FR 2751882 A1 19980206 FR 9609677 A 19960731 SURFACES HYPERBACTERICIDES La présente invention porte sur le procédé de fabrication de surfaces à propriétés antibiotiques, bactéricides, fongicides ou virucides permanentes, sur les surfaces susceptibles d'être obtenues par le procédé de fabrication et sur leur utilisation dans les domaines médical, cosmétique, alimentaire, de l'hygiène, ou des fluides industriels. Dans l'ensemble du présent texte, les termes molécules ou substances antibiotiques, cytotoxiques, bactéricides doivent être compris comme incluant non seulement la propriété bactéricide stricto sensu, mais également virucide, fongicide ou de manière générale toute substance bio-active cytotoxique pour toute cellule vivante dont l'élimination est recherchée. II existe déjà des surfaces bactéricides notamment à usage médical, par exemple des gants ou encore des tissus. Des mélanges non covalents entre des surfaces et des substances bactéricides ont été décrits; il peut s'agir notamment de gants incorporant entre deux couches de latex un milieu liquide contenant un agent pharmacologique efficace (brevet français n0 8711753) ; il peut également s'agir d'une émulsion de micro-goutelettes stabilisée par un copolymère bloc (brevet n" 9315561 du 23 décembre 1993). Des implants médicaux ou des cathéters ont également été recouverts avec un antibiotique ou des mélanges d'antibiotiques ; la liaison avec le support est de type ionique et l'antibiotique est simplement adsorbé sur le substrat (WO 9317746). Le brevet EP 348462 décrit des lentilles de contact constituées d'un polymère acrylique dont la surface est modifiée par greffage de molécules organiques ayant les propriétés souhaitées (résistance UV, résistance, cytotoxicité sélective etc...). Cette molécule comprend un groupe silane réactif vis-à-vis des groupes carboxyliques des chaînes polymères acryliques. La surface modifiée de ces lentilles comprend une multicouche du groupe chimique sélectionné d'épaisseur o variable: 50 à 100 A dans certains cas (tableau 1, colonne 4), 2 000 à 6 000 A dans d'autres cas quand la lentille est modifiée pour lui conférer des propriétés particulières. Le dépôt de molécules organiques sur des substrats de verre ou de silice par greffage d'une couche monomoléculaire a été décrit dans Appl. Phys. Lett., 62, 2256 (1993), Sciences et Avenir, 567, 87 (1994) et La Recherche, 275 (26), 460 (1995); ces surfaces ainsi modifiées trouvaient leur application dans les domaines de surfaces autolubrifiantes, d'isolants électriques ultraminces, de vitres non salissables. L'intérêt de surfaces antibiotiques apparaît en particulier pour lutter contre le développement des infections nosocomiales en milieu hospitalier; il serait en effet intéressant de pouvoir disposer de matériaux dont la surface serait cytotoxique et qui inhiberait le développement des bactéries qui viendraient en contact avec ces mêmes matériaux. On peut envisager ici les instruments chirurgicaux, les cathéters, mais aussi la vaisselle, les portes et fenêtres en verre, les revêtements de murs, la céramique etc.... Par ailleurs, I'apparition de souches bactériennes devenues résistantes aux doses normales d'antibiotiques nécessite l'utilisation de produits cytotoxiques à des concentrations de plus en plus élevées. II faut donc que le nombre de molécules antibiotiques par unité de surface soit le plus grand possible. La présente invention est relative à une surface douée de propriétés antibiotiques, antiseptiques, virucides, ou encore fongicides constituée d'un substrat solide minéral ou organique, dont la surface a été recouverte par des moyens chimiques appropriés d'une couche monomoléculaire, homogène et dense, de molécules ayant ces propriétés bio-actives. Lesdites molécules sont fixées par des liaisons covalentes sur le substrat, ce qui confère à la couche active un caractère permanent et irréversible. Le substrat modifié selon l'invention est caractérisé par le fait que les molécules antibiotiques sont fixées sur la surface par des liaisons covalentes par l'intermédiaire d'un ou plusieurs espaceurs . Ces molécules espaceurs sont généralement des chaînes alkyles, composées d'une série de 3 à 18 atomes de carbone, et de deux groupes fonctionnels en extrémités permettant une liaison covalente irréversible avec un site de surface du substrat solide d'une part, et la molécule bio-active, d'autre part. L'espaceur selon l'invention répondra de préférence à la formule A-(CH2)n-Y dans laquelle: - A est CO-Z, avec Z = H, OH ou Cl, ou > G-Si, X étant un halogène ou un groupe alkoxy de 1 à 3 atomes de carbone; - le nombre n de groupes méthylène formant la chaîne alkyle est compris entre 3 et 24,; - Y est choisi parmi les résidus méthyle, vinyle, ou CO-Z, avec Z = H, OH ou Cl. Dans la formule ci-dessus, n est de préférence compris entre 10 et 18. En effet, un espaceur trop court risquerait d'avoir une rigidité trop importante