FR 2729823 A1 19960802 FR 9501130 A 19950131 CONSERVTION DE PRELEVIMENTS DE SANG, EN PARTICULIER CITEZ LE8 IIALADES TRAITES PAR L'HEPARINZ L'invention concerne une composition pour la conservation de prélèvements de sang, en particulier de ceux obtenus de malades traités par l'héparine. Le problème de cette conservation se pose de façon constante, dès lors que ces prélèvements doivent faire l'objet de différents examens biologiques, parfois étalés dans le temps, tels que numérations de plaquettes, mesures de temps de coagulation par diverses techniques de dosages, ayant pour objectifs l'étude des doses d'héparine antérieurement administrées sur différents facteurs de coagulation, voire sur des inhibiteurs de ces facteurs, etc.... La personne du métier est évidemment à même d'apprécier ce que peut être la complexité à la fois de ces dosages et de leur interprétation, notamment lorsque l'on sait que nombreux sont les autres facteurs ou inhibiteurs qui sont eux-mêmes, ou dont les interventions dans la chaîne de coagulation sont encore inconnus à ce jour. Une technique de conservation couramment utilisée comporte l'addition à des prélèvements sanguins à étudier des solutions de sels de l'acide citrique, tels que le citrate trisodique. L'action de ces solutions de citrates, souvent appelées ci-après "liquides de prélèvement" se manifeste principalement par un effet de chélation des ions calcium empêchant le processus de la coagulation sanguine. Mais pour simples que ces techniques soient, elles s'avèrent souvent insuffisantes, par exemple lorsque des délais trop longs s'écoulent entre l'obtention du prélèvement sur le patient et l'exécution des divers dosages à mettre en oeuvre. Les défauts de conservation des prélèvements sanguins en cause ne peuvent donc que nuire à la signification des résultats. Certains de ces défauts ont été analysés comme essentiellement liés au fait qu' aux concentrations classiquement utilisées (par exemple 0,011 M), le citrate trisodique n'inhibe pas la neutralisation de l'activité anticoagulante de l'héparine par le facteur plaquettaire 4 (Levine SP et al, Brit. J Haematol. 1984, 57, 585-596). Ce facteur apparaît au cours de l'activation plaquettaire qui peut se produire au cours de la conservation du sang. LEVINE et AL déjà cités, (BODE AP et al, Am. J. Clin. Pathol. 1989, 91, (4) 430-434),(BRANDT JT et al, Am. J. Clin. Pathol. 1981, 76, 530-537. Ce dernier phénomène a été démontré particulièrement par CONTANT G. et al, Thromb. res. 1983, 31, 365-374) ; VAN DER BESSELAR et al, Thromb. Haemost. 1987, 57 (2), 226-231. C'est pourquoi G. Contant et coll ont proposé l'utilisation pour la conservation du sang, de le prélever sur un liquide à prélèvement à base de citrate acide 0,011 M, théophylline 1.5 mM, adénosine 0.37 mM, dipyridamole 0,1198 mM. Cette solution, dénommée CTAD par ses promoteurs, permet une meilleure conservation du sang de malades traités par l'héparine, ne modifie pas les tests de coagulation classiques et réalise un meilleur blocage des activations plaquettaires. Mais il a été constaté que les plasmas de certains patients traités par l'héparine, n'étaient pas davantage conservés dans les conditions d'efficacité optimales, même sur CTAD (tubes STAGO), le défaut de conservation se manifestant, par exemple, par une diminution incontrôlée dans le temps du nombre de plaquettes. L'invention découle de la découverte que ce dernier effet pouvait néanmoins être pallié par l'association dans le liquide d'un agent de chélation du calcium sanguin avec une prostacycline, également appelée époprosténol, de formule, FORMULE I Epoprostenol ou d'un analogue ou dérivé de l'époprosténol capable d'inhiber l'agrégation plaquettaire induite dans un échantillon sanguin par des agents agrégants tels que 1'ADP, le collagène ou l'adrénaline, notamment à des concentrations de l'ordre de 0,2 à 2 nanomoles/ml. Un agent de chélation de choix est constitué par un citrate du type de ceux déjà utilisés dans le passé pour la conservation d'échantillons de sang ou de plasma, notamment un citrate trisodique. Naturellement d'autres agents de chélation réversibles peuvent être utilisés, tels qu'un mélange de théophylline, d'adénosine et de dipyridamole, par exemple notamment dans des concentrations relatives qui sont déjà les leurs