FR 2755136 A1 19980430 FR 9613039 A 19961025 La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de nanoparticules formées d'un composé méthylidène malonate polymérisé, lesdites nanoparticules, contenant éventuellement une ou plusieurs molécules biologiquement actives, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant. Par "nanoparticules", on entend des particules submicroniques ayant un diamètre inférieur à environ 500 nanomètres. Des nanoparticules formées par polymérisation en émulsion d'un cyanoacrylate d'alkyle sont décrites dans le brevet EP 0 007 895. Le procédé utilisé dans la préparation de ces particules de cyanoacrylate d'alkyle repose sur la polymérisation (anionique) du monomère qui a lieu spontanément et en milieu aqueux. La préparation suivant le même principe (polymérisation anionique en émulsion) de nanoparticules constituées d'un polymère de méthylidène malonate est décrite notamment dans F. Lescure et al, Phare. Res., 1994, 11, 1270-1276. Ces monomères, dont la préparation est décrite dans le brevet EP 0 283 364, ont une structure proche de celle des cyanoacrylates mais la fonction nitrile de ces derniers est remplacée par un ester ou un ester d'ester. Comme les cyanoacrylates, ils polymérisent à froid en milieu aqueux et peuvent être biodégradables. Les nanoparticules de méthylidène malonate ainsi obtenues présentent cependant certains désavantages. En effet, la polymérisation en émulsion des méthylidènes malonates sous forme de nanoparticules aboutit, en phase aqueuse et à pH légèrement acide, à la formation d'oligomères, majoritairement de type trimère ou tétramère, hautement biodégradables. Ces espèces moléculaires sont partiellement hydrosolubles, de sorte que la dispersion de ces nanoparticules en milieu aqueux aboutit à leur solubilisation et à la perte rapide de la structure particulaire (P. Breton et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 1996, 42, 95-103). Lorsqu'une molécule biologiquement active est associée aux nanoparticules de méthylidène malonate, elle est donc susceptible d'être libérée très rapidement après l'administration, suite à l'effet de dilution dans le torrent circulatoire qui entraîne la solubilisation rapide des oligomères formant la matrice particulaire, éventuellement avant d'arriver au site d'action du principe actif. Certaines expériences ont montré que la polymérisation à pH basique permettait la formation de polymères de masses moléculaires plus élevées tout en conservant la taille des nanoparticules. Cependant, de telles synthèses se caractérisent par: - I'impossibilité d'obtenir des polymères de Mw Mw - I'impossibilité de constituer à pH élevé (pH > 7) des polymères de Mw > 20 000 et a fortiori de Mw supérieur, sans la formation inévitable d'aggrégats rendant l'administration intravasculaire de ces préparations impossible. On entend par Mw la masse moléculaire moyenne en masse (ou masse moléculaire moyenne) définie ainsi : Mw = ss ni. Mi2 / 2 ni. Mi et par Mp la masse moléculaire de l'espèce quantitativement majoritaire. Dans la suite de la description, la masse moléculaire est exprimée en équivalents polystyrènes (Ep). Ce procédé de préparation ne convient donc pas si l'on désire préparer des nanoparticules de polyméthylidène malonate constituées de: - polymères de masse moléculaire moyenne comprise entre environ 5000 et 10 000, notamment d'environ 8000, - polymères de masse moléculaire moyenne supérieure à 20 000 sans formation d'agrégats. La présente invention consiste donc à préparer des nanoparticules de méthylidène malonate ayant un diamètre inférieur à 500 nm, en particulier de 100 à 500 nm, formées d'espèces moléculaires homogènes de masses situées dans une large gamme (Mw compris entre environ 2 000 et 80 000). Le principe consiste à solubiliser le monomère dans une phase organique aprotique miscible à l'eau mais qui, dans les conditions de préparation des nanoparticules, forme avec le milieu aqueux de polymérisation un mélange non solvant du polymère forme. Par "phase organique aprotique" ou "solvant organique aprotique", on entend une phase organique ou un solvant sans proton labile capable d'initier un anion. Les avantages de ce procédé de préparation suivant l'invention sont nombreux: - il permet une dispersion plus homogène du monomère dans le milieu de polymérisation, -il utilise des solvants non chlorés et facilement éliminables car volatils, - il évite la formation d'aggrégats de polymères, - il donne lieu à des rendements de polymérisation élevés, - il permet la constitution de polymères de masse moléculaires homogènes situées dans une large gamme (Mw d'environ 2 000 à 80 000) en formant des nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 500 nm. En outre, le procédé permet l'utilisation d'agents de dispersion tels que des agents tensioactifs non ioniques ou des polymères protecteurs de colloides, ce qui aboutit à l?obtention de particules ayant des propriétés de surface modulables. Enfin, la masse moléculaire des oligomères/polymères formant les nanoparticules suivant l'invention peut être parfaitement maîtrisée en jouant sur les conditions suivantes de préparation: - la concentration en monomère dans la phase organique, - le pH et la molarité du milieu de polymérisation, - la nature et la concentration de l'agent de dispersion, - le rapport volumique phase aqueuse (milieu de polymérisation) /phase organique, - le mode d'introduction du mélange organique dans la phase aqueuse. L'invention concerne donc dans un ler aspect un procédé de préparation de nanoparticules formées d'un polymère d'un composé de formule (I) dans laquelle - A représente un groupe ou un groupe - R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe C1-C6 alkyle linéaire ou ramifié; n=1,2,3,4ou5; caractérisé en ce que le monomère est, préalablement à la polymérisation, solubilisé dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau formant avec le milieu de polymérisation un mélange non solvant du polymère formé. Selon un aspect particulier, le procédé selon l'invention permet la préparation de nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm, et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 1000 et 80000, en particulier entre environ 2 000 et 80 000, de préférence entre environ 8 000 et 80 000. En particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à: - préparer une solution d'un composé de formule (I) dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau, - ajouter, sous agitation, cette phase organique à un milieu de polymérisation aqueux à un pH compris entre 4,5 et 10, - récupérer les nanoparticules ainsi obtenues après homogénéisation du mélange et évaporation sous vide du solvant organique. On peut également ajouter le milieu de polymérisation aqueux à la phase organique contenant le monomère préalablement solubilisé et selon un autre aspect, le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à: - préparer une solution d'un composé de formule (t) dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau, - ajouter, sous agitation, à cette phase organique un milieu de polymérisation aqueux à un pH compris entre 4,5 et 10, - récupérer les nanoparticules ainsi obtenues après homogénéisation du mélange et évaporation sous vide du solvant organique. Comme illustré plus loin dans les exemples, le pH du milieu de polymérisation est choisi en fonction de la masse moléculaire du polymère que l'on souhaite préparer. Avantageusement, le mélange de la phase organique et du milieu aqueux est homogénéisé par agitation continue pendant environ 30 min, puis on complète éventuellement la préparation par de l'eau distillée. Le polymère formé précipite dans le milieu de polymérisation et peut être récupéré par exemple par filtration. On peut ensuite conditionner et lyophiliser la suspension nanoparticulaire ainsi obtenue. Le solvant organique aprotique utilisé pour disperser le monomère doit être un solvant dudit monomère qui soit également miscible à l'eau. Ce solvant est de préférence choisi parmi l'acétone, l'acétonitrile, le dioxanne et le tétrahydrofurane, l'acétone étant particulièrement préférée. Des aspects préférés du procédé sont les suivants - la concentration du monomère de formule (I) dans le solvant organique est de l'ordre de 30 mg/ml à 150 mg/ml; - la molarité du milieu de polymérisation est de l'ordre de 1/30 M à 1/3 M; - le rapport volumique phase aqueuse / phase organique est compris entre 3/1 et 15/1. Avantageusement, le milieu de polymérisation contient un ou plusieurs agents tensioactifs ou protecteurs de colloïdes. Les agents tensioactifs peuvent par exemple être des tensioactifs ioniques ou non ioniques. On utilisera de préférence des agents tensioactifs non ioniques choisis parmi les copolymères de polyoxyéthylène, de polyoxypropylène, les poloxamers et les polysorbates. En tant qu'agents protecteurs de colloïdes, on utilisera de préférence les dérivés polysaccharidiques tels que les dextrans, les dérivés cellulosiques hydrosolubles ; les polyéthylènes glycols ; l'alcool polyvinylique. De préférence, le composé polymérisé pour former les nanoparticules selon le procédé de l'invention est un composé de formule (I) dans laquelle A représente un groupe dans lequel n = 1 et R1 = R2 = éthyle. Dans un 2ème aspect, l'invention concerne des nanoparticules formées d'un polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I), ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 1000 et 80000, en particulier entre environ 2 000 et 80 000, de préférence comprise entre environ 8000 et 80 000, susceptibles d'être obtenues par ce procédé. Dans un aspect préféré, l'invention concerne des nanoparticules formées d'un polymère d'un composé de formule (I), ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 8000 et 80000. Avantageusement, lesdites nanoparticules sont formées d'un composé de formule (I) dans laquelle A représente un groupe dans lequel n = 1 et R1 = R2 = éthyle. Selon un aspect ultérieur de l'invention, lesdites nanoparticules comprennent dans leur réseau polymérique une ou plusieurs molécules biologiquement actives telles que mentionnées plus haut. En effet, dans un aspect avantageux du procédé selon l'invention, la phase organique (lorsqu'il s'agit d'une molécule biologiquement active insoluble dans l'eau) ou le milieu de polymérisation peut contenir une ou plusieurs molécules biologiquement actives. Par "molécule biologiquement active", on entend de manière non limitative toute molécule ayant une activité biologique prophylactique ou curative, in vitro ou in vivo, notamment un agent anti-infectieux, en particulier un agent antiseptique, antibiotique, antiviral, antiparasitaire ou antimitotique, notamment anticancéreux. Des agents antibiotiques ou antiseptiques utilisables peuvent être par exemple la rifampicine et la colistine. A titre d'exemples d'agents antiviraux, on peut citer de manière non limitative la didanosine, la ribavirine, la zidovudine, l'acyclovir, le ganciclovir, le foscarnet, la vidarabine et la zalcitabine. Le cis-plastine et le taxol peuvent par exemple être utilisés en tant qu'agents anticancéreux. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdites nanoparticules comprenant une ou plusieurs molécules biologiquement actives, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les compositions selon l'invention peuvent être des compositions administrables par exemple par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale, rectale, pulmonaire ou nasale. Les formes d'administration appropriées comprennent notamment les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, ainsi que les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale. L'invention est illustrée par les exemples ci-dessous, dans laquelle la préparation des particules est effectuée à température ambiante (environ 21in). La taille, ou diamètre, des nanoparticules a été mesuré avec un compteur à diffusion d'un rayon laser. (Coulter Electronic Inc., USA). La masse moléculaire des polymères a été déterminée par chromatographie en perméation de gel. EXEMPLE 1: 500 mg de monomère 1-éthoxyvarbonyl-1-éthoxycarbonyl méthylèneoxycarbonyléthène (LABORATOIRES UPSA /CARPIBEM, France) préalablement désorbés du SO2 pendant 3 h sous 25 mbars sont dissous dans 5,55 ml d'acétone. Cette solution est ensuite mélangée progressivement et sous agitation magnétique avec 50 ml d'un milieu aqueux tamponné à pH 8 (Na2HP04/KH2P04, 1/15 M) et contenant 500 mg de dextran 70 (FLUKA CHEMIE, Suisse). La polymérisation quasi-instantanée produit une opacification du mélange qui présente un effet Tyndall caractéristique des solutions colloïdales. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes après l'introduction complète de la phase organique. Ensuite, 50 ml d'eau distillée contenant 2,5 g de glucose ou de tréhalose (protecteurs de colloïdes et coprotecteurs) sont ajoutés à la suspension nanoparticulaire et le mélange est soumis à une évaporation sous vide afin d'éliminer l'acétone et de réduire le volume de la suspension aqueuse à 50 ml. Après filtration sur filtre papier (diamètre des pores 5 à 15 clam), la préparation est lyophilisée. Mesurées par diffusion d'un rayon laser, les particules contenues dans le filtrat ont un diamètre de 288 nm. La masse moléculaire moyenne (Mw) du méthylidène malonate constituant la matrice polymère des particules est évaluée à 67000 par chromatographie en perméation de gel. EXEMPLE 2: On procède suivant la technique décrite dans exemple 1, mais en faisant uniquement varier le pH du tampon phosphate. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous, dans lequel Mp est la masse moléculaire de l'espèce principale et Mw est la masse moléculaire moyenne du polymère. Tableau 1 pH du milieu de polymérisation 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 taille (nm) 280 344 424 423 361 382 313 288 écart-type+/-nm 9 9 7 6 9 7 2 3 caractéristiques du polymère (Ep) Mp 662 655 655 19700 31500 36900 40300 59300 Mw 2080 4740 11140 17600 28900 39000 53200 67200 Les résultats montrent que la masse moléculaire moyenne des polymères constituant les nanoparticules augmente régulièrement avec le pH du milieu de polymérisation. Le profil de chromatographie en perméation de gel de la Figure 1 représente la distribution de masse moléculaire du polymère préparé à pH 5,5 (concentration : 90 mg/ml). On observe en 1 un large pic correspondant aux espèces de haute masse moléculaire moyenne (Mw) et en 2 un pic étroit correspondant aux oligomères minoritaires (trimères et tétramères majoritaires). Les lignes en pointillés délimitent la portion analysable du chromatogramme. Le pic F est celui du toluène utilisé comme étalon interne et le pic négatif correspond aux traces d'eau. EXEMPLE 3: On procède suivant la technique décrite dans l'exemple 1, mais en faisant uniquement varier la concentration du monomère dans l'acétone. Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous: Tableau 2 concentration en monomère dans la phase organique (mg/ml) 30 60 90 taille (nm) 213 239 288 écart-type+/-nm 2 4 3 caractéristiques du polymère (Ep) Mp 31500 39600 59300 Mw 44700 63000 67200 Les résultats montrent que la masse moléculaire de l'espèce principale (Mp), de même que la masse moléculaire moyenne (Mw) des polymères constituant les nanoparticules augmentent régulièrement avec la concentration en monomère dans la phase organique. EXEMPLE 4: On procède selon les exemples 1 à 3 mais en remplaçant le dextran 70 protecteur de colloïdes par un tensioactif non ionique, le Pluronic F68 (BASF Corporation, USA). Les résultats sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 pH du milieu de polymérisation contenant 0,5 % de Pluronic F 68 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Taille (nm) 87 80 95 117 122 121 146 153 écart-tvpe +/-nm 1 2 2 5 9 1 3 1 caractéristiques du polymère * Mp 656 13300 14800 25600 38600 43700 45300 77800 Mw 5520 9740 12300 23600 33000 51600 70900 88900 * concentration en monomère dans l'acétone = 90 mg/ml Les résultats montrent, pour des mimes conditions de pH: - une augmentation de la masse moléculaire de l'espèce principale (Mp) et de la masse moléculaire moyenne (Mw) des polymères constituant les nanoparticules en présence du tensioactif par rapport au protecteur de colloides, - une diminution de la taille de ces mêmes nanoparticules en présence du tensioactif par rapport au protecteur de colloides. EXEMPLE 5: Selon le procédé décrit dans l'exemple 1, on introduit 500 mg de monomère dissous dans 16,6 ml d'acétone, dans un tampon phosphate (Na2HP04/KH2P04) de molarité croissante, et contenant par ailleurs 0,5 % de Pluronic F68. Les résultats sont rapportés dans le tableau 4 ci-dessous: Tableau 4 molanté taille des écart-type Mp Mw nanoparticules (nm) (nm) E 0,033 M 127 2 15200 12500 0,066 M 123 1 14600 12400 0,133M 124 1 653 9790 0,267 M 179 3 660 8690 Les résultats montrent une diminution de la masse moléculaire moyenne (Mw) des polymères constituant les nanoparticules proportionnellement à une augmentation de la molarité du milieu. EXEMPLE 6: Des nanoparticules sont préparées suivant les exemples 1 à 3 et comparées à des nanoparticules préparées selon le procédé décrit par Lescure et al., Pharm. Res. 1994, 11. 1270 - 1276. Pour cela, on introduit 100 mg de monomère sous agitation dans 10 ml d'un milieu tampon phosphate (Na2HP04/KH2P04, 1/15 M) de pH 5 à 8. Les résultats sont rapportés dans le tableau 5 ci-dessous dans lequel les oligomères sont définis comme toute espèce moléculaire de masse moléculaire inférieure ou égale à environ 920. Tableau 5 pH du milieu de polymérisation contenant 1 % de dextran 70 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Procédé selon taille (nm) 260 296 337 335 271 322 Lescure et al.,1994 écart-type 5 5 10 4 6 6 +/-nm Mp 666 660 675 685 15572 13000 Mw 1719 2421 5335 6041* 6759* 7594* % oligomères 43 33 27 38 18 13 rendement 87 5 71,5 59,5 21 23 d'obtention des nanoparticules % t5 Procédé selon taille (mn) 424 423 361 382 313 288 I'invention ** écart-type 7 6 9 7 2 3 +/-nm ~ Mp 655 19695 31508 36290 40278 59300 Mw 11138 17569 28918 38997 53181 67201 Q oligomères 19 14 8 4 3 2 rendement 82,5 73 84,5 91 85 86,5 d'obtention des nanoparticules * présence d'agrégats ** concentration en monomère dans l'acétone = 90 mg/ml Les résultats montrent que, pour toute condition expérimentale de pH identique: - la masse moléculaire moyenne (Mw) des polymères constituant les nanoparticules fabriquées selon Lescure et al. est inférieure à celle du polymère obtenu selon le procédé de l'invention; - les taux d'oligomères (trimères-tétramères) constitutifs des polymères sont significativement inférieurs pour les nanoparticules préparées selon le procédé de l'invention; - les rendements de polymérisation sous forme de nanoparticules sont supérieurs pour le procédé de l'invention par rapport au procédé selon Lescure et al (la formation d'agrégats se traduit par de faibles rendements à pH basique pour le procédé selon Lescure et al). Le profil de chromatographie en perméation de gel de la Figure 2 représente les distributions de masse moléculaire des polymères préparés à pH 7,5 selon le procédé de l'invention d'une part (tracé A), et selon le procédé de Lescure et ai d'autre part (tracé B). Mis à part le pic 3 correspondant au toluène, on observe pour le tracé A un pic 1 unique correspondant à l'espèce principale (Mp=40278) alors que pour le tracé B, on observe également la présence d'un pic 2 significatif correspondant aux oligomères (trimères et tétramères). EXEMPLE 7: 50 ml d'un milieu aqueux tamponné à pH 5 ; 6,5 ou 8 (Na2HPO4/KH2PO4 1/15 M) et contenant 0,5 % de Pluronic F68 (BASF Corporation, USA) sont ajoutés progressivement et sous agitation magnétique à 5,55 ml d'une solution de 500 mg de monomère 1-éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonyl méthylèneoxycarbonyléthène (LABORATOIRES UPSA/CARPIBEM, France) préalablement désorbés du SO2 pendant 3 h sous 25 mbars dans 5,55 ml d'acétone. L'agitation est maintenue pendant 16 h pour les essais à pH 5 et 6,5 ou pendant 30 minutes pour l'essai à pH 8 après l'introduction complète de la phase organique. Ensuite, 50 ml d'eau distillée contenant 2,5 g de glucose ou de tréhalose (protecteurs de colloïdes et cryoprotecteurs) sont ajoutés à la suspension nanoparticulaire et le mélange est soumis à une évaporation sous vide afin d'éliminer l'acétone et de réduire le volume de la suspension aqueuse à 50 ml. Après filtration sur filtre en papier (diamètre des pores 5 à 15 Fm), la préparation est lyophilisée. Le diamètre des particules contenues dans le filtrat est mesuré par diffusion d'un rayon laser. La masse moléculaire moyenne (Mw) du méthylidène malonate constituant la matrice polymère des particules est évaluée par chromatographie en perméation de gel. Les résultats sont rapportés dans le tableau 6 ci-dessous, dans lequel Mp est la masse moléculaire de l'espèce principale et Mw est la masse moléculaire moyenne du polymère. Le rendement est déterminé par le rapport entre la quantité de monomère introduit dans le milieu réactionnel et la quantité de polymère constituant les nanoparticules. Tableau 6 pH du milieu de polymérisation 5,0 6,5 8,0 taille (nm) 848 394 754 écart-type +/-nm 36 32 34 caractéristiques du polymère F Mp 312 | 24300 26500 Mw 6450 | 20100 20100 rendement 59 57 30 écart-type 5,1 4,6 4,2 EXEMPLE 8 : Préparation de nanoparticules contenant de la rifampicine 5 mg de rifampicine base (Sigma) sont dissous dans 1 ml d'acétone auquel on ajoute 90 mg de monomère 1-éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonyl méthylèneoxycarbonyléthène (LABORATOIRES UPSA /CARPIBEM, France) préalablement désorbé du 502 pendant 3 h sous 25 mbars. A l'aide d'une pipette en verre, cette solution est ensuite ajoute progressivement et sous agitation constante (750 rpm) à 9 ml de milieu aqueux tamponné à pH 6,0 à l'aide d'un tampon phosphate (NasHP04/KH2P04 0,066M) et contenant 90 mg de dextran 70 (1% p/v). Après 18 h de polymérisation à 20in, 9 ml d'eau distillée contenant 5% de Dglucose sont additionnés sous agitation à la suspension nanoparticulaire, puis le mélange est soumis à une évaporation sous vide à l'aide d'un Rotavapor (20 C, 25 mbars) afin d'éliminer l'acétone et de réduire le volume de la suspension aqueuse à 9 ml. La préparation est ensuite lyophilisée; la congélation a lieu à -30iC et la sublimation à +20*C pendant 36 h à une pression de 0,05 mbar. La taille des nanoparticules et la concentration en rifampicine sont mesurés avant et après lyophilisation. La taille est mesurée par diffusion d'un rayon laser. Le dosage de la rifampicine est réalisé par chromatographie liquide haute performance couplée à un spectrophotomètre. La phase mobile est composée d'un mélange méthanol/acétate d'ammonium 0,05M (65:35), le pH est ajusté à 7,3, le débit est fixé à lml/min et l'absorption est lue à 254 nm. Le taux de rifampicine non lié aux nanoparticules est mesuré dans le surnageant obtenu après ultracentrifugation de la suspension nanoparticulaire (80000g, 1 h à 4*C). La quantité de rifampicine fixée aux nanoparticules correspond à la fraction présente dans le culot, qui est dissous dans le flfF avant de procéder au dosage direct de la rifampicine. On obtient les résultats suivants: - taille des nanoparticules contenant de la rifampicine : 266+63 nm avant lyophilisation et 282+54 nm après lyophilisation; - pourcentage de fixation de la rifampicine : 8,5+0,5% avant et après lyophilisation. EXEMPLE 9 : Préparation de nanoparticules contenant de la colistine On procède de la même manière que dans l'exemple 8, mais le principe actif étant hydrosoluble, celui-ci est incorporé dans le milieu de polymérisation à une concentration de 0,5 mg/ml avant addition de la phase organique. La taille des nanoparticules contenant de la colistine mesurée par diffusion d'un rayon laser est de 282+65 nm après évaporation et de 283+26 nm après conservation à +4iC pendant 4 jours. Dosce selon la technique de diffusion sur gélose (S.P. Gotoff et al., Antimicrob. Agents Chemother, 19 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de nanoparticules formées d'un polymère d'un composé de formule (I) dans laquelle - A représente un groupe ou un groupe - R1 et R2, identiques ou différents, représente un groupe C1-C6 alkyle linéaire ou ramifié; - n = 1,2,3,4 ou 5, caractérisé en ce que le monomère est, préalablement à la polymérisation, solubilisé dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau formant avec le milieu de polymérisation un mélange non solvant du polymère formé. 