FR 2760024 A1 19980828 FR 9702092 A 19970221 La présente invention concerne un procédé permettant la mise en évidence de signatures correspondant à une séquence spécifique d'acide nucléique double brin. Dans le domaine de l'analyse de séquence de l'ADN, la présente invention concerne un procédé qui permet d'accélérer ou de contourner le processus de séquencage de l'ADN génomique, problème qui présente un intérêt industriel considérable. Le procédé selon la présente invention permet la mise en évidence de signatures spécifiques d'une séquence sur un long fragment d'ADN. Ce procédé permet notamment de rechercher rapidement la présence de structures particulières dans la séquence des bases et/ou la qualité des appariements qui peuvent être partiels et, en particulier, présenter des mésappariements. Ce procédé permet aussi l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents patients. Il est entendu que l'invention s'applique aussi à des duplex ADN simple brin - ADN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés, ou encore à des duplex ADN simple brin - ARN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés, ou encore à des duplex ARN simple brin - ARN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés. De plus, le duplex peut être constitué du ré appariement au moins partiel de deux simples brins provenant d'échantillons d'origines différentes. Enfin, l'invention s'applique aussi aux structures secondaires d'un ADN simple brin unique ou d'un ARN simple brin unique. Pour clarifier l'exposé, on utilise dans la suite l'exemple spécifique d'un ADN double brin, étant entendu que les généralisations ci-dessus sont facilement réalisables par simple développement des méthodes décrites. Une "signature" permet de caractériser" une séquence d'ADN. A titre d'exemple, l'appariement des bases G et C implique trois liaisons hydrogènes, tandis que l'appariement des bases A et T n'en implique que deux, dans ces conditions, si l'on ouvre mécaniquement la double hélice d'ADN en tirant séparément les extrémités de deux brins d'un même côté d'une molécule isolée d'ADN, on peut s'attendre à ce que le signal correspondant aux forces excercées dépende de la séquence. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente invention a permis de démontrer que la séparation de deux brins appariés se traduit essentiellement par l'obtention d'une signature", c'est-à-dire un ensemble d'informations spécifiques et locales qui est relié à la séquence et/ou à l'état d'appariement. De façon inattendue, lors de l'ouverture d'un duplex, le signal en force peut présenter notamment des structures en dents de scie, avec une montée douce et une descente plus abrupte, où l'ouverture se produit en partie par saccades. Les forces mesurées lors de l'ouverture présentent donc un ensemble de caractéristiques particulières, ou signature, combinaison complexe de la séquence où les zones riches en GC sont plus dures à ouvrir que les zones riches en AT, et de la raideur mécanique du système (construction moléculaire et système de mesure), qui intervient pour induire des événements où plusieurs bases contiguës s'ouvrent plus rapidement. En modifiant la raideur mécanique du système, on peut accentuer (à faible raideur), ou diminuer (à forte raideur) les effets d'instabilité et obtenir un ensemble de signatures pour une même séquence. Ainsi, une signature" ne constitue pas un séquençage base à base de toute une séquence, mais permet d'obtenir un ensemble d'informations spécifiques et locales, reliées à la séquence et/ou à l'état d'appariement. Les mesures de force sur des molécules isolées d'ADN constituent actuellement un domaine très actif (voir références 1 à 11). Pour une gamme de forces s'étendant du subpicoNewton jusqu'à des dizaines dc picoNewtons, lesquelles forces sont typiquement mises en jeu dans les interactions moléculaires faibles, des dispositifs de mesure de forces sensibles tels que les pinces optiques (Svoboda et al., 1993 ; Yin et al., 1996) ou les micro-aiguilles souples sont de plus en plus utilisés. Dans une configuration typique destinée à ouvrir 1'ADN, les molécules peuvent être spécifiquement ancrées sur deux substrats solides (lame de microscope, micro-pipette, microparticule). L'une des extrémités étant fixée et l'autre étant connectée par exemple par l'intermédiaire d'une particule, à un dispositif de mesure de force. Le brevet n WO 94/23065 décrit un dispositif pour mesurer la force, base à base, lors de l'ouverture mécanique de 1'ADN en utilisant un microscope à force atomique. Cependant, la résolution base à base se heurte à des limitations fondamentales liées au bruit thermique (Thompson al., 1995 ; Viovy et al., 1994). Par ailleurs, la réalisation pratique de l'ouverture présente des difficultés de mise en oeuvre, notamment: - le dessin de la construction moléculaire, - la chimie des surfaces et leur préparation, - la façon de sélectionner l'endroit où l'on fait la mesure. En particulier, il est crucial pour effectuer ces expérimentations de réduire: - le niveau d'adsorption de la molécule à l'étude sur les surfaces (lame de microscope ou particule) - les interactions adhésives entre les particules et entre les particules et les surfaces. Finalement comme une seule mesure peut prendre quelques dizaines de minutes, il est nécessaire d'avoir un mécanisme de sélection très efficace pour identifier macroscopiquement les points les plus intéressants de façon à effectuer les mesures en dépit du fait que la chimie des surfaces est imparfaite, et bien entendu, du fait que les constructions en elles-mêmes peuvent être imparfaites. La présente invention inclut les aspects concernant la chimie des surfaces et les constructions particulières de façon à obtenir des résultats satisfaisants. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre au moins une signature desdits duplex, qui est liée à la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce que l'on compare la signature obtenue ou certaines caractéristiques de celle-ci avec des références. Il est entendu, à titre d'exemple, qu'une référence peut être constituée par une autre mesure, une combinaison de plusieurs mesures, ou encore par un calcul numérique, par exemple comme celui qui sera décrit par la suite, ou encore une combinaison des cas précédents. Par duplex d'acide nucléique" on entend désigner n'importe quel type de duplex ADN/ARN comme cela a été mentionné précédemment. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé caractérisé en ce que l'extrémité 5' de l'un des brins du duplex est fixée sur un support 1 et l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex est fixée sur un support 2, la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement apparier, lesdites séquences étant mesurée par éloignement, respectivement rapprochement, desdits supports 1 et 2, caractérisé en ce que, lors de la fixation, le point de fixation de l'extrémité 3' sur le support 2 et le point de fixation de l'extrémité 5' sur le support 1 sont reliés ensemble par un fil moléculaire d'une longueur d'au moins 0,03 llm, et de préférence comprise entre 0,5 et 30 Fm. Dans le cadre de la présente invention, et pour clarifier les notations, I'extrémité 5' de l'un des brins du duplex sera appelée "extrémité 5' du duplex" et l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex sera appelée "extrémité 3' du duplex", et, dans cette définition, les brins peuvent être inversés, bien entendu. Par "fil moléculaire", on entend désigner aussi bien la distance comptée sur la molécule (celle-ci pouvant etre repliée), par exemple le bras espaceur (Mode 1), que la distance spatiale (mesurée notamment le long des brins entre les deux points de fixation (Mode II). Les supports 1 et 2 peuvent également etre interchangés dans les développements qui suivent. Avantageusement, le procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'on modifie localement la structure du duplex, notamment par la création d'un triplex, d'un complexe ou de la fixation d'une protéine. Sont définis ci-après quelques termes qui seront ensuite utilisés conformément à leur définition respective. Les expérience étant réalisées dans un tampon, un "puits" est un élément destiné à contenir un petit volume de tampon et il peut, avec avantage, incorporer ou contenir un ou plusieurs éléments détachables ou non appelés "lames". La lame" est un élément solide de nature flexible ou rigide et présente les particularités suivantes a) Une partie au moins de cette lame est en contact avec un tampon essentiellement aqueux, et une fraction au moins de cette partie en contact est fonctionnalisable sur une surface d'au moins 0,01 zm2, et de préférence entre 1 zm2 et 10 cm2. b) La lame étant en place dans le puits, on peut approcher, pour obtenir une image de la partie fonctionnalisable en contact avec le tampon, soit un objectif de microscope à immersion cn milieux aqueux, soit un objectif dc microscope à immersion dans l'huile et, en ce cas, la lame peut avec avantage être mince, plane et substantiellement transparente. A titre d'exemple particulier, la lame peut etre une lamelle de microscope, une lamelle de polymère ou une particule maintenue par une micropipette. Un puits peut être conçu avec avantage de façon à pouvoir recevoir une "micropipette". Une micropipette est un élément solide, de nature flexible ou rigide, dont on peut fixer une extrémité sur un système fixe ou de déplacement, et dont au moins l'autre extrémité est destinée à être immergée dans un liquide. Elle est d'aspect substantiellement allongé et son diamètre caractéristique est supérieur à 0,01 llm, de préférence entre 0,1 ym et 2 mm, et elle peut avec avantage être creuse. Les supports envisagés peuvent être aussi bien des lames, des particules, des micropipettes ou un élément d'un appareil de mesure de force. Dans le procédé selon la présente invention, les manipulations sont réalisées, de préférence, avec des constructions moléculaires spécifiques, attachées avec avantage, respectivement, entre une lame par exemple, et des microparticules, ou bien par fixation des extrémités sur deux particules. Ce procédé comporte essentiellement deux modes de mise en oeuvre. Plus particulièrement, dans le premier mode (mode I) de mise en oeuvre du procédé, il s'agit d'un procédé dans lequel l'extrémité 3' du duplex à caractériser (respectivement l'extrémité 5') est fixée sur l'un des supports par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 Clam, de préférence comprise entre 0,5 et 30 Fm. Dans ce procédé, I'une des caractéristiques est que les duplex d'ADN destinés à être ouverts ne sont pas directement fixés sur un support, mais le sont par l'intermédiaire d'au moins un bras espaceur placé soit sur le support 1, soit sur le support 2, soit sur les deux. En effet, l'utilisation d'un bras espaceur permet de sélectionner l'endroit et/ou le moment où on effectue la mesure. On peut, par exemple, adapter à ce type de construction moléculaire la technique de sélection et de mesure utilisée par Smith et al. (1996). On peut aussi réaliser des ancrages multiples sur une lame. Dans ces conditions, les particules reliées à la lame par l'intermédiaire d'une construction moléculaire ont une certaine liberté de mouvement. Bien entendu, la longueur du bras espaceur peut être adaptée avec avantage par rapport à la résolution spatiale du système de repérage de la position des billes. Lorsqu'on applique simplement une force faible sur les particules, 1'ADN ne va pas s'ouvrir, et l'on va pouvoir constater le mouvement caractéristique suivant une particule se déplace mais est ensuite bloquée dans son déplacement par la présence du bras espaceur. Les caractéristiques de ce mouvement permettent de sélectionner les systèmes intéressants sur lesquels lancer un cycle de mesure et permettent notamment (i) d'éliminer les attachements imparfaits, en particulier si la particule commence à s'adsorber sur la lame, ou si 1'ADN commence à s'adsorber, les caractéristiques des déplacements seront plus limitées, et donc différentes (ii) lors de la phase un peu brutale de collage d'une micro-aiguille de mesure, la relative liberté de mouvement de la particule permet d'éviter l'arrachement des points d'attache. Le bras espaceur pourra être constitué d'ADN double brin, de 100 à 500 bases, soit environ 0,03 Fm à 0,2 Fm, mais de préférence le bras espaceur correspondra à 1 kb ou même comportera de 5 à 100 kb, ce qui correspondra environ à un débattement de 1,5 à 30 pm, mais il est possible également de prévoir des bras espaceurs qui ne seraient pas constitués d'un ADN double brin, mais qui seraient constitués par d'autres composants de type polymère synthétique, de type protéique, ou bien d'autres polymères, polysaccharidiques par exemple. Ainsi, juste avant la mesure, l'échantillon se trouvant sous le microscope consiste en - des particules non attachées mobiles - des particules immobiles sur la lame - des particules avec un mouvement limité. Bien entendu, seules ces dernières particules présentent de l'intérêt. Afin d'améliorer la sélection de ces particules, il est possible de leur appliquer, soit un gradient de champ magnétique, en particulier un aimant, si on a choisi des particules sur lesquelles un gradient magnétique exerce une force, soit un champ de type fluidique, soit un champ électrique, soit un gradient de champ électrique. Et l'on choisit à ce moment les particules qui ont une zone de déplacement qui correspond à l'extension attendue du bras espaceur en l'absence de fixations non désirées du bras espaceur ou de la séquence d'ADN avec la surface ou avec les particules elles-mêmes. De façon générale, on connait la longueur du bras espaceur, ce qui permet de repérer les particules pouvant faire l'objet d'une étude. Les techniques destinées à permettre le greffage sur les extrémités de constructions moléculaires sont connues, il s'agit essentiellement de systèmes utilisant une association ligand/récepteur, ou encore de liaisons covalentes. De préférence, les extrémités à greffer sont biotinilées ou fonctionnalisées avec un ligand tel que dig, tandis que les lames de verre par exemple, ou les particules sont revêtues respectivement avec de l'avidine ou de la streptavidine ou un anticorps antidig. De façon générale, pour fixer l'extrémité de la séquence d'acide nucléique au support on peut utiliser une interaction - covalente - antigène / anticorps - ligand / récepteur - avidine ou streptavidine / biotine. La fixation éventuelle de la particule ou du support sur le dispositif de mesure de force pourra être réalisée par tout moyen, notamment par liaison, comme précédemment, mais également par collage ou par influence magnétique en utilisant des billes appropriées. Des constructions plus spécifiques seront décrites dans les exemples ci-après. Le bras espaceur peut, bien entendu, être placé ou bien sur le premier support, une lame constituée d'une surface de verre par exemple, mais il est possible de prévoir une fixation sur la particule par l'intermédiaire d'un bras espaceur, dans ce cas le procédé est caractérisé en ce que l'extrémité 5' du duplex à caractériser, respectivement l'extrémité 3', est fixée sur le support 2 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 Fm, mais de préférence comprise entre 0,5 Fm et 30 Clam, dans ce cas, l'une des extrémités du duplex peut être fixée directement sur la lame. Afin d'améliorer encore le procédé, il est possible de prévoir l'utilisation de deux bras espaceurs, l'un par rapport à la surface ou support 1, l'autre par rapport à la particule ou support 2. Dans le second mode de réalisation (mode II), le support 2 est fixé à l'extrémité 3', respectivement 5', alors que le duplex à caractériser a été au moins partiellement dénaturé et que les extrémités des deux séquences d'acide nucléique désappariées le comportant ont été partiellement éloignées spatialement d'une distance d'au moins 0,03 llm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 (sm. De préférence, les extrémités libres du duplex sont reliées par une séquence en épingle à cheveux, ce qui permet de dénaturer l'ensemble du duplex. De façon plus spécifique, - le duplex étant bloqué par une épingle à cheveux, on fonctionnalise chacune des extrémités libres, par exemple avec de la biotine et du dig, - puis on fixe une particule comportant, par exemple, de la streptavidine, sur l'extrémité correspondante, - cette bille est alors immobilisé par un moyen quelconque, mécanique par exemple (micro-pipette), - on dénature alors le complexe et on place l'ensemble dans un courant de fluide, - l'extrémité non fixée sur la bille s'éloigne et on fixe par exemple une bille traitée anti-dig sur cette extrémité, la bille peut être approchée par tout moyen, notamment des pinces optiques. Dans le mode I préféré de réalisation, le bras espaceur sera constitué d'un ADN double brin, par exemple d'un ADN double brin provenant du phage-k. Le duplex d'ADN (DNA 1) dont on souhaite obtenir une signature selon la présente invention doit être relié au bras espaceur. De préférence, le duplex est digéré par au