FR 2729138 A1 19960712 FR 9500160 A 19950109 NOUVELLE SUBSTANCE ANTITUMORALE ET ANTILEUCEMIOUE SA PREPARATION ETLES COMPOSITIONS PHARMACEUTIOUES QUI LA CONTIENNENT La présente invention concerne le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane de formule : ainsi que ses formes stéréoisomères, un procédé d'obtention à partir de la plante Ottelia alismoïdes et les compositions pharmaceutiques qui la contiennent Plus particulièrement, la présente invention concerne le produit de formule (I) qui présente les caractéristiques suivantes: - pouvoir rotatoire: [a]20(Na 589) = +32,3# 1,3 (dichlorométhane; c =0.5) [a]20(Hg 436) = +75,0#1,8 (dichlorométhane; c =0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractéristiques à 3419, 3074, 1635, 1592, 1495, 1271, 1126 et 1029 cm-1. - spectre de masse (DCINH3) : 328 (M + NHq)+ (EI) : 310 (M)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHz ; CDCl3 ; 6 en ppn; constante de couplage J en Hz) : 1,95 (m, 1H); 2,05 (m, 1H); 2,18 (s, 3H) ; 2,62 (d, J = 8 et 13, 1H) ; 3,16 (dd, J = 6 et 13, 1H) ; 3,58 (m, 1H) ; 3,83 (m, 1H) ; 3,88 (m, 1H); 4,25 (s, 1H); 4,98 (d, J = 8, 1H); 5,01 (d, J = 16, 1H); 5,58 (s, 1H) ; 5,78 (dd, J = 8 et 16, 1H) ; 6,53 (d, J = 7, 1H) ; 6,69 (dd, J = 7 et 1, 1H) ; 6,79 (d, J = 7, 1H) ; 6,82 (dd,J = 1, 1H); 6,85 (d,J = 7, 1H) - spectre ultra-violet: # max = 282 nm (# = 4650) ; 225 nm (épaulement) ; 207 (# = 48800) (c = 10,1 g/cm3 ; méthanol) A max = 282 nm ; 225 nm (épaulement) ; 206 nm (c = 10,1 mg/cm3 ; méthanol-acide chlorhydrique) # max = 297 nm (épaulement) ; 288 nm ; 243 nm (épaulemen) ; 214 nm (c= 10,1 mg/cm3 ; méthanol-potasse) Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthy-1-vinyl-indane peut être obtenu à partir de la plante Ottelia alismoides par extraction au moyen dtm solvant convenable suivie de la séparation du 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4- hydraxy-7-méehyl-l-vinyl-indane de l'extrait obtenu. Ottelia alismoïdes, qui appartient à la famille des hydrocharitacées, est rye plante aquatique submergée ou partiellement flottante. Les feuilles d'Ottelia alismoïdes sont radicales formant, pour la partie immergée, une couronne rétrécie. La longue partie flottante est pétiolée, ovale et lancéolée, oblongue ou cordée. lies fleurs sont hermaphrodites et solitaires, sessiles avec une longue spate pédonculée, et sont constituées de trois sépales linéaires et oblongues et de trois pétales larges ovoïdes ou orbiculaires. Selon l'invention, Ottelia alismoides, sous forme de la plante entière, généralement séchée et finement broyée, est traitée une ou plusieurs fois par un solvant choisi parmi les éthers aliphatiques contenant 1 à 6 atomes de carbone pour fournir, après concentration, un extrait sec qui est repris par un hydrocarbure aliphatique contenant 5 à 8 atomes de carbone ou un hydrocarbure cycloaliphatique contenant 5 à 7 atomes de carbone éventuellement associé à un nitrile contenant 1 à 4 atomes de carbone pour obtenir une solution dont les insolubles sont séparés par filtration et qui après concentration fournit un extrait sec dont on sépare le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy- benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane par application de techniques chromatographiques. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est particulièrement avantageux d'effectuer rextracdon de la plante entière au moyen de médwl tert-butyl éther et de traiter l'extrait sec obtenu par un hydrocarbure aliphatique tel que l'heptane associé à un nitrile tel que racétonitrile. La séparation du 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1- vinyl-indane à partir de l'extrait issu du traitement par un hydrocarbure aliphatique éventuellement acssocié à un nitrile est généralement effectuée par liquide à haute performance ou par chromatographie de partage centrifuge. Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane présente des propriétés biologiques remarquables. In vitro, le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl- indane présente la propreté d'inhiber la polymérisation de la tubuline. La tubuline, issue de cervelles de porcs, est purifiée par trois cycles de polymérisation dépolymérisation selon la méthode de M.L SHELANSKI et colL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70. 765-768 (1973) suivie d'une chromatographie sur phosphocellulose selon la méthode de M.D. WEINGARTEN et coll., Proc. NatL Acad. Sci USA, 72, 1858-1862 (1975). La tubuline, à une concentration de 8,5pM dans un tampon Mes 0,05 M (pH = 6,8), MgC12 0,25 mM, EGTA 0,5 mM, glycérol 3,4 M, GTP 1 mM est polymérisée à 370C pendant 30 minutes après addition de MgC12 (6 mM) et de concentrations croissantes de 0,8 à 16 iM de 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4- hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane en solution à 1 mg/cm3 dans l'éthanol absolu L'assemblage de la tubuline en microtubules se traduit par une augmentation de la turbidité observée à 350 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane provoque une inhibition de la polymérisation de la tubuline qui se traduit par une augmentation du temps de latence, une diminution de la vitesse de polymérisation ainsi qu'une turbidité plus faible à l'état stationnaire. La concentration de produit de forimile (I) qui inhibe de 50 % la polymérisation de la tubuline à une concentration voisine de 5 I1M In vitro, le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl- indane manifeste une cytotoxicité inférieure à 1 Fg/cm3 sur les lignées cellulaires de la leucémie murine P388. L'exemple suivant illustre la présente invention. EXEMPLE 1 85 kg d'Ottelia alismoïdes, sous forme de plante entière séchée et finement broyée, sont agités dans un filtre monoplaque garni d'une toile Tergal# avec 400 litres de méthyl tert-butyl éther pendant 1 heure puis on laisse en contact pendant 12 heures. Après filtration sous un pression d'azote de 2 bars, la plante est à nouveau extraite par 400 litres de méihyl tert-butyl éther pendant 1 heure. On lasse en contact pendant 12heures. La plante est alors lavée par 200 litres de méthyl tert-butyl éther. La solution éthérée ainsi obtenue est concentrée jusqu'à un volume de 15 lites dans un évaporateur à thermosiphon, puis concentrée à sec sous réduite à 40 C. On obtient ainsi 754 g d'extrait mou de couleur verte qui est repris par 30 litres d'un mélange heptane-acétonitrile (1-1 en volumes). Après filtration d'un insoluble inactif, le filtrat est concentré à sec. On obtient ainsi 270 g d'un produit huileux de couleur marron vert On reprend 10 g de extrait obtenu par 150 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-heptane-méthanoleau (2-3-3-2 en volumes) puis on chromatographie par chromatographie de partage à contreurant sur un appareil SFCC 800 type ayant un volume de 2500 cm3 réparti en 3 bobines en opérant dans les suivantes: -phase stationnaire: phase lourde - phase mobile phase légère -mode ascendant - vitesse de rotation: 380 tours/minute - débit 8 cm3/minute -rétention 46 % L'injection est réalisée à l'équilibre des 2 phases. On recueille les fractions toutes les 8 minutes. La séparation est arrêtée après avoir récupéré 30 fractions Les fractions 19 à 26 sont réunies et concentrées à sec. On obtient ainsi 3,5 g d'un errait huileux dont on sépare le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1- vinyl-indane pur par chromatographie sur une colonne de silice AMICON (0,0300,070 mm) de 3 cm de hauteur et de 1,2 cm de diamètre. On élue avec de l'heptane en utilisant un gradient croissant en méthyl tert-butyl éther et en recueillant des ions de 5 cm3.Les fractions 22 et 23 qui correspondent à l'élution par un mélange heptane -méthyl tert-butyl éther (8-2 en volumes) sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 0,5 mg de 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-4-bnezyl)-4- hydraxy-7-méthyl-l-vmyl-indane sous forme d'un solide jaune pâle dont les caractéristiques