FR 2775972 A1 19990917 FR 9803398 A 19980316 DERIVES DU THIRAME, CONJUGUES ANTIGENIQUES INCLUANT L'UN DE CES DERIVES, ANTICORPS SPECIFIQUES DU THIRAME ET DESDITS CONJUGUES, PROCEDE DE DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DU THIRAME ET KIT DE DOSAGE CORRESPONDANT. L'invention concerne des dérivés du thirame, des conjugués antigéniques incluant l'un de ces dérivés, des anticorps spécifiques du thirame et desdits conjugués, un procédé de dosage immuno-enzymatique du thirame et un kit de dosage correspondant. Le thirame est un dithiocarbamate fongicide, utilisé en agriculture dans le contrôle des maladies (telles gue le mildiou, la rouille, le charbon, etc....) des légumes feuilles et plus particulièrement des salades. Avant la mise sur le marché des légumes, à l'état frais ou surgelé, ceux-ci sont soumis à l'analyse des résidus de pesticides. La limite maximale en résidus (LER) de thirame est fixée à 5 ppm (exprimée en sulfure de carbone) pour les fines herbes, les laitues et similaires, à 2 ppm pour les abricots, les fraises, les fruits à pépins, les oranges, les pêches, les raisins, les cucurbitacés à peau non comestible, les légumes-bulbes, les légumes tiges, à 0,5 ppm pour les endives et les légumes racines, à 0,1 ppm pour les noix et à 0,01 ppm pour les autres fruits et légumes (valeurs fixées par l'arrêté du 16 juin 1994). La technique officielle de dosage dans les feuilles de salade, (voir KEPPEL G.E. (1971) "Collaborative study of the determination of dithiocarbamate residues by a modified carbon disulfide evolution method". Journal of Association of Analytical Chemistry, 54, n 3, 528-532), fait appel à l'hydrolyse acide des échantillons, suivie d'une distillation et d'un dosage spectrophotométrique du sulfure de carbone (cl ) libéré. Cette technique présente de no^,nreux inconvénients dont un temps d'analyse relativement long et l'absence de spécificité du dosage. Or, il serait souhaitable de pouvoir effectuer des contrôles rapides à proximité des lieux de production, ainsi que le tri préalable des lots de fruits et légumes avant leur conditionnement et leur vente. Il serait donc utile de mettre au point une technique de dosage rapide, fiable et peu coûteuse, pour doser le thirame dans les fruits et légumes. Ce but est atteint à l'aide d'un procédé de dosage immuno-enzymatique du thirame, détaillé ultérieurement L'invention concerne premièrement un dérivé du thirame présentant la formule (1) suivante dans laquelle R1, R2 et R3 sont un groupe méthyle ou un groupe éthyle et n est un nombre entier variant de 1 à 10 et deuxièmement un dérivé du thirame présentant la formule (2) suivante dans laquelle R; et R son. un croupe méthyle ou un groupe éthyle et p est un nombre entier variant de 1 à 10. L'invention concerne également les conjugués antigéniques (3) et (4) suivantes incluant les dérivés de thirame selon les formules (l) ou (2) précitées dans lacuelle n est un nombre entier variant de 1 à 10, m est un nombre entier variant de 10 à 30 et R est ur.e protéine ou une enzyme, et dans laquelle p est un nombre entier variant de 1 à 10, m est un nombre entier variant de 10 à 30 et R est une protéine ou une enzyme. De préférence, la protéine est choisie parmi la sérum-albumine bovine, l'ovalbumine, la thyroglobuline ou l'hémocyanine de lamproie et l'enzyme est choisie parmi la phosphatase alcaline, la peroxydase de raifort ou l'acétylcholinestérase ou tout autre marqueur enzymatique. L'invention concerne également des anticorps, qui se lient s?écifique.m.ent au thirame ou à l'un des conjugués antigéniques précités. Le procédé de dosage selon l'invention comprend les étapes consistant à mettre un échantillon contenant le thirame à doser en contact et en compétition, avec l'un des conjugués antigéniques précités dans lecuel R est une protéine et avec l'un des anticorps précités pour permettre la formation de complexes immuns, et à - détecter les complexes immuns ainsi formés. Ce procédé est un dosage ENLISA compétitif, indirect. L'invention concerne enfin un kit de dosage immuno- enzymatique du thirame comprenant - un moyen de conteneur, - un conjugué antigénique précité dans laquelle R est une protéine, et - un anticorps précité et éventuellement un anticorps anti-immunoglobuline lié à une enzyme et un substrat dont la transformation en produit coloré est catalysée par ladite enzyme. Ces procédés et kits de dosage immuno-enzymatique permettent de doser le thirame de façon rapide, fiable et économique. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation de l'invention, donné à titre d'exemple illustratif et non limitatif, cette description étant faite en référence aux schémas joints dans lesquels - la figure 1 est un schéma illustrant les différentes étapes du procédé de dosage immunoenzymatique selon l'invention, et - les figures 2 et 3 sont des courbes de dosage immuno-enzymatique, correspondant respectivement aux exemples 6 et 7 et indiquant la concentration en thirame en fonction de la DO. Le thirame (disulfure de bis(diméthylthiocarbamyle)) est un dithiocarbamate présentant la formule à deux motifs symétriques suivante Cette molécule est d'une taille trop faible pour être immunogène et déclencher une réponse immunitaire. An conséquence, afin de produire des anticorps spécifiques de ce fongicide, il est nécessalre de la coupler à une racromolécule, généralement une partie de protéine. Plus précisément, on fabrique tout d'abord un haptène oui une fois lié à une protéine, pourra déclencher une réponse immunitaire spécifique de cet haptène. Cet haptène est un analogue structurel du thirame à doser, présentant un bras de liaison de longueur variable muni d'une fonction acide carboxylique terminale. L'invention concerne deux dérivés du thirame présentant les formules (1) et (2) suivantes et susceptibles de jouer le rôle d'haptène dans une réponse immunologique dans laquelle R, R et R sont un croupe méthyle ou un groupe éthyle et n est un nombre entier variant de 1 à 10, et dans laquelle R4 et R5 sont un groupe méthyle ou un groupe éthyle et p est un nombre entier variant de 1 à 10. L'haptène de formule (1) est préparé selon le procédé utilisé par NAKAI et al, 4 new reagent or aldehyde synthesis : methylene bis(N,N diméthyldithiocarbamate), Chemical Letters, pp 731-732, 1979., pour préparer le méthylène bis(N,Ndiméthyldithiocarbamate). Ce procédé consiste à coupler des sels de sodium d'acides thiocarbamiques et à l'aide de dichlorométhane, selon le schéma réactionnel suivant dans lequel n, et R2 et R3 ont les valeurs citées précédemment. L'haptène de formule (2) est préparé en faisant réagir de la diméthylamine avec du sulfure de carbone et de l'acide bromocarboxylique selon le schéma réactionnel suivant On donnera ci-après deux exemples de fabrication d'haptènes particuliers correspondants aux for:nules (i) et (2) précitées. EXEMPLE 1. Préparation de l'acide 4-[N,N-diméthyl,N'- méthlméthylène-bisdithiocarbamoyl] butanoïque (dérivé de formule (1) avec n = 3 et R:, R2 et R3 =CH3). Ce dérivé du thirame (haptène) est préparé en couplant les sels de sodium des acides thiocarbamiques (a) et (b) suivants à l'aide de dlchlorométhane, selon le schéma réactionnel suivant Plus précisément, le N,N-diméthyldithiocarbamate de sodium (b) est disponible commercialement auprès de la société Aldrich. Par ailleurs, le 4- (N-dithiocarboxy-N-méthylamino) butanoate de disodium (a) est préparé comme suit Dans 50 ml d'eau sont mélangés, à température ambiante, 1,53 g d'acide 4-(méthylamino)butanoïque sous forme de chlorhydrate (provenant de chez Alårich) et 1,2 g d'hydroxyde de sodium. On ajoute goutte à goutte à cette solution, 0,91 g de sulfure de carbone. Une heure après la fin de l'addition du sulfure de carbone, le milieu est chauffé à 40 C pendant deux heures. Après retour à la température ambiante, on ajoute de l'acétone jusqu'à l'apparition de deux phases. La phase cétonique est éliminée, puis l'opération est renouvelée jusqu'à la précipitation du produit (a) sous forme d'un solide blanc. On obtient 2 g de ce produit. Son analyse donne : C6H9NO2S2Na2 Ses caractéristiques RMN sont les suivantes H, D2O : 6 ppm (intégration, multiplicité, J Hz) 1,8-2,05 (2H, m); 2,2 (2H, t, 7 Hz); 3,45 (3H, s); 4.05 (2H, t, 7 Hz). 13C, D2O :# ppm, attribution Ci 25,4, C-3; 36,5, C-2; 44,8, C-5; 58,1, C-4; 184,2, C-1; 209, C-6. Pour la synthèse du dérivé proprement dit, on mélange à température amiante, 0,78 g de 4-(N- dithiocarboxy-N-méthylamino) butanoate de sodium (a) et 1,17 g de N,N-diméthyldithiocarbamate de sodium (b) dans 15 ml de méthanol. On ajoute à cette solution, 5 ml de dichlorométhane. Après 20 heures d'agitation, le méthanol est évaporé sous pression réduite. Te résidu est repris par 20 ml d'eau et ce mélange est acidifié à pH 3-4 à l'aide d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 3M avant extraction avec 2 ois 15 ml de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu est analysé par chromatographie sur gel de silice (acétate d'éthyle / hexane : 1/2) pour donner 0,3 g de l'haptène précité (Rf=0,2) et deux produits symétriques correspondants (Rf=0,05 et 0,9). L'analyse du dérivé donne : C10H16N2O2S4 Ses caractéristiques RMN sont les suivantes H, CDCl3 : 8 ppm (intégration, multiplicité, J Hz) 2,0 (2H, q, J = 7 Hz); 2,45 (2H, t, J = 7 Hz); 3,32, 3,5 (3H, 2s); 3,36, 3,55 (6H, 2s); 3,75, 4,1 (2H, 2t, J = 7 Hz); 5,33 (2H, s); 10,7 (1H, s). 13C, CDCl3 : # ppm, attribution Ci C9/C10 : 41,5/45,5; C7 : 46,2 ; C4 : 53,3/55,8; C3 : 21,3/22,0; C2 : 30,5/30,8; C5 : 39,6/43,6; C1 : 178,1/178,6; C6 : 195,0/195,8; C6 : 195,13. EXEMPLE 2 Préparation de l'acide 6-lN,N- diméthyldithiocarbamoyl] hexanoïque. (dérivé de formule (2) avec n = 5 et R; et R5 = CE Ce dérivé du thirame (haptène) a été préparé de la façon suivante. Dans 25 ml d'eau, sont mélangés, à température ambiante, 1,2 g d'hydroxyde de sodium et 2,25 g d'une solution aqueuse à 40% de diméthylamine. On a ajouté goutte à goutte 1,9 g de sulfure de carbone. Trente minutes après la fin de l'addition du sulfure de carbone on a ajouté un mélange constitué de 3,9 g d'acide 6-bromohexanoïque et de 0,9 g d'hydroxyde de sodium dans 10 ml d'eau. L'agitation a été maintenue 20 heures. La solution a été extraite avec deux fois 15 ml d'éther diéthylique, puis la phase aqueuse a été acidifiée par une solution aqueuse d' acide chlorhydrique 3M et réextraite avec du dichlorométhane (2 x 20 ml). Cette deuxième phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pressicn réduite. Le résidu solide obtenu est recristallisé dans un mélange hexane/dichlorométhane pour donner 3,2g de l'haptène récité. L'analyse du dérivé donne : C9H17NO2S2 Ses caractéristiques RMN sont les suivantes H, CDCl3 : 8 ppm (intégration, multiplicité, J Hz) 1,2-1,9(6H, m); 2,35(2H, t, J = 7 Hz) ; 3,25(2H, t J = 7 Hz) ; 3,32(3H,s) ; 3,5(3H, s). 13C, D2O : # ppm, attribution C@ C8/C9 : 41,5/45,3 ppm ; C6 : 33,9 ppm ;C3/4/5 : : 24,2/28,3/28,3 ppm ; C2 :37,2 ppm ; C1 : 180 ppm ; C- :197,3 ppm. L'invention concerne également, les conjugués antigéniques obtenus par couplage de l'un des deux haptènes (1) ou (2) précités avec la sérum albumine bovine (BSA) ou toute autre protéine immunogène comme par exemple l'ovalbumine (OVA), la thyroglobuline (THY) et l'hémocyanine de lamproie (KLH). Le conjugué antigénique obtenu à partir de l'haptène (1) présente la formule (3) suivante dans laquelle n est un nombre entier variant de 1 à 10, m est un nombre entier variant de 10 à 30 et R est l'une des protéines suivantes : BSA, OVA, THY, KLH, et le conjugué antigénique obtenu à partir de l'haptène (2) présente la formule (4) suivante dans laquelle p est un nombre entier variant de 1 à 10, m est un nombre entier variant de 10 à 30 et R est l'une des protéines suivantes : 3SA, OVA, THY, KLH. Le conjugué antigénique (3) est obtenu en couplant l'haptène (1) aux restes lysine d'une protéine, selon la technique BAUMINGER S. et WILCHEK K.M. (1980) The use of carbodiimide in the preparation of immunizing conjugates. Methods in enzymology, 70, 151-159. Ce couplage est schématisé ci-dessous + H&num;}J (1) s s o DCC LsKNOaP I o \ ssÉNM;O S A + t + H P Prot S TamponHCQ /cl=3 0,1 M L s I j Prot m La fonction acide carboxylique terminale de l'haptène (1) est transformée en ester actif par réaction avec la N-hydroxysuccinimide (NHS), en présence de N,N'dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Ensuite, l'haptène (1), la NHS et le DCC sont mis à réagir avec du diméthylformamide puis avec la protéine pour obtenir le conjugué antigénique précité. On donnera ci-après trois exemples de fabrication des conjugués antigèniques précités. EXEMPLE 3 Synthèse du conjugué antigénique haptène (1)-BSA. La fonction acide carboxylique terminale de l'haptène (1) est transformée en ester actif par réaction avec la N-hydroxysuccinimide ensuite, 50 mg d'haptène (1), 70 mg NHS et 60 mg de DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide) sont mis sous agitation dans 1 ml de diméthylformamide (DMF) pendant 30 minutes, à température ambiante. La dicyclchexylurée qui précipite est éliminée par centrifugation (5 minutes, à 10.000g) et le surnageant est rajouté à 0,2 g de sérumalbumine bovine (BSA) dissous dans 10 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M, refroidi à + 4 C. a réaction est poursuivie pendant 3 heures à + 4 C, sous agitation. Le conjugué antigénique obtenu est ensuite purifié par dialyse pendant 72h contre du tampon phosphate de sodium (PBS) pH 7,4 (changé toutes les 24h) ou par ultrafiltration, puis lyophilisé. Le nombre de résidus fixés est déterminé par la méthode à l'OPDA (SVEDAS V.J.K., GALAEV I.J., BORISOV I.L., BEREZIN I.V. (1980) The interaction of aminoacids with o-phthaldialdehyde : a kinetic study and spectrop,hotometric assay of the réaction product. Analytical 3iochemistry, 101, 188-195.) et par dosage du sulfure de carbone libéré, après hydrolyse acide du conjugué selon la méthode officielle de dosage des dithiocarbamates (KEPPEL G.E. (1971) Collaborative study of the determination of dithiocarbamate residues by a modified carbon disulfide evolution method. Journal of Association of Analytical Chemistry, 54, n03, 528-532.). EXEMPLE 4: Synthèse du conjugué antigénique haptène (1)-OVA. Le principe du couplage est le même que celui décrit précédemment dans l'exemple 3. 50 mg d'haptène de formule (1), 70 mg de NHS et 60 mg de DCC sont mis sous agitation dans 1 ml de diméthylformamide (DMF) pendant 30 minutes, à température ambiante. La dicyclohexylurée qui précipite est éliminée par centrifugation (5 minutes, 10.000g) et le surnageant est rajouté à 0,2 g d'ovalbumine (OVA) dissous dans 10 mi de tampon bicarbonate de sodium 0,1M, refroidi à + 40C. La réaction est poursuivie 3 heures à + 40C sous agitation. Le conjugué antigénicue obtenu est ensuite purifié par dialyse pendant 72 h contre du tampon PBS (changé toutes les 24h) ou par ultrafiltration, puis lyophilisé. Le nombre de résidus fixés est déterminé par la méthode à l'OPDA (SVEDAS V.J.K., GALAEV I.J., BORISOV I.L., BEREZIN I.V. (1980) The interaction of aminoacides with o-phthaldialdehyde : a kinetic study and spectrophotometric assay of the reactien produit. Analytical 3iochemistry, 101, 188-195.) et par dosage du sulfure de carbone libéré, après hydrolyse acide du conjugué selon la méthode officielle de dosage des dithiocarbamates (KEPPEL G.E. (1971) Collaborative study of the determination of dithiocarbamate residues by a modified carbon disulfide evolution method. Journal of Association of Analytical Chemistry, 54, n03, 528-532.). EXEMPLE 5 Synthèse du conjugué antigénique haptène (2)-OVA. Le principe de la réaction est le même que celui décrit précédemment dans les exemples 3 et 4. Dans le but de préparer l'ester activé, 50 mg d'haptène de formule (2), 70 mg NwS et 60 mg de DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide) sont mis à réagir dans 1 ml de diméthylformamide (DMF) pendant 30 minutes, à température ambiante, sous agitation. La dicyclohexylurée cui précipite est éliminée par centrirugation (5 minutes, à 10.000g) et le surnageant est rajouté à 0,2 g d'ovalbumine (OVA) dissoute dans 10 ml de tampon bicarbonate de sodium 0,1M, refroidi à + 4 C. La réaction se poursuit pendant 3 heures à + 40C sous agitation. Le conjugué antigénique obtenu est ensuite purifié par dialyse pendant au moins 72 h contre du tampon P3S (changé toutes les 24h) ou par ultrafiltration, puis lyophilisé. Le nombre de résidus mixés est détermine par la méthode à l'OPDA (SVEDAS V.J.K., GALAEV I.J., BORISOV I.L., BEREZIN I.V. (1980) The interaction of aminoacids with o-phtha2dia2dehyde : a kinetic study and spectrophoto,metric assay cf the reaction product. Analytîcal 3iochemistry, 101, 188-195.). L'invention concerne également des conjugués antigéniques obtenus par couplage des haptènes de formules (1) et (2) précités avec des enzymes du type phosphatase alcaline, peroxydase de raifort ou acétylcholinestérase etc...), ou tout autre marqueur enzymatique, ces conjugués étant utilisables dans des techniques de dosage immuno-enzymatiques. Ces conjugués sont produits par le procédé décrit. Ces conjugués haptène-enzyme sont susceptibles d'être utilisés dans un procédé de dosage immuno-enzymatique de type ELISA, par compétition directe. L'invention concerne aussi les anticorps polyclonaux spécifiques du thirame, obtenus par injection des conjugués antigéniques (haptène-protéine) précités, à un animal (lapin, souris, cr,èvre, etc...) selon un protocole classique de production d'anticorps polyclonaux. Le protocole c'imm.unisation utilisé est par exemple le suivant : on injecte à un animal par voie sous- . cutanée, 1 mg de conjugué haptène-3SA en suspension dans 1 ml de tampon phosphate salin. On effectue 4 injections à j, j+15, j+30, j+45. Lors de la première injection, la suspension d'immunogène est émulsifiée avec 1 ml d'adjuvant complet de Freund ; lors de la deuxième injection, la suspension d'immunogène est émulsifiée avec 1 ml d'adjuvant incomplet de Freund. Le sérum est collecté à j+55. De plus, l'invention concerne un procédé de dosage immuno-enzymatique compétitif, indirect, de type ELISA, du thirame. Les deux exemples suivants illustrent la mise en oeuvre de ce procédé de dosage. EXEMPLE 6. Cet exemple illustre l'utilisation du conjugué haptène (1)-ovalbumine pour le dosage du thirame dans un test ELISA compétitif indirect. Protocole expérmental Le conjugué haptène (1)-ovalbumine est fixé sur un support solide qui est ici une plaque de microtitration présentant 96 cavités ou puits, (voir étape I en figure 1). . Le support solide peut également etre des perles ou des tubes de polystyrène. Pour cela les conjugués sont mis en solution dans un tampon bicarbonate pH 9,6. Le mélange placé au fond des puits est incubé pendant une minute à + 4 C. Après quatre lavages au tampon PBS tween 0,05% (300 l/puits) (les lavages sont symbolisés pas les fleches en figure 1), les conjuguées sont mis en contact avec une solution aqueuse de thirame (tampon de lavage à 6 % d'acétone pour permettre la dissolution du pesticide) et avec du sérum dilué contenant les anticorps spécifiques du thirame, (voir étape Il (saturation) et étape III en figure 1). Dans la pratique la solution de pesticide est déposée au fond des puits avant celle du sérum dilué. Le pesticide à doser et le conjugué haptène-ovalbumine entrent en concurrence pour occuper les sites libres des anticorps en solution, (voir étape III en figure 1). . Les concentrations en anticorps et en conjugué doivent être limitantes pour permettre la compétition. Elles sont déterminées au cours d'essais préliminaires. Après une étape de lavage (6 lavages dans du tampon PBS tween 0,05%, 300 pl/puits) qui élimine les molécules de pesticides et d'anticorps non fixés, le complexe (conjugué haptèr.e-protéine/anticorps) est révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de lapin couplé à une phosphatase alcaline (solution commerciale utilisée selon les recommandations du fournisseur), (voir étape IV en figure 1). Il suffit alors, après une autre étape de lavage (6 lavages dans du tampon r3S tween 0,05%, 300 pl/puits) d'ajouter un substrat standardisé (pnitrophénylphosphate) pour pouvoir mesurer la quantité d'enzyme par le biais de leur activité, (voir étape V en figure 1). Les enzymes catalysent la transformation de substrat en un produit coloré (p-nitrophénate) cui fournit après lecture par un spectrophotomètre, une valeur de densité optique (DO) et par comparaison avec les valeurs de DO des standards, donne la concentration de l'échantillon à doser. La DO sera d'autant plus faible que la concentration en thirame sera plus élevée et que les molécules de pesticides entreront en compétition avec celles des conjugués haptènes-protéines. Les résultats obtenus sont illustrés sur la figure 2 jointe et représentent la moyenne et l'écart type de 4 expériences comprenant un nort-e total de 27 échantillons. EXEMPLE 7 Cet exemple illustre l'utilisation du conjugué haptène (2)-ovalbumine pour le dosage du thirame dans un test ELISA compétitif indirect. Protocole expérimental Le conjugué haptène (2)-ovaîbumine est fixé sur un support solide cui est ici une plaque de microtitration offrant 96 cavités ou puits. Le support solide peut également étre des perles ou des tubes de polystyrène. Pour cela les conjugués sont mis en solution dans un tampon bicarbonate pH 9,6. Le mélange placé au fond des puits est incubé pendant une nuit à + 40C. Après quatre lavages tampon P3S tween 0,058 (300 pltpuits), les conjugués sont mis en contact avec une solution aqueuse de thirare (tampon de lavage à 6 % d'acétone pour permettre la dissolutlon du pesticide) et avec du sérum dilué contenant les anticorps spécifiques du thirame. Dans la pratique la solution de pesticide est déposée au fond des puits avant celle du sérum dilué. Le pesticide à doser et le conjugué ovalbumine-haptène entrent en concurrence pour occuper les sites libres des anticorps en solution. Les concentrations en anticorps et en conjugué doivent hêtre limitantes pour permettre la compétition. Elles sont déterminées au cours d'essais préliminaires. Après une étape de lavage (6 lavages dans du tampon PBS tween 0,05%, 300 l/puits) qui élimine les molécules de pesticides et d'anticorps non fixés, le complexe (conjugué haptène-protéine/anticorps) est révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de lapin couplé à une phosphatase alcaline (solution commerciale utilisée selon les recommandations du fournisseur). Il suffit alors, après une autre étape de lavage (6 lavages dans du tampon PBS tween 0,05%, 300 Al/puits) d'ajouter un substrat standardisé (p-nitrophénylphosphate) pour pouvoir mesurer la quantité d'enzyme par le biais de leur activité. Les enzymes transforment le substrat en un produit coloré (pnitrophénate) cui fournit après lecture par un spectrophotomètre, une valeur de densité optique (DO) et par comparaison avec les valeurs de DO des standards, donne la concentration de l'échantillon à doser La DO sera d'autant plus faible que la concentration en thirame sera plus élevée et que les molécules de pesticides entreront en compétition avec celles des conjugués haptènes-protbines. Les résultats obtenus sont illustrés sur la figure 3 jointe et représentent la moyenne et l'écart type de 5 expériences comprenant un nombre total de 30 échantillons. On notera que les anticorps polyclonaux précités pourraient également être liés à une enzyme et utilisés par exemple dans un test de détection par compétition directe, semblable au procédé décrit ci-dessus mais sans l'étape IV de la figure 1. Enfin, 11 invention concerne un kit de dosage contenant les éléments nécessaires pour effectuer le dosage immuno-enzrn.atique, à savoir - un moyen de conteneur ou type plaque de microtitration à 96 puits ou des perles ou des tubes de polystyrène, - un conjugué antigénique de formule (3) ou (9) dans laquelle R est une protéine, de préférence lié audit conteneur, - un anticorps REVENDICATIONS 1. Dérivé du thirame présentant la formule (1) suivante dans laquelle R, R2 et R3 sont un groupe méthyle ou un groupe éthyle et n est un nombre entier variant de I à 10. 2. Dérivé du thirame selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 3 et R, R2 et 33 représentent un groupe méthyle. 3. Dérivé du thirame présentant la formule (2) suivante dans laquelle a4 et R5 sont un groupe méthyle ou un groupe éthyle et p est un nombre entier variant de 1 à 10. 4. Dérivé du thirame selon la revendication 3, cractérisé en ce que p est éga' à s et R et R représentent un groupe éthyle. 5. Conjugué antigénicue présentant la formule (3) suivante dans laquelle n est un nombre entier variant de 1 à 10, rn est un nombre entier variant de 10 à 30 et R est une protéine ou une enzyme. 6. Conjugué antigénique présentant la formule (4) suivante dans laquelle p est un nombre entier variant de 1 à 10, m est un rzo.nre envier variant de O à 30 et R est une protéine ou une enzyme. 7. Conjugué antigénique selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la protéine est choisie parmi la sérum-albumine bovine, l'ovalbumine, la thyroglobuline ou l'hémocyanine de lamproie. 8. Conjugué antigénique selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi . la phosphatase alcaline, la peroxydase de raifort ou l'acétylcholinestérase ou tout autre marqueur enzymatique. 9. Anticorps qui se lient spécifiquement au thirame ou au conjugué antigénique selon la revendication 5 ou 6. 10. Anticorps selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'il sont polyclonaux. 11. Anticorps selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'il sont obtenus par l'injection du conjugué antigénique selon la revendication 5 ou 6 dans lequel R est une protéine, à un animal et par recueil du sérum de l'animal. 12. Procédé de dosage par immuno-enzymatique du thirame, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: - mettre un échantillon contenant le thirame à doser en contact et en compétition, avec un conjugué antigénique selon la revendication S ou 6 dans lequel R est une protéine et avec un anticorps selon la revendication 9 pour permettre la formation de complexes immuns, et - détecter les complexes immuns ainsi formés. 13. Kit de dosage immuno-enzymatique du thirame comprenant - un moyen de conteneur, - un conjugué nticénivue selon la revendication 5 ou 6 dans laquelle R est une protéine, et - un anticorps selon la revendication 9. 14. Kit de dosage immuno-enzymatique du thirame selon la revendication 13 comprenant en outre - un anticorps anti-immunoglobuline lié à une enzyme et - un substrat dont la transformation en produit coloré est catalysée par ladite enzyme.