FR 2746804 A1 19971003 FR 9604385 A 19960402 La présente invention concerne un procédé d'homo ou d'hétéro polymérisation de protéines dotées de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures, en particulier les protéines contenant des cystéines libres ou des cystines. De nombreuses propriétés fonctionnelles des protéines s'expriment dans leur capacité de polymérisation (gélification et après séchage fabrication des colles par exemple) ou d'agrégation (viscosité, fabrication de mousses par exemple). Dans de nombreux cas, il est nécessaire qu'il y ait une formation de réseaux de polymères, soit comme dans le cas des gélatines, des soies ou des kératines, soit sous forme de réseaux moléculaires stabilisés par les interactions hydrophobes, ioniques ou les liaisons covalentes. Pour aboutir à cette polymérisation, il est fréquemment nécessaire de dénaturer les protéines. I1 est connu d'y parvenir soit par la dénaturation thermique, soit en utilisant tout autre dénaturant chimique (sels, solvants, etc...), soit encore par l'intervention de réactifs chimiques tels que le formol, le glyoxal, etc... (polymérisation médiée par des réactifs bi ou polyfonctionnels). Les inconvénients majeurs de ces différentes techniques résident dans leur insuffisance, dans leur complexité et surtout par le fait qu'elles ne sont pas bien contrôlées. En outre, l'utilisation de réactifs chimiques entratne généralement la structuration de produits secondaires non comestibles qui ne permettent pas l'utilisation des technologies concernées dans le domaine alimentaire. La présente invention propose un nouveau procédé permettant d'oligomériser, de polymériser ou d'agréger des protéines identiques ou différentes, contenant des groupements thiols ou substitués avec des groupements thiols, et ceci d'une façon relativement simple et contrôlée. Un autre but de l'invention est de proposer une technologie de polymérisation écologiquement acceptable et inoffensive d'un point de vue alimentaire. Ce procédé s'adresse plus particulièrement aux peptides ou aux protéines dotées de cystines (ponts disulfures) et, éventuellement, de cystéines. Le procédé conforme à la présente invention consiste à soumettre les protéines à une dénaturation par la pression, en présence d'un agent réducteur. Le traitement sous pression réalise un dépliage de la structure des protéines ; il rend possible la levée des interactions hydrophobes et ioniques stabilisant les structures quaternaires, tertiaires et secondaires des protéines qui doivent le reste de leur cohésion aux ponts disulfures uniquement. L'agent réducteur permet d'induire la création de liaisons intermoléculaires du type ponts disulfures, pour l'obtention d'homo ou d'hétéro oligo/polymères, en fonction des protéines de base et des conditions de traitement appliquées. En fait, la présence de l'agent réducteur rend possible l'rechange bien contrôlé des liaisons covalentes (ponts disulfures) intramoléculaires, et la création de liaisons disulfures intermoléculaires pour aboutir à la création de structures supramoléculaires. L'addition d'agent(s) réducteur(s) dans des quantités catalytiques ou dans des quantités stoechiométriques aux protéines ou à leur mélange pressurisé, permet de réduire et d'échanger les ponts disulfures desdites protéines, soit en engageant des cystéines de la liaison native ou originelle dans les liaisons avec d'autres partenaires thiols, soit en les réduisant. Cette addition permet ainsi de libérer les channes polypeptidiques des protéines dénaturées et de transformer toute protéine à ponts disulfures en pelote statistique. Un échange et une oxydation des cystéines à ce stade permettent une production d'homo ou d'hétéro oligo/polymères aux compositions variées. La réaction est stoppée par dépressurisation. Le repliage des protéines polymérisées est naturellement discontinu avec des séparations locales des domaines hydrophobes et hydrophiles. Néanmoins, il est maintenu par un réseau de liaisons covalentes formées par les ponts disulfures et par la recomposition des hétérodomaines intercaténaires et/ou intermoléculaires. Les ponts disulfures inter et intramoléculaires nouvellement formés confèrent une structuration originale aux oligomères ou aux polymères obtenus par le procédé, qui peut avoir une influence sur les propriétés des produits obtenus. En effet, l'arrangement des ponts disulfures (cystines) constitue une très importante contrainte structurale définissant en grande partie le repliage protéique et les propriétés fonctionnelles d'une protéine ou de son agrégat. Très souvent, il suffit de connaître la disposition des cystéines dans les chalnes polypeptidiques d'une protéine pour pouvoir prédire sa structure tridimensionnelle. Oxydées sous forme de cystines, elles constituent les points initiaux de la renaturation et la dirigent, en grande partie, vers un mode de repliage intramoléculaire. Le substrat protéique de base Comme cela a été évoqué ci-avant, le procédé conforme à la présente invention s'applique à tout peptide ou toute protéine doté(e) de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures. Ces groupements thiols peuvent être présents naturellement ou rapportés par substitution (greffage). Il s'adresse en particulier aux protéines dotées de cystéines ou de cystines ; il peut s'agir de protéines d'un même type ou d'un mélange. Le substrat protéique peut se présenter en solution ou en suspension, dans l'eau ou dans tout autre milieu approprié. L'aqent réducteur Tout type d'agent réducteur peut être utilisé. De préférence il sera doté d'au moins un groupement thiol et de façon encore préférée il comprendra au moins une cystéine libre. L'utilisation d'un agent réducteur admis du point de vue alimentaire sera particulièrement intéressante. A ce titre, on pourra faire intervenir des acides aminés comme la cystéine, des peptides alimentaires tels le glutation ou certaines protéines alimentaires à cystéines non appariées L'agent réducteur est utilisé dans des quantités catalytiques et/ou dans des quantités stoechiométriques aux protéines dénaturées par la haute pression. Le traitement sous pression Le traitement sous pression qui est appliqué est adapté pour obtenir une dénaturation (dépliage) de la protéine ou du mélange de protéines. Cet objectif est atteint par les hautes pressions, en particulier à des valeurs supérieures à 200 MPa. La valeur de pression appliquée est fonction de la stabilité des protéines en présence. On peut par exemple travailler sous une pression voisine de 1000 MPa pour être sûr de travailler dans une zone de dénaturation efficace. Le temps d'application du traitement par la pression est également adapté au substrat protéique de base et en fonction du taux de polymérisation désiré. Le degré de la réticulation, agrégation, oligomérisation ou polymérisation peut être modulé et contrôlé par la pression appliquée, par le temps d'application de cette pression et par les concentrations des différents produits et substrats mis en oeuvre (rapport réducteur/oxydant, rapport réducteur/substrat protéique ...). La température, le pH, la force ionique et éventuellement les concentrations d'autres additifs n'intervenant pas directement dans la réaction, peuvent aussi avoir une influence ; ils peuvent également être utilisés pour le contrôle de la réaction de polymérisation. En fonction du degré de polymérisation on peut obtenir des viscosités différentes, ainsi que des gels ou des masses solides. Le caractère varié des réseaux créés par le réarrangement des ponts bisulfures peut permettre une co/oligo/polymérisation de substances tiers, soit hydrophobes, soit hydrophiles. APPLICATIONS Cette nouvelle méthodologie d'homo ou d'hétéro polymérisation peut donner source à l'élaboration de technologies nouvelles qui ont jusqu'à maintenant en grande partie fait abstraction du contrôle rigoureux des conditions oxydoréductrices du milieu pendant les process technologiques. Les applications d'un tel procédé peuvent être très diverses. Il pourra être utilisé comme une solution alternative pour la précipitation des protéines dont l'élimination de la solution est difficile, par exemple pour la diminution de la charge en matière organique des effluents de l'industrie agroalimentaire (industrie laitière : récupération des protéines du lactosérum telles que l'alpha-lactalbumine et la bêta-lactoglobuline amidonnerie, glutennerie : récupération des protéines solubles du blé...). Ce procédé pourra également trouver des applications intéressantes dans le domaine alimentaire si l'on utilise des agents réducteurs admissibles du point de vue alimentaire. Ainsi, les oligomères/polymères obtenus peuvent trouver application comme agents gélifiants, épaississants, émulsifiants ou moussants. Ils peuvent également constituer des collodiums comestibles et faciles à incorporer dans d'autres produits alimentaires. En particulier, les protéines du lactosérum sont peu exploitées jusqu'à présent car elles ne peuvent pas être incluses dans les coagulats de caséines lors des procédés laitiers, en raison de leur grande solubilité. Provoquer des phénomènes d'agrégation permet d'obtenir des molécules de haut poids moléculaire, plus facilement utilisables. Les réseaux d'oligomères et de polymères protéiques interconnectés par liaisons covalentes disulfures peuvent être utilisés pour piéger d'autres polymères, soit alimentaires (comme par exemple des polyglucides), soit non alimentaires. Egalement, des composés d'intérêt alimentaire, nutritionnel (colorants, aromatisants, vitamines ...) ou non alimentaire de moindre taille moléculaire peuvent être incorporés et piégés dans les agrégats ainsi formulés, sans perte de couleur, arôme ou activité biologique. Le traitement conforme à la présente invention peut également être utilisé pour faire disparaître l'odeur soufrée d'origine protéique sans induire la disparition d'autres odeurs ou arômes. La stabilisation par ponts disulfures intercaténaires peut rendre le polymère protéique plus résistant ou plus sensible à l'hydrolyse. Puisque l'on utilise des méthodes d'oxydoréduction douce, une partie des oligo/polymères produits peut se révéler comestible. Des réseaux biocomposites avec l'incorporation de polysaccarides, d'amphiphiles, ou de gommes modifiant l'élasticité de ces structures supramoléculaires peuvent être créés. Ce procédé peut aussi contribuer à réduire les allergénicités en modifiant la présentation des épitopes allergènes de certaines protéines alimentaires. EXEMPLES ET RESULTATS L'étude du mécanisme de polymérisation sous haute pression a été réalisée sur l'alpha-lactalbumine et la bêta-lactoglobuline, constituants majeurs du lactosérum. /Matériels et méthodes/ A. PREPARATION DE L'ALPHA-LACTALBUMINE ET DE LA BETA LACTOGLOBULINE Les protéines ont été isolées à partir de lait de vache suivant la méthode de MAILLART P. et RIBADEAU DUMAS B. ("Préparation of bêta-lactoglobulin and bêtalactoglobulin-free proteins from whey retentate by NaCl salting out at low pH" - (1988) Journal of food science, 53(3), 743-752). Il est nécessaire de purifier l'alphalactalbumine par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions avec un gradient en sel. La pureté des protéines est, au final, supérieure à 98 % (Chromatographie liquide de haute performance (HPLC)). B. SOLUBILITE La proportion de protéine précipitée d'une solution est estimée par la différence de densité optique à 280 nm entre la solution avant et après une centrifugation à 15000 g pendant 12 minutes. C. EXPERIENCE DE HAUTE PRESSION L'appareil de haute pression est un modèle LCP 30 de la Société UNIPRESSEQUIPMENT, VARSOVIE-POLOGNE; il est utilisé sous le mode "presse". La pression est engendrée par l'avancement d'un piston dans une chambre de compression cylindrique (430 mm x 118 mm) en acier inoxydable. Son déplacement est réalisé avec une pompe à main. Les solutions à comprimer sont introduites dans des cellules en verre d'une contenance de 3 ml, de forme ellipsoidale, avec un orifice d'un millimètre de diamètre non obstrué pendant l'expérience. Ces cellules sont disposées dans la chambre de compression, dans de l'hexane. Les traitements de haute pression ont été réalisés à la pression maximum de l'appareil : 1000 MPa. La durée du traitement a été de 30 minutes. Le décompte du temps commence quand la pression de 1000 MPa est effectivement atteinte et il s'arrête lorsque l'on commence à décompresser l'enceinte. La montée en pression dure une demi-heure ; le retour à la pression atmosphérique dure 20 minutes. D. ELECTROPHORESE Les puits sont chargés avec 5 microlitres d'échantillons préparés à la concentration de 0,14 mM, à l'aide du tampon de dissolution (Tris 0,5 M pH 6,8 2,5 ml ; glycérol 2 ml ; SDS 10 % 4 ml ; H20 qsp 1L) et plongés 2 minutes dans l'eau bouillante. L'électrophorèse a été effectuée à 30 mA pendant 3 heures, dans du tampon de migration (Tris 6 g ; glycine 28,8 g; SDS 1 g ; H20 qsp 1 L). Les gels ont été révélés au bleu de Coomassie. Le terme abrégé Tris ci-dessus correspond à du Tris (hydroxyméthyl) aminométhane et le terme SDS à du dodecyle sulfate de sodium. Pour une meilleure compréhension des résultats, les électrophorèses ont été présentées sous forme d'histogrammes. E. GEL-FILTRATION SUR HPLC On a utilisé la colonne de gel-filtration référencée TSK-G4000SWXL (7,8 mm x 30 cm) de la Société TOSOHAAS JAPON. Elle est utilisable à un pH compris entre 2 et 8. Sa calibration est donnée par le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Protéines Poids Illoleculilirc (kD) Temps de rétention (nli')) a-Lactalbumine 14,2 2X,30 Albumine de plasma bovin 67 25,53 Alcool déshydrogènase 158 25,20 ss-Amylase 20() 24.25 Ferritine 440 22,60 Thyroglobuline 669 2(),33 Bleu dextran 200() 13,90 Les échantillons ont été préparés à une concentration de 0,14 mM et filtrés avec un filtre en cellulose de diamètre de pore de 0,45 micromètres. L'injection est de 20 microlitres. L'analyse dure 30 minutes à débit de 0,4 ml/min. L'élution a été faite avec le tampon Tris 1 M, pH = 7,5, dégazé. /RESULTATS/ A. AGREGATION INDUITE PAR LA PRESSION EN PRESENCE D'AGENTS REDUCTEURS 1) Mise en évidence d'aqréqats La haute pression ne permet pas, à elle seule, de dénaturer irréversiblement l'alpha-lactalbumine et encore moins de provoquer son agrégation. Néanmoins, associée à l'addition de petites quantités d'agents réducteurs, elle permet effectivement d'accentuer un phénomène d'agrégation négligeable à pression atmosphérique. 1.1 - Une série d'expériences à été réalisée : Des solutions d'alpha-lactalbumine à une concentration de 50 mg/ml, additionnées d'agents réducteurs (dithiotréitol (DTT), bêta-mercaptoéthanol (2ME), cystéine (Cys)) dans une proportion stoechiométrique précise par rapport à la protéine (respectivement : 1, 2 et 4) ont été exposées une demi-heure à une pression de 1000 MPa. Le rapport stoechiométrique est différent selon le réducteur pour tenir compte le mieux possible de leur différence de réactivité observée vis-à-vis des lysosymes (HAYAKAWA, S. and NAKAMURA, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem. 50(8), 2039-2046). La figure 1 montre les mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE des différents échantillons. La numérotation sur la figure correspond à ce qui suit: 1 - Bande à l'entrée du gel de concentration (Particules à la limite de la solubilité) 2 - Bande à l'entrée du gel principal (polymères de poids moléculaire supérieur à 500 KD) 3 - Bande de la bêta-lactoglobuline dimérique (dimères de poids moléculaire voisin de 36 KD) 4 - Bande de la bêta-lactoglobuline monomérique (monomères de poids moléculaire voisin de 18 KD) 5 - Bande de l'alpha-lactalbumine monomérique (monomères de poids moléculaire voisin de 14 KD) Les échantillons diffèrent par le type de réducteur additionné à la solution a-DTT ( LDTT = [alpha-lactalbumine]) b-2ME ( [2ME] = 2 x[alpha-lactalbumine)] c-Cys ( [Cys] = 4 x [alpha-lactalbumine]) Les électrophorèses SDS-PAGE de ces échantillons avant le traitement de haute pression (P = 0,1 MPa histogrammes blancs) possèdent excepté avec le DTT, une seule bande, caractéristique de l'alpha-lactalbumine monomère. En revanche, après pression (histogrammes gris), d'autres bandes apparaissent, localisées à l'entrée du gel principal et à l'entrée du gel de concentration. L'apparition de ces bandes met en évidence la formation d'agrégats de nature covalente, de poids moléculaire supérieur approximativement à 500 KD (bandes 1 et 2). 1.2 - La figure 2 montre la répartition de la taille des agrégats déterminée par gel-filtration. Sur cette figure, la numérotation correspond à 1-DTT ( [DTT] = Ealpha-lactalbumine 2-2ME ( [2ME) = 2 xalpha-lactalbumine 3-Cys ( Cys] = 4 x[alpha-lactalbumine] ) 4-témoin (alpha-lactalbumine seule) Une perte de la quantité globale de protéines a été mesurée. Sa cause a été attribuée à l'étampe de filtration précédant l'injection sur filtre de 450 nm de diamètre de pore. L'estimation de cette perte a été directement utilisée pour comptabiliser le pourcentage d'agrégats de diamètre moyen supérieur à 450 nm présents dans la solution. La proportion d'agrégats de diamètre inférieur à 450 nm a été estimée par intégration des pics de temps de rétention inférieurs à celui de l'alphalactalbumine monomérique. L'histogramme a concerne les agrégats dont la taille est supérieure à 450 nm et l'histogramme b concerne les agrégats dont la taille est inférieure à 450 nm (données en pourcentage). Les analyses de gel-filtration par HPLC confirment le résultat précédent à savoir la formation de grands agrégats. 1.3 - La figure 3 montre une gel-filtration par HPLC d'un échantillon d'alpha-lactalbumine à une concentration de 50 mg/ml additionné de cystéine avec une stoechiométrie de 2 par rapport à la protéine. a est le chromatogramme avant le traitement haute pression; b est le chromatogramme après le traitement haute pression (1000 MPa, 1/2 heure). Les profils des échantillons avant le traitement de haute pression montrent que l'alpha-lactalbumine est pure à plus de 90 %. Les profils des échantillons après le traitement révèlent non seulement une perte d'intensité du pic caractéristique de la forme monomère de l'alphalactalbumine, mais également, l'apparition de pics étalés et mal séparés avec un temps de rétention compris entre 13 et 26 minutes. C'est la preuve que les agrégats ont des tailles très variées, partant de 80 KD, et dépassant les 2000 KD. Cela correspond à des oligomères de 6 à 140 unités et plus. 2) Ponts disulfures intermoléculaires 2.1 - Différents échantillons d'alpha-lactalbumine ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demiheure, à une concentration protéique de 50 mg/ml dans un tampon Tris 50 mM, pH-8,5 en présence d'agents réducteurs (DTT, 2ME, Cys) dans les proportions stoechiométriques suivantes par rapport à la protéine: - alpha-lactalbumine, DTT ( Ealpha-lactalbuminej / [DTT] =1) - alpha-lactalbumine, 2ME ( [2ME] / [alpha-lactalbuminej = 2) - alpha-lactalbumine, cystéine - ( [cystéine] / Ealpha- lactalbumine] = 4) - alpha-lactalbumine, cystéine ( E,cysteinej / Ealpha- lactalbumini = 2) Il a été montré qu'en présence de bêtamercaptoéthanol (2ME), l'electrophorese SDS-PAGE est typiquement celle de l'alpha-lactalbumine sous sa forme monomère. Le traitement par le bêta-mercaptoéthanol (2ME) dissocie donc tous les agrégats formés en monomères. 2.2 - Ces résultats sont à confronter avec les électrophorèses SDS-PAGE sans bêta-mercaptoéthanol, figure 4, qui présentent des bandes caractéristiques de molécules de haut poids moléculaire. La figure 4 correspond en effet aux mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE. La numérotation correspond à ce qui suit 1 - Bande à l'entrée du gel de séparation (polymères ou particules) 2 - Bande à l'entrée du gel principal (intermédiaires, poids moléculaire supérieur à 500 KD) 3 - Bande caractéristique de la forme monomérique de 1 'alpha-lactalbumine. Les échantillons analysés ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demi-heure, à une concentration de 50 mg/ml en présence de cystéine dans les proportions suivantes a- rCys7 = galpha-lactalbumini b- CCyi = 2 x [alpha-lactalbumini c- (Cys] = 4 x Ealpha-lactalbumine Les histogrammes blancs correspondent aux résultats sans traitement de haute pression (P = 0,1 MPa) ; les histogrammes gris correspondent aux résultats après la traitement de haute pression (P = 1000 MPa). Ces résultats signifient que les agrégats obtenus ne sont pas dissociés par le SDS, mais le sont par le bêta-mercaptoéthanol. Ces faits prouvent donc que l'agrégation est assurée par des ponts disulfures intermoléculaires. Le mécanisme d'agrégation incriminé est une réaction en chaîne d'échanges de ponts disulfures. A priori, ces échanges de ponts disulfures peuvent être, soit intramoléculaires, soit intermoléculaires. Lorsque ce sont des échanges intermoléculaires, les premières entités formées sont des dimères. Viennent ensuite les trimères, les tétramères, puis, si le phénomène d'association se prolonge, des oligomères. Lorsque les échanges sont intramoléculaires, des molécules d'alphalactalbumine possédant des ponts disulfures non natifs peuvent être engendrées. Dans les conditions citées ci-dessus, divers degrés d'agrégation dont le diamètre, le trimère et le tétramère ont été mis en évidence. Ces résultats confirment la responsabilité des échanges thiol-disulfure dans le processus d'agrégation. D'autre part, ils indiquent que la haute pression favorise l'agrégation, en dénaturant la protéine. En effet, de cette manière, ses ponts disulfures deviennent plus accessibles aux réducteurs libres et leur réactivité s' accroît. D'autre part, les différences entre a) et b) de la figure 4 montrent l'influence de la concentration sur la formation des polymères. 3) Influence de la quantité et de la nature des agents réducteurs 3.1 - L'électrophorèse SDS-PAGE de la figure 1 souligne les différences de comportement des différents traitements réducteurs - le DTT ( [DTT] = 1 x Calpha-lactalbuminei ) a une action aussi efficace à pression atmosphérique qu'à 1000 MPa. Dans les deux cas, 40 % de l'alpha-lactalbumine est sous forme agrégée. - le 2ME ( [2ME] = 2 x Calpha-lactalbumini ), par contre, voit son action nettement amplifiée grâce à la haute pression. Alors qu'à pression atmosphérique la forme monomerique représente 85 % de l'alpha-lactalbumine, elle nten représente plus que 40 % après le traitement de haute pression. - la cystéine ( [CYSg = 4 xEalpha-lactalbumine ) est l'agent réducteur qui apparaît le plus efficace. Comme le 2ME, elle est inactive à pression atmosphérique. A haute pression, elle provoque une agrégation plus importante que le 2ME. La forme monomérique n'est plus que de 35 %. La proportion d'agrégats à l'entrée du gel de séparation est plus importante (30 %) que dans le cas du 2ME (15 Un échantillon témoin ne contenant que de l'alphalactalbumine montre que la présence d'agent réducteur est indispensable pour que l'agrégation ait lieu. 3.2 - Ces résultats ont été croisés avec les analyses de gel-filtration par HPLC de la figure 2. Ces analyses montrent qu'un équivalent de DTT ne produit que des agrégats de diamètre inférieur à 450 nm. Le 2ME (2 équivalents) et la cystéine (4 équivalents), par contre, ne produisent que des agrégats de taille supérieure à 450 nm. Cette série d'expériences a permis de montrer que le traitement combinant haute pression et cystéine en concentration 4 fois supérieure à celle de la protéine est le traitement le plus efficace parmi ceux étudiés. 4) Quantité optimum d'agents réducteurs Plusieurs études ont rapporté que chaque agent réducteur a une quantité optimum d'activité (HAYAKAWA, S. and NAKAMURA, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem. 50(8), 2039-2046). En trop petite quantité, le nombre de thiols initialement présents dans la solution est insuffisant pour déclencher la réaction en chaîne d'échange thiol-disulfure intermoléculaire. De même, en trop grande quantité, les groupes thiols détruisent les ponts disulfures intermoléculaires nouvellement formés. Etant donné que le traitement avec la cystéine est le plus puissant des trois, on a déterminé sa quantité optimale d'action. Pour cela l'effet de traitements utilisant la cystéine en concentration 4 fois, 2 fois et 1 fois supérieure à la concentration de l'alphalactalbumine a été analysé. Les résultats apparaissent sur les figures 4 et.5. La figure 4 correspond à des mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE qui a été décrite précédemment (Voir A-2.2). La figure 5 est une estimation du pourcentage d'alphalactalbumine agrégée, par gel-filtration par HPLC. Les échantillons analysés ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demi-heure, à une concentration protéique de 50 mg/ml en présence de cystéine dans différentes proportions 1 -ECys= 1 équivalent 2 -ECys= 2 équivalents 3 -ECysj= 4 équivalents Les histogrammes blancs correspondent aux résultats sans traitement de haute pression (P = 0,1 MPa) ; les histogrammes gris correspondent aux résultats après le traitement de haute pression (P = 1000 MPa). Comme on peut le voir sur les résultats d'électrophorèse et de gel filtration, c'est lorsque la concentration en cystéine est 2 fois supérieure à la protéine que le traitement de haute pression donne le plus fort pourcentage d'agrégats de taille inférieure à 450 nm, tandis que 4 équivalents de cystéine favorisent clairement l'apparition de polymères plus grands. B. LA BETA-LACTOGLOBULINE COMME AGENT REDUCTEUR La figure 6 montre le profil de gel filtration par HPLC comparant des échantillons ayant été soumis à un traitement de haute pression de 1000 MPa, à une concentration de 50 mg/ml en protéine, pendant une demiheure, dans du tampon Tris 50 mM à pH = 8,5 avec des témoins. Sur la figure 6 a représente le profil de la bêta-lactoglobuline avant compression. b représente le profil de la bêta-lactoglobuline après compression. c représente le profil d'un mélange alphalactalbumine/bêta-lactoglobuline, 50/50 avant compression. d représente le profil du mélange alpha-lactalbumine/bêtalactoglobuline, 50/50 après compression. La figure 7 est un graphique tiré de données d'électrophorèses qui montre la quantité de protéines (alpha-lactalbumine et bêta-lactoglobuline) monomériques, agrégée en fonction de la proportion de bêta-lactoglobuline ajoutée. La gel-filtration de la figure 6 et les électrophorèses de la figure 7 montrent qu'une agrégation à lieu en présence d'alpha-lactalbumine et de bêtalactoglobuline. La bêta-lactoglobuline s'avère être un agent réducteur aussi efficace que les autres. Son pouvoir réducteur est attribué à sa cystéine libre (119 ou 121). Cette particularité lui donne la capacité de s'autoagréger, durant le traitement de haute pression, sans addition de réducteur (figure 6). La figure 7 montre que la quantité d'alphalactalbumine et de beta-lac C. GELIFICATION A pH = 8,5, l'obtention de gel n'a pas été rendu possible par le seul traitement sous pression. Pour contraindre les particules à se rencontrer, les échantillons ont été congelés ; en effet, la cristallisation des molécules d'eau tend à confiner les protéines dans le volume réduit de l'eau liquide résiduelle. Un gel a été obtenu pour les échantillons contenant de la cystéine comme agent réducteur et ayant été soumis à un traitement de haute pression. Les résultats des essais réalisés sont consignés dans le tableau 2 ci-dessous Tableau 2 pH Rducteur [réducteurjJ Traitement Congélation Type de gel 30 30 min, 12 I I, -20 C lactalbumine] 1000 MPa 8,5 Cystéine 4 oui oui en masse 8,5 2-mercaptoéthanol 2 oui oui en masse 8,5 Cystéine 2 oui oui en 6,5 Cystéine 2 oui non 3 arborescent 5,5 C stéine 2 oui non arborescent L'ensemble des gels formés a été soumis à un simple test : ils ne se dissolvent pas dans une solution à 10 % en dodecyle sulfate de sodium (SDS) mais se dissolvent parfaitement dans une solution de bêta-mercaptoéthanol (2ME). Cela signifie que ces gels doivent leur existence à des ponts disulfures intermoléculaires. Les gels les plus homogènes, prenant en masse l'ensemble de la solution, n'ont pu être obtenus qu'après congélation. Le pH (pH = 8,5) de ces expériences est le pH utilisé auquel la forme thiolate est maximale. Ces gels en masse évoluent au cours du temps. Probablement fortement hydratés, le gel a tendance à se ratatiner; une phase surnageante apparaît peu à peu. Ceci semble indiquer que la rétention d'eau par le réseau protéique pourrait être accrue par ce traitement. - REVENDICATIONS 1.- Procédé d'homo ou d'hétéro polymérisation de protéines dotées de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures ou de protéines greffées avec des groupements thiols, caractérisé en ce que qu'il consiste: - à soumettre lesdites protéines à un traitement par la pression adapté pour obtenir leur dépliage, ce traitement sous pression étant conduit en présence d'un agent réducteur apte à induire la création de liaisons du type ponts disulfures intermoléculaires, puis - à stopper la réaction par dépressurisation. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un agent réducteur apte à induire l'rechange et/ou la création de ponts disulfures intramoléculaires simultanément à la création des ponts disulfures intermoléculaires, leurs proportions étant fonction de la concentration en produits utilisés. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le traitement sous pression est réalisé à des valeurs supérieures à 200 MPa. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer un traitement sous pression voisin de 1000 MPa. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un agent réducteur doté d'au moins un groupement thiol. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser la cystéine à titre d'agent réducteur. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer le traitement de haute pression sur de l'alpha-lactalbumine en présence de deux équivalents de cystéine. 8.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent réducteur utilisé est une cystéine libre présente dans la ou l'une des protéines du substrat protéique de base. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer le traitement de haute pression sur la bêta-lactoglobuline seule ou en présence d'un autre type de protéine dotée de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures, par exemple 1 'alpha-lactalbumine. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer une opération complémentaire de congélation pour obtenir une gélification du substrat protéique polymérisé.