FR 2768626 A1 19990326 FR 9711820 A 19970923 REGULATION DE L'APOPTOSE CELLULAIRE PAR DES MODULATEURS DE RECEPTEURS PAR. La présente invention est relative à l'utilisation de modulateurs des récepteurs 13-adrénergiques (ss-ARs) pour le traitement de pathologies associées à une dérégulation de l'apoptose. On désigne sous le terme d'apoptose une forme particulière de mort cellulaire qui dépend d'un processus génétiquement programmé. L'apoptose est un mécanisme physiologique qui intervient normalement au cours du développement et de la vie d'un organisme. Elle est, entre autres, impliquée dans les changements morphologiques des organes au cours de l'ontogénèse, la régulation du nombre de cellules dans les tissus, l'élimination de certaines sous-populations de lymphocytes dans la régulation du système immunitaire, et l'élimination des cellules anormales. Certaines maladies sont associées à une dérégulation de l'apoptose. Si celle-ci est anormalement augmentée, elle conduit à une mort cellulaire excessive (par exemple dans le cas de l'hépatite, de l'ischémie cardiaque, des maladies neurodégénératives, et du SIDA). Si au contraire elle est insuffisante, elle permet la survie et la prolifération de cellules indésirables (par exemple dans le cas de la carcinogenèse, des maladies auto-immunes et de certaines infections virales). La mort cellulaire provoquée par l'apoptose résulte de l'activation d'endonucléases endogènes qui détruisent l'ADN cellulaire ; différents facteurs aboutissant à cette activation ont été décrits. Toutefois, les mécanismes régissant le mode d'action de ces facteurs sont encore mal connus. Deux protéines, le TNF-a et le ligand Fas [ITOH et al, Cell, 66, pp. 233-240, (1991) ; OEHM et al., J. Biol. Chem., 267, pp. 10709-10715, (1992)] jouent un rôle particulièrement important dans le déclenchement des processus d'apoptose au niveau de nombreuses cellules. Ces protéines interagissent avec leurs récepteurs respectifs, TNFR [ou TNF-ar] et Fas [ou FasAg, CD95, APO-1], à la surface de la cellule. Il a été constaté que l'expression de ces protéines et/ou de leurs récepteurs membranaires était altérée dans certaines pathologies associées à une dérégulation de l'apoptose ; par exemple, dans les hépatites, on a observé une augmentation de l'expression de TNF-a et TNFR [SPENGLER et al., Cytokine, 8(11), pp. 864-872, (1996)], ainsi que de celle des récepteurs Fas [HIRAMATSU et al., Hepatology, 19, pp. 1354-1350 ; (1994) ] ; [MOCHIZUKI et al., J. Hepatology, 24, pp. 1-7, (1996)], qui est au contraire diminuée dans le cas des hépatocarcinomes [HIGAKI et al., Am. J. Pathol., 149, pp. 429-437, (1996)]. Des anticorps anti-Fas possèdant une activité similaire à celle du FasL, sont utilisés dans des modèles expérimentaux d'apoptose. L'injection de ces anticorps à des souris provoque une hépatite fulminante due à une apoptose massive des hépatocytes, entraînant la mort des souris dans les quelques heures suivant l'injection [OGASAWARA et al., Nature, 364, pp. 806-809, (1993) NAGATA, Prog. Mol. Subcell. Biol., 16, pp. 87-103, (1996)]. Différents facteurs inhibiteurs in vivo de l'apoptose ont été mis en évidence. Il a par exemple été observé que des souris transgéniques exprimant la protéine Bcl-2 humaine [LACRONIQUE et al., Nature Medecine, 2, pp. 80-86, (1996) ; RODRIGUEZ et al., J. Exp. Med., 183, pp. 1031-1036, (1996)], l'antigène T de SV40 [ROUQUET et al., Oncogene, 11, pp. 1061-1067, (1995)], ainsi que des souris auxquelles on avait administré des inhibiteurs de protéases de type ICE (interleukin 113 converting enzyme) [ROUQUET et al., Curr. Biol., 6, pp. 1192-1195, (1996) ; RODRIGUEZ et al., J. Exp. Med., 184, pp. 2067-2071, (1996)] , ou un immunomodulateur, le linomide [REDONDO et al., J. Clin. Invest., 98, pp. 1245-1252, (1996)], étaient protégées contre l'apoptose hépatique induite expérimentalement par des anticorps anti-Fas. Par ailleurs, l'équipe des Inventeurs a précédemment obtenu une souris transgénique, dénommée F28, qui exprime des récepteurs ss2-adrénergiques humains (Hss2-ARs) fonctionnels [ANDRE et al., Eur. J. Biochem., 241, pp. 417-424 (1996)]. Chez la souris F28, les Hss2-ARs sont exprimés dans le muscle, le codeur, le cerveau, le poumon, et surtout dans le foie, où le niveau d'expression est très élevé. L'expression des ss2-ARs dans le foie des souris F28 est plus proche de celle observée chez l'homme que de celle observée chez la souris normale. Les Inventeurs ont maintenant constaté que lorsque des anticorps anti-Fas étaient administrés aux souris transgéniques F28, celles-ci survivaient à cette administration, et que leur foie ne présentait que peu de foyers apoptotiques, alors que chez les souris normales, des anticorps anti-Fas administrés dans les mêmes conditions provoquaient une apoptose massive des hépatocytes, et la mort des animaux. Les Inventeurs ont alors émis l'hypothèse d'une relation entre l'augmentation du nombre de ss2-ARs dans les cellules hépatiques des souris F28, et la résistance de celles-ci à l'apoptose ; ils ont alors également recherché si cette résistance pouvait être corrélée à une augmentation de l'activité ss2-adrénergique hépatique. D'autre part, certaines observations ont montré que l'activation de l'adénylyl cyclase et/ou la stimulation de la voie de signalisation par l'AMP cyclique (AMPc) stimulent l'apoptose dans, par exemple, les thymocytes [KIZAKI et al., Cytokine, 5, pp. 342-347, (1993) ; MENTZ et al., Eur. J. Immunol., 25, pp. 1798-1801, (1995)] , les cellules granulaires [AHARONI et al., Exp. Cell. Res., 218, pp. 271-282, (1995)] et les cellules B [LOMO et al., J. Immunol., 154, pp. 1634-1643,(1995) BAIXERAS et al., Scand. J. Immunol., 43, pp. 406-412, (1996)], mais en revanche, l'inhibent dans, par exemple, des hybridomes de cellules T [LEE et al., J. Immunol., 151, PP. 5208-5217, (1993) HOSHI et al., Int. Immunol. 6, pp. 1081-1089, (1994)], des neutrophiles humains [ROSSI et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, pp. 892-899, (1995)] des cellules de carcinome mammaire MCF-7 [BOE et al., Br. J. Cancer, 72, pp. 1151-1159, (1995)] et des cellules dérivées de moelle épinière [BERRIDGE et al., Exp. Hematol., 21, pp. 269-276, (1993)]. I1 est d'autre part connu que les ss2-ARs interviennent dans la stimulation de la voie de signalisation par 1'AMPc. Pour déterminer l'importance du rôle éventuel de l'activité ss2-adrénergique hépatique dans la résistance à l'apoptose, les Inventeurs ont administré un agoniste des ss2-ARs, à des souris normales, et ont constaté qu'elles survivaient à l'injection d'anticorps anti-Fas, et étaient protégées contre l'apoptose hépatique induite par ces anticorps. Ils ont en outre constate qu'en revanche, l'administration aux souris d'un antagoniste des ss2-ARs inhibait la résistance à l'apoptose des souris F28, ou celle des souris normales traitées par l'agoniste des B2-ARs. Ces résultats montrent donc que la régulation ss-adrénergique joue un rôle majeur dans le contrôle physiologique du processus d'apoptose in vivo. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un modulateur ss-adrénergique pour l'obtention d'un médicament régulateur de l'apoptose cellulaire. La localisation des 13-ARs dans différents tissus est connue. Les récepteurs Bl-adrénergiques (P1-ARs) et/ou ss2-adrénergiques (ss2-ARs) sont présents dans de nombreux tissus comme, par exemple, le coeur, le rein, le poumon, le foie, le cerveau, le tissu adipeux, les muscles lisses et striés, les cellules du système immunitaire etc. Les récepteurs 133-adrénergiques (ou ss3-ARs), qui sont présents en quantité moins importante que les précédents, ont été détectés dans le colon, le coeur, le rein, le poumon, le foie, le cerveau, le muscle, et en particulier dans le tissu adipeux. Un quatrième type de 13-AR a été décrit récemment dans le coeur humain [KAUMANN et MOLENAAR, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 355(6), pp. 667-681, (1997) ; KAUMANN et LYNHAM, Br. J. Pharmacol., 120(7), pp. 1187-1189, (1997)]- Les modulateurs de l'activité ss-adrénergique utilisables conformément à la présente invention, comprennent en particulier les agonistes et les antagonistes des ss-ARs. Certains agonistes ou antagonistes ss-adrénergiques sont communs à plusieurs types de 13-ARs par exemple les 131-ARs et les B2-ARs ont l'isoprotérénol pour agoniste et le propanolol pour antagoniste. D'autres agonistes ou antagonistes sont spécifiques d'un type de récepteur déterminé. Des agonistes spécifiques des 131-ARs sont par exemple le xamotérol et le prénaltérol ; des antagonistes spécifiques des 131-ARs sont par exemple le CGP20,712A et le practolol, des agonistes spécifiques des ss2-ARs sont par exemple le clenbutérol, le salbutamol, et le procatérol ; des antagonistes spécifiques des ss2-ARs sont par exemple 1'ICI 118,551 et la butoxamine [BILSKI et al., Br. J. Pharmacol., 69, 292P, (1980) ; DOOLEY et BITTIGER, J. Pharmacol. Meth., 18, pp. 131-136, (1987) STROSBERG, Recombinant Cell Surface Receptors : Focal Point for Therapeutic Intervention, ed. M.Y. Browne, 57-76 (1996), R.G. Landes Company] ; des agonistes spécifiques des ss3-ARs sont par exemple le CL316,243 et le BRL 37,344 ; un antagoniste spécifique des ss3-ARs est par exemple le SR59,230A [KAUMANN et MOLENAAR, Br. J. Pharmacol., 118(8), pp. 2085-2098, (1996)]. Selon le type du tissu dans lequel on souhaite réguler l'apoptose, et selon le type de régulation que l'on souhaite obtenir, à savoir une régulation positive entraînant une augmentation de l'apoptose, ou une régulation négative entraînant une diminution de l'apoptose, on choisira un agoniste ou un antagoniste des 131-ARs, des B2-ARs ou des ss3-ARs. Par exemple Dans le foie, pour inhiber l'apoptose cellulaire, par exemple dans le cadre du traitement des hépatites, on utilisera un agoniste des ss2-ARs ; au contraire, si l'on souhaite stimuler l'apoptose, par exemple pour détruire des cellules cancéreuses, on utilisera un antagoniste des ss2-ARs. Dans le poumon, si on souhaite stimuler l'apoptose de, par exemple, les cellules cancéreuses dans le cas d'adénocarcinomes, on utilisera des antagonistes des pl- et/ou ss2-ARs. Dans le coeur, pour inhiber l'apoptose cellulaire dans le cadre du traitement d'ischémies cardiaques, on utilisera un agoniste des pl- et/ou ss2-ARs. Dans le cerveau, on pourra par la même approche diminuer l'apoptose excessive observée dans les maladies neurodégénératives, ou au contraire stimuler l'apoptose dans le cas de cancers. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non limitatifs illustrant la mise en évidence du rôle des ss2-ARs dans la prévention de l'apoptose hépatique, et l'utilisation d'un agoniste ss2-ARs, le clenbutérol, pour inhiber cette apoptose. EXEMPLE 1 : MISE EN EVIDENCE DE LA RESISTANCE DES SOURIS F28 A L'APOPTOSE HEPATIQUE ET DE L'EFFET PROTECTEUR DU CLENBUTEROL. Dans une première série d'expérimentations, effectuées sur des groupes de 3 à 4 animaux, 12 souris transgéniques F28 (décrites par ANDRE et al., [Eur. J. Biochem., 241, pp. 417-424 (1996)], et 10 souris contrôle C57B1/6 (fournies par IFFA CREDO Lyon, France), ont reçu, par injection intra-veineuse, 15 pg d'un anticorps monoclonal anti-Fas (anticorps Jo2 PHARMINGEN) dilués dans 200 pl de sérum physiologique. Dans une seconde série d'expérimentations, effectuées également sur des groupes de 3 à 4 animaux, 12 souris F28, et 10 souris C57B1/6 ont reçu préalablement un traitement par le clenbutérol, administré par voie orale (par addition de 1,3 mg/l à l'eau de boisson) 17 heures avant l'injection intraveineuse de l'anticorps monoclonal anti-Fas. Le pourcentage des souris survivantes dans chaque lot, en fonction du temps (en heures) après l'injection de l'anticorps monoclonal anti-Fas est illustré par la figure 1. Légende de la figure 1 - souris C57B1/6 non-traitées au clenbutérol = - souris C57B1/6 traitées au clenbutérol = O - souris F28 non-traitées au clenbutérol = z - souris F28 traitées au clenbutérol = X. Ces résultats montrent qu'en l'absence de prétraitement au clenbutérol, la totalité des souris F28 survit à l'injection de l'anticorps anti-Fas, alors que la plupart des souris contrôle sont mortes dans les 5 heures suivant l'injection, et aucune ne survit plus de 24 heures. Après traitement au clenbutérol, la plupart des souris contrôle survivent à l'injection de l'anticorps anti-Fas ; ce traitement ne modifie pas la survie des souris F28. Dans chacun des groupes, les foies de quelques animaux ont été prélevés, pour effectuer une étude histologique. Dans le cas des animaux non-traités au clenbutérol, on observe, chez les souris contrôle, des lésions hémorragiques et une apoptose massive ; chez les souris F28 on n'observe que quelques rares foyers apoptotiques. Dans le cas des animaux traités au clenbutérol, on observe chez les souris contrôle traitées beaucoup moins de foyers apoptotiques que chez les souris contrôle non traitées. Aucune lésion apoptotique n'est visible chez les souris F28 traitées. EXEMPLE 2 : INHIBITION PAR LE PROPANOLOL DE LA PROTECTION CONFEREE PAR LE CLENBUTEROL - MISE EN EVIDENCE D'UN EFFET DOSE-DEPENDANT DU CLENBUTEROL. Afin de vérifier que la protection conférée par le clenbutérol faisait bien intervenir les ss-ARs, des expérimentations ont été effectuées en présence de l'antagoniste ss-adrénergique propanolol. Des souris C57BL/6 réparties en 5 lots de 3, ont reçu les traitements suivants Lot 1 : injection intra-veineuse de 15 pg d'anticorps monoclonal anti-Fas Jo2, sans prétraitement Lot 2 : injection intra-veineuse de 15 pg d'anticorps monoclonal anti-Fas Jo2, après 18 heures de traitement avec 1,3 mg/l de clenbutérol Lot 3 : injection intra-veineuse de 15 pg d'anticorps monoclonal anti-Fas Jo2, après un prétraitement de 48 heures avec 7 mg/l de propranolol et 17 heures avec 7 mg/l de propranolol plus 1,3 mg/l de clenbutérol Lot 4 : injection d'anticorps monoclonal anti Fas Jo2, après 18 heures de traitement avec 2,6 mg/l de clenbutéroî Lot 5 : injection d'anticorps monoclonal anti Fas Jo2, après un prétraitement de 48 heures avec 7 mg/l de propranolol et 18 heures avec 7 mg/l de propranolol plus 2,6 mg/l de clenbutérol. L'injection de l'anticorps monoclonal anti-Fas et le prétraitement par le clenbutérol sont effectués comme décrit pour l'exemple 1 ci-dessus. Le propanolol est administré, comme le clenbutérol, par voie orale par ajout à l'eau de boisson. Le pourcentage des souris survivantes dans chaque lot, en fonction du temps (en minutes) après l'injection de l'anticorps monoclonal anti-Fas est illustré par les figures 2a et 2b. Légende de la figure 2a Lot 1 : N Lot 2 : Lot 3 : O Légende de la figure 2b Lot 1 : N Lot 4 : Lot 5 : O Ces résultats montrent que la protection conférée par le clenbutérol peut être inhibée par le propranolol (totalement pour une dose de clenbutérol de 1,3 mg/l, et partiellement pour une dose de clenbutérol de 2,6 mg/l). En outre, la comparaison des résultats de la figure 2a avec ceux de la figure 2b montre que la protection conférée par le clenbutérol est dosedépendante. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un modulateur ss-adrénergique pour l'obtention d'un médicament régulateur de l'apoptose cellulaire. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit modulateur ss-adrénergique est un agoniste ss-adrénergique. 3) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit modulateur ss-adrénergique est un antagoniste ss-adrénergique. 4) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit modulateur ss-adrénergique est spécifique des récepteurs 131-AR. 5) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit modulateur ss-adrénergique est spécifique des récepteurs B2-AR. 6) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit modulateur ss-adrénergique est spécifique des récepteurs ss3-AR. 7) Utilisation selon une quelconque des revendications 1, 2 ou 5, caractérisée en ce que l'on utilise un agoniste des récepteurs ss2-AR pour l'obtention d'un médicament inhibiteur de l'apoptose cellulaire hépatique.