FR 2777906 A1 19991029 FR 9805584 A 19980427 DESCRIPTION Indication du domaine technique La présente invention a pour objet un procédé capable de générer des cellules dendritiques humaines à partir de monocytes. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans l'émergence de la réponse immunitaire. En effet, seules les cellules dendritiques sont capables d'induire une réponse primaire à partir des lymphocytes T. Elles sont donc les cellules les plus importantes pour l'initiation de la réponse immune. Une telle fonction est à rapprocher de nombreuses propriétés de surface. En effet, grâce à de larges expansions de leur membrane cytoplasmique, les cellules dendritiques ont une surface de contact avec l'extérieur particulièrement importante. De plus, elles possèdent à leur surface de très nombreux antigènes d'histocompatibilité de classe I et de classe II. Elles sont très riches en molécules de costimulation, telles que les molécules CD80, CD86, CD40 qui activent les molécules CD28, CTLA-4 et CD40L respectivement en initiant la réponse immune. Elles possèdent aussi de très nombreuses molécules de l'adhésion, comme la molécule CD54, la molécule LFAI, ce qui facilite la coopération entre les cellules dendritiques et les cellules T. Une autre caractéristique particulière des cellules dendritiques est de déployer des fonctions différentes en fonction de leur stade de différenciation. Ainsi la capture de l'antigène et son traitement sont les fonctions principales de la cellule dendritique tandis que les capacités de stimuler les cellules T augmentent au fur et à mesure que les cellules dendritiques migrent dans les tissus et les ganglions. Indication de l'état de l'art Ces cellules dendritiques sont capables de présenter des antigènes tumoraux dans des systèmes expérimentaux de façon à induire une réponse cytotoxique contre les cellules tumorales. Ces cellules ont donc un intérêt tout particulier dans l'immunothérapie antitumorale. Jusqu'à la description de notre procédé, l'isolement des cellules dendritiques du sang périphérique était très difficile puisque moins de I % des cellules mononuclées appartiennent à cette catégorie. Une avance importante a été réalisée lorsque l'on a pu générer des cellules dendritiques à partir de précurseurs myéloïdes et des monocytes en présence de différentes cytokines. La production de cellules dendritiques à partir de monocytes peut se faire en présence de GM-CSF et d'IL-4 pour obtenir une maturation après contact avec du TNFcx ou avec d'autres agents tels que le CD40 ligand, le LPS ou des milieux conditionnés à partir de macrophages. Cependant, à cause de la différenciation des monocytes en macrophages en présence de sérum humain, il a toujours été nécessaire de recourir à des sérums bovins, ce qui a restreint l'utilisation de cellules dendritiques dans la thérapie humaine. Exposé de l'invention Notre invention. en modifiant le milieu et les conditions de culture, vise à éviter cet inconvénient et à pouvoir cultiver des cellules dendritiques dérivées de monocytes, en présence de sérum humain, en particulier en contrôlant le pH et en partant de monocytes purifiés dépourvus de cellules T. De plus. notre procédure évite que le sérum humain soit inhibiteur de la différenciation des cellules dendritiques. De la même façon, notre invention a permis d'établir que l'utilisation de plasma autologue fonctionne aussi bien, et même parfois mieux, que le sérum homologue. Procédures générales de production des cellules dendritiques Le sang périphérique est prélevé chez le sujet concerné. Ce sang est ensuite centrifugé minutes à 200 g de façon à diminuer la contamination des cellules du sang périphérique par les plaquettes. La partie supérieure contenant la plupart des plaquettes et le plasma est éliminée soigneusement avant de purifier les cellules mononuclées en les centrifugeant sur un gradient de séparation de Ficoll dont la densité est de 1,077. La couche de cellules mononuclées est récupérée puis lavée deux fois dans un tampon PBS et déposée sur un gradient contenant 4 densités discontinues de Percoll pour isoler les monocytes. Ce gradient est constitué par des dilutions d'une solution isotonique de percoll à raison de 75 % (6,5 ml), 50.5 % (15 ml), % (3,5 ml) et 30 % (3 ml) dans un milieu de Dulbecco sans magnésium ni calcium et contenant 5 % de sérum humain. 75 à 100 millions de cellules sont ainsi déposées sur chaque tube et centrifugées à 1000 g pendant 25 minutes à 4 C. Les cellules de faible densité, principalement les monocytes, sont récoltées à l'interface 50.5 % et lavées deux fois dans du PBS. Elles sont ensuite resuspendues dans un milieu de culture, puis déposées dans des plaques à culture contenant 6 puits à une densité de 5 x 106 par puits dans un volume final de 3 ml et laissées adhérer pendant I heure à 37 C. On peut substituer cette étape d'adhérence par une purification complémentaire des monocytes en utilisant un système de purification négatif utilisant un mélange d'anticorps monoclonaux associant un anti- CD3, CD7, CD19, CD45A, CD56 et anti-IGE à l'aide d'un système de microbilles de type Macs. Cette purificationcomplémentaire permet d'obtenir des concentrations de monocytes ayant une pureté supérieure à 90%. Les cellules sont ensuite mises en culture dans des puits de culture à 37 C sous 5 % de CO2. Le milieu qui comporte du RPMI, contient 200 U/ml de GM-CSF humain recombinant, 500 U/ml de IL-4 humaine recombinante dans un volume final de 6 mi. Au jour 3 et au jour 5, les cultures sont renouvelées en éliminant 3 ml et en ajoutant 3 ml de milieu frais avec les cytokines. Au 6ème jour, les cellules sont transférées dans des pots en Teflon et cultivées à une densité de 5 x 105 cellules par pots sous 3 ml en présence de TNFcx humain recombinant à raison de 200 U/ml pendant 2 jours. Les cellules sont récoltées au 8ème jour, lavées et cultivées en l'absence de stimulation pendant 3 jours supplémentaires. Au cours de toute cette culture, le pH du milieu de culture est étroitement mesuré et corrigé avec du bicarbonate entre 1 à 2 %, soit un ajout compris entre 1 à 3 mg/ml. Il convient, dans cette technique, de surveiller étroitement le pH qui doit être compris très exactement entre 7.2 et 7.4 et surtout ne jamais descendre au-dessous de 7.15 en présence de 1 à 25 % de sérum humain autologue ou homologue (en moyenne 10 %). Au terme de la culture, la qualité de la maturation est évaluée par l'expression des molécules CD80, 83, 86, 14, la, HLA-DR à la surface des cellules. Ces marquages révèlent que plus de 80 % des monocytes viables ont maturé en cellules dendritiques caractérisés par le phénotype suivant: CD83+, CD86++, CD80++, HLA-DR+++, CDla-, CD14-, CD401+++, CD54++, ce qui les place dans le groupe des cellules dendritiques tissulaires très différenciées. L'utilisation de cette technique a pu être réalisée dans les exemples suivants ler exemple: Production de cellules dendritiques pour identifier des antigènes mineurs d ' histocompatibilité. Cette technique consiste à récupérer les monocytes en les faisant différencier en cellules dendritiques matures, puis en les utilisant comme des cellules stimulantes dans une réaction de culture mixte lymphocytaire entre individus de la même famille HLA compatible. Il s'avère que, dans ce système, on arrive à détecter des disparités concernant les antigènes mineurs d'histocompatibilité et de pouvoir approfondir la compatibilité ou les incompatibilités entre personnes d'une même famille, ce qui présente des avantages certains dans le domaine des greffes de tissus et d'organes en intra familial ou même extra familial. 2ème exemple: Utilisation des cellules dendritiques issues de monocytes MODC dans l'émergence d'une réponse antitumorale. Pour ce faire, nous avons choisi le système d'un antigène tumoral s'exprimant fortement dans les cancers médullaires de la thyroïde. Il s'agit de la thyrocalcitonine qui est relativement peu immunogène. Dans notre système, nous avons pu faire produire des clones lymphocytaires T diriges contre la thyrocalcitonine. Il s'agit de clones cytotoxiques susceptibles d'avoir une activité antitumorale dans les cancers à thyrocalcitonine. Une étude clinique est en cours pour valider ce système. 3ème exemple: Utilisation des MODC dans les activités anti-infectieuses. En utilisant l'anatoxine tétanique comme antigène présenté par les MODC, il a été possible de générer des clones cytotoxiques anti-anatoxines tétaniques, ce qui démontre à l'évidence que ce système permet d'avoir une immunisation primaire vis-à-vis d'antigènes de type infectieux. 4ème exemple: Utilisation des MODC dans l'induction d'une réponse de tolérance. En effet, il est clair que les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie. Il s'avère qu'en cultivant ces cellules en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporine ou l'histamine, nous entraînons une modification des antigènes de membrane qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. Dans ce système, il est donc possible d'éduquer les cellules dendritiques pour les orienter vers une réaction de tolérance. Cette constatation pourrait avoir des implications importantes dans le cadre des greffes d'organes d'une part, et des traitements des maladies autoimmunes d'autre part, comme la polyarthrite rhumatoïde, la myasthénie, le diabète insulinodépendant, la sclérose en plaques, l'eczéma, le psoriasis, etc... et les maladies allergiques. ème exemple:Modifications de l'expression des antigènes de surface par le système de culture Dans notre système de culture, les cellules dendritiques produites ont un assortiment d'antigènes de surface très particulier. En effet, comparativement à une culture en présence de sérum de veau foetal. on assiste, en présence de bicarbonate, à une forte expression de la molécule CD54, CD80, surtout CD83 et CD40. Ceci est encore plus net pour les molécules CD83 et CD86. 6ème exemple: Utilisation des MODC pour induire une culture mixte lymphocytaire allogénique ou même autologue. En présence de MODC, les lymphocytes allogéniques. au 6ème et même au 8ème jour, sont doués d'une prolifération extrêmement importante, très largement supérieure à ce que l'on constate avec l'utilisation des lymphocytes B allogéniques ou des monocytes allogéniques. Il en est de même pour une culture mixte autologue. Revendications 1) Procédé d'obtention de cellules dendritiques humaines à partir de monocytes (MODC) en présence d'IL-4 + GM-CSF + TNFc - l'utilisation de sérum humain autologue ou homologue de 1 à 25 %. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisée par le fait que l'adjonction de sérum humain autologue ou homologue n'inhibe pas vers la phase de différenciation en cellules dendritiques de type tissulaire. 3) Procédé selon la revendication 1 caractérisée par le fait que les cellules dendritiques ainsi obtenues sont utilisables dans les techniques de détection et de caractérisation des antigènes mineurs d'histocompatibilité. 4) Procédé selon la revendication 1 caractérisée par le fait que les MODC permettent d'obtenir in vitro une réponse immunitaire vis-à- vis des antigènes tumoraux utilisable en immunothérapie antitumorale. ) Procédé selon la revendication 1 caractérisée par le fait que les MODC sont capables de présenter les antigènes de micro organismes susceptibles d'être utilisés dans la thérapeutique anti-infectieuse. 6) Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que les MODC ainsi produits peuvent modifier la réponse immune dans le sens d'une tolérance ou du traitement des maladies autoimmunes et allergiques.