alors que s'il était trop long, il y aurait des risques de repliement de la chaîne aliphatique sur elle-même, ce qui conduirait à une moins bonne efficacité du couplage avec l'antibiotique. Les substrats à modifier sont soit des surfaces minérales, en particulier à base de silice (sable, billes de verre, laine de verre) soit des substrats organiques, selon l'utilisation que l'on souhaite en faire dans des domaines aussi différents que ceux cités ci-dessus. Parmi les substrats organiques, on peut citer, sans être limitatif, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle (PVC), les polyacrylates, les polyméthacrylates, le polypropylène, les polyamides, les polyuréthanes, I'acrylonitrilebutadiène-styrene (ABS), les polyesters saturés ou insaturés tel le polyéthylène téréphtalate (PET), les polycarbonates, les polyacrylamides, le téflon (PTFE), les polysiloxanes, les polysaccharides ou tout polymère ou copolymère susceptible d'être greffé avec un espaceur comprenant deux extrémités réactives. Le substrat peut également être un métal ou son oxyde tel l'aluminium (Al), l'étain (Sn) ou l'indium (In). Parmi les substrats utilisés, notamment les substrats organiques, certains possèdent des fonctions naturellement réactives, soit dans leurs chaînes latérales tel le PVC (Cl), le polyacrylate (-COOH), le polyamide (-CO-NH2) ou le polyhydrométhylsiloxane (Si-H), soit dans leur chaîne principale tel le polyuréthane, le polycarbonate, les polyesters. Pour d'autres, au contraire, leurs fonctions réactives doivent être générées in situ par les méthodes standard d'activation comme l'oxydation chimique ou le traitement par un plasma, selon les techniques décrites dans L. Penn et al. (Polymers for Advanced Technologies (1994) 5: 809-817); c'est le cas par exemple pour le polyéthylène, le polypropylène, les polydialkylsiloxanes et de nombreux autres polymères ou copolymères En dehors des polymères cités, tout polymère ayant des groupements réactifs dans leur squelette, ou à leur surface, ou des groupements susceptibles d'être transformés en fonction réactive, sont des bons candidats comme substrat des surfaces de l'invention. La surface sera bien entendu choisie en fonction de l'utilisation antibiotique ou cytotoxyque que l'on souhaite développer. Les formes des surfaces varient également en fonction de l'utilisation que l'on souhaite en faire. Dans les domaines biologiques ou médicaux, les surfaces planes ou pseudo-planes peuvent être des bouteilles, des poches, flacons ou autres contenants, cela peut être des surfaces tubulaires, telles des cathéters, des seringues, des aiguilles, etc..., ou encore des microfibres pleines ou creuses; à titre d'exemple d'utilisation de fibres creuses, on peut citer des cartouches de dialyse rénale ou des systèmes à fibre creuse pour la culture de cellules animales. Les surfaces sphériques peuvent être des billes ou microbilles et avoir tout diamètre approprié à l'utilisation que l'on souhaite en faire, notamment entre quelques microns et quelques millimètres. A titre d'exemples d'utilisation de billes, on peut citer les bacs à sable pour les enfants, les abrasifs contenus dans les pâtes dentifrices, les systèmes de purification d'eau par contact avec des particules de grande surface spécifique et permettant de décontaminer une solution par simple agitation et sans risque de relarguage d'antibiotiques dans le milieu. Dans le domaine de la décontamination des fluides industriels (fluides de coupe pour les machines-outils, etc...), les surfaces peuvent être des fibres pleines assemblées en une cartouche filtrante. Les antibiotiques utilisables à la réalisation des surfaces de l'invention sont nécessairement des antibiotiques qui agissent préférentiellement au niveau de la paroi cellulaire; les antibiotiques agissant au niveau de la transcription ou de la traduction sont moins intéressants dans le cas présent, dans la mesure où la fixation covalente ne permet pas à l'antibiotique de pénétrer dans la bactérie dans les mêmes conditions que lorsqu'il est en solution. Ces antibiotiques peuvent notamment être ceux comportant un noyau p-lactame telles les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, les thiénamycines, les inhibiteurs des 13-lactamases, les inhibiteurs de la synthèse des peptidoglycanes, des polypeptides basiques tels que la bacitracine ou la novobiocine. Les bactéricides à base d'ammonium quaternaire de même que les fongicides choisis notamment parmi: - la famille des imidazoles, comme la nystatine et l'amphotéricine B; - les fongicides aliphatiques comme l'undécylénate de zinc, de calcium ou de sodium; - la famille des carbamates, des dithiocarbamates et des iodocarbamates comme le 3-iodo 2-butyl carbamate; - des dérivés organomercuriels comme le silicate de methoxy-ethyl-mercure; - la famille des fongicides hétérocycliques comme les triazines ou le 1,3,5 hexahydrotriazine; - les dérivés de l'isothiazoline, du