FR 2730063 A1 19960802 FR 9415090 A 19950201 DESCRllrlWON Domaine technique de l'invention: diagnostic de biologie médicale Problème technique posé. Généralité sur Chlamydia Chlamydia se développent à l'intérieur de cellules hôtes (épithélium cylindrique pour Chlamydia trachomatis ou CT, macrophage pour Chlamydia pneumoniae ou CP) en formant une inclusion cytoplasmique: .la particule infectieuse ou corps élémentaire (ce) pénètre par phagocytose dans la cellule hôte, elle est alors contenue dans une vacuole. .le ce se transforme en corps réticulé (cr) capable de division binaire pour donner une Morula, fiy a inhibition de la fusion lysosome vacuole. I'inclusion augmente de taille, se rompt et libère les corps élémentaires qui vont parasiter de nouvelles cellules. Les incertitudes concernant les infections a Chlamydiae portent sur: - les différences importantes de sensibilité entre les techniques de diagnostic direct. - les différences importantes dans les chiffres de prévalence des infections à CT. - la possibilité de retrouver le germe après traitement. - la faiblesse de la technique IF directe dont la validité peut toujours être attaquée par un scientifique. - I'existence d'infections chroniques résistantes aux traitements alors que le germe est toujours sensible aux antibiotiques in vitro. - les causes qui font que Chlamydia dissemine plus facilement chez certaines personnes par rapport à d'autres (réinfestation avec apport supplémentaire de germe; existence de sérotypes plus envahissants que d'autres; susceptibilite individuelle; systèmes immunitaires differents) - I'existence d'un portage sain asymptomatique. - I'existence d'un blocage du cycle; et si oui à quel stade ? - l'intérèt ou pas de la sérologie : anticorps temoins d'infection ou pas? - la fréquence des Ac de classe IgM et IgA. - l'existence de Chlamydia morts inertes in vivo gardant leurs propriétés antigéniques. Les techniques actuelles de recherche de Chlamvdia * la culture - technique difficile car le germe est fragile - délai pour l'obtention du résultat important 48 h - matériel lourd et onéreux - faux négatif possible * mise en évidence de l'Ag Chiamydia - réactifs relativement bon marché - IF directe longue et laborieuse - Elisa rapide - ne permet pas de dire que le germe est vivant - ne renseigne pas sur l'état du cycle * Amplification génomique (ARN ou ADN) - technique onéreuse et délicate - résultat positif après traitement - ne permet pas de dire si le germe se multiplie et donc s'il sera touché par l'antibiotique Des convictions * Lorsqu'on a affaire à une infection aigüe, tous les stades du cycle sont en phase et touchés en même temps par l'antibiotique, la quantité de germe dans le prélèvement est alors importante; le pronostic est bon, on a de bonnes chances de trouver peu de particules après traitement qui seront sans doute évacuées lors de la prochaine desquamation de la cellule hôte. *lors d'infections à bas bruit, les particules ne sont plus en phase; il y a contamination des cellules voisines de la cellule hôte; l'éradication est beaucoup plus difficile, I'infection devient chronique. *les cellules qui hébergent Chlamydia ont une durée de X ie longue (épithélium cylindrique mono- couche, macrophage) ce qui concourt à leur pérennité in situ. *il faut dire au clinicien s'il y a Chlamydiose (multiplication du germe et donc sensibilité aux antibiotiques) et non s'il y a des Chlamydia dont le cycle peut-être bloqué in vivo. *le problème est de savoir où le cycle est bloqué: le corps élémentaire ou le corps réticulé. si on trouve des corps élémentaires en quantité relativement faible par IFD ou PCR chez un patient, celui-ci est-il malade ou porte-t-il le germe a l'état dormant a-t-on le droit de dire qu'il est contaminant alors que ces corps élémentaires peuvent rester intracellulaires et inertes. *Chlamydia est un germe à multiplication intracellulaire, les Ac produits ne sont donc pas opsonisants et ne sont sans doute pas protecteurs; s'il y a 1' Ac, il y a sans doute le germe dans l'organisme. Un problème de Santé publique et de Sociologie * les statistiques officielles sur les infections à Chlamydia sont incohérentes, ou inexistentes ; elles sont en tous cas sous-estimées. le développement d'informations est pourtant une des préocupations affichées dans le dernier livre blanc sur le système de Santé et d'assurance maladie (R. SOUTE) les Chiamydioses sont un véritable problème de Santé publique comme cela a été confirmé aux U.S. : 40 millions d'individus contaminés en l'an 2000 d'après le CDC d'Atlanta * au plan médicolégal, quelle technique doit être utilisée ; la culture doit-elle rester la méthode de référence. * il y a désinformation sur les infections à C. trachomatis. CT est considéré comme MST ; c'est une source de conflit dans un couple ; un sujet tabou on préfere donc ne pas en parler. Il y a blocage de l'information accentué par le secret professionnel. il existe pourtant des Chiamydioses infracliniques chez certains sujets sans effet pathologique et ces personnes ne doivent pas être inquiétées par le corps médical. * les dépenses de Santé occasionnées par les infections à Chlamydia sont considérables, surtout en cas de chronicité ou d'infection haute (salpingite, perihépatite, GEU, stérilité, infection neonatale). Exposé de l'invention Résumé Mise en évidence et éventuellement quantification par un procédé d'immuno-marquage (immuno-fluorescence, immuno-enzymologie ou autre) des anticorps (Ac) ou partie d'Ac (de nature IgA, IgAs, IgM, IgG,IgE ou autre) contre le germe Chlamydia ou une partie de germe (espèce trachomatis, pneumoniae ou psitacci) sur des prélèvements humains ou aminaux autres que le sang. intérêt physiopathologique ces Ac sont produits par le système immunitaire associé aux muqueuses. c'est une zone de contact avec les Ag et un système relativement autonome. la présence dlgA et'ou IgM (+ IgG ou autres ? ) antichlamydia in situ semble contemporaine de la phase active de 1' infection la quantité d' Ac produits semble corrélée avec la gravité de l'infection et avec la clinique; des quantités faibles d'Ac existent apparemment chez des individus sains, mais aussi chez d' authentiques chlamydioses patentes. matériel utilisé - microscope optique à fluorescence - lames Chlamydia trachomatis et pneumoniae en inclusions de marque BIOS MUNICH (premiers essais non satisfaisants avec les lames Bio-Mérieux et la souche TWAR de la Washington Research Foundation de Seattle). - conjugués marqués lITC : anti IgM, Bios anti IgA et IgG, Bios et Tago anti Pièce Sécrétoire, Immunotech anti IgE, Dako - tampon PBS, Bios et Bio-Mérieux - eau distillée de très bonne qualité pour les dilutions. Manipulation * partir d'un prélèvement humain tel que : gorge - nez - oreille - conjonctive - crachat aspiration bronchique - urètre - urine - endocol - liquide transcellulaire - derme - ou autres. * utiliser le prélèvement liquide: si le prélèvement est sur écouvillon, le remettre en suspension dans un ml de liquide stérile. * après centrifugation, déposer une goutte de sumageant sur un puits d'une lame tapissé d'inclusions de Chlamydia en cellules (ou de corps élémentaires). la qualité des lames est primordiale. incuber 30 mn ou plus - laver avec du tampon PBS * déposer une goutte dlg animale anti IgA humaine (ou anti-pièce sécrétoire ou anti IpM ou anti IgG ou autres ) marquée au si la deuxième Ig ne peut être obtenue conjuguée, une troisième étape est nécessaire avec une Ig marquée anti Ig animale. la dilution optimale du conjugué doit être trouvée par le manipulateur. incuber 30 mn ou plus - laver - sécher. * lire au microscope à fluorescence des inclusions de couleur vert pomme montrent la positivité du test. * I'utilisation de matériel Chlamydia de même sérotype que celui hébergé par le patient devrait améliorer la sensibilité de la technique surtout au début de l'infection où les Ac produits semblent uniquement des anti-sérot:ppes. * l'emploi de Chlamydia à l'état d'inclusions plutôt que de corps élémentaires facilite la lecture et ltelimination des artéfacts. Praticabilité * ma technique donne une réponse claire, franche, sans ambiguité. * le résultat est un signal donné par une humeur et non par un germe à localisation hétérogène dont la quantité est dépendante du prélèvement. * la technique semble peu génée par la présence de facteurs rhumatoïdes, ni par des Ac hétérologues beaucoup moins nombreux que dans le sang. une élimination possible des IgG par un absorbant peut être réalisée avant dosage des IgA ou des IgM. * la technique est simple et peu onéreuse. * elle peut s'opérer sur prélèvement différé. * elle peut être automatisée, en particulier dans une méthode Elisa par "coating" de l'Ag Chlamydia ou deune partie de celuici (comme les Ag de surface ou une partie du genome). * une quantification peut être faite par pesée du prélèvement et dilution; en considérant que le prélèvement a une densité voisine de I et en travaillant avec des dilutions successives, on peut exprimer comme résultat l'inverse de la dilution ou le test est encore positif. *pour la réalisation du test dans les urines, on peut envisager d'exprimer un résultat quantitatif par rapport à une substance témoin de la filtration glomérulaire et donc du débit, comme la créatinine. * le signal semble proportionnel à la quantité de Chlamydia qui imprègne les tissus environnants de 1' hôte. * le test peut servir à une enquête épidémiologique par comparaison des résultats obtenus avec différents sérotypes. O Des exemples significatifs dans notre Laboratoire * une péricardite à Chlamydia pneumoniae Dr DP né en 1925, hospitalisé en Août 90 pour précordialgies fébriles. antécédents : - tuberculose pulmonaire très ancienne traitée - listériose neuro-méningée d'évolution favorable - douleurs articulaires d'origine arthrosique début clinique en 88 avec douleurs rétro-sternales syndrôme inflammatire récurrent suspicion de lithiase vésiculaire à l'échographie biliaire fièvre B 3808 radio pulmonaire: épanchement pleural minime biologie : NF 10700 blancs dont 9000 polyneutro - VS 44 lère heure - PCR 218 - Fibrine 6,66 sérologies tuberculose, listériose, entérovirus négatives échographie: signe de péricardite ponction pleurale: cultures négatives traitement: anti-inflammatoire ( Cébutid) diagnostic : péncardite récurrente bénigne en 92 : reprise de tous les syndrômes sauf la fièvre analyse de crachat en Octobre 92 :IgAs anti CP t++ (le reste de la bactériologie est négative) traitement au Rulid les symptômes cèdent sous le traitement, le diagnostic est établi. désormais le traitement sera intermittent, avec macrolide ou cycline avec ce traitement les symptômes régressent, le bilan inflammatoire se normalise, la sérologie CP sanguine diminue. à l'arrêt du traitement, tous les signes réapparaissent en quelques mois. * Une uréthrite à Chlamydia trachomatis Mr. JP. S a été contaminé par CT en 86 lors d'un rapport sexuel avec une femme infectée. il fait une utéthrite. son médecin lui donne trois semaines de cyclines, lui dit qu'il est guéri - même discours chez le vénérologue - des prélèvements uréthraux sont effectués dans différents laboratoires qui se révèlent négatifs. mais l'écoulement persiste. fin 90 réapparition des symptômes alors qu'il nty a pas eu recontamination. en 91 différents prélèvements uréthraux à notre Labo. Chlamydia par 1t : + avec leucocyturie NF :varie dans I'annee de 9000 à 12 000 blancs / mm3 en 92 : prélèvement uithral : IgAs anti CT désormais le patient est suivi par son médecin généraliste, différents antibiotiques sont essayés, les blancs diminuent dans la prise de sang sont état de santé s'améliore. a l'arrêt des médicaments l'infection reprend, les blancs remontent. cet état durera un an sans qu'il y ait guérison * Un prélèvement d'urine. -Mr G.C. Ce patient présente des signes inflammatoires importants dans sa prise de sang: Il 600 blancs / mm3 - PCR: 104 (n inf a 10) - fibrine: 6 (n 2 a 4,.5) - vs: 22 a 42 . proteinogramme très perturbé avec proteines inflammatoires augmentées. HLA B27 positif. dans les urines: 170 000 hematies;ml 10 800 000 leucocytes s ml absence de germes à la coloration de Gram cultues classiques négatives anticorps antiXhlamydia trachomatis positif L+c - Pour d'autres patients, des anticorps même faiblement positifs dans les urines semblent être corrélés avec des signes cliniques patents. une forte baisse de la quantité d'anticorps produits dans les urines a pu être observée chez un de nos patients apres traitement. * prélèvement d'acné Melle PN fait des poussées d'acné depuis l'adolescence prélèvement bactériologique : - nombreux poly. neutrophiles - gam pauvre, IgA anti CP + - cultures classiques : peu nombreux staph épidermidis CP est un des candidats à l'étiologie de l'acné. * prélèvement de bouche Mme VH, prélèvement d'aphtes au niveau de la gencive: - peu nombreux poly.neutrophiles - IgA IgM anti-herpès négatifs - cultures