FR 2738576 A1 19970314 FR 9510525 A 19950908 La présente invention se rapporte à des anticorps spécifiques de la 5 a réductase humaine, et à leurs applications, en particulier dans le domaine du diagnostic. La 5 a réductase est une enzyme liée à la membrane cellulaire présente dans la prostate, les vésicules séminales, les glandes sébacées, le cerveau et d'autres tissus. Elle catalyse la réduction NAPH dépendante de la testostérone (T) en 5 a dihydrotestostérone (DHT). I1 s'agit d'une étape déterminante dans le métabolisme des androgènes, qui régule notamment la croissance cellulaire normale ou pathologique de la prostate. Cette enzyme joue un rôle dans plusieurs désordres endocriniens comme l'hyperplasie de la prostate, le cancer de la prostate et au niveau cutané, I'acné et l'hirsutisme. Depuis de nombreuses années, des études ont été entreprises pour caractériser, localiser et inhiber l'enzyme. Ainsi deux formes d'isoenzymes ont été mises en évidence et caractérisées chez l'homme (IS.C.: Delos. JBS 94). Elles présentent des activités maximales à pH neutre-basique (type 1) et acide (type 2) et sont codées par deux gènes différents qui ont été clonés. Elles répondent différemment à divers inhibiteurs (azastéroïdes) ou modulateurs comme l'extrait lipidostérolique de Serenoa Repens (ELSSR). Après de nombreuses controverses il est aujourd'hui établi que les deux isoformes sont exprimées dans la prostate humaine mais que leur expression dépend du type cellulaire (stroma ou épithélium) ou pathologique (tumeur bénigne ou maligne). Afin de mieux étudier l'activité respective des inhibiteurs sur les deux types enzymatiques, le clonage et l'expression des gènes de ces deux enzymes dans un système eucaryote a été mis au point. Il serait donc souhaitable de disposer d'anticorps spécifiques de cette enzyme, afin notamment de pouvoir la mettre en évidence ou la doser. L'invention a donc pour objet des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre la 5 a réductase de type 1. Plus particulièrement, l'invention a pour objet les anticorps désignés par 3D2, 14C6, 2E2 et 12B12. L'obtention de tels anticorps nécessite la production en quantité importante de l'isoforme correspondante de la 5 Q réductase. Ceci est possible dans un système à baculovirus, dans lequel les gènes de la 5 Q réductase ont été insérés ; des cellules d'insectes SF9 sont ensuite infectées, comme décrit par lehlé et al (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 46, 1993, 177- 182). Après culture les cellules infectées avec le baculovirus exprimant la 5 a réductase de type I (SaRi) sont récoltées, lysées, homogénéisées et centrifugées. Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, le culot est remis en suspension dans une solution tampon contenant de la testostérone et du NADPH. Une solution de phospholipides est additionnée dans des conditions conduisant à la formation de liposomes, ayant encapsulé la SQ R1. De manière inattendue, I'encapsulation de la S ctR1 dans des liposomes permet sa purification tout en maintenant l'affinité et l'activité de l'enzyme. La préparation liposomale ainsi obtenue peut ensuite être directement injectée à des souris afin de provoquer une réaction immunitaire. Les splénocytes de souris ainsi immunisées sont prélevés et fusionnés pour préparer des hybridomes. Ceux-ci sont ensuite testés sur des cellules DU145, qui ne produisent que l'isotype 1 de la 5 Q réductase (contrôle positif). Ce criblage permet de sélectionner les hybridomes présentant une réactivité plus importante. Les clones secrétant un anticorps en concentration importante et présentant une réactivité importante avec la 5aR1 sont sélectionnés par des techniques ELISA et en immunoblot. Une application avantageuse de ces anticorps est leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, pour mesurer la production de SaR1 dans des échantillons biologiques, en particulier des tissus prostatiques. L'invention a donc pour objet un kit de diagnostic immunologique comprenant de tels anticorps. Les diagnostics en cause peuvent être des kits de type connus, notamment du type Sandwich, à anticorps monoclonaux et notamment de type ELISA ou RIA par exemple. Ces anticorps spécifiques de la SaRî sont de préférence marqués, notamment par des substances chromogènes, fluorescentes ou radioactives. Des anticorps selon l'invention pourront également être inclus dans des produits servant à l'imagerie permettant la mise en évidence in situ de l'antigène. Les anticorps selon l'invention seront particulièrement utiles pour diagnostiquer des maladies androgénodépendantes entraînant une hyperconcentration de 5aR1, dans le cancer de la prostate par exemple. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Exemple 1 : Préparation de la S Q réductase de type 1 Des cellules de Spodoptera frugiperda (SF9) (ATCC, CRL1711) sont maintenues à 27 C dans du milieu pour insecte de Grace, supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 3,3 g/l de yeastolate, 3,3 g/l d'hydrolysat de lactalbumine (Gibco/BRL) 50 Fg/ml de sulfate de gentamycine et 2,5 cig/ml d'amphotéricine B (Sigma, France). Les cellules sont transfectées avec l'ADN de virus polyhèdre Autographa californica (AcNPV) (Invitrogen Co., CA, U.S.A.) pour obtenir des stocks viraux de type sauvage. Production et isolement de baculovirus recombinants Cette étape a été détaillée pour SaR1 par lehlé et al (J. Steroid Biochem. Nlolec. Biol., 1993, 177-182). L'expression de la protéine SaR1 par les baculovirus recombinants sélectionnés désignés par CS et pure de polyhèdre a été confirmée par des dosages d'activité S a réductase dans les culots cellulaires, en présence de testostérone et de NADPH. Purification partielle de la 5 a réductase 1 recombinante Les cellules SF9 infectées avec les baculovirus exprimant la ScxR1 ont été récoltées 4 jours après l'infection et homogénéisées dans un tampon à haute force ionique (Tris 100 mM, pH 7,2, citrate de sodium 100 mM, KCI 100 mM, D1T 5 mM, EDTA 1 mM, glycérol 20%) (tampon A) contenant 10 Fg/ml d'aprotinine, 10 llg/ml de leupeptine et 10 yg/ml de TAME, comme décrit dans Sargent et al (J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 1991, 38, 73-77).L'homogénat est soumis à une centrifugation une heure à 105 000 g, et 4 C, puis le culot cellulaire est remis en suspension dans le tampon A contenant 1 FM de testostérone et 5 mM de NADPH, pour obtenir une préparation microsomale. Une solution méthanol-chloroforme (2:1) de phospholipides provenant de cerveau de boeuf (Sigma , France) est évaporée à sec sous vide, remise en suspension sous sonication dans une solution de n-octyl - D-glucopyranoside, puis ajouté directement à la préparation microsomale pour donner une concentration finale en lipides de 5 mg/ml et en octyl glucoside de 0,8% p/v. Le mélange est gardé sur la glace pendant 90 min, agité à