FR 2735125 A1 19961213 FR 9506761 A 19950608 La présente invention a pour objet un procédé de production du cis3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé biologique d'obtention d'alcool spécifié ci-dessus. De nombreux aldéhydes et alcools en C6 sont produits lors du broyage des tissus végétaux et possèdent des propriétés organoleptiques et physiologiques très intéressantes. Parmi ces composés, le cis-3-hexènol est largement employé dans les compositions aromatiques pour leur donner une note "verte et fraîche". L'obtention de cet alcool est difficile, que ce soit par les voies biologiques ou par les voies de la synthèse organique. De nombreuses études ont été menées pour déterminer et mesurer la faculté de certains tissus végétaux à former du cis-3-hexènol. Parmi ces études, il convient de citer l'étude du Professeur Peter Schreier qui a fait l'objet de l'article (1986) "C6 volatils in homogenates from Green Leaves: localization of hydroperoxidase lyase activity", Lebensm. Wiss.u.Technol. 19, 152-156. Cette étude a montré que de nombreux tissus végétaux, notamment les feuilles, étaient susceptibles de produire des quantités mesurables de cis-3-hexènol. Plus particulièrement, il a été montré que les fanes de radis et de vignes pouvaient produire jusqu'à 80 mg dc cis-3hexènol par kg dc matériel végétal humide. L'article mentionné ci-dessus expose la voic enzymatique la plus généralement admise pour passer d'acides gras insaturés, notamment de l'acide linolénique, au cis-3hexènal puis au cis-3-hexènol. Ainsi, une lipoxygénase catalyserait la formation d'un hydro péroxyde qui serait ensuite ouvert par une hydropéroxyde lyase pour fournir les aldéhydes volatils en C6.Une aldéhyde réductase permettrait ensuite la réduction des aldéhydes en alcool correspondant. Les rendements évoqués ci-dessus, bicn qu'ils démontrent l'existence d'un système enzymatique permettant de fabriquer le cis-3hexènol à partir d'acide gras insaturé, sont insuffisants pour permettre une exploitation industrielle. C'est la raison pour laquelle, il a été proposé d'ajouter au broyat de feuilles de l'acide linolénique, précurseur naturel des aldéhydes et alcools en C6, pour augmenter la production du cis-3-hexènol et cis-3-hexènal. Les brevets US 4 769 243 et 4 806 879 donnent une bonne illustration d'une telle technique. Toutefois, ces techniques ne permettent qu'un rendement en alcool désiré médiocre. Le brevet français 2 652 587 fournit un procédé de synthèse du cis3-hexènol qui permet une amélioration significative par rapport aux résultats obtenus dans les procédés exposés ci-dessus. Dans le procédé de synthèse du cis-3-hexènol décrit dans FR 2 652 587, la synthèse est réalisée à partir d'acide gras insaturé par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol comme indiqué dans le schéma 1 ci-après. Dans ce procédé, I'addition de levure permet de privilégier la transformation du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol plutôt que l'isomérisation du cis-3-hexènal en trans-2-hexènal. En outre, le cis-3hexènol est plus stable que son homologue aldéhydique, et aucune isomérisation en trans-2-hexènol n'est observée. Le but de la présente invention est d'augmenter le rendement en cis-3-hexènol par ce procédé de production à partir d'acides gras insaturés par action combinée d'un système naturel d'enzymes et de levures. On a découvert selon la présente invention, que le rendement était fortement augmenté en utilisant un système enzymatique consistant en un broyat végétal de feuilles, notamment de fenouil, récoltées entières sans les pré-dilacérer. La présente invention a donc pour objet un procédé de production du cis-3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé, dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol. Selon une première caractéristique de la présente invention, le système enzymatique consiste en une masse végétale obtenue par broyage de feuilles récoltées entières sans les pré-dilacérer. On a également découvert que la quantité de cis-3-hexènol produite selon le procédé dépend de la granulométrie du broyat. Si le broyat est un broyat cellulaire, la quantité de cis-3-hexènol produite est augmentée. De façon avantageuse, selon une deuxième caractéristique de la présente invention, le système enzymatique est introduit sous forme d'un broyat cellulaire obtenu