FR 2750504 A1 19980102 FR 9608026 A 19960627 PROCÉDÉ D'ANALYSE D'ACIDES NUCLÉIQUES PAR HYBRIDATION ET DISPOSITIF POUR SA MISE EN OEUVRE. La présente invention concerne le domaine de l'analyse de séquences d'acides nucléiques, en simples brins ou en doubles hélices, inconnues par hybridation avec des sondes oligonucléotidiques fixées sur un support. Ce type d'analyse trouve son application dans le séquençage, le diagnostic ou encore le contrôle qualité, en recherche ou en production industrielle. La loi d'appariement A-T (ou A-U) et G-C confère aux acides nucléiques la propriété de former des complexes d'hybridation spécifiques entre des séquences complémentaires. Cette propriété connue de longue date permet d'utiliser un fragment d'acide nucléique, ou oligonucléotide, pour mettre en évidence la présence d'une séquence nucléique complémentaire. L'analyse de fragments d'ADN après séparation-sur gel (E. Southern, J. mol. Biol., 1975, 98, 503-517) est aujourd'hui largement répandue tant dans le domaine de la recherche fondamentale que dans celui de l'analyse médicale (Caskey, Science, 1987, 236, 1223-1228 ; Landegrer et al., Science, 1988, 242, 229-237 ; Arnheim et al., Ann Rev. Biochem., 1992, 61, 131-156). Plusieurs techniques d'analyse des acides nucléiques, basées sur leur propriété d'hybridation avec des sondes, ont été développées notamment pour le séquençage d'ADN ou d'ARN inconnus, la détection de séquences associées à une pathologie, la recherche de mutations ponctuelles dans des séquences (S. Ikata et al., Nuclei. Acids Res., 1987, 15, 797-811 ; J. A. Matthews, L. J. Krieka, Analytical Biochemistry, 1988, 169, 1-25). Plus récemment, il a été proposé de nouveaux procédés d'analyse de fragments d'ADN inconnus, basés sur l'hybridation avec une série d'oligonucléotides comportant de 5 à 9 bases arrangées selon une séquence connue et immobilisée sur un support solide (E. Southern, Brevet Européen publié sous le numéro : 0 373 203 ; K. R. Khrapko et al., FEBS Letters, 1989, 256, 118-122 ; R. Drmanac et al., Genomics, 1989, 4, 114-128 ; R. Drmanac et al., DNA and Cell Biology, 1990, 9,527534 ; K. R. Khrapko et al., J. DNA Sequencing Mapp., 1991, 1, 375-388 ; R. Drmanac et al., Science, 1993, 260, 1649-1652; R. J. Lipshutz, J. Biomol. Struct. Dyn., 1993, 11, 637-653 ; U. Maskos, E. Southern, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 4663-4669 ; A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994, 91, 5022-5026 ; J. C. Williams, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 1365-1367 ; E. M. Southern, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 1368-1373). Ces nouveaux procédés d'analyse consistent à détecter, après hybridation et lavage, les signaux émis par les hybrides éventuellement formés entre le fragment d'ADN marqué analysé et un ou plusieurs oligonucléotides de la série immobilisés sur le support solide. Chaque position révélée positive sur le support correspond à une séquence complémentaire ainsi identifiée dans le fragment d'ADN analysé. Indépendamment des difficultés de préparation des supports sur lesquels a lieu la synthèse des oligonucléotides, le problème majeur de ces procédés, réside dans la discrimination entre les hybrides parfaits et les hybrides comportant un ou plusieurs mésappariements. L'analyse des complexes d'hybridation obtenus par les procédés ci-dessus est fondée sur la plus grande stabilité des hybrides sans mésappariement par rapport à celle des hybrides comportant un ou plusieurs méasappariements. La discrimination entre un hybride parfait et des hybrides avec mésappariement peut être réalisée par exemple en élevant la température du milieu, ce qui provoque une dissociation des complexes avec mésappariement avant celle du complexe sans méasappariement. Il est en effet connu que la stabilité d'un duplexe d'ADN est dépendante de sa longueur et de sa séquence en bases. La température de fusion, dénommée Tm, est la température à laquelle les deux brins d'ADN sont à 50% sous forme de duplexe. Pour une séquence et une taille donnée d'un duplexe, le Tm varie avec la composition du milieu d'hybridation. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'affecter la valeur du Tm, comme des agents dénaturants, par exemple l'urée ou la formamide qui abaissent le Tm, ou encore les modifications de la force ionique. La stabilité des hybrides, et donc la valeur du Tm, est également fonction de la composition en base. Il est en effet connu que la paire de base G-C, caractérisée par trois liaisons hydrogènes, est plus stable que les paires A-T ou A-U qui ne possèdent que deux liaisons hydrogène. Par exemple, dans le cas d'un duplexe de 9 paires de base de long, la différence de Tm entre une séquence uniquement composée de paires G-C, et une séquence composée uniquement de paires A-T, est de l'ordre de 500C. En conséquence, à longueur égale, un hybride parfait riche en paires A-T est susceptible de présenter un Tm voisin, voir même inférieur, à celui d'un hybride imparfait riche en paires G-C. En effet, la déstabilisation due à un mésappariement dans un duplexe riche en paires G-C peut représenter une variation de Tm de 20C à plus de 250C, selon la position et la nature du mésappariement. Il apparaît donc impossible de fixer des conditions d'hybridation uniques permettant de discriminer les duplexes parfaits des duplexes imparfaits quelque soit leur séquence. Ce phénomène conduit à des signaux faux positifs ou faux négatifs selon les conditions de température, d'hybridation et de lavage, mises en oeuvre dans les procédés d'analyse d'ADN sus-mentionnés. Ces procédés d'analyse de fragments d'ADN inconnus sont avantageusement mis en oeuvre pour séquencer lesdits fragments par hybridation avec une série d'oligonucléotides de même longueur couvrant toutes les séquences possibles pour cette longueur donnée des oligonucléotides. Ainsi, pour des oligonucléotides de 2 bases, choisies parmi les quatre constituant 1'ADN, 16 séquences sont possibles, pour des oligonucléotides de 3 bases, 64 séquences sont possibles, pour des oligonucléotides de 4 bases, 256 séquences sont possibles, pour des oligonucléotides de 5 bases, 1024 séquences sont possibles, pour des oligonucléotides de 6 bases, 4096 séquences sont possibles, etc... En conséquence, pour chaque ensemble de séquences possibles, les Tm de chaque duplexe parfait seront différents dans une gamme de température large avec un problème de discrimination pour les mésapariements. Il apparaît aussi, que plus la séquence des duplexes est petite, plus la différence de Tm entre un hybride parfait et un hybride présentant un mésapariement est significative. Cependant, plus la séquence des duplexes est courte, moins elle est informative pour le séquençage; en effet, pour un fragment d'ADN à séquencer de 1000 bases, une séquence quelconque de 3 bases sera statistiquement présente au moins une quinzaine de fois et une séquence de 4 bases sera présente statistiquement probablement 4 fois, alors qu'une séquence de 5 bases ne devrait être présente statistiquement qu'une fois. Un compromis doit donc être trouvé pour permettre de séquencer des fragments les plus grands possibles avec le moins d'oligonucléotides possibles. En outre, il est évident que la température d'hybridation est différente pour chaque séquence que l'on cherche à déterminer ou à détecter avec la série d'oligonucléotides. Pour augmenter les possibilités de discrimination des mésapariements et contourner le problème précédent, il est nécessaire de réaliser une cinétique de dénaturation ou de renaturation de chaque séquence oligonucléotidique du support afin de déterminer le Tm le plus élevé pour chaque séquence de duplexe parfait. La valeur du Tm de chaque hybride possible sur le support est mesurée dans l'art antérieur de la façon suivante - on met en contact le support avec un fragment d'ADN à analyser, cette mise en contact étant réalisée à basse température, c'est à dire à moins de 10 C en dessous du Tm le plus faible de la série d'oligonucléotides, puis - on lave le support en augmentant progressivement la température, et - on quantifie pour chaque oligonucléotide du support les duplexes formés tout au long du gradient de température. Cette dernière étape de quantification n'est pas facile à réaliser car à chaque température inférieure ou égale au Tm de l'hybride considéré, la quantité de duplexe formé varie avec la concentration du fragment d'ADN mis en contact avec le support, ainsi qu'avec la quantité de l'oligonucléotide considéré par unité de surface sur le support. Cette quantification est compliquée du fait même des techniques de synthèse des oligonucléotides sur le support, qui engendrent d'une part une grande variation de la quantité des différents oligonucléotides à chaque position du support et d'autre part des aléas dans l'uniformité de la séquence de l'oligonucléotide synthétisé à chaque position du support. Il sera donc impératif de réaliser pour chaque support fabriqué et pour chaque site d'oligonucléotide positionné sur celui-ci, une calibration des courbes de dénaturation. En outre, la quantification de l'hybride formé sur le support limite l'utilisation des marqueurs et des moyens physiques de mesure, en raison des interactions entre les marqueurs et le support; il faut donc adapter les marqueurs, et par conséquent les moyens de détection, à chaque support. La présente invention vise à offrir un procédé permettant de palier les inconvénients et difficultés de la méthode décrite ci-dessus-. Ce but est atteint en détectant non pas la quantité de duplexe formé, mais la quantité d'ADN libéré de la zone d'hybridation au cours d'une étape de dénaturation des duplexes. Le procédé d'analyse d'acides nucléiques selon l'invention consiste à mettre en contact lesdits acides nucléiques avec des oligonucléotides fixés sur un support de façon à former des complexe d'hybridation, puis à soumettre lesdits complexes d'hybridation à un gradient de dénaturation et enfin à détecter et analyser par tout moyen approprié les acides nucléiques libérés du support au fur et à mesure de l'avancement du gradient de dénaturation. Le procédé de l'invention vise plus particulièrement l'analyse d'acides nucléiques simple brin, mais peut être aussi appliqué pour détecter des séquences d'ADN en double hélice dont l'un des deux brins est riche en bases puriques, via alors la formation de triple hélice (T. Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7260 ; H. E. Moser, P. B. Dervan, Science 1987, 238, 645-650 ; D. A. Collier et al., J. Am. Chemin. Soc., 1991, 113, 1457-1458 ; P. A. Beal, P. B. Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363 ; D. S. Pilch et al., Biochemistry, 1991, 30, 6081-6087 ; C. Giovannangeli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 8631-8635 ; P.J. Bates et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 3627-3632 ; Nguyen T. Thuong, C. hélène, Angew. Chem. Int. Ed., 1993, 105, 666-690). Dans ce cas il convient d'entendre par complexe d'hybridation également des triples hélices, pouvant être aussi dénommées triplexes, formées entre l'acide nucléique double brin analysé et les oligonucléotides fixés sur le support. Le procédé selon l'invention est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la mise en contact des acides nucléiques simple brin à analyser avec un support sur lequel est fixée une série d'oligonucléotides identiques ou différents, dans des conditions dénaturantes faibles de façon à réaliser l'hybridation des acides nucléiques à tester avec la majeure partie des oligonucléotides du support, puis - éventuellement un ou plusieurs lavages visant à éliminer du support les acides nucléiques non hybridés, - l'exposition du support à un gradient de dénaturation assurant la libération progressive des acides nucléiques du support en fonction du niveau d'appariement de chaque acide nucléique avec un oligonucléotide fixé sur le support, - la détection et l'analyse par tout moyen approprié des acides nucléiques libérés dudit support au fur et à mesure de l'avancement du gradient de dénaturation. A la différence des méthodes de l'art antérieur, le procédé de l'invention vise à mesurer non pas la quantité de duplexe formé entre les acides nucléiques testés et les oligonucléotides du support mais, la quantité d'acide nucléique libéré du support. Par acide nucléique, on entend selon l'invention, des séquences d'ADN en simple brin ou en double hélice ou d'ARN ou encore ces séquences comportant ou constituées de nucléosides modifiés. Le procédé d'analyse d'acide nucléique selon l'invention peut être mis en oeuvre tant pour le séquençage dudit acide nucléique, que pour la détection d'une ou plusieurs séquences particulières ou d'une ou plusieurs mutations éventuellement présentes dans ledit acide nucléique. Dans le cas de la détection d'une séquence particulière ou d'une mutation éventuellement présente dans un acide nucléique, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec un support comportant des oligonucléotides de longueurs et de séquences identiques correspondant à celles de la séquence particulière ou de la mutation recherchée. Selon que l'on connaît ou non la séquence ou la mutation recherchée, la séquence de I'oligonucléotide peut être choisie parfaitement complémentaire ou non de ladite séquence ou mutation recherchée. Le procédé de l'invention peut également permettre la détection de plusieurs séquences particulières ou de mutations différentes présentes dans un même ou plusieurs acides nucléiques. Le procédé est alors mis en oeuvre avec un support comportant des oligonucléotides dont plusieurs sont de séquences et de longueurs différentes afin de couvrir les différentes séquences ou mutations analysées. Dans ce cas, il est avantageux de procéder, préalablement à la mise en oeuvre du procédé, à l'étalonnage des Tm de chacun des oligonucléotides différents fixés sur le support. Dans le cas du séquençage d'acide nucléique, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec un support comprenant une série d'oligonucléotides de longueurs identiques et de séquences différentes de façon à couvrir toute les possibilités de séquence pour cette longueur. Dans ce cas, il est avantageux de procéder, préalablement à la mise en oeuvre du procédé, à l'étalonnage des Tm de chacun des oligonucléotides fixés sur le support. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec tout type de gradient de dénaturation, tel que des gradients de température, de force ionique, d'agent dénaturant. Dans le cas des gradients de température, il est avantageux, pour réaliser des hybridations avec des oligonucléotides courts, de l'ordre de 5 à 10 bases, de se placer à des températures relativement basses, inférieures à la température ambiante. Dans le cas de l'analyse d'ADN double brin, l'hybridation est avantageusement réalisée avec des oligonucléotides de 10 à 15 bases. La détection des acides nucléiques libérés du support peut être réalisée par tout moyen approprié. Généralement les acides nucléiques analysés sont marqués, par exemple avec un traceur radioactif, fluorescent, enzymatique ou immunologique et donc détectés lors de leur libération du support par tout moyen de détection adapté au type de marquage utilisé. Le support sur lequel sont fixés les oligonucléotides peut présenter des formes variées et être réalisé en toute matière avec lesquels il est possible - de synthétiser ou fixer après synthèse lesdits oligonucléotides selon les techniques décrites dans la littérature, tout en permettant d'exposer lesdits oligonucléotides à la solution d'hybridation ainsi que les hybrides formés à la solution de lavage et au gradient de dénaturation (il est en effet très important de ne pas limiter les réactions d'hybridation et de libération entre les oligonucléotides et les acides nucléiques analysés), - de libérer du support les acides nucléiques séparés des complexes d'hybridation. Le support devra donc être adapté notamment à la technique de détection utilisée. Il peut s'agir d'une détection en flux ou en veine liquide, et le support peut alors se présenter sous forme de billes, de fibres, de fils et filaments, de membranes en matière diverse, placés dans une colonne ou dans une veine; la colonne ou la veine est chargée avec les acides nucléiques analysés, lavée, puis soumise à un gradient de dénaturation; la nature et la quantité de chacun des acides nucléiques libéré en fonction des Tm sont détectées à la sortie de la colonne ou de la veine par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut également s'agir d'une élution par palier. Dans ce cas, la réaction d'hybridation peut être réalisée dans une cupule où est placé le support, on ajoute la solution de lavage à une première température ou une force ionique ou une concentration de dénaturant donnée et l'on manalyse par tout moyen approprié la quantité d'acide nucléique libéré du support. On répète la procédure pour une seconde, une troisième, etc... température ou une force ionique ou une concentration de dénaturant donnée. Il peut s'agir aussi d'une détection sur un élément solide avantageusement plat, comme une membrane, un film ou une feuille par exemple de cellulose, de verre, de résine, de polymère ou de coton, traité de façon à réagir avec le marqueur des acides nucléiques qui est utilisé; les acide nucléiques libérés du support d'hybridation au fur et à mesure de l'avancement du gradient de dénaturation sont déposés sur l'élément solide où ils sont révélés. Un mode de mise en oeuvre tout à fait particulier de ce type de détection consiste à utiliser un dispositif se présentant sous l'aspect d'un stylo ou d'un pinceau comprenant à l'une au moins de ses extrémités un support sur lequel les oligonucléotides sont fixés. Ce support peut être une bille mobile du type de celle d'un stylo à bille, des filaments tressés ou non comme les poils d'un pinceau, un tampon du type de celui d'un stylo feutre, en toute matière permettant, comme indiqué précédemment, de fixer les oligonucléotides et de les exposer à la solution d'hybridation puis de soumettre les hybrides formés à la solution de lavage et au gradient de dénaturation. Un tel dispositif est utilisé dans le cadre du procédé de l'invention, de la façon suivante - on met en contact l'extrémité du dispositif avec la solution d'hybridation, par exemple par simple trempage, pendant une durée suffisante pour permettre la formation des duplexes entre les acides nucléiques analysés et les oligonucléotides fixés sur le support à l'extrémité du dispositif, - on lave éventuellement ledit support afin d'éliminer les acides nucléiques n'ayant pas réagi, - on applique le gradient de dénaturation au niveau du support portant les duplexes en déplaçant le dispositif sur un élément solide plat soumis à un gradient de dénaturation; les acides nucléiques sont alors libérés du support et déposés sur ledit élément plat au fur et à mesure du déplacement du support sur le gradient de dénaturation. - on détecte et analyse les acides nucléiques libérés et révélés sur l'élément solide. Une alternative à la technique précédente, consiste à placer sur le dispositif un système permettant d'appliquer le gradient de dénaturation au niveau du support. Comme précédemment, le dépôt des acides nucléiques libérés au fur et à mesure de lavancement du gradient de dénaturation est réalisé en déplacant le support sur un élément solide plat. Selon une forme de réalisation toute particulière, le dispositif comprend - à l'une de ses extrémités au moins un support, comme défini précédemment, sur lequel sont fixés les oligonucléotides, - une ou plusieurs cartouches débouchant sur le support, lesdites cartouches contenant la solution d'hybridation et éventuellement une solution de lavage, - des moyens de pression permettant d'amener la solution d'hybridation et donc les acides nucléiques analysés au contact du support pour la réalisation des réactions d'hybridation, ainsi qu ' éventuellement la solution de lavage. L'application du gradient de dénaturation est réalisée comme indiqué précédemment. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs, et concernant des protocoles de mise en oeuvre du procédé de l'invention et son application à la détection de mutations. Exemple 1 - Application au diagnostic de mutations sonctuelles : détection d'un mesapariement en position 5' du duplexe. Des oligonucléotides identiques répondant à la formule : 3' T C G T T C C A C - Acridine 5', désignés B02911, ont été synthétisés sur une membrane en cellulose de 5,5 mm de diamètre. Cet oligonucléotide est homologue à une partie de la séquence de l'exon 11 du gène CFTR pouvant porter la mutation ponctuelle R560T. Dans le schéma du dispositif de la figure 1, la membrane de cellulose comprenant les oligonucléotides de formule (I) est placée dans une veine liquide ou une colonne (5), une pompe péristaltique (2) permet de faire passer la solution d'hybridation puis la solution de lavage depuis le tube (1) dans la colonne (5) puis dans le tube de collecte (6) où sont recueillis et détectés les acides nucléiques libérés du support. La colonne (5) contenant la membrane de cellulose et 60 cm environ de microtube (3) arrivant à la colonne sont placés dans un bain thermostaté et agité (4). Pour cet exemple, l'hybridation selon le procédé de l'invention n'a pas été mise en oeuvre avec un fragment d'acide nucléique provenant d'un sujet, mais avec deux sondes nucléiques, marquées au 32P par kination, correspondant à la portion du gène CFTR pouvant porter la mutation R560T. Ces deux sondes nucléiques répondent aux formules suivantes 5' T T C T T T A G C A A G G T G A A 3' (B02907), 5' T T C T T T A G C A A G G T C A A 3' (B03671). Deux expériences ont été réalisées, chacune avec l'une des sondes nucléiques du gène CFTR, selon les modalités suivantes - L'hybridation est réalisée par passage en recirculation de la solution d'hybridation contenant la sonde nucléique pendant 1 heure à une température de 300C. Après cette étape de mise en contact, la solution d'hybridation est remplacée par la solution d'élution, un lavage de 6 ml est réalisé pour éliminer les acides nucléiques non hybridés, puis le gradient de température et la collecte des fractions sont démarrés. - Solution d'hybridation : 200 pmoles d'une des deux sondes nucléiques marquées (1500000 cpm) dans 1,5 ml de SSPE 5x, 0,5 % SDS. Composition SSPE 5X 0,9 M NaC1, 50 mM NaH2P04, pH 7,5. - Solution d'élution : SSPE 5x et 0,5 % SDS. - Débit des solutions mesuré à 300C avec de l'eau : 1,0 ml/min. - Gradient de température : 300 à 600C en 13 minutes, comme indiqué sur le graphique de la figure 2. - Collecte de 42 fractions égales (15 gouttes d'environ 0,309 ml) sur toute la durée du gradient. - Volume mort de l'ensemble (entrée/sortie) d'environ 1,0 ml. La sonde B02907, ne portant pas la mutation, s'hybride parfaitement avec l'oligonucléotide B02911 cellulose - 3' T C G T T C C A C - Acridine 5' 5' T T C T T T A G C A A G G T G A A 3' (B02907) Alors que la sonde B03671 présente un mésapariement avec l'oligonucléotide B02911 cellulose - 3' T C G T T C C A C - Acridine 5' 5' T T C T T T A G C A A G G T C A A 3' (B03671). Ce type de mésapariement, placé à l'extrémité du duplexe, est le moins déstabilisant, donc le plus difficile à détecter. En effet, pour le même duplexe, un mésapariement plus central tel que cellulose - 3' T C G T T C C A C - Acridine 5' 5' T T C T T T A G C A A C G T G A A .3' produit une déstabilisation supérieure à 400C. Le graphique de la figure 2 représente le profil de dénaturation des deux sondes B02907 et B0371, après hybridation sur la membrane. Sur ce graphique, on remarque un pic d'élution net, et l'on observe la déstabilisation due au mésapparariement (C/C à la place de G/C en 5' de l'oligonucléotide fixé sur le support). La différence de Tm entre les deux duplexes est de l'ordre 4,500C. On observe également que les deux pics d'élution se recouvrent beaucoup, et qu'aucune température ne permet d'obtenir un signal nul pour le mésapariement tout en maintenant un signal raisonnablement positif pour le duplexe parfait. Exemple 2 - ApDlication au diagnostic de mutations sonctuelles : détection d'un mesapariement en position centrale du duplexe. Des oligonucléotides identiques répondant à la formule : 3'- G A C T T A C C T - Acridine 5', désignés CE95, ont été synthétisés sur une membrane en cellulose de 5,5 mm de diamètre. Cet oligonucléotide est homologue à une partie de séquence de l'exon 11 du gène CFTR humain portant la mutation ponctuelle S549N (G/A). Cette mutation correspond au remplacement par la base A, souligné dans le fragment ci-après désigné CE90, de la base G dans 1'ADN non muté. Cette portion du gène CFTR est connue pour présenter plusieurs mutations possibles du codon 549. Dans le schéma du dispositif de la figure 1, la membrane de cellulose comprenant les oligonucléotides CE95 est placée dans une veine liquide ou une colonne (5), une pompe péristaltique (2) permet de faire passer la solution d'hybridation puis la solution de lavage depuis le tube (1) dans la colonne (5), puis dans le tube de collecte (6), ou dans un détecteur de fluorescence de type Jasco FP 920, où sont détectés les acide nucléiques libérés du support. La colonne contenant la membrane de cellulose et 60 cm environ de microtube (3) arrivant à la colonne sont placés dans un bain thermostaté et agité (4). Pour cet exemple, l'hybridation selon le procédé de l'invention, n'a pas été mise en oeuvre avec un fragment d'acide nucléique provenant d'un sujet, mais avec 3 fragments de synthèse marqués en 5' à la fluorescéine (FTC). Ces fragments correspondent à la portion de l'exon 11 du gène CFTR humain - Le fragment CE90 présente la mutation S549N, c'est à dire le remplacement de la base G par la base A soulignée dans la formule ci-dessous 5' FTC - A A T C A C A C T G A A T G G A G G T - 3'. - Le fragment CE89 présente la mutation S549R, c'est à dire le remplacement de la base A par la base C soulignée dans la formule ci-dessous 5' FTC - A A T C A C A C T G C G T G G A G G T - 3'. - Le fragment CE91 présente la mutation S549I, c'est à dire le remplacement de la base G par la base T soulignée dans la formule ci-dessous 5' FTC - A A T C A C A C T G A T T G G A G G T - 3'. Trois expériences ont été réalisées, chacune avec l'une des sondes nucléiques selon les modalités suivantes - L'hybridation est réalisée par passage en recirculation de la solution d'hybridation contenant la sonde nucléique pendant une heure, à une température de 280C. Après cette étape de mise en contact, la pompe est stoppée, la solution d'hybridation est remplacée par la solution de lavage, et la sortie du détecteur est dirigée vers la poubelle. La pompe est relancée, et le lavage permet d'éliminer les acides nucléiques non hybridés. - Le gradient de température est démarré lorsque le niveau de fluorescence se rapproche de la ligne de base, cela correspond au passage de 5 à 10 ml de solution de lavage. - Solution d'hybridation : 500 picomoles de chaque sonde dans 2 ml de SSPE 5X. - Solution de lavage : SSPE 5X. - Débit des solutions mesuré à 300C avec de l'eau : 1 ml/min. - Gradient de température : 280C à 500C en 16 minutes, comme indiqué sur le graphique de la figure 3. - Volume mort de l'ensemble (entrée/sortie): environ 1,5 ml. - Détecteur de fluorescence réglé en excitation à 495 nm et en émission à 520 nm, à la sensibilité 100X. La sonde CE90 s'hybride parfaitement avec l'oligonucléotide CE95 sur la membrane Cellulose ---------3'- G A C T T A C C T - Acridine 5' 5'FTC - A A T C A C A C T G A A T G G A G G T - 3' CE90 alors que la sonde CE91 présente un mésappariement et la sonde CE89 présente deux mésappariements avec l'oîigonucléotide CE95 sur la membrane Cellulose ---------3'- G A C T T A C C T - Acridine 5' 5'FTC - A A T C A C A C T G C G T G G A G G T - 3' CE89 Cellulose ---------3'- G A C T T A C C T - Acridine 5 5'FTC - A A T C A C A C T G A T T G G A G G T - 3' CE91 Ce type de mésappariement est très déstabilisant. Le graphique de la figure 3 représente le profil de dénaturation des trois sondes CE89, CE90 et CE91 après hybridation sur la membrane.On observe sur le graphique de la figure 3, qu'un pic d'élution est du duplexe. La discrimination de mésappariements ponctuels en position centrale est donc sans ambiguïté dans le procédé de l'invention. Exemple 3 - Asplication au diacrnostic de mutations sonctuelles : détection de mésappariement en Position centrale du duplexe effet de la concentration en sonde. Des oligonucléotides identiques répondant à la formule : 3'- G A C T A A C C T - Acridine 5', désignés CE96, ont été synthétisés sur une membrane en cellulose de 5,5 mm de diamètre. Cet oligonucléotide est homologue à une partie de séquence de l'exon 11 du gène CFTR humain portant la mutation ponctuelle S549I (G/T) . Cette mutation correspond au remplacement par la base T, souligné dans le fragment désigné CE91, de la base G dans l'ADN non muté. Cette portion du gène CFTR est connue pour présenter plusieurs mutations possibles du codon 549. Dans le schéma du dispositif de la figure 1, la membrane de cellulose comprenant les oligonucléotides CE96 est placée dans une veine liquide ou une colonne (5), une pompe péristaltique (2) permet de faire passer la solution d'hybridation puis la solution de lavage depuis le tube (1) dans la colonne (5), puis dans le détecteur de fluorescence de type Jasco FP 920 (6), où sont détectés les acides nucléiques libérés du support. La colonne contenant la membrane de cellulose et 60 cm environ de microtube (3) arrivant à la colonne sont placés dans un bain thermostaté et agité (4). Comme dans les exemples précédents, l'hybridation selon le procédé de l'invention, n'a pas été mise en oeuvre avec un fragment d'acide nucléique provenant d'un sujet, mais avec 2 fragments de synthèse marqués en 5' à la fluorescéine (FTC). Ces fragments correspondent à la portion de l'exon 11 du gène CFTR humain - Le fragment CE91 présente la mutation S549I, c'est à dire le remplacement de la base G par la base T soulignée dans la formule ci-dessous 5' FTC - A A T C A C A C T G A T T G G A G G T - 3'. - Le fragment CE90 présente la mutation S549N, c'est à dire le remplacement de la base G par la base A soulignée dans la formule ci-dessous 5' FTC - A A T C A C A C T G A A T G G A G G T - 3'. Deux séries d'expériences ont été réalisées, avec l'une des sondes nucléiques selon les modalités suivantes - L'hybridation est réalisée par passage en recirculation de la solution d'hybridation contenant la sonde nucléique pendant une heure, à une température de 280C. Après cette étape de mise en contact, la pompe est stoppée, la solution d'hybridation est remplacée par la solution de lavage, et la sortie du détecteur est dirigée vers la poubelle. La pompe est relancée, et le lavage permet d'éliminer les acides nucléiques non hybridés. - Le gradient de température est démarré lorsque le niveau de fluorescence se rapproche de la ligne de base, cela correspond au passage de 5 à 10 ml de solution de lavage. - Solution d'hybridation : 500 picomoles de chaque sonde dans 2 ml de SSPE 5X pour les courbes désignées CE91/1 et CE90/1 dans le graphique de la figure 4, et 1500 picomoles de chaque sonde pour les courbes désignées CE91/2 et CE90/2 dans le graphique de la figure 4. - Solution de lavage : SSPE 5X. - Débit des solutions mesuré à 300C avec de l'eau : 1 ml/min. - Gradient de température : 280C à 570C en 18 minutes, comme indiqué sur le graphique de la figure 4. - Volume mort de l'ensemble (entrée/sortie) : environ 1,5 ml. - Détecteur de fluorescence réglé en excitation à 495 nm et en émission à 520 nm, à la sensibilité 100X. La sonde CE91 s'hybride parfaitement avec l'oligonucîéotide CE96 sur la membrane Cellulose ---------3'- G A C T A A C C T - Acridine 5' 5' FTC - A A T C A C A C T G A T T G G A G G T - 3', alors que la sonde CE90 présente un mésappariement avec l'oligonucléotide CE96 sur la membrane Cellulose ---------3'- G A C T A A C C T - Acridine 5' 5XFTC - A A T C A C A C T G A A T G G A G G T - 3'. Ce type de mésappariement est très déstabilisant. Le graphique de la figure 4 représente le profil de dénaturation des sondes CE90 et CE91 après hybridation à différentes concentrations sur la membrane. On observe sur le graphique de la figure 4, qu'un pic d'élution est obtenu avec la sonde CE91 à une température de 45,50C. L'augmentation dun facteur 3 de la concentration de la sonde CE91 ne provoque pas de déplacement du pic délution, mais seulement une augmentation de la surface, donc de la quantité de sonde éluée. La sonde CE90 présente un mésappariement, et aucun pic d'élution n'est observé; l'émission de fluorescence reste au niveau de la ligne de base, et représente un bruit de fond extrêmement faible, ceci même en triplant la concentration de sonde pour l'hybridation. Aucune hybridation n'a donc été obtenue à 28"C avec la sonde présentant un mésappariement en zone centrale du duplexe, même à très forte concentration. La discrimination de mésappariements ponctuels en position centrale est donc sans ambiguïté dans le procédé de l'invention. Exemple 4 - Détection de séquence dans l'exon 11 du crène CFTR humain. Des oligonucléotides identiques répondant à la formule : 3'- G A C T C A C C T - Acridine 5', désignés FCE93, ont été synthétisés sur 40 cm de fil de coton, puis 15 cm de ce fil est empaqueté dans un tube de 2 mm de diamètre et de 3 mm de long. Ce tube adapté au circuit du dispositif de la figure 1 sert de colonne. Cet oligonucléotide est homologue à une partie de séquence de l'exon 11 du gène CFTR humain portant la mutation ponctuelle S549I (G/T). Cette mutation correspond au remplacement par la base T, souligné dans le fragment désigné CE91, de la base G dans l'ADN non muté. Cette portion du gène CFTR est connue pour présenter plusieurs mutations possibles du codon 549. Dans le schéma du dispositif de la figure 1, le fil de coton comprenant les oligonucléotides FCE93 est placée dans une colonne (5), une pompe péristaltique (2) permet de faire passer la solution d'hybridation puis la solution de lavage depuis le tube (1) dans la colonne (5), puis dans le détecteur de fluorescence de type Jasco FP 920 (6), où sont détectés les acide nucléiques libérés du support. La colonne contenant le fil de coton et 60 cm environ de microtube (3) arrivant à la colonne sont placés dans un bain thermostaté et agité (4). Pour cet exemple, l'hybridation selon le procédé de l'invention, a été mise en oeuvre avec des fragments d'acide nucléique simple brin marqués en 5' à la fluorescéine, provenant d'un sujet. Cet ADN ne porte pas de mutation dans cette région. Ces fragments d'acide nucléique simple brin marqués en 5' à la fluorescéine ont été préparés de la façon suivante - Une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des amorces encadrant la région de l'exon 11 à analyser, est réalisée sur de 1'ADN génomique humain 5'GATTGAGCATACTAAAAGTGACTCTCTAATTTTCTATTTTTGGTAATAG GAC ATC TCC AAG TIT GCA GAG AAA GAC AAT ATA GTT CTT GGA GAA Asp fle Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn 11e Val Leu Gly Glu Mutations du CTG-Mutations du codon 549 : S549R, S549N, S549I GGT GGA ATC ACA CTGt1GGA GGT CAA CGA GCA AGAATlrCTTT Gly Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala AGCAAGGTGAATAACTAATTATTGGTCTAGCAAGCATTTGCTGTAAATG TCATTCATGTAAAAAAATTACAGACATTTCTCTATGCTTTATA3' Cette première PCR est réalisée avec 1250 ng/ml d'ADN, 1250 pmole/ml d'amorces et 6,25 U/ml d'enzyme Taq polymerase. - Une seconde PCR est réalisée sur une fraction de produit provenant de la première PCR, avec une des amorces portant une biotine en 5'. Cette seconde PCR est réalisée avec 50 Rl/ml de produits de la première PCR, 125 pmole/ml d'amorces et 6,25 U/ml d'enzyme Taq polymerase. - Le produit de cette seconde PCR est mis en contact pendant 15 minutes sous agitation avec des billes "Dynabeads M280 streptavidin" commercialisées par la Société Dynal. On lave quatre fois 50 l de Dynabeads avec 50 l de tampon PBS 1X 0,1% BSA, puis on ajoute 50 l de tampon B & W 1X et 50 l des produits de la seconde PCR. On agite lentement 15 minutes (vortex) et on élimine le surnageant. On ajoute alors 50 l de NaOH 0,1 N, on agite lentement 10 minutes et on élimine le surnageant. On lave les billes avec B & W 1X deux fois. B & W 2X : 10 mM tris HCl (pH 7,5) ; 1 mM EDTA 2 M NaCl. PBS 10X pH 7,4 : 0,58 M Na2HPO4 ; 0,17 M Na2H2PO4 ; 0,68 M NaCl. - On lave deux fois les billes avec 50 l de tampon mix radom 1X, puis on ajoute aux billes le mélange réactionnel du random priming suivant hexamètre FTC (0,3mg:ml) 7 7 tLl Mix random 10 X : 2 l . dATP (1 mM) : 1 l . dTTP (1 mM) : 1 l . dGTP (1 mM) : 1 l . dCTP (1 mM) : 1 l . Klenow (2,5 U/ l) : 2 l . H2O QSP 20 l : 5 l Après incubation 2 heures à 37 C, on enlève le surnageant, on lave les billes deux fois avec B & W lx, on dénature avec 50 l de NaOH 0,1 N 10 minutes à température ambiante, et on lave 10 minutes avec 25 l de NaOH 0,1 N. On rassemble les surnageants que l'on neutralise avec 30 l d'HCl 0,2 N puis 10 F1 SSPE 5X sont rajoutés. - Cette solution d'ADN neutralisée est diluée dans 300 microlitres de SSPE 5X. Le procédé a ensuite été réalisé selon les modalités suivantes - L'hybridation est réalisée par la mise en contact du fil de coton portant l'oîigonucléotide FCE93 avec la solution d'ADN simple brin marqué en 5' à la fluorescéine dans un tube de type eppendorf. Cette hybridation est faite à température ambiante pendant 1 heure. Un lavage rapide dans le tube est alors effectué avec 2 fois 1 ml de SSPE 5X, puis la colonne contenant le fil est installé dans le dispositf de la figure 1 et la pompe péristaltique est mise en route. Le gradient de température est démarré lorsque le niveau de fluorescence se rapproche de la ligne de base, cela correspond au passage de 5 à 10 ml de solution de lavage. - Solution de lavage : SSPE 5X. - Débit des solutions mesuré à 300C avec de l'eau : 1 ml/min. - Gradient de température : 280C à 550C en 15 minutes, comme indiqué sur le graphique de la figure 5. - Volume mort de l'ensemble (entrée/sortie): environ 1,5 ml. - Détecteur de fluorescence réglé en excitation à 495 nm et en émission à 520 nm, à la sensibilité 1000X. La sonde s'hybride parfaitement avec l'oligonucléotide FCE93 sur la membrane Cellulose --3'- G A C T C A C C T - Acridine 5' 5'Fluo -XXXXXXXMkTCACA C T G A G T G G A GGTXDXXX - 3' Le graphique de la figure 5 représente le profil de dénaturation de 1'ADN génomique sauvagesimple brin sauvage après hybridation sur la colonne.On observe sur le graphique de la figure 5, qu'un pic d'élution de 1'ADN est obtenu à une tempréture de 44,5"C, ce qui confirme l'intérêt du procédé de l'invention. REVENDICATIONS 1) Procédé d'analyse d'acides nucléiques consistant à mettre en contact lesdits acides nucléiques avec des oligonucléotides fixés sur un support de façon à former des complexes d'hybridation, caractérisé en ce que l'on soumet lesdits complexes d'hybridation à un gradient de dénaturation et en ce que l'on détecte et analyse par tout moyen approprié les acides nucléiques libérés du support au fur et à mesure du gradient de dénaturation. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la mise en contact des acides nucléiques simple brin à tester avec un support sur lequel sont fixés des oligonucléotides, dans des conditions dénaturantes faibles de façon à réaliser l'hybridation des acides nucléiques à tester avec la majeure partie des oligonucléotides du support, - éventuellement, un ou plusieurs lavages visant à éliminer les acides nucléiques non hybridés, - l'exposition du support à un gradient de dénaturation assurant la libération progressive des acides nucléiques du support en fonction du niveau d'appariement de chaque acide nucléique avec un oligonucléotide fixé sur le support, - la détection et l'analyse par tout moyen approprié des acides nucléiques libérés dudit support au fur et à mesure du gradient de dénaturation. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les oligonucléotides fixés sur le support sont de séquences et de longueurs identiques. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que tout ou partie des oligonucléotides fixés sur le support sont de séquences et de longueurs différentes. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les oligonucléotides fixés sur le support sont de longueur identique et de séquences différentes de façon à couvrir toute les possibilités de séquences pour cette longueur. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'étalonnage des Tm de chaque oligonucléotide différent. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gradient auquel est soumis le support portant les complexes d'hybridation est choisi parmi les gradients de température, de force ionique, d'agent dénaturant. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les acides nucléiques analysés sont des séquences d'ADN ou d'ARN ou des séquences comportant ou constituées de nucléosides modifiés, marquées par un traceur radioactif, fluorescent, enzymatique ou immunologique. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support sur lequel sont fixés les oligonucléotides présente une forme et est constitué d'une matière permettant - de synthétiser ou fixer après synthèse lesdits oligonucléotides - d'exposer lesdits oligonucléotides à la solution d'hybridation et les complexes d'hybridation formés à la solution de lavage ainsi qu'au gradient de dénaturation, - de libérer les acide nucléiques séparés des complexes d'hybridation. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support est choisi parmi des billes, des fibres, des fils ou filaments, une ou plusieurs membranes, placés dans une colonne ou dans une veine liquide, laquelle après chargement avec la solution d'hybridation est lavée puis soumise à un gradient de dénaturation, de façon à détecter au fur et à mesure de leur sortie de la colonne ou de la veine, les acides nucléiques libérés du support. 11) Dispositif pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous l'aspect d'un baton de la dimension d'un stylo ou d'un pinceau, comprenant à l'une au moins de ses extrémités un support sur lequel les oligonucléotides sont fixés, ledit support étant constitué d'une bille mobile, ou de filaments, ou encore d'un tampon. 12) Procédé d'analyse d'acides nucléiques simple brin mettant en oeuvre un dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étape suivantes - la mise en contact d'une extrémité du dispositif avec une solution d'hybridation contenant les acides nucléiques à analyser, pendant une durée suffisante pour permettre la formation de complexes d'hybridation entre les acides nucléiques analysés et les oligonucléotides fixés sur le support à l'extrémité du dispositif, - le lavage éventuel dudit support afin d'éliminer les acides nucléiques n'ayant pas réagi, - la mise en contact et le déplacement du support portant les complexes d'hybridation sur un élément solide plat soumis à un gradient de dénaturation, de façon à libérer et déposer les acides nucléiques sur ledit élément plat au fur et à mesure du déplacement du support sur le gradient de dénaturation, - la détection et l'analyse des acides nucléiques déposés sur l'élément plat. 13) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comporte un système de gradient de dénaturation au niveau du support, permettant de libérer les acides nucléiques dudit support au fur et à mesure de l'avancement dudit gradient de dénaturation. 14) Dispositif selon l'une des revendications 11 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs cartouches débouchant sur le support, lesdites cartouches contenant la solution d'hybridation et éventuellement une solution de lavage, ainsi que des moyens de pression permettant d'amener d'abord la solution d'hybridation au contact du support pour permettre la formation des complexes d'hybridation, puis la solution de lavage.