FR 2773416 A1 19990709 FR 9800220 A 19980106 La présente invention concerne des particules magnétiques et thermosensibles, ayant une taille prédéterminée comprise entre 0,1 et 10 pm, qui comprend, d'une part, un noyau composite interne et, d'autre part, une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique. L'invention concerne également des procédés d'obtention et des utilisations de telles particules. Dans l'exposé qui suit, le terme composite est synonyme de composé magnétique simple, tel que de la ferrite, ou complexe, tel que de la ferrite distribuée, incorporée ou enrobée dans une matrice polymère. Ce noyau composite interne peut avoir un diamètre compris entre 20 nm et 10 pm. Le diagnostic biologique consiste à déceler une maladie à partir de l'analyse de prélèvements biologiques (urines, sang, liquide céphalo-rachidien, sédiment, crachat, etc...). Dans ce cadre de la recherche, on souhaite notamment pouvoir extraire et concentrer, dans des conditions compatibles avec les tests d'activité, certaines protéines ou des acides nucléiques, afin de mettre en évidence la présence, chez les personnes malades, d'une protéine ou d'une séquence d'ADN ou d'ARN particulière. Dans le cas des protéines, les méthodes actuellement utilisées consistent à introduire dans le milieu une grande quantité de sels qui entraînent la précipitation des protéines, puis à séparer protéines et sels par centrifugation. Mais ces méthodes sont très lourdes et, en outre, les protéines ainsi extraites sont souvent dénaturées, c'est-à-dire qu'elles ont perdu leurs propriétés biologiques. Ceci explique l'intérêt porté, depuis quelques années, aux latex magnétiques dans le domaine biomédical. En effet, les supports polymères sous forme de latex sont très utilisés car ils présentent de nombreux avantages, en particulier celui d'offrir une grande surface spécifique (plusieurs dizaines de m2) par gramme de particule. L'état de la technique peut être défini par les documents EP-A-0.106.873 et EP-A-0.446.260 qui décrivent des particules superparamagnétiques et monodisperses comprenant un noyau poreux à base de copolymère polystyrène/divinylbenzène dans lequel sont incorporés des grains d'oxyde de fer magnétique, et une couche externe fonctionnalisée susceptible d'interagir avec des sondes d'acides nucléiques. Selon le procédé de préparation des particules décrites dans ces documents, les oxydes de fer magnétiques sont incorporés par précipitation des sels correspondants, ce qui limite la proportion de charge magnétique incorporée, et ne permet d'obtenir la charge magnétique qu'en une monocouche en surface, ce qui peut induire des phénomènes d'inhibition des activités des biomolécules. De même, le document EP-A-O.5B5.868 décrit des particules magnétiques constituées par un noyau à base d'un premier polymère et d'une couche magnétique recouvrant le noyau constituée d'un second polymère dans lequel est distribué le matériau magnétique à base de ferrite, et capable d'interagir avec un antigène ou un anticorps, le matériau magnétique étant déposé par précipitation des sels de fer. Le matériau magnétique incorporé est directement exposé aux traitements ultérieurs des particules et il s' ensuit une perte de la charge au cours de l'utilisation des particules, ce qui peut entraîner des problèmes notamment d'inhibition enzymatique et de dénaturation d'entités biologiques. Selon l'article de A. KONDO, (A. KONDO, H. KAMURA, et K. HIGASHITANI (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, 99-105) un procédé d'obtention de particules magnétiques est connu, qui comprend un noyau à base d'un premier polymère consistant en un polystyrène et dans lequel est distribué un matériau magnétique, et une couche hydrophile recouvrant le noyau, à base d'un polymère thermosensible consistant en du poly(N-isoproprylacrylamide). Le procédé décrit comprend les deux étapes suivantes. Selon une première étape pour l'obtention du noyau magnétique, on met en contact le matériau magnétique avec du styrène en présence d'un amorceur de polymérisation. Selon une seconde étape pour l'obtention de la couche hydrophile, on met en contact le noyau obtenu avec du N- isoproprylacrylamide et de l'acide méthacrylique, en présence de l'amorceur de polymérisation précédent. Sur les particules ainsi obtenues, on fixe de la sérumalbumine bovine pour ensuite procéder à l'isolement d'anticorps dirigés contre la sérum albumine bovine, présents dans un échantillon. L'inconvénient de ces particules survient à l'étape de leur séparation ; ces particules incorporent une faible proportion de charge magnétique, qui ont une disposition hétérogène de cette charge magnétique dans le polymère, et sont en outre de tailles très variables, limitant considérablement l'efficacité d'un champ magnétique appliqué pour séparer les particules. De plus, lesdites particules ne sont efficaces que pour les protéines. La séparation des acides nucléiques n'est pas envisageable. Ainsi pour assurer une séparation aussi efficiente que possible de ces particules dans l'échantillon, les demandeurs ont eu recours à une thermofloculation selon laquelle on augmente la température de l'échantillon, qui intervient pour compléter l'action d'un champ magnétique. Il s'agit du document PCT/FR97/00912 qui propose des particules qui sont superparamagnétiques, qui ont une charge magnétique distribuée de manière très homogène, dont la proportion peut varier entre 1 et 80 %, en particulier de 25 et 80 % en poids par