FR 2727687 A1 19960607 FR 9414796 A 19941202 STABILISATION DE, CONIPOSES RADIONIARQUES Un composé organique radioactivement marqué, en solution, est sujet à la décomposition radiolytique pendant le stockage et le transport. 1l est donc intéressant, du point de vue économique et scientifique, de trouver des additifs qui permettent d'augmenter la durée de conservation de telles solutions tout en maintenant leur efficacité par la diminution de la formation d'impuretés radioactives. Ces additifs ne doivent évidemment pas interférer avec les applications ultérieures des produits ainsi stabilisés. Le brevet US 4,390,517 se rapporte à l'utilisation d'une large gamme d'amines primaires, secondaires, et tertiaires comme stabilisants de composés radiomarqués. Le brevet US 4,411,881 se rapporte à l'utilisation d'amines thiocarbonylées comme stabilisants. Le brevet US 4,451,451 se rapporte à l'utilisation de l'acide 4-aminobenzoïque comme antioxydant dans des solutions contenant du technétium 99m. Le brevet US 4,793,987 se rapporte à l'utilisation des acides pyridines carboxyliques comme stabilisants. Le brevet PCT/WO93/22260 se rapporte à l'utilisation de compositions contenant un stabilisant et un colorant. Le stabilisant est issu du tryptophane, du para-aminobenzoate, de l'indoleacetate ou des groupes azoles. Le colorant est sélectionné à partir du Sulphorhodamine B, du Xylène Cyanol, de l'Azocarmine B ou du New Coccine. Les nucléotides marqués sont souvent vendus dans des solutions tampons, transportées dans la carboglace puis stockées à -70 C. Pouvoir transporter ces solutions à température ambiante et les conserver à A C (sans congélation) constituerait un énorme avantage pour le producteur et l'utilisateur. Les solutions de nucléotides radiomarqués sont généralement incolores. Une solution colorée serait également utile lors des manipulations. Cette invention se rapporte à une composition comprenant un composé organique marqué par un radionucléide émetteur ss sujet à l'autodécomposition radiolytique pendant le stockage et le transport, et la vitamine B 12. Cette dernière présente deux avantages -elle stabilise la solution radiochimiquement, -elle colore la solution en rouge. Cette invention concerne particulièrement les composés organiques qui sont vendus et stockés en solution aqueuse etiou plus rarement dans un solvant organique hydrophile. Le produit peut également se trouver sous forme solide. L'invention est applicable aux composés organiques marqués radioactivement qui sont sujets à ia décomposition radiolytique, par exemple les acides- aminés, les stéroïdes, les lipides, les acides gras, les peptides, les carbohydrates, les protéines, et tout particulièrement les nucléotides, thionucléotides, nucléosides, les acides nucléiques, les bases puriques et pyrimidiques, leurs dérivés. La nature du radionucléide émetteur n'est pas restrictive: 3H et 14C sont possibles mais la préférence va au 32P, 33P et 35S. La vitamine B 12 est utilisée dans les solutions de composés organiques à des concentrations comprises entre 0.04mmolaire et 90mmolaires, plus particulièrement Smmolaires. La solution est ajustée à pH basique ( entre 7 et 12), préférentiellement à pH=9. Des additifs de type tampon, stabilisant et/ou colorant peuvent être ajoutés à cette composition. La vitamine B12 colore la solution (plus visible lors des manipulations), permet un transport à température ambiante (moins onéreux que la carboglace), et un stockage à 40C (sous forme liquide). De plus, elle est compatible avec les applications ultérieures des nucléotides marqués, et n'interfère donc pas lors des manipulations des utilisateurs. PARTIE EXPERIMENTALE. Le 33P a une demi-vie de 25,4 jours et les nucléotides marques au 33P sont synthétisés ou purifiés tous les 15 jours. On analyse donc la stabilité de ces solutions sur une période de 2 semaines. Les exemples qui suivent, illustrent l'invention. Tous les nucléotides se trouvent dans une solution tampon à pH=8, ont une activité spécifique de +/- 3000Ci/mmole et une concentration de 10 mCi/ml à la date de calibration Tous les résultats sont exprimés en pourcentage et comparés à une référence du même lot stockée à -20 C, +4"C ou température ambiante. Exemple 1: On a déterminé la pureté radiochimique d'échantillons de ATP y(33P) stockés pendant 15 jours par chromatographie sur couche mince (CCM) dont la visualisation se fait grâce à un lecteur de plaque CCM. Les conditions de stockage +400CfFA/+40C indiquent que le nucléotide est resté à 40"C pendant 48H, puis à température ambiante pendant 24H, et enfin à 40C pendant le reste de l'expérience. Echantillon Stockage J2 J3 J 15 Référence -20 C 100 99,09 98,00 Référence +40 C/TA/+4 C 99,00 99,00 28,00 B12, 5mM +40"CTTA/+4"C 99,00 98,99 97,00 B12, 5mM -20 C 100 99,34 99,00 Les échantillons stabilisés à la B 12 restent purs radiochimiquement pendant 15 jours. Exemple 2: Test d'incorporation du ATP !(33P) du même lot que dans l'exemple I dans un oligonucléotide dT15 (Promega), en présence de T4 Polynucléotide Kinase (New England Biolabs). Echantillon Stockage JO J3 J15 Référence 40 C/TA/+4 C 75,21 63,00 38,00 B12 5mM +40 C/TA/+4 C 74,23 75,83 75,50 B12 5mM -20 C 75,30 77,40 76,32 Référence -20 C 78,01 77,24 76,25 La vitamine B12 n'interfère pas avec le test d'incorporation et stabilise l'échantillon pendant au moins 15 jours Exemple 3: Détermination de la pureté radiochimique de I' ÂTP 7(33P), dATP &alpha;(33P), dCTP &alpha;(33P), CTP &alpha;(33P), UTP a(33P) stabilisés avec de la B12 à une concentration finale de 5mmolesilitre en milieu tamponné à pH=9. Une comparaison avec des solutions de référence à pH=9 et à pH=8 est effectuée !ATP Stockage JO J8 Jîl J15 Référence pH=8 +4 C 100 95,00 82,57 78,50 Référence pH=9 4aC 100 93,20 84,83 83,00 B12 pH=9 4 C 100 96,00 87,73 86,30 Référence pH=8 -20 C 99,99 99,89 100 88,30 adATP Stockage JO J8 Jîl J15 Référence pH=8 -4 C 96,04 95,21 84,20 72,70 Référence pH=9 +4 C 95,55 95,60 84,39 74,81 B12 pH=9 -40C 92,43 96,40 89,90 83,49 Référence pH=8 -200C 95,10 98,92 87,38 85,74 adCTP Stockage JO J8 Jil J15 Reference pH=8 +4 C 96,56 95,93 84,65 82,63 Référence pH=9 +40C 97,97 95,71 85,04 83,63 B12 pH=9 +4 C 96,60 96,40 89,96 85,83 Référence pH=8 -200C 100 87,05 90,70 88,32 &alpha;CTP Stockage JO J8 Jîl J15 Référence pH=8 +4 C 100 97,38 83,50 77,80 Référence pH=9 +4 C 97,97 98,00 86,19 82,30 B12 pH=9 +4 C 100 97,57 89,45 85,91 Référence pH=S -20 C 100 97,81 94,44 86,86 aUTP Stockage JO J8 Jil J15 Référence pH=8 40C 99,S0 98,38 88,84 84,31 Référence pH9 +4 C 96,62 97,77 92,32 83,85 B12 pH=9 +4 C 99,90 99,60 93,54 85,28 Référence pH=8 -200C 100 98,90 96,71 85,14 On observe une stabilisation de tous les nucléotides testés par la vitamine B12 à une concentration de Smmolaires. Un ajustement du pH à 9 favorise cette stabilisation. Exemple 4: Un séquençage a été réalisé en utilisant - du dATP a(33P) stabilisé à la B12 à un pH=9, transporté à température ambiante pendant 24H puis stocké à 4 C pendant 8 jours. - du dATP a(33P) non stabilisé, transporté dans la carboglace, puis stocké à -20 C, pendant 8 jours. La séquence a été réalisée sur un plasmide, en utilisant comme polymérase la Sequenase USB, suivant le protocole du fabricant. Le résultat est obtenu par radiographie du gel de séquence. Le nucléotide stabilisé et conservé S jours à 4 C donne d'aussi bons résultats que le nucléotide non stabilisé et conservé à -20 C. REVEi\UICATIONS -1. Une composition comprenant un composé organique marqué radioactivement, sujet à la décomposition radiolytique pendant le stockage et le transport, est caractérisée par la présence et ta vitamine B 12 utilisée comme stabilisant et colorant. -2. Une composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé organique marqué radioactivement est présent en solution aqueuse et/ou dans un (des) solvant(s) organique(s) hydrophile(s). -3. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé organique est sujet à la décomposition radiolytique tel que les acides aminés, les stéroides, les lipides, les acides gras, les peptides, les carbohydrates, les protéines, les bases puriques et pynmidiques et plus particulièrement les nucléotides, les thionucléotides, les nucléosides, les acides nucléiques et ainsi que leurs dérivés. -4. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le radiomarqueur est le 32P ou 33P ou 35S ou 3H ou 14C. -5. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la vitamine B12 est présente dans des concentrations comprises entre 04molaire et 90mmolaires. -6. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est ajustée à pH basique ( entre 7 et 12), préférentiellement à pH=9. -7. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu elle est utilisable pour le transport à température ambiante et le stockage à +4 C. -8. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle se trouve avec des additifs de type tampon, stabilisant et/ou colorant. -9. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle peut se trouver sous forme solide.