FR 2758045 A1 19980710 FR 9716004 A 19971217 PROCEDE POUR CONFERER UNE RESISTANCE AUX INSECTES A UNE PLANTE MONOCOTYLEDONE UTILISANT UNE SEQUENCE DE CODAGE DE PEROXYDASE La présente invention concerne, d'une manière générale, des procédés et des compositions pour lutter contre les insectes dans les plantes monocotylédones (monocotes) , en particulier le maïs. Plus précisément, l'invention concerne (1) un procédé pour lutter contre les insectes dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules végétales monocotylédones transgéniques comprenant de 1'ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase et (2) une plante monocote transgénique fertile comprenant de 1'ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase. Les insectes nuisibles sont un facteur majeur dans la perte des récoltes agricoles commercialement importantes dans le monde. On a utilisé de façon poussée un large spectre de pesticides chimiques pour combattre ou éradiquer les parasites d'importance agricole. Bien que les insecticides soient efficaces pour lutter contre la plupart des insectes nocifs, l'utilisation de ces composés pose des problèmes considérables. Les insecticides sont coûteux à produire et à appliquer. Souvent, des applications répétées sont nécessaires pour obtenir une maîtrise effective. On se soucie également de la résistance qu'ont ou que peuvent acquérir les insectes à un grand nombre des produits chimiques utilisés pour lutter contre eux. Les insecticides détruisent souvent des insectes bénéfiques qui sont des pollinateurs ou qui s'attaquent aux insectes herbivores. En outre, l'utilisation à long terme d'insecticides chimiques est un danger pour l'environnement. Des programmes de gestion des parasites sont en cours d'introduction ; ils diminuent l'utilisation d'insecticides chimiques. Ces programmes comprennent l'amélioration des récoltes par la sélection, ltemploi d'agents de lutte biologique et de prédateurs d'insectes, et l'incorporation de gènes résistants aux insectes par des programmes d'élevage et le génie génétique. Les gènes les plus utilisés pour le génie génétique sont les gènes de protéine cristal de Bacillus thuringiensis. Cf, par exemple, Rice et al., EP-A-292 435 et Koziel et al., WO 93/07278. La majorité des protéines cristal produites par Bacillus sont toxiques pour les larves d'insectes des ordres des lépidoptères, des diptères et des coléoptères. En général, lorsqu'une protéine cristal insecticide est ingérée par un insecte sensible, le cristal est solubilisé et agit comme partie toxique. Pour éviter le développement d'insectes qui sont résistants à ces toxiques, on a besoin de toxines additionnelles qui ont des effets additifs ou synergiques. Les peroxydases appartiennent à une sous-classe d'oxydoréductases qui utilisent un peroxyde comme HzO en tant que substrat. Les peroxydases sont des glycoprotéines monomères contenant un hème capable de lier des cations bivalents (principalement Ca', mais également Mn2)(Maranon et Van Huystee, Phytochemistry 37 : 1217-1225 (1994)). Les groupes prosthétiques pour la peroxydase ont des rôles différents. Tandis que leur groupe hème intervient dans la catalyse, les cations bivalents stabilisent la partie hème, et les groupes glycosyle peuvent aider à stabiliser la peroxydase en diminuant sa vitesse de remplacement (Maranon et Van Huystee, Phytochemistry 37 : 1217-1225 (1994)). Les peroxydases sont souvent groupées en formes anioniques, cationiques et neutres selon leur migration sur des gels à focalisation isoélectrique. Bien que comme enzymes elles soient considérées comme ayant une large spécificité de substrat, elles semblent bien avoir certaines "préférences" de substrat pour des isoenzymes différentes (Van Huystee, Ann. Rev. Plant Physiol., 205-219 (1987)). Il existe plusieurs types de peroxydases et d'enzymes apparentées, y compris la peroxydase de gaïacol, la NADH peroxydase, la peroxydase de cytochrome C, la catalase, la glutathion peroxydase, la L-ascorbate peroxydase, et la manganèse peroxydase. Chez les plantes, les peroxydases sont des protéines monomères qui sont des enzjues hautement complexes dont les activités sont étroitement régulées par la plante. Les peroxydases sont critiques dans la biosynthèse des parois des cellules végatales. Les peroxydases favorisent la polymérisation par peroxydation des monolignols que sont les alcools coniférylique, r-coumarylique et sinapylique en lignine (Greisbach, dans The Biochemistry of Plants, Ed. Conn., Academic, New York pp. 457-480 (1991)). Différentes espèces de plantes ont des rapports différents de l'espèce monolignol assemblée d'une manière semialéatoire (Hwang et al., Carbohydrate Polymers 14:77-88 (1991)). La lignification sert à renforcer les parois cellulaires. Le résultat global est un durcissement du tissu végétal. On utilise une peroxydase anionique de tabac pour transformer N. tabacum et N. sylvestris (Lagrimini, Plant Cell 2:7-18 (1990) ; Lagrimini, Plant Physiology 96:577-583 (1991)). Ces plantes transgéniques surexpriment de manière constitutive une peroxydase anionique de tabac à partir d'un promoteur 35S. Le phénotype le plus frappant de la surexpression de la peroxydase est un flétrissement chronique qui commence approximativement au moment de la floraison. En outre, les plantes ont une croissance retardée, ont des cellules plus petites et compactées, et brunissent rapidement en réponse à la blessure. On utilise également le même produit d'assemblage pour transformer des plants de tomate (Lagrimini et al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 117:1012-1016 (1992) Lagrimini et al., Hortscience 28:218-221 (1193)). On trouve également que ces plants se flétrissent sévèrement après floraison, et présentent un brunissement excessif et une réduction de la taille des fruits. Des études initiales ont montré que certains tissus de plants de tabac et de tomate transgéniques exprimant un gène de peroxydase anionique de tabac sont résistants à certains insectes (Dod e al., Présentation au Congrès national de la société d'entomologie d'Amérique, Indianapolis, décembre 1993). Le tabac et la tomate sont des plantes dicotylédones ("dicotes") étroitement apparentées, appartenant à la même famille, celle des solanacées. En revanche, les monocotes transgéniques de l'invention ont une physiologie, une biochimie, une anatomie et un métabolisme très différents lorsqu'on les compare aux dicotes. Ainsi, les monocotes ont un usage de codon différent, ils emploient le métabolisme C4 au lieu de C3, ont une teneur en acide gras différente, des fleurs imparfaites, etc. Ainsi on ne savait pas s'il existait chez les monocotes des substrats pouvant être utilisés par la peroxydase pour lutter contre les insectes. En outre, les peroxydases sont des glycoprotéines qui doivent subir une modification de posttranscription spécifique et une incorporation de groupes contenant de l'hème pour être stables et enzymatiquement actives. Les peroxydases interviennent dans la synthèse des métabolites secondaires et des lignines dont la nature dépend des substrats disponibles dans la plante spécifique. Par conséquent, les produits finals obtenus par expression de peroxydases peuvent différer d'une plante à l'autre. En outre, la résistance aux vers de l'épi de maïs est en corrélation négative avec le brunissement de la soie, ce qui indique qu ' un accroissement de la peroxydase abaisserait la résistance (Byrne et al., Environ. Entomol. 18:356-360 (1989)) . Ceci enseigne qu'il faut s'abstenir d'utiliser une peroxydase pour lutter contre les insectes dans les monocotes. En outre, l'altération de la production de lignine dans le maïs (dans les mutants bm) provoque un accroissement de la sensibilité aux insectes (Barrière et Argillier, Agronomie 13:865-876 (1983)). Ainsi, on ne s'attendrait pas qu'une peroxydase étrangère modifiant la lignification diminue la sensibilité aux insectes. En outre, il était inattendu d'après les enseignements de Bergvinson et al., The Canadian Entomologist 127:111-122, 1995, qu'une résistance aux insectes soit conférée aux plantes par un durcissement des tissus dû à l'activité de peroxydase dans les premiers stades de la croissance. Par conséquent, avant l'invention, l'effet de l'expression d'un peroxydase recombinante dans les monocotes était imprévisible. Il est fourni des procédés pour lutter contre les insectes et des plantes monocotes résistantes aux insectes. L'invention fournit plus spécifiquement un procédé pour lutter contre les insectes, dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules de plantes monocotylédones transgéniques, comprenant un ADN recombinant incluant une séquence de codage codant pour la peroxydase, où l'expression de la peroxydase confère une résistance aux insectes dans les cellules de plantes monocotylédones transgéniques. L'invention fournit également une plante monocotylédone transgénique fertile dont au moins une partie comprend des cellules ayant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, l'expression de la peroxydase conférant à la plante monocotylédone un trait phénotypique. L'invention fournit également une cellule, un tissu ou une graine de plante transgénique obtenus à partir de la plante décrite ci-dessus. L'invention fournit en outre les descendants transgéniques de la plante décrite ci-dessus. L'invention fournit également une cellule, un tissu ou une graine de plante transgénique obtenue à partir des descendants décrits ci-dessus. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront d'après la description qui suit. FIGURE 1. Le plasmide, pJS20293, est présenté comme contenant une peroxydase anionique de tabac insérée entre (1) le promoteur CaMV 355 lié à l'intron rétréci et (2) le terminateur CaMV 35S. FIGURE 2. Représentation du plasmide, pUBIAc. Les définitions suivantes aideront à préciser l'invention. Cellule végétale : L'unité structurelle et physiologique des plantes, constituée d'un protoplaste et d'une paroi cellulaire. Le terme de "cellule végétale" se réfère à toute cellule qui soit fait partie d'une plante, soit en dérive. Certains exemples de cellules comprennent des cellules différenciées qui font partie d'une plante vivante ; des cellules différenciées en culture ; des cellules non différenciées en culture ; des cellules d'un tissu non différencié comme un cal ou des tumeurs ; des cellules différenciées de graines, d'embryons, de propagules et de pollen. Tissu végétal : Groupe de cellules végétales organisées en une unité structurelle et fonctionnelle. Est inclus tout tissu d'une plante dans des planta ou en culture. Le terme inclut, sans sty limiter, les plantes entières, les organes de plantes, les graines de plantes, les cultures tissulaires ou tout groupe de cellules végétales organisé en unités structurelles et/ou fonctionnelles. L'utilisation de ce terme conjointement avec, ou en l'absence de, tout type spécifique de tissu végétal tel qu'énuméré ci-dessus ou autrement compris par cette définition n'est pas conçue pour exclure un quelconque autre type de tissu végétal. Protoplaste : cellule végétale sans paroi. Plante descendante : plante de génération future obtenue par voie sexuée ou asexuée qui inclut, sans s'y limiter, des plantes progénitures. Plante transgénique : plante dans laquelle est incorporé de façon stable un ADN recombinant dans son génome. ADN recombinant : toute molécule d'ADN formée par réunion de segments d'ADN provenant de différentes sources et produite en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Technologie de l'ADN recombinant : technologie qui produit de l'ADN recombinant in vitro et transfère l'ADN recombinant dans des cellules où il peut être exprimé ou propagé (Cf. Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, dir.publ., Juo, CRC Press, Boca Raton (1996)), par exemple transfert d'ADN dans un ou plusieurs protoplastes ou cellules sous diverses formes, y compris, par exemple (1) un l'ADN nu sous forme circulaire, linéaire ou superenroulée, (2) un ADN contenu dans des nucléosomes ou des nucléosomes ou leurs noyaux ou parties de noyaux, (3) un ADN complexé ou associé avec d'autres molécules, (9) un ADN inclus dans des liposomes, des sphéroplastes, des cellules ou des protoplastes ou (5) un ADN transféré à partir d'organismes autres que l'organisue hôte (par exemple Agrobacterlurti tumefaciens) . Ces procédés d'introduction de l'ADN recombinant dans les cellules, ainsi que d'autres, sont connus des spécialistes et peuvent étre utilisés pour produire les cellules transgéniques et les plantes transgéniques de l'invention. La technologie de l'ADN recombinant inclut également les procédés de haute combinaison homologue décrits dans Treco et al., WO 94/12650 et Treco et al., WO 95/31560 qui peuvent être appliqués à une activité croissante de peroxydase dans une monocote. Spécifiquement, on peut introduire des régions régulatrices (par exemple des promoteurs) dans le génome de la plante afin d'accroitre l'expression de la peroxydase endogène. Est également incluse comme technologie de l'ADN recombinant l'insertion d'une séquence de codage de peroxydase dépourvue de signaux d'expression choisis dans une monocote et le dosage de la plante monocote transgénique pour déterminer l'accroissement de l'expression de peroxydase dû aux séquences de commande endogène dans la monocote. Ceci aboutirait à une augmentation du nombre d'exemplaires et de séquences de codage de peroxydase dans la plante. L'insertion initiale de l'ADN recombinant dans le génome de la plante R n'est pas définie comme étant accomplie par des procédés classiques de sélection des plantes mais plutôt par des procédés techniques tels qu'ici décrits. Après l'insertion initiale, on peut propager les descendants transgéniques en utilisant essentiellement des procédés de sélection traditionnels. Gène chimérique : molécule d'ADN contenant au moins deux parties hétérologues, par exemple des parties dérivées de séquences d'ADN préexistantes qui ne sont pas associées dans les états préexistants, ces séquences ayant été de préférence engendrées en employant la technique de l'ADLT recombinant. Cassette d'expression : Molécule d'ADN comprenant un promoteur et un terminateur entre lesquels une séquence de codage peut être insérée. Séquence de codage : Une molécule d'ADN qui lorsqu'elle est transcrite et traduite, aboutit à la formation d'un polypeptide ou d'une protéine. Gène : Région chromosomique discrète comprenant une séquence d'ADN régulatoire à l'origine de la commande de l'expression, c'est-à-dire de la transcription et de la traduction, et une séquence de codage qui est transcrite et traduite pour donner un polypeptide et une protéine distincts. Trait phénotypique : Propriété observable résultant de l'expression d'un ou plusieurs gènes. L'invention concerne des procédés pour lutter contre les insectes tels que les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères, les mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les dermaptères, les isoptères, les anoploures, les siphonaptères, et les trichoptères. Comme exemples particuliers de tels insectes parasites on peut citer la pyrale européenne du maïs, la pyrale de la tige de maïs, la noctuelle ypsilon, le ver de l'épi du maïs, la chenille de la leucanie, la pyrale du maïs du sud-ouest des Etats Unis, la petite pyrale de la tige de maïs, la chenille mineuse de la canne à sucre, le ver des racines du maïs de l'ouest de Etats-Unis, le ver des racines de mais du nord des Etats-Unis, le ver des racines du maïs du sud des Etats-Unis, les vers fil-de-fer, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis, le hanneton masqué du sud des Etats-Unis, le hanneton japonais, l'altise du mais, le charançon du maïs, le puceron des feuilles de maïs, le puceron des racines de maïs, le "chinch bug", le criquet à pattes rouges, le criquet migrateur, le ver des graines de maïs, les teignes des taches du maïs, les thrips de l'herbe, les fourmis voleuses et les acariens à deux taches. Tout procédé dans lequel l'expression de la peroxydase confère une résistance aux insectes chez les cellules végétales monocotylédones est comprise dans l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé pour lutter contre les insectes en nourrissant les insectes ou en les mettant en contact avec une quantité insecticide de cellules végétales monocotylédones transgéniques, le génome desdites cellules végétales codant pour une enzyme ayant une activité de peroxydase. Lors de l'expression, la peroxydase confère une résistance aux insectes aux cellules végetales transgéniques. Le transgène codant pour la peroxydase constitue un gène additionnel inséré dans le génome d'une plante progénitrice qui ne code pas naturellement pour ladite peroxydase. Dans un autre mode de réalisation préféré, on utilise les procédés de recombinaison homologues décrits dans Treco et al., WO 94/12650 et Treco et al., 270 95/31560 pour augmenter l'activité de peroxydase dans une monocote et ainsi la résistance aux insectes. Spécifiquement, on introduit des régions régulatoires (par exemple des promoteurs) dans le génome de la plante pour accroitre l'expression de la peroxydase endogène, ce qui augmente la résistance de la plante aux insectes. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'insertion d'une séquence de codage de peroxydase dépourvue de signaux d'expression sélectionnée dans une monocote et on dose dans la plante monocote transyénique l'accroissement de l'expression de la peroxydase dû aux séquences de commande endogènes dans la monocote. Ceci aboutit à une augmentation du nombre d'exemplaires de séquences codant pour la peroxydase dans la plante. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé pour augmenter le nombre d'exemplaires du gène de peroxydase endogène dans lequel on confère une résistance aux insectes à la plante monocote. Un tel procédé s'accomplit de préférence en utilisant des procédés traditionnels de sélection des plantes ou en utilisant des techniques de culture tissulaire. Les plantes résistant aux insectes comprennent une résistance aux insectes accrue par rapport à celle que l'on trouve dans les plantes natives non manipulées, étant donné les niveaux accrus de peroxydase. L'invention concerne en outre un sachet commercial comprenant des graines d'une plante monocotylédone transformée avec un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, où l'expression de la peroxydase confère à ladite plante un trait phénotypique. On préfère dans l'invention un sachet commercial comprenant des graines d'une plante transgénique où l'expression de la peroxydase confère à ladite plante une résistance et une capacité accrue à lutter contre les insectes. Un autre but préféré de l'invention est un sachet commercial de ce type avec des instructions sur une étiquette pour l'utilisation des graines qu'il contient. Résistance d aux insectes De préférence, les monocotes transgéniques de l'invention sont résistantes aux insectes choisis dans les odres incluant, sans s'y limiter, les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères, les mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les dermaptères, les isoptères, en particulier les coléoptères et les lépidoptères. Pour les buts de l'invention, on reconnaît que les plantes transgéniques de l'invention peuvent etre résistantes non seulement aux insectes mais également aux champignons, aux bactéries, aux nématomes, aux mites, etc. Les plants de maïs de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Ostrinia nubilalis, la pyrale européenne du maïs Sesamia nonegrioides, la pyrale de la tige du maïs Agrotis ipsilon, la noctuelle ipsylon ; Helicoverpazea, le ver de l'épi de maïs ; Spodoptera frugiperda, la chenille de la leucanie ; Diatraea grandiosella, la pyrale du maïs du sud-ouest des Etats-Unis Elasmopalpus lignosellus, la petite pyrale de la tige de maïs ; Diatraea saccharalis, la chenille mineuse de la canne à sucre ; Diabrotica virgifera, le ver de la racine du maïs de l'ouest des Etats-Unis ; Diabrotica longicornis barberl, le ver de la racine de maïs du nord des Etats-Unis ; Diabrotica undecl'npunctata howardi, le ver de la racine du mais du sud des Etats Unis ; Milanotus spp, les vers fil-de-fer Cyclocephala borealis, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis (ver blanc) ; Cyclocephala immaculata, le hanneton masqué du sud des Etats-Unis (ver blanc) Popillia japonica, le hanneton japonais (forme ver et adulte), Chaetocnema pulicaria, l'altise du mais, Sphenophorus maidis, le charançon du maïs; Rhopalosiphururn maidis, le puceron des feuilles de mais, Anuraphis maidiradicis, le puceron des racines de maïs, Blissus leucopterus, le "chinch bug" ; Melanoplus femurrubrum, le criquet à pattes rouges ; Melanoplus sanguinipes, le criquet migratoire ; Hylemya platura, le ver des graines de maïs ; Agromyza parvicornis, la teigne des taches du maïs ; Anaphothrips obscurus, le thrips de l'herbe ; Solenopsis milesta, la fourmi voleuse, et Tetranycus urticale, l'araignée à deux taches. Les plantes de sorgho de l'invention sont de préférence résistantes à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Chilo pertellus, la pyrale du sorgho ; Spodoptera frugiperda, la chenille de la leucanie ; Hellcoverpa zea, le Over de l'épi de maïs ; Elasmopalpus lignosellus, la petite pyrale de la tige de maïs Feltia subterranea, la noctuelle granulée ; Phyllophaga crinita, ver blanc ; Eleodes Conoderus et Aeolus spp., vers fil-de-fer ; Oulema melanopus, l'altise des céréales ; Chaetocnema publicaria, l'altise du maïs Sphenophorus maidis, le charançon du maïs Rhopalosiphum maidis, le puceron des feuilles de maïs Sipha flaira, le puceron jaune de la canne à sucre Blissus leucopterus leucopterus, le "chinch bug" Contarlnla sorghicola, le moucheron du sorgho Tetranychus cinnabarinus, l'araignée rouge ; et Tetranychus urticae, l'araignée à deux taches. Les plants de blé de l'invention sont de prérérence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Pseudaletia unipunctata, chenille ; Spodoptera frugiperda, la chenille de la leucanie ; Elasmopalpus lignosellus, la petite pyrale de la tige de maïs ; Agrotis orthogonia, la noctuelle pâle de l'ouest des Etats-Unis ; Oulema melanopus, le hanneton des feuilles de céréale ; Hypera punctata, le charançon des feuilles de trèfle Daibrotica undecimpunctata howardii, le ver des racines de maïs du sud des Etats-Unis ; le puceron du blé de Russie ; Schizaphis graminum, la punaise verte Macrosiphum avenae, le puceron des graines d'Angleterre ; Alelanoplus femurrubrum, le criquet à pattes rouges Nelanoplus differentialis, le criquet différencié P[elanoplus sanguinipes, le criquet migratoire Mayetiola destructor, la mouche de Hesse ; Sitodiplosis moesllana, le moucheron du blé ; Meromyza americana, le ver des tiges de blé ; Hylemya coarctata, la mouche grise du blé ; Frankliniella fusca, le thrips du tabac; Cephus cinctus, tenthrède de la tige de blé ; et Aceria tulipae, la mite enroulée du blé. Les plants de riz de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe comprenant, sans s'y limiter, Diatraea sacralis, la chenille mineuse de la canne à sucre ; Spodoptera frugiperda, la chenille de la leucanie ; Helicoverpa zea, le ver de l'épi de maïs ; Colapsis brunnea, le colaspis du raisin ; Lissorhoptrus oryzophilus, le charançon d'eau du riz ; Sitophilus oryzae, le charançon du riz ; Nephotettix nigropictus, le criquet du riz ; Blissus leucopterus leucopterus, le "chinch bug" ; et Acrosternurn hIlare, la punaise verte. Les plants d'orge de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe comprenant sans s'y limiter, l'Ostrinia nubilalis, la pyrale du maïs d'Europe ; Agrotis ypsilon, la noctuelle ypsilon ; Schizaphis graminum, la punaise verte; Blissus leucopterus leucopterus, le "chinch bug", Acrosternum hIlare, la punaise verte puante ; Euschistus se vos, la punaise brune puante Hylemya platura, le ver des graines de mals ; Playetlola destructor, la mouche de Hesse; Thysanoptera, le thrips ; et Petrobia latens, la mite brune du blé. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante monocotylédone (monocote) transgénique fertile comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour une peroxydase. Les monocotes sont des plantes dont l'embryon présente un cotylédon. Les monocotes appartiennent à une des deux grandes classes d'angiospermes (les dicotes étant l'autre grande classe). Les familles préférées dans la classe des monocotes comprennent les graminées (famille de l'herbe ; les membres préférés des graminés comprennent les herbes à fourrage (par exemple Festuca (fétouque)), Hordeum (orge), Avena (avoine), Zea mays (mais), Tritium (blé) , Secale (seigle) , Sorgum vulgare (sorgho) , et Oryza sativa (riz) ; les liliacées (familles du lys de préférence Allium (oignon) et Asparagus ; et les dioscoréacées (famille des ignames) qui sont tous compris dans l'invention. L'invention inclut également sans s'y limiter, les espèces monocotes, par exemple les lignées préférées de Zea mays comprennent Funk 5N984, Funk 5N986, Funk 2717, Funk 211D, Funk 2N217A, B73, A632, CMl05, B37, B84, B14, Mol7, Al88, CG00526, CG00615 et CG00714. Les propriétés génétiques conférées par génie génétique à des graines et à des plantes transgéniques mentionnées ci-dessus se tran.nettent par reproduction sexuée ou croissance végétative et peuvent être ainsi maintenues ou propagées dans les plantes descendantes. Généralement le maintien et ladite propagation font appel à certains procédés agricoles connus mis au point pour s ' adapter à des objectifs spécifiques comme le labourage, l'ensemencement ou la récolte. On peut également appliquer des procédés spécialisés comme la culture hydroponique ou les techniques en serre. Etant donné que la culture en cours de croissance est vulnérable à l'attaque et au dommage causé par les insectes ou aux infections ainsi qu'à la comptétition par des mauvaises herbes, des mesures sont prises pour lutter contre les mauvaises herbes, les maladies de plantes, les insectes, les nématodes et autres conditions négatives afin d'améliorer le rendement. Ces mesures comprennent des mesures mécaniques comme le labourage du sol et l'enlèvement des mauvaises herbes et des plantes infectées ainsi que l'application de produits agrochimiques comme les herbicides, les fongicides, les gamétocides, les nématicides, les régulateurs de croissance, les agents de mûrissement et les insecticides. L'utilisation des propriétés génétiques avantageuses des plantes et graines transgéniques sel comprennent, sans s'y limiter, l'hybridation, la sélection consanguine, le rétrocroisement, la sélection multilignée, le mélange de variétés, l'hybridation interspécifique, les techniques aneuploides, etc. Les techniques d'hybridation comprennent également la stérilisation des plantes pour donner des plantes stériles mâles ou femelles par des moyens mécaniques, chimiques ou biochimiques. La pollinisation croisée d'une plante stérile mâle avec un pollen d'une lignée différente assure que le génome de la plante mâle stérile mais fertile sous forme femelle reçoivent uniformément les propriétés des deux lignées parentales. Ainsi, les graines et plantes transoéniques selon l'invention peuvent être utilisées pour la sélection de lignées végétales améliorées qui par exemple augmentent l'efficacité des procédés classiques comme le traitement par herbicides ou pesticides ou permettent de se dispenser desdits procédés de par leurs propriétés génétiques modifiées. On peut également obtenir de nouvelles récoltes ayant une tolérance au stress améliorée qui, de par leur "équipement génétique" optimisé, donnent des produits récoltés de meilleure qualité que les produits qui ne peuvent tolérer des conditions de développement défavorables qui soient comparables. Dans la production des graines, la qualité de la germination et l'uniformité des graines sont les caractéristiques essentielles du produit, tandis que la qualité et l'uniformité de germination des graines recueillies et vendues par l'agriculteur n'est pas importante. Etant donné qu'il est dirfile de maintenir une récolte pure de toutes autres graines de plantes cultivées et de mauvaises herbes, pour lutter contre les maladies portées par les graines, et pour produire des graines ayant une bonne germination, les producteurs de graines ont mis au point des pratiques de production de graines assez extensives et bien définies, avec l'expérience de la technique de culture, du conditionnement et de la mise sur le marché de graines pures. Ainsi, la pratique courante des agriculteurs consiste à acheter des semences certifiées répondant à certaines normes de qualité spécifiques au lieu d'utiliser des graines recueillies dans leurs propres cultures. Les matériaux de propagation à utiliser comme graines sont habituellement traités avec un revêtement protecteur comprenant des herbicides, des insecticides, des fongicides, des bactéricides, des nématicides, des mollusquicides ou leurs mélanges. Les revêtements protecteurs habituellement utilisés comprennent des composés comme le captan, la carboxine, le thirame (TMTDQ) , le méthalaxyle (Apront), et le pirimiphos-méthyle (Actellic) . Si on le désire, on formule ces composés avec d'autres supports, agents tensio-actifs ou adjuvants favorisant l'application habituellement employés dans la technique de formulation pour conférer une protection contre les dommages provoqués par les parasites bactériens, fongiques ou animaux. On peut appliquer les revêtements protecteurs en imprégnant le matériau de propagation avec une formulation liquide ou en le revêtant d'une formulation humide ou sèche combinée. D'autres procédés d'application sont également possibles, comme le traitement dirigé vers les bourgeons ou les fruits. Un autre aspect de l'invention consiste à fournir de nouveaux procédés agricoles tels que les procédés donnés en exemple ci-dessus qui se caractérisent par l'utilisation de plantes transgéniques, de matériaux végétaux transgéniques, ou de graines transgéniques selon 1' invention. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une cellule végétale, un tissu , un organe, une graine ou une partie de plante transgénique obtenus à partir de la plante transgénique. Sont également inclus dans l'invention les descendants transgéniques de la plante ainsi que les cellules, tissus, organes, graines et parties de plantes transgéniques obtenus à partir des descendants. Telle qu'ici décrite, l'invention concerne une plante monocote transgénique fertile transformée avec une séquence de codage de peroxydase. De préférence, la séquence de codage de peroxydase confère à la plante monocote un trait phénotypique que l'on ne trouve pas chez une plante parente dépourvue de la séquence codant pour la peroxydase ou de sa surexpression. Les traits phénotypiques qui peuvent être produits comprennent la résistance aux insectes et une capacité accrue à lutter. De préférence encore, la séquence de codage de peroxydase dans la plante transgénique est sexuellement transmise. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de peroxydase est sexuellement transmise par un cycle sexué normal complet de la plante RO à la génération R1. On préfère en outre que la séquence de codage de peroxydase soit exprimée de manière que le niveau de peroxydase dans les cellules, les tissus, les graines ou les plantes soient accru audessus du niveau que l'on trouve dans les cellules, les tissus, les graines ou les plantes d'une monocote qui ne diffère qu'en ce que la séquence de codage de la peroxydase est absente. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de peroxydase est une séquence de codage de peroxydase anionique, cationique ou neutre. Dans un autre mode de réalisation préféré, la peroxydase est une peroxydase de gualacol, la NADH-peroxydase, la cytochrome-C peroxydase, la catalase, la glutathion peroxydase, la L-ascorbate peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase produisant le peroxyde d'hydrogène, et/ou la peroxydase formant la lignine. Les spécialistes disposent et peuvent employer dans l'invention de diverses séquences codant pour la peroxydase. Ainsi, on a cloné des peroxydases à partir du tabac, (Lagrimini, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7542-7546 (1987), de la pomme de terre (Roberts et al., Plant Molecular Biology 11:5-26 (1988) ; du raifort (Fujiyama et al., European Journal of Biochemistry, 173, 681-687 (1988) ; Fujiyama et al. Gene 89:163-169 (1990) et Welinder, K.G., European Journal of Biochemistry 96:483-502 (1979)),de la tomate (Roberts, E. et Kolattukudy, P.E. Nolecular Genes and Genetlcs, 217, 223-232 (1989)), de l'arachide (Buffard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8874-8878 (1990)), du concombre (Morgens et al., Plant Nolecular Biology, 14:715-725 (1990)), d'Arabidopsis (Intapruk et al. Gene 98:237-241 (1991)); du blé (Hertig et al., Plant Molecular Biology 16:171-174 (1991) ; et Rebmann et al., Plant Molecular Biology 16:329-331 (1991)), de l'orge (Rasmussen, S.K. et al., Plant Molecular Biology 16:317-327 (1991) ; et Theilade, B. et Rasmussen, S.K., Gene 118:261-266 (1992)), du riz (Reimman et al., Plant Physlology 100: 1611-1612 (1992)), du maïs (Hwang, thèse de Ph.D., université d'état de l'Ohio), et du navet (Mazza et Welinder, European Journal of Biochemlstry 108:481-489 (1980)). Les séquences de codage de peroxydase utilisées dans l'invention ne doivent pas être limitées aux séquences de codage de peroxydase connues. On peut isoler de nouvelles séquences de peroxydase pour utilisation dans l'invention par identité ou similitude avec des séquences connues. La peroxydase anionique de tabac présente une identité ou une similitude avec les séquences d'acides aminés de la peroxydase cationique de raifort et de la peroxydase cationique de navet. L'identité ou similitude globale entre le tabac et le raifort est de 52'' ; pour le tabac et le navet, les peroxydases ont une identité ou une similitude de 46. En outre, il existe des régions dans la séquence de codage de peroxydase dans laquelle l'identité ou la similitude approche de 100''. . Quatre de ces régions conservées correspondent à des domaines critiques pour l'activité générale de peroxydase. Par conséquent, on peut utiliser des séquences d'ADN provenant des régions conservées pour cloner d'une manière générale les séquences codant pour la peroxydase provenant de n'importe quelle espèce de plante en utilisant des procédés bien connus des spécialistes (cf. par exemple, Current Protocols in Molecular Biology, dir.publ. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (printemps 1996)). De même, on peut isoler de nouvelles séquences de peroxydase en utilisant des anticorps suscités contre une enzyme de peroxydase afin d'isoler d'autres enzymes de peroxydases. On a mis en évidence une homologie entre les divers lysozymes de peroxydases avec des anticorps suscités avec la peroxydase anionique de tabac. Par analyse d'immunobuvardage, ces anticorps réagissent fortement de façon croisée avec les isozymes de raifort et de navet et réagissent également de façon croisée avec la plupart des autres isozymes de tabac (cf. Lagrimini, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7542-7546 (1987). On peut séquencer les nouvelles enzymes peroxydases en utilisant des procédés bien connus des spécialistes, et l'on peut isoler leurs séquences de codage correspondantes en utilisant des procédés bien connus des spécialistes (par exemple voir, Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1988)). L'expression transgénique dans les plantes de séquences de codage de peroxydase dérivées de sources autres que la plante hôte (par exemple de sources bactériennes) peut nécessiter la modification de ces séquences de codage pour réaliser et optimiser leur expression chez la plante hôte. Dans certains cas, une modification des séquences de codage et de la séquence adjacente n'est pas nécessaire. Il suffit d'isoler un fragment contenant la séquence de codage à laquelle on s intéresse et de l'insérer en aval d'un promoteur végétal. Par exemple voir, Gaffney et al., Science 261:754-756 (1993). De préférence, on doit laisser aussi peu que possible de séquences microbiennes adjacentes attachées en amont de l'ATG et en aval du codon d'arrêt. On peut optimiser l'accroissement de l'expression de la séquence de codage de peroxydase dans la monocote hôte. Ainsi, étant donné que l'usage du codon et la fréquence du codon préférées chez la plante hôte peuvent différer de l'usage et de la fréquence des sequences de codage de peroxydase auxquelles on s'intéresse, la comparaison de l'usage et de la fréquence des codons dans une séquence de codant clonée avec l'usage et la fréquence dans des séquences de codage de plantes (et en particulier des séquences de codage provenant de la plante cible) permet une identification des codons dans la séquence de codage que l'on peut modifier de préférence. Les codons préférés peuvent être déterminés à partir des codons ayant la fréquence la plus élevée dans les protéines exprimées en plus grande quantité dans la plante ou à partir des codons les plus préférés dans la plante. (Cf par exemple, Adang et al., EP-A-359 472 ; Fischhoff et al., EP-A-385 962 ; Cornelissen et al., WO 91/16432 Koziel et al., WO 93/07278 ; Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328 (1991) ; et Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989). De cette manière, on peut optimiser l'expression des séquences nucléotidiques dans la plante spécifique à laquelle on s'intéresse. On reconnaît que la totalité ou une quelconque partie de la séquence de codage peut être optimisée ou synthétique. Autrement dit, on peut également utiliser des séquences synthétiques ou partiellement optimisées. Les plantes diffèrent des micro-organismes en ce que leurs messages ne possèdent pas un site de liaison ribosomique défini. Les ribosomes s'attachent plutôt à l'extrémité 5' du message et balayent pour rechercher le premier ATG disponible auquel commencer la traduction. Chez les plantes, il existe une préférence pour certains nucléotides adjacents à l'ATG et ainsi, l'expression des gènes microbiens peut être accrue par l'inclusion d'un initiateur de traduction consensus eucaryotique à l'ATG. Clontech (1993/199Zl catalogue, page 110) ont suggéré une séquence comme initiateur de traduction consensus pour l'expression du gène d'. coli uidA dans les plantes. En outre, Joshi, Nucl. Acid. Res. 15:6643-6653 (1987) compare de nombreuses séquences végétales adjacentes à i'ATG et suggère également une séquence consensus. Dans les situations dans lesquelles on rencontre des difficultés dans l'expression de séquences de codage microbiennes dans les plantes, on préfère l'inclusion de l'une de ces séquences à l'ATG initiateur. Les séquences de codage clonées à partir de sources non végétales peuvent également contenir des motifs qui peuvent être reconnus dans les plantes sous forme des sites d'épissage en 5' ou 3', produisant ainsi des messages tronqués ou délétés. Ces sites peuvent être retirés en utilisant les techniques connues des spécialistes (cf. par exemple, Current Protocols in Molecular Biology, dir.publ. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (printemps 1996)) On peut utiliser un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour une peroxydase dans le but de produire des tissus végétaux transgéniques. On transforme de préférence une plante avec au moins un ADN recombinant qui peut en outre comprendre une région d'initiation de transcription et un promoteur, tous deux étant liés de manière opératoire à la séquence de codage de la peroxydase. Les régions d'initiation de transcription peuvent être natives ou étrangères pour l'autre. Le terme d'étrangère signifie que la région d'initiation de transcription ne se trouve pas chez l'hôte de type sauvage dans lequel la région d'initiation de transcription est introduite. On peut obtenir la région de terminaison à partir de (1) le même yène que celui à partir duquel on a obtenu la région d'initiation de transcription, (2) le gène de peroxydase utilisé, ou (3) une autre source. La séquence de codage de peroxydase est de préférence fusionnée de manière opératoire à un promoteur expressible dans la plante, et les promoteurs préférables comprennent des promoteurs constitutifs, inductibles, temporairement régulés, régulés dans leur développement, chimiquement régulés, préférés d'un tissu et/ou spécifiques d'un tissu. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de peroxydase est liée de manière opératoire à son promoteur naturel et/ou à la séquence signal de polyadénylation. Les promoteurs constitutifs préférés comprennent les promoteurs CaMV 35S et 19S (Fraley et al, brevet américain N" 5 352 605) . Un promoteur préféré additionnel est dérivé de l'une quelconque ou de plusieurs des gènes d'actine, qui sont connus pour être exprimés dans la plupart des types cellulaires. Les cassettes d'expression de promoteur décrites par McElroy et al, Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991) peuvent être facilement modifiés en vue de l'expression de la séquence de codage de la peroxydase et conviennent particulièrement pour utilisation chez les hôtes monocotylédones. Un autre promoteur constitutif encore préféré est dérivé de l'ubiquitine, qui est un autre produit génique connu pour s'accumuler dans de nombreux types cellulaires. On a cloné le promoteur de l'ubiquitine à partir de plusieurs espèces aux fins d'utilisation dans des plantes transgéniques (parexemple le tournesol Binet et al., Plant Science 79:87-94 (1991), le mais Christensen et ai. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989)). On a mis au point le promoteur de l'ubiquitffiine de maïs dans des systèmes monocotes transgéniques et les vecteurs construits pour la transformation d'une monocote sont décrits dans Chrisriansen et al., EP-A342 926. Le promoteur de l'ubiquitine convient pour l'expression de la séquence de codage de peroxydase chez les plantes transgéniques, en particulier les monocotylédones. Les promoteurs spécifiques d'un tissu ou préférentiels d'un tissu utiles pour la séquence de codage de peroxydase chez les plantes, en particulier le maïs, sont ceux qui dirigent l'expression dans la racine, la médulla, la feuille ou le pollen. De tels promoteurs sont décrits dans Koziel et ai., WO 93/07278. On préfère également des promoteurs chimiquement inductibles utiles pour diriger l'expression de la séquence de codage de la peroxydase dans les plantes (cf, Alexander et al., t o 95/19443). Outre les promoteurs, on dispose également de divers terminateurs de transcription pour utilisation dans la construction d'un gène chimérique utilisant une séquence de codage de peroxydase. Les terminateurs de transcription sont à l'origine de la terminaison de la transcription au-delà du transgéne et de sa polyadénylation correcte. Les terminateurs de transcription appropriés et ceux qui sont connus pour fonctionner dans les plantes comprennent le terminateur CaMV 35S, le terminateur tml, le terminateur rbcS E9 du pois et d'autres connus des spécialistes. On trouve des régions de terminaison commodes dans le plasmide Ti d'A. tuinefaclens, comme les régions de terminaison oe l'octopine synthétase et de la nopaline synthétase. Voir également Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987) Guerineau et al., Mol.Gen. Genet., 262: 14l-l4 (1991); Proudfoot, Cell, 64:671-674 (1991); Sanfacon et ai., Genes Dev., 5:141-149 ; Mogen et al., Plant Cell, 2:1261-1232 (1990) ; Munroe et al., Gene, 91:151-158 (1990) ; Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17:7391-7903 (1989) ; Joshi et al., Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1937)). On a également trouvé que de nombreuses séquences accroissent l'expression du gène à partir duquel l'unité de transcription et ses séquences peuvent être utilisées conjointement à la séquence de codage de la peroxydase pour accroître l'expression dans les plantes transgéniques. On a montré que diverses séquences d'intron accroissent l'expression, en particulier dans les cellules monocotylédones. Ainsi, on a trouvé que l'intron du gène Adh 1 du maïs accroît de manière significative l'expression de gène de type sauvage sous son promoteur apparenté lorsqu'on l'introduit dans des cellules de maïs (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). On a incorporé de manière habituelle des séquences d'intron dans des vecteurs de transformation de plantes, typiquement dans la séquence de tête non traduite. Le produit d'assemblage peut également induire un régulateur comme un signal de localisation nucléaire (Kalderon et al., Cell 39:499-509 (1984) et Lassner et al., Plant Molecular Biology 17:229-234 (1991)), une séquence consensus de traduction végétale (Joshi, C.P., Nucleic Acides Research 15: 6643-6653 (1987)), un intron (Luehrsen et Walbot, 14o1. Gen. Genet. 