rapport au(x) polymère(s) constituant les particules. La présente invention permet d'atteindre des proportions de charge magnétique incorporée élevées, en particulier car le procédé employé permet de répartir la charge magnétique sous forme de multicouches. Il en résulte un avantage considérable à savoir la possibilité de séparer efficacement de l'échantillon, les particules de l'invention, sans avoir recours à l'action combinée d'une autre technique de séparation, telle que la floculation. Les propriétés des particules de l'invention résultent de leur structure et composition particulières et plus précisément à la présence d'un polymère thermosensible constitutif au moins pour supporter le matériau magnétique. Si ces particules répondent à la plupart des attentes des biologistes, elles comportent un certain nombre d'inconvénients. Ainsi ces particules ne permettent pas de séparer les protéines des acides nucléiques, ce qui peut être particulièrement intéressant en fonction des travaux entrepris (identification d'anticorps, amplification de séquences, etc). De plus, dans le cas de séparation d'acides nucléiques, les particules selon l'invention n'inhibent pas les différentes techniques d'amplification qui peuvent être utilisées (PCR, NASBA, TMA). Enfin, il n'est pas absolument nécessaire de relarguer les substances extraites (protéines ou acides nucléiques) par rapport aux particules, les tests d'identification ou d'amplification peuvent être effectués directement après la séparation magnétique. A cet effet, la présente invention concerne une particule magnétique et thermosensible, ayant une taille prédéterminée comprise entre 0,05 et 10 pm, qui comprend - un noyau composite interne, et - une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, caractérisée par le fait que le noyau interne est constitué d'une particule organique ou inorganique, contenant en son sein une charge magnétique, et que le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100C et de préférence entre 20 et 60"C. Dans un mode préférentiel de réalisation, 2. une couche intermédiaire est présente qui isole la charge magnétique du noyau interne par rapport à la couche externe fonctionnalisée. Quel que soit le mode de réalisation, le noyau interne est constitué par des grains de ferrite incorporés dans ledit noyau interne. Le (les) constituant(s) formant le noyau interne et/ou la couche intermédiaire est(sont) constitué(s) par au moins un polymère, tel qu'un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle. Le polymère externe est obtenu par polymérisation de - au moins un monomère hydrosoluble d'acrylamide et/ou d'un dérivé d'acrylamide, et - au moins un amorceur. Selon un mode préféré de constitution, le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - au moins un agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel. Selon un premier mode de réalisation, le polymère externe est le poly(NIPAM) obtenu par polymérisation de - N-isopropylacrylamine (NIPAM), et - au moins un amorceur cationique, tel que le chlorure d'azobis (2amidinopropane) (V50). Dans ce cas, le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - N,N'-méthylène bisacrylamide (MBA), comme agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel cationique, tel que chlorure de 2-aminoéthyl méthacrylate (MAE). Selon un second mode de réalisation, le polymère externe est le poly(NIPAM) obtenu par polymérisation de - N-isopropylacrylamine, et - au moins un amorceur anionique tel que le persulfate de potassium. Dans ce cas, le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - N,N'-méthylène bisacrylamide, comme agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel anionique, tel qu'un monomère carboxylique ou sulfate. Quel que soit le mode de réalisation, le polymère externe est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le poly(NIPAM). Selon ce premier mode de réalisation, le polymère externe est fonctionnalisé par un groupe amine protoné ou amidine. Selon ce second mode de réalisation, le polymère externe est fonctionnalisé par un groupe carboxylique ou sulfate. Dans tous les cas de figures, la particule est de forme essentiellement sphérique. La présente invention concerne également un procédé d'obtention de particules, telles que définies ci-dessus. Dans le cas où le procédé est utilisé pour l'obtention de particules telles que définies selon le premier mode de réalisation ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser des particules magnétiques cationiques en encapsulant par polymérisation, sur des noyaux composites, des monomères hydrosolubles d'acrylamide et/ou de dérivés d'acrylamide en présence du chlorure d'azobis (2-amidinopropane). Dans ce premier cas, la polymérisation s'effectue en présence de N, N' -méthylène bisacrylamide et/ou de chlorure de 2aminoéthyl méthacrylate. Dans le cas où le procédé est utilisé pour l'obtention de particules telles que définies selon le second mode de réalisation ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser des particules magnétiques anioniques en encapsulant par polymérisation, sur des noyaux composites, des monomères hydrosolubles d'acrylamide ou de dérivés d'acrylamide en présence de persulfate de potassium. Dans ce second cas, la polymérisation s'effectue en présence de N,N'-méthylène bisacrylamide et/ou de monomères carboxyliques. Dans tous les cas, préalablement à la polymérisation, on recouvre les particules magnétiques, obtenues par adsorption ou polymérisation, par