FR 2729973 A1 19960802 FR 9500904 A 19950126 Procédé de criblage de composés anti-viraux L'invention a pour objet un procédé de criblage de composés anti-viraux. Elle vise plus spécialement un procédé pour mettre en évidence chez un composé à tester des propriétés inhibitrices d'une activité pathogène d'origine virale. Par "activité pathogène d'origine virale", on entend une activité de produit de gène, ARN ou protéine, ou un fragment actif, nécessaire au déroulement du cycle d'un virus, notamment d'un rétrovirus pathogène pour 1'homme ou l'animal. La recherche de nouveaux moyens de lutte contre les virus mobilise de nombreuses équipes de chercheurs de par le monde, un effort particulièrement important étant développé dans le domaine des rétrovirus depuis la découverte du rôle de HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1) en tant qu'agent causal du SIDA. Comme tous les rétrovirus, HIV-1 possède un génome ARN, qui est copié en ADN grâce à une réaction catalysée par la transcriptase inverse, enzyme codée par le génome du rétrovirus. La copie ADN double brin proviral est plus longue que 1'ARN génomique en raison de la duplication et de l'association de certaines séquences aux extrémités de 1'ARN génomique viral lors de la transcription inverse. Ces séquences répétées que l'on trouve aux extrémités du provirus s'appellent LTR (long terminal repeat) et sont indispensables lors de l'étape d'intégration. L'ADN rétroviral est ensuite intégré dans le génome de la cellule-hôte grâce à l'intégrase, une autre enzyme codée par le rétrovirus. Cette enzyme provoque des coupures décalées et, tout au moins en première approximation, aléatoires dans le génome de la cellulehôte où se produisent les intégrations. Cette étape d'intégration, nécessaire à la multiplication du virus, constitue une cible potentielle pour un traitement thérapeutique. Les études menées jusqu'à présent ont plutôt été axées sur la transcriptase inverse. Il est en effet très facile de détecter son activité enzymatique in vitre. Ainsi la majorité des agents thérapeutiques anti SIDA, et en particulier l'AZT, ont pour rôle d'empêcher son fonctionnement. Mais ces traitements ne donnant pas de résultats définitifs, de nouvelles stratégies ont été développées, concernant essentiellement la protéase rétrovirale. En ce qui concerne l'intégrase, ce n'est que très récemment que des molécules inhibitrices ont été isolées. Ce retard s'explique par le fait que les tests in vitre permettant de détecter l'activité de l'intégrase n'ont été mis au point que depuis peu, et certainement par le fait qu'il n'existe pas de test simple de mise en évidence de l'activité invivo. L'invention a précisément pour but de fournir des moyens permettant de réaliser un test in vive dans un modèle cellulaire et, par là, de détecter des propriétés anti-intégrase chez des produits testés. De manière plus générale, l'invention vise à fournir des moyens permettant le criblage de composés actifs contre une activité pathogène d'un produit de gène d'un virus, notamment d'un rétrovirus. Ce produit de gène, ARN ou protéine, ou un fragment actif, sera appelé ci-après molécule cible. L'invention repose ainsi sur l'élaboration d'un système cellulaire dans lequel on introduit une molécule cible capable de provoquer l'apparition d'un caractère phénotypique pouvant être visualisé, étant entendu que l'activité qui produit le caractère phénotypique est étroitement liée à celle produite chez un hôte infecté, nécessaire au déroulement du cycle viral. Le système cellulaire mis en oeuvre selon l'invention comprend des microorganismes en culture, génétiquement modifiés par l'introduction d'une séquence d'ADN capable d'exprimer la molécule cible dans les cellules du microorganisme. L'invention vise donc l'utilisation d'un tel système cellulaire dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs d'un effet pathogène de composés d'origine virale, notamment rétrovirale. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé in vive et comprend - l'utilisation d'un microorganisme en culture, génétiquement modifié par l'introduction d'une séquence d'ADN capable de se répliquer dans le microorganisme et d'exprimer une activité pathogène d'une molécule cible d'origine virale, telle que définie ci-dessus, - l'addition au microorganisme en culture d'un composé à tester, ce composé étant capable de pénétrer à l'intérieur des cellules du microorganisme, et n'interférant pas avec la multiplication naturelle de ce dernier, d'une manière qui rende le test inutilisable. La culture du microorganisme étant réalisée dans des conditions permettant, au moment de l'addition dudit composé, une expression de la molécule cible