FR 2762010 A1 19981016 FR 9704555 A 19970414 La présente invention a pour objet un gène impliqué dans la fructification du champignon comestible Agrocybe aegerita ainsi que l'utilisation de ce gêne. Les basidiocarpes des basidiomycètes sont les structures les plus complexes produites parmi les champignons ; chez les champignons comestibles industriels ces structures, qui constituent le produit commercial, sont d'une grande valeur ajoutée économique. Par conséquent, la connaissance des gènes qui déclenchent le début de la différenciation du basidiocarpe présente un intérêt tant pour l'élucidation de la régulation de la différentiation eucaryote que pour la culture industrielle des champignons car le rendement d'une culture industrielle dépend de la régulation de la fructification. Chez les champignons, la plupart des études ont été effectuées sur l'influence des facteurs de l'environnement sur la fructification (Raudaskoski et Viitanen, 1982; Sietsma et al., 1977), mais la régulation des gènes qui interviennent de façon spécifique dans ce phénomène est peu connue. En effet, I'un des problèmes majeurs de la culture industrielle des champignons comestibles est d'obtenir l'initiation ou le déclenchement de la fructification. Dans les conditions de culture industrielle, la fructification est obtenue après l'envahissement du substrat de culture par le mycélium dicaryotique, sous l'action de facteurs extérieurs (température, humidité, C02, gobetage, etc...) et nutritifs complexes. Ces facteurs, souvent difficiles à contrôler. mettent en activité des gènes spécifiques de la différentiation. Chez les basidiomycètes, les gènes qui interviennent à divers stades du développement des basidiocarpes ont été isolés à partir du champignon Schizophyllum commune et à partir des champignons Agarics hisporus et Lentinula edodes. Le gène Sc7 (Shuren et al., 1993) et le gène mfbAc (Kondoh et al., 1995) sont exprimés de façon préférentielle au cours des derniers stades de la différenciation des basidiocarpes chez S.commune et L. edodes, respectivement. Les gènes hypA (De Groot et al., 1996) et ABHI (Lugones et al., 1996), I'un et l'autre isolés à partir d'A.bisporus, et le gène Sc4 (Shuren et Wessels, 1990) de S. commune sont exprimés de l'initiation jusqu'à la maturation du basidiocarpe, ce qui semble indiquer que ces gènes ont un rôle dans l'expansion et/ou le maintien du basidiocarpe plutôt que dans sa différenciation. Trois gènes sont caractérisés comme étant spécifiques de l'initiation de la fructification, les gènes priA (Kajiwara et al., 1992) et priBc (Endo et al., 1994) de L.edodes et le gène Scl (Dons et al., 1984) de S.commune. Un cas différent est celui du gène FRT1 isolé à partir de S. commune, qui est exprimé dans la croissance mycéliale ainsi que dans la fructification, cependant l'intégration génomique ectopique du gène FRITZ permet d'induire la fructification (Horton et Raper, 1995). L'étude de nouveaux gènes de morphogénèse intervenant spécifiquement dans les premiers stades du développement des primordia semble d'un intérêt particulier pour connaître le déterminisme génétique de la fructification. Chez le champignon comestible Agrocybe aegerita huit clones d'ADNc (EMAa- 1 à EMAa-8) préférentiellement exprimés au cours de la différenciation des primordia de basidiocarpes ont été isolés (Salvado et Labadère, 1991). Ce champignon est un modèle performant pour les études de développement, car il peut différencier les basidiocarpes sur un milieu synthétique, et la transformation est maîtrisée chez cet organisme (Noël et Labarère, 1994), aussi il fournit un bon outil pour étudier la fonction et la régulation des gènes morphogénétiques clonés. Une banque génomique d'A.aegerita a été criblée en utilisant comme sonde l'ADNc d'EMAa-4 préalablement cloné, aboutissant à l'isolement de la séquence génomique correspondante appelée Aa-Pril. Les séquences nucléotidiques de l'ADNc et de l'ADN génomique cloné ont été déterminées et comparées afin de déterminer la structure du gêne Aa-Pril et la présence possible d'introns. Les régions du gène voisines en 5' et 3' ont été séquencées et étudiées, en recherchant les signaux de régulation intervenant dans la transcription. Les points de départ de transcription (tsp) ont été identifiés par extension d'amorce. L'expression du gène Aa-Pril au cours de la fructification a été confirmée en utilisant l'ADNc d'EMAa4 pour sonder un buvardage Northern d'ARN totaux provenant de mycélia végétatifs et de trois stades de développement de basidiocarpes (agrégats/préprimordiaux, primordia immatures, basidiocarpes). La séquence d'acides aminés déduite du gène Aa-Pril a été analysée et comparée avec les banques de données protéiques. Le gène Aa-Pril est spécifiquement transcrit au stade des primordia/basidiocarpes immatures, ce qui suggère qu'il joue un rôle au cours du début de la fructification, mais