FR 2741950 A1 19970606 FR 9514250 A 19951201 REACTIF ET PROCEDE POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DE LA MONONUCLEOSE INFECTIEUSE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE, NOTAMMENT SOUS FORME DE SERUM HUMAIN L'invention concerne un nouveau réactif et un procédé mettant en oeuvre ce réactif, pour le diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse dans un échantillon biologique, notamment sous la forme d'un sérum humain. En particulier, le procédé selon l'invention vise à améliorer la qualité de la visualisation d'une réaction positive, voire même à foumir des résultats au moins semiquantitatifs. Des tests autrefois couramment utilisés reposaient sur la capacité d'anticorps contenus dans des échantillons biologiques, notamment sérums provenant des personnes développant une mononucléose infectieuse d'agglutiner fortement des globules rouges ou hématies de moutons (réaction de PAUL - BUNNEL). En effet, le pouvoir agglutinant du sérum de sujets atteints est considérablement augmenté par rapport à celui également induit par des anticorps hétérophiles naturels, tels que les anticorps de FORSSMAN, également souvent présents chez des sujets sains. Les anticorps de la mononucléose infectieuse (ci-après souvent dénommées FORSSMAN ou des anticorps caractéristiques d'autres maladies du sérum. Néanmoins et compte tenu des caractéristiques insuffisamment spécifiques des tests mettant en oeuvre des réactifs à base de globules rouges de mouton, il était également courant de les compléter par d'autres aux fins de discriminer entre les divers types d'agglutinations. Ainsi avait-il déjà été proposé, notamment lorsque le premier essai semblait a priori foumir une agglutination suffisante à caractériser une mononucléose infectieuse, de répéter les mêmes essais sur d'autres échantillons du même sérum, ceux-ci ayant au préalable fait l'objet d'absorptions avec des extraits de rein de cheval, pour les uns, et avec des globules rouges de boeuf pour les autres (réactions de PAUL - BUNNEL - DAVIDSOHN). L'on sait en effet que des extraits de rein de cheval convenablement préparés ont la capacité, lorsqu'ils sont mis en contact avec des sérums humains, d'absorber les anticorps de FORSSMAN et des anticorps hétérophiles caractéristiques de la maladie sérique que ces sérums peuvent contenir. En revanche, ils n'adsorbent pas les anticorps MNI. De même il est connu que les globules rouges de boeuf ont dans les mêmes conditions, la capacité d'adsorber des anticorps caractéristiques de la mononucléose infectieuse et de la maladie sérique. Ces deux tests permettent donc d'apprécier "différentiellement" si l'agglutination première avait eu comme cause principale la présence d'anticorps caractéristiques de la mononucléose infectieuse (anticorps MNI) ou la présence d'anticorps hétérophiles naturels du type anticorps de FORSSMAN, voire des anticorps caractéristiques de maladies distinctes. En effet, la répétition du test d'agglutination avec les globules rouges de mouton sur des sérums préalablement absorbés sur des extraits de rein de cheval, conduit encore à une réaction positive avec les globules rouges de mouton, dès lors qu'avant absorption, ces sérums contenaient des anticorps caractéristiques de la mononucléose infectieuse. Au contraire, le même sérum préalablement soumis à une réaction d'absorption avec des globules rouges de boeuf, ne conduira plus qu'à une réaction d'agglutination plus faible, voire inexistante, avec les globules rouges de mouton, puisque le sérum préalablement traité par les globules rouges de boeuf est alors essentiellement débarrassé de sa teneur initiale en anticorps MNI. Le remplacement des hématies de mouton dans ces tests d'agglutination par des hématies de cheval (notamment selon le procédé décrit dans le brevet français 1521350 (Gail Hoff) a permis l'obtention d'agglutinations à caractère beaucoup plus spécifique des anticorps MNI. Compte tenu des difficultés rencontrées lors de l'utilisation d'hématies fraîches, il a déjà été proposé de les soumettre à des traitements de fixation partielle ou de stabilisation avec des aldéhydes, par exemple du type