FR 2729661 A1 19960726 FR 9500581 A 19950119 Procédé de Préparation de substances aromatiques Par voie biochimique. L'invention a pour objet un procédé de préparation de certaines substances aromatiques par voie biochimique. Par substances aromatiques, on entend des aldéhydes naturels présentant un intérêt aromatique, c'est-àdire un parfum et/ou un goût propre à leur utilisation dans les industries alimentaire, pharmaceutique ou de la parfumerie. Différents procédés de préparation des aldéhydes naturels ont déjà été décrits. Ainsi - le brevet US n" 4 617 419 décrit un procédé de préparation du benzaldéhyde et de l'acétaldéhyde au moyen d'une réaction "rétro-aldol", - des phénylaldéhydes sont préparés par voie enzymatique dans la demande de brevet européen n" 542 348, - les brevets US n" 5 017 388, US n" 5 128253 et la demande de brevet européen n" 453 368 décrivent des procédés de préparation de la vanilline faisant intervenir des microorganismes, - le brevet américain n" 5 057 424 décrit un procédé de préparation de compositions aromatiques de vanille au moyen de cellules végétales. Ces procédés nécessitent cependant la mise en oeuvre de composés ou produits spécifiques et onéreux devant être mis en oeuvre dans des conditions relativement strictes. La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients de la technique et permet la préparation de substances aromatiques au moyen de composés faciles à se procurer, peu coûteux et dans des conditions réactionnelles faciles à réaliser. La Société demanderesse a en effet eu le mérite d'établir qu'il était possible de préparer des substances aromatiques de formule: en soumettant à une oxydation en présence d'au moins une protéine et d'au moins un ion métallique, un substrat répondant à la formule dans laquelle R1 peut être un radical -H, -CH3, -CH2OH, -CHO, -COOH, -OCH3, ou -C00-CH(COOH )-CH,-C,H,(OH),, R2 peut être un radical -H, -OH, ou -OCH3, R3 peut être un radical -H, -OH, -OCH3, ou O-glucoside, R4 peut être un radical -H, -OH, ou -OCH3. En ce qui concerne le radical R3, le glucoside du radical 0-glucoside est choisi dans le groupe comprenant le glucopyranoside seul ou lié à un oside tel que le glucopyranoside, le rhamnopyranoside, l'arabinopyranoside. Avantageusement, les substances aromatiques conformes à 1' invention appartiennent au groupe comprenant la vanilline, l'aldéhyde benzoïque, l'aldéhyde anisique et l'aldéhyde protocatéchique. La protéine mise en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention peut être choisie parmi - les métalloprotéines, c'est-à-dire des protéines ou des enzymes ayant une structure hémique ; parmi elles, on peut citer la myoglobine, l'hémoglobine, les cytochromes (c, P450...) ainsi que de nom breuses oxydoréductases comme la peroxydase, la catalase, la cytochrome oxydase, ou des deshydrogénases comme l'alcool deshydrogé nase, ou encore des oxygénases, des protéines ou des enzymes associées à un ion métallique, parmi elles on peut citer la ferritine ainsi que la ferredoxine et cer taines dioxygénases, - des protéines dites "simples" dont l'action, dans le cadre de la présente invention, doit être complétée par un ion métallique non compris dans leur structure, cet ion métallique pouvant se trouver soit sous forme libre soit sous forme complexée (par exemple à des porphyrines ou à des protoporphyrines) ; parmi elles, on peut citer la gélatine, la caséine, la sérum albumine bovine. Quelle que soit la protéine mise en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention, l'ion métallique, sous forme libre ou complexée, est choisi dans le groupe comprenant le fer, le cobalt, le cuivre, le magnésium, le manganèse et le zinc. Avantageusement, plusieurs protéines et plusieurs ions métalliques, sous forme libre ou complexée, peuvent simultanément être mis en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention. En effet, il a été constaté que les rendements obtenus étaient d'autant plus élevés qu'ils résultaient de la mise en oeuvre de la combinaison d'au moins deux des composés suivants : une protéine "simple", une métalloprotéine, un ion métallique, une protoporphyrine, une porphyrine. Le procédé conforme à l'invention présente notamment l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre au moyen de composés peu coûteux et faciles à se procurer. De plus, les conditions réactionnelles ne nécessitent aucune précaution particulière de stérilité ou de régulation du milieu réactionnel. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, l'ion métallique, sous quelque forme qu'il soit, est utilisé à raison de 0,0005 à 0,2 % en poids par rapport au substrat. Avantageusement, les substrats soumis à l'action conjointe d'une protéine et d'un ion métallique sont choisis dans le groupe comprenant l'isoeugénol, l'eugénol, l'aldéhyde cinnamique, l'anéthol et l'acide rosmarinique. Les protéines mises en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention peuvent être utilisées sous forme purifiée ou non purifiée. Sous une forme non purifiée, ces protéines peuvent être mises en oeuvre par le biais de compositions les contenant telles qu'une suspension de cellules microbiennes, d'un broyat de cellules, de tissus ou d'organes d'origine végétale ou animale, ou encore d'un préconcentré protéique de ces compositions appelé fraction acétonique. A titre d'exemple on peut citer - des cellules de bactéries de levure ou de moisissure, - des broyats végétaux tels que de fruits d'aubergines, de fruits de tomates, de feuilles d'épinards ou de fanes de radis, - des extraits animaux, tels que du sang frais, du sang séché ou des cellules du foie. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, la protéine, sous quelque forme qu'elle soit, est utilisée à raison de 0,01 à 20% en poids par rapport au substrat, de préférence à raison de 0,1 à 5 ss en poids par rapport au substrat. Le procédé conforme à 1' invention peut être mis en oeuvre dans de l'eau ou dans un milieu aqueux tamponné à l'aide d'un tampon phosphate, citrate, borate ou phosphate-citrate-borate, le pH de la réaction devant être compris entre 2 et 10. Avantageusement, dans le cas où le substrat est l'isoeugénol, l'anéthol ou l'aldéhyde cinnamique, le pH est compris de préférence entre 4 et 9 et plus préférentiellement entre 5 et 7 ; dans le cas où le substrat est l'eugénol, le pH est de préférence compris entre 2 et 7 et plus préférentiellement entre 2,5 et 4,5. Le procédé conforme à l'invention peut également être mis en oeuvre dans un milieu non aqueux tel que dans un ou plusieurs solvants organiques choisis parmi l'hexane, le cyclohexane, le méthylcyclohexane, le dichloroéthane, le dichloromethane. Par ailleurs, dans le cas où le substrat est l'eugénol, et ceci en raison de la très grande réactivité de ses groupements SH, l'ajout d'un composé sulphydryl peut être favorable. Ce composé peut être choisi dans le groupe comprenant la cystéine, le glutathion, le dithiothreitol, le dithioérythritol. Selon d'autres caractéristiques avantageuses de l'invention : - la temperature du milieu de réaction est comprise entre 15 et 50"C et de préférence entre 25 et 40"C, - l'aération du milieu de réaction doit permettre la fourniture d'au moins une mole d'oxygène par mole de substrat à oxyder, de ce fait la réaction est réalisable à la pression atmosphérique, mais peut donner lieu à des rendements améliorés si le milieu réactionnel est enrichi en air ou en oxygène par exemple par simple bullage ; la réaction est également réalisable sous une pression comprise entre 103 et 10 pascals, - le milieu réactionnel est soumis à une agitation vigoureuse pouvant être comprise entre 150 et 250 tr/min sur table d'agitation et entre 100 et 1000 tr/min en réacteur agité, - la durée de la réaction est comprise entre 2 heures et 5 jours, - les substances aromatiques préparées sont isolées du milieu réactionnel par extraction ou par distillation. L'invention ne se limite pas strictement au procédé décrit, elle en embrasse au contraire toutes les variantes. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention ; ils ne sont pas limitatifs et concernent les modes de réalisation avantageux de 1 'inven- tion. EXEMPLE 1 : Preparation de vanilline On prepare un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 20 g de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 800 mg d'isoeugénol et - 50 mg de Tween 80. Un milieu réactionnel conforme à l'invention est également préparé et comprend, outre le milieu réactionnel de base, de l'hémoglobine purifiée. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 28"C, pendant 3 jours, en flacons placés sur une table agitée à 175 tr/min. Le tableau I rend compte des résultats obtenus. TABLEAU I Composition du milieu réactionnel Vanilline obtenue en g/l Rendement milieu de base 1.27 100% (témoin) milieu de base + hémoglobine purifiée 1,55 120 % (20 mg) Il apparaît très clairement que l'ajout d'hémoglobine purifiée améliore nettement le rendement d'obtention de la vanilline. EXEMPLE 2 : Préparation de vanilline Le milieu réactionnel de base devant servir de témoin est le même que celui de l'exemple 1. Plusieurs milieux réactionnels conformes à l'invention sont préparés et comprennent, outre le milieu réactionnel de base décrit dans l'exemple 1, au moins un des composés suivants à la quantité indiquée - de la gélatine, - du fer sous forme FeCI2, - de la protoporphyrine IX. Les conditions réactionnelles sont identiques à celles indiquées dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau II. TABLEAU II Composition du milieu réactionnel Vaniiline obtenue en 9/1 Rendement milieu de base 0.93 100 % (témoin) milieu de base + gélatine (20 mg) 0.6 64,50 % milieu de base 0.85 91,40 % + fer (0,1 mg) milieu de base + gélatine (20 mg) + fer (0.1 mg) 1.35 145 % milieu de base + gélatine (20 mg) + protoporphy- 4.59 493 % rine (20 mg) + fer (0,025 mg) milieu de base + gélatine (20 mg) + protoporphy- 5.29 568 % rine (20 mg) + fer (0,125 mg) Alors que le rendement obtenu au moyen du milieu de base + gélatine ou du milieu de base + fer est inférieur à celui obtenu avec le milieu de base seul (simple constatation), l'association gélatine + fer permet d'accroître considérablement la quantité de vanilline obtenue, ceci d'autant plus que la protoporphyrine est présente dans le milieu et que la quantite de fer dans le milieu est élevée. EXEMPLE 3 : Préparation de vanilline Le milieu réactionnel de base devant servir de témoin est le même que celui de l'exemple 1. Plusieurs milieux réactionnels conformes à l'invention sont préparés et comprennent, outre le milieu réactionnel de base decrit dans l'exemple 1, au moins un des composés suivants à la quantité indiquée - de l'hémoglobine purifiée, - du fer sous forme FeCl2, - de la protoporphyrine IX. Les conditions réactionnelles sont identiques à celles indiquées dans l'exemple 1. Le tableau III présente les résultats obtenus. TABLEAU III Composition du Vanilline obtenue en milieu réactionnel C 9/1 milieu de base (témoin) 1.15 100 % milieu de base + hémoglobine purifiée 1.72 149 % (20 mg) milieu de base + hémoglobine purifiée (20 mg) + proto- 3.56 309 % porphyrine (20 mg) + fer (0.025 mg) milieu de base + hémoglobine purifiée (20 mg) + protoporphyrine (20 mg) + 5.07 440 % fer (0,125 mg) L'effet de l'hémoglobine sur le rendement est potentialisé par la présence de la protoporphyrine et du fer, et ceci d'autant plus que la quantité de ce dernier est importante. EXEMPLE 4 : Préparation de vanilline On prépare, dans un réacteur agité, un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 2 1 de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 80 g d'isoeugénol et - 500 mg de Tween 80. Deux milieux réactionnels conformes à l'invention sont également preparés et comprennent, outre le milieu réactionnel de base, respectivement 1 g d'hémoglobine purifiée et 1 g de sang seché. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30"C, pendant 24 heures, en milieu agite à 600 tr/min, sous une pression de 4.104 pascals d'oxygène. Le tableau IV rassemble les résultats obtenus. TABLEAU IV Composition du milieu Vanilline obtenue réactionnel milieu de base (teman) 1.75 100 % milieu de base + hémo- 3.45 196 % globine purifiée (1 g) milieu de base + sang 4.25 243 % séché (1 g) Le sang séché, dont la composition comprend outre l'hémoglobine, des protéines plasmatiques (comme l'albumine et les globulines) et du fer, permet l'obtention de meilleurs résultats encore qu'avec l'hémoglobine purifiée. EXEMPLE 5 : Préparation de vanilline On prépare, dans un réacteur agité, un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 2 1 de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 100 g d'isoeugénol et - 500 mg de Tween 80. Un milieu réactionnel conforme à l'invention est également préparé et comprend, outre le milieu réactionnel de base, 2 g d'hémoglobine purifiée. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30"C, pendant 24 heures, en milieu agité à 600 tr/min, sous une pression de 5.104 pascals d'oxygène. Le tableau V rend compte des résultats obtenus. TABLEAU V Composition du milieu réactionnel Vanilline obtenue en g/l Rendement milieu de base (témoin) 1,75 100 % milieu de base + hémoglobine purifiée (2 g) 8.4 Ces résultats confirment les résultats obtenus dans les exemples précédents. EXEMPLE 6 : Préparation de vanilline On prépare deux milieux réactionnels de base identiques comprenant - 25 g de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 400 mg d'isoeugènol et - 50 mg de Tween 80. L'un d'entre eux, considéré comme le milieu témoin, est additionné de 25 g de fruit d'aubergine broyé finement ayant subi au préalable un traitement thermique à 110 C pendant 15 minutes. L'autre milieu est complémenté avec 25 g de fruit d'aubergine broyé finement et non traité thermiquement (fruit frais). I1 est connu que le fruit entier d'aubergine comprend des protéines à raison de 1 g par 100 g d'aubergine. Ainsi, dans 25 g d'aubergine, on a environ 250 mg de protéines (parmi lesquelles on compte certaines activites enzymatiques oxydatives) et environ 0,075 mg de fer et 3,75 mg de magnésium. Les deux milieux sont mis à incuber à 28 C, pendant 3 jours, en flacons placés sur table agitée à 175 tr/min. Le tableau VI présente les résultats obtenus. TABLEAU VI Composition du milieu Vanilline obtenue en mg/I Rendement réactionnel milieu de base témoin 700 100 % milieu de base + fruit frais 1750 (25 g) Ceci démontre que les broyats végétaux notamment permettent l'obtention d'excellents résultats dans le cadre de l'invention. EXEMPLE 7 : Préparation de vanilline On prépare un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 20 g de tampon phosphate/citrate/borate, 0,1 M, pH 6,5, - 800 mg d'eugénol et - 50 mg de Tween 80. Deux milieux réactionnels conformes à l'invention sont également prépares et comprennent, outre le milieu réactionnel de base, respectivement de la cystéine et de la cystéine + de l'hémoglobine purifiée. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30"C, pendant 2 heures, en milieu agité à 150 tr/min, sous une pression de 8.105 pascals d'oxygène. Le tableau VII rend compte des résultats obtenus. TABLEAU VII Composition du milieu Vanilline obtenue. en m! réaction nel milieu de base (temoln > 18 100 % milieu de base + cystéine (0.6 g) 177 983 % milieu de base + cystéine (0.6 g) 703 3 950 % + hémoglobine purifiée (20 mg) La grande réactivité de l'eugénol vis à vis de la cysteine se trouve ici démontrée et cette combinaison est considérablement potentialisée par l'ajout d'hémoglobine purifiée. EXEMPLE 8 : Préparation de vanilline On prépare un milieu réactionnel de base, devant servir de témoin, comprenant - 20 g de tampon phosphate/citrate/borate, 0,1 M, pH 6,5, - 800 mg d'eugénol, - 50 mg de Tween 80. Un milieu réactionnel conforme à l'invention est également préparé et comprend, outre le milieu réactionnel de base - de la cystéine, - de la gélatine, - de la protoporphyrine IX et - du fer sous forme FeSO4. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30"C, pendant 2 heures, en milieu agité à 150 tr/min, sous une pression de 105 pascals d'oxygène. Les resultats obtenus sont résumés dans le tableau VIII. TABLEAU VIII Composition Vanilline obtenue en Rendement du milieu réactionnel mg/l milieu de base (téman) 18 100 % milieu de base + cystéine (0.6 9) + gélatine (20 mg) 556 3 088 % + protoporphyrine IX (20 mg) + fer (0,125 mg) Ici, d'excellents résultats sont encore obtenus et la réactivité de l'eugénol vis à vis de la cystéine est renforcée par la présence de la gélatine, de la protoporphyrine IX et du fer. EXEMPLE 9 : Préparation de benzaldéhyde On prépare, dans un réacteur agité, un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 2 1 de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 82 g d'aldéhyde cinnamique et - 1 g de Tween 80. Un milieu réactionnel conforme à l'invention est egalement préparé et comprend, outre le milieu réactionnel de base - de l'hémoglobine purifiée, - du fer sous forme FeCl2. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30"C, pendant 48 heures, en milieu agité à 600 tr/min, sous une pression de 104 pascals d'oxygène. Le tableau IX présente les résultats obtenus. TABLEAU IX Composition du milieu réaction ne milieuéactionnel milieu de base (témoin) 500 100 % milieu de base + hémoglobine purifiée (2 g) + 4 220 844 % fer (10 mg) L'hémoglobine et le fer potentialisent de façon spectaculaire la réaction d'oxydation de l'aldéhyde cinnamique en benzaldéhyde. EXEMPLE 10 : Préparation d'anisaldéhyde On prépare, dans un réacteur agité, un milieu réactionnel de base devant servir de témoin comprenant - 2 1 de tampon borate, 0,1 M, pH 6,5, - 80 g d'anethol et - 1 g de Tween 80. Un milieu réactionnel conforme à 1 invention est également prépare et comprend, outre le milieu réactionnel de base - de l'hémoglobine purifiée, - du fer sous forme Fez1,. Les milieux réactionnels sont mis à incuber à 30oC, pendant 48 heures, en milieu agité à 600 tr/min, sous une pression de 104 pascals d'oxygène. Le tableau X présente les resultats obtenus. TABLEAU X Composition du milieu réactionnel Anisaldéhyde en g/I Rendement milieu de base (temoin) 1.7 100 % milieu de base + hémoglobine purifiée (2 g) + 14 823 % fer (10 mg) L'hémoglobine et le fer potentialisent de façon spectaculaire la réaction d'oxydation de l'anéthol en anisaldéhyde. REVENDICATIONS 1. Procedé de préparation de substances aromatiques de formule caractérisé par le fait que l'on soumet à une oxydation en présence d'au moins une protéine et d'au moins un ion métallique, un substrat répondant à la formule dans laquelle R1 peut être un radical -H, -CH3, -CH2OH, -CHO, -COOH, -OCH3, ou -COO-CH(COOH)-CH2-C6H3(OH)2, R2 peut être un radical -H, -OH, ou -OCH3, R3 peut être un radical -H, -OH, -OCH3, ou O-glucoside, R4 peut être un radical -H, -OH, ou -OCH3. 2. Procédé selon la revendication 1, caracterisé par le fait que le glucoside dans le radical R3 est choisi dans le groupe comprenant le glucopyranoside seul ou lié à un oside tel que le glucopyranoside, le rhamnopyranoside, l'arabinopyranoside. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que les substances aromatiques appartiennent au groupe comprenant la vanilline, l'aldéhyde benzoïque, l'aldéhyde anisique, 1'aldéhyde protoca téchique. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la protéine mise en oeuvre est une métalloprotéine 5. Procéde selon la revendications 4, caracterisé par le fait que la métalloprotéine est choisie dans le groupe comprenant l'hémoglobine, la myoglobine, les oxydoréductases, les deshydrogénases, les oxygénases. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la protéine est choisie dans le groupe comprenant la gélatine, la caséine, la sérum albumine bovine. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'ion métallique, mis en oeuvre sous une forme libre ou complexée, est choisi dans le groupe comprenant le fer, le cobalt, le cuivre, le magnésium, le manganèse, le zinc. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la protéine est utilisée sous forme purifiée. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la protéine est utilisée sous forme non purifiée au moyen d'une suspension de cellules microbiennes, d'un broyat de cellules, de tissus ou d'organes d'origine végétale ou animale ou d'un preconcentré protéique de ces compositions. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que la proteine est utilisée à raison de 0,01 à 20% en poids par rapport au substrat, de préférence à raison de 0,1 à 5 % en poids par rapport au substrat et que l'ion métallique est utilisé à raison de 0,0005 à 0,2 % en poids par rapport au substrat. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans de l'eau ou dans un milieu aqueux tamponné de pH compris entre 2 et 10. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre à une température comprise entre 15 et 50"C et de préférence entre 25 et 40OC. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre à la pression atmosphérique ou sous une pression d'air ou d'oxygène comprise entre 103 et 107 pascals. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre sous agitation. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre pendant une durée comprise entre 2 heures et 5 jours. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérise par le fait que les substances aromatiques préparées sont isolées du milieu réactionnel par extraction ou par distillation.