au moins une substance qui isole la charge magnétique, telle que du polystyrène et/ou du polyméthacrylate de méthyle. Le procédé consiste - à disperser les noyaux composites dans de l'eau, et - à ajouter l'amorceur et les monomères hydrosolubles d'acrylamide et/ou d'un dérivé d'acrylamide. Il s'effectue en présence d'au moins un agent de réticulation et/ou d'au moins un agent stabilisant. Il consiste à utiliser les réactifs dans une proportion de - 10 à 30% de monomère hydrosoluble d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, - au plus 108 d'au moins un agent de réticulation, et - 1 à 5E d'au moins un agent stabilisant, par rapport à la masse totale de la particule obtenue par le procédé. La présente invention concerne enfin l'utilisation des particules telles que définies ci-dessus. Dans le cas d'une utilisation de particules telles que définies selon le premier mode de réalisation ci-dessus, il s'agit d'une utilisation de particules cationiques pour immobiliser ou extraire les acides nucléiques ou toutes entités polyélectrolytiques et pour relarguer et/ou analyser, après séparation magnétique, lesdits acides nucléiques ou entités, la température d'utilisation étant constamment inférieure à la LCST. Dans le cas d'une utilisation de particules telles que définies selon le premier mode de réalisation ci-dessus, il s'agit d'une utilisation de particules anioniques pour extraire les protéines par fixation sur les particules lorsque la température est supérieure à la LCST et pour relarguer et/ou analyser, après séparation magnétique, lesdites protéines lorsque la température est inférieure à la LCST. L'invention est à présent décrit dans les exemples I à IV suivants à l'appui des figures 1 à 7 selon lesquelles - la figure 1 représente l'influence de la température sur l'adsorption de la protéine HSA sur des particules de l'invention, pour deux valeurs de température, 20"C (O) et 400C (g), à un pH de 4,7 et une force ionique de 0,01 mole/l - la figure 2 représente l'influence du temps d'adsorption de la protéine HSA sur des particules de l'invention, sur la quantité de protéine adsorbée, à une température de 40"C, un pH de 4,7 et une force ionique de 0,01 mole/l, pour une concentration initiale de HSA de 0,14 g/l - la figure 3 représente l'influence du pH sur l'adsorption de la protéine HSA sur des particules de l'invention, pour trois valeurs de pH, 5,7 (O), 4,7 ( - la figure 4 représente l'influence de la force ionique sur l'adsorption de la protéine HSA sur des particules de l'invention, pour un pH de 4,7 et une concentration initiale de HSA de 0,14 g/l (O) et pour un pH de 8,6 et une concentration initiale de HSA de 0,04 g/18,6 ((), à une température de 40"C - la figure 5 représente l'influence de la masse de latex introduite sur la quantité de protéine HSA adsorbée sur des particules de l'invention, à une température de 400C, un pH de 4,7, une force ionique de 0,01 mole/l et une concentration initiale de HSA de 0,14 g/l - la figure 6 représente l'influence de la force ionique sur la désorption de la protéine HSA des particules de l'invention, la protéine ayant été adsorbée dans les conditions suivantes température 40"C, pH 4,7, force ionique 0,01 mole/l, concentration initiale HSA 0,1 g/l et temps d'adsorption 10 min, et la désorption étant réalisée dans les conditions suivantes : température 20"C, pH 8,6, force ionique variable et temps de désorption 2 heures - la figure 7 représente l'influence du temps de désorption sur la quantité de protéine HSA désorbée des particules de l'invention, pour trois valeurs de temps, 2 heures (-), 3 heures (+) et 15 heures (O), à une température de 20wu, un pH de 8,6 et une force ionique de 0,1 mole/l. EXEMPLE I - Encapsulation des noyaux composites ou particules magnétiques commerciales De nombreuses particules magnétiques sont commercialisées. La surface de ces particules est anionique ou cationique. En revanche, leur composition n'est jamais détaillée. Ces particules possèdent un indice de polymolécularité variable. En effet, les particules Seradyn, Spherotec et Dynal sont monodisperses alors que celles de chez Estapor, bien qu'ayant un diamètre moyen de 1 mm, sont très polydisperse. Toutes ces particules ont été testées dans les procédés d'amplification d'acides nucléiques et elles engendrent des réactions d'inhibition. Il est donc nécessaire de modifier leur surface pour pouvoir travailler sur les acides nucléiques. A/ Préparation du latex magnétique hydrophile cationique Les réactions d'encapsulation ont été réalisées sous atmosphère d'azote et à 70"C. 1 g de particules semence a été dilué avec 40 ml d'eau milliQ préalablement chauffée à ébullition et dégazée sous azote. Le styrène a été ajouté simplement lorsque les particules semence sont hydrophobes. Il a été ajouté seul, avant le début de la synthèse, et laissé un certain temps, par exemple entre 30 et 60 minutes, en contact avec le noyau magnétique composite. Les monomères ont été introduits dans les proportions suivantes: - NIPAM: 0,3254 g soit 32,5E / semence (80%/polymère si la semence contient 60% de ferrite), - MBA: 0,0274 g soit 6,18 mol%/NIPAM, - MAE: 0,0740 g soit 15,5 mol%/NIPAM, et - V50: 0,0061 g soit 0,80 molE/NIPAM. Il y a nécessité d'ajouter un tensioactif, par exemple, de 0,14 g de Triton X405. L'amorceur est introduit avec 1 ml d'eau. Les monomères sont ajoutés par la suite. Ils sont dilués dans 9 ml et ils sont introduits progressivement dans le réacteur, c' est-à-dire dans un intervalle de temps de 15 minutes, ou ils sont introduits d'un seul coup dès l'ajout de l'amorceur. Dans le cadre de la présente invention, des noyaux composites Estapor ont été encapsulées. Des particules anioniques (les particules EM1 100/20 et EM1 100/30) et des particules cationiques (les particules R95-07) ont été utilisées. Les particules préparées à partir des latex EM1 100/20 et EM1 100/30 ont permis d'obtenir une densité de charge comprise entre 50 et 300 millimoles de NH2 (mmol NH2) par gramme de latex, suivant le mode de polymérisation utilisé (réacteur fermé, addition différé ou en continu). Les particules préparées à partir du latex R95-07 ont permis d'obtenir une densité de charge comprise entre 50 et 300 mmol NH2 par gramme de latex, suivant le mode de polymérisation. Selon le protocole d'addition des monomères dans le système de réaction, on peut différencier plusieurs méthodes de polymérisation. 1 - Polymérisation à réacteur fermé appelée " batch Les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. En raison de la différence de réactivité des monomères, ce procédé conduit souvent à l'apparition d'une dérive de composition Celle-ci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode s'avère peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymérisation est effectuée en batch " avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en grand nombre, mais avec une conversion limitée. Ce comportement est lié à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et il est attribué à la prépondérance du mécanisme de nucléation homogène. 2 - Polymérisation en semi-continu Une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une vitesse fixe ou bien suivant un profil donné. Le but est de contrôler l'addition du mélange des monomères de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée ; c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition. Ceci permet d'obtenir des copolymères homogènes en composition. 3 - Polymérisation par addition différée appelée shot " : Lors d'une copolymérisation, et une fois que la réaction est en cours, le monomère fonctionnel seul, ou en présence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymérisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation superficielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface. 4 - Polymérisation sur semence Elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné pur ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en semi-continu. Parmi les différentes techniques de polymérisation précitées, seules la polymérisation en réacteur fermé et la polymérisation sur semence ont été utilisées. B/ Préparation du latex magnétique hydrophile anionique Les latex utilisés sont constitués d'un coeur de polystyrène et de ferrite, ce qui leur confère des propriétés magnétiques. Ils sont en outre recouverts, par polymérisation, de N isopropylacrylamide (NIPAM). Un réticulant, le méthylènebisacrylamide (MBA) est ajouté. L'amorceur utilisé est le persulfate de potassium (K2S20e ou KPS), ce qui explique la présence de groupements sulfates en surface du latex, et donc son caractère anionique. EXEMPLE II - Séparation des acides nucléiques Cette invention a pour finalité de mettre au point un nouveau modèle de test de diagnostic, qui devrait permettre de déceler de manière très précoce la présence de gènes infectieux chez un individu. Il s'agit d'établir un protocole permettant d'extraire spécifiquement des ADN ou des ARN de manière à pouvoir les doser tout en ayant au préalable éliminé les protéines présentes en grande quantité dans le milieu de prélèvement. Le support choisi doit dans une première étape ne pas induire de réaction d'inhibition des procédés d'amplification des ADN et des ARN, de type PCR, NASBA ou TMA. Cette étape étant positive, le support devra être capable d'isoler spécifiquement des acides nucléiques en quantité suffisante. Le support doit donc être hydrophile et ne pas relarguer de substances inhibitrices des réactions d'amplification. Cette étude consiste à obtenir des latex magnétiques cationiques recouverts d'une chevelure hydrophile constituée de Nisopropylacrylamide (NIPAM) et fonctionnalisée par le chlorure de 2aminoéthyl méthacrylate (AEM). La surface des noyaux composites ou particules commerciales a été modifiée et les noyaux ou particules ont été encapsulées. Les principales particules disponibles sont les particules de Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec ou Estapor (marques déposées). La demande de brevet FR96/04691, déposée le 9 avril 1996 par le demandeur, concerne une telle séparation des acides nucléiques. Son contenu est donc intégré à la présente demande de brevet. EXEMPLE III - Séparation des protéines L'intérêt des latex est d'être non seulement thermosensible mais aussi magnétique, ce qui permet d'éviter les étapes de centrifugation. Un simple aimant de laboratoire permet de séparer les particules magnétiques du reste du milieu. Cette technique présente donc l'intérêt d'être plus rapide et plus facilement automatisable dans la perspective d'une éventuelle utilisation industrielle. Dans un premier temps, il est nécessaire d'optimiser les conditions physico-chimiques permettant de concentrer des solutions contenant l'albumine humaine (HSA : Human Serum Albumine), protéine modèle. Dans un deuxième temps, il faut trouver les conditions qui permettent de concentrer l'ensemble des protéines présentes dans les urines. Les tests sur des solutions préparées à partir de HSA seule ont été réalisés avec un coeur EM1 070/60 alors que les applications sur les urines ont été réalisées avec un coeur EM1 100/20. Après lavage des noyaux composites à l'eau MilliQ (eau purifiée sur le système de purification Millipore-MilliQ) dégazée et boullie sous azote pendant 1 heure, 1 g de latex Estapor en solution dans 40 3 cm d'eau est introduit dans le réacteur, maintenu pendant toute l'expérience à 700C et sous courant d'azote. Après ajout de 200 ml de styrène, on laisse gonfler pendant 2 heures. 