FR 2740219 A1 19970425 FR 9512607 A 19951020 Le domaine de la présente invention est celui de la chimie analytique, domaine dans lequel on s'intéresse, plus particulièrement, à l'identification et au dosage d'espèces chimiques, de préférence biologiques, et notamment d'espèces de haut poids moléculaire, telles que les acides nucléiques ou bien encore les biopolymères de nature protéique, e. g. : enzymes/substrats, antigènes/anticorps. Plus précisément, la présente invention concerne, - de première part, un système d'analyse qualitatives et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, - de deuxième part, un procédé d'analyse mettant en oeuvre ce système, - et de troisième part un nécessaire d'analyse comprenant ledit système. Les substances ou espèces biologiques, plus particulièrement mais non limitativement, visées par l'invention sont les acides nucléiques ARN et ADN et toute structure génétique en comprenant, ainsi que les composés susceptibles d'être impliqués dans des réactions immunologiques antigènes (Ag)/anticorps (Ac), de même que les produits s'appariant entre eux dans le cadre d'un mécanisme de reconnaissance et de réaction enzymatique . enzyme/substrat, enzymeAmhibiteur, récepteur/ligand et lectine/sucre. Pour détecter, identifier ou doser ce genre de molécules ou structures, il est classique d'exploiter leur propriété de bioaffinité, à savoir leur aptitude singulière à s apparier spécifiquement avec leurs complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique, de reconnaissance immunologique ou enzymatique. La chimiluminescence, et plus spécifiquement encore celle dite amplifiée, est l'une des techniques analytiques qui procède de ce principe et qui est couramment utilisée en laboratoire. La détection par chimiluminescence amplifiée peut trouver pour cadre les procédures analytiques bien connues de type "western blot" ou de type "ELISA" pour ce qui concerne les protéines, ou bien encore "southern & northern blot" en ce qui concerne l'ARN et l'ADN. Cette technique de chimiluminescence amplifiée constitue une alternative avantageuse et prometteuse par rapport aux analyses immunologiques classiques dans lesquelles on a recours aux isotopes radioactifs, à titre de marqueur et de révélateur de l'appariement considéré. La radioanalyse commence, en effet, à être désuète car elle présente un grand nombre d'inconvénients dont, notamment: - manipulation dangereuse, - faible durée de conservation utile de la substance marquée radioactivement, - difficulté de marquage radioactif, - et traitement des déchets radioactifs. Malheureusement, le développement de ces techniques d'analyse par chimiluminescence amplifiée est freiné, en raison de la sensibilité limitée des systèmes existant actuellement. Cette sensibilité dépend, pour partie, de la lumière émise au cours et à l'issue, de la réaction de luminescence révélatrice des appariements considérés. A ce stade de l'exposé, il paraît utile de fixer les idées en rappelant les principes de la détection par chimiluminescence amplifiée. Tout d'abord, la luminescence peut être définie comme étant l'émission de lumière résultant de la restitution d'une partie de l'énergie émanant d'une substance dans un état excité. Dans la chimiluminescence, l'excitation résulte d'une réaction chimique. Cette dernière est déclenchée suite à l'appariement d'un ligand, directement ou indirectement, avec une ou plusieurs substances, de préférence biologiques, à analyser. Ce ligand est l'un des éléments d'un système d'analyse comprenant, en outre, un réactif chimiluminescent, une enzyme ou sous-unités catalytiques de chimiluminescence, un substrat spécifique de cette enzyme ou de la ou des sous-unités catalytiques et apte à se transformer sous l'effet de celle en au moins un initiateur d'excitation du réactif luminescent, cette excitation s'accompagnant de production de lumière. L'un des systèmes les plus utilisés en chimiluminescence amplifiée est celui au coeur duquel se trouvent les réactions chimiques de réactifs de type diacylhydrazide cyclique, tels que le luminol ou l'isoluminol. Dans un tel système, les enzymes mises en oeuvre sont, par exemple, des peroxydases aptes à transformer un substrat dénommé oxydant, tel que l'H202 en un initiateur d'oxydation du luminol. Etant donné que cette oxydation produit trop peu de photons, l'excitation du luminol ne peut être détectée avec une sensibilité significative, il est donc nécessaire d'amplifier cette réaction d'oxydation. Parmi les amplificateurs connus les plus efficaces, on peut citer ceux appartenant à la famille des halogénophénols et de leurs dérivés. Mais, comme déjà signalé supra, les performances atteintes à l'aide de tels amplificateurs restent notablement insuffisantes, notamment au regard de la quantité de lumière émise après réaction. ll existe plusieurs propositions techniques antérieures qui traitent, vainement, de ce problème. C'est ainsi que le brevet EP 0 116 454 divulgue un système d'analyse de chimiluminescence, dans lequel la réaction luminescente a lieu entre une peroxydase, un oxydant et un réactif chimiluminescent formé par le luminol : 2,3-dihydro-1,4phtalazinedione. L'invention protégée dans ce brevet vise la mise en oeuvre d'un amplificateur constitué, notamment, par du 4-iodophénol, du 4-bromophénol, du 4chlorophénol et d'autres dérivés des phénols, tels que l'acide 4-hydroxycinnamique, le 2naphtol, le 6-bromonapht-2-ol, le disulfure de 4-hydroxyphényle, entre autres. Ces amplificateurs permettent une amélioration de l'émission de la lumière et, plus particulièrement, du rapport signal bruit de fond. Mais, le meilleur rapport signal/bruit à l'aide de ces amplificateurs reste insuffisant au regard de la sensibilité de la méthode. Cela