FR 2730491 A1 19960814 FR 9501489 A 19950209 NOUVEAUX INHIBITEURS DE FARNESYL TRANSFERASE, LEUR PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES QUI LES CONTIENNENT La présente invention concerne de nouveaux inhibiteurs de farnésyl transférase de formule générale: leur préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. L'inhibition de la farnésyl transférase et, par conséquent, de la farnésylation de la protéine ras, bloque la capacité de la protéine ras mutée à transformer les cellules normales en cellules cancéreuses, La séquence C-terminale du gène ras contient le motif "CAAX" ou "Cys-Aaal-Aaa2-Xaa" dans lequel Aaa repres' un aminoacide aliphatique et Xaa représente un aminoacide quelconque. ll est connu que des tétrapeptides avec une séquence CAAX peuvent inhiber la farnésylation de la protéine ras. Par exemple, dans la demande PCT WO 91/16340 et dans la demande EP 0 461 869 ont été décrits des peptides inhibiteurs de la farnésyl transférase Cys-Aaal-Aaa2-Xaa qui sont plus particulièrement représentés par les peptides Cys-Val-Leu-Ser, Cys-Val-Ile-Met et Cys-Val-Val-Met qui manifestent leur activité inhibitrice à des concentrations voisines de 10-6M ou 10-7M. n a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'omet de la présente invention, que les peptides de formule générale (I) manifestent leur activité inhibitrice (IC50) à des concentrations de l'ordre de 10-8M. Dans la formule générale (I), R1 représente un radical de formule générale YA1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène, ou un reste d'aminoacide ou un reste d'acide gras ou un radical allyle ou alkoxycarbonyle, ou un radical R4-S- dans lequel R4 représente un radical allyle contenant 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle, ou radical de formule générale dans laquelle A1, X1, Y1, R2, R'2, X2, Y2, X, R3, R'3 et R sont définis comme ci-après, et A1 représente un radical alcoylène droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué en a du groupement > c(X1)(Y1) par un radical amino, alkylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone, alcanoylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkoxycarbanylamino dont la partie alkyle contient 1 à 4 atomes de carbone, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > c=O, R2 représente un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical cyclohexyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 6 atomes de carbone, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical aryle contenant droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, alkoxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, mercapto, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, aLtcylsul- finale contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkylsulfonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, étant entendu que, lorsque R3 représente un radical alkyle substitué par un radical hydroxy, R3 peut former avec le radical carboxy en a une lactone, R'3 représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 6 atomes de carbone, X représente un atome d'oxygène ou de soufre, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle éventuellement substitué par un radical alkoxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfinyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, phényle, phénoxy, phenylthio, phènylsulfinyle, phénylsulfonyle, alkylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou diakylamino dont chaque partie allyle contient 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical vinyle éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes ou radicaux, identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène et les radicaux allyles, alkoxy, aUcylthio ou alcanoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone. Plus particulièrement, R1 représente un radical de formule Y-S-A1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène ou un reste lysine ou un reste d'acide gras contenant jusqu'à 20 atomes de carbone et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R2 représente un radical isopropyle, méthyl-1 propyle, tert-butyle ou cyclowl- méthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto, méthylthio, méthylsulfinyle ou méthylsulfonyle, R'3 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X représente un atome d'oxygène, et Rreprésenteun atome d'hydrogène ou un radical aLkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical alcoxy, ou un radical phényle. Plus particulièrement encore, R1 représente un radical de formule Y-S-A1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > CO, R2 représente un radical isopropyle, méthyl-1 propyle, tert-butyle ou cyclohexylméthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto ou méthylthio, R'3 représente un atome d'hydrogène, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone. Tout particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (I) dans laquelle R1 représente un radical mercapt2 éthyle ou amino-l mercapo2 éthyle, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > CO, R2 représente un radical isopropyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C--O, R'2 représente un atome d'hydrogène, R3 représente un radical méthylthio-2 éthyle ou méthylsulfinyle-2 éthyle, R'3 représente un atome d'hydrogène et R représente un atome d'hydrogène. La présente invention concerne également les formes stéréoisomères des produits de formule générale (I). Les restes des aminoacides représentés ~ par par R1C(X1)(Y1), R2CH(NR92)lC(x2)(Y2)] et R3CH(NR'3)CO-OH ont de préférence la configuration des aminoacides naturels. La présente invention concerne également les sels minéraux ou organiques ainsi que les esters des produits de formule générale (I). Selon l'invention, les nouveaux produits de formule générale (I) peuvent être obtenus par synthèse en phase solide en utilisant une stratégie de synthèse "9-fluorénylméthoxycarbonyl (FMOC)". Dans ce cas, les groupements thiols sont protégés par des groupements trityl ou acétamidométhyl, les fonctions amines par des groupements Boc (tbutoxycarbonyl) et les fonctions acides sous forme d'ester t butylique, les fonctions alcool par des groupements t. butyl et les fonctions amide et imidazole par des groupements trityl. La synthèse peut être réalisée sur une résine confinée dans des seringues d'extraction en phase solide de 3 cm3 en polyéthylène haute densité munies de filtres en teflon. Les seringues sont montées sur une vanne à deux voies en teflon et fermées par un bouchon à ailettes à usage unique en polyéthylène haute densité. L'agitation des seringues est réalisée sur un appareil rotatif pour tubes à hémolyse. Les opérations de lavage et de filtration sont conduites sur une station de travail d'extraction en phase solide. Les synthèses sont alors réalisées sur 50 llmoles de résine. Les couplages des acides aminés sont réalisés en traitant pendant 1 heure la résine par 250 moles de l'acide aminé convenablement protégé en présence de 250 innoles de 2-(1H- benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium, hexafluorophosphate (HBTU), 250 moles de N-hydoxybenzotriazole et 750 moles de diisopropyléthylamine dans 1,2 cm3 d'un mélange N-méthylpyrrolidone-2 (NMP)ldiméthylformarnide (m en volume).La déprotection du groupement FMOC est réalisée par 3 traitements successifs de la résine pendant 2 fois 1 minute puis 20 minutes par 2 cm3 de pipéridine en solution à 2 % (vlv) dans la NMP. Par exemple, la Cys-(NMe)Val-[cis-3-phényl-DL-prolyl]-Met peut être préparée de la manière suivante: On soumet successivement 50 moles de résine Fmoc-Met-chlorotrityl aux traitements suivants: - déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de la FMOC-cis-3-phényl-DLproline, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déproteetion du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de la FMOC-N-méthylvaline, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de la FMOC-cystéine(S-trityl), - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP. La synthèse terminée, les produits sont séparés par traitement de la résine par 10 cm3 d'un mélange acide trifluoroacétique-phénol-éthanedithiol-thioanisole-eau (40-3-1-2-2 en volumes) pendant 1 heure 30 minutes. La résine est ensuite éliminée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite au moyen d'un évaporateur centrifuge (RC10-10 Jouan) équipé d'une pompe à palettes et d'un piège à -90 C pendant 1,5 heures, la température de la chambre d'évaporation étant maintenue à 500C. Le volume final du concentrat est d'environ 1 cm3. Le produit est ensuite précipité par addition de 15 cm3 d'un mélange de méthyl-tert-butyléther et d'éther de pétrole (2-1 en volumes) puis il est recueilli par centrifugation.Le culot est ensuite solubilisé dans 1 cm3 d'acide trifluoroacétique, précipité par addition de 15 cm3 de méthyl-tert-butyléther puis lavé par 15 cm3 de méthyl-teet-butyléther. Le produit est ensuite séché sous pression réduite (3,5 kPa). Le produit est enfin purifié par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur une colonne C18 100 A (250 x 10 mm, BioRad) éluée par un gradient d'acétonitrile contenant 0,07 % d'acide trifluoroacétique (en volumes) dans l'eau contenant 0,07 % d'acide trifluoroacétique (en volumes) à un débit de 6 cm3/min puis lyophilisé. Les produits obtenus sont caractérisés par leurs spectres de masse (electrospray). L'introduction du groupement protecteur FMOC sur un aminoacide est effectuée par action de l'aminoacide sur le chloroformiate de 9-fluorénylméthyl (EMOC.chlouure) en présence d'une base. La résine FMOC-Met chlorotrityl peut être obtenue par réaction de 25011moles de résine chlorotritylchiorure (Novabioehem avec 1 mmole de FMOC-Méthionine dans 2 cm3 de dichiorométhane et 0,5 cm3 de cilisopropyléthylamine pendant 30 minutes. Après addition de 2 cm3 de méthanol, la réaction est poursuivie pendant encore 30 minutes. La résine est ensuite lavée par 5 fois 4 cm3 de dichlorométhane puis séchée. Les cis- et trans-phénylprolines, sous forme racémique, peuvent être obtenues dans les conditions décrites par R. Sarges etJ. R Tretter, J. Org. Chem., 32, 1710 (1974). L'activité inhibitrice de la farnésyltransférase et de la farnésylation de la protéine Ras peut être mise en évidence dans le test suivant: L'activité farnésyltransférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyl transférée à partir du (3H) farnésylpyrophosphate [(3H) FPP) sur la protéine p21 H-ras. Le mélange réactionnel standard est composé, pour un volume final de 60 pi, de Tris-HCl 50mM, MgC12 5mM, dithiotréitol 5 mM, octyl-frD-giucopyranoside 0,2 %, p21 H-ras 200 picomoles, (3H) FPP (à 61000 dpnUpicomole) 4,5 picomoles. La réaction est initiée par addition d'environ 5 ng de farnésyltransférase humaine purifiée à partir de cultures de cellules THP1. Après incubation pendant 20 minutes à 37 C en plaque de microtitration contenant 96 trous de 1 cm3 par plaque Citer Plate), Beckman), la réaction est stoppée par addition de 0,4 cm3 de SDS à 0,1 % dans le méthanol à 0 C. Le mélange est ensuite additionné de 0,4 cm3 d'acide 8 trichioroacétique (TCA) à 30 % dans le méthanol Les plaques sont laissées pendant 1 heure dans la glace.Le contenu précipité est alors retenu sur membrane en fibre de# verre Fîitermat, Pharmacia) avec l'unité de filtration (Combi Cell Harvester#, Skatron) et rincé avec de l'acide trichloroacétique à 6 % dans l'veau distillée. Les sont séchées au four à micro ondes puis imprégnées de scintillant Par fusion sous air chaud de Meltilex# (Pharmacia) et enfin comptées en cpm dans un compteur ssPlate# (LKB). Chaque essai est répété 3 fois. L'unité d'activité est définie par 1 picomole de (3H) FPP transférée sur p21 H-ras en 20 minutes. Les pourcntages d'inhibition sont obtenus par comparaisoa des essais avec et sans inhibiteur après déduction des blancs, les IC50 étant mesurées à partit des inhibitions obtenues avec 9 concentrations différentes en utilisant les logiåds Enzfitter# ou Grafit#. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau L TABLEAU I Activité Produit inbibBlice ICso Cys-(N-Me)Val-[cis-3-phényl)-DL-prolyl]-Met 1,55 x 10 8 M Cys-(N-Me)Val-[trans-3-phényl-DL-propyl]-Met 9,2 x 1t7 M Les nouveaux peptides de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables.Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoique, fumarique, méthanesulfonique, trifluoroacétique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine) selon la nature des aminoacides qui constituent le peptide de formule générale (I). Les nouveaux peptides selon l'invention, qui inhibent la farnésyltransférase et la farnésylation de la protéine Ras, sont des agents anticancéreux remarquables qui agiseent tant au niveau des tumeurs solides que liquides. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un peptide de formule générale (I) en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables qu'ils soient inertes ou physiologiquement actifs. Ces compositions peuvent être administrées par voie orale, parentérale ou rectale. Les compositions pour administration orale comprennent des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium. Comme compositions liquides pour administration orale peuvent être utilisées des émulsions phannaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops, des élixirs contenant des diluants inertes tel que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substnces autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les compositions selon l'invention pour administration parenrérale peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le ptopylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive ou des esters organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao. Les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles en thérapeutique humaine dans le traitement de cancers d'origines diverses. En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché, de la durée du traitement et des facteurs propres au sujet à traiter. Généralement, les doses sont comprises, chez l'homme, entre 0,1 et 20 mg/kg par jour par voie intra-péritonéale. REVENDICATIONS 1 - Nouveaux peptides de formule générale: dans laquelle: R1 représente un radical de formule générale Y-SA1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène, ou un reste d'aminoacide ou un reste d'acide gras ou un radical allyle ou aikoxycarbonyle, ou un radical R4-S- dans lequel R4 représente un radical allyle contenant 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle, ou radical de formule générale dans laquelle A1, X1, Y1, R2, R'2, X2, Y2, X, R3, R'3 et R sont définis come ci-après, et A1 représente un radical alcoylène droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué en a du groupement > C(X1)(Y1) par un radical amino, aikylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone, alcanoylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkoxycarbonylamino dont la partie alkyle contient 1 à 4 atomes de carbone, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R2 représente un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical cyclohexyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 6 atomes de carbone, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical allyle contenant droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, atkoxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, mercapto, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, al:::ylsul- finyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou attcylsutfonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, étant entendu que, lorsque R3 re-ente un radical allyle substitué par un radical hydroxy, R3 peut former avec le radical carboxy en a une lactone, R 3 représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle droit ou ramifié contenant 1 à 6 atomes de carbone, X représente un atome d'oxygène ou de soufre, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical allyle éventuellement substitué par un radical alkoxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, alxylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfinyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, aikylsulfonyle conte-t 1 à 4 atomes de carbone, phényle, phénoxy, phenylthio, phénylsulfinyle, phénylsulfonyle, aucylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou dialxylamino dont chaque partie allyle contient 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes ou radicaux, identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène et les radicaux allyles, alkoxy, alxylthio ou alcanoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone. 2 - Nouveaux peptides selon la revendication 1 pour lesquels R1 représente un radical de formule Y-SA1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène ou un reste lysine ou un reste d'acide gras contenant jusqu'à 20 atomes de carbone et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > c=O, R2 représente un radical isopropyle, méthyle propyle, tert-butyle ou cyclohexylméthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto, méthylthio, méthylsulfinyle ou méthylsulfonyle, R'3 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X représente un atome d'oxygène, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical alcoxy, ou un radical phényle. 3 - Nouveaux peptides selon la revendication 1 pour lesquels R1 représente un radical de formule Y-SA1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > CO, R2 représente un radical isopropyle, méthyle propyle, tert-butyle ou cyclohexylméthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto ou méthylthio, R'3 représente un atome d'hydrogène, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone. 4 - Nouveaux peptides selon la revendication 1 pour lesquels R1 représente un radical mercapS2 éthyle ou amino-l mercapto-2 éthyle, X1 et Y1 oe-e chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > CO, R2 représente un radical isopropyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement > C=O, R'2 représente un atome d'hydrogène, R3 représente un radical méthylthio-2 éthyle ou méthylsulfinyle-2 éthyle, R'3 représente un atome d'hydrogène et R représente un atome d'hydrogène. 5 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité suffisante d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 en asociation avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables inertes ou physiologiquement actifs.