FR 2741806 A1 19970606 FR 9514450 A 19951130 Vaccin vivant recombinant à base d'herpèsvirus félin de type 1, notamment contre b péritonite infectieuse féline. La présente invention a trait à des vaccins, de préférence pour chats, produits à partir d'herpèsvirus félins recombinants, et aux méthodes d'obtention et de préparation de ces virus recombinants. En particulier, la présente invention a plus particulièrement trait aux recombinants herpèsvirus félins comprenant une cassette d'expression pour un (ou des) gène(s) étranger(s). La rhinotrachéite infectieuse féline est causée par l'herpèsvirus félin de type 1 (en anglais Feline HerpesVirus Type 1 ou FHV-1). L'herpèsvirus félin (FHV-1) est classé dans la famille des Alphaherpesvirinae. La rhinotrachéite infectieuse féline est une maladie très répandue chez les chats et, en pratique, tous les chats médicalisés sont vaccinés contre cette affection virale. II existe actuellement plusieurs vaccins pour prévenir la rhinotrachéite infectieuse. Ces vaccins sont soit de type vivant atténué, soit de type inactivé (virus entier ou sous-unités purifiées). L'atténuation des vaccins vivants actuellement utilisés a été obtenue après passages répétés sur cellules, et la cause de leur atténuation n'est pas connue.De plus, ces vaccins présentent en général une virulence résiduelle et sont pour cette raison administrés par voie parentérale (sous-cutanée ou intramusculaire) plutôt que par voie intranasale (qui serait cependant la voie de choix compte tenu de la réplication locale de ce virus). Les vaccins inactivés présentent une bonne innocuité, mais leur faible immunogénicité nécessite de multiples injections pour induire une protection satisfaisante. Par ailleurs, les chats domestiques sont exposés à de nombreuses autres maladies, et la mise au point d'un vecteur vaccinal pouvant exprimer différents antigènes d'agents pathogènes félins permettrait de simplifier et d'améliorer l'efficacité des programmes de vaccination. Enfin, parmi les maladies affectant le chat domestique, certaines résistent toujours aux approches vaccinales classiques. Le cas le plus connu est celui de la péritonite infectieuse féline causée par un coronavirus (virus de la Péritonite Infectieuse Féline (PIF) ou, en anglais, "Fl PV" (Feline Infectious Peritonitis Virus)). Un vecteur FHV-1, dont l'atténuation serait telle qu'il puisse être administré par voie oronasale chez le chat sans entraîner de pathologie locale et/ou générale, et qui permettrait l'induction d'une réponse immunitaire protectrice à la fois contre la rhinotrachéite infectieuse féline et contre d'autres agents pathogènes félins, constituerait un progrès significatif en matière de vaccination de la population féline domestique. On a déjà proposé un certain nombre de gènes de FHV comme sites d'insertion: La demande de brevet EP-A-O 447 303 a proposé l'insertion dans le site RR2 des alphaherpèsvirus, y compris FHV. La demande donne les moyens d'effectuer l'insertion dans le site RR2 de l'herpèsvirusde la dinde (virus HVT). La demande de brevet WO-A-90 01547 propose des vecteurs FHV TK- pour l'expression de gènes hétérologues. De même, la demande de brevet WO-A-93 09238 propose un vaccin contre la leucémie féline formée d'un vecteur FHV dans lequel un gène de FeLV a été inséré dans le gène TK du virus FHV. Voir aussi dans le même sens les articles de R.C. WARDLEYeta1. dans J. Gen. Virol. 1992. 73. 1811-1818 et de G.E. COLE et ai. dans J. Virol. 1990. 64. 4930-4938. La demande de brevet WO-A-94 03621 propose l'insertion dans les gènes gl, gE, US9, US10 et US11. La demande de brevet WO-A-95 00172 propose d'insérer un ADN servant de marqueur dans la région du génome comprenant les gènes gl et gE. La demande de brevet EP-A-O 576 092 propose le cadre ouvert de lecture ("ORF") situé entre le gène gC et le gène homologue du gène HSV-1 UL46 comme site préférentiel pour l'insertion sur le génome FHV. Voir aussi M.J. WILLEMSE et a!. dans J. Gen. Virol. 1994. 75. 3107-3116. Divers promoteurs, y compris ceux généralement disponibles dans le commerce, ont été utilisés dans les différentes constructions décrites dans l'art antérieur, parmi lesquels le promoteur HCMV IE (CMV immediate early humain), la séquence promotrice de la région LTR du virus RSV (Rous Sarcoma Virus), et le promoteur précoce du virus SV40. La présente invention a pour objectif de fournir un vaccin FHV vivant, atténué mais ayant conservé une bonne capacité de réplication in vivo, en vue d'immuniser les chats contre la rhinotrachéite infectieuse. Un autre objectif de l'invention est de fournir un vaccin vivant recombinant à base de FHV qui soit efficace contre les autres agents pathogènes félins. En particulier, en raison des nombreux échecs observés dans la vaccination contre la péritonite infectieuse féline avec des vaccins inactivés ou vivants atténués, principalement en raison du phénomène de "facilitation" (exacerbation de la maladie), le besoin d'un vaccin réellement efficace contre la PIF existe toujours.Un tel vaccin à base d'un vecteur FHV-1 recombinant qui serait réellement efficace contre la péritonite infectieuse féline, maladie pour laquelle personne n'a encore commercialisé de vaccin satisfaisant, pourrait en outre ouvrir la voie à des vaccins très efficaces contre d'autres maladies du chat, comme, par exemple et entre autres, la leucémie féline, le syndrome d'immunodéficience féline dû à FIV, ou encore la panleucopénie féline. Un autre objectif encore de l'invention est de permettre une vaccination efficace des chats en utilisant la voie oronasale. La demanderesse a caractérisé une nouvelle partie du génome de FHV, dans laquelle elle a caractérisé de nouvelles régions du génome du virus FHV, régions dénommées ci-après (voir exemple 3) FHV ORF2 et FHV ORF5, qui se sont avérées utilisables pour l'insertion de gènes étrangers dans des conditions permettant de remplir les objectifs exposés ci-dessus. La présente invention a donc pour objet un vaccin vivant recombinant utilisant comme vecteur un herpèsvirus félin comprenant, et exprimant, au moins une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide, cette séquence étant insérée dans le site ORF5 et/ou le site ORF2. De préférence, la séquence insérée code pour un polypeptide antigénique et, préférentiellement, pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène félin. On peut également insérer des séquences codant pour des protéines immunomodulatrices telles que des cytokines. Selon une modalité avantageuse, on peut associer une séquence codant pour une cytokine, ou analogue, et une séquence codant pour un antigène. Si besoin est, plusieurs séquences de cytokines peuvent être associées entre elles, éventuellement en combinaison avec une ou des séquences codant pour des antigènes. L'insertion dans les deux sites nouvellement caractérisés est réalisée par insertion simple (sans délétion) ou après délétion partielle ou totale des ORFs utilisées comme sites d'insertion. Selon une modalité particulièrement préférée de l'invention, on effectue des insertions et/ou des délétions dans les deux sites décrits. Cette modalité est particulièrement adaptée à l'utilisation de souches sauvages virulentes du virus FHV-1 pour l'obtention de recombinants. On peut donc insérer au moins une séquence nucléotidique dans chacun des sites, ou encore n'insérer que dans un site, de préférence ORF5, et déléter tout ou partie de l'autre site. Selon une autre modalité, qui s'applique plus aux souches vaccinales atténuées, sans y être limitée, l'insertion est effectuée dans un seul des deux sites, de préférence le site ORF5. Les herpèsvirus félins selon l'invention sont de préférence les virus FHV de type 1. On peut utiliser en particulier la souche FHV-1 CO dont la séquence de la région génomique (ORF1 à ORF8) est indiquée dans la liste de séquences sous la référence SEQ ID NO 1 (voir aussi tableau 1 exemple 3). Le site ORF2 est situé entre les nucléotides 1655 et 2596. Le site ORF5 est situé entre les nucléotides 5869 et 7113. Pour l'expression des gènes étrangers insérés sur le génome de FHV-1 selon la présente invention, on utilisera de préférence un promoteur eucaryote fort, tel que, préférentiellement, un promoteur CMV immediate early (IE). Par promoteur CMV IE, on entend notamment un fragment tel que donné dans les exemples ainsi que ses sous-fragments conservant la même activité promotrice. Le promoteur CMV IE peut être le promoteur humain (HCMV IE) ou le promoteur murin (MCMV IE), ou encore un promoteur CMV IE d'une autre origine, par exemple du rat, du cobaye, ou du porc. On pourra insérer au moins deux séquences nucléotidiques dans l'un des sites ORF2 ou ORF5 sous le contrôle de promoteurs différents. II pourra notamment s'agir de promoteurs CMV IE d'origines différentes. Selon un développement avantageux de l'invention, on associe au promoteur CMV IE un autre promoteur selon une disposition tête-bêche, ce qui permet d'insérer, dans la région d'insertion, deux séquences nucléotidiques, I'une sous la dépendance du promoteur CMV IE, l'autre sous celle du promoteur associé. Cette construction est remarquable par le fait que la présence du promoteur CMV lE, et notamment de sa partie activatrice (enhancer), peut activer la transcription induite par le promoteur associé. Comme promoteur associé, on peut citer, par exemple, un promoteur CMV d'espèce différente du premier promoteur. On peut également envisager d'autres promoteurs tels que le promoteur RNA1.8 du virus de la maladie de Marek (MDV) (G. Bradley et al. J. Virol. 1989. 63.25342542). La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur FHV pour être exprimée peut être toute séquence codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène félin capable, une fois exprimée dans les conditions favorables procurées par l'invention, d'assurer une immunisation conduisant à une protection efficace de l'animal vacciné contre l'agent pathogène. On pourra donc insérer, dans les conditions décrites par la présente l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour les antigènes d'intérêt pour une maladie donnée. Le cas typique de l'invention est l'insertion d'au moins une séquence nucléotidique codant convenablement pour un polypeptide du virus de la péritonite infectieuse féline (PIF ou FIPV) et, de préférence, le polypeptide FIPV M ou le polypeptide FIPV S modifié. On obtient ainsi un vaccin vivant recombinant assurant, en plus d'une protection contre la rhinotrachéite infectieuse féline, une protection contre la péritonite infectieuse féline. Si on le souhaite, on peut aussi insérer, en sus ou à la place, une séquence codant pour un autre antigène du virus PIF, tel que la protéine N, la protéine 7b, et/ou encore les polypeptides codés par le gène polymérase (polB) du virus de la PIF. D'autres cas préférés de l'invention sont l'insertion de séquences nucléotidiques codant pour des antigènes ou des fragments d'antigènes du virus de la leucémie féline (FeLV), en particulier gènes env, gag et pol (Osterhaus A. et a!. J. Immunol., 1985. 135. 591-596; Lutz H. Vet. Microbiol. 1990. 23. 131-146; Clark N. et al. JAVMA, 1991. 199. 1433-1443; Thomsen D. et ai. J. Gen. Virol., 1992. 73. 1819-1824), du virus de l'immunodéficience féline (FIV) (Jarrett O. et ai. AIDS, 1990, 4 (suppl. 1): S163-S165; Miyazawa T. et al. Arch. Virol; 1994, 134, 221-234; de Rhonde A. et a!. Virology, 1994. 198. 257-264), en particulier gènes env, gag et pol, du virus de la panleucopénie féline (FPV) (Carlson J. et al. J. Virol. 1985. 55. 574-582; Martyn J. et a!. J. Gen. Virol. 1990. 71, 2747-2753), en particulier le gène de capside VP2, du calicivirus félin (FCV) (Neill J. et al. J. Virol. 1991. 65. 5440-5447; Carter M. et a!. Virology. 1992. 190. 443-448), en particulier le gène de capside. Un cas typique de l'invention est un vaccin comprenant une séquence nucléotidique codant pour un antigène du virus de la PIF sous le contrôle de CMV IE et une séquence nucléotidique codant pour un antigène d'une autre maladie virale féline, notamment celles citées plus haut, sous le contrôle de l'autre promoteur. La présente invention a aussi pour objet une formule de vaccin multivalent, comprenant, en mélange ou à mélanger, au moins deux vaccins vivants recombinants tels que définis plus haut, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes, notamment de pathogènes différents. La présente invention a aussi pour objet les virus FHV modifiés dans l'un ou les deux sites ORF2 et ORF5 comme indiqué ci-dessus. Elle a aussi pour objet une méthode de vaccination, en particulier des chats, dans laquelle on administre par toute voie parentérale ou locale, mais de préférence par voie oronasale, une quantité efficace d'un vaccin tel que défini plus haut. La dose vaccinale sera comprise entre 102 DlCC5O et 107 DlCC5O. Tel que défini, le vaccin est efficace en général après une seule administration par voie oronasale. Cependant, des administrations répétées peuvent être nécessaires. La présente invention a aussi pour objet les fragments d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence définie par les positions 1 à 8193 sur SEQ ID NO 1, notamment tout ou partie des sites ORF2 et ORF5 définis et/ou des séquences flanquantes localisées en amont et en aval de ces sites, fragments qui seront utiles comme bras flanquants pour les techniques de recombinaison homologue avec le génome du virus FHV parental. Bien entendu, I'invention concerne aussi les variantes de ces fragments qui correspondent aux séquences équivalentes des autres souches de FHV. Le spécialiste a toute latitude pour choisir les régions servant de bras flanquants en liaison avec le type d'insertion (avec ou sans délétion) ou de délétion (partielle ou totale) choisi. D'une manière générale, les bras flanquants pourront ainsi avoir de 100 à 800 paires de bases. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de réalisation non limitatifs, pris en référence au dessin, dans lequel Figure 1: Séquence de la région FHV-1 (10803 paires de bases) et traduction des différents cadres ouverts de lecture (ORF) présents sur cette séquence (ORF1 à ORF8). Figure 2 : Construction du plasmide pPB107 (plasmide donneur pour l'insertion de cassettes d'expression dans le site FHV-1 ORF2) Figure 3 : Construction du plasmide pPB110 (plasmide donneur pour l'insertion de cassettes d'expression dans le site FHV-1 ORF5) Figure 4 : Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV M (plasmide pPB105) Figure 5 : Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV S (plasmide pPB055) Figure 6 : Mutagénèse du site Al du gène FIPV S (plasmide pJCA084) Figure 7 : Mutagénèse du site A2 du gène FIPV S (plasmide pJCA085) Figure 8 : Mutagénèse des sites Al + A2 du gène FIPV S (= FIPV S*) (plasmide pJCA087) Figure 9 :Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV S * modifié (mutations dans les sites Al et A2) (plasmide pPB056) Figure 10: Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV N (plasmide pJCA09î) Figure Il : Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV M dans le site FHV-1 ORF2 (pPB111) Figure 12 : Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV S * dans le site FHV-1 ORF2 Figure 13 : Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV N dans le site FHV-1 ORF2 (pPB113) Figure 14:Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV M dans le site FHV-1 ORF5 (pPB114) Figure 15 : Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV S * dans le site FHV-1 ORF5 (pPB1 15) Figure 16 :Construction du plasmide donneur pour l'insertion de la cassette d'expression du gène FIPV N dans le site FHV-1 ORF5 (pPB116) Liste des séquences SEQ ID pour les constructions dans les sites ORF2 et ORF5 SEQ ID NO 1 Séquence complète de la région FHV-1 ORF1 -- > ORF8 représentée à la figure 1 SEQ ID NO 2 Séquence acides aminés partielle ORF FHV-1 ORF1 de la figure 1 SEQ ID NO 3 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF2 de la figure 1 SET NID NO 4 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF3 de la figure 1 SEQ ID NO 5 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF4 de la figure 1 SEO ID NO 6 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF5 de la figure 1 SEQ ID N 7 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF6 de la figure 1 SEQ ID N 8 Séquence acides aminés ORF FHV-1 ORF7 de la figure 1 SEQ ID N 9 Séquence acides aminés partielle ORF FHV-1 ORF8 de la figure 1 SEQ ID NO 10 Oligonucléotide JCA054 SEQ ID N 11 Oligonucléotide JCA055 SEQ ID Nu 12 Oligonucléotide PB080 SEQ ID Nu 13 Oligonucléotide PB081 SEQ ID N 14 Oligonucléotide PB082 SEQ ID Nu 15 Oligonucléotide PB083 SEQ ID N 16 Oligonucléotide PB084 SEQ ID N 17 Oligonucléotide PB085 SEQ ID Nu 18 Oligonucléotide JCA056 SEO ID Nu 19 Oligonucléotide JCA057 SEQ ID N 20 Oligonucléotide PB088 SEQ ID N 21 Oligonucléotide PB089 SEO ID NO 22 Oligonucléotide JCA058 SEO ID N 23 Oligonucléotide JCA059 SEQ ID N 24 Oligonucléotide JCA060 SEQ ID N 25 Oligonucléotide JCA06î SEQ ID N 26 Oligonucléotide JCA062 SEQ ID N 27 Oligonucléotide JCA063 SEQ ID N 28 Oligonucléotide JCA064 SEQ ID N 29 Oligonucléotide JCA065 SEQ ID N 30 Oligonucléotide JCA066 SEQ ID N 31 Oligonucléotide JCA067 SET NID N 32 Oligonucléotide JCA068 SEQ ID N 33 Oligonucléotide JCA069 2. EXEMPLES Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2"d Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (Bl0101 Inc. La Jolla, CA). Le virus utilisé comme virus parental est la souche CO de l'herpèsvirus félin de type 1 (FHV-1). Ce virus a été isolé à partir de cellules rénales d'un chaton nouveau-né dont la mère était atteinte de rhinotrahéite infectieuse (C. Benoit Jeannin, Thèse de Doctorat de 3ème cycle, Université de Lyon, 1983). Les conditions de culture de ce virus ont déjà été décrites (Fargeaud D. et al. Arch. Virol. 1984. 80. 69-82). Brièvement, des cellules CRFK ("Crandell Rees Feline Kidney cells"), cultivées en milieu minimum essentiel de Eagle (milieu "MEM) sont inoculées avec la souche FHV-1 CO en utilisant une multiplicité d'infection de 1. Les cellules infectées sont alors incubées à 370C pendant environ 36 heures, juqu'à apparition d'un effect cytopathique complet. Exemple 1: Extraction de l'ADN de l'herpèsvirus félin de type 1: Après culture, le surnageant et les cellules lysées sont récoltées et la totalité de la suspension virale est centrifugée à 1000 g pendant 10 minutes à + 40C pour éliminer les débris cellulaires. Les particules virales sont alors récoltées par ultracentrifugation à 400000 g pendant 1 heure à + 40C. Le culot est repris dans un volume minimum de tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Cette suspension virale concentrée est traitée par la protéinase K (100 pglml final) en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS) (0,5% final) pendant 2 heures à 370C. L'ADN viral est ensuite extrait avec un mélange de phénol/chloroforme, puis précipité avec 2 volumes d'éthanol absolu. Après une nuit à - 200C, I'ADN est centrifugé à 10000 g pendant 15 minutes à + 40C.Le culot d'ADN est séché, puis repris dans un volume minimum d'eau ultrapure stérile. Exemple 2: Isolement de l'ARN génomique de la souche FIPV 79-1146 et clonage de l'ADN complémentaire La souche FIPV 79-1146 a été cultivée sur cellules CRFK en milieu DMEM (Gibco). L'ARN viral génomique a été isolé en utilisant la technique d'extraction thiocyanate de guanidium/phénol-chloroforme (Chomczynski P. et Sacchi N., Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). Des oligonucléotides spécifiques (comportant à leurs extrémités 5' des sites de restriction pour faciliter le clonage des fragments amplifiés) ont été synthétisés de telle façon qu'ils couvrent entièrement les régions codantes des gènes devant être amplifiés (respectivement M, S et N). La réaction de transcription inverse (RT) et l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont été effectuées selon les techniques standards (Sambrook J. et al. 1989).Chaque réaction de RT-PCR a été faite avec un couple d'amplimers spécifiques et en prenant comme matrice l'ARN génomique viral extrait. L'ADN complémentaire amplifié a été extrait au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24: 1) avant d'être digéré par les enzymes de restriction. Exemple 3: Clonage et caractérisation de la région FHV-1 ORF1 - ORF7 (fragments Ecorl D et EcoRI F) L'ADN génomique purifié de la souche CO du virus FHV-1 a été digéré par EcoRI et les fragments D (environ 9200 pb) et F (7600 pb) ont été clonés dans le vecteur pBlueScript SKII + pour donner respectivement les plasmides pFHVEcoRID et pFHVEcoRIF. Le plasmide pFHVEcoRID a été digéré par EcoRI et Pstl et le fragment EcoRI-Pstl de 979 pb a été isolé et ligaturé avec le vecteur pBSSKll +, préalablement digéré par EcoRI et Psf pour donner le plasmide pPBO5O. Le plasmide pFHVEcoRID a été digéré par Pstl et le fragments Pstl-Pstl de 2388 pb a été isolé et ligaturé avec le vecteur pBS SKII+, préalablement digéré par PsA pour donner le plasmide pPB051. Les inserts contenus dans les plasmides pFHVEcoRIF, pPB05O et pPB05l ont été entièrement séquencés sur les deux brins pour donner la séquence de la figure 1 (SEQ ID NO 1). Plusieurs cadres ouverts de lecture de taille supérieure à 65 acides aminés ont été identifiés sur cette séquence (figure 1). Le premier cadre de lecture (ORF1) (positions 1 - 1587) est incomplet et code pour une protéine tronquée de 529 acides aminés (SEQ ID NO 2). Le deuxième cadre de lecture (ORF2) (positions 1655 - 2596) code pour un polypeptide de 314 acides aminés (SEQ ID NO 3). Le troisième cadre de lecture (ORF3) (positions 2733 - 4094) est situé sur le brin complémentaire et code pour un polypeptide de 454 acides aminés (SEQ ID NO 4). Le quatrième cadre de lecture (ORF4) (positions 4476 - 5660) code pour un polypeptide de 395 acides aminés (SEQ ID NO 5). Le cinquième cadre de lecture (ORF5) (positions 5869 - 7113) code pour un polypeptide de 415 acides aminés (SEQ ID N06). Le sixième cadre de lecture (ORF6) (positions 7449 - 8900) code pour un polypeptide de 484 acides aminés (SEQ ID N07). Le septième cadre de lecture identifié sur la séquence de la figure 1 (ORF7) (positions 9153 - 9731) code pour une protéine de 193 acides aminés (SEQ ID NO 8). Le huitième et dernier cadre de lecture identifié sur la séquence de la figure 1 (ORF8) (positions 9908 - 10803) est incomplet. Il est situé sur le brin complémentaire et code pour une protéine tronquée de 298 acides aminés (SEQ ID NO 9). Les différents cadres ouverts de lecture sont rassemblés dans le tableau ci-dessous: (Tableau 1) Cadre ouvert de Début - Fin Taille en acides lecture (positions sur figure 1) aminés ORF 1 1 - 1587 529 aa ORF 2 1655 - 2596 314 aa ORF 3 4094 - 2733 454 aa ORF 4 4476 - 5660 395 aa ORF 5 5869 - 7113 415 aa ORF 6 7449 - 8900 484 aa ORF 7 9153 - 9731 193 aa ORF 8 10803 - 9908 298 aa On pense que le cadre ouvert de lecture FHV ORF2 nouvellement caractérisé est l'homologue du gène HSV-1 UL40 (RR2). Exemple 4: Construction du plasmide donneur pour le site FHV-1 ORF2 (pPB107) (figure nO 2) Le plasmide pFHVEcoRID a été digéré par EcoRI et Sacil pour isoler le fragment EcoRI-Sacil de 1509 pb. Un adaptateur Kpnl-EcoRI contenant le site Pmel a été obtenu par hybridation des 2 oligonucléotides synthétiques suivants JCA054 (24 mer) (SEQ ID N 10): 5'CTTGCCGGGGIIIAAACCGGTTCG 3' et JCA055 (32 mer) (SEQ ID N 11):: 5'AATTCGAACCGGIIIAAACCCCGGCAAGGTAC 3' Le fragment EcoRI-Sacil et l'oligonucléotide double brin ont été ligaturés dans le vecteur pBSSKll +, préalablement digéré par Kpnl et Sacil, pour donner le plasmide pPB106 (4407 pb). Un oligonucléotide synthétique double brin comportant les sites de clonage Hindlil, Clal et Apal a été obtenu par hybridation des 2 oligonucléotides suivants: PB080 (32 mer) (SEQ ID NO 12): 5' TGCAAAGCTTATCGATCCCGGGGCCCGGTGCA 3' et PB081 (32 mer) (SEQ ID NO 13): 5' CCGGGCCCCGGGATCGATAAGCTTTGCATGCA 3' L'oligonucléotide ainsi obtenu a été ligaturé avec le plasmide pPB106, prélablement digéré par Psfl (site unique sur pPB106) et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pPB107 (4439 pb) (figure nO 2). Ce plasmide contient les bras flanquants 5' (Sacll-Pstl 530 pb) et 3' (Pstl-EcoRI 979 pb) du site FHV-1 ORF2 ainsi qu'un site multiple de clonage permettant l'insertion d'une cassette d'expression. Exemple 5: Construction du plasmide donneur pour le site FHV-1 ORF5 (pPB110) (figure nO 3) Le plasmide pFHVEcoRIF (voir exemple 3) a été digéré par Sacl et Smal pour isoler le fragment Sacl-Smal de 1367 pb. Un adaptateur Sall-Kpnl contenant le site Pmel a été obtenu par hybridation des 2 oligonucléotides suivants: PB082 (21 mer) (SEQ ID NO 14): 5' GGGGGCCGTTTAAACCGGTAC 3' PB083 (17 mer) (SEQ ID NO 15): 5' CGGTTTAAACGGCCCCC 3' L'oligonucléotide double brin ainsi obtenu et le fragment Sacl-Smal 1367 pb ont été ligaturés avec le vecteur pBSSKll +, préalablement digéré par Kpnl et Sacl pour donner le plasmide pPB109 (4247 pb).Un site multiple de clonage a été obtenu par hybridation des 2 oligonucléotides synthétiques suivants: PB084 (28 mer) (SEQ ID N 16): 5' TCGAGAAAGCTTATCGATCCCGGGCCCG 3' PB085 (28 mer) (SEQ ID N 17): 5' TCGACGGGCCCGGGATCGATAAGCTTTC 3' L'oligonucléotide double brin ainsi obtenu a été ligaturé avec le plasmide pPB109, préalablement digéré par Sall et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pPB110 (4275 pb) (figure nO 3). Ce plasmide contient les bras flanquants 5' (Sacl-Sall 699 pb) et 3' (Sall-Smal 668 pb) du site FHV-1 ORF5 ainsi qu'un site multiple de clonage permettant l'insertion d'une cassette d'expression. Exemple 6: Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV M (figure nO 4) Une réaction de RT-PCR a été réalisée avec l'ARN génomique de la souche FIPV 79-1146 et avec les oligonucléotides suivants: JCA056 (40 mer) (SEQ ID N018) 5' TTTGAGCTCGCGGCCGCATGAAGTAATTTTGCTAATACTC 3' JCA057 (27 mer) (SEQ ID N019) 5' TTTGGTACCGTTTAGTTACACCATATG 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la glycoprotéine de membrane (FIPV M) sous la forme d'une cassette Sacl-Kpnl. Après purification, le produit de RT-PCR de 823 pb a été digéré par Kpnl et Sacl pour isoler un fragment Kpnl-Sacl de 813 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SKll +, préalablement digéré avec Kpnl et Sacl, pour donner le vecteur pJCA080 (3668 pb).La séquence du gène M a été vérifiée par séquencage et a été trouvée identique à celle précédemment publiée (Vennema H. et a!. Virology. 1991. 181. 327-335), séquence qui est incorporée par référence dans la présente demande. Le plasmide pCMVss (CLONTECH) a été digéré par EcoRI et Nofl pour isoler le fragment EcoRI-Notl de 819 pb contenant la région promotrice du gène immediate-early du cytomégalovirus humain (fragment A). Le plasmide pJCA080 a été digéré par Kpnl et Nofl pour isoler le fragment Notl-Kpnl (gène FIPV M) de 804 pb (fragment B). Les fragments A et B ont alors été ligaturés avec le vecteur pGEM-7Zf + (Promega), préalablement digéré par EcoRI et Kpnl, pour donner le plasmide pPB104 (4614 pb). Une réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: PB088 (30 mer) (SEQ ID NO 20) 5' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3' PB089 (32 mer) (SEQ ID NO 21) 5' TTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3' et la matrice pCMVss pour produire un fragment de 252 pb contenant le signal de polyadénylation du gène précoce du virus SV40. Ce fragment a été digéré par Kpnl pour isoler le fragment Kpnl-Kpnl de 233 pb (fragment B). Ce fragment a alors été ligaturé avec le plasmide pPB104, préalablement digéré par Kpnl et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pPB1OS (4847 pb) (figure nO 4).Ce plasmide contient une cassette d'expression promoteur HCMV-IE - gène FIPV M - polyA SV40 mobilisable par digestion Apal-Clal ou Apal-Hindlil. Exemple 7: Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV S (figure nO 5) Une réaction de RT-PCR a été réalisée avec l'ARN génomique de la souche FIPV 79-1146 et avec les oligonucléotides suivants: JCA058 (39 mer) (SEQ ID NO 22) S'TTTGAGCTCGCGGCCGCATGATTGTGCTCGTAACTTGC 3' JCA059 (38 mer) (SEQ ID NO 23) 5'TTTGGTACCGTTTAGTGGACATGCACTTTTTCAATTGG 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la glycoprotéine spicule (ou "spike" ou encore désignée ci-après "S") (FIPV S). Après purification, le produit de RT-PCR de 4387 pb a été digéré par Kpnl et Sacl pour isoler un fragment Kpnl-Sacl de 4375 pb.Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SKII +, préalablement digéré avec Kpnl et Sacl, pour donner le vecteur pJCA081 (7234 pb). La séquence du gène S a été vérifiée par séquençage et a été trouvée identique à celle précédemment publiée (de Groot R. et a!. J. Gen. Virol. 1987. 68. 2639-2646), séquence qui est incorporée par référence dans la présente demande. Le plasmide pCMVss a été digéré par EcoRI et Notl pour isoler le fragment EcoRI Notl de 819 pb contenant la région promotrice du gène immediate-early du cytomégalovirus humain (fragment A). Le plasmide pJCA081 a été digéré par Kpnl et Notl pour isoler le fragment Notl-Kpnl (gène FIPV S) de 4372 pb (fragment B). Les fragments A et B ont alors été ligaturés avec le vecteur pGEM-7Zf+, préalablement digéré par EcoRI et Kpnl, pour donner le plasmide pJCA082 (8180 pb). Une réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: PB088 (SEQ ID Nu 20) et PB089 (SEQ ID N0 21) Kpnl pour isoler le fragment Kpnl-Kpnl de 233 pb (fragment B). Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pJCA082, préalablement digéré par Kpnl et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pPB055 (8413 pb)(figure nO 5). Ce plasmide contient une cassette d'expression promoteur HCMV-IE - gène FIPV S - polyA SV40 mobilisable par digestion Apal Cipal. Exemple 8: Construction du gène spike modifié (FIPV S*) La séquence du gène FIPV S a été mutagénisée de manière à modifier les régions responsables de l'induction d'anticorps facilitants, sans changer les fonctions de la glycoprotéine S. Cette modification a déjà été décrite dans la demande de brevet FR-94 10379 et a été réalisée de la manière suivante: 8.1. : Mutagénèse du site Al (figure nO 6) Le fragment central du gène FIPV S Hindlil-Hindlil de 1723 pb (nucléotides 1696 à 3418) a été cloné dans le vecteur pBS-SKII +, préalablement digéré par Hindlil et traité avec la phophatase alcaline, pour donner le plasmide pJCA083 (4678 pb). Le site Al est situé sur le sous-fragment Hindlll-Sspl (positions 1696 à 1845) de ce fragment. Le site Al a été mutagénisé par PCR en utilisant la stratégie suivante: Les oligonucléotides suivants ont été synthétisés: JCA060 AGAATTGGTTAGAACGAATACAGTACACAACAGTATTG 3' JCA062 (20 mer) (SEQ ID NO 26) 5' ATGAAGCTTAGTGGTTATGG 3' JCA063 (20 mer) (SEQ ID NO 27) 5' AAAAATATTGTACCATAAAG 3' Les oligonucléotides JCA060 et JCA061 ont été hybridés entre eux grâce à leur séquence complémentaire commune de 23 paires de bases.L'hybride ainsi obtenu a été utilisé, après élongation de ses extrémités 3', comme matrice pour une réaction PCR utilisant les oligonucléotides JCA062 et JCA063. Cette réaction d'amplification par PCR a permis d'obtenir un fragment de 159 pb. Ce fragment a été digéré par Hindîll et Sspl pour produire un fragment Hindlll-Sspl de 149 pb (fragment A). Ce fragment contient le site Al modifié à deux positions (Val au lieu de Asp à la position 568 et Tyr au lieu de Asp à la position 591). Le plasmide pJCA083 a été digéré par Hindlil et digéré partiellement par Sspl pour isoler le fragment Sspl-Hindlll de 1569 pb (fragment B) par Geneclean (bol0101 Inc., La Jolla. Ca.). Le vecteur pBS-SKII+ a été digéré par Hindi il et traité avec la phosphatase alcaline pour produire le fragment C (2960 pb). Les fragments A, B et C ont été ensuite ligaturés ensemble pour produire le plasmide pJCA084 (4678 pb) (figure nO 6). Ce plasmide contient le fragment Hindlll-Hindlll du gène FIPV S modifié pour deux acides aminés du site Al. Le gène FIPV S peut être ensuite reconstitué en remplaçant le fragment Hindlil- Hindlil naturel (positions 1696 à 3418) par le fragment Hindlil-Hindlil contenu dans le plasmide pJCA084. Le gène complet FIPV S modifié au site Al peut alors être utilisé pour des constructions de plasmides d'expression ou de virus recombinants. 8.2.:Mutagénèse du site A2 (figure nO 7) Les oligonucléotides suivants ont été synthétisés JCA064 (20 mer) (SEQ ID NO 28) 5' GGACAATATTTTTAATCAAG 3' JCA065 (36 mer) (SEQ ID NO 29) 5' TTTAACAACCTGCTCATTGGTTCCTGTACGTGCAGC 3' JCA066 (36 mer) (SEQ ID NO 30) 5' AAGTTTTATGTTGCTGCACGTACAGGAACCAATGAG 3' JCA067 (20 mer) (SEQ ID N 31) 5' ATCACTAACATTTTTAAAGC 3' Une réaction PCR (PCR A) a été réalisée avec les oligonucléotides JCA064 et JCA065 et avec le plasmide pJCA083 commme matrice pour synthétiser un fragment PCR de 199 pb (fragment A). Une réaction PCR (PCR B) a été réalisée avec les oligonucléotides JCA066 et JCA067 et avec le plasmide pJCA083 comme matrice pour donner un fragment PCR de 273 pb (fragment B). Les fragments PCR A et B ont été hybridés entre eux grâce à leur région complémentaire de 46 pb et le produit de cette hybridation, après élongation des extrémités 3', a été amplifié par une réaction PCR (PCR C) avec les oligonucléotides JCA064 et JCA067 pour donner un fragment PCR de 424 pb. Ce fragment PCR a été digéré par Sspl et Dral pour donner le fragment de restriction Sspl-Dral de 402 pb (fragment C). Le plasmide pJCAO83 a été digéré par Hindlil et Sspl pour isoler le fragment Hindlll-Sspl de 149 pb (fragment D). Le plasmide pJCA083 a été digéré par Hindlil et Dral pour isoler le fragment de restriction Dral-Hindlil de 1170 pb (fragment E). Le vecteur pBS-SKII+ a été digéré par Hindlil et traité avec la phosphatase alcaline pour donner le fragment F (2960 pb). Les fragments C, D, E et F ont été ensuite ligaturés ensemble pour donner le plasmide pJCA085 (4678 pb) (figure n 7). Le fragment central Hindlil-Hindlil 1723 pb du gène FIPV S contenu dans pJCA085 possède un site A2 modifié au niveau de 3 acides aminés (Tyr au lieu de Asp à la position 643, Gly au lieu de Arg à la position 649, et Lys au lieu de Arg à la position 656). Le gène FIPV S peut être ensuite reconstitué en remplaçant le fragment Hindlil- Hindîll naturel (positions 1696 à 3418) par le fragment Hindlil-Hindlil contenu dans le plasmide pJCA085. Le gène complet FIPV S modifié au site A2 peut alors être utilisé pour des constructions de plasmides d'expression ou de virus recombinants. 8.3. : Mutagénèse des sites Al et A2 (figure nO 8) Les fragments A (exemple 8.1), C et E (exemple 8.2) ont été ligaturés avec le vecteur pBS-SKll +, préalablement digéré par Hindîll et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pJCA085. Le fragment central Hindlil-Hindlil de 1723 pb du gène FIPV S contenu dans pJCA085 présente 2 changements d'acides aminés au niveau du site Al (voir exemple 8.1) et 3 changements d'acides aminés au niveau du site A2 (voir exemple 8.2). Le plasmide pJCA081 (exemple 7) a été digéré par Hindlil pour isoler le fragment Hindlil-Hindlil de 5511 pb (fragment A). Le plasmide pJCA085 a été digéré par Hindlil pour isoler le fragment Hindlll-Hindlll de 1723 pb (présentant 5 changements d'acides aminés par rapport à la séquence de la souche FIPV 79-1146) (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pJCA087 (7234 pb) (figure nO 8). Ce plasmide contient le gène FIPV S modifié au niveau des sites A1 et A2 (= gène FIPV S*). 8.4. Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV S (figure n09) Le plasmide pCMV a été digéré par EcoRI et Notl pour isoler le fragment EcoRI Notl de 819 pb contenant la région promotrice du gène immediate-early du cytomégalovirus humain (fragment A). Le plasmide pJCA087 (exemple 8.3) a été digéré par Kpnl et Notl pour isoler le fragment Notl-Kpnl (gène FIPV S) de 4372 pb (fragment B). Les fragments A et B ont alors été ligaturés avec le vecteur pGEM-7Zf +, préalablement digéré par EcoRI et Kpnl, pour donner le plasmide pJCA088 (8180 pb). Une réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: PB088 (SEQ ID NO 20) et PB089 (SEQ ID NO 21) (voir exemple 6) et la matrice pCMVss pour produire un fragment de 252 pb contenant le signal de polyadénylation du gène précoce du virus SV40. Ce fragment a été digéré par Kpnl pour isoler le fragment Kpnl-Kpnl de 233 pb (fragment B). Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pJCA088, préalablement digéré par Kpnl et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pPB056 (8413 pb) (figure nO 9). Ce plasmide contient une cassette d'expression promoteur HCMV-IE - gène FIPV S" - polyA SV40 mobilisable par digestion Apal-Clal. Exemple 9: Construction de la cassette d'expression pour le gène FIPV N (figure nO 10) Une réaction de RT-PCR a été réalisée avec l'ARN génomique de la souche FIPV 79-1146 et avec les oligonucléotides suivants: JCA068 (37 mer) (SEQ ID NO 32) 5' HTGAGCTCGCGGCCGCATGGCCACACAGGGACAACG 3' JCA069 (33 mer) (SEQ ID NO 33) 5' TTTGGTACCGTTTAGTTCGTAACCTCATCAATC 3' pour isoler précisément le gène codant pour la protéine de nucléocapside "N" (FIPV N). Après purification, le produit de RT-PCR de 1161 pb a été digéré par Kpnl et Sacl pour isoler un fragment Sacl-Kpnl de 1148 pb.Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SKll +, préalablement digéré avec Kpnl et Sacl, pour donner le vecteur pJCA089 (4007 pb). La séquence du gène N a été vérifiée par séquençage et a été trouvée identique à celle précédemment publiée (Vennema H. et a!. Virology. 1991. 181. 327-335), séquence qui est incorporée par référence dans la présente demande. Le plasmide pCMVss (CLONTECH) a été digéré par EcoRI et Notl pour isoler le fragment EcoRI-Notl de 819 pb contenant la région promotrice du gène immediate-early du cytomégalovirus humain (fragment A). Le plasmide pJCA089 a été digéré par Kpnl et NoS pour isoler le fragment Notl-Kpnl (gène FIPV N) de 1137 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés avec le vecteur pGEM-7Zf +, préalablement digéré par EcoRI et Kpnl, pour donner le plasmide pJCA090 (4953 pb). Une réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: PB088 (SEQ ID N 20) et PB089 (SEQ ID N 21) (exemple 6) et la matrice pCMVss pour produire un fragment de 252 pb contenant le signal de polyadénylation du gène précoce du virus SV40. Ce fragment a été digéré par Kpnl pour isoler le fragment Kpnl-Kpnl de 233 pb (fragment B). Ce fragment a alors été ligaturé avec le plasmide pJCAO9O, préalablement digéré par Kpnl et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pJCAO9î (5186 pb) (figure nO 10). Ce plasmide contient une cassette d'expression promoteur HCMV-IE - gène FIPV N - polyA SV40 mobilisable par digestion Apal-Clal ou Apal-Hindlil. Exemple 10: Construction du plasmide donneur pPB111 et isolement de vFHVOî (figure n011) Le plasmide pPB105 (exemple 6, figure n04) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 1925 pb (fragment A). Le plasmide pPB107 (exemple 4, figure nO 2) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 4419 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPB111 (6332 pb) (figure nO 11). Ce plasmide contient la cassette d'expression HCMV-IE/gène FIPV M/polyA SV40 dans le site FHV ORF2. Le plasmide pPB111 a été linéarisé par digestion avec Pmel, extrait avec un mélange phénol-chloroforme, précipité avec de I'éthanol absolu, puis repris dans de l'eau stérile. Des cellules CRFK, formant un tapis cellulaire bien établi en boîte de Petri (Corning 4,5 cm de diamètre) ont ensuite été transfectées avec le mélange suivant: 1 ug de plasmide pPB111 linéarisé + 5 pg d'ADN viral de FHV-1 dans 300 gl de milieu MEM et 100 pg de LipofectAMINE (Gibco-BRL Cat&num; 18324-012) dilués dans 300 pI de milieu (volume final du mélange = 600 p1). Ces 600 pI ont été ensuite dilués dans 3 ml (volume final) de milieu MEM et étalés sur 3.106 cellules CRFK. Le mélange a été laissé en contact avec les cellules pendant 5 heures, puis éliminé et remplacé par 5 ml de milieu de culture. Les cellules ont alors été laissées en culture pendant 24 heures à + 370C.Après 24 heures à 48 heures de culture, 1 ml de surnageant de culture a été récolté et plusieurs dilutions de ce surnageant ont été utilisées pour infecter de nouvelles cellules CRFK (cultivées en boîte de Petri (Corning 4,5 cm de diamètre) de manière à obtenir des plages isolées, chaque boîte étant infectée avec 1 ml d'une dilution du surnageant initial. Après un contact d'1 heure à 370C, le milieu d'infection a été éliminé et remplacé par 5 ml de milieu MEM à 1 % d'agarose, maintenu en surfusion à 420C. Lorsque l'agarose a été solidifiée, les boîtes ont été incubées 48 heures à 370C en étuve CO2 jusqu'à apparition de plages.La couche d'agarose a alors été éliminée et un transfert des plages virales a été réalisé sur une membrane stérile de nitrocellulose de même diamètre que la boîte de Petri ayant servi à la culture. Cette membrane a été elle-même transférée sur une autre membrane de nitrocellulose de manière à obtenir une "copie" inversée du premier transfert. Les plages transférées sur cette dernière copie ont été alors hybridées, selon les techniques usuelles connues de l'homme de l'art, avec un fragment du gène FIPV M marqué à la digoxigénine (DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, CAT &num; 1175033). Après hybridation, lavages et mise en contact avec le substrat de révélation, la membrane de nitrocellulose a été mise en contact avec un film autoradiographique. Les images d'hybridation positive sur cette membrane ont indiqué quelles étaient les plages qui contenaient des virus FHV recombinants ayant inséré la cassette FIPV M. Les plages correspondant à ces plages positives ont été découpées stérilement sur la première membrane de nitrocellulose, placées dans un tube Eppendorf contenant 0,5 ml de milieu MEM et soniquées pour libérer les virions de la membrane. Le milieu contenu dans le tube Eppendorf a été ensuite dilué en milieu MEM et les dilutions ainsi obtenues ont servi à infecter de nouvelles cultures de cellules CRFK.Un virus recombinant, contenant la cassette HCMV-IE/FIPV M/polyA insérée dans le site ORF2, pur à 100 % a été ainsi isolé après 3 cycles de purification et a été appelé vFHVOî. L'homologie de la recombinaison a été vérifiée par PCR en utilisant des oligonucléotides situés de part et d'autre du site d'insertion. L'absence de remaniement sur le génome du virus recombinant vFHVOî, ailleurs que dans la région de recombinaison, a été vérifiée par la technique du Southern blot. Exemple 11: Construction du plasmide donneur pPB112 et isolement de vFHV02 (figure n 12) Le plasmide pPB056 (exemple 8.4, figure n 9) a été digéré par Apal et Clal pour isoler le fragment Apal-Clal de 5466 pb (fragment A). Le plasmide pPB107 (exemple 4, figure n 2) a été digéré par Apal et Cipal pour isoler le fragment Apal-Clal de 4426 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPB112 (9898 pb) (figure n 12). Ce plasmide contient la cassette d'expression (HCMV-IE/gène FIPV S*/poîyA SV40) dans le site FHV-1 ORF2. Des cellules CRFK ont été transfectées avec un mélange de plasmide pPB112 (linéarisé par Pmel) et d'ADN viral de FHV-1 comme décrit dans l'exemple 10. Une plage virale positive pour la cassette HCMV-IE/gène FIPV S+ a été purifiée comme décrit dans l'exemple 10, mais en utilisant une sonde homologue FIPV S+, et amplifiée pour donner le virus recombinant vFHVO2. Exemple 12: Construction du plasmide donneur pPB113 et isolement de vFHVO3 (figure n 13) Le plasmide pJCAO9l (exemple 9, figure n 10) a été digéré parApal etHindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 2244 pb (fragment A). Le plasmide pPB107 (exemple 4, figure n 2) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 4419 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPB113 (6671 pb) (figure n0 13). Ce plasmide contient la cassette d'expression (HCMV-IE/gène FIPV N/polyA SV40) dans le site FHV-1 ORF2. Des cellules CRFK ont été transfectées avec un mélange de plasmide pPBî 13 (linéarisé par Pmel) et d'ADN viral de FHV-1 comme décrit dans l'exemple 10. Une plage virale positive pour la cassette HCMV-IE/gène FIPV N a été purifiée comme décrit dans l'exemple 10, mais en utilisant une sonde homologue FIPV N, et amplifiée pour donner le virus recombinant vFHVO3. Exemple 13: Construction du plasmide donneur pPB114 et isolement de vFHV04 (figure n 14) Le plasmide pPB1OS (exemple 6, figure n 4) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 1925 pb (fragment A). Le plasmide pPBl 10 (exemple 5, figure n 3) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 4256 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPBl 14 (6169 pb) (figure n 14). Ce plasmide contient la cassette d'expression (HCMV-IE/gène FIPV M/polyA SV40) dans le site FHV-1 ORF5. Des cellules CRFK ont été transfectées avec un mélange de plasmide pPB114 (linéarisé par Pmel) et d'ADN viral de FHV-1 comme décrit dans l'exemple 10. Une plage virale positive pour la cassette HCMV-IE/gène FIPV M a été purifiée comme décrit dans l'exemple 10 et amplifiée pour donner le virus recombinant vFHVO4. Exemple 14: Construction du plasmide donneur pPB115 et isolement de vFHV0S (figure n 15) Le plasmide pPB056 (exemple 8.4, figure n 9) a été digéré par Apal et Cipal pour isoler le fragment Apal-Clal de 5466 pb (fragment A). Le plasmide pPB1 10 (exemple 5, figure n 3) a été digéré par Apal et Cipal pour isoler le fragment Apal-Clal de 4263 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPBl 15 (9735 pb) (figure n 5). Ce plasmide contient la cassette d'expression (HCMV-IE/gène FIPV S*/polyA SV40) dans le site FHV-1 ORF5. Des cellules CRFK ont été transfectées avec un mélange de plasmide pPB115 (linéarisé par Pmel) et d'ADN viral de FHV-1 comme décrit dans l'exemple 10. Une plage virale positive pour la cassette HCMV-IE/gène FIPV S a été purifiée comme décrit dans l'exemple 10, mais en utilisant une sonde homologue FIPV S+, et amplifiée pour donner le virus recombinant vFHV05. Exemple 15: Construction du plasmide donneur pPBl 16 et isolement de vFHV06 (figure nO 16) Le plasmide pJCA091 (exemple 9, figure n0 10) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 2244 pb (fragment A). Le plasmide pPB1 10 (exemple 5, figure nO 3) a été digéré par Apal et Hindlil pour isoler le fragment Apal-Hindlil de 4256 pb (fragment B).Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pPBî 16 (6508 pb). Ce plasmide contient la cassette d'expression (HCMV-IE/gène FIPV N/polyA SV40) dans le site FHV-1 ORF5. Des cellules CRFK ont été transfectées avec un mélange de plasmide pPB116 (linéarisé par Pmel) et d'ADN viral de FHV-1 comme décrit dans l'exemple 10. Une plage virale positive pour la cassette HCMV-IE/gène FIPV N a été purifiée comme décrit dans l'exemple 10, mais en utilisant une sonde homologue FIPV N, et amplifiée pour donner le virus recombinant vFHV06. Exemple 16: Construction de plasmides donneurs pour l'insertion de cassettes d'expression dans le site ORF2 de FHV-1 Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de cassettes d'expression (gènes placés sous le contrôle des promoteurs HCMV-IE ou MCMV-IE ou double promoteur MCMV-IE/RNA 1.8 kpb) dans le site ORF2, il est possible de construire des herpèsvirus félins recombinants exprimant à un niveau élevé des immunogènes du calicivirus félin (FCV), du virus de la panleucopénie féline (FPV), du virus de la leucémie féline (FeLV), du virus de l'immunodéficience féline (FIV), ou d'autres pathogènes félins, ou encore des cytokines félines. Exemple 17: Construction de plasmides donneurs pour l'insertion de cassettes d'expression dans le site ORF5 de FHV-1 Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de cassettes d'expression (gènes placés sous le contrôle des promoteurs HCMV-IE ou MCMV-IE ou double promoteur MCMV-IE/RNA 1.8 kpb) dans le site ORF5, il est possible de construire des herpèsvirus félins recombinants exprimant à un niveau élevé des immunogènes des virus FCV, FPV, FeLV, FIV, ou d'autres pathogènes félins, ou encore des cytokines félines. Exemple 18: Production de vaccins Pour produire un vaccin, les virus recombinants obtenus selon l'invention sont cultivés sur cellules CRFK. La récolte du virus recombinant se fait lorsque l'effet cytopathique est complet. Les cellules lysées et le surnageant de culture sont récoltés. Après clarification du lysat cellulaire pour éliminer les débris cellulaires, la solution virale est titrée. La solution virale est ensuite diluée dans une solution stabilisatrice pour la lyophilisation, répartie à raison d'une dose vaccinale (102 DlCC5O à 107 DlCC5O) par flacon, et enfin lyophilisée. REVENDICATIONS 1 - Vaccin vivant recombinant comprenant, comme vecteur, un herpèsvirus félin comprenant et exprimant au moins une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 2 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées dans les sites ORF5 et/ou ORF2 par insertion simple, ou après délétion totale ou partielle de ces sites. 3 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées dans l'un des sites ORF5 ou ORF2, et qu'une délétion est réalisée dans l'autre de ces sites. 4 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour exprimer la séquence insérée, le vecteur comprend un promoteur eucaryote fort. 5 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur fort est un promoteur CMV immediate-early, de préférence le promoteur CMV immediate-early murin ou humain. 6 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences nucléotidiques insérées dans le site ORF5 ou ORF2 sous le contrôle de promoteurs eucaryotes différents. 7 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que les promoteurs eucaryotes sont des promoteurs CMV immediate-early d'origines animales différentes. 8 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une première séquence nucléotidique associée au promoteur CMV immediate early et, en disposition tête-bêche avec ce dernier promoteur, un autre promoteur sous la dépendance duquel se trouve une autre séquence nucléotidique. 9 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide antigénique, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 10 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène félin, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 1 1 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour un antigène choisi parmi le groupe des antigènes du virus de la péritonite infectieuse féline, du virus de la leucémie féline, du virus de l'immunodéficience féline, du virus de la panleucopénie infectieuse féline et du calicivirus félin, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 12 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides M, S modifié ou N de FIPV, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 13 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique choisie parmi le groupe des séquences correspondant aux antigènes env, gag, pol du virus de la leucémie féline, aux antigènes env, gag, pol du virus de l'immunodéficience féline, à l'antigène de capside VP2 du virus de la panleucopénie infectieuse féline, à l'antigène de capside du calicivirus félin, aux antigènes M, S modifié, N, 7b, polymérase du virus de la péritonite infectieuse féline. 14 - Vaccin vivant recombinant selon l'ensemble des revendications 8 et 12, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique insérée sous le contrôle du promoteur CMV immediate early est une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide M, N ou S modifié du virus FIPV et en ce que la séquence nucléotidique insérée sous le contrôle du promoteur associé est une séquence nucléotidique codant pour un antigène d'une autre maladie féline. 15 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide immunomodulateur, cette séquence étant insérée dans les sites ORF5 et/ou ORF2. 16 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce que cette séquence nucléotidique est choisie parmi le groupe des séquences codant pour des cytokines. 17 - Formule de vaccin multivalent comprenant, en mélange ou à mélanger, au moins deux vaccins vivants recombinants tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 16, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes. 18 - Fragment d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence définie par les positions 1 à 8193 sur la séquence SEQ ID NO 1.