FR 2737497 A1 19970207 FR 9509420 A 19950802 L'Invention est relative à des polypeptides permettant la sécrétion directe de protéines produites dans des cellules eucaryotes. Au cours des dernières années, le système baculovirus/cellules d'insectes a été utilisé avec succès pour l'expression de divers gènes d'intérêt. Dans le cadre de ce système, comme de manière plus générale, dans le cadre des différents systèmes connus de production de protéines recombinantes en cellules-hôte, il est souhaitable de disposer de moyens d'exportation desdites protéines recombinantes dans le milieu de culture des cellules. Ceci facilite en effet la récolte et la purification de ces protéines. Habituellement, pour obtenir l'exportation d'une protéine recombinante à partir d'une cellule-hôte eucaryote, on cherche à utiliser la voie classique de sécrétion qui implique le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Dans ce but on ajoute à la protéine que l'on souhaite faire sécréter un peptide-signal N-terminal clivable, en procédant à la fusion d'une séquence codant pour ledit peptide-signal avec la séquence codant pour la protéine recombinante. La présence de ce peptide-signal permet la translocation du polypeptide à travers la membrane du réticulum endoplasmique, par le relais duquel elle sera transportée, dans les vésicules de l'appareil de Golgi, jusqu'à la membrane plasmique. Cependant, cette approche ne permet pas toujours d'aboutir au résultat espéré [JARVIS et al., J. Biol. Chem. n 268, p. 1675416762, (1993)]. Le principal inconvénient de cette stratégie réside dans le fait que le passage par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi peut entraîner l'addition sur le polypeptide, de résidus de sucre qui peuvent conduire à un mauvais repliement de la protéine et/ou à la formation de nouveaux épitopes. I1 a d'autre part été constaté, au cours de travaux précédents de l'équipe des Inventeurs concernant l'expression du récepteur de la prolactine ou de différentes portions de ce récepteur, dans des baculovirus recombinants, [CAHOREAU et al., Biochimie, n 74, p. 1053-1065, (1992)], que lorsque la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine était exprimée seule, elle était excrétée dans le milieu de culture, bien que ne possédant pas de peptide-signal. Des études ultérieures sur la structure de cette région intra-cytoplasmique ont montré qu'elle n'était pas N-glycosylée, (bien qu'elle possède plusieurs sites potentiels de glycosylation), et qu'elle était ubiquitinylée [CAHOREAU et al., FEBS Letters, n 350, p. 130-234, (1994)]. Le récepteur de la prolactine (PRL) appartient à une famille de récepteurs qui comprend également les récepteurs de l'hormone de croissance (GH), et ceux de plusieurs interleukines, ceux de l'érythropoïétine et du GM-CSF (= Granulocyte-macrophage colony stimulating factor) et du récepteur de l'interféron y, etc.. Ces récepteurs sont constitués d'une région N-terminale extracellulaire, d'une région intramembranaire et d'une région C-terminale intra-cytoplasmique (pour revue, voir par exemple [DUSANTER-FOURT et al., Médecine/Sciences Synthèse, 10, p. 825-835, (1994)]). Le récepteur de la prolactine existe sous deux formes : une forme courte, composée de 291 acides aminés, et une forme longue, constituée de 591 acides aminés chez le rat, 592 acides aminés chez le lapin, et 598 acides aminés chez l'homme). Le récepteur de l'hormone de croissance est constitué de 620 acides aminés (chez l'homme et le lapin) et présente de nombreuses régions homologues avec la forme longue du récepteur de la prolactine [KELLY et al., in Recent Progress in Hormon Research, 48, P. 123 (Academic Press Ed. (1993)] : en particulier, on retrouve dans la région intra-cytoplasmique 4 régions conservées. Les autres récepteurs de la même famille (récepteur de l'érythropoïétine, récepteurs de facteurs de croissance, récepteurs des interleukines 2, 3, 4, 5, 6, 7, et 9, récepteur GM-CSF, G-CSF, récepteur de l'interféron Y, etc...), présentent également des structures très proches. Les Inventeur s ont maintenant montré que la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine était non seulement capable d'être exportée dans le milieu de culture lorsqu'elle était exprimée seule, mais pouvait également permettre l'exportation d'une protéine (dite protéine "passagère") fusionnée à son extrémité C-terminale. Les Inventeurs ont en outre mis en évidence la région minimum responsable de cette propriété. D'autre part, les Inventeurs ont également observé que la région intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance (GH), exprimée dans un système baculovirus/cellules d'insecte, était excrétée dans le milieu de culture de manière analogue à la région intracytoplasmique du récepteur de la prolactine. Les inventeurs ont ainsi identifié, en particulier, un polypeptide de 372 acides aminés, codé par le fragment de la séquence codant pour le récepteur de l'hormone de croissance compris entre le site NcoI et le codon stop de ladite séquence, et un polypeptide de 329 acides aminés, codé par le fragment de la séquence codant pour le récepteur de l'hormone de croissance compris entre le site ClaI et le codon stop de ladite séquence. La mise en évidence par les Inventeurs de ces caractéristiques des domaines intra-cytoplasmiques des récepteurs de la prolactine et de l'hormone de croissance permet d'envisager leur utilisation comme transporteurs pour permettre l'exportation, à partir d'une cellule hôte, de protéines dont la localisation est habituellement cytoplasmique ou nucléaire. La présente Invention a pour objet l'utilisation d'une protéine dont la séquence polypeptidique est choisie dans le groupe constitué par - la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, à savoir la région constituée par les acides aminés 235 à 591, selon la numérotation des acides aminés décrite par KELLY et al. (1993, publication précitée), de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme, par les acides aminés 235 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin) - la séquence du fragment du récepteur de la prolactine constitué par les acides aminés 240 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin, par les acides aminés 235 à 591 de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme ; ; - la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance (GH), constitué chez l'homme, par la région C-terminale de 350 acides aminés de ce récepteur - la séquence d'un fragment du récepteur de l'hormone de croissance (GH), comprenant tout ou partie du domaine intra-cytoplasmique dudit récepteur, et comprenant les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez l'homme (par exemple le fragment constitué par les acides aminés 249 à 620), ou bien les acides aminés 272 à 620 dudit récepteur chez le rat, ou bien les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez le lapin, pour obtenir la sécrétion d'une protéine d'intérêt produite dans une cellule-hôte eucaryote, en particulier une cellule-hôte d'insecte. Pour mettre en oeuvre la présente Invention, on fait produire par un système d'expression en cellules eucaryotes, une protéine chimérique de fusion comprenant la protéine d'intérêt que l'on souhaite exporter, prolongée à son extrémité N-terminale par la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou par la région intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance, ou par un fragment, tel que défini cidessus, de l'une ou l'autre de ces régions. Les deux régions de la protéine chimérique peuvent être fusionnées directement, ou séparées par un oligopeptide apportant un site spécifique de clivage par une protéase (par exemple un site de clivage pour une entérokinase (EC 3.4.21.9), ou pour le facteur Xa (EC 3.4.21.6) ou toute autre protéase spécifique). Une protéine chimérique conforme à l'invention peut être obtenue en construisant, par les techniques classiques de biologie moléculaire, un gène recombinant codant pour cette protéine. Un tel gène recombinant comprend une séquence d'ADN codant pour la protéine d'intérêt que l'on souhaite exprimer, fusionnée à son extrémité 5' avec une séquence codant pour le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine ou du récepteur de l'hormone de croissance, ou pour un fragment, tel que défini cidessus, de l'un ou l'autre de ces domaines avantageusement, ces deux séquences sont séparées par une séquence codant pour un oligopeptide portant un site spécifique de clivage par une protéase. La mise en oeuvre de la présente Invention permet la récupération des protéines recombinantes à partir du milieu de culture, ce qui facilite leur purification. En outre, du fait qu'il s'agit d'une voie alternative par rapport à celle qui implique le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, elle présente l'avantage de permettre à certaines protéines cytoplasmiques ou nucléaires, pour lesquelles les modifications post-traductionnelles effectuées spécifiquement dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi sont inutiles, d'être excrétées sous une forme soluble dans le milieu de culture. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du domaine intracytoplasmique du récepteur de la prolactine pour permettre l'excrétion de diverses protéines. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX GENERAUX: A - Cultures de cellules et de virus Des cellules de Spodoptera frugiperda Sf9 sont maintenues à 28 C dans du milieu TC100 supplémenté avec 5 de sérum de veau foetal. Le baculovirus AcMNPV (virus sauvage), ainsi que les baculovirus recombinants sont propagés dans ces cellules Sf9. Pour l'infection, les cellules (4 x 106 par flacon de 25 cm2) sont inoculées à l'aide d'une suspension virale à une multiplicité d'infections de 10 PFU par cellule. Après une heure d'adsorption à la température de la pièce, l'inoculum viral est enlevé et du milieu de culture frais est ajouté. Les virus recombinants sont obtenus après cotransfection des cellules Sf9 avec 1'ADN viral, et 1'ADN du vecteur de transfert, par lipofection (DOTAP, Boerhinger Mannheim, Allemagne) [FELGNER et RINGOLD, Nature n 337, p. 387-388, (1989)]. Le criblage et la purification des virus recombinants sont effectués selon les procédures courantes décrites par exemple par SUMMERS et SMITH [Texas Agric. Exp. St. Bull., n 1555, p. 1-56, (1987)]. B - Clonage de la séquence codant pour la région intra-cytoplasmique de la forme longue du récepteur de la prolactine de lapin La forme longue du récepteur de la prolactine de lapin, est constituée d'un domaine N-terminal extracellulaire de 210 acides aminés, d'une région intramembranaire de 24 acides aminés et d'une région C-terminale intra-cytoplasmique de 358 acides aminés (Figure 1). Plusieurs sites de coupure par des enzymes de restriction sont présents sur le gène codant pour le récepteur de la prolactine de lapin [EDERY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, n 86, 2112-2116 (1989)]. La séquence d'ADNc de 5kb qui code pour le récepteur de la prolactine de lapin a été clonée à partir du plasmide pECE-PRL-R24 décrit par EDERY et al. (1989, Publication précitée) dans un plasmide pUC18, pour donner le plasmide pUC18 L2 PRL-R [CAHOREAU et al., Biochimie, n 74, p. 1053-1065, (1992)]. C - Plasmides de transfert Les plasmides de transfert pour baculovirus de la famille des pGmAc sont préparés à partir du fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d' Autographa californica (AcMNPV)qui contient le gène et le promoteur polyédrine, en insérant ledit fragment dans le plasmide bactérien pUC8. Pour obtenir le plasmide pGmAc31, la séquence codante située entre les nucléotides + 24 et + 522 (par rapport au A(+1) de 1'ATG) du gène de la polyédrine a été délétée et remplacée par un lieur SmaI, ce qui permet l'insertion d'une séquence hétérologue en phase derrière 1'ATG de la polyédrine. La protéine recombinante est ainsi produite sous la forme d'une protéine de fusion avec les 7 premiers acides aminés de la polyédrine. En outre ce plasmide possède un site de restriction KDnI situé à 109 nucléotides en aval du site SmaI. Exemple 1 : Effet de différentes délétions sur la sécrétion du domaine intra-cvtoDlasmioue du récepteur de la prolactine Afin d'identifier la séquence minimale responsable de la sécrétion, différentes régions du domaine intra-cytoplasmique ont été exprimées dans les cellules d'insectes. Les plasmides pGmAc31I1, pGmAc31I2 et les baculovirus recombinants exprimant ces plasmides sont obtenus comme décrit dans la publication de CAHOREAU et al. [CAHOREAU et al., Biochimie, n 74, p. 1053-1065, 1992]. pGmAc31I1 résulte de l'insertion d'un fragment BstEII-KDnI de 1151 pb, comprenant la totalité de la séquence codant pour la partie intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, entre le site SmaI et le site KDnI de pGmAc31, et comprend une séquence codant pour 353 acides aminés C-terminaux du récepteur de la prolactine. pGmAc31I2 résulte de l'insertion d'un fragment SmaI-KDnI de 998 pb entre le site SmaI et le site KDnI de pGmAc31, et comprend une séquence codant pour 302 acides aminés C-terminaux de I1. Trois formes tronquées obtenues par des délétions internes (I5), N-terminales (I4), ou C-terminales (I3) du fragment I1 ont été construites - sGmAc31I3 : Ce plasmide comprend le sous-fragment BstEII Bsu36I 6 I du fragment I1. Ce sous-fragment code pour 114 acides aminés N-terminaux de I1. - pGmAcl68I4 : Le plasmide pGmAc31I2 a été clivé à l'aide de Bsu36I, pourvu d'extrémités franches en utilisant la polymérase de KLENOW, et coupé avec Ase718. Le fragment d'ADN de 729 pb qui en résulte a été ligaturé dans le vecteur de transfert pGmAcl68 clivé entre BalII (extrémité réparée avec la polymérase de KLENOW) et Ase718. (Le vecteur de transfert pGmAcl68 présente une délétion du gène de la polyédrine entre les nucléotides +5 et +483 (par rapport au A de 1'ATG). Un lieur BalII a été inséré entre ces deux positions). L'insertion du fragment 14 en phase avec les 5 premiers nucléotides de la polyédrine conduit à la production d'une protéine de fusion comportant 1 acide aminé supplémentaire provenant de la polyédrine.Le plasmide ainsi obtenu est dénommé pGmAc168I4. I1 comprend un sous-fragment qui code pour 239 acides aminés C-terminaux de - DGmAc31I5 : Pour obtenir ce plasmide, pGmAc31I1 a été digéré avec XbaI et ssu36I ; un fragment XbaI-ssu36I a été délété ; les extrémités de part et d'autre de ce fragment ont été rendues franches en utilisant la polymérase de KLENOW, et ligaturées avec un lieur BamHI (10 mer) . Le plasmide obtenu comprend un sous-fragment qui code pour 52 acides aminés N-terminaux de I1, fusionné à un sous-fragment qui code pour 239 acides aminés C-terminaux de Il.. Les inserts I1, I2, I3, I4, Ig localisés par rapport à la séquence codant pour le domaine intracytoplasmique de la prolactine, sont représentés sur la figure 1 par des rectangles blancs unis. Le promoteur de la polyédrine est représenté en noir uni ; le début de la séquence codant pour la polyédrine est représenté par des points noirs sur fond blanc. Trois baculovirus recombinants, nommés AcPhI3, AcPhI4 et AcPhI5 ont été obtenus par recombinaison homologue entre pGmAc31I3, pGmAcl68I4, et pGmAc31I5, respectivement, et 1'ADN total de AcMNPV de type sauvage. Un baculovirus recombinant exprimant la protéine I2 a été utilisé comme contrôle positif. Des cellules de Spodoptera frugiperda ont été infectées avec chacun de ces virus. 48 h après l'infection, les lysats de cellules et les milieux de culture ont été analysés après transfert immunoélectrophétique sur membrane de nitrocellulose, et révélation à l'aide d'un sérum polyclonal anti-récepteur de la prolactine, comme décrit par CAHOREAU et al. [Biochimie, n 74, p. 1053-1065, 1992] Les résultats obtenus indiquent que les trois protéines I3, 14 et Ig conservent la capacité d'être sécrétées dans le milieu de culture des cellules. Ezle le 2 : Utilisation du domaine intra- cvtoDlasmioue du récepteur de la Drolactine, ou de ses fragments, cour Dermettre la sécrétion de la cvcline B et de la cvcline A. Pour étudier la capacité des différents fragments du domaine intracellulaire du récepteur de la prolactine pour transporter une protéine passagère, des baculovirus recombinants exprimant ces fragments fusionnés par leur extrémité C-terminale à l'extrémité Nterminale d'une protéine passagère, ont été construits. La cycline A, ou la cycline B ont été utilisés comme protéines passagères. La cycline A et la cycline B ont déjà été exprimées dans le système baculovirus/cellules d'insectes. Dans ces conditions, la cycline A est présente dans le noyau des cellules infectées [ZINDY F., "Etude des fonctions et de l'expression de la cycline A humaine normale et de sa forme modifiée par l'intégration de 1ADN du virus de l'hépatite B", Thèse, Université Paris 6, 15 Juin 1993], tandis que la cycline B forme des granulations insolubles dans le cytoplasme des cellules [LORCA et al., Mol. Cel. Biol. 11, p. 1171-1175, (1991)] ; il s'agit donc de protéines qui, normalement ne sont pas excrétées. Le vecteur de transfert pGmAc3lI2 a été modifié par mutation du codon stop (TGA) du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, de telle sorte qu'un site KDnI le remplace. Le fragment KDnI-KDnI est ensuite délété par digestion à l'aide de l'enzyme de restriction KDnI, puis le vecteur est religué. Les deux ADNc codant respectivement pour la cycline A et la cycline B ont été insérés dans le site KDnI unique restant : le gène de la cycline B a été coupé par HindIII, réparé par l'enzyme de KLENOW et SmaI, puis inséré au site KDnI réparé par l'enzyme de KLENOW, du vecteur de transfert. Les différentes étapes de cette construction sont illustrées par la figure 2. La séquence complète du gène codant pour la cycline B a été inséré au site BALAI réparé par l'enzyme de KLENOW, du vecteur de transfert pGmAc31I3. Dans le cas de la cycline A, 1ATG du gène a été remplacé de telle sorte que l'on obtienne un site KDnI, et un fragment K=nI-KDnI renfermant la totalité du gène de la cycline A a été directement inséré au site KDnI du vecteur de transfert. Le gène CycB a ainsi été inséré dans les vecteurs de transfert pGmAc31I2 et pGmAc31I3, et le gène CycA a été inséré dans pGmAc3lI2. Les virus recombinants dénommés respectivement AcPhI2-CycB, AcPhI3-CycB, et AcPhI2-CycA ont été obtenus par recombinaison homologue entre ces vecteurs de transfert, et 1'ADN total d'AcMNPV de type sauvage. Des baculovirus exprimant uniquement les séquences codant pour la cycline A et la cycline B nonfusionnées avec le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ont également été construits à titre de témoin. Des cellules de Spodoptera frugiperda ont été infectées avec chacun des virus recombinants pendant 48 heures, et les protéines des extraits de cellules et des surnageants de cultures ont été caractérisées par immunoélectrotransfert, en utilisant un sérum polyclonal anti-récepteur de la prolactine. Les résultats sont les suivants - La cycline A et la cycline B seules, ont été uniquement détectées dans les lysats de cellules ; aucune sécrétion dans le milieu de culture n'est détectable - Les protéines chimériques I2-CycB et I2-CycA sont présentes à la fois dans les lysats cellulaires et dans les milieux de culture de cellules. Chacune des protéines fusionnée à 12 est donc sécrétée de manière efficace. - La protéine chimérique I3-CycB s'accumule dans le cytoplasme, ce qui indique que la délétion de la portion C-terminale du domaine 12 réduit substantiellement l'efficacité de la sécrétion. L'immunodétection en utilisant un anti-sérum anti-ubiquitine montre que I2CycB et I2CycA sont ubiquitinylés, tandis que CycA, CycB, et I3CycB ne le sont pas. I1 est donc possible que les résidus d'ubiquitine jouent un rôle dans le processus de sécrétion. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une protéine dont la séquence polypeptidique est choisie dans le groupe constitué par - la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine - la séquence du fragment du récepteur de la prolactine constitué par les acides aminés 240 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin, par les acides aminés 235 à 591 de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme - la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance - la séquence d'un fragment du récepteur de l'hormone de croissance comprenant les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez l'homme, ou bien les acides aminés 272 à 620 dudit récepteur chez le rat, ou bien les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez le lapin, pour obtenir la sécrétion d'une protéine d'intérêt produite dans une cellule-hôte eucaryote. 2) Protéine chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend - une première région constituée par une protéine d'intérêt que l'on souhaite exporter, prolongée à son extrémité N-terminale par une seconde région constituée par le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou par le domaine intracytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance, ou par un fragment, tel que défini dans la revendication 1, de l'un ou l'autre de ces domaines. 3) Protéine chimérique selon la revendication 2 caractérisée en ce que les deux régions sont séparées par un oligopeptide comprenant un site spécifique de clivage par une protéase. 4) Gène recombinant caractérisé en ce qu'il code pour une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 2 ou 3.