FR 2769323 A1 19990409 FR 9712552 A 19971008 De manière générale, la présente invention est relative à des moyens pour l'analyse qualitatitative et quantitative des populations microbiennes éventuellement présentes dans un échantillon. Elle concerne plus particulièrement des moyens d'analyse qualitative et quantitative mettant en oeuvre des sondes à cibles oli gonucléoti di ques. L'analyse des populations microbiennes éventuellement présentes est requise pour de nombreux types d'échantillons solides ou fluides. Peuvent être notamment cités des échantillons issus d'un environnement de type naturel ou biologique, tels que eaux naturelles, eaux thermales, prélèvements sur homme ou animal de type sang, urine, flore vaginale ou intestinale, ou bien encore des échantillons de type urbain, agricole ou industriel, tels que produit alimentaire, eaux industrielles, effluents industriels, effluents urbains, boues industrielles, milieu de fermentation, aérosol, filtre ou air de circuit de climatisation. Différentes techniques ont été développées en laboratoire pour analyser de manière qualitative et quantitative les populations microbiennes éventuellement présentes dans un échantillon donné. Une première technique connue met en oeuvre la numération des microorganismes se développant après mise en culture de l'échantillon (ou d'un extrait) sur différents milieux nutritifs sélectifs. Cette technique est simple mais présente d'importants risques d'erreurs et d'artefacts (faible spécificité des critères morphologiques, absence de développement des microorganismes sous forme viable mais non cultivable, absence de développement des microorganismes à croissance très lente, croissance exponentielle sur le milieu nutritif de souches microbiennes qui sont en fait en phase de croissance latente dans l'échantillon). Son temps de réponse est, de plus, généralement supérieur à 24 heures. Une deuxième technique, utilisant la mesure d'une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s), permet la quantification rapide de populations de microorganismes vivants (microorganismes cultivables et/ou microorganismes sous forme viable mais non cultivable). Cette technique permet notamment le suivi d'un ensemble de populations mais ne permet pas d'accéder à un niveau très fin de spécificité. Une troisième technique, mettant en cuvre des sondes immunologiques, présente un temps de réponse fréquemment supérieur à 24 heures, manque souvent de sensibilité et de spécificité (des artefacts dus à des réactions croisées peuvent être observés). Les plus récentes techniques mettent en oeuvre des sondes oligonucléotidiques spécifiques, généralement marquées de manière à permettre leur détection après hybridation à leurs cibles. Deux grands types de sondes oligonucléotidiques ont été développées : les sondes ayant pour cible des ADN (ou les ARNm qui leur correspondent), et les sondes ayant pour cible des ARNr (Atu ribosomiques). Les sondes à ADN ou ARNm, bien que potentiellement très spécifiques, présentent l'inconvénient d'être peu sensibles du fait du faible nombre de copies ADN (ou ARUM) par cellule microbienne. L'amplification des hybrides sonde-cible par PCR (amplification en chaîne par polymérase) , ou RT-PCR (transcriptase inverse et amplification en chaîne par polymérase), permet de pallier le défaut de sensibilité des sondes à ADN ou AlUn, mais présente plusieurs inconvénients : elle donne notamment lieu à des réactions faussement négatives du fait de la présence d'inhibiteurs, ou faussement positives du fait de contaminations de type carry-over . Du fait du grand nombre de copies APNr naturellement présentes dans un microorganisme, l'utilisation de sondes à Atur permet par contre de s'affranchir de cette étape d'amplification, ainsi que des contraintes et artefacts qui y sont associés. L'hybridation des sondes à ARNr peut être réalisée soit après lyse cellulaire et purification des populations AWr de l'échantillon, soit in situ sur cellules entières, généralement après perméabilisation de la membrane (ou de la paroi) des microorganismes éventuellement présents dans l'échantillon. La lyse cellulaire et la purification des populations oligonucléotidiques après une telle lyse restent toutefois de manipulation délicate : elles requièrent en effet un équipement coûteux, un personnel qualifié et des conditions expérimentales strictes, notamment afin d'éviter toute contamination par des nucléases lors des manipulations de l'échantillon. Ces techniques ne sont donc pas adaptées aux analyses de routine en industrie ou en laboratoire d'analyse : son application est essentiellement limitée aux expériences de recherche expérimentale. L'hybridation i n yb ri s u r os in situ sur cellules entières permet quant à elle de s'affranchir de