FR 2759909 A1 19980828 FR 9702198 A 19970225 DILUEUR DE SPERME COMPRENANT DU PHOSPHOCASEINATE NATIF OU DE LA B-LACTOGLOBULINE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES UTILISATIONS. La présente Invention est relative à l'utili- sation de fractions protéiques laitières purifiées pour améliorer la survie des spermatozoïdes et leur aptitude à la fécondation, en vue de l'insémination artificielle ou de toute autre pratique de reproduction assistée. Les techniques d'insémination artificielle qui sont de plus en plus utilisées actuellement, posent des problèmes de conservation du sperme en attente de l'insémination. En effet, après la récolte, le sperme perd rapidement son pouvoir fécondant. Pour remédier à cette situation, et permettre la conservation du sperme jusqu'à son utilisation pour l'insémination artificielle, on utilise habituellement un milieu dénommé "dilueur" dans lequel on dilue le sperme aussitôt après sa récolte. La durée de conservation que l'on peut obtenir en présence de dilueur dépend de l'espèce concernée et des conditions de conservation, et en particulier du type de dilueur choisi ; elle varie en général de quelques heures à quelques jours. Chez certaines espèces, on peut prolonger cette durée par la congélation du sperme cependant, cette technique entraîne également la destruction ou l'inactivation d'un nombre important de spermatozoïdes, et donc une baisse de fertilité du sperme. L'obtention de dilueurs permettant d'améliorer la conservation et la capacité fécondante des spermatozoides a fait l'objet de diverses recherches. Parmi les dilueurs les plus fréquemment préconisés pour la conservation du sperme, on citera en particulier le lait, et les dilueurs à base de lait, qui sont utilisés par exemple chez les espèces caprine, ovine, bovine, et équine. Par exemple, chez cette dernière espèce, le dilueur dénommé INRA 82 , décrit par PALMER [10th Int. Congress on Anim. Reprod. and AI, Urbana-Champaign, IL USA, 3:377, (1984)] ou le dilueur de KENNEY [KENNEY et al., Proc. 21sot Am. Assoc. Equine Pract., 327-336, (1975)] sont actuellement les plus utilisés pour la semence d'étalon en vue d'inséminations artificielles immédiates ou différées. La température de conservation joue également un rôle important, bien que les différentes observations réalisées à ce sujet, en utilisant des dilueurs différents, aboutissent à des résultats divergents. Par exemple, chez le cheval, VARNER et al. [Theriogenology, (32) 515-525, (1989)] utilisent le dilueur de KENNEY et n'observent aucune différence de fertilité après utilisation du sperme conservé à 50C ou à 200C ; SQUIRES et al. [Proc llth Int Congress on Anim Reprod and AI, Dublin, Ireland, (3) 297, (1988)] utilisent le même dilueur et concluent à une meilleure fertilité du sperme conservé à SOC, mais uniquement pour certains étalons. De même la durée maximale de conservation a fait l'objet de rapports contradictoires. Certains auteurs [DOUGLAS-HAMILTON et al., Theriogenolgy, (22) 291-304, (1984)] ont utilisé les doses 6 heures à 24 heures après la récolte, et obtenu des gestations. D'autres, (SQUIRES et al. 1988, communication précitée) n'obtiennent par contre aucune gestation après conservation de la semence pendant 48 heures à 20"C. Une étude plus récente [HEISKANEN et al., Theriogenology (42) 10431051 (1994)] utilisant du sperme conservé 70 et 80 heures à 50C dans le dilueur de Kenney supplémenté en théophylline (10 mM) et Hepes (10 mM), donne des résultats de 77% et 57 de fertilité par cycle. Le lait présente en effet des qualités qui ont fait préconiser son emploi en tant que dilueur : c'est un milieu tamponné qui contient des constituants potentiellement protecteurs des spermatozoïdes (lipides, protéines et lactose). Cependant, il s'agit d'un produit naturel et particulièrement complexe, contenant plus de 100 000 espèces moléculaires, dont la composition n'est pas totalement connue, et où la présence de constituants potentiellement néfastes pour les spermatozoïdes (c'est à dire spermicides ou diminuant la motilité des spermatozoïdes), a été soupçonnée [GARCIA et GFAHAH, Cryobiology (24) 446454, (1987)]. En outre, du fait que le lait est un produit dont les composants ont une concentration variant sous l'effet de nombreux facteurs (stade de lactation, race, alimentation, etc.), les performances obtenues avec un dilueur à base de lait peuvent varier d'un lot à 1 'autre. La présente Invention a pour but l'obtention de dilueurs à base de constituants du lait, de composition définie et reproductible, et permettant d'améliorer la conservation du sperme, et d'en contrôler les conditions. Les Inventeurs ont découvert que, de façon surprenante, l'utilisation de fractions protéiques purifiées obtenues à partir du lait, en particulier le phosphocaséinate natif, et/ou la ss-lactoglobuline, en remplacement du lait dans le milieu de dilution du sperme, permettait d'augmenter de façon très significative, par rapport aux dilueurs à base de lait connus dans l'art antérieur, aussi bien la durée de conservation du sperme, que le taux de fertilité obtenu après conservation. Les Inventeurs ont également constaté qu'en revanche, d'autres protéines laitières, comme l'a-lactalbumine, étaient toxiques pour les spermatozoïdes. La présente Invention a pour objet l'utilisation d'une préparation purifiée de phosphocaséinate natif et/ou de ss-lactoglobuline pour l'obtention d'un dilueur de sperme. La présente Invention a en particulier pour objet un dilueur de sperme constitué par un milieu de base formé de constituants convenant pour la dilution du sperme d'une espèce animale déterminée, et par une fraction purifiée de phosphocaséinate natif, et/ou une fraction purifiée de ss-lactoglobuline. Par un milieu de base comprenant les constituants convenant pour la dilution du sperme d'une espèce déterminée , on entend tout milieu comprenant les constituants habituellement utilisés dans les dilueurs de sperme utilisés pour ladite espèce, et dans lequel les constituants toxiques pour les spermatozoïdes, en particulier l'a-lactalbumine, sont absents ou ne sont présents que sous forme de traces, de manière à ce que ces constituants ne soient présents dans le dilueur conforme à l'invention qu'à une teneur au plus égale à 2 à 3% (en poids) de la teneur en ss-lactoglobuline ou en phosphocaséinate natif et de préférence au plus égale à 0,5 à 1% (en poids) de la teneur en ss-lactoglobuline ou en phosphocaséinate natif. Un milieu de base convenant pour l'obtention d'un dilueur conforme à l'invention est par exemple constitué par une solution de sels minéraux et de glucides, tamponnée à un pH approprié. Avantageusement, il comprend également des additifs tels que des antibiotiques ou des antifongiques. La présente Invention a également pour objet un dilueur de sperme susceptible d'être obtenu par le procédé conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit dilueur de sperme comprend entre 1 et 100 g/l, de préférence entre 10 et 50 y/l de phosphocaséinate natif et/ou entre 10 et 200 g/l, de préférence entre 20 et 100 g/l de ss-lactoglobuline. La présente Invention a pour objet un procédé de préparation d'un dilueur de sperme, tel que défini cidessus, comprenant du phosphocaséinate natif, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape au cours de laquelle on procède à la dissolution du phosphocaséinate natif dans le milieu de base, à une température comprise entre 30 et 800C, de préférence entre 40 et 600C. La présente Invention a également pour objet un dilueur de sperme susceptible d'être obtenu par le procédé conforme à l'invention. La présente Invention a également pour objet des préparations du sperme en vue de l'insémination artificielle, caractérisée en ce que ledit sperme est dilué dans un dilueur conforme à l'invention. La mise en oeuvre d'un dilueur de l'Invention améliore nettement la conservation du sperme, par rapport aux dilueurs à base de lait utilisées dans l'art antérieur. Le sperme préparé en utilisant un dilueur conforme à l'Invention peut être conservé à des températures positives, comprises entre 40C et 200C, et avantageusement aux environs de 150C. La température de conservation optimale dépend également de l'espèce considérée. Chez le cheval, par exemple, la mise en oeuvre d'un dilueur conforme à l'invention permet de conserver le sperme à 150C en conditions aérobies, et d'obtenir une durée de conservation et un taux de fertilité supérieurs à ceux obtenus avec les dilueurs de l'art antérieur. Cette conservation à 150C permet d'éviter l'effet de choc thermique intervenant habituellement lors du refroidissement du sperme. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation d'un dilueur conforme à l'Invention, et de son utilisation chez le cheval. EXEMPLE 1 - PREPARATION D'UN DILUEUR CONFORME A L'INVENTION 1) Fractionnement du lait Le fractionnement des composants du lait écrémé cru est effectué par microfiltration sur membrane, [PIERRE et al. Lait (72) 461-474, (1992)] qui permet de séparer le microfiltrat (ou petit lait) du phosphocaséinate natif (caséines sous la forme micellaire qu'elles ont dans le lait). La ss-lactoglobuline est obtenue à partir du microfiltrat, selon le protocole décrit par MAUBOIS et al. [Bull. IDF, 212, 154-159, (1987)] Les étapes de ce fractionnement sont schématisées sur la Figure 1 en annexe. 2) Milieu de base Le milieu de base utilisé est le milieu HGLL, dont la composition est la suivante 0,140 g de CaCl2 0,40 g de KCl 0,06 g de KH2PO4 0,2 g de MgSO4, 7H2O 8 g de NaCl 0,35 g de NaHCO3 4,76 g d'Hepes 13,5 g de glucose 45 g de lactose eau distillée qsp 0,5 litres on ajoute à ce milieu de l'amphotéricine B, de la pénicilline, et de la gentamicine, pour parvenir à des concentrations finales dans le milieu de base respectives de 0,5 Ag/l, 500 UI/ml, et 100 Ag/ml. Ledit milieu de base est ensuite stérilisé par filtration sur une membrane dont le diamètre des pores est de 0,22 Am. 3) Préparation d'un dilueur à base de phosphocaséinate natif (dilueur PPCN). On ajoute à 0,5 litres d'eau, à une température de 600C, et sous agitation forte, 27 y de phosphocaséinate natif ; on poursuit l'agitation jusqu'à dissolution complète, et obtention d'une solution d'aspect laiteux. Cette solution est ensuite soumise à un traitement UHT (1453C, 2 secondes), puis mélangée à 0,5 litres de milieu de base obtenu comme décrit en 2) ci-dessus. Si nécessaire, le pH du mélange est ajusté à une valeur de 7,1. Le mélange est ensuite conditionné de façon aseptique. 4) Préparation d'un dilueur à base dess-lactoglobuline. On ajoute à 0,5 litres de milieu de base obtenu comme décrit en 2) ci-dessus, 0,5 litres d'une solution de P-lactoglobuline à 80 g/l, préalablement stérilisée par filtration sur une membrane dont le diamètre des pores est de 0,22 Am. Si nécessaire, le pH du mélange est ajusté à une valeur de 7,1. Le mélange est conditionné de façon aseptique. EXEMPLE 2 : EFFET DES DIFFERENTES FRACTIONS DU LAIT SUR LA MOBILITE DES SPERMATOZOIDES IN VITRO Différentes fractions du lait, à savoir le phosphocaséinate natif, et la -lactoglobuline mentionnés ci-dessus, et également l'a-lactalbumine, et le résidu d'ultrafiltration ont été testées. Ces fractions sont additionnées au dilueur de base HGLL. A titre de témoins, on a utilisé du HGLL additionné de 1% de BSA (Bovine Serum Albumine, Sigma A7906), du lait UHT du commerce, et du dilueur INP Dix étalons ont été utilisés au total, avec un minimum de 6 étalons (1 éjaculat par étalon) pour chaque test. Après la récolte, le sperme filtré sur de la gaze est dilué, pour obtenir une concentration de 20 x 106 spermatozoides/ml, dans les différents milieux à tester, puis stocké en conditions aérobies à 15 0C ou à 370C (0,5 ml de sperme dilué dans des tubes de 5 ml), ou anaérobies à 4 0C (5 ml de sperme dilué dans des tubes de 5 ml). Les durées de conservation ont varié entre 6 et 96 heures en fonction de la température et de la qualité des dilueurs utilisés afin que les observations soient réalisées à un moment où les dilueurs puissent être discriminés. Avant l'analyse, les échantillons sont réchauffés 10 minutes à 37nC. La qualité de la conservation du sperme est évaluée par analyse automatisée de la mobilité des spermatozoïdes (Hamilton Thorn Motility Analyser, Hamilton Thorn Research, Danvers, NIA, USA), en retenant comme critère le pourcentage de spermatozoïdes rapides c'est à dire ayant une vitesse supérieure à 30 Wm/sec. Les résultats sont illustrés par le Tableau I ci-après TABLEAU I Fractions HGLL HGLL HGLL ultrafiltrat de lait + + + + phosphocaséinate natif ss-lactoglobuline a- BSA (27g/l) (40 gli) lactalbumine (10 g/l) (1,2 11) témoins \ 40C 96h 15"C 96h 4"C 48h 1S"C 48h 370C 6h 15"C 48h ss 31% 43% 52% 35% 24% 135S, * * * ns * * HG'LL+lOfin BSA 16% l 18% 40Li0 51% BG, 31% 478 ns * Lriit UJIT &commat;0'7, 30L7o 4C/o 31% 4367c 52% 35%' INRA 82 47'77 21 C7! Les résultats obtenus avec les dilueurs témoin sont indiqués en italique. * p A 15 0C. après 96 heures de conservation, le pourcentage de spermatozoïdes rapides le plus élevé a été obtenu dans le dilueur HGLL + phosphocaséinate natif. Par contre à 40C, les résultats obtenus avec ce dilueur sont identiques à ceux obtenus avec le lait et inférieurs à ceux obtenus avec 1'INRA 82. La ss - lac tog ss-lactoglobuline permet d'obtenir des résultats significativement supérieurs à ceux obtenus avec la BSA à 4 C ; par contre à lSC ces 2 protéines apportent une protection identique. L'&alpha;-lactalbumine et l'ultrafiltrat sont 2 fractions toxiques pour les spermatozoïdes. EXEMPLE 3 : EFFET D'UN DILUEUR CONFORME A L' INVENTION COMPRENANT DU PHOSPHOCASEINATE NATIF, SUR LA FERTILITE IN VIVO 1) Sperme conservé pendant 24 heures Quatre expériences utilisant du sperme conservé 24 heures ont été réalisées. Dans chacune de ces 4 expériences deux types de conditions de conservation du sperme ont été comparées - dans 1'INRA 82 ou le dilueur de Kenney à 40C, en conditions anaérobies dans des seringues de 20 ml ne contenant que 10 ml de sperme dilué (piston tiré à moitié) - dans le dilueur HGLL + phosphocaséinate natif conforme à l'invention, à 150C en conditions aérobies dans des seringues de 20 ml contenant 10 ml de sperme dilué et 10 ml d'air (piston tiré complètement). La semence d'étalon est diluée à une concentration de 20 x 106 spermatozoïdes par ml. Les races des étalons, leur nombre, le nombre de cycles ont varié selon les expériences. Les conditions expérimentales sont résumées dans le tableau II ci-après. TABLEAU II N d'expérience 2 3 A 4 Animaux poneys chevaux de selle et lourds chevaux de sclle nombre d'étalons 2 3 4 4 nolllbrc de cycles X4 90 1 125 62 dilueur 4'DC INRA 82 dilucur de dilueur de dilueur de KENNEY KENNEY KENNEY Les ponettes et les juments ont été échographiées chaque jour à partir du premier jour des chaleurs et réparties au hasard dans les 2 lots. Dans l'expérience n01, les ponettes ont été inséminées une première fois quand le follicule dominant a atteint 33 mm. L'ovulation a été induite 24 heures après par une injection intraveineuse de 25 mg de C.E.G (crude equine gonadotrophin ou extrait hypophysaire équin total) et une seconde insémination a été réalisée 48 heures après la première, si l'ovulation n'était pas survenue. Dans les expériences n 2 à 4, les conditions ont été plus proches des conditions d'élevage : les juments ont été inséminées à partir du jour où le follicule dominant a atteint 33 mm, toutes les 48 heures jusqu'à ovulation. Le tableau III ci-dessous reyroupe les résultats de ces 4 expériences, exprimés en pourcentage de femelles chez lesquelles le diagnostic de gestation est positif au 14eme jour après l'ovulation TABLEAU III N i 2 3 4 Total (I' expérience 4 C 36% n =41 39% n =44 34'4 n 64 5X'S n 31 41%n = 171 n z"C 6()67 n = 43 50% n =46 47% n = 61 87% n = 31 57% n n = 175 Dans chaque expérience les doses conservées à 15"C avec le dilueur conforme à l'invention ont permis d'obtenir une fertilité par cycle supérieure à celle obtenue avec les doses conservées à 40C. 2) Sperme conservé pendant 72 heures Une expérience utilisant du sperme conservé 72 heures avant insémination a également été réalisée. Toutes les doses ont été préparées dans le dilueur HGLL + phosphocaséinate natif conforme à l'invention et ont été utilisées soit pour insémination immédiate, soit après conservation à 15 0C avec agitation constante. Les ponettes ont été échographiées chaque jour à partir du premier jour des chaleurs et réparties au hasard dans les 2 lots. Cent deux cycles de ponettes ont été utilisés au total. Dans la première partie de l'expérience, toutes les ponettes ont été inséminées une seule fois, environ 7 heures avant l'ovulation induite par une injection intraveineuse de 25 my de C.E.G. Dans la seconde partie, les ponettes du lot "inséminations différées" ont été inséminées 2 fois : la première fois environ 12 heures avant l'ovulation induite et la seconde fois environ 4 heures après l'ovulation. Les résultats (en pourcentage de femelles chez lesquelles le diaynostic de gestation est positif au 14eme jour après l'ovulation) sont illustrés par le tableau IV ci dessous TABLEAU IV IA immédiate IA 72 heures première partie 65% n = 17 50% n=20 n = 2(1 seconde partie 70Ç, n = 33 47% n=32 n = 32 Total 68 % n = 50 AXt n = 52 Les résultats obtenus pour les 2 parties de l'expérience sont été identiques. On n'a pas observé d'effet du nombre d'inséminations et pas d'effet d'une seconde insémination post-ovulation très proche du moment de l'ovulation. Les pourcentages de fertilité par cycle sont de 48% obtenus après inséminations différées de 72 heures, et de 68% obtenus après inséminations immédiates. Ces résultats montrent que la fertilité obtenue après 72 heures de conservation du sperme à 150C dans le dilueur HGLL + phosphocaséinate natif est d'une qualité qui peut permettre son utilisation dans les élevages. REVENDICATIONS 1) Dilueur de sperme, constitué par un milieu de base formé de constituants convenant pour la dilution du sperme d'une espèce animale déterminée, et par une fraction purifiée de phosphocaséinate natif, et/ou une fraction purifiée de ss-lactoglobuline. 2) Dilueur de sperme selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend entre 1 et 100 g/I de phosphocaséinate natif et/ou entre 10 et 200 g/l de - lactoylobuline. 3) Dilueur de sperme selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend entre 10 et 50 g/l de phosphocaséinate natif et/ou entre 20 et 100 g/l de - lactoglobuline. 4) Procédé de préparation d'un dilueur de sperme selon une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant du phosphocaséinate natif, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape au cours de laquelle on prépare une solution de phosphocaséinate natif, en procédant à la dissolution dudit phosphocaséinate natif dans un milieu aqueux, à une température comprise entre 30 et 800C, de préférence entre 40 et 600C. 5) Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ladite solution de phosphocaséinate natif est stérilisée par traitement UHT. 6) Préparation de sperme en vue de l'insémination artificielle, caractérisée en ce que ledit sperme est dilué dans un dilueur selon une quelconque des revendications 1 à 3. 7) Utilisation d'une fraction purifiée de phosphocaséinate natif, et/ou d'une fraction purifiée de -lactoglobuline, pour l'obtention d'un dilueur de sperme. 8) Utilisation d'un dilueur de sperme selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour la conser vation de sperme de mammifère en vue de l'insémination artificielle. 9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit mammifère appartient à l'espèce équine. 10) Utilisation selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que ladite conservation est effectuée à une température de 1500 en conditions aérobies.