FR 2734579 A1 19961129 FR 9506028 A 19950522 PROCEDE D'EVALUATION DE LA TOXICITE DES FUMEES ET APPAREILLAGE UTILISABLE POUR LA MISE EN OEWRE D'UN TEL PROCEDE L'invention concerne un procédé d'évaluation de la toxicité des fumées ou d'autres effluents gazeux analogues. Pour la suite de l'exposé on entend par milieu gazeux (notamment un effluent gazeux) soit des gaz seuls soit un mélange de gaz et d'aérosols solides et ou liquides. L'invention trouve une application première dans l'évaluation de la toxicité des fumées d'incinération de déchets. Ces dernières apparaissent comme un mélange de gaz et d'aérosols liquides et/ou solides y compris avec de fines particules solides. Elles présentent le plus souvent une forte teneur en d'eau et sont en général rejetées à l'atmosphère à température élevée. Pour répondre aux exigences d'une réglementation stricte les installations d'incinération de déchets sont équipées de dispositifs d'épuration conçus pour éliminer ou réduire de façon significative la quantité des poussières et agents polluants considérés comme particulièrement agressifs voire toxiques, par exemple: monoxyde de carbone, oxydes de soufre, chlorure et fluorure d'hydrogène, composés organiques volatils, composés métalliques. Des appareils de contrôles physico-chimiques sont placés en aval des dispositifs d'épuration pour surveiller les émissions et rejets vers l'atmosphère et pour permettre une régulation optimale de la combustion et des dispositifs d'épuration des fumées. En particulier certains produits connus pour les effets nocifs sur la santé ou sur l'environnement sont systématiquement mesurés.De plus, la réglementation impose aux méthodes d'analyse de la composition des fumées d'être plus en plus performantes tant du point de vue qualitatif (augmentation de la largeur du spectre des composés détectés et analysés) que du point de vue quantitatif (abaissements des seuils de détection). L'analyse chimique présente toutefois des limites, d'une part dans le choix des substances à contrôler (ce qui pose le problème de la non détection de certains polluants eu égard à la grande diversité de la composition des fumées d'incinération de déchets), d'autre part dans l'absence d'informations globales sur les effets nocifs du mélange contrôlé, notamment sur l'impact réel des phénomènes d'interaction (synergie, antagonisme ou simple addition) entre les substances détectées constitutives du mélange. On connaît les travaux menés par C. VOISIN et ses collaborateurs sur la culture cellulaire en phase gazeuse (aérobiose) en général (voir l'article intitulé "La culture cellulaire en phase gazeuse" de C. VOISIN et Coll., Bulletin Européen de Physiopathologie Respiratoire 1977, 1l, pages 69 à 82) et sur le comportement qualitatif et quantitatif des cellules cultivées en aérobiose (en particulier des macrophages alvéolaires) vis-à-vis du milieu gazeux auquel elles sont exposées (voir l'article intitulé "Intérêt de la culture cellulaire en aérobiose pour l'évaluation de la cytotoxicité globale de l'atmosphère" de C. VOISIN et Coll. 1985 - Clean Air Congress - Sydney, Proceedings, 5, pages 30 à 37). Dans ces travaux, sont notamment étudiés d'une façon générale les effets sur des populations de cellules cultivées en aérobiose de leur contact avec le milieu gazeux environnant, en particulier les effets des très faibles concentrations en polluants atmosphériques. L'invention a pour but un procédé industriel d'évaluation de la toxicité globale des fumées, mélanges gazeux a priori agressifs et de compositions variables et indifférenciées, notamment des fumées d'incinération de déchets ou d'effluents gazeux analogues, susceptible d'être utilisé de façon indépendante ou en complément des mesures ou analyses physico-chimiques présentées ci-avant. L'invention propose un procédé d'évaluation de la toxicité des fumées ou d'effluents gazeux analogues caractérisé en ce qu'il comporte les opérations suivantes: - réalisation à partir d'une même suspension cellulaire de cellules de type macrophagique issue d'une lignée cellulaire, d'au moins une culture cellulaire en aérobiose, ci-après désignée culture-essai, et d'au moins une autre culture cellulaire en aérobiose, ci après désignée culture-témoin, - prélèvement et transport du milieu gazeux à évaluer vers la culture-essai avec préconditionnement d'adaptation dudit milieu gazeux prélevé pour le rendre compatible avec une exposition à une culture cellulaire en aérobiose, - exposition pendant un temps prédéterminé dans les mêmes conditions expérimentales des cellules de la culture-essai à un flux du milieu gazeux prélevé et des cellules de la culture-témoin à un flux d'air témoin non toxique, - mesure d'un paramètre représentatif du nombre de cellules vivantes dans chaque culture après exposition et établissement d'un indice de toxicité relative du milieu gazeux prélevé par rapport à 1 'air-témoin. Ainsi donc, le procédé selon l'invention est basé sur la mesure des effets produits par tous les constituants du milieu gazeux polluant (sans pour autant reconnaître ces constituants) sur une cible biologique représentée par une culture cellulaire en phase gazeuse (aérobiose). A ce stade, il est intéressant de remarquer que le procédé selon l'invention est particulièrement orienté sur l'évaluation et la mesure de la toxicité d'un milieu gazeux particulier a priori toxique, milieu dont on recherche à suivre les évolutions, par rapport à un milieu gazeux de référence Avantageusement, le procédé selon l'invention comporte une phase de préconditionnement d'adaptation du milieu gazeux après prélèvement. Cette adaptation pourra prendre des formes diverses, notamment mise en température, séchage, dilution. Cette phase de préconditionnement pourra être également adaptée pour réduire les pertes en agents polluants collectés lors du prélèvement pendant le transport du milieu gazeux prélevé vers le site d'exposition aux cultures-essais. Cette phase de préconditionnement est d'autant plus délicate que les fumées de l'incinération de déchets qui sont prélevées sont plus humides (jusqu'à 50% en volume) et plus hautes en température ( > 2000C). Selon une première variante du procédé selon l'invention, les cellules de type macrophagique sont choisies parmi des lignées cellulaires monocytaires susceptibles de culture cellulaire en aérobiose, présentant une morphologie, un équipemement biochimique de défense (réponse immunitaire) et un comportement visà-vis des polluants susceptibles d'être rencontrés dans le milieu gazeux prélevé comparables à ceux des macrophages alvéolaires, par exemple même aptitude à la survie en aérobiose, même comportement phagocytaire et/ou défense immunitaire. L'utilisation d'une lignée cellulaire (dont le propre est d'être constituée de cellules susceptibles de multiplication en culture) présente le double avantage de faciliter grandement la technique expérimentale (en s'affranchissant des techniques de prélèvement in vivo dans les voies pulmonaires de cobayes, ce qui est nécessaire pour les macrophages alvéolaires incapables de multiplication et de développement in vitro) et d'apporter une référence biologique pour les cellules cibles constante, stable et reproductible. Avantageusement, on utilise de préférence les lignées THP-1 et U-937 présentant un comportement face aux agressions aux polluants comparable à celui des macrophages alvéolaires. Toutefois d'autres lignées sélectionnées selon les critères ci-dessus, par exemple la lignée P388-D1, sont également susceptibles d'être utilisées. Selon un autre aspect de la première variante du procédé selon l'invention, l'opération de préconditionnement du milieu gazeux prélevé comporte un traitement destiné à éviter la condensation d'eau dans le milieu gazeux prélevé pendant le transport vers la culture-essai. Cette caractéristique technique a pour but d'éviter la formation et la présence de condensats dans les conduites de transport du milieu gazeux prélevé, condensats susceptibles de concentrer des agents polluants, par exemple les halogénures d'hydrogène, et de ce fait de mettre en cause la fiabilité du caractère global du test biologique (par suite de ces pertes pendant le transport). Avantageusement le traitement contre la condensation comporte au moins une des opérations choisies parmi le séchage et la dilution du milieu gazeux prélevé. De façon intéressante pour les fumées d'incinération prélevées à humidité élevée le séchage du milieu gazeux prélevé est réalisé dans un dispositif à perméation. Selon un autre aspect de la première variante du procédé selon l'invention le préconditionnement du milieu gazeux prélevé comporte une phase de dilution à l'aide de l'air-témoin. Outre la faculté d'absorber une partie de l'humidité du flux du milieu gazeux prélevé, la dilution permet d'ajuster les paramètres du test biologique (tels que le temps d'exposition, le débit du milieu gazeux proposé à l'exposition) pour obtenir une bonne sensibilité selon les caractéristiques de base des fumées à étudier. Avantageusement on fixe pour les cultures-essais et les cultures-témoins des cultures cellulaires d'environ l million de cellules, un temps d'exposition de l'ordre d'une heure avec un débit continu de flux gazeux de l'ordre de 2 1/minute. On peut noter, en comparaison avec d'autres tests biologiques, la relative courte durée d'exposition (1 heure) qui, sans aller jusqu'à un suivi de la toxicité des fumées en continu, permet des prélèvements réguliers rapprochés. Pour accroître la fiabilité du test, on utilise comme air-témoin dans une variante du procédé selon l'invention de l'air reconstitué (22% 02, 78% N2) de qualité "air médical", milieu gazeux de référence non toxique. On évite ainsi l'opération complexe d'une purification sur site de l'air atmosphérique. La base de référence du test s'en trouve simplifiée, améliorée qualitativement et également stabilisée. Selon encore un autre aspect de la première variante du procédé selon l'invention, la proportion de cellules vivantes dans chaque culture après exposition est mesurée par méthode colorimétrique avec mise au contact des cellules avec une solution contenant un sel de tétrazolium. Avantageusement on mesure la densité optique d'une solution de sel de formazan (bleu/violet) produit par la réduction du sel de tétrazolium MTT par les cellules vivantes de la culture. Comme il apparaîtra dans la description ci-après l'utilisation d'un sel de tétrazolium comme marqueur des cellules vivantes et la méthode de mesure colorimétrique associée, s'avère rapide, facile à mettre en oeuvre et fiable ce qui la rend particulièrement appropriée pour ce type de test biologique orienté vers une application industrielle, par exemple sur le site même d'une usine d'incinération de déchets. L'invention concerne également un appareillage d'exposition de cultures cellulaires en aérobiose avec sonde de prélèvement utilisable notamment pour la mise en oeuvre du procédé défini ci-avant d'évaluation de la toxicité d'un milieu gazeux prélevé, l'appareillage comportant: - une enceinte d'exposition d'au moins une culture cellulaire en aérobiose à un milieu gazeux à étudier, ci-après l'enceinte d'essai, - une enceinte d'exposition d'au moins une culture cellulaire en aérobiose à de l'air-témoin non toxique, ci-après l'enceinte-témoin, - une ligne d'essai comportant une sonde de prélèvement du milieu gazeux à étudier, une conduite de transport équipée d'une pompe de circulation et une conduite d'entrée d'essai reliée à l'enceinte d'essai et connectée à une première conduite d'injection régulée de dioxyde de carbone, - une ligne-témoin comportant une source indépendante d'air-témoin, une conduite d'air-témoin reliant ladite source d'air-témoin à une conduite d'entrée témoin reliée à l'enceinte-témoin et connectée à une seconde conduite d'injection régulée de dioxyde de carbone. Il est à noter que la source d'air-témoin est indépendante de la ligne d'essai et de la sonde de prélèvement de façon à améliorer la fiabilité du test. De plus en variante de la présente invention, on utilise de préférence comme air-témoin de l'air reconstitué (22% 02, 78% N2) de qualité "air médical", non toxique. Dans un premier mode de réalisation, la source d'airtémoin est reliée par une conduite de dilution à la conduite de transport de la ligne d'essai. En variante de ce premier mode de réalisation, la conduite de transport de la ligne d'essai est équipée d'un dispositif de séchage du milieu gazeux prélevé, de préférence un dispositif du type tube à perméation à tube droit. Avantageusement 1 'appareillage selon 1' invention comporte des moyens pour maintenir la conduite de transport en amont du dispositif de séchage à une température de transport supérieure à la température de rosée (première condensation) du milieu gazeux prélevé (la température de transport est fixée au maximum à 1300C si toutefois la température de prélèvement est supérieure à 1300C). Cette température de 1300C correspond au point de rosée le plus élevé susceptible d'être rencontré pour les fumées compte tenu de l'humidité et de la concentration en acide chlorhydrique. D'autres caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention et de son appareillage de mise en oeuvre apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre en référence aux dessins ci-annexés dans lesquels: - la figure 1 représente une vue schématique en coupe d'une boîte de culture cellulaire en aérobiose utilisée dans la présente invention; - la figure 2 représente un croquis schématique en perspective d'une coupe verticale d'une enceinte d'exposition utilisée dans la présente invention; et - la figure 3 représente de façon schématique un mode de réalisation de l'appareillage d'exposition des cultures cellulaires en aérobiose avec sonde de prélèvement et utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention. La description ci-après donnée à titre d'exemple non limitatif concerne plus particulièrement la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour l'évaluation de la toxicité (en l'espèce la cytotoxicité) des fumées d'incinération de déchets. D'une façon générale les fumées d'incinération se présentent sous la forme d'un mélange essentiellement gazeux et comportant des aérosols liquides et/ou solides y compris avec de fines particules solides. Elles sont le plus souvent porteuses d'une quantité importante d'eau (entre 10 et 50% en volume) et rejetées à l'atmosphère à des températures supérieures à 1000C.Toutefois sans sortir du cadre de l'invention, le procédé d'évaluation de cytotoxicité est utilisable sur d'autres milieux gazeux potentiellement toxiques ou agressifs pour la santé et/ou l'environnement en particulier les effluents atmosphériques d'installations industrielles spécifiques. Le procédé d'évaluation de la toxicité des fumées d'incinération de déchets est basé sur l'exposition à ces fumées de cultures de cellules cultivées en phase gazeuse ou aérobiose (permettant ainsi de s'affranchir des distorsions rencontrées avec des cultures cellulaires en phase aqueuse). Pour des raisons de finalité industrielle du test (avec ses impératifs de commodité, de rapidité et de coûts) et de fiabilité du test au niveau de la cible cellulaire, il s'est avéré opportun de travailler sur des lignées cellulaires (éliminant ainsi les opérations de prélèvement in vivo). De plus en ce qui concerne plus spécifiquement les cibles cellulaires on a choisi de travailler sur des cellules de type macrophagique comparables à certains égards aux macrophages alvéolaires. En effet les macrophages alvéolaires présents dans les voies pulmonaires sont des cellules adaptées à la vie en aérobiose et ont des fonctions de défense immunitaire entre autres, contre les polluants de l'atmosphère. Toutefois les macrophages alvéolaires ne sont pas susceptibles d'être cultivés en lignée cellulaire. Ainsi donc les cellules de type macrophagique sont choisies de préférence parmi des lignées cellulaires monocytaires susceptibles de culture en aérobiose et présentant une morphologie, un équipement biochimique de défense (réponse immunitaire) et un comportement vis à vis des polluants susceptibles d'être rencontrés comparables à ceux des macrophages alvéolaires. En particulier on vérifie l'aptitude de ces cellules à la culture en aérobiose sur membrane (selon la méthode développée par C. VOISIN et Coll., voir article de 1977 cité ci-avant) et leurs réponses à une exposition à des milieux gazeux en comparaison avec les réponses des macrophages alvéolaires. On apporte ainsi au test d'évaluation de la toxicité des fumées une référence biologique pour les cellules cibles constante, stable et reproductible. A titre d'exemple non limitatif, sont utilisées de préférence les lignées cellulaires THP-1 et U-937, lignées respectivement répertoriées ATCC TIB 202 et ATCC CRL 1593 dans le catalogue de l"'American Type Culture Collection" (Rockville-E.U.A). La lignée THP-1 est une lignée cellulaire sanguine humaine, isolée puis cultivée suite à une leucémie monocytaire aiguë. . Elle possède toutes les propriétés du monocyte y compris les fonctions immunologiques (voir article de TSUCHIYA et Coll. 1980 "Establishment and Characterization of a Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line - THP-1"; J. Cancer, 261- pages 171 à 176). La culture THP-1 est entretenue en milieu MEM de Dulbecco, 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine et 0,0125 mM