FR 2786771 A1 20000609 FR 9915256 A 19991203 Procédé de stabilisation d'un macrolide poly-ène et composition pharmaceutique contenant un tel composé La présente invention concerne la stabilisation d'un composant pharmaceutiquement actif sensible à l'oxydation, par exemple d'un macrolide poly-ène, de préférence d'un macrolide poly-ène ayant des propriétés immunosuppressives, en particulier de rapamycines. La manipulation et le stockage, en particulier en vrac, de composants pharmaceutiquement actifs qui sont sensibles à l'oxydation, sont difficiles. Une manipulation spéciale est nécessaire, et le composant sensible à l'oxydation est fréquemment stocké en conditionnement étanche à l'air, sous gaz protecteur. D'importantes quantités de stabilisants sont ajoutés pendant la mise en forme de tels composants pharmaceutiquement actifs. Les macrolides poly-ènes ont des propriétés de stabilité satisfaisantes. Toutefois, on a constaté à présent que leur stabilité vis-à-vis de l'oxygène pouvait être nettement améliorée par l'addition d'un stabilisant, par exemple un antioxydant, pendant l'étape de leur isolement. La présente invention concerne: 1. Un procédé pour la stabilisation d'un macrolide poly- ène, comprenant l'addition d'un antioxydant au macro- lide purifié, de préférence au début de l'étape de son isolement. Ce procédé est particulièrement utile pour la pro- duction d'un macrolide poly-ène stabilisé en vrac. La quantité d'antioxydant peut aller convenablement jus- qu'à 1 %, encore mieux de 0,01 à 0,5 % (par rapport au poids du macrolide). Une quantité aussi faible est dénommée ci-après quantité catalytique. La présente invention fournit également: 2. Un mélange, par exemple un mélange en vrac, de préfé- rence sous forme solide, comprenant un macrolide poly- ène et un antioxydant, de préférence une quantité cata- lytique de celui-ci. Le mélange peut être sous forme particulaire, par exemple sous forme cristallisée ou amorphe. Il peut en outre être en un état stérile ou pratiquement stérile, par exemple en un état approprié à l'utilisation phar- maceutique. 3. L'utilisation d'un mélange tel que défini ci-dessus en 2, dans la fabrication d'une composition pharmaceu- tique. Comme exemples de macrolides poly-ènes, on peut citer des molécules comprenant des doubles liaisons, de préférence des doubles liaisons conjuguées, par exemple celles ayant des propriétés antibiotiques et/ou immunosuppressives, par exemple des macrolides comprenant une liaison lactame ou lactone et leurs dérivés, par exemple des composés ayant une activité biologique qualitativement semblable à celle du macrolide naturel, par exemple des macrolides substitués chimiquement. Comme exemples convenables, on peut citer les rapamycines et les ascomycines. Un macrolide préféré est un macrolide comprenant au moins deux doubles liaisons conjuguées, par exemple trois doubles liaisons conjuguées. La rapamycine est un macrolide de type lactame qui peut être produit, par exemple, par Streptomyces hygroscopicus. La structure de la rapamycine est donnée par Kessler H. et coll., 1993, Helv. Chim. Acta 76:117. La rapamycine a des propriétés antibiotiques et immunosuppressives. On connaît des dérivés de la rapamycine, par exemple des rapamycines 16-0-substituées, par exemple telles que décrites dans WO 94/0236 et WO 96/41807 ; rapamycines 40-0-substituées, par exemple telles que décrites dans WO 94/09010, WO 92/05179, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 94/02385 et WO 96/13273, qui sont tous incorporés ici par référence. Les dérivés de rapamycine qui sont préférés sont par exemple les rapamycines dans lesquelles le groupe hydroxyle en position 40 de la formule A, représentée page 1 de WO 94/09010, est remplacé par-OR, R étant un groupe hydroxyalkyle, hydroxyalcoxyalkyle, acylaminoalkyle ou aminoalkyle, par exemple, la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine, la 40-0-(3-hydroxy)propylrapamycine et la 40-0-[2-(2-hydroxy)éthoxy]éthylrapamycine. Les ascomycines, parmi lesquelles FK506 et l'ascomycine sont les mieux connues, constituent une autre classe de macrolides de type lactame, dont de nombreux ont une forte activité immunosuppressive et antiinflammatoire. FK506 est un macrolide de type lactame produit par Streptomyces tsukubaensis. La structure de FK506 est donnée dans l'appendice du Merck Index, 11e édition (1989) en tant que composé A5. L'ascomycine est décrite, par exemple, dans US-A-3 244 392. L'ascomycine, FK506 et d'autres macrolides existant dans la nature, ayant une activité biologique similaire, et leurs dérivés, par exemple des analogues et dérivés synthétiques, sont dénommés collectivement "ascomycines". Comme exemples d'analogues ou de dérivés synthétiques, on peut citer les ascomycines halogénées, par exemple la 33-épi-chloro-33désoxyascomycine, telle que décrite dans EP-A-427 680, et des dérivés tétrahydropyranne, par exemple tels que décrits dans EP-A-626 385. Les macrolides particulièrement préférés sont la rapamycine et la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine. Les antioxydants préférés sont par exemple le 2,6di-tert-butyl-4-méthylphénol (désigné ci-après par l'abréviation BHT), la vitamine E ou C, le BHT étant particulièrement préféré. Un mélange particulièrement préféré de l'invention est un mélange de rapamycine ou 40-0-(2-hydroxy)éthyl- rapamycine et 0,2 % (par rapport au poids du macrolide) d'un antioxydant, le BHT de préférence. L'antioxydant peut être ajouté au macrolide poly- ène au début des étapes d'isolement, de préférence à l'étape finale d'isolement, encore mieux juste avant l'étape de précipitation finale. Le macrolide est de préférence en un état purifié. Il peut être dissous dans un solvant inerte, et l'antioxydant est ajouté à la solution résultante, puis on effectue une étape de précipitation du macrolide stabilisé, par exemple à l'état amorphe ou sous forme de cristaux. Le mélange de l'invention est de préférence à l'état amorphe. Le macrolide stabilisé résultant manifeste de façon inattendue une stabilité améliorée vis-à-vis de l'oxydation, et sa manipulation et son stockage, par exemple en vrac, avant d'être mis par exemple sous forme d'une composition galénique, deviennent plus aisés. La stabilisation est particulièrement intéressante pour les macrolides à l'état amorphe. Le macrolide stabilisé selon l'invention peut être utilisé tel quel pour la production de la forme galénique désirée. De telles formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon des méthodes connues,dans la technique, comprenant l'addition d'un ou plusieurs diluants ou véhicules pharmaceutiquement acceptables, et comprenant, si on le désire, l'addition d'un autre stabilisant. En conséquence, l'invention concerne également: 4. Une composition pharmaceutique comprenant, en tant que composant actif, un mélange stabilisé tel que décrit ci-dessus, conjointement avec un ou plusieurs diluants ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. La composition de l'invention peut être destinée à l'administration orale, parentérale, locale (par exemple sur la peau), oculaire, nasale ou par inhala- tion (par exemple pulmonaire). Une composition préférée est une composition pour administration orale, de pré- férence une composition anhydre lorsque le composant actif est un macrolide de type lactone. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent comprendre d'autres excipients, par exemple un lubrifiant, un désintégrant, un tensioactif, un véhicule, un diluant, un aromatisant, etc. Elles peuvent être sous forme liquide, par exemple sous forme de solutions, suspensions ou émulsions, telle que des microémulsions, par exemple comme décrit dans US-A-5 536 729, ou sous forme solide, par exemple de gélules, comprimés, dragées, poudres (y compris des compositions particulaires micronisées ou à taille de particules réduite d'une autre façon), dispersions solides, produits granulés, etc., par exemple comme décrit dans WO 97/03654, dont le contenu est incorporé ici par référence, ou sous des formes semisolides telle que des pommades, gels, crèmes et pâtes. Elles sont de préférence adaptées à être sous une forme appropriée à l'administration orale. Elles sont de préférence sous forme solide. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être préparées selon des méthodes connues, par mélange du macrolide stabilisé selon l'invention avec les composants supplémentaires, sous agitation; les composants peuvent être broyés et, si on le désire, tassés, par exemple en comprimés. La présente invention offre un intérêt particulier pour des compositions de rapamycine sous forme liquide ou solide. Une composition particulièrement préférée est une dispersion solide, par exemple, comprenant une rapamycine stabilisée selon l'invention et un véhicule, par exemple un polymère soluble dans l'eau, tel que l'hydroxypropylméthylcellulose, par exemple comme décrit dans WO 97/03654. Les compositions de l'invention sont utiles pour les indications telles qu'elles sont connues pour le macrolide qu'elles contiennent, par exemple aux doses connues. Par exemple, lorsque le macrolide a des propriétés immunosuppressives, par exemple la rapamycine ou un dérivé de rapamycine, la composition peut être utile, par exemple, dans le traitement ou la prévention de rejet aigu ou chronique d'allogreffe ou de xénogreffe de tissus ou d'organes, des maladies auto-immunes ou des états inflammatoires, l'asthme, des troubles proliférants, par exemple des tumeurs, ou des troubles vasculaires hyperproliférants, de préférence dans la prévention ou le traitement du rejet de greffe. La quantité du macrolide et de la composition à administrer est fonction d'un certain nombre de facteurs, par exemple du composant actif utilisé, de l'état à traiter, de la durée du traitement, etc. Par exemple, pour la rapamycine ou la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine, une dose journalière appropriée pour l'administration orale va de 0,1 à 10 mg, administrée en une fois ou en doses fragmentées. Sous un autre aspect, la présente invention fournit également de la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous une forme cristalline, en particulier sous une forme pratiquement pure. La forme cristalline est caractérisée de préférence par l'absence ou pratiquement ,1'absence de tout com- posant de type solvant ; ne s'agit pas d'un produit de solvatation. La 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline appartient au système monoclinique. Les cristaux résultants ont un point de fusion de 146-147 C, en particulier de 146,5 C. Pour faciliter l'identification de la nouvelle forme cristalline, on fournit des données de l'analyse par diffraction des rayons X. Les conditions dans lesquelles ces données sont obtenues sont les suivantes : Température 293(2) K Longueur d'onde 1,54178 Groupe espaceur P21 Dimensions de la maille élémentaire a 14,378(2) Â b 11,244(1) Â c 18,310(2) Â ss 108,58(1) Volume 2 805,8(6) Â 3 Z 2 Densité (calculé) 1,134 g/cm3 Coefficient d'absorption 0,659 mm F(OOO) 1 040 Taille du cristal 0,59 x 0,11 x 0,03 mm Intervalle e pour la collecte de données 2,55 à 57,20 Réflexions recueillies 4 182 Réflexions indépendantes 4 037 [R(int) = 0,0341] Diminution de l'intensité 32 % Méthode d'affinement matricielle totale des moindres carrés sur F Données/restrictions/paramètres 3134/1/613 Validité de l'ajustement sur F2 1,055 Indices R finals [1 > 2 sigma(I)] R1 = 0,0574, wR2 = 0,1456 Pic et lacune maximaux de diffraction 0,340 et -0,184 e/Â3 La 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline peut être préparée par dissolution du composé amorphe dans un solvant, l'acétate d'éthyle par exemple, et addition d'un hydrocarbure aliphatique CnH2n+2 (n = 5, 6 ou 7). Après addition de l'hydrocarbure, on peut chauffer le mélange résultant, par exemple, à une température de 25 à 50 C, par exemple jusqu'à 30-35 C. Le stockage du mélange résultant peut s'effectuer convenablement à basse température, par exemple au-dessous de 25 C, de préférence à une température de 0 à 25 C. Les cristaux sont séparés par filtration et séchés. L'heptane est préféré en tant qu'hydrocarbure aliphatique. Si on le désire, on peut déclencher des processus de nucléation, par exemple, par sonication ou ensemencement. La présente invention fournit également un procédé de purification de la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine, comprenant la cristallisation de 40-0-(2-hydroxy)éthyl- rapamycine à partir d'un milieu engendrant des cristaux, par exemple comme décrit plus haut, et la récupération des cristaux ainsi obtenus. Le milieu engendrant des cristaux peut comprendre un ou plusieurs composants, en plus de ceux indiqués plus haut. Un milieu engendrant des cristaux qui est particulièrement approprié s'est révélé être un milieu comprenant environ 2 parties d'acétate d'éthyle et environ 5 parties d'un hydrocarbure aliphatique, l'heptane par exemple. La 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline s'est révélée avoir in vitro et in vivo une activité immunosuppressive comparable à celle de la forme amorphe. Dans la réaction localisée du greffon contre l'hôte, une dose de 3 mg de 40-0-(2-hydroxy)éthyl- rapamycine sous forme cristalline permet d'atteindre une inhibition maximale (70-80 %) du gonflement des ganglions lymphatiques. La 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine peut être utile pour les mêmes indications que celles connues pour le composé amorphe, par exemple pour prévenir ou traiter le rejet aigu et le rejet chronique d'allogreffe ou de xénogreffe, des maladies auto-immunes ou des états inflammatoires, l'asthme, des troubles proliférants, par exemple des tumeurs, ou des troubles vasculaires hyperproliférants, par exemple comme décrit dans WO 94/09010 ou dans WO 97/35575, dont les contenus sont incorporés ici par référence. En général, on obtient des résultats satisfaisants dans l'administration orale à des doses de l'ordre de 0,05 ou jusqu'à 70 mg/kg/jour, par exemple de l'ordre de 0,1 à 2 ou jusqu'à 7,5 mg/kg/jour, administrées en une fois ou en doses fragmentées, à raison de deux à quatre fois par jour. Des doses journalières appropriées pour des patients sont donc de l'ordre de 10 mg au maximum, par exemple de 0,1 à 10 mg. La 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline peut être administrée par une voie classique quelconque, par exemple par voie orale, par exemple sous forme de comprimés ou de gélules, ou par voie nasale ou pulmonaire (par inhalation). Elle peut être administrée en tant que seul composant actif ou conjointement avec d'autres principes actifs, par exemple des agents immunosuppresseurs et/ou immunomodulateurs et/ou antiinflammatoires, par exemple comme décrit dans WO 94/09010. En conséquence, la présente invention fournit également : 5. Un procédé pour la prévention ou le traitement de rejet aigu ou chronique d'allogreffe ou de xénogreffe, de maladies auto-immunes ou d'états inflammatoires, de l'asthme, de troubles proliférants ou de troubles vas- culaires hyperproliférants, chez un sujet nécessitant un tel traitement, lequel procédé,comprend l'adminis- tration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline ; 6. de la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cris- talline, pour utilisation en tant qu'agent pharmaceu- tique ; par exemple dans un procédé tel qu'indiqué plus haut; 7. une composition pharmaceutique comprenant de la 40-0- (2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline, con- jointement avec un véhicule ou diluant pharmaceutique- ment acceptable pour celle-ci; 8. un nécessaire ou conditionnement pour utilisation dans l'immunosuppression ou l'inflammation, comprenant une composition pharmaceutique telle que décrite plus haut et une composition pharmaceutique comprenant un prin- cipe actif immunosuppresseur ou immunomodulateur, ou un agent anti-inflammatoire. La présente invention est illustrée plus en détail à l'aide des exemples descriptifs et non limitatifs ciaprès. Exemple 1 Cristallisation On dissout 0,5 g de 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine amorphe dans 2,0 ml d'acétate d'éthyle à 40 C. On y ajoute 5,0 ml d'heptane, et la solution devient "laiteuse". Après avoir chauffé la solution à 30 C, elle se clarifie de nouveau. Après refroidissement jusqu'à 0 C et avec grattage, une huile se sépare en précipitant de la solution. Le tube à essai est bouché et conservé à 10 C pendant une nuit. Le solide volumineux blanc résultant est ensuite séparé par filtration et lavé avec 0,5 ml d'un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane (1: 2,5), et les cristaux résultants sont séchés à 40 C sous 5 mbars pendant 16 heures. On obtient ainsi de la 40-0-(2-hydroxy)thylrapamycine sous forme cristalline, ayant un PF de 146,5 C. La cristallisation à une plus grande échelle peut être effectuée comme suit : dissout 250 g de 40-0-(2- hydroxy)éthylrapamycine amorphe dans 1,0 1 d'acétate d'éthyle, sous argon, avec lente agitation. On chauffe cette solution à 30 C et on y ajoute ensuite goutte à goutte, en l'espace de 45 minutes, 1,5 1 d'heptane. On y ajoute par portions, dans les mêmes conditions, 0,25 g de cristaux d'ensemencement préparés comme décrit plus haut. On agite encore le mélange à 30 C pendant 2 heures, et on refroidit le mélange de cristallisation jusqu'à 25 C en l'espace de 1 heure et ensuite jusqu'à 10 C pendant 30 minutes, puis on le filtre. On lave les cristaux avec 100 ml d'un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane (2: 3). Le séchage ultérieur est effectué à 50 C et sous environ 5 mbars. PF: 146,5 C. Spectre IR (KBr): 3452,2931, 1746,1717, 1617,1453, 1376, 1241,1191, 1163,1094, 1072,1010, 985, 896 cm-1. La structure indiduelle aux rayons X, avec les coordonnées, est indiquée sur les figures 1 à 3 ci-annexées. Exemple 2 Préparation de 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine stabilisée On dissout 100 g de 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine dans 600 ml d'éthanol absolu. Après addition de 0,2 g de BHT, on verse goutte à goutte la solution résultante, sous agitation, dans 3,0 1 d'eau, en l'espace de 1 heure. La suspension résultante est agitée pendant encore 30 minutes. Après filtration avec lavage subséquent (3 x 200 ml d'un mélange d'éthanol et d'eau 5 :1 v/v), on obtient un produit blanc humide, qui est séché davantage sous vide (1 mbar) à 30 C pendant 48 heures. Le produit séché résultant contient 0,2 % (p/p) de BHT. Le produit résultant présente une stabilité améliorée au stockage. La somme des sous-produits et produits de dégradation, en pourcentage, est comme suit: Composé 50 C en flacon ouvert Exemple 1 (0,2 % de BHT) 1,49 Sans BHT > 10 On peut répéter le mode opératoire de l'exemple cidessus, mais en utilisant de la rapamycine comme composant actif. REVENDICATIONS 1. Procédé de stabilisation d'un macrolide poly- ène, comprenant l'addition d'un antioxydant au macrolide purifié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antioxydant est ajouté en une proportion allant jusqu'à 1 %, par rapport au poids du macrolide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'antioxydant est le 2,6-di-tert-butyl-4méthylphénol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le macrolide poly-ène est la rapamycine ou la 40-0-(2(hydroxy)éthylrapamycine. 5. Mélange sous forme solide, comprenant un macrolide poly-ène et un antioxydant. 6. Mélange selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'antioxydant est présent en une proportion allant jusqu'à 1 %, par rapport au poids du macrolide. 7. Mélange selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'antioxydant est présent en une proportion de 0,2 %, par rapport au poids du macrolide. 8. Mélange selon la revendication 5,6 ou 7, caractérisé en ce que l'antioxydant est le 2,6-di-tertbutyl-4-méthylphénol. 9. Mélange selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le macrolide poly-ène est la rapamycine ou la 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine. 10. Composition pharmaceutique comprenant, en tant que composant actif, un mélange selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, conjointement avec un ou plusieurs véhicules ou diluants pharmaceutiquement acceptables. 11. 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine sous forme cristalline. 12. Composé selon la revendication 11, sous forme cristalline qui n'est pas un produit de solvatation. 13. Composé selon la revendication 11 ou 12, ayant un réseau cristallin a = 14,37 Â, b = 11,24 , c = 18,31 , le volume étant égal à 2805 3. 14. Composition pharmaceutique, comprenant un composé selon la revendication 11 ou 12, conjointement avec un ou plusieurs diluants ou véhicules pharmaceutiquement acceptables pour celui-ci. 15. Procédé de purification de la 40-0-(2hydroxy) éthylrapamycine, comprenant la cristallisation de 40-0-(2-hydroxy)éthylrapamycine à partir d'un milieu engendrant des cristaux, et la récupération des cristaux ainsi obtenus.