FR 2742756 A1 19970627 FR 9515778 A 19951222 STABILISANTS POUR VACCINS VIVANTS, VACCINS LES CONTENANT ET PROCEDES POUR LEUR PREPARATION La présente invention concerne des agents stabilisants pour vaccins vivants monovalents ou multivalents, les vaccins stabilisés contenant ces agents ainsi que les procédés destinés à la préparation de tels vaccins. Les vaccins comprenant des virus vivants et plus particulièrement des virus vivants atténués présentent une importante fragilité dans leurs conditions de préparation et de stockage. On constate d'importantes chutes du titre viral pendant les étapes de lyophilisation, durant le stockage et aussi pendant les étapes de récolte du virus après culture. Etant donné l'importance du titre viral dans l'efficacité de l'immunisation, le recours à des agents stabilisants destinés à préserver au mieux le titre viral s'avère indispensable. Les agents stabilisants sont des composés chimiques et/ou biologiques que l'on peut ajouter aux vaccins aux différents stades de leur préparation en vue de maintenir un titre infectieux maximal lors de son utilisation qui peut parfois avoir lieu plusieurs années après le début du stockage. De nombreux composés ont été testés pour leur propriétés stabilisantes de différents vaccins contenant des virus vivants atténués. Les composés testés dans l'art antérieur (cf. par exemple US 3,783,098, US 3,915,794, EP 028,563), dont l'un des premiers fut le SPGA contiennent essentiellement de la sérum-albumine bovine ou humaine, de la caséine plus ou moins hydrolysée ou encore de la gélatine, éventuellement un sel de métal alcalin de l'acide glutamique, un sucre (glucose, saccharose, dextran), et un phosphate monométallique ou dimétallique de métal alcalin ou un de leurs mélanges. EP 065,905 décrit un composé stabilisant pour le vaccin contre la fièvre jaune qui comporte un ou plusieurs acides aminés choisis dans un groupe de onze acides aminés, du lactose, du sorbitol et une solution tampon phosphate (PBS). Toutes ces compositions présentent cependant des inconvénients majeurs. En premier lieu, elles contiennent des protéines ou des hydrolysats de protéines d'origine animale ou humaines (albumines...), qui représentent un risque biologique potentiel et ne constituent pas des composants chimiquement définis. Par ailleurs, les compositions de l'état de la technique ne confèrent pas une stabilité suffisante aux vaccins vivants atténués, ce qui rend les possibilités de stockage de tels vaccins limitées et leur éventuelle exposition lors de leur stockage ou lors de leur expédition à des températures élevées risquée. En effet, leur perte d'activité entraîne une vaccination inefficace et donc non protectrice en cas d'infection réelle.De plus, les compositions connues sont d'une efficacité encore plus limitée lorsqu'il s'agit de stabiliser les différentes valences d'un vaccin multivalent contenant différents virus. Le vaccin tétravalent MMRV (rougeole-oreillons-rubéole-varicelle) constitue ainsi un exemple de vaccin multivalent pour lequel il n'existe actuellement pas de stabilisant en adéquation avec les quatre valences. Les agents stabilisants selon l'invention ne présentent pas les inconvénients exposés cidessus. Ces agents stabilisants pour vaccins contenant un ou plusieurs virus vivants atténués, comprennent un ou plusieurs composants choisis dans chacun des groupes que sont les acides-aminés, les disaccharides, les polyalcools, et les solutions tampons, étant entendu que le groupe des disaccharides comprend au moins le saccharose. Dans l'agent stabilisant selon l'invention, le ou les éléments choisi(s) dans le groupe des disaccharides peut ou peuvent être présent(s) en proportion allant de 2 à 9 %. Avantageusement, le ou les éléments choisi(s) dans le groupe des disaccharides peut ou peuvent être présent(s) en proportion de 5%. Le groupe des polyalcools qui est un composant de l'agent stabilisant selon l'invention peut notamment comprendre le sorbitol et le mannitol. L'agent stabilisant selon l'invention peut comprendre le sorbitol et le mannitol. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend le sorbitol, celui-ci est préférentiellement présent dans une proportion allant de 2 à 6 %. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend le sorbitol, celui sera avantageusement présent dans une proportion allant de 3 à 5 %. De manière particulièrement avantageuse, le sorbitol pourra être présent en proportion de 5 %.Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend le mannitol, celui-ci sera préférentiellement présent dans une proportion allant de 1 à 2,5 %.Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend le mannitol, celui-ci sera avantageusement présent en proportion de 2,5 %. Le groupe des solutions tampons qui est un composant de l'agent stabilisant selon l'invention peut notamment comprendre les tampons phosphates et l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA). De manière avantageuse, L'agent stabilisant selon l'invention comprendra un tampon phosphate. L'agent stabilisant selon l'invention pourra comprendre en outre du Dextran. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend du Dextran, celui-ci sera préférentiellement présent dans une proportion allant de 1 à 4 %. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend du Dextran, celui-ci sera avantageusement présent en proportion de 3 %. L'agent stabilisant selon l'invention pourra comprendre en outre de l'urée, un des dérivés de l'urée ou un mélange de ceux-ci. Des exemples de dérivés de l'urée utilisables sont l'allyurée, I'acétamide, le méthylcarbamate ou le butylcarbamate. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend de l'urée, un des dérivés de l'urée ou un mélange de ceux-ci, celui-ci ou ceux-ci seront préférentiellement présents dans une proportion allant de 0,125 à 2 %. Dans le cas ou l'agent stabilisant selon l'invention comprend de l'urée, un des dérivés de l'urée ou un mélange de ceux-ci, celui-ci ou ceux-ci sera ou seront avantageusement présent(s) en proportion de 0,5 %. Le pH des compositions selon l'invention sera préférentiellement ajusté en fonction du ou des virions à stabiliser. L'ajustement du pH à 7 est notamment avantageux. De nombreux vaccins monovalents contenant essentiellement une espèce ou souche virale ou multivalent contenant plusieurs espèces ou souches virales peuvent être stabilisés avec les agents stabilisants selon l'invention. L'objet de l'invention réside aussi dans les vaccins stabilisés à l'aide des agents stabilisants susmentionnés. De tels vaccins stabilisés selon l'invention peuvent par exemple comprendre au moins un virus de la famille Herpesviridae. La famille Herpesviridae comprend notamment le virus de la varicelle, le cytomégalovirus et le virus herpès simplex. Le virus de la varicelle est particulièrement fragile et thermolabile lorsqu'on le compare à d'autres virus. Les agents stabilisants selon l'invention présentent donc tout leur intérêt lorsqu'il s'agit de stabiliser un virus aussi instable que celui de la varicelle. Les agents stabilisants selon l'invention sont applicables à d'autres virus, qui peuvent notamment être choisis parmi les Paramyxoviridae (morbillivirus dont la rougeole, le virus des oreillons, les virus parainfluen=a de types 1, 2, 3, 4, les pneumovirus, RSV), les Togaviridae (rubéole), et les virus influenza (A, B, C). Des mélanges obtenus à partir des virus précités ou d'autres virus et constituant des vaccins multivalents peuvent avantageusement être stabilisés à l'aide des agents stabilisants selon l'invention. On peut citer parmi les vaccins multivalents envisageables le vaccin Rougeole Oreillons-Rubéole. Dans le contexte des associations de valences, les agents stabilisants selon l'invention présentent en plus des avantages cités plus haut des propriétés intéressantes en ce que leur aptitude à stabiliser chacune des valences permet leur association. En effet, la combinaison d'agents infectieux de différentes maladies représente un progrès économique et pratique dans la mesure ou une prophylaxie permet de protéger contre plusieurs maladies contrairement aux vaccins monovalents.Cependant, la coexistence d'agents infectieux différents pose d'importants problèmes de compatibilité entre ces agents qui rend difficile une polyvaccination simultanée efficace. Les agents stabilisants selon l'invention apportent une solution à ces problèmes. La fabrication d'un vaccin tétravalent Rougeole-Oreillons Rubéole-Varicelle est une illustration de ces problèmes d'association vaccinale car trois des valences de l'association présentent une thermoinstabilité. Lorsqu'on utilise un agent stabilisant selon l'invention, on parvient à stabiliser et à conserver un pouvoir infectant suffisant pour chacune des quatre valences. De préférence, ces vaccins seront lyophilisés lorsque cela sera possible en vue d'améliorer encore la stabilité du vaccin final. Lors de la préparation de vaccins vivants lyophilisés lesdits vaccins seront de préférence mis en contact avec une quantité appropriée d'agent stabilisant selon l'invention. La mise en contact des virus avec l'agent stabilisant