FR 2790959 A1 20000922 FR 9903153 A 19990315 La présente invention concerne l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un antigène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à orienter la réponse immunitaire vers une réponse de type Th1 et/ou de type mixte Thl/Th2 dirigée contre ledit antigène ou haptène. L'invention comprend en outre des procédés de préparation desdites fractions membranaires et les compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications à la prévention et au traitement de maladies infectieuses, en particulier les infections à paramyxovirus tels que le VRS, et les cancers, notamment ceux dont les tumeurs sont associées à des antigènes tumoraux. La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire notamment les infections. Le succès des campagnes de vaccination dans ce domaine a permis d'étendre le concept des vaccins aux domaines des maladies auto-immunes, du cancer et de la fertilité. En revanche, les antigènes vaccinants ne sont pas toujours capables d'induire seuls une réponse anticorps rapide et soutenue, ce qui requiert la présence d'adjuvants, c'est-à-dire de composés qui les aident (du latin adjuvare : aider) à induire de telles réponses. Les adjuvants constituent un groupe de composés variés quant à leur structure et leur origine. Ainsi l'on trouve, entre autres, dans cette catégorie aussi bien des émulsions eau dans huile (adjuvant incomplet de Freund) ou huile dans eau, des composés d'origine bactérienne comme des dérivés du lipopolysaccharide des bactéries à Gram négatif, que des sels d'aluminium. A l'heure actuelle, seuls les sels d'aluminium sont employés chez l'homme comme adjuvant de préparations vaccinales. La mise en place d'une réponse anticorps dirigée contre un antigène nécessite une série d'événements complexes. Elle met en jeu des cellules présentant l'antigène, des lymphocytes T régulateurs (Th pour T "helper") et des lymphocytes B producteurs d'anticorps. Deux types de lymphocytes Th peuvent être distingués selon le profil de cytokines produites : lymphocytes Th de type 1 produisant de l'IFN-y et de l'IL-2 et favorisant la formation d'IgG2a chez la souris, et lymphocytes Th de type 2 produisant de l'IL-4, IL-5 et IL-10 avec formation d'IgGl chez la souris (Mosmann, T. R. and Sad S. Immunol. Today 1996, 17:138). Par ailleurs, il a été montré que, pour un même antigène donné, c'est l'adjuvant qui oriente vers l'isotype majoritaire lors de la réponse anticorps (Tocllner K. -M. et al. J. Exp. Med. 1998, 187:1193). Ainsi, il est connu que les sels d'aluminium, comme l'Alhydrogcl, induisent chez la souris une réponse essentiellement de type Th2 et favorisent la formation d'IgG1voire d'IgE (Allison A. C. In Vaccine design - The rôle of cytokine networks Vol. 293, 1-9 Plenum Press 1997), ce qui peut poser des problèmes chez des sujets à terrain allergique. De plus, en fonction de la cible thérapeutique visée, une réponse de type Thl ou mixte (Thl/Th2) peut être désirée. Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer de nouveaux adjuvants capables d'induire une réponse immune de type Thl ou mixte (Thl/Th2). De manière surprenante, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence des propriétés particulières de la fraction membranaire d'une bactérie à gram négatif Klebsiella pneumoniae (dénommée FMKp), notamment des fractions membranaires obtenues par les procédés tels que décrits ci-après dans les exemples. Les auteurs ont en effet découvert que ladite fraction membranaire FMKp associée à un antigène avait non seulement la capacité d'augmenter la réponse anticorps dirigée contre ledit antigène mais également de réorienter la réponse cytokinique vers un profil Thl/Th2, correspondant ainsi à l'activité adjuvante particulière recherchée, et ce quel que soit le mode d'administration desdites fractions membranaires. Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un antigène ou haptène pour orienter la réponse immunitaire vers une réponse de type Thl et/ou de type mixte Thl/Th2 dirigée contre ledit antigène ou haptène, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à orienter la réponse immunitaire vers une réponse de type Thl et/ou de type mixte Thl/Th2 dirigée contre ledit antigène ou haptène. L'invention concerne également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la fraction membranaire comprend au moins des fractions membranaires de deux souches différentes de bactéries. Par fraction membranaire de bactérie, on entend désigner dans la présente invention toute fraction ou extrait membranaire purifié ou partiellement purifié obtenu à partir d'une culture de ladite bactérie et dont le procédé de préparation comprend au moins une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation de la fraction contenant les membranes desdites bactéries du lysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Par fraction membranaire de bactérie lorsque ladite bactérie est Klebsiella pneumoniae, on entend désigner également dans la présente invention la protéine P40, fraction active de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae, de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2, ou l'un de ses fragments. Selon l'invention, les fractions membranaires pourront être préparées selon les méthodes connues de l'homme de l'art telles que par exemple la méthode décrite par par Haeuw J. F. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998). Selon un mode de réalisation particulier, l'invention est relative à une utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la fraction membranaire est préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie d'une centrifugation de ladite culture ; b) le cas échéant, désactivation des enzymes lytiques du culot de bactéries obtenu à l'étape a), puis centrifugation de la suspension obtenue ; c) extraction et élimination des protéines non membranaires et des acides nucléiques du culot obtenu à l'étape a) ou b) par au moins un cycle de lavage du culot dans une solution d'extraction ; d) digestion du culot de membranes obtenu à l'étape c) en présence d'enzymes protéolytiques suivie d'une centrifugation ; e) au moins un cycle de lavage du culot obtenu à l'étape d) dans une solution physiologique et/ou dans de l'eau distillée ; et f) ultra-sonication du culot obtenu à l'étape e). L'étape b) de désactivation des enzymes lytiques du culot de bactéries obtenu à l'étape a) peut être réalisée par toutes méthodes connues de désactivation d'enzymes, telles qu'en particulier par chauffage du culot bactérien remis en suspension à une température de préférence voisine de 100 C, ou par addition d'inhibiteur de l'activité de ces enzymes. L'étape c) d'extraction et d'élimination des protéines non membranaires et des acides nucléiques du culot obtenu à l'étape a) ou b) peut être réalisée par exemple par au moins un cycle de lavage du culot dans une solution d'extraction correspondant à l'addition d'une solution hypertonique (solution d'extraction), de préférence une solution saline de molarité voisine de 1 M, suivie après un temps de contact suffisant pour l'effet désiré d'une centrifugation de la suspension obtenue et de l'élimination du surnageant obtenu après ladite centrifugation, ce cycle de lavage pouvant être reproduit plusieurs fois. L'étape d) de digestion du culot de membranes obtenu à l'étape c) peut être réalisée en présence d'une solution d'enzymes protéolytiques telles que par exemple la trypsine, la chymiotrypsine ou toute enzyme à activité protéolytique connue, les conditions de la réaction, pH de la solution, température et durée de la réaction, étant de préférence ajustées aux conditions optimales pour l'activité de ou des enzymes choisies, suivie d'une centrifugation, ce cycle de digestion pouvant être reproduit plusieurs fois avec la même enzyme, la même combinaison d'enzymes ou avec une enzyme différente pour chaque cycle de digestion effectué. L'étape e) de lavage du culot obtenu à l'étape d) est réalisée par reprise du culot en dans une solution physiologique ou dans de l'eau distillée suivie, après un temps de contact suffisant, d'une centrifugation, ce cycle de lavage pouvant être reproduit plusieurs fois. Enfin, l'étape f) d'ultra-sonication, du culot a pour objectif en particulier de désintégrer et d'homogénéiser la fraction membranaire obtenue en fin d'étape e). Les conditions d'ultra-sonication (durée et puissance) seront déterminées par l'homme de l'art en fonction par exemple de la quantité de fraction membranaire à traiter. Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention est relative à une utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la fraction membranaire est préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie le cas échéant d'une centrifugation ; b) la congélation du milieu de culture ou du culot obtenu à l'étape a) suivie d'une décongélation et du séchage des cellules ; c) élimination au moyen d'une DNase des acides nucléiques des cellules sèches obtenues à l'étape b) remises en suspension ; d) broyage des cellules obtenues à l'étape c) et clarification de la suspension obtenue : c) précipitation en milieu acide de la suspension obtenue l'étape d) et élimination du culot ; f) neutralisation du surnageant obtenu à l'étape e) contenant la suspension membranaire, suivie d'une dialyse et d'une concentration de la suspension membranaire ; et g) stérilisation de la suspension membranaire concentrée obtenue à l'étape f). Les conditions de décongélation à l'étape b) du procédé ci-dessous seront bien entendu déterminées par l'homme de l'art en fonction de la quantité de culot initiale à traiter, de préférence réalisée à 4 C pendant au moins 48 heures pour l'équivalent de 1 Kg de cellules sèches. A l'étape c), l'élimination des acides nucléiques est réalisée par exemple par l'addition d'une DNase, à une concentration finale de 5 mg/ml d'une suspension de cellules à une concentration équivalente à 5 % de cellules sèches. Le broyage des cellules obtenues à l'étape c) peut être réalisé au moyen de tout système ou appareillage connu par l'homme de l'art pour le broyage de cellules tel que les presses ou de préférence tel que le broyage en boucle de Manton Gaulinet pendant 30 minutes. La clarification de la suspension obtenue après broyage pourra être réalisée au moyen de tout système ou appareillage connu par l'homme de l'art pour la clarification de broyats cellulaires bactériens tel que le système Sharpless. L'étape e) de précipitation en milieu acide de la suspension obtenue à l'étape d) peut être réalisée par exemple avec l'acide acétique. La précipitation est suivie par l'élimination du culot au moyen d'un système de type Sharpless et par la récupération du surnageant. L'étape f) consiste en une étape dans laquelle le surnageant, obtenu après précipitation en milieu acide, est neutralisé, dilué, dialysé puis concentré. Enfin, la dernière étape consiste en une étape de stérilisation du concentré de fraction membranaire obtenu à l'étape précédente comme par exempte par chauffage à 121 C pendant environ 35 minutes. L'invention concerne de manière particulière l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la fraction membranaire est la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae de séquence SEQ ID N 2, ou l'un de ses fragments. Par fragment de la protéine P40, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine p40 capable d'augmenter une réponse immune non spécifique et/ou capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale, et comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15 acides aminés. Bien entendu, ladite protéine P40, ou ses fragments, pourront être obtenus par synthèse chimique ou sous forme de peptides recombinant. L'invention concerne de manière particulière l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les antigènes ou haptènes spécifiques d'un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, un champignon ou un parasite, ou parmi les antigènes associés à des cellules tumorales. Selon l'invention, lesdits antigènes ou haptènes sont de préférence choisis parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse immunitaire vers une réponse de type Thl et/ou de type mixte Thl/Th2 contre un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'un antigène associé à une cellule tumorale. Bien entendu, ledit antigène ou haptène, lorsqu'il est de nature peptidique pourra être obtenu par synthèse chimique ou recombinant. Les méthodes de préparation de peptides recombinants sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces peptides recombinants, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520- 525), mais également les cellules de levure (Buckholz R. G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gène Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards C.P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4,558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V. A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4, 564-572). L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite fraction membranaire, notamment couplé par liaison covalente avec l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire. Dans un mode préféré de réalisation, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé de manière covalente à un peptide support pour former un complexe capable de se lier spécifiquement à la sérumalbumine de mammifère, de préférence ledit peptide support est un fragment peptidique issu de la protéine G du streptocoque, notamment le fragment C-terminal dénommé BB. Bien entendu, ledit complexe pourra être préparé par recombinaison génétique. Le complexe chimérique ou hybride peut être produit par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à une séquence d'ADN codant pour ledit fragment peptidique de la protéine G de streptococcus d'une séquence codant pour ledit antigène ou haptène de nature protéique. Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990). Selon la présente invention, le couplage par liaison covalente pourra être réalisé par synthèse chimique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il pourra être introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique. De préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre un composé de la fraction membranaire, et ledit antigène ou haptène. Le couplage covalent entre ledit composé de la fraction membranaire et ledit antigène ou haptène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C- terminale dudit composé de la fraction membranaire ou dudit antigène ou haptène, si ceux-ci sont par exemple de nature peptidique. Les réactifs bifonctionnels permettant le couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit antigène ou haptène à coupler. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène, haptène ou le complexe et l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène, haptène, ou complexe et ledit composé membranaire sont de nature peptidique. Le couplage entre ledit antigène, haptène ou complexe, et l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire peut être en effet réalisé par recombinaison génétique. On pourra par exemple, avant d'en extraire sa fraction membranaire, préalablement transformer ladite bactérie à gram négatif par un vecteur contenant une construction nucléique codant pour un antigène d'intérêt ou ledit complexe, de telle sorte que la bactérie ainsi transformée exprime l'antigène d'intérêt ou ledit complexe fixé à la membrane ou ancré dans la membrane de ladite bactérie. De telles méthodes d'expression de protéines recombinantes fixées à la membrane sont bien connues et nécessitent par exemple la présence de séquence régulatrice spécifique comme une séquence de type signal peptide. L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend en outre un agent permettant de véhiculer ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptène ou complexe sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, tel que sous la forme d'une émulsion de type huile dans eau ou eau dans huile, ou sous la forme d'une particule de type liposome, microsphère, nanosphère ou tout type de structure permettant l'encapsulation