FR 2729674 A1 19960726 FR 9500747 A 19950120 La présente invention concerne de nouvelles lignées cellulaires utilisables pour la production d'adénovirus recombinants défectifs. Elle concerne également les préparations virales purifiées produites dans ces lignées, ainsi que les plasmides permettant leur construction. Plus particulièrement, les nouvelles lignées cellulaires selon l'invention permettent la transcomplémentation de la région E4 et une production clonale avec des titres élevés d'adénovirus recombinants défectifs notamment pour tout ou partie de la région E4. Les adénovirus présentent certaines propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation comme vecteur de transfert de gènes en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adênovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et aL, Nature 361 (1993) 647), le foie staffe et al.. Nature genetics 1 (1992) 372), le système nerveux (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224). etc. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (rIR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceuxì, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5. Les génome de l'adènovirus Ad5 a été entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées. Pour leur utilisation en thérapie génique, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (égal, OTC, a-lAT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région El, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Ces adénovirus sont produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée.Plus précisément, la lignée 293 contient l'extrémité gauche (environ 11 12Q/o) du génome de l'adénovirtis sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela, Elb, et une partie de la région codant pour la protéine pIX. Cette lignée est capable de trans complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés Cependant, les vecteurs déficients pour la région El (vecteurs El-, dits de première génération) présentent certains inconvénients pour une utilisation thérapeutique.En particulier, ils pourraient ne pas être totalement défectifs pour la réplication in vivo, en raison notamment de l'existence de certaines fonctions cellulaires transcomplémentantes. Ainsi. une activité de transcomplémentation de El a été mise en évidence dans les cellules de carcinome embryonnaire F9 (Imperiale et al.. 1984). Une activité de même type, régulée par l'interleukine-6, a également éte mise en évidence (Spergel et al., 1992). D'autres inconvénients liés à ces vecteurs sont la présence de nombreux gènes viraux, susceptibles d'être exprimés in vivo auprès transfert de gènes, et d'induire une réponse immunitaire et/ou inflammatoire. Pour palier à ces inconvénients, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de liaison à 1'ADN (DBP) de 72kDa (Van der Vliet et al., 1975). Ces vecteurs peuvent également être produits avec des titres élevés dans les cellules de la lignée 293 à la température permissive (32 C). Toutefois, ce type de vecteur présente aussi un certain nombre d'inconvénients tels qu'une surexpression in vivo de la région E4; la présence d'une mutation ponctuelle, donc sujette à réversion, un risque d'activité partielle à 37 C, etc. Une autre approche pour remédier à ces problèmes réside dans la délétion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale. A cet égard, la demanderesse s'est intéressée plus particulièrement à la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits voir notamment la demande PCT/FR94/00851).Toutefois, la construction et rexploitation industrielle et thérapeutique de tels vecteurs implique la mise à disposition d'un système efficace de transcomplémentation de ces deux fonctions pour la production des stocks viraux. La présente invention apporte une solution à ce problème. La présente invention fournit en effet des lignées cellulaires permettant la transcomplémentation de la région E4 et une production clonale et avec des titres élevés d'adénovirus recombinants défectifs pour cette région. Les lignées selon l'invention sont avantageusement capables de transcomplémenter les deux fonctions El et E4, et permettent donc de produire des virus déficients pour ces deux fonctions. La présente invention fournit également des plasmides permettant la construction de ces lignées; un procédé de préparation d'adénovirus recombinants défectifs et des stocks viraux purifiés. Plus particulièrement, la demanderesse a maintenant montré que des lignées de production capables de transcomplémenter efficacement la région E4 sont obtenues par introduction d'une partie seulement de la région E4.Ainsi des lignées ayant des propriétés particulièrement avantageuses sont obtenues lorsque seulement une unité fonctionnelle réduite de la région E4, correspondant à la phase de lecture ORF6 ou aux phases de lecture ORF6 et ORF6/7, sont présentes. Un premier objet de l'invention réside donc dans un cellule utilisable pour la production d'adénovirus recombinants défectifs comprenant, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. Selon un mode préféré, les cellules de l'invention comprennent une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant les phases de lecture ORF6 et ORF6/7 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. Comme indiqué ci-avant, les lignées cellulaires selon la présente invention présentent des propriétés particulièrement avantageuses : Elles permettent tout d'abord la transcomplémentation des fonctions El et E4. Mais, de manière particulièrement avantageuse, elles sont capables d'induire la formation de plages de virus déficients dans ces fonctions, ce qui est indispensable au clonage des virus recombinants, puis à leur amplification et à leur purification. A cet égard, la demanderesse a en effet montré que des lignées possédant l'ensemble de la région E4 ou des unités fonctionnelles plus grandes, incluant par exemple la phase de lecture ORF4, sont incapables de former des plages de virus déficients pour la région E4. L'identification d'unités fonctionnelles spécifiques de la région E4 permet la réalisation d'un système très efficace de transcomplémentation et de production de virus défectifs pour les fonctions El et M. D'autres avantages des lignées selon l'invention sont notamment leur aptitude pour l'amplification en milieu liquide de tels virus déficients pour les régions El et M, les titres élevés de tels virus qu'elles produisent, et l'absence de production de particule virale réplicative contaminante. La région M du génome adénoviral est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 et ORF6/7 (figure 2). Comme indiqué ci-avant, les cellules de l'invention sont caractérisées particulièrement par la présence d'une partie seulement de cette région, correspondant à la phase de lecture ORF6 éventuellement associée à la phase de lecture ORF6,'7. Ces différentes parties de la région M peuvent être obtenues par coupures enzymatiques selon les méthodes connues de l'homme du métier. A titre d'exemples préférés, la phase de lecture ORF6 peut être isolée de la région E4 sous forme d'un fragment BglII-PvuII, correspondant aux nucléotides 34115-33126, et les phases de lecture ORF6-ORF6/7 peuvent être isolées de la région M sous forme d'un fragment BglII-BglII correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de l'Ad5. n est particulièrement important que la partie de la région M présente dans les cellules de l'invention ne contiennent pas la phase de lecture ORF4 fonctionnelle. A cet égard, un mode de réalisation particuliérement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment BglII BgllI correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de rAd5. Ce fragment est présent notamment dans le plasmide pORF6Gen décrit dans les exemples, utilisé pour la construction de la lignée cellulaire clone&num;2. Un autre mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment Bgln-PvuII correspondant aux nucléotides 34115- 33126 du génome de lAdS. La partie de la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'adénovirus de différentes origines ou sérotypes. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'un adénovirus d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement encore. parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemples. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande WO94/26914 incorporée à la présente par référence. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, la partie de la région E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, elle est issue du génome d'un adénovirus Ad2 ou Ad5. Comme indiqué précédemment, la partie de la région E4 présente dans les cellules de l'invention est placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans lesdites cellules. Avantageusement, il s'agit d'un promoteur inductible, permettant de contrôler les niveaux et/ou les périodes d'expression de ces gènes. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit du promoteur du LTR de MMTV (Pharmacia > , qui est induit par la déxaméthasone ou d'un promoteur régulé par la tétracycline (demande US publiée n"08/076,327; W094/04672). Il est entendu que autres promoteurs peuvent être utilisés, et notamment des variants du LTR de MMTV portant par exemple des régions hétérologues de régulation (régions "enhancer" notamment). Les cellules selon l'invention peuvent être préparées à partir de différentes cellules pharmaceutiquement utilisables, c'est-à-dire cultivables dans des conditions industriellement acceptables et n'ayant pas de caractère pathogène reconnu. ll pet s'agir de lignées cellulaires établies ou de cultures pnmaires. n s'agit avantageusement de cellules d'origine humaine, infectables par un adénovirus. A cet égard, on peut citer les cellules KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, etc Les cellules de la lignée KB sont issues d'un carcinome épidermique humain Elles sont accessibles à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les conditions permettant leur culture. La lignée de cellules humaines Hela est issue d'un carcinome de l'épithelium humain.Elle est également accessible à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture. Les cellules de la lignée 293 sont des cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). La lignée de cellules gm DBP6 ugh et al., Virology 190 (1992) 624) est constituée de cellules Hela portant le gêne E2 d'adénovirus sous le controle du LTR de MMTV. ll peut s'agir également de cellules d'origine canine (BHK, MDCK, etc). A cet égard, les cellules de la lignée canines MDCK sont préférées. Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9. Les lignées cellulaires selon l'invention peuvent être construites de différentes manières. De façon générale, elles sont préparées par transformation d'une culture cellulaire avec un plasmide portant le fragment sélectionné de la région E4 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. La transfection des cellules peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment en péseoce de phosphate de calcium, par électroporation, etc. Selon un mode particulier de réalisation, le plasmide utilisé porte également un gène marqueur permettant d'identifier et de sélectionner les cellules transformées. n peut s'agir notamment de tout gène de résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, etc).Le gène marqueur peut également être porté par une construction séparée, -transfectée avec le plasmide. Après transfection et sélection pour le gène marqueur, les cellules obtenues peuvent être sélectionnées pour leur capacité à transcomplémenter des adénovirus dépourvus de la région EA. Pour cela, différents adénovirus mutants défectifs pour différentes parties de la région E4 peuvent être utilisés, tels que notamment les adénovirus Ad2d1808 (Weinberg et al., 1986), Ad5dl1004, du1007 ou dl1014 (Bridge et al., 1989 > . dol1011 (Bridge et aI., 1993), comme indiqué dans les exemples. Avantageusement, les cellules selon l'invention sont également capables de transcomplémenter pour la région E 1. Celles-ci peuvent être construites comme décrit ci-avant à partir de cellules qui transcomplémentent déjà la région El (exemple cellules 293), ou par introduction séquentielle d'une construction apportant la région E 1 et d'une construction apportant la partie de la région E4 selon l'invention. Selon un mode particuliérement préféré, les cellules selon l'invention dérivent de la lignée cellulaire 293. A cet égard, des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec des cellules de la lignée 293 transformées par le plasmide pORF6Gen. La présente invention décrit également la construction de plasmides comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 ou 0RF6 et 0RF6/7 sous contrôle d'un promoteur inductible (voir notamment plasmide pORF6Gen). Ces plasmides peuvent être utilisés directement pour transfecter une population cellulaire choisie, puis, par sélection, pour l'identification de cellules ayant acquis stablement la fonction E4. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation des cellules décrites ciavant pour la production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4. L'invention fournit en effet un procédé de production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4 particulièrement avantageux, mettant en oeuvre les cellules ci-avant. Selon ce procédé, on transforme une culture de cellules telles que décrites ci-avant avec un ou plusieurs plasmides apportant les différentes régions du génome dudit adénovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits. Ce procédé est particulièrement avantageux pour la production d'adénovirus possédant des régions El et E4 non fonctionnelles. Il s'agit notamment de vecteurs dans lesquels les régions El et E4 ont été inactivées ou rendues non fonctionnelles par délétion totale ou partielle.De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situe par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. La ou lesdites modificatices génétiques peuvent être localisées dans une partie codante de la region, ou en d'une région codant, et par exemple dans les régions responsables de rvian et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes. La délétion peut être effectuée par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Selon un mode particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est utilisé pour la production d'adénovirus recombinants dans lesquels la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-Bgln allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n" M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. Dans un mode particulier, le procédé permet la production de vecteurs comprenant une délétion de la totalité de la région E4. Ceci peut être réalisé par excision d'un fragment MaeII-MscI correspondant aux nucléotides 35835-32720. Les lignées cellulaires selon l'invention sont en effet capables de transcomplémenter et d'amplifier des adénovirus portant tout type de délétion ou inactivation de la région E4. Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4 est délétée. Cette partie comprend au moins les phases ORF3 et ORF6. A titre exemple, ces phases codantes peuvent être délétées du génome sous forme de fragments PvuII AluI et BglII-PvuII respectivement, correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 respectivement. Les délétions de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dl1004. Ad5 dl1007, Ad5 elle11 ou Ad5 dl1014 peuvent également être utilisées dans le cadre de l'invention.A cet égard, les cellules de Invention sont particulièrement avantageuses pour la production de virus comprenant une région El inactive et une délétion dans la région M du type de celle présente dans le génome de Ad5 d11014. c'est-à-dire de virus E4- conservant la phase de lecture ORF4. Par ailleurs, les adénovirus produits peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres région peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ces effets secondaires liés à l'expression de gènes viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 ou IVa2 notamment peut être délétée. Concernant la région E3, il peut cependant être particulièrement avantageux de conserver la partie codant pour la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adénovirus fasse l'objet d'une réaction imrmmitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. Les adénovirus recombinants selon l'invention possédent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génétique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité (les risques de réaction immunitaire et/ou inflammatoire sont fortement réduits) et de capacité de transfert de gènes très élevées. Comme indiqué avant, les adénovirus constituent des vecteurs de transfert de gènes très efficaces pour des applications de thérapie génique et cellulaire. Pour cela. une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché peut être insérée dans leur génome. Cette séquence peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques, tels qu'un gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.Parmi les produits thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les Iymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, i, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAW. ApoE, etc (FR 9305125), la dysbFbine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII.IX. etc, les gènes suicides : Thynudine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab. ScFv, etc), etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles sequences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. 1l peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus Hnr, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotnce, il peut Sagir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. n peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissuspécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être inserée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur. Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion El. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 inactivée. La présente invention concerne également les préparations virales purifiées obtenues selon le procédé de l'invention, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs préparés selon ce procédé. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intrnasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. n peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, clone de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'irMection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure. généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Selon le gène thérapeutique. les adénovirus ainsi produits peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure : Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome. Figure2: Organisation génétique de la région M. Figure : Analyse de la production de la fibre adénovirale par détection immunologique à l'aide d'un sérum polyclonal contre la bibre (Boulanger et al.). Les extraits cellulaires sont préparés après 72h d'infection virale, la déxaméthazone est ajoutée en même temps que le virus (concentration finale 600 nM). (A) Infection par le virus dl1014 (MOI = 10); (B) Infection par le virus dl1001 (MOI = 1); Infection par le virus dli 004 (MOI = 10); (wt) Infection par le virus Ad5 (MOI = 10). Flgure : Inductibilité de E4 dans les cellules du clone &num;2. Analyse des extraits cellulaires non infectés (contrôle inférieur à 0) ou infectés par le virus dol007, 72 après infection. DM = déxaméthazone (600 nM). Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la Ineraure' [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "cures Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par élecrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoltchl ofofmes précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5 proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur.La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du pbage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. Il (1985) 8749-8764 en utilisant le kit distribué par Amersham. L amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR olymérase- catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Muslis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Exemple 1. Construction de plasmides portant différentes unités fonctionnelles de la région E4 sous contrôle d'un promoteur 1.1. Construction du plasmide pE4Gen Le plasmide pPY2 correspond au clonage du fragment Avr2-Sall (environ 1.3 kb incluant le promoteur du MMTV) du plasmide pMSG (Pharmacia) entre les sites Xbal et Sall du plasmide plC20H préparé à partir d'un contexte E. coli dam+. Le plasmide pPY4 dérive du plasmide pPY2 par délétion d'un fragment de 35 pb après coupure par BamH1 et Bgl2 puis religature. Le plasmide pPY5 correspond au plasmide pIC20H dans lequel le fragment Taql-Bgl2 incluant la région E4 de l'adénovirus de type 5 située entre les positions 35576 (Taql) et 32490 (Bgl2) > a été cloné entre les sites Clal et BamH1. La région E4 du plasmide pPY5 est donc incluse dans un fragment EcoRV-Sphl que l'on peut cloner après digestion partielle entre les sites Smal et Sphl du plasmide pPY4, ce qui génère le plasmide pPY6. L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY6 génère le plasmide pE4GelL Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et la totalité de la région E4 de l'adénovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives portées par le même brin d'ADN.Dans ce plasmide, le site principal 5' donneur pour l'épissage localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) est donc conservé pour assurer un épissage alternatif correct, permettant de générer les différents produits d'expression de toutes les phases codantes de la région E4 et de manière comparable à l'épissage alternatif observé lors du cycle viral. 1.2. Construction du plasmide pORF6Gen Le plasmide pPY13 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xbal du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC2OH. Ce fragment de 1.6 kb inclus donc la séquence de l'adénovirus de type 5 de la position 34115 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2. suivi du site Xbal provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H). Le plasmide pPY13 contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de l'adénovirus, maintenant incluses dans un fragment Xhol-Sphl. Le clonage de ce fragment entre les sites Sall et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY15.L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY15 génère le plasmide pORF6Gen. Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adénoviims exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN.Dans la mesure ou l'épissage alternatif est séquentiel et implique en premier lieu la reconnaissance du site 5' donneur. le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a donc pas été inclus dans la construction du plasmide pORF6Gen pour permettre ultkiewemfflt une expression efficace des produits des phases de lecture ORF6 et ORF6/7. 1.3. Construction du plasmide pORF4Gen Le plasmide pPY14 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xba1 de 1,9 kb (obtenu après digestion partielle par l'enzyme Bgl2), du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC20H. Ce fragment de 1.9 kb inclus donc la séquence de l'adénovirus de type 5 de la position 34387 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2, suivi du site Xbal provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H). Le plasmide pPY14 est donc isogénique au plasmide pPY13 à l'exception qu'il inclus en plus un fragment Bgl2 correspondant à la totalité de la phase ouverte de lecture ORF4. Ce plasmide contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture ORF4, ORF6 et ORF7 de l'adénovirus, maintenant incluses dans un fragment Xho1- Sphl. Le clonage de ce fragment entre les sites Sall et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY16. L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY16 génère le plasmide pORF4Gen.Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF4, ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adénovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN. Comme pour le plasmide pORF6Gen, le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a pas été inclus dans la construction du plasmide pORF4Gen pour permettre ultérieurement une expression efficace des produits des phases de lecture ORF4, ORF6 et ORF6n. Exemple 2 - Construction des lignées cellulaires Cet exemple décrit la construction de lignées cellulaires complémentantes pour les régions El et E4 des adénovirus selon l'invention. Ces lignées permettent la construction et la propagation d'adénovirus recombinants délétés pour ces régions, sans avoir recours à un virus helper. Les lignées de l'invention ont été construites par co-transfection des cellules choisies en présence de phosphate de calcium, par les plasmides décrits dans l'exemple 1 et une construction codant pour le récepteur aux glucoeorticoïdes (Hollenberg et al., 1985). Plus précisément, les cellules de la lignée 293 en boites de 5cm de diamètre ont été transfectées par 1 à 5 tcg de plasmide E4 (pE4Gen, pORF6Gen ou pORF4Gen) et éventuellement 5 pg d'un plasmide d'expression du récepteur humain aux glucocorticoides exprimé à partir du promoteur précoce du virus SV40 (plasmide pSG5HGR construit par le Dr R.Foy), en présence de phosphate de calcium, selon le protocole décrit par Graham et Van der Eb (Virology 52 (1973) 456). 2.1. Sélection des clones résistants à la généticine Après transfection des cellules, celles ci sont lavées, puis le milieu de culture (MEM, Sigma) supplémenté en sérum de voeu foetal (7% final) est ajouté et les cellules sont mises à incuber pendant 20 heures. Le lendemain, on sélectionne les cellules en présence de généticine à la concentration effective de 400 mg/l. La généticine est changée tous les trois jours et les clones sélectionnables apparaissent après environ 3 semaines. Quand toutes les cellules non transfectées sont mortes, seules les cellules ayant inséré le gène de resistance subsistent et se divisent pour générer des clones cellulaires. Quand les clones cellulaires sont suffisamment gros pour être visibles à l'oeil nu, ils sont individuellement transférer dans les puits de culture d'une plaque de culture "24 trous".Chaque clone est ensuite progressivement amplifié en présence de généticine d'abord dans les puits d'une plaque de culture "12 trous", puis "6 trous" pour etre ensuite amplifié en boites de culture cellulaires. Chaque clone cellulaire est alors conservé par congélation dans l'azote liquide. 2.2. Sélection des clones capables de produire des virus décifients pour E4. Les adénovirus Ad2d1808 (Weinberg et Ketner, J. Virol. 57 (1986) 833), Ad5dl1004, dl1007 ou d11014 (Bridge et Ketner, J. Virol. 63 (1989) 631), dIlOîl (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794) sont des mutants de délétion portant des délétions importantes au niveau de la région E4. Ces mutants sont incapables de se répliquer dans les cellules 293. mais peuvent être produits dans les cellules W162 (Weinberg et Ketner, PNAS 80 (1983) 5383). Dans une seconde étape, les 50 clones résistants à la généticine ont été testés pour leur capacité à produire ces virus E4- et donc à transcomplémenter la région M. Pour cela, chaque clone est infecté en milieu liquide par le virus dl808 à une multiplicité d'infection d'environ 0,1 PFU/cellule (le titre viral est obtenu sur la lignée W162). L'apparition d'un effet cytopathique amplifiable par réinfection successive des cellules par le lysat cellulaire obtenu est indicateur d'une certaine propagation virale de dl808 par les cellules du clone considéré. Cette transcomplémentation est ensuite objectivée à la fois par analyse du niveau de réplication virale et la faculté des cellules à former des plages virales (un protocole possible est décrit par Hitt, M.; Bett, AJ.; Prevec, L. et Graham, F.L. Coostron and propagation of human adenovirus vectors" in: Cell Biology; a LabofSy Handbook. Volume 1. J.E.Celis (Ed); Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA). p479490) après infection par d1808. Cette étape a permis de mettre en évidence 2 clones particuliers présentant des propriétés efficaces de transcomplémentation de la région E4. Le premier, désigné Clone&num;2, isolé après transfection du plasmide pORF6Gen; le second désigné Clone#4, isolé après transfection du plasmide pE4Gen. 2.3 Capacité à propager des adénovirus déficients pour El. La capacité des lignées préparées à complémenter la région El a été vérifiée après infection par l'adénovirus Ad-RSVBGal. Cet adénovirus de première génération (déficient dans El seulement), comprend le gêne LacZ de E.coli sous contrôle du promoteur du LTR du virus RSV (Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. InvesL 2û (1992) 626). Les cellules des clones &num;2 et &num;4 ont été infectées par le virus Ad RSVBGal et une propagation virale a été observée pour les deux clones. Ces résultats montrent que la capacité des cellules à transcomplémenter la région El n'a pas été affectée par l'introduction supplémentaire de la partie distale de la région E4 (clone &num;2) ou de la région E4 complète (clone &num;4). 2.4. Analyse en Southern et Northern blot pour vérifier l'intégration d'une unité M fonctionnelle dans le génome. Les cellules des clones &num;2 et &num;4 ont été analysées en Southern blot pour vérifier l'expression des protéines virales. Plus particulièrement, l'analyse en Southern Blot (analyse du DNA génomique hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adénovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par Maniatis et al. L'analyse en Northern Blot (analyse des ARNs cellulaires des clones 2 et 4 hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adénovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par Maniatis et al., les ARNs cellulaires polyadénylés ayant été préparés selon le protocole décrit par R.E. Farrell Jr. "RNA isolation strategies". in: RNA Methodologies; a Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA). p46-92). Ces analyses ont permis de montrer que ces 2 clones possèdent leur unité fonctionnelle E4 respective intégrée à raison de quelques copies par cellules. De plus, ces études démontrent que ces deux clones expriment la protéine de la fibre de l'adènovirus après infection avec les mutants de délétion Ad5dl1004, AdSdllOll et Ad5dl1014 (Figure 3). Cette protéine est une protéine tardive du cycle réplicatif et infectieux de l'adénovirus, dont la synthèse implique l'expression de E4. La présence de cette protéine dans les cellules infectées par les mutants E4- confirme que ces cellules expriment bien une activité E4 fonctionnelle. 2.5. Formation de plages Cette analyse montre clairement les propriétés particulièrement avantageuses des lignées selon l'invention. En effet, alors que les deux clones (clone&num;2 et clone&num;4) sont capables de transcomplémenter la région M et de propager avec une efficacité comparable les mutants Ad2d1808 ou Ad5dl1004 par exemple, ils présentent une différence très significative en ce qui concerne la formation de plages de virus après infection par les mutants Ad2dl808 ou Ad5dllO04. La capacité de former des plages de virus est une propnété essentielle des lignées de production. C'est en effet sous cette condition que des clones de virus recombinants peuvent être isolés, puis amplifiés et purifiés. Les résultats obtenus montrent clairement que la formation de plages de virus est toujours observée avec le clone#2, alors que cela ne se produit que rarement avec le clone&num;4. Ces résultats démontrent clairement les propriétés très supérieures des lignées de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. 2.6. Expression régulée de l'activité E4 Une autres propriété avantageuse du clone&num;2 selon l'invention réside le caractère régulé et inductible de l'expression de l'activité M. Ainsi, les résultats obtenus montrent que la formation de plages de virus n'est observée qu'en présence de déxaméthazone. De même, dans le clone#2, l'expression de la protéine de fibre de l'adénovirus après infection par le mutant Ad5dl1007 est significativement augmentée dans les conditions d'induction (figure 4). En revanche, I'expression de l'activité E4 dans le clone&num;4 est constitutive. L'ensemble de ces résultats démontre clairement les avantages des lignées cellulaires de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. Ces avantages résident en particulier dans la capacité à former des plages de virus et à permettre l'amplification des virus défectifs en milieu liquide. Ces avantages sont également dans le caractère régulé de l'expression de l'activité E4, contrairement aux lignées dans lesquelles des lmiîés fonctionnelles plus grandes de M sont présentes. Exemple 3 - Production de virus défectifs pour les fonctions El et E4 Cet exemple décrit l'utilisation des lignées cellulaires selon l'invention pour la production de virus recombinants déficients dans les régions El et E4. Ces adénovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co-transfection, dans les cellules de l'invention, de deux fragments d'ADN, l'un apportant la partie gauche du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région El), l'autre apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région E4). Plus précisément, les cellules 293E4 (clone&num;2 et #4) ont été cotransfectées par 10 mg de 1' ADN du virus Ad-RSVBGal (Stratford-Perricaudet et at) digéré par Srfl (ou 5 mg d'ADN du plasmide ayant servi à la construction de ce virus et digéré par Xmnl), et 10 mg de l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par exemple Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007 ou Ad5dl1014) digéré par l'enzyme Clal. Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont purifiés par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation de plages sur clone 2. Les plages correspondant à l'infection du virus recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion El et E4) sont alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les virus sont conservés à -80"C selon les techniques classiques de l'homme de l'art. Outre la faculté du clone 2 à faire des plages virales, il permet une propagation en milieu liquide particulièrement efficace pour le virus AD5dl1014 (E1+E4- mais ORF4+) ou pour le virus E1-E4- construit à partir du virus dl1014. Par contre le clone 4 obtenu après transfection du plasmide pE4Gen n'est pas très performant pour faire des plages car il a du mal à tenir la confluence cellulaire pendant un temps suffisamment long pour que les plages de lyse virale soient facilement repérables (et surtout si le virus recombinant recherché ne code pas pour la bgalactosidase). REVENDICATIONS 1 Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. 2. Cellule selon la revendication 1 caractérisée en ce que la partie de la région E4 comprend les phases de lecture ORF6 et ORF6/7. 3 Cellule selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la partie de la région E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C. 4. Cellule selon la revendication 3 caractérisée en ce que la région E4 est issue du génome d'un adénovirus Ad2 ou Ad5. 5. Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur inductible. 6. Cellule selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur MMTV et ses dénvés. 7. Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle dérive d'une cellule qui transcomplémente pour la région El. 8. Cellule selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle dérive de la lignée cellulaire 293. 9. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle dérive des cellules KB, Hela, MDCK, Véro ou gmDBP6. 10. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle dérive d'une culture de cellules primaires. 11. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, un fragment Bglll-Bglîl correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de lAdS. 12. Cellule selon la revendication 1 1 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la lignée 293 13. Cellule selon la revendication 11 ou 12 caractérisée en ce qu'il s'agit dune cellule de la lignée 293 transformée par le plasmide pORF6Gen. 14. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, un fragment BglII-PvuII correspondant aux nucléotides 34115-33126 du génome de l'Ad5. 15. Plasmide comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur inductible. 16. Plasmide selon la revendication 15 caractérisé en ce que la partie de la région E4 du génome d'adénovirus porte les phases de lecture ORF6 et ORF6/7. 17. Plasmide selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pORF6Gen. 18. Utilisation d'une cellules selon l'une des revendications 1 à 14 pour la production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4. 19. Procédé de production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4 caractérisé en ce que l'on transforme une culture de cellules selon l'une des revendications 1 à 14 avec un ou plusieurs plasmides apportant les différentes régions du génome dudit adénovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits. 20. Procédé selon la revendication 19 pour la production d'adénovirus recombinants défectifs pour les régions El et E4 21. Procédé selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules selon l'une des revendications 1 1 à 14. 22. Stock d'adénovirus recombinant défectifs purifié obtenu selon le procédé des revendications 19 à 21.