FR 2761158 A1 19980925 FR 9703790 A 19970324 METHODE ET OUTIL DE DIAGNOSTIC DE L'EHRLICHIOSE CANINE La présente invention a trait à une méthode et à un outil de diagnostic de l'ehrlichiose canine. Ehrlichia canis est l'agent responsable de l'ehrlichiose canine ou pancytopénie canine tropicale, qui se caractérise par de la fièvre, de l'anorexie, une thrombocytopénie et des hémorragies. E. canis appartient au genre Ehrlichia de la famille des Rickettsiaceae. I1 s'agit de cocci gram-négatifs qui sont des parasites obligatoires intracellulaires. Les espèces d'Ehrlichia se rencontrent aussi chez le cheval, les ruminants et l'homme. Au moins six autres espèces ont ainsi été caractérisées : E. equi, E. risticii, E. sennetsu, E. chaffeensis, E. platys et E. ewingii. I1 a été montré que si E. canis était une espèce à part entière bien définie, elle présentait une réactivité croisée antigénique avec la plupart des autres espèces Ehrlichia. On sait également que E. canis se rencontre dans de nombreuses régions du monde et que des variations génomiques peuvent exister entre souches d'origines différentes. Le diagnostic des infections à E. canis se fait sur la base des signes cliniques, de recherches hématologiques, de la recherche de morulae d'E. canis dans les monocytes circulant et d'anticorps dirigés contre E. canis. En général, les titres en anticorps sont mesurés par un test d'immunofluorescence indirecte (IFA). C'est à partir de cellules infestées par E. canis servant d'antigène que l'on crible les sérums à tester. Les chiens infectés par E. canis ont généralement des titres élevés en anticorps, souvent supérieurs à 1:80 et même à 1:5000. L'inconvénient de cette technique, outre qu'elle est lourde à mettre en oeuvre et ne peut être mise en oeuvre en routine sur le terrain, est qu'elle détecte l'ensemble des anticorps dirigés contre E. canis et l'on peut donc se poser des questions sur sa spécificité. Même si des études anciennes ont conclu au caractère spécifique de cette technique, des études récentes ont par contre relevé des réactions croisées avec d'autres Ehrlichia et Rickettsia. Des techniques de diagnostic plus modernes ont été développées pour d'autres espèces, comme le marquage de tissus à l'immunoperoxydase et la réaction en chaîne par la polymérase (PCR) pour la détection d'E. chaffeensis. Il existe aussi un kit ELISA sur bandelette pour la recherche d'anticorps contre E. canis, au moyen d'un extrait antigénique entier obtenu par sonication, ce qui n'est pas sans poser des problèmes de coût comme de spécificité, ainsi que d'interprétation des résultats. Il apparaît donc souhaitable de rechercher des outils de diagnostic plus sûrs remédiant aux insuffisances de l'art antérieur. Toutefois, l'une des difficultés majeures à surmonter est de pouvoir assurer une détection qui, tout en étant spécifique d'E. canis, puisse être valable pour les différentes souches d'E. canis rencontrées dans les différentes régions du monde. Dans Journal of Clinical Microbiology, septembre 1994, p 2107-2112, Y. Rikihisa et al. ont rapporté une analyse en Western Immunoblot de sérums humains et canins infectés par E. chaffeensis, E. canis et E. Ewingii. Les auteurs ont rapporté l'existence d'un grand nombre d'antigènes et ont surtout mis en avant des antigènes majeurs de 74, 64, 43 et 30 kDa. Chez les chiens infectés par E. canis, l'antigène à 30 kDa induit la réponse immunitaire la plus précoce. Pour E. chaffeensis, les antigènes à 64, 47, 40 et 30 induisent des réponses précoces. Les antigènes de 30 kDa d'E. canis et E. chaffeensis sont fortement reconnus de 2 à 4 semaines après exposition aux bactéries par un sérum homologue, mais pas par un sérum hétérologue, ce qui suggère une hétérogénéité antigénique inter-espèce. Ce document ne donne cependant aucune indication concernant la détection des différentes souches dE. canis. La présente invention a pour objectif de proposer un antigène permettant de mettre au point un diagnostic spécifique d'E. canis, dans des conditions éliminant les inconvénients de l'art antérieur, et ce quelle que soit l'origine géographique de l'infection. Elle a en particulier pour objet de fournir un test de diagnostic utilisable en routine sur le terrain. L'invention a donc pour objet l'utilisation d'un antigène d'E. canis de poids moléculaire d'environ 110 kDa tel qu'apparaissant en immunoempreinte (Western Blot ou Blotting) après SDS-PAGE, pour la réalisation d'un réactif de diagnostic de l'ehrlichiose canine. Dans ce cadre, l'antigène en question peut être utilisé comme réactif de diagnostic ou pour la préparation d'anticorps spécifiques de cet antigène, qui seront utilisés comme réactif. L'invention est particulièrement remarquable par le fait qu'elle permet de diagnostiquer de manière sûre, rapide et spécifique l'infection par E. canis, quelle que soit l'origine de l'infection qui, rappelons-le, peut se rencontrer sur tous les continents avec des risques de différenciation intersouches. Les anticorps dirigés contre l'antigène de 110 kDa sont révélés rapidement suite à une infection, ce qui est un avantage important pour la sécurité du diagnostic. L'invention a donc pour objet une méthode de diagnostic de lehrlichiose canine dans laquelle l'on recherche, dans un échantillon de fluide physiologique provenant d'un chien à tester, la présence de cet antigène de 110 kDa, en cherchant à détecter soit l'antigène lui-même, soit, de préférence, des anticorps dirigés contre cet antigène. De manière générale, on prélève un échantillon de fluide physiologique (sang, plasma, sérum) de l'animal à tester, échantillon que l'on fait ensuite réagir en présence d'un réactif (antigène ou anticorps) préparé à partir d'un antigène d'E. canis de poids moléculaire d'environ 110 kDa tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE. Bien entendu, les antigènes et anticorps selon l'invention pourront être utilisés dans toutes les techniques de diagnostic de laboratoire connues. Toutefois, on préférera les mettre à profit dans des techniques pouvant être mises en oeuvre directement sur le terrain par le vétérinaire, l'éleveur ou le propriétaire de l'animal. L'homme du métier dispose de l'ensemble des techniques de laboratoire et du terrain et est donc parfaitement en mesure de les adapter à l'utilisation de cet antigène et/ou des anticorps comme réactif(s) de diagnostic. Les techniques de diagnostic qui seront préférentiellement utilisées dans le cadre de la présente invention sont le Western Blot après traitement du type SDS-PAGE, le diagnostic en milieu liquide comme la microscopie confocale, et le diagnostic sur support solide de type ELISA ou de type bandelette, en particulier immunochromatographie. En ce qui concerne la mise en oeuvre de méthodes par immunochromatographie, le spécialiste pourra se reporter notamment à Robert F. Zurk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) ainsi qu'aux brevets ou demandes de brevet WO-A-88/08 534, WO-A-91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 et US-A-5 238 652. L'antigène de 110 kDa, en tout ou partie, plus ou moins purifié ou obtenu par synthèse chimique sera de préférence utilisé pour la détection d'anticorps dans un échantillon biologique. Dans le cas d'anticorps produits à partir de cet antigène, ceux-ci seront de préférence utilisés aussi dans un test de détection d'anticorps, notamment en combinaison avec l'antigène lui-même dans un test de type compétition ou de déplacement ("blocking"). Ainsi, l'on recherche de préférence à détecter les anticorps spécifiques de l'antigène de 110 kDa dans l'échantillon. Pour ce faire, on utilise l'antigène lui-même comme réactif de diagnostic, ou un fragment de cet antigène, conservant la reconnaissance des anticorps. On pourra alors recourir de préférence - soit à un test de diagnostic indirect, en particulier ELISA ou immunochromatographie, dans lequel l'antigène ou fragment, de préférence fixé sur un support (puits, bandelettes, etc.) est mis en présence de l'échantillon à tester, tandis que la révélation de la fixation antigèneanticorps est assurée par un anti-Ig de chien marqué, - soit à un test par compétition ou de déplacement, dans lequel on utilise l'antigène ou fragment, et un anticorps marqué spécifique de l'antigène de 110 kDa. L'antigène ou fragment est là aussi de préférence fixé à un support solide tel que puits, bandelette, etc. Dans le test de compétition, on met l'antigène ou fragment simultanément en présence de l'échantillon (anticorps de l'échantillon) et d'un anticorps marqué spécifique de l'antigène de 110 kDa. Dans le test de déplacement, on met l'antigène ou fragment en présence de l'échantillon (anticorps de l'échantillon), puis l'on apporte l'anticorps marqué. Le marquage peut avantageusement être un marquage à la peroxydase ou un marquage particulaire, de préférence à l'or colloïdal. On peut aussi chercher à détecter l'antigène de 110 kDa lui-même dans l'échantillon à l'aide d'un anticorps marqué spécifique de cet antigène. Le marquage est avantageusement comme décrit ci-dessus. Par anticorps spécifique de l'antigène de 110ka, utilisable notamment en compétition ou déplacement ou pour la détection de l'antigène lui-même, on entend anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène de 110 kDa, fragments de ces anticorps, de préférence fragments Fab ou F(ab)21. Un autre aspect de l'invention est la production d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, spécifiques de l'antigène de 110 kDa conforme à l'invention, ces anticorps pouvant être ensuite utilisés notamment comme réactifs de diagnostic pour la détection de l'antigène 110 kDa dans un échantillon de fluide physiologique, ou même pour la détection d'anticorps présents dans un tel échantillon. L'invention inclut aussi les fragments immunologiquement fonctionnels de ces anticorps, en particulier les fragments F(ab) et F(ab)2. Des anticorps pourront être préparés par les techniques usuelles. On peut notamment se référer à Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA où à J.W. Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press Inc., dont les contenus sont incorporés ici par référence. On pourra notamment procéder, comme cela est connu en soi, à la fusion de cellules spléniques de souris immunisées par l'antigène de 110 kDa ou par au moins l'un de ses fragments, avec des cellules myélomateuses adéquates. L'invention a aussi pour objet une préparation purifiée d'antigène de 110 kDa susceptible d'être obtenue par élution, par exemple électroélution, d'un fragment de gel d'acrylamide portant la bande à 110 kDa. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de cet antigène dans lequel on récupère le fragment de gel d'acrylamide ou d'un gel analogue portant la bande à 110 kDa, auquel on fait subir un traitement du type élution, par exemple électroélution, de manière à récupérer l'antigène sous forme d'une préparation purifiée. L'invention a également pour objet une préparation, de préférence pure ou partiellement purifiée, ou même brute d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de l'antigène 110 kDa de l'ehrlichiose canine tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE, notamment anticorps de souris ou de lapin. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic comportant cet antigène de 110 kDa et/ou des anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques de cet antigène. Il s'agit en particulier de kits de diagnostic correspondant aux techniques de diagnostic décrites plus haut. 1/ Préparation de 1antigène brut Erlichia canis (souche Oklahoma EcOK ; Centers for Disease Control and Prevention CDC, Atlanta, Georgie, USA) est cultivé dans la lignée cellulaire continue de macrophages canins DH82 (disponible auprès du CDC sous forme saine et sous forme infectée par E. canis). 2/ Préparation des échantillons d'antigène Toutes les manipulations se font à + 40C - Décongélation d'un culot de cellules infectées, conservé à -200C (80 à 100 % des cellules sont infectées) - Le culot est repris dans 5 ml de tampon PBS - Exposition aux ultra-sons 5 x 1 min sur 50 watts (Sonifier B-12) - Contrôle de la lyse complète des cellules et des bactéries sur frottis coloré au may-grumwald-giemsa En parallèle, un culot de cellules saines subit le même traitement dans les mêmes conditions. Les antigènes sont conservés aliquotés à -200C (aliquots correspondant à environ 1 mg de protéines). 3/ SDS-PAGE et WESTERN-BLOTTING 3-a Séparation des protéines de l'antigène E. Canis par électrophorèse en gel d'acrylamide SDS-PAGE (même traitement pour les cellules saines) - Décongélation d'l aliquot d'antigène (soit 1 mg), à température ambiante - Addition de 2 % de SDS (lauryl sulfate), (poids/volume) - Dilution de l'antigène dans du tampon de dissociation de façon à avoir en final 2 ml à 2% SDS et 5% ss-mercaptoethanol Ces 2 ml d'antigène sont déposés dans des puits de 11 cm sur un gel à 12.5 % d'acrylamide Migration 1 nuit à +40C Le gel est ensuite transféré (transfert semi-sec), sur une membrane de nitrocellulose ou PVDF (polyvinylydène difluoride). 3-b Technique du Western Blotting - Saturation : 1h à 370c en PBS, 5% lait écrémé - Lavages : 4 x en PBS tween - Incubation des sérums : dilution en PBS-tween, 1% lait 1h à 370C - Lavages - Conjugué : protéine A marquée à la peroxydase 1h à 370C - Lavages - Révélation : diaminobenzidine (DAB) 4/ Résultats 45 chiens ont été incorporés à l'étude. Ces chiens provenaient de régions géographiques diverses, Corse, Martinique, Sénégal, Djibouti, Abidjan, France continentale. Parmi eux, des chiens positifs (sérologie supérieure à 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120), des chiens négatifs et des chiens EOPS (exempts d'organismes pathogènes spécifiques). Les Western Blotting ont confirmé la présence chez l'ensemble des chiens à sérologie positive d'une bande antigénique entre 97 et 116 kDa qui correspond à l'antigène de 110 kDa selon l'invention. Cette bande n'est pas apparue chez les chiens témoins et négatifs. Elle apparaît présente chez tous les chiens infectés, quelle que soit l'origine géographique et le type de la souche responsable de l'infection. Des études de cinétique ont démontré par ailleurs son apparition précoce, en moins de 20 jours en moyenne. 