FR 2740782 A1 19970509 FR 9613467 A 19961105 PROCEDE ET KIT POUR LA QUANTIFICATION ET LA DETECTION DES MICRO-ORGANISMES La présente invention concerne la quantification et la détection des micro-organismes. Elle concerne plus particulièrement le dosage quantitatif et/ou la détection des micro-organismes porteurs d'un génome à ADN ou à ARN. L'invention s'applique à tous les micro-organismes connus, tels que des virus, bactéries, bacilles, protozoaires, hématozoaires, porteurs d'un génome à ADN ou à ARN, touchant l'homme, l'animal ou les végétaux, ainsi qu'aux micro-organismes tels qu'ils existent chez l'homme, les animaux et les végétaux, en état pathologique ou normal; elle s'applique également à la quantification et la détection de ces mêmes micro-organismes dans les produits issus des animaux, y compris l'homme, et des végétaux, de même que de ceux susceptibles d'exister dans l'eau. La méthode selon l'invention est décrite plus loin pour la quantification de l'infection par le virus à ARN de l'immunodéficience humaine (VIH) et de l'infection par le virus de l'hépatite B à ADN humain (VHB). L'étude de l'épidémiologie, le traitement et la prophylaxie des pathologies humaines, animales et végétales sont de nos jours un objectif prioritaire de la médecine humaine et vétérinaire et de l'agronomie ou de l'industrie phytosanitaire. L'identification et la quantification des micro-organismes dans des milieux tels que par exemple les tissus, les fluides biologiques et les préparations in vitro sont des étapes indispensables à la bonne conduite de tels projets. Compte tenu de la taille de la plupart des micro-organismes, notamment des virus, et de leur concentration dans les milieux biologiques (en général de l'ordre de 101 à 1012 micro-organismes/ml), seuls les outils technologiques actuels faisant appel à l'amplification de fragments de génomes permettent à la fois l'identification moléculaire et une évaluation quantitative.La méthode d'amplification génomique la plus utilisée actuellement est dénommée amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en anglais polymerase chain reaction ou PCR). Grâce à une enzyme, la polymérase, il est ainsi possible d'amplifier un fragment de génome à ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est spécifiquement identifié par différentes méthodes (sonde radioactive ou colorée, taille du fragment). Des méthodes de quantification de VIH par ACP sont par exemple décrites par Holodniy M. et al., dans J. Infect. Dis. 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei S. et al., dans J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992); Bagnarelli P. et al., dans J. Virol. 66, 7328-7335 (1992); Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993); Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20 (1993)- Des méthodes de quantification d'ARN du virus de l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994); Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9 (1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 6547 (1995). Des méthodes de quantification d'ADN du virus de l'hépatite B ont été décrites par exemple par Lehtovaara P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu J. et al., dans J. Virol. Methods 49(3), 331-41 (1994); Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 2088 91 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol. 27(9), 1930-33 (1989). Cependant, la relation entre le produit amplifié et l'ADN ou l'ARN initial n'est réellement pas vraiment constante d'une expérience à l'autre, d'où la nécessité de se préoccuper du problème de la mesure d'un étalon dont les concentrations sont connues par ailleurs. Les capacités d'amplification de l'ACP ont pu être évaluées jusqu'ici grâce à des cellules n'ayant le génome à doser qu'en un nombre constant d'exemplaires ou à des plasmides comportant chacun un unique morceau de gène. Il a ainsi pu être établi que même un seul fragment de gène peut, grâce à l'ACP, être spécifiquement identifié. On a également établi qu'il existait un rapport de proportionnalité entre des concentrations d'ADN d'un plasmide soumises à amplification et les concentrations d'ADN mesurées après amplification. Cependant ce rapport de proportionnalité s'est avéré changer d'une expérience à l'autre, car l'amplification par ACP est un processus biologique, résultant de l'action de la polymérase, qui n'est pas maîtrisé de façon aussi complète que le serait une technique purement physique. Cela a conduit les chercheurs et les ingénieurs des firmes de biotechnologie à introduire un étalonnage dans chaque expérience de quantification virale. Jusqu'à présent, l'étalon est constitué d'une série de concentrations (trois à cinq en général) d'un plasmide étalon dont le fragment d'ADN à amplifier a les mêmes amorces et est selon les technologies de séquence partiellement différente ou de séquence identique. Le rapport d'amplification de l'ADN de concentrations égales de deux plasmides à amorces identiques, mais de longueur et donc de séquences différentes: 1) peut être différent d'un cas à l'autre et 2) n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN issu de concentrations identiques de virus natifs au sein de la même expérience. Le problème est plus complexe encore si l'on cherche à quantifier ou à identifier des virus à ARN, tels que par exemple celui du SIDA (VIH). En effet, l'étape d'amplification par ACP doit, pour les virus à ARN, être associée à une étape de rétrotranscription souvent réalisée soit grâce à une autre enzyme, la transcriptase réverse ou transcriptase inverse (en abrégé TR), soit grâce à une enzyme ayant les deux actions (de rétrotranscription et d'amplification de l'ADN). Dans l'un et l'autre cas, les enzymes actuellement disponibles sur le marché permettent d'obtenir des rapports de rétrotranscription pouvant varier d'une expérience à l'autre de 10 : 1 (c'est-à-dire que 10 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN) à 100 : 1 (100 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN).Le problème qui en résulte, à savoir la non-comparabilité des résultats d'expériences sucessives, a jusqu'à présent été résolu par incubation simultanée d'une gamme de concentrations d'un fragment d'ARN étalon (transcrit étalon) utilisant les mêmes amorces, mais dont la partie amplifiée est soit identique si on l'utilise en étalon externe, soit différente, en séquence ou en longueur, si on l'utilise en coamplification, le transcrit étant alors incubé dans le même tube que l'ARN du microorganisme cible à doser. Il apparaît malheureusement que les concentrations d'amplificats issus des mêmes concentrations de deux transcrits peuvent être différentes et de même différentes de celles issues d'ARN provenant de concentrations identiques de virus. En conclusion, - les techniques connues de rétrotranscription et/ou d'amplification ne