FR 2751512 A1 19980130 FR 9709409 A 19970724 - 1 - Domaine technique de l'invention L'invention a trait à un procédé de préparation d'un produit alimentaire contenant des AFP et à des produits alimentaires contenant des AFP. Arrière-plan de l'invention On a proposé des peptides anti-congélation (AFP) pour améliorer la tolérance des produits alimentaires envers la congélation. On a décrit dans la littérature des protéines anti- congélation, voir, par exemple, Marilyn Griffith et K. Vanya Ewart dans Biotechnology Advances, volume 13, n 3, pages 375 à 402, 1995. Les propriétés anti-congélation englobent en général une ou plusieurs des propriétés O5 suivantes: hystérésis thermique, inhibition de la recristallisation de la glace, régulation de la forme des cristaux de glace et interaction avec des agents de germination de glace. L'hystérésis thermique est la propriété la mieux connue des AFP et on utilise normalement cette propriété afin d'évaluer la présence des AFP. Une hystérésis thermique résulte d'un abaissement de la température de congélation apparente d'une solution contenant un AFP actif lors d'une hystérésis thermique sans affecter la -2- température de fusion. On décrit largement dans la littérature l'identification des sources de l'AFP au moyen d'essais d'hystérésis thermique, voir par exemple John G. Duman dans Cryobiology 30, pages 322 à 328 (1993). L'inhibition de la recristallisation de la glace est une autre propriété des AFP. On désigne également cette activité comme étant la suppression de la croissance de cristaux de glace. On peut évaluer cette propriété en comparant à un certain instant la taille des cristaux de glace en présence de AFP et en absence de AFP. On décrit dans le brevet US 5 118 792 (DNA Plant Technology Corporation) l'application de ce procédé dans l'évaluation des AFP de poisson. Une troisième propriété des AFP est leur capacité d'influencer la forme des cristaux de glace. Cette propriété provient de la fixation sélective des AFP à certaines faces du cristal de glace et de la limitation conséquente de la croissance cristalline dans certaines directions. On considère alors que la présence de cristaux de glace ayant une forme bipyramidale hexagonale indique la présence de AFP. On décrit par exemple ce procédé de l'évaluation de l'activité des AFP extracellulaires de seigles d'hiver dans WO 92/22581 (Université de Waterloo). Une quatrième propriété des AFP est leur capacité d'inhiber l'activité de substance de germination de glace. Cette interaction entre un AFP et un agent de germination de glace peut, par exemple, aboutir à une hystérésis thermique accrue. On évalue par exemple cette propriété dans WO 96/40973 (Université de Notre Dame du Lac). On a proposé les AFP pour l'amélioration de la tolérance des produits envers la congélation. On a proposé de nombreuses applications dans ce contexte. Par exemple, on a proposé les AFP pour améliorer la conservation par le froid de matières biologiques (WO -3- 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). De même, on a proposé les AFP pour empêcher des fuites à partir des liposomes, par exemple dans les cosmétiques ou les produits pharmaceutiques (voir WO 96/20695). Une application supplémentaire possible est l'augmentation de la tolérance des plantes envers la congélation en y introduisant (ou en y produisant de manière transgénétique) un AFP (voir J. Cell. Biochem Suppl. volume 14e, 1990, page 303 XP002030248, Lee et al., résumé R228). De même, on a proposé des AFP de poisson pour une utilisation dans des produits alimentaires, par exemple dans le yaourt congelé ou la crème glacée (US 5 620 732 de Pillsbury et WO 96/11586, partenariat limité de recherche et de développement HSC). Toutefois, jusqu'à présent, on n'a pas mis en oeuvre l'utilisation des AFP sur une échelle industrielle. Les demandeurs sont d'avis que l'une des raisons du manque de mise en oeuvre industrielle est que, bien que l'on ait décrit de nombreux AFP, la mise en oeuvre pratique dans des produits industriels réels rencontre de graves problèmes. Les demandeurs ont trouvé que l'une des raisons clés de ces problèmes est que, parmi le grand nombre de AFP qui ont été décrits dans la littérature, il n'y a qu'un ensemble limité de AFP que l'on peut mettre en oeuvre de manière