225:81-93 (1991)), etc liée de manière opératoire à la séquence nucléotidique appropriée. De préférence, la séquence de tête 5c est incluse dans le produit d'assemblage de la cassette d'expression. De tel les séquences de têtes peuvent agir pour accroître la traduction. Les syuens de tête de traduction sont connues des spécialistes et comprennent: le séquences de tête de picornavirus, par exemple la séquence de tête d'EMCV (région non codante 5 c d'Encéphalomyocardite) (Elroy-Stein, O. Fuerst, T.R. et Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)) ; les séquences de tête de potyvirus, par exemple, la séquence de tête de TEV, par exemple le virus de l'attaque du tabac) : Virology, 154:9-20 (1986), et la protéine de liaison à chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (BiP), (Macejak, D.G., et Samow, P, Nature, 353:90-94 (1991) ; la séquence de tête non traduite de l'ARNm de la protéine d'enveloppe du virus de la mosaïque de la luzerne (AMV ARN 4) (Jobling, S.A. et Gebrke, L., Nature, 325:622-625 (1987)) ; la séquence de tête du virus de la mosaïque du tabac (TMV) (Gallie, D.R. et al., P!olecular-Sloloqy of RNA, pages 237-256 (1989)) ; et la séquence de tête du virus des taches chlorotiques du maïs (MCMV)(Lommel, S.A. et al., Virology 91:382-385 (1991)). Cf également, Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987). Lorsqu'on prépare l'ADN recombinant, on peut manipuler divers fragments d'ADN de manière à pourvoir aux séquences d'ADN dans l'orientation correcte et, de manière appropriée, dans le cadre de lecture convenable. A cet effet, on peut employer des adaptateurs ou des lieurs pour réunir les fragments d'ADN, ou bien on peut faire appel à d'autres manipulations pour assurer des sites de restriction commodes, l'élimination de l'ADN superflu, on emploie de préférence une mutagenèse in vitro, une réparation des amorces, une restriction, un annelage, une résection, une ligature, etc, lorsqu'il s'agit d' insertions, de délétions ou de substltutions, par exemple de transitions et de transversions. On dispose de nombreux vecteurs de transformation pour la transformation des plantes, et l'on peut utiliser les séquences de codage de la peroxydase conjointement avec n importe lequel de ces vecteurs. La sélection d'un vecteur pour l'utilisation dépend de la technique de transformation préférée et de l'espèce cible pour la transformation. Pour certaines espèces cibles, on préfère des antibiotiques ou des marqueurs de sélection d'herbicides différents. Les marqueurs de sélection employés habituellement dans la transformation comprennent le gène nptll qui confère la résistance à la kanamycine et aux antibiotiques apparentés (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982) Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), le gène bar qui confère une résistance à l'herbicide phosphinothricine (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor. Applic. Genet. 79 : 625-631 (1990)), le gène hph qui confère une résistance à l'antibiotique hygromycine (Blochinger & Diggelmann, Mol . Cell. Biol. 4:2929-2931), et le gène dhfr, qui confère une résistance au méthotréxate (Bourouis et al., EMBO J.2:1099-1104 (1983). De nombreux vecteurs sont disponibles pour la transformation en utilisant Agrobacterium tumefaciens. Ils portent typiquement au moins une séquence d'ADN-T et comprennent des vecteurs tels que pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids. Res. 12(22) : 8711-8721 (1984)). Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de la peroxydase peut être insérée dans l'un ou l'autre des vecteurs binaires pCIB200 et pCIB2001 pour utilisation avec Agrobacterium. Ces cassettes de vecteur pour la transformation se fa i se. par la mediation d'Agrobacterium peuvent être construites de la manière suivante. pTJS75kan a été créé par digestion par NarI de pTJS75 (Schmidhauser @ Helsinki, J Bactoril. 164:446-455 (1985)) permettant l'excision du gène de la résistance à la tétracycline, puis par insertion d'un fragment Acci provenant de pUC4K portant un NPTII (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982) Bevan et al., Nature 304 184-187 (1983) ; McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)). On ligature des lieurs XhoI au fragment EcoRV de pCIB7 qui contient les bordures d'ADN T droite et gauche, un gène chimérique nos/nptII sélectionnable par une plante et le lieur multisite pUC (Rothstein et al., Gene 53:153161 (1987)), et on clone le fragment digéré par Xhoi dans pTJS75kan digéré par Salle pour créer pCIB200 (voir également EP-A-332 104, exemple 19). pCIB200 contient les sites de restriction de lieurs multisites uniques suivant : EcoRI, SstI, Kpni, BglII, Xbai et SalI. pCI2001 est un dérivé de pCIB200 qui est créé par insertion de sites de restriction additionnels dans le lieur multisite. Les sites de restriction uniques dans le lieur multisite de pCIB20001 sont EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, Pilul, Boit, Avril, ApaI, Spat, et Stul . pCI2001, outre qu'il contient ces sites de restriction uniques, possède également une sélection vis-à-vis de la kanamycine végétale et bactérienne, des bordures d'ADN-T droite et gauche pour la transformation se faisant par la médiation d'Agrobacterium, la fonction trfA dérivée de RK2 pour la mobilisation entre E. coli et d'autres hôtes, et les fonctions OriT et OriV provenant également de RK2. Le lieur multisite pCIB2001 convient pour le clonage de cassettes d'expression de plantes cotent leur propre signaux régulatoires. Un autre vecteur utile pour la transformation se faisant par la médiation d'Agrobacterium est le vecteur binaire pCIB10 qui contient un gène codant pour la résistance à la kanamycine aux fins de sélection dans des plantes, des séquences bordures droite et gauche d'ADN-T et incorpore des séquences provenant du plasmide pRK252 à large gamme d'hôtes, lui permettant de se répliquer à la fois dans E. coli et dans Agrobacterium. Sa construction est décrite par Rothstein et al., Gene 53:179-188 (1983). On a construit divers dérivés de pCIB10 qui incorporent le gène de l'hygromycine B phosphotransférase décrit par Gritz et al., Gene 25:179-188 (1987). Ces dérivés permettent la sélection de cellules végétales transgéniques sur l'hygromycine seule (pCIB743), ou l'hygromycine et la kanamycine (pCIB715, pCIB717). Un vecteur de ce genre utile pour les techniques de transfert de gène direct en combinaison avec la sélection par l'herbicide Basta (ou phosphinothricine) est pCIB3064. Ce vecteur se fonde sur le plasmide pCIB246, qui comprend le promoteur CaMV 35S en fusion opératoire avec le gène GUS E. coli et le terminateur de transcription CeMV 35S et est décrit dans Koziel et al., WO 93/07278. Le gène fournissant une résistance à la phosphinothricine est le gène bar de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et ai., EMBO J. 6:25192523 (1987)). Ce vecteur convient pour le clonage de cassettes d'expression de plantes contenant leurs propres signaux régulatoires. Un vecteur de transformation additionnelle est pSOG35 qui utilise le gène de dihydrofolate réductase d'E. coli (DHFR) comme marqueur sélectionnable conférant une résistance au méthotrexate. On utilise la PCR pour amplifier le promoteur 35S (environ 800 pb), l'intron b provenant du gène Adh1 du mais (environ 550 ph ; cf Dennis et al., Nucleic Acid Res. 12:3983-400 (1984)) et 18 pb de la séquence de tête non tradu dihydrofolate réductase d'E. coli en utilisant une PCR et on assemble ces deux fragments PCR avec un fragment Saci-Psti de pB1221 (Clontech) qui comprend l'ossature du vecteur pUC19 et le terminateur de nopaline synthétase. L'assemblage de ces fragments engendre pSOG19 qui contient le promoteur 35S en fusion avec la séquence d'intron 6, la séquence de tête GUS, le gène DHFR et le terminateur de nopaline synthétase. Le remplacement de la séquence de tête GUS dans pSOG19 avec la séquence de tête du virus de la tache chlorotique du maïs (MCMV) produit le vecteur pSOG35. pSOG19 et pSOG35 portent le gène pUC de la résistance à l'ampicilline et ont des sites HindIII, SphI, Psti et EcoRI disponibles pour le clonage de séquences étrangères. L'ADN recombinant décrit ci-dessus peut être introduit dans la cellule végétale selon un certain nombre de manières reconnues des spécialistes. Ces spécialistes apprécieront que le choix du procédé peut dépendre du type de plante ciblée pour la transformation. Les procédés appropriés de transformation des cellules végétales comprennent la micro-injection (Crossway et al., Bio Techniques 4:320- 334 (1986)), l'élécroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986), la transformation se faisant par la relation d'Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6:915921 (1988) ; voir également, Ishida et ai., Nature Biotechnology 14:745-750 (juin 1996) pour la transformation du mois, le transfert direct de gène (Paszokowski et al., EMBO J., 3:2717-2722 (1984) Hayashimote et ai., Plant Physiol. 93:857-863 (1990) (riz)), et l'accélération de particules balistiques utilisant des dispositifs commercialisés par Agracetus Inc., Madison, Wisconsin et Dupent, Inc., Wilmington, Delaware (voir par exemple Sanford et al., brevet américain N 4 945 050 ; et McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). Cf également, Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Partlculate Science and Technology 5:27-37 91987) (oignon) ; Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 8526-8530 (1990)(chloroplaste du tabac) ; Christou et al., Plant Physiol. 87 : 671674 (1988) (soja) ; Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (maïs) Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (maïs) ; Klein et al., Plant Physiol. 91 :440-444 (1988) (maïs) ; Fromm et al., Bio/Technology 8 :833-839 (1990) ; et Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 : 603-618 (1990) (maïs) ; Koziel et al. Biotechnology 11 : 194-200 (1993) (maïs) ; Shimamoto et al., Nature 338 :274-277 (1989) (riz) ; Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991) (riz) ; Datta et al., Bio/Technology 8 : 736-740 (1990) (riz) ; demande de brevet européen-A-332 581 (dactyle pelotonné et autres Pooideae), Vasil et ai., Biotechnology il 1553-1558 (1993) (blé) ; teeks et al., Plant Physiol. 102 : 1077-1084 (1993) (blé) ; Wan et al., Plant Physiol. 104 : 37-48 (1994) (orge) ; Jahne et ai., theor. Appl. Genet. 89 : 525-533 (1994) (orge) ; Umbect: et al., Bio/Technology 5 : 263-266 (1987) (coton) Casas et ai., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 90 : 11212- 11216 (déc. 1993) (sorgho) ; Somers et al., Bio/Technology 10 : 1589-1594 (déc. 1992) (avoine) Torbert et al., Plant Cell Reports 14 : 635-640 (1995)(avoine) ; Weeks et al., Plant Physiol. 102 1077-1084 (1993) (blé) ; Chang et al., WO 94/13822 (blé) et Nehra et al., The Plant Journal 5 : 285-297 (1994) (blé) L'invention a pour objet des procédés selon l'invention, dans lesquels ladite plante est transformée en utilisant une technique choisie dans le groupe constitué par le bombardement de particules, l'électroporation et le traitement au polyéthylène glycol. Un ensemble de modes de réalisation particulièrement préférés pour l'introduction des molécules d'ADN recombinantes dans le maïs par bombardement de microprojectiles se trouve dans Koziel et al., Biotechnology ll : 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85 : 119-123 (1995) et Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792 : 164-171 (1996). Un autre mode de réalisation préféré est le procédé de transformation d'un protoplaste pour le maïs tel que décrit dans Shillito et al., EP-A-292 435. On peut procéder à la transformation de plantes avec une seule espèce d'ADN ou des espèces d'ADN multiples, c'est-à-dire une cotransformation, et ces deux techniques conviennent pour utilisation avec la séquence de codage de la peroxydase. On fait appel à des procédés utilisant soit une forme de transfert direct de gène, une technique de canon à particules ou un transfert se faisant par la médiation d'Agrobacterium de manière habituelle, mais non nécessaire, avec un marqueur sélectionnable ou criblable qui fournit une résistance à un antibiotique (par exemple kanamycine, hygromycine ou méthotrexate) ou un herbicide (par exemple phosphinothricine) . Comme exemples de tels marqueurs on peut citer la néomycine phosphotransférase, 1 'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphinothricine acétyltransférase, l'acide 2,2-dichloropropionique déshalogénase, l'acétohydroxyacide synthétase, la 5énolpyruvyl-shikimate phosphate synthétase, 1 'haloaryl- nitrilase, l'acétylcoenzyme A carboxylase, la dihydroptéroate synthétase, la chloroamphénicol acétyl transférase, et la ss-glucuronidase. Cependant, le choix de marqueurs sélectionnables ou criblables pour la transformation des plantes n'est pas critique pour l'invention. La séquence de codage de la peroxydase est de préférence utilisée seule ou en combinaison. Autrement dit, on peut insérer une ou plusieurs séquences de codage de peroxydase dans une plante pour combattre différents insectes parasites. On peut le faire en (1) transformant une plante hôte avec une séquence d'ADN comprenant plus d'une séquence de codage de peroxydase, (2) transformant une plante hôte avec une séquence d'ADN comprenant une seule séquence de codage de peroxydase et en identifiant les insertions multiples de la séquence d'ADN dans le génome hôte, ou (3) en transformant de façon répétée une plante hôte avec une séquence de codage de peroxydase jusqu'à ce que la plante hôte comprenne le nombre désiré de séquences de codage de peroxydase. On peut également accroître le niveau de protection d'une plante contre les insectes, contre un insecte donné et/ou son spectre d'activité insecticide en combinant une séquence de codage de peroxydase avec d'autres séquences de codage codant pour des protéines capables de lutter contre les insectes. Bacillus thuringiensis (Bt) est une astérie sporulante gram-positive qui produit un cristal parasporal au cours de la sporulation. Oc en trouvera un examen dans Koziel et al., Biotech. aid Gen. Engin. Reviews 11:171-228 (1993)). Ces cristaux sont contitués de manière prédominante d'une ou plusieurs protéines, appelées o-endotoxines ou protéines cristal insecticides, connues pour posséder une activité insecticide lorsqu'elles sont ingérées par certains insectes. On connaît à l'heure actuelle de nombreuses souches de Bt. Chaque souche produit des nombres différents de #-endotoxines ayant diverses activité insecticides. Comme exemples d'endotoxines Bt que l'on peut utiliser en combinaison avec les peroxydases on peut citer, sans s'y restreindre, CryIA(b) (Koziel et al., Bio/Technology il : 194-200 (1993)), CryA(c) (brevet américain N 5 530 197), CrylH (également appelée