FR 2714475 A1 19950630 FR 9315538 A 19931223 DISPOSITIF DE DETECTION IMMUNOLOGIQUE INSTANTA=,./ > 1 44 La presente invention a pour but la determination très rapide qualitative,semi-quantitative et quantitative d'un ligand dans un fluide.Elle est relative à un dispositif destiné à mettre en valeur les divers procédés,rappelés ci-dessous,basés sur une immunofiltration à travers differentes membranes,de haut en bas,de l'echantillon à tester.Tous les dispositifs decrits avec ces procédés dans les differents brevets cités ci dessous,sont pratiquement identiques l'immunofiltration de haut en bas consistait à faire traverser par l'echantillon une superposition da membranes dont chacune avait un rôle precis,pour aboutir à la dernière membrane porteuse d'un substrat qui se colorait en cas de test positif.L'exemple le plus ancien,et qui sera detaillé plus loin,concerne le brevet français Liotta No 82/16973 decrivant une superposition de zones : "une première zone contenant des anticorps liés à une enzyme,une seconde zone contenant une substance capable de reagir avec les dits anticorps liés à une enzyme..." I1 est apparu que cette trop grande proximité (moins de 100 microns dans tous les dispositifs etudiés) de la membrane inferieure contenant le substrat,avec la membrane selective sensée pieger les anticorps marqués non liés à un antigène (absent dans l'echantillon,donc en cas de test antigène negatif) entrainait des colorations parasites plus ou moins intenses et qui apparaissaient de toutes façons après quelques minutes,même si le substrat etait parfaitement incolore tout de suite après le test.Ce qui aboutissait donc à de faux positifs.Il est par ailleurs difficile de demander à l'utilisateur de lire immediatement le resultat sans tenir compte de colorations tardives,car cet utilisateur des ire souvent garder le test pour le montrer plus tard à son medecin par exemple.Ce problème s'est notablement aggravé lorsque a été mis au point une association de reactifs amplifiant un nombre considerable de fois le signal obtenu par une infime quantité d'anticorps marqués echappant à la membrane selective associés à l'infime quantité de ligand present dans l'echantillon (de l'ordre de quelques picogrammes).Cette amplification a donc amplifié les colorations parasites de proximité. I1 est donc apparu necessaire d'eloigner au maximum l'etape de revelation de l'etape selective. L'objet de la presente invention est donc un nouveau dispositif dans lequel les reactîfs des membranes de tout l'etage inferieur (en dessous de la membrane selective MS) sont à present deposés de façon sequentielle (figure 1-2 - planche I ) horizontalement d'arrière en avant sur une bande de support poreux chimiquement et immunologiquement neutre (que l'on va appeler bande de revelation BR),aboutissant loin (quelques centimetres) vers l'avant à une succession de spots de reactifs d'amplification puis à un spot de substrat. Tout l'etage superieur est conservé en superposition verticale : une première membrane (*Y*) supportant,non fixés,les anticorps marqués,une seconde membrane (MS) destinée à pieger ces anticorps marqués quand ils ne sont pas saturés en ligand (absent dans l'echantillon).Ces deux premieres membranes sont donc disposées au dessus de l'extrémité arrière de la bande. Lorsque l'echantillon ne contenant pas de ligand recherché (figure 1 - planche II) est deposé sur la première membrane (*Y* = anticorps marqués par enzymes ou chemiluminescence ou fluorescence ou par radioactivité entre autres),les anticorps marqués qui y ont été prealablement deposés et lyophilisés,sont mis immediatement en solution et migrent d'abord verticalement vers le bas vers la membrane selective (MS) specialement traitée (voir plus loin les differents procédés decrits dans l'art actuel) pour pieger ces anticorps marqués non liés au ligand recherché.Poursuivant toujours sa migration verticale vers le bas,l'echantillon avec tous ses composants (ne contenant plus les anticorps marqués)traverse cette membrane selective (MS) pour arriver sur l'extremité arrière de la bande de revelation.Les qualités buvard de cette bande font que la migration des liquides n'est plus verticale mais horizontale vers l'avant.Depassant vers l'avant l'extremité de cette bande de revelation (position des deux premieres membranes),les liquides entrent dejà après un centimetre de migration lente,avec un reactif R1 (figure 1 - planche I).Le produit de cette reaction de l'echantillon avec R1 migre ensuite lentement vers un second reactif R2,puis vers un troisieme reactif R3 et eventuellement un quatrième reactif R4 pour arriver après quelques centimetres de migration,au niveau du spot (S) de substrat.L'ensemble des reactions de l'echantillon avec les differents reactifs,a pour but d'amplifier chimiquement la coloration eventuelle du substrat.Si aucun anticorps marqué n'a traversé la membrane selective (test negatif),aucun signal n'apparaitra à l'extremité de la bande de revelation,malgré toutes les amplifications chimiques.Par contre si des complexes (anticorps + ligand recherché) traversent la membrane selective (test positif - figure 2 - planche II),même en quantités infinitesimales de l'ordre du picogramme,la reaction avec les differentes substances d'amplification en R1,R2,R3 etc,aboutit à l'extremité de la bande de revelation à un signal parfaitement visible en cas de colorimetrie (S) ou quantifiable en cas de chemiluminescence ou de fluorescence ou de radioactivité. Comme les liquides de l'echantillon sont souvent incolores quand ils arrivent à l'extremité avant de la bande de revelation,il est difficile de