FR 2738014 A1 19970228 FR 9610357 A 19960822 La présente invention concerne un micro-organisme du genre Escherichia producteur d'acide L-glutamique et un procédé de production d'acide L-glutamique par fermentation qui utilise ce micro-organisme. L'acide Lglutamique est un acide aminé important, notamment dans les préparations alimentaires et pharmaceutiques. L'acide L-glutamique est produit par fermentation, principalement à l'aide de souches producrrices d'acide L-glutamique dites coryneformes appartenant au genre Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou à des mutants de ces genres (Amino-Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pages 195-215, 1986).D'autres proolôs connus pour produire de l'acide Lglutamique par fermentation utilisent des micrForganismes appartenant au genre Bacillus, Streptomyces ou Penicillium (brevet US n0 220 929) et des micro organismes appartenant au genre Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia ou Candida (brevet US n 3563857). Ces procédés conventionnels permettent d'augmenter sensiblement le rendement en acide L-glutamique. Toutefois, pour répondre à la demande qui va croître dans le futur, il est nécessaire de développer un procédé de production d'acide L-glutamique moins coûteux et plus efficace. fi sera possible dans le futur d'utiliser des bactéries du genre Escberichia comme excellentes souches productrices d'acide L-glutamique du fait qu'elles ont une vitesse de croissance élevée et que l'analyse de leurs gènes est développée. Jusqu'à maintenant, on a seulement décrit qu'un mutant de la souche de type sauvage Escherichia coli W accumulait une quantité d'acide L-glutamique aussi faible que 2,3 g/l (J. Biochem., vol. 50, pages 164-165, 1961).Toutefois, récemment, on a montré qu'un mutant de Escherichia coli K-12 dans lequel l'activité a-cétoglutarate déshydrogénase (abrégée dans la suite en "a-CGDH") est absente ou réduite présente un haut rendement de production d'acide Lglutamique (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 244970/1993). Les souches de type sauvage qui appartiennent au genre Escherichia coli comprennent des souches dont les propriétés sont meilleures que celles de Escherichia coli K-12 et de ses mutants. Par exemple, il a été décrit que Escherichia coli B présente une vitesse de croissance plus élevée que Escherichia coli K-12 et ses mutants et produit un rendement élevé de biomasse par rapport au glucose consommé (J. Biotechnology, vol. 2, pages 191-206, 1985 ; et Appl. Environ. Microbiol., vol. 56, pages 1004-1011, 1990). A la suite d'études approfondies portant sur un procédé de production d'acide L-glutamique à l'aide de bactéries du genre Escherichia coli, on a constaté qu'une souche obtenue par amplification de l'activité citrate synthase (abrégée dans la suite en "CS") et de l'activité phosphoénolpyruvate carboxylase (abrégée dans la suite en "PPC") dans une souche sensible à la valine présente un haut rendement de production d'acide L-glutamique. La présente invention est basée sur cette constatation et concerne donc un micro-organisme appartenant au genre Escherichia qui présente une sensibilité à la valine, qui a une activité citrate synthase et une activité phosphoénolpyruvate carboxylase amplifiées et qui est capable de produire de l'acide L-glutamique.Dans une forme de réalisation de l'invention, l'activité a-cétoglutarate déshydrogénase du micro-organisme est absente ou réduite. Par ailleurs, le micro-organisme selon l'invention peut être un micmorganisme Escherichia coli, qui peut appartenir par exemple à la souche Escherichia coli B ou la souche Escherichia coli K-12. En outre, la présente invention concerne un procédé de production d'acide L-glutamique par fermentation qui comprend la culture dans un milieu liquide d'un micro-organisme défini précédemment, I'accumulation de l'acide L-glutamique dans le bouillon de culture et la récupération de l'acide L-glutamique. La présente invention peut être mise en oeuvre par exemple de la manière suivante: (1) Isolement d'un mutant sensible à la valine Pour cultiver la souche selon la présente invention, un mutant sensible à la valine est tout d'abord isolé en utilisant, comme souche parentale, une souche de type sauvage qui appartient au