FR 2726764 A1 19960515 FR 9413606 A 19941114 Adjuvant pour composition vaccinale La présente invention est relative au domaine des compositions vaccinales. Plus particulièrement, I'invention concerne de nouveaux adjuvants utilisés pour augmenter l'immunogénicité de compositions vaccinales. Il existe une grande quantité d'antigènes qui, injectés chez l'animal, vont provoquer une fabrication d'anticorps qui leur sont spécifiques. Un des principes de la vaccination est de stimuler la fabrication d'anticorps par l'organisme d'un homme ou d'un animal, en lui administrant des antigènes choisis. Les anticorps ainsi fabriqués permettront, ensuite, à l'organisme de se défendre contre une infection ultérieure. Cependant, certains antigènes n'entraînent pas de stimulation suffisante du système immunitaire lorsqu'ils sont administrés seuls. Il est donc nécessaire de leur adjoindre un adjuvant qui va permettre d'augmenter la réponse immunitaire de l'organisme afin d'obtenir une quantité d'anticorps suffisante pour être protectrice. Parmi les adjuvants connus, on peut citer l'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium qui sont utilisés habituellement dans les vaccins humains. Cependant, ces composés ne possèdent pas de propriété adjuvante vis-à-vis de tous les antigènes. Ils ne permettent notamment pas d'augmenter l'immunogénicité du vaccin contre la grippe. II est donc nécessaire de pouvoir disposer d'adjuvants qui permettent d'augmenter l'immunogénicité des antigènes administrés dans une composition vaccinale, sans aucun risque de toxicité. Pour atteindre ce but, I'invention propose un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire, pour son utilisation comme adjuvant dans l'administration d'une composition vaccinale. L'invention a également pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé amphipathique possédant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire pour la fabrication d'une composition vaccinale. L'invention a encore pour objet un produit contenant au moins un antigène et un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en vaccination. Un autre objet de l'invention est une méthode d'induction d'une réponse immunitaire chez un mammifère, consistant à administrer au mammifere au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer en outre au moins un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire. Au sens de la présente invention, le terme amphipathique désigne un composé qui possède à la fois une portion hydrophobe et une portion hydrophile. Parmi les dérivés de stérol pouvant conduire aux composés selon l'invention, on peut citer le cholestérol, le phytostérol, I'ergostérol. Les dérivés de cholestérol conviennent particulièrement bien. Le groupement polaire des composés amphipathiques selon l'invention peut être constitué par un groupement anionique, un groupement cationique ou un groupement saccharidique. Un groupement cationique tel qu'un ammonium quaternaire ou une amine protonable est particulièrement adapté. Le groupement lipophile est relié au groupement polaire grâce à une liaison ester, éther, amide ou carbamoyle parmi lesquelles les liaisons ester, amide et carbamoyle présentent l'avantage d'être hydrolysables dans la cellule. La liaison entre les 2 groupements est réalisée de préférence par l'intermédiaire d'un bras espaceur constitué par une chaîne alkylique linéaire ramifiée ou non comprenant de 1 à 20 atomes de Carbone. Parmi les composés convenant aux fins de l'invention, on peut citer: -I'iodure de cholestéryl-3ss-carboxamidoéthylènetriméthylammonium, - la cholestéryl-3 -carboxyamidoéthylènamine, - I'iodure de cholestéryl-3ss-oxysuccinamidoéthylènetriméthylammonium, - le 3 -[N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl] -cholestérol, - le 3J3-[N-(polyéthylênamine)-carbamoylj-cholestérol. parmi lesquels le 3 -[N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl]cholestérnl est particulièrement avantageux. Les composés amphipathiques selon l'invention peuvent être obtenus par condensation entre un dérivé de stérol et un composé à groupement polaire, selon une des méthodes décrites dans "Advanced Organic Chemistry" Part B : Reactions and Synthesis (F.A. Carey and R.J. Sundberg - Plenum Publishing Corp.). Plus particulèrement, on peut réaliser certains des composés selon l'invention selon les méthodes décrites dans le brevet US 5 283 185. Les composés amphipathiques obtenus en solution alcoolique peuvent, ensuite, être dispersés dans de l'eau ou dans un tampon aqueux et conduire à une suspension de micelles ou de liposomes. Avantageusement, les composés amphipathiques de l'invention sont associés à un lipide neutre tel qu'un phospholipide, par exemple la dioleoyl phosphatidyléthanolamine (DOPE) ou la dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC). Cette association conduit les composés amphipathiques selon l'invention à s'organiser sous forme de liposomes plutôt que de micelles lors de la phase de dispersion dans un environnement aqueux. La proportion molaire de lipide neutre associé aux composés amphipathiques est, de préférence, supérieure à 20 %. Les produits obtenus selon l'invention n'ont conduit à aucune réaction de toxicité aigüe lors de leur inoculation à des souris. L'antigène utilisé pour induire une réponse immunitaire protectrice est constitué par n'importe quel antigène utilisé habituellement dans une composition vaccinale, que ce soit seul ou en combinaison avec un autre antigène. De façon particulière, les composés amphipathiques selon l'invention se révèlent de bons immuno-adjuvants lorsqu'ils sont associés au vaccin contre le virus de la grippe qui comprend notamment : la protéine HA qui est une hémagglutinine située à la surface de l'enveloppe du virus Influenza, la protéine NP qui est une nucléoprotéine de capside liée à l'ARN viral et une protéine M ou "matrice" protéique de l'enveloppe. L'association entre l'antigène dont on veut accroître l'immunogénicité et la suspension micellaire ou liposomale de composés amphipathiques est réalisée spontanément par interaction hydrophobe et électrostatique lors du mélange des constituants. Les compositions vaccinales obtenues présentent une bonne stabilité. Cependant, la suspension liposomale semble préférable à la suspension micellaire. En outre, la suspension liposomale est stérilisable par filtration et lyophilisable. Il est évident qu'il est possible d'ajouter aux compositions vaccinales obtenues des éléments utilisés classiquement dans les vaccins, tels que de l'eau, du sérum physiologique ou une substance tampon. L'administration des compositions vaccinales obtenues selon l'invention peut être effectuée par toutes les voies habituellement utilisées pour l'administration de vaccins et, notamment, par voie sous-cutanée. Il est possible d'administrer, de façon séparée, la composition comprenant l'antigène et la composition contenant les composés amphipathiques selon l'invention; cependant, I'administration d'une composition liposomale de composés amphipatiques selon l'invention associés à l'antigène permet non seulement d'augmenter la réponse immunitaire de type humorale, mais aussi d'induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques. L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs qui suivent, en référence aux figures. La figure 1 illustre le schéma de réaction de la fabrication du DC chol. Les figures 2 à 6 illustrent les résultats des tests d'induction des lymphocytes T cytotoxiques pour chaque groupe de souris mentionné à l'exemple 8. Exemple 1 svnthése de 3B-lN-(N'.N'-diméthvlaminoéthane)-carbamowll- cholestérol oec chol) 2.3 me Le DC chol est synthétisé par réaction de cholestéryl chloroformate et de N,Ndiméthyléthylènediamine selon le schéma de la figure 1, ainsi que cela est décrit dans l'article de X. Gao et L. Huang (BBRC 179 (1): 280-285). Une solution de cholestéryl chloroformate (2,25 g, 5 mmol dans 5 ml de chloroforme sec) est ajoutée goutte à goutte à une solution en excès de N,Ndiméthyléthylènediamine (2 ml, 18.2 mmol dans 3 ml de chloroforme sec) à 0 C. Après extraction du solvant par évaporation, le résidu est purifié par 2 recristallisations successives dans de l'éthanol absolu à 4"C et séché sous vide. On obtient alors 0,545 g de DC chol sous forme de poudre blanche. La structure du composé a été vérifiée par RMN et spectrométrie de masse. Les résultats obtenus sont conformes aux données publiées dans l'article cité ci-dessus. Exemple 2 : préparation d'une composition vaccinale contre le virus de la erippe, à partir d'une suspension micellaire de DC chol 2s3 mg 30 mg de DC chol obtenu selon l'exemple 1 sont dissous dans 100 Cil d'éthanol. 75 Cll de la solution ainsi obtenue sont injectés par l'intermédiaire d'une seringue Hamilton dans 3 ml d'eau maintenue sous agitation à 45"C. Après 5 minutes d'agitation supplémentaire à 45"C, la suspension micellaire obtenue est mélangée à 200 1ll du vaccin monovalent contre le virus de la grippe (souche A Singapour) comprenant notamment comme antigènes: I'hémagglutinine HA, la nucléoprotéine NP et la protéine M. Le mélange obtenu est fractionné en doses vaccinales de 0,3 ml. Chaque dose comprend 5g de HA et 2,3 mg de DC chol. Exemple 3 : Préparation d'une composition vaccinale contre le virus de la zippe à partir d'une suspension micellaire de DC chol 0a45 mz On procède comme dans l'exemple 2 en partant de 6 mg de DC chol obtenu selon l'exemple 1. Exemple 4 Préparation d'une suspension de liposomes constitués