FR 2712301 A1 19950519 FR 9313442 A 19931110 Séquence nucléotidique du promoteur de la cycline A humaine et séquences anti-sens v relatives La présente invention concerne la séquence d'ADN du promoteur de la cycline A humaine, toute séquence nucléotidique ADN ou ARN correspondant à tout ou partie de la séquence du promoteur, et aux séquences anti-sens y relatives aptes à bloquer la transcription du gène de la cycline A. Les cyclines sont des protéines-clef de la régulation du cycle cellulaire. La cycline A humaine et son gène ont été récemment découverts lors d'études portant sur l'intégration de 1'ADN du virus HBV dans le génome humain. Du mme coup, le séquençage de l'ADNc de cette cycline A a été effectué et publié par J. Wang et al. dans Nature, volume 343, février 1990, pages 555 à 557. La cycline A humaine agit lors des phases S et G2/M du cycle cellulaire et est donc associée à la division cellulaire dont elle constitue un élément indispensable. On sait d'autre part que la cycline A est impliquée dans la prolifération cellulaire. J. Wang et al. (ci-dessus) l'ont montré à propos de l'intégration de l'ADN du virus HBV, laquelle est présente dans les cellules hépatiques à un état précoce du développement tumoral. Dans la demande de brevet internationale WO 91/12 324, il est indiqué que l'expression de la cycline A était maximum dans les leucémies aiguës myéloblastiques hyperleucocytaires à temps de doublement rapide et très faible dans le cancer primitif du foie, pour lequel le temps de doublement de la tumeur est lent. Il y est proposé de bloquer la synthèse de cycline A dans des hépatocytes à l'aide d'un ADN cycline A humaine anti-sens, comme cela a d'ailleurs été rapporté par F. Zindy et al. dans Biochem. and Biophys. Research Comm., février 1992, vol. 182, n 3, pages 1144 à 1154. Conformément à l'invention, le gène complet de la cycline A humaine avec son promoteur a été caractérisé et séquence et l'on a découvert qu'il était alors possible de bloquer la transcription de ce gène, ouvrant la voie à de nouveaux traitements préventifs et curatifs de la prolifération cellulaire en général. L'invention a donc en premier lieu pour objet la séquence d'ADN du promoteur de la cycline A humaine représentée à la figure 4, séquence qui trouve notamment son utilité dans la détermination et la préparation de molécules anti-sens destinées à bloquer la synthèse in vivo de cycline A et donc la prolifération cellulaire. Elle a aussi pour objet toute séquence de nucléotides (ADN ou ARN) correspondant à tout ou partie de la séquence de ce promoteur, ainsi qu'aux séquences d'ADN la comprenant en tout ou partie. En second lieu, l'invention a pour objet les séquences nucléotidiques anti-sens complémentaires de tout ou partie, de préférence d'une partie, de la séquence du promoteur de la cycline A humaine et aptes à bloquer la transcription du gène lorsque l'anti-sens se lie à sa séquence complémentaire. Il peut s'agit d'ADN ou d'ARN anti-sens, et notamment d'oligonucléotides anti-sens. Les anti-sens peuvent tre produits par toute technique connue, par exemple par synthèse chimique pour des anti-sens de petites dimensions, notamment oligonucléotides. A partir de la séquence du promoteur et de la fraction choisie de celle-ci, la synthèse de l'anti-sens est un travail de routine pour le spécialiste. Il peut notamment utiliser la voie bien connue et largement documentée des phosphoramidites, en particulier en mettant à profit les appareils automatiques de synthèse qui travaillent à partir de la séquence oligonucléotidique entrée au clavier. La synthèse est suivie de préférence, comme cela est bien connu, par une purification, par exemple par électrophorèse en gel d'acrylamide ou par HPLC (chromatographie liquide à haute performance) sur colonne en phase inverse ou en échange d'ions. En outre, si les fragments choisis sont relativement longs, notamment dépassent les 50 bases, on peut, comme cela est également bien connu, synthétiser des fragments plus petits par les méthodes classiques telles que celle qui vient d'tre décrite, puis synthétiser les parties manquantes par voie biologique par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le spécialiste peut aussi produire des anti-sens par réplication de tout ou partie du brin d'ADN sens du promoteur de la cycline A humaine. On peut avantageusement insérer l'ADN dans des plasmides qui permettent la synthèse d'ARN anti-sens. On a indiqué sur la séquence du promoteur représentée à la figure 4 un certain nombre de sites individualisés, ce qui constitue un guide, non limitatif, pour le choix de parties de cette séquence qui pourront donner lieu à un anti-sens. Bien entendu, comme cela est bien connu, la spécificité des oligonucléotides dépend de leur longueur et il est donc préférable qu'ils présentent un minimum de 30 paires de bases environ, et notamment recouvrent plusieurs sites. Comme cela est également connu, l'anti-sens peut agir au moment de la transcription du gène, donc sur le brin sens déroulé. Il peut aussi s'agir d'un anti-sens anti-double brin venant directement se fixer sur la double hélice d'ADN. On peut en outre modifier les oligonucléotides anti-sens dans un dessein de protection contre les nucléases, par exemple par greffage de ligands (alkylphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate), modification du squelette phosphodiester, substitutions (2'-O-alkyl), utilisation d'anomères du sucre (alpha-oligomère). On peut améliorer leur pénétration dans la cellule par greffage de ligands hydrophobes ou polycationiques (cholestérol, poly-lysine, cytokines) ou par leur association avec des liposomes ou des lipoprotéines. Leur affinité vis-à-vis de leur cible peut aussi tre accrue par exemple par leur liaison covalente à des agents intercalants, par modification de bases, du squelette ou par l'emploi de groupements réactifs, par exemple alkylants. La séquence du gène de la cycline A humaine avec le promoteur est représentée en totalité à la figure 1B. En effet, l'invention prévoit aussi la préparation d'anti-sens recouvrant, en plus de tout ou partie du promoteur, une partie du gène proprement dit. L'anti-sens a de préférence au plus 2000 paires de bases. L'invention permet donc la réalisation de séquences anti-sens composées de préférence d'au moins 30, et d'au plus 2000, paires de bases. L'invention va tre maintenant décrite plus en détail par la description de la caractérisation et du séquençage du promoteur de la cycline A humaine en liaison avec le dessin annexé. La figure 1 présente la structure primaire du gène de la cycline A. En (A), la carte de restriction du gène de la cycline A humaine. Les boîtes représentent les exons, les boîtes pleines les séquences codantes. Les abréviations signifient : H : HindIII ; S : SacI ; Xh : XhoI ; N : NheI ; : BglII ; R : EcoRI ; pA indique les sites majeurs de polyadénylation. En (B), la séquence nucléotidique complète du gène de la cycline A, y compris le promoteur. Les exons sont soulignés. Le codon de début de traduction, le codon stop, les signaux de polyadénylation (AATAAA) et les séquences de dégradation d'ARNm (ATTTA) sont soulignés deux fois. L'extrémité 5'de l'exon 1 correspond au site de début de transcription le plus en 3' (voir fugure 2). L'extrémité 3'de l'exon 8 représente le site prédominant de polyadénylation. La figure 2 représente en (A) des Northern blot d'ARN de Raji sélectionnés à l'aide d'oligo (dT), hybridés avec 1'ADNc de 1,6 kb de la cycline A ; en (B) des Northern blot d'ARN de NL 60 préparés aux instants qui sont indiqués plus loin d'un traitement à l'actinomycine D et hybridés avec une sonde c-myc et une sonde cycline A. La figure 3 représente la cartographie du site de début de transcription de la cycline A. En (A) est représentée la carte du premier exon sur laquelle sont représentées les deux sondes utilisées lors d'une analyse sans protection contre la nucléase S1. Les abréviations signifient : S : SacI ; Xh : XhoI ; N : NheI. (B) correspond à la protection de la sonde 1 vis-à-vis de la nucléase S1. Les colonnes indiquent de gauche à droite : colonne"sonde 1 : sonde 1 non digérée ; colonne"Marqueur" : indicateur de poids moléculaire (la taille est donnée par le nombre de paires de bases) ; colonne"ARNt" : ARNt hybridé avec la sonde 1 et digéré par la nucléase S1 ; colonne"Raji" : ARN de la lignée cellulaire du mme nom, hybridé avec la sonde 1 et digéré par la nucléase S1. La taille des fragments protégés est indiquée à droite de la figure. (C) correspond à la protection de la sonde 2. Colonne"Marqueur" : indicateur de poids moléculaire (taille en paires de bases) ; colonne"Sonde 2" : sonde 2 non digérée ; colonne"ARNt": ARNt hybridé avec la sonde 2 et digéré par la nucléase S1 ; colonne Raji : ARN Raji hybridé avec la sonde 2 et digéré par la nucléase S1. La taille des fragments protégés est indiquée. La figure 4 donne la séquence de la région du promoteur de la cycline A. Les astérisques indiquent les lieux majeurs de début de transcription ( 2pb). La numérotation correspond à celle de la figure 1 ; la numérotation entre parenthèses se réfère au A du site d'initiation ATG du gène de la cycline A qui est numéroté 1. Les sites de liaison pour facteur de transcription consensus ou quasi-consensus sont soulignés. Une partie répétée de 10 pb et le site de début de traduction sont également soulignés. Les sites de restriction représentés sont ceux qui ont été utilisés pour les essais in vitro (voir la figure 5). La figure 5 se rapporte à un essai in vitro. La ligne supérieure montre l'exon 1 de la cycline A et les séquences en amont. Sont indiquées les positions des motifs consensus de facteur de transcription (voir la figure 4) et des sites de restriction utilisés pour la réalisation des fragments A à F montrés ci-après. Leur position relative par rapport à l'ATG du gène de la cycline A est indiquée. Les fragments A à F ont été clones en amont de l'ADNc de la luciférase et transfectés dans des cellules HeLa (voir Méthodes). Le pourcentage d'activité luciférase obtenue pour chacune de ces constructions est indiqué à droite des fragments promoteurs correspondants. 100 % correspond à l'activité du fragment A BamHI-XhoI de 3,6 kilobases. Les valeurs sont des valeurs moyennes arrondies obtenues sur au moins cinq transfections indépendantes. Les abréviations signifient : B : BamHI ; Bg : BglII ; H : HindIII ; S : Sacl ; A : AatII ; D : DraII ; Xh : XhoI ; : Smal. METHODES 1) Clonage et séauençage de 1 ADN On a construit une banque gnomique humaine (normal) en clonant de l'ADN placentaire partiellement digéré par Sau3a dans le vecteur phagique lambda EMBL3 coupé par BamHI. Un sous-clonage des inserts phagiques a été réalisé à l'aide du vecteur plasmidique pBluescript SK (Stratagene). On a préparé une banque d'ADNc dans le phage lambda gtlO à l'aide d'ARN sélectionné par oligo (dT) à partir d'un tissu tumoral de foie humain en amorçant la synthèse d'ADNc par oligo (dT). Le séquençage de l'ADN a été réalisé sur matrices plasmidiques double-brin dénaturées, par la méthode de terminaison de chaîne aux didésoxynucléotides en présence d'ADNpolymérase T7 modifiée (Sequenase = United States Biochemical) et d'amorces dérivées de séquences de vecteur ou d'insert. 2) Etude de stabilité de l'ARN cycline A Des cellules en culture asynchrone provenant de la lignée cellulaire HL60 (leucémie promyélocytique) ont été traitées avec 50 ug/ml de l'inhibiteur de transcription actinomycine D. Des Nothern blot d'ARN total préparés à différents instants après l'ajout de l'actinomycine D ont fait l'objet d'hybridation avec un ADNc cycline A de 1,6 kb (J. Wang et al., Nature, volume 343,555-557,1990), puis avec un fragment ClaI-EcoRI de 1,4 kb du troisième exon du gène humain c-myc. 3) Cartographie de l'extrémité 5'de l'ARN N Les sites de fixation du chapeau de l'ARN cycline A ont été localisés par analyse sous protection vis-à-vis de la nucléase Sl comme cela est décrit par D. Eick, Nucl. Acids. Res., 18,1199-1205,1990. On a utilisé deux sondes double-brin (figure 3), un fragment SacI-XhoI de 613 pb (sonde 1) et un fragment SacI-NheI de 827 pb (sonde 2), marqués respectivement au 32p à l'extrémité 5'aux sites Xho I et Nhe I. On a préparé de l'ARN à partir de lignées cellulaires HL60 (leucémie promyélocytique), Raji (lymphome de Burkitt), EW1 (sarcome d'Ewing) et de fibroblastes primaires humains normaux. 40 ug d'ARN et d'ARNt cellulaire à titre de contrôle ont été hybrides avec chaque sonde et digérés par la nucléase S1 (Boehringer, Mannheim). Les fragments protégés ont et é séparés sur gel de séquençage à 6 % de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie. 4) Etude du promoteur in vitro. On a construit le vecteur d'expression de la luciférase pL en insérant une séquence polylinker dans le site unique HindIII de pSVOAL 5' (J. R. De Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7,725-737). Les fragments de restriction gnomiques A à F (figure 5) ont été clones dans pL, soit directement, soit après réalisation d'extrémités franches, puis liges dans le site XhoI de pL. 2.105 cellules d'hépatocarcinome HeLa ou Huh7 (H. Nakabayashi et al., 1982, Cancer Res., 42,3858-3863) par disque de 35 mm ont été transfectés suivant la méthode au phosphate de calcium (F. L. Graham et al., 1973, Virology 52,456-467) pendant 8 heures avec 1,5 ug de plasmide reporter et 1 ug de plasmide pCH110 (Pharmacia) exprimant la Bgalactosidase. 36 heures après la transfection, les cellules ont été lysées dans 400 ul de tampon contenant 0,6 % de Nonidet P-40, NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 7,9 et 1 mM d'EDTA. L'activité luciférase de 100 ul de lysat clarifié a été mesurée comme cela est décrit par V. Nguyen et al. (Analyt. Biochem. 171,404-408,1988) à l'aide de luminomètre Berthold LB 9501. L'activité luciférase a été ramenée à l'efficacité de la transfection déterminée par l'activité B-galactosidase (P. Herbomel et al., 1984, Cell 39,653-662). L'activité luciférase des extraits cellulaires transfectés par le plasmide pL sans promoteur n'excède pas le niveau de base de la machine qui est de 50 RLU (Relative Light Units). Comme contrôle positif on a utilisé un plasmide dans lequel le promoteur du cytomegalovirus (CMV) est inséré dans pSVOAL 5'. La plus faible activité de promoteur observée pour un fragment situé en amont de la cycline A (fragment E-figure 4) était de 103 RLU. Pour chaque plasmide reporter, on a réalisé au moins 5 transfections indépendantes. RESULTATS 1) Clonage et sécuençage du gène de la cvcline A humaine. Un clone d'ADNc de 1,6 kb de la cycline A humaine avait été isolé d'une banque de foie normal à l'aide d'une séquence-sonde adjacente au site d'intégration du virus de l'hépatite B dans un carcinome hépatocellulaire (J. Wang, supra). En se servant de cet ADNc comme d'une sonde, une série de clones phagiques chevauchants ont été isolés à partir d'une banque placentaire, représentant 40 kb d'ADN gnomique. Une carte de restriction de cette région a été réalisée et un tronçon central de 12 kb, s'hybridant avec l'ADNc, a été sous-clone dans de petits clones pBluescript (Stratagene) chevauchants. Ces clones ont été séquences à l'aide d'amorces dérivées de vecteurs commerciaux et d'amorces spécifiques. La carte de restriction et la séquence sont représentés à la figure 1. 2) Clonage de l'ADNc cvcline A. Sur des Nothern blot d'ARN sélectionnés par oligo (dT), la sonde d'ADNc cycline A de 1,6 kb détecte une espèce majeure à 2,7 kb, une espèce mineure à 1,8 kb et une espèce très réduite à 2,5 kb (figure 2A). Etant donné que l'ADNc ne réagit pas avec des fragments de restriction supplémentaires sur Southern blot génomiques, mme dans des conditions non stringentes, les trois ARNm observés sont considérés comme dérivant du locus clone. Pour obtenir des ADNc cycline A en nombre suffisant pour représenter ces ARNm, une tumeur de foie abondant en ARN cycline A a été choisie pour construire une banque d'ADNc. 22 clones ont été isolés à l'aide de l'ADNc de 1,6 kb servant de sonde. Les 15 d'entre eux contenant une zone poly (A) ont été séquences en tout ou partie. 9 ADNc sur 15 étaient polyadénylés en position 8266 (par référence aux nucléotides) (figure 1), 18 pb en aval d'un signal consensus de polyadénylation (AATAAA). 6 clones d'ADNc sur 15 correspondaient à des ARNm polyadénylés en position 7341, 17 pb en aval d'un signal de polyadénylation. 1 ADNc représentait un ARN polyadénylé en position 7936, un signal de polyadénylation étant présent 23 pb en amont. Si l'on considère laposition des sites de fixation de chapeau de la cycline A dans la région 877-925 (voir plus loin), la taille et la fréquence relative de clonage des trois types d'ADNc ont une bonne concordance avec la taille et la fréquence relative des ARNm cycline A observés sur Nothern blot. Une comparaison de l'ADNc et de la séquence gnomique montre que le gène de la cycline A est organisé en huit exons présentant des bordures intron/exon et exon/intron canoniques. Les ARNm ne différent que dans le huitième exon, en ce qui concerne la longueur de leur région non codante en 3' (Figure 1). Du fait de la présence de trois signaux de dégradation d'ARNm ATTTA (G. Shaw et al., 1986, Cell 46, 659-667) dans la série majeure à 2,7 kb, un test a été réalisé pour savoir si cette série était moins stable que la série à 1,8 kb. Des cellules HL60 ont été traitées avec l'actinomycine D (inhibiteur de transcription). Un Nothern blot d'ARN préparé à différents instants après l'addition de l'actinomycine D a été hybridé avec une sonde cycline A et une sonde spécifique de c-myc servant de contrôle. La figure 2B ne montre toutefois aucune différence apparente de stabilité entre les deux ARNm cycline A majeurs ; leurs temps de demi-vie (moyenne sur le cycle cellulaire) sont supérieurs à trois heures. 3) Localisation et caractérisation fonctionnelle du promoteur de la cvcline A. Les sites de début de transcription de la cycline A ont été cartographiés à l'aide d'expériences sous protection vis-à-vis de la nucléase S1 en utilisant deux sondes différentes. Il a été localisé 10 points de début de transcription majeurs et quelques points mineurs dans la région de transcription 877-925 avec une précision de 2 pb (figure 3). Les sites de début de transcription se sont avérés identiques dans tous les types cellulaires étudiés (voir partie Méthodes). Toutefois, pour ce qui est des cellules HL60, plus de 90 ic de l'initiation de transcription s'effectue au site de début situé les plus près de l'extrémité 3' (nucléotide 925-non représenté). La figure 4 montre la séquence de la région en amont de la cycline A. Il n'y a pas de boîte TATA, mais une boîte CAAT inversée ou un site de liaison (position-311) NF-1/CTF (C. Santoro et al., 1988, Nature 334, 413-419). Il existe 4 sites Spl (positions-451,-428,-396,-141) (J. T. Kadonga et al., 1986, P. N. A. S. USA 83,5889-5893), un site ATF (position-335) (K. A. W. Lee et al., 1987, P. N. A. S. USA 84, 8355-8359) et deux sites chevauchants (positions-148 et-144) pour le facteur de transcription spécifique G1/S murin Yi (Q.-P. Dou et al., 1991, P. N. A. S. USA 88,11561161). Un site AP-1 quasi-consensus (P. Angel et al., 1987, Cell 49,721-739) se trouve en position-534. Deux motifs inclus TGCCT (-203) pourraient tre une cible pour p53 (S. E. Kern et al., 1991, Science 252,1708-1711). L'octamère TTTGGCTC (-225) possède une différence avec le site de liaison pour E2F du gène N-myc, tandis que l'octamère TTTGGCCG (-91) diffère d'une base par rapport au site E2F du promoteur c-myb (M. Mudryj et al., 1990, EMBO J. 9,2179-2184). A la position-555, on observe un 10-mère qui se répète à partir de la position-565. Pour l'identification fonctionnelle du promoteur de la cycline A et afin de définir les séquences amont nécessaires à la fonction promotrice, il a été clone différents fragments de restriction de la région en amont de la cycline A, les fragments étant placés devant l'ADNc de la luciférase de luciole servant de gène reporter (voir partie Méthodes). Les résultats obtenus en transfections sur cellules HeLa sont donnés à la figure 5. La séquence B, un fragment BglII-XhoI de 1,3 kb s'étendant de-1306 à-161 a en gros la mme activité promotrice dans des cellules en cycle que le fragment A BamHIXhoI (-3600 à-161), ce qui suggère que le fragment B contient les éléments régulateurs essentiels. L'activité du fragment B correspond à 0,15 fois l'activité du promoteur de contrôle CMV. Le retrait de la séquence-1303 à-612 du fragment B (on a alors le fragment D) conduit à une augmentation d'un facteur 3,6. La déletion de la séquence-612 à-334 du fragment B (on a alors le fragment C) conduit à l'élimination du site AP-1 et de la série de 3 sites Spl et modifie le site ATF de TGACGTCA en AGACGTCA. L'activité du fragment C correspond à 58 % de celle du fragment A. La déletion du fragment BglII- AatII de C (fragment E) réduit par contre l'activité promotrice de 10 fois (à 6% de celle du fragment A). Il faut noter que la procédure de clonage du fragment E a modifié le site ATF en CTACGTCA. L'activité du fragment E a été augmentée de 2,5 fois en y ajoutant le reste de la partie non codante de l'exon 1 (fragment F-334 à-12). La délétion des sites de début de la séquence F supprime complètement l'activité promotrice (fragment XhoI-SmaI, non représenté). Dans les cellules Huh7, les fragments E et F étaient inactifs d'un point de vue transcriptionnel (non représentés). Ces données impliquent que la séquence-1303 à-472 contient des éléments régulateurs positifs (C versus E) et négatifs (B versus D). L'addition de la région-472 à-334 qui présente les trois sites Spl au fragment E conduit à un accroissement de l'activité d'un facteur 60 (D versus E). La partie non codante de l'exon 1 qui contient les sites de liaison putatifs Spl et Yi contribue d'une manière positive à l'initiation de transcription de la cycline A (F versus E). PREPARATION DES ANTI-SENS 1)Oligonucléotides. A partir de la séquence représentée à la figure 4, on choisit une ou plusieurs régions couvrant entre 30 et 40 paires de bases. Les séquences anti-sens déterminées à partir des régions sélectionnées sont enregistrées dans un automate de synthèse disponible dans le commerce. Celui se charge ensuite de la synthèse des oligonucléotides anti-sens. Une purification des oligonucléotides est ensuite effectuée par électrophorèse préparative en gel d'acrylamide. Elle peut aussi tre réalisée par HPLC sur colonne en phase inverse ou en échange d'ions. Bien entendu, il est possible, comme cela est bien connu, de modifier les oligonucléotides pour les protéger contre les nucléases, pour améliorer leur pénétration dans les cellules-cible et leur affinité pour celles-ci. Des techniques disponibles ont été citées plus haut. 2) Longues chaînes. On peut produire un anti-sens recouvrant la totalité de la séquence du promoteur de la cycline A. Pour ce faire, on peut par exemple insérer l'ADN correspondant au promoteur, ce qui est rendu possible par la caractérisation qui en a été faite par les inventeurs, dans un plasmide apte à assurer la synthèse d'ARN en orientation anti-sens. REVENDICATIONS 1-Séquence d'ADN du promoteur de la cycline A humaine représentée à la figure 4. 2-Séquence de nucléotides correspondant à tout ou partie de la séquence d'ADN du promoteur de la cycline A humaine représentée à la figure 4. 3-Séquence d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence représentée à la figure 4. 4-Séquence nucléotidique anti-sens complémentaire de tout ou partie du promoteur de la cycline A humaine et apte à bloquer la transcription de l'ADN codant pour la cycline A humaine sur lequel cette séquence anti-sens vient se fixer. 5-Séquence nucléotidique anti-sens selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un ARN ou d'un ADN anti-sens. 6-Séquence nucléotidique anti-sens selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un oligonucléotide. 7-Séquence nucléotidique anti-sens selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 30 paires de bases. 8-Séquence nucléotidique anti-sens selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une partie complémentaire d'une fraction du gène de la cycline A humaine.