dans le CTAD. Un dérivé préféré de l'époprosténol pour les besoins de l'invention est constitué par le composé connu sous la désignation "Iloprost" (qui sera aussi utilisée dans la suite de l'exposé pour le désigner) de formule FORMULE Il lloprost Son poids moléculaire est de 360,48. Il va de soi que les concentrations relatives indiquées ci-dessous en citrate et en dérivé d'époprosténol, notamment en iloprost, se sont avérées fournir des résultats particulièrement efficaces dans le système expérimental utilisé. Sans qu'il y ait lieu de considérer les proportions relatives qui suivent comme ayant un caractère limitatif, il peut être indiqué que ces concentrations pourront en général être contenues dans des intervalles - de l'ordre de 0,350 à de l'ordre de 1,1 M pour le citrate trisodique - de l'ordre de 35 x 10-6 à de l'ordre de 35 x 10-9 M pour le dérivé d'époprosténol, notamment en iloprost, les concentrations étant exprimées par rapport au volume de liquide de prélèvement. L'invention concerne aussi les compositions solides contenant les proportions pondérales appropriées des constituants de base des solutions sus-indiquées permettant de réaliser des solutions ayant les concentrations respectives sus-indiquées, par exemple en citrate trisodique et en Iloprost. Elle concerne naturellement les solutions ellesmêmes, souvent préparées à l'avance en tube initialement fermé, aux fins de recevoir les échantillons de plasma ou de sang à conserver, par exemple dans un rapport de 9 volumes de sang ou plasma pour 1 volume de liquide de prélèvement. Enfin, le procédé selon l'invention concerne le procédé de conservation lui-même d'un échantillon de sang ou de plasma, procédé qui consiste à mettre et à maintenir en contact cet échantillon avec le liquide de prélèvement, notamment dans les condition susindiquées, de préférence à la température ordinaire. L'efficacité d'une solution conforme à l'invention ci-après, désignée par l'abréviation "C + IW est illustrée par le Tableau I suivant, dans lequel sont rapportés des résultats d'essais comparatifs effectués sur du sang prélevé, à plusieurs mois d'intervalle, et cela chaque fois à raison de 1 volume de liquide de prélèvement pour 9 volumes de sang. Les essais ont été réalises avec un liquide de prélèvement constitué d'une solution aqueuse, contenant les constituants désignés ci-après, aux concentrations molaires respectives également indiquées ci-apres Citrate trisodique 2,5 H20 : 0,109 M/1 "Iloprost" (Laboratoire Schering) 5 x 10-7 M/1. TABLEAU I Compte plaquettaire x 10 /mm en fonction de la durée de conservation du sang du patient Prélèvement du sang Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 sur: 1/4 114 h. I h. 1/4 I h. 3h30 1/4 h . I h Citrate 0.01 I M 219 162 278 65 106 270 153 CTAD 300 178 273 233 232 non testé Liquide de préleve- 337 347 271 271 236 286 267 ment proposé CIL La concentration de l'Iloprost choisie est celle pour laquelle est obtenue une inhibition presque complète de l'activation et de l'agrégation plaquettaire. Les résultats ont été exprimés par les numérations de plaquettes après les intervalles de temps indiqués dans le Tableau I. On constate la stabilité dans le temps nettement plus grande des nombres de plaquettes dans le sang prélevé sur les liquides de prélèvement C + I, que dans les échantillons de comparaison. Les nombres de plaquettes mesurées tiennent compte des dilutions du sang par le solution stabilisante. I1 est remarquable que la composition selon l'invention soit apte à surmonter la plus grande résistance à l'héparine qui est observée chez certains malades, comme cela avait aussi été remarqué pour le même malade. Afin de le montrer plus précisemment, du sang de ce même malade a été prélevé sur des solutions de CTAD, de citrate de sodium et, enfin de citrate de sodium et d'Iloprost, et ce aux fins d'obtenir, notamment pour les deux derniers liquides de prélèvement, des concentrations finales dans le plasma, respectivement - de citrate de sodium 0,109 M/1 et - de citrate 0,109 M/1 additionné d'Iloprost, 5 x 10-7 M/1. Les mélanges ont été conservés à la température du laboratoire, parallèlement à un sang normal servant de témoin et subissant les mêmes manipulations.La concentration finale de l'Iloprost dans le plasma citraté était voisine de 10-7 M/1. On a ajouté des concentrations croissantes d'héparine de 0,1 à 0,5 unité internationale (concentration finale) et mesuré l'allongement du temps de céphaline plus activateur. L'héparine utilisée était 1'héparine produite par la Société Léo 5000 U/ml diluée dans du sérum physiologique. Le plasma du patient a été obtenu par centrifugation (20 min à 2000 g) pour réaliser les concentrations d'héparine souhaitées. Un sang normal témoin a été utilisé comme témoin. Des numérations plaquettaires ont été pratiquées immédiatement avant la centrifugation, aussi bien sur l'échantillon de sang à l'étude que sur le témoin. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau II et la figure 1. TABLEAU II Témoin ----------- Patient L. Jacques------- Citrate Citrate 0.10') M 0.109 M CIAD Solution C.ll % dc plaquettes agrégées 5% 35 8 10 46 0% Concentration héparine néccs- sairc pour 0,20 > 0,50 0,35 0,20 doubler le TCA Les résultats sont exprimés vis à vis des concentrations d'héparine capable de doubler le temps de céphaline avec activateur (TCA) du patient, par rapport aux valeurs mesurées, sans addition d'héparine, et les pourcentages calculés des plaquettes agrégées pour ces mêmes concentrations d'héparine. La numération des plaquettes a été faite à l'appareil Coulter S+. Le TCA a été réalisé avec le réactif APTT (Laboratoire Organon) sur un automate de coagulation appelé KC 10. Là encore, le liquide de prélèvement de l'invention s'est révélé être supérieur au CTAD, en ce qui concerne plus particulièrement sa capacité à inhiber le phénomène d'activation plaquettaire, et cela tout particulièrement chez un malade dont avait auparavant été constatée la résistance à l'héparine. En effet, la concentration en héparine nécessaire à l'obtention d'une TCA doublée chez le malade étudié s'est avéré être égal au TCA mesuré sur le sang témoin, alors que les concentrations nécessaires en présence des autres liquides de prélèvement étaient beaucoup plus élevés. L'expérience a été répétée en prolongeant le séjour du sang à la température du laboratoire de 15-20 minutes à 60 minutes, les résultats obtenus ont confirmé les précédents. Les résultats obtenus semblent témoigner de ce que pour le patient considéré, la résistance à l'héparine était due à un artéfact, voire un facteur lié à l'activation et à l'agrégation plaquettaire, qui se produit dans le sang prélevé dans les conditions habituelles. Dans une autre série d'essais, le sang du patient a été comparé avec ceux d'un groupe de 12 volontaires sains (n=12) en terme d'activité neutralisante de l'héparine. Le sang des volontaires et du patient ont été prélevés sur EDTA pour la numération conventionnelle des plaquettes, sur citrate, sur CTAD et sur citrate-Iloprost (liquide C + I), et ce pour atteindre les concentrations finales en citrate exprimées par rapport aux volumes de plasma mis en contact avec ces liquides de prélèvement. Les prélèvements ont été conservés pendant 1 heure à la température du laboratoire, puis les plaquettes ont été comptées sur un automate Coulter S+. Les prélèvements ont ensuite été immédiatement centrifugés (2000 g, 20 minutes) et la sensibilité à l'héparine des plasmas obtenus a été étudiée. L'héparine (Laboratoire Leo 5000 U/ml) a été diluée en sérum physiologique et introduite dans les plasmas, à raison de 1 volume de solution d'héparine pour 9 volumes de plasma, pour réaliser des concentrations plasmatiques finales de respectivement 0 - 0,10 - 0,20-0,30 et 0,40 Ul/ml. Les résultats sont exprimés dans la figure 1, par des points correspondant aux pertes de plaquettes exprimées en % (axe des ordonnées) pour chacun des échantillons, testés en présence de liquides de prélèvement à base respectivement de citrate seulement (C), de CTAD ou du réactif citrate + Iloprost (C + I). La numération plaquettaire au Coulter S+ montre que la perte d'éléments est plus importante avec le citrate qu'avec la solution CTAD et la solution citrate Iloprost. Les résultats sont significativement meilleurs avec le réactif citrate + Iloprost (p Wilcoxon, séries appariées et calcul de p en se référant à la table de l'écart réduit pour la loi normale). Dans le cas de la sensibilité à l'héparine, les résultats concernant l'allongement du temps de thrombine, du TCA et de l'activité anti-Xa (dosage amidolytique