2. Procédé selon la revendication 1, pour la préparation de nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm, et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 1000 et 80000, en particulier entre environ 2000 et 80000, de préférence entre environ 8000 et 80000. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu?il comprend les étapes consistant à - préparer une solution d'un composé de formule (I) dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau, - ajouter, sous agitation, à cette phase organique un milieu de polymérisation aqueux à un pH compris entre 4,5 et 10, - récupérer les nanoparticules ainsi obtenues après homogénéisation du mélange et évaporation sous vide du solvant organique. 4. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes constitant à: - préparer une solution d'un composé de formule (I) dans un solvant organique aprotique miscible à l'eau, - ajouter, sous agitation, à cette phase organique un milieu de polymérisation aqueux à un pH compris entre 4,5 et 10, - récupérer les nanoparticules ainsi obtenues après homogénéisation du mélange et évaporation sous vide du solvant organique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé ce que le solvant organique aprotique est choisi parmi l'acétone, l'acétonitrile, le dioxanne et le tétrahydrofurane. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la concentration du composé de formule (I) dans le solvant organique est de l'ordre de 30 mg/ml à 150 mg/ml. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la molarité du milieu de polymérisation est de l'ordre de 1/30 M à 1/3 M. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu de polymérisation contient un ou plusieurs agents tensioactifs ou protecteurs de colloïdes. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les agents tensioactifs sont des tensioactifs non ioniques choisis parmi les copolymères de polyoxyéthylène, de polyoxypropylène, les poloxamers et les polysorbates. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que les agents protecteurs de colloïdes sont choisis parmi les dextrans, les dérivés cellulosiques hydrosolubles, les polyéthylènes glycols et l'alcool polyvinylique. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la phase organique ou le milieu de polymérisation contient une ou plusieurs molécules biologiquement actives. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le composé polymérisé est un composé de formule (I) dans laquelle A représente un groupe dans lequel R1 = R2 = éthyle et n = 1. 13. Nanoparticules formées d'un polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I) dans laquelle --A représente un groupe ou un groupe - R1 et R2, identiques ou différents, représente un groupe C1-C6 alkyle linéaire ou ramifié; - n = 1, 2,3,4 ou 5, ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 1000 et 80000, en particulier entre environ 2 000 et 80 000, de préférence entre environ 8000 et 80000, suceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Nanoparticules formées d'un polymère d'un composé de formule (I) dans laquelle - A représente un groupe ou un groupe - R1 et R2, identiques ou différents, représente un groupe C1-C6 alkyle linéaire ou ramifié; - n = 1, 2, 3, 4 ou 5, ayant un diamètre inférieur à 500 nm, de préférence compris entre 100 et 500 nm et une masse moléculaire moyenne (Mw) comprise entre environ 8 000 et 80 000. 15. Nanoparticules selon la revendication 14 formées d'un polymère d'un composé de formule (I) dans laquelle R1 = éthyle et A est un groupe dans lequel n = 1 et R1 = R2 = éthyle. 16. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisées en ce qu'elles comprennent une ou plusieurs molécules biologiquement actives. 17. Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif des nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.