FR 2734484 A1 19961129 FR 9506417 A 19950524 COMPOSITION VACCINALE LIQUIDE ET SON PROCEDE DE FABRICATION L'invention concerne le domaine des compositions vaccinales. Plus particulièrement, I'invention concerne une composition vaccinale liquide comprenant au moins un polysaccharide capsulaire de bactérie couplé à une protéine tétanique. On connaît dans l'art antérieur, et notamment par l'article "Clinical and Immunologic responses to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b alone or conjugated to tetanus toxoid in 18 - to 23 - month - old children", Bo A. Claesson and al, The Journal of Pediatrics, May 1988, un antigène susceptible d'être utilisé à des fins vaccinales chez les jeunes enfants et de les protéger ainsi des infections provoquées par Haemophilus influenzae de type b. Cet antigène est constitué par un polysaccharide capsulaire de la bactérie, le polyribosylribitol phosphate (ou PRP) qui est rendu T-dépendant grâce à un couplage à une protéine porteuse, I'anatoxine tétanique. L'antigène conjugué ainsi obtenu, ou PRP-T, s'est révélé être un bon immunogène, très bien toléré lors de la vaccination de jeunes enfants.Cependant, ainsi que le mentionne cet article, on a remarqué que l'antigène, adsorbé sur hydroxyde d'aluminium, était, après stockage, moins immunogène que l'antigène maintenu en solution saline. Or, étant donné qu'un certain nombre de compositions vaccinales comportent un adjuvant à base d'aluminium sur lequel viennent se fixer les antigènes, il serait avantageux de pouvoir, sans perte d'immunogénécité, leur ajouter l'antigène constitué par le PRP-T. Afin de disposer d'un moyen d'administrer en une seule injection le PRP-T et d'autres antigènes vaccinaux, il a été proposé dans l'art antérieur une seringue particulière à 2 compartiments, le PRP-T étant contenu sous forme lyophilisée dans un premier compartiment alors que les autres antigènes sont présents en suspension aqueuse dans un second compartiment, le contenu des 2 compartiments étant mélangé extemporanément. Cette solution, si elle permet bien de résoudre le problème des injections multiples des diverses valences vaccinales présente cependant des inconvénients, notamment au niveau de la fabrication , la lyophilisation et les opérations particulières de conditionnement, ainsi que l'utilisation d'une seringue spécifique, compliquent le procédé de fabrication, ce qui en augmente le coût. En outre, au moment de l'administration, il est nécessaire d'effectuer une reprise du lyophilisat, ce qui représente une contrainte supplémentaire pour le praticien et qui comporte, comme toute opération, le risque d'être mal effectuée. Il existe donc un besoin de pouvoir disposer de compositions stables associant le maximum de valences vaccinales, pouvant être administrées facilement en une seule injection, et dont les conditions de fabrication permettent la production au moindre coût. Le but de la présente invention est de proposer de telles compositions. Pour atteindre ce but, I'invention a pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène constitué par un polysaccharide capsulaire de bactérie couplé à une protéine tétanique, ainsi que des complexes d'aluminium à titre d'immunoadjuvant, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des moyens pour maintenir la stabilité du polysaccharide capsulaire de bactérie, en milieu liquide. Selon une caractéristique particulière de l'invention, les complexes d'aluminium sont constitués par des phosphates d'aluminium en suspension. Selon une autre caractéristique, la composition vaccinale de l'invention est additionnée d'anions, tels que des phosphates ou des citrates. Ainsi, même en présence d'une suspension d'hydroxydes d'aluminium qui est un adjuvant communément utilisé pour les vaccins, L'antigène constitué par le PRP-T conserve son bon caractère immunogène, et il est donc possible de disposer de combinaisons vaccinales stables entièrement liquides. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène constitué par un polysaccharide capsulaire de bactérie couplé à une protéine tétanique, ainsi que des complexes d'aluminium à titre d'immunoadjuvant, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à maintenir la stabilité du polysaccharide capsulaire de bactérie en milieu liquide. Selon un mode particulier, le procédé selon l'invention consiste à maintenir la stabilité du polysaccharide en évitant ou en réduisant sa fixation aux complexes d'aluminium. Ainsi, le polysaccharide est maintenu en solution dans la composition vaccinale et conserve toute son immunogénicité. Selon une caractéristique particulière, le procédé de fabrication selon l'invention consiste à utiliser à titre d'immunoadjuvant, des complexes d'aluminium constitués essentiellement par des phosphates d'aluminium. Selon une autre caractéristique, le procédé de fabrication selon l'invention consiste à ajouter aux complexes d'aluminium des anions tels que des phosphates ou des citrates. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre. L'antigène polysaccharidique capsulaire de bactérie dont il s'agit est par exemple constitué par un polymère linéaire consistant en ribose, ribitol, et acide phosphorique, qui a la structure monomère suivante: Cet antigène est conjugué avec une protéine porteuse capable d'induire une réponse immunitaire des cellules T, qui est l'anatoxine tétanique. Une méthode d'obtention de cet antigène peut être celle décrite par Schneerson et al dans "Quantitative and qualitative analysis of serum antibodies elicited in adults by Haemophilus influenzae type b and pneumococcus type 6A capsular polysaccharidetetanus toxoïd conjugates", Infect. Immun. 52:519 (1986). On a remarqué qu'en présence d'une suspension de complexes d'aluminium, telle que par exemple de l'hydroxyde d'aluminium, de lthydroxyphosphate d'aluminium, comprenant ou non des sulfates de potassium, la fixation du PRP-T aux complexes d'aluminium était réduite, voire supprimée, lorsqu'on ajoutait à la suspension des anions tels que des phosphates ou des citrates. Cette réduction ou suppresssion de la fixation du PRP-T aux complexes d'aluminium présente l'avantage de maintenir le caractère immunogène du PRP-T. Les quantités d'ions phosphates qu'il est nécessaire d'ajouter à la suspension de complexes d'aluminium varient selon la nature des complexes. Ainsi, lorsqu'il s'agit d'une suspension d'hydroxydes d'aluminium contenant 20 pg/ml de PRP-T, on a remarqué qu'une adjonction d'ions phosphates à une concentration de 50 mmole/l permettait de séduire la fixation à 10 %, alors que, lorsqu'il s'agit d'une suspension de phosphates d'aluminium, sans ajout d'ions phosphates, la fixation de PRP-T n'est que de 40 %, et l'ajout d'une faible quantité d'ions phosphates permet de réduire fortement le taux de fixation; par exemple l'ajout d'ions à une concentration de 2 mmole/l permet de réduire le taux de fixation à 10 % et l'ajout d'ions à 4 mole'l permet de supprimer complètement la fixation.Les concentrations molaires indiquées correspondent aux concentrations calculées à partir de la quantité d'anions ajoutées et de la quantité d'anions éventuellement apportées par les substances tampon utilisées. Que les ions phosphates soient ajoutés à la suspension de complexes d'aluminium préalablement à l'ajout du PRP-T, ou que les ions phosphates soient ajoutés au PRP-T préalablement à sa mise en contact avec les complexes d'aluminium, on obtient toujours une réduction de la fixation du PRP-T aux complexes d'aluminium. Alternativement, il est possible de remplacer les ions phosphates par d'autres anions, tels des ions citrates, ou par une combinaison d'anions de différentes natures. Grâce à la présente invention, il est possible de produire des combinaisons vaccinales entièrement liquides, stables, et comportant l'antigène capsulaire polysaccharidique de Haemophilus influenzae type b, possédant pour chaque valence vaccinale une très bonne immunogénicité. On peut ainsi combiner dans une seule composition les antigènes correspondants à des valences vaccinales diverses telles que : diphtérie, tétanos, hépatite A, hépatite B, poliomyélite, coqueluche (que ce soit à germe entier ou à base d'antigène purifié) etc... De plus, on a remarqué que l'utilisation d'une telle composition vaccinale liquide permettait lors de la vaccination de rappel effectuée chez des nourrissons de 12 mois ayant reçu des injections à 2, 4 et 6 mois, d'accroître la production d'anticorps anti PRP-T de façon particulièrement accrue par rapport à un rappel effectué dans les mêmes conditions avec le vaccin TETRAct-HIBo commercialisé par la Société PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins. Ex. 1. On fabrique une dose de 0,5 ml d'une composition vaccinale à partir des éléments suivants: . anatoxine tétanique purifiée (ATP) i 1 unité vaccinante . anatoxine diphtérique purifiée (ADP) 1 unité vaccinante mélange cellulaire Pertussis 15 OU (unités opacimétriques) . PRP-T 12 g . merthiolate 43,75 g hydroxyde d'aluminium (exprimé en Al) 0,3 mg . phosphates 30 moles tampon tris 10 mmolaire comprenant du 0,125 ml saccharose à 8,5 % # eau p.p.i. qsp 0,5 mi Les ions phosphates sont apportés à partir d'une solution contenant du phosphate monopotassique, du phosphate disodique et du chlorure de sodium. Ex. 2: On a testé l'immunogénicité de la composition vaccinale obtenue selon l'exemple 1, comparativement à l'immunogénicité d'un vaccin de l'art antérieur, constitué par le vaccin commercialisé sous la marque TETRAct-HIBTM et qui possède les mêmes valences vaccinales mais où la valence PRP-T conservée lyophilisée est reconstituée juste avant l'injection par la composition vaccinale contenant les anatoxines diphtériques, tétaniques ainsi que le mélange cellulaire Pertussis. Ce test a été réalisé sur un groupe de 262 nourrissons, dont 132 ont reçu la formulation selon l'exemple 1 et 130 ont reçu le vaccin commercial TETRAct-Ht L'administration des vaccins a été effectuée à 2, 6 mois et 12 mois en intra-musculaire. Avant immunisation, le titre GMT en anti-corps anti-PRP était de 0,2 pg/ml dans les 2 groupes ; il était de 1,9 et 1,4 pg après la seconde injection et de 5,9 et 5,8 après la 3ème injection respectivement pour le vaccin selon l'invention et le vaccin de l'art antérieur. Après la seconde injection, 98% (avec le vaccin selon l'invention) et 93 % (avec le vaccin selon l'art antérieur) des nourrissons avaient un taux d'anticorps anti-PRP supérieur à 0,15 llg/ml; ce taux était atteint après la 3ème injection chez 100 % des nourrissons ayant reçu le vaccin selon l'invention et chez 99 % des nourrissons ayant reçu le vaccin selon l'art antérieur. Après la 3ème injection, les quantités dianticorps dirigés contre chacune des valences vaccinales étaient en moyenne les suivantes Vaccin art antérieur Vaccin invention Diphtérie 1,35 1,56 UI/ml Tétanos 5,1 4,4 UI/ml Pertussis 597 601 titre PRP pg/ml 5,8 5,9 Après l'injection de rappel effectuée à 12 mois, les quantités d'anticorps étaient cette fois:: Vaccin art antérieur Vaccin invention Diphtérie 3,2 4,5 Ul/nil Tétanos 12,0 11,5 Ul/mI Pertussis 2447 2560 titre CH2 g/ml 19,4 32,6 Ces résultats montrent que la combinaison vaccinale obtenue selon l'invention est stable; en effet l'injection de rappel effectuée sur des enfants de 12 mois, a été réalisée avec un vaccin ayant été fabriqué 18 mois auparavant : or les résultats montrent que l'immunogénicité de chacun des antigènes de la combinaison est conservée. En outre, on obtient, de façon surprenante, un effet rappel nettement supérieur avec la composition vaccinale selon l'invention, par rapport à l'effet rappel obtenu avec un vaccin de l'art antérieur possédant les mêmes valences vaccinales. Revendications 1. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène constitué par un polysaccharide capsulaire de bactérie couplé à une protéine tétanique ainsi que des complexes d'aluminium à titre d'immuno-adjuvant, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des moyens pour maintenir la stabilité du polysaccharide capsulaire de bactérie en milieu liquide. 2. Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polysaccharide capsulaire de bactérie est le polysaccharide capsulaire de Haemophilus influenzae de type b ou polyribosylribitol phosphate, et en ce que la protéine tétanique est l'anatoxine tétanique. 3. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les moyens pour maintenir la stabilité du polysaccharide comprennent des moyens pour réduire ou éviter la fixation du polysaccharide aux complexes d'aluminium. 4. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les complexes d'aluminium comprennent des phosphates d'aluminium. 5. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les complexes d'aluminium comprennent des hydroxydes d'aluminium. 6. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les moyens pour maintenir la stabilité du polysaccharide comprennent l'addition d'anions. 7. Composition vaccinale selon la revendication 6, caractérisée en ce que les anions sont choisis parmi : les phosphates, les citrates. 8. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une ou plusieurs des valences vaccinales choisies parmi . diphtérie, tétanos, coqueluche, hépatite B, poliomyélite. 9 Procédé de fabrication d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène constitué par. un polysaccharide capsulaire de bactérie couplé à une protéine tétanique ainsi que des complexes d'aluminium à titre d'immunoadjuvant, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à maintenir la stabilité du polysaccharide capsulaire de bactérie en milieu liquide. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polysaccharide capsulaire de bactérie est le polysaccharide capsulaire de Haemophilus influenzae de type b ou polyribosylribitol phosphate, et en ce que la protéine tétanique est l'anatoxine tétanique. 11. Procédé selon une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il consiste à maintenir la stabilité du polysaccharide en milieu liquide en réduisant ou en évitant sa fixation aux complexes d'aluminium. 12. Procédé selon une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser à titre d'immunoadjuvant des complexes d'aluminium comprenant des phosphates d'aluminium. 13. Procédé selon une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à ajouter aux complexes d'aluminium des anions. 14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les anions sont choisis parmi : les phosphates, les citrates. 15. Procédé selon une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la quantité d'anions ajoutée est calculée pour conduire au moment de leur addition à une concentration d'au moins 2 mmoles/l dans la composition vaccinale.