l'étape préalable d'extraction des populations oligonucléotidiques cibles par lyse cellulaire, et des inconvénients qui lui sont associés. L'hybridation FISH (Fluorescent In Situ Hybridation), qui met en oeuvre des sondes à APNr présentant un marquage fluorescent, constitue un exemple d'une telle technique. Ce type de technique permet une analyse qualitative fine et rapide pour de nombreux types d'échantillons. La quantification des sondes à ARNr ainsi hybridées à leur cible in situ à l'intérieur de cellules entières peut actuellement être réalisée soit directement sur l'échantillon (cytométrie de flux, microscopie), soit après lyse cellulaire et purification des sondes hybridées à leur cible. Ces méthodes de quantification ne sont toutefois pas satisfaisantes : la quantification directe sur l'échantillon est techniquement coûteuse, longue, et ne permet pas une quantification correcte des sondes hybridées lorsque l'échantillon est complexe et non homogène (cas par exemple des flocs ou des agrégats créés par les bactéries filamenteuses dans les boues de station d'épuration, cas des échantillons comportant des microorganismes autofluorescents) ; la quantification après lyse cellulaire est quant à elle longue à réaliser et techniquement délicate du fait des contraintes de manipulation qu'elle exige (équipement coûteux, personnel qualifié, contamination par des nucléases). Il en résulte que la technique d'hybridation in situ sur cellules entières à l'aide de sondes oligonucléotidiques reste actuellement une technique essentiellement qualitative. Son application est, à ce titre, limitée aux échantillons simples de laboratoire (e.g. cultures pures de microorganismes). Afin de répondre aux nécessités d'une performance industrielle sur des échantillons qui peuvent être complexes et/ou non homogènes, la présente invention propose des moyens permettant l'analyse qualitative et quantitative des populations microbiennes éventuellement présentes dans un échantillon biologique, lesdits moyens ne présentant pas les inconvénients des techniques de l'art antérieur. La présente invention vise en effet un procédé d'analyse qualitative et quantitative de la (ou des) population(s) microbienne(s) éventuellement présente(s) dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact, dans des conditions favorables à une hybridation in situ sur cellules entières, des microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon, avec au moins une sonde à AWr permettant de cibler le (ou les) domaine(s) microbiologique (s) souhaité(s), sonde(s) ci-après désignée(s) sonde(s) spécifique(s), - l'extraction, par désappariement de leur(s) cible(s) et élution hors desdites cellules, de celles des sondes qui se sont hybridées, - la détection des sondes extraites ainsi que la mesure de leurs abondances respectives. Par domaine microbiologique, nous entendons ici l'ensemble des microorganismes qu'une sonde donnée est capable de reconnaître, par reconnaissance d'une cible moléculaire (oligonucléotidique) présente chez chacun des membres dudit ensemble. Un domaine microbiologique peut correspondre à un ensemble large tout comme à un ensemble plus étroit : il peut par exemple être défini par une activité biologique (e. g. le domaine des bactéries nitrifiantes), ou bien être limité à un groupe phylogénétique, un genre, une espèce, voire une souche microbienne donnée (e.g. le domaine des bactéries Gram positives à forte teneur en G et C, le domaine des bactéries du genre Nitrobacter, le domaine des Proteobacteria de sous-classe alpha, beta ou gamma). Selon le type d'information souhaitée pour l'échantillon considéré, est (sont) choisi(s) le (ou les) domaine(s) microbiologique(s) qui devront être ciblés. On peut par exemple choisir de rechercher des mycomycètes du groupe Corynebacteriuin-]ycobacteriurn-Nocardia (ou groupe CMN) dans un échantillon d'effluent de bassin de traitement des eaux par boues activées afin de prévenir, diagnostiquer ou limiter le développement de mousses visqueuses, ou bien encore rechercher des bactéries pathogènes dans un échantillon issu d'un homme ou d'un animal. Doivent alors être utilisées des sondes spécifiques du (ou des) domaine(s) choisi(s) : de nombreuses sondes à APNr ont été décrites dans l'art antérieur (notamment : publications scientiques, brevets). Les sondes à APNr permettant de cibler les domaines microbiologiques ainsi choisis sont donc le plus souvent connues de l'homme du métier. Dans le cadre du traitement des eaux, on peut par exemple consulter Los Reyes et al. 1997, Appli. Environ. Microbiol. Vol. 63 n"3 p. 1107-1117 ; Mobarry et al. 1996, Appli. Environ. Microbiol. Vol. 62 n"6 p. 2156-2162 ; Wagner et al. 1994, Appli. Environ. Nicrobiol. Vol. 60 nO 3 p. 792-800 ; Kane et al. Appli. Envi ronm. Nicrobiol. Vol.59 n03 p. 682-686. Dans le cas où une telle connaissance ne serait pas encore acquise, il est également possible de déterminer et d'élaborer les sondes nécessaires aux domaines choisis par comparaison des séquences ARNr des membres du domaine ciblé aux séquences oligonucléotidiques de voisins phylogénéti ques. Le procédé selon l'invention donne des résultats quantitatifs particulièrement précis lorsque ledit échantillon présente une concentration en microorganismes supérieure ou égale à environ 104 cellules par gramme. La concentration en microorganismes de l'échantillon à analyser peut être mesurée à l'aide de techniques classiques connues de l'homme du métier, telles que par exemple par mesure spectrophotométrique pour un échantillon liquide, ou pour un extrait d'échantillon mis en solution. La concentration en microorganismes d'un échantillon liquide peut, si désiré, être augmentée, par exemple par filtration, préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Selon une disposition avantageuse de l'invention, lesdits microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon sont également mis en contact avec une sonde, ci-après désignée(s) sonde(s) universelle(s) ,permettant de cibler un domaine plus large que celui (ceux) ciblé(s) par ladite (lesdites) sonde(s) spécifique(s). La (ou les) sonde(s) universelle(s) cible (ciblent) un domaine microbiologique plus large que le (ou les) sonde(s) spécifique(s) utilisée(s). Elle(s) sert (servent) à établir une (des) valeur(s) de référence qui facilite la comparaison entre les abondances respectives mesurées pour chacun des domaines ciblés à l'ai de des sondes s péci fi ques. Par exemple, si les domaines ciblés par les sondes spécifiques utilisées sont les bactéries du groupe CMN, une sonde universelle appropriée peut être une sonde ciblant le domaine des organismes bactériens ; le choix de cette sonde permettra alors de déterminer la proportion de bactéries qui sont du groupe CNN dans l'échantillon analysé. Avantageusement, lesdits microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon peuvent être extraits dudit échantillon, notamment par centrifugation, préalablement à la mise en oeuvre d'une quelconque étape du procédé selon l'invention. Il peut en particulier être procédé ainsi afin d' éliminer le bruit de fond qu' un échantillon de composition complexe peut générer, ou bien afin de placer en solution les microorganismes éventuellement contenus dans un échantillon solide, gazeux, ou visqueux. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite mise en contact est réalisée après perméabilisation des cellules correspondant aux microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon. Cette étape de perméabilis ation, également appelée fixation, permet aux sondes de pénétrer à l'intérieur des cellules microbiennes tout en maintenant ces mêmes cellules entières, et d'ainsi atteindre leur(s) cible(s) in situ. Ladite perméabilisation de cellules peut avantageusement être réalisée par incubation des di tes cellules dans une solution de paraformaldéhyde à moins de 10, préférentiellement à 4 environ, pendant 3 à 12 heures à 4"C. Après perméabilisation, lesdites cellules peuvent être conservées à -20 C dans une solution tamponnée à pH environ (tampon PBS par exemple) contenant de l'éthanol à 50 environ, jusqu'à utilisation. Le cas échéant, ledit échantillon est homogénéisé préalablement à ladite perméabilisation, de manière à ce que la (les) sonde(s) qui sera (seront) mise(s) en contact aient accès à i? intégralité des populations microbiennes éventuellement présentes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite perméabilisation est suivie d'une étape de séchage, préalablement à ladite mise en contact. Ladite étape de séchage peut ainsi être réalisée en placant ledit échantillon en contact avec au moins une solution d'éthanol, préférentiellement avec des solutions d'éthanol de concentrations croissantes, par exemple en plaçant ledit échantillon en présence successivement d'une solution d'éthanol à 70 0, d'une solution d'éthanol à 80 puis d'une solution d'éthanol à 95 . De manière avantageuse, ladite mise en contact est réalisée en plaçant ledit échantillon en contact avec ladite (lesdites) sonde(s) en présence d'une solution, ciaprès désignée solution d'hybridation, comprenant notamment du dodécyl sulfate de sodium (SDS) à une concentration comprise entre 100 et 1000 pll par litre environ, préférentiellement à une concentration de 500 pl par litre environ, du Tris-HCl à une concentration comprise entre 5 et 50 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 20 ml par litre environ, et du chlorure de sodium à une concentration comprise entre 50 et 400 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 