FR 2743818 A1 19970725 FR 9600718 A 19960123 L'Invention est relative à des vecteurs d'expression dérivés des adénovirus, à leur obtention, et à leur utilisation pour augmenter le niveau d'expression de gènes d'intérêt. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire ; leur génome, dont la séquence complète de certains types est connue [par exemple CHROBOEZEK et al. Virology, 186, 280-285 (1992)], comprend à peu près 36000 pb et comporte à ses extrémités des séquences inversées répétées (ITR). L'infection d'une cellule-hôte par un adénovirus comprend deux phases - une phase précoce au cours de laquelle sont exprimées 4 unités de transcription, dénommées El, E2, E3 et E4, et où sont synthétisés en particulier les facteurs de réplication de l'ADN viral, ainsi que des protéines régulant l'expression de certains gènes viraux et cellulaires ; parmi les gènes transcrits pendant la phase précoce, on mentionnera en particulier les gènes El (Ela, et Elb) qui sont situés à l'extrémité gauche (extrémité 5') du génome de l'adénovirus, et qui sont indispensables à la réplication virale - une phase tardive, au cours de laquelle sont exprimés les gènes tardifs L1 à L5 ; les gènes codant pour les protéines de structure du virion sont transcrits, sous contrôle du promoteur fort MLP (Major Late Promoter). Les adénovirus peuvent constituer des vecteurs fonctionnels dans des cellules, pour l'expression de gènes d'intérêt. Leur emploi a ainsi été préconisé pour l'obtention de vaccins vivants recombinants, pour la thérapie génique, et également pour la production de protéines hétérologues dans des cultures cellules de mammifères. De très nombreux systèmes d'expression utilisant les adénovirus ont ainsi été décrits. Pour obtenir ces vecteurs, les séquences d'ADN hétérologue que l'on souhaite exprimer sont insérées à la place de séquences génomiques de l'adénovirus : des séquences localisées dans les régions El (E1A et E1B) E3 et E4 ont en particulier été utilisées dans ce but. Lorsque qu'une séquence hétérologue est insérée dans E3, qui n'est pas une région essentielle pour la réplication, les adénovirus peuvent être répliqués dans n'importe quelle lignée cellulaire permissive. Des lignées cellulaires permissives pour les adénovirus sont d'origine humaine ou animale (mammifères, oiseaux, poissons). En revanche, si une séquence hétérologue est insérée dans la région El, les adénovirus obtenus sont incapables de réplication dans les cellules-hôte habituelles, où ils restent bloqués en phase précoce ; de tels adénovirus, dits "défectifs", sont dépourvus d'effets pathogènes, de ce fait ils sont particulièrement avantageux pour l'utilisation en thérapie génique et pour l'utilisation vaccinale. La réplication des adénovirus défectifs pour El doit être effectuée sur des cellules telles que les cellules 293 [GRAHAM et al. J. Gen. Virol., Vol. 36, p. 59-72 (1977)] ces cellules sont issues d'une lignée de rein embryonnaire humain, dans le génome de laquelle est intégrée la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 ; elles complémentent en trans pour la région El et permettent la réplication des virus défectifs pour cette région El. Généralement, les adénovirus utilisés comme vecteurs d'expression comprennent au moins : les séquences ITR, localisées à chaque extrémité du génome viral (la séquence ITR gauche de Ad5 comprend par exemple les nucléotides 1 à 103 du génome) une séquence d'encapsidation, (dénommée séquence Psi), située entre l'ITR gauche et la région El, à la même localisation que les signaux activateurs de la transcription du gène E1A (Elt I et II). Ils comprennent également ceux des gènes essentiels pour la réplication de l'adénovirus qui ne sont pas apportés par la lignée cellulaire hôte et/ou par un autre adénovirus utilisé comme auxiliaire. Ils comprennent en outre d'autres séquences, dont la nature varie selon l'usage que l'on envisage pour le vecteur, et qui sont des séquences d'adénovirus et/ou des séquences hétérologues. Ces autres séquences comprennent en particulier, outre le gène d'intérêt que l'on souhaite exprimer, des signaux de régulation de l'expression dudit gène, tels que des promoteurs. Une grande variété de promoteurs est utilisable pour contrôler l'expression de gènes hétérologues clonés dans un adénovirus. Il peut s'agir de promoteurs cellulaires tissu-spécifiques ou non, inductibles ou non, de promoteurs viraux d'adénovirus ou d'autres virus, de promoteurs synthétiques, etc Une grande variété d'adénovirus recombinants, conçus pour des usages divers, ont ainsi été obtenus ; on citera à titre d'illustration les vecteurs décrits dans les Demandes Internationales PCT publiées sous les numéros WO 94/08026 du 14 Avril 1995, au nom de RHONE-POULENC RORER S.A. et al.; WO 95/02697 du 26 Janvier 1995, au nom de RHONE-POULENC RORER S.A. ; WO 95/14101 du 26 Mai 1995, au nom de RHONE-POULENC RORER S.A. et al.; WO 95/16772 du 22 Juin 1995, au nom de CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC. US. Que ce soit au cours de la phase précoce, ou au cours de la phase tardive, la plus grande partie du génome de l'adénovirus est transcrite par l'ARN polymérase II de la cellule-hôte. Cependant, une courte région du génome, située entre les nucléotides 10160 et 10574 contient deux gènes (VA I et VA II), qui sont transcrits surtout pendant la phase tardive de l'infection, par 1'ARN polymérase III pour donner naissance à des ARNs dénommés ARN VA (pour "Virus Associated"), qui s'accumulent dans la cellule en grande quantité. Les gènes des ARN VA comprennent des séquences promotrices intragéniques, reconnues par l'ARN polymérase III, et qui sont dénommées respectivement boîte A et bote B. Dans le cadre de l'exposé qui va suivre, on désignera par ARN VA "endogène" un ARN VA I ou VA II résultant de la transcription d'un gène d'ARN VA I ou VA II non-modifié, qui est situé dans son contexte naturel de transcription, c'est à dire à sa position habituelle dans le génome d'adénovirus, et qui est flanqué des séquences qui l'entourent naturellement. D'autre part, on désignera par ARN VA "exogène" un ARN VA I ou VA II résultant de la transcription d'un gène modifié, et/ou situé hors de son contexte naturel de transcription. L'espèce d'ARN VA la plus représentée est 1'ARN VA I qui est synthétisé de manière très active, et s'accumule pendant la phase tardive jusqu'à une quantité supérieure à 10 molécules par cellule. L'ARN VA II est synthétisé en quantité environ 10 fois moindre. I1 a été montré que, dans des cellules infectées par les adénovirus, l'ARN VA I était nécessaire pour accroître la traduction des ARNm pendant la phase tardive. L'ARN VA I agit essentiellement en bloquant l'activation de l'enzyme PKR (également dénommée DAI), [Pour revue, cf. MATHEWS M.B., Enzyme, 44, p. 250-264, (1990) ; MATHEWS et SHENK, J. Virol., 65, p. 5657-5662, (1991)] Cette enzyme PKR est associée au ribosome, dans un complexe réunissant tous les facteurs de la traduction. Sa synthèse est induite par l'interféron, et l'enzyme est normalement activée par les ARN double brins (ARN-ds). Cette activation se traduit par une autophos phorylation de l'enzyme, puis une phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF-2 (Eukaryotic Initiation Factor 2). Le facteur eIF-2 phosphorylé ne peut être recyclé, ce qui conduit à une inhibition de l'initiation de la traduction des ARNm. Le blocage de l'activité PKR par l'ARN VA I endogène s'exerce après la transition vers la phase tardive du cycle viral, et lève l'inhibition de la traduction des ARNm tardifs viraux. Il a également été observé dans le cadre d'expérimentations d'expression transitoire, que 1'ARN VA I pouvait stimuler l'expression de gènes rapporteurs introduits dans des cellules en l'absence d'infection par des adénovirus. Il n'est pas nécessaire que d'autres séquences virales soient présentes sur la construction portant le gène rapporteur, pour que cet effet se manifeste. C'est ainsi qu'en 1985, SVENSSON et AKUSJÂRVI [EMBO J. 4, p. 957-964] ont démontré que l'augmentation d'efficacité d'expression ne se limite pas aux ARNm viraux ces auteurs ont en particulier procédé à la cotransfection de cellules avec un plasmide porteur du gène CAT, et un plasmide porteur de la région VA I. Ils ont montré dans ces conditions une stimulation significative (6,5x) dans les cellules 293, qui complémentent en trans pour le gêne E1A, mais pas dans les cellules HeLa et CV-1 (environ 2x). Selon ces auteurs, ces résultats seraient dus à une mauvaise efficacité de transcription du gène VA I dans ces deux derniers types cellulaires. KAUFMANN [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p. 689-693, (1985)] a également montré l'augmentation de l'expression d'un gène rapporteur par le gêne VA I fourni en cis ou trans. Selon cet auteur, cet effet est surtout marqué pour des gènes rapporteurs placés sous le contrôle du MLP et de ses trois séquences leader non traduites situées en 5' du gène. L'ARN VA I possède une structure complexe. La structure de l'ARN VA I de l'adénovirus Ad2 est représentée à la Figure 1 [d'après la publication de MA et MA THEWS J. Virol., 67, 6605-6617 (1993)]. Cette structure comprend une région terminale (nucléotides 0 à 18 formant un duplex imparfait avec les nucléotides 138 à 160) et une région apicale (nucléotides 42 à 90, formant égalemnt une structure en duplex), qui sont séparées par un domaine central (nucléotides 19 à 41 et 91 à 137). Différents travaux ont permis de décrire le mécanisme d'interaction VA I-PKR et les sites impliqués [MELLITS et MATHEWS, EMBO J. 7, p. 2849-2859, (1988) MELLITS et al., Cell. 61, p. 843-852, (1990) ; MELLITS et al., J. Virol., 66, p. 2360-2377, (1992) ; MA et MATHEWS, 67, p. 6605-6617, (1993) , PE'ERY et al., J. Virol. 67, p. 3534-3543, (1993)]. L'étude de mutants de délétion a montré que l'extrémité du duplex apical (nucléotides 54-77 chez Ad2) de 1'ARN VA I intervient dans la première phase de liaison entre le VA I et la PKR, sans activation de la PKR. Dans un deuxième temps se crée une interaction entre le domaine central du VA I et la PKR, d'où résulte l'activation de la pKR. Il a été montré que des mutations de 1'ARN VA I qui altèrent l'extrémité apicale sans détruire sa structure secondaire ne détruisent pas sa fonction. En revanche, les mutations qui affectent la structure du domaine central inactivent la fonction de l'ARN VA I. Bien que l'on ait observé que l'ARN VA I pouvait stimuler l'expression de gènes en augmentant la traduction d'ARNm, cette propriété n'avait jusqu'à présent pas trouvé d'applications