FR 2726285 A1 19960503 FR 9413355 A 19941028 ADENOVIRUS DEPOURVUS DE PARTICULES CONTAMINANTES VIABLES. PREPARATION ET UTILISATIONS La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux. Plus particulièrement, la présente invention concerne des adénovirus recombinants comme vecteurs pour la thérapie génique. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. Parmi ces virus, les adénovirus présentent certaines propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intégrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adénovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), le foie (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), le système nerveux (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), etc. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (Ela et E lb notamment) sont nécessaires à la réplication virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Li à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus de sérotypes différents (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées. Compte tenu des propriétés des adénovirus mentionnées ci-dessus, ceux-ci ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (D-gal, OTC, cr- lAT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, I'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés des régions El (Ela et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).D'autres constructions comportent une délétion au niveau de la région El et d'une partie non essentielle de la région E4 (W094/12649). Néanmoins, les vecteurs décrits dans l'art antérieur présentent certains inconvénients qui limitent leur exploitation en thérapie génique. En particulier, les lots de virus recombinants du type de ceux décrits dans l'art antérieur peuvent être contaminés par des particules réplicatives, notamment de type sauvage. Actuellement, les vecteurs dérivés des adénovirus sont en effet produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 contient l'extrémité gauche (environ 11-12%) du génome de I'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et la région El, incluant Ela, Elb et une partie de la région codant pour la protéine pIX. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, nécessaire à la réplication. En effet, les adénovirus recombinants El- peuvent être préparés dans les cellules 293 du fait de la bonne transcomplémentation de la région El contenue dans cette lignée.Néanmoins, il existe des zones d'homologie entre la région de I'adénovirus intégrée dans le génome de la lignée et l'ADN du virus recombinant que l'on souhaite produire. De ce fait, au cours de la production, différents événements de recombinaison peuvent se produire, générant des particules virales réplicatives, notamment des adénovirus de type El+. Comme indiqué sur la figure 2, il peut s'agir d'un événement simple de recombinaison suivi d'une cassure du chromosome (figure 2A), ou d'une double recombinaison (figure 2B). Ces deux types de modification conduisent à remplacer la partie gauche de l'ADN recombinant, dépourvue d'une région El fonctionnelle, par la partie correspondante présente dans le génome de la cellule, qui porte une copie fonctionnelle de la région El.Par ailleurs, compte tenu des titres élevés de vecteur recombinant produits par la lignée 293 (supérieur à 1012), la probabilité que ces événements de recombinaison aient lieu est élevée. De fait, il a été constaté que de nombreux lots de vecteurs adénoviraux recombinants défectifs étaient contaminés par des particules virales réplicatives. La contamination par des particules réplicatives constitue un inconvénient important. En effet, la présence de telles particules dans des compositions thérapeutiques induirait in vivo une propagation virale et une dissémination incontrolée, avec des risques de réaction inflammatoire, de recombinaison, etc. Les lots contaminés ne peuvent donc être utilisés en thérapie humaine. La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. La présente invention décrit en effet de nouvelles constructions permettant la production d'adénovirus recombinants défectifs dépourvus de toute contamination par des particules réplicatives. La présente invention décrit également une méthode pour la production des ces adénovirus recombinants. Elle fournit ainsi de nouveaux vecteurs recombinants défectifs dérivés des adénovirus, particulièrement appropriés pour un usage en thérapie génique, notamment pour le transfert et l'expression de gènes in vivo. La présente invention réside plus particulièrement dans la construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant un génome d'adénovirus dont l'organisation génétique est modifiée et dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales nonréplicatives et/ou non-viables. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de modifier l'organisation génomique de l'adénovirus pour éviter la production de particules réplicatives lors de la production des stocks. Un premier objet de la présente invention concerne donc un adénovirus recombinant comprenant un génome d'adénovirus (i) dont la région El est inactivée, (ii) dont l'organisation génomique est modifiée et (iii) dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non-viables. Au sens de la présente invention, on entend par organisation génétique ou génomique l'agencement des différents gènes ou régions fonctionnelles présents dans le génome de I'adénovirus sauvage, tel que représenté sur la figure 1. Une organisation génétique ou génomique modifiée correspond donc à un génome dans lequel certains gènes ou certaines régions ne sont pas à leur position d'origine. Ainsi, certains gènes ou certaines régions peuvent être déplacées du génome et insérées en un autre site. Il est également possible d'insérer en un site particulier un gène ou une région donnés, et de supprimer ou d'inactiver la région d'origine (par mutation, délétion, insertion, etc). Le terme particule virale non-viable désigne au sens de l'invention un adénovirus incapable de répliquer son ADN et/ou de se propager de façon autonome dans les cellules infectées. Une particule virale non-viable possède donc un génome d'adénovirus dépourvu au moins de séquences nécessaires à sa réplication et/ou sa propagation dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences. Les séquences nécessaires à la réplication et/ou la propagation sont par exemple la région El, la région E4 ou la région L5. Plus particulièrement, s'agissant de la région E4, les gènes importants sont les gènes ORF3 et ORF6. La demanderesse a plus particulièrement montré qu'il est possible de déplacer une fonction essentielle à la réplication ou à la propagation virale sans affecter les propriétés de I'adénovirus comme vecteur de thérapie génique, à savoir son haut pouvoir d'infection des cellules, notamment humaines, et sa capacité à transférer efficacement une gène d'intérêt dans lesdites cellules. Ainsi, dans un mode préféré, la présente invention a pour objet des adénovirus recombinants dont une région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est présente dans une position génomique autre que sa position d'origine. Avantageusement, cette région se situe au niveau ou à proximité d'une autre région génomique rendue non fonctionnelle. Les vecteurs de l'invention sont particulièrement avantageux puisqu'ils permettent l'incorporation de gènes d'intérêt de grande taille et qu'ils peuvent être produits à des titres élevés, sans production de particule virale réplicative contaminante. Dans les vecteurs de l'invention, la région El ou tout autre région peut être inactivée ou rendue non fonctionnelle par différentes techniques connues de l'homme du métier, et notamment par suppression, substitution, délétion, et/ou addition d'une ou plusieurs bases. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de I'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées dans une partie codante de la région, ou en dehors d'une région codante, et par exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes.L'inactivation peut donc se manifester par la production de protéines inactives en raison de modifications structurales ou conformationelles, par l'absence de production, par la production de protéines ayant une activité altérée, ou encore par la production de protéines naturelles à un niveau atténué ou selon un mode de régulation désiré. Parmi les agents mutagènes utilisables pour l'inactivation, on peut citer par exemple les agents physiques tels que les rayonnements énergétiques (rayons X, ", ultra violet, etc..), ou les agents chimiques capables de réagir avec différents groupements fonctionnels des bases de l'ADN, et par exemple les agents alkylants [éthylméthane sulfonate (EMS), N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, Nnitroquinoléine-l-oxyde (NQO)], les agents bialkylants, les agents intercalants, etc. Les modifications génétiques peuvent également être obtenues par disruption génique, par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202]. Dans ce cas, tout ou partie de la séquence codante est préférentiellement perturbée pour permettre le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence génomique par une séquence non fonctionnelle ou mutante. Préférentiellement, dans les adénovirus de l'invention, la région concernée est inactivée par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases. Encore plus préférentiellement, elle est inactivée par délétion totale ou partielle. Plus particulièrement, on entend par délétion toute suppression de tout ou partie du gène considéré. Il peut s'agir notamment de tout ou partie de la région codante dudit gène, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription dudit gène. La suppression peut être effectuée par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. De manière particulièrement préférée, l'inactivation des gènes est réalisée de telle sorte qu'elle n'affecte que le gène considéré et pas les autres gènes viraux, notamment les gènes voisins. Par ailleurs, certaines altérations telles que des mutations ponctuelles étant par nature capables d'être corrigées ou atténuées par des mécanismes cellulaires, il est particulièrement préféré que l'inactivation soit parfaitement stable ségrégationellement et/ou non-réversible. Dans le cas d'inactivation par délétion totale ou partielle, la région essentielle à la viabilité virale se situe préférentiellement au niveau ou à proximité du site de délétion. Il est cependant possible d'utiliser d'autres sites d'insertion, comme par exemple des sites de restriction déjà présents dans le génome sauvage. A cet égard, on préfère néanmoins que l'insertion soit réalisée au moins à proximité du site de délétion, c'est-à-dire en dehors du site de délétion, mais suffisamment prêt pour qu'il ne puisse pas se produire d'événements de recombinaison dans l'intervalle séparant le site de délétion et le site d'insertion. De préférence, la distance entre le site de délétion et le site d'insertion ne devrait pas excéder 50 pb. Dans un mode préféré de la présente invention, la région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est déplacée pour être incluse au niveau de la région El inactivée et/ou de la région E3. Selon un mode particulièrement avantageux, dans les adénovirus recombinants de la présente invention, la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n" M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinflI-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. La région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale selon la présente invention est avantageusement choisie parmi tout ou partie de la région E4 et/ou de la région pIX-IVa2 et/ou de la région L5, etc. Dans un mode tout particulièrement préféré de la présente invention, la région essentielle est constituée de tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 et elle est insérée au niveau ou à proximité du site de délétion de El. Selon ce mode de réalisation, la région E4, essentielle à la propagation virale, est insérée dans un position autre que sa position d'origine, de sorte que cette région soit absente dans toute construction qui résulterait de la recombinaison avec le génome de la lignée de production (Cf figure 3). La présente invention a donc également pour objet un adénovirus recombinant dont le génome est caractérisé par la présence de régions El et E4 inactivées, et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 est insérée au niveau ou à proximité de la région El. Un tel vecteur adénoviral comprend préférentiellement deux ITR, une région d'encapsidation, une délétion dans la région El au niveau de laquelle est insérée tout ou une partie fonctionnelle de E4, et une région E4 d'origine inactivée. La région E4 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des mutants dépourvus de E4 sont incapables de se propager. E4 constitue ainsi une région essentielle à la réplication et/ou propagation virale. Cette région E4 est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF 1, 0RF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 et ORF6/7 (figure 4). Parmi celles-ci, ORF3 et ORF6 sont les deux gènes essentiels à la propagation virale. Chacun de ces gènes est capable d'induire la propagation virale. En revanche, I'inactivation de la région E4 implique l'inactivation de ORF3 et ORF6. Dans un mode particulier, dans les vecteurs de l'invention, la totalité de la région E4 est insérée au niveau ou à proximité du site de délétion El. Il peut s'agir en particulier d'un fragment MaeII-MscI correspondant aux nucléotides 35835-32720. Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4, c'est-àdire suffisante pour permettre la propagation virale, est insérée. Cette partie comprend au moins un gène ORF3 ou ORF6 fonctionnel. Préférentiellement, la partie fonctionnelle de E4 est constituée essentiellement de ORF3 ou ORF6. A titre d'exemple, ces phases codantes peuvent être isolées de la région E4 sous forme de fragments PvuII-AluI et BglII-PvuII respectivement, correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 respectivement. Avantageusement, la région E4 ou la partie fonctionnelle de cette région comprend également un région promotrice de la transcription. Il peut s'agir du promoteur de la région E4 ou de tout autre promoteur fonctionnel, tel que les promoteurs viraux (Ela, SV40, LTR-RSV, etc), eucaryotes ou mammifère. Préférentiellement, le promoteur utilisé est le promoteur de la région E4. Comme indiqué ci-avant, la partie fonctionnelle de E4 insérée au niveau de El ne correspond pas nécessairement à la partie de E4 délétée dans la position d'origine. Ainsi, la région initiale peut être inactivée par mutation ponctuelle (sans délétion) et une région E4 fonctionnelle insérée au niveau de El. De même, la région E4 initiale peut être entièrement délétée et seulement une partie fonctionnelle insérée au niveau de El. L'inactivation de la région E4 implique au sens de l'invention l'inactivation fonctionnelle au moins des régions ORF3 et ORF6. Ces régions d'origine peuvent être inactivées par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, toutes les méthodes données ci-avant peuvent être appliquées à l'inactivation de ORF3 et ORF6 ou toute région supplémentaire de E4. A titre d'exemple, la délétion de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dllO04, Ad5 du1007, Ad5 Elle11 ou Ad5 Elle14 peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention (Cf exemple 3.). Ces adénovirus peuvent