FR 2721510 A1 19951229 FR 9407628 A 19940622 NANOPARTICULES FILTRABLES DANS DES CONDITIONS STERILES La présente invention concerne des nanoparticules de très petites dimensions qui présentent outre l'avantage de pouvoir circuler dans le flux sanguin sans problème de dimension au niveau des capillaires, celui de pouvoir être filtré de façon stérile. Dans les demandes de brevet EP 520 888 et EP 520 889 ont été décrites des particules sphériques de petites dimensions présentant l'avantage d'être injectables. Cependant les nanoparticules ainsi préparées présentent néanmoins des diamètres moyens de l'ordre de 50 à 500 nm et ne seraient pas stérilisables par filtration stérilisante sans une perte considérable de rendement et sans phénomène de colmatage des filtres. Dans Eur. J. Pharm. Biopharm., zip(5), 173-191 (1993) les auteurs ont examiné les technologies actuellement disponibles dans le domaine des nanoparticules destinées à l'industrie pharmaceutique. Il est précisé page 182 que la filtration stérile de suspensions de nanoparticules n'a jamais été décrite. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que l'on peut préparer des particules dont le diamètre moyen est à 95 % inférieur à 100 nm, et plus précisément dont le diamètre moyen est compris entre 50 et 70 nm et qui peuvent donc être soumises à une filtration stérile sur des filtres de 0,22 um sans perte du rendement. Selon l'invention, les nanoparticules comprennent un polymère ou un copolymère hydrophobe non hydrosoluble émulsionné dans une solution de phospholipides et de sels biliaires. Selon l'invention un principe actif peut être introduit avec le polymère ou le copolymère dans les nanoparticules. Les phospholipides sont choisis à titre d'exemple parmi les phospholipides naturels, synthétiques ou semi-synthétiques; on utilise plus particulièrement les lécithines (phosphatidylcholine), comme par exemple les lécithines d'oeuf ou de soja purifiées (lécithine E100 r, lécithine E80 R, Phospholipons R par exemple Phospholipon 90 R ), la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol, la dipalmitoylphosphatidylcholine, la dipalmitoylglycérophosphatidylcholine, la dimyristoylphosphatidylcholine, la distéaroylphosphatidylcholine, l'acide phosphatidique ou leurs mélanges. Selon l'invention les sels biliaires sont par exemple des sels dérivés de l'acide cholique choisis notamment parmi les cholates, les taurocholates, les glycocholates, les déoxycholates, les chénodéoxycholates, les glycodéoxycholates, les taurodéoxycholates, les taurochénodéoxycholates, les déhydrocholates ou encore des dérivés de ces sels ou des mélanges. On utilise avantageusement les sels de sodium. Le polymère ou le copolymère hydrophobe non hydrosoluble peut être par exemple choisi parmi les polymères de l'acide lactique ou glycolique ainsi que leurs copolymères polylactique/polyoxyde d'éthylène (ou de propylène) de préférence de poids moléculaire compris entre 1000 et 200000, les polymères de l'acide polyhydroxybutyrigue, les polylactones des acides gras contenant au moins 12 atomes de carbone ou les polyanhydrides. Les nanoparticules selon l'invention sont tout à fait adaptées à une application à des principes actifs hydrophobes. Les principes actifs pouvant être utilisés peuvent être choisis parmi les grandes classes de médicaments destinés à la médecine humaine ou vétérinaire. Ils peuvent être également choisis parmi des principes destinés à l'industrie cosmétique, agro-alimentaire ou parmi les agents de diagnostic. A titre d'exemple, des principes actifs intéressant l'industrie pharmaceutique peuvent être choisis, à titre non limitatif, parmi les antirhumatismaux, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les analgésiques, les anti-tussifs, les psychotropes, les stéroïdes, les barbituriques, les antimicrobiens, les anti-allergiques, les antiasthmatiques, les antispasmodiques et anti-sécrétoires, les cardiovasculaires et les vasodilatateurs cérébraux, les protecteurs cérébraux et les protecteurs hépatiques, les agents thérapeutiques du tractus gastrointestinal, les agents anti-cancéreux ou les agents anti-viraux, les vitamines, les contraceptifs, les vaccins Selon l'invention, les nanoparticules peuvent être obtenues à partir d'une solution ou d'une dispersion aqueuse de phospholipides et de sels biliaires dans laquelle est ajoutée une phase organique non miscible comprenant le principe actif et le polymère ou le copolymère hydrophobe non hydrosoluble. Le mélange est pré-émulsionné puis soumis à une homogénéisation et à l'évaporation du solvant organique pour obtenir une solution aqueuse de nanoparticules de très petites dimensions. La mise en oeuvre de ce procédé est décrite plus en détail dans les exemples. La phase organique non miscible est de préférence choisie parmi les solvants volatiles pouvant être de bons solvants du système polymère choisi. Par exemple on choisira des esters comme notamment l'acétate d'éthyle, des solvants chlorés, par exemple le dichlorométhane ou le chloroforme, ou encore parmi les cétones comme la méthyl éthyl cétone. D'une manière générale le principe actif constitue environ 20 % en poids par rapport à la quantité de polymère introduite. Cependant cette quantité pourra éventuellement être plus faible et même aller jusqu'à 50 % en poids par rapport à la quantité de polymère introduite. La phase organique non miscible est constituée de telle manière que le principe actif et le polymère ou le copolymère représentent de 0,1 à 3 % de la solution. La phase aqueuse constituée d'une solution ou d'une dispersion aqueuse de phospholipides et de sels biliaires comprend avantageusement ces constituants dans une proportion molaire respective de 1/1. Néanmoins cette proportion peut varier de telle manière que le rapport molaire phospholipides par rapport aux sels biliaires soit de 0,1 à 1. La phase aqueuse est constituée de telle manière que les phospholipides et les sels biliaires représentent au total de 0,2 à 2 % en poids dans la solution. Les quantités relatives de phase organique et de phase aqueuse sont choisies de telle manière que la phase organique représente 20 à 60 % en volumes par rapport à la phase aqueuse. Les nanoparticules ainsi obtenues peuvent être filtrées sans donner lieu à des problèmes de colmatage et avec de bons rendements. La filtration s'effectue par filtrations en cascades sur filtres de porosités décroissantes, suivies d'une dernière filtration sur filtre de 0,22 um. Après la filtration, la suspension obtenue est lyophilisable si désiré, en présence de environ 5 % (poids/volume) d'agent cryoprotecteur. La solution destinée à la lyophilisation comprend certains additifs comme des composés non ioniques, par exemple un agent cryoprotecteur ou un agent destiné à ajuster l'isotonicité de la solution finale à injecter. Ces agents peuvent être choisis parmi des sucres (glucose, mannitol, sorbitol, saccharose par exemple), des polymères [par exemple dextran (dextran 1500, dextran 40000) polyvinylpyrrolidones injectables, polyéthylèneglycol ...], des acides aminés (par exemple le glycocolle), ou tout autre agent pouvant exercer cette fonction. Elle peut également contenir un/(des) agent(s) conservateur(s). Le cas échéant, le lyophilisat peut être repris au moment de l'emploi par de l'eau pour préparations injectables. Il est entendu que de telles opérations ne modifient pas la dimension des particules. Les nanoparticules selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de compositions stériles destinées aux domaines pharmaceutiques ou vétérinaires, au domaine cosmétique, agroalimentaire ou aux agents de diagnostics. Cette technique est particulièrement intéressante du fait qu'elle ouvre la voie à la préparation à l'échelle industrielle de suspensions nanoparticulaires décontaminées, éventuellement chargées de principes actifs ce qui n'était pas possible jusqu'alors. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent la présente invention. Ex emle i 4,0 g de poly(acide d,l-lactique) d'une masse moléculaire de 2000 D et 1,0 g de diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl-(S) ]-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S, 7aS) sont dissous dans un volume de 100 ml d'acétate d'éthyle chauffé au bain-marie à une température de 450C (solution A). 1,25 g de cholate de sodium et 1,75 g de lécithine E80 R sont dispersés sous agitation à l'Ultra- turrax R dans un volume de 500 ml d'eau pour préparation injectable (solution B). La solution A est pré-émulsionnée dans la solution B pendant 1 minute à l'Ultra-turrax R. La pré-émulsion est ensuite introduite dans un homogénéisateur de type Microfluidizer 110 T R où elle subit 20 passages successifs à une pression d'utilisation de 6 bars et une température de refroidissement de OOC. Un volume de 610 ml de l'émulsion est introduit dans un ballon de 2 litres. L'acétate d'éthyle est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif, sous vide + microfuite, à une température de 300C, pendant environ 45 minutes. Un volume de 450 ml de suspension nanoparticulaire est récupéré et est complété à 500 ml par de l'eau pour préparation injectable. Sous une pression de 0,5 bars d'azote, la suspension est filtrée successivement sur 4 membranes d'esters de cellulose Millipore , d'un diamètre de 45 mm et de porosités décroissantes référencées: RAWP 1,2 um, AAWP 0,8 um HAWP 0,45 um et GSWP 0,22 um. La suspension filtrée stérile est lyophilisée en présence de 5% poids/volume de glucose ou de saccharose. Le diamètre moyen des particules mesuré par diffusion de lumière sur un appareil Brookhaven R est d'environ 70 nm. Le rendement de fabrication, exprimé par le rapport de la concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl) -2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S,7aS) finale après filtration sur la concentration théorique initiale (2 mg/ml), est de 95%. La densité optique à 405 nm de la suspension avant et après la dernière filtration sur 0,22 um est respectivement de 2,20 et de 2,10. La concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl) -2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S,7aS) avant et après la dernière filtration sur 0,22 um reste inchangée. Le diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl (S)1-2 perhydroisoindolol-4-(3aS,4S,7aS) peut être préparé comme décrit dans la demande de brevet PCT/FR 93/00352. Exemple2 En opérant comme précédement à l'exemple 1, mais à partir de 4,0 g d'un co-polymère dibloc constitué de l'association d'un poly(acide d,l-lactique) de masse 30 kD et d'un polyéthylène glycol de masse 2 kD (PLA-PEG) et de 1,0 g de diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4 (3aS,4S,7aS), on obtient une suspension nanoparticulaire. Sous une pression de 0,5 bars d'azote, la suspension est filtrée successivement sur 4 membranes d'esters de cellulose Millipore , d'un diamètre de 45 mm et de porosités décroissantes référencées: RAWP 1,2 um, AAWP 0,8 um, HAWP 0,45 uffi et GSWP 0,22 um La suspens ion filtrée stérile est lyophilisée en présence de 5% p/v de glucose ou de saccharose. Le diamètre moyen des particules mesuré par diffusion de lumière sur un appareil Brookhaven &commat; est d'environ 75 nm. Le rendement de fabrication, exprimé par le rapport de la concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl- (S) 1-2 perhydroisoindolol-4-(3aS,4S,7aS) finale après filtration sur la concentration théorique initiale (2 mg/ml), est de 98%. La densité optique à 405 nm de la suspension avant et après la dernière filtration sur 0,22 un est respectivement de 2,7 et de 2,6. La concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl- (s)] -2 perhydroisoindolol-4-(3aS,4S,7aS) avant et après la dernière filtration sur 0,22 un reste inchangée. Exemple 3 160 mg de poly(acide d,l-lactique) d'une masse moléculaire de 70 000 D et 40 mg de diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl- (5)1-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S,7aS) sont dissous dans un volume de 4 ml d'acétate d'éthyle chauffé au bain-marie à une température de 450C (solution A). 100 mg de cholate de sodium et 70 mg de lécithine E80 R sont dispersés sous agitation à l'Ultra-turrax dans un volume de 20 ml d'eau pour préparation injectable (solution B). La solution A est pré-émulsionnée dans la solution B pendant 1 minute à l'Ultra-turrax. La pré-émulsion est ensuite introduite dans un homogénéisateur de type Microfluidizer 110 S R où elle subit 3 minutes de recyclage continu à une pression d'utilisation de 6 bars et une température de refroidissement de OOC. Un volume de 30 ml de l'émulsion est introduit dans un ballon de 200 ml. L'acétate d'éthyle est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif, sous vide + microfuite, à une température de 300C, pendant environ 45 minutes. Un volume de 19 ml de suspension nanoparticulaire est récupéré et est complété à 20 ml par de l'eau pour préparation injectable. La suspension est filtrée successivement sur 2 membranes d'esters de cellulose Millipore R , d'un diamètre de 25 mm et de porosités décroissantes référencées: HAWP 1,2 um et SLGS 0,22 um. La suspension filtrée stérile est lyophilisée en présence de 5% poids/volume de glucose ou de saccharose. Le diamètre moyen des particules mesuré par diffusion de lumière sur un appareil Brookhaven R est d'environ 60 nm. La densité optique à 405 nm de la suspension avant et après la dernière filtration sur 0,22 um est respectivement de 1,29 et de 1,14. La concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S,7aS) avant et après la dernière filtration sur 0,22 um reste inchangée. Exemole 4 160 mg de poly(acide d,l-lactique) d'une masse moléculaire de 70 000 D et 40 mg de diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4- (3aS,4S,7aS) sont dissous dans un volume de 4 ml d'acétate d'éthyle chauffé au bain-marie à une température de 450C (solution A). 50 mg de cholate de sodium et 70 mg de lécithine E80 R sont dispersés sous agitation à l'Ultra-turrax dans un volume de 20 ml d'eau pour préparation injectable (solution B). La solution A est pré-émulsionnée dans la solution B pendant 1 minute à l'Ultra-turrax R . La pré-émulsion est ensuite introduite dans un homogénéisateur de type Microfluidizer 110 S R où elle subit 3 minutes de recyclage continu à une pression d'utilisation de 6 bars et une température de refroidissement de OOC. Un volume de 30 ml de l'émulsion est introduit dans un ballon de 200 ml. L'acétate d'éthyle est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif, sous vide + microfuite, à une température de 300C, pendant environ 45 minutes. Un volume de 19 ml de suspension nanoparticulaire est récupéré et est complété à 20 ml par de l'eau pour préparation injectable. La suspension est filtrée successivement sur 2 membranes d'esters de cellulose Millipore R , d'un diamètre de 25 mm et de porosités décroissantes référencées: HAWP 1,2 um et SLGS 0,22 pm. La suspension filtrée stérile est lyophilisée en présence de 5% p/v de glucose ou de saccharose. Le diamètre moyen des particules mesuré par diffusion de lumière sur un appareil Brookhaven R est d'environ 70 nm. La densité optique à 405 nm de la suspension avant et après la dernière filtration sur 0,22 Vm est respectivement de 1,88 et de 1,80. La concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl- (S)]-2 perhydroisoindolol-4-(3aS,4S,7aS) avant et après la dernière filtration sur 0,22 um reste inchangée. Exemple 5 400 mg d'un co-polymère dibloc constitué de l'association d'un poly(acide d,l-lactique) de masse 30 kD et d'un polyethyylène glycol de masse 2 kD (PLA-PEG) et 100 mg de diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)4 [(méthoxy-2 phényl) -2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4 (3aS,4S,7aS) sont dissous dans un volume de 10 ml d'acétate d'éthyle chauffé au bain-marie à une température de 45"C (solution A). 125 mg de cholate de sodium et 175 mg de lécithine E80 R sont dispersés sous agitation à l'Ultra-turrax R dans un volume de 50 ml d'eau pour préparation injectable (solution B). La solution A est pré-émulsionnée dans la solution B pendant 1 minute à l'Ultra-turrax R . La pré-émulsion est ensuite introduite dans un homogénéisateur de type Microfluidizer 110 S R où elle subit 10 minutes de recyclage continu à une pression d'utilisation de 6 bars et une température de refroidissement de OOC. Un volume de 60 ml de l'émulsion est introduit dans un ballon de 200 ml. L'acétate d'éthyle est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif, sous vide + microfuite, à une température de 300C, pendant environ 45 minutes. Un volume de 45 ml de suspension nanoparticulaire est récupéré et est complété à 50 ml par de l'eau pour préparation injectable. La suspension est filtrée successivement sur 2 membranes d'esters de cellulose Millipore R , d'un diamètre de 25 mm et de porosités décroissantes référencées: HAWP 1,2 pm et SLGS 0,22 pm. La suspension filtrée stérile est lyophilisée en présence de 5% p/v de glucose ou de saccharose. Le diamètre moyen des particules mesuré par diffusion de lumière sur un appareil Brookhaven R est d'environ 60 nm. La densité optique à 405 nm de la suspension avant et après la dernière filtration sur 0,22 um est respectivement de 0,87 et de 0,81. La concentration en diphényl-7,7 (méthoxy-2 phényl)-4 [(méthoxy-2 phényl)-2 propionyl-(S)]-2 perhydroisoindolol-4-(3aS,4S,7aS) avant et après la dernière filtration sur 0,22 um reste inchangée. REVENDICATIONS 1 - Nanoparticules filtrables dans des conditions stériles caractérisées en ce qu'elles comprennent un polymère ou un copolymère hydrophobe non hydrosoluble émulsionné dans une solution de phospholipides et de sels biliaires. 2 - Nanoparticules filtrables dans des conditions stériles, selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'un principe actif est introduit avec le polymère ou le copolymère. 3 - Nanoparticules filtrables dans des conditions stériles, selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que leur diamètre moyen est à 95 % inférieur à 100 nm. 4 - Préparation de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on prépare une solution ou une dispersion aqueuse de phospholipides et de sels biliaires dans laquelle est ajoutée une phase organique non miscible comprenant le polymère ou le copolymère hydrophobe non hydrosoluble et le cas échéant le principe actif, puis on effectue une pré-émulsion et soumet le mélange à une homogénéisation et à l'évaporation du solvant organique. 5 - Utilisation des nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation de compositions stériles après filtration stérilisante. 6 - Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 3, de qualité stérile, caractérisé en ce qu'elles ont subi une opération de filtration stérilisante. 7 - Nanoparticules selon la revendication 6, caractérisé en ce que la filtration stérilisante est effectuée en cascades, sur filtres de porosités décroissantes.