dans le cadre de l'utilisation des vecteurs adénovirus le fait que cette stimulation n'intervienne qu'en phase tardive du cycle de réplication (lorsque le niveau d'ARN VA I endogène est suffisant) lui enlevait beaucoup de son intérêt pratique potentiel, en particulier dans le cas des vecteurs adénovirus utilisés pour la thérapie génique ou la vaccination, qui sont bloqués en phase précoce de l'infection. D'autre part, il n'a pas non plus été proposé auparavant de chercher à augmenter le niveau d'efficacité de 1'ARN VA I. Or, les Inventeurs ont maintenant obtenu des constructions d'ADN recombinant permettant d'exprimer à un niveau élevé l'ARN VA I d'adénovirus pendant la phase précoce de l'infection virale. Ils ont également obtenu des ARN VA I modifiés, qui lorsqu'ils sont introduits dans la même cellule qu'un gène hétérologue codant pour une protéine d'intérêt permettent d'augmenter la synthèse de ladite protéine. La présente Invention a pour objet une construction d'ADN recombinant permettant d'obtenir une cassette d'expression fonctionnelle en cellules de mammifères, et qui comprend au moins les éléments suivants, dans le sens 5'-3': - une séquence d'ADN S1 comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III - une séquence S2 dont le produit de transcription peut former une structure similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus; - une séquence d'ADN S3, S1 S2 et S3 étant fusionnées pour former une séquence différente de la séquence naturelle du gène d'un ARN VA I d'adénovirus. S1 peut par exemple être le promoteur du gène d'un ARN VA d'adénovirus, le promoteur du gène d'un ARN de transfert, ou bien le promoteur du gène d'un ARN EBER du virus d'Epstein-Barr. La séquence S2 peut par exemple comprendre une séquence dont le transcrit est constitué par les nucléotides 54-72 d'un ARN VA I d'adénovirus Ad2 ; cependant, S2 peut également comprendre toute autre séquence dont le transcrit peut adopter la même structure que cette portion d'ARN VA I d'adénovirus. La séquence S3 est avantageusement choisie de manière à ce que les produits de transcription des constructions d'ADN recombinant conformes à l'Invention soient des mutants d'ARNs VA I dans lesquels le domaine central du VA I est au moins partiellement délété ou substitué par une séquence différente. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention S3 comprend, à la place de la séquence du domaine central du VA I, un lieur comprenant au moins un site de restriction pour le clonage d'une séquence d'ADN hétérologue (construction VAemp). Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, il s'agit d'un lieur multisite. Selon encore un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention S3 comprend en outre une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par 1'ARN polymérase III. Des signaux de fin de transcription qui peuvent être utilisés pour l'obtention d'une construction conforme à l'Invention sont ceux reconnus par 1'ARN polymérase III, tels que par exemple les signaux de fin de transcription d'ARNs de transfert, ou bien ceux des ARNs VA I ou VA II d'adénovirus, ou le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr. Des constructions conformes à l'Invention, dénommées VArib et VAie, comprennent respectivement - la séquence représentée dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 1, qui contient la séquence d'un ribozyme de l'ARNm du gène CAT, et - la séquence représentée dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 2, qui contient une séquence antisens de 1'ARNm du gène IE (immediate early) du virus de la maladie d'Aujeszky. Les séquences des constructions VArib et VAie sont également représentées à la figure 3. Lorsque des constructions d'ADN recombinant conformes à l'Invention sont introduites dans la même cellule qu'un gène hotérologue codant pour une protéine d'intérêt, on peut obtenir, de manière similaire à ce qui a été observé avec les ARN VA I de type sauvage, l'augmentation de la synthèse de ladite protéine. Cet effet est inattendu, dans la mesure où le domaine central du VA I était généralement considéré comme indispensable pour l'inhibition de l'activation de la PKR. En outre, les Inventeurs ont observé cette augmentation du niveau d'expression du gène hétérologue aussi bien dans des cas où le domaine central du VA I est substitué par des séquences sans rapport avec le domaine fonctionnel initial (forme VArib), que dans le cas de la délétion du domaine central du VA I (forme VAemp) sans l'insertion de séquences de remplacement ; dans ce dernier cas, l'effet est toutefois moins intense, et ne se manifeste que dans certaines conditions de cotransfection. Les Inventeurs ont en outre constaté que, de façon surprenante, l'association d'un élément activateur de la transcription par la polymérase II avec au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur VA I reconnu par la polymérase III, permet d'exprimer à un niveau suffisamment élevé 1'ARN VA I sauvage, ou recombinant pendant la phase précoce de l'infection virale. Ceci présente un intérêt tout particulier, dans la mesure où il devient ainsi possible de stimuler l'expression de gènes hétérologues, par l'intermédiaire d'ARN VA I, pendant cette phase précoce. La présente Invention a en conséquence pour