FR 2728467 A1 19960628 FR 9415680 A 19941221 La présente invention concerne un produit cosmétique A base d'extraits protéiques naturels d'algues. A titre d'information, on a déjà mentionné l'usage d'extraits d'algues dans des produits à activités lipolytiques. On pourra consulter à ce sujet les documents suivants: EP-A-438 302, FR-A-2 581 876 et la demande de brevet français 94 00686 déposée le 18/01/94 par la présente demanderesse. Toutefois, on n'a pas jusqu'ici mis en évidence les effets améliorateurs d'extraits d'algues sur le derme de la peau et ses composants. Un objet de l'invention consiste à prévoir un produit cosmétique de ce type qui présente ces avantages. Suivant la présente invention, il est prévu un produit cosmétique a base d'extraits protéiques naturels d'algues microscopiques du type chiorella laquelle possède la particularité d'être monocellulaire. Suivant une autre caractéristique, l'extrait protéique est l'extrait de protéines totales. Suivant une autre caractéristique, l'extrait protéique est l'extrait de protéines précipitées. Suivant une autre caractéristique, l'extrait protéique est l'extrait de protéines surnageant. L'invention concerne également une composition cosmétique qui est caractérisée en ce qu'elle contient un produit cosmétique précédeninent décrit. L'invention concerne également des utilisations des produits cosmétiques décrits précédemment ou de la composition précédente respectivement pour l'amélioration de la matrice extracellulaire du derme, pour leurs propriétés antiélastasiques, pour leurs propriétés anticollagénases et pour la stimulation de la néosynthêse des collagènes. Afin de mettre en évidence ces effets et propriétés sur le derme d'un tel produit, on a préparé, comme on va le voir, trois types d'extraits protéiques de l'algue: (1) l'extrait de protéines totales appelé par la suite extrait CT, l'extrait de protéines précipitées appelé par la suite extrait EP et l'extrait de protéines surnageant appelé par la suite ES. On décrira ensuite quatre effets différents sur le derme, c'est à dire plus particulièrement sur la matrice extracellulaire du derme qui constitue le milieu environnant des cellules dermiques, qui est, comme on le sait, synthétisée par les fibroblastes lesquelles sont les cellules majeures du derme, et qui est composée principalement de protéines, telles que collagène, élastine, fibronectine, etc., et de glycosaminoglycanes. En ce qui concerne la préparation de l'extrait protéique de chiorella CT, on se reportera à la Fig.l du dessin et, en ce qui concerne les préparations des extraits protéiques de chlorelle ES et EP, on se reportera à la Fig. 2. Les informations données dans ces figures font partie de la description. Le dosage de l'azote total a permis de déterminer la concentration en protéines de chacun des extraits. L'extrait sec a été obtenu par passage à l'étuve à 1050C et les cendres ont été déterminées après un passage au four à moufle. Le dosage des minéraux a été réalisé par spectrophotométrie. Les trois extraits CT, EP et ES ont été lyophilises. Le résultat des analyses est donné dans le Tableau 1 suivant. Tableau 1 EXTRAIT EP ES CT Ext sec % 94,77 94,46 97,31 Cendres % 13,19 24,92 17,74 Protéine % 67,5 51,87 52,23 Mg g/kg 0,598 0,626 0,92 Ca g/kg 1,019 1,15 2,2 Fe mg/kg 307,56 426,58 204,54 Cu mg/kg 106,57 110,36 31,43 Mn mg/kg 21,72 37,7 30,3 Zn mg/kg 180,99 1310,78 275,86 Cl% 3,92 3,09 2,l8 Pg/kg 0,486 La composition en acides aminés dans les extraits EP, ES et CT est donnée dans le Tableau 2 suivant, en ce qui concerne les acides usines totaux. Tableau 2 EP ES CT Acides aminés totaux % % % Lysine 6,07 7,59 5,53 Histidine abs Abs Abs Arginine 5,85 5,99 5,63 Acide aspartique 11,97 10,54 13,18 Thréonine 5,88 5,34 5,21 Sérine 4,68 5,71 4,97 Acide glutamique 16,39 15,13 15,68 Proline 4,45 5,53 6,29 Glycine 6,27 11,24 6,83 Alanine 9,55 11,24 9,93 Cystéine 0,47 1,87 1,23 Valine 6,31 4,68 6,17 Méthionine 0,61 1,83 2,63 Isoleucine 3,69 1,97 3,10 Leucine 8,41 4.12 7.67 Tyrosine 3,64 2,20 1,45 Phénylalanine 0.05 0.01 4.47 Tryptophane non dosé non dosé non dosé En ce qui concerne les acides aminés libres, l'extrait EP présente 0,02 % d'acides aminés libres, l'extrait CT présente 0,11 8 et l'extrait ES présente 0,14 â. On va maintenant étudier, à titre indicatif, quatre effets des actifs cosmétiques ES, EP et CT et en donner les résultats expérimentaux. I - Effet sur le dépôt de la matrice extracellulaire par des fibroblastes en culture. La matrice extracellulaire, constituée principalement de collagène et d'élastine, represente l'élément de soutien majeur du derme. Elle est synthétisée