FR 2740471 A1 19970430 FR 9512844 A 19951031 FERMENTS LACTIQUES, ET LEUR UTILISATION POUR L'OBTENTION DE PRODUITS HYPOCHOLESTEROLEMIANTS. La présente Invention est relative à l'obtention de produits fermentés permettant d'abaisser le taux de cholestérol sanguin. On sait que la composition du régime alimentaire peut influencer le métabolisme des lipides et joue en conséquence un rôle important parmi les facteurs de risque de développement des maladies cardiovasculaires chez l'homme. A l'heure actuelle, les stratégies diététiques de prévention de ces maladies font appel à la réduction de la consommation des matières grasses, et particulièrement des matières grasses saturées, qui sont connues pour augmenter le niveau de cholestérol sanguin. Cependant, il est également de plus en plus préconisé d'agir qualitativement sur la prise alimentaire, en incorporant dans celle-ci des aliments dotés d'une action bénéfique sur le métabolisme lipidique, et ayant pour effet de diminuer le cholestérol sanguin et particulièrement le LDL cholestérol. On sait par exemple que l'enrichissement de l'alimentation en fibres aurait pour effet de diminuer la lipidémie et la cholestérolémie. On connaît également des oligosaccharides comprenant 2 à 20 monomères, et dénommés oligosaccharides non-digestibles (NDO), car ils ne sont pas digérés au niveau gastro-intestinal. Ces oligosaccharides sont fermentescibles au niveau du colon, et il a été montré que certains d'entre eux peuvent réduire le cholestérol et les triglycérides sériques chez l'animal. Parmi ces oligosaccharides, les fructo-oligosaccharides (FOS) apparaissent comme particulièrement intéressants. Cependant, la plupart des études qui font état d'un effet hypocholestérolémiant et hypolipidémiant des FOS ont été effectuées d'une part chez l'animal, et d'autre part chez des sujets diabétiques, ou hyperlipidémiques ; cet effet n'a pas été confirmé chez les sujets sains [revue bibliographique, pages 17 et 18 de la brochure d'information NUTRITIONAL PROPERTIES OF ACTILIGHT distribuée par Béghin-Mejii Industries]. Il a par ailleurs été supposé que certaines souches de bactéries peuvent exercer des effets hypocholestérolémiants [SANDERS, J. Dairy. Sci. 76, 18191828 (1993)]. On a montré que ces bactéries fixaient le cholestérol in vitro [KHEDKAR et al., Indian J. Dairy. Sci., 46, 12, 577-580, (1993)], et on a émis l'hypothèse qu'elles pourraient agir de même au niveau intestinal, détournant ainsi une partie du cholestérol apporté par l'alimentation. La Demande de Brevet Européen 0101 209 au nom de KABUSHIKI KAISYA ADVANCE KAIHATSU KENKYUJO mentionne les propriétés hypocholestérolémiantes et hypotriglycéri démiantes d'un streptocoque, Streptococcus faecium. ZACCONI et al., [Microbiologica, 15, 413-418, 1992)] ont observé, chez la souris, qu'Enterococcus faecium (dénomination actuelle de Streptococcus faecium) pouvait induire un abaissement du cholestérol sanguin ils ont également constaté un effet du même type, mais moindre, induit par certaines souches de Lactobacillus acidophilus. Cependant, des travaux plus récents effectués chez le rat [ODA et HASHIBA, J. Nut. Sci. Vitaminol, 40, 617-621, (1994)], ou chez la souris [TANNOCK et McCONNELL, Microbial Ecology In Health And Disease, Vol. 7 331-334 (1994)], ne montrent aucun effet des lactobacilles sur le cholestérol sanguin. Ces résultats ont été obtenus chez des animaux, et ne peuvent pas aisément être extrapolés chez l'homme, étant donné les spécificités d'espèces qui existent au niveau métabolique. Les études effectuées chez l'homme ont également conduit à des résultats variables - LIN et al., [J. Dairy. Sci, 72, 2885-2899 (1989)], relatent une absence d'effet de l'ingestion de tablettes comprenant Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus sur la concentration de lipoprotéines et de cholestérol sanguin, bien que ces mêmes bactéries absorbent le cholestérol in vitro. Les auteurs attribuent au moins en partie cette divergence à la faible viabilité de ces souches dans le tractus digestif ; d'autre part, AGERBAEK et al. [EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL NUTRITION, 49, 346-352, (1995)], décrivent 1effet hypocholestérolémiant, sur des sujets sains, d'un lait fermenté en présence d'Enterococcus faecium et de deux souches de Streptococcus thermophilus. KHEDKAR et al. [CULTURED DAIRY PRODUCTS JOURNAL, août 1993, pages 14-18], ont effectué une revue de divers travaux concernant l'effet de laits fermentés sur le cholestérol sanguin, et concluent que cet effet est inconstant. Il apparaît donc que, bien l'on puisse présumer un effet hypocholestérolémiant de certains produits laitiers fermentés, les facteurs qui en sont responsables n'ont pas été identifiés avec précision. Les Inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau produit laitier fermenté favorisant la baisse du taux de cholestérol sanguin ; ce produit est obtenu en utilisant un nouveau ferment, qui comprend en particulier une souche spécifique de Lactobacillus acidophilus. La présente Invention a pour objet la souche de Lactobacillus acidophilus déposée le 6 juillet 1990, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, à Paris, sous le numéro I-967. La présente Invention a également pour objet un ferment lactique comprenant un mélange de la souche de Lactobacillus acidophilus I-967 mentionnée ci-dessus, avec au moins une autre souche de Lactobacillus acidophilus. Selon un mode de réalisation préféré d'un ferment lactique conforme à la présente Invention, la souche de Lactobacillus acidophilus I-967 est associée avec la souche de Lactobacillus acidophilus, qui a été déposée le 24 Octobre 1995 auprès de la CNCM, sous le numéro I-1633. Avantageusement, un ferment lactique conforme à la présente Invention, peut comprendre en outre au moins un lactocoque mésophile , il s'agit de préférence de la souche de Lactococcus lactis ssp. lactis, qui a été déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1631 Le ferment lactique conforme à l'Invention peut être associé à différentes espèces de bactéries utilisables dans la fabrication du yoghourt ou d'autres produits laitiers fermentés; de préférence, on l'associera par exemple à au moins une souche de Streptococcus thermophilus, et/ou au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Des souches de Streptococcus thermophilus, et de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus qui peuvent être avantageusement utilisées pour la mise en oeuvre de la présente Invention sont les suivantes - La souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus déposée le 30 décembre 1994 auprès de la CNCM sous le numéro I-1519 - la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1632 - la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1630. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit fermenté, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un ferment lactique conforme à l'Invention éventuellement associé à au moins une souche de Streptococcus thennophilus, et/ou au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. La présente Invention a également pour objet les produits fermentés, en particulier des produits laitiers fermentés, susceptibles d'être obtenus par un procédé conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré d'un produit fermenté conforme à l'Invention, il contient après fermentation au moins 1x105 UFC (=Unités Formant Colonie) par ml de chacune des espèces bactériennes qui constituent le ferment. Une efficacité optimale d'un produit fermenté conforme à l'Invention a été observée pour une concentration minimale d'environ lux10 à lux10 UFC par ml de chaque espèce bactérienne du ferment. Selon un autre mode de réalisation préféré d'un produit laitier fermenté conforme à l'Invention, il comprend en outre des fructo-oligosaccharides (FOS). Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit produit laitier fermenté comprend entre 0,1 et 20 g pour 100 ml, et de préférence entre 1 et 10 g pour 100 ml de fructo-oligosaccharides. Les fructo-oligosaccharides sont des oligomères glucidiques, qui peuvent être obtenus par l'action d'une transfructosidase sur le saccharose. Ils sont constitués de fructose(F), et de glucose(G), et répondent à la formule générale G(Fn), dans laquelle n, qui est supérieur ou égal à 2 représente le nombre de molécules de fructose. Pour la mise en oeuvre de la présente Invention, on utilisera avantageusement des fructooligosaccharides dans lesquels n est inférieur ou égal à 8, et de préférence inférieur ou égal à 4. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, un produit laitier fermenté conforme à l'Invention comprend entre 0,05 et 20 g pour 100 ml, et de préférence entre 0,1 et 10 g pour 100 ml de matières grasses d'origine végétale et/ou entre 0,05 et 15 g pour 100 ml, et de préférence entre 0,1 et 5 g pour 100 ml de matières grasses d'origine animale. Les matières grasses d'origine végétale peuvent être apportées par l'utilisation d'au moins une huile végétale telle que l'huile de colza, l'huile de soja, les huiles d'olive, de germe de blé, de mais, de tournesol, de pépins de raisin, de pépin de cassis, etc.. .; les matières grasses d'origine animale peuvent être des matières grasses laitières, apportées par exemple par ajout de crème, et/ou des huiles de poisson. Ces matières grasses peuvent également être enrichies en vitamines liposolubles, en particulier en vitamine E, de manière à ce que le produit fermenté prêt à la consommation contienne entre 0,03mg et lOmg pour 100ml. La consommation régulière de produits laitiers fermentés conforme à l'Invention induit une baisse