FR 2759708 A1 19980821 FR 9701821 A 19970217 MOYENS POUR IDENTIFIER, ISOLER ET CARACTERISER DES SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES IMPLIQUEES DANS L'APOMIXIE L'invention a pour objet des moyens pour identifier, isoler et caractériser des séquences nucléotidiques impliquées dans l'apomixie. Elle vise plus particulièrement un procédé permettant d'identifier ces séquences dans le génome de plantes apomictiques, puis de les isoler et de les caractériser et les outils pour la mise en oeuvre de ce procédé. Dans son acception moderne, l'apomixie, ou agamospermie, regroupe l'ensemble des phénomènes de reproduction asexuée par graine. On trouve des plantes apomictiques chez près de 300 espèces d'angiospermes appartenant à plus de 35 familles. Les différentes formes d'apomixie, qui n'affectent généralement que la reproduction femelle, se caractérisent par l'absence de réduction méiotique, l'absence de fécondation de l'oosphère, et le développement parthénogénétique des embryons. Une plante apomictique produit donc des descendants qui lui sont génétiquement identiques. La contrepartie naturelle de l'apomixie est la reproduction sexuée, ou amphimixie. Par opposition à l'apomixie, la reproduction sexuée inclut les processus comprenant à la fois méiose réductionnelle et restauration de la ploïdie originale par syngamie. La méiose répartit au hasard entre les gamètes les chromosomes homologues issus des parents. Elle permet aussi la recombinaison entre chromosomes homologues, par l'intermédiaire des crossing-overs. La syngamie est la fusion des gamètes. Elle permet de réunir dans un individu une combinaison particulière de l'information génétique issue des deux parents. L'amphimixie produit donc, par recombinaison des génomes parentaux, des descendants génétiquement uniques. Dans les cycles de développement des plantes, on observe ainsi l'alternance de deux générations successives, séparées par la méiose et la fécondation. La première génération correspond au sporophyte diploïde. Une ou plusieurs cellules du sporophyte subissent la méiose, produisant les méiospores. Les méiospores se développent en gamétophytes haploïdes, qui représentent la génération gamétophytique, à l'origine des gamètes. La fusion des gamètes conduit au zygote, qui représente le retour à la génération sporophytique. Selon l'origine de l'embryon, on distingue deux formes fondamentales d'apomixie : dans les cas d'embryonnie adventive, les embryons se différentient directement à partir de cellules somatiques du nucelle ou du tégument de l'ovule. Il n'y a donc pas d'alternances des générations sporophytiques et gamétophytiques ; dans l'apomixie gamétophytique, on observe au contraire la formation d'un gamétophyte femelle non-réduit, et le développement parthénogénétique de l'embryon à partir de l'oosphère. Dans la suite de la description et dans les revendications, toute référence à l'apomixie se rapportera à l'apomixie gamétophytique. On observe deux grands types d'apomixie gamétophytique, qui diffèrent par l'origine du gamétophyte femelle. Chez les formes aposporiques, le sac embryonnaire non-réduit est dérivé d'une cellule somatique de l'ovule, généralement du nucelle. Chez les formes diplosporiques, il est issu d'une cellule générative, la cellule archésporiale. L'apoméiose recouvre à la fois aposporie et diplosporie. Chez la majorité des plantes apomictiques, l'embryon se développe sans fécondation, mais l'albumen demeure sexue. Au niveau embryonnaire, l'apomixie correspond donc bien à une reproduction asexuée par graine. Elle résulte d'une somme de composantes clairement identifiables : l'apoméiose, ou formation d'un sac embryonnaire sans réduction méiotique, et la parthénogenèse, ou formation d'un embryon sans fécondation de l'oosphère. Apoméiose et parthénogenèse assurent l'alternance des générations sporophytiques et gamétophytiques, mais sans alternance des phases nucléaires : sporophyte et gamétophyte conservent le même niveau de ploïdie. Différentes analyses génétiques ont montré que l'apomixie est héritée comme un locus unique. Au niveau d'une plante, l'apomixie est en fait un mode de reproduction facultatif, associant amphimixie et reproduction asexuée. Il apparaît en effet dans les descendances de plantes apomictiques des individus génétiquement différents de leur plante mère. Pour qu'il y ait développement apomictique au sens strict, il faut que les deux conditions de non-réduction et nonfécondation soient réunies. En fonction de la réalisation ou de l'échec de la méiose et de la fécondation, les classes de descendances possibles chez une plante apomictique facultative sont les suivantes Méiose Apoméiose Fécondation n+n 2n+n Parthénogenèse n+O. 2n+0 La définition des hybrides de type "n+n", ou "2n+n", etc..., est empruntée de Harlan et al (1). Le premier terme désigne l'état du gamétophyte, réduit (n) ou non réduit (2n). Le deuxième terme traduit la présence ou l'absence de fécondation de l'oosphère. La catégorie "2n+0" représente donc l'apomixie stricto sensu et la catégorie "n+n" l'amphimixie. La catégorie "2n+n" conduit à une accumulation génomique, et la catégorie "n+O" à l'haploïdisation de la plante mère. Dans la suite de la description, les références à l'apomixie concernent aussi bien les formes apomictiques facultatives qu'obligatoires produisant exclusivement des descendances de type 2n + O. L'apomixie est inconnue chez les principales plantes cultivées (maïs, blé, riz, pommes de terre). L'apomixie suscite un grand intérêt eu égard à son potentiel pour l'amélioration des plantes. Les modalités de son utilisation, en particulier de son introduction chez les plantes cultivées, restent cependant à définir et peuvent être abordées selon une grande diversité d'approches. Les travaux les plus anciens, et probablement les plus avancés, utilisent des plantes naturellement apomictiques. Les allèles correspondants y sont présents et fonctionnels. Leur transfert dans des espèces cultivées importantes peut se faire soit par l'intermédiaire de croisements interspécifiques entre une espèce cultivée et un apparenté apomictique, (des programmes portent ainsi sur le maïs (Zea mays) et le plus proche apparenté apomictique connu, Tripsacum, soit en isolant les gènes correspondants, pour les introduire ensuite dans l'espèce cible par transgénie. Une autre approche, en développement rapide, consiste à générer l'apomixie chez des espèces sexuées, par différentes méthodes de mutagénèse. Ces approches sont basées sur l'hypothèse fondamentale qu'un contrôle génétique simple est en cause, et que le transfert, ou la modification d'un nombre très faible d'allèles, fournit les conditions suffisantes à l'expression de l'apomixie. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à rechercher chez le maïs des gènes orthologues de celui ou ceux responsables de l'apomixie chez les espèces apomictiques du genre Tripsacum, genre apparenté au maïs. Cette approche a permis de développer une stratégie conduisant à identifier, puis cloner la séquence nucléotidique responsable de ce caractère et de mettre au point de nouveaux outils pour sa réalisation. L'invention a donc pour but de fournir un procédé pour identifier chez les graminées, et plus spécialement chez le maïs, une séquence de nucléotides orthologue de celle responsable de l'apomixie chez les plantes apomictiques. Elle a également pour but de fournir un procédé d'isolement d'une telle séquence. L'invention vise en outre l'utilisation de cette séquence pour récupérer la séquence orthologue chez les plantes apomictiques. Le procédé selon l'invention pour identifier chez les graminées, et plus spécialement chez le maïs, une séquence de nucléotides orthologue de celle responsable de l'apomixie chez les plantes apomictiques est caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui du maïs1 des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues des séquences contrôlant l'apomixie chez les espèces apomictiques. On observera que le critère retenu dans ce procédé correspond à l'échec de la méiose. Les nombreux travaux de cartographie comparée effectués à ce jour, à l'échelle des graminées, montre une très forte conservation de l'architecture génomique. C'est en particulier le cas entre le chromosome 6L du maïs et le chromosome de Tripsacum contrôlant l'apomixie. Les inventeurs ont mis en évidence que les gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie chez Tripsacum possèdent un ou plusieurs orthologues dans le génome du maïs. L'utilisation selon l'invention d'un même jeu de marqueurs chez maïs et Tripsacum, a permis d'identifier des gènes candidats présentant à la fois (1) la même localisation génomique que l'apomixie et (2) un phénotype apparente. L'invention vise notamment un procédé d'identification chez une graminée, plus spécialement chez le maïs, d'une séquence orthologue telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'on localise différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement du maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum. L'invention vise plus particulièrement un tel procédé appliqué aux différentes mutations méiotiques du maïs dans lequel lesdits marqueurs sont capables de localiser les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum dactyloïdes. De manière préférée, la localisation concerne les loci elongate, Afdl et igl. Le procédé de 1 invention est encore caractérisé en ce qu'il comprend l'étiquetage à l'aide de transposons des mutations méiotiques localisées. L'invention vise en particulier l'étiquetage à l'aide de transposons du locus Elongate. L'utilisation de transposons dont on connaît la séquence permet de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion du transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractérise par la perte de sa fonction. Des transposons particulièrement intéressants comprennent les éléments transposables du type Mutator ou Ac/Ds. Le gène muté peut alors être lui-même isolé en repérant le site d'insertion du transposon. Les différents loci où ont été insérés des transposons sont clonés par les techniques classiques de biologie moléculaire. Le site correspondant plus particulièrement au locus Elongate est identifié par cartographie génétique. Il est ensuite séquencé. L'invention vise également l'utilisation d'au moins une partie de cette séquence pour identifier, puis isoler, la séquence directement responsable chez des plantes apomictiques de l'expression de l'apomixie. Elle vise notamment les sondes d'hybridation élaborées à partir de cette séquence, ainsi que les amorces utilisables dans les techniques PCR. Les techniques d'hybridation ou de PCR sont avantageusement réalisées selon les méthodes classiques. L'invention vise en particulier un procédé d'identification et d'isolement d'un gène responsable de l'échec de la méiose chez les Tripsacum apomictiques caractérisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la séquence du locus Elongate. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement - la figure 1, la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant l'apoméiose et la comparaison avec des plantes diploïdes sexuées chez Tripsacum et le maïs, - la figure 2, la construction d'une population de cartographie BCl pour la mutation ell, (elongate), et - la figure 3, l'étiquetage à l'aide de transposons du locus Elongate. Exemple 1 : Cartographie génétique de 1'apoméiose chez TriDsacum On rapporte ci-après la réalisation d'une carte génétique du segment de chromosome contrôlant l'apoméiose chez des formes apomictiques et sexuées du genre Tripsacum. 1) Matériels - Cartographie des Tripsacum diploïdes Les deux parents utilisés sont des plantes diploïdes sexuées (2n=36) de la collection ORSTOM-CIMMYT, maintenue sur la station expérimentale de Tlaltizapan, Etat de Morelos, au Mexique. Il s'agit d'un Tripsacum maizar Hern. and Randolph, accession CIMMYT &num;99-1114 et d'un Tripsacum dactyloides var. meridionale de Wet and Timothy, accession CIMMYT #575-5136. La population comprend 175 plantes F1, parmi lesquelles 56 ont été utilisées pour la cartographie. - Cartographie de l'apoméiose La population de cartographie comprend 232 plantes F1 maïs-Tripsacum. Le parent maïs (H1) est un hybride de maïs (2n=2x=20) entre deux lignées CIMMYT (CML 135 par CML 139). L'autre est un Tripsacum dactyloides tétraploïde et apomictique (2n=4x=72), accession CIMMYT #65-1234. La plante apomictique a été utilisée comme mâle. L'apomixie rend en effet le croisement réciproque difficile. 2) Méthodes Détermination des modes de reproduction Elle est effectuée d'après Leblanc et al. (2) Détection de marqueurs moléculaires de type RFLP liés à l'apoméiose. La stratégie suivie correspond globalement à celle décrite par Michelmore et al. (3) pour la détection de marqueurs moléculaires liés à une réponse phénotypique déterminée. Les sondes ont été obtenues auprès de l'Université de Missouri, Columbia. Une centaine de sondes RFLP ont été choisies sur les cartes génétiques existantes pour le maïs, pour obtenir une densité d'environ 20-30 cM entre deux marqueurs (voir (2), annexe 4). Différentes cartes de référence ont été utilisées : la carte UMC (University of Missouri Colombia ; Maize DataBase, carte UMC95), la carte de l'Université de Cornell (4) et différentes cartes produites au CIMMYT (5). Un test de x2 a été utilisé pour détecter les liaisons potentielles, et les taux de recombinaisons ont été évalués d'après Allard (6). Le parent donneur du segment contrôlant l'apoméiose étant une plante tétraploïde hétérozygote, trois conditions sont nécessaires à la détection d'une liaison entre la diplosporie et un allèle RFLP (1) existence d'un polymorphisme RFLP entre les deux parents à ce locus, (2) hétérozygotie pour cet allèle chez Tripsacum, (3) l'allèle doit être simplex chez le tétraploïde, c'est-à-dire différentiable des 3 autres. - Cartographie des diploïdes On a utilisé une population de cartographie F1 entre deux parents hétérozygotes appartenant à deux espèces distinctes. Les méthodes de cartographie sont telles que décrites par Ritter et al (7). 3) RESULTATS - Identification de marqueurs RFLP liés à 1 ' apomÈlose La figure 1 représente la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant l'apoméiose, et la comparaison avec les plantes diploïdes sexuées chez Tripsacum et le maïs. "Apo" correspond au locus responsable de l'apoméiose. La position d'umc71 sur le chromosome 6 du maïs est indiquée de manière approximative, l'allèle sur le chromosome 6 ayant été retiré des dernières versions de la carte UMC. La carte a été développée à partir de 52 plantes de la population F1 entre maïs et Tripsacum. Dans cette population, méiose et diplosporie sont en ségrégation 1:1 (24 plantes apomictiques contre 28 plantes sexuées, X2= 0,31, P=O,6). Quatre-vingt quatre sondes, sélectionnées sur la carte UMC pour couvrir aussi largement que possible le génome du maïs, ont été testées. 90% d'entre elles détectent au moins un polymorphisme entre maïs et Tripsacum. Trois sondes, présentant un allèle polymorphe et spécifique du bulk apomictique, ont été testées sur l'ensemble de la population F1. Un allèle, détecté par la sonde umc28, s'est avéré lié à l'apomgiose. Dans une deuxième étape, quatorze sondes proches du locus umc28 sur la carte UMC ont été testées. Quatre d'entre elles, umc71, umc62, csu68, et cdo202, détectent des allèles RFLP qui sont à la fois liés à la diplosporie, et en complète coségrégation entre eux. - Cartographie comparée entre diploïdes sexués et tétraploïdes apomictiques Les cinq marqueurs liés à la diplosporie ont été cartographiés sur la population diploïde. Tous ont pu l'être sur un même parent (575-5136). On remarque que les cinq marqueurs sont tous strictement liés chez la plante tétraploïde, mais sont séparés par des taux de recombinaison importants à la fois chez le parent diploïde et le maïs. - Cartographie comparée maïs-Tripsacum: Les sondes détectant des allèles liés au segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez Tripsacum détectent toutes des allèles appartenant au même groupe de liaison sur la carte du maïs. Il s'agit du bras long du chromosome 6. Certaines d'entre elles détectent aussi des allèles dans d'autres régions du génome, en particulier les chromosomes 3 et 8. Les localisations sur la carte maïs des différentes sondes liées à l'apoméiose sont données dans le tableau suivant 1: localisations sur la carte maïs des différentes sondes liées à la diplosporie: Clones Localisation UMC38* 6L; 8L; 3L UMC62 6L UMC71 6L; 8L UMC28 6L CSU68 6L; 8L; 3L Do202 6L; 8L; 3L *: non liée a la diplosporie, mais appartient au même groupe de liaison. Exemple 2 : Identification de gènes orthologues chez le maïs . Identification de relations d'orthologie entre le locus Elongate et l'allèle responsable de l'apoméiose chez Tripsacum. On a recherché chez le maïs, les gènes qui conduisent chez Tripsacum à l'expression de l'apoméiose. On a donc cherché à identifier chez le maïs des gènes candidats présentant à la fois (1) la même localisation génomique que l'apoméiose et (2) un phénotype apparenté à l'apoméiose. Il existe de très nombreux mutants de méiose chez le maïs. La capacité à produire un gamétophyte fonctionnel indépendamment de l'échec de la méiose a été choisi comme critère de sélection. Les travaux dont les résultats sont rapportés ci-après ont été réalisés sur Elongate (ell), qui est un mutant de méiose récessif (6). La figure 2 donne la construction d'une population de cartographie BC1 pour la mutation ell (elongate). Les graines Ell/ell sont normales. Les graines ell/ell présentent une proportion variable (30 à 70 %) d'embryons triploïdes, associés à un endosperme mal formé. Ce mutant a été obtenu auprès du Maize Genetic Stock Center, Urbana, Illinois. On a utilisé la lignée homozygote de phénotype sauvage, W23, pour la construction de la population. Chez les plantes homozygotes pour le locus ell, les chromosomes restent décondensés durant la métaphase et l'anaphase de première division, entraînant diverses anomalies chromosomiques dont une proportion importante de gamétophytes non réduits (de 30 à 70 %, fonction entre autres du fond génétique dans lequel on place la mutation). La fécondation par le pollen d'une plante normale conduit à un embryon triploïde, et à un albumen pentaploïde déficient. Le ratio d'imprinting est en effet de 4m:lp. La localisation précise du locus Elongate était inconnue jusqu'à l'invention. Il appartient au bras long du chromosome 8. étiquetage et isolement de la séquence du locus Elongate à l'aide d'éléments transposables. Les premiers transposons ont été découverts chez le maïs dans les années 1940. Depuis, des éléments comparables ont été trouvés chez de nombreux organismes, en fait probablement tous ceux pour lesquels on dispose d'une caractérisation moléculaire suffisamment fine. Il s'agit d'éléments semble-t-il essentiellement parasites, dont le rôle et l'impact dans la biologie des organismes restent très largement incompris. Les transposons se sont cependant révélés un outil d'une puissance incomparable pour l'analyse fonctionnelle des gènes, le génie génétique, ou la compréhension des mécanismes évolutifs. L'étiquetage consiste à utiliser des transposons dont on connaît la séquence afin de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion d'un transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractérise la plupart du temps par la perte de sa fonction. Le gène muté peut ensuite être lui-même cloné en repérant le site d'insertion du transposon. Les expériences ci-après ont été réalisées avec le système Mutator (8) et (9) qui comprend une série d'éléments transposables non autonomes apparentés et un élément autonome, le MuDR. Celui-ci est responsable à la fois de la transposition des éléments non autonomes et de sa propre transposition. Les expériences de cartographie et d'étiquetage à l'aide de transposons ont été menées parallèlement. Le principe de l'étiquetage à l'aide de transposons pour le locus Elongate est schématisé sur la figure 3 (f: fréquence d'apparition [EL] et [el] phénotypes dominant et récessif ; El* : allèle nul. Les plantes homozygotes pour la mutation récessive sont croisées sur des plantes homozygotes pour l'allèle sauvage, Ell. Dans la population de gamètes produite par la parent EL1/Ell, on retrouve une ou plusieurs mutations au locus Elongate. Lorsque l'insertion conduit à la perte de la fonction de cet allèle, on retrouve alors quelques plantes F1 de génotype ell/Ell, mais de phénotype ell. Le gène est alors marqué. Résultats Trois plantes F1 de génotype hétérozygote Ell/ell ont été croisées sur trois plantes homozygotes ell/ell. Pour chaque famille, 50 plantes ont été mises au champ, autofécondées, et évaluées pour leur phénotype. Afin de confirmer les phénotypes elongate, dix à vingt embryons à l'intérieur des graines présentant un albumen déficient ont été prélevés, et analysés en cytométrie de flux. L'analyse confirme qu'il s'agit bien d'embryons triploïdes. Au total, les phénotypes ell et Ell ségrègent en proportions 1:1 (x2= 0.5 ; P=0.6). Différentes sondes RFLP appartenant aux chromosomes 3, 6, et majoritairement 8 ont été testées tout d'abord en BSA, avec deux enzymes de restriction, EcoR1 et HindIII, puis sur 50 plantes de la population, pour celles détectant un polymorphisme intéressant. Le taux de polymorphisme dans la population est d'environ 40 %. Les mutants distribués par le "stock center" le sont dans un fond génétique indéterminé. Celui contenant la mutation elongate apparaît génétiquement proche de W23, la lignée de phénotype Ell/Ell utilisée. Umc28, umc62, cdo202 et umc71 ne présentent pas d'allèles polymorphes liés à elongate avec les deux enzymes testées. Csu68, par contre, est lié au locus elongate, à 12 % de recombinaison. Références bibliographiques 1/ HARLAN JR, DE WET JMJ (1975) On O.Winge and a prayer: the origins of polyploidy. Bot Rev 41: 361390. 2/ LEBLANC O, PEEL MD, CARMAN JG, SAVIDAN Y (1995a) Megasporogenesis and megagametogenesis in several Tripsacum species (Poaceae). Am J Bot 82: 57-63. 3/ MICHELMORE RW, PARAN I, KESSELI RV (1991) Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genome regions by using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA. 88: 9828-9832. 4/ AHN SN, TANKSLEY SD (1993) Comparative linkage maps of the rice and maize genomes. 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REVENDICATIONS 1/ Procédé pour identifier chez les graminées, et plus spécialement chez le maïs, une séquence de nucléotides orthologue de celle responsable de l'apomixie chez les plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui du maïs des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues des séquences contrôlant l'apomixie chez les espèces apomictiques. 2/ Procédé selon la revention 1, caractérisé en ce qu'on localise différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement, du maïs à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est appliqué aux différentes mutations méiotiques du maïs et que lesdits marqueurs sont capables de localiser les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum dactyloïdes. 4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite localisation concerne les loci Elongate, Afdl et igl. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étiquetage des mutations méiotiques localisées. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étiquetage par transposon est réalisé au locus Elongate à l'aide des éléments transposables du type Mutator ou Ac/Ds. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on clone le gène muté après avoir repéré le site d'insertion du transposon. 8/ Utilisation d'au moins une partie de la séquence du gène cloné selon la revendication 7 pour identifier et isoler la séquence directement responsable de l'expression de l'apomixie chez des plantes apomictiques. 9/ Sondes d'hybridation et amorces moléculaires élaborées à partir de la séquence du gène cloné selon la revendication 7. 10/ Procédé d'identification et d'isolement d'un gène responsable de l'échec de la méiose chez les Tripsacum apomictiques caractérisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la séquence du locus Elongate.