pyridine ethione, les alcools aminés, etc... peuvent également entrer dans la constitution des surfaces actives de l'invention. Le bactéricide ou l'antibiotique peut nécessiter une modification chimique préalable afin de le rendre greffable sur une surface, par exemple une surface de verre. Pour cela, les groupes réactifs des antibiotiques seront utilisés, comme par exemple la fonction amine naturellement présente dans la structure chimique de certains antibiotiques comportant un noyau p-lactame comme l'acide aminopénicillanique. Sur le substrat modifié de l'invention, les molécules antibiotiques forment une couche monomoléculaire d'épaisseur inférieure à 4 nm. La couche peut être homogène ou hétérogène dans sa composition afin d'optimiser les propriétés antibiotiques, fongicides ou virucides et le cas échéant d'élargir le spectre d'action antibiotique de la surface ainsi modifiée; I'hétérogénéité peut être à un niveau moléculaire ou à un niveau macroscopique: par exemple, des microbilles, homogènes individuellement et porteuses de molécules de nature différente peuvent être mélangées. L'homme du métier saura, en fonction du spectre antibiotique qu'il souhaite conférer à la surface de l'invention, s'il doit greffer un seul antibiotique et lequel, ou un mélange de plusieurs antibiotiques et dans quelles proportions. Dans le deuxième cas, on peut utiliser, soit un seul type d'espaceur et les antibiotiques choisis réagissent avec la même extrémité réactive de 'espaceur, soit plusieurs types d'espaceurs, chacun d'entre eux étant susceptible de réagir avec un antibiotique particulier. II est également possible de mélanger des molécules de spécificités bio-actives différentes. La couche monomoléculaire formée par les molécules bioactives est très dense et les molécules sont au contact direct les unes des autres, formant un empilement bi-dimensionnel compact. Les surfaces de l'invention ont une densité de sites actifs d'antibiotiques par unité de surface qui peut atteindre 5.10'4 molécules d'antibiotiques par centimètre carré. Cette densité conduit à une concentration locale très importante d'environ 1 mole par litre ou 300 g/l, soit plus de dix mille fois supérieure aux concentrations usuelles en solution volumique, ce qui rend l'efficacité cytotoxique de cette surface extrêmement élevée et le risque de développement de souches résistantes devient quasiment nul. Si on le souhaite, et pour des applications particulières, il est possible de diminuer la densité de molécules bio-actives présentes à la surface du matériau en introduisant une concentration variable d'espaceurs passifs, c'est-à-dire incapables de former une liaison covalente avec une molécule bio-active. La densité d'antibiotiques peut ainsi être ajustée facilement, par exemple entre 10'1 et 5.10'4 molécules I cm Les risques de relarguage accidentel de molécules cytotoxiques dans le milieu extérieur, et à partir de la surface, sont inexistants. La couche monomoléculaire est greffée de façon irréversible sur le substrat solide. Les molécules bio-actives ne peuvent donc se détacher du substrat sur lequel elles ont été fixées. Les liaisons covalentes avec le substrat et entre les molécules elles-mêmes à l'intérieur de la couche monomoléculaire sont extrêmement fortes et ne peuvent être détruites que par des traitements chimiques ou photochimiques très particuliers (irradiation ultra-violette vers 210 nm en présence d'ozone, rayonnements ionisants, etc...). De plus, même si la couche complète venait à se détacher, les risques biologiques resteraient limités: Si on dissout 1 cm2 de la couche greffée dans un volume liquide de 1 ml, par exemple du sang, la concentration d'antibiotiques serait au maximum de 0,3,umolellitre, ou encore 0,1 mg/litre. Il y a donc un effet de dilution considérable. Par rapport à la concentration locale présente à la surface du matériau cytotoxique, le rapport de dilution est de 3 x 106. Une concentration de 0,3 limole/litre ne présente aucun danger pour l'organisme. Les matériaux à propriétés cytotoxiques décrites dans cette invention sont donc utilisables pour des applications sous-cutanée, intramusculaire ou intravasculaire. La couche monomoléculaire résiste à des nettoyages prolongés par des solvants aqueux ou organiques, ainsi qu'à des températures de l'ordre de 100" C. La couche monomoléculaire est permanente dans le temps et ne nécessite pas de conditions de stockage et de conservation particulières. La présente invention porte également sur un procédé de fixation covalente de molécules à caractère bactéricide ou antibiotique sur des surfaces organiques et minérales par l'intermédiaire de molécules de type espaceurs répondant à la formule ci-dessus. Ce procédé diffère en fonction de la nature exacte du support et de l'antibiotique à greffer. Dans le cas où la surface est en verre ou en silice, ce procédé de préparation des surfaces a déjà été décrit dans le cas