FR 2766706 A1 19990205 FR 9710812 A 19970829 COMPLEXES PARTICULAIRES STABLES DE CHARGE GLOBALE NEUTRE OU NÉGATIVE DE STRUCTURE MULTILAMELLAIRE COMPOSÉS PAR AU MOINS UNE SUBSTANCE BIOLOGIQUEMENT ACTIVE GLOBALEMENT ANIONIQUE ET UN CONSTITUANT CATIONIQUE, LEUR PRÉPARATION ET UTILISATION. La présente invention a pour objet des complexes particulaires résultant de l'association de substances biologiquement actives avec des vésicules utiles comme vecteurs de substances actives. Elle concerne aussi l'utilisation des vésicules adaptées à la formation de ces complexes ainsi que les compositions comprenant lesdits complexes. L'invention concerne enfin la préparation desdites vésicules et complexes et des compositions les contenant. On connaît dans l'art antérieur de nombreux systèmes de vectorisation de substances actives, comme les liposomes, les nanoparticules, les particules polymériques, les immuno- et ligand-complexes, les cyclodextrines (Drug Transport in antimicrobial and anticancer chemotherapy. G. Papadakou Ed. CRC Press, 1995) Toutefois, aucun de ces systèmes ne s'est avéré réellement satisfaisant pour vectoriser des acides nucléiques comme, par exemple, l'acide desoxyribonucléique (ADN) et cette lacune constitue un des problèmes pour l'application de la thérapie génique (R. G. Crystal, Science, 270, 404-410, 1995). Il existe aujourd'hui plusieurs méthodes de transfection cellulaire que l'on peut regrouper de la façon suivante - l'utilisation du phosphate du calcium ou de polycations, la microinjection, la fusion protoplasmique, - l'électroporation et l'injection d'ADN libre, - l'infection virale, et - les vecteurs synthétiques. Les méthodes du premier groupe ne sont pas adaptables à la transfection in vivo. En conséquence, la plupart des premiers essais cliniques de thérapie génique ayant lieu aujourd'hui sont basés sur l'utilisation de vecteurs retroviraux et adénoviraux. En effet, ceux-ci ont démontré, notamment dans l'étude de clones cellulaires, leur efficacité de pénétration cellulaire et leur stabilité dans l'expression d'un transgène. Toutefois, l'utilisation clinique des vecteurs d'origine virale semblent très hypothétique en raison de leur toxicité potentielle. Les virus à ADN tels que les adenovirus ou virus herpès, sont des transporteurs potentiels mais présentent des problèmes d'immunogenicité, de toxicité et de coût de production. L'électroporation et l'injection d'ADN libre, bien que peu efficace, présente une alternative intéressante mais est limitée à l'administration exclusivement locale. L'utilisation de vecteurs synthétiques tels que les vecteurs lipidiques ou polypeptidiques suscitent un intérêt grandissant, car cette stratégie apparaît beaucoup moins toxique. Le matériel génétique à délivrer se constitue alors d'un ADN plasmidique (pDNA) dont la production est simple et peu coûteuse. Cet ADN recombinant, provenant d'une production bactérienne, contient non seulement la séquence codante du gène à transférer mais aussi des séquences contrôlant en cis la régulation de l'expression du gène comme les séquences du promoteur et du enhancer, les séquences opérateurs, un site d'attachement ribosomal, un codon d'initiation et les signaux de fin de transcription et de polyadenylation. D'autres séquences d'ADN peuvent y être insérées, telles que des séquences tampon, d'origine de réplication, de sites de recombinaison homologues, ou des introns. D'une manière générale le transport d'acides nucléiques (AN) est limité par leur grande biodégradabilité et notamment le pDNA doit être délivré de façon complètement intacte dans le noyau de la cellule cible pour permettre l'expression du transgène. Le chemin du pDNA après une administration systémique présente de nombreuses étapes, chacune d'elles représentant une barrière potentielle à l'expression transgénique - le transport dans la circulation sanguine depuis le site d'injection intraveineuse aux tissus/cellules ciblés, - la diffusion du compartiment intravasculaire au compartiment extravasculaire, aussi désigné l'extravasion dans les tissus, et l'entrée dans les cellules, - le relargage des particules vecteur synthétique/pDNA ou du pDNA libre dans le compartiment cytoplasmique, - la dissociation du pDNA des vecteurs synthétiques, - le transit du cytoplasme au noyau. - la pénétration dans le noyau. - l'expression du transgène. Les travaux de recherche effectués par la Demanderesse ont permis de définir les caractéristiques d'un système de transport optimal pour le transfert de gène - L'obtention de particules vecteur synthétique/DNA homogènes de faibles tailles permettant la compaction d'ADN. - La protection de 1'ADN vis-à-vis des nucléases. - L'obtention de particules dont la demi-vie plasmatique est améliorée, par diminution des interactions avec les éléments figurés du sang ou les protéines plasmatiques - Le transport dans la cellule cible de 1 'ADN. - Le relargage de 1'ADN dans le cytoplasme et le nucléoplasme. - a capacité de ciblage cellulaire. Parmi les vecteurs synthétiques, les vecteurs lipidiques comme les liposomes semblent, vis-àvis des vecteurs polypeptidiques, présenter l'avantage d'être potentiellement moins immunogeniques et, pour l'instant, d'être plus performants. L'utilisation de liposomes conventionnels pour la délivrance d'ADN est cependant très limitée du fait du faible taux d'encapsulation d'une part et d'autre part, leur incapacité à compacter ces molécules de grande taille. La formation de complexes d'ADN avec des lipides cationiques a été récemment étudiée par de nombreux laboratoires (Felgner et al, PNAS 84, 7413-7417 (1987); Gao et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285, (1991) ; Behr et al., Bioconj. Chem. 5, 382-389 (1994)). Ces complexes ADN-lipides cationiques sont aussi désignés dans l'art antérieur sous la dénomination lipoplexes (P. Felgner et al., Hum. Genet. Ther., 8, 511-512, 1997). Les lipides cationiques permettent la formation de complexes électrostatiques avec 1'ADN, qui est une molécule de nature polyanionique. Cette approche s'est montrée efficace pour le transport