sont les suivantes: - pouvoir rotatoire: [a]20(Na 589) = +32,3#1,3 (dichlorométhane; c =0.5) [&alpha;]20(Hg 436) = +75,0+1,8 (dichicirométhane; c =0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractristiques à 3419, 3074, 1635, 1592, 1495, 1271, 1126 et 1029 cm-i. - spectre de masse (DCI NH3) : 328 (M + NH4)+ (EI) : 310 (M)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHz; CDCl3; 6 en pnm; constante de couplage J en Hz): 1,95 (m, 1H); 2,05 (m, 1H) ; 2,18 (s, 31* ; 2,62 (d, J = 8 et 13, 1H); 3,16 (dd, J = 6 et 13, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,83 (m, 1H) ; 3,88 (m, 1H); 4,25 (s, 1H); 4,98 (d, J = 8, 1H); 5,01 (d, J = 16, 1H); 5,58 (s, 1H) ; 5,78 (dd, J = 8 et 16, 1H); 6,53 (d, J = 7, 1H); 6,69 (dd, J = 7 et 1, 1H); 6,79 (d,J = 7, 1H); 6,82 (dd, J = 1, 1H); 6,85 (d, J = 7, 1H) - spectre ultra-violet: # max = 282 nm (E = 4650); 225 nm (épaulement) ; 207 (# = 48800) (c = 10,1 g/cm3 ; méthanol) À max = 282 nm ; 225 nm (épaulement) ; 206 mn (c = 10,1 mg/an3; méthanol-acide chlorhydrique) À max =297 nm (épaulement) ; 288 mn; 243 nm (épaulement) ; 214 nm (c= 10,1 mg/cm3 ; méthanol-potasse). Le produit obtenu peut être visualisé par chromatographie sur couche mince de silice Merck F254 en éluant avec un mélange dichlorométhane-méthanol (99-1 en volumes) et révélation par le réactif de GIBBS spécifique des phénols. Le produit apparaît sous forme d'un spot de Rf = 0,48 de couleur bleue. Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane manifeste une activité inhibitrice significative de la prolifération cellulaire anormale et possède des propriétés thérapeutiques permettant le traitement de malades ayant des conditions pathologiques associées à une prolifération cellulaire anormale. Les conditions pathologiques incluent la prolifération cellulaire anormale de cellules malignes ou non malignes de divers tissus et/ou organes, comprenant, de mamère noei limitative, les tissus musculaires, osseux ou conjonctifs, la peau, le cerveau, les poumons, les organes sexuels, les systèmes lymphatiques ou rénaux, les cellules rnan ou sanguines' le foie, l'appareil digestif, le pancréas et les glandes thyrol- des ou adrénales. Ces conditions pathologiques peuvent inclure également le sont les tumeurs solides, les cancers de l'ovaire, du sein, du cerveau, de la prostate, du colon, de l'estomac, du rein ou des testicules, le sarcome de Kaposi, le cholangiocarcinome, le choriarinome, le neuroblastome, la tumeur de Wilms, la maladie de Hodgkin, les mélanomes, les myélomes multiples, les leucémies lymphocytaires chroniques, les lymphomes granulocytaires aigus ou chroniques.Le nouveau produit selon l'invention est particulièrement utile pour le traitement du cancer du sein, de l'ovaire, du colon ou du rein Le produit selon rinvention peut être utilise pour prévenir ou retarder rapparition ou la réapparition des conditions pathologiques ou pour traiter ces conditions pathologiques. Le produit selon l'invention peut être administré à un malade selon différentes formes adaptées à la voie d'administration choisie qui, de préférence, est la voie par térale. L'administration par voie parentérale comprend les administrations intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous cutanée. Plus particulièrement préférée est l'adinistration intrapéritonéale ou intraveineuse. La présente invention comprend également les compositions -maoet tiques qui contiennent le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1- vinyl-indane en une quantité suffisante adaptée à l'emploi en thérapeutique humaine ou vetérinaire. Les compositions peuvent être préparées selon les méthodes hatituelles en utilisant un ou plusieurs adjuvants, supports ou excipients acceptables. Les supports convenables incluent les diluants, les milieux aqueux stériles et divers solvants non toxiques.De préférence les comons se présentent sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses, de solutions injectables qui panent contenir des agents émulsifiants, des colorants, des préservatifs ou des stabilisants. Le choix des adjuvants ou excipients peut être déterminé par la solubilité et les propiétés chimiques du produit, le mode particulier d'administïion et les bonnes pratiques pharmaceutiques. Pour l'administration parentérale, on utilise des solutions ou des suspensions stériles aqueuses ou non aqueuses. Pour la préparation de solutions ou de suspensions non aqueuses peuvent être utilisés des huiles végétales naturelles telle que l'huile d'olive, l'huile de sésame ou l'huile de paraffine ou les esters organiques injectables tels que roléate d'éthyle. Les solutions aqueuses conviennent pour l'administration intraveineuse dans la mesure où le pH est convenablement ajusté et où risotnicité est réalisée, par exemple, par une quantité suffisante de chlorure de sodium ou de glucose. La stérélisation peut être réalisée par chauffage ou par tout autre mayen qui n'altère pas la composition. n est bien entendu que tous les produits entrant dans les compositions selon l'invention doivent être purs et non toxiques pour les quantités utilisées Les compositions peuvent contenir au moms 0,001 56 de produit thérapeuti- quement actif. La quantité de produit actif dans une composition est telle qu'une posologie convenable pusse être prescrite. De préférence, les compositions sont préparées de telle façon qu'une dose unitaire contienne de 0,01 à 100 mg environ de produit actif pour l'administration par voie parentérale. Le traitement thérapeutique peut être effectué concuremment avec d'aures traitements thérapeutiques incluant des médicameffls aníinéoplastiques, des anticorps monoclonaux, des thérapies immunologiques ou des radiothérapies ou des modifi- cateurs des réponses biologiques. Les modificateurs des réponses incluent, de manière non limitative, les lymphokines et les cytokines telles que les interleukines, les interférons (a, ou o) et le TNF.D'autres agents chimiothérapeutiques utiles dans le traitement des désordres dus à la prolifération anormale des cellules incluent, de manière non limitative, les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote comme la mechloretamine, le cyclophosphamide, le melphalan et le chlorambucil, des sulfonates d'allyle comme le busuifan, les nitsosouées comme la carmustine, la lomustine, la sé- mustine et la streptozocine, les triazènes comme la dacarbazine, les comme les analogues de l'acide folique tel que le méthotrexate, les analogues de zr- rimidine comme le fluorouracil et la cytarabine, des analogues de peines comme la mercaptopurine et la thioguanine, des produits naturels tels que les alcaloïdes de vinca comme la vinblastine, la vinaistine et la vendésine, des épipodophyllotoxines comme rétoposide et le teniposide, des antibiotiques comme la dactinomycine, la deunorubi cine, la doxorubicine, la bléomycine, la plicamycine et la mitomycine, des enzymes comme la L-asparaginase, des agents divers comme les complexes de coordination du platine tel que le cisplatine, les urées substituées tel que l'hydroxyurée, les dérivés de méthylhydrazine comme la procarbazine, les suppresseurs adrénocorticoïques comme le mitotane et l'aminogiutéthymide, les hormones et les antagonistes comme les adré- nocorticostéroïdes comme la prednisone, les progestines comme le caproate d'hydroxyprogestérone, l'acétate de méthoxyprogestérone et l'acétate de megesbl, les oestrogènes comme le diéthylstilbestrol et l'éthynylestradiol, les antioestrogènes comme le tamoxifène, les androgènes comme le propionate de testostérone et la fluoxymesterone. Les doses utilisées pour mettre en oeuvre les méthodes selon PinvmtKMl sont elles qui permettent un traitement prophylactique ou un maximum de réponse théra- peutique. Les doses varient selon la forme d'administration et les car propres du sujet à traiter. En général, les doses sont celles qui sont théra~ efficaces pour le traitement des désordres dus à une prolifération cellulaire Le produit selon l'invention peut être administré aussi souvent que nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique désiré.Certains malades peuvent répondre rapidement à des doses relativement fortes ou faibles puis avoir besoin de doses d'entretien faibles ou ralles Généralement, de faibles doses seront utilisées au début du traiteinent et, ai nécessaire, des doses de plus en plus fortes seront administrées jusqu'à l'obtention brm effet optimum. Pour d'autres malades il peut être nécessaire d'administrer des doses d'entretien 1 à 8 fois par jour, de préférence 1 à 4 fois, selon les besoins physiologiques du malade considéré. n est aussi possible que pour certains malades i soit nécessaire de n'utiliser qu'une à deux administrations journalières. Chez l'homme, par voie intraveineuse, les doses sont généralement comprises entre 0,05 et 50 mg/kg et, de préférence entre 0,01 et 5 mg/kg et, encore pus spécifiquement entre 0,1 et 2 mg/kg. ll est entendu que, pour choisir le dosage le approprié. devront être pris en compte la voie d'administration, le poids du malades son état de santé général, son âge et tous les facteurs qui peuvent influer sur l'efficacité du traitement. L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention. EXEMPLE On dissout 40 mg du produit obtenu à l'exemple 1 dans 1 cm3 d'Emulphor EL 620 et 1 cm3 d'éthanol puis la solution est diluée par addition de 18 cm3 de sérum physiologique. La composition est administrée par perfusion pendant 1 heure par introduc- tion dans du soluté physiologique. REVENDICATIONS 1 - Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane de formule: ainsi que ses formes stéréoisomères. 2 - Le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane caractérisé en ce qu'il présente les caractéristiques suivantes: - pouvoir rotatoire: [a]20(Na 589) = +32,3#1,3 (dichlorométhane; c = 0.5) [&alpha;]20 (Hg 436) = +75,0 # 1,8 (dichlorométhane ; c = 0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractéristiques à 3419, 3074, 1635, 1592, 1495, 1271, 1126 et 1029 cm-1. - spectre de masse (DCI NH3) : 328 (M + NH4)+ (H) :310 (M)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHZ ; CDC13 ; 6 en ppm; constante de couplage J en Hz) : 1,95 (m, 1H); 2,05 (m, 1H); 2,18 (s, 3H); 2,62 (d, J = 8 et 13, 1H); 3,16 (dd, J = 6 et 13, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,83 (m, 1H); 3,88 (m, 1H); 4,25 (s, 1H); 4,98 (d, J = 8, 1H); 5,01 (d, J = 16, 1H); 5,58 (s, 1H); 5,78 (d"l, J=8et16, 1H) ;6,53 (d,J=7, 1H) ;6,69(dd,J=7et 1, 1H) ;6,79(d,J=7, 1H}; 6,82 (dd,J = 1, 1H); 6,85 (d, J = 7, 1H) - spectre ultra-violet: A max = 282 nm (# =4650) ; 225 nm (épaulement) ; 207 (E = 48800) (c = 10,1 g(cm3 ; méthanol) À max = 282 nm ; 225 nm (épaulement) ; 206 nm (c = 10,1 mg/cm3 ; méthanol-acide chlorhydrique) A max =297 nm (épaulement) ; 288 nm ; 243 nm (épaulement) ; 214 mn (c= 10,1 mg'cm3 ; méthanol-potasse) 3 - Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce l'on extrait la plante Ottelia alismoïdes au moyen d'un solvant convenable puis sépare le produit selon la revendication 1 de l'extrait obtenu 4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'on extrait la plante au moyen d'un solvant choisi parmi les éthers aliphatiques contenant 1 à 6 atomes de carbone pour fournir, après concentration, un extrait sec qui est repris par un hydrocarbure aliphatique contenant 5 à 8 atomes de carbone ou un hydroearbtioe cycloaliphatique contenant 5 à 7 atomes de carbone éventuellement associé à un nitrile contenant 1 à 4 atomes de carbone pour obtenir, après concentration, un extrait sec dont on sépare le 3-(3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-4-hydroxy-7-méthyl-1-vinyl-indane par application de techniques chromatographiques. 5 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient le produit selon l'une des revendications 1 ou 2 à l'état pur ou en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants et éventuellement avec ou plusieurs produits eux-mêmes théra peutiquement actifs.