0,0061 g de KPS sont dissous dans 1 ml d'eau. Puis, toutes les minutes, on ajoute 1 ml d'une solution de 0,325 g de NIPAM, 0,027 g de MBA et 0,14 g de Triton (X-405) dans 9 ml d'eau ; ce mélange est laissé à l'agitation pendant au moins 10 heures. Il y a ensuite le lavage du latex. Cette opération a pour but d'éliminer le tensioactif, ainsi que les électrolytes et les chaînes polymères libres en solution. En effet, le tensioactif peut entraîner des perturbations avec le réactif de Bradford (méthode chimique utilisée pour doser les protéines) et peut diminuer les capacités d'adsorption des latex. Le latex utilisé étant magnétique, il est très facile, en utilisant un aimant, d'enlever le surnageant, de le remplacer par de l'eau milliQ fraîchement permutée, puis de l'agiter vigoureusement en utilisant un vortex. On recommence ce lavage jusqu'à ce que le surnageant soit limpide (on peut aussi vérifier que la conductivité du latex après le dernier lavage est pratiquement aussi faible que la conductivité de l'eau milliQ (= 0,02 mS)). A/ L'albumine du sérum humain (HSA) HSA est une protéine modèle pour étudier différents paramètres, tels que pH, force ionique, permettant de concentrer la protéine au maximum. Il s'agit d'une protéine ellipsoïdale de dimensions approximatives 4 x 4 x 14 nm et de poids moléculaire voisin de 62000 g/mol. Son potentiel zéta (mesure physico-chimique relative à la densité de charge à la surface de la particule) varie avec le pH : la protéine HSA est cationique pour pH PI. B/ Méthodes de mesure de la concentration en protéines Le dosage des protéines, par exemple la HSA, est effectué en utilisant le réactif de Bradford. Ce dosage est possible grâce à l'utilisation du bleu de Coomassie (G 250) qui forme un complexe avec les protéines (initialement brun, il se colore en bleu d'autant plus vif que la concentration en protéines augmente) . Le complexe protéine/colorant a un coefficient d'extinction très élevé, ce qui permet d'avoir une méthode très sensible. De plus, la coloration est quasi-instantanée, ce qui permet un dosage rapide. Tous les dosages Bradford sont réalisés dans les mêmes conditions : 15 ul de la solution dont on veut déterminer la concentration en protéines + 135 ul du tampon adéquat (pH et force ionique voulus) + 150 pl de réactif de Coomassie. 1 - Détermination de la quantité adsorbée La quantité de protéines adsorbées Ns est donnée par la formule suivante -l Ns (mg.g ) = V (Ci-Cf) / m avec Ci (mg/ml) = concentration initiale en protéines de la solution en contact avec le latex Cf = concentration finale HSA dans le surnageant après adsorption ; V (ml) = volume total de la solution m (g) = masse de latex dans la solution. 2 - Détermination de la quantité désorbée Si les protéines étaient initialement adsorbées sur une masse m (en g) de latex et que, après désorption dans un volume V (ml), on détermine par dosage Bradford une concentration C (mg.ml ) de protéine, alors la quantité désorbée est donnée par -l Ns (mg.g ) = V*C / m C/ Optimisation des paramètres 1 - Adsorption de la protéine HSA Dans cette partie, on détermine les valeurs du pH, de la force ionique et de la température permettant d'adsorber sur les particules de latex le maximum de protéines. a. Mode opératoire Les expériences sont réalisées dans des tubes Eppendorf (contenance maximale : 1,5 ml). Volume de latex : 100 pl (soit 2,1 mg) Volume de la solution de HSA : 200 pl (masse variable) Volume de tampon : 700 pl Etant donné que l'on introduit 0,2 ml de solution de HSA de concentration donnée pour un volume total de 1 ml, la concentration réelle de la solution de HSA en contact avec le latex est obtenue après correction par un facteur de dilution de 0,2. b. Influence de la température L'influence de la température sur l'adsorption est notable, indépendamment du pH. La figure 1 montre la variation de la quantité de protéines adsorbées en fonction de la concentration initiale en protéines, à deux températures différentes, pour un pH=4,7 et une force ionique de 0,01 mol/l. La même tendance est observée à pH 5,7 (à 200C, l'adsorption est 30 % plus faible qu'à 40"C) et à pH 8,6. Puisque seule la nature hydrophile/hydrophobe du latex varie avec la température, cette étude permet de mettre en évidence l'influence des interactions hydrophobes sur l'adsorption. Le fait que les courbes soient confondues pour les premiers points pourrait être dû au mode opératoire. Pour tester l'adsorption à 400C, latex, protéines et tampon ont été mélangés à température ambiante puis chauffés jusqu'à 400C. Il se peut donc que, pour les faibles concentrations en HSA, alors que nous pensions adsorber à 40"C, les protéines s'adsorbent sur le latex dans sa forme hydratée car T c. Influence du temps d'adsorption Dans les conditions jugées optimales pour l'adsorption, on réalise une étude cinétique de la quantité adsorbée en fonction du temps d'incubation. La figure 2 montre que, au bout de 30 minutes, on a déjà adsorbé pratiquement la quantité maximale possible. d. Influence du pH L'adsorption a été réalisée pour les pH 4,7, 5,7 et 8,6 pour -l des concentrations en HSA comprises entre 0 et 0,2 g.l . Pour l'adsorption à pH=8,6, on ne peut tracer la courbe pour (HSA) > 0,06 g.l car la quantité adsorbée étant très faible, (Ci - Cf) est quasiment nulle, et la méthode de mesure n'est pas assez précise pour détecter cette petite variation. En superposant les trois courbes obtenues, on obtient le graphe de la figure 3 qui met en évidence i) l'existence d'un palier pour une adsorption de 50 mg de protéines par g de latex (saturation des sites d'adsorption) ii) une adsorption maximale pour pH=4,7. Ce résultat est en accord avec l'influence des interactions électrostatiques : pour pH PI, la protéine et le latex sont anioniques, d'où une répulsion électrostatique qui réduit la quantité de HSA adsorbée. Cette étude met donc en évidence l'influence des forces électrostatiques sur l'adsorption. e. Influence de la force ionique Les courbes donnant la quantité adsorbée en fonction de la force ionique, pour une même concentration initiale en protéine, sont reproduites sur la figure 4. i) pH=4,7 et (HSA)=0,14 mg.ml 1 et T=40"C Cette courbe montre que l'adsorption est maximale pour une force ionique faible ; ceci est en accord avec des interactions électrostatiques attractives, qui favorisent d'autant plus l'adsorption qu'elles sont moins écrantées au fur et à mesure que la salinité du milieu diminue. -l ii) pH=8,6 et (HSA)=0,04 mg.ml et T=400C Cette courbe montre que l'adsorption est maximale pour une force ionique élevée ; à pH basique, les interactions électrostatiques sont répulsives, donc l'adsorption est d'autant plus grande que ces interactions sont écrantées. f. Influence de la quantité de latex La figure 5 montre que, pour 0,14 mg de HSA et un latex de taux de solide 2,1 %, on atteint un palier de la quantité adsorbée pour un volume de 0,125 ml de latex (soit 2,6 mg). Ce palier correspond à approximativement 50 mg de protéines par gramme de latex soit, en supposant que les particules de latex ont un diamètre voisin de 1 mm et une densité de 1,85 g/cm (#=3,24 m/g) : 15 mg de HSA 2 par m de polymère. Ce résultat est dans la moyenne attendue. C'est donc ce rapport (environ 2 mg de latex pour 0,1 mg de protéines) qui sera utilisé par la suite. g. Bilan pour l'adsorption Les paramètres optimisés pour l'adsorption sont donc pli=4,7 Fi=0,01 mol/l T=40"C t=lOmn D/ Désorption de la protéine HSA : L'adsorption est réalisée dans les conditions optimales déterminées ci-dessus, puis on étudie les paramètres qui gouvernent la désorption. Les premiers tests de désorption ont été réalisés dans des tubes Eppendorf. Tout d'abord, l'adsorption est conduite dans les conditions définies ci-dessus (on vérifie que la quasi-totalité des protéines présentes dans le milieu sont adsorbées). Le surnageant est ensuite soutiré puis remplacé par 1 ml de la solution dont on veut étudier la capacité à favoriser la désorption. Après un temps de désorption variable, la mesure de la densité optique de ce nouveau surnageant permet de déduire la quantité de HSA désorbée, donc l'influence du temps de désorption. La désorption se fait mieux à pH basique qu'à pH acide, et à 20"C mieux qu'à 40"C, ce qui était prévisible d'après l'influence du pH et de la température. En outre, nous avons choisi un temps d'adsorption faible (= 10 mn) a été choisi car ce délai est suffisant pour adsorber la quasi-totalité des protéines, et que, plus les protéines restent en contact avec le latex, moins la désorption est importante. L'influence d'autres paramètres était moins évidente, et les résultats obtenus sont détaillés ci-dessous. 1 - Influence de la force ionique La figure 6 montre l'influence de la force ionique du tampon sur la désorption. Cette courbe fait apparaître la présence d'un maximum de désorption pour une force ionique proche de 0,1 mol.l . Ce résultat est assez surprenant. A pH basique, le latex et HSA sont anioniques, donc les forces électrostatiques sont répulsives. Afin d'augmenter la désorption, il ne faut pas les écranter ; il faut a priori une force ionique faible. Mais, d'autre part, lorsque la force ionique augmente, la chevelure de polyNIPAM se trouve en mauvais solvant, donc se contracte, et les protéines se rapprochent. Comme elles portent la même charge négative, la répulsion électrostatique entraine la désorption d'une certaine quantité de protéines. L'existence de deux phénomènes d'influences opposées justifie l'existence d'un maximum. 2 - Influence du temps de désorption La figure 7 montre que la quantité désorbée augmente légèrement lorsque le temps de désorption augmente. On a cependant choisi un temps de désorption assez faible (2h) pour des raisons pratiques on désorbe ainsi environ 15E de moins que ce que l'on pourrait obtenir. 3 - Bilan pour la désorption Les paramètres optimisés pour la désorption sont donc pH > 8,6 Fi=0,l mol/l T=20"C t > 2h E/ Bilan : concentration de solutions contenant de la HSA L'adsorption est réalisée pour un volume total de 10 ml, dans les conditions optimales, dans des tubes "Falcon". Pour cela, après préparation d'une solution de HSA, dans un tampon de pH=4,7 et de force ionique 0,01 mol/l, de concentration telle que la concentration de protéines réellement en contact avec le latex soit -l de 0,1 g.l 1 compte tenu de la dilution, on introduit 27 mg de latex. La quantité adsorbée est environ 0,095 mg.ml 1 (soit 95% des protéines initialement présentes). Après séparation par utilisation d'un aimant, la désorption est ensuite réalisée en introduisant 1 ml de tampon de pH=8,6 puis pH=10,8. Dans le premier cas, la solution obtenue a une concentration en HSA égale à 0,23 mg.ml 1 (on désorbe -l 24E de la quantité adsorbée) et 0,37 mg.ml (on désorbe 39%) dans le second. La concentration initiale peut donc, dans ces conditions, être multipliée au maximum par 3,7. EXEMPLE IV - APPLICATION AUX URINES A/ Remarque générale Les études préliminaires ont été effectuées sur un milieu extrêmement simple : une seule protéine, de concentration connue, dans un milieu tamponné dont tous les paramètres ont été déterminés. En revanche, les urines constituent un milieu très complexe, contenant plusieurs dizaines de protéines de poids moléculaires différents, et riche en sels. Cependant, pour établir la concentration en protéines des urines à partir de la densité optique, on a utilisé les courbes d'étalonnage établies pour HSA les résultats obtenus sont donc qualitatifs. De plus, le pH et la concentration en protéines des urines dépendent des personnes et de leur alimentation. Il est donc nécessaire de déterminer ces valeurs pour chaque lot d'urine utilisé. B/ Résultats pour des urines de témoins négatifs La première série d'expériences a été réalisée en utilisant les conditions des tests préliminaires. Dans la deuxième série, certaines étapes ont été modifiées en fonction des résultats de la première série. 1 - Mode opératoire Après introduction dans des tubes "Falcon" de 10 ml des urines à concentrer et de 27 mg de latex, le mélange est placé au bainmarie à 40"C pendant un temps variable. Ensuite, le surnageant est soutiré, puis remplacé par 1 ml de tampon à pH=4,7, que l'on enlève presque instantanément : cette opération a pour but de laver le latex, sans désorber. Après ajout de 1 ml de tampon de pH=10,6 et force ionique 0,01M, on laisse désorber à 20"C pendant un temps tD. Le dosage Bradford du surnageant permet de déterminer la concentration totale en protéines désorbées. 2 - Dosage des protéines (par Bradford) Le pH des urines étudiées est voisin de 7 et la concentration initiale en protéines (pour le lot utilisé) est de l'ordre de 0,02 g.l . L'analyse des surnageants montre que 1) il est nécessaire d'acidifier les urines ; à leur pH naturel proche de 7, l'adsorption n'atteint pas 508 des protéines présentes, alors qu'elle approche les 809 dans les urines acidifiées à pH=4,6 2) l'étape de lavage entraîne la perte d'environ 208 des protéines adsorbées ; cette étape a donc été supprimée dans les expériences suivantes. L'étude de l'influence du temps d'adsorption et de désorption montre que, contrairement aux résultats obtenus lors de l'étude préliminaire sur HSA, il est nécessaire d'adsorber pendant au moins 60 mn pour atteindre le palier d'adsorption. Après un temps de désorption de 60 mn dans un volume de 1 ml, la solution obtenue est 4 fois plus concentrée en protéines que les urines de départ. Ce résultat est assez satisfaisant puisqu'il est en accord avec les tests de concentration de HSA seule. Le but final consistant à isoler la protéine d'intérêt, il convient d'analyser les différents échantillons ainsi obtenus sur gel d'électrophorèse, pour mettre en évidence la ou les différentes protéines. Une étude préliminaire a permis de vérifier que l'utilisation de particules de latex magnétiques et thermosensibles permet, en jouant sur différents paramètres physiques (pH, température, force ionique), d'adsorber et de désorber l'albumine humaine (HSA). Il est ainsi possible, à partir d'une solution de 10 ml diluée de cette protéine, de passer à une solution de 1 ml environ 4 fois plus concentrée. En optimisant les paramètres, il est possible d'adsorber jusqu'à 95% des protéines. Le fait que l'on ne puisse concentrer plus est dû à une désorption incomplète. Afin d'augmenter ce taux de désorption, il est envisageable d'ajouter des tensioactifs susceptibles de s'échanger avec les protéines adsorbées. L'application des conditions de concentration optimales pour HSA aux urines permet d'obtenir des résultats semblables. Il est possible de multiplier par quatre la concentration en protéines d'un lot d'urines en désorbant dans un tampon approprié. En lyophilisant les échantillons ainsi concentrés, on peut obtenir un facteur multiplicatif de 100, proche du taux de concentration obtenu par la méthode de précipitation au sulfate d'ammonium. Cependant, la solution obtenue après lyophilisation est trop concentrée en sels. Une étape de dialyse serait donc nécessaire afin de remplacer le tampon de force ionique 0,1 mol/l par un milieu moins salin, à moins que l'on ne décide de désorber dans un milieu de force ionique presque nulle, quitte à ne désorber qu'une plus faible quantité de protéines. REVENDICATIONS 1. Particule magnétique et thermosensible, ayant une taille prédéterminée comprise entre 0,05 et 10 10ut, qui comprend - un noyau composite interne, et - une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, caractérisée par le fait que le noyau interne est constitué d'une particule organique ou inorganique, contenant en son sein une charge magnétique, et que le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 1000C et de préférence entre 20 et 60"C. 2. Particule, selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'une couche intermédiaire est présente qui isole la charge magnétique du noyau interne par rapport à la couche externe fonctionnalisée. 3. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que le noyau interne est constitué par des grains de ferrite incorporés dans ledit noyau interne. 4. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisée par le fait que le (les) constituant(s) formant le noyau interne et/ou la couche intermédiaire est(sont) constitué(s) par au moins un polymère, tel qu'un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle. 5. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que le polymère externe est obtenu par polymérisation de - au moins un monomère hydrosoluble d'acrylamide et/ou d'un dérivé d'acrylamide, et - au moins un amorceur. 6. Particule, selon la revendication 5, caractérisée par le fait que le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - au moins un agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel. 7. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait que le polymère externe est le poly(NIPAM) obtenu par polymérisation de - N-isopropylacrylamine (NIPAM), et - au moins un amorceur cationique, tel que le chlorure d'azobis (2-amidinopropane). 8. Particule, selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée par le fait que le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - N,N'-méthylène bisacrylamide, comme agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel cationique, tel que chlorure de 2-aminoéthyl méthacrylate. 9. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait que le polymère externe est le poly(NIPAM) obtenu par polymérisation de - N-isopropylacrylamine, et - au moins un amorceur anionique tel que le persulfate de potassium. 10. Particule, selon l'une quelconque des revendications 6 ou 9, caractérisée par le fait que le polymère externe est obtenu par polymérisation en présence de - N, N' -méthylène bisacrylamide, comme agent de réticulation, et/ou - au moins un monomère fonctionnel anionique, tel qu'un monomère carboxylique ou sulfate. 11. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée par le fait que le polymère externe est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le poly(NIPAM). 12. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 8, caractérisée par le fait que le polymère externe est fonctionnalisé par un groupe amine protoné ou amidine. 13. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 9 ou 10, caractérisée par le fait que le polymère externe est fonctionnalisé par un groupe carboxylique ou sulfate. 14. Particule, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 13, caractérisée par le fait qu'elle est de forme essentiellement sphérique. 15. Procédé d'obtention de particules, telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, 11, 12 ou 14, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser des particules magnétiques cationiques en encapsulant par polymérisation, sur des noyaux composites, des monomères hydrosolubles d'acrylamide et/ou de dérivés d'acrylamide en présence du chlorure d'azobis (2amidinopropane). 16. Procédé, selon la revendication 15, caractérisé en ce que la polymérisation s'effectue en présence de N,N'-méthylène bisacrylamide et/ou de chlorure de 2-aminoéthyl méthacrylate. 17. Procédé d'obtention de particules, telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 9 à 11, 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser des particules magnétiques anioniques en encapsulant par polymérisation, sur des noyaux composites, des monomères hydrosolubles d'acrylamide ou de dérivés d'acrylamide en présence de persulfate de potassium. 18. Procédé, selon la revendication 17, caractérisé en ce que la polymérisation s'effectue en présence de N,N'-méthylène bisacrylamide et/ou de monomères carboxyliques. 19. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que, préalablement à la polymérisation, on recouvre les particules magnétiques, obtenues par adsorption ou polymérisation, par au moins une substance qui isole la charge magnétique, telle que du polystyrène et/ou du polyméthacrylate de méthyle. 20. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce qu'il consiste - à disperser les noyaux composites dans de l'eau, et - à ajouter l'amorceur et les monomères hydrosolubles d'acrylamide et/ou d'un dérivé d'acrylamide. 21. Procédé, selon la revendication 20, caractérisé en ce outil il s'effectue en présence d'au moins un agent de réticulation et/ou d'au moins un agent stabilisant. 22. Procédé, selon la revendication 21, caractérisé en ce gtil consiste à utiliser les réactifs dans une proportion de - 10 à 30E de monomère hydrosoluble d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, - au plus 10E d'au moins un agent de réticulation, et - 1 à 5% d'au moins un agent stabilisant, par rapport à la masse totale de la particule obtenue par le procédé. 23. Utilisation de particules cationiques, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, 11, 12 ou 14, pour immobiliser ou extraire les acides nucléiques ou toutes entités polyélectrolytiques et pour relarguer et/ou analyser, après séparation magnétique, lesdits acides nucléiques ou entités, la température d'utilisation étant constamment inférieure à la LCST. 24. Utilisation de particules anioniques, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 9 à 11, 13 ou 14, pour extraire les protéines par fixation sur les particules lorsque la température est supérieure à la LCST et pour relarguer et/ou analyser, après séparation magnétique, lesdites protéines lorsque la température est inférieure à la LCST.