donnent pas des résultats identiques d'une expérience à l'autre pour un même échantillon; - un étalon s'impose, qui peut être soit interne, soit externe; - un étalon externe composé soit d'un plasmide pour un micro-organisme à ADN, soit d'un ARN transcrit pour un micro-organisme à ARN, ne permet qu'une quantification relative, car le rapport d'amplification n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme complet; - un étalon interne coamplifié fait de plus intervenir des longueurs ou des séquences différentes du plasmide ou du transcrit et a les mêmes inconvénients qu'un étalon externe utilisant un plasmide ou un transcrit. Dans l'état de la technique actuelle, l'amplification de l'ADN d'un plasmide n'est pas vraiment proportionnelle à celle subie par l'ADN viral. Quant à l'étalon actuellement utilisé pour les virus à ARN, il s'agit d'un transcrit, qui a les mêmes inconvénients qu'un plamside et y ajoute la possibilité de dégradation d'ARN libre. Il y avait donc un besoin pour des tests de quantification et de détection de micro-organismes procurant des valeurs absolues du nombre de microorganismes cible. On a maintenant trouvé que l'on peut quantifier ou détecter de façon absolue et directe n'importe quel microorganisme à ADN ou à ARN, à la condition: (1) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer par ailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la concentration de l'ADN ou de l'ARN porté par ce microorganisme, appelé micro-organisme étalon, et (2) que l'on compare la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du microorganisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN ou de l'ADN de plusieurs concentrations connues du dit micro-organisme. Un tel procédé constitue le premier objet de la présente invention. Selon une variante de ce procédé, l'étape (2) peut consister essentiellement en une révélation comparative fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon avec les concentrations du micro-organisme cible telles que détectées de préférence au moyen de la méthode dite de l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du microorganisme cible. Pour préparer des concentrations connues de microorganisme, on procède selon l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier, de préférence en centrifugeant et purifiant (à partir d'échantillons humains, animaux ou végétaux du milieu à tester, ou à partir de cultures cellulaires) des quantités quelconques du micro-organisme à doser, puis en extrayant l'ADN ou l'ARN de ces préparations centrifugées purifiées, par des moyens classiques. Les quantités à mettre en oeuvre dans la suite du procédé sont des quantités quelconques, qui doivent seulement être suffisantes pour que l'on obtienne finalement des quantités d'ADN ou d'ARN du micro-organisme étalon mesurables par les méthodes microbiologiques directes, n'utilisant pas l'amplification de type ACP et qui sont à la portée de l'homme du métier.Dans la pratique et compte tenu de la précision des matériels actuellement disponibles dans les laboratoires pour ces mesures, des quantités de l'ordre de plusieurs centaines de nanogrammes ou de quelques microgrammes conviennent. Le procédé selon l'invention comporte avantageusement les étapes selon lesquelles: 1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant avantageusement suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes; 2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité (exprimée en ng ou en pg) recueillie; 3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné, ce nombre étant connu, par exemple d'après des banques de données, ou déterminable par des méthodes classiques; 4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de l'ADN ou de l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue (environ 330 daltons); 5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro (soit 6,02 x 1023), la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme; 6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes; 7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN du micro-organisme étalon ou cible et/ou à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des microorganismes étalon et cible ou les produits d'amplification des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible. A titre d'exemples de sources bibliographiques dans lesquelles on peut trouver des indications ou les références de banques de données concernant le nombre de bases nucléotidiques des micro-organismes, on peut citer: Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989); Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 25752583 (1988). Selon une variante avantageuse pouvant être mise en oeuvre si les micro-organismes sont assez gros pour pouvoir être détectés et comptés directement, notamment par des moyens optiques et/ou électroniques, les étapes 2) à 5) susdites du procédé selon l'invention sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de microorganismes. Selon un mode de mise en oeuvre préféré le procédé selon la présente invention peut comprendre en option l'addition d'un contrôle interne, de préférence sous la forme d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces n'ont pas de rapport avec les ADN ou les ARN de la cible. Ledit contrôle interne est avantageusement ajouté à chacun des échantillons à examiner et sert de contrôle interne (ci-après en abrégé CI"), c'est-à-dire pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la transcription réverse (ci-après En variante, on peut remplacer dans le procédé selon l'invention la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues:: du même micro-organisme inactivé, dont 1'ADN ou 1'ARN demeure apte à la détection ou la quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de révélation dite à l'ADN branché et/ou la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou 1'ARN du virus natif, d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou d'une séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse. Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, on prépare et on stocke jusqu'à leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d'ADN ou d'ARN du génome du dit microorganisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme. Pour simplifier l'exposé, il est fait référence dans la suite, à titre de simple exemple illustratif, à une détection accomplie par une amplification, plus précisément au moyen d'une ACP ou d'une TR-ACP, mais d'autres méthodes d'amplification peuvent également être employées, comme par exemple la méthode dite NASBA (c'est-à-dire la méthode par Wnucleic acid sequence based assay"). Une quantification moléculaire et une détection selon l'invention présentent un intérêt marqué aussi bien pour de petits micro-organismes que pour de plus gros microorganismes, mais en faible concentration ou dont les techniques empiriques traditionnelles d'évaluation ne sont plus systématiquement maîtrisées dans les pays développés. L'invention a également pour objet un kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de microorganismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés: - une série de concentrations connues étalonnées du microorganisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à des concentrations connues du dit microorganisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par ACP, TR-ACP ou NASBA de l'ADN ou de l'ARN du microorganisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de l'ADN ou de l'ARN du microorganisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification. Ledit kit ou ensemble de mmoyens peut également comprendre en option un contrôle interne, par exemple sous la forme d'approximativement 103 copies/pl d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'ARN de transcrit hétérologue, en tant que contrôle pour l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la TR. Il convient de noter que les moyens d'analyse des produits d'ACP ou de TR-ACP peuvent consister en des moyens extérieurs au kit et destinés à être utilisés en combinaison avec celui-ci. Ces moyens peuvent par exemple comprendre des dispositifs et/ou des produits pour la détermination par életrophorèse, par colorimétrie, par radiométrie ou par tout autre moyen analytique approprié. Le procédé et les moyens susdits procurent de manière originale une quantification absolue des micro-organismes à ADN ou à ARN, car le micro-organisme cible ou son génome à doser, est identique au micro-organisme étalon ou son génome traité en parallèle. De plus, ce procédé et ces moyens se sont avérés procurer une technique universelle de quantification et d'identification, car ils permettent la quantification de tous les micro-organismes. En dehors même des préoccupations de quantification, le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être employés pour une détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des microorganismes à ARN ou à ADN. En pratique, la quantité minimale mesurable est de l'ordre de un à cinq microorganismes pour les micro-organismes à ADN, tandis qu'elle est de l'ordre de 10 à 100 micro-organismes pour les micro-organismes à ARN. L'invention est décrite plus concrètement ci-après en référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels: - Fig. 1 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité d'amplification de différentes expériences d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations différentes d'ADN étalon du même virus; - Fig. 2 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité d'amplification de différentes expériences de TR-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du même virus; - Fig. 3 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN issues de préparations de virus provenant de différents patients, au sein de la même expérience;; - Fig. 4 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations du même virus et avec plusieurs concentrations d'ADN issues de deux plasmides différents; - Fig. 5 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN issues de préparations de virus provenant de différents patients; - Fig. 6 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ARN issues de préparations de virus provenant de différents patients et avec deux ARN de transcrits différents. Ainsi, à titre indicatif, on a concentré, purifié et extrait l'ARN de VIH issu d'une culture de façon à en obtenir 300 ng; sachant que le nombre total de nucléotides du VIH est de 19000 et que la masse moléculaire d'un nucléotide est de 330 daltons, on en a déduit que la masse moléculaire globale d'un ARN de VIH est de 6.300.000 daltons. On a alors obtenu, par un calcul utilisant le nombre d'Avogadro, le nombre exact de génomes viraux et donc de virus d'où émane la quantité de 300 ng d'ARN, soit approximativement 3x1010 virus. Connaissant la concentration de virus d'une partie aliquote de la préparation virale purifiée, on peut alors préparer une gamme étalon de ce virus et l'utiliser dans le procédé selon la présente invention. Le procédé selon l'invention permet une identification fiable et/ou une quantification absolue, car le micro-organisme cible (à doser) est identique au micro-organisme étalon. La méthode que ce procédé met en oeuvre est en outre universelle, car elle permet la quantification de tous les micro-organismes dont la quantité est mesurable parallèlement. Ce procédé et le kit pour sa mise en oeuvre peuvent être utilisés non seulement pour la quantification des micro-organismes dans tous milieux ou spécimens, mais également pour la détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des microorganismes à ARN ou à ADN. Pour les micro-organismes à ADN la quantité minimale mesurable est de l'ordre de 1 à 5 micro-organismes, tandis qu'elle est d'environ 10 à 100 micro-organismes pour ceux à ARN. La présente invention apporte un progrès décisif aux moyens et aux méthodes de dosage quantitatif de microorganismes in vitro en procurant un moyen et une technique simples et efficaces pour la standardisation des dosages. L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels les proportions et les pourcentages sont en poids/poids, sauf indication contraire. Exemple 1: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ADN cible par ACP (en anglais PCR). On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité d'amplification de l'ACP sur l'ADN issu de différentes concentrations du même VHB. Les plasmas ont été obtenus à partir de porteurs de VHB chroniques par plasmaphérèse avec des titres en HBsAg élevés. Du virion à ADN de VHB a été purifié par centrifugation (pendant une nuit à 25.000 tours/min et à 40C dans une centrifugeuse Spinco 25) à travers un lit à 30 % (en poids/volume) de saccharose dans du milieu TEBM (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6, NaEDTA 0,001 M, 1 % d'albumine sérique bovine et 0,3 % de 2-mercapto-éthanol). La pureté des virions de VHB fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ADN associé aux virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit de purification d'ADN du commerce. L'ADN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie.Le nombre de copies d'ADN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral de l'ADN de VHB. En variante le nombre de virions peut également être quantifié par microscopie électronique. Des dilutions en série (10, 100, 1000, 10.000 copies) de l'ADN de VHB ont été soumises à une succession de cycles d'ACP identiques (940C pendant 60 s, 560C pendant 60 s et 720C pendant 90 s), avec 100 pmol de paires d'amorce de VHB spécifiques pour le gène C: (GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/ GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y-32P (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta. Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 1. Il apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible. Ainsi, pour chaque input d'ADN de matrice constante (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la figure 1 un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre. Exemple 2: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ARN cible par TR-ACP (en anglais RT-PCR). On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité de la transcription réverse/amplification de l'ACP sur l'ARN issu de différentes concentrations du même VIH-1. Du virion à ARN de VIH-1 a été purifié par passage du surnageant de culture de blastes de cellules mononuclées du sang infectés par un isolat primaire sur une colonne de sépharose. La pureté des virions de VIH-1 fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ARN associé aux virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit d'isolation d'ARN du commerce. L'ARN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ARN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral de 1'ARN de VIH-1.Après addition de 1 microgramme d'ARNt, des dilutions en série (1.000.000, 100.000, 10.000, 1000 copies) de l'échantillon d'ARN ont été pastillées et remises en suspension dans 10 pl. Une partie aliquote de 10 Rl d'ARN et 1 pg d'ARNt de référence (exempt de VIH) ont été ajoutés immédiatement à chacun des mélanges réactionnels (90 pl) de TR-ACP contenant 10 unités de transcriptase réverse de virus de leucémie murine de Moloney recombinant et 3 unités d'ADN polymérase ampliTaq pour l'amplification du gène gag du VIH.La TR ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 420C, puis pendant 5 min à 940C et ensuite sur 40 cycles (940C peandnt 60 s, 560C pendant 60 s et 720C pendant 90 s) d'ACP utilisant 100 pmol de chacune des paires d'amorce de VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/ TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y-32P (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta. Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 2. Il apparaît que la variabilité des résultats est très importante d'une expérience à l'autre. Là encore, il apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible. Ainsi, pour chaque input d'ARN constant (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la figure 2 un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre. Exemple 3: Validation d'un étalon d'ADN de virion. Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles d'ACP identiques d'ADN de virion de VHB natif provenant de sérums de différents patients infectés par VHB. Des dilutions en série d'échantillons de différents ADN de virion de VHB préparés comme indiqué dans l'exemple 1 ont été soumises à un même nombre de cycles d'ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm. Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 3 montrent que l'efficacité d'amplification par ACP est identique quelle que soit la source du virion VHB (ici pour quatre sources différentes). Exemple4: Validation d'un étalon d'ADN de virion. En procédant comme indiqué dans l'exemple 3, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles d'ACP un ADN de virion natif et des ADN issus de deux plasmides VHB (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par ACP (voir figure 4). Des fragments d'ADN de la séquence de gène C de vHB ont été produits par ACP à partir de sérums de HBVsAg+ et ligaturés dans des plasmides pGEM-3Z (Promega) et pCTs (Invitrogen) (respectivement plasmide ADN1 et ADN2 de VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié. Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 4 montrent qu'un nombre connu de copies peut avoir ou non une efficacité d'amplification comparable à celle d'un nombre de copies identique d'ADN viral natif issu de plusieurs échantillons. Il ressort ainsi des exemples 3 et 4 que des concentrations connues d'ADN de virion VHB de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ADN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ADN natifs. ExemDle 5: Validation d'un étalon d'ARN de virion. Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles de TR-ACP identiques d'ARN de virion de VIH natif provenant de sérums de différents patients infectés par du VIH. Des dilutions en série d'échantillons de différents ARN de virion de VIH préparés comme indiqué dans l'exemple 2 ont été soumises à un cycle de TR-ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm. Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 5 montrent que l'efficacité d'amplification par TR ACP est identique quelle que soit la source du virion VIH. ExemDle 6: Validation d'un étalon d'ARN de virion. En procédant comme indiqué dans l'exemple 5, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles de TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec un nombre connu de copies (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir figure 6). Des fragments d'ARN de séquence gag de VIH-1 ont été produits par transcription de matrices d'ADN de VIH-1 (respectivement plasmide pBR322 d'ADN de VIH-Z6 et plasmide pBH10-R3 d'ADN de VIHIIIB) avec de l'ARN polymérase de T7 (respectivement transcrits ARN1 et ARN2 de VIH). Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 6 montrent qu'un ARN de transcrit ayant un nombre connu de copies a une efficacité d'amplification par TR ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon. Il ressort ainsi des exemples 5 et 6 que des concentrations connues d'ARN de virion VIH de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ARN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ARN natifs. Ainsi: - l'utilisation selon l'invention d'ADN de virion comme étalon externe est de loin plus précise et commode que celle d'un ADN de plasmide servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai d'ACP quantitative; - l'utilisation selon l'invention d'ARN de virion comme étalon externe est de loin plus précise et commode que celle d'un ARN de transcrit servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai de TR-ACP quantitative. Exemple7: Kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par visualisation 7.1. INTRODUCTION Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d'ARN génomique de VIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-1 et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture.On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler 1'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de 1'ARN de virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplification utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure simple de visualisation sur gel d'agarose, qui permettait une limite de détection de 1000 copies d'ARN viral et une gamme de quantification de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 réactions (40 l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 pl. Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH (ci-après "VirionStandard") comme expliqué plus haut (104, 103, 102 et 10 copies/l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d'ARN de virion VIH du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne (ci-après "CI") (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions). 7.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -200C dans un congélateur à température constante ou à 40C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. Sil est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette. No. Réactif Volume Quantité Commentaires 1 VirionStandard de VIH 1a VirionStandard 1 (104 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1b VirionStandard 2 (103 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1c VirionStandard 3 (102 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1d VirionStandard 4 (10 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1e VirionStandard 5 (sérum négatif auVIH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 l 4 Dissout les échantillons d'ARN 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de CI, éventuellement d'ADNc 5 Mélange enzymatique 28 l 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/ l) 40 l 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH 7 CI optimal (103 copies/ l) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à la TR 8 Eau passée à l'autoclave 40 l 1 Contrôle de signal (négatif) de fond 7.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS 7.3.1. REACTIFS - Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Agarose (exempt de DNase) - Bromure d'éthidium - Solution d'isolement d'ARN 7.3.2. EQUIPEMENTS - Centrifugeuse à microtube (40C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Générateur et bain pour électrophorèse 7.4.PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE 7.4.1. EXTRACTION D'ARN 100 1 d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 R1 de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 pl de chloroforme ont été ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 40C pendant 15 minutes. Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 1) et la phase aqueuse supérieure (-320 1). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique. La phase aqeuse (300 Zl) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté et les échantillons ont été conservés à -200C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (40C) et le pellet (pastille) a été brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 p1) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 1 de tampon de réserve d'ARN. Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. I1 est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité. 7.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 p1 d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 itl). 40 1ll de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 1 de mélange d'amplification de VIH + 1,1 l de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique (dénommé commercialement Thermal Cycler), à couvercle chauffant. - 420C pendant 25 minutes; - 940C pendant 5 minutes; - 35 cycles (940C pendant 35 s, 550C pendant 45 s et 720C pendant 60 s); - puis 550C pendant 5 minutes et ensuite 720C pendant 5 minutes. 7.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION 10 1 du mélange post-réactionnel ont été distribués sur du gel d'agarose à 1,5% contenant 0,5 Rg/ml de bromure d'éthidium et on a effectué une électrophorèse sous 150 V pendant 10 minutes. Les séquences de VIH spécifiquement amplifiées pouvaient être visualisées aisément par différences de taille. Les gammes de copies d'ARN de viron VIH dans 100 1 d'échantillons de plasma/sérum pouvaient être estimées par comparaison de leurs bandes d'amplification avec celles du VirionStandard de VIH (semi-quantification). Exemple 8: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection avec un lecteur de densité optique 8.1. INTRODUCTION Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d'ARN génomique de VIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-1 et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture.On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de l'ARN de virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplification utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la DIG (digoxigénine), qui permettait une limite de détection de 100 copies d'ARN viral et une gamme de quantification d'environ 2 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 réactions (40 Rl chacune) dans un protocole avec volume final de 50 Rl. Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH VirionStandard1 (103, 102, 10 et 1 copies/l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d'ARN de virion VIH du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne NCIN (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions). 8.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -200C dans un congélateur à température constante ou à 40C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette. No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VIH liée à une transcription réverse (TR) et marquage par DIG 1 VirionStandard de VIH 1a VirionStandard 1 (103 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1b VirionStandard 2 (102 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1c VirionStandard 3 (10 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1d VirionStandard 4 (1 copie/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1e VirionStandard 5 (sérum négatif auVIH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARn 250 l 4 Dissout les échantillons d'ARN 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et CI, (5% de DIC-dUTP) d'ADNc 5 Mélange enzymatique 28 l 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/ l) 40 l 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH 7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/ l) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR 8 Eau passée à l'autoclave 40 l 1 Contrôle de signal (négatif de fond II Hybridation liquide et détection par DIG 9 Sonde de VIH biotinylée 200 l 1 Capture d'ADNc de VIH en hybridation liquide 10 Contrôle interne biotinylé, 100 l 1 Capture d'ADNc de CI en hybridation liquide sonde spécifique d'ADN 11 Tampon de dénaturation 4 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié 12 Tampon d'hybridation 40 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible 13 Tampon de lavage (10x) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-spécifique 14 Billes revêtues de streptavidine (ou microplaque) 200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hybridation liquide 15 Solution de travail anti-DIG-POD 40 ml 1 Se fixe aux molécules DIG du produit spécifiquement amplifié 16 Solution de substrat ABTS 40 ml 1 Permet le développement de couleur en système POD 8.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS 8.3.1. REACTIFS - Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN - Microplaque revêtue de streptavidine 8.3.2.EQUIPEMENTS - Centrifugeuse à microtube (40C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Lecteur de densité optique automatisé 8.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE 8.4.1. EXTRACTION D'ARN 100 pl d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 pl de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 zl de chloroforme ont été ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 40C pendant 15 minutes. Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 Rl) et la phase aqueuse supérieure (-320 p1). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique. La phase aqeuse (300 pl) a été transférée dans des nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté et les échantillons ont été conservés à -200C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (40C) et le pellet (pastille) a été brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 l) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 itl de tampon de réserve d'ARN. Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité. 8.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 l d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 l). 40 itl de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,7 l de mélange d'amplification de VIH + 1,1 l de mélange enzymatique + 0,2 F1 de DIG-dUTP) ont été placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant. - 420C pendant 25 minutes; - 940C pendant 5 minutes; - 36 cycles (940C pendant 35 s, 550C pendant 45 s et 720C pendant 60 s); - puis 550C pendant 5 minutes et ensuite 720C pendant 5 minutes. 8.5. DETECTION ET QUANTIFICATION 2 1ll de produit amplifié (x2) et une dilution par 10 fois (x2) ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 18 pl de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 pl de solution d'hybridation (x4) contenant une sonde de VIH et une sonde de CI, vortex, puis transfert à la pipette dans un puits d'une microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à 370C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 Fl de tampon de lavage, 200 Rl de solution de substrat ABTS ont été ajoutés dans chaque puits, suivis d'une incubation de 30 minutes à 370C avec agitation.La plaque a été maintenue dans l'obscurité pendant l'incubation. On a lu l'absorbance à 405 nm. Les nombres de particules de VIH par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé utilisant une courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue). Exemple 9: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par fluorescence 9.1. INTRODUCTION Un kit de quantification du génome du virus de limmunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures. 9.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -200C dans un congélateur à température constante ou à 40C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette. No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VIH liée à une transcription réverse (TR) 1 VirionStandard de VIH 1a VirionStandard 1 (103 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARn d'échantillon 1b VirionStandard 2 (102 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1c VirionStandard 3 (10 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1d VirionStandard 4 (1 copie/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1e VirionStandard 5 (sérum négatif au VIH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 l 4 Dissout les échantillons d'ARN 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de CI d'ADNc 5 Mélange enzymatique 28 l 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/ l) 40 l 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH 7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/ l) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR 8 Eau passée à l'autoclave 40 l 1 Contrôle de signal (négatif) de fond II Hybridation liquide et comptage de fluorescence 9 Microplaque revêtue de sondes de VIH (souches + & -) 8 puits 12 Capture d'ADNc de VIH en hybridation liquide 10 Microplaque revêtue de sonde de CI 8 puits 12 Capture d'ADNc de CI en hybridation liquide 11 Tampon de dénaturation 2 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié 12 Tampon d'hybridation 20 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible 13 Tampon de lavage 100 ml 1 Retient spécifiquement l'ADN amplifié dans la microplaque 14 Fluorochrome 10 ml 1 Permet la détection d'ADNds post-amplification 9.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS 9.3.1. REACTIFS - Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN 9.3.2. EQUIPEMENTS - Centrifugeuse à microtube (40C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Fluorimètre sensible 9.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE 9.4.1.EXTRACTION D'ARN 100 pl d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 p1 de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 p1 de chloroforme ont été ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 40C pendant 15 minutes. Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 p1) et la phase aqueuse supérieure (-320 F1). ) . Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique. La phase aqeuse (300 l) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté et les échantillons ont été conservés à -200C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (40C) et le pellet (pastille) a été brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 Rl) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 l de tampon de réserve d'ARN. Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. I1 est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité. 9.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 itl d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ffi 40 l de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 pl de mélange d'amplification de VIH + 1,1 p1 de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant. - 420C pendant 25 minutes; - 940C pendant 5 minutes; - 35 cycles (940C pendant 35 s, 550C pendant 45 s et 720C pendant 60 s); - puis 550C pendant 5 minutes et ensuite 720C pendant 5 minutes. 9.5. DETECTION ET QUANTIFICATION 5 l (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 15 1 de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 1 (x2) de solution d'hybridation, vortex, puis transfert à la pipette dans un puits d'une microplaque revêtue de sondes de VIH, puis 2 heures d'incubation à 370C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 itl de tampon de lavage. 100 l de solution de fluorochrome ont été ajoutés, suivis par le transfert de la microplaque sur un fluorimètre automatisé pour comptage de fluorescence et édition des résultats. Exemple 10: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par chimioluminescence 10.1. INTRODUCTION Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures. 10.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -200C dans un congélateur à température constante ou à 40C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette. No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VIH liée à une transcription réverse (TR) 1 VirionStandard de VIH 1a VirionStandard 1 (103 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1b VirionStandard 2 (102 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1c VirionStandard 3 (10 copies/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1d VirionStandard 4 (1 copie/ l) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon 1e VirionStandard 5 (sérum négatif auVIH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 l 4 Dissout les échantillons d'ARN 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de CI biotinylées d'ADNc 5 Mélange enzymatique 28 l 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/ l) 40 l 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH 7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/ l) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR 8 Eau passée à l'autoclave 40 l 1 Contrôle de signal (négatif) de fond II Hybridation liquide et marquage par chimioluminescence 9 Sonde spécifique pour VIH 100 l 1 S'hybride spécifiquement à l'ADNc de VIH 10 Sonde spécifique de l'ADNc de CI 100 l 1 S'hybride spécifiquement à l'ADNc de CI 11 Tampon de dénaturation 5 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié 12 Tampon d'hybridation 50 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible 13 Tampon de lavage (x10) 50 ml Elimine l'ADN non-spécifique dans la microplaque 14 Billes revêtues de streptavidine (ou microplaque) 200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hybridation liquide 15 Solution de travail anti-ADNds-PAL 10 ml 1 Marquage d'ADN cible hybridé 16 Solution de substrat de chimioluminescence 10 ml 1 Permet détection par luminescence et quantification 10.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS 10.3.1. REACTIFS - Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN 10.3.2. EQUIPEMENTS - Centrifugeuse à microtube (40C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Luminomètre 10.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE 10.4.1.EXTRACTION D'ARN 100 itl d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 1ll de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 Rl de chloroforme ont été ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 40C pendant 15 minutes. Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 Zl) et la phase aqueuse supérieure (-320 1) . Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique. La phase aqeuse (300 1ll) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté et les échantillons ont été conservés à -200C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (40C) et le pellet (pastille) a été brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 F1) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 gl de tampon de réserve d'ARN. Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité. 10.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 p1 d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 1). 40 l de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 Ill de mélange d'amplification de VIH + 1,1 Ill de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant. - 420C pendant 25 minutes; - 940C pendant 5 minutes; - 35 cycles (940C pendant 35 s, 550C pendant 45 s et 720C pendant 60 s); - puis 550C pendant 5 minutes et ensuite 720C pendant 5 minutes. 10.5. DETECTION ET QUANTIFICATION 5 ,ul (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 tubes frais et mélangés avec 15 p1 de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 l (x2) de solution d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VIH ou une sonde spécifique pour l'ADN du contrôle interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revêtues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à 370C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 111 de tampon de lavage. 200 itl des anticorps anti ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à 370C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 1ll de tampon de lavage, 100 itl de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés.Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VIH par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue). Exemnleîî: Kit de quantification de génome de virus de l'hépatite B humaine (VHB) pour détection par chimioluminescence 11.1. INTRODUCTION Un kit de quantification du génome du virus de l'hépatite B humaine (VHB) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d'ADN génomique de VHB dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.).On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler 1'ADN viral par une méthode rapide, l'amplification de 1'ADN du virion vHB avec de la Taq ADN polymérase et la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la chimioluminescence, qui permettait une limite de détection de 50 copies d'ADN viral et une gamme de quantification de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 5 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 réactions (40 l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 Fl. Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion vHB 'VirionStandard1 (104, 103, 102 et 10 copies/Rl, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d'ADN de virion VHB du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VHB de plasmide (103 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un ADN de plasmide hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne "CI" (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions). 11.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT Le kit de quantification de génome de VHB doit de préférence être conservé à -2O0C dans un congélateur à température constante ou à 40C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette. No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VHB 1 VirionStandard de VHB 1a VirionStandard 1 (104 copies/ l) 0,2 ml 1 Calibre l'ADN d'échantillon 1b VirionStandard 2 (103 copies/ l) 0,2 ml 1 Calibre 1'ADN d'échantillon 1c VirionStandard 3 (102 copies/ l) 0,2 ml 1 Calibre l'ADN d'échantillon 1d VirionStandard 4 (10 copies/ l) 0,2 ml 1 Calibre l'ADN d'échantillon 1e VirionStandard 5 (sérum négatif au VHB) 0,2 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) 2 Mélange d'amplification de VHB, avec amorces 1,1 ml 4 S'hybride au génome d'ADN de VHB 3 ADN polymérase Taq 25 l 1 Amplifie l'ADN de cible 4 ADN de VHB de plasmide (102 copies d'ADN/ l) 50 l 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VHB 5 ADN de plasmide hétérologue (102 copics d'ADN/ l) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification 6 Eau passée à l'autoclave 100 l 1 Contrôle de signal (négatif) de fond 7 Tampon de décharge ou libération d'ADN II Hybridation liquide et marquage par chimioluminescence 8 Sonde spécifique pour VHB 100 l 1 S'hybride spécifiquement à l'ADNc de VHB 9 Sonde spécifique de l'ADN de CI 100 l 1 S'hybride spécifiquement à l'ADN de CI 10 Tampon de dénaturation 5 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié 11 Tampon d'hybridation 50 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible 12 Tampon de lavage (x10) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-spécifique 13 Billes revêtues de streptavidine (ou microplaque) 200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VHB hybridé en hybridation liquide 14 Solution de travail anti-ADNds-PAL 10 ml 1 Marquage d'ADN cible hybridé 15 Solution de substrat de chimioluminescence 10 ml 1 Permet détection par luminescence et quantification 11.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS - Centrifugeuse à microtube - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie pour hybridation liquide - Luminomètre 11.4. PROTOCOLE POUR PREPARATION D'ECHANTILLON ET AMPLIFICATION 11.4.1. PREPARATION D'ECHANTILLON 50 Rl d'échantillons de VirionStandard de vHB et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 50 1ll de tampon de décharge ou libération d'ADN, et on a ensuite laissé reposer à 980C pendant 10 minutes. Après centrifugation, les ADN restaient exclusivement dans la phase liquide (10-15 1li), tandis que les protéines étaient dans le pellet. 11.4.2. AMPLIFICATION D'ADNc 10 Rl de la phase liquide ont été transférés dans de nouveaux tubes (200 l) . 40 Ill de mélange d'amplification de VHB + 5 Rl de Taq ADN polymérase) ont été placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant. - 940C pendant 5 minutes; - 35 cycles (940C pendant 35 s, 600C pendant 45 s et 720C pendant 60 s); - puis encore 720C pendant 5 minutes. 11.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION 5 Fl (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 nouveaux tubes en parallèle et mélangés avec 15 Rl de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 Ill (x2) de solution d'hybridation contenant une sonde spécifique pour vHB ou une sonde spécifique pour l'ADN du contrôle interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revêtues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à 370C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 Zl de tampon de lavage. 200 Rl des anticorps anti ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à 370C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ul de tampon de lavage, 100 pl de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VHB par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VHB (quantification absolue). REVENDICATIONS 1. Procédé pour la quantification et la détection de n'importe quel micro-organisme à ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) l'utilisation ou la détermination d'une concentration étalon du micro-organisme ou de la concentration de l'ADN ou de l'ARN porté par ce micro-organisme, appelé microorganisme étalon, et (2) la comparaison de la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du microorganisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN ou de l'ADN de concentrations connues du dit microorganisme. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (2) consiste essentiellement en une révélation comparative fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon avec les concentrations du micro-organisme cible telles que détectées de préférence au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes selon lesquelles: 1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes; 2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité recueillie; 3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné; 4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de 1'ADN ou de l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue; 5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro, la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme; 6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes; 7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible et/ou à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des microorganismes étalon et cible ou les produits d'amplification des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les étapes 2) à 5) sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de micro-organismes. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, qui comprend également l'addition d'un contrôle interne, de préférence sous la forme d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces n'ont pas de rapport avec les ADN ou ARN cible, pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la TR. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on remplace la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues: du même micro-organisme inactivé, dont l'ADN ou l'ARN demeure apte à une détection ou à une quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de révélation dite à l'ADN branché et/ou la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou 1'ARN du virus natif, d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou dune séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on prépare et on stocke jusqu'à leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d'ADN ou d'ARN du génome du dit microorganisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme. 8. Kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de micro-organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés: - une série de concentrations connues étalonnées du microorganisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à des concentrations connues du dit microorganisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de 1'ADN ou de 1'ARN du microorganisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification. 9. Kit ou ensemble de moyens selon la revendication 8, qui comprend des moyens pour la simple mesure directe du nombre de microorganismes. 10. Kit ou ensemble de moyens selon l'une des revendications 8 ou 9, qui comprend également un contrôle interne, de préférence sous la forme d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces ne sont pas en rapport avec les ADN ou ARN de la cible, pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la TR. 11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la quantification des microorganismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme. 12. Utilisation d'un kit ou ensemble selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour la quantification des micro-organismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme.