FR 2745083 A1 19970822 FR 9601874 A 19960215 L'invention a pour objet un procédé pour une détermination qualitative et/ou quantitative d'un ou plusieurs analytes éventuellement présents dans un échantillon. Par "analyte", on entend toute substance que l'on souhaite analyser telle que notamment des composés chimiques ou biologiques, ainsi que des micro-organismes et en particulier des bactéries, des levures, des moisissures et des algues unicellulaires. I1 est fréquent de devoir procéder à des déterminations qualitatives et/ou quantitatives d'analytes ou substances à analyser, dans un échantillon. Par échantillon", on entend toute substance susceptible de contenir l'analyte recherché, cette substance pouvant être notamment sous la forme d'une solution, suspension, émulsion, dispersion ou gel. Ces échantillons peuvent être par exemple des produits alimentaires, des fluides biologiques, de l'eau, des produits cosmétiques ou dermatologiques tels que des crèmes, des shampooings, des laits, des lotions, des mascaras, des vernis à ongles, des exfoliants, des masques, etc. Or, chaque technique de détermination, qualitative ou quantitative, quel que soit le type d'analyte considéré, ne peut généralement être mise en oeuvre que dans un intervalle limité de concentrations de l'analyte. Bien entendu, la concentration en analyte présent dans les échantillons que l'on souhaite analyser n'est pas toujours incluse dans l'intervalle de concentrations dans lequel la technique de détermination que l'on désire utiliser peut être appliquée de façon fiable. Ainsi, il est fréquemment nécessaire de diluer l'échantillon à tester afin de réduire sa concentration en analyte, ce que l'on réalise généralement en plusieurs étapes successives. Cette dilution doit permettre d'obtenir un échantillon représentatif de l'échantillon de départ. De plus, si l'échantillon contient plusieurs analytes, il faut réduire la concentration de chaque analyte proportionnellement au facteur de dilution appliqué, et bien entendu maintenir sensiblement constantes les proportions relatives des analytes présents dans l'échantillon de départ. Dans ce but, les dilutions étaient jusqu'à présent réalisées de la façon suivante - introduction d'une quantité déterminée de l'échantillon de départ dans un conteneur, - introduction d'une quantité déterminée de liquide de dilution, - homogénéisation, - prélèvement d'une quantité déterminée de l'échantillon dilué et introduction dans un nouveau conteneur, et ainsi de suite dans le but d'obtenir une ou plusieurs autres dilutions, dont l'une au moins permet la mise en oeuvre de l'analyse que l'on souhaite réaliser. I1 convient en outre, parmi les différentes dilutions ainsi obtenues, de prélever au moins une fraction d'au moins l'une d'entre elles afin de procéder à la détermination proprement dite. Bien entendu, les moyens de prélèvement utilisés à cet effet doivent permettre de réaliser le prélèvement sans introduire ni éliminer d'analyte(s) ni de milieu de dilution en une quantité telle que les proportions relatives en analyte(s) ou leur(s) concentration(s) soient modifiées. Par "moyens de prélèvement", on entend tout dispositif permettant de prélever une fraction du mélange tel que par exemple une pipette ou un système de vidange. Habituellement, on considère que lorsque l'on souhaite effectuer des prélèvements à partir de milieux de plus en plus concentrés, il est possible d'utiliser un même moyen de prélèvement sans nettoyage intermédiaire. En effet, la quantité résiduelle d'échantillon dans le moyen de prélèvement après le premier prélèvement, qui risque d'être introduite dans le milieu plus concentré, ou dans sa fraction prélevée, est faible par rapport à la quantité d'analyte présente dans ce milieu plus concentré, et peut donc être considérée comme négligeable. Par contre, lorsque l'on souhaite effectuer des prélèvements à partir de milieux de plus en plus dilués, on considère que l'utilisation d'un même moyen de prélèvement, sans nettoyage intermédiaire, introduirait dans le milieu plus dilué une quantité importante d'analyte par rapport à la quantité d'analyte initialement présente dans ce milieu plus dilué. Cette quantité introduite ne peut être considérée comme négligeable, et il est donc couramment admis chez les spécialistes que lorsque l'on souhaite effectuer des prélèvements dans des mélanges de plus en plus dilués, il convient de nettoyer le moyen de prélèvement après chaque prélèvement ou d'utiliser pour chaque prélèvement un moyen de prélèvement non contaminé. Ainsi, les prélèvements de fractions des différents milieux