FR 2733419 A1 19961031 FR 9505054 A 19950427 EXTRAITS VEGETAUX, LEUR PROCEDE DE FABRICATION, CONJUGUES PHYTOPROTEIQUES LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS La présente Invention se rapporte à des extraits végétaux, à leur procédé de préparation, à des conjugués phytoprotéiques contenant lesdits extraits et aux applications de ces extraits et conjugués. Dans le traitement des cancers, la chimiothérapie tient une place importante, qu'elle soit utilisée seule, dans le cas des leucémies, ou en association avec d'autres thérapies telles que la chirurgie ou la radiothérapie, dans le cas par exemple des cancers du sein ou des sarcomes ostéogènes. Le principe de la chimiothérapie est de détruire toutes les cellules malignes qui présentent une croissance non inhibée, tout en épargnant, dans la mesure du possible, les cellules saines. La plupart des agents chimiothérapiques utilisés à l'heure actuelle en clinique sont des substances cytostatiques qui exercent leurs effets en interférant avec des mécanismes variés de la croissance cellulaire. On distingue ainsi des agents alkylants capables de se lier à 1'ADN (moutardes à l'azote, nitrosurées, ..), des agents intercalants capables de se glisser entre les spires de 1'ADN et d'inhiber sa réplication (anthracyclines, ellipticines, .), des inhibiteurs des topo-isomérases I et II (camptothécines, .), des inhibiteurs de la synthèse protéique au niveau du ribosome (puromycine, girolline, ...), des antimétabolites (méthotréxate, 5-fluoro-uracile, ..) et des poisons du fuseau (vinblastine, taxol, .). Ces agents cytostatiques n'ont généralement pas un effet spécifique sur les cellules malignes, de sorte que l'emploi de doses massives de tels agents s'accompagne d'effets secondaires importants immédiats (nausées, vomissements, diarrhées, réactions d'hypersensibilité, fièvres, .. > ou retardés (myélosuppression, alopécies, ulcérations orales et gastrointestinales, hémorragies, ...) traduisant une toxicité aiguë à l'égard des cellules saines. Ces effets indésirables ainsi que l'existence de résistances tumorales aux agents chimiothérapiques rendent nécessaire la recherche de nouveaux antitumoraux susceptibles d'agir par des effets autres que cytostatiques directs, de présenter une spécificité vis-à-vis des cellules malignes et, par voie de conséquence, des effets secondaires moindres. Ainsi, par exemple, il a été proposé d'utiliser des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des antigènes associés à la tumeur, seuls ou conjugués à des toxines ou encore couplés à des radio-isotopes. Leurs avantages théoriques sont leur sensibilité, leur spécificité vis-à-vis d'antigènes donnés et leur absence habituelle de liaison aux cellules saines. En réalité, leur efficacité clinique est limitée par l'hétérogénéité des cellules tumorales et le développement d'anticorps humains anti-souris, de sorte que l'utilisation des anticorps monoclonaux ne représente pas actuellement une voie thérapeutique satisfaisante. Or, les Inventeurs ont trouvé que des extraits végétaux préparés à partir de trois plantes médicinales appartenant aux genres Germanium, Plantago et Calendula sont capables, de manière inattendue, de stimuler les défenses immunitaires de l'organisme et notamment, de stimuler l'activité cytotoxique des lymphocytes B et des monocytes, et présentent, de ce fait, un intérêt majeur dans le traitement des pathologies tumorales. La présente Invention a donc pour objet un extrait végétal, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'extraits d'au moins trois plantes choisies parmi les genres Germanium, Plantago et Calendula. Selon un mode de réalisation préféré de l'Invention, les plantes sont choisies parmi les espèces Geranium robertanium, Plantago lanceolata et Calendula officinales. Un extrait végétal conforme à l'Invention est susceptible d'être obtenu par une macération des parties aériennes, fraîches ou sèches, desdites plantes dans un solvant approprié. De manière avantageuse, l'extrait végétal est susceptible d'être obtenu par une macération des feuilles desdites plantes dans de l'eau. Conformément à l'Invention, lorsque ledit extrait végétal est obtenu par une macération des feuilles des plantes dans de l'eau, celle-ci est avantageusement réalisée à une température comprise entre 15 et 30'C et pendant une période de 3 à 15 jours. De manière préférée, l'extrait végétal conforme à l'Invention est susceptible d'être obtenu par une macération de 300 à 400 grammes de feuilles fraîches de Geranium robertanium, 10 à 50 g de feuilles sèches de Plantago lanceolata et de 10 à 50 g de feuilles sèches de Calendula officinales dans 3 litres d'eau. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'extrait végétal est susceptible d'être obtenu, en outre, par une filtration. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait végétal tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - macération des parties aériennes, fraîches ou sèches, d'au moins trois plantes choisies parmi les genres Geranium, Plantago et Calendula dans un solvant approprié et, si nécessaire - filtration de l'extrait obtenu. Selon un mode de mise en oeuvre préféré dudit procédé, les plantes sont choisies parmi les espèces Geranium robertanium, Plantago lanceolata et Calendula officinales. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'Invention, les feuilles desdites plantes sont mises à macérer dans de l'eau. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les feuilles desdites plantes sont mises à macérer dans de l'eau à une température comprise entre 15 et 30'C et pendant une période de 3 à 15 jours. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, 300 à 400 grammes de feuilles fraîches de Geranium robertanium, 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Plantago lanceolata et 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Calendula officinales, sont mises à macérer dans 3 litres d'eau. La présente Invention a également pour objet un extrait végétal tel que défini ci-avant, pour l'utilisation comme médicament dans le traitement des affections où une immunostimulation est recherchée et notamment, dans le traitement des pathologies tumorales malignes et bénignes. En effet, les extraits végétaux conformes à l'Invention ont un effet stimulant sur l'activité cytotoxique des lymphocytes B et des monocytes. Des études expérimentales réalisées chez l'animal et des études cliniques montrent qu'une administration orale quotidienne de ces extraits permet d'obtenir en quelques semaines un arrêt de la croissance des tumeurs suivi d'une régression de celles-ci, aboutissant le plus souvent à une rémission de la pathologie tumorale. La présente Invention a également pour objet un conjugué phytoprotéique comprenant un extrait végétal tel que défini ci-avant et de lla-foetoprotéine, cette dernière servant de substance de transport spécifique vers les cellules tumorales. Un tel conjugué peut être préparé selon les protocoles décrits dans la Demande Internationale publiée sous le n 94/19021. La présente Invention a aussi pour objet un conjugué phytoprotéique, tel que précédemment défini, pour l'utilisation comme médicament dans le traitement des affections dans lequel une immunostimulation est recherchée tel que notamment, le traitement des pathologies tumorales. La présente Invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un extrait végétal ou un conjugué phytoprotéique tels que précédemment définis. L'Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre et qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation et d'utilisation d'un extrait végétal conforme à l'Invention. EXEMPLE 1: PREPARATION D'UN EXTRAIT VEGETAL CONFORME A L'INVENTION On introduit dans un récipient en verre - 360 grammes de feuilles fraîches de Geranium robertanium, - 25 grammes de feuilles sèches de Plantago lanceolata, - 25 grammes de feuilles sèches de Calendula officinales, et - 3 litres d'eau minérale. Après avoir fermé hermétiquement le récipient, on laisse macérer les feuilles pendant 8 jours à température ambiante (environ 23 C), en procédant à une ou plusieurs agitations quotidiennes. Au terme de la macération, le mélange est pressé et la solution aqueuse obtenue est soumise à une filtration sur un filtre de 0,22, puis à un contrôle bactériologique. L'extrait végétal ainsi obtenu est prêt à l'emploi et peut être conservé à 4 C. EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DES PROPRIETES THERAPEUTIQUES D'UN EXTRAIT VEGETAL CONFORME A L'INVENTION 1. Expérimentations in vitro La capacité d'un extrait végétal conforme à l'Invention à stimuler la cytotoxicité des monocytes vis-à vis des cellules tumorales, a été mise en évidence in vitro selon un protocole consistant à cultiver des cellules tumorales en présence de monocytes, et en l'absence ou en présence d'une dilution de l'extrait végétal à tester, puis en déterminant le pourcentage de cellules tumorales survivantes. Ce test a été réalisé avec deux types de cellules tumorales d'une part, des cellules de carcinome ovarien humain résistantes aux anthracyclines (SKVLB) et d'autre part, des cellules de carcinome ovarien sensibles aux anthracyclines (SKOV3). Les cellules tumorales ont été cultivées dans des plaques de 96 puits, à raison de 5000 cellules par puits, dans 100 Rl d'un milieu de culture à base de RPMI 1640 comprenant - 10% de sérum bovin foetal, - 100 Rg/ml de pénicilline, et - 100 Rg/ml de streptomycine, en présence de monocytes selon des rapports en volumes cellules tumorales/monocytes égaux respectivement à 1:1,2 1:2,5 ; 1:5 et 1:10, et en l'absence (contrôle) ou en la présence d'une dilution au 1/100 d'un extrait végétal obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 1. Les cultures ont été maintenues dans une chambre d'incubation en présence d'une teneur en CO2 égale à 5% et à une température de 37'C C pendant 72 heures. Puis, les puits ont été lavés avec du milieu de culture pour éliminer les monocytes et le nombre de cellules tumorales survivantes a été déterminé au moyen d'un test MTT (3-[4,5 diméthylthiazol-2-yl] -2, 5-diphényltétrazolium bromide), classiquement utilisé dans les tests de cytotoxicité. Les résultats obtenus sont illustrés dans le Tableau 1 ciaprès. Ils sont exprimés en pourcentages d'activité cytotoxique, lesquels ont été calculés selon la formule DOt - DO x 100 DOt dans laquelle DOt est la densité optique des puits avant incubation en présence des monocytes tandis que DO est la densité optique après incubation en présence des monocytes. TABLEAU 1 Pourcentages d'activité cytotoxique Rapport cellules cellules SKVLB I Cellules SKOV3 cibles/monocytes v:v contrôle extrait contrôle extrait 1:1,2 6,2 21,9 2,8 13,1 1:2,5 14,3 31,6 4,0 16,2 1:5 26,6 34,7 6,6 12,0 1:10 26,6 48,5 21,6 46,3 Ce tableau 1 montre que l'activité cytotoxique des monocytes à l'égard de cellules tumorales telles que des cellules de carcinome est significativement augmentée lorque ces monocytes sont mis en présence d'une dilution d'un extrait végétal conforme à l'Invention. 2. Expérimentations in vivo chez l'animal a) Exsérimentation 1 L'activité antitumorale d'un extrait végétal conforme à l'Invention et obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 1, a été testée chez 16 souris Balb/c ayant un poids moyen compris entre 18 et 20 g et ayant été soumises à une double injection, sous-cutanée d'une part et intrapéritonéale d'autre part, de 0,1 ml d'une suspension contenant 107 cellules issues d'un myélome Sp2/o. Parmi ces 16 souris - 7 souris n'ont reçu aucun traitement afin de constituer un groupe contrôle - 5 souris (groupe 1) ont reçu dès le 2ème jour suivant l'injection des cellules tumorales, une dose quotidienne d'extrait végétal égale à 1,6 ml (soit 4 x 0,4 ml par jour), tandis que - 4 souris (groupe 2) n'ont été traitées avec l'extrait végétal conforme à l'Invention qu'à partir du 26ème jour suivant cette injection. Les résultats de ce test ont été les suivants - les 7 souris du groupe contrôle sont toutes décédées entre les 37ème et 40ème jours suivant l'injection des cellules tumorales - les souris du groupe 1 n'ont pas développé de tumeurs visibles. Trois d'entre elles sont toutefois mortes : la première, au 30ème jour, pour des raisons inexpliquées ; la seconde, au 39ème jour, en présentant une petite tumeur de 3 mm de diamètre et la troisième, au 48ème jour, également avec une tumeur de petite taille. Les 2 autres souris étaient vivantes et en parfaite santé au 50ème jour suivant l'injection des cellules tumorales. - les 4 souris du groupe 2 ont toutes développé une tumeur atteignant au 26ème jour une taille respectivement égale à 27x30, 10x24, 14x17 et 12x18 mm. L'administration de l'extrait conforme à l'Invention à compter du 26ème jour a permis d'obtenir un arrêt de la croissance de ces tumeurs. Trois souris sont toutefois mortes aux 41ème et 49ème jours. La 4ème était vivante au 50ème jour de l'expérimentation et montrait une tumeur de même taille qu'au 26ème jour, témoignant d'un arrêt de la croissance de celle-ci. Ces résultats mettent en évidence qu'un extrait végétal conforme à l'Invention permet de retarder, voire de prévenir le développement de tumeurs lorsqu'il est administré par voie orale à des souris immédiatement après l'inoculation de cellules tumorales, tandis qu'il permet de stopper la croissance des tumeurs lorsqu'il est administré, également per os, alors que celles-ci sont déjà formées. b) Excérimentation 2 50 souris Balb/c ont été soumises à une injection unique et sous-cutanée de 0,1 ml d'une suspension contenant 107 cellules issues d'un myélome murin. 20 d'entre elles n'ont reçu aucun traitement afin de constituer un groupe contrôle. Les 30 autres souris ont été réparties en trois groupes de 10 et ont reçu quotidiennement, pendant 10 jours, une dose per os d'un extrait végétal obtenu conformément au protocole décrit à l'exemple 1, égale à - groupe 1 : 4 x 0,4 ml, - groupe 2 : 8 x 0,1 ml, et - groupe 3 : 8 x 0,2 ml, puis à compter du llème jour, une dose per os quatre fois plus faible que celle initialement administrée, c'est à dire respectivement égale à : - groupe 1 : 4 x 0,04 ml, - groupe 2 : 8 x 0,05 ml, et - groupe 3 8 x 0,1 ml. Les résultats au 19ème jour suivant le début du traitement sont illustrés dans le Tableau 2 ci-après. TABLEAU 2 Groupes j Nombre de souris ayant développé une tumeur Contrôle 17/20 1 i 1/10 2 l 1/8 3 | 2/10 Ainsi, contrairement aux souris du groupe contrôle, la majorité des souris traitées n'ont pas développé de tumeurs en dépit d'une inoculation d'une dose élevée de cellules tumorales. De plus, les tumeurs présentées par les souris du groupe contrôle étaient des tumeurs visibles tandis que celles développées par les souris traitées étaient des petites tumeurs bien circonscrites. 3. Etudes cliniques L'activité antitumorale d'un extrait végétal, obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 1, a été testée chez 21 patients adultes, affectés de différentes pathologies tumorales essentiellement malignes. Tous ont été traités par une administration orale dudit extrait, à raison de 40 ml par jour (4 x 10 ml) pendant une période comprise entre 1 et 12 mois en fonction de la réponse tumorale. Trois patients, atteints respectivement d'un carcinome rectal avec métastases, d'un carcinome ovarien envahissant et d'un carcinome colique, ont reçu conjointement une chimiothérapie classique tandis qu'un patient atteint d'un adénome prostatique, a reçu conjointement une hormonothérapie. Les résultats sont illustrés dans le Tableau 3 ci-après. Ce Tableau montre que l'administration quotidienne d'un extrait végétal conforme à l'Invention a permis d'obtenir une rémission totale de la pathologie tumorale chez 17 patients et une réduction tumorale suffisamment importante pour permettre une résection chirurgicale de la tumeur chez les 4 autres patients. TABLEAU 3 DUREE DU PATIENTS DIAGNOSTIC RESULTATS TRAITEMENT 1 Carcinome épidermoide pulmonaire infiltrant 8 mois Rémission totale 2 Astrocytome grade III 12 mois Réduction tumorale 3 Fibroadénome mammaire 2 mois Rémission totale 4 Carcinome épidermoide du larynx 45 jours Rémission totale 5 Carcinome de la tête du pancréas 2 mois Rémission totale 6 Carcinome intracanaliculaire mammaire 8 mois Rémission totale 7 Carcinome du col utérin envahissant 3 mois Rémission totale 8 Carcinome mammaire 1 mois Rémission totale Disparition des adénopathies et réduction 9 Mastopathie fibrokystique avec adénopathies 45 jours tumorale de 50% 10 Carcinome épidermoide pulmonaire 45 jours Réduction tumorale de 50% 11 Adénocarcinome de l'endomètre 3 mois Rémission totale 1 mois 12 Carcinome rectal avec métastases en association avec une Rémission totale chimiothérapie 13 Mélanome malin de haut grade 10 mois Rémission totale 14 Carcinome du col utérin envahissant 2 mois Rémission totale 6 mois Adénocarcinome prostatique et de la vésicule 15 en association avec une Rémission totale séminale hormonothérapie 3 mois 16 Carcinome ovarien envahissant en association avec une Rémission totale chimiothérapie Réduction tumorale et chute des marqueurs 17 Carcinome mammaire non précisée tumoraux (CA 15.3 et CEA) 4 mois 18 Carcinome colique avec métastases en association avec une Rémission totale chimiothérapie 19 Mastase récidivante 2 mois Disparition de la mastose 20 Carcinome de la vessie 9 mois Rémission totale 21 Myome utérin 4 mois Rémission totale REVENDICATIONS 1. Extrait végétal, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'extraits d'au moins trois plantes choisies parmi les genres Germanium, Plantago et Calendula. 2. Extrait végétal selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites plantes sont choisies parmi les espèces Geranium robertanium, Plantago lanceolata et Calendula officinales. 3. Extrait végétal selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par une macération des parties aériennes, fraîches ou sèches, desdites plantes dans un solvant approprié. 4. Extrait végétal selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par une macération des feuilles desdites plantes dans de l'eau. 5. Extrait végétal selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par une macération des feuilles desdites plantes dans de l'eau, à une température comprise entre 15 et 30"C et pendant une période de 3 à 15 jours. 6. Extrait végétal selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par une macération de 300 à 400 grammes de feuilles fraîches de Geranium robertanium, 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Plantago lanceolata et 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Calendula officinales, dans 3 litres d'eau. 7. Extrait végétal selon l'une quelconque des Revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu en outre par une filtration. 8. Extrait végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour l'utilisation comme médicament. 9. Procédé de préparation d'un extrait végétal comprenant un mélange d'extraits d'au moins trois plantes choisies parmi les genres Geranium, Plantago et Calendula, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - une macération des parties aériennes, fraîches ou sèches, desdites plantes dans un solvant approprié et, Si nécessaire - une filtration de l'extrait obtenu. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi les espèces Geranium robertanium, Plantago lanceolata et Calendula officinales. 11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que les feuilles desdites plantes sont mises à macérer dans de l'eau. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que les feuilles desdites plantes sont mises à macérer dans de l'eau, à une température comprise entre 15 et 30'C et pendant une période de 3 à 15 jours. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que 300 à 400 grammes de feuilles fraîches de Geranium robertanium, 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Plantago lanceolata et 10 à 50 grammes de feuilles sèches de Calendula officinales, sont mises à macérer dans 3 litres d'eau. 14. Conjugué phytoprotéique comprenant un extrait végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et de lla-foetoprotéine. 15. Conjugué phytoprotéique selon la revendication 14 pour l'utilisation comme médicament. 16. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un extrait végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou un conjugué phytoprotéique selon la revendication 14 ou 15.