genre Escherichia et qui présente une résistance à la valine, ou un mutant de celle-ci. Une telle souche de type sauvage peut être par exemple: Escherichia coli B (ATCC 11303) Escherichia coli W (ATCC 9637) Le mutant sensible à la valine est isolé à partir de la souche qui appartient au genre Escherichia et qui présente une résistance à la valine de la manière suivante. Tout d'abord, la souche résistant à la valine mentionnée ci-dessus est mutée par un procédé conventionnel, par exemple par un procédé dans lequel la souche est irradiée par des rayons X ou des rayons ultraviolets ou est traitée avec un mutagène tel que la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (appelée dans la suite "NG"). Ou bien encore, la mutation voulue peut être introduite de manière efficace par un procédé de génie génétique tel que la transduction ou la recombinaison, par exemple. La souche sensible à la valine est obtenue par transduction de la manière suivante. On sait que Escherichia coli K-12 est sensible à la valine (Amino Sadd : Biosynthesis and Genetic Regulation, compilé par Klaus M. Hetman & Ronald L Somerville, Addison-Wesley Publishing Company lnc., pages 25s251, 1983). De ce fait, la sensibilité à la valine dérivée de Escherichia coli K-12 peut être transmise à une souche résistant à la valine par transduction au moyen d'un lysat phagique obtenu par infection de Escherichia coli K-12 avec le phage P1. Après que la sensibilité à la valine a été introduite par mutation de la souche parentale ou par transduction, la souche sensible à la valine voulue peut être isolée sous forme d'un mutant qui ne se développe pas sur un milieu minimum contenant de la valine ou dont la vitesse de croissance est notablement réduite. La souche Escherichia coli B11 est un exemple spécifique dc souche sensible à la valine ainsi obtenue. Escherichia coli B11 est une souche sensible à la valine dérivée dc Escherichia coli B par mutation. On suppose que, dans ce mutant, le flux métabolique de l'acide pyruvique à la valine est supprimé par la valine biosynthétisée dc sorte que le flux de l'acide pyruvique à l'acétyl-CoA est amplifié. n n'est pas nécessaire d'obtenir une nouvelle souche qui appartient au genre Escherichia et qui est sensible à la valine si l'on dispose d'une autre souche présentant ces caractéristiques. Il peut s'agir par exemple de la souche Escherichia coli K-12 ou de la souche Escherichia coli W3110. Escherichia coli AJ12624 ct Escherichia coli AJ12628 qui sont décrites dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 244 970/1993 sont dérivées de la souche Escherichia coli W3110 et ont une activité a-CGDH nulle ou réduite. Une souche dont l'activité a-CGDH est nulle ou réduite a un rendement de production d'acidc L-glutamique amélioré de sorte qu'une telle souche est préférable comme micro- organisme dans la présente invention. (2) Amplification de l'activité PPC et de l'activité CS Dans l'exemple qui sera décrit dans la suite, une souche qui appartient au genre Escherichia et qui a une activité PPC et une activité CS amplifiées a été obtenue à l'aide d'un hôte constitué par une souche du genre Escherichia sensible à la valine. fi est possible également d'obtenir une souche ayant une activité PPC et une activité CS amplifiées en utilisant comme hôte une souche du genre Escherichia résistante à la valine à laquelle on confère ensuite une sensibilité à la valine. Ainsi, on utilise comme hôte pour la culture de la souche ayant une activité PPC et une activité CS amplifiées, un mutant du genre Eseheriehia auquel on confère une sensibilité à la valine, une souche de type sauvage du genre Eseheriehia qui a une résistance à la valine ou un mutant de celle-ci. On donne cidessous des exemples spécifiques d'un tel hôte: Escherichia coli B11 Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) Escherichia coli B (ATCC 11303) Escherichia coli W (ATCC 9637) Pour amplifier l'activité PPC et l'activité CS, des gènes codant PPC et CS sont clonés sur un vecteur approprié puis l'hôte mentionné cidessus est transformé avec le vecteur recombiné ainsi obtenu.Etant donné que le nombre de copies des gènes codant PPC et CS (abrégés dans la suite en "gène ppc" et gêne gltA" respectivement) dans le transformant est accru, l'activité PPC et l'activité CS sont amplifiées. Le vecteur mentionné ci-dessus peut être par exemple un vecteur plasmidique, un vecteur phagique ou un vecteur transposon. On peut obtenir le gène ppc et le gène gltA en utilisant des mutants dans lesquels l'activité PPC ou l'activité CS est nulle et cn isolant des gènes permettant d'assurer la complémentation de leurs auxotrophies. Comme les séquences nucléotidiques de ces gènes de Escherichia coli ont déjà été décrites (J. Biochem., vol. 95, pages 909-916, 1984 ; et Biochemistry, vol. 22, pages 52435249, 1983), il est possible aussi de synthétiser des amorces sur la base des séquences nucléotidiques respectives et d'obtenir les gènes par ACP (amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction = PCR)) en utilisant comme matrices des ADN chromosomiques. Pour le clonage des gènes on peut utiliser un plasmide quelconque à condition qu'il soit réplicable dans les bactéries du genre Escherichia coli. n peut s'agir par exemple des plasmides pBR322, pTWV228, pMW119 et pUC19. On introduit le gène ppc et le gène gltA dans l'hôte constitué par la souche parentale d'origine mentionnée cidessus en les clonant sur un vecteur unique ou séparément sur deux types de vecteurs coexistants. On peut amplifier l'activité PPC et l'activité CS en ligaturant le gènc ppc et le gène gltA avec un ou des vecteurs plasmidiques, en introduisant le ou les plasmides recombinés obtenus dans l'hôte mentionné ci-dessus et en maintenant le ou les plasmides dans l'hôte. On peut aussi amplifier l'activité PPC et l'activité CS en opérant de manière que des copies supplémentaires du gène ppc et du gène gltA existent dans l'ADN chromosomique de l'hôte mentionné ci-dessus.On introduit des copies supplémentaires du gène ppc et du gène gltA dans l'ADN chromosomique du micro-organisme du genre Escherichia par recombinaison homologue en utilisant comme cible des séquences présentes dans l'ADN chromosomique. il s'agit de préférence d'une séquence qui est présente sous forme de copies multiples et on peut utiliser par exemple un ADN répétitif, une répétition inversée présente à une extrémité d'une séquence d'insertion ou d'un transposon. Ou bien encore, comme décrit dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 109985/1990, il est possible aussi de cloner le gène ppc et le gène gltA sur un transposon que l'on transpose dans l'ADN chromosomique.Dans les deux procédés, le nombre de copies du gène ppc et du gène gltA est augmenté dans le transformant si bien que l'activité PPC et l'activité CS sont amplifiées. Mise à part l'amplification de gène mentionnée ci dessus, on peut aussi amplifier l'activité PPC et l'activité CS en remplaçant les promoteurs du gène ppc et du gène gltA par des promoteurs forts. Par exemple, on sait que le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur trc, le promoteur tac, le promoteur PR et le promoteur PL d'un phage X sont des promoteurs forts. Lorsque l'on remplace les promoteurs des deux gènes par ces promoteurs, I'expression du gène ppc et du gène gltA est augmentée de sorte que l'activité PPC et l'activité CS sont amplifiées. Il a été décrit que le rendement de production d'acide L-glutamique est amélioré si l'on confere à une souche une faible aptitude à dégrader l'acide Lglutamique et l'expression constitutive de l'opéron malate synthase-isocitrate lyase-isocitrate déshydrogénase quinase/phosphatase (dans la suite en abrégé "opéron ace") (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n244970/1993). On comprend aisément que lorsque la souche prodüetriee d'acide L-glutamique de la présente invention a ces propriétés, le rendement de production d'acide L-glutamique est avantageusement augmenté. Bien entendu, sous l'angle de l'amélioration du rendement de production d'acide L-glutamique, il est avantageux que la souche produetriee d'acide L-glutamique de la présente invention présente des auxotrophies, résistances à des médicaments, sensibilités à des médicaments et dépendances visà-vis de médicaments dont on sait qu'elles sont efficaces pour améliorer le rendement de production des souches productrices d'acide L-glutamique. (3) Production d'acide lrglutamique à l'aide de la souche de la présente invention La production d'acide L-glutamique à