5/ Isolement de la bande à 110 kDa L'antigène de 110 kDa peut être isolé à partir du gel d'acrylamide par les techniques classiques telles que l'électroélution. Il suffit de découper les bandes correspondant à l'antigène dans le gel d'acrylamide, éventuellement à les broyer, puis les placer dans un dispositif d'électroélution. Cela permet d'isoler un échantillon relativement pur d'antigène 110 kDa. 6/ Test de diagnostic Le Western Blotting décrit plus haut est en soi une technique de diagnostic de laboratoire. Sa description et les résultats représentés sont un exemple de mise en oeuvre de l'antigène de 110 kDa dans un test de diagnostic de 1 'Ehrlichiose canine. L'antigène isolé pourra être ensuite utilisé comme réactif de diagnostic ou pour préparer des anticorps. A noter que, comme cela est connu en soi, la préparation d'anticorps peut être directement réalisée à partir d'un broyat de la bande de gel d'acrylamide portant l'antigène et injection à la souris ou au lapin, ou encore par insertion sous la peau de l'animal du fragment découpé correspondant de membrane de nitrocellulose après transfert de l'antigène depuis le gel. Enfin, pour une production d'antigène à plus grande échelle, on pourra recourir à la technique bien connue de filtration sur gel (GFC). On peut aussi citer l'immunochromatographie sur bandelette de type nitrocellulose sur laquelle on définit au moins deux zones, l'une comprenant un anticorps anti-Ig de chien (disponible dans le commerce), marqué à l'or colloïdal, et une zone comprenant l'antigène de 110 kDa immobilisé. L'échantillon de fluide biologique à tester est appliqué sur la première zone. Les anticorps présents dans l'échantillon peuvent se lier aux anti-Ig marqués et, par chromatographie, migrer vers la deuxième zone où les anticorps de l'échantillon spécifique de l'antigène de 110 kDa vont se fixer. Grâce à la coloration générée par l'or colloïdal, une réponse positive pourra être lue directement à l'oeil nu. Une troisième zone est de préférence prévue de l'autre côté de la deuxième zone par rapport à la première, troisième zone dans laquelle les anti-Ig marqués qui n'ont pas réagi pourront venir s'accumuler, constituant ainsi un témoin de bon fonctionnement de test notamment en cas de résultat négatif. REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic de l'ehrlichiose canine dans laquelle l'on recherche, dans un échantillon de fluide physiologique provenant d'un chien à tester, la présence d'un antigène ayant un PM de 110 kDa tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on cherche à détecter, dans l'échantillon, les anticorps spécifiques de l'antigène de 110 kDa à l'aide d'un réactif de diagnostic basé sur cet antigène. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le réactif de diagnostic est l'antigène de 110 kDa ou un fragment conservant la reconnaissance par les anticorps spécifiques de l'antigène de 110 kDa. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'on réalise un test de diagnostic indirect dans lequel l'antigène ou fragment est mis en présence de l'échantillon à tester, tandis que la révélation de la fixation antigèneanticorps est assurée par un anti-Ig de chien marqué. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'anti-Ig de chien est marqué à la peroxydase ou à un marqueur particulaire, de préférence de l'or colloïdal. 6. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'on réalise un test de diagnostic par compétition ou par déplacement dans lequel on utilise l'antigène ou fragment et un anticorps marqué spécifique de l'antigène de 110 kDa. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'anticorps marqué est choisi parmi le groupe consistant en : anticorps monoclonaux spécifiques de l'antigène de 110 kDa, anticorps polyclonaux spéficiques de l'antigène 110 kDa, fragments de ces anticorps, de préférence fragments Fab ou F(ab)2. 8. Méthode selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'anticorps marqué est marqué à la peroxydase ou à un marqueur particulaire, de préférence de l'or colloïdal. 9. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on cherche à détecter, dans l'échantillon, l'antigène de 110 kDa lui-même, à l'aide d'anticorps spécifiques de cet antigène, choisis dans le groupe consistant en : anticorps monoclonaux spécifiques de l'antigène de 110 kDa, anticorps polyclonaux spéficiques de l'antigène 110 kDa, fragments de ces anticorps, de préférence fragments Fab ou F(ab) 10. Préparation purifiée d'antigène 110 kDa susceptible d'être obtenue par électroélution d'un fragment de gel d'acrylamide portant la bande à 110 kDa telle qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE. 11. Utilisation de l'antigène de 110 kDa d'Ehrlichia canis tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE, pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'Ehrlichiose canine. 12. Préparation pure d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de l'antigène de 110 kDa de l'Ehrlichiose canine tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE. 13. Utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de l'antigène de 110 kDa d'Erlichia canis tel qu'apparaissant en Western Blot après SDS-PAGE, pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'ehrlichiose canine.