FR 2737781 A1 19970214 FR 9509710 A 19950810 MESURE DE LA DIGESTIBILITE DES ALIMENTS CHEZ LES RUMINANTS La présente invention concerne un nouveau procédé de détermination de la valeur nutritionelle d'ensilages donnés à des ruminants. Depuis longtemps on cherche à optimiser la valeur nutritive des aliments donnés aux animaux d'élevage afin de favoriser, en particulier pour les ruminants, la production laitière etlou la production de viande. It, est connu par exemple selon les publications parues dans Can. J. Anim. Spi67; 557-562 (June 1987) qu'il est possible de déterminer aussi bien la digestibilité "in vitro" de divers hybrides de maïs que la même digestibilité par une méthode de détermination par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. II est aussi connu selon l'article des auteurs suivants: Valdes, Hunter et Pinter paru dans Can. J. Plant Sci. 67; 747-754 (July 1987) de déterminer les valeurs IVMD (digestibilité de la matière sèche in vitro) qui était jusqu'alors réalisée par une technique de fermentation ruminale Zin vitro", décrite par Tilley et Terry en 1963, par une méthode d'analyse spectrophotométrique dans le proche infrarouge. Les méthodes décrites dans les deux publications précédentes ont permis d'associer des méthodes d'analyse de la digestibilité "in vitro" avec des méthodes d'analyse spectophotométrique dans le proche infrarouge. Cette association pour estimer la digestibilité "in vivo" de méthodes d'analyse chimique et enzymatique ayant elles même des variabilités importantes avec une méthode spectrophotométrique dans le proche infrarouge ayant elle aussi une variabilité importante permettait d'obtenir des appréciations de la digestibilité assez moyennes. En ce qui concerne la prédiction de la digestibilité "in vivo" par analyse spectrophotométrique dans le proche infrarouge aucune publication n'est parue à ce jour. D'autres publications associant des analyses "in vitre" avec la spectrophotométrie dans le proche infrarouge sont parues telles que la publication de Dardenne, Andrieu, Barrière, Biston, Demarquilly, Femenias, Lila, Maupetit, Rivière et Ronsin, Ann. Zootech (1993) 42, 251 270 qui a établi des courbes de calibration pour les analyses suivantes matière sèche, cendres, protéines totales, les carbohydrates solubles dans l'eau, les celluloses, les constituants des parois cellulaires, les fibres totales, les fibres détergentes acides et neutres, la lignine, le solubilités enzymatiques déterminées par les méthodes de Aufrère, Limagrain et Lila. Ces différentes analyses "in vitro" permettent de déterminer comme précédemment une valeur de digestibilité "in vivo". L'ensemble de ces analyses "in vitro" a pu être réalisé grace à une détermination par spectrophotométrie dans le proche infrarouge ce qui a permis par calcul de déterminas une valeur de digestibilité "in vivo". Aucune de ces méthodes n'a jamais à ce jour associé une détermination "in vivo" de la valeur nutritionelle d'un ensilage directement avec une analyse par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. Cette détermination n'était pas évidente à la lecture de tout cet art antérieur essentiellement chimique et mathématique car dans l'organisme de l'animal apparaissent de nombreux phénomènes physiologiques qui n'ont jamais été pris en compte dans les analyses chimiques ou enzymatiques réalisées à ce jour et qui donc n'ont pu donner lieu à une détermination par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. La présente invention a pour objectif la détermination de la valeur nutritionelle "in vivo" d'aliments chez les ruminants par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. Elle concerne plus particulièrement la détermination de la valeur de dégradabilité ruminale des fourrages chez les ruminants. Elle peut aussi concerner la valeur de digestibilité intestinale des acides aminés. Ainsi cette méthode peut permettre de déterminer la valeur de dégradabilité réelle des aliments au cours de leur transit digestif. Parmi les aliments dont la valeur nutritionelle et la valeur de dégradabilité ruminale peuvent être déterminées par analyse dans le proche infrarouge on peut citer les ensilages et tout particulièrement les ensilages d'herbes, de mais, de luzerne, de drèches, de pulpes de betteraves. Ces ensilages sont de préférence stockés dans de minisilos contenant environ 4kg d'ensilage, le prélèvement au niveau de ces minisilos est plus représentatif car plus homogène que dans des silos classiques. Selon un plan pratique la méthode de détermination de la digestibilité ruminale consiste à inclure la matière première dont on désire déterminer la digestibilité dans des sachets de nylon, à inclure ces sachets de nylon dans le rumen de vaches canulées au niveau du rumen, à laisser les sachets un temps variable dans le rumen, les vaches étant alimentées normalement. Après le délai choisi les sachets sont sortis, lavés à l'eau et leurs contenus sont analysés. Les analyses chimiques suivantes sont réalisées sur l'ensilage avant introduction dans le rumen: - matières minérales - matière azotée totale - amidon - cellulose brute - NDF (fibres détergentes neutres) - ADF(fibres détergentes acides) - lignine Après la période d'incubation dans le rumen les analyses suivantes sont réalisées: - matière azotée totale (MAT) - amidon - matière sèche (MS) - NDF (fibres détergentes neutres) Les dégradabilités ruminales de l'azote, de l'amidon, de la matière sèche (DMS) et des fibres détergentes neutres sont déterminées par différence. En ce qui concerne la digestibilité intestinale des matières alimentaires et plus particulièrement des aminoacides on procède comme suit. On analyse sur les sachets sortis du rumen la teneur en aminoacides. On introduit les sachets dans une solution de pepsine et d'acide à pH2 pendant une période de 2,5 heures. On introduit ensuite les sachets dans une vache par une canule duodénale lors du repas du soir, les sachets sont collectés dans les fécès le lendemain, lavés à l'eau puis séchés. A chacune des étapes on mesure la quantité d'aminoacides résiduelle et on détermine la quantité d'aminoacides disponible pour l'animal par différence. Après obtention des résultats chimiques et "in sacco", chaque échantillon d'ensilage sous sa forme broyée et séchée est enregistré par l'intermédiaire d'un spectrophotomètre travaillant dans le proche infra-rouge (c'est àdire entre 700 et 2500nm). La mesure effectuée se présente sous la forme d'un spectre qui est en fait une information physico-chimique de l'échantillon. L'étape suivante consiste à associer les données N.l.R. (données spectrales) avec les résultats déterminés par les analyses de valeur nutritionelle classiques décrites précédemment. Ce processus aboutit à des équations de prédictions permettant de déterminer directement en fonction du spectre N.l.R. la valeur nutritionnelle d'un ensilage. La gestion de ces opérations se fait par l'intermédiaire d'un système informatique commercial, vendu sous la dénomination "NIRS 2, version 3.00" et distribué par Infrasolt International l.S.I. Ces opérations permettent par une méthode simple, peu coûteuse et non destructive de la matière première, de déterminer la valeur nutritive de différents types de fourrages en un temps très court sans utiliser de calculs mathématiques. Cette méthode peut être utilisée de manière simple par chaque éleveur désirant adapter au mieux la ration alimentaire qu'il va donner à ses animaux. Les exemples suivants permettent de décrire l'invention de manière plus complète, ils ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. EXEMPLES - Animaux I-I. Animaux 6 vaches laitières taries, non gestantes, de poids similaire, canulées au niveau du rumen et du duodénum. L'expérience peut également être réalisée sur 3 vaches, chaque échantillon sera passé deux fois sur les 3 vaches. 1-2. Rationnement La ration se compose de fourrage et de concentré: 7 kg de foin, 2 kg de concentré. Une pierre à lécher est mise à disposition des animaux pour l'apport en minéraux et en oligo-éléments. La quantité de foin donnée est réajustée selon l'état de l'animal. TABLEAU 1: Composition du concentré MATIERES PREMIERES % Orge 41 Pulpe de betterave deshydratée 37 Tourteau de soja 48 15 Urée 2 Mélasse 5 Valeurs au kg :0,9 UFL - 125 PDIN - 100 PDIE - 3 g de P - 13 g de Ca. La distribution de concentré et de fourrage se fait à 8 h et 17 h chaque jour. Les animaux seront adaptés au régime 3 semaines avec le début de l'expérience. II - Réception et traitement des échantillons II - 1. Réception des échantillons Ouverture des mini-silos, enregistrement du poids et du pH Les ensilages de mais sont stockés dans les mini-silos (environ 4 kg d'ensilage de mals par mini-silo). Ces mini-silos sont ouverts environ 2 mois après leur confection. Le contenu de chaque mini-silo est versé dans un grand bac puis le bac est pesé et la quantité d'ensilage de chaque mini-silo est enregistrée. Le pH de l'ensilage est mesuré à l'aide d'un pHmètre en différents points de ce bac (au moins 5 mesures par bac) la moyenne des différentes mesures est ensuite réalisée. Il - 2. Traitement des échantillons Détermination de la matière sèche et séchage de l'échantillon Cinquante grammes d'ensilage sont prélevés dans le bac placé à l'étuve à 104"C pendant 16 h pour détermination de la matière sèche. Le poids de l'échantillon est enregistré au bout de 16 h puis 2 h plus tard. Ces mesures permettent d'obtenir 2 valeurs de matière sèche, la moyenne de ces deux valeurs est réalisée. Le reste de l'ensilage contenu dans le bac est placé dans une autre étuve à 60"C pendant environ 3 jours. Ce délai varie selon la quantité d'ensilage à sécher. Le bac est retiré de l'étuve lorsque l'ensilage est parfaitement sec. o Broyage de l'échantillon L'ensemble de l'échantillon est broyé avec un broyeur à couteau avec un tamis de 3 mm. L'ensilage broyé est séparé en 3 échantillons: un échantillon (200 g) est envoyé pour analyse chimique, un autre échantillon (150 g) est utilisé pour les cinétiques de dégradation et le reste de l'échantillon est placé dans une boîte et est conservé en chambre froide à 4"C. III - Méthodes in sacco La technique des sachets Nylon est réalisée à partir de la méthode INRA (Michalet- Doreau 1987). lil - 1. Préparation des sachets Caractéristiques des sachets - Dimensions internes : 6 - 11 cm - Porosité 48 pm - Quantité d'échantillon : 4 g - Ratio poids/surface :30 mg/cm2 - identification des sachets: N d'échantillon, vache (A, B, C, D, E, F), N de cinétique (de 1 à 6) # Mode opératoire Le sachets vides sont laissés à l'étuve pendant 24 h à 80 C. II sont ensuite pesés puis remplis avec 4 g d'échantillon et soudés. II sont pesés remplis et fixés à une chaîne lestée : 36 sachets par chaînes. III 2. Incubation ruminale Chaque échantillon d'ensilage est incubé sur les 6 vaches. Les résidus de l'incubation seront ensuite regroupés par point de cinétique pour l'analyse. TABLEAU 2: Chronologie de chaque cinétique 1 er Jour 2ème jour 3ème Jour 7 h 45: Introduction des 7 h 45 : Sortie des 7 h 45 : Sortie des sachets 2, 4, 8, 24 et sachets 16 h, 24 h sachets 48 h 48 h 8 h: Repas 8 h : Repas 8 h: Repas 9h45:Sortiedes sachets 2 h 11 h45:Sortiedes sachets 4 h 15h45: Sortie des sachets 8 h, introduction des sachets 16 h 17 h: repas 17 h: Repas 17 h: Repas 111-3. Lavage des sachets Les sachets sont lavés à la sortie du rumen à l'eau froide dans une machine à laver de type Calor par cycle de 5 mn jusqu'à obtention d'une eau de rinçage claire. Les sachets sont ensuite placés au congélateur jusqu'à la fin de l'incubation ruminale puis à l'étuve pendant 16 h à 104"C. Ils sont pesés au bout de 16 h puis 2 h plus tard. La plus faible des 2 valeurs est conservée pour les calculs ultérieurs. Les résidus de cinétique sont ensuite regroupés par point de cinétique pour être envoyés à l'analyse. IV- Analyses IV - 1. Analyse chimique sur le produit brut Deux cent grammes d'ensilage de mais séché et broyé est envoyé à l'analyse pour dosage des MM, MAT, amidon, CB, NDF, ADF, lignine. Les valeurs UFL et UFV sont calculées. IV - 2. Analyse chimique sur les résidus de cinétique Trois dosages sont réalisés sur les résidus d'incubation, ils sont présentés dans le tableau 3. TABLEAU 3 : Dosages réalisés sur les résidus Points de cinétiques Dosages 2h MAT, amidon 4h MAT, amidon 8h MAT, amidon 16h MAT, CB 24h MAT, CB 48h MAT IV 3. Calcul des valeurs PDI Les valeurs PDIA, PDIE, PDIN sont calculées à l'issue des analyses chimiques et des cinétiques de dégradabilité en tenant compte des teneurs en CB, MAT et de la DT réelle. V - Analyse par le proche infra-rouge (N.l.R.) > Traitement des échantillons L'analyse infra-rouge est effectuée sur des échantillons ayant été préparés selon la procédure décrite au paragraphe 11-2, c'est à dire après séchage et broyage. La quantité de matière première utilisée pour ce type de mesure est de l'ordre de 150 à 200 grammes en fonction de la densité du produit. > Enregistrement des spectres N.l.R. Cette opération s'effectue par l'intermédiaire d'un spectrophotomètre à réseau de type N.l.R.S. 6500 (distribué par Perstorp Analytical Int.) fonctionnant selon le mode "Réflectance". L'une des principales spécificités de cet instrument est de travailler sur l'ensemble du proche infra-rouge et non pas sur quelques longueurs d'ondes spécifiques, comme cela est le cas pour certains appareils plus classiques. L'échantillon est conditionné dans une cellule de transport rectangulaire se composant de trois faces opaques et d'une face munie d'un quartz. Après positionnement de la cellule dans le spectrophotomètre, la lumière réfléchie par l'échantillon qui est porteuse d'informations sur la composition chimique de ce dernier va être enregistrée sous forme d'un spectre. Chaque type de matière première et par conséquence chaque échantillon possède un spectre différent. > Constrution d'une population de calibration Cette opération consiste à élaborer à partir de l'ensemble des échantillons dont on possède l'identité spectrale et les résultats chimiques et "in sacco" (MAT, NDF, ADF, DMS, DT) une base de données représentative des ensilages étudiés. Au sein d'un même fichier de calibration, il y a donc mise en commun des données numériques et spectrales. > Centrage de la population de calibration L'ensemble du fichier de calibration construit est soumis à un calcul statistique qui permet de détecter la présence de spectres hors normes qui présentent des distances de Mahalabonis (distance H statistique) trop importantes par rapport au spectre moyen de la population (centre de gravité). Une fois détectée, ces échantillons sont éliminés afin d'obtenir une population homogène. > Calibration te fichier de calibration contenant l'ensemble des échantillons est soumis à un traitement statistique, dont il existe différents types : "Modified Partial Least Square" (M.P.L.S.), Partial Least Square (P.L.S.) qui est une forme générale de régression par composantes principales ou encore "Step Up" qui correspond à une régression linéaire plus simple. Après avoir choisi la méthode de régression adéquate, il est préférable d'effectuer un traitement mathématique par dérivation pour toutes les analyses. Ce traitement mathématique est déterminé par une séquence d'évaluation a, b, c, d: a=ordre de la dérivée, b=intervalle en nm sur lequel porte le calcul de la dérivée, c=constante 1 de lissage, d=constante 2 de lissage. Après initialisation par les choix précédents, une phase de calibration est lancée. Une courbe de calibration est jointe en annexe. > Utilisation des équations de calibration Les déterminations par lecture infra-rouge sur des échantillons d'ensilages inconnus, sont réalisées à partir des équations de prédictions les plus performantes. Cette sélection s'opère en fonction de différents paramètres statistiques tels que le coefficient de corrélation (R2) ou encore l'erreur standard de prédiction. REVENDICATIONS - 1 - Procédé de détermination de la valeur nutritionelle "in vivo", lors du transit digestif d'aliments chez les ruminants caractérisé en ce que l'on analyse lesdits aliments par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. - 2 - Procédé de détermination de la valeur de dégradabilité ruminale des aliments chez les ruminants caractérisé en ce que cette valeur est déterminée par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. - - Procédé de détermination de la valeur de digestibilité intestinale des acides aminés.chez les ruminants caractérisé en ce que cette valeur est déterminée par spectrophotométrie dans le proche infrarouge. - 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les aliments sont choisis parmi les ensilages d'herbes, de maïs, de luzerne, de drèches, de pulpes de betteraves. - 5 - Procédé de détermination de la valeur alimentaire d'ensilages caractérisé en que ces ensilages sont stockés dans de minisilos contenant environ 4kg d'ensilage, des échantillons sont prélevés et inclus dans des sachets qui sont introduits dans le rumen de l'animal pendant le temps nécessaire à la digestion desdits aliments, puis leur contenu est analysé par voie chimique ou enzymatique les données analytiques obtenues étant comparées au spectre tracé dans le proche infrarouge de l'échantillon brut, des courbes de corrélation sont tracées qui permettent ensuite de déterminer la valeur nutritive de nouveaux échantillons.