FR 2748208 A1 19971107 FR 9605669 A 19960502 La présente invention concerne la prévention d'une contamination par des microorganismes dans les solutés buvables et injectables, dans les vaccins à un seul composant antigénique (vaccins monovalents) ou à plusieurs composants (vaccins combinés ou polyvalents), dans les sérums et dans les produits cosmétiques. Cette prévention de la contamination est, jusqu'à présent, assumée ou non par des conservateurs à efficacité médiocre (Phénoxy-éthanol, Métacrésol, Phénol, Esters parahydroxybenzoïques...) ou neurotoxiques et neurocumulatifs (dérivés mercuriels type Merthiolate...). La CHLORPHENESINE ou 3p-Chlorphénoxypropane- 1,2 diol ou p-chlorphénylglycérol éther (PM = 202,6), utilisée seule ou en association avec un autre conservateur compatible, permet de remédier à cet inconvénient. La présente étude comporte deux étapes: - Déterminer une zone de concentrations efficaces de la CHLORPHENESINE. - Démontrer son efficacité selon les exigences des Pharmacopées Européenne et Britannique. I/ Determination de Concentratlons efficaces de la CHLORPHENESINE La concentration efficace de la chlorphénésine est la concentration minimale bactéricide (C.M.B.) et fongicide (C.M.F.) I. 1. Mlcro-orgamsmes testes Les micro-organismes utilisés dans la détermination de concentration efficace de la chlorphénésine sont référencés A.T.C.C. (American Type Culture Collection) - Eschérichia coli ATCC 8739 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 - Staphylococcus aureus ATCC 6538 - Apergillus niger ATCC 16404 - Candida albicans ATCC 10231 I.2. Inoculum: Les micro-organismes testés doivent être en phase exponentielle de croissance et en milieu liquide type Bouillon Mueller-Hinton (b.M.H.) ou type Bouillon Trypto-Caséine Soja (b.T.C.S.). L'inoculum pour la détermination de C.M.B. et C.M.F. doit être vérifié par: - Numération en milieu gélosé type gélose Mueller-Hinton (g.M.H.) ou gélose type T.C.S. (g.T.C.S.) pour E.coli, Ps.aeruginosa et C.albicans. - Détermination du Nombre Le Plus Probable (N.P.P.) en b.M.H. ou b.T.C.S. selon les tables de Mc GRADY pour S.aureus et A.niger. En effet, ces derniers sont en amas difficilement dissociables et ne peuvent en conséquence etre numérés de façon classique. I.3. Concentration Minimale Inhlbltnce (C.I.) - Concentratlon Minimale Bactéricide C.M.B.) ou Fongicide (C.g.F.) La détermination de la C.M.I. est réalisée sur plaque à 96 cupules et en milieu nutritif liquide type b.M.H. ou type b.T.C.S. La chlorphénésine est diluée au maximum de sa solubilité en b.M.H. ou b.T.C.S. à 0,6 % (P/V) à 20-250C. Les concentrations finales de Chlorphénésine testées suivent une progression géométrique de raison 2 avec une concentration initiale à 0,0125 microgramme/ml et la plus élevée à 0,400 microgramme/ml. Un témoin inoculum sans chlorphénésine et la concentration maximale de 0,600 microgramme de chlorphénésine/ml sont également testés. L'inoculum de micro-organisme, de 1.1 0Lt à 5.105 unités viables par cupule de 100 microlitres, doit être sous un volume négligeable inférieur ou égal à 5 microlitres. La plaque, recouverte d'une feuille de cellophane stérile pour éviter l'évaporation, est alors incubée à 30-35"C pour les bactéries et à 20-250C pour la levure et la moisissure. La lecture de la C.M.I. est réalisée après 24 h d'incubation pour les bactéries et après 48 h pour la levure et la moisissure. Après relevé de C.M.I., un repiquage de 100 microlitres de chacune des cupules sans croissance apparente par tube de 10 ml de b.M.H. ou b.T.C.S. permet, après incubation dans les mêmes conditions décrites pour la C.M.I., de déterminer la C.M.B. ou la C.M.F. Les résultats sont récapitulés dans le tableau ci-après Tableau N" 1 : C.M.I. et C.M.B. ou C.M.F. de la chlorphénésine Escherichia Pseudomonas Staphylococcus Aspergillus Candidada Coli ATCC aeruginosa aureus niger ATCC albicans ATCC 8739 ATCC 9027 ATCC 6538 16404 10231 C.M.I. 0,10 0,20 0,20 0,10 0,20 C.M.B. ou 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 C.M.F La concentration efficace de la chlorphénésine utilisée comme agent conservateur est donc de 0,400 microgramme/ml. L'incertitude étant d'une à deux dilutions d'écart, la zone de concentrations efficaces de la chlorphénésine est donc l'intervalle 0,100 microgramme /ml-0,600 microgramme/ml ; cette dernière concentration étant la solubilité maximale à température ambiante 20-25"C. II/ Efficacité de la chlorphenesine comme agent conservateur selon les exigences des Pharmacopées Européenne et Britannique II.1. Principe: L'essai consiste en - la contamination artificielle d'une solution aqueuse contenant 10 % (P/V) d'une substance interférente quelconque : protéine, lipide, glucide à l'aide d'un inoculum de micro s organismes (minimum 1.10 /ml), en présence de 0,400 microgramme de chlorphénésine en concentration finale par millilitre. - le maintien de la préparation inoculée à la température de 20-25"C et à l'obscurité. - le prélèvement d'échantillons à partir des contenants, à intervalles de temps déterminés. - le dénombrement des micro-organismes dans les échantillons ainsi prélevés. L'essai ainsi défini va permettre de démontrer l'efficacité de la chlorphénésine comme agent conservateur vis-à-vis des produits dermo-cosmétiques (stick pour lèvres, shampoing, démaquillant, crème pour soin corporel ou soin des mains, crème ou lotion anti-acnéique, savon liquide médico-chirurgical, pâte dentifrice, etc...) et pharmaceutiques (vaccins, sérums, crème, pommade, suppositoire, ovule, collyre, solution nasale, collutoire, sirop, gélule, etc...) à usage humain ou vétérinaire. II.2. Cnteres de la Pharmacopee Europeenne. Réduction Logarythmiquel au Témoin 6h 24h 7 jours 14jours 28 jours Peptone s.aeruginosa; Non aureus 2 3 retrouvé .albicans; Pas niger 2 d'augmentation II.3. Cnteres de la Pharmacopee Bntanmque Réduction Logaryduniquel au Témoin Peptone 6h 24 h 1 7jours 14jours 28 jours I Ps.aeruginosa; S.aerugmosa , 3.aureus ; 3 Non retrouvé Non retrouvé A.niger d'augmentation II.4. Résultats : Remarque: - Les inoculums de E.coli, Ps.aéruginosa et C.albicans sont vérifiés par numération sur gélose Mueller-Hinton ou gélose T.C.S. Par contre, ceux de S.aureus et A.niger sont appréciés par leur Nombre le Plus Probable selon Mc GRADY en bouillon Mueller Hinton ou en bouillon T.C.S. - Les éventuels survivants à la chlorphénésine sont dénombrés en tenant compte de la teneur résiduelle de la chlorphénésine qui doit être, dans le milieu de culture, inférieure ou égale au 1/4 de la C.M.I. de chaque micro-organisme. Tableau : Activité anti-micro-organisme de la chlorphénésine à 0,40 % P/V soit 0,400 microgramme/ml. Réduction logarythmique/Témoin Peptone à l'instant T. Réd. log./ Témoin Peptone T+6h T + 24 h T + 7 jours T + 14jours T + 28 jours coli > 3 Non retrouvé NR Non retrouvé NR .con s.aeruginosa > 3 Non retrouvé NR Non retrouvé NR S.aureus > 3 Non retrouvé NR Non retrouvé NR albicans > 2,5 > 6 niger > 2,5 > 4 III/ Conclusion La chlorphénésine est efficace comme agent conservateur. REVENDICATIONS 1) CHLORPHENESINE ou 3p.CHLORPHENOXYPROPANE-1,2 DIOL utilisée comme agent conservateur. 2) CHLORPHENESINE selon la revendication 1 utilisée à des gammes de concentration allant de 0,100 à 0,600 microgramme/ml en absence ou en présence de substances pouvant être interférentes. Exemples : protéine, lipide, glucide. 3) Utilisation de CHLORPHENESINE comme agent conservateur dans les industries cosmétiques et pharmaceutiques, à usage humain ou véténnaire. Exemples: - Dermo-Cosmétique: Stick pour lèvres, shampoing, démaquillant, crème pour soin corporel ou soin des mains, crème ou lotion anti-acnéique, savon liquide médico-chirurgical etc... - Pharmaceutique : Vaccins, sérums, crème, pommade, suppositoire, ovule, collyre, solution nasale, collutoire, sirop, gélule, etc...