FR 2734838 A1 19961206 FR 9506466 A 19950531 La présente invention concerne le clonage d'un gène impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) dans les plantes. Plus particulièrement, la présente invention concerne un fragment d'acide nucléique isolé codant pour une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA. L'acide abscisique (ABA) est considéré comme une "hormone de stress" végétale parce qu'il est accumulé lorsque les plantes sont soumises à des stress divers tels que sols salins, faibles températures, gel et sécheresse. L'ABA induit des réponses au niveau de la plante hôte qui augmentent la tolérance au stress. La teneur en eau des tissus végétaux et le fonctionnement des stomates sont régulées par l'ABA (Tal et Nevo, 1973). L'ABA commande également les aspects de dormance et de germination des graines (Koornneef et al., 1982, 1989), et favorise une embryogenèse normale et une formation de protéines stockées dans les graines (se reporter à Kermode, 1990) . Malgré son importance capitale pour les plantes, la physiologie de l'ABA est encore mal comprise. La majorité des informations concernant la physiologie de l'ABA et son rôle a été fournie par l'analyse de mutants affectés dans la synthèse ou dans la réponse induite par l'ABA (Zeevaart et Creelman, 1988). Les données moléculaires obtenues jusqu'ici concernent seulement des gènes impliqués dans le signal de transduction de l'ABA. Des mutants au niveau du locus vivinarous-l du maïs () présentent une sensibilité réduite à l'ABA (Robichaud et al., 1980). Le gène vl, cloné par étiquetage par un transposon (McCarty et al., 1989), code pour un activateur transcriptionnel VP1.Les mutants d'Arabidopsis insensibles à l'ABA (abi) ont été sélectionnés grâce à leur capacité à germer sur de fortes concentrations d'ABA (Koornneef et al., 1984). Les gènes abil et abi3 ont été isolés par un clonage positionnel encore appelé méthode de marche sur le chromosome (Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994; Giraudat et al., 1992). Le gène abil code pour une phosphatase régulée par le calcium, alors qu'abi3 code pour une protéine homologue à VP1 . Des études biochimiques de mutants déficients en ABA ont permis l'élucidation de la voie de biosynthèse de l'ABA. La biosynthèse de 1'ABA chez les plantes supérieures se réalise via une voie de synthèse C40, dénommée "indirecte", voie de synthèse qui dérive des caroténoïdes (Zeevaart et Creelman, 1988; Gage et al., 1989). Une preuve récente indique que le précurseur de type xanthophylle de 1'AXA est la 9'-cis-néoxanthine, qui est formée à partir de la trans-violaxanthine (Li et Walton, 1989; Parry et al., 1990). Des mutants présentant des taux d'ABA réduits ont été sélectionnés sur la base de leur dormance de graine réduite ou de leur phénotype de flétrissement.Les mutants viviparous du maïs vD-2. vD-5, vp-7 et vp-9 sont déficients en ABA et sont bloqués de manière simultanée dans les stades précoces de la biosynthèse des caroténoïdes. En conséquence, ils présentent un photo-blanchiment, dû au manque de protection des appareils photosynthétiques par les caroténoïdes (Moore et Smith, 1985; Neil et al., 1986). Le mutant aba d'Arabidopsis thaliana présente une déficience au niveau de l'époxydation de la zéaxanthine (Duckham et al., 1991; Rock et Zeevaart, 1991) qui est considérée comme la première étape de la biosynthèse de l'ABA (Taylor, 1991).Plusieurs mutants isolés chez la tomate (flacca et sitiens), la pomme de terre (droopv), I'orge (nar2a) ou chez Nicotiana Dlumbaginifolia (abal) présentent une déficience au niveau de la dernière étape de la voie de synthèse (pour revue voir Taylor, 1991): I'oxydation de l'aldéhyde-ABA en ABA (Linforth et al., 1987). Finalement, le mutant wiltv du pois (Duckham et al., 1989) et le mutant notabilis de la tomate (Taylor et al., 1988) sont probablement affectés dans une des autres étapes de la voie de biosynthèse (Taylor, 1991). Malgré un progrès considérable dans l'élucidation des étapes biochimiques de la voie de biosynthèse de l'ABA, aucun gène de cette voie de synthèse n'a pu être cloné jusqu'à maintenant. Le but de la présente invention est l'isolement d'un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA. Compte-tenu du rôle physiologique de l'ABA au niveau du développement, de la tolérance des plantes au stress, de la dormance ou de la maturation des graines, un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA peut être utilisé pour contrôler ou modifier la synthèse de l'ABA dans des plantes transgéniques. Comme la productivité des plantes est fortement affectée par les stress environnementaux, l'amélioration génétique d'une tolérance au stress est une des tâches les plus importantes en agriculture. Une surproduction d'ABA, à l'aide d'un promoteur inductible, peut accélérer la réponse d'une plante vis-àvis d'un stress environnemental. Par exemple, la transformation de certaines plantes tropicales avec un gène de la biosynthèse de l'ABA sous la commande d'un promoteur pouvant être induit par le froid peut aboutir à une meilleure adaptation à des climats froids. Une autre application importante de la modification génétique de la biosynthèse de l'ABA est la création de plantes transgéniques ayant une dormance de graine réduite par diminution des niveaux en ABA dans les graines matures.Ceci peut être réalisé par l'introduction d'un gène anti-sens de la biosynthèse de 1 'ABA, sous la commande d'un promoteur spécifique aux graines. Dans cette stratégie, il est essentiel d'assurer un stockage protéique et lipidique correct dans les graines, pour garantir un bon développement des futures plantes. La présente invention fournit pour la première fois l'isolement et la caractérisation moléculaire d'un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA. Un nouveau mutant déficient en ABA (appelé aba2) a été isolé par une mutagenèse d'insertion induite par un élément transposable Ac dans Nicotiana plumbazinifolia. L'intérêt essentiel de ce mutant est que le gène de la voie de biosynthèse de l'ABA y est étiqueté car la mutation, cause de déficience en ABA est dûe à l'insertion de l'élément Ac. L'analyse de l'ADNc correspondant indique que celui-ci code pour une époxydase de la zéaxanthine. Cette époxydase est originale et le contrôle de son expression est déterminant car elle catalyse vraisemblablement les deux premières étapes de la biosynthèse de 1 'ABA. Les expériences d'étiquetage de gène, à l'aide de mutation par insertion d'éléments transposables, quelle que soit l'espèce, sont totalement aléatoires et peuvent prendre plusieurs années. En effet, il faut obtenir des transformants primaires (2 à 6 mois selon les espèces), puis obtenir leurs descendants jusqu'à la quatrième génération pour obtenir éventuellement un mutant et le caractériser génétiquement. Le temps de génération varie selon les espèces de 6 semaines chez Arabidonsis à 4 mois chez Nicotiana plumbaginifolia. Par ailleurs, ces expériences doivent être menées sur une grande quantité de plantes pour espérer isoler un mutant donné. Le génome d'Arabidopsis est estimé à 100 Mégabases, celui de N. plumbaginifolia est estimé à 1000 Mégabases. La séquence transcrite du gène isolé mesure environ 2 Kilo bases. Les insertions dans les introns ne donnent en général pas de mutation détectable. On peut donc estimer qu'il serait nécessaire de tester la descendance d'environ 50 000 plantes pour Arabidopsis et 500 000 plantes chez N. plumbaginifolia, ayant subi un événement de transposition. Ceci représente un travail et une surface de serre impossibles à réaliser de façon systématique. Il était connu un mutant d'Arabidopsis thaliana déficient en ABA mais le