de l'activité sur automate ACE Dupont) démontrent la performance supérieure de la solution C + I par rapport aux deux autres liquides à prélèvement. En retenant les résultats pour 0,1 et 0,2 UI/ml d'héparine, les temps de thrombine (CTT(s) sur l'axe des ordonnées de la Figure 2) sont supérieurs à 60 secondes pour 9 volontaires sains avec le citrate seul et le CTAD, tandis que les valeurs mesurées pour les trois volontaires sains sont comprises entre 30 et 60 secondes pour le citrate seul et le CTAD. En revanche les 12 valeurs sont supérieures à 60 secondes avec la solution citrate + Iloprost. Les résultats relatifs à l'activité anti-Xa mesurée, stable 1 heure après le prélèvement du plasma sur le liquide de prélèvement C + I, sont tout à fait comparables aux résultats obtenus avec les deux autres liquides de prélèvement. Ces résultats montrent que le liquide de prélèvement proposé C + I peut aussi être utilisé pour la mesure de l'activité anti-Xa. Les résultats de TCA obtenus tout à fait parallèles aux précédents, ont été obtenus sur des sangs, obtenus à partir d'autres malades traités par l'héparine, prélevés sur les 3 liquides de prélèvement étudiés et conservés pendant 1 heure à la température du laboratoire, avant la centrifugation. Dans le cas de l'addition d'héparine au sang in vitro une perte de l'activité de l'héparine jugée à l'aide du temps de thrombine a eté observée dans 3 cas sur 12 avec le citrate seul et le CTAD ce qui suggère qu'un petit nombre de sang témoins subit une amorce d'activation plaquettaire malgré le temps relativement court de conservation du sang court (1 heure) utilisé dans les expériences. En revanche, cette amorce d'activation plaquettaire ne s'est manifesté pour aucun des sangs testés, lorsque ceux-ci ont été prélevés sur C + I. L'ensemble des résultats démontre la supériorité de la solution citrate-Iloprost agent de conservation de prélèvements sanguins, y compris chez ceux dans lesquels est observée une activation plaquettaire excédant les valeurs normales. REVENDICATIONS 1. Liquide de prélèvement d'échantillons de sang ou de plasma dans lequel sont associés un agent de chélation du calcium sanguin avec une prostacycline, également appelée époprosténol, de formule, FORMULE I Epoprostenol ou d'un analogue ou dérivé de l'époprosténol capable d'inhiber l'agrégation plaquettaire induite dans un échantillon sanguin par des agents agrégants tels que 1'ADP, le collagène ou l'adrénaline, notamment à des concentrations de l'ordre de 0,2 à 2 nanomoles/ml. 2. Liquide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé de l'époprosténol est l"'Iloprost" de formule, FORMULE Il lloprost 3. Liquide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est de l'acide citrique ou un citrate du type utilisé pour la conservation d'échantillons de sang ou de plasma, de préférence un citrate trisodique. 4. Liquide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est un EDTA ou un mélange de théophylline, d'adénosine et de dipyridamole. 5. Liquide selon la revendication 1 en combinaison avec la revendication 2 ou selon la revendication 1 en combinaison avec la revendication 3, caractérisé en ce que leurs concentrations relatives sont contenues dans des intervalles - de l'ordre de 0,350 à de l'ordre de 1,1 M/1 pour le citrate trisodique - de l'ordre de 5 x 10-6 à de l'ordre de 5 x 10-9 M/1 pour l'époprosténoi ou l'iloprost, les concentrations étant exprimees en mole par volume total de plasma + liquide de prélèvement. 6. Liquide selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites concentrations relatives sont choisies de façon à obtenir des concentrations finales dans le plasma lui-même, de - Citrate trisodique 2,5 H20 : 0,109 M/1 "Iloprost" : 10-7 M/1 7. Composition solide pour la constitution de liquides de prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, notamment sous forme de solutions aqueuses. 8. Procédé de conservation d'un échantillon de sang ou de plasma caractérisé par la mise et le maintien en contact de cet échantillon avec le liquide de prélèvement selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'occasion de cette mise en contact, les échantillons de plasma ou de sang et du liquide de prélèvement sont pris à raison de 9 volumes de sang pour 1 volume de liquide de prélèvement.