Cry9C) (Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 : 80-86 (1996) ) et CryIIIR (Adang et al., Plant Mol. Biol. 21 : 1131-1145 (1993) Les protéines pesticides produites au cours de la croissance végétative de souches de Bacillus (protéines insecticides végétatives, PIV) peuvent également être utilisées en combinaison avec les peroxydases. On trouvera des exemples de PIV dans Warren et al., WO 94/21795 ; Warren et al., WO 96/10083 ; et Estruch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 5389-5394 (1996) Comme exemples d'autres protéines avec des composés insecticides qui peuvent être utilisés en combinaison avec les peroxydases on peut cuiter, sans s'y limiter, les cholestérols oxydases (brevet américain ri 5 518 908), les inhibiteurs de protéase, les lectines et les &alpha;-amylases. On peut préparer des monocotes exprimant plus d'une séquence de codage de la résistance aux insectes, par n ' importe quel procédé connu des spécialistes. Ainsi, on peut utiliser la séquence de codage de a peroxydase pour transformer une monocote en même temps qu'un autre gène principal d' insecte (cotransrormaticn) , le second gène principal d'insecte peut être introduit dans une plante qui a déjà été transformée avec une séquence de codage de peroxydase, ou vice versa, ou encore des plantes transgéniques, l'une exprimant une séquence de codage de peroxydase et l 'autre exprimant un second gène principal d'insecte peuvent être réticulées pour amener les séquences de codage ensemble dans la même plante. L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans les exemples, les procédés de préparation, de manipulation, et d'analyse des acides nucléiques sont réalisés par des modes opératoires de référence tels que décrits dans Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Nanual, 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1988). EXEMPLES Exemple 1 : Plants de maïs transgéniques comprenant une séquence de codage de peroxydase Construction du vecteur pPOD3.5 (Lagrimini et al., Proc. Natl. Acad. Scí. 84: 438-442 (1987)) contient l'ADNc de peroxydase anionique du tabac à 1256 pb qui comprend toute la séquence de codage de la peroxydase, y compris un signal peptide à 22 acides aminés qui facilite la sécrétion dans l'espace de la paroi cellulaire. On digère pPOD3.5 avec BamHI et on le clone dans les sites BamHI de pCIB710 (Rothstein et al., Gene 53 : 153-161 (1987)). On digère ce nouveau produit d'assemblage avec EcoRI et on le sous-clone dans Bluescript SK+ (Catalogue Straragene, 1994) - on met le produit d'assemblage résultant désigné par pJIS20293 figure 1) en dépôt à l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Autorité internationale de dépôt, 1818 N. University Street, Peoria IL 61604 U.S.A. le 27 septembre 1996 sous le N NRRL B-21626. pJS20293 contient le clone d'ADNc de peroxydase à 1200 pb derrière le promoteur CaMV 35S et l'intron rétréci (Werr et al., E.BO J. t: 1373-1380 (1935)) suivi par le terminateur CaMV 35S dans un plasmide Blue Script (Stratagene) (figure 1). On cotransforme pJS20293 avec pUBI/Ac (figure 2), plasmide contenant un gène bar chimérique codant pour la résistance à la phosphinothricine. Transformation utilisant des embryons zygotiques immatures Dans deux expériences séparées, on excise de façon aseptique 600 embryons immatures de CG00526, type Lancaster sélectionné en consanguinité, 12-13 jours après pollinisation à partir des épis cultivés en serre et stérilisés à leur surface. On dépose en plaques des embryons d'une taille de 1,5 à 20 mm avec le scutellum côté haut sur un milieu d'initiation de cal, 2DG4 + 5 mg/litre de chloramben. Le milieu 2DG4 est le milieu "D" de Duncan (Duncan et al., Planta 165:322-332 (1985)) modifié pour contenir 20 mg/litre de glucose. On précipite 1'ADN de pJS20293 sur 1 mm de microsupport tel que décrit par le manuel Biolistic de Dupent. On prépare le mélange ADN/or de manière à ce qu'il fournisse environ 1 mg d'ADN de pJS20293 par bombardement. Pour la transformation de l'embryon immature, on utilise 6,34 mg de pJS20293 + 7,21 mg de pUBI/Ac pour 50 ml de microsupport. On alêne a 85 ml les deux préparations avec de l'méthanol et on seiche 10 ml de chacune sur des microsupports. Quatre heures avant le bombardement, on transfère les embryons sur 12DG4 + 5 mg/litre de chloramben pour le e traitement osmotique. On bombarde 38 embryons sur une lame en utilisant le dispcsitif Biolisics PDS1000He selon les instructions du fabricant (Dupont). On dispose les embryons sur la lame cible autour d'un cercle de 2 cm de diamètre au centre de la lame avec les extrémités coléorhi zales du scutellum toutes orientées dans la même direction. On dispose alors les lames cibles selon un angle de 30 vers le haut, de manière que les extrémités coléorhizales soient touchées les premières par le bombardement de particules. On utilise un écran standard de 24 x 24 mm fourni par le fabricant Biolistic avec des disques de rupture d'une valeur de 10850 kPa pour les bombardements. Trois heures après le bombardement, on renvoie les embryons dans des milieux 2DG4 + 5 mg/litre de chloramben puis on les cultive dans l'obscurité à 25 C. Quatorze jours après le bombardement, on transfère les réponses embryogéniques à des milieux d'entretien de cal 2DM4 + 0,5 mg/litre d'acide 2,4dichlorophénoxyacétique (2,4-D). Le milieu M4 est le même que G4 moins les acides casamino. Ce milieu contient 5 mg/litre de Basta et on augmente graduellement jusqu'à 20 mg/litre. On amorce la régénération au bout de 12 semaines sur une sélection Basta. On sous-cultive le cal de type I sur un milieu de Murashige et Skoog, Physioloçia Plantarum 15 : 473-497 (1962)) modifie contenant 3 de saccharose, 0,25 mg/litre de 2,4-D, 5 mg/litre de benzyliminopurine et 5 mg/litre dc Basta et on cultive sous 16 heures de lumière (50 mE/m-2/s-l) , 8 heures d'obscurité, 25 C. Deux semaines plus tard, on transfère le tissu sur un milieu MS contenant 3 do saccharose et 5 mg/litre de BastaR. On cultive les plantes régénérées sur milieu MS modifié pour contenir ld moitié de la concentration de sels et 3 de saccharose dans des récipients GA7. Transformation utilisant le cal embryogénique type I Pour la transformation du maïs utilisant le cal embryogénique type I, on obtient le cal aurpès d'embryons zygotiques immatures en utilisant des techniques de culture de référence. Pour la fourniture du gène, on prépare environ 300 mg du cal de type I soit en réduisant en morceaux avec une lame de scalpel, soit en effectuant une sous-culture 3-5 jours avant la fourniture du gène. Avant la fourniture du gène, on place le cal préparé sur un milieu de culture semisolide contenant encore 12% de saccharose. Au bout d'environ 4 heures, on bombarde le tissu avec pJS20293 en utilisant le dispositif PDS-1000/Biolistic He de BioRad. On précipite 2 mg de pJS20293 sur 1 mm de particules d'or en utilisant essentiellement le protocole standard de Biorad. Environ 16 heures après fourniture du gène, on transfère le cal sur un milieu de culture standard contenant 2Ó de saccharose et 1 mg/litre de phosphinothricine. On sous-cultive le cal sur une sélection pendant 8 semaines, après quoi on transfère le cal qui survit et qui croît sur un milieu de régénération standard pour la production de plantes. On dose la résistance des plantes régénérées au pyrale du maïs d'Europe. On obtient des plants résistants. On utilise les plants transgéniques résultantes dans un schéma de sélection de plantes classiques pour produire un plus grand nombre de plantes transgéniques ayant des propriétés insecticices similaires. On croise également les plantes transgéniques avec d'autres variétés cie la même plante. Les plantes transgéniques produisent également des semences qui contlennent le géne d la peroxydase chimérique inséré de façon stable dans leur génome. On identifie par analyse de bavardage Southern des plants de maïs transgéniques contenant la séquence de cocuage de la peroxydase. Lorsqu'on digère i'AD. génique des plantes transgéniques avec l'enzyme de restriction EcoRI, on peut détecter une bande d'environ 1,3 Kb en utilisant le gène de la peroxydase comme sonde spécifique signalant la présence d'un gène de peroxydase intact. On identifie également par analyse de buvardage northern le maïs transgénique exprimant la séquence de codage de la peroxydase. On observe une bande d'une taille d'environ 1,2 Kb dans la tache de l'ARN lorsqu'on hybride avec une sonde spécifique de la peroxydase. Bio-essai sur les insectes On évalue à l'origine l'activité insecticide d'un total de 46 plants de maïs transgéniques contre Ostrinia nubilalis (ECB). On réalise ce premier groupe de bio-essais en appliquant 10 larves d'ECB de premier instar à des morceaux de feuilles qui ont été mis dans une boîte de Petri Gelman avec un tampon de filtre humidifié afin d'empêcher la dessication des morceaux de feuilles. On laisse les larves se nourrir sans les perturber pendant 2 jours. Deux plantes du phénomène 554 sont positives dans le bio-essai préliminaire. Ces deux échantillons de plantes ne présentent pas ce signe d'alimentation des insectes, et les larves sont mortes. Le reste des plantes de ce phénomono et citautres phénomènes présentent des insectes qui se nourrissent de façon saine. Cette activité étant notée, on réalise des répétitions supplémentaires dans le blo-essal ra suivant. On procède a quatre répétitions avec cinq larves par répétition. On prend la lecture dc pourcentage de mortalité au bout do deux jours. Etant donné que les plantes semblent toujours contenir une activité insecticide, on décide de les tester à nouveau contre d'autres insectes cibles. On dose l'activité insecticide de plants de maïs transgéniques exprimant l'enzyme peroxydase au moyen de bio-essais d'insectes. Le procédé est semblable à celui utilisé pour n'importe quel plant de maïs transformé avec n'importe quel gène insecticide, mais il est décrit ici en utilisant comme exemple une séquence de codage de peroxydase. On découpe des sections de 1 à 4 cm à partir d'une feuille étendue d'un plant de maïs transformé. On met chaque morceau de feuille sur un disque filtre humidifié dans une boîte de Petri de 50 x 9 mm. On place sur chaque morceau de feuille chaque larve nouvelle née de l'insecticide (pyrale du maïs d'Europe, chenille de la leucanie, ver de l'épi de maïs, chenille de la betterave et noctuelle noire) Etant donné qu'on échantillonne chaque plante de multiples fois, ceci fait un total de 5 à 20 larves par plante. On fait incuber les boîtes de Petri à 300C et on évalue les dommages sur l'alimentation en feuilles et les données de mortalité au bout de 24, 48 et 72 heures. Les données de toxicité sont présentées au tableau I. Tableau I : Valeurs de mortalité de différents insectes lorsqu'on les expose à des feuilles de maïs exprimant enzyme peroxydase 554-1 554-3 Ostrinia nubilalis (ECB) 100'-5 100 Spodoptera frugiperda (FAW) 15% 15%* Spodoptera exigua (BAW) 06 5@, Heliothis zea (CEW) 1004 100@ Agrotis ipsilon (BCW) Oz O 0- * Ces feuilles ont un fort effet anorexigène contre la chenille de la leucanie. Descendants transgéniques On soumet à des essais aux champs des plants de maïs transgénique provenant des phénomènes N" 554 et 755 (dont on a montré qu'ils possèdent des propriétés insecticides contre la pyrale du maïs d'Europe dans des bio-essais in vitro) . Lorsque les plantes aux champs atteignent environ 40 cm de hauteur des feuilles étendues, on commence l'infestation avec les larves ECB. On dépose environ 300 larves nouvelles nées mélangées avec du gruau d'épi de maïs dans le verticille de chaque plante. On poursuit les infestations sur une base hebdomadaire pendant 4 semaines pour simuler la pyrale du maïs de première génération (ECB1) . En commençant deux semaines après l'infestation initiale, on évalue chaque plante semaine après semaine, et on note une évaluation du dommage moyen par ECB1 (voir tableaux II et III). Lorsque les plants de maïs atteignent l'anthèse, on applique chaque semaine 300 larves nouvelles nées par plante pendant 4 semaines pour simuler l'infestation de seconde génération (ECB2). Au bout de 50 jours après le début de l'infestation simulée par ECB2, on divise les tiges, on mesure les dommages causés au canal (voir tableaux 2 et 3). Les conditions expérimentales sont données plus en détail par Koziel et al., Bio/Technology il : 194200 (1993). Tableau II Croisements de plantes Evaluation des Dommage dùs à ECB2 Plante N0 dommages aux Longueur du canal2 (cm) feuilles par ECB1 (CG00526 x 554-3)5 self Plante N 10 1 58 Plante N 15 1 15 Plante N 22 1 8 (CG00526 x 554-3)6 self Plante N 4 1 0 Plante N 5 2 5 Plante N 9 1 7 Plante N 14 2 5 Plante N 19 1 Plante N 20 1 3 Plante N025 1 0 Plante N 28 1 9 Plante N 29 1 7 Plante N 32 1 0 Nombre de cas positifs 13 évalués Total canal 121 Moyenne 9,3 Ecart-type 15 (CG00526 non transformé) 1 lantes mortes, detruites par ECB 2 Plantes mortes, detruites par ECB 3 Plantes mortes, detruites par ECB Nombre de cas négatifs 3 évalués Canal total Moyenne Ecart-type Les évaluations des dommages aux feuilles sont faites comme suit 1. Pas d'atteinte visible aux feuilles 2. Traces d'atteinte fine en "carreau de fenêtre" uniquement sur les feuilles non enroulées là où les larves additionnées de gruau d'épi de maïs tombent dans le verticille. Pas de pénétration des feuilles en trou d'épingle. 3. Trace de fins dommages en "carreaux de fenêtre" sur deux feuilles non recourbées là où les larves tombent dans le verticille avec du gruau d'épi de maïs. Pas de pénétration en trou d'épingle des feuilles. 4. Trace d'atteinte d'absorption en trou d'épingle ou en trou de balle de fusil pénétrant sur deux ou plusieurs feuilles qui émergent du verticille (toute lésion de moins de 6,35 mm de longueur). 5. Lésions allongées et/ou absorption à la nervure médiane évidente sur plus de trois feuilles qui émergent du verticille. Lésions de moins de 25,4 mm de longeur. 6. Plusieurs feuilles avec lésions allongées (19, 05 mm à 38,10 mm de longueur) et/ou pas plus d'une feuille avec nervure médiane brisée. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur au moins la moitié des feuilles et/ou deux ou trois feuilles avec nervures médianes brisées. 8. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur environ deux tiers des feuilles et/ou plus de trois feuilles avec nervures médianes brisées. 9. La plupart des feuilles portent des lésions longues. Plusieurs feuilles présentent des nervures moyennes brisées. Possibilité de plantes rabougries due à une absorption par ECB. 2 On mesure l'étendue des dommages internes par ECB dans le canal dans une section de 92 cm de tige, 46 cm au-dessus et en-dessous du premier noeud d'épi sur des plantes transgéniques et des plantes témoin. Le dommage maximum que l'on peut évaler est de 92 cm. Les plantes témoins sont complètement détruites vers la fin de l'expérience, et par conséquent aucune mesure n'est possible. Tableau III Croisements de plantes Evaluation des Dommage dûs à ECB2 Plante N dommages aux Longueur du canal' (cm) feuilles par ECB1 (CG00714 x 755 9)Ségrégants positifs Plante N 6 3 15 Plante N 12 3 31 Plante N 16 3 19 Plante N 20 4 Plante N 24 3 Plante N 25 1 26 (CG00714 x 755 9) Ségrégants négatifs Plante N 7 7 plante morte Plante N 8 plante morte plante morte Plante N 9 7 plante morte Plante N 10 7 plante morte Plante N 11 9 plante morte Nombre de cas positifs évalués 6 Canal total 133 Moyenne 22,17 Ecart-type 5,91 Nombre de cas négatifs 5 évalués Canal total Moyenne Ecart-type Les évaluations des dommages aux feuilles sont faites comme il est dit pour le tableau II 1. Pas d'atteinte visible aux feuilles 2. Trace de fins dommages en "carreaux de fenêtre" uniquement sur les feuilles non recourbées là où des larves additionnées de gruau d'épi de maïs tombent dans le verticille. Pas de pénétration de la feuille en trou d'épingle. 3. Trace de fins dommages en "carreaux de fenêtre" sur deux feuilles non recourbées là où des feuilles additionnées de gruau d'épi de maïs tombent dans le verticille. Pas de pénétration en trou d'épingle de la feuille. 4. Trace d'atteintes par absorption en trou d'épingle ou en trou de balle de fusil pénétrant sur deux ou plusieurs feuilles qui émergent du verticille (toute lésion de moins de 6,35 cm de longueur) 5. Lésions allongées et/ou absorption à la nervure médiane évidente sur plus de trois feuilles qui émergent du verticille. Lésions de moins de 25,4 mm de longeur. 6. Plusieurs feuilles présentent des lésions allongées (19,05 mm à 38,10 mm de longueur) et/ou pas plus d'une feuille avec nervure médiane brisée. Longues lésions (plus de 25,4 mm) commune sur environ la moitié des feuilles et/ou deux ou trois feuilles avec nervures médianes brisées. 8. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur environ deux tiers des feuilles et/ou plus de trois feuilles avec nervures médianes brisées. 9. La plupart des feuilles portent des lésions longues. Plusieurs feuilles présentent des nervures moyennes brisées. Possibilité de plantes rabougries due à une absorption par ECB. 2 On mesure sur des plantes transgéniques et des plantes témoins l'étendue des dommages internes au canal par ECB dans une section de 92 cm de tige, 46 cm au-dessus et en-dessous du premier noeud d'épi. Le dommage maximum que l'on peut évaler est de 92 cm. Les plantes témoins sont complètement détruites vers la fin de l'expérience, et par conséquent aucune mesure n'est possible. Exemple 2 : Plants de blé transgéniques comprenant une séquence de codage de peroxydase On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer blé en utilisant les procédés de Chang et ai., WO 94/13822, Weeks et al., Plant. Physiol. 102:1077-1084 (1993) ou Nehra et al., The Plant Journal 5(2):285-297 (1994). On expose brièvement la transformation du blé en utilisant un procédé Chang et al., WO 94/13822 comme suit (d'autres procédés exposés dans Chang et al. peuvent également être utilisés) Préparation d'un cal de blé, génotype UC703 On cultive des plants de blé de génotype UC703 jusqu'à floraison et on effectue une autopollinisation. On retire des plantes des épis contenant des embryons contenant de 1 à 2,5 mm de longueur et on les stérilise avec une solution de Ciorox à 10) pendant 10 minutes. On retire les embryons des graines immatures et on les met avec l'axe de l'embryon vers le bas dans un milieu de Murashige et Soog contenant 5 ou 10 mg par litre de 2,4-D, 13, V? p/v de maltose, 100 mg/litre de proline et 100 mg/litre de myoinositol solidifié avec de la phytogélose à 0,V-0,8 v/v ou de la gelrite à 0,10,2(milieu d'initiation). Au bout de trois semaines de culture dans l'obscurité à 27"C, on reconnaît un cal préféré par la présence d'embryons somatiques globulaires bien formés (cal de type M) se développant sur le scutellum de certains explants. On retire ces cals et on les met soit sur du milieu MS contenant de 1,0 à 5,0 mg/litre de 2,4-D et du saccharose à 2-3, soit sur un milieu contenant un niveau réduit (5'A) de maltose avant de les mettre sur le milieu de saccharose. On sous-cultive alors la matière chaque semaine sur du milieu MS frais contenant du saccharose à 39. Préparation cellulaire pour bombardement On donne aux cellules pour bombardement un traitement de plasmolyse avant et après le bombardement. On mesure le volume cellulaire empilé et on dilue les cellules dans un milieu liquide MS avec addition d'osmoticum : sorbitol 0,4 M pour les cellules en suspension et sorbitol 0,6 M pour les cellules de cal. Les cellules sont diluées de manière que le volume final empilé par cible est de un trentième de ml pour une suspension fine et de 1/10ème de ml pour un cal. On met les cellules diluées dans un ballon de 250 ml contenant une barre d'agitation et on agite pendant un minimum de 30 minutes, jusqu'à quelques heures. Pour déposer les cellules en lames, on retire 2 ml du ballon et on les met avec une pipette au sommet d'un ballon vide sur lequel on place un filtre Whatman GFA de 2,5 cm. On applique un vide jusqu'à ce que les cellules soient séchées sur le filtre. On place les filtres sur des boites de Petri de 60 x 15 mm contenant 5 ml de milieu de plasmolyse post-bombardement solide, qui est du 1 MS contenant du sorbitol 0,2 M pour les cellules en suspension ou du sorbitol 0,4 M pour les cellules de cal. On met deux filtres sur chaque boite. Vecteurs utilisés pour le bombardement On peut utiliser les vecteurs suivants dans lesquels on insère une cassette d'expression contenant de la peroxydase pour le bombardement des particules (outre la cotransformation de pJS20293 (figure 1) et de pUBIAc (figure 2) en utilisant des quantités égales d'ADN) : pSOG30 est un vecteur d'expression de bglucuronidase (Gus) dérivé du plasmide pBI121, commercialisé par Clontech Laboratories, Palo Alto, Californie. On amplifie l'intron 6 du gène Adhl de maïs par PCR à partir du plasmide pB428, décrit dans Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:41254128 (1987) et on le ligature dans le site BamHI de pBI121, qui est entre le promoteur CaMV 35S et le gène Gus. On insère une séquence de tête du virus des taches chlorotiques du maïs (MCMV) de 17 pb, décrit dans Lommel et ai., Virology 181:382-385 (1995), dans la séquence de tête non traduite du gène 35S-Gus. La fusion génique finale contient la structure : promoteur 35S-intron 6 d'Adh séquence de tête de MCMV-Gus- terminateur Nos, tous dans l'ossature du vecteur pUC19. pSOG35 est un vecteur d'expression de dihydrofolate réductase (dhrf) . On obtient ce produit d'assemblage en fusionnant le promoteur 35S, l'intron 6 d'Adh 1 et la séquence de tête de MCMV décrite ci-dessus au gène dhfr du plasmide pHCO, décrite dans Bourouis et al., E1rIBO J. 2:1099-1104 (1983) . La fusion génique finale contient la structure : 35S-intron 6 d'Adh séquence de tête de MCMV-dhfr-terminateur Mos, tous dans l'ossature du vecteur pUCi9. pTG48 comprend le gène Gus sous la commande du promoteur ant43D spécifique de l'anthère et un gène dhfr dans une ossature de pUC19. C'est le résultat de la combinaison de 4 fragments d'ADN différents. On obtient le fragment 1 à partir de pSOG35 après coupure par restriction avec HindIII et EcoRI. On adapte l'extrémité EcoRI du fragment isolé contenant le gène dhfr à une extrémité de restriction SalI. Le fragment 2 consiste en un promoteur ant43D spécifique de l'anthère isolé à partir du plasmide pCIB 3178 après coupure par resctriction avec HindIII et XbaI. Le plasmide pCIB 3178 est décrit en détail dans EP-578 611, dont les parties pertinentes sont ici incorporées à titre de référence et qui a été déposé sous le numéro d'accès NRRL B-18978. On obtient le fragment 3 à partir du plasmide pSOG30 après coupure par restriction avec XbaI et EcoRI, et il contient le gène Gus, et le fragment 4 correspond au vecteur pUC19 du commerce coupé avec SalI et EcoRI. Préparation des particules On lave des particules d'or (1,0 micron ; de BioRad) par addition de façon aliquote dans un tube de microcentrifugation, en ajoutant environ 1 ml d'éthanol à 1002r, en centrifugeant, en décantant, en enlevant le surnageant, et en répétant deux fois l'eau stérile. Après le lavage final, on enlève autant d'eau que possible et on ajoute une solution de polylysine (polylysine à 0,02% + acétate d'ammonium 15 rnM) pour immerger complètement les particules. On centrifuge les particules, on les décante, et on enlève le surnageant. On laisse les particules séchées pendant la nuit dans une hotte à écoulement laminaire ou pendant 30 minutes sous un courant d'azote doux. Pour une "pleine" préparation de particules, on pèse 10 mg de particules et on les met dans un tube de microcentrifugation stérile contenant une barre d'agitation. On ajoute 100 ml (1 mg/ml) de chaque ADN (ou encore 50 ml (1 mg/ml) de chaque ADN) puis on centrifuge. Ensuite on ajoute 10 ml de NaHPO. 100 mM, puis on centrifuge. On ajoute 10 ml de CaCl2 100 nM, puis on centrifuge. Enfin on ajoute 380 ml d'éthanol à 1003, puis on centrifuge. Tout en agitant vigoureusement la suspension, on en prélève 3 ml qu'on jette avec une pipette sur des feuilles de matière plastique (projectiles). On laisse sécher les particules sur les feuilles pendant au moins 15 minutes avant le bombardement. Bombardement des cultures cellulaires On renverse la boîte de Petri contenant les filtres cellulaires sur la plate-forme située au sommet de la platine, et centrée sur l'ouverture de la rampe des particules. Le couvercle clair est placé au sommet de la plate-forme. Un microprojectile est placé sur la goupille de culasse et la culasse fermée. On appuie sur le bouton "armer" pour remplir le réservoir avec la quantité appropriée de gaz hélium (généralement 1260013300 kPa). On fait un vide sur la chambre à environ 27 mm. Après qu'on ait arrêté de faire le vide, on appuie sur les bontons "armer" et "déclencher". On met alors le bouton "armer" sur la position "arrêt". Chaque filtre fait généralement l'objet de deux tirs. Culture après bombardement et sélection Après bombardement, on maintient les cellules dans l'obscurité pendant la nuit. Le jour suivant on enlève les filtres du milieu de plasmolyse et on les met sur un milieu 1 MS. On applique une sélection i à 10 jours après le bombardement pour les cellules en suspens ion et au bout de 14 jours pour les cellules de cal. On gratte les cellules de filtre et on les étend à la surface de lames contenant 1 MS + 2 litre de méthotrexate (ou d'un agent de sélection approprié). On fait incuber les lames dans l'obscurité pendant plusieurs semaines. On transfère les colonies résistantes qui apparaissent au bout de quelques semaines sur 1 MS + 4 mg/litre de méthotrexate (ou milieu de sélection approprié). On transfère alors les colonies qui continuent à proliférer pendant environ 3 semaines sur un milieu de maintien "0,5 Ms" qui est une solution aqueuse de sels de MS, de vitamines, de fer, de saccharose à 3t, de gélose à 0,7U, et de 0,5 mg/litre de 2,4-D. On sous-cultive le tissu sur ce milieu deux fois par semaine jusqu'à ce que des structures embryogènes apparaissent ou que le tissu semble approprié à la régénération. Régénération On transfère le tissu sur le milieu MS contenant soit 3 mg/litre de BAP, soit 1 mg/litre de N.9A + 5 mg/litre de GA, et on déplace les lames à la lumière. Au bout de 2 à 4 semaines, on transfère le tissu sur milieu MS sans hormones. Les pousses qui apparaissent sont mises dans des récipients avec soit du milieu MS sans hormone, soit du milieu MS avec 0,5 mg/litre de NkA. Lorsqu'une croissance suffisante des racines et des pousses s est produite, on transfère les plantules dans le sol et on les met dans un phytotron. Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993) On expose la transformation du blé avec le procédé de Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993), brièvement comme suit : on cultive des plants de blé (Triticum aestivum L.) et on excise des embryons immatures de 0,5 à 1 mm de longueur à partir de plantes cultivées en serre (10-18 jours après l'anthèse, selon le moment de l'année) et on les met, côté scutellum exposé, sur des milieux d'entretien de cal contenant 1,5 mg/litre de 2,4-D. Cinq jours après l'amorçage dans une culture tissulaire, le tissu proliférant du cal est visible aux bords des embryons. A ce stade, on bombarde les embryons avec des particules d'or revêtues de 7 mg de pJS20293 et 7 mg de pUBIAc. *Bombardement de particules Avant le bombardement, on revêt des particules d'or de 1 mm avec de l'ADN de pJS20293 et pUBIAc par le procédé de Daines, Biolistic Systems Newsletter 1: 1-4 (1990). On met en suspension une suspension de réserve de particules d'or (BioRad) à raison de 60 mg/ml dans l'éthanol absolu. On verse de façon aliquote 35 ul de la suspension dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, on les lave dans de l'eau distillée stérile et on les remet en suspens ion dans 25 ml de Tris-EDTA contenant 25 mg d'ADN de plasmide superenroulé. On ajoute les solutions suivantes, dans l'ordre : 220 ml d'eau stérile, 250 ml de CaCi 2,5 M, et 50 ml de spermidine 0, 5 M (base libre). On agite les tubes de microcentrifugation avec un mélangeur vortex à 4"C pendant 10 minutes et on centrifuge à 16 000 g pendant 5 minutes. On enlève le surnageant et on lave le précipité avec 600 ml d'éthanol. On remet en suspension les précipités d'or revêtus d'ADN dans 36 ml d'éthanol. Pour le bombardement, on met 10 mi de la suspens ion d'ADN-or dans le centre d'un macroprojectile (également connu sous le nom de feuille support). On met environ 25 embryons au centre d'une boite de Petri de 15 x 100 mm contenant un milieu d'entretien de cal solidifié avec du Phytagel à 0,35,. Au bout de 5 jours de culture, on bombarde les cals dérivés de l'embryon sous vide avec des particules d'or revêtues de pJS20293, en utilisant le système d'administration Biolistic DuPont à vecteur hélium et les composants jetables fournis par BioRad. La distance entre la plaque d'arrêt et la cible est de 13 cm, et la résistance du disque à la rupture est de 7700 kPa. Immédiatement après le bombardement, on transfère les cals à des milieux de sélections MS contenant la quantité appropriée d'agents de sélection telle qu'un spécialiste peut la déterminer. Régénération des plants de blé Pour la régénération, on transfère les cals embryogéniques à un milieu MS contenant 0,5 mg/litre de dicamba comme il est dit par Hunsinger et Schautz, Plant Breeding 98:119-123 (1987). On transfère les pousses dérivées de cals dans des tubes à essais pour culture en Pyrex contenant des milieux d'enracinement composés de MS à demi-concentration sans hormone. Aux fins de sélection après bombardement, on complémente les milieux gélosés à chaque étape avec la quantité appropriée d'agent de sélection comme peuvent le déterminer les spécialistes. On transfère les plantules de milieux d'enracinement à des pots de mélange de sol et on les acclimate à une plus faible