formaldéhyde, glutaraldéhyde, etc. ou des dérivés d'acide tannique. Même si ces procédés ont pour effet de réduire dans une certaine mesure la sensibilité des hématies de cheval à l'agglutination en présence d'anticorps directement liée à la mononucléose infectieuse, il en résulte aussi un effet plus sélectif, ces traitements de fixation bloquant également les sites antigéniques éventuellement mis en oeuvre dans des réactions parasites d'agglutination avec des anticorps de FORSSMAN ou d'autres anticorps hétérophiles liés à d'autres maladies. La spécificité peut encore être améliorée par un traitement de globules rouges de cheval par un antisérum dirigé contre des antigènes de type FORSSMAN, par exemple comme le suggère le brevet US 3.708.572.La spécificité de ces réactifs est alors telle que les essais de contrôle avec des sérums ayant fait l'objet d'adsorption préalable en présence, respectivement, d'extraits de cheval et de globules rouges de boeuf sont pratiquement superflus. Cela étant, I'utilisation de ces essais de contrôle est restée usuelle, compte tenu du souci des autorités sanitaires que les épreuves de diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse soient aussi "indiscutables" que possible. II n'empêche que l'accroissement de spécificité est au prix d'une diminution de la sensibilité de la réaction, de sorte que les réactions d'agglutination sont en général mises en oeuvre avec des sérums purs, à tout le moins peu dilués. Enfin, si au plan de la réaction immunologique, I'on en était arrivé à un degré élevé de fiabilité, encore fallait-il que ces tests soient mis en oeuvre par des techniciens hautement qualifiés. Ces tests sont réalisés soit en tubes, soit sur lames. Lorsque l'on travaille en tube, même en milieu dilué, il faut un oeil exercé pour distinguer entre les agglutinations spécifiques et les agglutinations non-spécifiques observées, notamment après agitation ou secouement, et centrifugation des tubes, d'où l'utilisation à cette fin de miroirs concaves associés à ces tubes. Lorsque I'on travaille sur lame, la lecture des réactions faites doit être quasiimmédiate (quelques minutes à cause de l'évaporation des réactifs). L'invention a pour but de remédier en grande partie à ces inconvénients. Parmi les buts que l'invention s'est alors fixé, on mentionnera la recherche à la fois d'une grande sensibilité et d'une excellente lisibilité de la réaction, même entre des mains relativement inexpertes. Un autre but de l'invention est d'autoriser des analyses au moins semi-quantitatives des teneurs en anticorps caractéristiques de la mononucléose infectieuse dans des échantillons biologiques, plus particulièrement des sérums, provenant de personnes éventuellement infectées. On remarquera encore que l'invention vise aussi à s'affranchir du paramètre temps dans lequel les mesures doivent être faites. L'invention découle de la découverte que lorsque l'on poussait davantage encore la fixation des globules rouges de cheval, au point que l'on n'obtenait même plus d'agglutinations sur lame avec des sérums dilués contenant des anticorps caractéristiques de la mononucléose infectieuse à des dilutions relativement faibles, ces hématies de cheval plus fortement fixées acquéraient une propriété nouvelle révélable dans des conditions appropriées, à savoir la capacité à produire des "micro-agglutinations en tapis" spécifiques de la mononucléose infectieuse, au contact d'échantillons biologiques dilués, notamment de sérums humains dilués, contenant des anticorps MNI. C'est ainsi que le réactif selon l'invention pour le diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse à base d'hématies de cheval fixées est caractérisé par un degré de fixation apte à prévenir toute "agglutination sur lame" de ces hématies, lorsqu'une suspension de ces hématies dans un véhicule aqueux est mise en contact avec un sérum humain suffisamment dilué à cet effet, mais à autoriser une "agglutination en tapis" notamment dans un tube à embout approximativement conique1 ou dans les microtubes ou tubules d'une microplaque. En particulier l'invention concerne un tel réactif, dont le degré de fixation est tel qu'une suspension de ces hématies fixées dans un véhicule aqueux, par exemple du type sérum physiologique, à raison de 1 volume d'hématies pour 20 volumes de véhicule aqueux, ne produit pas d'agglutination sur lame au contact d'un sérum humain dilué au 1/20e, ce degré de fixation n'excédant naturellement plus celui qui entraînerait également la perte dans les mêmes conditions de la capacité de cette même suspension d'hématies à produire une agglutination en tapis, au contact de ce sérum dilué, notamment dans un tube à embout au moins approximativement conique ou dans les microtubes ou tubules d'une microplaque. II va sans dire que cette capacité de "micro-agglutination en tapis" cesse également à partir de degrés de dilutions davantage poussées à la fois des suspensions d'hématies de cheval fixées etlou de sérums ayant des teneurs en anticorps MNI, cette propriété étant d'ailleurs mise en oeuvre dans les essais au moins semi-quantitatifs dont il sera question ciapres. Pour la clarté de l'exposé, il est proposé de préciser certaines des définitions dans le cadre de ce brevet. L'expression "agglutination" ou encore "agglutination sur lame" désigne la réaction visible à l'oeil nu qui peut être observée sur une lame, lorsque l'on met en présence un réactif contenant des hématies de cheval avec un sérum concentré contenant des anticorps MNI. Lorsque la réaction est réalisée dans un tube, on observe de même une forte agglutination visible à l'oeil nu, notamment dans les conditions qui ont été indiquées plus haut. Au contraire, en l'absence d'anticorps MNI dans le sérum testé mis en contact avec les hématies de cheval, on observe -en particulier dans les conditions sus-indiquées des concentrations volumiques de la suspension d'hématies et de dilution du sérum humain- une simple "sédimentation" des hématies, celles-ci se concentrant alors dans le fond du tube sous la forme d'un anneau ou, lorsque le tube ou microtube comporte un bout approximativement conique, sous la forme d'un "bouton" étroit des hématies à l'extrême pointe de ces mêmes tubes. On observe également cette "sédimentation" lorsque la suspension d'hématies de cheval fixées est mise en contact avec une trop forte dilution (ou dilution sub-agglutinante , dont on verra dans ce qui suit qu'elle est très élevée dans le cadre de l'invention) d'un sérum contenant des anticorps MNI. L'expression "micro-agglutination en tapis" désigne le phénomène que constitue la formation de microagglutinats en "tapis" ("mat pattem" selon une expression anglaise utilisée pour désigner ce type de phénomène) sur une surface beaucoup plus importante dans les fonds des mêmes tubes, même lorsque ceux-ci sont pourvus d'un embout conique, comme cela est schématisé sur la figure unique annexée à la présente description, comme suite au contact entre une suspension diluée des hématies de cheval présentant au moins le degré de fixation ou stabilisation défini plus haut et une dilution suffisante à cet effet d'un sérum contenant des anticorps MNI. L'expression "titre de micro-agglutination en tapis" sera utilisée pour désigner la dernière des dilutions qui, en tube, conduit à la formation du susdit "tapis" ou "mat pattern", lorsque la suivante, encore plus importante (ou dilution alors devenue sub-agglutinante), ne conduit plus qu'à une "sédimentation". La technique selon l'invention (avec micro-agglutination en tapis) est en outre capable de donner des indications approximativement quantitatives quant à la teneur en anticorps MNI du sérum testé, notamment grâce à la détermination possible du seuil de dilution qui sépare, pour une suspension donnée d'hématies de cheval stabilisées, la dernière des dilutions dans le sens des dilutions croissantes, pour laquelle on observe encore une micro-agglutination en tapis ou "mat pattem", et la première des dilutions plus élevées, pour lesquelles on n'observe plus qu'une sédimentation. L'invention concerne donc également un procédé pour le diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse mettant en oeuvre des hématies de cheval stabilisées à un degré suffisant pour ne plus être agglutinées sur lame par un sérum dilué contenant même des anticorps MNI, le degré de stabilisation sus-indiqué autorisant néanmoins une agglutination en tapis, lorsqu'une suspension de ces hématies et ce sérum dilué sont mis en contact dans un tube, de préférence microtube à embout approximativement conique. Le procédé selon l'invention s'inscrit donc dans un champ de dilutions extérieur à celui dans lesquels les procédés classiques étaient mis en oeuvre, puisque l'on se place dans des conditions ou les agglutinations antérieurement recherchées ne peuvent en fait plus se faire. Et l'on y parvient en particulier en poussant la "fixation" ou la "stabilisation" des hématies de cheval par des traitements, notamment avec des aldéhydes ou dérivés de l'acide tannique, au L'un des éléments remarquables du procédé selon l'invention réside dans le fait que les titres obtenus comparativement à la méthode d'agglutination sur lame se trouvent multipliés de 20 à 200 fois, comme cela sera illustré dans des exemples qui suivent : en d'autres termes, le procédé selon l'invention permet une augmentation importante de la sensibilité du test en microplaques par rapport au test sur lame, en ce qu'il permet de détecter des taux faibles d'hétéroanticorps significatifs à partir d'une première dilution élevée du sérum, par exemple à partir d'une première dilution élevée du sérum, par exemple au 1140ème ou 1180ème, alors que dans les procédés classiques on ne pousse guère les dilutions du sérum à tester au delà du 1110ème. La lisibilité des résultats est nettement meilleure que dans les tests classiques. Enfin, I'on s'affranchit complètement du paramètre temps, la lecture de la réaction pouvant être effectuée de 2 à 24 heures après la mise en contact des réactifs. En soi les techniques de fixation appliquées aux hématies de cheval sont connues. II a déjà été fait référence plus haut à la technique décrite dans le brevet américain 3.708.572. On peut avoir recours à tous autres produits ayant des propriétés équivalentes de fixation et de stabilisation d'hématies. On peut aussi faire référence à titre d'exemple, aux techniques décrites dans le brevet français 80 03440 du 15 février 1980 pour ce qui est des techniques à utiliser. Elles seront d'ailleurs davantage illustrées dans les exemples qui suivent. La nouveauté réside dans l'application particulière qui en est faite aux hématies de cheval, afin de leur conférer les propriétés ci-dessus définies. II est clair que l'homme du métier saura apprécier jusqu'où la fixation ou stabilisation doit être poussée, notamment par répétition des mises en contact des hématies à traiter avec un ou plusieurs agents fixateurs distincts. Elle sera par exemple poussée (fixations répétées avec un ou plusieurs réactifs fixateurs) jusqu'à ce qu'une suspension des hématies de cheval stabilisées dans un volume aqueux approprié, à raison de 1 volume d'hématies pour 20 volumes du véhicule aqueux, mis en contact avec un sérum humain dilué au 1120ème et contenant des anticorps MNI, n'entraîne plus d'agglutinations sur lame, ces agglutinations étant alors "remplacées" en quelque sorte par des micro-agglutinations en tapis . II existe alors une grande gamme de degrés de fixation compatibles avec cet objectif, étant évidemment entendu qu'on risque, à vouloir pousser la fixation trop loin, d'aboutir à une despécification telle des hématies "hyper-fixées" obtenues, que même la réaction de micro agglutination en tapis ne pourrait plus se faire, quelles que soient les dilutions correspondantes de sérums amenées à leur contact. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention il est avantageux d'avoir recours à des dilutions de sérum à au moins 1140ème et à leur mise en contact avec des hématies stabilisées dans des suspensions de solution physiologique, à raison de 0,8 à 2% en volume d'hématies vis-à-vis du volume total de la suspension. Comme cela a déjà été indiqué, I'un des avantages essentiels de l'invention réside dans la possibilité qu'offre le procédé selon l'invention de procéder à des analyses semi-quantitatives de la teneur d'un sérum en anticorps anti-MNI. Ce procédé comprend, en particulier en cas de réponse positive à un test de détection d'anticorps MNI dans les conditions qui ont déjà été indiquées, la répétition des tests en mettant en oeuvre des dilutions respectivement croissantes de l'échantillon biologique testé avec la même suspension d'hématies de cheval fixées et à détecter le titre de microagglutination en tapis, lequel peut alors être corrélé à la teneur initiale de l'échantillon biologique initial en anticorps MNI. Cette analyse semiquantitative comparative des sérums étudiés avant et après absorption par les extraits de rein de cheval et de globules rouges de boeuf stabilisés permet d'apprécier d'emblée la nature des hétéroanticorps spécifiques ou non de la mononucléose infectieuse. Même si l'on ne retient pas la mesure semiquantitative des hétéroanticorps comme un critère d'évolution ou de guérison de la maladie, elle permet néanmoins une meilleure interprétation globale de la nature des hétéroanticorps spécifiques ou non présents dans le sérum étudié. L'invention sera encore davantage illustrée par un certain nombre d'exemples présentés bien entendu de façon non limitative. Ils permettent de mieux apprécier les résultats auxquels l'invention est à ce jour capable d'aboutir. 1. Préparation des hématies fixées à un degré suffisant nour autoriser la mise en oeuvre du Procédé selon l'invention Les exemples de préparation qui suivent des hématies de cheval stabilisées ont en commun une phase initiale de production de la suspension d'hématies de cheval, aux fins de leur stabilisation et, lorsque la stabilisation a été réalisée, par exemple selon les modalités foumies dans les exemples qui suivent, une phase finale de remise en suspension des hématies stabilisées, dans des conditions permettant ensuite leur utilisation dans le procédé selon l'invention Phase initiale commune à tous les exemples Les hématies de cheval recueillies dans une solution d'Alsever sont lavées 5 fois dans une solution tampon phosphate physiologique de molarité 0,15 M et de pH 6 à 7,2 et contenant des conservateurs: - sodium ethylmercurithio 2 benzoate 0,05 à 0,2 g 0/00; - azide de sodium : 0,5 g à 2 g/l. Les hématies sont remises en suspension à une concentration de 8 à 20% dans ce même tampon, en vue de leur stabilisation ou fixation dans les conditions exposées dans les exemples qui suivent: Phase finale commune à tous les exemples: Une fois la stabilisation effectuée, les hématies traitées sont remises en suspension à une concentration de 0,8 à 2% dans le même tampon, après rajout d'une substance protéinique tel que le sérum de lapin normal à la concentration de 0,2 à 3% ou de l'albumine bovine à la concentration de 0,1 à 0,5 g % du volume de la suspension globulaire.Les conditions opératoires peuvent être résumées comme suit: Exemple 1: - traitement par le glutaraldéhyde d'une suspension de 1 volume d'hématies de cheval de 8 à 20% avec 1 volume de glutaraldéhyde de 0,5 à 2% (solution stock à 25%); - incubation du mélange au bain-marie sous agitation à une température de 37 à 56 C pendant au moins 15 heures; - 5 lavages en tampon phosphate physiologique 0,15 m de pH 6 à 7,2. Exemple 2: - traitement par le formaldéhyde d'une suspension de 1 volume d'hématies de cheval de 10 à 20% avec 1 volume de formaldéhyde de1 à3%; - incubation du mélange au bain-marie sous agitation à une température de 37 à 56 C pendant au moins 15 heures; - 5 lavages en tampon phosphate physiologique 0.15 M de pH 6 à 7,2, comme dans l'exemple 1. Exemple 3: traitement de la suspension d'hématies nar le alutaraldéhvde et Dar le formaldéhyde dans 2 bains successifs On utilise des hématies ayant déjà subi un traitement au glutaraldéhyde tel que décrit dans l'exemple 1 et l'on procéde à un deuxième traitement par le formaldéhyde tel que décrit dans l'exemple 2. Exemples: traitement par le glutaraldéhyde et nar le formaldéhyde en 1 bain On met en présence: - 1 volume d'hématies de cheval de 8 à 20% en tampon phosphate tel que décrit plus haut -1/2 volume de glutaraldéhyde de 0,5 à 3% - Y2 volume de formaldéhyde de 1 à 3% - 1 volume de tampon phosphate physiologique 0,15 m pH 6 à 7,2 et on incube au bain-marie à une température de 37 à 56 C pendant une durée de 5 à 17 heures. ExemDle 5: traitement par le alutaraldéhyde et par le formaldéhyde en 2 bains On utilise les hématies de cheval déjà traitées au glutaraldéhyde, comme décrit dans l'exemple 1, puis on applique le traitement par le mélange formaldéhyde-glutaraldéhyde comme décrit dans l'exemple 4. Exemple 6: traitement par le alutaraldéhyde et par l'acide tannique en 2 bains Premier traitement des hématies de cheval comme décrit dans l'exemple 1. Puis: répétition de ce traitement sur une suspension d'hématies de cheval en suspension de 8 à 20% et finalement traitement avec 1 volume d'acide tannique à une concentration de 1 g à 3 g par litre de tampon phosphate. Incubation chaque fois pendant une heure à une température de 37 à 56"C. 2. Préparation des réactifs utilisables pour les essais de contrôle Pour réaliser les absorptions des hétéroanticorps non spécifiques éventuellement contenus dans les sérums étudiés, par mise en oeuvre des techniques de PAUL - BUNNEL - DAVIDSOHN, on utilise: 1 - pour absorber les anticorps de FORSSMAN, des extraits de reins de cobaye ou de rein de cheval (contenant l'antigène de FORSSMAN), obtenus après broyage des organes et chauffage au bain-marie de 80 à 100"C durant une heure ; filtration et rajout de 0,5% d'acide phénique afin d'obtenir une conservation de longue durée à + 4"C, 2. pour absorber les hétéroanticorps spécifiques de la mononucléose infectieuse selon DAVIDSOHN des globules rouges de boeuf traités selon l'un des procédés suivants fournis à titre d'exemples: Procédé A Application aux globules rouges de boeuf du procédé de l'exemple 1, tel que décrit pour le traitement des hématies de cheval. Incubation au bain-marie à une température de 37 à 56"C, pendant une durée de 4 à 15 heures. Les globules rouges de boeuf traités sont conservés à une concentration de 7 à 20% en tampon phosphate 0,15 M de pH 6 à 7,2. Procédé B Application aux globules rouges de boeuf du procédé selon l'exemple 4, tel que décrit pour le traitement des hématies de cheval. Les globules rouges de boeuf traités sont conservés à une concentration de 7 à 20% en tampon phosphate 0,15 M de pH 6 à 7,2. Les globules rouges de boeuf ainsi préparés conservent un haut pouvoir absorbant des anticorps MNI, une condition qui est requise compte tenu de l'extrême sensibilité du procédé selon l'invention. Les préparation classiques d'extraits de rein de cheval conviennent parfaitement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. D'autres préparations peuvent également être utilisées. On peut aussi utiliser comme source d'antigènes de FORSSMAN, des globules rouges de mouton stabilisés selon les différents procédés utilisés pour le traitement des hématies de cheval. 3. Mise en oeuvre du procédé de détection d'anticorps MNI en microplacues avec l'un quelconque des réactifs des exemples I à 6 ci-dessus On peut utiliser les microplaques standardisées du commerce comportant des microtubes ou alvéoles (dont les parties supérieures ont un diamètre, par exemple de l'ordre de 7 mm) à fonds coniques en V, dont la pente terminale présente une inclinaison plus faible d'environ 10 à 30 degrés; selon l'invention, une plaque à micro-tubes dont les fonds ont des pentes terminales se situant entre 10 et 20 degrés donne une lecture optimisée. Toutes les plaques présentant ces caractéristiques peuvent se présenter sous forme compacte de 96 puits ou sous forme sécable. 3.1 Phase d'absorption des hétéroanticorps On introduit - dans le tube 1: le sérum pur à étudier ou une dilution de ce sérum de préférence au 1/5 ou au 1/10 en tampon phosphate de pH 6 à pH 7,2, - dans le tube 2: 0,1 ml de sérum pur + 0,3 ml d'extrait de rein de cheval dilué à 7 à 20%, - dans le tube 3: 0,1 ml de sérum pur + 0,3 ml de globules rouges de boeuf en suspension de 7 à 20%. Après agitation, les tubes 2 et 3 sont laissés Y2 heure à température ambiante de 18 à 30"C. On procède à une centrifugation afin d'éliminer les antigènes particulaires. On procède à une dilution au 115ème des surnageants des tubes 2 et 3 en tampon phosphate pH 7,2, ce qui correspond à une dilution finale du sérum au 1120ème dans la solution tampon phosphate pH 6 à 7,2. Le cas échéant, I'absorption peut également être pratiquée sur une quantité réduite de sérum, par exemple 50,ul de sérum + 150 ml d'absorbant. On distribue 50 ,ul de tampon phosphate de molarité 0,15 M, pH 6 à 7,2, dans les alvéoles de la microplaque, soit 3 lignes de 12 puits pour la réalisation d'un test. Dans la Première rangée, on introduit: 50 Cil de sérum non absorbé dilué au 1/20 ème en tampon phosphate que l'on mélange à 50 p de tampon; puis on transfère 50 pI de la 1ère alvéole à la 2ème, puis après mélange du contenu de la 2ème alvéole avec 50 pi de tampon, on transfère 50 pI de la 2ème alvéole dans la 3ème et ainsi de suite jusqu'à la 12ème alvéole et on rejette 50 pI du mélange. Dans la deuxième rangée on introduit: 50 pi de sérum absorbé par l'extrait de rein de cheval, soit une dilution au 1120ème du sérum absorbé, et on transfère 50 pi comme décrit ci-dessus à la 2ème alvéole, puis ainsi de suite jusqu'à la dernière. Dans la troisième rangée on introduit: 50 pI de sérum absorbé par les globules rouges de boeuf stabilisés soit une dilution au 1/20ème du sérum absorbé et on transfère 50 pi comme décrit ci-dessus, etc., de sorte que l'on obtient les dilutions successives ci-dessous dans les rangées: 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1181920 1er tube sérum seul 2ème tube sérum + extrait de cheval 3ème tube sérum + globules rouges de boeuf on ajoute dans chaque cupule de 15 à 30 p de globules rouges de cheval stabilisés, en concentration volumique de 1 à 3%, dans une solution aqueuse. On détermine le titre obtenu avec le sérum seul et après absorption par les globules rouges de boeuf. Une réaction positive dans un microtube ou alvéole donné se traduit par une micro-agglutination en tapis des hématies de cheval. Une réaction négative se traduit par un anneau étroit ou un point de sédimentation des hématies. A. Exemples d'une réaction positive, témoignant de la présence d'anticorps spécifiques de la mononucléose infectieuse dans le microtube ou alvéole considéré: lectures faites de 2h à 24h après la mise en contact de la suspension d'hématies de cheval fixées avec le sérum dilué. Tel est le cas, lorsque l'on obtient, par exemple, les résultats suivants, à partir des préparations initialement contenues dans les 1er, 2ème et 3ème tubes. 1 er tube réaction positive au 11640ème, 2ème tube réaction positive au 11640ème, 3ème tube réaction négative au 1140ème. L'absorption complète des anticorps par les globules rouges de boeuf confirme la spécificité des anticorps décelés. L'absorption des anticorps de FORSSMAN et, le cas échéant, d'autres anticorps hétérophiles, par l'extrait de rein de cheval est sans effet sur la réaction avec les anticorps de cheval. En revanche, I'absorption par les globules rouges de boeuf se manifeste par une remontée considérable du titre de micro-agglutination en tapis (de 11640ème à plus de 1/40ème) pour lequel on observe à nouveau une micro-agglutination en tapis mettant en jeu les hématies de cheval. Ces résultats attestent par conséquent de la présence d'anticorps spécifiques de la mononucléose infectieuse à un titre significatif. B. Exemples de réaction non spécifique: Tel est le cas, par exemple, lorsque l'on obtient les résultats suivants: 1er tube réaction positive au 11160ème, 2ème tube réaction négative au 1/40ème, 3ème tube réaction positive au 11160ème. La remontée du titre vers des dilutions faibles inférieures aux 1140ème pour laquelle on observe une première micro-agglutination dans la 2ème rangée, vis-à-vis de ce qui a été observée dans la première rangée, atteste de ce que dans la précédente, les anticorps détectés étaient principalement des anticorps non spécifiques de type FORSSMAN absorbés par les globules rouges de mouton stabilisés non absorbés par les globules rouges de boeuf. On fournit à titre indicatif des résultats obtenus: - avec un procédé classique fait sur lame: lecture faite 2 minutes après la mise en contact d'un sérum non dilué, contenant des anticorps MNI, avec une suspension d'hématies de cheval fixées par traitement avec un aldéhyde (en concentration de 4 à 6%), selon la technique de Gail Hoff; - avec le procédé selon l'invention. Les résultats comparatifs apparaissent dans le tableau suivant: Amplification Sérum de Titre Titre de micro- relative des mononucléose agglutinant agglutination titres avec le positif sur lame en tapis procédé selon de verre (en microplaque) I'invention (en microplaque) N01 1/8 1/1280 160 fois N"3 1/32 1/1280 40 fois N"4 négatif sur sérum pur 1/80+ 80 fois N"5 1/4 1/640 160 fois N"7 1/16 1/1280 80 fois N"9 1/16 1110240 640 fois N010 11128 1/40000 312 fois N 11 1/64 1/10240 160 fois N"13 1/16 1/5120 320 fois Ces résultats font apparaître l'amplification des titres avec le nouveau procédé en microplaques de 20 à 640 fois selon les sérums étudiés, en moyenne amplification de 200 fois par rapport au titre obtenu sur lame de verre. REVENDICATIONS 1. Réactif pour le diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse à base d'hématies de cheval fixées, caractérisé par un degré de fixation suffisant des hématies de cheval pour prévenir toute "agglutination sur lame" de ces hématies, lorsqu'une suspension de ces hématies dans un véhicule aqueux est mise en contact avec un sérum humain dilué, mais pour autoriser dans ces conditions une "agglutination en tapis" notamment dans un tube à embout approximativement conique, ou dans les microtubes ou tubules d'une microplaque. 2. Réactif selon la revendication 1 dans lequel les hématies de cheval sont caractérisées par un degré de fixation qui est tel qu'une suspension de ces hématies fixées dans un véhicule aqueux, à raison de 1 volume d'hématies pour 20 volumes de véhicule aqueux, ne produit pas d'agglutination sur lame au contact d'un sérum humain dilué au 1/20e, ce degré de fixation n'excédant naturellement plus celui qui entraînerait également la perte dans les mêmes conditions de la capacité de cette même suspension d'hématies à produire une agglutination en tapis, au contact de ce sérum dilué, notamment dans un tube à embout au moins approximativement conique ou dans les microtubes ou tubules d'une microplaque. 3. Procédé de diagnostic in vitro de la mononucléose infectieuse caractérisé par la mise en contact d'un fluide biologique, notamment sérum humain à l'état dilué, avec une suspension d'hématies de cheval stabilisées à un degré suffisant pour ne plus être agglutinées sur lame par un sérum dilué contenant même des anticorps MNI, le degré de stabilisation sus-indiqué autorisant néanmoins une agglutination en tapis lorsqu'une suspension de ces hématies et ce sérum dilué sont mis en contact dans un tube, de préférence microtube à embout approximativement conique. 4. Procédé de diagnostic selon la revendication 3 caractérisé en ce que le degré de fixation des hématies de cheval est tel qu'une suspension de ces hématies fixées dans un véhicule aqueux, à raison de 1 volume d'hématies pour 20 volumes de véhicule aqueux, ne produit plus d'agglutination sur lame au contact d'un sérum humain dilué au 1120e, ce degré de fixation n'excédant naturellement plus celui qui entrainerait également la perte dans les mêmes conditions de la capacité de cette même suspension d'hématies à produire une agglutination en tapis, au contact de ce sérum dilué, notamment dans un tube à embout au moins approximativement conique ou dans les microtubes ou tubules d'une microplaque. 5. Procédé de diagnostic selon la revendication 3 ou la revendication 4 caractérisé en ce que le fluide biologique, notamment sérum à tester, est dilué au moins au 1/40ème. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 caractérisé par la mise en oeuvre d'une suspension des susdites hématies dans une solution physiologique, à raison de 0,8 à 2% en volume d'hématies vis-à-vis du volume total de la suspension. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 caractérisé en ce qu'il est répété par des mises en contact successives de la même suspension d'hématies fixées avec des dilutions croissantes successives produites à partir de la solution diluée du fluide biologique, notamment de sérum humain, mise en oeuvre dans la première de ces mises en contact, et que l'on détecte le titre de micro-agglutination en tapis, lequel peut alors être corrélé à la teneur de l'échantillon biologique initial en anticorps MNI.