FR 2788282 A1 20000713 FR 9900148 A 19990108 CONSTRUCTION DE RECOMBINANT DE GRANDE TAILLE AU MOYEN D'AGENTS COMPACTANT L'ADN. La présente invention est relative à la construction de recombinants de grande taille in vitro. Elle concerne aussi le procédé de préparation de telles constructions et les kits pour leur mise en oeuvre. La construction des vecteurs ADN destinés a être transférés dans les cellules procaryotes ou eucaryotes, vise toute utilisation in vitro et in vivo de ces séquences : des effets biologiques de la séquence ADN (effet de l'ADN ou de son expression), expression d'ARN, expression de protéines, amplification de sondes d'hybridation pour le diagnostic médical, thérapie cellulaire ou thérapie génique,etc... La construction de vecteur recombinant, consistant à insérer un fragment d'ADN dans un vecteur, passe par une étape de refermeture du vecteur in vitro. Pour qu'il y ait refermeture, les extrémités du vecteur finalisé doivent être proches l'une de l'autre. Ces extrémités se déplacent au sein d'une sphère de rayon égal à la longueur du fragment et ayant pour centre l' une des extrémités.Ce volume est d'autant plus grand que la taille du vecteur finalisé est élevée. Par conséquent, la probabilité de rencontre des deux extrémités décroit avec la longueur du vecteur finalisé. Quant à l'insertion du fragment dans le vecteur, elle se fera si la probabilité de rencontre entre les extrémités de l'insert et celles du vecteur d'origine est élevée. L'insertion dépend donc de la concentration en extrémités. En d'autres termes, la proportion de produits insérés et cyclisés dépend de la longueur du vecteur finalisé pour le processus intramoléculaire de refermeture, et de la concentration totale en extrémités libres, pour ce qui concerne le processus intermoléculaire de ligation. Les vecteurs de toute première génération sont des vecteurs d'origine bactérienne, dérivés de plasmides. D'autres vecteurs tiennent compte plus précisément des spécificités des gènes eucaryotes, en particulier de leur taille. C'est le cas des cosmides, composés hybrides de phage À. et de plasmides se répliquant dans E. Coli, et des YAC dont l'organisme hôte est la levure. Les cosmides permettent l'insertion jusqu'à 45 kb, les YAC jusqu'à 1000kb. Ces vecteurs sont destinés à l'analyse des banques d'ADN génomique ou à l'analyse chromosomique. Leur efficacité est liée à l'éventail de fragments différents qu'ils peuvent accueillir. Ils seraient d'un emploi lourd s'il s'agissait de n'y insérer qu'un fragment précis et de l'amplifier. Ainsi, pour préserver leur stabilité, le vecteur d'insertion doit conserver une taille minimale (33kb pour les cosmides, 150kb pour les YAC). Or, la manipulation de telles longueurs d'ADN comporte de nombreuses difficultés (cassures, cisaillement,...), alors que la séquence considérée est fréquemment de taille inférieure, n'atteignant que quelques kb lorsque l'ADN complémentaire est préféré à l'ADN génomique. En outre, la réplication dans E. Coli de vecteurs de taille importante tels que les cosmides, ainsi que la stabilité des YAC dans la levure, sont limitées, ce qui conduit à des remaniements de séquence. Pour les cosmides, l'efficacité de l'empaquetage de l'ADN et de l'infection par le phage # compense cet inconvénient dans une certaine mesure. Une autre technique d'insertion consiste à utiliser des adjuvants de nature chimique, tel le polyéthylène glycol (Zimmerman S.B. and Pheiffer B. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,5852 (1983), ou encore le chloride d'Hexamine cobalt (Maniatis et al., molecular cloning/ a laboratory manual, second edition, 1989) pour les ligations à bouts francs. Ces ligations sont moins aisées que leurs homologues à bouts cohésifs, et exigent des concentrations en ADN et ligase plus élevées. Ces adjuvants chimiques ont pour but de favoriser l'aggrégation entre insert et vecteur (réaction intermoléculaire), et de diminuer les concentrations en ADN et ligase, et ils ne s'adressent pas à la construction de vecteurs de grande taille. A ce jour, il n'existe pas de technique permettant de faciliter la circularisation et la préparation de vecteurs de grande taille valable aussi bien pour les tailles modérées (quelques milliers de paires de bases) que pour des tailles plus importantes (au dessus de 10 kb). Par vecteur de grande taille, il faut entendre un vecteur d'au moins 10 kb, pouvant intégrer un insert de plusieurs kilobases. Cosmides et YAC répondent à des besoins d'analyse et recherchent un éventail d'insertion aussi large que possible des banques d'ADN. Les adjuvants à la ligation, actuellement employés, ne sont jamais des protéines naturellement conçues pour condenser l'ADN et il ne s'agit pas de favoriser l'insertion de fragments de grande taille et la refermeture du recombinant. La présente invention a pour but de faciliter la circularisation et la préparation de vecteurs de grande taille. Dans la méthode selon la présente invention, c'est la présence de protéine au moment de la ligation qui augmente le taux de produits de ligation et la probabilité d'amplifier le produit correct. Un des intérêt de l'invention réside dans le domaine du clonage qui comporte généralement une étape préalable de cyclisation du recombinant in-vitro. L'efficacité de la cyclisation dépend de la taille du recombinant, et est améliorée par la compaction de l'ADN. En effet, la construction de vecteur passe par une étape de fermeture de ce vecteur in-vitro. L'efficacité de cette fermeture dépend de la taille du fragment d'ADN. Le procédé, selon la présente invention, de préparation d'acides nucléiques recombinants de grande taille circularisés, du type constitués d'un vecteur et d'un insert de grande taille supérieure à quelque kilobases, est caractérisé en ce que a) on réalise la ligation de l'insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN, et b) on sélectionne par tout moyen approprié les acides nucléiques recombinants constitués du vecteur et de l'insert. Lors de l'étape b), il faut entendre par moyen approprié de sélection, le transfert des produits de la ligation dans un milieu cellulaire approprié au clonage de l'ADN (E. Coli ou la levure , par exemple), en présence d'un antibiotique (ampicilline, tetracycline,...) car le vecteur présente généralement un gène de résistance à un antibiotique, et un test pour la présence de l'insert (par exemple, dans le cas du gène-témoin lacZ, l'hydrolyse du composé X-gal par la P-galactosidase produite). Les histones sont les protéines les plus abondantes du noyau ; elles sont de petite taille (11 à 25 kDa) et possèdent un caractère très basique (pH>10). Il existe cinq types d'Histones appelés respectivement Hl, H2A, H2B, H3 et H4, et ces cinq types se retrouvent avec des variantes chez tous les eucaryotes (excépté Hl qui ne semble pas exister chez la levure, et qui est remplacé par l'histone H5 dans certains organismes). In vivo, H2a, H2b, H3 et H4 s'assemble sous forme d'octamère. L'ADN s'enroule deux fois autour du c#ur octamérique pour former une structure nucléosomique. L'histone Hl ne fait pas partie de ce noyau, mais sert à verrouiller l'ADN autour de l'octamère. Dans la cellule eucaryote, la compaction de l'ADN par les histones aurait notamment pour effet de rapprocher deux sites de régulation transcriptionnelle éloignés sur le chromosome, et de permettre la formation d'une boucle de chromatine par interaction directe entre ces sites. L'expression d'un gène peut ainsi être commandée à distance de ces gènes (Amouyal, Biochimie (1991), 73, p.1261-1268). Selon l'invention, la ligation de l'insert et du vecteur d'origine est effectuée en présence de produits compactant l'ADN. Le vecteur d'insertion contient une origine de réplication et un gène de résistance pour la croissance et la sélection dans le type cellulaire considéré. Les agents de compaction de l'ADN sont des protéines, des mélanges de protéines, ou des dérivés des protéines. Par le terme protéines, il faut entendre protéines naturelles et synthétiques. Les produits compactant l'ADN sont des protéines ou tout agent présentant les mêmes propriétés, et plus particulièrement des protéines histones ou protéines apparentées. Outre les histones, l'agent de compaction de l'ADN peut être choisi parmi toutes les protéines connues pour compacter l'ADN, notamment les protéines d' enveloppe virales ou de phages et les protéines du chromoïde bactérien (HU, H-NS, ...) , tout mélange de ces composés, ou tout dérivés de ceux-ci. Par conséquent, pour l'étape a) du procédé selon l'invention, l'agent de compaction de l'ADN est choisi parmi une histone, une protéine d'enveloppe virale ou de phage, une protéine du chromoïde bactérien, et/ou un mélange desdits agents de condensation. De manière préférentielle, l'agent de compaction de l'ADN est un mélange d'histones. La demanderesse a démontré qu'un mélange d'histones ou une histone isolément conduisaient à des résultats analogues. L'histone Hl, de structure différente, et n'étant pas une histone formant l'octamère, mais plutôt une histone de verrouillage, utilisé isolément ne semble pas apporter d'aussi bons résultats que les autres histones. Ceci s'explique car Hl, du fait de sa structure différente, ne se fixe pas sur l'ADN linéaire, mais se fixe de préférence sur de l'ADN superenroulé (Van Holde et al., Biophysical journal, 1997,72, p.1388-1395). Dans un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les agents de compaction sont ajouté au milieu de ligation. Ce milieu comprend l'ADN en solution dans le tampon de ligation. La ligation est assurée par addition d'une enzyme de ligation au milieu de ligation. De manière préférée, mais non limitative, la ligase utilisée est la E. Coli T4 DNA Ligase. Une caractéristique de l'invention réside dans la concentration (C) d'agents de compaction présents dans le milieu de ligation. Cette concentration (C) en agent de compaction est déterminée de façon à ne pas entraîner une rigidification de l'ADN. Si cela se produisait, l'ADN ne pourrait se courber, il ne pourrait y avoir contact entre les extrémités du vecteur finalisé, et la ligation serait empêchée. Pour une protéine ou un mélange de protéines donné, la quantité d'agent de compaction est définie par calcul et testé par gel de retardement, de manière à ne pas saturer un fragment d'ADN-témoin en protéines. Cette concentration (C) peut être exprimée en mg de protéines par nanogramme d'ADN total contenu dans le mélange de ligation et par paire de base de recombinant . Elle dépend de la longueur d'ADN à liguer, et les inventeurs ont défini plusieurs lois, correspondant à chacun des agents protéiques employés: Ainsi pour le mélange naturel d'histones Sigma, (C) = 1,5.10-11 mg/ng ADN/pb pour l'histone H2b Sigma, (C) = 1,5.10-12 mg/ng ADN/pb Par extrapolation, les inventeurs ont défini la loi suivante qui peut s'appliquer à toutes les protéines compactantes utilisées : (C) = 10-x mg/ng ADN/pb dans laquelle x est compris entre 8 et 15. La valeure x est fonction de la nature de l'agent de compaction utilisé. Pratiquement, l'efficacité du clonage est toujours améliorée si la concentration se trouve dans un intervalle encadrant la valeur ainsi définie de 20 à 1000%, et de manière préférée entre 33 à 200%. Le procédé selon la présente invention se caractérise donc en ce que la concentration (C) en agent de compaction est determinée par la loi suivante : (C) = ( 10-x mg/ng ADN/pb ) X Y dans laquelle : x est compris entre 8 et 15, et de préférence entre 10 et 12,et Y varie entre 0,2 et 10, de préférence entre 0,33 et 2. La présente invention est aussi relative à un kit pour la mise en #uvre de la méthode de préparation d'acides nucléiques recombinants de grande taille circularisé telle que définie auparavant. Ce kit est constitué des éléments suivants : - Un tampon de ligation, - une ligase, - un agent de compaction. Comme agent préférentiel de compaction, il sera utilisé soit un mélange d'histones, une histone isolée, ou toute autre protéine de condensation. Une autre caractéristique de l'invention concerne les paramètres de mise en #uvre de la méthode et du kit objet de l'invention. La ligation est conduite dans les conditions usuelles, avec les modifications suivantes. Les conditions usuelles dépendent de la ligase employée et des indications fournies par la société commercialisant l'enzyme. Pour la T4 DNA ligase commercialisée par NEB Biolabs, la ligase est employée avec un tampon : - 5mM Tris-Hcl - lmM MgC12 - lmM DTT - 0,1 mM ATP - 2,5 g/ml BSA Préalablement à la ligation, l'agent protéique est mis en solution dans le tampon de ligation contenant ou non du glycerol (ou dilué dans le milieu de ligation, s'il est fourni sous forme de solution). Il est incorporé dans le milieu de ligation dans les proportions définies par la loi indiquée auparavant. De façon préférentielle, le kit comprend un agent stabilisant incorporé au milieu de ligation en même temps que la protéine, et destiné à empêcher la dénaturation ,l'aggrégation et/ou l'adsorption de la protéine sur les parois du tube réactionnel à ces fortes dilutions. Il se présente donc sous la forme suivante : - un tampon de ligation, - une ligase, - un agent de compaction, - éventuellement un agent stabilisant pour la protéine. De manière privilégiée, ce tampon de dilution est le glycérol ou tout composé présentant les mêmes caractéristiques. Un kit préférentiel selon la présente invention se caractérise en ce que : - la ligase est la E.Coli T4 ligase, - le tampon de ligation correspondant, - l'agent de compaction est un mélange d'histones (ou un histone isolé), - l'agent stabilisant, s'il est présent, est du glycérol. L'invention concerne aussi les recombinants de grande taille susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus. Un tel recombinant peut être constitué par : un vecteur pouvant contenir une origine de réplication, un gène de résistance pour la croissance et la sélection,... ; un insert pouvant être associé à un gène indicateur, un gène de résistance, ... D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre non limitatif, et concernant la construction d'un recombinant de grande taille au moyen de protéines compactant 1 'ADN, et de son clonage dans E.Coli et dans lequel les figures annexées représentent : Figure 1 : Complexation de la protéine au fragment fR4 dans les conditions de ligation, suivie par retardement de la migration électrophorétique du fragment en gel d'agarose 0,4%. - la : Essai 1 - 1b : Essai 4 - 1c : Essai 1 avec protéine purifiée Hl (exemple 2) Figure 2 : Digestion par EcoRI des trois recombinants R4-LZ avec insert obtenus dans l'essai 11. Figure 3 : : Digestion par EcoRI de 6 des 20 recombinants K-LZ (exemple 1b). Figure 4 : Augmentation de la quantité de produits de ligation en présence d'histones, gel d'agarose 0,4%. Figure 5 : Test de sensibilité aux nucléases éventuellement présentes dans la préparation d'histones EXEMPLE 1 : LIGATION EN PRESENCE D'UN MELANGE D'HISTONES, SELECTION ET AMPLIFICATION DES PRODUITS DE LIGATION PAR E.COLI. Deux recombinants de taille différente ont été construits. Le premier (recombinant R4-LZ) a une taille de 12034 paires de bases, et le second, plus petit, (recombinant K-LZ) a une taille de 6785pb - Exemple la : Clonage d'un recombinant de 12034 pb. I : Matériel et Méthodes I-1 . Fragments Ce premier recombinant R4-LZ d'une taille de 12034 paires de bases est issu de la ligation de deux fragments fR4 et fLZ. - Fragment de 8159 paires de bases : fR4 Ce fragment est issu du plasmide pREP4 (invitrogen) par digestion complète du plasmide de 10183pb par les enzymes de restriction SalI (positions 7 et 1091) et SpeI (site unique à 9250). Les fragments obtenus par digestion ont des tailles respectives de 8159,1084 et 940pb. Le fragment de 8159pb contient l'origine de réplication colEl et le gène de résistance à l'ampicilline d'E. coli. Il est séparé des autres fragments par migration électrophorétique sur gel d'agarose à bas point de fusion (Seaplaque LMP agarose FMC Bioproducts), excision et extraction de la bande correspondante. - Fragment de 3875 paires de bases fLZ Ce fragment est issu d'un plasmide de 6206pb contenant le gène lacZ sous le contrôle d'un promoteur d'E. coli (construction dérivée du plasmide pUT79 de la société Cayla, Toulouse). Par digestion aux sites uniques SpeI (position 29) et SalI (position 3904 suivie d'une séparation électrophorétique, le fragment de 3875pb contenant le gène lacZ sous contrôle du promoteur bactérien, est séparé du fragment de 2331pb. 1-2 : Protéine compactante Il s'agit de la préparation de type IIA (référence H9250 Sigma) contenant toutes les histones de sérum de veau sans fractionnement. Cette préparation commercialisée sous forme lyophilisée est mise en solution dans le tampon de ligation juste avant emploi, dans les concentrations indiquées ultérieurement. 1-3 : Ligations Les deux fragments fR4 et fLZ sont mélangés dans les proportions indiquées ultérieurement dans 20 l de tampon de ligation pour la T4 DNA ligase d'E. coli. Ces conditions de ligation sont voisines de celles classiquement employées (voir Current Protocols et Maniatis). Lorsque c'est nécessaire, la protéine est ajoutée au mélange des fragments, à la concentration souhaitée. La T4 DNA ligase est ajoutée après incubation dans un laps de temps compris entre 0 à 20 minutes, et plus particulièrement entre 3 et 5 minutes. 1-4 : Transformation cellulaire par le milieu de ligation La souche DH5a est une souche déficiente en protéine RecAl, ce qui ne favorise pas les recombinaisons et réarrangements de l'ADN au sein de la cellule (notamment, les plasmides restent sous forme monomère tandis que les délétions sont évitées, page 4-13 Maniatis). La souche est transformée par 10 l du mélange de ligation selon une variante de la méthode d'Hanahan ( J. Mol. Biol. 166,557, 1983) conduisant à une efficacité de 107 colonies/ug d'ADN. La sélection des cellules contenant le recombinant se fait sur milieu LB avec une concentration de 200ug/ml d'ampicilline, et des boîtes de Pétri recouvertes de 200ul d'X-gal en solution dans le DMF. 1-5 : Concentration en histones Une première valeur de la concentration en histones a été déterminée en calculant la quantité du mélange naturel d'histones supposée nécessaire à la formation d'un nucléosome toutes les 200 paires de base, et en choisissant délibérément de ne prendre qu'une partie de la quantité de protéine ainsi déterminée (le quart dans cet exemple) pour éviter la saturation du fragment en protéine. La loi qui en dérive est la suivante : (C) = 1. 2 10-11 mg de mélange d'histones / ng d'ADN/ pb du recombinant Cette loi a été appliquée à la complexation du fragment le plus long, c'est-à-dire fR4 dans le cas présent. La complexation a été suivie par gel de retardement dans un gel à 0.4% d'agarose, en présence de la concentration déterminée et deux autres concentrations l'encadrant à 50% et 200% (Figure 1). La loi réajustée à partir de ces gels et qui a été employée par la suite est très proche de la valeur calculée : (C) = 1. 5 10-11 mg du mélange d'histones /ng d'ADN/ pb de recombinant Chaque ligation a été effectuée en présence de 3 concentrations de protéine, la quantité dérivant de cette loi, et deux quantités l'encadrant à 50% et 200%. Sur ces gels, on a : - Voie 1 : Fragment fR4 sans protéines (excepté dans le gel correspondant à l'essai 4), - Voie 2 : Fragment fR4 + 0,025 g de protéine, - Voie 3 : Fragment fR4 + 0,05 g de protéine, - Voie 4 : Fragment fR4 + 0,1 g de protéine, - Voie 5 : Fragment fR4 + 0,2 g de protéine (essai 4) Pour 500 ng de fragment fR4, 0,025 ug , 0,05 ug et 0,1 ug du mélange d'histone remplissent les conditions. Les ligations se déroulent aux trois concentrations corespondantes. 1-6 : Vérification de l'absence de remaniements de séquence Les premiers tests pour l'obtention d'un recombinant dont la séquence n'a pas subi de réarrangements est la résistance à l'ampicilline conférée à la cellule et sa capacité à exprimer la b-galactosidase (colonies bleues en présence d'X-gal) Une vérification supplémentaire est effectuée par digestion enzymatique. Ainsi, la coupure par EcoRI d'un recombinant R4-LZ correctement lié et refermé, doit résulter en 6 fragments de taille respective : 4172,3076, 2875,2021, 393 et 283pb. Ces résultats sont illustrés par la figure 2, dans laquelle : - Voie 1 : marqueur #x174/HaeIII - Voie 2 : marqueur 1Kb - Voie 3,5, 7 : recombinants sans coupure - Voie 4,6, 8 : digestion de ces mêmes recombinants par EcoRI 1-7 : Autres tests préliminaires La transformation d'E. coli a été effectuée avec le mélange de ligation ne contenant qu'un seul des deux fragments, en présence ou absence d'histones, pour confirmer la pureté électrophorétique des fragments et l' absence de refermeture au sein de la cellule. Un gel de retardement a été effectué sur le fragment fR4 avant chaque ligation avec ce fragment pour monitorer la complexation de l'ADN par la protéine. La séparation se fait sur gel d'agarose standard de 0.4%. Ce gel est effectué dans les mêmes conditions que les expériences de ligation, dans 20ul déposés sur gel et est repris dans la figure 4, dans laquelle : - Voie 1 : mélange de ligation (recombinant R4-LZ) sans histones (fragments fR4-8159pb- et fLZ-3875pb)fléchés) - Voie 2 : mélange de ligation en présence de 0,025 g d'histones - Voie 3 : mélange de ligation en présence de 0,05 g d'histones - Voie 4 : recombinant R4-LZ purifié - Voie 5 : marqueur 1Kb (Gibco BRL) - Voie 6 : marqueur #x174RF/HaeIII (Gibco BRL) II : Résultats Les 13 premiers essais ont été réalisés en se fondant sur la quantité de protéine déterminée par gel de retardement à partir de la complexation du seul fragment fR4, au lieu de la loi résultant de ces expériences. Or, la taille (8159pb) du fragment fR4, ne représente que les 2/3 de la taille totale du recombinant. En employant cette valeur pour les ligations, la loi n'est suivie qu'aux deux tiers (loi aux 2/3). Les essais les plus récents, qui sont aussi les plus performants ont été réalisés en tenant compte de la quantité de protéine (1/3 de plus) qu'il fallait ajouter pour complexer l'ensemble du vecteur et de l'insert de la même manière que le seul fragment. La présence d'inserts lacZ a été testée par la capacité de la colonie sélectionnée, à hydrolyser le composé X-gal (coloration bleue) et par l'obtention d'un profil correct de coupure enzymatique (test EcoRI) comme détaillé dans la légende de figure 2. Nombre de recombinants R4-LZ (12034pb) obtenus à partir des ligations en présence du mélange d'histones : Essai 1 2 3 4 4' 5 6 (- protéine) 0 0 0 0 0 0 (+ protéine) N bre total 3,0,0 0,0,1 2,0,0 1,4,0,0 7,3,0,0 0,0,1 0,0,0 AvecinsertlacZ 3,0,0 0,0,1 0,0,0 0,0,0,0 0,2,0,0 0,0,1 0,0,0 Essai 7 8 9 10 11 11' (- protéine) 0 0 0 0 0 0 (+ protéine) N bre total 0,0,0 0,0,0 0,1,0 3,5,3 0,3,2 1,1,0 Avec insert 0,0,0 0,0,0 0,1,0 1,1,0 0,3,2 0,0,0 Essai 12 12' 12" 12'" 13 (-protéine) 1(sans insert) 0 (+protéine) N bre total 1,2,2 1,2,2 4,3,3 1,3,1 0,0,0 Avec insert 0,2,1 1,0,0 3,2,1 0,2,1 Essai 14 15 (- protéine) 0 0 (+protéine) Nbre total 11,8,2 0,1,0 Avec insert 9,2,2 0,1,0 i)- Essais 1-6, 9-13 : loi aux 2/3 - Essai 4 et 4' : 4 quantités de protéine ont été testée ; 50,100, 200, 400% - Essai 7 : quantité de protéine 3 fois plus forte (150,300, 600%) - Essai 8 : quantité de protéine 10 fois plus forte (500,1000, 2000%) (pour compenser un éventuel défaut de complexation due à une concentration en ADN plus faible) - Essais 14 et: 15 : loi exacte ii) Effet du stockage et de la congélation de la protéine : - Essai 2 : dilution de la protéine à partir d'une solution-stock de 100mg/ml dans le tampon de dilution contenant 50% de glycérol, conservée à -20 C, pour tester l'effet du stockage. Pour tous les autres essais, la solution de protéine a été fraîchement préparée à partir de la poudre lyophilisée. iii) Quantité d'ADN - Essais 1-5, 9-14 :fragment fR4 : 370ng fragment fLZ : 190ng (quantités équimoléculaires de vecteur et d'insert, 10 l de milieu de ligation) - Essais 6, 7 et 15 :fragment fR4 150ng fragment fLZ 75ng (quantités équimoléculaires 2. 5 fois plus faibles, lOul) - Essai 8 : fragment fR4 :150ng fragment fLZ : 190ng (3 fois plus de molécules fLZ que de molécules fR4, 10 l) iiii) Ordre d'addition de certains composants dans le milieu de ligation - Essai 3 : le fragment fLZ a été ajouté en même temps que la ligase, après incubation de fR4 avec les histones comme dans les gels de retardement. Ce procédé a été évité par la suite car il favorise probablement la refermeture du vecteur sans insert. iiiii) Effet de la congélation du mélange de ligation : - Essais 4 et: 4': L'essai 4 a été réalisé avec 20ul de mélange de ligation. Après addition de la ligase, la moitié du mélange a été congelée à -20 C pour une transformation ultérieure (essai 4'). La congélation ne semble pas nuire à l'efficacité des histones. iiiiii) Présence de glycérol dans le tampon de dilution : - Essais 9, 10, 11 ', 12', 12''', 14, 15 Le glycérol est habituellement additionné au tampon de stockage, comme ci-dessus, pour empêcher la dénaturation et l'aggrégation des protéines lors des cycles successifs de congélation-décongélation. De même, le tampon de dilution de la protéine (tampon de ligation) a été additionné 0,1% de glycérol pour prévenir l'aggrégation ou la dénaturation de la protéine dès sa mise en solution, ainsi que pour éviter de perdre la protéine sur les parois du tube dans les dilutions finales. Dans l'essai 11', le glycérol a été ajouté tardivement (après la première série de ligation de l'essai 11, c'est-à-dire après une dizaine de minutes). iiiiiii) Temps d'incubation avec les histones - Essais 11', 12', 12''' : 15 minutes au lieu de 5 minutes au maximum On sélectionne toujours une part de recombinants ne possédant pas la séquence attendue par clonage dans E. Coli, même en l'absence d'adjuvants protéiques. Ces défauts sont engendrés au moment de la ligation in vitro, ou part réplication incorrecte de l'ADN par la cellule. Dans notre exemple, la présence de recombinants incorrects est témoignée par la présence de colonies blanches. Dans le but de déterminer si la présence de ces recombinants incorrects est due spécifiquement à l'empli d'une préparation protéique, notamment à la présence éventuelle de nucléases, et à la dégradation partielle de l'ADN qui pourrait en résulter un test de sensibilité de l'ADN aux nucléases dans la préparation d'histones employée a été effectué. Pour cela, le fragment fR4 ou le plasmide pR4 sont incubés avec les quantités de protéine indiquées voies 3 à 10. Les résultats sont illustrés par la figure 5, dans laquelle : - Voie 3 : fragment fR4 (500 ng) - Voie 4 : fragment fR4 + 0,025 g d'histones - Voie 5 : fragment fR4 + 0,05 g d'histones - Voie 6 : fragment fR4 + 0,1 g d'histones - Voie 7 : plasmide pR4 (500 ng) - Voie 8 : plasmide pR4 + 5 g d'histones - Voie 9 : plasmide pR4 + 0,025 g d'histones - Voie 10 : plasmide pR4 + 0,05 g d'histones - Voie 11,12, 13 : comme voies 8,9, 10. Incubation à 20 C pendant 1h30 au lieu de 20h. - Voie 1 et 14 : marqueur 1Kb (Gibco BRL) - Voie 2 et 15 : marqueur x174RF/HaeIII(Gibco BRL) Aucune digestion nucléasique n'a été détectée dans ces conditions. Les conditions expérimentales les plus performantes (celles qui permettent d'obtenir avec certitude, ne serait-ce qu'un seul recombinant, même si par ailleurs les autres conditions sont modifiées, ou celles qui introduisent une amélioration de l'efficacité de clonage), sont réunies lorsque les quantités de protéine sont déterminées à partir de la loi définie ci-dessus, lorsque la solution de protéine est fraîchement préparée, le temps d'incubation court (moins de 5 minutes) et les concentrations en ADN suffisantes (370ng de fragment fR4 et 190ng de fragment fLZ pour 10 l de milieu de ligation pour l'exemple ci-dessus). La présence de glycérol au moment de la mise en solution de la protéine semble bénéfique à l'efficacité du clonage, dans le cas du mélange naturel d'histones. Elle ne semble pas l'être particulièrement avec les histones isolées (Hl ou H2b), exemple 2). C'est pourquoi le kit pourra comporter (quelle que soit la protéine employée) un tampon de dilution incluant du glycérol (ou tout autre agent ayant les mêmes propriétés) ainsi qu'un tampon de dilution sans glycérol (qui est également le tampon de ligation). Remarque L'exemple la représente tout autant le clonage d'un insert de 3875pb dans un vecteur de 8159pb que le clonage d'un fragment de 8159pb dans un vecteur de 3875pb. - Exemple lb Clonage d'un fragment de 6785 pb. I-1 . Fragments - Fragment de 2910 paires de bases :fK Ce fragment est issu de la digestion du plasmide pBlueScript KS (Stratagene) par SpeI et SalI. Il contient une origine de réplication pour E. coli et la résistance à l'ampicilline d'E. coli. 1-2 : Vérification de l'absence de remaniements de séquence La coupure par EcoRI du recombinant K-LZ, doit se traduire par 3 fragments de 3426,3076 et 283pb. De la même manière, ces résultats sont illustrés par la figure 3 (Agarose 1%, marqueurs 1Kb (et/ou #x174) sur les voies de droite) . 1-3 : Resultats Les essais ont été réalisés avec des quantités équimoléculaires de vecteur fK (180ng/10ul, 2910pb) et d'insert fLZ (245ng/10ul, 3875pb) aux mêmes concentrations en vecteur et insert que dans l'exemple précédent (recombinant R4-LZ). Les quantités de protéine employées correspondent à 33%, 67% et 134% de la quantité indiquée par la loi indiquée ci-dessus (loi aux 2/3). Nombre de recombinants K-LZ (6785pb) obtenus par ligation en présence d'un mélange d'histones et clonage dans E. coli : Essai1 Essai 2 (- protéine) 8 2 (+protéine) Nbretotal 4,7, 20 n.t., 5, 5 Avecinsert n. t., n. t., 17 n.t., 5,4 La présence d'histones au moment de la ligation améliore également l'efficacité de clonage. - Exemple lc : Refermeture d'un fragment de 8159 pb. Il s'agit du fragment fR4 de 8159 pb déjà décrit. Essai 1 Essai 2 (- protéine) 0 0 (+ protéine) 5, 1, 9 0, 0, 0 L'essai 2 a été effectué avec 150ng de fragment fR4 au lieu de 370ng pour l'essai 1 et 10 l de milieu de ligation. La protéine a été solubilisée en présence de glycérol dans l'essai 1, sans glycérol dans l'essai 2. EXEMPLE 2 LIGATION EN PRESENCE D'HISTONES ISOLEES ET CLONAGE DU RECOMBINANT DE 12034 pb A PARTIR D'E. COLI. Les deux histones qui ont été employées sont l'histone Hl de thymus de veau (type III-SS, ref. H4524, Sigma) et l'histone H2b de thymus de veau (type VII-S, ref. H4255, Sigma). La loi qui a été calculée pour Hl, l'a été sur la base d'une quantité équivalente en moles à la quantité présente dans le mélange naturel, c'està-dire 6 fois moins (masse moléculaire du mélange M=130 268, masse moléculaire de la protéine Hl M= 21 500). Cette loi a été testée par gel de retardement (Figure le) - Exemple 2a : ligation en présence d'histone Hl Nombre de recombinants obtenus : Essai 1 2 3 4 5 (-protéine) 1(ss insert) 0 0 0 0 (+protéine) Nbretotal 1,2,4 2,0,0 0,0,0 0,0,0 0,0,0 Avecinsert 0,1,1 0,0,0 0,0,0 0,0,0 0,0,0 - Essais 1, 2, 3 : quantité d'histone Hl équivalente en moles à la quantité d'histone Hl présente dans le mélange (essais 1 et 2, loi aux 2/3, essai 3 : loi exacte) - Essais 4 et 5 : quantité d'histones Hl équivalente en moles à la quantité totale d'histones présente dans le mélange naturel, en remplacement des autres histones Essai 5 : quantité d'ADN 5 fois moins importante que dans les autres essais - Essai 1 et: 2 : Glycérol ajouté au tampon de dilution de l'histone Hl - Essais 3 : sans glycérol ajouté. L'histone Hl n'accroît pas l'efficacité du clonage aussi clairement que le mélange naturel d'histones, dans les mêmes conditions. - Exemple 2b : ligation en présence de l'histone H2b Dans ce cas, la protéine (M = 13 774) représente le dixième du mélange (M = 130 268), et la loi devient : (C) = 1. 5 10-12 mg H2b /ng ADN/pb de recombinant Nombre de recombinants obtenus : Essai 1' 2' 3' 4 4' (- protéine) 1 0 0 5(sansinsert) (+ protéine) Nbretotal 1,1,2 5,1,0 25,0,0 26,5,7 12,18,9 Avecinsert 0,0,0 2,0,0 15,0,0 13,3,3 4,6,2 - Essais 4,4', 3' : sans glycérol, loi exacte - Essais l'et 2' . avec glycérol, loi aux 2/3 Les essais 1', 2' et 3' ont été réalisés en parallèle aux essais 1,2 et 3 effectués en présence de la protéine Hl (même préparation d'ADN, de tampon, et de boites de culture) et en parallèle à l'essai 14 avec le mélange d'histones). Contrairement à l'histone Hl, l'histone H2b accroît à elle-seule l'efficacité de clonage. REVENDICATIONS 1) Procédé pour la préparation d'acides nucléiques recombinants de grande taille circularisés, du type constitués d'un vecteur et d'un insert de grande taille supérieure à quelque kilobases, caractérisé en ce que : a) on réalise la ligation de l'insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN, et b) on sélectionne par tout moyen approprié les acides nucléiques recombinants constitués du vecteur et de l'insert. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de compaction de l'ADN est une protéine ou un mélange de protéines. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de compaction de l'ADN est choisi parmi une histone, une protéine d'enveloppe virale ou de phage, une protéine du chromoïde bactérien, un mélange de ceux-ci ou un dérivé de ceuxci. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent de compaction de l'ADN est un mélange d'histones ou de dérivés de celles-ci. 5) Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la concentration (C) en agent de compaction n'entraîne pas une rigidification de l'ADN. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration (C) en agent de compaction nécessaire est déterminée par la loi suivante : (C) = ( 10 -x mg/ng ADN/pb ) x Y dans laquelle : x est compris entre 8 et 15 et de préférence entre 10 et 12, et Y est compris entre 0,2 et 10 et de préférence entre 0,33 et 2. 7) Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape a) de ligation de l'insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN s'effectue dans un milieu de ligation constitué d'une ligase et d'un tampon correspondant. 8) Procédé selon la revendication 1 à 7, caractérisé en ce que la ligase est la E.Coli T4 ligase. 9) Kit pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : - une ligase, - un tampon de ligation correspondant à la ligase, - un agent de compaction - éventuellement un agent stabilisant. 10) Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que : la ligase est la E.Coli T4 ligase, - le tampon de ligation adapté, - l'agent de compaction est un mélange d'histones, ou un histone isolé, - l'agent stabilisant, s'il est présent est le glycerol.