non pour le maintien de la structure du basidiocarpe. La séquence nucléotidique complète du gène (492 pb) et des régions situées en amont et en aval a été déterminée. La SEQ ID N" 1 représente une séquence nucléotidique d'ADN génomique d'Agrocybe aegerita comprenant la partie codante du gène Aa-Pril (comprenant un intron) encadrée des portions 5' et 3' non codantes. Cette séquence est également représentée sur la figure 1B. La présente invention a donc pour objet une séquence nucléotidique correspondant à: a) une séquence selon SEQ ID N" 1 en tout ou en partie; b) une séquence s'hybridant avec a) ; ou c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b). Plus particulièrement, elle a pour objet une séquence nucléotidique correspondant à un gène ou un fragment de gène comportant: a) une partie de la séquence selon SEQ ID N" 1; b) une séquence s'hybridant avec a); c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b); d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène ou un fragment de gène selon a), b) ou c), ou pour une protéine équivalente. Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de l'ADN que de l'ARN (y compris de l'ARNm) ou des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont modifiés de quelque manière que ce soit (y compris substitués par des nucléotides non naturels), soit pour améliorer l'une quelconque de leurs propriétés, soit pour permettre leur identification. Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués précédemment). De plus, il convient de rappeler que la présente invention couvre aussi bien la séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après. L'invention concerne également les séquences nucléotidiques présentant une forte homologie avec la séquence nucléotidique ou le gène mentionné précédemment, de préférence une homologie supérieure à 80 % sur les parties essentielles dudit gène, soit en général au moins 50 % de la séquence ; plus préférenciellement l'homologie sur les parties essentielles sera supérieure à 90 % (déterminée notamment par le logiciel Clustal. W, version 1.4 pour Macintosh). Enfin, lorsque ledit gène ou fragment de gène code pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles. La Figure 1 représente la structure du gène Aa-Pri d'Agrocybe aegerita. La figure 1A est une représentation schématique du fragment génomique EcoRI EcoRI de 2,4 Kb contenant Aa-Pri. L'encadré grisé représente la région codante pour Aa-Pri avec l'intron (segment gris foncé) et les positions 5' et 3' non traduites. La figure 1B représente la séquence nucléotidique et la séquence prédite en acides aminés du gène Aa-Pri. Un astérisque (*) marque le codon stop (TTA). Les boîtes CCAAT et TATAAAT sont grisées. Les points de départ de la transcription déterminés par extension d'amorce et par une cartographie à la nucléase S1 sont indiqués par des flèches et par un rond noir respectivement. Les séquences introniques éventuellement impliquées dans le phénomène d'épissage et la formation d'un lasso sont repérées en gras et sont soulignées. Les séquences s'apparentant au signal de polyadénilation sont encadrées et le commencement de la queue poly (A) est représenté par un triangle. La Figure 2 représente les caractéristiques structurales de la protéine Aa-Pri déduite. Le site de phosphorylation de la protéine kinase dépendant de l'AMP cyclic est représenté par un encadré non grisé, les sites de phosphorylation de la caséine kinase II sont représentés par des encadrés grisés et les sites de phosphorylation de la protéine kinase C sont indiqués en-dessous. Les sites putatifs de glycosylation (NASS et NKTI) sont indiqués par des flèches. Pour la traduction du gène, on n'utilise que 49 codons sens sur 61, ce qui montre un biais dans l'utilisation des codons. Cependant, le degré de biais du gène Aa-Pril est moins marqué que dans les gènes fongiques hautement exprimés dans lesquels à peine 28 codons peuvent être utilisés (Gurr et al., 1987). Le gène Aa Pril suit les schémas de base dans l'utilisation de la troisième base décrite pour les gènes constitutifs ou hautement exprimés provenant de levures et de champignons filamenteux (Gurr et al, 1987) : lorsqu'il existe un choix entre les purines et les pyrimidines, on note une préférence pour les codons qui se terminent par des pyrimidines, en particulier C qui est utilisée dans 66% des codons, et de même, si une purine est requise en position de flottement, 66% des codons utilisent G. La comparaison de 1'ADNc et des séquences génomiques montre un court intron long de 54 pb aux positions nucléotidiques +125 à +179. De courts introns situés dans la partie en 5' des gènes fongiques sont décrits dans les gènes pyrG d'Aspergillus nidulans et cutA de Fusarium solani, qui possèdent respectivement un intron de 59 pb au niveau du nucléotide +53 et de 52 pb au niveau du nucléotide +66, (Gurr et al., 1987). L'intron du gène Aa-Pril est un intron de classe II d'après les séquences consensus aux limites intron-exon (5'GT/AG 3') (Michel et al., 1989). A la limite 5', au lieu du classique GT, l'intron du gène Aa Pril possède la paire de nucléotides GC. On a trouvé d'autres exceptions à la règle de la limite GT chez des champignons dans les gènes des-J et qa-IS provenant de Neurospora crassa (Gurr et al., 1987) et dans les gènes pgal et ras d'Aspergillus niger et L. edodes, respectivement (Unkless, 1992). L'analyse de la région non codante en 5' révèle la présence d'un motif TATAAAT au niveau du nucléotide -83 et d'un motif CCAAT au niveau du nucléotide -156 (73 nucléotides en amont de la boîte TATA prédite) (Fig. 1). Ces deux séquences intervenant dans la transcription des gènes codant pour des protéines eucaryotes (McKnight et Kingsbury, 1982), ont été identifiées dans de nombreux gènes fongiques respectivement aux environs de 30-350 pb et 83-500 pb à partir du site d'initiation de la traduction (Gurr et al., 1987 et Unkless, 1992). A titre d'exemples, on a localisé des boîtes TATA et CAAT en positions -96 et 188 respectivement dans le promoteur cbh2 de Trichoderma reesei (Unkless, 1992) et en positions - 111 et - 167 dans le promoteur priA de L. edodes (Kajiwara et al., 1992). Sur trois points de départ de la transcription (pdt) potentiels identifiés par extension d'amorce (nt -49, -85 et -91), le pdt situé à -49 semble plus probable, et les deux autres pdt sont tous deux localisés en amont de la boîte TATAA putative. De plus, ce pdt commence par un A précédé par un C, ce qui est la paire dinucléotidique la plus courante que l'on trouve dans les pdt eucaryotes (Breathnach et Chambon, 1981) et est entourée par une forte séquence inductrice (CCA+1TTCC) correspondant à la séquence d'initiation consensus YYA+1NWYY (W=A ou T; Y=C ou T)(Javahery et al., 1984) dans laquelle un T en position +3 et un environnement riche en pyrimidine semblent être importants pour une forte initiation (Javahery et al., 1984). A l'extrémité 3' du gène Aa-Pril, la queue poly(A) commence à 145 nucléotides en aval du codon stop de traduction prédit (TAA). La séquence de polyadénylation AATAAA que l'on trouve fréquemment dans les gènes eucaryotiques (Gurr et al., 1987) n'est pas retrouvée dans la région Aa-Pril non codante en 3', mais des séquences similaires : [T(A)5TA] et [T(A)3T(A)4T(A)6] ont été identifiées à 44 nucléotides et 29 nucléotides respectivement en amont du site de polyadénylation. Le gène Aa-Pril code potentiellement pour un polypeptide à 145 aa de 16093 Da (calculé d'après le logiciel DNA Strider 1.2). Bien que son homologie avec l'Asp-hémolysine d'A.fumigatus (Ebina et al., 1994) soit significative, elle ne fournit pas d'éléments concrets sur la fonction d'Aa-Pril dans la différenciation des primordia. Les agents cytolytiques sont synthétisés par divers microorganismes, plantes et animaux. Des hémolysines fongiques ont été signalées chez les champignons Gyromitra esculenta (Gray, 1973), Tricholoma populinum (Lindequist et al., 1989) et Laetiporus sulfureus (Konska et al., 1994); une protéine cytolytique a été purifiée (pleurotolysine) à partir du champignon Pleurotus ostreatus (Bernheimer et Avigad, 1979), et on a signalé l'activité cytolytique de la rubescenslysine et de la phallolysine provenant d'Amanita rubescens et d'Amanita phalloides, respectivement (Seeger et Wachter, 1981) mais les fonctions biologiques in vivo dans les cellules fongiques ne sont pas claires. Quoiqu'il en soit, à partir de l'aptitude de l'Asp-hémolysine, classée comme cytolysine, à interagir avec les récepteurs spécifiques dans les membranes (Thelestam et Moly, 1979), on peut prédire un rôle hypothétique de la protéine Aa-Pril, dans la liaison à des récepteurs spécifiques situés à la surface des hyphes végétatives, ce qui pourrait permettre leur agglutination et leur tassement pour former les primordia. La propriété de liaison à une membrane cellulaire et/ou nucléaire a été signalée pour la protéine priA provenant de L. edodes qui semble jouer un ou plusieurs rôles au cours du début de la fructification (Kajiwara et al., 1992), mais le mécanisme de la liaison putative semble être différent pour les deux protéines car on n'a trouvé aucune boîte Cys-Aaa-Aaa-Xaa C-terminale (Aaa=acide aliphatique, Xaa= n'importe quel aa) dans la protéine Aa-Pri 1. Il semble particulièrement intéressant que la protéine Aa-Pril contienne plusieurs résidus (lysine, sérine et thréonine) pouvant agir comme substrats pour la phosphorylation par différents types de protéine kinases. Un site putatif de phosphorylation de protéine kinase dépendant de l'AMPc (KRNT) commence au résidu lysine106. Un rôle possible de l'AMP.cyclique dans la formation des basidiocarpes de Coprinus macrorhizus a été supposé en fonction des protéines disponibles pour la phosphorylation par les protéine kinases dépendantes de l'AMP cyclique (Ishikawa et Uno, 1977). De plus, il est connu que des niveaux élevés d'AMP cyclique sont étroitement apparentés à l'apparition d'une fructification et/ou à la formation de primordia chez le champignon L.edodes (Takagi et al., 1987) et qu'on a trouvé un site putatif de phosphorylation de protéine kinase dépendant de l'AMP (RRNS) dans la protéine priBc qui est synthétisée de façon préférentielle au stade primordia (Endo et al., 1994). Deux sites de phosphorylation de caséine kinase II, SNKD et SGTE ont été localisés aux résidus sérine3 et sérine76, respectivement (Fig. 2). Le site SNKD se chevauche avec un site de phosphorylation de protéine kinase C (SNK) ; deux autres sites consensus pour la phosphorylation de la protéine kinase C, TIR et SKR, sont situés aux résidus thréonine93 et sérine105, respectivement. L'activation de la protéine Aa-Pril par phosphorylation peut aboutir à des réactions intervenant dans la différenciation des basidiocarpes à partir de primordia par analogie avec d'autres phénomènes de croissance comme la division cellulaire ou le développement d'une tumeur dans lesquels des fonctions régulatrices de protéine kinases semblent être impliquées (Hanks et al., 1988). Chez les basidiomycètes, on a isolé divers gènes intervenant à différents stades du développement des basidiocarpes. Des études sur la régulation de leur transcription ont montré que seuls trois gènes sont spécifiques du stade primordia/corps fructifiant immature : les gènes PriA et PriBc du champignon L. edodes dont les protéines correspondantes commandent vraisemblablement l'expression du ou des gènes qui sont en relation avec l'apparition de fructification (Kajiwara et al., 1992 ; Endo et al., 1994) et du gène Scl du champignon S.commune, codant pour une protéine hydrophobine qui développe un complexe insoluble dans les parois cellulaires des hyphes qui émergent (Dons et al. 1984 Wessels et au.1991). La fonction de la protéine Aa-Pri 1, spécifiquement exprimée au cours de la formation des primordia, reste inconnue. Bien que I'homologie avec l'Asphémolysine d'A.fumigatus soit significative, elle ne fournit pas de preuve manifeste de la fonction putative de la protéine Aa-Pril car les régions fonctionnelles de l'hémolysine d'Asp n'ont pas été identifiées. Il est cependant intéressant de noter que les deux protéines pourraient interagir avec la membrane. De plus, comme la protéine pri Bc de L. edodes, la protéine Aa-Pril possède un site de phosphorylation dépendant de l'AMPc, ce qui suggère que le gène de structure correspondant pourrait être régulé par la quantité d'AMPc dans les cellules. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence cidessus mentionnée pour induire la fructification non seulement chez Agrocybe aegerita mais également chez tout autre espèce de champignon basidiomycète. Cette utilisation comprend l'insertion par transformation de ladite séquence dans une cellule, une hyphe ou une spore sexuée ou asexuée de basidiomycète, ladite transformation pouvant être réalisée au moyen d'un vecteur. En effet, la présente invention a notamment pour but une meilleur maîtrise de la fructification des champignons comestibles basidiomycètes. Comme indiqué précédemment, la fructification naturelle des champignons n'est déclenchée que par l'activation de gènes clefs eux-mêmes sous l'influence de facteurs extérieurs plus ou moins complexes et difficilement contrôlables. Comme cela sera montré dans l'exemple ci-après, le gène Aa-Pril est un bon candidat pour être l'un de ces gènes clefs. Par conséquent, son utilisation, ou plutôt celle de SEQ ID N" 1 ou N" 2, en tout ou partie, modifiée si nécessaire (par exemple par mutation) devrait permettre, par son insertion au sein d'hyphes de basidiomycètes par un moyen transformant quelconque, par exemple un vecteur, puis éventuellement par son intégration au sein du génome, de pallier à l'incertitude de l'expression du gène naturel. Par exemple, la séquence introduite pourrait être sensible à des seuils inférieurs de stimulations par les facteurs extérieurs ou seulement à certaines d'entre elles ou encore pourrait être fonctionnelle spontanément dès que le basidiocarpe a atteint un certain stade de maturation. L'invention a donc pour objet les cellules, hyphes et spores sexuées ou asexuées de champignon basidiomycète transformées par une séquence nucléotidique selon l'invention. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention comprenant au moins une partie codante pour produire une protéine ou fragment protéique. Cette utilisation comprend l'insertion de la séquence en question dans un vecteur d'expression apte à transformer des cellules procaryotes ou eucaryotes et la transformation desdites cellules avec ledit vecteur d'expression. Outre le vecteur transformant mentionné ci-dessus, I'invention concerne également les vecteurs d'expression aptes à transformer des cellules procaryotes ou encaryotes. Ces vecteurs en question expriment la séquence protéique correspondant à la séquence nucléotidique qu'ils contiennent dans la cellule transformée ladite séquence protéique pouvant ensuite être récupérée par des techniques conventionnelles. Un autre objet de l'invention concerne les cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par un vecteur d'expression selon l'invention ou par quelque moyen que ce soit. Enfin, I'invention concerne une protéine ou un fragment protéique susceptible d'être obtenu par culture des susdites cellules transformées. La présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. Elle sera mieux comprise à la lumière de l'exemple ci-dessous qui n'est mentionné qu'à titre purement illustratif. Exemple: Souches et conditions de culture La souche dicaryotique d'A.aegerita provient de sous-cultures de fragments de basidiocarpes de la souche de type sauvage SM51 (AlBl/A2B2). Pour obtenir les basidiocarpes à divers stades de développement, on inocule des fragements de mycélium dicaryotiques de 5 mm dans des boîtes de Petri contenant un milieu Raper complet solide (Raper et al., 1972), on cultive pendant 10 jours à l'obscurité à 25"C (croissance végétative) puis on les transfère dans des conditions de fructification (température ambiante dans des conditions naturelles de lumière/obscurité). Les stades de développement sont définis antérieurement (Salvado et Labarère, 1991). On cultive le mycélium végétatif sur du milieu complet liquide (Raper et al., 1972) dans des fioles de Roux sans agitation dans l'obscurité à 25"C. On cultive la souche JM83 d'Escherichia coli (Yanish-Perron et al., 1985) utilisée pour la propagation des plasmides, à 37"C dans un milieu LB liquide ou solide contenant 50 pg/ ml d'ampicilline. Isolement et analyse de l'ADN On isole l'ADN total selon le procédé du bromure de N-céthyl-NNNtriméthyl ammonium (Noël et Labarère, 1989). On sépare l'ADN digéré dans un gel d'agarose à 0,8% puis on le transfère sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham Corp.) selon le procédé du fabricant et en utilisant un système de buvardage sous vide (Appligene). On effectue les hybridations de l'ADN digéré total avec les ADNc marqués (voir préparation des sondes radioactives) dans un tampon d'hybridation de référence contenant 6 x SSC (1 x SSC dans NaCI 0,15 M et citrate de sodium 0,015 M, pH 7,6), 5 x solution de Denhardt, SDS à 0,5% (p/v), ADN de sperme de hareng dénaturé à 100 llg/ml. On lave successivement deux fois les filtres (2 x 5 minutes) dans 6 x SSC/SDS à 0,1%, deux fois (2 x 10 minutes) dans 2 x SSC/SDS à 0,1% puis deux fois (2 x 15 minutes) dans 0,2 x SSC/SDS à 0,1%. On effectue la construction et l'isolement des ADN de plasmide selon Maniatis et al. (1982). Isolement et analyse de l'ARN On isole les ARN totaux en utilisant le procédé du phénol chaud (De Vries et al., 1980). On fractionne les ARN dans du gel d'agarose à 1,4%-formaldéhyde selon Maniatis et al. (1982) puis on buvarde sur une membrane de nylon par transfert capillaire en utilisant NaCI 1 ,5M/NaOH 0,5 M comme tampon de transfert. On effectue les hybridations avec l'ADNc d'EMAa-4 ou l'ADNr 18 S de Pleurotus cornucopiae utilisés comme sondes, à 42"C dans le tampon d'hybridation de référence en présence de formamide à 50%. On lave les membranes de nylon 20 minutes avec 1 x SSC/SDS à 0,1% à 25"C puis pendant 10 minutes avec 0,2 x SSC/SDS à 0,1% à 55"C. On prépare des ARN poly(A) en utilisant le système d'ARNm polyAtract (Promega), selon les instructions du fabricant. Le poly(A) isolé par ce procédé représente 0,5% des ARN totaux. Préparation des sondes radioactives On purifie les inserts d'EMA libérés après la digestion des plasmides de pEMA par BamHI, à partir d'une électrophorèse sur gel d'agarose par le système "Gene Clean" (BIO 101). On marque les inserts et les plasmides de pEMA linéarisés avec BamHI au moyen d'un amorçage aléatoire avec 25 ZCi d'a-32PdCTP (3000 Ci/mmole, Amersham Corp.) jusqu'à une activité spécifique de 107108 cpm/pg, en utilisant le système de marquage Primer-a-Gene (Promega). On obtient l'ADNr 18S de Pleurotus cornucopiae utilisé dans l'analyse de buvardage Northern, par digestion par Sall-Eco Rl de l'insert pPcR1 contenant une partie de l'unité de l'ADNr de P. cornucopiae (Iraçabal et Labardère, 1994) et on marque comme il est dit ci-dessus. Construction de la banque génomique et criblage On digère avec Pst 1 l'ADN génomique isolé à partir du mycélium végétatif d'A.aegerita et on le sépare sur des gels d'agarose à 0,8%. On découpe le segment de gel contenant des fragments d'ADN compris entre 2,9 et 3,3 kb et on purifie l'ADN à partir d'un gel d'agarose en utilisant le système "Gene jean" (Bio 101). On ligature 1'ADN purifié au vecteur pUC18 préalablement digéré par Pst 1 et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline bactérienne. On utilise le mélange de ligature pour transformer des cellules d'E. coli JM83, on crible 3000 clones transformants par hybridation sur colonies en utilisant un insert d'ADNc EMAa-4 marqué (Salvado et Labarère, 1991) comme sonde. Séquençage et analyse de séquence On détermine les séquences nucléotidiques du fragment génomique d'EcoR! à 2,4 kb et de l'insert d'ADNc d'EMAa-4 correspondant sur les deux brins en utilisant une série de sous-clones délétés qui se chevauchent, produits par le procédé d'Henikoff (1984) avec le kit Erase-A (Promega). On élimine les ambiguïtés de la séquence en utilisant des oligo-nucléotides spécifiques comme amorces de séquençage. On effectue la séquençage avec le kit Sequenase version 2.0 (United States Biochemical) en utilisant le procédé du désoxyribonucléotide (Sanger et al., 1977). On détermine la séquence d'acides aminés prédite en utilisant le code génétique universel et on compare avec les protéines provenant de GenBank et des bases de données EMBL en utilisant l'algorithme de recherche (Altschul et al., 1990). Pour comparer les séquences d'ADN, on utilise le programme de Genetics Computer Group (BESTFIT - GCG - ensemble Wisconsin). On produit une courbe d'hydrophobicité avec le programme DNA Strider (1.2) basé sur l'algorithme de Kyte-Doolittle. Extension de l'amorce On détermine les points de départ de transcription par extension d'amorce. On suit le procédé de Kajiwara et al. (1992) avec des modification mineures : (i) on fixe 2,2 pg sur un oligonucléotide 18-mère (5'-GAG CAT AGG CCC TTT CAT) correspondant au brin anti-sens allant du nucléotide 17 à 34, les ARN poly(A) (4,4 pg) pendant 5 minutes à 70"C, (ii) on ajoute une transcriptase inverse (67 unités de transcriptase inverse AMV, Promega) et 25 ,uCi d'cr-32P-dCTP (3000 Ci/mmole, Amersham Corp.) et on procède à l'incubation à 42"C pendant 60 minutes. Après extraction au phénol/chloroforme et précipitation, on sèche à l'air les produits d'extension, on les sépare dans un gel sur électrophorèse d'urée 7M/polyacrylamide à 6% et on les visualise par autoradiographie. On détermine la taille des produits d'extension par comparaison avec les échelles de séquençage (GATC) qui sont dérivées de l'ADN témoin (bactériophage Ml 3mpl 8) inclus dans le kit Sequenase 2.0 en utilisant une amorce 17-mère universelle. Clonage d'un fragment d'ADN génomique d'Agrocybe aegerita s'hybridant à l'insert d'ADNc d'EMAa-4 On digère l'ADN total d'A. aegerita avec les endonucléases EcoRI, HindIII et Pst I et on hybride avec la sonde plasmidique pEMAa-4 selon Sma I), ces sites de restriction étant situés dans le lieur multisite (linker) pUC18, ne permet pas de trouver une combinaison d'un site sensible et d'un site résistant à la digestion par l'exonucléase III, c'est-à-dire deux types de sites situés du même côté de l'insert. Par conséquent, on a décidé de sous-cloner le fragment interne EcoR I de 2,4 kb. De fait, on a préalablement établi par analyse de buvardage Southern de l'ADN total d'A.aegerita avec l'insert EMAa-4 comme sonde, que ce fragment porte la séquence homologue à l'ADNc. De plus, ceci permet l'utilisation des sites Xba I et Sph I pour le clonage. On libère le fragment à 2,4 kb par digestion avec EcoR I du fragment Pst I de 3,1 kb, on le sépare par électrophorèse sur gel d'agarose puis on le purifie et on l'introduit dans le vecteur pUC18 en suivant le procédé décrit pour le fragment Pst I de 3,1 kb. On sous-clone le fragment EcoR I dans les deux orientations comme on le montre d'après l'analyse des schémas de digestion par BamH I des plasmides recombinants obtenus ( deux fragments BamH I de 2,9 et 2,2 kb pour une orientation et deux fragments BamH I de 0,2 et 4,9 kb pour l'autre). On utilise les plasmides recombinants représentant chaque orientation du fragment EcoR I comme bases pour le séquençage de l'ADN après construction par traitement à l'exonucléase III des sous-clones délétés qui se chevauchent. Analyse de la séquence nucléotidique On détermine la séquence nucléotidique complète du fragment EcoR I de 2,4 kb et de l'ADNc hybridant (insert EMAa-4a) sur les deux brins. L'analyse de la séquence EcoR I de 2,4 kb (1,2 programme DNA Strider) révèle un cadre ouvert de lecture de 492 nt, homologue à la séquence d'ADNc, commençant par le codon méthionine ATG (+1) et se terminant par le codon d'arrêt de traduction TAA (+492) (figure 1A). Les séquences nucléotidiques de tout le gène, du cadre ouvert de lecture (ORF) appelé gène Aa-Pril (492 pb) et d'une partie de ses régions voisines en 5' (400 pb) et 3' (186 pb) sont reportées dans la figure 1 B. La séquence ATACCATGGG autour du site de début de tracuction (ATG) de 4 nucléotides sur 7 (A en position -3, C en positions -1 et -2 et G en position +I) correspond à la séquence consensus CC(A/G)CCATGGC de Kozac (1984) dans laquelle le nucléotide 3 est toujours une purine, et généralement un A. On suppose que cette séquence intervient dans la reconnaissance du codon AUG correct par le ribosome (Ballance, 1991). L'alignement des séquences génomiques et de l'ADNc correspondant (insert EMAa-4) montre que la séquence génomique contient un intron à 54 pb localisé aux nucléotides + 125 à +179. Le site d'épissage intronique en 3' (CAG) porte les séquences consensus typiques pour l'épissage (YAG; Y=C ou T)(Gurr et al., 1987). Cependant, à la limite en 5', I'intron a la paire nucléotidique GC au lieu du classique GT. La séquence interne putative requise pour la formation d'un lasso (TACTTAC) ressemble à -la séquence consensus NNCTRAY (N = A, C, G ou T; R = A ou G; Y = C ou T) décrite pour les champignons filamenteux (Unkless, 1992), et ce n'est que le T en position 5 de l'élément qui ne correspond pas à la séquence consensus. Dans la région voisine en 5' de la séquence génomique, on identifie une boîte TATA (TATAAAT) au nucléotide -83 et une boîte CAAT (CCAAT) au nucléotide - 156. Dans la région voisine en 3', on localise deux séquences semblables à la séquence de polyadénylation consensus AATAAA dans les positions nucléotidiques +593 [T(A)5TA] et +608 [T(Aj3T(A)4T(A)6]. L'extension de l'amorce révèle trois points de début de transcription (pdt) aux nucléotides -49, -85 et -91. L'un d'entre eux (pdt au nt -49) est entouré par une séquence CCA+1TTCC correspondant à la séquence d'induction consensus YYA+1NWYY (W = A ou T; Y = C ou T)(Javahery et al., 1984). Séquence d'acides aminés déduite de la protéine Aa-Pri La traduction du cadre ouvert de lecture débarrassé de son intron, en utilisant le code génétique universel, montre qu'il code pour une protéine acide (pI = 5,8 calculé avec le programme Isoelectric-GCG-WISCONSIN Package, v 9.0) de 145 acides aminés ayant un poids moléculaire calculé de 16093 Da (calculé d'après le logiciel DNA Srider 1.2). La protéine déduite est riche en acide aspartique (7,5%), en asparagine (8,9%), en glycine (11%), en lysine (7,5%) et en sérine (9,6%). La courbe d'hydrophobicité de Kyte et Doolittle révèle que la protéine Aa-Pril est principalement hydrophile. Une région hydrophobe de 20 aa (de aa12 à aa32) est prédite dans la séquence NH2-terminale, déterminant une hélice o: putative (programme TopPredII), ce qui suggère l'éventualité selon laquelle la protéine Aa-Pri 1 pourrait être une protéine associée à une membrane. On peut mettre en évidence des motifs potentiellement significatifs pour la glycosylation ou la phosphorylation dans la séquence d'acides aminés (figure 2). Deux sites putatifs de N-glycosylation (N-X-S/T-X, X'P) à savoir NASS et NKTI sont localisés en positions 73 et 91, respectivement. On met en évidence six sites putatifs de phosphorylation: (i) un pour une protéine kinase p dépendant de l'AMP cyclique (R/K-R/K-X-S/T) commençant à la lysine1 06, (ii) deux pour une protéine de caséine kinase II (S/T-X-X-D/E) commençant à la sérine3 et à la sérine76 et (iii) trois pour une protéine kinase C (S/T-X-R/K) commençant à la sérine3, la thréonine93 et la sérine105. La comparaison de la séquence d'acides aminés Aa-Pril avec les bases de données GenBank et EMBL montre qu'elle présente des homologies avec l'Asphémolysine provenant de l'Hyphomycète Aspergillus fumigatus (Numéro d'accès GenBank D16501). Expression du gène Aa-Pril au cours du cycle vital Afin d'étudier l'expression du gène Aa-Prîl, on a isolé les ARN cellulaires totaux à partir de quatre stades de développement: mycelia végétatifs, agrégats, primordia/corps fructifères immatures et corps fructifères matures. Pour chaque stade, on a soumis les ARN totaux à une analyse de buvardage Northern en utilisant comme sonde l'insert d'ADNc EMAa-4 marqué. On charge la même quantité d'ARN totaux (30 pg) dans chaque piste, ce qui est vérifié par coloration du gel au bromure d'éthidium avant transfert. L'analyse Northern avec la sonde d'ADNc EMAa-4 a révèlé un fort signal correspondant à une bande d'ARN de 600 b dans l'extrait de primordium. Les mycélia végétatifs, les agrégats et les corps fructifères matures ne contiennent pas de quantités détectables du produit de transcription Aa-Pril (données non montrées). Comme témoin, après hybridation du buvardage Northern avec la sonde, on examine le transfert stoechiométrique des quatre préparations d'ARN par lavage et nouvelle hybridation de la bande avec l'ADNr 18S de Pleurotus cornucopiae (voir ci-dessus) qui ne présente pas d'expression différentielle au cours du cycle vital. On a détecté des signaux d'ADNr 18S dans toutes les bandes d'ARN avec des intensités similaires (données non mentionnées). Etant donné que les concentrations d'ARN dans chaque échantillon sont similaires, il est évident que le gène Aa-Pril n'est activement transcrit qu'au stade des primordia/corps fructifères immatures. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) (B) RUE: 147 AVENUE DE L'UNIVERSITE (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75007 (i) DEPOSANT: (A) NOM: UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX 2 (B) RUE: 146 RUE LEO SAIGNAT (C) VILLE: BORDEAUX (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 33000 (ii) TITRE DE L' INVENTION: GENE IMPLIQUE DANS LA FRUCTIFICATION DES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCETES ET UTILISATIONS (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1079 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:401..523 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT:525..578 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:581..889 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TGTTTAAAAA CTCGCGAGTT ATGCGTGGGT CCGCGCGAAG GATGCTTTCT CGATTGAATA 60 GAGAATGGAG GAGAGGTTCG TTTGGCAAGT GATACTTTCA TCAACGCCGA GAATGGAAGT 120 CGAGCTGCTG TCTCCGATTT CCGTAGCCTA CAAGTTGCTC TTTGAATGGA TCATCCATGG 180 GGCTCGTGGC GATGTGGCGT GGTCGGGTGG TACTGACCAA CCTTCTGGCA TATTCCTCAG 240 AGCTCCAATT AGACGTAAAG AGAACATCGT CCGGCTCGAC GAAGAAAAAA AGGGAAATTG 300 AGGGCCTGTA GAAATTGTAT AAATACTATA CCTGCTAAGA GCAGATTCCT CATTCCAAAG 360 CACCCACCGA GTACATCCAA CAGCCACCCG TTTGAATACC ATG GAT AGC AAC AAG 415 Met Asp Ser Asn Lys 1 5 GAT GAA AGG GCC TAT GCT CAA TGG GTG ATC ATC ATC CTC CAC AAC GTC 463 Asp Glu Arg Ala Tyr Ala Gln Trp Val Ile Ile Ile Leu His Asn Val 10 15 20 GGC TCG TCC CCT TTC AAG ATC GCG AAC CTC GGC CTC TCC TGG GGA AAG 511 Gly Ser Ser Pro Phe Lys Ile Ala Asn Leu Gly Leu Ser Trp Gly Lys 25 30 35 CTC TAC GCT GAC G GCAAGCCGC TTCATCAGTC CAAACGCATA TGGTACTTAC 563 Leu Tyr Ala Asp Gly 40 CATTGTCTTT AACAG GT AAC AAG GAC AAA GAA GTC TAT CCC AGT GAC TAC 613 Asn Lys Asp Lys Glu Val Tyr Pro Ser Asp Tyr 45 50 AAT GGA AAG ACG GTT GGG CCC GAC GAG AAG ATA CAA ATC AAT TCG TGC 661 Asn Gly Lys Thr Val Gly Pro Asp Glu Lys Ile Gln Ile Asn Ser Cys 55 60 65 GGC CGG GAG AAC GCC TCC TCT GGC ACC GAG GGG TCC TTC GAT ATC GTC 709 Gly Arg Glu Asn Ala Ser Ser Gly Thr Glu Gly Ser Phe Asp Ile Val 70 75 80 85 GAC CCC AAT GAT GGC AAT AAG ACC ATC CGT CAC TTC TAC TGG GAA TGC Asp Pro Asn Asp Gly Asn Lys Thr Ile Arg His Phe Tyr Trp Glu Cys 90 95 100 CCC TGG GGG AGC AAA AGA AAC ACC TGG ACT CCT AGC GGC TCG AAT ACC 805 Po Trp Gly Ser Lys Arg Asn Thr Trp Thr Pro Ser Gly Ser Asn Thr 105 110 115 SAG TGG ATG GTC GAG TGG AGC GGC CAG AAC TTG GAC AGC GGA GCA CTC 853 Lys Trp Met Val Glu Trp Ser Gly Gln Asn Leu Asp Ser Gly Ala Leu 120 125 130 GGC ACC ATC ACC GTC GAT GTC CTG CGC AAG GGC AAC TAAATACGTG 899 Gly Thr Ile Thr Val Asp Val Leu Arg Lys Gly Asn 135 140 145 AGTATACATA CGTACCTTAT CCAGTTCTCG CGAATGGTTA CTGAACCAGA AACCAAAGGT 959 GGCATCTGCT GCCAATTTCG TGAGGAAAAT CAGTAAAAAT AAGGATGGTA AATAAAATAA 1019 AAAATGATGA ACTTGTCTTG CTGTAGTTGT CGCCGAGGTC GTAGGGTTGA TTTGATGTAC 1079 REFERENCES Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.V. and Lipmant, D.J. 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REVENDICATIONS 1- Séquence nucléotidique correspondant à: a) une séquence selon SEQ ID N" 1 en tout ou en partie; b) une séquence s'hybridant avec a) ; ou c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b). 2- Séquence nucléotidique selon la revendication 1 correspondant à un gène ou un fragment de gène comportant: a) une partie de la séquence selon SEQ ID N" 1; b) une séquence s'hybridant avec a); c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b); d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène ou un fragment de gène selon a), b) ou c), ou pour une protéine équivalente. 3- Utilisation d'une séquence selon la revendication 1 ou 2 pour induire la fructification chez un champignon basidiomycète. 4- Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que le champignon basiodiomycète est Agrocybe aegerita. 5- Utilisation selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce qu'elle comprend l'insertion par transformation d'une séquence selon la revendication I ou 2 dans une cellule, une hyphe ou une spore sexuée ou asexuée de champignon basidiomycète. 6- Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que la transformation est réalisée par un vecteur. 7- Cellule,hyphe, spore sexuée ou asexuée de champignon basidiomycète transformée par une séquence selon la revendication 1 ou 2. 8- Utilisation d'une séquence selon la revendication 2 pour produire une protéine ou un fragment protéique caractérisée en ce qu'elle comprend l'insertion d'une séquence selon la revendication 2 dans un vecteur d'expression apte à transformer des cellules procaryotes ou eucaryotes et la transformation desdites cellules avec ledit vecteur d'expression. 9- Vecteur d'expression d'une séquence selon la revendication 2. 10- Cellule procaryote ou eucaryote transformée par un vecteur selon la revendication 9. 11- Protéine ou fragment protéique susceptible d'être obtenu par mise en culture d'une cellule selon la revendication 10.