FR 2767325 A1 19990219 FR 9710387 A 19970814 IDENTIFICATION ET LOCALISATION DE POLYPEPTIDES EPIL EXPRIMES, CODES PAR LE GENE INSL4 ET LEURS APPLICATIONS La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage ,de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, à la vascularisation de tissus spécifiques et/ou à la régénération de tissus. L'insuline, l'IGF-l, l'IGF-2 ( Insulin-like growth factors 1 and 2 ou facteurs de croissance de type insuline l et 2) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire. L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-l sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale. La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, les trophoblastes et la prostate (Bogic, L.V. et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau où une expression très importante a été observée, reste à élucider. On a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L qui sont actuellement clonés sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig comme par exemple dans le corpus luteum, les trophoplastes, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995). Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire. On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent à la super-famille des récepteurs tyrosinekinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que cerbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF). La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosinekinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription. Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives. Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chaîne C et une chaîne A. Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de préprohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée. Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit à la forme active de l'hormone. Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression. Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été caractérisé (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisé sur le chromosome 9p24. Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé EPIL (peptide insulin-like de placenta précoce). Pour plus de clarté dans la présente description, on désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique codante et tel que défini dans la figure 1. La séquence d'acides amines déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans la formation de 3 ponts disulfures Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 sont présents en particulier au niveau du tissu placentaire et utérin. L'analyse par analogie de la séquence peptidique et nucléotidique de l'EPIL, comparée aux autres séquences des membres de la famille, ainsi que l'étude de la distribution des transcrits laisse supposer aux auteurs de ces documents que le polypeptide EPIL a une structure plus proche de l'insuline, de la relaxine et de LEY-IL que de l'IGF 1 et 2 (Chassin, D. et al., 1995). L'analyse par homologie de l'EPIL comparée aux autres membres de la famille ne permet pas de déduire les caractéristiques essentielles comme par exemple l'identification et la localisation de la forme exprimée du polypeptide EPIL codé par le gène INSL4. La connaissance de ces caractéristiques essentielles permettrait en effet d'élaborer par exemple, des peptides synthétiques correspondant à des formes prédéterminées (pré-prohormone, prohormone ou hormone mature) exprimées ou à des domaines particuliers de ces formes prédéterminées (chaînes A, B ou peptide C) . Ces peptides synthétiques peuvent être utilisés comme agonistes ou antagonistes de l'activité correspondante. Ils peuvent également être utilisés comme peptide antigénique et permettre l'obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre des formes ou domaines particuliers de cette hormone. La localisation tissulaire de la ou des formes exprimées par le gène INSL4 permettrait de préétablir le ou les types d'activité biologique dans lesquelles cette nouvelle hormone est impliquée. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Compte tenu de ce qui précède, en particulier de l'analogie de structure entre l'insuline, la relaxine et le polypeptide EPIL, laissant supposer ainsi que la forme exprimée et mature du polypeptide EPIL est unique et sous une forme dépourvue de chaîne C et compte tenu des pratiques habituelles d'identification et de localisation de la forme exprimée d'une hormone à partir de la connaissance de sa séquence codante, les inventeurs ont néanmoins utilisé des anticorps anti-chaîne C, à partir de constructions de peptide mimant le domaine C du polypeptide EPIL putatif, en plus des anticorps anti-chaîne A et B dans leur recherche d'identification et de localisation des formes exprimées. Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante deux formes exprimées du polypeptide EPIL. Une forme pourvue de la chaîne C et une forme dépourvue de la chaîne C. Les inventeurs ont également et de manière tout aussi surprenante mis en évidence que ces deux formes exprimées étaient localisées à des niveaux tissulaires différents. La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1. Dans la présente description , le terme de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide. Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être. obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenues par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non-naturels ou modifiés. L'invention concerne également un polypeptide EPIL 1 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain. L'invention concerne en outre un polypeptide EPIL 1 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, notamment les cellules endothéliales vasculaires foetales. De préférence, le polypeptide EPIL 1 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foétale. L'invention a également pour objet un polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué a) d'une chaîne A dont la séquence d'acide aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53 extrémités incluses ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses. L'invention comprend en outre un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain. L'invention comprend également un polypeptide EPIL 2 selonl'invention, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle. L'invention est relatif aussi à un polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses. L'invention est relative à des polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qutils sont impliqués dans le processus de différentiation, de prolifération et/ou de régénération des cellules humaines et/ou animales, notamment les cellules endothéliales. Les polypeptides selon l'invention, sont également caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires et/ou dans le processus de vascularisation des tumeurs. Les fragments de polypeptide selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs, font également partie de l'invention. Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des activités d'un polypeptide selon l'invention notamment - la capacité de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules, comme en particulier les cellules endothéliales, notamment les cellules vasculaires - la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ;et/ou - la capacité de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, en neutralisant par exemple la fixation d'un polypeptide selon l'invention sur son récepteur cellulaire spécifique. Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés. L'invention comprend également les polypeptides homologues et variants des polypeptides selon l'invention. On entendra désigner comme polypeptides homologues, les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides selon l'invention, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80k, de préférence 90k, de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutées pouvant exister, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé. L'invention comprend en outre les séquences d'acide nucléique caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention. L'invention comprend également les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs. Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans lesdites cellules hôtes, font également partie de l'invention. L'invention a également pour objet une méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon l'invention. La méthode d'obtention d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante se caractérise de préférence en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par lesdites méthodes, font aussi partie de 1' invention. L'invention comprend également les polypeptides ou un de leurs fragments selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par synthèse chimique. Les polypeptides correspondant aux polypeptides selon l'invention obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention. Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle. Ces polypeptides peuvent être produites à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules murines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO. Le vecteur. doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, ltélectroporation, le choc thermique. L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention. Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993). Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine porteuse (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique. Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple - un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention. Les anticorps. monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridones décrite par Kôhler et Milstein, 1975. Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention Ladite utilisation est comprise dans l'invention. Il est bien entendu qu'on entend par l'expression plusieurs anticorps dans la présente description, au moins deux anticorps selon l'invention de spécificité différente, c'est à dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents de polypeptide selon l'invention. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de l'invention de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différent. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de polypeptide selon l'invention sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale d'un polypeptide selon l'invention dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative. L'invention concerne également des sondes ou amorces oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un de ses fragments capable de d'hybrider spécifiquement à ladite séquence, de préférence les sondes pourront être marquées. L'invention concerne en outre l'utilisation de sonde ou d' amorce, pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon 1 ' invention. Les sondes ou amorces oligonucléotidiques présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence 30 bases. Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants selon l'invention, on peut citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des polypeptides selon l'invention, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Ces oligonucléotides sens ou anti-sens font également partie de l'invention. L'invention concerne également un procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps forme. L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) un ou plusieurs anticorps selon l'invention; b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique c) les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la détection et/ou le dosage des complexes antigèneanticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas où les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués à la fluoroscéine ou radiomarqués capables de reconnaître spécifiquement les anticorps de l'invention, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif. L'invention concerne en outre un Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon l'invention à l'aide d'amorces selon 1' invention; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification. L'invention concerne aussi un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à 1'ADN contenu dans l'échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique. L'invention comprend également un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon l'invention et /ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notammentmarquée, selon l'invention. L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'inventio c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. L'invention comprend en outre un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention pouvant être fournie préimmobilisée sur un support; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'invention; c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de 1'ADN. Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, celles qui seront décites ci-après. L'invention est donc relative également à des méthodes de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elles mettent en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon l'invention ou une sonde, notamment marquée, et/ou une amorce selon 1 'invention. On préfère les méthodes de marquage selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un procédé selon l'invention. Les techniques de marquages de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, telles que celle décrite à l'exemple 4, sont bien connues des immumocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne seront pas développées dans la présente description. Parmi les méthodes de marquage de cellule selon l'invention mettant en oeuvre une sonde de l'invention, on préfère également les méthodes comprenant l'utilisation d'une sonde marquée selon l'invention et/ou les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible d'être pressente à l'aide de couple d'amorces de séquence nucléique selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification (Compton 1991), TAS Transcription based Amplification System (Guatelli et al. 1990), LCR Ligase Chain Reaction (Landegren et al. 1988), Endo Run Amplification (ERA), Cycling Probe Reaction (CPR), et SDA Strand Displacement Amplification (Walker et al. 1992), bien connues de l'homme du métier. L'invention concerne en particulier les méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce que la cellule est une cellule endothéliale, notamment vasculaire. L'invention a aussi pour objet une méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée. L'invention a également pour objet une cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode d'obtention selon l'invention. L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention. Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, caractérisée en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, ou une cellule selon l'invention. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée ou sélectionnée selon l'invention. Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un des polypeptides selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'activité desdits polypeptides en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides. Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différentiation, la prolifération ou la régénération de cellules. L'invention a en outre pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la prolifération et/ou la régénération de cellules humaines et/ou animales, en particulier de favoriser ou d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération desdites cellules, notamment les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires. L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention. L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisi parmi a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention; b) un anticorps selon l'invention; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon 1' nvention; d) un vecteur selon l'invention; e) un vecteur selon l'invention présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon 1' invention. L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement des tumeurs1 en particulier destinés au traitement des tumeurs du pancréas, du foie , de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome ou un léiomyosarcome On pourra, par exemple, se référer aux publications de Clark, R. (1997) ; Ferrara, N., et al. (1997), ou de la revue Scrip NO 2209, pp21, et Scrip NO 2202 concernantl'article sur la société Genentech, pour les activités biologiques dans lesquelles sont impliqués l'IGF1 et l'EGF ( facteur de croissance endothéliale), hormones apparentées au polypeptide EPIL. L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques, et au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de l'athéroslérose ou de l'hyperthyroidie. Enfin, l'invention comprend des composés selon l'invention, destinés à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial ,suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme. Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De tels composés utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines cellules ou tissus, suite par exemple à un traumatisme. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc... On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite de remplacement permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides. La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas où l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992),des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de 1'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL. Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. Il est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contrôlée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après. Légende des Fissures Figure 1 : Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé par cette séquence. Figure 2 A. Représentation schématique de la structure du polypeptide EPIL et localisation des sites de liaisons des domainesdu polypeptide EPIL reconnus par les anticorps 1661 et 7381. B. Structures primaires de la partie amino-terminale de la chaîne C de 1'EPIL ET DE RLX-H2 (relaxine H2) . Les résidus damino-acides identiques sont notés par *. Figure 3 : Courbes d'inhibition compétitive, obtenues par méthode ELISA , de la fixation des anticorps 7381 et 1661, par différents peptides compétiteurs A. Inhibition de la fixation de l'anticorps 7381 (dilué au 1/500) dirigé contre le peptide EPIL 59-108-Y adsorbé sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 59-108 Y (+), EPIL 88-108-Y (0), RLX-H2 63-92 (A) et RLX-H2 74-92 (O). B. Inhibition de la fixation de l'anticorps 1661 (dilué au 1/300) dirigé contre les peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 adsorbés sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 23-52 (+), EPIL 115-139 (0), et par un mélange de peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 (O). Figure 4 : Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps polyclonal 7383. Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque avec le peptide EPIL 23-52 adsorbé Le pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps 7383 dilué au 1/500 est calculé en fonction de quantité croissante de peptide inhibiteur chaîne B (23-52), ayant servi d'immunogène, dont la concentration molaire est exprimée en notation scientifique : 1,0 E-10 équivalent à 1,0 x 1010. Figure 5 : Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps monoclonal EPIL 02. La figure 5 représente l'analyse d'inhibition compétitive de l'anticorps EPIL 02 pour deux dilutions différentes : dilution au 1/2500 (g) et dilution au 1/5000 (+). Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque sur laquelle est adsorbée le peptide EPIL (125-137-Y). Figure 6 : Schéma représentant les caractéristiques de la construction du vecteur INSL4-pSec TAG CM contenant l'insert INSL4 de 418 pb. Figure 7 : Détection immunohistochimique des polypeptides EPIL 1 et EPIL 2. Des coupes de tissus chorioniques villeux de placenta âgé de moins de 3 mois(6 à 8 semaines) (photographies A, B, E et F) ou de placenta à terme (photographies C et D) ont été marquées - avec des anticorps anti-EPIL 1 préabsorbés (photographies A et C) et des anticorps 7381 anti-EPIL 1, dilués tous les deux au 1/500 (photographies B et D); - avec des anticorps anti-EPIL 2 préabsorbés (photographie E) et des anticorps 1161 anti-EPIL 2 (photographie F), tous les deux dilués au 1/300. Les cytotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie B) et de placenta à terme (photographie D) montrent un marquage prédominant avec les anticorps anti-EPIL 1 alors que les anticorps anti-EPIL 2 marquent à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie F). Agrandissement : photographies A et B : x 400, photographies C à F : x 1 000. Figure 8 : Analyse quantitative des niveaux de transcrits ARNm du gène INSL4 dans les cytotrophoblastes (CT) comparée aux syncytiotrophoblastes (ST). La quantification est réalisée par RT-PCR compétitive en utilisant un ADN standard quantitatif en témoin interne (IQS). L'électrophorèse est réalisé sur le séquenceur d'ADN ABI de Perking Elmer et on mesure les surfaces de pic obtenu. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surface de pic obtenue avec l'ADNc cible et 1'IQS correspondant. Les expériences ont été réalisées deux fois de manière indépendante, les barres représentant l'écart entre les deux résultats obtenus. Figure 9 : Analyse par immunoempreinte (Western blot) - Figure 9A : Anticorps révélateur EPIL 02 Ligne 1 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Les bandes correspondantes aux polypeptides EPIL recombinants sont très peu marquées et peu visibles comte tenu du facteur de dilution des polypeptides dans le surnageant brut de culture. Ligne 2 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 3 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 4 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 5 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 6 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse. Ligne 7 : Fraction 16 après chromatographie phase inverse. Figure 9B : Anticorps révélateur 7381 Ligne 1 : Etalon de masse moléculaire. Ligne 2 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Ligne 3 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 4 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 5 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 6 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 7 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse. - Figure 9C : Anticorps révélateur 7383. Ligne 1 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Ligne 2 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 3 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02). Ligne 4 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 5 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 6 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse. Ligne 7 : Fraction 16 après chromatographie phase inverse. EXEMPLE 1 Caractérisation de la ou les formes de polvreptide EPIL exprimées dans les tissus Production d'anticorps anti-EPIL, spécifique de domaines particuliers du polypeptide EPIL. La stratégie de détection de la ou des formes exprimées du polypeptide EPIL, repose sur la production et l'utilisation d'anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre des peptides synthétiques, couplés à des protéines porteuses, mimant différentes régions de protéine putative. 1 Synthèse des peptides et préparation des immunogènes. Des peptides synthétiques sont construits selon la méthode conventionnelle en phase solide sur un automate Applied Biosystems model 431A. Les peptides synthétisés sont présentés lors de la description des anticorps (voir 3). Ces peptides sont purifiés par une chromatographie d'exclusion suivie d'une HPLC puis ils sont analysés (composition en acides aminés et séquençage peptidique). Ils sont ensuite conjugués à des protéines porteuses afin de préparer des immunogènes. 2 Production et caractérisation des anticorps polyclonaux et monoclonaux. La production des anticorps polyclonaux est réalisée par injection des immunogènes (conjugués peptide-protéine porteuse) chez des lapins femelles Grand Fauve de Bourgogne âgés de 70 jours environ. L'immunogène (150 pg) est injecté par voie intradermique multipoints au niveau du dos en présence d'adjuvant complet de Freund dans du sérum physiologique. Deux rappels suivants sont effectués à respectivement J+21 et J+42 par injection de 25 Sg d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund par voie souscutanée. Un troisième rappel peut être effectué à J+70. Une semaine après le rappel, un prélèvement de sang est réalisé au niveau de l'oreille pour tester la présence d'anticorps. Les lapins bons répondeurs sont saignés à blanc par ponction intracardiaque. La production des anticorps monoclonaux est réalisée par la technique d'hybridation cellulaire. Brièvement, des souris de souche BALB/c sont immunisées par l'injection de 50-100 pg de conjugué peptide-protéine porteuse en adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Des rappels par voie intra-péritonéale (25 Ci d d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund) sont réalisés à trois mois d'intervalle jusqu'à obtenir une réponse immune, attestée par la présence d'anticorps détectables dans le sérum de l'animal. La fusion cellulaire est effectuée 3 jours après injection i.v. (intra veineuse) de l'immunogène. Elle consiste à prélever puis dissocier la rate de la souris et, dans un second temps, fusionner par le polyéthylèneglycol (PEG 1000) les lymphocytes ainsi libérés avec des cellules myélomateuses, entretenues en culture continue. Les hybridomes sont sélectionnés en milieu sélectif contenant de l'aminoptérine. La production d'anticorps monoclonaux par les hybridomes est analysée par une méthode immunoenzymatique en phase solide (liaison au peptide immunogène). Les hybridomes producteurs sont clonés deux fois par dilution limite et la production en masse d'anticorps est réalisée par injection des hybridomes en intrapéritonéal chez la souris Nude. Les anticorps monoclonaux sont ensuite purifiés à partir des liquides d'ascite par une méthode de chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A (Pharmacia) après précipitation des protéines au sulfate d'ammonium. Les caractéristiques de liaison des anticorps sont établies par des méthodes immunoenzymatiques en phase solide (ELISA) et radioimmunologiques (RIA). Brièvement, la méthode ELISA est réalisée en adsorbant un ou plusieurs peptides mimant une séquence d'un domaine du polypeptide putatif EPIL, dilué dans un tampon Phosphate 0,1 M, pH 7,4, sur un support solide (plaque de polystyrène COSTAR/EIA). Après une incubation de 18 heures à + 40 C, les supports sont saturés par une solution d'albumine et les anticorps à tester sont ajoutés pour une incubation de 1 heure à 37C C. Après lavages, la liaison des anticorps est détectée par l'addition d'un anticorps secondaire marqué à la peroxydase (RAM/IgG (H+L) Po, TEBU). La solution de chromogène (ophénylène diamine) en présence d'H2O2 permet de révéler la réaction enzymatique. Une méthode par inhibition compétitive peut être réalisée pour préciser la localisation des sites reconnus par les anticorps. Pour cela, les anticorps sont préalablement incubés avec des peptides synthétiques à différentes concentrations, par exemple représentatifs de séquences plus courtes que celle du peptide adsorbé sur le support. Le mélange est ensuite déposé sur le support et l'activité anticorps résiduelle est mesurée. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison. La méthode RIA est développée de façon semblable, excepté le fait que le peptide est radiomarqué par un isotope 125I selon le procédé dit du Iodogène. Les complexes immuns potentiellement formés avec l'anticorps sont précipités par le polyéthylène glycol (PEG 6000) et, après lavage, la radioactivité est mesurée. I1 est aussi possible de réaliser une expérience d'inhibition compétitive comme décrit ci-dessus. 3 Caractéristiques des anticorps. Les nombres associés aux séquences ci-dessous correspondent aux positions des acides aminés définies dans la séquence d'acides aminés de la figure 1. Trois anticorps polyclonaux et un anticorps monoclonal dirigés contre des peptides synthétiques sont décrits cidessous o Un anticorps polyclonal, numéroté 7381, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108 Tyrosine (Y) de la chaîne C putative (figure 2) couplé par la benzidine à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse. Cet anticorps se lie à la séquence 59-108 du domaine C du polypeptide EPIL (figure 3A). I1 ne reconnaît pas la séquence analogue dans la relaxine H2 (RLX-H2), protéine qui présente la plus forte similitude structurale (67%) dans le domaine C. Cet anticorps est capable de détecter le polypeptide recombinant comportant le domaine C, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, et de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 physiologique, par exemple au niveau du placenta ( voir exemple 4 , concernant 1' immunohistochimie). Un anticorps polyclonal, numéroté 1661, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences 23-52 de la chaîne B putative et 115-139 de la chaîne A putative (figure 2) couplés par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse. Cet anticorps polyclonal comporte des anticorps majoritairement dirigés contre la région 115-139 de la chaîne A et dans une moindre mesure contre la séquence 23-59 de la chaîne B (figure 3B). I1 permet de détecter un polypeptide recombinant comportant les domaines A et/ou B, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, ainsi que le polypeptide EPIL natif et ses formes moléculaires comportant les domaines A et/ou B, telles que par exemple les polypeptides EPIL 1 et EPIL 2 (voir exemple 4). Un anticorps polyclonal, numéroté 7383, et obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences (3149) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) de la chaîne B putative couplés par le MBS (m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysuccimimide) à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse (figure 4). Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 02 (IgG2a), est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 125137-Y de la chaîne A putative couplé par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse (figure 5). Cet anticorps est utilisable pour la préparation de colonne de chromatographie d'affinité permettant de séparer et de purifier le polypeptide d'origine recombinante (voir exemple 2). EXEMPLE 2 Production de la forme extra courte en cellule SF9 Les étapes suivantes sont réalisées 1 Construction dans le vecteur d'expression pFastBac. La forme extra courte INSL4 (séquence codante) est insérée dans le vecteur d'expression d'eucaryote inférieur (baculovirus) pFastBacTM (GIBCOBRL) au site Kpnl. Par la suite, une coinfection des cellules d'insecte SF9 par de 1'ADN du baculovirus sauvage (AcMNPV, GIBCOBRL) et du vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt est réalisée, afin de constituer une recombinaison homologue. 2 Séquençage. Afin de vérifier la présence et l'orientation de la séquence codante INSL4 dans la construction recombinante, l'analyse du profil de restriction de 1'ADN recombinant est réalisée grâce à différentes endonucléases (Kpnl, EcoRi) et par séquençage automatique (amorces spécifiques de 1'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du bacmide pFastBacTM. 3 Analyse de l'expression du polypeptide EPIL. Après infection des cellules ovariennes d'insecte (Spodoptera frugiperda 9) et amplification du titre viral, l'expression du polypeptide recombinant EPIL, codé par le gène INSL4, est analysée , par SDS-PAGE suivi d'immunoempreintes. 4 Purification et caractérisation du polypeptide recombinant EPIL. Solubilisation des protéines. Environ 200 x 106 cellules Sf9 infectées sont centrifugées. Le culot de centrifugation est repris dans 1 ml de tampon Na2HPO 0,05 M, pH 8,5 contenant 0,1 % NP 40 et 5 Ag/ml de leupeptin. Après agitation par basculement pendant 4 h à 40C, le mélange est centrifugé 10 mn à 14 000 t/mn à + 40C. Le surnageant est récupéré pour les étapes suivantes. Chromatographie d'affinité. Dans un premier temps, une colonne de Sépharose CNBr~EPIL 02 est préparée de la façon suivante. Trois grammes de gel sont mis à gonfler dans 20 ml d'HCl pendant 4 heures. Le gel est ensuite introduit dans une colonne (20 x 1,5 cm) puis rincé avec une solution de couplage (NaHCO3 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Après élimination de celle-ci, 1,5 à 4 mg d'anticorps monoclonal purifié EPIL 02, dilué dans la solution de couplage, sont ajoutés. Après 18 heures à + 40C sous agitation, les sites libres sont bloqués avec de ltéthanolamine 1 M puis la colonne est lavée avec une solution de CH3COONa 0,1 M, CH3COOH 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4. Enfin, la colonne est rincée par Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5. Le surnageant récupéré après solubilisation est dilué au 1/10 dans du tampon Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5. Après dilution, la solution est mise en contact pendant 18 h à + 40C avec le support Sépharose-CNBr-EPIL 02 en agitation lente. Des lavages sont effectués avec un tampon NazHPO4 0,05 M, pH 8,5 en présence de 0,01 NP40. La procédure est automatisée sur un équipement FPLC (Pharmacia). Le temps de lavage est conditionné par le retour de la densité optique au niveau de base. Les fractions recueillies constituent l'effluent. L'élution de l'antigène lié à l'anticorps s'effectue avec un tampon d'acide acétique 2,5. Les fractions recueillies constituent l'éluat. L'effluent et l'éluant sont analysés par une technique d'immunoempreinte avec comme anticorps révélateurs EPIL 02, 7381 et 7383. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse. Deux chromatographies successives sont ensuite réalisées sur les fractions recueillies après élution avec l'acide acétique 2,5 t. Ces fractions sont rassemblées puis déposées tout d'abord sur une colonne Lichrosorb RPB C8 7 Am (250 mm x 4 mm) montée sur un système HPLC Beckman GOLD. Le chargement s'effectue en continu par une vanne externe avec un débit de 2 ml/mn et les fractions sont recueillies par collection automatique toutes les 30 secondes. Deux phases mobiles sont utilisées : phase A TFA 0,1 % - 99,9 k H2O et p polyacrylamide (30 % w/v acrylamide, 0,8 % w/v bis acrylamide ; Tris-Hcl 1,5 m, pH 8,8) pendant 30 minutes sous 200 volts. Après migration, les protéines sont transférées sur un support de type papier filtre PVDF sous l'influence d'un champ électrique. Le support est ensuite saturé dans un tampon de blocage puis incubé avec les anticorps. Après lavage, la liaison éventuelle des anticorps est révélée soit par un anticorps secondaire marqué à la peroxydase soit par la méthode au luminol (kit ECL, Amersham, NW) . Les masses moléculaires relatives sont calculées à partir des standards de référence. Dans ces conditions, les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383 révèlent plusieurs fractions positives après chromatographie phase inverse et correspondent à des temps d'élution différents. Ces fractions référencées 7, 8, 9 et 16 contiennent différentes populations de protéines variant par leur masse moléculaire relative (figure 9). Ces masses relatives sont comprises entre 13 kDa et 32 kDa. 6 Analyse par spectrométrie de masse par ionisation à électro-spray en mode positif. Cette étude est réalisée sur un analyseur PlatformII (Micromas Ltd) utilisant comme étalon le myoglobine de cheval (Masse moléculaire : 16 951,50 t 0,17 Da). La fraction 7 obtenue après chromatographie phase inverse et positive après une analyse d'immunoempreinte avec les 3 anticorps EPIL 02, 7381 et 7383, est lyophilisée puis reprise dans une solution de CH3CN/H20 (V/V) et acide formique 0,1 %. L'analyse de cet échantillon révèle un mélange de deux produits présentant des masses moléculaires expérimentales moyennes M1 : 13 346,62 t 2,14 Da et M2 : 15 491,86 + 3,46 Da. La masse moléculaire théorique du polypeptide EPIL 1 (1-139) correspond à une masse de 15 445,05 Da. La différence de masse de 43 Da par rapport à la masse moléculaire expérimentale M2 pourrait être attribuée à un groupement acétyl (CH3-CO-). Ces résultats suggèrent la présence dans l'échantillon de la molécule EPIL 1 acétylée en position N-terminale. Une masse moléculaire théorique égale à 13 347,46 Da est calculée lorsque les 18 premiers acides aminés du polypeptide EPIL 1 sont délétés et que 3 ponts bisulfures sont réalisés entre les 6 cystéines. La masse expérimentale trouvée (13 346,62 + 2 Da) est proche de cette masse théorique calculée. Cette observation pourrait suggérer que la deuxième molécule présente majoritairement dans l'échantillon correspond à la molécule EPIL 1 sans le peptide signal 1-18 et avec une structure tertiaire présentant 3 ponts disulfures. EXEMPLE 3 Production de la forme extra courte en cellules CHO Les étapes suivantes sont réalisées 1 Construction. La séquence codante correspondant à la forme extra courte INSL4 est clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pSec Tag C (INVITROGEN) au site BamHl-Xbal (schéma figure 6). En parallèle, un vecteur de référence pSec Tag C, digéré par les mêmes endonucléases de restriction (pSec Tag C MOCK), est construit. Après transformation de bactéries TOP10 (INVITROGEN), un clone recombinant est sélectionné 1/ par analyse par PCR, 2/ par une étude du profil de restriction de 1'ADN recombinant vis-à-vis de différentes endonucléases (BamH1, Xbal, ECOR1) et 3/ par séquençage automatique (amorces spécifiques de 1'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du plasmide pSec Tag Cl'). La fonctionnalité du cadre ouvert de lecture est confirmée par une étude de transcription/traduction in vitro (TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System, PROMEGA) . Cette expérience met en évidence l'expression de deux espèces protéiques néosynthétisées. Ces deux espèces, identifiées par l'anticorps 7381, spécifique du peptide C, et l'anticorps 7383 dirigé contre la chaîne B, présentent des masses moléculaires respectivement égales à 15 et 20 kDa. Afin d'obtenir une lignée produisant le polypeptide recombinant EPIL de façon stable, le vecteur d'expression ayant intégré le gène INSL4 est transfecté dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (lignée CHO). Deux méthodes de transfection peuvent être utilisées : la méthode au Phosphate de Calcium et l'électroporation. L'utilisation de 10 à 20 Mg d'ADN plasmidique permet l'intégration génomique de 1'ADN recombinant INSL4. Grâce à la présence d'un marqueur de résistance aux antibiotiques présent dans le vecteur, les clones cellulaires recombinants stables, ayant intégré pSec Tag C INSL4, sont sélectionnés par culture dans un milieu contenant 600 ssg/ml de ZEOCINTM (INVITROGEN). 2 Northern blot. Les clones sélectionnés sont établis en culture. L'étude de l'expression des transcrits pSec TagC INSL4 est réalisée par Northern blot après extraction des ARNm. Vingt quatre heures après hybridation de la sonde INSL4 (insert BamHl-Xbal), l'expression du transcrit recombinant pSec Tag C INSL4 est mise en évidence dans toutes les cellules transfectées. La taille de l'ARNm, 900 pb, correspond à celle attendue pour le transcrit putatif (907 pb). 3 RT-PCR. L'expression du transcrit recombinant INSL4 dans les cellules CHO est aussi confirmée par une analyse en RT-PCR. L'analyse par RT-PCR des ARNm extraits des cellules CHO transfectées par la construction CHO-pSec Tag C MOCK (vecteur vide contrôle) ainsi que de ceux extraits des cellules parentales CHO montre l'absence d'expression du transcrit recombinant INSL4 après 30 cycles d'amplification. 4 Détection du polypeptide recombinant. La purification des diverses formes hormonales placentaires recombinantes produites à partir des milieux de. culture et des cellules transfectées montre, par la méthode des immunoempreintes, la présence de formes protéiques de 16,5 et 20 kDa dans les cellules transfectées, ainsi que des espèces protéiques de 6,5, 10 et 16,5 kDa dans le milieu des cellules CHO transfectées pSec Tag C INSL4. EXEMPLE 4 Détection des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL L'existence des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL dans les tissus humains normaux est recherchée par une méthode immunohistochimique grâce aux anticorps décrits ci-dessus. Cette technique est réalisée sur du placenta dans la mesure où le gène INSL4 a été cloné à partir de ce tissu. Echantillons de tissu Des villosités placentaires obtenues à partir de placenta précoce (7 semaines) et à terme ont été fournis par le Service de Gynécologie obstétrique de l'Hôpital Antoine Béclère, France, selon les procédures appropriées par le comité éthique. Les tissus sont fixés en tampon à pH neutre contenant 10 W de formol puis inclus en paraffine. On utilise également des cellules de cytotrophoblastes villeux et de syncytiotrophoblastes préalablement purifiées de placenta à terme. L'isolement des cellules de. cytotrophoblastes à partir de placenta villeux est effectué comme décrit par Guillaudeux T. et al. (1995) par digestion enzymatique et centrifugation en gradient de Percoll comme pour les cultures primaires. Les cytotrophoblastes villeux et s les syncytiotrophoblastes villeux différenciés, formés in vitro à partir de cytotrophoblastes (à 4-5 jours de culture), sont hautement purifiés (moins de 1 k de cellules contaminantes). Pour plus de clarté, les cellules purifiées de cytotrophoblastes villeux et les cellules différenciées in vitro de syncytiotrophoblastes sont dénommées ici cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes respectivement. Immunohistochimie On utilise des tissus placentaires âgés de 6 à 12 semaines (n = 6) et des tissus de placenta à terme (n = 2). On réalise des coupes de tissus de 3 ym, montées sur des plaques SuperFrost/Plus et dégraissées sur xylène. Les coupes réhydratées sont passées sur microondes pendant 15 minutes en présence de tampon citrate 10 mM, pH 6,0. Après plusieurs lavages en tampon phosphate salin (PBS), les coupes sont incubées pendant 20 mn en présence de l'anticorps donné. Les coupes sont ensuite lavées puis marquées par un anticorps biotinylé suivi par une phosphatase alkaline couplée à la streptavidine. La révélation du marquage est ensuite obtenue par incubation en présence de la solution de substrat chromogène (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate system, Carpinteria, CA) . Les coupes de tissus témoins contrôle négatif sont réalisées avec des coupes incubées en présence d'anticorps non spécifiques (sérum préimmun) ou en présence d'anticorps préabsorbés sur un excès de peptide correspondant (figure 7). EXEMPLE 5 Analyse des transcrits ARNm des cytotrophoblastes et des syncytiotrophoblastes Les ARNm d'INSL4 sont quantifiés par la méthode RT-PCR (reverse transcriptase-polymérase chaîne réaction) comme déc.rit dans Bellet, D. et al. (1997) . Brièvement, les transcrits TFIID sont quantifiés et utilisés comme ARNm endogène de contrôle. La PCR est réalisée sur 30 cycles d'amplification. Les séquences nucléiques des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont les suivantes INSL4-F : F 5'- AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3' INSL4-R : 5'-TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT-3' TFIID-F : F 5'-ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3' TFIID-R : 5'-CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3' (F : colorant fluorescéine) RéSULTATS Deux anticorps, désignés 7381 et 1661, dirigés respectivement contre les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 ont été sélectionnés. L'anticorps 7381 dirigé contre le domaine 59-108-Y de la chaîne C conjugué avec une protéine porteuse s'est révélé totalement spécifique du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3. En effet, les expériences d'inhibition compétitive réalisées avec des peptides ou des sous-peptides analogues de la portion de la chaîne C du polypeptide putatif EPIL ou de la portion correspondante de la relaxine humaine, démontrent que l'anticorps 7381 se lie seulement au domaine C du polypeptide putatif EPIL au niveau de sa portion 59-88 et ne reconnaît pas la chaîne C de la relaxine humaine (Figure 3A). L'hormone relaxine est le seul membre de la superfamille des insulin-like présentant un pourcentage significatif (37 t) de similitude avec le polypeptide putatif EPIL dans la portion du domaine C correspondant à la région 59-88 du polypeptide EPIL. L'anticorps 1661 a été obtenu par immunisation réalisée avec un mélange de deux peptides analogues au domaine 115-139 de la chaîne A et au domaine 23-52 de la chaîne B. Ces deux régions du polypeptide putatif EPIL ne présentent pas de pourcentage significatif de similitude avec des régions correspondantes d'autres membres de la superfamille ( B reflète plus vraisemblablement des affinités similaires de ces deux sous-populations d'anticorps pour leurs épitopes chaîne A et chaîne B, puisque la structure primaire de ces deux régions distinctes ne présente pas de similitude significative. * Les méthodes immunohistochimiques basées sur les anticorps 7381 et 1661 ont été utilisées pour détecter la présence des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement dans les tissus de placenta précoce (moins de 3 mois) et de placenta à terme. La Figure 7 représente les résultats obtenus à partir d'expériences réalisées sur des tissus d'au moins deux femmes enceintes. L'immunomarquage réalisé avec l'anticorps 7381 dirigé contre le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est très important dans les cytotrophoblastes de placenta précoce alors qu'il est léger voire absent dans les syncytiotrophoblastes (Figure 7B). Dans le placenta à terme, de rares cytotrophoblastes présentent une coloration intense alors que les syncytiotrophoblastes ne présentent pas de coloration appréciable (Figure 7D). De plus, cet anticorps antipolypeptide EPIL 1 marque les cellules foetales endothéliales vasculaires, particulièrement dans le placenta précoce (figure 7B). Les résultats obtenus avec l'anticorps 1661 anti polypeptide EPIL 2 montrent qu'à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce sont colorés (Figure 7F). Par opposition, cet anticorps ne marque pas les trophoblastes de placenta à terme (résultats non présentés). Analyse des transcrits ARNm Les résultats -obtenus par la méthode RT-PCR et la méthode d'analyse quantitative par PCR montrent que les niveaux de transcrits d'ARNm d'INSL4 dans les syncytiotrophoblastes villeux différenciés in vitro obtenus à partir de placenta à terme, sont dix fois plus (une unité log) élevés que ceux observés dans les cytotrophoblastes (Figure 8). Par opposition, les niveaux de transcrits TFIID sont similaires dans les deux types de cellules. La détection d'ARNm n'implique pas que les protéines sont synthétisées, comme par exemple pour l'expression HLA classe I dans le placenta. En effet, les cytotrophoblastes villeux expriment les ARNm d'HLA classe I, mais ne synthétisent pas les protéines correspondantes, alors que les trophoblastes extravilleux transcrivent et traduisent les gènes HLA de la classe I (Hunt, J. S. et al., 1990). Cependant, le placenta, qui transcrit un nombre important de gènes, est aussi une source de nombreux polypeptides, incluant les facteurs de croissance de type insulin-like, qui sont connus pour être essentiels au stade précoce du développement embryonnaire et, après la naissance, et pour participer à la croissance et à l'activité fonctionnelle de presque tous les organes du corps humain (Le Roith, D. 1997). Ces résultats montrent pour la première fois que les trophoblastes non seulement expriment l'ARNm de l'INSL4, mais contiennent des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 immunoréactifs. D'autre part, il est d'un grand intérêt d'observer que l'immunomarquage important des tissus trophoblastiques de placenta précoce obtenu 1'EPIL. 2, est similaire à ceux décrits pour plusieurs facteurs de croissance, incluant le TGFa et 1'EGF (Horowitz, G. M. et al., 1993). Un autre résultat surprenant est l'expression importante de polypeptides EPIL 1 et /ou EPIL 3 dans les cytotrophoblastes comparée aux syncytiotrophoblastes, alors que, à la fois les études d'hybridation in situ réalisées sur des placenta précoces (résultats non représentés) et l'analyse quantitative par PCR compétitive réalisée sur des placenta à terme indiquant que les transcrits d'INSL4 sont plus abondants dans les syncytiotrophoblastes. De plus, les polypeptides EPIL 2 sont détectés à la fois dans les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce avec des intensités du marquage similaires dans les deux types de cellules. Prises ensembles, ces observations montrent que, in vivo, la maturation de 1'EPIL diffère dans les cytotrophoblastes en comparaison avec les syncytiotrophoblastes. Dans la superfamille des insulin-like, les peptides C de jonction ou chaîne C sont les médiateurs de la formation de la structure tertiaire des protéines et en particulier de l'assemblage correct des trois ponts disulfures de l'hormone mature. Ces résultats montrent que dans les cytotrophoblastes, le peptide C du polypeptide putatif EPIL est maintenu alors que 1'EPIL 2 présent dans les syncytiotrophoblastes ne présente pas de peptide C de jonction. Ainsi, nous pouvons déduire de ces résultats et de ces observations que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 contenant le peptide C peut être sécrété à partir des cytotrophoblastes dans le liquide amniotique et que 1' EPIL 2 ne contenant pas le peptide C peut être sécrété à partir des syncytiotrophoblastes dans la circulation maternelle. L'EPIL 3, correspondant au peptide C est par définition également reconnu par les anticorps anti-chaîne C , tel que l'anticorps 7381. Cette forme du polypeptide putatif EPIL et qui correspond au sous-produit de clivage aboutissant à l'EPIL 2, peut également avoir une activité biologique autre que celle de participer à la formation de la structure tertiaire de 1'EPIL (Ido, Y. et al., 1997, Steiner, D. F. et al., 1997). Cette capacité d'excrétion sélective de peptides différents dans des compartiments biologiques variés a déjà étéillustrée par d'autres hormones polypeptidiques comme pour 1'HCG et ses sousunités libres. D'autre part, il est remarquable de voir que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est (sont) présent(s) également dans les cellules foétales endothéliales vasculaires. Des résultats récents (Zhou, Y. et al., 1997), ont montré que les cytotrophoblastes extravilleux sont plastiques et ont la capacité d'acquérir des caractéristiques de cellules endothéliales. Ainsi, ces résultats établissent en fait que les cytotrophoblastes villeux et les cellules foétales endothéliales doivent très certainement partager des caractéristiques phénotypiques communes. Ces résultats montrent également que le polypeptide EPIL, en particulier l'EPIL 1, est impliqué dans le processus de différentiation des cellules trophoblastiques, et de manière générale le polypeptide EPIL est très certainement impliqué dans le processus de différentiation, de prolifération et de régénération des cellules , en particulier endothéliales comme les cellules vasculaires. Références Biblioqraphiques Adham, I.M. et ai., (1993), J. Biol. Chem. 268 : 2666826672. Bogic, L.V. et ai., (1995), J. Clin. Endocrinol. Metab. 80 : 130-137. Bellet, D. et ai., (1997), Cancer Res. 57 : 516-523. Bidart, J.M. et al., (1987), J. Biol. Chem. 1987 : 85518556. Bryant-Greenwood, G.D. et al., (1994), Endocr. Rev. 15 : 526. Buckholz, R.G., (1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 538542. Büllesbach, E.E. et al., (1995), J. Biol. Chem. 270 16001-16015. Carter, B.J., (1993), Curr. Op. Biotechnology 3 : 533-539. Chassin, D. et al., (1995), Genomics 29 : 465-470. Clark Ross.,(1997), Endocrine Reviews, 18, 2 : 157-179. Compton, J.et al., (1991), Nature, 350 : 91-92. Edwards, C.P. et al., (1993), Curr. Op . Biotechnology 4 558-563. Epstein, A., (1992), Médecine/Sciences 8 : 902-911. Ferrara, N.et ai., (1997), Endocrine Reviews, 18, 1 : 4-25. Guatelli J.C. et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878. Guillaudeux, T. et ai., (1995), J. Immunol. 154 : 32833299. Horowitz, G.M. et al., (1993), J. Clin. Endocrinol. Metab. 76 : 786-792. Hunt, J.S. et al., (1990), J. Immunol. 144 : 4420-4425. Ido, Y. et al., (1997),Science, 277 : 583-586. Kohler et Milstein , (1975), Nature 256, 495-497. Landegren U. et al., (1988), Science241: 1077-1080. Luckow, V.A.,(1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 564-572. Le Roith, D., (1997), N. Engl. J. Med. 336 : 633-640. Olins, P.O., and Lee,(1993), Curr. Op. Biotechnology 4 520-525. Ozturk, M. et al., (1988), J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 117-1121. Perricaudet, M. et ai, (1992) ,La Recherche 23 : 471-473. Steiner, D. F. et al. (1997) Science, 277 : 531-532. Tashima, L.S. et ai., (1995), J. Clin. Endocrin. Metab. 80 : 707-710. Temin, H.M. , (1986) ,ed. Gene Transfer, New York, Plenum Press, 149-187. Walker, G.T. et ai.,(1992), Nucleic Acids Res. 20: 16911696. Zhou, Y. et al., (1997), J. Clin. Invest. 99 : 2139-2151. REVENDICATIONS 1. Polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1. 2. Polypeptide EPIL 1 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain. 3. Polypeptide EPIL 1 selon selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales. 4. Polypeptide EPIL 1 selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules endothéliales sont des cellules endothéliales vasculaires. 5. Polypeptide EPIL 1 selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules endothéliales vasculaires sont des cellules endothéliales vasculaires foetales. 6. Polypeptide EPIL 1 selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foétale. 7. Polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué a) d'une chaîne A dont la séquence d'acide aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses. 8. Polypeptide EPIL 2 selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain. 9. Polypeptide EPIL 2 selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle. 10. Polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les cellules trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses. 11. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de différentiation de cellules humaines et/ou animales. 12. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de prolifération de cellules humaines et/ou animales. 13. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de régénération de cellules humaines et/ou animales. 14. Polypeptide selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules endothéliales. 15. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires. 16. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des tumeurs. 17. Fragment de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il est biologiquement actif. 18. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17. 19. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 18. 20. Vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte. 21. Cellule hôte transformée par un vecteur selon l'une des revendications 19 et 20. 22. Méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon la revendication 21. 23. Méthode d'obtention d'un polypeptide recombinant selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'on cultive les cellules transformées selon la revendication 21 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. 24. Polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par une méthode selon l'une des revendications 22 et 23. 25. Polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse chimique. 26. Anticorps monoclonal et polyclonal ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25. 27. Anticorps selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il est immunoconjugué ou marqué. 28. Sonde ou amorce oligonucléotidique, caractérisée en ce qu elle est constituée d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 18 ou un de ses fragments capable de d'hybrider spécifiquement à ladite séquence. 29. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est marquée. 30. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps selon l'une des revendications 26 et 27, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide ou d'un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25, ou pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16. 31. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une des revendications 28 et 29, pour la détection, 1' identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18. 32. Procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 26 et 27; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé. 33. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 26 et 27 b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique c) les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. 34. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) isolement de lsADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de 1'ARN de l'échantillon biologique b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon la revendications 18 à l'aide d'amorces selon la revendications 28; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification. 35. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 28 et 29 avec un échantillon biologique, 1'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à 1'ADN contenu dans l'échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et 1'ADN de l'échantillon biologique. 36. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon la revendication 28 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, 1'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon la revendication 28 et /ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à lrADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et 1'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de 1'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon l'une des revendications 28 et29. 37. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18 dans un échantillon biologique ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 28 et 29; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 28 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l1ADN. 38. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendications 18, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 28 pouvant être fournie préimmobilisée sur un support; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'une des revendications 28 et 29 c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 28 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. 39. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon lune des revendications 26 et 27. 40. Méthode de marquage selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un procédé selon la revendication 32. 41. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une amorce et/ou une sonde, notamment marquée, selon l'une des revendications 28 et 29. 42. Méthode de marquage selon la revendication 41, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 34 à 36. 43. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 39 à 42, caractérisée en ce que la cellule est une cellule endothéliale. 44. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 43, caractérisée en ce que la cellule endothéliale est une cellule vasculaire. 45. Méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25 et/ou une séquence d'acide nucléique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 39 à 44, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée. 46. Cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode selon la revendication 45. 47 Procédé de détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 39 à 44 48. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25, ou une cellule selon l'une des revendications 21 et 46. 49. Méthode de sélection selon la revendication 48, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales. 50. Méthode de sélection selon la revendication 49, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales. 51. Méthode de sélection selon la revendication 49, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales. 52. Méthode de sélection selon l'une des revendications 49 à 51, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules endothéliales. 53. Méthode de sélection selon la revendication 52, caractérisée en ce que les cellules endothéliales sont des cellules vasculaires. 54. Composé chimique ou biochimique, en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode selon l'une des revendications 48 à 53. 55. Composé selon la revendication 54 à titre de médicament. 56. Composé selon la revendication 55, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17, 24 et 25 b) un anticorps selon la revendication 26 c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 17 d) un vecteur selon l'une des revendications 19 et 20 e) un vecteur selon l'une des revendications 19 et 20 présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 16. 57. Composé selon l'une des revendications 55 et 56, destiné au traitement des tumeurs. 58. Composé selon la revendication 57, caractérisé en ce que la tumeur est une tumeur du pancréas, du foie ,de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome, ou un léiomyosarcome 59. Composé selon selon l'une des revendications 55 et 56, destiné à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques. 60. Composé selon l'une des revendications 55 et 56, destiné au traitement de de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de l'athérosclérose ou de l'hyperthyroidie. 61. Composé selon l'une des revendications 55 et 56, destiné à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial ,suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.