FR 2732357 A1 19961004 FR 9504234 A 19950331 VECTEURS VIRAUX ET UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DES DESORDRES HYPERPROLIFERATIFS. NOTAMMENT DE LA RESTENOSE La présente invention concerne une nouvelle méthode particulièrement efficace pour le traitement, par thérapie génique, de pathologies associées à des désordres hyperprolifératifs. La méthode selon l'invention consiste plus particulièrement à bloquer de manière spécifique la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) par transfert in vivo du gène gax. La méthode de l'invention est tout particulièrement adaptée au traitement de la resténose post-angioplastie par surexpression du gène gax dans la paroi vasculaire. Le gène gax peut être transféré selon la présente invention par des vecteurs viraux. II s'agit de préférence de vecteurs adénoviraux. Différents gènes associés à l'arrêt de la division cellulaire ont été isolés. Les gènes gas (growth-arrest specific : gas 1-6) et Gadd (growtharrest and DNA damage-inducible : Gadd34, Gadd45, Gadd153) sont ainsi fortement exprimés dans les cellules quiescentes, c'est à dire bloquées en phase Go du cycle cellulaire (Schneider et al., Cell 1988, 54 : 787-793, Del Sal et al., Cell 1992, 12: 3514-3521; Cowled et ai., Exp.Cell.Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini et Schneider, J.Cell.Biol. 1994, 124 : 743-756; Zhan et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 13 : 4242-4250 ; Jackman et al., Cancer Res. 54. 5656-5662, 1994). En accord avec ces données d'expression du gène, la microinjection de la protéine gas-1 bloque la synthèse d'ADN (Del Sal et al., Cell, 1992, 70 : 595-607). Inversement, I'addition de facteurs de croissance tels que le PDGF ou de sérum de veau foetal (Platelet-Derived Growth Factor) diminue l'expression de ces gènes dans des modèles in vitro (Coccia et al. Mol.Cell.Biol. 1992, 12 : 3514-3521). Cette spécificité d'expression visà-vis de l'état de prolifération cellulaire semble également avoir sa contrepartie in vivo. Ainsi, le gène gas-1 est fortement exprimé dans l'utérus de rat après ovactéromie (Ferrero et Cairo, Cell.Biol.lnt. 1993, 17, 857-862). Dans ce même modèle animal, le traitement par des oestrogènes entraîne une prolifération cellulaire qui est reflétée, au niveau de l'utérus, par une augmentation de l'expression du proto-oncogène c-myc et par une baisse de l'expression du gène gas-1. De manière similaire, dans un modèle de prolifération/régénération hépatique, I'expression du gène gas-6 est fortement réduite quatre heures après l'hépatectomie partielle, i.e. dans la période de transition de GO à G1; elle revient à la normale, probablement une fois la division des hépatocytes initiée (Ferrero et al. J.Cell.Physiol. 1994, 158 : 263-269). La demanderesse s'est intéressé à un nouveau gène, le gène gax (growth arrest specific homeobox), et a maintenant montré que ce gène possède des propriétés particulièrement avantageuses pour des applications de thérapie génique des désordres hyperprolifératifs, notamment de la resténose. Le gène gax a été initialement identifié à partir d'une banque d'ADNc d'aorte de rat. II code pour une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax possède certaines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la transition GO/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est donc réprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Un avantage de la méthode selon l'invention résident principalement dans la spécificité de l'expression du gène gax. En effet, chez le rat adulte, le gène gax est essentiellement exprimé dans le système cardiovasculaire (aorte, coeur). En revanche, la présence d'ARNm de gax n'a pas été mise en évidence par northern blot dans le foie, le cerveau, I'estomac et le muscle squelettique. La resténose post-angioplastie est un désordre hyperprolifératif localisé qui se développe consécutivement à une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Ainsi, le traitement d'une lésion athéroscléreuse par angioplastie résulte de façon très fréquente jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure mécanique de la paroi artérielle.Un événement clef de ce mécanisme est la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la média vers l'intima, notamment du fait de l'absence de protection et/ou de rétrocontrôle exercé par les cellules endothéliales de l'intima. La capacité d'exprimer sélectivement un gène antiprolifératif selon l'invention dans les cellules CMLV constitue un avantage très important. Un autre avantage de la méthode selon I0 invention réside également dans l'appartenance du gène gax à la famille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnels qui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des régions spécifiques de l'ADN (ou homéoboîtes) (revue : Gehring et al. Cell, 78: 211223, 1994). L'homéodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245.De manière intéressante, les gènes homéotiques identifiés à ce jour sont impliqués dans le contrôle de la différenciation/croissance cellulaire au cours de l'embryogènèse ce qui renforce le potentiel thérapeutique de la méthode selon l'invention (revue Lawrence et Morata Cell 78 181-189, 1994; Krumlauf, Cell 78 191-201, 1994). Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. L'invention réside égalament dans l'utilisation d'un tel virus pour le traitement des pathologies hyperprolifératives. Dans les virus de l'invention, le gène inséré peut être un fragment d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. II peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique de GAX, ainsi que tout homologue de GAX obtenu à partir d'autres espèces. Ces fragments et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par hybridation ou par clonage par expression, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques incluent les suppressions, délétions, mutations, etc. Le gène inséré au sens de l'invention est préférentiellement le gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX de rat ou de son homologue humain. Il s'agit plus préférentiellement d'un ADNc ou d'un ADNg. Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. II peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. II peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc.Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, -actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (promoteur de l'actine des cellules du muscle lisse), les promoteurs préférentiellement activés dans les cellules en division, ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinolque, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, le gène inséré comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de GAX, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle (celle du gène de la thymidine kinase par exemple), ou d'une séquence signal artificielle. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. Le virus selon l'invention peut être dérivé d'un adénovirus, d'un virus adéno-associé (AAV) ou d'un rétrovirus.Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus. II existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mail, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour GAX (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovims Ad5. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovims défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. II comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus.Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par cotransfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) dAAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc également un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une séquence codant pour GAX bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne également un plasmide comprenant une séquence codant pour GAX bordée de deux ITR d'un AAV.Un tel plasmide peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de GAX, éventuellement incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-virus). Concernant les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt.Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour GAX selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env.De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,71 9); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Pour le traitement de la resténose, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les adénovirus possèdent en effet un forte capacité à infecter les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération. Ceci permet d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à hauts niveaux le gène gax introduit, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De telles compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable, notamment pour une injection au niveau de la paroi vasculaire. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Il peut également s'agir d'un hydrogel préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique.De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande W093/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies liées aux désordres hyperprolifératifs, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection. Préférentiellement, pour le traitement de la resténose, les adénovirus de l'invention sont administrés directement au niveau de la paroi vasculaire au moyen d'un ballon d'angioplastie enrobé d'un film hydrophile (par exemple un hydrogel) imbibé des adénovirus ou de tout autre cathéter contenant une chambre d'infusion pour la solution adénovirale, qui peut ainsi être appliqué de manière précise sur le site à traiter, et permettre une libération locale et efficace des adénovirus au niveau des cellules à traiter. Cette méthode d'administration permet avantageusement d'infecter un pourcentage élevé de cellules de la média (jusqu'à 9,6%), qui constituent la cible préférentielle pour le traitement de la resténose, alors que les méthodes d'administration classiques (injection intraveineuse par exemple) ne permettent pas d'infecter de manière très significative ces cellules. La méthode de traitement de l'invention consiste avantageusement à introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant un hydrogel imbibé d'adénovirus recombinants. L'hydrogel peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale. Avantageusement, l'hydrogel est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, I'hydrogel imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé et de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. La présente invention offre un nouveau moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux désordres hyperprolifératifs tels que la resténose. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc. La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Représentation du plasmide pCO1. Figure 2: Représentation du plasmide pXL-CMV-Gax HA Figure 3 : Localisation nucléaire de la protéine GAX-HA dans les CMLV transfectées par pXL-CMV-Gax HA Figure 3A: CMLV transfectées par le vecteur pCGN (absence d'insert GAX) Figure 3B : CMLV transfectées par le vecteur pXL-CMV-Gax HA Figure 4: Localisation nucléaire de la protéine GAX-HA dans les CMLV traitées par Ad-CMV-Gax. Figure 5: Effet de Ad-CMV-GAX sur la prolifération de CMLV (t=24 heures) - Les CMLV sont comptées 24 heures après le traitement par Ad CMV-Gax (1000pfu/cellule) ou par un adénovirus contrôle (Ad RSV-pGal, 1000 pfu/cellule). La croissance cellulaire est bloquée (0,5% SVF) ou stimulée (SVF 20%). Figure 6: Effet de Ad-CMV-GAX sur la prolifération de CMLV (t=48 heures) - Les CMLV sont comptées 48 heures après le traitement par Ad CMV-Gax (1000pfu/cellule) ou par un adénovirus contrôle (AD RSV-pGal, 1000 pfu/cellule). La croissance cellulaire est bloquée (0,5% SVF) ou stimulée (SVF 20%). Figure : Effet de Ad-CMV-Gax sur la viabilité de CMLV incubées en présence de sérum de veau foetal (SVF 20%). - conditions expérimentales cf. figure 6 Figure 7A : cellules non traitées par adénovirus Figure 7B : cellules traitées par Ad-RSV-pGal Figure 7C : cellules traitées par Ad-CMV-Gax TECHNIQUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [eolymérasecatalyzed Chain Action, Saiki R.K. et al., Science 2XQ (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un WDNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. ExemDle 1 . construction du vecteur pXL-CMV-Gax HA portant le ène codant Dour la protéine gax de rat sous le contrôle du Dromoteur CMV. Cet exemple décrit la construction d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la protéine gax (espèce : rat) et des séquences adénovirales permettant une recombinaison. L'épitope de l'hémagglutinine du virus influenza (épitope HA1), comprenant 18 acides aminés, est ajouté à l'extrémité N-terminale de la protéine gax (Field et al., Mol.Cell.Biol. 8 2159-2165, 1988). Ce procédé d'addition d'épitope permet de suivre, notamment par des techniques d'immunofluorescence, I'expression de gax à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitoge HA1. Outre sa sensibilité, cette méthode permet de s'affranchir du bruit de fond corespondant à l'expression de protéines gax endogènes à la fois in vitro et in vivo. 1.1. Construction du plasmide pCO1 A - Construction du plasmide pCE Le fragment EcoRI-Xbal correspondant à l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et Xbal du vecteur plC19H. Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et Smal du vecteur plC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB.Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites Nrul et BglIl du vecteur plC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage. B - Construction du plasmide pCD' Le fragment Sau3A (3346) - Sstl (3645) et le fragment Sstl (3645) Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites Clal et BamHI du vecteur plC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment Sall-Taql du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et Taql (5207) a ensuite été cloné entre les sites Sall et Clal du vecteur plC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment Taql (5207) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Taql du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites Sall et Narl du vecteur plC20H.Ceci génère le plasmide pCC'. Le fragment Narl (5519) - Nrul (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Narl du plasmide pCC' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites Sall et Nrul du vecteur plC20R. Ceci génère le plasmide pCD'. C - Construction du plasmide pC0î Une digestion partielle par Xhol puis une digestion complète par Sall du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site Nrul (6316). Ce fragment a été cloné dans le site Sall du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pC01 (figure 1), qui contient la partie gauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hinfl (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - Nrul (6316) de l'adénovirus Ad5. 1.2. Construction du vecteur pXL-CMV-Gax HA (cf. figure 2) L'ADNc de Gax a été cloné entre les sites Xbal-BamHI du vecteur pCGN (Tanaka et Herr, Cell 60 : 375-386, 1990). Le vecteur pGCN-Gax résultant contient les promoteur précoce et séquence enhancer du cytomégalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart et al, Cell, 41: 521-530, 1985), la séquence leader de la thymidine kinase de de l'Herpes simplex virus incluant le codon d'initiation AUG ainsi que les les trois premiers acides aminés (+55, +104;Rusconi et Yamamoto, EMBO J., 6:1309-1315, 1987), la séquence codant pour I'épitope HA1 [Y P Y D V P D Y A S L G G P (SEQ ID N" 2)], l'ADNc de gax de rat et enfin la séquence de poly adénylation du gène de ss-globine de Lapin (Pabo et al, cell, 35 : 445-453, 1983). Le vecteur pCGN-Gax a ensuite été coupé par Xmnl et Sfil et le fragment obtenu, contenant promoteur, ADNc et séquence de polyadénylation, préalablement traité à la Klenow, a été introduit au site EcoRV du vecteur navette pCO1 contenant les séquences adénovirales nécessaires à la recombinaison. Le plasmide obtenu a été désigné pXL CMV-Gax HA (cf. figure 