FR 2748032 A1 19971031 FR 9605223 A 19960425 SYSTèME D'EXPRESSION DERIVE DU GENE DE LA TYROSINE HDROXYLASE La présente invention conceme un nouveau système pour l'expression de gènes. Elle conceme également l'utilisation de ce système en thérapie génique ou cellulaire, pour augmenter l'expression de gènes d'intérêt, ou pour la production de protéines recombinantes. Les thérapies génique et cellulaire consistent à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme (thérapie cellulaire), soit directement in vivo dans le tissu approprié (thérapie génique). Différentes techniques existent pour effectuer le transfert de gènes, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des vecteurs chimiques ou biochimiques, naturels ou synthétiques tels que des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), I'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), lipides cationiques, etc. Une autre technique repose sur l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires et en particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés et les adénovirus. L'une des difficultés pour le développement de ces thérapies génique et cellulaire réside cependant dans l'efficacite du traitement. En particulier, il est important de pouvoir obtenir une expression forte du gène d'intérêt afin d'améliorer l'effet thérapeutique. Le même type de problématique se pose dans le cas de procédes de production de protéines recombinantes. Différents types de promoteurs ont été decrits dans la littérature et sont utilisés pour controler l'expression de gènes d'intérêts. Cependant, les niveaux d'expression obtenus sont parfois insuffisants pour obtenir des quantites industrielles de protéine recombinante in vitro ou pour générer in vivo un effet thérapeutique important etlou durable. La présente invention décrit maintenant un nouveau système d'expression de gènes particulièrement efficace. La presente invention découle notamment de l'identification de régions dotées d'une activite enhancer de la transcription, permettant d'augmenter la force de promoteurs, et ainsi les niveaux d'expression de gènes. La présente invention résulte plus particulierement de l'identification de régions du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase, capables d'augmenter l'activité de promoteurs transcriptionnels. Ces régions sont localisées plus précisement au niveau du microsatellite HUMTHO1 présent dans le premier intron de ce gène. Les microsatellites représentent une classe abondante de séquences répétées d'ADN qui présentent un grand polymorphisme lié à des variations dans le nombre de motifs répétés etlou dans la séquence de ces motifs. Ces microsatellites ont pour cette raison été utilisés comme marqueurs génétiques pour la construction de cartes génétiques et pour l'identification de loci impliqués dans des pathologies. La taille des différents allèles d'un microsatellite dépend de variations dans le nombre de motifs répétés. Des expériences de séquençage de dimères répétés ont ainsi permis de montrer une variation dans le nombre de motifs répétés et dans leur séquence. Ces variations peuvent correspondre notamment à des répétitions "parfaites", c'est-à-dire sans interruption dans la séquence de bases, ou à des répétitions "imparfaites", contenant une ou plusieurs interruptions dans la séquence des motifs, qu'il s'agisse de délétion(s) ou d'insertion(s). De la même façon, des variations de longueur eVou de séquence ont également été observées dans les motifs trimériques ou tétramériques répétés. Ainsi, des variations de ce type ont été observées dans les microsatellites HUMHPRTB (Edwards et al., Genomics 12 (1992) 241) et HUMTH01 (Puers et al., Am.J.Hum.Genet. 53 (1993) 953). Le microsatellite HUMTHO1 est localisé dans le premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase Cm), qui est l'enzyme limitante de la voie de biosynthèse des catecholamines. Une partie de la séquence de cet intron est représentée SEQ ID N. 1 (a partir du nucleotide 871). Cette séquence inclut le microsatellite HUMTH01 (allèle (TCAT)9, represente en gras), qui est localisé a la position 1170 (GenBank, accession &num; D00269). Le microsatellite HUMTH01 est constitué de motifs tétramériques TCAT répétés. II présente un certain polymorphisme, différents allèles ayant été décrits possédant des nombres de motifs répétés variables. L'allèle le plus souvent rencontré (allèle Ei) comporte 10 motifs répétés et une délétion d'une paire de base dans le cinquième motif répété, qui comporte la séquence CAT (SEQ ID N. 2). D'autres allèles ont été identifiés portant de 5 a 10 motifs TCAT. La demanderesse a maintenant montré que, de manière surprenante, ces séquences sont reconnues spécifiquement par des protéines présentes dans différents extraits nucléaires (exemple 1). De plus, la demanderesse a démontré que ces séquences permettaient d'augmenter la transcription de gènes dans différents systèmes cellulaires (exemples 3 et 4). Ainsi, dans les cellules PC12, une augmentation d'un facteur 25 a 50 de l'activité transcriptionnelle a été observée. Dans les cellules Hela, une augmentation remarquable d'un facteur 100 a 350 fois a été observée. Ces séquences présentent donc des propriétés d'activateurs transcriptionnels très puissants. Ces propriétes sont particulièrement inattendues, et bien supérieures aux effets observés avec d'autres enhanceurs transcriptionnels. Ainsi, une augmentation de l'activité transcriptionnelle d'un facteur 3 a 6 a été observée avec des séquences HRAS1-VNTR (Green et al., 1993, ref), et d'un facteur 2 a 5 avec des séquences INS-VNTR (Catignani et al., 1995). L'augmentation obtenue avec les séquences de l'invention peut dépasser un facteur 300, et constitue un avantage énorme par rapport aux systèmes antérieurs. En outre, les résultats obtenus montrent que les séquences de l'invention sont fonctionnelles dans différents types cellulaires et dans des cellules d'organismes différents (cellules de rat PC12, cellules humaines HeLa), ce qui démontre un potentiel d'applications très large. Un premier objet de l'invention concerne donc un fragment d'ADN ayant une activité d'enhancer transcriptionnel consistant essentiellement en une portion du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase. Avantageusement, le fragment de l'invention comprend moins de 200 pb et inclut un allèle du microsatellite HUMTH01. Plus préférentiellement, le fragment comprend moins de 1 OOpb. De manière particulièrement avantageuse, le fragment est constitué essentiellement d'un allèle du microsatellite HUMTH01. Comme indiqué ci-avant, le microsatellite HUMTHO1 est localisé a la position 1170 environ du gène TH humain (GenBank accession &num;D00269), et est constitué principalement de motifs tétramériques TCAT répétés. Différents allèles de ce microsatellite ont été décrits possédant des nombres de motifs répétés variables (de 5 a 10) et des variations de séquences, certains allèles possédant des mutations de bases. Ainsi, I'allèle le plus souvent rencontré (allèle Ei) comporte 10 motifs répétés et une délétion d'une paire de base dans le cinquième motif répété, qui comporte la séquence CAT (SEQ ID N. 2). D'autres allèles ont été identifiés portant de 5 a 10 motifs TCAT (SEQ ID N. 9-15). En outre, un fragment d'ADN portant 3 motifs TCAT peut être synthétisé et teste comme enhanceur transcriptionnel, selon l'invention. A cet egard, I'invention a également pour objet un fragment isolé d'ADN caractérise en ce qu'il possède une activite d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il possède la séquence trCAT)-(CAT)o-(TCAT)p, dans laquelle n est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est compris entre 0 et 50. Selon une variante particulière de PUivention, I'enhanceur transcriptionnel possède une séquence (TCAT)"-(CAT)o-(TCAT)p dans laquelle n est compris entre 2 et 20 inclus, et o et p valent 0. Selon une autre variante particulière de rinvention, I'enhanceur transcriptionnel possède une séquence (TCAT),-(CAT)0(TCAT)p dans laquelle n est compris entre 1 et 10, o est compris entre 1 et 5 et p est compris entre 1 et 10. A titre d'exemple spécifique d'enhanceurs transcriptionnels selon l'invention, on peut citer les fragments de séquence SEQ ID N.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8,9,10,11,12,13, 14et15. Un autre objet de la présente invention réside dans une cassette d'expression comprenant une séquence codante, un promoteur permettant son expression et un enhancer de la transcription tel que défini ci-avant. Avantageusement, la cassette comprend en outre un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. II peut s'agir notamment d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés, tels que le promoteur du gène p53. II peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). II peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, Ce CFTR, R, Facteur VIII, ApoAl, ApoAII, Albumine, Thymidine kinase, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, de la villine, de la protéine intestinale de liaison des acides gras, de l'a-actine du muscle lisse, promoteur de l'enolase specifique neuronale (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187); etc), du promoteur générant la forme V1 de l'AnNm de la VAChT (transcporteur de I'acetylcholine : Cervini et al., J.Biol.Chem. 270 (1995) 24654) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroldes, récepteur de l'acide rétinolque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, le promoteur du gène TK d'un virus de l'herpes, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition ou délétion de séquences. A cet effet, le promoteur utilise peut etre un promoteur'minimal", c'est-a-dire un promoteur reduit dont l'activité dépend essentiellement de la présence d'un transactivateur tel qu'un enhaceur de l'invention. De ce fait, en l'absence de l'enhanceur, l'activité du promoteur est reduite et le gène n'est pas ou peu exprimé. En revanche, en présence de l'enhanceur, l'activité du promoteur minimal est forte et l'expression du gène d'intérêt importante. Le promoteur minimal est constitué généralement d'une boite TATA ou INR. Ces éléments sont en effet les éléments minimum nécessaires à l'expression d'un gène en présence d'un transactivateur. Il comprend avantageusement moins de 200 pb, incluant la region TATA ou INR. Le promoteur minimal peut être préparé à partir de tout promoteur par modification génétique. A titre d'exemple particulier de promoteur candidat on peut citer le promoteur du gène de la thymidine kinase. Des résultats intéressants ont plus précisément été obtenus avec un promoteur minimal dérivant du promoteur du gène de la thymidine kinase du virus de l'herpes simplex type I (TK) composé des nucléotides -109 a +52, ou -37 à +19. Le promoteur minimal peut également dériver du CMV humain. En particulier, il peut être constitué du fragment compris entre les nucléotides -53 à +75 ou -31 à +75 du CMV (+1 correspondant au codon ATG). Tout promoteur conventionnel peut toutefois être utilisé tel que par exemple le promoteur des gènes codant pour la chloramphénicol acétyle transférase, la ss-galactosidase ou encore la luciférase. Avantageusement, le promoteur transcriptionnel est un promoteur fonctionnel dans les cellules mammifères, et notamment un promoteur viral CrK, CMV) ubiquitaire (PGK) ou spécifique (promoteur de l'enolase spécifique neuronale, promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT. Dans un autre mode de réalisation préféré, le promoteur transcriptionnel est un promoteur minimal, composé essentiellement d'une région de moins de 200 pb comprenant une boite TATA ou INR. La séquence codante comprend avantageusement une ou plusieurs séquences codant pour des protéines. II peut s'agir notamment d'une séquence codant pour un produit thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, la séquence codante est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain,animal, végétal, etc) codant pour un produit protéique tel que des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (W091/19813) etc. La séquence codante peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140308. La présente invention est egalement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes tueurs capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv antiras (W094/29446), etc). Ce système est également particulièrement intéressant pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple. La cassette d'expression est avantageusement constituée des éléments suivants: - comme région enhanceur, une séquence (TCAT)n-(CAT)o-(TCAT) dans laquelle n'est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est compris entre 0 et 50, - comme promoteur, le promoteur du gène de la thymidine kinase du virus HSV-1 ou un promoteur minimum en derivant, le promoteur précoce du CMV ou un promoteur minimum en dérivant, le promoteur PGK, le promoteur de l'enolase spécifique ou le promoteur du gène VAChT, - une séquence codante d'intérêt. Encore plus préférentiellement, le promoteur est constitué de la région -109 a +52, ou -37 à +19 du promoteur du gène de la thymidine kinase du HSV-1. Avantageusement, la région enhanceur est choisie parmi les fragments de séquence SEQ ID N.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14et 15. En outre, une propriété particulièrement remarquable des régions enhanceur de l'invention est qu'elles semblent être actives aussi bien dans l'orientation sens (orientation normale du microsatellite dans le gène TH) que dans l'orientation antisens (orientation inverse de celle du microsatellite dans le gène TH). De ce fait, dans les cassettes d'expression de l'invention, la région enhanceur peut être positionnée dans les deux orientations (5' + 3' ou3'+5s). Un autre aspect de l'invention réside également dans un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression telle que définie cidessus. Le vecteur peut être de nature plasmidique ou virale. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer plus préférentiellement les adénovirus, les rétrovirus, les virus de l'herpès ou encore les virus adéno associés. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par les séquences de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, le génome des adénovirus recombinants de l'invention comprend au moins les ITR et la région d'encapsidation d'un adénovirus, et la séquence d'acides nucléiques codant pour une molécule chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution (par exemple par les séquences de l'invention), délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094J28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérées la région E4 et les séquences de l'invention (Cf FR94 13355). Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la cassette d'expression de l'invention et des séquences homologués a l'adénovirus. La recombinaison homologué se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. Le génome adénoviral peut également être prépare in vitro, dans une bactérie (FR95 01632) ou dans une levure (W095/03400). La lignée cellulaire utilisée pour la production des adénovirus doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Concemant les virus adénoassociés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91118088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep etlou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la cassette d'expression de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breaktield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McConmick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("m urine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et les séquences de l'invention (cassette d'expression) est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61(1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. La cassette de l'expression peut également être insérée dans un vecteur plasmidique (FR95 02117). Le système d'expression de gènes de l'invention est particulièrement approprié pour une utilisation en thérapie génique ou cellulaire, ou pour la production de protéines recombinantes. Pour des applications de thérapie génique ou cellulaire, les cassettes ou vecteurs plasmidiques peuvent être utilisés sous forme d'ADN nu, ou complexe a des vecteurs inertes de transfert Différents types de vecteurs inertes capables de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes ont en effet été décrits. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative aux virus, en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui conceme la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKVn, polyéthylène immine (W096/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser I'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces demiers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, W095/18863) et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc). Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La présente invention a également pour objet toute composition pharm unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Un autre objet de l'invention consiste en une cellule comprenant un fragment d'ADN, une cassette d'expression ou un vecteur tels que definis cidessus. Ces cellules sont obtenues par toute technique connue de l'homme du métier permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée. II peut s'agir notamment de transformation, transfection, infection, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. S'agissant de la transformation in vitro ou ex vivo, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, la transformation de cellules peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la technique de Durrens et al. (Cun. Genet. 