selon l'invention pourra être effectuée avant, pendant ou après la récolte desdits virus. La mise en contact sera avantageusement effectuée avant la récolte desdits virus. L'invention sera décrite de manière plus détaillée dans la suite de la description. A titre d'illustrations, nous avons choisi d'exposer en tant qu'exemples de réalisation de l'invention la préparation d'un vaccin monovalent varicelle stabilisé ainsi que celle d'un vaccin multivalent Rougeole-Oreillons-Rubéole-Varicelle stabilisé car les problèmes de stabilité et d'association y sont particulièrement affirmés. EXEMPLES Exemple : préparation d'un vaccin varicelle stabilisé selon l'invention La souche de varicelle attenuée utilisée pour la préparation d'un vaccin stabilisé selon l'invention est la souche OKA [Biken]. On prépare un stabilisant en utilisant les composants suivants qui sont mélangés dans de l'eau p.p.i (préparation pour injection) dans les rapports qui suivent: - Sorbitol 5 %. - Mannitol 2,5 %, - Saccharose 5 %, - Dextran70 3 %, - mélange d'acides aminés 0,4 %, - Urée 0.5 %, - EDTA 0,05 %, - Glutamate de sodium 0,05 %. La récolte ou libération des virus des cellules infectées est réalisée soit par désintégration cellulaire (sonication, cisaillement, hautes-pressions...) dans le stabilisant, soit spontanément dans le stabilisant. On obtient ainsi après clarification une suspension virale stabilisée. Les essais sont répartis après ajustement du titre par dilution en petits flacons puis lyophilisés suivant un cycle adapté. Tests de stabilité du vaccin obtenu. Les préparations lyophilisées à tester sont réhydratées et titrées. L'activité est déterminée par le nombre d'unités formant plages (pfù) à l'aide de la numération des effets cytopathogènes obtenus en boite de 25 cm2 pour differentes dilutions des essais. Le stabilisant-contrôle utilisé est un stabilisant traditionnel de type connu et correspondant pour exemple à celui décrit dans le brevet US 4.147.772. Stabilité comparée aux différentes phases de la préparation du vaccin. Titre (pfu/ml) Conditions et phases de test | Contrôle | Stabilisant selon Invention Pendant la récolte x x | x+ 1 log Après lyophilisation x x + 0,2 log Stockage 7 jours à 37 x x + 1,1 log Dans le tableau ci-dessus, x est le titre standard. Stabilité obtenue avec le stabilisant selon l'invention dans différentes conditions de stockage. Durée Perte de titre Durée Perte de titre Durée Perte de titre du stockage à 22.5 C du stockage à 5 C du stockage à -70 C (#pfu/dose) (#pfu/dose) (#pfu/dose) 1 mois 0,3 6 mois 0 9 mois 0,1 1.5 mois 0,3 12 mois 0,1 18 mois 0,3 2 mois 0,46 18 mois 0,15 30 mois 0,1 3 mois 0,54 24 mois 0,28 36 mois 0,06 30 mois 0,35 36 mois 0,4 Les valeurs indiquées dans le tableau ci-dessus ont été obtenues en réalisant une moyenne sur trois essais. Le stabilisant selon l'invention permet de maintenir le titre viral pendant les différentes phases de la préparation du vaccin ainsi que pendant son stockage, qui est ici testé à quatre températures différentes (37 OC, 22 OC, 5 OC, -70 C). Exemple 2 préparation d'un vaccin multivalent Rougeole-Oreillons-Rubéole-Varicelle stabilisé selon l'invention Les produits viraux concentrés rougeole, oreillons, rubéole et varicelle, conservés congelés à basse température sont décongelés puis mélangés extemporanément. Ce mélange est ensuite réparti entre les différents essais additionné de produit stabilisant selon l'invention exemplifié dans l'exemple 1 précédent. On procède ainsi de façon à obtenir les proportions de solutions finales suivantes : rougeole : 1,5 volume ; oreillons : 0,01 volume ; rubéole : 1,0 volume et varicelle : 2,5 volumes. Ces différentes proportions, indiquées par rapport aux exemples, peuvent varier, selon le titre des produits viraux concentrés et ne sont pas limitatives. Les essais sont répartis en petits flacons puis lyophilisés suivant un cycle standard. Les tests de stabilité sont réalisés en plaçant des flacons pendant 7 jours à 37 C ou 21 jours à 220C ou 30 moisà+40 C. Stabilité obtenue avec le stabilisant selon l'invention dans différentes conditions de stockage. Perte de titre par dose (log) ESSAIMS 7 jours à 37 C 14 jours à 22 C 21 jours à 22 C Rougeole 0,5 &num; 0 &num; 0 Oreillons 1 0,3 0,4 Rubéole 0,09 &num; 0 &num; 0 Varicelle 1 0,15 0,16 Essais Perte de titre par dose (log) à + 4 C Rougeole Oreillons Rubéole Varicelle 3 mois 0,37 0,33 0,23 0,03 6 mois &num; 0 0,03 0,16 0,06 9 mois 0,3 0,27 0,2 0,1 12 mois 0,1 0,36 &num; 0 &num; 0 18 mois 0,23 0,6 0,07 . 