objet une construction d'ADN recombinant qui comprend les éléments suivants, dans le sens 5'-3' - au moins une séquence d'ADN qui constitue un élément activateur de transcription PolII - une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III et au moins une séquence dont le produit de transcription peut former une structure similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus (il s'agit en particulier de toute séquence dont le transcrit peut adopter la même structure que les nucléotides 54-72 du gène d'un ARN VA I) ; et - au moins une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par 1'ARN polymérase III. On entend par : "élément activateur de transcription PolII" une séquence qui active habituellement la transcription par la polymérase II. De nombreux éléments activateurs de la transcription PolII sont connus en euxmêmes ; il peut s'agir par exemple d'éléments activateurs du gène IE (immediate early) du CMV ou d'autres gènes viraux, ou bien d'éléments activateurs de gènes cellulaires (immunoglobuline, albumine, etc...) Avantageusement, il s'agira d'un élément activateur de la transcription du gène E1A d'adénovirus. Les constructions conformes à l'Invention, comprenant un élément activateur de la transcription par la polymérase II permettent d'exprimer en phase précoce de l'infection virale, aussi bien des ARN VA I de type sauvage, que des ARN dérivés de VA I Selon une modalité préférée de cette disposition, une construction d'ADN recombinant conforme à l'Invent ion comprend au moins - les nucléotides 0 à 352 de 1'adénovirus Ad5 ou une région homologue d'un autre adénovirus humain ou animal; - les nucléotides 1 à 77 du gène VA I de 1'adénovirus Ad2 - le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr. Des constructions conformes à l'Invention peuvent comprendre en particulier l'une des séquences représentées dans la liste de séquence en annexe, sous les numéro SEQ ID NO: 1, et SEQ ID NO: 2. La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants comprenant une construction conforme à l'Invention telle que définie ci-dessus. Ces vecteurs recombinants permettent l'introduction et l'expression desdites constructions dans les cellules hôtes ; il peut s'agir en particulier de plasmides, ou de virus, et en particulier ou d'adénovirus recombinants bloqués en phase précoce du cycle (infection). Selon un mode de réalisation préféré d'un vecteur conforme à l'Invention, il s'agit d'un adénovirus recombinant. Cet adénovirus recombinant peut être obtenu à partir de n'importe quel type d'adénovirus habituellement utilisable pour l'obtention de vecteurs, qu'il s'agisse d'un adénovirus humain, animal, ou mixte. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit adénovirus recombinant résulte du clonage d'une construction conforme à l'invention dans un adénovirus qui comprend déjà une copie d'un gène VA I La présente Invention a pour objet l'utilisation d'une construction d'ADN recombinant telle que définie ci-dessus, pour l'obtention de vecteurs permettant d'augmenter l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule-hôte de mammifère. Pour augmenter l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule-hôte de mammifère, on introduit et on exprime simultanément dans ladite cellule-hôte une construction d'ADN comprenant ledit gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur approprié, et d'une construction d'ADN conforme à l'Invention. Le gène d'intérêt dont on souhaite accroître le niveau d'expression, peut être introduit dans les cellules dans un plasmide d'expression transitoire, dans un plasmide réplicatif en position extrachromosomique (lignée cellulaire constitutive), dans un plasmide capable de s'intégrer aux chromosomes cellulaires, ou bien dans un virus recombinant, qui peut être en particulier un adénovirus, humain, animal, ou mixte, La construction d'ADN comprenant ledit gène d'intérêt, et la construction d'ADN conforme à l'Invention peuvent être portées par le même vecteur, ou bien par deux vecteurs différents. La présente Invention englobe également les vecteurs comprenant une construction d'ADN conforme à l'Invention, et une construction d'ADN comprenant un gène d'intérêt que l'on souhaite exprimer, sous contrôle d'un promoteur approprié. L'augmentation de l'expression est indépendante de la séquence du gène d'intérêt et de la nature des séquences de régulation 5' et 3' qui lui sont associées. Les Inventeurs ont constaté que l'augmentation de l'expression observée avec les constructions conformes à l'Invention est plus importante que celle observée avec le VAI endogène. Les Inventeurs ont vérifié que cette augmentation de l'expression se manifestait pour différents gènes hétérologues, variant aussi bien par les promoteurs utilisés, que par les régions codantes, ou les séquences en 5 non traduites de 1'ARN messager, et également dans différentes lignées cellulaires (HeLa et Vero). Les constructions conformes à la présente Invention peuvent être utilisées en association avec d'autres moyens visant à augmenter ou réguler le niveau de transcription des gènes. Par exemple, elles peuvent être associées avec des promoteurs tissu-spécifiques ou avec des promoteurs inductibles. Le domaine de la thérapie génique ou cellulaire par vecteur adénovirus est donc un domaine privilégié, mais non unique d'application. Les constructions conformes à la présente Invention peuvent également être utilisées pour l'obtention de vaccins, ou bien pour la production in vitro de protéines d'intérêt en cellules de mammifères. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de vecteurs conformes à 1' Invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. CELLULES ET VIRUS UTILISES Les adénovirus ont été multipliés et titrés sur cellules de rein embryonnaire humain 293. Différentes cellules (cellules simiennes Vero, cellules humaines Hela) ont d'autre part été employées pour mesurer le niveau d'expression de protéines exogènes. Les cellules Hela sont issues d'une lignée de carcinome épithélial humain ; elles possèdent une activité ElA-like, et sont donc capables, à forte multiplicité d'infection, de complémenter en partie pour le gène E1A absent. Les cellules Vero sont issues d'une lignée de.rein de singe ; elles ne permettent pas la réplication des virus défectifs pour la région E1A. Toutes ces cellules ont été entretenues en milieu de EAGLE modifié DULBECCO, additionné de 10% de sérum de veau foetal et d'antibiotiques. PLASMIDES Les différents plasmides ont été construits suivant des procédures standard connues de l'homme du métier, telles que celles décrites par SAMBROOK et al.[Molecular cloning A Laboratory Manual ; Second Edi- tion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. Le plasmide pMLPluc comprend le gène luciférase précédé des séquences leader des ARNm tardifs de l'adénovirus sous le contrôle du promoteur MLP d'adénovirus. Le plasmide pCMVcat exprime le gène CAT sous le contrôle du promoteur du gène immediate early (IE) du cytomégalovirus. La construction des plasmides conformes à l'Invention exprimant des séquences dérivées du VA I est décrite plus en détail dans les exemples qui suivent. CONSTRUCTION DES ADENOVIRUS RECOMBINANTS Les adénovirus porteurs des différents ARN-VA modifiés ont été construits par ligation entre 1) des plasmides intégrant 1'ITR de gauche de 1'adénovirus Ad5, les signaux d'encapsidation, les signaux activateurs du gène ElA, le gène VA I modifié et 2) la partie droite du génome d'Ad5 digéré par l'enzyme ClaI. Cette partie comporte le gène de type sauvage de l'ARN VAI (également dénommé ci-après VAI endo gène). Les produits de ligation ont été transfectés dans des cellules 293. Les plages de lyse ont été isolées 10 à 15 jours plus tard. Après amplification, le DNA léger a été extrait par la technique de HIRT [GLUZMAN et al., J. Virology, 45, p. 91-103, (1983)] et la conformité de la construction a été vérifiée par analyse de restriction. Par construction, ces adénovirus ont donc un phénotype Ela-, E1B+. DOSAGES DE L'ACTIVITE LUCIFERASE ET CAT Le dosage de l'activité CAT a été réalisé par un test ELISA (BOEHRINGER). Le dosage de l'activité luciférase a été effectué suivant une procédure standard (Kit Luciferase Assay System ; PROMEGA BIOTECH) en utilisant un compteur à scintillation. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE pVAemp ET DU VIRUS Ad-VAemp. Un plasmide pVAemp a été construit comme suit Un plasmide (pMLP-gI) similaire au plasmide pMLP10-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) a été utilisé. Le site EcoRI en position 0 de pMLPgI a été supprimé par digestion, remplissage des extrémités par le fragment de Klenow de l'ARN polymérase II, et religation. Les séquences de ce plasmide comprises entre le site SacII (nucléotide 352) et ClaI (nucléotide 2498) ont été délétées. La région 0-352 comprend l'ITR et les signaux d'encapsidation (nucléotides 0-352) du virus de l'Ad5. Ces derniers sont indissociables des signaux activateurs de la transcription du gène E1A (Elt I et II).En aval du site SacII ont été clonés - la partie 5' du gène VA I (nucléotides 1 à 77), comprenant les deux séquences promotrices intragéniques A et B, - un polylinker et - les signaux de fin de transcription du gène EBER I du virus Epstein-Barr. Ces séquences (222 pb) ont été isolées par clivage NsiI du plasmide VApIEBER (Origine T. Ragot Unité des virus oncogènes, CNRS, Villejuif ; ce plasmide est similaire, en ce qui concerne la région comprenant les séquences EBER I, à celui décrit dans la publication de VENTURA et al., [Nucl. Acid Res. 21, 14, 3249-3255(1993)]). Le plasmide pVAemp est schématisé à la Figure 2. Légende de la Figure 2 ITR : séquence terminale inversée gauche de l'Ad5 Elt I, Elt II : signaux activateurs du gène E1A AI à AV : signaux d'encapsidation de l'adénovirus type 5 TTTT signal de fin de transcription du gène EBER I du virus Epstein-Barr Les chiffres non entourés correspondent à la séquence de 1'Ad5. Les chiffres entourés renvoient à la séquence du VA I (nucléotide 1 initiation de la transcription). Le plasmide pVAemp contenu dans la souche DH5 de E. coli a été déposé le 16 Janvier 1996, sous le numéro I-1655 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, à Paris. Le virus Ad-VAemp a été construit par digestion du plasmide pVAemp par AatII et AccI et ligation avec le fragment droit du génome d'adénovirus Ad-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) digéré au site ClaI. Le produit de ligation est transfecté dans des cellules 293, et les virus recombinants sont isolés comme