FR 2724945 A1 19960329 FR 9411511 A 19940927 VECTEURS VIRAUX ET UTILISATION EN THERAPIE GENIOUE La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux Plus particulièrement, la présente invention concerne des adénovirus recombinants comme vecteurs pour la thérapie génique. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génue dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce Second cas. différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.ViroL 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), remploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfectiom A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires.En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. Parmi ces virus, les adénovirus présentent certaines propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à leur extrémité, une séquence d'encapsidation, des gènes précoces et des giEnes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont les gènes El (Ela et Elb), E2, E3 et E4. Les principaux gènes tardifs sont les gènes L1 à L5. Compte tenu des propriétés des adénovirus mentionnées ci-dessus, ceuxwi ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (égal, OTC, a- 1AT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés des régions El (Ela et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Goeh.Choudhury et aL, Gene 50 (1986) 161).Néanmoins, les vecteurs décrits dans l'art antérieur présentent de nombreux inconvénients qui limitent leur exploitation en thérapie génique. En particulier, tous ces vecteurs comportent de nombreux gènes viraux dont l'expression in vivo n'est pas souhaitable dans le cadre d'une thérapie génique. De plus, ces vecteurs ne permettent pas l'incorporation de fragments d'ADN de très grande taille, qui peuvent être nécessaires pour certaines applications. La présente invention permet de remédier à ces inconvéniens. La présente invention décrit en effet de nouveaux adénovirus recombinants utilisables en thérapie génique, notamment pour le transfert et l'expression de gènes in vivo. En particulier, les adénovirus de l'invention permettent un transfert efficace et une expression durable in vivo d'un gène d'intérêt, tout en limitant les risques de production de protéines virales, de transmission du virus, de pathogénicité, etc. La présente invention réside plus particulièrement dans la construction d'adénovirus recombinants dans lesquels au moins un gène viral particulier, désigné IVa2, a été rendu non fonctionnel. Le gène IVa2 est un petit gène situé dans la partie gauche du génome de l'adénovirus. n se chevauche en partie avec extrémité du gene E2B notamment, ce qui rend délicate sa manipulation. Le gène IVa2 semble jouer un rôle d'activateur de la transcription des gènes tardifs dans le cycle réplication de l'adénovirus. Sa présence permet ou favorise donc rexpression des protéines du virus, nécessaires à la formation des particules virales. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible d'inactiver ce gène dans le génome de l'adénovirus. La demanderesse a par ailleurs montré que cette inactivation n'affectait pas les propriétés de l'adénovirus comme vecteur de thérapie génique, à savoir son haut pouvoir d'infection des cellules, notamment humaines, et sa capacité à transferer efficacement une gène d'intérêt dans lesdites cellules De plus, par rapport aux vecteurs de l'art antérieur, les vecteurs décrits dans la présente invention possèdent une capacité d'incorporation de gènes d'intérêts améliorée, résultant de l'inactivation par délétion du gène IVa2; et, surtout, sont nettement moms immunogènes puisque l'expression des gènes tardifs éventuellement présents dans les adénovirus recombinants selon l'invention est considérablement diminuée, voire abolie. Les vecteurs de l'invention sont donc particulièrement avantageux puisqWils permettent l'incorporation de gènes d'intérêt de grande taille (supérieure à 8 kb et pouvant attendre plus de 11 kb) sans particulièrement affecter les titres obtenus, et qu'ils possèdent très peu de régions virales exprimées, ce qui réduit fortement voire supprime les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique tels que l'immunogénicité, la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, etc. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux particulièrement adaptés au transfert et à l'expression in vivo de sequences d'ADN désirées. Un premier objet de la présente invention concerne donc un adénovirus recombinant défectif dans lequel le gène IVa2 au moins est inactivé. Les adénovirus sont dits défectifs lorsqu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans les cellules infectées. Généralement, le génome des adénovirus selon la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences necessaies à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit êenenees (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par une séquence d'acides nucléiques hétérologue. Comme indiqué ci-avant, la demanderesse a maintenant montré qu'il est possible d'inactiver le gène IVa2 dans le génome de l'adénovirus sans affecter les propriétés recherchées de ce virus. Plus particulièrement, pour la préparation des vecteurs de l'invention, le gène IVa2 peut être inactivé par différentes techniques connues de l'homme du métier, et notamment par suppression, substitution, délétion, et/ou addition d'une ou plusieurs bases. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées dans la partie codante du gène, ou en dehors de la région codante, et par exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes. L'inactivation du gène peut donc se manifester par la production d'une protéine inactive en raison de modifications structurales ou conformationelles, par l'absence de production, par la production d'une protéine ayant une activité altérée, ou encore par la production de la protéine naturelle à un niveau atténué ou selon un mode de régulation désiré. Parmi les agents mutagènes utilisables pour l'inactivation, on peut citer par exemple les agents physiques tels que les rayonnements énergétiques ayons X, g, ultra violet, etc..), ou les agents chimiques capables de réagir avec différents groupements fonctionnels des bases de 1'ADN, et par exemple les agents alkylants [éthylméthane sulfonate (EMS), N-méthyl-N'-nitro N-nitrosoguanidine, Nnitroquinoléine-1-oxyde (NQO)], les agents bialkylants, les agents inteoealants, etc. Les modifications génétiques peuvent également être obtenues par disruption génique, par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstem [Meth Enzymol. 101 (1983) 202]. Dans ce cas, tout ou partie de la séquence codante est préférentiellement perturbée pour permettre le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence génomique par une séquence non fonctionnelle ou mutante. Préférentiellement, dans les adénovirus de l'invention, le gène IVa2 est inactivé par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases. Encore plus préférentiellement, le gène IVa2 est inactivé par délétion totale ou partielle. Plus particulièrement, on entend par délétion toute suppression de tout ou partie du gène considéré. n peut s'agir notamment de tout ou partie de la région codante dudit gène, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transription dudit gène. La suppression peut être effectuée par digestion au moyen azymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. De manière particulièrement préférée, l'inactivation des gènes est réalisée de telle sorte qu'elle n'affecte que le gène considéré et pas les autres gènes virmrx, notamment les gènes voisins. Par tailleurs, certaines altérations telles que des mutations ponctuelles étant par nature capables d'être corrigées ou atténuées par des mécanisnes cellulaires, il est particulièrement préféré que l'inactivation soit parfaitement stable ségrégationellement et/ou non-réversible. Selon un mode particulièrement avantageux, dans les adênovirus recombinants de la présente invention, le gène IVa2 est inactivé par délétion crun fragment BssHII-BstEII allant du nucléotide 4106 au nucléotide 5186, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n" M73260). Les adénovirus recombinants selon l'invention comprennent avantageusement les séquences 1TR et une région permettant l'encapsidation. Les séquences inversées répétées (1TR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'oû elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences 1TR des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence 1TR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides 1 à 103 du génome. La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation du génome viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invenlion. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus, entre rrin gauche (5') et le gène El (Cf figure 1). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence micléotidiques de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2).Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, une séquence d'encapsidatioei fonctionnelle est comprise entre les nucléotides 194 et 358 du génome. Dans un premier mode particulier de réalisation, les adénovirus de l'invention portent une délétion de tout ou partie des gènes El et IVa2. Dans un autre mode particulier de réalisation, les adénovirus recombinants de l'invention portent une délétion de tout ou partie des gènes E4 et Ira2. Toujours selon un mode préféré de réalisation, les adénovirus recombinants de l'invention portent une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2 et E3. Dans une variante particulièrement avantageuse, les adénovirus recombinants de l'invention portent une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2 et E4. Des adénovirus recombinants selon l'invention possédant des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génique sont ceux portant une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2, E3, E4 et éventuellement l5Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité et de capacité de transfert de gènes très élevées. Avantageusement, les adénovirus recombinants de l'invention comportes en outre une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché. En particulier, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques et/ou un ou plusieurs gènes codant pour des peptides antigéniques. Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique. I1 peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits potaqv ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement expimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, lexvion ckme protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la celle ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine.Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on petit citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de syithse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la %rU ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides: lEynudine kinase, cytosine désaminase, etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Comme indiqué plus haut, la séquence d'ADN hétérologue peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigémque, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation de vaccins permettant d'immlnw l'homme, notamment contre des microorganismes ou des virus. n peut stagir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudrage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée. II peut s'agir d'une région promotrice naturellement oe,ciisable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. n peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, ü peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter.De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y covs l'adénoviuus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expprouon tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Toujours dans un mode particulierement avantageux, les vecteurs de l'invention possèdent en outre un gène E3 fonctionnel sous controle d'un promoteur hétérologue. Plus préférentiellement, les vecteurs possèdent une partie du gine E3 permettant l'expression de la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adénovirus fasse l'objet d'une réaction immunitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. Les adénovirus recombinants selon l'invention peuvent être d'origines diverses. I1 existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une oegaflisation génétique comparable. De ce fait, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus. Plus particulièrement, les adénovirus de rinvention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale). Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adénovints humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande FR 93 05954). La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement transcomplémentés par des adénovirus d'origine hum aine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse.L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à rutissation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles. Les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et aL, Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sérotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), JZA (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à rATCC (types 1 à 8) sous les références ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769.On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR528), l'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); l'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc. De préférence, parmi les différents adénovirus d'origine animale, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus ou des régions d'adénovirus d'anane canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adénovirus canins ont fait rottiet de nombreuses études structurales. Ainsi, des cartes de restriction complètes des adénovirus CAV1 et CAV2 ont été décrites dans rart antérieur (Spibey et al., J. GesL Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences 1TR ont été clonés et séquencés (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Inné, Vins Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525). Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés de différentes façons. Une première méthode consiste à transfecter RADON du virus recombnt défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préféretiellernoet intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire. La préparation de telles lignées cellulaires est décrite dans les exemples. Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée llulaire apppropriée l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) et l'ADN d'un ou de plusieurs virus ou plasmide helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée celulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recombinant. Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs. La préparation d'adénovirus recombinants défectifs de l'invention selon cette méthode est également illustrée dans les exemples. A cet égard, la présente demande décrit également la construction de plasmides portant la partie gauche modifiée du génome de radénovirus Ad5 (plasmides pCO1 et po2). Ces plasmides sont particulièrement utiles pour la construction d'adénovirus recombinants défectifs en tant que vecteurs de thérapie génique. Ainsi, le plasmide pCO1 porte la région gauche du génome de l'adénovirus, depuis llTR gauche jusqu'au nucléotide 6316, avec une délétion de la région comprise entre les nucléotides 382-3446, correspondant au gène El.Ce plasmide est particulièrement avantageux puisqu'il comporte, par rapport aux autres plasmide de ce type décrits dans antérieur, une délétion plus grande au niveau du gène El, offrant plus de capacités de clonage et, surtout, moins de risques de recombinaison. Le plasmide pC02 dérive du plasmide pCO1 par délétion d'une région supplémentaire comprise entre les nucléotides 4106-5186, et correspondant à une partie du gène Ira2. Cette délétion a l'avantage de ne pas affecter le gène E2. Les plasmides pCO1 et pC02 contiennent par ailleurs un multisite de clonage permettant l'incorporation d'une séquence d'acides nucléiques hétérologue d'intérêt.La construction résultante peut ensuite être utilisée pour préparer l'adénovirus recombinant défectif par cotransfection avec un ADN correspondant à la partie droite du génome de l'adénovirus dans une lignée cellulaire compétente. En ce qui concerne ce dernier, il peut être issu du génome d'un virus sauvage, ou d'un virus lui-même défectif tel que Addl324 qui est délété de la région E3 : Sadd1808 qui est délété de la région E4 (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833), etc (Cf exemples). Parmi les lignées cellulaires utilisables, on peut citer notamment la lignée de rein embryonnaire humain 293, les cellules KB, les cellules Hela, MDCX, GHK, etc, et plus généralement, toute lignée cellulaire complémentant pour la ou les régions délétées (Cf exemples). Ensuite, les virus recombinants qui se sont multipliés sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de la virologie. Le plasmide pCO1 permet ainsi la construction d'adénovirus recombmants défectifs portant une délétion au niveau du gène El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. Le plasmide pC02 permet la construction d'adénovirus recombinants défectifs portant une délétion au niveau du gène El, allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, et une délétion au niveau du gène IVa2, allant du nucléotide 4106 au nucléotide 5186. La présente invention concerne également toute composition -reuti comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent encre formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des cule5 pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. ll peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la consStution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon rinveEian sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 luu, et de préférence 106 a 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forcing unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est détenniné par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées.Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Selon la séquence d'ADN hétérologue insérée, les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limita Légende des figures Figure 1: Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de rAd5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectiormer ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome. Figure 2: Carte de restriction de l'adénovirus CAV2 souche Manhattan (draspis Spibey et al précité). Figure 3: Carte de restriction du fragment HindIII contenu dans le plasmide pCO1. Figure 4: Carte de restriction du fragment Hindm contenu dans le plasmide pCO2. Figure 5 : Construction et représentation du plasmide pPY32. Figure 6 : Représentation du plasmide pPY55. Figure 7: Construction du plasmide pE4Gal. Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN pianidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Labosato, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la sérine M13 srt d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de RADON ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du founiisr. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécificatioeîs du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandatioeis du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amemhn. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PcR Lolymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K et al., Science XQ (1985) 1350 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enznt 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467l en utilisant le kit distribué par Amersham. Lignées cellulaires utilisées Dans les exemples qui suivent, les lignées cellulalres suivantes ont ou peuvent être utilisées: - Lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). - Lignée de cellules humaines KB : Issue d'un carcinome épidermique humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les conditions permettant sa culture. - Lignée de cellules humaines Hela: Issue d'un carcinome de r humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture. - Lignée de cellules canines MDCK: Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9. - Lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Cette lignée est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adénovirus sous le controle du LTR de MMTV. EXEMPLES Exemple 1 - Construction du plasmide pCOl (figure 3) A - Construction du plasmide pCE Le fragment EcoRI-XbaI correspondant à extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et XbaI du vecteur pIC19H Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par HinfL ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de RADON polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus AdS a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et SmaI du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481).Ceci génère le plasmide pCB. Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de radénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites NruI et BglII du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénoviuus Ad5 suivies d'un multisite de clonage. B - Construction du plasmide pCD' Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - NarI (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites ClaI et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment SalI-TaqI du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et TaqI (5207) a ensuite été cloné entre les sites SalI et ClaI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment TaqI (5207) - NarI (5519) du génome de radénovinas Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-TaqI du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC'.Le fragment NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-NarI du plasmide pCC' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'. C - Construction du plasmide pCO1 Une digestion partielle par XhoI puis une digestion complète par SalI du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été cloné dans le site SalI du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pCO1 (figure 3), qui contient la partie gauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hinft (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus AdS. Exemple 2 - Construction du plasmide pC02 (figure 4) A - Construction du plasmide pCD" Le fragment BssHII-BstEII correspondant au fragment BssHII (4106) BstEII (5186) du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été enlevé du plasmide pCA'. Ceci génère le plasmide pCB", dont une caractéristique intéressante est qu'il possède une délétion d'une partie de la séquence du gène IVa2. Le fragment TaqI (5207) NarI (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-TaqI du plasmide pCB" ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC". Le fragment NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-NarI du plasmide pCC" ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R Ceci génère le plasmide pCD". B - Construction du plasmide pC02 Une digestion partielle par XhoI puis une digestion complète par SalI du plasmide pCD" génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316), dont le fragment BssHII (4106) -BstEII (5186) a été délété. Ce fragment a été cloné dans le site SalI du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pC02 (figure 4), qui contient la partie rauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hinfi (382), un multisite de clonage et le fait Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5, dont le fragment BssHII (4106) BstEII (5186) a été délété. Exemple 3 - Construction d'un adénovirus recombinant portant une délétion dans le gène El Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif portant une délétion dans la région El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. Cet adénovirus est particulièrement avantageux puisqu'il comporte une délétion plus grande au niveau du gène El, offrant plus de capacités de clonage et, surtout, moms de risques de recombinaison. Cet adénovirus recombinant a été obtenu par recombinaison in vivo, par cotransfection dans les cellules 293, en présence de phosphate de calcium, de RADON du virus AdRSVssgal digéré par ClaI et du plasmide pCO1 digéré par XmnL Les cellules sont ensuite récoltées, disruptées par trois cycles de congélationdéegélation dans leur surnageant, puis centrifugées à 4000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu est ensuite amplifié sur culture cellulaire fraiche. Les virus sont alors purifiés à partir de plages et leur ADN est analysé selon la méthode de Hirt (précité). Des stocks de virus sont ensuite préparés sur gradient de chlorure de césium. Exemple 4 - Construction d'un adénovirus recombinant portant une délédon dans les gènes El et IVa2 Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif portant une délétion dans la région El, allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, plus une délétion dans la région IVa2. Cet adénovirus est particulièrement avantageux puisque, par rapport à l'adénovirus décrit dans l'exemple 3, il comporte une délétion au niveau du gène IVa2, offrant plus de capacités de clonage et, surtout, moins de risques de production de protéines virales in vivo. L'adénovuus recombinant a été préparé selon les trois protocoles suivants: (a) l'ADN du virus AdRSVBgal digéré par ClaI et le plasmide pC02 digéré par XmnI ont été co-transfectés dans les cellules 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison in vivo. (b) l'ADN du virus AdRSVBgal digéré par ClaI et par XcaI et le plasmide pC02 digéré par XmnI ont été co-transfectés dans les cellules 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison in vivo. (c) l'ADN du virus AdRSVBgal et le plasmide pC02 tous deux digérés par XcaI sont d'abord ligaturés in vitro puis la construction résultante est transfectée dans les cellules 293 en présence de phosphate de calcium. Les virus produits sont ensuite amplifiés et purifiés comme dans rexemple 3. Exemple 5 - Construction d'un adenovirus recombinant portant une délétion dans les gènes El. E3 et IVa2 Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif portant une délétion dans la région El, allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, une délétion dans le gène IVa2, et une délétion dans la région E3. Cet adénovinrs est particulièrement avantageux puisque, par rapport à l'adénovirus décrit dans rexeme 4, il comporte une délétion au niveau de la région E3, offrant plus de capacités de clonage. L'adénovirus recombinant a été préparé selon les trois protocoles suivants: (a) 1'ADN du virus Addl324 digéré par ClaI et le plasmide pC02 digéré par XmnI ont été cotransfectés dans les cellules 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison in vivo. (b) 1'ADN du virus Addl324 digéré par ClaI et par XcaI et le plasmide pC02 digéré par XmnI ont été co-transfectés dans les cellules 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison in vivo. (c) l'ADN du virus Addl324 et le plasmide pC02 tous deux digérés par Xi sont d'abord ligaturés in vitro puis la construction résultante est transfectée dans cellules 293 en présence de phosphate de calcium. Les virus produits sont ensuite amplifiés et purifiés comme dans l'exemple 3. Exemple 6 - Construction d'un adénovirus recombinant portant une délétion dans les ènes El. E3. E4 et lVa2 Cet exemple décrit la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invention dont le génome est délété des gènes IVa2, El, E3 et E4. Ces adénooius possèdent tout d'abord une capacité d'incorporation de gènes hétérologues importante. Par ailleurs, ces vecteurs présentent une sécurité élevée en raison de la délétion de la région IVa2 et de la région E4. Cette dernière est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans le processing des ARN pré-messagers tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de 1'ADN viral. Ces vecteurs possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. En, de manière particulièrement avantageuse, ces vecteurs peuvent être produits à des titres élevés. La partie droite d'un génome virai, délété pour les régions E3 et E4 (cf. section B), ou seulement pour la région E4 comme dans le cas des virus dol808, dllO04, dllO07 ou dllO10 décrits par G. Ketner par exemple (J. of 'rirology, Q (1989) 631). Selon une autre alternative, la partie droite peut oontnir des délébona dans plusieurs régions et par exemple dans les régions E3 et E4 comme contruites in vitro et présentées dans le virus préparé comme suit à partir du plasmide pPY55. A/ Construction de l'adénovirus délété dans les gènes El. E3 et E4. A.1 Construction du plasmide pPY55 a) Construction du plasmide pPY32 Le fragment AvrII-BcII du plasmide pFG144 [F.L. Graham et aL EMBO J. 8 (1989) 2077-2085], correspondant à l'extrémité droite du génome de TadénoWus Ad5, a d'abord été cloné entre les sites XbaI et BamHI du vecteur pIC19H, préparé & partir d'un contexte dam-. Ceci génère le plasmide pPY23. Une caractéristique intéressante du plasmide pPY23 est que le site SalI provenant du multisite de clonage du vecteur pIC19H reste unique et qu'il est localisé à coté de rexlrémité droite du génome de l'adénovirus Ad5.Le fragment HaeE-SalI du plasmide pPY23 qui contient l'extrémité droite du génome de l'adénovirus Ad5, à partir du site Haem localisé en position 35614, a ensuite été cloné entre les sites EcoRV et XhoI du vecteur pIC2OH, ce qui génère