intervalle régulier, puis dialysé contre 3,5 I de tampon A à 4" C pendant 3 jours (seuil moléculaire de coupure du Spectrapore 12 000 - 14 000). La préparation résultante (5aR1 encapsulé dans les liposomes) a été utilisée comme source pour des études de cinétique enzymatique. L'activité de la 5aR1 a été mesurée dans le culot cellulaire initial et après encapsulation dans les liposomes. La concentration en protéine a été mesurée en utilisant la technique BCA (Pierce, IL, U.S.A.). L'encapsulation dans les liposomes de l'isoenzyme de type 1 préserve l'activité et l'affinité et permet une purification. L'isoenzyme encapsulée a un Km apparent de 1,8 FM et une activité spécifique de 6,5 nmol/mg de protéine/min, alors qu'elles sont respectivement de 2,9 FM et 2,4 nmol/mg de protéine/min avant l'encapsulation ; on observe donc une décroissance légère mais non significative du Km et une diminution de près de 3 fois dans l'activité spécifique. Exemple 2 : Immunisations Des souris BALB/c femelle de 16-18g (~ 6 semaines) ont été immunisées avec les liposomes, les dates d'injection, la concentration en antigène et les adjuvants utilisés sont reportés ci-après. immunisalions prélèv. des immunisalion pièlèv, des lmmunisalion prélèv. des immunisation prélèv. des 0B/06/1993 23/06/06/1993 sérums 0B/07/1993 sérums 27/07/1993 sérums 26/11/1993 sérums Souris 1 (S1) JO. lipos#ACF J15; lipos#AIF J28: 05/07 J70 lipos#AIF J42: 20/07 Souris 2 (S2) JO. lipos#ACF J15; lipos#AIF J28: 05/07 J30 lipos#AIF J42: 20/07 Souris 3 (S3) JO. Papl#ACF J15: lipos#AIF J27: 20/07 J34 pepl#AIF J44: 06/08 J156: pepl#AIF J166: 06/12 Souris 4 (S4) JO. Pepl#ACF J15. lipos#AIF J27: 20/07 J34: pepl#AIF J44: 06/08 J156: pepl#AIF J166: 06/12 Souris 5 (S5) JO. pepl#ACF J15. pepl#AIF J27: 20/07 J34: pepl#AIF J44: 06/08 J156: Pepl#AIF J166: 06/12 Souris 6 (S6) JO. pepl#ACF J15. pept#AIF J27: 20/07 J34. pepl#AIF J44: 06/08 J156: pepl#AIF J166: 06/12 Séiums pié-immuns S1#S2 J.3. 05/06 J.3: 05/06 Séiums pié-immuns S1#S5 J.3. 20/06 J.3: 20/06 ACF: adjuvanl complel de Freund AIF: adjuvanlincomplel de Freund lipos: liposomes (100pl de liposomes par souris el par injection) pepl: peptide (25 g de peptide par souris el par lnjection) Contrôle des immunisations Les sérums des souris ont été prélevés tous les 10 jours après chaque rappel et testés sur cytospins (cellules SF9 sauvages et transfectées, cellules DU145) par une technique d'immunomarquage. TECHNIQUE D'lMMUNCNlARQUAGE DES CELLULES - environ 20 000 cellules sont projetées sur une lame de microscopie à l'aide d'une cytocentrifugeuse Shandon, - les cellules sont séchées à l'air, - fixation par une solution de 3,7% formaldéhyde, - rinçage par du PBS, - fixation dans du méthanol et de l'acétone à -20 C, - séchage à l'air et rinçage dans du PBS, - les péroxidases endogènes sont bloquées dans du PBS avec H2O2 à 0,3% (2 ml d'H2O2 à 30% dans 198 ml de PBS), - les sites non spécifiques sont saturés avec du sérum normal de chèvre, - les cellules sont incubées avec les surnageants utilisés purs, - après rinçage, les anticorps liés de façon spécifique sont révélés avec le complexe biotine avidine-peroxydase à l'aide d'un anticorps de liaison biotinylé chèvre anti-souris, - visualisation des complexes grâce à une réaction chromogénique qui utilise comme substrat la DAB (diaminobenzidine), - avant lecture les lames sont contrecolorées à l'hématoxyline. Les résultats montrent clairement une