savoir si leur migration est terminée ou non.En cas de test colorimetrique positif cela est facile puisqu'un spot coloré apparait (annonçant la fin de la migration).Mais en cas de test colorimetrique negatif (aucune colration) ou en cas de test radioimmunologique,il est difficle de faire la difference entre la bande mouillée à son extremité et la bande encore sèche (migration insuffisante par exemple).Pour parer à ce problème il a été necessaire de deposer encore plus loin vers l'avant que le substrat,un spot (C) d'une substance qui se colore dans tous les cas (negatif ou positif) au contact des liquides de l'echantillon quand ils ont reellement terminé leur migration à l'extremité avant de la bande de revelation,à condition toutefois que tous les reactifs utilisés pour ce test aient été bien conservés.Si au moins l'un des reactifs n'etait plus operationnel,ce spot (C) ne se colorerait pas. De cette façon,la coloration de (C) annonce 10) - la fin du test 20) - invite l'utilisateur à lire le resultat (si colorimetrie) ou à mesurer le resultat (en inserant le test dans un lecteur de fluorescence ou de radioactivité par exemple) 30) - garantit le bien fondé du resultat observé -- que la non-coloration de (S) est bien due à l'absence d'anticorps marqués qui ont été piégés loin vers 1 'arrière,par la membrane selective (MS) et non pas à une defaillance quelconque du systeme de coloration ou de son amplification. -- que la coloration de (S) est bien le temoin de passage d'anticorps marqués à travers la membrane selective,liés au ligand recherché. Une fois le test terminé,la coloration de (C) est stable tandis que la non-coloration de (S) en cas de negatif colorimetrique est reellement definitive à l'abri d'interferences avec les enzymes des anticorps piégés plusieurs centimetres loin derrière sur la MS.Ce qui permet de dire qu'en cas de radioimmunologie ou de fluorescnce,le test peut être relu longtemps (en cas de negatif) après car les marqueurs radioactifs ou fluorescents sont piegés definitivement en arrière sur la MS et ne viendront jamais parasiter le spot de lecture (S) Un autre contrôle supplementaire vient consolider encore plus la validité du resultat lorsque l'appareillage de lecture (en cas de fluorescence ou de radioactivité par exemple) possedera deux sondes de lecture : l'une pour mesurer l'intensité de (S) comme decrit plus haut et une seconde sonde pour mesurer l'intensité de la fluorescence ou de la radioactivité à l'endroit de la depose de l'echantillon,au contact de la MS.Ceci permet -- 10) - d'abord de confirmer que les marquages sont encore vivants -- 20) - que leur absence au niveau de (S) est due à leur piegeage par MS -- 30) - et surtout d'affiner le diagnostic et la mesure en faisant une evaluation automatique de la difference entre par exemple la radioactivité totale préexistante deposée au dessus de la MS et la radioactivité qui y persiste à la fin du test quand (C) s'est coloré;cette dernière coloration pouvant d'ailleurs elle même declencher (par cellule optique)les calculs quand elle apparait pour signaler la fin du test. Une amelioration notable du dispositif consiste à imprimer en negatif sur un adhesif,les lettres correspondant au diagnostic recherché.Par exemple,on imprime en blanc la totalité d'un carré d'adhesif sauf à l'emplacement de lettres "HCG +" par exemple,l'adhesif restant transparent au niveau de ces lettres.En cas de test negatif,la non coloration de la bande de revelation (blanche au depart) ne revelera aucune dufference entre le blanc de l'adhesif et le blanc de la bande de revelation que l'on voit par transparence à travers les lettres HCG.En cas de test positif,la benzidie du spot (S) de la bande de revelation se colore en bleu.L'adhesif imprimé en blanc opaque sauf sur les lettres HCG+,cachera le bleu du spot,sauf au niveau des lettres HCG+ qui se verront vues de dessus,colorées en bleu puisque l'adhesif est resté transparent au niveau des lettres (qui n'ont pas été imprimées en blanc opaque).Le resultat du test sera donc,teintées en bleu,les lettres "HCG +",ce qui ne laisse aucun doute sur le diagnostic.(voir l'exemple du PSA Planche VII) Cette modalité technique,rendue abordable par les techniques informatiques de PAO et CAO (publication et conception assistée par ordinateur),permet donc d'obtenir,de qualité très nette, tous les sigles possibles comme par exemple "NORMAL" pour les tests semi-quantitatifs,"PSA" pour 1' antigene prostatique specifique couplé,sur la même carte,à un second test " > 4 ng" pour le dosage semi-quantitatif de PSA annonçant ainsi 1 - qu'il existe du PSA donc adenome probable 2 - qu'il est en excès,donc eventuelle cancerisation de l'adenome prostatique. L'ensemble du dispositif (figure 1-2-3 - planche VII complet se presente en fait sous la forme d'une mince (500 microns) carte de type credit-card formée de deux feuillets emprisonnant les deux membranes et la bande de revelation - le feuillet inferieur (FI) est plan sans aucun orifice et supporte sur sa face superieure,les membranes *Y* et MS posées sur l'extremité arrieère de la bande de revelation BR - le feuillet superieur (FS) vient recouvrir les membranes,la BR et le feuillet inferieur FI,et est perforé en trois endroits 1 - à l'arrière et juste au dessus de la membrane *Y*,un orifice OR1 pour deposer l'echantillon de telle sorte qu'il entre en contact avec les anticorps marqués 2 - quelques centimetres vers l'avant,un second orifice OR2 juste au niveau du spot (S) de substrat pour lire la coloration eventuelle ou mesurer par sonde un eventuel signal 3 - et quelques millimetres vers l'avant de OR2,un troisième orifice OR3 juste au dessus du spot de (C) pour y lire la coloration de (C) annonçant la fin du test. Un systeme d'adhesifs double face vient mettre solidement en contact les deux feuillets emprisonnant ainsi les membranes *Y*,MS et BR.Le dispositif apparait alors comme une carte rigide type credit-card de 0,45 mm d'epaisseur presentant à sa face superieure ces orifices. Un système d'impression offset et laser permet d'imprimer diverses explications comme le montre par exemple la figure 3 - planche IV A la face inferieure du volet inferieur peuvent être imprimées diverses notes,mode d'emploi,precautions,etc Le dispositif vraiment complet comprendra en outre une pipette sterile à usage unique pour prelever le volume adequat d'echantillon et le deposer en OR1. En ce qui concerne le test sur sang total,il est necessaire de proceder à une dilution (fig 1-2 Planche IV)car le sang total est trop visqueux et ne migrera pas dans le dispositif :dans ce cas,la pipette à usage unique contiendra un tampon adequat evitant surtout à tout prix la moindre hemolyse qui libereait de l'hemoglobine,facteur de faux positifs en cas de test colorimetrique.Si l'echantillon est un prelevement de cellules (et non plus d'antigene en solution comme dans la grossesse par exemple) sur des lesions de muqueuses comme par exemple dans les maladies sexuellement transmissibles,la pipette contiendra un detergent doux de type CHAPS par exemple,capable de liberer instantanément les antigènes recherchés (comme par exemple l'antiène LPS dans les chlamydiae). L'ensemble du dispositif sera obligatoirement - être à l'abri de l'action oxydante de l'oxygène de l'air : emballé sous vide puis reinjection de gaz neutre de type argon pour que la pression du vide ne deforme pas la carte - être à l'abri de l'action oxydante de la lumière (sur le susbstrat qui est très sensible) = emballage opaque - accompagné d'explications detaillées sur la maladie en question pour laquelle on fait ce test,avec description complete du dispositif,des precautions d'emploi,du mode de prelevement avec le volume exact à deposer et de l'interpretation la plus claire du resultat obtenu. - être entièrement réemballé après usage dans un sac etanche et solide prevu à cet effet pour subir plus tard une biodegradation totale non contaminante et non polluante. REVUE DE L'ART ANTERIEUR L'art anterieur comprend deux groupes de dispositifs: 1 - Les dispositifs faisant migrer des microbilles teintées sur un support horizontal avec signal de resultat au niveau même de la reaction immunologique à la fin de la migration. 2 - Les dispositifs à immunofiltration verticale de haut en bas avec reaction immunologique au debut de la migration et non plus à la fin,et signal de resultat sur la membrane terminale inferieure. La presente invention n'appartenant à aucun de ces groupes,elle appartiendrait plutôt à un groupe de dispositifs à immunofiltration de haut en bas au cours d'une première etape et signal de resultat à la fin de la migration horizontale,à un endroit où,contrairement au premier groupe,il n'y a plus aucune reaction immunologique mais plutôt une amplification chimique de signal. 1 - Le dispositif le plus ressemblant mais d'apparence seulement est l'objet de la demande de Certificat d'utilité Unilever.NV deposé en Grande Bretagne le 27 Avril 1987 sous le No 87/09873 et le 30 Octobre 1987 sous le No 87/25457,enregistré en France sous le No 88/05600 et publié sous le No 2 614 423 ,au "BOPI" Brevets No 43 du 28 Octobre 1988.I1 est basé sur la technologie des microbilles colorées (latex bleu par exemple) deposées à l'extremité arrière d'une pellicule de nylon plastifié et coatées d'un premier anticorps.Le depôt de l'echantillon à l'extremité de cette pellicule fait migrer les microbilles de latex vers l'avant.En cas de test positif,l'antigène lié d'abord aux anticorps des microbilles sera piégé dans une seconde etape à l'extremité de la pellicule de nylon sur une ligne de seconds anticorps qui le prennent ainsi en "sandwich".L'accumulation de microbilles sur cette ligne forme un signal visuel.En cas de test negatif,aucune microbille ne s'arrête sur cette ligne.Une seconde ligne encore plus en avant piège toutes les microbilles restantes quel que soit le resultat et indiquant la fin de la migration des microbilles.Ainsi un seul trait (le dernier) est un resultat negatif,deux traits : un resultat positif. Les differences avec le dispositif objet de la presente invention sont très importantes et nombreuses 1 - le signal y est visuel (accumulation de microbilles bleues par exemple) alors qu'ici le signal est une reaction chimique 2 - la fin du test est une accumulation des microbilles restantes alors qu'ici il s'agit de la coloration de reactifs attestant de la bonne conservation des reactifs 3 - le dispositif ne peut doser que des antigenes (pour former le sandwich sur la ligne du resultat) alors qu'ici le dispositif permet indifferemment la detection d'antigenes et d'anticorps (voir exemples ci dessous) 4 - la sensibilité est faible car il faut des quantités considerables d'antigenes pour former une ligne de microbilles bleues sur la ligne du resultat.C'est la raison pour laquelle ce dispositif n'est utilisé que pour la grossesse (quantités enormes d'HCG dans les urines) ou quelques maladies infectieuses (grosses quantités de bacteries dans le prelevement). Alors que le dispositif present se destine à des diagnostics extrêmement fins et sensibles comme les cytokines,les recepteurs membranaires ou marqueurs tumoraux,en atteigant une sensibilité inferieure à 10 picogrammes/ml.Cette extrême sensibilité est d'ailleurs le resultat de l'amplification chimique du resultat une unité d'anticorps marqué par une enzyme produit 1000 sous-produits par seconde au contact de R1.Chacun de ces sous-produits va produire à son tour 1000 sous-produits au contact de R2,etc. alors qu'une microbille qui a piégé un antigène ne donnera que le signal d'une seule microbille bleue;il faudra donc d'enormes quantités d'antigenes et donc de microbilles pour que l'oeil humain puisse voir une ligne bleue. 5 - Enfin,et bien que l'echantillon subit dans les deux cas une première reaction immunologique (contact antigène avec les anticorps marqués dans un cas ou avec les anticorps des microbilles dans l'autre cas),dans le cas present,il subit une seconde reaction immunologique au cours d'une seconde etape : la traversée de la membrane selective qui decide du resultat,alors que dans le dispositif de microbilles c'est la ligne des anticorps en bout de pellicule qui est le siège de la seconde reaction immunologique qui arrête ou non les microbilles en fonction de la presence ou de l'absence de l'antigène. En bref,la "puce" intelligente est ici au depart,alors que dans le systeme de microbilles,la "puce" est à l'arrivée.C'est une difference capitale tant dans le principe que dans la configuration. 2 - Le second groupe de brevets correspondant à l'art anterieur comprend donc les dispositifs à immunofiltration verticale avec signal de resultat visible sur la membrane inferieure en retournant le dispositif.Ce sont - le brevet français Liotta No 82/16973 publié sous le No 2 514 511 - le brevet americain Hybidtech No 4 632 901 et sa demande PCT No 85/05451 - le brevet europeen Abbott Lab. No 186 100 - le brevet europeen Murex Corp. No 206 561 - le brevet Unilever PLC No EP-A-274198 qui est plutôt une colonne de type chromatographique. - le brevete Konica No EP-A-328106 - le brevet europeen Boehringer Biochemica Robin (0 303 110) decrit bien une migration horiizontale mais la reaction immunologique differenciant le resultat negatif du positif se fait au cours de la migration sur la bande horizontale grace à des antigenes immobilisés sur cette bande de migration.Ce qui n'est pas le cas dans le dispositif objet de la presente invention dans laquelle aucune reaction ummunologique ne se produit sur cette bande horizontale. - le brevet Sarl CIS-TEST no W0-A-8903039 - le brevet Cie ORIS Industrie no WO-A-8910564 - le brevet Toledano Jacques PCT/FR/00891 utilisant une membrane selective universelle à base d'immunoglobulines anti-enzyme et anti-Fab EXEMPLES DE MONTAGES DE DISPOSITIFS CONSIDERATIONS GENERALES Un "test" est une unité composée de la bande de revelation,de la membrane selective,de la membrane d'anticorps lyophilisés marqués.Chaque test sert à la detection d'un ligand.Il peut y avoir un seul test enserré entre deux feuillets de la carte,comme par exemple pour le test de grossesse. Mais il peut y avoir plusieurs tests differents enserrés dans la même carte,chacun destiné à detecter un ligand different.Par exemple une carte est decrite plus loin dans laquelle sont disposés trois tests pour la detection precoce de p24,de GP40 et de GP120;chacun des tests utilisant 50 ul du même echantillon (qui devra donc être de 150 jil : 15 ul de sang total et 135 ul de tampon).Ce sont donc 3 tests de detection d'antigenes.Mais il peut y avoir un test antigene et un test anticorps comme dans l'exemple HIV decrit plus loin.Ou plusieurs tests antigenes et un test anticorps de la même affection comme pour l'hepatite. Il peut y avoir un test semi-quantitatif unique dans le dispositif comme pour le D-Dimere dont l'interêt est simplement de savoir s'il est en excès. Il peut y avoir plusieurs tests semi-quantitatifs differents dans la même carte comme pour les marqueurs tumoraux : l'on sait qu'un marqueur seul est peu significatif mais que l'augmentation de plusieurs marqueurs en même temps est hautement pathologique (99% des cas où le CEA,le CA 19-9 et le CA 15-5 sont augmentés en même temps tous les trois,sont des cancers digestifs que l'on peut esperer detecter tôt et suivre leur evolution grace à cette technologie extrêmement sensible) Il peut y avoir un test qualitatif et un test semiquantitatif comme pour le PSA : la simple presence temoigne d'une affection benigne,l'excès d'une affection maligne. Il peut y avoir toute une serie de tests identiques dans la même carte comme pour la detection du pic urinaire de LH : un test par jour du 8ème au 17 ème jour : la carte etant alors en fait une dizaine de minicartes attachées les unes aux autres et livrées sous blister comme les comprimés de medicaments. La bande de revelation (sans la membrane selective cette fois) peut servir à faire des tests chimiques comme par exemple le dosage colorimetrique du cholesterol en associant à la bande de revelation de la cholesterol-esterase : le taux de peroxyde (donc taux d'acidité) alors produit provoque sur les reactifs deja presents sur la bande (des indicateurs de pH en fait),l'apparition d'une gamme de couleurs differentes selon le taux de cholesterol. Le même procédé peut servir au dosage des phosphatases (avec l'ATP),de phosphorylases (avec l'activation de glycogenases qui aboutissent à la formation de D-Glucose puis de peroxyde),de transaminases (avec des molecules aminées),de Glucose sanguin (avec la technique classique de Glucose oxydase),etc.. La methode d'amplification du signal peut permettre d'accompagner les tests immunologiques par des tests chimiques de la plus haute utilité.Exemples - Dosage des transaminases avec un test HBs antigene et un test HBc anticorps.L'etude des resultats est riche d'enseignements : fig 1-2-3 Planche V * Antigene HBs positif sans elevation des anticorps HBc : phase infectieuse aigue au tout debut car la technique est très sensible. ** Antigene et transaminases elevés : infection en cours et grave. *** HBc anticorps positif seul : trace d'hepatite ancienne **** HBc anticorps positif et transaminases elevés : hepatite recente mais en phase post-infectieuse avec phenomenes de cytolyse hepatique persistante - Dosage chimique des phosphatases acides accompagnant le test du PSA.Enseignements * PSA elevé sans elevation de phosphatases acides : pas de metastases osseuses à partir du cancer de la prostate ** PSA et phosphatases acides elevées : mauvais pronostic. - Immunodosage de l'insuline et dosage chimique de la glycemie (extrêment utile : la resistance à l'insuline va en augmentant avec l'age et la sedentarité;elle se traduit par de lthyperinsulinisme,de l'obesité et de diabète avec son cortège de consequences graves).Ceci permet: * de dire de quel type de diabète il s'agit ** d'orienter le traitement vers les recepteurs cellulaires de l'insuline *** de suivre enfin l'evolution sous regime et sous traitement. **** mais surtout eviter les traitements intempestifs par insuline qui aboutissaient à des desastres (acceleration des degenerescences arterielles) Ce devrait être le test glycemique de l'avenir. - Enfin il n'y a pas que la detection d'excès de ligand.La presente invention peut inverser le signal et detecter ainsi une baisse d'une substance vitale comme les facteurs de coagulation,de l'insuline,etc.. Chacun des exemples suivants illustre une possibilité EXEMPLE 1:DETECTION PRECOCE D'ANTIGENE HBs D'HEPATITE 1 - On prepare le première membrane porteuse d'anticorps marqués lyophilisés : anticorps monoclonaux anti HBs antigène,marqués Peroxydase. 2 - On prepare ensuite la membrane selective en decoupant un rond de Nylon Immunodyne de Pall,à porosité 0,65 p et le traitant selon le procédé decrit par le dernier brevet cité : J.Toledano PCT/FR/00891,c'est à dire en le coatant avec des immunoglobulines anti-enzyme 3 - On prepare la bande de revelation en deposant sur une bande de fibre de verre Wathman de 5 mm de large sur 5 cm de long,les reactifs suivants sous forme de spots de 1 ul espacés de 7 mm d'arrière en avant R1 : Ferrocène (Sigma) à 0,1 mg/ml R2 : Acide acetique 1% R3 : Spot de 1 ul de Benzidine à 1 mg/ml R4 : Spot de Phenol Red 1% : incolore à sec.Se colore en rose à l'arrivée de tous les reactifs en bout de bande de migration horizontale indiquant la bonne fin du test. 4 - On colle cette bande sur un support rigide; 5 - On prepare la carte superieure.Par exemple une carte de polystyrène de mêmes dimensions qu'une carte de credit (84 mm de log et 56 mm de large). A 15 mm du bord gauche et à 15 mm du bord superieur,on pratique un orifice OR1 de 6 mm de diametre.Il servira à deposer 1' echantillon. A 35 mm du bord gauche mais à la même hauteur que l'orifice precedent (à 15 mm du bord superieur) on pratique un second orifice OR2 de même diametre et destiné à lire la coloration eventuelle du spot de benzidine A 45 mm du bord gauche et toujours sur la même ligne (à 15 mm du bord superieur) on pratique un troisieme orifice OR3 destiné à lire la coloration en rose du spot de contrôle. Cette carte superieure aura été prealablement imprimée de diverses explications ou images facilitant l'emploi le dessin d'une pipette juste au dessus du trou dans lequel l'echantillin doit être versé,le dessin d'un rond incolore et un rond bleu en expliquant que 1 un est un resultat negatif et l'autre un resultat positif,enfin un dessin de rond rose expliquant que c'est la coloration necessaire du troisième trou à attendre pour lire le resultat. 6 - On y adjoint une pipette en plastique à usage unique contenant un tampon de type PBS 7 - Un tampon alcoolisé pour desinfecter le doigt après la piqure de prelevement. MONTAGE 1 : On colle donc la bande de revelation par l'intermediaire d'un adhesif double face, sur une zone bien repérée auparavant pour qu'elle soit exactement sous les divers orifices de la plaque superieure. 2 : on colle sur l'extremité gauche de la bande le rond de nylon constituant la membrane selective MS 3 : on colle ensuite sur cette membrane selective MS la membrane *Y* supportant les anticorps marqués lyophilisés 4 : on colle sur le spot (incolore) de benzidine un carré de plastique adhesif transparent au depart puis imprimé en blanc,portant le sigle "HBs +" resté transparent incolore car non imprimé en blanc.Si la benzidine se colore (test positif) seul le sigle "HBS +" va apparaitre vu de dessus,coloré en bleu.Le reste du spot bleu de la bande de revelation ne se verra pas vu du dessus,car occulté par l'impression en blanc de l'adhesif. 5 : on colle la plaque superieure sur tout cet ensemble et sur la plaque inferieure 6 : On y adjoint la pipette à usage unique contenant 45 u1 de PBS non hemolysant. 7 : on emballe sous vide poussé puis reinjection d'argon dans une enveloppe opaque et solide (type aluminium souple) 8 : On l'insère dans une boite de carton contenant - un petit livret dans lequel figure une documentation complète sur l'hepatite et ses comopsantes immunologiques,un mode d'emploi detaillé avec des schemas clairs et une projection de tous les resultats possibles expliquant dans quel cas le test n'est pas valable,sa fiabilité,sa sensibilité ainsi que la combinaison de tous les resultats possibles : OR2 coloré ou non,OR3 coloré ou non et le resultat qui en decoule - un gant sterile à usage unique - un stylet emballé sterile pour piquer l'extremité d'un doigt - un sac en plastique solide destiné à contenir l'ensemble de tous les composants de ce dispositif après usage,avec un bon systeme de fermeture etanche;le tout etant biodegradable et non polluant. MODE OPERATIONNEL 1 : on deballe le carton et on dispose tous les elements bien evidence.On ouvre le livret et on suit scrupuleusement le mode d'emploi 2 : on sort la carte de son enveloppe opaque et on la pose bien à plat. 3 : on pique le doigt du patient a s'associe bien aux anticorps marqués lyophilisés de la première membrane qu'il rencontre (*Y*).L'absorption est terminée après 5 secondes et la goutte a disparu. 15 secondes après la depose de l'echantillon,le sigle "HBs +" commence à se colorer en bleu par la gauche puis entièrement après quelques secondes. 20 secondes après la depose,soit 5 secondes après la coloration totale du sigle "HBs +",une coloration rose commence à colorer le bord gauche de OR3 qui sera completement coloré en 5 autres secondes. 30 secondes après la depose,le test est terminé Ce même patient a subi un contrôle parallèle par un laboratoire d'analyses à qui a été demandé une quantification de l'antigène HBs.Le resultat est de 2 nanogrammes par ml de plasma (2 Unités Internationales) par la Technique immunoenzymatique ELISA. COMPARAISON DE LA SENSIBILITÉ DU DISPOSITIF PAR RAPPORT A LA TECHNIQUE ELISA Le plasma de ce patient est dilué 2 fois puis 20 fois puis 100 fois puis 200 fois puis 500 fois puis 1000 fois puis 2000 fois.Les doses d'antigenes HBs sont donc : 1 0,1 0,02 0,01 0,002 0,001 0,0005 Resultats transmis par la technique ELISA 1 0,1 douteux O 0 0 0 Intensité du Signal transmis par la carte +++ +++ ++ ++ + + Temps mis par la benzidine à se colorer: en secondes 1 2 5 10 20 30 2min 1 2 5 10 20 30 2min La sensibilité de la carte est donc de 1 mUI/ml si l'on veut bien attendre 30 secondes après la fin du test.Elle n'est "que" de 0.01 UI/ml après 10 secondes. De nombreuses variétés de cartes sont possibles - test anticorps HBc et transaminases (pour le suivi post-hepatite) ou gamma-GT (suivi de cirrhose du foie) - test antigenes HBs et HCV (detection hepatite B ou C) avec ou sans leur anticorps correspondants. EXEMPLE 2 : DOSAGE SIMULTANE DE p24-GP40-GP120 du HIV 1 - Sur une carte inferieure on dispose à 5 mm l'une de l'autre 3 bandes de revelation preparées auparavant. 2 - Sur l'extremité arrière de chaque bande on colle une membrane selective du même type que dans l'exemple precedent. 3 - Au dessus de chaque membrane selective on colle une membrane supportant les anticorps marqués lyophilisés : les anticorps marqués anti-p24 sur le dispositif superieur,les anticorps marqués anti GP40 sur le dispositif moyen et les anticorps marqués anti GP120 sur le dispositif inferieur. 4 - On colle la carte superieure sur l'ensemble.Elle est perforée de 9 trous : Un pour chaque depose = 3 trous,Un pour chaque resultat = 3 trous et Un pour chaque contrôle = 3 trous. 5 - La pipette ne contient plus 45 ul mais 135 ul de tampon PBS non hemolysant.Elle est graduée pour aspirer 15 jil de sang total qui va se melanger aussitôt à ces 135 u1 de tampon et donner un echantillon de sang dilué au 1/10.0n depose 50 u1 dans chaque trou de gauche. Si tous les trois trous de resultats se colorent,c'est que l'echantillon contient ces 3 antigenes et donc assurément du virus HIV.Ceci est extrêmement utile car bien avant la seropositivité en anticorps,apparaissent ces antigenes viraux mais en quantité infinitesimales indosables par les methodes classiques : seulement 50 picogrammes de p24/ml circulent en debut d'infection chez des sujets susceptibles d'être des donneurs de sang (car seronegatifs en anticorps) alors qu'ils sont contaminés.La carte objet de la presente invention peut facilement et rapidement (20 secondes) detecter 10 picogrammes de p24/ml.Si seul le trou du p24 se colore,on ne peut en deduire qu'il s'agit de virus HIV car cet antigène p24 appartient à d'autres virus benins. EXEMPLE 3 : CARTE ASSOCIANT QUATRE DOSAGES DIFFERENTS TROIS TESTS ANTIGENES : p24 - GP40 - GP120 ET UN TEST ANTICORPS SERIQUES ANTI-HIV 1 - Sur une carte inferieure on dispose non plus les 3 bandes comme pour le dosage antigenes mais quatre bandes. 2 - Pour cette carte on utilise les membranes selectives decrites dans le brevet français No 93/04266 du 9 Avril 1993 ,utilisant la technologie des antiidiotypes et capables de detecter indifferement antigenes ou anticorps et resolvant astucieusement le problemes des complexes antigenes+anticorps circulants (et pour lesquels tout un artifice de traitement par des tampons TRIS très acides etait necessaire) Une sur chaque bande de revelation 3 - Au dessus de chaque spot de benzidine on colle un adhesif portant l'impression correspondante à chaque test : "p24" pour la première ligne,"GP40" pour la seconde,"GP120" pour la troisieme et "HIV/Ab"pour la quatrieme (dosage d'anticorps) 4 - Les membranes d'anticorps marqués lyophilisés sont les mêmes que dans l'exemple precedent,sauf pour le test anticorps qui sera fait sur le dispositif inferieur dont la memebrane ne contient plus un anticorps marqué mais un melange de trois anticorps marqués : un anti p24,un anti GP40,un anti GP120.En cas de presence d'anticorps seriques,il y a forte concurrence entre eux et les anticorps marqués au niveau de cette fameuse membrane selective qui est vite saturée par les anticorps seriques et laisse passer les anticorps marqués.Alors qu'en cas d'absence d'anticorps seriques,les anticorps marqués sont tous piégés par cette membrane selective. De même en cas de presence d'antigenes,les anticorps marqués forment avec eux des complexes qui traversent la membrane selective;alors qu'en cas d'absence d'antigene les anticorps marqués sont piégés par la membrane selective. Le mode operationnel est le même sauf que la pipette contient 180 ul de tampon non hemolysant et permet d'aspirer 20 u1 de sang total qui sera ainsi dilué au 1/1 0. 50 ul sont deposés sur chaque orifice marqué "pipette". L'apparition en bleu des sigles p24,GP40,GP120 et HIV/Ab signe la presence certaine de HIV dans l'echantillon avec une sensibilité extrême : le sigle "HIV/Ab" apparait en 1 minute avec un serum seropositif dilué à 1/100.000,et en 5 secondes avec un serum dilué à 1/1000. EXEMPLE 4 : DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE D-DIMERE PLASMATIQUE. La membrane selective est celle decrite dans le brevet français No 93/03176 du 19 Mars 1993 utilisant la technologie des peptides anti-peptides.Elle est conçue pour ne laisser passer les anticorps marqués anti-D Dimere que si le D-Dimere depasse la concentration de 0,4 microgrammes/ml (seuil considéré comme physiologique). Le sigle imprimé sur adhesif est "D-DIM > " On peut associer à ce test un dosage d'un ou des facteurs de la coagulation (l'augmentation du D-Dimere etant du à une fibrinolyse) EXEMPLE 5 : DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE PSA (ANTIGENE PROSTATIQUE SPECIFIQUE) Absent chez le sujet normal,le PSA s'elève à un maximum de 4 ng/ml dans l'adenome prostatique benin et depasse largement ce taux en cas de cancerisation de cet adenome (30% des adenomes) Il faut deux tests dans la même carte - une pour le dosage qualitatif : PSA oui ou non - une pour le dosage semi-quantitatif si excès de PSA Le sigle imprimé pour le premier test est "PSA" qui s'imprime en cas de presence de PSA. Le sigle pour le second test sera " > 4 ng". De telle sorte que si le PSA est inferieur à 0,4 ng/ml la fin du test montre simplement "PSA" Alors que s'il y a excès de PSA,le resultat sera PSA > 0,4 ng " Fig 1-2-3 planche VII On peut associer à ce test un dosage chimique colorimetrique des phosphatases acides dont l'excès indique l'atteinte des os par le processus malin parti de la prostate. EXEMPLE 6 : DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE LH urinaire DETECTION DU PIC DE LH (OVULATION) La carte comprend dix tests contigus : un par jour du 7ème au 16 ème jour du cycle.Planche VI. Dix bandes de revelation sont collées en position verticale et non plus horizontale,separées l'une de l'autre par un sillon etanche après le montage. Dix membranes selectives utilisent la technologie des anti-f(ab')2 selon le brevet français No 90/12661 du 18 Octobre 1990 - PCT /FR/00891.Elles permettent de fair un dosage semi-quantitatif. Dix pipettes sont fournies pour prelever 50 ul d'urines pour chaque jour du test. Le signal sera tout simplement un spot bleu accompagné de l'habituel spot rose de fin de test. Chez une femme normale la carte va montrer à la fin des dix jours de tests,une première succession de spots incolores (les 3 ou 4 premiers) suivis de 3 ou 4 spots bleus (signal d'excès de LH),suivis à leur tour d'une succession de spots incolores (les 3 ou 4 derniers). Il est très interessant de noter que l'elevation de LH se fait en realité dès le 10ème jour dans les urines mais que l'ovulation ne se fait que le 13ème jour.Or les spermatozoides survivent chez la femme 2 à 3 jours après les rapports.Le fait que le signal apparait 3 jours avant l'ovulation,permet donc de preconiser l'abstinence assez tôt.Mais comme l'ovule ne survit que peu de temps après l'ovulation en l'absence de spermatozoides,la persistance du signal bleu les 14ème et 15ème jours ne permet la reprise des rapports sans risque de rencontre de spermatozoides avec un ovule encore operationnel. EXEMPLE 7 : COMBINAISONS DE MARQUEURS TUMORAUX ET CYTOKINES De très nombreuses combinaisons peuvent être insérées dans la même carte surtout avec l'arrivée de nouveaux marqueurs beaucoup plus specifiques.Un exemple de combinaisons CEA (Antigene carcino-embryonnaire) - AFP (alpha foeto proteine) - CA 19-9 (en theorie specifique du pancreas mais apparait dans d'autres cancers) - CA 15-5 (en theorie specifique du sein) - CA 153 (ovaires) On peut associer le dosages de cytokines : certaines interleukines peuvent harmonieusement completer une carte de marqueurs tumoraux. On peut y associer un dosage chimique du fer (effondré dans les processus malins) Une carte de detection de la Maladie de Hodgkin est possible en y associant la detection d'interleukines impliquées dans les hemopathies malignes,avec certains marqueurs tumoraux et surtout avec les dosages chimiques du Cuivre (très augmenté) et du fer (effondré). Une carte de suivi des chimiotherapies serait d'une grande utilité en y associant le dosage des G-CSF (Growth colonies stimulating factors : cytokine qui a rendu possible l'usage de quantités plus importantes de chimiotherapie en stimulant fortement le renouvellement et la croissance de nouveaux leucocytes et eviter l'aplasie medullaire post-chimiotherapique).Ces nouvelles therapeutiques sont de maniement extrêmement delicat (l'interferon par exemple est resonsable de desordres graves et d'intolerances severes).Le suivi par une carte de dosage de ces substances eviterait les accidents de surdosage. EXEMPLE 8 : SUIVI THERAPEUTIQUE - DOSAGE DE MEDICAMENTS De nombreux patients sont plurimedicalisés,notemment les personnes agées dont l'elimination renale ou biliare est sujette à variations.Ce qui provoque de nombreux accidents de surdosage ou de sous-dosage.Exemple de tests: Digitaline - Theophylline - Beta-bloquants Neuroleptiques - Antibiotiques - Corticoïdes Medicaments anti-rejet dans les greffes d'organes Cocaïne - Heroïne - (detection de drogues) REVENDICATIONS 1 - Dispositif de detection immunologique très rapide d'un ligand dans un fluide biologique caracterisé en ce que le signal est fourni non plus par le marquage du reactif mais par une quantité infiniment plus importante de nouvelles molecules de type ionique,naissant,à raison de plusieurs millions par seconde pour une molecule de ligand detecté,au contact du reactif marqué (notemment un anticorps marqué qui a capté le ligand) avec des produits chimiques d'amplification,aboutissant à une sensibilité extrême.Ce signal est donc de nature chimique (et non physique comme par exemple l'accumulation de microbilles de latex bleu au niveau de la zone signal) 2 - Dispositif de detection immunologique d'un ligand dans un fluide biologique comprenant une zone chimique horizontale dans laquelle ne s'effectue aucune reaction immunologique,surplombée à son extremité par une zone immunologique verticale;caractérisées en ce que - la zone immunologique que l'echantillon traverse de haut en bas est formée de la superposition de deux membranes poreuses * la première supportant,non fixés et lyophilisés de preference,des reactifs marqués (des anticorps ou des antigenes notemment) destinés à former au cours de cette première etape immunologique,un complexe avec le ligand recherché,eventuellement present dans 1' echantillon, ** la seconde supportant,solidement fixées,des immunoglobulines destinées à pieger les reactifs marqués en l'absence du ligand recherché dans l'echantillon,mais aptes à les laisser passer vers la seconde zone à migration horizontale lorsqu'ils sont complexés au ligand detecté dans l'echantillon - en ce que la zone chimique horizontale est formée d'une seule membrane poreuse absorbant horizontalement les liquides de l'echantillon qui ont traversé la première zone,et est destinée à une forte amplification d'un signal visible (colorimetrie) ou mesurable (chemiluminescence, fluorescence ou radioactivité) se trouvant sur cette membrane de migration horizontale,loin de la zone immunologique. 3 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication No 2 caracterisé en ce que le contrôle de bon fonctionnement à la fin du dosage sont representés par la coloration d'un spot terminal à l'extremité de la bande de migration;c'est encore un signal de nature chimique et non physique (comme par exemple l'agglutination de microbilles de latex coloré) 4 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication 2 caracterisé en ce que les signaux obtenus (signal et contrôle),sont sur la même face du dispositif que la face de depose de l'echantillon (le dispositif n'est donc pas retourné pour lire le signal). 5 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication 2,caracterisé en ce que les membranes sont avantageusement enserrées entre les deux feuillets d'une bandelette ou d'une carte dont le feuillet superieur est perforé de trois orifices * un premier orifice surplombant la membrane de reactifs marqués lyophilisés,pour la depose de l'echantillon ** un second orifice surplombant le signal pour le voir ou le mesurer *** un troisième orifice surplombant le spot de bon fonctionnement et de fin de migration de l'echantillon,pour declencher la lecture visuelle ou la mesure du signal par un appareillage. 6- Dispositif de detection immunologique selon la revendication 5,caracterisé en ce qu'il comprend dans la même carte,non plus un mais une association de dispositifs identiques (pour des tests quotidiens d'ovulation par exemple) ou une association de dispositifs de diagnostic different (comme par exemple un test de detection antigenes HIV et un test de detection anticorps HIV à partir du même echantillon) ou une association de dispositifs pour un groupe d'affections (comme par exemple un ensemble de marqueurs tumoraux ou un groupe de cytokines) ou un test qualitatif associé à un test semi-quantitatif de dosage du même ligand. 7 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication 5,caracterisé en ce qu'il comprend dans la même carte un (ou des) dispositif(s)immunologiques associé(s) à un ou des tests chimiques colorimetriques completant harmonieusement le diagnostic immunologique (comme par exemple le dosage immunologique du PSA pour le cancer de la prostate et un dosage chimique de phosphatases acides pour evaluer d'eventuelles metastases osseuses,ou le dosage immunologique de l'antigene HBs de l'hepatite avec le dosage colorimetrique quantitatif des transaminases pour evaluer l'intensité de la cytolyse heapatique,ou le dosage immunologique de l'insuline avec le dosage chimique du glucose dans les cas de resistance à l'insuline et d'obesités) 8 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication 2 caracterisé en ce que le signal colorimetrique qui est au depart un spot est recouvert d'une membrane plastique transparente,imprimée en blanc opaque sauf au niveau de lettres correspondants au diagnostic et qui se trouvent ainsi imprimées en negatif : le spot coloré sera vu de dessus uniquement à travers les lettres restées transparentes;le signal sera donc par exemple "HCG" ou "HIV" ou "PSA > 0,4" ou "ACE" ou "IL-2" ou "LH" ou "NORMAL",etc. 9 - Dispositif de detection immunologique selon la revendication 1 caracterisé en ce que le signal emis est different selon qu'il y a excès ou deficit du ligand recherché dans l'echantillon : en cas de lecture colorimetrique par exemple,il sera * d'une certaine couleur en cas de deficit ** incolore en cas de valeur normale *** d'une autre couleur en cas d'excès