FR 2751513 A1 19980130 FR 9709411 A 19970724 -1 - Domaine technique de l'invention L'invention a trait à des produits alimentaires congelés contenant des AFP. Arrière-plan de l'invention On a décrit des protéines anti-congélation dans la littérature, voir, par exemple, Marilyn Griffith et K. Vanya Ewart dans Biotechnology Advances, volume 13, n 3, pages 375 à 402, 1995. Les protéines anti-congélation possèdent en général une ou plusieurs des propriétés suivantes: hystérésis thermique, inhibition d'une recristallisation de la glace, régulation de la forme des cristaux de glace et interaction avec des agents de germination de glace. L'hystérésis thermique est la propriété la mieux connue des AFP et on utilise normalement cette propriété afin d'évaluer la présence de AFP. L'hystérésis thermique résulte d'un abaissement de la température de congélation apparente d'une solution contenant un AFP actif sur l'hystérésis thermique sans affecter la température de fusion. On décrit largement l'identification des sources de l'AFP au moyen d'essais d'hystérésis thermique dans la littérature, voir, par exemple, John G Duman dans Cryobiology 30, pages 322 à 328, (1993). -2- L'inhibition de la recristallisation de la glace est une autre propriété des AFP. On désigne également cette activité comme étant la suppression de la croissance cristalline de la glace. On peut évaluer cette propriété en comparant à un certain instant la taille des cristaux de glace en présence d'AFP et en absence d'AFP. La mise en oeuvre de ce procédé dans l'évaluation des AFP de poisson est décrite dans le brevet US 5 118 792 (DNA Plant Technology Corporation). Une troisième propriété des AFP est leur capacité d'influencer la forme des cristaux de glace. Cette propriété a pour origine la liaison sélective des AFP à certaines faces du cristal de glace et la limitation par ceux-ci de la croissance cristalline selon certaines directions. On considère que la présence de cristaux de glace ayant une forme bipyramidale hexagonale est indicatrice de la présence d'AFP. On décrit par exemple ce procédé pour l'évaluation de l'activité des AFP extracellulaires de seigles d'hiver dans WO 92/22581 (Université de Waterloo). Une quatrième propriété des AFP est leur capacité à inhiber l'activité de substance de germination de glace. Cette interaction entre un AFP et un agent de germination de glace peut par exemple aboutir à une hystérésis thermique accrue. Cette propriété est évaluée par exemple dans WO 96/40973 (Université de Notre Dame du Lac). On a proposé les AFP pour l'amélioration de la tolérance envers la congélation des produits. On a proposé de nombreuses mises en oeuvre dans ce contexte. Par exemple, on a proposé les AFP pour améliorer la conservation par le froid de matières biologiques (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). On a également proposé les AFP pour empêcher les fuites de liposomes, par exemple -3dans les produits cosmétiques ou pharmaceutiques (voir WO 96/20695). Une application possible supplémentaire est d'augmenter la tolérance des végétaux envers la congélation en y incluant (ou en produisant de manière transgénétique dans ceux-ci) un AFP (voir J. Cell. Biochem Suppl. volume 14e, 1990, page 303 XP002030248, Lee et al., résumé R228). On a également proposé les AFP de poisson pour une utilisation dans les produits alimentaires, par exemple dans du yaourt congelé ou de la crème glacée (brevet US 5 620 732 de Pillsbury et WO 96/11586, partenariat limité de recherche et de développement HSC). Toutefois, jusqu'à présent, on n'a pas appliqué l'utilisation des AFP à une échelle industrielle. Les demandeurs sont d'avis qu'une des raisons du manque de mise en oeuvre industrielle est que, bien que l'on ait décrit de nombreux AFP, la mise en oeuvre en pratique dans des produits industriels véritables rencontre de graves problèmes. Les demandeurs ont trouvé que l'une des raisons clé de ces problèmes est que parmi le grand nombre d'AFP que l'on a décrits dans la littérature, on ne peut appliquer de manière appropriée qu'un ensemble limité de AFP pour chaque mise en oeuvre; de même les demandeurs ont trouvé que ce choix des AFP appropriés dépend de la mise en oeuvre et/ou des attributs du produit souhaité à réaliser. Une source particulièrement souhaitable des AFP est la matière végétale. On peut obtenir relativement facilement des matières végétales en des quantités assez grandes et on peut utiliser des procédés d'isolation assez simples afin d'obtenir un concentré contenant de l'AFP. De plus, on pense que l'utilisation des AFP provenant de matières végétales est en faveur chez les consommateurs qui tendent à préférer des sources naturelles végétales par rapport, par exemple, aux AFP de poisson. -4- Marilyn Griffith et K. Vanya Ewart dans Biotechnology Advances, vol. 13, n 3, pages 375 à 402, 1995, ont donné une liste de 27 espèces de plantes supérieures dans lesquelles on trouve une activité anticongélation. Cet article propose également une large gamme d'applications possibles pour les AFP. Les demandeurs ont maintenant trouvé que si l'on choisit une application spécifique de l'utilisation des AFP végétaux, ceux-ci créent le besoin d'un essai spécifique afin de choisir l'ensemble limité des AFP que l'on peut appliquer avec avantage dans cette mise en oeuvre. Le but de la présente invention est donc de fournir ces AFP végétaux que l'on peut utiliser avec avantage dans des produits congelés de confiserie. De manière étonnante, les demandeurs ont trouvé que, malgré le fait qu'un grand nombre de plantes contiennent des AFP, il n'y a qu'un ensemble limité de plantes qui contiennent des AFP qui sont capables d'offrir une bonne texture aux produits congelés de confiserie. De manière étonnante, il s'est avéré que l'on pouvait utiliser un procédé relativement simple pour le choix des AFP appropriés. Selon un premier aspect, l'invention a trait aux produits congelés de confiserie comprenant un ou plusieurs AFP d'origine végétale, dans lesquels les AFP dans de l'eau possèdent une taille de cristaux de glace, (mesurée telle que décrite ci-dessous), après congélation rapide à - 40 C suivi par un stockage pendant une heure à -6 C, inférieure à 15 Mm. Arrière-plan de l'invention Un certain nombre d'articles a proposé que l'on puisse utiliser potentiellement les AFP pour influencer de manière favorable les propriétés de texture des produits congelés -5- de confiserie tels que la crème glacée. Toutefois, la plupart de ces documents n'apportent pas un enseignement sur la manière comme on peut effectivement réaliser ces propriétés favorables dans la pratique. Un ensemble de documents supplémentaires décrit l'utilisation d'AFP de poisson. WO 96/11586 enseigne la mise en oeuvre de polypeptides anti-congélation de poisson dans des produits alimentaires fermentés congelés. Ce document n'enseigne pas l'utilisation d'AFP spécifiques d'origine végétale, dans ces produits. WO 96/39878 décrit la mise en oeuvre d'AFP dans la crème glacée. Les AFP appropriés dans cette mise en oeuvre peuvent provenir du sang et du tissu musculaire de poissons de l'Antarctique, de poissons de l'arctique, de vers et d'insectes. Ici encore, on n'apporte aucun enseignement sur la possibilité d'utilisation d'AFP végétal. US 