FR 2763600 A1 19981127 FR 9706102 A 19970520 PROCEDE DE DETECTION OUALITATIVE ET OUANTITATTVE D'ALTERATIONS DE L'ADN ET DES LIGANDS DE CES ALTERATIONS La présente invention a pour objet un procédé de détection qualitative et quantitative d'altérations sur de l'Acide DésoxyriboNucléique (ADN), ces altérations pouvant être dues au métabolisme de la cellule ou à des agents physiques ou chimiques, endogènes ou exogènes, ainsi qu'un procédé de détection qualitative et quantitative de de ligand(s) reconnaissant de l'ADN altéré. La définition la plus satisfaisante (parmi les nombreuses controversées) de la génotoxicité est une définition générale qui envisage l'apparition d'altérations physiques ou chimiques de l'ADN dues à une action directe de l'agent génotoxique ou d'un métabolite, ainsi que ses conséquences biologiques (Butterworth, 1990, Mutat. Res., 239. 117-132; Ashby, 1992, Mechanism of Carcinogenesis in risk identification, Vainio H., Magee P.N., McGregor D.B. & McMichael A.J. (eds) IARC, Lyon, 135164). Parmi les génotoxiques, de nombreuses molécules ou agents physiques sont susceptibles d'induire l'apparition de mutations, lesquelles sont détectées par différents systèmes bactériens ou eucaryotes. Le système de détection des mutagènes le plus généralement utilisé est celui décrit par B.N. Ames (Ames et al., 1973, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2281-2285), complété par le test dit du micronoyau (Mac Grégor étal., 1987, Mutat. Res., 189, 103-112). Puisque la mutagénèse semble être dans de nombreux cas la conséquence de la présence de lésions (dues en particulier à des agents génotoxiques), de nombreux systèmes capables de détecter et quantifier ces dommages à l'ADN ont été développés. La détection de lésions de l'ADN fait appel à des techniques physico-chimiques comme le post-marquage (Randerath et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6126-6129), l'élution alcaline ou neutre (Kohn et al., 1976, Biochemistry, 15, 4629-4637), des techniques immunologiques (Philips D.H., Chemical-carcinogenesis and mutagenesis, vol. I, 503-546, Springer Verlag, Heidelberg, 1990, Cooper and Grover (eds), ou fait appel aux conséquences d'événements de réparation de ces lésions comme l'essai des Comètes (Singh et al.,1988, Exp. Cell Res. 175. 184-191). Certains essais utilisent la capacité de réparation des lésions de la cellule dont le mécanisme fait intervenir une étape de synthèse d'ADN de novo. Cette étape de polymérisation d'ADN peut être quantifiée en utilisant des nucléotides radio-marqués (Cleaver, 1984, Methods for studying excision-repair of eukariotic DNA damaged by physical and chemical mutagens (Kilbey B.J., Nichols W. & Ramel C., eds) 33-69, Elsevier, Amsterdam). Cet essai a été dénommé UDS (Unscheduled DNA Synthesis) et utilisé pour la détection de génotoxique ou pour l'évaluation des capacités de réparation de cellules. Ce test UDS a été perfectionné dans le sens d'une non utilisation de marqueur radioactif (Selden et al., 1994, Mutation Res., 315, 147-167) mais ce perfectionnement est relativisé du fait de l'utilisation de la cytométrie de flux qui alourdit la méthode. La réparation de l'ADN est majoritairement due au système d'excision des lésions, système qui a été récemment reproduit avec des extraits cellulaires (Wood et al., 1988, Cell, 53 97-106; Sibghat-Ullah et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17 44714484). Cet essai utilise des plasmides traité et non traité (contrôle) incubés en présence d'extraits actifs transcriptionnellement (Manley et al., 1983, Meth. Enzymol., 101, 568582). La réaction de réparation consiste dans l'incision-excision des lésions puis la resynthèse d'un fragment d'ADN. La méthode tire profit de cette étape au cours de laquelle un ou des nucléotides radio-marqués est (sont) incorporé(s). Deux grands mécanismes sont impliqués dans la restauration des dommages de l'ADN : l'excision de nucléotides (NER) et l'excision de bases (BER). Ces 2 mécanismes seront décrits plus loin. Dans le cas de ce test in vitro, la réparation des lésions par NER ne concerne qu'un faible pourcentage des lésions, de l'ordre de 7%. Ces essais ne sont pas applicables à une large application de criblage ou dans un sens plus large de recherche industrielle pour différentes raisons : (i) le nombre d'échantillons traitables simultanément (de l'ordre de quelques dizaines) est trop faible, (ii) le temps requis pour l'analyse (environ 2 jours) est relativement long, (iii) l'utilisation de molécules radio-marquées restreint ce test à des laboratoires agréés, (iv) le test est restreint à l'utilisation d'ADN plasmidique hautement purifié (forme surenroulée). Tenant compte de ces contraintes, un nouvel essai de synthèse réparatrice in vitro susceptible de pallier les inconvénients des autres systèmes avait été développé, en autorisant t'analyse simultanée de plus de 100 échantillons en 5 heures, avec un système de détection non radioactif. Cette méthode, autorisant également l'utilisation d'ADN de différentes natures, a fait l'objet d'une demande de brevet français n" 95 03230 du 15 mars 1995 et d'une demande PCT n" PCT/FR 96/00391 du 13 mars 1996, publiée sous le n" WO 96 28571 le 19 septembre 1996. La présente invention a pour objet un procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN qui puisse assurer une détection de l'ensemble des altérations de l'ADN grâce à une méthode dont la mise en oeuvre soit relativement simple. Pour ce faire, la présente invention propose un procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN, caractérisé en ce que a) on met ladite séquence d'ADN en présence d'une composition comportant au moins un composé reconnaissant le type d'altération en cause, dénommé ligand, dans un milieu assurant la reconnaissance, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par ledit ligand. Par reconnaissance de l'altération par ledit ligand, on entend que t'on détecte la fixation directe ou indirecte du ligand sur l'ADN endommagé. Il peut s'agir d'une fixation indirecte lorsque le ligand fait partie d'un complexe par exemple. Par altération, on entend tout d'abord les dommages de l'ADN. Ceux-ci peuvent être d'origine physique (par exemple radiation ionisante ou non, thermique) ou chimique. Ces facteurs endommageant l'ADN peuvent être d'origine exogène ou endogène. Les types de lésions générés sur l'ADN peuvent grossièrement être classés en 5 types: . les adduits (complexation généralement covalente, mais pouvant faire appel à un autre type de liaison chimique comme la liaison de coordination d'une molécule sur une base de l'ADN), . les pontages de bases (réalisés par apport d'énergie, le type le plus connu étant retrouvé dans les dimèes de bases pyrimidiques formés sous l'action de rayonnement UVC ou UVB), Ia complexation de bases de l'ADN à des protéines (ce type de complexation, le plus souvent covalent, étant également la conséquence d'un apport d'énergie), . les dommages oxydatifs engendrant des modifications de la structure de l'ADN sous forme de cassures ou délétions de bases, cassures du désoxyribose, cassures de la liaison phosphodiester, etc.), . les cassures causées par les rayonnements ionisants (comme certains rayonnements radioactifs). En plus de ces dommages, d'autres altérations de l'ADN peuvent survenir. Lors de la réplication de l'ADN, la polymérase impliquée dans ce processus se doit de synthétiser le nouveau brin en appariant correctement les nouvelles bases au brin matrice selon le modèle A-T, G-C. Un mauvais appariement ( mismatch ) constitueune altération de l'ADN. Ce mésappariement peut être naturel (dû à une erreur statistique de la polymérase) ou être la conséquence d'une dtogue qui va perturber l'activité de l'enzyme. Le procédé selon la présente invention permet de détecter aussi bien les dommages de l'ADN que les mésappariements . Face à toutes ces altérations, la cellule possède heureusement un arsenal enzymatique lui permettant de rétablir l'ADN dans sa forme normale. Ces mécanismes sont regroupés sous l'appellation générale de réparation de l'ADN . Selon le type d'altération, 5 mécanismes principaux interviennent: l'excision de nucléotides, l'excision de bases, le système de réparation des mésappariements, la réparation des cassures simple brin d'ADN et la réparation des cassures double brin d'ADN. Ces mécanismes ont en commun de faire appel dans une première étape à une reconnaissance de l'altération. C'est précisément grâce à l'existence de composés, notamment des protéines, intervenant au niveau de la reconnaissance de l'altération, appelées ci-après ligand , que le procédé selon la présente invention a pu être développé. C'est pourquoi, dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, le ligand révélé sera, de préférence, une protéine de reconnaissance du système de réparation de l'ADN. Par système de réparation , on entend désigner aussi bien les systèmes de réparation de l'ADN endommagé que les systèmes de réparation des mésappariements. Enfin, par protéine de reconnaissance , on entend aussi bien la protéine assurant la reconnaissance primaire de l'altération qu'une protéine impliquée dans cette reconnaissance, notamment lorsqu'il y a formation d'un complexe (par exemple XP-A, RPA ou TFIIH notamment). Parmi les protéines en cause, il faut citer les protéines du système NER, . les protéines du système BER, les protéines de réparation des mésappariements, les protéines des systèmes détectant les cassures de l'ADN, qu'il soit double ou simple brin. Le système de réparation par excision de nucléotides (Nucleotide Excision Repair: NER) est le mécanisme reconnaissant le plus large spectre de lésions sur l'ADN, ces lésions étant principalement constituées d'adduits encombrants. La réparation par NER est classiquement décomposée en 4 étapes reconnaissance de la lésion (1) excision de la lésion (2) , resynthèse du fragment excisé (3); ligation du brin néosynthétisé (4). Le mécanisme de reconnaissance des lésions réparées par NER n'est pas encore clairement défini mais il est par contre clairement établi que la protéine XP-A est impliquée (en association ou non avec la protéine RPA et éventuellement le complexe transcriptionnel TFIIH) dans l'un des premiers stades de reconnaissance. XP-A est la protéine pour laquelle les patients du groupe A de Xeroderma pigmentosum sont déficients. L'absence d'une protéine de réparation de NER rend ces malades très sensibles aux rayonnements UVC qui génèrent sur l'ADN des dommages réparés par NER, la forme XP-A étant la forme la plus sévère. La protéine XP-A est une protéine en doigt de zinc (structure classique de protéines interagissant avec l'ADN) constituée de 273 acides aminés et traduite à partir d'un ARN messager de 1,4 kb (Tanaka K. et al, 1990, Nature, 348, 73-76). XP-A reconnaît (avec une préférence d'un facteur 1000 par rapport à un ADN non lésé) les dommages générés par les UVC (environ 75% de dimères de pyrimidine sous forme cyclobutane, 25% de dimères de pyrimidine sous forme de photoproduits (6-4)). Seuls ces types de lésions ont été analysés dans cette étude (Robins P. et al., 1990, EMBO J. 10 3913-3921). Ces auteurs ont également générés des anticorps polyclonaux contre 2 peptides synthétiques de la protéine XP-A et déterminé que la protéine XP-A ne nécessite pas de phosphorylation pour être active. En utilisant des colonnes de chromotographie constituées soit d'agarose couplé à de l'ADN simple brin ou de la cellulose couplée à de l'ADN irradié aux UVC, ou en incubant différents types d'ADN (simple ou double brin, lésé aux UVC ou non) Eker et al. concluent que la protéine XP-A extraite de thymus de veau ou de cellule HeLa présente une affinité plus forte pour l'ADN simple brin que pour l'ADN double brin, mais pas de préférence pour l'ADN lésé aux UVC (Eker et al., 1992, Mutation Res., DNA, 274. 211-224). Ces auteurs ont également générés des anticorps polyclonaux contre la protéines XP-A recombinante. Les résultats obtenus par Tanaka et al. ont été complétés en 1993 à l'aide d'une protéine XP-A recombinante. Il a été confirmé que XP-A reconnaît bien les lésions UVC et principalement les photoproduits (6-4), ainsi que les lésions dues à l'agent antitumoral cis-platine (cis-diamine-dichloroplatinum (II)). Un fragment d'ADN simple brin est 4 fois plus efficace dans une compétition envers un ADN lésé aux UVC vis-à-vis de XP-A qu'un ADN double brin. Par contre, ces auteurs n'ont pas pu mettre en évidence d'affinité de XPA vis-à-vis d'un ADN contenant des adduits issus de psoralène photoactivé (Jones C.J. & Wood R.D., 1993, Biochemistry, 32, 1209612104). A la reconnaissance des lésions dues aux UVC ainsi qu'à celles dues au cisplatine, Asahina et al. ont ajouté en 1994 les lésions dues au tétroxyde d'osmium (Asahina H. et al., 1994, Mutation Res., DNA Repair, 315, 229-237). Le clonage des gènes codant pour XP-A chez le poulet, le xénope et la drosophile (chez laquelle il a été appelé Dxpa) montre une forte conservation de ce gène de l'évolution chez les eucaryotes (T. Shimamoto et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 22452-22459). L'excision de bases apparaît normale dans les cellules XP (Cleaver J.E. & Kraemer K.H., 1989, The metabolic basis of inherited disease, ed.Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S. & Valle D. (McGrall-Hill, New York), 6* Ed., 2949-2971), ce qui confère à XP-A la spécificité de reconnaissance des lésions réparées par NER. Toutefois, en utilisant des ADN lésés par un rayonnement y ou par les radicaux hydroxyles générés par décomposition de l'eau oxygénée, traités de façon à ce qu'ils ne soient plus reconnus par le système de réparation par excision de bases, Satoh et al. montrent l'implication de XP-A (ainsi que XP-B et XP-C, deux autres sous-groupes de Xeroderma pigmentosum qui en compte sept nommés XP-A à XP-G), dans la réparation de certaines classes de lésions induites par des radicaux libres oxygénés (Satoh M.S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6335-6339). Le type de substrat utilisé pour mettre en évidence l'implication de protéines du groupe XP dans ce processus de réparation étant totalement artificiel, ces résultats doivent être pris avec précaution. Enfin, il a été montré par la technique du double hybride ou par des techniques immunologiques plus classiques que la protéine XP-A (recombinante) se liait à la protéine RPA (Replication Protein A, également appelée Human Single-Stranded DNA Binding protein, HSSB). Il n'a toutefois pas été montré dans ces expériences que cette association était impliquée dans la réparation par excision de nucléotides (Matsuda T., 1995, J. Biol. Chem., 270, 21800-21805). Il faut ajouter le rôle potentiel des protéines HMG (High Mobility Group). Ces protéines interviennent lors de lésions provoquées par le cis-platine, agent utilisé en chimiothérapie (Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 13520-13527). Quatre protéines HeLaS3 spécifiques des adduits provoqués par le cis-platine ont été mises en évidence (Donahue et al., 1990, Biochemestry, 29, 587-5880 ; Andrews et Jones, 1991, Cancer Comn. 3 1-10; Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem., 267 13520-13527). Le séquençage de Nter de deux de ces protéines a révélé une forte homologie avec les protéines HMG2 et HMGI. De même, la liaison covalente de sel de chrome sur l'ADN induit des adduits reconnues par HMGI et HMG2 in vivo. L'affinité des HMG est dose/dépendante vis-à-vis du sel de chrome (Wang et al., 1997, Carcinogenesis, 18 371-375). Cependant, leur rôle exact dans la réparation de l'ADN n'a pas encore été établi (pas de reconnaissance en particulier de lésions provoquées par les UV). Dans la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on utilisera de préférence la révélation de la protéine XP-A ou des protéines apparentées ainsi qu'éventuellement les protéines RPA, TFIIH et HMG ou d'autres protéines du complexe. Selon la nature du ligand détecté, on pourra, en outre, envisager de mieux définir le type de génotoxique en cause. En effet, XP-A reconnaît des adduits volumineux et correspond à de nombreux génotoxiques mais ne reconnaît pas des adduits non volumineux et des liaisons oxydatives. La réparation par excision de bases (BER) est moins bien connue que la réparation par excision de nucléotides (NER). La raison principale réside dans l'absence de mutants pouvant servir à la recherche de gènes impliqués dans ce mécanisme puisqu'il n'existe pas de maladie identifiée comme résultant d'un déficit en BER. La réparation par excision de bases intervient sur les bases de l'ADN lésées par des espèces réactives oxygénées endogènes, des radiations ionisantes et des agents alkylants. Pour simplifier, le BER intervient sur des dommages peu volumineux au contraire du NER qui reconnaît les dommages volumineux. Les enzymes clés du BER sont les glycosylases qui enlèvent les bases modifiées par clivage de la liaison N-glycosidique entre la base et le désoxyribose. Il existe différentes glycosylases reconnaissant différents types de dommages. A ce jour, on a identifié une dizaine de ces enzymes chez Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae et chez l'homme (Seeberg et al., 1995, TIBS, 20, 391-397). Une fois la base enlevée, le site AP (apurinique ou apyrimidique) est excisé par une AP-endonucléase ou une AP-lyase qui clivent le brin d'ADN respectivement du côté 5' ou 3' du site AP. Le désoxyribose-phosphate restant est excisé par une phosphodiestérase et la resynthèse du brin d'ADN est restaurée par une DNA polymérase. La continuité du brin est ensuite restaurée par une DNA ligase. Il a été longtemps admis que c'était la polymérase ss qui était impliquée dans la resynthèse du brin d'ADN dans le BER. Or, il a été récemment montré sur des extraits cellulaires d'hamster (CHO) que 2 mécanismes différents pouvaient réparer des petits adduits dus à des alkylants. L'un implique la polymérase P, l'autre présente certaines similitudes avec le NER puisque faisant intervenir le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen; facteur intervenant dans le NER) (Frosina et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, 9573-9578). Les dommages à l'ADN dus aux UVA sont vraisemblablement réparés par BER. En effet, des cellules d'une lignée XP-D ne montrent pas de différence de comportement, par rapport à une lignée sauvage, en terme de courbe de survie suite à une irradiation UVA (320-410 nm) dont les dommages sont de type oxydatif, donc réparés par BER, alors qu'elles sont hypersensibles aux UVB (307-312 nm) et UVC (254 nm) (Stary et al., 1997, 383, 1-8). La poly(ADP-ribose) polymérase, ou PARP, impliquée dans la réparation des cassures simple brin est également impliquée dans l'étape finale de ligation de la réparation par BER (Kubota et al., 1996, EMBO J. 15, 6662-6670). Dans le système BER, le ligand utilisé sera, de préférence RPA. La fixation de PARP restant à déterminer. Les mésappariements de bases peuvent survenir au cours de la réplication, la recombinaison ou suite à des dommages sur l'ADN. Le mécanisme de réparation des mésappariements est bien connu chez la bactérie E. Coli. Le système MutHLS a ainsi été reconstitué in vitro : il est composé des protéines MutH, MutL, MutS et UvrD (ou hélicase II). Le mécanisme est complété par la DNA polyméase III, la DNA ligase et la SSB (Single-Stranded DNA Binding protein) et une exonucléase spécifique de simple brin (Exo I, Exo VII ou la protéine RecJ (Friedberg et al., 1995, DNA repair and Mutagenesis, ASM Press). La protéine MutS reconnaît le mésappariement et MutH est une endonucléase. Aucune activité n'a pour l'instant été attribuée à MutL, bien qu'elle interagisse avec MutS et soit nécessaire à l'activation de MutH. Plusieurs données semblent montrer qu'il existe chez l'homme l'homologue du système MutHLS, en particulier la purification d'homologues à MutL (appelé hMLH1) et MutS (appelé hMSH2). MSH2 reconnaît à la fois les mésappariements de simple base (comme MutS) mais également des mésappariements plus complexes dus à de multiples délétions/insertions (Fishei et al., 1994, Science, 266, 1403-1405 ; Alani et al., 1995, Genes Dev., 9 234-247). Il a de plus été montré récemment que hMSH2 peut être copurifié avec une protéine de 160 kD, appelée GTBP (G/T Binding Protein) (Drummond et al., 1995, Science, 268, 1909-1912 ; Palombo et al., 1995, Science, 268, 1912-1914), mais le rôle de cette GTBP n'est pas clairement élucidé. De la même façon, hMLH1 semble etre associée à une autre protéine, hPMS2, et former un hétérodimère appelé hmutLa (Li & Modrich, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 1950-1954). Une déficience dans ce mécanisme de réparation des mésappariements est clairement corrélée à une prédisposition à des cancers, en particulier au cancer du colon non polypeux héréditaire. C'est le cas lors de mutations de hMSH2 (Fishel et al., 1993, Cell, 75 1027-1038 ; Leach et al., 1993, Cell, 75 1215-1225) ou de hMLH1 (Bronner et al., 1994, Nature, 368, 258-261; Papadopoulos et al., 1994, Science 263 16251629. Les protéines Mut, notamment MutS ou HMSH2, constituent les cibles de choix pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention. L'intérêt de la recherche de ce type de ligand réside dans la caractérisation d'extraits cellulaires (biopsie ou directement in vivo). En effet, une déficience du système HMSH2 est, en général, associée à un risque accru de développements de cancers. Les dommages à 1'ADN de type cassures simple brin peuvent être induites par des agents alkylants ou des radiations ionisantes. Ces cassures sont immédiatement reconnues dans la cellule par la poly(ADP-ribose) polymérase, ou PARP. Cette enzyme est présente en très forte quantité (de l'ordre du million de molécules) dans les noyaux des cellules eucaryotes (à l'exception de la levure). L'étude de la séquence nucléique a montré que cette protéine possède 2 domaines, un domaine N-terminal contenant 2 doigts de zinc et se fixant à l'ADN, et un domaine C-terminal à fonction catalytique (Cherney et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8370-8374). La reconnaissance de la coupure se fait en recouvrant 7-8 nucléotides de chaque côté de la coupure (Gradwohl et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87. 2990-2994). Lorsqu'elle est fixée sur une coupure simple brin d'ADN, l'activité catalytique de la PARP est activée. La PARP produit du poly(ADP)ribose) en employant comme substrat la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). La durée de vie de la chaîne de poly(ADP-ribose est normalement très courte, de l'ordre de quelques minutes. Il est possible de bloquer la réaction à l'étape d'interaction ADN-PARP en inhibant la synthèse de poly(ADP)ribose à l'aide d'un analogue structural du NAD, le 3-aminobenzamide (Prigent et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14 310-317). PARP ne participe pas à la réparation de l'ADN mais protège la cassure d'endonucléases. Il a en particulier été montré que la PARP n'intervient pas dans le mécanisme NER (Molinette et al., 1993, EMBO J. 12, 2109-2117 , Aboussekhra et al., 1995, Cell, 80, 859-868). Si un rôle dans la reconnaissance des cassures simple brin de l'ADN est bien établie pour la PARP, son rôle physiologique est moins clair. Il a été proposé qu'elle pourrait par exemple avoir un rôle dans le déclenchement de l'apoptose, par différentes voies mais en particulier en déplétant le stock cellulaire de NAD. La PARP pourrait protéger la stabilité génomique de la cellule en évitant de trop fréquents événements de recombinaison aux sites de cassures. Elle pourrait également intervenir dans l'ouverture de zones de chromatine en interférant avec les histones (revu par Lindahl et al., 1995, TIBS, 20 405-411). Les cassures double brin de l'ADN sont créées en particulier par les radiations ionisantes, mais peuvent provenir d'origine endogène comme dans certaines réactions de recombinaison. Une mauvaise réparation ou une absence de réparation de ces lésions peut être très délétère car pouvant engendrer des délétions ou des translocations ayant pour conséquences possibles l'inactivation d'un gène. Chez les mammifères, 4 groupes de complémentation ont été identifiés pour la réparation des cassures double brin, définissant 4 gènes impliqués dans ce processus (revu par Jackson & Jeggo, 1995 TIBS, 20. 412-415). Parmi ces 4 groupes (IR4-7; IR pour Ionizing Radiation), les groupes IR5 et IR7, dont les produits sont XRCC5 et XRCC7 (X-ray Repair Cross-Complementing), nous intéressent plus particulièrement. Les groupes IR5 et IR7 sont déficients dans des constituants de la DNA PK. La DNA-PK (DNA-dependent protein Kinase) est une kinase sérine/thréonine qui n'est active que lorsqu'elle est liée à l'ADN (on peut au passage noter la similitude avec la PARP) (Getts & Stamato, 1994, J. Biol. Chem., 269, 15981-15984; Rathmell & Chu, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91* 7623-7627 ; Taccioli et al., 1994, Science, 265, 1442-1445). La DNA-PK est constituée d'une sous-unité catalytique (DNA-PKcs) et d'une sous-unité interagissant avec l'ADN appelé Ku. Ku, à l'origine identifié comme autoantigène est un hétérodimêre constitué de 2 polypeptides de 70 à 80 kDa (Ku70 et Ku80) et correspond à XRCC5. Il se fixe aux extrémités d'ADN mais pas à l'ADN cellulaire (Gottlieb & Jackson, 1993, Cell 72 131-142) et active ainsi la sous-unité DNA-PKcs. Mis à part l'inactivation par phosphorylation de la RNA polymérase I au voisinage de cassures d'ADN (Kuhn et al., 1995, Genes Dev., 9 193-203), les substrats de la DNA- PKcs. (codée par XRCC7) ne sont pas encore bien définis et son rôle dans la réparation de l'ADN reste à prouver. Le ligand Ku utilisé pour la mise en oeuvre des cassures double brin est plus particulièrement utilisable pour la mise en évidence des rayonnements ionisants (centrales nucléaires ou hôpitaux par exemple). Comme il vient d'être décrit, si les mécanismes de réparation de l'ADN ne sont pas toujours connus en détail, on sait que les altérations de l'ADN sont tout d'abord reconnues par des ligands bien précis ou protéines de reconnaissance, cette reconnaissance précédant l'étape de réparation ayant pour but de reconstituer l'ADN dans sa forme propre. Il est intéressant de noter, par exemple, que si dans le cas de la réparation par NER, seulement 7% des lésions sont réparées in vitro, la majorité des lésions, sinon la totalité, sont reconnues puisqu'elles induisent toutes une déformation de l'ADN et que c'est l'étape de réparation proprement dite qui est limitante. C'est pourquoi le procédé selon l'invention met en oeuvre la constatation que dans un système in vitro l'essentiel des altérations, même si elles ne sont pas réparées, sont néanmoins reconnues et que c'est cette étape de reconnaissance qui doit être utilisée pour la mise en évidence des altérations. Le procédé selon l'invention repose donc sur la détection de l'interaction d'une ou des molécule(s) des systèmes de réparation reconnaissant les altérations de l'ADN, en particulier les protéines. Le procédé selon la présente invention est d'abord un procédé qualitatif, c'est-à-dire qu'il permet de détecter l'existence d'une altération de l'ADN et sa nature en fonction précisément du type de ligand. Ainsi, la mise en évidence d'une interaction de XP-A I avec l'ADN montre une altération faisant intervenir NER, au contraire l'interaction de MutS ou HMSH2 démontre un problème de mésappariement. Ce type de test permet notamment de définir la génotoxicité d'un environnement et la nature de l'action sur l'ADN. Mais, il peut être quantitatif si la quantité de ligand fixé peut être quantifiée, par exemple par rapport à des standards. Dans ce dernier cas on pourra ainsi évaluer l'importance de l'altération ou suivre les évolutions de celle-ci. Dans ce cas notamment, on pourra classer par exemple les génotoxiques en fonction de leur génotoxicit Dans les tests décrits précédemment, le produit testé est un ADN altéré par un génotoxique dont on veut évaluer l'activité. On peut également utiliser le procédé selon l'invention pour, à partir en quelque sorte d'une altération déterminée d'ADN connue , mesurer l'activité d'un système de réparation. En particulier, on peut prévoir la mise en évidence d'une déficience de certains systèmes de réparation. En effet, dans le procédé selon la présente invention, afin d'assurer les conditions de la reconnaissance, il est nécessaire de prévoir, outre le ligand, la présence dans le milieu d'autres éléments assurant la reconnaissance, co-facteurs notamment; pour ce faire, on utilisera en général un extrait cellulaire qui pourra apporter le ligand ou non (dans ce cas le ligand sera ajouté). Lorsque l'on souhaitera tester une éventuelle déficience d'un système de réparation de certaines cellules (prélèvements biologiques par exemple) on pourra utiliser un extrait de ces cellules pour le tester directement sur un ADN altéré, l'activité de réparation pouvant être évaluée par un standard réalisé, par exemple, avec un extrait cellulaire normal. C'est pourquoi, la présente invention concerne également un procédé permettant la mise en évidence dans un échantillon d'une altération du système de réparation de l'ADN, caractérisé en ce que: a) on met l'échantillon en présence d'un ADN altéré, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par un ligand du système de réparation, c) on évalue le résultat obtenu à l'étape b) par rapport à un standard. On conçoit que l'ensemble des développements effectués sur le procédé principal sont également utilisables dans le procédé décrit précédemment. Le standard pourra être, par exemple, un échantillon normal traité dans des conditions équivalentes ou toute autre méthode, notamment des courbes d'étalonnage. Par altération du système de réparation on entend désigner toute modification de la réponse dans le test précédent d'un système de réparation par rapport à un système témoin servant de standard. Cette altération sera caractérisée en général par une déficience de la reconnaissance de l'ADN altéré, mais le contraire est également possible. Ainsi, le procédé selon l'invention pourra permettre de mettre en évidence la présence ou l'absence de protéines en relation par exemple avec une pathologie déterminée. Une telle application peut être mise à profit pour évaluer la résistance acquise à certains agents alkylants utilisés en traitement antitumoral chez des patients et ceci par mesure d'un défaut de réparation des mésappariements (Eshlemen & Markowitz, 1995, Curr. Opin. Oncol. 7 83-89). De plus, ce même procédé selon l'invention permet de mettre en évidence des altérations dans les modulateurs de reconnaissance de ligands d'ADN (comme des agents antitumoraux interagissant avec des facteurs de réparation). En effet, dans ce cas, on notera des modifications dans la réponse des ligands de reconnaissance. La mise en oeuvre spécifique du procédé selon la présente invention peut être réalisée selon différentes variantes. Le procédé selon la présente invention peut être mis en oeuvre selon différentes variantes. L'ADN testé peut être un extrait cellulaire total, un extrait cellulaire semipurifié ou bien un ADN purifié, ceci dépendra du type de recherche effectuée. Le milieu de reconnaissance pourra être entièrement synthétique ou bien être constitué par un extrait cellulaire, lequel pourra notamment comporter également le ligand, dans ce cas la révélation sera effectuée avec un marqueur de la fixation du ligand, anticorps marqué par exemple. En tout état de cause, le milieu de reconnaissance devra comporter tous les cofacteurs nécessaires à la reconnaissance de l'altération. De façon préférentielle, le milieu de reconnaissance est constitué d'un extrait cellulaire plus ou moins purifié quant à la présence de ligand endogène et d'ADN endogène audit milieu de reconnaissance. L'interaction du ligand et de l'ADN pourra être mise en évidence par toute méthode appropriée, en particulier comme cela a été précisé, à l'aide d'un ligand marqué ou à l'aide d'un anticorps reconnaissant le ligand. Dans tous les cas, le marquage pourra être radioactif ou non. On préférera l'utilisation de marquages non radioactifs, c'est-à-dire fluorescents par exemple, ou de marquages enzymatiques. En particulier, il est possible de prévoir que l'étape a) comporte des composés reconnaissant différents types d'altération et en ce que dans l'étape b) on puisse identifier séparément les différents types de reconnaissance. Dans le cas de marqueurs fluorescents, on pourra ainsi utiliser des chromophores différents. Ceci permet de visualiser immédiatement le type d'altération ou même les diverses altérations. De façon plus spécifique, le procédé comprend les étapes suivantes . l'action, dans le cas de l'utilisation d'un ADN cible, de l'agent (physique ou chimique) à tester sur cet ADN, dans le cas d'un agent chimique, l'action du composé peut nécessiter l'action concommitante d'un mélange activateur des composés (comme par exemple l'action biotransformante d'un extrait hépatique de type S9 en présence de tous les cofacteurs nécessaires) . la purification d'ADN de cellules ou tissus dont on veut connaître le degré d'altération de I'ADN (par exemple suivi de malades ou personnes en contact avec des environnements à risque, incubation de cellules en culture avec des agents dont la génotoxicité est à déterminer; recherche de corrélation entre l'état d'altération de l'ADN cellulaire et la présence ou prédisposition à certaines maladies par exemple) l'action d'un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice, ou au minimum de reconnaissance des altérations, sur cet ADN, ou plus simplement d'une protéine, ou complexe protéique, reconnaissant ces altérations ou un extrait déficient en une protéine que l'on ajoutera; . la révélation de l'interaction d'une protéine ou complexe protéique à l'aide d'un anticorps; plus simplement, dans le cas d'une protéine purifiée reconnaissant les lésions, il est possible de greffer directement sur cette protéine un marqueur de révélation direct (de type fluorescence par exemple) ou indirect (de type enzymatique), ces exemples n'étant pas limitatifs . dans le cas de l'utilisation d'un anticorps, sa révélation directe ou indirecte (anticorps directement marqué) ou révélation par un anticorps (ou ligand) secondaire; . détection choisie de préférence parmi les techniques sensibles telles que la luminescence (substrat luminescent) ou la fluorescence. L'ensemble de ces étapes peut se faire en phase liquide ou en phase semisolide en fixant l'un des réactifs sur un support (plaque de microtitration, membrane ou microbille, gel ou colonne d'agarose ou colonne d'affinité par exemple); dans le premier cas, on choisira préférentiellement un système ne nécessitant pas de lavages entre les différentes étapes ou un système en une seule étape, dans le second cas, les différentes étapes sont séparées par des lavages. Dans le cas d'un dosage avec une phase solide ou semi-solide, la nature du réactif fixé, ligand ou ADN notamment, pourra dépendre du type de dosage effectué, dosage de l'importance de la lésion ou bien dosage du système de réparation. Dans le cas d'un dosage en phase liquide, il est nécessaire de pouvoir mettre en évidence la fixation du ligand sur l'ADN, on peut notamment prévoir deux marquages différents pour I'ADN et le ligand et évaluer visuellement la proximité des marqueurs, on peut également utiliser des systèmes type TRACE dans lesquels l'un des marqueurs ne peut être révélé que par la proximité du second. De façon générale, le test consiste à incuber l'ADN (lésé ou non) à la fois en présence d'un anticorps anti-ADN et d'une protéine spécifique d'altérations de l'ADN. Ladite protéine peut être couplée directement à un fluorophore ou être révélée par un anticorps. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-ADN et d'une protéine spécifique, chacun des deux ligands peut être couplé à un fluorophore dont les longueurs d'onde d'émission diffèrent suffisamment pour être lues simultanément avec une bonne discrimination. On peut également, dans les deux cas de figure envisagés ci-dessus, utiliser un système de détection TRACE (Time-Resolved Amplified Cryptate Emission) décrit par CIS bio international. On pourrait, dans ce cas, conjuguer l'anticorps anti-ADN au cryptate (trisbipyridine diamine Europium) et lier une potéine de reconnaissance des lésions ou l'anticorps la reconnaissant, à un fluorophore accepteur d'énergie tel que la phycobiliprotéine modifiée, appelée par CIS Bio International XL665 (ou l'inverse). On peut envisager de standardiser la lecture en rapportant le signal à la quantité d'ADN. Cette quantité d'ADN (relative) peut être obtenue à l'aide du même système en utilisant par exemple deux anticorps anti-ADN, l'un couplé au cryptate, l'autre au fluorophore accepteur d'énergie. L'avantage du système TRACE porte sur sa rapidité (puisqu'il n'est pas nécessaire de procéder à des étapes de lavage), mais surtout sur la quantité d'ADN (et donc de lésions) analysable par condition. De plus, ce système est tout à fait automatisable. Si l'on ne dispose pas du ligand d'altération purifié, ou si celui-ci nécessite des cofacteurs, protéiques ou non, pour l'étape d'interaction, on peut dans ce cas utiliser un extrait cellulaire purifié de manière à ce que ces cofacteurs soient présents. Dans ce cas, l'interaction du ligand avec l'altération sera mise en évidence à l'aide d'un anticorps dirigé contre ce ligand. Cet anticorps peut être à un système permettant de le détecter, ou on fait appel à une méthode connue de l'homme de l'art consistant à utiliser un second anticorps dirigé contre le premier, ce second anticorps étant couplé à un système de détection. Dans le dosage en phase solide, on pourra fixer l'ADN endommagé sur un support et révéler la fixation d'un ligand sur l'ADN fixé par exemple, d'autres méthodes sont envisageables qui dérivent des méthodes décrites précédemment pour la phase liquide. Il est possible également d'utiliser des systèmes de dosage de type biochips , notamment les techniques développées par Altymetrix. On peut envisager de fixer l'ADN sur les chips Un oligonucléotide ou ADN contenant un mésappariement peut permettre de détecter la présence de HMSH2 dans une biopsie ou in vivo et donc le risque de développement d'un cancer. Cette méthode a surtout besoin d'être qualitative (en général la protéine est absente ou présente). Le fait de savoir qu'il y a présence du ligand indique un risque pathologique (et certainement la recherche d'informations plus précises). Un oligonucléotide ou ADN contenant un adduit d'un génotoxique utilisé en chimiothérapie (alkylant, cis-platine, etc.) pourrait servir à un suivi du taux de protéines XPA et ainsi un suivi de la résistance au traitement. On peut également prévoir la fixation de la protéine sur les chips: Il n'est plus question d'utiliser des anticorps anti-protéines mais les protéines elles mêmes. On peut en théorie, à partir de ce système, détecter tous les types de lésion et la quantification de l'ADN se ferait en utilisant un anticorps anti-ADN qui permettrait de rapporter le signal obtenu pour chaque type de lésion à un signal ADN . Ce système semble assez intéressant pour le suivi thérapeutique. Comme cela a été décrit dans le préambule, le procédé selon la présente invention est plus particulièrement utilisable pour évaluer la génotoxicité d'un environnement sur un échantillon par mesure de l'altération de l'ADN dudit échantillon. Par environnement , on entend désigner aussi bien des facteurs chimiques, biologiques que physiques (rayonnement par exemple). L'invention est notamment applicable à l'évaluation qualitative et quantitative de lésions sur l'ADN de cellules cultivées in vitro, isolées ex vivo ou issues de tissus animaux ou végétaux, par exemple application à la détection de xénobiotiques génotoxiques, au suivi thérapeutique de patients atteins de tumeurs soumis à un traitement chimiothérapeutique, application au suivi des risques de personnes en contact avec des agents potentiellement génotoxiques. On peut également l'utiliser, en général, à l'évaluation qualitative et quantitative de composés réagissant avec des molécules nucléophiles (ADN, composés lipidiques, etc.) tels que les radicaux libres, notamment dans le domaine des cosmétiques par exemple, de même que dans l'évaluation qualitative et quantitative de composés inhibant l'action d'agents oxydants. Enfin, le procédé permet la détermination des capacités d'un extrait cellulaire à reconnaître des lésions ainsi que la détermination du type de lésions induites sur l'ADN grâce à l'utilisation, soit d'extraits cellulaires déficients dans une partie du système de réparation de ces lésions, soit de protéines spécifiques, soit d'anticorps dirigés contre des protéines spécifiques. Le présent procédé, basé sur la mise en évidence d'une interaction spécifique de protéines impliquées dans la réparation de l'ADN lésé, présente un grand nombre d'avantages: . ce test est, dans le cas d'un support solide, un simple ELISA, et comme tel automatisable et adapté au high throughput screening , ce test est d'autant plus automatisable dans son option totalement phase liquide, . par rapport au test décrit dans le brevet français n" 95 03230 du 15 mars 1995, publié le 20 septembre 1996 sous le n" 2 731 711; demande PCT/FR 96/00391 du 13 mars 1996, en référence le 19 septembre 1996 sous le n" WO 96 28571, celui-ci est avantageux car il nécessite moins d'extraits cellulaires ou . il ne nécessite pas d'extraits cellulaires, une (ou une combinaison de) protéine(s) purifiée(s) ou même produite(s) par génie génétique étant suffisante, il ne nécessite pas de nucléotide modifié, . il ne nécessite pas d'adsorption de l'ADN sur un support sensibilisé, mais la fixation de l'ADN cible peut, par exemple, se faire par une extrémité (exemple : ADN biotinylé, support couplé à un ligand de biotine, tel que la streptavidine) . il est plus rapide (puisqu'il ne s'intéresse qu'à l'étape de reconnaissance de la lésion et non pas à l'ensemble reconnaissance-réparation), ce qui peut réduire le test à un temps de l'ordre de 2 à 3 heures, . si on utilise une protéine du NER il est possible d'incuber l'ADN cible en présence d'un système activateur: différentes sources de fractions activatrices pouvant être utilisées fraction S9 ou microsomale, de foie de rat ou de cobaye, induit ou non, extrait de cellules humaines HepG2 stimulées à l'hydrocortisone 21 hémisuccinate et au benzanthracène, extrait de cellules de la lignée humaine MCL 5 (société Gentest), extrait de cellules eucaryotes recombinantes exprimant des P450, catalyse par les porphyrines. Dans le cas de l'utilisation d'une seule protéine de reconnaissance (porteuse ou non d'un marqueur), la protéine XP-A sera préférentiellement utilisée car elle est la première à reconnaître une lésion de l'ADN. De plus, cette protéine, dont l'ADN complémentaire est cloné, peut être exprimée dans un vecteur propagé dans un microorganisme et ainsi être produite en grande quantité dans un fermenteur par exemple. On peut également co-incuber la protéine XP-A et le complexe RPA. On peut également envisager d'utiliser de la même façon uniquement RPA ou le complexe RPA. On peut également envisager d'utiliser de la même façon les protéines HMG. De façon générale, les systèmes les plus intéressants selon la présente invention sont les systèmes NER et BER. REVENDICATIONS 1) Procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN, caractérisé en ce que a) on met ladite séquence d'ADN en présence d'une composition comportant au moins un composé reconnaissant le type d'altération en cause, dénommé ligand, dans un milieu assurant la reconnaissance, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par ledit ligand. 2)Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système de réparation de l'ADN. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu assurant la reconnaissance est constitué par un extrait cellulaire. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système NER. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système BER. 6) Procédé selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système de réparation des mésappariements. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système détectant les cassures de l'ADN. 8) Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que le ligand est marqué. 9) Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce qu'on utilise dans l'étape b) un élément de révélation de la reconnaissance du ligand. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'élément de révélation de la reconnaissance du ligand comporte un anticorps. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'ADN utilisé dans l'étape a) est au moins partiellement purifié. 12) Procédé selon l'une des revendications I à 10, caractérisé en ce que l'ADN utilisé dans l'étape a) est un extrait cellulaire total. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'ADN de l'étape a) est fixé sur un support solide. 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le procédé est mis en oeuvre en milieu liquide. 15) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'étape a) comporte des composés reconnaissant différents types d'altération et en ce que dans l'étape b) on peut identifier séparément les différents types de reconnaissance. 16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les composés reconnaissant les différents types d'altération sont révélés par des marqueurs différents. 17) Procédé permettant la mise en évidence dans un échantillon d'une altération du système de réparation de l'ADN, caractérisé en ce que a) on met l'échantillon en présence d'un ADN altéré, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par un ligand du système de réparation, on évalue le résultat obtenu à l'étape b) par rapport à un standard constitué par un échantillon normal traité dans les mêmes conditions. 18) Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 16, à la mise en évidence des propriétés génotoxiques d'un environnement par mesure de l'altération que l'environnement produit sur l'ADN de l'échantillon.