180 ml par litre environ. De manière également avantageuse, ladite extraction de sonde(s) est réalisée après élimination de l'excès de sonde(s) mise(s) en contact, notamment par lavage à l'aide d'une solution, ci-après désignée solution de lavage, comprenant notamment du dodécyl sulfate de sodium (SDS) à une concentration comprise entre 50 et 500 ,ul par litre environ, préférentiellement à une concentration de 200 1ll par litre environ, du Tris-HCl à une concentration comprise entre 50 et 400 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 180 ml par litre environ, et du chlorure de sodium à une concentration comprise entre 10 et 50 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 20 ml par litre. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite extraction est réalisée en plaçant les microorganismes éventuellement présents dans des conditions de stringence élevée, notamment en présence d'un agent déstabilisant de l'hybridation sonde-cible tel qu'un agent déstabilisant de la double hélice, et dans des conditions de température supérieure à la température de fusion de la sonde considérée, notamment dans des conditions de température de 100"C environ. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ledit agent déstabilisant de la double hélice est du formamide. Ladite extraction est alors réalisée par incubation des di ts microorganismes dans du formamide à 100"C pendant 10 min, de préférence à l' aide d' un thermocycleur. Afin d'améliorer leur détection, ladite (lesdites) sondes extraites peut (peuvent) être concentrée(s) préalablement à la mesure de leur(s) abondance(s) respective(s), notamment concentrées au Speed-Vac(R). Avantageusement, ladite détection de sondes extraites est réalisée par détection d'un marqueur associé ou compris dans chacune des sondes mises en contact, tel que notamment un marqueur radioactif (P, 3'S, '-I) ou chimioluminescent (marqueur colorimétrique, marqueur fluorescent), et ladite mesure de leur(s) abondance(s) respective(s) est réalisée par mesure, sur les sondes extraites, de l'abondance du marqueur correspondant. De manière particulièrement avantageuse, ledit marqueur est un marqueur fluoresrnt, notamment la fluorescéine. Lesdites sondes spécifique(s) et/ou universelle (s) peuvent être placées dans des échantillons distincts ou dans le même échantillon. Dans ce dernier cas, chaque sonde utilisée doit pouvoir être distinguée des autres à l'étape de détection, par exemple en portant chacune un marquage qui lui est propre (e.g. différents fluorochromes). L'abondance mesurée pour chacune des sondes spécifique(s) ou universelle(s) utilisée(s) constitue un indice de la représentation du domaine microbiologique ciblé qui correspond à chacune d'entre elles. La représentation de chaque domaine microbiologique ciblé peut alors être exprimée par le calcul de l'abondance relative de chaque sonde spécifique par rapport à l'abondance d'une même sonde universelle. Ledit (ou au moins un desdits) domaine (s) mi crobiologi que(s) ciblé(s) par ladite (lesdites) sonde(s) spécifique(s) peut avantageusement être choisi parmi le groupe constitué par le domaine des bactéries filamenteuses, des actinomycètes, des bactéries sulfatoréductrices, des bactéries du genre Acinetobacter, des bactéries nitrifiantes, des bactéries déphosphatantes, des bactéries pathogènes pour l'homme ou l'animal telles que Escherichia coli, Candida. Comme ci-avant précisé, le choix d'un domaine microbiologique à cibler découle directement du type d'information recherchée. Du choix d'un domaine microbiologique particulier, découle le choix de la (des) sonde(s) appropriées. Des sondes spécifiques d'intérêt comprennent notamment Nbl00 (SEQ ID n0l), Nsol225 (SEQ ID Le (ou au moins un des) domaine(s) plus large(s) ciblé(s) par ladite (lesdites) sonde(s) universelle (s) peut notamment être choisi parmi le groupe constitué par le domaine des microorganismes, le domaine des bactéries, le domaine des champignons, le domaine des virus, le domaine des eucaryotes, le domaine des cellules de mammifères. Des sonde(s) universelle(s) d'intérêt comprennent notamment S Univ-1390 (SEQ ID ne3), S lac338 (SEQ ID n04). Le procédé selon l'invention peut être appliqué à une grande variété d' échantillons. Des échantillons, pour lesquels une analyse à l'aide du procédé selon l'invention est d'un intérêt particulier, comprennent les échantillons issus de fluides tels que eaux naturelles, eaux industrielles, effluents indus triels, effluents urbains, boues industrielles, boues thermales, liquide ou gel alimentaire, milieu de fermentation, air, gaz, aérosol, un échantillon issu d'une conduite d'aération de batiments, d'une conduite de climatisation, un échantillon de solide alimentaire, de sol, un échantillon issu