FR 2750705 A1 19980109 FR 9608337 A 19960704 SYSTEME DE DETECTION DES INTERACTIONS PROTEINE-PROTEINE L'invention a pour objet un système de détection des interactions protéineprotéine, et plus particulièrement des séquences d'ADN pour la mise en oeuvre de ce système, ainsi que des hôtes cellulaires contenant lesdites séquences d'ADN. Les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental chez les organismes vivants supérieurs tant au niveau du développement normal de l'organisme qu'au niveau de certaines situations pathologiques. Les méthodes biochimiques et biophysiques existantes exigent d'une part que les différents partenaires aient été préalablement identifiés et, d'autre part, nécessitent de grandes quantités de protéines (donc leur clonage et leur purification). I1 est donc indispensable de disposer d'outils permettant de réaliser l'étape initiale, c'est-à-dire permettant d'identifier et de cloner des protéines interagissant entre elles. De tels systèmes ont été récemment développés en utilisant la levure comme hôte et l'activation de la transcription d'un gène spécifique comme "sonde" (voir Fields et Sternglanz, 1994). Cependant, quoique déjà bien utilisé, ce système présente certaines limites. L'étude de ces interactions protéine-protéine peut se faire en utilisant des techniques biochimiques et biophysiques in vitro. Mais cellesci ne sont concevables que lorsque les protéines sont clonées et peuvent être produites et purifiées en grande quantité. D'autre part, elles ne permettent pas d'identifier de nouveau partenaire d'interaction. Une alternative attrayante aux méthodes biochimiques consiste en une utilisation de banques d'expression d'ADNc (reflétant l'ensemble des ARN messagers) ou d'ADN génomique. L'avantage de ces stratégies réside dans le fait que les gènes des protéines ainsi identifiées sont immédiatement disponibles (pour une comparaison de ces méthodes voir Phizicky et Fields, 1995). Parmi les méthodes s'appuyant sur l'utilisation de banques d'expression, on peut distinguer celles qui utilisent une sélection in vitro (comme la révélation de plages de lyse par une protéine purifiée et marquée radioactivement interagissant avec une protéine inconnue) de celles utilisant une sélection in vivo. Dans ce dernier domaine, des progrès sensibles ont pu être réalisés grâce à la technique du "double-hybride" dans la levure (Ma et Ptashne, 1988; Fields et Song, 1989; Chien et al., 1991; Gyuris et al., 1993; Durfee et al., 1993; Vojtek et al., 1993; Le Douarin et al., 1995). Dans le système développé par Fields et Song (1989), permettant d'identifier in vivo chez la levure des protéines interagissant entre elles, une protéine X connue est greffée sur un domaine de fixation à l'ADN (Gal4 ou LexA) et on cherche une deuxième protéine Y (greffée sur un domaine de l'activation ou "AD-activation domain" de la transcription) capable d'interagir avec la protéine X et de provoquer ainsi l'activation de la transcription. Dans une revue, Fields S. et Sternglanz R. ("The two-hybrid system: an assay for protein-protein interaction" (1994) TIG, vol. 10, p. 286-292) discutent les possibilités et les limites de cette méthode. Une des limites est que les deux protéines hybrides doivent parvenir dans le noyau de la cellule. L'autre difficulté majeure consiste à identifier des protéines Y qui interagissent avec une protéine X pourvue d'un domaine d'activation de la transcription, puisque, dans ce cas, la protéine cible (Gal4-X ou LexA-X) donnera un signal d'activation constitutif en absence de toute protéine Y. S'agissant de Gal4 comme support de fixation à 1'ADN, elle a été Initialement mise au point en utilisant le domaine de fixation à 1'ADN ou DBD ("DNA binding domain") de la protéine Gal4 (Ma et Ptashne, 1988; Fields et Song, 1989). Gal4 est une protéine modulaire de 881 acides aminés possédant au moins deux domaines fonctionnels. Un domaine de fixation à 1'ADN comprenant les acides aminés 1-94 et un domaine d'activation de la transcription. La fonction d'activation est en fait répartie sur trois segments différents de la protéine, à savoir 94-106, 148-196 et 768-881 (Marmorstein et al., 1992). La structure de Gal41 65 impliquée dans un complexe avec l'ADN a été déterminée par cristallographique aux rayons X (Marmorstein et al., 1992) tandis que la structure du domaine d'activation reste très mal définie. Ainsi, Fields et Song (1989) ont greffé, d'une part la protéine SNF1 (une sérine/thréonine kinase) sur Gal41 l47, et d'autre part la protéine SNF4 sur le domaine d'activation 768-881 de Gal4. Aucune des deux protéines hybrides, Ga141-147-SNF1 ou SNF4-Ga14768-881 seules n'étaient capable d'activer la transcription du gène reporter lacZ placé sous le contrôle du promoteur GAL1. Par contre la coexpression des deux protéines hybrides a abouti à une activation de la transcription notable (180 unités), bien que nettement inférieure à l'activation observée avec la protéine Gal4 entière (4000 unités). Cette différence est imputable, d'une part à l'absence du domaine d'activation comprenant les acides aminés 148-196 et, d'autre part, au fait que l'interaction entre SNF1 et SNF4 ne remplace pas complètement une liaison covalente entre les deux domaines de Gal4. Une fusion directe entre Gal41147 et Gal4768-881 provoque en effet seulement une réduction d'un facteur 2 par rapport à Gal4 entier (Ma et Ptashne, 1987a). Depuis, des dizaines de couples de protéines X,Y ont été testées. De nombreuses combinaisons sont capables de restituer un activateur fonctionnel de la transcription (pour une revue, voir Bartel et al., 1993). Outre l'analyse de l'interaction d'un couple de protéines connues, la technique du double-hybride permet également l'identification d'un partenaire inconnu du moment où on est en possession du gène de la protéine cible X. L'équipe de Stanley Fields a été la première à exploiter cette possibilité (Chien et al., 1991) en créant des fusions entre le domaine d'activation 768-881 de Gal4 et des séquences protéiques codées par des fragments d'ADN d'une banque d'ADN génomique de levure. Cette fois-ci, le domaine d'activation a été placé en extrémité NH2-terminale de cette famille de protéines de fusion, afin de faciliter la construction des protéines hybrides. Afin d'éviter un trop grand nombre de clones faux-positifs, il est préférable d'insérer la banque dans le plasmide portant le domaine d'activation, puisque Ma et Ptashne (1987b) avaient montré auparavant, que de nombreux fragments protéiques fusionnés aux 147 premiers acides aminés de Gal4 étaient capables d'activer la transcription. Depuis l'article de Chien et al. (1991) les souches et plasmides utilisés ont évolué. Notamment la combinaison d'une sélection métabolique associée à un crible lacZ s'est généralisée. Tandis que Chien et al. (1991) travaillaient uniquement sur la base du crible lacZ, des approches plus récentes utilisent également l'acquisition de la capacité à pousser sur un milieu manquant soit d'histidine, soit de leucine. En principe seules les cellules portant une protéine hybride issue de la banque, capable d'activer l'expression du gène de sélection (His3, Leu2) via une interaction X,Y formeront des colonies sur boîte. Une telle sélection permet l'analyse d'un plus grand nombre de clones. Parallèlement à Gal41 l47 comme support de fixation à 1'ADN, l'équipe de Roger Brent (Harvard Medical School) a introduit le répresseur LexA d'Escherichia coli comme support (Golemis et Brent, 1992 ; Gyuris et al., 1993). LexA est une protéine de 202 acides aminés, composée de deux domaines reliés par une région charnière d'environ 30 acides aminés. Les 70 premiers acides aminés constituent le domaine de fixation à l'ADN (Hurstel et al., 1986; Fogh et al., 1994) et les acides aminés 100 à 202 forment le domaine de dimérisation de la protéine (Schnarr et al., 1985). LexA reconnaît des sites palindromiques sur l'ADN (les opérateurs SOS) et plusieurs opérateurs adjacents peuvent être occupés d'une façon coopérative (Lloubès et al., 1991). L'utilisation de LexA comme support de fixation à l'ADN peut avoir plusieurs avantages. LexA appartient à un organisme hétérologue (Escherichia coli), n'affecte pas la croissance de la levure, ne possède pas d'activité transcriptionnelle résiduelle (comme le segment 94-106 de Gal4) et peut être utilisé dans des souches de levure gai +. De ce fait, une des protéines hybrides (généralement celle contenant le domaine d'activation) peut être placée sous le contrôle de Gal4. Ainsi, la protéine hybride sera exprimée uniquement en présence de galactose, mais pas en présence de glucose. Le domaine d'activation utilisé par l'équipe de Roger Brent est également issu d'Escherichia coli. I1 s'agit d'un des domaines activateurs artificiels isolés par Ma et Ptashne (1987b). Ce domaine (nommé B42) possède un potentiel d'activation plus faible que les domaines d'activation de Gal4 ou de VP16, ce qui permet d'éviter les problèmes de toxicité liés à un éventuel " squelching " (la titration d'un élément essentiel de la machinerie de transcription par un domaine d'activation). Une description récente du système double-hybride s'appuyant sur l'utilisation de LexA se trouve dans Golemis et al. (1996) et Golemis et Brent (1996). Malgré la fréquence d'utilisation des différents systèmes double-hybride, peu d'études ont été menées cherchant à corréler des données obtenues in vivo avec des mesures d'affinité in vitro. Estojak et al. (1995) ont cherché à établir une telle corrélation dans le cas de plusieurs protéines à hélice-loop-hélice (Myc, Max, Mxi) et dans le cas de mutants du répresseur lambda. Leurs résultats sont quelque peu décevants. En effet, le système double-hybride montre une forte polarité pour le couple Myc/Max. Lorsque Myc est fixé sur DBD et Max sur AD, aucune activation de la transcription n'est observée. Par contre, lorsque Max est fixé sur DBD et Myc sur AD, on observe une activation en accord avec des données biochimiques montrant que les deux protéines interagissent. Lorsque cette dernière géométrie est utilisée avec des reporters lacZ ayant un nombre variable d'opérateurs en amont du gène, la hiérarchie des affinités apparentes in vivo entre les couples Max/Myc et Max/Mxi n'est pas la même selon le reporter utilisé. La situation est encore plus confuse dans le cas des mutants du répresseur lambda. Des mutants ayant une capacité de dimérisation fortement amoindrie activent certains gènes reporters mieux que la protéine sauvage (Estojak et al., 1995). Par ailleurs, bien que tous les variants activent assez fortement le gène lacZ, trois sur quatre sont incapables d'activer le gène leu2 et auraient, de ce fait, échappé à une sélection sur milieu dépourvu de leucine. En conclusion, Estojak et al. (1995) estiment qu'aucun gène reporter montre une corrélation satisfaisante avec les affinités mesurées in vitro. Etant donné la complexité de l'assemblage d'un complexe d'initiation de la transcription chez les eucaryotes (voir : Hori et Carey, 1994 ; Maldonado et Reinberg, 1995) qui mobilise au moins une trentaine de protéines différentes, et le fonctionnement toujours mal compris des activateurs de la transcription, ces résultats ne sont pas tellement surprenants. LexA est le répresseur du système SOS chez E.coli. LexA, composé de deux domaines, est inactivé in vivo suite à des dommages sur 1'ADN par un clivage protéolytique localisé entre les deux domaines (pour une revue sur LexA, voir Schnarr et Granger-Schnarr, 1993). La séparation du domaine de fixation à 1'ADN du domaine de dimérisation entraîne alors une diminution de l'affinité pour 1'ADN d'environ 1000-fois, ne permettant plus une répression transcriptionnelle efficace. D'autre part, la constante de dimérisation de LexA (KA = 2 x 104 M-1) est relativement faible (Schnarr et al., 1985), ce qui suggère que la greffe d'un domaine de dimérisation hétérologue à affinité modeste devrait reconstituer un répresseur hybride fonctionnel. Schmidt-Dorr et al. (1991) ont pu montrer en effet que la fusion de la glissière à leucine ("leucine-zipper") de l'oncoprotéine Jun à LexAl 87 restaure une répression transcriptionnelle. Par contre, la fusion de la glissière à leucine Fos ("leucinezipper Fos"), qui est incapable de conférer l'homodimérisation, ne restaure pas la répression (Porte et al., 1995). En partant de cette observation, la partie glissière de Fos ("Fos-zipper") de la protéine de fusion a ensuite été mutagénéisée, afin de caractériser les anti-déterminants de l'homodimérisation de Fos (Porte et al., 1995). La souche bactérienne indicatrice est déficiente en LexA et porte le gène lacZ sous le contrôle d'un opérateur SOS reconnu par LexA (l'opérateur sulA). La protéine hybride, placée sous le contrôle du promoteur iacUV5 inductible par 1'IPTG, est produite à partir d'un plasmide de façon à pouvoir adapter la quantité de protéine aux nécessités expérimentales. Ce système est parfaitement adapté à l'étude d'un complexe homodimérique, mais son utilisation devient laborieuse du moment où l'on veut étudier l'hétérodimérisation entre deux protéines différentes capables de former également des homodimères. Parallèlement au système LexA, l'équipe de James Hu a développé une approche voisine en utilisant le domaine de fixation à 1'ADN du répresseur lambda (Hu, 1995). L'avantage de ce système est d'offrir les possibilités de sélection du phage lambda. Son inconvénient réside dans le fait que le domaine de fixation à l'ADN du répresseur lambda contient déjà un élément de dimérisation (l'hélice 5), qui peut masquer l'effet de domaines de dimérisation hétérologues relativement faibles. L'invention a notamment pour objet de résoudre les difficultés présentées par les systèmes de l'art antérieur et, en particulier, l'invention a pour but de permettre l'étude de l'hétérodimérisation. L'invention a pour objet un système permettant la détection d'interaction entre deux protéines greffées, par visualisation de la répression de la transcription et non pas par une activation de la transcription. En effet, contrairement au système levure, une protéine ayant une activité activatrice intrinsèque pourrait être utilisée. L'invention a pour objet un système de détection des interactions protéineprotéine à l'aide d'une bactérie (Escherichia coli) comme organisme hôte, couramment utilisée dans tous les laboratoires de biologie moléculaire. L'invention a pour objet un système de détection des interactions protéineprotéine évitant le problème de l'adressage des protéines de fusion dans le noyau comme c'est le cas dans la levure et ce, grâce à la non-compartnnentation d'E. coli, notamment à l'absence d'un noyau structuré. L'invention a pour objet un système adapté à l'étude des interactions de protéines situées dans la membrane cytoplasmique. L'invention a pour objet un test (répression de la transcription) permettant potentiellement l'identification de protéines interagissant avec les domaines d'activation des facteurs de transcription, parmi lesquels on trouve de nombreux produits oncogéniques impliqués dans la cancérogénèse, comme Jun, Fos ou les membres de la famille Ets. L'invention a pour objet un système d'étude d'interaction protéineprotéine (détermination des forces d'interaction, identification des éléments de structure ou de séquence importants pour cette interaction, analyse de la spécificité de l'interaction) plus fiable que le système levure (Estojak et al. 1995). L'invention a pour objet un système d'étude d'interaction protéineprotéine permettant de détecter des interactions lorsque la protéine "hameçon" (celle pour laquelle on recherche le ou les partenaires) a des capacités intrinsèques d'activation de la transcription (revues Bartel et al. 1993, Golemis et Brent 1996, Golemis et al. 1996) et ceci se produisant assez fréquemment (Ma et Ptashne 1988), et donc l'invention a pour objet un système permettant l'étude des interactions d'un "vrai" domaine d'activation de la transcription; L'invention a pour objet un système de détection d'interaction protéineprotéine permettant l'examen d'un grand nombre de clones ( > 106) grâce à l'efficacité de transfection de E. Coli qui est nettement supérieure à celle de la levure (de l'ordre de 1 000 fois) et ainsi le criblage de banques d'ADNc ou d'ADN génomique. L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN comprenant: - une séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice (gène indicateur), - un promoteur, - un opérateur muté, ladite séquence nucléotidique étant sous le contrôle du susdit promoteur comprenant le susdit opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), cet opérateur étant tel que, à l'état non muté (sauvage), il entraîne la répression de la transcription du gène indicateur, lorsque des protéines régulatrices sous forme d ' homodimère se fixent sur chacune desdites séquences répétées inversées via leur site de fixation à 1'ADN, cet opérateur muté étant tel que l'une de ses séquences est mutée (mutation 1), tandis que l'autre est à l'état sauvage, ou mutée de façon silencieuse ou comporte une mutation différente (mutation 2) de la susdite mutation 1, la transcription du gène indicateur étant réprimée par des protéines régulatrices sous forme d'hétérodimères via leur site de fixation à 1'ADN, chaque monomère de ces hétérodimères étant tel qu'il reconnaisse spécifiquement l'un la séquence comportant la mutation 1, l'autre la séquence qui est à l'état sauvage, ou qui est muté de façon silencieuse ou qui comporte une mutation 2, les homodimères susceptibles d'être formés à partir de chacun des monomères étant incapables de réprimer la transcription du susdit gène indicateur, - pour détecter ou quantifier des interactions entre deux protéines ou domaines protéiques, ou cribler des protéines ou domaines protéiques présentant des interactions avec une protéine ou domaine protéique déterminé(e), ces interactions étant révélées lorsqu'il y a répression de la transcription du susdit gène indicateur, cette répression résultant de la formation d'hétérodimères comprenant: 1) un premier monomère contenant une première protéine de fusion contenant le site de fixation à 1'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence de l'opérateur muté contenant la mutation 1, le susdit site de fixation étant fusionné à l'une des deux protéines ou à l'un des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions, 2) un deuxième monomère contenant une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2 de l'opérateur muté, le susdit site de fixation étant fusionné à l'autre des deux protéines ou à l'autre des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions. L'utilisation selon l'invention repose sur le fait qu'une protéine régulatrice, par exemple LexA, régule in vivo l'expression de gènes en se fixant sur des séquences spécifiques situées en amont de ces gènes (séquences opérateur). L'opérateur utilisé dans le cadre de l'invention est un opérateur muté dérivant d'un opérateur non muté qui est tel que, à l'état sauvage, ses séquences sont palindromiques (répétées inversées) et reconnues par des homodimères de la protéine régulatrice. La protéine régulatrice, par exemple LexA, est organisée en deux domaines, un domaine de fixation à 1'ADN qui reconnaît spécifiquement les séquences opérateur et un domaine de dimérisation par lequel se font les interactions entre deux monomères protéiques stabilisant l'interaction des dimères sur l'ADN. Chaque monomère se fixe sur un demi-opérateur. Par "demi-opérateur" on désigne la séquence spécifiquement reconnue par chaque monomère. Ces séquences spécifiques sont identiques dans le cadre d'un opérateur sauvage ou doublement muté, et différentes dans le cadre d'un opérateur muté. Cette fixation est renforcée par l'existence de contacts entre les domaines de dimérisation de chaque monomère. Le domaine de fixation à 1'ADN seul (dépourvu du domaine de dimérisation) est incapable de fixer efficacement l'opérateur et donc de réguler l'expression d'un gène. Si on remplace le domaine de dimérisation de LexA par des motifs protéiques hétérologues mais susceptibles d'interagir, on restitue l'activité régulatrice de LexA. Ceci étant, dans le cadre de l'invention, la séquence opérateur reconnue par une protéine régulatrice, par exemple LexA, a été modifiée de telle sorte qu'un demi-opérateur restant sauvage sera reconnu par la protéine régulatrice sauvage, par exemple LexA, tandis que l'autre demi-opérateur sera muté et reconnu par une forme mutée de la protéine régulatrice. Chacun de ces domaines de fixation à l'ADN peut être fusionné à des domaines protéiques susceptibles d'hétérodimériser et toute interaction entre ces domaines est mesurée par une répression plus ou moins importante du gène indicateur (également désigné par "gène reporter"). Par "homodimères", on désigne des associations non covalentes de protéines dans lesquelles les domaines d'interaction protéine-protéine sont identiques et liés de façon covalente à des domaines protéiques hétérologues ou homologues de fixation de l'ADN, eux-mêmes identiques ou différents. Par "hétérodimères", on désigne des associations non covalentes de protéines dans lesquelles les domaines d'interaction protéine-protéine sont différents et liés de façon covalente à des domaines protéiques hétérologues ou homologues de fixation de l'ADN, eux-mêmes identiques ou différents. Par "mutation silencieuse portée par l'une des séquences de l'opérateur", on désigne une mutation qui n'affecte pas la reconnaissance de ladite séquence par la protéine régulatrice sauvage. Par "mutation 2 portée par la séquence de l'opérateur", on désigne une mutation différente de la mutation 1, et qui est telle que la séquence comportant ladite mutation 2 est reconnue par une protéine régulatrice non susceptible de reconnaître la séquence portant la mutation 1, la mutation 1 étant elle-même telle qu'elle est reconnue par une protéine régulatrice qui n'est pas susceptible de reconnaître la séquence portant la mutation 2. Par "interaction protéine-protéine", on désigne l'assemblage non covalent de deux (ou plusieurs) protéines par interaction Van der Waals (interactions électrostatiques entre charges opposées, liaisons hydrogène, interactions hydrophobes). La surface masquée par une telle interaction est généralement de 1400 à 1600 A"2 (pour une revue voir: J. Janin "Principles of protein/protein recognition from structure to thermodynamics" 1995, Biochimie E:497-505). Par "domaine de fixation à 1'ADN d'une protéine", on définit la partie de la protéine dont l'intégrité est indispensable à sa fixation non covalente à 1'ADN. Par "détection de l'interaction", on désigne une méthode permettant de visualiser une interaction entre deux protéines. Par "quantification de l'interaction", on désigne une méthode permettant de chiffrer la force de cette interaction. L'expression "protéine susceptible de reconnaître la séquence d'un opérateur" désigne une protéine capable de faire des liaisons non covalentes avec une séquence particulière d'ADN. L'expression "domaine de fixation fusionné à une protéine" désigne un domaine protéique relié par une liaison peptidique à une autre protéine ou domaine de protéine. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine régulatrice est dépourvue de son domaine de dimérisation, lequel peut toutefois être toléré si les interactions résultant de la présence du domaine de dimérisation sont plus faibles que celles que l'on veut mettre en évidence. L'invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant: - une séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice (gène indicateur), - un promoteur, - un opérateur muté, ladite séquence nucléotidique étant sous le contrôle d'un promoteur comprenant un opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), cet opérateur étant tel que, à l'état non muté (sauvage), il entraîne la répression de la transcription du gène indicateur, lorsque des protéines régulatrices sous forme d'homodimère se fixent sur chacune desdites séquences répétées inversées via leur site de fixation à 1'ADN, cet opérateur muté étant tel que l'une de ses séquences est mutée (mutation 1), tandis que l'autre est à l'état sauvage, ou mutée de façon silencieuse ou comporte une mutation différente (mutation 2) de la susdite mutation 1, la transcription du gène indicateur étant réprimée par des protéines régulatrices sous forme d'hétérodimères via leur site de fixation à l'ADN, chaque monomère de ces hétérodimères étant tel qu'il reconnaisse spécifiquement l'un la séquence comportant la mutation 1, l'autre la séquence qui est à l'état sauvage, ou qui est muté de façon silencieuse ou qui comporte une mutation 2, les homodimères susceptibles d'être formés à partir de chacun des monomères étant incapables de réprimer la transcription du susdit gène indicateur, ladite mutation 1 étant en outre telle qu'elle est reconnue spécifiquement par une protéine régulatrice comportant un site de fixation à 1'ADN entrant dans la constitution d'une première protéine de fusion, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine ou un domaine protéique susceptible d'interagir avec une autre protéine ou un autre domaine protéique entrant dans la constitution d'une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à 1'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2. L'invention concerne une séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend un opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), l'une de ces deux séquences étant mutée, et l'autre étant à l'état sauvage. La séquence mutée peut être en amont ou en aval de la séquence à l'état sauvage. L'invention a également pour objet une séquence d'ADN caractérisée en ce que l'opérateur muté contient les séquences suivantes CCGT et ACAG espacées par une séquence d'environ 3 à environ 20 nucléotides, et notamment de 8 à 12, et avantageusement 8 nucléotides, et notamment caractérisée en ce que 1' opérateur muté contient la séquence suivante 5-CGGAATTCAATAGGGH,GATCTTTGHGTCACTGGATGTACcGTACATccATACAGTAACTcAcAGGGGc.3 Les séquences CCGT et ACAG correspondent aux séquences respectivement CTGT et ACAG de l'opérateur non muté. La présente invention concerne une séquence d'ADN caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codant pour la protéine indicatrice est le gène lacZ chez E. coli, codant pour la ss-galactosidase, l'opérateur muté contient deux séquences et dérive d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), l'une de ces deux séquences étant mutée, et l'autre étant à l'état sauvage, la séquence mutée étant de préférence celle située en aval de la séquence à l'état sauvage, la séquence sauvage étant reconnue spécifiquement par la protéine LexA sauvage ou par un fragment de LexA contenant le site de fixation à 1'ADN notamment un fragment défini par les positions 1 à x de LexA, x variant de 69 à 87, et notamment par les fragments 1 à 69 ou 1 à 87 de LexA, et la séquence mutée étant reconnue par la protéine LexA mutée ou par un fragment muté de LexA contenant le site de fixation à l'ADN, notamment un fragment muté de LexA correspondant à celui défini par les positions 1 à x de LexA, x variant de 69 à 87, et notamment par les fragments 1 à 69 ou 1 à 87, et les mutations de LexA étant avantageusement P40 o A, N41 o S, A42 e S, le domaine de dimérisation de LexA étant absent à la fois de LexA ou du fragment de LexA et de LexA muté ou du fragment muté de LexA. Les trois mutations simultanées P40 X A, N41 Par "domaine de dimérisation", on désigne la partie de la protéine dont l'intégrité est indispensable à l'interaction non covalente avec elle-même (homodimère) ou avec un autre domaine de dimérisation (hétérodimère) protéines ou à l'un des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions, 2) le deuxième monomère étant tel qu'il contient une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2 de l'opérateur muté, le susdit site de fixation étant fusionné à l'autre des deux protéines ou à 1' autre des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions. La présente invention concerne également un complexe caractérisé en ce que: - la séquence d'ADN est telle que définie ci-dessus et en ce que - les hétérodimères contiennent 1) un monomère contenant une première protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN de LexA muté ou d'un fragment muté de LexA reconnaissant la séquence de l'opérateur muté contenant la mutation 1, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine déterminée ou un fragment protéique déterminé susceptible d'être impliqué dans une interaction tel que décrite ci-dessus, laquelle protéine ou lequel domaine protéique contient par exemple un domaine d'activation ou de dimérisation, 2) un monomère contenant une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN de LexA sauvage, ou porteur d'une mutation silencieuse ou d'une mutation 2 ou d'un fragment de LexA reconnaissant la séquence non mutée de LexA ou mutée de façon silencieuse ou comportant une mutation 2, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine déterminée ou un fragment protéique déterminé, contenant par exemple une protéine ou un domaine protéique susceptible d'interagir avec la protéine ou le fragment protéique défini en 1) ou avec les susdits domaines d'activation ou de dimérisation. L'invention a également pour objet un hôte cellulaire contenant une séquence d'ADN telle que décrite ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé pour détecter et quantifier des interactions entre deux protéines ou fragments de protéines, caractérisé - en ce que l'on met en présence des séquences nucléotidiques codant respectivement pour le premier et le deuxième monomère contenant respectivement une première et une deuxième protéine de fusion telle que définie ci-dessus avec une séquence d'ADN telle que décrite précédemment, et - en ce que l'on détecte l'éventuelle répression de la transcription du gène indicateur tel que défini ci-dessus, notamment par transfection d'un hôte cellulaire tel que décrit ci-dessus, avec des vecteurs contenant, d'une part, les susdites séquences nucléotidiques codant respectivement pour le premier et le deuxième monomère contenant respectivement la première et la deuxième protéine de fusion et, d'autre part, les éléments nécessaires à l'expression des susdits monomères. L'invention concerne un procédé pour identifier une protéine interagissant avec une protéine déterminée, caractérisé - en ce que l'on met en présence les éléments suivants une séquence nucléotidique codant pour un premier monomère contenant une première protéine de fusion entre, d'une part, une protéine régulatrice selon l'invention et, d'autre part, la protéine déterminée, une banque génomique, contenant notamment des fragments d'ADN, et notamment d'ADNc, chacun étant susceptible de coder pour une protéine interagissant avec la protéine déterminée, chacun des différents éléments de la banque génomique étant respectivement fusionné à la séquence codant pour une protéine régulatrice telle que définie ci-dessus, une séquence d'ADN selon l'invention, et - en ce que l'on détecte l'éventuelle répression de la transcription de la séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice telle que décrite cidessus, notamment par transfection d'un hôte cellulaire selon la présente invention, d'une part, avec un vecteur contenant la séquence nucléotidique codant pour le susdit premier monomère contenant la première protéine de fusion et, d'autre part, un ensemble de vecteurs contenant une séquence nucléotidique codant pour un deuxième monomère contenant une deuxième protéine de fusion, chaque séquence nucléotidique codant pour chaque deuxième monomère contenant la séquence nucléotidique codant pour la protéine régulatrice selon la présente invention, et en aval de celle-ci l'un des éléments d'ADN de la susdite banque, tous les vecteurs contenant en outre les éléments nécessaires à l'expression des susdits monomères. Description des figures - Figure 1 : la Figure 1 concerne le principe du fonctionnement du système double-hybride chez E. coli Le système est basé sur le fait qu'un opérateur muté contenant 1/2 opérateur sauvage (WT) et 1/2 opérateur muté (408) n'est reconnu que par un dimère mixte LexAWT/LexA408. Un gène indicateur (lacZ représenté par un rectangle vide) a été mis sous le contrôle de cet opérateur mixte (représenté par un rectangle noir pour la partie non mutée et annotée WT et par un rectangle hachuré pour la partie mutée et annotée 408). Des protéines ou des sous domaines de protéines X et Y susceptibles d'interagir sont fusionnés aux domaines de fixation à l'ADN de LexA1-87WT (représenté par une sphère noire) et de LexA1-87408 (représentée par une sphère hachurée). LexA1-87WT- X (représenté par un rectangle hachuré relié à une sphére hachurée) et LexAl g7408-Y(représenté par un rectangle noir relié à une sphére noire) sont clonés sur des plasmides compatibles et leur expression est contrôlée par un promoteur inductible (lacs5, Oertel-Buchheit P., Lamerichs R.M.J.N., Schnarr M. and Granger-Schnarr M. 1990 Mol.Gen.Genet. 223,4048 Genetic analysis of the LexA repressor: isolation and characterization of LeucA(Def) mutant proteins.). Les plasmides sont représentés par des cercles dont une partie épaissie est séparée en deux, l'une représente le gène codant pour les protéines, LexAl g7WT-X ou LexA1-87408-Y et l'autre pour leur séquence pomoteur, lacUV5). Ces protéines, LexAl-87WT-X et LexA1 g7408-Y peuvent exister soit sous forme libre dans la bactérie, soit sous forme liée à l'ADN (représentée par un rectangle noir relié à une sphére grisée entrelacé avec un rectangle hachuré relié à une sphére hachurée eux mêmes reliés aux rectangles noirs et hachurés représentant l'opérateur mixte ci-dessus décrit.). Le promoteur LacUV5 est lui même sous le contrôle d'une protéine régulatrice, le répresseur lactose (représenté par un carré aux coins arrondis et segmenté en cartiers). Le gène codant pour ce répresseur (gène lacI) est cloné sur un épisome, le facteur F' (Willetts N. and Skurray R. in E.coli and Salmmonella Typhimurium, Cellular and Molecular Biology Ed. Neidhardt F.C. 1987, pp 1110-1133 et Oertel-Buccheit et al 1990) lui même représenté par un arc de cercle. Le répresseur lactose peut exister exister soit sous forme libre dans la bactérie, soit sous forme liée à 1'ADN (représenté par un carré aux coins arrondis et segmenté en cartiers relié aux séquences pomoteur, lacUV5 décrites ci-dessus). Le terme LexA(Def) signifie que la souche est dépourvue de LexA endogène. - Figure 2 : la Figure 2 représente la construction de la souche indicatrice pour la mise en oeuvre d'un système double hybride chez E. coli. Le plasmide pRS415 (représenté par le cercle contenant à l'intérieur l'indication "pRS415" (SIMONS R.W., HOUMAN F. & KLECKNER N. (1987). Improved single and multicopy lac-based cloning vectorsforprotein and operon fusions. Gene 53, 85-96.)) porte le gène lacZ, dépourvu de région promoteur/opérateur (représenté par un épaississement du trait) et deux sites uniques de coupure pour deux enzymes de restriction EcoRI et BamHI. "Lac signifie que ce plasmide est incapable de produire le produit du gène lacZ puisqu'il est dépourvu d'une séquence promoteur/opérateur. Ce plasmide est coupé par ces deux enzymes puis ligué à un oligonucléotide de 70 paires de bases (70mer et représenté par un rectangle noir) dont la séquence est la suivante: GAATTCAATAGGGTTGATCTTTGTTGTCACTGGATGTACCGTACA TCCATACAGTAACTCACAGGGGCACCCTAGG-3' cet oligonucléotide introduit ainsi devant le gène lacZ une séquence promoteur/opérateur permettant au gène lacZ d'être transcript et régulé par l'opérateur mixte tel qu'il est défini dans la légende de la figure 1. Cette ligation symbolisée par une flèche entre le plasmide et le 70mer crée le plasmide pGC202 (représenté par le cercle contenant à l'intérieur l'indication "pGC202"). "Lac+" signifie que ce plasmide est maintenant capable de produire le produit du gène lacZ puisqu'il est pourvu d'une séquence promoteur/opérateur. Le gène indicateur ainsi constitué (représenté par un rectangle noir pour la séquence promoteur/opérateur et par un rectangle blanc pour le gène lacZ) est ensuite transféré sur l'ADN d'un phage lambda (X) par un double événement de recombinaison entre 1'ADN plasmique et phagique (on entend par double évènement de recombinaison un mécanisme moléculaire complexe se produisant in vivo et aboutissant à l'échange de fragments d'ADN entre des molécules partiellement homologues, ceci est matérialisé sur la figure par deux croix entre le plasmide pGC 202 et une droite symbolisant l'ADN du phage) donnant lieu au phage kGC 202. Ce phage a la capacité de s'intégrer dans le chromosome bactérien par un mécanisme complexe ayant lieu in vivo (Elledge et al. 1991). L'intéret de ce système réside dans le fait que le gène indicateur sera sur le chromosome bactérien et non plus sur un plasmide, ce qui permet d'utiliser les vecteurs plasmidiques comme véhicule des protéines de fusion. - Figure 3 : la Figure 3 concerne la caractérisation de la souche SU202 en fonction de la quantité de protéines présentes dans la cellule. En abscisse, figurent les concentrations en IPTG (M) et en ordonnées, l'expression relative de la p-galactosidase. La variation de la quantité de protéines est obtenue en cultivant les bactéries en présence de concentrations variables en IPTG, les gènes codants pour les protéines chimères étant sous le contrôle du promoteur inductible lacUV5. Les unités P-galactosidases sont mesurées selon la méthode décrite par Miller (1972).L'expression relative de la P-galactosidase est calculée en faisant le rapport entre les unités p-galactosidases mesurées en présence des vecteurs d'expression et celles mesurées en leur absence, ces dernières correspondent à l'état non réprimé du gène lacZ. Les carrés blancs correspondent aux valeurs mesurées lorsque la souche contient un plasmide exprimant LexA1-87408- cJunZip (pDL606, voir figures 6 et 7). Les cercles blancs correspondent aux valeurs mesurées lorsque la souche contient un plasmide exprimant le domaine de fixation à 1'ADN seul (JWL96, Little JW and Hill S.A. (1985) Deletion within the hinge region of a specific DNA-binding protein Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 2301-2305). Les triangles blancs correspondent aux valeurs mesurées lorsque la souche contient un plasmide exprimant LexA1-87WT-cFosZip (pMS404, voir figures 8 et 9). Les carrés noirs correspondent aux valeurs mesurées lorsque la souche contient à la fois le plasmide exprimant le domaine de fixation à l'ADN seul (JWL96) et celui exprimant LexA1-87408-cJunZip (pDL606, voir figures 6 et 7). Les cercles noirs correspondent aux valeurs mesurées lorsque la souche contient à la fois le plasmide exprimant LexAl 87408-cJunZip (pDL606, voir figures 6 et 7) et celui exprimant LexA1-87WTcFosZip (pMS404, voir figures 8 et 9). - Figure 4 : la Figure 4 représente la souche bactérienne SU202 qui permet de mesurer sélectivement l'hétérodimérisation de protéines de fusion susceptibles d'homodimériser. En abscisse, figurent les concentrations en IPTG (M) et en ordonnées, l'expression relative de la ss-galactosidase. Des mutants de la glissière à leucine ("leucine zipper") de Fos ont été construits au laboratoire, ces mutants ont acquis la capacité à homodimériser (contrairement au leucine zipper de Fos qui lui en est incapable). Quatre de ces mutants sont utilisés ici et sont décrits dans: Porte D., Oertel-Buccheit P., Granger-Schnarr M. and Schnarr M. 1995 J. Biol. Chem. 270, 22721-22730 Fos leucine zipper variants with increased association capacity, I1 s'agit * d'un mutant pour lequel les cinq positions "a" de la glissière ("zipper") (définies dans Porte et al. 1995) sont occupées par des résidues leucine (LexAl g7WT-cFosZipLLLLL) et qui est représenté par des cercles blancs dans les figures 4A, B et C, * d'un mutant pour lequel les cinq positions "a" de la glissière ("zipper") (définies dans Porte et al. 1995) sont occupées successivement par deux valines, une isoleucine, une phénylalanine et une valine (LexA187WT- cFosZipVVIFV) et qui est représenté par des cercles noirs dans les figures 4A, B et C, * d'un mutant pour lequel les cinq positions "a" de la glissière ("zipper") (définies dans Porte et al. 1995) sont occupées successivement par deux isoleucines, une leucine et deux isoleucines (LexA1-87WT-cFosZipIILII) et qui est représenté par des carrés blancs dans les figures 4A, B et C, * d'un mutant pour lequel les cinq positions "a" de la glissière ("zipper") (définies dans Porte et al. 1995) sont occupées successivement par une isoleucine, une leucine, une phénylalanine, une leucine et une phénylalanine (LexAl g7WT-cFosZipILFLF) et qui est représenté par des carrés noirs dans les figures 4A, B et C, * les triangles noirs représentent LexAl g7WT-cFosZip sauvage, * les courbes en pointillés représentent les mesures faites en absence de plasmide. Chacune de ces constructions est soit introduite séparément dans les souches bactériennes indicatrices (figure 4A pour la souche SU202 et 4B pour la souche SU101) soit co-introduites avec la protéine de fusion LexA1-87408cJunZip (figure 4C). L'activité p-galactosidase est ensuite mesurée dans les conditions décrites par Miller et al. 1972 en fonction de concentrations variables en IPTG. En absence de protéine, le nombre d'unités mesurées reste constant, indiquant que le gène codant pour la b-galactosidase est complètement exprimé, lorsque le nombre d'unités mesurées diminue, cela signifie que le gène codant pour la ss-galactosidase est réprimé, l'intensité de la répression étant fonction à la fois de la quantité de protéine présente dans la cellule (elle augmente lorsque l'on augmente la concentration en IPTG) et de la force d'interaction des protéines entre elles. A- La souche SU202 (comme décrite dans cette revendication) ne "répond" pas à l'homodimérisation (lacZ contrôlé par un opérateur mixte WT/408). B- L'homodimérisation des différentes protéines est mise en évidence dans une souche (SU101) dans laquelle lacZ est contrôlé par un opérateur WTC-La souche SU202 mesure sélectivement leur hétérodimérisation avec LexA408JunZip - Figure 5 : sur la Figure 5, on voit que la souche SU 202 est transformée soit avec chacun des plasmides portant les gènes codant pour les protéines de fusion LexA1-87408-cJunZip et LexA187WT-cFosZip soit cotransformée avec les deux plasmides. Les cellules transformées sont laissées une nuit à température ambiante dans du LB additionné respectivement soit de kanamycine, chloramphénicol, ampicilline soit de kanamycine, chloramphénicol, tétracycline soit des quatre antibiotiques: kanamycine, chloramphénicol, ampicilline et tétracycline, avant d'être étalées sur milieu solide McConkey contenant les mêmes antibiotiques. Les cellules transformées par un seul des deux plasmides poussent rouges. Cette coloration signifie que le gène de la P-galactosidase n'est pas réprimé par les protéines de fusion et que l'enzyme produit fermente le lactose du milieu. Les bactéries cotransformées par les deux plasmides poussent blanches, le gène de la ,8-galactosidase est réprimé. - Figure 6 : la Figure 6 représente la carte du plasmide pDL606 (pour le clonage de "l'hameçon"). Les sites de restrictions indiqués sont des sites uniques. Ap représente la gène codant pour la résistance à l'ampicilline, pl5A 1' origine de réplication du plasmide. Le vecteur est de type pACYC (New En gland Biolabs, Inc) : pACYC177. - Figure 7 : la Figure 7 représente la séquence d'une partie du plasmide pDL606 codant pour la protéine de fusion LexAl g7408-ciunZip. Les sites indiqués permettent de se repérer sur la carte de la figure 6. - Figure 8 : la Figure 8 représente la carte du plasmide pMS404. Les sites de restriction indiqués sont des sites uniques. Tet représente le gène codant pour la résistance à la tétracycline, Ori 1' origine de réplication du plasmide. Le vecteur est de type pUC (New En gland Biolabs, Inc). - Figure 9 : la Figure 9 représente la séquence d'une partie du plasmide pMS404 codant pour la protéine de fusion LexA1-87WT-cFosZip. Les sites indiqués permettent de se repérer sur la carte de la figure 8. - Figure 10 : la Figure 10 représente la carte du plasmide pL23B (vecteur plasmidique pour clonage de banque pour SU202). Les sites de restriction indiqués sont des sites uniques. Tet représente le gène codant pour la résistance à la tétracycline, Ori 1' origine de réplication du plasmide. Ce plasmide porte le domaine de fixation à l'ADN d'un mutant de LexA, LexA1-823 (mutation G- > S en position 23). Cette mutation n' affecte pas la spécificité de reconnaissance (LexA23 reconnaît la même séquence que LexAWT) mais affecte la force avec laquelle cette interaction protéine/ADN se produit. En effet, pour améliorer le système, nous avons trouvé qu'en diminuant la force d'interaction entre LexA et l'ADN, on gagnait en sensibilité. Ce plasmide est prévu pour le clonage d'une banque. - Figure 11 : la Figure 1 1 représente la séquence d'une partie du plasmide pL23B codant pour LexA1-8723. La banque peut être clonée derrière LexA1-8723 en utilisant l'un des sites uniques suivants: XhoI, EcoRI, SfiI. En aval de ces sites trois codons stops (TAA) ont été insérés dans les trois cadres de lecture afin de limiter la protéine de fusion. Les sites indiqués permettent de se repérer sur la carte de la figure 10. L'invention sera complétée par la description détaillée et les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif. Principe du fonctionnement du système double-hybride chez E. coli Le système double-hybride chez E. coli est basé sur l'utilisation de LexA, répresseur bactérien. LexA sauvage reconnaît spécifiquement et sous forme de dimères une séquence palindromique de 16 paires de bases, CTGT (N)8 ACAG, appelée opérateur. Les 4 paires de bases externes sont fortement conservées, alors que le motif central est plus variable. Chaque monomère de LexA est composé d'un domaine de fixation à 1'ADN qui reconnaît la séquence CTGT et d'un domaine de dimérisation indispensable à la fixation sur l'ADN puisque le domaine de fixation à l'ADN dépourvu de domaine de dimérisation, ne fixe que très faiblement 1 'ADN. La littérature décrit des mutants de LexA ayant une nouvelle spécificité de fixation à l'ADN. Celui qui a été utilisé, LexA408, porte une triple mutation (P40- > A, N41- > S, A42- > S) et reconnaît la séquence suivante CCGT (N)8 ACGG. Le système selon la présente invention est basé sur le fait qu'un opérateur muté contenant 1/2 opérateur sauvage et 1/2 opérateur muté n'est reconnu que par un dimère mixte LexAWT/LexA408. Un gène indicateur (lacZ7) également désigné par gène reporter a été mis sous le contrôle de cet opérateur. Des protéines ou des sous domaines de protéines X et Y susceptibles d'interagir sont ensuite fusionnés aux domaines de fixation à l'ADN, LexA1~87WT et de LexAl 87408. La figure 1 illustre ce système. LexA1~87WT-X et LexA1~87408-Y sont clonés sur des plasmides compatibles et leur expression est contrôlée par un promoteur inductible (lacUV5). La souche indicatrice surexprimant le répresseur du promoteur lactose (puisque lacis), on peut alors moduler l'expression de LexA1~87WT-X et LexA1~87408-Y en ajoutant des concentrations variables de l'inducteur IPTG. Ce système a deux utilisations principales: I)- X et Y peuvent être des protéines ou des domaines de protéines caractérisés et interagissants entre eux, ils confèrent alors aux protéines hybrides la capacité de se fixer de façon stable sur l'ADN et ainsi de réprimer le gène lacZ. Une telle interaction peut être visualisée sur un milieu indicateur approprié (par exemple Mac Conkey et décrit ci-après) et peut également être quantifiée par dosage du produit du gène lacZ, la P-galactosidase selon la méthode décrite par Miller J.H., 1972 "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, NY) ; il est ainsi possible 1) de quantifier la force de cette interaction; 2) d'identifier les déterminants de cette interaction (par mutagenèse par exemple) 3) d'identifier des molécules capables d'interférer avec cette interaction et susceptibles d'être utilisées in vivo ; petites molécules susceptibles d'être mises dans le milieu de culture et de passer à travers la paroi bactérienne. II)- X (ou Y) est une protéine ou un domaine de protéine susceptible d'interagir avec une ou des protéine(s) encore inconnue(s) que l'on veut identifier. On greffe alors sur Y (ou X) une banque, cette banque étant cointroduite dans la souche indicatrice avec le gène codant pour la protéine hybride dont on cherche le ou les partenaires. Tout élément de la banque codant pour une protéine ou un domaine de protéine interagissant avec X (ou Y) donne lieu à un clone bactérien dont la couleur sur milieu approprié est différente de ceux pour lesquels il n'y a pas d'interaction. Ce ou ces éléments sont alors identifiés par séquençage. EXEMPLE: Construction de la souche indicatrice pour la mise en oeuvre d'un système double hybride chez E. coli Cette construction nécessite 1) le clonage de lacZ sous le contrôle d'un promoteur régulé par un opérateur de type CCGT (N)8 ACAG; 2) de faire passer cette construction sur le chromose d'un hôte bactérien délété de son opéron lactose, déficient en LexA chromosomique et exprimant le répresseur lactose, souche JL1434 (LITTLE J.W. & HILL S.A. 1985 Deletions within a hinge region of a specific DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2301-2305 et ceci par l'intermédiaire d'un phage lambda (Figure 2). 1. Construction de plasmides portant le gène lacZ placé sous le contrôle d'un opérateur muté WT / 408 Le plasmide pRS415 portant le gène lacZ, dépourvu de région promoteur/opérateur (SIMONS R.W., HOUMAN F. & KLECKNER N. (1987). Improved single and multicopy lac-based cloning vectorsforprotein and operon fusions. Gene 53, 85-96.) est ouvert aux sites de restriction EcoRI/BamHI. Entre ces deux sites uniques de restriction, a été inséré l'oligonucléotide double brin suivant: S'-GAATTCAATAGGGTTGATCTTTGTTGTCACTGGATGTACCGTACATCCATACAGTAACTCACAGGGGCACCCTAGG-3' (bases en caractère gras = éléments du promoteur, bases soulignées = opérateur) créant ainsi le plasmide pGC202. 2. Isolement de bactériophages Lac + recombinants La souche JL1434 (LexA(Def), Lac-), transformée par les plasmides pGC202, a été infectée par le bactériophage kfd (Lac-, HOCHSCHILD A. & PTASHNE M. (1988). Interaction at a distance between X repressors disrupts gene activation. Nature 336, 353-357) dont le génome porte immédiatement à gauche d'un gène lacZ dépourvu de promoteur et de codon d'initiation (ATG) de la traduction, une séquence dérivant du vecteur pBR322 et que l'on retrouve également à gauche du site de clonage EcoRI du plasmide pRS415 (voir figure 2). Grâce aux séquences homologues situées de part et d'autre de la séquence "promoteur/opérateur/initiateur" et suite à un double événement de recombinaison entre l'ADN plasmique et phagique, le gène lacZ se retrouve sous le contrôle de la région promoteur/opérateur cloné dans pGC202 donnant lieu au phage kGC 202. 3. Isolement de bactéries lysogènes pour les bactériophages Lac + recombinants L'isolement de bactéries lysogènes a pour but d'obtenir l'intégration stable du phage recombinant dans le chromosome bactérien, qui s'y trouve alors à l'état de prophage. Ceci se fait à partir d'une deuxième infection des bactéries JL1434 avec des minipréparations du phage précédemment obtenu afin de se débarrasser du plasmide initial et de s'assurer ainsi que le caractère Lac+ est bien porté par le phage. Après infection de la souche JL1434, les phages X recombinants commencent un cycle lysogène qui conduit à l'intégration stable par recombinaison site-spécifique de leurs génomes (et donc du gène lacZ contrôlés par l'élément promoteurs/opérateurs décrit ci-dessus) dans le chromosome bactérien, au niveau du site att b entre les opérons gal et bio. La souche lysogène Lac + SU 202 a ainsi été isolée. Cette souche indicatrice porte les gènes de résistance à la Kanamycine et au Chloramphénicol. Description des plasmides porteurs des protéines hybrides Les gènes codant pour les protéines hybrides sont portés par deux vecteurs plasmidiques compatibles portant des origines de réplication différentes (pMB 1 ou plSA) ainsi que la sélection pour deux marqueurs différents (tetR ou ampR) rendant ainsi possible leur maintien simultané dans la même bactérie hôte. Utilisation de la souche SU202 pour identifier et quantifier des interactions protéine/protéine La souche indicatrice SU202 a été testée avec les protéines chimères suivantes LexA1-87408-cJunZip et LexA1-87WT-cFosZip, elles sont constituées du domaine de fixation à l'ADN (mutant 408 ou sauvage (WT)) du répresseur LexA (aa 1-87) et du domaine de dimérisation (glissière à leucine ou "leucine zipper") des oncoprotéines cJun (aa 277-315) et cFos (aa 102-200). Le gène codant pour LexA1-87408-cJunZip est porté par le plasmide pDL606 (voir figures 6 et 7). La figure 6 représente une carte de l'ensemble du plasmide accompagné des sites uniques de restriction, le vecteur est un pACYC177 (New En gland Biolabs, Inc.) ; il porte la résistance à l'ampicilline et p15A comme origine de réplication. La figure 7 représente la partie de la séquence de ce plasmide correspondant à la protéine de fusion, cette séquence étant repérable sur la carte générale à l'aide des sites de restriction. Le gène codant pour LexA187WT-cFosZip est porté par le plasmide pMS404 (voir figures 8 et 9). La figure 8 représente une carte de l'ensemble du plasmide accompagné des interaction between fos and jun nuclear oncoproteins: role of the "leucinezipper" domain. Nature (London) 334, 692-695.). Les gènes codant pour ces deux protéines de fusion sont contrôlés par le promoteur inductible lacUV5. Les souches indicatrices surexprimant ce répresseur (puisque lacis), permettent de moduler l'expression de LexAl 87408-cJunZip et LexAl g7WT-cFosZip en présence de différentes concentrations en inducteur (IPTG). Test qualitatif La souche SU 202 est transformée soit avec chacun des plasmides portant les gènes codant pour les protéines de fusion LexAl 87408-cJunZip et LexAl g7WT-cFosZip soit cotransformée avec les deux plasmides. Les cellules transformées sont laissées une nuit à température ambiante dans du LB (Maniatis et al.) additionné respectivement soit de kanamycine, chloramphénicol, ampicilline soit de kanamycine, chloramphénicol, tétracycline soit des quatre antibiotiques: kanamycine, chloramphénicol, ampicilline et tétracycline, avant d'être étalées sur milieu McConkey contenant les mêmes antibiotiques. La figure 5 montre, après repiquage sur une même boîte, les résultats obtenus. Ce type de milieu de culture contient entre autre du lactose qui est hydrolysé par la ss-galactosidase en allolactose. L'allolactose étant l'inducteur naturel du promoteur lactose, lorsque les bactéries possédant l'un ou les deux gènes codant pour les protéines chimères sont cultivées sur ce milieu, ceux-ci sont partiellement induits. On estime que l'induction correspond à celle que l'on observe en milieu LB additionné de 10-5 M en IPTG. I1 a été observé une différence importante dans la coloration des clones bactériens indiquant que la souche indicatrice construite répondait aux critères définis, en effet: - les cellules transformées par un seul des deux plasmides poussent rouges; cette coloration signifie que le gène de la ss-galactosidase n'est pas réprimé par les protéines chimères et que l'enzyme produit fermente le lactose du milieu; dans le cas LexA1-87408-cJunZip, les homodimères qui sont susceptibles de se former sont incapables in vivo de reconnaître l'opérateur muté et donc de réprimer le gène lacZ. En ce qui concerne la glissière à leucine ("leucine zipper") de Fos, la réponse était attendue puisqu'il n'homodimérise que très mal; - les bactéries cotransformées par les deux plasmides poussent blanches, la ss-galactosidase n' est donc pas produite par les cellules; cette double transformation permet à la cellule de produire simultanément les deux protéines chimères LexAl g7408-ciunZip et LexAl 87WT-cFosZip; l'absence de production de la ss-galactosidase indique que l'hétérodimère LexA1-87408- cilln7ip/LexAl g7WT-cFosZip, est contrairement aux homodimères, capable de réprimer le gène lacZ. Cette souche indicatrice est donc bien fonctionnelle, elle permet de mettre en évidence des interactions protéine/protéine sur la simple base de la couleur des clones, elle est très spécifique et permet de discriminer entre homo- et hétérodimérisation. Test quantitatif L'efficacité avec laquelle le gène indicateur est réprimée peut être mesurée quantitativement par dosage in vitro de l'activité ss-galactosidase. Ce test est effectué dans les conditions décrites par MILLER J.H. (1972) dans Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Les valeurs des dosages décrits représentent la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes et sont réalisées en présence de concentrations variables en IPTG. La figure 3 montre que: * quelle que soit la concentration en IPTG, la souche non transformée produit le même nombre d'unités ss-galactosidase (en moyenne 2500 unités); * lorsqu'elle est transformée avec le plasmide codant pour LexA1-87WT- cFosZip et quelle que soit la concentration en IPTG (c'est-à-dire même en surexprimant la protéine chimère), le nombre d'unités ne varie pas; * lorsqu'elle porte les deux protéines chimères, on observe une répression très forte du gène reporter (le nombre d'unités ss-galactosidase chute à 20 pour les concentrations 104 et 10-3 M en IPTG); * cette répression est due à l'interaction spécifique entre les parties glissière à leucine ("leucine zippers") des protéines chimères aboutissant à la formation d'hétérodimères actifs, et non pas à la simple coexistence de deux protéines chimères dont les domaines de liaison à 1'ADN seraient capables de se fixer indépendamment sur chaque demi site de l'opérateur muté; en effet, lorsque la souche porte le gène codant pour le domaine de fixation à 1'ADN WT de LexA dépourvu de son domaine de dimérisation et celui codant pour LexA 87408-cJunZip, on n'observe pas de répression du gène reporter. On dispose donc d'un test permettant de mettre en évidence des interactions protéine/protéine utilisable comme crible mais aussi avec la possibilité de mesurer et de comparer la force de ces interactions. Recherche et identification de mutants affectés dans ces interactions Cette souche peut être également utilisée pour identifier les déterminants de ces interactions soit par mutagenèse aléatoire soit par mutagenèse dirigée. Par exemple, il avait été émis l'hypothèse que la spécificité d'hétérodimérisation entre les glissières ("zippers") de Jun et de Fos était due à la non homodimérisation de la glissière ("zipper") de Fos. Cette souche a permis de montrer que tel n'était pas le cas puisque de mutants de Fos capables d'homodimériser n'ont pas perdu cette spécificité (figure 4). Les cellules transformées uniquement par les plasmides codant pour les mutants de Fos poussent rouges sur milieu McConkey. L'homodimérisation n'est donc pas détectée dans cette souche. Dans le cas où les bactéries produisent en plus LexAl g7408-cJunZip, elles poussent blanches si les mutants de Fos sont améliorés dans leur interaction protéine/protéine par rapport à Fos sauvage, et roses si les mutants de Fos sont moins bons. L'intensité de la couleur est toujours inversement proportionnelle à la capacité d' hétérodimérisation (dosage ss-galactosidase). Utilisation de la souche SU202 pour identifier le ou les partenaires d'une protéine ou d'un domaine protéique caractérisé Deux plasmides sont utilisés: 1- le plasmide portant la protéine ou le domaine de protéine caractérisé pour lequel on veut identifier le ou les partenaires fusionné(s) au domaine de fixation à 1'ADN de LexA408, pDL606 : constituant "l'hameçon". 2- le plasmide portant la banque, pLE23B (voir figures 10 et 11). La figure 10 représente une carte de l'ensemble du plasmide accompagné des sites uniques de restriction, le vecteur est un plasmide apparenté à un pBR322 (New En gland Biolabs, Inc.) il porte la résistance à la tétracycline et pMB1 comme origine de réplication. La figure 1 1 représente la partie de la séquence de ce plasmide correspondant à la protéine de fusion, cette séquence étant repérable sur la carte générale à l'aide des sites de restriction. Les deux plasmides sont simultanément introduits dans la souche SU202 et les bactéries transformées sont: - soit directement sélectionnées sur milieu solide LB + antibiotiques (kanamycine, chloramphénicol, ampicilline et tétracycline), les clones positifs étant ensuite révélés par répliques des boîtes sur milieu indicateur McConkey + les mêmes antibiotiques, - soit sélectionnées en milieu liquide LB + antibiotiques (kanamycine, chloramphénicol, ampicilline et tétracycline) pendant une nuit, puis révélées par étalement des cultures sur milieu indicateur McConkey + les mêmes antibiotiques. Chaque clone porte un élément de banque différent codant pour une protéine ou un domaine de protéine différent, lorsque cette protéine ou ce domaine de protéine est susceptible d'établir des interactions protéine/protéine avec "l'hameçon", il donne lieu à un clone blanc ou rosé parmi un tapis de clones rouges, qui eux représentent tous les éléments de la banque codant pour des protéines ou des domaines de protéine n'interagissant pas avec l'hameçon. La constitution de la banque passe par l'intermédiaire d'une navette phage Elledge S.J. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1731-1735. "hues: multifunctional cDNA expression vector for the isolation of genes by complementation of yeast and E. coli mutations". REFERENCES 1. Bartel, P.L., Chien, C.-T., Sternglanz, R. & Fields, S. (1993) "Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions", In: Cellular Interactions in Development: A practical approach (Oxford University Press, Oxford) pp. 153-179. 2. 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REVENDICATIONS 1- Utilisation d'une séquence d'ADN comprenant: - une séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice (gène indicateur), - un promoteur, - un opérateur muté, ladite séquence nucléotidique étant sous le contrôle du susdit promoteur comprenant le susdit opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), cet opérateur étant tel que, à l'état non muté (sauvage), il entraîne la répression de la transcription du gène indicateur, lorsque des protéines régulatrices sous forme d'homodimère se fixent sur chacune desdites séquences répétées inversées via leur site de fixation à l'ADN, cet opérateur muté étant tel que l'une de ses séquences est mutée (mutation 1), tandis que l'autre est à l'état sauvage, ou mutée de façon silencieuse ou comporte une mutation différente (mutation 2) de la susdite mutation 1, la transcription du gène indicateur étant réprimée par des protéines régulatrices sous forme d ' hétérodimères via leur site de fixation à 1'ADN, chaque monomère de ces hétérodimères étant tel qu'il reconnaisse spécifiquement l'un la séquence comportant la mutation 1, l'autre la séquence qui est à l'état sauvage, ou qui est muté de façon silencieuse ou qui comporte une mutation 2, les homodimères susceptibles d'être formés à partir de chacun des monomères étant incapables de réprimer la transcription du susdit gène indicateur, - pour détecter ou quantifier des interactions entre deux protéines ou domaines protéiques, ou cribler des protéines ou domaines protéiques présentant des interactions avec une protéine ou domaine protéique déterminé(e), ces interactions étant révélées lorsqu'il y a répression de la transcription du susdit gène indicateur, cette répression résultant de la formation d'hétérodimères comprenant: 1) un premier monomère contenant une première protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence de l'opérateur muté contenant la mutation 1, le susdit site de fixation étant fusionné à l'une des deux protéines ou à l'un des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions, 2) un deuxième monomère contenant une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2 de l'opérateur muté, le susdit site de fixation étant fusionné à l'autre des deux protéines ou à l'autre des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions. 2. Séquence d'ADN comprenant: - une séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice (gène indicateur), - un promoteur, - un opérateur muté, ladite séquence nucléotidique étant sous le contrôle d'un promoteur comprenant un opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), cet opérateur étant tel que, à l'état non muté (sauvage), il entraine la répression de la transcription du gène indicateur, lorsque des protéines régulatrices sous forme d'homodimère se fixent sur chacune desdites séquences répétées inversées via leur site de fixation à l'ADN, cet opérateur muté étant tel que l'une de ses séquences est mutée (mutationl), tandis que l'autre est à l'état sauvage, ou mutée de façon silencieuse ou comporte une mutation différente (mutation2) de la susdite mutation 1, la transcription du gène indicateur étant réprimée par des protéines régulatrices sous forme d' hétérodimères via leur site de fixation à 1'ADN, chaque monomère de ces hétérodimères étant tel qu'il reconnaisse spécifiquement l'un la séquence comportant la mutation 1, l'autre la séquence qui est à l'état sauvage, ou qui est muté de façon silencieuse ou qui comporte une mutation 2, les homodimères susceptibles d'être formés à partir de chacun des monomères étant incapables de réprimer la transcription du susdit gène indicateur, ladite mutation 1 étant en outre telle qu'elle est reconnue spécifiquement par une protéine régulatrice comportant un site de fixation à 1'ADN entrant dans la constitution d'une première protéine de fusion, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine ou un domaine protéique susceptible d'interagir avec une autre protéine ou un autre domaine protéique entrant dans la constitution d'une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2. 3. Séquence d'ADN selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend un opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), l'une de ces deux séquences étant mutée, et l'autre étant à l'état sauvage. 4. Séquence d'ADN selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que 1 'opérateur muté contient les séquences suivantes CCGTetACAG espacées par une séquence d'environ 3 à environ 20 nucléotides, et notamment de 8 à 12, et avantageusement 8 nucléotides, et notamment caractérisée en ce que l'opérateur muté contient la séquence suivante 5' -CGGAATTCAATAGGGTTGATCTTTGTTGTCACTGGATGT ACCGTACATCCATACAGTAACTCACAGGGGC-3 5. Séquence d'ADN selon l'une des revendications 3 à 4, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codant pour la protéine indicatrice est le gène lacZ chez E. coli, codant pour la ss-galactosidase, l'opérateur muté contient deux séquences et dérive d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), l'une de ces deux séquences étant mutée, et l'autre étant à l'état sauvage, la séquence mutée étant de préférence celle située en aval de la séquence à l'état sauvage, la séquence sauvage étant reconnue spécifiquement par la protéine LexA sauvage ou par un fragment de LexA contenant le site de fixation à 1'ADN notamment un fragment défini par les positions 1 à x de LexA, x variant de 69 à 87, et notamment par les fragments 1 à 69 ou 1 à 87 de LexA, et la séquence mutée étant reconnue par la protéine LexA mutée ou par un fragment muté de LexA contenant le site de fixation à 1'ADN, notamment un fragment muté de LexA correspondant à celui défini par les positions 1 à x de LexA, x variant de 69 à 87, et notamment par les fragments 1 à 69 ou 1 à 87, et les mutations de LexA étant avantageusement P40 o A, N41 o S, A42 o S, le domaine de dimérisation de LexA étant absent à la fois de LexA ou du fragment de LexA et de LexA muté ou du fragment muté de LexA. 6. Complexe entre - une séquence d'ADN comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice, ladite séquence nucléotidique étant sous le contrôle d'un promoteur comprenant un opérateur muté contenant deux séquences et dérivant d'un opérateur contenant deux séquences répétées inversées (palindrome), cet opérateur étant tel que, à l'état non muté (sauvage), il entraîne la répression de la transcription du gène indicateur, lorsque des protéines régulatrices sous forme d'homodimère se fixent sur chacune desdites séquences répétées inversées via leur site de fixation à l'ADN, cet opérateur muté étant tel que l'une de ses séquences est mutée (mutation 1), tandis que l'autre est à l'état sauvage, ou mutée de façon silencieuse ou comporte une mutation différente (mutation 2) de la susdite mutation 1, la transcription du gène indicateur étant réprimée par des protéines régulatrices sous forme d'hétérodimères via leur site de fixation à l'ADN, chaque monomère de ces hétérodimères étant tel qu'il reconnaisse spécifiquement l'un la séquence comportant la mutation 1, l'autre la séquence qui est à l'état sauvage, ou qui est muté de façon silencieuse ou qui comporte une mutation 2, les homodimères susceptibles d'être fournis à partir de chacun des monomères étant incapables de réprimer la transcription du susdit gène indicateur, - et des hétérodimères dont les monomères les constituant (respectivement premier monomère et deuxième monomère) sont impliqués entre eux dans une interaction protéine/protéine 1) le premier monomère étant tel qu'il contient une première protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence de l'opérateur muté contenant la mutation 1, le susdit site de fixation étant fusionné à l'une des deux protéines ou à l'un des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions, 2) le deuxième monomère étant tel qu'il contient une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN d'une protéine régulatrice susceptible de reconnaître spécifiquement la séquence non mutée, ou mutée de façon silencieuse ou comportant la mutation 2 de l'opérateur muté, le susdit site de fixation étant fusionné à l'autre des deux protéines ou à l'autre des deux domaines protéiques, impliqué(e) dans les susdites interactions. 7. Complexe selon la revendication 6, caractérisé en ce que - la séquence d'ADN est telle que définie selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, et en ce que - les hétérodimères contiennent 1) un monomère contenant une première protéine de fusion contenant le site de fixation à l'ADN de LexA muté ou d'un fragment muté de LexA reconnaissant la séquence de l'opérateur muté contenant la mutation 1, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine déterminée ou un fragment protéique déterminé susceptible d'être impliqué dans une interaction selon la revendication 1, laquelle protéine ou lequel domaine protéique contient par exemple un domaine d'activation ou de dimérisation, 2) un monomère contenant une deuxième protéine de fusion contenant le site de fixation à 1'ADN de LexA sauvage, ou porteur d'une mutation silencieuse ou d'une mutation 2 ou d'un fragment de LexA reconnaissant la séquence non mutée de LexA ou mutée de façon silencieuse ou comportant une mutation 2, lequel site de fixation est fusionné avec une protéine déterminée ou un fragment protéique déterminé, contenant par exemple une protéine ou un domaine protéique susceptible d'interagir avec la protéine ou le fragment protéique défini en 1) ou avec les susdits domaines d'activation ou de dimérisation. 8. Hôte cellulaire contenant une séquence d'ADN selon la revendication 2. 9. Procédé pour détecter et quantifier des interactions entre deux protéines ou fragments de protéines, caractérisé - en ce que l'on met en présence des séquences nucléotidiques codant respectivement pour le premier et le deuxième monomère contenant respectivement une première et une deuxième protéine de fusion telle que définie dans la revendication 1, avec une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, et - en ce que l'on détecte l'éventuelle répression de la transcription du gène indicateur tel que défini à la revendication 1, notamment par transfection d'un hôte cellulaire selon la revendication 8, avec des vecteurs contenant, d'une part, les susdites séquences nucléotidiques codant respectivement pour le premier et le deuxième monomère contenant respectivement la première et la deuxième protéine de fusion et, d'autre part, les éléments nécessaires à l'expression des susdits monomères. 10. Procédé pour identifier une protéine interagissant avec une protéine déterminée, caractérisé - en ce que l'on met en présence les éléments suivants une séquence nucléotidique codant pour un premier monomère contenant une première protéine de fusion entre, d'une part, une protéine régulatrice selon la revendication 1 et, d'autre part, la protéine déterminée, une banque génomique, contenant notamment des fragments d'ADN, et notamment d'ADNc, chacun étant susceptible de coder pour une protéine interagissant avec la protéine déterminée, chacun des différents éléments de la banque génomique étant respectivement fusionné à la séquence codant pour une protéine régulatrice selon la revendication 1, une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, et - en ce que l'on détecte l'éventuelle répression de la transcription de la séquence nucléotidique codant pour une protéine indicatrice selon la revendication 1, notamment par transfection d'un hôte cellulaire selon la revendication 8, d'une part, avec un vecteur contenant la séquence nucléotidique codant pour le susdit premier monomère contenant la première protéine de fusion et, d'autre part, un ensemble de vecteurs contenant une séquence nucléotidique codant pour un deuxième monomère contenant une deuxième protéine de fusion, chaque séquence nucléotidique codant pour chaque deuxième monomère contenant la séquence nucléotidique codant pour la protéine régulatrice selon la revendication 1, et en aval de celle-ci l'un des éléments d'ADN de la susdite banque, tous les vecteurs contenant en outre les éléments nécessaires à l'expression des susdits monomères.