moins une enzyme de restriction, ce qui permet de connaître la nature de ses extrémités, tranchée ou cohésive, et en ce cas la séquence cohésive. I1 est ensuite aisé pour l'homme de l'art d'attacher le segment au bras espaceur (ADN lambda ou autre), par exemple par un système de type cassette, Un exemple de réalisation est donné sur la figure 2B qui est un système cassette de bras espaceur, DNA 2 est un ADN double brin du phage-k, complété par: (i) fonctionnalisation dig d'un côté : ceci est réalisé, par exemple, à l'aide de oligo 3, qui est une séquence Cos fonctionnalisée dig en 3' et est attachée de façon covalente par hybridation puis ligation (ii) le système d'adaptateurs oligo 1 et oligo 2 : oligo 1 a une séquence Cos et est fixé par hybridation et ligation sur DNA 2 ; oligo 2 est fonctionnalisé 3' avec de la biotine, il possède une séquence complémentaire d'une partie d'oligo 1 et peut donc s'y fixer par simple hybridation, I'extrémité libre du duplex oligo 1-oligo 2 est choisie de façon à ce qu'elle soit cohésive avec la coupure de l'ADN DNA 1 avec une enzyme de restriction. Par hybridation puis ligation, on obtient une liaison covalente des deux brins 3' et 5' d'une extrémité de DNA 1: le brin 3' sur oligo 2 et le brin 5' sur oligo 1. Dans la construction finale, on fixe l'extrémité dig sur un support 1 et la biotine sur un support 2. Le support 1 peut être, par exemple, une lamelle de verre recouverte d'antidig, et le support 2 peut, par exemple, être une microbille recouverte de streptavidine. L'ouverture de DNA 1 peut être obtenue en déplaçant le support par rapport à la bille, ce qui tire son brin 3' lié à la bille, et son brin 5' lié à la lamelle par le bras espaceur DNA 2. Dans cet exemple, on peut naturellement interchanger les positions des fonctionnalisations dig et biotine. Un ensemble cassette tel qu'il vient d'être décrit à titre d'exemple peut être un élément d'une trousse de diagnostic, de façon à obtenir la construction qui permet l'ouverture, par une simple opération d'hybridationligation. A titre d'exemple, on décrit une telle technique, appliquée à l'ouverture de 1'ADN du phage lambda (DNA 1, figure 2), avec un bras espaceur constitué par 1'ADN double brin d'un phage lambda (DNA 2, figure 2). Dans la construction finale, le connecteur oligo 2 peut avoir une région non appariée libre, près de la biotine, de façon à faciliter la réaction ultérieure avec les microparticules. L'ensemble de la construction est lié par des étapes de ligation après les différentes étapes d'hybridation, laissant la possibilité d'ouvrir la molécule à l'extrémité biotinilée. Naturellement, d'autres combinaisons de ligands et de récepteurs peuvent être choisies, ou encore de multiples ligands d'un même type peuvent être utilisés à la place d'un seul (Cluzel et al., 1996 ; Strick et al., 1996). Enfin, le bras espaceur peut être naturellement placé, soit entre support 1 et ADN à ouvrir (exemple donné ici), soit entre ADN à ouvrir et support 2, soit une combinaison de cas précédents. Un élément complémentaire du procédé est introduit en ce qui concerne l'autre extrêmité de la molécule à ouvrir. Celui-ci peut être coiffé avec un oligonucléotide en épingle à cheveux cohésive (hairpin-oligo), ce qui évite que les deux brins se séparent lorsque l'on atteint la fin du processus d'ouverture. Ceci permet de répéter des cycles complets d'ouverturefermeture. On peut aussi ne pas utiliser cet élément complémentaire et procéder à une ouverture partielle en évitant de désapparier complètement le duplex, ce qui permet avantageusement de répéter des cycles partiels d'ouverture-fermeture. Modification de signature Comme on le verra dans la suite, la signature dépend de la raideur totale du système, c'est-à-dire du système de mesure et aussi de la construction moléculaire, notamment celle des simples brins de la molécule ouverte. On peut avec avantage varier ce paramètre de raideur pour obtenir des signatures différentes pour une même séquence. 1) Raideur du système de mesure S'agissant du levier, il est facile de changer pour des leviers de raideur différente. Dans le cas d'une mesure par pince optique, ceci peut être obtenu, par exemple, par simple modification de l'intensité ou de la position du laser de piégeage. Naturellement d'autres modes de fonctionnement, notamment avec rétroaction (par exemple Finer et al, 1994 ; Svoboda et al., 1993 ; Yin et al., 1996), peuvent être utilisés avec avantage. On donne deux exemples: (i) Dans un de ces cas, la position de la pince peut être ajustée automatiquement par rétroaction pour s'opposer aux déplacements de la bille. La variation de la force lors de l'ouverture se traduit par une variation de la position du piège. (ii) Dans l'autre exemple, l'intensité de la pince peut être contrôlée par rétroaction de façon à garder fixe la position de la bille. La variation de la force lors de l'ouverture se traduit par une variation de l'intensité du laser. En conclusion, la présente invention inclut plusieurs modes de mesures, se traduisant éventuellement par différents types de signatures. On peut donc pour une même séquence accumuler plusieurs signatures différentes dont les informations peuvent se recouper et se compléter. 2) Raideur des simples brins Dans le même esprit, la présente invention inclut la modification de la raideur des simples brins (qui sont en série dans la mesure) en introduisant dans le tampon de mesure des molécules particulières connues pour modifier la raideur des simples brins. Notamment, il existe de nombreuses protéines qui ont une affinité pour les simples brins, comme recA ou SSBP (Single Strand Binding Protein), et qui peuvent augmenter la raideur des simples brins. De même, des oligonucléotides (par exemple une population de séquence aléatoire) peuvent aussi être utilisés. Autres conditions exoérimentales envisageables Il peut être utile de varier les conditions expérimentales pour obtenir des signatures différentes sur la même molécule. Ainsi, on peut varier la température et/ou modifier le tampon utilisé. En particulier, on peut utiliser avec avantages certains tampons spécifiques pour avoir une action sur la stabilité des appariements entre bases (par exemple, Rees, 1993). Modification du duplex ou des simples brins On peut induire en certains points de la signature des marques particulières, ou empreintes. Celles-ci sont obtenues en ouvrant une molécule modifiée par adjonction de réactif. Par le terme réactif", on entend ici toute molécule capable d'établir une interaction spécifique avec partie du duplex, que celui-ci soit ouvert, fermé ou à la fois ouvert sur certaines parties et fermé sur d'autres. La modification du duplex ou des simples brins est choisie avec avantage pour modifier, de façon locale et substantielle, la force de séparation des brin, pouvant même aller jusqu'à un blocage complet de l'ouverture. Sans pour autant s'y limiter, on donne ci-dessous quelques exemples avec: A) - l'introduction d'une liaison plus forte en une ou plusieurs zones particulières de la séquence ; ceci conduit dans la signature à une ou plusieurs montées caractéristiques, quand le point d'ouverture moyen atteint ces zones - l'introduction d'une ou plusieurs protéines caractérisées en ce qu'elles sont capables de se fixer de façon spécifique sur le duplex, par exemple sur certaines séquences (telle une enzyme de méthylation) ou encore sur certaines structures (telles la fixation sur un mésappariement, avec la protéine Mut par exemple) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner un réactif particulier (attaché à une protéine) permettant d'induire un "cross link" inter-brin, avec un groupement photoactivable par exemple - I'introduction d'une liaison inter-brin renforcée, par exemple par formation de triple hélice (avec une séquence d'oligonucléotides ou de leurs analogues) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner un réactif particulier (attaché à l'oligo) permettant d'induire un cross-link inter-brin, avec un groupement photoactivable par exemple - le tampon utilisé et/ou le choix de la température peuvent également modifier de façon substantielle la force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, le duplex. B) on peut faire interagir sur les simples brins de la molécule d'acide nucléique partiellement ouverte des molécules additionnelles caractérisées en ce qu'elles se fixent de préférence sur au moins un site spécifique sur un simple brin ; lors de la refermeture et/ou réouverture, le signal de la signature est alors modifié. Utilisations des signatures Une ou plusieurs signatures, avec empreinte ou non, correspondant à un duplex donné, peuvent être comparées à des références, constituées soit par une ou plusieurs mesures sur un autre duplex, soit à des calculs numériques, soit une combinaison des deux. On peut ainsi détecter et localiser l'absence ou la présence d'un ou plusieurs des éléments suivants donnés à titre d'exemple - homologie, - translocation, - délétion, - amplification, - des région de répétition homologue, - zone d'appariement partiel, - motif particulier de la séquence, - différence, - mutation, - contigation, - une région particulière, identifiable par son contenu GC, - un ilôt CpG. Cette méthode constitue une aide au séquencage. Elle permet aussi l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents patients ou différents échantillons d'ADN à tester. L'invention concerne, enfin, un coffret de diagnostic destiné à la mise en oeuvre du procédé revendiqué et qui est décrit ci-dessous. Le coffret de diagnostic est caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des éléments suivants: - au moins un bras espaceur, - au moins une construction moléculaire cassette de bras espaceur, - au moins un oligonucléotide de jonction, - au moins un oligonucléotide en épingle à cheveux, - au moins une enzyme de restriction, - au moins une construction moléculaire destinée à fixer les brins du duplex à ouvrir sur des éléments de l'appareil de mesure de force, - un support fixable à l'extrémité fonctionnalisée du bras espaceur. - au moins un puits, - au moins une lame, - au moins un type de billes fonctionnalisées et avantageusement aimantables, destinées à être attachées à un élément fonctionnalisé du duplex à ouvrir, - au moins un aimant, - au moins un tampon, - au moins une enzyme de ligation, - au moins un tampon de ligation, - au moins une colonne de séparation par centrifugation. - La figure 1 illustre, sur un exemple, le principe de la mesure de sur un micro-manipulateur. Une fois que le levier (fixé à sa base) est attaché, à son extrémité souple, à une construction moléculaire, le puits est déplacé latéralement et la déflexion correspondante de l'extrémité du levier est mesurée sur la vidéo. Un ordinateur (PC) est utilisé pour contrôler le déplacement et acquérir les données de déflexion. - La figure 5 rend compte de ce que la force (déflexion du levier) est une fonction de la distance extrémité à extrémité" pendant l'extension de la construction moléculaire. - La figure 6 rend compte de données relatives à la force en fonction de la distance extrémité à extrémité pour trois mesures (A, B, C) de la même molécule utilisant des vitesses de translation variées. Une structure à l'intérieur du plateau apparaît plus clairement quand la translation est lente (figure 6A). - La figure 7 illustre la comparaison des forces en fonction du signal de la distance extrémité à extrémité de la construction moléculaire A et A-1 (défini plus loin). La vitesse de translation utilisée dans ces mesures d'ouverture est d'environ V = 0,06 ,ams-1. Au niveau de la figure 7B, les deux mesures sont directement superposables. - La figure 8 illustre la teneur moyenne en GC le long de la molécule du phage A. Un moyennage est réalisé sur 200 bases (figure 8C), sur 1 000 bases (figure 8B) et sur 2 000 bases (figure 8A). - La figure 9 illustre la comparaison de la force mesurée pendant l'ouverture (figure 9A) et la fermeture (figure 9B) de la même molécule à la même vitesse de translation. La figure 10 montre la reproductibilité du signal de force pour deux mesures, à des instants différents, sur la même molécule, et à la même vitesse de déplacement (160 nm/sec). - La figure 1 1 montre le détail d'un signal de force à faible vitesse de déplacement (40 nm/sec), où l'on voit clairement la structure en dents de scie. - La figure 12 permet de comparer un détail de la mesure (amplitude pic pic de 2 pN environ ; creux GC au milieu de l'ouverture du A) avec le contenu GC (moyenne glissante sur 500 bases) représenté pour le morceau correspondant entre les index de base de 15 000 à 25 000. - La figure 13 illustre un calcul numérique du signal de force pour une molécule d'ADN du phage A. L'axe horizontal est décalé par rapport aux mesures expérimentales car le bras espaceur n'est pas inclus dans la description théorique. - La figure 14 illustre un ensemble de résultats théoriques sur la physique de l'ouverture. Du bas vers le haut, la force de déflextion, le nombre moyen de paires de bases ouvertes, et la variance de j sont présentés en fonction du déplacement de l'échantillon (en micromètre) qui contrôle le processus d'ouverture. La teneur moyenne en GC correspondant à la séquence ouverte est tracée sur la droite (moyenne glissante sur 100 bases). Par le choix des axes communs, la figure permet de relier les structures dans le contenu GC, à la force de déflexion, à et à la variance de j (et vice versa). - La figure 15 illustre l'effet de la raideur du levier et des simples brins. On a porté le nombre moyen de paires ouvertes, en fonction du déplacement (échelle de déplacement donnée par la barre horizontale). Dans ces calculs, la raideur du levier bien. est quatre fois plus petite (courbe A), deux foix plus grande (courbes B et C), ou dix fois plus grande (courbe D) que la raideur du levier utilisé dans les expériences. Pour les courbes C et D, on a supposé que la longueur de chacun des deux simples brins est réduite de 20 000 bases, ceci permet d'observer l'influence de l'élasticité des simples brins. Exemple de réalisation pratique On décrit ici à titre non limitatif, et comme exemple, le détail de la préparation et de la mesure de signature selon la présente invention sur l'ADN du phage lambda. Construction (figures 1 et 2) Oligo 1 est un élément connecteur entre DNA 1 (ADN du phage x destiné à être ouvert) et DNA 2 (ADN du phage X qui sert de bras espaceur). Oligo 2, élément connecteur, est biotinylé 3', ce qui sert à l'attachement sur une bille. Oligo 3 est fonctionnalisé 3' dig et sert à l'attachement sur la surface. Oligo 4 est une mini-épingle à cheveux cohésive. Les séquences choisies à titre d'exemple sont les suivantes Oligo 1 5' Agg TCg CCg CCC AAg ggA CTA CgA gAT Tg 3' Oligo 2 (fonctionnalisé 3' biotine) 5' Agg TCg CCg CCC CAA TCT CgT AgT CCC AAA AAA TCA gCA gTA AC Biotine 3' Oligo 3 (fonctionnalisé 3' dig) 5' ggg Cgg CgA CCT dig 3' Oligo 4 (mini-épingle à cheveux cohésive) 5 ' ggg Cgg CgA CCT AgC gAAAgCT3' La préparation est effectuée de la façon suivante, par exemple à partir de 10 Fg de DNA 1 et 10,ug de DNA 2: Le tampon utilisé lors des fusions ci-après est le tampon de ligation sans ATP (Pharmacia). Les volumes de réaction sont typiquement de 20 à 60 1. Fusion (55"C, 1 heure) et ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 1 heure, 16"C) de: - DNA2 + oligo 3, c'est-à-dire la préparation A (rapport de molarité:1/10); - DNA1 + oligo 4, c'est-à-dire la préparation B (rapport de molarité:1/10). Ibis. Thermo-inactivation de la ligase. 2. Fusion (55"C, 1 heure), ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 1 heure, 16"C), thermo-inactivation de la ligase et purification de: - préparation A + oligo 1, c'est-à-dire la préparation C (rapport de molarité: 2/10); - préparation B + oligo 2, c'est-à-dire la préparation D (rapport de molarité: 2/10). 3. Fusion (40"C, 1 heure, puis refroidissement lent), ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 2 heures, 16"C), thermo-inactivation de la ligase et purification de - préparations C et D, en ajoutant du PEG (10%) pour promouvoir la réaction, c'est-à-dire la préparation E. Typiquement, on a utilisé 2 ng de construction par expérience. Les étapes de purification sont réalisées par des colonnes de filtration Amicon-100. L'échantillon Les expériences sont effectuées dans un liquide (tampon de pH contrôlé et de concentration en sel donnée, on utilise par exemple du PBS, 10mM phosphate, 150mM Na+, pH = 7.0). Un anneau en plastique est collé à la parafine sur la lame du microscope et permet de maintenir un petit volume de tampon au-dessus de la surface de verre. Ceci constitue un puits dans lequel les mesures seront effectuées. La surface de verre fonctionnalisée (fond du puits) va ancrer la construction moléculaire. Puis les particules sont ajoutées et un certain nombre d'entre elles vont se fixer. Le puits est placé sur un microscope inversé et la mesure des forces est effectuée en utilisant une micro-aiguille souple, introduite dans le liquide par la partie libre du ménisque. Naturellement, un piège optique (Svoboda et al., 1993 ; Finer et al., 1994 ; Yin et al., 1996) peut être utilisé avec avantage comme capteur de force, à la place d'une micro-aiguille. On doit, enfin, prendre garde d'éviter les surfaces chargées positivement de façon à éviter les adsorptions non souhaitées d'ADN. 1) Support n" 2 les particules sont des billes Les billes utilisées sont des billes commerciales Dyna, paramagnétiques (diamètre 2,9 ,am). Ces billes sont revêtues de streptavidine et on leur a appliqué un traitement complémentaire avec un agent d'acétylation (NHS acétate). 2) Support n" 1 : Lamelles de microscope et leur DréDaration Dans les étapes de préparation un très petit volume de réaction, environ 10 crl est créé par l'utilisation d'un petit disque circulaire de verre mince (diamètre 12 mm) qui est disposé à l'intérieur de l'anneau en plastique du puits et sert du couvercle. Lorsqu'il est nécessaire d'effectuer une chimie par voie liquide, le liquide, environ 10 Fl, est d'abord ajouté au puits et le disque placé ensuite par dessus adhère par capillarité. Le liquide se retrouve confiné entre le fond du puits, d'une part, et la lamelle circulaire, d'autre part ; le liquide est réparti sur toute la surface avec une épaisseur approximativement uniforme d'environ 10 pm. L'incubation est alors effectuée dans le puits couvert. Pour l'étape suivante 300 à 400 p1 de tampon sont ajoutés à l'intérieur de l'anneau du puits, le disque en verre flotte en dehors de la base du puits et est facilement éliminé avec des brucelles. L'excès de tampon est éliminé en inclinant le puits sur un papier absorbant. On prépare des lamelles de microscope en verre sur lesquelles sont greffés des polymères linéaires, chargés négativement (polymérisation statistique d'acide maléique et d'acrylamide sur les lamelles silanisées vinyl, ce qui crée une surface chargée négativement et très hydrophile). Ceci permet la fonctionnalisation subséquente avec l'antidig. A titre d'exemple, on peut utiliser pour la silanisation un trichlorosilane, avec une chaîne intermédiaire composée de 5 à 20 carbones, terminée par un groupe vinyle. Les surfaces de verre sont introduites dans une enceinte étanche, munie d'une trappe d'accès et de tuyaux d'entrée et de sortie, munis de robinets. Cette enceinte contient un tube qui génère de 1'U.V., constitué d'une lampe basse pression à mercure (marque Heareus) générant de l'U.V. sur une gamme de longueur d'onde qui recouvre partiellement la bande d'absorption de l'oxygène. Dans un premier temps (10 minutes), l'enceinte est balayée par un courant d'oxygène gazeux. Les robinets sont ensuite fermés et on allume la lampe pendant une à plusieurs heures. De l'ozone est créé et aide au nettoyage des surfaces de verre. Après arrêt de l'U.V., un flux gazeux est introduit pendant 5 minutes. Il s'agit d'oxygène ayant barboté dans de l'eau. Les lamelles sont extraites rapidement de la chambre et introduites dans une enceinte hermétique, en verre, dans laquelle on a disposé quelques gouttes de silane. La silanisation se produit par transfert gazeux. Après quelques heures, les lamelles sont mises dans un four (typiquement 1500C pendant une heure), puis rincées sous un filet d'eau et stockées dans un pochon de feuille d'aluminium par exemple. A partir des lamelles, on fabrique des puits comme décrit précédemment. Dans les puits on introduit un petit volume d'un mélange constitué de: - acrylamide, - acide maléique neutralisé pli 7 au moment de l'utilisation, - eau désoxygénée, - persulfate (initiateur), - TEMED (initiateur). Le rapport acrylamide/acide maléique est choisi dans la gamme 10/1 à 5/1. La polymérisation est réalisée dans les puits, protégés par leur couvercle. Cette procédure permet l'obtention d'une matrice électronégative et hydrophile constituée ici par les groupements acides (issus de l'acide maléique), incorporés dans les polymères longs issus de la polymérisation de l'acrylamide, eux-mêmes ancrés sur la surface. Le caractère fortement électronégatif permet de combattre efficacement l'adsorption de l'ADN, polyélectrolyte de charge négative. L'homme de l'art peut naturellement adapter cette conception particulière de matrice électronégative à d'autres systèmes. A titre d'exemple, on peut citer encore une matrice obtenue par fixation de dextran, suivie d'une étape de transformation des sucres pour obtenir des groupements acides. Une matrice électronégative est caractérisée en ce qu'elle est constituée de polymères de caractère globalement électronégatif et hydrophile, attachés sur un support, les polymères peuvent être statistiques et/ou branchés, mais en moyenne sont constitués de l'assemblage d'au moins un type de monomère. La taille typique des polymères exprimée en nombre de monomères incorporés est d'au moins deux, de préférence entre 10 et 1 000 et pouvant même aller jusqu'à un million, et la matrice finale présente de façon statistique ou régulière une densité de groupements -COOH au moins supérieure à 1/1 000 et de préférence comprise entre 1/20 et 1/1. L'antidig (polyclonal, Boehringer Mannheim) est couplé par des groupes NH2 à une partie de la matrice COOH en utilisant les techniques des EDC-NHS ou EDC-NHSS. Après élimination du couvercle et rinçage, un film mince de tampon demeure sur la surface hydrophile de la surface en verre traitée. On peut alors effectuer les autres opérations de couplage. Le couplage de l'antidig est effectué de la façon suivante - 10 minutes d'incubation EDC-NHSS (dans de l'eau) (EDC = 1-Ethyl-3 (3-Diméthyl-aminopropyl)-Carbodiimide sous forme de chlorhydrate, NHSS = Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide)) - 10 secondes de rinçage sous un filet d'eau; - 10 minutes de couplage avec l'antidig dans du PBS; - 10 minutes de désactivation avec de la glycine 1M pH8, pour permettre la récupération des groupes COOH à partir des sites activés résiduels EDC-NHSS; rinçage. Les surfaces antidig avec un agent antimicrobien (0,02 % NaN3) et protégées par une lamelle sont placées dans un sac avec une atmosphère humide et peuvent être stockées des semaines dans un réfrigérateur. En effectuant les expériences, les puits revêtus d'antidig sont rincés avec du PBS, incubés avec une dilution de construction moléculaire dans du PBS (typiquement 1 ng de construction dans 10 p1) pour 30 minutes. Les dilutions et tampons d'incubation peuvent naturellement être adaptés. Puis un excès de tampon est ajouté et les billes revêtues de streptavidine sont introduites. Elles sédimentent et réagissent avec la construction moléculaire à la surface de la lame de microscope. Après une heure d'incubation typiquement, une grande partie des billes non attachées sont éliminées en trempant rapidement un petit aimant dans le puits, l'aimant attire et colle les particules libres. Puis on effectue l'étape de sélection des billes décrite précédemment et qui utilise la présence de bras espaceur. Typiquement, de 0 à 50 billes attachées sont observées dans un champ de vue, sous le microscope avec un objectif 20X. Dans le même champ, typiquement une fraction variant du 1/10 aux 3/4 des billes peuvent être collées ou adsorbées. Naturellement, d'autres surfaces que le verre, notamment des matériaux polymériques, peuvent être utilisées, à la fois pour le fond du puits et pour le couvercle. Ce dernier peut aussi être réalisé avec d'autres matériaux, un métal ou une céramique à titre d'exemple non limitatif. Le levier de force : micro-aiguille sounle en verre On utilise un appareil commercial à tirer des pipettes. On prépare des micro-aiguilles (dont les dimensions typiques sont : diamètre : 1 mm, diamètre de l'extrémité : 1 pm et longueur 1 cm). La raideur varie en fonction des aiguilles et est calibrée (voir suite). Les aiguilles sont biotinilées chimiquement comme suit: - lavage au mélange sulfochromique; - silanisation (avec un silane terminé par une amine primaire) - réaction avec NHS-LC-biotine (Boehringer) (qui réagit les amines primaires). Le levier traité adhère rapidement aux microbilles revêtues de streptavidine simplement en les touchant. On peut immédiatement procéder aux mesures de force. Après la mesure, les microbilles peuvent être séparées par un choc mécanique sur le levier, ou en utilisant un effet de ménisque simplement en soulevant le levier hors du puits puis en le replongeant dans le liquide. Mesure des forces L'échantillon est placé sur un microscope inversé comportant un objectif à grande magnification (Zeiss Achroplan, immersion dans l'huile, x 100, N.A. 1,25). L'image de la bille et de l'extrémité souple du levier est recueillie par une caméra vidéo. Une platine de translation piezo permet un déplacement latéral précis de l'échantillon par rapport à la base fixe du levier de force. (L'inversion cinématique est bien sûr envisageable). Ce déplacement est mesuré avec une résolution meilleure que le micron en utilisant un senseur inductif. Un ordinateur permet de connecter les informations sur le déplacement de l'échantillon et la dé flexion du levier qui est enregistrée par une caméra vidéo, (l'image vidéo est capturée par un système d'acquisition numérique). Les forces impliquées dans les expériences d'ouverture de 1'ADN sont de quelques dizaines de PicoNewtons, qui correspondent typiquement à un déplacement de l'extrémité du levier de quelques dizaines de microns. On a utilisé deux types de méthodes pour obtenir ces données de déflexion. Dans le mode peu résolu (appelé Analyse 1), la détermination de la déflexion est faite à une résolution de 0,2 Fm environ, qui correspond à celle des pixels (acquisition numérique de l'image). Un deuxième mode plus sensible a été utilisé (appelé Analyse II). Utilisant le fait que les billes présentent une image très contrastée (blanc au centre, noir sur leur périphérie), la méthode choisie est la suivante : une unique ligne vidéo de l'image est retenue et sélectionnée de façon à recouvrir une section de la bille ; la ligne vidéo présente une structure de fond gris, sur lequel est superposée la modulation forte et localisée noir-blanc-noir qui correspond à la bille. Une méthode numérique permet alors avec une résolution du subpixel l'interpolation de la position du centre de la bille. On peut ainsi, à partir de l'enregistrement vidéo des déplacements de la bille collée au levier, remonter à la déflexion au cours de l'expérience, avec une résolution de l'ordre d'une vingtaine de nanomètres (Analyse II). La platine à déplacement piezoélectrique permet des séquences arbitraires de déplacement en fonction du temps. Calibration de la raideur des leviers La micro-aiguille à calibrer est d'abord biotinilée comme décrit précédemment. Une bille paramagnétique (Dyna) est attachée à l'extrémité de la micro-aiguille dans un puits (sans ADN) rempli de tampon. Un petit aimant est approché à quelques dizaines ou centaines de microns, et la déflexion de l'extrémité du levier en fonction de la distance entre la bille et l'aimant est mesurée. L'aimant est écarté ensuite à une position qui correspond à une petite déflexion. La bille est alors détachée mécaniquement à partir du levier souple en utilisant une seconde microaiguille plus raide contrôlée par micro-manipulation. La bille se déplace alors rapidement vers l'aimant. En utilisant une illumination stroboscopique, on repère la position en fonction du temps de la bille pendant l'accélération vers l'aimant. La vitesse de la bille en fonction de la distance bille/aimant est obtenue à partir d'informations vidéo. La vitesse locale v est proportionnelle à la force sur la bille (par la formule de Stokes: F = 67r riRv dans laquelle n est la viscosité du tampon et R est le rayon de la bille). A partir des deux jeux de mesure (déflexion du levier en fonction de la distance bille/aimant et vitesse de la bille en fonction de la distance bille/aimant) on obtient la relation entre force et déflexion, c'est-à-dire la raideur du levier. Un seul levier a été utilisé au cours des différentes expériences. Sa raideur a été estimée à 1,7 pN/micron (avec une précision de 20 %). Une confirmation indépendante de cette calibration est la suivante : parfois lorsque la molécule refuse de s'ouvrir, un plateau caractéristique dans la courbe extension en fonction de la force de la double hélice, sont alors mesurées (Cluzel et al., 1996 ; Smith et al., 1996). En utilisant la raideur de la calibration, les valeurs des forces obtenues pour ce plateau sont compatibles avec celles données dans la littérature. Mesures de l'ouverture de l'ADN t'ar des forces mécaniques Dans la figure 5, avec l'Analyse I, on a représenté un premier exemple de mesure de force lors de l'ouverture de l'ADN du phage A. L'axe horizontal correspond à la distance entre les deux ancrages de la construction moléculaire (distance bout à bout, définie comme le déplacement du puits mesuré à partir de l'attachement du levier, retranché de la déflexion du levier). Au point A, à une force zéro et à une distance zéro, aucune force mécanique mesurable n'est exercée par le levier sur la molécule ; par l'action des forces entropiques, le bras espaceur double brin de l'ADN A, avant attachement du levier, se trouve compacté près du point d'ancrage (distance égale à zéro, identifée comme la position moyenne de la bille avant l'attachement au levier). Juste après l'attachement de la bille au levier, on lève le levier de quelques micromètres au-dessus de la surface pour éviter les frictions solides. En déplaçant l'échantillon latéralement dans la direction X positive ou négative, une déflexion mesurable apparait lorsque les distances bout à bout approchent de la longeur du bras espaceur ADN A (environ 16 Fm). Le segment A-B-C (respectivement A'-B'-C') correspond à l'extension entropique du bras espaceur. On trouve ici le régime décrit par Bustamante et al., (1994) sur l'extension d'une double hélice d'ADN simple. Au point C (respectivement C'), on observe un soudain changement dans la dépendance de la force en fonction de la distance. Un quasi plateau C-D (respectivement C'-D') est observé à une force d'environ 11 à 13 pN. Ce plateau correspond à la séparation de deux brins de la molécule d'ADN, dont un brin est fixé au long bras espaceur d'ADN et le second brin à la bille. La distance A-D de la figure 5 excède trois fois 16 Fm, ce qui est attendu puisque les longueurs suivantes sont impliquées : le bras espaceur d'environ 16 Fm plus deux fois la longueur de 1'ADN monobrin étendu. A ce niveau grossier de résolution, l'ouverture apparait à une valeur de force pratiquement constante. La figure 5 a été obtenue par un cycle de déplacement rapide. En effectuant le retour de D à A, les deux brins se réapparient et un nouveau cycle de mesure peut être effectué. Durant le retour, on observe un phénomène d'hysteresis comme cela sera décrit dans la figure 9. Lorsque la molécule k est totalement ouverte, la force augmente et correspond à l'extension linéaire des trois composants en série, le bras espaceur et les deux monobrins reliés par l'épingle à cheveux. Parfois, les caractéristiques de l'ouverture sont différentes - une force très supérieure à ce qui est attendu, est observée, juste avant l'ouverture (ceci correspond probablement à une adsorption partielle des billes sur le double brin). Parfois, les molécules ne s'ouvrent pas, même pour des forces supérieures à 50 pN, - la courbe distance bout à bout, en fonction de la force, croît, bien que l'ouverture ne soit pas complète ; ce blocage de l'ouverture peut être répété ou transitoire, ceci peut être dû à des noeuds ou des liaisons inter-brins. Analvse plus fine de la courbe force/distance Un certain nombre de détails apparaissent lorsque la vitesse de déplacement est plus lente (figure 6). Ceci offre la possibilité d'optimiser la qualité du signal force en choisissant une séquence appropriée de déplacement en fonction du temps. Pour montrer que la courbe force en fonction de l'extension est reliée à la séquence de base de la molécule de 1'ADN A, on a préparé une construction dans laquelle l'ADN k destiné à être ouvert, a été inversé. Cette construction dénommée Ki, par opposition à la précédente, notée elle A, est réalisée de façon à ouvrir le même type de molécule phage h, mais en partant de l'autre extrémité. En prenant le brin 5'-3' gauche de l'ADN k comme référence, l'ouverture de A part de l'extrémité 5' et l'ouverture A-1 part de l'extrémité 3'. Sur la figure 7, la courbe force en fonction de l'extension de la structure inversée A-1 est comparée à celle de la structure directe A. Les éléments de symétrie apparaissent lors de la mesure de la force. A partir de cette symétrie approximative entre A et A-1, on peut mettre en évidence des détails qui apparaissent à l'origine de la même séquence explorée dans les deux sens. Le signal de force de la construction inversée est mis en sens inverse sur la figure 7. Ceci permet de comparer des détails d'information obtenus par les deux mesures qui semblent se compléter mais ne se superposent pas. Les flèches indiquent l'ouverture de direction. Signature de la force en fonction de la séquence La séquence des bases complètes de la molécule de k est connue. Dans la figure 8 on représente les moyennes de contenu G-C le long de la molécule. Zéro sur l'axe horizontal correspond aux paires de bases qui s'ouvrent d'abord dans la construction A. La mesure des forces sur A correspond à la forme caractéristique du contenu local en G-C, comme cela peut être vu en comparant les figures 7 et 8. On n'espère pas un accord parfait, compte-tenu de ce que l'ouverture mécanique est un processus dynamique complexe qui n'est pas le même pour A et A-1, et enfin que la longueur des simples brins varie lors du processus d'ouverture et donc leur élasticité varie. A partir de l'inspection du nombre de caractéristiques dans la courbe d'ouverture, on constate déjà que la résolution du processus est meilleure que 500 bases. Les zones riches en GC correspondent à des forces d'ouverture plus grandes comparativement aux zones pauvres en GC. Effets de sel En effectuant différentes mesures préliminaires avec Na+ 10mM, ou Na+ 1M (PB 10 mM Phosphate, 10 mM Na+ ou PBS avec du sel ajouté: 10 mM Phosphate, 1M Na+), on a constaté une très faible dépendance du niveau initial de force Fo nécessaire pour ouvrir l'ADN. Par rapport aux mesures standards effectuées dans PBS (10 mM de Phosphate, 150 mM Na+), on observe une tendance d'augmentation faible de Fo (à environ 14 pN) dans Na+ 1M et une décroissance faible dans 10 mM Na+ (à environ 10 pN). Un effet plus important est évidemment envisagé à des niveaux de sel très faibles (de l'ordre du millimolaire ou sub millimolaire). Refermeture des brins Jusqu'à maintenant, on a essentiellement étudié le signal de force apparaissant lorsque l'on ouvre une double hélice. Lorsque la distance bout à bout décroît, les brins indépendants se ré apparient. Comme cela apparaît dans la figure 9, le signal de force acquis durant l'étape du retour peut différer du signal obtenu durant l'ouverture. En particulier, des chutes prononcées apparaissent parfois dans la courbe force en fonction de la distance. Une interprétation possible de ces effets est qu'il existe un réappariement transitoire différé. Plusieurs sources peuvent être envisagées 1) des structures secondaires, c'est-à-dire une fixation locale entre deux brins en mésappariement 2) des séquences particulières peuvent induire des instabilités; 3) d'autres modifications: - d'autres macromolécules (en particulier des molécules d'ADN libres en solution peuvent s'interposer dans la fourche de fermeture) - des solides microscopiques (des poussières par exemple). I1 est clair que l'élasticité de l'ensemble du système est impliquée. En particulier, il faut noter que sur l'instabilité durant la fermeture, la pente de la courbe force/distance augmente alors que la longueur des brins simples diminue. Reproductibilité On a effectué des mesures à grande résolution (Analyse II définie précédemment) sur une même molécule, à deux instants différents, et à la même vitesse moyenne de 160 nm/sec. La figure 10 présente le résultat de ces deux mesures. On pourra également comparer ces Analvse de signature à forte résolution et à basse vitesse A forte résolution (Analyse II définie précédemment) et à basse vitesse, le signal d'ouverture présente des répétitions de motifs caractéristiques en dents de scie, constitués d'une montée lente en force, en fonction du déplacement imposé, suivi d'une décroissance brutale, signe d'instabilité. La figure 1 1 est un exemple d'une partie de mesure réalisée à la vitesse moyenne de 40 nm/sec. Les positions et amplitudes de ces motifs en dent de scie dépendent de la séquence. Ainsi que décrit plus loin, la naissance d'une instabilité peut être induite par une variation très locale du contenu GC, induisant un point de blocage d'ouverture, suivi d'une zone d'ouverture plus facile. Après avoir atteint le seuil de force nécessaire pour ouvrir un point dur, l'énergie élastique stockée dans la construction moléculaire et dans le dispositif de mesure de force va permettre le déplacement du point d'ouverture le long de l'ADN, même lorsque la position de la platine de déplacement est peu changée. Qualitativement, ces motifs se superposent à une ligne de base qui dépend de la proportion GC de la séquence. Il est ainsi clair que la signature des forces résulte d'une interaction complexe entre les séquences et la raideur mécanique impliquée dans cette mesure. On pourra avec avantage réaliser des signatures avec des raideurs différentes. Dans l'exemple donné, le nombre de dents de scie est typiquement de 50, pour l'ouverture d'un segment de 20 kb. Ceci correspond à un intervalle moyen entre dents de scie de 400 bases environ. On a remarqué que les descentes des dents de scie, observées à déplacement constant, correspondent à des temps supérieurs au temps caractéristique de réponse du levier. D'autre part, et de façon remarquable, l'amplitude caractéristique des plus petites dents de scie visibles est inférieure au niveau moyen de vibration de la pointe du levier (sujette à des perturbations exérieures : acoustiques, sismiques, etc.). La signature n'est donc pas trop sensible aux perturbations mécaniques lors de la mesure. La figure 12 présente un exemple additionnel de la relation entre la signature de force et le contenu GC (moyenne glissante sur 500 bases). Les données correspondent à une mesure basse vitesse (20 nm/sec) de la région centrale pauvre en GC du A. On voit clairement la correspondance entre les deux courbes mais la signature ne se confond pas avec un simple moyennage. On voit encore que la résolution obtenue révèle des détails correspondant approximativement à 500 bases. Modélisation du système et résolution numérique La signature d'une séquence donnée correspond à un problème de physique statistique, faisant intervenir l'agitation thermique, les raideurs, et les énergies d'appariement. Les valeurs moyennes observables (force d'ouverture, position de point d'ouverture, etc.) peuvent être calculées numériquement à partir de la fonction de partition du système. Comme on va le voir par la suite, on peut, à partir d'une séquence connue, calculer numériquement la signature. Notre modèle, bien que simplifié, fait ressortir les caractéristiques essentielles observées expérimentalement. La ou les signatures de référence d'une séquence peuvent donc être obtenue(s) soit numériquement soit expérimentalement. Sur la figure 13 est présenté un exemple de calcul sur l'ouverture du phage k (correspondant à la configuration A précédente). Un accord entre simulation et expérience apparaît en comparant les figures 10 et 13. En bas de la figure 14 est présenté un agrandissement de la zone centrale de la figure précédente. La structure en dents de scie apparaît clairement. Les montées lentes correspondent à des zones où le point d'ouverture se déplace très peu, par opposition aux descentes plus rapides, où ce point d'ouverture se déplace beaucoup. Ceci apparaît dans le milieu de la figure 14, où la grandeur tracée sur l'axe vertical est la valeur qui identifie la position moyenne de la zone d'ouverture. Le contenu GC de la zone d'ouverture correspondante est tracé à droite. En haut de la figure 14 est présenté le calcul de la variance de la position du point d'ouverture, mesure de la résolution locale. On observe de fortes variations de la résolution qui dépendent de la séquence. Cette résolution est presque partout meilleure que 100 bases. Les pics de variance correspondent à des endroits où le signal en force baisse brutalement. Modifications de signature Signature et raideurs La signature dépend de la raideur totale du système, c'est-à-dire les raideurs totales du système de mesure et les raideurs liées à la construction moléculaire, notamment celles des simples brins de la molécule ouverte. Une faible raideur favorise des grands événements d'instabilité et une forte raideur les diminue. Ceci est démontré théoriquement dans la figure 15. REFERENCES 1. Bustamante C., Marko J.F., Siggia E.D. et Smith S., Entropic elasticity of h-phage DNA , Science 265, p. 1599 (1994). 2. Chu S., Science, 253, 861 (1991). 3. Cluzel P., Lebrun A., Heller C., Lavery R, Viovy J.L, Chatenay D. et Caron F., A new structural transition in DNA revealed by force measurements on a single molecule", Science 271, pp. 792-794 (1996). 4. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A., Nature 368, 113 (1994). 5. Perkins T.T., Smith D.E., Chu S., Direct observation of tube-like motion of a single polymer chain", Science, 264, 819-822 (1994). 6. 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REVENDICATIONS 1/ Procédé de caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre au moins une signature" desdits duplex, qui est liée à la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce que l'on compare la signature obtenue avec des références. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrémité 5' de l'une des deux séquences est fixée sur un support 1 et l'extrémité 3' de l'autre séquence est fixée sur un support 2, la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites séquences étant mesurées par éloignement, respectivement rapprochement, desdits supports 1 et 2, caractérisé en ce que, lors de la fixation, le point de fixation de l'extrémité 3' sur le support 2 et le point de fixation de l'extrémité 5' sur le support 1 se retrouvent reliés par un fil moléculaire d'une longueur d'au moins 0,03 zm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 Item. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les extrémités libres, c'est-à-dire non fixées, des séquences d'acide nucléique sont reliées entre elles. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on modifie localement le duplex. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la modification locale est effectuée par création d'un triplex ou d'un complexe ou par la fixation d'une protéine. 6/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la modification locale est effectuée par une molécule capable de créer un pontage entre les brins du duplex. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on modifie localement les simples brins une fois désappariés au moins partiellement. 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre avec un tampon qui modifie les énergies d'appariement. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à une température qui modifie les énergies d'appariement. 10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les supports sont choisis parmi les lames, les billes de verre ou de polymère ou un élément d'un appareil de mesure de force, préférentiellement les lames sont choisies parmi les lamelles de verre ou de polymère. 11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les étapes de fonctionnalisation et/ou de fixation sont réalisées dans un volume délimité par une surface plane de fixation sur laquelle est posé un élément formant enceinte latérale susceptible d'être couvert par un couvercle. 12/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'au moins un des supports est recouvert d'une matrice électronégative sur au moins une partie de sa surface. 13/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'un des supports est déplacé par une aiguille ou une micropipette ou une platine de translation ou des pinces optiques. 14/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le duplex d'ADN à étudier est inclus dans une construction moléculaire possédant au moins deux sites distincts de fixation et où l'éloignement de ces deux sites induit l'ouverture du duplex d'ADN. 15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la construction moléculaire est un système cassette. 16/ Procédé selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'au moins un site de la construction moléculaire adhère à un capteur de force directement ou par l'intermédiaire d'un support et que ce capteur détermine la force de l'ouverture du duplex quand au moins un autre site de la construction moléculaire est éloigné et induit cette ouverture. 17/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'au moins une extrémité de la séquence d'acide nucléique ou bien un site d'une construction molécule est fixé au support par une interaction - covalente - antigène / anticorps - ligand / récepteur - avidine ou streptavidine / biotine. 18/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le capteur de force est un levier dont on mesure la déflexion. 19/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les variations de force sont mesurées par un microscope à force atomique. 20/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le capteur de force est un piège optique. 21/ Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le piège optique est à rétroaction. 22/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que la raideur des simples brins a été modifiée de façon substantielle par adjonction d'autres molécules choisies parmi - les protéines, - les oligonucléotides d'acide nucléique ou de leurs analogues. 23/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que l'extrémité 3' du duplex à caractériser est fixée sur le support 2 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 Fm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 Fm. 24/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 23, caractérisé en ce que l'extrémité 5' du duplex à caractériser est fixée sur le support 1 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 Fm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 llm. 25/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 24, caractérisé en ce que le support 1, respectivement support 2, est une lame, une particule ou une micropipette et que le support 2, respectivement support 1, est une particule. 26/ Procédé selon l'une des revendications 23 et 24, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur est une séquence nucléotidique. 27/ Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur est un ADN double brin. 28/ Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur, par l'une de ses extrémités, est lié à l'un des brins de l'ADN double brin par une séquence oligonucléotidique de jonction. 29/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 28, caractérisé en ce que le duplex d'ADN à étudier est inclus dans une construction moléculaire contenant au moins un bras espaceur. 30/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 29, caractérisé en ce que la construction moléculaire avec au moins un bras espaceur est un système cassette. 31/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 30, caractérisé en ce qu'on sélectionne les particules fixées sur l'une des branches du duplex ou du bras espaceur ou de la construction moléculaire en lui appliquant un champ de force ou un gradient de champ, en particulier un aimant ou un écoulement fluide. 32/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que le support 2 est fixé à l'extrémité 3', respectivement le support 1 à l'extrémité 5', alors que le duplex à caractériser a été au moins partiellement dénaturé et que le support l a été fixé auparavant à l'extrémité 5', respectivement le support 2 à l'extrémité 3', et que les extrémité 3' et 5' ont été partiellement éloignées d'une distance d'au moiiis 0,03 llm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 zm. 33/ Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que les séquences d'acide nucléique sont totalement dénaturées. 34/ Procédé selon l'une des revendications 32 et 33, caractérisé en ce que les séquences sont éloignées l'une de l'autre par le flux d'un liquide. 35/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 34 à l'analyse d'un ADN inconnu ou imparfaitement connu. 36/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 34 à la mise en évidence de la présence ou de l'absence d'une séquence ou d'un ensemble de séquences d'ADN déterminées dans un échantillon à tester. 37/ Application du procédé selon l'une des revendications l à 36 à la mise en évidence d'au moins un mésappariement. 38/ Application du procédé selon l'une des revendicatiolls l à 36 a la comparaison de deux échantillons d'ADN à tester. 39/ Coffret de diagnostic destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'unie des revendications l à 34, caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des éléments suivants - au moins un bras espaceur, - au moins une construction moléculaire cassette de bras espaceur, - au moins un oligonucléotide de jonction, - au moins un oligonucléotide en épingle à cheveux, - au moins une enzyme de restriction, - au moins une construction moléculaire destinée à fixer les brins du duplex à ouvrir sur des éléments de l'appareil de mesure de force, - un support fixable à l'extrémité fonctionnalisée du bras espaceur. - au moins un puits, - au moins une lame, - au moins un type de billes fonctionnalisées et avantageusement aimantables, destinées à être attachées à un élément fonctionnalisé du duplex à ouvrir, - au moins un aimant, - au moins un tampon, - au moins une enzyme de ligation, - au moins un tampon de ligation, - au moins une colonne de séparation par centrifugation, - au moins un levier de mesure.