de matériel médical, un échantillon issu d'un animal ou d'un homme, tel que sang, urine, flore vaginale ou intestinale. Le procédé selon l'invention n'utilise ni culture microbiologique, ni microscopie, ni amplification en chaîne par polymérase, et est affranchi de toute étape de lyse cellulaire ; il est reproductible, simple, rapide (moins de 3 heures), peu coûteux et il ne nécessite pas de personnel spécialement qualifié. Le procédé selon l'invention présente de plus l'avantage d'être très aisément automatis able. Le procédé selon l'invention donne notamment une mesure qualitative et quantitative du statut microbiologique, ou de l'état sanitaire, dudit échantillon, et, en conséquence, du produit dont est issu cet échantillon. Le procédé selon l'invention peut donc avantageusement être associé, en particulier sur une ligne de production à caractère industriel, à un procédé de déclenchement d'alarme pour le contrôle qualité, sûreté et/ou sanitaire du produit dont est issu ledit échantillon. Lorsque la valeur seuil ou la valeur consigne est dépassée, le procédé selon l'invention permet alors le déclenchement de l'alarme qualité, sûreté et/ou sanitaire correspondante. Il permet également la régulation ou l'asservissement d'un procédé d'élimination ou d'enrichissement microbiologique. La présente invention vise également l' application dudit procédé au diagnostic in vu trio de maladies infectieuses. Au-delà des applications de type "mesure d'un statut ou d'un état" ou de type "alarme", la présente invention vise en particulier l'application dudit procédé à la régulation ou à l'asservissement d'un procédé microbiologique tel que fermentation méthanique de lisier, traitement d'effluents organiques, procédé d'épuration des eaux tel que procédé d'épuration par boues activées, ou à la régulation ou à l'asservissement d'un procédé visant à éliminer ou à prévenir le développement de microorganismes. Ainsi, le procédé selon l'invention peut être avantageusement appliqué à la détection de la formation de mousses se développant lors de la mise en oeuvre de procédés par boues activées, et/ou à l' asservissement d'un procédé visant à éliminer ou à prévenir le développement de telles mousses. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à travers les exemples de réalisation suivants, donnés à titre indicatif et non limitatif. EXEMPLE 1 : Analyse qualitative et quantitative d'un échantillon d'effluent de bassin d'épuration des eaux. a) Etape de fixation Des échantillons d' effluents de bassins d' épuration des eaux par boues activées sont homogénéisés puis centrifugés, de manière à en récupérer les cellules microbiennes. Le culot cellulaire est lavé à l'aide d'un tampon phosphate à pH7 (PBS phosphate-buffered saline). Le culot cellulaire est alors repris dans trois volumes d'une solution de paraformaldéhyde à 4 est mis à incuber de 3 à 12 heures à 4 C. Après centrifugation le surnageant est éliminé et le culot est à nouveau repris dans un tampon phosphate à pH (PBS phosphate-buffered saline). On ajoute un volume équivalent d' éthanol et l' échantillon peut être conservé à -20 C jusqu' à utilisation. b) Etape de séchage L'échantillon fixé est centrifugé : on ajoute 1 ml d'méthanol à 70' sur le culot, et les cellules sont remises en suspension. On centrifuge pendant 5 minutes puis on élimine le surnageant. Cette opération est renouvelée avec de l'éthanol à 80 puis avec de l'éthanol à 95 c) Etape d'hybridation On prépare un bain-marie à la température d'hybridation requise par la sonde utilisée (cette température dépend de la longueur et de la séquence de cette sonde). Dans 1' exemple ici rapporté, les sondes suivantes ont été utilisées Sonde Nb100 spécifique du genre Nitrobacter, de séquence SEQ ID N0l : 5' TGCGACCGGTCATGG 3', Sonde Nso1225 spécifique des protéobactéries B qui oxydent 1' ammonium, de séquence SEQ ID N02 5' CGCCATTGTATTACGTGTGA 3', Sonde S Univ-1390, sonde universelle spécifique de tout microorganisme, de séquence SEQ ID N03 5' GACCGGCGGGACCGGCGGTGTGATCAA 3', et Sonde S Bac338, sonde spécifique des bactéries, de séquence SEQ ID N"4 : 5' GACGGGCGGTGTGTACAA 3'. Ces sondes ont été synthétisées, purifiées par HPLC (chromatographie liquide à haute performance) puis marquées à l'extrémité 5' par la fluorescéine. Elles sont disponibles auprès de la compagnie américaine Operon Technologies, Alameda CA, ou, en France, de la compagnie Gens et à Paris. Les cellules issues de l' étape de séchage sont remises en suspension dans 400 ul d'une solution d'hybridation comprenant, pour 10 ml, NaCl 5M 1,8 ml; Tris-HCl 1M 200 ul; SDS (dodécyl sulfate de sodium) 5 ul; eau bidistillée 8 ml qsp. On ajoute la quantité nécessaire de chacune des sondes qui ont été préalablement marquées par un fluorochrome (ici 1,5 nanomoles). Les cellules dans la solution d'hybridation en présence des sondes sont mises à incuber pendant 2 heures à la température d'hybridation. Les échantillons d' hybri dation sont centrifugés et les surnageants sont éliminés. d) Etape de lavages Les cellules sont, après hybridation, lavées deux fois pendant 15 minutes à la température d'hybridation dans une solution de lavage tamponnée comprenant, pour 50 ml, NaCl 5M 1 ml; Tris-HCl 1M 9 ml; SDS 20" 50 ul. e) Etape d' extraction de la fluorescence par élution On ajoute 300 pi de formamide chaude à 100 C aux échantillons issus de l'étape de lavage et on remet délicatement le culot en suspension. Chaque tube est placé à 100"C pendant 10 minutes, de préférence à l'aide d'un thermocycieur. On centrifuge pendant 10 minutes; le surnageant est récupéré et conservé à l'obscurité jus qu' à analyse par spectrofluorométrie. La fluorescence est quantifiée à l' aide d'un spectrofluoromètre. Les abondances mesurées en so LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENE FALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: SUEZ LYONNAISE DES EAUX (B) FUSE: 72 avenue de la Liberté (C) VILLE: NANTERRE CEDEX (E) PAYS: FIANCE (F) CODE POSTAL: 92753 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Moyens pour l'analyse qualitative et quantitative des populations microbiennes éventuellement présentes dans un échantillon (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR I1M PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURNTION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: NblO0 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TGCGACCGGT CATGG 15 (3) INFOPMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CABACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: Nso1225 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CGCCATTGTA TTACGTGTGA 20 (4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: S Univ-1390 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GACCGGCGGT GTGTACAA 18 (5) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: S Bac338 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GACGGOCGGT GTGTACAA 18 REVEND I CATIONS 1. Procédé d'analyse qualitative et quantitative de la (ou des) population(s) microbienne (s) éventuellement présente(s) dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact, dans des conditions favorables à une hybridation in situ sur cellules entières, des microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon, avec au moins une sonde à AWr permettant de cibler le (ou les) domaine(s) microbiologique (s) souhaité(s), sonde (s) ci-après désignée(s) sonde(s) spécifique(s), - l'extraction, par désappariement de leur(s) cible(s) et élution hors desdites cellules, de celles des sondes qui se sont hybridées, - la détection des sondes extraites ainsi que la mesure de leurs abondances respectives. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon sont également mis en contact avec une sonde, ci-après désignée(s) sonde(s) univers elle(s),permettant de cibler un domaine plus large que celui (ceux) ciblé(s) par ladite (lesdites) sonde(s) spécifique(s). 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon sont extraits dudit échantillon, notamment par centrifugation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalisée après perméabilisation des cellules correspondant aux microorganismes éventuellement contenus dans ledit échantillon. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite perméabilisation de cellules est réalisée par incubation des di tes cellules dans une solution de paraformaldéhyde à moins de l0Vq préférentiellement à 4 environ, pendant 3 à 12 heures à 4"C. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que ladite perméabilisation est suivie d'une étape de séchage, préalablement à ladite mise en contact. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite étape de séchage est réalisé en plaçant ledit échantillon en contact avec au moins une solution d'éthanol, préférentiellement avec des solutions d'éthanol de concentrations croissantes. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalisée en placant ledit échantillon en contact avec ladite (lesdites) sonde(s) en présence d'une solution, ciaprès désignée solution d'hybridation, comprenant notamment du dodécyl sulfate de sodium (SDS) à une concentration comprise entre 100 et 1 000 pli par litre environ, préférentiellement à une concentration de 500 Kll par litre environ, du Tris-HCl à une concentration comprise entre 5 et 50 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 20 ml par litre environ, et du chlorure de sodium à une concentration comprise entre 50 et 400 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 180 ml par litre environ. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite extraction de sonde(s) est réalisée après élimination de l'excès de sonde(s) mise(s) en contact, notamment par lavage à l'aide d'une solution, ci-après désignée solution de lavage, comprenant notamment du dodécyl sulfate de sodium (SDS) à une concentration comprise entre 50 et 500 Cil par litre environ, préférentiellement à une concentration de 200 pl par litre environ, du Tris-HCl à une concentration comprise entre 50 et 400 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 180 ml par litre environ, et du chlorure de sodium à une concentration comprise entre 10 et 50 ml par litre environ, préférentiellement à une concentration de 20 ml par litre. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite extraction est réalisée en plaçant les microorganismes éventuellement présents dans des conditions de stringence élevée, notamment en présence d'un agent déstabilisant de l'hybridation sonde-cible tel qu'un agent déstabilisant de la double hélice, et dans des conditions de température supérieure à la température de fusion de la sonde considérée, notamment dans des conditions de température de 1000C environ. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit agent dés tabilisant de la double hélice est du fo rmami de. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite (lesdites) sondes extraites est (sont) concentrée(s) préalablement à la mesure de leur(s) abondance(s) respective(s), notamment concentrées au Speed-Vac(X. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite détection de sondes extraites est réalisée par détection d'un marqueur associé ou compris dans chacune des sondes mises en contact, tel que notamment un marqueur radioactif ou chimioluminescent, et en ce que ladite mesure de leur(s) abondance(s) respective(s) est réalisée par mesure, sur les sondes extraites, de l'abondance du marqueur correspondant. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur fluorescent, notamment la fluorescéine. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit (ou au moins un desdits) domaine(s) microbiologique(s) ciblé (s) par ladite (lesdites) sonde(s) spécifique(s) est choisi parmi le groupe constitué par le domaine des bactéries filamenteuses, des actinomycètes, des bactéries sulfatoréductrices, des bactéries du genre Acinetobacter, des bactéries nitrifiantes, des bactéries déphosphatantes, des bactéries pathogènes pour l'homme. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite (ou au moins une desdites) sonde(s) spécifique(s) est choisie parmi le groupe constitué par Nbl00 (SEQ ID n01), Nso1225 (SEQ ID ne2). 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 16, caractérisé en ce que le (ou au moins un des) domaine(s) plus large(s) ciblé(s) par ladite (lesdites) sonde(s) universelle(s) est choisi parmi le groupe constitué par le domaine des microorganismes, le domaine des bactéries, le domaine des champignons, le domaine des virus, le domaine des eucaryotes, le domaine des cellules de mammifères. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, caractérisé en ce que ladite (ou au moins une desdites) sonde(s) universelle(s) est S Univ-1390 (SEQ ID n03), S Suc338 (SEQ ID n04). 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit échantillon est issu de fluides tels que eaux naturelles, eaux industrielles, effluents industriels, effluents urbains, boues industrielles, boues thermales, liquide ou gel alimentaire, milieu de fermentation, air, gaz, aérosol, un échantillon issu d'une conduite d'aération de batiments, d'une conduite de climatisation, un échantillon de solide alimentaire, de sol, un échantillon issu de matériel médical, un échantillon issu d'un animal ou d'un homme, tel que sang, urine, flore vaginale ou intestinale. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est associé à un procédé de déclenchement d'alarme pour le contrôle qualité, sûreté et/ou sanitaire du produit dont est issu ledit échantillon. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué au diagnostic in vitro d'une maladie infectieuse. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la régulation ou à l'asservissement d'un procédé microbiologique tel que fermentation méthanique de lisier, traitement d'effluents organiques, procédé d'épuration des eaux tel que procédé d' épuration par boues activées. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la régulation ou à l'asservissement d'un procédé visant à éliminer ou à prévenir le développement de microorganismes. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la détection de la formation de mousses se développant lors de la mise en oeuvre de procédés par boues activées, et/ou à l' asservissement d'un procédé visant à éliminer ou à prévenir le développement de telles mousses.