FR 2735146 A1 19961213 FR 9506921 A 19950612 PROCEDE DE CULTURE DE CELLULES D'INVERTEBRES MARINS ET CULTURES OBTENUES. L'invention se rapporte à l'établissement de cultures de cellules d'Invertébrés marins. Elle concerne plus particulièrement un procédé d'obtention de cellules isolées d'Invertébrés marins et de culture de ces cellules. Elle vise également les cultures ainsi obtenues, et leurs applications, en particulier dans des biotests. Les cultures de cellules, cultures primaires et lignées, constituent des modèles expérimentaux dont les applications sont multiples aussi bien en recherche fondamentale qu'en recherche appliquée. Les premiers travaux dans le domaine de la culture de cellules d'Invertébrés marins datent de bientôt cinquante ans et ont porté sur la culture, par explant, de manteau d'huître. Si des Echinodermes (étoile de mer et oursin), des Arthropodes (les crevettes notamment), et quelques autres Invertébrés marins ont servi aux expérimentations, c'est parmi les Mollusques et surtout les bivalves que les animaux ont été essentiellement choisis pour les essais de culture. On a rapporté le maintien in vitro de cellules isolées d'Invertébrés marins, à plus ou moins long terme (de quelques heures à plusieurs semaines), ainsi que des bioessais permettant quelques études à court terme. Mais la valeur et les limites des modèles mis en place jusqu'à ce jour ne peuvent être appréciés de manière rigoureuse compte tenu des rares tests de capacité fonctionnelles mis en oeuvre pendant la durée des cultures. Par le choix d'un ensemble de paramètres et de conditions, les inventeurs ont mis au point un protocole d'isolement et de culture de cellules d'Invertébrés marins, permettant de réaliser ces cultures en routine avec maintien in vitro d'au moins certaines de leurs activités de biosynthèse. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de culture de cellules d'Invertébrés marins, fonctionnelles à court terme, mais également à plus long terme, sans problème de contamination microbienne. Elle vise également à fournir un procédé de congélation - décongélation de cellules isolées permettant d'obtenir des cultures dont l'activité de biosynthèse est préservée, ce procédé étant applicable, de manière générale, au matériel biologique mis en oeuvre selon l'invention. L'invention a également pour but de fournir des cultures de ces cellules d'Invertébrés marins et leurs utilisations, en particulier comme modèles cellulaires dans des bioessais. Le procédé de culture de cellules d'Invertébrés marins de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation de cellules isolées, viables, pratiquement exemptes de contaminants, à une température et dans un milieu dont la composition, à base d'eau de mer stérile, et les propriétés physico-chimiques, en particulier l'osmolarité et le pH, sont choisis de manière à obtenir des cellules viables et le maintien ou llamélioration de leurs capacités fonctionnelles pendant au moins 30 jours. Conformément à l'invention, le contrôle de la viabilité des cellules, effectué aussi bien au niveau des cellules isolées mises en oeuvre que des cellules de la culture, est apprécié par le test au bleu Trypan, tel que décrit dans les exemples, la qualité des cellules étant contrôlée en microscopie électronique. Pour la réalisation de ce test, l'osmolarité du bleu Trypan a été ajustée à celle de l'eau de mer, de l'ordre de 1100 mOsm/ml, par addition dlun glucide de bas poids moléculaire, afin d'éviter la formation de précipités et une solution trop visqueuse. Comme précisé dans les exemples, llarabinose est particulièrement préféré. Par "pratiquement exemples de contaminants", on entend des cellules débarassées des bactéries, protozoaires, champignons, dont les levures, qui contaminent le plus généralement les Invertébrés marins. Les capacités fonctionnelles des cellules, dont l'étude est réalisée de manière à suivre et à contrôler l'évolution des cultures, sont appréciées au regard de la biosynthèse de protéines, de lipides et d'ADN, par visualisation et mesure de l'incorporation de précurseurs radiomarqués, selon les protocoles donnés dans les exemples. Les cellules isolées mises en culture sont telles qu'obtenues à partir d'explants ou par dissociation de tissus et après un pré-traitement de décontamination. Les fragments de tissus ou explants sont immergés dans un milieu de culture approprié, l'isolement des cellules étant obtenu par migration à partir des expirants. Pour la dissociation des tissus, on a recours à un système chimique et/ou à un système enzymatique et/ou à un système mécanique. Les paramètres entrant en jeu dans cette étape sont liés les uns aux autres et seront ajustés aisément par l'homme du métier pour obtenir les résultats recherchés. Ainsi, lorsque la concentration en agent de dissociation est faible, la durée de traitement doit être allongée. Quant à la température, il s'avère avantageux, le plus généralement, d'opérer à basse température, en particulier à une température n'excédant pas 10 C, et plus avantageusement de l'ordre de 4"C. Un agent de dissociation particulièrement approprié est à base de pronase. L'utilisation de faibles concentrations de pronase, de l'ordre de 0,020 à 0,030E, plus spécialement de 0,025E, durant environ 12 heures, à une température n'excédant pas environ 40C permet d'obtenir une dissociation satisfaisante des cellules avec un taux de viabilité élevé, comme confirmé par les contrôles effectués. Le pré-traitement des tissus, et même des animaux, assure une décontamination des matériaux utilisés. Selon une disposition avantageuse de l'invention, la décontamination des tissus est effectuée par traitement à l'aide d'antibiotiques et, le cas échéant, d'agent mucolytique Des antibiotiques appropriés comprennent la pénicilline, la streptomycine, la kanamycine, la gentamycine, seules ou en mélange. Comme agent mucolytique, on citera plus spécialement le dithiothréitol. Le pré-traitement des animaux utilisés pour l'obtention des cellules permet d'améliorer la décontamination. On a ainsi avantageusement recours au brossage et/ou à l'action de désinfectants tels que l'alcool à 90" et/ou à la manipulation en atmosphère stérile et/ou au lavage avec de grands volumes d'eau de mer stérile et/ou à la dissection des tissus dans des conditions stériles et/ou au traitement des tissus avec des bains d'antibiotiques et/ou d'agents mucolytiques. De manière avantageuse, les animaux prélevés sont mis en stabulation en écloserie, en eau de mer, par exemple pendant une quinzaine de jours, puis laissés au repos dans des bacs alimentés en eau de mer recyclée et stérilisée par UV. Pour réaliser l'étape d'incubation du procédé de culture de l'invention, on ensemence les cellules, dont on a vérifié la viabilité, par exemple à l'aide du test au bleu Trypan tel qu'évoqué ci-dessus, à raison d'environ 1 à 2 millions de cellules viables par ml de milieu. Comme montré dans les exemples, un taux d'ensemencement de l'ordre de 1,5 millions/ml donne des résultats satisfaisants. Les paramètres physico-chimiques du milieu de culture sont choisis en tenant compte des tests de viabilité et d'études de capacité fonctionnelles effectués à titre de contrôle. Ainsi, l'osmolarité est de l'ordre de 800 à 1300 mOsm, compte-tenu de l'osmolarité de l'eau de mer et de l'hémolymphe, et avantageusement de l'ordre de 1100 mOsm. Le pH du milieu est avantageusement choisi en fonction du pH du milieu interne et de celui du milieu externe. Les valeurs sont généralement de l'ordre de 7,3 à 8 ou plus. Un milieu tampon est de préférence ajouté aux milieux de culture. A titre d'exemple, on citera un tampon organique, comme le tampon Hepes. Le milieu de culture à base d'eau de mer est avantageusement complémenté en additifs tels que présents dans le milieu Leibovitz. Il en résulte un effet favorable sur l'adhésion cellulaire et sur le maintien des caractères morphologiques. Il est plus spécialement avantageux de complémenter l'eau de mer avec du milieu Leibovitz-15, à raison de 10 à 20% (V/V) environ, et en particulier de 15% environ (V/V). Selon une autre disposition avantageuse, l'eau de mer est en outre complémentée en sérum, notamment en sérum d'origine mammalienne. Des concentrations qui se révèlent appropriées sont de l'ordre de 5 à 15E (V/V), notamment de 10% (v/v) environ. On utilise de préférence du sérum décomplémenté. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, le milieu de culture comprend des lipides, plus spécialement des lipides insaturés origine marineven particulier de microalgues, ou encore au moins un facteur de complémentation d'origine marintou mammalienne choisi parmi llhémolympghe, les extraits dlembryonsvdes facteurs de croissance, comme l'EGF ou le bFGF, des extraits de ganglions cérébroïdes. Une température d'incubation généralement appropriée pour la réalisation des cultures est de l'ordre de 15 à 16"C. Toutefois, d'autres températures pourront être choisies en fonction des résultats des contrôles de viabilité et de capacité de biosynthèse des cellules et des types cellulaires à cultiver. Au cours de l'incubation, on opère sous atmosphère normale, non enrichie en CO2. Selon les techniques classiques, la culture est effectuée sur support, les supports en matériau plastique s'avérant satisfaisant à cet égard. Des facteurs d'attachement peuvent être utilisés pour favoriser l'adhésion cellulaire. Le milieu est renouvelé durant la culture. Les différentes étapes évoquées ci-dessus sont particulièrement appropriées pour la culture de cellules embryonnaires ou de cellules différenciées d'hémocytes et de cellules de divers organes tels que, selon les espèces, le manteau, les palpes labiaux, les muscles, les branchies, la glande digestive et le coeur, qui constitue un organe particulièrement préféré pour la mise en oeuvre du procédé de culture de l'invention. Ce procédé est d'application générale, et sera avantageusement mis en oeuvre pour la culture de cellules de Mollusques, d'Echinodermes, d'Arthropodes et autres Invertébrés marins. Parmi les Mollusques, on citera les bivalves, tels que les ostréidés, les mytilidés et les pectinidés, les Gastéropodes et les Céphalopodes ; parmi les Echinodermes, les Astéridés, les Echinides, parmi les Arthropodes, les crustacés comme les crevettes. L'invention vise également un procédé pour l'obtention sous forme congelée d'un matériel biologique tel que défini ci-dessus et comprenant les cellules isolées, avant ensemencement, les cellules recueillies après quelques jours de culture, ainsi que la matière première utilisable dans le cadre de la réalisation de cultures selon l'invention, telle qu'embryons et gamètes. Le matériel biologique, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus, est mis en contact avec un agent cryoprotecteur, puis est congelé à un température inférieure à - 200C, avantageusement inférieure à - 50"C, de préférence de l'ordre de -80 C, à une vitesse lente comprise entre 1 et 5 C/min, et plongé dans de l'azote liquide. Un agent cryoprotecteur particulièrement préféré est constitué par du diméthylsulfoxyde (DMSO). Le temps de contact avant la congélation est plus spécialement de 10 à 20 minutes. La décongélation du matériel biologique est réalisée en portant les récipients les renfermant à une température avantageusement supérieure à l'ambiante, de préférence de l'ordre de 30 à 400C, notamment de 370C environ. Pour réaliser cette étape, on plonge par exemple les récipients dans un bain-marie à la température choisie. Le milieu de congélation est alors avantageusement dilué avec un