gène n'était pas étiqueté de sorte qu'il n'avait jamais pu être isolé. La méthode dite de clonage positionnel ou encore de marche sur le chromosome ne pouvait permettre d'isoler de façon évidente un tel gène à partir du mutant de biosynthèse de l'ABA chez cette espèce. La marche sur le chromosome nécessite en effet, de disposer de marqueurs (RAPD, AFLP...) à proximité (environ 200 Kilobases) du gène à cloner et d'une banque de YACS ou de cosmides. Une fois le gène localisé sur un cosmide ou un YAC, il s'agit de transformer le mutant avec des fragments de ce clone jusqu'à trouver le gène correspondant. L'ensemble de ces expériences nécessite plusieurs années de travail. Seulement quelques gènes ont été clonés par cette technique à ce jour, alors que plusieurs centaines de mutants ont été identifiés chez Arabidopsis. C'est pourquoi, bien que le mutant déficient en acide abscissique ait été isolé en 1982 chez Arabidopsis le gène correspondant n'a toujours pas été cloné par cette technique. La présente invention a donc pour objet un fragment d'acide nucléique isolé codant pour un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) chez les plantes. Plus particulièrement, I'enzyme est une époxydase impliquée dans les deux premières étapes de la voie de biosynthèse de l'ABA. Plus particulièrement encore, l'enzyme présente une activité d'époxydation de la zéaxanthine. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique isolé, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquence N 1, ou tout ou partie d'une séquence homologue à celle montrée dans l'identificateur de séquence N" 1, ou tout ou partie d'une séquence complémentaire de ladite séquence de l'identificateur de séquence N" 1 ou d'une séquence homologue. Par "fragment d'acide nucléique", on entend ici un polymère de nucléotides pouvant être de type ADN ou ARN. Ces termes sont définis dans tous les ouvrages de base de biologie moléculaire. Préférentiellement, un fragment d'acide nucléique selon l'invention est un fragment d'ADN double brin. Le terme partie" désigne un fragment comportant une portion d'au moins 500 de préférence au moins 1000 nucléotides identiques à une portion d'une longueur équivalente de la séquence nucléotidique indiquée dans l'identificateur de séquence (IDS N" 1) ou de son complémentaire. Le terme homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant une ou plusieurs modification(s) de séquence par rapport à tout ou partie de la séquence montrée dans L'IDES N" 1, et codant pour un enzyme ayant l'activité mentionnée ci-dessus. Ces modifications peuvent être obtenues par mutations, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotide(s) par rapport à la séquence native. Elles peuvent être introduites notamment pour améliorer l'activité de l'enzyme. Dans ce contexte, on préférera un degré d'homologie de 70 % par rapport à la séquence native, avantageusement de 80 % et, de préférence, de 90 %. L'homme du métier sait où effectuer les modifications afin de ne pas altérer de manière drastique la fonction de l'enzyme et connait également les techniques permettant d'évaluer si l'homologue généré a l'activité enzymatique, par exemple par insertion en amont d'un gène reporter dont l'expression est facilement détectable (Bgalactosidase, cathéchol-oxygénase, luciférase ou encore un gène conférant la résistance à un antibiotique).Mais tout autre technique conventionnelle peut également être employée. La séquence de L'IDES N" 1 est une séquence isolée du mutant aba2 décrit ci-après. Il s'agit de la séquence d'ADNc c'est-à-dire dépourvue des introns. De préférence, le fragment selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nucléotide n" 41 à 2029, de 1'IDS/41 N"1, ou son complémentaire, ou d'une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence homologue. De façon avantageuse, le fragment selon l'invention comporte en outre la séquence leader allant du nucléotide n" 1 à 40 de L'IDES N" 1. De même, le fragment selon l'invention comporte de façon avantageuse, la séquence de terminaison allant du nucléotide 2030 à 2400 de L'IDES N" 1. De façon classique, il comporte ladite séquence de terminaison augmentée d'une queue poly A à son extrémité 3'. Selon une variante encore préférée, le fragment selon l'invention comprend la séquence complète de 2400 nucléotides telle que montrée sur 1'IDS N" 1, une séquence homologue, une séquence complémentaire, ou une séquence homologue à ladite séquence complémentaire. L'invention inclut également toute séquence capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une de ces séquences et codant pour une même activité enzymatique impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA, notamment dans les deux premières étapes. La présente invention a pour objet un vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il comporte un fragment d'acide nucléique selon la présente invention. Dans un mode de réalisation, un vecteur de clonage comporte une séquence codante complète de 2400 nucléotides telle que représentée dans L'IDES N" 1. Il doit être bien entendu que l'invention a également pour objet toute séquence d'ADN équivalente, c'est-à-dire qui diffère des séquences mentionnées ci-dessus seulement par une ou plusieurs mutations neutres, c'est-à-dire dont le changement ou la substitution de nucléotides en cause n'affecte pas la séquence primaire de la protéine résultante. A titre de vecteur de clonage comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus etc. On utilisera de préférence toutefois, des plasmides. De préférence le fragment d'ADN selon l'invention sera associé à une séquence régulatrice appropriée pour sa transcription et sa traduction (ci-après régulon) tels que des promoteurs, y compris des codons start et stop, des "enhancer", des opérateurs. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces promoteurs sont bien connus de l'homme du métier. Les fragments d'ADN selon l'invention peuvent être introduits dans des cellules de plantes selon des mécanismes connus tels que par l'intermédiaire du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens, ou par transferts directs de gènes tels que par la méthode d'électroporation. On pourra utiliser avantageusement dans ce cas, mais non obligatoirement, le régulon constitutif du gène correspondant. Alternativement, les fragments d'ADN selon l'invention peuvent être utilisés pour transformer des micro organismes ou des cellules eukaryotiques pour cloner et produire l'enzyme Epoxydase correspondant. La présente invention permet enfin d'améliorer la résistance au stress des plantes, en introduisant dans les cellules desdites plantes un fragment d'ADN codant selon l'invention, dans des conditions permettant sa réplication et son expression. Les procédés de génie génétique qui permettent de bloquer l'expression d'un gène dans une plante, sont connus. Ainsi, I'expression du gène peut être bloquée par hybridation de l'ARNm transcrit par ledit gène avec un fragment d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par l'un desdits gènes. Ledit fragment d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par l'un desdits gènes peut être introduit tel quel dans les cellules de plantes à transformer ou sous forme d'un fragment d'ADN placé sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, de sorte que la transcription dudit fragment d'ADN fournisse une séquence d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par le gène. On peut introduire dans les cellules d'une plante, un plasmide contenant un fragment d'ADN exogène placé sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, de sorte que la transcription dudit fragment d'ADN fournisse une séquence