FR 2723834 A1 19960301 FR 9410290 A 19940825 ELECTRODE ET CAPTEUR DE DETECTION IN VIVO DU MONOXYDE D'AZOTE ET DE SES DERIVES ET PROCEDE DE DETECTION AMPEROMETRIQUE IN VIVO DU MONOXYDE D'AZOTE ET DE SES DERIVES La présente invention concerne une électrode et un capteur de détection in vivo du monoxyde d'azote et de ses dérivés, ainsi qu'un procédé de détection arrtpérométrique in vi vo du monoxyde d'azote et de ses dérivés du type R-NO. Chez les êtres humains et les animaux, le monoxyde d'azote NO est présent dans de nombreux organes (cerveau, pancréas), dans le système circulatoire et dans le système respiratoire. il joue aussi bien un rôle de messager (neuro-transmetteur) que d'agent inducteur des défenses immunitaires en participant à la destruction des éléments pathogènes. Les neuro-transmetteurs sont généralement stockés dans des vésicules synaptiques, puis libérés dans l'espace extra-cellulaire par des processus dépendants de l'activité électrique du neurone et impliquant divers canaux ioniques (K+, Na+, Ca2+). Une fois libérés, ces neuro-transmetteurs exercent leur action sur des cibles particulières à travers des récepteurs spécifiques. On suppose que le NO une fois synthétisé passe par diffusion dans la cellule cible et va activer le récepteur du NO. Par ailleurs, le NO peut jouer un rôle d'activateur ou d'lnhibiteur enzymatique. Cette propriété est utilisée par le système immunitaire dans les processus de destruction des éléments pathogènes. Ainsi, le NO libéré par certains lymphocytes, sous l'action des cytokines, pourrait diffuser rapidement dans les cellules voisines et les asphyxier en se Liant au site actif de l'hémoglobine. Enfin, le NO peut également inhiber la synthèse de l'AON (acide désoxyribonucléique) ou bloquer la chaîne de transfert des électrons impliqués dans l'énergie oxydative des cellules, au niveau des mitochondries. Dans certaines situations, lorsque les mécanismes de production du NO sont altérés, ce dernier peut être toxique et détruire certains éléments cellulaires. Ainsi, l'étude de malades atteints de maladies neurodégénératives comme par exemple la chorée de Huntington et la maladie d'Alzheimer a permis de mettre en évidence la neuro-toxicité du NO. Au niveau cellulaire, la demi-vie du NO en solution dans un milieu biologique est d'environ 5 secondes, ce qui explique la difficulté à le mettre en évidence par les méthodes d'analyse classiques. On pense que sa forte réactivité lui confère une action quasi-immédiate qui cesse avec l'arrêt de sa production. Le rôle biologique du monoxyde d'azote a été étudié dans de nombreux laboratoires, mais l'on connaît toutefois peu de procédés de détection directs et in vi vo. Les procédés connus de détection du monoxyde d'azote font appel à des procédés de détection conductimétriques cu électrochimiques. Le procédé de detection conductimétrique est basé sur les changements de conductivité d'un semiconducteur de type n (SnO2, NO?, ZnO, TiO2, Bi203, etc...) en présence de NO. Cette technique est toutefois peu sensible et peu sélective car le NO2 et d'autres composés tels que CO, S02 et 02 viennent interférer au moment de la détection. Cette technique a donc surtout été développée et testée pour détecter le NO2 plutôt que le NO. Cette technique est décrite par J. Huusko, V. Lantto et H. To.vela dans Sensors and Actuators B, 15-16, (1993), 245 ; par G. Wiegleb et J. Heltbaam dans Sensors and Actuators B, 17, (1994), 93 ; et par G. Williams et G.S.V. Coles dans Sensors and Actuators X, 15-16, (1993), 349. On connaît également un autre procédé de détection basé sur les changements de conductivité d'un substrat en quartz sur lequel sont déposées des molécules de phthalocyanines. Le système ainsi obtenu est sensible à NO2 mais la sensibilité à NO n'a pas été étudiée. Ce procédé est décrit par A.K. Ray, M.J. Cook, S.C. Thorpe et S. Mukhopadhyay dans Phys. Stat. Sol., 140, (1993), K85 ; et par R. Zhou, M. Haug, K.X. Geckeler et W. Gospel, dans Sensors and Actuators B, 15-16, (1993), 312. Parmi les méthodes de détection électrochimique, la détection du NO en solution est basée sur la conversion électrocatalytique du NO par des complexes métalliques de transition. Récemment, par M.M. Iravani, Z.L. Kruk et J. Millar dans un article paru dans J. Physiology, 467, (1993), 48P, ont montré qu'il était possible de détecter le NO à partir d'une simple électrode en fibre ce carbone, en l'absence d'un catalyseur et en utilisant la voltampérométrie cyclique à grande vitesse de balayage. Néanmoins, ce système de détection n T est pas du tout sélectif puisque de nombreux composés électroactifs et notamment les ions nitrites peuvent interférer avec la mesure du NO. En conséquence, un tel système de détection n' est pas susceptible d'être utilisé in vivo, où de nombreux éléments susceptibles d'interférer avec la mesure sont présents. La voie la plus explorée est l'immobilisation d'un catalyseur à la surface d'une électrode ain de réaliser des coucnes sensibles au NO. Cette immobilisation peut être réalisée soit par adsorption, soit par immobilisatlon dans une matrice polymère à la surface de l'électrode. La première technique est illustrée par l'article de J. Zhang, A.B.P. Lever et W.J. Pietro, Inorg. Chem., 33, (1994), 1392 qui décrit la réduction électrocatalyque du NO sur une complexone d'alizarine de fer, adsorbée sur des électrodes en graphite. La deuxième technique est illustrée par l'article de A.P. Doherty et J.G. Vos, J. Chers. Soc., Faraday Trans., 88, (1992), 2903 cui décrit une électrode au carbone vitreux recouverte d'un polymère rédox [Os(2,2'-bipyridyl)2(poly(4-vinylpyridine) )10CljCl. Ce polymère constitue un catalyseur potentiel de la réduction du NO mais malheureusement il gonfle lorsqu'il est immergé dans l'électrolyte, ce qui peut conduire à son détachement de l'électrode de carbone. Afin d'éviter la dégradation des ligands organiques qui entourent les sites actifs des catalyseurs, il est possible d'utiliser des catalyseurs avec des ligands inertes (face aux produits intermédiaires formés durant l'électrocatalyse) ou des catalyseurs capables de transférer de nombreux électrons au substrat en évitant ainsi la formation de produits intermédiaires. J.E. Toth et F.C. rnnson, J. Am. Chem. Soc., lil, (1989), 2444, ont montré que les hétéropolyanions mixtes du type [Feii XW1lO3g(HnO)ln- (avec X=P ou As et n=4 ; X=Ge ou Si et n=5) possèdent les deux caractéristiques précitées, ce qui permet de les impliquer dans la catalyse de la réduction du N 2- ou du NO, en phase homogène et de les utiliser dans des méthodes de détection en solution. La détection du NO in situ, c'est-à-dire dans les milieux biologiques Ta été étudiée que très récemment. L'article de K. Shibuki, Neuroscience Research, 9, (1990), 69 divulgue un microcapteur électrochL ue dont le principe de fonctionnement repose sur l'oxydation du NO sur une électrode de platine. Ce microcapteur a été utilisé pour la détermination de la concentration en NO sur des tranches de tissu cérébral. Néanmoins, ce microcapteur n'est pas sélectif et pour certains potentiels, le courant observé est attribuable non seulement à l'oxydation du NO mais également à l'oxydation du NO2-. Un tel microcapteur ne peut donc pas être utilisé pour des mesures in vivo. T. Malinski et Z. Taha, Nature, 358, (1992), 676 divulguent également un microcapteur permettant d'effectuer des mesures in situ du monoxyde d'azote. Ce microcapteur est constltué par une électrode en fibre de carbone recouverte d'un dépôt de poly[porphyrine tétrakis(3-méthoxy-4-:nydroxyphényl) de nickel (Il)], protégé par une couche d'un polysulfonate perfluoré connu sous le nom de marque Nafion (Aldrich). Ce microcapteur permet une détection du NO jusqu'à 10 nM, par la réaction d'cxydation du NO en NO+, sans interférence des ions nitrites et nitrates.Les auteurs de l'article précité ont utilisé leur microcapteur pour la détection du NO sanguin ou dans un milieu de culture contenant des cellules endothéliales provenant de l'artère pulmonaire du porc, voir l'article de T. Malinski, Z. Taha, S. Grunfeld, A. Burewicz, P. Tomboulian et F. kiechle, Anal. Chim. Acta, 279, (1993), 135. toutefois, un tel capteur est difficilement utilisab e n vivc, car il est fragile et manque de reproductibilité. Un essai de détection du NO in vivo et in situ a été réalisé et décrit dans l'article de A. Meulemans, Neuroscience Letters, 157, (1993), 7. Selcn cet article, une microélectrode en fibre de carbone a été implantée dans le cortex cérébral d'un rat. Aucun signal dû à l'oxydation ou à la réduction du NO n'a toutefois été observé alors que la détection en solution, d'une concentration de NO comprise entre 10-5 et 5x10-2 M, dans un tampon phosphate à pH 7,4, était possible avec la même électrode. L'auteur en a conclu que la concentration en NO dans le cortex devait se situer en dessous de la limite de détection de la microélectrode. L'invention a pour but de remédier aux inconvénients précités de l'art antérieur et de mettre au point une électrode de détection du monoxyde dTazote et de ses dérivés in vi vivo et in situ, ainsi qu'un procédé de détection. Selon les caractéristiques de l'invention, cette électrode comprend un support électriquement conducteur recouvert d'un film de polymère conducteur électronique dopé par des hétéropolyanions mixtes répondant à l'une des formules [M111X1W11039(H20)]n- ou [MIIIX2W17O61 (H20)]7- dans lesquelles M représente Fe, Rh, Al, Ga, In ou T1, Xl représente P OU As et n est égal à 4, Xl représente Si ou Ge et n est égal à 5, ou Xl représente 3 et n est égal à 6, X2 représente P ou As, ce film étant recouvert d'un polymère anionique choisi parmi la polyamide sulfonée, le polystyrène sulfonate ou le polysulfonate perfluoré. De préférence, le support conducteur est en carbone vitreux, en fibre de carbone, en or ou en platine. Lorsqu'il s'agit d'une fibre de carbone, l'électrode de travail selon l'invention est préparée par exemple, selon la technique suivante. On procède à l'étirement d'un tube capillaire en verre d'un diamètre externe de 1,5 mm et d'un diamètre interne de 1,3s mm jusqu'à obtenir une extrémité de quelques micromètres de diamètre. Une fibre de carbone d'un diamètre d'environ 30 m et d'une longueur de 20 à 40 mm est introduite dans ce capillaire jusqu'à ce qu'elle soit bloquée par l'étranglement formé à l'extrémité de celui-ci. L'extrémité du capillaire est coupée et la fibre de carbone est alors poussée de quelques millimètres.Ensuite, un fil d'argent d'un diamètre légèrement inférieur au diamètre interne du capillaire est trempé dans une solution de poudre d'argent et de résine puis introduit dans ce capillaire. Pendant son introduction, il est soumis à une rotation constante qui provoque l'enroulement sur lui-même de la fibre de carbone en assurant ainsi un contact électrique optimum. L'ensemble est laissé à sécher pendant environ 4 heures puis le fil d'argent est rendu solidaire du tube de verre par du ciment dentaire tandis que l'extrémité fine du capillaire d'où émerge la fibre de carbone est recouverte du film de polymère conducteur électronique dopé par les hétéropolyanions mixtes. De façon avantageuse, le support électriquement conducteur de l'électrode est recouvert du film de polymère conducteur électronique comprenant les hétéropolyanions mixtes par le procédé décrit ci-après. De préférence, on prépare tout d'abord une solution contenant d'une part un monomère précurseur capable par oxydation de former la matrice polymère et d'autre part un sel de l'hétéropolyanion mixte, répondant à l'une des formules suivantes An (MIIIXW11O39 (H2O) ]n ou -I[M-1X?W iX2Wl706l(H2o)]7 dans lesquelles A représente Na+, H+, K+ si la synthèse est réalisée dans l'eau ou A représente l'ion tétrabutylammonium [(C4H9)aN]+si la synthèse est réalisée dans l'acétonitrile, X et M étant tels que définis précédemment. Cette préparation a été décrite par F. Zonnevijlle, C.M. Tourné et G.F. Tourné, dans Inorg. Chem., 21, (1982), 2742-2751. Le choix du solvant de synthèse est dicté par la solubilité du monomère. Lorsque le polymère conducteur électronique est le poly(N-alkyipyrrole) , le solvant est l'acétonitrile, lorsqu'il s'agit d'une polyaniline, le solvant est liteau et lorsque ce polymère est le polypyrrole, le solvant utilisé est de l'eau ou de l'acétonitrile. Le sel d'hétéropolyanion mixte est utilisé comme électrolyte. L'oxydation électrochimique est réalisée par application d'une différence de potentiel entre l'électrode de travail préalablement traitée par électrochimiquement et une électrode de référence Ag/AgCl, immergée dans la solution de synthèse. Ceci permet de former directement sur l'électrode de travail, un dépôt de polymère conducteur électronique dopé par un hétéropolyanion mixte, dont l'épaisseur dépend de la durée d'application de la différence de potentiel. Cette électrosynthèse peut être réalisée de deux manières différentes a) par un balayage linéaire de potentiel entre deux bornes dont l'une est voisine du potentiel du début d'oxydation du onomere ; ou b) par une électrolyse à un potentiel ou à courant imposé. Dans les deux cas, l'électrosynthèse est suivie soit par chronoampérométrie si on impose un potentiel, soit par chronopotentlomé~rie si on impose un courant. Le dépôt croît de façon régulière sur l'électrode en fonction du temps. Dans les deux cas, on obtient un polymère conducteur comprenant généralement entre 0,04 et 0,12 hétéropolyanion mixte par motif monomère du polymère. Après l'électrosynthèse, l'électrode modifiée par le dépôt de polymère conducteur électronique dopé par l'hétéropolyanion mixte est trempé dans un solvant de synthèse puis dans de l'eau (si la synthèse n'a pas été réalisée dans de l'eau), avant d'être transférée dans une solution aqueuse tamponnée à un pH de 4,6 (CH3COOH 0,1 M et CH3COONa 0,1 M). De préférence, l'hétéropolyanion mixte est [FeIIIPW1103g(H20)]4- et le polymère conducteur électronique est le poly[N-méthylpyrrolej. De façon avantageuse, le film de polymère anionique déposé sur le film de polymère