FR 2768744 A1 19990326 FR 9711678 A 19970919 L'invention concerne un procédé de culture mixotrophique de spirulines pour la production d'une biomasse riche en composés biologiquement actifs, en particulier riche en acides gras polyinsaturés co 6, en particulier en acide y-linolénique, et/ou en sulfolipides. Les spirulines ont été découvertes et sont utilisées comme complément alimentaire pour l'homme depuis plusieurs siècles. Ce sont des micro-algues bleuesvertes précieuses et rares ayant une valeur nutritionnelle particulière chez les enfants malnutris [1-5]. Elles se développent principalement dans les eaux sodées d'un certain nombre de lacs tropicaux, en zone aride. Elles sont riches en composés d'intérêt nutritionnel et biomédical : acides aminés indispensables, vitamines (A, B12, E), acides gras polyinsaturés essentiels (spécialement l'acide y-linolénique) précurseurs des elcosanoides (prostaglandines PGE1, PIGEZ et thromboxanes TXB2 etc.) chez les mammifères [6]. Les eïcosanoïdes (PGE2) et leucotriènes sont impliqués dans la réactivité immunitaire et la réaction inflammatoire. La prostaglandine PGE2 inhibe la prolifération des lymphocytes T4 qui interviennent dans la surveillance des cellules cancéreuses. La présente invention concerne un procédé de culture de spirulines pour obtenir une biomassc riche en acide y-linolénique et/ou en sulfolipide antiviral [7]. Les spirulines sont des algues bleues-vertes appartcnant au Phyllum Cyanophyta, classe: Cyanophyceae, ordre: Nostocales, famille: Oscillatoriaceae, genre : Spirulina ou Arthrospira. Il en existe différentes espèces, notamment les espèces platensis et maxima (Bourrelly P. 1970. Les algues bleues ou cyanophycées, dans Les Les Algues d'eau douce , Tome III, Editions N. Boubée). On a maintenant trouvé que des conditions de culture particulières, utilisant en tant que supplément le linoléate d'ammonium dans des conditions de température et d'éclairement optimisées, permettaient d'obtenir une biomasse de spirulines particulièrement riche en composés biologiquement actifs. Les spirulines poussent assez bien dans les milieux de culture supplémentés en linoléate d'ammonium. Elles absorbent l'acide linoléique exogène sous forme de linoléate d'ammonium pour synthétiser l'acide y-linolénique dans leurs lipides comme les monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), le digalactosyldiacylglycérol (DGDG), le sulfoquinovosyldiacylglycérol (SQDG) et le phosphatidylglyccrol (PG). L'invention concerne donc un procédé de culture mixotrophique de spirulines pour la production d'une biomasse riche en acides gras polyinsaturés co 6, en particulier en acide y-linolénique, et/ou en sulfolipides, caractérisé en ce que ladite production comprend au moins une étape de culture des spirulines en présence de linoléate d'ammonium. La concentration de linoléate d'ammonium ajouté dans le milieu est comprise entre 30 et 90 M/l, de préférence de 35 à 75 zM/1. Avantageusement, l'étape dc culture des spirulines en présence de linoléate d'ammonium est effectuée à une température comprise entre 20 et 350C et sous un éclairement compris entre 50 et 125 E/m2/s, de préférence entre 75 et 100 E/m2/s, de préférence selon un cycle d'éclairement par 24 h d'environ 8 à 12h dc lumière blanche et cnviron 16 à 12 h dans l'obscurité. Dans un aspect particulièremcnt préféré, le cycle d'éclairement est d'cnviron 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité. Le linéolate d'ammonium est avantageusement ajouté au milieu de culture durant la phase de croissance exponenticîle, dc préférence au milieu dc cette phase. De préférence, lorsqu'on effectue la production d'unc biomasse de spirulines riche en acides gras polyinsaturés co 6, en particulier cn acide y-linoléniquc, la température est comprise entre environ 240C et 350C, avantageusement environ 30 C et l'éclairement est de préférence compris entre 75 ct 125 ,uE/m2/s, avantageusement entre 75 et 100 uE/m2/s, dc préférence selon un cycle d'éclairement par 24 h d'cnviron 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité. Dans un aspect particulièrement préféré, le cycle d'éclairement est d'environ 12 h de lumière blanche ct environ 12 h dans l'obscurité. Lorsqu'on veut produire une biomasse de spirulines riche en sulfolipides, la température est dc préférence comprise entre environ 20 et 25 C, et l'éclairement est de préférence compris entre 100 et 125 HE/m2/s, avantageusement selon un cycle d'éclairement par 24 h d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité. Dans un aspect particulièrement préféré, le cycle d'éclairement est d'environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité. Dans un aspect avantageux de l'invention, on peut également supplémenter le milieu en glucose, de préférence pendant la phase dc croissance exponentielle, à une concentration de l'ordre de 2 à 5 g/l, de préférence 2,5 à 3 g/l. Cette supplémentation peut avantageusement etre effectuée à une température d'environ 30 C, sous éclairement d'cnviron 50 à 100 E/m/s selon un cycle alterné par 24 h d'environ 8-12 h de lumière blanche et 16-12 h dans l'obscurité, de préférence 12. h de lumière blanche et 12 h dans l'obscurité. La biomasse de spirulines peut être produite cn bassin ou en photobioréacteur stérile. Les bassins et photobioréactcurs appropriés pour ce type de culture sont bien connus de l'homme du métier et décrits par plusicurs auteurs [12,13]. La production de biomasse de spirulines riche en acides gras polyinsaturés co 6, en particulier en acide y-linolénique et/ou en sulfolipides en bassin ou en photobioréacteur peut être réalisée cn 3 étapes, à savoir: 1) la conservation des souches originales et la multiplication des souches (préparation des préculturcs pour l'cnsemencement), 2) la production cn masse, ct 3) la récolte dc la biomasse ainsi produitc. I - Souches de spirulines utilisées Le procédé de culture selon l'invention s'applique à toutes les souches de spirulines existantes, notamment à celles décrites dans les publications citées plus haut. La souche utilisée peut, par exemple, être choisie parmi les souches suivantes: - Spirulina platensis PCC 8005 provenant de l'institut Pasteur, Paris; - Spirulina maxima et Spirulina texcoco (Société Texcoco, Mexique); - Spirulina crater (Laboratoire La Roqucttc, France). La composition chimique générale de ces souches a été déterminée selon des méthodes d'analyse bien connues [8 - 12] et est présentée dans les tableaux 1, 2 et 3 ci-après. Tableau 1: Composition chimique générale ( %) Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater Protéines 56 - 61 59 - 60 60 - 61 58 - 60 Carbohydrates 16-19 18-19 13-14 12-14 Lipides 6,7 - 6,9 6,3 - 6,4 6 - 6,3 5 - 6 Sels minéraux | 7 - 13 7,5 - 8 6 - 12 7 - 8 Humidité 7 - 8 7,7 - 8 6,8 - 7 7 - 8 Caroténoides | 0,12 - 0,22 0,25 - 0,27 0,1 - 0,14 0,12 - 0,15 Chlorophylle a 0,7 - 0,8 0,77 - 0,80 0,7 - 0,76 0,7 - 0,78 Tableau 2 : Composition lipidique (%) Sp. 8005 Sp. maxima Sp. tcxcoco Sp. crater MGDG 31,5 - 33 34,0 - 38,9 34 - 38 35 - 39 DGDG 15,7 - 17,3 15,0 - 17,8 14,0 - 17,5 16 - 18 PG | 24,8 - 26,2 22,0 - 23,4 25,0 - 26,7 22,0 - 23,6 SQDG 24,8 - 26,6 22,3 - 23,7 24 - 26 22,0 - 24,5 Tableau 3 : Composition des acides gras totaux ( %) Sp. 8005 Sp. maxima Sp.texcoco Sp. crater A. palmitique 51,2 51,4 50,6 49,2 (C16:0) A. palmitoléique 3,6 5,0 4,3 2,1 (C16:1) A. stéarique 0,7 1,0 1,5 2,7 (C18:0) A. oléique 5,9 7,3 7,2 7,0 (C18:1) A. linoléique 18,2 14,6 15,0 18,5 (C18:2) A.&gamma;-linolénique 20,4 20,7 21,4 20,5 (y-C18:3) #C16/#C18 | 54,8 / 45,2 56,4 / 43,6 54,9 / 45,1 51,3 / 48,7 Dans le tableau 3 ci-dessus, les acides gras saturés et insaturés sont désignés de la manière suivante - C16:0 : acide palmitique (ou acide hexadécanoïque) - C16:1 (#9cis C16:1) : acide palmitoléique (ou acide cis-9-hexadécénoique) - C18:0 : acide stéarique (ou octadécanoïque) - C18:1 n-9 (#9cis C18:1) : acide oléique - C18:2 n-6 (#9,12 cis,cis C18:2): acide linoléique (ou acide cis,cis-9,l2- octadécadiénoïque) - C18:3 n-6 (#6,9,12 cis,cis,cis C18:3) : acide &gamma;-linolénique (ou acide cis,cis,cis-6,9,12-octadécatriénoïque). II - Conservatlon des souches originales La conservation des souches originales est réalisée à partir de souches dites de garde , sélectionnées et conservées de la manière suivante a) Milieu Zarrouk liquide de culture aseptique ayant sensiblement la composition chimique citée dans le tableau 4 ci-après; b) Température du milieu de culture d'environ 20 - 22 C ; c) Milieu de culture de réaction alcaline ou basique correspondant à un pH environ égal à 8,5; d) Eclairement dc la culture relativement faible (de l'ordre de 50 à 75 E/m/s) ; e) Eclairement dispensé pendant des plages d'environ 16 h alternant avec des plages d'obscurité d'cnviron 8 h par 24 h; f) Bouillon de précultures préliminaires maintenu en aération et turbulence générale par barbotage d'air stérile, enrichi en gaz carbonique (CO2) à une teneur de 1 % en volume environ, au débit d'environ 20-30 litres d'air enrichi en CO2/ litre de culture / heure dans le cas de préparation d'inoculum pour la production cn masse. Grâce à la lente croissance de la souche de garde dans le milieu Zarrouck liquide à 22 C, sous éclairement de 50 à 75 E/m/s, on peut repiquer régulièremcnt tous les 15-20 jours afin de toujours réserver une quantité suffisante de l'inoculum; g) Dans le cas de conservation des souches originales, on n'a pas besoin d'aération pendant 2-3 mois, à environ 22 C, sous l'éclairement de 50 à 75 E/m/s; h) Le pH du milieu Zarrouk est ajusté à 8,5 avant la stérilisation à 1200C pendant 20 min. Tableau 4 : Composition chimique du milieu dc Zarrouk (1966) NaHCO3 16,8 g K,HPO4 0,5 g NaNO3 2,5 g MgSO4,7H2O 0,2g K2SO4 1,0 g NaCI 1,0 g CaCl2 40 mg FeSO4 10 mg EDTA 80 mg Solution A5* 1 ml Solution B6** 1 ml H2O 1 litre * 1 litre de solution A5 contient H3BO3 2,86 g MnCl2, 4H2O 1,81 g ZaSO4, 7H2O 0,2 g CuSO4, 5H2O 79 mg MoO3 15 mg (ou NaMoO4) 21 mg ** 1 litre de solution B6 contient NH4VO3 23 mg K2Cr2(SO4)4, 24H2O 96 mg NiSO4, 7H2O 48 mg Na2WO4, 2H2O 18 mg Tio(S04)3 40 mg Co(NO3)2, 6H2O 44 mg III - Production en masse Dans la suite de la description, le nombrc d'étapes ou de phases de préculture ou de culture, ainsi que leur durée, est indiqué à titrc puremcnt indicatif, étant donné qu'il peut bien sûr varier selon les conditions utilisées, notamment selon la concentration cellulaire initiale. Pour la production mixotrophiquc de biomasse de spirulines riche en acides gras polyinsaturés # 6, en particulier en acide y-linolénique, ct/ou en sulfolipides en bassin, la phase de préparation des préculturcs pour l'ensemencement, également appelée préparation de l'inoculum (multiplication des souchcs) peut par exemple être réalisée en 7 étapes successives qui sont détaillées dans la figure 1. On notera que cette phase de préparation de l'inoculum n'est effectuée dans sa totalité qu'une seule fois au début du procédé de production. Pour préparer l'inoculum final, on peut ensuite réensemencer le milieu à un stade antérieur soit avec l'inoculum obtenu aux dernières étapes de préculturc (6ème ou 7ème étapc), soit avec une partie des souches dc spirulines obtenues en fin de production, ce qui représente un gain de temps et de faisabilité important à l'échelle industrielle. Un paramètre important, indépendamment du nombrc de phases, est la mesure de la concentration cellulaire, mesurée par la densité optique (D.O.) à 560 nm, qui permet une estimation du poids sec cellulaire. La mesure de la D.O. permet de mesurer la concentration cellulaire initiale et d'optimiser les conditions de culture: en utilisant une concentration cellulaire initiale élevée, on peut diminuer la durée de culture tout en augmentant le rendement de production, ce qui est particulièrement avantageux pour une production à l'échelle industrielle. Cette mesure permet également de définir le stade de croissance de la souche, et donc de déterminer le moment où le linoléate d'ammonium est ajouté dans le milieu de culture (la D.O. à ce moment est de l'ordre de 2). La biomasse s'évalue à cette longueur d'onde située dans un creux du spectre d'absorption et qui ne corrcspond donc à aucun pigment particulier. L'absorbance à cette longueur d'onde, pour autant qu'elle ne dépasse pas une valeur de 2, varie de manière linéaire avec la concentration de culture. La courbc d'étalonnage montre que la D.O. à 560 nm, qui varie avec la concentration et les volumes cellulaires, est linéairement proportionnellc au poids sec cellulaire : D.O. = 1 0,7 g sec /1. Lorsque la multiplication initiale des souches (préparation des précultures) est réalisée cn 7 étapes, il est possiblc, à partir dc la Suent étape, d'utiliser les milieux neufs stériles ZK dont les compositions sont données ci-après dans le tableau 5, à la place du milieu Zarrouk. Les milieux ZK (1) à (4) sont des milieux dc culture nouveaux particulièrement adaptés à la mise en oeuvre du procédé dc culture des spirulines décrit ci-dcssus, notamment à l'échelle industrielle, et représentent un objet ultérieur dc l'invention. Le milieu ZK (1) est particulièrement préféré. Tableau 5 : Composition chimique des milieux ZK (1) à (4) ZK (1) ZK (2) NaHCO3 8,4 g NaHCO3 8,4 g NaCl 5,0 g NaCI 4,5 g K2HPO4 0,2 g K2HPO4 0,2 g MgSO4, 7H2O 0,2 g NaNO3 3,0 g KNO3 2,5 g MgSO4, 7H2O 0,2 g FeSO4 0,01 g FeSO4 0,01 g ou FeSO4, 7H2O 0,018 g H2O 1 litre H2O 1 litre ZK (3) ZK (4) NaHCO3 8,4 g NaHCO3 8,4 g NaCl 5,5 g NaCI 5,5 g K2HPO4 0,3 g (NH )2CO ou (NH4)2SO4 0,1 g MgSO4, 7H2O 0,2 g NH4H2PO4 0,1 g (NH2)2CO ou (NH4)2SO4 0,2 g K2SO4 0,2 g FeSO4 0,01 g MgSO4, 7H2O 0,2 g H2O 1 litre FeSO4 0,01 g H2O 1 litre Des conditions dc culture particulièrement avantageuses pour la production d'une biomasse de spirulines riche cn acides gras polyinsaturés co 6, en particulier en acide y-linolénique et/ou en sulfolipides consistent à: - faire barboter 60 à 80 I d'air enrichi à 1 % (en volume) CO2/l dc milieu/h dans les précultures; - maintenir le pH du milieu de culture pendant la croissance entre 8,5 et 10,5, de préférence dc 9 à 10, pour éviter les contaminations par d'autres microorganismes qui ne peuvent pas se développer dans un milieu très basique; - maintenir les concentrations minimales en ions bicarbonate, phosphate et nitrate, adaptées aux besoins de la souche de spiruline au cours de la croissance; - maintenir la température de culture à 30"C en assurant un éclairement de 100 à 125,uE/m2/s à raison d'environ 8 à 12 h de lumière et environ 12 à 16 h dans l'obscurité par 24 h pendant la croissance, puis abaisser l'éclairement à 75100 ;È/m2/s pendant la dernière phase de la production. Dans un aspect avantageux, les concentrations en ions bicarbonate, phosphate et nitrate couvrant les besoins des souches de spirulines au cours de la croissance sont les suivantes * conccntration de bicarbonate de sodium d'environ 8 à 10 g/l au début dc la phase exponentielle de croissance et environ 0,8 à 0,9 g/l en phase stationnaire; * concentration en hydrogenophosphate d'environ 0,2 g/l au début de la phase exponentielle et d'cnviron 0,02 g/l en phase stationnaire; * concentration en nitrate de sodium ou nitrate de potassium d'cnviron 2,5 g/l et celle de nitrate NO3 est d'environ 0,45 à 1 g/l; Inti.1 - Production de biomasse en bassin a) Production de biomasse riche en acide y-linolénique La production de biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique en bassin peut par exemple être réalisée en 5 phases successives dans chacune desquelles on effectue un repiquage d'une quantité donnée de culture de la phase précédente dans une quantité donnée de milieu neuf (milieu Zarrouk ou milieu ZK), à partir d'un inoculum préparé lors d'une phase préalable (phase 0). la croissance est mesurée par la densité optique (D.O.) à 560 nm. De manière avantageuse, on effectue une supplémentation de linoléate d'ammonium durant la phase de croissance exponentielle, par exemple au milieu de cette phase de croissance, sous éclairement de 75 à 10OE/m2/s. Cette phase est de préférence réalisée dans un nouveau bassin de 10 m3 alors que les 4 premières ont cu lieu dans un premier