FR 2723847 A1 19960301 FR 9410380 A 19940829 COMPOSITIONS ANTITHROMBOTIQUES ET NON HEMORRAGIQUES A BASE D'HEPARINE, PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES La présente invention concerne des compositions à base d'héparine ainsi que leur procédé de préparation et leurs applications thérapeutiques. Elle concerne plus particulièrement des compositions à base d'héparines neutralisées par la protamine, présentant une activité antithrombotique mais sensiblement dépourvues d'activités hémorragique et anticoagulante. Les héparines sont connues et utilisées depuis de nombreuses décennies pour la préparation de médicaments à activité antithrombotique et/ou anticoagulante destinés en particulier au traitement préventif et curatif des thromboses veineuses et artérielles ou encore pour prévenir l'activation de la coagulation dans les circulations extracorporelles. Depuis quelques années, on sait préparer des héparines de bas poids moléculaire, qui présentent toujours une activité antithrombotique mais dont les propriétés anticoagulantes sont réduites. Néanmoins, qu'il s'agisse d'héparines non fractionnées ou d'héparine de bas poids moléculaire, le risque hémorragique reste la complication majeure des traitements à base d'héparine. De ce fait, il existe une limitation importante à l'utilisation d'héparines qui sont en particulier contre-indiquées chez des patients prédisposés aux hémorragies, les patients souffrant d'ulcères duodénaux ou gastriques ou encore des patients ayant subi récemment une intervention chirugicale chez lesquels le traitement antithrombotique par héparine peut entraîner des hémorragies. Par suite, les propriétés avantageuses des héparines, à savoir leur activité antithrombotique ou anticoagulante, ne peuvent être correctement mises à profit en raison de leurs effets secondaires importants liés à ce risque hémorragique permanent. Lorsque surviennent des hémorragies au cours des traitements par héparine, le traitement fait appel au sulfate de protamine qui provoque la neutralisation de l'héparine in vivo. Bien, que la protamine soit ainsi utilisée depuis plusieurs années, on ne connaît pas bien le mécanisme de la neutralisation de l'héparine par la protamine. Une étude relativement récente a simplement montré que les hépaiines de bas poids moléculaire étaient neutralisées à un degré moindre par rapport aux héparines non fractionnées ("In Vitro Protamine Neutralization Profiles of Heparins Differing in Source and Molecular Weight", SEMINARS IN THROMBOSIS AND IN HEMOSTASIS, vol. 15 N"4, 1989). Le problème que vise à résoudre la présente invention est donc de réduire le risque hémorragique important exposé ci-dessus, limitant l'utilisation thérapeutique des héparines. Le but de l'invention est plus précisément de supprimer le plus possible le risque hémorragique des héparines tout en conservant leurs principales propriétés, en particulier l'activité antithrombotique. Aussi, le but de la présente invention est de fournir des compositions d'héparines qui présentent des propriétés pharmacologiques très intéressantes, en particulier antithrombotique, sensiblement équivalentes à celles des héparines utilisées jusqu'alors, sans en présenter l'inconvénient majeur qui réside dans le risque hémorragique important. Un autre but de la présente invention est encore de fournir un procédé de préparation de telles compositions qui soit simple à mettre en oeuvre et peu coûteux, permettant en outre de développer leurs applications thérapeutiques. L'invention vise également les applications thérapeutiques de ces compositions. Ces buts sont atteints à l'aide des compositions d'héparines selon l'invention qui présentent une activité antithrombotique et sont pratiquement dépourvues d'activité hémorragique. Ces compositions sont caractérisées par le fait qu'elles sont constituées essentiellement de fractions d'héparine telles qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'héparine par la protamine. Par fraction d'héparine neutralisée par la protamine, on entend toute fraction provenant d'une héparine native ou déjà fractionnée, ou d'une héparine de synthèse, dont le pouvoir hémorragique a été neutralisé par l'action de la protamine ou de tout analogue ou équivalent de ce] le-ci ayant une capacité similaire de réduction du pouvoir hémorragique. Les compositions selon l'invention sont avantageusement constituées de fractions d'héparine tel le qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine non fractionnée ou d'une héparine de bas poids moléculaire, par la protamine. Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition est constituée de fractions d'héparine dont 25 % présentent une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa et 40 % présentent une masse moléculaire supérieure à 20 kDa. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition est constituée uniquement de fractions d'héparine présentant une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa. Dans d'autres modes de réalisation les fractions d'héparine ont un spectre de masses moléculaires dépendant des modes de neutralisation par la protamine qu'on utilise. Les compositions conformes à l'invention sont sensiblement exemptes de protamine. L'invention fournit également un procédé pour la préparation des compositions précitées caractérisé par le fait qu'il comprend une étape de neutralisation in vitro d'héparine par la protamine. Les inventeurs ont découvert que, d'une manière surprenante, on pouvait neutraliser in vitro, notamment à l'aide de la protamine, l'activité hémorragique de l'héparine tout en préservant ses propriétés antithrombotiques. D'une manière plus précise, le procédé selon l'invention consiste à faire réagir, en solution, une héparine avec la protamine, notamment sous la forme de sel de protamine, selon des rapports héparine/protamine variables. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, on mélange une solution d'héparine avec une solution de sel de protamine, de préférence à la température ambiante, on centrifuge le mélange obtenu et on récupère le surnageant. Selon l'invention, par solution d'héparine, on entend une solution d'héparine native ou déjà fractionnée, ou d'héparine de synthèse. Le sel de protamine consiste avantageusement en du sulfate de protamine. Selon l'invention, on peut utiliser tout analogue ou équivalent de la protamine ayant une capacité similaire, neutralisation de l'héparine et donc de réduction du pouvoir hémorragique. Le surnageant peut être ensuite lyophilisé. L'héparine à traiter et la protamine peuvent être utilisées selon différents rapports qui conduisent essentiellement à l'élimination du risque hémorragique lié aux héparines. Le procédé comprend l'étape de neutralisation d'une héparine par la protamine ou un équivalent, de préférence dans des proportions héparine/protamine de 2/l à 1/2. Selon un mode de réalisation de ce procédé, le rapport héparine/protamine est de l'ordre de 1/1. Dans ce cas, on obtient des compositions d'héparine comprenant des fractions dont au moins 25 % présentent une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa et au moins 40 présentent une masse moléculaire supérieur à 20 kDa. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le rapport héparine/protamine est de l'ordre de 1/2. On obtient alors des compositions d'héparines comprenant essentiellement des fractions présentant une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa. Selon le procédé conforme à la présente invention, on obtient des compositions d'héparines exemptes de protamine. L'étude pharmacologique des compositions d'héparine de l'invention a permis de mettre en évidence, d'une manière surprenante, qu'elles sont pratiquement dépourvues d'activité hémorragique et conservent parallèlement leur propriété antithrombotique. Cette étude pharmacologique a également mis en évidence, d'une manière surprenante, que les fractions d'héparines obtenues par neutralisation par la protamine conformément à l'invention, exercent une activité antithrombotique qui crolt avec l'administration de doses croissantes, sans augmentation parallèle de leur activité hémorragique ou anticoagulante. Un autre protocole expérimental a permis de montrer que les compositions selon l'invention étaient capables d'inhiber l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine, de manière plus efficace que l'héparine non fractionnée. La suppression du risque hémorragique, conformément à l'invention, permet d'envisager une administration par voie parentérale ou par voie broncho-pulmonaire en aérosol, dans le traitement de certaines affections broncho-pulmonaires pouvant impliquer un excès d'élastase leucocytaire, telles que les syndromes de détresse respiratoire aigüe, la mucoviscidose, les broncho-pneumopathies chroniques obstructives. Les compositions d'héparine selon l'invention, qui sont stables et non toxiques, peuvent être employées pour la préparation de médicaments utiles dans diverses applications thérapeutiques. Ces applications sont celles de l'héparine et de ses dérivés classiques y compris les cas où l'héparine est contre-indiquée en raison du risque hémorragique que présente le patient. Elles peuvent servir en particulier à la préparation de médicaments pour le traitement et la prévention des thromboses veineuses ou artérielles ou encore pour prévenir l'activation de la coagulation dans la circulation extracorporelle. L'invention est donc également relative à des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition d'héparine selon l'invention telle que décrite précédemment, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir, par exemple, de compositions pharmaceutiques antithrombotiques ou encore pour l'inhibition de l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine. Les fractions d'héparine de ces compositions peuvent être mises sous la forme de sel pharmaceutiquement acceptable selon les procédés classiques. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont avantageusement des formulations injectables destinées en particulier à une administration par voie parentérale. Pour d'autres applications telles que l'inhibition de l'élastase leucocytaire, on prévoit avantageusement des formulations appropriées à une administration par voie broncho-pulmonaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples donnés ci-après à titre indicatif et non limitatif, en référence aux dessins annexés dans lesquels - la figure l est un graphe comparatif de l'activité hémorragique d'héparine non fractionnée, d'héparine de bas poids moléculaire et non hémorragique des compositions d'héparines selon l'invention (Si, S2, S3) - la figure 2 est un graphe comparatif de l'activité antithrombotique d'héparine non fractionnée, d'héparine de bas poids moléculaire et de compositions d'héparines selon l'invention (S1, S2, S3). EXEMPLES Produits utilisés : Héparine standard (LEO), Sulfate de protamine (CHOAY) et Héparine de bas poids moléculaire, "Enoxaparine", commercialisée sous le nom "LOVENOX" (PHARMUKA). - EXEMPLE 1 : Préparation du surnageant S1 On prépare 14,4 ml d'une solution d'héparine standard présentant un titre de 72000 UI (480 mg) et 48 ml d'une solution de sulfate de protamine présentant un titre de 48000 UAH. On mélange ces solutions à température ambiante. Le rapport héparine/protamine est alors de l/l, c'est-àdire qu'on neutralise 1 mg d'héparine par l mg de sulfate de protamine. On centrifuge le mélange ainsi obtenu pendant 10 minutes et on récupère le surnageant qu'on lyophilise. - EXEMPLE 2 : Préparation du surnageant S2 On procède comme décrit à l'exemple l à partir de 9 ml d'une solution d'héparine standard (soit 45000 UI, 