classiques négatives en germe pathogène - IgA anti CP négatif, IgM anti CP positif Mr CG, prélèvement au niveau des gencives: - assez nombreux poly.neutrophiles - absence de germe pathogène en culture classique - absence de trichomonas tenax, rares Candida albicans - TgA anti CP positif CP est un candidat à ltétiologie de la maladie de Behcet: aphtes buccaux récidivants - aphtes génitaux - uvéite - synovite - vascularite cutanée méningoencéphalite. * conjonctivite Mme ME est une dame âgée qui rentre dans mon box a prélèvements avec une conjonctivite aigue à chaque oeil - elle peut à peine ouvrir les yetix un oeil est plus rouge et plus enflammé que l'autre les IgA anti CP seront plus forts sur cet oeil que sur l'autre; elles sont donc bien sécrétées in site le reste des recherches est négatif sur les deux yeux: cultures classiques, IgA anti-mycoplasma, IgA anti - adénovirus, IgA anii-herpès. * sécrétions nasales M GM est envoyé au labo par un ORL pour un lavage de nez avec recherche d'éosinophilie. cytologie: très nombreux poly.neutrophiles formant pus, absence d'éosinophile bacteriologie: IgA anti CP 0, cultures classiques négatives * liquide transcellulaire Mme RR a eu un prélèvement de liquide synoviaL protides: 29 g/l (N: : 15 à 25) latex-waaler rose négatifs peu nombreux cristaux d'acide urique cytologie : 40 000 hématies; 27 500 000 éléments nucléés/ml dont 70 % de poly.neutro 8 % d'éosino, 23 % de macrophages bactériologie: IgA anti CP ++, IgM anti CP +, cultures classiques et BK négatifs # Evaluation de ma technique Le Phannacienconseil de la CPAM de Nancy m'a conseillé au cours d'un entretien de publier mes travaux. Un responsable de l'Agence du Médicament qui m'a également reçu, m'a encouragé à évaluer ma technique dans d'autres laboratoires. fai donc fait une étude en aveugle avec deux Responsables de l'institut FOURNIER de Paris qui m' ont donné 50 prélèvements d'urètres et d'endocols. fai recherché IgA et IgM anti CT j'ai obtenu 6 positifs faibles en IgA 6 positifs nets en IgA sans IgM 4 positifs forts en IgA avec IgM faible sur ces 4 derniers llnstitut FOURNIER a trouvé 2 positifs en culture, il n'y a pas eu d'autres cultures positives par ailleurs. cf. tableau ci-aprcs Dans notre laboratoire, il est arrivé que sur des prélèvements d'endocol, IgA IgM antiT soient négatives, IgG positives avec une méthode directe de recherche du germe également positive (immuno-chromatographie "clearviewn - UNIPATH). REVENDICATIONS 1- Procédé pour le diagnostic in vitro d'infections à Chlamydia (trachomatis, pneumoniae ou psitacci) caractérisé par la mise en évidence et éventuellement la quantification d'anticorps produits par le système immunitaire associé aux muqueuses contre Chlamydia sp, 2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé par la mise en contact de prélèvements humains ou animaux autres que le sang obtenus à l'état de fluide ou remis en suspension dans un milieu liquide, avec l'antigène Chlamydia entier ou avec une partie du germe en particulier sous forme de corps élémentaires ou bien d'inclusions dans des cellules, antigène lié à un support qui peut être le puits d'une lame. 3- Procédé selon la revendication 2 caractérisé après incubation et lavage par la mise en contact avec le premier complexe Ag-Ac ainsi formé, avec des Ac anti-immunoglobulines humaines ou animales selon le cas (de nature IgAs IgA IgM IgG ou autres) conjugués avec un marqueur en particulier de type FROC, puis la lecture du signal obtenu, après lavage, en particulier la lecture de spots fluorescents obtenus au microscope. 4 Procédé selon une variante des revendications 2- et 3 caractérisé par une incubation en un temps avec mélange du prélèvement et du conjugué. 5- Procédé selon une variante des revendications 2- et 3 caractérisé par une immunocapture permettant d'éliminer un facteur rhumatoide éventuel. s Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence d' anticorps anti-Chlamydia (d'une ou de plusieurs classes) semble corrélées avec une infection active chez le sujet prélevé. 7- Procédé selon la revendication 1- et 3 caractérise en ce que la quantité du signal obtenu c'est-à-dire la quantité d'anticorps, semble corrélée avec la quantité de Chlamydia imprégnant les tissus voisins du prélèvement et avec la gravité de 1' infection chez 1' hôte.