appropriée pour chaque application; de même les demandeurs ont trouvé que ce choix de AFP appropriés dépend de l'application et/ou des attributs du produit souhaité à réaliser. WO 90/13571 décrit des peptides anti-congélation produits chimiquement ou à l'aide de techniques de recombinaison d'ADN. On peut utiliser de manière appropriée les AFP dans des produits alimentaires tels que la crème glacée. L'exemple 3B présente des formes de cristaux de --4--- glace modifiés si on congèle un mélange eau-glace en un film en combinaison avec 0,01% en poids d'AFP. WO 92/22581 décrit des AFP d'origine végétale. Ce document décrit également un procédé d'extraction d'une composition de polypeptide provenant des espaces extra- cellulaires de végétaux en infiltrant les feuilles avec un milieu d'extraction sans briser les cellules végétales. WO 94/03617 décrit la production des AFP provenant de levure et leur utilisation possible dans la crème glacée. WO 96/11586 décrit des AFP de poisson produits par des microbes. La présente invention vise à fournir des produits alimentaires congelés ayant une texture relativement dure et fragile, ladite texture étant conservée lors d'un stockage prolongé aux basses températures. Un certain nombre de références de la littérature ont proposé que l'on peut utiliser potentiellement les AFP pour influencer favorablement les propriétés de texture des produits congelés de confiserie tels que la crème glacée. Toutefois, la plupart de ces documents ne fournissent aucun enseignement sur la façon de réaliser effectivement en pratique ces propriétés favorables. WO 96/11586 (non pré-publié) enseigne l'application des polypeptides anticongélation de poisson dans des produits alimentaires congelés. On ne mentionne pas de produits durs et fragiles. WO 96/39878 (non pré-publié) décrit la mise en oeuvre d'AFP dans la crème glacée en utilisant un procédé de congélation spécifique. On peut extraire les AFP convenant à cette mise en oeuvre à partir du sang et du tissu musculaire de poissons de l'Antarctique, de poissons de l'Arctique, de vers ou d'insectes. A nouveau, on ne mentionne pas de produits durs et fragiles. -5- De manière étonnante, il s'est avéré que l'on peut incorporer de manière commode des AFP dans des produits alimentaires congelés afin d'aboutir aux propriétés de produits souhaitées tant que l'on fait varier le produit et les conditions de traitement de sorte que la forme des cristaux de glace satisfasse à des conditions spécifiques. En conséquence, dans un premier aspect, l'invention a trait à un procédé de production d'un produit alimentaire congelé comprenant de l'AFP, dans lequel on choisit les conditions de sorte que les cristaux de glace dans le produit aient un rapport d'aspect supérieur à 1,9, de préférence de 1,9 à 3,0. Si les produits alimentaires sont congelés, il se forme des cristaux de glace dans tout le produit. Si on inclut des AFP dans des produits alimentaires à congeler, ceci aboutira en général à une modification favorable des propriétés de recristallisation de glace. L'agrégation des cristaux de glace de produits contenant de l'AFP peut provoquer la fragilisation du produit. De nombreux consommateurs sont en faveur de produits alimentaires congelés ou leurs ingrédients relativement durs et fragiles tels que la crème glacée ou la glace à l'eau. Par exemple, on peut utiliser une glace à l'eau croustillante en tant qu'ingrédient intéressant dans des produits congelés de confiserie, de même une grande part des consommateurs préfèrent une crème glacée relativement dure. De manière étonnante, nous avons trouvé que les AFP offrent l'occasion de formuler des produits alimentaires congelés qui d'une part sont relativement durs et fragiles et d'autre part ont des propriétés de recristallisation de glace améliorées. Les demandeurs ont trouvé que l'on peut réaliser de manière étonnante cette combinaison avantageuse de propriétés si le rapport d'aspect des cristaux de glace -6- du produit est supérieur à 1, 9, de préférence compris entre 1,9 et 3. On définit le rapport d'aspect des cristaux de glace comme le rapport de la longueur et de la largeur des cristaux de glace. Un rapport d'aspect supérieur à 1,9, de préférence compris entre 1,9 et 3 correspond à des cristaux de glace allongés, qui n'ont pas