milieu de culture nutritif, et les cellules séparées. On effectue par exemple une centrifugation et, après récupération du culot cellulaire, on remet les cellules en suspension en vue de leur ensemencement. Comme illustré par les exemples, ce procédé permet d'obtenir des cellules dont la viabilité et l'activité de biosynthèse sont maintenues par rapport aux cellules obtenues après l'étape d'isolement. L'invention fournit ainsi un matériel de base qui facilite la réalisation de cultures cellulaires telles qu'indiquées ci-dessus et permet une standardisation des tests effectués avec ces cultures. Les cultures cellulaires telles qu'obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et les cellules recueillies à partir de ces cultures ainsi que de manière générale le matériel biologique tel que traité selon l'invention, en particulier le matériel biologique sous forme congelée entrent également dans le cadre de 1' invention. Les cultures cellulaires sont caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement, constituées de cellules viables, capables de néosynthétiser de l'ADN et autres produits à haute valeur ajoutée comme les protéines et lipides, en particulier les lipides insaturés définis dans les exemples et mis en évidence dans les tests de capacité fonctionnelle décrits dans ces exemples. L'invention vise également, en tant que produits nouveaux, ces protéines et lipides tels qu'identifiés par les tests décrits dans les exemples. Les cultures obtenues peuvent être des cocultures. L'invention vise notamment les co-cultures de cellules de type épithélial et de myocytes de Bivalves, notamment de coquille St-Jacques. Les études de faisabilité concernant l'utilisation des cultures cellulaires, des cellules et, d'une manière générale, du matériel biologique comme modèles dans des bioessais in vitro ont mis en évidence leur intérêt pour de nombreuses applications. Les cultures cellulaires et cellules de l'invention, et d'une manière générale ledit matériel biologique, plus spécialement les embryons et gamètes sous forme congelée, sont ainsi particulièrement avantageux comme modèles cellulaires in vitro en toxicologie et en pathologie. Ces modèles permettent la réalisation de test de toxicité aiguë sur des cellules d'Invertébrés marins, telles qu'obtenues selon les techniques décrites cidessus, qu'il s'agisse de cellules fraîches, congelées ou en kit. Ils constituent des biomarqueurs d'effets cytotoxiques et génotoxiques de xénobiotiques. On citera à titre d'exemple leur application à la surveillance de la qualité des eaux de mer, des sédiments, à l'étude des effets de produits sur l'environnement, que ce soient des produits purs ou en mélange, par exemple dans les effluents et les rejets. Ces modèles facilitent, d'une manière générale, l'étude d'effets cytotoxiques à court terme ou à long terme et permettent d'effectuer des tests de viabilité, comme des tests de fonction (en ciblant une fonction ou un mécanisme de la cellule). Ces cultures cellulaires, cellules et matériel biologique de l'invention, sont également utilisées avec avantage en pathologie. Ils constituent en particulier des modèles de choix pour mettre en évidence les effets cytopathogènes d'un virus, ou autres organismes pathogènes, sur une culture, et pour rechercher d'une manière générale, les effets de ces virus et organismes sur les Invertébrés marins. Selon un autre aspect, ils permettent également la production à des fins de recherche de ces organismes pathogènes. Entrent également dans le champ de l'invention, les kits pour la mise en oeuvre de ces tests. Ces kits comprennent le matériel biologique et les réactifs nécessaires à la réalisation des tests. De manière appropriée, le matériel biologique comprend les cellules isolées, les cellules congelées, les milieux de culture étant fournis dans des récipients distincts, ou les cultures cellulaires, avec leur milieu de culture. L'invention fournit également avec les cultures cellulaires des outils de grande utilité pour réaliser des fécondations in vitro, pour des applications en écloserie. L'utilisation de lots congelés d'ovocytes, le cas échéant de spermotazoides, permet de disposer à tout moment de cellules reproductrices. Il est ainsi possible de se dégager des contraintes de saison et d'être assuré d'une qualité constante toute l'année. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans la description qui suit d'expérimentations se rapportant à deux bivalves marins, la coquille St-Jacques et l'huître creuse. Il y est fait référence aux figures 1 à 31 qui représentent - les figures 1 et 2, les autoradiographies de cultures de cellules de coeur de coquille St-Jacques (respectivement de myocytes et de cellules de type épithélial) après incorporation de thymidine 3H ; - la figure 3, l'autoradiographie de cultures de cellules de branchies de coquille St-Jacques, après incorporation de thymidine 3H ;; - les figures 4 et 5, une photo d'un test Brd U sur des cellules de coeur de coquille St-Jacques en culture après incubation respectivement de 48h et de 24h - la figure 6, l'incorporation de leucine 14C et de thymidine 3H (Dpm/,ug prot) en fonction du temps de culture pour des cellules de coeur de coquille St-Jacques, - les figures 7 à 9, l'autoradiographie de cellules de coeur de coquille St-Jacques après incubation de leucine 14C, - la figure 10, l'autoradiographie de cellules de branchies de coquille St-Jacques après incubation de leucine 14C, - les figures llA et B et 12, respectivement l'électrophorèse (11A) et l'autoradiographie de l'électrophorèse (11B et 12) des protéines de cultures de cellules de coeur de coquille St-Jacques, à différents jours de cultures - les figures 13 et 14, les photos d'autoradiographie de cellules de coeur de coquille après incubation d'acétate 14C, - les figures 15 et 16, les autoradiographies de chromatogrammes sur couche mince séparant des lipides néosynthétisés à partir d'acétate 14C par des cellules de coeur de coquille St-Jacques, - les figures 1A et 17B, le profil, respectivement, en lipides polaires et en lipides neutres, de cellules cardiaques de coquilles St-Jacques, juste après isolement et au bout de 7 jours de culture, - les figures 18A et 18B, les histogrammes des compositions en acides gras des lipides polaires et des lipides neutres dans ces cellules cardiaques, juste après isolement et après 7 jours de culture, - les figures 19A et l9B, la composition quantitative en acides gras des lipides polaires et des lipides neutres dans les cellules cardiaques juste après isolement et après 7 jours de culture, - la figure 20, la composition en acide gras du milieu de base contenant du SVF, - les figures 21 et 22, les autoradiographies d'électrophorèse des protéines néosynthétisées à partir de méthionine 35S par des cellules de coeur de coquille St-Jacques;; - les figures 23 à 25, les autoradiographies de chromatogrammes sur couche mince séparant les lipides néosynthétisés à partir d'acétate 14C par des cellules de coeur de coquille St-Jacques, - la figure 26, l'incorporation de leucine 14C et de thymidine 3H, mesurée par comptage en scintillation, après 7 jours de culture, par des cellules congelées-décongelées, comparativement à des cellules du même lot ensemencées dès l'isolement, - la figure 27, l'autoradiographie d'électrophorèse des protéines néosynthétisées à partir de méthionine 35S par des cellules de coeur de coquille St-Jacques non congelées et congelées-décongelées après 7 jours de culture dans le milieu de base - les figures 28A et 28B, l'autoradiagraphie de chromatogrammes sur couche mince séparant les lipides néosynthétisés à partir d'acétate 14C par des cellules de coeur de coquille St-Jacques non congelées et congeléesdécongelées après 7 jours de culture dans le milieu de base, - la figure 29, l'effet du chlorure de mercure (10-2M) sur la courbe de consommation d'oxygène des cellules de branchies de coquille St-Jacques en suspension ; - la figure 30, l'effet de métaux lourds sur la courbe de consommation d'oxygène des cellules embryonnaires d'huître en suspension - les figures 31A à 31D, l'effet de métaux lourds sur l'activité estérasique de cellules de coeur de coquilles St-Jacques en culture primaire. Matériel et Méthodes utilisés - Résultats obtenus Le matériel biologique, animaux et cellules, est constitué par - Pour les animaux, des coquilles Saint-Jacques Pecten maximus et des huîtres creuses Crassostrea gigas. Les coquilles St-Jacques sont prélevées par dragage, soit en Baie de St-Brieuc, soit en Rade de Brest (Finistère). Elles sont mises en stabulation en écloserie pendant environ un mois avant les manipulations. Les huîtres, destinées à l'obtention d'embryons, sont aussi conditionnées à l'écloserie pour subir une maturation contrôlée pendant un mois. - Pour les cellules, des cellules embryonnaires et des cellules différenciées. Les cellules embryonnaires sont obtenues par dissociation d'embryons d'huître au stade de division 416 cellules. Les embryons sont obtenus par fécondation in vitro, en procédant comme suit - Prélèvement des gamètes Le procédé classiquement utilisé en écloserie pour obtenir, chez les bivalves, l'émission artificielle des gamètes est l'induction par chocs thermiques, d'amplitude variable selon les espèces (7-80C pour l'huître creuse). Pour l'huître, il est aussi possible de ponctionner directement dans la gonade les cellules sexuelles matures. Après ouverture de l'huître, la glande génitale est désinfectée par badigeonnage d'un antiseptique (la bétadine) dilué au demi dans de l'eau de mer. Les gamètes sont directement prélevés dans la gonade par ponction à la seringue stérile. Un examen au microscope photonique est pratiqué pour vérifier s'il s'agit d'ovocytes ou de spermatozoïdes et apprécier leur qualité (motilité pour les spermatozoïdes, état de maturité pour les ovocytes). Les gamètes mâles et femelles sont recueillis séparément, dans de grands volumes d'eau de mer stérilisée, filtrée à 0,2 um, et additionnée d'une solution d'antibiotiques (solution A donnée ci-après) - Fécondation On réalise une fécondation croisée, selon la méthode de Gruffydd et Beaumont (1970) (les références bibliographiques sont données en fin de description) : le sperme de plusieurs mâles en mélange est progressivement ajouté aux ovocytes jusqu'à ce que soient observés cinq à sept spermatozoïdes autour de chaque ovocyte. L'émission du premier globule polaire permet de vérifier microscopiquement que la fécondation a eu lieu. - Embryogénèse - Recueil des embryons Les oeufs sont maintenus en atmosphère stérile à une température de 15"C jusqu'à l'obtention d'embryons au stade de développement 8-16 cellules. Ceux-ci sont alors concentrés, sous hotte à flux laminaire, par filtration sur des tamis de porosité 30 pin puis aliquotés. Les cellules différenciées sont isolées de divers organes de coquille Saint-Jacques - le manteau et les palpes labiaux, dont les épithéliums sont soutenus par un tissu conjonctif épais riche en fibroblastes, - le muscle et le coeur, qui permettent de réaliser des suspensions cellulaires exemptes de contaminants microbiens. Le coeur notamment, protégé par une membrane péricardique, n'est pas directement en contact avec l'eau de mer qui contient nécessairement divers types de microorganismes, - les branchies, organes largement en contact avec l'eau de mer, constituant un modèle intéressant pour des études en toxicologie. I) C U L T U R E Les animaux et les tissus sont soumis tout d'abord à un pré-traitement, puis on procède à l'isolement des cellules et à leur culture. Ces différentes étapes sont réalisées comme suit 1) - PRE-TRAITEMENT Les animaux, avant dissection, sont soigneusement brossés en eau de mer filtrée (à 0,2 um) afin de les débarrasser de leur épifaune. Avant ouverture des valves, les coquilles sont désinfectées (par exemple à l'alcool 900). Les coquilles Saint-Jacques et les huîtres sont ensuite ouvertes en atmosphère stérile et lavées par un grand volume d'eau de mer stérile, puis désinfectées. On utilise par exemple de la bétadine diluée au demi dans de l'eau de mer stérile pendant 5 min. Les différents tissus sont disséqués stérilement. Avant d'être dissociés, les divers tissus sont traités par des bains d'antibiotiques de concentration décroissante (4X, 2X, 1X). Chaque bain dure cinq minutes. On utilise avantageusement la solution d'antibiotiques A, répondant à la composition suivante, d'autres solutions étant toutefois utilisables Solution A Pénicilline - Streptomycine : (Gibco) 50 UI/ml-50 pg/ml Kanamycine ( Sigma ) : 10 pg/ml Gentamycine ( Sigma ) : 20 pg/ml Les antibiotiques sont dissous dans de l'eau de mer stérile. 2) - ISOLEMENT DES CELLULES Deux techniques sont utilisées afin d'isoler les cellules : la technique par explants et la dissociation des tissus. A. par explants Les divers organes prélevés et décontaminés sont redécoupés stérilement en fragments d'environ 1 mm3. Les échantillons obtenus sont déposés un à un sur le support de culture, puis recouverts progressivement de milieu. Afin d'éliminer le facteur individuel, chaque culture est réalisée avec des fragments provenant de plusieurs individus. On observe des migrations de cellules à partir d'explants de coeur, de branchies et de palpes labiaux. Les cellules qui migrent à partir des fragments de branchies et de coeur sont de type fibroblaste. Pour les palpes labiaux, des cellules de type épithélial sont aussi observées. Ces migrations de cellules se produisent généralement après deux à trois jours de culture dans le cas du coeur et des branchies, plus tardivement pour les palpes labiaux (environ quinze jours) . Le nombre de cellules migrant à partir des explants augmente pendant deux à trois semaines, et dans le cas du coeur, elles finissent par former un tapis cellulaire, puis elles se détachent progressivement du fond des boîtes et dégénèrent. Les explants de coeur continent à se contracter rythmiquement, même après trois semaines in vitro. B. par dissociation des tissus SYSTEME DE DISSOCIATION Des essais de dissociation enzymatique, chimique ou mixte, ont été réalisés pour les divers organes étudiés et pour les embryons. Parmi les enzymes et produits utilisés, on citera - la pronase : Streptomyces griseus (Sigma) - l'élastase : Porcine pancreas (Boehringer) - la trypsine : Bovine pancreas (Boehringer) - la collagénase : Clostridium histolyticum (Sigma) - la pepsine : Porcine stomach mucosa (Sigma) - la collagénase- dispase :Acinetobacter iophagus/Bacillus polymixa (Boehringer) - l'EDTA : (sel disodique de l'acide éthylène diamine tétraacétique) - la solution de dissociation non enzymatique prête à l'emploi (HBSS Sigma) - l'Alsever, un anti-agrégant à base d'EDTA dont la composition est la suivante : glucose, 20.8 g; citrate de sodium, 8 g ; EDTA, 3.3 g ; NaCl, 22.30 g; eau distillée 100 ml. Ces composés, utilisés à des concentrations variables en solution de Hanks sans calcium ni magnésium, de pH 7,3, dont l'osmolarité est ajustée à 1100 mOsm par addition de NaCl, sont généralement additionnés au mélange d'antibiotiques. Le temps de contact des cellules avec la solution de dissociation est d'une heure. Le traitement est complété par une agitation mécanique. Les expériences sont réalisées à température ambiante. L'action enzymatique est stoppée par deux lavages successifs en eau de mer stérile. A l'exception du muscle pour lequel plusieurs enzymes permettent d'obtenir des cellules isolées avec un taux de viabilité de l'ordre de 80 % au moins, le traitement d'une heure à 150C par la pronase à 0,2 %, donne souvent les meilleurs résultats pour les autres organes étudiés. Les taux de viabilité moyens sont proches de 80 % ou supérieurs à cette valeur. La pronase, seule ou en association, s' avère particulièrement appropriée pour dissocier les embryons, bien protégés par une enveloppe épaisse et résistante. L'examen en microscopie électronique des cellules embryonnnaires d'huître, des cellules de branchies et de coeur de coquille Saint-Jacques isolées par la pronase, confirme que la majeure partie des cellules ne présente aucune altération ultrastructurale. DE CONTAMINATION DES SUSPENSIONS CElLULAIRES Certaines populations cellulaires obtenues par dissociation se sont révélées fortement contaminées par des bactéries, en particulier les branchies et le manteau. Un protocole de décontamination est alors avantageusement suivi selon lequel on utilise un produit mucolytique, le dithiothréitol (DTT). Les tissus sont traités par immersion durant 15 minutes, dans un bain d'eau de mer stérile contenant du DTT à 25 mM, 50 mM ou 100 mM. Après lavage à l'eau de mer stérile, ils sont ensuite immergés dans des bains d'antibiotiques de concentrations décroissantes (4X, 2X, 1X), avant d'être dissociés. Un contrôle microbiologique est réalisé par ensemencement des suspensions cellulaires sur milieu de Zobell (milieu de culture pour bactéries marines). L'action du DTT sur les cellules dissociées a également été vérifiée par rapport à des lots contrôles. Cette étude a été faite pour les diverses concentrations du produit, pour diverses concentrations de pronase (0,1 %, 0,05 % ou 0,025 %) et pour des conditions de dissociation de 12 heures à 40C ou d'un quart d'heure à température ambiante. Les données sont traitées par analyse de variances afin de comparer les divers résultats obtenus. Le contrôle bactériologique de branchies ainsi traitées montre une très nette diminution du nombre de colonies. Cette diminution est "dose-dépendante" : le nombre des colonies diminue d'autant plus que la concentration en DTT augmente. Ce traitement est conforté si nécessaire par un traitement plus spécifique par antibiotiques. La viabilité des cellules de branchies n'est pas affectée par un tel traitement, quelle que soit la dose de DTT. L'utilisation de pronase à 0,025 % additionnée d'antibiotiques, pendant 12 heures à 4 C, après action de DTT à 50 mM, donne les meilleurs résultats. EVALUATION DE LA VIABILITE DES CELLULES ISOLEES La viabilité des cellules après isolement a été évaluée par la méthode d'exclusion du bleu Trypan. Le bleu Trypan est un colorant qui ne pénètre que dans les cellules mortes ou endommagées. Ce test a dû être adapté au milieu marin en ajustant l'osmolarité de la solution colorante à l'aide d'un sucre de faible poids moléculaire, l'arabinose, pour éviter d'avoir des solutions trop visqueuses qui auraient gêné la sédimentation des cellules. Les comptages sont réalisés sur des suspensions cellulaires diluées au 1/20ème dans du bleu Trypan à 0,2 % (p/v) en concentration finale. Les cellules mortes, colorées en bleues, et vivantes, non colorées, sont dénombrées par comptage en cellule de Malassez, ce qui permet le calcul du taux de viabilité des cellules. 3) - CULTURE DES CELLULES DANS LE MILIEU DE BASE Les cellules mises en culture pour ces études sont essentiellement des cellules de branchies et de coeur de coquilles St-Jacques et des cellules embryonnaires d'huître. CONDITIONS DE CULTURE Dénombrement et ensemencement des cellules Après appréciation de la viabilité cellulaire par le test au bleu Trypan, les cellules sont inoculées en plaque multipuits, en boîtes de culture ou en flacons à raison de 1,5 millions de cellules viables par millilitre de milieu. Milieu de culture Paramètres physico-chimiques a) Osmolarité L'osmolarité du milieu est ajustée à 1100 mOsm par addition de NaCl (Sigma) .Les mesures sont faites à l'aide d'un osmomètre (Osmomat 030, Merck). b) pH Le pH du milieu varie selon les essais de 7,3 à 7,9. Un indicateur de pH, le rouge de phénol (Sigma), est ajouté au milieu de culture à raison de 10 ug/ml, afin de contrôler les variations éventuelles de pH durant la culture des cellules. c) système tampon Un tampon organique, l'Hepes (Calbochiem), est généralement ajouté aux milieux de culture. Sa concentration finale est de 10 mM. Les cultures de cellules de branchies et de coeur de coquille St-Jacques et celles de cellules embryonnaires d'huître sont réalisées dans un milieu dont la constitution est la suivante - eau de mer - 10 % de Leibovitz L-15 - 10 % de sérum de veau foetal non décomplémenté - Mélange d'antibiotiques : pénicilline 50 U.I./ml, streptomycine 50 ug/ml, kanamycine 10 ug/ml, gentamycine 20 ug/ml - 10 mM d'Hepes - 10 ug/ml de rouge de phénol. Les milieux sont stérilisés par filtration à 0,2 um et conservés à -20 C jusqu'à leur utilisation. Le sérum est ajouté extemporanément. Support des cultures On utilise des supports en matériau plastique. Les cellules sont cultivées à 15"C et en atmosphère non enrichie en CO2. Que ce soit pour les embryons d'huître ou pour les branchies et le coeur de coquille Saint-Jacques, les cellules mises en culture forment, immédiatement après l'inoculation, de petits amas dont la plupart adhèrent au plastique. Deux ou trois jours plus tard, de nombreuses cellules adhérentes, bien étalées sur la surface, sont visibles à proximité des agrégats. Leur nombre augmente en fonction du temps de culture, régulièrement jusqu'à 20 jours. Les cellules forment alors un tapis quasiconfluent. Pour les cellules de branchies et les cellules embryonnaires, quelques amas cellulaires restent toujours en suspension et une activité ciliaire intense est observée pendant environ une semaine. Dans ces deux cas, les cellules adhérentes sont de type fibroblaste. En revanche, en ce qui concerne les cultures de cellules cardiaques, deux types de cellules adhérentes sont observés après trois ou quatre jours de culture - des cellules de type épithélial, qui sont toujours minoritaires, - des cellules de type fibroblaste, les plus nombreuses. Pour ces cultures une différenciation cellulaire terminale est observée après environ une semaine d'incubation : lorsque les cellules sont quasiconfluentes, elles reconstituent des symplastes, formations plurinucléées de type myotubes, qui se contractent à intervalles de temps réguliers. L'adhésion cellulaire a été évaluée comme suit: Après trois ou quatre jours d'incubation, un test MTT et un dosage de l'acide désoxyribo-nucléique (ADN) sont réalisés afin de comparer l'efficacité des différents revêtements par rapport au plastique de culture. La quantité d'ADN permet d'apprécier le nombre de cellules adhérentes mais il ne prend pas en compte l'aspect viabilité cellulaire, renseignement qu'apporte le test MTT. L'ADN des cellules est dosé par fluorimétrie (Labarca et Paigen, 1980), après plusieurs lavages des puits de culture. Ce dosage utilise le réactif de Hoechst qui, lié à l'ADN, émet une fluorescence à 458 nm quand il est excité à 356 nm. Conditions d'incubation En tenant compte des conditions de stabulation des huîtres et des coquilles Saint-Jacques en écloserie, on utilise une température de 15 C-16 C pour cultiver les cellules de coeur et de branchies de coquille Saint Jacques et une température de 20 C pour les cellules embryonnaires d'huître. Les cellules sont cultivées en atmosphère normale non enrichie en CO2. Renouvellement du milieu Le premier changement de milieu est effectué au bout de trois à quatre jours, une fois que les cellules ont bien adhéré au support de culture. Seule la moitié du milieu est renouvelée. Par la suite, un changement complet du milieu est effectué tous les trois jours. DETERMINATION DU POURCENTAGE D'ADHESION Quatre jours après l'ensemencement, les cellules adhérentes sont, après lavage en eau de mer, décollées du support par de la pronase à 0,025 gO. Après trois à quatre minutes de traitement, elles sont reprises dans un grand volume d'eau de mer, centrifugées à 1500 trs/min pendant quatre minutes, puis dénombrées en cellule de Malassez. Le rapport entre le nombre de cellules adhérentes et le nombre de cellules totales ensemencées, multiplié par 100, donne le pourcentage d'adhésion. IDENTIFICATION DES CELLULES ADEPTES EN CULTURE Microscopie électronique Afin d'identifier les cellules adhérentes en culture, les cellules ont été examinées en microscopie électronique à transmission. Pour le coeur de la coquille St-Jacques, on note dans le cytoplasme de la quasi-totalité des cellules de type fibroblaste la présence de myofibrilles. Leur examen prouve que ce sont des cardiomyocytes. Le cytoplasme est généralement chargé en inclusions lipidiques, comparativement à celui des cellules de coeur avant ensemencement. Immunocytochimie Les cellules de type fibroblaste adhérentes au support ont été caractérisées par immunofluorescence indirecte, à l'aide d' anticorps primaires, l'antimyosine Rb (Sigma M-7648) ou l'anti-tropomyosine Rb (Sigma T-3651) dilués au 1/l0ème. Après un lavage bref en tampon phosphate (PBS - osmolarité 1100 mOsm), les cellules sont fixées pendant 30 minutes à 4"C avec du paraformaldéhyde à 4% en tampon cacodylate de sodium 0,1M, pH 7,4. Elles sont ensuite lavées à deux reprises pendant 15 minutes en tampon cacodylate 0,1M, puis sont mises à incuber dans trois bains de 30 minutes de NH4C1 qui permettent de saturer les aldéhydes. Un traitement de 30 minutes dans de l'albumine sérique de boeuf (BSA) à 3 % sature ensuite les sites non spécifiques. La membrane cellulaire est perméabilisée par une incubation d'une heure dans de la saponine 0,1 % en tampon PBS. Le premier anticorps anti-myosine ou antitropomyosine dilué au 1/l0ème dans le mélange PBSsaponine 0,1% est ensuite appliqué pendant 1 heure. Après deux lavages par le mélange PBS-saponine, les cellules sont incubées en présence du deuxième anticorps, antirabbit IgG - FITC conjugué (Sigma F - 0511), dilué au 1/50ème pendant une heure. Elles sont ensuite lavées deux fois pendant 30 minutes par du PBS et des lamelles sont appliquées sur le fond des boîtes. Le montage est effectué avec du PBS-glycérol (lv/9v) . L'observation est faite au microscope à fluorescence. Des boîtes servant de témoins négatifs, non traitées par le premier anticorps ou le deuxième anticorps sont réalisées en parallèle. Les cellules de coeur fusiformes, adhérentes en culture, observées au microscope à fluorescence après incubation en présence d'anticorps anti-myosine, marqueur des fibres musculaires, puis d'un anticorps secondaire couplé à la fluorescéine, apparaissent vertes fluorescentes. Le témoin négatif, non traité par l'anticorps primaire, ne présente que quelques inclusions intracytoplasmiques fluorescentes. Ces inclusions correspondent vraisemblablement à des lipofuschines ou à des lipocarotènes. Une réaction fortement positive est également notée après traitement par l'anticorps anti-tropomyosine, moins spécifique cependant des cellules musculaires que la myosine. Dans ce cas, les filaments de tropomyosine sont nettement visibles dans les cellules. Les témoins, non incubés en présence d'anticorps primaire, ne présentent que quelques globules fluorescents jaunes. Il est intéressant de noter que des anticorps d'origine mammalienne réagissent positivement avec les cellules de bivalves, mais il est nécessaire de les utiliser à plus forte concentration. Ces diverses observations confirment que la majeure partie des cellules adhérentes de coeur de coquille St-Jacques, d'aspect fibroblastique, sont des myocytes. La qualité des cultures et la capacité fonctionnelle des cellules cultivées sont évaluées par observation microscopique et à l'aide de tests de capacité fonctionnelles pour l'observation microscopique, on utilise un microscope inversé, en prenant en considération les critères suivants : adhésion des cellules, étalement, présence ou absence de vacuoles intracytoplasmiques, aspect granulaire général. Une étude plus ponctuelle en microscopie électronique a aussi permis de vérifier l'intégrité cellulaire. Pour les tests de capacité fonctionnelle, on a recours aux techniques d'autoradiographie, à l'utilisation d'un analogue de la thymidine, la 5-bromo2'-déoxyuridine (BrdU), au comptage en scintillation, à l'électrophorèse et à l'autoradiographie d'électrophorèse, a la chromatographie sur couche mince (CCM) et à l'autoradiographie de chromatogrammes. a) - Autoradiographie On visualise l'incorporation de précurseurs radiomarqués dans les cellules en culture, afin de préciser les lieux de synthèse des macromolécules. Après marquage des cellules, une émulsion photographique sensible aux radioéléments et contenant un sel d'argent est coulée sur les cultures ; les radioéléments l'impressionnent, ce qui se traduit par des grains d'argent métallique noirs. On étudie ainsi - la néosynthèse d'ADN par l'utilisation de thymidine 3H - la néosynthèse des protéines par incorporation de leucine 14C - la néosynthèse des lipides à l'aide d'acétate 14C La localisation des grains d'argent à l'intérieur de la cellule peut être facilitée par une coloration histologique permettant de différencier le noyau et le cytoplasme. Les différentes étapes de cette technique sont les suivantes - cellules adhérentes en culture ; - 2 lavages rapides en eau de mer - incubation : avec acide aminé marqué - rinçages (7 x 5 min) avec eau de mer ; - fixation : 3 min avec glutaraldéhyde 2,5 % en tampon cacodylate Na 0,1M ; - lavages : 2 x 5 min avec tampon cacodylate Na 0,1M ; - élimination du tampon - coulage d'une émulsion photographique; - exposition : 1 semaine - révélation : 4 min - lavage à l'eau distillée - coloration (MGG ou rouge nucléaire). Les cellules en culture sont rincées deux fois à l'eau de mer stérile puis elles sont incubées pendant 24 heures en présence de leucine 14C à 0,2 pCi/ml (activité spécifique : 311 mCi/mol, Amersham), d'acétate 14C à 3 ,uCi/ml (activité spécifique : 56 mCi/mol, Amersham) ou de thymidine 3H à 1 uCi/ml (activité spécifique : 27 mCi/mol, Amersham) dans de l'eau de mer artificielle contenant des antibiotiques. Après incubation, les cellules sont rincées sept fois à l'eau de mer, afin d'éliminer la radioactivité non spécifique ; on effectue un comptage sur le dernier surnageant afin de vérifier en scintillation liquide qu'il ne reste plus de radioactivité. Divers témoins non traités par les éléments marqués subissent les mêmes traitements. Les cellules sont ensuite fixées à la glutaraldéhyde 2,5 % en tampon cacodylate de sodium 0,1 M, pH 7,2, 1100 mosm pendant trois minutes sur de la glace. Elles sont rincées deux fois par du tampon cacodylate et peuvent ensuite être conservées dans ce tampon à 40C, jusqu'à traitement ultérieur. Après élimination du tampon, une émulsion (Amersham LM-1) est coulée sur les boites de culture. Après environ une semaine d'exposition à 40C, les autoradiographies sont développées : la révélation est effectuée pendant 4 minutes à température ambiante (révélateur Il fort Hypam). Les boîtes de cultures sont lavées à l'eau distillée et conservées dans de l'eau distillée jusqu'à coloration soit par un "May-Grunwald Giemsa "(MGG), soit au rouge nucléaire. b) - Test BrdU Pour détecter une éventuelle prolifération des cellules en culture, on met en oeuvre une technique utilisant un analogue de la thymidine, la BrdU (kit RPN 20 -Amersham). La BrdU est incorporée dans 1'ADN réplicatif, puis localisée en utilisant un anticorps monoclonal spécifique (anti-BrdU) couplé à une nucléase qui dénature l'ADN. Pour augmenter la sensibilité de la technique, les cellules sont exposées simultanément à la BrdU et à la 5-fluoro-2'-deoxyuridine, un inhibiteur de la thymidilate synthétase qui augmente l'incorporation de la BrdU en diminuant la compétition avec la thymidine exogène. La détection de l'anticorps primaire est réalisée en utilisant l'anticorps de souris IgG2A, puis couplée au système peroxydase-antiperoxydase. Ce test présente l'avantage de ne pas utiliser d'élément radioactif. On opère selon les étapes suivantes - cellules adhérentes en culture - incubation : BrdU (24 h); - lavage rapide en PBS - fixation : acide acétique-éthanol (30 min) ; - lavages avec PBS (3 x 3 min) - incubation : PBS + 10 % SVF (sature les sites aspécifiques) - incubation : nucléase-anti BrdU (1 h) - lavages en PBS (3 x 3 min) ; - incubation : IgG2A anti souris-peroxydase (30 min); - lavages en PBS (3 x 3 min); - coloration : DAB + "substrat intensifieur" (10 min) ; - coloration au GIEMSA (3 min). La BrdU est diluée au 1/l000ème dans le milieu de culture. Les cellules sont incubées pendant 24 à 48 heures en présence de ce substrat puis sont lavées au PBS (osmolarité ajustée à 1100 mOsm). Elles sont ensuite fixées à l'acide acétiqueéthanol pendant 30 minutes à température ambiante (éthanol absolu 90 %, acide acétique glacial 5 %, eau 5 %). Trois lavages de trois minutes chacun sont effectués en PBS avant de saturer les sites aspécifiques par du PBS additionné de 10 % de SVF. Trois lavages en tampon phosphate sont ensuite réalisés. Le mélange reconstitué nucléase/anti BrdU est alors mis en contact des cellules pendant une heure à température ambiante. Trois nouveaux lavages en PBS (3 minutes chacun) précédant l'application du IgG2A antisourisperoxydase pendant 30 minutes à température ambiante sont réalisés. Après encore trois nouveaux lavages en PBS (3 minutes chacun), une fraction aliquote de diéthylaminobenzidine (DAB) concentrée est diluée dans 50 ml de tampon phosphate, auquel on rajoute cinq gouttes de substrat intensifieur. La coloration dure dix minutes. Elle est suivie de trois lavages à l'eau distillée, de trois minutes chacun. Une coloration au GIEMSA est ensuite effectuée. Dans les cellules qui ont incorporé la BrdU, les noyaux et surtout la chromatine sont colorés en bleu foncé. Des boîtes de culture, "témoins négatifs", sont traitées sans application du système BrdU-antiBrdU (remplacé par du PBS). c) - Comptage en scintillation La mesure de l'incorporation de thymidine 3H et de leucine 14C permet d'apprécier la capacité des cellules en culture à néosynthétiser de l'ADN et des protéines. De manière classique, les cellules sont soumises aux étapes suivantes - cellules adhérentes en culture - 2 lavages rapides : eau de mer ; - incubation : 24 heures avec acide aminé marqué ; - lavages en eau de mer (2 x 5 min) - sonication dans 150 ul PBS ; suivie du dosage des protéines (Bradford) sur 50 ,ul et du dosage de la radioactivité incorporée sur 100 pl auxquels on ajoute 250pu d'acide trichloracétique (TCA) 60 % + 250 pl de BSA (précipitation : 1 nuit à 4 C ; centrifugation : 3000 trs/min 15 min, reprise par TCA 10 % ; centrifugation : (3000 trs/min 15 min) ; reprise par TCA 5 % (x 2) ; centrifugation (3000 trs/min 15 min) ; addition d'acide formique, mesure de la radioactivité en scintillation liquide). Les cellules adhérentes sont rincées deux fois à l'eau de mer stérile, puis les cultures sont incubées pendant 24 heures en présence de leucine 14C 0,2 ,uCi/ml (activité spécifique : 311 mCi/mmol, Amersham) ou de thymidine 3H à 1 uCi/ml (activité spécifique 27 ,uCi/mmol, Amersham) en eau de mer artificielle stérile additionnée d'antibiotiques. Elles sont ensuite rincées deux fois en eau de mer puis congelées "à sec" à -80 C. Précipitation des protéines et comptage de la radioactivité Les cellules sont soumises à un traitement de sonication dans 150 ul de PBS. Cinquante microlitres sont prélevés pour le dosage des protéines par la technique au bleu de Coomassie, les 100 pl "restant" servent à doser la radioactivité incorporée. A ces 100 pl sont ajoutés 250 ul d'acide trichloracétique (TCA) (Carlo Erba) à 60 % et 250 ul d'albumine sérique de boeuf (Sigma) à 0,6 mg/ml. La précipitation se fait pendant une nuit à 40C. Les précipités sont concentrés en culot par centrifugation à 3000 trs/min pendant 15 minutes. Les surnageants sont éliminés et les culots sont repris par 250 pl de TCA à 10 %.Les précipités sont ensuite lavés deux fois par du TCA 5 % afin d'éliminer le précurseur non incorporé ; 150 ul d'acide formique sont ensuite ajoutés afin de dissoudre les protéines et la radioactivité est mesurée en scintillation liquide. Dosage des protéines au bleu de Coomassie, selon la méthode de Bradford (1976) Une gamme étalon d'albumine sérique de boeuf est réalisée à partir d'une solution mère à 0,25 mg/ml. Cinq dilutions successives au demi sont effectuées dans du tampon PBS. Cinquante microlitres de chaque échantillon à analyser et de la gamme étalon sont déposés en duplicate dans une plaque de lecture de 96 puits. Après avoir ajouté 200 ul de bleu de Coomassie R-250 (Biorad) dilué au 1/4 dans de l'eau ultra-pure (filtration appareil Milli Q), l'absorbance est mesurée au spectrophomètre à 620 nm. - Calcul de la radioactivité incorporée Les comptages obtenus à l'aide du compteur ss (Packard) sont ensuite ramenés à la quantité de protéines par puits de culture. Les résultats sont exprimés en Dpm/ug de protéines (Dpm = désintégration par minute). d) Electrophorèse et autoradiographie d 'électrophorèse Afin de visualiser d'éventuelles différences au niveau de la synthèse des protéines en fonction du temps de culture, ces composés sont séparés par électrophorèse après incubation des cellules avec de la méthionine marquée au 35S. Les étapes mises en oeuvre sont les suivantes - cellules adhérentes en culture - 2 lavages rapides : eau de mer - incubation : 24 heures avec méthionine 35S ; - lavages en eau de mer (2 x 5 min) ; - congélation à sec à - 80"C ; - "sonication" : solution de dissociation (2 x 20 sec) ; - chauffage : 100"C, Smin ; - comptage en scintillation liquide sur un échantillon - dépôt sur gel d'électrophorèse (migration ; coloration au nitrate d'argent ; séchage du gel : 370C, 12 heures ; dépôt film : autoradiographie et, exposition -80 C, révélation). Incorporation de méthionine marquée Après deux rinçages en eau de mer stérile, les cellules sont incubées pendant 24 heures en présence de méthionine 35S à 5 uCi/ml en eau de mer artificielle stérile complémentée en antibiotiques. Après incubation, les cellules subissent deux lavages en eau de mer puis elles sont congelées "à sec" à -800C. Obtention des protéines et comptage Les cellules sont "soniquées" (2x20 sec) dans 250 ul d'un mélange Tris-HCl 10mM ; EDTA lmM, pH 8 dodecyl sulfate de sodium (SDS) 2,5 % ; mercaptoéthanol 5 % ; bleu de bromophénol 0,01 %. Les suspensions obtenues sont ensuite chauffées à 1000C pendant cinq minutes. Un échantillon est prélevé et la radioactivité est comptée au compteur à scintillation liquide. Electrophorèse et coloration La séparation des protéines s'effectue par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de SDS (Biorad) selon la méthode de Laemmli (1970). Le gel utilisé est un gel de polyacrylamide de gradient 10-15. L'électrophorèse est effectuée à l'aide de l'appareil Phast System (Pharmacia). Les échantillons sont dilués afin d'obtenir la même quantité de radioactivité. Un microlitre de chaque échantillon est déposé sur le gel. Après migration, le gel est coloré au nitrate d'argent selon une méthode dérivée de celle de Heukeshoven et Demick (1985). Le gel est ensuite séché à l'étuve pendant 12 heures à 37 0C. Révélation Des films pour autoradiographie (hyperfilm ss max, Amersham) sont déposés sur les gels d'électrophorèse. L'exposition est faite à -80 C pendant un temps variable selon les manipulations, en fonction de la quantité de radioactivité "déposée". L'estimation du poids moléculaire des différentes protéines s'effectue en se référant à des standards de poids moléculaires connus déposés en même temps que les échantillons : SDS standard (Biorad) Bas poids moléculaire : 14 à 97 kilodaltons. Haut poids moléculaire: 40 à 200 kilodaltons. e) - Chromatographie sur couche mince (CCM) et autoradiographie de chromatogramme Afin d'étudier la synthèse des lipides par les cellules cardiaques en fonction du temps de culture après incorporation d'un précurseur, l'acétate marqué au 14C, ceux-ci sont extraits. Les divers types de lipides néosynthétisés sont séparés par chromatographie sur couche mince puis révélés par contact avec un film pour autoradiographie. Parallèlement, les lipides du tissu cardiaque sont extraits et séparés de la même façon que pour les cellules en culture afin d'essayer d'identifier les lipides présents dans le tissu et de les comparer à ceux néosynthétisés par les cellules en culture. Les étapes suivies sont schématisées ci-après - cellules adhérentes en culture - 2 lavages rapides : eau de mer ; - incubation : 24h avec acétate 14C ; - lavages en eau de mer (2 x 5 min) ; - congélation à - 800C (au moins 15 min) - sonication : méthanol - chloroforme - agitation 2 min, puis addition de Kcl - agitation : 2 min, centrifugation (2000 trs/min pendant 5 min) - récupération phase organique ; - évaporation sous azote ; - chloroforme - méthanol (2/1) et - comptage en scintillation liquide sur un échantillon, et - dépôt sur plaque de silice sur la partie restante (migration ; dépôt film autoradiographie ; exposition -800C ; révélation). Incorporation d'acétate marqué Les cellules sont rincées deux fois à l'eau de mer stérile, puis les cultures sont incubées pendant 24 heures en présence d'une solution d'acétate 14C à 5 ,uCi/ml (activité spécifique 56,2 mCi/mmole, Amersham) en eau de mer artificielle stérile additionnée d'antibiotiques. Après incubation, les cellules sont rincées deux fois à l'eau de mer puis congelées à sec à 80"C. Extraction et comptage des lipides Les lipides sont extraits selon la technique de Bligh et Dyer (1959). Les cellules sont soumises à une sonication (2x20 sec) dans lml de méthanol puis transférées dans des tubes en verre. Trois ml de chloroforme sont ajoutés puis les tubes sont agités pendant deux minutes au vortex. Après addition d' 1 ml de KCl, agitation pendant deux minutes au vortex et une attente de deux minutes, les tubes sont centrifugés à 2200 trs/min pendant cinq minutes. Deux phases sont obtenues. La phase organique est récupérée et évaporée sous azote. Les résidus sont repris dans un mélange chloroforme-méthanol (2-1). Une fraction aliquote est prélevée et la radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide. Séparation des lipides par chromatographie sur couche mince Des prélèvements de 5 à 20 ul en fonction du nombre de coups (environ 10.000 Cpm) sont déposés sur des plaques de silice 60WF 2545. Deux systèmes de migration sont utilisés Pour la séparation des lipides neutres : la migration se fait dans un mélange hexane - diéthylétheracide formique (90/10/1) sur 12 cm, selon la technique d'Oshima et ai. (1987). Par la séparation des lipides polaires : la première migration qui dure dix minutes est effectuée dans l'acétone, puis une deuxième migration est réalisée dans un mélange chloroforme-méthanol-eau (65/35/4) sur 12 cm, selon la technique de Ratnayake et Ackman (1985). Révélation Des films pour autoradiographie (hyper film ss max, Amersham) sont déposés sur les chromatogrammes pour une exposition à -80 C pendant un temps variable selon la quantité de radioactivité déposée (Cpm). Une identification des différents lipides est tentée grâce à des standards non marqués, qui migrent en même temps que les lipides néosynthétisés et radiomarqués. Les produits standards (Sigma) utilisés sont les suivants Pour les lipides neutres - l'acide palmitique, - le cholestérol, - le palmitate de cholestérol, - la tristéarine, - le 1,2 oléyl glycérol. Pour les lipides polaires - la L a lysophosphatidylcholine - la L a lysophosphatidyléthanolamine - la phosphatidylcholine - la phosphatidyléthanolamine. La tristéarine et le 1,2 oleyl glycérol sont révélés par pulvérisation de 2',7' dichlorofluorescéine (Sigma, diluée au 1/4 dans de l'éthanol). Les taches sont ensuite visualisées sous UV. Les autres standards non marqués sont révélés par immersion des plaques pendant 20 secondes dans une solution eau-acide acétique-acide sulfurique (95/5/0,5) contenant 0,5 % de sulfate de cuivre puis chauffage à 1500C pendant 15 minutes et à 200"C pendant ce même temps. L'intensité des taches correspondant aux lipides synthétisés est appréciée de façon visuelle sur les films d'autoradiographie. f) - Composition en acides gras des cellules par chromatographie en phase gazeuse Une analyse des acides gras des cellules de coeur est réalisée afin de comparer leur profil dans les cellules après isolement et après sept jours de culture dans le milieu de base. Les cellules, après comptage, sont reprises dans du chloroforme-méthanol (2/1). Cet extrait est ensuite évaporé sous vide, repris par un petit volume de chloroforme-méthanol (98/2) et les lipides neutres (triglycérides, stérols libres et esters de stérols) et polaires (phospholipides) sont séparés sur une microcolonne de silice (30 mm x 5 mm) à l'aide respectivement de CHCl3-MeOH (98/2) et de MeOH. Les fractions sont collectées dans des tubes en pointe contenant du C23:0 (standard interne) et du BHT (Butylhydroxytoluène-antioxydant).Les acides gras sont ensuite transestérifiés par le méthanol en présence de BF3 à 14% (Metcalfe et Schmitz, 1961) et les esters méthyliques des acides gras obtenus sont analysés sur une colonne capillaire DBWAX (25 mm x 0.32 mm; 0.2 um epf épaisseur du film de phase). Les acides gras sont identifiés par comparaison de leur temps de rétention à celui de standards. Les acides gras sont nommés suivant la formule C : X (n-Y) où C est le nombre d'atome de carbone, X le nombre de doubles liaisons et Y la position de la première double liaison comptée à partir du CH3 terminal. Une analyse du sérum de veau foetal a également été réalisée selon le même protocole. ACTIVITE BIOSYNTHETIQVE DES CELLULES EH CULTURE On rapporte ci-après les résultats obtenus avec des cellules en culture du coeur et de branchies de coquilles Saint-Jacques, en fonction du temps de culture, dans le milieu de base, puis dans un milieu complémenté. - DANS LE MILIEU DE BASE OSYNTHH:SE DE L'ADN Histoautoradiographie Comme le montrent les figures 1 et 2, le noyau de certaines cellules de coeur en culture depuis sept jours, après incorporation de thymidine tritiée, renferme de nombreux grains d'argent (voir flèche). Ce marquage est observé aussi bien pour les myocytes (figure 1) que pour les cellules de type épithelial (figure 2). Ces résultats mettent en évidence la synthèse d'ADN par les cellules en culture. De même, des grains d'argent sont observés dans le noyau de cellules de branchies (figure 3), prouvant là aussi que ces cellules néosynthétisent de l'ADN. Marquage à la 5-bromo déoxyuridine (BrdU) Sur des cultures de coeur de 7 jours, on observe qu'après incubation en présence de BrdU, le noyau de certaines cellules est coloré en noir (figures 4 et 5). Cette réaction positive prouve aussi que les cellules de coeur synthétisent de l'ADN. Le nombre de noyaux marqués positivement varie en fonction du temps d'incubation des cellules avec la BrdU. En effet, après 48 heures de contact avec le produit (figure 4), le nombre de noyaux noirs est beaucoup plus important qu'après une incubation de 24 heures (figure 5). Certaines images évoquent aussi des mitoses (figure 5). Comptage en scintillation La mesure par comptage en scintillation de l'incorporation de thymidine 3H en fonction du temps de culture, dont les résultats, pour trois cultures différentes, sont regroupés sur la figure 6, indiquent que de la thymidine est incorporée. Mais cette incorporation est faible. Les valeurs trouvées en début de culture sont d'ailleurs du même ordre de grandeur que celles enregistrées pour des hépatocytes de rat, pris comme témoin, afin de valider la technique. Une synthèse accrue d'ADN est notée après une semaine de culture même si le pic de synthèse n'apparaît pas strictement le même jour selon les cultures. OSYNTHZSE DES PROTE1vES - Histoautoradiographie Le cytoplasme de nombreuses cellules de coeur en culture est intensément marqué après incorporation de leucine 14C comme le montrent les figures 7 à 10. Ces figures concernent respectivement des cellules fibroblastiques colorées au rouge nucléaire, des cellules fibroblastiques colorées au MGG et des plages de cellules épithéliales intensément marquées par la leucine 14C. Les grains d'argent sont là aussi indiqués par une flèche. Les cardiomyocytes (figures 7 et 8) comme les cellules de type épithélial (figure 9) réagissent positivement, ce qui démontre leur synthèse de protéines. Une observation similaire est faite pour les cellules de branchies en culture (figure 10). On observe en effet que les grains d'argent dans le cytoplasme des cellules après l'incorporation de leucine 14C. Ces cellules néosynthétisent donc elles aussi des protéines. - Electrophorèse et autoradiographie d 'électrophorèse Les électrophorèses et les autoradiographies d'électrophorèse, obtenues à différents temps de culture, après incubation des cellules de coeur avec de la méthionine 35S, sont regroupées sur les figures 11 et 12. L'autoradiographie d'électrophorèse montre que les cellules néosynthétisent de très nombreuses protéines, pour tous les temps de culture étudiés, et que les profils sont les mêmes (figure 11 B). Par comparaison avec les électrophorèses réalisées, les standards de bas et de haut poids moléculaire (désignés par BPM et HPM sur les figures) étant déposés en parallèle, il apparaît qu'une protéine d'un poids moléculaire d'environ 45 kilodaltons est toujours majoritairement néosynthétisée (voir flèche). L'électrophorèse révèle, elle, la présence majoritaire d'une protéine d'un poids moléculaire d'environ 66 kilodaltons (voir flèche). La protéine majoritairement présente dans les cellules ne correspond donc pas à celle qui est néosynthétisée en plus grande quantité. Cette protéine doit vraisemblablement être rapidement réutilisée ou dégradée. La figure 12 représente l'autoradiographie d'électrophorèse (piste 1 : après 27 jours de culture; piste 2 : après 29 jours de culture). On constate que les cellules continuent à néosynthétiser des protéines même après 29 jours de culture. - Comptage en scintillation Pour les cultures où les comptages ont été réalisés, on note que 1 incorporation de leucine est plus ou moins intense en fonction du temps de culture. Un premier pic de synthèse des protéines est noté au bout de 7 jours de culture dans les trois cas (figure 6). Un deuxième pic est ensuite systématiquement observé mais il apparaît plus ou moins tard, après 15 à 24 jours selon les cultures. Une synthèse accrue de protéines apparaît donc s'effectuer par vagues successives, CSYNTHESE DES LIPIDES Histoautoradiographie Les figures 13 et 14 présentent des cellules de coeur respectivement colorées au MGG et au rouge nucléaire après incorporation d'acétate 14C. On note que les grains d'argent sont essentiellement localisés au niveau de la membrane cytoplasmique (voir flèche). Des observations similaires sont faites pour les cellules de branchies. Chromatographie sur couche mince et autoradiographie de chromatogramme Les figures 15 et 16 montrent les autoradiographies de chromatogrammes sur couche mince obtenues après incubation des cellules avec de l'acétate 14C, après différents temps de culture. Les autoradiographies permettent de constater que les cellules en culture néosynthétisent, quel que soit le temps de culture, de nombreux lipides, mais dans des proportions variables ; les lipides polaires sont synthétisés en plus grande quantité que les lipides neutres. Pour les lipides neutres, au moins 4 types de lipides peuvent être distingués, repérés par des lettres de A à D en fonction de leur distance de migration par rapport au dépôt (figure 15). En ce qui concerne les lipides polaires, au moins 12 types différents sont néosynthétisés par les cellules en culture ; ils sont aussi signalés par les lettres de A à L (figure 16). Si l'on compare les profils de lipides obtenus en fonction du temps de culture, aucune différence majeure n'est observée jusqu'à 19 jours. Au bout de 19 jours de culture, de légères modifications d'ordre quantitatif et/ou qualitatif au niveau des lipides neutres comme des lipides polaires sont notées en comparant les autoradiographies de chromatogramme, obtenues pour une même culture. Pour les lipides neutres, l'un des lipides (C) est synthétisé en moins grande quantité alors qu'un autre lipide (B) apparaît (voir flèche). En ce qui concerne les lipides polaires (lipides 16), un lipide nouveau est synthétisé (E) (voir flèche) alors que l'un d'entre eux (F) (voir flèche) semble avoir disparu et qu'un autre, (I), est synthétisé en plus grande quantité. Analyse de la composition en acides gras des cellules de coeur La composition en acides gras des cellules de coeur juste après isolement (Jo) a été comparée, par chromatographie en phase gazeuse, à celle des cellules cultivées pendant sept jours dans le milieu de base contenant du SVF normal (figures 17, A et 17 B), SVF dont le profil en acides gras a été établi. Une augmentation en lipides dans les cellules après sept jours de culture est notée, les cellules contenant 0,16 g pg d'acides gras/ug de protéines après isolement contre 0,9 ug d' d'acides gras/ug de protéines après sept jours de culture. La quantité de phospholipides est multipliée par trois environ (0,127 pg/ug de proteines à Jo contre 0,39 ug/ug de protéines à J7), celle des lipides neutres par 17 (0,03 ug/ug de protéines à Jo contre 0,51 ug/ug de proteines à J7). Il y a donc dans les cellules une modification des compartiments lipidiques après sept jours de culture dans le milieu de base contenant du SVF. Les histogrammes présentés sur les figures 18 A et 18 B montrent la différence de composition en acides gras, (exprimée en pourcentage), des lipides polaires et des lipides neutres dans les cellules à Jo et après sept jours de culture. Que ce soit pour les lipides polaires ou les lipides neutres, le pourcentage d'acides gras saturés reste globalement le même ; celui des monoinsaturés augmente après sept jours de culture. Le pourcentage d'acides gras de la série (n-6) croît alors que celui de la série (n-3) diminue. Les figures 19 A et 19 B montrent la composition quantitative en acides gras des lipides polaires et des lipides neutres après isolement et après sept jours de culture. Si l'on compare les profils en acides gras des cellules après sept jours de culture au profil en acides gras du SVF (Figure 20), on s'aperçoit que le profil en acides gras des cellules cultivées en présence de SVF reflète la composition de celui-ci. Une accumulation dans les cellules du 20:4(n-6) et du 20:5 (n-6) est observée de même qu'une absorption sélective du 22:6 (n-3). - DANS LE MILIEU COMPLEMENTE Les mesures d'incorporation des précurseurs marqués permettent de mettre en évidence le rôle de certains facteurs d'origine mammalienne ou d'origine marine. On a ainsi procédé à des mesures d'incorporation de leucine 14C et de thymidine 3H par les cellules cultivées dans le milieu de base diversement complémenté. Ces mesures, effectuées pour évaluer l'effet de chaque facteur ajouté au milieu, ont été faites uniquement entre cinq jours et neuf jours de culture, compte-tenu du fait que pour les cellules cultivées dans le milieu de base un premier pic de synthèse de protéines est observé à 7 jours. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau qui suit. TABLEAU Effet des divers compléments testés sur la synthèse d'ADN et de protéines J5 J7 J9 Hémolymphe d'huître + - - Synthèse protéines + + + Synthèse ADN Extrait d'embryons d'huître + - + Synthèse protéines + + - Synthèse ADN EGF - - + Synthèse protéines + - - Synthèse ADN hémolymphe de coquille - - Synthèse protéines + - - Synthèse ADN Extrait d'embryons de coquille - - - Synthèse protéines + + - Synthèse ADN Extrait de ganglions de moule - - - - Synthèse protéines + + - Synthèse ADN Extrait SKC 5 - - Synthèse protéines (milieu avec SVF délipidé) + - Synthèse ADN Extrait lipides de gonade de coquille + + # Synthèse protéines (milieu avec SVF normal) - - - Synthèse ADN bFGF - - Synthèse protéines + - - Synthèse ADN Extrait SKC2 - - Synthèse protéines (milieu avec SVF délipidé) - - Synthèse) ADN Extrait de lipides de Skeletonema - - - Synthèse protéines costatum (milieu avec SVF normal) - - - Synthèse ADN extrait de lipides de gonade de - - Synthèse protéines coquille (milieu avec SVF délipidé) - - Synthèse ADN HGF - - - Synthèse protéines - - - Synthèse ADN effet positif: +, aucun effet : .NEOSYNTHESE DES PROTEINES PAR AUTORADIOGRAPHIE D 'ELECTROPHORESE Les figures 21 et 22 regroupent les autoradiographies d'électrophorèse montrant les protéines néosynthétisées à partir de méthionine 35S par les cellules de coeur de coquilles St-Jacques ensemencées dans les milieux diversement complémentés. Dans la figure 21, les pistes T, 1, 2, 3, 4 correspondent respectivement à T - Milieu de base avec sérum de veau (SVF) délipidé 1 - Milieu de base avec sérum de veau délipidé additionné de lipides extraits de gonade de coquille St-Jacques 2 - Milieu de base avec sérum de veau délipidé additionné de lipides extraits de microalgues (2pg/ml) 3 - Milieu de base avec sérum de veau délipidé additionné de lipides extraits de microalgues (5,ug/ml) 4 - Milieu de base avec SVF normal Dans la figure 22, les pistes T, 1, 2, 3, 4, 5 correspondent respectivement à T - Milieu de base 1 - Milieu additionné de lipides extraits de coquille St-Jacques 2 - Milieu additionné de lipides extraits de Skeletoma costatum 3 - Milieu additionné d'un extrait de ganglions cérébroïdes de moule 4 - Milieu additionné d'un mélange de vitamines, antioxydants, facteurs de croissance 5 - Milieu additionné d' HGF Les résultats obtenus pour les divers milieux testés ne font pas apparaître de différence au plan qualitatif dans le profil des protéines néosynthétisées. NEOSYNTHESE DES LIPIDES PAR AUTORADIOGRAPHIE DE CHROMATOGRAMME Les figures 23 A et 23 B, 24 A et 24 B et 25 A et 25 B présentent les autoradiographies de chromatogrammes sur couche mince, réalisés après incubation des cellules avec de l'acétate 14C, après 7 jours de culture, dans le milieu de base diversement complémenté (figures 23A et 23B) et dans le milieu de base additionné de lipides d'origine marine (figure 24A et 24B). Les figures A correspondent aux lipides neutres et les figures B aux lipides polaires. Dans les figures 23A et 23B, les pistes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 correspondent respectivement à des 1- Cellules en culture dans le milieu de base 2- Cellules cultivées dans le milieu de base additionné d'HGF 3- Cellules en culture dans le milieu addtionné de vitamines, d'antioxydants, de facteurs de croissance 4- Cellules en culture dans le milieu additionné d'un extrait de ganglions de moules 5- Cellules en culture dans le milieu de base addtionné de lipides extraits de Skeletonema costatum 6- Cellules en culture dans le milieu de base additionné de lipides extraits de gonade de Pecten maximus Dans les figures 24A et 24B, les pistes 1, 2, 3, 4 et 5 correspondent respectivement à des 1- Culture témoin dans le milieu de base complémenté en sérum de veau (SVF) délipidé 2- Cellules cultivées dans le milieu addtionné de lipides extraits de gonade de coquille St-Jacques 3- Cellules cultivées dans le milieu additionné de lipides extraits de microalgues (5ug/ml) 4- Cellules cultivées dans le milieu additionné de lipides extraits de microalgues (2ug/ml) 5- Culture en milieu de base avec SVF normal Les cellules synthétisent au moins trois classes différentes de lipides neutres et huit classes de lipides polaires. Parmi les facteurs testés y compris les lipides, qu'ils soient ajoutés au milieu additionné de sérum de veau délipidé ou non (figure 24 A et figure 24 B), seul l'extrait d'embryons de coquille St- Jacques modifie le profil des composés lipidiques néosynthétisés. En effet dans la catégorie des lipides neutres, désignés par A et B sur les autoradiographies apparaissent spécifiquement dans le milieu complémenté par cet extrait. De plus, le lipide dit de type D est néosynthétisé en plus grande quantité que pour les autres facteurs étudiés. En ce qui concerne les lipides polaires, des différences sont également notées puisque deux lipides, appelés C et F, ne sont observés que dans ce cas. En revanche, si le profil lipidique n'est que rarement modifié, l'intensité des taches est variable d'une culture à une autre (figures 23 et 24). II CONGELATION / DECONGELATION -CONGELATION DES CELLULES ISOLEES On utilise le milieu Leibovitz L-15 additionné de 10% de SVF (osmolarité ajustée à 1100 mOsm) comme milieu de congélation et de décongélation. Six millions de cellules isolées par voie enzymatique sont mises en suspension en ampoules à congélation dans 0,8ml de milieu de Leibovitz L-15 (GIBCO) complémenté en 20 % de SVF (D. Dutscher). Un volume équivalent de milieu de Leibovitz contenant le cryoprotecteur à tester est ensuite introduit lentement dans la suspension cellulaire sous agitation douce. Le cryoprotecteur est constitué par du diméthylsulfoxyde (DMSO). Ce composé présente l'avantage d'empêcher la diffusion des cations et des composants cytoplasmiques à travers les pores membranaires obturés par les cristaux de glace. Pour éviter que le dégagement de chaleur produit par l'addition du DMSO au milieu ne détruise les cellules, l'addition du cryoprotecteur est réalisée très progressivement. Le pourcentage en DMSO est de 12 % et le temps de contact de 10 min. On remplit des ampoules avec les cellules dans leur milieu de congélation, en présence de DMSO. Afin de descendre lentement en température, les ampoules sont emballées dans plusieurs épaisseurs de papier absorbant, tranférées dans un congélateur puis à -800C pendant 12 heures, avant d'être immergées dans l'azote liquide. - DECONGELATION L'étape de décongélation est réalisée rapidement afin d'éviter la formation de cristaux intracellulaires qui endommageraient la cellule. De manière classique, on place les échantillons dans un bain-marie à 37"C, et on dilue le milieu de congélation dans du milieu contenant 10 % de SVF, dès la disparition des derniers cristaux de glace. Les cellules, ainsi remises en suspension, sont centrifugées à 1 500 trs/min pendant quatre minutes. Le surnageant est éliminé et les cellules sont à nouveau remises en suspension dans le milieu de culture. Après comptage au bleu Trypan, les cellules sont ensemencées à raison de 1,5 millions de cellules viables par ml de milieu. Les cellules de type épithélial et de type fibroblaste/sont observées après congélationdécongélation. Le nombre de cellules adhérentes augmente en fonction du temps de culture. Au bout de 20 jours de culture, les fibres cardiaques reconstituent également des myotubes lorsque des tapis quasi-confluents de cellules sont obtenus. La capacité fonctionnelle des cellules congelées-décongelées est appréciée par les mêmes critères que ceux décrits pour les cellules ensemencées immédiatement après isolement : néosynthèse de l'ADN et des protéines par comptage en scintillation, néosynthèse des protéines par autoradiographie d'électrophorèse et néosynthèse des lipides par autoradiographie de chromatogramme sur couche mince. Ces études sont réalisées après sept jours de culture comparativement à des cellules n'ayant pas été congelées. - NEOSYNTHESE DES PROTEINES ET DE L'ADN PAR COMPTAGE EN SCINTILLATION Les résultats de l'incorporation de leucine 14C et de thymidine 3H, mesurée par comptage en scintillation après sept jours de culture par les cellules congeléesdécongelées comparativement aux cellules du même lot ensemencées dès l'isolement sont présentés sur la figure 26. Dans cette figure C.f, C.cl, C.c.2, C.c.3 ont les significations suivantes C.f : cellules fraîches C.c.1 : cellules congelées : 10 min de contact avec DMSO C.c.2 : cellules congelées : 15 min de contact avec DMSO C.c.3 : cellules congelées : 20 min de contact avec DMSO Les cellules qui ont été congelées incorporent les deux types de précurseurs radiomarqués comme les cellules témoins non congelées.L'incorporation de leucine pour les cellules congelées est toujours au moins égale et parfois nettement supérieure à celle observée pour les cellules ensemencées dès l'isolement. En ce qui concerne la thymidine, pour les 5 expériences menées, les résultats montrent une plus grande variabilité dans le taux d'incorporation du précurseur marqué : cette incorporation peut être équivalente et légèrement supérieure ou inférieure à celle des cellules témoins non congelées, sans que les valeurs s'écartent significativement. De plus, il n'existe pas de différence significative entre les résultats obtenus après divers temps de contact avec le DMSO. - NEOSYNTHESE DES PROTEINES PAR ELECTROPHORESE ET AUTORADIOGRAPHIE D'ELECTROPHORESE Les électrophorèses et autoradiographies d'électrophorèse prouvent que les cellules congeléesdécongelées, après 7 jours de culture, néosynthétisent des protéines et que ces protéines sont les mêmes que celles révelées chez les cellules témoins non congelées. Les résultats sont présentés sur la figure 27. Les pistes 1, 2, 3, 4, 5, 6 correspondent 1 - Cellules témoins non congelées - 1er essai 2 - Cellules congelées-décongelées 3 - Cellules témoins non congelées - 2ème essai 4 - Cellules congelées-décongelées 5 - Cellules témoins non congelées - 3ème essai 6 - Cellules congelées-décongelées Le profil des protéines pour les cellules congelées est similaire à celui obtenu pour les cellules ensemencées dès l'isolement. Les protéines majoritairement néosynthétisées sont observées dans les deux cas. - NEOSYNTHESE DES LIPIDES PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHEMINCE ET AUTORADIOGRAPHIE DE CHROMATOGRAMME Les expérimentations réalisées pour vérifier que les cellules après congélation-décongélation néosynthétisaient les mêmes types de lipides que les cellules "fraîchement" isolées, permettent d'observer par autoradiographie de chromatogrammes sur couche mince (figures 28 A et 28 B) que ces composés, néosynthétisés après 7 jours de culture par les cellules congelées à partir d'acétate 14C, sont les mêmes que ceux synthétisés par les cellules ensemencées dès l'isolement. La figure 28 A correspond aux lipides neutres, et la figure 28B aux lipides polaires et les pistes 1, 2, 3 1 - Aux cellules ensemencées après dissociation 2 - Aux cellules ensemencées après congélation décongélation (10 min de contact avec le DMSO) 3 - Aux cellules ensemencées après congélation décongélation (15 min de contact avec le DMSO). En effet, que ce soit pour les lipides neutres ou polaires, les profils des lipides sont identiques. En revanche, pour les lipides polaires, des différences au plan quantitatif sont notées comme en témoigne l'intensité des taches. La même observation est faite en ce qui concerne les lipides neutres. Les cellules congelées-décongelées apparaissent synthétiser les lipides en plus grande quantité que les mêmes cellules ensemencées après isolement. En outre, 10 minutes ou 20 minutes de contact avec le DMSO avant congélation des cellules ne modifie en rien le profil de lipides néosynthétisés. III APPLICATIONS COMME MODELES IN VITRO EN TOXICOLOGIE Les cellules en suspension (cellules de branchies de coquille St-Jacques et cellules embryonnaires d'huître) ou en culture (cellules de coeur de coquille St-Jacques) ont été utilisées comme biotests, afin d'évaluer la cytotoxicité de métaux lourds et de pesticides ainsi que l'effet génotoxique d'une substance mutagène de référence. Les tests de cytoxicité retenus pour les essais rapportés sont la mesure de la consommation d'oxygène des cellules et le test FDA. Mesure de la consommation d'oxygène L'effet de divers métaux lourds sur la respiration des cellules dissociées a été évalué par mesure de la consommation d'oxygène de cellules embryonnaires d'huître et de cellules de branchies de coquille St-Jacques mises en suspension dans l'eau de mer. L'oxymètre (Gilson) est d'abord étalonné ; la ligne de base (100 % d'oxygène) est réglée sur de l'eau de mer oxygénée par bullage, introduite dans la cuve de mesure comportant une électrode de Clark. Un enregistreur utilisant un papier millimétré thermosensible permet de contrôler la stabilité de cette ligne "100 % d'oxygène". Le zéro est réglé par addition de dithionate de sodium. Une fois la calibration effectuée, la cuve est soigneusement rincée à l'eau de mer. Les cellules sont alors introduites dans la cuve de mesure thermostatée à 150C et la consommation d'oxygène est suivie pendant quelques minutes, jusqu'à pente constante. Les métaux lourds à tester sont alors ajoutés à la suspension cellulaire et leur effet sur la consommation d'oxygène est mesurée. Une rupture de pente provoquée par l'addition des métaux, c'est-à-dire la diminution de la consommation d'oxygène des cellules par unité de temps (donnée par la vitesse de déroulement du papier), reflète la toxicité des produits. Seules des doses fortes de métaux, chlorure de mercure (HgC12), chlorure de zinc (ZnCl2), chlorure de cuivre (CuCl2) ont été testées (10-3 à 10-5 M) dans le but d'optimiser la technique. Test FDA Le test de déestérification du diacétate de fluorescéine (test FDA) de grande sensibilité, a été utilisé pour apprécier, sur les cellules de coeur de coquille St-Jacques en culture, la cytotoxicité de métaux lourds (cuivre, plomb, zinc, cadmium). Après dénombrement, les cellules de coeur sont mises en culture en plaques 96 puits, à raison de 250 000 cellules viables pour 100 pi de milieu de culture et par puits. Le milieu de culture est renouvelé tous les trois jours et les cultures sont maintenues en incubation pendant huit jours. De nombreuses cellules cardiaques adhèrent au support de culture après ce laps de temps. Elles sont alors mises en contact avec les toxiques pendant 18 heures. Le test FDA a été mis en oeuvre en suivant le protocole de Minier et al. (1993). Après avoir éliminé le milieu de culture, les cellules (quatre puits par dose de toxique, quatre puits témoins) sont mises à incuber en présence de FDA. Le FDA (Sigma) solubilisé à 0,333 mg/l dans de l'acétone, est dissous dans de l'eau de mer pour obtenir une concentration finale de 40 pM. 100 pi de cette solution sont ajoutés dans chaque puits. Une mesure de fluorescence est réalisée après huit heures. Les lectures sont réalisées au fluorimètre (Fluorolite 1000, Dynatech) équipé de filtres de 485 nm pour l'excitation et de 538 nm pour l'émission. Les mesures de fluorescence sont exprimées arbitrairement en unités de fluorescence. La mesure de la consommation d'oxygène permet de mettre en évidence la toxicité aiguë de certains métaux lourds, à certaines concentrations, vis à vis des cellules de coquilles St-Jacques et d'huître. C'est ainsi que l'addition de chlorure de mercure à des cellules de branchies en suspension diminue la consommation d'oxygène des cellules, ce qui se traduit sur les enregistrements par une rupture de pente. Cet effet inhibiteur du métal sur la respiration cellulaire est observé pour des concentrations finales allant de 10-2M à l06M et s'avère dose-dépendant. Sur la figure 29, on a représenté la consommation d'oxygène de ces cellules pour une concentration en chlorure de mercure de 10-2 M.Une concentration de l03M de mercure a la même action inhibitrice sur la consommation d' oxygène des cellules embryonnaires d'huître. A une concentration finale de 10-3M, le chlorure de zinc et de cuivre ont le même effet inhibiteur que le mercure. La figure 30 illustre ces résultats comparativement aux tracés témoins obtenus pour des cellules du même lot, en absence de toxique d'une part et en présence de cyanure de potassium, inhibiteur connu de la respiration d'autre part. L'adjonction de FDA aux cellules cultivées permet d'obtenir une réponse dont l'intensité est dépendante de la concentration en substrat. Cette hydrolyse du FDA croît rapidement en fonction du temps d'incubation des cellules avec le produit pour les doses de 10, 16, 20, 32 et 40 uM. Pour 32 et 40 uM de substrat, une phase plateau est obtenue entre 8 et 10 heures environ. Des mesures après 8 heures de contact minimum avec 40 uM de FDA ont été effectuées de manière à ce que la concentration en substrat soit non limitante et à répondre à la fois aux objectifs de standardisation et de rapidité du test. Les résultats obtenus pour le test FDA, appliqué aux cultures primaires de cellules de coeur de coquille St-Jacques après sept jours de culture et 18 heures de contact seulement avec des sels de métaux lourds (plomb, cuivre, cadmium, zinc) comparativement à des cultures témoins, sont illustrés sur les figures 31 A à 31 D. L'analyse statistique des données a été faite dans ce cas par le test U de Mann-Whitney. Un contrôle d'hydrolyse spontanée du diacétate de fluorescéine a permis de vérifier que ce phénomène reste de faible intensité (de l'ordre de 10 %) et que la fluorescence mesurée au cours des essais est imputable pour l'essentiel aux cellules cultivées. Cette étude de l'impact des "métaux lourds" sur l'activité estérasique des cellules montre que 18 heures d'incubation en présence du plomb, même à une dose de 103M, ne provoquent pas de variation significative de l'hydrolyse du FDA. En revanche, une inhibition est observée pour les concentrations les plus élevées en cuivre, zinc, et cadmium. Une concentration en zinc de l02M apparaît cytotoxique. L'activité estérasique, à 8 heures, est significativement différente de celle des cultures témoins. Dans le cas du cadmium et du cuivre, les concentrations 102M et l03M inhibent fortement l'hydrolyse du FDA par les cellules de coeur. En outre, pour ces dernières doses, les ions métalliques provoquent le décollement des cellules adhérentes en culture. L'invention fournit ainsi un protocole d'isolement de cellules # iFun ensemble de conditions pour réaliser la culture de cellules d'Invertébrés marins et des moyens pour adapter à des cellules d'origine marine des méthodes analytiques couramment employées en culture cellulaire. Les dispositions définies ci-dessus permettent de réaliser en routine, sans problème de contaminations microbiennes, des cultures primaires de cellules d'Invertébrés marins, avec le maintien in vitro d'activités majeures de biosynthèse, comme illustré cidessus avec les cellules de bivalves. L'invention fournit également les moyens d'obtenir des cellules et matériel biologique à l'état congelé - décongelé d'Invertébrés marins dont l'activité de biosynthèse est préservée comme démontré par comparaison avec des témoins. De telles cultures et matériaux biologiques offrent de nombreux avantages en terme de facilité de réalisation des procédés, de nondépendance à l'égard de la ressource naturelle et de standardisation en vue d'applications dans des biotests, en particulier en toxicologie in vitro ou en pathologie. Références bibliographiques BLIGH E.G. & DYER W.J. (1959). A rapid method of total lipids extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol., 37: 912-917. BRADFORD M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Vbiochem., 72 : 248-254. GRUFFYDD L.D. & BEAUMONT A.R. (1970). Determination of the optimum concentration of eggs and spermatozoa for the production of normal larvae in Pecten maximux (Mollusca, Lamellibranchia). Helgol Wiss. Meeres., 20 : 486-497. LABARCA C. & PAIGEN K. (1980). A simple, rapid and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biol., 102 344-352. LAEMMLI U.K. (1970). 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Rapid analysis of canola gum lipid composition by Iastrocan REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture de cellules d'Invertébrés marins, caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation de cellules isolées, viables, pratiquement exemptes de contaminants, à une température et dans un milieu dont la composition, à base d'eau de mer stérile, et les propriétés physicochimiques, en particulier l'osmolarité et le pH, sont choisis de manière à obtenir des cellules viables et le maintien ou l'amélioration de leurs capacités fonctionnelles pendant au moins 30 jours. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules isolées mises en culture sont telles qu'obtenues à partir d'explants ou par dissociation de tissus et après un pré-traitement de décontamination. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la dissociation des tissus est effectuée à l'aide d'un système chimique et/ou d'un système enzymatique et/ou d'un système mécanique. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la dissociation des tissus est effectuée à l'aide de pronase, de préférence à des concentrations de 0,020 à 0,030%, notamment de 0,025%n durant environ 12 heures, à une température n'excédant par 40C. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la décontamination des tissus est effectuée par traitement à l'aide d'antibiotiques et, de préférence, d'agent mucolytique, en particulier à l'aide d'une solution d'antibiotiques comprenant de la pénicilline, de la streptomycine, de la kanamycine, la gentamycine, seuls ou en mélange, et d'un agent mucolytique constitué par le dithiothréitol. 6.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de prétraitement des animaux avec recours au brossage et/ou à l'action de désinfectants et/ou à la manipulation en atmosphère stérile et/ou au lavage avec de grands volumes d'eau de mer stérile et/ou à la dissection des tissus dans des conditions stériles et/ou au traitement des tissus avec des bains d'antibiotiques et/ou d'agents mucolytiques. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les animaux prélevés sont mis en stabulation en écloserie, en eau de mer, par exemple pendant une quinzaine de jours, puis laissés au repos dans des bacs alimentés en eau de mer recyclée et stérilisée par Uv. 8.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape d'incubation est réalisée avec des cellules viables ensemencées à raison de 1 à 2 millions de cellules par ml de milieu, notamment de l'ordre de 1,5 millions/ml. 9.- Procédé selon d'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'osmolarité du milieu de culture est de l'ordre de 800 à 1300 mOsm, avantageusement de l'ordre de 1100 mOsm, et le pH de 7,3 à 8 environ. 10.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture à base d'eau de mer stérile est tamponné et complémenté en additifs tel que présents dans le milieu de Leibovitz, en particulier le milieu de Leibovitz-15 et ce, à raison de 10 à 208 (V/V) environ, en particulier de 15 environ. 11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu de culture renferme du sérum, en particulier du sérum décomplémenté, à raison de 5 à 15% (V/V), notamment de 10% environ. 12.- Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend des lipides, plus spécialement des lipides insaturés d'origine marine. 13.- Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape d'incubation est réalisée à une température de l'ordre de 15 à 16"C, sous atmosphère normale non enrichie en CO2. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les cellules mises en oeuvre sont des cellules embryonnaires ou des cellules différenciées d'hémocytes et de divers organes tels que, selon l'espèce, le manteau, les palpes labiaux, les muscles, les branchies, la glande digestive et le coeur. 15.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les cellules proviennent de Mollusques, en particulier de bivalves tels que des ostréidés, les mytilidés et les pectinidés, de Gastéropodes et de Céphalopodes, ou encore d'Echinodermes comme les Asténidés et les Echinides, ou d'Arthropodes, notamment de Crustacés comme les crevettes. 16.- Procédé de congélation/décongélation d'un matériel biologique comprenant des cellules isolées telles que mises en oeuvre dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 7, 14 ou 15, des cellules recueillies après culture selon le procédé de l'une des revendications 1 à 15, et les tissus et organes d'où ces cellules sont issues, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériel biologique, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus, avec un agent cryoprotecteur, tel que le diméthylsulfoxyde, puis la congélation lente à 1 à 50min à une température inférieure à -200C, avantageusement inférieure à -500C, de préférence de l'ordre de -80 C et l'immersion dans de l'azote liquide. 17.- Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que, pour décongeler le matériel biologique, on porte les récipients le renfermant à une température supérieure à l'ambiante, de préférence de l'onde de 30 à 400C, notamment de 37"C environ, puis on dilue le milieu de congélation avec un milieu de culture nutritif, on sépare les cellules par exemple par centrifugation, et on les remet en suspension en vue de leur ensemencement. 18.- Cultures cellulaires et matériel biologique tels qu'obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 17. 19.- Cultures cellulaires selon la revendication 18, caractérisées en ce qu'elles sont constituées essentiellement de cellules viables, capables de néosynthétiser de l'ADN, des protéines et des lipides, en particulier des lipides insaturés. 20.- Application des cultures cellulaires et matériel biologique selon la revendication 18 ou 19 comme modèles dans des bioessais in vitro, notamment en toxicologie et en pathologie. 21.- Kits pour la mise en oeuvre de bioessais, caractérisés en qu'ils comprennent un matériel biologique ou une culture cellulaire selon la revendication 18 ou 19 avec le cas échéant des milieux de culture appropriés et des réactifs pour la réalisation des bioessais.