de pDNA en culture cellulaire. Cependant l'application in vivo de ces complexes, particulièrement après administration systémique, pour le transfert de gène est pauvrement documentée (Zhu et al, Science 249, 209-211(1993); Thierry et al, PNAS 92 , 9742-9746 (1995) ; Hofland et al, J. Biol. Chem. 93,7305-7309 (1996)) bien que ce type d'administration soit d'un intérêt essentiel pour certaines applications médicales. Ceci s'explique par la difficulté d'obtenir des complexes de structure et de taille homogène et relativement stables vis-à-vis de leur biodégradation. La demande de brevet WO 9603977, par exemple, revendique des liposomes utiles pour la délivrance d'ADN in vivo, constitués de lipides cationiques et de lipides neutres. Cependant, le caractère globalement cationique de ces liposomes combinés au pDNA constitue une importante limitation à ce type de système. Il était jusqu'à ce jour impossible d'obtenir des lipoplexes stables et homogènes de charge globale neutre ou négative et qui soient efficaces pour la transfection cellulaire. Cette difficulté est liée à des problèmes galéniques de formulation. En effet, les réactions mises en jeu lors de la formation des lipoplexes impliquent la formation de liaisons électrostatiques entre des constituants polyanioniques qui sont délicates à contrôler. Or, il est reconnu que des particules positives se lient efficacement et de façon nonspecifique avec des protéines sériques qui sont majoritairement de charge globale négative, ce qui conduit à leur inactivation et à une rapide élimination plasmatique, et induit une toxicité accrue et potentiellement une réaction inflammatoire. De plus des particules chargées positivement interagissent avec les matrices extracellulaires et ont, par conséquent, une faible extravasation de l'espace vasculaire à l'espace interstitiel. Ainsi, le caractère cationique des lipoplexes développés dans l'art antérieur constitue une sévère limitation à leur utilisation pour une administration systémique. Ceci explique en partie la grande divergence entre les résultats d'efficacité obtenus in vitro et ceux obtenus in vive. A cet égard, il est intéressant de noter que les lipoplexes qui ont été développés ne sont pas efficaces pour la transfection de la cellule musculaire après injection intramusculaire mais que les liposomes HVJ le sont (Yanagihara et al, Gène Ther. 3, 549-557 (1996)). Les liposomes HVJ sont des préparations de liposomes neutres dont les membranes contiennent des particules inertes du virus HVJ (Hemaaglutonin Virus of Nanan) et qui encapsulent le pDNA préalablement compacté avec des histones HMG1. Ce système s'est avéré efficace pour différentes applications in vivo, mais son application clinique semble être sérieusement limitée, du fait de problèmes d'immunogenicité et de toxicité, liés à la présence de particules virales. Les raisons de leur efficacité dans les cellules musculaires comparées aux vecteurs lipidiques cationiques s'expliquerait par un meilleur relargage endosomal et la neutralité de leur charge. Par ailleurs, I1 a été démontré ( Komatsu H et al, BBA 1235 (1995) 270-280) que des solvants hydrophiles aprotiques, comme ltéthanol, confèrent un comportement particulier aux membranes liposomales. Ce comportement est lié à un arrangement des phospholipides en présence de solvant où les chaînes d'acides gras, constituant les parties hydrophobes de ceux-ci, se juxtaposent au lieu de se faire face, comme c'est le cas dans les bicouches phospholipidiques classiques. On obtient des vésicules à membranes que l'on peut qualifier "d'interdigitées". Ces membranes sont également moins épaisses que les bicouches phospholipidiques ( Liposomes). Dans l'art antérieur, les substances actives sont encapsulées dans les vésicules, sans réarrangement structural. Les travaux de recherche de la Demanderesse lui ont permis de préparer des vésicules particulièrement adaptées à la formulation de substances biologiques anioniques comme 1'ADN, et ainsi d'obtenir des complexes stables permettant la vectorisation de ces substances biologiques à des fins médicales. La présente invention vise à offrir un système de transport d'agents actifs et plus particulièrement d'acides nucléiques, ne présentant pas les inconvénients des systèmes de l'art antérieur. La formulation de l'invention permet notament le transfert optimal de gène, car elle offre les avantages ci-dessous sur lesquels repose une transfection efficace: - Compaction d'ADN. - Protection de 1'ADN vis-à-vis des nucléases. - Demi-vie plasmatique améliorée, par diminution des interactions avec les éléments figurés du sang ou les protéines plasmatiques - Transport dans la cellule cible de l'ADN. - Relargage de 1'ADN dans le cytoplasme et le nucléoplasme. - Capacité de ciblage cellulaire. Ce but est atteint grâce à des complexes particulaires stables de charge globale neutre ou négative de structure multilamellaire composés par au moins - une substance biologiquement active globalement anionique, et - un constituant cationique. Selon un mode de réalisation adaptée à la taille des capillaires, les complexes de l'invention présentent une taille inférieure à 400 nm. Les complexes de l'invention constituent un système de vectorisation de substances actives se présentant sous une forme particulaire, qui sera aussi désigné ci-après par le terme Neutraplexe. Par rapport à l'art antérieur, les Neutraplexes constituent des lipoplexes de charge globale neutre ou négative. Le système de l'invention est remarquable en ce qu'il permet de disposer de complexe particulaire de charge globale neutre ou faiblement négative, offrant l'avantage d'une forte compaction de pDNA, et étant fusogénique et non immunogénique. D'une manière générale, il est préférable d'utiliser un système de délivrance de charge neutre (ou négative) car le rendement de délivrance de la substance active à son site d'action est grandement amélioré par rapport à un système chargé positivement qui est limité au niveau de sa biodistribution et de sa toxicité. La neutralité du complexe de l'invention permet d'amoindrir les barrières pharmacologiques et physiologiques et, notamment, d'améliorer le transport dans la matrice cellulaire des tissus, voire l'extravasation. L'invention concerne tout particulièrement des complexes particulaires stables de charge globale neutre ou négative de structure multilamellaire composés par au moins - une substance biologiquement active globalement anionique, - un premier constituant cationique, et - un deuxième constituant anionique, l'un au moins desdits premier et deuxième constituants étant de nature phospholipidique. Outre les premier et deuxième constituants, la particule multilamellaire peut comprendre un troisième constituant neutre. L'un des avantages des complexes de l'invention est la compaction de la substance biologiquement active vectorisée; ce but est atteint notament grâce au premier constituant qui est une substance présentant des propriétés de compaction d'une substance anionique. L'agent actif entrant dans la composition des complexes particulaires de l'invention est avantageusement un acide nucléique, aussi l'invention envisage plus particulièrement que le premier constituant soit une substance présentant des propriétés de compaction de 1'ADN, mais tout composé cationique est acceptable dans le cadre de l'invention, comme par exemple, des histones, spermines ou spermidines. On préfère cependant un premier constituant qui soit de nature phospholipidique. Parmi ceux-ci, on peut citer les lipomonoamines comme le DOTAP et le DOTMA, et les lipopolyamine comme le DOGS et le DOSPA DOTAP : l-2-dioleoyloxy-3(trimethyl amino)propane, DOTMA : N[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl- ammonium chloride, DOGS : dioctadecylamidoglycilspermine, DOSPA : (2,3-dioleoyloxy-N(2-sperminecarboxamido)ethyl- N,N-dimethyl-l-propanaminium trifluoroacetate. Selon un mode de réalisation particulier des complexes de l'invention, le premier constituant cationique peut être de nature non-phospholipidique dès lors que le deuxième constituant est de nature phospholipidique. Parmi les constituants de nature nonphospholipidique, on peut citer des polypeptides, le chitosan, la polylysine ou la polyéthylèneimine, qui sont aussi connus pour leur capacité à compacter 1'ADN. Le deuxième constituant anionique entrant dans la composition des complexes particulaires de l'invention est avantageusement également de nature phospholipidique. Tout phospholipide chargé globalement négativement, comme la phosphatidylsérine ou le phosphatidylinositol et leurs dérivés, est acceptable dans le cadre de l'invention, mais on préfère tout particulièrement comme deuxième constituant la cardiolipine ou ses dérivés naturels ou synthétiques. Mais le second constituant anionique des complexes de l'invention peut être aussi de nature nonphospholipidique dès lors que le premier constituant est de nature phospholipidique. Dans le cas des complexes de l'invention où la substance active est un acide nucléique, on préfère tout particulièrement que le second constituant soit la cardiolipine, qui est composée majoritairement de diphosphatidylgycerol, ou l'un de ses analogues synthétiques ou de ses dérivés, ou que le complexe de l'invention comprenne un troisième constituant qui soit un lipide neutre, tel qu'un lipide à caractère fusogénique comme la phosphatidyl éthanolamine et ses dérivés tel que le DOPE. En effet, les complexes de l'invention présentent alors la propriété fusogenique indispensable au relargage de 1'ADN des endosomes vers le cytoplasme. De plus, un lipide neutre, comme le cholestérol ou le DOPE, peut participer à la stabilisation de la structure des complexes de l'invention. Ce troisième constituant peut être aussi un composé lipidique zwittérionique comme la sphingomyeline, qui peut avoir un potentiel fusogénique dans les complexes de l'invention. Ainsi, le système de transport d'ADN conforme à la présente invention combine de façon unique les propriétés suivantes indispensables pour l'obtention d'un vecteur d'ADN optimal - avantageusement de nature exclusivement lipidique, donc très faiblement immunogénique. - compaction de l'ADN remarquable assurant la pénétration de 1'ADN dans la cellule. - fusogenicité. - nature membranaire très structurée. Le complexe de l'invention est remarquable en ce qu'il propose pour la première fois d'associer un constituant de charge négative à un constituant cationique pour l'obtention de vésicules permettant la compaction d'acides nucléiques tout en permettant la préparation des complexes stables de charge globale négative ou neutre ayant les propriétés pré-citées. Les substances actives combinées aux vésicules dans les complexes de l'invention sont avantageusement des substances biologiques ou chimiques présentant un effet biologique et avantageusement des propriétés thérapeutiques, vaccinales où diagnostiques. L'invention envisage plus particulièrement les substances actives choisies parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes. D'autres composés peuvent aussi entrer dans la composition des complexes de l'invention, comme d'autres polyanions tels que l'héparine et les gangliosides, ou bien des composés globalement négatifs choisis parmi les protéines, les peptides, les lipoprotéines, les glycolipides, les hormones, les nucléosides et vitamines ainsi que leurs conjugués. Le système de l'invention permet la vectorisation d'au moins une substance biologiquement active. I1 est ainsi possible de préparer des complexes associant dans une particule multilamellaire plusieurs substances biologiquement actives choisies notamment parmi celles citées ci-dessus. Le système de l'invention est tout particulièrement adapté au transport d'acides nucléiques. Ainsi, la substance active est un ADN codant pour une protéine, comme celles choisies dans le groupe suivant: les médiateurs cellulaires (comme par exemple les cytokines, les facteurs de croissance, les chimiokines et interleukines. . .) les facteurs de transcription, les protéines de membranes, les protéines et épitopes de protéines virales, les facteurs de coagulation sanguine, les hormones... L'invention se rapporte aussi à des compositions comprenant des complexes précédents identiques ou différents dans un milieu qui est compatible avec la substance active et qui assure le respect de la charge globale neutre ou négative des complexes de l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation, pour la préparation de complexes de l'invention, de vésicules unilamellaires cationiques ou neutres à membrane interdigitée formée d'un premier constituant cationique, d'un deuxième constituant anionique et éventuellement d'un troisième constituant neutre, l'un au moins desdits premier et deuxième constituants étant de nature phospholipidique. Les vésicules de l'invention sont avantageusement de faible dimension et sont constituées de membranes interdigitées et/ou de type SW (Small Unilamellar Liposomes) et de charge nette globale positive ou neutre. Les vésicules de l'invention sont tout particulièrement destinées à entrer dans la composition des complexes définis ci-dessus, et en conséquence présentent les caractéristiques énoncées lors de la description des complexes. En conséquence, le premier constituant est une substance présentant des propriétés de compaction d'une substance anionique. Avantageusement, le premier constituant est de nature phospholipidique, et dans le cas où l'agent actif qui sera complexé aux vésicules de l'invention est un acide nucléique, on préfère tout particulièrement que ce premier constituant soit une substance présentant des propriétés de compaction de 1'ADN. Parmi ceux-ci, on peut citer comme précédemment les lipomonoamines et les lipopolyamines. Mais le premier constituant peut aussi être de nature non phospholipidique dès lors que le deuxième constituant est de nature phospholipidique. Parmi, les constituants de nature non-phospholipidique, on peut citer comme précédemment notamment des premiers constituants de nature polypeptidique. De même, on préfère que le deuxième constituant soit également de nature phospholipidique, et dans ce cas l'invention envisage spécifiquement la cardiolipine et ses dérivés naturels ou synthétiques. Mais le second constituant peut être aussi de nature non-phospholipidique dès lors que le premier constituant est de nature phospholipidique. Le troisième constituant, s'il est présent est avantageusement un lipide neutre, comme le DOPE. L'invention concerne donc aussi les compositions comprenant des vésicules de l'invention identiques ou différentes dans un milieu compatible. L'invention a également pour objet la préparation des vésicules et des complexes ci-dessus, ainsi que des compositions les contenant. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation des vésicules décrites ci-dessus ou d'une composition desdites vésicules pour la vectorisation d'une ou plusieurs substances biologiquement actives globalement anioniques. Comme indiqué précédemment, la substance biologiquement active globalement anionique est un polyanion choisi parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes, l'héparine et les gangliosides, ou bien un composé globalement négatif choisi parmi les protéines, les peptides, les lipoprotéines, les glycolipides, les hormones, les nucléosides et vitamines ainsi que leurs conjugués. L'obtention des complexes neutres ou négatifs de l'invention est basée sur l'utilisation du type particulier de vésicules décrites ci-dessus et sur un procédé de formulation de celles-ci ainsi que sur la mise en oeuvre d'une composition comprenant la substance anionique. Ce procédé et cette composition visent à résoudre entre autre le problème que constitue l'addition de la substance anionique dans une préparation de vésicules stables et de structure homogène. I1 est en effet connu (Xu Y., Szoka F.C. Biochem. 35, 5616-5623, 1996) que l'addition d'une substance anionique telle qu'un phospholipide anionique perturbe grandement la stabilité du complexe par compétition au niveau de l'interaction électrostatique entre le lipide cationique et un polyanion comme un acide nucléique. La préparation des complexes et vésicules de l'invention est caractérisé par le fait que le premier constituant cationique et le deuxième constituant anionique, l'un au moins étant de nature phospholipidique, sont dispersés dans un ou plusieurs solvants hydrophiles aprotiques, avant ou lors de leur mélange pour préparer les vésicules de l'invention. Plus particulièrement, le procédé de préparation de complexes selon l'invention comprend les étapes suivantes a) on mélange un premier constituant cationique et un deuxième constituant anionique, l'un au moins étant de nature phospholipidique, l'un ou l'autre ou les deux desdits premier et second constituants étant soit séparément dispersés dans un solvant hydrophile aprotique identique ou différent avant leur mélange, soit dispersés dans un solvant hydrophile aprotique lors de leur mélange, b) on ajoute un excès d'une solution aqueuse, c) on ajoute au mélange ci-dessus au moins une substance biologiquement active globalement anionique en solution. Selon une forme de réalisation préférée du procédé ci-dessus, l'étape (a) consiste à mélanger dans un solvant hydrophile aprotique un premier constituant cationique avec un second constituant anionique, l'un au moins desdits constituants étant de nature phospholipidique. Le procédé ci-dessus, vise plus particulièrement le mélange d'un premier et d'un deuxième constituant de nature phospholipidique. Dans ce cas, les vésicules de l'invention sont préparées avec 0,1 à 5% (p/p) de lipides par rapport au solvant, ce qui favorise la formation de complexes supramoléculaires avec des composés anioniques, comme 1'ADN. On préfère tout particulièrement utiliser comme solvant hydrophile aprotique pour mélanger les premier et deuxième constituants à l'étape (a) du procédé, une solution alcoolique avantageusement de 1 'éthanol. Avantageusement, lesdits premier et deuxième constituants sont mélangés dans un rapport molaire compris entre environ 0,1:2 et 10:1. La solution aqueuse ajoutée à l'étape (b) est de préférence de l'eau, et est ajoutée au mélange des deux constituants dans une proportion d'environ 100 à 2000 W1 par mg desdits premier et deuxième constituants. Selon une forme préférée de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le mélange de l'étape (a) est réalisée et maintenue jusqu'à l'étape (b) à une température de l'ordre de 30 à 500C. Le procédé de l'invention peut comprendre également l'addition d'un troisième constituant neutre, avantageusement de nature lipidique, à l'étape (a) Dans un procédé selon l'invention où la substance biologiquement active globalement an ionique en solution est choisie parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes, on ajoute celle-ci à l'étape (c) dans une proportion comprise entre environ 10 et 500 Rg par mg des premier et deuxième constituants. Un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention consiste à l'étape (a) à reprendre un film d'un phospholipide cationique ou anionique avec une solution alcoolique de volume minimal de phospholipide de charge opposée à celle du film et à sa limite de solvatation. Ainsi dans le cas où le film est constitué d'un phospholipide cationique, l'étape (a) du procédé de l'invention consiste à reprendre celui-ci avec une solution alcoolique d'un phospholipide anionique. A l'inverse, dans le cas où le film est constitué d'un phospholipide anionique, l'étape (a) du procédé de l'invention consiste à reprendre celui-ci avec une solution alcoolique d'un phospholipide cationique. Le solvant du phospholipide de charge opposée à celle du film de l'étape (a) est choisi parmi les solvants hydrophiles aprotiques comme l'éthanol, l'isopropanol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, le glycérol, le DMSO, l'acétone, l'acétonitrile. Les premier, deuxième et troisième constituant mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, sont similaires à ceux définis précédemment pour les complexes et vésicules de l'invention. Les vésicules de l'invention sont préparés conformément aux étapes (a) et (b) du procédé décrit ciavant. Dans le but de maintenir le rapport éthanol/lipoplex le plus bas possible pour des raisons pharmacologiques de toxicité, tout en conservant les propriétés du solvant pour la mobilité membranaire, la présente invention propose un procédé optimal de préparation des vésicules de l'invention comprenant les étapes suivantes - on sèche sous vide en film du DOGS, - on dissout ce film avec une solution alcoolique de cardiolipine: étape (a) ci-dessus, - pour parfaire et assurer la dissolution complète, on tiédit, - on ajoute un excès d'eau : étape (b) cidessus. De manière plus précise, 1 mg de DOGS est séché puis dissous avec 50 A1 de solution éthanolique de cardiolipine à 10 mg/ml. De préférence, le rapport constituant cationique (DOGS) /constituant anionique (cardiolipine) est de l'ordre de 0,05 à 10 (p/p). La préparation des Neutraplexes peut être réalisée extemporanément à partir de préparations de vésicules stockées à 40C après l'étape b) . De préférence, la substance biologiquement active, plus particulièrement un acide nucléique est ajouté aux vésicules aux concentrations de l'ordre de 10 à 500 Rg par mg de vésicules et de 10 à 2000 Ag/ml de préparation finale. Des préparations dérivées de celles de l'invention peuvent être obtenues par l'ajout à l'une au moins des étapes (a) à (c) ou après l'étape (c), de composés dont les propriétés sont connues pour améliorer le potentiel de transport des lipoplexes en général - Stabilisation de la structure membranaire, par exemple avec du Cholestérol. - Augmentation de la circulation plasmatique, par exemple avec des dérivés à base de PEG (polyéthylenegîycol) - Ciblage cellulaire par l'addition de ligands ou anticorps. - Protection de la structure de 1'ADN, par exemple avec des histones ou des nucléoprotéines. - Déroulement de 1'ADN pour la transcription, par exemple avec de la Topoisomerase ou d'autres facteurs de transcription. Un aspect remarquable du procédé de l'invention est fondé sur l'utilisation d'éthanol au cours de la formulation. Outre ses propriétés de solvant, l'éthanol présente l'intérêt d'être aussi un détergent remplissant un rôle tensioactif. L'éthanol facilite ainsi la mobilité à l'intérieur hydrophobique des membranes phospholipidiques, et il est retenu dans la bicouche phospholipidique constituée d'un composé cationique et d'un composé anionique. Dans le cas où la substance active est un acide nucléique, l'éthanol semble aussi faciliter le glissement et l'enveloppement de l'acide nucléique fortement anionique sur les faces extérieures et intérieures à polarité cationique de la bicouche des vésicules dans un équilibre thermodynamique. L'acide nucléique condenserait alors les bicouches phospholipidiques et s'associerait à deux faces polaires, réorientant les parties polaires des membranes vers la chaîne polyanionique. I1 en résulterait une réaction spontanée d'auto-assemblage conduisant à une nouvelle structure stable sans causer d'agrégation, où l'acide nucléique fait partie intégrante de la structure particulaire des complexes de l'invention. De la sorte le Neutraplexe selon l'invention est formé à partir d'un changement brutal et spontané de la structure particulaire au départ liposomale (unilamellaire) et devenant une structure particulière lamellaire, enroulée et condensée, de forme sphérique, et stable comme montré sur les micrographies de la figure 1. Ainsi l'éthanol faciliterait l'équilibre thermodynamique qui conduit à l'obtention de cette structure particulaire malgré les forces ioniques opposées des différents constituants, et permettrait d'obtenir des lipoplexes neutres ou négatifs (Neutraplexes). D'autres solvants présentant des propriétés de solvatation et de tensioactivité similaires à celle de l'éthanol peuvent être utilisés. Il s'agit des solvants hydrophiles aprotiques, comprenant des alcools tels que l'isoprapanol, l'éthylèneglycol, le propylène glycol; le glycérol, et d'autres solvants comme le DMSO, l'acétone, l'acétonitrile. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent qui concernent la préparation et l'utilisation des complexes et des vésicules de l'invention et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels - La figure 1 représente des micrographies de l'ultrastructure des vésicules NX1D (figure la) et des complexes NxlD/pDNA (figure lb) par cryo-microscopie éléctronique. Leur échelle est de 1 cm pour 70 nm. - La figure 2 représente un schéma de préparation des complexes Neutraplexes. Exemple 1 : Préparation de vésicules NxlD de composition DOGS/cardioliine. 1 mg de lipopolyamine cationique DOGS solubilisé dans l'méthanol est évaporé jusqu'à séchage dans un tube en verre borosilicaté à fond rond sous rotation. Le film lipidique sec obtenu est resuspendu dans 50 F1 d'une solution de cardiolipine dans méthanol (10 mg/ml). Le rapport DOGS/cardiolipine est de 0.5. La resuspension est favorisée par une légère agitation et par chauffage du tube dans un bain à 30-50 C pendant 15 min. Ensuite 350 1ll d'eau desionisée et stérile sont ajoutés rapidement à la solution lipidique et le mélange est légèrement agité par vortex. La préparation peut être stockée à 4C . Exemple 2 # Préparation de Neutraplexe Nx1D/pDNA de composition DOGS/cardiolilDine/pDNA. Une préparation DOGS/cardiolipine est diluée au tiers dans une solution 150 mM NaCl (25 Cil de préparation dans 50 ,ul de solution 150 mM NaC1) et laissée à température ambiante pendant 15 min. 30 Ag de pDNA dilué dans un tampon (60 ,ul) sont ajoutés rapidement à la préparation et le mélange est légèrement agité puis homogénéisé. La préparation de lipoplex ainsi obtenue est incubée une heure à température ambiante et stockée à 4C . Les complexes ainsi obtenus sont de charge neutre : ce sont des Neutraplexes. Exemple 3 : Préparation de vésicules Nx2D de comnosition DOGS/DOPE/cardiolipine. 1 mg de lipopolyamine cationique DOGS et 1 mg de DOPE solubilisés dans ltéthanol sont évaporés jusqu'à séchage dans un tube en verre borosilicaté à fond rond sous rotation. Le film lipidique sec obtenu est resuspendu dans 50 1ll d'une solution de cardiolipine dans l'éthanol (10 mg/ml). Le rapport poids DOGS/DOPE/cardiolipine étant de 1/1/0.5. La resuspension est favorisée par une légère agitation et par chauffage du tube dans un bain à 30-50 C pendant 15 min. Ensuite 350 l d'eau desionisée et stérile sont ajoutés rapidement à la solution lipidique et le mélange est légèrement agité par vortex. La préparation peut être stockée à 4CO Exemple 4 : Préparation de Neutratlexes Nx2D/pDNA de comtosition DOGS/DOPE/cardiolisine/sDNA. Une préparation DOGS/DOPE/cardiolipine est diluée au tiers dans une solution 150 mM NaCl (25 A1 de préparation dans 50 A1 de solution 150 mM NaCl) et laissée à température ambiante pendant 15 min. 30 Ag de pDNA dilué dans un tampon (70 F1) sont ajoutés rapidement à la préparation et le mélange est légèrement agités puis homogénéisé. La préparation de lipoplex ainsi obtenu est incubée une heure à température ambiante et stockée à 4CO. Les complexes ainsi obtenus sont de charge neutre. Si plus 30 Fg de pDNA sont ajoutés, les complexes sont de charge négative. Exemple 5 : Optimisation de la formulation des Neutraplexes. Plusieurs types de formulations ont été testés pour obtenir une suspens ion stable et homogène de vésicules résultant du mélange d'un lipide cationique (DOGS) et d'un lipide anionique (cardiolipine = CL). Les formulations comparées sont: A = Suspension film lipidique dans l'eau. B = Suspension film lipidique dans 1 'éthanol. C = Mélange de lipides cationiques et anioniques dans une solution éthanolique. D = Suspension film lipide cationique avec une solution éthanolique de lipide anionique Le tableau 1 ci-dessous rapporte les résultats obtenus à partir des formulations ci-dessus en utilisant divers lipides et une concentration fixe d'ADN de 30 Ag d'ADN/60 g de DOGS. Tableau 1 Lipides Rapport Formulation Suspension Suspension lipides vésicules des des vésicules Neutraplexes DOGS/CL 1/1 A impossible impossible B impossible impossible 1/0,5 A impossible impossible B aggrégation impossible C mauvaise impossible solubilité D oui oui 1/0,2 A impossible impossible D oui oui C C oui Non déterminée DOGS/DOPE 1/1/1 A impossible impossible /CL B a ré ation impossible 1/1/0,5 A impossible impossible B aggrégation impossible D oui oui 1/1/0,2 D oui oui 1/1/0,1 D oui oui Le tableau 1 montre que seulement la formulation D, consistant à ajouter de la cardiolipine dans une solution éthanolique (EtOH) à un film lipidique sec de lipide cationique permet l'obtention d'une suspension de vésicules et la formation de Neutraplexes stables et homogènes in fine. Exemple 6 : Analvse particulaire des comnlexes et vésicules de l'invention. L'analyse particulaire a été réalisée en utilisant un analyseur "laser-scattering". Les résultats obtenus à partir de compositions des vésicules préparées selon les exemples 1 (NxlD) et 3 (Nx2D) et à partir de Neutraplexes préparés suivant les formulations décrites dans l'exemple 2 (NxlD/pDNA) et l'exemple 4 (Nx2D/pDNA) sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Formulation Préparation Moyenne z Polydispersité NxlD &num;1 251 0,292 248 0,307 248 0,262 Moyenne :249 Moyenne : 0,287 NxlD/pDNA #1 622 0,833 702 0,836 698 0,757 Moyenne : 674 Moyenne : 0,809 Nx2D #1 197 0,351 195 0,378 197 0,367 Moyenne : 197 Moyenne : 0,365 152 152 0,3 151 0,318 153 0,316 Moyenne : 152 Moyenne : 0,311 &num;2, 1 mois 153 0,302 après 152 0,295 préparation 151 0,300 Moyenne : 152 Moyenne : 0,299 Nx2D/pDNA #1 353 0,386 397 0,513 349 0,413 Moyenne : 366 Moyenne : 0,417 262 262 0,260 257 0,276 261 0,258 Moyenne : 260 Moyenne : 0,265 &num;2, 1 mois 251 0,185 après 243 0,218 préparation 243 0,188 Moyenne : 246Moyenne : 0,197 La moyenne z correspond à la taille moyenne de la population particulaire en nanomètres. Le coefficient de polydispersité donne une évaluation de l'homogénéité de la population particulaire. Compte-tenu de la nature des vésicules l'invention, une polydispersité inférieure à 0,350 est considérée comme acceptable. Les résultats démontrent que les préparations particulaires NxlD et Nx2D sont de faible taille moyenne et correspondent à une population homogène. Les préparations de complexes (+pDNA) sont de taille moyenne supérieure aux préparations de vésicules, sans 1'ADN. La préparation Nx2D/pDNA et, à un degré moindre la préparation NxlD/pDNA, présentent une homogénéité acceptable. Les préparations Nx2D et Nx2D/pDNA se montrent reproductibles et très stables après un mois de stockage à 40C. Exemple 7 : Observation de l'ultrastructure des complexes de l'invention sar microscosie électronique. Les vésicules préparées selon l'exemple 1 (NxlD) et selon l'exemple 2 (NxlD/pDNA) ont été observées par cryo-micoscopie électronique (figure 1A et 1B, respectivement). L'observation de la préparation NxlD montre la présence exclusive de vésicules sphériques de type liposomale et unilamellaire. L'épaisseur de la membrane de ces vésicules est inférieure à celle des particules liposomales classiques et laisse supposer l'existence d'interdigitations dues au réarrangement des phospholipides en présence d'alcool. L'observation de la préparation NxlD/pDNA montre exclusivement la présence de particules très denses et multilamellaires. Cette étude permet l'observation du changement radical de structure particulaire consécutif à l'addition de 1'ADN aux vésicules. Le complexe particulaire nucleo-lipidique obtenu ne résulte pas d'une simple agrégation mais bien d'un reassemblage supramoleculaire conduisant à des particules à structure définie et relativement homogènes. Ces études de cryo-microscopie éléctronique montrent que les complexes Neutraplex sont denses et extrêmement sensibles au faisceau électronique (résultats non montrés), ils contiennent donc une grande concentration en matière qui ne peut être, dans ce cas, que de 1'ADN. L'invention concerne donc tout particulièrement ces complexes particulaires stables de charge globale neutre ou négative de structure multilamellaire où 1'ADN est inséré entre les lamelles formées de constituants cationique et anionique de nature phospholipidique. D'autre part, ces observations montrent que ces deux types de particules (vésicules et complexes) sont très stables puisque les micrographies ont été effectuées 1 mois après leur préparation. Exemple 8 : Transfection in vitro à l'aide des Neutraplexes. Des cellules 293 humaines embryoniques de rein, en culture à demi-confluence, ont été exposées à une préparation Nx2D/pGFP-DNA (2\in). Le plasmide pGFP DNA code pour la GFP (Green Fluorescent Protein) qui est une protéine fluorescente facilement détectable sous rayonnement U.V. 48 heures après transfection 70 à 80 % des cellules expriment la GFP. Un niveau de transfection cellulaire a été aussi bien obtenu avec la même préparation Nx2D/pDNA utilisée 3 semaines après stockage à 40C. Exemple 9: Expression du facteur IX humain dans le sana de souris suivant administration intraveineuse avec le système Neutranlexe. Le gène du Facteur IX humain (hFIX) inséré dans un plasmide d'expression [pLIXSN] a été associé au système de l'invention Neutraplexe selon l'exemple 2 (NxlD/pDNA) et l'exemple 4 (Nx2D/pDNA) et a été administré par voie i.v. dans la queue de souris C57 Black6. Des rapports récents de différents groupes ont montré que ces souris ne développaient pas d'anticorps spécifiques au Facteur IX humain. 20 Ag pLIXSN-DNA sous forme de neutraplexes NxlD/pLIXSN-DNA ont été administrés par souris. Le sang des souris a été prélevé au sinus retro-orbital 2,5 jours après injection et placé dans des tubes contenant de l'héparine ou du citrate et stocké à -20 CO. La détection du hFIX est réalisée extemporanément à l'aide d'un test ELISA. Le résumé des résultats est rapporté dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Formulation Souri hFIX (ng/ml) s NxlD/pLIXSN 1 8,6 2 4,7 3 5,8 4 2,3 5 1,2 Moyenne : 4,5 Nx2D/pLIXSN 1 4,3 2 18,5 3 4,4 4 4,8 5 2,8 Moyenne : 6,7 Les résultats obtenus révèlent que l'injection de l'une ou l'autre préparation Neutraplexe induit l'expression significative de hFIX dans la circulation sanguine. Les niveaux de hFIX ainsi observés semblent être de 5 à 10 fois supérieurs à ceux observés antérieurement après transfert de gène par vecteurs synthétiques (Baru et al., Gene 161, 143-150, 1995). REVENDICATIONS 1) Complexe particulaire stable de charge globale neutre ou négative de structure multilamellaire composé par au moins - une substance biologiquement active globalement anionique, et - un constituant cationique. 2) Complexe particulaire stable de charge globale neutre ou négative de structure multilamellaire selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est composé par au moins - une substance biologiquement active globalement anionique, - un premier constituant cationique, et - un deuxième constituant anionique, l'un au moins desdits premier et deuxième constituants étant de nature phospholipidique. 3)) Complexe selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un constituant neutre. 4) Complexe selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le premier constituant est une substance présentant des propriétés de compaction de la substance biologiquement active globalement anionique. 5) Complexe selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le premier constituant est un phospholipide, avantageusement choisi parmi les lipomonoamines et les lipopolyamines. 6) Complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le deuxième constituant est un phospholipide, avantageusement choisi parmi la cardiolipine et ses dérivés comme le diphosphatidylglycerol. 7) Complexe selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que le constituant neutre est un lipide. 8) Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est un polyanion choisie parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes, l'héparine et les gangliosides. 9) Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est un composé globalement anionique choisi dans le groupe des protéines, des peptides et glycopeptides, des lipoprotéines, des glycolipides, des nucléosides, des hormones et vitamines ainsi que leur conjugué. 10) Composition comprenant des complexes identiques ou différents selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans un milieu compatible. 11) Vésicule unilamellaire cationique ou neutre à membrane interdigitée formée d'un premier constituant cationique, d'un deuxième constituant anionique et éventuellement d'un troisième constituant neutre, l'un au moins desdits premier et deuxième constituants étant de nature phospholipidique. 12) Vésicule selon la revendication 11, caractérisée en ce le premier constituant est une substance présentant des propriétés de compaction de d'une substance anionique. 13) Vésicule selon l'une des revendications 11 à 12, caractérisée en ce que le premier constituant est un phospholipide, avantageusement choisi parmi les lipomonoamines et les lipopolyamines. 14) Vésicule selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que le deuxième constituant est un phospholipide, avantageusement choisi parmi la cardiolipine et ses dérivés comme le di-phosphatidylglycerol. 15) Vésicule selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que le troisième constituant est un lipide neutre. 16) Composition comprenant des vésicules identiques ou différentes selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 dans un milieu compatible. 17) Utilisation de vésicules selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 ou d'une composition de vésicules selon la revendication 16 pour la vectorisation d'une substance biologiquement active globalement anionique. 18) Utilisation d'une vésicule selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 ou d'une composition de vésicules selon la revendication 16 pour la fabrication de complexe particulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une composition selon la revendication 10. 19) Procédé de préparation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une composition contenant lesdits complexes selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on mélange un premier constituant cationique et un deuxième constituant anionique, l'un au moins étant de nature phospholipidique, l'un ou l'autre ou les deux desdits premier et second constituants étant soit séparément dispersés dans un solvant hydrophile aprotique identique ou différent avant leur mélange, soit dispersés dans un solvant hydrophile aprotique lors de leur mélange, b) on ajoute un excès d'une solution aqueuse, c) on ajoute au mélange ci-dessus au moins une substance biologiquement active globalement anionique en solution. 20) Procédé de préparation d'un complexe selon la revendications 19, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) on mélange dans un solvant aprotique hydrophyle un premier constituant cationique avec un second constituant anionique, l'un au moins desdits constituants étant de nature phospholipidique. 21) Procédé de préparation d'un complexe dans lequel la substance biologiquement active globalement anionique en solution est choisi parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes, selon l'une quelconque des revendications 20 à 21, caractérisé en ce que on ajoute ladite substance biologiquement active à l'étape (c) dans une proportion comprise entre environ 10 et 500 Ag par mg des premier et deuxième constituants. 22) Procédé de préparation de vésicules selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on mélange un premier constituant cationique et un deuxième constituant anionique, l'un au moins étant de nature phospholipidique, l'un ou l'autre ou les deux desdits premier et second constituants étant soit séparément dispersés dans un solvant hydrophile aprotique identique ou différent avant leur mélange, soit dispersés dans un solvant hydrophile aprotique lors de leur mélange, b) on ajoute un excès d'une solution aqueuse. 23) Procédé selon l'une quelconque des revendication 19 à 22, caractérisé en ce que le premier et le deuxième constituant sont de nature phospholipidique. 24) Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que le rapport entre les lipides et le solvant hydrophile aprotique est de 0,1 à 5 % (p/p). 25) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que le solvant hydrophile aprotique est choisi parmi l'éthanol, l'isopropanol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, le glycérol, l'acétone, l'acétonitrile et le DMSO. 26) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que à l'étape (a), lesdits premier et deuxième constituants sont mélangés dans un rapport molaire compris entre environ 0,1:2 et 10:1. 27) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 26, caractérisé en ce que la solution aqueuse ajoutée à l'étape (b) est de l'eau, et est ajoutée au mélange des deux constituants dans une proportion d'environ 100 à 2000 1 par mg desdits premier et deuxième constituants. 28) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 27, caractérisé en ce que le mélange de l'étape (a) est réalisée et maintenue jusqu'à l'étape (b) à une température de l'ordre de 30 à 500C. 29) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 28, caractérisé en ce que l'étape (a) consiste à reprendre un film d'un phospholipide cationique ou anionique avec une solution alcoolique de volume minimal de phospholipide de charge opposée à celle du film et à sa limite de solvatation. 30) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 29, caractérisé en ce que l'on ajoute un troisième constituant neutre, avantageusement de nature lipidique, à l'étape (a). 31) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à l'une au moins des étapes (a) à (c) ou après l'étape (c), d'un composé choisi parmi ceux présentant les propriété suivantes - Stabilisation de la structure membranaire, par exemple avec du Cholestérol. - Augmentation de la circulation plasmatique, par exemple avec des dérivés à base de PEG. - Ciblage cellulaire par l'addition de ligands ou anticorps. - Protection de la structure de 1'ADN, par exemple avec des histones ou des nucléoprotéines. - Déroulement de 1'ADN pour la transcription, par exemple avec de la Topoisomerase ou d'autres facteurs de transcription.