conduisant à l'apparition d'un caractère phénotypique détectable, - l'examen de la culture pour vérifier si le caractère phénotypique est modifié, voire supprimé ou, au contraire, est maintenu, afin de déterminer si le composé testé est respectivement un inhibiteur de l'activité virale pathogène ou s'il n'a pas d'effet sur cette activité. En effet, la disparition du caractère phénotypique, malgré la présence du produit de gène viral, permettra d'établir que le composé exerce un effet inhibiteur vis-à-vis de ce produit. Au contraire, le maintien de ce caractère signifiera que le composé testé est inactif vis-à-vis du produit viral. La séquence d 'ADN introduite dans le microorganisme comprend l'information nécessaire pour coder au moins pour la partie active de la molécule cible, c'est-à-dire celle capable de provoquer l'apparition du caractère phénotypique vis-à-vis du microorganisme dans lequel elle est introduite. Comme indiqué plus haut, l'activité qui produit le caractère phénotypique dans le microorganisme doit correspondre à celle qui est nécessaire au déroulement du cycle viral lors de l'infection chez l'homme ou l'animal. Cette condition peut être testée par exemple en modifiant par mutagénèse dirigée la molécule cible de manière à la rendre inactive dans le cycle viral et en déterminant si cette modification supprime également le caractère phénotypique dans le microorganisme. Avantageusement, la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur inductible, ce qui permet de déclencher l'expression de la molécule cible ou de la réprimer par simple modification de la teneur en composé responsable de l'induction dans le milieu de culture. Pour la réplication de la séquence d'ADN dans le microorganisme, on a recours à un vecteur comportant, outre cette séquence, une origine de réplication fonctionnant dans le microorganisme. En variante, la séquence d'ADN sera intégrée dans un chromosome du microorganisme hôte et se répliquera donc en même temps que le chromosome. Des phages tempérés pourront être utilisés dans le cas de la transformation de bactéries. L'activité pathogène de la molécule cible exprimée par la séquence d'ADN provoque, par exemple, une modification de la forme des cellules ou des colonies une inhibition de la multiplication du microorganisme ou un effet létal sur le microorganisme. Dans ce dernier cas, la séquence d'ADN doit nécessairement comporter un promoteur inductible. On utilise avantageusement, dans le procédé de l'invention, des séquences d'ADN codant pour au moins la partie active d'enzymes nécessaires à la multiplication de rétrovirus responsables de pathologies graves chez l'homme ou l'animal. On citera en particulier les enzymes de lentivirus à pouvoir cytopathogène et tout spécialement des rétrovirus du type HIV-1 et HIV-2 isolés à ce jour chez l'homme et ceux de type SIV isolés chez le singe. Ce procédé peut être étendu à d'autres rétrovirus tels que des oncornavirus (HTLV-1 et HTLV-2, isolés chez l'homme). Une séquence d'ADN présentant un intérêt particulier à cet égard correspond à celle codant pour l'intégrase ou des fragments actifs de cette dernière. D'après les résultats obtenus avec HIV-1, celle-ci exerce un effet mutagène létal sur la levure. Le système cellulaire servant de cellule hôte est plus spécialement constitué par un microorganisme tel qu'un champignon unicellulaire, notamment une levure, ou une bactérie. Les systèmes élaborés à partir de levures sont particulièrement préférés. Par rapport aux cellules humaines ou de mammifères en culture, qui constituent l'hôte naturel de HIV, ces systèmes levures présentent l'avantage de permettre la réalisation de cultures en milieu solide, facilitant l'obtention de clones, et l'obtention d'une disruption aisée des gènes. Selon une disposition avantageuse de l'invention, on utilise des souches de levures génétiquement modifiées, plus spécialement par mutation rad 52 et/ou par mutation protéases (-), et/ou obtenues par diploïdisation. L'utilisation de souches protéases (-) permet en effet d'éviter une destruction, par les protéases cellulaires, de l'enzyme exprimée par la séquence d'ADN introduite. Dans le cas de l'expression d'intégrase, on notera que, de manière surprenante, des résultats satisfaisants sont obtenus avec des souches diploïdes, alors qu'aucun effet n'est observé avec les souches haploïdes correspondantes. Ce résultat peut s'expliquer par l'existence de recombinaisons mitotiques entraînant l'apparition de cassures dans l'ADN, si l'on suppose que l'ADN cassé est particulièrement sensible à l'intégrase de rétrovirus. Ceci peut constituer une explication du phénotype létal dû à l'intégrase. Une autre explication de ce phénotype létal pourrait être l'effet endonucléolytique dû à l'intégrase même en l'absence de LTR. Dans l'un ou l'autre cas, l'effet de l'intégrase de HIV-1 sur 1'ADN de levure provoque l'apparition d'un phénotype létal dû à la destruction de gènes indispensables à la survie des levures (effet mutagène létal). L'étude de l'effet létal de l'intégrase, rapportée dans les exemples, montre que cet effet résulte d'une action sur différentes cibles cellulaires, mais qu'il s'exerce principalement sur l'ADN. En effet, l'expression d'intégrases sauvages et mutantes, dans des conditions d'expression conduisant à des concentrations maximales d'intégrase (utilisation d'un milieu sans leucine, donnant un nombre élevé de copies de plasmides et, comme source de carbone, de lactate, qui permet une dérépression maximale du promoteur ADH2/GAP) montre que l'effet létal dû à l'intégrase sauvage n'est pas levé par des mutations faux-sens connues pour inactiver totalement l'action de l'enzyme au niveau de l'ADN. Ceci suggère que l'intégrase de HIV-1 peut agir sur la levure de différentes manières.Cependant, 1'ADN constitue la cible la plus sensible comme il a été prouvé en diminuant la concentration intracellulaire d'intégrase par répression partielle du promoteur ADH2/GAP. Il a été en effet ainsi possible de supprimer totalement l'effet létal de l'intégrase portant les mutations faux-sens supprimant l'interaction entre l'intégrase et 1'ADN. Ce résultat a été obtenu, en utilisant, comme décrit dans les exemples, un nombre de plasmides par cellules élevé et une concentration en glucose de 5,6 %, qui n'entraîne pas de répression totale du promoteur de l'intégrase, en raison de l'existence de fuites du promoteur. Le composé à tester dans le procédé de l'invention est choisi parmi les composés capables de pénétrer spontanément dans le microorganisme originel ou dans un microorganisme génétiquement modifié pour permettre cette pénétration. Il est bien entendu que ce composé ne doit pas interférer avec la multiplication naturelle du microorganisme d'une manière qui rende le procédé inutilisable. L'addition dans le milieu de culture d'un composé à tester, lorsqu'on déclenche l'expression de l'enzyme, conduit selon les propriétés du composé, soit à un maintien du phénotype létal, soit, au contraire, à une restauration de la multiplication du microorganisme. Pour augmenter le niveau d'expression de la molécule cible dans la cellule de levure, il est avantageux d'utiliser en plus du promoteur inductible, le gène leu2d faiblement exprimé, qui augmente le nombre de plasmides par cellule de levure, sur milieu dépourvu de leucine. Les tests seront réalisés en milieu solide, comme décrit dans les exemples, mais également en milieu liquide, ce qui permet d'utiliser de plus faibles quantités de composés à tester. L'invention fournit ainsi les moyens pour disposer d'une nouvelle famille de produits anti-viraux, et notamment anti-rétroviraux permettant de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les composés isolés par mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus, ou en utilisant un système cellulaire tel que décrit plus haut qui ont permis d'établir des propriétés anti-virales chez ces derniers, font également partie de l'invention. D'une manière avantageuse, le procédé de l'invention permet de tester rapidement et aisément un très grand nombre de composés. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans la partie expérimentale qui suit dans laquelle le modèle cellulaire utilisé est la levure Saccharomyces cerevisiae transformée par des constructions plasmidiques exprimant le gène de l'intégrase de HIV-1. Dans une première partie appelée "Matériels et Méthodes", on indique I) les milieux de culture, 11) la nature des souches, III) leur transformation par des plasmides, IV) les méthodes d'obtention de 1'ADN plasmidique, V) la détermination des concentrations en cellules des suspensions de levure et VI) les conditions utilisées pour la culture des levures. Une deuxième partie (Exemples 1 à 3) concerne des expériences réalisées pour démontrer la corrélation entre l'effet létal observé et l'action de l'intégrase de HIV-1 sur l'ADN de levures et son application au criblage d'inhibiteurs de l'activité intégrase. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 6 qui représentent - les figures 1 et 2 les cartes de restriction, respectivement des plasmides pHIVlSF2IN et pBS24.1, - les figures 3A à 3C, des photos de tests en goutte, de levures illustrant l'effet de l'induction du promoteur ADH2/GAP régulant la transcription du gène de l'intégrase sur les levures, - la figure 4, une quantification du phénomène décrit dans la figure 3, - la figure 5, une photo de tests en gouttes illustrant l'effet d'intégrases sauvages ou mutées de HIV-1 sur des souches de levures rad 52 mutées dans la réparation de l'ADN, - la figure 6, une photo de tests en goutte illustrant l'effet induit par l'intégrase de HIV-1 sur des souches de levures haploïdes ou diploïdes dérivées, et - les figures 7A à 7C, une photo de tests en goutte illustrant l'effet de l'expression de l'intégrase sur la croissance de souches diploïdes transformées par des plasmides exprimant l'intégrase sauvage de HIV-1 ou des intégrases de HIV-1 modifiées par des mutations fauxsens. PARTIE EXPERIMENTALE ) MATERIEL ET METHODES I) MILIEUX DE CULTURE On indique tout d'abord les milieux complets, les milieux minimums et les milieux de sporulation utilisés pour la culture des levures, - milieux complets : yeast extract 1 %, bactopeptone Difco (2 %), glucose (2 %). Le milieu YPDA correspond au milieu YPD ci-dessus, mais est supplémenté en adénine (100 mg/l), - milieux synthétiques sélectifs : le milieu YNB contenant 0,67 % de nitrogen base (Difco), sans acide aminé ni base azotée, le milieu YCA contenant en plus 0,5 % d'extraits de caséine et le milieu YCAS du sorbitol 1M. Comme sources carbonées, on utilise du glucose 0,1 %, 2 % ou 5,6 % ; du lactate 2 % (v/v). Dans ce dernier cas, le milieu est ajusté à pH 5 par l'addition de pastilles de soude avant autoclavage. L'expression de l'intégrase sous le contrôle d'un promoteur inductible sensible à la répression glucose sera ainsi modulée en fonction des différentes sources carbonées dont la levure dispose dans son milieu de culture. On utilise le glucose à 0,1 % ou le lactate à 2 % pour déréprimer le promoteur de l'intégrase, et le glucose à 5,6 % pour le réprimer. On peut ajouter au milieu YNB tous les acides aminés ou bases azotées correspondants aux marqueurs d'auxotrophie des levures à la concentration de 20 à 30 mg par 1. Les milieux de culture solides sont obtenus en supplémentant le mélange décrit avec 2,5 % d'agar (Difco). La stérilité est réalisée par autoclavage, 30 minutes à 120 C. Pour la culture des bactéries, on utilise un milieu riche de Luria Bertani modifié (LB), composé de 1 % de tryptone, 0,5 % d'extraits de levure, 0,5 % de NaCl (pH 7,5), et supplémenté en ampicilline (100 ug/ml). 11) SOUCHES DE LEWRES ET SOUCHES BACTERIENNES a) souches de levure. Les souches utilisées sont rapportées dans le tableau 1 suivant Tableau 1 TYPE SOUCHES SEXUEL G E N O T Y P E ET DEGRE DE PLOIDIE AUXOTROPHIES MUTATIONS MUTATIONS DANS LES GENES DANS LES GENES DE REPARATION DES PROTEASES DE L'ADN ura3-52 ; prbl-1122 JSC 302 MAT a trpl pep4-3 n leu 2, prcl-407 ura3-1, trpl-1 W 303 1A MAT a leu2-3, 112 n ade2-1 his3-11, 15 ura3-1, trpl-1 W 303 1B MAT &alpha; leu2-3, 112 n ade2-1 his3-11, 15 ura3-1, rad 52: :TRP 1 W 839 5C MAT a leu2-3, 112 n ade2-1 his3-11, 15 ura3-1, trpl-1 AB2* leu2-3, 112 2 n ade2-1 his3-11, 15 * obtenue par le croisement de W 303 1-A et W 303 1-B I1 est fait référence à la souche JSC 302 décrite par Nevinsky et al dans Eur. J. Biochem. 207, 351-358, 1992, et aux souches W 303 1A et W 303 1B décrites par Bailis et al dans Molecular and Cellular Biology, p 4988-4993, Nov. 1992. Comme on peut le voir dans ce tableau, ces souches sont auxotrophes pour l'uracile (ura3-52) et la leucine (leu2). Les deux gènes correspondants, URA3 et LEU2, sont présents sur les vecteurs utilisés et servent à la sélection des souches transformées. Celles-ci seront alors cultivées sur milieu sans uracile et/ou sans leucine pour exercer une pression de sélection pour le maintien du vecteur dans les levures. Les autres mutations concernent : a) un gène de réparation de 1'ADN, à savoir le gène RAD 52, et b) des gènes de structure des trois principaux types de protéases présents chez les levures. a) Le gène RAD 52 est impliqué dans la réparation des cassures double brin de 1'ADN qui peuvent être provoquées par l'intégrase. Les souches mutées pour ce type de gènes seront notées rad 52. b) Les mutations concernant les protéases portent sur le gène PEP4 pour la protéinase A, le gène PRB1 pour la protéinase B et le gène PRC1 pour la carboxypeptidase Y. Les souches mutées correspondantes seront appelées souches protéases (-). La souche W 303 1A, qui ne possède aucune mutation dans les gènes des protéases, sera notée protéases (+). Les souches transformées par un plasmide seront désignées comme suit : tT] lorsqu'elles sont transformées par le plasmide témoin T, EIN], lorsqu'elles sont transformées par le plasmide IN dont il sera question ciaprès. La souche diploïde utilisée dans les différentes expériences rapportées ci-après a été obtenue à partir des souches haploïdes isogéniques selon les méthodes de micromanipulation classiques. b) souches bactériennes Les bactéries utilisées, sensibles à l'ampicilline, sont les DH5a. Les plasmides utilisés possédant le gène de résistance à l'ampicilline, les souches transformées seront cultivées sur milieu LB contenant cet antibiotique. III) TRANSFORMTION DES SOUCHES DE LEVURES ET DES SOUCHES BacTERIENNEs On utilise des plasmides navette pouvant se répliquer à la fois chez la levure et chez la bactérie. Ils possèdent en effet la séquence 2 p qui permet leur réplication autonome chez la levure sous forme multicopies et l'origine de réplication bactérienne de E, coli (ori). Ils comportent des gènes de sélection s'exprimant dans la levure, permettant la sélection des plasmides dans les cellules de levure. Les gènes choisis sont URA3 et LEU2 comme indiqué plus haut. Le gène LEU2 est faiblement exprimé et noté LEU2d. Une croissance normale des levures sur milieu sans leucine nécessitera alors une augmentation du nombre de copies du plasmide. Ainsi, URA3 permettra de réaliser une sélection des souches transformées contenant un nombre faible de copies du plasmide, tandis que LEU2d permettra de sélectionner les souches ayant un nombre élevé de copies du plasmide. Ces plasmides possèdent de plus le gène AMP qui s'exprime chez la bactérie E. coli, et qui permet leur sélection dans E. coli. Le plasmide pHIVlSF2IN (IN en abrégé), dont la carte de restriction est donnée sur la figure 1, contient le gène de l'intégrase de HIV-1. La synthèse de l'intégrase est sous la dépendance du promoteur ADH2/GAP qui a la particularité d'être soumis à la répression par le glucose. Le terminateur de transcription du facteur a servira de terminateur de transcription de la protéine. Le plasmide pBS24.1 (T en abrégé), qui est similaire au précédent, mais ne contient pas le gène de l'intégrase, est utilisé comme témoin. Sa carte de restriction est donnée sur la figure 2. Des plasmides ont également été construits pour la synthèse d'une intégrase comportant des mutations faux-sens résultant de la substitution d'un seul nucléotide, provoquant un changement unique d'acide aminé abolissant l'activité catalytique. Ces mutations ont été obtenues par la technique de PCR recombinant ou par clonage dans le vecteur pUc. Les plasmides dérivés du plasmide IN par introduction des différentes mutations ont été appelés pD116N, pD116A et pE152A. Dans pD116A et pD116N , les codons GAC codant pour un motif aspartate en position 116 de l'intégrase ont été remplacés respectivement par un codon GCC et AAC dont l'un code pour un motif alanine et l'autre pour un motif asparagine. Dans pE152A le codon GAA codant pour un motif glutamate en position 152 a été remplacé par un motif GCA codant pour une alanine. Les caractéristiques des gènes des intégrases mutées portées par le plasmide ont été vérifiées par séquençage. Les souches de levure ont été transformées par électroporation selon les techniques classiques. Les transformants ont été obtenus après quatre à six jours d'incubation. Les bactéries ont été transformées selon la technique de Hanahan, 1983, Studies on transformation of E. coli with plasmides, J. Mol. Biol., 557-580. IV) OBTENTION DE L' ADN PLASMIDIOUL La transformation de bactéries a été réalisée en opérant selon la technique de Hanahan mentionnée cidessus. La préparation des plasmides selon la méthode appelée boiling method a été décrite par Maniatis et al, 1989, dans Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New-York. V) ETUDE DU DEVELOPPEMENT DE La CULTURE On a recours à deux tests pour étudier l'effet de l'intégrase sur les cellules : 1) on utilise un test en goutte (des gouttes de 3 pl d'eau contenant 20000 cellules de levures sont déposées sur un milieu gélosé, séchées, puis incubées pendant 4 à 6 jours à 30"C). Un effet létal se traduit par une absence de multiplication des levures ; 2) Les cellules obtenues selon le test cidessus sont mises en suspension dans l'eau, traitées aux ultrasons pour obtenir des cellules isolées, diluées par un facteur connu, comptées au microscope, puis étalées sur milieu solide après une seconde dilution par un facteur connu. Le nombre de colonies obtenues après incubation des boîtes permet de déterminer le nombre de cellules vivantes dans la suspension originelle et donc le taux de létalité. B) ETUDE DE L'EFFET DE L' INTEGRaSE DE HIV-1 EXPRIKEE DANS La LEVURE ET APPLICATIONS. 1 - Etude de l'effet induit par l'intégrase de HIV-1 sur la levure nature de la molécule responsable de l'effet létal Les expériences rapportées sur les figures 3A à 3C ont été effectuées en milieu solide, en opérant comme suit. Des suspensions de souches protéases (-) JSC 302 et protéases (+) W 303 1A, transformées par le plasmide tIN] exprimant l'intégrase de HIV-1, ou le plasmide témoin (TJ n'exprimant pas l'intégrase, ont été testées par tests en gouttes su milieu minimum YNB permettant la dérépression du promoteur de l'intégrase (glucose 0,1 *), en conditions de nombre de copies du milieu YNB réprimant le promoteur de l'intêgrase (glucose 5,6 %) en condition de nombre faible de copies du plasmide par cellule (C). Toutes les gouttes contiennent environ 20000 cellules. Lorsque les gouttes sont sèches, les boîtes sont mises à incuber à 28"C ; les photos sont prises après 4 jours d'incubation. Ces photos sont données sur les figures A, B et C qui correspondent respectivement aux conditions énoncées ci-dessus. Sur ces photos, les gouttes correspondent aux souches suivantes : 1, 2, 3 : JSC 302 (T] ; 4, 5, 6 : JSC 302 tIN] ; 7, 8, 9 : W 303 1A LT), et 10, 11, 12: W 303 1A LIN]. Dans l'expérience A (glucose 0,1 %, nombre faible de copies de plasmides par cellule), on constate que l'expression de l'intégrase n'entraîne aucun effet détectable sur la souche protéases (+). Pour la souche protéases (-), un faible effet d'inhibition de croissance est observé lorsque l'intégrase est exprimée. Dans l'expérience B (glucose 0,1 %, nombre élevé de copies de plasmides par cellules), l'inhibition sous l'effet de l'intégrase est à peine détectable pour la souche protéases (+), mais en revanche, une inhibition complète est obtenue pour la souche protéases (-) exprimant l'intégrase, par rapport aux témoins 1, 2 et 3. Ces expériences mettent donc bien en évidence que les plasmides portant le gène de l'intégrase de HIV-1, dans des conditions permettant l'expression du gène, provoquent une inhibition de croissance des souches de levures. Des résultats similaires ont été obtenus par des expériences sur un autre milieu permettant aussi la dérépression du promoteur ADH2/GAP : le lactate (2 %). Dans l'expérience C (conditions où le promoteur est réprimé et nombre faible de copies du plasmide par cellules), on n'observe aucune inhibition de croissance des souches. Les expériences décrites dans les figures 3A à 3C permettent de conclure que 1) l'effet létal est déclenché par la dérépression du promoteur ADH2/GAP (comparaison des tests 4-5-6 fig. 3A et 4-5-6 fig. 3C). Ceci indique que l'intégrase est responsable de l'effet létal 2) l'inhibition de croissance observée étant plus accentuée lorsque les souches sont protéases (-), les résultats de la figure 3 confirment que cet effet est bien dû à une protéine (fig. 3B, tests 4-5-6 comparés à 10-11-12). L'inhibition de croissance observée peut donc bien être corrélée à l'expression de l'intégrase chez la levure. Quantification des tests en gouttes. Les levures obtenues par le test en goutte défini ci-dessus peuvent être mises en suspensions dans 1 ml d'eau distillée ; la mesure de la densité optique de la suspension obtenue indique le nombre de levures obtenues. La figure 4 donne les résultats d'une telle quantification. Les colonnes correspondent à JSC 302 ET] et 3 à JSC 302 [IN]. La colonne 2 montre, en outre, que, même en milieu glucose 5,6 %, on observe en condition de nombre de copies de plasmides par cellule élevé, une inhibition de croissance due à l'intégrase de HIV-1, ce qui met en évidence que la répression du promoteur ADH2/GAP n'est pas totale. 2 - Arguments montrant que 1'intégrase agit au niveau de 1'ADN - effet de mutations affectant la réparation de 1'ADN sur l'inhibition de croissance due à l'intégrase. On a testé par tests en gouttes des souches mutées ou non dans les gènes de réparation de 1'ADN. Pour cela, on a utilisé les souches de levure protéases (+) W 303 1A ou les souches W 839 5C qui en dérivent uniquement par disruption du gène rad 52. Les levures W 839 5C, aussi notées rad 52 sont déficientes pour la réparation des cassures double brin de 1'ADN. Les deux types de souches utilisées, transformées avec le plasmide exprimant l'intégrase sauvage [IN], ou le plasmide exprimant une intégrase mutée [D116N] ou [E152A], ou le plasmide témoin n'exprimant pas l'intégrase ET] ont été testées sur un milieu permettant une dérépression partielle du promoteur ADH2/GAP (glucose 5,6 %, nombre de copies du plasmide élevé par cellule). Les conditions sont celles de la figure 3. Les résultats sont donnés sur la photo de la figure 5. 1: W 839 5C ET] ; 2: W 839 5C [IN] ; 3: W 839 5C tD116N]; 4: W 839 5C tE152A]. 5: W 303 1A LT] ; 6: W 303 1A LIN] ; 7: W 303 1A [D116N]; 8: W 303 1A LEî52AJ. On retrouve le résultat rapporté plus haut indiquant que l'intégrase n'entraîne aucun effet sur les souches protéases (+) W 303 1A tIN] (figure 5, goutte 6). En revanche, l'expression de l'intégrase produit une forte létalité dans le cas de la souche disruptée au niveau du gène rad 52 (figure 5, goutte 2), et cet effet est totalement levé par les mutations fauxsens inactivant l'intégrase, décrites précédemment (figure 5, gouttes 3 et 4), à condition que la concentration d'intégrase ait été diminuée par répression partielle du promoteur ADH2/GAP. Les tests de viabilité sur W 839 5C LT] et W 839 5C LIN] montrent que 12 % de cellules contenant le plasmide survivent (la mutation rad 52 entraînant par elle-même une létalité) dans le cas de la souche portant le plasmide témoin, mais seulement 0,14 % lorsque la souche exprime le gène de l'intégrase. Ce résultat confirme que l'inhibition de croissance des levures due à l'intégrase telle qu'on la détecte par test en goutte (par exemple fig. 5 test 2 comparé au test 1) s'explique bien par un effet létal sur les cellules. L'augmentation de la létalité due à l'intégrase de HIV-1, lors de l'utilisation de la souche rad 52, et le fait que les mutations faux-sens suppriment l'effet létal, permettent d'établir que l'effet obtenu résulte de l'action de l'enzyme sur 1'ADN des levures. - Comparaison de l'effet induit par l'intégrase de HIV-1 sur les souches haploïdes et diploïdes de levures. Les souches haploïdes W 303 1A (Mat a) et W 303 1B (Mat a), et les souches diploïdes dérivées AB2, transformées chacune par le plasmide exprimant l'intégrase de HIV-1 [IN], ou le plasmide témoin (T) n'exprimant pas l'intégrase, ont été testées par test en gouttes sur un milieu réprimant partiellement le promoteur ADH2/GAP (glucose 5,6 %, nombre élevé de copies du plasmide par cellule). Les tests ont été réalisés comme pour la figure 3. Les photos obtenues sont données sur la figure 6 où les gouttes correspondent aux sources suivantes 1, 2, 7, 8: W 303 1A (T]; 13, 14, 19, 20 : W 303 1A tIN]; 3, 4, 9, 10: AB2 (T]; 15, 16, 21, 22:AB2 (IN]; 5, 6, 11, 12: W 303 1B (T] et 17, 18, 23, 24: W 303 1B (IN] Les résultats obtenus montrent que l'intégrase n'a aucun effet sur les souches haploïdes protéases (+) de signe sexuel a ou a, mais exerce au contraire une très forte létalité sur les souches diploïdes correspondantes. Les souches diploïdes, dans lesquelles le génome se trouve en deux exemplaires et dont on aurait pu s'attendre à une sensibilité moindre des cellules vis-àvis de l'intégrase, apparaissent donc constituer en fait un modèle intéressant pour mettre en évidence un effet de l'intégrase. - effet de mutations faux sens dans la séquence codante de l'intégrase sur la croissance de souches diploïdes. Cette expérience montre que les résultats obtenus avec la souche rad 52 sont aussi valables pour la souche diploïde AB2. L'étude de cet effet permet de vérifier que l'absence de croissance de la levure observée dans les expériences rapportées ci-dessus résulte de l'activité intégrase (conditionnant l'activité virale). En effet cette létalité ne peut être qu'abolie lorsqu'on utilise les plasmides portant les mutations faux-sens, si elle est liée à l'activité intégrase de l'enzyme. En revanche, si cette inhibition est due à un mécanisme indépendant, les mutations introduites n'auront pas d'effet sur celle-ci. Comme pour l'expérience correspondant à la figure 5, la source de carbone utilisée est le glucose 5,6 % qui, du fait de l'existence de fuites, ne réprime pas totalement le gène de l'intégrase, et le milieu ne contient ni uracile ni leucine, ce qui conduit à un nombre élevé de copies du plasmide par cellules. On rapporte sur les photos des figures 7A à 7D les expériences réalisées sur les souches diploïdes AB2 en utilisant le test en goutte, où - 2 et 8 correspondent à des souches AB2 transformées par des plasmides IN, exprimant l'intégrase sauvage, - 1 et 7, par les plasmides T correspondants, ne contenant pas le gène de l'intégrase, - 3 et 9, à des souches [D116N], c'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle l'asparte, en position 116 est remplacé par le motif asparagine, - 4 et 10, à une souche [D116N] dans laquelle la mutation a été réalisée par la méthode de PCR recombinante (comme pour 5 et 6) - 5 et 11 à une souche (Dîî6A], e'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle l'asparte en position 116 est remplacé par le motif alanine, et - 6 et 12, à une souche tE152A], c'est-à-dire exprimant une intégrase dans laquelle le motif glutamate en position 152 est remplacé par un motif alanine. Les photos (A) représentent les résultats obtenus au bout de 1 jour d'incubation, (B) de deux jours, (C) de trois jours, et (D) de quatre jours. L'examen de ces figures montre clairement que les mutations apportées à l'intégrase suppriment totalement l'effet de cette dernière. L'évolution des levures en fonction de la durée d'incubation montre que les levures exprimant les intégrases mutées (tests 3, 4, 5, 6 et 9, 10, 11, 12) se comportent comme celles n'exprimant pas l'intégrase (tests 1 et 7), toutes ces souches évoluant de la même façon). 3 : Criblage de composés a l'aide d'un urodèle de levure selon l'invention. Les composés testés répondent aux deux conditions déjà énoncées : ils sont capables de pénétrer dans la levure et n'inhibent pas la multiplication propre de la levure d'une manière rendant le test inutilisable. On utilise par exemple la souche diploïde AB2. La culture est réalisée soit sur boîte dans un milieu solide dépourvu de leucine et d'uracile, et contenant du glucose 5,6 % comme source de carbone, soit en milieu liquide, dans le même milieu sans agar. Si l'expérience est réalisée en milieu solide, après 3 ou 4 jours d'incubation, on photographie les boites et on vérifie en opérant selon la partie V de matériel et méthodes" le développement ou l'arrêt de croissance de la culture des levures exprimant le gène de l'intégrase, selon les propriétés anti-intégrase ou non du composé testé. Si l'expérience est réalisée en milieu liquide, l'activité intégrase provoque un arrêt de croissance décelable par mesure de la densité optique à 600 nm. REVENDICATIONS 1/ Procédé pour le criblage de composés antiviraux, caractérisé en ce qu'il est réalisé in vive et comprend - l'utilisation d'un microorganisme en culture, génétiquement modifié par l'introduction d'une séquence d 'ADN, capable de se répliquer dans le microorganisme et d'exprimer une activité pathogène d'une molécule cible d'origine virale provoquant l'apparition d'un caractère phénotypique qui peut être détecté, - l'addition à la culture de microorganisme d'un composé à tester, ce composé étant capable de pénétrer dans les cellules du microorganisme, et n'interférant pas avec sa multiplication naturelle d'une manière qui rende le test inutilisable, la culture étant réalisée dans des conditions permettant, au moment de l'addition dudit composé, une expression de la molécule cible conduisant à l'apparition dudit caractère phénotypique, - l'examen de la culture, pour vérifier si le caractère phénotypique est modifié, voire supprimé ou, au contraire, est maintenu, afin de déterminer si le composé testé est, respectivement, un inhibiteur de l'activité virale pathogène, ou s'il n'a pas d'effet sur cette activité, 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est portée par un vecteur d'expression, comportant une origine de réplication fonctionnant dans le microorganisme, ce vecteur étant un plasmide ou, en variante, la séquence d 'ADN est intégrée dans un chromosome du microorganisme hôte avec, par exemple dans le cas de bactéries, un phage tempéré. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d 'ADN exprime une molécule cible dont l'activité pathogène se traduit par un effet létal vis-à-vis du microorganisme et se trouve sous le contrôle d'un promoteur inductible. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d 'ADN code pour au moins la partie active d'enzymes nécessaires à la multiplication de rétrovirus, par exemple du type des lentivirus tel que HIV ou des oncornavirus tels que HTLV. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour l'intégrase. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le microorganisme est un champignon, notamment une levure, ou une bactérie. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise une levure en culture, génétiquement modifiée par mutation rad 52, et/ou protéases (-), et/ou diploîdisation. 8/ Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on utilise une levure en culture, génétiquement modifiée par l'introduction d'une séquence d'ADN capable de coder pour l'intégrase de HIV exprimant un effet létal vis-à-vis des cellules de levure. 9/ Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la levure est une souche de S. cerevisiae. 10/ Utilisation pour le criblage de composés anti-viraux d'un système cellulaire dans lequel a été introduit un gène exprimant, dans le système cellulaire, un ARN ou une protéine d'un virus, notamment d'un rétrovirus, constituant une molécule cible, produisant une activité pathogène, capable de provoquer l'apparition d'un caractère phénotypique pouvant être détecté, l'activité de la molécule cible produisant le caractère phénotypique étant étroitement liée à celle produite chez un hôte infecté et nécessaire au déroulement du cycle viral. 11/ Composés isolés par mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon l'une des revendications 1 à 9, ou par utilisation d'un système cellulaire selon la revendication 10.