conducteur électronique est du polysulfonate perfluoré connu sous le nom de marque Nafion. Le Nafion n'est pas poreux et empêche la diffusion des ions nitrites (et d'autres anions susceptibles d'interférer lors des mesures in vi vo, tels que les anions dérivés des peptides), vers la surface du film de polymère conducteur électronique dopé en hétéropolyanion mixte. Toutefois, le Nafion n'empêche pas l'électrode de rester perméable au NO. Le Nafion est déposé sur l'électrode recouverte du polymère de manière potentiostatique. Plus précisément, une goutte de solution de Nafion est déposée au centre d'un anneau en tungstène et l'électrode de travail recouverte du film de polymère dopé est placée au centre de cet anneau, plongeant ainsi dans la goutte. Une forte différence de potentiel de 3,5 Volts est appliquée entre l'électrode de travail modifiée et l'anneau, pendant 5 fois 2 secondes. Cette étape est suivie d'un séchage à l'étuve à une température comprise entre 30 et 500C pendant 5 à 10 minutes environ.On obtient ainsi une couche de Nafion d'une épaisseur de 0,1 pm à 5 um L'invention concerne également un capteur pour la détection du monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vivo comprenant - une électrode de détection (ou électrode de travail) conforme à celle qui vient d'être décrite, - une électrode auxiliaire, - une électrode de référence, - des moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection et l'électrode de référence, et - des moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique circulant entre l'électrode de détection et l'électrode auxiliaire. De préférence, l'électrode de référence est une électrode Ag/AgCl et l'électrode auxiliaire est une électrode de platine ou de tungstène. Dans ce capteur, la détection ampérométrique du monoxyde d'azote NO est basée sur la mesure du courant catalytique accompagnant l'oxydation du NO en ion NO+, lorsqu'on utilise comme catalyseur, l'hétéropolyanion mixte immobilisé dans le polymère conducteur électronique. Plus précisement, la mesure est effectuée par voltampérométrie pulsée normale différentielle (VPNO), par balayage entre deux bornes de potentiel (0,4 à 1,3 V par rapport à une électrode Ag/AgCl), à une vitesse de balayage relativement faible (10 mV/s) . La réponse de l'électrode in vivo laisse apparaître un pic anodlque à 0,65 V environ et dont l'amplitude varie en fonction de la quantité de NO présent. Lors de l'oxydation du NO en NO+ en présence de l'hétéropolyanion mixte, deux mécanismes réactionneis peuvent être proposés, basés sur les hypothèses suivantes a) lors de l'oxydation électrocatalytique, le NO réagit avec les formes réduites de l'hétéropolyanion mixte immobilisé dans le polymère conducteur, pour former un complexe du type nitrosyl [FeiI(NO)XW1lO3g](n+l) . Le processus réactionnel est le suivant avec X=P, As et n=4 X=Si, Ge et n=5 X=B et n=6 b) L'électrocatalyse ne passe pas par la formation du complexe nitrosyl car à pH voisin de 7, sa constante de vitesse de formation est trop faIble. Le processus réactionnel est alors le suivant In vi vo, le balayage de potentiel est poursuivi pendant 2 à 3 heures, à raison d'un cycle toutes les 2 minutes.Il faut noter que la valeur du potentiel du pic (0,65 V) reste inchangée pendant ce temps. L'épaisseur du dépôt de polymère conducteur dopé par les hétéropolyanlons mixtes est directement liée à la charge accumulée pendant la synthèse du polymère cui est facilement mesurable au moyen d'un coulomètre. De préférence, on utilise des électrodes dans lesquelles le film de polymère conducteur électronique dopé par les hétéropolyanions mixtes a une épaisseur de 0,2 um à 2 Am, ce qui correspond à une charge accumulée de 10 à 100 mc/cm2 d'électrode. Le capteur selon la présente invention est performant et permet une mesure en temps réel de la concentration en NO. Il présente une bonne sensibilité puisqu'il permet de détecter jusqu'à 108M de NO, une bonne sélectivité puisque la réponse électrochimique n'est pas perturbée par des interférents et une stabilité de plusieurs heures susceptible d'être mise à profit pour la détection du NO dans des conditions chroniques, c'est-à-dire chez un animal non immobilisé et non anesthésié. Enfin, l'invention concerne également un procédé de détection ampércmétrique du monoxyde d'azote et de ses dérivés in vivo consistant à mesurer le courant catalytique accompagnant l'oxydation du NO en implantant in vivo les trois électrodes du capteur et en mesurant par voltampérométrie pulsée normale différentielle, l'intensité du pic obtenu à 0,65 V environ, cette intensité étant proportionnelle à la quantité de NO présent in vive. De préférence, la mesure est effectuée par voltampérométrie pulsée normale différentielle (V?ND). Cette technique est une modification intéressante de la voltampérométrie pulsée différentielle (VPD). Les sauts de potentiels délivrés sont d'amplitude croissante et à la fin de chaque saut, le potentiel retourne à sa valeur initiale. Ce retour à l'état initial constitue tout l'intérêt de la technique, car il permet à certains systèmes électrochimiques, sensibles à des potentiels trop oxydants, de ne pas être dégradés. Ce procédé est utilisable dans des domaines très divers - dans le domaine des neurosciences pour la mesure directe du NO dans le cerveau, associée à divers aspects comportementaux tels que le sommeil, l'apprentissage ou une situation de stress par exemple, - dans le domaine cardiovasculaire pour la détermination du rôle du NO dans les mécanismes de régulation de la pression. artérielle ou de la migraine, - dans le domaine de l'immunologie pour la détermination du rôle du NO dans la stimulation des défenses immunitaires, - dans le domaine de la pneumologie pour la détermination du rôle du NO dans la régulation de la respiration et dans le cancer du poumon et tous les états asthmatiques, et - dans le domaine de la mise au pcint de substances pharmacologiques, afin de pouvoir doser directement et in vivo les effets induits par le NO dans un organe cible. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la iecture de la description suivante, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, cette description étant faite en faisant reerence aux dessins joints, dans lesquels - la figure 1 est un schéma il lustrant une électrode de détection selon l'invention, - la figure 2 est une courbe représentant le cyclage électroonimique de l'électrode selon l'invention, implantée dans le cortex cérébral, - la figure 3 est une courbe représentant l'évolution de l'intensité Ipa mesurée à 0,65 V en fonction du temps de cyclage lors de la détection du NO in vivo pour les exemples i et 6, - la figure 4 est une courbe représentant le cyclage électrochimique de l'électrode immédiatement après la disparition totale du pic à 0,65 V, induite par l'inhibiteur de la NO-synthase, et - la figure 5 est une vue schématique de la cellule utilisée pour la détection du NO in vitro. L'électrode de travail 1 en fibre de carbone (préparée comme décrit précédemment) est illustrée en figure 1. Elle comprend un support électriquement conducteur 3 placé dans une pipette de verre 5. Son extrémité de mesure 7 dépasse hors de la pipette 5. Cette extrémité est recouverte du film polymère conducteur 9 dopé par des hétéropolyanions et d'une couche de polymère anionique 11. Son autre extrémité est reliée à un conducteur 13. On donne ci-après un exemple de réalisation de I'électrode de détection selon l'invention et de son application à la détection du NO. Exemple 1 : Détection du NO dans le cortex cérébral d'un rat à partir d'une fibre de carbone modifiée par un dépôt de poly(N-méthyl pyrrole) /[FeIIIPW11O39 (H20)]4- /Nafion (marque déposée) a) Traitement électrochimique de la microélectrode Ce traitement augmente considérablement la sélectivité et la sensibilité des électrodes de travail. Les processus =redox mis en jeu sont plus rapides. L'électrode de travail 1 nue ainsi que les électrodes de référence (Ag/AgCl) et auxiliaire (tungstène) sont immergées dans un tampon phosphate PBS (pH = 7,4 ; vol. = 2,5 ml) et connectées à un potentiostat ("Biopulse" marque déposée de Scléa, Tacussel). Il est rappliqué entre l'électrode de travail et l'électrode de référence une différence de potentel de 2,90 V pendant 20 s, puis de 1,30 V pendant 4 s (la variation du potentiel appliqué en fonction du temps est de forme triangulaire et la valeur de sa fréquence est de 70 Hz). Après ce traitement, les électrodes sont rincées à l'eau distillée. b) Synthèse du film poly(N-méthyl pyrrole)/ [FeIIIPW11O39(H20)]4- à la surface de la microélectrode On prépare tout d'abord le sel de l'hétéropolyanion (HPA) mixte [(C4H9)4N]4[Fe11PW11O39'H2O)], -7H20 (selon la méthode décrite par Zonnevijile et al.) qui va servir d'électrolyte support lors de la synthèse. (F. Zonnevijlle, C.M. Tourné et G.F. Tourné, Inorg. Chem., 21, (1982), 2751) Dans 100 ml d'eau, on ajoute 65,97 g de Na2WO4, 2H2O (2x10-1 mole) et 6,91 g de Na3PO4, 12 H20 (1,82x10-2 mole) . La solution est portée à 80 C. L'addition lente de 27,4 ml de HCl 37e à cette solution permet d'obtenir le sel Na7PW11O39. Durant cette étape, il faut veiller à ce que le pH soit toujours supérieur à 3 afin d'éviter la dégradation de [PWllO39]7- en [PW12040]3-. La solution est ensuite portée jusqu'à 95 C. Pour obtenir le sel de sodium de [FeTIIPW11O39 (H2O)14-, est nécessaire de lui ajouter par petites portions, 7,49 g de Fe(N03)3, 9H20 (1,85x10-2 mole), soit un excès de 2 par rapport à la quantité stoéchiométrlque. La solution devient jaune, orange puis marron et trouble. Elle est maintenue à 95 C pendant 15 minutes après la fin de l'addition. Ensuite, elle est filtrée à chaud pour récupérer l'excès de fer qui a précipité sous la forme Fe!OH)3. On laisse refroidir le filtrat à l'air, jusqu'à la température ambiante. Pour former le sel de tétrabutylammonium de [FeIIIPW11O39(H2O)]4-, on lui ajoute 23,6 g de [(C4H9)4N]Br 99% (7,27x10-2 mole) par petites portions et l'on constate qu'un précipité jaune apparaît. Celui-ci est recristallisé dans de l'eau chaude et le sel ainsi purifié est séché dans une étude à 90 C pendant 2 jours. Le rendement de la synthèse est voisin de 65% et la formule du produit, déduite de l'analyse élémentaire, est : [(C4H9)4N]4[Fe111PW11039(H20)], H2O. Ensuite, la synthèse électrochimique du poly(Nméthyl pyrrole)/[FeIIIPW11O39(H2O)]4- peut être réalisée. On prépare dans un pilulier en verre (5 mi) une solution d'acétonitrile contenant 5x10-2 M de [(C4Hg)4N] 4[Fe111PW11O39(H20)], #7H20 et 10-2 M de N-méthyl pyrrole. L'électrode de travail (fibre de carbone traitée), et les électrodes auxiliaire et de référence sont plongées dans cette solution puis connectées au potentiostat. Les films de poly(N-méthyl pyrrole)/ [FeIIIW11O39(H2O)]4- peuvent être synthétisés, soit par un balayage linéaire de potentiel, soit par électrolyse à potentiel imposé. Ces deux méthodes électrochimiques donnent des films d'éiectroactivité et de stabilIté comparables. Pour former sur ia fibre de carbone traitée un dépôt de poiy(N-méthyl pyrrole)/[Feii PW1l03g(H20)]4-, on la porte au potentiel de 0,86 V (contre Ag/AgC1) pendant 2 fois o0 s. Après une courte période transitoire, le courant de synthèse alors enregistré (lors de la chronoampérométrie) est constant, traduisant ainsi une croissance régulière du film sur l'électrode de travail. Celui-ci contient approximativement 0,06 à 0,C8 [FeIIIPW11O39(H20)]4- par motif (N-méthyl pyrrole) (valeur déduite de l'analyse élémentaire). Après i'électrosyntnèse, les trois électrodes sont rincées dans i'acétonitrile, puis dans l'eau avant de les transférer dans une solution aqueuse tamponnée à pH=4,6 avec 0,1 M CH3COOH et 0,1 M CH3COONa. c) Dépôt de Nafion (marque déposée) sur le film de poly(N-méthyl pyrrole)/[FeiiIPW1l039(H20)]4~ Ce dépôt est effectué comme indiqué précédemment. d) Cyclage de l'électrode modifiée dans un tampon phosphate (pH=7,4) L'électrode de travail (fibre de carbone modifiée) ainsi que les électrodes de référence et auxiliaire sont plongées dans un tampon PBS (pH=7,4 vol.=2,5 ml), dégazé auparavant à l'argon pendant 30 minutes. Dans ce milieu, le cyclage de l'électrode modifiée est réalisé entre 0,4 et 1,3 V (contre une électrode de référence Ag/AgCl) à 10 mV/s. Le courant anodique obtenu par VPND diminue tout d'abord puis augmente à partir de 0,9 V ce qui signifie que l'électrode de travail est étanche. La réponse se stabilise au bout de 6 à 7 cycles avec 1 cycle/2 min. A ce moment, le cyclage est stoppé et les trois électrodes sont laissées dans le tampon. Ces électrodes sont ainsi stabilisées. Le cyclage ayant été effectué à un pH voisin de 7, ces électrodes sont prêtes à fonctionner en milieu biologique. e) Préparation de l'animal en vue de l'implantation des électrodes Un rat mâle de 320 g a été utilisé comme animal d'expérience. La phase chirurgicale débute après l'anesthésie (Chloral Hydrate Cl3CCH(OH)2, 400 mg/kg) et l'immobilisation de la tête de l'animal en position stéréotaxique. La cranlectomie est alors réalisée. Pour cela une incision sagittale médiane du plan cutané cranien dorsal est pratiquée. Cette incision est suivie de la résection des plans musculaires sous-jacents. a boîte cranienne, ainsi rendue accessible, est alors très méticuleusement nettoyée avec une solution contenant des antibiotiques et des sulfamides.Les orifices permettant de mettre en place les électrodes de référence (cortex occipital : (CxO), auxiliaire (CxO) et de travail (électrode à NO : Cx frontal droit, premiers 500 Am)) sont réalisés grâce à un tour de dentiste. Enfin, pour éviter une compression cérébrale lors de l'introduction de l'électrode de travail, la dure-mère, interposée entre la paroi osseuse externe et le tissu cérébral, est au préalable incisée. Dès que les électrodes sont mises en place, les enregistrements peuvent débuter. Une mesure est réalisée toutes les deux minutes. Le niveau de l'anesthésie est maintenu par des injections répétées de chloral hydrate (concentration : 100 mg/ml 0,2 ml/20 