de 2 Mercapto-éthanol. La lignée U-937 est une lignée monocytaire pleurale humaine, isolée puis cultivée suite à un lymphome histiocytaire généralisé (voir article de SUNDSTRÔM et NILSSON, 1976 "Establishment and Characterization of a Human Histiocytic Lymphoma Cell Line (U-937)"; Int. J. Cancer, 12, pages 565 à 577). La culture U-937 est entretenue en milieu RPMI 1640, 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine et 0,0125 mM de 2-Mercapto-éthanol. Il est à noter que ces cellules d'origine humaine, sont incapables de se développer en dehors des milieux de culture riches présentés ci-avant. Elles n'ont été l'objet d'aucune manipulation génétique et présentent un caractère non pathogène. Parmi les autres cultures également utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer la lignée monocytaire P388-D1 (ATCC TIB 63 / Monocyte de Souris). Du point de vue laboratoire, les lignées THP-1 et U-937 sont maintenues dans un incubateur à atmosphère régulée à 5% de dioxyde de carbone (CO2) pour la régulation du pH, à une température de 370C et sous atmosphère saturée en eau. Deux jours avant le test le stock cellulaire est adapté aux futurs besoins en nombre de cellules. La mise en culture en phase gazeuse (en aérobiose) suit sensiblement la méthode mise au point par C. VOISIN et Coll. décrite dans l'article de 1977 précité. Son principe consiste à déposer des cellules sur l'une des faces d'une membrane filtre, au contact sur son autre face avec un liquide nutritif. La figure 1 montre une vue en coupe d'une boîte de culture en aérobiose utilisée dans la présente invention. Dans le fond d'une boîte de Pétri 10 (diamètre 55 mm) est disposé un anneau 12 en matériau synthétique (hauteur 6 mm) évidé en son milieu (sur un diamètre de 25 mm). L'anneau 12 forme ainsi un réceptacle-réservoir pour un liquide nutritif 14 affleurant la face supérieure de l'anneau 12.Sur l'anneau 12 et au contact du liquide nutritif est disposée la membrane poreuse 16 (diamètre moyen des pores = 0,2 ym) sur laquelle sont déposées les cellules à cultiver 18. Le liquide nutritif est constitué de milieu RPMI 1640 complété de sérum de veau foetal à 5% et de 2 mM de glutamine et 0,0125 mM de 2-Mercaptoéthanol. Pour chaque test on procède de façon stérile à la préparation de plusieurs boîtes de culture cellulaire en aérobiose à partir de la même suspension cellulaire. De préférence, on choisit un nombre total de 9 boîtes de culture, 3 boîtes de cultures-essais, 3 boîtes de cultures-témoins et 3 boîtes destinées à servir de contrôle général (incubateur), ce dernier contrôle étant toutefois facultatif. Pour 9 boîtes de culture on prélève entre 30 et 50 ml de suspens ion cellulaire du stock en phase liquide pour les placer dans un tube à centrifuger. La solution est centrifugée au maximum à 2000 tr/min (soit une centrifugation s 800 g) pendant 10 minutes. Après homogénéisation du culot cellulaire dans 2 ml de milieu de culture neuf, on prélève une goutte de la nouvelle suspension cellulaire pour dépôt sur cellule de Thoma afin de procéder à une numération cellulaire. Une cellule de Thoma est principalement constituée d'un ensemble d'une lame et d'une lamelle quadrillée distantes de 0,1 mm.Sous microscope (grossissement x200 ou x400) les cellules sont dénombrées sur quatre lignes du quadrillage de la cellule de Thoma, soit une unité de quadrillage de dimension 1 mm x 1 mm x 0,1 mm d'un volume de 10 yl. Après vérification de la présence d'au moins 100 cellules par unité de quadrillage, on calcule le nombre de cellules disponibles par unité de volume. Les cellules sont une nouvelle fois "reprises" dans du milieu de culture (soit en dilution, soit en concentration) pour obtenir une suspension cellulaire finale de l'ordre de 10 millions de cellules par ml. La préparation des boîtes de culture cellulaire en aérobiose se termine par le dépôt au centre de la membrane 16 placée dans chaque boîte (juste au-dessus du réservoir 14 du milieu de culture) de 100 Fl de la suspension cellulaire finale (soit environ un million de cellules par boîte). Les boîtes de culture sont placées en incubateur à atmosphère saturée en humidité, régulée à 5% de CO2 et à 370C pendant au moins 3 heures. Avant leur utilisation dans le test d'évaluation de toxicité, les boîtes sont désignées de façon aléatoire (tirage au sort): trois d'entre elles sont désignées comme contenant les cultures-essais et seront placées dans l'enceinte d'exposition aux fumées d'incinération de déchets, trois autres sont désignées comme contenant les cultures-témoins et seront placées dans l'enceinte d'exposition à l'air-témoin; les trois dernières boites restant dans l'incubateur à CO2. Les deux enceintes d'exposition utilisées dans le test d'évaluation de toxicité des fumées sont identiques. Leur agencement est illustré schématiquement en coupe verticale médiane à la figure 2. Chaque enceinte d'exposition comporte un premier ensemble de cuve de bain à immersion 20 en inox et pourvu d'un dispositif de régulation en température du bain-marie (eau à 370C). Dans la cuve 20 est disposée la chambre d'exposition 22 proprement dite isolée de l'extérieur, munie d'un couvercle et équipée d'une grille de fond 24 sur laquelle sont placées trois boîtes de Pétri contenant les cultures cellulaires en aérobiose (seules deux boîtes 26 sont visibles sur la figure 2). L'enceinte d'exposition présente une conduite d'amenée 28 et une conduite de sortie 30 du milieu gazeux prélevé (ou de l'air-témoin) en communication avec l'intérieur de la chambre close 22 et traversant le couvercle de la chambre d'exposition 22. La conduite d'amenée 28 se termine par une rampe de diffusion en L disposée parallèlement à la grille 24 au niveau des boîtes de culture et dont les orifices sont disposés sur toute la largeur de la chambre d'exposition 22.Dans le fond de la chambre d'exposition 22 sous la grille 24 est reçu un volume d'eau 34 faisant fonction de source d'humidité ambiante. La figure 3 illustre de façon schématique un appareillage d'exposition de cultures cellulaires en aérobiose avec sonde de prélèvement du milieu gazeux à étudier utilisé notamment et de façon non limitative pour la mise en oeuvre du procédé d'évaluation de la toxicité des fumées selon l'invention. Les références 40 et 42 désignent respectivement l'enceinte d'exposition des cultures-essais (enceinte d'essai 40) et l'enceinte d'exposition des cultures-témoins (enceinte-témoin 42), les deux enceintes étant du type décrit ci-avant en relation avec la figure 2 et comportant chacune trois boîtes de culture contenant les cultures cellulaires en aérobiose issues de la même suspension cellulaire selon le mode opératoire décrit ci-avant.L'entrée 41 de l'enceinte d'essai 40 est connectée à une ligne d'essai 44 comportant une sonde de prélèvement 46 en verre borosilicaté (de diamètre int/ext de 6/8 mm) disposée sur une cheminée 48 d'évacuation des fumées d'une unité d'incinération de déchets à hauteur des sondes de prélèvement des équipements d'analyses chimiques, d'une conduite de transport 50 équipée d'une pompe de circulation 52 et d'un dispositif de séchage du milieu gazeux prélevé 54, d'un débitmètre 56, d'une boule de mélange 58 connectée à une conduite d'injection régulée 60 de dioxyde de carbone régulée par un débitmètre 64 et reliée à une source de dioxyde de carbone 62, par exemple une bouteille de gaz comprimé. Cette injection de dioxyde de carbone à 5% complète le conditionnement final du milieu gazeux prélevé. La conduite d'entrée 43 de l'enceinte-témoin 42 est connectée à une ligne-témoin 66 comportant une source d'air-témoin 68 non toxique et indépendante du milieu gazeux prélevé (en l'occurrence une bouteille d'air comprimé reconstitué (22% 02, 78% N2) de qualité "air médical"), une conduite d'air-témoin 70, un débitmètre 72, une boule de mélange 74 connectée à une conduite d'injection régulée 76 de dioxyde de carbone régulée par un débitmètre 78 et reliée à la source de dioxyde de carbone 62. De façon optionnelle, l'appareillage comporte un circuit de dilution du milieu gazeux prélevé constitué d'une conduite de dilution 80 munie d'un débitmètre 82 et disposée entre la source d'air-témoin 68 et une boule de mélange 84 placée sur la conduite de transport 50 en aval de la pompe 52 et le débitmètre 56. D'une façon générale, les boules de mélange 58, 74, 84 et les portions de conduites sont calorifugées et/ou équipées d'un dispositif de régulation en température de façon à assurer une température constante entre 200C et 370C au milieu gazeux et à l'air-témoin entrant dans les enceintes d'exposition 40 et 42. Par ailleurs les boules de mélange 58, 74, 84, de structure identique, sont constituées d'une boule de verre borosilicaté de 8 cm de diamètre environ à deux entrées et une sortie.De préférence pour améliorer la diffusion, l'entrée correspondant à l'amenée d'un gaz d'apport (en l'espèce les entrées des boules reliées aux conduites 60, 76 et 80) est pourvue d'un tampon en fritté à grande porosité, la sortie étant éventuellement équipée d'un col tubulaire (non représenté) se projetant jusqu'au centre de la boule de mélange de façon à séparer le mélange sortant d'éventuels condensats retenus dans la boule avant évacuation. Enfin il est à noter que chacun des débitmètres 56, 64, 72, 78 et 82 comporte à son entrée une vanne de régulation (non représentée). La sonde de prélèvement 46 est en général enfonçée à midiamètre de la cheminée 48 en aval des dispositifs en place de filtration et de dépoussiérage des fumées. Toutefois selon les conditions atmosphériques, le type de déchets incinérés et le type de traitement des fumées, les caractéristiques physiques et chimiques des fumées prélevées sont très variables notamment en température (environ de 60 à 2500C), en composition notamment en vapeur d'eau (généralement de 10 à 50% en volume). Il importe donc pour maintenir l'intégrité du milieu gazeux à étudier d'éviter des condensations parasites dans la conduite de transport 50. Cette difficulté est résolue selon l'invention par l'utilisation du dispositif de séchage 54 et/ou à l'aide du circuit de dilution 80, 82. Pour ce faire la sonde de prélèvement 46 est suivie d'une ligne de prélèvement 53 (portion de la conduite 50) qui est chauffée et régulée à 1300C (température supérieure dans tous les cas au point de rosée des fumées d'incinération) à l'aide de moyens de chauffage régulé 51. Les fumées parcourent ensuite le dispositif de séchage 54 qui, dans le mode de réalisation ici décrit à titre non limitatif, est du type à tube à perméation. En particulier le dispositif à perméation 54 comporte un tube central droit 86 disposé verticalement (pour éviter le piégage des particules) et dont la paroi est constituée d'une membrane "perfluorinée" échangeuse d'ions, monté dans un tube externe 88 pour définir une chambre annulaire 90 destinée à recevoir le gaz de séchage, le tout étant disposé dans une enceinte (non représentée) régulée en température, par exemple à 900C dans le cas de fumées de températures supérieures à 1300C.Dans le tube central 86 circule de haut en bas le milieu gazeux prélevé, tandis que dans la chambre annulaire 90 circule, à contre-courant du milieu gazeux prélevé, le gaz de séchage, en l'espèce de l'air ou de l'azote sec délivré par une source convenable d'air ou d'azote comprimé 92. La différence des pressions de vapeur entre les deux courants gazeux opposés (la pression dans le tube 86 étant supérieure à la pression dans la chambre annulaire 90) entraîne une migration de la vapeur d'eau au travers de la membrane échangeuse d'ions de l'intérieur du tube 86 vers la chambre 90. La force de séchage (proportion d'eau transférée à partir des fumées prélévées au gaz de séchage) est déterminée par la différence des pressions de vapeur entre les deux courants gazeux, les débits des courants gazeux (le débit du gaz de séchage étant supérieur au débit du gaz à sécher), la surface de la membrane et la température du dispositif 54, en l'espèce 900C.A titre d'exemple pour un débit de milieu gazeux prélevé à 2 1/min, le débit du gaz de séchage est de l'ordre de 9 1/min. Ainsi donc les fumées (milieu gazeux prélevé) en sortie du dispositif 54 sont asséchées jusqu'à atteindre un point de rosée théorique inférieur à 370C. Jusqu'à l'enceinte d'exposition 40 des culturesessais, la ligne 50 est ensuite maintenue à température d'essai inférieure à 370C. Les fumées traversent successivement la pompe 52, le débitmètre 56, et, après apport de dioxyde de carbone pour atteindre la concentration de 5% de CO2, l'enceinte d'exposition d'essai 40 puis sont rejetées à l'atmosphère par la conduite de sortie 45 de l'enceinte d'essai 40.La boule de mélange 84 en sortie du dispositif de séchage 54 permet une dilution des fumées pour améliorer la sensibilité du test par un apport d'air de dilution (air-témoin). De même l'air-témoin non toxique circule dans la conduite 70, traverse le débitmètre 72, est additionné de 5% de dioxyde de carbone, puis introduit dans l'enceinte-témoin 42 par la conduite d'entrée 43 et rejeté à l'atmosphère par la conduite de sortie 47. Il est à noter que l'appareillage selon l'invention ici décrit est susceptible (à l'exception de la sonde de prélèvement 46 et de la ligne de prélèvement 53) d'être regroupé au pied de la cheminée 48 et de recevoir une protection adéquate. De plus l'appareillage se prête à la réalisation d'une installation mobile, par exemple montée sur véhicule Bien entendu l'appareillage selon l'invention n'est pas limité au dispositif de séchage décrit ci-avant, mais concerne également des variantes utilisant d'autres dispositifs de séchage. Selon une autre variante (non représentée) de l'invention, une boule de mélange est disposée en sortie immédiate de la sonde de prélèvement et branchée sur la conduite de dilution ainsi prolongée et sur la pompe de circulation de la ligne d'essai (le dispositif 54 étant éliminé).Dans ces conditions l'air de dilution (avec un taux compris entre 1/2 et 1/20) est capable d'absorber une part importante de l'humidité des fumées. Dans tous les cas d'exposition de cellules on choisit un débit de fumées (diluées ou non diluées) en sortie du débitmètre 56 compris entre 0,5 et 2 1/min (de préférence de l'ordre de 2 1/min). Il est à noter que sans sortir du cadre de l'invention l'appareillage d'exposition de cultures cellulaires en aérobiose et ses variantes décrits ci-avant sont utilisables avec des milieux gazeux autres que les fumées (notamment pour l'étude de l'air ambiant) et/ou en association avec des cellules autres que des cellules de type macrophagique, notamment avec des cellules prélevées in vivo ou issues d'autres lignées cellulaires pour autant que ces cellules soient susceptibles de culture cellulaire en aérobiose. L'exposition des cellules aux fumées et à l'air-témoin se fait de la façon suivante: - introduction des 3 boîtes contenant les cultures essais dans l'enceinte d'essai 40 (boîtes découvertes); - l'introduction des 3 boîtes contenant les cultures témoins dans l'enceinte-témoin 42 (botes découvertes); - addition systématique de 5% de dioxyde de carbone dans les mélanges gazeux (milieu gazeux prélevé (fumées) ou air-témoin) avant entrée dans les enceintes (conditionnement final); - de façon optionnelle dilution préalable du milieu gazeux prélevé (fumées) à un taux de 1/2 à 1/20; - durée d'exposition des cellules au milieu gazeux prélevé (fumées) ou à l'air-témoin pour chaque enceinte d'exposition: 1 heure en débit continu. Le débit du milieu gazeux prélevé ou de l'air-témoin à l'entrée de chaque enceinte est de 2 1/min, la pression relative dans l'ensemble du circuit étant nulle. Les débitmètres régulent à température et pression constantes, les proportions des mélanges fumées/air de dilution/dioxyde de carbone à l'entrée de l'enceinte d'essai 40 et les proportions du mélange air-témoin (air médical)/dioxyde de carbone à l'entrée de l'enceintetémoin 42. Soit par exemple: a à l'entrée de l'enceinte d'essai 40: - fumées d'incinération (diluées ou non) = 1,9 1/min; CO2 = 100 cm3/min - en cas de dilution de 1/2 des fumées, le débit de fumées en amont de la pompe 52 égale 0,95 1/min. a à l'entrée de l'enceinte-témoin 42: - air médical = 1,9 1/min; CO2 = 100 cm3/min. Ainsi donc les cellules cultivées en aérobiose des cultures-essais sont directement au contact du milieu gazeux prélevé, sans interposition de milieu liquide entre ces cellules et le milieu gazeux dans l'enceinte d'exposition. La toxicité peut être directe (destruction cellulaire) ou indirecte (activation cellulaire avec production de toxines). Cette toxicité est révélée par des marqueurs biologiques. Ces marqueurs sont choisis de préférence sensibles, fiables et reproductibles. En particulier on préfère des marqueurs conduisant à une mesure colorimétrique facilement mise en oeuvre, notamment les sels de tétrazolium. Dans l'exemple de mise en oeuvre de l'invention donné à titre non limitatif, le sel de tétrazolium est le MTT. La solution mère est obtenue à partir de 5 mg/ml dans du PBS (solution tamponnée au sulfate) à pH = 7,4. Le mode opératoire est le suivant: - les membranes porteuses des cultures sont retirées de leurs boîtes après exposition et placées dans de nouvelles boîtes de Pétri; - 1 ml de MTT est versé sur chaque culture; - les boîtes de Pétri sont refermées et placées en incubateur à atmosphère saturée en humidité et à 5% de CO2, pendant 2 heures (à température de 370C). Les cellules vivantes adoptent une couleur violet-bleu en réduisant une proportion de sel de tétrazolium MTT (jaune) en sel de formazan (violet-bleu). Le mode opératoire se poursuit comme il suit: - le MTT est éliminé de chaque boîte, par exemple par aspiration; - 2 ml de DMSO (diméthyl sulfoxyde) sont versés sur chaque membrane; les boîtes sont agitées pendant 1 minute pour permettre la dissolution par le DMSO des cristaux de formazan bleu-violet; - 3 volumes de 200 yl sont prélevés de chaque boîte puis distribués sur une microplaque de 96 puits; - on procède alors à une mesure colorimétrique (densité optique DO) dans un lecteur de microplaque équipé d'un filtre de 570 nm pour la lecture et un filtre de 650 nm pour la DO de référence. On rappelle que selon la loi de Beer-Lambert sur l'absorption de la lumière par les solutions, la densité optique DO d'une solution est proportionnelle au produit de la concentration C de la substance absorbant la lumière par l'épaisseur E de la couche de solution traversée, soit DO = log Io/I = K x C x E où Io et I sont les intensités lumineuses incidente et résultante et K une constante (coefficient d'extinction molaire) dépendant de la nature de la substance absorbante et de la longueur d'onde de la lumière. Les blancs de lecture correspondent à trois puits de la microplaque, remplis chacun de 200 microlitres de DMSO. Pour chaque puits rempli, on lit la densité optique DO à 570 nanomètres (longueur d'onde de lecture) et la DO à 650 nanomètres (qui permet d'évaluer la part de DO due à des interférences parasitaires: présence de membranes cellulaires, traces sur la plaque ...). Ainsi pour chaque puits on calcule la densité optique effective DOeff= D0570nm - D 650xlm On calcule la moyenne DOeff* des trois DO effectives obtenues pour chaque boîte d'une même culture (cultureessai ou culture-témoin) et la moyenne DObl,c* des trois blancs. La densité optique DOef f* est corrigée par rapport à la densité optique DOblanc *. Pour chaque culture (cultureessai, culture-témoin, ou culture restée en incubateur pour le contrôle général), on calcule la densité optique corrigée DOC* = DOeff* - * DOc * représente la "vitalité" des cellules, en particulier la "vitalité-essai" pour les cultures exposées dans l'enceinte d'essai et la "vitalité-témoin" pour les cultures exposées dans l'enceinte-témoin . Il est ainsi possible de définir un indice de toxicité relative (cytotoxicité), % Tox calculé en pourcentage comme il suit: % Tox = (vitalité-témoin - vitalité-essai) x 100 vitalité-témoin Les essais réalisés ont montré que: - les DO sont en général inférieures à 1 et se situent entre 0 et 0,6; - les trois lectures effectuées à partir d'une même boîte de culture ne sont jamais significativement différentes (probabilité Student). Les résultats qui suivent concernent des tests réalisés sur site lors deux jours consécutifs, j et j+1: jour j jour j+1 essai 1 essai2 essai3 essai 4 essai 5 % Tox (MTT), en % 32 39 30 87 83 Concentrations des composants majeurs des furnées: % O2 (vol) env. 9 % % CO2 (vol) env. 8 % % H2O (vol) env. 28 Poussières en mg/Nm 3 3 4 4 4 1) en mg/Nm (*) Polluants 2) en mmol/Nm (*) 21,8 26,2 25,2 31,2 32 HCl 0,60 0,72 0,89 0,86 0,88 i i i i 1 oe 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 90 116 115 382 328 NO 3 3,87 3,83 12,73 10,93 106 147 119 34 32 SO2 1,86 2,30 1,86 0,53 0,5 TOTAL en mmol/Nm 5,29 6,92 6,42 14,16 12,35 (*) Nm = normo-mètre cube, m3 de fumées dans les conditions normales de température et de pression. (*) mmol = milli-mole, un millième de mole. On peut remarquer que la cytotoxicité a augmentée de j à j+1 en rapport avec l'augmentation de la concentration de HCl et de NO. Par ailleurs, la concentration cumulée des polluants majeurs dans les fumées d'incinération (HCl, CO, NO et SO2), exprimée en mmol/Nm3, est passée de 5 à 7 mmol/Nm3 à 12 à 14 mmol/Nm3. Si l'on considère une série de 33 tests réalisés dans des conditions expérimentales comparables, une grande part des essais qui affichent une toxicité globale (par la méthode utilisant le MTT) de 10% à 30% correspond à la méthode utilisant le MTT) de 10k à 30% correspond à des concentrations totales de polluants majeurs dans les fumées d'incinération proches de 6 à 8 mmol/Nm3.La toxicité dépasse souvent 30% pour des concentrations cumulées supérieures à 8 mmol/Nm3, avec plusieurs pointes de 70% à 90k qui semblent liées soit à des concentrations cumulées élevés (en l'espèce 12 mmol/Nm3 et 14 mmol/Nm3), soit à la teneur exceptionnellement forte des fumées en un polluant majeur (en l'espèce une teneur en CO de 0,75 mmol/Nm3 - c'est-à-dire 21 mg/Nm3 très supérieure au 1 mg/Nm3 plus fréquemment mesuré), soit encore problablement à la modification d'une condition physique ou chimique mais qui n'a pas été mesurée au cours du test (par exemple une modification liée aux poussières ou à l'apparition d'un micropolluant non détecté). Cette dernière hypothèse montre bien l'intérêt du caractère global du test selon l'invention. Bien entendu sans sortir du cadre de l'invention, la méthode de mesure utilisant le MTT comme révélateur de toxicité cellulaire peut être remplacée par d'autres méthodes, notamment par la méthode connue de mesure de 1'ATP cellulaire. REVENDICATIONS: 1. Procédé d'évaluation de la toxicité des fumées ou d'effluents gazeux analogues caractérisé en ce qu'il comporte les opérations suivantes: - réalisation à partir d'une même suspension cellulaire de cellules de type macrophagique issue d'une lignée cellulaire, d'au moins une culture cellulaire en aérobiose, ci-après désignée culture-essai, et d'au moins une autre culture cellulaire en aérobiose, ci après désignée culture-témoin, - prélèvement et transport du milieu gazeux à évaluer vers la culture-essai avec préconditionnement d'adaptation dudit milieu gazeux prélevé pour le rendre compatible avec une exposition à une culture cellulaire en aérobiose, - exposition pendant un temps prédéterminé dans les mêmes conditions expérimentales des cellules de la culture-essai à un flux du milieu gazeux prélevé et des cellules de la culture-témoin à un flux d'air témoin non toxique, - mesure d'un paramètre représentatif du nombre de cellules vivantes dans chaque culture après exposition et établissement d'un indice de toxicité relative du milieu gazeux prélevé par rapport à l'air-témoin. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de type macrophagique sont choisies parmi des lignées cellulaires monocytaires susceptibles de culture cellulaires en aérobiose, présentant une morphologie, un équipement biochimique de défense (réponse immunitaire) et un comportement vis-à-vis des polluants susceptibles de se trouver dans le milieu gazeux comparables à ceux du macrophage alvéolaire. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules de type macrophagique sont choisies parmi l'une des lignées suivantes: lignée THP-1, ligne U-937 et lignée P388-D1. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque culture cellulaire en aérobiose est réalisée dans une boite stérile sur l'une des faces d'une membrane de culture adaptée à recevoir les cellules et dont l'autre face est maintenue au contact d'un liquide nutritif. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que chaque boîte de culture cellulaire en aérobiose utilisée pour ladite culture-essai et ladite culturetémoin reçoit environ 1 million de cellules. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que les boîtes de culture sont disposées dans des enceintes d'exposition respectivement au milieu gazeux prélévé et à l'air-témoin, en condition d'atmosphère saturée, régulées à 370C (par bain à l'immersion), le milieu gazeux prélevé et l'air-témoin recevant en entrée dans l'enceinte d'exposition correspondante un apport de 5â en volume de dioxyde de carbone. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit préconditionnement du milieu gazeux prélevé comporte un traitement destiné à éviter la condensation d'eau dans le milieu gazeux prélevé pendant son transport vers la culture-essai. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit traitement contre la condensation comporte au moins une des opérations choisies parmi le séchage et la dilution du milieu gazeux prélevé. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit traitement contre la condensation comporte un séchage du milieu gazeux prélevé dans un dispositif à perméation de préférence à tube droit. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit préconditionnement du milieu gazeux prélevé comporte une phase de dilution à l'aide de l'air-témoin non toxique. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'exposition de la culture-essai et de la culture-témoin est réalisée pendant environ une heure avec un débit gazeux sur les cellules de l'ordre de 2 1/minute. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la proportion de cellules vivantes dans chaque culture après exposition est mesurée par méthode colorimétrique avec mise au contact des cellules avec une solution contenant un sel de tétrazolium. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on mesure la densité optique DO d'une solution de sel de formazan (bleu/violet) produit par la réduction de sel de tétrazolium MTT par les cellules vivantes de l'échantillon. 14. Appareillage d'exposition de cultures cellulaires en aérobiose utilisable notamment pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant: - une enceinte d'exposition (40) d'au moins une culture cellulaire en aérobiose à un milieu gazeux à étudier, ci-après l'enceinte d'essai, - une enceinte d'exposition (42) d'au moins une culture cellulaire en aérobiose à de l'air-témoin non toxique, ci-après 1 'enceinte-témoin, - une ligne d'essai (44) comportant une sonde de prélèvement (46) du milieu gazeux à étudier, une conduite de transport (50) équipée d'une pompe de circulation (52) et une conduite d'entrée (41) d'essai reliée à l'enceinte d'essai (40) et connectée à une première conduite d'injection régulée de dioxyde de carbone (60), - une ligne-témoin (66) comportant une source indépendante d'air-témoin (68), une conduite d'air témoin (70) reliant ladite source (68) à une conduite d'entrée-témoin (43) reliée à l'enceinte-témoin (42) et connectée à une seconde conduite d'injection régulée de dioxyde de carbone (76). 15. Appareillage selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite source d'air-témoin (68) est réalisée par une source d'air reconstitué de qualité "air médical", non toxique. 16. Appareillage selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que ladite source d'air-témoin (68) est reliée par une conduite de dilution (80) à ladite conduite de transport (50) de la ligne d'essai (44) . 17. Appareillage selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que ladite conduite de transport (50) de la ligne d'essai (44) est équipée d'un dispositif de séchage (54) du milieu gazeux prélevé. 18. Appareillage selon la revendication 17, caractérisé en ce que le dispositif de séchage (54) est du type tube à perméation, de préférence à tube droit. 19. Appareillage selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (51) pour maintenir la conduite de transport en amont du dispositif de séchage (54) à une température proche de la température du milieu gazeux en sortie de la sonde de prélèvement (46) lorsque celle-ci est inférieure ou égale à 1300C. 20. Appareillage selon l'une des revendications 14 à 19, caractérisé en ce que les conduites d'entrée d'essai (41) et d'entrée-témoin (43) sont associées à des régulateurs de débit (58, 76) et de température.