l'aide d'une souche qui appartient au genre Escherichia, à laquelle une sensibilité à la valine a été confréc et qui a une activité PPC et une activité CS amplifiées peut être réalisée par un procédé de culture courant dans un milieu nutritif ordinaire contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et éventuellement un micro- nutriment organique tel qu'un acide aminé ou une vitamine. On peut utiliser une source de carbone et une source d'azote quelconques à condition que ces sources puissent être utilisées dans la souche qui doit être cultivée. La source de carbone peut être constituée par exemple par des glucides tels que le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose, le mannose, le galactose, un hydrolysat d'amidon et des mélasses. De plus, on peut utiliser des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide citrique commc source de carbone unique ou en combinaison avec d'autres sources de carbone. La source d'azote peut être constituée par exemplc par l'ammoniac, des sels d'ammonium tels que le sulfate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, Ic chlorure d'ammonium et le phosphate d'ammonium, et des nitrates. les nutriments organiques à l'état de traces comprennent les acides aminés, les vitamines, les acides gras et les acides nucléiques ainsi que la peptonc, les casaminoacides, les extraits de levure et les hydrolysats de protéines de soja les contenant. Lorsque l'on utilise un mutant auxotrophe qui nécessite un acide aminé ou analogue pour sa croissance, on doit le lui fournir. Les sels inorganiques peuvent être par exemple des phosphates, des sels de magnésium, des sels de calcium, des sels de fer et des sels de manganèse. La culture est réalisée dans des conditions aérobies à une température de fermentation de 20 à 45-C tandis que le pH est maintenu entre S et 9. Lorsque Ic pH décroît pendant la culture, il est contrôlé avec du carbonate de calcium ou avec un alcali tel que l'ammoniac gazeux. On conduit la culture de cette manière pendant 10h à 4 jours pour accumuler une quantité considérable d'acide Lglutamique dans le bouillon de culture. On peut extraire l'acide L-glutamique du bouillon de culture à la fin de la culture par un procédé connu, par exemple par un procédé dans lequel on retire les cellules du milieu de culture, puis on concentre et on cristallise, ou encore par chromatographie d'échange d'ions. Exemple La présente invention va être illustrée de manière plus détaillée grâce à l'exemple suivant. (1) Isolement d'un mutant sensible à la valine de Escberichia coli B On a déposé en taches 5 5,ul d'une suspension de cellules (105 cellules/ml) de Escherichia coli B et de Escherichia coli W3110 dérivées de Escherichia coli K-12 sur du milieu gélosé minimum M9 (A Short Course In Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, J. Miller, page 437, 1992) contenant de la valine à différentes concentrations, puis on a incubé pendant une nuit à 3roc. On a ensuite examiné la croissance des cellules. On a ainsi constaté que Escherichia coli B pouvait se développer sur le milieu minimum M9 contenant 5 g/I de valine mais que Escherichia coli W3110 ne pouvait pas sc développer, même dans du milieu minimum M9 contenant 50 mg/l de valine.On notera que les deux souches pouvaient se développer sur du milieu minimum M9 cxempt de valine. Isolement à partir de Escherichia coli B du mutant ayant la même sensibilité à la valine que W3110 On a cultivé Escherichia coli B pendant une nuit à 37-C dans du milieu liquide 2YT contenant 16 g/l de bactotryptone, 10 g/l d'extrait de bactolevure et 5 g/l de NaCI (pH 7,2) puis on a inoculé de nouveau dans le milieu liquide 2YT et on a cultivé à 37.C. On a recueilli les cellules qui étaient dans la phase de croissance logarithmique, on les a lavées avec du tampon phosphate 50 mM (pH 6,0), on les a mises en suspension dans du tampon phosphate contenant 200 fzg/ml de NG et on les a cultivées à 37.C pendant 30 min. Ensuite, on a recueilli les cellules et on les a lavées avec le tampon phosphate.On a inoculé une partie des cellules dans le milieu liquide 2YT et on les a cultivées pendant une nuit à 3;ru. Puis on a recueilli les cellules et on les a lavées avec le tampon phosphate. On a inoculé une partie des cellules dans du milieu liquide minimum M9 contenant 100 mg/I de valine et on les a cultivées dans ce milieu à 370C pendant 2 h. Puis, on a ajouté de la pénicilline en une quantité de 200 unités/ml et on a prolongé la culture pendant une nuit pour concentrer le mutant sensible à la valine. Ensuite, on a dilué la culture de manière appropriée et on a dénombré le nombre de cellules vivantes.On a dilué la culture pour mettre en oeuvre une technique de répliques d'étalement sur la base du nombre de cellules vivantes, on l'a étalée sur du milieu gélosé minimum M9 et on l'a cultivée pendant une nuit à 37.C. On a transféré les colonies formées sur du milieu gélosé minimum M9 qui contenait 100 mg/l de valine et on a cultivé pendant une nuit à 3TC. On a isolé les souches considérécs comme sensibles à la valine qui ne pouvaient pas se développer sur le milieu contenant de la valine. Après avoir isolé une seule colonie, on a examiné la croissance de ces souches dans du milieu gélosé minimum M9 contenant de la valine à différentes concentrations. On a ainsi isolé les trois mutants sensibles à la valine qui ne pouvaient pas se développer sur le milieu gélosé minimum M9 contenant 50 mg/l de valine. On a inoculé Escherichia coli B et les trois souches sensibles à la valine ainsi obtenues dans des tubes à essai de 50 ml contenant chacun 5 ml d'un milieu dont la composition est indiquée dans le tableau 1, et on a cultivé à 3TC sur une secoueuse à va-et-vient (115 tr/min) jusqu'à ce que le glucose du milieu soit consommé. A la fin de la culture, on a mesuré la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le surnageant de la culture au moyen d'un appareil Biotech Analyzer produit par la société Asahi Chemical Industry Co., Ltd. On a ainsi constaté que ni Escherichia coli B ni les trois souches sensibles à la valine n'avaient accumulé d'acide L-glutamique dans le bouillon de culture.En même temps, on a examiné l'accumulation de valine dans le surnageant de chaque culture par chromatographie en couche mince et par la réaction avec la ninhydrine. On a observé une légère tache de valine dans le cas de Escherichia coli B mais pas dans le cas des souches sensibles à la valine. La souche typique des souches sensibles à la valine isolées est appelée Escherichia coli 11. Tableau 1 Ingrédients Concentration Glucose 40 (NH4)2SO4 20 KH2PO4 MgSO4.7H2O FcS04.7H20 0,01 MnSO4.5H2O 0,01 Extrait de levure 2 Tableau 1(suite) Ingrédients Concentration (g/l) Chlorhydrate de thiamine 0,01 CaCOs 20 (2) Clonage du gène gltA de Escherichia coli W3110 La séquence nucléotidique du gène gltA de Escherichia coli a déjà ét décrite (Biochemistry, vol. 22, pages 5243-5249, 1983).Des amorces ayant les séquences ne 1 et 2 du tableau de séquences indiqué dans la suite ont été synthétisées sur la base de la séquence nucléotidique décrite, et le gène gltA a été amplifié par ACP (PCR) en utilisant comme matrice un ADN chromosomique de Escherichia coli W3110. La séquence n 1 des amorces synthétisées correspond à la séquence comprise entre la base ne -342 et la base ne -323 de la séquence nucléotidique du gène gltA décrite dans le document Biochemistry, vol. 22, page 5246, 1983, à ceci près que la base G n -331 a été remplacée par C et qu'une séquence de reconnaissance pour l'endonucléase de restriction Pstl a été insérée. La séquence n 2 correspond à la séquence comprise entre la 2 060ème base et la 2 079ème base de la séquence nucléotidique du gène gltA décrite dans le document Biochemistry, vol. 22, page 5247, 1983, à ceci près que la 2 070ème base A a été remplacée par G et qu'une séquence de reconnaissance pour l'endonuciéase de restriction EcoRI a été insérée. Dans la séquence nucléotidique représentée par la séquence n 2, le brin inverse de la séquence nucléotidique, de la 2 060ème base à la 2 079ème base, indiquée dans le document Biochemistry, vol. 22, page 5247, 1983, est décrit depuis le côté 5'. L'ADN chromosomique de Escherichia coli W3110 a été préparé par un procédé standard (Seibutsu Kohgaku Zikken-sho, compilé par la Society for Fermentation and Bioengineering, Japon, pages 97-98, Baifukan, 1992). Dans l'ACP (PCR), on a utilisé les conditions réactionnelles standards décrites dans le document PCR Technology, compilé par Henry A. Ehlich, Stockton Pssss, 1989. Le produit d'ACP a été purifié par un procédé standard puis digéré avec les endonucléases de restriction PstI et EcoRI. Le fragment obtenu a été ligaturé avec pTWV228 (acheté auprès de la société Takara Shuzo), qui avait été digéré avec PstI et EcoRt, au moyen d'une trousse de ligature (achetée chez Takara Shuzo).Des cellules compétentes (achetée chez Takara Shuzo) de Escherichia coli JM109 ont été transformées avec le produit de ligature ainsi obtenu et ont été étalées sur du milieu L (pH 7,2) contenant 10 g/l de bactotryptone, 5 g/l d'extrait de bactolevure, S gui de NaCI, 15 gon de gélose, 10yg/ml D'ERG (isopropyl-B-P- thiogalactopyranoside, 40yg/ml de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indole- > D- galactoside) et 100 jug/ml d'ampicilline, et ont été cultivées pendant une nuit. Puis, les colonies blanches formées ont été prélevées. Un plasmide a été préparé à partir de la souche transformante par le procédé à l'alcali (Seibutsu Kohgaku Zikken-sho, compilé par la Socîety for Fermentation and Bioengineering, Japon, page 105, Baifukan, 1992). Puis, la carte de restriction du fragment d'ADN inséré dans le vecteur a été établie et comparée à la carte de restriction du gène gltA décrite. Le plasmide dans lequel est inséré le fragment d'ADN présentant la même carte de restriction est appelé pTWVC. Par ailleurs, pour confirmer l'expression ou l'absence d'expression du gène gltA, pTWVC a été introduit dans des cellules compétentes de la souche déficiente en gltA ME8330 (gltA6, fur::TnS, galK30, pyrD36, relAl, rpsL129, thi1, supE44, ~) qui avaient été préparées par le procédé au chlorure de rubidium (Saishin Nohgaku Zikken no kiso, compilé par Tohoku University, Agricultural Department, Soft Science Kick., page 157, 1990). L'auxotrophie du transformant obtenu a été examinée et on a mis en évidence que pTWVC assurait la complémentation de gltA6 de ME8330. Cette souche ME8330 a été obtenue auprès du National Institute of Genetics, Genetic Stock Research Centrer.La souche ME8330 déficiente en le gène gltA a besoin d'acide L-glutamique pour croître et peut être cultivée dans du milieu minimum M9 contenant de la thiamine, de l'uracile et l'acide L-glutamique. L'activité CS de W3110, de ME8330 déficiente en gltA et de ME8330 contenant le plasmide pTWVC a été mesurée par le procédé de Weitzman et al. (Mtthods in Enzymology, vol. 13, pages 22-26, 1969). fi est ainsi apparu, comme le montre le tableau 2, que ME8330 n'avait pas d'activité CS tandis que ME8330 contenant le plasmide pTWVC présentait une activité CS qui était environ 4 fois supérieure à celle de la souche de type sauvage W3110. Tableau 2 Soucbc Activité CS (unittsimg protéine) W3110 0,69 MES330 O ME33WPTWVC 2,71 (3) Construction d'un plasmide comportant le gène ppc et le gène gILA La construction du plasmide pMWCP contenant le gène ppc et le gène gltA est représentée sur la figure unique. Tout d'abord, le plasmide pS2 dans lequel un fragment Sall de 4,4 kb contenant toute la région du gène ppc dérivé de Escherichia coli K-12 avait été inséré dans le site SalI de pBR322 (J. Biochem., vol. 95, pages 909-916, 1984) a été digéré avec SalI. Le fragment Sali de 4,4 kb contenant le gène ppc a été préparé par électrophorèse en gel d'agarose et a été inséré dans le site SalI de pMW119 (acheté auprès de la société Nippon Gene). Le plasmide obtenu est appelé pMWP. D'autre part, le plasmide pTWVC comportant le gène gltA a été digéré avec PstI et ses deux extrémités ont été transformées en extrémités franches. Ce fragment a été digéré encore avec EcoRI. Le fragment d'ADN ainsi obtenu a été mélangé avec pMWP digéré avec SmaI et EcoRI, et le mélange a été soumis à une ligature. La souche ME8330 a été transformée avec l'échantillon d'ADN ainsi ligaturé et une souche transformante résistante à l'ampicilline qui avait perdu l'auxotrophie pour l'acide L-glutamique a été sélectionnée. Un plasmide a été préparé à partir de cette souche, et ME8330 a été retransformée avec ce plasmide. On a mis en évidence que le transformant avait perdu l'auxotrophie pour l'acide L-glutamique. De plus, la carte de restriction a été préparée et on a confirmé que le gène ppc et le gène gltA étaient présents dans ce plasmide.Ce plasmide est appelé pMWCP. La transformation a été réalisée par le procédé au chlorure de rubidium. (4) Introduction de pMWCP dans Escherichia coli B et le mutant sensible à la valine B11 et évaluation de la culture Des cellules Escherichia coli B et des cellules Escherichia coli B11 sensibles à la valine ont été transformées avec le plasmide pMWCP par le procéda au chlorure de rubidium. Trois transformants de chaque type obtenus indépendamment ont été inoculés dans un tube à essai de 50 ml contenant 5 ml d'un milieu dont la composition est représentée dans le tableau 1, et ont été cultivés à 3TC au moyen d'une secoueuse à va-et-vient jusqu'à ce que le glucose présent dans le milieu soit consommé.De plus, des cellules B11 transformées avec pMWP ou pMWC ont également été soumises à la culture mentionnée cidessus. pMWC a été construit par ligature d'un fragment pstI-EcoRI contenant le gène gltA préparé à partir de pTWVC avec pMW119 digéré avec psti et EcoRI. Dans la culture des transformants, 100 ug/ml d'ampicilline ont été ajoutés pour maintenir le plasmide de manière stable. A la fin de la culture, la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture a été mesurée et les résultats sont représentés dans le tableau 3. Dans les résultats de la culture des transformants, la quantité d'acide Lglutamique est indiquée sous forme de la valeur moyenne des trois transformants. Dans la souche qui a été obtenue en utilisant comme hôte Escherichia coli B résistant à la valine et qui présentait une activité CS et une activité PPC amplifiées, il n'y avait pas d'accumulation d'acide L-glutamique tandis que, dans la souche qui a été obtenue en utilisant comme hôte B11 sensible à la valine et qui présentait une activité CS et une activité PPC amplifiées, une quantité considérable d'acide Lglutamique s'était accumulée. Dans la souche qui a été obtenue par introduction de pMWP dans B11 et qui présentait seulement une activité PPC amplifiée, il n'y avait pas d'accumulation d'acide L-glutamique tandis que, dans la souche qui a été obtenue par introduction de pMWC dans B11 et qui présentait seulement une activité CS amplifiée, de l'acide L-glutamique s'était accumulé mais la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans cette souche était inférieure à celle qui s'était accumulée dans la souche présentant une activité CS et une activité PPC amplifiées. Tableau 3 Souchc Fopriété de l'hôte Quantité d'acide L glutamique acalmuléc (g/l) B/pMWCP résistance à la valine O BlIIpMWCP sensibilitéàlavaline 9,8 B1lIpMWP sensibilité à la valine O B1lIpMWC sctibilit à la valinc 3,6 D'après les résultats mentionnés ci-dessus, on constate que la combinaison de la mutation sensible à la valine et de l'amplification de l'activité CS et de l'activité PPC est indispensable pour cultiver une souche productrice d'acide Lglutamique à partir d'une souche de type sauvage résistant à la valine telle que Escherichia coli B. La souche obtenue par introduction du plasmide pMWCP comportant le gène gltA et le gène ppc dans B11 est appelée AJ13138. Le mutant sensible à la valine B11 de Escherichia coli B est obtenu par retrait du plasmide de AJ13138 déposé sans détérioration des cellules hôtes. Le plasmide est parfois perdu naturellement ou peut être retiré (Bact. Rev., vol. 36, pages 361-405, 1972). Dans le processus de retrait du plasmide, AJ13138 est cultivée dans du milieu L pendant une nuit à 40 C. Puis, la culture est diluée de manière appropriée et étalée sur du milieu L exempt d'ampicilline. Après incubation de la culture pendant une nuit à 37C, les colonies formées sont transférées dans du milieu L contenant 100,ug/ml d'ampicilline, puis les colonies sensibles à l'ampicilline sont isolées. La souche sensible à l'ampicilline ainsi obtenue est la souche B11. (5) Introduction de pMWCP dans Escherichia coli K-12 et évaluation de la culture Des cellules Escherichia coli W3110sucA::Kmr ont été transformées avec les plasmides pMWP, pMWC et pMWCP par le procédé au chlorure de rubidium pour obtenir trois types de transformants. Quatre transformants de chaque type obtenus indépendamment ont été inoculés dans un ballon de Sakagushi de 500ml contenant 20 ml d'un milieu ayant la composition représentée dans le tableau 4, et ont été cultivés à 3TC au moyen d'une secoueuse à va-et-vient pendant 25 h jusqutà ce que le glucose présent dans le milieu soit consommé. Dans la culture des transformants, 100gg/ml d'ampicilline ont été ajoutes pour maintenir les plasmides de manière stable.Escherichia coli W3110sucA:Kmr est décrite dans la demande de brevet européen publiée n 0 670 370 et est déficiente en a-CGDH du fait de la destruction du gène sucA. Tableau 4 Ingrdients Concentration ( ) Glucose 20 (NH4)2SO4 20 KH2PO4 1 MgS04.7H20 1 FeS04.7H20 0,01 MnSO43.5H2O 0,01 Extrait dc levure 2 Chlorhydrate de thiamine 0,01 CaCO3 3 A la fin de la culture, la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture a été mesurée et les résultats sont présentés dans le tableau 5. Dans les résultats de la culture des transformants, la quantité d'acide L-glutamique est indiquée sous forme de la valeur moyenne des quatre transformants. Dans le résultat concernant la souche qui a été obtenue au moyen de la souche déficiente en a-CGDH dérivée de Escherichia coli K-12 sensible à la valine comme hôte et qui avait une activité CS et une activité PPC amplifiées, une quantité considérable d'acide L-glutamique s'est accumulée. Tableau S Souche Rendement d'acide L-glutamiquc accumulé(%) W3110sucA::Kmr 41,1 W3110sucA::Kmr/pMWP 42,3 W3110sucA :Kmr/pMWC 44,5 W3110sucA :Kmr/pMWCP 47,3 Effets de l'inveuth Grâce au procédé selon la présente invention, il est possible d'augmenter le rendement en acide L-glutamique d'une souche de type sauvage résistant à la valine qui appartient au genre Escherichia et de produire de l'acide Lglutamique efficacement et à faible coût. La souche Escherichia coli AJ12624 a été déposée auprès du National Institute of Bioscicncc and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 24 juillet 1991 sous le numéro de dépôt FERM P-12379. Cette souche a fait ltobjet d'un dépôt international conformément au traité dc Budapest le 15 mai 1992 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM BP-3853. La souche Escherichia coli AJ12628 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 24 juillet 1991 sous le numéro de dépôt FERM P-12380. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt international conformément au traité de Budapest le 15 mai 1992 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM BP-3854. La souche Escherichia coli AJ13138 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 17 août 1995 sous le numéro de dépôt FERM P-15115. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt international conformément au traité de Budapest le 7 juin 1996 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM BP-5565. Tableau de séquences: Séquence n 1 Longueur de la séquence 20 nucléotides Type de séquence : acide nucléique Nombre de brins : un seul brin Topologie: linéaire Type de séquence : ADN synthétique Caractéristiques de la séquence: amorce pour l'amplification du gène gltA de Escherichia coli Séquence: TCrGTTACCT GCAGACGTCG 20 Séquencc n' 2 Longueur de la séquence: 20 nucléotides Type de séquence : acide nucléique Nombre de brins: un seul brin Topologie: linéaire Type de séquence: ADN synthétique Caractéristiques de la séquence: amorce pour l'amplification du gène gltA de Escherichia coli Séquence: AAGTGAATTC CGCCAGAACC 20 REVENDICATIONS 1.Micto-organisme caractérisé en ce qu'il appartient au genre Escherichia, en ce qu'il présente une sensibilité à la valine, une activité citrate synthase et une activité phosphoénolpyruvate carboxylase amplifiées et en ce qu'il est capable de produire de l'acide L-glutamique. 2. Miero organisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que son activité a-cétoglutarate déshydrogénase est nulle ou réduite. 3. Micro-organisme selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il appartient à Escherichia coli. 4. Miero organisme selon la revendication 3, caractérise en ce qu'il apppartient à la souche Escherichia coli B. 5. Miero-organisme selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il appartient à la souche Escherichia coli K-12. 6. Procédé de production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans un milieu liquide d'un micro organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, l'accumulation d'acide L-glutamique dans le milieu de culture et la récupération dudit acide Lglutamique.