significative du taux de cholestérol sanguin, et en particulier du LDL cholestérol. La présente Invention englobe également l'utilisation de souches bactériennes, de ferments lactiques, ou de produits fermentés conformes à l'Invention pour l'obtention de produits induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation de produits fermentés conformes à l'Invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - OBTENTION D'UN PRODUIT LAITIER FERMENTE CONFORME A L'INVENTION On prépare un mélange, dont la composition (en W p/p) est donnée dans le Tableau I ci-dessous TABLEAU I INGREDIENT QUANTITE (W) Lait écrémé 90 Crème (40%MG) 1,3 Poudre de lait 0WMG 5,5 Huile de soja " 0,25 Huile de colza " 0,25 ACTILIGHT 950P " ( Fructo-oligosaccharides) 2,50 Stabilisant (Gélatine) 0,20 a Les huiles de soja et de colza sont enrichies en vitamine E et apportent au total 0,35 mg de vitamine E (exprimée sous forme de a-dl tocophérol) pour 100g de mélange. b ACTILIGHT 950P: Préparation à plus de 90% de fructooligosaccharides, commercialisée par BEGHIN-MEIJII INDUSTRIES. Les ingrédients sont mélangés pendant 1 heure sous agitation, de manière à obtenir une bonne réhydratation de la poudre de lait, et un mélange homogène. Le mélange est ensuite chauffé à 750C préalablement à l'homogénéisation. Après homogénéisation à 200 bars, le mélange est pasteurisé, et refroidi avant d'être ensemencé à 380C avec des cultures actives des différentes souches. La fermentation est effectuée dans une étuve régulée à 38+1 C, jusqu'à un pH de 4,75+0,15. L'arrêt de la fermentation est effectué par refroidissement de la préparation jusqu'à 200C environ. Le produit est ensuite conditionné et réfrigéré à 40C. Les concentrations en début de fermentation (concentration initiale) et en fin de fermentation (concentration finale) sont indiquées (en UFC par ml) dans le Tableau II ci-dessous TABLEAU II CONCENTRATION SOUCHE INITIALE FINALE Lactobacillus acidophilus 3,3 X 106 1,2 X 108 (I-1633)+(I-967) Lactobacillus totaux 4,8 x 10 3,7 > x 108 10 Lactococcus lactis ssp lactis(I-1631) 1,4 x 106 6,7 x 107 > 10 Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus 1,5 X 106 2,5 X 108 (I-1519) +(I-1632) Streptococcus thermophilus (I-1630) 1,5 x 10 1,6 x 10 Les méthodes utilisées pour le dénombrement des bactéries sont les suivantes Lactobacillus totaux : ensemencement en masse sur gélose MRS acide (pH =5,4) ; incubation 72 heures à 370C en anaérobiose. Lactobacillus acidophilus : ensemencement en masse sur gélose MRS acide OXGALL (0,2a); incubation 72 heures à 370C en anaérobiose. Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus : la population est évaluée en calculant la différence (Lactobacillus totaux) - (Lactobacillus acidophilus). Streptococcus thermophilus : ensemencement en masse sur gélose M17 ; incubation 48 heures à 440C. Lactococcus lactis ensemencement en masse sur gélose M17 ; incubation 5 jours à 170C. EXEMPLE 2 - ACTION D'UN PRODUIT LAITIER FERMENTE CONFORME A L'INVENTION, SUR LE CHOLESTEROL SANGUIN CHEZ L'UOMME. L'effet hypocholestérolémiant d'un produit fermenté conforme à l'Invention a été étudié en utilisant comme témoin un yoghourt, comprenant 1% de graisse animale, et fermenté avec uniquement les ferments du yoghourt. Le produit fermenté conforme à l'Invention a été obtenu selon le procédé décrit à l'exemple 1, et comprend 0,5% de graisse végétale, 0,5% de graisse animale, et 2,5% de fructo-oligosaccharides. L'étude de l'effet hypocholestérolémiant a été effectuée, dans un essai randomisé croisé en doubleaveugle, chez 30 sujets mâles en bonne santé, âgés de 30 à 65 ans. Ces sujets ont été répartis en deux groupes chacun de ces deux groupes comprend 60% d'homozygotes et 40% d'hétérozygotes pour l'apolipoprotéine E3 ; les sujets homozygotes pour l'apolipoprotéine E3, qui est impliquée dans le métabolisme des lipides, sont supposés être plus sensibles à l'influence de la composition en matières grasses du régime alimentaire sur ce métabolisme. Un premier groupe de 15 sujets sains a reçu pendant 3 semaines un produit fermenté conforme à l'Invention ; après une interruption d'une semaine, les mêmes sujets ont reçu pendant 3 semaines le yoghourt de contrôle ; parallèlement, le second groupe de sujets sains a reçu pendant les 3 premières semaines le yoghourt de contrôle, puis, après une interruption d'une semaine, a reçu pendant 3 semaines le produit fermenté conforme à l'Invention. Pendant chacune des périodes de traitement, chaque sujet a consommé, en plus de son régime habituel 3 x 125 g de produit réparti en 3 prises quotidiennes, dans le cadre des repas habituels (petit déjeuner, déjeuner et dîner). Le cholestérol sanguin a été dosé chez les sujets en début du traitement, à la fin de la première période, et à la fin de la seconde période ; les résultats, représentant la moyenne des dosages effectués après la consommation de yoghourt contrôle, et après la consommation du produit fermenté conforme à l'Invention, sont résumés dans le Tableau III ci-dessous TABLEAU III TRAITEMENT CONTROLE TEST CHOLESTEROL TOTAL (mmo 1/1) 5,41 5,17 CHOLESTEROL LDL (mmol/l) 3,52 3,33 CHOLESTEROL HDL (mmol/l) 1,23 1,21 RAPPORT LDL CHOLESTEROL/HDL CHOLESTEROL 3,02 2,86 L'analyse statistique des résultats à la fin de la première et à la fin de la seconde période, et de la moyenne des rapports (LDL CHOLESTEROL/HDL CHOLESTEROL) obtenus pour chacun des individus à la fin des deux périodes a permis de mettre en évidence une diminution significative du cholestérol sérique total (-4,3t p Ces résultats, qui ont été observés chez des sujets n'ayant fait l'objet d'aucune restriction alimentaire, sont du même ordre de grandeur, en particulier en ce qui concerne la diminution du rapport LDL/HDL, que ceux qui ont été observés antérieurement chez des sujets soumis à un régime restrictif (qui a entraîné une diminution d'environ 7% du rapport LDL CHOLESTEROL /HDL CHOLESTEROL) [VAN DOKKUM et al., Eur. J. Clin. Nutr., 45, 431-439, (1991)]. En revanche, aucune différence significative n'a été observée en ce qui concerne le cholestérol HDL il en est de même pour le niveau de triglycérides, et le niveau de glucose sanguin (résultats non montrés). D'autre part, les sujets homozygotes pour l'apolipoprotéine E3 n'ont pas réagi différemment des hétérozygotes. REVENDICATIONS 1) Souche de Lactobacillus acidophilus déposée le 6 juillet 1990, auprès de la CNCM sous le numéro I967. 2) Ferment lactique comprenant un mélange de la souche de Lactobacillus acidophilus I-967 avec au moins une autre souche de Lactobacillus acidophilus. 3) Ferment lactique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche de Lactobacillus acidophilus I-967 est associée avec la souche de Lactobacillus acidophilus, qui a été déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM, sous le numéro I-1633. 4) Ferment lactique selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un lactocoque mésophile. 5) Ferment lactique selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit lactocoque mésophile est constitué par la souche de Lactococcus lactis ssp lactis, qui a été déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1631 6) Procédé de préparation d'un produit fermenté, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'une souche selon la revendication 1 d'un ferment lactique selon une quelconque des revendications 2 à 5, éventuellement associé à au moins une souche de Streptococcus thermophilus et/ou au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. 7) Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit ferment lactique est associé à au moins une souche du groupe constitué par - la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus déposée le 30 décembre 1994 auprès de la CNCM sous le numéro I-1519 - la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1632 - la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 24 octobre 1995 auprès de la CNCM sous le numéro I-1630. 8) Produit fermenté, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé selon une quelconque des revendications 6 ou 7. 9) Produit fermenté selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il contient, après fermentation, au moins lux105, de chacune des bactéries qui constituent le ferment selon une quelconque des revendications 1 à 5. 10) Produit laitier fermenté selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des fructo-oligosaccharides (FOS). 11) Produit laitier fermenté selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend 0,1 à 20 g de fructo-oligosaccharides pour 100 ml. 12) Produit laitier fermenté selon une quelconque des revendications 10 ou 11 caractérisé en ce qu'il comprend des fructo-oligosaccharides qui répondent à la formule générale G(Fn), dans laquelle G représente le glucose, F représente le fructose, et n représente le nombre de molécules de fructose qui est supérieur ou égal à 2, et inférieur ou égal à 8. 13) Produit laitier fermenté selon une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend 0,05 à 20 g pour 100 ml de matières grasses d'origine végétale et/ou 0,05 à 15 g pour 100 mi de matières grasses d'origine animale. 14) Utilisation d'une souche bactérienne selon la revendication 1, pour l'obtention de produits induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin. 15) Utilisation d'un ferment lactique selon une quelconque des revendications 2 à 5, pour l'obtention de produits induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin. 16) Utilisation d'un produit fermenté selon une quelconque des revendications 8 à 13, pour l'obtention de produits induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin.