FR 2757864 A1 19980703 FR 9616207 A 19961230 La présente invention concerne des anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine nitrosylée et avantageusement les composés résultant de la conjugaison de NO avec ses transporteurs, comme l'albumine. L'invention se rapporte aussi à des compositions immunogènes pour la préparation de tels anticorps polyclonaux ou monoclonaux. L'invention a encore pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif ces anticorps, et leur utilisation pour le traitement de pathologies impliquant le monoxyde d'azote, ses dérivés et conjugués, notamment dans les situations où il y a une hyperproduction de NO. L'invention concerne enfin l'utilisation de ces anticorps pour la détection de composés nitrosylés et le diagnostic des pathologies impliquant ces composés. Le monoxyde d'azote, ci-après désigné aussi NO, est décrit comme étant la plus petite molécule élaborée par les cellules. D'abord assimilé à 1'EDRF, il a ensuite été reconnu comme neuromédiateur, et serait le premier neurotransmetteur à activité rétrograde, ainsi que comme molécule cytotoxique/cytostatique. Du fait de sa forte réativité, le monoxyde d'azote est susceptible de réagir avec un grand nombre de molécules pour former des conjugués possédant de multiples fonctions et participer ainsi à des nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques. Le monoxyde d'azote, produit en grande quantité ou de façon inadéquate est impliqué dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques, comme les infections, les chocs septiques, les maladies dégénératives et autoimmunes, les rejets de greffe, et son action est souvent relayée par celle de ses dérivés et conjugués. Ainsi, l'albumine nitrosylée possède une activité hypotensive, expliquant la durée d'action du NO. De même, la nitrohémoglobine a récemment été décrite comme agissant sur la vasodilatation. Afin de palier les effets néfastes de la production en grande quantité ou de façon inadéquate du NO ou de ses conjugués, il a été proposé dans l'art antérieur utiliser des inhibiteurs de l'enzyme NO-synthase. On a observé toutefois que ces inhibiteurs ne sont pas actifs sur des molécules déjà formées et qu'en outre, leur distribution dans l'organisme et leur toxicité limitent leur utilisation. La présente invention vise précisément à palier (Des inconvénients en proposant des molécules biologiques tapissant sélectivement sur les molécules transportant le monoxyde d'azote En outre, la détection de substances nytrosylées permettrait de révéler des molécules ou tissus cibles impliqués dans les pathologies citées précédemment. I1 a été ainsi été proposé dans l'art antérieur d'utiliser des anticorps anti-nitrotyrosine pour mettre en évidence la tyrosine nitrée, qui est le marqueur de la formation du peroxynitrite, résultant de la réaction entre l'anion superoxyde 02- avec NO, dans de nombreuses pathologies. La présente invention vise aussi à fournir de nouveaux moyens de détection de molécules nitrosylées utiles pour le diagnostic de pathologies impliquant celles-ci. Ces buts sont atteints selon l'invention grâce à des anticorps purifiés reconnaissant spécifiquement une protéine nitrosylée, et avantageusement des composés résultant de la conjugaison de NO avec ses transporteurs. Parmi-ceux-ci, l'invention concerne tout particulièrement des anticorps purifiés dirigés contre les albumines nitrosylés. On entend dans ce qui suit par protéine nitrosylée, également les peptides et polypeptides nitrosylés et plus généralement tout conjugués antigénique nitrosilé. Les anticorps de l'invention présentent de nombreux avantages, notamment en ce qui concerne leur rapidité d'action et leur efficacité sur des molécules nytrosylées déjà formées et actives. En outre, leur capacité de diffusion dans un organisme est limitée aux propriétés physicochimiques des immunoglobulines. Outre leur efficacité, les anticorps de l'invention présentent l davantage d'être très spécifiques et non toxiques. Les anticorps sont des macromolécules élaborées par les organismes en réponse à la présence d'une substance étrangère. Des anticorps d'origine animale ont té utilisés de longue date en thérapeutique humaine. Par exemple, le sérum de cheval a été utilisé comme anticorps antitétanique après immunisation de celui-ci par la toxine tétanique. Les travaux de recherche ayant conduit à la présente invention ont débuté par l'induction d'anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine nitrosylée, normalement plus stable in vivo qu'un acide aminé nitrosylé. En outre, les différentes réponses immunes ont été étudiées en modifiant non seulement les épi topes et Leur présentation mais aussi l'espèce animale. L'invention concerne également un ensemble d'anticorps polyclonaux précédents obtenus en injectant à un animal un immunogène décrit ci-après. Puis, dans un second temps, des anticorps monoclonaux ont été préparés selon les méthodes classiques de fusion cellulaire. NO possède une grande affinité pour la cystéine et la tyrosine et en s'y fixant. I1 est impliqué dans des multiples fonctions qui pourraient être liées à des processus de transport, de stockage, et finalement de relargage de NO au niveau de ses sites d'action. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été réalisés en utilisant différentes molécules antigéniques nitrosylées. Pour les rendre immunogéniques, les acides aminés (haptènes) ont été couplés à des protéines porteuses par l'intermédiaire de différents agents couplants. Ainsi, l'albumine, qui est la protéine la plus abondante du plasma, stocke et transporte le NO, et il a été montré que cette albumine nitrosylée possède une activité vaso-dilatatrice importante et également cytotoxique et cytostatique. Cette propriété de l'albumine est due à a présence d'une cystéine dont l'affinité pour le NO est élevée. Les travaux de recherche réalisés par les Inventeurs et rapportés ci-après, ont permis de préparer des anticorps poly et mono-clonaux dirigés contre des conjugués de NO et de résidus d'acide aminés, la cystéine, le tyrosine et le tryptophane, eux-mêmes couplés a une protéine porteuse, la sérum albumine humaine ou bovine. Puis, les anticorps spécifiques de la sérum albumine nitrosylée ont été sélectionnés et ont été utilisés pour reconnaître et neutraliser certaines des propriétés de ce conjugué in vitro. En synthétisant plusieurs formes d'immunogènes, les Inventeurs ont montré que ces composés sont uffisamment stables pour induire une réponse immune et cluse celle ci est spécifiquement dirigée contre l'épitope nitrosylé correspondant. La possibilité d'induire ces anticorps et l'intervention de nitrosothiols et de cystéine dans les mécanismes de vasodilatation (Ignarro et aJ , 1981) , ont amené les Inventeurs à rechercher existence de dérivés nitrosylés in vitro et in vivo et à bloquer leurs effets. L'invention concerne aussi les immunogènes pour la préparation des anticorps définis ci-dessus. Ces immunogènes sont constitués d'un acide aminé nitrosylé couplé à une protéine porteuse. La synthèse de ces immunogènes est réalisée par exemple en couplant l'haptène L-tyrosine (Tyr) ou L-cystéine-N-acétylée (Cys) à une protéine porteuse telles que la sérum albumine bovine (SAB) ou la sérum albumine humaine (SAH) par la carbodiimide. Puis, les conjugués obtenus sont nitrosylés par un donneur de NO comme le nitrite de sodium (NaNO2) en milieu acide L'utilisation de différents agents couplants tels que la carbodiimide, le glutaralgéhyde (G) ou t'anhydride succinique (AS) et de protéines, peptides ou polypeptides porteurs distincts, permet d'obtenir des épi topes associés à la nitrosylation de conformation différente. Ces immunogènes peuvent également être constitués d'une protéine dont la séquence possède un résidu d'acide aminé capable d'être nitrosylé comme l'albumine qui possède une cystéine. Dans les immunogènes de l'invention ci-dessus, on entend par protéine porteuse également les peptides et polypeptides. Les conjugués nitrosylés suivants ont été préparés dans le cadre de l'invention : NO-Tyr-SAB; NO-Cys(acétylée)-SAB; NO-Cys(non acétylée)-SAB; NO-Tyr-G SAB; NO-Cys-G-SAB; NO-Tyr-SA-SAB; NO-Cys-SA-SAB; NO-Tryp-SAB; NO-?'ryp-G-SAB; NO-SAB. La préparation de ces antigènes nitrosylés a permis le développement d'anticorps i,olyclonaux et monoclonaux qui ont servi à la détection de a nitrosylation de molécules de l'organisme (SAB) ou d'agents pathogènes et à la neutralisation de leur activité. La production d'Ac spécifiquement dirigés contre des immunogènes portant un épitope nitrosylé est délicate, car de nombreux couplages de différentes petites molécules à des protéines porteuses se sont révélés efficaces chez une espèce animale et pas chez une autre. Ceci a été remarqué lors de la modification de la présentation de l'antigène. Chez le lapin par exemple, deux immunogènes se sont révélés efficaces, le NO-Cys(acétylée)-SAB et le NO-Tyr-SAB, où l'agent couplant utilisé est la carbodiimide. L'élaboration de ces sérums immuns de lapin a permis d'entreprendre le développement d'anticorps monoclonaux murins. La réalisation de ceux-ci a tout d'abord nécessité la production des Ac polyclonaux chez la souris, où seul le couplage au glutaraldéhyde a permis d'obtenir de bons résultats. Ces derniers ont été obtenus uniquement lors de l'utilisation de l'immunogène NO-Cys-G-SAB Pour les autres conjugués, les réponses obtenues n'ont pas été spécifiques de l'épitope nitrosylé. En conséquence, la présentation de l'immunogène in vivo, est un élement déterminant pour stimuler la réponse immunitaire, et obtenir une approche réussie contre des petites molécules nitrosylées. Les travaux de recherche réalisés par les Inventeurs ont permis de mettre en évidence des activités portées par des molécules nitrosylées et de les neutraliser grâce à la réalisation d'anticorps dirigés contre des épitopes nitrosylés En conséquence l'invention concerne les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif un anticorps de l'invention avantageusement dispersé dans un véhicule ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. L'invention concerne aussi l'utilisation des anticorps de l'invention pour la préparation de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies dans lesquelles NO, ses dérivés ou conjugués sont impliqués, comme les infections par des microorganismes et des parasites, les maladies autoimmunes et inflammatoires, le choc septique, les cancers, le rejet de greffe, la neurotoxicité, . . La surproduction de "NO-lié" serait responsable de l'effet délétère du NO dans certaines pathologies, et pourrait donc être neutralisée par les anticorps de l'invention avantageusement et préalablement humanisés. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence in vivo le rôle de NO dans le développement des maladies autoimmunes et inflammatoires. Jusqu'à présent, les inhibiteurs de la NO-synthase constituent les molécules les plus utilisées pour le blocage de l'activité de NO dans des conditions pathologiques données. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente sur deux maladies expérimentales : l'encéphalite autoimmune et l'arthrite inflammatoire expérimentales chez la ratte Lewis, ont permis de montrer l'utilité des anticorps de l'invention comme inhibiteurs de l'effet nocif de NO ou de ses dérivés Les anticorps de l'invention sont extrêment utiles sur les plans physiologiques et physiopathologiques tant pour des applications thérapeutiques que diagnostiques. Ils permettent en effet de détecter la synthèse de molécules portant des épi topes NO-cystéine et donc d'élucider de nouveaux mécanismes et de traiter des affections faisant intervenir le monoxyde d'azote, ses dérivés et conjugués, notamment dans les situations où l'on est confronté à une hyperproduction de NO, tels que les infections, les chocs, les inflammations aigües ou chroniques (systémiques ou localisées) , les transplantations, les maladies dégénératives, les diabètes, les maladies auto-immunes, les cancers, etc... Aussi, l'invention concerne un procédé de détection in vitro de protéines nitrosylées dans un échantillon biologique, comme un fluide ou un tissu, comprenant au moins les étapes suivantes - la mise en contact de cet échantillon avec au moins un anticorps de l'invention ou un ensemble de ces anticorps, éventuellement marqués, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques; - la détection d'un complexe immunologique antigène-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques. L'invention concerne aussi un kit pour la détection in vitro de protéines nitrosylées dans un échantillon biologique, notamment pour le diagnostic de pathologie impliquant le NO, ses dérivés et conjugués. Ce kit comprend - au moins un anticorps de l'invention ou un ensemble de ces anticorps éventuellement marqués; - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique entre ledit anticorps et les protéines nitrosylées éventuellement présentes dans un échantillon biologique; - éventuellement un ou plusieurs réactifs de détection éventuellement marqués aptes à réagir avec les complexes immunologiques éventuellement formés; - éventuellement un ou plusieurs réactifs biologiques de référence et de contrôle. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent concernant - la caractérisation et les fonctions de NO; - la préparation d'anticorps polyclonaux dirigés contre des conjugués nitrosylés; - la détection et neutralisation de dérivés de ne par les anticorps polyclonaux; - la préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des conjugués NO-cys-glutaraldehyde couplés à une protéine porteuse; - La détection d'antigènes nitrosylés et le rôle protecteur des anticorps monoclonaux. I - CARACTÉRISATION ET FONCTIONS DU MONOXYDE D'AZOTE. Le monoxyde d'azote ou oxyde nitrique est un gaz diatomique radicalaire. I1 est produit enzymatiquement par plusieurs isoformes de l'enzyme NO-synthase. La synthèse de NO a lieu dans de nombreux types cellulaires. Ceci explique en partie, son implication dans une très large variété de fonctions biologiques (Moncada et al., 1991; Nnowles et Moncada, 1992; Lowenstein et Snyder, 1992; Nathan, 1992; Stamler et al., 1992a) - a) La synthèse de NO La formation de NO se fait par oxydation de la -arginine au niveau de l'azote terminal de la fonction n anidine. La production de NO à partir de l'arginine entrame la formation simultanée de L-citrulline (Marletta et al., 1988). L'oxydation de la L-arginine est contrôlée ar la NOS et nécessite la présence de l'oxygène moléculaire et de cofacteurs tels que la flavine adénine dinucléotide (FAD) , le flavine mononucléotide (FMN), la tétrahydrobioptérine (BH4), le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) (Marletta, 1993; 1994). b) Les différentes formes de NO-svnthase (NOS) Plusieurs types de NOS ont été clonés et classés fzn deux familles distinctes: les NOS dites constitutives (cNOS) et les NOS inductibles (iNOS). Une différence fondamentale entre ces isoformes concerne l'activité NOsynthase in situ (Bredt et al., 199l; Moncada et al., 1991; Hevel et Marletta, 1992; Lamas t al , 1992; Nathan, 1992): Les cNOS sont calcium ralmoduline dépendantes et produisent de faibles cîrjantîtés de NO (picomoles/min/mg protéine) sur des Triodes brèves en réponse à l'activation de récepteurs dans des conditions physiologiques (Stuehr et Griffith, 1992). Ces enzymes sont généralement trouvées dans les cellules endothéliales, les neurones, les astrocytes, les plaquettes, les polynucléaires neutrophiles et les glandes - rrénales (Moncada et al., 1991; Lacaze-Masmonteil, 1992; Nussler et al., 1995). Les iNOS sont calcium / calmoduline indépendantes. Elles sont induites par des cellules immunocompétentes, principalement par l'intermédiaire de cytokines, et de nombreuses autres molécules, en particulier dérivées de microorganismes (Moncada et al., 1991). La stimulation des iNOS entraîne la synthèse de grandes quantités de NO (nanomoles/min/mg protéine) pendant de longues périodes (Nathan et Xie, 1994). Ces décharges de NO sont responsables des phénomènes cytostatiques et cytotoxiques. On trouve ces iNOS dans les macrophages activés, les cellules musculaires, les hépatocytes, les fibroblastes, les astrocytes, polynucléaires neutrophiles et les cellules endothéliales (Stuehr et Griffith, 1992; Marletta, 1993; Anggard, 1994). Chez l'homme, une iNOS a été mise en évidence dans les hépatocytes et les cellules musculaires lisses de l'aorte (Geller et al., 1993), dans les chondrocytes (Palmer et al., 1993), les kératinocytes (Heck et al., 1992), les astrocytes (Lee et al., 1993) et les îlots de Langerhans où l'induction de la NOS par l'interleukine 1 (IL-1) pourrait participer à la destruction de ces cellules (Corbett et al., 1993) . Plus récemment, une Production de NO a été mise en évidence dans les monocytes 'humains par un mécanisme de transduction impliquant le CD23 (Dugas et al., 1995). c) Les inhibiteurs de NOS De nombreuses arginines N-substituées ont été synthétisées comme inhibiteurs spécifiques des NOS parmi lesquelles: la Nco monomethyl-Larginine (NMMA) qui est un ion inhibiteur des trois isoformes et la Nco-nitro rl-arginine qui est plus active sur cNOS (Stuehr et c;riffith, 1992). L'aminoguanidine est plus active sur la NOS (Misko et al., 1993). D'autres inhibiteurs des différentes isoformes des NOS ont été récemment mis en évidence tels que la thiocitrulline (Southan et al., 1995) et le 7-nitro-indazole (Mayer et al., 1994). d) La chimie et la biochimie de NO Le monoxyde d'azote, contrairement à la plupart des radicaux libres, ne se dimérise et ne se dismute pas. Sa réactivité dépend essentiellement de ses capacités à céder son électron célibataire à d'autres radicaux (ion superoxyde, radical tyrosyl, etc.) ou à des espèces susceptibles d'intervenir dans des réactions radicalaires (oxygène moléculaire, thiols, phénols, etc.) ou encore aux métaux de transition avides d'électrons (fer, cuivre...) (Stamler et al., 1992a). NO est soit complexé, soit transformé en ion nitrosonium NO+. Le potentiel d'oxydo-réduction du milieu environnant est déterminant pour le devenir de NO en NO+ et NO-. . Cependant, l'existence de ces deux ions n'a jamais été démontré dans les milieux physiologiques. - Réaction de NO avec l'oxyaène : NO est oxydé en nitrite (N02-) en présence d'oxygène (Farkas et Menzel, 1995). Sa durée de vie in ivo dépend essentiellement de cette réactivité avec L'oxygène. A l'état gazeux, il se forme le dioxyde d'azote radicalaire (NO2 ) , qui se dimérise en N204 et qui se dissout dans l'eau en donnant les acides nitreux et nitrique. A l'état dissous et à pH 7,4, le mélange de NOO et d'oxygène ne génère que NO2-, mais pas de nitrate, avec la stoechiométrie suivante: 4NO + 02 + 2H20 -- > 4HN02 -- > 4H+ + 4N02 - Réaction avec t'anion superoxyde Les dérivés de l'oxygène, l'ion superoxyde (02 ) , le radical hydroxyl (HO) et l'eau oxygénée (H202), sont générés dans des processus métaboliques normaux et pathologiques. Simultanément à NO, l'ion superoxyde o2-, produit par la NADPH oxydase, est sécrété par divers tissus en particulier lors d'inflammations ou de chocs septiques. Le couplage des radicaux NO et O2- donne du peroxynitrite avec une constante de réaction de 6,7 x 109 mol-l L En fait, la constante de réaction de la SOD avec 2 - étant de (2 x 109 mol-l L s-l) NO et la superoxyde dîsmutase (SOD) sont en compétition pour piéger 2 (Koppenol et al., 1992). Le peroxynitrite peut aussi se former par la réaction de NO2- avec H2O2 ou de l'anion nitroxyle (NO-) avec l'oxygène (Fontecave et Pierre, 1994; Butler et al., 1995): NO + O2 - N 2 + H2O2 ======= > O=N-O-O ---- > NO3 NO + 2 - Réaction avec le peroxyde d'hydrogène: H2O2 peut réagir directement avec NO. Sa concentration dans les milieux biologiques est supérieure à celle de 02- (Fontecave et Pierre, 1994) . La réaction ne donne pas ONOO- mais de l'oxygène singulet (102) détectable par chimioluminescence: 2NO + H2O2 ----- > 102 + H20 + N20 Cet oxygène singulet formé est très réactif et peut participer à la destruction cellulaire et à des processus inflammatoires pendant l'activation des macrophages. Réaction avec les thiols: Les thionitrites, telle que la S-nitrosocystéine ou la nitrosoalbumine, de durée de vie supérieure à celle de NO, seraient les composés susceptibles de le transporter depuis la NOS jusqu'à la cible de NO. Les thionitrites peuvent se former par nitrosylation à partir de thiols libres présents dans le cytosol cellulaire et le sang (Girard et Potier, 1993) . La formation de thionitrites à la suite de l'activation de la NOS in vivo a été souvent décrite : elle pourrait jouer un rôle dans la modulation de certaines activités enzymatiques ainsi que dans le transport de NO. De nombreux travaux ont mis en évidence la nitrosylation de groupement SH libre de la cystéine libre ou de la sérum albumine bovine (Cys 34). Récemment, il a été démontré que le NO libéré dans un système biologique réagit en présence de thiols pour former des dérivés S-nitrosoprotéines. En effet, les protéines plasmatiques servent de réservoir de NO produit par les cellules endothéliales (Stamler et al., 1992b). Chez l'homme, le plasma contient environ 7 M S-nitrosothiols dont 96% sont sous la forme de S-nitrosoprotéines, parmi lesquelles on trouve 82% de Snitroso-sérum-albumine (Stamler et al., 1992b) . La concentration plasmatique des thiols est de 0,5 mM et la concentration plasmatique de NO est de 3 nM (Stamler et al. , 1992b) . Le NO libre a une demi-vie de quelques secondes à quelques minutes (Kelm et Schrader, 1990). Dans le plasma, sous la forme SNO-Cys ou S-NO-protéine, il a une demi-vie plus élevée, respectivement 10 et 40 min (Ignarro et al., 1981; Ignarro, 1989; Stamler et ail., 1992c) Dans un tampon phosphate à pH 7,4 à 25C, NO-SAB a ne demi-vie d'environ 24 heures (Stamler et al., 1981, 1992c,d) qui passe à 12 heures à 37C (Stamler et al., 1992c). Dans ces mêmes conditions, NO et S-nitrosocystéine ont respectivement une demi-vie de 0,1-1 s (Kelm et Schrader, 1990) et 15-30 s (Ignarro et al., 1981). In vitro, le traitement des thiols en milieu acide avec un agent nitrosant tel que NaNO2, donne la réaction suivante (Fontecave et Pierre, 1994): NaNO2, RSH ------- > R1SNO (nitrosothiol) Nc Le nitrosothiol formé peut transférer NO à un second thiol ou un autre nucléophile par un mécanisme de transnitrosylation (Butler et al., 1995): R1SNO + R2S- ------- > R1S- + R2SNO - Réaction avec la sérum albumine: A pH 7, NO ne réagit pas directement avec les thiols pour donner les nitrosothiols mais la formation de ces derniers est observée en milieu oxygéné. Des données récentes montrent que pour des thiols de faible poids moléculaire (N-acétyl-Cys, glutathion,..), l'agent nitrosant essentiel est le N203 (Kharitovov et al., 1995) selon les réactions suivantes: 2NO + 2 ------- > 2N02 NO2 + NO ------- > N203 N203 + H2O ----- > 2H+ + 2NO2 N203 + RSH ----- > H+ + NO2 + RSNO En revanche, dans le cas des deux protéines sérum albumine humaine et bovine la situation est différente car la vitesse de la réaction est 10 fois moindre que celle des thiols de faible poids moléculaire (3-1,5 x 105 M-1 s-l, contre 0,3-0,06 x 105 M-l sl) . Leur nitrosylation par le N203 n'est donc pas significative. Keaney et al., (1993) suggéraient la possibilité de la nitrosylation de la SAH par sa réaction avec le NO + qui pourrait être formé à la suite de la réaction de NO avec les Fe2+ des hémoprotéines telle que l'hémoglobine (Kharitonov et al., 1995): Hb+ + NO > Hb + NO+ - Réaction avec la tyrosine La tyrosine possédant un groupement aromatique, la nitrosylation se fait par transfert de charges entre NOw et ce groupe aromatique donneur d'un électron Ar-NO+ c======== > Ar + NO (Stamler et ail., 1Ç)-92a) Cette réaction peut avoir lieu au niveau d'une protéine contenant un acide aminé radicalaire au niveau de son site actif. Tel est le cas de la ribonucléotide réductase (Fontecave et Pierre, 1994). Au niveau de la sous-unité R2 de cette enzyme, il y a un radical tyrosyl stable qui est essentiel pour l'activité enzymatique. La réaction révéresible de ce radical avec NO peut expliquer en partie le mécanisme régulateur de ce dernier au niveau de l'enzyme. - Réaction avec les métaux de transition De nombreuses cibles de NO se sont révélées être les métalloprotéines. En effet, NO peut se fixer à tous les métaux de transition. De ce fait, il est utilisé comme inhibiteur des protéines du transport et du métabolisme de l oxygène: hémoglobine, myoglobine, oxydases, oxygénases, etc. L'affinité de NO est généralement beaucoup plus forte pour Fe2+ que pour Fe3+. NO se fixe aussi au Co2+ dans plusieurs de ses états d'oxydation, et à Mn2+ et Cu2+. NO peut agir aussi comme réducteur vis-à-vis de certaines métalloprotéines (Henry et al., 1991; Stamler et al., 1992a; Traylor et Sharma, 1992; Henry et al., 1993). e) Les rôles shvsioloqiques et pathologiques de NO - Rôle de NO dans le système cardiovasculaire Dès 1980, Furchgott et Zawadski ont observé que ta relaxation des artères isolées soumises à l'action de l'acétylcholine dépend de l'endothélium (Furchgott et Zawadski, 1980). Ils en ont déduit l'existence d'un facteur fugace appelé "endothelium derived relaxing factor" (EDRF), sécrété par les cellules endothéliales traitées à l'acétylcholine ou à la bradykinine, entraînant l'élongation des cellules musculaires lisses adjacentes. Sa nature chimique, n'a été reconnue qu'en 1987 par Palmer et Moncada (Palmer et al. , 1987, 1988; Ignarro et a1.,1987) Outre l'action EDRF, NO radicalaire possède un effet sur les plaquettes: l'augmentation de GMPc sous son contrôle provoque une diminution de l'agrégation et de l'adhésion plaquettaires (Radomski et al., 1987). Chez l'homme NO est utilisé sur le plan thérapeutique: la molsidomine par exemple constitue un donneur de NO utilisé comme agent vasodilatateur dans le traitement d'un certain nombre d'affections cardiovasculaires. NO est aussi directement utilisé en inhalation sous forme gazeuse à la dose de 10 à 40 p. p. m. dans certains services de réanimation, dans le but de provoquer une vasodilatation de la circulation pulmonaire, et donc d'améliorer les échanges gazeux respiratoires, dans le cadre du traitement de patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire sévère ou de syndrome de détresse respiratoire aigu de l'adulte (ARDS) (Pepke-Zaba et al., 1991; Falke et au. ,1991) Production massive de NO Un excès de production de NO peut avoir des onséquences nocives visà-vis du système cardiovasculaire. Dans le choc septique par exemple, il y a sécrétion missive de NO non seulement par les cellules endothéliales mais aussi par les mastocytes, les fibres musculaires visses, les leucocytes et les cellules rénales. Cette libération importante de NO est due à l'induction de la iNOS (Anggard, 1994) L'excès de NO synthétisé est responsable de l'hypotension, de l'hyporéactivité vasculaire et de la dépression myocardique (Lancaster, L992) dans le choc septique expérimental à endotoxine, ou (ytokines (Kilbourn et al., 1990; Reed et al. 1990; Thiemermann et Vane,1990; Gray et al., 1991; Vallance et Moncada, 1993) et peut provoquer une destruction tissulaire (Palmer et al., 1992). Chez l'homme, il a été démontré que I utilisation de NMMA chez des patients présentant un choc peptique provoque une augmentation dose dépendante de la pression artérielle (Petros et al., 1994). Ces résultats indiquent la contribution de NO dans des changements au niveau cardiovasculaire et suggèrent un rôle éventuel des inhibiteurs de la NOS dans la thérapie du choc septique. Production diminuée de NO Un défaut de production de NO pourrait être à 1 origine de certaines élévations tensionnelles. Ainsi, chez le rat génétiquement hypertendu, sensible au sel (rats Dahl), l'administration de L-arginine abaisse la pression artérielle (Chen et Sanders, 1991) . Cette diminution de la pression artérielle peut être la conséquence de la stimulation de la production de NO. Dans les modèles expérimentaux d'athérosclérose, il a été démontré une réduction de la libération de NO par l'endothélium vasculaire chez les lapins (Coene et ail., 1985). Il est possible que la destruction de t'endothélium, notamment par l'athérosclérose, entraîne llne incapacité à synthétiser correctement du NO, avec pour conséquence une diminution de la vasorelaxation et, peut entre, un effet permissif sur la prolifération cellulaire. Ainsi, l'hypertension ou d'autres troubles de la pression sanguine pourrait provenir d'une production anormale de NO. I1 s'avère maintenant que la réponse zasodilatatrice dépendante de l'endothélium est diminuée dans les modèles animaux d'hypertension, ainsi qu'en cas d'athérosclérose et de maladie coronarienne chez l'homme. Rôle de NO dans le système nerveux Produit sous l'influence de la stimulation des récepteurs de type NMDA présynaptiques par le glutamate, et agissant par l'intermédiaire de l'augmentation du taux intraneuronal postsynaptique de GMPc (Green et al., 1991), NO exerce, aussi bien chez le murin que chez l'homme, une action de signal dans le système nerveux, non seulement central (Bredt et Snyder, 1989), mais aussi périphérique. En neurophysiologie NO est maintenant considéré comme un messager biologique (Garthwaite, 1991) ou un messager rétrograde (Barinaga, 1991; Feldman et al., 1993) . I1 pourrait avoir un rôle dans la potentialisation a long terme (PLT) dans l'hippocampe. La PLT est un phénomène qui correspond à une augmentation particulière d l'efficacité de la transmission synaptique favorisant ainsi la mémorisation. Ceci indique une implication de la production de NO dans certaines formes d'apprentissages dependant de l'hippocampe (Bredt et Snyder, 1990; Bredt et al., 1991; Zhuo et al., 1993). Il constitue un neurotransmetteur non cholinergique, non adrénergique, et médiateur de la relaxation du tube digestif (Desai et al., 1991); et participe aussi bien au contrôle neuronal du tonus vasculaire cérébral (Beckman, 1991), ou de l'érection (Rajfer et al. , 1992), qu'à celui de la sécrétion d'insuline par les cellules ss des îlots de Langerhans (Schmidt et al., 1992). Par ailleurs, NO est impliqué dans des processus de destruction du cerveau, après des chocs aigus, tels que l'ischémie-hypoxie (Moncada et al., 1991; Snyder et Bredt, 1992; Choi, 1993). Le NO formé au cours de l'ischémie serait neurotoxique par plusieurs mécanismes. Le NO réagit avec les ions superoxydes pour former des peroxynitrites qui initient la peroxydation lipidique (Beckman, 1990). Le NO est capable de bloquer la respiration mitochondriale (Drapier et al. , 1988) et d'inhiber la synthèse d'ADN (Kwon et al., 1993) . En plus de ces effets cytotoxiques directs, NO exercerait un effet en favorisant la libération de glutamate survenant au cours de l'ischémis (Buisson et al., 1993) ce qui déclenche une entrée d'ions calcium qui se lient à la calmoduline, conduisant à l activation de la NOS. Le NO produit diffuse à travers les membranes cellulaires et parvient aux cellules cibles où il se lie à l'atome de fer du site actif de la quanylate cyclase soluble. Celle-ci produit alors le GMPc. De plus, NO libéré peut agir au niveau pré-synaptique où il facilite la iibération de glutamate. Cependant, il a été démontré in vitro que l'addition directe de NO ou de molécules libérant NO sur des cultures de neurones, bloque l'activation des récepteurs NMDA (Manzoni et al., 1992). Ces observations ont conduit les auteurs à suggérer que le NO endogène synthétisé par les neurones exerce une activité de r-étro-inhibition vis-à-vis des récepteurs NMDA. Ce rétro-contrôle s'exercerait en diminuant la fréquence d'ouverture des canaux associés aux récepteurs et par conséquent en réduisant l'influx calcique. Cet effet serait dû à un blocage par le NO du site modulateur du récepteur NMDA (Lipton et al., 1993). - Rôle de NO dans le système immunitaire: Les premières études du NO ont surtout montré sa toxicité. On pensait autrefois que les nitrates excrétés par l'homme étaient uniquement d'origine alimentaire. Or t'équipe de Tannenbaum observa en 1981 que des individus et des rats qui consommaient peu de nitrates alimentaires excrétaient néanmoins de grandes quantités. L'alimentation n'était donc pas la seule source de nltrates. En outre, un sujet atteint de diarrhée infectieuse excrétait beaucoup de nitrates urinaires: la Formation de ces nitrates semblait liée au processus inflammatoire. Plus récemment une équipe a observé que l'injection d'endotoxine bactérienne stimulait l'excrétion de nitrates chez le rat (Green et al., 1981; Snyder et Bredt,1992). En effet, NO intervient dans la défense antitumorale, en particulier dans les mécanismes de cytotoxicité médiés par les macrophages (Stuehr et Marletta, 1985; Hibbs et al., 1987a, b; Drapier et al., 1988; Stuehr et Nathan,1989; Keller et al.,1990). L'activation des macrophages péritonéaux murins, cluse se soit in vivo par des pathogènes à multiplication cellulaire tels que Mycobacterium bovis, ou in vitro par des cytokines en particulier l'interféron-gamma (1'IFN-y), les rend cytotoxiques pour les cellules tumorales cibles, les mécanismes de cytotoxicité mis en jeu ne passant pas par des processus de phagocytose. I1 a été démontré ensuite que ces macrophages activés expriment la iNOS et synthétisent du NO3 (Stuehr et Marletta, 1987a) et du NO2- en réponse à une stimulation par l'IFN-y, seul ou en combinaison avec le lipopolysaccharide (LPS) ou avec le tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) (Stuehr et Marletta l987a,b; Ding et al., 1988). Ainsi, la cytotoxicité des macrophages activés contre des cellules tumorales a été établie (Hibbs et al., 198vu) comme dépendante de la concentration en L-arginine. Ces auteurs montrent aussi que les macrophages activés synthétisent la L-citrulline et le NO2- à partir de l'arginine et que le L-NMMA inhibe la synthèse de ces deux produits ainsi que l'expression de la cytotoxicité (Hibbs et al., 1987b). Le rôle de NO comme médiateur de la cytotoxicité a été initialement démontré (Hibbs et al., 1988), et la voie métabolique de la L-arginine a été considérée comme mécanisme de défense important contre les microorganismes intra- et extracellulaires, parasites, tDactéries, et champignons (Hibbs et al., 1990). NO agit sur ces cibles en particulier en se liant aux centres fer-soufre des protéines (Drapier et dl., 1991; Feldman et al., 1993). On note aussi qu'une perte massive de fer intracellulaire est une cause possible de la lyse des cellules tumorales induite par les macrophages activés. NO semble agir sur le site actif de différentes enzymes intervenant aussi bien dans la réplication de l'ADN (ribonucléotides réductase, RNR) (Lepoivre et al., 1990) que dans le cycle des acides citriques (aconitase) (Drapier et Hibbs, 1986) ou dans la respiration mitochondriale (complexes I et II de la chaîne de transport d'électrons) (Granger et Lehninger, 1982; Drapier et Hibbs, 1988) . Des études par résonance paramagnétique électronique (RPE) ont montré que NO perturbe la configuration spatiale de structures fer-soufre de certaines enzymes, en formant des complexes ter-nitrosyle (NO-Fe-SR) , ce qui aurait pour effet d'inhiber l'activité enzymatique (Drapier et Hibbs, 1988; Lancaster, 1990; Pellat, 1990; Drapier, 1991). Ce phénomène intervient pour des quantités élevées de NO, produit pendant plusieurs heures. On note que la production de NO peut être aussi induite dans les cellules cibles elles-mêmes, par exemple, au moment d'une autodestruction des cellules tumorales, ou autotoxicité de bactérie (Heiss et al., 1994). Dans le mécanisme d'action de l'effet antiinfectieux, il a aussi été démontré que NO pouvait réagir avec l'oxygène et produire différents toxiques tels que le radical hydroxyl (OH) ou le dioxyde d'azote (NO2) (Stamler et al., 1992a). L'ion peroxynitrite, l'un des plus oxydants et des plus cytotoxiques des dérivés de NO, Lst maintenant proposé comme principal médiateur de 'activité cytotoxique de NO. Il interviendrait dans la nitration de résidus tyrosines de certaines protéines cellulaires (Beckman et al., 1994a). On sait également que certains composés S-nitrosylés (S-nitrosocystéine, ,-nitrosoglutathion), et des thionitrites donneurs de NO, peuvent être puissamment microbicides, antiviraux ou anticancéreux (Maul, 1993; Roy et al., 1995). I1 semble que NO ait été récemment identifié chez le rat et la souris comme un des médiateurs de l'immunosuppression due aux macrophages. Une concentration levée en L-arginine intervient dans l'acquisition du caractère suppresseur (Albina, 1989a, b; Hoffman et al., 1990; Mills, 1991). De plus, l'addition de NMMA augmente la prolifération des lymphocytes (Mills, 1991; Nussler et 1995) . Ce rôle immunomodulateur du NO a été confirmé par d'autres équipes, en utilisant l'Hb (Albina et Henry, lDDl; Mills, 1991), ou l'anticorps monoclonal anti-IFNy Dans des co-cultures cellulaires macrophages-cellules spléniques (Albina et al., 1991) afin d'induire la prolifération lymphocytaire. Le NO inhiberait yDréférentiellement la prolifération des lymphocytes Thl, ,t exercerait un rétrocontrôle de sa production. Dans certaines trypanosomoses, où limmunosuppression est très marquée, des macrophages exercent une puissante activité suppressive par des mecanismes faisant intervenir les prostaglandines et NO (,chleifer, et Mansfield, 1993). - NO et HémoDrotéines Le NO se fixe à de nombreuses hémoprotéines (Fe II) in vitro. I1 se fixe aussi parfois à leur forme ferrique (Henry et al., 1991). D'autre part, lorsqu'il est inhalé, NO est un gaz nocif du fait de sa liaison au fer ferreux des hémoprotéines (Boucher et al., 1993; Rossaint et au., 1993). L'exemple le mieux connu est celui de l'hémoglobine. NO est capable de se fixer rapidement à la désoxyhémoglobine (Hb[FeII]) , pour former le complexe [FeII]NO relativement stable (tl/2 = 12min). En effet, l'affinité de NO pour la désoxyhémoglobine est 106 fois supérieure à celle de t'oxygène. L'oxyhémoglobine (Hb[FeII]O2), quand à elle, peut être convertie par NO en méthémoglobine (tl/2 = 20h) et en nitrate (Ducrocq et al., 1994). Par ailleurs, l'hémoglobine pourrait jouer un rôle de transporteur ou d'oxydant de NO (Henry et al., 1991; Traylor et Sharma, 1992; Boucher et al., 1993). En fait, chez l'homme, chaque sous-unité de l'hémoglobine contient un groupement héminique, et les sous-unités ss contiennent des résidus thiols très réactifs (Cys 93), formant la S-nitrosohémoglobine. Cette forme nitrosylée de l'hémoglobine a été récemment identifiée non seulement comme facteur de régulation des activités vasculaire, pulmonaire et systémique, mais aussi comme un élement de transnitrosylation (Jia et al., 1996) D'autres hémoprotéines sont activées par NO, telle que la guanylate cycIase où le recepteur de NO est atome de fer. La fixation de NO déforme le groupement Flème (qui contient l'atome de fer), et active la production du second messager le GMPc à partir du GTP, ce qui induit une vasodilatation et une inhibition de l'agrégation plaquettaire (Ignarro, 1991; Moncada et al., 1991; Schrrtidt, 1992; Snyder et Bredt, 1992). Citons aussi la prostaglandine H synthase (Salvemini et ail., 1993; Stadler et al., 1993), et d'autres qui sont plus ou moins réversiblement inhibées (Rogers et Ignarro, 1992; Assreuy et al., 1993; Rengasamy et Johns, 1993), telles que les cytochromes P-450 (Adams et al., 1992; Ducrocq et al., 1994) et les NOS elles-mêmes (Rogers et Ignarro, 1992; Assreuy et al., 1993; Rengasamy et Johns, 1993). En conclusion, NO se présente sous différentes formes de transport; les mécanismes enzymatiques de synthèse, stockage et de transport sont effectués en fonction de ses rôles d'intermédiaire et d'effecteur (Stamler et al. , 1992a, 1994). - NO et cancérogénèse : Dans différentes situations, NO paraît exercer plusieurs rôles, parfois même antagonistes. Ceci est vrai en ce qui conceme la cancérogénèse (Calmels et Ohshima, 1995). En contraste avec son rôle dans les défenses de l'organisme (bactéricide et cytotoxique) , NO est susceptible d'entraîner des altérations de l'ADN, favorisant ainsi le développement du cancer. Ceci cependant, a le plus souvent été mis en évidence dans des travaux in vitro souvent éloignés des conditions physiologiques. Plusieurs rôles distincts de NO au niveau des différentes étapes de la cancérogénèse ont été observés: (i) la formation de peroxynitrite, produit naturellement cytotoxique, qui après protonation, peut galement se décomposer en OH et NO2 (Beckman et ail., 1390). Ces radicaux seraient en partie responsables de dommages oxydatifs à 1'ADN permettant alors la tr-ansformation néoplastique ultérieure des cellules touchées; (ii) la génotoxicité du NO et la déamination de ADN NO peut induire des