives de construction de vecteurs rétroviraux à partir de lentivirus ont été rapportées. On citera à cet égard les travaux de Naldini et al (1996) réalisés à partir du rétrovirus HIV et ceux de Poeschla EM et al (1998) réalisés à partir du rétrovirus FIV. Les inventeurs ont recherché des déterminants impliqués dans le mécanisme d'entrée du génome rétroviral dans le noyau des cellules (mécanisme d'import nucléaire) infectées. L'identification d'un déterminant ADN triplex essentiel à l'import a conduit les inventeurs à définir de nouveaux moyens, et en particulier des vecteurs utilisables pour le transfert de gènes, ou plus généralement de séquences de nucléotides (désignés dans la suite par l'expression "transgènes") dans des cellules cibles. Les inventeurs ont en particulier travaillé à partir du rétrovirus HIV ("human immunodefficiency virus", ou VIH), membre de la famille des lentivirus, et ont identifié et isolé des déterminants viraux responsables de l'import nucléaire de l'ADN proviral de HIV dans les cellules cibles, déterminants viraux qui se sont avérés pouvoir fonctionner dans des vecteurs, comme déterminants d'import nucléaire permettant l'entrée du génome vecteur dans le noyau de cellules cibles. Les mécanismes d'entrée de 'ADN rétroviral dans le noyau comportent des différences considérables d'une famille rétrovirale à une autre. Le génome des lentivirus est capable de traverser la membrane nucléaire du noyau interphasique via l'adressage puis la translocation de son complexe de préintégration (ADN linéaire et protéines associées) à travers le pore nucléaire. Ainsi, ces virus sont capables de se répliquer en absence de division de la cellule cible. Ils infectent en particulier les macrophages tissulaires différenciés et les cellules dendritiques, cellules au centre de la transmission, de la dissémination, et de la physiopathologie du HIV. A l'inverse, les génomes des oncovirus et des spumavirus sont incapables de traverser la barrière représentée par la membrane nucléaire. Leur complexe de pré-intégration doit attendre la mitose, et la désorganisation de la membrane nucléaire, pour accéder aux chromosomes mitotiques et s'intégrer. Les déterminants viraux responsables de l'import nucléaire de l'ADN du virus HIVI ont été recherchés par les inventeurs. L'identification et la compréhension fonctionnelle des mécanismes moléculaires de l'import nucléaire du complexe de pré-intégration de HIV présente en effet des intérêts fondamentaux importants. Les inventeurs ont identifié un mécanisme original d'import nucléaire du génome HIV-1 selon lequel cet import serait gouverné par une structure ADN, un triplex au centre des molécules d'ADN linéaires, généré par des étapes particulières à la rétrotranscription lentivirale. La structure d'ADN triplex présente au centre des molécules d'ADN linéaires générées lors de la rétrotransciption lentivirale, en particulier dans le rétrovirus HIV, a été décrite par les inventeurs dans différentes publications antérieures (Charneau P. et al., J. Mol. Biol. 1994, 241, 651-662 ; Charneau P. et al, Journal of Virology, Mai 1991, p. 2415-2421; Charneau P. et al, Journal of Virology, 1992, vol. 66, p. 2814-2820. La structure d'ADN formant un triplex lors de la rétrotranscription virale, est un polynucléotide comportant une région cis- active d'initiation centrale, ou polypurine tract (cPPT), et une région cis- active de terminaison (CTS), ces régions permettant l'initiation de la transcription d'un brin+ dont la synthèse est initiée par la région PPT présente au centre du génome de HIV ou d'autres lentivirus, et l'interruption de la synthèse d'un second brin+, second brin+ dont la synthèse est initiée au niveau d'un site PPT 3' terminal du LTR rétroviral. La formation de la structure d'ADN triplex est la conséquence d'un évènement de déplacement de brin discret au sein du génome du rétrovirus. La structure d'ADN triplex ainsi formée lors de la rétrotranscription permet, ou à tout le moins contribue à l'entrée du génome rétroviral dans le pore nucléaire, permettant de ce fait l'infection de cellules non mitotiques. A partir de l'identification de ce mécanisme requis pour l'entrée de rétrovirus dans le noyau des cellules cibles, les inventeurs ont élaboré une stratégie de développement de vecteurs rétroviraux capables de s'intégrer en L'absence de division de la cellule cible et donc d'assurer notamment le transfert de gènes au sein de tissus qui ne sont pas en renouvellement (cerveau, muscle, foie, poumon...). L'invention a ainsi pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, ledit vecteur comprenant en outre une séquence de nucléotides déterminée (transgène), et des signaux de régulation de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like. Le terme "polynucléotide" utilisé se rapporte à toute séquence d'acide nucléique, sous forme de simple brin ou de double brin ou triple brin, qu'il s'agisse d'ADN par exemple d'ADNc, ou d'ARN. A titre d'exemple, I'invention a pour objet le transfert de transgènes à visée thérapeutique, en particulier dans le cadre de protocoles de thérapie génique somatique, pour insérer une séquence de nucléotides modulatrice ou réparatrice d'une activité déficiente dans les cellules somatiques d'un organisme afin de remédier au mauvais fonctionnement d'un gène endogène, ou pour permettre l'expression d'une fonction supplémentaire, notamment d'une fonction suppressive de l'expression ou de l'activité d'un gène, dans un but thérapeutique. Par l'expression "thérapeutique", on entend la recherche ou l'obtention d'un effet préventif ou curatif, ou encore la recherche ou l'obtention d'une amélioration ou d'une stabilisation de l'état pathologique d'un patient. Dans le cadre de l'invention, et à titre d'exemple, les séquences nucléotidiques dites transgènes peuvent donc être des gènes ou partie de gènes ou séquences dérivées de gènes, par exemple des ADNc ou des ARN. II peut aussi s'agir de séquences antisens, de séquences mutant négatifs d'un gène donné, ou de séquences intervenant dans les fonctions de transcription, d'expression, d'activation de gènes, ou encore des séquences appropriées pour l'activation de prodrogues ou de substances cytotoxiques. Les séquences de transgènes dans le cadre de l'invention peuvent aussi avoir une activité de stimulation ou d'induction de la réponse immunitaire, cellulaire ou humorale, par exemple lorsqu'elles sont utilisées pour transformer des cellules présentatrices de l'antigène. Ainsi, I'invention peut être appliquée à la préparation de vecteurs utilisables en vue d'une thérapie génique dans des domaines variés tels que celui des maladies héréditaires comportant l'altération d'un gène, ces maladies comprenant par exemple la myopathie de Duchenne, la mucovicidose, des maladies neuro-dégénératives ou encore des pathologies acquises telles que des pathologies malignes conduisant naturellement à une réponse faible du système immunitaire. L'invention permettant aussi d'envisager des traitements d'immunothérapie cellulaire pour stimuler la réponse à des agents pathogènes, par exemple par la production de CTL, par exemple dans le cas de pathologies telles que les cancers ou les maladies auto-immunes, ou encore des pathologies telles que le SIDA. Le vecteur de l'invention contient un transgène inséré sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription ou d'expression, virales ou non. Le transgène peut être inclus dans une cassette d'expression comprenant les séquences appropriées pour la régulation de son expression dans une cellule. Un premier mode de réalisation particulièrement intéressant de l'invention est celui dans lequel le vecteur recombinant est caractérisé