par broyage suivi d'une désintégration cellulaire. La présente invention fournit en outre des réactifs pouvant stimuler les activités enzymatiques nécessaires à la production de cis-3hexènol et/ou inhiber des activités enzymatiques secondaires responsables de fuites métaboliques induisant une baisse du rendement de production en cis-3-hexènol. On a en effet, découvert selon la présente invention que l'ajout d'un réactif choisi parmi un cation ferreux, l'acide acétylsalicylique, la chlorophylle B et l'enzyme catalase, permet d'augmenter les rendements en cis-3-hexènol. La présente invention a donc pour objet un procédé de synthèse du cis-3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé, dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol, caractérisé par le fait qu'on introduit avec ledit acide gras insaturé et ledit système enzymatique dans un milieu de culture aqueux, un réactif choisi parmi un cation ferreux, I'acide salicylique, la chlorophylle B et l'enzyme catalase. Avantageusement, I'ajout des réactifs se fait par addition de ceux-ci dans l'eau de dilution de la matière végétale. Le cation ferreux peut se présenter sous forme de sels ferreux notamment d'halogénure ferreux et en particulier de chlorure ferreux, mais aussi de complexes du fer tels que des porphyrines. Dans le procédé selon l'invention, les levures utiles dans le procédé peuvent être toute levure présentant les caractéristiques suivantes activité alcool déshydrogénase importante permettant de réduire les composés carbonylés en alcools correspondants. On utilise avantageusement une levure du type saccharomyces, de préférence Saccharomyces cerevisiae. Avantageusement, la réaction est réalisée dans un milieu de culture favorable aux systèmes enzymatiques et aux levures. Les milieux de culture favorables aux levures sont bien connus de l'homme du métier et n'ont pas besoin d'être détaillés dans la présente description. II convient toutefois de noter, que lorsqu'on utilise des broyats dc feuilles comme système naturel d'enzyme, la pulpe obtenue par mélange en milieux aqueux dudit broyat constitue un milieu de culture convenable. Pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention, il est souhaitable d'effectuer la séquence d'étapes suivantes a) introduction dudit acide gras insaturé et dudit système enzymatique dans un milieu de culture aqueux; b) introduction de la levure dans ledit milieu dc culture. Pour minimiser la production de composés indésirés, tels que le trans-2-hexènal et le trans-2-hexènol, I'introduction de ladite levure doit être effectuée au plus tard au moment où la concentration en cis-3hexènal dans ledit milieu est maximale. Comme la courbe de la teneur en cis-3-hexènal en fonction du temps est une courbe relativement aplatie, la période de temps pendant laquelle il n'y a pas grand dommage à attendre pour ajouter la levure est assez étendue. Toutefois on préfère introduire la levure simultanément aux autres réactifs car les aldéhydes et alcools en C6 se forment très rapidement. Pour obtenir un meilleur résultat, il est préférable qu'au moment de l'introduction de la levure dans ledit milieu de culture, ladite levure soit en phase de croissance. Avantageusement, le pH du milieu de culture est maintenu entre les valeurs arrondies 2 et 7, de préférence entre 3 et 6. La température à laquelle doit avoir lieu la synthèse est limitée par les cinétiques des systèmes enzymatiques et des levures. En outre, à partir d'une certaine élévation de température, les levures sont tuées et ne sont plus utilisables. C'est pourquoi, en général, on utilise une température comprise entre 0 C et 60oC avantageusement, entre 15"C et 40"C, en général aux alentours de la température ambiante, c'est-à-dire entre 17"C et 30"C. Toutefois, il peut cotre intéressant de mettre en oeuvre le système enzymatique à des températures comprises entre 0 C et 20 C, pour obtenir une excellente sélectivité de la production en dérivés du cis-hexène-3 par rapport à ceux du trans-hexène-2. Un abaissement de température significatif, bien que réduisant d'une manière importante la cinétique, permet de privilégier la formation du cis-3-hexènol par rapport au trans2-hexènal et au trans-2-hexènol en évitant l'évolution du cis-3-hexènal vers le produit thermodynamiquement le plus stable : le trans-2-hexènal. Le système enzymatique permettant d'obtenir une quantité importante de volatiles en C6 peut provenir d'un grand nombre de tissus végétaux. Ainsi, il peut provenir des feuilles de vigne, du tabac, de chicorée (notamment des espèces produisant des endives), de poireaux, de navet, de choux-rave et de radis. De tels systèmes existent également dans les tissus du soja, du colza et de différentes variétés de Rumex. On peut également citer les tissus de plantes fournissant des baies telles que les feuilles de fraisiers. Toutefois, le système enzymatique préféré selon la présente invention est celui que l'on peut obtenir à partir de fenouil. En général, ces systèmes enzymatiques utilisent les acides gras constitutifs qui sont susceptibles d'être transformés en aldéhyde en C6. II est cependant préférable d'ajouter certaines quantités d'acides gras comme précurseur pour augmenter le rendement. Ces acides gras sont en général des acides linoléniques ou linoléiques. Cela peut toutefois être tout acide gras insaturé à chaine linéaire, possédant au moins trois insaturations, lesquelles insaturations sont situées en position, 6, 9 et 12 à partir de l'extrémité Cl-13 de la chaine carbonéc. Lorsque l'on utilise comme système enzymatique une masse végétale obtenue par broyage de tissus adéquats, il est avantageux que l'acide gras introduit ait une concentration comprise entre 0,1 % et 2 % en poids de la masse végétale humide. Celle-ci est en suspension à 10 % à 25 % dans de l'eau distillée. Les acides gras peuvent être introduits sous forme acide ou sous la forme d'un sel dont le cation associé à l'acide gras est acceptable pour les levures et pour le système enzymatique. II est généralement souhaitable que les sels d'acide gras soient solubles en milieux aqueux. Les sels les plus couramment utilisés sont les sels des acides gras avec les métaux alcalins et avec le cation ammonium. L'acide linolénique peut être introduit soit sous forme pure, soit en mélange avec d'autres acides gras. En particulier, il est possible d'utiliser des mélanges d'acide gras provenant de la saponification d'huiles richcs en acide linolénique, telle que l'huile de lin. La saponification peut être réalisée soit par voie chimique, soit par voie biologique, par exemple au moyen de lipases.On utilise de façon appropriée un hydrolysat d'huilc de lin notamment dans une concentration de 0,5 % ou 1% par rapport au poids du matériel végétal humide mis en oeuvre. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. A. Protocole oDératoire général (Schéma I) 1. 50g de feuilles de fenouil (Foeniculum Vulgare, variété vulgare) sont broyées dans un broyeur puis mises en suspension dans 0,200 litre d'eau. On ajoute simultanément l'additif testé et l'hydrolîsat d'huile de lin à 1% en poids par rapport au matériel végétal mis en oeuvre. La température est la température ambiante (20"C environ). Les levures sont ajoutées à une concentration de 2% en poids par rapport au matériel végétal mis en oeuvre. Elles sont en phase de croissance et sont ajoutées soit simultanément et en tout les cas pas plus tard qu'après 45 min. d'incubation. L'homogénat obtenu est ajusté à plI 4 et laissé sous agitation pendant 15 min. L'homogénat est ensuite distillé. Plus précisément le cis-3-hexènol produit est extrait du broyat à l'aide d'une colonne à distiller par entraînement à la vapeur. Le distillat aqueux collecté est 40 fois plus conccntré que Ic broyat d'origine. Le distillat est extrait du solvant et l'extrait est rectifié. 2. Les mesures ont été réalisées en chromatographie en phase gazeuse, selon la méthode décrite ci-après. L'extraction et le dosage des volatiles se font suivant le protocole suivant. Après incubation, on ajoute au milieu 200 ml d'eau et le standard interne. Le milieu est ensuite soumis à un entraînement à la vapeur. 