FR 2752382 A1 19980220 FR 9610258 A 19960816 PROCEDE DE TRAITEMENT DE PRODUITS D'ORIGINE HUMAINE OU ANIMALE DESTINES A UNE UTILISATION THERAPEUTIQUE La présente demande a pour objet un procédé de traitement de produits d'origine humaine ou animale, destinés à une utilisation thérapeutique, notamment chirurgicale. Les techniques chirurgicales comportent parfois l'utilisation de produits d'origine humaine ou animale, dont il convient d'assurer, avant l'administration ou l'implantation chez l'homme ou l'animal, l'innocuité bactérienne et virale, à tout le moins pour les agents infectieux connus etlou détectables. En d'autres termes, l'utilisation dans des méthodes thérapeutiques, notamment chirurgicales, de produits d'origine humaine ou animale (appelés aussi produits biotechnologiques) nécessite au préalable leur décontamination virale et bactérienne. L'invention apporte une solution à ce problème grâce à un procédé de traitement de matériel d'origine biologique qui permet l'élimination etlou l'inactivation des virus eVou particules virales éventuellement présents dans le produit avant traitement. L'invention vise aussi les produits traités qui présentent une innocuité pour l'hôte auquel ils sont administrés, sur le plan bactérien et viral dans la mesure où les bactéries, particules virales ou virus éventuellement présents avant traitement ont été inactivés et/ou éliminés. Des techniques sont à ce jour disponibles pour réaliser la stérilisation de produits d'origine biologique et ainsi permettre la destruction des micro-organismes et en particulier des bactéries. L'invention a pour objet un procédé dont chacune des étapes a un effet de décontamination bactérienne du produit traité et/ou de décontamination virale. Les produits biotechnologiques préparés à partir de matériel d'origine humaine ou animale sont potentiellement exposés à une contamination virale. La contamination de produits biologiques peut provenir soit du matériel de départ (banque cellulaire d'origine humaine ou animale, sang humain ou tissus d'origine humaine ou animale), soit de produits introduits au cours du procédé de préparation (utilisation de sérum en culture cellulaire). Conformément aux recommandations de la Communauté Européenne (EC regulatory document, note for guidance, III/8115/89-EN. Validation of virus removal and inactivation procedures. Biologicals, 1991, 19, 247-251 et 11118379189-EN. Guidelines for Medicinal Products derived from human blood and plasma. Biologicais 1992, 20, 159-164), une des approches principales pour contrôler une contamination virale potentielle des produits biologiques, est de tester la capacité du procédé de fabrication du matériel utilisable en chirurgie ou plus généralement en thérapie, à éliminer et/ou à inactiver les virus. Pour une étape du procédé de fabrication à tester, ceci peut être réalisé (i) en contaminant avec une quantité significative de virus le matériel à purifier, et (ii) en déterminant la quantité de virus éliminée et/ou inactivée durant l'étape concernée. Cette approche expérimentale requiert la sélection de virus adventices et/ou modèles. Le procédé de traitement selon l'invention qui permet d'éliminer et/ou d'inactiver des virus présents dans un produit biologique d'origine humaine ou animale a été testé selon ces recommandations européennes, et en respecte les normes. A ce titre, le procédé selon l'invention permet l'inactivation et/ou l'élimination de virus présentant une faible résistance, une résistance moyenne ou une forte résistance aux traitements physicochimiques habituels. Ces virus que l'on cherche à éliminer ou à neutraliser dans le produit biologique d'origine humaine ou animale, ne sont généralement pas des virus endogènes chez l'hôte auquel on destine le matériel biologique traité. II s'agit au contraire de virus adventices, pathogènes ou susceptibles de le devenir. Pour évaluer l'efficacité d'élimination et/ou d'inactivation virale de ce procédé, différents virus appartenant aux trois catégories établies sur la base du niveau de résistance aux traitements physicochimiques, ont été utilisés comme modèles. II s'agit des virus suivants: - Virus de l'lmmunodéficience Humaine de type 1 (VlH-i ; ARN, enveloppé, faible résistance); - Virus de la Pseudorage porcine (PSR ; ADN, enveloppé, résistance moyenne); - Simian Virus 40 (SV4O ; ADN, non enveloppé, forte résistance). L'invention a donc pour objet un procédé de traitement d'un produit d'origine humaine ou animale destiné à une utilisation thérapeutique, comprenant les étapes de: 1) incubation du produit dans une solution comprenant un alcool et du chloroforme dans des conditions permettant le dégraissage du produit, 2) incubation du produit obtenu à l'issue de l'étape 1) dans une solution acide, dans des conditions permettant la déminéralisation du produit, 3) neutralisation du produit déminéralisé, 4) dessiccation du produit déminéralisé jusqu'à obtention d'un taux résiduel d'eau libre inférieur ou égal à 9%, 5) stérilisation antimicrobienne du produit déshydraté, les susdites étapes étant réalisées dans des conditions telles que chacune d'entre elles a une action bactéricide et/ou virucide et/ou stabilisatrice sur le produit traité. Les étapes ci-dessus décrites doivent conduire à l'obtention d'un produit qui, sous réserve d'une mise en forme ou d'une présentation appropriée, peut être administré, notamment par voie chirurgicale, à l'homme ou à l'animal, par exemple en vue d'une implantation chez l'hôte. Dans le contexte de la présente invention, les termes suivants répondent aux définitions suivantes: dégraissage signifie l'élimination des lipides; stabilisation signifie la conservation de la configuration du produit traité, la conservation d'un niveau de propriétés mécaniques, histologiques et physiologiques compatible avec l'utilisation finale recherchée du produit biotechnologique. déminéralisation correspond à la destruction des résidus protéiques du produit traité; action bactéricide signifie l'élimination et/ou l'inactivation des bactéries... action virucide signifie l'inactivation et/ou l'élimination d'un ou plusieurs types de virus déterminés et/ou de particules infectieuses d'origine virale, de façon telle que le titre viral pour un virus déterminé, dans un échantillon donné est le plus faible titre théorique obtenu, permettant de détecter une production virale dans un échantillon donné. Pour un virus donné, le titre infectieux est exprimé en Dose Infectant 50% des Cultures de Tissu par millilitre (DlCT50/ml), en utilisant la formule de Spearman Karber. L'effet virucide peut en variante être corrélé à la charge virale dont la détermination est exposée dans les exemples de la présente demande. De façon intéressante, les inventeurs ont établi que plusieurs, voire chacune des étapes du procédé défini ci-dessus est (sont) susceptible(s) d'avoir un effet virucide et donc de réduire la charge virale du produit traité. Ainsi, les étapes du procédé décrit permet une combinaison des effects virucides propres à chacune des étapes. Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé ci-dessus défini est caractérisé en ce que la stérilisation du produit est réalisée par une étape de chauffage pendant 48 h à une température comprise entre 50 et 52"C, de préférence 50"C en présence d'oxyde d'éthylène. L'oxyde d'éthylène est ensuite éliminé par désorption par chauffage à une température d'environ 35"C à 40"C jusqu'à obtention d'une quantité résiduelle d'environ 0,1 PPM d'oxyde d'éthylène dans le produit. L'étape de désorption de l'oxyde d'éthylène a une durée d'au moins 6 jours de préférence de 21 jours, à une température d'environ 35"C permettant d'éliminer l'oxyde d'éthylène jusqu'à l'obtention d'une quantité résiduelle d'environ 0,1 PPM. Pour autant que les propriétés du produit obtenu restent comparables dans les mêmes conditions d'innocuité, la stérilisation à l'oxyde d'éthylène peut être remplacée par exemple par une irradiation par exemple à l'aide de rayons X ou de rayons y. Le procédé de traitement de l'invention conduit à l'inactivation et/ou l'élimination de virus ou de particules virales infectieuses de virus déterminés de niveaux de résistance aux traitements physicochimiques variables. Parmi les virus qui peuvent être inactivés et/ou éliminés par le procédé selon l'invention, on citera à titre d'exemple, les virus de l'immunodéficience aquise (VIH-1 ou VIH-2 en particulier), les virus HTLV, notamment HTLV-1 ou HTLV-2, les herpesvirus tels que le cytomégalovirus (CMV) ou le virus d'Hepstein Barr (EBV), les virus de l'hépatite, et notamment les virus de l'hépatite A, de l'hépatite B ou de l'hépatite C. Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de traitement comprend les étapes de: 1) incubation du produit dans un mélange méthanol/chloroforme dans des conditions permettant le dégraissage du produit, 2) incubation du produit dégraissé obtenu à l'issue de l'étape 1) dans une solution d'acide chlorhydrique, dans des conditions permettant la déminéralisation du produit, 3) neutralisation du produit déminéralisé, 4) dessiccation du produit obtenu jusqu'à obtention d'un taux résiduel d'eau libre inférieur ou égal à 9%, 5) stérilisation du produit déshydraté à l'issue de l'étape 4), à l'aide d'oxyde d'éthylène. En particulier, les conditions de mise en oeuvre de ce procédé peuvent être les suivantes: 1) incubation du produit dans un mélange de méthanol/chloroforme (v/v) sous agitation pendant 24 h à 4"C + 2"C, 2) incubation du produit obtenu à l'issue de l'étape 1, dans une solution d'acide chlorhydrique (HCI) à 0,5 M, sous agitation pendant 48 h à 4 C + 2 C, 3) neutralisation du produit déminéralisé dans trois bains successifs de 2 heures dans une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,7Mou0,7Mà40C+20C, 4) dessiccation du produit obtenu jusqu'à obtention d'un taux résiduel d'eau libre inférieur ou égal à 9%, 5) stérilisation du produit obtenu à l'issue de l'étape 4) par chauffage en présence d'oxyde d'éthylène à une température comprise entre 50 et 52"C et de préférence d'environ 50"C pendant 48 h, 6) désorption de l'oxyde d'éthylène par chauffage à une température comprise entre 35 et 37"C, de préférence à une température d'environ 35"C pendant une durée suffisante pour obtenir un taux résiduel d'oxyde d'éthylène inférieur à 0,1 PPM. La dessiccation dont question précédemment peut être réalisée par lyophilisation, en utilisant de l'alcool éthylique 90" (PC R), de la carboglace (CARBOXIQUE) et au moyen d'un microsublimateur (à titre d'exemple MSP 32-4). L'étape de dégraissage est normalement précédée d'une étape de nettoyage du produit utilisé, en particulier lorsqu'il s'agit de tissu, par exemple d'un tissu conjonctif tel que le cartilage. En outre, on pourra le cas échéant effectuer un façonnage du matériel en pièces de dimensions déterminées, avant d'effectuer le traitement de décontamination. Le cas échéant, et dans la mesure où l'effet virucide peut effectivement être ainsi obtenu, les solutions d'incubation du produit permettant le dégraissage puis la déminéralisation peuvent être modifiées par rapport aux exemples de solutions décrits ci-dessus. A titre d'exemple, un alcool acyclique différent du méthanol peut être utilisé. Le procédé de traitement de l'invention est particulièrement adapté pour traiter des produits d'origine humaine tels que des tissus, notamment des tissus conjonctifs comme le cartilage, des tissus fibreux, de la matière osseuse, des artères, des tendons, des enveloppes. L'invention a également pour objet les produits à usage thérapeutique, d'origine humaine ou animale, obtenus après traitement selon le procédé décrit ci-dessus. Avantageusement, l'invention concerne du cartilage traité selon le procédé ci-dessus décrit. Des produits selon l'invention sont ainsi caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de particules virales infectieuses ou de virus de type VIH et/ou HTLV et/ou des virus de l'hépatite et/ou des herpesvirus. La validation du procédé de l'invention destinée à démontrer son efficacité en tant que méthode d'inactivation et/ou d'élimination de virus ou de particules virales infectieuses a été réalisée sur différentes souches virales, et en particulier sur le virus VIH-I, le virus de la pseudorage porcine (PSR) et le virus simien SV40. Les résultats rapportés ci-après démontrent que le procédé selon l'invention inactive et/ou élimine efficacement les virus en question dans du matériel d'origine humaine, et par exemple dans du cartilage. Les figures et exemples qui suivent apportent des éléments supplémentaires de caractérisation du procédé de l'invention et des produits traités, ainsi que des avantages supplémentaires. Figure 1: Schéma du procédé de prépartion du cartilage humain lyophilisé Figure 2: Relevé de température au cours du chauffage des cartilages à 50"C + 5"C pendant 48 heures EXEMPLES I - TRAITEMENT CHIMIQUE DU CARTILAGE Le traitement chimique n'est pas réalisé de façon stérile. Les changements de solutions s'effectuent cependant sous hotte stérile (Classe 100). 1. Dégraissage au chloroforme 1. Préparer 1 litre de solution VN chloroforme / méthanol dans la fiole de 2 litres, loin de toute source de chaleur ou de flamme. 2. Déposer les morceaux de cartilage dans la fiole. 3. Laisser agir 24 heures sous agitation permanente. 2. Déminéralisation à I'HCL 1. Vider le mélange chloroforme / méthanol dans un containeur prévu à cet effet. 2. Préparer 1 litre de solution d'HCL 0,5M. 3. Remplir la fiole contenant le cartilage avec cette solution. 4. Laisser agir 48 heures sous agitation permanente. 3. Neutralisation au bicarbonate de sodium 1. Vider la solution d'HCL. 2. Préparer 6 litres de solution de NaHCO3 0,7M. 3. Remplir la fiole contenant le cartilage avec cette solution. 4. Laisser agir 2 heures. Répéter 3 fois cette opération (neutralisation avec NaHCO3). Lyophilisation Le matériel utilisé est le suivant: - 5 flacons en verre de 250 ml - Alcool éthylique 90" (PCR) - Carboglace (CARBOXIQUE) - 1 Microsublimateur (MSP 324) La lyophilisation est effectuée comme suit: 1. Brancher le sublimateur. 2. Introduire la carboglace dans le piège à vapeur d'eau. 3.Recouvrir la carboglace avec l'alcool éthylique dénaturé à 95"C. 4. Introduire 4 morceaux de cartilage dans un flacon en verre de 250 ml. 5. Introduire l'extrémité conique du flacon dans le caoutchouc de l'araignée du sublimateur. 6.Mettre en marche le sublimateur. 7. Vérifier que les piquages non utilisés de l'araignée sont bien obturés. 8. Faire l'appoint de carboglace pendant la durée de la sublimation (24 heures). 9. Casser le vide. 10. Retirer les flacons. 11. Fermer les flacons de façon hermétique immédiatement. Si la mise en sachet pour la stérilisation n'est pas immédiate, stocker les flacons à +4"C, avec un apport de silicagel à l'intérieur. Stérilisation à l'oxyde d'éthylène. Le chauffage du cartilage à une température de 50"C pendant 48 heures, entre dans le protocole de Viro-lnactivation du cartilage costal humain. La durée de désorption est de 21 jours (0,1 PPM d'oxyde d'éthylène résiduel). II - ETUDE DE L'INACTIVATION DU VIH-1 AU COURS D'UN PROCEDE DE PREPARATION DE CARTILAGE HUMAIN On notera que de la même façon, l'étude de l'inactivation des virus PSR et SV40 a été réalisée. Trois étapes du procédé pour la préparation de cartilages d'origine humaine ont été étudiées, quant à leur capacité à inactiver et/ou éliminer des virus. Ces cartilages sont utilisés en chirurgie humaine. L'approche expérimentale de la validation virologique a été élaborée en accord avec les recommandations de la Communauté Européenne relatives aux validations des procédés d'inactivation et d'élimination virale (Références, paragraphe 2). Les étapes i.e. (i) traitement au méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4"C + 2"C, (ii) traitement par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 4"C + 2"C et (iii) chauffage à sec pendant 48 heures à 50"C + 5"C ont été testées avec le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). L'inactivation virale de chacune des trois étapes étudiées a été évaluée à partir de trois morceaux de cartilages contaminés et traités indépendamment. La charge virale des échantillons obtenus à partir des cartilages contaminés non traités et des cartilages contaminés traités a été déterminée par la technique de titrage en dilution limite par DlCTso (dose infectant 50% des cultures de tissu) sur une lignée T transformée par le HTLV-1 (cellules MT-4). Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que les trois traitements successifs sont efficaces pour l'élimination et/ou l'inactivation du VIH-1. Le procédé évalué dans cette étude est utilisé pour la préparation de cartilages d'origine humaine utilisés en chirurgie humaine. Après prélèvement du cartilage costal, celui-ci est soumis à un procédé de préparation incluant six étapes consécutives (figure 1). Les produits biotechnologiques préparés à partir de matériel d'origine humaine ou animale sont potentiellement exposés à une contamination virale. La contamination de produits biologiques peut provenir soit du matériel de départ (banque cellulaire d'origine humaine ou animale, sang humain ou tissus d'origine humaine ou animale), soit de produits introduits au cours du procédé de préparation (utilisation de sérum en culture cellulaire). Conformément aux recommandations de la Communauté Européenne (Références paragraphe 2), une des approches principales pour contrôler une contamination virale potentielle des produits biologiques, est de tester la capacité du procédé de préparation à éliminer et/ou à inactiver les virus. Pour une étape du procédé de préparation à tester, ceci peut être réalisé (i) en contaminant avec une quantité significative de virus le matériel à purifier, et (ii) en déterminant la quantité de virus éliminée etiou inactivée durant l'étape concernée. Cette approche expérimentale requiert la sélection de virus adventices et/ou modèles. PROCEDURE EXPERIMENTALE 1. But et approche expérimentale L'objectif de cette étude était d'évaluer la capacité des trois traitements suivants, du procédé de préparation de cartilages d'origine humaine, à inactiver les virus: - Etape de dégraissage; traitement par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4"C j 2"C. - Etape de déminéralisation ; traitement par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 4"C + 2 C. - Etape de désorbtion de l'oxyde d'éthylène ; chauffage à sec pendant 48 heures à 50"C j 50C. Les virus suivants ont été utilisés: - Virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-I ; virus à ARN, enveloppé, de faible résistance. C'est un virus adventice). - Virus de la pseudorage porcine (PSR ; virus à ADN, enveloppé, de résistance moyenne. C'est un virus modèle pour les Herpesvirus et pour le virus de l'Hépatite B). - Virus simien de type 40 (SV40 ; virus à ADN, non enveloppé, de forte résistance. C'est un virus modèle de forte résistance). Les résultats présentés dans la partie I ont été obtenus avec le VIH1. Les morceaux de cartilage ont été perforés puis contaminés par le VIH-1. Les trous ont été rebouchés à l'aide d'amalgame dentaire. Le traitement a été réalisé sur trois cartilages contaminés. Des cartilages contaminés ont été préparés pour les contrôles positifs parallèlement à l'expérience. La charge virale des échantillons obtenus à partir des cartilages contaminés non traités et des cartilages contaminés traités à été évaluée par la technique de titrage en dilution limite par DlCTso (Dose Infectant 50% des Cultures de Tissu) sur une lignée T transformée par le HTLV-1 (cellules MT4) en utilisant la formule de Spearman Barber. A partir des résultats expérimentaux, des facteurs de réduction des titres infectieux ont été calculés pour chaque étape (voir paragraphe 3.3.3). 2. Matériel 2.1. Matériel utilisé au cours de la validation Les produits utilisés pour l'étude sont donnés dans le tableau cidessous: Numéro de lot des produits utilisés pour les étapes: Produits utilisés Méthanol Acide chlorhydrique 0,5 N Chauffage à chloroforme 50 C # 5 C (v/v) Cartilages costals humains 967 1150 1231 Methanol Carlo Erba 102131 114691 114691 102131 114091 114091 code 30 9004 Chloroforme Merck 316K 19584149 232K 18256045 232K 18256045 code 2445 Acide chlorhydrique Labosi Non utilisé 1193334 1193334 code A4705151 - Virbromix 4 et amalgame dentaire Fluoralloy (ref. 94 065B); Dentoria. 2.2. Cellules Cellules CEM (ATCC-CCL 119) (Foley G. et ai. 1965; McDougal J. et a!. 1985) Lignée de cellules lymphoblastoïdes T humaines obtenue à partir du sang périphérique d'un patient atteint d'une leucémie Iymphoblastique aigüe. Les cellules sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 50 U/ml de Pénicilline, 50 pglml de Streptomycine et 100 g/ml de Néomycine. Ces cellules sont utilisées pour la production du VIH-1. Cellules MT-4 (Institut Pasteur, Unité de Biologie des Rétrovirus) (Harada S. et ai. 1985; Rey F. et a!. 1987) Lignée de cellules lymphoblastoïdes T humaines transformées par le HTLV-I. Ces cellules sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 50 U/ml de Pénicilline, 50 pgiml de Streptomycine et 100 pgiml de Néomycine. Ces cellules sont utilisées pour tester-le pouvoir infectieux du VIH-1. 2.3. Virus Le Virus de l'lmmunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) (Institut Pasteur, Unité de Biologie des Rétrovirus) (Fields B. and Knipe D. 1990; Wain-Hobson S. ef al. 1991; Barré-Sinoussi F. et al. 1983; Rey M. et al. 1984; Gregersen J. et al. 1988; Hoffman A. et ai. 1985) Le VIH-1 appartient à la famille des Rétroviridae, sous-famille des lentivirinae, genre Lentivirus. C'est un virus enveloppé, sphérique, de 80 à 130 nm de diamètre. Son génome est constitué de deux molécules d'ARN simple brin identiques de 9,2 Kb. Ce virus a une faible résistance vis à vis des traitements physico-chimiques. Le VIH-1 (souche Lai) est obtenu à partir de surnageants de culture de cellules CEM infectées. Ces cellules sont entretenues tous les 3 ou 4 jours par passage à 5 105 cellules/ml et addition de 50% de cellules CEM non infectées. Après clarification, le surnageant cellulaire est ultracentrifugé à 27000 rpm pendant 30 minutes (rotor Beckman SW28) et le culot est repris dans du tampon NTE (NaCI 0,1M; EDTA 0,001M; TRIS 0,01M; pH=7,4). La suspension est aliquotée et congelée à - 75"C + 5"C. Son titre infectieux sur cellules MT-4 est de I 107 DlCTso/ml. 3. Méthode 3.1. Validation virale 3.1.1. Organisation générale La validation a été effectuée selon le schéma général présenté dans la figure 2. Compte tenu de la nature particulière du matériel à contaminer et des conditions utilisées pour la contamination, les cartilages ont été préparés au laboratoire Texcell à partir de cartilage frais pour chaque étape à tester. En effet, pour l'étape de dégraissage, le cartilage frais a été directement utilisé. Par contre, pour l'étape de déminéralisation, des cartilages frais ayant subi l'étape de dégraissage ont été utilisés. Et enfin, pour l'étape de désorbtion de l'oxyde d'éthylène, les deux étapes précédentes (dégraissage et déminéralisation) ont été effectuées à partir du cartilage frais. Cependant, pour cette dernière étape, le chauffage à sec à 50"C ffi 5"C pendant 48 heures n'a pas été réalisé sur des cartilages préalablement traités à l'oxyde d'éthylène et cela pour des raisons de sécurité. La pénétration passive de la suspension virale jusqu'au centre du cartilage n'ayant pas été possible, la réalisation d'un trou dans le cartilage puis l'introduction de la suspension virale dans la cavité et le rebouchage ont donc été testés comme moyen de contamination de celui-ci. Le rebouchage du trou à l'aide d'amalgame dentaire après addition de la suspension virale a été contrôlé. II a été vérifié: - que l'amalgame dentaire utilisé n'avait aucun effet virucide sur le virus MLV (virus choisi pour sa faible résistance aux traitements physicochimiques), - que le bouchon d'amalgame était étanche (testé à l'aide d'un colorant placé à l'intérieur du trou), - que l'amalgame était utilisable quel que soit le traitement étudié. L'éventuel effet virucide du morceau de cartilage avant traitement a été contrôlé pour chaque étape testée. Des lavages en milieu de culture avec sérum se sont révélés indispensables pour éliminer cet effet virucide. Les conditions exactes de préparation du cartilage avant surcharge sont décrites pour chaque étape dans les paragraphes 3.1.2, 3.1.3 et 3.1.4. Tous les produits obtenus au cours de la réalisation des étapes et destinés à un titrage infectieux ont été immédiatement aliquotés puis congelés à -75 C + 5"C. Le titrage des échantillons a été réalisé à partir des fractions aliquotes décongelées extemporanément à 370C i 20C puis placées dans de la glace fondante. 3.1.2. Etape de dégraissage traitement avec un mélange méthanollchloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4"C + 2"C 3.1.2.1. Préparation des cartilages contaminés Des morceaux de cartilage frais congelés, d'environ 3 à 4 cm de longueur et de 0,5 à 1 cm de diamètre, ont été perforés à l'aide d'une chignole. Un foret de 4 mm de diamètre a été utilisé pour réaliser un trou d'environ 1 cm de long. Les cartilages perforés ont été lavés par 2 bains successifs de milieu de culture contenant 0,5% de serum de veau foetal pendant 15 minutes. Les cartilages ont été essuyés avec de la gaze stérile et une suspension virale concentrée a été introduite dans le trou réalisé (50 Wus). Le trou a été bouché par de l'amalgame dentaire préparé extemporanément (Fluoralloy des laboratoires Dentoria préparé à l'aide d'un Vibromix 4 sous agitation pendant 12 secondes). 3.1.2.2. Traitement des cartilages contaminés Six morceaux de cartilages ont été préparés comme précédemment décrit (paragraphe 3.1.2.1.). Cinq morceaux ont été contaminés puis trois morceaux ont été traités et les deux derniers ont été utilisés pour les contrôles positifs. Un morceau de cartilage a été utilisé comme contrôle négatif : du milieu de culture a été introduit dans l'orifice à la place de la suspension v 3.1.2.3. Récupération des virus à partir des cartilages contaminés Après traitement, les cartilages ont été lavés dans 50 ml de milieu de culture par morceau de cartilage pendant environ 1 minute sous agitation manuelle. Chaque morceau de cartilage a été essuyé sur de la gaze stérile puis coupé en plusieurs fragments qui ont été incubés dans 10 ml de milieu de culture pendant 15 minutes à 4"C + 2"C sous agitation douce. Le milieu de culture a ensuite été récupéré. Les morceaux de cartilage ont été déposés sur le filtre d'un tube "Leucosep" et centrifugés pendant 2 minutes à 1500 rpm. Les morceaux de cartilage ont été éliminés. Le milieu résiduel a été récupéré. Les deux solutions récupérées ont été réunies et centrifugées pendant 5 minutes à 1800 rpm. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé à 27000 rpm pendant 30 minutes (rotor Beckman SW28). 3.1.3. Etape de déminéralisation : traitement avec une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 4"C + 2"C 3.1.3.1. Préparation des cartilages contaminés Six morceaux de cartilage frais congelés, d'environ 3 à 4 cm de longueur et de 0,5 à 1 cm de diamètre, ont été perforés à l'aide d'une chignole. Un foret de 4 mm de diamètre a été utilisé pour réaliser un trou d'environ 1 cm de long. Une tige de téflon de diamètre identique au trou a été introduite dans l'orifice. Cette tige de téflon a été maintenue en place tout au long de la préparation des cartilages jusqu'à leur contamination. Les cartilages ont été lavés dans 2 bains successifs de milieu de culture contenant 0,5% de serum de veau foetal pendant 15 minutes, essuyés avec de la gaze stérile puis incubés pendant 24 heures dans un bain de 400 ml d'un mélange méthanollchloroforme (v/v) sous agitation douce. A la fin de ce traitement, les cartilages ont été séchés à 37 C i 2"C pendant 72 heures. Le poids des morceaux de cartilage a été noté avant et après séchage. Les cartilages ont ensuite été incubés dans du milieu de culture contenant 2% de sérum de veau foetal pendant 7 heures avec changement de milieu environ toutes les heures afin d'éliminer toute trace de méthanol/chloroforme, puis pesés. Compte tenu de leur réhydratation, les cartilages ont été séchés dans une étuve à 37"C j 2"C pendant 72 heures puis congelés à -20 C. Au moment de l'utilisation, la tige de téflon a été retirée et une suspension virale concentrée (ou du milieu de culture) a été introduite dans le trou (50 ,ul). Le trou a été bouché par de l'amalgame dentaire préparé extemporanément (Fluoralloy des laboratoires Dentoria préparé à l'aide d'un Vibromix 4 sous agitation pendant 12 secondes). 3.1.3.2. Traitement des cartilages contaminés Six morceaux de cartilages ont été préparés comme précédemment décrit (paragraphe 3.1.3.1). Cinq morceaux ont été contaminés puis trois morceaux ont été traités et les deux derniers ont été utilisés pour les contrôles positifs. Un morceau de cartilage a été utilisé comme contrôle négatif : du milieu de culture a été introduit dans l'orifice à la place de la suspension virale. Les trois morceaux de cartilage contaminés ont été placés dans une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M à 4"C + 20C pendant 48 heures sous agitation douce. Le cartilage contrôle négatif a été soumis à un traitement identique à celui décrit ci-dessus pour les trois cartilages contaminés. 3.1.3.3. Récupération des virus à partir des cartilages contaminés Les conditions de récupération des virus ont été identiques à celles décrites pour l'étape précédemment décrite (voir paragraphe 3.1.2.3). 3.1.4. Etape de désorbtion de l'oxyde d'éthylène : chauffage à sec pendant 48 heures à 50"C t 5"C 3.1.4.1. Préparation des cartilages contaminés Six morceaux de cartilage frais congelés, d'environ 3 à 4 cm de longueur et de 0,5 à 1 cm de diamètre, ont été perforés à l'aide d'une chignole. Un foret de 4 mm de diamètre a été utilisé pour réaliser un trou d'environ 1 cm de long. Une tige de téflon de diamètre identique au trou a été introduite dans l'orifice. Cette tige de téflon a été maintenue en place tout au long de la préparation des cartilages jusqu'à leur contamination. Les cartilages ont été lavés dans 2 bains successifs de milieu de culture contenant 5% de serum de veau foetal pendant 15 minutes, essuyés avec de la gaze stérile. Ils ont été incubés pendant 24 heures dans un bain de 400 ml d'un mélange méthanol/chloroforme (v/v) à 4"C i 2"C sous agitation douce puis pendant 48 heures dans 400 ml d'une solution à d'acide chlorhydrique 0,5 M à 4 C ffi 2 C sous agitation douce. A la fin de ces deux traitements, les morceaux de cartilage ont été pesés puis congelés à -20 C. Les cartilages ont subi 3 lavages successifs de 2 heures chacun dans une solution de bicarbonate de sodium 0,6 M à 4 C i 2 C sous agitation douce. Puis les cartilages ont été séchés dans une étuve à 37"C ffi 2 C pendant la nuit. Les cartilages ont ensuite été incubés dans du milieu de culture contenant 5% de sérum de veau fcetal pendant 7 heures avec changement de milieu environ toutes les heures. Compte tenu de leur réhydratation, les cartilages ont été séchés dans une étuve à 37"C i 2 C pendant la nuit. Les cartilages ont été pesés avant et après séchage afin de contrôler leur état d'hydratation avant l'étape de chauffage. La tige de téflon a été retirée et une suspension virale concentrée (ou le milieu de culture) a été introduite dans le trou (50 pI). Le trou a été bouché par de l'amalgame dentaire préparé extemporanément (Fluoralloy des laboratoires Dentoria préparé à l'aide d'un Vibromix 4 sous agitation pendant 12 secondes). 3.1.4 2. Traitement des cartilages contaminés Six morceaux de cartilages ont été préparés comme précédemment décrit (paragraphe 3.1.4.1). Cinq morceaux ont été contaminés puis trois morceaux ont été traités et les deux derniers ont été utilisés pour les contrôles positifs. Un morceau de cartilage a été utilisé comme contrôle négatif : du milieu de culture a été introduit dans l'orifice à la place de la suspension virale. Les trois morceaux de cartilage contaminés ont été placés dans un four chauffé à 50"C i 50C pendant 48 heures. Le cartilage contrôle négatif a été soumis à un traitement identique à celui décrit ci-dessus pour les trois cartilages contaminés. La température a été suivie à l'aide d'une sonde de température reliée à un superviseur de température (réf. Fluke 2286A). 3.1.4.3. Récupération des virus à partir des cartilages contaminés Les conditions de récupération des virus ont été identiques à celles décrites pour les étapes précédemment décrites (voir paragraphe 3.1.2.3). 3.1.5. Contrôles Contrôles positifs L1: Un morceau de cartilage contaminé selon les conditions décrites dans les paragraphes 3.1.2.1, 3.1.3.1 et 3.1.4.1 puis traité immédiatement pour la récupération du virus selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.2.3. L2: Un morceau de cartilage contaminé selon les conditions décrites dans les paragraphes 3.1.2.1, 3.1.3.1. et 3.1.4.1, laissé pendant la durée de l'expérience à 4"C + 2"C dans 10 ml de milieu de culture, puis traité pour la récupération du virus selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.2.3. V1: Stock de virus en milieu de culture à la même concentration que celle obtenue à la fin de l'expérience, aliquoté et congelé à -75 C + 5"C jusqu'au titrage. V2: Stock de virus en milieu de culture à la même concentration que celle obtenue à la fin de l'expérience, ultracentrifugé à 27000 rpm pendant 30 minutes (rotor Beckman SW28). Le culot a été resuspendu dans du milieu de culture, puis aliquoté et congelé à -75 C i 5"C jusqu'au titrage. V3: Stock de virus en milieu de culture à la même concentration que celle obtenue à la fin de l'expérience, laissé pendant la durée de celle-ci à 4"C + 2"C, ultracentrifugé à 27000 rpm pendant 30 minutes (rotor Beckman SW28). Le culot a été resuspendu dans du milieu de culture, puis aliquoté et congelé à -75 C i 5 C jusqu'au titrage. Contrôles négatifs NI : Milieu de culture des cellules utilisées pour le titrage. N2: Un morceau de cartilage non contaminé contenant du milieu de culture (voir paragraphes 3.1.2.2, 3.1.3.2 et 3.1.4.2), traité selon les conditions de l'étape étudiée puis traité pour la récupération du virus selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.2.3. 3.2. Titrage Les titrages du pouvoir infectieux des échantillons ont été réalisés selon les procédures opératoires de l'Institut Pasteur - Texcell n" 1053 et 1061, pour le dosage de l'activité transcriptase inverse et pour le titrage sur cellules MT-4, respectivement. 3.2.1. Principe du titrage sur cellules MT-4 La méthode de titrage du VI H-I sur cellules MT-4 est basée sur la détection d'une production virale mesurée par dosage de l'activité transcriptase inverse présente dans les surnageants de culture des cellules infectées. Les cellules MT-4 sont inoculées avec le virus ou les échantillons à tester. Le VIH-1 se multiplie dans les cellules puis est libéré dans le surnageant de culture par bourgeonnement. Le surnageant de culture est récupéré à jour 7. La présence du virus est détectée par le dosage de l'activité transcriptase inverse, enzyme associée au virion. La transcriptase inverse, contenue dans le virion, est une ADNpolymérase-ARN dépendante caractéristique des rétrovirus. Pour le VIH-1, la polymérase fonctionne en présence du cation divalent Mg2+. Elle copie un modèle synthétique [poly r(A)] associé à une amorce [poly r(A)-oligo (dT)]. Son activité est suivie grâce à l'incorporation d'un nucléotide marqué dans un polynucléotide précipitable par l'acide trichloroacétique. La radioactivité incorporée dans ce produit de réaction enzymatique est déterminée à l'aide d'un compteur (ss plate Pharmacia). 3.2.2. Méthode de titrage sur cellules MT-4 80 lul d'échantillon à tester, pré-dilué ou non dans du milieu de culture sont distribués dans une plaque 96 cupules contenant 160 gul de milieu de culture. Des dilutions de raison 3 sont effectuées dans la plaque et 8 puits sont réalisés par dilution. Les cellules MT-4 (2 104 cellules/puits) sont ensuite ajoutées. L'ensemble est incubé à 37"C ~ 2 C en présence de 5% # 0,5% de CO2. Au jour 7, le surnageant de prolifération des cellules est prélevé et conservé à -75 C i 5 C. La présence de VIH-1 dans les surnageants de culture est détectée par la mesure de l'activité de la transcriptase inverse. Le titre infectieux est exprimé en dose infectant 50% des cultures de tissu par millilitre (DlCT50iml), en utilisant la formule de Spearman Barber. 3.2.3. Toxicité Le contrôle de la cytotoxicité est réalisé dans les conditions du titrage sur cellules MT4 décrites dans le paragraphe 3.2.2, mais dans ce cas les échantillons inoculés correspondent à des dilutions successives de milieu de culture récupéré à partir de l'échantillon N2. L'absence de cytotoxicité de ces échantillons est évaluée sur la base de la qualité des cellules au cours du titrage comparativement au contrôle négatif de référence tel que le milieu de culture (Figure 2, échantillon NI) ou le produit non contaminé (Figure 2, échantillon N2). La dilution la moins élevée pour laquelle aucune cytotoxicité n'est observée est appelée dc. 3.2.4. Limite de détection pour un titrage = dl La limite de détection dl, pour un titrage donné, correspond au plus faible titre théorique obtenu permettant de détecter une production virale dans un des réplicats réalisés. Comme une production virale est détectée dans un volume Vc (ml) de la dilution dc, la limite de détection dl est calculée avec un risque d'erreur de 5% selon la formule de Poisson. p(95%) = e-dl [Vc dc] = 0,05 -Log (0,05) d'où dl= Vc dc avec Vc = [vo nc] vo = volume par réplicat nc = nombre de réplicats à la dilution dc 3.2.5. Limite de positivité du dosage de l'activité transcriptase inverse Cette limite de positivité est calculée à partir de la radioactivité moyenne mesurée dans un surnageant de culture de cellules non infectées (bruit de fond) majorée d'au moins deux écarts type. Selon l'expérience, cette limite peut varier de 1000 cpm/50 l à 2000 cpmi50pl. 3.2.6. Calcul du titre viral (Schwartz D., 1993; Kaplan M. & Koprowski H., 1973) Le titre viral, T, évalué par DlCTso, peut être défini par sa moyenne, noté m(T), et son intervalle de confiance. m(T) peut être calculé à partir de la formule suivante: m(T) = 1/Vo 10m(a) avec vO = volume par réplicat (puits) "a" est également défini par sa moyenne, m(a), et son écart type, S(a). m(a) et S(a) sont calculés à partir des formules simplifiées de SpearmanKarber. avec a = log10 du titre moyen rapporté au volume de l'échantillon testé. a0 = log10 de l'inverse de la dilution la plus faible pour laquelle tous les puits sont positifs. k = log10 de la raison des dilutions successives. pi = proportion de puits positifs à la dilution di ni = nombre de réplicats. Avec un risque d'erreur de 5%, l'intervalle de confiance de a est le suivant: amin amax = m(a) + 2S(a) Avec un risque d'erreur de 5%, l'intervalle de confiance pour le titre viral T est donc: Tmin # T # Tmax avec : Tmin =1/Vo 10a Tmax =1/Vo 10a 3.3. Evaluation du facteur de réduction d'une étape du procédé 3.3.1. Limite de détection de la charge virale pour la totalité d'une fraction La limite de détection, DL, correspond à la charge virale minimale qui peut, théoriquement, être détectée dans la totalité d'une fraction appartenant au procédé à l'échelle réduite. DL est calculée avec la formule suivante: DL = dl Vt c avec c = facteur de concentration de l'ultracentrifugation. Vt = volume total de la fraction appartenant au procédé à l'échelle réduite. Les limites de détection pour le matériel pré- et post- purifié sont notées DLi et DLf respectivement. 3.3.2. Calcul de la charge virale pour la totalité d'une fraction Une charge virale, L, est définie par sa moyenne m(L) et son intervalle de confiance m(T)Vt m(L) = # et Lmin # L # Lmax c avec : Lmin = Tmin Vt et Lmax = Tmax Vt c c c c avec c = facteur de concentration de l'ultracentrifugation. Vt = volume total de la fraction appartenant au procédé à l'échelle réduite. Trois situations peuvent être prédites concernant le calcul du titre et de la charge virale : Evaluation du titre (T) Evaluatin de la charge (L) Tmin > dl moyenne = m(T) moyenne = m(L) Tmin # T # Tmax Lmin # L # Lmax 0 Tmin # dl T = dl L = DL Tmin=O T L 3.3.3. Calcul du facteur de réduction Selon les documents réglementaires de la Communauté Européenne, le facteur de réduction d'une étape individuelle de purification ou d'inactivation virale est défini comme le logî 0 du rapport entre, d'une part la charge virale (Li) dans le matériel pré-purifié et, d'autre part, la charge virale (Lf) dans le matériel post-purifé qui est prêt à subir l'étape suivante dans le procédé de fabrication. Ce facteur de réduction, R, est défini par sa moyenne m(R) et son intervalle de confiance [Rmin 2 R 2 Rmax]. En pratique, il faut considérer plusieurs cas qui dépendent de l'effet du matériel pré-purifié sur le virus. - Cas 1: Le matériel pré-purifié n'a pas d'effet éliminant/inactivant significatif, c'est-à-dire que le facteur de réduction moyen, m(R0 ), défini comme étant le logi0 du rapport de la charge virale (Lcm ) dans le milieu de culture sur la charge virale (Li ) dans le matériel pré-purifié, est inférieur ou égal à 1. Dans ce cas, le facteur de réduction de l'étape correspond au facteur de réduction du traitement. - Cas 2 : Le matériel pré-purifié a un effet éliminant/inactivant significatif, c'est-à-dire que le facteur de réduction moyen, m(R0 ), est supérieur à 1. Dans une première approche, le facteur de réduction de l'étape étudiée, m(R), peut être calculé comme étant la somme du facteur de réduction associé à l'effet inactivant, m(R0 ), et du facteur de réduction du traitement, m(Rt ). Dans une deuxième approche, lorsque m(R0 ) est supérieur à 1, il faut envisager de faire une cinétique d'inactivation à partir du matériel pré-purifié. CAS SOUS-CAS EVALUATION DU FACTEUR DE REDUCTION (R) Casi ) k D4 (R > 1 glot DLf ) avec log i Inf 'Oaro( il m(RY1 min Lmax min max m(Lj) il i L1 > Lf m(R)=1og10 et 1 glOlLmax R s R s log10nL5 min max R=O Li Lf Rt ne peut pas etre évalué Cas2 m(Li) Li R rInfrlogl0 DLj > I glOtmXLim))(- saVeclogloti) Skf s loglOt DLi ) DLi jj DLi s : selon les trois souscas de Cas 1 Nm(RO) - loglot *) ) et logll8 > LL > 5 Ro W LCm Dans le contexte particulier du cartilage, I'évaluation de Li et Lf ne peut être faite qu'à partir d'échantillons indépendants. Ainsi, pour les étapes testées au cours de cette étude la charge virale avant traitement (Li) est obtenue à partir des particules infectieuses récuDérées du morceau de cartilage contaminé et aussitôt traité pour la récupération des virus (décrit dans le paragraphe 3.1.2.3.) (échantillons L1 pour chaque expérience). Selon cette approche, le facteur de réduction associé a un effet éliminantiinactivant immédiat ne pourra pas être pris en compte dans le calcul du facteur de réduction de l'étape contrairement à ce qui est indiqué pour le cas n 2. RESULTATS Généralités sur les conditions expérimentales L'approche expérimentale de cette étude est basée sur les recommandations des autorités réglementaires, conçues tout particulièrement pour assurer la sécurité virale des dérivés sanguins et des protéines recombinantes, à savoir des médicaments dont le procédé de fabrication est toujours basé sur des molécules actives en solution. II est clairement demandé de calcuier des facteurs de réduction (R) pour chaque étape étudiée en comparant la quantité totale de particules infectieuses (Li) dans la solution devant subir le traitement à la quantité totale de particules infectieuses (Lf) dans la solution ayant subi le traitement. Selon cette conception, il s'agit, physiquement, de la même solution contaminée par un virus qui sera utilisée pour évaluer Li et Lf. Dans le cas du procédé étudié ici, le matériel de départ n'est pas une solution mais un morceau de cartilage, en conséquence l'évalutation de Li et Lf ne peut être faite qu'à partir d'échantillons indépendants. Ainsi, pour les étapes testées au cours de cette étude, la charge virale avant traitement (Li) est obtenue à partir des particules infectieuses récupérées du morceau de cartilage contaminé et aussitôt traité pour la récupération des virus (décrit dans le paragraphe 3.1.2.3.) (échantillons L1 pour chaque expérience). 1. Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanolichloroforme (v/v) pendant 24 heures sur le VIH-1 Les résultats obtenus sont reportés dans les tableaux 1. 1.1. Analyse des contrôles Cytotoxicité Le milieu récupéré du morceau de cartilage (lot n" 967) non contaminé et traité par le mélange méthanol/chloroforme pendant 24 heures puis ultracentrifugé n'est pas toxique sur les cellules utilisées pour le titrage (Tableau 1.1, échantillon N2). Effet de l'ultracentrifugation sur le virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée au cours de I'ultracentrifugation. En effet, le titre infectieux du virus est identique avant et après ultracentrifugation (Tableau 1.1, échantillon V2 comparé à VI; titre infectieux "b" comparé à "a"). Effet du cartilage et des conditions de récupération sur le virus Une perte de particules infectieuses de 1,23 log a été observée lorsque le morceau de cartilage contaminé a été immédiatement traité pour la récupération du virus comme décrit dans le paragraphe 3.1.2.3. (Tableau 1.1, échantillon LI comparé à S ; charge virale "e" comparée à "d"). Cette perte de particules infectieuses est toutefois faible et peut être attribuée à l'étape de la récupération des particules infectieuses pour cet échantillon. En effet, une perte non significative de particules infectieuses est obtenue à partir du cartilage contaminé laissé à 4"C :::: 2"C pendant la durée de l'expérience, puis traité pour la récupération du virus (Tableau 1.1, échantillon L2 comparé à S, charge virale "f" comparée à "d"). Effet de la durée de l'expérience sur le virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée pendant la durée de l'expérience que le virus soit dilué dans le milieu de culture (Tableau 1.1 ; échantillon V3 comparé à V2, titre infectieux "c" comparé à "b") ou que le virus soit dans le cartilage (Tableau 1.1 échantillon L2 comparé à L1, charge virale "f" comparée à "e"). 1.2 Analyse de I'expérience La charge virale totale de référence pour le matériel pré-purifié (cartilage avant traitement) est obtenue à partir de l'échantillon L1, soit le cartilage contaminé et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus (paragraphe 3.1.2.3.). Ainsi, I'efficacité du traitement a été évaluée uniquement sur la base des particules infectieuses que l'on était capable de récupérer du cartilage contaminé. Les résultats obtenus au cours du traitement par le mélange (v/v) méthanol/chloroforme pendant 24 heures sont résumés dans le tableau ci dessous: Pouvoir infectieux du VIH-1 Echantillons Charge moyenne Intervalle de confiance (DICT50) olution récupérée d'un Aucune cytotoxicité Les artilage non contaminé mais traité contrôles harge virale introduite dans 1,37 107 9,15 106#L#2,05 107 harge virale récupérée d'un artilage aussitôt après surchargeL1 8,10 105 4,16 10@ # L # 1,57 106 Cartilage harge virale récupérée d'un artilage aussitôt après surcharge L1 8,10 10@ 4,16 10# # L # 1,57 10@ avant traitement Cartilage harge virale récupérée après 1er cartilage 21 2ème cartilage 22 traitement 3ème cartilage 21 Facteur de réduction raitement par le mélange Facteur dc Intervalle dc confianoe éthanol/chloroforme réduction moven 1er cartilage > 4.59 (= Inf) 4,30 # Inf # 4,87 2ème cartilage > 4.57 (= Inf) 4,28 # Inf # 4,85 3ème cartilage > 4.59 (= Inf) 4,30 5 Inf S 4,87 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à "lnf' ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Aucune particule infectieuse n'a été récupérée à partir des trois morceaux de cartilage contaminés et traités par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4"C i 2 C (Tableau 1.2 charges virales "g", "h" et "i" comparées à la charge virale e ). Les facteurs de réduction obtenus au cours de l'expérience montrent que ce traitement est efficace pour inactiver etiou éliminer le VIH1. 2. Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique HCI 0,5 M pendant 48 heures sur le VIH-1 Les résultats obtenus sont reportés dans les tableaux 2. 2.1. Analyse des contrôles Cytotoxicité Le milieu récupéré à partir du morceau de cartilage (lot n 1150) non contaminé préparé dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1,3.1. et traité par la solution d'HCI 0,5 M pendant 48 heures à 4 C + 2 C n'est pas toxique sur les cellulse utilisées pour le titrage (Tableau 2.1 échantillon N2). Effet de l'ultracentrifugation sur le virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée au cours de l'ultracentrifugation. En effet, le titre in différent avant et après ultracentrifugation (Tableau 2.1, échantillon V2 comparé à VI ; titre infectieux "b" comparé à "a"). Effet du cartilage et des conditions de récupération sur le virus Aucune perte significative de pouvoir infectieux n'est observée lorsque le virus est récupéré du cartilage contaminé et immédiatement traité pour la récupération du virus comme décrit dans le paragraphe 3.1.2.3. (Tableau 2.1; la charge virale "e" récupérée à partir du cartilage L1 comparée à la charge virale "d" introduite dans le cartilage). Effet de la durée de l'expérience sur le virus Aucune perte de pouvoir infectieux n'est observée pendant la durée de l'expérience lorsque le virus est dilué dans du milieu de culture (Tableau 2.1; échantillon V3 comparé à V2, titre infectieux "c" comparé à "b"). Par contre, une perte de 1,15 log a été observée lorsque le virus a été récupéré à partir du cartilage préparé dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.3.1., contaminé et laissé pendant la durée de l'expérience à 4"C + 2"C sans traitement (Tableau 2.1; échantillon L2 comparé à L1, charge virale "f' comparée à "e"). 2.2 Analyse de l'expérience Comme précédemment décrit, la charge virale totale de référence pour le matériel pré-purifié (cartilage avant traitement) est obtenue à partir de l'échantillon L1 (cartilage contaminé et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus, paragraphe 3.1.2.3). Les résultats obtenus au cours du traitement par la solution d'HCI 0,5 M pendant 48 heures à 4"C + 2"C sont résumés dans le tableau ci dessous: Pouvoir infectieux du VIH-1 Echantillons Charge moyenne Intervalle de confiance (DICT50) Solution récupérée d'un Aucune cytotoxicité Les cartilage non contaminé mais traité Charge virale introduite dans contrôles 5,81 105 2,72 105 # L # 1,24 106 le cartilage Charge virale récupérée d'un cartilage aussitôt après surcharge 6,10 104 3,13 104 s L i 1,19 105 Li Cartilage Charge virale récupérée d'un cartilage aussitôt après surcharge 6,10 104 3,13 104 # L # 1,19 105 avant traitement Cartilage Charge virale durée après 1er cartilage 17 2ème cartilage 19 traitement 3ème cartilage 18 Traitement par la solution Facteur de réduction HCl 0,5 M pendant 48 heures à 4 C Facteur de # 2 C réduction moyen Intervalle de confiance 1er cartilage 3,55 (= Inf) 3,26 # Inf # 3,85 2ème cartilage 3,51 (= Inf) 3,22 # Inf # 3,80 3ème cartilage 3,53 (= Inf) 3,24 # Inf # 3,82 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à "Inf' ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Aucune particule infectieuse n'a été récupérée à partir des trois morceaux de cartilage préparés dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.3.1., contaminés et traités par la solution d'HCI 0,5 M pendant 48 heures à 4 C # 2 C (Tableau 2.1 ; charges virales "g", "h" et "i" comparées à la charge virale e ). Les facteurs de réduction obtenus au cours de l'expérience montrent que ce traitement est efficace pour inactiver etiou éliminer le VIH-1. 3. Influence du traitement des cartilages par un chauffage à sec à 500C + 5 C pendant 48 heures sur le VIH-1 Les résultats obtenus sont reportés dans les tableaux 3. 3.1 Analyse des contrôles Cytotoxicité Le milieu récupéré à partir du morceau de cartilage (lot n 1231) non contaminé, préparé dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.4.1. et chauffé à sec à 50"C s 5 C pendant 48 heures puis ultracentrifugé, n'est pas toxique sur les cellules utilisées pour le titrage (Tableau 3.1; échantillon N2). Effet de l'ultracentrifugation sur le virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée au cours de l'ultracentrifugation. En effet, le titre infectieux du virus est identique avant et après ultracentrifugation (Tableau 3.1, échantillon V2 comparé à VI; titre infectieux "b" comparé à "a"). Effet du cartilage et des conditions de récupération sur le virus Une perte de particules infectieuses de 1,25 log a été observée lorsque le morceau de cartilage contaminé a été immédiatement traité pour la récupération du virus comme décrit dans le paragraphe 3.1.2.3. Cette perte de particules infectieuses peut être attribuée aux conditions de récupération des particules infectieuses à partir du cartilage etiou à un effet virucide résiduel faible de l'étape précédente. Le facteur de réduction calculé pour cette étape ne prendra pas en compte cette perte de particules infectieuses (Tableau 3.1; échantillon L1 comparé à V2, charge virale "e" comparée à "d"). Effet de la durée de l'expérience sur le virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée pendant la durée de l'expérience que le virus soit dilué dans le milieu de culture (Tableau 3.1 ; échantillon V3 comparé à V2, titre infectieux "c" comparé à "b") ou que le virus soit dans le cartilage (Tableau 3.1 échantillon L2 comparé à L1, charge virale "f" comparée à "e"). 3.2 Analyse de l'expérience Comme précédemment décrit, la charge virale totale de référence pour le matériel pré-purifié (cartilage avant traitement) est obtenue à partir de l'échantillon L1 (cartilage contaminé et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus, paragraphe 3.1.2.3). Les résultats obtenus au cours du traitement de chauffage à sec pendant 48 heures à 50"C + 5"C sont résumés dans le tableau ci dessous: Pouvoir infectieux du VIH-1 Echantillons Charge moyenne intervalle de confiance (DICTso) Solution récupérée d'un cartilage non contaminé mais traité Les Charge virale introduite dans contrôles 1,00 106 5,35 105 # L # 1,89 106 le cartilage Charge virale récupérée d'un cartilage aussitôt après surcharge 5,60 104 3,72 104 S L # 8,50 104 L1 Cartilage Charge virale récupérée d'un 5,00 10@ @,72 10@ # L # @,@0 10@ cartilage aussitôt après surcharge avant traitement Cartilage Charge virale récupérée 1er cartilage 18 après 2ème cartilage 18 traitement 3ème cartilage 19 Facteur de réduction Chauffage à sec à 50 C # 5 C Facteur de Intervalle de confiance pendant 48 heures réduction moyen 1er cartilage > 3,49 (= Inf) 3,32 # Inf # 3,67 2ème cartilage > 3,49 (= Inf) 3,32 # Infg 3,67 3ème cartilage > 3,47 (= Inf) 3,29 # Inf # 3,65 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à "Inf" ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Aucune particule infectieuse n'a été récupérée à partir des trois morceaux de cartilage contaminés et chauffés à sec à 50 C # 5 C pendant 48 heures (Tableau 3.2 ; charges virales "g", "h" et "i" comparées à la charge virale e ). Les facteurs de réduction obtenus au cours de l'expérience montrent que ce traitement est efficace pour inactiver le VIH-1. Tableaux 1 . Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) sur le VIH-1 Tableau 1.1 : CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et m(R) de (ml) intervalle de confiance confiance (DICT50/ml) (DICT50) Contrôle négatif : Non toxique non dilué N2 Cartilage* non contaminé (lot 967) traité par le mélange méthanol/ chloroforme, puis soumis à l'étape de récupération** Contrôles positifs : 2,77 x 108 (a) Contrôle du stock de virus V1 Virus dilué en milieu de culture 1,59 x 108#T#4,49x108 V2 Virus dilué en milieu de culture, 2,73 x 108 (b) Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué ultracentrifugé en milieu de culture log(a)-log(b)=0 1,83 x 108#T#4,09x108 V3 Virus dilué en milien de culture, 2,07 x 108 (c) Effet de durée de l'expérience sur le virus laissé à 4 C#2 C pendant la durée dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=0 1,21 x 108#T#3,56x108 de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la 0,05 2,73 x 108 (b) 1,37 x 107 (d) contamination des cartilages, 1,83 x 108#T#4,09x108 9,15 x 106#L#2,05#107 ultracentrifugée L1 Virus récupéré** à partir du carti- 5 1,62 x 105 8,10 x 105 (e) Effet du cartilage sur le virus et des conditions 0,77 # R lage contaminé de récupération du virus** log(d)-log(e)= 1,23 # 1,69 8,33 x 104#T#3,15x105 4,16 x 105#L#1,57x106 L2 Virus récupéré** à partir du carti- 5 2,90 x 105 1,45 x 106 (f) Effet de la durée de l'expérience sur levirus 0,53 # R lage contaminé après incubation à dans le cartilage log(e)-log(f)=0 # 1,41 1,59 x 105#T#5,32x105 7,95 x 105#L#2,66x106 4 C#2 C pendant la durée de l'expérience Effet du cartilage,des conditions de récupération et de la durée de l'expérience log(d)-log(f)=0,98 * le cartilage frais a été préparé selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.2.1. pour cette étape. *** Etat de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Le titre est exprimé en Dose Infectant 50 % des Cultures de Tissu par millilitre (DICT50/ml). Tableaux 1 (suite) : Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) sur le VIH-1 Tableau 1.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale(L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance ( intervalle de confiance (ml) DICT50/ml) (DICT50) m(R) Cartilage* contaminé ; virus récupéré** à partir 1,62 x 105 8,10 x 105 du cartilage contaminé 5 8,33x104#T#3,15x105 4,16x105#L#1,57x106 Traitement des cartilages contaminés, par le mélange méthanol/chloroforme pendant 24 heures Virus récupéré** à partir des cartilages traités 1er cartilage 5 4,29 21 (g) log (e) - log (g) > 4,59 (= Inf) 4,30 # Inf # 4,87 2ème cartilage 5 4,34 22 (h) log (e) - log (h) > 4,57 (= Inf) 4,28 # Inf # 4,85 3ème cartilage 5 4,13 21 (i) log (e) - log (i) > 4,59 (= Inf) 4,30 # Inf # 4,87 - pour le premier cartilage 4,59 (= Inf) 4,30 # Inf # 4,87 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE : - pour le second cartilage 4,47 (= Inf) 4,28 # Inf # 4,85 - pour le troisième cartilage 4,59 (= Inf) 4,30 # Inf # 4,87 * le cartilage frais a été préparé selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.2.1. pour cette étape. ** Etat de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Le titre est exprimé en Dose Infectant 50 % des Cultures de Tissu par millilitre (DICT50/ml). Tableaux 2. Influence du traitement des cartilages par un mélange d'acide chlorhydrique 0,5 M sur le VIH-1 Tableau 2.1 : CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle de intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et m(R) confiance (ml) intervalle de confiance (DICT50/ml) (DICT50) Contrôle négatif : Non toxique non dilué N2 Cartilage* non contaminé (lot 1150) traité par la solution d'HCl 0,5 M puis soumis à l'étape de récupération** Contrôles positifs : 7,94 x 107 (a) Contrôle du stock de virus V1 Virus dilué en milieu de culture 4,80 x 107#T#1,32x108 V2 Virus dilué en milieu de culture, 1,16 x 107 (b) Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué 0,29#R#1,38 ultracentrifugé 5,45 x 106#T#2,47x107 en milieu de culture log(a)-log(b)=0,84 V3 Virus dilué en milieu de culture, 2,01 x 107 (c) Effet de la durée de l'expérience sur le virus laissé à 4 C#2 C pendant la durée 1,10 x 107#T#3,67x107 dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=0 de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la 0,05 1,16 x 107 (b) 5,81 x 103 (d) contamination des cartilages, ultra- 5,45 x 106#T#2,47x107 2,72 x 105#L#1,24x106 centrifugée L1 Virus récupéré** à partir du carti- 5,4 1,13x 104 6,10 x 104 (e) Effet du cartilage et des conditions de récupé- 0,36#R#1,60 lage contaminé 5,80 x 103#T#2,20x104 3,13 x 104#L#1,19x105 ration sur le virus** log(d) - log(e) = 0,98 L2 Virus récupéré** à partir du carti- 5 8,62 x 102 4,31 x 103 (f) Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,54#R#1,76 lage contaminé après incubation à 4,10 x 102#T#1,81#103 2,05 x 103#L#9,06x103 dans le cartilage log(e) - log(f) = 1,15 4 C#2 C pendant la durée de l'expérience * le cartilage frais a été préparé selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.3.1. pour cette étape. ** Etat de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Le titre est exprimé en Dose Infectant 50 % des Cultures de Tissu par millilitre (DICT50/ml). Tableau 2.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance intervalle de confiance (ml) (DICT50/ml) (DICT50) m(R) Cartilage* contaminé ; virus récupéré** à partir 1,13 x 104 6,10 x 104 du cartilage contaminé 5,4 5,80x103#T#2,20x104 3,13x104#L#1,19x105 Traitement des cartilages contaminés, par la solution d'HCl 0,5 M pendant 48 h à 4 C#2 C Virus récupéré** à partir des cartilages traités 1er cartilage 2ème cartilage 5 3,49 17 (g) log (e) - log (g) > 3,55 (= Inf) 3,26 # Inf # 3,85 3ème cartilage 5 3,83 19 (h) log (e) - log (h) > 3,51 (= Inf) 3,22 # Inf # 3,80 5 3,54 18 (i) log (e) - log (i) > 3,52 (= Inf) 3,24 # Inf # 3,82 - pour le premier cartilage 3,55 (= Inf) 3,26 # Inf # 3,85 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE : - pour le second cartilage > 3,51 (= Inf) 3,22 # Inf # 3,80 - pour le troisième cartilage > 3,53 (= Inf) 3,24 # Inf # 3,82 * le cartilage frais a été préparé selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.3.1. pour cette étape. ** Etat de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Le titre est exprimé en Dose Infectant 50 % des Cultures de Tissu par millilitre (DICT50/ml). Tableaux 3 Influence du chauffage à 50 C # 5 C pendant 48 heures des cartilages sur le VIH-1 Tableau 3.1 CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle de intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et m(R) confiance (ml) intervalle de confiance (DICT50/ml) (DICT50) Contrôle négatif : Non toxique non dilué N2 Cartilage* non contaminé (lot 1231) chauffé à 50 C et soumis à l'étape de récupération** Contrôles positifs : 2,31 x 107 (a) Contrôle du stock de virus V1 Virus dilué en milieu de culture 1,61 x 107#T#3,31x107 V2 Virus dilué en milieu de culture, 2,01 x 107 (b) Effet de l'ultracentrifugation sur le virus ultracentrifugé dilué en milieu de culture log(a)-log(b) = 0 1,07 x 107#T#3,78x107 V3 Virus dilué en milieu de culture, 6,71 x 106 (c) Effet de la durée de l'expérience sur le virus laissé à 4 C#2 C pendant la durée dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=0 3,24 x 106#T#1,39x107 de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la 0,05 2,01 x 107 (b) 1,00 x 106 (d) contamination des cartilages, 1,07 x 107#T#3,78x107 5,35 x 105#L#1,89x106 ultracentrifugée L1 Virus récupéré** à partir du carti- 5 1,12x 104 5,60 x 104 (e) Effet du cartilage et des conditions de 0,80#R#1,71 lage contaminé récupération sur le virus** 7,43 x 103#T#1,70x104 3,72 x 104#L#8,50x104 log(d) - log(e) = 1,25 L2 Virus récupéré** à partir du carti- 5 8,17 x 103 4,09 x 104 (f) Effet de la durée de l'expérience sur le virus lage contaminé, après incubation dans le cartilage log(e) - log(f) = 0 4,03 x 103#T#1,65x104 2,02 x 104#L#8,25x104 à 4 C#2 C pendant la durée de l'expérience * le cartilage frais a été préparé selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.4.1. pour cette étape. ** Etat de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Le titre est exprimé en Dose Infectant 50 % des Cultures de Tissu par millilitre (DICT50/ml). Tableau 3.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle CONCLUSION Dans les conditions expérimentales décrites précédemment et conformément aux recommandations de la C.E. relatives aux validations de procédés d'inactivation et d'élimination virale (Références, paragraphe 2), on a montré que le VIH-1 est efficacement inactivé etiou éliminé au cours des trois étapes étudiées du procédé de préparation de cartilages d'origine humaine utilisé par la banque de tissus de l'Hôpital Saint-Louis (Paris). Les facteurs de réduction obtenus pour les trois traitements étudiés sont résumés dans le tableau ci-dessous: Facteurs de réduction moyens et intervalles de confiance obtenus après traitement des os contaminés par le VIH-1 Traitement ler cartilage 2ème cartilage 3ème cartilage Moyenne Méthanol/chloroforme (v/v) > 4,59 (= Inf) > 4,57 (= Inf) > 4,59 (= Inf) > 4,58 (= Inf) pendant 24h à 4 C # 2 C 4,30 # Inf # 4,87 4,28 # Inf # 4,85 4,30 # Inf # 4,87 4,29 # Inf # 4,8 Acide chlorhydrique 0,5 M pendant48hâ > 3,55 (= Inf) > 3,51 (= Int > 3,53 (= Ini) > 3,53(=Inf) 4 C # 2 C 3,26 # Inf # 3,85 3,22 # Inf # 3,80 3,24 # Inf # 3,82 3,24 # Inf # 3,8 Chauffage à sec pendant 48h à > 3,49 (= Inf) > 3,49 (= Inf) > 3,47 (= Inf) > 3,48 (= Inf) 50 C # 5 C 3,32 # Inf # 3,67 3,32 # Inf # 3,67 3.29 # Inf # 3,65 3,31 # Inf # 3,6 Cumul des facteurs de réduction moyens et intervalle > 11,59 (Inf) de confiance 10,84 # Inf # 12,34 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à "inf" ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Cette valeur correspond à la limite de détection du test présenté ici. III - ETUDE DE L'INACTIVATION DU VIRUS DE LA PSEUDORAGE PORCINE (PSR) ET DU VIRUS SIMIEN TYPE 40 (SV40) 1. Introduction Les conditions expérimentales mises en oeuvre pour cette étude et les paramètres mesurés sont identiques à ceux qui ont été décrits dans la partie Il. Les facteurs de réduction moyens m(R) et les intervalles de confiance obtenus au cours des trous étapes validées sont résumés dans le tableau qui suit: Facteurs de réduction moyens m(R) Traitement et intervalles de confiance (Rmin # R 5 Rmax) PSR SV40 Méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4 C # 2 C ler cartilage > 4,63 (= Inf) 2,86 4,52 # Inf # 4,71 2,72 # R # 3,01 2ème cartilage > 4,64 (= Inf) 3,82 4,53 # Inf # 4,72 3,70 # R # 3,95 3ème cartilage > 4,65 (= Inf) 2,59 4,54 # Inf z 4,73 2,47 s R s2,71 Moyenne des facteurs de réduction moyens m(R) et > 4,64 (= Inf) 3,09 intervalles de conflance 4,53 # Inf # 4,72 2,96 # R # 3,22 Acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 40C i 20C 1er cartilage > 3,73 (= Inf) > 6,25 (= Inf) 3,65 # Inf # 3,80 6,14 # Inf # 6,33 2ème cartilage > 3,75 (= Inf) > 6,25 (= Inf) 3,67 # Inf # 3,82 6,14 # Inf # 6,34 3ème cartilage # 3,74 (= Inf) > 6,25 (= Inf) 3,66 # Inf # 3,81 6,14 # Inf # 6,33 Moyenne des facteurs de réduction moyens m(R) et > 3,74 (= Inf) > 6,25 (l'if) intervalles de confiance 3,66 # Inf # 3,81 6,14 # R # 6,33 Chauffage à sec pendant 48 heures à 50 C # 5 C ler cartilage > 4,18 (= Inf) 3,61 4,13 # Inf # 4,21 3,43 # R # 3,82 2ème cartilage > 4,18 (= Inf) 3,32 4,14 # Inf # 4,22 3,17 # R # 3,48 3ème cartilage > 4,19 (= Inf) 2,81 4,14 # Inf # 4.22 2,69 # R # 2,94 Moyenne des facteurs de réduction moyens m(R) et > 4,18 (= Inf) 3,25 intervalles de confiance 4,14 s Inf 22 3,l0 3,41 Cumul des facteurs de réduction moyens et > 12,56 (= Inf) > 12,59 (= Inf) intervalles de confiance 12,13 # Inf Inf z 12,75 12,20 12,96 Le facteur de réduction est présent comme supérieur à "Inf' ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du morceau de cartilage contaminé et traité. Cette valeur est directement liée à la limite de détection de notre test. Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que les trois traitements sont efficaces pour l'élimination et/ou l'inactivation des virus PSR et SV40. 2. Matériel Les produits utilisés pour l'étude sont donnés dans le tableau cidessous : Numéro de lot des produits utilisés pour les étapes : Produits utilisés Méthanol/chloroforme Acide Chauffage à (v/v) chlorhydrique 50 C # 5 C PSR SV40 0,5N PSR et SV40 PSR et SV40 Cartilages costais humains 967 967 1150 1231 Méthanol Carlo Erba 114691 114691 114691 114691 code 309004 Chloroforme Merck K 18256045 Non utilisé 232K 18256045 232K 18256045 code 2445 Chloroforme Prolabo Non utilisé 91179 Non utilisé Non utilisé code 22711.290 Acide chlorhydrique Non utilisé Non utilisé 1193334 119334 Labosi code A4705151 - Vibromix 4 et amalgame dentaire Fluoralloy (ref. 94 065B); Dentoria 2.1. Cellules (Freshney R., 1989) Les cellules sont entretenues selon la procédure opératoire d'lnstitut Pasteur-Texceil ne3001. Cellules FEL (Institut Pasteur, Laboratoire de Virologie Médicale) Lignée de fibroblastes d'embryons de lapin, cultivée en milieu Dulbecco additionné de 20 mM de tricine 1,1 girl de bicarbonate de sodium et de 5% de sérum de veau nouveau-né. Cellules Vero (ATCC CCL-81) (Simizu B. & Terasima T., 1988) Lignée continue de cellules de reins de singe vert d'Afrique, cultivée en milieu Dulbecco additionné de 20 mM de tricine, 1,1 girl de bicarbonate de sodium et de 5% de sérum de veau nouveau-né. Cellules CV-1 clone B5 (ECACC 90032601) Lignée continue de cellules de reins de singe, dérivée de la lignée CV-1, sélectionnée pour sa sensibilité au virus SV40, cultivée en milieu Dulbecco additionné de 20mM de tricine, 1,1 gel de bicarbonate de sodium, 2 mM de glutamine et 10% de sérum de veau nouveau-né. 2.2. Virus (Fields B. & Knipe D., 1990) Virus de la pseudorage porcine (PSR): (ATCC VR-135) (Aujeszky A., 1902). Le virus de la pseudorage porcine (virus de la maladie d'Aujeszky) appartient à la famille des Herpèsviridae, sous-famille des alphaherpèsvirinae, genre Varicellavirus. C'est un virus sphérique de 150200 nm de diamètre. Le virion est constitué d'une enveloppe avec des projections de surface doublée à l'intérieur par un tégument amorphe, d'une nucléocapside icosaédrique de 100 nm de diamètre avec 162 capsomères prismatiques et d'un noyau ( core ) d'ADN enroulé sur un tambour fibrilaire. Le génome est un ADN linéaire double brin de 120-200 Kpb. Le virus de la pseudorage porcine (souche Kojnock) est produit dans le surnageant de culture des cellules FEL infectées (procédure opératoire ne1225). Après clarification à 5000 rpm pendant 15 minutes, le titre est déterminé par la méthode des plages en carboxyméthylcellulose (CMC) sur cellules Vero. Le stock de virus utilisé pour la validation a un titre de 2,77 107 Unités Formant Plages par millilitre. Virus simien type 40 (SV40) (ATCC VR-305) (14) (Melnick J.L. et al., 1974). Le SV40 appartient à la famille des Papovaviridae, sous-famille des polyomavirinae, genre Polyomavirus. C'est un virus non enveloppé, de symétrie icosaédrique, de 45 nm de diamètre et dont le génome est constitué d'une molécule d'ADN double brin circulaire de 5 kpb. Le SV40 (souche A2895) provient d'un surnageant clarifié à 10000 rpm pendant 30 minutes de cellules CV-1 B5 infectées. Le titre infectieux est déterminé par la méthode des plages en agarose sur cellules CV-1 B5. Le virus utilisé pour l'expertise a un titre de 1,23 109 Unités Formant Plages par millilitre (UFP/ml). 3. Méthode Elle est identique à la méthode rapportée dans la partie I. Résultats L'analyse des contrôles donne des résultats conformes à ceux de la partie I. L'analyse de l'expérience a été réalisée dans les mêmes conditions que pour la partie I. Elle conduit aux résultats suivants: 1. Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanollchloroforme (v/v) pendant 24 h sur les virus Les tableaux 4 et 5 présentent les résultats obtenus. La charge virale L est représentée dans le tableau ci-après par sa valeur moyenne (m(L) et son intervalle de confiance UFP: Unité Formant Plage Virus Echantillons PSR SV40 Charge virale totale (L) utilisée pour la contami nation des cartilages (9,15 # 2,70) 105 (7,30 # 1,05) 107 (UFP**) Charge virale (L*) Cartilage récupérée de cartilage avant aussitôt après surcharge (7,45 + 1,65) 105 (4,52 + 0,55) 107 traitement Charge viral (L ) récupérée à partir du: Cartilage 1er cartilage 18 (6,25 + 1,30) 104 après 2ème cartigale 17 (6,80 + 1,05) 103 traitement 3ème cartilage 17 (1,17 # 0,18) 105 (UFP**) Facteurs de réduction moyens [m(R)] et intervalles de confiance pour le: ler cartilage > 4,63 (= Inf) 2,86 452 2,72cR 2ème cartilage > 4,64 (= Inf) 3,82 4,53 # Inf # 4,72 3,70 # R # 3,95 3ème cartilage > 4,65 (= 111f) 2,59 4,54 # Inf # 4,73 2,47 # R # 2,71 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à Inf ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Pour le virus enveloppé de la PSR, aucune particule infectieuse n'a été détectée dans les échantillons obtenus à partir des 3 cartilages contaminés et traités (Tableau 2.2, charges virales g , h et i Pour le virus non enveloppé SV40, quelques particules infectieuses ont été récupérées à partir des 3 cartilages contaminés et traités (Tableau 3.2, charges virales g , h et i Ces résultats montrent que le traitement des cartilages par le mélange méthanol-chloroforme (v/v) est efficace pour l'inactivation etlou l'élimination des virus et principalement pour les virus enveloppées. 2. Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 h sur les virus. Les tableaux 6 et 7 présentent les résultats obtenus. Comme précédemment décrit, la charge virale totale de référence pour le matériel pré-purifié (cartilage avant traitement) est obtenue à partir de l'échantillon L1 (cartilage contaminé et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus, paragraphe 3.1.2.3). Les résultats obtenus au cours de traitement par la solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 4"C + 2"C sont résumés dans le tableau ci-dessous: La charge virale L est représentée dans le tableau ci-après par sa valeur moyenne (m(L) et son intervalle de confiance UFP: Unité Formant Plage Virus Echantillons PSR SV40 Charge virale totale utilisée pour la contami nation des cartilages (2,18 # 0,40) 105 (1,42 # 0,30) 108 (UFP**) Charge virale (L*) Cartilage récupérée de cartilage avant aussitôt après surcharge (7,40 + 1,25) 104 (1,41 + 0,31) 107 traitement Charge viral (L*) récupérée à partir du : Cartilage ler cartilage après 2ème cartigale 13 traitement 3ème cartilage 13 8 (UFP**) Facteurs de réduction moyens [m(R)] et intervalles de confiance pour le: ler cartilage > 3,73 (= Inf) 6,25 (= Inf) 3,65 65 80 6 14 # Inf # 6,33 2ème cartilage > 3,75 (= Inf) 6,25 (= Inf) 3,67 67 3,82 6 14 3ème cartilage > 3,74 (= Inf) 6,25 (= Inf) 3,66 # Inf # 3,81 6,14 # Inf # 6,33 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à Inf ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Pour les deux virus étudiés, aucune particule infectieuse n'a été récupérée à partir des trois morceaux de cartilage préparés dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.3.1., contaminés et traités par la solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures à 4 C + 2 C (Tableaux 6.2 et 7.2, charges virales g , h et i ). Les facteurs de réduction obtenus au cours de l'expérience montrent que ce traitement est efficace pour inactiver etiou éliminer le virus de la pseudorage porcine et le SV40. 3. Influence du traitement des cartilages Par un chauffage à sec à 50 C + 5"C pendant 48 heures sur les virus Les tableaux 8 et 9 présentent les résultats obtenus respectivement avec les virus de la PSR et SV40. 3.1 Analyse des contrôles Cytotoxicité Le milieu récupéré à partir du morceau de cartilage (lot ne1231 ) non contaminé, préparé dans les conditions décrites dans le paragraphe 3.1.4.1. et chauffé à sec à 50"C + 5"C pendant 48 heures puis ultracentrifugé, n'est pas toxique sur les cellules utilisées pour le tirage (Tableaux 8.1 et 9.1, échantillon N2). Effet de l'ultracentrifugation sur les virus Aucune perte significative de particules infectieuses n'est observée au cours de l'ultracentrifugation. (Tableaux 8.0 et 9.1, échantillon V2 comparé à l'échantillon V1; titre infectieux b comparé au titre infectieux a ). Effet du cartilage et des conditions de récupération sur les virus Aucune perte significative de pouvoir infectieux n'a été observée lorsque le morceau de cartilage contaminé a été immédiatement traité pour la récupération du virus comme décrit dans le paragraphe 3.1.2.3. (Tableaux 8.1. et 9.1., échantillon L1 comparé à l'échantillon S, charge virale e comparée à la charge virale d ). Toutefois pour SV40, la totalité des particules infectieuses introduites n'est pas récupérée pour l'échantillon L1 contrairement à l'échantillon L2 (voir ci-dessous). Cette perte de particules infectieuses peut être due à un problème technique pour cet échantillon L1, soit au cours de l'ultracentrifugation soit au cours de la récupération. Pour cette raison, le facteur de réduction sera estimé à partir de l'échantillon L2. Effet de la durée de l'expérience sur les virus Pour SV40, aucune perte significative de particules infectieuses n'est est observée que le virus soit dilué en milieu de culture ou introduit dans le morceau de cartilage et laissé pendant la durée de l'expérience à 4"C + 2"C (Tableau 9.1, échantillon V3 comparé à l'échantillon V2; titre infectieux c comparé au titre infectieux b et échantillon L2 comparé à l'échantillon LI ; charge virale f comparée à la charge virale e ). Pour le virus de la PSR, une perte de 1,61 log et 1,35 log de particules infectieuses est observée pendant que la durée de l'expérience respectivement lorsque le virus est dilué en milieu de culture ou placé dans le morceau de cartilage et laissé pendant la durée de l'expérience à 4"C + 2"C (Tableau 8.1, échantillon V3 comparé à l'échantillon VI; titre infectieux c comparé au titre infectieux b et échantillon L2 comparé à l'échantillon LI ; charge virale f comparée à la charge virale e ). 3.2 Analyse de l'expérience Comme précédemment décrit, la charge virale totale de référence pour le matériel pré-purifié (cartilage avant traitement) est obtenue à partir de l'échantillon LI (cartilage contaminé et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus, paragraphe 3.1.2.3.) pour le virus de la PSR et l'échantillon L2 (cartilage contaminé, laissé à 4"C + 2"C pendant la durée de l'expérience et soumis aussitôt aux conditions de récupération du virus, paragraphe 3.1.2.3) pour le SV40. Les résultats obtenus au cours du traitement à sec pendant 48 heures à 50"C + 5"C sont résumés dans le tableau ci-dessous: La charge virale L est représentée dans ce tableau par sa valeur moyenne (m(L) et son intervalle de confiance UFP: Unité Formant Plage Virus Echantillons PSR SV40 Charge virale totale (L*) utilisée pour la contami nation des cartilages (1,41 # 0,32) 106 (6,20 # 1,00) 107 (UFP**) Charge virale (L*) laissé à 4 C # 2 C Cartilage récupérée de cartilage avant la récupération avant aussitôt après surcharge (2,57 10,23) 105 (3,23 + 0,46) 107 traitement (UFP**) Charge viral (L*) récupérée à partir du: Cartilage ler cartilage (8,00 + 2,40) 103 après 2ème cartigale (1,56 + 0,32) 104 traitement 3ème cartilage 17 (4.95 # 0,67) 104 (UFP**) Facteurs de réduction moyens [m(R)] et intervalles de confiance pour le: ler cartilage > 4,18 (= Inf) 3,61 4,13 # Inf # 4,21 3,43 # R # 3,82 2ème cartilage > 4,18 (= Inf) 3,32 4,14 # Inf # 4,22 3,17 # R # 3,48 3ème cartilage > 4,19 (= Inf) 2,81 4,14 # Inf # 4,22 2,69 # R # 2,94 Le facteur de réduction est présenté comme supérieur à Inf ( > Inf) lorsqu'aucune particule infectieuse n'est détectée dans l'échantillon préparé à partir du cartilage contaminé et traité. Pour le virus de la PSR, aucune particule infectieuse n'a été récupérée à partir des trois morceaux de cartilage contaminés et chauffés à sec à 50 C + 5 C pendant 48 heures (Tableau 8.2 ; charges virales g , h et i ). Pour le SV40, quelques particules infectieuses ont été récupérées à partir des 3 cartilages contaminés et traités (Tableau 9.2, charges virales g , h et i ). Les facteurs de réduction obtenus au cours de l'expérience montrent que ce traitement est efficace pour l'inactivation des virus et principalement sur un virus enveloppé de type PSR. CONCLUSION Dans ces conditions expérimentales et conformément aux recommandations de la C.E. relatives aux validations de procédés d'inactivation et d'élimination virale (Références, pargraphe 2), les deux virus testés ont été efficacement inactivés et/ou éliminés au cours de trois étapes étudiées du procédé de préparation de cartilages d'origine humaine. Les facteurs de réduction obtenus pour les trois traitements étudiés sont résumés dans le tableau ci-après: Facteurs de réduction moyens m(R) Traitement et intervalles de confiance (Rmin s R # Rmax) PSR SV40 Méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures à 4 C j 20C ler cartilage > 4,63 (= lnf) 2,86 4,52 # Inf # 4,71 2,72 # R # 3,01 2ème cartilage > 4, 64 (= Inf) 3,82 4,53 # Inf # 4,72 3,70 # R # 3,95 Conditions d'ultracentrifugation Virus type de Volume Vitesse Temps Rotor par tube (rpm) (9) (min) PSR TL 100.4 4,75 ml 95000 500000 8 Sv40 TL 100.4 4,75ml 95000 500000 20 Rotor Beckman. PSR = virus de la pseudorage porcine (souche Kojnock) SV40 = Simian Virus 40. Tableaux 4 Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures sur le virus de la pseudorage porcine Tableau 4.1 @ CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot 967) Non toxique non dilué N2 traité par le mélange méthanol/ chloroforme, puis soumis à l'étape de récupération* V1 Stock de virus dilué en milieu de (1,82 # 0,53) 107 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué culture, ultracentrifugé (1,83 # 0,54) 107 (b) en milieu de culture log(a)-log(b)=0 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,12 # R culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (8,00 # 1,75) 107 (c) dilué en milien de culture log(b)-log(c) = 0,36 # 0,58 durée de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la 0,05 contamination des cartilages, ultra- (1,83 # 0,54) 107 (b) (9,15 # 2,70) 105 (d) centrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de contaminé (1,49 # 0,33) 105 (7,45 # 1,65) 105 (e) récupération sur le virus log(d)= log(e)=0 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,12 # R contaminé après incubation à 4 C#2 C (7,66 # 1,14) 104 (3,83 # 0,57) 105 (f) dans le cartilage log(e)-log(f) = 0,29 # 0,45 pandant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 4.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de confiance [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance intervalle de confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage contaminé ; virus récupéré* à partir (1,49 # 0,33) 103 (7,45 # 1,65) 105 (e) du cartilage contaminé 5 Traitement des cartilages contaminés, par le mélange méthanol/chloroforme pendant 24 heures Virus récupéré* à partir des cartilages traités 1er cartilage 5 3,51 18 (g) log (e) - log (g) > 4,63 (= Inf) 4,52 # Inf # 4,71 2ème cartilage 5 3,45 17 (h) log (e) - log (h) > 4,64 (= Inf) 4,53 # Inf # 4,72 3ème cartilage 5 3,37 17 (i) log (e) - log (i) > 4,65 (= Inf) 4,54 # Inf # 4,73 - pour le premier cartilage > 4,63 (= Inf) 4,52 # Inf # 4,71 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE : - pour le second cartilage > 4,64 (= Inf) 4,53 # Inf # 4,72 - pour le troisième cartilage > 4,65 (= Inf) 4,54 # Inf # 4,73 * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableaux 5 Influence du traitement des cartilages par un mélange méthanol/chloroforme (v/v) pendant 24 heures sur le SV40 Tableau 5.1 @ CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot 967) Non toxique non dilué N2 traité par le mélange méthanol/chloroforme, puis soumis à l'étape de récupération* V1 Stock de virus dilué en milieu de (1,76 # 0,23) 109 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué culture, ultracentrifugé (1,46 # 0,21) 109 (b) en milieu de culture log(a)-log(b)=0 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (1,60 # 0,22) 109 (c) dilué en milieu de culture log(b)-log(c) = 0 durée de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la 0,05 contamination des cartilages, (1,46 # 0,21) 109 (b) (7,30 # 1,05) 107 (d) ultracentrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de 0,09 # R contaminé (9,03 # 1,11) 106 (4,52 # 0,55) 107 (e) récupération sur le virus log(d)- log(e) = 0,21 # 0,32 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,09 # R contaminé après incubation à 4 C#2 C (5,55 # 0,84) 106 (2,78 # 0,42) 107 (f) dans le cartilage log(e)-log(f) = 0,21 # 0,33 pendant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 5.2 @ EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle de (ml) confiance m(R) (UFP/ml) (UFP) Cartilage contaminé ; virus récupéré* à partir (9,03 # 1,11) 106 (4,52 # 0,55) 107 (e) du cartilage contaminé 5 Traitement des cartilages contaminés, par le mélange méthanol/chloroforme pendant 24 heures Virus récupéré* partir des cartilages traités 1er cartilage 5 (1,25 # 0,26) 104 (6,25 # 1,30) 104 (g) log (e) - log (g) = 2,86 2,72 # R # 3,01 2ème cartilage 5 (1,36 # 0,21) 103 (6,80 # 1,05) 103 (h) log (e) - log (h) = 3,82 3,70 # R # 3,95 3ème cartilage 5 (2,33 # 0,36) 104 (1,17 # 0,18) 105 (i) log (e) - log (i) = 2,59 2,47 # R # 2,71 - pour le premier cartilage 2,86 2,72 # R # 3,01 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE : - pour le second cartilage 3,82 3,70 # R # 3,95 - pour le troisième cartilage 2,59 2,47 # R # 2,71 * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableaux 6 Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures sur le virus de la pseudorage porcine Tableau 6.1 @ CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance intervalle de confiance confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot n 1150) Non toxique non dilué N2 traité par HCl 0,5M, puis soumis à l'étape de récupération* V1 Stock de virus dilué en milieu de (8,64 # 1,15) 106 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué 0,16 # R culture, ultracentrifugé (4,36 # 0,81) 106 (b) en milieu de culture log(a)-log(b)= 0,30 # 0,44 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,35 # R culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (1,35 # 0,23) 106 (c) dilué en milieu de culture log(b)-log(c) = 0,51 # 0,66 durée de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la contamination des cartilages, 0,05 (4,36 # 0,81) 106 (b) (2,18 # 0,40) 105 (d) ultracentrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de 0,31 # R contaminé (1,48 # 0,25) 104 (7,40 # 1,25) 104 (e) récupération sur le virus log(d)- log(e) = 0,47 # 0,62 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus contaminé après incubation à 4 C #2 C (1,21 # 0,15) 104 (6,05 # 0,75) 104 (f) dans le cartilage log(e)-log(f) = 0 pendant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 6.2 @ EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle de (ml) confiance m(R) (UFP/ml) (UFP) Cartilage contaminé ; virus récupéré* à partir (1,48#0,25) 104 (7,40#1,25)104(e) du cartilage contaminé 5 Traitement des cartilages contaminés, par HCl 0,5 M pendant 48 heures Virus récupéré* à partir des cartilages traités 1er cartilage 2ème cartilage 5 (g) log (e) - log (g) > 3,73(=Inf) 3,65#Inf#3,80 3ème cartilage 5 (h) log (e) - log (h) > 3,75(=Inf) 3,67#Inf#3,82 5 (i) log (e) - log (i) > 3,74 (=Inf) 3,66#Inf#3,81 - pour le premier cartilage > 3,73(=Inf) 3,65#Inf#3,80 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE: - pour le second cartilage > 3,75(=Inf) 3,67#Inf#3,82 - pour le troisième cartilage > 3,74(=Inf) 3,66#Inf#3,81 * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableaux 7 Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures sur le SV40 Tableau 7.1 CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance confiance (ml)(UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot 1150) Non toxique dilué au 1/4 N2 traité par HCl 0,5M, puis soumis à l'étape de récupération* V1 Stock de virus dilué en milieu de (3,02#0,30) 109 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué culture, ultracentrifugé (2,83#0,60) 109 (b) en milien de culture log(a)-log(b)=0 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,06#R culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (1,71#0,23) 109 (c) dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=0,22 #0,37 durée de l'expérience, ultracentrifugé Suspension virale utilisée pour la contamination des cartilages, 0,05 (2,83#0,60) 109 (b) (1,42#0,30) 108 (d) ultracentrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de 0,81#R contaminé (2,82#0,62) 106 (1,41#0,31) 107 (e) récupération sur le virus log(d)-log(e)=1,00 # 1,19 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus 0,41#R contaminé après incubation à 4 C#2 C (6,88#1,72) 105 (3,44#0,86) 106 (f) dans le cartilage log(e)-log(f)=0,61 #0,82 pendant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 7.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle de (ml) confiance m(R) (UFP/ml) (UFP) Cartilage contaminé ; virus récupéré* à partir (2,82#0,62) 106 (1,41#0,31) 107 (e) du cartilage contaminé 5 Traitement des cartilages contaminés, par HCl 0,5 M pendant 48 heures Virus récupéré* à partir des cartilages traités 1er cartilage 2ème cartilage 5 (g) log(e) - log(g) > 6,25(=Inf) 6,14#Inf#6,33 3ème cartilage 5 (h) log(e) - log(h) > 6,25(=Inf) 6,14#Inf#6,34 5 (i) log(e) - log(i) > 6,25(=Inf) 6,14#Inf#6,33 - pour le premier cartilage > 6,25 (=Inf) 6,14#Inf#6,33 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE: - pour le second cartilage > 6,25(=Inf) 6,14#Inf#6,34 - pour le troisième cartilage > 6,25(=Inf) 6,14#Inf#6,33 * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableaux 8 Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures sur le virus de la pseudorage porcine Tableau 8.1 @ CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot 1231) Non toxique non dilué N2 chauffé à 50 C # 5 C, puis soumis à l'étape de récupération * V1 Stock de virus dilué en milieu de (4,13#0,79) 107 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué culture, ultracentrifugé (2,81#0,65) 107 (b) en milieu de culture log(a)-log(b)=0 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus 1,40#R culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (6,90#1,66) 105 (c) dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=1,61 #1,82 durée de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la contamination des cartilages, 0,05 (2,81#0,65) 107 (b) (1,41#0,32) 106 (d) ultracentrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de 0,59#R contaminé (5,14#0,47) 104 (2,57#0,23) 105 (e) récupération sur le virus log(d)-log(e)=0,74 #0,87 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus 1,20#R contaminé après incubation à 4 C#2 C (2,32#0,66) 103 (1,16#0,33) 104 (f) dans le cartilage log(e)-log(f)=1,35 #1,53 pendant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 8.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle de (ml) confiance m(R) (UFP/ml) (UFP) Cartilage contamine; virus récupéré* à partir (5,14#0,47) 104 (2,57#0,23) 105 (e) du cartilage contaminé 5 Chauffage à sec à 50 C # 5 C des cartilages contaminés pendant 48 heures Virus récupéré* à partir des cartilages traités 1er cartilage 2ème cartilage 5 (g) log(e) - log(g) > 4,18(=Inf) 4,13#Inf#4,21 3ème cartilage 5 (h) log(e) - log(h) > 4,18(=Inf) 4,14#Inf#4,22 5 log(e) - log(i) > 4,19(=Inf) 4,14#Inf#4,22 - pour le premier cartilage > 4,18(=Inf) 4, 13#Inf#4,21 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE: - Tableaux 9 Influence du traitement des cartilages par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M pendant 48 heures sur le SV40 Tableau 9.1 CONTROLES Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction (R) Code Définition Vt Titre moyen [m(T)] Charge moyenne Facteur de réduction moyen Intervalle et intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et de confiance intervalle de confiance confiance (ml) (UFP/ml) (UFP) m(R) Cartilage non contaminé (lot 1231) Non toxique non dilué N2 chauffé à 50 C # 5 C, puis soumis à l'étape de récupération* V1 Stock de virus dilué en milieu de (2,93#0,61) 109 (a) Contrôle du stock de virus culture V2 Stock de virus dilué en milieu de Effet de l'ultracentrifugation sur le virus dilué 0,21#R culture, ultracentrifugé (1,24#0,20) 109 (b) en milieu de culture log(a)-log(b)=0,37 #0,53 V3 Stock de virus dilué en milieu de Effet de la durée de l'expérience sur le virus culture, laissé à 4 C#2 C pendant la (1,62#0,22) 109(c) dilué en milieu de culture log(b)-log(c)=0 durée de l'expérience, ultracentrifugé S Suspension virale utilisée pour la contamination des cartilages, 0,05 (1,24#0,20) 109 (b) (6,20#1,00) 107 (d) ultracentrifugée L1 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effets cumulés du cartilage et des conditions de 0,82#R contaminé (1,36#0,22) 106 (6,80#1,10) 106 (e) récupération sur le virus log(d)-log(e)=0,96 # 1,10 L2 Virus récupéré* à partir du cartilage 5 Effet de la durée de l'expérience sur le virus contaminé, après incubation à 4 C#2 C (6,46#0,92) 106 (3,23#0,46) 107 (f) dans le cartilage log(e)-log(f)=0 pendant la durée de l'expérience * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). Tableau 9.2 : EXPERIENCE Description des échantillons Vol Titre infectieux (T) Charge virale (L) Remarques et calcul des facteurs de réduction Titre moyen [m(T)] et Charge moyenne Définition Vt intervalle de [m(L)=m(T)xVt] et Facteur de réduction moyen Intervalle de confiance confiance intervalle de (ml) confiance m(R) (UFP/ml) (UFP) Cartilage contaminé ; virus récupéré* à partir (6,46#0,92) 106 (3,23#0,46) 107 (f) du cartilage contaminé 5 Chauffage à sec à 50 C#5 C des cartilages contaminés pendant 48 heures Virusrécupéré* à partir des cartilages traités 1er cartilage 2ème cartilage 5 (1,60#0,48) 103 (8,00#2,40) 103 (g) log(f) - log(g)=3,61 3,43#Inf#3,82 3ème cartilage 5 (3,12#0,65) 103 (1,56#0,32) 104 (h) log(f) - log(h)=3,32 3,17#Inf#3,48 5 (9,90#1,35) 103 (4,95#0,67) 104 (i) log(f) - log (i)=2,81 2,69#Inf#2,94 - pour le premier cartilage 3,61 3,43#R#3,82 FACTEURS DE REDUCTION DE L'ETAPE: - pour le second cartilage 3,32 3,17#R#3,48 - pour le troisième cartilage 2,81 2,69#R#2,94 * Etape de récupération : Les cartilages ont été coupés puis placés dans environ 10 millilitres de culture pendant une heure à 4 C. Le milieu a été récupéré et ultracentrifugé. Les culots ont été repris dans 5 millilitres de culture. Les titres sont exprimés en unités formant plage par millilitre (UFP/ml). REFERENCES 1. Réglementations relatives aux principes des "Bonnes Pratiques de Laboratoire" Ministère des Affaires Sociales et de la Solidarité Nationale (France). Direction de la Pharmacie et du Médicament ;"Bonnes Pratiques de Laboratoire" (Instruction of May 31st 1983-reprinted in 1989). Order in Council 90 - 206 on March 7th, 1990 and annexes (J.O. of the French Republic). European Economic Community (EEC): J.O. N" L 15-29 (1987) - L 145-35 (1988) - L 315(1989) - L 11-37 (1990) (Directive 90i181EEC on December 18th, 1989). Organisation for Economic Co-operation and Development (O.E.C.D.) "Good Laboratory Practices in the testing of Chemicals" (1982). Proposition of decision - Recommendation of the O.E.C.D. C(89) 317 finalized on June 23rd, 1989. Environment Monographs number 45, 46, 47 and 48 (1992) and 73 (1993). Food an Drug Administration (F.D.A. - United States) : "Good Laboratory Practice Regulations" Finalized rule CFR 21 Part 58 (1987-revised in 1991). 2. Recommandations de la Communauté Européenne EC regulatory document, note for guidance, III/8115/89-EN. Validation of virus removal and inactivation procedures. Biologicals, 1991, 19, 247-251. EC regulatory document, note for guidance, 111/8379/89-EN. Guidelines for Medicinal Products derived from human blood and plasma . Biologicals, 1992, 20, 159-164. 3. Articles Barré-Sinoussi F., et al, Science, 1983, 220, 868-871 Fields B. & Knipe D. in: Fields Virology (Vol. 1 and 2) Raven Press Ltd, 1990. Foley G., et al, Cancer, 1965, 18, 522-529. Gregersen J., et al., J. Virol. Meth., 1988,19,161-168. Harada S., et al., Science, 1985, 229, 563-566. Hoffman A., et al., Virology, 1985,147,326-335. Kaplan M. & Koprowski H. (Ed.) in: Laboratory Techniques in Rabies. Third edition. 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Published by Department of Microbiology School of Medicine Chiba University, 1988. REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement d'un produit d'origine humaine ou animale destiné à une utilisation thérapeutique, comprenant les étapes de: 1) incubation du produit dans une solution comprenant un alcool, dans des conditions permettant le dégraissage du produit, 2) incubation du produit obtenu à l'issue de l'étape 1) dans une solution acide, dans des conditions permettant la déminéralisation du produit, 3) neutralisation du produit déminéralisé, 4) dessiccation du produit déminéralisé jusqu'à obtention d'un taux résiduel d'eau libre inférieur ou égal à 9%, 5) stérilisation antimicrobienne du produit déshydraté, les susdites étapes étant réalisées dans des conditions telles que chacune d'entre elles a une action bactéricide et/ou virucide et/ou stabilisatrice sur le produit traité. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de stérilisation est réalisée par chauffage pendant 48 h à une température comprise entre 50 et 52"C, de préférence 50"C en présence d'oxyde d'éthylène puis désorption de l'oxyde d'éthylène par chauffage à une température d'environ 40"C jusqu'à obtention d'une quantité résiduelle d'environ 0,1 PPM d'oxyde d'éthylène. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il permet l'inactivation et/ou l'élimination de virus ou de particules virales infectieuses de virus ayant un faible niveau de résistance et/ou de virus ayant un niveau moyen de résistance et/ou de virus ayant un niveau de forte résistance. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les virus ou particules virales infectieuses inactivés et/ou éliminés sont parmi les virus VIH, HTLV, les herpesvirus, les virus de l'hépatite. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les virus ou particules virales infectieuses inactivés et/ou éliminés sont parmi les virus VIH-1, VIH-2, virus d'Epstein Barr, cytomégalovirus, virus de l'hépatite A, de l'hépatite B ou de l'hépatite C. 6. Procédé de traitement selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: 1) incubation du produit dans un mélange de méthanol/chloroforme (v/v) sous agitation pendant 24 h à 4 C + 2 C, 2) incubation du produit obtenu à l'issue de l'étape 1, dans une solution d'acide chlorhydrique (HCI) à 0,5 M, sous agitation pendant 48 h à 4 C + 2 C 3) neutralisation du produit déminéralisé dans trois bains successifs de 2 heures dans une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,7 M ou 0,7 M à 40C + 20C, 4) dessiccation du produit obtenu jusqu'à obtention d'un taux résiduel d'eau libre inférieur ou égal à 9%, 5) chauffage du produit obtenu à l'issue de l'étape 4) en présence d'oxyde d'éthylène à une température comprise entre 50 et 52"C et de préférence d'environ 50 C pendant 48 h, désorption de l'oxyde d'éthylène par chauffage à une température comprise entre 35 et 40 C, de préférence à une température d'environ 35 C pendant une durée suffisante pour obtenir un taux résiduel d'oxyde d'éthylène inférieur à 0,1 PPM. 7. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le produit à usage thérapeutique est un tissu d'origine humaine ou animale. 8. Procédé de traitement selon la revendication 7, caractérisé en ce que le produit à usage thérapeutique est un cartilage. 9. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le produit à usage thérapeutique est choisi dans le groupe des os, artères, tendons, enveloppes ou tissus fibreux. 10. Produit à usage thérapeutique, d'origine humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de particules virales infectieuses ou de virus de type VIH et/ou HTLV et/ou des virus de l'hépatite et/ou des herpesvirus. 11. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 6 à 9 pour l'inactivation et/ou l'élimination de particules virales infectieuses et/ou de virus au sein d'un produit à usage thérapeutique, d'origine humaine ou animale. 12. Utilisation selon la revendication il dans laquelle les virus devant être inactivés et/ou éliminés sont les virus de type VIH, et/ou les virus de type HTLV et/ou les virus de l'hépatite et/ou les herpesvirus.