FR 2747786 A1 19971024 FR 9704608 A 19970415 Titre DISPOSITIF INTEGRE POUR LA DETECTION MOLECULAIRE OPTIQUE ET PROCEDE DE CETTE DETECTION Domaine de l'invention La présente invention concerne des dispositifs intégrés pour la détection moléculaire optiques et des procédés de cette détection. Arrière-plan technologique Récemment, un effort accru a été consenti pour développer des puces pour la détection moléculaire. En général, une puce de détection moléculaire comprend un substrat sur lequel est disposé un arrangement de sites de liaison. Chaque site de liaison (ou site d'hybridation) comporte un récepteur moléculaire respectif qui se lie à, ou s'hybride avec, une molécule de structure prédéterminée. Une solution échantillon est déposée sur la puce de détection, et les molécules contenues dans l'échantillon se lient à ou s'hybrident avec un ou plusieurs des sites de liaison. Les sites de liaison particuliers auxquels se produit l'hybridation sont détectés, et la présence d'une ou de plusieurs structures moléculaires dans l'échantillon est subséquemment déduite. Les puces de détection moléculaire présentent un grand intérêt pour la mise en séquence de gènes. Ces puces, souvent appelées puces à ADN, utilisent à un groupement de sites de liaison présentant chacun des éprouvettes d'ADN à un seul brin respectives. Un échantillon de fragments d'ADN à un seul brin, dénommé ADN cible, est déposé sur la puce à ADN. Les fragments d'ADN se fixent sur une ou plusieurs des éprouvettes d'ADN selon un processus d'hybridation. Il est possible de déterminer une séquence de bases de nucléotides dans le fragment d'ADN en détectant les éprouvettes d'ADN avec lesquelles s'est hybridé un fragment d'ADN. Pour accélérer le processus d'hybridation, une concentration locale d'ADN cible peut être augmentée en des sites prédéterminés au moyen d'un champ électrique. Dans ce cas, chaque site est associé à une électrode destinée à générer de manière sélective un champ électrique à proximité de celui-ci. Le champ électrique est généré en appliquant un potentiel électrique entre une électrode située au niveau du site et une contreélectrode située dans une partie périphérique de la puce. Pour attirer les fragments d'ADN vers le site, la polarité du potentiel électrique est choisie de manière à générer un champ électrique présentant une polarité opposée à la charge des fragments d'ADN. Pour déshybrider le site, un champ électrique présentant la même polarité que les fragments d'ADN peut être généré afin d'éloigner les fragments d'ADN du site. Différentes approches ont été utilisées pour détecter un phénomène d'hybridation au niveau d'un site de liaison. Dans l'une de ces approches, un marqueur radioactif est fixé à chaque molécule d'une pluralité de molécules dans l'échantillon. La liaison d'une molécule à un récepteur moléculaire peut ensuite être détectée en détectant le marqueur radioactif. D'autres approches de la détection utilisent des marqueurs fluorescents, tels que des fluorogènes qui produisent de la lumière de manière sélective lorsque l'hybridation se produit. Ces fluorogènes sont éclairés par une source absorbant la lumière, externe au substrat. Une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) externe est utilisée pour détecter la fluorescence éclairés. Une puce à ADN pour la détection optique est décrite dans "Real-time detection of DNA hybridization and melting on oligonucleotide arrays by using optical wave guides" [Détection en temps réel de l'hybridation et de la fusion d'ADN sur des groupements d'oligonucléotides au moyen de guides d'ondes lumineuses], Proceedings of the National Academy of Sciences, VOL. 92, pp. 6379-6383. Cette puce à ADN utilise un substrat en verre dont une surface définit les sites de liaison. Le substrat en verre présente une extrémité adjacente à la surface dans laquelle la lumière est injectée au moyen d'une source lumineuse externe. Une caméra à CCD externe est utilisée pour détecter la lumière dispersée aux niveau des sites de liaison où se produit l'hybridation. Brève description des dessins L'invention est décrite de manière spécifique dans les revendications jointes. Toutefois, d'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront plus clairement, et l'invention sera mieux comprise en se référant à la description détaillée ci-dessous, prise en conjonction avec les dessins joints, parmi lesquels: La figure 1 est un schéma fonctionnel d'un dispositif intégré de détection moléculaire selon la présente invention; La figure 2 est une vue schématique en coupe transversale d'un dispositif intégré de détection moléculaire selon la présente invention; La figure 3 est un organigramme d'un mode de réalisation d'un procédé de détection de l'hybridation d'une molécule avec un récepteur moléculaire; La figure 4 est une vue schématique en perspective d'un mode de réalisation préféré d'une puce intégrée de détection moléculaire selon la présente invention; et La figure 5 est une vue schématique en coupe transversale du mode de réalisation préféré de la puce intégrée de détection moléculaire. Description détaillée d'un mode de réalisation préféré Les modes de réalisation de la présente invention fournissent avantageusement un dispositif intégré de détection moléculaire qui incorpore des sites de liaison, une source lumineuse, et les circuits électroniques de détection optique sur une seule puce. Un mode de réalisation préféré utilise un substrat en verre microusiné, une source lumineuse consistant en une diode électro-luminescente polymère et un transformateur d'image optique consistant en un transistor à couche mince permettant de produire une puce totalement intégrée. En incluant en outre des électrodes transparentes à proximité des sites de liaison, le dispositif permet d'améliorer l'hybridation et la déshybridation en utilisant un champ électrique. Les modes de réalisation de la présente invention peuvent être utilisés pour des applications dans la mise en séquence et la détection d'ADN. La figure 1 est un schéma fonctionnel d'un dispositif intégré de détection moléculaire 10 selon la présente invention. Le dispositif intégré de détection moléculaire 10 comporte un substrat 12 qui définit un site de liaison 14 destiné à recevoir un récepteur moléculaire 16. En général, le récepteur moléculaire 16 est choisi en fonction du type de molécule qui doit être détecté. Le récepteur moléculaire 16 comporte typiquement une molécule biologique ou synthétique qui présente une affinité spécifique pour la molécule à détecter. Pour les applications de mise en séquence et/ou de détection d'ADN, le récepteur moléculaire 16 comporte au moins une éprouvette d'ADN qui présente une séquence spécifique de paires de bases. Il faut remarquer que les modes de réalisation de la présente invention ne se limitent pas à la détection de l'hybridation des molécules d'ADN. Par exemple, des modes de réalisation de la présente invention peuvent être utilisés pour détecter la liaison anticorps-antigène. Une source lumineuse 18 est intégrée dans le substrat 12. La source lumineuse 18 éclaire le site de liaison 14 à travers le substrat 12 afin de produire une indication optique de l'hybridation ou de la liaison d'une molécule 19 avec le récepteur moléculaire 16. L'indication optique peut être fournie, par exemple, par un fluorogène qui produit de manière sélective de la lumière lorsqu'une hybridation se produit. Un détecteur optique 20 est également intégré dans le substrat 12. Le détecteur optique 20 détecte l'indication optique à travers le substrat 12, et détecte ainsi l'hybridation ou la liaison de la molécule 19. Dans l'un des modes de réalisation préférés, le substrat 12 est formé de verre, de sorte que le site de liaison 14 peut être éclairé à travers le substrat 12, et que l'indication optique peut être détectée à travers le substrat 12. En général, le substrat 12 peut être formé d'un matériau essentiellement transparent pour permettre l'éclairage et la détection à travers celui-ci. La figure 2 est une vue schématique en coupe transversale d'un autre mode de réalisation d'un dispositif intégré de détection moléculaire selon la présente invention. Le dispositif intégré de détection moléculaire comporte un substrat 30 qui peut être formé en verre. Le substrat 30 définit une première face 32 (ou face supérieure) et une seconde face 34 (ou face opposée). Comme illustré, la première face 32 est à l'opposé de la seconde face 34 dans ce mode de réalisation. Un site de liaison 36 destiné à recevoir un récepteur moléculaire 37 est défini sur la première face 32 du substrat 30. Le site de liaison 36 peut être formé en ménageant un puits par gravure chimique ou par microusinage dans le substrat 30. Le récepteur moléculaire 37 est déposé dans le site de liaison 36 en utilisant une technique de distribution robotisée, une technique d'assemblage automatique, ou d'autres techniques connues du spécialiste de la technique. Pour les applications de mise en séquence et/ou de détection d'ADN, le récepteur moléculaire 37 comporte une chaîne d'au moins un nucléotide pour détecter une molécule ayant une chaîne complémentaire d'au moins un nucléotide. Dans ce cas, le récepteur moléculaire 37 peut comporter au moins une éprouvette d'ADN qui s'hybride de manière sélective avec des molécules d'ADN prédéterminées. Une source lumineuse 38 est incorporée sur la seconde face 34 du substrat 30. Dans l'un des modes de réalisation préférés, la source lumineuse 38 comporte une diode électro-luminescente polymère fabriquée sur la seconde face 34 du substrat 30. Le site de liaison 36 est éclairé par la source lumineuse 38 à travers le substrat 30. En d'autres termes, la lumière générée sur la seconde face 34 du substrat 30 (par la source lumineuse 38) est transmise à travers le substrat 30 pour atteindre le site de liaison 36 sur la première face 32. L'éclairage du site de liaison 36 agit pour illuminer un indicateur optique d'une molécule qui s'est hybridée avec le récepteur moléculaire 37. L'éclairage de l'indicateur optique agit pour produire une indication optique de l'hybridation. L'indicateur optique peut être fourni par un fluorogène qui devient actif de manière sélective lorsqu'une hybridation se produit. Dans ce cas, la source lumineuse 38 présente de préférence une caractéristique spectrale qui correspond aux bandes d'absorption du fluorogène. Le nombre de molécules fluorescentes peut être augmenté en fixant de multiples molécules fluorescentes à une perle ou à un élément similaire qui est lié à la molécule. Il faut noter, toutefois, que les modes de réalisation de la présente invention ne sont pas limités à l'utilisation d'indicateurs fluorescents, et que d'autres indicateurs optiques peuvent être utilisés aux mêmes fins. Un détecteur optique 40 est incorporé sur la seconde face 34 du substrat 30 afin de détecter l'indication optique. Le détecteur optique 40 peut comporter une photodiode fabriquée sur la seconde face 34 du substrat 30. Le détecteur optique 40 détecte l'indication optique, et donc l'hybridation de la molécule, à travers le substrat 30. En d'autres termes, l'indication optique générée sur la première face 32 du substrat 30 est transmise à travers le substrat 30 jusqu'au détecteur optique 40 sur la seconde face 34. Dans le mode de réalisation de la figure 2, la source lumineuse 38 et le détecteur optique 40 sont situés l'un à côté de l'autre sur la seconde face 34 du substrat 30. Pour protéger le détecteur optique 40 de la lumière émise par la source lumineuse 38, le dispositif intégré de détection moléculaire comporte un filtre 42 incorporé sur le détecteur optique 40. Dans ce cas, le filtre 42 peut comporter un filtre coloré destiné à éliminer la lumière fluorescente provenant de la source lumineuse 38. Le dispositif intégré de détection moléculaire comprend facultativement une électrode transparente 44 incorporée dans le substrat 30 en un emplacement proche du site de liaison 36. L'électrode transparente 44 est utilisée pour accélérer l'hybridation et la déshybridation de la molécule d'avec le récepteur moléculaire 37 au moyen d'un champ électrique. En raison de sa transparence, l'électrode transparente 44 permet l'éclairage et la détection de l'indicateur optique sur la seconde face 34 du substrat 30. La figure 3 est un organigramme d'un mode de réalisation d'une méthode de détection de l'hybridation d'une molécule avec un récepteur moléculaire. De préférence, le procédé est utilisé en conjonction avec un dispositif de détection moléculaire tel que décrit dans le présent document. Il faut remarquer, toutefois, que le procédé peut également être utilisé pour détecter l'hybridation dans d'autres dispositifs. Comme indiqué à la case 50, le procédé comporte une étape de fourniture d'un substrat qui définit un site de liaison destiné à recevoir le récepteur moléculaire. Le substrat peut être fourni dans un dispositif de détection moléculaire, tels que les modes de réalisation du dispositif de détection moléculaire décrits dans le présent document. Comme décrit plus haut, le substrat est formé d'un matériau, tel que le verre, qui permet la transmission de la lumière. Comme indiqué à la case 52, le procédé comporte une étape facultative de production d'un champ électrique au moyen d'une électrode transparente située à proximité du site de liaison. Le champ électrique est généré pour attirer les molécules vers le site de liaison afin d'améliorer l'hybridation avec le récepteur moléculaire. Comme indiqué à la case 54, une étape consistant à éclairer le site de liaison à travers le substrat est réalisée pour produire une indication optique de l'hybridation d'une molécule avec le récepteur moléculaire. Si une électrode transparente est incluse, le site de liaison et l'indication optique sont éclairés à travers l'électrode transparente. Comme décrit plus haut, le site de liaison peut être éclairé depuis une face du substrat se trouvant à l'opposé de la face sur laquelle est défini le site de liaison. Le site de liaison peut être éclairé par une source lumineuse, telle qu'une diode électro-luminescente, fabriquée sur le substrat. Comme indiqué à la case 56, une étape de détection de l'indication optique à travers le substrat est réalisée. Si une électrode transparente est incluse, l'indication optique est détectée à travers l'électrode transparente. L'indication optique peut être détectée depuis une face du substrat opposée à la face sur laquelle est défini le site de liaison. L'indication optique peut être détectée au moyen d'un détecteur optique, tel qu'une photodiode, fabriqué sur le substrat. Comme indiqué à la case 58, le procédé comporte une étape facultative consistant à générer un champ électrique au moyen de l'électrode transparente afin de déshybrider la molécule d'avec le récepteur moléculaire. La figure 4 est une vue schématique en perspective d'un mode de réalisation préféré d'une puce intégrée de détection moléculaire selon la présente invention. La puce intégrée de détection moléculaire comporte un substrat 60 qui définit une pluralité de sites de liaison 62. La pluralité de sites de liaison 62 est formée de puits 64 ménagés par qravure chimique sur la face supérieure 66 du substrat 60. Dans ce mode de réalisation, la pluralité de sites de liaison 62 sélectifs est agencée sous la forme d'une matrice. Dans d'autres modes de réalisation, la pluralité de sites de liaison 62 peut être agencée selon un autre type de groupement. La figure 5 est une vue schématique en coupe transversale du mode de réalisation préféré de la puce intégrée de détection moléculaire. Des récepteurs d'ADN 70 spécifiques présentant des séquences spécifiques de paires de bases sont déposés dans les puits 64. Les récepteurs d'ADN 70 spécifiques peuvent être déposés en utilisant des techniques qui comprennent, sans y être limités, des techniques de distribution robotisée et des techniques d'assemblage automatique. Intégré dans le substrat 60, sous chaque site de la pluralité de sites de liaison 62, est disposé le détecteur respectif d'une pluralité de détecteurs optiques 72. Chaque détecteur de la pluralité de détecteurs optiques 72 comporte une photodiode a-Si fabriquée dans la surface inférieure 74 du substrat 60. La pluralité de détecteurs optiques 72 peut être adressée selon une matrice en utilisant des transistors a-Si ou poly-Si à couche mince pour former un groupement d'imagerie en correspondance biunivoque avec les sites de liaison 62. Entre chaque paire adjacente d'une rangée de la pluralité de détecteurs optiques 72 se trouve une source respective d'une pluralité de sources lumineuses 76 intégrées dans le substrat 60. Chaque source de la pluralité de sources lumineuses 76 comprend une diode électro-luminescente polymère fabriquée dans la surface inférieure 74 du substrat 60. La pluralité de sources lumineuses 76 présente une caractéristique spectrale correspondant aux bandes d'absorption des fluorogènes utilisés pour fournir l'indication optique. Un filtre coloré 78 est incorporé sur chaque détecteur de la pluralité de détecteurs optiques 72 afin d'occulter la lumière émise par la pluralité de sources lumineuses 76. Dans le but d'accélérer les processus d'hybridation et de déshybridation, chaque site de la pluralité de sites de liaison 62 présente une électrode respective d'une pluralité d'électrodes transparentes 80 intégrée à proximité de celui-ci. Les électrodes transparentes 80 génèrent un champ électrique destiné à favoriser l'hybridation et la déshybridation. Les électrodes transparentes 80 sont individuellement adressables à des fins d'adressage et d'assemblage automatiques. La puce intégrée de détection moléculaire peut en outre comporter une membrane polymère à chaque site de la pluralité de sites de liaison 62 pour faciliter la liaison des molécules avec ceux-ci. Pendant le fonctionnement, les séquences d'ADN appropriées s'hybrident avec les sites sélectifs de la pluralité de sites de liaison 62 en utilisant une hybridation classique, ou une hybridation assistée par une technique électrique ou thermique. Après l'hybridation, les séquences indésirables, dont la liaison est seulement partielle, sont déshybridées en utilisant un champ électrique ou la désorption thermique. La pluralité de sources lumineuses 76 émet de la lumière, et la fluorescence de chaque site de la pluralité de sites de liaison 62 est lue par la pluralité de détecteurs optiques 72. Des techniques de détection sensibles à la phase peuvent être incorporées en modulant un circuit d'entraînement relié à chaque détecteur de la pluralité de détecteurs optiques 72. Ces techniques sont avantageuses pour améliorer la sensibilité de la détection. Les sites hybridés peuvent alors être détectés en vue de déterminer les séquences de nucléotides spécifiques dans l'échantillon d'ADN. La puce de détection moléculaire peut ensuite être totalement déshybridée en utilisant des moyens chimiques, thermiques ou électriques, de manière à pouvoir répéter le processus d'hybridation et de détection. En conséquence, sont ici décrits un concept, ainsi que plusieurs modes de réalisation comprenant des modes de réalisation préférés d'un dispositif intégré de détection moléculaire optique et un procédé de cette détection. Du fait que les différents modes de réalisation de la présente invention intègrent un site de liaison, une source lumineuse, et un détecteur optique sur un seul et même substrat, ils offrent une amélioration notable en ce qu'un dispositif moléculaire totalement intégré est produit. Par ailleurs, les différents modes de réalisation de la présente invention, tels qu'ils sont décrits dans le présent document, comportent une électrode transparente située à proximité de chaque site de liaison afin de faciliter l'hybridation et la déshybridation au moyen d'un champ électrique. La transparence de l'électrode permet à la fois d'éclairer et de détecter une indication optique à travers l'électrode. Il sera évident pour le spécialiste de la technique que l'invention décrite ici peut être modifiée de nombreuses façons et peut prendre la forme de nombreux modes de réalisation qui sont différents de la forme préférée spécifiquement présentée et décrite ci-dessus. En conséquence, les revendications jointes sont destinées à couvrir toutes les modifications de l'invention qui respectent l'esprit et à l'étendue de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Dispositif intégré de détection moléculaire comprenant: un substrat qui définit un site de liaison destiné à recevoir un récepteur moléculaire; une source lumineuse intégrée dans le substrat, la source lumineuse étant destinée à éclairer le site de liaison à travers le substrat afin de produire une indication optique de l'hybridation d'une molécule avec le récepteur moléculaire; et un détecteur optique intégré dans le substrat, le détecteur optique étant destiné à détecter l'indication optique à travers le substrat. 2. Dispositif intégré de détection moléculaire selon la revendication 1 dans lequel le substrat est sensiblement transparent. 3. Dispositif intégré de détection moléculaire selon la revendication 1 dans lequel le substrat est formé en verre. 4. Dispositif intégré de détection moléculaire selon la revendication 1 dans lequel le substrat définit une première face sur laquelle est défini le site de liaison et une seconde face opposée à la première face sur laquelle est intégrée la source de lumière. 5. Dispositif intégré de détection moléculaire selon la revendication 1 dans lequel le récepteur moléculaire comporte une chaîne d'au moins un nucléotide, et dans lequel la molécule comporte une chaîne complémentaire d'au moins un nucléotide. 6. Procédé de détection de l'hybridation d'une molécule avec un récepteur moléculaire, le procédé comprenant les étapes de: fourniture d'un substrat qui définit un site de liaison destiné à recevoir le récepteur moléculaire; éclairage du site de liaison par une source lumineuse intégrée dans le substrat, le site de liaison étant éclairé à travers le substrat afin de produire une indication optique de l'hybridation d'une molécule avec le récepteur moléculaire; et détection de l'indication optique à travers le substrat au moyen d'un détecteur optique intégré dans le substrat. 7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel l'indication optique est détectée depuis la seconde face du substrat. 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel l'indication optique est détectée grâce à une photodiode fabriquée sur la seconde face du substrat. 9. Procédé selon la revendication 7 comprenant en outre l'étape consistant à protéger le détecteur optique de la lumière qui éclaire le site de liaison. 10. Procédé selon la revendication 6 dans lequel l'indication optique est détectée à travers une électrode transparente située à proximité du site de liaison.