FR 2726574 A1 19960510 FR 9413249 A 19941104 PROCEDE DE DISSOCIATION DES CELLULES EUCARYOTES EN CULTURE La présente invention est relative à une amélioration des procédés de recueil, et de manipulation des cellules eucaryotes adhérentes cultivées. La culture cellulaire est actuellement un des passages obligés des techniques de génie génétique soit pour exprimer des protéines recombinantes, soit lorsque ces cellules ont été transfectées par des virus recombinants, comme cellules hôtes administrables en thérapie génique. Dans ce dernier cas il arrive qu'on réimplante directement des cellules transfectées par des vecteurs viraux ou rétroviraux dans des tissus ; une revue de ces différentes techniques est donnée dans l'ouvrage intitulé Thérapie génique, I'ADN médicaments coordonné par Axe Kahn, Editeur John Libby, (1993); on pourra également se référer utilement à l'article de RC. MULLIGAN, Science (1993), Vol.: 260, p 926. Le rendement en cellules viables est un point critique lorsque l'on cultive des cellules eurcaryotes tant pour la qualité même des cellules ou des produits qui en sont obtenus que pour les questions de rendement lesquels jouent à la fois sur les quantités de produits obtenus et sur le prix de revient dudit produit; en particulier lorsqu'une thérapie génique est réalisée par injection des cellules, par exemple des cellules d'empaquetage, contenant un virus ou rétrovirus recombinant, le titre infectieux du virus ou du rétrovirus dépendant directement de l'état physiologique des cellules d'empaquetage et de leur concentration. Les cellules adhérentes sont souvent utilisées en culture cellulaire pour la production de produits soit sécrétés par ces cellules soit en tant que tel en thérapie génique ; les exemples les plus classiques sont soit les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary Cells) pour la production de molécules recombinantes ou récepteurs clonés ou d'autres cellules fibroblastiques utilisées en thérapie génique et en particulier des cellules dérivées de 3T3 telles NIH-3T3. Pour décoller les cellules de leur support, différentes techniques physiques (racloir) ou chimique (chélateurs de type EDTA ou enzyme protéolytique de type trypsine) ont été employées. Ces techniques présentent toutes des inconvénients. L'utilisation de moyens physiques ou de chélateurs est délicate et entraînent l'apparition d'agrégat, et les enzymes protéolytiques comme la trypsine, dégradent les protéines de surface de la cellule et perturbent leur propriété biologique sans même supprimer totalement la présence des agrégats, conduisant à des taux d'infectivité plus faibles qu'ils ne pourraient l'être. C'est le cas par exemple de l'utilisation de cellules d'empaquetage NIH3T3 qui sont des cellules de fibroblaste de souris utilisées en thérapie génique, et cultivées sur supports plastiques pour être ensuite collectées et injectées directement dans des tumeurs ; le principe de ce type de thérapie est de faire produire par des dérivés de cellules NIH-3T3, appelées cellules M11, in vivo au sein des tumeurs, des rétrovirus thérapeutiques ; à titre d'exemple d'un tel traitement on se référera aux articles de M. Caruso et al dans Proc Nat. Acad. Sci. USA, (1993) 90: 70-24, 70-28; ou KW Culver et al, Science 256 n" 5063 p. 1550-1551-(1992). L'intégrité et la capacité de ces cellules à produire des virus sont donc primordiales pour l'efficacité thérapeutique du traitement. L'utilisation de d'EDTA conduit à des agrégats, et l'utilisation d'enzymes protéolytiques modifient de telle façon les membranes cellulaires que les cellules ne disposent plus des glycoprotéines de surface leur permettant de produire des rétrovirus à un titre optimum. Les agrégats présentent toute une série d'inconvénients dont les plus importants sont d'entraîner une sous estimation du nombre des cellules et une très mauvaise reproductibilité des comptages cellulaires. De plus la présence d'agrégats perturbe les procédés de congélation indispensables au bon stockage des cellules, les cellules situées au centre des agrégats, n'étant pas atteintes par les produits de conservation tels le dimethyl-sulphoxide (DMSO) ce qui les rend plus fragiles et entraîne une mortalité supérieure. Enfin les agrégats perturbent la diffusion des cellules quand elles sont injectées au sein des tissus ou de tumeurs au cours de traitements de thérapie génique. Les dispositifs