FR 2738016 A1 19970228 FR 9509959 A 19950821 PROCEDE D'INTEGRATION STABLE DE GENES DANS LA LEVURE La présente invention est relative à une amélioration des procédés permettant la transformation de l'acide malique en acide lactique par l'enzyme malolactique dans des conditions de type industriel, ce qui signifie notamment que la stabilité du gène de l'enzyme et son expression ne peuvent être assurées par la présence de milieux de sélection, et que de grands volumes sont mis en jeu. En vinification, la fermentation alcoolique par les levures est suivie d'une étape appelée fermentation malolactique. réalisée par les bactéries lactiques. Elle est essentielle à l'amélioration des qualités organoleptiques du vin, ainsi qu'à sa stabilisation microbiologique, dans la mesure où le malate peut être utilisé comme un substrat de croissance d'autres bactéries. Un vin qui contient encore de l'acide malique ne peut, dans de nombreux cas, recevoir la labellisation prévue (AOC, etc...). Pour ces principales raisons, et d'autres encore, évoquées par les producteurs de vin de base pour les eaux de vie ou les mousseux, la fermentation malolactique est indispensable. Dans les brevets FR2705687 et FR2705362, les auteurs ont identifié, cloné et exprimé l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis. ci-après dénommée mleS. L'expression en avait été réalisée dans Saccharomvces cerevisiae grâce au clonage dans un ou plusieurs vecteurs multicopies chez la levure (1). Le problème de ce type de construction est que la stabilité du gène mleS et de son expression ne sont assurées que par la pression de sélection exercée pour maintenir le plasmide. Aussi, ce procédé n'est pas applicable en milieu non sélectif, dans les conditions de fermentation d'un moût de raisin par exemple et de production de ferments industriels. L'application industrielle du clonage dans la levure du gène mleS doit donc nécessairement passer par l'obtention de souches de levure ayant intégré dans leur génome le gène de telle façon que sa structure et son expression restent stables quelles que soient les conditions de culture ou de croissance de la levure qui le contient. La présente invention est relative à un procédé assurant l'intégration stable dans un génome de levure d'un ou plusieurs gènes hétérologues mettant en oeuvre d'une part la transformation de ladite levure par un plasmide porteur du ou des gènes hétérologues sous la dépendance de promoteurs et de terminateurs appropriés, et d'un gène marqueur dominant de sélection, ce dernier ayant en son sein les sites d'intégration au génome de la levure par recombinaison homologue. Le gène dominant de sélection a pour fonction de sélectionner les cellules ayant intégré le plasmide recombinant dans leur génome; il n'a aucune fonction de maintien d'une pression de sélection sur des cellules dont le génome contient le plasmide à l'état intégré. Le principe de la recombinaison homologue est d'intégrer un gène donné dans son homologue génomique. La séquence cible où devra se faire l'intégration de la séquence que l'on souhaite introduire est clonée et coupée en deux. Chaque moitié est ligaturée aux extrémités de la séquence à introduire. Le recombinant est alors transféré dans des cellules que l'on souhaite modifier. Les extrémités de l'ADN introduit étant exactement homologues à la séquence cible, une recombinaison va se produire avec l'ADN génomique, ce qui se traduira par son intégration au point exact où on le souhaitait. Expérimentalement, il a été montré que la recombinaison est beaucoup plus rapide si l'ADN injecté est linéaire, les extrémités libres favorisant vraisemblablement le phénomène de recombinaison. Une synthèse de cette technique de recombinaison homologue pour cibler un ADN à intégrer dans un génome a été faite dans (2). Dans le procédé selon l'invention, le gène de sélection et d'intégration est un gène codant pour la C14 lanostérol déméthylase (gène P450j4). Les extrémités recombigénes dans ce gène sont générées par une coupure unique des plasmides intégratifs dans une forme mutée du gène P45014DM : cette forme mutée, le gène P450,4DMFLZR (3) constitue un marqueur dominant pour la sélection des levures transformées ; en effet, le gène P450r40MFLZR confère la résistance à des inhibiteurs de la biosynthèse de l'ergostérol comme le fluzilazole. Les transformants sont donc sélectionnés sur milieux complets additionnés de fluzilazole. Le gène P450140MFLZR s'intègre grâce à ses extrémités recombinogènes, dans le gène correspondant de la levure. Un plasmide porteur à la fois du gène P45014DM et du gène mleS peut de cette façon être intégré dans le gène de la levure conduisant à l'expression stable du transgène. Le plasmide recombinant comprenant au moins un gène hétérologue sous la dépendance de promoteurs et de terminateurs appropriés, ainsi que le gène marqueur dominant de sélection ayant les sites d'intégration dans le génome de la levure par recombinaison homologue fait également partie de l'invention. De façon préférée, le gène marqueur dominant est le gène P450,4D,^FLZR, correspondant au gène P45014D, muté de telle façon à lui conférer une résistance au flusilazole. Dans les constructions de l'invention, le nombre de copies de chaque gène hétérologue qui peuvent être intégrés dans le plasmide peut être variable et contrôlé; par exemple, si on cherche à intégrer le gène mleS de l'enzyme malolactique, on peut intégrer dans le plasmide de l'invention une ou plusieurs copies de ce gène. Le gène mleS seul ne permet néanmoins que d'assurer une dégradation partielle du L-malate du milieu en L-lactate. Afin d'optimiser la consommation de l'acide lactique, le gène de la malate perméase de Schizosaccharomvces Dombe, codant pour une perméase au malate, peut être intégré dans le plasmide de l'invention avec l'objectif également de l'intégrer de façon stable dans le génome de la levure. La double intégration et expression des gènes mleS et maze1 est un perfectionnement essentiel à l'utilisation industrielle des levures exprimant l'enzyme malolactique car elles assurent un système malolactique qui permet de dégrader la totalité de l'acide malique d'un jus de fruit ou d'un milieu qui le contient. La structure du gène maze1 a été déterminée par l'équipe de Van Vuuren et al. et publiée dans Yeast (4). La séquence de l'ADN et la séquence de protéines correspondante sont représentées dans la figure 1. Une telle séquence peut être obtenue soit par des voies biologiques notamment par amplification enzymatique d'un ADN matrice de levure, soit par voie de synthèse chimique, par exemple par la méthode de Merrifield (5). Le procédé de l'invention qui permet d'assurer l'intégration stable dans le génome de la levure de gènes hétérologues est particulièrement intéressant quand le ou les gènes hétérologues ou les ADN sont ceux codant pour l'enzyme malolactique et pour la malate perméase. Le nombre de copies de chacun des deux gènes hétérologues peut être modulé en fonction du taux d'expression que l'on souhaite pour chacun et, plus particulièrement, pour contrôler le taux d'acidité résiduel du milieu dans lequel les levures auront été ensemencées. Une des caractéristiques essentielles de l'invention est l'expression des protéines présentant les fonctions requises. Tout plasmide comprenant une séquence ou un fragment de séquence exprimant la même fonction fait également partie de l'invention. Quand les fonctions sont celles de l'enzyme malolactique, ou celles de la malate perméase, tout plasmide portant un fragment de l'une ou l'autre enzyme, issu de la même souche ou d'une souche différente et présentant les activités enzymatiques requises fait partie également de l'invention. Les plasmides recombinants qui intègrent soit le gène de l'enzyme malolactique issue de L. lactis et le gène marqueur permettant l'intégration dans le génome par recombinaison homologue, notamment le gène P45014Dl,Z, portant une mutation conférant à l'hôte une résistance au flusilazole font également partie de l'invention, comme tout plasmide de ce type contenant en outre une ou plusieurs copies du gène codant pour la malate perméase de S. Dombe. Les plasmides utilisables pour permettre une intégration stable par recombinaison homologue dans le génome de la levure peuvent être constitués de tout plasmide ou vecteur susceptible de transférer ce type de cellule que ces vecteurs soient viraux, rétroviraux ou autres, à partir du moment où ils portent un gène homologue à un gène de l'hôte et porteurs d'extrémités recombigènes. Les cellules hôtes qui ont intégré dans leur génome un plasmide de l'invention qui contient une ou plusieurs copies du gène de l'enzyme malolactique, le cas échéant, une ou plusieurs copies du gène codant pour la malate perméase et impérativement un gène marqueur dominant de sélection permettant la recombinaison homologue, et notamment un allèle mutant du gène P45014DM lui conférant une résistance au flusilazole, font également partie de l'invention. De façon préférée dans l'invention, une cellule hôte ayant intégré de façon stable les plasmides recombinants est une levure oenologique transformée par recombinaison homologue par au moins un gène mleS et au moins un gène mael, ces gènes étant intégrés au niveau du gène P45014DS de ladite levure. De cette façon, I'expression de l'enzyme malate perméase permet l'entrée dans la cellule du L. malate et sa transformation par l'enzyme malolactique en L. lactate, de telle façon que la totalité ou une quantité contrôlée de l'acide malique du milieu dans lequel se développe ladite levure soit dégradée. La présente invention est relative également à l'utilisation d'une cellule hôte transformée de façon stable par un plasmide tel que décrit ci L'acide L. malique, en acide L. lactique, et notamment dans un processus de fermentation de jus de fruits ou de légumes. Un processus de fermentation particulièrement représentatif est la vinification, et les cellules utilisées dans ce cas là sont des souches de levure oenologiques de Saccharomvces cerevisiae. II apparaît clairement qu'aucune pression de sélection n'est nécessaire pour conserver la stabilité de la structure et de l'expression de l'un ou l'autre gène à partir du moment où il est intégré dans le génome de ladite levure. Les exemples, ainsi que les figures jointes, permettent à titre d'illustration de montrer un mode de réalisation de l'invention. II ne constitue en aucun cas une limitation ni à la nature des gènes utilisés et leur nombre de copies. Les légendes des figures sont les suivantes: - la figure 1 représente la séquence de l'ADN et de la protéine de la malate perméase de Schizosaccharomvces tombe telle que déterminée par Van Vuuren et al.; - la figure 2 représente la construction du plasmide pYMALO1 porteur du gène mIeS de L. lacis et le gène P450140MFLZR muté et ayant en son sein le site de restriction Nicol. - la figure 3 représente la construction des plasmides pYMALO2 porteur des gènes mae et mleS, ainsi que le gène porteur de la résistance au flusilazole (P450l4DMFLZR). DESCRIPTION DES CONSTRUCTIONS ET EXEMPLES: 1) Construction des vecteurs intégratifs: 1.1) Plasmide intégratif contenant le gène mleS et le marqueur: Une molécule d'ADN a été construite pour introduire les deux gènes, mleS et marqueur, et cibler leur intégration (figure 2). Pour cela, le fragment d'ADN contenant le gène P45014DMFLZR a été isolé par électroélution à partir d'une digestion Hindlll/EcoRI du plasmide pFD386 le contenant (Doignon, 1992). Ce fragment de 3 kpb a ensuite été cloné dans le vecteur pBlueScriptSK+ de E. coli conduisant au plasmide pSKP450. D'autre part, le gène mleS a été isolé du plasmide pMDMALO (Denayrolles, 1994) coupé par Ndel sous le forme d'un fragment d'ADN de 4,1 kpb. Ce gène reste sous la dépendance des séquences d'ADN spécifiques de l'expression des gènes dans la levure S. cerevisiae (promoteur et terminateur de la phospho glycérate kinase). Ce fragment d'ADN a alors été cloné dans le plasmide pSKP450 à la suite du gène P45014DMFLZR Ce clonage a permis d'isoler une molécule d'ADN contenant les deux gènes d'intérêt en continuité, pYMALO1. Afin de cibler l'intégration de la construction dans le génome des levures, le plasmide est linéarisé dans le gène P45014D,,FLZR par une coupure enzymatique unique, Ncol, générant des extrémités dites recombinogènes (figure 2). 1.2) Plasmide intégratif contenant les gènes mleS, maze1 et le marqueur: Une molécule d'ADN a été construite pour introduire les deux gènes, mleS et mael et le marqueur, et cibler leur intégration (figure 3). Un fragment d'ADN de 1360 pb contenant le gène mael a été amplifié par une réaction de PCR à l'aide des oligonucléotides suivants: Omael, 5'CCCCUTAGATCTCGATTCGAC3': Omae2, 5'GGAAGAATTCAAGCTTAMC GC3'. Les oligonucléotides choisis permettent d'introduire un site Bglll en 5' du gène et un site EcoRI en 3', et ainsi de cloner le fragment amplifié dans le pTG887 (Transgene S.A.). Le gène maze1 ainsi cloné (construction pMDMAE) est sous la dépendance du promoteur fort de la PGK et de son terminateur. Une digestion Ndel du plasmide pMDMAE permet d'isoler le gène maeî avec le promoteur et le terminateur de la pGK sous la forme d'un fragment d'ADN de 3,4 kpb. Ce fragment d'ADN a alors été cloné dans le plasmide pYMALO1 coupé par Sall et réparé par l'enzyme de Klenow. Le plasmide obtenu, pYMALO2, contient donc le marqueur P45014DMFLZR, le gène mleS et le gène mae1 sous la dépendance d'éléments spécifiques de l'expression des gènes chez S. cerevisiae. Afin de cibler l'intégration de la construction dans le génome des levures, le plasmide est linéarisé dans le gène P45014DMFLZR par une coupure enzymatique unique, Hpal, générant des extrémités dites recombinogènes (figure 3). 2) Transformation des levures par le pYMALOl La transformation de la souche FL(2n) (Denayrolles et al., 1994) a été réalisée selon la méthode chimique de Giezt et al (1992, 1995) utilisant l'acétate de lithium combiné au PEG et à de l'ADN simple brin. Les cellules transformées ont été incubées une heure dans du milieu complet à 30"C avant d'être étalées sur milieu sélectif. Douze clones obtenus sur milieu complet à 7 pg/ml de fluzilazole ont été repiqués et testés par PCR pour la présence ou non du gène mleS. Une amplification a été obtenue pour 11 clones sur les 12 testés. 3) Vérification de la présence du plasmide pYMALO1 intégré par Southem blot: Parmi les 11 clones répondant positivement à l'amplification dans le gène mleS, 4 ont été analysés par Southem blot en comparaison avec la souche non transformée. L'ADN de ces 4 clones et de FL(2n) a été extrait, digéré par l'enzyme de restriction Clal. Après électrophorèse horizontale en gel d'agarose 0,8 % (w/v) et transfert sur membrane de nylon, I'hybridation a été réalisée avec le plasmide intégratif comme sonde marquée à la digoxigénine (Boehringer Mannheim). On peut constater que seuls les 4 clones positifs en PCR montrent un profil d'hybridation correspondant à l'intégration du plasmide pYMALO1. 4) Tests de production de L-lactate: L'activité malolactique des clones 1, 2, 4 et de FL(2n) a été évaluée par la capacité des levures à produire du L-lactate en milieu synthétique glucose contenant 3 g/l de L-malate, à pH 3. Après 5 jours de culture en semi-anaérobiose (tubes bouchés non agités), à 25"C, le L-lactate du milieu est dosé par voie biochimique (kit de dosage Boehringer-Mannheim): Cultures L-lactate en g/l clone 1 0,398 clone 2 0,418 clone 4 0,388 FL(2n) 0,023 non ensemencé 0,053 Seuls les clones contenant le plasmide pYMALO1 intégré produisent du L-lactate. Notre construction et son intégration dans le génome de la levure se trouvent donc validées in vivo. 5) Transformation des levures par le pYMAL02: L'intégration dans le génome de la levure du gène mleS codant pour l'enzyme malolactique a donc été possible. Le système moléculaire adopté permet de cibler l'intégration dans le gène P45014dm dont la forme mutée, R P45014FLZR, apportée par la construction pYMALO1, assure la sélection des clones transformés. Ce système d'intégrationlsélection peut donc s'appliquer à toutes les levures S. cerevisiae sensibles au FL. II peut permettre l'intégration de tout autre gène. Les levures transformées par pYMALO1 et pYMALO2 ont des champs d'application différents. Dans le premier cas, elles permettent d'assurer une désacidification partielle du vin, en ajoutant à l'activité malique intrinsèque des levures une activité malolactique. Dans le deuxième cas, elles dégradent en totalité l'acide malique grâce à l'ajout de la perméase qui élimine l'obstacle du transport du malate dans la cellule. BIBLIOGRAPHIE 1. Denayrolles M., Aigle M., Lonvaud-Funel A. (1994). Cloning and sequence analysis of the gene encoding L. lactis malolactic enzyme: Relationships with malic enzymes. FEMS Microbiology Lette 116:79 86. 2. Orr-Weaver T.L., Szostak J.W., Rothstein R.J. (1983). Genetic Applications of Yeast Transformation with linear and gapped plasmids. Methods in Enzymology, 101:228-244. 3. Doignon F., Aigle M., Ribéreau-Gayon P. (1993). Resistance to imidazoles and triazols in Saccharomyces cerevisiae as a new dominant marker. Plasmid, 30:224-233. 4. Van Vuuren et al. (1995). Yeast (sous presse). 5. Merrifield B. (1986). Solid Phase Synthesis. Science 232:341-347. REVENDICATIONS 1. Procédé assurant l'intégration stable dans un génome de levure d'un ou plusieurs gènes hétérologues, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre: a) la transformation de ladite levure par un plasmide porteur: - du ou des gènes hétérologues sous la dépendance d'un promoteur et d'un terminateur, - d'un gène marqueur dominant de sélection et ayant les sites d'intégration au génome de levure par recombinaison homologue; b) la sélection des souches ayant intégré ledit plasmide dans un génome. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène marqueur en b) est le gène P45014DM, codant pour la C14 lanostérol diméthylase, portant une mutation lui conférant une résistance au flusilazole. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la sélection est une sélection par la résistance à des inhibiteurs de la biosynthèse de l'ergostérol et le flusilazole. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le plasmide porte au moins une copie d'un gène codant pour l'enzyme malolactique, ou tout ou partie de ce gène codant pour la fonction enzymatique de cette enzyme. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le plasmide porte au moins un gène mIeS codant pour l'enzyme malolactique et au moins une copie d'un gène maeî codant pour une malate perméase ou un fragment de ceuxei. 6. Plasmide recombinant caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un gène hétérologue, sous la dépendance d'un promoteur et d'un terminateur, - un gène marqueur dominant de sélection et ayant des sites d'intégration dans le génome d'une levure par recombinaison homologue. 7. Plasmide recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène hétérologue est le gène mleS issu de L. lactis codant pour l'enzyme malolactique, ou un fragment de celuici. 8. Plasmide recombinant selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il contient au moins une copie d'un deuxième gène hétérologue qui est le gène maeî codant pour la malate perméase de S. Dombe, ou un fragment de celuici. 9. Plasmide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène P45014DM codant pour la C14 lanostérol diméthylase, et portant une mutation conférant la résistance au flusilazole. 10. Cellule hôte ayant intégré de façon stable dans son génome un plasmide selon l'une quelconque des revendications 6 à 9. 11. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de S. cerevisiae. 12. Cellule hôte selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de dégrader la totalité de l'acide malique du milieu dans lequel se développe ladite cellule. 13. Utilisation d'une cellule hôte selon l'une des revendications 10 à 12, dans un procédé de désacidification de produits alimentaires contenant de l'acide L. malique, notamment dans un processus de fermentation de jus de fruit ou de légume. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que la cellule est une levure capable d'assurer une fermentation alcoolique dans un processus de vinification.