humidité à 21"C dans une chambre environnementale. Au bout de deux semaines, on transfère les plantes en serre. Ces régénérants transgéniques primaires sont appelés plantes T,. Analyse des plantes transgéniques On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence do codage de la peroxydase et de 1'ARN, respectivement. On évalue l'activité insecticide de plants de blé dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de la peroxydase au moyen d'une analyse Southern, contre Pseudaletia unipunctata, chenille Spodoptera frugiperda, chenille de la leucanie Elasmopalpus lignosellus, petite pyrale de la tige de maïs ; Agrotis orthogonia, noctuelle pâle de l'ouest des Etats-Unis ; Oulema melanopus, altise des céréales ; Hypera punctata, charançon des feuilles de trèfle; Diabrotica undecimpunctata howardi, ver de la racine du maïs du sud des Etats-Unis, puceron du blé de Russie Schizaphis graminum, punaise verte ; Macrosiphum avenae, puceron des graines d'Angleterre; Melanoplus femurrubrum, criquet à pattes rouges Mel ; Melanoplus differentialis, criquet différencié ; Melanoplus sanguinipes, criquet migratoire ; Mayetiola destructor, mouche de Hesse ; Sitodiplosis mosellana, moucheron du blé ; Meropyza americana, ver des tiges de blé Hylemya coarctata, mouche grise du blé ; Frankieniella fusca, thrips du tabac ; Cephus cinctus, tenthrède des tiges de blé ; ou Aceria tulipae, mite enroulée du blé en utilisant des techniques bien connues des spécialistes. On soumet à des essais aux champs les plants de blé transgéniques ayant des propriétés insecticides. Exemple 3 : Plants de sorgho transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer du sorgho en utilisant le procédé de Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216 (décembre 1993) tel que décrit brièvement comme suit. Bombardement de microprojectiles On conduit des expériences avec le système Biolistics PDS 1000/He (Sanford et ai., Technique J. Methods Cell Mol. Biol. 3:3-16 (1991) en utilisant des microprojectiles de tungstène (M-25, 1,7 mm de diamètre, DuPont N 75056) ou d'or (1,5-3,0 mm de diamètre, Aldrich N 37 658-5) . On revêt les particules d'or (3 mg) ou de tungstène (0,75 mg) préalablement lavées dans l'éthanol dans une suspension aqueuse (50 ml) avec 5-10 ml d'ADN plasmidique, comme il est dit par le fabricant (BioRad). On détermine expérimentalement les pressions de bombardement et les distances à partir de la lame de lancement. On bombarde des embryons zygotes immatures, à raison de 10 à 5 par boîte de Petri en matière plastique (15 x 60 mm) pendant 24 à 72 heures après culture sur le milieu. On transfère les embryons des papiers filtres (4,5 cm de diamètre) qui sont préhumidifiés mais non saturés en milieu liquide. Les papiers filtres fonctionnent pour absorber l'eau à partir de la surface des embryons et on laisse les embryons pendant 2 à 3 heures sur les papiers avant le bombardement. Immédiatement après le bombardement, on enlève des papiers les embryons immatures, et on les transfère sur un milieu semi-solide. Régénération des plants transgéniques et évaluation de leur résistance aux insectes Les procédés de sélection et d'entretien des tissus embryogéniques et pour la formation des pousses et des racines à partir de structures organisées sont tels que décrits (Cai & Butler, Plant Cell Tissue Organ Cul t., 20 :101-110 (1990) . On utilise l'agent de sélection approprié connu des spécialistes. On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de peroxydase et de l'ARN, respectivement. On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon De Block et al., EMBO J. 6:2513-2518 (1987). On évalue l'activité insecticide de plants de sorgho dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de la peroxydase par une analyse Southern, en les essayant contre Chilo partellus, la pyrale du sorgho ; Spodoptera frugiperda ; la chenille de la leucanie ; Helicoverpa zea, le ver de l'épi de maïs Elasmopalpus lignosellus, petite pyrale de la tige de maïs ; Feltia subterranea, noctuelle granulée Pyllophaga cri ni ta, ver blanc ; Eleodes, Conoderus et Aeolus spp., les vers fil-de-fer ; Oulema melanopus, l'altiste des céréales ; Chaetoctnema pulicaria, l'altise du maïs ; Sphenophorus maidis, le charançon du maïs ; Rhopalosiphum maidis, le puceron des feuilles de maïs ; Anuraphis maidiradicis, le puceron des racines de maïs ; Blissus leucopterus leucopterus, le "chinch bug" ; Contarinia sorghicola, le moucheron du sorgho ; Tetranychus cinnabarinus, l'araignée rouge ou Tetranychus urticae, l'araignée à deux taches, en utilisant des techniques bien connues des spécialistes. On soumet à des essais aux champs les plants de sorgho transgéniques ayant des propriétés insecticides. Exemple 4 : Plants de riz transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer du riz en utilisant les procédés de Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989) (riz) Christou et al., Biotechnology 9:957-962 (1991) ; Datta et ai., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (riz) et/ou Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857-863 (1990)(riz) On exposera brièvement comme suit la transformation du riz utilisant le procédé de Christou et al., Biotechnology 9:957-962 (1991) Préparation de l'ADN On prépare des particules d'or revêtues d'ADN en mélangeant des particules d'or (10 mg) avec une solution de 1'ADN (20 mg) dans 100 ml de tampon (chlorure de sodium 150 mNl, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) et on centrifuge doucement pendant 5 à 10 secondes. On ajoute de la spermidine (100 ml d'une solution 0,1M) et 100 ml d'une solution de PEG à 25% (PM 1300-1600) tout en centrifugeant, puis on ajoute goutte à goutte 100 ml de chlorure de calcium (2,5 M). On laisse reposer le mélange à la température ambiante, puis on le fait passer dans une microcentrifugeuse. On enlève le surnageant et on remet en suspension l'or précipité avec le complexe d'ADN dans 10 ml d'éthanol à 100. On dépose alors la suspension résultante sur une feuille support de 18 mm x 18 mm à raison de 163 ml par feuille support, soit un taux calculé de 0,05 mg/cm2. Isolement d'embryons immatures et préparation pour le bombardement de particules On récolte des embryons immatures de riz âgés de 12 à 15 jours à partir de panicules dilatés et on stérilise avec de l'hypochlorite de sodium à 2 pendant 5 minutes. On les rince ensuite de façon répétée avec de l'eau stérile et on enlève les glumes sous un mircoscope à dissection. On prélève alors les embryons de manière aseptique et on les dépose sur une lame de gélose aqueuse, le côté faisant face à l'axe étant en contact avec le milieu. Bombardement de particules On charge la feuille support portant les perles sur l'accélérateur de particules, qui utilise la décharge d'un capaciteur haute tension par l'intermédiaire d'une petite gouttelette d'eau comme force motrice. On place un écran de retenue de 0,149 mm entre la feuille et le tissu cible suspendu au-dessus de la machine. On fait alors le vide dans l'assemblage jusqu'à 500 mm de mercure pour réduire la résistance aérodynamique. On décharge de 10 à 16 Kv d'un capaciteur de 2 mF à travers une gouttelette d'eau de 10 ml dans la chambre d'expansion. On souffle ainsi la feuille contre l'écran de retenue, permettant aux particules d'or de continuer sur leurs lancée jusqu'à toucher le tissu cible suspendu au-dessus de l'écran. Les embryons immatures ciblés sont positionnés sur une plaque de gélose aqueuse de manière que, lorsque la plaque est insérée au-dessus de l'écran, la région scutellaire des embryons soit dans le trajet direct des particules accélérées. Régénération des plantes Après le bombardement particulaire, on dépose les embryons en plaques sur des milieux MS et CC additionnés de 2,4-D à raison de 0,5 ou 2 mg/litre et on recueille le cal embryogénique et les plantules comme il dit (Hartke, S. et Lara, H., Genet & Breed. 43: 205-214 (1989) ; Datta, S.K; et al., Plant Sci. 67:85-88 (1990)). Récupération du cal embryogénique transformé et des plantes On recuille le cal transformé et les plantes dans des conditions tant sélectives que non sélectives. Dans de expériences dans lesquelles la sélection est incorporée dans le protocole de transformation/régénération, on emploie la quantité appropriée d'agent de sélection connue par les spécialistes. On soumet les transformants putatifs ainsi analysés à une analyse moléculaire et génétique pour confirmer l'intégration stable et le caractère hérité du gène introduit. Analyse des plantes transgéniques On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant des techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de la peroxydase et de 1'ARN, respectivement. On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518 (1987). On évalue dans des plants de riz dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de peroxydase par une analyse Southern, l'activité insecticide contre Diatraea saccharalis, chenille mineuse de la canne à sucre ; Spodoptera frugiperda, chenille de la leucanie; Helicoverpa zea, ver de l'épi de mais ; Colaspis brunnea, colaspis du raisin ; Lissorhoptrus oryzophilus, charançon d'eau du riz Si ; Sitophilus oryzae, charançon du riz ; Nephrotettix nigropictus, criquet du riz ; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug" ; ou Acrosternum hilare, punaise puante verte, en utilisant des procédés bien connus des spécialistes. Exemple 5 : Plantes d'avoine transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer de l'avoine en utilisant les procédés de Somers et al., Bio/Technology 10:1589-1594 (décembre 1992) (avoine) et/ou Torbert et al., Plant Cell Reports 14:635-640 (1995)(avoine). On exposera brièvement la transformation de l'avoine en utilisant le procédé de Somers et ai. Bio/Technology 10:1589-1594 (décembre 1992) comme suit. Cultures cellulaires On utilise des embryons immatures de lignées d'avoine dérivés de GAF-30/Park pour amorcer un cal (Rines, H.W. & Luke, H.H., Theor. Appl. Genet 71:16-21 (1985)). On sélectionne à l'oeil nu des lignées de cals embryogéniques friables (Bregitzer, P. et al., Crop. Sci 29:798-803 (1989)) et on en effectue une sousculture toutes les deux semaines sur des milieux MS2D solidifiés avec du Gelrite à 0,2 contenant du sel MS (Murashige, T. & Skoog, F., Physiol. Plant 15:473-497 (1962)) avec 150 mg/litre d'asparagine, 0,5 mg/litre de chlorhydrate de thiamine, 20 g de saccharose et 2,0 mg/litre de 2,4-D à pH 5,8. On amorce des cultures le haut et vers le bas et on charge 1 ml de la suspension de particules d'ADN sur le macrosupport du système de fourniture de particules. Fourniture de l'ADN On rince trois fois des cellules de culture en suspension avec du milieu MS2D dépourvu d'asparagine avant le bombardement. Trois à cinq jours après la sous-culture, on recueille les cellules de culture en suspension par filtration sous vide sur un tampon support MF Millipore AP 10 de 4,7 cm de diamètre (Millipore Corp.) pour former une couche mince régulièrement répartie de cellules de cultures tissulaire d'un poids frais d'environ 0,5 g. On transfère alors les tampons portant les cellules dans des boites de Petri de 60 x 20 mm. Pour le bombardement du cal, on répartit également un cal embryogénique friable agé de deux semaines (0,5 g) sur les tampons supports Millipore préhumidifiés avec 2 ml de milieu MS2D moins l'asparagine dans des boîtes de Petri de 60 x 20 mm. On positionne les boîtes de Petri contenant des échantillons en suspens ion ou dans un cal (Gordon Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)) à une distance de 5 cm de la lame d'arrêt et on bombarde ave le système de fourniture de particules Biolistic PDS1000 (poudre à canon)(DuPont Co.). Sélection des transformants Après bombardement, on enlève les cellules par lavage de chaque tampon support Millipore avec 5 ml de milieu liquide MS2D dépourvu d'asparagine dans une boîte de Petri de 60 x 20 mm, que l'on scelle avec une pellicule de paraffine que l'on fait incuber entre 21 et 23"C dans l'obscurité. Au bout de 5 jours d'incubation en milieu liquide, on dépose les cellules bombardées en une mince couche sur des disques de papier filtre Whatman N01 de 7,0 cm de diamètre surmontant un milieu de sélection MS2D solidifié avec de la Gelrite, dépourvu d'asparagine et contenant 3 mg/litre de phosphinothricine (PPT) (Crescent Chemical Co. Inc). Les cellules provenant d'un bombardement sont typiquement réparties sur deux ou plusieurs papiers filtres selon la densité des cellules. On transfère les papiers filtres revêtus de cellules dans un milieu de sélection frais à des intervalles de 2 à 3 semaines. Les colonies résistant au PPT commencent à apparaitre 7 à 8 semaines après le bombardement et on les souscultive directement sur milieu de sélection frais sans papier filtre toutes les deux à trois semaines par la suite. Régénération des plantes On met les cultures tissulaires résistant à PPT sur un milieu de régénération des plants d'avoine N + B (Brgitzer, P., et al., Crop Sci 29:798-803 (1989)) (sels MS (Murashige, T. & Skoog, F., Physiol. Plant 15:473497 (1962)), 2 mg/litre d'acide naphtalène acétique, 0,2 mg/litre de benzylaminopurine) contenant 3 mg/litre de PPT. Au bout de 2 à 6 semaines, on enlève les pousses du cal et on les transfère sur milieu MS sans hormone mais contenant 3 mg/litre de PPT pour la formation des racines. On transfère les plants enracinés dans un mélange de sol d'enrobage et on les cultive jusqu'à maturité dans des chambres de croissance. Analyse des plantes transgéniques On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de la peroxydase et de 1'ARN, respectivement. On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518 (1987). On évalue, en utilisant des procédés bien connus des spécialistes, l'activité insecticide de plants d'avoine dont on montre par une analyse Southern qu'ils contiennent la séquence de codage de peroxydase. Exemple 6 : Plants d'orge transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer de l'orge en utilisant les procédés de Wan et al., Plant Physiol. 104:37-48 (1994) et/ou Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533 (1994). On procède en bref à la transformation de l'orge en utilisant le procédé de Wan et ai., Plant Physiol. 104:37-48 (1994) de la façon suivante Matériaux végétaux On cultive des plants du cultivar de printemps d'orge (Hordeum vulgare L.) Golden Promise dans des chambres de croissance avec une période de 16 heures de lumière/8 heures d'obscurité à 12"C et à 60 à 80? d'humidité (Hunter, C.P., Plant Regeneration from Micropores of Barley, Hordeum vulgare, thèse de PhD, Wye College, Université de Londres, Ashford, Kent (1988)). Les niveaux lumineux à hauteur de tête sont d'environ 350 à 400 mE. On fait germer des graines d'un cultivar d'hiver, Igri dans le sol de la chambre de croissance dans les mêmes conditions. Lorsqu'ils ont environ 17 cm de hauteur, on vernalise les plantes de semis pendant 8 semaines sous une période de 10 heures de lumière (10-15 mE)/14 heures d'obscurité à 4"C (Hunter , C.P., Plant Regeneration from Microspores of Barley, Hordeum vulgare, thèse de PhD, ;Jye Collège, Université de Londres, Ashford, Kent (1988)) . Après vernalisation, on les cultive sous le meme régime que les plants Golden Promise. On fertilise tous les plants avec Osmocote (Sierra, 17-6-12 plus des quantités mineures d'autres matières) au moment de l'implantation puis deux fois par semaine avec du Verdi à 0,023 (Peter's, 20-20-20) Embryons immatures et cal dérivé d'embryons immatures On stérilise la surface d'épis de cultivars Golden Promise avec des embryons immatures d'une taille d'environ 1,5 à 2,5 mm dans une lessive à 20R (v/v) (hypochlorite de sodium à 5/25O) pendant 5 minutes, on rince brièvement trois fois, et on lave pendant 5 minutes avec de l'eau stérile. On dissèque les embryons immatures à partir de jeunes caryopses et on les laisse intacts ou on les coupe en deux dans le sens de la longueur. Pour l'induction du cal en vue du bombardement, on place les embryons (intacts ou coupés en deux) côté scutellum vers le bas sur le milieu d'induction de cal, qui est le milieu de Murashige et Skoog (Murashige, T. & Skoog, F., Physiol. Plant 15: 473-497 (1962)) additionné de 30 g/l de maltose, 1,0 mh/l de chlorhydrate de thiamine, 0,25 g/l de myoinositol, 1,0 g/l d'hydrolysat de caséine, 0,69 g/l de Pro, et 2,5 mg/l de dicamba, on solidifie avec 3,5 g/l de gelrite (Scott, Carson, CA) ou de Phytagel (Sigma). On fait incuber les embryons à 25"C dans l'obscurité, et on sélectionne le cal embryogénique pour le bombardement au bout de 2 semaines. Culture d'anthère et embryons dérivés de microspores (EDM) On recueille des épis, enveloppés par les feuilles du "drapeau", à partir de cultivars de plantes Igri lorsque les microspores sont au stade uninucléé médian jusqu'aux stades binucléés précoces et on stérilise brièvement la surface avec de l'méthanol à 70'S. On dissèque les anthères d'épillets et on place 60 anthères dans chaque boîte de Petri (35 x 10 mm) avec 3 ml de mannitol 0,3 M. On scelle les boîtes de Petri avec une pellicule de paraffine et on fait incuber à 25"C dans l'obscurité pendant 3 ou 4 jours. On transfère ensuite les anthères dans des boîtes de Petri avec 3 ml de milieu FHG liquide de Hunter (milieu de Murashige et Skoog modifié à teneur faible en NHNO3 et élevée en Gln; Kasha, K., et al., "Haploids in Cereal Improvement: Anther and Microspore Culture", J.P. Gustafson, dir. Publ., Gene Manipulation in Plant improvement II, Plenum Press, NY (1990), pp. 213-235, sans Ficoll-400 et on complète avec 1 mg/l d'IER et 0,2 mg/l de kinétine (appelé FHG') et on fait incuber comme il est dit. Les EDM sont visibles au bout d'environ 2 ou 3 semaines et sont utilisés pour le bombardement au bout d'environ 4 semaines. Préparation des lames de bombardement et bombardement par microprojectiles Un jour avant le bombardement, on coupe en deux dans le sens de la longueur des EI (1,5-2,5 mm) provenant de jeunes caryopses de cultivars Golden Promise et on les met dans trois orientations différentes (côté scutellum vers le haut, côté scutellum vers le bas, ou surface découpée vers le haut) sur un milieu d'induction de cal au centre de boîtes de Petri (100 x 15 mm). Pour le bombardement du cal, on découpe environ 0,5 g de cal embryogénique, provenant d'EI cultivés, en petits morceaux (environ 2 mm) et on les met au centre d'une boîte de Petri (100 x 15 mm) contenant un milieu d'induction de cal. On recueille les EDM à partir de lames de culture d'anthères en utilisant une pipette Pasteur et on répartit de façon régulière dans des boîtes de Petri (100 x 15 mm) sur un morceau de papier filtre Whatman N"3 de 5 cm porté par deux filtres de 7 cm. Avant bombardement, on retire des filtres l'excès de milieu. On adsorbe de 1'ADN plasmidique sur des particules d'or (1,0 mm, Dupont, Wilmington, Delaware, Etats-Unis) comme il a été dit plus haut (Daines, R.J., Biolistic Particle Delivery Systems Newsletter 1:1,4 (1990)). Lorsqu'on utilise deux plasmides, on mélange des quantités égales (en mg) d'ADN des deux plasmides. On bombarde une fois tous les matériaux cibles, en utilisant un système de délivrance Dupont PDS 1000 He Biolistic. On positionne les matériaux cibles à environ 13 cm en-dessous de la lame d'arrêt des microprojectiles; on utilise des disques à rupture à 7700 kPa. Transformants de sélection EI et cals Un jour après bombardement, on transfère individuellement des semi-embryons et des morceaux de cals dans un milieu d'induction de cal avec 5 mg/litre de bialaphos; on cultive les semi-embryons côté scutellum vers le bas, quelle que soit leur orientation pendant le bombardement. Le tissu reste sur la première lame de sélection pendant environ 10 à 14 jours. Lors du transfert sur la seconde lame de sélection (5 mg/litre de bialaphos), on brise les divers embryons pour formation de cals ou les morceaux de cal en utilisant un forceps, pour obtenir plusieurs petits morceaux que l'on maintient séparés. Au cours des deux à trois passages de sélection ultérieurs (d'environ 10 à 20 jours chacun, avec 5 mg/litre de bialaphos) , on transfère plus tôt les morceaux de cal montrant des témoignages de croissance plus vigoureuse vers de nouvelles lames de sélection et on manipule le tissu de manière identique. Tout tissu de cal qui se développe originellement à partir de chaque morceau d'embryon ou de cal est définie comme une lignée. On entretient les lignées de cal résistant au bialaphos par une sousculture mensuelle sur milieu d'induction de cal avec 5 mg/litre de bialaphos. EDM Après bombardement, on ajoute plusieurs gouttes de milieu FHGf aux EDM. Au bout de 2 ou 3 jours, on transfère individuellement les embryons de plus de 1,5 mm sur un milieu d'induction de cal avec 3 ou 5 mg/litre de bialaphos. Les plus petits embryons restent sur les filtres et on les transfère dans le milieu de sélection lorsqu'ils ont environ 1,5 mm. On lave les papiers-filtre tous les 2 ou 3 jours par des additions et enlèvement répétés de milieu FHG liquide. Les EDM restent sur le premier milieu de sélection pendant 10 à 20 jours. On transfère les EDM montrant des signes de formation de cal dans des milieux de sélection frais avec 5 mg/litre de bialaphos. Au cours du transfert, on brise chaque EDM en quelques petits morceaux. La suite de la sélection est telle que décrite dans la section précédente. Régénération des plantes et application d'herbicide On régénère les plantes à partir de lignées de cals PAT-positives en transférant un cal embryogène dans un milieu FHG avec 1 mg/litre de bialaphos à 23"C ou 250C sous des lumières fluorescentes (45-55 mc, 16 h/jour). Au bout d'environ 2 semaines, on observe des plantules. On transfère les plantules vertes, d'environ 2 cm, dans des boîtes magenta contenant un milieu de croissance pour plantules (milieu d'induction de cal sans hormone) avec 1 mg/litre de bialaphos. Avant qu'elles ne croissent jusqu'au sommet de la boite, on transfère les plantules dans des pots de 15,24 cm contenant du Supersoil et on les met en serre (période lumineuse de 16 heures, à 18"C). Les régénérants croissent jusqu'à maturité et sont autopollinisés. Certaines des plantes sont testées pour leur réponse à Basta (200 g/ litre de PPT, Hoechst AG, Francfort, Allemagne) par pulvérisation avec une solution à 0,5'; additionnée de Tween 20 à 0,1%. On régénère également les plantes à partir d'un cal de type sauvage sur le milieu sans bialaphos. Analyse des plantes transgéniques On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de la peroxydase et de 1'ARN respectivement. On évalue, sur des plants d'orge dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de la peroxydase au moyen d'une analyse Southern, l'activité insecticide contre Ostrinia nubilalis, la pyrale du maïs d'Europe, Agrotis ipsilon, la noctuelle ypsilon Echizaphis graminum, la punaise verte ; Blissus leucopterus leucopterus, le "chinch bug" ; Acrosternum hilare, la punaise verte puante ; Suschistus servos, punaise brune puante ; Hylemya platura, le ver des grains de mals ; Mayetiola destructor ; la mouche de Hesse; Thrysanoptera, le thrips ; ou Petrobia latens, l'acarien brun du blé en utilisant des procédés bien connus des spécialistes. Toutes les publications mentionnées ci-dessus sont ici incorporées dans leur totalité à titre de référence. Bien que l'invention ait été décrite avec un certain détail dans des buts de clarté et de compréhension, les spécialistes apprécieront à la lecture de sa description que l'on peut procéder à diverses modifications de forme et de détail sans s'écarter de la véritable portée de l'invention et des revendications jointes. Les souches telles que déposées, en particulier la souche NRRL B-21626 de l'exemple 1, ne devront être accessibles qu'à un expert, conformément aux dispositions de la loi sur les brevets. REVENDICATIONS 1. Procédé de lutte contre les insectes dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules de plantes monocotylédones transgéniques, lesdites cellules végétales comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit procédé comprend la transformation d'une plante monocotylédone avec une séquence d'ADN comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase. 3. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite séquence d'ADN comprend un promoteur lié de manière opératoire à ladite séquence de codage. 4. Procédé de la revendication 3, dans lequel ladite séquence d'ADN comprend un gène chimérique comprenant un promoteur lié de manière opératoire à ladite séquence de codage. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite peroxydase est une peroxydase anionique. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdites cellules comprennent une partie d'une plante fertile transgénique. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite plante est choisie dans le groupe constitué par le blé, le riz, l'avoine, l'orge, le sorgho et maïs. 8. Procédé de la revendication 7, dans lequel ladite plante est un plant de maïs. 9. Procédé de la revendication 8, dans lequel ledit plant de maïs provient d'une lignée de mais sélectionnée dans le groupe constitué par CG00526, CG00615, et CG00714. 10. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite plante est transformée en utilisant une technique choisie dans le groupe constitué par le bombardement de particules, I'élect roporation et et le traitement au polyéthylène glycol. 11. Procédé de la revendication 1 dans lequel ladite séquence d'ADN comprend en outre un gène marqueur sélectionnable ou criblable. 12. Procédé de la revendication 11, dans lequel ledit gène marqueur code pour une enzyme choisie dans le groupe constitué par la néomycine phosphotransférase, l'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphinothricine acétyltransférase, l'acide 2,2-dichloropropionique déshalogénase, l'acètohydroxy acide synthétase, la 5énolpyruvylshikimate phosphate synthétase, l'haloarylnitrilase, l'acétyl-coenzyme A carboxylase, la dihydropteroate synthétase, la chiorophénicol acétyl transférase, et la Q-glucuronidase. 13. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit insecte provient d'un ordre choisi dans le groupe consitué par les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères, les mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les dermaptères, les isoptères, les anoploures, les siphonaptères et les trichoptères. 14. Procédé de la revendication 13, dans lequel ledit insecte est choisi dans le groupe constitué par la pyrale du mais d'Europe, la pyrale de la tige de maïs, la noctuelle ypsilon, le ver de l'épi de maïs, la chenille de la leucanie, la pyrale du maïs du sud-ouest des Etats-Unis, la petite pyrale des tiges de rnaïs, la chenille mineuse de la canne à sucre, le ver des racines de maïs de l'ouest des Etats-Ur.is, le ver des racines du maïs du nord des Etats-Unis, le ver des racines de maïs du sud des Etats-Unis, les vers fil-defer, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis, le hanneton masqué du sud des Etats-Unis, le hanneton du Japon, l'altise du maïs, le charançon du maïs, le puceron des feuilles de maïs, le puceron des racines de maïs, le "chinch bug", le criquet à pattes rouges, le criquet migratoire, le ver des graines de maïs, les teignes des taches de maïs, le thrips de l'herbe, la fourmi voleuse et l'araignée à deux taches. 15. Plante monocotylédone fertile transgénique comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, dans laquelle l'expression de la peroxydase confère à ladite plante monocotylédone un trait phénotytique. 16. Plante de la revendication 15, dans laquelle ledit trait phénotypique est choisi dans le groupe constitué par la résistance aux insectes et une capacitéaccrueàluter. 17. Plante de la revendication 16, dans laquelle ledit trait phénotypique est la résistance aux insectes. 18. Plante de la revendication 15, dans laquelle ladite séquence de codage de peroxydase est un gêne de peroxydase anionique. 19. Plante de la revendication 15, où ladite plante est choisie dans le groupe constitué par le blé, le riz, l'avoine ,l'orge, le sorgho et le maïs. 20. Plante de la revendication 19, où ladite plante est un plant de maïs. 21. Plante de la revendication 20, où ledit plant de maïs provient d'une lignée de maïs choisie dans le groupe constitué par CG00526, CG00615, et CG00714. 22. Plante de la revendication 15, où ladite séquence d'ADN comporte en outre un gène marqueur sélectionnable ou criblable. 23. Plante de la revendication 22, dans laquelle ledit gène marqueur code pour une enzyme choisie dans le groupe constitué par la néomycine phosphotransférase, l'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphonothricine acétyltransférase, l'acide 2,2-dichloropropionique déshalogénase, l'acétohydroxy acide synthétase, la 5énolpyruvylshikimate phosphate synthétase, l'haloarylnitrilase, i 'acétyl-coenzyme A carboxylase, la dihydroptéroate synthétase, la chlorophénicol acétyl transférase, et la B-glucuronidase. 24. Cellule, tissu ou semence ou graine de plante transgénique, obtenue à partir de la plante selon la revendication 15. 25. Descendant transgénique de la plante selon la revendication 15. 26. Cellule, tissu ou graine de plante transgénique obtenue à partir du descendant selon la revendication 25. 27. Utilisation d'un ADN recombinant codant pour la peroxydase dans le but de conférer une résistance aux insectes aux cellules de plantes monocotylédones. 28. Utilisation d'une plante comprenant un ADN recombinant codant pour la peroxydase pour lutter contre les dommages aux plantes provoqués par l'attaque des insectes. 29. Procédé agricole faisant appel à un matériau végétal transgénique ou à des plantes comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, dans lequel l'expression de la peroxydase confère à ladite plante monocotylédone un trait phénotypique.