le plasmide pPY29. Une caractéristique intéressante de ce plasmide est que les sites XbaI et ClaI provenant du multisite de clonage du vecteur pIC20H sont localisés à coté de la jonction EcoRV/Haem résultant du clonage. De plus cette jonction modifie le contexte nucléotidique immédiatement adjacent au site ClaI qui est maintenant devenu méthylable dans un contexte dam+. Le fragment XbaI(30470) MaeII(32811) du génome de ladénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites XbaI et ClaI du plasmide pPY29 préparé à partir d'un contexte dam-, ce qui génère le plasmide pPY30. Le fragment SstI du plasmide pPY30, qui correspond à la séquence du génome de l'adénovirus Ad5 du site SstI en position 30556 jusqu'à extrémité droite a enfin été cloné entre les sites SstI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY3 1, dont une carte de restriction de l'insert localisé entre les sites Hincitil est donnée à la Figure 5. Le plasmide pPY32 a été obtenu après digestion partielle du plasmide pPY31 par BglII, suivie d'une digestion totale par BamHI, puis religature. Le plasmide pPY32 correspond donc à la délétion du génome de l'adénovirus Ad5 située entre le site BamHI du plasmide pPY31 et le site BglII localisé en position 30818. Une carte de restriction du fragment Hindi du plasmide pPY32 est donnée à la Figure 5.Une caractéristique du plasmide pPY32 est qu'il possède des sites SalI et XbaI uniques b) Construction du plasmide pPY47 Le fragment BamHI(21562)-XbaI(28592) du génome de Padénovinrs Ad5 a tout d'abord été cloné entre les sites BamHI et XbaI du vecteur plC19H préparé à partir d'un contexte dam-, ce qui génère le plasmide pPY17. Ce plasmide contient donc un fragment HindIII (26328)-BglII(28133) du génome de l'adénovirus Ad5, qui peut être cloné entre les sites Hindi et BglII du vecteur pIC20R, pour générer le plasmide pPY34. Une caractéristique de ce plasmide est que le site BamHI provenant du multisite de clonage est localisé à proximité immédiate du site Hindm(26328) du génome de l'adénovirus Ad5. Le fragment BamHI (21562)-HindIII(26328) du génome de radénovirus Ad5 provenant du plasmide pPY17 a ensuite été cloné entre les sites BamHI et Hindm du plasmide pPY34, ce qui génère le plasmide pPY39. Le fragment BamHl-XbaI du plasmide pPY39 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovinis Ad5 comprise entre les sites BamHI(21562) et BglII(28133), a ensuite été cloné entre les sites BamHI et XbaI du vecteur pIC19H préparé à partir d'un contexte dam-. Ceci génère le plasmide pPY47 dont une caractéristique intéressante est que le site SalI provenant du multisite de clonage est localisé à proximité du site Hindi (figure 6). c) Construction du plasmide pPY55 Le fragment SalI-XbaI du plasmide pPY47 préparé à partir d'un contexte dam-, et qui contient la partie du génome de l'adénovirus Ad5 allant du site BamHI(21562) jusqu'au site BglII(28133), a été cloné entre les sites SalI et XbaI du plasmide pPY32, ce qui génère le plasmide pPY55. Ce plasmide est directement utilisable pour l'obtention d'adénovirus recombinants au moins délétés pour la région E3 (délétion entre les sites BglII localisés aux positions 28133 et 30818 du génome de l'adénovirus Ad5) et pour la région E4 dans son intégralité (délétion entre les sites MaeII(32811) et HaeIII(35614) du génome de l'adénovirus Ad5 (figure 6). A.2. Construction du plasmide pMGal Pour cela, un plasmide portant les 1TR jointives de rAd5, la séquence d'encapsidation, le gène E4 sous controle de son propre promoteur et, comme gbne hétérologue, le gène LacZ sous controle du promoteur LTR du virus RSV a été construit (figure 7). Ce plasmide, désigné pE4Gal a été obtenu par clonage et ligature des fragments suivants (voir figure 7): - fragment HindIn-SacII issu du plasmide pFG144 (Graham et al, EMBO J. 8 (1989) 2077). Ce fragment porte les séquences ITR de rAd5 en tête à queue et la séquence d'encapsidation : fragment Hindi (34920)SacII (352). - fragment de l'Ad5 compris entre les sites SacII (localisé au niveau de la paire de bases 3827) et PstI (localisé au niveau de la paire de bases 4245); - fragment de pSP 72 (Promega) compris entre les sites PstI (pb 32) et SalI (pb 34); - fragment XhoI-XbaI du plasmide pAdLTR GallX décrit dans Stratford Perricaudet et al (JCI 90 (1992) 626). Ce fragment porte le gène LacZ sous controle du LTR du virus RSV. - fragment XbaI (pb 40) - NdeI (pb 2379) du plasmide pSP 72; - fragment NdeI (pb 31089) - Hindi (pb 34930) de l'Ad5. Ce fragment localisé dans l'extrémité droite du génome de rAdS contient la région E4 sous controle de son propre promoteur. Il a été cloné au niveau des sites NdeI (2379) du plasmide pSP 72 et Hindi du premier fragment. Ce plasmide a été obtenu par clonage des différents fragments dans les régions indiquées du plasmide pSP 72. 