FR 2729570 A1 19960726 FR 9500785 A 19950124 PROCEDE DE PREPARATION DE MACROPHAGES ACTIVES, TROUSSES ET COMPOSITIONS POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de macrophages activés, ainsi que des trousses et des compositions susceptibles d'être utilisées pour la mise en oeuvre de ce procédé. Les macrophages jouent un rôle majeur dans la réponse antitumorale, ils peuvent être activés par des activateurs immunologiques contre des cellules cancéreuses (Adams D. and Hamilton T.: Activation of macrophages for tumor cell kill: effector mechanism and regulation. In Heppner & Fulton (eds), Macrophages and cancer. CRC Press, 1988, p. 27; Fidler I.: Macrophages and metastases. A biological approach to cancer therapy. Cancer Res. 45: 4714, 1985). Des macrophages présentant une activité cytotoxique particulièrement importante (encore désignés macrophages activés ou MAK (marque déposée)) ainsi qu'un milieu de culture et un procédé d'obtention de tels macrophages ont fait l'objet de la demande internationale n" PCT/EP 93/01232, déposée le 18 mai 1993. Le procédé de préparation des macrophages défini dans la demande internationale susmentionnée, est réalisé à partir d'une composition enrichie en cellules sanguines obtenue par cytaphérèse réalisée sur un individu sain, et comprend une étape de culture de monocytes dans un milieu de culture contenant de la vitamine D3 1,25-dihydroxy et du GM Macrophages colony stimulating factor). Avantageusement, les monocytes sont cultivés en présence des lymphocytes, pendant environ 6 à 7 jours, et les macrophages différenciés ainsi obtenus sont activés par addition d'interféron y (IFN-y) dans le milieu de culture. Cette étape de culture est, comme dans tout procédé d'obtention de macrophages décrit jusqu'à ce jour, précédée par une étape de séparation d'une part des cellules mononucléaires, et d'autre part des globules rouges, granulocytes et d'une partie des plaquettes contenus dans la composition dérivée du sang obtenue par cytaphérèse, et par une étape d'élimination, par lavage, d'une partie des plaquettes sanguines et des anticoagulants restant après l'étape précédente. L'étape de séparation susmentionnée des globules rouges et granulocytes est généralement réalisée par centrifugation du milieu contenant les monocytes dans un gradient de densité, notamment dans une solution ayant une densité d'environ 1,0 à environ 1,3 g/ml, telle qu'une solution du type Ficoll Paque (Pharmacia) ayant une densité de 1,077 g/ml. Dans la demande internationale susmentionnée, la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse contient environ 7 à 9.109 leucocytes pour un volume d'environ 200 ml. Après l'étape de séparation des globules rouges et des granulocytes par centrifugation sur un gradient de densité, la composition de la suspension cellulaire mise en culture contient alors, pour un volume d'environ 500 ml à 1000 ml:: Hématocrite (Globules rouges) dans la composition Plaquettes Globules blancs 3 à 5.109 Lymphocytes 50-70% en nombre de globules blancs présents dans la composition Monocytes 30-50% en nombre de globules blancs présents dans la composition Polynucléaires (ou granulocytes) dans la composition L'élimination des globules rouges et des granulocytes, préalablement à l'étape de culture, a toujours été considérée comme une étape indispensable en raison notamment du fait que ces derniers sont susceptibles d'inhiber totalement ou partiellement la différenciation des monocytes en macrophages lors de l'étape de culture. Cette inhibition serait principalement due au fait que les globules rouges, les granulocytes, et les plaquettes utilisent les constituants du milieu de culture pour leur propre métabolisme, épuisant ainsi les réserves nécessaires au développement des monocytes, et entraînant une acidification du milieu de culture dans des proportions telles que l'étape de culture ne peut être amenée jusqu'à son terme (qui est d'environ 6 à 7 jours). Par ailleurs, les granulocytes et les plaquettes seraient notamment susceptibles de sécréter des facteurs suppresseurs de la fonctionalité des macrophages, tels que le TGF (Transforming growth factor), et les prostaglandines. Ainsi, il est couramment admis que les granulocytes ainsi que le plus de plaquettes possible doivent être séparés des monocytes avant la mise en culture de ces derniers, bien que cette étape de séparation entraîne également une élimination d'environ 20% à environ 50%, notamment d'environ 30% des cellules mononuclées présentes dans le milieu avant séparation. La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé d'obtention de macrophages, le cas échéant activés, qui soit plus simple à mettre en oeuvre et présentant de meilleurs rendements que les procédés d'obtention des macrophages décrits jusqu'à maintenant. Un autre but de l'invention est de fournir des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ce procédé. Un autre but de la présente invention est de fournir à l'utilisateur de telles trousses, des compositions utilisables en tant que témoins internes pour le contrôle du suivi des différentes étapes du procédé, notamment pour le contrôle de la teneur en monocytes, et le cas échéant en autres constituants de la composition de départ du procédé de l'invention, et pour le contrôle de la teneur en macrophages, le cas échéant activés, de la composition finale recherchée. La présente invention est illustrée à l'aide des figures suivantes: - la figure 1 représente le montage du kit d'élutriation, - la figure 2 représente le montage de la chambre d'élutriation sur le rotor, - la figure 3 représente le montage pour la stérilisation de la chambre d'élutriation montée sur le rotor. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de macrophages, le cas échéant activés, ne comprenant pas d'étape de séparation par voie physique, notamment par centrifugation sur un gradient de densité de la manière indiquée ci-dessus, d'une part des globules rouges et/ou des granulocytes, et, d'autre part, des autres globules blancs, notamment des monocytes, présents dans la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé de préparation d'une composition comprenant des macrophages, notamment des macrophages activés, caractérisé en ce que, partant d'une composition dérivée du sang d'origine humaine, et enrichie en cellules sanguines, et plus particulièrement en globules blancs tels que les monocytes, notamment d'une composition dérivée du sang telle qu'obtenue par cytaphérèse, ledit procédé comprend les étapes suivantes: : - avantageusement une dilution de ladite composition dérivée du sang, notamment dans environ 2 à 3 fois le volume de cette dernière, à l'aide d'une solution physiologique appropriée, - une centrifugation de ladite composition dérivée du sang, et lavage du culot issu de la centrifugation susmentionnée, après récupération du culot dans une solution physiologique de lavage appropriée, notamment dans une poche (du type poche de transfert), en effectuant par exemple une pression sur ladite poche, la solution de lavage étant alors éliminée vers une autre poche ou autre récipient, pour récupérer une composition dépourvue d'éventuels anticoagulants et de résidus divers et appauvrie en plaquettes, - le cas échéant répétition de l'opération de centrifugation et lavage susmentionnée, notamment entre environ 1 et 3 fois, - une étape de culture des cellules contenues dans la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage susmentionnée, en plaçant celleci dans un milieu de culture approprié, notamment dans une poche avantageusement hydrophobe, pendant environ 6 à environ 7 jours, cette étape de culture étant le cas échéant suivie par une étape d'activation des macrophages obtenus dans le milieu de culture lors de l'étape précédente, par addition dans ledit milieu de culture d'un activateur, tel que l'interféron y, ledit activateur étant mis en contact avec le contenu du milieu de culture pendant environ 16 à environ 24 heures, ces étapes de culture et d'activation étant, le cas échéant, suivies par une centrifugation du milieu de culture, et le cas échéant lavage du culot issu de la centrifugation, notamment de la manière indiquée ciessus, ces étapes de culture, d'activation et de centrifugation étant: précédées et/ou suivies par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les monocytes susceptibles d'être présents dans la composition de départ, notamment des plaquettes, des globules rouges, des granulocytes et des lymphocytes, par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage précédant l'étape de culture, ou obtenue après l'étape de centrifugation suivant l'étape de culture, avec des anticorps dirigés contre tout ou partie des constituants susmentionnés, et récupération de la solution contenant les monocytes, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps, et/ou suivies par une étape d'élutriation dans laquelle les macrophages activés sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après les étapes de culture, d'activation et de centrifugation susmentionnées, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique. L'invention découle de la découverte faite par les inventeurs que, contrairement aux idées reçues dans ce domaine, il est possible d'amener la culture des monocytes en macrophages à son terme avec de bons rendements lorsque le milieu de culture contient des quantités maîtrisées en globules rouges, granulocytes et plaquettes. L'invention offre donc l'avantage de disposer d'un procédé d'obtention de macrophages permettant de s'affranchir de l'étape de séparation par voie physique d'une part des cellules mononucléées, et plus particulièrement des monocytes, et d'autre part des globules rouges, des granulocytes (et de la grande majorité, sinon la totalité des plaquettes) contenus dans la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse, cette étape étant coûteuse (nécessitant la possession d'un matériel sophistiqué) et longue à mettre en oeuvre. Avantageusement, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé susmentionné de l'invention, à savoir la composition de suspension cellulaire enrichie en cellules sanguines, telle qu'issue de la cytaphérèse, et avant centrifugation et lavage, est telle qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5%, notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. Une telle composition de départ, est avantageusement obtenue par mise en oeuvre d'un procédé de cytaphérèse réalisé sur un patient, ce procédé étant notamment effectué selon toute technique et avec tout matériel connus de l'homme de l'art dans ce domaine, le cas échéant, selon une procédure adaptée pour l'obtention d'une composition de départ telle que définie dessus et ciaprès. Avantageusement, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine susmentionnée, peut contenir jusqu'à environ 1% de globules rouges, et de préférence est telle qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 196, notamment de 0,3% à 0,5%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. Avantageusement encore, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine susmentionnée, est telle que: - le nombre de plaquettes est compris entre environ 2.1011 à environ 6.1011 pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml, - le nombre de globules blancs est compris entre environ 5.109 à environ 5.1010 pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml, - la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de monocytes est comprise entre environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'étape de centrifugation et lavage de la composition de départ, de préférence répétée 3 fois, permet essentiellement d'éliminer une partie des plaquettes, et le cas échéant des réactifs utilisés lors de l'obtention de la composition de départ, notamment lors de la cytaphérèse, tels que les anticoagulants. Avantageusement, le pourcentage de plaquettes éliminées lors de cette étape est d'environ 80% à environ 90%. La composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, contient avantageusement, dans un volume d'environ 600 ml à environ 1000 ml, les constituants suivants: - Hématocrite: 0,2 à 0,4% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Plaquettes: environ 2 à environ 6.1010 - Globules blancs: environ 4. 109 à environ 4. i010 - Lymphocytes: environ 60% à environ 80% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Monocytes: environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Polynucléaires: environ 10% à environ 15% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. Selon un mode de réalisation préférée du procédé de l'invention, l'étape de culture et de différenciation des monocytes en macrophages, est réalisée à partir d'une composition dérivée du sang d'origine humaine contenant, non seulement des cellules mononucléées, à savoir des monocytes et des lymphocytes, mais aussi des globules rouges (dans des quantités appropriées, notamment dans les proportions indiquées ci-dessus), des granulocytes et des plaquettes, ladite étape de culture étant notamment réalisée à partir de la composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, telle que décrite ci-dessus. La composition de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré décrit ciessus, dans un volume d'environ 600 ml à 1000 ml, est avantageusement la suivante: - Lymphocytes: environ 2.109 à environ 2.1010 - Macrophages: environ 6. 108 à environ 6. 109 Cette dernière composition comprend peu ou pas de granulocytes, ces derniers s'étant en grande partie décomposés durant l'étape de culture. Les rendements de l'étape de culture susmentionnée, sont avantageusement d'environ 80% en cellules mononucléées, et d'environ 50% à environ 70% pour la différenciation en macrophages (en prenant en compte le nombre de monocytes de départ). Les rendements susmentionnés sont calculés en faisant le rapport entre le nombre de macrophages obtenus après l'étape de culture et le nombre de monocytes présents dans la composition avant culture. Avantageusement, dans le mode de réalisation préférée du procédé de l'invention décrit dessus, les étapes de culture, d'activation et de centrifugation susmentionnées sont suivies par une étape d'élutriation dans laquelle les macrophages activés sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après les étapes de culture, d'activation et de centrifugation susmentionnées, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique. Avantageusement, les étapes de culture, d'activation et de centrifugation mises en oeuvre dans le cadre du procédé préféré susmentionné, sont suivies d'une étape d'élutriation représentée sur la figure 1, cette dernière étant de préférence réalisée en utilisant le dispositif suivant: - une poche A contenant la composition comprenant les macrophages activés, obtenue après l'étape de culture et celle d'activation, une poche B contenant une solution physiologique susceptible de maintenir l'ensemble du système d'élutnation dans un milieu viable pour les macrophages activés, et une prise d'air C, sont reliées à un transfuseur à trois branches muni d'un filtre D, - la prise d'air C étant fermée, une pompe péristaltique E enaratne le contenu de la poche A dans un élutriateur équipé d'un rotor F avec une chambre d'élutriation G, I'alimentation de l'ensemble du circuit d'élutriation en liquide physiologique étant assurée par ltentraînement du contenu de la poche B, à l'aide de la pompe susmentionnée, pendant toute la durée de l'élutriation, - la vitesse de rotation du rotor de l'élutriateur F et le débit de la pompe E sont tels que les divers constituants de la composition de la poche A, introduits dans le rotor F, sont séparés en fonction de leur taille dans la chambre d'élutriation G, les constituants de plus petite taille migrant en premier vers le haut de la chambre (proche de la sortie de l'élutriateur), tandis que les constituants de plus grande taille, à savoir les macrophages activés, migrent vers la sortie de la chambre en dernier, - les différents constituants de la composition contenue dans la poche A ainsi séparés sont récoltés séparément dans des poches reliées à l'élutriateur, les plaquettes et divers résidus de petite taille étant récupérés les premiers dans une poche H, les globules rouges étant ensuite récupérés dans une poche I, puis les lymphocytes dans une poche J, et enfin les macrophages activés dans une poche K, les différentes catégories susmentionnées de constituants étant extraites de l'élutriateur, en fonction de leur taille respective, soit en diminuant la vitesse de rotation de l'élutriateur, soit en augmentant le débit de la pompe E, la récupération des macrophages activés dans la poche K pouvant avantageusement être réalisée par arrêt du rotor de l'élutriateur F et ouverture de la prise d'air C, la poche K contenant ainsi la composition de macrophages activés recherchée, avantageusement sous forme essentiellement pure. En variante du procédé préféré décrit ci-dessus, l'étape de culture et différenciation des monocytes en macrophages, peut être précédée par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les cellules mononucléées, en particulier autres que les monocytes, susceptibles d'être contenus dans la composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, telle que décrite ci-dessus, ladite étape d'élimination étant effectuée non pas par voie physique, mais par mise en oeuvre de réactions immunologiques entre tout ou partie des constituants susmentionnés et des anticorps susceptibles de reconnaître lesdits constituants. L'étape d'élimination par anticorps susmentionnée, est avantageusement réalisée par mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, avec des anticorps anti-plaquettes, et/ou anti-globules rouges et/ou anti-granulocytes fixés sur un support solide, notamment sur les parois d'une poche du type transfert, ou sur les parois de tout autre dispositif dans lequel ladite composition issue de l'étape initiale de lavage est susceptible d'être introduite, ledit dispositif étant le cas échéant aménagé de manière à autoriser la circulation de ladite composition le long des parois sur lesquelles sont fixés lesdits anticorps. La mise en contact de ladite composition avec lesdits anticorps est réalisée, soit simultanément avec tout ou partie des anticorps susmentionnés, soit successivement notamment par introduction de ladite composition dans une poche ou autre dispositif tel que décrit ciessus, contenant des anticorps antiplaquettes, puis passage de ladite composition dans une seconde poche contenant des anticorps anti-globules rouges, et/ou passage de ladite composition dans une troisième poche contenant des anticorps anti-granulocytes, les lymphocytes étant éliminés lors de l'étape d'élutriation suivant l'étape de culture. Selon un autre mode de réalisation préférée du procédé de l'invention, ce dernier ne comprend pas d'étape d'élutriation, et les étapes de culture, d'activation et de centrifugation sont: - précédées par une étape de mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, avec des anticorps antiplaquettes, et/ou anti-globules rouges et/ou anti-granulocytes fixés sur un support solide, notamment de la manière indiquée ci-dessus, la mise en contact de ladite composition avec lesdits anticorps étant réalisée, soit simultanément avec tout ou partie des anticorps susmentionnés, soit successivement notamment de la manière indiquée dessus, ladite composition étant ensuite transférée dans la poche contenant le milieu de culture, - et suivies par une étape de mise en contact de la composition issue de la centrifugation, et le cas échéant lavage, après culture et activation, avec des anticorps anti-lymphocytes, par introduction de ladite composition dans une (ou plusieurs) poche(s) ou autre dispositif tel que décrit ciessus, contenant des anticorps anti-lymphocytes, et récupération de la composition de macrophages activés recherchée, sous forme essentiellement pure. Avantageusement, lorsque le procédé préféré décrit ci-dessus est réalisé par mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, successivement avec des anticorps anti-globules rouges, puis anti-plaquettes, puis anti-granulocytes, la composition de la suspension cellulaire ainsi obtenue avant l'étape de culture, dans un volume d'environ 600 ml à environ 1000 ml, est avantageusement la suivante: - Globules rouges: - Plaquettes: - Globules blancs: environ 3. 109 à environ 3.1010 - Lymphocytes: environ 60% à environ 80% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Monocytes: environ 20% à environ 30% en wmbre de globules blancs présents dans ladite composition - Polynucléaires: La composition de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré décrit dessus, dans un volume d'environ 600 ml à 1000 ml, est avantageusement identique à celle de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré précédent ne faisant pas appel à une étape de réaction immunologique préalablement à l'étape de culture, à savoir: - Lymphocytes: environ 2.109 à environ 2.1010 - Macrophages: environ 6.108 à environ 6. 109 Les rendements de l'étape de culture susmentionnée, sont avantageusement identiques à ceux décrits dans le cadre du procédé préféré précédent, à savoir environ 80% en cellules mononucléées, et environ 50% à environ 70% pour la différenciation en macrophages (en prenant en compte le nombre de monocytes de départ). Les rendements des procédés décrits cidessus, sont avantageusement du même ordre, que ces procédés soient réalisés suivant le principe de l'élutriation après l'étape de culture, ou suivant le principe de la réaction immunologique avant et après l'étape de culture. Ainsi, les procédés décrits ci-dessus de l'invention sont tels que l'on obtient des suspensions cellulaires comprenant des macrophages, le cas échéant activés, sous forme essentiellement pure, notamment dans des proportions d'environ 80% à environ 95%, et avec des rendements finals d'environ 20% à environ 50% (lesdits rendements étant calculés en faisant le rapport entre la quantité de macrophages purifiés obtenus en final et la quantité de monocytes mis en culture au départ). Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux des procédés de l'invention décrits ciessus, la composition de la suspension cellulaire de départ, et/ou l'une au moins des compositions de suspension cellulaire obtenue aux différentes étapes des procédés susmentionnés, et/ou la composition de la suspension cellulaire finale, peu(ven)t être comparées à des compositions dites témoins internes, en vue du suivi du bon déroulement des procédés en question. Un témoin interne particulièrement avantageux est celui constitué d'une quantité déterminée de monocytes, purifiés à partir du sang prélevé chez un individu sain, avantageusement fixés, notamment dans un mélange de paraformaldéhyde à 4% et de glutaraldéhyde à 0,1%, ou lyophilises, ledit témoin interne permettant de quantifier le nombre de monocytes présents dans la composition de départ. Un témoin interne particulièrement préféré est tel qu'il comprend environ 2.106 à environ 4.106 monocytes fixés pour un volume d'environ 1 ml à environ 2 ml d'un mélange de paraformaldéhyde à 4% et de glutaraldéhyde à 0,1%. La quantification du nombre de monocytes présents dans la composition de départ, est avantageusement réalisée par prélèvement d'une partie aliquote de la composition de départ, marquage des monocytes susceptibles d'être présents dans la fraction prélevée, notamment à l'aide d'anticorps marqués, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence, révélation du marquage effectué à l'aide de tout dispositif approprié, et comparaison à l'intensité de marquage obtenue dans les mêmes conditions opératoires avec ledit témoin interne. Les anticorps marqués susceptibles de reconnaître des antigènes de surface spécifiques des monocytes sont avantageusement ceux dirigés contre les antigènes suivants: CD14, HLADR et le CD64. Un autre témoin interne particulièrement avantageux est celui constitué d'une quantité déterminée de macrophages, le cas échéant activés, purifiés et activés à partir du sang prélevé chez un individu sain, avantageusement fixés, notamment dans un mélange de formaldéhyde à 4% et de glutaraldéhyde à 1 %, ou lyophilisés, puis reconstitués dans une solution adéquate de 1 à 2 ml, ledit témoin interne permettant de quantifier le nombre de macrophages, le cas échéant activés, présents dans la composition finale. Un témoin interne particulièrement préféré est tel qu'il comprend environ 2.106 à environ 4.106 macrophages fixés ou lyophilisés pour un volume d'environ 1 ml à environ 2 ml d'un mélange tel que décrit dessus. La quantification du nombre de macrophages présents dans la composition finale, est avantageusement réalisée par prélèvement d'une partie aliquote de la composition finale, marquage des macrophages susceptibles d'être présents dans la fraction prélevée, notamment à l'aide d'anticorps marqués, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence, révélation du marquage effectué à l'aide de tout dispositif approprié, et comparaison à l'intensité de marquage obtenue dans les mêmes conditions opératoires avec ledit témoin interne. Les anticorps marqués susceptibles de reconnaître des antigènes de surface spécifiques des macrophages sont avantageusement dirigés contre les antigènes suivants: CD14, MAX-1, CD64, HLADR décrits notamment dans les articles suivants: Andreesen et al., Biology 47: 490497 (1990), Lopez et al., Journal of Immunotherapy 11: 209-217 (1992), Chokri et al., Anticancer Research 12: 2257-2260 (1992). Avantageusement, les témoins internes susmentionnés sont constitués de billes, choisies notamment parmi les billes de latex fluorescentes, présentant un diamètre comparable à celui des monocytes ou macrophages, et susceptibles de donner des signaux identiques à ceux donnés par les monocytes et les macrophages dans les solutions de départ et finale respectivement. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des procédés décrits dessus de l'invention, le contrôle des compositions de macrophages, le cas échéant activés, obtenues lors de la mise en oeuvre de ces procédés, peut être effectuée par détection, et le cas échéant mesure, des cytokines sécrétées par les macrophages dans lesdites compositions, et comparaison au profil standard de sécrétion de cytokines par les macrophages, le cas échéant activés. A titre d'illustration, la détection des cytokines sécrétées, comme l'IL-l (Interleukine 1) et le TNF L'invention a également pour objet des trousses (ou kits) pour l'obtention de compositions de macrophages, notamment de macrophages activés, caractérisée en ce qu'elles comprennent: les éléments nécessaires aux lavages, la mise en culture et l'élutriation, comprenant: - une ou plusieurs poche(s) de lavage, - une ou plusieurs poche(s) de culture, de préférence hydrophobe(s), - un ou plusieurs connecteur(s) et aiguille(s) pour l'élimination du surnageant des lavages, - une ou plusieurs tubulure(s) de connexion entre les poches précédentes, - le cas échéant, un ou plusieurs site(s) d'injection dans la (ou les) poche(s) de culture, - un ou plusieurs système(s) permettant l'ouverture ou la fermeture des liaisons entre la (ou les) poche(s) de lavage et la (ou les) poches de culture, notamment des systèmes de clamp sur les tubulures, - une poche contenant la solution physiologique d'élutriation, - un transfuseur trois branches avec prise d'air, - une tubulure et un raccord au rotor servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l'élutriateur, - une (ou plusieurs) poche(s) de collecte, le cas échéant reliées entre elles par des tubulures munies d'un système de clamp, - une tubulure et un raccord au rotor servant de liaison entre la (ou les) poche(s) de collecte susmentionnée(s) et le rotor de l'élutriateur, les réactifs nécessaires à la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle, comprenant: : - une poche de milieu de culture, notamment à base d'IMDM modifié, à savoir un milieu Dubelcco modifié Iscove (IMDM, Gibco), auquel on a ajouté de la L-glutamine (2 mM, Gibco), de l'acide pyruvique (2 mM, Gibco), de l'Indométhacine (5.10 6 M, Sigma), du mercaptoéthanol (3.10-5 M, Gibco), des acides aminés non essentiels (2%, Gibco) et 2 à 5% de sérum AB+ (ou sérum autologue), - des suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, notamment:: * des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine, * du GMCSF, * de la vitamine D3, - le cas échéant un activateur tel que l'interféron y, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, - avantageusement un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) comprenant des monocytes et/ou macrophages, ces derniers étant le cas échéant activés, avantageusement fixés, ou lyophilisés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence, - des anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3 (marqueur des lymphocytes utilisé en tant que témoin négatif), CD45 (marqueur des leucocytes en général), CD14, CD64, HLA-DR et MAX-1. Une trousse particulièrement avantageuse dans le cadre de la présente invention, se présente sous forme de deux ensembles: - l'ensemble I contenant les poches, tubulures, sites d'injection, systèmes de clamp, le transfuseur trois branches, à savoir les éléments dits "secs" utilisés pour les lavages, la mise en culture et la purification par élutriation, ainsi que la poche contenant la solution d'élutriation, - l'ensemble II contenant les réactifs pour la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle de qualité. La trousse susmentionnée est davantage caractérisée en ce que: l'ensemble I est constitué de deux sousensembles sous forme de deux boîtes: - la boîte A contenant le matériel nécessaire pour les lavages des cellules provenant de la cytaphérèse et après culture, notamment: * quatre poches de transfert de 600 ml, * un site d'injection, * trois aiguilles stériles pour l'élimination des surnageants des lavages dans les poches, * trois connecteurs pour le remplissage de la poche contenant les cellules par la solution physiologique, * deux poches de culture hydrophobes de 3 litres, - la boîte B contenant les éléments pour séparer les macrophages différenciés des autres cellules présentes dans la culture lors de l'étape d'élutriation, notamment:: * une poche de 3 litres, contenant 300 ml de la solution d'élutriation concentrée 10 fois, * un transfuseur trois branches avec prise d'air, * une tubulure en silicone, et deux raccords au rotor, la tubulure et l'un des deux raccords servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l'élutriateur, l'autre raccord servant de liaison avec ledit rotor et l'ensemble de quatre poches ci-après, cette dernière tubulure contenant un site de prélèvement d'échantillon, * un ensemble de trois poches de collecte d'une capacité d'un litre, et d'une poche de 600 ml pour contenir la fraction finale des macrophages purifiés, et une poche pour l'injection aux patients des macrophages, le cas échéant activés, .I'ensemble II est représenté par la boîte C, cette dernière étant une boîte isotherme avec refroidisseur pour maintenir la température à 4"C, et contenant notamment: - une poche d'un litre de milieu de culture à base d'IMDM modifié, - une boîte contenant les produits liquides ou lyophilisés suivants:: * un flacon d'antibiotiques (pénicilline, avantageusement 1 000 U/streptomycine, avantageusement 1000 yg), * un flacon de vitamine D3 (avantageusement 4 yg), * un flacon de GMCSF (avantageusement 5.105 U), * un flacon d' interféron y (avantageusement 25.104 U), - une boîte contenant un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) tels que décrits ci-dessus, et six flacons contenant des anticorps anti CD3, anti-CD45, anti-CD14, anti-CD64, anti-MAX-l et anti-HLA-DR marqués, notamment couplés à la fluorescéine. L'invention vise également l'utilisation d'une trousse telle que définie cidessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit cidessus selon l'invention comprenant une étape d'élutriation. L'invention a également pour objet une trousse pour l'obtention de compositions de macrophages, notamment de macrophages activés, caractérisée en ce qu'elle comprend: - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-globules rouges, - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-plaquettes, - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-granulocytes, - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-lymphocytes, - une (ou plusieurs) poches de culture, - une (ou plusieurs) poche(s) de récupération des macrophages, le cas échéant activés, purifiés, - des tubulures de raccord entre les différentes poches susmentionnées, - des suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, notamment: * des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine, * du GMCSF, * de la vitamine D3, - le cas échéant un activateur tel que l'interféron y, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, - avantageusement un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) comprenant des monocytes ou macrophages, ces dernier étant le cas échéant activés, avantageusement fixés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence, tel(s) que décrit(s) ci-dessus, - des anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3, CD45, CD14, CD64, MAX-1 et HLA-DR. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une trousse telle que décrite ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit cidessus selon l'invention comprenant une étape de réaction immunologique. L'invention concerne également toute composition liquide contenant une suspension cellulaire dérivée de sang d'origine humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5 %, notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'invention a également pour objet toute composition telle que décrite cidessus, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 1%, notamment de 0,3% à 0,5%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que: - le nombre de plaquettes est compris entre environ 2.1011 à environ 6.1011 pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml, - le nombre de globules blancs est compris entre environ 5.109 à environ 5.1010 pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml, - la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'invention vise plus particulièrement les compositions susmentionnées telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé de cytaphérèse réalisé notamment sur un volume sanguin d'environ 5 à 10 litres. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition telle que décrite ciessus, pour l'obtention d'une composition de macrophages, le cas échéant activés, notamment par mise en oeuvre d'un procédé selon I'invention, ladite composition étant susceptible de pouvoir être administrée à un patient, le cas échéant après dilution des macrophages activés ainsi obtenus dans une solution injectable appropriée. L'invention concerne également les compositions susceptibles d'être utilisées en tant que témoins internes dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon 1' invention, telles que décrites ci-dessus. A titre d'illustration, les instructions écrites pour la préparation de macrophages autologues activés & vi vivo, susceptibles d'accompagner une trousse selon l'invention, peuvent se présenter de la manière suivante: INSTRUCTIONS ÉCRITES ROUR LA PREPARATION DE MAK# REsPoNsABLE DE LA PREPARATION: DATE DU DEBUT DE LA PREPARATION: CODE DU PATIENT: DATE DE FIN DE LA PREPARATION: COLLER ICI L'ETIQUETTE CODE-BARRES "N CYTA" PREPARATION DE MAK Code Patient : Date : Cette procédure a pour objet la description détaillée des modes opératoires de préparation et de contrôle de macrophages autologues activés ex vivo, en vue de leur utilisation dans l'immunothérapie adoptive antitumorale chez des patients cancéreux. - SOMMAIRE - - Transfert du produit de cytaphérèse et du prélèvement pour le sérum autologue -Préparation du sérum autologue - Produit de cytaphérèse - Déplaquettisation du produit de cytaphérèse - Mise en culture des cellules mononucléées - Activation des macrophages - Elutriation des MAK - Préparation de la poche de MAK à réinjecter - Analyse rétrospective - Décision de conformité - Etiquetagefinal et transport vers le lieu de réinjection Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient: | Date: TRANSFERT DU PRODUIT DE CYTAPHERESE ET DU PRÉLÉVEMENT POUR LE SERUM AUTOLOGUE -Compléter l'étiquetage : étiquetage Nombre de poches '': g =' 4 g g E SE ffi W W &verbar; 1 8 ~ ~ &verbar; &verbar; . g &verbar; &verbar; Date Heure Responsable Visa Expédition Réception Visa Opérateur Visa du responsable d la préparaqtion : PREPARATION DE MAK# Code Patient: D : Date: PRÉPARATION DU SÉRUM AUTOLOGUE - Prélever 150 ml de sang sur poche de transfert sec (600 ml) Prélèvement effectué : OUI # NON m - laisser à température ambiante pendant 2 heures: Heure de début: Heure de fin: - Placer la poche à +4 C pendant 30 minutes : Heure de début : . Heure de fin: Centrifuger la poche à 550 g (........... rpm) pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée a +4 C Marque : . . . N .. . . . Sous hotte à flux laminaire Marque: N' - Retirer le surnageant à l'aide d'une presse et répartir le sérum dans deux tubes à centrifuger stériles de 50 ml Lot N': - Chauffer pendant 30 minutes dans un bain-marie préalablement équilibré à la température de +56'C Température du bain-marie ... 'C C (Normes = 55 - 57'C) Heure de début: Heure de fin: - Aliquoter par 20 ml dans des tubes à centrifuger de 50ml Lot N' : Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient: | Date: PRÉPARATION DU SÉRUM AUTOLOGUE (Suite N@1) Compléter l'étiquetage:: B - Congeler à -20 C si non utilisé visa Opérateur Visa du respondable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : PRODUIT DE CYTAPHÉRE#SE - Compléter le tableau suivant: Poids P = Hématocrite Plaquettes N1= Globules blancs N2= Polynucléaires Lymphocytes Monocytes Cellules mononucléées = N3 Glob.blancs-Polynucléaires - Calculer le nombre de monocytes obtenus par cytaphérèse (Normes: 2 - 15 x 109) Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : DÉPLAQUETTISATION DU PRODUIT DE CYTAPHÉR#SE Transférer le contenu de la poche de cytaphérèse dans une poche de transfert de 600 ml. mettre en place un site d'injection N ....................................... sur une sortie de la poche de transfert. - Peser la poche contenant les cellules mononucléées. Poids P1 = . g - Ajouter dans la poche contenant les cellules mononucléées un poids de solution saline tamponnée telle que le poids final de la poche soit de 400 g: Poids ajouté P2=400-Pl = ----- -- --- g de solution saline tamponnée Lot N .. .. . Homogénéiser la suspension cellulaire. - Centrifuger à 500 g (....................... rpm) pendant 10 minutes dans la centrifugeuse réfrigérée à +4 C Marque N' - Extraire le surnageant dans une poche de 600 ml, à l'aide d'une presse. - Répéter l'opération trois fois. - Détacher les cellules de la poche de centrifugation par friction après la dernière centrifugation -Evaluer par pesée le volume résiduel dans la poche (Normes : 10 à 15 ml). - Compléter à 200 ml avec le milieu de culture (Cf "Préparation du milieu de culture" en page 26) Lot N' Noter le volume ajouté: V = . . . .. ml 'risa Opérateur Visa du oesponsablc dc la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : DÉPLAQUETTISATION DU PRODUIT DE CYTAPHÉR#SE (Suite N@1) - Après homogénéisation, prélever stérilement (Cf. annexe N'1): # 1 ml de suspension pour effectuer une numération, une viabilité et un contrôle de la taille des cellules Prélèvement effectué : OUI NON# # 2,5 ml pour effectuer un phénotypage Prélèvement effectué :OUI NON# - Étiqueter le(s) tube(s) : CONTROLEN 1 Destinataire : .............................. Préciser le destinataire du prélèvement ou le contrôle à effectuer. Coller l'étiquette code-barres "N CYTA". Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKI Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES - Compléter le tableau suivant: Resultits Normes Concentrahon en cellules mortesN m imi lml Conoentrabon en cellules /ml vlables N, Vablllte Nv m v Nbre total de cellules 9 viables (N = N x 196,5) 2 10 v s de pelltes celhles r9096 % degrossesoellules 2 10% Phenotypage CD3 ~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~ CD14 210% cD14 r > 10% ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ 90% HLADR ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 109, MAX-1 (-) -------------- (-) CD64 2 1070 Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES (Suite N 1) - Calculer le volume total du milieu de cu culture requis pour obtenir une concentration d'environ 5x106 cellules vlables/ml : PREPARATION DU MILIEU DE CULTURE 1.Composition - Compléter le tableau suivant: LOT N Quantité Milieu IMDM modifié 1000 ml Sérum autologue Ro) 20 ml GM - CSF 500 U/ml -8 Dihydroxyvitamine D3 10 M 2. Mode Opératoire Sous hotte à flux laminaire Marque N : .. - Ajouter stérilement la dihydroxyvitamine D3 en solution stérile Lot N ... ... . ............ Ajout effectué: OUI NON le GMF Lot N' Ajout effectué : OUI NON m et le sérum autologue Lot N : . ..... ................. Ajout effectué : OUI NON visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES (Suite N@2) - Compléter l'étiquetage: 3 &verbar; É &verbar; &verbar; &verbar; &verbar; S E / E 3gE . &verbar; X &verbar; E' &verbar; E &verbar; w I - Détruire le reliquat à péremption: Date de destruction : ................................. Opérateur : ................................................ Visa : ......................................................... Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES (Suite N'3) - Dès l'obtention des résultats, remplir le tableau ci-dessous :: Résuhats Normes Concen;ltionencellules /ml mortesN t m Conenhatonencellules /ml vlables N , Viabllte N, X 100 71)- 100 Nbre total de cellules 9 v'ables(N=N v xVT -1)) > 10 Sbdepebtesaellules s % de gri > sses cellules 2 long. 10% Stenhte bacténenne SrERiLE milieu trypticasesqa Stenlite bactFnenne STERI LE milieu tl'iiiglyoellate Visa Opérateur Vida du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKI Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES (Suite N 4) - Calculer le nombre de poches requises, sachant que le volume maximal par poche est de 400 à 500 ml : Vc Pth = = ... 500 arrondi au nombre de poches supérieures soit : P = ................ poches - Calculer le volume à répartir dans chaque poche : Vc Vp = = .................... ml p - Répartir le volume Vp dans les poches étiquetées - Compléter l'étiquetage : au X X w w ! b &verbar; &verbar; &verbar; g &verbar; 0 &verbar; - Homogénéiser et prélever stérilement 1 ml de suspension dans chaque poche de culture pour effectuer un contrôle bactérien (Cf. annexe N 1) Prélèvements effectués : OUI NON - Étiqueter le(s) tube(s) : CONTROLEN 2 Destinataire : ................... préciser le destinataire du prélèvement ou le contrôle à effectuer. Coller l'étiquette code barris "N' CYTA". Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLÉÉES (Suite N'S) - Sortir les poches de la hotte à flux laminaire et les placer dans l'étuve Marque N' à +3TC sous atmosphère d'air +5% de CO2, saturé en vapeur d'eau, et sur un plateau réservé au patient traité: N plateau - A partir de ce moment et pendant toute la période de culture (hormis le week-end) relever chaque matin la température et le taux de C02 de l'étuve: RELEVE DES POINTS DE CONSIGNE À C02 Incubateur à C02 Marque N :: - En cas de non conformité des mesures avec les normes, prévenir le responsable de fabrication. - Normes de température: +36-37'C - Normes de CO2 : 5 - 7% - Compléter le tableau suivant: Date Température %CO 2 Opérateur Visa 2 3 4 5 6 7 8 - Ne plus manipuler les poches jusqu'au jour de l'activation. Vlsa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ACTIVATION DES MACROPHAGES PREPARATION DE LA SOLUTION D'INTERFERON 1. Composition Compléter le tableau suivant: par flacon du flacon Interféron &gamma; y 8x1O6 U/ml Oml Albumine humaine 39,5 ml à 4% 2.Mode opératoire Sous hotte à flux laminaire Marque N' - Prélever le contenu du flacon d'interferon gamma (0,5ml) à l'aide de la seringue et le transférer dans un tube à centrifuger de 100 ml Lot N Prélèvement effectué : OUI # NON # - Ajouter 39,5 ml d'albumine humaine à 4% à l'aide d'une seringue stérile de 50 ml. Ajout effectué : OUI # NON # -Homogénéiser. - Répartir, à l'aide d'une pipette stérile, la solution à raison de 3 ml dans des tubes stériles Lot N ..... - Boucher les tubes. Visa Opérateur Visa du responsabic dc la séparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient: Date: ACTIVATION DES MACROPHAGES (Suite N'I) étiqueter les tubes Compléter l'étiquetage: l EE I g F al i g 0 &verbar; N &verbar; &verbar; &verbar; &verbar; ! ! m N 0 01 I &verbar; ]l iS &verbar; g g &verbar; &verbar; E 0 n i E E ss . F ! S g ! !!1 ....: ...,.:... E - Congeler les tubes à -20'C dans le congélateur Marque : .................................... N : ............................................ - Détruire le reliquat à péremption: Date de destruction : Opérateur : .................................... Visa : ............................................ Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ACTIVATION DES MACROPHAGES (Suite N 2) Date (correspond à la date de mise en culture plus 6 jours) Heure : (Heure conseillée: 16h00, 16h30) - Sortir les poches de culture de l'étuve Marque : .... N : . - Vérifier la concordance de l'étiquetage avec la localisation dans l'étuve N' étuve : N' plateau: Concordance : OUI NON # - Calculer la quantité d'interféron y à rajouter pour avoir une concentration finale due 250 U/ml dans les Vc = ........................................ ml de suspension contenue dans chacune des poches 250 x vr ... mI v = 105 = ... - Décongeler à température ambiante la solution dtinterféron &gamma; à 105 U/ml Lot N : . Sous hotte à flux laminaire Marque : N : . - Prélever le volume de la solution d'interféron avec une seringue stérile à usage unique de 2 ml Lot N' Prélèvement effectué : OUI # NON E Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKI Code Patient : Date : ACTIVATION DES MACROPHAGES (Suite N 3) - Inoculer dans chaque poche et repérer les poches après ajout de l'interféron en apposant une deuxième étiquette : - Compléter l'étiquetage : | i | g | i | | c E N B W g gW g | g E g E g l 11 lM S ,&num; - Dès l'addition du gamma interféron, prélever stérilement dans chacune des poches après homogénéisation: v 1 ml de suspension cellulaire pour effectuer une numération, une viabilité et un contrôle de la taille des cellules Prélèvement effectué : OUI # NON 1 ml de suspension cellulaire pour effectuer un contrôle bactérien Prélèvement effectué : OUI # NON - Étiqueter le(s) tube(s) : CONTROLE N 3 Destinataire : ................................. préciser le destinataire du prélèvement ou le contrôle à effectuer. Coller l'étiquette code-barres "N' CYrA". - Placer les poches dans l'étuve et à l'endroit préalablement repéré N' étuve : N plateau: ...... . - Noter l'heure de mise à l'étuve: Heure de début d'activation:. raseur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient = Date: ACTIVATION DES MACROPHAGES (Suite N'4) - Dès l'obtention des résultats, remplir le tableau suivant:: RguUilLE Normes CoMPnh;tbon en cenults /ml morteshl, t Conoenahon en cenules /ml vlabtes N V Viablité Nbrr total de oellules viables (N = Nv x 1VT - 3)) l X 2 10 9 i j X de pestes cellules l s 90X % de growes aiules 2 10s Sténlité l,icténe'i'nii rERlLE sur nulieu trypticassola Stérilité bactérienne sur milieu thicelycollate l STERILE Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation:: PREPARATION DE MAKS Code Patient: Date: ÉLULTRIATION DES MAK Date . . . Heure : ................................... (correspond à l'heure de début d'activation plus 16 à 17 heures)) - Sortir les poches de culture de l'étuve Marque : .. N : .. - Vérifier la concordance de l'étiquetage avec la localisation dans l'étuve N étuve : ..... . . N plateau : .................. Concordance: OUI NON - Placer les poches au réfrigérateur Marque : N' : pendant 25 +5 min Heure de début Heure de fin: Sous hotte à flux laminaire Marque : N . . . - Transvaser les différentes poches de culture dans une seule - Conserver la poche à +4 'C jusqu'à injection dans le circuit d'élutnation - Prélever stérilement après homogénéisation: 1 ml de suspension cellulaire pour effectuer une numération, une viabilité et un contrôle de la taille des cellules Prélèvement effectué : OUI NON L visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK Code Patient : Date: ÉLUTRIATION DES MAK (Suite N'1) - Dès l'obtention des résultats, remplir le tableau suivant: Résulbts résultat j Normes Concenh-ahon en cellules /ml Inil mortes N m Conentration en cellules CoKanhaon en ellules k vlables N, t /ml Viablhte Nv 70 - 100 S, Nbre total de llules 9 'ne5(N=NVXVT 109 I de petites cellules X de grosses cellules Visa Opérateur Visa du responsable de la prépartion: PREPARATION DE MAK# Code Patient: Date: ÉLUTRIATION DES MAK (Suite N'2) - Monter la chambre d'élutriation sur le rotor suivant le schéma N'1 de l'annexe N'2. - Préparer l'eau oxygénée à 6% dans un flacon stérile et compléter le tableau suivant: Eau oxygénée (30%) LOT N 100 ml Eau p.p.i. LOT N 400 ml - Stériliser le circuit à l'eau oxygéné 6% pendant 30 min et rincer à l'eau p.p.i. comme décrit dans le schéma N'2 de l'annexe N'3. MONTAGE DU KIT D'ÉLUTRIATION - Monter sur l'entrée de la chambre d'élutriation stérilisée, le kit d'entrée Lot N ..............................;...... et sur la sortie de la chambre d'élutriation le kit de sortie Lot N ............................. suivant le schéma N 3 de l'annexe N 3 PREPARATION DE LA SOLUTION D'ÉLUTRIATION 1. Composition ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ LOT N Quantité Solution saline 3000 ml tamponée Albumine humaine 100 ml à 20% 2. Mode Opératoire Sous hotte à flux laminaire Marque : . . . .. N' - Ajouter stérilement 100 ml d'albumine humaine à 20%. Ajout effectué : OUI # NON Visa rateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient: Date: ÉLUTRIATION DES MAK (Suite N 3) - Etiqueter: &verbar; &verbar; E &verbar; - &verbar; E &verbar; &verbar; S N g &verbar; S &verbar; = &verbar; &verbar; b &verbar; F &verbar; &verbar; E E E S ffi i . I lE &verbar; ! &verbar; S L 1: - Conserver à +4'C - Détruire le reliquat à péremption: Date de destruction: : ........................................ Opérateur : .................................................... Visa : ............................................................. Sous hotte à flux laminaire Marque : N : - Monter sur les deux connexions du kit d'entrée: Une poche de 3 litres de solution d'élutriation Lot N ....................................... La poche contenant la suspension cellulaire. mettre en route l'élutriateur BECKMAN J6 ME N' dont la vitesse de centrifugation est réglée à 2500 rpm et la pompe péristaltique Marque : N': : dont le débit est réglé à 65 ml/mn. - Remplir le circuit, éliminer les bulles et rincer avec au moins 100 ml de solution d'élutriation - Simultanément, fermer l'arrivée de la solution d'élutriation et ouvrir celle de la poche de suspension cellulaire sans changer le débit de la pompe (65 ml/min). Visa teur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient : Date : ÉLUTRIATION DES MAK (Suite N 4) - Dès que la totalité des cellules est passée, fermer l'arrivée de la poche des cellules et ouvrir celle de la solution d'élutriation. - Prélever un échantillon en fin de dépot de cellules pour analyse au Coulter. Prélèvement effectué : OUI NON # - Augmenter le débit de la pompe tous les 500ml et prélever un échantillon, avant et après les changements de débit, pour analyse volumétrique, par exemple : 65mlJmin, 85ml/rtnn,95 ml/min - Quand les cellules de taille macrophagique (# 10 m)commencent à sortir, arrêter la centrifugation et dévier le prélèvement sur la poche de collecte de 600ml en fermant l'arrivée de la solution d'élutriation et en ouvrant la prise d'air, selon le schéma N 3 de l'annexe N 3. - Poser trois agrafes sur la tubulure d'entrée de la dernière poche et couper la tubulure entre les deux agrafes externes. - Compléter l'étiquetage: Le" XD | | | ! S - Placer immédiatement la poche à +4"C. Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : PREPARATION DE LA POCHE DE MAK A REINJECTER - Prélever pour contrôle: .1 1 ml pour numération -viabilité-taiUe des cellules .2,5 ml pour phénotypage .1 1 ml pour activité cytotoxique et cytostatique . 2 ml pour contrôle de stérilité .1 1 ml pour recherche des endotoxines. Prélèvements effectués : OUI NON # - Etiqueter les prélèvements et indiquer CONTROIEN 4 Destinataire - - Centrifuger la poche contenant les MAK élutriés dans une centrifugeuse réfrigérée à +4 C Marque : N : ......................................... dont la vitesse de centrifugation est réglée à 550 g (soit ................... ....... . rpm) pendant 10 minutes : - Éliminer le surnageant à l'aide d'un extracteur de poche - Remettre les cellules en suspension dans une solution d'albumine humaine à 4% (solution de 40 à 100 ml) Lot N' - Homogénéiser - Au moyen d'une seringue de 50 ml Lot N .......................................... transférer la suspension cellulaire dans une poche d'injection Lot N' .... - Laver la chambre d'élutriation comme indiqué dans l'annexe N' S. M Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : PRÉPARATION DE LA POCHE DE MAK A REINJECTER (Suite N 1) - Noter dans le tableau suivant les résultats des contrôles du produit fini qui doivent être connus avant la décision de conformité:: Résultats Normes MEntrahonencellules /mlf mortes N, CoMentratron en cellules /ml r > vlables N, L ViabiLte NV X 100 1 70 - 100 Sa Nb,e total de ciiIlulea vlablff (N = NV X (VT - /\ %depetiteioeflulei(PC) s 10 X 46degrosescellules(GC) > 90 % Nb,e total de MAK t > 110 Nx oe = 2 MAK s 100 Rendement Final MAK zZ08 ('6 ntie de rnoecytes inia en culture Stérilité par examen en rmaoscopie auprès coloration stérile GRAM Endotoxine s 1 UEI ml Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ANALYSE RETROSPECTIVE - Rassembler dans le tableau ci-dessous les résultats obtenus après la réinjection des MAK : Examens Résultats Normes Phénotypage CD3 # 20% CD14 # 90% HLADR # 90% MAX 1 # 90% CD64 # 90% Cytotoxicité # 30% Cytostase # 30% Stérilité bactérienne sur STÉRILE milieu liquide Stérilité bactérienne sur STÉRILE milieu solide Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient: Date: DECISION DE CONFORMITE - ETIQUETAGE FINAL ET TRANSPORT VERS LE LIEU DE REINJECTION Décision de conformité Conforme : OUI # NON N' CYTA : Date : .................................... Visa : .................................... Transport vers le lieu de réiniection - Compléter l'étiquetage : g WE S S lE ll1 | | , | m - Compléter le tableau suivant: Date Heure Responsable Visa Expédition Réception Visa Opérateur Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient: Date: ANNEXES ANNEXE 1 CONTRôLE DE QUALITE ANNEXE 2 MONTAGE DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION SUR LE ROTOR ANNEXE 3 STÉRILISATION DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIAllON MONTÉE SUR LE ROTOR ANNEXE 4 MONTAGE DU KIT D'ÉLUTRIATION ANNEXE 5 LAVAGE DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION APRÈS USAGE Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient: Date: ANNEXE N 1 CONTRôLE DE QUALTTÉ 1. CONTRôLES STANDARDS EN BACTÉRIOLOGIE (A) Stérilité La stérilité des produits intermédiaires est vérifiée par les techniques standards de contrôles du sang, à savoir hémoculture sur: - bouillon à la trypticase-soja (bactérie aérobie) - bouillon au thioglycollate (bactérie anaérobie). La stérilité du produit fini est vérifiée à la fois par les techniques précédentes (pour analyse rétrospective) et par la technique standard de coloration GRAM (pour analyse rapide avant réinjection). (B) Endotoxines Le titre en endotoxine est déterminé avant délivrance du produit fini par la technique du LAL (Limulus Amoebocyte Lysate). 2. CONTRôLES STANDARDS EN CYTOLOGIE Numération cellulaire - Taille - Viabilité Essai La numération cellulaire et la répartition des cellules par taille est déterminée au moyen d'un Coulter Multisizer couplé au compteur Coulder (diamètre de l'orifice: 100 llm). L'intégrité de la membrane cellulaire est contrôlée par la technique des colorants vitaux 100 Isl d'une solution de bleu trypan à 0,5% sont ajoutés à la suspension cellulaire. les cellules colorées (mortes) et non colorées vivantes sont comptées indépendamment au moyen d'une cellule de Malassez. Résultats: La viabilité est le rapport du nombre de cellules vivantes sur le nombre total de cellules, déterminées à la cellule de Malassez. La répartition des cellules est exprimée en pourcentage de cellules à taille de lymphocytes, de monocytes ou de macrophages analysés au Coulter Multisizer et corrigés de la viabilité. Le rendement est exprimé comme le rapport du nombre de MAK réinjectés sur le nombre de monocytes mis en culture. Visa du ippponsable de la préparation: PREPARATION DE MAKI Code Patient: Date: ANNEXE N 1 (Suite N 1) CONTRÔLE DE QUALITÉ 3. CONTRôLES SPECIFIQUES (A) Pkénotypage par immunofluorescence en cytométrie de nux Essai : Une fraction aliquote (2xl06 cellules) de la suspension de cellules mononucléées est centrifugée et le sumageant éliminé. Les cellules en suspension dans I ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,2% d'albumine bovine. 100ml de cette suspension sont incubés dans des tubes de polypropylène pendant 30 minutes à +40C en présence bun des anticorps monoclonaux, couplés ou non couples à la fluoresceine - antiCD3, antiCD14, anti-HLADR, anti-MAX1, anti-CD64. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois en tampon phosphate salin, puis remises en suspension dans 200p1 de PBS avant analyse en cytometrie pour le marquage direcL Pour le marquage indirect, (anti-MAX 1), les cellules sont incubées avec une solution au 1/40ème de (Fab)2 d'lgG de chèvre anti-lgG de souris, marquee à la fluorescéine (sous forme TlTC). Après une incubation à +4 C pendant 25 minutes, les cellules sont lavées 3 fois et les surnageants élimines. Les cellules sont remises en suspension dans 200 pl de tampon phosphate salin et analysées au cytofluorimétire de flux. La fenêtre est réglée pour cemer la population majeure de grosses cellules (taille # 15 m). Témoin des témoins sont réalisés dans les mêmes conditions en remplaçant l'anticorps monoclonal spécifique d'un marqueur par une immunoglobuline de même isotype. Résultats : L'expression du marqueur par une cellule est exprimée: - d'une part comme le pourcentage de cellules fluorescentes, à taille de macrophage (# 10 m) parmi les cellules analysées - d'autre part, comme rintensité de fluorescence totale rapportée au nombre de cellules fluorescentes à taille de macrophages (# 10 m). (B) Contrôle interne Un flacon contenant des macrophages activés purifiés (MAK) fixes ou lyophilises. Ces cellules sont peéparées en parallèle de la même façon que les échantillons, le pourcentage et l'intensité de marquage seront comparés à ce contrôle. Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ANNEXE N 2 MONTAGE DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION SUR LE ROTOR - Monter la chambre d'élutriation selon le schéma suivant (consulter également la notice technique fournie par le constructeur): Voir figure 2 Visa Responsable de fabrication : Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ANNEXE N 2 (Suite N 1) MONTAGE DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION SUR LE ROTOR - Positionner les tubulures inox après avoir graissé les joints noirs avec la graisse silicone-vacuum. - Desserer les vis d'un demi-tour. - Fixer l'axe du rotor. Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ANNEXE N 3 STÉRILISATION DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION MONTÉE SUR LE ROTOR - Faire le montage suivant avec du matériel stérile : Voir figure 3 - Brancher le flacon dans le circuit décrit ci-dessus. - Mettre en route la pompe péristaltique (55ml/mn) et évacuer les 100 premiers millilitres dans le flacon "Poubelle". - Retirer la tubulure du flacon "Poubelle" et brancher le circuit en boucle. Visa Responsable de fabrication : Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient: Date: ANNEXE N 3 (SUITE N 1) STÉRILISATION DE LA CHAMBRE D'ÉLUTRIATION MONTÉE SUR LE ROTOR - Faire circuler en contin pendant 30 minutes puis vider le circuit. - Remplacer le flacon d'eau oxygénée par un flacon contenant 500 ml d'eau p.p.i. - Placer la tubulure de sortie dans le flacon poubelle. - Rincer avec la totalité de l'eau p.p.i. puis vider le ciruit. - Remplacer le flacon d'eau p.p.i. par un flacon contenant 300 ml de solution d'élutriation. - Relier entre elles les 2 tubulures (entrée-sortie) et les conserver ainsi jusqu'au montage sur le circuit d'élutriation. Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAKS Code Patient : Date : ANNEXE N 4 MONTAGE DU KIT D'ÉLUTRIATION Voir figure 1 Visa Responsable de fabrication : Visa du responsable de la préparation: PREPARATION DE MAK# Code Patient : Date : ANNEXE N 5 LAVAGE DE LA CHAMBRE D'ELUTRIATION APRES USAGE | - La chambre d'élutriation étant en place sur son rotor dans l'élutriateur en fin de fabrication, passer soe ml d'eau chaude à +50 C à travers le circuit - Retirer le rotor de ta centrifugeuse et débrancher les circuits. - Démonter ta chambre d'élutriation de t'axe du rotor. - - Laver la chambre et les accessoires dans l'éthanol 70% pendant & u0 Mn. - Rincer la chambre à t'eau p.p.i. et sécher à l'air comprime. | - Stocker dans un endroit propre. Visa du responsable de la préparation: REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une composition comprenant des macrophages, notamment des macrophages activés, caractérisé en ce que, partant d'une composition dérivée du sang d'origine humaine, et enrichie en cellules sanguines, et plus particulièrement en globules blancs tels que les monocytes, notamment d'une composition dérivée du sang telle qu'obtenue par cytaphérèse, ledit procédé comprend les étapes suivantes:: - avantageusement une dilution de ladite composition dérivée du sang, notamment dans environ 2 à 3 fois le volume de cette dernière, à l'aide d'une solution physiologique appropriée, - une centrifugation de ladite composition dérivée du sang, et lavage du culot issu de la centrifugation susmentionnée, après récupération du culot dans une solution physiologique de lavage appropriée, notamment dans une poche (du type poche de transfert), en effectuant par exemple une pression sur ladite poche, la solution de lavage étant alors éliminée vers une autre poche ou autre récipient, pour récupérer une composition dépourvue d'éventuels anticoagulants et de résidus divers et appauvrie en plaquettes, - le cas échéant répétition de l'opération de centrifugation et lavage susmentionnée, notamment entre environ 1 et 3 fois, - une étape de culture des cellules contenues dans la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage susmentionnée, en plaçant celleci dans un milieu de culture approprié, notamment dans une poche avantageusement hydrophobe, pendant environ 6 à environ 7 jours, cette étape de culture étant le cas échéant suivie par une étape d'activation des macrophages obtenus dans le milieu de culture lors de l'étape précédente, par addition dans ledit milieu de culture d'un activateur, tel que l'interféron y, ledit activateur étant mis en contact avec le contenu du milieu de culture pendant environ 16 à environ 24 heures, ces étapes de culture et d'activation étant suivies par une centrifugation du milieu de culture, et le cas échéant lavage du culot issu de la centrifugation, notamment de la manière indiquée dessus, ces étapes de culture, d'activation et de centrifugation étant: précédées et/ou suivies par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les monocytes susceptibles d'être présents dans la composition de départ, notamment des plaquettes, des globules rouges, des granulocytes et des lymphocytes, par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage précédant l'étape de culture, ou obtenue après l'étape de centrifugation suivant l'étape de culture, avec des anticorps dirigés contre tout ou partie des constituants susmentionnés, et récupération de la solution contenant les monocytes, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps, et/ou suivies par une étape d'élutriation dans laquelle les macrophages activés sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après les étapes de culture, d'activation et de centrifugation susmentionnées, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique. 2) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine, est telle qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5%, notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine, est telle qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 1%, notamment de 0,3% à 0,5 %, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine, est telle que: - le nombre de plaquettes est compns entre environ 2.101 t à environ 6.101 l par environ 150 ml à environ 200 ml, - le nombre de globules blancs est compris entre environ 5.109 à environ 5.1010 par environ 150 ml à environ 200 ml, - la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les étapes de culture, d'activation et de centrifugation sont suivies d'une étape d'élutriation représentée sur la figure 1, et réalisée en utilisant le dispositif suivant: - une poche A contenant la composition comprenant les macrophages activés, obtenue après l'étape de culture et celle d'activation, une poche B contenant une solution physiologique susceptible de maintenir l'ensemble du système d'élutriation dans un milieu viable pour les macrophages activés, et une prise d'air C, sont reliées à un transfuseur à trois branches muni d'un filtre D, - la prise d'air C étant fermée, une pompe péristaltique E enchaîne le contenu de la poche A dans un élutriateur équipé d'un rotor F avec une chambre d'élutriation G, l'alimentation de l'ensemble du circuit d'élutriation en liquide physiologique étant assurée par l'entrainement du contenu de la poche B, à l'aide de la pompe susmentionnée, pendant toute la durée de l'élutriation, - la vitesse de rotation du rotor de l'élutriateur F et le débit de la pompe E sont tels que les divers constituants de la composition de la poche A, introduits dans le rotor F, sont séparés en fonction de leur taille dans la chambre d'élutriation G, les constituants de plus petite taille migrant en premier vers le haut de la chambre (proche de la sortie de l'élutriateur), tandis que les constituants de plus grande taille, à savoir les macrophages activés, migrent vers la sortie de la chambre en dernier, - les différents constituants de la composition contenue dans la poche A ainsi séparés sont récoltés séparément dans des poches reliées à l'élutriateur, les plaquettes et divers résidus de petite taille étant récupérés les premiers dans une poche H, les globules rouges étant ensuite récupérés dans une poche I, puis les lymphocytes dans une poche J, et enfin les macrophages activés dans une poche K, les différentes catégories susmentionnées de constituants étant extraites de l'élutriateur, en fonction de leur taille respective, soit en diminuant la vitesse de rotation de l'élutriateur, soit en augmentant le débit de la pompe E, la récupération des macrophages activés dans la poche K pouvant avantageusement être réalisée par arrêt du rotor de l'élutriateur F et ouverture de la prise d'air C, la poche K contenant ainsi la composition de macrophages activés recherchée, avantageusement sous forme essentiellement pure. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les étapes de culture, d'activation et de centrifugation sont: - précédées par une étape de mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage avec des anticorps anti-plaquettes, et/ou anti-globules rouges et/ou anti-granulocytes fixés sur un support solide, notamment sur les parois d'une poche du type transfert, ou sur les parois de tout autre dispositif dans lequel ladite composition issue de l'étape initiale de lavage est susceptible d'être introduite, ledit dispositif étant le cas échéant aménagé de manière à autoriser la circulation de ladite composition le long des parois sur lesquelles sont fixés lesdits anticorps, la mise en contact de ladite composition avec lesdits anticorps étant réalisée, soit simultanément avec tout ou partie des anticorps susmentionnés, soit successivement notamment par introduction de ladite composition dans une poche ou autre dispositif tel que décrit ci-dessus, contenant des anticorps antiplaquettes, puis passage de ladite composition dans une seconde poche contenant des anticorps anti-globules rouges, et/ou passage de ladite composition dans une troisième poche contenant des anticorps anti-granulocytes, ladite composition étant ensuite transférée dans la poche contenant le milieu de culture, - et suivies par une étape de mise en contact de la composition issue de la centrifugation, et le cas échéant lavage, après culture et activation, avec des anticorps anti-lymphocytes, par introduction de ladite composition dans une (ou plusieurs) poche(s) ou autre dispositif tel que décrit ci-dessus, contenant des anticorps anti-lymphocytes, et récupération de la composition de macrophages activés recherchée, sous forme essentiellement pure. 7) Trousse (ou kit) pour l'obtention de compositions de macrophages, notamment de macrophages activés, caractérisée en ce qu'elle comprend: les éléments nécessaires aux lavages, la mise en culture et l'élutriation, comprenant: - une ou plusieurs poche(s) de lavage, - une ou plusieurs poche(s) de culture, de préférence hydrophobe(s), - un ou plusieurs connecteur(s) et aiguille(s) pour l'élimination du surnageant des lavages, - une ou plusieurs tubulure(s) de connexion entre les poches précédentes, - le cas échéant, un ou plusieurs site(s) d'injection dans la (ou les) poche(s) de culture, - un ou plusieurs système(s) permettant l'ouverture ou la fermeture des liaisons entre la (ou les) poche(s) de lavage et la (ou les) poche(s) de culture, notamment des systèmes de clamp sur les tubulures, - une poche contenant la solution physiologique d'élutriation, - un transfuseur trois branches avec prise d'air, - une tubulure et un raccord au rotor servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l'élutriateur, - une (ou plusieurs) poche(s) de collecte, le cas échéant reliées entreelles par des tubulures munies d'un système de clamp, - une tubulure et un raccord au rotor servant de liaison entre la (ou les) poche(s) de collecte susmentionnée(s) et le rotor de l'élutriateur, les réactifs nécessaires à la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle, comprenant: - une poche de milieu de culture, notamment à base de milieu Dubelcco modifié Iscove (IMDM), - des suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, notamment:: * des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine, * du GMCSF, * de la vitamine D3, - le cas échéant un activateur tel que l'interféron y, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, - avantageusement un témoin interne comprenant des monocytes et/ou des macrophages, ces derniers étant le cas échéant activés, avantageusement fixés, ou lyophilisés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence, - des anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3, CD45, CD14, CD64, HLA-DR et MAX1. 8) Trousse selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de deux ensembles: - l'ensemble I contenant les poches, tubulures, sites d'injection, systèmes de clamp, le transfuseur trois branches, à savoir les éléments dits "secs" utilisés pour les lavages, la mise en culture et la purification par élutriation, ainsi que la poche contenant la solution d'élutriation, - l'ensemble II contenant les réactifs pour la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle de qualité. 9) Trousse selon la revendication 8, caractérisée en ce que: l'ensemble I est constitué de deux sousensembles sous forme de deux boîtes: - la boîte A contenant le matériel nécessaire pour les lavages des cellules provenant de la cytaphérèse et après culture, notamment: * quatre poches de transfert de 600 ml, * un site d'injection, * trois aiguilles pour l'élimination des surnageants des lavages, * trois connecteurs pour le remplissage de la poche contenant les cellules par une solution physiologique, * deux poches de culture hydrophobes de 3 litres, - la boîte B contenant les éléments pour séparer les macrophages différenciés des autres cellules présentes dans la culture lors de l'étape d'élutriation, notamment:: * une poche de 3 litres, contenant 300 ml de la solution d'élutriation concentrée 10 fois, * un transfuseur trois branches avec prise d'air, * une tubulure en silicone, et deux raccords au rotor, la tubulure et l'un des deux raccords servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l'élutriateur, l'autre raccord servant de liaison avec ledit rotor et l'ensemble de quatre poches ci-après, cette dernière tubulure contenant un site de prélèvement d'échantillon, * un ensemble de trois poches de collecte d'une capacité d'un litre, et d'une poche de 600 mi pour contenir la fraction finale des macrophages purifiés, * une poche pour l'injection aux patients des macrophages, le cas échéant activés, l'ensemble ll est représenté par la boîte C, cette dernière étant une boîte isotherme avec refroidisseur pour maintenir la température à 4"C, et contenant notamment: - une poche d'un litre de milieu de culture à base de milieu Dubelcco modifié Iscove (IMDM), - une boîte contenant les produits liquides ou lyophilisés suivants:: * un flacon d'antibiotiques (pénicilline, avantageusement 1 000 U/streptomycine, avantageusement 1000 ;g), * un flacon de vitamine D3 (avantageusement 4 ssg), * un flacon de GMCSF (avantageusement 5.105 U), * un flacon d'interféron y (avantageusement 25.104 U), - une boîte contenant un témoin interne (macrophages activés et fixés ou billes calibrées, le cas échéant marqués, notamment par fluorescence), et six flacons contenant des anticorps antiCD3, anti-CD45, anti CD14, anti-CD64, anti-MAX-l et anti-HLA-DR marqués, notamment couplés à la fluorescéine. 10) Utilisation d'une trousse selon l'une des revendications 7 à 10, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 11) Trousse pour l'obtention de compositions de macrophages, notamment de macrophages activés, caractérisée en ce qu'elle comprend: - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-globules rouges, - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-plaquettes, - une (ou plusieurs) poche(s) à 1 ' intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-granulocytes, - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-lymphocytes, - une (ou plusieurs) poche(s) de culture, - une (ou plusieurs) poche(s) de récupération des macrophages, le cas échéant activés, purifiés, - des tubulures de raccord entre les différentes poches susmentionnées, - des suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, notamment: * des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine, * du GMCSF, * de la vitamine D3, - le cas échéant un activateur tel que l'interféron 7, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, - avantageusement un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) comprenant des monocytes ou macrophages, ces dernier étant le cas échéant activés, avantageusement fixés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence, tel(s) que décrit(s) ci-dessus, - des anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3, CD45, CD14, CD64, anti-MAX-l et HLA DR. 12) Utilisation d'une trousse selon la revendication 1 1 pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 4 et 6. 13) Composition liquide contenant une suspension cellulaire dérivée de sang d'origine humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5%, notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 14) Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 1 %, notamment de 0,3% à 0,5%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 15) Composition selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisée en ce que: - le nombre de plaquettes est compris entre environ 2.1011 à environ 6.101 l par environ 150 ml à environ 200 ml, - le nombre de globules blancs est compris entre environ 5.109 à environ 5.1010 par environ 150 ml à environ 200 ml, - la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. 16) Composition selon l'une des revendications 13 à 15, telle qu'obtenue par mise en oeuvre d'un procédé de cytaphérèse réalisé notamment sur un volume sanguin d'environ 5 à 10 litres. 17) Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 13 à 16, pour l'obtention d'une composition de macrophages activés, notamment par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, ladite composition étant susceptible de pouvoir être administrée à un patient, le cas échéant après dilution des macrophages activés ainsi obtenus dans une solution injectable appropriée.