dilués obtenus par le procédé de dilution décrit précédemment, sont effectués selon l'un des deux modes de réalisation suivants. Selon le premier mode de réalisation, les prélèvements sont effectués en commençant par le milieu le plus dilué, puis en prélevant des fractions de milieux de plus en plus concentrés. Bien entendu, cela peut être effectué avec un même de moyen de prélèvement, comme expliqué précédemment. Ce premier mode de réalisation implique toutefois l'utilisation de nombreux conteneurs, de très nombreuses manipulations ainsi que le stockage d'au moins une fraction des milieux obtenus aux différents stades de dilution. Selon le second mode de réalisation, on effectue les prélèvements au fur et à mesure des dilutions et on utilise, à chaque prélèvement, un moyen de prélèvement non contaminé. Ce second mode de réalisation permet d'éviter le stockage des milieux obtenus aux différents stades de dilution, mais implique l'utilisation de nombreux moyens de prélèvement, ou le nettoyage du moyen de prélèvement à chaque utilisation. En outre, il implique également de très nombreuses manipulations ainsi que l'utilisation de nombreux conteneurs. Ainsi, le procédé connu présente donc d'importants inconvénients. En outre, un tel procédé est très difficilement automatisable. On a maintenant découvert que, de façon surprenante, il est possible de réaliser des dilutions successives dans un conteneur unique en n'introduisant qu'une erreur négligeable dans la détermination. Autrement dit, cette méthode conserve aux échantillons dilués la caractéristique d'être représentatifs, aux facteurs de dilution près, de l'échantillon initial, à condition bien entendu de n'opérer que sur des échantillons de viscosité suffisamment faible, car les produits trop visqueux, sont difficiles à homogénéiser et, ayant tendance à adhérer aux parois des conteneurs et moyens de prélèvements, risquent de conduire à des erreurs importantes. Naturellement, si l'échantillon à analyser est trop visqueux, il est d'abord dilué pour être facilement manipulable, comme on l'a toujours fait, par de simples manipulations de routine. La présente invention a donc pour objet un procédé pour une détermination qualitative et/ou quantitative d'un analyte présent dans un échantillon, dans lequel on réalise des dilutions successives dudit échantillon et on effectue une détermination sur au moins une partie desdites dilutions, caractérisé par le fait que l'on effectue lesdites dilutions successives dans un conteneur unique sans lavages, ni rinçages intermédiaires dudit conteneur. Par "détermination qualitative", on entend la recherche et/ou l'identification d'un ou plusieurs analytes éventuellement présents dans l'échantillon. Par "détermination quantitative", on entend l'évaluation de la concentration en analyte(s) présent(s) dans l'échantillon. La méthode d'analyse ainsi que les moyens d'analyse utilisés dépendent bien entendu du type de détermination souhaitée ainsi que de l'analyte recherché. Ainsi, par exemple, lorsque l'analyte recherché est un microorganisme, on peut procéder à un dénombrement par spectrophotométrie ou à l'oeil nu après culture d'un échantillon dilué sur un milieu et dans les conditions connues, ou encore par des immunoessais à l'aide d'anticorps appropriés. Lorsque l'analyte est un composé chimique, sa détermination peut être effectuée selon les méthodes connues de la chimie analytique. Selon un mode d'exécution particulier, le procédé défini précédemment comprend les étapes consistant à (a) obtenir dans ledit conteneur une solution ou dispersion d'un échantillon à analyser dans une quantité prédéterminée d'un liquide de dilution, ladite solution ou dispersion constituant un échantillon de départ, (b) prélever dans ledit conteneur une partie dudit échantillon de départ obtenu à l'issue de l'étape (a) et, éventuellement acheminer, à l'aide de moyens de transfert, au moins une partie de la quantité prélevée, vers des moyens d'analyse qualitative et/ou quantitative, (c) introduire dans ledit conteneur une quantité déterminée d'un liquide de dilution de façon à obtenir un échantillon plus dilué, et (d) recommencer à partir de l'étape (b) autant de fois que nécessaire en utilisant à chaque fois comme échantillon de départ, celui obtenu à l'issue de l'étape (c) immédiatement précédente, étant entendu que l'acheminement vers des moyens d'analyse, suivi de l'étape de détermination qualitative ou quantitative, est réalisé au moins une fois. Bien entendu, pour la dernière dilution que l'on réalise, il n'est pas nécessaire d'effectuer l'étape (c) après l'étape (b). En outre, il va de soi que l'étape (d) est réalisée au moins une fois. Le conteneur utilisé dans le procédé selon l'invention peut être réalisé en tout matériau approprié, généralement inerte vis-àvis de l'échantillon que l'on souhaite analyser ainsi que vis-à-vis de l'analyte. Parmi les matériaux constitutifs dudit conteneur, on peut notamment citer le verre, le téflon, l'acier ou l'inox. Le conteneur peut avoir toute forme appropriée, notamment la forme d'un erlenmeyer, d'un ballon, d'un tube, etc. La taille du conteneur est choisie en fonction des quantités que l'on souhaite traiter, qui peuvent varier par exemple de 0,1 à 100 ml. L'échantillon peut être dilué à l'aide d'un ou plusieurs liquides de dilution. Parmi les liquides de dilution pouvant être utilisés dans le procédé de l'invention, on peut notamment citer l'eau, les alcools, les mélanges hydroalcooliques, les huiles, les milieux de culture biologiques. Dans le cas d'une analyse bactériologique ou analogue, les liquides de dilution peuvent contenir des agents tels que par exemple des tensio-actifs, capables de neutraliser les agents conservateurs éventuellement présents dans l'échantillon à analyser. Dans ce cas, on peut n'utiliser l'agent neutralisant que pour la première dilution. Les liquides de dilution peuvent être introduits dans le conteneur à l'aide de différents moyens d'introduction tels qu'une pipette, un tube relié à une source de liquide de dilution, et éventuellement à une pompe, à une vanne et/ou à un robinet. Le conteneur peut être muni de moyens d'introduction d'un liquide de dilution, par exemple un tube. A la suite de l'introduction du liquide de dilution, on peut homogénéiser, de façon connue, l'échantillon dilué ainsi obtenu. Le prélèvement d'une partie dudit échantillon peut être réalisé à l'aide de différents moyens tels que par exemple une pipette, un tube relié éventuellement à un dispositif d'aspiration, ou un orifice d'évacuation situé à la base du conteneur. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, on prélève ladite partie dudit échantillon de départ à l'aide d'un moyen de prélèvement unique, sans lavages ni rinçages intermédiaires dudit moyen de prélèvement. On a en effet constaté qu'il n'est généralement pas nécessaire de nettoyer le moyen de prélèvement après chaque prélèvement, lors d'une même opération de dilutions en série. Selon un mode de réalisation particulier, le conteneur est muni de moyens de prélèvement. Ces moyens de prélèvement peuvent, en particulier, être un tube unique, de sorte que tous les échantillons sont prélevés par le même tube. Les moyens de prélèvement tels que définis précédemment peuvent servir aussi bien à transférer une fraction de l'échantillon vers les moyens d'analyse qu'à prélever une fraction de l'échantillon en vue de l'éliminer. En effet, afin d'éviter une augmentation très importante du volume de l'échantillon à chaque cycle de dilution, une partie de l'échantillon est généralement éliminée avant l'introduction d'un liquide de dilution pour l'obtention d'un échantillon plus dilué. Cette élimination peut être réalisée par prélèvement et évacuation d'une quantité déterminée de l'échantillon. Bien entendu, la quantité d'échantillon à éliminer à chaque cycle du procédé dépend de la taille du conteneur, de la quantité de l'échantillon de départ, de la quantité nécessaire pour la mise en oeuvre de la détermination et du facteur de dilution choisi pour chaque cycle du procédé. On appelle ici facteur de dilution, le nombre N (avec N supérieur à 1) par lequel est divisée la concentration en analyte lors de l'opération de dilution. Le procédé de l'invention fournit en particulier des résultats satisfaisants avec des facteurs de dilution, à chaque cycle, pouvant aller par exemple de 10 à 1000, et notamment de 10 à 500. Le facteur de dilution appliqué à chaque cycle est choisi en fonction de nombreux paramètres tels que notamment le facteur de dilution final recherché, la commodité de manipulation et le type d'analyse souhaité. Bien entendu, au cours de la mise en oeuvre du procédé, le facteur de dilution peut varier d'un cycle à l'autre. La mise en oeuvre du procédé tel que défini précédemment est particulièrement avantageuse, étant donné qu'elle permet l'utilisation d'un seul conteneur, et aussi d'un seul moyen d'introduction de liquide de dilution, d'un seul moyen de prélèvement permettant en outre le transfert de l'échantillon vers le dispositif d'analyse proprement dit et l'élimination d'une partie de l'échantillon, et cela quel que soit le nombre de dilutions effectuées. De plus, le procédé de l'invention réduit considérablement le nombre de manipulations à effectuer, par rapport aux procédés antérieurs, et rend inutiles d'éventuelles opérations de stockage d'échantillons dilués. La mise en oeuvre du procédé tel que défini précédemment est donc peu onéreuse, permet une exécution rapide, et peut être facilement automatisée. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXE3dPLES EXPIIPLP i : Dilutions successives au I/lOème Afin de montrer la validité du procédé selon l'invention, on introduit volontairement dans un lait démaquillant une quantité connue de bactéries Enterococcus faecalis. (a) Dans un tube à essais de 30 ml, on introduit 1 g de lait démaquillant préalablement contaminé puis 9 g de milieu de culture liquide commercialisé sous la dénomination "Eugon LT 100&commat;" par la Société bioMérieux, préalablement stérilisé. On homogénéise ensuite le mélange à l'aide d'un homogénéiseur de type "Vortex". (b) A l'aide d'une pipette, on prélève 9 g du mélange contenu dans le tube à essais dont on étale 0,1 g sur une boîte de Pétri contenant 18 ml d'un milieu de culture du type "Eugon LT 100&commat;" gélosé. (c) A l'aide d'une pipette, on introduit dans le tube à essais 9 g de milieu de culture liquide "Eugon LT 100&commat;" préalablement stérilisé puis on homogénéise le mélange à l'aide d'un homogénéiseur de type "Vortex". (d) On répète 2 fois ces opérations à partir de l'étape (b) pour obtenir une série de dilutions, la plus grande dilution correspondant à un facteur de dilution total de 104. Les boîtes de Pétri ensemencées avec les différentes dilutions prélevées sont placées dans une étuve à 35"C pendant 2 jours. Puis, on retire les boîtes de l'étuve, on compte les colonies d'Enterococcus faecalis qui se sont développées à la surface des milieux de culture, et à partir des résultats obtenus, on estime la concentration d'Enterococcus faecalis exprimée en cellules par gramme dans l'échantillon initial. Les résultats sont les suivants TABLEAU 1 : Facteur de Concentra- Estimation Nombre de Tube dilution tion du de la con- colonies centration théorique mélange initiale 1 1 Ind / 2 101 Ind / 3 102 1972 1,9.104 1,9.106 4 103 202 2.10 2.106 5 104 19 1,9.102 1,9.106 Inci = Indéterminé (les colonies sont confluentes) Concentration du mélange = nombre de colonies masse du mélange étalé sur boîte de Pétri Estimation de la concentration initiale = concentration du mélange dilué x facteur de dilution du mélange A titre de comparaison, on a effectué des déterminations analogues, mais en diluant la solution initiale selon la méthode conventionnelle consistant à effectuer les dilutions dans des conteneurs distincts. (i) On introduit dans un tube à essais stérile 1 g de lait démaquillant identique à celui utilisé précédemment, puis on ajoute 9 g de milieu de culture liquide "Eugon LT 1004D" préalablement stérilisé. (ii)Après homogénéisation, on prélève 1 g du mélange obtenu, à l'aide d'une pipette stérile, que l'on introduit dans un nouveau tube à essais stérile puis ajoute 9 g de milieu de culture liquide "Eugon LT 100#" préalablement stérilisé. On répète 2 fois les opérations de l'étape (ii) jusqu'à l'ob- tention de la solution diluée à un facteur total de 104. A l'aide d'une pipette stérile, on prélève 0,1 g de la solution contenue dans le tube contenant le mélange le plus dilué (10^) que l'on étale sur une boîte de Pétri contenant un milieu de culture de type "Eugon LT 100#" gélosé puis, on prélève avec la même pipette 0,1 g du mélange dilué à 10-3 que l'on étale également sur une boîte de Pétri. On répète ces opérations de prélèvement et d'étalement jusqu'au tube à essais contenant la solution initiale en prélevant, à l'aide de la même pipette, des fractions de mélanges de plus en plus concentrés. Les boîtes de Pétri ainsi ensemencées sont placées dans une étuve à 35"C pendant 2 jours, puis on compte le nombre de colonies qui se sont développées sur chaque boîte de Pétri. On estime alors à partir de chaque dénombrement, la concentration en cellules présentes dans la solution initiale. Les résultats obtenus sont les suivants TABLEAU 2 Facteur de Concentra- Estimation Nombre de Tube dilution tion du de la con- colonies centration théorique mélange initiale 1 1 Ind / 2 101 Ind / 3 102 2018 2.104 2.106 4 109 204 2.10 2.106 5 104 20 2.102 2.106 ~~~ = Indéterminé (les colonies sont confluentes) On constate que les résultats obtenus avec le procédé de l'invention sont analogues à ceux obtenus en mettant en oeuvre le procédé conventionnel. Le procédé de l'invention permet donc d'obtenir des résultats significatifs en limitant considérablement le nombre de manipulations nécessaires ainsi que la consommation de matériel. Ixni?u 2 : Dilutions successives au 1/100ème puis au 1/10""' Afin de montrer la validité du procédé selon l'invention, on introduit dans une solution pour la peau une quantité connue de spores de la moisissure appelée Aspergillus niger. (a) Dans un tube à essais de 30 ml, on introduit 0,1 g de la lotion pour la peau, préalablement contaminée, puis 9,9 g du milieu de culture liquide commercialisé sous la dénomination de Eugon LT 100 19" par la Société bioMérieux, préalablement stérilisé. On homogénéise ensuite le mélange à l'aide d'un homogénéiseur de type "Vortex". (b) On prélève alors 9,5 g du mélange contenu dans le tube à essais, à l'aide d'une pipette, dont on étale 0,1 g sur une boîte de Pétri contenant 18 ml d'un milieu de culture du type "Eugon LT 100&commat;" gélosé. (c) A l'aide d'une pipette, on introduit dans le tube à essais 4,5 g de milieu de culture liquide "Eugon LT 100&commat; préalablement stérilisé puis on homogénéise le mélange à l'aide d'un homogénéiseur de type "Vortex". (e) On prélève alors 4,5 g du mélange contenu dans le tube à essais, à l'aide d'une pipette dont on étale 0,1 g à la surface d'une boîte de Pétri contenant 18 ml de Eugon LT 100&commat;" gélosé. (f) A l'aide d'une pipette, on introduit dans le tube à essais 4,5 g de "Eugon LT 100&commat;" préalablement stérilisé puis on homogénéise à l'aide d'un homogénéiseur de type "Vortex". (g) A partir du mélange obtenu à chaque fois en (c') on répète deux fois la succession des opérations (b') et (c'). (h)A partir du mélange obtenu en (d), on répète l'étape (b'). Les cultures et les dénombrements sont effectués selon le même mode opératoire que décrit à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont les suivants TABLEAU 3 Facteur de Concentra- Estimation Nombre de Tube dilution colonies tion du de la con colonies centration théorique mélange initiale 1 1 Ind / 2 102 Ind / 3 103 Ind / 4 104 Ind / 5 105 75 7,5.102 7,5.10? 6 106 8 8.10' 8.107 Ind = indêtenrirné (les colonies sont confluentes) A titre de comparaison, on a effectué des déterminations analogues, mais en diluant la solution initiale successivement au 1/10 selon la méthode conventionnelle dans des conteneurs distincts. Les résultats obtenus sont les suivants TABLEAU 4 Facteur de Concentra- Estimation Nombre de Tube dilution tion du de la con- colonies centration théorique mélange initiale 1 1 Ind / 2 10 Ind / / 3 102 Ind / 4 103 Ind / 5 104 Ind / 6 105 82 8,2.102 8,2.107 7 106 9 9 9.10' 9.107 Ind = Indéterminé (les colonies sont confluentes) On constate que les résultats obtenus avec le procédé de l'invention sont sensiblement les mêmes que ceux obtenus par la mise en oeuvre du procédé conventionnel et permettent d'estimer de façon correcte la concentration initiale. REVENDICATIONS 1. Procédé pour une détermination qualitative et/ou quantitative d'un analyte présent dans un échantillon, dans lequel on réalise des dilutions successives dudit échantillon et on effectue une détermination sur au moins une partie desdites dilutions, caractérisé par le fait que l'on effectue lesdites dilutions successives dans un conteneur unique, sans lavages ni rinçages intermédiaires dudit conteneur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à (a) obtenir dans ledit conteneur une solution ou dispersion d'un échantillon à analyser dans une quantité prédéterminée d'un liquide de dilution, ladite solution ou dispersion constituant un échantillon de départ, (b) prélever dans ledit conteneur une partie dudit échantillon de départ obtenu à l'issue de l'étape (a) et, éventuellement acheminer, à l'aide de moyens de transfert, au moins une partie de la quantité prélevée, vers des moyens d'analyse qualitative et/ou quantitative, (c) introduire dans ledit conteneur une quantité déterminée d'un liquide de dilution de façon à obtenir un échantillon plus dilué, et (d) recommencer à partir de l'étape (b) autant de fois que nécessaire en utilisant à chaque fois comme échantillon de départ, celui obtenu à l'issue de l'étape (c) immédiatement précédente, étant entendu que l'acheminement vers des moyens d'analyse, suivi de l'étape de détermination qualitative ou quantitative, est réalisé au moins une fois. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on prélève ladite partie dudit échantillon de départ à l'aide d'un moyen de prélèvement unique, sans lavages ni rinçages intermédiaires dudit moyen de prélèvement. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit analyte est un microorganisme.