FR 2761576 A1 19981009 FR 9704125 A 19970404 ANIMAL TRANSGENIQUE NON HUMAIN DANS LEQUEL L'EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L'INSULINE EST SUPPRIMÉE L'invention a pour objet un animal transgénique non humain dans lequel l'expression du gène codant pour l'insuline est supprimée. Le gène unique de l'insuline de l'homme, les deux gènes de l'insuline de rat et les deux gènes de l'insuline de souris ont été clonés depuis plusieurs années. Chez la souris comme chez le rat, les deux gènes codant pour des insulines fonctionnelles très voisines (les insulines 1 et 2 ne différent que par deux acides aminés) produites dans des proportions voisines. La séquence de ces gènes est connue, elle est considérée comme identique dans toutes les lignées de souris. Ceci n'est pas vrai des séquences nucléotidiques des régions d'ADN flanquant de part et d'autre le gène. Pour augmenter la probabilité de recombinaison au site d'un gène endogène, qui est très faible, il faut que les séquences flanquantes soient le plus strictement homologues sur le vecteur de recombinaison à construire et sur l'ADN cellulaire. Or cette homologie n'est stricte qu'à l'intérieur d'une dignée consanguine de souris. On sait que l'insuline, hormone peptidique sécrétée par les cellules ss des îlots pancréatiques, agit par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase et que le signal qu'elle transmet ainsi joue un rôle fondamental dans le métabolisme des glucides, des lipides et des protéines. Sa déficience, due à la destruction autoimmune des cellules P au cours du diabète dit "de type I" est rapidement létale, à la suite de troubles métaboliques profonds. Les trois tissus cible majeurs de l'insuline sont le foie, le tissu adipeux et le muscle. Les récepteurs de l'insuline sont présents sur tous les types cellulaires de l'organisme et l'effet de l'insuline sur ces cellules en culture, autres que les trois types mentionnés plus haut, est admis, pouvant induire synthèse d'ADN, traduction des ARN messagers et assimilation du glucose. Toutefois, un récepteur très voisin, celui des facteurs de croissance apparentés à l'insuline (insulin-like growth factors ou IGFs) est co-exprimé sur la plupart des cellules. Chacun des ligands peut lier également le récepteur de l'autre ligand, mais on en ignore la signification fonctionnelle éventuelle. Il n'en reste pas moins que l'absence d'insuline chez l'enfant et l'adulte a les effets désastreux mentionnés plus haut, essentiellement à cause de la défaillance du foie. A ce jour, on ne connaît aucun exemple chez l'homme ou chez l'animal de mutation abolissant la synthèse d'insuline (mutation nulle) et, par conséquent, on ignore le rôle éventuel joué par l'insuline de l'embryon dans son développement. Sur la base d'expériences avec des cellules en culture, I'insuline est considérée comme un facteur important dans la croissance et la différenciation des cellules nerveuses. L'insuline maternelle ne franchit pas la barrière foetoplacentaire. Mais on sait, depuis quelques années, qu'un des deux gènes insuline, celui de l'insuline 2, est transcrit chez l'embryon de souris dans les structures primitives du système nerveux central. Cependant, le rôle de l'insuline dans le développement du système nerveux central n'est pas connu. Par ailleurs, la croissance foetale est attribuée aux IGFs et aucun rôle n'est reconnu à ce jour à l'insuline. L'un des aspects de l'invention est de fournir un modèle expérimental permettant de cribler des médicaments actifs sur les pathologies impliquant I'insuline. L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques dans lequel l'un au moins des gènes codant pour l'insuline n'est plus exprimé. L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques dans lequel le gène codant pour l'insuline 1 n'est plus exprimé. L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques dans lequel le gène codant pour l'insuline 2 n'est plus exprimé. L'un des aspects de l'invention est de disposer de la carte de restriction des gènes de l'insuline, ce qui permet de recloner des fragments de gènes insuline et de leurs régions flanquantes provenant de la lignée des souris 129, étant donné que les cellules souches embryonnaires (ES) proviennent de la même lignée de souris 129. L'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain, dans lequel l'un au moins des allèles de l'un au moins des deux gènes codant pour l'insuline endogène est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline, pour la détermination de médicaments actifs, sur des pathologies impliquant l'insuline. L'observation des souris mutantes obtenues a permis de montrer pour la première fois que l'insuline n'est pas indispensable au développement des structures du système nerveux central. L'observation des souris mutantes obtenues a permis d'établir pour la première fois que l'insuline intervient dans le processus de croissance foetale, puisqu'il y a chez elles un retard de croissance foetale supérieur à 20%. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dans lequel l'expression de l'insuline 1 endogène et/ou de l'insuline 2 endogène est supprimée par rapport à une expression normale, notamment dans les cellules du pancréas. Dans ce qui suit, on désigne par "Insl", le gène de l'insuline l et par "Ins2" le gène de l'insuline 2. Le terme "mammifère" inclut tous les mammifères à l'exception des humains, avantageusement les rongeurs et notamment les souris. Par "animal transgénique", on désigne un animal dans le génome duquel on a introduit une construction génique exogène, qui s'est insérée soit au hasard dans un chromosome, soit très précisément au locus d'un gène endogène, ce qui aboutit dans ce dernier cas à l'impossibilité de l'expression de ce gène endogène parce que celui-ci est soit interrompu, soit remplacé entièrement ou partiellement par une construction telle qu'elle ne permette plus l'expression du gène endogène ou encore une construction qui, en plus de la délétion du gène endogène, introduit un gène exogène. On désignera de tels animaux par animaux "knock-out" ou animaux dont le susdit gène endogène est invalidé. L'expression normale du gène de l'insuline peut être définie de la façon suivante 1) Détermination de l'ARN messager correspondant à l'un des gènes codant pour l'insuline. Ceci est possible par une rétrotranscription de L'ART messager à partir d'une amorce identique pour les deux messagers insuline 1 et insuline 2, suivie de l'amplification selon une progression géométrique des ADNs complémentaires générés, par l'action d'une polymérase (amplification en chaîne par polymérase-transcriptase inverse : RT-PCR), les deux fragments homologues et amplifiés étant alors séparés par électrophorèse, grâce à un polymorphisme de restriction MspI qui permet de générer un fragment de 71 paires de bases pour insuline 1 et de 112 paires de bases pour insuline 2. Les amorces communes utilisées pour la "RT-PCR" sont 5'-GGCTTCTTTCTACACACCCA-3' et 5' CAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3', et la sonde commune aux deux produits est un ol igonucléotide 5' -ACAATGCCACGCTTCTG-3'. 2) Détermination de la quantité de protéine correspondant à l'un des gènes codant pour l'insuline. Ceci est possible grâce à l'utilisation d'anticorps reconnaissant le produit de chaque gène, ou encore par séparation électophorétique des deux insulines révélées l'une et l'autre par un anticorps commun anti-insuline disponible commercialement. L'expression fonctionnellement inopérante signifie que par rapport à une expression normale ci-dessus définie, I'expression d'insuline est nulle et l'ARN messager correspondant totalement absent. L'absence d'expression du gène de l'insuline t et/ou 2 peut être déterminée de la façon suivante 1) Des souris où le gène codant pour l'insuline a été remplacé par une construction telle qu'il ne puisse plus être exprimé sont d'abord caractérisées relativement à l'ADN par analyse avec la méthode de transfert d'ADN (Southern blot), à l'aide d'une sonde consistant en un fragment contenant tout ou partie de la région du gène codant pour l'insuline, cette sonde étant définie dans les exemples. L'hybridation de cette sonde montre clairement que la bande d'ADN correspondant à l'une des insulines de type sauvage (c'est-à-dire normalement présent chez les animaux) n'est plus présente dans les animaux homozygotes vis-àvis de la mutation, mais remplacée par une bande correspondant au génome modifié. 2) L'analyse par RT-PCR des ARNs extraits des tissus exprimant au moins l'une des insulines, notamment du pancréas, montre qu'il n'y a plus d'expression d'ARN correspondant au gène sauvage. Les amorces et la sonde utilisées ont été définies ci-dessus, dans le paragraphe intitulé "Détermination de l'ARN messager correspondant à l'un des gènes codant pour l'insuline". Les cellules dans lesquelles l'expression d'un gène codant pour l'une des insulines est supprimée sont essentiellement les cellules du pancréas. Dans le cadre de l'invention, la suppression de l'expression du gène insuline 2 survient également dans les autres tissus où il est exprimé, notamment le sac vitellin, le cerveau et le thymus. L'invention concerne plus particulièrement un animal mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, dans lequel l'un au moins des allèles de l'un au moins des deux gènes codant pour l'insuline endogène est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline. Selon un mode de réalisation particulier, les animaux de l'invention sont tels que l'un des deux allèles du gène codant pour l'insuline 1 est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline 1. Selon un autre mode de réalisation, les animaux de l'invention sont tels que les deux allèles du gène de l'insuline 1 sont rendus fonctionnellement inopérants vis-à-vis de l'expression de l'insuline 1. En d'autres termes, il n'y a plus d'expression de l'insuline 1. Dans ce cas, I'expression de l'insuline 2 ne compense pas l'absence d'expression de l'insuline 1 ; les animaux vivent et se reproduisent cependant sans pathologie apparente. Selon un mode de réalisation particulier, les animaux de l'invention sont tels que l'un des deux allèles du gène codant pour l'insuline 2 est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline 2. Selon un autre mode de réalisation, les animaux de l'invention sont tels que les deux allèles du gène de l'insuline 2 sont rendus fonctionnellement inopérants vis-à-vis de l'expression de l'insuline 2. En d'autres termes, il n'y a plus d'expression de l'insuline 2. Dans ce cas, les animaux peuvent avoir un diabète sucré transitoire à la naissance, qui disparaît après quelques jours. Dans ce cas, I'expression de l'insuline 1 compense l'absence d'expression de l'insuline 2. Selon un autre mode de réalisation, les animaux sont tels que l'un des deux allèles du gène codant pour l'insuline 1 est rendu fonctionnellemnt inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline 1 et les deux allèles du gène de l'insuline 2 sont rendus fonctionnellement inopérants vis-à-vis de l'expression de l'insuline 2. Selon un autre mode de réalisation, les animaux sont tels que l'un des deux allèles du gène codant pour l'insuline 2 est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline 2 et les deux allèles du gène de l'insuline 1 sont rendus fonctionnellement inopérants vis-à-vis de l'expression de l'insuline 1. Dans ce cas, les animaux peuvent avoir un diabète sucré transitoire à la naissance, qui disparaît après quelques jours. Selon un autre mode de réalisation, les animaux de l'invention sont tels que les deux allèles respectivement du gène de l'insuline 1 et du gène de l'insuline 2 sont rendus fonctionnellement inopérants. Dans ce cas il n'y a pas production d'insuline. Les animaux ont un diabète sucré avec acidocétose qui se développe dès le début de l'alimentation et est létal en 2 à 3 jours. Ce diabète est sensible à l'administration d'insuline. Ces animaux sont désignés par le terme double nullizygotes. L'invention concerne notamment un animal mammifère non humain ou cellules de mammifère dans lequel l'un au moins des allèles codant pour l'insuline 1 et/ou l'insuline 2 est remplacé par un gène susceptible de coder pour une protéine présentant une activité enzymatique. Comme gènes susceptibles de coder pour une protéine présentant une activité enzymatique, on peut citer ceux de la ss galactosidase, de la luciférase, de la chloramphénicol acétyltransférase, d'une aminoglycosylphosphotransférase. Le gène présentant une activité enzymatique peut être soit sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline, soit sous le contrôle de son propre promoteur. De préférence, le gène susceptible de coder pour une protéine enzymatique remplace l'un au moins des allèles du gène de l'insuline 2. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le gène susceptible de coder pour une protéine enzymatique remplace l'un au moins des allèles du gène de l'insuline 1. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifère dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et contenant un transgène permettant l'expression d'insuline humaine. L'invention concerne également l'utilisation d'un animal mammifère transgénique tel que défini au paragraphe précédent. Le transgène permettant l'expression d'insuline humaine exogène correspond à un fragment d'ADN humain contenant l'unité de transcription du gène insuline et ses régions flanquantes, notamment un fragment de 11 kilobases. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment p, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine et, d'autre part, un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat, et permettant l'induction de la prolifération des cellules ss. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat, et permettant l'induction de la prolifération des cellules ss. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine et, d'autre part, un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat préalablement modifié de façon à induire l'arrêt de sa transcription sous l'effet de la présence de tétracycline, et permettant l'arrêt de la prolifération des cellules ss en présence de tétracycline. Selon un mode de réalisation avantageux, I'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et contenant en outre d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine et, d'autre part, une construction contenant le transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat préalablement modifié de façon à induire sa transcription sous l'effet de la présence d'une substance, notamment d'un antibiotique, d'une hormone, d'une cytokine ou d'un facteur de croissance, et permettant l'induction de la prolifération des cellules ss en présence de la susdite substance. L'invention concerne également des cellules encapsulées dans un matériel inerte apte à la greffe de ces cellules in vivo dans des conditions d'abri vis-à-vis du système immunitaire. Pour "matériel inerte", on désigne une substance ou un complexe physicochimique ne modifiant pas le matériel biologique greffé et n'induisant pas de réaction immunologique de l'hôte, ce qui rend ce matériel apte à la greffe. L'expression "condition d'abri vis-à-vis du système immunitaire", signifie que les cellules vivantes greffées sont séparées du système immunitaire de l'hôte de telle sorte que les cellules du système immunitaire, les anticorps et autres facteurs de rejet, ne puissent les atteindre. L'invention concerne également un animal mammifère non humain ou cellules de mammifères, résultant du croisement des animaux ci-dessus définis, ou de croisement de l'un quelconque des animaux ci-dessus définis avec un autre animal de même espèce. L'invention concerne également des cellules cultivées à partir des animaux mammifères transgéniques non humains décrits ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des cultures cellulaires contenant l'une des susdites constructions transgéniques. Ces cultures cellulaires peuvent être obtenues soit à partir de cellules prélevées sur des animaux transgéniques tels que définis ci-dessus soit à partir de lignées cellulaires en utilisant les susdites constructions transgéniques, cette deuxième possibilité pouvant être effectuée à l'aide de techniques standard de transfection cellulaire. L'invention concerne également un mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des susdites constructions transgéniques, obtenue par recombinaison homologue, sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57 Black 6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des susdites constructions et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des susdites constructions. L'homozygote présente un fond génétique 129/C57 Black 6 50/50. On peut revenir sur un fond génétique C57 Black 6 par croisement homozygote avec des souris C57 Black 6 sur 12 générations au moins. On choisit de façon avantageuse les souris C57 Black 6, car ce fond génétique est plus favorable pour certaines expériences de comportement. L'invention concerne également un mammifère transgénique tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant l'une des constructions transgéniques définies ci-dessus. L'invention concerne également le procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant l'insuline et de leur traitement comprenant - le remplacement de tout ou partie du gène codant pour l'insuline 1 par le gène neo, et notamment le remplacement du fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,687 kilobase (par référence à l'origine du transcrit situé à la position + 1), et notamment le remplacement de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pInsineo, * le sous-clonage d'un fragment ApaI/XhoI de 7,2 kb (correspondant à la région flanquante en aval (en 3') de Insl) dans un plasmide pSK+ préalablement digéré par ApaI et XhoI, aboutissant à p4, * le sous-clonage d'un autre fragment BamHI/HindIII (correspondant à la région en 5' de Insl) dans pSK+, donnant pR1, * le vecteur utilisé pour fabriquer le vecteur de recombinaison étant dérivé de pKS+ contenant les gènes neo (fragment BamHI provenant de pMC 1 POLA -Stratagène) au site BamHI et tk (fragment XhoI/HindIII provenant de pMCtk décrit dans Liu et al., Cell, 1993, Vol. 75, 59-72) entre les sites XhoI et HindIII et désigné par pNTK, * le clonage du fragment NotI/PvuII de pR1 correspondant au fragment de séquence homologue en 5' dans pNTK entre les sites NotI et XbaI, donnant pR2, dans lequel le fragment HindIII de 6,5 kb de p4, (correspondant au fragment de séquence homologue en 3'), a été cloné au site HindIII donnant pînsineo, - et/ou le remplacement de tout ou partie de la séquence codante du gène de l'insuline 2 par une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique et notamment le remplacement du fragment nucléotidique allant de la position +21 à la position +856 paires de bases (par référence à l'origine du transcrit situé à la position + 1,), et notamment le remplacement de la séquence codante d'un ou deux allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2 par celle du gène LacZ d'Escherichia coli dans des cellules embryonnaires souches de souris (ES), et notamment par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pIns2Zne * le sous-clonage d'un fragment EcoRI de 7 kb, correspondant à la région flanquante, en 3' du gène de l'insuline 2, au site EcoRI de pSK+, donnant p12, * la destruction d'un site NsiI présent dans l'insert de 7 kb de p12, donnant p126NsiI, * le sous-clonage d'un fragment XbaI de 5 kb contenant le gène de l'insuline 2 également dans pSK +, donnant p 13, * la synthèse de la région -950/+20 du gène de l'insuline 2 par une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les amorces nucléotidiques suivantes 5' -CGCTCTAGACCCTCCTCTTGCATTTCAAA-3' et 5' -CGCATGCATGTAGCGGATCACTTAGGGT-3' ces amorces apportant des sites XbaI et NsiI dans le produit de PCR obtenu, * le clonage du produit PCR en amont de la séquence codante du gène LacZ dans le vecteur pGN (Le Mouellic et al. 1990, PNAS, 87, 4712 4716) entre les sites XbaI et NsiI, * la destruction du site NsiI donnant pl5, * le remplacement du fragment XbaI/SfiI de plS par un fragment XbaI/SfiI provenant de p13, donnant p16, * la modification du vecteur pNTK tel que défini ci-dessus en y insérant au site HindIII un linker NsiI, donnant plO, * le clonage du fragment XbaI/XhoI provenant de p16 (contenant à la fois le fragment de 2,7 kb de séquence homologue en 5' et LacZ) dans plO entre les sites XbaI et SpeI, donnant p17, * le clonage du fragment SmaI/EcoRI de 5,5 kb provenant de pl2ANsiI (correspondant au fragment de séquence homologue en 3'), au site NsiI de p17 en utilisant des linkers NsiI et donnant pîns2Zneo - I'introduction des susdites cellules dans des embryons, notamment des blastocytes de mammifères non humains, notamment des souris, - la sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, - le croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6 donnant des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions telle que définie ci-dessus, et - éventuellement le croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions telle que définie ci-dessus, - éventuellement le croisement d'homozygotes par rapport à chacune des constructions définies ci-dessus pour obtenir des doubles hétérozygotes pour chacune des constructions, - éventuellement le croisement des doubles hétérozygotes, donnant en particulier des animaux doubles homozygotes. L'invention concerne également un procédé de criblage de médicaments actifs sur les pathologies impliquant l'insuline, notamment le diabète, comprenant l'administration d'un médicament à tester à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humain transgéniques * contenant à la place de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2, une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position + 21 paires de bases à la position + 856 paires de bases, et notamment une construction pIns2Zne telle que définie ci-dessus, * et éventuellement contenant, à la place de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, le gène neo et notamment le fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,856 kilobase, et notamment une construction pînsineo telle que définie ci-dessus, - la détermination de l'activité ss galactosidase des cellules ss. L'invention concerne également une construction transgénique dans laquelle * tout ou partie de la séquence d'un allèle du gène endogène codant pour l'insuline 1 est remplacé par le gène neo, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,687 kilobase, et notamment - I'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, est remplacé dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par : pînsineo, * le sous-clonage d'un fragment ApaI/XhoI de 7,2 kb (correspondant à la région flanquante en aval (en 3') de Insl) dans un plasmide pSK+ préalablement digéré par ApaI et XhoI, aboutissant à p4, * le sous-clonage d'un autre fragment BamHI/HindIII (correspondant à la région en 5' de Insl) dans pSK+, donnant pR1, * le vecteur utilisé pour fabriquer le vecteur de recombinaison étant dérivé de pKS+, contenant les gènes neo (fragment BamHI provenant de pMC1 POLA -Stratagène) au site BamHI et tk (fragment XhoI/HindIII provenant de pMCtk décrit dans Liu et al., Cell, 1993, Vol. 75, 59-72) entre les sites XhoI et HindIII et désigné par pNTK, * le clonage du fragment NotI/PvuII de pR1 correspondant au fragment de séquence homologue en 5' dans pNTK entre les sites NotI et XbaI, donnant pR2, dans lequel le fragment HindIII de 6,5 kb de p4, correspondant au fragment de séquence homologue en 3', a été cloné au site HindIII donnant pInsl"eO, et/ou dans laquelle tout ou partie de la séquence d'un allèle du gène endogène codant pour l'insuline 2 est remplacé par une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position +21 à la position +856, et notamment - la séquence codante d'un ou deux allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2 est remplacée par celle du gène LacZ d'Escherichia coli dans des cellules embryonnaires souches de souris (ES), et notamment par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pIns2Zne , * le sous-clonage d'un fragment EcoRI de 7 kb, correspondant à la région flanquante, en 3' du gène de l'insuline 2, au site EcoRI de pSK+, + , donnant pl2, * la destruction d'un site NsiI présent dans l'insert de 7 kb de p12, donnant pl2ANsiI, * le sous-clonage d'un fragment XbaI de 5 kb contenant le gène de l'insuline 2 également dans pSK+, donnant p13, * la synthèse de la région -950/+20 du gène de l'insuline 2 par une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les amorces nucléotidiques suivantes 5' -CGCTCTAGACCCTCCTCTTGCATTTCAAA-3' et 5' -CGCATGCATGTAGCGGATCACTTAGGGT-3 ' ces amorces apportant des sites XbaI et NsiI dans le produit de PCR obtenu, * le clonage du produit PCR en amont de la séquence codante du gène LacZ dans le vecteur pGN (Le Mouellic et al. 1990, PNAS, 87, 4712 4716) entre les sites XbaI et NsiI, * la destructi L'invention concerne également l'ADN génomique de l'insuline 2 de la lignée de souris consanguines 129, caractérisé par les sites de restriction suivants, par référence à l'origine du transcrit situé à la position + i - en amont du site + i un site NsiI (à -10,8 kilobases) deux sites EcoRI (à -5,4 kilobases et -455 paires de bases) un site XbaI (à -2,7 kilobases) un site SfiI (à -239 paires de bases) - en aval du site + i deux sites EcoRI (à +378 paires de bases et 7,9 kîlobases) un site SmaI (à +856 paires de bases) un site Xbal (à +2,2 kilobases) un site NsiI (à +4,2 kilobases) un site XhoI (à + 7 kilobases). Conclusions: L'intérêt des souris mutantes de l'invention dans l'étude du diabète, par rapport aux modèles animaux déjà existants, tels que la souris de la lignée NOD ou le rat de la lignée BB, est que l'absence d'insuline est totale dès la naissance, que cette absence existe dès la vie embryonnaire, qu'elle existe sans la maladie autoimmune, cause de la maladie des animaux susmentionnés et du diabète humain de type I. Elles permettent d'explorer le rôle propre de l'absence d'insuline sans composante immunitaire associée. Leur intérêt par rapport à l'induction expérimentale d'un diabète par destruction des cellules pancréatiques ss obtenue avec des drogues telles l'alloxane ou la streptozotocine est que les cellules ss sont indemnes en l'absence totale d'insuline, ce qui exclue l'interférence des effets cytolytiques dans le syndrome d'absence d'insuline et permet d'étudier l'effet de l'absence d'insuline en présence de tous les acteurs cellulaires de l'organisme. Les souris mutantes dont seulement un, deux ou trois gènes d'insuline sont invalidés, n'ont pas de syndrome diabétique chronique détectable. Les souris mutantes de l'invention permettent de déterminer si, à un âge avancé, ces animaux ne développent pas de complications vasculaires, habituelles chez le diabétique même en apparence bien équilibré par l'insulinothérapie. Ces complications sont responsables de cécité, d'insuffisance rénale et d'artérite. il est possible que les souris définies ci-dessus soient mal équilibrées de façon jusqu'ici imperceptible mais qu'elles puissent représenter un modèle animal pour les complications vasculaires du diabète, modèle qui n'existe pas du tout à l'heure actuelle. La souris est actuellement le seul animal dont on sache dériver des lignées de cellules pancréatiques ss de façon reproductible. De plus, ces cellules conservent leurs propriétés fonctionnelles essentielles, synthèse et stockage d'insuline, et sécrétion induite par le glucose. La possibilité de dériver de telles cellules à partir d'animaux mutants dépourvus de synthèse d'insuline est une ouverture importante dans la perspective de développer des cellules ss susceptibles d'être utilisées dans une thérapeutique cellulaire du diabète. En effet, I'introduction d'un transgène humain de l'insuline dans les souris mutantes ou même directement dans les cellules ss déjà établies en culture, permet d'obtenir des cellules ss éventuellement greffables chez l'homme (grâce aux procédés d'encapsulation cellulaire, permettant de protéger les cellules greffées du système immunitaire de l'hôte) qui sécrétent sous le contrôle physiologique de l'hôte de l'insuline humaine, c'est à dire une protéine du soi qui n'induit pas elle-même de réaction immunitaire. Figure 1: Elle représente l'interruption ciblée de Insl (Figure la) et de Ins2 (Figure lb). Les structures des vecteurs de ciblage, ainsi que le type sauvage (wt) et les allèles recombinants sont représentées respectivement sur la figure la pour Insi et sur la figure lb pour Ins2. On a indiqué les enzymes de restriction et les sondes utilisées pour le génotypage des ADN de souris et cellulaires. Les autoradiogrammes des analyses par Southern blot confirment l'obtention des cellules (D3) souches embryonnaires (ES) portant un allèle recombiné pour insi (D3R1) ou Ins2 (D3R2) dans (c) et de Insl-/- et de Ins2-/- et des souris mutantes qui sont doubles homozygotes en (d) neo = gène de neomycine phosphotransférase ; tk gène de la thymidine kinase du virus simplex de l'herpès type 1, B = Bam HI ; E, ECoRI ; H, HindIII ; N, N SiI; ; P, PVuII ; X, XbaI. Figure 2 : Analyse RT-PCR de l'expression de Insl/Ins2 dans le pancréas de souris sauvages et de mutantes doubles nullizygotes. L'ARNm de p-actine est amplifié comme témoin. Figure 3 : Retard de croissance (a) de nouveaux nés doubles nullizygotes (n= 11) comparés à des animaux témoins. La morphologie du témoin (b) et d'un souriceau déficient en insuline (c). Le squelette d'un nouveau né déficient en insuline (e) est plus petit que celui du témoin (d). Figure 4 : Analyse du foie et du pancréas de souris sauvages et doubles nullizygotes. Analyse histologique des sections de foie de souris de type sauvage (a) et déficientes en insuline (b). Coloration immunocytochimique des sections de pancréas de souris sauvages (c, e,) et déficientes en insuline (d, f,) en utilisant des anticorps contre le peptide 1-C (c, d), le peptide 2-C (e, f). L'expression de LacZ dans les sections pancréatiques de souris déficientes en insuline est visualisé par la coloration avec X-Gal (j). La coloration de fond obtenue avec des animaux de type sauvage est représentée en (i). Echelle : a, b 10 11 ; c, j = 8 y. Figure 5 : Carte de restriction du gène de l'insuline 1 de la lignée des souris consanguines 129. Figure 6 : Carte de restriction du gène de l'insuline 2 de la lignée des souris consanguines 129. Matériels et méthodes La mutation nulle du gène de l'insuline 1 (Insl) ou celle du gène de l'insuline 2 (Ins2) a nécessité les étapes suivantes 1) clonage du gène dans une banque d'ADN de souris consanguines de la lignée 129, 2) établissement de la carte de restriction du locus cloné, 3) construction du vecteur plasmidique de recombinaison, 4) électroporation de ce vecteur dans des cellules embryonnaires souches mâles (cellules ES) de souris de la lignée 129, 5) sélection de cellules ES ayant intégré le vecteur de recombinaison et caractérisation moléculaire du locus muté, 6) micro-injection de cellules ES portant la mutation dans des blastocystes de souris, transfert de ces derniers dans l'oviducte de femelles porteuses et obtention de souris chimères mâles, 7) croisement des chimères avec des souris sauvages et identification, dans les descendants de la première génération d'individus dérivés de la cellule ES et portant la mutation nulle (à l'état hétérozygote), 8) croisement entre elles de souris hétérozygotes et identification dans la descendance de souris portant la mutation nulle à l'état homozygote (souris nullizygotes), 9) entretien et propagation de la lignée par croisement de nullizygotes entre eux, Les souris portant une mutation nulle des deux allèles du gène Insi et du gène Ins2 (doubles nullizygotes) sont obtenues en deux étapes. Tout d'abord, le croisement d'une souris nullizygote pour Insi avec une souris nullizygote pour Ins2 produit une première génération de souris toutes hétérozygotes pour chacune des mutations. Puis, le croisement de ces dernières entre elles génère avec une fréquence de 0.0625 des souris double nullizygotes (soit en moyenne une souris sur 16). Clonage du gène dans une banque d'ADN de souris consanguines de la lignée 129 Pour cribler la banque, on a utilisé comme sondes des ADN complémentaires (ADNc) correspondant, I'un à Insl, I'autre à Jans2, marquées au 32phosphore. Une banque de souris 129 disponible dans le commerce (Stratagene) a permis de cloner plusieurs phages X Ins2 . Une autre banque, construite dans l'Unité INSERM 184, a permis de cloner plusieurs autres phages X correspondant à Jnsl. L'utilisation de diverses enzymes de restriction a permis d'établir la carte de restriction des différents clones et d'orienter les différents phages correspondant à l'un ou l'autre gène. Puis, utilisant ces cartes, plusieurs fragments de restriction ont été sous-clonés. Construction du vecteur plasmidique de recombinaison A - Pour Insl, un fragment Hind III/SmaI de 8,7 kilobases (kb) et un fragment ApaI/XhoI de 8,2 kb (correspondant aux régions flanquantes en amont (en 5') et en aval (en 3') de Insi ) ont été sous-clonés séparément dans un plasmide pSK+ préalablement digéré par Hind III et SmaI, pour l'un, ApaI et Xho!, pour l'autre, aboutissant aux plasmides p34 et p4. Un autre fragment BamHI/HindIII (correspondant à la région en 5' de Insl) a également été, cloné dans pSK+, donnant pR1. Le vecteur utilisé pour fabriquer le vecteur de recombinaison est dérivé de pKS+ contenant les gènes neo au site BamHI et tk entre les sites XhoI et HindIII. Le fragment NotI/PvuII de pRl correspondant au fragment de séquence homologue en 5' a été cloné dans pJorg entre les sites NotI et XbaI, donnant pR2, dans lequel le fragment HindIII de 6,5 kb de p4, correspondant au fragment de séquence homologue en 3,' a été cloné au site HindIII. Le résultat est le vecteur de recombinaison pour Insl. Les sondes synthétiques 1 et 2 (voir Figure 1) correspondent l'une au fragment BamHI de p34, l'autre au fragment HindIII/XhoI de p4. B - Pour Ins2, la séquence codante du gène a été remplacée par celle du gène LacZ d'Escherichia coli. LacZ code l'enzyme ss galactosidase qui scinde le lactose en glucose et galactose. L'utilisation pour substrat de l'enzyme d'un précurseur X-gal incolore génère un produit de coloration bleue intense qui peut être visualisé sur des préparations anatomiques ou histologiques et titré par colorimétrie. Deux fragments EcoRI de 5 et 7 kb, correspondant aux régions flanquantes, I'un en 5', I'autre en 3' du gène Ins2 , ont été sous-clonés au site EcoRIde pSK+, donnant l'un pll, I'autre pi2. Un site NsiI présent dans l'insert de 7 kb de p12 a été détruit, donnant pl2ANsiI. Un fragment XbaI de 5 kb contenant Ins2 a également été sous-cloné dans pSK+, donnant p13. La région - 950/+20 de Ins2 a été synthétisée par une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les amorces nucléotidiques suivantes 5' -CGCTCTAGACCCTCCTCTTGCATTTCAAA-3' et 5'-CGCATGCATGTAGCGGATCACTTAGGGT -3' Ces amorces apportent des sites XbaI et NsiI dans le produit de PCR obtenu. Celui-ci a été cloné en amont de la séquence codante du gène LacZ dans le vecteur pGN (obtenu de Philippe Brûlet,) entre les sites XbaI et NsiI. Le site NsiI a alors été détruit, donnant pl5. Le fragment XbaI/SfiI de pl5 a été remplacé par un fragment XbaI/SfiI provenant de p13, donnant pal6. Pour construire le vecteur de recombinaison, le dérivé pKS + ci-dessus défini a d'abord été modifié en y insérant au site HindIII un linker NsiI, donnant plO. Le fragment XbaI/XhoI provenant de pal6, contenant à la fois le fragment de 2,7 kb de séquence homologue en 5' et LacZ a été cloné dans plO entre les sites XbaI et SpeI, donnant pal7. Le fragment SmaI/EcoRI de 5,5 kb provenant de pl2DNsiI correspondant au fragment de séquence homologue en 3', a été cloné au site NsiI de p17 en utilisant des linkers NsiI, donnant le vecteur de recombinaison pour Ins2. La sonde synthétique 3 correspond au fragment XhoI/EcoRI de p12 et la sonde 4 au fragment neo (voir Figure 2). Toutes les manipulations des phages, des bactéries et de l'ADN ont été exécutées en utilisant les protocoles expérimentaux décrits dans la référence [1]. Génération des souris mutantes Les cultures de cellules ES et les manipulations d'embryons de souris ont été faites selon les méthodes décrites [2-4]. Les ADNs des vecteurs de recombinaison ont été linéarisés par digestion par NotI avant d'être électroporés dans des cellules ES de la lignée D3. Après sélection par les drogues G418 (Gibco) et Ganciclovir (Syntex), 3 clones recombinants pour Insi et 12 pour Ins2 ont été identifiés par analyse moléculaire (voir infra). Dix à quinze cellules provenant de ces clones ont été micro-injectés dans la cavité de blastocystes de la lignée de souris C57BL/6 (B6) qui ont ensuite été transférés dans l'oviducte de femelles pseudogestantes. Plusieurs chimères mâles ont été obtenues. Elles ont été croisées avec des femelles B6. Deux clones cellulaires indépendants pour chacune des mutations ont été utilisés. Les souris de première génération dont le pelage est agouti dérivent de cellules germinales dérivées de cellules ES. L'analyse moléculaire (voir infra) permet d'identifier celles d'entre elles qui ont hérité de l'allèle Ins recombinée c'est à dire de l'allèle nul. Les souris hétérozygotes pour une mutation ont été croisées entre elles. Dans leur descendance de première génération, on a trouvé un quart des animaux nullizygotes, c est à dire homozygotes pour la mutation nulle considérée. Le croisement entre eux de ces animaux nullizygotes a permis d'établir des lignées nullizygotes soit pour le gène Insi, soit pour le gène Ins2. Le croisement d'une souris nullizygote pour Insi avec une souris nullizygote pour Ins2 produit des animaux de première génération qui sont tous hétérozygotes pour chacune des mutations. Le croisement entre elles de ces doubles hétérozygotes produit, selon les combinaisons chromosomiques, des animaux ayant 0, 1, 2, 3 ou 4 gènes Ins invalidés. La combinaison génique réalisée chez chaque individu peut être identifiée par des tests de biologie moléculaire (voir infra). Analyse moléculaire des cellules et des animaux 1) Analyse de fragments de restriction de l'ADN La présence de la mutation nulle dans des cellules ES recombinées, à l'exclusion de toute autre insertion aléatoire du vecteur de recombinaison est détectée par analyse de l'ADN. Les fragments de restriction générés à partir de l'ADN sont séparés par électrophorèse, transférés sur une membrane de Nylon sur laquelle ils sont incubés avec une sonde radioactive spécifique, dont l'hybridation à des fragments d'ADN de taifle déterminée, révélée par autoradiographie, permet de conclure à la présence de la mutation attendue. Pour Insi, la digestion par PvuII permet de visualiser pour l'allèle muté, le remplacement d'une bande de 9,0 kb par une bande de 9,5 kb (avec la sonde 1) et celui d'une bande de 7,5 kb par une bande de 8,0 kb (avec la sonde 2). La coexistence de deux doublets 9,0/9,5 kb (sonde 1) et 8,0/7,5 kb (sonde2) indique l'hétérozygotie pour la mutation. La présence, chez une souris, de deux bandes uniques de 9,5 kb (sonde 1) et 8,0 kb (sonde 2) signe l'homozygotie pour la mutation. Pour Ins2, la digestion par EcoRI permet de visualiser pour l'allèle muté le remplacement d'une bande de 7,5 kb par une bande de 7,0 kb (avec la sonde 3). La digestion par NsiI, I'apparition d'une bande de 15 kb (avec la sonde 4). L'existence d'un doublet EcoRI avec la sonde 3 indique l'hétérozygotie, celle d'une bande unique de 7,0 kb l'homozygotie pour la mutation. 2) La discrimination entre les différents génotypes dans les intercroisements peut se faire en pratiquant le même examen. 4) La recherche des transcrits Insi et Ins2 se fait par une technique combinant la transcription inverse de l'ARN messager suivie de l'amplification de l'ADNc générée selon un protocole décrit [5]. 4) La mise en évidence du précurseur (pro-insuline) de chacune des insulines 1 et 2 dans les cellules ss des îlots de Langerhans se fait sur des coupes histologiques de pancréas en utilisant une technique classique d'immunocytochimie en présence d'anticorps spécifiques de l'un ou l'autre produit. 5) La mutation introduite dans le gène Ins2 comporte la séquence codante du gène LacZ qui se trouve placée sous le contrôle des séquences régulatrices du gène Ins2. En fait, le gène LacZ fonctionne désormais comme le gène Ins2 et à sa place. Comme cela a déjà été mentionné plus haut, le produit de ce gène, l'enzyme P galactosidase, est capable de cliver un précurseur incolore en générant un dérivé bleu. Celui-ci peut être vu par transparence sur un pancréas entier, sur des coupes histologiques. Il peut être mis en évidence et sa concentration mesurée par colorimétrie d'extraits cellulaires ou tissulaires. Les souris transgéniques de l'invention dépourvues d'insuline permettent de développer ou de tester des stratégies de thérapies alternatives du diabète. En particulier, elles permettent d'obtenir des cellules P destinées à une thérapie cellulaire du diabète. 1) Obtention de souris dont la seule insuline produite est de l'insuline humaine: Les lignées de souris transgéniques exprimant le gène de l'insuline humaine sont disponibles. Ces souris sont obtenues en micro-injectant dans le pronucleus de zygotes (ovocyte fécondé par un spermatozoïde et dans lequel les deux pronuclei mâle et femelle sont toujours distincts) un fragment d'ADN humain de 11 kilobases contenant le gène de l'insuline (1430 paires de bases). Certaines des souris dérivées du développement de ces embryons ont intégré l'ADN étranger (le transgène) dans un de leurs chromosomes. Elles expriment le transgène, ont une fraction de leur insuline qui est de l'insuline humaine et ne présentent aucune pathologie, leur quantité globale d'insuline synthétisée et stockée étant normale. Elles ont servi à établir, par croisement, des lignées de souris transgéniques pour le gène humain de l'insuline, L'une de ces lignées (Tg171), dans laquelle le transgène humain est intégré dans le chromosome N" 18 [6] est utilisée pour introduire le transgène humain dans une lignée dépourvue de gènes fonctionnels d'insuline de souris. Pour cela, les souris Tel71 ont été croisées avec des souris portant des allèles nuls de Insi et Ins2. Des souris de première génération portant un allèle nul pour Insi, un allèle nul pour Ins2 et un transgène humain ont été obtenues. Leur croisement entre elles permettra d'obtenir des individus portant deux allèles nuls de Insi, deux allèles nuls de Ins2 et deux allèles du transgène. Contrairement aux souris double nullizygotes, ces souris survivent à la période néonatale car elles ont une production d'insuline. Cette insuline est uniquement de l'insuline humaine. 2) Obtention de cellules ss: Il existe des lignées de souris transgéniques pour une construction génique comportant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène Ins2 de rat (transgène Ins-Tag). Ces souris expriment l'antigène T dans les cellules ss, ce qui a pour effet d'induire leur prolifération, tant in vivo que lorsqu'elles sont mises en culture. Cette prolifération notable en culture, qui n'existe pas pour les cellules ss de souris ordinaires, permet d'établir des lignées de cellules ss, conservant leurs propriétés biologiques essentielles. il est toutefois impossible d'arrêter leur prolifération, qui reste incontrôlée. [7-9]. Plus récemment, on a construit une lignée de souris portant le même transgène Ins-Tag, préalablement modifié de façon à induire l'arrêt de sa transcription sous l'effet de l'administration de tétracycline. La prolifération des cellules ss en culture dérivées de tels animaux est stoppée par l'addition de tétracycline au milieu de culture [10]. D'autres souris transgéniques peuvent être construites, chez lesquelles le transgène Ins-Tag est modifié de façon à induire la transcription sous l'effet d'une drogue. La prolifération des cellules ss, tant après la naissance qu'en culture n'est possible qu'après administration de cette drogue et cesse avec elle. Ce cas de figure est beaucoup plus intéressant opérationnellement pour envisager une thérapie cellulaire. L'introduction du transgène codant pour l'antigène T, sous une des trois formes décrites ci-dessus, dans le patrimoine génétique des souris ne produisant que de l'insuline humaine, permet d'établir différentes lignées de cellules ss susceptibles d'être transplantées chez un hôte. On utilise depuis quelques années des cellules encapsulées dans un matériel inerte pour greffer ces cellules in vivo dans des conditions où elles sont à l'abri du système immunitaire. La microencapsulation, dans des microsphères d'alginate de sodium, d'îlots de Langerhans suivie de leur greffe chez l'animal diabétique permet de supprimer l'hyperglycémie de ces derniers [11]. L'utilisation de cellules ss de souris ne produisant que de l'insuline humaine dans un tel protocole permet de tester l'efficacité, de ce traitement cellulaire du diabète de souris ou de rat. De telles cellules, surtout si leur prolifération in vivo est dépendante de l'administration d'une drogue, sont susceptibles d'être utilisées dans des essais cliniques. Une autre voie de la thérapie cellulaire est représentée par les tentatives de modifier des fibroblastes ou d'autres types cellulaires autres que les cellules ss de façon à ce qu'ils sécrètent de l'insuline de façon régulée par le glucose. Les souris mutantes dépourvues d'insuline peuvent être utilisées pour tester l'efficacité de ces traitements. 3) Test de stratégies des thérapies géniques du diabète 3-1) Production d'une insuline transgénique dans le foie ou dans toute autre localisation Des manipulations génétiques diverses aboutissant à l'expression et à la sécrétion d'insuline ou d'un analogue dans un tissu autre que les cellules pancréatiques ss peuvent ouvrir une voie alternative au traitement de diabètes. L'efficacité de la régulation de l'homéostasie du glucose et le maintien prolongé de la sécrétion peuvent être testés chez des souris mutantes dépourvues de toute insuline d'origine pancréatique. 3-2) Expression constitutive de la glucokinase hépatique Beaucoup des complications métaboliques du diabète sucré dépendent essentiellement des désordres hépatiques du métabolisme du glucose. On considère généralement que beaucoup des enzymes glycolytique,,,s sont induites par le signal insulinique. Il est toutefois possible que cela ne soit vrai que pour la première enzyme de la chaîne métabolique, la glucokinase, nécessaire à la transformation du glucose en glucose-6-phosphate, et que les autres enzymes soient en fait seulement induites par l'hyperglycémie du diabète. Dans ce cas, l'introduction par transgénèse chez la souris d'un gène de la glucokinase muté, pour rendre cette enzyme active de façon constitutive, permet de corriger de façon importante les troubles métaboliques du diabète. 4) Identification (screening) de drogues pouvant moduler l'expression du gène insuline Les souris portant une mutation d'un gène Ins2 ont le gène LacZ qui est induit et actif comme l'est le gène Ins2. L'introduction du transgène codant pour l'antigène T Ins-Tag chez ces souris, par les croisements de souris adéquats, permet de développer à partir de ces animaux une ou des lignées cellulaires ss dont l'activité ss galactosidase sert d'indicateur pour cribler des drogues de toutes natures susceptibles d'induire ou au contraire de réprimer la transcription du gène Ins2. 5) Evaluation d'analogues d'insuline pour le traitement De façon plus générale, les souris double nullizygotes pour Ins et exprimant le gène de l'insuline humaine peuvent être utilisées pour apprécier l'effet immunogène éventuel d'insulines de synthèse ou d'insulines recombinantes susceptibles d'être utilisées chez l'homme pour le traitement de diabètes ou dans d'autres indications. 6) Etude des complications du diabète Les souris nullizygotes pour le gène Ins2 n'ont pas de troubles évidents de la glycémie. Toutefois, à la naissance, certaines d'entre elles ont une glycosurie transitoire de quelques heures. Cette observation s'explique par le fait qu'avant la naissance, le taux de transcrits de l'autre gène, Insi, est semblable à celui des souris non mutantes, mais que, dès après la naissance, il y a une compensation de l'absence d'lns2 par l'activité transcriptionnelle accrue d'lnsl. En revanche, cette compensation transcriptionnelle massive n'a pas été trouvée de la part du gène Ins2 quand il s'agit de souris nullizygotes pour Insi. Le diabète transitoire observé chez des souriceaux nouveau-nés nullizygotes pour Ins2 a été observé, de façon plus prolongée (quelques jours) chez certains des animaux ayant trois copies de gènes Ins invalidées. Ces animaux mutants sont examinés pour détecter s'ils sont porteurs d'anomalies vasculaires. Il n'existe pas en effet, à l'heure actuelle, d'animaux modèles pour des complications vasculaires du diabète sucré et les mutants faisant l'objet de cette invention peuvent en être un premier exemple. 7) Etude du rôle de l'insuline dans l'autoimmunité: A l'état normal, le gène Ins2, et pas le gène Insi, est transcrit dans le thymus de souriceaux. Le même phénomène a été décrit pour le gène unique d'insuline chez l'homme. La disponibilité de souris nullizygotes pour Ins2 offre l'opportunité d'examiner le rôle de l'expression d'lns2 dans le thymus dans l'établissement normal de l'auto-immunité L'analyse de cette question nécessite l'utilisation d'hybridomes T particuliers, établis dans d'autres lignées de souris et utilisables seulement dans ces lignées. L'introduction de la nullizygotie pour Ins2 dans une de ces lignée sera effectuée par des croisements adéquats. Ainsi il est possible de développer une lignée nullizygote pour Ins2 qui peut être analysée avec les hybridomes disponibles. Le rôle d'auto-antigène de l'insuline dans le développement des diabètes auto-immunisés dits juvéniles ou de type I, peut être exploré en utilisant des souris NOD double nullizygotes, obtenues par des croisements adéquats. S'il s'avère que ces souris ne développent plus de diabète autoimmun, I'exploration se poursuit en introduisant des transgènes d'insuline portant des mutations dans les épitopes soupçonnés d'être en cause dans la maladie autoimmune. Références 1. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), 2nd Ed. 2. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M.H. & Robertson, E.J. (1984) Nature 309, 255-256. 3 Mansour, S.L., Thomas, K.R. & Capecchi, M.R. (1988) Nature 336, 348-352. 4. Joyner, A.L. (Ed.) Gene Targeting. A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press, UK). 5. Deltour L., Jami J., Bucchini D. (1992) Methods in Mol. Cell. Biol. 3, 35-38. 6. Michalova K., Bucchini D., Ripoche M-A., Pictet R., Jami J. (1988) Hum. Genet. 80, 247-252. 7. Hanahan D. (1985) Nature 315, 115-122. 8. Efrat S., Leiser M., Surana M., Tal M., Fusco-Demane D., Fleischer N. (1993) Diabetes 42,901-907. 9. Knaack D., Fiore D.M., Surana M., Leiser M., Laurance M., Fusco de Mane D., Hegre O.D., Fleischer N., Efrat S. (1994) Diabetes 43, 1413-1417. 10. Efrat S., Fusco-De Mane D., Lemberg H, al Emran O., Wang X. (1995) Proc. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dans lequel l'un au moins des allèles de l'un au moins des deux gènes codant pour l'insuline endogène est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline pour la détermination de médicaments actifs, sur des pathologies impliquant l'insuline. 2. Utilisation selon la revendication 1, d'un animal mammifère transgénique non humain dans lequel l'expression de l'insuline 1 endogène et/ou de l'insuline 2 endogène est supprimée par rapport à une expression normale, notamment dans les cellules du pancréas. 3. Animal mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, dans lequel l'un au moins des allèles de l'un au moins des deux gènes codant pour l'insuline endogène est rendu fonctionnellement inopérant vis-à-vis de l'expression de l'insuline. 4. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifère, dans lequel l'expression du gène codant pour l'insuline 1 est supprimée. 5. Animal mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifère, dans lequel l'expression du gène codant pour l'insuline 2 est supprimée. 6. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifère dans lequel l'expression du gène codant pour l'insuline 1 et celle du gène codant pour l'insuline 2 sont supprimées. 7. Animal mammifère non humain ou cellules de mammifère selon la revendication 3, dans lequel l'un au moins des allèles codant pour l'insuline 1 et/ou l'insuline 2 est remplacé par un gène susceptible de coder pour une protéine présentant une activité enzymatique. 8. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifère dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et contenant un transgène permettant l'expression d'insuline humaine. 9. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine et, d'autre part, un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat, et permettant l'induction de la prolifération des cellules ss. 10. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine exogène et, d'autre part, un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat préalablement modifié de façon à induire l'arrêt de sa transcription sous l'effet de la présence de tétracycline, et permettant l'arrêt de la prolifération des cellules P en présence de tétracycline. 11. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et en outre contenant un transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat préalablement modifié de façon à induire l'arrêt de sa transcription sous l'effet de la présence de tétracycline, et permettant l'arrêt de la prolifération des cellules ss en présence de tétracycline. 12. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères, notamment ss, dans lequel l'expression du gène endogène codant pour l'insuline 1 et celle du gène endogène codant pour l'insuline 2 sont supprimées et contenant en outre d'une part un transgène permettant l'expression d'insuline humaine et, d'autre part, une construction contenant le transgène comprenant la séquence codante de l'antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur du gène de l'insuline 2 de rat préalablement modifié de façon à induire sa transcription sous l'effet de la présence d'une substance, notamment d'un antibiotique, d'une hormone, d'une cytokine ou d'un facteur de croissance, et permettant l'induction de la prolifération des cellules '3en présence de la susdite substance. 13. Cellules P dans lesquelles l'expression du gène codant pour l'insuline 1 et celle du gène codant pour l'insuline 2 sont supprimées, contenant un transgène tel que défini dans les revendications 8 à 12, lesquelles cellules ss sont encapsulées dans un matériel inerte apte à la greffe de ces cellules in vivo dans des conditions d'abri vis-à-vis du système immunitaire. 14. Cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains selon l'une quelconque des revendications 3 à 13. 15. Procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant l'insuline et de leur traitement comprenant - le remplacement de tout ou partie du gène codant pour l'insuline 1 par le gène neo, et notamment le remplacement du fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,687 kilobase (par référence à l'origine du trancrit situé à la position 1), et notamment - le remplacement de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pInslneO, * le sous-clonage d'un fragment ApaI/XhoI de 7,2 kb (correspondant à la région flanquante en aval (en 3') de Insl) dans un plasmide pSK+ préalablement digéré par ApaI et XhoI, aboutissant à p4, * le sous-clonage d'un autre fragment BamHI/HindIII (correspondant à la région en 5' de Insl) dans pSK+, donnant pR1, * le vecteur utilisé pour fabriquer le vecteur de recombinaison étant dérivé de pKS+, contenant les gènes neo (fragment BamHI provenant de pMC1 POLA -Stratagène) au site BamHI et tk (fragment XhoI/HindIII provenant de pMCtk décrit dans Liu et al., Cell, 1993, Vol. 75, 59-72) entre les sites XhoI et HindIII et désigné par pNTK, * le clonage du fragment NotI/PvuII de pR1 correspondant au fragment de séquence homologue en 5' dans pNTK entre les sites NotI et XbaI, donnant pR2, dans lequel le fragment HindIII de 6,5 kb de p4, (correspondant au fragment de séquence homologue en 3'), a été cloné au site HindIII donnant pInslneO, - et/ou le remplacement de tout ou partie de la séquence codante du gène de l'insuline 2 par une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique et notamment le remplacement du fragment nucléotidique allant de la position +21 à la position +856 paires de bases (par référence à l'origine du transcrit situé à la position + 1), et notamment le remplacement de la séquence codante d'un ou deux allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2 par celle du gène LacZ d'Escherichia coli dans des cellules embryonnaires souches de souris (ES), et notamment par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pîns2Zneo * le sous-clonage d'un fragment EcoRI de 7 kb, correspondant à la région flanquante, en 3' du gène de l'insuline 2, au site EcoRI de pSK+, donnant pl2, * la destruction d'un site NsiI présent dans l'insert de 7 kb de p12, donnant pl2ANsiI, * le sous-clonage d'un fragment XbaI de 5 kb contenant le gène de l'insuline 2 également dans pSK +, donnant p 13, * la synthèse de la région -950/+20 du gène de l'insuline 2 par une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les amorces nucléotidiques suivantes 5' -CGCTCTAGACCCTCCTCTTGCATTTCAAA-3' et 5 ' -CGCATGCATGTAGCGGATCACTTAGGGT-3 ' ces amorces apportant des sites XbaI et NsiI dans le produit de PCR obtenu, * le clonage du produit PCR en amont de la séquence codante du gène LacZ dans le vecteur pGN (Le Mouellic et al. 1990, PNAS, 87, 4712 4716) entre les sites XbaI et NsiI, * la destruction du site NsiI donnant pl5, * le remplacement du fragment XbaI/SfiI de pl5 par un fragment XbaI/SfiI provenant de p13, donnant p16, * la modification du vecteur pNTK tel que défini ci-dessus en y insérant au site HindIII un linker NsiI, donnant p10, * le clonage du fragment XbaI/XhoI provenant de p16 (contenant à la fois le fragment de 2,7 kb de séquence homologue en 5' et LacZ) dans plO entre les sites XbaI et SpeI, donnant p17, * le clonage du fragment SmaI/EcoRI de 5,5 kb provenant de pl2ANsiI (correspondant au fragment de séquence homologue en 3'), au site NsiI de p17 en utilisant des linkers NsiI et donnant pIns2Zneo. - I'introduction des susdites cellules dans des embryons, notamment des blastocytes de mammifères non humains, notamment des souris, - la sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, - le croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6 donnant des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 12 et - éventuellement le croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon l'une des revendications 3 à 12, - éventuellement le croisement d'homozygotes par rapport à chacune des constructions définies ci-dessus pour obtenir des doubles hétérozygotes pour chacune des constructions, - éventuellement le croisement des doubles hétérozygotes, donnant en particulier des animaux doubles homozygotes. 16. Procédé de criblage de médicaments actifs sur les pathologies impliquant l'insuline, notamment le diabète, comprenant l'administration d'un médicament à tester à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humain transgéniques * contenant à la place de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2, une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position +21 paires de bases à la position +856 paires de bases, et notamment une construction pIns2Zneo définie à la revendication 15, * et éventuellement contenant, à la place de l'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, le gène neo et notamment le fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,687 kilobase, et notamment une construction pInslneO définie à la revendication 15, - la détermination de l'activité ss galactosidase des cellules ss. 17. Construction transgénique dans laquelle * tout ou partie de la séquence d'un allèle du gène endogène codant pour l'insuline 1 est remplacé par le gène neo, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position -0,8 kilobase à la position +0,687 kilobase, et notamment I'un au moins des allèles du gène endogène codant pour l'insuline 1, est remplacé dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pInslneO, * le sous-clonage d'un fragment ApaI/XhoI de 7,2 kb (correspondant à la région flanquante en aval (en 3') de Insl) dans un plasmide pSK+ préalablement digéré par ApaI et XhoI, aboutissant à p4, * le sous-clonage d'un autre fragment BamHI/HindIII (correspondant à la région en 5' de Insl) dans pSK+, donnant pR1, * le vecteur utilisé pour fabriquer le vecteur de recombinaison étant dérivé de pKS+, contenant les gènes neo (fragment BamHI provenant de pMC 1 POLA -Stratagène) au site BamHI et tk (fragment Xhol/HindIII provenant de pMCtk décrit dans Liu et al., Cell, 1993, Vol. 75, 59-72) entre les sites XhoI et HindIII et désigné par pNTK, * le clonage du fragment NotI/PvuII de pR1 correspondant au fragment de séquence homologue en 5' dans pNTK entre les sites NotI et XbaI, donnant pR2, dans lequel le fragment HindIII de 6,5 kb de p4, correspondant au fragment de séquence homologue en 3', a été cloné au site HindIII donnant pInslneO, et/ou dans laquelle tout ou partie de la séquence d'un allèle du gène endogène codant pour l'insuline 2 est remplacé par une séquence codant pour une protéine à activité enzymatique, et notamment le fragment nucléotidique allant de la position +21 paires de bases à la position +856 paires de bases, et notamment la séquence codante d'un ou deux allèles du gène endogène codant pour l'insuline 2 est remplacée par celle du gène LacZ d'Escherichia coli dans des cellules embryonnaires souches de souris (ES), et notamment par une construction telle qu'obtenue de la façon suivante et désignée par pins2Zneo * le sous-clonage d'un fragment EcoRI de 7 kb, correspondant à la région flanquante, en 3' du gène de l'insuline 2, au site EcoRI de pSK+, donnant p12, * la destruction d'un site NsiI présent dans l'insert de 7 kb de p12, donnant pl2ANsiI, * le sous-clonage d'un fragment XbaI de 5 kb contenant le gène de l'insuline 2 également dans pSK+, donnant p13, * la synthèse de la région -950/+20 du gène de l'insuline 2 par une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les amorces nucléotidiques suivantes S, -CGCTCTAGACCCTCCTCTTGCATTTCAAA-3' et 5 ' -CGCATGCATGTAGCGGATCACTTAGGGT-3 ' ces amorces apportant des sites XbaI et NsiI dans le produit de PCR obtenu, * le clonage du produit PCR en amont de la séquence codante du gène LacZ dans le vecteur pGN (Le Mouellic et ai 1990, PNAS, 87, 4712 4716) entre les sites XbaI et NsiI, * la destruction du site NsiI donnant pl5, * le remplacement du fragment XbaI/SfiI de p15 par un fragment XbaI/SfiI provenant de p13, donnant p16, * la modification du vecteur pNTK tel que défini ci-dessus en y insérant au site HindIII un linker NsiI, donnant p10, * le clonage du fragment XbaI/Xhol provenant de p16 (contenant à la fois le fragment de 2,7 kb de séquence homologue en 5' et LacZ) dans p10 entre les sites XbaI et SpeI, donnant p17, * le clonage du fragment SmaI/EcoRI de 5,5 kb provenant de pl2ANsiI (correspondant au fragment de séquence homologue en 3'), au site NsiI de p17 en utilisant des linkers NsiI et donnant pîns2Zneo. 18. ADN génomique de l'insuline 1 de la lignée de souris consanguines 129, caractérisé par les sites de restriction suivants, par référence à l'origine du transcrit situé à la position + 1 - en amont du site + i deux sites PvuII (à -8,4 et à -0,8 kilobases) deux sites BamIII (à -3,9 et 3,3 kilobases) un site HindIII (à -8,3 kilobases) un site ApaI (à -0,4 kîlobases) - en aval du site + 1 un site SmaI (à +388 paires de bases) deux sites PvuII (à +479 paires de bases et +8 kilobases) deux sites HindIII (à +687 paires de bases et +7,3 kilobases) un site XhoI (à +7,8 kîlobases) 19. ADN génomique de l'insuline 2 de la lignée de souris consanguines 129, caractérisé par les sites de restriction suivants, par préférence à l'origine du transcrit situé à la position + i - en amont du site + 1 un site NsiI (à -10,8 kilobases) deux sites EcoRI (à -5,4 kilobases et -455 paires de bases) un site XbaI (à -2,7 kiiobases) un site SfiI (à -239 paires de bases) - en aval du site + 1: deux sites EcoRI (à +378 paires de bases et 7,9 kilobases) un site SmaI (à +856 paires de bases) un site XbaI (à +2,2 kiiobases) un site NsiI (à +4,2 kilobases) un site XhoI (à + 7 kilobases).