d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm endogène transcrit par le gène. On peut aussi se contenter d'agir sur la régulation du gène endogène de l'enzyme en modifiant les gènes de régulation qui contribuent à son expression de manière à ce qu'ils induisent un blocage de l'expression de l'enzyme endogène du fait de ces modifications. De façon appropriée, ledit fragment d'ADN exogène code pour une séquence d'ARN complémentaire d'une partie de l'ARNm transcrit par le gène comportant le site de liaison au ribosome et/ou le site d'initiation de la traduction. Le gène exogène est en général un gène hétérologue, c'est-à-dire qui provient d'une plante, d'une espèce différente de la cellule hôte, le gène codant pour l'enzyme ordinairement non produit par la plante dans le génome de laquelle il est introduit. Le gène exogène introduit dans le génome de la plante peut aussi être un gène homologue au gène endogène, c'est-à-dire dont l'expression produit l'enzyme ordinairement produite par la plante. De façon appropriée, ledit fragment d'ADN exogène code pour une séquence d'ARN complémentaire de plus de 80 % de l'ARNm par l'un des gènes précités. Ledit fragment d'ADN exogène peut être un fragment d'un des gènes fonctionnels codant pour une enzyme précitée, ce fragment étant placé en sens inverse du gène endogène par rapport au promoteur, de sorte que la transcription dudit fragment de gène inversé se produit dans un sens inverse au sens de transcription du gène pour s'hybrider à l'ARNm endogène dudit gène et en bloquer l'expression. On entend par "gène fonctionnel codant pour l'enzyme une séquence d'ADN qui peut donc être plus courte ou plus longue que la séquence codante totale, du gène complet de l'enzyme. En particulier, le "gène fonctionnel" pourra correspondre à une séquence codante dépourvue des introns. On peut aussi pour introduire un fragment d'ARNm ou d'ADN dans la plante, mettre en oeuvre tout d'abord les méthodes de transfert direct de gènes connues de l'homme de l'art, telles que la micro-injection directe dans des cellules d'embryon ou encore la précipitation directe au moyen de EPG ou le bombardement par canon de particules ou par infection avec une souche bactérienne dans laquelle le fragment d'acides nucléiques a été introduit. On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne, notamment d'Agrobacterium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et van Montagu, 1983) ou d'Anrobacterium rhizogenes, notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation (Chilton et al., 1982). La souche bactérienne comportera ledit fragment d'ADN codant pour l'enzyme sous le contrôle d'éléments assurant la transcription en ARNm dudit gène. La souche pourra être transformée par un vecteur dans lequel est inséré le gène codant l'enzyme sous le contrôle d'éléments assurant la transcription dudit gène. Ce gène sera inséré par exemple dans un vecteur binaire tel que pBINIl9 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et Klee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides T1 et Ri.Il pourra aussi être utilement introduit par recombination homologue dans un plasmide T1 ou Ri désarmé, tel que pGV 3850 (Zambryski et al., 1983) avant la transformation de la plante. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures dans lesquelles La figure 1 représente l'effet de la dessiccation sur le poids de feuilles détachées de type sauvage et du mutant AA67 (aba2) de Nicotiana Plumbaginifolia. Les feuilles ont été récoltées, séchées doucement sur un papier de type absorbant et pesées toutes les 5 min. dans l'atmosphère desséchante d'une hotte à flux laminaire. La moyenne et l'erreur standard de six expériences indépendantes sont indiquées. La figure 2 représente le profil en caroténoïdes de feuilles de type sauvage et du mutant AA67 (aba2). La figure 3 représente le schéma de biosynthèse de 1'ABA à partir de la zéaxanthine. Adaptée à partir de la voie de synthèse proposée par Li et Walton (1990) et Parry et al. (1990). La figure 4 représente l'analyse de Southern de l'ADN de la descendance mutante et sauvage de la plante mutante AA67 (aba 2), portant un élément trAc. L'ADN digéré par EcoRI a été hybridé à la sonde A (sur le bord 5' de Ac ). Ro indique le transformant primaire; R1, la plante AA67 parentale; M1 à M3, la descendance mutante R2; N1 à N5, les plantes R2 ayant un phénotype sauvage; p indique la proportion de mutants dans la descendance de chaque plante. La figure 5 représente la carte de restriction partielle du locus muté par l'insertion de Ac. Les positions des sondes correspondant à Ac et à l'ADN adjacent sont indiquées par des barres A, B et C. La figure 6 représente l'analyse de northern de l'ARN de feuilles de type sauvage et du mutant aba2 hybridé avec la sonde C (figure 3B) et avec la sonde BATPase. La figure 7 représente l'analyse de Southern de l'ADN de plantes révertantes dans la descendance d'une plante mutante homozygote. La digestion a été réalisée par EcoRV et l'hybridation avec la sonde C (figure 5). Les pistes sont les suivantes : WT, type sauvage; R1, plante AA67 parentale; R2, une plante R2 hétérozygote; lignes 1 à 5 sont les plantes révertantes de la descendance R3 d'une plante mutante R2 homozygote; M4 et M5, deux plantes mutantes R2 homozygotes. La figure 8 représente la séquence de l'ADNc complet avec la séquence d'acides aminés déduite pour le plus grand ORF démarrant par une méthionine. Le premier codon d'initiation et le codon stop sont indiqués en caractères gras. La séquence de 8 pb dupliquée dans le locus génomique après l'insertion de Ac est encadrée. La figure 9 représente les trois domaines d'homologie significative de la protéine sont représentés. Le motif de liaison à l'ADP (a), le motif central de fonction inconnue (b) et le motif de liaison au FAD (c). Les positions des acides aminés sont indiquées entre parenthèses. Abréviations: (-) n'importe quel résidu; (w) Y, W, F (acides aminés ayant un groupe aromatique); (x) K, R, H, S, T, Q N (acides aminés basiques ou hydrophiles); (y) A, I, L, V, M, C (acides aminés petits et hydrophobes); (z) D, E (acides aminés acides); (&num;) inégalités de la séquence de l'époxydase; (Epox.) époxydase supposée de la zéaxanthine de Nicotiana plumbaginifolia. La Figure 10 représente les études d'import dans les chloroplastes des produits de traduction du cDNA. La piste 1 est chargée des marqueurs de poids moléculaire, T est chargé avec un microlitre de mélange de traduction, C est chargé avec la réaction d'import (correspondant à 1/4 du total de la réaction de l'import), P est chargé avec la réaction de l'import après traitement protéasique (correspondant à 1/4 de la réaction de l'import). Les abréviations suivantes sont utilisées ci-après "ABA" pour acide abscissique ; "ABA-GE" pour ester de l'ABA-glucose; "pb" pour paires de bases; "DW" pour poids sec; "FW" pour poids frais ; "HPLC" pour chromatographie liquide haute-pression ; "nt" pour nucléotide (s) ; "ORF" pour cadre de lecture ouvert. 1. Isolement d'un mutant déficient en ABA dans une lignée de Nicotiana olumbazinifolia portant un élément transposable Ac L'élément transposable du maïs Ac inséré dans la séquence d'un marqueur de résistance à la kanamycine (Baker et al., 1987) a été introduit via une transformation par Agrobacterium dans N. olumbaninifolia. donnant naissance à des transformants primaires Ro (Marion-Poll et al., 1993). 1.1. Matériel et méthode Des plantes transgéniques de Nicotiana plumbaginifolia cv. viviani ont été obtenues par transformation avec la construction pGV 3850 Hygro:pKU 3Ti (Baker et al., 1987) et caractérisées comme précédemment décrit (Marion-Poll et al., 1993). Le criblage des phénotypes mutants a été réalisé en utilisant des graines stérilisées en surface, étalées sur un milieu BNO3 (Gabard et al., 1987). Pour favoriser une germination uniforme, les graines ont été placées pendant 10 à 20 jours dans une chambre de germination ayant une différence importante au niveau des températures jour/nuit (25"/17"C) et des jours courts (8 h/16 h). Les boîtes contenant de jeunes plantules ont été transférées dans une chambre de croissance (16 h de jour/8 h de nuit et 25"C) pour permettre une croissance plus rapide. Des plantules âgées de 6 semaines ont été transférées en sol.Les plantules du mutant aba2 ont été incapables de croitre dans des conditions de serre standards et ont été mises à pousser sous un film de plastique dans la serre (avec une atmosphère saturée en eau) ou dans une chambre de croissance (90 % d'humidité relative, 16 h de jour/8 h de nuit et de 25"/17"C). Toutes les analyses moléculaires et biochimiques ont été réalisées sur des feuilles non-stressées récoltées avant la période de floraison. Le protocole de stress hydrique utilisé a été décrit par Parry et al., (1991). 1.2. Résultats La transposition de Ac a été contrôlée dans la descendance (R1) des transformants primaires en utilisant le marqueur d'excision de la résistance à la kanamycine. Ceci a permis la sélection de 1000 plantes R1 résistantes à la kanamycine qui ont été cultivées jusqu'à maturité, et dont la descendance a été mise à germer in vitro. L'une d'entre elles (AA67) a montré une ségrégation pour un phénotype de germination précoce. Des graines du mutant AA67 fraichement récoltées ont germé en 4 à 7 jours, alors que les graines de type sauvage ont nécessité 10 à 15 jours. Ce phénotype présentait une ségrégation de type mendélien caractéristique d'une mutation récessive et monogénique. Les jeunes plantules mutantes étaient extrêmement sensibles au stress hydrique probablement parce qu'elles n'assuraient pas la fermeture de leurs stomates. Les feuilles mutantes ont perdu 48% de leur poids frais (FW) en 60 min dans un courant d'air alors que pendant la même période, les feuilles de type sauvage ont perdu seulement 11% de FW (figure 1). Ceci a imposé de mettre les plantes à pousser dans 90 à 100 % d'humidité relative.Les jeunes plantes mutantes traitées par une pulvérisation journalière d'ABA à 40 zM pendant deux semaines ont récupéré la vitesse de transpiration du type sauvage lorsque des feuilles détachées ont été testées (données non-présentées). Le greffage de plantes mutantes sur des tiges de tabac de type sauvage a également permis la restauration du phénotype sauvage. Le mutant AA67 a été croisé avec le mutant aba 1, précédemment isolé chez N. plumbaginifolia (Bitoun et al, 1989, Rousselin et al., 1992). La complémentation entre ces deux mutants a montré qu'ils étaient mutés sur des gènes différents. En conséquence, le mutant AA67 a été appelé aba2. 2. Relation entre la mutation aba2 et l'insertion de l'élément Ac 2.1. Matériel et méthode 2.1.1. Analyse de Southern L'ADN génomique a été extrait à partir de 2 g de matériel foliaire comme décrit par Dellaporta et al. (1983), et purifié sur un gradient de chlorure de césium. Dix Fg d'ADN ont été digérés par les enzymes de restriction appropriées, séparés sur des gels d'agarose à 0,8 % et transférés sur une membrane de nylon (Hybond-N, Amersham). L'hybridation des membranes a été réalisée dans des conditions stringentes en utilisant les sondes A (un fragment Accl-Hindlll de 0,7 kb de l'extrémité 5' d'Ac), B (un fragment Hindlll-Accl de 0,8 kb du bord 3' d'Ac) et C (une sonde d'lPCR décrite ci-dessous), comme représenté sur la figure 5. 2.1.2. Analyse de northern Les ARN totaux des feuilles ont été extraits selon Verwoerd et al. (1989) et 8Fg ont été chargés sur un gel d'agarose à 1,2 % contenant du formaldéhyde (Maniatis et al., 1982). Les hybridations ont été réalisées dans des conditions stringentes un utilisant la sonde C (figure 5) et le fragment d'ADNc EcoRI-Sall de 1,6 kb de la sous-unité ss, codée par le noyau, de l'ATPase mitochondriale provenant de N. plumbazinifolia (Boutry et Chua, 1985). 2.1.3. Réaction inverse de polymérisation en chaine (IPCR) L'amplification IPCR des séquences adjacentes à Ac a été réalisée comme décrit par Earp et al. (1990). Pour l'amplification des séquences adjacentes 5' et 3', l'ADN génomique a été digéré par Kpnl et ligaturé à l'aide de l'ADN ligase du phage T4. La réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides &num;2 (5'CGATAACGGTCGGTACGGGA-3') et &num;6 (5'- CCCGTTCGTTTTCGTTACCG3'). L'oligonucléotide &num;2 s'hybride à 44 pb situées en aval du bord 5' d'Ac. L'oligonucléotide &num;6 s'hybride à 115 pb situées en amont du bord 3' d'Ac.Les réactions de PCR ont utilisé les conditions suivantes: 30 cycles de dénaturation de 45 sec à 94"C, 30 sec d'hybridation à 60 C, 2 min d'extension à 72"C avec une extension finale unique de 10 min à 72"C. Le fragment de 2 kb amplifié a été cloné et partiellement séquencé par des processus classiques. Ce fragment a été utilisé comme sonde C (figure 5) pour s'hybrider à des transferts northern et Southern et pour cribler une banque d'ADNc. 2.2. Résultats 2.2.1. La mutation aba 2 est dûe à l'insertion de Ac. La mutation responsable de la déficience en ABA a co-ségrégé avec une nouvelle bande s'hybridant à Ac dans l'analyse de Southern de la descendance par autofécondation d'une plante R1 AA67. Les ADN provenant de la descendance mutante et sauvage ont été analysés par digestion par différentes enzymes et hybridés avec la sonde A (bord 5' de Ac). Après digestion EcoRI, le transformant primaire (Ro) a présenté une bande unique de 3 kb s'hybridant à Ac correspondant à la localisation d'Ac au sein de 1'ADN-T (figure 4). Dans la plante R 1 AA67, deux nouvelles insertions d'Ac (signaux d'hybridation à 4,5 et à 2,6 kb) ont été révélées par la même sonde.Comme visualisé sur la figure 4, la bande de 4,5 kb était présente dans chaque plante mutante R2 (M1 à M3) mais seulement dans certaines des plantes soeurs R2 présentant un phénotype sauvage (N1 à N5). La bande plus petite de 2,6 kb représentait une seconde insertion d'Ac, non-liée à la mutation responsable de la déficience en ABA. En tout, 26 plantes présentant un phénotype sauvage et 13 plantes mutantes ont été analysées. Toutes les plantes mutantes ont présenté la bande de 4,5 kb s'hybridant à Ac. Sur 26 plantes normales, 17 avaient la bande de 4,5 kb et présentaient une ségrégation, au niveau de leur descendance, dans laquelle une plante sur quatre avait le phénotype mutant. 8 autres plantes ne présentaient pas la bande de 4,5 kb et ont donné une descendance de type sauvage. Ces résultats sont en accord avec le rapport des hétérozygotes pour la mutation (deux-tiers) (66,6%) attendu au sein de plantes ayant un phénotype de type sauvage. Ces données ont suggéré que la mutation était liée à la bande trAc. Une des plantes à phénotype sauvage ne présentait pas la bande à 4.5 kb mais ségrégeait le phénotype mutant en descendance. La possibilité d'une excision d'Ac dans cette plante a été étudiée. 2.2.2. La mutation aba2 est instable. Le mutant hétérozygote ne présentant pas la bande de 4.5 kb pourrait être dû à un événement d'excision imprécise ne restaurant pas la fonctionnalité du gène. Un fragment Kpn I (figure 5) a été cloné et séquencé après amplification IPCR. Des oligonucléotides ont été synthétisés de chaque côté de l'insertion d'Ac. L'ADN correspondant a été amplifié et séquencé chez le sauvage et le mutant hétérozygote. Une empreinte d'excision de 7pb laissée par l'excision d'Ac est vraisemblablement responsable du phénotype. En effet, la séquence partielle du fragment Knp I indique que l'insertion d'Ac s'est produite dans une séquence codante. L'excision d'Ac a provoqué l'introduction d'un codon stop TGA en phase dans les 7pb additionnelles et le mutant stable a été appelé aba 2-sl. La descendance provenant d'une plante mutante, homozygote pour la bande de 4,5 kb s'hybridant à Ac a été mise à pousser et criblée pour l'apparition d'événements de réversions somatique et germinale, aboutissant à une vitesse de transpiration normale et à une survie dans des conditions de serre. La réversion de la mutation vers le type sauvage devrait être en corrélation avec la restauration d'un fragment d'ADN de la taille de celui du type sauvage. Cinq plantes révertantes (trouvées parmi approximativement 5000 graines) ont été analysées au niveau moléculaire (figure 7). Lorsqu'elles sont hybridées avec la sonde C, les transferts de Southern des plantes mutantes ont présenté un fragment EcoRV de 10 kb, s'hybridant également aux sondes d'Ac . Une bande EcoRV de 2,8 kb a été également révélée et correspond à un fragment génomique situé en aval du point d'insertion d'Ac (figure 5).Les plantes de type sauvage ont présenté une bande de 5,5 kb et la bande de 2,8 kb. Les révertants portaient le fragment EcoRV de 10 kb avec des quantités variables du fragment de 5,5 kb trouvé dans le type sauvage. Des niveaux variables de signaux suggèrent que les révertants sont des chimères, dans lesquelles seulement une partie des cellules a récupéré la potentialité à synthétiser l'ABA, complémentant ainsi les secteurs mutés et conférant un phénotype de type sauvage. Le profil à deux bandes trouvé dans les plantes révertantes était similaire à celui observé avec l'ADN provenant de plantes hétérozygotes R2 (ligne R2 sur la figure 7), alors que dans des plantes mutantes homozygotes, seule la bande s'hybridant à Ac était visible, ainsi que la bande de 2,8 kb, située en aval de l'insertion d'Ac (pistes M4 et M5 sur la figure 7).La descendance de certaines plantes révertantes a été semée et évaluée vis-à-vis d'un phénotype à germination précoce. Les révertants 1, 2 et 3 ont présenté une ségrégation de la descendance avec un taux de un quart de germination précoce, ainsi ils ont été considérés comme des événements d'excision d'Ac affectant les cellules L2 engendrant une descendance révertante. Le révertant 4 a donné une descendance homogène à germination précoce et il pourrait être considéré comme un révertant somatique. Pour deux de ces révertants, I'excision d'Ac a restauré exactement le profil du type sauvage (voir figure 8). 2.2.3. L'insertion d'Ac est dans une séquence codante. L'analyse de transfert northern réalisée sur 1'ARN total de feuilles de type sauvage et mutantes permet d'observer un transcrit unique de 2,5 kb dans les feuilles de type sauvage après hybridation avec la sonde C (figure 5), alors que chez les feuilles mutantes l'ARNm était long de 7,1 kb. Cette différence de 4,6 kb a suggéré la présence d'un élément Ac entier dans une séquence codante (figure 6). Ceci a été confirmé par le séquençage partiel du fragment d'lPCR (voir plus loin). Un témoin d'hybridation a été réalisé avec la sous-unité B, codée par le noyau, de l'ATPase mitochondriale de N. Dlumbaninifolia (Boutry et Chua, 1985). 3. Déficience du mutant aba2 pour l'époxidation de la zéaxanthine. Comme l'instabilité de la mutation aba2 pouvait donner naissance à des secteurs de réversion, les mesures d'ABA et de caroténoïdes ont été effectuées sur les feuilles du mutant aba2-sl. 3.1. Matériel et méthode 3.1.1. Analyse de 1'ABA L'analyse de l'ABA et de ses métabolites a été réalisée comme décrit par Julliard et al., (1993). Des échantillons de feuilles ont été immédiatement congelés dans l'azote liquide et lyophilisés avant d'être réduits en poudre. Une extraction dans du méthanol non-oxydatif/eau (80:20, v/v), une pré-purification et un fractionnement par chromatographie liquide haute-pression (HPLC) utilisant un gradient d'acide formique/méthanol 0,2 % (v/v) ont été réalisés comme décrit cidessus. Une quantification des molécules immunoréactives a été réalisée en utilisant un test d'immunosorbant lié à l'enzyme (ELISA).Ce test ELISA a été légèrement modifié, en utilisant un anticorps monoclonal anti-ABA disponible auprès de Phytoscience (Angers, France), marqué par la péroxydase conjuguée à un anticorps de chèvre dirigé contre des immunoglobulines de souris (Sigma). 3.1.2. Analyse des caroténoïdes Pour les mesures des chlorophylles et des caroténoïdes, des feuilles ont été congelées dans l'azote liquide et stockées à -80 C. Des échantillons de feuilles (100 mg de poids frais), ont été broyés dans un mortier avec de l'azote liquide et environ 5 mg de NaHCO3 et ensuite, ont été extraits par un solvant contenant un mélange d'acétone-méthanol-éther de pétrole (5030-20 %). Les extraits ont été centrifugés pendant 5 min à 12 000 g et le surnageant stocké dans de la glace. Le culot a été remis en suspension dans le solvant ci-dessus et centrifugé de nouveau. Ce processus a été répété jusqu'à ce que le surnageant soit incolore. Les surnageants finaux ont été passés à travers des filtres de 0,5 llm et ensuite évaporés. Les extraits secs ont été stockés à -20 C à l'obscurité sous argon. Les pigments de type caroténoïde ont été séparés par une HPLC non-aqueuse en phase inverse comme décrit par Gilmore et Yamamoto (1991). 3.2. Résultats 3.2.1. La teneur en ABA est réduite chez le mutant aba2-sl. Trois mesures indépendantes (chacune répétée cinq fois) de la teneur en ABA ont été effectuées sur des feuilles non stressées de 3 à 5 plantes. Les feuilles sauvages présentaient de 393 + 57 à 1263 + 36 pmol d'ABA par gramme de poids sec, et de 158 + 11 à 236 + 21 pmol (équivalent ABA) d'ABA-GE par gramme de poids sec. La teneur en ABA du mutant aba 2-s1 était comprise entre 23 et 48 % du sauvage, tandis que celle en AGA-GE était indétectable dans deux des expériences et de 139 pmol dans la troisième. 3.2.2. La composition en caroténoïdes est modifiée chez le mutant aba2-s 1. La possibilité que la lésion dans le mutant aba2 affecte la partie C40 de la voie de biosynthèse de l'ABA a été étudiée en analysant le contenu en caroténoïdes des deux types de feuilles sauvages et mutantes. Une des trois mesures indépendantes réalisées est représentée sur la figure 2. Il n'y a aucune différence significative dans la quantité totale de caroténoïdes accumulés dans les deux génotypes (respectivement 3065 + 160 et 3704 + 900 yg de caroténoïdes totaux par g de FW). Il y avait des différences significatives concernant la zéaxanthine et les produits dérivés. La zéaxanthine apocaroténoïde n'a pas pu être détectée dans les feuilles de type sauvage, mais elle s'est accumulée jusqu'à 7% du contenu total en pigments dans les feuilles du mutant.Au contraire, la violaxanthine, l'anthéraxanthine et la néoxanthine n'ont pu être détectées dans les feuilles du mutant, comparées aux feuilles de type sauvage, où la quantité totale des trois molécules a représenté 4,1% du contenu total en caroténoïdes. Il peut être noté que les niveaux de Carotène, de lutéine et de chlorophylles ont été comparables dans le type sauvage et chez le mutant, suggérant que la photo-protection des appareils photosynthétiques n'est pas affectée par la mutation. Selon les mesures des caroténoïdes, on peut conclure que le mutant aba2-sl présente une déficience au niveau de 1 'époxydation de la zéaxanthine qui est de manière conséquente accumulée et aboutit à l'absence des produits suivants dans la biosynthèse de 1'ABA (figure 3). 4. Clonage d 'ADNc et séquence nucléotidique 4.1. Matériel et méthode Construction et criblage d'une banque d'ADNc. De jeunes plantes, au premier stade foliaire, (âgées de 3 à 4 semaines) ont été récoltées (en incluant les racines) et l'ARN total a été purifié. La fraction poly (A)+ a été sélectionnée sur des colonnes oligo dT (Pharmacia). L'ADNc double-brin a été synthétisé en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (Promega) et un adaptateur-amorce-NotI-oligo (dT). Après la ligation d'adaptateurs EcoRI (Pharmacia), l'ADNc a été digéré par NotI et cloné de manière directionnelle dans le vecteur kgtlI Sfi-Not (Promega). Environ 1,5 x 106 recombinants indépendants ont été obtenus après empaquetage phagique (Stratagene) et infection dans la souche LE 392 (Promega). La banque d'ADNc de Xgtll a été amplifiée dans la souche RY 1090 d'Escherichia coli. Une hybridation de plaques phagiques, en utilisant la sonde C, a été réalisée selon des procédures standards (Maniatis et al., 1982).Des lavages ont été faits dans des conditions de faible stringence dans SCC 2 x, sarkosyl 0,5 % à 65"C. Les inserts d'ADN des phages recombinants positifs ont été clonés de manière subséquente dans les sites EcoRI-NotI d'un vecteur pBS-SK+ (Stratagene) et dans les sites Eco RI-SacI d'un vecteur pGEM-7Z (Promega). En utilisant ces sous-clones, le séquençage des deux brins a été réalisé après digestion partielle à l'aide d'un kit de délétion à une Exonucléase III (Pharmacia). La séquence nucléotidique des clones délétés a été déterminée avec un dispositif de séquençage d'ADN automatique ABI 373A (Applied Biosystems) en utilisant des amorces à coloration et une enzyme Sequenase. 4.2. Résultats La sonde C radioactive a été utilisée pour cribler 3 x 105 plaques de la banque Agtll. Un clone positif a montré un insert de 2,4 kb. Ceci était la taille attendue pour le transcrit (figure 6). Après le clonage dans un vecteur pBluescript, et un sous-clonage dans un vecteur pGEM, l'insert a été complètement séquencé sur les deux brins. La séquence complète de l'ADNc (longue de 2400 nucléotides) et le plus grand cadre de lecture ouvert (ORF) démarrant par une méthionine sont représentés sur la figure 8. Cet ORF se compose de 1989 pb, correspondant à un polypeptide de 663 résidus d'acides aminés (aa), ayant une masse moléculaire prédite de 72,54 kDa. Un codon stop en phase situé en amont de cet ORF au niveau de la position nucléotidique -20 confirme que l'ORF présenté sur la figure 6A est la région codante entière du gène correspondant.Si l'ATG au niveau du nucléotide 1 est le codon d'initiation, l'ADNc a une séquence 5' nontraduite de 40 pb, une région codante de 1989 pb, et une séquence 3' nontraduite de 310 pb, suivie par une queue poly(A) (longue de 58 pb). La séquence 3' non-traduite contient trois signaux supposés d'addition de poly(A) (ATAAA) au niveau des nucléotides 2015, 2109 et 2276 (Joshi, 1987). Comme indiqué par un séquencage partiel du fragment Kpnl d'lPCR cloné, l'insertion d'Ac a lieu dans 1'ORF au niveau du nucléotide 434 (aa 145). Les 8 pb dupliquées après l'insertion d'Ac dans l'ADN génomique sont encadrées sur la figure 8. 4.3. Recherche d'homologie de séquence. Les séquences des nucléotides et des acides aminés ont été utilisées pour vérifier les homologies possibles avec des séquences dans des banques de données. Les recherches dans les banques de données (National Center for Biotechnology Information utilisant the BLAST network service) ont révélé trois segments de la séquence d'acides aminés ayant une homologie significative avec des protéines connues de Pseudomonas sp. ou d'E. coli (figure 9). Les meilleurs ajustements ont été obtenus avec nahG (salicylate 1-hydroxylase, You et al., 1991); ubiH (2-octaprényl-6-méthoxyphénol monooxygénase, Nakahigashi et al., 1992), visA (ferrochélatase, Nakahigashi et al., 1992), pheA (phénol monooxygénase, Nurk et al., 1991); pcpB (pentachlorophénol-4-monooxygénase, Orser et al., 1993) et PHBH (phydroxybenzoate hydroxylase, Weijer et al., 1982).Toutes ces séquences protéiques partagent une fonction commune, qui est une hydroxylation ou une oxydation d'un cycle aromatique. Ceci est en accord avec l'activité supposée de la protéine codée par l'ADNc cloné, c'est-à-dire l'époxydation de la zéaxanthine, un substrat contenant un cycle aromatique. Deuxièmement, ces enzymes utilisent un cofacteur commun, soit le FAD soit le NAD(P). Ainsi, un site de liaison à 1'ADP est localisé au niveau des acides aminés 81 à 109, qui correspondent à la séquence consensus (empreinte) impliquée dans la liaison à 1'ADP (Wierrenga et al., 1986). Ce motif riche en glycines, commun aux enzymes se liant au cofacteur, permet de prédire si une séquence d'acides aminés particulière peut se replier en BaS avec des propriétés de liaison à la partie ADP de la NAD(P) ou du FAD. Ainsi, un site supposé de liaison au FAD a été trouvé. La séquence d'acides aminés MOHGRLFLAGD est impliquée dans la liaison au FAD de PHBH (Wijnands et al., 1986). Les résidus d'acides aminés 359 à 372 montrent 9 résidus identiques avec cette séquence, suffisamment pour garantir la conformation qui est nécessaire à la liaison au FAD. Quelques résidus au-delà de ce segment, les acides aminés 379 et 382 de notre époxydase supposée sont présents dans les séquences de PHBH et de la salicylate-1-hydroxylase et ont été décrits comme ayant une importance structurale et fonctionnelle dans ces enzymes (You et al., 1991). Un troisième fragment d'homologie est compris entre les résidus d'acides aminés 230 et 249 de l'ORF. Ce segment d'homologie n'a pas encore été décrit jusqu a maintenant, mais est présent dans toutes les séquences protéiques présentant une certaine homologie avec la séquence en question. 5. La protéine ABA2 est importée dans les chloroplastes Les recherches sur les bases de données ont indiqué l'existence d'une extension à l'extrémité amino terminale de l'ADNc par rapport aux protéines de Pseudomonas et d'E. coli. L'extension à l'extrémité amino terminale était comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 50. Le contenu en acides aminés dans cette région de la séquence a révélé un enrichissement en sérine et en thréonine. Ces acides aminés constituent respectivement 18 et 8% du contenu total en acides aminés de ce peptide, alors qu'ils sont beaucoup moins abondants dans la séquence complète de 663 acides aminés (6,8 et 5% respectivement). Cette caractéristique a été décrite dans des peptides connus d'adressage au chloroplaste, responsables de l'import de protéines nucléaires (Von Heijne et al., 1989). 5.1. Matériel et méthode. L'ADNc cloné dans un vecteur pBS-SK+ était traduit à partir du promoteur de L'ART polymérase de T3. La construction PsaD, codant pour une protéine du photosystème I localisée dans les chloroplastes (Kjaruff et Okkels, 1993), a été utilisée comme témoin positif pour les réactions d'import. La transcription/traduction in vitro a été réalisée avec 1pg de chaque plasmide et avec de la méthionine marquée au S35 en utilisant le Système de Lysats de Réticulocytes couplés au TNT (Promega Corporation, Madison, WI). Des chloroplastes ont été isolés à partir de feuilles provenant de plantes de pois âgées de deux semaines selon Cline et al. (1985). Les tests d'import ont été réalisés comme décrit par Hoff et al. (1995). Les échantillons ont été analysés sur des gels de polyacrylamide SDS (12 % pour la réaction d'import de PsaD et 5% pour notre construction) selon Laemmli (1970), suivis par une fluorographie (Skinner et Griswold, 1983). 5.2. Résultats Afin d'étudier la localisation chloroplastique de la zéaxanthine époxydase, on a réalisé la transcription et traduction in vitro du clone d'ADNc correspondant. Les produits de traduction marqués ont été incubés avec des chloroplastes purifiés de pois. Une partie aliquote de la réaction a été traitée avec de la thermolysine pour dégrader les protéines situées à la surface du chloroplaste, ainsi seules les protéines situées à l'intérieur des organites étaient protégées. La Figure 10 représente la fluorographie du gel de polyacrylamide-SDS chargé avec les réactions d'import. PsaD, une protéine de 28 kDa du photosystème I, utilisée comme témoin positif, a été importée et maturée (20kDa) comme attendu (données non présentées).La protéine époxydase (72,5 kDa) a été également importée et maturée en une protéine mature de 69 kDa, en accord avec l'analyse des données de séquences. 6. L'ADNc cloné complémente la mutation aba2-sl. 6.1. Matériel et méthode. Le vecteur de transformation végétale pKYLX71-35S2 a été utilisé pour cloner l'ADNc entre un promoteur 35S ayant un domaine activateur dupliqué B et une région rbcS 3' (Maiti et al. 1993). Le plasmide résultant, ainsi qu'un plasmide témoin sans l'insert d'ADNc, ont été introduits par conjuguaison triparentale dans une souche LBA4404 d'Awrobacterium tumefaciens désarmée, comme décrit par Koncz et Schell (1986). La transformation de disques de feuilles a été réalisée comme décrit précédemment (Marion-Poll et al., 1993). Des feuilles de mutants homozygotes aba2-sl de plantes cultivées in vitro ont été utilisées. 6.2. Résultats Des disques de feuilles de plantes aba2-sl ont été transformés via Anrobacterium par une construction comportant l'ADNc de l'époxydase sous contrôle du promoteur 35S ou par un plasmide témoin sans insert. Les transformants régénérés poussant sur un milieu sélectif ont été testés pour leur composition en caroténoïdes. Les régénérants transformés par un plasmide témoin ont montré une absence d'anthéraxanthine, de néoxanthine et de violaxanthine, et une accumulation de zéaxanthine comme le témoin non-transformé. Les régénérants obtenus après transformation par la construction contenant l'ADNc ont présenté une composition en caroténoïdes de type sauvage.Ainsi l'ADNc cloné a été capable de rétablir le phénotype sauvage lorsqu'il est réintroduit dans l'environnement génétique mutant, fournissant un argument supplémentaire pour l'étiquetage du gène de l'époxydase. 7. Cartographie du locus ABA2 dans Arabidopsis. 7.1. Matériel et méthode. Cartographie de l'EST d'Arabidopsis. Le criblage par PCR de la banque YAC CIC a été effectué sur des lots de YACS tridimensionnels. Les oligonucléotides utilisés permettaient l'amplification d'un fragment de 230 pb de la séquence EST (T45502). 7.2. Résultats. La comparaison de la séquence d'ADNc avec des séquences EST (Expressed Sequence Tags) d'une base de données (dbEST) a abouti à l'identification d'une EST homologue chez Arabidonsis thaliana (numéro de référence T45502). Cette séquence EST est longue de 480 pb et la séquence d'acides aminés déduite entre la paire de bases 4 et la paire de bases 210 montre 71 % d'identité (81 % de similarité) avec la séquence d'acides aminés de l'ADNc de N. plumbazinifolia. Des oligonucléotides, permettant d'amplifier un fragment de 230 pb dans l'ADNc de A. thaliana et un fragment génomique de 416 pb, ont été utilisés pour cribler la banque YAC CIC d'Arabidopsis (Creusot et al., en préparation).Un clone YAC unique a été identifié qui est situé en bas du chromosome cinq et fait partie d'un contig contenant le marqueur RFLP ve028, situé à la position 134.1 sur la carte (Lister, 1995). Cette localisation est en parfaite corrélation avec la position du locus aba sur la carte d'Arabidonsis (Koornneef et al., 1982). Ce résultat, sans être une preuve définitive, fournit un argument supplémentaire pour dire que le locus ABA2 de N. plumbaginifolia est l'homologue du locus ABA d'Arabidopsis. BIBLIOGRAPHIE 1. 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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INRA (B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75338 (ii) TITRE DE L' INVENTION: CLONAGE DU GENE DE L'ACIDE ABSCISSIQUE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2400 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (iv) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: NICOTIANA PLUMBAGINIFOLIA (B) SOUCHE:CV. viviani (D) STADE DE DEVELOPPEMENT: plantule (F) TYPE DE TISSU: plante entiere (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:41..2032 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TGAAGACTAC ACTCTTTCTT GAACTTGGGT TCAAGTAAAG ATG TAT TCA ACT GTG 55 Met Tyr Ser Thr Val 1 5 TTT TAC ACT TCA GTT CAT CCA TCC ACT TCA GCT TTT TCA AGA AAG CAG 103 Phe Tyr Thr Ser Val His Pro Ser Thr Ser Ala Phe Ser Arg Lys Gln 10 15 20 CTG CCT TTA TTG ATC TCT AAG GAT TTT CCA ACA GAG TTG TAT CAT TCT 151 Leu Pro Leu Leu Ile Ser Lys Asp Phe Pro Thr Glu Leu Tyr His Ser 25 30 35 TTA CCA TGC AGT AGA AGC TTG GAA AAT GGT CAA ATC AAG AAA GTC AAA 199 Leu Pro Cys Ser Arg Ser Leu Glu Asn Gly Gln Ile Lys Lys Val Lys 40 45 50 GGT GTA GTA AAA GCC ACA ATA GCT GAA GCT CCA GCA ACT ATT CCT CCA 247 Gly Val Val Lys Ala Thr Ile Ala Glu Ala Pro Ala Thr Ile Pro Pro 55 60 65 ACT GAT TTA AAA AAG GTA CCA CAG AAG AAG CTG AAA GTA TTA GTA GCA 295 Thr Asp Leu Lys Lys Val Pro Gln Lys Lys Leu Lys Val Leu Val Ala 70 75 80 85 GGT GGT GGG ATT GGA GGA TTA GTT TTT GCA TTG GCG GCA AAG AAA AGG 343 Gly Gly Gly Ile Gly Gly Leu Val Phe Ala Leu Ala Ala Lys Lys Arg 90 95 100 GGA TTT GAT GTG TTG GTA TTT GAG AGA GAT TTA AGT GCT ATT AGA GGA 391 Gly Phe Asp Val Leu Val Phe Glu Arg Asp Leu Ser Ala Ile Arg Gly 105 110 115 GAA GGA CAA TAT AGA GGA CCA ATT CAG ATA CAA AGC AAT GCA TTG GCT 439 Glu Gly Gln Tyr Arg Gly Pro Ile Gln Ile Gln Ser Asn Ala Leu Ala 120 125 130 GCT TTA GAA GCA ATT GAT ATG GAT GTT GCT GAA GAC ATA ATG AAT GCT 487 Ala Leu Glu Ala Ile Asp Met Asp Val Ala Glu Asp Ile Met Asn Ala 135 140 145 GGT TGT ATC ACT GGT CAA AGG ATT AAT GGT TTG GTT GAT GGT GTT TCT 535 Gly Cys Ile Thr Gly Gln Arg Ile Asn Gly Leu Val Asp Gly Val Ser 150 155 160 165 GGT AAC TGG TAT TGC AAG TTT GAT ACG TTT ACT CCA GCC GTG GAA CGC 583 Gly Asn Trp Tyr Cys Lys Phe Asp Thr Phe Thr Pro Ala Val Glu Arg 170 175 180 GGA CTT CCT GTG ACA AGA GTC ATC AGC CGC ATG ACT TTG CAA CAG AAC 631 Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Ser Arg Met Thr Leu Gln Gln Asn 185 190 195 CTT GCA CGT GCC GTC GGG GAA GAT ATC ATT ATG AAT GAA AGT AAT GTA 679 Leu Ala Arg Ala Val Gly Glu Asp Ile Ile Met Asn Glu Ser Asn Val 200 205 210 GTG AAC TTT GAG GAT GAT GGT GAA AAG GTT ACT GTG ACT CTT GAG GAT 727 Val Asn Phe Glu Asp Asp Gly Glu Lys Val Thr Val Thr Leu Glu Asp 215 220 225 GGA CAG CAA TAT ACA GGT GAT CTT CTG GTT GGT GCT GAT GGC ATA ACC 775 Gly Gln Gln Tyr Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Ala Asp Gly Ile Arg 230 235 240 245 TCT AAG GTA CGG ACT AAT TTG TTC GGA CCC AGT GAT GTA ACT TAC TCT 823 Ser Lys Val Arg Thr Asn Leu Phe Gly Pro Ser Asp Val Thr Tyr Ser 250 255 260 GGC TAC ACT TGT TAC ACT GGA ATT GCA GAT TTT GTT CCT GCT GAT ATT 871 Gly Tyr Thr Cys Tyr Thr Gly Ile Ala Asp Phe Val Pro Ala Asp Ile 265 270 275 GAG ACA GTT GGC TAC CGA GTC TTT TTG GGC CAC AAA CAG TAC TTT GTT 919 Glu Thr Val Gly Tyr Arg Val Phe Leu Gly His Lys Gln Tyr Phe Val 280 285 290 TCT TCA GAT GTG GGT GGA GGC AAC ATC CAG TGG TAT GCA TTT CAC AAT 967 Ser Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Met Gln Trp Tyr Ala Phe His Asn 295 300 305 GAA CCA GCT GGC GGT GTG GAT GAT CCA AAC GGT AAA AAG GCA AGA TTG 1015 Glu Pro Ala Gly Gly Val Asp Asp Pro Asn Gly Lys Lys Ala Arg Leu 310 315 320 325 CTT AAA ATA TTT GAG CGC TGG TGT GAC AAT GTT ATA GAC CTA TTA GTA 1063 Leu Lys Ile Phe Glu Gly Trp Cys Asp Asn Val Ile Asp Leu Leu Val 330 335 340 GCC ACA GAT GAA GAT GCA ATT CTT CGA CGT GAC ATC TAT GAT AGA CCC 1111 Ala Thr Asp Glu Asp Ala Ile Leu Arg Arg Asp Ile Tyr Asp Arg Pro 345 350 355 CCA ACA TTT AGT TGG GGA AAA GGT CGT GTT ACA TTC CTT CGC GAC TCT 1159 Pro Thr Phe Ser Trp Gly Lys Gly Arg Val Thr Leu Leu Gly Asp Ser 360 365 370 GTC CAT GCT ATG CAG CCT AAT TTG GGT CAA GGG GGA TGC ATC GCC ATA 1207 Val His Ala Met Gln Pro Asn Leu Gly Gln Gly Gly Cys Met Ala Ile 375 380 385 GAG GAT AGC TAT CAA CTA GCA CTG GAA CTT GAT AAA GCA TTC AGC CGA 1255 Glu Asp Ser Tyr Gln Leu Ala Leu Glu Leu Asp Lys Ala Leu Ser Arg 390 395 400 405 AGC GCC GAG TCA GGA ACC CCT GTG GAT ATC ATC TCA TCT TTA AGG AGC 1303 Ser Ala Glu Ser Gly Thr Pro Val Asp Ile Ile Ser Ser Leu Arg Ser 410 415 420 TAT GAA AGT TCT AGA AAA CTT CGA GTT GGA GTT ATC CAT GGA CTG GCT 1351 Tyr Glu Ser Ser Arg Lys Leu Arg Val Gly Val Ile His Gly Leu Ala 425 430 435 AGA ATG GCT GCA ATC ATG GCA TCA ACT TAC AAG GCT TAT CTT GGT GTC 1399 Arg Met Ala Ala Ile Met Ala Ser Thr Tyr Lys Ala Tyr Leu Gly Val 440 445 450 GGA CTT GGT CCA TTA TCA TTT TTC ACC AAG TTT AGG ATA CCA CAT CCT 1447 Gly Leu Gly Pro Leu Ser Phe Leu Thr Lys Phe Arg Ile Pro His Pro 455 460 465 GGA AGA GTT GGT GGA AGA TTT TTT ATT GAC TTC GGA ATG CCC CTT ATC 1495 Gly Arg Val Gly Gly Arg Phe Phe Ile Asp Leu Gly Met Pro Leu Met 470 475 480 485 TTA AGC TGG GTT CTA GGA GGC AAC CGC GAA AAG CTT GAA GGC AGA ATA 1543 Leu Ser Trp Val Leu Gly Gly Asn Gly Glu Lys Leu Glu Gly Arg Ile 490 495 500 CAA CAT TGC AGG CTA TCT GAG AAA GCA AAT GAC CAA TTC AGA AAT TGG 1591 Gln His Cys Arg Leu Ser Glu Lys Ala Asn Asp Gln Leu Arg Asn Trp 505 510 515 TTT GAA GAT GAT GAT GCT TTA GAG CGT GCT ACT GAT GCA GAG TGG CTA 1639 Phe Glu Asp Asp Asp Ala Leu Glu Arg Ala Thr Asp Ala Glu Trp Leu 520 525 530 TTC CTT CCT GCC GGG AAT AGC AAT GCT GCT TTA GAA ACT CTC GTT TTA 1687 Leu Leu Pro Ala Gly Asn Ser Asn Ala Ala Leu Glu Thr Leu Val Leu 535 540 545 AGC AGA GAT GAG AAC ATG CCT TGC AAT ATT CGC TCT GTC TCA CAT GCA 1735 Ser Arg Asp Glu Asn Met Pro Cys Asn Ile Gly Ser Val Ser His Ala 550 555 560 565 AAC ATT CCT GGA AAA TCA GTT GTT ATA CCT TTC CCT CAG GTG TCC GAA 1783 Asn Ile Pro Gly Lys Ser Val Val Ile Pro Leu Pro Gln Val Ser Glu 570 575 580 ATC CAC GCC CGG ATA TCC TAC AAA GGT GGA GCA TTT TTT GTA ACT GAT 1831 Met His Ala Arg Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ala Phe Phe Val Thr Asp 585 590 595 TTA CGA AGT GAA CAT GGT ACC TGC ATT ACG GAT AAC GAA GGC AGA AGA 1879 Leu Arg Ser Glu His Gly Thr Trp Ile Thr Asp Asn Glu Gly Arg Arg 600 605 610 TAC CGA GCA TCT CCA AAC TTC CCT ACT CGC TTT CAT CCA TCA GAT ATT 1927 Tyr Arg Ala Ser Pro Asn Phe Pro Thr Arg Phe His Pro Ser Asp Ile 615 620 625 ATT GAA TTT GGT TCT GAT AAA AAC GCA GCA TTT CGC GTA AAG GTA ATG 1975 Ile Glu Phe Gly Ser Asp Lys Lys Ala Ala Phe Arg Val Lys Val Met 630 635 640 645 AAA TTT CCT CCA AAA ACT GCT GCA AAA GAA GAG CGT CAA GCA GTG GGG 2023 Lys Phe Pro Pro Lys Thr Ala Ala Lys Glu Glu Arg Gln Ala Val Gly 650 655 660 GCA GCT TGA AAATTCGGAA GTTTGGCCTG ATATAAACGG GGAAATTGTA 2072 Ala Ala * CAGCATTTTT ATAGCAACAG CACAAACTGA GCCATTTAAA TCAGCTAATT TTGTATACTG 2132 TAGGTTTAGA AGATTGATAA ACAGAACAAC AATGCAAGAA ACTACAAGGG TTATATAGCT 2192 TCCCCCTATA GAAACCTGGA GAAAGTTATG GTACATTGGT CCTTTCTACC ATTGCTAAAA 2252 TATAGTAGTA GTTTTGTATG TATACCCAAT TACAGGGGCC ATAATGTTAA GTTGTCTTCC 2312 TTCATAAATT ACGGCCATAT ATTTTCTTAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2372 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2400 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1989 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (iv) ANTI-SENS:NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: NICOTIANA PLUMBAGINIFOLIA (B) SOUCHE: CV. viviani (D) STADE DE DEVELOPPEMENT: plantule (F) TYPE DE TISSU: plante entiere (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATGTATTCAA CTGTGTTTTA CACTTCAGTT CATCCATCCA CTTCAGCTTT TTCAAGAAAG 60 CAGCTGCCTT TATTGATCTC TAAGGATTTT CCAACAGAGT TGTATCATTC TTTACCATGC 120 AGTAGAAGCT TGGAAAATGG TCAAATCAAG AAAGTCAAAG GTGTAGTAAA AGCCACAATA 180 GCTGAAGCTC CAGCAACTAT TCCTCCAACT GATTTAAAAA AGGTACCACA GAAGAAGCTG 240 AAAGTATTAG TAGCAGGTGG TGGGATTGGA GGATTAGTTT TTGCATTGGC GGCAAAGAAA 300 AGGGGATTTG ATGTGTTGGT ATTTGAGAGA GATTTAAGTG CTATTAGAGG AGAAGGACAA 360 TATAGAGGAC CAATTCAGAT ACAAAGCAAT GCATTGGCTG CTTTAGAAGC AATTGATATG 420 GATGTTGCTG AAGACATAAT GAATGCTGGT TGTATCACTG GTCAAAGGAT TAATGGTTTG 480 GTTGATGGTG TTTCTGGTAA CTGGTATTGC AAGTTTGATA CGTTTACTCC AGCCGTGGAA 540 CGCGGACTTC CTGTGACAAG AGTCATCAGC CGCATGACTT TGCAACAGAA CCTTGCACGT 600 GCCGTCGGGG AAGATATCAT TATGAATGAA AGTAATGTAG TGAACTTTGA GGATGATGGT 660 GAAAAGGTTA CTGTGACTCT TGAGGATGGA CAGCAATATA CAGGTGATCT TCTGGTTGGT 720 GCTGATGGCA TAAGGTCTAA GGTACGGACT AATTTGTTCG GACCCAGTGA TGTAACTTAC 780 TCTGGCTACA CTTGTTACAC TGGAATTGCA GATTTTGTTC CTGCTGATAT TGAGACAGTT 840 GGGTACCGAG TCTTTTTGGG CCACAAACAG TACTTTGTTT CTTCAGATGT GGGTGGAGGC 900 AAGATGCAGT GGTATGCATT TCACAATGAA CCAGCTGGGG GTGTGGATGA TCCAAACGGT 960 AAAAAGGCAA GATTGCTTAA AATATTTGAG GGGTGGTGTG ACAATGTTAT AGACCTATTA 1020 GTAGCCACAG ATGAAGATGC AATTCTTCGA CGTGACATCT ATGATAGACC GCCAACATTT 1080 AGTTGGGGAA AAGGTCGTGT TACATTGCTT GGGGACTCTG TCCATGCTAT GCAGCCTAAT 1140 TTGGGTCAAG GGGGATGCAT GGCCATAGAG GATAGCTATC AACTAGCACT GGAACTTGAT 1200 AAAGCATTGA GCCGAAGGGC CGAGTCAGGA ACCCCTGTGG ATATCATCTC ATCTTTAAGG 1260 AGCTATGAAA GTTCTAGAAA ACTTCGAGTT GGAGTTATCC ATGGACTGGC TAGAATGGCT 1320 GCAATCATGG CATCAACTTA CAAGGCTTAT CTTGGTGTCG GACTTGGTCC ATTATCATTT 1380 TTGACCAAGT TTAGGATACC ACATCCTGGA AGAGTTGGTG GAAGATTTTT TATTGACTTG 1440 GGAATGCCGC TTATGTTAAG CTGGGTTCTA GGAGGCAACG GGGAAAAGCT TGAAGGCAGA 1500 ATACAACATT GCAGGCTATC TGAGAAAGCA AATGACCAAT TGAGAAATTG GTTTGAAGAT 1560 GATGATGCTT TAGAGCGTGC TACTGATGCA GAGTGGCTAT TGCTTCCTGC CGGGAATAGC 1620 AATGCTGCTT TAGAAACTCT CGTTTTAAGC AGAGATGAGA ACATGCCTTG CAATATTGGG 1680 TCTGTCTCAC ATGCAAACAT TCCTGGAAAA TCAGTTGTTA TACCTTTGCC TCAGGTGTCC 1740 GAAATGCACG CCCGGATATC CTACAAAGGT GGAGCATTTT TTGTAACTGA TTTACGAAGT 1800 GAACATGGTA CCTGGATTAC GGATAACGAA GGCAGAAGAT ACCGAGCATC TCCAAACTTC 1860 CCTACTCGCT TTCATCCATC AGATATTATT GAATTTGGTT CTGATAAAAA GGCAGCATTT 1920 CGCGTAAAGG TAATGAAATT TCCTCCAAAA ACTGCTGCAA AAGAAGAGCG TCAAGCAGTG 1980 GGGGCAGCT 1989 REVENDICATIONS 1. Fragment d'acide nucléique codant pour un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) chez les plantes. 2. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une époxydase impliquée dans les deux premières étapes de la voie de biosynthèse de 1'ABA. 3. Fragment selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'enzyme présente une activité d'époxydation de la zéoxanthine. 4. Fragment selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est isolé de Nicotiana Plumbaginifolia. 5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquence (IDS) N" 1. 6. Fragment selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nucléotide n" 41 à 2029 de L'IDES N" 1. 7. Fragment selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre la séquence leader allant du nucléotide n" 1 à 40 de L'IDES N" 1. 8. Fragment selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comporte en outre la séquence de terminaison allant du nucléotide 2030 à 2400 de l'lDS N0 1. 9. Fragment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte ladite séquence de terminaison augmentée d'une queue poly A à son extrémité 3'. 10. Fragment selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence complète de 2400 nucléotides telle que montrée sur l'lDS N 1. 11. Fragment selon l'une des revendications 4 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence complémentaire, homologue ou complémentaire de l'homologue de celle de la ou desdites séquence(s) de L'IDES N 1. 12. Fragment d'acide nucléique capable de s'hybrider dans des conditions faiblement stringentes avec un fragment selon l'une des revendications 1 à 1 1 et codant pour unedite enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA.