FR 2736055 A1 19970103 FR 9507817 A 19950629 NOUVEAUX THIOPHENOXY PEPTIDES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES QUI EN RENFERMENT La présente invention se rapporte au domaine de la chimie organique et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique. Elle a plus particulièrement pour objet de nouveaux peptides contenant de la phenylalanine dans lequel le groupe méthylène a été remplacé par un isostère portant un groupe thiophénoxy. Spécifiquement, l'invention se rapporte à un dérivé de nonapeptide synthétique de formule Ile-Arg-Lys-Ile-Phe-Leu-Asp Gly-Ile dont le groupe méthylène porté par la molécule de phénylalanine a été remplacé par un atome de soufre, c'est-àdire que le changement de structure selon l'invention peut s'écrire de la façon suivante dans lequel X et Y sont des résidus d'acides aminés, protégés ou non ou des peptides, R est un radical alcoyle, linéaire ou ramifié. et R2 est un radical alcoyle, phényle, un halogène, un nitro ou un amino et n est égal à 0, 1,2 ou 3. Les composés selon l'invention de formule I peuvent donc s'écrire plus précisément de la manière simplifiée suivante dans laquelle Ar est un radical phényle non substitué ou substitué. Les composés de formule I sont des inhibiteurs de replication du HIV en agissant comme inhibiteur d'une petite aspartyl protéase dimère qui clive spécifiquement les précurseurs d'une polyprotéine codant pour les protéines de structure et les enzymes constitutives du virus (Martin S.A, Recent Advances in the Design of HIV proteinase inhibitors, Antiviral Res. 17 (1992) 265-278). Les composés de formule générale I sont préparés en utilisant un synthon de formule Acide [(Boc-Leu) - amino] phényl sulfanyl acétique de formule II Boc = t.butoxycarbonyl dans laquelle Y est un radical phényle, non substitué ou substitué par un, deux ou trois substituants R qui est employé au cours de la synthèse peptidique sur matrice pour introduire le motif fondamental sur lequel repose la présente invention. Ce synthon est préparé par la méthode suivante Boc - Leucinamide 7 [(Boc Leu)amino] + glyoxylate d'allyle hydroxyacétate d'allyle 1 (Boc Leu) amino]acetoxy acétate d'allyle 1 [(Boc Leu) amino]phényl sulfanyl acétate d'allyle 1 Acide [(Boc Leu) amino] phénylsulfanylacétique (2) En utilisant la méthode de synthèse peptidique en phase solide, suivant le mode opératoire décrit par Nguyen et al (J.Chem.Soc, Perkin Transact. 1 (1987) 1915-1919), on accroche au départ de ce synthon les différents aminoacides qui constituent la chaîne de ce nonapeptide.On part d'une résine MBHA (p.méthyl benzhydrylamine) ou d'une résine CM (résine chlorométhylée réticulée à 1%) contenant 0,40 mmol d'Ile par gramme. Le couplage a été effectué en utilisant deux équivalents de BOC amino-acide et deux équivalents de [benzotriazolyloxy trisdimethyl aminophosphonium] hexafluoro phosphate (BOP) (fourni par Novabiochem). Après couplage, on effectue la déprotection avec 50 % d'acide trifluoroacétique Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile OH FmOC-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-NH2 Ile-Arg-Lys-Ile-Leu (S) -Phe-Leu-Asp-Gly-NH2 FmOC-Ile-Ary-Lys-Ile-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile OH Ile-Ar-Lys-Ile-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile (OH) dans cet énoncé et dans ce qui suit, le symbole FmOC signifie Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl Le schéma, ci-joint, explicite les différentes étapes de la synthèse du synthon (2). L'invention a encore pour objet les compositions pharmaceutiques, notamment destinées au traitement des infections virales dues au virus HIV, qui contiennent, à titre de principe actif, au moins un composé de formule générale I dans laquelle Z est de l'hydrogène ou un reste Ile Ar est un radical phényle, non substitué ou substitué en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable. Parmi les composés de formule générale I, on utilisera de préférence comme principe actif, celui pour lequel Ar est un radical phényle. On pourra également utiliser des composés pour lesquels Ar est un phényle substitué par un, deux ou trois radicaux choisis dans le groupe formé par un alcoyle inférieur, un alcoxy inférieur, un trifluorométhyle, un trifluorométhoxy, un nitro, un carboxamido, un cyano, les halogènes et un phényle. Le virus du SIDA produit une aspartyl-protéase dimère qui coupe spécifiquement les précurseurs de polyprotéine qui code pour les protéines structurelles et les enzymes constitutifs du virus. Cette activité protéolytique est nécessaire pour la production de virions infectieux matures et est, par conséquent, un objectif intéressant pour une intervention sur le plan thérapeutique. Les chimistes de chimie thérapeutique ont essayé de concevoir et de synthétiser des inhibiteurs de cet enzyme aspartyl protéase qui joue un rôle décisif. La plupart des laboratoires ont employé le concept d'analogue d'état de transition. Ce concept consiste à synthétiser le substrat de peptide le plus court possible, dans lequel la liaison amide, normalement clivée, est remplacée par une fonction non hydrolysable mimant un motif de l'état de transition tétrahédrique. Jusqu'à présent, un grand nombre de motifs mimant 1état de transition tétrahédrique de différents états ont été mis en présence de la protéase de HIV1. Il s'agit d'isostères aminoéthyléniques (RICH D.H et al. J.Med.Chem. 33 (1990) 12851288), d'analogues de statine (HUY K.Y et al. FASEB J. 5 (1991) 2606-2610 - VENAUD S et al. Res. Virol. 143 (1992) 311-319), d'isostères d'acide phosphinique (Grobeiny D et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 169 (1990) 1111-1116), de difluorocétones (SHAM H.L et ai. Biochem.Biophys.Res.Commun. 175 (1991) 914-919), d'isostères dihydroxyéthylène et hydroxyéthylamine (THAISRIVONGS S et al. J.Med.Chem. 34 (1991) 2344-2356 - RICH D.H et al. J.Med.Chem. 34 (1991) 1222-1225). Les inhibiteurs de protéase de HIV1 sont également conçus en tenant compte de la structure tertiaire de l'enzyme. Ces composés peuvent être classifiés comme inhibiteurs symétriques et comme inhibiteurs de dimérisation. Dans un souci d'augmenter l'étendue générale et l'approche du peptide anti-HIV, les demandeurs ont fait porter leur étude sur le nouveau concept d'inhibiteur de HIV2 basé sur les observations expérimentales suivantes 1. Si après analyse séquentielle des séquences de protéines structurales et des enzymes des virions matures infectieux on ne peut mettre en évidence un substrat spécifique de la protéase HIV, on remarque cependant certaines spécificités dans les sites de clivage effectués par ces virions infectieux. 2. Beaucoup de peptides qui représentent des modèles connus de site de traitement protéolytique à l'intérieur des polyprotéines de HIV1 ont été considérés comme étant clivés avec précision par une protéase synthétique ou recombinante de HIVî. 3. Plusieurs peptides ont été conçus à partir de la déduction du séquençage des fonctions amide ou carboxyle terminale des protéines des HIV1 matures. Parmi celles-ci, le peptide synthétique Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Glu-Leu a été trouvé comme étant clivé entre le résidu LEU-PHE, cette coupure correspondant au site de clivage 727/728 pol normal. En supposant que le remplacement du groupe méthylène du résidu phénylalanine dans le peptide I par un hétéroatome tel que le soufre, ne va pas changer le site de clivage entre LEU et PHE, il est possible de mentionner ici, la synthèse et les propriétés inhibitrices surprenante vis-à vis de HIV1, de nouveaux thiophénoxy isostères du peptide I. Le modèle de base de ce nouveau peptide contenant une glycine substituée en a est représentée par la formule I. D'une manière habituelle, une glycine a-substituée dans laquelle le carbone en a est relié à un atome d'azote d'oxygène ou de soufre est instable. Cependant, différentes glycines a-substituées N-acétylées de ce type, ont été décrites dans la littérature. L'acylation du groupe amino mène à la stabilisation de la molécule en délocalisant les électrons de l'azote sur la liaison peptidique. Au lieu d'utiliser une simple N-acylation pour fournir la stabilité chimique de telles glycines a-substituées, les demandeurs ont utilisé la liaison peptidique LEU-PHE de façon à mimer le peptide I. On a synthétisé les peptides énumérés dans le Tableau 1 par la technique de la synthèse en phase solide. Cette synthèse nécessite l'emploi d'un synthon clé(2). Celui-ci a été préparé selon la procédure suivante 0 l'amide de BOC-LEUCINE (3) a été condensé avec l'hydrate de glyoxalate d'allyle (4) pour fournir le dérivé a-hydroxylé correspondant donc l'ester allylique de BOC-LEU-GLY (5). Après acétylation de la fonction hydroxylée, l'ester résultant (6) a été déplacé par un thiophénol nucléophile. L'élimination du groupe ester allylique en utilisant le complexe (bis palladium triphénylphosphine) en présence de triphénylphosphine a conduit au synthon désiré (2) sous la forme d'un mélange de diastéréoisomères. On doit noter que l'emploi d'autres esters d'acide glyoxylique a été trouvé non approprié pour la condensation sur l'amide BOC-LEUCINE. Vraisemblablement, les conditions de déprotection finale de la fonction ester ont conduits au clivage de la liaison peptidique. En outre, la condensation directe entre l'acide glyoxylique et l'acide BOC-LEUCINE s'est avérée être inopérante dans les conditions expérimentales de l'essai dans la mesure où la synthèse en phase solide des peptides énumérés au Tableau 1, exige des grammes de synthon (2). Cette étude a été effectuée en employant le composé (2) sous la forme du mélange de diastéréoisomères. En tenant compte des résultats anti-HIV inattendus, la séparation par HPLC en phase inverse du mélange de (2) et ou la synthèse énantiomérique du peptide correspondant a été effectuée dans une deuxième étape de recherche. TEST D'ACTIVITE DE LA PROTEASE HIV1 Les peptides modèles énumérés au Tableau 1 ont été mis en incubation avec la protéase de HIV1 partiellement purifiée en employant une procédure standard et les produits de clivage ont été analysés par HPLC en phase inverse. Comme on l'avait supposé, les résultats ont été conformes, à l'hypothèse seul le modèle de peptide 1 a été clivé d'une manière surprenante, les peptides contenant du soufre (2,7,8,9,10 et 11) ont été résistants à tout clivage protéolytique dans les conditions de l'essai. En liaison, les peptides contenants du soufre ont été ajoutés à un essai en employant le peptide I comme substrat de modèle. On a constaté qu'ils n'étaient pas des inhibiteurs à des concentrations de molarité égale aux substrats (environ 2mM). ACTIVITE ANTI-VIRALE Les composés représentatifs énumérés au Tableau 1 ont été également testés pour leur aptitude à inhiber l'infection par HIV1 en culture de cellules L'effet fusogénique de HIV1 dans la lignée cellulaire MT4 a été déterminé comme décrit par REY et coll. comme montré dans le Tableau 1. Certains des nouveaux thiophénoxypeptides de l'invention ont été trouvés actifs comme inhibiteurs de la replication de HIV. Les composés les plus actifs ont été (9) et (11). Ces résultats montrent que la protection du groupement N-terminal par un groupe FMOC dans les composés (8) ou (10) a entraîné une perte importante de l'aptitude à l'inhibition de la replication virale en comparaison avec les congénères dont le groupement Nterminal est libre (9) et (11). En outre, si on prend en considération les résultats précédents, publiés par BILLICH et al (J. Biol. Chem. 263 (1988) 17905-17908), qui ont montré que les peptides synthétiques à partir de 7 à 18 amino acide de long, peuvent être employés comme substrats modèles et inhibiteurs, pour l'investigation de la protéase, on a trouvé que la longueur minimale pour les peptides contenant de la glycine substituée par un S-phényl en a, était de 9 ou 10 amino acides.Dans cette perspective, à la fois les dipeptides (2) et (7) qui contiennent la fraction S définie, se sont avérés n'être pas actifs en tant qu'inhibiteur de la replication virale. En ce qui concerne le résidu terminal carboné, ce résultat préliminaire semble indiquer que le groupe carboxyle (11) ou le groupe carboxamide (9) pourrait être approprié en tant qu'inhibiteurs de la replication du virus HIV. Cette étude a montré que des inhibiteurs modérement puissants de la replication de HIV1, incorporant un isostère de phénylalanine pourraient être identifiés. A la connaissance des demandeurs, c'est la première fois que des peptides synthétiques qui ne sont pas des substrats ou des inhibiteurs de protéase de HIV1 peuvent être actifs sur l'infection par HIV1 dans les cultures de cellule de MT4. Cette nouvelle classe de peptides synthétiques de la protéase de HIV qui est basée sur le remplacement isostérique d'un groupe méthylène par un atome de soufre dans un résidu phénylalanine positionné sur le site de clivage d'un substrat peptidique synthétique de protéase de HIV, pourrait être intéressant. Assurément, la question du mécanisme d'action pour cette nouvelle classe de composés semble être cruciale. Il n'y a pas de doute que la réponse à cette question pourrait nécessiter encore des investigations. Les essais destinés à identifier la cible dans le cycle de replication de HIV déclanchée par cette nouvelle classe de composés, devront être poursuivis. Cependant, en analysant les essais effectués pour déterminer le mécanisme par lequel ces composés interfèrent avec le cycle de replication virale à l'intérieur de la cellule, les résultats rapportés ici laissent supposer que si certains peptides incorporent un motif thiophénoxy, ils ne sont pas cependant actifs au niveau de l'inhibition du virus HIV. Ce manque d'activité peut être associé à une faible perméabilité membranaire de ces composés vis-à-vis de cellules MT4, pour ces nouveaux peptides synthétiques. En effet, pour autant que les composés comme (9) et (11) qui ont une fonction ester terminale libre, ont montré le plus grand effet anti-HIV, les peptides (8) et (10) ont été trouvés inactifs dans des cultures infectées. Il apparait donc qu'à l'intérieur de cette nouvelle classe de peptides synthétiques qui incorpore la fraction thiophénoxy, les composés qui entrent dans la cellule infectée, avec le plus grand effet, pourraient être de bons candidats pour des études de mécanisme d'action. En résumé, une nouvelle série d'inhibiteurs de la replication du virus HIV en culture cellulaire qui favorise le remplacement par un atome de soufre dans le résidu phénylalanine a été développée. Si le mécanisme d'action de ces nouveaux composés synthétiques demeure peu connu, une fois que l'optimisation de ces résultats annexés aura été achevée, ils pourraient représenter une nouvelle approche dans la recherche de nouveaux médicaments anti-HIV. MODE OPERATOIRE POUR L'EVALUATION DES PROPRIETES ANTIRETROVIRALES DE NOUVEAUX ANALOGUES PEPTIDIQUES INCLUANT UN RESIDU GLYCINE a- SUBSTITUE METHODE L'évaluation de l'effet antiviral est basée sur l'étude de l'effet cytopathogène du virus HIV 1 sur la lignée cellulaire MT4. La lignée MT4 a pour origine des cellules T isolées à partir d'un patient, transformées par le virus HTLV 1. Cette lignée est mycoplasmée. Les mycoplasmes sont des agents infectieux ubiquitaires, bactéries vivant à la surface des MT4 en tant qu'hôtes naturels. Cette bactérie de l'ordre de 300 à 700 nm est responsable du grand effet cytopathogène du HIV par la formation de cellules géantes (fusion par la gp 120) SYNCITIA. Cette infection par HIV est observée 4 à 5 jours après l'infection, suivie par la mort des cellules. Cet effet cytopathogène est directement corrélé à l'infection des cellules par le virus, à sa réplication intracellulaire et à l'expression des antigènes viraux par les cellules. Une inhibition de cet effet correspond donc à une inhibition de la multiplication du virus HIV 1. Cette lignée lymphoblastoïde infectée par HIV 1 peut être utilisée pour la production virale. L'action du traitement par agents infectieux est permanent. En effet, il est présent avant, pendant et après l'infection virale. Les perspectives antivirales portent essentiellement sur les inhibiteurs de la protéase qui contrôle la maturation des protéines et donc la production de particules infectieuses, mais aussi sur les inhibiteurs de la protéine TAT qui participe au réveil et à la dissémination du virus régulateur positif de la transcription virale et enfin sur les inhibiteurs de la transcriptase inversé (reverse transcriptase) qui transforme 1'ARN viral en ADN double brin, renfermant le message viral et qui s'intègre à l'état de provirus dans 1'ADN de la cellule hôte. Des dilutions successives sont effectuées dans du milieu à 10% afin de pouvoir cultiver les MT4 pendant 8 jours et de pouvoir lire la formation des syncitia. TEST MT4 - avant infection 3.106 cellules/100 ul sont distribuées dans une microplaque à 96 puits, centrifugées 3 fois à 2000 tpm et le culot est préincubé avec 100 ul de concentrations successives de l'antiviral à tester, 1 heure à 37 CO2. - infection Elle est réalisée en micropuits en rajoutant une dilution 10-3 du virus HIV (cette dilution du virus HIV 1 est déterminée pour induire la formation de syncitia en 4 à 5 jours). L'antiviral est toujours présent lors de 1 l'infection, la concentration finale du virus est alors de 5.10-4. - après infection Après une incubation de 1 heure à 37 sous CO2, les MT4 sont lavées 3 fois avec du RPMI 1640 et mises en culture à raison de 3.105 cellules pour 1 ml de chacune des concentrations des composés à tester en plaques 24 puits. Ce jour est considéré comme JO. A J3 ou J4, les cellules MT4 sont diluées au 1/3, de nouveau dans les différentes concentrations de 1'antiviral. Chaque jour, l'apparition de syncitia est observée au microscope pour voir s'il y a un peu de retard par rapport au témoin HIV 1. A J8, le dosage de la transcriptase inverse est effectué. Si les cellules ne sont pas infectées, c'est donc qu'il y a une protection par l'antiviral testé. La dose IC50, concentration de l'antiviral qui inhibe 50% de la valeur de la transcriptase inverse du témoin HIV 1 sera déterminée. - Numéro des composés 1 Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH 8 Fmoc-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu 9 Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S) -Phe-Leu-Asp-Gly-NH2 10 Fmoc-Ile-Arg-Lys-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH 11 Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH 2 BocNH--Leu(S)-PheOH 7 BocNH-Leu(S)-PheOCH2-CH-=CH2 Leu-(S)-Phe Numéro composés IC50 M AM TI(ID50/IC50) 1 inactif 8 inactif/toxique 9 5 + 2 50 10 100 + 50 10 11 10 + 5 10 2 inactif 7 inactif IC50 : concentration requise pour inhiber la formation de syncitia de 50% par rapport à l'essai témoin TI : index thérapeutique concentration requise pour provoquer la mort de 50% de cellules MT4 non infectées (IDso) par rapport à la concentration requise pour inhiber la formation de syncitia de 50% (IC50) Essais effectués sur cellules MT4. Souche virale HIV-1 Bru REVENDICATIONS 1. Un nonapeptide synthétique dont la structure s'écrit dans laquelle X et Y sont les résidus d'acides aminés, protégés ou non, ou des peptides R est un radical alcoyle linéaire ou ramifié et R'' est un radical alcoyle, phényle, halogène, un nitro, un amino alcoxy, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, carboxamido ou un cyano et n est égal à O, 1, 2 ou 3 2. Un nonapeptide selon la revendication 1, dont la formule simplifée est dans laquelle Ar est un radical phényle, non substitué ou substitué - 3.Un nonapeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, à savoir . Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(s)-phe-Leu-Asp-Gly-NH2 4. Un peptide selon la revendication 1 ou 2, à savoir Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S) -Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH 5. Un procédé d'obtention des peptides selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on utilise un synthon de formule acide[(BOC Leu)-amino]phényl sulfanyl acétique de formule II dans laquelle Y est un radical phényle, non substitué ou substitué par un, deux ou trois substituants R auquel on accroche les différents amino acides qui constituent la chaîne de ce nonapeptide par la technique des résines en phase solide. puis on déprotège la fonction amine terminale par l'acide trifluoroacétique ou bien on réalise la déprotection de la chaîne et le clivage de la résine à l'aide d'acide fluorhydrique en présence d'anisole. 6, Les compositions pharmaceutiques qui contiennent à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I dans laquelle Z est de l'hydrogène ou un reste Ile et Ar est un radical phényle, non substitué ou substitué en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement-acceptable. 7. A titre d'intermédiaire pour la synthèse des composés de formule I FmOC-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S)-Phe-Leu-Asp-Gly-Z 8. A titre d'intermédiaire pour la synthèse des composés de formule I FmOC-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu(S) -Phe-Leu-Asp-Gly-Ile OH 9. A titre d'intermédiaire pour la synthèse des composés de formule I, l'acide[(Boc Leu)amino] phénylsulfanylacétique