11 est entendu que des fragments équivalents peuvent être obtenus par l'homme du métier à partir d'autres sources. A.3. Co-transfection dans les cellules 293 Les adénovirus sont obtenus recombinaison in vivo, selon les stratégies suivantes: (i) L'ADN du virus Ad-dl324 (Ihimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le plasmide pPY55, tous deux digérés par BamHI, sont d'abord ligaturés in vitro, puis cotransfectés avec le plasmide pE4Gal dans les cellules 293. (ii) L'ADN du virus Ad-dl324 digéré par EcoRI et le plasmide pPY55 digéré par BamHI sont contranfectés, avec le plasmide pE4Gal, dans les cellules 293. (iii) L'ADN de l'adénovirus Ad5 et le plasmide pPY55, tous deux digérés par BamHI, sont ligaturés puis cotransfectés avec le plasmide pE4Gal dans les cellules 293. (iv) L'ADN de l'adénovirus Ad5 digéré par EcoRI et le plasmide pPY55 digéré par BamHI sont cotransfectés avec le pE4Gal dans les cellules 293. Les stratégies (i) et (ii) permettent de générer un adénovirus recombinant délété pour les régions El, E3 et M; les stratégies (iii) et (iv) permettent de générer un adénovirus recombinant délété pour les régions E3 et E4. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une lignée cellulaire dérivée d'une lignée exprimant la région El, par exemple la lignée 293, et exprimant également au moins les phases ouvertes 0RF6 et 0RF6/7 de la région E4 de l'adénovirus Ad5 (Cf FR93 08596). L'utilisation de telles lignées permet d'éviter l'emploi du plasmide pE4Gal. B/ Construction de l'adénovirus délété dans les gènes IVa2. El. E3 et E4. Cet adénovirus a été obtenu par recombinaison, après co-transfection dans les cellules 293 du plasmide pC02 (exemple 2) et la partie droite d'un adévovirus au moins délété pour la région E4, et par exemple l'adénovirus obtenu après utilisation du plasmide pPY55 (cf. section A). Après co-transfection au phosphate de calcium, les cellules sont récoltées, disruptées par trois cycles de congélation-décongélation dans leur surnageant, puis centrifugées à 4000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu est ensuite amplifié sur culture cellulaire fraiche. Les virus sont alors purifiés à partir de plages et lerP ADN est analysé selon la méthode de Hirt (précité). Des stocks de virus sont ensuite préparés sur gradient de chlorure de césium. REVENDICATIONS 1. Adénovirus recombinant défectif dans lequel le gène IVa2 au moins est inactivé. 2. Adénovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène IVa2 est inactivé par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases. 3. Adénovirus recombinant selon la revendication 2 caractérisé en ce que le gène IVa2 est inactivé par délétion partielle. 4. Adénovirus recombinant selon la revendication 3 caractérisé en ce que le gène IVa2 est inactivé par délétion d'un fragment allant du nucléotide 4106 au nucléotide 5186. 5. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une région d'encapsidation. 6. Adénovirus recombinant selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acides nucléiques hétérologue. 7. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El et IVa2. 8. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion au niveau du gène El, allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, et une délétion au niveau du gène IVa2, allant du nucléotide 4106 au nucléotide 5186. 9. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes E4 et IVa2. 10. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2 et E3. 11. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2 et M. 12. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2, E3 et E4. 13. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, IVa2, E3, L5 et E4. 14. Adénovirus selon l'une des revendication précédentes caractérisé en ce qu'il est d'origine humaine, animale, ou mixte. 15. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovx d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). 16. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovints d'origine canine, bovine, mutine, ovine, porcine, aviaire et simienne. 17. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend en outre une partie du gène E3 codant pour la protéine gpl9K sous controle d'un promoteur hétérologue. 18. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue comporte un gène thérapeutique et/ou un gène codant pour des peptides antigéniques. 19. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule, l'organe et/ou l'organisme infecté. 20. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend en outre une séquence de sécrétion 21. Adénovirus recombinants défectifs caractérisé en ce qu'il porte une délétion allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. 22. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adéflovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 21. 23. Composition pharmaceutique selon la revendication 22 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 24. Plasmide pC0l ayant les caractéristiques représentées sur la figure 3. 25. Plasmide pC02 ayant les caractéristiques représentées sur la figure 4.