impose d'augmenter les volumes d'amplificateurs mis en oeuvre pour obtenir une sensibilité suffisante. n s'ensuit d'éventuelles perturbations de la réaction et une augmentation indéniable du coût de l'analyse. Pour tenter de perfectionner ce système connu, il a été ultérieurement proposé, au travers de la demande de brevet internationale PCT WO 91/05 872, de nouveaux amplificateurs de chimiluminescence. Ces derniers sont destinés à être mis en oeuvre dans un système comprenant du luminol comme réactif une peroxydase comme enzyme et 1IH2O2 comme substrat oxydant. Lesdits moyens d'amplification sont constitués par des précurseurs inactifs, choisis dans la famille des esters de phalogénophénols, e. g. iodophénols. L'activation des ces précurseurs d'amplificateurs est réalisée à l'aide d'une estérase, lors de la mise en présence de toutes les composantes du système de chimiluminescence, en vue d'obtenir la production de lumière, qui servira de révélateur de détection. D'après les inventeurs cités dans cette demande PCT, le couplage, ainsi réalisé, d'une enzyme de chimiluminescence et d'une enzyme d'activation de l'amplificateur, est à l'origine d'un phénomène d'amplification, de nature à améliorer la sensibilité d'analyse. Mais, là encore, les améliorations obtenues restent insuffisantes. La demande de brevet EP 0 516 948 divulgue, également, des amplificateurs de chimiluminescence pour système luminol/H202/peroxydase, constitués par des esters de formule ArOX dans laquelle X est un groupement de masquage activable sous l'action d'une enzyme hydrolitique et Ar est un groupement aromatique. n s'agit là encore de précurseurs inactifs d'amplificateurs, aptes à être transformés en produits actifs sous l'effet d'une enzyme qui peut être, par exemple, une esterase dans le cas où ces préamplificateurs sont des esters. Sont notamment cités dans cette demande les esters phosphoriques disodiques de l'iodophénol, les esters acétiques de diphénol et, enfin, les dérivés exolydiques d'iodophénol et de diphénol. Les moyens d'amplification décrits dans cette demande de brevet européen n'apportent pas de meilleurs résultats que ceux selon la demande PCT WO 91/05 872 évoquée ci-dessus. La référence antérieure "Analytical Letters, 27(6), 1109-1122, (1994)" de H. HORI et al. décrit, elle aussi, de nouveaux amplificateurs phénoliques de chimiluminescence dans le cadre de leur réaction luminoUH202/peroxydase. Ces nouveaux amplificateurs sont des 4-hydroxybenzylidène-cyclopentènediones, d'une part, et des 4-hydroxybenzylidène-malononitriles, d'autre part. Les améliorations d'émission de lumière obtenues avec ces amplificateurs restent inférieures à celles constatées pour le p-iodophénol décrit auparavant. Par ailleurs, I'étude relatée dans cet article est révélatrice d'un changement de tendance dans le cadre du développement de nouveaux amplificateurs. En effet, les travaux sur les esters inactifs dérivant d'halogénophénols ne sont plus de mise. Enfin, la demande de brevet internationale PCT WO 94/23 060 vise un procédé d'amplification de réaction de chimiluminescence faisant intervenir du luminol, une peroxydase, un substrat oxydant (= H202) et un amplificateur destiné à accroître le ratio signal/bruit d'émissions lumineuses. L'amplificateur est constitué par une combinaison d'un composé organoboré et d'un composé organique non boré. Le composé organoboré répond à la formule ArB(OR)2 dans laquelle Ar = groupement aromatique substitué ou non. Le composé organique non boré d'amplification est un dérivé d'halogénophénol, du type de ceux mentionnés ci-dessus dans les autres références de l'art antérieur. Une nouvelle fois, l'amélioration du ratio signal/bruit, obtenue grâce à l'invention décrite dans cette demande WO 94/23 060, n'est pas significativement intéressante. Dans cet état de connaissances, I'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, permettant une réelle et significative amélioration de l'émission de lumière, résultant du passage à l'état excité d'un réactif chimiluminescent. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un système de chimiluminescence amplifié, du type de celui ci-dessus, et qui soit simple à mettre en oeuvre et économique. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un système d'analyse par chimiluminescence du type de ceux comprenant du luminol ou analogues à titre de réactif luminescent, une peroxydase à titre d'enzyme de luminescence, un peracide ou peroxyde, tel que H202 à titre de substrat oxydant et, en outre, un amplificateur appartenant à la famille des dérivés de phénol, ledit système se devant d'être parfaitement efficace à faible dose, quant au niveau de luminescence obtenu. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence, procurant les performances d'émission de lumière et de sensibilité évoquées ci-dessus. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un nécessaire d'analyse par chimiluminescence faisant application dudit système et dudit procédé. Lors de la quête de ces objectifs, la demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence, après de nombreuses recherches et expériences et de manière tout à fait surprenante et inattendue, qu'il convient de sélectionner l'amplificateur dans la sousfamille des esters dérivés de phénol, lesdits esters se singularisant par leur caractère peu hydrolysable. D'où il s'ensuit que la présente invention concerne, tout d'abord, un système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, système du type de ceux faisant intervenir, essentiellement: a) au moins un ligand apte à s'apparier avec la ou les substances à analyser, b) au moins un réactif chimiluminescent appartenant à la famille des hydrazides cycliques diacylées et fusionnées à un reste