FR 2731015 A1 19960830 FR 9502153 A 19950224 PROCEDE D' D'KblLICBISSrnT ENZYMATIQUE D ' HUILES D' ORIGINE MARINE BT LES TRIGLYCERIDES D'ACIDES GRAS POLYINSATURES AINSI OBTENUS La présente invention a pour objet un nouveau procédé de production d'acides gras polyinsaturés sous forme pure ou concentrée. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé de production d'acides polyinsaturés de la série o > -3 à partir d'huiles de poissons à l'aide d'un traitement enzymatique. Elle a spécifiquement pour objet un procédé de production de triglycérides d'acides gras polyinsaturés sous forme pure ou concentrée à partir d'huile de poissons, caractérisé en ce qu'il permet d'obtenir, par traitement enzymatique, un mélange renfermant au moins 60 % d'acide docosahexaenoique (DHA) et d'acide eicosapentaenoique (EPA). L'invention réside essentiellement dans un procédé d'obtention de concentrés d'acides gras polyinsaturés qui consiste à soumettre une huile de poisson contenant du DHA et de 1'EPA, à une hydrolyse enzymatique sélective, en position 1, 3 ou 2, pour obtenir un mélange d'acides gras libres, de monoglycérides et de diglycérides, à séparer les constituants de ce mélange, à recueillir les acides gras libres que l'on purifie par cristallisation à l'urée, pour augmenter la teneur en EPA et en DHA, à décomplexer les acides gras isolés, à effectuer une interestérification entre les acides gras libres, concentrés en acides gras polyinsaturés et l'huile brute, en présence d'une lipase spécifique de position ou d'encombrement stérique, afin d'obtenir un mélange enrichi en triglycérides d'acides gras polyinsaturés que l'on sépare et que l'on débarrasse des acides gras libres. D'une manière préférée, on utilise l'huile de sardine obtenue par pression des sardines fraîches pêchées dans les mers froides. La sardine offre l'avantage d'un approvisionnement facile et constant. Au contraire, l'huile d'orbitales oculaires de thon, exploitée industriellement, quoique présentant une teneur plus élevée en EPA et DHA, présente l'inconvénient que l'approvisionnement en matière première constitue la principale limite à sa production. L'hydrolyse enzymatique initiale a pour effet de scinder la fonction ester du glycérol estérifiée par un acide gras polyinsaturé et de laisser intactes les autres fonctions esters selon le schéma.A. I1 est possible également, d'hydrolyser les triglycérides présents dans l'huile de sardine par une lipase non spécifique de manière à obtenir un mélange d'acides gras libres dans lequel les acides gras polyinsaturés représentent environ 30 % du mélange total. Ce mélange d'acides gras est fractionné par des moyens physiques pour conduire à un mélange dans lequel les acides gras polyinsaturés et notamment 1'EPA et le DRA prédominent, pouvant aller jusqu'à 70-80 % du mélange d'acides gras libres. Les acides gras polyinsaturés libres sont reestérifiés en présence d'un enzyme et notamment en présence d'une lipase non spécifique ou d'une lipase spécifique de la position 2. Si on utilise une lipase non spécifique, le glycérol sera mis à réagir avec le mélange d'acides gras libres polyinsaturés et on obtient un triglycéride dont la teneur en acide gras polyinsaturé est de l'ordre de 60 t. Au contraire, si on interestérifie à l'aide d'une lipase spécifique de la position AG.2 un mélange d'acides gras polyinsaturés déjà concentré et d'un glycéride estérifié en une seule position par un acide gras polyinsaturé, on peut obtenir un diglycéride-1,2 dont deux positions sont estérifiées par un acide gras polyinsaturé. I1 est également possible d'hydrolyser un triglycéride dont la position 2 est estérifiée par un acide gras polyinsaturé à l'aide d'un enzyme spécifique et notamment par une lipase du type SN.2 spécifique pour obtenir un mélange d'acides gras polyinsaturés libres, de monoglycérides et de diglycérides ayant une teneur en acides gras polyinsaturés comprise entre 80 et 100 % Après fractionnement de ce mélange, les acides gras libres sont purifiés par cristallisation à froid en présence d'urée, pour augmenter la teneur en EPA et en DHA. Ce mélange concentré est alors soumis à une interestérification par un triglycéride dont la position 2 est occupée par un acide gras polyinsaturé en présence d'une lipase-l,3 spécifique, de façon à obtenir un triglycéride dont au moins deux hydroxyles sont estérifiés par un acide gras polyinsaturé. Les schémas joints illustrent ces diverses variantes du procédé. L'enrichissement de l'huile brute de sardine, par extraction des AGHI, d'une teneur moyenne de 30 % à une teneur correspondant à 50-60 t du total en acides gras peut être mené selon l'un des deux procédés schématisés (A et B) selon l'invention. Jusqu'à ces dernières années, la majorité de la production d'huile de poissons, considérée comme un sous-produit de la transformation, était destinée, après hydrogénation, à la fabrication de la margarine. La faible valeur ajoutée du produit et la mise en oeuvre de traitements physico-chimiques pour l'extraction, la désodorisation, la décoloration et l'hydrogénation entraînant une destruction des propriétés de l'huile, expliquent le peu d'intérêt des industriels en ce qui concerne la qualité. La principale caractéristique des huiles de poissons est leur teneur naturelle élevée (20-30 t) en acides gras polyinsaturés, de types o-3, et en particulier en acide docosahexaenoique (DHA) et eicosapentaénoique (EPA). A l'heure actuelle, l'huile de poisson est la seule source commercialement exploitable d'acides gras polyinsaturés à longue chaîne, malgré les tentatives de production par des procédés microbiologiques. Depuis les études épidémiologiques rapportées par Bang et al en 1971, et études physiologiques, il est apparu que les acides gras essentiels sont les principaux constituants des phospholipides de la rétine, de la matière grise, de l'épiderme; ils jouent un rôle important au niveau du système nerveux central et présentent des propriétés pharmacologiques importantes dans les maladies cardio-vasculaires, en tant qu'antithrombotiques. En conséquence, l'intérêt que montrent les industries pharmaceutiques, cosmétiques et parapharmaceutiques est à l'origine d'un marché en pleine expansion, aux USA, au JAPON et en EUROPE. Le marché des AGHI (acides gras polyinsaturés), sur la base de la qualité des huiles et donc de la valeur ajoutée, présente 3 domaines d'utilisation les huiles brutes, jusqu'à 30 % en AGHI, pour les applications en IAA, l'oléochimie, biopolymères, alimentation animale. les huiles enrichies, de 30 à 60 , pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques. les AGHI purifiés, de 80 à 98 % pour la pharmacie. Actuellement, les challenges de l'industrie de l'huile de poisson se situent à différents niveaux, compte tenu de ces nouveaux marchés. * qualité de la matière première * stabilité des caractéristiques techniques au cours de l'année, nécessitant donc une sélection des huiles * méthodes d'extraction à reconsidérer * définition des conditions de raffinage en fonction des cahiers des charges * conditions de stockage Les huiles de poissons, sardines ou foie de morue, contiennent en moyenne 20 à 30 i d'EPA+DHA par rapport au total des acides gras. Parmi la grande variété d'huiles de poisson, les huiles d'orbitales oculaires de thon, exploitées industriellement, se caractérisent par une teneur plus importante, jusqu'à 40 %, mais l'approvisionnement en matière première est la principale limite à sa production.Bien qu'il soit plus aisé de purifier des AGHI, libres ou sous la forme d'esters éthyliques, la demande du marché des AGHI, en particulier la pharmacie et la cosmétique, concerne exclusivement les acides gras sous forme naturelle de triglycérides pour des raisons d'efficacité.En partant d'huiles contenant jusqu'à 30 t en EPA et DHA, de nombreuses techniques sont applicables à l'huile brute, telles que la wintérisation, la distillation moléculaire ou la cristallisation par solvant. Du fait du nombre de combinaisons possibles de la position des acides gras sur les triglycérides, obtenir à partir d'une huile brute, des teneurs en AGHI supérieure à 30 t nécessite la mise en oeuvre de techniques plus complexes. Cependant, le fractionnement des acides gras libres ou estérifiés jusqu'à 6580 t est possible par un certain nombre de méthodes, telles que l'extraction par fluide supercritique, la complexation à l'urée, la chromatographie, la séparation sur zéolite et même jusqu'à 90 t par HPLC. En dehors de ces méthodes physico-chimiques, l'enrichissement par voie enzymatique, est utilisé avec succès sur des huiles végétales. Les techniques physico-chimiques, du fait de leur coût en investissement (par exemple 3MF pour un extracteur FSC industriel de 1 m3), ne peuvent être économiquement viables que pour des enrichissements supérieurs à 80 t caractérisés par une forte valeur ajoutée. Par contre, les techniques enzymatiques, plus simples et donc moins coûteuses, sont en théorie bien adaptées dans un créneau allant de l'huile brute à une huile titrant 55-60 % en AGHI. En effet, depuis quelques années, de nombreux travaux ont montré l'importance physiologique et diététique des acides gras polyinsaturés et surtout de l'acide eicosapentaenoîque (EPA) et de l'acide docosahexaenoique (ou DHA = acide A-4, 7, 10, 13, 16, l9-docosahexaenoique). Ces composés se forment dans l'organisme humain en très petites quantités et les quantités produites selon les deux schémas biologiques ci-après, vont en diminuant au cours des années, de telle sorte qu'il peut en résulter une carence chez les femmes enceintes et chez les personnes âgées. Le schéma ci-après résume le schéma de formation des acides gras polyinsaturés dans l'organisme. n-6 n-3 18:2 A-9, 12 18:3 A-9,12,15 (acide linoléique) (acide a-linolénique) W A-6 desaturase 18:3 A-6,9,12 18:4 A-6,9,12,15 (acide t-linoléique) (acide octadécatétraénoique) s élongation 20:3 #-8,11,14 20:4 #-8,11,14,17 (acide dihomo-Y-linolénique) (acide eicosatétraénoique > z b-5 desaturase 20:4 A-5,8,11,14 20::5 A-5,8,11,14,17 (acide arachidonique) (acide eicosapentaénoîque) # élongation 22:4 A-7,10,13,16 22:5 A-7,10,13,16,19 (acide adrénique) (acide docosapentaénoïque) s A-4 desaturase 22:5 b-4,7,10,13,16 22::6 A-4,7,10,13,16,19 (acide docosapentaénoique) (acide docosahexaénoique) Les applications des enzymes dans le traitement du poisson sont multiples, production d'hydrolysats protéiques par des protéases, ensilage, dépeçage du thon, attendrissement de la chair, hydrolyse des tissus enveloppant les oeufs (caviar), élimination des membranes de foie. En ce qui concerne les huiles, de nombreuses publications montrent l'intérêt des traitements enzymatiques pour extraire et purifier les acides gras polyinsaturés.Les enzymes les plus couramment utilisées sont des lipases qui permettent, soit d'hydrolyser les triglycérides en acides gras et glycérol dans des conditions aqueuses, soit inversement, d'estérifier les acides gras dans des conditions anhydres ou en présence de solvants organiques. De nombreuses lipases hydrolysent les triglycérides selon la séquence suivante : 1,2 - diglycéride Triglycéride 2,3 - diglycéride 2-monoglycéride - diglycéride Cependant, certains lipases ne répondent pas à cette cinétique du fait de la "reconnaissance" spécifique : - de certains acides gras - de la position de ces acides gras sur le triglycéride - de glycérides de différents poids moléculaires ou - de leur stéréospécificité. Il existe ainsi de nombreuses lipases de spécificités différentes : les lipases intestinales ou de tissu adipeux, du muscle d'insectes, qui hydrolysent préférentiellement les monoglycérides comparativement aux triglycérides. les lipases de Mucor, de Rhizopus, de lait, et la lipase pancréatique de porc, qui sont spécifiques des positions 1,3 sur le triglycéride, alors que la lipase de Pseudomonas est spécifique de la position 2. la lipase de Candida qui hydrolyse préférentiellement les liaisons d'ester de DHA. la lipase de chou (B.napus) qui reconnaît la position de la double liaison sur les acides gras et différencie l'acide a linolénique du DHA, ou la lipase de Geotrichum qui est spécifique des acides gras contenant des insaturations CIS-9 et CIS-9 -CIS-12. Cette spécificité des lipases est généralement à la base des procédés de fractionnement d'acides gras commercialement intéressants contenus dans les huiles végétales ou de poissons. On a ainsi décrit des procédés d'enrichissement d'acide alinolénique dans une huile de primevère (de 9,5 % à 64,6 t) avec une lipase de chou; de DHA dans une huile de foie de morue (de 12,7 à 45,9 %) avec une lipase de Mucor; d'EPA + DHA dans une huile de foie de morue (de 23 à 72,2 %) avec une lipase de Mucor; de DHA dans une huile de thon (facteur de concentration=3) avec une lipase de Candida; d'acide 5eicosaenoique (20:1) dans une huile de Meadowfoam (de 83,5 à 95 ) par une lipase de Chromabactérium. Schématiquement, la préparation de triglycérides enrichis en AGHI est basée sur une interestérification catalysée par une lipase sélective : R lipase 1-3 spécifi te - R' R RwCOO +R'COOR" x ~ R + R'CoeR" R (AGHI libre ou esters R' R COOR" d'AGHI en excès) R" = -H = -Et Cependant, les procédés enzymatiques antérieurs nécessitent un apport d'AGHI, libres ou estérifiés, de pureté élevée. En conséquence, cet apport doit être précédé d'une hydrolyse totale des triglycérides pour libérer les AGHI libres par une lipase et d'une purification par voie chimique ou à l'aide de lipases spécifiques. Ce sont des difficultés particulières que le présent procédé vise à résoudre. Selon un mode d'exécution préféré de l'invention, il est nécessaire de déterminer au préalable la position des acides gras polyinsaturés dans les triglycérides d'huile de sardines traitée. Selon les espèces, et peut-être selon les saisons, les acides gras polyinsaturés sont soit en position 2, soit en position 1,3. Il est donc nécessaire, après cette détermination, de choisir une lipase appropriée pour la réaction d'hydrolyse comme pour la réaction d'interestérification ou de transestérification. La technique utilisée pour déterminer cette position, est basée sur l'hydrolyse par des enzymes spécifiques et sur l'analyse par des méthodes physiques (CPG, C ou HPLC) de la teneur en EPA et en DHA dans les produits d'hydrolyse. A partir des stocks d'enzymes disponibles dans le commerce (estérases et lipases), immobilisées ou non, les tests d'hydrolyse ont été effectués pour déterminer l'optimum en matière de teneur en acides gras polyinsaturés de manière à ce que les étapes ultérieures de séparation et de purification soient facilités. Les paramètres étudiés ont été les suivants : choix des enzymes en fonction de leur spécificité : hydrolyse des longues chaînes d'AG, hydrolyse des courtes chaînes spécifiquement, hydrolyse des liaisons EPA et DHA spécifiquement teneur en eau (dont dépend la cinétique de la réaction) rapport huile/enzyme température inhibition par les produits de la réaction A partir des résultats à l'échelle du laboratoire, une montée en échelle (scale-up) (facteur 10) a été expérimenté pour évaluer la rentabilité économique de cette phase. Ces essais ont montré que trois enzymes conduisaient aux meilleurs rapports EPA/DHA, à savoir : - une lipase de Pseudomonas fluorescens - une lipase de Mucor javanicus - une lipase de Mucor miehei Les résultats fournissent une teneur en triglycérides à acides gras polyinsaturés à 70 % environ, avec un rapport EPA/DHA de l'ordre de 1. A l'étape suivante, les acides gras libres sont séparés des autres produits d'hydrolyse (monoglycérides, diglycérides, glycérol) par lavage à l'eau basique ou par saponification. La troisième étape du procédé consiste à purifier le mélange d'acides gras libres par cristallisation à froid en présence d'urée en milieu éthanolique. Les essais effectués ont montré que les acides gras à longue chaîne en C20 ou en C22 cristallisaient plus facilement à froid (-100C) après complexation à l'urée et qu'ainsi, on pouvait obtenir une concentration et des rendements intéressants en acides gras polyinsaturés (de 63 à 83 %). Cependant, cette technique basée sur la solubilité différentielle des acides gras dans le solvant utilisé, nécessite une adaptation aux acides gras polyinsaturés désirés et une optimisation des paramètres de précipitation (température, rapports Urée/Acide gras polyinsaturé) et des conditions de décomplexation. L'étape de saponification nécessaire pour séparer les acides gras libres des autres produits de l'hydrolyse enzymatique doit répondre à des conditions expérimentales précises, car elle détermine les effets des produits d'hydrolyse sur les lipases spécifiques et non spécifiques, sur le rendement de séparation et sur le rendement de purification. L'étape d'interestérification de l'huile brute par des acides gras polyinsaturés concentrés, est une étape enzymatique inverse de l'étape initiale du procédé selon l'invention. Elle nécessite des conditions expérimentales totalement différentes pour déplacer l'équilibre réactionnel et, en particulier, le choix de la concentration en eau, la présence éventuelle de solvants organiques ou le choix du pH et des concentrations. Les acides gras polyinsaturés concentrés sont mis en contact avec l'huile de poissons brute et avec l'enzyme choisi. L'enzyme utilisé est une lipase spécifique des liaisons esters ne contenant pas d'acide gras polyinsaturé, de manière à préserver la liaison ester combinée à un acide gras polyinsaturé présent, initialement, dans l'huile brute (+ 30 ). La teneur en eau est de préférence faible et maintenue constante. La nature du solvant, s'il y en a, est importante. Celui-ci doit être compatible avec l'enzyme. D'une manière préférée, l'enzyme utilisée est une lipase de Mucor miehel commercialisée sous la dénomination NOVOZYME 435 par la Société Novo Nordisk. L'enzyme utilisé peut être séparé en fin de réaction et, éventuellement, réutilisé. Un enzyme immobilisé permet plus facilement une séparation et une réutilisation. Après réaction d'interestérification, les acides gras libres sont séparés par lavages en phase aqueuse à pH basique. Les triglycérides formés ne passent pas en phase aqueuse et peuvent ensuite être repris par un solvant. Par évaporation, on obtient le mélange concentré désiré renfermant entre 50 et 70 w d'acides gras polyinsaturés. La détermination de la position des acides gras polyinsaturés sur les triglycérides permet d'effectuer le choix entre les deux variantes de procédé : position 1,3 - > procédé A position SN.2 o procédé B L'invention a encore pour objet des concentrés d'acides gras polyinsaturés, riches ou enrichis en acide eicosapentaenoîque et en acide docosahexaenoique, obtenus par le procédé selon l'invention. Elle a encore pour objet, des triglycérides enrichis en acide eicosapentaenoique et en acide docosahexaenoique obtenus par le procédé d'interestérification selon l'invention. Elle a aussi pour objet les huiles de poissons et notamment les huiles de sardines enrichies ou concentrées en EPA et en DHA obtenues selon le procédé de l'invention. Il va de soi que le procédé de l'invention peut comporter de nombreuses variantes pour s'adapter aux diverses modalités particulières rendues nécessaires par la variabilité de l'huile de poisson dans sa teneur en acides gras et dans les rapports triglycérides d'acides gras polyinsaturés et triglycérides d'acides gras saturés, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. Exemple Saponification . les triglycérides sont saponifiés à partir d'une huile de préférence riche en AGHI. La réaction s'effectue en milieu éthanolique basique, par exemple 1 volume d'huile de sardine pour 1 volume du mélange de saponification (1/3 d'eau à 20 % de soude, 2/3 éthanol à 99 %) porté à chaud (700C) pendant environ 30 mn sous atmosphère inerte. Suite à des étapes successives de lavage à pH acide (faisant passer les acides gras sous la forme R-COOH), les acides sont récupérés par séparation de phases. Fractionnement à l'urée l'méthanol est saturé à l'urée. Cette saturation permet de se libérer des problèmes de température de fractionnement. Les rapports d'épuisement sont 1 volume d'huile/2 volumes d'urée/ 6 à 8 volumes d'éthanol La phase enrichie atteint des valeurs voisines de 85 % d'AGHI par rapport aux acides gras totaux. C'est ainsi qu'en partant d'une huile de poisson à 20 % d'AGHI, on a pu obtenir une fraction contenant 70 à 75 z d'EPA+DHA par rapport aux acides gras totaux. Les rendements en AGHI obtenus par ce procédé sont proches de 85 %. Résultats de 1 l'hydrolyse enzymatique . le positionnement préférentiel des AGHI sur le squelette glycérique est le DHA préférentiellement en position ss à environ 60 % l'EPA répartition quasi uniforme en a, ss. Le résultat du criblage des enzymes testées figure dans le tableau ci-après. Dans ces premières données, il n'a pas été observé d'hydrolyse qui enrichisse la fraction d'acides gras libres en EPA et/ou DHA. On note par contre une augmentation en EPA ou DHA dans la fraction des monoacylglycérides. Les monoacylglycerides à teneur élevée en AGHI oméga 3, produits, peuvent constituer une voie de commercialisation possible. En effet, ils seraient plus facilement absorbés au niveau de la paroi intestinale comparativement aux triglycérides. Par ailleurs, les AGHI sont préférables sous leur forme de monoacylglycérides à leur forme libre très oxydable. Suivant sa spécificité, la lipase hydrolyse le triglycéride soit en fonction des positions sur le glycéride soit en fonction de l'encombrement stérique des acides gras. Ainsi, le choix de la lipase appliquée sur une huile dont la répartition des acides gras sur le squelette glycérique est connue, permet d'influer sur la balance EPA/DHA, en fonction de l'application visée. Les acides gras produits par l'hydrolyse sont éliminés par lavage à l'eau basique. Suivant ce procédé, aucun solvant n'est utilisé. Résultats : Criblage de l'activité des lipases sur de l'huile de sardine Répartition Bilan matière en après hydrolyse AGPI Balance EPA+DHA pour Enzyme utilisée (% de la masse) EPA+DHA DHA/EPA 100g d'huile T=100-%TG % en g en % Huile avant AG libres hydrolyse = 0,28 20 1 20 20 Lipase TG 34,1 (T=65) 19,6 1,1 6,7 38,2 pancréatique de AG 31,7 5,5 0,84 1,74 9,9 porc DAG 20,2 25,3 1,0 5,1 29,3 MAG 13,9 28,4 2,0 3,9 22,6 Lipase de germe de blé T = 0 Lipase de AG 67,7 (T=100) 10,3 1,6 7 34,4 Pseudomonas DAG 6,1 25,3 0,99 1,54 7,7 fluorescens MAG 26,2 44 1,1 11,5 57,6 Lipase de TG 23,4 (T=77) 21,9 1 5,1 34,4 Penicillium AG 37,3 7,8 0,75 2,9 16 roqueforti DAG 32,4 25 1 8,1 44,8 MAG 6,9 28,2 1,68 1,9 10,7 Lipase de TG 64 (T=36) 20,9 1,2 13,4 34,4 Candida AG 16,8 3,8 1,1 0,64 3,4 cylindracea DAG 17,8 24,4 1,4 4,3 23 MAG 1,5 31,7 1,3 0,47 2,5 Lipase de AG 68,1 (T=100) 10,1 0,48 6,9 35,7 Rhizopus DAG 10,4 28,4 3,1 3,0 15,3 delemar MAG 21,4 44,2 3,3 9,5 48,9 Lipase AG 73,3 (T=100) 12,8 0,73 9,4 34,4 de Mucor DAG 4,5 21,2 2,2 0,95 4,9 javanicus MAG 22,2 40,7 4,1 9 46,6 Lipase de AG 77,7 (T=100) 9,4 0,6 7,3 34,4 Mucor miehel DAG 6,5 38,3 2,7 2,5 14,7 MAG 15,7 45,1 4 7,1 42 Lipase de Rhizopusarrhizus T = 0 Contrôle T = 0 Résultats après hydrolyse et extraction des MAG+DAG Enzyme Rdt répartition balance de la masse DEA/XPA EPA+DBA EPA DIL Pseudomonas DAG 19 0,99 25,3 fluorescens MAG 81 1,1 44 Total 32,3 1,8 40,37 19,4 21 Rhizopus DAM 33 3,1 28,4 delemar MAC 67 3,3 44,2 Total 31.8 3,23 39,3 9.3 30 Mucor DAG 16,8 2,2 21,2 javanicus MAG 83,1 4,1 40,7 Total 26,7 3,78 37,3 7,8 29,5 Mucor DAG 30 2,7 38,3 miehei MAG 70 4 45,1 Total 22,2 3,62 43,2 9,35 33,9 Greffage enzymatique : Exemple d'estérification des AGHI sur du glycérol naturel : enzyme utilisé :Novozyme 435 15 heures à 450C élimination des acides gras libres n'ayant pas réagi par lavage basique 72% de triglycérides. Triglycérides + diglycérides = 98 w DHA/EPA = 0,65 EPA+DHA = 68 w AGHI = 83 % A la vue de ces trois voies et en se rapportant aux résultats d'hydrolyse de différentes enzymes, la première voie, c'est-àdire l'hydrolyse suivie d'un greffage paraît la plus appropriée car elle offre une plus grande souplesse dans la modulation du rapport DHA/EPA. Par ailleurs, les produits d'hydrolyse, représentés de façon majoritaire par des monoacylglycérides sont susceptibles d'être commercialisables. Ainsi, suivant la lipase utilisée, on peut obtenir un mélange de mono et diacylglycérides avec soit une balance DHA/EPA de 1,1 avec la lipase de Pseudomonas fluorescens ou bien de 4 avec la lipase de Mucor miehel. Un greffage de ces mono et diacylglycérides avec des AGHI purifiés à une balance DHA/EPA connue, à l'aide d'un enzyme non spécifique (par exemple la Novozyme 435 de la société Novo Nordisk Bioindustries (U.K) permet d'obtenir des triglycérides riches en AGHI. On peut remarquer que l'on peut produire facilement des monoacylglycérides riches en AGHI par un greffage enzymatique d'AGHI purifiés sur du glycérol naturel. Une autre voie possible, celle d'une hydrolyse incomplète avec transestérification simultanée peut permettre d'aboutir à une augmentation des AGHI sur les triglycérides (Y.Shimada et al, 1994). REVENDICATIONS 1. Un procédé d'obtention de concentrés d'acides gras polyinsaturés par voie enzymatique qui consiste à soumettre une huile de poisson contenant de l'acide docosahexaénoique (DHA) et de l'acide eicosapentaenoique (EPA) à une hydrolyse enzymatique sélective en position 1,3 ou en 2 pour obtenir un mélange d'acides gras libres, de monoglycérides et de diglycérides, à séparer les constituants de ce mélange, à recueillir les acides gras libres que l'on purifie par cristallisation à l'urée pour augmenter la teneur en EPA et en DHA, à décomplexer les acides gras isolés, puis à effectuer une interestérification entre les acides libres concentrés en acides gras polyinsaturés et l'huile brute en présence d'une lipase spécifique de position, afin d'obtenir un mélange enrichi en triglycérides d'acides gras polyinsaturés que l'on sépare et que l'on débarrasse des acides gras libres. 2. Un procédé selon la revendication 1 dans lequel l'huile de poisson contenant du DHA et de l'EPA est l'huile de sardines obtenue par pression des sardines pêchées dans les mers froides. 3. Un procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel on soumet l'huile de poisson à un traitement enzymatique qui libère non sélectivement tous les acides gras présents et que l'on isole séparement les acides gras polyinsaturés. 4. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le traitement enzymatique fournit un mélange de monoglycérides, de diglycérides et d'acides gras libres. 5. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel les acides gras libres libérés sont constitués principalement d'acides gras polyinsaturés. 6. Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 5 dans lequel on concentre les acides gras libres polyinsaturés par cristallisation avec de l'urée, à froid et en milieu éthanolique. 7. Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 6, dans lequel le mélange concentré d'acides gras polyinsaturés est interestérifié avec un triglycéride dont la position 2 est occupée par un acide gras polyinsaturé en présence d'une lipase-1,3 spécifique pour obtenir un triglycéride dont au moins deux hydroxyles sont estérifiés par un acide gras polyinsaturé. 8. Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 6, dans lequel le mélange concentré d'acides gras polyinsaturés est mis à réagir avec le glycérol en présence d'une lipase non spécifique pour obtenir un diglycéride dont deux fonctions alcool sont estérifiées par un acide gras polyinsaturé. 9. Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 6, dans lequel on hydrolyse un triglycéride d'huile de poisson dont une position est estérifiée par un acide gras polyinsaturé, par un enzyme non spécifique, pour obtenir un mélange d'acides gras polyinsaturé libres, de monoglycérides et de diglycérides, on fractionne ce mélange et on purifie les acides gras libres par cristallisation au froid en présence d'urée pour augmenter la teneur en EPA et en DHA, soumet le mélange concentré à une interestérification avec un triglycéride dont au moins une position est occupée par un acide polyinsaturé en présence d'une lipase spécifique de la position 2 pour obtenir un triglycéride à haute teneur en acide gras polyinsaturé. 10.Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 6, dans lequel on soumet un triglycéride d'huile de poisson dont une des fonctions hydroxyle est estérifiée par un acide gras polyinsaturé en présence de lipase spécifique 1,3 pour obtenir un mélange d'acide gras polyinsaturé de mono- et de diglycérides que l'on fait réagir avec un triglycéride dont seule la position 2 se trouve bloquée par un acide gras polyinsaturé en présence d'une lipase 1,3 spécifique pour former un triglycéride dont au moins deux fonctions alcool sont estérifiées par un groupe acyle dérivé d'un acide gras polyinsaturé. ll.Un procédé selon au moins l'une des revendications 1 à 10, dans lequel l'enzyme non spécifique est choisi parmi une lipase de Pseudomonas fluorescens, une lipase de Mucor javanicus et une lipase de Mucor miehei. 12.Un procédé selon au moins une des revendications 1 à 10, dans lequel l'enzyme spécifique est une lipase de Mucor michei, notamment celle commercialisée sous la dénomination Novozyme 435 par la Société Novo Nordisk 13.Un mélange concentré d'acides gras polyinsaturés contenant 70 % environ d'acide docosahexaenoîque et d'acide eicosapentaenoîque. 14.Un mélange concentré d'acides gras selon la revendication 13, dans lequel le rapport EPA/DHA est de l'ordre de 1. 15.Une huile de sardines enrichie en EPA et en DHA dont la teneur varie entre 30 et 60 % obtenue par le procédé de la revendication 1.