18 (1990) 7). Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet EP 361 991. S'agissant d'électroporation, elle peut être réalisée selon Becker et Guarentte (in: Methods in Enzymology Mol194 (1991)182). Les cellules selon l'invention peuvent être de différentes origine. En particulier, il peut s'agir de bactéries ou de cellules eucaryotes (levures, cellules animales, cellules végétales) etc. Parmi les bactéries, on peut citer plus préférentiellement E.coli, B. subtilis, Streptomyces. Pseudomonas (e, putida. e. aeruginosa), Rhizobium meliloti. Agrobacterium hrmefaciens. Staphylococcus aureus. Streptomvses pristinaesniralis, Enterococcus faecium ou Clostridium, etc. Parmi les bactéries, on préfère utiliser E. coli. Parmi les levures, on peut citer Kluyveromyces. Saccharomyces. Pichia, Hansenula, etc. Parmi les cellules animales de mammifères, on peut citer les cellules CHO, COS, NIH3T3, PC12, etc. Pour des applications de thérapie génique ex vivo, on peu egalement citer les cellules souches hématopoietiques (W088/08450, WO93/20195, WO93/09815, WO93/11230), les cellules endothéliales (W089/05345, WO90/06757, WO92109222), les myoblastes (W093/03768,WO93/24151,WO94/01129), les fibroblastes (US 5,219,740, W089/02468, W093/07906), les hépatocytes (WO89/07136,WO92/12242,WO93/03142), les astrocytes (WO94/01135), les neuroblastes (WO94Iî 0292, WO94/16059), les kératinocytes (WO94J11011), les macrophages (FR93/10222). Ces cellules possedent généralement la capacite de produire un produit d'intérêt thérapeutique et peuvent être implantées in vivo. Parmi les cellules sanguines, on peut citer les erythrocytes, les granulocytes neutrophiles, basophiles et éosinophiles, les lymphocytes B et T, notamment les lymphocytes CD4, les lymphocytes cytotoxiques (CD8 CTL), les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) et les LAK, les monocytes et les macrophages, les cellules dendritiques, les mégacaryocytes et les plaquettes. La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures Figure 1: Représentation du plasmide pTK-Luc ; promoteur minimal Thymidine kinase ; Répétition parfaite, sens de l'intron TH ; Répétition parfaite, antisens ; Répétition imparfaite, sens de l'intron TH ; Répétition imparfaite, antisens. Figure 2 Activité luciférase dans les cellules Hela transformées Figure : Activité luciférase dans les cellules PC12 transformées Techniques générales de Biologie Moléculaire Les méthodes classiques de biologie moléculaires telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par les enzymes de restriction, I'électrophorèse sur gel,la transformation dans EMPLI la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis ss aI.,1 989). Les enzymes ont été fournies par New-England Biolabs (Beverly, MA). Pour les ligatures les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose de 0,8 à 1,5 96, purifiés par GeneClean (Bl0101, LaJolla CA) et incubés de nuit à 14"C dans un tampon Tris-HCI pH 7.4 50 mM, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4. L'amplification par PCR, (Polymerase Chain Reaction), a également été réalisée selon Maniatis B 1-, 1989, avec les spécifications suivantes: -Concentration en MgC12 portée à 8mM. -Température de dénaturation 95"C, température d'hybridation 55"C, température d'allongement 720C. Ce cycle a été répété 25 fois dans un PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk CO). Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en ss par un groupement cyanoéthyl, (Sinha M.,1984, Giles 1985), avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied Biosystem modèle 394, (Applied Biosystem, Foster City CA), selon les recommandations du fabricant. Le séquencage a été éffectué sur des matrices double-brin par la méthode de terminaison de chaînes en utilisant des amorces fluorescentes. Nous avons utilisé le kit se séquencage Taq Dye Primer Kit de chez Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) selon les spécifications du fabricant. ExemDles Exemple 1: Intéraction avec des protéines nucléaires L'implication possible du microsatellite HUMTH01 dans la régulation de l'expression de gènes a été étudiée par des expériences de retard sur gel (test de mobilite electrophoretique, EMSA). Pour cela, des extraits nucléaires de cellules Hela ont été préparés, et incubés en présence d'oligonucleotides correspondants a des séquences du microsatellite HUMTH01. Les extraits nucléaires de cellules Hela ont été préparés selon la méthode de Dignam (NAR 11 (1983) 1474), et les concentrations protéiques selon la technique de Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248). Le test de mobilité électrophorétique a été réalisé dans un volume final de 10 1l1, en présence de 10 a 15 p9 d'extrait nucléaire incubé 5 min en présence de 1 g de poly (dl-dC)-(dl-dC), dans un tampon HEPES 4mM, pH 7,6, KCI 100 mM, Glycerol 12%. 25 fmol d'oligonucléotides doublebrins marques au ySP-ATP au moyen de la T4 polynucleotide kinase (Amersham), ont ensuite été incubés pendant 5 min avec les protéines, a température ambiante. Les oligonucleotides utilisés sont des sondes correspondant aux alleles Ei et Ep du microsatellite HUMTH01. Pour les expériences de compétition, les oligonucléotides non-marqués ont été ajoutés 5 min avant les sondes marquées. La séquence des oligonucléotides est la suivante: Ei-sens : TCATTCATCA TTCATTCATT (SEQ ID N. 3) Ei-as : AATGAATGAA TGATGAATGA (SEQ ID N. 4) Ep-sens : TCATTCATTC ATTCATTCAT (SEQ ID N. 5) Ep-as : ATGAATGAAT GAATGAATGA (SEQ ID N. 6) Les complexes ADN-protéine formés ont ensuite été résolus par électrophorèse en gel non-denaturant, 6% d'acrylamide dans un tampon 0,5X TBE a 4C. Après séchage, les gels sont autoradiographes pendant la nuit a température ambiante. Les résultats obtenus montrent que les deux oligonucléotides sont reconnus par des protéines de l'extrait nucléaire. Par ailleurs1 la specificite de l'intéraction a été démontrée dans une expérience de compétition avec des oligonucléotides froids, démontrant une liaison dose-dépendante. Ces résultats démontrent donc clairement que des facteurs nucléaires interagissent avec le microsatellite HUMTH01. Dans une seconde étape, une série d'expériences de compétition avec des oligonucléotides differents a été réalisée. Les oligonucléotides utilisés correspondent a la séquence TRE de liaison du facteur AP1 (TGACTCA). Les résultats obtenus montrent que cet oligonucléotide ne déplace pas la liaison des oligonucléotides Ei et Ep aux facteurs nucléaires. Ceci indique que les facteurs liant le microsatellite HUMTH01 sont differents de Jun et Fos. Des expériences de compétition ont également été réalisées avec des oligonucléotides contenant d'autres séquences de liaison de protéines : CRE-TH; CRE; Pou; SP1; AP4 et E-TH. Aucune de ces séquences, en exces molaire de 100 fois, n'a permis de déplacer la liaison des extraits nucléaires des cellules Hela aux oligonucléotides du microsatellite, confirmant la spécificité de l'intéraction. Exemple 2 : Construction de cassettes et vecteurs d'expression. 2.1. Synthèse des régions enhanceur Différentes régions enhanceur ont été synthétisées sous forme d'oligonucléotides double-brins. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur Beckman oligo 1000, selon les recommandations du fabricant. Les enhanceurs produits sont les suivants: - Tl0i-sens (SEQ ID N. 7): CCCTCATTCA TTCATTCATC ATTCATTCAT TCATTCATTC ATTCACCGCG CGCG Ce fragment d'ADN comprend l'allèle imparfait du microsatellite HUMTH01, dans l'orientation sens (orientation normale dans l'intron TH) - T10i-as (SEQ ID N. 8): CGCGCGCGGT GAATGAATGA ATGAATGAAT GAATGATGAA TGAATGAATG AGGG Ce fragment d'ADN comprend l'allèle imparfait du microsatellite HUMTH01, dans l'orientation antisens (orientation inverse de l'intron TH) - T10p-sens (SEQ ID N. 9): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCATT CATTCACCGC GCGC Ce fragment d'ADN comprend l'allèle parfait du microsatellite HUMTH01 ((TCAT)10). - T10p-as (SEQ ID N. 10): GCGCGCGGTG AATGAATGAA TGAATGAATG AATGAATGAA TGAATGAATG AGGG - T9-sens (SEQ ID N. 11): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCATC C - TOsens (SEQ ID N. 12): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATCC - T7-sens (SEQ ID N. 13): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TCC - T6sens (SEQ ID N. 14): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATCC - Tisons (SEQ ID N. 15): CCCTCATTCA TTCATTCATT CATCC 2.2. Construction de vecteurs 2.2.1. Vecteur comprenant un promoteur TK Un vecteur comprenant un gène hétérologue (luciferase) sous le controle d'un promoteur TK, ainsi qu'un enhanceur selon l'invention a été construire. Pour cela le plasmide pTK-Luc (DeThe et al., Nature 343 (1990) 177) a été utilisé. Ce vecteur comprend un promoteur TK modifié (minimal), comprenant les nucléotides -109 a +52. Une construction similaire est réalisée avec un fragment plus petit (nucleotides -37 a +19). Différentes régions enhancer ont été introduites dans ce plasmide, en amont du promoteur TK. Plus particulièrement, les enhanceurs de 54 mer decrits dans l'exemple 2.1. ont été sousclonés dans le plasmide pTK-Luc par ligation d'extrémités franches dans le site Sall. L'insertion et l'orientation des inserts a été controlée par séquencage. La structure des cassettes d'expression du vecteur résultant est présentée sur la figure 1. il est entendu que les régions enhanceur de l'invention peuvent être positionnées également en aval du promoteur et du gène d'intérêt. 2.2.2. Vecteur comprenant un autre promoteur Le vecteur décrit ci-dessus peut facilement être modifié pour remplacer le promoteur TK par tout autre promoteur transcriptionnel souhaite, tel que le promoteur précoce du CMV ou tout promoteur minimal en dérivant tel qu'un promoteur constitué du fragment compris entre les nucléotides -53 à +75 ou -31 à +75 du CMV. II peut egalement s'agir du promoteur du gène PGK murin ou humain, du promoteur de l'enolase spécifique neuronale, ou du promoteur promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT. Par ailleurs, différents vecteurs ou cassettes portant ces différents promoteurs ont été décrits dans la littérature. II est ainsi possible de construire des vecteurs ou cassettes de l'invention par insertion d'une séquence enhanceur dans ces constructions (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187; Cervini et al., J.Biol.Chem. 270 (1995) 24654; etc) 2.23. Plasmide RSV-CAT Le plasmide RSV-CAT a été utilisé dans les expériences pour déterminer l'efficacité de transfection cellulaire. Ce plasmide a donc été co- transfecté avecles vecteurs de l'invention. Ce plasmide comprend le gène CAT sous le controle du LTR du virus RSV. Sa construction a été décrite dans Gorman et al (Science 221 (1983) 551). Exemple 3: Effet sur l'expression de gènes dans les cellules HeLa Cet exemple décrit une étude de l'activité des séquences de l'invention sur les niveaux d'expression de gènes dans des cellules d'un carcinome. Les cellules étudiées sont les cellules Hela. II s'agit de cellules issues d'un carcinome epithelial humain. Ces cellules ont été déposées a l'ATCC sous la référence ATCC CCL-2. Les cellules Hela ont été cultivées en milieu Dulbecco complémenté par 7% de serum Supreme. 106 cellules ont été reprises dans 0,15 ml de milieu sans serum, et transféctées par éléctroporation en utilisant le'Gène Pulser de Biorad, avec 1 pmol de chaque vecteur a tester, 5 pmol d'ADN véhicule (Bluescript II), et 0,5 pmol de plasmide RSV-CAT permettant d'évaluer l'efficacite de transfection. Les cellules ont été récoltées 24 et 48 heures apres la transfection, et testées en triple pour l'activité luciférase. Pour cela, le luminomètre LU MAT LB9501 (Berthold) a été utilisé, avec un volume réactionnel de 150 pl (luciférine 0,08 mM; ATP 0,1 mM; Tris Phosphate 25 mM pH 7,8; MEC12 8 mM; dithiothreitol 2mM; EDTA 1mM; Triton 1%; Glyceral 15%). L'activité luciférase de chaque vecteur a ensuite été normalisée a l'activité CAT résultant du vecteir RSV-CAT co-transfecté. L'activité CAT a été mesurée par comptage en scintillation liquide. L'activité luciférase normalisée est exprimée en RLU (Relative Light Units). Les résultats donnés sont les moyennes de trois expériences. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. Ils montrent que les séquences Ti 0i et Ti 0p induisent toutes les deux une forte augmentation de l'expression du gène. Ainsi, après 24 heures, la séquence T1 0i induit une augmentation de l'activité luciférase d'un facteur 90 et la séquence Ti 0p d'un facteur 160. L'augmentation observée est d'un facteur 250 environ pour les deux séquences, lorsque celles-ci sont disposées dans l'orientation inverse. Apres 48 heures, I'augmentation des niveaux d'expression observée est d'environ 300 a 350 fois, pour les deux séquences, dans les 2 orientations. Exemple 4: Effet sur l'exeression de gènes dans les cellules PC12 Cet exemple décrit une etude de l'activité des séquences de l'invention sur les niveaux d'expression de gènes dans des cellules d'un pheochromocytome de rat. Les cellules étudiées sont les cellules PC12, déposées a l'ATCC sous la référence ATCC CRL-1721. Les cellules PC12 ont été cultivées en milieu RPMI complémenté par 10% de sérum de cheval et 5% de sérum de veau fetal. Le protocole de transfection et de mesure de l'activité est identique a celui utilisé dans l'exemple 3 pour les cellules Hela. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3. Ils montrent que les séquences T1 0i et TI 0p induisent, quelle que soit leur orientation, une augmentation de l'expression du gène d'un facteur 25 après 24 heures et d'un facteur 50 après 48 heures. SEQ ID N.1 (partie du premier intron du gène TH, a partir du nucléotide 871) CTTGAATCTT AACGATCGGA ATGTGGAAAC AAATCCATCC AAAAAATCCA AGATGGCCAG AGGTCCCCGG CTGCTGCACC CAGCCCCCAC CCTACTCCCA CCTGCCCCTG CCTCCCTCTG CCCCAGCTGC CCTAGTCAGC ACCCCAACCA GCCTGCCTGC TTGGGGAGGC AGCCCCAAGG CCCTTCCCAG GCTCTAGCAG CAGCTCATGG TGGGGGGTCC TGGGCAAATA GGGGGCAAAA TTCAAAGGGT ATCTGGGCTC TGGGGTGATT CCCATTGGCC TGTTCCTCCC TTATTTCCCT CATTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCACC ATGGAGTCTG TGTTCCCTGT GACCTGCACT CGGAAGCCCT GTGTACAGGG GACTGTGTGG GCCAGGCTGG ATAATCGGGA GCTTTTCAGC CCACAGGAGG GGTCTTCGGT GCCTCCTTGG GCACTCAGAA CCTTGGGCTC CCTGGCACAT TTAAAATGGG TTTTTATTTA TGGACCTTGA TTGAAATGTG GTGTGAGTTG TAGCAGTGTC ATTTCCAGGT ACCTTCTCAG GGACACAGGG CGCCCTCCCC CGTCCTCCCC CGCCCTCCCC TACCCTCCCC CACCAGGCTC CCCATC REVENDICATIONS 1. Fragment isolé d'ADN caracterisé en ce qu'il possède une activité d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il consiste essentiellement en une portion du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase. 2. Fragment selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un allèle du microsatellite HUMTH01. 3. Fragment isolé d'ADN caractérisé en ce qu'il possède une activité d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il possède la séquence (TCAT): (CAT)o-(TCAT)p, dans laquelle n'est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est compris entre 0 et 50. 4. Fragment selon la revendication 3 caracterise en ce que n est compris entre 2 et 20 inclus, et o et p valent 0. 5. Fragment selon la revendication 3 caractérisé en ce que n'est compris entre 1 et 10, o est compris entre 1 et 5 et p est compris entre 1 et 10. 6. Fragment selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il possède la séquence SEQ ID N.1, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12,13, 14ou 15. 7. Cassette d'expression comprenant - un promoteur transcriptionnel - une séquence codante - un enhanceur transcriptionnel tel que défini dans les revendications 1 a6. 8. Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel est un promoteur fonctionnel dans les cellules mammifères. 9. Cassette d'expression selon la revendication 8 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel est choisi parmi les promoteurs viraux, ubiquitaires et spécifiques de tissu. 10. Cassette d'expression selon la revendication 8 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel comprend essentiellement une région TATA ou INR. 11. Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'enhanceur transcriptionnel est en orientation sens. 12 Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'enhanceur transcriptionnel est en orientation antisens. 13. Vecteur d'expression comprenant une cassette selon la revendication 7. 14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique. 15. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 16. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 a 6. 17. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite une cassette d'expression selon la revendication 7. 18. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite un vecteur selon la revendication 13. 19. Utilisation de séquences dérivées du microsatellite HUMTHO1 comme enhanceur transcriptionnel. 20. Procède de production de protéines comprenant l'introduction dans une cellule d'une cassette selon la revendication 7 ou d'un vecteur selon la revendication 13.