mutations dans des lignées cellulaires lymphoblastoïdes humaines (Nguyen et al., L992); (iii) la formation de nitrosamines: le NO après oxydation est susceptible de réagir avec un substrat nitrosable pour former des nitrosamines. Ces demiers sont de puissants cancérigènes chez l'animal et sont également suspectés à l'origine de certains cancer chez l'homme (Loser et al., 1989; Jacob et Belleville, 1991). NO peut également favoriser l'évolution du cancer par le biais d'une immunosuppression (Hoffman et al., 1990; Albina et al., 1991; Mills, 1991). Des études ont montré par exemple que sa présence semble favoriser le processus de transformation néoplasique de fibroblastes murins in vitro (Werner-Felmayer et al., 1993). Cependant, de récents travaux indiquent un effet protecteur plus ou moins controversé de NO vis-à-vis de la cytotoxicité induite par les espèces oxygénées (Wink et al., 1993) et vis-à-vis de la progression de tumeurs de la peau induites sous W chez la souris (Yuin et al., 1993; Calmels et Ohshima, 1995) . Enfin, malgré son rôle dans la cancérogénèse, NO est également un élement effecteur important vis-à-vis des cellules tumorales (Hibbs et al., 1990). De plus, NO peut également médier l'apoptose de différents types cellulaires (Sarih et al., 1993; Me,Bmer et al., 1994; Fehsel et al., 1995). Toutes ces données mettent en évidence les diverses influences de NO. - NO et maladies inflammatoires autoimmunes Il a récemment été découvert que NO est impliqué dans certaines pathologies inflammatoires (Schmidt et Water, 1994; Moilanen et Vapaatalo, 1995). Parmi celles-ci, la sclérose en plaques (SEP) (Sherman et al., 1992) et la polyarthrite rhumatoïde (PR) (Grabowski et al. , 1996) sont les plus étudiées. Les Inventeurs se sont intéressés à ces deux dernières pathologies pour montrer l'effet de NO et de ses dérivés nitrés ou nitrosylés dans leur évolution clinique. Les études sont basées sur des modèles expérimentaux pour la SEP (l'encéphalite autoimmune expérimentale) et pour la PR (l'arthrite inflammatoire expérimentale). Les mécanismes d'action du NO, direct ou par l'intermédiaire de dérivés, sont encore mal connus. Du fait de sa nature, NO peut diffuser à travers les membranes des cellules avoisinant celles où il a été synthétisé. Cette diffusion de NO peut expliquer un effet locale à très courte distance du fait de sa grande réactivité. C'est probablement ce mécanisme qui entraîne l'activation de la guanylate cyclase des cellules musculaires lisses des vaisseaux par le NO synthétisé par les cellules endothéliales. Cependant, une action à distance du NO peut également être envisagée. Cette action a distance peut être liée à l'existance de molécules capables de fixer le NO puis de le relarguer. Parmi les composés susceptibles de jouer ce rôle, les composés -nitrosothiols jouent un rôle participant important. Ainsi des S-nitrosothiols ont été mis en évidence dans les phénomènes de vasodilatation dès 1981 (Ignarro et al.). Plus récemment des nitrosothiols ont été également mis en évidence au niveau des cellules de système immunitaire (Dias-Da-Motta et al., 1996 ; Wagner et al., 1996; Zhao et al., 1996) . Les mécanismes de libération de NO par ces molécules sont mal connus et en particulier les réactions conduisant au passage du NO sur d'autres molécules. De plus, s'agit-il toujours de la forme NO ou les formes NO + peuvent elles être impliquées dans des mécanismes de nitrosylation ? Peut-il également y avoir intervention d'autres radicaux en particulier les dérivés de 1'02 ? Quelque soient les modes d'action du NO localement ou à distance, il peut donc exister des molécules intermédiaires douées des propriétés et de stabilité plus grande que le NO dont la fonction n'est pas encore connue. Les anticorps de l'invention ont permis dans un premier temps d'étudier la stabilité et les propriétés de composés nitrosylés, puis ils ont été utilisés pour masquer des épi topes nitrosylés qui apparaissent dans certains états pathologiques où une surproduction de NO a ete objectivée. Une production élevée de ces dérivés nitrosylés pourrait être responsable, au moins en partie, des troubles observés. II- PRÉPARATION D'ANTICORPS POLYCLONAUX DIRIGÉS CONTRE DES CONJUGUÉS NITROSYLÉS. 1) La réPonse immunitaire. La destruction des agents infectieux est produite par un ensemble d'éléments appartenant au système immunitaire. Cette protection est obtenue grâce à une réponse immunitaire de type humoral et/ou cellulaire dont les acteurs indispensables sont les cellules lymphocytaires et macrophagiques (Oberg et al., 1993). Les lymphocytes B favorisent la réponse humorale via la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement un antigène donné, s'accompagnant dans certains cas de la neutralisation de l'effet nocif de ce dernier. Les lymphocytes T helper (Thl) interviennent dans l'activation des macrophages en sécrétant des cytokines telles que lIFN- et le TNF-(X/ . Les macrophages activés libèrent différentes molécules dites effectrices qui exercent un effet cytostatique ou cytotoxique vis-à-vis des microorganismes intra- ou extracellulaires. Parmi ces molécules, on trouve des radicaux libres et en particulier le NO (Liw, 1991; Ahvazi et al., 1995; Blasi et al. 1995; kJllretic et api., 1995; Lin et al. 1995) qui, en se fixant des cibles moléculaires, génère in vivo des néoantigènes nitrosylés pouvant induire une réponse humorale. Pour reproduire au mieux la structure de ces nenantigènes, les Inventeurs ont synthétisé des conjugués artificiels par couplage de NO à deux acides aminés, la tyrosine et la cystéine. A t'aide de ces conjugués, ils ont induit des anticorps polyclonaux dirigés contre des épi topes NO-Tyr et NO-Cys chez le lapin. 2) L'immunochimie des haptènes. L'immunochimie des petites molécules ou haptènes, est basée sur la reconnaissance spécifique d'un antigène particulier par un anticorps (Ac), et ce de façon hautement sélective (Landsteiner, 1945; Kabat, 1968; Goodman, 1975). Les haptènes tels que les acides aminés (cystéine, tyrosine, tryptophane,...) ont un faible poids moléculaire (75-300 daltons) et ne sont donc pas immunogéniques par eux-mêmes. Le développement d'Ac (;pécifiques repose sur un certain nombre de principes méthodologiques et de concepts. Ainsi - une substance est immunogénique lorsqu'elle possède la capacité de stimuler la production d'Ac; sa raille doit être supérieure à 1000 daltons. - un composé est antigénique lorsqu'il entre en Interaction spécifique avec un site Ac. Pour cela, celui-ci doit discriminer des conjugués structuralement proches, différents par la position d'un groupement chimique sur l'haptène (Landsteiner, 1945; Geffard et al., 1985a); - la liaison antigène-Ac s'établit grâce à des liaisons de différents types: hydrogène, Van Der Walls, ionique, hydrophobe. Pour réaliser cette approche, les Inventeurs ont t dans un premier temps synthétisé des conjugués nitrosylés, puis des conjugués possédant une analogie structurale avec les premiers. L'étude a porté exclusivement sur des conjugués nitrosylés et leurs correspondants non nitrosylés ainsi que des conjugés nitrés. A l'aide de ces outils, il a été produit et caractérisé des Ac polyclonaux anti-haptènes nitrosylés couplés à des protéines porteuses en utilisant la carbodiimide comme agent couplant. 3) Materiel et methodes. a) Synthèse des immunoaènes NO-tyrosine et NO-cystéine couplés à une protéine porteuse par un couplage type "carbodiimide": La synthèse des immunogènes est réalisée dans un premier temps par le couplage de l'haptène L-tyrosine (Tyr) ou L-cystéine-N-acétylée (Cys) à une protéine porteuse telles que la sérum albumine bovine (SAB) ou la sérum albumine humaine (SAH) par la carbodiimide selon le procédé indiqué ci-dessous (Harlow et Lane, 1988). Dans un second temps les conjugués obtenus sont nitrosylés par un donneur de NO. 10 mg de Tyr (Fluka), ou 20 mg de Cys (Sigma), -ont solubilisés dans le tampon MES (2 [N-Morpholino] thanesulfonic acîd, Sigma) (0,2 M) pH 5,4, puis un microlitre d'isotope radioactif [3H-Tyr] (NEN, activité spécifique: 31,0 ci/mmole) est ajouté. Ensuite, 20 mg de SAB ou SAH dissous dans le même tampon MES sont alors ajoutés pour conjuguer l'haptène par une liaison amide. L'activation du groupement carboxylique de la Tyr ou de la ys est initiée par l'addition de la carbodiimide [l-ethyl-3 (3-diméthylamino propyl) carbodiimide, Sigma]. Les molécules de Tyr et de Cys non liées sont éliminées par dialyse contre l'eau distillée pendant 24 heures (h) à 4 C . Le marqueur radioactif permet de déterminer la concentration enhaptène conjugué comme suit: Concentration (M) en haptène couplé = X mg hap x (;PM après / CPM avant x Vol av x PM hap où X mg est la quantité d'haptène utilisée pour raire le couplage; CPM av est la radioactivité avant dialyse; CPM après est la radioactivité après dialyse; Vol clV est le volume avant dialyse; PM hap est le poids moléculaire de l'haptène. Pour calculer la concentration en protéine selon la loi de Beer-Lambert DO = c 1 (dans ce travail longueur de la cuve t = 1cm) , l'absorbance à des longueurs d'onde 280 nm et 300 nm a été utilisée (Geffard et al. , 1985a): Concentration (M) en protéine = DO 280 nm - DO 300 nm / protéine où est le coefficient d'extinction molaire de la protéine à 280 nm; il est de 34 500 pour la SAB et la SAH; Pour les haptènes qui absorbent à 280 nm (Tyrosine, Tryptophane), les Inventeurs ont utilisé, pour déterminer la concentration de la protéine la formule suivante D280 = Chap x hap + Cprotéine x protéine Le rapport de couplage est le nombre de moles d'haptène couplé par une mole de protéine: Rapport (R) = concentration en haptène / concentration en protéine Le poids en conjugué est déterminé en utilisant la relation suivante Poids du conjugué = [(R x PMhap) + PM prot] x conc protéine où la concentration (conc) est exprimée en M. Le poids est en mg/ml. - Nitrosylation des conjugués néosvnthétisés La nitrosylation se fait en utilisant un donneur chimique de NO, le nitrite de sodium (NaNO2) en milieu acide (Stamler et al., 1992d). Ainsi, la formation de la liaison NO-haptène a été évaluée par spectrophotométrie en mesurant les DO entre 320 et 500 nm. De plus, la ',-nitrosylation a été prouvée par la méthode de (1958) en utilisant le chlorure de mercure HgCl2. En effet, le HgCl2 en présence du composé S-nitrosylé entraîne une libération undiate de l'azote lié au soufre du résidu nitrosothiol. Cet hydrolyse rapide peut être expliquer par l'affinité des tons Hg2+ pour le soufre. Le tableau 1 ci-dessous montre la structure des deux haptènes nitrosylés liés à la protéine porteuse SAB. Tableau 1 Conjugués Structures moléculaires Tyrosine -SAB HO -CH2-CH-CO-NH-BSA NH2 NO-Tyrosine-SAB HO- CH2-CH-CO-NH-BSA NO NH2 Cystéine-acétylée-SAB SH-CH2-CH-CO-NH-BSA NH-CO -CH3 NO-Cystéine-acétylée-SAB NO- S-CH2 -CH-C O-NH- BSA NH- CO-CH3 b) Synthèse d'autres conjugués nitrosylés et nitrés L'utilisation de différents agents couplants tels que la carbodiimide, le glutaralgéhyde (G) ou l'anhydride succinique (AS), permet d'obtenir des épitopes e coIlformation distincte. - Type "carbodiimide" Synthèse de NO-Tryptophane-SAB La carbodiimide, le tryptophane (Tryp, Sigma) et par l'addition de 200 Rl d'une solution de NaBH4 (10 mM); quand le mélange est devenu translucide, chaque solution des différents conjugués est mise à dialyser contre de l'eau distillée 24 h à 40C (Atassi, 1984). - Type "anhvdride succinique" Synthèses de NO-Tyr-AS-SAB et NO-Cys-AS-SAB 20 mg de Tyr ou de Cys (non acétylée) sont repris dans 200 de Diméthyl-sulfoxide (DMSO, Merck) et 800 ssl d'eau distillée. La succinylation s'effectue en additionnant 17 mg d'anhydride succinique (AS) (Sigma), puis une quantité de NaOH 1N est ajoutée pour neutraliser le mélange. I1 est ensuite mis à lyophyliser. 5 mg d'haptène succinylé sont dissous dans 1 ml de diméthylformamide (DMF, Merck) pure anhydre, contenant 50 pl du triéthyl-amine (TEA, Merck) pure, anhydre. On active les groupements COOH libres de l'haptène succinylé en ajoutant 200 l d'Ethyl chloroformate (ECF, Prolabo) prédilué au 1/6. Puis, la solution contenant 10 mg de SAB est ajoutée. Le mélange réactionnel est dialysé contre de l'eau distillée pendant 24 h à 4"C sous agitation. La méthode de nitrosylation des deux types de couplage (G et AS) est identique à celle décrite plus haut pour le couplage de type carbodiimide. Synthèse de NO2-tyrosine-SAB : La synthèse de ce conjugué nécessite 20 mg de l'haptène NO2-Tyr (Sigma) et 20 mg de SAB. Le couplage est effectué en utilisant la carbodiimide selon le même protocole décrit ci-dessus. Synthèse de conjugués NO-protéines : Cette forme de la SAB nitrosylée ou S-nitroso-SAB a été préparée à partir de la SAB et de nitrite de sodium. Une même quantité de protéine et de NaNO2 est pesée pour faire le couplage NOSAB selon la methode de Stamler (1992d). c) Obtention et caractérisation d'Ac polyclonaux anti-NO conjugué - Immunisation des lapins : A partir des conjugués NO-Tyr et NO-Cys, les Inventeurs ont immunisé par voie sous cutanée (Vaitukaitis et al., 1971) des lapins: le lapin "T" par les conjugués NO-Tyr-protéine (SAB ou SAH), et le lapin "C" par les conjugués NO-Cys-protéine. L'immunisation a été faite en alternant ces deux protéines porteuses (Geffard et al., 1984a, b; 1985a) . L'immunisation a été effectuée en injectant une émulsion contenant 200 g du conjugué, d'adjuvant complet de Freund (ACF, DIFCO) et du tampon phosphate salin (TPS) . Le prélèvement des antisérums a été fait entre 12-21 jours après chaque injection. - Purification des immunoalobulines: Une réponse immune a été induite. Pour enrichir les sérums en immunoglobulines (Ig) spécifiquement dirigées contre les haptènes couplés, les méthodes de purification suivantes ont été utilisées: Adsorption des sérums Dolyclonaux sur les protéines Porteuses Les sérums polyclonaux ont été adsorbés sur les conjugués non nitrosylés correspondants: Tyr-SAB/SAH pour le lapin "T" et Cys-SAB/SAH pour le lapin "C". (Geffard et al. , t984a; Geffard et al., 1985b; Campistron et ail., 1986). LWadsorption a été faite dans les proportions de 5 mg de conjugué par ml de sérum natif. Le mélange a été incubé 16 h à 4"C sous agitation et les immunoprécipités ont été éliminés par centrifugation 15 minutes à 10 OOOg. Le surnageant est enrichi en Ig spécifiques, alors que le culot contient les complexes immuns protéines porteuses-Ig de lapin. Purification des Ia par précisitation au sulfate d'ammonium A un volume de sérum polyclonal de lapin, est ajouté un volume égal d'une solution saturée de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4. Le mélange est incubé 1 h à 40C, puis centrifugé 15 minutes à 10 OOOg. Le culot (contenant les Ig précipitées) est repris dans un volume minimum de tampon TPS puis dialysé pendant 3 jours contre du tampon TPS (Na2HPO4, 0,01 M, NaCt 0,15 M). Purification des IQ sar chromatoqraphie d'exclusion Après précipitation au sulfate d'ammonium, les Ig ont été séparées selon leur poids moléculaire (PM) par la technique de chromatographie d'exclusion sur colonne G 200 (Séphadex) (Mons et Geffard, 1987). La détermination de la concentration en Ig a été déduite de l'analyse spectrophotométrique d'un aliquot dilué, elle a ensuite été estimée de la manière suivante: 1,4 unité de DO à 280 nm correspond à une quantité de 1 mg/ml d'Ig. Les Ig spécifiques sont principalement des Ig G. les surnageants purifiés selon une de ces méthodes ont été utilisés pour étudier le titre, l'avidité et la spécificité en utilisant le test ELISA. d) Test immunoenzymatique (méthode ELISA) Quatre grandes étapes sont nécessaires pour la réalisation du test immunoenzymatique (Engvall et al., 1972): 1ère étape Revêtement des plaques de microtitration. C'est l'étape d'adsorption des conjugués: NO-Tyr-SAB et Tyr SAB pour le lapin "T" ou NO-Cys-SAB et Cys-SAB pour le lapin "C", dans des puits de plaques de microtitration (Maxisorp certifiées, NUNC). Cette étape de revêtement a été faite également avec les conjugués couplés "G", "AS" et pour la SAB et NO-SAB. 2ème étase : La saturation. Il est nécessaire de "saturer" les puits, pour éviter l'accrochage non spécifique. Cette étape se fait avec le tampon suivant: TPS-tween-glycérol-SAB. Tween 0,05 % pH = 7,2, glycérol 10%. La concentration en SAB a été optimisée à 5 g/l. 3ème étape : Formation des complexes primaires. Elle correspond à la fixation des Ac primaires potentiellement contenus dans le sérum à tester à une dilution optimale de 1/20 000 (pour le lapin "T" et "C") sur les conjugués déposés au fond des puits. 4ème étape : Formation des complexes secondaires. Elle correspond à l'addition des Ac secondaires de chèvre anti-Ig de lapin (Diagnostic Pasteur) marqués à la péroxydase dilués au 1/8000 dans le tampon TPS-Tween-SAB. 5ème étape : Visualisation des complexes secondaires. Elle se fait par l'utilisation du substrat spécifique de la péroxydase (H202, Prolabo), en présence d'un chromogène, l'orthophénylène diamine (OPD, Sigma). La visualisation est réalisée par l'oxydation de l'OPD qui passe de l'état réduit incolore à l'état oxydé jaune. La réaction est ensuite stoppée par addition d'une solution d'acide sulfurique (H2SO4, 4N) dans chaque puits. Les DO sont lues à 492 nm à l'aide d'un spectrophotomètre multiscan informatisé (EL 312e, Bio-Tek Instruments). La valeur expérimentale obtenue est celle mesurée sur les puits ayant le conjugué (haptène-nitrosylé-protéine) ou protéine nitrosylée soustraite de celle lue sur les puits contrôles contenant le conjugué non nitrosylé ou de la SAB. - Caractérisation immunochimiçue des sites Ac Elle est basée sur deux propriétés des Ac: l'avidité et la spécificité: L'avidité de chaque antisérum a été appréciée comme suit Des dilutions de conjugués NO-Tyr-SAB pour l'antisérum anti NO-Tyr ou NO-Cys-SAB pour l'antisérum anti NO-Cys, allant de 2 x 10-5 M à 2x10-12 M dans.le TPS-Tween-SAB glycérol ont été préparées. Ces compétitions sont faites par incubation de l'Antisérum ("T" ou "C") en présence de l'immunogène pendant une nuit à 40C. Le test se déroule ensuite comme décrit plus haut en utilisant ces dilutions comme des Ac primaires. Pour la spécificité: les composés utilisés pour les expériences de compétition sont les suivants pour les deux types d'Ac: NO-Tyr-SAB; Tyr-SAB; NO-Cys-SAB; Cys-SAB; NO-Cys(non acétylée)-SAB; Cys(non acétylée)-SAB; NO-Tyr-G-SAB; Tyr-G-SAB; NO-Cys-G-SAB; Cys-G-SAB; NO-Tyr-SA-SAB; Tyr-SASAB; NO-Cys-SA-SAB; Cys-SA-SAB; NO2-Tyr-SAB; NO-Tryp-SAB; Tryp-SAB; NO-Tryp-G-SAB; Tryp-G-SAB; NO SAB. A l'issue des compétitions, des courbes de déplacement pour les différents composés testés ont été erabliées. 4) Résultats. a) Analyse des conjugués nitrosylés - Analyse spectrophotométrique des conjugués: lOne étude spectrophotométrique a été utilisée pour suivre les différentes étapes de la synthèse des immunogènes. Celle-ci est faite entre les longueurs d'onde 240 et 500 nm. Par comparaison des spectres obtenus avant et après nitrosylation, les Inventeurs ont déterminé la zone d'absorbance de NO lié. Comme montré respectivement sur les courbe des figures 1 et 2, la zone d'absorbance de NO-Tyr-SAB a été observée entre 320 et 440 nm (figure 1) et celle de NO-Cys-SAB a été détectée entre 320 et 400 nm (ligure 2). Une absence d'absorbance entre les longueurs d'onde 320 et 500 nm a été remarquée dans les spectres des conjugués: Tyr-SAB et le Cys-SAB; La bande d'absorbance du même conjugué NO-Cys SAB n'a pas été trouvée après le traitement de ce dernier avec une solution de lmM de HgCl2. Ceci montre que ta liaison covalente "S-NO" a été abolie. b) Analyse immunochimique des sites Ac. - Evaluation du titre en Ac dirigés contre les éitopes NO-Tyr et NO-Cvs Pour le lapin "T" immunisé avec la NO-Tyr conjuguée, le titre en Ac spécifiques a évolué après chaque immunisation et la réponse optimale a été obtenue après la troisième immunisation. Ainsi, comme montré par la courbe de la figure 3, deux types de réponses sont visualisées pour les lapins "T". La première correspond à une réponse dirigée contre le conjugué NO-Tyr-SAB qui est restée au cours de l'immunisation plus importante que la deuxième qui est dirigée contre le conjugué Tyr-SAB. Sur la figure 3, la flèche blanche indique le prélèvement avant immunisation et les flèches noires indiquent les jours des prélévements après chaque immunisation. Pour le lapin "C" immunisé par la NO-Cys conjuguée, aucune réponse spécifique, n'a été obtenue avant la 5ème immunisation. Avant cette immunisation, les Inventeurs ont observé une augmentation plus importante de ta réponse anti-Cys-SAB par rapport à t'anti-NO-Cys-SAB. En revanche suite à la 5ème immunisation les Inventeurs ont détecté une chute de la réponse non spécifique. La figure 4 montre l'évolution des deux types de réponse chez ce lapin celle correspondant à une réponse sur le conjugué NO-Cys-SAB qui est une réponse globale comprenant tes anticorps dirigés contre la protéine porteuse et une deuxième dirigée contre le conjugué Cys-SAB. Sur la figure 4, , la flèche blanche indique le prélèvement avant immunisation et les flèches noires indiquent les jours des prélèvements après chaque immunisation. Le prélèvement du lapin "T" après la 3ème immunisation a servi pour la caractérisation immunochimique des Ac spécifiquement dirigés contre 'épitope nitrosylé. De même, les Inventeurs ont utilisé je prélèvement après la 5ème immunisation pour le lapin "C" - Détermination de l'avidité et de la sPécificité des Ac développés L'avidité des Ac anti-NO-Tyr conjuguée et anti-NO-Cys conjuguée a été faite par des tests de compétition. Une inhibition de la liaison des anti-sérums "T" et "C" a été obtenue en incubant chacun de ces deux Ac avec le conjugué nitrosylé qui a servi d'immunogène. La diminution de la DO (B) indique la présence de compétition entre t'haptène conjugué qui est adsorbé sur la plaque de microtitration et t'haptène préincubé avec t'antisérum correspondant. Bo est la DO correspondant ci la réponse obtenue avec 1'antisérum en l'absence du compétiteur. Une dilution de l'antisérum (1/20 000) tonnant une DO d'environ 1,0 à 492 nm a été choisie pour l'ajustement de la valeur de Bo; le rapport B/Bo a été utilisé pour tracer les courbes de compétition de la figure 5 obtenues avec les compétiteurs. - Pour le lapin "T", l'avidité déterminée au demi-déplacement est de 1,1 x 10-8 M (figure 1, courbe 1) et pour le lapin "C", l'avidité est de 4,5x10-8 M. La spécificité de chaque antisérum a été également évaluée par des expériences de compétition entre le conjugué NO-Tyr-SAB (pour l'antisérum "T"), ou NO-Cys-SAB (pour t'antisérum "C") et les analogues structuraux conjugués. Les courbes de déplacement ont été obtenues à partir des résultats des tests de compétitions avec les haptènes conjugués et qui n'ont pas été utilisés dan ns l n s immunisation. En utilisant le rapport B/Bo pour chacun des compétiteurs, les Inventeurs ont pu déterminer ?os spécificités correspondantes pour le lapin "T" le conjugué le mieux reconnu St l'immunogène qui a donné une avidité de 1,1 x 10-8 M. es autres conjugués reconnus sont les suivants: le N()2 Tyr-SAB (ICso = 1,4 x 10-7 M); NO-Tyr-SA-SAB (ICso = 5 x 10-5 et le NO-Tryp-G-SAB (ICso = 3 x 10-6 M). La courbe 2 de la figure 5 montre aussi l'absence de la reconnaissance du Tyr-SAB par cet antisérum. - Pour le lapin "C" l'immunogène NO-Cys-SAB et le conjugué NO-Cys(non acétylée)-SAB ont été reconnus avec une avidité de 4,5 x 10-8 M et une spécificité de ~ 10-6 M. Tous les autres conjugués, nitrosylés (par exemple la NO-SAB) ou non, ne sont pas reconnus par l'Ac "T" ou l'Ac "C". (IC50 est la concentration molaire du compétiteur donnant 50 % d 'inhibition). Il convient aussi de remarquer que, des tests ELISA indirects ont montré une descrimination entre la NO-SAB et la SAB par les Ac polyclonaux "T" et "C". Les DO obtenues avec ces antisérums sont respectivement de l'ordre de 0,34 + 0,062 et 0,27 + 0,05. En revanche, en phase liquide, la NO-SAB n'a pas été reconnue ce qui pourrait etre expliqué par la modification confermatiennette de cette molécules en phase solide (test indirect) et phase liquide (test de compétition). 5) Discussion. En se basant sur les travaux de Landsteiner, (1945); Goodman, (1975); Geffard et al., (1985b); et Mons e t Geffard, (1987) pour l'induction des antisérums contre les petites molécules, le développement d'Ac anti-NO (conjugué a été réalisé. La réactivité de NO avec les .Jroupements thiols pourrait expliquer, en partie, son ntervention dans différents processus biologiques (Girard tt Potier, 1993). En fait, il a été postulé que NO est rahilisé sous forme de S-nitrosothiol qui peut conserver s réactivité biologique. La présente étude immunologique t- est basée sur I > l'hypothèse de la stabilité des dérivés-NO. Les Inventeurs ont utilisé différents conjugués nitrosylés }résumées transporteurs de NO (résidus aryls nitrosylés et -nitroso-Cys) . La caractérisation immunochimique des anti-NO-Tyr et anti-NO-Cys développés montre un pouvoir de discrimination différent de ces Ac pour les immunogènes correspondants. De plus, le titre spécifique optimal anti-Tyr nitrosylée a été observé après la 3ème immunisation, au bout de 1-2 mois (figure 3), alors que t'anti-Cys nitrosylée, ne présente pas d'évolution du titre avant une période de 2-3 mois (figure 4), et donne un titre optimal après la 5ème immunisation. En ce qui concerne la spécificité de ces Ac préincubés avec d'autres conjugués présentant une analogie structurale avec le composé utilisé comme immunogène, on note également une différence dans les réponses obtenues avec ces deux Ac. Ainsi, 1'Ac "T" reconnait deux conjugués qui n'ont pas été utilisés dans l'immunisation, le N02-Tyr-SAB et le NO-Tryp-SAB, ce qui n'est pas le cas de t'Ac "C". Aucun des autres conjugués non nitrosylés n'a ete reconnu par ces deux Ac. Les réponses différentes observées avec ces deux types d'Ac pourraient également etre expliquées par les différences de structures Inoléculaires des immunogènes, leur stabilité dans le milieu biologique, leur métabolisme, ou bien par les modifications favorisées par les cellules présentatrices de l'antigène. Tous ces facteurs peuvent jouer un rôle fondamental dans la stimulation du système immunitaire et dans l'avidité de l'Ac induit. Enfin, la reconnaissance de la NO-SAB synthétisée chimiquement par les Anticorps polyclonaux, ()nt amené les Inventeurs à utiliser cette forme de transport de NO dans des multiples applications in vitre, on utilisant les macrophages activés comme donneurs biologiques de NO. III - DÉTECTION ET NEUTRALISATION DE DÉRIVÉS DE PcO PAR LES ANTICORPS POLYCLONAUX. Les cellules macrophagiques jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire. En effet, dès l'apparition d'une infection, elles peuvent intervenir dans la destruction du microorganisme, en le phagocytant. De plus, les macrophages activés lors d'une réponse immunitaire spécifique exercent un effet microbicide cytotoxique sur des microorganismes intracellulaires (Ruskin et Remington, 1968). Une des voies métaboliques de t 'arginine est essentielle dans l'activation des macrophages et dans leur effet cytotoxique sur des cellules tumorales (Hibbs et al., 1987a) et cytostatique sur des espèces fongiques telle que Crypteseccus neoformans (Granger et al., 1988). Cette voie métabolique conduit à la synthèse de la L-citrulline et de NO à partir de l'arginine (Hibbs et al., 1987b; Hibbs et al., 1988), grâce à la iNOS. L'analogue structural de l'arginine, NMMA a ensuite été caractérisé comme inhibiteur compétitif de cette synthèse à partir des macrophages activés (Hibbs et al., 1987a, b; Drapier et Hibbs 1988; Hibbs et al., 1988). Ce phénomène de cytotoxicité a été étudié essentiellement in vitro dans les macrophages murins et il existe maintenant un large consensus pour affirmer que la voie de biosynthèse L-arginine - > NO en est la base (Drapier, 1993). Le rôle cytotoxique de NO a également été interprété comme résultat de la formation de complexes fer-nitrosyls au niveau des enzymes du métabolisme oxydatif des cellules cibles (Stuehr et Nathan 1989; Stuehr et al., 1989). En conclusion, une infection induit une stimulation des lymphocytes T via la présentation de l'antigène. Les cellules T sécrètent l'IFN-" en réponse à leur activation et une stimulation successive se maintient donc avec la présence persistante de l'antigène ou d'une réinfection. L'IFN-7 active alors les macrophages qui produisent d'autres cytokines comme le TNF-a et l'IL-t qui, en synergie avec L'IFN-7 peuvent stimuler les macrophages. L'activation macrophagique permet l'élimination de certaines cellules tumorales et de nombreux agents pathogènes. Parmi les différents mécanismes élaborés par les macrophages, un des plus efficaces est la synthèse de NO. La destruction des leishmanies et des schistosomes peut être complètement inhibée par le NMMA (James et Glaven, 1989; Green et al., 1990; Liew et al., 1990). Ceci semble indiquer que dans ces cas NO est nécessaire, et pourrait même être suffisant, pour expliquer le rôle microbicide des macrophages. NO est donc un élément indispensable de la défense de l'organisme. Les travaux rapportés ci-après vise à mettre en évidence la forme sous laquelle NO est transporté pour agir au niveau de ses cibles. Afin de se rapprocher des conditions physiologiques, les Inventeurs ont utilisé une source biologique de NO (macrophages activés par le BCG), la SAB comme transporteur de NO et des trypanosomes extracellulaires. L'objectif est de détecter des épitopes nitrosylés formés in vitro possédant un rôle cytotoxique et d'obtenir leur blocage en utilisant nos anticorps polyclonaux anti-NO-Tyr et anti-NO-Cys conjuguées. 1) Matériel et méthodes. a) Prélèvement et culture des macrophaaes : Des macrophages péritonéaux provenant de souris Swiss préalablement infectées avec le BCG (Institut Pasteur) ou des macrophages normaux, ont été mis en culture à 1,5 x 106 cellules/ml/boîte de Pétri, pendant 8 h à 370C dans une étuve contenant 5% C02. Le milieu de culture utilisé est le HBSS (Hank's Balanced Salt (;olution, GIBCO). La culture a été effectuée en présence ce non de NMMA à 0,5 mM. b) Détection de la formation des coniuqués-NO et Xe Dar Par le test ELISA : - Tests de compétition entre le conjugué nitrosylé formé dans le milieu de culture et les conjugués NOTyr-SAB ou NO-Cys-SAB néosynthétisés Les surnageants provenant des milieux de culture de macrophages activés contenant les conjugués nitrosylés (NO-Tyr-SAB ou NO-Cys-SAB), ont été incubés en présence de t'antisérum "T" ou "C" ulitisés à 1/20 000. Ces conjugués nitrosylés ont été formés à partir de NO produit par les macrophages et les conjugués Tyr-SAB ou Cys-SAB ajoutés dans le milieu. Après incubation ces surnageants ont ensuite servi comme Ac primaires pour le test ELISA. Ce dernier a été réalisé sur des plaques de microtitration adsorbées par les conjugués NO-Tyr-SAB ou NO-Cys-SAB. Le reste du test est identique à celui décrit précédemment. Le même protocole a été utilisé pour le surnageant provenant de milieux de culture de macrophages normaux (contrôle). Pour ce travail, 5 expériences ont été faites et une bonne reproductibilité a été obtenue avec t 'anti-NO-Cys. - Détection de la nitrosylation des épitopes portés par la SAB en utilisant les Ac anti-NO-Tyr et anti-NO-Cys: Cette application a nécessité l'utilisation de la SAB délipidée (4 mg/ml) , pour éviter la lipopéroxydation (NO + 2- ) des acides gras adsorbés sur la SAB. Cette lipopéroxydation donne des composés entraînant des réactions non spécifiques. La protéine a été ajoutée dans le milieu de culture (HBSS) des macrophages activés ou non pendant 8 h. Les plaques de microtitration ont ensuite été adsorbées pendant 6 h par les surnageants provenant des milieux de culture des macrophages activés (contenant NO-SAB) des macrophages non activés ou du milieu de culture seul. Après saturation les Ac primaires "T" ou "C" ont été utilisés à la dilution de 1/1000. Neutralisation de l'effet trypanestatique de NO-SAB La souche Partinico II de T. musculi a été utilisée. Les trypanosomes ont été purifiés par passage sur colonne de diéthyl aminoéthyl cellulose (Lanham, 1968) . Les trypanosomes ont été ensuite co-cultivés pendant 8 h en présence des macrophages de souris normales ou infestées par le BCG en milieu RPMI contenant la SAB délipidée (4 mg/ml). Les Ac polyclonaux (1/100) ou le NMMA (0,5 mM) ont été ajoutés dans quelques puits pour pouvoir comparer leurs effets inhibiteurs. Le sérum de lapin normal et un Ac polyclonal anti-SAB ont été utilisés comme contrôle à la même dilution que les antisérums "T" et "C". Neutralisation du transfert de cet effet trvoanostatiaue : L'objectif de ce travail a été de confirmer l'effet trypanostatique de NO-SAB. Pour cela, le surnageant de cultures contenant de la SAB et des macrophages activés par le BCG en présence ou non de NMMA, est transféré après 8 h d'incubation, sur une co-culture de macrophages normaux /T. musculi selon les mêmes conditions. Les Ac polyclonaux "T", "C", le sérum de lapin normal ou l'anti SAB dilués au 1/100 sont appliqués avec le surnageant. Par ces deux méthodes, les Inventeurs ont dans un premier temps, étudié l'effet cytostatique trypanostatique de la NO-SAB soit direct soit transféré. Dans un second temps, ils ont comparé la neutralisation de cet effet par les Ac polyclonaux selon deux procédés légèrement différents. Le fait d'inhiber l'effet trypanostatîque par ces Ac selon ces deux conditions prouve d'une part la synthèse de NO et donc la formation de la NO-SAB et, d'autre part que c'est un effet à priori propre à la NO-SAB et non pas à d'autres dérivés oxygénés. Mesure de la quantité de nitrite produit La production de NO est donnée par la formation du NO2 accumulé dans le milieu de culture en utilisant une réaction colorimétrique la méthode de Griess (Hageman et Reed, 1980; Lepoivre et al., 1989). Le réactif de Griess photosensible est obtenu en mélangeant volume à volume sulfanilamide (1% dans HCl 1,2 N; Sigma) et N-(1-naphtyl) éthylènediamine dihydrochlorate (3% dans l'eau; Sigma); un volume de 200 Fl de réactif est ajouté à 100 pl d'échantillon, incubé 30 minutes à l'obscurité, puis l'abserbance à 550 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque. Une gamme étalon est réalisée pour chaque dosage en utilisant une solution de NaNO2. 2) Résultats. a) Détection de la formation du conjugué NO-Cys-SAB dans le milieu de culture de macrophaaes Le NO produit in vitro par les macrophages activés par le BCG, induit la formation de NO-Cys-SAB à partir du conjugué Cys-SAB préalablement ajouté dans le milieu. Ce dernier joue le rôle d'une cible, de réservoir et d'une forme stable de NO produit. Le dérivé nitrosylé formé est détectable par les expériences de compétition. En présence de NMMA, il a été noté une inhibition de la synthèse de NO et l'absence de signal. La figure 6 représente la cinétique de formation et la concentration en NO-Cys-SAB formé dans le surnageant de culture des macrophages activés déterminées à différents temps d'incubation: 0, 3, 4, 6, 8, 11, 14, 18, et 20 h en utilisant l'antisérum "C". Le même procédé a ete appliqué aux cellules non activées et au milieu de culture seul en présence ou non de NMMA. La concentration (kan) de NO-Cys-SAB formé à partir de la courbe de l'avidité de t'antîsérum "C" a ensuite été calculée. Les surnageants de culture des macrophages normaux ont été testés de la même façon; aucune formation de conjugués nitrosylés n'a été trouvée. b) Détection des épitoges nitrosylés sar le test EI,ISA La SAB nitrosylée a pu être détectée par le test ELISA en utilisant les deux Ac "T" et "C" dilués au 1/1000. Ces tests montrent une reconnaissance par ces Ac des épitopes tels que le NO-Tyr et le NO-Cys, formés au niveau de la NO-SAB. Les deux Ac ont donné des valeurs du même ordre avec les macrophages activés et normaux, en présence ou en absence de NMMA. Dans le tableau 2 ci-dessous les valeurs représentent la moyenne et l'écart-type de 5 expérimentations. Tableau 2 DO (492 nm)/NO-SAB Concentration NMMA anti-NO-Tyr anti-NO-Cys de NO2 0,5mM 1/1000 1/1000 (pM) Macrophages - 0,241 0,261 26,00 + 0,051 + 0,034 + 2,00 BCG + 0,096 0,099 3,00 + 0,018 + 0,034 + 0,005 Macrophages - 0,125 0,116 2,00 + 0,031 + 0,02 + 1,00 Normaux + 0,143 0,112 2,00 + 0,004 + 0,018 1 1,00 En présence de NMMA, les DO obtenues avec les nacrophages activés sont diminuées d'environ 2,5 par rapport à celles obtenues en absence de NMMA. Par contre avec les macrophages normaux, on ne note pas une grande différence dans les D les surnageants contenant NO-SAB ont été transférés dans des puits de co-culture macrophages normaux / T. musculi. Les figures 7 et 8 représentent le nombre de parasites dénombrés tous les jours pendant 4 jours dans les différents puits de culture: - Après incubation des trypanosomes avec la NO-SAB selon les deux procédés cités dans "Matériels et Méthodes" en absence ou en présence du sérum de lapin normal ou de l'anti-SAB, le nombre des parasites est resté presque stable puis a diminué vers le 4ème jour. Ces résultats montrent l'effet trypanostatique de NO transporté sous la forme de "NO-protéine" et l'effet cutostatique et / ou cytotoxique qui s'est révélé par la diminution du nombre des parasites. - En revanche, lorsque les Ac "T", "C" ont été ajoutés aux milieux de culture, le nombre des parasites a évolué de 104 à 106 parasites/ml entre les 2ème et le 4ème j,-)urs d'incubation. Ce même effet a également été constaté lorsque NMMA a été ajouté dans les milieux de culture des macrophages activés. Ceci montre un rôle inhibiteur de ces molécules sur l'effet cytostatique et cytotoxique dépendant du NO qui pourrait être dû à la NO-SAB ou même épitopes nitrosylés (NO-Cys ou NO-Tyr) formés au niveau de la SAB nitrosylée. La figure 7 représente l'inhibition de l'effet c-ytostatique des macrophages BCG sur le T. musculi in "irco tro en présence de NMMA (0,5 mM), des antisérum ("T") ou ("Q") utilisés au 1/100. Les cocultures de trypanosomes et de macrophages BCG en milieu normal et en milieu supplémenté avec du sérum de lapin normal ou d'Ac antiCiAB, ont été utilisés comme contrôles. La figure 8 représente l'effet cytostatique des surnageants contenant NO-SAB provenant des macrophages activés et ajoutés à des macrophages normaux contenant des T. musculi. Inhibition de cet effet en présence de NMMA (0,5 mM), des antisérum ("T") ou ("C") utilisés au 1/100. Absence de l'effet inhibiteur en présence d'un sérum de lapin normal ou d'Ac anti-SAB (1/100). Chaque point des courbes des figures 7 et 8 est te résultat de 4 expériences. 3) Discussion. Les résultats ci-dessus montre l'effet cytostatique et/ou cytotoxique de NO (sous forme de NO SAB) sur les trypanosomes extracellulaires. Ils révèlent également que les dérivés nitrosylés formés dans les milieux de culture des macrophages activés, en présence de SAB, sont suffisamment stables pour être détectés par voie immunochimique. na haute spécificité des anticorps polyclonaux de l'invention a permis le blocage de l'effet de NO "transporté" au niveau des trypanosomes. On peut conclure qu'une des formes de transport de NO lors de ses actions cytostatiques pourrait être (NO-protéine) ou (NO-acide-aminé). Ajoutons aussi que le signal mmunochimique disparait quand le NMMA est utilisé ou quand le surnageant provient des macrophages normaux avec u sans NMMA. Ces travaux ont permis de mettre en evidence in aitro une nitrosylation de la SAB lors de son exposition à N() produit à pH 7, à partir de macrophages activés par le HCG. Cette nitrosylation se traduit par une modification fle certaines molécules. Celles-ci sont cytotoxiques pour Des parasites et portent des épitopes nitrosylés, qui sont ta tyrosine et la cystéine nitrosylées, reconnus par les Ac polyclonaux de l'invention. IV - PRÉPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGÉS CONTRE DES CONJUGUÉS NO-CYS-GLUTARALDEHYDE COUPLÉS À UNE PROTÉINE PORTEUSE. Comme déjà indiqué, les dérivés nitrosylés interviennent dans de très nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques (inflammation, choc septique, maladies autoimmunes,. . Moncada et al., 1991; Nussler et Billiar, 1993; Stevanovic-Racic et al., 1993; Anggard, 1994) de l'organisme. I1 est donc capital d'obtenir des molécules capables de détecter et de bloquer (-es dérivés NO, qui peuvent détruire des agents pathogènes ct bloquer une fonction biologique majeure de l'organisme. L'approche polyclonale rapporté précédemment a montré la possibilité de blocage de l'effet cytostatique et cytotoxique de NO sur les T. musculi. Néanmoins, l'hétérogénéité de la réponse immunitaire ne permet pas à ces immunsérums d'être suffisamment performants pour des des complexes où l'attention est portée sur un épitope inique. Pour confirmer l'effet de NO sur les trypanosomes er pour éviter des accrochages non spécifiques, il a également été développé une approche monoclonale. Les Inventeurs ont donc induit des Ac monoclonaux dirigés contre le conjugué NO-Cys-G-protéine. Cet Ac monoclonal a servi dans un premier temps comme outil de détection in vltuoo de certains sites de fixation de NO (tels que la cystéine) au niveau des parasites, et dans un deuxième temps d'inhibition in vivo du développement des maladies lnflammatoires telles que l'encéphalite autoimmune et l'arthrite inflammatoire expérimentales chez des rattes Lewis. 1) Matériel et méthodes. a) Synthèse de l'immunocène L'immunogène utilisé dans la production de l anticorps monoclonal est la Cys couplée par le (G) sur ta SAB ou SAH puis nitrosylée par le NaN02. conformément ail protocole décrit en détail précédemment. b) Voie d'immunisation - Voie intrapéritenéale (IP): Des souris âgées de 5 semaines, provenant de la lignée cosanguine Balb/c (IFFA CREDO), ont été immunisées par voie IP avec 100 g d'immunogène en adjuvant complet de Freund, pour la première immunisation. Les autres injections ont été faites en utilisant l'adjuvant incomplet de Freund. - Voie lvmphatique: coussinet plantaire (CP) A partir d'une solution de 1 mg/ml (dans le TPS) ie conjugué, des souris Balb/c ont reçu une injection dans les (CP) tous les trois jours pendant 10 jours (3 !rljections). . Certaines ont reçu une quatrième injection pour augmenter le titre et l'avidité de la réponse Ac. c) Obtention d'Ac monoclonaux diriqés contre la NO-Cys-G conjuquée par la technique de l'hybridation lymphocytaire et sélection monoclonale Les souris ont été immunisées en alternance avec ies immunogènes NOCys-G-SAB et NO-Cys-G-SAH; lorsque le titre, l'avidité et la spécificité des Ac produits ont été trimés satisfaisants, les souris sélectionnées ont été laissées au repos pendant un mois avant de recevoir un rappel final par voie intraveineuse, 4 jours avant hybridation lymphocytaire. Les cellules spléniques (5 x 107) et le myélome P2/O/Ay (2,5 x 107) (Shulman et al., 1978) ont été ;lslonnés avec du polyéthylène glycol 1500 selon un protocole de fusion éprouvé. La technique employée est dérivée de celle proposée par Kohler et Milstein (1975), (-lméllorée par Lane (1985), et adaptée au laboratoire pour les petites molécules (Chagnaud et al., 1987; 1989a, b; 1990). . Les cellules fusionnées sont ensuite cultivées en milieu sélectif: RPMI 1640 enrichi en L-glutamine (2 mM), en antibiotiques pénicilline/streptomycine et supplémenté en sérum de veau foetal (10%) contenant 50 M d'hypoxanthine et 10 M d'azasérine. Après dix jours de culture, les puits contenant des hybridomes ont été dénombrés : Les clones producteurs d'Ac spécifiques ont ensuite été criblés à l'aide du test ELISA et sous-clonés selon les étapes suivantes: - Pour le premier criblage, tous les clones ont été testés sur les conjugués suivants : NO-Cys-G-SAB, Cys-G-SAB et SAB-G. Les Ac de chèvre anti-Ig de souris sont utilisés à une dilution de 1/5000 pour la révélation des clones positifs et particulièrement spécifique de l'immunogène (NO-Cys-G-BSA). - Ensuite, les clones positifs ont été sous-clonés (Sous-Clonage 1) pour obtenir une cellule/puits. Après une semaine de culture les clones ont etc retestés sur des plaques ELISA adsorbées par les conjugués cités ci-dessus; - Après le premier sous-clonage nous avons réalisé des études de la spécificité des clones positifs. Ainsi, une étude de la dilution a été réalisée dans le but d'obtenir une DO - 1 pour effectuer les tests de compétitions selon le même procédé que celui décrit précédent; - Les clones qui ont montré une spécificité pour le conjugué NO-Cys-GSAB ont été sous-clonés pour une deuxième fois (Sous-Clonage 2) et retestés sur des conjugués nitrosylés ou non diférents : (NO-Cys-G-BSA; (?ys-G-BSA; NO-Cys-SAB; Cys-SAB; NO-Tyr-G-SAB; Tyr-G-SAB; N()-Tyr-SAB; Tyr-SAB; SAB-G; ainsi que la NO-SAB) . Les résultats de tests ELISA indirects, ainsi que des tests de ïompétition ont permis de choisir les meilleurs clones; - Après ces deux sous-clonages qui ont permis de s'assureur de la monoclonalité des hybridomes, les clones choisis ont été conservés dans de l'azote liquide. La production en masse des Ac a été effectuée en liquide d'ascites (Potter, 1976) et les Ig ont ensuite été purifiées par précipitation au sulfate d'ammonium. * 2) Résultats. a) Analvse spectrophotométrioue de l'immunoaène utilisé peur l'approche monoclonale La nitrosylation du groupement SH de la Cys couplée a été suivie par spectrophotométrie. La figure 9 représente l'analyse spectrométrique de l'immunogène NO Cys-G-SAB et de son homologue structural Cys-G-SAB en fonction de la longueur d'onde. La bande d'absorbance de NO pour le conjugué NO-CysG-SAB a été détectée entre les longueurs d'ondes 340 et 640 nm. Le spectre du conjugué Cys-G-SAB qui a été obtenu avant nitrosylation montre une absence d'absorbance entre ces deux longueurs d'ondes. I1 convient aussi de remarquer que la zone d'absorbance obtenue avec le NO-Cys-GSAB est plus importante que celle du conjugué NO-Cys-SAB malgré le même rapport de couplage des deux conjugués. Ceci pourrait être dû au type de couplage et donc à l'exposition de t'haptène accessible à NO. Le tableau 3 ci-dessous donne la structure moléculaire de t'immunogène NO-Cys-G-SAB et Cys-G-SAB Tableau 3 Cys-G-SAB SH-CH2-CH-NH- (CH2) 5-NH-SAB (cystéinylglutaraldéhyde) COOH NO-Cys-G-SAB NO-S-CH2-CH-NH- (CH2) 5-NH-SAB (NO-cystéinylglutaraldéhyde) COOH b) Evolution de l'immunisation des souris - Souris immunisée sar voie (IP) La dilution optimale de l'Ac primaire est de 1/8000. On note l'évolution de deux réponses immunes : une est importante, dirigée contre le NO-Cys-G-SAB a été obtenue après la troisième immunisation. Elle est suivie d'une 2ème qui est plus faible. C'est cette demière qui a été dirigée contre l'haptène et la protéine porteuse (Cys-G- SAB). LA figure 10 représente l'évolution au cours de l'immunisation de la réponse en anticorps chez la souris immunisée par voie intrapéritonéale. La même dilution de l'Ac primaire a été utilisée pour l'étude de l'avidité et de la spécificité. - Souris immunisée dans les (CP) Après la troisième immunisation, il a été remarqué l'apparition de la réponse dirigée contre le NO-Cys-G-SAB, et l'absence de reconnaissance du Cys-G-SAR. La figure 11 représente l'évolution au cours de l immunisation de la réponse en anticorps chez la souris immunisée dans les coussinets plantaires (CP). Le titre obtenu après cette immunisation étant insuffisant pour la caractérisation de l'Ac (DO c) Caratérisation immunochimique des sérums immuns de souris - Etude de l'avidité et de la spécificité des réponses obtenues chez les deux souris injectées par deux voies d'immunisation différentes L'avidité et la spécificité de la réponse anti-NO-Cys-G-SAB ont été évaluées par rapport à l'immunogène et ses analogues structuraux, nitrosylés ou non. Souris immunisée par voie (IP) La figure 12 représente l'avidité et la spécificité des anticorps anti-NO-Cys-G de la souris (IP). s courbes de déplacement sont obtenues après des tests de compétitions en présence de l'anticorps et de chacun des conjugués indiqués. Après incubation de l'immunogène avec t'anti-NO-Cys-G-conjugué dilué au 1/8000 l'avidité de cet antisérum a été évaluée au demi-déplacement. Elle est de 1,1 x 10-8 M. Quand aux autres compétiteurs utilisés (Cys-G-SAB; NO-Cys-SAB; Cys-SAB; et la SAB-G) une reconnaissance très faible a été trouvée pour le Cys-SAB et la SAB-G avec respectivement une IC50 de 10-5 M et 5,6 x 10-6 M. Malgré ces réactivités croisées le NO-Cys-G-SAB est le conjugué le mieux reconnu. Souris immunisée vOar voie (CP): La figure 13 représente l'avidité et la spécificité des anticorps anti-NO-Cys-G de la souris (CP). Les courbes de déplacement sont obtenues après des tests de compétitions en présence de l'anticorps et de chacun des conjugués indiqués. Après la quatrième immunisation, les Inventeurs ont remarqué, dans le sérum de cette souris, une augmentation du titre (devenu 1/70 000) et de l'avidité de l'anti-NO-Cys-G-conjugué. L'avidité de 1'Ac est calculée à partir de la courbe de déplacement obtenue après incubation du sérum et de l'immunogène de la figure 13. Elle est égale à 4 x 10-9 M. En ce qui concerne l'étude de la spécifité, les molécules utilisées (Cys-GSAB; NO-Cys-SAB; Cys-SAB et SAB-G) n'ont pas montré un déplacement des valeurs des DO ce qui signifie l'absence d'un accrochage non spécifique avec cet Ac au niveau de ces conjugués. Par comparaison de ces deux types d'anticorps polyclonaux dirigés contre le même épi tope (NO-Cys-G), ne différant que par la voie d'administration de l'immunogène, des valeurs de titre et d'avidité différentes ont été obtenues. En outre, chez la souris immunisée par voie CP la réponse a été plus précoce (au bout de 10-15 jours) (figure 11) et plus spécifique que chez la souris immunisée par voie IP. Pour cette dernière, (figure 10) la réponse immunitaire a été trouvée dans un délai bien reconnu pour cette voie d' immunisation classique et qui varie entre 20 et 30 jours. d) Caractérisation des anticorps monoclonaux Le sang des souris choisies pour la réalisation de cette approche monoclonale a été récupéré au moment du prélèvement de la rate. Le signal sur le conjugué nitrosylé correspondant a été analysé. Après 10 jours de culture en milieu sélectif, le rendement de la fusion (nombre de puits ayant un ou plusieurs clones) a été de 25 % pour la fusion des Iymphecytes de la souris immunisée en ([P). En revanche pour la fusion des lymphocytes à partir de la rate de souris immunisée dans les (CP), le rendement a été de 97 gn. Tous les puits ont été testés et le rendement nombre de puits positifs après un test ELISA) voisin de Tous Tous les hybridomes séléctionnés ont reconnu llimmunogène. Le bruit de fond de la réponse (signal mmunologique sur le conjugué non nitrosylé/signal -nmunologique sur le conjugué nitrosylé) a été dans tous les cas inférieur à 10%. Les clones qui reconnaissaient les différents conjugués n'ont pas été sélectionnés. - Avidité des Ac monoclonaux anti-NO-Cys-G conluquée : Le surnageant contenant les anticorps monoclonaux anti NO-Cys-G a été dilué au 1/5, et le liquide d'ascites au 1/30 000. Ces dilutions ont été choisies pour donner une DO optimale - 1,0 à 492 nm. La ligure 14 rapporte l'avidité et la spécificité des Ac nnnoctonaux anti-NO-Cys-G. Les courbes sont obtenues après des s tests de compétition en présence de l'Ac et de chacun des conjugués indiqués. Ces tests de compétition réalisés n incubant l'immunogène NO-Cys-G-SAB en présence du surnageant, montrent une avidité de 4 x 10-9 M. Le liquide 'ascites utilisé au 1/30 000 a donné une avidité de 2,5 x 10-8 M. Cette différence dans l'avidité peut être due à la présence dans le liquide d'ascites prélevé à partir de souris, de facteurs, de protéines ou de complexes immuns qui inhibent les réponses spécifiques. - Spécificité des Ac monoclonatLx anti-NO-Cvs-G coniuauée : La spécificité des Ac monoclonaux a été étudiée par incubation du surnageant de culture des hybridomes à une dilution finale de 1/5 avec des conjugués présentant une analogie structurale avec l'immunogène: Cys-G-SAB NO-Cys-SAB; Cys-SAB; NO-Tyr-G-SAB; Tyr-G-SAB; NO-Tyr-SAB; TyrSAB; et la SAB-G. Au demi-déplacement, un seul conjugué Cys-SAB a été reconnu avec une spécificité de 4 x 10-6 M (figure 14). Ces résultats montrent que le conjugué NO-Cys-G-SAB est le mieux reconnu par ces Ac monoclonaux. Malgré l'absence de compétition avec la NO-SAB, les tests ELISA indirect ont montré que t'Ac monoclonal reconnaît la protéine nitrosylée. Le surnageant (1/5) et te liquide d'ascites (1/30 000) ont donné respectivement, des DO de 0,36 1 0,085 et 0,54 + 0,12. Les résultats représentent la moyenne et l'écart-type de trois expérimentations. - Détermination de l'isotvpie des Ac monoclonaux Droduits : En utilisant un Kit de détection des Ig de souris (Mouse monoclonal antibody, isotyping kit, Sigma), il a été possible de déterminer l'isotypie du clone obtenu: Ig G 2b. 3) Conclusion. L'analyse des caractéristiques immunochimiques des Ac des souris antiNO-Cys-G conjuguée a montré que: - la partie immunodominante reconnue par les Ac est toujours l'épitope NO; - une légère différence structurale entre i , immunogène et ses analogues structuraux est prise en compte par les sites Ac, confirmant le pouvoir discriminateur élevé de ces immunoglobulines. Ces Ac monoclonaux ont une haute avidité et spécificité; ces caractéristiques immunochimiques ainsi que la reconnaissance de la NO-SAB permettent leur utilisation dans des modèles biologiques bien définis. V - DÉTECTION D'ANTIGÈNES NITROSYLÉS ET RÔLE PROTECTEUR DES ANTICORPS MONOCLONAUX. Lors de la réponse immune, l'apparition de molécules effectrices très réactives (dérivés de loxygène, dérivés de l'azote,...) est susceptible de modifier t'antigénicité des éléments reconnus par cette répondre. Ainsi, les antigènes portés par les microorganismes contre lesquels l'organisme élabore une réponse immune de type Thl avec production de dérivés de l'azote, peuvent aboutir à des derivés nitrosylés et nitrés. Ces antigènes nitrosylés peuvent donc entraîner la synthèse d'anticorps, leur présence et leur rôle éventuel sont donc à étudier. Le fait que les dérivés nitrés soient de bons immunogènes relativement bien connus (Kofler et au. 1992; Maeji et al., 1992; Yuhasz et al., 1995), et existence avérée d'anticorps anti-nitrotyrosine (Beckman t al. 1994a) nous ont amenés à postuler l'existence de tels anticorps in vivo . Les Inventeurs ont donc recherché, dans un premier temps, la présence d'antigènes nitrosylés sur les cibles parasitaires, par une technique immunocytochimique, on utilisant des anticorps anti-nitroso-cystéine (poly- et monoclonaux) et anti nitroso-tyrosine (polyclonaux). Dans Iin deuxième temps, ces antigènes nitrosylés ayant été détectés, ils ont recherché la présence des anticorps correspondants dans le sérum des animaux trypanosomés. Les trypanosomes représentent une cible privilégiée du NO. Dans les trypanosomoses, on constate, en effet une augmentation considérable du nombre et de l'activité des macrophages. Le rôle cytostatique in vitro et l'induction de la NO-synthase constatée dans les macrophages de souris infestées indiquent que le NO pourrait être impliqué dans les mécanismes effecteurs contre les parasites. De plus, les trypanosomes circulant chez leur hôte définitif (forme trypomastigote) ont une mitochondrie non fonctionnelle, leur énergie dépendant de la glycolyse. Ils représentent donc des cibles de NO beaucoup moins complexes que les autres agents pathogènes ou les cellules tumorales, d'où l'intérêt de leur étude. Si l'effet cytostatique du NO sur le trypanosome naturel des souris (T. musculi) et sur les trypanosomes du croupe brucei (T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. b. brucei), responsables des trypanosomoses humaines et animales a été bien établi in vitre, in vivo l'effet du NO est beaucoup plus complexe. NO en effet participe aux mécanismes d'immunosuppression en inhibant la transformation et la multiplication des lymphocytes, et de plus il induit l'apoptose. Le rôle immunosuppresseur de NO est important dans les trypanosomoses du fait de la quantité importante du NO produit. C'est pourquoi, il est difficile avec les anticorps polyclonaux et monoclonaux d'appréhender l'étude des molécules nitrosylées et d'un effet éventuellement protecteur lié à l'injection de ces anticorps. Dans un troisième temps, un rôle éventuel de des anticorps poly- et monoclonaux de l'invention, in vivo donc été recherché dans des modèles expérimentaux moins complexes, où le rôle délétère du NO à déjà été fortement incriminé. A - Approche immunocytochimique. 1) Matériel et méthodes. Des macrophages péritonéaux provenant de souris activées par le BCG (source de NO), et des trypanosomes mis en co-culture, ont été utilisés. La souche parasitaire utilisée est T. brucei gambiense (T. b. gambiense souche: "Féo" ITMAP/ 1893). Ces parasites ont été entretenus après injection par voie (IP) (5 x 103/souris) à des souris normales (Noireau et al., 1989). Les trypanosomes ont été cultivés dans des boîtes de Pétri (35 mm) (Falcon Plastics) à 2 x 106 parasites/ml/boîte dans le milieu de culture Mc Coy 5A modifié (GIBCO) supplémenté avec 100 U/ml pénicilline, 100 g/ml streptomycine, 25 mM Hepes, 2 mM sodium pyruvate, 0,2 mM L-Cystéine en présence de macrophages péritonéaux activés ou non (Albright et Albright 1980; Hirumi et Hirumi 1989; Vincendeau et al., 1985; Oka et al., 1988). Le NMMA a été ajouté dans certaines boîtes à une dilution finale de 0,5 mM. Après 12 h, la survie des parasites est évaluée dans les puits en présence des macrophages normaux ou activés, avec ou sans NMMA. La SAB délipidée a été ajoutée dans le milieu de culture à 4 mg/ml comme porteur de NO. Le surnageant contenant les parasites est récupéré après 12 h pour réaliser une fixation des parasites en vue du test immunocytochimique. - La fixation des trypanosomes est réalisée sur des lames dégraissées par des solvants organiques (Ether-Alcool) . La fixation la plus appropriée à ce protocole est réalisée par cytocentrifugation (Shandon Elliott cytospin) à 100g pendant 10 min. Après fixation, les lames sont séchées, puis après une étape de saturation par le tampon TBS-SAB (1 g/l) les différents anticorps primaires sont ajoutés. L'incubation a lieu pendant 1 h dans une chambre humide à la température ambiante (Harlow et Lane, 1988) . L'anticorps monoclonal anti-NO-Cys-G (surnaqeant) a été utilisé au 1/50; le sérum de souris normale utilisé à la même dilution; les anti-sérums polyctonaux (lapin "T" et "C") et un sérum de lapin non immunisé ont été employés à une dilution finale de 1/10000 pour comparer leurs marquages avec celui de l'anticorps monoclonal. Le tampon seul a été utilisé sur quelques lames comme contrôle négatif. L'incubation des anticorps primaires est suivie par te traitement des lames par les Ac secondaires marqués à la péroxydase à une dilution de 1/5000 dans le TPS-SAB. La révélation est ensuite réalisée par le 3-3' Diaminobenzidine tétrahydrochloride (DAB; Sigma) à 60 %, H202 (0,03 %) dans le TBS. 2) Résultats. Le marquage immunocytochimique à fort grossissement (x 100) est montré à la figure 15 - l'anticorps monoclonal anti-NO-Cys-G: a donné des marquages (immunoréactivités) bien nets au niveau des trypanosomes co-cultivés en présence des macrophages activés (Photo 1); un marquage beaucoup plus faible a été obtenu en co-culture de macrophages activés / trypanosomes, en présence de NMMA (0,5 mM) (Photo 2); aucun marquage n'a été obtenu sur les trypanosomes cocultivés avec des macrophages normaux. - Une absence totale de marquage des trypanosomes a été obtenue lors de l'utilisation d'un sérum de souris normale (Photo 3). aucun marquage des trypanosomes n'a été obtenu lors de l'utilisation de l'anticorps secondaire (anti-Ig souris marqué à la péroxydase) en absence d'un anticorps primaire. Ces resultats affirment la positivité du marquage obtenu dans la photo 1. - Anticorps polyclonaux "T" et "C" l'anticorps "C": la photo 4 de la figure 15 montre une intensité très proche de celle de l'Ac monoclonal; l'anti-NO-Tyr ("T"), donne un marquage positif d'une intensité moins forte que les deux types d'anticorps (mono- et polyclonaux) dirigés contre l'épitoge NO-Cys (photo 5); l'utilisation des Ac "T" et "C" avec les macrophages normaux, a donné un marquage des trypanosomes très faible, en comparaison de ceux obtenus en présence des macrophages activés. - L'Ac primaire d'un lapin normal a donné une absence de marquage (Photo 6). - Quand les Ac anti-Ig de lapin marqués à la péroxydase ont été utilisés en absence des anticorps primaires, aucun marquage n'a été observé. 3) Discussion. Les travaux réalisés montre l'effet cytostatique et cytotoxique de NO au niveau des parasites extracellulaires tels que les T. b. brucei, T. b. i7ambiense et T. musculi (Vincendeau et Daulouède, 1991; Vincendeau et al., 1992; Daulouède et al., 1994), de même que l'effet cytostatique/cytotoxique de NO au niveau des T. musculi par la SAB nitrosylée. Cet effet est amplifié en présence d'un porteur protéique dans le milieu de culture et inhibé en présence d'un anticorps "C" ou de NMMA, ce qui démontre le rôle microbicide éventuel de NO. Ce modèle d'étude de la cytotoxicité de NO est un modèle simple et facile à mettre en évidence par comparaison avec l'utilisation d'autres modèles tels que ceux des cellules tumorales. Ces dernières ont des métabolismes beaucoup plus complexes que celui des trypanosomes, et leur séparation des macrophages est plus difficile que celle des trypanosomes que l'on peut prélever à partir des surnageants de co-cultures (macrophages / parasites). De plus, T. b. gambiense a été utilisé au lieu des T. musculi car la seconde souche est beaucoup plus sensible que la première à l'action de NO ou de ses dérivés. Les T. musculi nécessitent 48 h pour que NO, produit par des macrophages activés par le BCG, ait un effet cytotoxique de l'ordre de 90%. D'autres molécules, comme la suramine, exerçant un effet sur les trypanosomes, nécessitent un porteur (SAB) pour se fixer au niveau des parasites (C échange de NO entre protéine porteuse et protéines et/ou acides aminés au niveau des trypanosomes, ainsi que sur d'autres sites parasitaires non encore détectés. La stabilité de la liaison NO au niveau de ces sites peut varier de quelques "secondes" voire quelques "heures" avant qu'il ne soit oxydé en N02- en présence d'O2. Toutes ces données incitent à utiliser la souche gambiense comme cible de NO et la SAB délipidée comme porteur de NO. Pour la détection des dérivés nitrosylés telle que la NO-SAB ou des cibles parasitaires qui ont fixé NO, les anticorps monoclonaux anti-NO-Cys-G et les Ac polyclonaux "T" et "C" ont été utilisés. Pour élargir le spectre de détection des produits nitrosylés, l'utilisation d'anticorps dirigés contre différents épitopes NO et ayant des avidités différentes permet d'être plus précis dans la résolution du problème posé. Les marquages immunocytochimiques obtenus avec les anticorps poly- et monoclonaux confirment la stabilité des dérivés nitrosylés au niveau des trypanosomes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives in vivo et in vitre, pour des pathologies mettant en jeu le rôle de NO, telles que les maladies neurodégénératives, maladies inflammatoires chroniques et aigues, ainsi que des maladies inflammatoires/autoimmunues telles que la sclérose en plaques et la polyarthrite rhumatoïde. Ces nouvelles perspectives sont fondées sur - la mise en évidence chez des souris parasitées d'anticorps développés contre des épitopes nitrosylés; - le développement chez des rattes Lewis de modèles expérimentaux (l'encéphalite autoimmune expérimentale et la polyarthrite à adjuvant) qui sont respectivement des modèles de pathologies humaines: sclérose en plaques et polyarthrite rhumatoïde. Le but est la mise en évidence in vivo du rôle de NO dans le développement de ces deux pathologies et la neutralisation de ces effets nocifs en utilisant les anticorps monoclonaux de l'invention. B - Mise en evidence des anticorps dirigés contre des néoantisènes nitrosvlés dans le sérum de souris Darasitées. 1) Matériel et méthodes. Des souris Swiss sont infestées avec trois souches de parasites : T. b. gambiense, T. b. brucei (souche: ANTAT 1.1) et T. musculi. Chaque souris reçoit 50000 parasites par voie intrapéritonéale. Puis la parasitémie est évaluée à partir du 3eme jour après Lnfestation. On prélève ensuite le sang des souris au 5ème jours (délai limite de la survie des souris parasitées par T. b. gambiense et T. b. brucei et au 21ème jour pour les souris infestées par T. musculi. Plusieurs conjugués nitrosylés ont été préparés pour cette étude immunoenzymatique : NO-SAB; NO-SAB délipidée; NO-Cys-SAB; NO-Tyr-SAB; NO-Cys-G-SAB; NO-Tyr-G-SAB et NO-Tryp-G-SAB. Les analogues structuraux non nitrosylés ont été aussi utilisés dans les mêmes conditions. Les sérums ont été dilués au 1/1000 et les Ac secondaires ont été utilisés à une dilution finale de t 5000. 2) Résultats. - Réponse immunologicue sur des conjugués nitrosylés La recherche d'Ac dirigés contre des épitopes riitrosylés dans les sérums des souris trypanosomées a été effectuée sur une population constituée de: 15 souris infestées par T. musculi (groupe 1) , 15 souris infestées par T. b. brucei (groupe 2), et 15 souris infestées par T. b. gambiense (groupe 3). Les sérums provenant de 15 souris normales ont été employés comme contrôles. Les moyennes des DO obtenues sur différents epitopes nitrosylés ont été calculées pour chaque groupe de souris cités ci-dessus. Les figures 16 à 22 montrent les valeurs en DO pour les sérums des souris normales et des souris parasitées. Les DO obtenues sur les molécules ont été corrigées par la soustraction des DO obtenues sur les analogues structuraux non nitrosylés qui ont servi comme blanc dans le test ELISA. Ces figures 16 à 22 correspondent respectivement aux réponses sur les épi topes suivants: NO-SAB; NO-SAB délipidée; NO-Cys-SAB; N()-Cys-G-SAB; NO-Tyr-SAB; NO-Tyr-G-SAB et NO-Tryp-G-SAB. chaque valeur de DO est une moyenne de 2 déterminations, les barres sur les figures montrent les moyennes (calculées par le test de Mann-Whitney) des DO de chaque groupe de souris. - NO-SAB et NO-SAB délipidée : Ces protéines nitrosylées ont été reconnues uniquement par les souris infestées par la souche T. b. qambiense. Les moyennes et les écarts-types obtenus sont de 0,25 1 0,029 (NO-SAB) et 1,1 + 0,006 (NO-SAB délipidée). NO-Cys-SAB et NO-Cys-G-SAB Un signal immunologique statiquement ;ignificatif (p Groupe 1 . 0,75 + 0,39 (NO-Cys-SAB); 0,87 + 0,37 (N()('ys Cys-G-SAB) Groupe 2 : 0,60 + 0,30 (NO-Cys-SAB); 0,30 + 0,15 IOCys-G-AB); Groupe 3 : 0,90 + 0,34 (NO-Cys-SAB); 1,10 + 0,41 (NO-Cys-G-SAB); - NO-Tyr-SAB. NO-Tyr-G-SAB et NO-Tryp-G-SAB Egalement un signal immunologique important et statiquement significatif (p Groupe 1 : 0,72 + 0,53 (NO-Tyr-SAB); 0,73 + 0,27 (NO-Tyr-G-SAB); 0,60 + 0,28 (NO-Tryp-G-SAB); Groupe 2: 0,62 + 0,30 (NO-Tyr-SAB); 0,60 + 0,15 (NO-Tyr-G-SAB); 0,95 + 0,33 (NO-Tryp-G-SAB); Groupe 3 0,50 + 0,26 (NO-Tyr-SAB); 0,93 + 0,43 (NO-Tyr-G-SAB); 0,71 + 0,22 (NO-Tryp-G-SAB); Pour les souris contrôles les moyennes et les ecarts-types obtenus sur les différents conjugués sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 NO-SAB NO-SAB NO-Cys- NO-Cys-G No-Tyr- NO-Tyr-G NO-Tryp délipidée SAB -SAB SAB -5AB -G-SAB (,02 0 0,03 0,10 0,02 0,11 0,11 t 0,02 + 0,04 t 0,03 t 0,02 + 0,02 t 0,01 3) Discussion. Les résultats obtenus montrent: - Une différence de signaux immunologiques entre les sérums contrôles et ceux de souris parasitées. - Des différences entre les groupes de souris parasitées ainsi qu'entre les différents épitopes utilisés. Ceci pourrait être dû au type de couplage qui joue un rôle dans la présentation de l'épitope nitrosylé couplé à une protéine par une liaison peptidique (carbodiimide) ou par une liaison de type "amine primaire" - Ces données confirment l'implication de NO dans ces parasitoses, qu on peut résumer comme le résultat d'une activation des macrophages en présence des parasites suivie d'une expression de la iNOS qui libère NO en grande quantité pendant des heures, voire des jours. NO va donc exercer son effet cytostatique ou cytotoxique sur les parasites en se fixant sur leurs cibles protéiques et/ou au niveau des cellules du soi, formant ainsi des néoépitopes nitrosylés différents. Ces antigènes vont stimuler le système immunitaire qui va produire des anticorps dirigés contre ces épitopes nitrosylés. Après avoir obtenu ces résultats chez les animaux et en raison du rôle éventuel de NO dans l'effet cytostatique et cytotoxique sur les parasites intra et extracellulaires, les Inventeurs ont étudié chez des malades atteints de pathologies parasitaires différentes (trypanosomose, toxoplasmose, amibiase, hydatidose, paludisme) l'évolution des signaux immunologiques contre des épitopes nitrosylés. Les résulats obtenus ont montré une différence significative entre les sérums des malades atteints de trypanosomose ou de paludisme et ceux d'autres patients et témoins. Pour les premiers, les meilleurs signaux immunologiques ont été obtenus sur les épi topes NO-Tyr-G et NO-Tryp-G. En revanche, pour les autres, les signaux immunologiques ont été très faibles même sur ces deux épîtopes. Les tests ont été effectués sur 20 sérums de chaque pathologie. C - Rôle protecteur des anticorps monoclonaux dans l'encéphalite autoimmune et l'arthrite inflammatoire oxperimentales 1) Encéphalite autoimmune expérimentale. Le modèle de l'encéphalite autoimmune rj-,périmentale (EAE), a pour objectif de reproduire la démyélintsation observée dans la sclérose en plaques (,EP). . C'est une pathologie démyélinisante du système nerveux central (SNC) affectant la substance blanche. La myéline, gaîne protectrice de fibres nerveuses est la cible du processus pathologique. La dégradation de cette-ci est responsable de l'apparition des plaques. Lorigine de la SEP est très certainement multifactorielle: génétique, environnement, autoimmunité et stress émotionnel (Antel et Cashman, 1991; Poser, 1992; Talbot, 1995). Cependant, l'étiopathogénîe exacte demeure inconnue. Plusieurs anomalies de la réponse immune à médiation cellulaire et humorale ont été décrites (Brochet et Orgogozo, 1987; Olsson, 1995). Des hypothèses ont été formulées concernant les réponses autoimmunes qui ont été trouvées pendant la maladie. Elles provoqueraient une augmentation de la production de NO par les macrophages/microglies, les cellules musculaires lisses et/ou l'endothélium du SNC. Deux mécanismes dans la destruction cellulaire due au NO ont été proposés (Sherman et al., 1992): - Cytotoxicité directe par NO. - Lésions dues à la formation de péroxynitrite à partir de l'anion superoxyde et NO. D'autres travaux ont indiqué le rôle de NO dans la SEP (Offner at al., 1989; Villas et al., 1991; oprowski at al., 1993; Van Dam et al., 1995; Weinberg et al., 1994), et la présence des auto-Ac contre l'épitope NOCys-G chez des malades (Boullerne et al., 1995). Pour confirmer toutes ces données postulant le role de NO dans la SEP et surtout dans l'EAE, le modèle a été induit chez des rattes Lewis en les immunisant avec un peptide encéphalitogène de la protéine basique de la myéline (PBM) de cobaye supplémenté en Mycobacterium tubercuiesis dans de l'adjuvant. L'objectif de cette approche est de montrer l'implication du NO dans la création de néoépitopes donc dans la symptomatologie de la maladie, par le blocage de ces épitopes par nos Ac monoclonaux qui pourront avoir un rôle préventif. En parallèle, l'évolution des réponses immunes contre des néoantigènes nitrosylés et nitrés dans les sérums des rattes a été étudiée. a) Matériel et méthodes. Des modèles d'EAE chez la rate Lewis ont été proposés par différentes équipes (Panitch et Ciccone, 1981; Feurer et al., 1985; Levine, 1986; Polman et al., 1988) . Selon ces auteurs, ce modèle induit a comme avantage essentiel une incidence élevée des rechutes et une remarquable prédictibilité. - Antiaène encéphalitogène Il a été administré aux animaux le peptide synthétique encéphalitogène (Peninsula laboratories) de poids moléculaire 1730 daltons dont la séquence reproduit celle du fragment de la PBM de cobaye entre les acides aminés 68-84 dont la structure chimique est la suivante: Tyr-Gly-Ser-Leu-Pro-Gln-Lys-Ser-Gln-Arg-Ser-Gln-Asp-Glu-Asn 69 75 80 83 - Animaux. Le travail a été réalisé sur des rat tes Lewis, (IFFA CREDO), génétiquement susceptibles à l'EAE. Les rattes étaient réparties en lots homogènes d'âge compris entre 6 à 7 semaines. Trois groupes de rattes Lewis (poids moyen: 200 g) ont été constitués. Chaque animal a reçu par voie sous-cutanée dans les coussinets plantaires de chaque patte arrière 0,05 ml d'une émulsion d'adjuvant complet de Freund (ACP H37Ra, DIFCO) contenant: 100 \ig du peptide 68-84 de PBM de cobaye dans 0,05 ml de NaCl 0,9 %, plus 0,05 ml d'ACF supplémenté par de 1 mg Mycobacterium tuberculosis (DIFCO). Groupe "Témoin" il est constitué de 7 rattes. Chaque animal a reçu seulement l'émulsion indiquée ci-dessus. Groupe "Aminoguanidine" : il est constitué de 5 rattes. Ce groupe a reçu en plus de l'émulsion, et après 4 jours, une injection par voie sous-cutanée d'un inhibiteur spécifique de la iNOS qui est l'aminoguanidine (25 mg/kg), une fois par jour pendant deux jours successifs (Reimers et ai. 1994). L'inhibiteur de la iNOS a été utilisé pour comparer son activité à celle de l'anticorps monoclonal anti-NO-Cys-G. Groupe "Ac monoclonal" : il est constitué de 5 rattes. Chaque rate a reçu en plus de l'émulsion, et après 4 jours, par voie sous-cutanée, 5 mg/kg d'Ac monoclonal purifié par précipitation au sulfate d'ammonium (Mrabet et al., 1991; Lagier et al., 1992). - Evaluation clinique des symptômes rhumatoloqigues et neurologiques Les animaux sont observés cliniquement tous les jours après administration de l'émulsion. Les tests cliniques ont été évalués au moyen de critères portant sur L'apparition de l'arthrite qui se caractérise par le score suivant : O = pattes normales; 1 = oedème moyen; 2 = oedème plus évolué; 3 = arthrite inflammatoire; 4 - arthrite inflammatoire + difficulté à la marche; 5 = arthrite inflammatoire + difficulté à la marche + ulcération; 6 = arthrite inflammatoire et purulente + brande difficulté à la marche + ulcération; 7 = arthrite Loflammatoire, purulente, et sanglante + grande difficulté a la marche + ulcération. Le comportement et le tonus de chaque animal. r,e score clinique suivant a été attribué : O = normal; 1 = hypotonie de la queue; 2 = paralysie; 3 - paraplégie; 4 = tetraplégie. Un score égal ou supérieur à 2 est requis pour affirmer l'handicap neurologique (pousée d'EAE). Si ce score établi régresse, les animaux sont en phase de remission. Par contre, lorsque ce score clinique revient à une valeur au moins égale à 2, les animaux font une rechute (deuxième poussée). Test immunoenzymatioue Des prélèvements de sang sont effectués une fois par semaine pendant 5 semaines après l'administration de l'émulsion. Les sérums sont testés à une dilution finale de 1/500 dans les conditions optimales du test. La révélation des signaux a été faite en utilisant des anticorps de lapin anti-Ig de rat marqués à la péroxydase (Sigma) dilués à 1/5000. Ces sérums ont été testés sur les conjugués suivants NO-Cys-G-SAB; Cys-G-SAB; et la SAB-G: les deux demiers vont servir pour la correction des DO obtenues sur le conjugué nitrosylé. Le choix du NO-Cys-G-SAB repose sur le fait que l'anticorps monoclonal utilisé pour bloquer les signes cliniques est dirigé contre cet épitope. La possibilité d'apparition in vivo d'un néoantigène de même conformation spatiale et de comportement identique au NO-Cys-G-SAB a été recherché. Des travaux récents ont mis en évidence la formation des nitrotyrosines dans des sites inflammatoires (Kaur et Halliwell, 1994). Pour détecter la présence des réponses immunologiques dirigées contre ces épi topes dans les sérums des rattes, le N02-Tyr-SAB et le nitrosotyrorine conjuguée (NO-Tyr-SAB) ont été utilises. Le Tyr-SAB a été utilisé pour la correction des DO obtenues sur : N02-Tyr-SAB et NO-Tyr-SAB. b) Résultats. - Mise au point du modèle d'EAE chez les rattes Lewis par administration du peptide encéphalitoqène de cobaye: Chaque animal des 3 groupes de cette étude a été exploré cliniquement tous les jours pendant 40 jours. Grouse "Témoin" (PBM seul) Trois jours après l'immunisation, on observe l'apparition d'un oedème des pattes postérieures. Quelques jours plus tard les signes rhumatologiques évoluent vers tlrle ulcération. Il s'agit donc d'une arthrite inflammatoire au score moyen de 5. Vers les dixième-douzième jours : apparition des premiers signes neurologiques: hypotonie de la queue avec difficulté à la marche évoluant vers une paralysie des pattes postérieures. Cet état est suivi par une phase de rémission puis de rechute. Groupe Aminoguanidine Trois rattes sur cinq ont développé la maladie. Les mêmes signes neurologiques et d'arthrite évolutive que chez le groupe précédent ont été observés chez ces rattes. Les deux autres rattes ont développé seulement les signes d'arthrite. Ces résultats indiqueraient que l'aminoguanidine à une concentration de 25 mg/kg est relativement peu efficace. GrouPe "Ac monoclonal" L'objectif principal de ce modèle est de mettre en évidence le rôle de NO dans l'EAE. L' anticorps monoclonal de l'invention développé contre l'épitope NO-Cys-G a montré un rôle protecteur dans le développement de la maladie, et a montré que NO est impliqué dans ce modèle animal. La neutralisation de l'effet du NO par les Ac au cours de l'apparition des poussées, se manifeste par les observations suivantes - absence totale de signes neurologiques : pas d'hypotonie de la queue, de difficulté à la marche ou de paralysie postérieure; absence du développement des signes d'arthrite il apparait un oedème moyen (score 1) au niveau des sites d'immunisation, sans inflammation, ni ulcération. Le suivi de ce groupe a montré une absence de maladie chez ces animaux même après 40 jours. Il ne s'agit donc pas d'un simple retard dans l'apparition de la maladie mais d'une véritable protection. Les résultats de ce travail ouvre une nouvelle voie thérapeutique dans la (EP. La mise en évidence de NO ou de certains épitopes induits au cours de la maladie chez l'homme va servir par .'(mple, à comprendre les mécanismes biologiques et pathologiques qui peuvent déclencher la SEP. - Etude de l'évolution des Ac contre des néoénitopes nitrosvlés et nitrés dans le sérum des rattes: Les signaux immunologiques dirigés contre les conjugués NO-Cys-GSAB; NO-Tyr-SAB; NO2-Tyr-SAB ont été recherchés. Les figures 23 à 25 représentent l'étude de l'évolution des anticorps dirigés contre les conjugués NO Cys-G-SAB, NO-Tyr-SAB et NO2-Tyr-SAB, dans le sérum des rates (EAE). Les figures 23 à 25 montrent respectivement l'évolution de trois types de réponses immunes chez les trois groupes "Témoin", "Aminoguanidine" et "Ac monoclonal''. Les tests ont été faits deux fois et les résultats (DO) obtenus sont très similaires entre les rattes d'un même groupe avec des différences non significatives. Nous avons donc tracé toutes ces courbes après calcul des moyennes et des écarts-types des DO obtenues chez toutes les rattes d'un même groupe et sur le même conjugué. Groupe "Témoin" Pour ce groupe d'animaux une corrélation entre les réponses immunitaires et la clinique au cours du temps est trouvée. De plus, le signal immunologique évolue de façon identique pour les trois conjugués NO-Cys-G-SAB, NO-Tyr-SAB et NO2-Tyr-SAB. Les DO obtenues par le test ELISA sur ces conjugués ne sont pas très importantes (de l'ordre de 0,125) mais on ne peut pas les considérer comme un bruit de fond car elles sont indicatrices de la présence des Ac circulants, dont le taux augmente au moment des poussées et au contraire diminue au moment des remissions (figure 23). GrouPe "Aminoguanidine" Les réponses anti-NO-Tyr-SAB et anti-NO2-Tyr-SAB sont plus élevées que celles obtenues chez le groupe précédent (avec des DO entre 0,25 et 0,50 à partir de la troisième semaine après l'immunisation. Pour la réponse anti-NO-Cys-G-SAB le titre n'a pas augmenté mais est resté presque stable entre la 1ère et la 4ème semaine (figure 24). Les 3 rattes ayant développé quelques signes neurologiques et les deux autres ont montré des résultats treks voisins. Groupe "Ac monoclonal" Les signaux immunologiques de ce groupe sont différents de ceux des deux premiers groupes. La figure 25 représente l'évolution au cours du temps des réponses anti-NO-Cys-G, anti-NO-Tyr et anti-NO2-Tyr. Le NO2-Tyr-SAB est le conjugué le mieux reconnu parmi les trois (DO entre 0,20 et 0,30 après la 3ème semaine). De plus, une différence de reconnaissance entre les deux épi topes Tyr-nitrée et Tyr-nitrosylée, avait lieu par ces Ac induits. Les signaux anti-NO-Cys et anti-NO-Tyr sont restés stables entre la 1ère et la 5ème semaine (DO 0,125) sauf une légère augmentation (après 1 semaine) de 1'anti-NO-Tyr, suivie d'une diminution. Ces tests immunoenzymatiques ont permis d'étudier chez des rattes développant ou non l'EAE, l'évolution des titres en anticorps potentiellement induits in vivo après l'apparition des néoantigènes, nitrosylés ou nitrés. Le prélèvement sérique des rattes chaque semaine était limité. Le nombre de tests et des conjugués utilisés l'a été également. Il convient de remarquer que dans d'autres tests ELISA réalisés une absence de discrimination de ces Ac a été remarqué entre le conjugué NO-Cys-SAB et le conjugué Cys-SAB (couplage carbodiimide) . Les DO étaient très identiques sur ces deux conjugués, ce qui implique une liaison non spécifique et que la présentation de la NO-Cys aubout d'une chaîne carboné (couplage G), donne probablement à ce conjugué une conformation proche de celle de l'épitoge in vivo. Ces résultats montrent que Des dérivés nitrosylés (particulièrement 1'épitope NO-Cys) ou nitrés sont responsables du développement d'EAE chez les rattes Lewis. Ces dérivés possèdent in vivo des conformations spatiales identiques aux conjugués NO-Cys-G-SAB; NO-Tyr-SAB; ou NO2-Tyr-SAB adsorbés sur des plaques de microtitration. Ce qui permet aux Ac induits in vivo de montrer ces conjugués artificiels comme étant les dérivés contre lesquels ils sont dirigés. 1'Ac monoclonal a un rôle protecteur plus important que celui de l'aminoguanidine. Ces molécules exercent leurs effets d'une part en neutralisant les néoépitopes nocifs et d'autre part en stimulant le système immunitaire. Ce dernier induit donc in vivo, des anticorps dirigés contre ces néoantigènes générés après immunisation des animaux par une émulsion à caractère "immunogène". Ceci peut expliquer l'augmentation permanente de certains signaux immunologiques chez les groupes des rattes ayant reçu l'aminoguanîdine ou l'Ac monoclonal. 2) Arthrite inflammatoire expérimentale. Ce modèle a pour objectif de reproduire les aspects inflammatoires et rhumatologiques présents dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). C'est une maladie autoimmune Fréquente qui débute sous la forme d'une oligoarthrite inflammatoire des poignets ou des articulations inétacarpophalangiennes (Bach, 1993) . La PR évolue par poussées survenant plus ou moins fréquentes et entrecoupées de rémissions habituellement incomplètes. Il existerait plusieurs facteurs favorisants tels que des facteurs génétiques, environnementaux, et des facteurs immunitaires (Brostoff et al., 1993). Le NO a récemment été découvert comme un élément effecteur dans cette pathologie (Stefanovic-Racic et al., 1993; Moilanen et Vapaatalo, 1995) et dans d'autres affections articulaires (Stadler et al., 1991; Stefanovic-Racic et al., 1992). L'excès de sa production peut provoquer des effets cytotoxiques et cytostatiques (Nussler et Billiard, 1993; Stefanovic-Racic et al., 1993; Anggard, 1994) La présence dans les liquides biologiques des groupements aromatiques et des acides aminés nitrés par le ONOO- peut être un marqueur de la destruction cellulaire in vivo (Kaur et Halliwell, 1994) . Dans les maladies inflammatoires chroniques telles que la PR (Halliwell et al., 1992), la production excessive des radicaux oxygénés libres contribue à la destruction cellulaire. Par ailleurs, NO est reconnu pour participer à la destruction articulaire (Farrell et al., 1992; McCartney-Francis et al., 1993; Stefanovic-Racic et al., 1993). L'inhibition de la NOS supprime l'arthrite chez la souris (McCartney-Francis et al., 1993). Récemment, la production de NO a été indirectement mesurée sous forme de nitrites dans les serums et liquides synoviaux de patients atteints de PR ((,rabowski et al., 1996). Des taux élevés en nitrites chez les malades par comparaison aux témoins sains montrent le l-ole du NO comme possible agent médiateur dans les maladies rhumatismales. En tenant compte des données bibliographiques indiquant le rôle de NO dans des maladies inflammatoires en particulier la polyarthrite rhumatoïde à adjuvant (ralenti et al., 1993; Oyanagui, 1994; Cannon et al., 1995), les Inventeurs ont étudié le modèle d'arthrite à adjuvant, afin de déterminer si les Ac monoclonaux dirigés contre la NO-Cys-G conjuguée sont capables d'inhiber 1 'effet de NO dans l'induction de cette pathologie, et de rechercher si les épi topes ou les dérivés responsables du développement de la PR seront apparentés à ceux d'EAE. a) Matériel et méthodes. - L'arthrite à adjuvant : L'ensemble des expérimentations est effectué sur la souche de rattes Lewis. Chaque animal a reçu par voie sous-cutanée dans les coussinets de chaque patte arrière 0,05 ml d'une émulsion d'ACF H37Ra contenant 0,05 ml de NaCl 0,9 %, plus 0,05 ml d'ACF supplémenté par 1 mg de Mycobacterium tuberculosis. Des lots homogènes de rattes ont été constitués. Ils ont été soumis aux mêmes conditions que celles utilisées pour le modèle d'EAE. Quatre groupes de 5 rattes, âgées de 7 semaines (poids moyen: 200 g) ont été constitués. Groupe "Témoin" : chaque rate de ce groupe a reçu seulement l'émulsion indiquée ci-dessus. Groupe de sérum non immun de souris "SNI" chaque rate a reçu l'émulsion, et après 4 jours une Injection par voie sous cutanée, de 5 mg/kg 'immunoglobulines (précipitées au sulfate d'ammonium) de souris normales. L'injection a été faite une fois par jour pendant deux jours. Groupe "Aminognanidine" : chaque rate a reçu l'émulsion, et après 4 jours une injection, par voie sous-cutanée, de l'aminoguanidine (25 mg/kg) une fois par our pendant deux jours. Groupe "Ac monoclonal" : chaque rate a reçu en plus de l'émulsion, et, après 4 jours, 5 mg/kg d'Ac monoclonal anti NO-Cys (précipité au sulfate d'ammonium) par voie sous-cutanée. Evaluation clinique des symptômes arthritigues: Une attention particulière a été portée pour détecter t'atteinte articulaire arthritique. L'état onflammatoire des pattes a été apprécié de la façon ,suivante : oedème de la patte (ne gênant pas la marche); grosse patte; oedème de la patte gênant la marche ou patte "inflammatoire". En se basant sur le score arthritique déjà cité {l dessus, il a été possible de suivre chez les rattes de ris 4 groupes l'évolution des signes cliniques au cours du temps pendant 40 jours après l'immunisation. Test immunoenzymatigue Les Inventeurs ont recherché dans le sérum des rattes la présence d'Ac dirigés contre des épitopes nitrosylés ou nitrés qui peuvent apparaître in vivo au cours du développement de ce modèle. Nous avons donc testé la présence des signaux immunologiques sur les conjugués suivants N02-Tyr-SAB; NO-Tyr-SAB; Tyr-SAB; NO-Cys-SAB; Cys-SAB et la SAB-G pour les mêmes raisons citées dans le modèle précédent. Les conditions du test ELISA sont aussi les mêmes. b) Résultats. - Etude comparative des résultats cliniques Groupe "Témoin" et goupe "SNI" : Les rattes de ces deux groupes ont développé les signes typiques d'une arthrite articulaire qui se traduit par une apparition d'oedèmes au niveau des coussinets plantaires des pattes postérieures deux jours après l'immunisation; ces signes rhumatologiques ont évolué avec le temps, vers des grosses pattes avec ulcération purulente; après environ 10 jours,une difficulté à la marche; certaines rattes ont montré des déformations articulaires au niveau des pattes postérieures. En conclusion, ces deux groupes ne présentent pas de différence. Les scores cliniques chez la plupart de ces dix rattes sont passés aux scores 5, 6 et 7. Le sérum de souris non immunisée injecté 4 jours après l'administration de l'antigène, n'a pas eu d'effet sur l'aggravation de la maladie ni d'effet protecteur. Groupe "Aminoguanidine" : Trois rattes ont développé des oedèmes sans difficulté à la marche, puis sont passées aux scores 4 et 5. Les deux autres rattes ont atteint les scores 6 et 7. Groupe "Ac monoclonal" : les résultats obtenus avec ces rat tes peuvent être décrits de la façon suivante: apparition au bout de la première semaine seulement d'un oedème moyen chez toutes les rattes; absence de l'évolution vers le stade d'ulcération; pas de difficulté à la marche: les rattes ont (onservé leur capacité à s'appuyer normalement sur les pattes postérieures; une seule rate a présenté une stade inflammatoire sans difficulté à la marche, ou une présence d'arthrite sanglante ou purulente qui a été observée chez le groupe "Témoin" et le groupe "SNI". En conclusion, NO ou un de ses dérivés qui peut entre la NO-Cys, le péroxynitrite, la nitro-tyrosine ou d'autres réactifs oxygénés ont un rôle dans le développement du modèle de polyarthrite articulaire et donc dans les processus inflammatoires. - Etude de l'évolution des Ac développés contre des néoéqitopes nitrosylés et nitrés dans le sérum des rattes Les figures 26 à 29 rapportent l'étude de 'dévolution des anticorps dirigés contre les conjugués NOCys-O-SAB, NO-Tyr-SAB et NO2-Tyr-SAB dans les sérums des rates (PR) , la figure 26 pour le groupe " Témoin", la figure 27 pour le groupe "SNI", la figure 28 pour le groupe "Aminoguanidine" et la figure 29 pour le groupe "Anticorps monoclonal". Chaque point représente la moyenne de l'écart type de DO obtenues chez toutes les rattes. Groupes "Témoin" et "SNI" Les sérums des dix rat tes prélevés pendant 5 semains ont été testés sur les conjugués NO-Cys-G-SAB; NO-Tyr-SAB; N02 Tyr-SAB, et sur les conjugués non nitrosylés correspondant. Les figures 26 et 27 montrent chez les groupes "Témoin" et "SNI", respectivement, l'évolution au cours du temps des anticorps induits contre deux épitopes : N02-Tyr-SAB et NO-Tyr-SAB. Ces résultats représentent la moyenne de deux tests. Les DO obtenues dans chaque groupe sont équivalentes sur tous les conjugués testés, chaque point représente la moyenne et l'écart-type des DO obtenues avec les 5 rattes d'un même groupe pour un même conjugué. Pour ces deux conjugués les DO obtenues varient entre 1 et 2 entre les 2ème et 5ème semaines. Pour le conjugué NO-Cys-G-SAB les signaux sont très faibles (DO O, t > Les croupes "Aminoauanidine et Ac monoclonal": Les signaux immunologiques révélés chez les 10 rat tes de ces deux groupes sont équivalents entre les rattes d'un même groupe et sur tous les conjugués testés. Les courbes représentent la moyenne de deux tests et les résultats sont analysés de façon identique aux groupes précédents. Comme dans les autres groupes, pour le conjugué NO-Cys-G-SAB les signaux restent très faibles. Pour le groupe "Aminoguanidine" : (figure28) t'anti-NO-Tyr est la réponse la plus élevée, les DO sont entre 1,5 et 2 (entre les 2ème et 5ème semaines). La réponse anti-N02-Tyr est aussi importante, on note une augmentation des signaux entre les 1ère et 2ème semaines. ils se stabilisent jusqu'à la 3ème semaine puis augmentent lOgèrement vers la 4ème semaine. Pour le groupe "Ac monoclonal" (figures 29): on remarque que chez ces animaux aussi la réponse anti-NO-Tyr est plus importante que celle anti-N02-Tyr. Mais, on note également qu'un plateau a été trouvé pour les deux types d'Ac et ceci entre les 3ème et 5ème semaines. Ceci peut être dû à une réactivité croisée entre ces Ac puisque les deux réponses ont évolué puis se sont stabilisées aux mêmes périodes. De plus, le taux d'anti-NO-Tyr et d'anti N02-Tyr dans le sérums de ces rattes sont légèrement moins importants que ceux obtenus chez les rattes des groupes "SNI" et "Aminoguanidine". Par contre la courbe représentant l'anti-NO-Tyr montre le même aspect et la même amplitude que celle du groupe "Témoin". Du fait de l'importance des réponses anti-NO-Tyr et anti-N02-Tyr, d'autres tests pour rechercher des Ac anti-NO-Tyr-G-SAB ont été réalisés. Ainsi, des DO obtenues dans les mêmes conditions de test ELISA étaient presque négligeables chez les quatres groupes. Ces résultats signifient que la présentation de l'épitope est capitale. Une différence dans la conformation spatiale entre les différents épi topes nitrosylés est sûrement présente in vive. Elle est essentielle pour induire une réponse immunitaire. En conclusion, ces tests immunoenzymatiques n'ont mis en évidence aucune différence significative entre les quatres groupes. Une augmentation du titre en anticorps induits contre des épi topes nitrosylés et nitrés a été trouvée dans chaque prélèvement. Pour le groupe "Ac monoclonal", une protection efficace mais partielle des rattes a été observée, en revanche, les réponses immunologiques obtenues chez les animaux de ce groupe ont été identiques à celles des trois autres groupes. c) Discussion. La production d'anticorps circulants, a été trouvée dans le sérum des animaux par le test ELISA dans les deux modèles. Pour l'EAE, des travaux récents ont mis en évidence la présence d'anticorps anti-NO-Cys-G dans le sérum des rat tes qui ont développé cette pathologie (Boullerne, 1996, thèse d'Université). Les travaux cidessus confirment l'implication du néoépitope (NO-Cys), parmi d'autres facteurs déclenchant les signes neurologiques, dans cette maladie expérimentale et donc la présence in vivo des anticorps reconnaissant cet épi tope. L'utilisation d'Ac monoclonaux dirigés contre ce même épitope est donc indispensable pour capter ce dernier. Pour la PR, aucun travail n'a mis en évidence l'implication de l'épitoge NO-Cys dans le développement de cette maladie. Mais la cystéine (Stamler et al., 1992b) est une cible de la nitrosylation avec la formation de thionitrites. De plus, une nitration de la tyrosine par le ONOO- par exemple, (Beckman et al., 1994b; Van Der Vliet et al., 1994) donne la nitrotyrosine qui a été mise en évidence dans des procéssus inflammatoires. Des phénomènes de transnitrosylation peuvent aussi avoir lieu in vivo, entre différentes molécules portant des résidus thiols accessibles au NO (Scharfstein et al., 1994) ce qui donne lieu à plusieurs produits nitrosylés. Dans le modèle de PR a adjuvant, le NO et l'anion superoxyde sont considérés comme facteurs d'induction et de développement de cette pathologie (Ialenti et al., 1993; Oyanagui, 1994; Cannon et al., 1995). Ce modèle expérimental a été induit chez des rat tes injectées avec du mycobacterium en présence ou non d'aminoguanidine ou de l'Ac monoclonal dirigé contre lJn épi tope NO-conjugué afin de comparer leur rôle protecteur. La protection des rattes par les Ac contre le développement de la maladie chez les rattes EAE est de 100 Les Ac monoclonaux ont un rôle inhibiteur moins important dans le modèle PR, suggérant l'intervention d'autres facteurs que la NO-Cys dans le déclenchement de ta maladie. Il convient également de remarquer la bonne tolérance des Ac monoclonaux de souris par les rattes, du Fait de la faible distance immunologique entre souris et r a t Par ailleurs, les réponses immunologiques trouvées dans le sérum de tous les animaux contre les conjugués NO-Cys-G-SAB; NO-Tyr-G-SAB et N02-Tyr-SAB, permettent de suivre et comparer non seulement les signes cliniques, mais aussi l'apparition et l'accroissement de ces signaux. Les Ac monoclonaux de l'invention ont permis de mettre en évidence le rôle de NO dans le développement de T'EAU où les résultats obtenus étaient très satisfaisants. Par contre, l'utilisation de ces Ac chez les rattes développant la PR à adjuvant est moins efficace ce qui limite l'utilisation de ces Ac monoclonaux à l'épitope contre lequel ils sont dirigés. VI - CONCLUSIONS. La possibilité d'obtenir l'induction d'une réponse immunitaire spécifique dirigée contre des épi topes nitrosylés, en utilisant des immunugènes synthétisés, a abouti à rechercher la possibilité de cette induction dans des conditions "naturelles". La présence d'Ac dirigés contre des épitopes nitrosylés dans des affections parasitaires où d'une part les quantités d'Ac produits sont considérables et d'autre part l'implication du monoxyde-drazote a été mise en évidence, a été recherchée. Dans ces affections, on constate, en effet, une augmentation du taux d'IFN-y, la mise en évidence de différents rôles du NO et d'une production de nitrites par les macrophages péritonéaux. Dans le cas des travaux montrant in vi tro le rôle cytotoxique de NO sur les parasites intracellulaires tels que les Leishmanies, les macrophages activés ont été identifiés comme cytotoxiques vis-à-vis de ces parasites (Murray et al., 1983; Hall et Titus, 1995) . Plus récemment les oxydes d'azote et particulièrement le NO libérés par les macrophages activés, ont été considérés comme des produits indispensables pour leur cytotoxicité intracellulaire contre les Leishmanies (Liew et al., 1990; Reiner et Locksley, 1992). Chez l'homme Vouldoukis et coll. ont également mis en évidence cet effet en présence des monocytes humains activés (1995). Ils ont montré que la ligation de CD23 par le complex IgE-anti-IgE, ou par l'anticorps monoclonal anti-CD23 induit la synthèse de NO. De plus, il y avait une génération de différents cytokines par les monocytes/macrophages humains. Ainsi, la ligation (IgE-anti-IgE)/CD23 induit un effet cytotoxique vis-à-vis des parasites intracellulaire: Leishmania major dans les macrophages humains via l'induction de la voie L-arginine/NO. Ceci a été démontré par une augmentation de N02-, et par le blocage de cet effet par le NMMA. Egalement l'activation de ces macrophages humains par l'IFN^y/TNFa induit la même activité leishmanicide inhibée par un anti-TNFa. D'autres part, les Inventeurs ont montré l'effet cytostatique des monocytes humains vis-àvis des parasites extracellulaires (T. gambiense) . En présence de 1 'Ac monoclonal (anti-NO-Cys-G) ou de NMMA cet effet trypanostatique a été inhibé indiquant alors le rôle de NO. Tous ces résultats montrent la possibilité de 1 'activation des monocytes humains pour induire un effet cytostatique et / ou cytotoxique sur des microorganismes intracellulaires ou extracellulaires. Des travaux réalisés in vivo ont également montré le rôle du NO dans la défense de l'hôte contre la leishmaniose. Une injection de NMMA à des souris résistantes à cette parasitose, inhibe la production endogène de NO et entraîne une exacerbation des lésions (Evans et al., 1993). Plus récemment, il a été démontré qu'une mutation du gène de la iNOS chez les souris résistantes les rend suscéptibles (Wei et al., 1995). Lors des trypanosomoses, on constate une réponse de type "Thl" dirigée contre les antigènes parasitaires (Schleifer et au. 1993). La présence de produits d'origine parasitaire declenchant la production d'IFN-y, de TNF-a, et de iNOS entraîne une hyperproduction de NO (Olsson et au. 1991; (;ternberg et Mabott, 1996). Outre son rôle drltiparasitaire, le NO produit, participe à I'immunosuppression observée au cours de la trypanosomose. La chronologie et le lieu de production de NO peuvent être déterminants dans l'effet global lié à NO observé dans les trypanosomoses. Chez les souris (C57 BL/6) résistantes à Plasmodium chabaudi AS, il y a expression précoce de la iNOS au niveau de la rate, correlée avec la résistance à l'affection. Chez les souris susceptibles, il y a une expression tardive de la iNOS au niveau du foie Uacobs et al., 1995). Les mêmes souches de souris sont "résistantes" (C57 BL/6) et susceptibles (BALB/c) à Leishmania major (Evans et al., 1993; Wei et al, 1995) et à T.-musculi (Albright et Albright, 1981). La protection contre Leishmania major est correlée à une production de NO. Dans les trypanosomoses provoquées par les trypanosomes du groupe brucei, on observe une immunodépression très marquée. L'inhibition de la synthèse de NO prolonge la survie des animaux trypanosomés (Sternberg et al, 1994) . Le rôle cytostatique et/ou cytotoxique de NO produit par les macrophages sur T. musculi a ainsi été mis en évidence. En utilisant différents conjugués nitrosylés, il a été possible de détecter dans le sérum de souris trypanosomées des Ac dirigés contre plusieurs épitopes nitrosylés. La présence de ces Ac mérite d'être soulignée à plusieurs titres. Tout d'abord, ils apparaissent naturellement au cours d'une réponse immunitaire de type Thl qui entraîne la production de NO, dont la fixation sur les antigènes provoque des modifications conformationnelles reconnues par le système immunitaire. Dans différentes affections parasitaires les Ac "induits" ont un rôle de "marqueur" de la parasitose, et peu d'efficacité contre l'agent pathogène; dans certains cas, ils masquent les parasites ou bloquent l'action d'autres Ac, plus efficaces qu'eux. La caractérisation de sos Ac est donc intéressante. Egalement, la mise en évidence de ces Ac aux différentes étapes d'une affection, peut renseigner sur les types successifs de réponses immunitaires mises en jeu. Ainsi, dans certaines affections, la protection est assurée par la successsion d'une réponse type "Thl" et d'une réponse type "Th2". L'apparition d'antigènes modifiés par NO et ses dérivés pourrait déclencher l'induction d'un réponse immunitaire de type protecteur ? Quelque soit leur rôle, la détection d'antigènes nitrosylés peut se révéler très intéressante. Les Ac polyclonaux et monoclonaux peuvent grandement aider à cette détection et se révèlent d'un interêt capital. Ainsi, des Ac antinitrotyrosine permettent la détection de la nitrotyrosine, dont l'apparition est liée à la présence de peroxynitrite (Van Der Vliet et al. , 1994; Irchiropoulos et Al-Mehdi, 1995; Crow, 1996) . Cet Ac permet donc de connaître les situations où le peroxynitrite est synthétisé et de détecter les cibles de l'affection. La nitrotyrosine a été visualisée en utilisant des techniques immunologiques au niveau des vaisseaux coronaires lors d'une athérosclérose (Beckman et aI. 1994a) . De plus, chez les malades atteints de la PR, elle a été détectée dans les liquides synoviaux (Farrell (-t- al. 1992). Mais, malgré une corrélation entre nitration et évolution pathologique, il reste à rechercher -;i la nitration des tyrosines au niveau des protéines provoque les lésions primaires qui déclenchent l'inflammation, ou si elle est secondaire aux processus inflammatoires. En fait, le péroxynitrite réagit de façon :implexe avec je avec les différentes molécules biologiques entraînant l'hydroxylation, la fragmentation de 1'ADN, l'oxydation des centres fer-soufre des protéines, etc. et surtout la formation de la nitrotyrosine qui constitue la race la plus marquante de peroxynitrite. Cette nitrotyrosine ainsi formée, induit des lésions tissulaires via plusieurs mécanismes (Beckman et al., 1994a) : 1) altération de la phosphorylation de la tyrosine; 2) altération des fonctions protéiques par introduction de charges négatives sur les sites hydrophobes de la tyrosine, ce qui pourrait altérer la conformation protéique; 3) initiation de processus autoimmuns par la présence des nitrophénols telle que la nitrotyrosine, reconnue très antigénique (Kofler et al., 1992; Maeji et al. , 1992; Mizutani et al., 1995; Yuhasz et al., 1995). A partir de ces données montrant le rôle de nitrotyrosine dans des processus inflammatoires et destructifs, il est possible de déduire que les Ac dirigés contre les différents éléments dérivés du NO peuvent également permettre leur caractérisation et la connaissance de leur propriétés. Citons par exemple, le rôle bien connu des thiols, des S-nitrosothiols et de la Snitrosoalbumine dans la vasodilatation in vivo et in vitro (Stamler et al., 1992c, d; Keaney et al., 1993; Simon et al., 1993). Grâce aux Ac anti-NO-Cys, une fonction immunitaire portée par l'albumine a pu être établie. Rappelons ici que la NO-SAB peut servir de réservoir de NO dans le plasma, à partir duquel NO peut être transporté vers le milieu intracellulaire par un mécanisme de transnitrosylation. Après son transport, NO a accès à ses cibles intracellulaires telles que la guanylate cyclase ou les hémoprotéines, ce qui résulte en une activité physiologique qui peut devenir pathologique en cas d'altération au niveau de la transnitrosylation. La forme NOSAB formée à partir d'une source biologique (macrophages) a été largement utilisé, mais, dans un premier temps, d'autres molécules nitrosylées (;ynthétisées à pH acide à partir d'un donneur de NO ont c;té utilisé. Ceci a permis de développer des Ac poty- et monoclonaux. Dans un deuxième temps, la présence des molécules nitrosylées a été détectée en utilisant ces Ac. Ces dérivés nitrosylés étaient synthétisés dans des co-cultures: macrophages activés / SAB ou macrophages activées / SAB / parasites. La détection a été réalisée non seulement par la technique immunoenzymatique mais aussi par la révélation du rôle cytotoxique de NO sur des parasites extracellulaires. Cet effet de NO est amplifié lors de la présence de la protéine porteuse, la SAB, et a été neutralisé en présence des Anticorps de l'invention. Les macrophages activés produisent NO, mais peuvent aussi produire d'autres dérivés oxygénés tels que HOCl (De Violet et al., 1984; Vincendeau et al., 1989), H2O2 (Vincendeau et al., 1981), et surtout 02-0 La question posée est de savoir si la présence de cet anion est nécessaire à la formation de l'albumine nitrosylée. O2C ou un autre derivé de l'oxygène (H202, 3OCl) peut être l'élément réagissant avec NO. Il est connu on effet que les neutrophiles et les macrophages murins roduisent simultanément NO et H202 ainsi que d'autres espèces réactives oxygènées qui participent à la cytotoxicité (Pacelli et al., 1995). Il est en effet connu que les dérivés de l'azote et de l'oxygène peuvent également interagir pour former ciels dérivés ayant différentes fonctions. La neutralisation de ces fonctions par un blocage sélectif de telle ou telle molécule peut se révéler très instructive. De plus, il convient de remarquer que, lors de l'utilisation d'un donneur chimique de NO (NaNO2), un pH acide était nécessaire pour réaliser la nitrosylation. Par contre, dans le milieu de culture le pH est neutre. Nous pouvons répondre à cette question en tenant compte des données de P;haritonov qui montre qu'une nitrosylation peut avoir lieu n vitro, en milieu oxygéné et à pH 7 par le biais de N203 (haritonov et al., 1995), même si cette nitrosylation est moins importante que celle de la Cys ou le Glutathione, par exemple. Mais, pour répondre à cette question, il faudra mettre en oeuvre des piégeurs de dérivés oxygénés tels que SOD, catalase, taurine, qui permettront d'étudier ta nitrosylation in vitro, à pH neutre. La nitrosylation de la SAB in vitro et l'effet cytotoxique correspondant, incitent à éclaircir un point important concernant les expérimentations réalisées dans des conditions légèrement différentes - Dans les premières conditions, les trypanosomes et la SAB ont été incubés ensemble. Les macrophages activés vont produire NO, mais aussi de nombreux autres radicaux libres. Ainsi, des dérivés oxygénés, toxiques ou non, seront formés. Ceci nous permet de postuler que, pendant l'incubation, ces dérivés pourraient agir "en compétition" avec NO sur les trypanosomes pour masquer et/ou interférer avec son effet toxique. - D'où l'intérêt des secondes conditions expérimentales où la SAB a été placée en présence de macrophages activés pour être nitrosylée. Puis, la NOSAB formée a été transférée dans des milieux de co-cultures parasites / macrophages normaux qui ne produisent pas ou très peu des radicaux libres. Dans ces conditions, on peut admettre que l'effet de la NO-SAB ajoutée dans ces cultures, pauvres en radicaux libres, est dû à NO et non pas à d'autres dérivés oxygénés. - Les résultats obtenus au cours de ces expérimentations ont été confirmés en utilisant un Ac anti-SAB. Lors de l'utilisation de cet antisérum, l'effet trypanocide de la NO-SAB a persisté dans les premières et les deuxièmes conditions. Ceci indique que l'effet neutralisant, observé en présence des Ac "T" ou "C", est propre à ces derniers malgré leur caractère polyclonal. Il convient aussi d'ajouter que les secondes conditions ont permis également de montrer l'absence d'un effet "stimulateur" ou "inhibiteur" des complexes immuns qui pourraient être formés au niveau des macrophages. En effet, l'utilisation des macrophages normaux (n'exprimant pas la iNOS) , en présence des Ac polyclonaux, des trypanosomes, et du surnageant contenant la SAB nitrosylée, a montré des résultats équivalents à ceux obtenus selon les premières conditions. Ceci montrent que quelque soit l'influence de complexes immuns au niveau des macrophages activés, la production de NO à partir de ces cellules (exprimant la iNOS) n'a pas été modifiée. Ainsi, nous déduisons que selon ces deux conditions, l'effet cytotoxique de NO sur les T. musculi est dû particulièrement à la formation de la NO-SAB. Celle-ci a donc exercé cet effet soit par la libération de NO qui s'est fixé sur ses cibles, soit par un mécanisme d'échange de NO entre la SAB et les acides aminés ou les protéines parasitaires. La mise en évidence de la formnation de dérivés nitrosylés in vitro par les tests immunoenzymatiques, ou par l'effet cytotoxique a conduit à rechercher les sites de fixation de NO au niveau de ces parasites. Cette recherche a débuté par l'utilisation de la technique immmunocytochimique : - Les meilleurs résultats étaient obtenus avec les macrophages activés. Les Ac poly et monoclonaux ont servi comme outils de marquage des sites de fixation de NO au niveau des parasites. Ces résultats ont été très reproductibles, ce qui n'était pas le cas lors de 1utilisation de NaNO2 ou de NO-SAB synthétisés chimiquement. Avec ces molécules, la demi-vie des trypanosomes ne dépassait pas 10 min et leur forme n'était pas conservée. Nous avons expliqué ce fait par la présence d'excès de NO libéré par ces donneurs chimiques, qui avaient une action intense sur les parasites se traduisant par leur lyse. - L'utilisation de contrôles a donné des marquages faibles ou une absence totale d'immunoréacivité. Ceci a confirmé la positivité des marquages obtenus en présence des macrophages activés (sans NMMA) avec les Ac poly et monoclonaux utilisés comme Ac primaires. Ces Ac spécifiques des épitopes nitrosylés, ont montré la présence d'au moins des résidus cystéines et tyrosines nitrosylés. Ceux-ci ont été reconnus par leur Ac correspondant. Cette immunoréactivité pourrait être expliquée soit par la fixation de la SAB nitrosylée à la surface parasitaire, soit par des mécanismes de transnitrosylation entre cette molécules et les antigènes parasitaires portant un résidu thiol. Leur nitrosylation pourrait donc être à l'origine de l'effet cytostatique médié par la NO-SAB. En effet, des nombreuses études ont mis en évidence le rôle de NO dans la modulation de l'activité de certaines protéines en se fixant sur leur residu thiol (Stamler et al., 1994) ce qui permet la régulation de certains mécanismes cellulaires. Parmi celles-ci nous citons la guanylate cyclase soluble (Stamler et al., 1992a); le récepteur NMDA (Lipton et al. 1993); protéine kinase C (Gopalakrishna et al., 1994 > ; le p21raS (Lander et al., 1995); GADPH (Mohr et al., 1996) ainsi que le facteur de transcription OxyR (Hausladen et at., 1996). La transnitrosylation de NO à partir de la SAB des thiols des molécules biologiques, dépend de la réactivité de ces molécules, de celle de la SAB ainsi que de la stabilité de S-nitrosothiol formé (Scharfstein et al. , 1994). Donc, pour identifier ces molécules nitrosylées détectées au niveau des trypanosomes, des expérimentations par immunoempreintes utilisant le gaz NO ou le NaNO2 pour la nitrosylation des protéines parasitaires sont envisageables. Ces expérimentations autorisent la détection de sites protéiques ayant été accessibles au phénomène de nitrosylation in vitre. Les résultats obtenus sont très préliminaires et peu satisfaisants. En effet, la nitrosylation selon des conditions bien déterminées pourrait entraîner une meilleure accessibilité aux Ac correspondants. Notons que cette hypothèse a déjà été citée pour des dérivés nitrés ((rot, 1996) L'optimisation de ce protocole peut être obtenue en utilisant les macrophages activés comme donneurs du NO. Des mécanismes intervenant lors du contact parasites / cellules activées, aidant à la nitrosylation et à la modification structurale des cibles protéiques peuvent etre envisagés. Après leur nitrosylation à partir des donneurs chimiques du NO, les protéines seront peut être mieux reconnues par les Ac que lorsqu'elles sont nitrosylées chimiquement. I1 est important de noter ici, qu'une différence significative entre la nitrosylation produite par NO synthétisé enzymatiquement et celle réalisée par des donneurs chimiques de NO a été démontrée (Ignarro et al., 1993). Enfin, il existe probablement d'autres sites de nitrosylation sur les parasites, autres acides aminés (lysine, tryptophane, etc.), centres fer-souffre de certaines enzymes, etc. Après ces travaux in vitro, le rôle pathologique de NO a été étudié in vivo. NO a été mis en évidence dans des nombreuses pathologies (Bagasra et al., 1995; Moilanen et Vapaatalo, 1995; Grabowski et al., 1996). Par exemple, dans le cas du choc septique, l'expression de la iNOS dans le système vasculaire aboutit à une vasodilatation, une diminution de l'activité vasoconstrictrice, une hypotension, et une destruction tissulaire (Petros et al., 1994) . Mais, ces modifications au niveau du système vasculaire, ne sont pas strictement dues au NO libre. Des nombreux travaux in vivo et in vitro ont montré que des dérivés S-nitrosylés sont des composés vasodilatateurs, inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire, et régulateurs du débit sanguin et de la tension artérielle. Les plus étudiés sont les S-nitrosocystéines, S-nitrosoalbu 1986; Koh et al., 1986; Koh et Choi, 1988). Ces neurones semblent être également préservées dans des pathologies telles que la maladie d'Alzheimer ou la chorée d'Huntington où le rôle de NO a été mis en évidence (Ferrante et al., 1985; Meldrum et Garthwaite, 1990; Olney, 1991). Plus récemment, NO a été identifé comme un liement effecteur des troubles neurologiques observée chez des malades atteints du syndrome d'immunodéficience acquise (Bukrinsky et al., 1995; Lipton et Gendelman, 1995) . Le NO est considéré comme nécessaire mais pas suffisant pour induire la mort cellulaire. Il peut réagir avec d'autres radicaux libres tels que les superoxydes, donnant lieu à la formation de peroxynitrite, espèce chimique particulièrement toxique (Beckman et al., 1990; Radi et al., 1991). Le NO est également un des médiateurs impliqués dans différent maladies "autoimmunes". Ainsi, par exemple, il participerait à la destruction des cellules ss des ilot de Langerhans et entraînerait l'apparition d'un diabète (Welsh et al., 1994; Lindsay et al., 1995; McDaniel et al. 1996) . De plus, NO synthétisé peut se fixer sur des acides aminés (surtout la cystéine et la tyrosine) entraînant une nitrosylation et une modification des protéines ou des enzymes au niveau tissulaire. Ces protéines du soi peuvent donc devenir, dans des conditions pathologiques, des molécules étrangères à l'organisme induisant chez l'homme des auto-anticorps, comme dans le cas de la sclérose en plaques et de la polyarthrite inflammatoire. La nitrosylation d'antigènes et l'apparition d'Ac correspondants serait un phénomène naturel, éventuellement majoré par une surproduction de NO. Le rôle de ces dérivés nitrosylés antigéniques pourrait être la destruction des cellules cibles qui les portent. Ainsi, la nitrosylation d'antigènes microbiens pourrait s'accompagner de celles d'antigènes du soi. Les Ac produits outre leur divers rôles sur les antigènes exogènes, pourraient également agir sur le soi. Selon la quantité produite, les propriétés biologiques liées à t'isotypie de l'Ac, et son affinité, différents résultats pourraient être observés: destruction des cellules, masquage des épitopes entraînant la protéction, etc... D'un point de vue expérimental, l'intervention du NO dans les pathologies inflammatoires et immunes expérimentales induites chez la rate Lewis est mai tenant bien établie. Plusieurs auteurs ont rapporté par des approches différentes que NO pourrait avoir un rôle important dans ces processus dégénératifs, l'un touchant myéline centrale, l'autre l'articulation et sa synoviale. Deux modèles animaux ont été développés dans le cadre de l'invention. Le premier qui mime l'évolution tourologique de la SEP et le second qui consiste en un odèle d'arthrite inflammatoire à adjuvant. Le rôle de NO ,t des dérivés nitrés dans les processsus inflammatoires et la destruction tissulaire a été démontré (Halliwell et au 1992; Winyard et al., 1992; Morris et al., 1995). Ensuite, des Ac circulants d'apparition précoce après induction des modèles expérimentaux ont été mis en évidence. Ces immunoglobulines reconnaissent trois cibles antigéniques portant NO ou N02 NO-Cys-G, NO-Tyr et NC -Tyr. Leur présence pourrait signer une stimulation Clntlgénique liée à l'hyperproduction de NO. D'autre part, l'analyse des processus physiopathologiques, cliniques et itrimunologiques, confirme une augmentation de la production d NO. Celle-ci pourrait être principalement localisée au niveau des lésions et sans doute en rapport avec la stimulation macrophagique. Mais les cibles endogènes: Cys et Tyr transporteurs potentiels de NO sont-elles des éléments clés dans la physiopathogénie ? Les effets thérapeutiques de l'Ac monoclonal anti-NO-Cys-G soulignent le rôle potentiel joué par l'épitope NO-Cys. La reconnaissance in vivo de cette cible entraîne l'abolition des symptômes d'EAE et diminue considérablement l'arthrite inflammatoire. L'antigène NO-Cys apparaît donc dans ces conditions comme une étape clé conduisant vers la destruction myélinique pour l'EAE et l'inflammation de la synoviale dans l'arthrite. La présence d'Ac dans le sérum des animaux expérimentaux et le rôle protecteur des Ac injectés, indiquent que la neutralisation de l'épitoge NO-CysG joue tin rôle protecteur important. L'absence de protection chez les animaux non injectés, malgré la présence des Ac, indique que (i) les Ac produits ont une affinité trop faible, ou sont en quantité insuffisante, ou produits trop tardivement. (ii) Les Ac produits n'ont pas les mêmes fonctions ou sont peut être d'un autre isotype que les Ac injectés. La détermination isotypique, l'étude ammunochimique des Ac produits, leur purification puis leur injection à des animaux expérimentaux permettront de rependre à ces questions. Enfin, les deux modèles animaux utilisés ont permis d'obtenir des résultats importants. En prenant 1'EAE (modèle expérimental de la SEP chez l'homme), pour laquelle une protection presque totale a été notée, les résultats obtenus constitue une approche thérapeutique de ta SEP. Références - ADAMS M. 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Revendications 1) Anticorps purifié reconnaissant spécifiquement une protéine nitrosylée. 2) Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine est un transporteur de NO. 3) Anticorps selon les revendications 1 ou 2, reconnaissant spécifiquement une albumine nitrosylée. 4) Anticorps selon l'une quelconque des îevcndications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est un anticorps polyclonal. 5) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est un anticorps rnonoclonal. 6) Ensemble d'anticorps selon la revendication 4 7) Immunogène pour la préparation d'anticorps ,=lon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine porteuse nitrosylée dont la séquence possède un site de nitrosylation, ou par un acide aminé nitrosylé couplé à une protéine porteuse. 8) Immunogène selon la revendication 7, caractérisé en ce que le site de nitrosylation ou l'acide aminé est choisi parmi la tyrosine, la cystéine éventuellement acétylée ou le tryptophane. 9) Immunogène selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la protéine porteuse est une albumine. 10) Procédé de préparation d'un immunogène selon l'une quelconque des revendications 8 à 9, caractérisé en ce que t'on couple un acide aminé à une protéine porteuse, puis en ce que l'on nitrosyle le conjugué obtenu par un composé donneur de NO. 11) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un ensemble d'anticorps selon la revendication 6 avantageusement dispersé dans un véhicule ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. 12) Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'un ensemble d'anticorps selon la revendication 6 ou d'une composition selon la revendication 11, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une pathologie dans lesquelles NO, ses dérivés ou conjugués sont Impliques. 13) Procédé de détection in vi tro de protéines nitrosylées dans un échantillon biologique comprenant au moins les étapes suivantes - la mise en contact de cet échantillon avec au moins un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un ensemble d'anticorps selon la revendication 6, éventuellement marqués, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques; - la détection d'un complexe immunologique antigène-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques. 14) kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un ensemble d'anticorps selon la revendication 6, éventuellement marqués, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique entre ledit anticorps et les protéines nitrosylées éventuellement présentes dans un échantillon biologique; - éventuellement un ou plusieurs réactifs de détection éventuellement marqués aptes à réagir avec les complexes immunologiques éventuellement formés; - éventuellement un ou plusieurs réactifs biologiques de référence et de contrôle.