particulier où les molécules greffées sont des trichloroalkylsilanes ou des trialkoxyalkylsilanes ne comportant pas en extrémité libre de groupe fonctionnel permettant une liaison covalente avec une molécule antibiotique (Nature, 360, 719 (1992)). Une description détaillée du mode de dépôt d'une couche monomoléculaire de chaînes hydrocarbonées sur des surfaces de silice hydratée via un groupe trichlorosilane peut être trouvée dans plusieurs articles récents (JB Brzoska et al, (1994) Langmuir 10: 4367- 4373; ; D. L. Allara et al (1995), Langmuir Il : 2357, 2360). Le procédé décrit dans ces articles a été modifié de façon significative pour permettre la fixation des molécules bio-actives. Le procédé de préparation des surfaces comprend donc: - un nettoyage préalable de ladite surface, le but du nettoyage étant d'éliminer toute particule ou molécule qui serait susceptible d'empêcher la fixation de l'espaceur sur les groupements réactifs de la surface, - le cas échéant, une activation chimique de la surface solide afin de générer des groupes réactifs, - un dépôt d'une couche d'accrochage possédant une fonction réactive en position terminale externe, - un greffage chimique de l'antibiotique ou du bactéricide sur le groupement réactif de la surface ainsi modifiée. Quand les surfaces sont des surfaces minérales, le nettoyage est effectué: - soit par immersion dans une solution d'eau oxygénée (H202) à 15 % que l'on décompose en ajoutant quelques gouttes de FeCI3, suivie d'une deuxième immersion dans une solution d'H2SO4 à 50 % ; - soit par immersion dans un bain d'eau oxygénée 15 % et de soude (12 g/l). La réactivité de ces surfaces peut être augmentée en les plongeant quelques secondes dans une solution de HF entre 3 et 10 %. Les surfaces ainsi traitées sont ensuite rincées abondamment à l'eau distillée et séchées à l'étuve à 80"C pendant 10 à 15 min. Dans le cas de surfaces de type organique, il peut être nécessaire selon la nature du support de générer des groupements réactifs a) si le substrat est un silicone, la surface est préalablement activée par trempage dans une solution d'acide fluorhydrique entre 3 et 10%; b) si le substrat est du PVC, la surface est préalablement activée par le traitement suivant: .mise en contact avec une solution aqueuse d'azide de sodium à 5.10.2 mol/l contenant 5 à 15 % de diméthylformamide (DMF), pendant 24 h; rinçage à I' eau; mise en contact avec une solution aqueuse ou méthanolique de NaBH4 à 5.10.2 mol/l pendant 24 heures, à 40 C. c) lorsque le substrat est du polyéthylène téréphtalate (PET), la surface est préalablement activée par mise en contact de la surface avec une solution de 1 à 5 % de 3-aminopropyltriethoxysilane dans du toluène pendant 24 heures sous argon. De manière générale, que le substrat soit naturellement réactif ou modifié pour le rendre réactif, le procédé de l'invention consiste à faire réagir les groupes réactifs à la surface du substrat solide avec des molécules espaceur comportant une tête greffable sur le support, une chaîne alkyle comportant 3 à 18 groupes méthyle et une fonction terminale externe qui servira à greffer la molécule bio-active. Par exemple, on peut utiliser le 10-chloroformyl-décyltrichlorosilane (CFDTCS). Le support préalablement nettoyé, et éventuellement activé, est immergé dans une solution contenant les molécules espaceur (environ 10-2M). On laisse la réaction se faire pendant 24 heures à température ambiante. Les molécules bio-actives utilisées peuvent être soit des ammoniums quaternaires, comme le bromure du 2-hydroxyéthyldiméthyldodécylammonium (HEDMDA), soit des antibiotiques, comme, par exemple le 6-aminopenicillanate de triéthylammonium (APATEA), soit des fongicides. De manière générale, ces molécules doivent posséder un groupe fonctionnel permettant la formation d'une liaison covalente avec les molécules espaceur déposées sur le substrat. La réaction se fait en plongeant le support solide modifié avec les molécules espaceur dans une solution diluée contenant l'antibiotique (environ 10.2 M). La réaction dure 24 heures à température ambiante. La présente invention porte également sur l'utilisation des surfaces de l'invention décrite ci-dessus, et susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus et illustré dans les exemples ci-dessous. L'utilisation des surfaces de l'invention à des fins de décontamination peut intéresser de nombreux domaines industriels tels la santé, l'hygiène et l'agro-alimentaire. A titre d'exemple, on peut citer: - I'utilisation d'une surface à la fabrication de contenants à usage médical tels des bouteilles, des poches, des tubages, notamment ceux à usage unique; - I'utilisation d'une surface à la fabrication de dispositifs médicaux pour le traitement des organes ex vivo ou in vivo, tels des cartouches de dialyse rénale; - I'utilisation d'une surface à la fabrication de matériels ou materiaux pour la dentisterie ou le nettoyage des