FR 2736266 A1 19970110 FR 9510049 A 19950824 INHIBITEUR DE L'AGRÉGATION PLAQUETTAIRE ET PROCÉDÉ POUR PRÉPARER CELUI-CI ChamD de l'invention La présente invention a trait à un nouvel inhibiteur d'agrégation plaquettaire et à un procédé pour le préparer, de manière plus spécifique à un polypeptide inhibant l'agrégation plaquettaire et à un procédé pour le préparer à partir du venin de Salmosa (Askistrodon halvs brevicaudus). Arrière Dlan de l'Invention Il est connu que le venin de vipère contient des peptides ou des protéines diverses, qui ont un effet sur la thrombose et l'hémostase. La thrombose est d'une signification particulière, puisque les thrombus formés par l'hyperagrégation anormale de plaquettes peut conduire l'homme à la mort et à l'invalidité. A cet égard, on a isolé une diversité de peptides ou de protéines inhibant ou activant l'agrégation plaquettaire à partir des venins de diverses espèces de vipères et on a caractérisé leurs propriétés biochimiques et biologiques. Il a été aussi rapporté que l'agrégation plaquettaire se produit par la fixation du fibrinogène à ses récepteurs spécifiques plaquettaires associés au complexe GPIIb-IIIa qui est une glycoprotéine sur la membrane de surface de plaquettes ou la séquence d'acides aminés à Arg-Gly-Asp du fibrinogène est essentiellement engagée (voir: Rouslahti et Pierschbacher, Science, 238: 491 à 497 (1987)). Naturellement on a suggéré que les peptides ou les protéines contenant la séquence d'acides aminés Arg-Gly-Asp soient capables d'inhiber l'agrégation plaquettaire, basée sur l'interférence de la fixation de fibrinogène aux récepteurs des plaquettes. Au stade initial des recherches, les inhibiteurs de fixation du fibrinogène sur les récepteurs plaquettaires isolés à partir des venins de vipères avaient principalement été identifiés, comme étant des petites protéines de 5 à 9 kDa (voir: Huang et al., J. Biol. Chem., 262: 16 157 à 16 163 (1987)). Plus tard, on a également isolé, à partir des venins de diverses espèces de vipères, plusieurs inhibiteurs de masse moléculaire élevée. Tous les inhibiteurs définis ainsi jusqu'ici ont été caractérisés en tant que protéines riches en cystéine qui contiennent essentiellement la séquence d'acides aminés Arg-Gly-Asp pour la fixation spécifique du complexe GPIIb-IIIa sur les récepteurs plaquettaires. On a récemment analysé, par spectrométrie RMN, les structures précises de quelques inhibiteurs d'agrégation plaquettaire tels que Kistrine (voir: Adler et al., Science, 253: 445 à 448 (1991); Adler et al, Biochemistry, 32: 282 à 289 (1993)), Flavoridine (voir: Klaus et al., J. Mol. Biol., 232: 897 à 906 (1993); Senn and Klaus, J. Mol. Biol., 232: 907 à 925 (1993)), Albolabrine (voir: Jaseja et al., Eur. J. Biochem., 218: 853 à 860 (1993)) et Echistatine (voir: Chen et al., Biochemistry, 30: 11 625 à 11 636 (1991); Cooke et al., Eur. J. Biochem., 202: 323 à 328 (1991); Cooke et al., Protein Eng., 5: 473 à 477 (1992); Saudek et al., Biochemistry, 30: 7369 à 7372 (1991); Dalvit et al., Eur. J. Biochem., 202: 315 à 321 (1991)).De plus, on a clairement démontré une interférence dans la fixation du fibrinogène au complexe GPIIb-IIIa par les inhibiteurs au moyen d'une expérimentation in vivo en utilisant un modèle animal (voir: Collen, J. Clin. Invest., 76: 101 à 108 (1985); Gold et al., Circulation, 77: 670 à 677 (1988); Yasuda et al., J. Clin. Invest., 81: 1 284 à 1 291 (1988); Coller et al., Blood, 68: 783 à 786 (1986); Hanson et al., J. Clin. Invest., 81: 149 à 158 (1988)). Dans ces circonstances, les présents inventeurs ont étudié 14 espèces de serpents coréens afin de dépister un nouvel inhibiteur d'agrégation plaquettaire, et ils ont découvert qu'un petit polypeptide isolé à partir du venin d'une vipère coréenne, Salmosa (Aakistrodon halvs brevicaudus), est un nouvel inhibiteur efficace d'agrégation plaquettaire qui n'a pas été rapporté jusqu'ici. Résumé de l'invention Un but principal de l'invention est donc de fournir un nouveau peptide inhibant l'agrégation plaquettaire provenant du venin de Salmosa (Aakistrodon halvs brevicaudus). L'autre but de l'invention est de fournir un procédé pour la préparation du polypeptide inhibant l'agrégation plaquettaire à partir du venin de Salmosa. Brève description des dessins: Ce qui précède et les autres buts et caractéristiques de la présente invention deviendront plus clairs gracie aux descriptions suivantes données conjointement avec les dessins annexes, dans lesquels: la figure 1 est une photographie montrant le spectre SDS PAGE d'un peptide inhibant l'agrégation plaquettaire purifié à partir du venin de Salmosa; la figure 2 est une liste des séquences amino-acides des peptides inhibant l'agrégation plaquettaire selon la présente invention (SEQ ID NO: 1 et selon l'état de la technique antérieure (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5); et, la figure 3 est un spectre de masse MALDI (Ionisation par désorption de matrice à l'aide de laser) du peptide inhibant l'agrégation plaquettaire selon l'invention. DescriPtion détaillée de l'invention Pour isoler l'inhibiteur de l'agrégation plaquettaire de l'invention, les présents inventeurs ont obtenu le venin de SALMOSA (Aakistrodon halvs brevicaudus), une vipère coréenne. Puis, on a chargé le venin sur une colonne d'affinité à sérine protéinase afin de recueillir la solution ayant traversé la colonne sans se lier, et on a pratiqué une série d'opérations chromatographiques sur colonne, à savoir, échange anionique, filtration sur gel et chromatographies liquides à haute performance (CLHP) en colonne à phase inverse. On a identifié le peptide inhibant l'agrégation plaquettaire (désigné dans la suite sous le nom "Salmosine") purifié comme ci-dessus, comme étant une petite protéine de masse moléculaire d'environ 7 500 Da, qui n'a pas été décrite jusqu'ici. La modélisation par ordinateur de la Salmosine, basée sur l'analyse des séquences d'amino-acides, enseigne que la structure tridimensionnelle de la Salmosine est un hybride de Kistrine et d'Echistatine, qui sont des peptides inhibant l'agrégation plaquettaire connus dans l'état de la technique. De plus, on a aussi démontré que la Salmosine inhibe l'agrégation plaquettaire d'une manière beaucoup plus efficace que tout autre peptide connu inhibant l'agrégation plaquettaire. Donc on propose que la Salmosine puisse être développée en tant qu'agent thérapeutique pour la maîtrise de la thrombose. Dans la description de la séquence d'amino-acides des protéines et des peptides de la présente invention, on utilise les symboles abrégés à une lettre selon les normes IUPAC-IUB comme suit: Acide aminé Svmbole Alanine A Arginine R Asparagine N Acide aspartique D Cystéine C Glutamine Q Acide Glutamique E Glycine G Histrdine H Isoleucine I Leucine L Lysine K Methionine M Phénylalanine F Proline P Sérine S Thréonine T Tryptophane W Tyrosine Y Valine V La présente invention est, de plus, illustrée dans les exemples suivants qui ne doivent pas être pris comme limitant le champ de l'invention. Exemple 1: Purification de la Salmosine On a dilué d'un facteur 10, 1 ml de venin obtenu à partir de Aakistrodon halvs brevicaudus avec Tris-HCl 20 mM (pH 7,5). On a chargé le diluant sur une colonne benzamidine-Sepharose (Pharmacia-LKB, Suède) (2,5 x 10 cm) prééquilibrée avec le Tris-HCl 20mM (pH 7,5) avec un débit de 30 ml/h. Puis, on a recueilli la solution ayant traversé la colonne sans se lier et on l'a appliquée sur une colonne DEAE-Toyopearl (Pharmacia, Suède) (2,5 x 5,0 cm) à un débit de 60 ml/h, et on l'a éluée avec un gradient de concentration saline de NaCl par paliers (20 mM, 50 mM, 100 mM et 1 M). On a réuni et on a concentré les fractions actives en utilisant un système d'ultrafiltration (Modèle 8 200, Amicon, USA).On a chargé le concentrat ainsi préparé sur une colonne CLHP TSK G2000 (Toyosoda, Japon) (7,5 x 300 mm) à un débit de 60 ml/h et on a effectué une élution. On a réuni et on a concentré les fractions actives en utilisant un système d'ultrafiltratiob (Centriprep-3, Amicon, USA). On a ensuite appliqué les fractions actives ainsi concentrées sur une colonne CLHP à phase inverse Vydac C18 (Vydac, USA) (2,5 x 300 mm) équilibrée avec TFA (acide trifluoroacétique) 0,1% (v/v), lavees avec TFA 0,1% (v/v) et avec de l'acétonitrile 20% (v/v) d'une manière séquentielle, et éluées avec un gradient linéaire de concentration d'acétonitrile de 20% à 60% (v/v). On a élué la Salmosine avec un temps de rétention de 31,8 minutes. on a dosé l'activité biologique de la Salmosine au cours de la purification selon le procédé ELISA comme suit: on a recouvert des plaques de microtitration ayant 98 puits avec du fibrinogène à 40C pendant une nuit. Puis, on a fait réagir le fibrinogène avec le récepteur GPIIb-IIIa isolé à partir de plaquettes humaines et avec des solutions contenant la Salmosine à température ambiante pendant 2 heures. Après lavage avec un tampon de Tris-HCl 20mM (pH 7,5 contenant NaCl 0,15 M, 0,05% de Tween 20 et 0,02% de NaN3), on a fait réagir les plaquettes avec un anticorps de souris GPIIIa antihumain (Tagoimmunologicals, Biosource International, USA) pendant 2 heures, on a lavé trois fois avec le même tampon et on a fait réagir ensuite avec IgG-HRP (peroxydase de raifort) antisouris de chèvre (Tagoimmunologicals, Biosource International, USA) pendant 1 heure. Après 3 lavages avec le tampon, on a ajouté un substrat chromogène, la o-phénylènediamine, et on a mesuré l'absorbance à 490 nm. Exemple 2: Détermination de la pureté de la Salmosine Pour déterminer la pureté de la Salmosine préparée dans l'exemple 1, on a traité la solution de Salmosine éluée par chromatographie CLHP à phase inverse C18 avec 100% de TCA (acide trichloroacétique) afin de précipiter la Salmosine, etc on a mis en suspension la Salmosine avec un volume de Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8, contenant 4% (p/v) de SDS, 2% (v/v) de glycérol et 10% (v/v) de mercaptoéthanol), et on a laissé incuber à 1000C pendant 5 minutes. On a analysé la Salmosine ainsi préparée sur SDS-PAGE en utilisant un gel à 18% de Tris-glycine (Novex, USA) et on a effectué une coloration au nitrate d'argent (voir: figure 1). Sur la figure 1, la colonne 1 est la Salmosine préparée dans l'exemple 1, et la colonne 2 représente les marqueurs de masses moléculaires.Tel que présenté dans la figure 1, le spectre SDS-PAGE laisse voir une seule bande de Salmosine. En conséquence, il est clairement démontré que l'on a isolé la Salmosine à partir du venin de (Aakistrodon halvs brevicaudus) dans une forme pure. Exemple 3: Analyse des séquences d'amino-acides de la Salmosine On a fait digérer la Salmosine purifiée par CNBr et on a déterminé sa séquence d'amino-acides en utilisant un analyseur automatique de séquence d'amino-acides. On présente à la figure 2 les séquences d'amino-acides de la Salmosine et plusieurs peptides connus inhibant l'agrégation plaquettaire (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 et SEQ ID NO 5). Sur la figure 2, le soulignement indique des acides aminés distincts l'un de l'autre, lorsqu'on les compare à l'Halysine (voir: Huang et al., Biochem.Pharmacol., 42: 1 209 à 1 219 (1991a)), peptide connu inhibant l'agrégation plaquettaire isolé à partir du venin d'une vipère japonaise, Mamushi (Aakistrodon halvas), qui, sur le plan de la taxinomie, est identique en termes d'espèces à une vipère coréenne, Salmosa (Aakistrodon halvs brevicaudus). Comme il est montré sur la figure 2, la Salmosine est un nouveau peptide inhibant l'agrégation plaquettaire, qui a une séquence d'acides aminés différente de celle des peptides inhibiteurs connus. ExemPle 4: Détermination de la masse moléculaire de la Salmosine On a déterminé que la valeur de la masse moléculaire de la Salmosine est égale à 7 473,6 Da au moyen de MALDI MS (spectrométrie de masse à ionisation par désorption de matrice au moyen de laser, Kratos Kompact Mold II, Kratos Analytical, Manchester, Royaume Uni) (Voir: figure 3). Exemple 5: Analyse de la structure tri-dimensionnelle de la Salmosine A partir de la séquence d'amino-acides de la Salmosine déterminée dans l'exemple 3, on a analysé la structure tri-dimensionnelle de la Salmosine au moyen d'un système de modélisation par ordinateur qui utilise Indigo2-XZ (Silicon Graphics Corp., USA) et Insight II/Discover and Homology (Biosym. Corp., USA), en tant que matériel et logiciel, respectivement. L'analyse par modélisation à l'ordinateur enseigne que la structure tri-dimensionnelle de la Salmosine est un hybride de la Kistrine et de L'Echistatine, qui sont des peptides inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire déjà connus dans l'état de la technique. Exemple 6: Comparaison de l'activé d'inhibition de l'agrégation plaquettaire Afin de comparer les activités de la Salmosine et les peptides connus inhibant l'agrégation plaquettaire, on a mesuré l'activité d'inhibition de l'agrégation plaquettaire au moyen de deux procédés différents comme suit: (1) Le procédé ELISA de l'exemple 1 (2) Le dosage d'agrégation plaquettaire humaine: On a mélangé 225 yl de plasma humain riche en s plaquettes (3 x 105 plaquettes/yl de plasma) avec 25 Ctl de peptide inhibant l'agrégation plaquettaire dans du PBS (0,1 yg/ml) et on l'a incubé dans un Agrégomètre (Chromo-Log Corp., USA) à 250C pendant 5 minutes, et on a mesuré la turbidité après l'addition d'un agent d'agrégation, à savoir, l'ADP. On a présenté dans le tableau 1 les activités d'inhibition de l'agrégation plaquettaire de la Salmosine et des peptides connus inhibant l'agrégation plaquettaire, à savoir, Kistrine, t-Trigramine (voir: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 2 471 (1989)), Echistatine et un peptide synthétique (GRGDSP), mesurées au moyen des procédés décrits ci-dessus. Comme on peut le constater dans le tableau 1, il est clairement démontré que la Salmosine a une activité d'inhibition d'agrégation plaquettaire supérieure à tout inhibiteur d'agrégation plaquettaire connu. Tableau 1: Comparaison de l'activité d'inhibition de l'agrégation plaquettaire 1C50 (nM) Peptide inhibant Procédé ELISA Dosage l'agrégation d'agrégation plaquettaire plaquettaire humaine Kistrine 2,7 128 -Trigramine 2,2 240 Echistatine 2,7 560 Salmosine - 0,7 50 GRGDSP 300 230 000 peptide synthétique dont la séquence d'aminoacides est Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro. Tel qu'il est illustré et démontré clairement cidessus, la présente invention fournit un nouveau peptide inhibant l'agrégation plaquettaire, à savoir la Salmosine et un procédé pour préparer celle-ci à partir du venin d'une vipère coréenne, Salmosa (AaXistrodon halvs brevicaudus). La Salmosine inhibe l'agrégation plaquettaire d'une manière plus efficace que tout autre peptide connu inhibiteur d'agrégation plaquettaire. On suggère que la Salmosine peut être développée en tant qu'agent thérapeutique pour la maîtrise de la thrombose. REVENDICATIONS 1. Peptide (Salmosine) inhibiteur d'agrégation plaquettaire, provenant du venin de Salmosa (Askistrodon halvs brevicaudus), qui est constitué de la séquence d'amino-acides représentée par (SEQ ID Nô: 1): EAGEE CDCGS PGNPC CDAAT CKLRQ GAQCA EGLCC DQCRF40 MKEGT ICRRA RGDDL DDYCN GISAG CPRNP FHA 73 2. Procédé pour la préparation du peptide (Salmosine) inhibant l'agrégation plaquettaire selon la revendication 1 à partir du venin de Salmosa (Askistrodon halvs brevicaudus), qui comprend les étapes consistant: à obtenir le venin de Salmosa; à charger le venin sur une colonne d'affinité à sérine-protéinase afin de recueillir la solution ayant traversé la colonne sans se lier; et à soumettre la solution à une série d'opérations, d'échange anionique, de filtration sur gel et de chromatographies CLHP en colonne à phase inverse.