FR 2728897 A1 19960705 FR 9415848 A 19941229 PROCéDA DH PRODUCTION DB FRAKBINONB La présente invention a pour objet un procédé de production simple dan arôme par oxydation enzymatique catalysée par une alcool déshydrogénase. La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de production de frambinone à partir de frambinol. Les arômes correspondent à un secteur de lgindustrie alimentaire en pleine expansion. En effet les exigences des consommateurs relatives à la reproductibilité du goût et de arôme rendent nécessaire leutilisation arômes naturels et artificiels dans les produits alimentaires. Les arômes artificiels, dits de synthèse, présentent certains avantages par rapport aux arômes naturels. D'une part, il nBy a pas de contrainte d'approvisionnement et vautre part le coût de production dBun arôme artificiel est considérablement plus faible que celui dun arôme naturel. Il existe donc des besoins de procédés permettant d'obtenir des arômes artificiels à l'échelle industrielle, notamment de frambinone artificielle. Par ailleurs depuis quelques années le public se tourne de plus en plus vers les produits naturels, en particulier les arômes dits naturels ou dits identiques à la nature. L'obtention de ces produits est difficile, et leur extraction est souvent onéreuse. Les industriels sont donc également amenés à chercher des précurseurs de ces produits facilement accessibles et peu coûteux afin obtenir des produits naturels à haute valeur ajoutée. Mais pour conserver le label naturel ces produits ne doivent pas être obtenus par des réactions de synthèse organique à partir de ces précurseurs. I1 existe donc également un besoin dun procédé permettant, à partir d'un précurseur naturel, d'obtenir un arôme naturel ou identique à la nature, notamment un arôme de fruits et plus particulièrement de framboise, et ce de façon simple et peu coûteuse. Ainsi, on recherche un procédé de préparation d'arômes qui trouve à s'appliquer tant à des précurseurs naturels que de synthèse. En particulier, on recherche un procédé pour la préparation de l'arôme de framboise, connu sous le nom de frambinone. La frambinone est un composé connu, et est aussi désignée dans la littérature sous le nom de 4- 4-(para- hydroxyphényl)-2-butanone, ou raspberry ketone en anglais. On connaît à l'heure actuelle deux voies permettant la synthèse de cette cétone. La première voie consiste en la condensation de p-hydroxy-benzaldéhyde avec de l'acétone, suivie de l'hydrogénation de l'intermédiaire produit en frambinone. La seconde voie consiste en la condensation de méthyl-vinyl-cétone avec du phénol. Seule la première voie est actuellement utilisée à l'échelle industrielle. Le frambinol, précurseur naturel de la frambinone, est aussi un composé connu per se. Le frambinol est également identifié dans la littérature sous les noms de rhododendrol ou bétuligénol. Virinder S. Parmar et al (J.Chem. Soc.Perkin Trans 1, pp 2687-2689, 1991) décrivent la détermination de la configuration absolue de l'épi-rhododendrine et de sa forme aglucone le (-)rhododendrol et il est indiqué que ces composés ont été initialement isolés à partir de feuilles de Rhododendron Chrysanthym. L' isolement à partir de framboises du 4' -0--D-glucopyranoside de 4- (4. -hydroxy-phényl)butane- 2-one et du 3-0-ss-D-glucopyranoside de 4-(3',4'- dihydroxyphenyl)butane-2-one est décrit par Anni Pabst et al.dans Phytochemistry, Vol 29, n012, pp 3853-3858, 1990. La synthèse par voie enzymatique du rhododendrol à partir du frambinol a également été décrite dans JP 90188641 relatif à l'obtention de (S)rhododendrol par utilisation de levure de boulanger, dans JP 90-45287 relatif à l'obtention de (S)rhododendrol par utilisation de callus d'Acer nikoense, et dans JP 91-311663 relatif à la préparation de (S) rhododendrol par utilisation d'une déshydrogénase de callus d'Acer nikoense. La catalyse enzymatique d'une réaction d'oxydation d'un alcool en cétone est connu per se. En effet, l'utilisation d'enzymes et notamment d'une alcool déshydrogénase pour réaliser des réactions d'oxydo-réduction est décrite dans de nombreux documents de l'art antérieur, bien que les recherches aient été plus particulièrement focalisées sur les réactions de réduction. L'article de J.B. Jones et al ( CAN. J. CHEM., Vol. 55, pp 2685-2691,1977) représente une étude générale réalisée sur les alcool déshydrogénases et il est décrit plus particulièrement que l'alcool déshydrogénase de foie de cheval, dénommée ci-après HLADH, catalyse les réactions d'oxydo-réduction d'un large spectre de substrats comprenant les alcools, les aldéhydes, les cétones et qu'elle favorise certaines réactions stéréospécifiques. L'article de Hans w. Adolph et al (Eur J. Biochem. 201, pp 615-625, 1991) concerne l'étude de la spécificité de substrat et de la stéréosélectivité de la HLADH. Il est connu d'autre part que les réactions doxydo- réduction catalysées par les alcool-déshydrogénases nécessitent un cofacteur spécifique de l'enzyme qui est consommé au cours de la réaction. Il peut donc s'avérer intéressant de régénérer ce cofacteur. Les systèmes permettant la régénération des cofacteurs sont largement décrits dans la littérature. Alors que la régénération des cofacteurs réduits est relativement répandue, celle des cofacteurs oxydés reste moins étudiée (Chenault et Whitesides Appl. Biochem. Biotechnol, 14, pp 147-197, 1985; L.G.Lee et al J. Am. Chem. Soc., 107, pp 6999-7008, 1985). L.G.Lee et al dans J. Am. Chem. Soc., 107, pp 6999-7008, 1985 décrivent une étude comparative de trois types de systèmes enzymatiques de régénération de NAD+ à partir de NADH pour une utilisation dans une synthèse organique à une échelle industrielle catalysée par une enzyme. Le premier système, et le plus couramment utilisé, comprend l'utilisation d'un oxydant organique le 2-oxoglutarate avec catalyse par une glutamate déshydrogénase. Le second comprend du dioxygène utilisé en tant qu'oxydant terminal avec un colorant correspondant à un accepteur d'électron intermédiaire et la diaphorase en tant que catalyseur. Le troisième est basé sur l'utilisation d'un oxydant inorganique le ferricyanure et de diaphorase en tant que catalyseur.L'utilisation de ces systèmes dans la conversion du cis-cyclohexanediméthanol en (+)-[lR,6Si-cis-8- oxabicyclo[4.3.0]nonane-7-one par la HLADH est notamment décrite. H. Keith Chenault et al dans Bioorganic Chemestry 17, pp 400-409, 1989 décrivent l'utilisation de la lactate déshydrogénase (LDH) couplée aux acides pyruvique et glyoxylique en tant qu 'oxydant comme système de régénération du NAD+ in situ, par exemple dans la cas de la conversion du cis-1,2-bis(hydroxyméthyl)cyclohexane en (+)-(1R-6S)-cis-8- oxabicyclo-[4-3-0]nonane-7-one par la HLADH. Dale G. Drueckhammer et al dans J. Org. Chem., 50, pp 5387-5389, 1985 décrivent un système efficace de régénération du NAD(P) basé sur la FMN réductase pour être utilisé dans les synthèses enzymatiques. Son utilisation dans l'oxydation catalysée par la HLADH du 3-méthyl-1,5-diol est notamment décrite. V.D.Westerhausen et al ( Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 31, n011, pp 1529-1531, 1992) décrivent un système de régénération non enzymatique pour le NADH et le NADPH avec le [(C5Me5)Rh111(bpy)(H2O)]C12 et des complexes similaires utilisés en tant que catalyseurs rédox homogènes et soit une électrode soit du formiate en tant que donneur. Ce système est appliqué à la réduction de la 4-phényl-2-butanone par la HLADH, et il est indiqué qu'il conduit à de meilleurs résultats que les systèmes utilisant un couplage du substrat avec les co-substrats tel que méthanol. Aucun des documents de l'art antérieur ne décrit ni ne suggère la présente invention telle que définie ci-après. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de production de frambinone, comprenant l'étape d'oxydation catalytique de frambinol par la HLADH, en présence de cofacteur NAD+. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l'invention, la réaction d'oxydation est mise en oeuvre avec un rapport des concentrations molaires frambinol/cofacteur de 1 à 104, de préférence de 1 à 100, et un rapport des concentrations molaires frambinol/HLADH de 103 à 109, de préférence de 103 à 105. Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé selon l'invention, la réaction d'oxydation est mise en oeuvre en solution aqueuse tamponnée à un pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 8 et 9, à une température de 4 à 600C, de préférence de 25 à 400C. Selon une première forme de réalisation du procédé selon l'invention, le frambinol est un frambinol d'origine naturelle, tel qu'obtenu par hydrolyse d'un extrait de rhododendron ou d'un extrait d'écorce de bouleau par la ss-D- glucosidase. Selon une seconde forme de réalisation du procédé selon l'invention, le frambinol est un frambinol de synthèse. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l'invention, le frambinol est choisi dans le groupe consistant en les isomères R et S, et le mélange racémique. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l'invention, ladite étape d'oxydation catalytique par la HLADH en présence de NAD+ est couplée à une étape de régénération du cofacteur NAD+ utilisant de lacétaldéhyde en tant que co-substrat. On ne sortirait pas du cadre de la présente invention si, outre les ajouts continu ou discontinu au mélange réctionnel de frambinol, et/ou d'acétaldéhyde, on ajoutait de l'enzyme ou du NAD+ en discontinu. La présente invention va à présent être décrite de façon plus détaillée, en référence aux figures. La figure 1 représente la réaction d'oxydation du FOH en FC=O selon la présente invention; La figure 2 représente le mécanisme de la réaction d'oxydation de frambinol en frambinone par la HLADH couplée au système de régénération du NAD+ selon la présente invention; La figure 3 représente une comparaison de l'activité de la HLADH sur deux frambinols, l'un étant en configuration R (origine naturelle) et l'autre étant un racémique (de synthèse); La figure 4 représente l'influence du tampon et du pH; Les figures 5(a), 5(b), et 5(c) représentent respectivement l'activité de la HLADH dans les tampons borate, phosphate et triéthanolamine; La figure 6 représente une comparaison de l'activité de la HLADH dans les tampons phosphate et triéthanolamine, pour un pH de 8,5.Le courbe montre aussi que des ajouts de cofacteur ou d'acétaldéhyde au cours de la récation permettent d'améliorer le pourcentage de conversion du frambinol, et que divers tampons peuvent être utilisés. Les produits de départ et conditions opératoires sont plus particulièrement décrits ci-après. Préparation et purification du frambinol. Le frambinol naturel est extrait à partir d'écorce de bouleau et de rhododendron selon le procédé d'extraction décrit dans une note de A. SOSA, compte rendu de l'Académie des sciences, 196, 1827 (1933). 1 kg d'écorce fraîche de bouleau blanc (Betula alba L.) est épuisé à l'alcool éthylique à une température de 800C pendant 20 minutes. Les écorces épuisées sont broyées et traitées par de l'alcool neuf. Les phases organiques réunies sont évaporées et le résidu est repris par de l'eau à 45"C afin de précipiter une quantité importante d'un produit essentiellement constitué de bétuline. Après filtration la solution aqueuse est lavée à l'éther éthylique puis additionnée de magnésie calcinée (100 g par kg d'écorce fraîche). La pâte obtenue est séchée à l'étuve puis épuisée par de l'alcool éthylique bouillant. Après concentration de l'alcool, le résidu est repris par de l'acétate d'éthyle bouillant. Le glucide cristallise par refroidissement. Il est purifié par cristallisation dans l'eau. Le rendement est d'environ 3 g par kg d'écorce fraîche. Le frambinol est obtenu classiquement par hydrolyse par la B-D-glucosidase. L'extrait obtenu est ensuite purifié par "chromatographie flash" dans les conditions suivantes. 2g de frambinol (10 à 20 ml de solution méthanolique) obtenu comme précédemment sont chargés sur une colonne de 200 g de gel de silice 60. L'élution est réalisée par un mélange dichlorométhane/méthanol = 98/2 (vol/vol). Le rendement est de 62%. Le pouvoir rotatoire spécifique du frambinol naturel purifié à partir d'écorce de bouleau, déterminé sur une fraction pure à 100 %, est: [(Z] 20 = - 15,8 tandis que (a] 20 D théorique = - 170. Le frambinol chimique racémique est obtenu par synthèse chimique classique. Conversion du frambinol en frambinone. Les enzymes utilisées correspondent à la HLADH de Boehringer (102741) et à la HLADH de Sigma (A6128). La première source est préférée. Le NAD+ est disponible chez Boehringer. Le frambinol naturel est issu d'écorce de bouleau; le frambinol de synthèse est obtenu par réduction chimique de la frambinone par un borohydrure de sodium selon un protocole de réduction classique. On utilise de l'acétate d'éthyle comme solvant de récuparation du frambinol. La réaction selon l'invention est mise en oeuvre dans un milieu tamponné à un pH de 7,8 à 9,6. Tout système tampon présentant un pouvoir tampon dans cette gamme de pH peut être utilisé, par exemple: tampon borate, phosphate, triéthanolamine, etc. La température réactionnelle utilisée est de 25 à 400C. Généralement le rapport molaire frambinol/HLADH est de 7,1 x 103 et le rapport molaire frambinol/cofacteur est de 25. Il est également possible d'utiliser des formes moins purifiées de l'enzyme HLADH telles que par exemple des poudres issues de précipitations acétoniques de broyats de foies de cheval. Pour diminuer le coût du procédé, il est préférable de régénérer in situ le NAD+ pour éviter de l'utiliser en quantité stoechiométrique. La régénération du cofacteur NAD+ peut éventuellement être couplée à la réaction d'oxydation. Elle comprend l'utilisation d'acétaldéhyde en tant que cosubstrat. L'acétaldéhyde est réduit en éthanol par la HLADH. La réaction peut être mise en oeuvre dans tout système de réacteur approprié selon un mode continu ou discontinu, un système fonctionnant en continu étant préféré. L'acétaldéhyde est de préférence ajouté en continu ou par parties de façon à éviter tout problème possible d'inhibition de la réaction. Le frambinol peut être ajouté par parties ou en continu dans le mélange réactionnel. Il peut être avantageux de rajouter de 1enzyme et/ou du NAD+ au cours de la réaction. Le produit de la réaction peut également être soutiré en continu ou par parties du mélange réactionnel par soutirage d'une partie du milieu réactionnel et séparé du frambinol par tout procédé classique et approprié de séparation par exemple par HPLC isocratique. La présence d'éthanol et d'acétaldéhyde ne posent pas de problème particulier, ces produits étant beaucoup plus volatils. Un recyclage après séparation des divers produits est aussi envisageable.L'enzyme peut être utilisée sous une forme immobilisée ou sous une forme libre, cette dernière correspondant à la forme préférée. Des modes de réalisation particuliers de la présente invention vont à présent être décrits dans les exemples qui suivent, ces derniers étant donnés à des fins purement illustratives et non limitatives. Dans ces exemples, le frambinol est désigné par FOH, tandis que la frambinone est désignée par FC=O. Exemple 1 Conversion du R-frambinol et du mélange racémique de frambinol, sans système de régénération. Les conditions opératoires utilisées sont les suivantes: HLADH Boehringer = 0,5U/ml; frambinol = 5 mM; NAD+ = 5 mN; tampon phosphate à 50mM pH 7,8, à 250C. La réaction d'oxydation est réalisée dans des tubes à hémolyse bouchés, avec un système d'agitation. Le volume total est de 2 ml. La réaction est amorcée par l'ajout de enzyme. L'activité enzymatique est déterminée par prélèvement de 100 gl de milieu réactionnel régulièrement et dilution dans une solution qui stoppe la réaction (mélange eau/acétonitrile/acide acétique = 75/25/0,5, vol/vol/vol) puis analyse par HPLC du mélange obtenu dans les conditions suivantes: Colonne HPLC C 18 KROMASIL 0,46 x 22 cm; Précolonne RP 18; Débit = 1.5ml/min; Volume injecté = 20R1; Eluant: eau/acétonitrile/acide acétique, 75/25/0,5, en volume; Temps de rétention: Frambinol (FOH) (166.22g/mol): 5 min Frambinone (FC=O) (164.20g/mol: 7min e = 1662 cm 1 M-1; Longueur d'onde de détection = 275 nm; On obtient alors le pourcentage de conversion comme suit Aire de FC=O Conversion (%) = ----------------------------- x 100 (Aire de FC=O + Aire de FOH) Les résultats de cette expérience sont représentés graphiquement à la figure 3. On constate que l'isomère R est oxydé mais moins rapidement que le mélange racémique, ce qui signifie que l'isomère S est un meilleur substrat pour la HLADH. ExemPle 2 Conversion réalisée à différents pH, sans système de régénération. Le pourcentage de conversion du frambinol a été déterminé pour différents tampons dans les conditions suivantes: HLADH Boerhinger = 0,5U/ml, frambinol = 3 mM, NAD+ = 5mM, tampon 50mM, 250C, durée de réaction 21 heures. Le tampon est un tampon glycine, un tampon phosphate, ou un tampon Tris. L'activité de l'enzyme est déterminée selon les procédés décrits dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés à la figure 4. I1 conviendra de tenir compte, en ajustant le pH, de la variation de la stabilité de l'enzyme en fonction du pH. exemple 3 étude du procédé de conversion selon la présente invention, dans différentes conditions opératoires. Les réactions de conversion sont réalisées dans les conditions suivantes: Conditions 1: HLADH 0,2U/ml, NAD+ = 400pM, pH=8,5, tampon phosphate 0,1M, 400C, 45 heures. Conditions 2: HLADH 0,4U ajoutée en 2 fois, NAD+ = 400 M, acétaldéhyde: 24mM ajoutés en 12 fois, tampon triéthanolamine 0,1M pH=8,5, 400C, 150 heures. Conditions 3: HLADH 0,4 U ajoutée en 2 fois, acétaldéhyde ajouté en continu à l'aide d'une seringue à raison de 2 mM/h, NAD+ = 400 M, tampon phosphate pH= 8,5, 0,lM, 350C. L'activité enzymatique déterminée selon les méthodes décrites dans l'exemple 1 conduit aux résultats suivants: conditions FOH mg/ml FC=O mg/ml % de con oPératoires vers ion 1 1,7 1,1 65 2 1,2 0,96 80 3 ~ 1,7 1,24 ~ 73 Ces résultats montrent qu'on peut obtenir jusqu'à lg/l de frambinone en solution. Exemple 4 Conversion avec système de régénération du NAD+ réalisée à différents pH. Le procédé de conversion du frambinol en frambinone selon la présente invention est réalisé en présence du système de régénération du NAD+ pour différents tampons: le tampon borate, le tampon phosphate et le tampon triéthanolamine, les trois pH considérés sont 8, 8,5 et 9. Les conditions opératoires sont les suivantes: - HLADH sigma = 0,2U/ml dans un tampon 100 mM à 40 C, frambinol = 7mM, NAD+ = 400WM, acétaldéhyde = 2 mM puis 2 sont rajoutés après chaque prélèvement (16 mM au total). Les résultats sont illustrés aux figures 5(a), 5(b) et 5(c). On observe que pour un pH = 8,5 les conditions de conversion sont bonnes dans les tampons phosphate et triéthanolamine (30% de conversion en 6h). Une seconde expérience est réalisée à ce pH avec ces deux tampons pour une plus longue durée. Les conditions réactionnelles sont les suivantes: - HLADH sigma = 0,2U/ml dans un tampon 100 mM à 400C, pH =8,5; frambinol = 7mM, NAD+ = 400 M; acétaldéhyde = 2 mM puis 2 mM sont rajoutés après chaque prélèvement (24 mM au total). La mesure de l'activité enzymatique selon les méthodes décrites à l'exemple 1 montre que, après 30h, 50% de frambinol sont transformés dans ces deux tampons. Un rajout d'enzyme et de cofacteur a été effectué. Ces résultats sont illustrés à la figure 6. Ils montrent qu'après environ 25 heures, l'enzyme et le cofacteur sont des composants limitants pour l'oxydation du frambinol. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de frambinone, comprenant l'étape d'oxydation catalytique de frambinol par la HLADH, en présence de cofacteur NAD+. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la réaction d'oxydation est mise en oeuvre avec un rapport des concentrations molaires frambinol/cofacteur de 1 à 1041 de préférence de 1 à 100, et un rapport des concentrations molaires frambinol/HLADH de 103 à 109, de préférence de 103 à 105. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la réaction d'oxydation est mise en oeuvre en solution aqueuse tamponnée à un pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 8 et 9, à une température de 4 à 600C, de préférence de 25 à 400C. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le frambinol est un frambinol d'origine naturelle. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le frambinol est un frambinol de synthèse. 6. Procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le frambinol est choisi dans le groupe consistant en les isomères R et S, et le mélange racémique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite étape d'oxydation catalytique par la HLADH en présence de NAD+ est couplée à une étape de régénération du cofacteur NAD+ utilisant de lacétaldéhyde en tant que co-substrat.