en ce que les séquences d'origine rétrovirales qu'il contient sont dérivées du génome d'un lentivirus. Dans le cadre de la présente demande, le terme "dérivé" englobe toute séquence identique à la séquence contenue dans le génome du rétrovirus, ou toute séquence modifiée par mutation, insertion, délétion, recombinaison, dès lors qu'elle conserve la fonction essentielle qu'elle possède au sein du génome rétroviral, en vue de son insertion au sein du vecteur de l'invention. Une telle séquence pourra être obtenue par tout moyen en soi connu permettant l'identification et l'isolement de séquences de nucléotides à partir de leur organisme d'origine, en particulier comprenant des étapes de clonage et/ou d'amplification, ou par synthèse selon toute technique disponible. Alternativement, le vecteur selon l'invention est caractérisé en ce que les séquences d'origine rétrovirale-like sont dérivées d'un rétrotransposon. A cet égard, on mentionnera à titre d'exemple, le rétrotransposon de levure TY1 (Heyman T et al). Le vecteur recombinant ainsi décrit peut par exemple être un plasmide recombiné par une construction rétrovirale ou rétrovirale-like et un transgène, le cas échéant contenu dans une cassette d'expression. Le vecteur recombinant peut aussi être un phage, tel qu'un phage X ou un phage filamenteux susceptible d'être introduit dans des bactéries ou un vecteur capable de transformer des levures, tel qu'un YAC. Un tel vecteur est utilisable pour la transduction de cellules, et en particulier de cellules d'encapsidation ou/et de cellules cibles, par toute méthode en soi connue, incluant la transfection ou l'infection. Un vecteur ainsi défini peut être transcomplémenté par un ou plusieurs vecteurs additionnels apportant les séquences codant pour les polypeptides de structure du génome d'un rétrovirus choisi, en particulier d'un lentivirus, ou les polypeptides de structure d'un rétrotransposon. A cet égard, le vecteur de l'invention peut être transcomplémenté par l'apport de séquences codant pour les polypeptides GAG, POL et ENV, ou pour une partie de ces polypeptides suffisante pour permettre la formation de particules rétrovirales destinées à vectoriser le vecteur recombinant dépourvu des gènes viraux et comportant le transgène dont on recherche l'expression. De façon générale, le(s) vecteur(s) utilisés pour la trans complémentation en protéines rétrovirales ou rétrovirales-like, sont dépourvus de signaux d'encapsidation. A ce sujet on citera les vecteurs préparés selon les techniques de Goldman et al (1997) utilisables pour la transcomplémentation d'un vecteur recombinant selon l'invention. L'invention a aussi pour objet des particules vecteur rétrovirales recombinantes comprenant: a) une séquence de nucléotides dite séquence gag codant pour les nucléoprotéines d'un lentivirus ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides GAG), b) une séquence de nucléotides dite séquence QQi codant pour les protéines RT, PRO, IN et RN d'un lentivirus ou pour un polypeptide dérivé fonctionnel (polypeptide POL), c) des signaux régulateurs de transcription et d'expression des séquences gag et BQI, d) une séquence de nucléotides dite séquence env codant pour des polypeptides d'enveloppe ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides ENV), la séquence env étant placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, e) une séquence de nucléotides recombinante comprenant une séquence de nucléotides déterminée (transgène), placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, une séquence contenant des signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like et un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, ces régions étant insérées dans une orientation fonctionnelle avec les signaux régulateurs d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like. Les polypeptides GAG et POL sont les polypeptides de nucléoprotéine issues de précurseurs clivés par la protéase virale. Les polypeptides POL comprennent la réverse transcriptase (RT), la protéase (PRO), l'intégrase (IN) et la Rnase H (RN) du rétrovirus. Le cas échéant, d'autres protéines du rétrovirus sont également utilisées pour la construction des particules vecteur. On note que les termes protéines ou polypeptides utilisés couvrent les formes non glycosylées ou les formes glycosylées des polypeptides en question. Les séquences gag. ! et env utilisées pour la construction des particules vecteur rétrovirales peuvent être, le cas échéant, modifiées par mutation, par exemple par mutation ponctuelle ou par délétion ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, dès lors qu'elles permettent la production de polypeptides fonctionnels pour la production de particules virales capables de vectoriser le transgène à exprimer. En particulier, on aura recours à des séquences mutées pour accroître la sécurité du rétrovirus ainsi produit. Avantageusement, le vecteur recombinant de l'invention ou les particules vecteur recombinantes sont telles que le transgène est sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression d'origine non rétrovirale. Un promoteur susceptible d'être utilisé pour contrôler l'expression du transgène, est par exemple le promoteur du CMV. Selon une variante de réalisation de l'invention, le transgène peut toutefois être placé sous le contrôle des signaux régulateurs identifiés précédemment comme étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, en particulier sous le contrôle de la séquence LTR. Un lentivirus utilisé pour dériver la construction rétrovirale selon l'invention peut être choisi parmi les rétrovirus HIV, par exemple HIV-1, HIV-2 ou tout isolat différent de ces deux types, ou par exemple parmi les virus CAEV (Caprine Arthritis Encephalitis Virus), EIAV (Equine Infectious Anemia Virus), VISNA, SIV (Simian Immunodeficiency Virus), ou FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Un vecteur particulièrement avantageux selon l'invention est le vecteur caractérisé en ce que le polynucléotide est une séquence d'ADN comprenant la région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et la région de terminaison (CTS) du génome d'un rétrovirus HIV-1, ou de tout autre lentivirus. Les séquences PPT centrale et CTS sont des séquences relativement conservées au sein des lentivirus et sont identifiées par la présence de nombreux résidus purines. Des mutations, même ponctuelles, au sein d'une de ces régions, peuvent abolir leur caractère fonctionnel lié à la formation des structures d'ADN triplex. Parmi les polynucléotides préférés utilisables dans le cadre de l'invention, on cite par exemple les séquences représentées à la figure 11, et plus précisément les séquences comprises entre les deux régions cPPT et CTS, incluant les séquences desdites régions. Le cas échéant, la séquence du nucléotide comprise entre les deux régions peut être mutée ponctuellement, ou mutée par délétion ou insertion de nucléotides. En tout état de cause, on utilisera des séquences mutées qui conservent la capacité à former un triplex d'ADN lors de la transcription du vecteur. Un vecteur recombinant selon un mode de réalisation particulier de l'invention peut donc comprendre, tout ou partie des séquences LTR rétrovirales ou de rétrotransposon, les sites rétroviraux PBS, et PPT 3'-terminal, la séquence rétrovirale nécessaire à l'encapsidation du génome vecteur dans des lignées d'encapsidation. La séquence LTR peut être en partie délétée, notamment dans la région U3. Un vecteur particulier selon l'invention est le plasmide pTRIP.EGFP, déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur, France) le 15 avril 1998, sous le numéro 1-2005. La carte de restriction de ce vecteur est représentée à la figure 10. Un vecteur recombinant particulier selon l'invention est caractérisé en ce que les séquences gag, QQi et env sont également dérivées des séquences d'un rétrovirus HIV, en particulier HIV-1 ou HIV-2. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences gag et QQj sont dérivées d'un rétrovirus HIV et la séquence env est dérivée d'un rétrovirus distinct de HIV ou d'un virus, par exemple le virus de la somatite vésiculeuse (VSV) ou le rétrovirus 4070A. De façon générale et en fonction de l'expression du transgène que l'on recherche, on choisira d'avoir recours à une séquence env codant pour des polypeptides env amphotropes par rapport à l'hôte dans lequel on souhaite exprimer le transgène, ou au contraire on choisira des séquences env codant pour des polypeptides env écotropes. Le tropisme de la séquence env peut être un tropisme spécifiquement humain. L'invention a aussi pour objet des particules vecteurs recombinantes comprenant: a) une séquence de nucléotides dite séquence gag codant pour les nucléoprotéines d'un rétrotransposon ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides GAG), b) une séquence de nucléotides dite séquence qui codant pour la protéines RT, PRO, IN et RN d'un rétrotransposon ou pour un polypeptide dérivé fonctionnel (polypeptide POL), c) des signaux régulateurs de transcription et d'expression des séquences gag et Dol, d) une séquence de nucléotides recombinante comprenant une séquence de nucléotides déterminée (transgène), placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, une séquence contenant des signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation de rétrotransposon et un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant dérivées d'un rétrotransposon et insérées dans une orientation fonctionnelle avec les signaux régulateurs de rétrotransposon. L'invention concerne par exemple un vecteur recombinant tel que défini précédemment, dans lequel les signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation et le polynucléotide comprenant les régions cPPT et CTS, sont dérivés d'un rétrotransposon, par exemple d'un rétrotransposon de levure. De façon générale, les signaux régulateurs de transcription et d'expression du transgène ou des séquences codant pour les polypeptides de structure des particules vecteur, lorsqu'ils ne sont pas d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, sont avantageusement des signaux inductibles ou conditionnels, susceptibles de conduire à une expression tissu-spécifique. Entrent également dans le cadre de l'invention, des cellules recombinantes caractérisées en ce qu'elles sont recombinées avec un vecteur selon l'une des définitions précédentes. La recombinaison peut être effectuée par tout moyen disponible, et en particulier par transfection ou par infection, notamment par transfection ou infection ex vivo. Les cellules ainsi peuvent être transfectées de façon transitoire, ou au contraire de façon stable. II peut s'agir de cellules d'encapsidation ou de cellules cibles, en particulier de cellules dans lesquelles on recherche un effet thérapeutique par l'expression du transgène. De façon tout à fait intéressante, des cellules recombinantes capables d'exprimer le transgène grâce à la transduction à l'aide d'un vecteur de l'invention, sont des cellules eucaryotes différenciées non mitotiques. L'invention permet cependant également la préparation de cellules recombinantes eucaryotes primaires non mitotiques, ou encore de cellules mitotiques. A titre d'exemple, on citera les cellules de poumon, les cellules cérébrales, musculaires, épithéliales, hépatiques, dendritiques, neuronales, les cellules de la moelle osseuse, les macrophages, les fibroblastes, les lymphocytes, les cellules hématopoïétiques. L'invention a donc pour objet des compositions à visée thérapeutique, caractérisées en ce qu'elles comprennent un vecteur tel que précédemment caractérisées en ce qu'elles comprennent un vecteur tel que précédemment décrit, ou une cellule recombinante définie selon les indications précédentes. L'invention concerne également une composition immunogène comprenant un vecteur tel que décrit précédemment ou des cellules recombinantes définies ciaessus, ladite composition étant susceptible de conduire à une réponse immunitaire, cellulaire ou humorale chez un hôte déterminé. L'invention met donc à disposition un polynucléotide tel que défini précédemment, comprenant des régions cPPT et CTS rétrovirales ou rétrovirales-like, et donne accès à son utilisation pour l'import nucléaire, notamment ex vivo dans des cellules déterminées, d'une séquence de nucléotides (transgène). D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et dans les figures qui suivent. LEGENDES DES FIGURES FIG. 1: : Rétrotranscription des Lentivirus La rétrotranscription des génomes lentiviraux diffère de celle des rétrovirus oncogènes par la synthèse du brin+ en deux moitiés distinctes. Un segment aval est initié au niveau d'une copie centrale du polypurine tract (cPPT), caractéristique des génomes lentiviraux. La synthèse du brin+ amont se termine après un déplacement de brin discret au centre du génome. Le blocage du déplacement de brin par la reverse transcriptase est gouvemé par une séquence cis-activedu génome HIV : le CTS (Central Termination Sequence). Le produit final de la rétrotranscription des lentivirus est un ADN linéaire portant une structure ADN centrale à trois brins (triplex central) sur une longueur d'une centaine de nucléotides. FIG. 2: : Plasmides utilisés pour la production des particules vecteur HIV Les particules vecteur sont produites par cotransfection de trois plasmides : le plasmide vecteur comprenant (pTRIP) ou non (pHR) les séquences cis-actives responsables de la formation de triplex, un plasmide d'encapsidation fournissant en trans les protéines structurales et les enzymes de la particule (pCMVAR8.2 ou pCMVAR8.91, Naldini et al, 1996 et Zufferey et al, 1997) , et un plasmide d'expression de l'enveloppe du virus VSV (VSV-G). Seules les parties pertinentes des plasmides cotransfectés dans des cellules Hela sont présentés (Naldini et al PNAS oct 1996, Zufferey et al Nature Biotech. 1997). Les plasmides d'encapsidation pCMVAR8.2 ou pCMVA8.91 permettent l'expression des protéines issues de gag et pol. .pMD.G code pour l'envelope hétérologue VSV. Les plasmides vecteur pHR-TRIP sont dérivés du plasmide pHR'CMVlacZ (Naldini et al) : une séquence triplex sauvage ou mutante a été insérée et le gène rapporteur lacZ changé ou non en EGFP. FlG.3 : Impact du triplex sur la transduction de l'EGFP dans des cellules Hela Des cellules Hela, cultivées en Labtek à 8 chambres, sont transduites par différents vecteurs exprimant la protéine autofluorescente EGFP. Les infections sont normalisées selon la quantité de protéine de capside (kit ELISA P24 Dupont) à 2 ng de P24 par inoculum. A 48 heures post-infection, les cellules sont fixées au PBS PFA 1 %, montées en mowiol, puis observées au microscope à fluorescence. Trois champs indépendants sont montrés pour le vecteur d'origine sans triplex (HR.EGFP, en haut), pour le vecteur avec le triplex (TRIP.EGFP, milieu) ou pour un vecteur contenant une séquence triplex mutée, non fonctionnelle (TRIP D.EGFP, en bas). A droite sont montrées les différentes transductions en présence de nevirapine, un inhibiteur de la rétrotranscriptase du HIV-1. FIG. 4 : Quantification du taux de transduction du gène EGFP par les vecteurs VIH avec ou sans triplex Des cellules Hela transduites par 2 ng P24 des vecteurs EGFP avec ou sans triplex sont trypsinnées à 48 heures post-infection. Les pourcentages de cellules positives pour l'expression de l'EGFP sont calculés par cytométrie en flux (canal FITC). Dans tous les cas, la transduction est inhibée en présence de nevirapine, un inhibiteur de la rétrotranscriptase du HIV-1. FIG. 5: : Quantification du taux de transduction du gène LacZ par les vecteurs VIH avec ou sans triplex L'impact du triplex sur la transduction est calculé par infection de cellules Hela, cultivées en plaques 96 puits, par différents vecteurs exprimant le gène rapporteur LacZ. A 48 heures, post-infection, les plaques de cultures sont lysées et l'activité beta-Galactosidase est mesurée selon un kit de réaction luminescente (Boehringer). Chaque transduction est réalisée en triplicate avec un innoculum normalisé à 2 ng de P24. Panneau supérieur: Cellules Hela en prolifération. Panneau inférieur: Cellules Hela bloquées en cycle par l'aphidicoline. Fig. 6 : Impact du triplex sur la transduction ex vivo du gène EGFP dans des cellules spinales primaires de rat Des cellules d'explants primaires de moelle épinière de rat sont infectées par 300 ng de P24 pour chaque vecteur avec et sans triplex, et observées en microscopie à fluorescence comme précédemment. FlG.7 : Impact du triplex sur la transdution in vivo du gène EGFP dans le cerveau de rat FIG 7a: Transduction au niveau du site d'injection Le transfert du gène EGFP est réalisé par injection directe dans le cerveau de rat de 2 microlitres de vecteur correspondant à 50 ng de P24. Les panneaux supérieurs (fig 7a) montrent les sites d'injection des vecteurs, en microscopie à contraste de phase, repérables par la lésion laissée par l'aiguille. L'observation des mêmes coupes en microscopie à fluorescence (panneaux inférieurs) montrent une transduction importante de EGFP en présence du triplex (panneau gauche), et très faible sans (panneau droit). FIG 7b: Diffusion des particules vecteur dans le cerveau de rat Les particules vecteur peuvent diffuser dans le cerveau à distance du site d'injection. Panneau gauche avec triplex ou panneau droit sans triplex. FIG. 8 Stratégie d'analyse du taux d'import nucléaire de l'ADN vecteur. L'ADN total des cellules transduites est digéré par Eco NI et Ava II. Après électrophorèse en gel d'agarose et tranfert sur membrane nylon, le filtre est hybridé avec un fragment PCR sonde, marqué au P32 et chevauchant exactement le site Eco NI. FIG. 9: : Analyse du taux d'import nucléaire des ADN vecteur. L'analyse par southern blot, 48 heures post-transduction dans les cellules Hela, montre un défaut d'import nucléaire typique dans le cas du vecteur sans triplex (HR GFP) ou contenant la séquence triplex dans l'orientation inverse, non fonctionnelle (TRIP. GFP inv). Dans le cas de ces vecteurs, le signal correspondant à l'ADN linéaire non intégré est équivalent au signal ADN total, indiquant que l'essentiel de l'ADN vecteur reste sous forme linéaire au lieu de s'intégrer. Dans le cas du vect FIG. 10: Carte de restriction du vecteur pTRIP.EGFP. FIG. Il : Séquence des polynucléotides comprenant les régions cPPT et CTS des virus CAEV, EIAV, VISNA, SIVAGM, HIV-2RoDl HIV-1LAI. La figure Il G montre les régions CPPT et CTS (grandes majuscules) pour chaque lentivirus. La position des régions CTS est putative car fondée sur l'homologie avec le CTS HIV-1 et la courbure de la séquence, à l'exception de VISNA pour lequel la séquence de terminaison a été caractérisée par PCR ancrée. MATERIEL ET METHODES Construction des plasmides vecteurs: Les plasmides pTRIP-LacZ et pTRIP-EGFP dérivent de la construction pHR'CMVlacZ (Naldini et al, 1996). Le gène rapporteur LacZ de pHR'CMVlacZ a été remplacé par I'ORF de la protéine autofluorescente EGFP. Le gène de l'EGFP a été amplifié par PCR à partir du plasmide pEGFP-N1 (Clontech) grâce à la polymérase thermostable fidèle Pfu (Stratagene). Les séquences des amorces PCR utilisées sont les suivantes: Bam EGFP: 5' cc gga tcc cca ccg gtc gcc acc 3' Xho EGFP: 5' cc ctc gag cta gag tcg cgg ccg 3' L'amplification PCR a été réalisée en 30 cycles dans les conditions suivantes: - Dénaturation 95 "C, 30 sec - Hybridation 50 "C, 1 min - Elongation 75"C, 30 sec Les sites de restriction BamHI et Xhol ont été ajoutés en 5' et 3' respectivement du fragment PCR EGFP de manière à l'insérer de façon orientée dans le fragment vecteur pHR'CMV, lui même digéré par BamHI et Xhol. L'insertion du fragment PCR EGFP, par des technologies classiques d'ADN recombinant (Maniatis et al, 1983), a généré le plasmide pHR-EGFP. Un fragment de 184 bp correspondant à la région centrale du génome VIH-1 et comprenant les boites cis-actives cPPT et CTS, responsables de la formation du triplex au cours de la rétrotranscription du VIH, a été inséré dans le site Clal des plasmides pHR-EGFP et pHR'CMVlacZ , en amont du promoteur CMV. La région centrale triplex a été amplifiée par PCR à partir de plasmides proviraux complets du génome VIH-1 LAI comprenant la séquence triplex sauvage (pBRU3; Charneau et al, 1991), mutée dans la séquence cisactive de terminaison CTS (pCTS; Charneau et al, 1994) ou encore mutée dans la séquence cis-active d'initiation centrale cPPT (p225; Charneau et al, 1992). Les séquences des amorces PCR utilisées sont les suivantes: Nar/Eco TRIP+: 5' gtc gtc ggc gcc gaa ttc aca aat ggc agt att cat cc 3' Nar TRIP: 5' gtc gtc ggc gcc cca aag tgg atc tct gct gtc c 3' Les conditions de réaction PCR étaient identiques à celles décrites précédemment. Les fragments PCR Triplex, digérés par Narl, ont été insérés au site Clal des plasmides pHR GFP et pHR'CMV LacZ par ligation/digestion compétitive T4 DNA ligase/Clal afin d'éliminer au cours de la ligation le vecteur recircularisé sur lui même. L'orientation de l'insertion est analysée par digestion Xhol/EcoRl, le site Eco RI ayant été introduit dans l'amorce PCR 5' Nar TRIP+. Les plasmides résultants sont dénommés pTRIP.EGFP dans l'orientation correcte du triplex et pTRIPinv.EGFP dans l'orientation inverse, non fonctionnelle. Les vecteurs comprenant une version mutée du triplex sont dénommés pTRIP X .EGFP, X correspondant au code du virus mutant de départ (AG, D, CTS ou 225) (Charneau et al J. Mol. Biol. 1994, Charneau et al J. Virol 1992). A partir des différents plasmides pTRIP.EGFP ou pTRIP X .EGFP, le gène EGFP a été remplacé par Lac Z par échange orienté Xhol/BamHI. Les plasmides résultants sont dénommés respectivement pTRIP.Z, pTRIPinv.Z, pTRIP CTS.Z, pTRIP 225.Z. Production des particules vecteurs non infectieuses La production des vecteurs VIH a été réalisée selon une modification du protocole décrit dans Naldini et al, 1996. Les particules vecteur ont été produites par co-transfection transitoire au phosphate de calcium de cellules humaines 293T (ATCC), cultivées en milieu DMEM (ICN), SVF 10%, pénicilline, streptomycine. Des boites demi-confluentes de 175 cm ont été transfectées simultanément par trois plasmides: 1 Spg de plasmide codant pour l'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV), pMD.G (Naldini et al, 1996) 3Opg de plasmide d'encapsidation, pCMVAR8.2 (Naldini et al, 1996) ou pCMVdR8.91 (Zufferey et al, 1997). et 30 g des différents plasmides vecteurs pHR ou TRIP. Les co-précipités phosphate-calcium/ADN ont été laissés au contact des cellules pendant 24 heures, le milieu a ensuite été collecté chaque 24 heures jusqu'au jour 3 post transfection. Les débris cellulaires des surnageants vecteurs ont été éliminés par centrifugation basse vitesse. Les surnageants vecteur ont été conservés par congélation à -80 C. Concentration des particules vecteur L'utilisation de l'enveloppe VSV-G, très stable, pour pseudotyper les particules vecteur permet leur concentration par ultracentrifugation. Les surnageants vecteurs, collectés selon la méthode décrite ci-dessus, ont été ultracentrifugés dans des tubes à fond coniques (Beckman) de 30ml, 90 min à 17000 rpm à +4"C dans un rotor SW 28 (Beckman). Les culots ont été ensuite repris dans 190# l de PBS, centrifugés 5 min à 2000rpm afin d'enlever les débris non resuspendables, aliquotés et congelés à -80 C. Transduction de cellules en culture Les cellules Hela (ATCC) ont été transduites par addition de surnageants vecteur, ultracentrifugés ou non, en présence de 10 ,ug/ml de DEAE Dextran. Les cellules Hela sont cultivées en milieu DMEM (ICN) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF). Les cellules HeLa ont été étalées à 20 000 cellules/puits en plaque 96 puits, la veille de l'infection puis transduites dans un volume de 200cul final. Les innoculum de vecteur ont été normalisés selon la concentration de protéine de capside (P24), calculée selon un test ELISA commercial (Du Pont). L'efficacité de transfert de gène a été mesurée, selon les expériences 24 à 48 heures post-infection. Le taux de transduction des vecteurs exprimant le gène rapporteur LacZ était révélé soit par une coloration XGal in situ (Charneau et al, 1992), soit par une réaction luminométrique selon un kit commercial (Boehringer) en suivant les instructions du fournisseur. Dans le cas de vecteurs exprimant le gène rapporteur EGFP, le taux de transduction a été évalué qualitativement par observation directe des cellules vivantes au microscope à fluorescence, sur le canal FITC. La quantification du nombre de cellules exprimant le marqueur EGFP a été réalisée par cytométrie de flux (canal FITC). Le dosage de la protéine EGFP a pu être réalisé par mesure de la fluorescence sur extrait cellulaire. Les plaques de cultures à 96 puits ont été rincées deux fois au PBS puis lysées par 100ul de PBS 1% NP40. La fluorescence EGFP a été lue grâce à l'utilisation d'un fluorimètre en plaque (modèle Victor, Wallac) avec un filtre d'exitation à 475 nm et un filtre d'émission à 510 nm. Des cellules Hela arrêtées dans leur cycle cellulaire en transition GI/S ont été préparées selon les mêmes conditions que précédemment avec un traitement préalable de 24 heures avant la transduction par 4 pM d'aphidicoline (Sigma). Dans ces conditions, plus de 95% de l'incorporation de thymidine tritiée était inhibée. Transduction ex vivo de cellules primaires Des cultures primaires de cellules de moelle épinière de rat ont été préparées de la façon suivante: des moelles d'embryons de rat de 13 à 14 jours ont été disséquées sous la loupe binoculaire. Les tissus ont été maintenus en milieu L15 (Gibco) supplémenté par 3.6 mg/ml de glucose pendant toutes les étapes. Les cellules nerveuses ont été dissociées par incubation dans la trypsine (0.05% w/v) pendant 15 min à 37 C. La digestion trysique a été inhibée par l'addition de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et centrifugation à basse vitesse. Le culot cellulaire a été repris dans du milieu L15, 3.6 mg/ml de glucose contenant 100 iug/ml de DNasel (Boehringer), par agitation mécanique douce. Les cellules ont été collectées par centrifugation basse vitesse à travers un coussin de BSA à 4% (w/v). Les cellules spinales ont été ensemmencées dans des plaques à 24 puits contenant des lamelles de verre de 12 mn de diamètre et recouvertes de poly-DL-Ornithine (6 ,ug/ml) et de laminine (3 lug/ml). Les cultures cellulaires ont été entretenues dans du milieu neurobasal (Gibco) contenant du supplément B27, 2% de SVF, 0.5 mM L-Glutamine, 25 pM de beta-mercaptoethanol et 25 pM de L-Glutamate. Les cultures ont été traitées après 24 heures par 10 ,ug/ml de 5' fluorodeoxyuridine pour prévenir la colonisation de la culture par des cellules non neuronales. Transduction in vivo de l'EGFP dans le cerveau de rat Les vecteurs exprimant la protéine marqueur EGFP ont été utilisés pour les expériences in vivo. Des injections dans le cerveau de rat avec 2pl de vecteur HR.EGFP ou TRIP.EGFP, ont été réalisées sur des rats OFA spague dawley de 5 semaines. Dans un premier temps, les rats ont été endormis par injection intrapéritonéale d'lmagene 500 (Rhône Merieux). Les injections ont été réalisées dans le striatum de chaque hémisphère à l'aide d'un guide stéréotaxique, avec une aiguille Hamilton de 5 l, à la vitesse de 2pl / Smin. Les rats ont été sacrifiés une semaine ou plus après injection, par perfusion au PBS puis au paraformaldehyde 2% (PFA). Les cerveaux ont ensuite été prélevés et découpés pour ne garder que la partie contenant le point d'injection, visible par la lésion laissée par l'aiguille. Une post fixation au PFA 2% a été réalisée toute la nuit, suivie d'une cryoprotection au sucrose 20% puis 30%. Les cerveaux ont été ensuite recouverts de tissus-tek, congelés dans la carboglace et stockés à -80 C. Des coupes sériées de 14 pm ont été réalisées à l'aide d'un cryostat puis observées avec un microscope confocal. EXEMPLES 1 Aspects fondamentaux. Import nucléaire du complexe de préintégration HIV-1: rôle du triplex central Le mécanisme de rétrotranscription du virus HIV diffère de celui des rétrovirus oncogènes par la synthèse du brin-plus (brin +) en deux moitiés distinctes (figure 1). Un segment aval est initié à une copie centrale du polypurine tract (cPPT), caractéristique des génomes lentiviraux. La synthèse du brin-plus amont se termine après un déplacement de brin discret au centre du génome. Le blocage du déplacement de brin par la reverse transcriptase est gouverné par une nouvelle séquence cis-active du génome HIV: le CTS (Central Termination Sequence). Le produit final de la rétrotranscription des lentivirus est donc un ADN linéaire portant une structure centrale en chevauchement de brin (triplex central) sur une centaine de nucléotides (Charneau et al, 1994). La mutagenèse dirigée du cPPT ou du CTS peut abolir l'initiation ou la terminaison centrale de la synthèse du brin-plus. Dans les deux cas, les virus mutants, dont l'ADN est dépourvu du triplex central, sont défectifs pour la réplication. L'analyse du défaut réplicatif des mutants d'initiation et de terminaison centrale a montré que le cycle réplicatif des mutants d'initiation ou de terminaison centrale de la rétrotranscription avorte lors d'une étape postérieure à la synthèse de I'ADN viral et postérieure au routage du complexe de rétrotranscription vers l'enveloppe nucléaire. Lorsqu'on analyse la structure de I'ADN viral présent dans les cellules infectées, on s'aperçoit que les phénotypes des mutants d'initiation et de terminaison sont semblables. Dans les deux cas, en effet, la quantité globale d'ADN rétrotranscrit n'est pas affectée par des mutations dans le cPPT ou le CTS. On observe en revanche une accumulation d'ADN linéaire non intégré, avec, dans le même temps, très peu de provirus intégrés ou de cercles à 1 ou 2 LTRs formés. Des expériences de fractionnement noyaux/cytoplasme et de perméabilisation du noyau ont ensuite montré que ces molécules d'ADN linéaire sont associées au noyau, mais que leur intégration et/ou leur circularisation ne peuvent se produire qu'après dissolution de l'enveloppe nucléaire, ce qui indique bien que 'ADN viral des mutants est retenu à l'extérieur de cette enveloppe. De plus des expériences d'attaque nucléasique de noyaux purifiés de cellules infectées par la DNasel immobilisée sur billes d'or démontre encore l'accumulation des ADNs linéaires mutants à la face cytoplasmique de la membrane nucléaire. Enfin, une quantification précise de la capacité intégrative des molécules d'ADN linéaires pourvues ou non d'un triplex central natif a récemment montré que le triplex central n'influence pas l'intégration de l'ADN linéaire dans une cible ADN hétérologue in vitro. Le défaut réplicatif des virus mutants pour l'initiation ou la terminaison centrale de la rétrotranscription concerne donc l'import nucléaire de leur complexe de pré-intégration, et plus précisément l'étape de translocation à travers les pores nucléaires. Les lentivirus, et le virus HIV en particulier, ont développé une stratégie originale de rétrotranscription dont le but est de créer le triplex au centre des molécules d'ADN non intégrées, déterminant indispensable à l'entrée du génome viral dans le noyau d'une cellule en interphase. Ce mécanisme distingue les lentivirus de tous les autres rétrovirus dont l'accès de l'ADN au site d'intégration dépend de la désorganisation de la membrane nucléaire pendant la mitose. 2. Génération de vecteurs lentiviraux contenant les séquences cis actives responsables de la formation du triplex 2-1 Principe et intérêt des vecteurs lentiviraux La génération de vecteurs lentiviraux efficaces suppose la connaissance des déterminants responsables de l'import nucléaire actif et donc de l'infection des cellules non mitotiques. La découverte de l'implication du triplex dans l'import nucléaire du génome HIV-1 a des conséquences importantes pour la construction de vecteurs lentiviraux efficaces. Elle suppose la conservation, au sein de la construction vecteur, des séquences actives en cis et responsables de la formation du triplex ADN lors de la rétrotranscription lentivirale. L'application en vectorologie de ce travail fondamental consiste à adjoindre dans les constructions de vecteurs lentiviraux la région centrale cPPT-CTS de façon à créer la structure ADN triplex lors de la rétrotranscription du génome vecteur. Il est à noter que de nombreuses tentatives de construction de vecteur lentiviraux, basées sur le même principe que les vecteurs dérivés des oncovirus (en général du MoMLV), se sont révelées très décevantes, au moins en terme de titre infectieux. Ces vecteurs sont des vecteurs de remplacement, c'est à dire que l'ensemble du génome rétroviral est délété puis remplacé, entre les deux LTRs et la séquence d'encapsidation, par le gène reporteur ou le gène d'intérêt thérapeutique (Miller et al, 89). Selon les inventeurs, ce type de construction n'est pas optimum dans le cas de vecteurs lentiviraux du fait de la nécessité de la région centrale cPPT-CTS pour l'import nucléaire de I'ADN viral. Toutefois, des vecteurs HIV construits sur le même principe que les vecteurs rétroviraux dérivés d'oncovirus, mais pseudotypés par l'enveloppe très fusiogène du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G) et concentrés par ultracentrifugation, permettent la transduction in vivo de neurones de rat (Naldini et al, 1997; Blomer et al, 1997), du foie et du muscle différentié (Kafri et al, 1997). Pourtant, des expériences de complémentation de xénogreffes d'épithelium pulmonaire humain par ces vecteurs HIV codant pour le gène CFTR (mucoviscidose) se sont révélées très décevantes. L'essentiel de l'ADN vecteur dans ce tissu resterait sous forme d'ADN linéaire non intégré, révélant ainsi un défaut probable d'import nucléaire (Goldman et al, 1997; voir le chapitre "influence du triplex central sur le taux d'import nucléaire de I'ADN vecteur"). Construction et production des vecteurs HIV "à triplex" Afin de tester l'importance de la structure triplex dans un système vecteur, les inventeurs ont pris pour base les constructions décrites par Naldini et al. Dans ce système (figure 2), les particules vecteur VIH sont produites par co-transfection transitoire de trois plasmides: un plasmide d'encapsidation exprimant l'ensemble des protéines virales à l'exception de l'enveloppe du VIH, un plasmide exprimant l'enveloppe VSV-G et un plasmide vecteur, pHR-CMV LacZ, comprenant les LTRs du VIH, le signal bipartite d'encapsidation du VIH et une cassette d'expression de LacZ. Dans un premier temps, le gène rapporteur LacZ a été remplacé par un gène codant pour une version très fluorescente de la EGFP (E Green Fluorescent Protein), plus pratique pour les études de transduction in vivo. La région centrale du génome VIH-1 LAI comprenant les séquences cis-actives cPPT et CTS, responsables de la formation du triplex, a été amplifiée par PCR puis insérée au site Clal, dans la construction vecteur pHR-EGFP. L'insertion d'un triplex sauvage dans l'orientation correcte génère le vecteur pTRIP-EGFP; dans l'orientation inverse (non fonctionnelle), le vecteur pTRIPinv-EGFP. Absence de virus infectieux helper dans les surnageants vecteur La production de particules vecteur à partir de trois plasmides indépendants et possédant un minimum de séquences homologues permet de minimiser la probabilité de générer un virus helper compétent pour la réplication. De plus, la construction d'encapsidation a été délétée pour l'enveloppe du VIH et pour l'ensemble des gènes dits accessoires à la réplication (Vif, Vpr, Vpu, Nef). Le génome vecteur encapsidé ne contenait plus du VIH que les 2 LTRs, les séquences nécessaires à l'encapsidation et la séquence triplex. Toutefois, chaque stock de vecteur a été testé pour la présence de virus helper infectieux. Des cellules MT4 ont été infectées en triplicate, sur microplaque, pendant une nuit, puis lavées extensivement et remises en culture pendant 5 jours afin d'amplifier l'innoculum. Des cellules indicatrices P4 (HeLa CD4 LTR-LacZ) ont ensuite été infectées avec les cellules MT4 et leur surnageant pendant 3 jours afin de détecter les particules infectieuses produites. Enfin, une coloration X-gal in situ a été réalisée. De cette façon, toute particule infectieuse produite est détectable sous forme d'un syncitia bleu. Ce protocole sensible permet de détecter un innoculum de VIH de 0,25 pg de P24, soit environ 3200 particules physiques. Sachant que dans le cas de HIV, on estime qu'une seule particule sur 1000, ou même sur 10 000, est infectieuse, le protocole devait probablement permettre de détecter une particule infectieuse unique. Les surnageants vecteur sont systématiquement dépourvus de particules infectieuses VIH. Effet du triplex sur l'efficacité de transduction par les vecteurs in vitro Dans un premier temps (figure 3),1'effet de l'insertion du triplex central sur la transduction de cellules HeLa a été mesuré. Des cellules HeLa ont été infectées avec un surnageant de transfection de vecteur le triplex central sauvage (TRIP GFP), un vecteur sans cette séquence (HR GFP), ou avec une séquence triplex mutante (TRIP GFP D). Le mutant D est un mutant du cPPT qui empêche l'initiation centrale du brin + et donc la formation du triplex central (figure 3). Les infections ont été réalisées avec des surnageants contenant la même quantité de particules normalisées sur la quantité de protéine de capside p24. La transduction de la GFP dans les cellules Hela a été augmentée en présence d'un triplex sauvage et était ramenée au taux basal en présence d'un triplex non fonctionnel. Ce gain de titre peut être quantifié grâce à l'utilisation du gène rapporteur LacZ (figure 4). Ces cellules ont été transduites en triplicate en normalisant par référence à la quantité de protéine p24. Les transductions ont été réalisées sur des cellules bloquées ou non en division à l'aphidicoline, qui bloque les cellules en GI/S. Les vecteurs utilisés étaient, HRZ (sans triplex), TRIP Z (avec triplex), TRIP Z inv (la séquence triplex est orientée en sens inverse, elle est non fonctionnelle et ne conduit pas à la formation d'un triplex central). Figure 4A: Le gain de transdution de la ssgal par des vecteurs contenant le triplex est de 6 à 10 fois. Il est perdu lorsque le triplex n'est pas formé (TRIP Z inv). Figure 4B: L'effet du triplex sur la transduction de tagal est indépendant de la division cellulaire: des résultats similaires sont obtenus sur des cellules en division ou bloquées à l'aphidicoline. Par ailleurs, les mêmes résultats sont obtenus sur cellules HeLa, que le plasmide d'encapsidation utilisé lors de la production des particules vecteur soit ou non délété dans les gènes accessoires Vif, Vpr, Vpu, Nef. Effet du triplex sur l'efficacité de transduction par les vecteurs ex vivo L'impact du triplex sur la transduction de la EGFP dans des cellules primaires non mitotiques a par la suite été mesuré. Des explants primaires de moelle épinière de rat enrichis en neurones ont été transduits avec des surnageants de vecteur ultracentrifugés. Les transductions ont été réalisées avec moins de 10C1l de vecteur ultracentrifugé, contenant de la même nombre de particules, normalisé sur le nombre de ng de protéine de capside p24. Figure 6: le vecteur possédant une séquence triplex transduit un beaucoup plus grand nombre de cellules d'explants primaires de moelle épinière de rat que le vecteur sans triplex. Impact du triplex sur la transduction in vivo de cerveau de rat L'effet du triplex sur la transducion de la EGFP in vivo a ensuite été mesuré par injection directe dans le cerveau de rat. Le même volume (2 pi) de surnageant de vecteur avec ou sans triplex contenant la même quantité de protéine p24 a été injecté dans le striatum. Alors qu'un grand nombre de cellules transduites ont été détectées chez les rats injectés avec le vecteur avec triplex (figure 7a), il n'a pas été possible de détecter de cellules exprimant la EGFP dans le cerveau des rats injectés avec le vecteur sans triplex, et ce même au point exact de l'injection, visible par la lésion laissée par l'aiguille. La figure 7b montre la diffusion des particules vecteur avec ou sans triplex dans le cerveau. Quelques cellules fluorescentes sont visibles après injection du vecteur sans triplex, alors qu'un grand nombre de cellules transduites sont observées en présence du triplex. Impact du triplex sur l'import nucléaire du génome vecteur Un test permettant de suivre au cours du temps l'ensemble des formes ADN vecteur dans la cellule transduite a été mis au point par les inventeurs ADN linéaire, cercles à 1 ou 2 LTRs mais aussi provirus intégré. Ce test est basé sur la détection par Southern de l'ADN viral selon une stratégie de coupure et de choix de sonde permettant de différencier les différentes formes d'ADN rétroviral (voir figure 8). L'ADN total des cellules infectées ou des cellules transduites par les vecteurs est digéré par une ou deux enzymes de restriction de façon à dégager un fragment interne, commun à toutes les formes d'ADN rétroviral ou d'ADN vecteur présentes dans les cellules (ADN linéaire non intégré1 ADN circulaire à un ou deux LTRs et provirus intégré). Dans le cas du vecteur1 les enzymes choisies sont Eco NI et Ava II. En utilisant pour sonde un fragment généré par PCR chevauchant exactement le site Eco NI, plusieurs bandes correspondant aux différentes formes d'ADN apparaissent. Le fragment interne permettra de calculer après quantification au Phosphorimager l'ADN total vecteur présent dans les cellules. Un fragment de 1.16 Kb correspond au fragment distal de l'ADN linéaire non intégré, un autre de 3.3 Kb correspond aux cercles non intégrés. Après quantification des signaux avec un phosphorimager, le taux d'import nucléaire est indiqué par le pourcentage d'ADN viral intégré et sous forme circulaire (ADNs viraux nucléaires) par rapport à l'ADN linéaire cytoplasmique. Les premiers blots préliminaires ont montré un profil d'ADN intracellulaire caractéristique d'un défaut d'import nucléaire dans le cas des vecteurs dépourvus de triplex ou dont la région centrale du génome HIV-1 a été insérée à l'envers. En effet, l'intensité du signal correspondant à 'ADN linaire était équivalent à celle du signal ADN total, 48 heures après infection. En d'autres termes, le processing de l'ADN vecteur est majoritairement bloqué au stade linéaire non intégré, très peu de molécules s'intègrent (figure 9). A l'inverse, dans le cas des vecteurs possédant un triplex, il ne subsiste que peu d'ADN linéaire à 48 heures, indiquant que leur majeure partie a été importée dans le noyau de la cellule transduite, puis s'est intégrée. 2-2 Vectorologie Etude de l'effet de position du triplex ADN dans la construction vecteur On trouve chez tous les lentivirus les séquences cis-actives cPPT et CTS, responsables de la formation du triplex lors de la rétrotranscription. Dans tous les cas, ce triplex se trouve à quelques nucléotides près au centre du génome ADN linéaire. Cette position centrale du triplex pourrait être importante pour le fonctionnement optimal de ce déterminant de la translocation à travers le pore nucléaire. Les constructions vecteur réalisées, la séquence triplex a été insérée juste en amont de l'unité transcriptionnelle du gène rapporteur. Selon la taille du gène rapporteur, ce triplex se trouvait plus ou moins près du centre du génome ADN linéaire vecteur. Dans le cas du gène rapporteur EGFP (0.7 Kb), le triplex est très proche du centre de la construction; alors que dans le cas de LacZ (3.1 Kb), il en est plus éloigné (figure 2). Dans les deux cas, la présence du triplex a induit un gain en titre important des surnageants vecteurs. II existe donc une certaine "flexibilité" dans la position du triplex sur le génome vecteur. Toutefois, les vecteurs codant pour la EGFP se sont avérés clairement plus efficaces que ceux codant pour LacZ. II est donc possible qu'un triplex placé idéalement permette un gain en titre supplémentaire. Afin de tester cette hypothèse, les inventeurs ont entrepris de cloner, à la place des gènes rapporteurs, une banque de fragments de taille aléatoire (digestion partielle Sau3A), la distribution en taille des fragment clonés étant analysée avant et après transduction de cellules cibles. Dans le cas où la position centrale du triplex serait importante pour sa fonction, la contrainte de construction d'un vecteur symétrique par rapport au triplex serait importante. II est possible de contourner cet obstacle en insérant l'unité transcriptionnelle du vecteur dans la région U3. Après rétrotranscription, le transgène sera dupliqué de part et d'autre du triplex avant de s'intégrer, respectant ainsi une position exactement centrale du triplex. Transfert in vivo dans différents tissus différentiés La capacité des vecteurs lentiviraux "triplex" à transduire efficacement et stablement les tissus différenciés affectés dans diverses pathologies génétiques est étudiée. Le potentiel de ces vecteurs dans le cerveau, et dans différents tissus tels que le muscle, l'épithélium quantitatives de l'impact du triplex sur le taux de transduction de ces tissus sont permises en utilisant le gène rapporteur luciférase. Par ailleurs, la capacité de ces vecteurs à transduire les cellules souches totipotentes du tissu hématopoïétique humain peut être évaluée, soit à partir de cellules CD34+ purifiées, soit à partir de cellules de sang de cordon total. Immunothérapie cellulaire anti-tumorale et anti-virale Un problème récurrent des pathologies malignes est la réponse faible du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Pourtant, les antigènes tumoraux existent et sont parfois même caractérisés en détail. L'approche générique proposée dans le cadre de l'invention consiste à générer une forte réponse CTL contre ces antigènes tumoraux par transduction stable, grâce aux vecteurs lentiviraux, de cellules dendritiques. De même, dans le cas du VIH, un nombre croissant d'arguments suggère qu'une réponse CTL forte et précoce peut permettre de rejeter une primo-infection et de protéger ensuite ces personnes "exposées non infectées" contre des expositions ultérieures. 4- BIBLIOGRAPHIE Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J Virol. 1997 Sep; 71(9): 6641-6649. Charneau P, F. Clavel. 1991. A single-stranded gap in human immunodeficiency virus unintegrated linear DNA defined by a central copy of the polypurine tract. J. Virol., vol. 65, N" 5, 2415-2421. Charneau P., Alizon M. and Clavel F. (1992). A second origin of plus strand synthesis is required for optimal HIV replication. J. Virol. 66: 2814-2820. Charneau P, G. Mirambeau, P. Roux, S. Paulous, H.Buc, F.Clavel.1994. HIV-1 reverse transcription : a termination step at the center of the genome. J.Mol.Biol., vol.241, 651-662. 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Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, ledit vecteur comprenant en outre une séquence de nucléotides déterminée (transgène) et des signaux de régulation de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les séquences d'origine rétrovirale sont dérivées du génome d'un lentivirus. 3. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les séquences d'origine rétrovirale-like sont dérivées d'un rétrotransposon. 4. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le transgène est contenu dans une cassette d'expression comprenant des signaux régulateurs de transcription et d'expression. 5. Particules vecteur rétrovirales recombinantes comprenant: a) une séquence de nucléotides dite séquence gag codant pour les nucléoprotéines d'un lentivirus ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides GAG), b) une séquence de nucléotides dite séquence XI codant pour les protéines RT, PRO, IN et RN d'un lentivirus ou pour un polypeptide dérivé fonctionnel (polypeptide POL), c) des signaux régulateurs de transcription et d'expression des séquences gag et pQ!, d) une séquence de nucléotides dite séquence env codant pour des polypeptides d'enveloppe ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides ENV), la séquence env étant placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, e) une séquence de nucléotides recombinante comprenant une séquence de nucléotides déterminée (transgène) placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, une séquence contenant des signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like et un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like et étant insérées dans une orientation fonctionnelle avec les susdits signaux régulateurs d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like. 6. Vecteur recombinant, selon la revendication 5, caractérisé en ce que les signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation sont d'origine lentivirale, le polynucléotide comprenant les régions cPPT et CTS est d'origine lentivirale. 7. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation et le polynucléotide comprenant les régions cPPT et CTS, sont dérivés d'un rétrovirus de type HIV, en particulier HIV-1 ou HIV-2. 8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que les signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation et le polynucléotide comprenant les régions cPPT et CTS, sont dérivés d'un virus choisi parmi les lentivirus CAEV, EIAV, VISNA, HIV,SIV ou FIV. 9. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide est une séquence d'ADN comprenant la région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et la région de terminaison (CTS) du génome d'un rétrovirus HIV-1. 10. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide comprend les régions cPPT et CTS d'une séquence qui peut être choisie parmi les séquences représentées à la figure Il ou en ce qu'il s'agit d'une de ces séquences, mutée notamment par délétion ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, dès lors que le polynucléotide permet la formation d'un triplex lors de la transcription du vecteur sous le contrôle des éléments de régulation appropriés. 11. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pTRIP.EGFP, déposé à la CNCM le 15Avril1998, sous le numéro 1.2005. 12. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que les séquences gag, 1 et énv sont dérivées des séquences d'un rétrovirus HIV, en particulier HIV-1, ou HIV-2. 13. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que les séquences gag et X! sont dérivées des séquences d'un rétrovirus HIV et la séquence env est dérivée d'un rétrovirus différent de HIV, ou d'un virus. 14. Vecteur recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence env code pour des polypeptides ENV amphotropes. 15. Vecteur recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence env code pour des polypeptides ENV écotropes. 16. Vecteur recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence env est dérivée du virus de la somatite vésiculeuse (VSV) ou du rétrovirus 4070A. 17. Particules vecteur recombinantes comprenant: a) une séquence de nucléotides dite séquence gag codant pour les nucléoprotéines d'un rétrotransposon ou pour des polypeptides dérivés fonctionnels (polypeptides GAG), b) une séquence de nucléotides dite séquence ! codant pour les protéines RT, PRO, IN et RN d'un rétrotransposon ou pour un polypeptide dérivé fonctionnel (polypeptide POL), c) des signaux régulateurs de transcription et d'expression des séquences gag et 2!, d) une séquence de nucléotides recombinante comprenant une séquence de nucléotides déterminée (transgène), placée sous le contrôle de signaux régulateurs de transcription et d'expression, des signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation de rétrotransposon et un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant dérivées d'un rétrotransposon et insérées dans une orientation fonctionnelle avec les signaux régulateurs de rétrotransposon. 18. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 13, caractérisé en ce que les signaux régulateurs de rétrotranscription, d'expression et d'encapsidation et le polynucléotide comprenant les régions cPPT et CTS, sont dérivés d'un rétrotransposon de levure. 19. Cellules recombinantes, caractérisées en ce qu'elles sont recombinées avec un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18. 20. Cellules recombinantes selon la revendication 19, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes différenciées non mitotiques. 21. Cellules recombinantes selon la revendication 19, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes primaires non mitotiques. 22. Cellules selon la revendication 20, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules de poumon, des cellules cérébrales, musculaires, épithéliales, hépatiques, dendritiques, neuronales, des cellules de la moëlle osseuse, des macrophages, des fibroblastes, des cellules hématopoiétiques, des lymphocytes. 23. Composition à visée thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 ou des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 19 à 22. 24. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 ou des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 19 à 22. 25. Utilisation d'un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like, pour la construction d'un vecteur recombinant. 26. Utilisation d'un polynucléotide comportant une région cis-active d'initiation centrale (cPPT) et une région cis-active de terminaison (CTS), ces régions étant d'origine rétrovirale ou rétrovirale-like pour l'import nucléaire ex vivo dans des cellules déterminées, d'une séquence de nucléotides (transgène). 27. Utilisation d'un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la transfection ou l'infection exvivo de cellules différenciées non mitotiques. 28. Utilisation d'un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la transfection ou l'infection exvivo de cellules primaires non mitotiques.