FR 2792319 A1 20001020 FR 9904650 A 19990414 La présente invention concerne un procédé de synthèse de monosulfate 4 ou 6 de disaccharides à partir d'un précurseur disaccharidique protégé sur les fonctions hydroxyles autres que 4 et 6 galactosiques comprenant des étapes de sulfatation et de déprotection des fonctions hydroxyles. En particulier, l'invention concerne un procédé de synthèse des 0-(béta-Dglucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D-galactopyranose et 0-(béta-Dglucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D-galactopyranose à partir du diol de formule : L'invention concerne encore la synthèse du diol par traitement à l'acide acétique du benzyl 0-(méthyl, 2,3,4 tri-O-benzoyl-ss-D-glucopyranosyluronate)-(1-3) 2-acetamido-4,6-0-benzylidène-2-desoxy-a-Dgalactopyranoside. La présente invention porte aussi sur l'utilisation des monosulfates 4 ou 6 de disaccharides en tant que médicament, en particulier pour le traitement des maladies du collagène, et de façon encore plus particulière pour les pathologies choisies dans le groupe formé par les dégénérescences dues au vieillissement, les troubles liés à l'administration de corticoïdes et l'arthrose dégénérative ; ou sur l'application cosmétique des monosulfates 4 ou 6 de disaccharides seuls ou associés dans des formulations topiques pour traiter le vieillissement cutané. Les protéoglycanes sulfates et plus particulièrement l'acide chondroïtine sulfurique (ACS) se trouvent à l'état naturel dans les trachées de mammifères, les brechets aviaires, les holothuries et dans divers poissons cartilagineux. Ces ACS se différencient les uns des autres par leur masse moléculaire et par le site de sulfatation en position 4 ou 6 sur le galactopyranose. Les ACS de masse moléculaire comprise entre 5 000 à 15 000 Da sont obtenus par extraction des matériaux biologiques et utilisés en thérapeutique pour traiter l'arthrose (Mazières coll. en 1992 dans la Revue Rhumatologie et Maladie Ostéroarthr.). Alors qu'il est possible d'obtenir par biotechnologie l'acide hyaluronique, il n'existe pas de chondroïtinase capable de réaliser les synthèses de ces protéoglycanes sulfates. Par contre, des chondroïtinases présentes dans le colon hydrolysent les ACS et permettent l'assimilation de fragments de bas poids moléculaires obtenus. Plusieurs essais de recherche de métabolites actifs ont été effectués sans succès dans le sang et/ou le liquide synovial. Des fragments ont été obtenus par hydrolyse avec l'acide chlorhydrique ou l'enzyme chondroltinase mais par la suite il est difficile de séparer les fragments pour obtenir les disaccharides monosulfates purs de formule : R4 R6 1 S03Na H Produit I 2 H S03Na - Produit II Séparés et purifiés par chromatographie, ils sont proposés comme' standard analytique à des prix de 900 F le mg pour une pureté limitée à 90 %. Selon la présente invention, les disaccharides monosulfates obtenus par synthèse pour la première fois sont : 0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D-galactopyranose (produit I) 0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D-galactopyranose (produit II) . Antérieurement, J.C. JACQUINET avait pu synthétiser des méthylglucosides mais il a fallu trouver un procédé nouveau pour obtenir les disaccharides correspondants et réaliser une synthèse stéréocontrôlée des deux dérivés 4 sulfate et 6 sulfate. Les produits I et II sont synthétisés par sulfatation d'un disaccharide intermédiaire : molécule dont les groupes fonctionnels sont protégés à l'exception des positions 4 et 6 sur le galactopyranose. Cette molécule est un intermédiaire commun pour l'obtention des produits I et II : nous l'appellerons molécule A - B. Elle a pour formule : Protocole d'obtention de la molécule A - B Les D-glucorono 6-3 lactone et D-glucosamine, matières premières commerciales, en utilisant les protocoles décrits par J.C. JACQUINET et coll. (J. Chem. Soc. 1995,1573-1581) sont dérivatisés et couplés stéréosélectivement pour obtenir le dérivé : Benzyl 0-(méthyl, 2,3,4 tri-0-benzoyl--D- glucopyranosyluronate)-(1-3) 2-acetamido-4,6-0benzylidène-2-desoxy-a-D-galactopyranoside (précurseur de A - B). Ce couplage est réalisé à partir des précurseurs en quantité stoechïométrique dans le dichlorométhane anhydre, à température ambiante, en présence de tamis moléculaire, on y ajoute 2 moles de triflate d'argent, et on agite pendant 4 heures, le disaccharide obtenu est purifié par chromatographie, le rendement de cette réaction est de 70 %. Caractéristiques : Point de fusion : 125 2 C aD = + 93 Microanalyse conforme à la formule C50 H47 NO15 Ce produit est traité par l' acide acétique à 60 % à 100 C pendant 30 minutes pour libérer le diol par hydrolyse du groupement benzylidène (rendement 87 %) selon le schéma,: Caractéristiques : Point de fusion : 201 2 C [alpha]D = + 78 Microanalyse conforme à la formule C43 H43 NO15 Procédé d'obtention du produit I Schéma de synthèse . Mode opératoire : Benzoylation en 6 : Le diol (molécule A - B) est traité par deux équivalents de cyanure de benzoyle dans la pyridine, à température ambiante pendant 16 heures pour conduire à la molécule C. Caractéristiques : Rendement 93 % Point de fusion : 267 2 C aD = + 64 Analyse conforme à la formule Cso H47 NO16 Sulfatation en 4 : La molécule C est O-sulfatée par action du complexe triméthylamine anhydride sulfurique, 10 équivalents, dans le DMF à 45 C pendant 48 heures. Après purification par chromatographie par échange d'ions sur Sephadex SPC-25 forme Na+, on obtient la molécule D (sel de sodium). Caractéristiques : Rendement 90 % Point de fusion : 172 2 C aD = + 70 Analyse conforme à la formule C50H46NaNO19S Débenzoylation : La molécule D est traitée par la soude 3N en excès pour hydrolyser les 4 groupes benzoyles et l'ester méthylique, la molécule E est obtenue avec un rendement de 80 %. Caractéristiques : Point de décomposition : 275-278 C aD = + 73 Analyse en accord avec le di sel de sodium de formule C21H27NNa2O15S Débenzylation L'hydrogénolyse de la molécule E est catalysée par le palladium sur charbon dans eau-méthanol et conduit au Produit I. Caractéristiques : Rendement.95 % Poudre amorphe aD = + 2 (équilibre des anomères) Analyse conforme à la formule C14 H21 NNa2 O15S Procédé d'obtention du produit II Schéma de synthèse : Mode opératoire : Obtention du 6 sulfate (Produit II) selon le schéma ci-dessus. Sulfatation en 6 : Le diol (produit A-B) est sélectivement O-sulfaté, du fait de la réactivité plus grande de l'alcool primaire, par action du complexe trimethyl amine anhydride sulfurique, 3 équivalents, dans le DMF à 45 C pendant 4 heures. Après traitement sur Sephadex SPC-25 forme Na+, la molécule C' est obtenue avec un rendement de 90 %. Caractéristiques : Point de décomposition : 180 C aD = + 66 Microanalyse conforme à la formule C43H42NNaO18S Débenzoylation : La molécule C' est hydrolysée comme précédemment (action soude 3N) pour obtenir la molécule D'. Caractéristiques : Rendement 82 % Point de décomposition : 275-278 C aD = + 73 Microanalyse conforme à la formule C21H27NNa2O15S Débenzylation : L'hydrogénolyse effectuée comme précédemment conduit au produit II. Caractéristiques : Rendement 85 % aD = + 4 (équilibre des anomères) Structure conforme à la formule C14H21NNa2O15S La structure des produits finaux I (4-sulfate) et II (6-sulfate) est confirmée par analyse RMN du proton et du carbone 13. EN RMN du proton, on observe pour le déplacement chimique du H-4 de I (position du sulfate pour le produit I) une différence ##-0.5 ppm par rapport à celui de H-4 de la molécule isomère non sulfatée en 4 (produit 6-sulfate 2) . De même, on observe pour le déplacement chimique des H-6a,b de 2 (position sulfatée du produit 2) une différence 5A-0.5 ppm par rapport à celui de son isomère non sulfaté en 6 (produit I). En RMN du carbone 13, on observe pour le déplacement chimique du C-4 de 1 (position sulfatée du produit I) une différence de déplacement chimique ##-5 ppm par rapport à celui du C-4 de l'isomère non sulfaté en 4 (produit II). De même, on observe pour le déplacement chimique du C-6 de II (position sulfatée dans le produit II) un 5A-4 ppm par rapport à celui du C-6 de l'isomère non sulfaté en 6 (produit I). La mise en #uvre des procédés ci-dessus nous a permis d'obtenir les produits I et II en accord avec les formules des monosulfates 4 et 6 du disaccharide sous la forme du sel disodique. Les propriétés pharmacologiques ont été déterminées sur des cultures ostéogènes de moelle humaine comparativement au placebo. Les deux dérivés stimulent la synthèse du collagène évalué par colorimétrie. La figure 1 représente le taux de collagène synthétisé par 106 cellules lorsque sont ajoutées à la culture : 1) une dose de 10 ng/ml TGFss facteur de croissance des tumeurs (tumor growth factor), 2) un témoin sovant, 3) le produit I (0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D- galactopyranose) selon l'invention aux doses 3ug/ml, lOug/ml et 30ug/ml, 4) le produit II (0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D- galactopyranose) selon l'invention aux doses 3ug/ml, lOug/ml et 30ug/ml. Les produits selon l'invention ont un effet positif sur la synthèse du collagène. Elles sont utilisables en thérapeutique pour le traitement de dégénérescences dues au vieillissement ou aux troubles liés à l'administration de corticoïdes. Les indications thérapeutiques sont : traitement de l'arthrose dégénérative par voie orale et le vieillissement cutané par voie topique. L'invention s'applique à l'utilisation des produits I et II obtenus selon les procédés décrits et à leurs applications thérapeutiques dans des formulations pharmaceutiques. A titre d'exemples non limitatifs, les compositions suivantes peuvent être utilisées en tant que médicament ou à titre d'application cosmétique. Exemple I Produit I (4 sulfate) 150 mg en gélules Exemple II Produit II (6 sulfate) 50 mg ADN saumon 20 mg Excipients pour émulsion Crème huile/eau qsp 100 g Exemple III crème E/H Produit I (4 sulfate) 30 mg Caféine carboxylate de Na 2 g Amidon 20 g Ethyl cellulose 10 g Autres excipients qsp 100 g REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de monosulfate 4 ou 6 de disaccharides à partir d'un précurseur disaccharidique protégé sur les fonctions hydroxyles autres que 4 et 6 galactosiques comprenant des étapes de sulfatation et de déprotection des fonctions hydroxyles. 2. Procédé selon la revendication 1 comprenant une étape de protection de la position 6 par benzoylation avant la sulfatation. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2 pour lequel le monosulfate de disaccharides préparé est le 0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D-galactopyranose de formule tel que ledit procédé comprend les étapes suivantes : benzoylation du diol correspondant de formule : sulfatation, puis débenzoylation et débenzylation. 4. Procédé selon les revendications 1 ou 2 pour lequel le monosulfate de disaccharides préparé est le 0-(béta-D-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D-galactopyranose de formule tel que ledit procédé comprend les étapes suivantes : sulfatation du diol correspondant de formule : puis débenzoylation et débenzylation. 5.Procédé de synthèse du diol selon l'une de revendication 3 ou 4 par traitement à l'acide acétique du Benzyl 0-(méthyl, 2,3,4 tri-0-benzoyl-- D-glucopyranosyluronate)-(1-3) 2-acetamido-4,6-0benzylidène-2-desoxy-a-D-galactopyranoside. 6. Monosulfate 4 ou 6 de disaccharides pour son utilisation en tant que médicament. 7.Composé choisi dans le groupe formé par le 0-(bétaD-glucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D-galactopyranose et le 0-(béta-Dglucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D-galactopyranose pour son utilisation en tant que médicament. 8.Composé selon l'une des revendications 6 ou 7 préparé suivant le procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour son utilisation en tant que médicament. 9. Composé selon l'une des revendications 6 à 8 pour son utilisation en tant que médicament pour le traitement des maladies du collagène. 10. Composé selon la revendication 9 à titre de médicament pour le traitement des pathologies choisies dans le groupe formé par les dégénérescences dues au vieillissement, les troubles liés à l'administration de corticoïdes et l'arthrose dégénérative. 11. Application cosmétique des monosulfate 4 ou 6 de disaccharides seuls ou associés dans des formulations topiques pour traiter le vieillissement cutané. 12. Application cosmétique du 0-(béta-Dglucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 4-0-sulfo-D-galactopyranose et du 0-(béta-Dglucopyranosyl uronique acide (1-3)-2 acétamido-2 désoxy 6-0-sulfo-D-galactopyranose seuls ou associés dans des formulations topiques pour traiter le vieillissement cutané.