FR 2776666 A1 19991001 FR 9803961 A 19980331 COMPLEXES D'INCLUSION DANS DES CYCLODEXTRINES D'ISOTHIOCYANATES ORGANIQUES, EN PARTICULIER BACTERIOSTATIQUES, BACTERICIDES ET/OU FONGICIDES OU DE LEURS PRECURSEURS NATURELS, ET LEUR PREPARATION DESCRIPTION Domaine technique La présente invention a pour objet des complexes formés par inclusion d'isothiocyanates organiques ou de leurs précurseurs d'origine naturelle dans des cyclodextrines. Elle concerne en particulier la solubilisation et/ou la libération contrôlée d'agents bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides constitués d'isothiocyanates organiques, à partir de tels complexes. Elle concerne également des compositions bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides comprenant de tels complexes, utilisables dans le domaine alimentaire et agro-alimentaire. Etat de la technique antérieure Les isothiocyanates organiques sont connus pour présenter de remarquables propriétés bactério- et fongi-statiques, et leur activité pour le contrôle de la prolifération de micro-organismes aérobies et anaérobies a été bien identifiée, comme il est décrit dans Antimicrobial Properties of Isothiocyanates in Food Preservation de P.J. Delaquis et G. Mazza, édité par James Giese dans Food Technology , novembre 1995, pages 73 à 84, [1]. Toutefois, leurs propriétés physiques (ce sont le plus souvent des liquides volatils) rend leur utilisation très difficile pour des applications alimentaires ou agro-alimentaires, en raison d'une impossibilité de maîtriser les doses minimales assurant le processus de conservation sans nuire aux propriétés organoleptiques de la denrée à conserver. Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour objet des compositions bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides dans lesquelles l'isothiocyanate organique est stabilisé sous la forme de complexe d'inclusion dans une cyclodextrine, ce qui permet d'assurer sa solubilisation dans un milieu aqueux et de maîtriser sa libération. Selon l'invention, le complexe d'inclusion est constitué d'un isothiocyanate organique inclus dans une cyclodextrine. Selon l'invention 1' isothiocyanate organique répond de préférence à la formule R1- N = C = S (I) dans laquelle Rl représente un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 6 atomes de carbone ; un groupe alcényle, linéaire ou ramifié, de 2 à 6 atomes de carbone ; un groupe arylalkyl dans lequel le groupe alkyle a 1 à 6 atomes de carbone ; un groupe de formule dans laquelle q = 1 ou 2 et R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle ou alcoxyle de 1 à 3 atomes de carbone, le substituant R2 étant en position ortho, para ou méta ; un groupe de formule R3CO(CH2)n dans laquelle R3 est un groupe alkyle de 1 à 3 atomes de carbone et n est un nombre entier égal à 3 ou 4 ; un groupe de formule R30Co(CH2) n- dans laquelle R3 et n sont tels que définis ci-dessus ; un groupe méthylthioalkyle de formule CH3S(CH2)p dans laquelle p est un nombre entier de 1 à 10 ; ou un groupe de formule CH3-S-CH=CH-(CH2) r dans laquelle r est un nombre entier de 1 à 8. A titre d'exemple de tels isothiocyanates, on peut citer ceux pour lesquels R1 a la signification donnée dans le tableau annexé. La cyclodextrine utilisée dans le complexe d'inclusion décrit ci-dessus peut être une cyclodextrine naturelle ou une cyclodextrine chimiquement modifiée. On rappelle que les cyclodextrines ou cyclomaltooligosaccharides sont des composés d'origine naturelle, formés par l'enchaînement d'unités glucose, liés en a-1,4. Les cyclodextrines naturelles sont l'a-cylodextrine qui comporte 6 unités glucose, la ss-cyclodextrine qui comporte 7 unités glucose, et la y-cyclodextrine qui comporte 8 unités glucose. De nombreux travaux ont montré que ces cyclodextrines pouvaient former des complexes d'inclusion avec des molécules hydrophobes, permettant ainsi leur solubilisation dans des milieux aqueux et leur utilisation dans diverses industries, comme il est décrit dans l'ouvrage intitulé : Cyclodextrins and their Industrial Uses , édité par D. Duchêne aux Editions de Santé en 1987, pages 299 à 326, [2]. Selon l'invention, on peut utiliser non seulement une cyclodextrine naturelle mais également une cyclodextrine naturelle modifiée chimiquement par adjonction de substituants appropriés. Une telle cyclodextrine modifiée peut répondre à la formule dans laquelle m = 6, 7 ou 8 et les R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent OH ou un groupe choisi parmi les groupes X-alkylés ou X-arylés dans lesquels X représente un atome de carbone ou un hétéroatome à condition que l'un au moins des R4 ne soit pas OH. Dans ce cas, les substituants R4 de la cyclodextrine sont choisis de façon à améliorer ses propriétés, notamment en ce qui concerne la solubilisation et la stabilisation des isothiocyanates organiques. Selon l'invention, le complexe d'inclusion d'un isothiocyanate organique dans une cyclodextrine peut être préparé aisément à partir d'une solution aqueuse de la cyclodextrine par addition à cette solution de l'isothiocyanate organique. De la sorte, on peut former le complexe d'inclusion soit sous forme de solution aqueuse, soit sous forme de précipité que l'on sépare ensuite de la solution. Dans ce dernier cas, on part d'une solution aqueuse saturée de cyclodextrine. Selon une variante de réalisation de l'invention, le complexe d'inclusion est constitué d'un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique inclus dans une cyclodextrine, et il peut être préparé également à partir d'une solution aqueuse de cyclodextrine par addition à cette solution du précurseur naturel. Les cyclodextrines utilisables sont les mêmes que celles décrites précédemment. Les précurseurs naturels d'isothîocyanates organiques, ou glucosinolates, utilisés peuvent répondre à la formule dans laquelle R1 a la signification donnée ci-dessus. Ces précurseurs naturels peuvent être en particulier ceux mentionnés dans le tableau annexé. Ces précurseurs naturels peuvent être obtenus à partir de sources végétales telles que celles répertoriées également dans le tableau annexé. On sait que ces précurseurs naturels peuvent être convertis en les isothiocyanates correspondants par réaction d'hydrolyse avec la myrosinase selon le schéma réactionnel suivant R1 CH2OH o ----, C NOSO3K(IV) myr R1 R1-N=C=S (I) + H2O OH OH H 1H I OH La myrosinase est un enzyme naturellement présent dans les crucifères. L'hydrolyse enzymatique du précurseur naturel de formule (IV) par la myrosinase conduit à l'isothiocyanate organique correspondant ainsi qu'à la libération d'une molécule de D-glucose et de sulfate acide de potassium. Selon l'invention, on a découvert que le complexe d'inclusion à base d'isothiocyanate organique pouvait être également préparé à partir d'un complexe d'inclusion contenant le précurseur naturel de cet isothiocyanate par action de la myrosinase sur ce complexe. Aussi, la présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion constitué d'un isothiocyanate organique inclus dans une cyclodextrine, qui comprend les étapes suivantes a) préparer en solution aqueuse un complexe d'inclusion d'un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique et de cyclodextrine, et b) soumettre le complexe ainsi obtenu à l'action de la myrosinase en solution aqueuse pour transformer le précurseur naturel inclus dans la cyclodextrine en 1' isothiocyanate organique correspondant. Dans ce cas, la solution aqueuse utilisée dans la seconde étape et éventuellement dans la première étape est une solution convenant à l'hydrolyse par la myrosinase. Il peut s'agir d'une solution tampon telle qu'une solution de tampon phosphate à pH 6. L'invention a encore pour objet une composition bactériostatique, bactéricide et/ou fongicide qui comprend un complexe d'inclusion d'un isothiocyanate organique à propriétés bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides dans une cyclodextrine. Cette composition peut se présenter sous la forme de solide ou de liquide. A titre d'exemple, la composition peut être sous la forme de poudre, de granules, de poudre mouillable, de pâte, de solution etc. Cette composition peut comprendre des véhicules et additifs appropriés tels que ceux généralement utilisés pour la fabrication de produits bactériostatiques, bactéricides ou fongicides, destinés aux industries alimentaires et agro-alimentaires. Elle peut être préparée par des procédés classiques. Selon une variante, l'invention fournit également une composition bactériostatique, bactéricide et/ou fongicide, constituée d'un mélange sec comprenant a) un complexe d'inclusion d'un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique à propriétés bactéricides, bactériostatiques et/ou fongicides dans une cyclodextrine, et b) de la myrosinase. Dans ce dernier cas, au moment de l'utilisation, lorsque le mélange sec sera mis en contact avec de l'eau ou avec une atmosphère humide, la présence d'eau convertira le précurseur naturel présent dans le complexe d'inclusion en l'isothiocyanate organique correspondant par hydrolyse enzymatique avec la myrosinase de la composition. Dans ce cas, la composition est par exemple sous la forme de poudre ou de poudre mouillable. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, d'exemples de réalisation donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Brève description des dessins La figure 1 est le spectre partiel de résonance magnétique nucléaire RMN d'une solution aqueuse d'a-cyclodextrine 10 mM dans D20 à 250C, enregistré à 500 MHz. La figure 2 est le spectre RMN partiel du complexe a-cyclodextrine-benzyl ITC dans D20 à 250C, enregistré à 500 MHz. La figure 3 est le spectre partiel de résonance magnétique nucléaire de l'a-cyclodextrine 10 mM dans D20 à 250C, enregistré à 500 MHz. La figure 4 est le spectre RMN partiel du complexe a-cyclodextrine-glucosinolate de Tropaeolum Majus dans D20 à 250C, enregistré à 500 MHz. Les figures 5 à 7 sont des spectres RMN partiels du complexe a-cyclodextrine-glucosinolate de Tropaeolum Majus en présence de myrosinase à 25"C, enregistrés à 500 MHz, avant l'addition de myrosinase (figure 5), 1 h après cette addition (figure 6) et 17 h après cette addition (figure 7). Exposé détaillé des modes de réalisation. Les exemples qui suivent illustrent la préparation de complexes conformes à l'invention, soit à partir de l'isothiocyanate de benzyle (benzyl-ITC), soit à partir de son précurseur naturel, le glucosinolate provenant de Tropaeolum Majus. L'isothiocyanate de benzyle répond à la formule (III) ci-dessous Ce composé se présente sous la forme d'un liquide huileux, insoluble dans l'eau, dont la manipulation est très délicate en raison de ses propriétés et de sa volatilité. Les exemples 1 et 2 qui suivent illustrent l'inclusion de ce composé dans l'o-cyclodextrine et dans la -cyclodextrine. Exemple 1 : Inclusion de l'isothiocyanate de benzyle dans l'a-ccylodextrine. On dissout 2,2 mg d'a-cyclodextrine dans 400 ul de D20. On ajoute à cette solution 0,3 ul d'isothiocyanate de benzyle (benzyl-ITC) et on obtient ainsi le complexe d'inclusion de cet isothiocyanate dans l'a-cyclodextrine. Ce fait est confirmé en enregistrant le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN de la solution, avant et après l'addition d'îsothiocyanate de benzyle, à 25"C et 500 MHz. La figure 1 représente le spectre RMN de l'a-cyclodextrine 10 mM dans D2O avant l'addition. La figure 2 représente le spectre RMN dans les mêmes conditions après l'addition d'isothiocyanate de benzyle. Une comparaison de ces deux spectres montre la formation d'un complexe d'inclusion, en particulier par le déplacement des signaux des H-3 et H-5 de la cyclodextrine situés à l'intérieur de la cavité. La mise en oeuvre de méthodes de RMN bidimensionnelles permet de proposer un modèle de la structure de ce complexe dans lequel la partie benzyle du benzyl-ITC se trouve dans la cavité de la cyclodextrine. Exemple 2 : Inclusion d'isothiocyanate de benzyle dans la -cyclodextrine. Dans cet exemple, on prépare un complexe d'inclusion sous forme solide en ajoutant à une solution saturée de ss-cylodextrine dans l'eau (10 mg/ml) une quantité stoechiométrique d'iosothiocyanate de benzyle. Le complexe précipite et on peut le séparer de la solution par filtration ou centrifugation. L'analyse par résonance magnétique nucléaire du complexe formé, dans le diméthylsulfoxyde, montre la présence des deux partenaires en concentrations équivalentes. On transforme ainsi l'isothiocyanate de benzyle instable et volatil, en une forme pulvérulente, facile à manipuler, d'un complexe d'inclusion stable. Exemple 3 : Préparation d'un complexe d'inclusion du précurseur glucosinolate de l'isothio cyanate de benzyle dans l'a-cyclodexrine. Dans cet exemple, on prépare une solution comprenant 2,2 mg d'a-cyclodextrine dans 400 ul de tampon phosphate deutéré 50 mM, pH = 6, et on y ajoute 7,5 mg du glucosinolate précurseur de benzyl ITC provenant de Tropaeolum Majus ou glucotropaeoline. Ce précurseur répond à la formule On vérifie la formation de ce complexe en enregistrant le spectre RMN de la solution avant et après l'addition du glucosinolate. La figure 3 représente le spectre de la solution d'a-cyclodextrine avant l'addition. La figure 4 représente le spectre RMN pris dans les mêmes conditions, après l'addition du glucosinolate (GSL). On remarque ainsi l'apparition de signaux correspondant au glucosinolate (GSL) à 4,2, 3,7, 3,4, 3,35 et 3,28 ppm. Exemple 4 Dans cet exemple, on convertit le complexe d'inclusion formé dans l'exemple 3 en complexe d'inclusion d'isothiocyanate de benzyle dans la cyclodextrine. Dans ce but, on ajoute de la myrosinase à la solution du complexe préparée dans l'exemple 3, puis on suit l'hydrolyse du glucosinolate par résonance magnétique nucléaire. Les résultats sont donnés sur les figures 5, 6 et 7 qui illustrent les spectres RMN obtenus à 250C et 500 MHZ, avant l'addition de myrosinase (figure 5), 1 heure après l'addition de myrosinase (figure 6), et 17 heures après l'addition de myrosinase (figure 7). Si l'on compare ces trois spectres, on remarque que le spectre de la figure 7 comprend des signaux correspondant au glucose-a, au glusose- et à l'isothiocyanate de benzyle, signaux qui n' existaient pas sur la figure 5 et qui commençaient à se former sur la figure 6. Par ailleurs, on note que l'iso-thiocyanate de benzyle formé par l'action de la myrosinase est toujours complexé dans la cyclodextrine et reste donc soluble en solution aqueuse. Références citées [1] : Antimicrobial Properties of Isothiocyanates in Food Preservation de P.J. Delaquis et G. Mazza, édité par James Giese dans Food Technology , novembre 1995, pages 73 à 84. [2] : Cyclodextrins and their Industrial Uses , édité par D. Duchêne aux Editions de Santé en 1987, pages 299 à 326. TABLEAU 1 Isothiocyanates Précurseur Sources végétales R-N = C = S R GSL méthyle Glucocapparine Boscia senegalensis éthyle Glucolépidine propyle isopropyle Glucoputranjivine Sysymbrium officinale (sisymbre) n-butyle isobutyle s-butyle Glucocochléarine 3-méthylbutyle 2-méthylbutyle Glucojiaputine allyle Sinigrine (SIN) Brassica nigra (moutarde noire) but-3-ényle Gluconapine (GNA) Isatis tinctoria (pastel) pent-4-enyle Glucobrassicanapine (GBN) benzyle Glucotropaeoline (GTL) Tropaeolum majus (capucine) 2-phényléthyle Gluconasturtine (GST) Nasturtium officinale (cresson) p-méthoxybenzyle Glucoaubriétine Aubrietia sp. m-méthoxybenzyle Glucolimnanthine Tableau 1 (suite) Isothiocyanates Précurseur R-N = C = S (GSL) Sources végétales R GSL p-hyroxybenzyle Glucosinalbine Sinapis alba/arvensis (moutarde blanche/sauvage) 1) EtCO(CH2)4 Gluconorcappasaline 2) PrCO(CH2)4 Glucocappasaline PrCO(CH2)3 Glucocapanguline EtOCO(CH2)3 Glucoérypestrine 3) MeS(CH2)3 Glucoibervirine (GIV) MeS(CH2)4 Glucoérucine(GER) Eruca saliva (roquette) MeS CH = CH(CH2)2 Glucoraphasatine Raphanus sativus (radis) MeS(CH2)5 Glucobertéroïne, MeS (CH2)6 Glucolesquerelline Lesquerella sp. MeS (CH2)8 Glucohirsutine Arabis sp. MeS(CH2)9 Glucoarabine Arabis sp. 1) Et = éthyle 2) Pr = propyle 3) Me = méthyle REVENDICATIONS 1. Complexe d'inclusion constitué d'un isothiocyanate organique inclus dans une cyclodextrine. 2. Complexe d'inclusion selon la revendication 1, dans lequel l'isothiocyanate répond à la formule R1- N = C = S (I) dans laquelle R1 représente un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 6 atomes de carbone ; un groupe alcényle, linéaire ou ramifié, de 2 à 6 atomes de carbone ; un groupe arylalkyl dans lequel le groupe alkyle a 1 à 6 atomes de carbone ; un groupe de formule dans laquelle q = 1 ou 2 et R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle ou alcoxyle de 1 à 3 atomes de carbone, le substituant R2 étant en position ortho, para ou méta ; un groupe de formule R CO(CH2)n- dans laquelle R3 est un groupe alkyle de 1 à 3 atomes de carbone et n est un nombre entier égal à 3 ou 4 ; un groupe de formule R OCO(CH2)n- dans laquelle R3 et n sont tels que définis ci-dessus ; un groupe méthylthioalkyle de formule CH3S(CH2)p- dans laquelle p est un nombre entier de 1 à 10 ; ou un groupe de formule CH3-S-CH=CH-(CH2) r dans laquelle r est un nombre entier de 1 à 8. 3. Complexes d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel la cyclodextrine est l'a-cyclodextrine, la ss-cyclodextrine ou la y-cyclodextrine. 4. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel la cyclodextrine répond à la formule dans laquelle m = 6, 7 ou 8 et les R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent OH ou un groupe choisi parmi les groupes X-alkylés ou X-arylés dans lesquels X représente un atome de carbone ou un hétéroatome à condition que l'un au moins des R4 ne soit pas OH. 5. Complexe d'inclusion selon la revendication 2 dans lequel l'isothiocyanate répond à la formule 6. Complexe d'inclusion selon la revendication 5, dans lequel la cyclodextrine est l'acyclodextrine. 7. Complexe d'inclusion selon la revendication 5, dans lequel la cyclodextrine est la ss-cyclodextrine. 8. Complexe d'inclusion constitué d'un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique, inclus dans une cyclodextrine. 9. Complexe d'inclusion selon la revendication 8, dans lequel le précurseur naturel répond à la formule dans laquelle R1 a la signification donnée dans la revendication 2. 10. Complexe d'inclusion selon la revendication 8, dans lequel le précurseur naturel d'un isothiocyanate est choisi dans le groupe comprenant la glucocapparine, la glucolépidine, la glucoputranjivine, la glucocochléarine, la glucojiaputine, la sinigrine, la gluconapine, la glucobrassicanapine, la glucotropaeoline, la gluconasturtine, la glucoaubriétine, la glucolimnanthine, la glucosinalbine, la gluconorcappasaline, la glucocappasaline, la glucocapanguline, la glucoérypestrine, la glucoibervirine, la glucoérucine, la glucoraphasatine, la glucobertéroine, la glucolesquerelline, la glucohirsutine et la glucoarabine. 11. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel la cyclodextrine est l'a-cyclodextrine, la P-cyclodextrine ou la y-cyclodextrine. 12. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel la cyclodextrine répond à la formule dans laquelle m = 6, 7 ou 8 et les R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent OH ou un groupe choisi parmi les groupes X-alkylés ou X-arylés dans lesquels X représente un atome de carbone ou un hétéroatome à condition que l'un au moins des R4 ne soit pas OH. 13. Complexe d'inclusion selon la revendication 8, dans lequel le précurseur naturel d'isothiocyanate est la glucotropaeoline et la cyclodextrine est l'a-cyclodextrine. 14. Procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 qui consiste à ajouter à une solution aqueuse d'une cyclodextrine un isothiocyanate organique pour former le complexe d'inclusion. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la solution aqueuse de cyclodextrine est une solution saturée afin d'obtenir le complexe d'inclusion sous forme de précipité que l'on sépare ensuite de la solution aqueuse. 16. Procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, qui consiste à ajouter à une solution aqueuse d'une cyclodextrine un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique pour former le complexe d' inclusion. 17. Procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, qui comprend les étapes suivantes a) préparer en solution aqueuse un complexe d'inclusion d'un précurseur naturel d'un isothiocyanate organique et de cyclodextrine tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 13, et b) soumettre le complexe ainsi obtenu à une hydrolyse enzymatique par la myrosinase pour transformer le précurseur naturel inclus dans la cyclodextrine en l'isothiocyanate organique correspondant. 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel la solution aqueuse est une solution tampon convenant à l'hydrolyse par la myrosinase. 19. Composition bactériostatique bactéricide et/ou fongicide comprenant un complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'isothiocyanate organique présente des propriétés bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides. 20. Composition bactériostatique, bactéricide et/ou fongicide selon la revendication 19 sous forme solide ou liquide. 21. Composition bactériostatique, bactéricide et/ou fongicide constituée par un mélange sec comprenant: a) un complexe d'inclusion d'un précurseur naturel d' un isothiocyanate organique dans une cyclodextrine, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 13, l'isothiocyanate présentant des propriétés bactériostatiques, bactéricides et/ou fongicides, et b) de la myrosinase. 22. Composition selon la revendication 21 sous la forme de poudre ou de poudre mouillable.