min). f) Détection du NO in vivo Après la mise en place des trois électrodes, les enregistrements in vivo débutent. La réponse de l'électrode modifiée obtenue par VPND (balayage entre 0,4 et 1,3 V ; électrode de référence Ag/AgCl ; 1 cycle/2 min ; vitesse de balayage =10 mV/s) laisse apparaître un pic anodique très fin 0,65 V (intensité 6,5 nA), correspondant à l'oxydation du NO catalysée par 1'HPA mixte immobilisé. Sur la figure 2, on peut constater que la auteur du pic est d'environ 6,5 ra, après stabilisation au bout de 2 heures. La variation e l'IntensIté du pic en fonction du temps de cyclage est montrée sur la figure 3. En 3 heures de cyclage, une diminution de 20% de l'intensité de ce pic est ooservée, probablement lié au trawa d'introduction de l'électrode. g) Action dlun inhibiteur de la NO-synthase Au bout de 3 heures de cyclage (après la fin d'un cycle et avant le début du suivant), llinhibiteur se la NO-synthase (ici la L-arginine p-nitroanilide 200 mg/kg) est administré à l'animai par voie intrapéritonéale. Après cette injection, une diminution progressive du pic anodique de 6 nA à 0,65 V est observée. Sa disparition est totale au bout de 22 minutes. La poursuite du cyclage sur 16 minutes supplémentaires montre qu'il ne réapparaît pas (voir figure 4). On notera que in vivo et dans une solution de NO cette même électrode détecte toujours un signal. Exemples 2 à 5 : Comparaison des caractéristiques (sensibilité, stabilité et action d'un inhibiteur de la NO-synthase) de plusieurs microcapteurs implantés dans le cortex cérébral de plusieurs animaux. Le protocole décrit dans l'exemple 1, est aussi utilisé pour l'implantation de quatre fibres de carbone modifiées par un dépôt de poly(N-méthyl pyrrole)/ [FeIIIPW11039(H20)4-/Nafion chez six rats différents. Les réponses électrochimiques enregistrées (dans le tampon PBS, dans le cortex cérébral : avant et après l'action d'un inhibiteur de la NO-synthase) présentent une allure similaire à celles enregistrées dans l'exemple 1. Les principaux résultats sont réunis dans le tableau 1. Tableau 1 Diminution de Temps de disparition Exemple Masse du rat (g) Ip(nA)a Ip en 2 h de totale du pic anodique cyclane (%) min b 1 320 6,1 20 22 2 310 2.0 30 32 3 1 290 4,5 # 10 10 mort du rat avant test 4 295 1,7 25 32 5 305 3,1 # 10 46 6 270 2.5 5 24 a Intensité du pic à 0,65 V correspondant à l'oxydation catalytique de NO (au bout de 2 h de cyclage avec 1 cycle toutes les 2 minutes). b Disparition induite par l'inhibiteur de la NOsynthase (L-arginine p-nitroanilide). Exemple 6 : Réimplantation d'un microcapteur à NO d'un rat de l'exemple 1 à un autre rat Après l'action de l'inhibiteur de la NO-synthase, les trois électrodes de l'exemple 1 sont otées du cortex cérébral du rat pour être réimplantées dans celui d'un autre rat dont la masse est de 270 g. Entre 0,4 et 1,3 V (électrode de référence Ag/AgCl), la réponse de l'électrode modifiée présente une allure similaire à ce lue testée dans l'exemple 1 (1 cycle/2 min). Le pic correspondant à l'oxydatlon catalytique du NO est toujours observé à 0,65 V mais son intensité est nettement plus aible (2,5 rA). Néanmoins, cette grandeur ne diminue pratiquement pas sur 2 h de cyclage (voir figure 3). Au bout de ce temps (après la fin d'un cycle et avant le début du suivant) la L-arginine p-nitroanilide est administrée par voie intrapéritonéale (200 mg/kg). La disparition totale du pic à 0,65 V intervient au bout de 24 min. La poursuite du cyclage sur 16 min montre qu'il ne réapparaît pas. Ceci montre que ie microcapteur selon l'invention peut être utilisé pour effectuer des mesures sur plusieurs individus successifs et que l'usage de l'inhibiteur n'altère pas les performances de l'électrode. Exemple 7 : Estimation de la concentration en NO au niveau du cortex cérébral d'un rat à partir de mesures in vitro Le protocole décrit dans l'exemple 1 est toujours utilisé pour l'implantation des trois électrodes (travail, référence et auxiliaire) dans le cortex cérébral d'un rat (masse=320 g). Après 2 heures de cyclage (entre 0,4 et 1,3 V ; 1 cycle/2 min), la réponse de l'électrode modifiée est stable et présente un pic anodique localisé à 0,65 V (électrode de référence Ag/AgCl) et dTintensité 2,5 nA. Afin d'estimer la concentration en NO in vivo, les trois électrodes sont otées du cortex du rat et placées dans la cellule en verre représentée en figure 5 où les électrodes de référence et auxiliaire portent respectivement les références 15 et 17. La réponse électrochimique de l'électrode modifiée, est enregistrée entre 0,4 et 1,3 V, d'abord dans un tampon PBS dégaze, puis dans de l'eau distillée contenant NO à 10-6 M. Dans ce dernier mi lieu, il apparaît à 0,70 V un pic correspondant à l'oxydation catalytique du NO. Son intensité n'est pas constante en fonction de la température. En effet, une étude réalisée sur une fibre de carbone modifiée et n'ayant pas été utilisée à la détection in vi vo, a montré que l'intensité du pic anodique en présence de NO à 10-5 M variait de 25 nA (à 270C) à 37 nA (à 37 C). Par conséquent, pour avoir une bonne estimation de la concentration en NO in vi vo, la réponse électrochimique sera enregistrée à 370C (température au niveau du cortex cérébral du rat). A cette température, l'intensité du pic anodique en présence de NO à 10- M est voisine de 1 nA. En remplaçant cette solution par de l'eau distillée contenant NO à 5x10-6 M, l'intensité est cette fois-ci de 5,2 nA. S'il existe en solution une relation linéaire entre l'intensité et la concentration en NO, cette dernière au niveau du cortex du rat peut être estimée à 2,5x10-6 M. Pour ne pas fausser les mesures réalisées in vitro, toutes les manipulations se ont sous atmosphère inerte (dégazage des solutions à l'argon, cellule et seringues étanches). REVEND I CATIONS 1. Electrode (1) de détection in vivo du monoxyde d'azote et de ses dérivés, caractérisé en ce quelle comprend un support électriquement conducteur (3) recouvert d'un film de polymère conducteur électronique (9) dopé par des hétéropolyanions mixtes répondant à l'une des formules [MIIIXIW11O39(H2O)]n- ou [MIIIXW17O61(H2O)]7- dans lesquelles M représente Ee, Rh, AD, Ga, In ou T1, X1 représente P ou As et n est égal à 4, X1 représente Si ou Ce et n est égal à 5, ou X1 représente 3 et n est égal à 6, X2 représente P ou As, ce film (9) étant recouvert d'un polymère anionique (11) choisi parmi la polyamide sulfonée, le polystyrène sulfonate ou le polysulfonate perfluoré. 2. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que e film (9) contient 0,04 à 0,12 hétéropolyanion mixte par motif monomère du polymère conducteur électronique. 3. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère conducteur électronique (9! es le poly(N-alkylpyrrole), le polypyrrole ou la wolyanl lne. 4. Electrode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le polymère conducteur électronique est Le zoly(N-méthylpyrrole). 5. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le film (9) de polymère conducteur électronique a une épaisseur de 0,2 à 2 um. 6. Electrode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'hétéropolyanion mixte est [FeIIIPW11O39 (H20) ]4- 7. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support conducteur (3) est en carbone vitreux, en fibre de carbone, en or ou en platine. 8. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère anionique (11) est le polysulfonate perfluoré. 9. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la couche de polymère anionique (llj a une épaisseur de 0,1 à 5 ssm. 10. Capteur pour la détection de monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vivo, caractérisé en ce qu'il comprend - une électrode de détection (1) du NO selon L'une quelconque des revendications 1 à 9, - une électrode auxiliaire (17), - une électrode de référence (15), - des moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection (1) et l'électrode de référence (15), et - des moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique circulant entre l'électrode de détection (1) et l'électrode auxiliaire :i7). 11. Capteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'électrode de référence (15) est une électrode Ag/AgCl. 12. Capteur selon la revendication 10, caractérIsé en ce que l'électrode auxiliaire (17) est une électrode de platine ou de tungstène. 13. Capteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que les moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection ( et L'électrode de référence (15) et les moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique clrcujant entre l'électrode de détection (1) et l'électrode auxiliaire (17) forment une unité de mesure par voltampérométrie pulsée normale différentielle. 14. Procédé de détection ampérométrique du monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vivo, caractérisé en ce que l'on mesure le courant catalytique accompagnant l'oxydation du NO en implantant in vivo les trois électrodes (1, 15, 17) du capteur selon l'une quelconques des revendications 10 à 12 et en mesurant par voltampérométrie pulsée normale différentielle, l'intensité du pic obtenu à 0,65 V environ, cette intensité étant proportionnelle à la quantité de NO présent in vive. 15. Procédé de détection selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on réalise une courbe d'étalonnage in vitro avant d'effectuer les mesures in vi vo.