et modelée par les fibroblastes. La quantité ainsi que le degré d'organisation et d'interaction de ses éléments constitutifs sont des paramètres importants de l'élasticité et de la fermeté cutanées. Les extraits EP, ES et CT ont été incubés en présence de fibroblastes à confluence pendant 48 h. Des cultures témoins, sans produit à l'essai, ont été réalisées en parallèle. Au cours de l'incubation, les cellules ont été observées avec un microscope optique à contraste de phase. Ensuite, les fibroblastes ont été décollés du support de culture par congélation/décongélation. On a ensuite fixé la matrice extracellulaire avec du glutaraldéhyde (2,5 8 P/V) dans un tampon de cacodylate de sodium (0.1 M, pH 7,4), on l'a déshydratée dans des bains successifs d'éthanol, puis séchée sous CC2, puis métallisée avec un mélange d'or et de palladium. Les préparations ont été observées au microscope à balayage et photographiées. L'extrait EP n'a pas montré d'action favorable sur la matrice déposée. Cependant il faut émettre une réserve sur ce résultat dans la mesure où, dans ce modèle, il n'y a pas de barrière cutanée. Mais tout laisse à croire que l'extrait EP pourrait avoir une action favorable. L'extrait CT à 40 Hg/ml modifie peu la densité des fibres déposées par rapport au témoin; en revanche, le diamètre de ces fibres est augmente. A 200 Hg/ml, il augmente fortement la densité de la matrice déposée et le nombre d'agrégats déposés le long des fibres est augmenté. L'extrait ES à 800 et 4000 g/ml modifie de façon importante l'aspect de la matrice: la quantité de protéines déposées est augmentée, le diamètre des fibres est plus important et de nombreux agrégats sont présents le long des fibres. Le Tableau 3 ci-dessous donne le récapitulatif des effets. Tableau 3 Composé Concentration Caractéristiques de la matrice déposée (par rapport aux g/ml cultures témoins) Quantité Longueur Diamètre Aspect de matrice des fibres des fibres de la matrice EP 8 0/- 0/- + 0 40 0 0 0 0 200 W- W- o fin CT 8 0 0 0 40 0/+ 0 + 0 200 + 0 0 structuré ES 160 0 0 0 0 800 + + 0/+ structuré 4000 + + + structuré 0:pas de différence observée par rapport aux témoins : disiisti:m liar rappor( ani ÉnoÊfls +:augmentation par rapport aux témoins En resumé, les fibroblastes cultivée in vitro déposent sur le support de culture les éléments majeurs de cette matrice, notamment les protéines. Ce dépôt peut être observé en microscopie électronique à balayage. Les composés CT et ES augmentent la densité du réseau de fibres déposées par les fibroblastes. Ces extraits peuvent donc permettre d'améliorer la qualité de la matrice déposée. Cette activité pourrait contribuer à la "restructuration" des tissus cicatriciels ou vieillisants. II - Hise en évidence des propriétés antiélastasiques des extraits EP, ES et CT. Le réseau d'élastine a pour fonction d'assurer la cohésion et l'élasticité du tissu. Une destruction graduelle du tissu élastique se produit sous l'action des élastases qui sont des enzymes. I1 est donc préférable d'en limiter l'action. L'extrait EP, ES ou CT est mis en contact direct avec une élastase en présence d'un substrat, le N-succinyl-(l-analine)3-pnitroanilide, dit S.A.N.A. L'élastase entrains la rupture protéolytique de la liaison amidique entre l'analine et le paranitroanilide du substrat et libere un chromophore. L'activité de l'élastase est déterminée par la vitesse d'apparition du chromophore et est mesurée pendant 20 minutes à 410 nm par spectrophotometrie. Afin dévaluer les propriétés des trois extraits EP, ES, CT les mesures suivantes sont effectuées. L'activité de l'élastase est mesurée sans actif et correspond à 100 % d'activité élastasique. c'est le témoin. L'activité de lwelastaae est mesurée en présence de l'actif supposé inhibiteur. c'est l'essai. Le Tableau 4 ci-dessous donne les résultats en pourcentages d'inhibition de l'élastase en fonction de la concentration finale de l'extrait. Tableau 4 % Extrait EP 0,03 0,045 0,06 0,075 % inlibition 18,1 30 45,5 54,4 %Extrait ES 0,15 0,25 0,35 0,5 % inhibition 7,2 21 25,6 42,1 % Extrait CT 0,03 0,06 0,084 % inhibition 9,8 21,1 30,8 III - Inhibition de la protéolyse in vitro: protection du collagène vis-à-vis de la collagénase. La présence de collagenases spécifiques dans la peau humaine ne fait plus de doute. L'inhibition de la collagénase est mise en évidence par un test de diffusion en gel d'agarose. Dans ce test, le substrat, c'est-à-dire le collagène, est incorporé dans un gel d'agarose et exposé à l'action de son enzyme catabolique, c'est-àdire la collagénase, au sein du gel. La dégradation du substrat par l'enzyme sert de base de comparaison pour l'évaluation du test où le substrat est incubé au préalable avec un des trois extraits EP, ES ou CT à 0,15 %. Les résultats sont les suivants: avec l'extrait EP, la protection est de 54,9 %; avec l'extrait ES, elle est de 41,4 8; et, avec l'extrait CT, elle est de 45,4 %. Les extraits EP, ES et CT présentent un effet protecteur du collagène. Ces résultats ont été confirmés par une étude réalisée sur coupe du derme. En protégeant les fibres de collagène du derme, ces extraits permettent de préserver l'intégralité des propriétés biomécaniques des tissus cutanés et de prévenir leur relachement. IV - Stimulation de la néosynthèse des collagènes a) Dans des cultures de fibroblastes de dermes humains Ce modèle 112 vitro, reposant sur l'utilisation de fibroblastes de derme humain en culture, a été retenu pour l'étude des effets des actifs ES et CT (EP présente une toxicité révélée au rouge neutre et trop importante pour être étudiée par ce modèle). Les cultures de fibroblastes ont été incubées pendant 48 h avec les actifs à l'essai. La proline tritiée, acide aminé précurseur des collagènes, a été ajoutée au milieu de culture pendant les 24 dernières heures de l'incubation. Les protéines synthétisées par les cellules ont été précipitées par l'acide trichloracétique. Les précipités, après lavage pour éliminer le précurseur non incorporé, ont été extraits par l'acide acétique. On mesure l'incorporation de proline tritiée dans les protéines acido-solubles correspondant principalement aux collagènes en scintillation liquide. Le Tableau 5 ci-dessous donne les résultats de l'incorporation de proline tritiée dans les protéines néosynthétisées par les fibroblastes en culture incubés en présence de l'extrait ES ou CT. Tableau 5 Concentration de ES 0 160 800 4000 en llghlíl % proline incorporée 100 113 182 94 dans les protéines acido-solubles par rapport aux cultures témoin Concentration de CT 0 8 40 200 en g/ml % de proline incorporée 100 132 83 71 dans les protéines acidosolubles par rapport aux cultures témoin Ainsi, les composés ES à 0,8 mg/ml et CT à 8 Hg/ml stimulent la synthèse des collagènes. b) Dans un modèle tridimensionnel Un modèle de peau reconstituée, tel que celui qui est fabriqué par la société ATS sous le nom SKIN2 et qui est proche du modèle vivant puisqu'vil s'agit de fibroblastes dermiques humains mis en culture sur un nylon recouvert par des cellules épidermiques, a permis de confirmer que les composés ES et CT présentent des effets stimulants sur la synthèse des protéines acido-solubles. I1 a également permis de montrer que les extraits EP et CT n'étaient pas toxiques in vivo. Le Tableau 6 ci-dessous donne les résultats des pourcentages de la synthèse des collagènes. Tableau 6 Concentration (% P/V) O @ 0,04 0,2 1 ES 100 226 280 162 EP 100 251 227 82 CT 100 247 227 97 Les propriétés mécaniques de la peau sont en grande partie dues aux collagènes qui constituent la trame principale de la matrice du derme. Dans cette étude, les composés EP, ES et CT ont montré des effets stimulants sur la synthèse des protéines acido-solublea. ces observations permettent de revendiquer une activité "raffermissante" du derme cutané ou "restructurante". REVENDICATIONS 1) Produit cosmétique à base d'extraits protéiques naturels d'algues, caractérisé en ce qu'il est constitué d'extraits protéiques naturels d'algues microscopiques du type chioreila laquelle possède la particularité d'être monocellulaire. 2) Produit cosmétique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait protéique est l'extrait de protéines totales. 3) Produit cosmétique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait protéique est l'extrait de protéines précipitées. 4) Produit cosmétique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait protéique est l'extrait de protéines surnageant. 5) Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un produit selon une des revendications 1 à 4. 6) Utilisation d'un produit cosmétique suivant l'une des revendications 1 à 4 ou d'une composition selon la revendication 5 pour l'amélioration de la matrice extracellulaire du derme. 7) Utilisation d'un produit cosmétique suivant l'une des revendications 1 à 4 ou d'une composition selon la revendication 5 pour leurs propriétés antiélastasiques. 8) Utilisation d'un produit cosmétique suivant l'une des revendications 1 à 4 ou d'une composition selon la revendication 5 pour leurs propriétés anticollagénases. 9) Utilisation d'un produit cosmétique suivant l'une des revendications 1 à 4 ou d'une composition selon la revendication 5 pour la stimulation de la néosynthèse des collagènes.