FR 2768749 A1 19990326 FR 9711772 A 19970922 VIRUS ARTIFICIELS DÉRIVES DE PAPILLOMAVIRUS, ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT EN THÉRAPIE GÉNIQUE. La présente invention a pour objet des virus artificiels (ou pseudovirus) dérivés de papillomavirus humains ou animaux, ainsi que leurs procédés d'obtention, et leurs utilisations, notamment dans des compositions pharmaceutiques dans le cadre de thérapies géniques, ou pour la détection d'anticorps neutralisant les papillomavirus. L'efficacité, la spécificité et l'innocuité des systèmes de vecteurs utilisés pour le transfert de gènes, sont des facteurs importants en vue de leurs applications chez l'homme, notamment dans le cadre de la thérapie génique ou de l'immunisation par l'ADN. Les techniques classiques pour le transfert de plasmides à l'intérieur des cellules eucaryotes, sont essentiellement celles utilisant les liposomes (Felgner et al., 1987 Felgner and Ringold, 1989) susceptibles de contenir des peptides de fusion d'origine virale, ou utilisant des virus entiers afin de faciliter le relargage de l'ADN dans le cytoplasme (Kamata et al. 1994 ; Wagner et al., 1994). Les virus représentent actuellement le plus efficace système naturel de transfert de gènes (II). Les adénovirus (Berkner, 1992 ; Kozarsky and Wilson, 1993 ; Kremer and Perricaudet, 1995), les virus associés aux adénovirus (Kremer and Perricaudet, 1995 Kotin, 1994 ; Fisher et al., 1997), le virus Epstein-Barr (Banerjee et al., 1995) et les rétrovirus (Miller, 1992 ; Danos and Mulligan, 1988 ; Naldini et al., 1996), ont été modifiés pour transporter des gènes d' intérêt thérapeutique et pour intégrer leur propre génome à l'intérieur de cellules cibles. L'utilisation de vecteurs viraux pose cependant des problèmes, notamment la production possible de virus capables de se répliquer dans le cas où se produit une recombinaison avec des virus sauvages présents dans les cellules cibles, l'inactivation des vecteurs par des anticorps neutralisant préexistants dirigés contre ces virus dans l'organisme hôte, et la réponse immunologique induite par le virus (Gahëry-Ségard et al., 1997 ; Juillard et al., 1995). Durant les dix dernières années, il a été montré que les protéines de structure de nombreux virus sont capables de s'auto-assembler en pseudo-particules virales (encore désignées ci-après par l'expression VLPs) lorsqu'elles sont exprimées dans des systèmes d'expression eucaryotes ou procaryotes. Les papillomavirus sont des membres de la famille des papovaviridae. Ce sont des virus à ADN non enveloppés, qui infectent les humains ainsi que certains animaux. La capside du papillomavirus est constituée de deux protéines, L1 et L2. L1 est la protéine majeure de capside, et a déjà été décrite comme étant capable de s'auto-assembler en VLPs. Des VLPs ont été obtenues par transformation de cellules de hamster, porteuses de génomes de papillomavirus bovin de type I (BPVI) capables de se répliquer de façon autonome, avec des virus de la forêt de Semliki (SVF) recombinants exprimant les protéines de structure de BPVI (Roden et al., 1996). Selon les auteurs de cet article, la protéine L1 exprimée par les SVF recombinants, est capable de s'autoassembler en VLPs. Toutefois, de l'ADN viral n'a pu être détecté que dans les VLPs résultant de la co-expression de L1 et L2, ce qui, toujours selon ces mêmes auteurs, indique que l'encapsidation d'ADN à l'intérieur des VLPs, ne peut avoir lieu que si ces VLPs sont constituées à la fois de L1 et L2. Le but du travail décrit dans cet article de Roden et al., est celui de l'obtention de particules infectieuses de papillomavirus humain (HPV) capables d'infecter des cellules de souris, et d'étudier la possibilité de neutraliser cette infection par des anticorps. Ainsi, les auteurs de cet article ont préparé des VLPs d'HPV type 16 ayant encapsidé le génome du BPV selon un procédé qui a la caractéristique d'être intracellulaire, puisque ce procédé, décrit ci-dessus, est effectué dans des cellules de hamster contenant le génome de BPV et transformées par des SVF exprimant les protéines L1 et L2 d'HPV-16. Des VLPs constituées de la protéine L1 de papillomavirus humain de type 11 (HPV-1 1), ont été obtenues par transformation de bactéries E. coli avec des plasmides contenant la séquence codant la protéine L1 (Li et al., 1997). Les auteurs de cet article, ont constaté que ces VLPs obtenues par transformation d'E.coli sont très difficiles à désassembler. Des VLPs constituées de la protéine L1, et des VLPs constituées des protéines L1 et L2, des papillomavirus humains de type 33 (HPV-33), ont été obtenues par un procédé intracellulaire comprenant la cotransformation de cellules Cos-7 d'une part avec un plasmide marqueur codant pour la ss-galactosidase et, d'autre part, avec le virus de la vaccine en tant que vecteur contenant la séquence codant pour L1, ou celles codant pour L1 et L2 (Unckell et al., 1997). Le taux de l'encapsidation par la méthode intracellulaire susmentionnée, du plasmide contenant la séquence codant pour la ,B-galactosidase, est très faible, puisque seulement 1 VLP sur 25.000 porte ce plasmide. Par ailleurs, le taux d'infection des cellules Cos-7 par les VLPs porteurs dudit plasmide est également très faible, puisque seulement 1 sur 2.000 VLPs porteuses du plasmide est capable d'infecter une cellule Cos-7. Enfin, les auteurs de cet article insistent sur le caractère essentiel de la protéine L2 dans le cadre de l'infection des cellules par les VLPs. Compte tenu des faibles taux d'intégration d'ADN plasmidique dans les VLPs, et d'infection de cellules par ces VLPs, les auteurs de cet article n'ont en aucun cas fait part de la possibilité d'utiliser de telles VLPs en tant que vecteurs de transfert de gènes, et se sont focalisés sur leur utilisation possible dans le cadre de la détection d'anticorps neutralisant contre les infections des papillomavirus. La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs que les VLPs de papillomavirus sont capables d'intégrer de l'ADN plasmidique avec un taux d'encapsidation bien supérieur à ceux décrits ci-dessus, dans la mesure où cette encapsidation est effectuée par un procédé extracellulaire (c'est-à-dire qui n'est pas effectué à l'intérieur de cellules hôtes), notamment par désassemblage-réassemblage in vitro de ces VLPs en présence de plasmide. De plus, les Inventeurs ont également mis en évidence que les taux d'infection de cellules par des VLPs porteurs d'ADN plasmidique obtenus selon le procédé extracellulaire d'encapsidation indiqué ci-dessus, sont bien supérieurs à ceux décrits dans l'art antérieur susmentionné, et ce même lorsque lesdites VLPs sont constituées de la seule protéine L1. Un des buts de la présente invention est de fournir de nouveaux vecteurs de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles, notamment dans le cadre de la thérapie génique, ou de 1' immunisation génique, ces vecteurs étant plus simples à préparer, et plus sûrs à utiliser que les virus vecteurs décrits jusqu'à présent. Un autre but de la présente invention est celui de fournir un procédé simple de préparation de ces vecteurs de transfert. Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs de transfert, et utilisables en thérapie génique, ou immunisation génique. Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouveaux réactifs pour la détection d'anticorps neutralisant les papillomavirus, ainsi que de nouveaux kits pour la mise en oeuvre d'une telle méthode de détection. La présente invention a pour objet l'utilisation de pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus humains ou animaux, pour la préparation de pseudovirus vecteurs utilisables pour le transfert de matériel génétique d'intérêt thérapeutique, dans des cellules cibles de l'organisme, notamment dans le cadre de thérapie génique ou d' immunisation génique. Avantageusement, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, contiennent la protéine L1, et le cas échéant la protéine L2, des papillomavirus. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les VLPs susmentionnées contiennent uniquement la protéine Lt (à savoir que lesdites VLPs sont formées de capsomères uniquement constitués de protéines L1). Par matériel génétique d'intérêt thérapeutique transféré par les pseudovirus vecteurs dans des cellules cibles dans le cadre de la présente invention, on entend toute séquence nucléotidique (ADN ou ARN) hétérologue d'intérêt thérapeutique, à savoir toute séquence susceptible de coder pour une protéine capable de traiter une pathologie déterminée, ou d'immuniser un individu contre une pathologie déterminée, ladite séquence n étant pas comprise dans le génome naturel des papillomavirus. Dans le cas particulier du traitement des pathologies dues aux infections par des papillomavirus, ou de l'immunisation contre ces pathologies, ladite séquence hétérologue peut consister en un fragment du génome des papillomavirus, ou en une séquence nucléotidique dérivée de ce fragment. Par séquence d'ADN hétérologue d'intérêt thérapeutique, on entend notamment: - toute séquence d'ADN susceptible de coder pour une protéine dans le cadre de pathologies dans lesquelles ladite protéine est déficiente, - toute séquence d'ADN codant pour une protéine agissant en tant que vaccin, - toute séquence d'ADN codant pour une protéine agissant en tant qu'anticorps neutralisant des pathogènes, - toute séquence d'ADN codant pour une protéine susceptible d'interagir directement ou indirectement avec des protéines impliquées dans le développement de certaines pathologies, - toute séquence d'ADN codant pour un ARN antisens susceptible d'inhiber la production d'une protéine impliquée dans le cadre du développement d'une pathologie. Les cellules cibles dans lesquelles le matériel génétique est transféré dans le cadre de la présente invention, sont toutes cellules susceptibles d'être infectées par des papillomavirus ou des VLPs de ces papillomavirus. Les pseudovirus vecteurs de l'invention sont soit administrés sous forme de compositions pharmaceutiques, notamment dans les conditions définies ciaprès, soit utilisés pour la mise en oeuvre d'un procédé de transformation in vitro de cellules, notamment des cellules d'un patient, les cellules ainsi transformées par les pseudovirus étant ensuite réadministrées au patient. Avantageusement, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, sont telles qu'obtenues par transformation de cellules hôtes avec des vecteurs contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine L1 des papillomavirus et, le cas échéant, une séquence d'ADN codant pour la protéine L2 des papillomavirus, lesdites séquences étant placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription, et récupération des VLPs produites dans lesdites cellules hôtes par assemblage des capsomères de protéines L1 et, le cas échéant de protéines L2. Les capsomères susmentionnés résultent eux-mêmes de l'assemblage des protéines L1, à raison d'environ 5 protéines L1 par capsomère, une VLP étant constituée de 7 capsomères. Dans le cas où les VLPs contiennent à la fois la protéine L1 et la protéine L2, il y a environ 30 protéines L2 par VLP. Avantageusement encore, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, sont telles qu'obtenues par transformation de cellules d'insectes, à titre de cellules hôtes, avec des baculovirus utilisés en tant que vecteurs contenant les séquences d'ADN codant pour la protéine L1 et, le cas échéant la protéine L2, lesdits baculovirus vecteurs étant eux-mêmes obtenus par transformation de ces derniers avec des plasmides contenant lesdites séquences d'ADN codant pour la protéine L1 et, le cas échéant L2, sous le contrôle d'éléments de régulation de leur expression. Selon un autre mode avantageux de réalisation de l'invention, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, sont telles qu'obtenues par transformation de levures ou de cellules de mammifères (telles que les cellules CHO), à titre de cellules hôtes, avec des plasmides utilisés en tant que vecteurs, contenant les séquences d'ADN codant pour la protéine L1, et le cas échéant la protéine L2, lesdites séquences d'ADN étant placées sous le contrôle d'éléments de régulation de leur expression. Avantageusement, les VLPs produites dans les cellules hôtes dans le cadre des procédés susmentionnés, sont purifiées à partir des milieux de culture desdites cellules hôtes, généralement après lyse de ces dernières ; parmi les techniques utilisables pour purifier lesdites VLPs à partir de ces surnageants de culture, on peut citer - l'ultracentrifugation en sucrose, isopycnique, ou en gradient de densité (ex CsCl), - la précipitation par relargage au polyéthylène glycol (PEG), ou au sulfate d'ammonium, - la chromatographie d'exclusion, ou d'échange d'ions, - l'utilisation dtimmunoadsorbants, - 1' isoélectrofocalisation. L'invention a également pour objet l'utilisation de VLPs de papillomavirus définies ci-dessus, pour la préparation d'un médicament comprenant des pseudovirus vecteurs tels que définis ci-dessus, ces derniers correspondant auxdites VLPs dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées, lesdits pseudovirus étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit médicament étant destiné au traitement ou à la prévention de pathologies, telles que décrites ci-dessus, susceptibles d'être traitées par thérapie génique ou prévenues par immunisation génique. L'invention concerne également tout pseudovirus vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles de l'organisme dans le cadre de la thérapie génique, ou de l'immunisation génique, caractérisé en ce qu'il correspond à une VLP de papillomavirus humains ou animaux, dans laquelle une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées. L'invention a plus particulièrement pour objet tout pseudovirus vecteur de transfert tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est formé d'une VLP en association avec une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues encapsidées à l'intérieur de cette VLP, ladite VLP comprenant un assemblage de capsomères de protéine L1, et le cas échéant de protéine L2, de papillomavirus (notamment dans les proportions indiquées ci-dessus). Avantageusement, les VLPs formant les pseudovirus susmentionnés, comprennent uniquement la protéine L1 de papillomavirus. Les pseudovirus vecteurs selon l'invention sont davantage caractérisés en ce que la ou les séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont insérées dans un plasmide contenant les éléments nécessaires à la régulation de l'expression de ces séquences d'ADN, la taille maximale dudit plasmide étant d'environ 8 à environ 8,5 kb. Avantageusement, les pseudovirus vecteurs selon l'invention, sont tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique, à l'intérieur desdites VLPs. De préférence, ce procédé extracellulaire d'encapsidation est effectué par désassemblage-réassemblage des VLPs définies cidessus, en présence d'un vecteur, notamment d'un plasmide, contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique. A ce titre, l'invention vise plus particulièrement tout pseudovirus vecteur tel qu'obtenu par un procédé in vitro de désassemblage-réassemblage des VLPs susmentionnées, ce procédé comprenant les étapes suivantes - désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chélateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le ss-mercaptoéthanol, - mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ 1,ug de plasmide, pour environ 5yg de VLP), - réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ +, et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse. Le cas échéant, le procédé susmentionné comprend une étape de séparation, notamment par des techniques chromatographiques, d'une part des VLPs dans lesquelles lesdites séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées et, d'autre part, des VLPs demeurées vides (ne contenant pas lesdites séquences nucléotidiques) après la mise en oeuvre dudit procédé. L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique (notamment vaccin), caractérisée en ce qu'elle comprend un pseudovirus vecteur de transfert contenant au moins une séquence d'ADN d'intérêt thérapeutique, et tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont davantage caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, sous-cutanée, nasale, vaginale, dermique, notamment à raison d'environ 10 ng à environ 10 yg de pseudovirus vecteurs par individu et par prise. La présente invention a également pour objet l'utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs telles que définies ci-dessus, dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues (notamment des séquences nucléotidiques codant pour des gènes rapporteurs) sont encapsidées, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit ci-dessus, desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de transfert in vitro desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs. A ce titre, la présente invention a pour objet tout procédé de transfert in vitro de séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par des pseudovirus vecteurs définis ci-dessus, lesdits pseudovirus étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des VLPs de papillomavirus, ce procédé étant tel que décrit ci-dessus (dans lequel le plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique est remplacé par un plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s)). L'invention concerne également l'utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs telles que définies ci-dessus, dans lesquelles au moins un gène rapporteur est encapsidé, lesdits pseudovirus étant tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit ci-dessus, du ou des gène(s) rapporteurs dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'anticorps neutralisant l'infection des papillomavirus humains ou animaux. L'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro d'anticorps neutralisant les papillomavirus humains ou animaux comprenant les étapes suivantes - incubation in vitro de pseudovirus vecteurs définis ci-dessus contenant un gène rapporteur, avec des cellules susceptibles d'être infectées par des pseudovirus vecteurs (telles que les cellules Hela ou Cos-7), en présence d'anticorps dont le pouvoir neutralisant est testé, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation du (ou des) gène(s) rapporteur(s) dans des VLPs de papillomavirus, ce procédé étant tel que décrit ci-dessus (dans lequel le plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique, est remplacé par un plasmide contenant le (ou les) gène(s) rapporteur(s)), - analyse de l'expression ou non du gène rapporteur à l'intérieur de ces cellules, l'absence d'expression du gène rapporteur dans lesdites cellules étant corrélable au fait que les anticorps testés ont neutralisé l'infection des cellules par lesdits pseudovirus, et donc que ces anticorps représentent des anticorps neutralisant susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement des pathologies dues à l'infection par des papillomavirus. Parmi les gènes rapporteurs susceptibles d'être utilisés, on peut citer ceux de la (-galactosidase, l'aequorine (GFP), la luciférase, etc... L'invention concerne également un kit (ou trousse) pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection tel que décrit ci-dessus, ce kit comprenant - des pseudovirus vecteurs contenant au moins un gène rapporteur, tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit cidessus, du ou des gènes rapporteurs dans lesdites VLPs, - des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs, - des réactifs nécessaires à la révélation de l'activité codée par le gène rapporteur. L'invention concerne également le procédé décrit ci-dessus de préparation de pseudovirus tels que définis ci-dessus de papillomavirus humains ou animaux susceptibles d'être utilisés en tant que vecteur de transfert de matériel génétique (à savoir de séquences nucléotidiques hétérologues, le cas échéant d'intérêt thérapeutique, telles que définies ciaessus) dans des cellules cibles, ledit procédé étant effectué par désassemblage-réassemblage in vitro des VLPs susmentionnées et comprend les étapes décrites suivantes - désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chélateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le ss-mercaptoéthanol, - mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s), le cas échéant d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ 1,ug de plasmide, pour environ 5sbg de VLP), - réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca + et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse, - le cas échéant, séparation, notamment par des techniques chromatographiques, d'une part des VLPs dans lesquelles lesdites séquences nucléotidiques hétérologues sont encapsidées et, d'autre part, des VLPs demeurées vides (ne contenant pas lesdites séquences nucléotidiques) après le réassemblage des capsomères en VLPs. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit du procédé de préparation de VLPs telles que définies ci-dessus, contenant une séquence d'ADN hétérologue contenant le gène de la -galactosidase, ou celui de la protéine fluorescente (GFP), à titre de gènes rapporteurs. I - Matériels et Méthodes a) Expression In vitro des VLPs de papillomavirus Les VLPs du papillomavirus humain de type 16 (HPV-16) sont obtenues par expression du gène L1 de HPV-16 dans le sytème d'expression du baculovirus selon la méthode décrite dans l'article de Le Cann et al., 1994, et résumée ci-après Le gène L1 d'HPV-16 a été amplifié à partir d'un produit pathologique, puis cloné dans le vecteur pTAG. Le gène est ensuite sous-cloné dans le vecteur pBlue Bac III (Invitrogen) dérivé d'un baculovirus spécifique de l'insecte Autographa californica. Les plasmides sont cotransfectés avec l'ADN du virus sauvage dans des cellules d'insectes, Sf9, Sf21, ou "high-five". Les virus recombinants sont ensuite sélectionnés par dilution limite. Les cellules de Spodoptera Frugiperda (Sf21) infectées avec le baculovirus recombinant, sont récoltées 4 jours après l'infection et lysées par une solution de NonidetB P40 dans du PBS pendant 15 mm à température ambiante. La fraction nucléaire est récupérée par centrifugation (10,000 xg, 15 mn, 4"C) et soumise à 3 x 15s aux ultrasons à la puissance maximale (Vibra-cell, Bioblock Scientific, Strasbourg, France). Le lysat nucléaire est déposé sur un grandient de CsCI, centrifugé à l'équilibre dans un rotor BeckmanB SW 28 (20 h, 27,000 rpm, 4"C) et récolté en fractions de 1,5 ml. La densité et la réactivité des HPV en ELISA ont été vérifiées selon la méthode décrite dans l'article de Touzé et al., 1996. Les fractions positives en ELISA qui ont une densité se situant entre 1,27-1,30, ont été réunies, diluées dans du PBS et soumises à une ultracentrifugation dans un rotor SW 28 (3 h, 28,000 rpm, 4"C). Le culot est resuspendu dans du NaCI 0,15M. Le contenu en protéines a été déterminé en utilisant le test MicroBCA PierceB . b) Plasmides Deux plasmides portant différents gènes rapporteurs ont été utilisés. pGreenLantern (Life Technologies, Eragny, France) contenant le gène codant pour la protéine fluorescente (GFP) de Aequoria victoria sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus. pCMV-ssgal contenant le gène codant pour la ss-galactosidase d'E.coli. Le plasmide pCMV-HBc a été utilisé pour les études d'immunisation. Ce plasmide contient le gène tronqué à l'extrémité 3' de l'antigène du noyau de l'hépatite B sous le contrôle de promoteur CMV. c) Désassemblage et réassemblage des VLPs d'HPV-16 Le désassemblage et le réassemblage des VLPs recombinantes d'HPV-16 ont été réalisés selon une méthode adaptée de celle décrite dans l'article de Colomar et al., 1993, dans le cadre des virions SV40. En résumé, les VLPs d'HPV-16 purifiées à une concentration de 500 yg/ml, sont incubées dans un tampon Tris-HC1 à 50 mM (pH 7,5) contenant NaCI 150 mM, EGTA lmM, et DTT 20mM dans un volume final de 50 ,ul à température ambiante pendant 30 mn. A cette étape, 1 ,ug de plasmide contenant le gène rapporteur (GFP ou ss-gal) dans un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) et NaCI 150 mM est ajouté aux VLPs désassemblées. Pour encapsider l'ADN dans les particules virales, la concentration en CaCl2 est ensuite augmentée graduellement jusqu'à 5mM et du DMSO est ajouté (1 % final) (volume final 100 cul1). Cette solution est incubée 1 h à 20"C. Les VLPs reconstituées sont traitées avec 10 U de Benzonase (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 1 h à 20"C pour vérifier que l'ADN plasmidique est intégré dans les VLPs, et non pas absorbé à leur surface. d) Expériences de transfection / infection Les cellules cultivées en monocouche dans du milieu DMEM/Glutamax (Life Technologies) complété avec du sérum de veau foetal (FCS), 10%, de la pénicilline 100 IU/ml et de la streptomycine 100 jug/ml, ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits (Nunc, Life Technologies) et cultivées jusqu'à 80 % de confluence. Les cellules ont été lavées deux fois avec du DMEM/Glutamax. Les pseudo-particules virales pCMV-ssgal-VLPs ou pGreenLantern-VLPs dans 1 ml de milieu de culture on été additionnées aux puits et incubées pendant 4 h à 37"C. A cette étape, les VLPs ont été retirées, et 3 ml de DMEM/Glutamax complété avec du FCS 10 % ont été additionnés. A titre de témoin positif, des cellules ont été transfectées en utilisant la même quantité d'ADN (1 ,ug) avec 10,a1 d'un liposome, la lipofectamineX (Life Technologies) selon les instructions du fabricant. Après 4 h d'incubation à 37"C, 2 ml de milieu de culture contenant du sérum foetal de boeuf ont été additionnés. Puis les cellules ont été incubées pendant 48 h à 37"C. A ce stade, les activités GFP ou ss-galactosidase des cellules ont été analysées. Pour les expériences de neutralisation, des virus artificiels ont été préincubés pendant 30 mm à 37"C avec du PBS contenant un antisérum de souris anti-HPV16-VLPs dilué au 1/100. Cet antisérum a été obtenu par immunisation souscutanée de souris avec 5 ,ug de VLPs d'HPV-16 absorbés sur ALOI3 en tant qu'adjuvant. e) Lignes cellulaires Huit lignées cellulaires ont été utilisées pour ces expériences. Trois lignées cellulaires humaines comprenant MRC5 (poumon), Hela (col de l'utérus) et CACO2 (colon). Les cellules embryonnaires NIH 3T3 provenant de souris et 4 autres lignées cellulaires animales comprenant les cellules Vero et Cos-7 (singe, rein), MDCK (chien, rein) et CHO (hamster, ovaire), ont été utilisées. f) Détection de l'activité du gène rapporteur Pour la détermination de l'activité ss-galactosidase in situ, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées pendant 10 mm à température ambiante avec une solution de formaline 2 % -glutaraldéhyde 0,2 % dans du PBS pour la détection de la P-galactosidase. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été exposées à 1 ml d'une solution de PBS contenant K3Fe(CN)6 4mM, K4Fe(CN)6 3H2O 4 rnM, MgCl2 2 mM, Tris 100 mM (pH 7,4) et 1 mg/ml de X-gal à 37"C, pour l'expression de la ss- galactosidase. Après le développement de la coloration (24 h), les cellules ont été lavées avec du PBS et observées. La détermination quantitative de la ss-galactosidase produite dans les lignées cellulaires transfectées a été testée par une méthode ELISA-p-gal (Boehringer, Mannheim, Dassel, Allemagne) selon les instructions du fabricant. En résumé, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS, 48 h après la transfection. Les cellules ont été lysées et, après centrifugation, le contenu en protéines total des surnageants a été déterminé en utilisant la méthode Bradford et ajusté à une concentration de 500 ,ug/ml avant de tester la présence de ss-galactosidase. Des échantillons du surnageant ont ensuite été additionnés aux puits d'une microplaque de 96 puits préenduite avec un anticorps anti-ss-galactosidase. Après une heure d'incubation à 37"C, les puits ont été lavés et une immunoglobuline anti-ss-galactosidase d'E. coli conjuguée à la digoxigénine a été additionnée. Après une deuxième incubation d'une heure à 37"C et trois lavages, les anticorps spécifiquement liés ont été détectés par incubation d'une heure à 37"C avec une immunoglobuline anti-digoxigénine conjuguée à la peroxydase du raifort. Après trois lavages, une solution d'ABTS a été additionnée et les densités optiques ont été lues à 405 nm après une incubation de 20 mn à température ambiante. La concentration de ss-galactosidase (pg/ml) a été déterminée par rapport à une courbe d'étalonnage. Pour la détermination de l'activité GFP, le nombre de cellules fluorescentes et non fluorescentes a été déterminé en utilisant la cytométrie en flux FAC Scan pour mesurer l'expression de la protéine GFP. A cet effet, les cellules ont été traitées par la trypsine, centrifugées et resuspendues dans 1 ml de milieu de culture. Les cellules ont été analysées à l'aide d'un cytomètre en flux FAC Sort (Becton-Dickinson, Montain View, CA, USA). Par ailleurs, les cellules ont été directement observées à l'aide d'un microscope à fluorescence et photographiées directement. g) Etude d'immunisation Des souris femelles BALB/c (H2d), âgées de 12 à 16 semaines, ont été gardées dans des conditions exemptes de pathogènes durant le protocole d' immunisation. Les souris BALB/c ont reçu deux injections de 5 g de VLPs d'HPV-16 reconstituées contenant le plasmide pCMV-HBc dans le muscle Tibialis anterior à deux semaines d'intervalle. Deux groupes de souris de contrôle ont reçu 100 yg du plasmide pCMV HBc au même endroit, avec ou sans cardiotoxine, 5 jours avant l'injection vaccinante, et un groupe de souris de contrôle a reçu 5 g de HBcAg recombinant purifié. L'injection intramusculaire de 100 ,t41 de cardiotoxine 10 mM a été réalisée de façon à augmenter la capture de l'ADN plasmidique par les cellules musculaires. Des échantillons de sang ont été recueillis à chaque injection vaccinante et 15 jours après la seconde. L'HBcAg recombinant assemblé au VLPs a été purifié à partir des cellules d'insectes infectées avec un baculovirus recombinant codant le gène HBc. h) Détection des anticorps anti-HBc et anti-HPVl6 Les anticorps dirigés contre les VLPs d'HBcAg et d'HPV-16, ont été étudiés suivant les techniques ELISA. Les VLPs d'HPV-16 ou d'HBcAg (100 mg/puits) dans du PBS (pH 7,4) ont été incubées une nuit à 40C. Après 4 lavages avec du PBS-Tween 20 0,1 %, les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués par incubation pendant 30 mn à 37"C avec du PBS-NBS 1 % (sérum de nouveau-né bovin). La solution bloquante a été remplacée par 100 ,ul de sérum de souris dilué deux fois dans SxPBS contenant du NBS 10 % et du Tween 20 2 %. Après incubation à 45"C pendant 90 mm, et 4 lavages, les anticorps liés ont été détectés avec une immunoglobuline anti-souris liée de façon covalente à la peroxydase de raifort (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France). Après incubation à 45"C pendant 90 mm, et 4 lavages, la solution de substrat contenant de l'o-phénylène diamine et H202 a été additionnée. La réaction est arrêtée après 30 mn par addition d'H2SO4 4N et les densités optiques (492 nm) ont été lues avec un lecteur automatique (Microplate reader EL 311, Bioteck Instruments). Les titres ou anticorps correspondent à l'inverse de la dernière dilution de sérum donnant un résultat positif (DO supérieur à 0,1). Les résultats sont exprimés en moyenne géométrique de titres calculée à partir des différents titres obtenus à partir de chaque souris de chaque groupe. Il - Résultats a) Désassemblage - réassemblage des VLPs de papillomavirus Les VLPs d'HPV-16 ont été produites dans des cellules d'insectes Sf21 en utilisant un baculovirus recombinant. Les VLPs ont été purifiées par ultracentrifugation en sucrose, puis en gradient de CsCl (Le Cann et al., 1994). Les fractions du gradient de CsCl contenant les VLPs ont été regroupées, diluées dans du PBS puis ultracentrifugées. Le culot est ensuite resuspendu dans un tampon contenant EGTA et DTT et incubé à température ambiante pendant 30 mn. Dans ces conditions, les VLPs sont complètement désagrégées en structures ressemblant aux capsomères. L'ADN plasmidique est alors ajouté et la préparation est diluée dans un tampon contenant une forte concentration en calcium et du DMSO 1 % de manière à reformer les VLPs. Environ 75 % des protéines L1 semblent se réassembler en VLPs dans ces conditions. b) Transfert in vitro d'ADN plasmidique par l'intermediaire des VLPs de papillomavirus Les cellules Hela ont été étudiées pour leur sensibilité aux VLPspGreenLantern. La fluorescence de la protéine GFP, produite dans les cellules transfectées a été analysée par cytométrie en flux. 70 % des cellules Hela transfectées par le plasmide pGreenLantern encapsidé dans les VLPs sont fluorescentes (Tableau 1). En comparaison, aucune cellule fluorescente n'a été trouvée lorsque les cellules sont incubées avec l'ADN plasmidique seul, ou avec le plasmide et la protéine L1 assemblée en capsomères, et 40 % des cellules sont fluorescentes lorsqu'elles sont traitées avec le plasmide pGreenLantern et la lipofectamine8. La spécificité du transfert par les VLPs a de plus été démontrée par le fait que des anticorps anti-VLPs d'HPV-16 bloquent complétement le transfert de gènes et que le traitement par la Benzonase n'affecte pas le transfert. Les capsomères libres ne peuvent pas agir en tant que vecteurs pour le transfert de gènes. De plus, aucun transfert de gène n'a pu être identifié avec 0,5 ,ug de VLPs-pGreenLantern lorsque les cellules Hela ont été incubées avec 10 ,ug (excès de 20 fois) de VLPs d'HPV-16 vides (Tableau 1). Tableau 1: Transfert du gène de la GFP par les pseudo-particules virales de VPH-16 mise en évidence et spécificité Cellules Hela traitées avec % cellules fluorescentes 5 ,ag de VLP-pGreenLantern 70 % 5 ,ug de VLP-pGreenLantern + Benzonasee 70 % 5 yg de VLP-pGreenLantern + AC anti-VLPs d'HPV-16 0 % 5 yg de capsomères + pGreenLantern 0 % pGreenLantern + LipofectamineB 40 % pGreenLantern 0% Le transfert de l'ADN de pCMV-ssgal a également été étudié. Les résultats montrent que les deux plasmides ont été transfectés avec la même efficacité et la proportion des cellules transfectées est similaire à celle évaluée par cytométrie en flux. L'expression de la P-galactosidase a été mesurée par ELISA dans le lysat cellulaire. Les résultats indiquent que le niveau d'expression correspond avec la quantité de pCMV-ssgal -VLPs utilisée. Une augmentation du niveau d'expression de la -galactosidase d'environ 100, a été observée entre des concentrations de vecteur VLP de 1 à 10 ,ug. Huit lignées cellulaires ont été étudiées pour leur capacité à être transfectées par le plasmide pCMV-ssgal encapsidé dans les VLPs d'HPV-16. Les résultats (Tableau 2) montrent que toutes les lignées cellulaires peuvent être transfectées par ce vecteur et que le niveau d'expression ss-gal obtenu est généralement 3 à 6 fois plus élevé que celui observé après transfection des mêmes cellules par lipofection. Toutefois, le niveau d'expression de la ss-galactosidase varie de 102 pg/ml dans les cellules Vero à 2253 pg/ml dans les cellules CaCo2. Tableau 2: Efficacité du transfert de gène médié par les pseudo-particules virales dans différentes lignées cellulaires animales et humaines Lignées cellulaires ss-galactosidase produite (pg/ml) étudiées Lipofectamine Pseudo-particules MRC5 79 265 Hela 234 852 CaCo2 320 2253 NIH3T3 65 275 Cos-7 487 3142 Vero 41 102 MDCK 5 145 CHO 43 150 c) Réponse immune humorale chez les souris Immunisées avec l'ADN de pCMV-HBc encapsidé à l'intérieur des VLPs d'HPV-16 L'immunisation par l'ADN a été étudiée chez les souris BALB/c, en utilisant le plasmide pCMV-HBc codant pour l'antigène du noyau de l'hépatite B comme application possible du transfert de gène au moyen d'un gène encapsidé dans les VLPs d'HPV-16. Les résultats de deux injections intramusculaires de 5 ,ug de pCMV-HBc HPV-VLPs dans un intervalle de deux semaines ont été comparés à ceux obtenus par injection intramusculaire de 100 yg d'ADN plasmidique seul, et à ceux obtenus par injection intramusculaire de 5 g de VLPs d'HBc produites dans les cellules Sf21 avec un baculovirus recombinant. Les anticorps anti-HBc ont été observés chez tous les animaux immunisés. Toutefois, le titre anti-HBc (20,138) est plus élevé chez les souris immunisées avec pCMV-HBc encapsidé à l'intérieur des VLPs d'HPV, que chez les souris immunisées avec pCMV-HBc seul (1,000 à 1,600), et plus élevé que le titre (6,400) observé par injection intra-musculaire de capsides HBc. Des anticorps anti-HPV-16 n'ont pas été détectés chez les souris immunisées avec les VLPs d'HBc ou avec l'ADN d'HBc, mais sont présents à un titre du 800 chez les souris immunisées avec les VLPs d'HPV contenant l'ADN d'HBc après la deuxième injection. Le niveau d'anticorps anti-HPV-16 est toutefois beaucoup plus faible que celui observé chez les souris immunisées avec 5 yg de VLPs d'HPV absorbées sur Al(OH)3 en tant qu'adjuvant, chez lesquelles les titres anti-VLP atteignent 30,000 à 70,000. III- Conclusion Les VLPs de protéine L1 d'HPV-16, obtenues par expression de la protéine majeure de capside du papillomavirus humain de type 16 dans des cellules d'insectes, peuvent encapsider un plasmide portant soit un gène pour la protéine GFP, soit un gène pour la ss-galactosidase lors du déassemblage-réassemblage in vitro des VLPs. L'introduction du plasmide dans différentes cellules par ces pseudovirions ou virus artificiels, est facilement détectée par l'accumulation du produit du gène, et le nombre de cellules porteuses du gène est fonction de la concentration en VLPs d'HPV-16 dans l'expérience de transfert. La mise en évidence de l'encapsidation du plasmide plutôt qu'une association entre le plasmide et la protéine L1 est basée sur la résistance à la BenzonaseB du transfert d'ADN médié par les VLPs à l'intérieur des cellules. L'efficacité du transfert de gène par les VLPs excède considérablement celle obtenue par le phosphate de calcium ou la transfection lipidique. Par opposition aux résultats obtenus par d'autres équipes (Zhou et ail., 1994 ; Roden et al., 1996 ; Unckell et al., 1997), les résultats présentés ici indiquent que la protéine L2 d'HPV n'est pas nécessaire pour une encapsidation