FR 2733251 A1 19961025 FR 9504590 A 19950418 La présente invention concerne notamment le dépistage familial de la prédisposition au glaucome juvénile ainsi que la possibilité de mettre en évidence le gène responsable de cette affection. Le glaucome juvénile qui touche près de 100 000 personnes en France y constitue une des principales causes de cécité. Comme son nom l'indique, les premiers symptômes se manifestent souvent avant 40 ans par une diminution du champ visuel. Cette affection indolore et d'évolution très progressive est souvent méconnue par le patient et n'est mise en évidence qu'à un stade avancé, souvent irréversible où elle évoluera vers la cécité. Ce glaucome juvénile provient de la combinaison d'une hypertension oculaire et d'une lésion du nerf optique. Actuellement des traitements efficaces existent, notamment médicaux et chirurgicaux, qui permettent de stopper la maladie ou d'en ralentir l'évolution. Toutefois, ces traitements ne sont très efficaces que lorque le glaucome est dépisté à un stade précoce, les dépistages tardifs conduisent à des chirurgies lourdes qui peuvent laisser des handicaps. Depuis quelques années, on a pu mettre en évidence le rôle majeur des facteurs génétiques dans la survenue du glaucome junvénile. Il est maintenant certain qu'il s'agit dans la plupart des cas d'une maladie transmise sur le mode mendélien simple dominant; le gène en cause étant situé sur le bras long du chromosome 1. C'est-à-dire que le glaucome juvénile est lié à la présence sur le chromosome 1 d'un gène particulier ou d'une structure particulière dont la présence d'une seule copie suffit pour la survenue de la maladie. Il est donc nécessaire, pour le dépistage précoce de la maladie, de déterminer si ce gène est ou non présent chez le patient. Actuellement, on connaît la région où se situe le gène que l'on nomme "locus de susceptibilité" mais pas sa position exacte ni sa structure. Un "locus de susceptibilité" peut comporter de l'ordre de 10 millions de bases, ce qui rend évidemment la localisation très compliquée d'autant que l'on ignore tout sur la structure du gène. Il n'est donc pas possible de mettre en évidence directement la présence du gène en cause, c'est pourquoi on doit avoir recours à un diagnostic mettant en oeuvre la technique des 'c microsatellites". Le chromosome comporte des séquences qui sont très polymorphes, c'est-à-dire qu'elles ont des compositions différentes selon les individus bien qu'étant situées au même endroit sur le chromosome, ces zones sont dénommées "microsatellites" et font l'objet de nombreuses publications. Dans le cas d'une affection de type familial et de caractère dominant, il est possible d'étudier la corrélation de la survenue du glaucome juvénile avec un allèle d'un marqueur microsatellite déterminé. Pour un taux de corrélation élevé, on pourra considérer que la présence de l'allèle du microsatellite est un indice de la présence du gène morbide. Ces microsatellites étant situés au même endroit, on peut envisager de mettre en évidence la présence d'un microsatellite particulier qui serait lié au gène que l'on recherche. Il est donc nécessaire d'étudier la famille du patient et de disposer de son "histoire", c'est-à-dire d'avoir pour chaque individu de la famille étudiée à la fois la présence de la maladie et la présence d'un marqueur spécifique, en fait allèle d'un microsatellite, qui soit nécessairement ou très probablement associé à la maladie. Si la famille est suffisamment nombreuse, on pourra déterminer quels sont les marqueurs qui sont statistiquement le plus souvent présent lorsque la maladie est détectée Le taux maximum de corrélation est obtenu pour un marqueur microsatellite qui est situé très près du gène en cause. En effet, dans ce cas, ces deux portions du chromosome sont transmises telles quelles à la descendance, par contre, si le marqueur est plus éloigné il peut se trouver séparé du gène lors de la transmission ("crossing over") et sa présence n'est plus nécessairement associée à la présence du gène défectueux. Il est donc nécessaire de comprendre que la mise en évidence d'un marqueur microsatellite chez un individu quelconque n'a pas, en principe de signification. En effet, en l'absence d'hérédité particulière, ce marqueur ne présente souvent aucun intérêt et il faut également comprendre que même lorsque l'histoire familiale fait apparaître un glaucome juvénile héréditaire, la présence du marqueur familial d'une autre famille n'est pas nécessairement déterminante pour prédire l'apparition de la maladie. Il est nécessaire de refaire des études de corrélation, même si lorsque les familles sont très proches (même région) et même en l'absence d'ancêtres communs connus, le marqueur peut dans certains cas être discriminant (déséquilibre de liaison entre le marqueur et la maladie). C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de dépistage d'une prédisposition au glaucome juvénile chez un patient, caractérisé en ce que l'on détecte, dans un prélèvement biologique chez ledit patient, la présence d'un marqueur microsatellite lié avec la survenue du glaucome juvénile dans sa famille,le marqueur microsatellite étant choisi parmi les marqueurs afm350yhl, afml22xa3, ngal, afm21, afm248wg5, afm278ye5, afm212xblO et afmi57xe7 du chromosome lq21q31. De façon plus précise, le marqueur microsatellite détecté est de préférence situé dans le locus correspondant à la région située entre le marqueur afm248wg5 et afm212xblO. Les techniques mises en oeuvre pour détecter la présence des marqueurs sont connues; il peut s'agir d'une détection en direct grâce à une sonde complémentaire du marqueur, mais on utilisera, de préférence, les méthodes mettant en oeuvre une amplification de la séquence marqueur par exemple par des méthodes de type PCR (Polymerase Chain Reaction) à l'aide d'amorces dont l'une est marquée par un fluorochrome. Afin de simplifier la détection des différents marqueurs en cause, il est possible d'utiliser la PCR "multiplex". Le principe est de réaliser plusieurs réactions de PCR simultanément à partir d'un même échantillon d'ADN génomique. L'intérêt est d'économiser les réactifs ainsi que l'ADN à typer, et de réduire le risque d'erreur en diminuant le nombre de manipulations. Dans ce but, les combinaisons de paires d'amorces sont testées deux à deux. Puis, si les résultats le permettent, une troisième paire sera introduite et ainsi de suite. Comme cela a été indiqué précédemment, la présence de ce marqueur microsatellite n'indique qu'une prédisposition à la survenue du glaucome juvénile et ceci lorsque l'histoire familiale ayant été analysée, il a été fait un lien entre la présence de ces marqueurs et la survenue du glaucome juvénile. La présente invention concerne également la séquence d'ADN située entre le locus comportant le marqueur afml22xa3 et afm212xblO laquelle partie est liée au système du glaucome juvénile. En effet, grâce aux développements précédents, il est possible de localiser le gène mis en cause dans le glaucome juvénile. La caractérisation des haplotypes recombinants au sein de grandes familles, grâce aux marqueurs microsatellites décrits ci-dessus, permet d'ordonner les marqueurs les uns par rapport aux autres. Chez les sujets glaucomateux, ces haplotypes recombinants permettent de mieux cerner la région chromosomique contenant le gène morbide. Une région de deux centiMorgans a été ainsi définie (figure annexée). Les marqueurs ainsi décrits ont permis d'identifier des clones de chromosome artificiels de levure couvrant la région. Deux YAC couvrant une distance maximale de 2.5 Mbases définissent ainsi un chemin de premier niveau. Il est alors possible d'isoler le gène par - recherche simultanée de nouveaux marqueurs polymorphes et de nouveaux haplotypes recombinants qui permettront de rétrécir encore la région contenant le gène, - recherche directe de gènes par plusieurs méthodes sélection de transcrits par hybridation . piègeage d'exons séquences phylogénétiquement conservées îlots CpG . expansion de triplets Enfin, le génotypage décrit permettra d'identifier des familles où le gène du glaucome localisé sur le chromosome 1 n'est pas impliqué, ouvrant la voie à la localisation d'autres gènes prédisposant au glaucome en d'autres endroits du génome. D'autres caractéristiques et modalités de mise en oeuvre du procédé pourront être déduits de la lecture de l'exemple qui suit. ExemDle Méthode de tvDaae de l'ADN nénomiaue humain avec 8 marqueurs microsatellites de la région la21a31. A) L'ADN est extrait du sang veineux périphérique après lyse cellulaire, digestion protéique, partition organique et finalement précipitation alcoolique. Le sang (20 ml) est prélevé par ponction veineuse périphérique sur un tube contenant de l'EDTA. Il est dilué avec un volume d'eau bidistillée. Après 10 minutes, les cellules sont collectées par centrifugation à 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée. Les cellules blanches sont lysées en présence de 20 ml de tampon CLB (Tris 10 mM pH 7.6, 5 mM MgCl2, sucrose 0.32 M, Triton X-100 1% (v/v). Les noyaux sont collectés par centrifugation à 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée. Les noyaux sont lavés une fois dans le tampon RSB (Tris 10 mM pH 8, NaCI 10 mM, EDTA 10 mtvl). Le culot est resuspendu dans 2 ml de tampon RSB auquel est ajouté du lauryl sulfate de sodium (1 %)et la protéinase K (200 llg/ml). Le mélange est incubé à 55 C pendant au moins 3 heures et régulièrement agité. La solution d'ADN ainsi obtenue est ensuite extraite avec un volume de phénol équilibré avec un tampon 50 mM Tris pH 8. Cette opération est répétée et complétée par une extration avec un volume de chloroforme/alcool isoamylique (24:1 v/v). L'ADN est précipité avec un volume d'isopropanol, rincé à l'éthanol (70 %), séché et enfin resuspendu dans 1 ml de tampon TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 0.5 mM). La concentration d'ADN est évaluée par mesure de l'absorbance à 260 mm en utilisant l'équivalence de 50 zg/ml d'ADN pour une unité d'absorbance. La concentration d'ADN est alors ajustée à 200 Fg/ml. B) Amplification de l'ADN génomique pour les marqueurs microsatellites fluorescents. Huit microsatellites sont utilisés pour déterminer les haplotypes associés à la région lq2 1 q3 1 sur le bras long du chromosome 1. Leur liste avec la description des amorces (séquence et addition d'un fluorochrome) est donnée dans le tableau 1. Les conditions d'amplification communes à ces marqueurs sont les suivantes Mélange réactionnel: . ADN génomique (2001lg/ml) 1 ctl . nucléotides triphosphate (chacun 1,25 mM) 4 l . amorces (chacune 10 picomoles/lll) 2 x 1 il .Taq DNA polymérase TM (5 U/pl) 0,05 itl .tampon de PCR 10 fois concentré 2.5 Crl .H20, qsp 25 1ll Composition du tampon de PCR 10 x : Tris 0.1 M pH 8.3 (à 20 C), KCI 0.5 M, Mg Cl2 15 mM, gélatine (SigmaTM G2500) 1 mg/ml. Pour l'amplification du marqueur afm22, I'anticorps TaqStartTM (Clontech) est ajouté à la concentration finale de 0.056 M (soit un rapport molaire anticorps/enzyme de 28:1). L'amplification est réalisée dans un thermocycleur TechneTM PHC-3 avec couvercle chauffant. Après un chauffage à 94 C pendant 5 minutes, 30 cycles sont effectués. Chaque cycle comprend 2 segments d'une minute chacun à 55 C et 94 C successivement. Un segment final d'élongation de 2 minutes à 72 C termine l'amplification. Tableau. Liste des marqueurs microsatellites utilisés pour haplotyper la région du gène du glaucome juvénile sur le chromosome lq21q31. MARQUEUR SÉQUENCE NUCLÉOTIDIQUE (taille en pb) des AMORCES (amont puis aval) afm35Oyhl JOE-5' -TCTTCCCACCACTGCC (189 bp) 5'-TGTATTCCTACTGCCCA afm122xa3 FITC-5 ' -CCTCAGTTCATTCCCATAA (olszlo) (121 pb) 5'-AGCTGkATeTCACCCAATAACTA nga1 5'-JOE CCAACGAGAATTCTATATTAACC (200 bp) 5'-TCTGGTAGGGCAGATCTGCTAGAA a f m 2 1 JOE-5 ' -CCTTCCTTTCTAAGGCTG (121 bpN) 5'-TCTTATCAGTCAGGCA afm2 4 8wg5 FITC-5 ' -TAATGGGTTCAGTGGACCTT (D1S452) (223 pb) 5 1 - TGCAGTTCCATATTCCAGGT afm278ye5 JOE-5'-TGAGCCGAGATTGAGCC (240 bp) 5'-CCAGGTCAGAGATGTTGG afm212xblO 5'-TAMRA-TCTACCACTTGAATTCCTGT (D1S242) (219 bp) 5'-ACCACTCCAGTTTGAGCAAC a fm157xe7 7 5 - FAM-TGTAAAAGCAAACTGTAGACGAT (D1S218) (274 pb) 5'-TTTATGTTATCACCAAGGCTTCT Les produits d'amplification (2 Ctl) d'un même individu sont rassemblés, coprécipités à l'éthanol (2.5 volumes, 2 heures à -20" C) et mis à migrer sur une même piste de gel d'acrylamide (6 %) - urée (8M), après resuspension dans un tampon de charge (formamide 2 crl, 0.5 pl Bleu ABITM, 0.5 jil GeneScan 2500 Rox, 1 zl H2O) et après dénaturation thermique. L'électrophorèse est réalisée dans un séquenceur automatique ABI 373, sous une puissance de 30 Watts pendant huit heures, le faisceau laser étant placé à une hauteur de 24 cm. Les données brutes sont analysées avec le logiciel GeneScan Analysis (ABI). Les pics de fluorescence sont identifiés avec le logiciel Genotyper (ABI), permettant ainsi d'assigner les allèles des marqueurs microsatellites. C) Interprétation des résultats. Ces résultats de typage sont interprétés en fonction du contexte - dans une famille où un haplotype de susceptibilité pour le glaucome associé cette région du chromosome 1 a déjà été caractérisé, la comparaison des allèles de l'échantillon testé avec ceux de l'haplotype familial permet de façon simple de déterminer la présence ou l'absence du gène de susceptibilité. En l'état actuel des connaissances, la présence de ce dernier confère un risque de développer la maladie qui est estimé à 80 %. En son absence, le risque rejoint celui de la population générale (1 à 2 % selon les études épidémiologiques). - dans une famille où un haplotype de susceptibilité pour le gène du glaucome associé à cette région du chromosome 1 n'a pas été déjà caractérisé, la vraisemblance de la présence du gène de la maladie est estimée à l'aide du logiciel LINKAGE. Les résultats observés sur différentes familles ont démontré l'excellent caractère prédictif des marqueurs mis en oeuvre. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) (B) RUE: 101 RUE DE TOLBIAC (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75013 (ii) TITRE DE L' INVENTION: DEPISTAGE DU GLAUCOME JUVENILE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version &num;1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TCTTCCCACC ACTGCC 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: TGTATTCCTA CTGCCCA 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 3: CCTCAGTTCA TTCCCATAA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGCTGAATCT CACCCAATAA CTA 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA 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TAAGGCTG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: TCTTATCAGT CAGGCA 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TAATGGGTTC AGTGGACCTT 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TGCAGTTCCA TATTCCAGGT 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 11: TGAGCCGAGA TTGAGCC 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CCAGGTCAGA GATGTTGG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: 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(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: TTTATGTTAT CACCAAGGCT TCT 23 REVENDICATIONS 1. Procédé de dépistage d'une prédisposition au glaucome juvénile chez un individu, caractérisé en ce qu'on caractérise dans un prélèvement biologique chez ledit individu, des marqueurs microsatellites liés avec la survenue du glaucome juvénile dans sa famille, les marqueurs microsatellites étant afm350yhl, afm122xa3, ngal, afm2 1, afm248wg5, afm278ye5, afm212xblO et afmlS7xe7 du chromosome lq21q31. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur est situé sur le locus correspondant à la région située entre le marqueur afm248wg5 et afm212 xblO. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la présence dudit marqueur est détectée par amplification de la zone du marqueur. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par PCR. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise une amplification PCR multiplex. 6. Séquence ADN située entre le locus correspondant au marqueur afml22wy3 et afm 212xb10 et liée à la survenue du glaucome juvénile.