2). ExemDle 2. mise en évidence des propriétés d'inhibition de prolifération du plasmide pXL-CMV-gax HA. Cet exemple décrit les procédures opératoires qui permettent de mettre en évidence in vitro la qualité des vecteurs (cf. exemple 1) permettant la recombinaison homologue, à la fois en expression (détection de la protéine gax et de l'épitope HA) et en activité (effet sur la prolifération cellulaire). Les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont mises en culture par digestion enzymatique d'aorte de lapin NZW selon une méthode adaptée de Chamley et al. (Cell Tissue Res. 177 : 503-522 1977). Brièvement, une fois prélevée, I'aorte de lapin est incubée pendant 45 minutes en présence de collagénase (collagénase Il, Cooper Biomédical) à 37"C. II est procédé alors à une deuxième digestion, en présence de collagénase et d'élastase (Biosys) pendant environ 2 heures, ce qui permet d'obtenir une suspension cellulaire. Les cellules sont maintenues en présence de 20% de sérum de veau foetal et utilisées pour l'ensemble des tests (cf. infra) avant le dixième passage. Dans l'ensemble des expériences, les cellules musculaires lisses sont caractérisées par immunomarquage à l'aide d'anticorps anti-aSM-actine (F-3777, Sigma). Afin de contrôler la qualité des vecteurs d'expression (cf. exemple 1), la présence et la localisation de la protéine gax sont contrôlées par immunofluorescence pour chaque construction. Pour cela, les cellules musculaires lisses ou les cellules 3T3 sont transfectées par les plasmides pXL-CMV-Gax HA et pCGNgax en présence d'un mélange DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL). Les cellules sont incubées en présence du complexe ADN/liposomes dans un milieu de culture ne contenant pas de sérum de veau foetal, pendant 4 à 8 heures (durée optimale : 8 heures pour les CML). Après 24 heures d'incubation en présence de sérum de veau foetal, les cellules sont ensemencées sur lame (Titertek) en vue de l'immunofluorescence, pendant de nouveau 24 heures. Les cellules sont alors fixées en présence de paraformaldéhyde 4% puis perméabilisées par addition de triton 0,1%. Après saturation en présence d'albumine bovine (BSA, Sigma), on procède successivement à l'addition des anticorps anti-HA (12CA5, Boehringer Mannheim) puis des anticorps conjugués à la fluorescéine. Les expériences d'immunofluorescence effectuées à la fois sur cellules NIH3T3 et sur culture primaire de CMLV de lapin démontrent que le plasmide pCGNgax mais également le plasmide "navette" pXL-CMV-Gax HA codent bien pour une protéine à localisation nucléaire (cf.Figure 3A plasmide témoin; 3B : plasmide pXL-CMV-Gax HA). En outre, après extraction des protéines nucléaires de cellules transfectées par pXL-CMV Gax HA, nous avons pu mettre en évidence par western blot une protéine révélée par les anticorps dirigés contre l'épitope HA. L'effet des vecteurs ci-dessus sur la prolifération cellulaire a ensuite été vérifié. Pour ce faire, une méthode indirecte a été utilisée, reposant sur la mesure de la formation de colonies. Brièvement, des cellules embryonnaires de souris NIH3T3 ont été utilisées pour effectuer des tests de formation de colonies selon une méthode adaptée de Schweighoffer et al. (Mol.Cell.Biol. 1993, 13 : 39-43). Brièvement, les cellules sont cotransfectées par un plasmide portant le gène de résistance à la néomycine et par un excès du vecteur d'intérêt (pCGNgax ou pXL-CMV-Gax HA ). Après une période de sélection en G418, les colonies sont colorées par une solution de fuchsine phéniquée (Diagnostica, Merck) et dénombrées. Les résultats d'une expérience représentative décrites dans le tableau I démontrent une diminution du nombre des colonies dans les cellules transfectées par pCGNgax. Tableau 1 condition de transfection des nombre de colonies après cellules 3T3 sélection en 6418 pCGN (51ru)+ pSV2neo (1 ) () 183+28 (*) pCGNgax (5 g) + pSV2neo (1 > 9) 93+11 () vecteur contrôle pCGN : absence d'insert gax (t) p Exemple 3: Construction de l'adénovirus recombinant Ad-CMVgax . Le vecteur pXL-CMV-Gax HA préparé dans l'exemple 1 a ensuite été linéarisé et cotransfecté pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus. L'adénovirus Ad-CMVgax a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVBgal (Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le vecteur pXL-CMV-Gax HA selon le protocole suivant: le vecteur pXL-CMV-Gax HA linéarisé par l'enzyme Xmnl et l'adénovirus Ad.RSVssgal linéarisé par Clal ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, I'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adènovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-CMVgax est conservé à 80"C dans 20 % de glycérol. Exemole 4: Mise en évidence des propriétés d'inhibition de la prolifération de l'adénovirus Ad-CMVgax. Cet exemple décrit les procédures expérimentales qui permettent de démontrer la qualité de l'adénovirus recombinant à la fois en terme de production de la protéine gax et en terme d'activité biologique (effet sur la prolifération cellulaire). Les CMLV d'aorte de lapin sont incubées en présence de l'adénovirus Ad-CMVgaxHA et d'un adénovirus témoin (ad-RSVpGal adénovirus recombinant exprimant la frgalactosidase sous le contrôle du promoteur RSV) dilué dans du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF). Après environ une heure à 37"C en atmosphère humide, le milieu contenant la solution adénovirale est aspiré et remplacé par du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) pour une période de 18 à 24 heures. Le milieu riche en SVF (concentration finale: 20%) est alors ajouté afin de stimuler la prolifération cellulaire et les cellules dénombrées 24 heures et 48 heures plus tard. En outre, 24 heures après l'addition de la solution adénovirale, I'expression de la protéine gax par les CMLV est contrôlée par les techniques décrites dans l'exemple 2, à savoir un marquage nucléaire par immunofluorescence (localisation de la protéine) mais également par western blot. La protéine produite par l'adénovirus recombinant est bien révélée par des anticorps reconnaissant l'épitope HA et a la même mobilité électrophorétique que la protéine gax détectée dans le noyau de CMLV transfectées par pCGNgax ou pXL-CMV-Gax HA La figure 4 illustre la localisation de la protéine Gax au niveau de CMLV incubées en présence de Ad-CMVgaxHA. Les résultats d'une expérience représentative, décrits dans la figure 4, démontrent une forte baisse du nombre des cellules après l'addition du virus Ad-CMVgaxHA. En revanche, une telle réduction du nombre de cellules n'est pas observée après traitement par l'adénovirus contrôle utilisé à la même concentration (M.O.I. 1000). Nous avons en parallèle vérifié par immunofluorescence que cette forte multiplicité d'infection permet d'exprimer soit le gène marqueur '3gag (utilisation d'anticorps anti frugal de E.Coli, Monosan) soit la protéine gax (utilisation d'anticorps anti-HA, cf. exemple 2) dans plus de 90% de la population des CMLV de lapin. L'addition de virus ad-RSV-pgal est associée à un faible effet cytostatique (-13%) après 24 heures de culture en présence de sérum de veau foetal (20%). Dans les mêmes conditions expérimentales, le traitement par Ad-CMVgaxHA entraîne une diminution de 57% du nombre de cellules (cf. Figure 5). L'activité biologique du virus Ad-CMVgaxHA est bien évidemment amplifiée après 48 heures de culture voire associée à une mort cellulaire (cf. Figure 6 et 7). Ainsi le blocage de la prolifération provoqué par Ad-CMVgaxHA est associé à une forte réduction du nombre de cellules qui est détectable après une période de culture de 24 heures (cf. FigureS). De manière intéressante, cet effet de Ad-CMVgaxHA est observé sur les cellules stimulées par une forte concentration de SVF (20%) et non sur les cellules privées de SVF (0,5%) (cf. figure 6). Cet exemple montre donc qu'un adénovirus recombinant codant pour la protéine gax est capable de bloquer de manière efficace la division cellulaire sans affecter de manière importante la viabilité de cellules bloquées dans leur cycle en GO. L'effet de l'adénovirus Ad-CMVgaxHA sur la viabilité des CMLV en culture est également illustré par la figure 7. Les propriétés inhibitrices de Ad-CMVgaxHA sur la synthèse d'ADN sont confirmées par des expériences d'incorporation de bromodéoxyuridine (BrdU). Brièvement, 24 heures après l'addition d'adénovirus, les CMLV sont incubées en présence de SVF (10 à 20%) et de BrdU (1OCtM) qui s'incorpore à la place de la thymine dans les cellules en phase de synthèse de l'ADN et peut être révélée par des anticorps spécifiques. L'incorporation de BrdU est quantifiée par cytométrie de flux. La même méthodologie de cytométrie de flux peut être utilisée afin de visualiser la progression dans le cycle cellulaire de CMLV de lapin traitées par Ad-CMVgaxHA. Le traitement par Ad-CMVgaxHA s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase GO/G1. REVENDICATIONS 1. Virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celleci. 2. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée. 3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2. 4. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine. 5. Virus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène inséré code pour tout ou partie de la protéine GAX de rat ou d'un variant de celle-ci. 6. Virus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène inséré code pour la protéine GAX de rat ou son homologue humain. 7. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNc. 8. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNg. 9. Virus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le gène inséré comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. 10. Virus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le gène inséré comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. 11. Adénovirus selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion de tout ou partie de la région El. 12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion de tout ou partie de la région E4. 13. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il sagit d'un virus adéno-associé (AAV). 14. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il sagit d'un rétrovirus. 15. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 14 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux désordres hyperprolifératifs. 16. Utilisation selon la revendication 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose. 17. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 14. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable et en ce qu'elle comprend de 104 à 1014 pfu/ml d'adénovirus. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle contient un adénovirus recombinant imbibé dans un hydrogel.