FR 2728913 A1 19960705 FR 9415857 A 19941229 La présente invention a pour objet un procédé de préparation conjointe de di-, tri- et tétraméthylpyrazines, par culture d'au moins un microorganisme des espèces Bacillus subtilis ou Brevibacterium linas, sm un milieu à base de soja enrichi. Ces pyrazines, notamment la 2,5diméthylpyraaine et la tétraméthylpyrazine sont des arômes connus que l'on cherche depuis des années à produire industriellement. On a, en fait, depuis longtemps étudié leur production par bioconversion dans des milieux à base de soja mais les rendements obtenus, toujours faibles, n'ont pas permis d'envisager de passer au stade industriel. On a notamment supposé, dès 1964, que l'acétone pouvait être un précurseur de la tétraméthylpyrazine (Pharm. Soc. Japan, 84, 545-548 (1964)). On a notamment étudié l'impact d'aminoacides, ajoutés à une culture de Bacillus natto, sur la formation des pyrazines. La 2,5-diméthylpyrame était principalement obtenue avec la L-thréonine, les tétra- et triméthylpyrazines principalement obtenues avec la L-sérine. Les résultats de cette étude ont été publiés dans Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, Vol. 36, No. 9, 762 - 764 (1989). Toutefois, à ce jour, à la connaissance de la Demanderesse, ces études n'ont pas débouché sur la mise au point d'un procédé assurant un rendement intéressant. Cest, en vue d'une telle mise au point, que la Demanderesse a effectué des travaux de recherche. Le résultat de ces travaux constitue l'invention présentement décrite et revendiquée. Ladite invention consiste en un procédé de production de pyrazines par bioconversion dans des milieux à base de soja enrichis; ladite bioconversion étant mise en oeuvre dans des conditions optimales, I'optimisation ayant portée, en premier lieu, sur le choix des précurseurs produits ajoutés en vue d'enrichir lesdits milieux à base de soja -. L'invention présentement revendiquée a donc pour objet un procddé de préparation conjointe de di-, tri-, tétraméthylpyrazines par culture d'au moins un microorganisme des espèces Bacillus subtilis ou Brevibacteriwx linens, sur un milieu à base de soja enrichi. De façon caractéristique, ledit milieu est enrichi en thréonine, en acétone et en ions ammonium. Le procédé de l'invention est basé sur les trois points suivants: - la culture de microorganisme(s) sur un milieu à base de soja : on cultive généralement un microorganisme; - I'enrichissement de ce milieu en précurseurs des pyrazines; - la production conjointe sur ledit milieu des di-, tri- et tétraméthylpyrazines: dans le même fermenteur, deux voies métaboliques sont exploitées. Les précurseurs intervenants sont donc d'une part la thréonine et d'autre part l'acétone et les ions ammonium. La thréonine intervient généralement sous sa forme naturelle de L-thréonine. Elle contribue essentiellement à la production de la 2,5- diméthylpyrazine. L'acétoiiie et les ions ammonium contribuent, eux, essentiellement à la production de la tétraméthylpyrazine. Selon l'invention, l'intervention de tels ions ammonium s'est révélée, de manière surprenante, fort intéressante. Lesdits ions ammonium peuvent être apportés dans le milieu de culture, sous différentes formes, compatibles évidemment avec ledit milieu. On peut notamment les apporter sous la forme de chlorure etlou d'acétate d'ammonium. On préconise, selon l'invention, I'intervention d'acétate d'ammonium. Cest avec ce produit que l'on a obtenu les meilleurs rendements. Lesdits ions ammonium, selon le procédé de l'invention, interviennent généralement à raison de 0,1 à 1M. Avantageusement, ils interviennent à raison de 0,1 à 0,7 M et dc préférence, à raison d'environ 0,35M (-5 g N/1). Pour ce qui concerne l'intervention de la thréonine et de l'acEtome, on preconise selon l'invention les quantités suivantes. La thréonine est généralement ajoutée à raison de 10 à 100 gfl, avantageusement à raison d'environ 40 g/l. L'acétoiiie est généralement ajoutée à raison, elle-aussi, de 10 à 100 g/l; avantageusement à raison de 40 à 70 g/l et de préférence à raison d'environ 60 g/l (- 60 ml /1). D'une manière générale, il convient d'ajouter, selon l'invention, les précurseurs, en une quantité minimale, pour l'obtention de l'effet escompbE; à savoir l'augmentation du rendement. Les ajouter en grande quantité génère souvent un effet d'inhibition. n est donc avantageux de s'en tenir aux gammes d'intervention préconisées cidessus. Le procédé de culture selon l'invention - avec apport de thréonine, d'acétoine et d'ions ammonium - est mis en oeuvre comme indiqué ci-dessus, sur un milieu à base de soja. Ce milieu peut être solide ou liquide. ll peut notamment consister en des grains de soja Dans cette hypothèse, lesdits grains sont préalablement imprégnés dune solution aqueuse qui renferme les précurseurs de l'invention. n peut également consister en une solution aqueuse de grains broyés, en une suspension de farine de soja, en du lait de soja, plus ou moins dilué. Dans cette hypothèse de milieu liquide, ledit milieu renferme les précurseurs de l'invention; avantageusement dans les quantités indiquées å dessus Pour ce qui concerne le soja, ledit milieu liquide de culture en renferme avantageusement de 20 à 300 g/l, et de préférence de 50 à 100 g/l. Avec les ingrédients ci-dessus, qui interviennent avantageusement dans les quantités préconisées, on peut par culture d'un microorganisme d'une des espèces également précisées ci-dessus, dans des conditions classiques de culture, obtenir, selon l'invention, des pyrazines, en des quantités intéressantes ... On peut toutefois encore améliorer le rendement du procédé de l'invention, en le mettant en oeuvre selon des variantes préférées, explicitées ci-après. Ces variantes ne s'excluent nullement mutuellement. Selon une première variante, le milieu de culture est enrichi dans un premier temps en thréonine seulement et dans un deuxième temps, avantageusement après la consommation de ladite thréonine (la synthèse de la 2,5diméthylpyrazine, principalement), en acétoine et ions ammonium. fl est bien sûr possible, selon l'invention, d'effectuer l'enrichissement global (thréonine + acétoine + ions ammonium) dès le début de la culture. ll est toutefois beaucoup plus avantageux de mettre en oeuvre la variante dessus; c'est-à-dire de décaler dans le temps les apports de thréonine d'une part et d'acétone et d'ions ammonium d'autre part. Ledit décalage, dans l'hypothèse où l'on attend la fin de la synthèse de la 2,5diméthylpyrazine, est de 30 heures à 50 heures. Selon une seconde variante, l'ajout de thréonine au milieu de culture est réalisé de façon séquentielle. Ledit milieu, enrichi ou non en acétome et ions ammonium (hypothèse de la première variante décrite d-dessas) est enrichi par ajouts successifs, espacés dans le temps, de thréonine. La concentration désirée en thréonine peut, par exemple, être rétablie, toutes les 6 heures. Selon une troisième variante, on met en oeuvre la culture à pH contrôlé. Lorsque ce paramètre n'est pas contrôlé, il varie d'environ 6,5 en début de procédé, à environ 9 en fin de procédé. Avantageusement il est contrôlé, pendant toute la culture, à une valeur autour de 7,5. Comme indiqué dessus, toutes ces variantes de l'invention, peuvent être avantageusement mises en oeuvre, conjointement ou successivement, lors du déroulement du procédé de l'invention. Par ailleurs, de façon classique, on peut stériliser le milieu de culture préalablement à ladite culture. La stérilisation (ou autoclavage initial) est avantageusement mise en oeuvre dans les conditions ci-après : à 132in pendant 30 minutes. Avant une telle stérilisation et avant l'inoculation, on peut avantageusement acidifier le milieu de culture, par exemple à un pH voisin de 4. De façon classique, on peut également, en fin de culture stériliser le milieu. Pour ce qui concerne les autres paramètres de la culture (température, durée, pression en oxygène), I'homme de l'art est à-même de les optimiser. La culture, de façon classique, est généralement mise en oeuvre entre 25 et 45-C, avantageusement à environ 40il. Pour ce qui concerne la pression en oxygène, il n'y a pas de contrainte particulière. On veillera toutefois à éviter d'être en limitation par l'oxygène dans la mesure où l'on vise à atteindre un rendement intéressant. Enfin, on a précédemment indiqué que les microorganismes intervenant dans le procédé de culture selon l'invention sont choisis parmi les espèces Bacillus subtilis et Brevibacterium linens. Avantageusement, on utilise les microorganismes identifiés ci-après: - Bacillus subtilis ATCC 7058 - Bacillus subtilis ATCC 7059 - Bacillus subtilis ATCC 15245 - Bacillus subtilis Ifs 3009 - Bacillus subtilis IFO 3013 - Bacillus subrilis DFO 3335 - Bacillus subtilis IFO 3336 - Bacillus subtilis IFO 3936 - Brevibacterium linens CNCM I-1416 -Brevibacterluna linens CNCM I-1417; (ATCC: American Type Culture Collection; IFO: Institute of Fermentation of OSAKA; CNCM:Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur). Le procédé de l'invention est illustré dans les exemples 4, 5 et 6 suivants. Les exemples 1 à 3 sont donnés à titre comparatif. Exemple 1 60 g de grains de soja sont imprégnés pendant 15 heures à 4 C dans 300 ml d'une solution aqueuse contenant 15 g (50 g/l) de L-thréonine et 18 ml d'acétoïne (60 ml/l). L'excès de solution est ensuite éliminé, puis les grains sont introduits dans un réacteur colonne en Pyrex d'un volume de 0,5 l; l'ensemble est stérilisé à l'autoclave pendant 20 minutes à 12C. Après un refroidissement, le milieu est inoculé à l'aide de 20 ml dhne préculture de Bacillus subtilis IFO 3013 réalisée en fiole Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de solution nutritive incubée pendant 20 heures à 2C. Cette préculture est elle-même ensemencée à partir des colonies obtenues sur un milieu gélosé tryptone-soja en boîte de Pétri, par agitation dans 2 ml d'eau distillée stérile. La solution nutritive est obtenue en ajoutant 1 ml d'une solution B à 49 mi d'une solution A, les deux étant stérilisées séparément à 12(rC pendant 20 minutes. La solution A contient 1,36 g" de K2HP04; 16 g/l de Na2HP04, 2H20; 0,5 g/l de NaCl, et 25 g/l d'extrait de levure. La solution B est constituée de 250 g/l de glucose. La culture est réalisée à 2rc avec un débit d'aération de 1 l/h (0,033 VVM). 2,5 g de substrat solide humide, conespondant à îg de matière sèche, sont mis en suspension dans 20 ml d'eau distillée contenant 5 ssd de butanol-1 (étalon interne). L'ensemble est placé dans un appareil d'entraînement à la vapeur de type Likens-Nickerson, et les métabolites volatils sont récupérés dans 2 ml de dichlorométhane. Cette solution est ensuite injectée dans un chromatographe en phase gazeuse équipé dune colonne capillaire de type polaire (par exemple Carbowax). L'identification des composés est réalisée par comparaison des temps de rétention avec des échantillons authentiques. On obtient au bout de 6 jours 0,02 g/l de 2,5-diméthylpyrazine, 0,10 g/l de triméthylpyrazine et 0,32 g/l de tétraméthylpyrazine, soit un total de 0,54 g/l de pyrazines. Exemple2 100 g de grains de soja jaune dépelliculés sont imprégnés dans 500 ml d'eau distillée pendant 15 heures à 4'C. L'excès d'eau est éliminé, puis le solide est remis en suspension dans 1 1 d'eau. L'ensemble est broyé, et le milieu obtenu est supplémenté avec 40 g de L-thréonine. LrmocUiaLion est effectuée après autoclavage à 12(rC pendant 20 minutes, à raide de 20 ml d'inoculum préparé comme dans l'exemple 1. La culture est réalisée à 40iC avec un débit d'aération de 12 Vh (0,2 VVM), sans régulation du pH, et 60 ml d'acétome sont ajoutés au bout de 30 heures. L'extraction et le dosage des métabolites sont effectués comme dans l'exemple 1, en remplaçant la suspension aqueuse des grains par 5 ml de milieu de culture. On obtient au bout de 72 heures 0,65 g/l de 2,5-diméthylpyrazine, 0,27 g/l de triméthylpyrazine, et 0,50 g/l de tétraméthylpyranne, soit un total de 1,42 g/l de pyrazines. Exemple 3 100 g de farine de soja (Soyamin 50I) sont mis en suspension dans 1 I d'eau contenant 40 g de L-thréonine. L'inoculation est effectuée après autoclavage comme dans l'exemple 2. La culture est conduite comme dans l'exemple 2, mais le pH du milieu de culture est maintenu constant à ne valeur de 7,5. On obtient au bout de 72 heures 1,42 g/l de 2,5-diméthylpyrazine, 0,22 g/l de triméthylpyrazine, et 0,10 g/l de tétraméthylpymne, soit un total de 1,74 g/l de pyrazines. Exemple 4 On procède comme pour l'exemple 3, mais 27,5 g d'acétate d'ammonium sont ajoutés, avec l'acétone (60 ml), au bout de 30 heures de culture. On obtient au bout de 72 heures 1,32 g/l de 2,5-diméthylpyras, 0,21 g/l de triméthypyrazine, et 1,08 g/l de tétraméthylpyrazine, soit un total de 2.61 g/I de pyrazines. Exemple 5 50 g de farine de soja sont mis en suspension dans 1 I d'eau, puis l'ensemble est autoclavé et inoculé comme dans l'exemple 2. La culture est conduite à une température de 40 C, avec un débit d'aération de 121h (0,2 VVM) et le pH du milieu de culture est maintenu constant à une valeur de 7,5. Aucun ajout d'acétoïne n'est effectué. 20 g de L-thréonine sont ajoutés au bout de 6 heures. La concentration résiduelle en acide aminé est suivie par injection du dérivé triméthylsilyl (TMS) dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d'une colonne capillaire de type apolairc (par exemple SPB-5 de chez Supelco).La concentration en L-thréonine est rétablie à 20 g/l toutes les 24 heures, en ajoutant le volume nécessaire dtmt solution aqueuse contenant 400 g/l de ce composé. 50 g/l de L-thréonine sont consommés au bout de 96 heures de culture. On obtient à ce moment 3,80 g/l de 2,5diméthylpyrne , soit un total de 4,10 g/l de pyrazines (Ces concentrations sont exprimées par rapport au milieu de culture initial non dilué.) Au bout de ces 96 heures, on ajoute au milieu de culture 60ml d'acétoiiie et 27,5 g d'acétate d'ammonium. On obtient, 72 heures après, 3,80 g/l de 2,5-diméthylpyrazine, 0,30 g/l de triméthylpyrazine et 1,08 g/l de tétraméthylpyrazine soit un total de 5.18 g/l de pyrazines. Exemple 6 50 g de farine de soja et 40 g de thréonine sont mis en suspension dans 1 litre d'eau, puis l'ensemble est acidifié à pH 4 avec de l'acide chlorhydrique, puis autoclavé à 132 C pendant 30 minutes. ll est ensuite inoculé à l'aide d'une préculture de Brevibacterium linens CNCM I-1417, réalisée comme dans l'exemple 1. La culture est conduite comme dans l'exemple 4, mais l'acétate d'ammonium et l'acétoïne sont ajoutés au bout de 48 heures de culture. On obtient au bout de 96 heures 1,30 g/l de 2,5 diméthylpyrazine, 0,30 g/l de triméthylpyrazine, et 1,85 g/l de tétraméthylpyrazine, soit un total de 3*45 g/l de pyrazines. - Revendications 1. Procédé de préparation conjointe de di-, tri-, tétraméthylpyrazijies par culture d'au moins un microorganisme des espèces Bacillus sub ou Brevibacterium linens, sur un milieu à base de soja enrichi, caractérisé en ce que ledit milieu est enrichi en thréonine, en acétoine et en ions ammonium. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ions ammonium sont ajoutés sous forme de chlorure et/ou d'acétate d'ammonium, avantageusement sous forme d'acétate d'ammonium. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la thréonine est ajoutée à raison de 10 à 100g/l, avantageusement à raison d'environ 40g/l. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que i'acétoine est ajoutée à raison de 10 à 100g(l, avantageusement à raison de 40 à 70g/1 et de préférence à raison d'environ 60g/l. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les ions ammonium sont ajoutés à raison de 0,1 à 1M, avantageusement à raison de 0,1 à 0,7 M et de préférence à raison d'environ 0,35M. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en milieu solide ou liquide; ledit milieu liquide renfermant avantageusement de 20 à 300g/1 de soja et de préférence de 50 à lOOg/l de soja. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu est enrichi dans un premier temps en thréonine pour la synthèse, principalement, de 2,5-diméthylpyrazine et dans un deuxième temps seulement, avantageusement après ladite synthèse, en acétoine et ions ammonium. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la thréonine est ajoutée au milieu de façon séquentielle. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caracterise en ce que la culture est mise en oeuvre à pH controlé, avantageusement à un pH voisin de 7,5. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture est initialement stérilisé à un pH voisin de 4. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre par culture d'au moins un microorganisme choisi parmi: - Bacillus subtilis ATCC 7058 - Bacillus subtilis ATCC 7059 - Bacillus subtilis ATCC 15245 - Bacillus subtilis IFO 3009 - Bacillus subtilis IFO 3013 - Bacillus subtilis IFO 3335 - Bacillus subtilis 'F0 3336 - Bacillus subtilis IFO 3936 - Brevibacterium linens CNCM I-1416 -Brevibacterium linens CNCM 1-1417.