aromatique, c) au moins une enzyme, d) au moins un substrat oxydant spécifique de l'enzyme (c) apte à se transformer sous l'effet de celle en au moins un initiateur d'oxydation du réactif (b) avec production de lumière, e) et au moins un amplificateur de la réaction de luminescence, caractérisé: en ce que l'amplificateur (e) répond à la formule générale suivante: dans laquelle: - RO est un radical linéaire ou ramifié en C-CI0 fonctionnalisé ou non, RO étant, de préférence, sélectionné parmi les radicaux suivants: * avec Rl correspondant: li à un alkyle linéaire ou ramifié en C,-C,0, avantageusement un méthyle, un propyle, un butyle, un pentyle ou un hexyle; 2i. à un substituant alkylcarboxylique en avantageusement alkylmonocarboxylique, les substituants malonyle, succinyle, glutaryle, adipyle, heptanoyloïque, maléyle ou fumaryle étant des alkyls monocarboxyliques particulièrement préférés; 3i - alkylamine ou aminoalkyle, 4i - aryle, aralkyle ou alkylaryle, de préférence phényle; * ou un radical de nature (poly)organosiloxanique et/ou (poly)organosiloxanique; - R est un radical choisi dans le groupe comprenant : les halogènes, l'iode étant plus particulèrement sélectionné, les alkyles linéaires ou ramifiés contenant de 1 à 30 atomes de carbone, les aryles en C-C30 ou les aralkyles ou alkylaryles en C1-C30 ; les halogènes, les phényles, les phtalates et les radicaux suivants étant plus spécialement retenus: Y représentant -CH2-, -O- ou -N=N- et V représentant l'hydrogène, ou bien Y représentant -O-, -S- ou -S-S- et V représentant hydroxyle; W représentant hydrogène ou carboxyle; -CH=CH-Z, Z représentant carboxyle ou 2,4-dinitrophényle CH2CH2COOC2H2 ; ou un alkyle en C-C6; - A représente l'hydrogène, B représente un halogène ou un alkyle en C1-C6 et R représente un halogène; - A représente l'halogène: B représente l'hydrogène et R représente un halogène ou un phényle, - ou bien A représente l'hydrogène ou un halogène et R, B représentent ensemble une chaîne complétant un noyau naphtalène qui, lue dans la direction de R vers B, est de formule: X représentant l'hydrogène ou un halogène, de façon que le composé de formule (1) soit un béta-naphtol de formule: - RO, R, A, B étant substitués ou non; et en ce qu'il est exempt d'enzyme hydrolytique apte à lyser la liaison entre l'oxygène et RO dans -ORO. Sous son aspect le plus général, la présente invention vise donc un système d'analyse chimiluminescence ou chimiluminométrique perfectionné. Elle est basée sur la découverte étonnante, d'amplificateurs particuliers dérivés des esters d'halogénophénols (e.g. iodophénols), qui améliorent de façon significative, la sensibilité de la réaction luminescente considérée. Au sens du présent exposé, le terme "amélioré" signifie que l'émission lumineuse totale de la réaction luminescente conforme à l'invention et/ou le rapport signal/bruit de fond de ladite réaction sont supérieurs à ceux atteints par les systèmes connus antérieurement. De plus, contrairement à ce que préconise certains enseignements de l'art antérieur, le système chimiluminescent selon l'invention ne comprend pas d'enzymes hydrolytiques destinées à permettre le clivage de liaison entre l'oxygène et le radical RO de la formule (1), de manière à rendre actif l'amplificateur. Du reste, l'esprit de l'invention est radicalement opposé à cela, puisque l'on cherche à obtenir un taux d'hydrolyse minima qui est synonyme de haute performance d'amplification de la luminescence. Suivant une caractéristique préférée de l'invention: dans la formule (1) de l'amplificateur (e). Dans ce cas, le taux d'ester: non hydrolysé de l'amplificateur (e) est préférablement supérieur ou égal à 40 % en poids, de préférence à 60 % en poids et, plus préférentiellement encore, à 90 % en poids. La présente invention procède donc de la sélection avantageuse et judicieuse de certains amplificateurs dérivés des phénols et, plus spécialement encore, constitués par des esters de phénol (halogénophénols e. g.) avec des acides carboxyliques, en particulier mono, di ou poly-carboxyliques, éventuellement fonctionnalisés, de préférence par des fonctionnalités amines ou bien encore par des restes aromatiques porteurs d'une ou plusieurs fonctions acides carboxyliques. L'amplificateur (e) mis en oeuvre peut être formé de composés de formule (1) de même nature ou, avantageusement, peut comprendre un mélange d'au moins un composé de formule (1), de préférence les esters, dans lesquels: Suivant une variante intéressante de l'invention, dans le cas où l'on a affaire à un mélange d'esters de formule (1) à titre d'amplificateur (e), au moins l'un de ces esters, comportant de préférence un substituant Rl sélectionné parmi les radicaux (i), (2i) et (3i), tels que définis supra et au moins un autre de ces esters étant particularisé par un substituant R1 sélectionné parmi les radicaux (4i), tels que définis supra. S'agissant du ligand compris dans le système conforme à l'invention, il est avantageusement constitué par au moins l'un des éléments des couples de substances appariables suivants: e antigène/anticorps. enzyme/substrat, enzymehmhibiteur, . récepteur/ligand . lectine/sucre acide nucléique/acide nucléique complémentaire, Ces termes d'enzymes, substrats, antigènes et anticorps peuvent désigner divers produits, tels que des protéines, des hormones, des haptènes, des stéroldes, des métabolites, entre autres. Le réactif chimique luminescent (b) est un produit qui peut être amené à l'état excité au cours d'une réaction chimiluminescente, par exemple initiée par le produit (OH') d'une réaction enzymatique et qui retourne ensuite à un état non excité après avoir émis ou en émettant de la lumière. Dans le cadre de l'invention, ce réactif chimiluminescent (b) est, de préférence, un produit appartenant à la famille des 2,3-dihydro-1,4-phtalazine dione (DPD). Plus préférentiellement encore, cette DPD répond à la formule générale (2) suivante: dans laquelle: - R4 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R5, R6 et R7 représente H, un allyle en C-C6, substitué ou non, un alcényle en Cl-C6, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle en Cl-C6, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, - où R5 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R4, R6 et R7 représente H, un alkyle en Cl-C6, substitué ou non un alcényle en Cl-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, - où R4 et R5 sont pris ensemble et représentent un dérivé amino-substitué ou non par un radical benzo et chacun des radicaux R6 et R7 représente H, alkyle en Cl-C6, substitué ou non, un alcényle en Cl-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, le luminol et l'isoluminol étant particulièrement préférés. Au sens de la présente invention, le terme "aminosubstitué" employé dans la légende de la formule (2) ci-dessus désigne, également, les restes amido. Dans le cas où l'on est en présence du réactif (b) préféré, à savoir le luminol R4, R5, R6 = H et R7 = NH2, ce radical amino peut servir de pont de couplage de (b) avec le ligand, de manière directe ou par l'intermédiaire d'un composé d'espacement du type de ceux connus et appropriés, e. g. hémisuccinates, hémiglutarates, hémimaléates, dérivés carboxyméthylés, glucuronyles, mercaptoacétates. Ainsi, après appariement direct ou indirect du ligand couplé à (b), avec l'espèce à analyser, la procédure d'analyse consistera à faire réagir le réactif chimiluminescent (b) fixé avec les autres composantes du système, de façon à révéler l'appariement au travers de la réaction de chimiluminescence. La fixation de (b) sur le ligand ne représente que l'une des variantes méthodologiques envisageables. Au sens de l'invention, le terme enzyme désigne aussi bien des protéines complètes que des sous-unités catalytiques. L'enzyme (c) correspond, de préférence à une enzyme d'oxydoréduction, comme celle définie par l'International Union ofBiochemistry. Cela concerne notamment les enzymes de la classe 1 ou oxydoréductases, de la classification de l'International Union ofBiochemistry. Un exemple avantageux d'oxydoréductase conforme à l'invention est la xanthine oxydase. L'enzyme (c) est, plus préférentiellement encore, sélectionnée parmi les peroxydases telles que la peroxydase de raifort, la microperoxydase, la peroxydase extraite de microorganisme Arthromyces ramosus et la lactoperoxydase; la peroxydase de raifort et la microperoxydase étant particulièrement préférées. Tout comme le réactif chimiluminescent (b), l'enzyme (c) peut, éventuellement, être couplée au ligand, directement ou indirectement, et constituer ainsi un marqueur. Selon des variantes, cette enzyme (c) peut se trouver en solution ou bien encore immobilisée sur une matnce. Dans le mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le substrat (d) est un oxydant formé, de préférence, par un peracide ou un peroxyde et, plus préférentiellement encore, par le peroxyde d'hydrogène et/ou un perborate d'alcalin ou d'alcalinoterreux. En réalité, dans le cas où le réactif chimiluminescent est le 2,3-dihydro-1,4phtalazine dione (spécialement le luminol ou l'isoluminol), cet oxydant est transformé, sous l'effet de l'enzyme (c) en un initiateur (OH') d'oxydation du réactif (b) Tout comme précédemment, il est envisageable que cet oxydant soit fixé directement ou indirectement au ligand, constituant ainsi un marqueur. Selon une alternative, il peut faire partie des moyens de révélation de l'appariement par chimiluminescence, qui sont mis en oeuvre pour réagir avec le ou les marqueur(s) portés par le ligand. S'agissant précisément de la localisation des composantes du système selon l'invention, il ressort de ce qui précède qu'il est avantageux qu'au moins l'une, et au plus trois, de ses composantes (b) à (e) est liée (ou portée par) le ligand (a), l'autre ou les autres composantes étant comprises dans le milieu d'analyse. Quels que soient le ou les marqueurs du ligand, il est préférable, conformément à l'invention, que, lors du déroulement de l'analyse chimiluminescente, le système considéré soit associé à une solution comportant au moins un régulateur de pH et/ou au moins un régulateur de la force ionique choisi parmi les sels, de préférence les halogénures (avantageusement chlorures) de métaux alcalins et/ou alcalino terreux, KCI, KBr, NaCI, Cas12, CsCl étant particulièrement préférés. n s'est avéré, en effet, utile que le pH du milieu d'analyse soit alcalin. L'alcalinité est favorable à la réaction de luminescence et joue également un rôle en ce qui concerne la solubilité des amplificateurs de Formule (1) et du réactif chimiluminescent de Formule (2). La régulation du pH est donc, avantageusement, assurée par un régulateur constitué par tout tampon approprié comme, par exemple, le tampon tris, le tampon carbonate ou le tampon phosphate. La force ionique est également un paramètre important du milieu d'analyse comprenant le système selon l'invention. Elle détermine, en effet, la stabilité des amplificateurs (e) de formule (1) au regard de l'hydrolyse du radical ORO et, plus particulièrement, de la liaison ester. n a été vu, ci-avant, qu'au plus le taux d'hydrolyse des amplificateurs (e) sous forme d'esters est faible, au plus les performances de luminescence sont importantes. Les halogénures mentionnées ci-dessus assurent donc, avantageusement, cette fonction de régulation de la force ionique. A cette fin, ils titrent, de 0,1 M à saturation, de préférence de 0,1 à 3 M. I1 existe, bien sûr, d'autres facteurs