0,1 24 mois 0,33 0,34 0,07 0,3 30mois 0,63 0,43 0,4 0,25 On ne constate pas de perte significativement differente de celle obtenue pour les vaccir monovalents correspondants. Revendications 1. Agent stabilisant pour vaccins contenant un ou plusieurs virus vivants atténués, caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs composants choisis dans chacun des groupes suivants: - les acides-aminés, - les disaccharides, - les polyalcools, et les solutions tampons étant entendu que le groupe des disaccharides comprend au moins le saccharose. 2. Agent stabilisant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les éléments choisi(s) dans le groupe des disaccharides est ou sont présent(s) en proportion allant de2à9%. 3. Agent stabilisant selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ou les éléments choisi(s) dans le groupe des disaccharides est ou sont présent(s) en proportion de 5 %. 4. Agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupe des polyalcools comprend le sorbitol et le mannitol. 5. Agent stabilisant selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend du sorbitol et du mannitol. 6. Agent stabilisant selon l'une des revendications 4 à 5, dans lequel le sorbitol est présent en proportion allant de 2 à 6 %. 7. Agent stabilisant selon la revendications 6, dans lequel le sorbitol est présent en proportion de 5 %. 8. Agent stabilisant selon l'une des revendications 4 à 5, dans lequel le mannitol est présent en proportion allant de 1 à 2,5 %. 9. Agent stabilisant selon la revendication 8, dans lequel le mannitol est présent en proportion de 2,5 %. 10. Agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le groupe des solutions tampons comprend un tampon phosphate et de l'acide éthylène diamine tétraacétique. 11. Agent stabilisant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend un tampon phosphate. 12. Agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 1 1 comprenant du Dextran. 13. Agent stabilisant selon la revendication 12, dans lequel le Dextran est présent dans une proportion allant de 1 à 4 %. 14. Agent stabilisant selon la revendication 13, dans lequel le Dextran est présent en proportion de 3 %. 15. Agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 14 comprenant de l'urée, I'un de ses dérivés ou un mélange de ceux-ci. 16. Agent stabilisant selon la revendication 15, dans lequel l'urée, I'un de ses dérivés ou un mélange de ceux-ci est ou sont présent(s) dans une proportion allant 0,125 à 2 %. 17. Agent stabilisant selon la revendication 16, dans lequel l'urée, l'un de ses dérivés ou un mélange de ceux-ci est ou sont présent(s) dans une proportion de 0,5 %. 18. Agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 17, pour lequel le pH est ajusté à 7. 19. Vaccin à virus vivants atténués, stabilisé comprenant un agent stabilisant selon l'une des revendications I à 18. 20. Vaccin selon la revendication 19, comprenant au moins un virus de la famille herpés. 21. Vaccin selon la revendication 20, dans lequel la famille herpès comprend le virus de la varicelle, le cytomégalovirus et le virus de l'herpès simplex. 22. Vaccin selon la revendication 21, comprenant le virus de la varicelle. 23. Vaccin selon la revendication 19, comprenant au moins un virus choisi parmi les Paramyxoviridae (morbillivirus, oreillons, parainfluen:a types 1, 2, 3, 4, pneumovirus, RSV), les Togaviridae (rubéole), et les virus influenza (A, B, C). 24. Vaccin selon l'une des revendications 20 à 23, comprenant les virus de la rougeole, de la rubéole et des oreillons. 25. Vaccin selon la revendication 19, comprenant les virus de la rougeole, de la rubéole des oreillons et de la varicelle. 26. Procédé de préparation de vaccins stabilisés contenant des virus vivants atténués, caractérisé en ce que les virus entrant dans la composition desdits vaccins sont mis en contact, préférentiellement avant l'étape de lyophilisation avec une quantité appropriée d'agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 18. 27. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la mise en contact des virus avec l'agent stabilisant est effectuée avant la récolte desdits virus. 28. Procédé de préparation de vaccins selon l'une des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que les virus entrant dans la composition desdits vaccins sont mis en contact, préférentiellement avant l'étape de lyophilisation avec une quantité appropriée d'agent stabilisant selon l'une des revendications 1 à 18. 29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la mise en contact des virus avec l'agent stabilisant est effectuée avant la récolte desdits virus.