5 118 792 décrit dans l'exemple 3B, l'inhibition d'une recristallisation au moyen d'une protéine de fusion 23 A-Saf5 purifiée dans un mélange de Popsicle . Ici encore, de document n'enseigne pas l'utilisation d'AFP d'origine végétale. WO 02/22581 décrit une pluralité de polypeptides provenant des espaces extracellulaires de seigle d'hiver. On décrit de nombreuses applications possibles de ces polypeptides, en général on situe parmi celles-ci la crème glacée. Toutefois, on n'apporte aucun enseignement quant à celui des polypeptides qu'il faut choisir pour obtenir une crème glacée de bonne qualité. Les demandeurs ont trouvé qu'il n'y a que certaines protéines spécifiques provenant du seigle d'hiver qui conviennent à une utilisation dans la crème glacée (voir exemples). Les demandeurs ont trouvé qu'un grand nombre de végétaux que jusqu'ici on n'avait pas énoncés en tant que -6- tels, contiennent une teneur significative en AFP. D'autre part, il s'est avéré que pas toutes les plantes contenant de l'AFP ne fournissent le bon type d'AFP en vue d'influencer de manière favorable la texture de la confiserie congelée. Les demandeurs visent à présent à offrir un choix particulièrement nouveau de sources végétales qui présentent de manière étonnante d'une part de bonnes propriétés d'AFP et d'autre part sont capables d'influencer de manière favorable les propriétés de texture de la crème glacée. En particulier, il s'est avéré que l'on peut choisir des AFP appropriés en prenant une composition comprenant de l'AFP dans une composition aqueuse, en congelant rapidement cette composition à -40 ou moins suivi par un stockage pendant une heure à -6 C. Les AFP appropriés entraînent une taille de cristaux de glace après stockage pendant une heure dans ces conditions, d'au moins 15 pm, de manière particulièrement préférée de 5 à 14 pm, de manière tout particulièrement préférée de 8 à 12 Mm. La température de congélation rapide est de manière avantageuse de -40 à -100 C, de préférence de -80 C. On donne dans l'exemple I une description détaillée d'un essai approprié à la détermination de cette caractéristique. En général, on peut appliquer l'essai à toute composition appropriée comprenant un AFP et de l'eau. En général, la concentration en AFP dans une telle composition d'essai n'est pas très critique et elle peut être, par exemple, de 0,0001 à 0,5% en poids, de manière particulièrement préférée 0,0005 à 0,1% en poids, de manière tout particulièrement préférée de 0, 001 à 0,05% en poids, par exemple 0,01% en poids. La concentration en eau dans la composition est avantageusement de 30% en poids ou plus, par exemple de 50% à 99,9999% en poids. -7- On peut utiliser toute composition appropriée comprenant de l'AFP et de l'eau pour effectuer l'essai. Si souhaité, des additifs peuvent être présents, par exemple du saccharose ou des agents tampon. Toutefois, en général, il ne sera pas nécessaire d'obtenir l'AFP sous forme purifiée. Pour les mises en oeuvre pratiques, il devrait suffire de préparer un extrait liquide ou un jus d'une matière végétale, dans lesquelles on peut alors évaluer cet extrait ou jus. On donne dans l'exemple II un procédé approprié de préparation de compositions liquides appropriés. Normalement, on a soumis au froid les végétaux à évaluer pour des AFP appropriés. Par exemple on peut évaluer des végétaux qui poussent dans des climats froids, par exemple des végétaux de l'Antarctique. En variante, on peut récolter des végétaux pendant la période d'hiver, de préférence de décembre à mars, de manière particulièrement préférée de janvier à février, de manière tout particulièrement préférée en janvier (hémisphère nord), ou de juin à septembre, de manière particulièrement préféré de juillet à août, de manière tout particulièrement préférée en juillet (hémisphère sud). Les demandeurs ont soumis un grand nombre de plantes à l'essai décrit cidessus. On donne les résultats dans les exemples III et IV. Les sources préférées des AFP proviennent de Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofaqus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Kumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulqaris, Aceana maqellanica, Pisum sativum, Acer saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (carotte), Vinca minor (pervenche) Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus niqra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Aqrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, -8- Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (herbe élancée), Poa pratensis (herbe bleue du Kentucky), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca reqalis, Himantormia lugubris, Hypoqymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon qlabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus Bromus sterilis et Festuca contracta. Les demandeurs sont d'avis qu'en se basant sur les directives données dans la description de l'invention, l'homme de métier sera bien en mesure de choisir d'autres AFP que l'on peut extraire de manière appropriée de végétaux. L'utilisation de ces AFP est également englobée dans le champ de la présente invention. Dans une forme de réalisation particulièrement utile pour une mise en oeuvre dans des produits alimentaires, on trouve ces AFP végétaux, qui satisfont l'essai de taille de cristal définie ci-dessus et que l'on extrait des végétaux non toxiques ou faiblement toxiques. Dans ce contexte, on préfère les AFP extraits de carotte, de graminée, de Bamboo, etc. Une autre sélection préférée parmi les sources ci- dessus constitue les AFP extraits de la famille des lichens, en particulier Alectoria niqricans, Caloplaca reqalis, Himantormia luqubris, Hypoqymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon qlabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana. Ces AFP présentent des propriétés particulièrement bonnes dans les produits congelés de confiserie. D'autres AFP qui présentent une activité particulièrement bonne sont extraits de Juncus squarrosus ou Geranium. -9- Pour certaines applications, on choisit les AFP qui conservent leur capacité à limiter la croissance des cristaux de glace (tel que mis en évidence par l'essai ci- dessus) même après un traitement thermique au-dessus d'une température de 60 C, de manière tout particulièrement de 80 à 105 C pendant une durée d'au moins 30 secondes, de manière particulièrement préférée pendant plus de 1 minute, minutes ou même plus de 1 heure. Les sources végétales appropriées qui sont thermiquement stables sont par exemple Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bronus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis et Acrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua. Outre les végétaux susmentionnés, les demandeurs ont évalué les AFP provenant de Secale cereale (seigle d'hiver). On a décrit plusieurs AFP de seigle d'hiver dans WO 92/22581. De manière étonnante, les demandeurs ont trouvé que la protéine de 32 kDa provenant du seigle d'hiver satisfait l'essai de taille de cristal décrit ci- dessus, tandis que d'autres protéines provenant du seigle d'hiver ne satisfont pas l'essai (voir l'exemple IX). Pour les besoins de l'invention, donc, si l'on utilise des AFP provenant de seigle d'hiver, on met en oeuvre de préférence la protéine de 32 kDa. Une autre forme préférée de réalisation de l'invention a trait à l'utilisation dans les produits congelés de confiserie d'AFP végétaux qui satisfont l'essai ci-dessus et qui ne sont pas extraits du seigle d'hiver. -10- Description détaillée de l'invention Des produits congelés selon la présente invention contiennent au moins un AFP, que l'on peut extraire de source végétale. On peut obtenir les AFP à partir de sources végétales par tout moyen approprié, par exemple les procédés d'isolement tels que décrits dans les documents susmentionnés. En variante, on peut extraire les AFP des végétaux, par exemple en préparant un extrait végétal à partir de parties de la plante suivi par une éventuelle étape de concentration. On donne dans les exemples des exemples de procédés appropriés en vue d'obtenir de tels extraits. De même, on peut modifier génétiquement des micro- organismes ou des végétaux afin d'exprimer des AFP puis on peut utiliser les AFP selon la présente invention. On peut utiliser des techniques de manipulation génétique afin de produire des AFP qui sont homologues aux AFP à raison d'au moins 80%, de manière particulièrement préférée plus de 95%, de manière tout particulièrement préférée de 100%, obtenus directement à partir de sources végétales qui contiennent naturellement les AFP. Pour le besoin de l'invention, on englobe également dans le terme "AFP extraits de végétaux" les AFP possédant ce degré élevé d'homologie. Pour le besoin de l'invention, le terme "AFP extrait de végétaux" n'inclut pas de préférence les AFP qui existent naturellement dans les sources non végétales, par exemple les poissons et qui sont produits par des végétaux au moyen de voie transgénétique. On peut utiliser les techniques de manipulation génétique de la manière suivante: on transformerait une cellule ou un organisme hôte approprié au moyen d'un produit de recombinaison de gène qui contient la zone codante pour le polypeptide souhaité. -11 - On peut insérer la séquence de nucléotides codant pour le polypeptide dans un vecteur d'expression approprié. Ledit vecteur codant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction, et d'une manière telle qu'ils seront exprimés dans des conditions appropriées (par exemple selon une orientation correcte et un cadre de lecture correct et avec des séquences cibles et d'expression appropriées). Les procédés nécessaires à la construction de ces vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme de métier. On peut utiliser un certain nombre de systèmes d'expression afin d'exprimer la séquence codant le polypeptide. Ceux-ci incluent, mais ne s'y limitent pas, les systèmes cellulaires de bactérie, de levure, d'insecte, les systèmes de culture de cellules végétales et les végétaux tous transformés avec les vecteurs d'expression appropriés. On peut utiliser les AFP que l'on peut obtenir à partir des sources susmentionnées dans tous produits congelés de confiserie appropriés. Pour le besoin de l'invention, le terme "produit congelé de confiserie" inclut les confiseries congelées contenant du lait telles que la crème glacée, le yaourt congelé, le sorbet, le lait glacé et la crème anglaise congelée, les glaces à l'eau, les granitas et les purées de fruits congelées. Pour certaines applications, on préfère moins leur utilisation dans les produits alimentaires fermentés congelés. De préférence la concentration en AFP dans le produit congelé de confiserie est de 0,0001 à 0,5% en poids par rapport au produit final, de manière particulièrement préférée de 0,0005 à 0,3% en poids, de manière tout particulièrement préférée de 0,001 à 0,2% en poids. -12- De préférence, la concentration en solides dans la confiserie congelée (par exemple du sucre, des graisses, des arômes, etc.) est supérieure à 2% en poids, de manière particulièrement préférée de 4 à 70% en poids. Si nécessaire, on peut aérer le produit congelé de confiserie de l'invention, par exemple jusqu'à un gonflement de 50 à 500%. On peut choisir le procédé de préparation du produit congelé de confiserie de l'invention parmi tout procédé approprié à sa préparation. On peut en général ajouter les AFP à diverses étapes de la préparation, par exemple on peut les ajouter dans le premier prémélange des ingrédients ou on peut les ajouter plus tard au cours d'une étape ultérieure du processus de préparation. Pour certaines applications, il est quelquefois préféré d'ajouter les AFP à une étape relativement tardive du processus de production, par exemple après une précongélation (partielle) du produit. On peut choisir le procédé de congélation des produits congelés de confiserie parmi tout procédé de congélation approprié et il peut éventuellement comprendre une étape d'aération, par exemple jusqu'à un gonflement de 50 à 300%. Pour certaines utilisations, il est avantageux que le procédé de congélation comprenne une étape de durcissement à froid, par exemple à une température de -34 C (-30 F) ou inférieure. Pour certaines mises en oeuvre, il peut être avantageux d'incorporer un ou plusieurs mélanges d'AFP différents dans le produit congelé de confiserie. Une raison pour ceci peut être, par exemple, que la source pour les AFP à utiliser, contient plus d'un AFP et il est plus commode d'ajouter ceux- ci, parce qu'ils sont tous les deux présents dans l'extrait végétal à utiliser. En variante, il -13- peut quelquefois être souhaitable d'ajouter plus d'un AFP provenant de différentes sources. On va maintenant illustrer l'invention à l'aide des exemples suivants. Exemple I Essai de détermination de la taille de particule de glace après refroidissement rapide suivi d'un stockage à 6 C pendant une heure. Le procédé préféré est le suivant: Ia: On a mesuré une activité anticongélation en utilisant un "essai avec flac" ("splat array") (Knight et al., 1988). On a transféré 2,5 pl de la solution étudiée dans du saccharose à 30% (p/p) sur une lame porte- objet propre, étiqueté de manière appropriée, d'un diamètre de 16 mm. On a placé une deuxième lame porte- objet par-dessus la goutte de solution et on a pressé ensemble le sandwich entre le doigt et le pouce. On a laissé tomber le sandwich dans un bain d'hexane maintenu à -80 C dans une boite de neige carbonique. Lorsqu'on avait préparé tous les sandwiches, on a transféré les sandwiches du bain d'hexane à -80 C vers la chambre d'observation contenant de l'hexane maintenu à -6 C en utilisant des pinces prérefroidies dans la neige carbonique. Lors du transfert à -6 C, on a observé que les sandwiches passaient d'un aspect transparent à un aspect opaque. On a enregistré les images à l'aide d'une caméra vidéo et on les a saisies dans un système d'analyse d'image (Lucia, Nikon) en utilisant un objectif 20 x. On a enregistré chaque prélèvement à l'instant T=0 et encore après 60 minutes. En variante (moins préféré) on peut mesurer les propriétés de la manière suivante: -14- Ib: On a ajusté la concentration en saccharose à 30% en poids pour un échantillon d'une eau contenant du produit contenant de l'AFP. (Si la concentration initiale de l'échantillon est supérieure à 30%, on l'y a conduit par dilution, si la concentration était plus faible, on a ajouté du saccharose jusqu'à la concentration de 30%). On a placé une goutte de 3 pl de l'échantillon sur une lame porte-objet de 22 ml. Puis on a placé une lame couvre- objet de diamètre 16 mm par-dessus et on a placé un poids de 200 g sur l'échantillon afin d'assurer une épaisseur uniforme de lame. On a scellé les bords de la lame porte- objet avec du vernis à ongles transparent. On a placé la lame sur une platine de microscope thermostaté Linkham THM 600. On a refroidi rapidement la platine (50 C par minute) jusqu'à - 40 C afin de produire une grande population de petits cristaux. Puis on a élevé rapidement la température de la platine (50 C par minute) jusqu'à -6 C et on l'y a maintenue à cette température. On a examiné la phase de glace à -6 C en utilisant un microscope Leica Aristoplan. On a utilisé des conditions de lumière polarisée conjointement avec une plaque onde afin d'améliorer le contraste des cristaux de glace. On a enregistré l'état de la phase de glace (taille des cristaux de glace) au moyen d'une microphotographie en 35 mm à T=0 et T=1 heure. A la suite de quoi une taille de particule moyenne (détermination visuelle, moyenne en nombre) inférieure à 15 pm indique un AFP approprié à une utilisation dans les produits selon l'invention. Exemple II Procédés pour obtenir des compositions contenant de l'AFP et de l'eau 15- A. On a broyé avec un pilon et un mortier (refroidis à 4 C) du tissu frais de parties végétales, par exemple les racines, les tiges, les bourgeons ou les feuilles, dans un tampon A à volume égal (par exemple EDTA 10mM, acide ascorbique 20 mM, tamponné avec Tris jusqu'à pH = 7,4) maintenu sur de la glace. On a filtré les homogénats à travers une ou plusieurs couches de mousseline et on les a conservés sur de la glace avant leur utilisation ultérieure. On peut appliquer en général ce procédé à la plupart des végétaux et on peut obtenir du jus de plante fraîche contenant l'AFP. En général on peut utiliser la plante entière dans ce but bien que pour des raisons pratiques, on peut n'utiliser quelquefois que certaines parties (par exemple les feuilles provenant d'arbres ligneux, les racines provenant de légumes à tubercule et les tiges de graminées). B. Procédé d'extraction des AFP de sources qui sont capables de supporter la chaleur telles que les graminées. On donne ce procédé à titre d'exemple en utilisant un mélange d'herbes. Toutefois, il sera évident que l'on peut également appliquer ce procédé à d'autres espèces thermiquement stables. On a coupé du tissu d'herbes mélangées (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) en janvier (la température moyenne pendant ce mois était de 3,5 C assurant l'acclimatation au froid appropriée des plantes). On a rapidement transporté le tissu d'herbes dans le laboratoire pour un traitement ultérieur et on l'a lavé minutieusement avec de l'eau pour éliminer les salissures. On a placé 500 g de tiges d'herbe coupée dans un four à micro-ondes de 650 Watts et on a chauffé à pleine puissance pendant 5 minutes, alors la température -16- s'est élevée jusqu'à 85, voire 100 C. Puis on a refroidi les tiges d'herbe coupée à la température ambiante. Après l'étape de chauffage, on a séparé le jus riche en AFP d'avec les tiges coupées par filtrage. On a agité en continu la masse pendant 5 minutes en présence d'un volume égal d'eau puis on l'a pressée à travers 3 couches de mousseline. Exemple III Sélection de diverses plantes. On a récolté des plantes ne provenant pas de l'Antarctique en janvier (milieu de l'hiver). On a récolté les plantes de l'Antarctique au milieu de l'été (février à mars). Sauf indication contraire, on a utilisé les racines pour préparer un jus contenant de l'AFP selon le procédé décrit dans l'exemple IIa. On a soumis les échantillons à l'essai de l'exemple Ia. On indique les AFP appropriés pour une mise en oeuvre 2 J dans les produits congelés de confiserie par un signe positif (+). En outre, on a mesuré les propriétés d'hystérésis thermique des jus de la manière suivante: on a déterminé l'hystérésis thermique d'un échantillon d'un produit contenant des AFP en plaçant le produit à l'état fondu sur une micro-lamelle (Camlab Cambridge, longueur de chemin 0,1 mm). On scelle les extrémités de la micro-lamelle avec de la gelée de pétrole. On introduit de la glace dans l'échantillon en utilisant une pulvérisation de refroidissement par aérosol. Puis on a immergé la lame dans un bain d'éthanol thermostaté à -0,1 C. Après équilibration pendant 5 minutes, on contrôle l'échantillon. Si la glace fond complètement, on a abaissé la température du bain par pas de 0,1 C suivi par une équilibration. On arépété ces -17- étapes jusqu'à atteindre une température o une faible quantité de cristaux de glace existait dans l'échantillon. Après équilibration à cette température, on a abaissé la température du bain par paliers de 0,01 C par minute. On a enregistré le point de congélation de l'échantillon comme étant la température à laquelle la propagation de la glace débute à partir des cristaux équilibrés. Puis on détermine la température de fusion de l'échantillon en élevant la température à partir du point de congélation, par pas de O,01 C par minute, jusqu'à ce que tous les cristaux de glace fondent. Cette température est la température de fusion de l'échantillon. L'hystérésis thermique de l'échantillon est la différence entre la température de fusion et la température de congélation. Les AFP ayant un degré significatif d'hystérésis thermique sont indiqués par un signe positif (+). On obtient les résultats suivants. -18- Nom de la plante Hystérésis Inhibition de la thermique recristallisation (exemple I Equisitum hymenale + Picea glauca + - Dicentra cucularia + - Viola sp. + - Brassica oleracea + - Brassica rapa + - Brassica napus + - Daucus carota + + Vinca minor + + Solanum tuberosum + Poa annua + Poa pratensis + Secale cereale + *) Petroselinum crispum + Salvia officinales + *) remarque: actif mais uniquement la protéine de 29 à 32 kDa. Ces résultats indiquent clairement que bien qu'un grand nombre de plantes présentent des propriétés d'hystérésis thermique, il n'y a qu'une faible proportion parmi celles-ci qui satisfont l'essai de recristallisation. Exemple IV Sélection de diverses plantes. On a récolté des plantes ne provenant pas de l'Antarctique en janvier (milieu de l'hiver). On a récolté les plantes de l'Antarctique au milieu de l'été (février à mars). -19- Sauf indication contraire, on a utilisé des racines afin de préparer un jus contenant de l'AFP selon le procédé décrit dans l'exemple IIa. On a soumis les échantillon à l'essai de l'exemple Ia. Les AFP appropriés à une mise en oeuvre dans les produits congelés de confiserie sont indiqués par un signe positif (+). Nom de la plante Essai d'inhibition de la recristallisation Equisetum Asplenium scolopendrium Polystichum mohriodes + Pinus sylvestris Picea glauca Cupress sp Laurus Ranunculus biternatus + Dicentra Platanus orientalis Urtica Pterocarya fraxinifolia Nothofagus antarctica + Nothofagus oblique Betula pendula Beta vulgaris Cerastium fontanum + Colobanthus quitensis + Rumex acetosella + Paeonia Hypericum -20- Alcea Viola Populus alba Salix alba "Britzensis" Salix daphnoides Salix fragilis + Sorbus aria Prassica napus Erysimum Calluna vulgaris + Primula Hydrangea Sedum Acanea magellanica + Crategus monogyna Cotoneaster spp x2 Fragaria x ananassa Alchemilla Cytisus Pisum sativum + Vicia faba Medicago sativa Daphne Eucalyptus Aucuba Ilex Acer saccharoides + Rhus Oxalis + -21- Géranium + Hedera Daucus carota + Pastinaca sativa Vinca + Polemonium + Rosmarinus Buddleia + Forsythia + Fraxinus ornus Lonicera pileata Sambucus nigra + Lactuca sativa Tragopodoon porrifolius Helianthus tuberosus' Juncus squarrosus + Carex aquatilis + Agrostis tenuis + Deschampsia antarctica + Festuca contracta + Festuca rubra + Paradiochloa flabellata + Phleum alpinum + Poa annua + Poa pratensis + Rostkovia magellanica + (herbe) Bambosoideae sp + Muscari armenicum Allium ampeloprasum cv -22- Alaska Allium cepa Chorisodontium aciphyllum + Drepanocladus uncinatus + Isothecium myosuroides + Neckera complanata Polystichum alpestre + Polytrichum commune Polytrichum formosum Racometrium lanuginosum Spagnum capillofolium Sphagnum palustsre Alectoria nigricans + Caloplaca regalis + Himantormia lugubris. + Hypogymnia physodes + Parmelia subrudecta + Ramalina farinaceae + Stereocaulon glabrum + Umbilicaria antarctica + Usnea subfloridana + Exemple V On a fabriqué un prémélange liquide afin de préparer une crème glacée, en mélangeant: -23- Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 11,390 Saccharose 3,140 Maltodextrine (MD40) 4,000 Gomme de caroube 0,072 Sirop de maïs 63DE 20,705 Gomme de guar 0,048 Genulta L100 0,020 Beurre 9,015 Avicel RC581 0,240 Gélatine 0,140 Monoglycéride (palmitate) 0,450 Vanilline 0,010 AFP (de l'exemple IIb) 0,01 ou aucun (témoin) Eau le complément * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée en AFP en utilisant une partie de l'eau ajoutée en tant que diluant, le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. On peut pasteuriser ce mélange de manière commode à C pendant 15 secondes et on peut l'entreposer refroidi dans une boîte. On peut utiliser les mélanges dans la préparation d'une crème glacée en la battant avec un mixer domestique classique jusqu'à un gonflement d'environ 100%, suivi par une congélation lente dans un congélateur domestique. La composition selon l'invention possédait une texture remarquablement améliorée par rapport à l'échantillon témoin. -24- On peut obtenir des résultats similaires en utilisant les sources végétales suivantes: Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus qcruintensis et Aqrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua. Exemple VI On a préparé un prémélange liquide pour la préparation de crème glacée en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 10,00 Saccharose 13,00 Maltodextrine (MD40) 4,00 Gomme de caroube 0,14 Matière grasse du lait 8,00 Monoglycéride (palmitate) 0,30 Vanilline 0,01 AFP (de l'exemple IIb) 0,01 ou aucun (témoin) Eau le complément - * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée en AFP dans une partie de l'eau; le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. On a mélangé les ingrédients à la température ambiante suivi par une pasteurisation pendant 60 secondes à 89 C. On a rempli de manière aseptique des paquets de 500 ml avec le mélange, on les a scellés et stockés aux températures ambiantes. -25- On peut utiliser le mélange dans la préparation d'une crème glacée en la battant avec un mixer domestique classique jusqu'à un gonflement d'environ 110%, suivi par une congélation dans des conditions calmes dans un congélateur domestique. Après deux mois de stockage, la composition selon l'invention possédait une structure remarquablement améliorée par rapport à l'échantillon témoin. Exemple VII Cet exemple décrit l'isolation et le séquençage de AFP de carotte. On peut utiliser des procédés similaires pour d'autres AFP végétaux. On a homogénéisé du tissu de racine de carotte provenant de carottes acclimatées au froid dans trois volume (p:v) de tampon (acide ascorbique 10mM, EDTA 10mM, Tris/HCl 50mM, pH 7,2) à l'aide d'un pilon et d'un mortier pré-refroidis et on a filtré à travers une couche de mousseline. On a centrifugé le filtrat à 6 000 g, pendant 10 minutes à 4 C; on a recueilli le surnageant et on a centrifugé à 100 000 g pendant une heure à 4 C. Le surnageant après 100 000 g provenant de cette étape est appelé la fraction soluble et le culot la fraction microsomale. On a appliqué le surnageant à une colonne chromatographique de Q Sepharose (Pharmacia) à écoulement rapide de 30 ml, pré-équilibré avec Tris/Hcl 50mM, pH 7,4, à un débit de 5 ml par minute fourni par une pompe HiLoad P-50 commandée par un système de chromatographie à basse pression Gradifrac (Pharmacia) à 4 C et on a mesuré la DO de l'éluat à 280 nm à l'aide d'un contrôleur UV (Monitor UV1, Pharmacia) avec enregistrement sur un enregistreur à papier (REC 102, Pharmacia). On a recueilli les fractions de 5 ml. On a lavé la colonne avec Tris/HCl 50mM, pH 7,4 au -26- mame débit jusqu'à ce que la DO à 280 nm revienne à zéro. Puis on a appliqué un gradient de 150 ml de NaCl de 0 à 0,4M dans Tris/HCl pH 7,4, suivi par un lavage de la colonne par NaCl 2M. On a soumis les fractions d'éluat à "l'essai de flac" comme dans l'exemple I. On a regroupé les fractions contenant une activité anti-congélation et on les a concentrées en utilisant du polyéthylèneglycol comme suit: on a transféré les fractions dans un tube de dialyse coupant à 10 kDa (Sigma) que l'on avait lavé dans de l'eau du robinet, bouilli dans EDTA OmM, pH 7,5, pendant 10 minutes et on rincé dans de l'eau de qualité "milli Q". On a recouvert le tube de dialyse contenant l'échantillon à concentrer d'un composé solide polyéthylèneglycol de masse moléculaire 15000 à 20000 (Sigma) et on a incubé à 4 C pendant jusqu'à 4 heures ou jusqu'à ce que le volume de l'échantillon dans le tube de dialyse se soit réduit d'un facteur 10. On a appliqué le concentré regroupé provenant de la colonne de Q Sepharose soit à une colonne de phényl- Sepharose, une colonne de perméation sur gel SMART superdex ou une colonne de perméation sur gel FPLC superdex 75. On a purifié des protéines anti-congélation provenant de racines de carottes au moyen d'une chromatographie par perméation de gel de la manière suivante: On a appliqué des aliquotes de 20 Ml d'échantillon à une colonne SMART superdex 75 (Pharmacia) pré-équilibrés avec Tris/HCl 50mM, pH 7,4, contenant NaCI 0,15M (tampon E) à un débit de 40 pl/minute et on a séparé les composants par perméation de gel au même débit dans le tampon d'équilibration. On a mesuré la DO de l'éluat à 280 nm et à 215 nm. On a recueilli des fractions de 80 pl entre 0,85 et 0,89 ml, des fractions de 40 pl entre 0,89 et 1,24 ml et des fractions de 100 pl entre 1,24 et 3,0 ml. Le volume des vides (Vo) de la colonne était de 0,91 ml tel que déterminé -27- par le volume de rétention d'une solution de Blue Dextran. On a étalonné la colonne superdex en appliquant 10 pl d'une solution contenant 5 mg/ml de BSA (Mr 66 kDa, rétention (Ve)=1,02 ml), 3 mg/ml d'anhydrase carbonique (Mr 29 kDa, Ve=1,22 ml), 2 mg/ml de Cytochrome C (Mr 12,4 kDa, Ve=1,41 ml) et 2 mg/ml d'Aprotinine (Mr 6,5 kDa, Ve=1,59 ml) et on a tracé une courbe d'étalonnage de Ve/Vo en fonction de logMr. On a identifié les fractions contenant une activité anticongélation au moyen des "essais de flac" dans l'exemple I, avec un pic d'activité qui indiquait un volume de rétention de 1,16 ml et une masse moléculaire apparente de 40 kDa. Ces mesures ont confirmé que la bande de 38 kDa des carottes acclimatées au froid était un peptide anti- congélation. On a effectué une analyse SDS-PAGE selon Laemmli (1970) en utilisant le mini-système Biorad. On a dissous les échantillons destinés à une analyse par SDS-PAGE dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE (Laemmli 1970), on les a chauffés pendant 5 minutes à 100 C sur un bloc de chauffage à sec (Techne) et on les a centrifugés pendant 3 minutes à 000 g à la température ambiante. On a appliqué les échantillons (10 à 50 pl) à des mini-gels (Biorad, épaisseur de 0,75, 1,0 ou 1,5 mm, 10, 12, 15% d'acrylamide ou 10 à 20% de gradient d'acrylamide {pré-versé de chez Biorad}) et on les a séparés par électrophorèse. On a fixé et coloré les polypeptides séparés dans le gel soit avec le bleu Coomassie (Coomassie Brilliant Blue à raison de 0,1% {p/v} dans un mélange d'acide acétique/méthanol/eau milli Q {5:4:31, en volume}) soit coloré à l'argent en utilisant la trousse de coloration à l'argent de Biorad en suivant les instructions du fabricant. On a séché les gels entre deux feuilles de collophane dans un séchoir gelair de Biorad en suivant les instructions du fabricant. On a utilisé des trousses de marquage Sigma pour masses moléculaires élevée -28- et faible en suivant les instructions du fabricant pour la détermination de la Mr apparente sur SDS-PAGE. On a réalisé la chromatographie par échange d'ions avec une racine de carotte acclimatée au froid et une racine de carotte non acclimatée au froid. Les gels SDS- PAGE résultants ont indiqué la présence d'une bande d'environ 38 kDa dans l'échantillon acclimaté au froid. Cette bande était nettement moins abondante dans le cas de la racine non acclimatée au froid. Ainsi on attribue cette bande de 38 kDa (environ) à une activité anti-congélation. Pour le séquençage des protéines, on a purifié la protéine de racine de carotte d'environ 38 kDa tel que décrit dans l'exemple précédent puis en vue d'assurer une purification supplémentaire d'échantillon à séquencer, on l'a excisée à partir du gel SDS PAGE puis on l'a fait digérer de manière protéolytique in situ dans la bande de gel de polyacrylamide. On a chargé sur un gel de polyacrylamide à 12% des préparations de protéines de pureté élevée d'environ 38 kDa, qui possédaient encore quelques protéines mineures de contamination. On a chargé 3 bandes chacune avec 2 pg de protéine et on a effectué une électrophorèse dans le gel jusqu'à ce que le front de coloration ait atteint le fond du gel. Puis on a coloré le gel dans du Brilliant Blue Coomassie à 0,2% (p/v), du méthanol à 30% (volume/volume), de l'acide acétique à 1% (v/v) pendant 20 minutes, puis on les a décolorées avec du méthanol à 30% jusqu'à ce que l'on puisse observer les bandes de protéines. On a identifié la bande de 38 kDa en la comparant avec des marqueurs de masse moléculaire chargés dans les pistes adjacentes et on a excisé la bande de chaque piste à l'aide d'une lame de scalpel, en prenant soin d'exclure les bandes de contamination. -29- On a transféré les bandes de gel dans un tube eppendorf propre et on les a lavées deux fois avec 0,5 ml d'acétonitrile à 50% (v/v), Tris/Cl 100 mM, pH 8,5. Le lavage a éliminé une partie de la coloration Coomassie et a également déshydraté partiellement les bandes de gel. Puis on a retiré les bandes de gel du tube et on les a soumises à un séchage à l'air sur la paillasse de laboratoire jusqu'à ce qu'elles aient rétréci de manière significative et commencé à se recroqueviller. Puis on les a transférées Ode nouveau vers le tube eppendorf et on les a réhydratées d'abord avec 10 pl de Tris/HCl lOOmM, pH 8,5, contenant 1 pg d'endoprotéinase Lys C (Boehringer Mannheim). C'est une protéinase qui sectionne spécifiquement les chaînes polypeptidiques sur le côté de terminaison carboxy des résidus de lysine. De plus, on a ajouté du tampon Tris aux bandes de gel jusqu'à ce qu'elles soient complètement réhydratées puis on les a incubées à 37 C pendant 16 heures. Après incubation, on a ajouté 1 p1 d'acide trifluoroacétique au tube afin d'arrêter la réaction puis on a lavé deux fois les bandes de gel avec 0,3 ml d'acétonitrile à 60% (v/v), TFA à 0,1% (v/v) à 30 C pendant minutes. C'était pour déshydrater encore partiellement les bandes de gel afin de provoquer leur rétrécissement et une élution des peptides que l'on avait engendrés. On a transféré le surnageant vers un autre tube eppendorf propre puis on l'a séché dans un évaporateur centrifuge pendant 2 heures jusqu'à ce que l'échantillon soit presque à siccité et on l'a remis en suspension dans un volume de 0,1 ml avec du TFA à 0,1%. Puis on a séparé les peptides au moyen d'une CLHP en phase inverse sur un système de micro-purification Smart (Pharmacia). On a chargé le digéré de peptide dans une colonne C18 (2,1 x 100 mm) équilibré avec TFA à 0,1% -30(solvant A) à un débit de 0,1 ml/min. Puis on a élué la colonne avec un gradient de 0 à 70% de solvant B (acétonitrile à 90% v/v, TFA à 0,085% v/v) pendant 70 minutes au même débit. On a mesuré la densité optique à 214 nm et on a recueilli les pics des peptides individuels dans le collecteur de fractions au cours d'étapes manuelles. On a séquencé les polypeptides en les chargeant sur un séquenceur de protéine modèle 492 Perkin Elmer en utilisant les cycles de chimie en phase liquide tel que recommandé par le fabricant. On a analysé plusieurs fragments de polypeptide (A à E) dans la bande des 38 kDa et ils avaient des séquences essentiellement homologues à: (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL- PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS (E) X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU- LYS On a préparé des cultures cellulaires en vue de produire des protéines anti-congélation de la manière suivante: On a amorcé de nouvelles cultures cellulaires en se basant sur des procédés décrits dans Gamborg et Wetter 1975, Torres 1989, Dodds et Roberts 1985. Carotte acclimatée au froid (Autumn King): on a stérilisé d'abord la surface de la racine en la lavant avec un détergent à base de Teepol à 10%, suivi par un frottement sous de l'eau courante puis un rinçage sous eau courante pendant 15 minutes. Là o c'était faisable, (en se basant sur la taille) on a pelé la racine. Puis on a découpé de manière aseptique la racine en bandes de 0,5 cm, que l'on a placées dans de l'éthanol à 70% v/v pendant 10 -31- minutes avec secouage suivi par Domestos à 10% v/v + 2 gouttes de Tween 20 (Signa) pendant 25 minutes, également avec secouage. Puis on a lavé les sections trois fois avec de l'eau distillée stérile. On a découpé des cylindres d'environ 0,5 cm de diamètre en traversant les bandes en utilisant un scalpel stérile, et on a découpé le reste en des longueurs de 2 à 3 mm. On a transféré de manière aseptique ces disques de tissus (explants) sur un milieu MS solide contenant 30 g/l de saccharose, 10 mg/l d'acide indole- acétique (IAA), 0,1 mg/l de kinétine et 8 g/l d'agar/agar, de qualité technique, qui était contenu dans des récipients Sterilin de 60 ml. On a incubé les explants dans l'obscurité à 20 C. Là o c'était nécessaire, on a partagé les callus résultants en des sections plus petites, que l'on plaque sur un milieu frais. Puis on a amorcé des cultures en suspension à partir du callus en cours de croissance active. En outre, on a obtenu des lignées de cultures de cellules de carotte en suspension (NOR et OX6) du département de biochimie et de biologie moléculaire, Université de Leeds. On a sous-cultivé 10 ml de ces cultures dans 90 ml de milieu Murashige et Skoog frais (Sigma) contenant 25 g/l de saccharose et 1 mg/l de 2,4-D, tous les sept jours. On a incubé les cultures dans un incubateur à secouage circulaire à 150 tr/mn à 25 C dans l'obscurité. On a traité à froid la culture NOR de la manière suivante: On a ajouté une culture NOR de 18 x 5 ml vieille de 7 jours à des erlenmeyer de 18 x 100 ml contenant 45 ml de milieu de carotte MS. On a incubé les cultures à 25 C comme décrit précédemment pendant 4 jours, puis on a diminué la température de l'incubateur à 4 C. On a retiré -32immédiatement les deux flacons et on a récolté les cellules et le milieu comme décrit précédemment à l'instant t = 0. On a récolté les flacons restants en double à t=8h, lj, 2j, 4j, 7j, 9j, 11j, et 14 jours. On a répété le traitement d'acclimatation au froid en utilisant des cultures plus importantes à la fois de NOR et de OX6, que l'on a transférées à 4 C après une croissance de 4j et 7j à 25 C. On a récolté des cultures à t=0, t=7j et t=14j. Outre la récolte, on a déterminé le PCV pour chaque culture à chaque instant de temps. On a préparé les cellules acclimatées au froid NOR pour une "analyse par flac" comme dans l'exemple I de la manière suivante: on a broyé les cellules congelées rapidement en une poudre fine dans de l'azote liquide en utilisant un pilon et un mortier. On a mis en suspension à nouveau les échantillons en poudre dans 2 x un volume de EDTA 10mM + de l'acide ascorbique 20mM, on les a mélangés en tourbillonnant pendant 30 secondes puis on les a centrifugés à 10 000 g pendant 10 minutes. On a effectué une "analyse par flac" des aliquotes de 10 pl des surnageants en utilisant le tampon témoin en tant que témoin négatif. On pouvait détecter une activité d'inhibition de recristallisation dans les cellules du milieu acclimatées au froid mais pas dans les échantillons non acclimatés au froid. On a analysé les échantillons des milieux provenant de la suspension NOR de la manière suivante. On a tamponné le milieu de carotte NOR en ajoutant 100 pl de Tris/HCl 1M, pH 7,4. Puis on l'a appliqué à une colonne de lml de Sepharose Q (Pharmacia) à un débit de 1 ml/min et on a élue les molécules liées avec des aliquotes de 3 ml de Tris/Hcl mM, pH 7,4 contenant des concentrations en NaCl 0,5M. On *a recueilli des fractions de 1 ml. -33- On a également utilisé ce procédé d'échange d'anions afin de fractionner des échantillons de milieu acclimaté au froid aux instants t=0, 2j, 4j, 7j, 11j, et les échantillons de milieu non acclimaté au froid de l'instant t=7j. On a évalué l'activité des fractions au moyen de "l'essai de flac" de sandwich tel que décrit dans l'exemple I. On a purifié l'activité anti-congélation dans le milieu de culture par une chromatographie par perméation sur gel de la manière suivante. On a fait précipiter dans l'acétone l'éluat à NaCl 0,5M acclimaté au froid 14 provenant de la colonne de sépharose Q (fraction 2) et on a remis le culot en suspension dans 50 pl de Tris/HCl 50 mM + NaCl 0,15M, pH 7,2. Puis on a centrifugé à 10 000 g pendant 10 minutes, et on a chargé 20 pl sur une colonne de perméation sur gel Superdex 75 sur le système SMART Pharmacia. Le débit était de 40 pl/minute et la phase mobile était du Tris/HCl 50mM + NaCl 0,15M, pH 7,2. On a recueilli des fractions de 80 il et on a effectué un "essai de flac". On a répété ce procédé en utilisant l'éluat à NaCl 0,5M non acclimaté au froid pris à l'instant t=14j provenant de la colonne de sepharose Q et du milieu frais. On peut effectuer une isolation supplémentaire des protéines actives au moyen d'une analyse par SDS-PAGE tel que décrit ci-dessus. Exemple VIII On a préparé un extrait de racine de carotte acclimatée au froid en brossant des carottes acclimatées au froid nouvellement tirées dans de l'eau froide. On a retiré les collets et on a extrait le jus en employant un extracteur de jus domestique (Russell Hobbs, modèle n 9915). On a congelé les jus en blocs de 1 litre et on -34- l'a stocké - 20 C avant de le recueillir pour une utilisation dans les essais de crème glacée. On a ajouté le jus de carotte avec AFP à la formulation de crème glacée suivante: Ingrédient Parties en poids Poudre de lait écrémé 10,000 Saccharose 13,000 MD40 4,000 Gomme de caroube 0,144 Genulacta L100 0,016 MGP 0,300 Matière grasse du lait 8,000 Vanilline 0,012 Eau 64,528 * Extrait de carotte 4,472 (provenant de carottes acclimatées au froid contenant 1 à 10 mg de AFP par kg) On a préparé la crème glacée en congelant la formulation ci-dessus et en l'aérant jusqu'à un gonflement de 106%. On a effectué des mesures sur des échantillons frais et sur des échantillons que l'on avait altérés par une conservation à -10 C pendant une durée de 10 jours. A titre de comparaison, on a mesuré un échantillon sans extrait de carotte de la même façon. On a effectué les mesures de la manière suivante: On a équilibré les échantillons à -18 C dans une armoire climatique Prolan pendant environ 12 heures. On a -35- choisi trois échantillons représentatifs parmi chaque lot de crème glacée et on a préparé une tranche à partir de chacun des lots dans une armoire thermostatée Cryostat en étalant une couche mince de crème glacée à partir du centre de chaque bloc sur une lame de microscope. On a appliqué une goutte unique de white spirit à la lame et on a appliqué une lame couvre-objet. Puis on a transféré chaque lame, à son tour, vers une platine de microscope thermostatée (Leit LaborLux S, objectif Leica x 10, température -18 C). On a recueilli des images de cristaux de glace (environ 400 cristaux de glace individuels) et on les a relayés à travers une caméra vidéo (Sanyo CCD) vers un système de stockage et d'analyse d'image (LEICA Q520MC). On a souligné manuellement les images stockées de i15 cristaux de glace en dessinant autour du périmètre qui souligne alors tout le cristal. Puis on a mesuré les images des cristaux soulignés en utilisant le logiciel d'analyse d'image qui compte le nombre de pixels requis pour compléter la ligne droite la plus longue (longueur), la ligne droite la plus courte (largeur), le rapport d'aspect (longueur:largeur). On a importé les données pour chaque cristal de glace individuel d'un lot de crème glacée dans un tableur o l'on a effectué une analyse de l'ensemble des données afin de trouver la moyenne et l'écart-type. On a effectué les mesures de dureté de crème glacée en utilisant un dispositif Hounsfield H10KM Universal Tester, une cellule de charge Hounsfield 100N et une sonde en acier inoxydable cylindrique de 10 cm. On a préparé les échantillons de crème glacée en incubant pendant 16 heures des blocs de crème glacée de 486 ml dans une armoire thermostatée Prolan réglée à -18 C. On a retiré le bloc de crème glacée de l'armoire thermostatée Prolan et on l'a placé dans le dispositif Hounsfield H10KM Universal Tester. On a enfoncé la sonde -36- cylindrique de 10 cm dans le bloc de crème glacée à une vitesse constante de 400 mm/minute jusqu'à une profondeur de 20 mm. On a utilisé la force maximale enregistrée au cours de la compression et on l'a exprimée en tant que la dureté de crème glacée. Si on observait une fissuration ou une rupture fragile des échantillons, on l'a indiqué dans la colonne de droite. On a obtenu les résultats suivants. Paramètres de taille des cristaux de glace Propriétés de la matière Echantillon Longueur Largeur Facteur de Rapport Dureté Observation moyenne du moyenne du forme d'aspect (N) d'une rupture cristal ("m) cristal (ujim) moyen du moyen du fragile cristal cristal Carotte à 26,79 + 1,3 19,00 0,9 1,15 + 0,013 1,43 + 0,024 40,8 Oui AFP - frais Carotte à 33,48 1,3 26,61 + 0,9 1,13 0,013 1,37 0,020 59,9 Oui AFP - altéré Témoin- 33,67 1,1 24,79 0,8 1,12 0,008 1,38 + 0,018 27,3 Non frais Témoin- 61,77 2,7 46,54 2,0 1,11 0,010 1,37 0, 020 32,7 Non altéré On peut tirer les conclusions suivantes: a) La taille des cristaux de glace initiale est inférieure dans de la crème glacée contenant de l'AFP de carotte, ainsi l'AFP de carotte inhibe la û recristallisation. b) Les cristaux de glace dans de la crème glacée à AFP de carotte sont retardés dans leur processus de recristallisation. c) La forme des cristaux de glace dans les crèmes glacées 2 à AFP de carotte ne diffèrent pas de manière significative des formes de cristaux observées dans les crèmes glacées classiques. d) Les propriétés de matière de crème glacée contenant de l'AFP de carotte sont modifiées par rapport à celles -37- notées pour de la crème glacée classique. A savoir, les crèmes glacées sont plus dures que la crème glacée classique mais encore plus molles que la crème glacée contenant par exemple des AFP de poisson. Deuxièmement, on a observé que la crème glacée contenant de l'AFP de carotte se rompait. De manière similaire, on a obtenu de très bons résultats en utilisant Geranium ou Juncus squarrosus. Exemple IX Cet exemple décrit l'isolation de diverses protéines à partir du seigle d'hiver et l'évaluation de celles-ci. On a coupé des feuilles de plants de seigle acclimaté au froid âgé de 30jours, en des longueurs de 3 cm et on les a lavées minutieusement dans de l'eau distillée afin d'éliminer tout contenu cellulaire. On a tamponné les morceaux de feuille à sec sur une serviette en papier et on les a immergés totalement dans un milieu d'extraction constitué de EDTA 5mM, d'acide ascorbique 10mM, d'acide caproique 2mM, de benzamidine 2mM et de fluorure de phénylméthylsulphonyle lmM (PMSF). Puis on les a infiltrés par aspiration dans un flacon Buchner pendant 60 minutes après quoi on a retiré les feuilles et on les a tamponnées complètement à sec. Puis on les a disposées dans le sens de la longueur dans un cylindre de seringue en matière plastique à séparer et on les a centrifugées doucement à 2000 g pendant 30 minutes. On a recueilli l'extrait apoplastique dans un tube eppendorf sous la seringue. On a concentré l'extrait apoplastique 7 fois en utilisant un ultrafiltre Amicon avec une membrane PM10. On a effectué une purification initiale en chargeant 50 pl d'extrait apoplastique concentré sur une colonne Superdex PC 3.2/3.0 (gamme de séparation 3 à 70 kDa) à exclusion de taille sur un système de séparation Smart, les deux -38- provenant de chez Pharmacia. Le tampon était du Tris/HCl mM à pH 9,5. On a effectué la séparation à un débit de pl par minute et on a recueilli des fractions de 50 pl jusqu'à un volume de 2,5 ml et on a évalué leur recristallisation tel que décrit dans l'exemple I. On a chargé les fractions actives sur une colonne FPLC MonoQ à échange d'anion fort provenant de chez Pharmacia, équilibrée avec Tris/CHCl 50mM à pH 9,5, et on a élué les protéines en utilisant le même tampon avec un gradient linéaire jusqu'à NaCl 0,5M. On a ajouté le tampon d'élution à une concentration de 0,5M de NaCl pendant 25 minutes, on l'a maintenu pendant 10 minutes, et on l'a réduit à OM pendant 15 minutes. On a effectué une chromatographie à un débit de 1 ml/minute et on a recueilli des fractions de 1 ml. On a concentré les fractions qui étaient positives dans l'essai selon l'exemple I sur un concentrateur centrifuge Centrican PM10 à 7000 tr/mn jusqu'à ce que le volume se réduise à 50 pl et on les a chargées une deuxième fois sur la colonne S75. La fraction qui a réussi l'essai de l'exemple I était une fraction à un seul pic à environ mM de concentration saline. On a séparé cette fraction active sur SDS-PAGE (méthodologie similaire à celle de l'exemple VII). Ceci a confirmé que la fraction de 32 kDa était la fraction active. On peut utiliser avec avantage la fraction de 32 kDa de protéine du seigle d'hiver dans la préparation de produits congelés de confiserie. -39- REVENDICATIONS 1. Produits congelés de confiserie comprenant un ou plusieurs AFP extraits de végétaux, dans lesquels les AFP dans une composition aqueuse possèdent une taille de cristal de glace, après congélation rapide à -40 C ou moins, suivi par un stockage pendant une heure à -6 C, de moins de 15 Mm. 2. Produits congelés de confiserie selon la revendication 1, dans lesquels l'AFP est extrait de Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofaqus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fraqilis, Calluna vulgaris, Aceana maqellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (carotte), Vinca minor (pervenche) Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus niqra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Aqrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (herbe verte), Poa pratensis (herbe bleue du Kentucky), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytri- chum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypoqymnia physodes, Parmelia subru- decta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis et Festuca contracta. -40- 3. Produits congelés de confiserie selon la revendication 2, dans lesquels l'AFP est extrait de la famille des lichens, en particulier Alectoria niqricans, Caloplaca reqalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon qlabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana. 4. Produits congelés de confiserie selon la revendication 2, dans lesquels l'AFP est extrait de Juncus squarrosus ou de Geranium. 5. Produits congelés de confiserie selon la revendication 2, dans lesquels les AFP conservent leur capacité à limiter la croissance de cristaux de glace après un traitement thermique au-dessus d'une température de 60 C pendant une durée d'au moins 30 secondes, de manière particulièrement préférée plus d'une minute. 6. Produits congelés de confiserie selon la revendication 5, dans lesquels l'AFP est extrait de Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bronus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis et Aqrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua. 2' 7. Produits congelés de confiserie selon la revendication 1, dans lesquels l'AFP est dérivé d'une plante non toxique. 8. Produits congelés de confiserie selon la revendication 2, dans lesquels l'AFP est la protéine de 32 kDa extraite du seigle d'hiver. 9. Produits congelés de confiserie selon la revendication 2, dans lesquels le produit est essentiellement exempt d'AFP provenant de seigle d'hiver.