FR 2774887 A1 19990820 FR 9801877 A 19980213 CAPTEUR OPTIQUE SUR SUBSTRAT DE SILICIUM ET APPLICATION A LA MESURE IN SITU D'UN MARQUEUR FLUORESCENT DANS LES PETITES BRONCHES La présente invention concerne le domaine des capteurs optiques miniaturisés, et plus particulièrement les capteurs destinés à la mesure d'un marqueur fluorescent dans de petites cavités, par exemple les petites bronches pour la mesure in vivo de la perméabilité capillaro-bronchique On connaît dans l'état de la technique des capteurs optiques miniaturisables, mettant en oeuvre une sonde interféromètrique hétérodyne intégrée sur silicium, notamment dans les applications biomédicales Le principe de la technique hétérodyne en interférométrie repose sur la modification de la fréquence optique sur l'un de bras de l'interféromètre. Les franges d'interférences peuvent être modulées en phase et détectées photoélectriquement. La technique permet un accès à la phase du phénomène observé directement à partir du signal optique. En comparaison avec les techniques homodynes, associant un comptage de franges aux méthodes d'interpolation linéaire, la détection hétérodyne présente deux avantages principaux - une amélioration de la résolution liée à l'extraction de phase, - une meilleure tolérance aux bruits de basses fréquences grâce au décalage du signal utile loin de parasites externes. La transposition des architectures massives de l'interférométrie hétérodyne en version fibrée conduit en général à une dégradation du rapport signal sur bruit, liée aux perturbations externes et les réflexions parasites. En outre, les dispositifs de décalage "tout fibre" sont rares et on se heurte aux problèmes de couplage entre les modulateurs de phase massifs et l'entrée de la fibre limitant sérieusement les applications exigeant une miniaturisation de la sonde. Grâce aux technologies optiques d'intégration sur silicium l'avenir est assuré aux microintererféromètres de très faible taille, pouvant être fabriqués par l'intégration monolithique. L'optique intégrée sur silicium est particulièrement bien adaptée aux applications " capteur biomédical" où l'on dépose sur le bras de mesure de l'interféromètre (généralement la configuration de Mach Zehnder) une couche sensible "superstrate" en hydrocarbure ou polymère. Quelques exemples typiques de capteurs biologiques et chimiques sont décrits dans les documents suivants - "Integrated optical gas sensors using organically modified silicates as sensitive films", Sensors and Actuators B, vol. 11, (1993), pp. 361-374, 4. A. Brandenburg, R. Edelhauser, F. Hutter, - "Integrated optical sensors for halogenated and non-halogenated hydrocarbons", Sensors and Actuators B, vol. 11, (1993), pp. 207-212, G. Gauglitz, J. Ingenhoff, - "Influence of thin superstrate films on evanescent waves in surface waveguides, Ber. Bunsenges. Phys. Chem, vol. 11, (1991), pp. 1588-1563, G. Gauglitz, J. Ingenhoff, - "Integrated optical chemical and direct biochemical sensors", Sensors and Actuators B, vol. 29, (1995), pp. 37-50. - "Integrated-optics with macro-flow cela, Proc. SPIE, vol. 1793, (1992), pp. 199-211,A.A. Boiarski, J.R. Busch, B.S. Bhullar, R.W. Ridgway, V.E. Wood. Si de nombreux "bio-capteurs" optiques intégrés sont apparus, ils sont basés principalement sur les techniques homodynes. La technique d'intégration de microsondes optiques se heurte à la difficulté de réaliser une modulation du faisceau de référence nécessaire à l'hétérodynage sur un substrat de silicium jouant un rôle passif. La présente invention vise à remédier à cet inconvénient en proposant une architecture optique originale, notamment pour une application "capteur biomédical" spécifique. Cette architecture ouvre une nouvelle voie de réalisation de la technique hétérodyne basée sur un schéma " actif" obtenu grâce à l'interaction entre un faisceau optique se propageant dans un guide silicium monomode et une onde acoustique de surface. Le matériau piézo-électrique nécessaire à la génération d'ondes acoustiques est une couche mince de l'oxyde de zinc. L'invention vise par ailleurs une application particulière d'un tel capteur pour l'estimation in vivo de la perméabilité des parois capillaires dans les petites bronches. Il n'existe pas, dans l'art antérieur, de procédé ni de dispositif permettant d'estimer in vivo la perméabilité des parois capillaires dans les petites bronches. L'invention répond à ce manque par un procédé et un dispositif permettant la mesure in situ d'un marqueur fluorescent par un capteur