permettant la culture cellulaire en masse de cellules eucaryotes adhérentes sont de différents types, le principe étant toujours d'avoir une surface maximale permettant l'adhésion des cellules sur cette dernière ; on pourra citer à titre d'exemple et comme étant les plus fréquentes les bouteilles roulantes (roller bottles) dans lesquelles les cellules tapissent une paroi cylindrique des bouteilles, - les appareils dits multi tray constitués d'une série de plaques superposées sur lesquelles s'attachent les cellules et baignant dans le milieu de culture, ou encore de type CellCube, - des micro-porteurs ou micro-billes tels ceux commercialisés par la société Pharmacia sous les marques Cytodex 1, 2 ou 3 ou encore Cytopore, - différents systèmes existants comportant des cartouches de fibres creuses dans lesquelles les cellules sont logées à titre d'exemple, parmi lesqueis on peut citer les systèmes de type Cellmax, Endotronix. Lorsque l'on veut récupérer des cellules soit pour constituer des banques cellulaires soit pour les repiquer soit encore pour les utiliser à titre d'agents thérapeutiques, la succession d'étapes est la suivante: a) I'élimination du milieu de culture de cellules, b) L'addition d'un milieu de dissociation comprenant un chélateur ou un enzyme protéolytique, ou une combinaison des deux, c) une ou plusieurs étapes de lavage dans un milieu approprié à l'utilisation que l'on souhaite faire de ces cellules. Si ces cellules sont destinées à être congelées, elles sont reprises dans un milieu contenant du DMSO de 5 à 20 % et du sérum de veau foetal de 30 à 70 les cellules congelées sont ensuite décongelées par resuspension dans un milieu composé de sérum physiologique auquel est ajoutée de l'albumine à 10 % et les cellules sont ensuite lavées et centrifugées plusieurs fois dans le même milieu jusqu'à reprise du culot cellulaire dans le milieu final adapté à leur utilisation. Le problème de la conservation de ces cellules à l'état isolé, en ayant leur intégrité membranaire et conservant une viabilité maximale est un problème aujourd'hui non résolu. L'invention résout ce problème en présentant un procédé de préparation de cellules eucaryotes adhérentes comprenant au moins une des étapes citées ci-dessus et consistant en l'addition dans la solution de traitement des cellules pendant l'une de ces étapes un dérivé d'un polymère polyosidique. De façon préférée ce polymère polyosidique est un polysaccharide de préférence un polysaccharide sulfaté ; des exemples de tels polysaccharides sulfatés sont par exemple l'héparine, le dextran sulfate, ou le sulfate d'hydroxyéthyl-amidon. Un polysaccharide selon l'invention à ajouter dans les solutions de traitement des cellules eucaryotes a un poids moléculaire compris de préférence entre 5000 et 500 000. L'héparine de poids moléculaire 20 000 constitue un cas particulier particulièrement efficace dans le procédé de l'invention. L'héparine est actuellement connue et utilisée comme anti coagulant. Plusieurs médicaments à base d'héparine ou de dérivés d'héparine ont reçus une autorisation de mise sur le marché pour cette indication. Mais l'avantage de l'addition d'héparine dans le procédé de l'invention ne peut être expliqué par un mécanisme physiologique tel celui de la coagulation ou l'hémostase. La dose de polysaccharides sulfatés à ajouter dans le procédé de l'invention est de 50 à 500 unités par ml et de préférence de 75 à 150 unités par ml. Cet effet des polysaccharides sulfatés sur la prévention de l'agrégation des cellules adhérentes ne peut pas être expliqué ni par ses propriétés antiagrégantes connues, ni par son action bien connue d'inhibition de la transformation de la pro thrombine en thrombine. L'invention est également relative à l'utilisation d'un dérivé de polymère polyosidique, notamment des polysaccharides sulfatés, dans le milieu de dissociation ainsi que dans les milieux de congélation ou de décongélation de cellules eucaryotes adhérentes. L'héparine, le dextran sulfate ou le sulfate d'hydroxyéthyl-amidon sont des polysaccharides sulfatés préférés de l'invention. Cette utilisation permet a) d'obtenir une meilleure dissociation des cellules, b) d'obtenir ces cellules avec un rendement supérieur à celui obtenu par les méthodes classiques, c) de diminuer la taille et le nombre des agrégats qui subsistent après l'étape de dissociation, d) d'obtenir une meilleure reproductibilité dans les comptages cellulaires. e) d'optimiser les procédures de congélation ou de décongélation et d'injection (lorsque c'est leur utilisation finale) de ces cellules. L'invention est également relative aux cellules eucaryotes obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus, ainsi qu'aux produits issus de ces cellules, notamment des virus, protéines recombinantes ou des récepteurs. L'utilisation des cellules eucaryotes recombinantes ou transformées pour utilisation en thérapie génique prend actuellement de plus en plus d'importance et les volumes à produire également. Le procédé de l'invention est considérablement amélioré lorsque après la première étape de dissociation des cellules, le reste du processus de traitement, suspension, re-suspension, lavages sont effectués à la température de 4"C au lieu d'être effectués à température ambiante. Aussi le procédé tel que décrit cidessus est particulièrement avantageux quand l'ensemble de ces étapes intermédiaires entre la dissociation sont réalisées à 4"C. L'utilisation de ces types de cellules étant essentiellement à but thérapeutique chez l'homme, il est intéressant de souligner que les polysaccharides sulfatés tels que ceux cités plus haut sont des produits qui ont déjà obtenus une autorisation de mise sur le marché et à ce titre ne posent à priori aucun problème de toxicité si des résidus potentiels restent associés aux cellules. Les expériences ci-dessous sont des exemples donnés à titre indicatif de l'amélioration conférée par le procédé de l'invention dans la qualité et le rendement des cellules obtenues ainsi que dans l'amélioration du titre infectieux des cellules dérivées de fibroblaste de souris transfectées par des rétrovirus recombinants tels que les cellules de packaging TCRIP (Danos O. et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85: 64,60-64-64 (1988). Ces expériences sont destinées à illustrer les performances du procédé de l'invention sans pour autant être limitées ni aux types cellulaires donnés, ni à la méthode de culture utilisée, ni au milieux, tampons ou traitement des cellules utilisées à partir de l'étape de dissociation. Tous les exemples ci-dessous sont réalisés en utilisant comme polysaccharides sulfatés l'héparine telle que commercialisée par la société Choay (Sanofi Winthrop, 9, rue du Président Allend, 94958 Gentilly Cedex), L'héparine lyophilisée étant remise en solution dans de l'eau distillée stérile et à raison de 25 000 unités par ml. Les cellules utilisées sont des cellules de type fibroblastique dérivées de NIH-3T3 transfectées par un rétrovirus recombinant de type Moloney intégrant dans son génome le gène de la un thymidine kinase, et décrit dans Caruso et ai 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7024-7028, et appelées cellules M11. Exemple n 1: Effet de l'addition d'héparine sur le nombre de cellules dissociées et collectées. La croissance des cellules est menée à confluence en bouteilles roulantes jusqu'au 6ème ou 8ème jour (J6 ou J8) de la production, puis le milieu de culture est jeté et les cellules sont mises en contact avec un milieu de dissociation constitué de tampon PBS auquel on ajoute 0,02 % d'EDTA. Les cellules sont ensuite comptées au Coulter counter à J6 ou J8 soit sans addition d'héparine soit avec addition de 100 unités par ml d'héparine ; les résultats sont présentés dans le tableau 1 suivant: Tableau 1: Nombre des cellules récoltées par bouteilles roulantes HEPARINE 0 100 U/ml J6 124.106 150.106 J8 136.106 164.106 On voit que le nombre de cellules récoltées par bouteilles roulantes est 20% supérieur lorsque 100 unités par ml d'héparine sont ajoutées au milieu PBS-EDTA. En outre lorsque l'on reprend les culots cellulaires en milieu de congélation, le nombre d'agrégats reformés est beaucoup plus faible qu'en l'absence d'héparine. Exemple n 2 Congélation puis décongélation des cellules en absence ou en Présence d'héparine. Des boites de cultures de 75 cm2 contiennent un tapis de cellules M11 en confluence. Les cellules sont décollées de la boite avec du milieu de dissociation PBS-EDTA 0, 02 % avec ou sans héparine à 100 unités par ml. Le milieu de dissociation est mis en présence du tapis cellulaire pendant 5 minutes puis les cellules sont récupérées et la dissociation est terminée avec une pipette de 5 ml. Les cellules sont alors comptées, centrifugées et le culot cellulaire repris dans un volume approprié de milieu de congélation composé de 50 % de sérum de veau nouveau-né (Hyclone référénce A-2111) et 50 % de milieu DME contenant 20 % de DMSO. Le milieu DME est le milieu DMEM (référence Gibco 41965) auquel on ajoute 6 ml de glutamine, 6 ml de solution d'antibiotique (pénicilline, streptomycine, néomycine (Référence GIBCO 15640048) et 10 % de sérum de veau nouveau-né. Les cellules sont congelées finalement dans 50 % de sérum de veau nouveau-né et 10 % de DMSO dans le DME. Protocole de décongélation: Les ampoules contenant les cellules congelées dans le milieu décrit cidessus sont sorties de l'azote liquide et placées dans la glace puis transférées dans un bain-marie à 37 jusqu'à l'apparition d'un premier glaçon, moment propice au transfert dans un tube falcon de 15 ml contenant 10 ml de milieu constitué de sérum physiologique auquel on ajoute 10 % d'albumine humaine. Les cellules sont ensuite lavées deux ou trois fois avec ce même milieu puis le culot cellulaire est remis en suspension dans un volume adéquat de DME (tel que défini ci Le tableau 2 ci-dessous résume les résultats obtenus dans les conditions expérimentales suivantes: lors de leur croissance après décongélation le milieu de culture DMEM contient de 0 à 100 unités par ml d'héparine puis les cellules sont récoltées en tampons PBS-EDTA avec ou sans 100 unités d'héparine. Les paramètres mesurés sont le nombre de cellules vivantes, la viabilité, la densité des cellules dans les flacons, le temps de doublement, le nombre de doublement. Tableau 2 Nbe d'Ul d'héparine ds 30 ml de DMEM 0 25 U/ml 50 U/ml 75 U/ml 100 U/ml Nbe d'Ul d'héparine ds 10 ml de PBS 1000 0 1000 1000 0 0 1000 1000 0 0 1000 0 000 0 EDTA Nbe de C vivantes (x10 6) 3,2 2,1 2,33 2,36 2,48 1,74 1,96 2.64 1,44 2,48 1,98 1,32 1,6 1,03 Viabilité 90% 72% 91% 86% 86% 75% 87% 92% 89% 91% 83% 80% 83% 82% Nbe de C vivantes par cm 2 0,042 0,028 0,031 0,032 0,033 0,023 0,026 0,035 0,019 0,019 0,026 0,018 0,021 0,014 Temps de dédoublement 66h 6j 4,7J 4,5j 4,1j 14j 7,8j 3,7 - 4,1j 7,5j - - Nbe de doublement 1,09 0.48 0,63 0,65 0,72 0,21 0,38 0,81 - 0,72 0,4 - - Confluence 2+(+) 2+(+) 2+(+) 2+(+) 2+(+) 2+(+) 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ II apparaît clairement que la présence d'héparine dans le milieu de croissance apparaît défavorable au nombre de cellules vivantes obtenues après récolte. Par contre la présence d'héparine dans le milieu de décollement augmente de façon très significative le nombre de cellules vivantes, la viabilité, la densité des cellules. A l'observation microscopique des cellules à J3, il apparaît que le nombre de cellules en suspension augmente avec la concentration en héparine du milieu et inversement le tapis cellulaire est moins dense. Les cellules cultivées en présence d'héparine puis traitées en PBS et D'EDTA sans héparine présentent un phénomène de décollement du tapis cellulaire ce qui fausse les comptages obtenus à partir du tapis décollé et diminue de fait le rendement des cellules obtenues. Cet exemple montre clairement que la présence d'héparine dans le milieu PBS-EDTA et dans les milieux de congélation, décongélation confère aux cellules un taux de viabilité de 90 % et un rendement en cellules vivantes bien supérieur à celui obtenu en absence d'héparine. Exemple n" 3 titre infectieux des cellules en culture avant été en contact de l'héparine Pendant les différentes phases de récolte. congélation et décongélation telles aue décrites dans les exemples cidessus. Le calcul du titre infectieux a été réalisé selon la méthode décrite dans Caruso et al, Proc Nat Acad Sci (1992) 89 : 182-186. Des cellules L en culture ont été infectées avec les lignées M11 récoltées de la façon décrite dans les exemples cidessus. Les cellules L infectées par les cellules M11 sont ensuite colorées au bleu trypan.. La mesure du titre infectieux de ces cellules est identique ou supérieure à celui obtenu en milieu PBS-EDTA simple, et constamment supérieure si on rapporte le titre au nombre de cellules effectivement comptées; il est également significativement supérieur au titre de cellules recueillies avec de la trypsine. En outre avec l'utilisation de la trypsine il est constant que le titre infectieux soit nul jusqu'à la quatrième heure alors que en présence de PPS et d'EDTA auquel on ajoute 100 unités par ml d'héparine, un titre infectieux apparaît dès la première heure après la mise en présence des cellules L avec les cellules M11. Ces résultats reflètent bien que les cellules M11 sont dans un meilleur état physiologique lorsque les cellules ont été préalablement mises en présence d'héparine lors des étapes de recueil, congélation et décongélation que lorsqu'elles ont été seulement en présence de D'EDTA ou de trypsine ou d'un mélange des deux. En conclusion l'addition d'une quantité de polysaccharides sulfatés telle l'héparine à une concentration de 50 à 500 unités par ml et de préférence une centaine d'unités par ml dans les milieux de manipulation des cellules adhérentes utilisés lors de leur recueil, de la congélation, ou de la décongélation, permet d'augmenter la viabilité et le nombre absolu de cellules vivantes obtenues avec de façon concomitante une diminution des agrégats et un comportement physiologique des cellules plus vigoureux puisqu'il est observé une augmentation de l'infectiosité des cellules transformées par un rétrovirus. Enfin ces conditions expérimentales permettent de faire les opérations de collecte des cellules à une température de 4", ce qui permet d'envisager un traitement homogène de quantité importante de cellules ce qui est nécessaire lors de la préparation de lots thérapeutiques. II est particulièrment intéressant de noter que l'utilisation de substances telles l'héparine ou l'hydroxy-éthyl-amidon ont déjà reçu des AMM pour des utilisations thérapeutiques et notamment comme anti-agrégant pour le premier ou comme substitut plasmatique pour l'autre, ce qui laisse penser que l'utilisation des milieux les contenant ne poserait pas de problème majeur au niveau de la constitution de dossier d'enregistrement clinique de nouveaux produits thérapeutiques à base soit des cellules dans le cas d'une thérapie génique soit de substances excrétées par la cellule dans le cas de protéines recombinantes. Revendications 1. Procédé de préparation des cellules eucaryotes adhérentes comprenant au moins une étape de recueil des cellules après leur croissance complétée le cas échéant par des étapes de congélation et de décongélation desdites cellules, caractérisé en ce que les solutions de préparation contiennent au moins un dérivé d'un polymère polyosidique. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polymère est un dérivé de polysaccharide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le polymère est une polysaccharide sulfaté. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le polymère est choisi de préférence parmi l'héparine, le dextran sulfate ou la sulfate d'hydroxyéthyl amidon. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le polymère a un poids moléculaire compris entre 5000 et 500 000. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le polymère est l'héparine. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le polymère est ajouté au milieu au moins dans l'une des étapes suivantes : la dissociation et le recueil des cellules, leur congélation, leur décongélation. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les étapes intermédiaires entre celle de dissociation, de congélation et de décongélation sont réalisées à 4"C. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le système de culture est un système en circuit fermé dans lequel les cellules sont dissociées puis récupérées, notamment un système de type Cell Cube, ou des fibres creuses, ou des microporteurs. 10. Procédé selon d'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que les cellules adhérentes sont des cellules de type fibroblastiques. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules recombinées susceptibles de produire une protéine recombinante ou un récepteur. 12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules hôtes comprenant un rétrovirus recombinant utilisable en thérapie génique. 13. Cellules eucaryotes obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 14. Produits issus des cellules eucaryotes de la revendication 13, notamment des virus, des protéines recombinantes ou des récepteurs. 15. Utilisation d'un dérivé des polymères polyosidiques dans les milieux de recueil, congélation ou décongélation de cellules eucaryotes adhérentes comme agent de dissociation de désagrégation desdites cellules. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide polysulfaté. 17. Utilisation selon la revendication 16 caractérisé en ce que le polymère est l'héparine.