FR 2770214 A1 19990430 FR 9713368 A 19971024 PROCEDE DE PREPARATION D'UN BENZAMIDE HALOGENE. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un benzamide halogéné, de préférence, du 2,6-difluorobenzamide, par hydrolyse biologique. Le 2,6-difluorobenzamide est un produit intermédiaire connu pour la préparation de produits insecticides, en particulier de diflubenzuron (cf. GB-A1 324 293). La préparation du 2,6-difluorobenzamide selon une voie de synthèse chimique pose problème. En effet, l'hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile s'effectue en milieu très acide, notamment en présence d'acide sulfurique concentré à 60 %. En dehors du fait que les rendements ne sont pas très élevés car ne dépassant pas 80 %, ce procédé ne donne pas satisfaction car il coproduit une quantité importante de sel qui le rend polluant et qui induit une purification difficile et onéreuse. De plus, une étape de neutralisation s'avère nécessaire en raison de la quantité importante d'acide sulfurique mise en oeuvre. Par ailleurs, on a décrit selon FR-A-2 294 999, un procédé d'hydrolyse d'amides par hydrolyse biologique. Ainsi, le benzamide est obtenu par hydrolyse du benzonitrile, sous l'action de bactéries de genre Brevibacterium au sens de Bergey. II est à noter que l'activité de la souche R 312 est spécifique des nitriles aliphatiques : I'activité est donc faible sur le benzonitrile (60 pmith.mg d'enzyme) ce qui la rend incompatible avec une exploitation industrielle, en raison d'une productivité, très insuffisante. Contre toute attente, il a été trouvé que le 2,6-difluorobenzamide pouvait être hydrolysé sous l'action d'une enzyme produite en particulier par les bactéries du genre Brevibacterium et plus particulièrement la souche R 312 et son mutant A4. Précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un benzamide halogéné par hydrolyse enzymatique d'un benzonitrile halogéné caractérisé par le fait que l'on soumet le benzonitrile halogéné à une hydrolyse en présence d'une enzyme tétramérique de structure a2 2 ayant au moins 50 % d'homologie, de préférence, supérieure à 80 %, avec la séquence d'acides aminés suivantes: - chaîne a MSVTlDHTtENAAPAQAPVSDRAWALFRALDG KGLVPDGYVEGW KKTFEEDFSPRRGAEL 60 VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLG PQG EYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAW P 119 ILGLPPTWYKSFEYRARWREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYD1TAETRYMVLPQRPAG 178 TEGW SQEQLQEIVTKDCLIGVAI PQVPTV 207 - chaîne [3 MDGVHDLAGVQGFGKVPHlVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV 58 VERMEPR HYMMTPWE RWIGVATLMVEKG I LTQDE LESLAGG PFP 104 LSRPSESEG I I I FEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI 153 SHR7EKWPFPDAlG HGR NDAGEEPTYHVKFAAEESDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA 212 Dans le présent texte, les abréviations des acides aminés correspondent à celles couramment utilisées dans ce domaine technique et notamment à celles mentionnées dans l'ouvrage de Albert L. Lehinger et al, Principes de Biochimie, 2ème édition, Médecine-Sciences Flammarion, p. 113. Elles signifient plus précisément : glycine = G, alanine = A, valine = V, leucine = L, isoleucine = I, proline = P, phénylalanine= F, tyrosine = Y, tryptophane = W, sérine = S, thréonine = T, cystéine = C, méthionine = M, asparagine = N, glutamine = Q, aspartate = D, glutamate = E, lysine = K, arginine = R, histidine = H. Selon la présente invention, le 2,6-difluorobenzonitrile peut être préparé par hydrolyse biologique, de manière tout à fait satisfaisante. Compte tenu du fait que dans l'état de la technique, I'hydrolyse enzymatique du benzonitrile apparaissait comme difficile, il était à craindre que le 2,6difluorobenzamide ne s'hydrolyse pas biologiquement. II ne pouvait en aucun cas, être prédit qu'il serait possible d'effectuer l'hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile et que les résultats d'hydrolyse seraient très nettement supérieurs. Conformément au procédé de l'invention, on effectue l'hydrolyse d'un benzonitrile halogéné de préférence, du 2,6-difluorobenzonitrile en présence d'une enzyme ayant la séquence d'acides aminés définie ci-dessus. II est possible selon l'invention de mettre en oeuvre aussi bien les cellules de micro-organismes comprenant l'enzyme que des préparations de l'enzyme acellulaire mais dans ce cas, il est nécessaire d'effectuer l'extraction de l'enzyme ce qui peut conduire à un surcoût de production. Par "enzyme", on désignera dans le présent texte, aussi bien les cellules exprimant l'enzyme que l'enzyme isolée. D'une manière préférée, on fait intervenir les cellules plutôt que l'enzyme isolée. L'enzyme tel que défini peut provenir de micro-organismes du genre Brevibacterium et plus précisément de la souche Brevibacterium R 312 ou de son mutant Brevibacterium sp A4. Les souches R 312 et son mutant A4 sont connues et décrites notamment dans FR-A-2 294 999 et la thèse de Nicolas Bernet présentée à l'Ecole nationale supérieure agronomique de Montpellier le 30 Juin 1989. Elles sont déposées au Centralbureau voor Shimmelcultures au Pays Bas sous les numéros CBS 71773 pour R 312 et CBS LMD 792 pour A4 Le mutant est caractérisé par le fait que cette souche a perdu l'aptitude à hydrolyser la plupart des amides tout en conservant la même activité nitrile hydratasique que la souche sauvage Brevibacterium sp. R 312. La souche Brevibacterium est obtenue par culture dans un milieu comprenant une source de carbone telle que le glucose, des phosphates, des ions ammonium, magnésium et ferreux. Le milieu peut être enrichi avec une source d'azote organique telle que de l'extrait de levure ou des peptones. On ne sortira pas également du cadre de la présente invention, en immobilisant l'enzyme ou la souche, par exemple sur un support tel que la silice, par agrégation ou dans un gel. La technique d'immobilisation sur support est connue de l'Homme du métier et l'on peut se référer notamment à à l'ouvrage " Immobilization of Enzymes and Cells" édité par Gordon F. Bickerstaff L'invention s'applique préférentiellement à l'hydrolyse du 2,6difluorobenzonitrile mais il est également possible de mettre en oeuvre dans le procédé de l'invention d'autres substrats de type benzonitrile halogéné répondant plus particulièrement à la formule (I) suivante dans ladite formule (I) soit R1 et R2, identiques ou différents représentent tous les deux un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome, . soit l'un des radicaux R1 et R2, représentent un atome d'hydrogène et l'autre un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome. Dans la formule (I), les radicaux R1 et R2, sont préférentiellement en position ortho par rapport au groupe nitrile. L'invention n'exclut pas d'autres substituants sur le noyau benzénique dans la mesure où ils ne gênent pas la réaction d'hydrolyse. On peut citer par exemple, un groupe hydroxyle, un radical alkyle ou alkoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone. Parmi les composés répondant à la formule (I), le substrat préféré est le 2,6difîurobenzonitriîe. Conformément au procédé de l'invention, on réalise l'hydrolyse d'un benzonitrile halogéné, de préférence, du 2,6-difluorobenzonitrile en présence de l'enzyme telle que définie. La réaction s'effectue en milieu aqueux tamponné. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, la masse réactionnelle comprend jusqu'à 3 mol/I de substrat 2,6difluorobenzonitrile. Les micro-organismes exprimés en poids de cellules sèches sont présents à raison de 1 à 50 g/l, de préférence, de 2 à 10 g/l. Le milieu de la réaction est tamponné : le pH variant avantageusement entre 6 et 8, et plus préférentiellement il se situe aux environs de 7. Afin d'obtenir le pH souhaité, on peut se référer à ce qui est décrit dans la littérature, notamment dans l'ouvrage de Rex. M. C. Davison et al, Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432. Dans le procédé de l'invention, on fait appel aux moyens classiques utilisés, en particulier au tampon phosphate comprenant de 1 à 500 mmol d'ions PO4 par litre de solution obtenu notamment à partir d'hydrogénophosphate de sodium et de potassium. Le pH désiré est ajusté avec de la soude ou un tampon de bicarbonate de sodium à la concentration adéquate pour obtenir le pH voulu à la température de fonctionnement. D'un point de vue pratique, le procédé de l'invention est simple à mettre en oeuvre. Dans le milieu tamponné amené au pH adéquate, on introduit sous agitation, le substrat, et l'enzyme sous forme isolée ou apportée par les cellules de micro-organisme. On chauffe à une température variant avantageusement entre 10"C et 30"C. On maintient la température pendant une durée variant le plus souvent entre 4 heures et 20 heures. En fin de réaction, on obtient le benzamide halogéné sous forme précipitée. II est récupéré d'une manière classique selon les techniques classiques de séparation liquide/solide, de préférence, par filtration. On peut si souhaité effectuer une purification à l'aide d'un solvant organique approprié. L'avantage du procédé de l'invention est qu'il permet d'obtenir un benzamide selon un procédé d'hydrolyse qui ne produit pas de sels et qui permet d'atteindre une bonne productivité. Les exemples qui suivent, illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Dans les exemples, les abréviations ont la signification suivante - DFBN = 2,6-difluorobenzonitrile - DFBZ = 2,6-diflurorobenzamide - CS = cellules sèches. Exemple 1 Production des cellules Le micro-organisme Brevîbacterium sp. A4 est cultivé dans le milieu suivant permettant la production de la nitrile hydratase: - Tampon (Na2HPO4/KH2Po4) pH 7 50 mmol - FeSO4, 7H2O 0,01 g/l - MgSO4, H2O 0,5 g/l - Chlorhydrate de thiamine 0,002 g/l - Glucose 10 g/l - NH4CI 5 g/l Des solutions aqueuses des différents composants sont préparées séparément et stérilisées par autoclavage à l'exception des solutions de fer et de thiamine qui sont stérilisées par filtration (membrane Mililipore, type HA, 0,45cil). Les milieux préparés pour la culture haute densité cellulaire de Brevibacterium sp.A4 contiennent ce milieu de base et sont additionnés d'extrait de levure DifcoO et glucose. Les cultures de Brevibacterium sp.A4 sont effectuées dans des erlenmeyers remplis au cinquième de leur volume de façon à assurer une bonne aération des milieux de culture. Ceux-ci sont soumis à une agitation sur table oscillante de 150 rpm à 28"C (5 cm d'amplitude). Tout d'abord, des boîtes gélosées avec un milieu Columbia (Difco) sont ensemencées à partir de stock de cellules dans l'azote liquide. Une première préculture est réalisée à partir des boîtes dans 50 ml de milieu. Environ vingt heures plus tard, la deuxième culture est ensemencée. Celle-ci sera en phase exponentielle de croissance quinze heures plus tard. Pour obtenir des quantités de cellules plus importantes, leur production a été effectuée en fermenteur de 2 litres. Les paramètres de culture qui ont été fixés sont les suivants - pH 7 - régulation de la pression partielle en oxygène : 50% La régulation s'effectue par l'ouverture de la vanne d'arrivée d'air à une agitation constante. Le maximum d'ouverture de vanne est réglé sur 1,5 wm pour ne pas poser des problèmes d'excès d'aération. - agitation : 300 rpm au départ (augmentation en cours de fermentation). - Température : 28"C. Récupération des cellules Les cellules sont centrifugées, lavées à l'eau physiologique ou à l'eau physiologique glycérolée 20% et de nouveau centrifugées. Les cellules peuvent être congelées de deux manières différentes. - les cellules sont reprises par du tampon phosphate 0,1 mol, distribuées également dans des tubes eppendorf puis stockées à -30 C. - le culot cellulaire peut être congelé directement dans l'azote liquide et stocké dans le congélateur à -80 C. Evaluation du poids sec Une quantité de cellules d'un volume donné de culture, qui a été lavée puis suspendue dans de l'eau distillée, est chauffée à 100"C pendant une nuit dans un four pasteur pour enlever toute trace d'eau. On obtient le poids sec des cellules du volume considéré. Exemple 2: Production de 2.6-difluorobenzamide Le tampon phosphate 0,1 mol pH 7 préparé selon Rex. M. C. Davison et al, Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432, est ajouté dans le réacteur. Le DFBN liquide à 35"C est rajouté, cristallise dans le milieu en se collant au fond du réacteur. On augmente l'agitation à 500 rpm pour le mettre en suspension et pour casser les gros cristaux. Au temps t=0, la suspension cellulaire est ajoutée et l'agitation est fixée à 500-600 rpm. Le réacteur est fermé pendant l'expérience. Le récipient utilisé est un réacteur parfaitement agité avec un système d'agitation comprenant pales et contre-pales. La régulation de température se fait grâce à un bain thermostaté. Les conditions opératoires et résultats sont répertoriés dans le tableau (I) Tableau (I) Concentration Tempé- Temps [CS] Molarité de Activité totale rajoutée rature (h) (g/l) I'amide spécifique de DFBN (mol) ("C) formé (Cimol/h.mg de (mmol) CS) 1,5 15 16 4,75 690 10 1,7 15 8 9,7 1352 17,4 1,66 25 6 2,6 728 44 1,67 25 14 2,8 1005 25,5 1,66 25 6 5,5 1600 48 2 25 ~ 8 5,5 1536 35 La meilleure activité est obtenue pour une concentration en cellules sèches de 2,5 g/l ou 5 g/l pour une durée de réaction de 6 heures. Pour atteindre une concentration en amide de 1,5 mol sur 6 heures dans un milieu à pH contrôlé, 5 g/l de cellules sèches sont nécessaires. Exemple 3. Influence du produit de la réaction L'amide sous forme de poudre à différentes concentrations, est initialement introduit dans un tampon phosphate 0,1 mol, pH 7, auquel est ajouté 5,3 g/l de cellules sèches de Brevibacterium sp.A4. L'activité d'hydrolyse du DFBN (815 mmol initialement) en présence de 0.5, 1, 2, 3 ou 4 mol de DFBZ est mesurée sur 1 heure à 30"C et est présentée dans le tableau (II). Tableau (lI) DFBZ Activité spécifique initial ( mol/h.mg de CS) (mol) 0,5 89 1 86 2 67 3 e 53 4 49 L'activité de la souche Brevibacterium est peu affectée en présence de concentrations élevées en produit de la réaction (DFBZ). Exemple 4: Activité de l'enzyme isolé La souche ou enzyme est mise en contact avec le DFBN (500 à 900 mmol), 1 heure à 30 C, sous agitation. Les activités sont présentées dans le tableau (III): T,ableau (III) Conditions de l'essai Activité spécifique Souche (S) ou enzyme (E) ( mol/h.mg de cellules sèches ou de protéines) Nom Concentration en CS ou protéines (g/l) Brevibacterium sp A 0,2 1108,3 (E) Brevibacterium sp A4 8,0 102 (s) Brevibacterium R 312 4,2 153 (S) REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation d'un benzamide halogéné par hydrolyse enzymatique d'un benzonitrile halogéné caractérisé par le fait que l'on soumet le benzonitrile halogéné à une hydrolyse en présence d'une enzyme tétramérique de structure a2132, ayant au moins 50 % d'homologie, de préférence, supérieure à 80 %, avec la séquence d'acides aminés suivantes: - chaîne a MSVTIDHTTENMPAQAPVSDRAWAURALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL 60 VARAWTDPEFRQLLLTDGTMVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP 119 I LG LPPTWYKSFEYRARWR EPR KVLSEMGTEIASDI El RVYDTTAETRYMVLPQR PAG 178 TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV 207 - chaîne 13 MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRW 58 VERMEPRHYMMTPYYERYVlGVATLMVEkG I LTQDELESLAGGPFP 104 LSRPSESEGRPAPVErrTFEVOORVRVRDEWPGHl RMPAYCRGRVGTl 153 SHRTTEKW PFPDAIGHGRNDAG EEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVWDLFEGYLEPAA 212 2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le benzonitrile halogéné répond à la formule (I) suivante: dans ladite formule (I) soit R1 et R2, identiques ou différents représentent tous les deux un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome, .soit l'un des radicaux R1 et R2, représentent un atome d'hydrogène et l'autre un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que le benzonitrile halogéné répond à la formule (I) dans laquelle les radicaux R1 et R2, sont en position ortho par rapport au groupe nitrile. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile halogéné est le 2,6-difluorobenzonitrile. 5- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé par le fait que l'enzyme provient de micro-organismes du genre Brevibacterium. 6- Procédé selon la revendication 5 caractérisé par le fait que l'enzyme provient de la souche Brevibacterium R 312 ou Brevibacterium sp A4. 7- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé par le fait que l'hydrolyse du benzonitrile halogéné est effectuée à un pH variant entre 6 et 8, de préférence, situé aux environs de 7. 8- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que l'hydrolyse du benzonitrile halogéné est effectuée dans un milieu tamponné. 9- Procédé selon la revendication 7 caractérisé par le fait que le milieu tamponné est un milieu phosphate. 10 - Benzamide halogéné obtenu selon le procédé décrit dans l'une des revendications 1 à 9. 1 1 - 2,6-difluorobenzamide obtenu par hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile selon le procédé décrit dans l'une des revendications 1 à 9.