décrit ci-dessus, à la partie "Matériels et Méthodes". EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE n-VArib ET DU VIRUS Ad-VArib Le plasmide p-VArib a été construit en clonant la séquence d'un ribozyme de 1'ARNm du gène CAT (représentée à la figure 3, ainsi que dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 1) au site EcoRI-HindIII du lieur multi-sites de pVAemp. Le virus Ad-VArib a été construit par digestion du plasmide p-VArib par NarI-DraI, et ligation du fragment NarI-DraI de 1061 pb avec le fragment droit du génome d'adénovirus Ad5 digéré au site ClaI. Légende de la Figure 3 Caractères gras : séquences insérées dans le lieur multi-site de pVAemp Caractères italiques . séquences ou séquences complémentaires des amorces ayant servi à réaliser la RT PCR de détection de l'expression du gène Boîtes A et B : séquences promotrices intragéniques du VA I Les séquences des sites de restriction ayant servi pour la construction sont soulignées. La fonctionnalité du vecteur d'expression de 1'ARN VArib a été vérifiée par RT-PCR (rétrotranscription suivie d'amplification par PCR) dans les cellules HeLa infectées par Ad-VArib. Un contrôle a été effectué en utilisant comme témoin le virus Ad-gD. Ce dernier virus est défectif pour le gène E1A, et intègre en partie gauche, à la place des séquences dérivées de VA I, le gène gD du virus de la pseudorage. Les amorces utilisées sont les suivantes (ces amorces sont également indiquées sur la figure 3) Gauche : 5' AGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTG 3 Droite : 5' AAAACATGCCGACCACCAGGGGT 3' Ces amorces permettent l'amplification de la totalité des 198 bases de 1'ARN Varib. Un produit d'amplification de 198 pb est en effet observé pour le recombinant Ad-VArib. Au contraire, le virus Ad-gD donne un résultat négatif. Un témoin réalisé en omettant la phase de rétrotranscription s'est révélé négatif, ce qui permet de vérifier que le signal obtenu pour Ad-VArib ne résulte pas d'une amplification des séquences de l'ADN viral. EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE P-VAie ET DU VIRUS Ad-VAie Le plasmide p-VAie a été construit en clonant une séquence antisens de l'ARNm du gène IE (immediate early) du virus de la maladie d'Aujeszky (représentée figure 3, ainsi que dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 2) entre les sites SmaI et HindIII du lieur multi-sites de pVAemp. Le virus Ad-VAie a été construit par digestion du plasmide p-VAie par AatII-AccI et ligation du fragment AatII-AccI de 1204 pb avec le fragment droit du génome d'adénovirus Ad5 digéré au site ClaI. EXEMPLE 4 : AUGaaENTATION DU NIVEAU D'EXPRESSION DE GENES HETEROLOGUES PAR LE VIRUS Ad-VArib Dans une première étude, le niveau d'expression du gène CAT dans des cellules infectées par Ad-VArib a été quantifié. Dans la mesure où il était initialement attendu un clivage de l'ARNm de CAT synthétisé après l'infection par le virus Ad-VArib, la stratégie suivante a été utilisée une lignée cellulaire Hela exprimant le gène CAT sous le contrôle d'un promoteur inductible, à savoir le promoteur de la métallothionine murine (mMT) a été construite, et un clone cellulaire résistant à l'hygromycine a été isolé. Des cellules de ce clone ont été trypsinées puis infectées à une multiplicité d'infection de 100 TCID50/cellule, soit par Ad-VArib, soit par Ad VAemp utilisé à titre de témoin. Seize heures après l'infection (TO), la synthèse de CAT a été induite par addition de métaux lourds (concentration finale : ZnCl2 100 ssM, CdCL2 1 UM). La synthèse de CAT a été suivie au cours du temps et comparée à celle des mêmes cellules en l'absence d'infection virale. La figure 4 présente les résultats obtenus. Il apparaît clairement une augmentation du niveau de synthèse de CAT de 12,5x dans les cellules infectées par Ad-VArib par rapport aux cellules non infectées. Dans les mêmes conditions, le virus Ad-VAemp, contenant uniquement les 77 premiers nucléotides du VA I provoque une augmentation de synthèse de 7,5x. En l'absence d'induction par les métaux lourds, les virus Ad-VArib et Ad-VAemp ont permis respec tivement une augmentation de 29x, et de 5x du niveau de synthèse de la CAT. Il est donc apparent que les virus Ad-VArib et, à moindre titre, Ad-VAemp, sont capables d'augmenter la synthèse de protéines. EXEMPLE 5 : AUGMENTATION DU NIVEAU D'EXPRESSION DE GENES HITIROLOGUIS PAR LA CONSTRUCTION pVArib EN DEHORS D'UN CONTEXTE VIRAL. Pour déterminer les séquences nécessaires pour augmenter le niveau d'expression de gènes hétérologues, 2x106 cellules HeLa ont été cotransfectées par le plasmide pMLP-luc contenant le gène luciférase sous le contrôle du promoteur MLP, et les différents plasmides pVArib, pVAemp, et à titre de contrôle pMLPCAT. 72 heures plus tard, les cellules ont été prélevées et l'activité luciférase a été quantifiée. Les résultats sont présentés dans le Tableau I ci-dessous. TABLEAU I Plasmides Luciférase (pg/106 cellules) pVArib + pMLP-luc 5000 pVAemp + pMLP-luc c60 pMLPCAT + pMLP-luc 1560 Ces résultats montrent une augmentation importante (3,2x) du niveau de synthèse de la luciférase par le plasmide pVArib, alors que le plasmide pVAemp induit un effet inhibiteur. EXEMPLE 6 : INFLUENCE DU VA I ENDOGENE ET DE SEOUENCES EXOGENES DE VA I SUR L'AUGMENTATION DE LA SYNTHESE DE PROTEINES Les Inventeurs ont effectué des essais comparatifs, en utilisant diverses constructions de génotypes différents en co-infection avec un adénovirus (Ad-MLPluc) défectif pour la région ElA/ElB, et codant pour la luciférase sous le contrôle du promoteur MLP. Pour cette expérimentation, deux types de cellules ont été utilisées les cellules 293, qui permettent la réplication des virus défectifs pour la région E1A (et donc une expression du VA I endogène), et des cellules Vero, ne permettant pas la réplication des virus E1A-. 200 à 250000 cellules Vero ou 293 ont été soit infectées par 100 TCIDs0 de virus Ad-MLP-luc, soit coinfectées par 100 TCIDs0 de virus Ad-MLP-luc et 100 TCID50 de l'un des virus suivants . Ad-gD, Ad-VAemp, Ad-VAie Ad-VArib. Le virus Ad-gD, qui est dépourvu de séquences VA I exogène, permet d'évaluer l'effet induit par le VA I endogène. Les cellules 293 ont été récoltées 24 h après l'infection, soit à un moment où l'effet cytopathique est complet. Les cellules Vero ont été récoltées 4 jours après l'infection. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Ad- Ad- Ad- Ad Ad- MLPluc + MLPluc + MLPluc + MLPluc + MLPluc Ad-gD Ad-VAemp Ad-VAie Ad-Varib VA I endogène + + + + + VA I exogène - - +(emp) +(ie) +(rib) Cellules 293 7560 10160 1260 3400 3600 Cellules Vero 1075 2025 2975 10450 Les signes + ou - sur la deuxième et la troisième ligne du tableau indiquent l'existence, dans les cellules transfectées, de VAI endogène ou de VAI exogène (on entend ici par VA I exogène les séquences VA I clonés en partie gauche du virus, et qui ne sont pas à l'emplacement habituel des séquences VA I). Les chiffres de la quatrième et de la cinquième ligne indiquent la quantité (en ng) de luciférase synthétisée pour 106 cellules. Ces résultats montrent que * Dans les cellules 293, la présence des séquences VA I exogène n'a pas d'effet positif sur la synthèse de luciférase. Ceci peut s'expliquer par le fait que le VA I endogène (ici celui du virus Ad-MLP-luc) qui s'exprime essentiellement en phase tardive de l'infection, suffit à l'augmentation du niveau de traduction des ARNm. Au contraire, les trois virus Ad-VAemp, Ad VAie et Ad-VArib semblent avoir un effet négatif (peut être en raison d'une dérégulation des étapes du cycle viral) sur la production de luciférase. * Dans les cellules Vero, les séquences VA I exogènes ont un effet positif net sur l'expression de luciférase. Les constructions Ad-VAemp et AD-VAie permettent un doublement de la synthèse de luciférase (1,9 à 2,8x) par rapport à Ad-gD. La comparaison des résultats entre le virus témoin Ad-gD et Ad-VArib montre une augmentation de la synthèse de luciférase d'environ 10 fois en faveur de ce dernier. Il doit être noté que les résultats illustrant la co-infection Ad-MLP luc + Ad-gD montrent déjà un effet positif important sur la synthèse de luciférase, bien que les deux virus Ad-MLP-luc et Ad-MLP-gD possèdent strictement le même gène VA I, qui ne s'exprime que très faiblement en phase précoce. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cet effet - La co-infection par les deux virus conduirait à une meilleure efficacité d'internalisation dans la cellule : en effet, 1'adénovirus est internalisé par un mécanisme d'endocytose médié par un récepteur (intégrines) qui interagit avec la protéine penton-base. Ce mécanisme est suffisant pour permettre la co internalisation de molécules (par exemple de l'ADN) délivrées en association avec l'adénovirus. Il est donc possible d'envisager que l'internalisation d'un virion permettrait l'internalisation d'autres virions non liés directement au récepteur cellulaire. - Alternativement, l'expression du gène E1B (qui est fonctionnel dans les constructions Ad-gD, Ad VArib, Ad-VAemp et Ad-Vaie mais délété dans la construction Ad-MLP-luc) pourrait augmenter la transcription en phase précoce du VA I endogène des différents virus impliqués dans les expériences de co-infection [SOLLERBRANT et al., J. Virol., 67, p. 4195-4204, (1993)]. La protéine E1B stabiliserait également l'ADN introduit, avec un effet indirect sur le niveau d'expression mesuré [HERRMANN et MATHEWS, Mol. Cell. Biol., 9, p. 5412-5423, (1989)]. Par contre, la protéine E1B n'ayant pas d'effet activateur connu sur le MLP, il est peu probable que la transcription du gène luciférase ait été augmentée [HERRMANN et al., Oncogène, 2, p. 25-35 (1987)]. - Enfin, il est possible que l'ARN VA I soit plus efficace lorsqu'il est délivré en trans plutôt qu'en cis. EXEMPLE 7 : ETUDE DE L' INFLUENCE DU PROMOTEUR ET DES SEOUENCES LEADER SUR L'AUGMENTATION DE L'EXPRESSION D'UN GENE EN PRESENCE DE SEOUENCES DERIVEES D'ARN VAI Les expérimentations relatées dans les exemples 4 à 6 ci-dessus permettent de conclure que l'effet d'augmentation de la synthèse de protéines ne dépend pas de la région codante puisque des résultats comparables ont été obtenus pour la luciférase et la CAT. Il a également été recherché si l'effet d'augmentation de la synthèse de protéines était dépendant du promoteur contrôlant la transcription du gène hétérologue et/ou de la présence des séquences leader non traduites dans les ARNm viraux tardifs. Le plasmide pCMV-CAT contient le gène CAT sous le contrôle du promoteur du gène "immediate early" (IE) du cytomegalovirus (et donc en l'absence des séquences leader de l'adénovirus). 2x106 cellules HeLa ont été cotransfectées par le plasmide pCMV-CAT, et l'un des plasmides pVArib, pVAemp, ou à titre de contrôle, pMLP-luc. 72 heures plus tard, les cellules ont été prélevées et l'activité luciférase a été quantifiée. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-dessous. Tableau III Plasmides CAT (pu/106 cellules) pCMV-CAT +pVArib > 500 pCMV-CAT +pVAemp 185 pCMV-CAT +pCMV-luc 65 On observe une augmentation importante (supérieure à 7,7x) du niveau de synthèse de la protéine CAT par le plasmide pVArib, alors que le plasmide pVAemp induit un effet plus limité (2,8x). Ces résultats démontrent que l'effet observé n'est pas dépendant de la présence du promoteur MLP ni de celle des trois séquences leader non traduites des ARNm tardifs de 1'adénovirus. LISTE DE SEQUENCES INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 194 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGCACTCTTC CGTGGTCTGG TGGATAAATT CGCAAGGGTA TCATGGCGGA CGACCGGGGT 60 TCGAACCCCG GATCCCCCGG GCAAAATTCG AGCAACTCTG ATGAGTCCGT GAGGACGAAA 120 CTGAAATGGA TCCTCTAGAG TCGACCTGGA GCCCAAGCTT ATCGATTTCG AACCCCTGGT 180 GGTCGGCATG TTTT 194 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 217 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGCACTCTTC CGTGGTCTGG TGGATAAATT CGCAAGGGTA TCATGGCGGA CGACCGGGGT 60 TGGAACCCCG GATCCCCCGA CTGCAGGCCG CGCGCCGGGA GCCCTGGCTG CCGCCGTCGG 120 GGCCGGACGC GATGCCCTCT TCCTCGGCCG GGGCGGCGGC CGCCAGGAGC TGGTTCGAAG 180 CTTATCGATT TCGAACCCCT GGTGGTCGGC ATGTTTT 217 REVENDICATIONS 1) Construction d'ADN recombinant qui comprend au moins les éléments suivants, dans le sens 5'-3': - une séquence d'ADN S1 comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III - une séquence S2 dont le produit de transcription peut former une structure similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus; - une séquence d'ADN S3, S1 S2 et S3 étant fusionnées pour former une séquence différente de la séquence naturelle du gène d'un ARN VA I d'adénovirus. 2) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 1 caractérisée en ce que S3 comprend au moins un site de restriction pour le clonage d'une séquence d'ADN hétérologue. 3) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 2 caractérisée en ce que S3 comprend en outre une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par 1'ARN polymérase III. 4) Construction d'ADN recombinant caractérisée en ce qu' elle comprend au moins les éléments suivants dans le sens 5'-3' - au moins une séquence d'ADN qui constitue un élément activateur de transcription PolII; - une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III et au moins une séquence dont le produit de transcription peut former une structure similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus (il s'agit en particulier de toute séquence dont le transcrit peut adopter la même structure que les nucléotides 54-72 du gène d'un ARN VA I) ; et - une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription. 5) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant qu'élément activateur de transcription Polît, les signaux activateurs de la transcription du gène E1A d'adénovirus. 6) Construction d'ADN recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins - les nucléotides 0 à 352 de l'adénovirus Ad5 - les nucléotides 1 à 77 du gène VA I de l'adénovirus Ad2 - le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr. 7) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences représentées dans la liste de séquence en annexe, sous les numéro SEQ ID NO: 1, et SEQ ID NO: 2. 8) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pVAemp déposé le 16 Janvier 1996 auprès de la CNCM sous le numéro I-1655. 10) Vecteur recombinant selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant. 11) Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il résulte du clonage d'une construction selon une quelconque des revendications 1 à 7, dans un adénovirus qui comprend déjà une copie d'un gène VA I 12) Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il résulte du clonage d'une cons truction selon une quelconque des revendications 1 à 7, dans un adénovirus défectif pour le gène VA I. 13) Utilisation d'une construction d'ADN recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'obtention d'un vecteur permettant d'augmenter l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule-hôte. 14) Vecteur permettant d'augmenter l'expres- sion d'un gène d'intérêt dans une cellule-hôte de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 7, et une construction d'ADN comprenant le gène d'intérêt que l'on souhaite exprimer, plaçé sous contrôle d'un promoteur approprié. 15) Construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'utilisation comme médicament. 15) Vecteur selon une quelconque des revendications 8 à 12, ou selon la revendication 14, pour l'utilisation comme médicament. 16) Utilisation d'une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 7, pour la production in vitro de protéines d'intérêt dans des cultures de cellules. 17) Utilisation d'un vecteur selon une quelconque des revendications 8 à 12, ou selon la revendication 14, pour la production in vitro de protéines d'intérêt dans des cultures de cellules.