une forme arrondie. On peut déterminer le rapport d'aspect des cristaux par tout procédé approprié. On illustre un procédé préféré dans les exemples. De préférence, le rapport est compris entre 2,0 et 2,9, de manière tout particulièrement préférée entre 2,1 et 2,8. De préférence les produits congelés de l'invention sont fragiles. De préférence, l'épaisseur de couche minimale à laquelle on peut observer un comportement de rupture est inférieure à 10 mm, de manière particulièrement préférée de 1 à 5 mm. On peut soit mesurer le comportement de rupture en préparant des couches d'épaisseur variable et en déterminant à quelle épaisseur minimale il se produit un comportement de rupture soit le calculer à partir du module de Young tel que décrit dans les exemples. Pendant la formulation et la congélation ultérieure des produits alimentaires, plusieurs paramètres peuvent influencer le rapport d'aspect des cristaux de glace à former. On donne ci-dessous des exemples de facteurs qui influencent le rapport d'aspect. Les demandeurs pensent que l'homme de métier dispose des compétences pour choisir ces conditions de façon que le rapport d'aspect des cristaux de glace tombe dans la plage souhaitée. y0 Un facteur influençant le rapport d'aspect des cristaux de glace est la vitesse de congélation du produit. De manière générale, une augmentation de la vitesse de congélation aboutit à une diminution du rapport d'aspect pour les cristaux de glace. Dans ce contexte, la -7- température de congélation peut influencer la vitesse de congélation et donc le rapport d'aspect des cristaux de glace. Dans ce contexte, on préfère quelquefois des procédés de congélation comprenant une étape de durcissement, par exemple à une température au-dessous de -34 C (-30 F). La température de stockage et la durée de stockage peuvent également influencer le rapport d'aspect, tandis que des températures de stockage plus élevées et/ou des durées de stockage plus longues tendent à favoriser la formation de rapports d'aspect élevés. Un autre facteur qui influence le rapport d'aspect des cristaux de glace est la mobilité du produit au cours de la congélation. Par exemple, si on doit congeler un mélange liquide de glace à l'eau ou de crème glacée, une congélation tranquille aboutira à un rapport d'aspect relativement élevé des cristaux de glace, tandis qu'une agitation aboutira à un rapport d'aspect plus faible. Un mélange avec un cisaillement élevé peut aboutir à des rapports d'aspect encore plus faibles. Un autre facteur influençant le rapport d'aspect des cristaux de glace est la présence et les quantités d'ingrédients. Par exemple, la présence d'ingrédients qui tendent à former une structure réticulée dans le produit (par exemple des gommes ou des matières grasses) peuvent aboutir à un rapport d'aspect plus faible que celui dans les produits sans ces ingrédients. De même d'autres ingrédients peuvent aboutir à des rapports d'aspect plus faibles, par exemple, des teneurs élevées en matière solide, par exemple des teneurs élevées en sucre peuvent aboutir à des rapports d'aspect faibles. Finalement, la nature et la quantité des AFP présents peuvent aboutir à une modification des rapports d'aspect. Certains AFP tendent à favoriser la formation de rapports d'aspect faibles, tandis que d'autres AFP tendent à induire -8-- des rapports d'aspect plus élevés. On décrit dans les exemples un essai approprié afin de choisir ces AFP. Une modification de la quantité des AFP peut également aboutir à une modification des rapports d'aspect. Selon une deuxième forme de réalisation, l'invention a trait à un procédé de production d'un produit alimentaire congelé comprenant de l'AFP, dans lequel on choisit la formulation, les conditions de congélation et de stockage de sorte que les cristaux de glace dans le produit aient un rapport d'aspect de 1,9 à 3. On peut appliquer le procédé de l'invention à tout produit alimentaire congelé contenant des AFP. Des exemples de produits appropriés sont les sauces, les repas tous prêts, etc. Les produits alimentaires préférés sont les produits congelés de confiserie tels que la crème glacée et la glace à l'eau. Les demandeurs ont -trouvé que les AFP à utiliser dans le procédé de l'invention peuvent provenir d'une diversité de sources telles que les végétaux, les poissons, les 23 insectes et les micro-organismes. On peut utiliser à la fois des espèces existant dans la nature ou des espèces que l'on a obtenues au moyen d'une modification génétique. Par exemple, on peut modifier génétiquement des micro- organismes ou des végétaux afin d'exprimer des AFP, puis on L5 peut utiliser les AFP selon la présente invention. On peut utiliser les techniques de manipulation génétique afin de produire des AFP de la manière suivante: on transformerait une cellule ou un organisme hâte approprié au moyen d'un produit de recombinaison de gène qui contient le polypeptide souhaité. On peut insérer la séquence de nucléotide codant pour le polypeptide dans un vecteur d'expression approprié codant les éléments nécessaires à une transcription et une traduction et d'une telle manière qu'ils seront exprimés dans des conditions -9- appropriées (par exemple, selon une orientation correcte et un cadre de lecture correct et avec un ciblage et des séquences d'expression appropriés). Les procédés nécessaires à la construction de ces vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme de métier. On peut utiliser un certain nombre de systèmes d'expression afin d'exprimer la séquence codant pour le polypeptide. Ceux-ci comprennent, mais ne s'y limitent pas, les bactéries, les systèmes cellulaires d'insecte et de levure, les systèmes de culture de cellules végétales et les végétaux tous transformés avec les vecteurs d'expression appropriés. On peut transformer une large diversité de végétaux et de systèmes de cellules végétales avec des produits de recombinaison d'acide nucléique des polypeptides souhaités. Les formes de réalisation préférées incluraient, mais ne s'y limiteraient pas, le maïs, la tomate, le tabac, les carottes, les fraises, les graines de colza et la betterave à sucre. ô rPour les besoins de l'invention, on extrait les AFP préférés de poisson (à savoir, soit on les obtient directement des poissons, soit on fait produire de manière transgénique les protéines de poisson par d'autres organismes). On préfère particulièrement l'utilisation des protéines de poissons du type III, de manière tout particulièrement préférée HPLC 12 tel que décrit dans notre document non pré-publié PCT/EP96/02936 (WO 97/2343). Pour certaines sources naturelles, les AFP peuvent se composer d'un mélange de deux ou plusieurs AFP. On choisit de préférence les AFP qui possèdent des propriétés d'inhibition significative de la recristallisation de glace. De préférence, les AFP selon l'invention fournissent une taille de particules de glace lors de la recristallisation, de préférence mesurées selon -10- les exemples, inférieures à 20 pm, de manière particulièrement préférée de 5 à 15 pm. On pense que la petite taille de cristal de glace combinée avec le rapport d'aspect spécifique est particulièrement avantageux en vue d'obtenir les caractéristiques structurales souhaitables. Un mode de réalisation très avantageux de l'invention a trait aux formulations de produits que l'on choisit telles que dans la préparation du produit, on peut utiliser des conditions de congélation tranquilles, tout en obtenant encore le rapport d'aspect tel que défini ci-dessus. Des exemples de tels produits alimentaires sont: les mélanges congelés de confiserie tels que les mélanges de crème glacée et les mélanges de glace à l'eau qui sont destinés à être stockés à la température ambiante ou à celle du réfrigérateur. Les formes de produits appropriés sont, par exemple: un mélange de poudres que l'on emballe par exemple dans un sacou dans des sachets. Ledit mélange étant capable de former la base du produit alimentaire congelé, par exemple après ajout d'eau et éventuellement d'autres ingrédients et une aération éventuelle. Un autre exemple d'un mélange approprié serait un mélange liquide (éventuellement aéré) que l'on peut congeler, si nécessaire, après ajout de composants supplémentaires et après une aération éventuelle supplémentaire. L'avantage net des mélanges susmentionnés est que la présence de l'ingrédient AFP permet de congeler les mélanges dans des conditions tranquilles, par exemple dans un congélateur de magasin ou domestique. On emballe ces mélanges de manière très commode dans des récipients fermés (par exemple, des cartons, des sacs, des boites, des récipients en matière plastique, etc.). Pour des portions uniques, la taille du conditionnement sera en général de 10 à 1000 g. Pour des portions -11 - multiples, des tailles de conditionnement allant jusqu'à 500 kg peuvent convenir. En général, la taille du conditionnement sera de 10 g à 5000 g. Comme indiqué ci-dessus, les produits préférés dans lesquels on utilise les AFP sont les produits congelés de confiserie tels que la crème glacée ou la glace à l'eau. De préférence, la concentration en AFP est de 0,0001 à 0,5% en poids par rapport au produit final. Si l'on utilise des mélanges à sec ou des concentrés, la concentration peut être plus importante afin d'assurer que la concentration dans le produit congelé final soit dans les gammes ci- dessus. Etonnamment, il s'est avéré que des compositions de l'invention peuvent contenir de très faibles quantités d'AFP tout en étant d'une bonne qualité. Jusqu'à présent, on a pensé généralement qu'il fallait des concentrations relativement élevées en AFP afin d'obtenir une amélioration acceptable des propriétés de recristallisation. La raison de ceci est que l'on pense 2O couramment que les AFP agissent sur des parties importantes de la surface des cristaux de glace et donc il faut qu'ils soient présents à des concentrations relativement élevées, par exemple, de 0,01% ou plus, afin d'obtenir un effet raisonnable. Etonnamment, il s'est également avéré que pour des produits congelés, on a déjà pu obtenir des propriétés de recristallisation améliorées et une augmentation de la tolérance envers la température si on utilise de faibles concentrations en AFP. Etonnamment, il s'est avéré que la concentration en AFP peut être aussi faible que 0,1 à 50 ppm tout en offrant encore des propriétés de recristallisation et une tolérance à la températures adéquates dans les produits congelés de confiserie. Bien que les demandeurs ne souhaitent en aucune -12- façon être liés à une quelconque théorie, il se peut que la raison pour cela soit que l'interaction entre les matières solides de la confiserie congelée et les AFP offre un excellent mécanisme d'inhibition de la croissance cristalline. De manière plus commode, la concentration en AFP est de 1 à 40 ppm, de manière particulièrement préférée de 2 à 10 ppm. Pour les besoins de l'invention, le terme "produit congelé de confiserie" inclut les confiseries congelées contenant du lait telles que la crème glacée, le yaourt congelé, le sorbet, le lait glacé et la crème anglaise congelée, les glaces à l'eau, les granitas et les purées de fruits congelées. Pour certaines applications, on préfère moins l'utilisation d'AFP dans les produits alimentaires fermentés congelés. De préférence, la teneur en solides de la confiserie congelée (par exemple, le sucre, la matière grasse, les arômes, etc.) est supérieure à 4% en poids, de préférence de 30% en poids, de manière particulièrement préférée de 40 nC à 70% en poids. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, on utilise les formulations de confiserie congelée dure et croustillante afin de créer un contraste de texture dans les confiseries glacées. De préférence, de telles confiseries glacées contiennent en tant qu'éléments discrets dans leur structure la composition contenant l'AFP selon l'invention. Par exemple, on peut revêtir une partie centrale de crème glacée relativement molle d'une couche mince de la composition de l'invention en lui conférant ainsi une couche externe relativement dure et croustillante entourant la partie centrale de la crème glacée. Une autre forme de réalisation serait l'incorporation de la formulation de l'invention sous forme d'inclusions dans des confiseries glacées. Un -13troisième mode de réalisation serait d'alterner des couches de crème glacée avec la formulation de l'invention afin de créer des couches croustillantes minces qui alternent avec les couches de crème glacée. Exemple I On a préparé un prémélange de préparation de crème glacée, en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 10,00 Saccharose 13,00 Maltodextrine (MD40) 4,00 Gomme de caroube 0,14 Matière grasse du lait 8,00 Monoglycéride (palmitate) 0,30 Vanilline 0,01 AFP (type III HPLC-12, 0,01 ou aucun voir WO 97/2343) (témoin) Eau le complément On peut stocker ce mélange de manière commode à la température ambiante, par exemple dans un récipient en matière plastique. On peut utiliser les mélanges dans une préparation de crème glacée par une homogénéisation à 13,8 MPa (2000 psi) et à 65 C suivi par un vieillissement pendant une nuit à C. On a congelé le mélange en utilisant un congélateur (MF50 SSHE Technohoy équipé d'un fouet rigide tournant à 240 tr/mn). La température d'extrusion était de -4,5 C, le gonflement était de 110%. Puis on a congelé le produit à -35 C et on l'a stocké à -80 C. -14- Après stockage pendant 2 mois, la composition selon l'invention possédait une structure remarquablement meilleure que celle de l'échantillon témoin. Exemple II On a préparé une crème glacée de formulation suivante: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 10,00 Saccharose 13,00 Maltodextrine (MD40) 4,00 Gomme de caroube 0,14 Matière grasse du lait 8,00 Monoglycéride (palmitate) 0,30 Vanilline 0,01 AFP (type III HPLC-12) 0,01 ou aucun (témoin) Eau le complément Le procédé de préparation était tel que dans l'exemple :0 I. On a équilibré les échantillons des deux produits à - 18 C dans une armoire climatique Prolan pendant environ 12 heures. On a préparé des lames pour microscope en étalant une couche mince de crème glacée à partir du centre des lames de verre minces. On a transféré chaque lame vers une platine de microscope thermostatée (à -18 C) o l'on a enregistré des images des cristaux de glace (environ 400 cristaux de glace individuels) et on les a transmis à travers une caméra vidéo vers un système de stockage et d'analyse d'image. On a souligné manuellement les images stockées de cristaux de glace en dessinant autour de leur périmètre, ce -15- qui souligne alors tout le cristal. On a alors mesuré les images des cristaux soulignés en utilisant un logiciel d'analyse d'image qui compte le nombre de pixels nécessaires pour compléter la ligne droite la plus longue (longueur), la ligne droite la plus courte (largeur), le rapport d'aspect (longueur:largeur). On a calculé le rapport d'aspect moyen pour les cristaux. Pour l'échantillon témoin, le rapport d'aspect était de 1,45. Pour l'échantillon contenant du AFP, le rapport d'aspect était de 2,24. Exemple III On a déterminé la fragilité de la crème glacée de l'exemple II au moyen de calculs du comportement de rupture de la crème glacée. On- a mesuré le module de Young en utilisant un essai de flexion en 3 points. On a mesuré le module de Young en préparant des bandes J de crème glacée, en les équilibrant pendant 18 heures dans une armoire congélateur et en les transférant vers une armoire thermostatée. Puis on a placé les bandes sur un dispositif de flexion en 3 points tel que décrit dans Handbook of Plastics Test Methods (2ème édition), éditeur R. P. Brown, George Godwin Ltd, 1981. On a réalisé immédiatement des essais d'échantillons à une vitesse de déformation de 50 mm/minute. On a mesuré la pente initiale d'après la courbe effort- déformation et on l'a utilisée pour calculer le module de Young selon l'équation suivante: pentexL3 Module de Young (Pa) 4xBxW3 4xBxW3 -16- o L = portée de la poutre (110 mm), B = largeur de l'échantillon, W = hauteur de l'échantillon. On a évalué habituellement 8 échantillons afin d'obtenir une valeur moyenne du module de Young. En utilisant les calculs décrits par Williams & Cawood dans Polymer Testing 9 pages 15 à 26 (1990), on peut calculer la résistance à la rupture. Les résultats étaient les suivants: pour l'échantillon témoin on a calculé une épaisseur de 966 mètres comme étant nécessaire pour obtenir une couche fragile. Pour l'échantillon contenant l'AFP, on a déjà trouvé une fragilisation (comportement de rupture) déjà à une épaisseur de 3 mm. Ceci indique nettement la fragilité améliorée des produits de l'invention. Les deux échantillons ont donné des produits relativement mous. Exemple IV Cet exemple décrit une méthodologie en vue de choisir les AFP qui favorisent la formation de formes cristallines de glace telles que préférées dans l'invention. La croissance des cristaux de glace dans les conditions normales a lieu le long de l'axe a du cristal. Si des AFP sont présents, la croissance est modifiée. On peut expliquer cette influence sélective de la forme du cristal par le fait que les AFP ont tendance à se lier à certaines parties du cristal de glace et en le faisant, ils inhibent la croissance du cristal de glace dans certaines directions. Une fixation peut, par exemple, avoir lieu au niveau des plants de prisme (perpendiculaire à l'axe a) ou au niveau des plans pyramidaux (qui se projettent de ces plans). Les demandeurs ont trouvé que l'on peut trouver les AFP qui favorisent la formation des rapports d'aspect selon la présente invention par exemple en choisissant les AFP 17- qui tendent à se fixer sur le plan de prisme. La méthodologie de choix de ces AFP à fixation spécifique peut être toute méthodologie appropriée. Un essai approprié utilise la dite "expérimentation de croissance 'hémisphérique' de monocristal de glace ", qui se base sur la technique décrite dans Knight C.A., C.C. Cheng et A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) pages 409 à 418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on specific ice cristal surface planes. On a rempli avec de l'eau désionisée un bêcher en matière plastique de 5 litres bien isolé et on l'a placé dans un armoire thermostatée à -1 C. Puis on l'a laissé se congeler lentement à partir du haut. Après deux jours, un monocristal de glace épais d'environ 4 cm recouvrait le bêcher. On a déterminé l'orientation cristallographique de ce cristal en utilisant les procédés de diffraction des rayons X par un monocristal. On a découpé des cubes de glace d'une taille d'environ 2 cm dans le gros monocristal, de façon que l'une des surfaces soit parallèle au plan de prisme et l'autre parallèle au plan de base. Ainsi on a produit des monocristaux de glace orientés. On utilise un appareil constitué d'un doigt froid en laiton (d'un diamètre d'environ 1 cm) sur lequel on congèle un cristal de germination orienté. On a d'abord évidé le germe de sorte que le cristal de germination s'adapte autour du doigt. Puis on a fait circuler un réfrigérant à travers le doigt et le germe s'est congelé en y adhérant. Puis on a trempé le doigt, avec le cristal de germination, dans un bêcher isolé de 100 ml contenant une solution de la matière étudiée. La température initiale de la solution était la température ambiante (18 C), et l'unique refroidissement était fourni par le doigt froid. Initialement, le cristal de germination a fondu partiellement mais il s'est développé ensuite en un -18- hémisphère monocristallin. Après plusieurs heures (6 à 8), il s'est formé un hémisphère d'un diamètre de 5 à 7 cm. On a réalisé l'expérimentation avec diverses solutions d'AFP. Les solutions d'AFP utilisées avaient une concentration en AFP de 10-3 mg/ml. Puis on a retiré l'hémisphère du doigt froid et on l'a déplacé vers une armoire thermostatée à -15 C. On a gratté la surface et on l'a laissée dans l'armoire au moins pendant une nuit (16 heures ou plus). On a fait circuler de l'air à travers l'armoire au moyen d'un ventilateur intégré. Pendant ce temps, il s'est produit une évaporation des couches superficielles de la glace. La surface de l'hémisphère de glace s'est ainsi transformée en une surface miroir lisse. Toutefois, pour un hémisphère contenant de l'AFP, on observe des taches rugueuses sur la surface. Ceci correspond aux taches o l'AFP s'est lié à la surface de l'hémisphère. Les grosses molécules de l'AFP empêchent l'évaporation des molécules de glace et ainsi il se forme un tapis rugueux de molécules d'AFP sur la surface 22 au niveau des surfaces o a lieu la fixation préférentielle à la glace. Puisqu'on connaît l'orientation de l'hémisphère, et que l'on peut calculer la distance angulaire entre ces plaques rugueuses et les directions de base et de prisme au moyen d'un goniomètre optique, on peut facilement déterminer la nature du plan de fixation. On peut utiliser cet essai afin de choisir les AFP qui ont tendance à se fixer aux plans primaires ou secondaires de prisme. Par exemple, l'AFP type I provenant de flétau d'hiver ou de carrelet d'Alaska a tendance à se fixer aux sites de fixation (2 0 - 2 1)1 tandis que les AFP provenant de morue de l'Antarctique ont tendance à se fixer au site de fixation (1 0 1 0)3 ou 5, tandis que l'AFP III provenant d'un zoarcidé de l'Antarctique a tendance à se fixer au site de fixation (1 0 - 1 0)2 ou 3 -19- Il est tout à fait de la compétence de l'homme de métier d'utiliser l'essai ci-dessus afin de déterminer les AFP qui tendent à favoriser la formation de rapports d'aspect élevés des cristaux de glace. Afin d'évaluer leur capacité d'adaptation aux produits congelés de l'invention, on peut réaliser de véritables produits et on peut déterminer le rapport d'aspect des cristaux dans les produits. Exemple V Essai pour déterminer la taille des cristaux de glace lors d'une recristallisation. On a ajusté une concentration en saccharose à 30% d'un échantillon d'une solution contenant de l'AFP dans de l'eau (si la concentration initiale de l'échantillon dépasse 30%, on l'y conduit par une dilution, si la concentration initiale était plus faible, on a ajouté du saccharose jusqu'à la concentration de 30%). En général, on peut appliquer l'essai à toute 23 composition appropriée comprenant de l'AFP et de l'eau. En général, la concentration en AFP dans une telle composition d'essai n'est pas très critique et elle peut, par exemple, être de 0,0001 à 0,5% en poids, de manière particulièrement préférée de 0,0005 à 0,1% en poids, de manière tout D particulièrement préférée de 0,01 à 0,05% en poids, par exemple 0,01% en poids. On place une goutte de 3 pl de l'échantillon sur une lame porte-objet de 22 mm. Puis on place une lame couvre- objet de 16 mm de diamètre par-dessus et on applique un poids de 200 g sur l'échantillon afin d'assurer une épaisseur de lame uniforme. On scelle les bords de la lame couvre-objet avec un vernis à ongle transparent. On place la lame sur une platine de microscope thermostatée Linkham THM 600. On refroidit rapidement la -20- platine (50 C par minute) jusqu'à 40 C afin de produire une grande population de petits cristaux. Puis on élè1ve rapidement la température de la platine (50 C par minute) jusqu'à -6 C et on la maintient à cette température. On observe la phase de glace à -6 C en utilisant un microscope Leica Aristoplan. On a utilisé des conditions de lumière polarisée conjointement avec une lame onde afin d'améliorer le contraste des cristaux de glace. On enregistre l'état de la phase de glace (taille des cristaux de glace) au moyen d'une microphotographie en 35 mm à T=0 et T=1 heure. A la suite de quoi, une taille de particule moyenne (détermination visuelle, moyenne en nombre) inférieure à 20 pm, de manière particulièrement préférée entre 5 et 15 pm, indique les AFP préférés pour une utilisation dans les produits selon l'invention. -21- REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un produit alimentaire congelé comprenant erLl'AFP, dans lequel les conditions sont choisies de sorte que les cristaux de glace dans le produit possèdent un rapport d'aspect supérieur à 1,9. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le rapport d'aspect est de 1,9 à 3,0. 3 Procédé selon la revendication 1, dans lequel les conditions visant à influencer le rapport d'aspect sont choisies dans le groupe de conditions: vitesse de congélation, mobilité du produit au cours de la congélation, température et durée de stockage, formulation du produit, et nature et quantité des AFP et de leurs combinaisons. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le produit alimentaire congelé est un produit congelé de confiserie. 5. Produit congelé de confiserie comprenant des AFP à raison de 0,0001 à 0,5% en poids, ledit produit ayant un rapport d'aspect des cristaux de glace supérieur à 1,9. 6. Produit congelé de confiserie selon la revendication 5, dans lequel le rapport d'aspect est de 1,9 à 3,0. - 7. Produit congelé de confiserie selon la revendication 5, dans lequel l'AFP se fixe préférentiellement aux plans primaires et secondaires de prisme de cristaux de glace. 8. Produit congelé de confiserie, possédant un contraste de texture, ledit produit comprenant des éléments discrets d'un produit de confiserie selon la revendication 5. -22- 9. Produit congelé de confiserie selon la revendication 8, comprenant des couches minces de crème glacée en alternance avec des couches minces de glace à l'eau, dans lequel les couches de glace à l'eau comprennent5 des AFP à raison de 0, 0001 à 0,5% en poids et possèdent un rapport d'aspect des cristaux de glace de 1,9 à 3,0. 10. Mélange de crème glacée approprié à une utilisation dans la préparation d'un produit congelé de confiserie selon la revendication 5.