250 ml de distillat sont récupérés ct extraits avec trois fois 100 ml de penthane ether (2:1). Après séchage et concentration à 1 ml, l'extrait est analysé en chromatographie en phase gazeuse comme décrit ci-dessous APpareil: Chromatographie Hewlett Packard 5890 équipé d'un injecteur split/splitless et d'un détecteur à ionisation de flamme. Colonne: FFAP Hewlett Packard 50 m - diamètre : 0,32 mm - Epaisseur du film 0,52 zm. Conditions d'analyse: Débit colonne Flue: 2ml/mn, make up : 30 ml/mn, air : 350 ml/mn, hydrogène: 30 ml/mn. Température de l'injecteur ct du détecteur : 250 C. Programme 50"C isotherme 3 minutes, 3 C/mn jusqu'à 120 C, puis 2 C/mn jusqu'à 200"C, et isotherme à 220 C pendant 60 minutes. B. Optimisation de la production de Cis-3-hexènol 1) Ajout de réactifs En mettant en oeuvre le protocole operatoire ci-dessus, différents essais ont été menés pour tester différents réactifs pouvant avoir une influence sur la production du cis-3-hexènal et du cis-3-hexènol par les tissus de végétaux. En outre on a examiné l'influence de la concentration du réactif. On rassemble ci-après dans les tableaux I à IV les données concernant les réactifs sélectionnés selon la présente invention. Bien que les mécanismes d'action de ces différents réactifs ne soient pas totalement élucidés dans la production de cis-3-hexènol, il semble possible que l'ajout du scl ferreux améliore l'activité enzymatique car les lipoxygénases nécessaires pour la production des aldéhydes ct alcools en C6 possèdent dans leur site actif un atome de Fer (ferreux) lié à 4 noyaux imidazoles provenant des 4 histidines, acides aminés constitutifs de l'enzyme de sorte que la transition réversible Fe2 + (ferreux)/Fe3 + (ferrique) permet les échanges d'électrons nécessaires à la formation des hydroperoxydes. L'utilisation de l'acide salicylique pourrait inhiber la voie métabolique secondaire conduisant aux dérivés jasmoniques à partir des hydroperoxydes produits par l'activité lipoxygénasique, et ainsi favoriser la voie conduisant aux alcools et aldéhydes en C6. L'addition de chlorophylle B pourrait être impliquée dans la chaîne de réactions enzymatiques conduisant des acides gras insaturés aux aldéhydes et alcools en C6 permettant d'accroitre l'activité enzymatique. La catalase est une enzyme connue pour former de l'eau et de l'oxygène à partir du peroxyde d'hydrogène (li202). Ce composé est un sous produit de l'activité enzymatique impliquée dans l'oxydation des acides gras insaturés et inhibiteur de l'activité enzymatique. L'addition de catalase au broyat végétal pourrait donc nous permettre de lever l'inhibition et ainsi de favoriser l'activité des enzymes nous intércssant. De l'examen des résultats il apparaît que pour certains réactifs il existe une quantité optimale qui peut être déterminée en fonction des systèmes enzymatiques concernés par dc simples opérations d'exécution. Ainsi la concentration en sel ferreux doit être supérieure à 1 mM dans le broyat végétal. La concentration en acide salicylique peut aller dc 0,5 à 1,5 mNí dans le broyat végétal. La concentration en chlorophylle B est avantageusement supérieure à 5 x 10-6 mM dans le broyat végétai. Enfin, la concentration en catalase dans le broyat végétal est avantageusement supérieure à 5000 unités d'activité enzymatique par litre de broyat. Les résultats obtenus sont les suivants a) Chlorure ferreux (FeCI2) TABLEAU I FeCl2 (concentration exprimée en 1 2 millimolaire dans le broyat végétal) Concentration en cis-3-hexènol en 327 302 ppm par rapport au fenouil Témoin sans FeCI2 342 281 # en % - 15 % + 7,5 % b) Acide acétylsalicylique TABLEAU II Acide acétylsalicylique (Concentration exprimée 0,25 0,5 1 2 en millimolaire dans le broyat) Concentration en cis-3 hexènol en ppm par 310 325 425 295 rapport au fenouil Témoin sans réactif 342 81 342 342 # en % - 10 + 16 + 24 - 14 c) Chlorophylle B TABLEAU III Chlorophylle B en mg pour 50 g de fenouil 1 2 Concentration en cis-3-hexènol en ppm par rapport au fenouil 346 417 Témoin sans réactif 342 342 A en % +1 + 22 Les concentrations en chlorophyle B sont de 4.4 10-6 et 8.8 10-6 millimolaire respectivement (PM = 907.51). d) Catalase TABLEAU IV Catalase en mg pour 50 g de fenouil 10 100 Concentration en cis-3-hexènol en ppm par rapport au fenouil 377 412 Témoin sans catalase 312 342 A en % + 10 + 20 Ces concentrations de îOmg pour 50g de fenouil et 100 mg pour 50g de fenouil correspondent respectivement à 6 160 et 12 320 unités d'activité enzymatique par litre de broyat. Dans les tableaux I à IV, la concentration en cis-3-hexènol est exprimée en ppm par rapport à la masse du broyat végétal de fenouil. 2) Influence du broyage sur son expression (Fenouil : Foeniculum Vulgare variété Vulgare) Il n'est pas possible de donner de fourchette de granulométrie pour caractériser la finesse du broyat, celui-ci étant très hétérogène. II contient en effet de nombreuses fibres de différentes tailles qui rendent incohérentes les mesures de granulométrie. Par contre, les différents essais effectués montrent sans amibiguïté l'influence déterminante de la nature du broyage. Lot 1 Lot 2 Lot 3 Moyenne % feuilles 38 31 27 32 A = 2 broyages avec un broyeur à marteaux 360 307 B = 1 seul broyage avec un broyeur à marteaux + 1 broyage par - 350 désintégrateur cellulaire C = 2 broyages avec un broyeur à marteaux + 1 broyage par 417 387 364 389 désintégrateur cellulaire Le potentiel de 389 ppm dans la plante entière, (ce qui correspond à 1215 ppm dans la feuille obtenue dans l'expérience C) montre que le broyage initial est non limitant. Le second broyage est limitant avec le broyeur à marteaux, mais le rendement maximum n'est atteint qu'avec le désintégrateur cellulaire. Le broyeur à marteaux utilisé est un broyeur à marteaux de type RIErZ RD 12 et le désintégrateur cellulaire est de type SILVERSON 600 LS à simple rotor. 3) Effet du mode de récolte sur le rendement Plante entière Ensileuse portée Ensileuse automotrice 389 ppm 216 ppm 290 ppm L'ensileuse coupe la plante en petits morceaux. L'ensileuse permet de récolter de la matière végétale prébroyée. Celle-ci occasionne donc un traumatisme important diminuant ainsi l'activité enzymatique. Le rendement maximum est obtenu avec la plante entière. SCHEMA I SCHEMA DE PRODUCTION DU CIS 3 HEXENOL Feuilles fraîches + + 200 ml d'eau distillée Broyage avec acide linolénique et réactif selon l'invention Homogenat 1 Incubation (45') à température du laboratoire sous agitation Homogenat riche en cis-3-hexènal en Addition de levure en phase dc croissance incubation (2h) Homogenat riche en cis-3-hexènol 1 Entraînement à la vapeur Extraction du distillat au penthane ether (2: :1) 1 Extrait riche en volatiles en C6 REVENDICATIONS 1. Procédé de production du cis-3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé, dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol, caractérisé en ce que le système enzymatique consiste en une masse végétale obtenue par broyage de feuilles récoltées entières sans les pré-dilacérer. 2. Procédé de production du cis-3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé, dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol, caractérisé en ce que le système enzymatique est introduit sous forme d'un broyat cellulaire obtenu par broyage suivi d'une désintégration cellulaire. 3. Procédé de production du cis-3-hexène-1-ol à partir d'acide gras insaturé, dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexènal et d'unc levure permettant la réduction du cis-3-hexènal en cis-3-hexènol, caractérisé par le fait qu'on introduit avec ledit acide gras insaturé et ledit système enzymatique dans un milieu de culture aqueux, un réactif choisi parmi un cation ferreux, I'acide salicylique, la chlorophylle B et l'enzyme catalase. 4. Procédé selon l'une des revendications là 3, caractérisé cn ce que ledit système enzymatique est introduit sous la forme de feuilles de fenouil. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit réactif est introduit dans ladite masse végétale obtenue après broyage. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'introduction de ladite levure dans ledit milieu de culture est effectuée au plus tard au moment où la concentration en cis-3-hexènal dans ledit milieu est maximale. 7. Procédé de synthèse selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'au moment de l'introduction, ladite levure est en phase de croissance. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le plI dudit milieu de culture est maintenu entre 2 et 7, de préférence entre 3 et 6. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la température du milieu dc culture est maintenu entre 15"C et 40"C. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit acide gras est choisi dans le groupe constitué par l'acide linolénique. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit acide gras est l'acide linoléniquc ct qu'il est introduit à une concentration comprise entre 0,1 % et 2% en poids de la masse végétale. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit acide gras linolénique est introduit sous forme d'hydrolysat d'huile de lin. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la récupération cis-3-hexène-1-ol se fait par entrainement à la vapeur.