être obtenus par exemple par co-transfection dans une lignée de production d'un premier plasmide portant la partie gauche du génome du virus que l'on souhaite produire (possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de E4) et un fragment d'ADN génomique viral apportant la partie droite du génome du virus (possédant une région E4 inactivée). Après recombinaison, les virus produits sont amplifiés et isolés. Ces adénovirus peuvent aussi être obtenus par permutation des extrémités du génome, comprenant les ITR plus la région contigüe.A cet égard, l'invention a également pour objet un adénovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède une région El inactivée et en ce que l'extrémité gauche, comprenant I'ITR et la région d'encapsidation, et l'extrémité droite, comprenant l'ITR et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, sont permutées.Plus particulièrement, l'extrémité gauche comprenant l'ITR gauche et la région d'encapsidation est contenue dans les 382 premiers nucléotides du génome de l'adénovirus Ad5 (par exemple jusqu'au site Hindi). De même, l'extrémité droite comprenant l'ITR droite et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, y compris le promoteur de la région E4 est contenue dans les 321 5 derniers nucléotides du génome de l'adénovirus Ad5 (par exemple à partir du site NIscI en position 32720). Les techniques de l'homme du métier permettent de construire un virus recombinant selon l'invention dans lequel l'ITR droite et tout ou partie de la région E4 sont maintenant situées à la gauche du virus, suivies de la région 3446-32720 du génome de I'adénovirus Ad5, puis de la séquence d'encapsidation et de I'ITR gauche qui devient maintenant l'extrémité droite du virus recombinant (Cf figure 5). Le génome de l'adénovirus recombinant ainsi obtenu est particulièrement avantageux puisque la région essentielle E4 déplacée à gauche est maintenue dans son environnement naturel et donc dans des conditions d'activité optimales pour un cycle infectieux à haut titre. De plus, cette région précède maintenant la région dont la présence dans le génome de la lignée de production 293 était à l'origine de l'apparition de particules viables. Dans un autre mode tout particulièrement préféré de la présente invention, la région essentielle est constituée de la région codant pour les protéines pIX et IVa2 et elle est insérée au niveau de la région E3, éventuellement en remplacement de séquences délétées (Cf figure 6). Plus particulièrement, la région codant pour les protéines pIX et IVa2 est comprise dans un fragment BglII-NruI correspondant aux nucléotides 3328 à 6316 sur la séquence de I'adénovirus Ad5 sauvage. Dans ce mode de réalisation, la recombinaison éventuelle de l'adénovirus recombinant avec la région de I'adénovirus intégrée dans la lignée de production ne génère que des particules virales non-viables car délétées des principaux gènes tardifs essentiels à la viabilité. Comme indiqué précédemment, les adénovirus recombinants selon l'invention comprennent avantageusement les séquences ITR et une région permettant I'encapsidation. Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences ITR des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et AdS) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence ITR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides I à 103 du génome. La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à I'encapsidation du génome viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invention. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus sauvages, entre l'ITR gauche et le gène El (Cf figure 1). Dans les adénovirus de l'invention, elle peut être localisée a coté de l'ITR gauche comme de l'ITR droite (cf figure 5). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence nucléotidiques de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2).Concernant l'adénovirus AdS par exemple, une séquence d'encapsidation fonctionnelle est comprise entre les nucléotides 194 et 358 du génome. Par ailleurs, les adénovirus selon l'invention peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres région peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ces effets secondaires liés à l'expression de gènes viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 notamment peut être délétée. Des adénovirus recombinants selon l'invention possédent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité et de capacité de transfert de gènes très élevées. Avantageusement, les adénovirus recombinants de l'invention comportent en outre une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché. En particulier, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques. Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique. Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation de vaccins permettant d'immuniser l'homme, notamment contre des microorganismes ou des virus. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être insérée en différents sites du génome de I'adénovirus recombinant selon l'invention. Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion El. Dans ce cas, elle est localisée à coté (en 5' ou en 3') de la région ou de la partie fonctionnelle de E4. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 inactivée. Toujours dans un mode particulièrement avantageux, les vecteurs de l'invention possèdent en outre un gène E3 fonctionnel sous controle d'un promoteur hétérologue. Plus préférentiellement, les vecteurs possèdent une partie du gène E3 permettant l'expression de la protéine gpl 9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adénovirus fasse l'objet d'une réaction immunitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. Les adénovirus recombinants selon l'invention peuvent être d'origines diverses. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. De ce fait, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus. Plus particulièrement, les adénovirus de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale). Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande FR 93 05954). La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adénovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse.L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles. Les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sérotypes I à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l l (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à I'ATCC (types I à 8) sous les références ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769.On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR528), I'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); I'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à I'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc. De préférence, parmi les différents adénovirus d'origine animale, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus ou des régions d'adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adénovirus canins ont fait l'objet de nombreuses études structurales. Ainsi, des cartes de restriction complètes des adénovirus CAVI et CAV2 ont été décrites dans l'art antérieur (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clonés et séquencés (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992)119, WO 91/11525). Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés de différentes façons. Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant (défectif) préparé in vitro dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas d'adénovirus dans lesquels seule la région El est déficiente, la lignée préférée est la lignée 293. Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée cellulaire apppropriée I'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro et I'ADN d'un ou de plusieurs virus ou plasmide helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de I'adénovirus recombinant. Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs. La préparation d'adénovirus recombinants défectifs de l'invention selon cette méthode est également illustrée dans les exemples. A cet égard, la présente demande décrit également la construction de plasmides portant la partie gauche modifiée du génome de I'adénovirus Ad5 (plasmides de la série pCOl-E4 par exemple). Ces plasmides sont particulièrement utiles pour la construction d'adénovirus recombinants en tant que vecteurs de thérapie génique. Ainsi, les plasmides pCOl-E4 portent la région gauche du génome de l'adénovirus, depuis l'ITR gauche jusqu'au nucléotide 6316, avec une délétion de la région comprise entre les nucléotides 382-3446, correspondant au locus El, au niveau de laquelle est insérée tout ou une partie fonctionnelle de E4. Les plasmides pCOl-E4 contiennent par ailleurs un multisite de clonage permettant l'incorporation d'une séquence d'acides nucléiques hétérologue d'intérêt. Les plasmides pCO 1 -E4 peuvent être utilisés pour préparer l'adénovirus recombinant défectif par cotransfection avec un ADN, préférentiellement d'origine virale, correspondant à la partie droite du génome de I'adénovirus possédant une région E4 inactivée, dans une lignée cellulaire compétente. En ce qui concerne ce dernier, il peut être issu du génome d'un virus défectif tel que Ad2 du808 qui est délété de la région E4 (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833), Ad5 dllO04; Ad5 dllO07, Ad5 dîlOl 1 ou Ad5 dol 1014, etc (Cf exemples).A cet égard, I'invention concerne également un procédé de préparation d'adénovirus recombinants dépourvus de particules réplicatives selon lequel on co-transfecte une lignée cellulaire compétente avec - un premier ADN comprenant la partie gauche du génome dudit adénovirus, possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de la région E4, et - un second ADN comprenant au moins la partie droite du génome dudit adénovirus, possédant une région E4 inactivée, et une partie d'adénovirus commune avec le premier ADN, et on récupère les adénovirus produits par recombinaison homologue entre lesdits ADN. Parmi les lignées cellulaires utilisables, on peut citer notamment la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Comme indiqué précédemment, cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de ladénovirus humain Ad5 (12 %). Avantageusement, dans le procédé de l'invention, le premier ADN est choisi parmi les plasmides de type pCO1- E4. Par ailleurs, pour préparer un adénovirus recombinant comprenant un gène thérapeutique, le premier ou le second ADN mis en oeuvre dans le procédé de l'invention porte en outre une séquence d'ADN hétérologue d'intérêt. Ensuite, les virus recombinants qui se sont multipliés sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de la virologie. Les plasmides pCOi-E4 permettent ainsi la construction d'adénovirus recombinants portant une délétion dans la région El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, au niveau de laquelle tout ou une partie fonctionnelle de E4 est insérée, aisni éventuellement qu'un gène thérapeutique. La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées.Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Selon la séquence d'ADN hétérologue insérée, les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1: Organisation génétique de I'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome. Figure 2 : Evénements de recombinaison entre I'adénovirus et la lignée 293. Figure 3 : Représentation d'un type de vecteurs de l'invention, et de sa recombinaison avec la lignée 293. Figure 4 : Organisation de la région E4 Figure 5 : Représentation d'un adénovirus de l'invention aux extrémités permutées. E4+ désigne une région E4 fonctionnelle; AE4 désigne une région E4 nonfonctionnelle, 9 désigne une séquence d'encapsidation. La cassette d'expression du gène d'intérêt n'est pas représentée mais peut être insérée comme indisué dans le texte. Figure 6 : Représentation d'un type de vecteurs de l'invention (pIX-IVa2). pIX+IVa2 contient au moins une région IVa2 fonctionnelle. AE1ApIX désigne une délétion des séquences de l'adénovirus comprise entre la région aY et la fin de la région codant pour la protéine 140kD (position 5200) de la région E2. Cette délétion inclue également la région IVa2 et concerne la séquence présente dans le chromosome de la lignée 293 en aval de la région E & . Figure 7: Carte de restriction du fragment HindIII contenu dans le plasmide pCOI. Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc . . sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à I'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de I'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant.La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Exemple 1- Construction du plasmide pCOl (figure 7) A - Construction du plasmide pCE Le fragment EcoRI-XbaI correspondant à l'extrémité gauche du génome de ladénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et XbaI du vecteur pIC19H. Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de I'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et SmaI du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB. Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de I'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites NruI et BglII du vecteur pIC20H.Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage. B - Construction du plasmide pCD' Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - NarI (5519) du génome de ladénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites ClaI et BamHIf du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment Sali-Taqi du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de I'adénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et TaqI (5207) a ensuite été cloné entre les sites SalI et ClaI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment TaqI (5207) - NarI (5519) du génome de ladénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-TaqI du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H.Ceci génère le plasmide pCC'. Le fragment NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-NarI du plasmide pCC' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'. C - Construction du plasmide pCO1 Une digestion partielle par XhoI puis une digestion complète par SalI du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été cloné dans le site SalI du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pCO1 (figure 7), qui contient la partie gauche de ladénovirus Ad5 jusqu'au site Hindi (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - NruI (6316) de I'adénovirus Ad5. Exemple 2 - Construction des plasmides de type pCO1-E4 (figure 7) Cet exemple décrit la construction de plasmides de type pCOl-E4, c'est-àdire de plasmides obtenus par incorporation de tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 d'un adénovirus dans le plasmide pCOl (exemple 1). 2.1. Clonage de la région E4 dans son intégralité 2.1.1. Exprimée à partir du promoteur originel de la région E4 Le plasmide pFG144 [F.L. Graham et al. EMBO J. (1989) 8 2077-2085] contient notamment un fragment Sau3A de 1162 pb incluant l'extrémité droite du génome de l'Ad5. Ce fragment est alors cloné dans le site BamHJ du plasmide pIC20H ce qui génère le plasmide pGY9 dans lequel le fragment Sau3A est maintenant inclus dans un fragment BamHI-EcoRI de 1184 pb du fait de l'orientation du fragment relativement au vecteur. Ce fragment est alors purifié par electroélution, coupé par AvrII, puis soumis à une hydrolyse partielle par l'enzyme MaeII.Un des produits de restriction corresponds au fragment MaeII (35835)-AvrII (35463) qui inclus le promoteur de la région E4 de 1'Ad5 et jusqu'à la limite de I'ITR droite. Ce fragment de 372 pb est alors purifié par électroélution et ligaturé en présence du fragment AvrII Sali du plasmide pPY6* entre les sites ClaI et SalI du plasmide pCOI ce qui génère le plasmide pGYlO qui est du type pCOI-E4 (Figure 7). Le plasmide pPY6* est identique au plasmide pPY6 à l'exception du site XbaI qui a été détruit après coupure par remplissage à l'aide du fragment Klenow de la DNA polymérase I d'E. coli (Biolabs), puis religature.Le plasmide pPY6* contient le fragment TaqI (35573) BglII(32490) du génome de 1'Ad5 préalablement introduit en aval du promoteur MMTV du plasmide pMSG selon les techniques classiques de la biologie moléculaire. Lors de ce clonage, le site BglII(32490) a été détruit du fait d'une jonction avec le site BamHI du multisite de clonage du plasmide pIC20H. De plus un site XbaI et un site Sall se trouvent donc localisé immédiatement en aval de la jonction BglII(32490)/ BamHI (dans le plasmide pPY6* la séquence est donc 5' AGATCCTCTAGCTAGAGTCGAC-3', le site Sali est souligné). Le plasmide pPY6* est donc la source d'un fragment AvrII(35463)-SalI incluant la totalité de la région E4 à partir du site AvrII en position 35463 et jusqu'à la position 32490 localisée approximativement 300 pb après le site de polyadénylation de la région E4. Exemple 3 - Construction des adénovirus recombinants dérivés des plasmides de tvpe pCO1-E4 Cet exemple décrit la construction d'adénovirus recombinants portant une délétion dans la région El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, une région E4 inactivée, et tout ou une partie fonctionnelle de E4 insérée dans la délétion El. Les techniques de l'homme de l'art permettent de construire et de propager des adénovirus recombinants El-E4+ dans la lignée 293. Les plasmides du type pCOI-E4 peuvent être par exemple cotransfectés dans les cellules 293 en présence d'un génome viral portant une modification/déletion dans la region E4 de sorte que cette region soit non fonctionnelle (mutation dans ORF3 et ORF6 au moins). De tels virus sont donc non viables dans une lignée qui ne transcomplémente pas fonctionnellement la région E4. Par contre ces virus peuvent être préalablement propagés dans la lignée W162 rWeinberg D.H. and Ketner G. Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 80: 5383-5386], ou dans une des lignées 293E4+ décrites dans le brevet FR. 94 04590 (18.04.1994). De tels virus incluent les virus Ad2dl808 [Challberg S.S. and Ketner G.Virology (1981) 114: 196-209], AdSdllO04, Ad5dl1OO7, ou Ad5d11014 [Bridge E. and Ketner G. J. Virol. (1989) 63: 631-638], ou encore AdSdllOll [Bridge et al. Virology (1993) 193: 794801] etc... Ainsi la cotransfection des plasmides de type pCOI-E4 linéarisés par l'enzyme XmnI et l'ADN génomique viral des virus portant une région E4 non fonctionnelle et restreint par l'enzyme Clal génère les virus correspondants après recombinaison homologue entre les deux ADN dans la lignée 293.Ces virus se caractérisent donc par la présence de l'ITR gauche et d'une séquence d'encapsidation fonctionnelle (nucléotide 1-382 par exemple), suivie d'une région E4 fonctionnelle (entière ou uniquement E4 ORF3 et/ou E4 ORF6) exprimée à partir d'un promoteur fonctionnel et par exemple le promoteur originel de la région E4 [inclus dans le fragment TaqI(35573)-MaeII(35835)], suivie de la région située en aval du site Sau3A localisé à la position 3446 du génome de 1'Ad5, et se poursuivant jusqu'à l'ITR droite et donc incluant la délétion de la fonction E4 présente dans le virus E4- de départ (Figure 3). De tels virus E1-E4+ peuvent être propagés dans la lignée 293 à des titres pouvant atteindre 1013 PFU/ml. A cet effet, les cellules sont récoltées, disruptées par trois cycles de congélation-décongélation dans leur surnageant, puis centrifugées à 4000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu est ensuite amplifié sur culture cellulaire fraiche. Les virus sont alors purifiés à partir de plages et leur ADN est analysé selon la méthode de Hirt (précité). Des stocks de virus sont ensuite préparés sur gradient de chlorure de césium. Les stocks viraux à haut titre ainsi obtenus ne sont pas contaminés par des particules viables dans un contexte cellulaire El-. REVENDICATIONS 1. Adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un génome d'adénovirus dont la région El est inactivée, dont l'organisation génomique est modifiée et dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non-viables. 2. Adénovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une région essentielle à sa réplication et/ou à sa propagation est présente dans une position génomique autre que sa position d'origine. 3. Adénovirus recombinant selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région essentielle se situe à proximité ou au niveau d'une autre région génomique non fonctionnelle. 