dents; - I'utilisation d'une surface à la fabrication de prothèses osseuses ou vasculaires; - I'utilisation des surfaces à la décontamination des fluides domestiques, et en particulier l'eau et les boissons d'usage courant (jus de fruits, lait, vins, etc...), ou autres fluides alimentaires. - I'utilisation des surfaces à la décontamination des effluents et fluides industriels, par exemple les fluides de coupe, lubrifiants, les fluides pétroliers tels le gazole, l'essence, le kérozène. Les exemples ci-après, sans aucun caractère limitatif, sont destinés à illustrer les modalités de préparation des surfaces selon I'invention et leurs propriétés bactéricides, selon le support utilisé, I'antibiotique greffé, et la nature des bactéries que l'on cherche à détruire. PARTIE EXPERIMENTALE: Toutes les surfaces ont été caractérisées par infrarouge (IR), photospectroscopie (XPS) et mesure de l'angle de contact par la méthode de la goutte sessile décrite par C. Allain et al., Journal of Colloïd and Interface Science, 107, 5 (1985). I. Préparation des réactifs A titre d'exemple, un silane portant un groupement terminal vinylique, un silane portant un groupement terminal chlorure d'acide, un antibiotique pénicillanique et un bactéricide ont été utilisés. La préparation des trois derniers composés est décrite ci-dessous. I. a. 1 0-chloroformyl-décyltrichlorosilane (CFDTCS) On introduit dans une ampoule 5 ml (50 mole) de trichlorosilane, 3,6 ml (17 mole) de chlorure d'undécénoyle et 220 mg d'AI BN (2.2'-azo-bis-isobutyronitrile) préalablement recristallisé. Après dégazage, on scelle l'ampoule sous vide et on la chauffe à 80 C pendant 36 heures. Le produit de la réaction est distillé sous vide (Td = 128 OC sous 0,2 mmHg). Rendement: 50 %. I.b. 6-aminopenicillanate de triéthylammonium (APATEA) On met en suspension 2 g (10 mole) d'acide 6aminopénicillanique (6-APA) dans 60 ml d'un mélange EtOH/H20,(5/1 v/v) et on ajoute 1,4 ml (10 mole) de triéthylamine (TEA). Après solubilisation totale, le solvant est évaporé et le produit séché sous vide, Rendement: 100 %. I. c. Bromure du 2-hydroxyéthyl-diméthyldodécylammonium (HEDMDA) On dissout 10 g (47 mole) de N,N diméthyldodécylamine et 10 g (80 limole) de 2-bromoéthanol dans 60 ml d'acétone. On agite le mélange à 30-40 C pendant 5 heures. Après refroidissement, le HEDMDA précipite. Ce précipité est filtré, lavé à l'éther et séché sous vide. Rendement: 81 %. II. Préparation des surfaces minérales Il-a. Nettoyage des surfaces : Deux modes de nettoyage ont été utilisés: 1. Les surfaces sont plongées pendant une heure dans une solution d'H2O2 à 15 %, que l'on décompose en ajoutant quelques gouttes de FeCI3. Elles sont ensuite trempées 5 min dans une solution d'H2SO4 à 50%, rincées abondamment à l'eau distillée et séchées à l'étuve à 80 C pendant 10-15 min. 2. Les surfaces sont plongées dans une solution d'H2O2 à 15 %. On ajoute prudemment de la soude en poudre (12 g/l) et l'ensemble est agité pendant 1 h. Après rinçage à l'eau, les surfaces sont séchées à l'étuve à 80 C pendant 10-15 min. Il-b. Dépot de la couche d'accrochage à terminaison chlorure d'acide ou vinylique: La technique utilisée a été décrite par J.B. Brzoska et al, (1994) Langmuir 10 4367. On prépare une solution de CFDTCS (103 mollI) dans un mélange Hexane/CH2Ci2 (70/30 v/v) que l'on refroidit à 0 C sous argon. Les surfaces sont mises en contact avec cette solution pendant 1 h 30. Elles sont ensuite rincées pendant 5 min dans une cuve à ultrasons contenant du chloroforme. Finalement elle sont séchées sous un flux d'azote. Il-c. Modification éventuelle de la couche d'accrochage pour obtenir des fonctions carboxyliques (-COOH): - A partir d'une surface fonctionnalisée avec un groupement vinylique (-CH = CH2): On plonge les surfaces silanisées dans une solution fraîchement préparée de KMnO4 (16 mg) et de dicyclohexano-18couronne-6 (37 mg) dans 100 ml de benzène ou de cyclohexane pendant 12 h. L'opération est reproduite 4 fois pour un temps total de contact de 48h. Les surfaces sont ensuite neutralisées par immersion dans une solution d'HCI 5% pendant 15 min, avant d'être rincées à l'eau distillée puis séchées sous azote. - A partir d'une surface fonctionnalisée avec un groupement chlorure d'acide (-COCl) : On plonge les surfaces silanisées dans une solution aqueuse de Na2C O3 à 5% pendant 2 x 24H. Après neutralisation comme précédemment, les surfaces sont rincées à l'eau distillée puis séchées sous azote. ll-d. Greffage de la molécule bio-active - Surface fonctionnalisée avec des groupements carboxyliques (-COOH): On prépare une solution de CHCl3 ou CH2CI2 contenant: 10.2 mollL d'APATEA et 10.2 mol/l de TEA. Après dissolution, on ajoute 10 mol/l de dicyclohexylcarbodiimide et 2.103 mol/l de N, N diméthylaminopyridine. Les surfaces sont plongées dans cette solution et le mélange est agité pendant 2 x 24 h. Les surfaces ainsi traitées sont rincées.au chloroforme et