secondaires que le pH et la force ionique, qui sont importants pour le bon déroulement de la réaction chimiluminescente. On citera, entre autres, la température, la concentration des composants du système (b) à (e), la vitesse de mélange et la technique de mesure de la lumière. Ce sont là des caractéristiques de procédé et d'analyse qui s'insèrent parfaitement dans le cadre du présent exposé, puisque, on le rappellera, la présente invention a également pour objet un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système tel que défini supra. De façon générale, les conditions de mise en oeuvre de ce procédé, et donc du système sus-évoqué, correspondent à celles mises en oeuvre antérieurement, notamment dans les procédés décrits dans le brevet EP 0 116 454 et dans la demande PCT WO 94/23 060. On intégre donc, par référence, les parties correspondantes de ces documents dans le présent exposé. Pour mémoire, on peut rappeler que la température d'analyse est, avantageusement, comprise entre 10 et 50 C et que les concentrations en composantes (b) à (e) du système sont les suivantes: - réactif (b) (e. g. DPD): 5 ;imole-200 mmole/l, - peroxydase (c) : 0,1 ng à 5 g/l, - substrat oxydant (d):10 ,1mole-30 mmole/l, - amplificateur (e) 1 pmole-100 mmole/l Ces concentrations sont données par rapport à la totalité du milieu d'analyse qui comprend, avantageusement, la solution aqueuse tamponnée, et a fortiori régulée, telle que définie ci-dessus. n est important de noter que l'efficacité exceptionnelle des amplificateurs (e) conformes à l'invention, permet d'envisager des réductions de concentration d'enzyme. n est en effet possible de se contenter de concentrations comprises entre 0,1 ng et 1 pg/I. Cela représente des économies en consommables non négligeables. La réaction conforme au mode préféré de mise en oeuvre de l'invention peut être schématisée comme suit: Luminol + H202 + Peroxydase #### lumière + produits d'oxydation amplificateur (e) de formule (1) Sous un autre de ses aspects avantageux, la présente invention vise, également, un nécessaire d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système tel que défini supra. Le système, le procédé et le nécessaire selon l'invention ont des applications immédiates et évidentes dans le domaine de l'analyse biochimique et biologique. Ils peuvent, en effet, parfaitement s'inscrire dans le cadre de techniques d'analyses immunologiques, immunoenzymatiques, immunohistologiques, enzymatiques et génétiques. n est important de noter que les systèmes de révélation peuvent inclure les systèmes de reconnaissance de type ligand/récepteur, sucre/lectine, enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur, par exemple récepteurs membranaires, hormones, neurotransmetteurs et, de façon générale, les transducteurs de signaux. n peut s'agir, par exemple, de techniques "ELISA", de type compétitif ou non, de type sandwich, de type "Western, Northern & Southern blot", ou bien encore de type immunohistologique (anticorps/antigène marqué ou sonde nucléique). C'est ainsi que les substances à analyser peuvent être comprises: sur ou dans des supports solides choisis, de préférence, dans la liste ci après: - plaque de microtitration entières ou sécables, - tube à essai en polymère synthétique ou en verre, - polymères biologiques, - lames d'immunohistologie, - membranes, - billes, etc. ou dans des supports liquides de type solution, émulsion ou dispersion, formant une partie du milieu d'analyse. Les supports solides sont mis en oeuvre dans des procédures analytiques dites hétérogènes, hétérogènes compétitives ou bien encore hétérogènes sur deux sites. Les milieux liquides sont plus adaptés à des procédures analytiques dites phases homogènes. Le système et le procédé selon l'invention peuvent également être utilisés pour identifier et doser, dans le milieu biologique des substances telles que les peroxydases ou les peroxydes endogènes (H202). Ce sont là des substances qui correspondent à un ou plusieurs des constituants du système d'analyse. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et variantes de mise en oeuvre. EXEMPLES I - DESCRIPTIONDES FIGURES La figure 1 annexée, montre des courbes de l'intensité de la lumière émise (ILE) en unités arbitraires (u.a) en fonction de la quantité d'enzyme peroxydase mise en oeuvre en attomoles pour l'iodophénol (courbe Q témoin) et pour l'iodophénylbutyrate amplificateur B de l'exemple 1. (Courbe I amplificateur B). La figure 2 annexée représente la cinétique d'émission de lumière en présence de l'amplificateur (B) au travers d'un graphe de l'intensité lumineuse émise exprimée en unités arbitraires (u.a.), en fonction du temps en heures. La figure 3 annexée présente les résultats du Western-Blot obtenus avec l'iodophénylbutyrate [amplificateur (B)] comparé aux résultats obtenus avec le témoin iodophénol. II - MA TRIELS ET METHODES Réactifs Tous les produits suivants proviennent de chez Sigma Chimie, France Peroxydase de Raifort (HRP : Horseradish peroxydase) type VI, luminol (5-amino-2,3dihydro- 1 ,4-phthalazinedione), Tris(hydroxymethyl)aminométhane, peroxyde d'hydrogène 30 %, Chlorure de potassium et dimethylsulfoxyde (DMSO). Tous les produits utilisés pour les synthèses chimiques proviennent d'Aldrich, France. L'anticorps polyclonal de lapin anti c-met provient de Santa Cwz Biotechnology, USA; L'anticorps polyclonal de chèvre anti lapin marqué à la peroxydase provient de CovalAb, LYON, FRANCE. Membrane de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, ECQUEVILLY, FRANCE). Film Kodak X-OMAT AR X-Ray (ROCHESTER, NEW YORK, USA). équipement d'analyse Les réactions de chimiluminescence ont été réalisées dans des tubes en polystyrène de 4 ml et dans des tubes en verre (borosilicate glass) de 4 ml (Costar Sc. Co, USA). La lumière émise a été mesurée en utilisant deux luminomètres ; TLXî monotube (L9990120-2121) (Dynatech Laborotories, France) et Biolumat LB9500 Berthold, France. Materiels pour l'électrophorèse en gel de polyacrylamide et pour le transfert proviennent de Biorad Laboratories, France. Les spectres infra-rouge (R) ont été tracés sur un spectomètre Perkin Elmer model 1310 et exprimés en cm-'. Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN 1H) ont été tracés sur un spectromètre Brüker AC200, les déplacements chimiques sont indiqués en ppm par rapport au tétraméthylsilane comme référence interne. Les séparations par chromatographie liquide sont réalisées sur colone de silice Merk Kieselgel 60 (70-230 mesh ASTM). III - SYNTHESE ET HYDROLYSE D'AMPLIFICATEURS (e) SELON L'INVENTION (Esters du 4-iodophénol) EXEMPLE 1: SYNTHESE DU 4-IODOPHENYLACETATE (AMPLIFICATEUR A) ET DU s IODOPHENYLBUTYRATE (AMPLIFICATEUR B) A une solution de 1 g de 4-iodophénol (4,5 mmole) dans 10 ml de pyridine maintenue à 0 "C, on additionne, goutte à goutte, 6,5 mmoles (1,5 eq) du chlorure d'acide correspondant. Après 3 heures à température ambiante, la solution est versée dans 100 ml d'une solution 0,5 M d'acide chlorhydrique. Après extraction à l'éther éthylique (2 x 50 ml), la phase organique est lavée à l'eau, puis par une solution de bicarbonate de sodium, et enfin à l'eau. Après séchage sur sulfate de magnésium, le solvant est évaporé et le résidu purifié par chromatographie sur Silice, éluant éther éthylique-pentane 5-95. Rendement : 75 à 90 %. -4-IODOPHENYLACETATE: PF = 27 C IR(fiim):1755cm-' RMN (CDCl3) : 2,28, s, 3 H; 6,86, m, 2H; 7,68, m, 2H. 4-IODOPHENYLBUTYRATE: PF = 34 C. IR(fiim):1755 cm-1. RMN (CDCl3):1,03, t, 3 H, 1,76, sex, 2 H;2,52, t, 2H;6,85, m,2 H;7,67, m, 2H. EXEMPLE 2: SYNTHESE DE L'ACIDE SUCCINIQUE MONO (4-lODOPHENYL) ESTER (AMPLIFICATEUR C) En atmosphère d'azote, sous agitation on additionne 0,10 g de sodium (4,5 mmoles) à une solution de 1 g de 4-iodophénol (4,5 mmoles) dans 25 ml d'éther anhydre. Lorsque le sodium a disparu, on ajoute 0,5 g (4,5 mmoles) d'anhydride succinique en solution dans le benzène. Le mélange est agité 24 heures à température ambiante. Le sel de sodium gélatineux est filtré, lavé à l'éther anhydre, puis mis en solution dans l'eau. Après acidification avec de l'acide chlorhydrique 0,5 M, I'acide-ester est extrait à l'éther, la solution est séchée. Après acidification avec de l'acide chlorydrique 0,5 M, l'acide ester est extrait à l'éther, la solution est séchée. Après évaporation du solvant, le résidu est recristallisé dans un mélange Hexane-Benzène. Masse obtenue: 0,4 g. PF= 145 OC. IR (CC14): 1745, 1 705 cm- RMN(CDCl3) : 2,6à2,9, m, 4H; 7,0, m, 2H; 7,68, 'n, 2H. EXEMPLE 3: SYNTHESE DE L'ACIDE ADIPIQUE MONO (4-lODOPHENYL) ESTER (AMPLIFICATEUR D) Acide adipique (0,66 g, 4,5 mmoles), 4-iodo phénol (1 g, 4,5 mmoles) et une goutte d'acide sulfurique 98 % sont ajoutés à 20 ml de toluène. La solution est chauffée à reflux, I'eau formée est éliminée par un appareil de Dean-Stark (24 heures). La majorité du toluène est évaporée, puis la solution restante est versée dans 50 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium fortement agitée. La solution aqueuse est extraite deux fois à l'éther, puis acidifiée avec de l'acide chlorhydrique 1 M jusqu'à pH 4. La solution acide est extraite au chloroforme (2 x 50 ml), les phases chloroformiques sont réunies et séchées. Après évaporation du solvant, le résidu est recristallisé dans un mélange benzène-hexane. Masse obtenue: 0,37 g. PF = 89 "C. IR(CC14):1745-1705 cm-l. RMN (CDCl3):1,6 à 1,8, m, 4H; 2,43, t, 2H; 2,58, t, 2H; 7,06, m, 2 H; 7,67, m, 2H. EXEMPLE 4 : HYDROLYSE DES 4-IODOPHENYLESTERS (A) ET (B) DANS UNE SOLUTION TAMPON DE pH = 8,6 4.1 MODE OPERATOIRE: On prépare tout d'abord une solution S1 de test comprenant: tamponTRiS: 0,1 M - pH : 8,6 ; e luminol: 1,2 mM, On prépare également une solution S2 comprenant en plus du chlorure de potassium à la concentration 3M. MODE OPERATOIRE: Ces solutions Sl et S2 sont mélangées avec des amplificateurs (e) A et B de l'exemple 1, à plusieurs concentrations (Conc) et stockées à 4" C plusieurs jours avant analyse. On détermine ensuite par chromatographie Phase gazeuse (CPV) les proportions d'iodophénol et d'ester. Ce dosage phénoVester est effectué comme indiqué ci-après: 10 ml de solution, 1 ml de solution de thymol dans le méthanol de concentration 1 mg/ml, 50 ml d'éther éthylique sont agités ; 50 g de sulfate de sodium sont ajoutés. La phase éthérée est soutirée, le solide est rincé avec 50 ml d'éther; les phases éthérées sont réunies, puis concentrées à environ 2 mi. 0,5 Ill sont injectés en CPV. 4.2 RESULTATS: Les résultats d'analyse sont donnés dans le Tableau 1 ci-après TABLEAU 1 CONC % % ESSAIS ECHANTILONS mg/10 ml) iodophénol ester 1 S, avec A 9 85 15 2 S" avec A 17 50 50 3 S, avec A 1,2 75 25 4 So avec A 0,9 55 45 5 S avec 19,5 3,7 96,3 6 S, avec B 20 2,5 97,5 7 S, avec 0,95 10 90 8 S avec 1,25 4 96 n apparaît, qu'en milieu basique, l'(ou les) halogénures de S2 ainsi que les nitrates alcalins ralentissent la vitesse d'hydrolyse des esters. HI- CHIMILUMINESCENCE EXEMPLES 5 A 9: REACTION DE CHIMILUMINESCENCE AMPLTHEE PAR LES ESTERS D'IODOPHENOL Dans 100 ml de tampon Tris 0,1 M pH 8,6 sont ajoutés 0,112 mmoles de luminol et 0,068 mmoles de témoin iodophénol (exemple 5) et de différents amplificateurs (e) (A, B, C, D des exemples 1 à 3) = exemples 6 à 9. La solution est préparée plusieurs heures avant son utilisation et stockée à 40 C. A 0,9 ml de cette solution, sont ajoutés 10 jil de H2O2 à 20 mM. Une première mesure de l'émission de la lumière est effectuée et correspond au bruit de fond. Dans ce même tube 50 1ll de peroxydase à 10-9 g/ml sont ajoutées puis l'émission de la lumière a été mesurée. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau 2 ci-après. Tableau 2 : Amplification de l'intensité lumineuse par les esters de l'iodo phenol. EXEMPLE AMPLIFICATEUR BRUIT DE FOND SIGNAL RAPPORT (u.a) (usa) SIGNAL/BRUT DE FOND 5 témoin (4-Iodo 1475 0,028.107 193 Phénol 6 A 8432 0,45.107 533 7 B 2432 0,45.107 1597 8 C 2699 0,89.107 3306 9 D 4661 1,43.107 3086 Légende: u.a. = unités arbitraires EXEMPLES 10 A 14 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE SUR L'AMPLIFICATION DE LA RECTION DE CHIMILUMINESCENCE Les procédures des exemples 5 à 9 sont répétées en présence de chlorure de potassium 2M. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau 3 ci-après. Tableau 3 : Effet de l'augmentation de la force ionique sur l'amplification de la réaction chimiluminescente EXEMPtE AMPLIFICATEUR BRUIT DE FOND SIGNAL RAPPORT (u.a) (RLU) SIGNAISU1T (uwa} DE FOND 10 témoin (4-Iodo 23327 0,52.107 222 Phénol) 11 A 17402 1,92.107 1104 12 B 12882 3,83.107 2973 13 C 6197 3,65.107 5891 14 D 6770 1,69.107 2510 EXEMPLE 15 : ETUDE COMPARATIVE DE LA REACTION DE CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE UTILISANT LA PEROXYDASE A DIFFERENTES CONCENTRATIONS Les procédures des exemples 5 à 8 sont répetées mais seulement avec l'iodophénol et l'iodophenylbutyrate B. La concentration de la peroxydase a été diminuée et utilisée de 50 à 500 attomoles (l0-lS moles). Les résultats de ces essais sont présentés dans la figure 1 annexée. On constate que l'amplificateur (B) de l'invention, est incontestablement plus performant que le témoin iodophénol. EXEMPLE 16 : ETUDE CINETIQUE DE LA REACTION DE CHIIILUMINESCENCE AMPLEEE. Les procédures des exemples 5 à 9 sont répétées en utilisant uniquement l'iodophénylbutyrate (amplificateur B de l'exemple 1). L'émission de la lumière a été mesurée toutes les 20 secondes pendant 3 heures. Les résultats de ces essais sont présentés dans la figure 2 annexée. EXEMPLE 17 : ETUDE COMPARATIVE DE LA CHIMILUMINESCENCE AMPLIHEE SUR LA DETECTION DE PROTEINE CELLULAIRE EN WESTERN-BLOT L'oncogène c-met code pour une protéine hétérodimère de 190 Kd dans les carcinomes papillaires thyroïdiens humain (B-CPAP) (C. Paulin et Col, Int. J. Oncology, 7; 657-660 (1995)). Ces cellules ont été utilisées pour détecter la protéine c-met selon le protocole décrit par C. Paulo, et Col. Les quantités de protéines cellulaires totales suivantes ont été utilisées: 50 lu; 40 lg; 30 Zig; 20 pg; 10 pg; 5 pg 2,5 pg et 1 pg. La technique d'électrophorèse en gel de polyacrylamide décrite par Laemmli, Nature 227, 680 (1970) a été utilisée pour séparer et transférer sur membrane de nitrocellulose les protéines cellulaires. La membrane est ensuite traitée avec différents réactifs dans les conditions suivantes : Saturation des sites non spécifiques sur la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans du tampon PBS pendant 30 min. Incubation de la membrane avec l'anticorps de lapin anti c-met pendant 1 hr à 37"C. Lavage en PBS Tween 0,2 % et incubation avec l'anticorps polyclonal de chèvre anti lapin marqué à la peroxydase pendant 1 hr à 37 "C. Après quatre lavages de 5 min en PBS-Tween 0,2 %, la membrane est immergée dans le réactif chimiluminescent décrit dans les exemples 5 à 9 pendant 3 min. Ensuite la membrane est égouttée puis couverte d'un film plastique et exposée à un film X-ray pour une durée allant de 30 secondes à une heure, puis développer. Plus précisément, la Figure 3 annexée représente la révélation en Western blot, de la protéine c-met (145 kDa) dans le lysat cellulaire, avec l'amplificateur B et avec un amplificateur témoin iodophénol. Le réactif chimiluminescent mis en oeuvre est identique à celui utilisé dans les exemples 5 à 9. Sur cette Figure 3, les nombres annotés sur le bord supérieur longitudinal correspondent aux quantités de protéines totales (QPT) contenues dans le lysat cellulaire déposé dans chaque piste. Les QPT sont données en microgrammes (pu). La rangée T correspond au témoin iodophénol et la rangée B à l'amplificateur (e) selon l'invention tel que synthétisé à l'exemple 1 et désigné par la lettre B. On constate un début de révélation pour une QPT de 1 g et une bande de révélation nette pour QPT = 2,5 llg, en ce qui concerne l'essai réalisé avec l'amplificateur (B). Alors que pour le témoin T la première des révélations n'apparaît qu'a un QPT de 5. Cela traduit bien l'extrême sensibilité du système selon l'invention. REVENDICATIONS: i - Système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, système du type de ceux faisant intervenir, essentiellement: a) au moins un ligand apte à s'apparier avec la ou les substances à analyser, b) au moins un réactif chimiluminescent appartenant à la famille des hydrazides cycliques diacylées et fusionnées à un reste aromatique, c) au moins une enzyme, d) au moins un substrat oxydant spécifique de l'enzyme (c) apte à se transformer sous l'effet de celle-ci en au moins un initiateur d'oxydation du réactif (b) avec production de lumière, e) et au moins un amplificateur de la réaction de luminescence, caractérisé: en ce que l'amplificateur (e) répond à la formule générale suivante: dans laquelle: - RO est un radical linéaire ou ramifié en Cl-Clo fonctionnalisé ou non, RO étant, de préférence, sélectionné parmi les radicaux suivants: * avec Rl correspondant: li- à un allyle linéaire ou ramifié en C,-C,0, avantageusement un méthyle, un propyle, un butyle, un pentyle ou un hexyle; 2i - à un substituant alkylcarboxylique en C,-C,, avantageusement alkylmonocarboxylique, les substituants malonyle, succinyle, glutaryle, adipyle, heptanoyloique, maléyle ou fumaryle étant des alkyls monocarboxyliques particulièrement préférés; 3i - alkylamine ou aminoalkyle; 4i aryle, aralkyle ou alkylaryle, de préférence phényle; * ou un radical de nature (poly)organosiloxanique et/ou (poly)organosiloxanique; - R est un radical choisi dans le groupe comprenant : les halogènes, l'iode étant plus particulèrement sélectionné, les alkyles linéaires ou ramifiés contenant de 1 à 30 atomes de carbone, les aryles en C1-C30 ou les aralkyles ou allcylaryles en C1-C30 ; les halogènes, les phényles, les phtalates et les radicaux suivants étant plus spécialement retenus: Y représentant -CH2-, -O- ou -N=N- et V représentant l'hydrogène, ou bien Y représentant -O-, -S- ou -S-S- et V représentant hydroxyle; W représentant hydrogène ou carboxyle; -CH=CH-Z, Z représentant carboxyle ou 2,4-dinitrophényle CH2CH2COOC2H2 ; ou un alkyle en C1-C6; - A représente l'hydrogène, B représente un halogène ou un alkyle en Cl-C6 et R représente un halogène; - A représente l'halogène: B représente l'hydrogène et R représente un halogène ou un phényle, - ou bien A représente l'hydrogène ou un halogène et R, B représentent ensemble une chaîne complétant un noyau naphtalène qui, lue dans la direction de R vers B, est de formule: X représentant l'hydrogène ou un halogène, de façon que le composé de formule (1) soit un bêta-naphtol de formule: - RO, R, A, B étant substitués ou non; et en ce qu'il est exempt d'enzyme hydrolytique apte à lyser la liaison entre l'oxygène et RO dans -ORO. 2 - Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que: dans la formule (n de l'amplificateur (e) et en ce que le taux d'ester: non hydrolysé de l'amplificateur (e) est supérieur ou égal à 40 % en poids, de préférence à 60 % en poids et, plus préférentiellement encore, à 90 % en poids. 3 - Système selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'amplificateur (e) comprend un mélange d'au moins deux esters de formule (1) avec: 4 - Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que: au moins l'un de ces esters, comportant de préférence un substituant R' sélectionné parmi les radicaux (i), (2i) et (3i), tels que définis dans la revendication 1, et au moins un autre de ces esters étant particularisé par un substituant Rl sélectionné parmi les radicaux (4i), tels que définis dans la revendication 1. 5- Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ligand (a) est constitué par au moins l'un des éléments des couples de substances appariables suivants: . antigène/anticorps enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur, récepteur/ligand . lectine/sucre . acide nucléique/acide nucléique complémentaire, 6 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif chimiluminescent (b) est le 2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione chimiluminescente de formule générale (4): dans laquelle: - R4 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R5, R6 et R7 représente H, un alkyle en Cl-C6, substitué ou non, un alcényle en C,-C6, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle en Cl-C6, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, - où R5 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R4, R6 et R7 représente H, un allyle en C-C6, substitué ou non un alcényle en C-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, - où R4 et R5 sont pris ensemble et représentent un dérivé amino-substitué ou non par un radical benzo et chacun des radicaux R6 et R7 représente H, alkyle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, le luminol et l'isoluminol étant particulièrement préférés. 7 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme de chimiluminescence (c) est sélectionnée parmi les oxydo-réductases, la xanthine oxydase étant avantageusement retenue, et de préférence parmi les peroxydases suivantes : la peroxydase de raifort, la microperoxydase, la peroxydase extraite de microorganisme Arthromyces ramosus et la lactoperoxydase ; la peroxydase de raifort et la microperoxydase étant particulièrement préférées. 8 - Système selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en ce que le substrat (d) est un oxydant formé, de préférence, par un peracide ou un peroxyde et, plus préférentiellement encore, par le peroxyde d'hydrogène et/ou un perborate d'alcalin ou d'alcalinoterreux. 9 - Système selon l'une quelconque des revendications I à 8, caractérisé en ce qu'au moins l'une, et au plus trois, de ses composantes (b) à (e) est liée au (portée par le) ligand (a), l'autre ou les autres composantes étant comprise dans le milieu d'analyse. 10 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est associé à une solution comportant au moins un régulateur de pH et/ou au moins un régulateur de la force ionique choisi parmi les sels, de préférence les halogénures (avantageusement chlorures) de métaux alcalins et/ou alcalino terreux, KCI, KBr, NaCI, Cas12, étant particulièrement préférés. 11 - Système selon la revendication 10, caractérisé en ce que le régulateur de la force ionique titre 0, 1 à saturation, de préférence de 0,1 à 3 M. 12 - Procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il consiste, essentiellement, à mettre en oeuvre le système selon l'une quelconque des revendications I à 11. 13 - Nécessaire d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 14- Nécessaire selon la revendication 13, caractérisé en ce que les substances à analyser sont comprises sur ou dans des supports solides choisis, de préférence, dans la liste ci après: - plaques de microtitration entières ou sécables, - tubes à essai en polymère synthétique ou en verre, - polymères biologiques, - lames d'immunohistologie, - membranes, - billes. ou dans des milieux liquides de type solution, émulsion ou dispersion, formant une partie du milieu d'analyse.