FR 2748204 A1 19971107 FR 9605612 A 19960506 Le genre Melaleuca appartient à une famille botanique, les Myrtaceae, aux nombreuses plantes fortement aromatiques (Myrtes, Eucalyptus, Giroflier...). I1 comprend plus de 100 espèces originaires d'Océanie. Trois d'entre elles sont très exploitées pour leur intérêt thérapeutique: Le Niaouli (Melaleuca viridiflora Gaertn.), le Cajput (Melaleuca leucadendron L.) et l'Arbre à thé (Melaleuca alternifolia Cheel) La découverte initiale de l'étonnant pouvoir antiseptique de l'huile essentielle des feuilles du Melaleuca alternifolia appelé dans les pays anglo-saxons "Tea Tree Oil" remonte à 1925. Depuis, bien des études scientifiques ont confirmé les effets antibactériens et antifongiques de cette huile essentielle. Une synthèse de ces travaux permet d'établir la liste des principaux micro-organismes sensibles à cette huile essentielle Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Propionibacterium acnes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Legionella sp., Enterobacter sp., Salmonella typhi, Candida albicans, Aspergillus niger, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton gypseum, Trychophvlon rubrum. La première norme de qualité portant sur l'huile essentielle de Melaleuca alternifolia a été publiée en 1967 par "the Standard Association ofAustralia" Cette norme n'étant pas assez fiable pour assurer une activité antimicrobienne reproductible de l'huile essentielle, une nouvelle norme a été établie en 1985 par l'Australian Standard (AS 2782). Cette seconde norme, à la différence de la première, n'est pas spécifique à Melaleuca alternifoha mais s'applique aux Melaleuca riches en terpinène-4-ol. Ainsi, la norme AS 2782 précise que les huiles essentielles de Melaleuca type "terpinène-4-ol" doivent contenir - un taux minimum de 30 % de terpinène-4-ol - un taux de 1,8-cinéole qui ne doit pas excéder 15 % En 1991, une norme AFNOR NF T-75-358 a repris les exigences de la norme australienne AS 2782 en y ajoutant des limites portant sur 11 constituants (en plus des limites du terpinène-4-ol et du 1,8-cinéole) gamma-terpinène 10,0 à 28,0 % I aromadendrène : traces à 7,0 % alpha-terpinène . 5,0 à 13,0 % l sabinène : traces à 3,5 % alpha-terpinéol 1,5 à 8,0 % I delta-cadinène: 0 à 8,0 % alpha-terpinolène: 1,5 à 5,0 % l globulol 0 à 3,0 % p-cymène : 0,5 à 12,0 % I viridifiorol 0 à 1,5 % d-limonène . 0,5 à 4,0 % I Une norme internationale ISO 4730 est parue en 1992. Elle reprend également les exigences de la norme australienne AS 2782, en y ajoutant des limites relatives à 7 constituants. Ces limites sont les memes que celles de la norme AFNOR NF T-75-358 (cidessus) sauf pour les composés suivants: Absence de limites pour: aromadendrènes, sabinène, delta-cadinène, globulol et viridifiorol. Par contre, une limite supplémentaire: alpha-pinène 1,0 à 6,0 % Toutes ces normes en vigueur ont permis de bien caractériser l'huile essentielle, d'éviter d'éventuelles falsifications, d'assurer ainsi un pouvoir antiseptique satisfaisant, en prenant des précautions à l'égard du 1,8-cinéole considéré par certains comme irritant pour la peau. Cependant, l'huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol usuelle présente malgré ces normes, deux inconvénients majeurs pour des applications cosmétiques, pharmaceutiques ou alimentaires: son odeur et sa tolérance au niveau cutané. L'odeur des huiles essentielles de Melaleuca type terpinène-4-ol est fortement aromatique rappelant un mélange d'eucalyptus, de résine fraîche de pin, et de térébenthine. Trois notes trop prononcées rendent cette odeur gênante : une note de tête désagréable due aux "terpènes" (pinènes, myrcène, limonène...); une note dure provenant du 1,8-cinéole; une note due au gamma-terpinène qui persiste sur la peau après évaporation des composés les plus volatils. Cette odeur s'avère donc peu compatible avec nombre de formulations cosmétiques, dermatologiques, ou alimentaires. Les huiles essentielles usuelles d'Arbre à thé ne présentent pas une tolérance cutanée suffisamment satisfaisante. En effet, des cas d'irritations suite à l'application prolongée et répétée d'huiles essentielles de Melaleuca type terpinène-4-ol sur la peau ont été signalés à plusieurs reprises dans la littérature. CARSON C.F., RILEY V. (Clinical Toxicol., 1995, 33, 2, pp. 193-194). Plusieurs auteurs ont mis en cause certaines substances -Pour Knight T.E. et collaborateurs (J. Am. Acad. Dermatol., 1994, 30, 3, pp. 423-427), le limonène serait l'agent le plus fréquemment allergisant chez des sujets traités localement par l'huile essentielle d'Arbre à thé. -Pour VAN DER VALK P.G. et collaborateurs (Ned. Tijdschr Geneeskd, 1994, 138, 16, pp. 823-825), LASSEK E.V. et collaborateurs (Austr. Med. Plants, 1983, p. 97), BARNES B. (Modern Phytotherapy, The clinical significance ofTea Tree and other essential oils, pp. 3542), les soupçons se porteraient sur le 1-8-cinéole. Parmi les composants naturels les plus fréquemment cités dans la littérature pour leurs effets allergisants on trouve l'alpha-pinène et le limonène. L'objet du présent brevet repose sur la mise au point d'un produit nouveau et naturel préparé à partir d'une huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol et ne présentant plus les deux inconvénients évoqués précédemment. Cette huile essentielle particulière se distingue de l'huile essentielle courante (définie par la norme AFNOR NF T-75-358) par sa composition différente et son procédé de purification (rectification) qui permet d'éliminer ou de fortement diminuer la présence de plusieurs groupes de composés présents dans l'huile essentielle courante: - des composés responsables de l'odeur gênante - des composés mal tolérés par la peau - des substances de faible intéret antiseptique. Le procédé permet aussi d'augmenter l'activité antiseptique de l'huile essentielle rectifiée comparée à une huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol usuelle. Les huiles essentielles de Melaleuca type terpinène-4-ol sont obtenues selon la méthode traditionnelle par hydrodistillation ou entraînement à la vapeur d'eau à pression atmosphérique des feuilles fraîches et des jeunes rameaux du Melaleuca. Pour la préparation d'une huile essentielle rectifiée de Melaleuca type terpinène-4-ol quatre méthodes de fractionnement (ou rectification) ont été examinées: Fractionnement au moyen d'éthanol à 60 % v/v Fractionnement par chromatographie sur colonne Fractionnement en étuve sous pression réduite Rectification par distillation sous pression réduite Exemple 1: Fractionnement au moyen d'éthanol à 60 % v/v 1 ml d'huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol est extrait par 4 ml d'éthanol à 60 % v/v sous agitation à température de 20"C pendant 10 minutes. Le mélange est ensuite centrifugé. La fraction surnageante est analysée par chromatographie en phase gazeuse. Le résultat du chromatogramme montre que le terpinène-4-ol représente 35,7 % de la fraction surnageante et 39,4 % de la fraction hydroalcoolique. Cette méthode manque donc de sélectivité vis à vis du terpinène-4-ol. Exemple 2 : Fractionnement par chromatographie sur colonne 0,1 ml d'huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol est mélangé avec du gel de silice, puis le mélange est placé sur une colonne de gel de silice G 60. L'huile essentielle est éluée successivement par de l'hexane, de l'éther diéthylique puis du méthanol. Une analyse des 3 fractions par Chromatographie en phase gazeuse montre que l'on retrouve dans chacune des fractions du terpinène-4-ol. Ce dernier représente 24 % de la fraction éluée par l'hexane, 67 % de la fraction éluée par éther et 12 % de la fraction éluée par le méthanol. Cette technique permet de séparer plus finement les catégories de molécules en fonction de leurs polarité comparée à celle décrite à l'exemple 1. Cependant, le terpinêne-4-ol reste présent en quantité notable dans les différentes fractions. D'autre part, cette méthode présente l'inconvénient de mettre en oeuvre plusieurs solvants organiques. Exemple 3 : Fractionnement en étuve sous pression réduite 0,5 ml d'huile essentielle de Melaleuca type terpinène-4-ol sont placés dans une étuve chauffée à 450C pendant 18 heures sous pression réduite. L'opération achevée, il s'avère que 40 % de l'huile essentielle s'est évaporée. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse montre que l'huile essentielle résiduelle contient 56 % de terpinène-4-ol, contre 40 % initialement. Un fractionnement dans des conditions identiques pendant 4 heures (au lieu de 18 heures) fournit une composition de l'huile essentielle identique à la composition initiale avant traitement. Une durée intermédiaire serait à examiner. Exemple 4 : Fractionnement par distillation sous pression réduite 50 litres d'huile essentielle de Melaleuca alternifolia sont placés dans une cuve équipée d'une colonne de distillation dont le nombre de plateaux théoriques est voisin de 30. La colonne comprend un garnissage ordonné, inox, de marque Sulzer. Un vide de 4-7 mm de mercure accompagné d'un reflux à température variable a permis d'aboutir à l'obtention d'une huile essentielle rectifiée particulièrement intéressante. D'après les résultats d'analyse par chromatographie en phase gazeuse, il apparaît que l'huile essentielle préparée par distillation sous pression réduite est très fortement "déterpénée". Elle est débarrassée de la note de tête désagréable, de la note "dure" et de la note due au gamma terpinène, ainsi que des principales substances considérées comme irritantes pour la peau. Le tableau, ci-après, présente d'une part la composition d'huiles essentielles type terpinène-4- ol usuelles (non rectifiées), et, d'autre part, la composition de l'huile essentielle rectifiée par distillation sous pression réduite d'une huile essentielle usuelle. -------Composants majeurs---lHuile essentielle usuelle l Huile -------(*)------------------------l valeurs extrêmes | essentielle ------- ---------------------------l (mini. et maxi.)(*) rectifiée 1-terpinène-4-ol--------| 28,6 à 59,9 % l 67,3 % -------gamma-terpinène-------l 9,5 à 28,3 % 1,8 % ------- 1,8-cinéole --------------l 0,5 à 17,7 % 1 0,09 % -------alpha-terpinène ---------l 4,6 à 12,8 % l 0,06 % -------p-cymène----------------l 0,4 à 12,4 % 0,2 % -------alpha-terpinéol----------l 1,5 à 7,6 % l 7,4 % -------delta-cadinène ----------l 0,1 à 7,5 % 1 3,6 % ------- aromadendréne ---------I 0,1 à 6,6 % ? ------- vindinorène -------------1 0,3 à 6,1 % l terpinolène j 1,6à 5,4% 1 1,9% -- alpha-pinéne ------------1 0,8 à 3,6 % 1 0,01 % -------globulol------------------l 0,îà 3,0% 1 0,6% -------limonène-----------------l 0,4 à 2,7 % 1 0,02 % -------alpha-phellandrène-----l 0,1 à 1,9 % 0 -------myrcène-----------------| 0,1 à 1,8 % l 0 -------beta-pinène--------------l 0,1 à 1,6% I 0 (*) Selon BROPHY J.J. et collaborateurs (J. Agric. Food Chem., 1989, 37, pp. 1330-5). Le tableau ci-dessus montre que le procédé par distillation sous pression réduite a permis de réduire à l'état de traces les composés indésirables suivants : 1,8-cinéole (très odorant et mal toléré), limonène, alpha-pinène et beta-pinène (sensibilisants). Le nouveau produit naturel selon la présente invention correspond à une huile essentielle rectifiée de Melaleuca type terpinène4-ol définie par la composition chimique suivante: - la somme des taux de limonène, d'alpha-pinène, de beta-pinène et de 1,8-cinéole dans l'huile essentielle rectifiée n'excède pas 0,5 % en poids. - le taux de terpinène-4-ol contenu dans l'huile essentielle rectifiée n'est pas inférieur à 60 % en poids - la somme des taux d'alpha-terpinène et gamma-terpinène contenus dans l'huile essentielle rectifée revendiquée n'excède pas 5,0 % en poids - l'huile essentielle rectifée revendiquée contient en particulier de l'alpha-terpinéol, du cadinène et du terpinolène Parmi les différentes espèces de Melaleuca type terpinène4-ol utilisées pour la préparation du nouveau produit selon l'invention, on peut citer : Melaleuca alternifolia, Melaleuca linarfifolia Melaleucadisirifolia Activité antiseptique des composants de l'huile essentielle rectifiée Les activités antimicrobiennes des 7 composants principaux de l'huile essentielle de Melaleuca alternifolia ont été comparées et rapportées par CARSON C.F. et RILEY V. (J. Appl. Bacteriol., 1995, 78, pp. 264-269). Parmi ces composants, le pouvoir antiseptique du terpinène4-ol apparaît comme le plus large, suivi de l'alpha-terpinéol, puis du terpinolène, de l'alpha-terpinène, et du cinéole. Le gamma-terpinène et le p-cymène présentent de faibles pouvoirs antiseptiques. En réexaminant le tableau précédent relatif à la composition d'huiles essentielles type terp:mène4-ol usuelles (non rectifiées) et la composition d'une huile essentielle après rectification on peut remarquer ceci - Parmi ces composés quantitativement "majeurs", les deux dont les pouvoirs antiseptiques sont les plus faibles ont été fortement réduits (gamma-terpinene et p-cymène) dans l'essence rectifiée. - L'antiseptique le plus intéressant (le terpinène4-ol) atteint les 213 de la composition totale de Ibuile essentielle rectifiée. - L'alpha-terpinéol, antiseptique le plus intéressant après le terpinène4-ol, devient quantitativement le deuxième composant de l'huile essentielle rectifiée. Exemple 5 : Activité antiseptique de l'huile essentielle rectifiée Etude comparative des activités bactéricides et fongicides d'huiles essentielles de Melaleuca alrernlfolia non rectifiées et rectifiées selon la méthode par dilution-neutralisation (note technique propharmacopoea ne288). Conditions expérimentales Milieux de subculture : Brain heart agar (Marque Difco) -Souches microbiennes Issues de la Collection Nationale de 'Institut Pasteur Pseudomonas aenrginosa, Eschscherichia coli, Siaphyloccocus aureus, Enrerococcus faecium. Candida albicans, Propionibaclerium acnes -Neutralisant : neutralisant-diluant Pharmacopée française Tween 80 Lécithine Histidine, HCI Peptone de Caséine NaCI Phosphate monopotassique Phosphate disodique dihydraté Eau distillée -Temps et températures de contact: 5 et 30 min; 32 +/- 10C -Température d'incubation des cultures: 37 C pour toutes les souches sauf Propionibacteflum acnes (30 C en atmosphère anaérobie) Résultats: La validité du neutralisant a été vérifiée pour la concentration de 5 % en produit pour les 6 souches. Souches Temps de Activité bactéricide contact (réduction de 5 Log) (minutes) CMB (*) huiles essentielles Non rectifiée Rectifiée Pseudomonas aeruginosa 5 > 5,0 % 30 2,5 %( ) Eschscherichia coli 5 0,5 % 1,0 % 30 0,5 % Staphyloccocus aureus 5 2,5 %( ) 1,0 % 30 2,5 % 0,5 % Enterococcusfaecium 5 > 5,0 % > 5,0 % 30 > 5,0 % 2,5 %( ) Candida albicans 5 > 5,0 % > 5,0 % 30 2,5 % 2,5 %(0) Propionibacterium acnes 5 > 5,0 % 30 1,0 %( ) (*): Concentration Minimum Bactéricide (C) : Réduction proche de 5 Log L'huile essentielle rectifiée possède un pouvoir bactéricide à l'égard de Pseudomnas aeruginosa, Staphylococcus aureus, et Enterococcus faecium supérieur à l'huile essentielle non rectifiée. Les effets fongicides à l'égard de Candida albicans et bactéricides vis à vis d'Escherichia coli des deux types d'huile essentielle étant assez proches. L'huile essentielle rectifiée de Melaleuca type terpinène-4-ol peut être utilisée comme ingrédient actif, seul ou en association avec d'autres ingrédients actifs, dans la prévention ou le traitement de troubles d'origines microbiennes variées : plaies, brûlures, infections cutanées bactériennes ou fongiques telles que l'acné, les dermatoses, les furonculoses, l'onycomycose, le pied d'athlète7 infections du cuir chevelu, infections bucco-dentaires, infections oto-rhinolaryngologiques, infections urinaires, infections vaginales. Cette huile essentielle rectifiée peut aussi être utilisée en tant qu'agent conservateur antibactérien et antifongique seul ou associé à d'autres agents conservateurs naturels ou d'origine synthétique. L'huile essentielle rectifiée de Melaleuca peut être incorporée dans toutes les formes galéniques employées en cosmétique ou dermopharmacie à savoir: émulsions, laits, lotions, gels, pommades, huiles, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks, crayons, sprays. Il en est de même pour toutes les formes galéniques employées en pharmacie, à savoir : solutés, émulsions, sirops, mélanges liquides pour inhalations, huiles essentielles pures ou diluées, gélules, suppositoires, patchs. La concentration de l'huile essentielle rectifiée dans les formules cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques ou alimentaires est comprise entre 0,01 et 99 % préférentiellement 0,5 à 10 % en poids de la composition totale. REVENDICATIONS 1/Composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, ou alimentaire caractérisée en ce qu'elle contient une huile essentielle rectifiée de Melaleuca type terpinène- 4-ol; la somme des taux de limonène, d'alpha-pinène, de beta-pinène et de 1,8-cinéole dans l'huile essentielle rectifiée n'excédant pas 0,5 % 2/Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le taux de terpinène-4-ol contenu dans l'huile essentielle rectifiée revendiquée n'est pas inférieur à 60,0 % de l'huile essentielle. 3/Composition selon la revendication 1 à 2 caractérisée en ce que la somme des taux d'alphaterpinène et gamma-terpinène contenus dans l'huile essentielle rectifiée revendiquée n'excède pas 5,0 % de l'huile essentielle. 4/Composition selon la revendication 1 à 3 caractérisée en ce que l'huile essentielle rectifiée revendiquée contient en particulier de l'alpha-terpinéol, du delta-cadinène et du terpinolène. 5/Composition selon la revendication 1 à 4 caractérisée en ce que le Melaleuca type terpinène-4-ol précité est choisi parmi les espèces : Melaleuca alternifolia, Melaleuca linarXifolia, Melaleuca disitiflora. 6/Composition selon les revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'huile essentielle rectifiée revendiquée est obtenue par distillation sous pression très réduite à partir d'une huile essentielle de Melaleuca type terpinène 4-ol préparée par hydrodistillation ou par distillationà la vapeur d'eau du feuillage et des branches terminales du Melaleuca. 7/Composition selon les revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la concentration de l'huile essentielle rectifiée revendiquée est comprise entre 0,01 et 99 % préférentiellement 0,5 à 10 % en poids de la composition totale. 8/ Composition selon les revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l'huile essentielle rectifiée revendiquée est utilisée dans toute forme galénique employée en cosmétique ou dermopharmacie à savoir: émulsions, laits, lotions, gels, pommades, huiles, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks, crayons, sprays. 9/Composition selon les revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l'huile essentielle revendiquée est utilisée dans toute forme galénique employée en pharmacie, à savoir: solutés, émulsions, sirops, mélanges liquides pour inhalations, huiles essentielles pures ou diluées, gélules, suppositoires, patchs. 10/Composition selon les revendications 1 à 9 caractérisée en ce que l'huile essentielle rectifiée revendiquée est utilisée comme ingrédient actif, seul ou en association avec d'autres ingrédients actifs, dans la prévention ou le traitements de troubles d'origine microbienne plaies, brûlures, infections cutanées bactériennes ou fongiques telles que l'acné, les dermatoses, les furonculoses, l'onycomycose, le pied d'athlète, infections du cuir chevelu, infections bucco-dentaires, infections oto-rhino-laryngologiques, infections urinaires, infections vaginales. 11/ Composition selon les revendications 1 à 10 caractérisée en ce que l'huile essentielle revendiquée est utilisée en tant qu'agent conservateur antibactérien et antifongique seul ou associé à d'autres agents conservateurs naturels ou d'origine synthétique.