séchées. - Surface fonctionnalisée avec des groupements chlorure d'acide (-COCI): Les surfaces sont plongées dans une solution d'acétone contenant 10.2 mol/l de HEDMDA et 10.2 mol/l de TEA. Après agitation (2 x 24h), les surfaces sont rincées au chloroforme et séchées. III. Préparation des surfaces organiques Tous les matériaux organiques utilisés sont nettoyés par immersion dans une solution éthanolique soumise à agitation ultrasonore pendant 5 min. Ill-a. Silicone Les surfaces en silicone sont préparées selon le même procédé que les surfaces minérales en utilisant un solvant approprié. Le silicone est préalablement attaqué par une solution d'HF à 5% pendant quelques secondes pour augmenter la quantité de groupes silanols à la surface. Le greffage de l'antibiotique ou du bactéricide est réalisé de la même façon que pour les surfaces minérales. Ill-b. Polychlorure de vinyle (PVC) Dans le cas du polychlorure de vinyle, il est nécessaire d'activer la surface en transformant les groupements chlorure en groupements amine. Pour ce faire, le PVC est plongé dans une solution aqueuse d'azoture de sodium à 5.10-2 mol/l contenant 10% de N,N diméthylformamide (DMF). Après agitation pendant 2 x 24 h, le PVC est lavé à l'eau. II est ensuite plongé dans une solution aqueuse ou alcoolique de NaBH4 à 5.10.2 mol/l pendant 24h, à 40"C. Après rinçage à l'eau, le PVC est plongé soit dans une solution à 3% v/v de chlorure de sébacoyle dans l'acétonitrile et en présence de triéthylamine, soit dans une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 5% v/v. L'ensemble est agité pendant 24 h sous argon. Le PVC est ensuite rincé à l'eau et aussitôt séché sous azote ou sous vide. La transformation éventuelle des fonctions terminales chlorure d'acide des molécules espaceurs en groupements carboxyliques est effectuée comme pour les surfaces minérales. Le greffage de l'antibiotique ou du bactéricide sur la fonction terminale de la molécule espaceur est effectué selon le même procédé que les surfaces minérales mais en utilisant l'acétonitrile comme solvant. Ill-c PET (polyéthylène téréphtalate) Comme dans le cas du PVC, il est nécessaire d'activer la surface du PET en incorporant dans les chaînes de polymères des molécules d'aminoalkylsilanes. Pour ce faire, la méthode décrite par L.N. Bui et al (1993), Analyst, fil18: 463 a été utilisée. Le PET est plongé dans une solution à 2 % v/v de 3aminopropyltriéthoxysilane dans du toluène pendant 24 h sous argon. Après rinçage au chloroforme et au toluène, le PET activé est soit immergé dans une solution de chlorure de TESTS BACTÉRIOLOGIQUES I. Protocole On commence par préparer une solution de milieu nutritif contenant une souche de staphylocoques blancs (SB) à une concentration de l'ordre de 106 bactéries/ml. Les surfaces sont testées soit en situation quasi-statique en les immergeant dans la solution de SB (sans agitation ou avec agitation douce), soit en situation dynamique en faisant circuler la solution de SB en circuit fermé dans un tube contenant les surfaces traitées. Le temps d'incubation est généralement de 24 h et la température de 37"C. Différents types de surface ont été utilisés: - Poudre (particules sphériques de diamètre inférieur au mm), - Billes (particules sphériques de diamètre supérieur au mm), - Films minces ou plaques épaisses, - Fibres. II. Résultats La concentration en bactéries dans la solution après incubation avec les surfaces traitées est déterminée par mesure de la densité optique à 600 nm, numération sur boîte de Pétri et/ou comptage au laser. Les résultats obtenus pour différents matériaux sont rassemblés dans les tableaux ci-dessous. T représente la température d'incubation en "C. t représente le temps d'incubation en heures de la solution [SB]o représente le nombre de bactéries par ml dans la solution à l'instant initial, t = O. [SB]t représente le nombre de bactéries par ml dans la solution après incubation pendant le temps t. Les mesures de concentration sont à 10% près. II-1. Sable (99 % silice Si02) Type Antibiotique Agitation T( C) t(h) [SB]o [SB]@ N Poudre sans sans 37 24 106 250.106 A1 (diamètre : APATEA sans 37 24 106 40.106 A2 220 m) HEDMDA sans 37 24 106 20.106 A3 11-2. Verre (boro silicate contenant 60 % de silice) Type Antibiotique Agitation T( C) t(h) [SB]o [SB]t N Poudre sans (diamètre: APATEA B2 40 m HEDMDA B3 Billes sans sans 37 24 106 350.106 B4 (diamètre : APATEA sans 37 24 106 230.106 B5 2 mm) HEDMDA B6 Fibres sans sans 37 48 2.10 250.10 B7 (diamètre: APATEA B8 30 m) HEDMDA sans 37 48 2.104 40.106 B9 Tube sans B10 APATEA B11 HEDMDA B12 11-3. Silicone Type Antibiotique Agitation T( C) t(h) [SB]o [SB]t N Poudre sans C1 APATEA C2 HEDMDA C3 Billes sans C4 APATEA C5 HEDMDA C6 Film sans C10 APATEA C11 HEDMDA C12 11-4. PVC Type Antibiotique Agitation T( C) t(h) [SB]o [SB]t N Poudre sans D1 APATEA D2 HEDMDA D3 Billes sans D4 APATEA D5 HEDMDA D6 Film sans D10 (épais- APATEA D11 seur: HEDMDA D12 0,38 mm) 11-5. PET Type Antibiotique Agitation T( C) t(h) [SB]o [SB]t N Poudre sans E1 APATEA E2 HEDMDA E3 Fibres sans E4 APATEA E5 HEDMDA E6 Film sans E10 (épais- APATEA E11 seur : HEDMDA E12 0,35 mm) III. Analyse des résultats L'examen des différents tableaux met en évidence un effet bactéricide ou bactériostatique très net dans le cas des surfaces traitées. La concentration finale de bactéries dans une solution mise en contact avec des antibiotiques greffés est de 10 à 20 fois plus faible que la concentration finale mesurée en l'absence d'antibiotiques, toutes conditions étant égales par ailleurs. Cet effet est présent pour tous les types de surfaces et tous les matériaux étudiés. On observe que l'effet est d'autant plus important que la surface spécifique est grande (grand nombre de sites antibiotiques ou bactéricides) (comparer, par exemple, les cas A2 et B5). Enfin, cet effet est plus important sous agitation mécanique ou en circulation. Dans ces deux cas, les contacts entre bactéries et surfaces traitées sont favorisés car la probabilité de rencontre n'est plus alors limitée par la diffusion brownienne. En volume, la concentration minimale inhibitrice de CMlvol. est définie comme le nombre de molécules d'antibiotiques par unité de volume pour lequel la concentration de bactéries reste égale à celle de l'inoculum, même après 24 h. On peut définir de même une concentration minimale inhibitrice de surface, CMlsurf comme le nombre de molécules antibiotiques par unité de surface pour lequel la concentration bactérienne initiale reste inchangée après 24 heures d'incubation. Pour pourvoir comparer CMlsurf à un CMI de volume, il est nécessaire d'effectuer une conversion qui tienne compte de la surface spécifique du matériau support. En effet, I'efficacité bactériologique est directement proportionnelle au nombre total de molécules bio-actives présentes dans le volume considéré. II faut aussi tenir compte du coefficient de remplissage géométrique du matériau support à l'intérieur du volume considéré. Pour des sphères de taille uniforme, ce coefficient de remplissage est de 0,50 à 0,70 suivant le type exact d'empilement compact. Pour des sphères avec une grande dispersion en taille, on peut parvenir au remplissage appolonien et ce coefficient se rapproche de 1. En pratique, on utilisera un coefficient de remplissage d'environ 0,5. La concentration minimale inhibitrice de surface normalisée, CMIsurf.norm obéit à la relation suivante: CMIsurf.norm (en nombre de molécules par ml) = CMlsuSspcLP avec CMlsurf la densité de molécules antibiotique fixée sur le matériau support (en nombre de molécules/cm2), Ssp la surface spécifique du matériau support (en cm2/g), a le coefficient de remplissage = 0,5 pour un empilement compact de sphères, p la densité volumique du matériau support (en g/ml). Cette CMI de surface normalisée a l'avantage d'être indépendante de la surface spécifique du matériau utilisé et de son coefficient de remplissage, et de pouvoir être comparée directement à la CMI mesurée en solution. Elle montre bien aussi que toutes choses égales par ailleurs, un matériau extrêmement divisé, c'est-à-dire de grande surface spécifique, aura donc besoin d'une densité de greffage plus faible en molécules antibiotiques qu'un matériau de faible surface spécifique. L'estimation de la CMI de surface est donnée ci-dessous pour les différents matériaux. Les valeurs de la CMlsurf. sont données dans les 1 ère et 3è colonnes pour APATEA et HEDMDA respectivement. Les valeurs normalisées, CMlsurf. nord, calculées à partir de CMlsurf. suivant la relation indiquée ci-dessus sont données dans les colonnes 2 et 4. A titre de comparaison, les valeurs de CM Ivol. mesurées pour ces mêmes antibiotiques en solution classique sont de 1,3 x 1020 molécules/ml (64 mg/ml) et 8 x 1018 molécules par ml (4 mg/ml) respectivement pour APATEA et HEDMDA. L'examen du tableau ci-dessous permet de conclure que la CMI de surface normalisée est soit égale soit plus faible que la CMI de volume, mais jamais supérieure. Matériaux @ APA TEA I HED MDA CMIsurf. CMIsurf.norm. CMIsurf. CMIsurf.norm. Verre Silicone PVC PET REVENDICATIONS 1. Surface douée de propriétés antibiotiques ou antiseptiques, constituée d'un substrat solide modifié par fixation covalente d'un ou plusieurs espaceurs, caractérisée en ce qu'une ou plusieurs molécules antibiotiques, bactéricides, virucides ou fongicides sont liées de façon covalente à l'extrémité réactive dudit ou desdits espaceurs. 2. Surface selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'espaceur est un silane de formule A-(CH2)n-Y dans laquelle: - A est CO-Z, avec Z = H, OH ou Cl, ou X3-Si, avec X un halogène ou un groupe alkoxy de 1 à 3 atomes de carbone; - n est compris entre 3 et 24,; - Y est choisi parmi les résidus méthyle, vinyle ou CO-Z, avec Z = H, OH ou Cl. 3. Surface selon la revendication 2 caractérisée en ce que n est compris entre 10 et 18. 4. Surface selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'antibiotique est susceptible d'agir au niveau des parois bactériennes, notamment ceux comportant un noyau p-lactame telles les penicillines, les céphalosporines les monobactames les thiénamycines, les inhibiteurs des p-lactamases , les inhibiteurs de la synthèse des peptidoglycanes, les polypeptides basiques telles la bacitracine, la novobiocine. 5. Surface selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le bactéricide est un ammonium quaternaire. 6. Surface selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le substrat est un support minéral, notamment en verre ou en fibre de verre. 7. Surface selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le substrat est un oxyde de métal tels Al203, SnO2, InO3. 8. Surface selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le support est un plastique organique notamment un polyéthylène, un chlorure de polyvinyle (PVC), des polyacrylates, des polyméthacrylates, du polypropylène, des polyamides, des polyuréthanes, de l'acrylonitrile-butadiene-styrene (ABS), des polyesters saturés ou insaturés tel le polyéthylène téréphtalate (PET) , des polycarbonates, des polyacrylamides, le Téflon (PTFE), des polysiloxanes, des polysaccharides ou tout polymère ou copolymère susceptible d'être greffé avec un espaceur comprenant deux extrémités réactives. 9. Surface selon l'une des revendications 1 à 8 constituant un contenant d'un produit à usage médical, chirurgical, cosmétique, alimentaire ou d'hygiène. 10. Surface selon l'une des revendications 1 à 8 constituant des particules de diamètre compris entre quelques microns et quelques millimètres. 11. Surface selon la revendication 10 caractérisée en ce que les particules forment du sable. 12. Surface selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle constitue une prothèse à usage médical. 13. Surface selon la revendication 12 caractérisée en ce que la prothèse est une lentille de contact. 14. Surface antibiotique selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que la densité de sites actifs d'antibiotiques par unité de surface est comprise entre 1011 et 5.1014 molécules d'antibiotiques par cm2. 15. Surface douée de propriétés antibiotiques selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisée en ce qu'un ou plusieurs antibiotiques différents sont greffés sur ladite surface, sur laquelle ils forment une couche monomoléculaire d'épaisseur inférieure à 4nm. 16. Procédé de préparation de surfaces selon l'une des revendications 1 à 8 comprenant au moins les étapes suivantes: - un nettoyage de la surface - le cas échéant, une activation chimique de la surface afin de générer des groupes réactifs; - un dépot d'une couche d'accrochage possédant une fonction réactive en position terminale externe; - le greffage chimique de l'antibiotique, du bactéricide ou du fongicide sur le groupement réactif de la surface ainsi modifiée. 17. Procédé selon la revendication 16 dans lequel les surfaces sont modifiées avec du APATEA ou du HEDMDA. 18. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que quand le substrat est un silicone, la surface est préalablement activée par traitement par une solution d'HF entre 3 et 10 % 19. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que quand le substrat est du PVC, la surface est préalablement activée par le traitement suivant: - mise en contact avec une solution aqueuse d'azoture de sodium contenant 5 à 15% de DMF, puis rincée, - mise en contact avec une solution aqueuse ou méthanolique de NaBH4 pendant 24 heures. 20. procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que quand le substrat est du polyéthylène téréphtalate (PET), la surface est préalablement activée par mise en contact de la surface avec une solution de 1 à 5% de 3-aminopropyltriethoxysilane dans du toluène pendant 24 heures sous argon. 21. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à la fabrication de contenants à usage médical tels des bouteilles, des poches, des tubages, notamment ceux à usage unique. 22. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à la fabrication de dispositifs médicaux pour le traitement des organes ex vivo ou in vivo, tels des cartouches de dialyse rénale. 23. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à la fabrication de matériels ou matériaux pour la dentisterie ou le nettoyage des dents. 24. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à la fabrication de prothèses telles des prothèses osseuses ou vasculaires. 25. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 10 et 11 à la préparation de bacs à sable pour les enfants. 26. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 10 et 11 pour la stérilisation des boissons d'usage courant et autres denrées fluides alimentaires. 27. Utilisation d'une surface selon l'une quelconque des revendications 10 et Il pour la stérilisation des fluides industriels.