par du DC chol associé à du dioleovl pbospbatidyléthanolamine (DOPE) On mélange 18 mg de dioleoyl phosphatidyéthanolamine (DOPE) et 4,5 mg de DC chol obtenu selon l'exemple 1, que l'on met en solution dans 3 ml de chloroforme. Le chloroforme est évaporé sous vide pour constituer un film lipidique qui est soumis à dessication sous vide, puis remis en suspension dans 3 ml d'eau. Après hydratation pendant 24 heures à 4"C, la dispersion est soumise à sonication pendant 5 à 10 minutes dans un bain à ultra-sons (Laboratory Supplies - Hicksville N.Y.) pour former des liposomes. Cette suspension est stable pendant au moins 6 mois à 4"C. Exemple 5 : Préparation d'une susDension de liposomes consitués par du DC chol associé à du dioleovl phosphatidylcholine (DOPE1 On procède comme dans l'exemple 4 en remplaçant les 18 mg de DOPE par 18 mg de dioleoylphosphatidylcholine (DOPE). On obtient une suspension liposomale stable pendant au moins 6 mois à 4"C. ExemDle 6 : Préparation d'une comnosition vaccinale contre le virus de la grigne à partir d'une suspension liposomale DC chol/DOPE 3 ml d'une suspension liposomale obtenue selon l'exemple 4 sont mélangés à 0,2 ml du vaccin grippe monovalent de la souche A/ Singapour contenant l'équivalent de 50 g de l'antigène constitué par l'hémagglutinine HA. Le mélange obtenu est ensuite fractionné en 10 doses vaccinales de 0,3 ml, comportant chacune 5 pg de HA et 0,45 mg de DC chol. Exemple 7 : PréDaration d'une composition vaccinale contre le virus de la griDpe à partir d'une suspension liposomale DC chol/DOPC 3 ml d'une suspension liposomale obtenue selon l'exemple 5 sont mélangés à 0,2 ml du vaccin grippe monovalent de la souche A/ Singapour. Le mélange obtenu est ensuite fractionné en 10 doses vaccinales de 0,3 ml comportant chacune 5 llg de HA et 0,45 mg de DC chol. Exemple 8 Immunisation On immunise 5 groupes de 4 souris Balb/c par 3 injections sous-cutanées effectuées à JO, J21 et J36 avec les compositions vaccinales suivantes: Groupe A : 0,3 ml de vaccin grippe monovalent souche A/ Singapour dilué à 5 g de HA dans 0,3 ml de PBS, Groupe B : 0,3 ml de composition vaccinale obtenue selon l'exemple 2, Groupe C : 0,3 ml de composition vaccinale obtenue selon l'exemple 3, Groupe D : 0,3 ml de composition vaccinale obtenue selon l'exemple 6, Groupe E: 0,3 ml de composition vaccinale obtenue selon l'exemple 7. Exemple 9: Dosage en anticorps anti-HA Afin d'effectuer les dosages en anticorps neutralisants, on prélève les sérums de souris à J21, J36 et J51 et on effectue le titrage en anticorps anti-HA grâce à la technique d'inhibition de l'hémagglutination induite par le virus de la grippe. Le tableau 1 ci-dessous illustre les résultats obtenus pour chaque groupe de souris après une injection et le tableau 2 les résultats après 2 injections. Tableau 1 moyenne 10g(2) o e O R > I DC.ChoK)M DCC?IOOPC DCChd DOPE . 1l voocln Tableau 2 moyenne long(2} o h, c O m oe o DC.C0,46 DOhoI2 Do dDOPO DCChol DOPE veodn Les titres d'anticorps neutralisants dans les sérums des souris sont présentés en log2 de la dilution la plus forte induisant l'inhibition de l'hémagglutination. Ces résultats montrent clairement le rôle d'adjuvant joué par le DC chol. En effet, le taux d'anticorps anti-HA est nettement plus élevé pour les lots de souris ayant reçu du DC chol comparativement aux souris ayant reçu le vaccin sans adjuvant (Groupe A). Il est important de noter que les taux d'anticorps neutralisants dans les groupes B, C, D et E sont supérieurs au taux d'anticorps neutralisants dans le groupe A même après une injection unique des différentes compositions vaccinales. Ces titres augmentent encore légèrement et se stabilisent après la deuxième injection. Les résultats obtenus après la 3ème injection sont sensiblement égaux à ceux de la 2ème injection (non représentés). Des essais réalisés avec un vaccin grippe trivalent comprenant la souche A Texas, la souche B Panama et la souche A Beijing ont également démontré le pouvoir adjuvant du DC chol. Exemple 10 : Mise en évidence de l'induction de cellules T cYtotoxiques On prélève à J5 1 les cellules spléniques des souris de chacun des groupes mentionnés à l'exemple 7. Ces cellules effectrices sont restimulées in vitro en présence de cellules stimulantes syngéniques infectées par le virus de la souche A/ Singapore correspondant au vaccin testé. La fonction cytotoxique spécifique de ces cellules stimulées est mise en évidence en utilisant comme cellules cibles la lignée de mastocytomes P815 sensibilisés par incubation avec un peptide épitope CTL de l'hémagglutinine du virus (réponse spécifique contre la HA) ou avec un peptide épitope CTL de la nucléoprotéine du virus (réponse spécifique contre la NP). La lyse non spécifique (bruit de fond) est mesurée sur des cellules P815 non sensibilisées ou sensibilisées avec un peptide épitope CTL du virus HIV(v3MN). La lyse des cellules cibles est mesurée par une technique radioactive basée sur le chargement des cellules cibles en CR-5 1 et sur le relargage de ce radioélément lors de la lyse cellulaire. Les résultats présentés sur les figures 2 à 6 qui illustrent le pourcentage de cytotoxicité en fonction du rapport cellules effectrices sur cellules cibles pour chacun des groupes de souris testés, montrent qu'il est particulièrement avantageux d'utiliser une composition liposomale de DC chol, car celle-ci permet d'induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques en plus de la réponse immunitaire de type humoral obtenue grâce à l'action adjuvante du DC chol. Revendications 1. Composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire, pour son utilisation comme adjuvant dans l'administration d'une composition vaccinale. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupement lipophile est un dérivé de cholestérol. 3. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement polaire est un groupement cationique. 4. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement polaire est un ammonium quaternaire ou une amine protonable. 5. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement lipophile est relié au groupement polaire par une liaison ester, éther, amide ou carbamoyle. 6. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement lipophile est séparé du groupement polaire par une chaîne alkylique ramifiée ou non comprenant de 1 à 20 atomes de Carbone. 7. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les composés suivants - I'iodure de cholestéryl-3 I3-carboxamidoéthylènetrimétbylammonium > - la cholestéryl-3ss-carboxyamidoéthylènamine, - L'ioduré de cholestéryl-3 t3oxysuccinamidoéthylènetriméthylammonium, - le 3ss-[N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl]-cholestérol, - le 3ss-[N-(polyéthylènamine)-carbamoyl]-cholestérol. 8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du 3-[N-(N',N'- diméthylami noéthane)-carb am oyl] -cholestérol. 9. Composé selon une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est associé à un lipide neutre. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la proportion de lipide neutre associé est d'au moins 20 % en mole. 11. Composé selon une des revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le lipide neutre associé est la dioleoyl phosphatidyléthanolamine (DOPE) ou la dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC). 12. Composé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est dispersé dans un environnement aqueux sous forme de liposomes. 13. Utilisation d'un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire pour la fabrication d'une composition vaccinale. 14. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le groupement lipophile est un dérivé de cholestérol. 15. Utilisation selon une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que le groupement polaire est un groupement cationique. 16. Utilisation de 3ss-[N-(N,N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl]cholestérol pour la fabrication d'une composition vaccinale. 17. Utilisation comme adjuvant dans l'administration d'un vaccin d'un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit composé amphiphatique est le 3ss-[N-(N', N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl]-cholestérol. 19. Utilisation selon une des revendications 17 ou 18, caractérisée en ce que ledit composé amphiphatique est associé à un lipide neutre. 20. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé amphipathique possédant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire. 21. Composition vaccinale selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit groupement lipophile est un dérivé de cholestérol. 22. Composition vaccinale selon une des revendications 20 ou 21 caractérisée en ce que ledit composé amphiphatique est le 3-[N-(N',N'-diméthylaminoéthane) carbamoyl]cholestérol. 23. Composition vaccinale selon une des revendications 20 à 22, caractérisée en ce que ledit composé amphiphatique se présente sous forme de liposomes incluant au moins un antigène. 24. Composition vaccinale selon une des revendications 20 à 23, caractérisée en ce que ledit composé amphipathique est associé à un lipide neutre. 25. Composition vaccinale selon une des revendications 20 à 24, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène du virus de la grippe. 26 Produit contenant au moins un antigène et un composé amphipathique comprenant un groupement lipophile dérivé d'un stérol lié à un groupement polaire, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en vaccination.