et la présentation sous forme particulaire de ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptène ou complexe. L'invention concerne aussi l'utilisation selon l'invention, caractérisé en ce que ledit agent est choisi parmi les sels d'aluminium, les sels de calcium, les composés d'origine végétale tels que le Quil A ou la saponine, ou les composés d'origine bactérienne tels que les dérivés d'anatoxine cholérique, pertussique, tétanique ou de la toxine thermolabile d'E. coli. Est également comprise dans la présente invention, l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend en outre un agent permettant de réguler la réponse immune induite par ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptène ou complexe. Parmi lesdits agents de régulation, on préfère notamment les cytokines, les facteurs de croissance, les hormones ou des composants cellulaires tels que des acides nucléiques, une protéine de la famille des protéines de choc thermique ou des ribosomes. L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des maladies infectieuses d'origine virale, bactérienne, fongique ou parasitaire, ou à la prévention ou au traitement des cancers, notamment les cancers dont les tumeurs sont associées à des antigènes tumoraux. Parmi lesdites maladies infectieuses d'origine virale, on préfère en particulier les maladies infectieuses provoquées par les paramyxovirus, notamment par le virus parainfluenzae et de manière plus préférée par le virus respiratoire syncytial (VRS). Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ledit antigène associé à la fraction membranaire comprend le peptide G2Na, fragment de la protéine G du virus de séquence d'acides aminés SEQ ID N 4, un peptide homologue à G2Na dont la séquence présente un taux d'identité d'au moins 80 % après alignement avec la séquence SEQ ID N 4, ou le peptide G2Na ou l'un de ses homologues, couplé par liaison covalenteà un fragment Cterminal (BB) de la protéine G de streptocoque pour former un complexe capable de se lier à la sérumalbuminc de mammifère, peptide BB tel que décrit dans les documents Power et al., 1997 (Virology, 230,155-166) ct WO 96/14416. Sous un autre aspect, l'invention est relative à un procédé de préparation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment Klebsiella pneumoniae, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie d'une centrifugation de ladite culture ; b) le cas échéant, désactivation des enzymes lytiques du culot de bactéries obtenu à l'étape a), puis centrifugation de la suspension obtenue ; c) extraction et élimination des protéines non membranaires et des acides nucléiques du culot obtenu à l'étape a) ou b) par au moins un cycle de lavage du culot dans une solution d'extraction ; d) digestion du culot de membranes obtenu à l'étape c) en présence d'enzymes protéasiques suivie d'une centrifugation ; e) au moins un cycle de lavage du culot obtenu à l'étape d) dans une solution physiologique et/ou dans de l'eau distillée ; et f) ultra-sonication du culot obtenu à l'étape e). L'invention comprend aussi le procédé de préparation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment Klebsiella pneumoniae, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie le cas échéant d'une centrifugation ; b) la congélation du milieu de culture ou du culot obtenu à l'étape a) suivie d'une décongélation et du séchage des cellules ; c) élimination au moyen d'une DNase des acides nucléiques des cellules sèches obtenues à l'étape b) remises en suspension ; d) broyage des cellules obtenues à l'étape c) et clarification de la suspension obtenue ; e) précipitation en milieu acide de la suspension obtenue à l'étape d) et élimination du culot ; f) neutralisation du surnageant obtenu à l'étape e) contenant la suspension mcmbranaire, suivie d'une dialyse et d'une concentration de la suspension membranaire ; et g) stérilisation de la suspension mcmbranaire concentrée obtenue à l'étape f). Les fractions membranaires susceptibles d'être obtenues par lesdits procédés font bien entendu partie de l'invention. Le titre en protéoglycanne des fractions membranaires susceptibles d'être obtenues par lesdits procédés, principe actif de la FMKp, représenté par la somme des teneurs en galactose et en protéine, est de préférence compris : - pour le galactose : entre 1,2 g/l et 3,4 g/1 ; - pour les protéines : entre 7,5 g/l et 14,9 g/l. De manière plus préférée, ce titre sera : - pour le galactose : entre 1,6 g/l et 2,6 g/l ; - pour les protéines : entre 9,3 g/1 et 11,7 g/l. L'invention concerne en outre les compositions pharmaceutiques comprenant une fraction membranaire susceptible d'être obtenue par les procédés selon l'invention, de préférence, lesdites compositions pharmaceutiques, comprennent en outre un antigène, haptène ou un complexe, tels que définis précédemment, associés à ladite fraction membranaire, tels que notamment les antigènes viraux ou complexes spécifiques de paramyxovirus, ou les antigènes associés à des cellules tumorales. Bien entendu, lesdites compositions pharmaceutiques selon l'invention pourront comprendre en outre les agents tels que les véhicules, agents de régulation définis précédemment. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que ledit antigène associé à la fraction membranaire comprend le peptide G2Na de séquence SEQ ID N 4 du virus respiratoire syncytial, un de ses homologues tels que définis précédemment, ou ledit peptide G2Na, ou l'un de ses homologues, couplé par liaison covalente à un fragment C-terminal (BB) de la protéine G de streptocoque pour former un complexe capable de se lier à la sérumalbumine de mammifère. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destines à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures : Figure 1 : BBG2Na adjuvé par la FMKp - Etude dose-réponse (titres IgG sériques anti-G2Na). * p Figure 2 : BBG2Na adjuvé par la FMKp -Titres IgG1et IgG2a anti-G2Na. Figure 3 : BBG2Na adjuvé par la FMKp - Etude de la protection. Figure 4 : Effet adjuvant de la FMKp vis-à-vis d'Immugrip (vaccin anti-grippal). * p Exemple 1 : Obtention de la faction membranaire de K. pneumoniae (FMKp) Procédé N 1 L'extraction des membranes de K. pneumoniae 1145 à partir du culot de centrifugation de l'étape est précédée de préférence par une étape de destruction des enzymes lytiques des composants cellulaires contenus dans le culot, par exemple par chauffage à 100 C de celui-ci, éventuellement après remise en solution. L'extraction proprement dite des membranes à partir du culot de centrifugation est réalisée de préférence par traitement des composants cellulaires du culot, après une éventuelle destruction des enzymes lytiques, à l'aide d'une solution saline, par exemple du chlorure de sodium 1 M, une ou plusieurs fois, puis centrifugation, de préférence, à 20 000 g, de la suspension obtenue, le surnageant de cette centrifugation, qui est éliminé, contient les impuretés non membranaires telles que protéines et acides nucléiques, tandis que le culot contient les membranes. Après séparation de la solution saline contenant les impuretés, les membranes sont digérées en présence d'enzymes protéolytiques, de préférence la trypsine et la chymotrypsine, en solution à pH 8 à 37 C pendant 4 heures. Après digestion, la solution est homogénéisée par ultra-sonication. Le produit ainsi obtenu constitue la fraction membranaire nommée FMKp. Le surnageant obtenu est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions, de préférence à 140 000 g. Préparation des glycopeptides membranaires Cette fraction est préparée à partir du culot obtenu par centrifugation à 40 000 g pendant 20 minutes. Ledit culot est remis en suspension dans du sérum physiologique puis cette suspension est portée pendant 10 minutes à 100 C dans un bain-marie d'eau bouillante pour désactiver les enzymes lytiques. Après refroidissement, on centrifuge 30 mn à 20 000 g. Le culot obtenu est extrait deux fois avec du NaCl 1M pour éliminer les protéines et les acides nucléiques. Les membranes sont recueillies par centrifugation durant 30 minutes à 20 000 g. Elles sont ensuite soumises à une digestion par de la trypsine à pH 8 et à 37 C pendant 4 heures puis par de la chymotrypsine dans les mêmes conditions. Les membranes sont alors recueillies par centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes, lavées avec du sérum physiologique puis de l'eau distillée et sont soumises à une désintégration par les ultrasons de 15 minutes. Procédé N 2 Après décongélation à + 4 C pendant 48 h minimum, 1 kg de cellules sèches de K. pneumoniae est remis en suspension à 5 % cellules sèches. La DNase est ajoutée à 5 mg/1. On procède ensuite au broyage en boucle au Manton Gaulin pendant 30 min puis à une clarification sur SHARPLES à 50 1/h, suivie d'une précipitation à l'acide acétique à pH = 4,2 + 0,1 pendant 30 min. Le culot est éliminé (SHARPLES à 25 1/h) et le surnageant est neutralisé, dilué à 2 fois le volume initial avec de l'eau osmosée. Une dialyse à volume constant est alors effectuée sur PUF 100 jusqu'à 800 #cm, suivie d'une concentration de la suspension membranaire (SM) ainsi obtenue, à 11 1/kg de cellules sèches. On procède alors à l'autoclavage de la SM à + 121 C durant 35 min que l'on peut conserver à + 4 C pendant 6 semaines. Caractéristiques de la FMKp Par définition, le titre en protéoglycanne, principe actif de la FMKp, est égal à la somme des teneurs en galactose et en protéines. - Galactose : en moyenne 2,2 g Il - Protéines : en moyenne 10,5 g/1 Exemple 2 : Effet adjuvant de la FMKp sur une protéine recombinante, BBG2Na BBG2Na est une protéine recombinante produite dans E. coli. Elle est constituée du peptide G2Na de séquence SEQ ID N 4, le fragment de la protéine G du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) de type A allant du résidu 130 au résidu 230, fusionnée à BB, un fragment de la protéine G des Streptocoques, ayant la capacité de se lier à l'albumine sérique. BBG2Na est un vaccin anti-VRS (Power U. Virology 1997, 230:155-166). Des souris BALB/c reçoivent 2 injections par voie sous-cutanée de 20 g de BBG2Na et différentes quantités de FMKp. Des prélèvements de sang sont effectués à J28 et les titres anticorps sériques sont déterminés par ELISA avec G2Na en phase solide. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 1. De manière surprenante, ils montrent que la FMKp augmente significativement la réponse IgG anti-G2Na ; titre IgG anti-G2Na atteint est similaire à ceux induits par l'alum ou l'adjuvant de Freund. L'effet est dose-dépendant : est observé à partir de 5 g de FMKp, maximal à partir de 50 g de FMKp et reste stable avec 100 g de FMKp. La FMKp est donc un adjuvant potentiel pour BBG2Na. Afin de connaître l'effet de la FMKp sur l'orientation de la réponse immunitaire, en terme de réponse Thl/Th2, les titres IgGl et IgG2a anti-G2Na ont été déterminés sur des sérums obtenus comme précisé ci-dessus. Les résultats (figure 2) montrent qu'étonnamment, la FMKp est capable de modifier le ratio IgGl/IgG2a antiG2Na, à l'inverse de ce qui est observé avec l'alum, pour lequel l'isotype majoritaire est l'IgGl. Ce profil est proche de celui induit par l'adjuvant de Freund. Ceci indique que la FMKp peut être utilisée comme adjuvant de l'immunité pour induire une réponse de type mixte (Thl/Th2). Les animaux immunisés comme décrit ci-dessus ont reçu une épreuve virale par voie nasale avec 105 TCIDso de VRS-A. Celle-ci a été effectuée 3 semaines après la dernière immunisation. Cinq jours après l'épreuve virale, les animaux ont été sacrifiés, et les poumons prélevés afin de déterminer les titres de VRS-A. Les résultats (figure 3) montrent que les animaux ayant reçu BBG2Na adjuvé par la FMKp sont protégés contre un challenge à RSV-A. En conclusion, la FMKp permet de réorienter la réponse anticorps sans affecter la capacité de protection des souris contre un challenge à VRS-A. Exemple 3 : Effet adjuvant de la FMKp sur un virus inactivé (vaccin anti-grippal) Des souris BALB/c reçoivent 1 seule injection de 0,01 g d'ImmugripTM (vaccin anti-grippal commercialisé par les Laboratoires INAVA), et de différentes quantités de FMKp. Les produits sont coadministrés. L'injection se fait par voie souscutanée à J0. Des prélèvements sanguins sont effectués à J7, J14 et J21. Le titre anticorps IgG sériques anti-Immugrip se fait par ELISA avec Immugrip à 2 g/ml en phase solide. Les résultats présentés (figure 4) montrent que la FMKp augmente significativement le titre anticorps anti-Immugrip et ceci dès la plus faible dose de FMKp, à savoir 0,1 g. L'effet adjuvant est dose-dépendant. On remarque de manière intéressante, que la présence de la FMKp induit la génération d'une réponse anticorps plus précoce, observée dès J7, comparée au contrôle Immugrip non adjuvé. Cet effet n'est pas obtenu avec l'adjuvant de référence, l'adjuvant complet de Freund (CFA). LISTAGE DE SEQUENCES PIERRE FABRE MEDICAMENT UTILISATION DE FRACTIONS MEMBRANAIRES BACTERIENNES A EFFET ADJUVANT, LEURS PROCEDES DE PREPARATION ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES CONTENANT. D17975 4 PatentIn Vers. 2.0 1 1035 ADN Klebsiella pneumoniae exon (1)..(1032) intron (1033)..(1035) CDS (1)..(1032) 1 atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg gct ccg aaa gat aac acc tgg 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 10 15 tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tcc cag tat cac gac acc ggt ttc 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ccg acc cgt aac gat cag 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 ctt ggt gct ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ccg tac ctc ggt 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc agc 240 ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc agc 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 gtt gac aac ggt gct ttc aaa gct cag ggc gtt cag ctg acc gct aaa 200 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 05 90 95 ctg ggt tac ccg atc act gac gat ctg gac atc tac acc cgt ctg ggc 336 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 ggc atg gtt tgg cgc gct gac tcc aaa ggc aac tac gct tct ace ggc 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 gtt tcc cgt agc gaa cac gac act ggc gtt tcc cca gta ttt gct ggc 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 ggc gta gag tgg gct gtt act cgt gac atc gct ace cgt ctg gaa tac 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 cag tgg gtt aac aac atc ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt cet 528 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 gat aac ggc atg ctg agc ctg ggc gtt tcc tac cgc ttc ggt cag gaa 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 gat gct gca ccg gtt gtt gct ccg gct ccg gct ccg gct ccg gaa gtg 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 gct acc aag cac ttc acc ctg aag tct gac gtt ctg ttc aac ttc aac 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 aaa gct acc ctg aaa ccg gaa ggt cag cag gct ctg gat cag ctg tac 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 act cag ctg agc aac atg gat ccg aaa gac ggt tcc gct gtt gtt ctg 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 ggc tac acc gac cgc atc ggt tcc gaa gct tac aac cag cag ctg tet 816 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 gag aaa cgt gct cag tcc gtt gtt gac tac ctg gtt gct aaa ggc atc 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285 ccg gct ggc aaa atc tcc gct cgc ggc atg ggt gaa tcc aac ccg gtt 912 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa gct cgc gct gcc ctg atc gat 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 tgc ctg gct ccg gat cgt cgt gta gag atc gaa gtt aaa ggc tac aaa 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 gaa gtt gta act cag ccg gcg ggt taa 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 2 344 PRT Klebsiella pneumoniae 2 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Scr Tyr Arg Phc Gly Gln Glu 180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 3 303 ADN Virus respiratoire syncytial, G2Na CDS (1)..(303) 3 acc gtg aaa acc aaa aac acc acg acc acc cag acc cag ccg agc aaa Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys 1 5 10 15 ccg acc acc aaa cag cgt cag aac aaa ccg ccg aac aaa ccg aac aac Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn 20 25 30 gt ttc cat ttc gaa gtg ttc aac ttc gtg ccg tgc agc atc tgc agc 144 Asp Plie His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser 35 40 45 aac aac ccg acc tgc tgg gcg atc tgc aaa cgt atc ccg aac aaa aaa 192 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys 50 55 60 ccg ggc aaa aaa acc acg ace aaa ccg acc aaa aaa ccg acc ttc aaa 240 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys 65 70 75 80 acc acc aaa aaa gat cat aaa ccg cag acc acc aaa ccg aaa gaa gtg 288 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val 85 90 95 ccg ace acc aaa ccg 303 Pro Thr Thr Lys Pro 100 4 101 PRT Virus respiratoire syncytial, G2Na 4 Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys 1 5 10 15 Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn 20 25 30 Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys 50 55 60 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys 65 70 75 80 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val 85 90 95 Pro Thr Thr Lys Pro 100 REVENDICATIONS 1/ Utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif associée à un antigène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à orienter la réponse immunitaire vers une réponse de type Th1 et/ou de type mixte Thl/Th2 dirigée contre ledit antigène ou haptène. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la fraction membranaire comprend une fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae. 3/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la fraction membranaire comprend au moins des fractions membranaires de deux souches différentes de bactéries. 4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la fraction membranaire est préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie d'une centrifugation de ladite culture ; b) le cas échéant, désactivation des enzymes lytiques du culot de bactéries obtenu à l'étape a), puis centrifugation de la suspension obtenue ; c) extraction et élimination des protéines non membranaires et des acides nucléiques du culot obtenu à l'étape a) ou b) par au moins un cycle de lavage du culot dans une solution d'extraction ; d) digestion du culot de membranes obtenu à l'étape c) en présence d'enzymes protéasiques suivie d'une centrifugation ; e) au moins un cycle de lavage du culot obtenu à l'étape d) dans une solution physiologique et/ou dans de l'eau distillée ; et f) ultra-sonication du culot obtenu à l'étape e). 5/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la fraction membranaire est préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie le cas échéant d'une centrifugation ; b) la congélation du milieu de culture ou du culot obtenu à l'étape a) suivie d'une décongélation et du séchage des cellules ; c) élimination au moyen d'une DNase des acides nucléiques des cellules sèches obtenues à l'étape b) remises en suspension ; d) broyage des cellules obtenues l'étape c) et clarification de la suspension obtenue : c) précipitation en milieu acide de la suspension obtenue à l'étape d) et élimination du culot ; f) neutralisation du surnageant obtenu à l'étape e) contenant la suspension membranaire, suivie d'une dialyse et d'une concentration de la suspension membranaire ; et g) stérilisation de la suspension membranaire concentrée obtenue à l'étape f). 6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les antigènes ou haptènes spécifiques d'un agent infectieux ou parmi les antigènes associés à des cellules tumorales. 7/ Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse immune de type Th1et/ou de type mixte Thl/Th2 contre un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'un antigène associé à une cellule tumorale. 8/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite fraction membranaire. 9/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé de manière covalente à un peptide support pour former un complexe capable de se lier spécifiquement à la sérumalbumine de mammifère. 10/ Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit peptide support est un fragment peptidique issu de la protéine G du streptocoque. 11/ Utilisation selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisée en ce que ledit complexe est préparé par recombinaison génétique. 12/ Utilisation selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que ledit antigène, haptène ou complexe est couplé par liaison covalente avec l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire. 13/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique. 14/ Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire et/ou dans ledit antigène, haptène ou complexe pour faciliter le couplage chimique. 15/ Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. 16/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que couplage entre ledit antigène, haptène ou complexe et l'un au moins des composés contenus dans la fraction membranaire est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène, haptène, ou complexe et ledit composé membranaire sont de nature peptidique. 17/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend en outre un agent permettant de véhiculer ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptène ou complexe sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité. 18/ Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit agent est une émulsion de type huile dans eau ou eau dans huile. 19/ Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit agent est une particule de type liposome, microsphère, nanosphère ou tout type de structure permettant l'encapsulation et la présentation sous forme particulaire de ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptène ou complexe. 20/ Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit agent est choisi parmi les sels d'aluminium, les sels de calcium, les composés d'origine végétale tels que le Quil A ou la saponine, ou les composés d'origine bactérienne tels que les dérivés d'anatoxine cholérique, pertussique, tétanique ou de la toxine thermolabile d'E. coli. 21/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend en outre un agent permettant de réguler la réponse immune induite par ladite fraction membranaire associée audit antigène, haptenc ou complexe. 22/ Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit agent de régulation est choisi parmi les cytokines, les facteurs de croissance, les hormones ou des composants cellulaires tels que des acides nucléiques, une protéine de la famille des protéines de choc thermique ou des ribosomes. 23/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 22, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des maladies infectieuses ou des cancers. 24/ Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que la maladie infectieuse est d'origine virale, bactérienne, fongique ou parasitaire. 25/ Utilisation selon la revendication 24, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des infections par les paramyxovirus. 26/ Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que le paramyxovirus est un virus respiratoire syncytial. 27/ Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit antigène associé à la fraction membranaire comprend le peptide G2Na de séquence SEQ ID N 4 ou l'un de ses homologues dont la séquence présente un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N 4. 28/ Utilisation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ledit peptide G2Na ou l'un de ses homologues est couplé par liaison covalente à un fragment Cterminal (BB) de la protéine G de streptocoque pour former un complexe capable de se lier à la sérumalbumine de mammifère. 29/ Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que le paramyxovirus est un virus parainfluenzae. 30/ Procédé de préparation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie d'une centrifugation de ladite culture ; b) le cas échéant, désactivation des enzymes lytiques du culot de bactéries obtenu à l'étape a), puis centrifugation de la suspension obtenue ; c) extraction et élimination des protéines non membranaires et des acides nucléiques du culot obtenu à l'étape a) ou b) par au moins un cycle de lavage du culot dans une solution d'extraction ; d) digestion du culot de membranes obtenu à l'étape c) en présence d'enzymes protéasiques suivie d'une centrifugation ; e) au moins un cycle de lavage du culot obtenu à l'étape d) dans une solution physiologique et/ou dans de l'eau distillée ; et f) ultra-sonication du culot obtenu à l'étape e). 31/ Procédé de préparation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites bactéries dans un milieu de culture permettant leur croissance suivie le cas échéant d'une centrifugation ; b) la congélation du milieu de culture ou du culot obtenu à l'étape a) suivie d'une décongélation et du séchage des cellules ; c) élimination au moyen d'une Dnase des acides nucléiques des cellules sèches obtenues à l'étape b) remises en suspension ; d) broyage des cellules obtenues à l'étape c) et clarification de la suspension obtenue ; e) précipitation en milieu acide de la suspension obtenue à l'étape d) et élimination du culot ; f) neutralisation du surnageant obtenu à l'étape e) contenant la suspension membranaire, suivie d'une dialyse et d'une concentration de la suspension membranaire ; et g) stérilisation de la suspension membranaire concentrée obtenue à l'étape f). 32/ Procédé selon la revendication 30 ou 31, caractérisé en ce ladite bactérie à gram négatif est Klebsiella pneumoniae. 33/ Fraction membranaire susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 31 à 33. 34/ Composition pharmaceutique comprenant une fraction membranaire selon la revendication 33. 35/ Composition pharmaceutique selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un antigène ou haptène associé à ladite fraction membranaire. 36/ Composition pharmaceutique selon la revendication 35, caractérisée en ce que ledit antigène est choisi parmi des fragments peptidiques de paramyxovirus. 37/ Composition pharmaceutique selon la revendication 36, caractérisée en ce que le paramyxovirus est un virus respiratoire syncytial ou un virus parainfluenzae. 38/ Composition pharmaceutique selon la revendication 37, caractérisée en ce que ledit antigène associé à la fraction membranaire comprend le peptide G2Na de séquence SEQ ID N 4 du virus respiratoire syncytial, ou l'un de ses homologues dont la séquence présente un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID.4. 39/ Composition pharmaceutique selon la revendication 38, caractérisée en ce que ledit peptide G2Na ou l'un de ses homologues est couplé par liaison covalente à un fragment C-terminal (BB) de la protéine G de streptocoque pour former un complexe capable de se lier à la sérumalbumine de mammifère.