interféromètrique, intégré sur substrat de silicium. Un tel dispositif micro-opto-électromécanique est apte à fournir au domaine médical un outil de mesure miniature, pouvant fonctionner à distance, in situ et in vivo. L'utilité de centrer la mesure sur les petites bronches plutôt que sur les alvéoles, c'est-à-dire de mesurer in vivo la perméabilité capillaro-bronchique, est de permettre une quantification de l'inflammation essentiellement au niveau des bronches d'un diamètre compris entre 0,5 et 3 mm. En effet, ces bronches sont le siège d'un oedème par augmentation de perméabilité des parois capillaires dans de nombreuses pathologies inflammatoires, dont l'asthme. Deux aspects de la perméabilité capillarobronchique peuvent être étudiés : la perméabilité aux liquides et la perméabilité à un indicateur fluorescent. Les techniques actuelles ne permettent de mesurer la perméabilité des capillaires que sur une bronche isolée. Ainsi, la perméabilité aux liquides est estimée à partir de la baisse de concentration d'un indicateur fluorescent nondiffusible en fonction du temps, lorsqu'un liquide hyperosmolaire est introduit dans la lumière bronchique. Pour la perméabilité aux solutés, on mesure le passage d'un indicateur perfusé dans la lumière bronchique vers l'épithélium bronchique. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit - la figure 1 représente l'architecture d'un microinterféromètre de Mach-Zehnder - les figures 2a et 2b représentent des vues en coupe de deux géométries de guide optique - La figure 3 représente le profil du mode guidé; - les figures 4a et 4b représentent deux géométries de guide optique avec la couche "superstrate". - la figure 5 représente une vue microphotographique d'une des jonctions Y du microinterféromètre - la figure 6 représente le spectre du signal d'interférences. Le capteur selon l'invention met en oeuvre une sonde interféromètrique hétérodyne intégrée sur silicium. Le procédé de mesure selon l'invention repose sur l'application à de petites bronches d'une technique de lavage broncho-alvéolaire qui est une technique couramment utilisée en clinique, au cabinet de consultation, ou au lit du malade pour échantillonner le liquide qui tapisse les bronches et les alvéoles pulmonaires à l'état physiologique. Un lavage broncho-alvéolaire standard nécessite l'introduction d'un fibroscope dans les voies aériennes distales, l'instillation du sérum physiologique suivi d'une réaspiration, cette opération étant répétée quatre à cinq fois. Des numérations de cellules et des mesures de concentration de substances chimiques, hormonales ou pharmacologiques sont ensuite effectuées sur les échantillons de liquide réaspiré. Cette analyse, appliquée à la mesure de la perméabilité capillaro-alvéolaire, permet d'estimer et d'assurer une quantification de l'inflammation pulmonaire surtout au niveau de l'alvéole. L'objectif de l'invention est de mesurer la perméabilité capillaro-bronchique. L'utilité de cette mesure est d'assurer une quantification de l'inflammation surtout au niveau des bronches d'un diamètre compris entre 0,5 et 3 mm. En effet, elles sont le siège d'un oedème par augmentation de perméabilité dans de nombreuses pathologies inflammatoires allergiques, dont l'asthme, et infectieuses. En pratique, si elle est précédée d'une saturation du territoire en liquide de lavage, une mesure en continu de la diffusion d'un indicateur fluorescent de la paroi vers la lumière bronchique, où serait situé le capteur, devrait nous permettre de développer une quantification de la perméabilité. D'autres applications biologiques, pharmacologiques et médicales sont possibles, sachant la possibilité de fixer des fluorochromes sur les ions et de nombreuses protéines. La réalisation de ce projet n'est possible qu'avec une mesure de la fluorescence dans des bronches d'un diamètre plus petit que celles auxquelles le fibroscope permet actuellement d'accéder, d'où l'intérêt de disposer d'un capteur de fluorescence miniaturisé. Des faibles variations de l'indice de réfraction (10-6 à 10-5) peuvent être détectées et quantifiées grâce à l'interférométrie optique. La configuration intégrée que nous utiliserons est le microinterféromètre de Mach-Zehnder dont l'architecture est représentée sur la figure 1. Le microinterféromètre est composé de deux jonctions (1, 2) Y micro-usinées sur un substrat (3) de silicium. La connexion par fibre optique (4, 5) (couplage via un V-groove) permet la miniaturisation de la tête optique et une mesure in situ et in vivo. La source utilisée sera une diode laser (6). Le faisceau source (10) de l'interféromètre est divisé en faisceau de mesure (9) et en faisceau de référence (8). Le faisceau de référence (8), dont la fréquence est décalée en phase par une modulation acoustique produite par un transducteur piezo-électrique (7), se recombine avec le faisceau de référence (9) sur le photodétecteur (11). La modulation du faisceau de référence de l'interféromètre est obtenue grâce à un transducteur piézo-électrique en couche mince d'oxyde de zinc, déposé à proximité de la couche guidante. Le dépôt d'une couche mince de ZnO d'épaisseur de 2,5 um est obtenu par sputtering. Les ondes acoustiques de surface sont générées par un transducteur interdigital constitué de deux électrodes métalliques en forme de peigne déposées sur la couche piézoélectrique. Celui-ci délivre un signal de battement, dont la phase sera modulée par la grandeur à mesurer. La modulation acoustique est ainsi un moyen d'hétérodynage optique actif qui améliore la résolution de mesure et permet un accès à la phase du phénomène à mesurer. Pour confiner l'onde acoustique dans la région du bras de référence une tranchée d'isolation est usinée séparant les branches de l'interféromètre. Les figures 2a et 2b représentent des vues en coupe de deux géométries de guide optique. Le guide optique présente un substrat (20) d'une épaisseur de 2 um et d'un indice de réfraction n=1,454 sur lequel est déposée une couche d'isolation (21), un coeur (22) d'une épaisseur de 0,5 um en SiON et éventuellement une gaine (23) d'une épaisseur de 1 um en oxyde de silicium. Pour bénéficier des avantages de la technologie silicium, le guide optique présente une structure multicouche de type substrat Silicium / Sio2 / SioN / SiO2. Elle présente une différence d'indice de réfraction Dn=o,066 entre la couche guidante en SiON et les couches adjacentes en SiO2. La couche inférieure de SiQ2 constitue une isolation entre le coeur du guide et le substrat de silicium et la couche supérieure peut éventuellement jouer le rôle de gaine. Les deux structures de guide optique sont fabriquées par dépôt LPCVD (éventuellement PECVD) de couches SiO2 et SiON. La figure 2(a) représente la structure du guide " rib" et la figure 2(b) illustre la structure du guide "rib inversé". Un saut d'indice nécessaire pour confiner latéralement l'onde guidée est obtenu respectivement par gravure RIE de la couche supérieure de SiON ("rib") ou de la couche inférieure de SiO2 ("rib inversé"). Le dispositif de mesure va être rendu sensible à la présence d'une substance chimique spécifique grâce au dépôt sur le bras de mesure (9) de l'interféromètre d'une couche supérieure "superstrate" dont le contact avec le liquide à détecter modifiera l'indice de réfraction de cette fenêtre "sensible". Une telle variation de l'indice entraîne une modification de l'indice de réfraction effective du guide optique et produit une variation de chemin optique, concrétisée par un décalage de franges. La sensibilité de mesure est directement proportionnelle à la longueur de la fenêtre sensible. Au contact avec le liquide à mesurer l'indice de réfraction effectif de structure guidée sera modifié d'une quantité nef f entraînant une modulation du signal d'interférences telle que où I() est l'intensité lumineuse de la figure d'interférences, est la longueur d'onde de la lumière incidente et L représente la longueur de la fenêtre sensible. L'originalité de l'invention est de réaliser une mesure quantitative et peu invasive de la perméabilité capillaire des petites bronches in vivo, avec une technique applicable à l'homme. En pratique, un capteur miniaturisé situé au niveau de la lumière bronchique (préalablement remplie de liquide) doit permettre une mesure en continu de la diffusion d'un indicateur fluorescent de la circulation vers la lumière bronchique. Ceci devrait nous permettre de développer une quantification de la perméabilité capillaire bronchique et de l'inflammation bronchique. D'autres applications biologiques, pharmacologiques et médicales sont possibles, sachant la possibilité de quantifier des échanges d'ions et de nombreuses protéines grâce à des indicateurs fluorescents spécifiques. Les fonctionnalités recherchées sont la miniaturisation et l'accroissement de performances à moindre coût. Ceci est rendu possible par le fait que la concentration du marqueur fluorescent à mesurer est très faible, surtout au début de la mesure, et aussi par le fait que le matériel utilisé devra être jetable. Un autre aspect original du dispositif intégré selon l'invention est le transducteur piézo-électrique (7) permettant de créer un signal d'interférences modulé en phase ce qui constitue une nouvelle voie pour la réalisation de microcapteurs optiques hétérodynes intégrables à base de silicium. La modulation de phase du faisceau de référence de l'interféromètre sera obtenue grâce à un transducteur piézoélectrique en couche mince d'oxyde de zinc déposé à proximité de la couche guidante. L'oxyde de zinc possède une structure hexagonale et pour obtenir des ondes acoustiques de surface la croissance de la couche doit être telle que l'axe C de symétrie du cristal soit orthogonal au substrat la direction de propagation de l'énergie est alors colinéaire à la direction de propagation de l'onde acoustique. Le dépôt d'une couche mince de ZnO est obtenu par sputtering. Les ondes acoustiques de surface seront générées par un transducteur interdigital constitué de deux électrodes métalliques en forme de peigne déposées sur la couche piézo-électrique. Un des éléments essentiels du dispositif intégré est le matériau de la couche supérieure "superstrate" dont le choix approprié définit à la fois la sensibilité et la gamme spectrale de mesure. Les polymères dont les caractéristiques optiques optimales sont les suivantes sont particulièrement adaptés - l'indice de réfraction doit être inférieur à l'indice de réfraction du coeur de guide (n=1,51) afin de permettre le confinement latéral du faisceau guidé. Cet indice de réfraction doit être aussi proche que possible de l'indice de réfraction de la couche SiO2 (n=1,454). Ce choix permet d'éviter en outre les trop grosses désadaptations d'indice à la transition guide/zone sensible, créatrices de réflexions. -la variation relative de l'indice de réfraction du polymère, produite par le contact avec le marqueur fluorescent à détecter, doit être aussi grande que possible afin d'assurer une bonne résolution de mesure. La valeur maximale de l'indice de réfraction, atteinte par le polymère, doit être toujours inférieure à celle de l'indice de réfraction du coeur du guide (n=1,51). - le polymère doit présenter une bonne sélectivité au marqueur fluorescent à détecter, -le pic d'absorption de la couche polymère doit se situer autour de 520 nm. La figure 3 représente le profil du mode guidé. La combinaison de deux guides optiques précédemment décrits en référence aux dessins de la figure 2 avec la fenêtre "sensible" en polymère, va conférer un aspect original au dispositif de mesure. Rappelons que dans un guide optique le champ électrique qui se propage peut être décomposé schématiquement en mode fondamental d'ordre 0 (appelé TEOO) situé au centre du coeur et une partie évanescente se propageant à l'extérieur du coeur (fig. 3). Pour obtenir une bonne précision de mesure on doit "privilégier" la partie évanescente du mode guidé car c'est elle qui reste en contact avec la couche sensible en polymère. En effet, il faut travailler avec des modes guidés transportant l'énergie préférentiellement dans les queues évanescentes, pour augmenter l'effet du milieu extérieur sur la propagation. Il faut donc utiliser des modes d'ordre élevé (ne pas travailler avec le mode 0) qui se propagent plus dans la gaine que dans le coeur et opter pour un guide à "coeur exposé" au moins dans la partie ou se fait la mesure (fenêtre sensible). Les figures 4a et 4b représentent la structure dans la région "sensible" selon deux géométries de guide optique avec la couche "superstrate". Dans le cas du guide "rib" (fig. 4a) la couche de polymère est déposée directement sur la jonction Y, sans que la structure de base soit modifiée. Cette structure est couramment utilisée (Référence 4). Le dépôt est facile à réaliser et de très grandes longueurs de la fenêtre sensible peuvent être fabriquées (plusieurs centimètres). Le principal défaut de cette configuration est que le coeur du guide "mis à nu" rend la structure sensible à toute les modifications de l'indice de réfraction du milieu extérieur car la queue évanescente se propage dans l'air libre entourant le guide optique. Par ailleurs, dans certaines applications biomédicales ou la mesure est effectuée dans des liquides "agressifs" (sang), l'exposition du coeur de guide peut s'avérer gênante. Dans le cas du "rib inversé" (fig. 4b) la couche de polymère remplace la couche supérieure du SiO2 dans la zone de mesure. Le coeur du guide est ainsi "mis à nu" localement et l'on utilise le polymère comme "superstrate" pour le confinement latéral. Pour cela on creuse une tranchée dans la couche supérieure de SiO2 et on la remplit avec le polymère. Cette architecture originale permet d'isoler le mode guidé des perturbations extérieures. En revanche, les pertes optiques étant beaucoup plus élevées dans le polymère (de l'ordre de 3 dB/cm) que dans la couche de SiO2 (0,1-0,5 dB/cm). Un déséquilibre entre le bras de référence et le bras de mesure de l'interféromètre est crée, entraînant une restriction sur la taille de la fenêtre sensible. Cette structure est avantageuse lorsqu'on doit fabriquer des jonctions Y relativement courtes (1-2 cm). L'architecture proposée est un interféromètre de Mach-Zehnder composé de deux jonctions Y. La technologie du guide d'onde est multicouche de type SiO2/SioN/SiO2 (guide de type "strip-load"). La figure 5 représente une vue microphotographique d'une des jonctions Y du microinterféromètre. En présence de la modulation acoustique, le signal d'interférences contient des battements dont la fréquence est celle de la modulation acoustique. Ce résultat est illustré par la figure 6 qui représente le spectre du signal d'interférences où apparaissent trois harmoniques différentes. La composante d'ordre un est située à la fréquence porteuse acoustique (48 MHz) et les ordres secondaires correspondent aux multiples entiers de celle-ci. Le lavage broncho-alvéolaire est effectué "à saturation", ce qui permet de réaspirer un échantillon de liquide de lavage - représentatif de l'ensemble du territoire broncho-alvéolaire lavé, - de le normaliser à un volume alvéolaire quantifié par dilution d'un indicateur ajouté au liquide instillé. L'indicateur utilisé est avantageusement un dextran neutre (macromolécule sans activité biologique) déjà utilisé chez l'homme, de poids moléculaire de 70000, sur lequel est fixé un isothiocyanate de fluorescéine. Ce dextran est administré en perfusion continue dans le sang pendant une heure tandis que l'on procède a un lavage broncho-alvéolaire séquentiel au cours de la deuxième demiheure. REVENDICATIONS 1 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent dans des cavités caractérisé en ce qu'il comporte un microinterféromètres de Mach-Zehnder présentant un bras de référence et un bras de mesure, ledit bras de référence présentant un dépôt d'une couche sensible dont le contact avec le marqueur spécifique modifie l'indice de réfraction. 2 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon la revendication 1 caractérisé en ce que le microinterféromètre est composé de deux jonctions (1, 2) Y micro-usinées sur un substrat (3) de silicium, d'une source formée par une diode laser (6), le faisceau source (10) de l'interféromètre étant divisé en faisceau de mesure (9) et en faisceau de référence (8) dont la fréquence est décalée en phase par une modulation acoustique produite par un transducteur piezo-électrique (7), le faisceau de mesure (8) se recombinant avec le faisceau de référence (9) sur un photodétecteur (11). 3 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que les bras de mesure (8) et de référence (9) sont constitués par des guides d'onde multicouche de type SiO2/SiON/SiO2. 4 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le microinterféromètres présente une fenêtre sensible de longueur L permettant le contact du liquide marqué avec le bras de mesure. 5 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la couche sensible est formée par un polymère. 6 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon la revendication 5 caractérisé en ce que le bras de mesure (9) présente une couche de polymère est déposée directement sur la jonction Y, sur le coeur (22) du guide. 7 - Capteur de mesure de la diffusion d'un marqueur fluorescent selon la revendication 5 caractérisé en ce que le bras de mesure (9) présente une couche de polymère remplaçant la couche supérieure de l'isolation SiO2 dans la zone de mesure. 8 - Application d'un Capteur de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes pour l'estimation in-situ de la perméabilité capillarobronchique. 9 - Système pour l'estimation in-situ de la perméabilité capillaro-bronchique caractérisé en ce qu'il comporte un capteur conforme à l'une au moins des revendications 1 à 7 et un liquide comprenant un dextran neutre sur lequel est fixé un isothiocyanate de fluorescéine. 10 - Système pour l'estimation in-situ de la perméabilité capillaro-bronchique selon la revendication 9 caractérisé en ce que le capteur est à usage unique.