4. Adénovirus recombinant selon la revendication 3 caractérisé en ce que la région génomique non fonctionnelle est une région inactivée par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases. 5. Adénovirus recombinant selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que la région non fonctionnelle est inactivée par délétion partielle ou totale. 6. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 2 à 5 caractérisé en ce que la région non fonctionnelle est représentée par la région El inactivée et/ou la région E3. 7. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328 ou d'un fragment HinflI-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. 8. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que la région essentielle à la réplication et/ou la viabilité virale est choisie parmi tout ou partie de la région E4 et/ou de la région pIX-IVa2 et/ou de la région L5. 9. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que son organisation génomique est telle que la région E4 est positionnée, en tout ou partie, au niveau ou à proximité du site de délétion de la région El. 10. Adénovirus recombinant selon la revendication 9 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par le fragment MaeII-MscI correspondant aux nucléotides 35835-32720. 11. Adénovirus recombinant selon la revendication 9 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par au moins la phase codante ORF3. 12. Adénovirus recombinant selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par au moins la phase codante ORF6. 13. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que son organisation génomique est telle que l'ensemble de la région codant pour les protéines pIX et IVa2 est positionnée au niveau de la région E3, éventuellement en remplacement de séquences délétées. 14. Adénovirus recombinant selon la revendication 13 caractérisé en ce que la région codant pour pIX-IVa2 est constituée d'un fragment BglII-NruI comprenant les nucléotides 3328 à 6316 sur la séquence de l'adénovirus Ad5. 15. Adénovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la lignée de production est la lignée 293. 16. Adénovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède des régions El et E4 inactivées et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 est présente au niveau ou à proximité de la région El inactivée. 17. Adénovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède une région El inactivée et en ce que l'extrémité gauche, comportant l'ITR et la région d'encapsidation, et l'extrémité droite, comportant l'ITR et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, sont permutées. 18. Adénovirus recombinant selon la revendication 17 caractérisé en ce que l'extrémité gauche est contenue dans les 382 premiers nucléotides du génome de 1'Ad5 et l'extrémité droite est contenue dans les 3215 derniers nucléotides du génome de lAdS. 19. Adénovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède des régions El et L5 inactivées et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région LS est présente au niveau ou à proximité de la région El inactivée. 20. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une région d'encapsidation. 21. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acides nucléiques hétérologue. 22. Adénovirus recombinant selon la revendication 21 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend un ou plusieurs gènes thérapeutiques. 23. Adénovirus recombinant selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est présente au niveau des région El, E3 ou E4, en supplément ou en remplacement de séquences délétées. 24. Adénovirus selon l'une des revendication précédentes caractérisé en ce que le génome d'adénovirus est d'origine humaine, animale, ou mixte. 25. Adénovirus selon la revendication 24 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). 26. Adénovirus selon la revendication 24 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne. 27. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 26. 28. Composition pharmaceutique selon la revendication 27 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 29. Plasmides pCO1-E4 comprenant la partie gauche du génome de l'adénovirus Ad5, depuis l'ITR gauche jusqu'au nucléotide 6316, avec une délétion de la région comprise entre les nucléotides 382-3446 correspondant au gène El, au niveau de laquelle est inséré tout ou une partie fonctionnelle de E4. 30. Procédé de préparation d'adénovirus recombinants dépourvus de particules réplicatives caractérisé en ce que l'on co-transfecte une lignée cellulaire compétente avec - un premier ADN comprenant la partie gauche du génome dudit adénovirus, possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de la région E4, et - un second ADN comprenant au moins la partie droite du génome dudit adénovirus, possédant une région E4 inactivée, et une partie commune à celle du premier ADN, et on récupère les adénovirus produits par recombinaison. 31. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que la lignée cellulaire est la lignée 293. 32. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que le premier ADN est choisi parmi les plasmides de type pCO1-E4. 33. Procédé selon l'une des revendications 30 à 32 caractérisé en ce que le premier ou le second ADN porte en outre une séquence d'ADN hétérologue d'intérêt.