bassin de 45 m3. Le bassin est de préférence équipé d'un système de circulation, par exemple une rouc à aubes, pour assurer la circulation du milieu de culture. On utilise l'éclairement altemé d'cnviron 8-12 h de lumière blanche ct environ 16-12 h dans l'obscurité par 24 h pendant 72 à 96 h, de préférence environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, en maintenant la température à environ 30"C, pour stimuler la synthèse d'acide y-linolénique dans les cellules de spirulines. En outre, après la supplémentation en linoléate, on abaisse le barbotage d'air enrichi à 1 % de CO, si nécessairc pour le mainticn du pH, et on le mainticnt au débit de 30-40 1/1 dc culture pendant 24 h pour éviter la formation de mousses, puis au débit plus fort de 50 à 70 de culture/h. b) Production dc biomasse riche en sulfolipides la production de biomasse de spirulines riche cn sulfolipides en bassin peut, par exemple, être réalisée dans un bassin dc 45 m3 en 6 phases successives dont les 4 premières sont effectuccs de la mcme manière que pour l'obtention dc biomasse dc spirulines riche cn acide y-linoléniquc. Lors de la phase de croissance exponentielle, réalisée dc préférence dans un second bassin de 12 m3, la culture est de préférence maintenue à environ 30 C sous éclairement de 75 à 100 E/m/s pendant 48 h, puis à environ 24 C sous éclairement plus élevé de 100 à 125 E/m/s pendant 48 à 72 heurcs. Simultanément, le cycle d'éclairement par 24 h doit être de préférence réglé à environ 8-12 h de lumière blanche /16-12 h dans l'obscurité, de préférence 12 h de lumière blanche et 12 h dans l'obscurité, afin de stimuler la synthèse de sulfolipidcs dans les cellules de spirulines. On mainticnt ensuite dc préférence la culture à une température de 20 à 22 C, sous un éclairement de 100 à 125 E/m/s, avec un cycle d'éclairement alterné d'environ 8-12 h de lumière blanche / environ 16-12 h dans l'obscurité pendant 72 à 96 h avant de récolter la biomasse. En outre, le barbotage d'air enrichi en 1 % de CO2 est avantageusement abaissé et maintenu au débit de 25 1/1 dc culture / heure pendant 24-48 h, puis au débit plus fort de 40-60 l / l de culture / h pendant 48-96 h après la supplémentation en linoléate d'ammonium, si nécessaire pour le maintien du pH. La supplémcntation en linoléate d'ammonium est effectuée durant cette phase dc croissance cxponenticllc, qui peut être par exemple la 5ème étape de la production. La récolte de la biomasse de spirulines riche cn acide y-linolénique est effectuée à la fin dc la phase dc croissance exponentielle tandis que la récolte de la biomasse riche en sulfolipides est effectuée pendant la phase stationnaire. La D.O à ce moment est de l'ordre dc 3 à 4. On maintient de la biomasse dans les décanteurs à 24 C pendant 24 h pour éliminer le surnageant. La récolte peut par exemple être effectuée dc la manière suivante La biomasse précipitée au fond des décanteurs est filtrée ou soumise à une centrifugation à 5 000 tours / min pendant 15 min puis rincée avec une solution de NaCI à la concentration dc 10 g / litre à 24 C afin d'éliminer une partie importante des sels résiduels et des traces de linoléate présents dans le milieu de culture. De plus, la teneur en sel de la solution de rinçage, similaire à celle du milieu de culture, permet d'éviter une rupture des membranes cellulaires due à la pression osmotique. Puis, on effectue une nouvelle centrifugation à 5 000 tours / min pendant 15 min et ensuite un rinçage à l'eau distillée ou déminéralisée (3 fois) à 20 - 24 C. La récolte de biomasse de spiruline est réalisée de préférence à une température comprise entre 20 et 24 C pour protéger la transformation d'acide linoléique en acide y-linolénique. Cette basse température permet également d'éviter la dégradation cellulaire et la dénaturation lipidique. La biomasse ainsi obtenue peut être lyophilisée ou atomisée, de préférence immédiatement afin d'éviter une contamination secondaire. Le surnageant peut être recyclé pour une nouvelle culture (6ème phase) sous réserve de recontrôler les concentrations en bicarbonate, nitrate, phosphate, potassium, sodium, linoléate, etc... et de recomplctcr lc milieu par les éléments nutritifs nécessaircs à la croissance des spirulines. Ces besoins sont d'environ 470 g de carbone; 120 g d'azote; 13,3 g de potassium; 7,6 g de phosphorc; 5,25 g dc soufre; 4 g dc chlore; 1,4 g de magnésium; 1 g de calcium ; 0,47 g de fcr ct 0,3 g dc sodium pour synthétiser 1 kg dc biomasse. Selon Ces besoins, on peut calculer les quantités des scls minéraux nécessaires afin dc recompléter après la récolte d'unc quantité connue de biomasse. III.2 - Production de biomasse en photobioréacteur La biomasse dc spirulines riche en acide &gamma;-linolénique ct/ou en sulfolipidcs peut alternativement être produit en photobioréactcur stérile. Ce type dc culture est particulièrement avantageux car il permet d'obtenir des biomasses de spirulines contenant une quantité encore plus importante d'acide y-linolénique ou dc sulfolipides que dans une culture cn bassin. De plus, le contrôlc des conditions de culture ct la culture en système fermé permettent d'assurcr une grande pureté du produit fini, particulièrement adapté à une utilisation pharmaceutique ou cosmétique. La préparation de l'inoculum (multiplication des souches de spiruline) peut par exemple être réalisée en 4 étapes successives dans chacune desquelles on effectue un repiquage d'une quantité donnée de la culture dc l'étape précédente dans une quantité donnée de milieu neuf, de préférence le milieu Zarrouk. On peut par exemple réaliser les 3 premières précultures en erlenmeyers de 50 ml, 250 ml et 11, et la 4ème préculture en photobioréacteur de 2 b) Production de biomasse riche en sulfolipides Pour l'obtention de biomasse de spirulines riche en sulfolipidcs en photobioréacteur, la production peut, par exemple, être réalisée en 2 phasmes. Au cours de la seconde phase, le milieu est supplémenté en linoléate d'ammonium dans les mêmes conditions que pour l'obtention d'unc biomasse de spirulines riche en acide &gamma;-linolénique. Cette phase se déroulc ensuite de préférence pendant 5 à 8 jours en 3 sousphases successives dans les conditions suivantes - 1ème sous-phase : . température de 28 C à 32 C, de préférence 30 C ; . éclairement de 75 à 100 E/m/s selon un cycle de 8 à 12 h de lumière blanche / 16 à 12 h dans l'obscurité par 24 h pendant 48 h; barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 avec un débit de 25 l/l de culture pendant 24 à 48 h ; - 2ème sous-phase : . température de 20 à 25 C, de préférence 24 C ; . éclairement de 100 à 125 E/m/s selon le même cycle que dans la 1ère sous-phasc; barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 avec un débit de 40 à 50 I/l de culture/h pendant 48 à 72 h; - 3ème sous-phase : . température de 20 à 22 C ; . éclairement de 100 à 125 E/m/s, selon le même cycle que dans la 1ère sous-phase pendant 72 - 96 h; barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 avec un débit de 40 à 60 1/1 dc culture/h pendant 72-96 h; La récolte de la biomassc de spirulines riche en sulfolipides est effectuée dans les conditions dccrites plus haut. Les procédés de culture décrits ci-dcssus, en bassin ouvcrt ou en photobioréacteur stérile permettent d'obtenir des biomasses de spirulines particulièrement riches en acide y-linolénique et/ou en sulfolipides, qui constituent un objet ultérieur de l'invention. Pour la biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique, la proportion d'acide y-linolénique dans la biomasse par rapport aux acides gras totaux est d'au moins environ 25 %, notamment d'environ 29 à 35 % pour la culture en bassin et d'environ 30 à 36 % pour la culture en photobioréacteur, alors que dans un procédé classique, cette proportion est de l'ordre de 20 à 22 %. Pour la biomasse de spirulines riche en sulfolipides, la proportion desdits sulfolipides par rapport aux lipides totaux est d'au moins environ 35 %, notamment d'environ 38 à 42 % pour la culture en bassin et d'environ 39 à 43 % pour la culture en photobioréacteur. Le pourcentage d'acide y-linolénique est également en légère augmentation. On observe également une augmentation de la teneur en lipides totaux dans les biomasses riches en acide y-linolénique ou riches en sulfolipides produites. Le procédé de culture des spirulines riche en acide y-linolénique selon l'invention peut avantageusement être utilisé pour produire une biomasse riche en cet acide gras sous forme d'un supplément alimentaire à haute valeur nutritive pour l'homme ou les animaux (par exemple poule pondeuse, crevettes, cerfs, chèvres). En outre, l'extraction de l'huile riche en acide y-linolénique à partir de biomasse de spiruline peut être réalisée par des méthodes connues [14] pour fournir une catégorie d'huile alimentaire contenant de 75 à 85 % d'acide y-linolénique. La purification d'acide y-linolénique isolé à partir de cette huile peut efficacement être réalisée car elle ne contient que des teneurs faibles d'acides gras saturés et monoinsaturés. Le produit fini sous forme d'acide ylinolénique naturel peut être utilisé dans l'industrie pharmaceutique et cosmétique. L'invention est illustrée par les exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif. Les figures auxquelles il est fait référence dans les exemples sont les suivantes - figure 1: schéma de la préparation des précultures (préparation de l'inoculum) de spirulines pour la production en masse; - figure 2: schéma du procédé de production de biomasse de spirulines riches en acide y-linolénique en bassin; - figure 3: schéma du procédé de production de biomasse de spirulines riches en sulfolipides en bassin; - figure 4: schéma de la production de biomasse de spirulines riches en acide y-linolénique en photobioréacteur; - figure 5: schéma de la production de biomasse de spirulines riches en sulfolipides en photobioréacteur. EXEMPLE 1 - PRODUCTION D'UNE BIOMASSE DE SPIRULINES RICHES EN ACIDE y LINOLENIQUE EN BASSIN 1. Préparation des souches originales et précultures pour la production en masse 1.1 Souches orignales: Les 5 souches suivantes de Spirulina ont été utilisées: - Spirulina platensis PCC 8005 provenant de l'institut Pasteur Paris; - Spirulina maxima et Spirulina texcoco (Société Texcoco, Mexique); - Spirulina crater (Laboratoire La Roquette, France). Elles ont été purifiées et conservées dans le milieu Zarrouk solide et liquide (Tableau 4), à 20-220C et sous faible lumière altemée (50 à 75,E/m2/s), avec 16 h de lumière / 8 h dans l'obscurité. 1.2 Précultures: Des précultures en erlenmeyer de 1 et 5 litres sont préparées et repiquées tous les quinze jours. Le pH du milieu de Zarrouk est ajusté à 8,5 avant la stérilisation à 1200C pendant 20 min. Les précultures peuvent être commencées par la concentration cellulaire initiale mesurée par la densité optique de 0,3 à 0,5, mesurées à 560 nm sur un spectrophotomètre Varian DMS-90. Ces précultures sont aérées grâce à un barbotage d'air qui permet également l'alimentation en CO2 avec un débit de mélange gazeux à 1 % de CO2 de 60-80 1/1 de culture/h. En outre, les précultures en petit erlenmeyer (500 ml, 11, 2 l) peuvent aussi être réalisées dans un incubateur à CO2 Gallemkamp, avec une agitation orbitale 100 rotations par minute dans lequel est maintenue une atmosphère à 1 % de CO2. Pour toutes les précultures, l'éclairage est de lOO,uE/m2/s. L'inoculum préparé en erlenmeyer de 5 l sera utilisé pour la multiplication des souches avec des gaines plastiques de 150 l ou des bassins de 100 et 500 1 pour obtenir 1000 l de préculture, qui sont transférés vers le bassin de 45 m3 afin de commencer la production cn masse( voir figure 1). 2. Préparation du milieu de culture pour la production en bassin: Toutes les précultures pour l'ensemencement ont été préparées avec le milieu de Zarrouk tandis que les cultures en masse à partir de 1 à 20 m3 ont été réalisées avec le milieu neuf ZK (1) (Tableau 5). Le milieu Zarrouk (stérilisé à 120 C, pH = 8,5 - 9 pendant 20 minutes et refroidi à 30 C) a été utilisé afin de préparer les précultures de spiruline (1è" à 4emc préculture). Pour les autres précultures (5ème et 7ème préculturcs) et la production en masse, on peut utiliser le milieu neuf ZK (1) pour remplacer le milieu Zarrouk. 2.1 Stérilisation de l'eau usuelle pour la culture en masse L'eau usuelle peut être stérilisée par la méthode d'ultrafiltration avec un système de Millipore Filter ou par stérilisation avec l'hypochlorite de sodium : on ajoute à 140 litres d'eau usuelle 20 ml d'hypochlorite de sodium et on maintient à 25- 30 C pendant 19-94 h. On ajoute 15,4 ml d'une solution de thiosulfate dc sodium (350 g/litrc). On peut éliminer la quantité dc chlore cn excès par un barbotage d'air stérilisé pendant 30-60 min. On peut également utiliser de l'eau dc mer cn ajoutant à 140 litres d'eau dc mer 40 ml d'hypochlorite de sodium. 2.2 Preparation de linoleate d'ammonium: Lc linoléatc d'ammonium peut être synthétisé par les 2 méthodes suivantes: (a) méthode 1: On ajoute 4 ml d'éther éthylique ammoniacal, préparé par barbotage d'ammoniac anhydre pendant 1 min dans un tube placé dans la glace contenant 10 ml d'éther éthylique, dans le tube contenant 0,5 g d'acide linoléique à sec. On évapore à sec avec de l'azote. On remet cn solution dans du tampon dilue (par exemple du tampon tris-HCl 10 mM) ou dans de l'eau tamponnée à pH 8-9 avec de l'ammoniaque afin d'éviter leur dissociation. Après rinçagc des parois, on ajoute l'eau tamponnée pour obtenir un volume final d'environ 50 ml. (b) méthode 2 : On ajoute à 0,5 g d'acide linoléique à sec 5,4 ml d'une solution d'ammoniaque 18 % et 4,6 ml d'eau bidistilléc. On chauffe le mélange à 50-60 C pendant 30-45 min. On ajuste le pH à 8-9 avec de l'eau bidistillée après l'élimination de l'ammoniaque en excès avec de l'azote. Le volume final de la solution de linoléate d'ammonium est d'environ 50 ml. La concentration de cette solution de linoléate est d'environ 10 mg/ml. La solution de linoléate est stérilisée par filtration sur filtre MilliporeR 0,1 0,2 ym dans des conditions stériles. En outre, pour éliminer les mousses à la surface du milieu de culture, on a utilisé le silicone 426 R (à la concentration 1 mg/l, pH 6) en tant qu' antimousse. 3. Production en masse de spirulines riches en acide y-linolénique en bassin (figure 2) (a) Après la préparation de 1 m3 d'inoculum (7ème préculture) avec la concentration cellulaire initiale (D.O à 560 nm = 1-1,2), on a utilisé un bassin de 45 m3 équipé d'une roue à aubcs pour faire circulcr le milieu de culture avec la vitesse de 10 à 20 cm/s; d'un thermorégulateur pour maintenir la température à 30 C et régler la température de culture à 20-350C selon le besoin du procédé de culture; d'un système d'éclairage pour assurer l'illumination de la culture de 50 à 125,aE/m2/s et d'une pompe centrifugeuse pour alimenter de l'eau et récolter la culture de spiruline. La profondeur du milieu de culture peut être réglée à 20-40 cm. Le linoléate d'ammonium ct le milieu neuf ZK (1) ont été préparés séparément à pH 8,5-9. Le bassin propre a été installé sous serre en plastiquc pour éviter la contamination en utilisant efficacement la lumière du soleil (b) le procédé de production comprend les phases suivantes: * Phase 0 : on prépare 1 m3 d'inoculum (rz préculture) ayant une D.O. z 11,2. On lave le bassin de 45 m3 ct on cn vérifie la propreté avant l'ensemencement, puis on prépare 2 m3 du milieu neuf ZK (1) et on ajuste le pH à 8,5-9. * Phase 1 : on aioutc à 2 m3 du milieu neuf ZK (1) 1 m3 d'inoculum ayant une D.O. # 0,3-0,4 . On regle et on maintient la température à 30 C ct l'intensité lumineuse à 100 à 125 E/m/s. La vitesse de circulation du milieu de culture (V) est maintenue à 10 cm/s. Après 72 h, on mesure la D.O. = 0,55-0,65 pour connaître la vitesse de croissance de la spiruline. * Phase 2 : on ajoute à 3 m3 de culture (de la phase 1) 2 m3 du milieu neuf ZK (1). On maintient la culturc à 30 C, 100 à 125,uE/m2/s, pH 9, V = 10 cm/s pendant 72 h. On mesure la D.O. > 0,76-0,9 pour connaître la croissance de spiruline. * Phase 3 : on ajoute à 5 m3 de culture (de la phase 2) 5 m3 du milieu neuf ZK (1) et on maintient toutes lcs conditions de culture de la phase 2. Après 72 h, la D.O. mesurée est = 1,1-1,25. * Phase 4: on ajoute à 10 m3 de culture (de la phase 3) 5 m3 du milieu neuf ZK(1) et on maintient toutes les conditions de culture de la phase 3. Après 72-96 h, la D.O. mesurée est E 1,4-1,8. * Phase 5 : on extrait 4 m3 de culture de la phase 4 et on transfère cette quantité vers de le second bassin de 12 m3 pour continuer à cultiver en présence de linoléate d'ammonium (35-75 M linoléate/l). La D.O. mesurée est = 1,9-2,1. En même temps, on rajoute à 11 m3 de culture dans le bassin principal 4 m3 du milieu neuf ZK (1) pour préparer une autre culture en phase 4 en contrôlant simultanément le milieu et en le recomplétant en éléments nutritifs nécessaires à la croissance des spirulines. On maintient la culture supplémentée cn linoléate à 30"C, l'éclairement de 75-100,aE/m~/s et le pH 9-10; après 72-96 h, la D.O. mesurée est > 2,4-2,9. (c) Conditions dc culture Les conditions dc pH, température, éclairement, barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 mentionnées plus haut dans la description doivent être maintenues. Il y a également lieu dc veiller à maintenir des concentrations en ions adaptées aux besoins de la spiruline au cours dc la croissance, comme indiqué également plus haut. (d) Récolte de la biomasse de spirulines La culture de spirulines est maintenue dans les dccantcurs à 240C pcndant 24 h pour éliminer le surnageant. La biomasse précipitc au fond de décanteurs et est récoltée par la filtration ou la centrifugation à 5000 tours / min pendant 15 min et ensuite rincée avec une solution de NaCI à la concentration de 10 g / litre à 240C. Puis la biomasse est récoltée par une nouvelle centrifugation à 5000 tours / min pendant 15 min et ensuite rincée 3 fois avec de l'eau distillée ou déminéralisée à 20-24 C avant lyophilisation ou atomisation. 4. Résultats La composition chimique générale des spirulines cultivées selon le procédé de l'invention pour l'obtention de biomasses riches en acide y-linolénique, leur composition lipidique et leur composition en acides gras totaux sont rapportes respectivement dans les tableaux 6, 7 et 8 ci-après. Tableau 6 : Composition chimique générale des spirulines ( % ) cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en acide y-linolénique. Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater Protéines 55 - 60 54 - 59 53 - 58 56 - 58 Carbohydrates 15-18 13,5 - 15,0 10 - 12 11 - 13 Lipides 6,8 - 7,4 6,8 - 7,5 7,0 - 7,5 6,7 - 7,4 Sels minéraux 7,0 - 12,0 7,0 - 8,5 8 - 11 7,0 - 8,5 Humidité 7,0 - 8,0 7,0 - 8,0 7,0 - 8,0 7,0 - 8,0 Caroténoides 0,20 - 0,29 0,30 - 0,35 0,15 - 0,20 0,15 - 0,19 Chlorophylle a 0,7 - 0,8 0,67 - 0,72 0,70 - 0,78 0,7 - 0,8 Tableau 7 : Composition lipidique des spirulines ( % ) cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en acide y-linolénique Sp. 8005 Sp. maxima Sp. tcxcoco Sp. cratcr MGDG 46,1 - 47,5 44,8 - 46,8 45,0 - 46,3 42,8 - 44,5 DGDG | 10,7 - 12,3 11,0 - 11,7 10,6 - 11,2 11,5 - 11,7 PG 19,0 - 20,4 18,9 - 19,5 18,8 - 19,6 19,5 - 20,1 SQDG | 21,5 - 22,5 21,7 - 22,4 22,5 - 22,8 21,2 - 23,7 Tableau 8: Composition des acides gras totaux ( % ) des spirulines cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en acide y-linolénique Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater A. palmitique 30 35 34,5 36,6 (C16:0) A. palmitoléique 1,3 1,2 1,3 1,2 (C16:1) A. stéarique 1,4 1,4 1,4 1,4 (C18:0) A. oléique 3,7 4,8 4,7 4,5 (C18:1) A. linoléique 28,8 27,9 28,4 27,2 (C18:2) A.&gamma;-linolénique 34,8 29,7 29,7 29,1 (&gamma;-C18:3) #C16/#C18 31,3 / 68,7 36,2 / 63,8 35,8 / 64,2 37,8 / 62,2 Les résultats montrent que: - les biomasses produites contiennent de 6,7 à 7,5 % du poids sec sous forme de lipides, en augmentation par rapport aux souches originales. En outre, la teneur en caroténoides augmente et atteint de 0,15 à 0,35 % [tableau 6]. Les biomasses obtenues contiennent une quantité importante de MGDG atteignant de 42,8 à 47,5 % des lipides totaux [tableau 7] tandis que la proportion de SQDG n'est environ que de 21,2 - 23,7 % des lipides totaux. Dc plus, la teneur cn acidc y-linoléniquc dans ces biomasses augmcntc ncttcmcnt ct atteint de 29 à 34,8 % des acidcs gras totaux - l'accumulation d'acidc y-linolcniquc est parallèlement accompagnée par l'augmentation d'acide linoléique dans ces biomasses [tablcau 8], ce qui montre que l'acide linoléique exogène sous forme de linoléate d'ammonium a été absorbé et désaturé par la #6 désaturase pour former l'acide y-linolénique dans les cellules de spiruline ; - les pourcentages des acides gras totaux C16 dans les biomasses diminuent en fonction dc l'augmentation des acides gras totaux C18 (31,3 / 68,7 chez Spirulina 8005). EXEMPLE 2 - PRODUCTION D'UNE BIOMASSE DE SPIRULINES RICHES EN SULFOLIPIDES EN BASSIN 1. La préparation des souches originales, les précultures et la préparation du milieu de cultures sont telles que décrites pour l'exemple 1. 2. Le procédé de production dont le schéma est représenté dans la figure 3, comprend les 6 étapes suivantes: * Phase 0 à phase 4 (dans le 1er bassin de 45 m3): les spirulines sont cultivées comme décrit dans l'exemple 1. A la fin de la phase 4, on prend 4 m3 de culture que l'on transfère vers le 2 bassin et on rajoute à 11 m3 de culture 4 m3 du milieu neuf ZK (1) en contrôlant simultanément le milieu et en le recomplétant en éléments nutritifs nécessaires à la croissance des spirulines. * Phase 5 (dans le 2 bassin de 12 m3): on cultive 4 m3 de spirulines supplémentées en linoléate d'ammonium à la concentration de linoléate de 35 75 pM / litre à 30 C / 48 h puis à 24 C pendant 48 h, sous éclairement de l'ordre de 75-125 tLE/m2/s. Après 96 h de culture, ce volume de culture est transféré vers le 3= bassin pour stimuler la synthèse de sulfolipides dans les cellules de spirulines. En mcme temps, on continue à prélever un nouveau volume de culture (4 m3) du 1er bassin afin de refaire une autre culture en présence de linoléate d'ammonium. La concentration cellulaire atteint une D.O. à 560 nm # 2,4 - 2,7 à la fin de la phase 5. * Phase 6 (dans le 3ème bassin de 12 m3) : on continue de cultiver les spirulines supplémentées en linoléate à 20 - 220C sous éclairement de 100125ssE/m2/s pendant 72 - 96 h avant de récolter la biomasse. La concentration cellulaire atteint une D.O. à 560 nm # 2,5 - 2,8 à la fin de la phase 6. La récolte est effectuée dans les conditions décrites dans l'exemple 1. 3. Résultats La composition chimique générale des spirulines cultivees selon le procédé de l'invention pour l'obtention de biomasses riches en sulfolipides, leur composition lipidique et leur composition en acides gras totaux sont rapportées respectivement dans les tableaux 9, 10 et 11 ci-après. Tableau 9 : Composition chimique générale ( % ) des spirulines cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en sulfolipides. Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater Protéines 54 - 59 53 - 60 53 - 59 56,0 - 59,5 Carbohydrates 13 - 16 13,0 - 14,8 10,0 - 11,5 12,0 - 13,4 Lipides | 6,7 - 7,2 6,6 - 7,2 6,8 - 7,1 6,9 - 7,0 Sels minéraux 7,0 - 10,8 7,3 - 8,2 8,0 - 11,0 7,4 - 8,5 Humidité | 7,0 - 8,0 7,2 - 8,0 7,0 - 8,0 7,3 - 8,2 Caroténoides 0,16 - 0,24 0,28 - 0,32 0,12 - 0,17 0,13 - 0,18 Chlorophylle a 0,7 - 0,8 0,7 - 0,8 0,73 - 0,78 0,72 - 0,77 Tableau 10 : Composition lipidique ( % ) des spirulines cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en sulfolipides Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater MGDG 34,0 - 34,8 34,5 - 35,6 37,0 - 38,4 36,9 - 38,1 DGDG 9,5 - 10,2 9,0 - 9,5 8,8 - 9,6 8,6 - 9,2 PG 12,9 - 13,4 14,0 - 14,6 12,0 - 12,8 13,6 - 14,0 SQDG 40,8 - 41,6 39,5 - 40,3 38,5 - 39,2 38,0 - 38,7 Tableau 11: Composition des acides gras totaux (%) des spirulines cultivées en bassin pour obtenir les biomasses riches en sulfolipides Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater A. palmitique 40,2 41,0 41,5 41,1 (C16:0) A. palmitoléique 2,7 2,8 2,5 3,3 (C16:1) A. stéarique 3,0 3,3 3,2 3,8 (C18:0) A. oléique 3,4 3,8 4,9 4,7 (C18:1) A. linoléique 24,9 24,4 22,2 21,4 (C18:2) A.&gamma;-linolénique 25,8 25,1 25,7 25,7 (y-C18:3) #C16 / #C18 | 42,9 / 57,1 43,8 / 56,2 44 / 56 44,4 / 55,6 Les résultats montrent quc: - les spirulines contienncnt environ dc 6,6 à 7,2 % du poids sec sous forme de lipides, en augmentation par rapport aux souches originales [tableau 9]; - le pourcentagc dc MGDG diminue en fonction dc l'augmentation de SQDG (ou sulfolipide). La proportion dc sulfolipides augmente significativement dans toutes les souches utilisées ct varic entre 38 ct 41,6 % des lipides totaux tandis que le pourcentage de MGDG chcz toutes les souches utilisées diminuc ct varie entre 34,0 et 38,4 % des lipides totaux [tableau 10]. Ces résultats prouvent que l'abaissement de la température (30 C # 24 C # 20 C) a stimulé la synthèse des sulfolipides; - la proportion d'acide y-linoléniquc augmcntc légèrement dc 20,4 à 25,8 %chez Spirulina 8005; - le rapport des acides gras totaux C16 / des acides gras totaux C18 nc varie pas fortement et n'est que d'cnviron 42,9 / 57,1 chez Spirulina 8005 [Tableau 11]. Ces résultats montrent que les conditions de culture du procédé selon l'invention influencent significativement la proportion de sulfolipides dans la biomasse. EXEMPLE 3 - PROCEDE DE CULTURE DE SPIRULINES RICHES EN ACIDE -&gamma; LINOLENIQUE EN PHOTOBIOREACTEUR STERILE (FIGURE 4). 1. Multiplication des souches de spiruline : On a utilisé les mêmes souches que dans l'exemple 1. Toutcs les précultures dc spirulines ont été préparées par les cultures cn erlenmeyers (50 ml, 250 ml ct 1 I) ct en photobioréacteur dc 2 l. La préparation des précultures n'est effectuée qu'une seule fois au début de la production en masse. La multiplication des souches est réalisée par les 4 étapes suivantes a) la première préculture (10 ml) est préparée par un erlenmeyer dc 50 ml placé dans un incubateur Gallemkamp, à agitation orbitalc de 100-120 rotations/min dans lequel est maintenue l'atmosphère à 1 % de CO2, sous l'éclairement de 100 E/m/s. Le cycle d'éclairement est d'environ 12 h de lumière blanche/ 12 h dans l'obscurité pendant 5-7 jours à 30 C. La concentration cellulaire initiale est d'environ 0,2 - 0,35 g sec par litre de milieu Zarrouk (D.O.560 = 0,3 - 0,5) ct la concentration cellulaire finale de la 1ère préculture atteint une D.O.560 t 1 - 1,2. b) on utilise 10 ml de 1ère préculture comme inoculum pour faire la seconde préculture dans un crlcnmcycr dc 250 ml contenu 40 ml de milieu Après 5-7 jours de culture, on peut obtenir 1 l de la 4ème préculturc avec une D.O.560 # 1,2-1,4. 2. Production d'une biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique en photobioréacteur (figure 4) a) on prépare 4 l de milieu stérile Zarrouk dans un photobioréacteur de 7 l en ajoutant 1 l de quatrième préculture comme l'inoculum préparé à l'étape 1.d). La culture est réalisée sous les mêmes conditions de culture que les précultures précédentes (D.O.560 t 1,4 - 2,0 après 5-7 jours de culture), avec une vitesse d'agitation d'environ 100 - 150 tours par minute. Le barbotage d'air enrichi à 1 % dc CO2cst réglé au débit de 50-70 l /l de culture / h. b) on prélèvc 4 l de culture dans le premier photobioréacteur en recomplétant 4 l de milieu neuf stérile Zarrouk pour continuer à préparer la prochaine culture. Ensuite, on transfere stérilement 4 l de cette culture vers le second photobioréacteur de 7 l en supplémentant en linoléate d'ammonium (à une concentration de 35 - 75 MM linoléate /1) au milieu dc la phase dc croissance exponentielle pendant 4-6 jours. La culture est réalisée sous les conditions suivantes: à 30 C, sous un éclairement de 75 à 100uE/m2/s, avec un cycle d'éclairement par 24 h de 8 - 12 h dc lumière blanche / 16-12 h dans l'obscurité après la supplémcntation de linoléate. Simultanément, le barbotage d'air enrichi en 1 % CO2 est réglé au débit de 20-30 litres /1 de culture / h après la supplémentation de linoléate et maintenu pendant 24 h pour éviter la formation des mousses à la surfacc du milieu de culture. On utilise le siliconc 426R comme agcnt antimousse. La vitesse d'agitation cst maintenue à environ 100 - 150 tours par minute. Puis le barbotage d'air enrichi à 1 % dc CO2 doit être augmenté et maintenu entre 50 ct 70 l/l de culture / h. c) après 4-6 jours de culture, on récolte la biomasse dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Dans cet exemple, la culture a été réalisée avec une concentration cellulaire plus élevée. Ccci a permis dc diminucr la durée de la production en augmcntant le rendement de culture (de : 2,4 à 2,6 g sec par litre). 3. Résultats Les spirulines cultivées en photobioréacteur selon le procédé de l'invention contiennent une quantité d'acide y-linolénique plus importante que celles cultivées en bassin. La proportion d'acide y-linolénique dc la biomasse obtenue est d'environ 30-36 % des acides gras totaux (Tableaux 12 et 13). Le rendement de la culture en photobioréacteur est supérieur à celui de la culture en bassin et atteint 1,78 - 2,2 g sec par litre. Tableau 12 : Composition lipidique ( % ) des spirulines cultivées en photobioréacteur pour obtenir les biomasses riches en &gamma;-linolénique Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater MGDG 45,8 - 47,8 45,1 - 47,0 45,3 - 46,6 43,1 - 44,8 DGDG | 11,0 - 11,5 11,3 - 11,8 11,0 - 11,5 11,6 - 11,8 PG 18,0 - 18,5 19,1 - 20,0 19,0 - 19,3 19,6 - 20,0 SQDG | 21,4 - 22,2 20,7 - 21,2 22,4 - 22,6 21,0 - 23,4 Tableau 13 : Composition des acides gras totaux ( % ) des spirulines cultivées en photobioréactcur pour obtenir les biomasscs riches en &gamma;-linolénique Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater A. palmitique 29,7 34,3 34,0 36,0 (C16:0) A. palmitoléique 1,2 1,2 1,3 1,2 (C16:1) A. stéarique 1,3 1,4 1,4 1,3 (C16:0) A. oléique 3,5 4,6 4,5 4,2 (C18:1) A. linoléique 28,3 28,0 28,6 27,3 (C18:2) A.&gamma;-linolénique 36,0 30,5 30,2 30,0 (&gamma;-C18:3) #C16/#C18 30,9 / 69,1 35,5 / 64,5 35,3 / 64,7 37,2 / 62,8 EXEMPLE 4 - PROCEDE DE CULTURE DE SPIRULINES RICHES EN SULFOLIPIDES EN PHOTOBIOREACTEUR STERILE (FIGURE 5) 1. Production d'une biomasse de spiruline riche en sulfolipides en photobioréacteur On a utilisé les mêmes souches que dans l'exemple 1. a) la multiplication de souche est réalisée par les 4 étapes indiquées à l'exemple 3.1. La préparation des précultures n'est effectuée qu'une seule fois au début de la production en masse. b) la préparation de 5 l de culture dans le premier photobioréacteur de 7 1 est réalisée par les étapes citées dans l'exemple 3, 2), a). c) on prélève 4 1 dc culture du premier photobioréactcur en recomplétant 4 1 de milieu neuf stérile Zarrouk dans ce photobioréacteur pour continuer à préparer une autre culture. Ensuite, on transfère stérilement 4 l de cette culture comme inoculum vers le second photobioréacteur de 7 l en supplémentant en linoléate d'ammonium (à une concentration dc 35 - 75 M linoléate /1) pendant 5-7 jours, sous les conditions de culture suivantes c.1) la première étape comprend 2 phases successives - Phase 1: la culture est maintenue à 300C sous c clairement de 75 à 100 E/m/s, pendant 48 h. Simultanément, le cycle d'éclairement doit être réglc environ 8-12 h de lumière blanche /16-12 h dans l'obscurité par 24 h. En outre, le barbotage d'air enrichi cn 1 % COn doit être abaissé et maintenu au débit de 25-35 1/1 de culture / h pendant 24 à 48 h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100 150 tours par minute. - Phase 2 : la culture est placéc à 24 C, sous éclairement plus fort dc 100 à 125 E/m/s pendant 48 h. Lc cycle d'éclairement est d'cnviron 8-12 h de lumière blanche / 16-12 h dans l'obscurité par 24 h. Le barbotage d'air enrichi cn 1 % dc CO2 est augmenté et maintenu au débit plus fort de 40-50 1/I de culture / h pendant 4872 h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100-150 tours / minute. c.2) dans la seconde étape, la température dc culture est abaissée à 20-22 C, sous l'éclairement 100 à 125 E/m/s. Le cycle d'éclairement est d'environ 12 h de lumière blanche / 12 h dans l'obscurité pendant 72 - 96 h avant de récolter la biomasse. Le pH est d'environ 9-10,5 pour optimiser la synthèse de sulfolipide dans les cellules dc spirulines. La culture est aérée par un mélange d'air enrichi en 1 % de CO2 au débit de 50-60 l / l de culture / h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100 - 150 tours / minute. La durée de la deuxième étape peut varier selon la souche cultivée. d) la biomasse riche en sulfolipides est récoltée par le procédé de récolte indiqué dans l'exemple 1. Lc schéma de la production de spirulines riches en sulfolipides en photobioréacteur est présenté dans la figure 5. L'augmentation de la concentration cellulaire initiale permet de réduire la durée de culture tout en augmentant le rendement de production (de 2,3 à 2,6 g sec /1). 2. Résultats Les spirulines produites en photobioréacteur par le procédé selon l'invention contiennent une quantité importante de sulfolipidcs atteignant 39 - 43 % des lipides totaux (Tableaux 14 et 15). Lc rendement de culture atteint de 1,65 à 2,1 g scc/l. Tableau 14 : Composition lipidique ( % ) des spirulines cultivées en photobioréacteur pour obtenir les biomasses riches en sulfolipides Sp. 8005 Sp. maxima Sp. tcxcoco Sp. cratcr MGDG 33,8 - 34,9 34,0 - 35,2 36,8 - 37,3 36,5 - 37,4 DGDG 9,8 - 10,8 9,2 - 9,6 8,9 - 9,2 8,6 - 9,1 PG x 11,0 - 11,3 13,0 - 14,0 12,4 - 12,8 12,6 - 13,0 SQDG 40,9 - 43,0 39,8 - 41,2 39, - 40,7 39,0 - 40,5 Tableau 15 : Composition des acides gras totaux ( % ) des spirulines cultivées en photobioréacteur pour obtenir les biomasses riches en sulfolipidcs Sp. 8005 Sp. maxima Sp. texcoco Sp. crater A. palmitique 40,2 41,3 41,8 41,5 (C16:0) A. palmitoléique 2,7 2,6 2,4 3,1 (C16:1) A. stéarique 3,2 3,4 3,2 3,6 (C18:0) A. oléique 3,4 3,7 4,8 4,5 (C18:1) A. linoléique 24,6 23,7 22,0 21,7 (C18:2) A.y-linolénique 25,9 25,3 25,8 25,6 (y-C18:3) #C16/#C18 42,9 / 57,1 43,9 / 56,1 44,2 / 55,8 44,6 / 55,4 EXEMPLE 5: EFFET DE LA SUPPLEMENTATION ADDITIONNELLE EN GLUCOSE Spirulina platensis PCC 8005 a été cultivée en photobioréacteur dans le milieu de Zarrouk supplémenté en linoléate d'ammonium ou cn linoléate d'ammonium et en glucose. La culture en photobioréacteur est réalisée avec les conditions suivantes - Les précultures en présence de glucose sont incubées dans l'obscurité sous agitation à 100 tours par minute pendant 10-14 jours à 300C. On utilise des erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml du milieu Zarrouk pour préparer ces précultures tandis que la culture mixotrophiquc est réalisée dans un photobioréacteur. La concentration cellulaire initiale (DO 560 nm) est d'environ 0,5 - 0,8. - Puis, la culture en photobioréacteur est placée à 30 C sous éclairement continu dc 50-100 E/m/s pendant 5 - 7 jours. Enfin, la culture est maintenue à 30 C sous éclairement de 50-100 E/m/s avec 8 - 12 h de lumière / 16 - 12 heures dans l'obscurité par 24 h pendant 5 - 7 jours. - La récolte de biomasse est réalisée à la fin de la période d'obscurité. Dans le cas de la supplémentation de glucose, le glucose exogène a été utilisé comme source de carbone pour synthétiser des substances organiques dans les cellules de spiruline. La concentration optimale de glucose pour la culture mixotrophique est d'environ 2,5 à 3 g/l. Le rendement de culture augmcnte en fonction de l'augmentation dc glucose dans le milieu (de 0,5 à 2,5 g/l), puis le rendement de culture s'abaissc légèrement à une concentration de glucose exogène plus élevée (à partir de 5 g/l jusqu'à 10 g/l). Le rendement de culture atteint 2,5 2,7 g sec par litre. Les résultats sont rapportés dans les tableaux 16, 17 et 18 ci-après. La teneur en lipides est environ 7,7 - 9,7 % du poids sec dans le cas de la supplémentation simultanée en glucose et linoléate (tableau 16). Les cellules supplémentées soit en linoléate, soit en glucose et linoléate ont synthétisé significativement MGlcDG (monoglucosyldiacylglycérol), précurseur de MGDG et la proportion de MGlcDG atteint 10,2 - 12,2 % des lipides totaux (tableau 17). En même temps, la synthèse d'acide y-linolénique a été stimulée dans ces cellules et la teneur de cet acide gras atteint 35,8 % des acides gras totaux (tableau 18). Tableau 16 : Composition chimique générale (%) de Spirulina platensis PCC 8005 cultivée dans le milieu Zarrouk supplémenté en linoléate (35,7 M/l) ou en glucose (2,5 g/l) & linoléate (35,7uWl) à 30 + Linoléate + Glucose & linoleate Protéines 55 - 60 57 - 62 Carbohydrates 15 - 18 15 - 19 Lipides 6,8 - 7,4 7,7 - 9,2 Scls minéraux 7,0 - 12,0 3,7 - 5,5 Humidité 7,0 - 8,0 6-7 Caroténoides | 0,20 - 0,29 0,2 - 0,3 Chlorophylle a 0,7 - 0,8 0,68 - 0,76 Tableau 17 : Composition lipidique chez Spirulina platensis PCC 8005 cultivée dans le milieu Zarrouk supplémenté en linoléate (35,7 M/l) ou en glucose (2,5 g/l) & linoléate (35,7 M/l) à 30 Conditions de culture Lipides polaires (%) MGlcDG MGDG DGDG PG SQDG - Sans supplémentation - 31,5-33 15,7-17,3 24,8-26,2 24,8-26,6 + Linoléate - 45,8-47,8 11,0-11,5 18,0-18,5 21,4-22,2 + Glucose & linoléate 11,6-12,2 43,0-44,0 11,7-12,3 13,0-13,6 18,9-19,7 Tableau 18 : Composition des acides gras totaux chez Spirulina platensis PCC 8005 cultivée dans le milieu Zarrouk supplémenté en linoléate (35,7 M/l) ou en glucose (2,5 g/l) & linoléate (35,7 M/l) à 30 C Conditions de culture Acides gras totaux (%) #C16/ #C18 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 yC18:3 - Sans supplémentation 51,2 3,6 0,7 5,9 18,2 20,4 54,8/45,2 + Linoléate 29,7 1,2 1,3 3,5 28,3 36,0 30,9/69,1 + Glucosc & linoléate 30,2 1,0 1,2 4,8 27,0 35,8 31,2/68,8 REFERENCES 1. ANUSUYA DEVI M. et VENKATARAMAN L.V., 1983b. Supplementary values of the proteins of the bluc green alga Spirulina platensis to rice and wheat proteins. Nutr. Rep. Intern. 28,1029-1935. 2. BUCAILLE P., 1990. Intérêt et efficacité de l'algue Spirulina dans l'alimentation des enfants présentant une malnutrition protéino-énergétique en milicu tropical. Thèse de doctorat d'état en Médccine générale, Université de Toulouse. 3. QUIDSIA AKHTER S., 1991. A study on recovery from malnutrition and anaemia using Spirulina. Paper presented at the lst seminar on "Use of Algae. A means to combat malnutrition." held at CESTI, Dhaka, on November 3rd, 1991. 4. NGUYEN Lan Dinh, 1995. "Evaluation du projet de lutte contre la malnutrition infantile" menée par le Centrc de nutrition infantile de Hochiminh ville grâce à l'assistance du CESVI. Communication from Victnam. 5. NGUYEN Lan Dinh, 1995. Stcps of developing and researching Spirulina at Child nutrition center. Paper presented at the seminar on "Utilisation de l'algue spiruline en nutrition et cn thérapeutique", held at Hochiminh city, Vietnam, on April 12th, 1995. 6. PHAM QUOC Kiet et PASCAUD Marc, 1996. Effccts of dictary y-linolcnic acid on the tissuc phospholipid fatty acid composition and the synthcsis of cicosanoids in rats. Ann. Nutr. Mctab. 40, 99-108. 7. GUSTAFSON K.R., CARDELLINA J.H., FULLER H.R.W., WEISLOW O.S., REBECCA F.K., SNADER K.M., PATTERSON G.M.L. ct BOYD M.R., 1989. AIDS-antiviral sulfolipids from cyanobacteria (Blue-grecn algac). J. Nat. Cancer Inst., MD, Vol. 81, 16, 1254-1258. 8. BUSSON F., 1970. "Spirulina platensis (Gom.) Geitier et Spirulina Geitieri J. de Toni. Cyanophycées alimcntaircs". Scrvicc dc santé, Parc du Pharo, 13 Marseille 7ème, 159p. 9. SOSA TEXCOCO, 1987. Communication from Sosa Tcxcoco, Mcxiquc. 10. SCHREURS W.H.P., 1987. Rcsults of analysis of samples of Spirulina from Burma. TNO-CIVO Institutes, Netherlands. 11. CYANOTECH, 1990. Communication from Cyanotech, Hawaï, USA. 12. VONSHAK A. ct RICHMOND A., 1988. Mass production of the blue-grcen alga Spirulina: an ovcrview. Biomass 15, 233-247. 13. CORNET J.F., 1989. Etude cinétique et énergétique d'un photobioréacteur. Thèse de doctorat de l'université de Paris-Sud, Orsay, France. 14. COHEN Z. et HEIMER Y.M., 1990, Production of polyunsaturated fatty acids (EPA, ARA, and GLA) by the microalgae Porphyridium and Spirulina. In Microalgal Biotechnology, Cambridge University Press, 243-273. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture mixotrophique de spirulines pour la production d'une biomasse riche en acides gras polyinsaturés co 6, en particulier en acide y-linolénique, et/ou en sulfolipides, caractérisé en ce que ladite production comprend au moins une étape de culture des spirulines en présence de linoléate d'ammonium. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de linoléate d'ammonium ajouté dans le milieu est comprise entre 30 et 90 ,uM/I, de préférence de 35 à 75,uM/1. 3. Procédé selon la revendication selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de culture des spirulines en présence de linoléate d'ammonium est effectuée à une température comprise entre 20 et 350C et sous un éclairement compris entre 50 et 125 4E/m2/s, de préférence entre 75 et 100,z4EJM2/s. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le linéolate d'ammonium est ajouté au milieu de culture durant la phase de croissance exponentielle, de préférence au milieu de cette phase. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 pour la production d'une biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique, caractérisé en ce que la température est comprise entre environ 240C et 350C, avantageusement environ 30 C et l'éclairement est compris entre 75 et 125 E/m/s, avantageusement entre 75 et 100E/m2/s. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 pour la production d'une biomasse de spirulines riche en sulfolipides, caractérisé en ce que la température est de préférence comprise entre environ 20 et 250C, et l'éclairement est compris entre 100 et 125zE/m2/s. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on ajoute du glucose au milieu de culture, de préférence pendant la phase de croissance exponentielle, à une concentration de l'ordre de 2 à 5 g/l, de préférence de 2,5 à 3 g/l. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la supplémentation en glucose est effectuée à une température d'environ 30"C, sous éclairement d'environ SO-lOO,uE/m2/s. 9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'éclairement est effectué selon un cycle alterné par 24 h d'environ 8-12 h de lumière blanche et 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence 12 h de lumière blanche et 12 h dans l'obscurité. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la biomasse de spirulines est produite en bassin ou en photobioréacteur stérile. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la production en masse d'une biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique et/ou en sulfolipides caractérisé en ce que les conditions de culture comprennent les conditions suivantes: - faire barboter 60 à 80 l d'air enrichi à 1 % C02/1 de milieu/h dans les précultures; - maintenir le pH pendant la croissance du milieu de culture entre 8,5 et 10,5, de préférence de 9 à 10; - maintenir les concentrations en ions bicarbonate, phosphate et nitrate, adaptées aux besoins de la souche de spiruline au cours de la croissance, - maintenir la température de culture à 30 C en assurant un éclairement de 100 à 125yE/m2/s à raison d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité par 24 h pendant la croissance, de préférence à raison d'environ 12h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, puis abaisser l'éclairement à 75 à 100E/m2/s pendant la dernière phase de la production de biomasse. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la production en bassin de biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique, caractérisé en ce que la production de ladite biomasse comprend une étape de supplémentation en linoléate sous éclairement de 75 à lOO,uE/m2/s, selon un cycle d'éclairement alterné par 24 h d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence à raison d'environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, en maintenant la température à environ 30 C et en abaissant si nécessaire le barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 à un débit de 30-401/I de culture / h pendant 24 h après ladite supplémentation. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la production en photobioréacteur stérile de biomasse de spirulines riche en acide ylinolénique, caractérisé en ce que, après l'incorporation de linoléate d'ammonium, la culture est réalisée dans les conditions suivantes: a) température de 28 C à 32 C, de préférence environ 30 C; b) éclairement de 75 à 100 E/m/s selon un cycle d'éclairement alterné par 24 h de 8 à 12 h de lumière blanche / 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence à raison d'environ 12h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, pendant 72 à 96 h; c) barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 avec un débit de 20 à 30 l/l de culture / h pendant 24 h après la supplémentation en linoléate d'ammonium. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la production en bassin de biomasse de spirulines riche en sulfolipides caractérisé en ce que la production de ladite biomasse comprend une étape de supplémentation de linoléate d'ammonium, sous éclairement de 75 à 100E/m2/s à environ 30 C pendant 48 h, puis de 100 à 125,uE/m2/s à environ 24 C pendant 48 à 72 h selon un cycle d'éclairement alterné d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12h dans l'obscurité par 24 h, enfin, de 100 à i25E/m2/s à environ 20-220C pendant 72 à 96 h selon un cycle d'éclairement alterné d'environ 8-12 h de lumière blanche et environ 16-12 h dans l'obscurité, éventuellement avec un barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 à un débit de 25 I/I de culture / h pendant 24-48 h après la supplémentation en linoléate d'ammonium, puis de 40-60 l/l de culture / h pendant 48 à 96 h. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour la production en photobioréacteur stérile de biomasse de spirulines riche en sulfolipides, caractérisé en ce que la production de ladite biomasse comprend une étape de supplémentation de linoléate d'ammonium, sous éclairement de 75 à 100 E/m/s à environ 30 C pendant 48 h, puis de 100 à 1 5,uE/m2/s à environ 240C pendant 48 à 72 h selon un cycle d'éclairement altemé d'environ 8 à 12h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité par 24 h, enfin, de 100 à 125ssE/m2/s à environ 20-22 C pendant 72 à 96 h selon un cycle d'éclairement alterné d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité, éventuellement avec un barbotage d'air enrichi à 1 % de CO2 à un débit de 25 1/1 de culture / h pendant 24-48 h après la supplémentation en linoléate d'ammonium, puis de 40-601/I de culture / h pendant 48 à 96 h. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la souche utilisée est choisie parmi Spirulina platensis, Spirulina maxima, Spirulina crater et Spirulina texcoco. 17. Biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique caractérisée en ce que la proportion d'acide y-linolénique dans la biomasse par rapport aux acides gras totaux est d'au moins environ 25 %. 18. Biomasse de spirulines riche en acide y-linolénique selon la revendication 17, caractérisée en ce que la teneur en lipides totaux dans la biomasse est augmentée. 19. Biomasse de spirulines riche en sulfolipides caractérisée en ce que la proportion desdits sulfolipides par rapport aux lipides totaux est d'au moins environ 35 %. 20. Biomasse de spirulines riche en sulfolipides selon la revendication 19, caractérisée en ce que la teneur en lipides totaux dans la biomasse est augmentée. 21. Milieu de culture pour la culture mixotrophique de spirulines, ayant l'une des compositions suivantes: ZK (1) ZK (2) NaHCO3 8,4 g NaHCO3 8,4 g NaCl 5,0 g NaCl 4,5 g K2HPO4 0,2 g K2HPO4 0,2 g MgSO4, 7H2O 0,2 g NaNO3 3,0 g KNO3 2,5 g MgSO4, 7H2O 0,2 g FeSO4 0,01 g FeSO4 0,01 g ou FeSO4, 7H2O O,018g H2O 1 litre H2O 1 litre ZK (3) ZK (4) NaHCO3 8,4 g NaHCO3 8,4 g NaCl 5,5 g NaCl 5,5 g K2HPO4 0,3 g (NH2)2CO ou (NH4)2SQ 0,1 g MgSO4, 7H2O 0,2 g NH4H2PO4 0,1 g (NH2)2CO ou (NH4)2SO4 0,2 g K2SO4 0,2 g FeSO4 0,01 g MgSO4, 7H2O 0,2 g H2O 1 litre FeSO4 0,01 g H2O 1 litre