FR 2752733 A1 19980306 FR 9610851 A 19960905 DISPOSITIF PERMEABLE A BASE D'HYDROGEL CONTENANT DES CELLULES VIVANTES, ET SES APPLICATIONS. La présente invention est relative à des dipositifs renfermant des cellules vivantes, utilisables pour l'administration de molécules d'intérêt, et en particulier pour l'administration de cytokines antiinflammatoires dans le traitement de maladies autoimmunes, telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR). Dans les maladies auto-immunes, telles par exemple que la polyarthrite rhumatoïde (PR), les cytokines proinflammatoires (en particulier IL-1, TNF-a, IL-6) jouent un rôle prépondérant dans l'activation des mécanismes commandant l'inflammation [WILLIAMS et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, p 9784 (1992) ; THORBECKE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, p 7375 (1992) VAN DEN BERG et ai., Clin. Exp. Immunol.,95, p 237, (1994) . PIGUET et al., Immunoiogy, 77, p 510, (1992)]. En revanche, les cytokines anti-inflammatoires, telles par exemple que L'IL-4, pourraient jouer un rôle inhibiteur important. L'IL-4 inhibe in vitro la production d'IL-1, de TNF-a et d'IL-6. I1 a également été montré que l'injection d'IL-4 recombinante purifiée améliorait chez la souris l'arthrite expérimentale au collagène (AEC) qui est un modèle animal de la PR [MARCELLETTI et al. J. Immunol. 147, p 4185(1991)]. Cette amélioration n'était toutefois observée que lorsque 1'IL- 4 était administrée à un stade relativement tardif de la maladie, lorsque les signes cliniques de celle-ci étaient déjà bien installés ; une administration à un stade plus précoce, c'est à dire immédiatement après l'apparition des signes cliniques, n'avait pas la même efficacité. Une autre cytokine, 1'IL-13 [MINTY et ai., Nature, 362 p. 248, (1993)], qui, comme l'IL-4, est produite par les lymphocytes Th2, présente avec celle-ci de nombreuses similitudes, par exemple au niveau de l'activité sur les monocytes et les cellules B [ZURAWSKI et DE VRIES, Immunol. Today, 15, p. 19, (1994)]. En particulier, ces deux cytokines inhibent la production de cytokines proinflammatoires, tout en activant la sécrétion d'un antagoniste de l'IL-1 (IL-lra). En revanche, contrairement à IL-4, IL-13 n'a pas d'action sur les lymphocytes T. CASH et al. [J. Immunol., 153, p. 4258, (1994)], ont étudié l'effet de l'IL-l3 sur l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), chez le rat et ont observé une atténuation des symptômes cliniques et histologiques de 1'EAE chez les animaux ayant reçu une injection de cellules CHO transfectées sécrétrices d'IL13. L'utilisation de cellules transfectées exprimant des cytokines ou d'autres substances à potentialité thérapeutique, pour administrer ces substances, fait l'objet d'un grand intérêt. L'un des principaux problèmes posés par cette utilisation résulte du fait qu'il s'agit le plus souvent de cellules xénogéniques ou allogéniques, dont l'implantation in vivo engendre une réponse de l'hôte qui aboutit à une réaction de rejet. Pour protéger les cellules implantées contre cette réaction, il a en particulier été proposé de les encapsuler dans des matériaux biocompatibles, préalablement à leur implantation. SAVELKOUL et al., [Journal of Immunological Methods, 170, p.185, (1994)] ont ainsi étudié ltencapsulation de cellules transfectées exprimant de 1'IL-4, de lIL-5, ou de l'IFN-y, ainsi que celle de cellules d'hybridomes dans des billes d'alginate. Ils ont constaté que, dans ces conditions, les cellules implantées demeuraient viables et capables de produire des cytokines ou des anticorps pendant environ 2 à 3 semaines. Ils indiquent également que la quantité de cytokines IL-4, ou d'IFN-7 produite par ces implants in vivo est suffisante pour que ces cytokines exercent un effet régulateur sur la formation d'IgE. Toutefois, aucune observation concernant d'autres effets immunomodulateurs de ces cytokines dans ces conditions n'est effectuée. Les Inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau système permettant l'administration de molécules d'intérêt, comme par exemple des cytokines telles que lBIL-4 et lIL-13, par implantation de cellules transfectées exprimant lesdites molécules. Ce système utilise comme matériau d'encapsulation, un hydrogel d'un copolymère d'acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements anioniques. Des hydrogels convenant tout particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention sont décrits dans la Demande EP 0347 267, où ils sont définis comme étant biologiquement inertes, possédant une structure microporeuse, une capacité ionique comprise entre 0 et 500 mEq/kg de gel, et présentant une aptitude à une déformation permanente sous contrainte, même à une température inférieure à 400C. La Demande EP 0347 267 décrit leur utilisation pour l'obtention d'objets à usage médical ou chirurgical, et en particulier d'implants oculaires ; aucune utilisation de ces hydrogels pour l'encapsulation de cellules vivantes xénogéniques ou allogéniques, et/ou l'encapsulation de cellules vivantes de manière à permettre la diffusion, à travers la paroi emprisonnant les cellules, de molécules d'intérêt produites par celles-ci, n'est suggérée. La présente invention a pour objet un dispositif pour l'administration in vivo de molécules d'intérêt exprimées par des cellules vivantes, dans lequel lesdites cellules sont entourées d'une paroi les séparant du milieu extérieur, lequel dispositif est caractérisé en ce que ladite paroi est constituée par un hydrogel non réticulé, d'un polymère d'acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements anioniques. Pour l'obtention d'un dispositif conforme à la présente invention, on utilise par exemple un hydrogel d'un copolymère d'acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium. Avantageusement, cet hydrogel a une teneur en eau comprise entre 70 et 90%. Préférentiellement, l'épaisseur de paroi du dispositif est comprise entre 0,05 et 0,15 mm. Selon un mode de réalisation préféré d'un dispositif conforme à la présente invention, ledit dispositif a la forme d'un tube, de section cylindrique ou en forme d'ellipse plus ou moins aplatie, dont la paroi est constituée par l'hydrogel défini ci-dessus. Avantageusement, ce tube est enroulé pour former une structure en forme de ressort. Les dimensions extérieures de cette structure peuvent varier, essentiellement selon la taille de l'hôte auquel le dispositif est destiné, et la dose de molécules actives que l'on souhaite administrer ; généralement, le diamètre extérieur du tube sera de l'ordre d'environ un millimètre à quelques millimètres, et sa longueur de quelques centimètres à quelques dizaines de centimètres ; le diamètre des spires de la structure pourra être de l'ordre d'environ un centimètre à quelques centimètres. Cette forme de dispositif peut être implanté chez l'hôte en un site précis, et y demeurer, contrairement aux implants sous forme de micro-capsules qui ont tendance à se disséminer en dehors du site d'implantation ; ceci permet en particulier de le retirer commodément lorsqu'on le souhaite. En outre, la quantité de cellules introduites, et donc de molécules actives administrées peut être contrôlée en choisissant les dimensions du dispositif. Il permet donc un meilleur contrôle du traitement que les implants sous forme de micro-capsules connus dans l'art antérieur. Les dispositifs conformes à la présente invention sont particulièrement bien adaptés à l'administration de molécules diffusibles produites par les cellules qu'ils contiennent. Ils sont en particulier utilisables pour l'administration de diverses molécules d'intérêt thérapeutique, dont la nature dépend du type de cellules contenues dans le dispositif. Selon un mode de réalisation préféré d'un dispositif conforme à la présente invention, il comprend au moins une souche de cellules produisant une cytokine, telle qu'en particulier, l > IL-4 ou lIL-13. Les Inventeurs ont étudié, sur l'arthrite expérimentale au collagène induite chez des souris, l'action de 1'IL-4 et celle de 1'IL-13 produites par des cellules xénogéniques (fibroblastes CHO) transfectées par le gène de l'une ou l'autre de ces cytokines. Ces cellules transfectées ont été soit injectées directement à l'animal receveur, soit emprisonnées dans des dispositifs conformes à l'invention, qui ont été implantés chez l'animal receveur. Les Inventeurs ont ainsi constaté que 1'IL-13 pouvait, comme 1'IL-4, réduire l'inflammation articulaire dans un modèle expérimental de PR, et qu'en outre, l'administration systémique de l'une ou l'autre de ces cytokines en utilisant des cellules transfectées, permet d'obtenir une efficacité thérapeutique réelle au niveau des lésions inflammatoires du tissu articulaire. Ces résultats permettent de proposer l'utilisation de cellules transfectées exprimant l'IL-4, et/ou de cellules transfectées exprimant 1'IL-13, pour le traitement de la PR. Lorsque les cellules transfectées sont introduites dans des dispositifs conformes à l'invention, elles se développent in vitro, et sécrètent normalement les cytokines IL-4 et IL-13, pendant au moins 30 jours environ. In vivo, l'utilisation de ces implants permet également de maintenir une concentration active de cytokines chez l'animal récepteur pendant une durée plus longue que dans le cas des cellules directement injectées. Ceci montre que les dispositifs conformes à l'invention permettent une administration efficace de molécules biologiques actives par l'intermédiaire de cellules vivantes exprimant ces molécules. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation de cellules transfectées produisant de l'IL-4 ou de l'IL-13, libres ou encapsulées dans des dispositifs conformes à l'invention, pour traiter l'arthrite expérimentale au collagène induite chez des souris. EXEMPLE 1 : REALISATION DE TUBES D'HYDROGEL. 1) Préparation de la solution Dans un récipient en verre, couvert pour éviter l'évaporation du solvant, et placé dans un bain-marie à 600C, on prépare, sous agitation, une solution à partir des 3 composants suivants - 6% de copolymère d'acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium (copolymère AN69, sous forme d'extrait sec, commercialisé par la société HOSPAL) - 91% de diméthylsulfoxide (DMSO) - 3% de NaCl à 0,9t dans l'eau (sérum physiologique). Le copolymère d'acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium est d'abord dissous dans DMSO, puis on introduit la solution de Nazi. On laisse refroidir à température ambiante, et on homogénéise afin d'éliminer les microbulles d'air qui auraient pu se former. 2) Réalisation des tubes a) Coextrusion de la solution, et d'une solution de NaCl à 0,9t dans l'eau. Les tubes sont préparés par coextrusion de la solution obtenue en 1), et d'une solution de NaCl à 0,9W dans l'eau, au travers d'une filière métallique constituée de 2 aiguilles coaxiales creuses. L'aiguille centrale a un diamètre interne de 0,5 mm et un diamètre externe de 0,85 mm ; l'aiguille périphérique a un diamètre interne de 1,1 mm et un diamètre externe de 1,4 mm. La solution obtenue en 1) est injectée dans l'aiguille périphérique, pendant que l'on injecte simultanément dans l'aiguille centrale la solution de NaCl à 0,9W dans l'eau, maintenue à une température de 40C. La solution sortant de l'aiguille périphérique se gélifie au contact de la solution de NaCl sortant de l'aiguille centrale, formant ainsi un tube. Ce tube est immédiatement immergé dans un bain de coagulation, constitué par du sérum physiologique maintenu à une température de 40C. Le tube entièrement gélifié est ensuite enroulé en forme de spires. b) Transformation du gel en hydrogel Le bain de coagulation est remplacé à plusieurs reprises par un bain frais, afin de permettre le relargage du DMSO, et son remplacement par le sérum physiologique. Cet échange permet la transformation du gel en hydrogel, totalement dépourvu de solvant. La teneur en eau de cet hydrogel est de 82 à 83%. EXEMPLE 2 : OBTENTION DE LIGNEES CELLULAIRES TRANSFECTEES, ET PREPARATION D'IMPLANTS. 1) Lignées cellulaires Des fibroblastes CHO (Chinese hamster ovary) ont - été transfectés avec de l'ADNc d'IL-13 murine [CHERWINSKI et al., J. Exp. Med., 166, p. 1229 (1987)], préalablement cloné dans un vecteur d'expression dérivé de pSEl, et comprenant le promoteur SV40, selon le protocole décrit précédemment par MINTY et al. [Eur. Cytokine Netw.,.4, p. 99 (1993)] pour MCP-3. Des fibroblastes CHO transfectés avec de l'ADNc d'IL-13 humaine [MINTY et al., Nature, 362 p 248 (1993)], d'IL-4 murine [PLATZER et al., Eur. J. Immunol., 22, p 1729 (1992)], ou d'IL-2, ont été obtenus de la même manière. Ces cellules seront respectivement dénommées ci-après CHO/mIL-13, CHO/hIL-13, CHO/mIL-4 et CHO/IL-2. Les cellules CHO/mIL-13 et CHO/mIL-4 produisent environ 10 ng/106 cellules/24h de cytokine. Des cellules CHO transfectées par le gène de la ss-galactosidase (CHO/ss-gal) sont utilisées comme contrôle. Les lignées cellulaires sont cultivées sur milieu RPMI 1640 supplémenté avec de la glutamine, 7% de SVF (sérum de veau foetal), et 1% de Pénicilline :streptomycine. 2) Encapsulation des cellules dans des tubes d'hydrogel, et culture des cellules encapsulées. Des tubes d'hydrogel de 40 cm de longueur, 1 mm de diamètre extérieur, 0,1 mm d'épaisseur de paroi, et 1,5 cm de diamètre de spire, préparés comme décrit à l'exemple 1 ci dessus, ont été utilisées. Les cellules CHO transfectées par les gènes IL-4, IL-13 ou IL-2, ou par le gène de la ss-galactosidase, obtenues comme décrit ci-dessus, ont été ensemencées stérilement, à différentes concentrations cellulaires, à l'intérieur des tubes d'hydrogel, à l'aide d'une seringue pourvue d'une aiguille de 0,45 mm de diamètre. Les tubes ont été refermés aux deux extrémités par des clips microchirurgicaux en titane, puis placés dans le milieu de culture indiqué en 1) ci-dessus. L'observation directe au microscope des cellules encapsulées a montré que les cellules ensemencées à une concentration de 2.5 x 106/ml étaient viables après 35 jours de culture. 3) Cinétique de production de l'IL-4 par les cellules CHO/IL-4 encapsulées et cultivées in vitro. Les cellules CHO/IL-4 ont été encapsulées et cultivées dans les conditions décrites ci-dessus, dans 10 ml de milieu de culture. L'IL-4 relarguée dans le surnageant a été dosée par ELISA (kit ELISA IL-4m DUOSET, GENZYME) à différents temps après l'encapsulation. Les résultats sont illustrés par la figure 1, qui montre que 1'IL-4 est détectée dans le milieu à partir du 5eme jour et qu'elle est présente, à une concentration d'environ 100 pg/ml, au moins jusqu'au 26ème jour après encapsulation. 4! Cinétique de production de cytokine IL-2 par des cellules CHO/IL-2 encapsulées et implantées in vivo. La cinétique de relargage in vivo après implantation intrapéritonéale de cellules CHO transfectées et encapsulées dans les tubes d'hydrogel, a été étudiée en utilisant des cellules CHO transfectées par le gène de l'IL-2 (CHO/IL-2) ; en effet cette cytokine est produite en quantité très importante par ces cellules, et est donc facilement détectable dans le sérum des animaux. 5 x 105 cellules CHO/IL-2 ont été ensemencées dans les tubes d'hydrogel et mises en culture in vitro, comme décrit ci-dessus. Après 6 jours de culture, les tubes ont été implantés dans la cavité péritonéale de souris DBA/1 (souche sensible à l'arthrite au collagène) de 20 g, préalablement anesthésiées avec 500 tkl d'avertine. Le plasma des souris a été prélevé différents temps après l'implantation, et la quantité d'IL-2 présente déterminée par ELISA. Le groupe témoin était constitué de souris ayant reçu une injection sous-cutanée de 4 x 105 cellules CHO/IL-2. Les résultats sont illustrés par la figure 2, qui montre que l'IL-2 est détectable dans le plasma des animaux ayant reçu l'implant jusqu'à au moins 8 jours après implantation (figure 2b), alors-qu'après 48 heures on ne la détecte plus chez les animaux ayant reçu l'injection de cellules non encapsulées (figure 2a). EXEMPLE 3 : TRAITEMENT DE L'ARTHRITE AU COLLAGENE PAR LES CELLULES CHO/IL-4 OU CHO/IL-13, LIBRES OU ENCAPSULEES DANS LES IMPLANTS CONFORMES A L'INVENTION. 1) Induction de l'arthrite L'arthrite a été induite par immunisation des souris par une première injection (J0) de 100 ssg de collagène de type II natif émulsionné dans de l'adjuvant eme complet de Freund, suivie d'un rappel au 21 jour par injection de 100 Zg de collagène de type II natif dans de l'adjuvant incomplet de Freund ; dans ce modèle d'arthrite au collagène chez la souris, la maladie se développe 35 jours après l'immunisation, sous la forme d'un gonflement et d'une déformation des articulations des pattes. L'examen clinique des souris permet l'évaluation régulière du phénomène, en établissant un "score arthritique, défini par la somme des atteintes de chaque articulation évaluée de 0 à 4 : 0 (normal), 1 (érythème), 2 (gonflement), 3 (déformation), 4 (nécrose), le total maximum étant de 40. 2) Traitements 2.1 - Cellules non-encapsulées Les souris ont reçu en 2 injections souscutanées (l'une 10 jours, et la seconde 25 jours apres la première injection de collagène de type II), soit 106 cellules CHO/ss-gal (groupe contrôle : 7 animaux), soit 106 cellules CHO/mIL-13 (10 animaux), CHO/hIL-13 (10 animaux), ou CHO/mIL-4 (10 animaux). 2.2 - Cellules encapsulées dans les tubes d'hydrogel Entre 10 et 13 jours après la première injection de collagène de type II, les souris ont reçu, par implantation intra-péritonéale, comme décrit à exemple 2, des tubes d'hydrogel contenant 5 x cellules CHO/mIL-4 (12 animaux), CHO/mIL-13 (10 animaux), ou préalablement cultivées in vitro pendant 9 jours. Les groupes témoins étaient constitués de souris recevant des tubes vides (6 animaux) ou des tubes contenant des cellules CHO/ss-gal (7 animaux). Les résultats sont illustrés par la figure 3, qui montre que les scores arthritiques des souris traitées par les 2 injections de cellules CHO/mIL-4 (figure 3a :H) ou CHO/mIL-13 (figure 3b :1), ou par l'implantation de tubes contenant les cellules CHO/mIL-4 (figure 3a :g) ou CHO/mIL-13 (figure 3b :g) sont significativement diminués (****/OOOO : p Les témoins ayant reçu les tubes contenant des cellules CHO/ss-gal ont un score arthritique similaire à celui des témoins ayant reçu les tubes vides. I1 a en outre été observé que le traitement par injection de cellules CHO/hIL-13 induisait également, bien que dans une moindre mesure, une diminution du score arthritique. Ces résultats montrent que l'administration systémique d'IL-4 ou d'IL-13 en utilisant des cellules transfectées encapsulées dans les implants conformes à l'invention, permet d'obtenir une diminution significative du score arthritique, et ce bien que la quantité de cytokines délivrée par les cellules transfectées soit relativement faible (mesurée in vitro, elle est de 10 ng/106 cellules/24h), et que les cellules soient administrées avant l'installation des signes cliniques. Ils montrent en outre que l'efficacité thérapeutique observée après une seule implantation (aux environs de J1o) de cellules transfectées encapsulées dans les tubes d'hydrogel est comparable à celle observée après 2 injections (à J1o et J25) de cellules transfectées libres. REVENDICATIONS 1) Dispositif perméable, pouvant être implanté dans un organisme vivant, comprenant des cellules vivantes entourées d'une paroi les séparant du milieu extérieur, lequel dispositif est caractérisé en ce que ladite paroi est constituée par un hydrogel obtenu à partir d'un polymère d'acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements anioniques. 2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite paroi est constituée par un hydrogel formé à partir d'un copolymère d'acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium. 3) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit hydrogel a une teneur en eau comprise entre 70 et 90%. 4) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite paroi a une épaisseur comprise entre 0,05 et 0,15 mm. 5) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il a la forme d'un tube. 6) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de cellules produisant une molécule d'intérêt, diffusible. 7) Dispositif selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite molécule d'intérêt est une cytokine. 8) Dispositif selon la revendication 7 caractérisé en ce que ladite cytokine est l'IL-4 ou 1'IL- 13. 9) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 8, pour l'administration in vivo de molécules d'intérêt exprimées par des cellules vivantes. 10) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 9, pour l'utilisation comme médicament. 11) Dispositif selon la revendication 7, pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.