augmentation du titre sérique des sérums des souris S1 et S2 sur les cellules DU145. La réactivité observée sur les cellules SF9+ ( sauvages") est par contre restée faible témoignant d'un faible bruit de fond lors de cette technique enzymatique. Une fusion cellulaire à partir des splénocytes de souris S1 a donc été réalisée. Exemple 3 : Préparation des hybridomes 1) Fusion cellulaire S1 (souris immunisée avec des liposomes 5&alpha;R1): Trois jours avant la fusion 40 l de liposomes sous 150 pl de PBS stérile, ont été injectés par voie intraveineuse à la souris S1. 80 x 106 splénocytes ont été mis en présence de 20 millions de cellules myélomateuses de souris syngénique (myélome X63Ag8/653) et incubées selon la technique d'hybridation lymphocytaire de Koehler et Milstein (Nature 256. 445-447,1975) avec du polyéthylène glycol (PEG 1500 Sigma) à 40%. - nombre de plaques préparées 16 plaques de 96 puits en présence de 10000 macrophages péritonéaux de souris Balb/c par puits 384 puits (4 plaques) à 105 splénocytes par puits 384 puits (4 plaques à 5 x 104 splénocytes par puits 768 puits (8 plaques) à 2,5 x 104 splénocytes par puits Milieu utilisé : RPMI 1640 (BioWhittaker) + 20% sérum de veau foetal origine SVF MultiSer Cytosystem Australie n lot 203 271 13 + HAT concentration H100cim, A 0,4 m, T 16pm, N Glutamine concentration 2mN1 + antibiotiques concentration Peni 200 U/mL, Strepto 200 > g/mL (pénicillinestreptomycine). 2) Criblage Les puits dans lesquels un seul clone a poussé ont été identifiés et les surnageants prélevés. 320 surnageants ont été testés sur des cytospins de cellules fixées DU145 (contrôle positif) et SF9 + (contrôle négatif). 27 hybridomes ont ainsi été sélectionnés et congelés (tableau 1). Tableau 1 LISTE DES HYBRIDOMES ANTI-SaR 1 sélectionnés pour leur réactivité sur DU145 1 : 1D11 10 7G10 19 llD7 2 : 1E3 11 8C5 20 11F5 3 2D2 12 8D2 21 : 12A5 4 : 2D5 13 8H1 22 12B12 5 2E2 14 8H8 23 12G10 6 3C10 15 9C8 24 13D11 7 : 3D2 16 9H10 25 14C1 8 5B6 17 10C4 26 14C6 9 6H11 18 lIDI 27 : 15B6 Exemple 4 Une analyse de spécificité fine a été réalisée avec trois techniques complémentaires. a) réactivité sur les cellules fixées SF9 transfectées avec le cDNA de la 5&alpha;R1 par la technique d'immunomarquage. 11 hybridomes ont présenté une réactivité plus importante sur cellules DU145 et SF9 transfectées que sur le contrôle négatif, SF9 natives. Les surnageants de ces hybridomes ont ensuite été analysés en immunoblot. Tableau 2 REACTIVITE DES SURNAGEANTS DE CULTURE SUR CELLULES Hybridomes DU145 SF9/5 R1 SF9[+] 1 D 11 +++ +++ + 1 E 3 ++ + + 2D2 + + 2D5 +++ + + 2E2 + 3C10 + 3D2 + 5 B 6 + 6H11 + 7G10 + 8 D 2 ++ - 8 H 1 +++ ++ ++ 8 H 8 ++ + 9 C 8 +++ + 9 H 10 ++ +++ + 10 C 4 ++ + 11D4 + 11 D 7 ++ + 11 F 5 ++ ++ + 12 A 5 - - 12 B 12 +++ ++ + 12 G 10 ++ + 14C 1 +/- ++ + 14 C 6 + 15 B 6 ++ ++ + b) réactivité en immunoblot sur des extraits protéiques de SF9+ et de SF9 5&alpha;R1: TECHNIQUE D'IMMUNOBLOT SUR EXTRAITS PROTEIQUES:: - migration électrophorétique des protéines, - transfert des protéines sur nitrocellulose, - incubation des anticorps, - révélation des Ig de souris par un anticorps anti-Ig de souris couplé à la biotine, - addition de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline, - addition du chromogène. Résultats (tableau 3): Plusieurs surnageants d'hybridomes ont présenté une réactivité contre différentes protéines de poids moléculaire différent de la 5&alpha;R1. Au niveau attendu de la SaRi (29Kd) quatre anticorps ont présenté une réactivité: Tableau 3 IMMUNOBLOT SUR EXTRAITS PROTEIQUES Hybridomes SF9/SaR1 SF9 [+] 3D2 29kD BFà25kD 11 F 5 29kD 28-30 kD 12G10 29kD 13 D11 29kD BF = bruit de fond c) réactivité en ELISA sur le peptide (acides aminés 234 à 258 de la séquence codante de la 5&alpha;R1): TECHNIQUE ENLISA SUR PEPTIDE:COUPLAGE PASSIF 1) coating passif du peptide sur plaque ELISA en plastique rigide - "Coating" : 10 g de peptide "5&alpha;R1" par puits sur plaque ELISA en plastique rigide, fond rond (IMMULON 2 Dynatech) en tampon carbonatebicarbonate (capsule SIGMA ref: C 3441) dissoudre une capsule dans 100 ml d'eau distillée (solution finale : 0,5 M PH 9,6); distribution de 50 l par puits ; une nuit à 4 C, - 2 lavages en PBS-Tween 20 0,05%, - saturation avec du lait écrémé à 3% dans du PBS 200 l/puits; ; 1 h à Température Ambiante (TA), - 2 lavages en PBS-Tween 20 0,05%, - incubation avec 50 Ill/puits des échantillons (surnageants purs) sur la nuit à 4 C, - 3 lavages en PBS-Tween 20 0,05%, - incubation avec l'Ac IgG (H-L) de souris conjugué à la péroxidase (Jackson) référence 115-036-003 : dilution au 1/5000ème en PBS-BSA 0,1%. 50 sipuits; lh à TA, - 3 lavages en PBS-Tween 20 0,05%, - substrat Tampon de dilution du substrat : phosphate/citrate pHS avec du perborate de sodium (substitut de H202) ref Sigma P4922. Dissoudre une capsule dans 100 ml d'eau distillée. Substrat : O.P.D. ref Sigma P8287 à 0,8 mg/ml dans le tampon de dilution (1 pastille de 10 mg dans 12,5 ml) 50 l/puits; 10 min à TA et à l'obscurité. - arrêt de la réaction avec 50 pll/puits d'H2SO4 1M. - lecture à 492 nm. Test des 27 surnageants utilisés purs sur peptide coaté à 4 C ou à 37 C (résultats tableau 4). Tableau 4 TEST DES SURNAGEANTS SUR PEPTIDE COUPLE PASSIVEMENT PAR UNE TECHNIQUE ELISA Résultats exprimés en multiple de Bruit de Fond (BF). Densité Optique (DO). Fus. 5aR1 ooet@n@ è 37 c coeting A 4 c Hybridomes petide peptide 1 D 11 1.5 1.4 1 E 3 2 L 1,7 2 D 2 1,2 1.5 2 D 5 1,3 1,6 2 E 1 1,8 1,4 3 C 10 1,7 2,2 3 D 2 1,3 1,3 5 B 6 1,6 1,4 6 H 11 1,5 1,7 7 G 10 1,3 1,4 8 C s 1,7 2 8 8 D 2 1,5 8 H i 1.5 1,2 8 H 8 2 9 C 8 1,6 1,9 9 H 10 1,9 1,4 10 C 4 1,5 1,6 11 D 4 1,3 1,5 11 D 7 1,8 1,7 11 F 5 1,7 1,8 12 A 6 1,8 1,4 12 B 12 6 2 12 G 10 1,3 1,4 13 D 11 1,3 1,7 14 C 1 1,3 1,3 14 C 6 2 1,3 15 B 6 1,3 1,3 bruit d2 fond 0,117 0,141 D.O 2ème protocole ELISA peptide : couplage covalent du peptide sur le plastique: TECHNIQUE ELISA SUR PEPTIDE:COUPLAGE COVALENT - "Coating": Hybridomes testés: 1E3,2E2,3D2,8H1,9C8,14C6. Plaques CovaLink (Nunc, Cat n 478042). Quatre concentrations de peptide sont testées - 1,2 g de peptide+ 300 ng de NHS (Pierce, Cat n" 24510, lot 931021159), - 0,6 g de peptide + 150 ng de NHS, - 0,3 g de peptide + 75 ng de NHS, - 0,15 ijg de peptide + 37,5 ng de NHS, Volume final : 50 sl, en eau distillée. Ajouter 50 l par puits de EDAC (Sigma, Cat n E-7750, lot 23H0063). Laisser incuber 2 heures à température ambiante (TA). - 3 lavages en PBS, Tween 20 0,05%, 2M NaCl, 50 mM MgCl2, - incubation avec 50 zl/puits des échantillons (surnageants purs) 1h30 à TA, - 3 lavages en PBS, Tween 20, 0,05%, 2 M NaCI, 50 mM MgCl2, - incubation avec l'Ac anti IgG (H+L) de souris conjugué à la péroxidase (Jackson) référence 115-036-003 : dilution au 1/5000ème en PBS-BSA 0,1%. 50 pl/puits; 1h à TA, - 3 lavages en PBS-Tween 20 0,05%, - substrat Tampon de dilution du substrat : phosphate/citrate pH5 avec du perborate de sodium (substitut de H202) ref Sigma P4922. Dissoudre une capsule dans 100 ml d'eau distillée. Substrat : O. P. D. ref Sigma P8287 à 0,8 mg/ml dans le tampon de dilution (1 pastille de 10 mg dans 12,5 ml) 50 Ill/puits; 10 min à TA et à l'obscurité. - Arrêt de la réaction avec 50 l/puits d'H2SO4 1M, - Lecture à 492 nm, Résultats (tableau 5) Tableau 5 TEST ENLISA SUR PEPTIDE COUPLE PAR METHODE COVALENTE Surnageants testés Nb de fois le BF Nb de fois le BF sur peptide sur plaque non coatée 5aR11E3 2,8 1 5aR1 2E2 19 1 5&alpha;R1 3D2 1 1 SaR1 8H1 2 1 5&alpha;R1 9C8 2,3 1 5&alpha;R1 14C6 14 1 * Résultats a) 5aRl-3D2 réactif en immunoblot sur une protéine de 29kD. Cet hybridome a fait l'objet d'un clonage suivi d'un criblage réalisé à partir des valeurs de dosage des immunoglobulines dans les surnageants de clone. La réactivité des surnageants présentant la plus forte concentration en immunoglobuline a ensuite été contrôlée. Le clone le plus réactif : le 3D2/1F7 a été produit en quantité suffisante pour être injecté à des souris afin d'obtenir une dizaine de ml d'ascite. L'anticorps spécifique produit par le 3D2/1F7 a été isotypé comme une IgM. b) 5aR1-14C6 et 5aR1-2E2 Ces hybridomes ont été sélectionnés car leurs surnageants sont réactifs en ELISA sur le peptide couplé de façon covalente sur le plastique. Ces anticorps ne réagissent pas sur la protéine en immunoblot. Ces hybridomes ont été clonés. La réactivité des surnageants de clone présentant la plus forte concentration en immunoglobuline a ensuite été contrôlée. c) 5&alpha;R1-12B12 Le surnageant présente une réactivité forte sur cellule et un fort signal en ELISA sur peptide. Cet hybridome a été cloné. La réactivité des surnageants de clone présentant la plus forte concentration en immunoglobuline a ensuite été contrôlée. REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal spécifique dirigé contre la 5 Q réductase de type I. 2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué des anticorps secrétés par l'un des hybridomes: 3D2, 14C6, 2E2, et 12B12, qui présentent une réactivité en ELISA sur un peptide comprenant la séquence comprise entre les amino acides 234 à 258 de la séquence de la 5 Q R1, et/ou en immunoblot sur une protéine de 29 Kd. 3. Lignée cellulaire caractérisée en ce qu'elle produit un anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2. 4. Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il contient un anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2. 5. Procédé de diagnostic in vitro, de maladies androgénodépendantes, caractérisé en ce qu'on met en contact un échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2, marqué et qu'on dose la 5 Q réductase dans l'échantillon. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de tissus prostatiques en vue du diagnostic du cancer. 7. Procédé de production d'un anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que a) des cellules eucaryotes sont transfectées de manière à leur faire produire de la 5 Q réductase de type 1 recombinante, b) lesdites cellules sont récoltées, lysées puis remises en suspension, c) une solution de phospholipides est rajoutée à la suspension, de manière à provoquer la formation de liposomes, d) les liposomes, ayant encapsulé la 5 Q réductase, sont récupérés, puis injectés à des souris, pour leur faire produire des anticorps spécifiques de la 5 ce réductase de type 1.