efficace de l'ADN, ni pour son transfert dans une cellule hôte. De plus, le transfert du gène est 103 à 104 fois plus efficace qu'avec les systèmes décrits par ces auteurs. Le transfert de gène a été spécifiquement inhibé soit par préincubation des VLPs avec un antisérum anti-VLP, soit par compétition avec des VLPs d'HPV-16 vides. Par conséquent, les pseudovirions d'HPV décrits ici représentent également un système utile pour la détection d'anticorps neutralisant anti-papillomavirus. L'utilisation des VLPs pour le transfert de gènes présente des avantages par rapport à l'utilisation des virus recombinants. La production de tels pseudovirions est beaucoup plus facile que celle des vecteurs viraux usuels, et le risque d'induction d'anticorps neutralisant est plus faible. De plus, ces pseudovirions sont plus sûrs d'utilisation car aucune recombinaison avec un virus sauvage n'est possible, puisqu'ils ne contiennent pas de séquence d'ADN de papillomavirus. REFERENCES Banerjee, S. et al., 1995 - Nature Med. 1:1303-1308 Berkner, K.L., 1992 - Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 : 39-66 Colomar, M.C. et al., 1993 - J. Virol. 67 : 2779-2786 Danos, O. & Mulligan R.C., 1988 - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 6460-6464 Felgner, P.L. et al., 1987 - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 : 7413-7417 Felgner, P.L & Ringold G. 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Utilisation de pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus humains ou animaux, pour la préparation de pseudovirus vecteurs utilisables pour le transfert de matériel génétique d'intérêt thérapeutique dans des cellules cibles de l'organisme, en particulier dans le cadre d'une thérapie génique, ou d'une immunisation génique. 2. Utilisation selon la revendication 1, de VLPs contenant la protéine L1, et le cas échéant la protéine L2, des papillomavirus. 3. Utilisation de VLPs de papillomavirus définies dans les revendications 1 ou 2, pour la préparation d'un médicament comprenant des pseudovirus vecteurs auxdites VLPs dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées, lesdits pseudovirus étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit médicament étant destiné au traitement ou à la prévention de pathologies, telles que décrites ci-dessus, susceptibles d'être traitées par thérapie génique ou d'être prévenues par immunisation génique. 4. Pseudovirus vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles de l'organisme dans le cadre de la thérapie génique, ou de l'immunisation génique, caractérisé en ce qu'il correspond à une VLP de papillomavirus humains ou animaux, dans laquelle une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées. 5. Pseudovirus vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que les VLPs contiennent la protéine L1 et, le cas échéant, la protéine L2, des papillomavirus. 6. Pseudovirus vecteur selon la revendication 4 ou 5, tel qu'obtenu par un procédé extracellulaire d'encapsidation d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique à l'intérieur des VLPs, notamment par un procédé de désassemblage-réassemblage in vitro des VLPs, en présence d'un plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique. 7. Pseudovirus vecteur selon la revendication 6, tel qu'obtenu par un procédé de désassemblage-réassemblage in vitro des VLPs comprenant les étapes suivantes - désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chélateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le P-mercaptoéthanol, - mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ 1yg de plasmide, pour environ 5yg de VLP), - réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ + et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse. 8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu elle comprend un pseudovirus vecteur selon l'une des revendications 4 à 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 9. Utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs contenant la protéine L1 et, le cas échéant, de la protéine L2, des papillomavirus humains ou animaux, dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues (notamment des séquences nucléotidiques codant pour des gènes rapporteurs) sont encapsidées, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de transfert in vitro desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs. 10. Utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs contenant la protéine L1 et, le cas échéant, de la protéine L2, des papillomavirus humains ou animaux, dans lesquelles au moins un gène rapporteur est encapsidé, lesdits pseudovirus étant tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation du (ou des) gène(s) rapporteur(s) dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'anticorps neutralisant l'infection des papillomavirus humains ou animaux. 11. Procédé de préparation de pseudovirus de papillomavirus humains et animaux, lesdits pseudovirus étant susceptibles d'être utilisés en tant que vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - désassembiage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chélateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le ss-mercaptoéthanol, mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s), le cas échéant d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ 1yg de plasmide, pour environ 5yg de VLP), - réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ + et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse.