FR 2759091 A1 19980807 FR 9701462 A 19970206 L'invention concerne un procédé biologique d'obtention de nouveaux dérivés de l'adénosine et les préparations pharmaceutiques qui les contiennent. On connaît depuis longtemps l'intérêt d'analogues de nucléosides dans le traitement des maladies virales, et notamment de l'herpès. Ces maladies sont traitées actuellement par des analogues de nucléosides, tels que l'aciclovir, le ganciclovir ou le foscarnet, mais leur utilisation sélectionne des souches de virus mutants résistants. Ceci est particulièrement fréquent chez les patients immuno-déprimés (personnes transplantées, atteintes du SIDA, etc...). La recherche d'autres analogues synthétiques des nucléosides conduit généralement à des composés présentant une cytotoxicité élevée, préjudiciable à la santé des malades. La demanderesse a maintenant découvert un procédé de préparation de nouveaux dérivés de nucléosides, dotés d'une excellente activité antivirale, et dénués de cytotoxicité. Plus précisément, l'invention concerne un procédé biologique d'obtention de nouveaux dérivés de l'adénosine répondant à la formule générale I dans laquelle R représente le groupement (CH2)n - CO- (CH2)m - CH3, où n et m représentent chacun un nombre entier compris entre 0 et 4 inclusivement, avec la réserve que n + m est inférieur ou égal à 4, leurs isomères, énantiomères, diastéréoisomères sous forme pure ou racémique, ainsi que leurs sels d'addition à un acide pharmaceutique acceptable, caractérisé en ce que l'on cultive, dans un milieu approprié à la culture de basidiomycètes, une souche de Macrocystidia cucumis, (Fr. ex Pers.) Heim, déposée le 28 Janvier 1997 auprès du CNCM-INSTITUT PASTEUR et enregistrée sous le numéro I-1813, pendant une durée comprise entre 2 et 4 semaines, à une température comprise entre 20 et 35 "C et une hygrométrie comprise entre 60 et 90%, sous agitation et aération constantes, puis on filtre le milieu obtenu, récupère le filtrat ou extrait brut (EB.) sur lequel est réalisée une extraction en phase solide destinée à éliminer partiellement les impuretés telles que les polysaccharides fongiques, l'éluat (E) ainsi obtenu étant ensuite séparé en ses différents constituants par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse, les trois fractions correspondant aux pics les plus importants sont recueillies et contiennent les dérivés de formule générale I qui sont, si l'on désire salifiés par un acide pharmaceutiquement acceptable. Les nouveaux dérivés de l'adénosine obtenus selon le procédé de l'invention se distinguent par rapport aux dérivés de l'adénosine connus par la saturation de la liaison en 4-5. L'extrait brut EB et l'éluat E présentent les mêmes propriétés antivirales que les composés de l'invention, et à ce titre, font également partie de l'invention, Comme acide pharmaceutique acceptable permettant de salifier les composés de l'invention, on peut citer à titre d'exemples et de façon non limitative, 1' acide chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, nitrique, phosphorique, méthane- ou éthanesulfonique, malique, maléique, oxalique, fumarique, tartrique, etc. Les composés obtenus selon le procédé de la présente invention possèdent des propriétés antivirales très intéressantes, notamment vis-a-vis de virus de la famille des Herpetoviridae. Cette activité ne s'accompagne d'aucune cytotoxicité, notamment contre les cellules infectées par le virus. Par ailleurs, administrés à l'animal (souris et lapin) jusqu'à la dose de 5 g /kg par voie intra-péritonéale, les composés de la présente invention se montrent totalement atoxiques. Ces composés se montrent donc particulièrement utiles dans le traitement des affections virales, notamment dues à des Herpetoviridae, comme l'herpès génital ou buccal, la varicelle et le zona. L'invention s'étend également aux compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif au moins un composé de formule I, seul ou en association avec un ou plusieurs excipients. Parmi les formes pharmaceutiques particulièrement adaptées à l'utilisation des composés de l'invention, on peut citer, et à titre non limitatif, celles qui conviennent aux voies orale, parentérale, per- ou transcutanée, oculaire, nasale, pulmonaire, rectale, vaginale ou urétrale, comme les comprimés, les dragées, les gélules, les sachets, les préparations injectables, les pommades, crèmes ou gels dermiques, les collyres, les gouttes nasales, les aérosols, les suppositoires, les ovules, etc... La posologie utile varie selon l'âge et le poids du patient, la nature de sa maladie, la voie d'administration et les traitements associés, elle est comprise entre 1 à 1000 mg, en 1 à 3 prises par jour. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention, et ne la limitent en aucune façon. Exemple 1: Culture du Basidiomvcète Macrocvstidia cucumis et obtention de l'extrait brut EB. Le Basidiomycète Macrocystidia cucumis est un champignon dont la culture in vitro a une croissance lente, et dont le développement nécessite plus de deux semaines pour atteindre la phase stationnaire, phase pendant laquelle le métabolisme secondaire produit les métabolites objets de l'invention. Cette culture est avantageusement réalisée en milieu liquide facilitant la séparation du surnageant contenant les métabolites et la biomasse contenant les corps cellulaires. La souche Macrocystidia cucumis est régulièrement entretenue sur milieu L.gélosé en boites de Petri. Le milieu L. est composé des éléments suivants - glucose 15 g/l - extrait de malt 3,5 g/l - tartrate d'ammonium 0,35 g/l - L (+) asparagine 0,50 g/l - hydrolysat de caséine 0,50 g/l - phosphate monopotassique 0,50 g/l - sulfate de magnésium 0,25 g/l - eau distillée qsp 1 litre. Pour obtenir le milieu L gélosé, on ajoute 16g de gélose par litre de milieu L. Le pH est ajusté à 6,2 avant la stérilisation à l'autoclave. L'incubation est réalisée sur table d'agitation en chambre de culture (70 % d'humidité, 24"C, à l'obscurité). A partir d'une culture âgée de trois semaines, des prélèvements sont effectués à l'emporte-pièce, et les morceaux découpés sont déposés sur un nouveau milieu L.gélosé. Après 21 jours, des fragments de culture sont prélevés pour ensemencer des fioles coniques remplies au quart de milieu L. Ces fioles sont incubées pendant 7 jours à l'obscurité dans les mêmes conditions d'humidité et de température que précédemment sur table d'agitation à une vitesse de 250 tours/mn, des fragments de cette nouvelle culture sont prélevés pour inoculer de nouvelles fioles coniques contenant le milieu L et incubés dans les mêmes conditions que précédemment. Au terme de 21 jours de fermentation, le milieu de culture est filtré sous vide sur filtre de porosité 0,8 clam, et ramené à pH 7. Le filtrat récupéré peut être utilisé immédiatement pour les phases de purification, ou stocké sous forme congelée à -20 C et constitue l'extrait brut (EB), objet également de la présente invention. Exemple 2 Purification des composés selon l'invention. L'extrait brut obtenu dans l'exemple précédent est purifié par extraction en phase solide, puis par HPLC. a) Extraction en phase solide et obtention de l'éluat E: L'extraction en phase solide est destinée à éliminer les principales impuretés, comme les polysaccharides d'origine fongique, les métabolites étant élués par un solvant polaire. Les colonnes utilisées sont de type Sep-Pak C 18 Cartridges (100 mg/ml de colonne, granulométrie (55 llm) (Waters Millipore ). Deux millilitres de méthanol sont injectés sur la colonne Sep-Pak (E) à l'aide d'une seringue, puis 2 ml d'eau ultrapure. Deux millilitres d'extrait brut préalablement centrifugé (à 4000 tr/mn, et à une température de + 4 C pendant 15 minutes) sont déposés sur la colonne, lavée ensuite par 4 ml d'eau ultrapure. L'élution est réalisée par 500 1ll de méthanol. L' éluat E est ensuite filtré sur filtre de porosité 0,22 pm et éventuellement conservé à une température de -20 C. b) Chromatographie liquide haute performance en phase inverse et obtention des composés de formule I. Les matériels et réactifs suivant sont utilisés - Précolonne: de type Adsorbosphère tD C18 Cartridges (10 x 4,6 mm) (Alltech). - Colonne semi-préparative ODS Microbondapac (E) C18 (300 x 7,8 mm) de granulométrie 10 pm. - Système de pompage Pompes commandées par un contrôleur de gradient automatique. - Injecteur: Waters# U6K, boucle d'injection de 2 ml - Détecteur : Détecteur spectrophotomètre UV Waters 480. La longueur d'onde utilisée est 260 nm. - Phase mobile : elle est composée d'un mélange d'eau ultrapure (phase A) et d'acétonitrile (phase B) et est dégazée par ultrasons. Le gradient d'élution en pourcentage de phase B est le suivant: 5 % pendant 5 minutes de 5 à 55 % en 5 minutes de 55 à 90 % en 15 minutes puis on revient progressivement aux conditions initiales. Le débit est fixé à 3ml par minute. Chromatographie CLHP: 400 microlitres de l'éluat obtenu au stade a) précédent sont injectés sur la colonne. Les fractions ayant un temps de rétention voisin de 5, 10 et 12 minutes dans ces conditions, contiennent les composés de formule I et sont recueillies, congelées à -20 C, ou lyophilisées et conservées à une température de +4"C. Exemple 3 Détermination de la structure des composés selon l'invention. Elle est déterminée par diverses techniques, telles que la 'H RMN, la 13C RMN ou la spectrométrie de masse. Les informations structurelles recueillies sont déduites soit par mesure directe soit par comparaison avec des produits de référence, tels que l'adénosine et l'acide myristique, présentant des caractéristiques proches de fragments structuraux des composés de formule I. a)1HRMN Cette technique permet de mettre en évidence les éléments caractéristiques d'une adénosine protonée en position 4 et substituée en 5 par une chaîne cétoaliphatique, l'adénosine ne possédant donc plus la double liaison en position 4-5. Les déplacements chimiques attribuables aux différents protons sont rassemblés dans le tableau suivant et sont exprimés en ppm. Le solvant utilisé est le DMSO, l'étalon interne étant le TMS. Identification et Composés Adénosine Acide myristique position des selon protons l'invention H(2) 8,11 8,13 H(8) 8,31 8,32 H(4) 8,51 NH2 7,24 7,24 H(1') 5,86 5,88 H(2') 4,52 4,62 H(3') 4,12 4,16 H(4') 3,94 3,97 H(5') 3,64 3,63 H(5") 3,55 3,56 OH(2) 5,38 5,36 OH(3) 5,34 5,49 OH(5) 5,00 5,31 CH3 0,90 0,88 CH2-CH3 1,26 1,24 Cll2-CH2-CO 1,73 1,70 CH2-CO 1,97 2,00 b)'3C RMN Les résultats, selon cette technique, confirment la présence d'une structure adénosine modifiée au niveau des atomes de carbone C4 et C5 (proton en 4 et chaîne latérale en 5). Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm, le solvant utilisé est le DMSO. Position des atomes de Composés selon Adénosine Carbone I'invention C(2) 1 152,1 150,6 C(4) 173 156 C(5) 163 149 C(6) I 118 118 C(8) 140,6 139,8 C(1') 87,7 87,7 C(2') 73,4 73,4 C(3') 69,8 70,5 C(4') 84,7 85,8 C(5') 60,8 61,6 CO 189 c) Spectrométrie de masse (technique SIMS-TOF) Les produits sont analysés directement après solubilisation dans un mélange acétonitrile-eau (5/95). Les spectres obtenus de 0 à 400 (m/z) montrent la présence de pics caractéristiques à: 133 (m/z): ribose non substitué 268 (m/z): adénosine substituée par un proton en position 4. Divers autres pics correspondent notamment aux fragments de chaîne latérale, mêlés à des fragments d'adénine et de ribose. Exemple 4: Activité antivirale. Elle est mesurée sur des cellules BHK 21 infectées par le virus Herpès Simplex de type 1 (HSV1) par une méthode immunoenzymatique. L'anticorps primaire est un anticorps antiherpétique, l'anticorps secondaire est conjugué à la peroxydase. La technique Elisa permet le dosage des antigènes viraux éventuellement synthétisés en présence ou en l'absence des produits. Les essais réalisés montrent une activité antiherpétique des métabolites dès la concentration de 0,2 pglml. L'extrait brut et l'éluat obtenus dans les exemples 1 et 2 présentent également une activité antivirale, bien qu'apparaissant à des concentrations légèrement supérieures. Exemple 5: Toxicité. a) Cvtotoxicité. A doses 100 fois supérieures aux concentrations antivirales, les composés selon l'invention ne présentent aucune cytotoxicité sur les 3 lignées cellulaires essayées (MRC5, Vero, BHK21) b) Toxicité in vivo. Administrés à la souris jusqu'à la dose de 5g/kg ip et au lapin jusqu'à la dose de 3g/kg iv, doses nettement supérieures aux concentrations actives, les composés de la présente invention n'ont montré aucune toxicité. Exemple 6: Solution injectable dosée à 10 mg/ml. Formule pour 1000 ampoules injectables d'un volume de 5 ml. Composés de l'invention 50 g Eau pour préparation injectable qsp 5 litres. Exemple 7: Comprimés dosés à 50 me de composés de l'invention. Préparation pour 10 000 comprimés terminés à 115 mg. Composés de l'invention 500 grammes Amidon de blé 150 Lactose 450 n Stéarate de magnésium 20 n Silice colloïdale 10 n Hydroxypropylcellulose 20 REVENDICATIONS 1) Procédé biologique d'obtention de nouveaux dérivés de l'adénosine répondant à la formule générale I dans laquelle R représente le groupement (CH2)n - CO- (CH2)m - CH3, où n et m représentent chacun un nombre entier compris entre 0 et 4 inclusivement, avec la réserve que n + m est inférieur ou égal à 4, leurs isomères, énantiomères, diastéréoisomères sous forme pure ou racémique, ainsi que leurs sels d'addition à un acide pharmaceutique acceptable, caractérisé en ce que l'on cultive, dans un milieu approprié à la culture de basidiomycètes, une souche de Macrocystidia cucumis (Fr. ex Pers)Heim, pendant une durée comprise entre 2 et 4 semaines, à une température comprise entre 20 et 35 "C et une hygrométrie comprise entre 60 et 90%, sous agitation et oxygénation constantes, puis on filtre le milieu obtenu, récupère le filtrat ou extrait brut (EB.) sur lequel est réalisée une extraction en phase solide destinée à éliminer partiellement les impuretés telles que les polysaccharides fongiques, l'éluat E ainsi obtenu étant ensuite séparé en ses différents constituants par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, les trois fractions correspondant aux pics les plus importants sont recueillies et contiennent les dérivés de formule générale I qui sont, si l'on désire, salifiés par un acide pharmaceutiquement acceptable. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de Macrocystidia cucumis est cultivée pendant 3 semaines. 3) Procédé selon revendication 1, caractérisé en ce que la souche de Macrocystidia cucumis est cultivée à l'obscurité sous hygrométrie de 70%. 4) Procédé selon revendication 1, caractérisé en ce que la température d'incubation est comprise entre 22 et 240C. 5) Procédé selon revendication 1, caractérisé en ce que la purification des composés de formule I est réalisée par CLHP en phase inverse en utilisant comme phase mobile un mélange eau /acétonitrile. 6) Composés de formule générale I, ainsi que l'extrait brut EB et l'éluat E obtenus selon procédé de la revendication 1. 7) Composition pharmaceutique contenant comme principe actif, au moins un composé de formule I, seul ou en association avec un ou plusieurs excipients inertes atoxiques. 8) Composition pharmaceutique selon la revendication 7 utile au traitement des affections virales 9) Composition pharmaceutique selon la revendication 7 utile au traitement des affections herpétiques.