300 mg) et de 60 ml de sulfate de protamine (soit 6000n UAH). Le rapport héparine/protamine est alors de 1/2, c'est-à-dire qu'on neutralise 1 mg d'héparine par 2 mg de sulfate de protamine. - EXEMPLE 3 : Préparation du surnageant S3 On procède comme décrit à l'exemple 1 à partir de 4 ml d'une solution d'héparine de bas poids moléculaire, "Enoxaparine" (LOVENOX), (soit 400 mg) et de 40 ml de sulfate de protamine (soit 40000 UAH). Le rapport héparine/protamine est alors de 1/1, c'est-à-dire qu'on neutralise 1 mg d'héparine de bas poids moléculaire par 1 mg de sulfate de protamine. CARACTERISATION BIOLOGIQUE - Distribution des masses moléculaires TABLEAU I Surnageant S1 obtenu selon l'exemple 1 - Distribution des masses moléculaires exprimées en pourcentage Masse moléculaire UV RI > 20 kDa 43.3 47.3 16-20 kDa 2.7 4.45 12-16 kDa 4.5 7.65 8-12 kDa 9.7 13.85 5-8 kDa 8.13 11.8 2.5-5 kDa 6.36 10.3 kDa 25.16 4.65 # = 99.85 # = 100 TABLEAU II Surnageant S2 obtenu selon l'exemple 2 - Distribution des masses moléculaires exprimées en pourcentage Masse, UV RI moléculaire > 20 kDa 0 0 16-20 kDa 0 0 12-16 kDa 0 0 8-12 kDa 0 0 5-8 kDa 0 0 2.5-5 kDa 0 0 kDa 100 100 # = 100 # = 100 - Spectre d'absorption en ultra-violet pour le surnageant S1 (exemple 1) Une solution diluée au 1/20 présente deux pics d'absorption aux longueurs d'onde suivantes 212 nm : DO=3,47 et 271,5 nm : DO=2,22 - Titrage du surnageant S1 (exemple 1) Avant lyophilisation du surnageant S1 préparé selon l'exemple 1, chaque flacon contient 0,7 ml de solution surnageante. 12 dosages identiques ont été réalisés pour vérifier la reproductibilité . les résultats sont donnés dans le tableau III ci-dessous TABLEAU III N@ Masso d'héparine par AZURB A A-Xa A-@@a FLACON flacon (mg/0.7ml) (Ul/mg/ml) (Ul/mg/ml) (Ul/mg/ml) 1 23.43 84 61 32 2 23.43 83 54 29 3 22.41 84 62 32 5 23.50 86 63 30 6 24.20 83 56 28 7 21.70 86 62 29 8 23.30 83 61 31 9 22.00 85 63 30 10 20.70 83 58 32 11 21.30 85 57 28 12 20.80 80 54 30 M # DS 22 # 1.2 84 # 2.2 59 # 3.3 30 # 1.4 AZURE A : Méthode de Klein M.D. et al. A-Xa Dosage chronométrique de l'héparine (Hépadot Laboratoire Stago) A-IIa : Méthode amidolytique - Dosage des protéines Le dosage des protéines dans les surnageants S1 et S2, respectivement préparés selon les exemples 1 et 2, est effectué selon la méthode de Pierce (Coffret réactif Laboratoire Pierce). Les résultats sont donnés dans le tableau IV ci dessous TABLEAU IV SOLUTIONS CONCENTRATION DES PROTEINES ( g/ml) S1 (2 mg/ml) 3.2 S1 (1 mg/ml) 1 S2 (2 mg/ml) 29.9 S2 (1 mg/ml) 11.2 LOVENOX (2 mg/ml) 8.6 LOVENOX (1 mg/ml) 6.7 - Composition en électrolytes (mEq/l) La composition en électrolytes des surnageants S1 et S2 est donnée dans le tableau V ci-après :: TABLEAU V Na K Si v I 0.55 S2 18 021 - Détermination du pH TABLEAU VI Solutions pH ETUDE PHARMACOLOGIQUE A. Etudes expérimentales chez le rat dans un modèle de thrombose veineuse induite par stase et un modèle d'hémorragie provoquée Des études ont été menées selon la méthode décrite par C. DOUTREMEPUICH et coll., "Experimental venous thrombosis in rats treated with heparin and a low molecular weight heparin fraction", Haemostasis, 13, 109-112 (1983). a. Modèle curatif (injections par voie sous-cutanée deux heures après l'induction de la thrombose) Deux études ont été réalisées selon le protocole suivant TO : ligature de la veine cave T0+2H : injection des solutions par voie sous-cutanée T0+5H30 : induction de l'hémorragie T0+6H : prélèvements (sang et caillot) Les résultats obtenus à l'issue de la première étude sont rassemblés dans les tableaux VII et VIII ci-dessous TABLEAU VII Poids caillot (mg) T.H.P (sec) T.C.K (sec) T.T.D (sec) Contrôle 5.5.4 # 1.54 108 # 20 19.6 # 1.3 19.4 # 0.5 @éparine (2 mg) 1.76 # 0.53 @ 420 # 00 @ 180.0 # 0. @ 180.0 # 0 @ S1 (2mg) 2.90 # 0.88 @ 141 # 36 23.2 # 1.8 20.5 # 1.5 S2 (2mg) 4.19 # 1.07 123 # 32 21.4 # 2.1 19.6 # 1.4 Lovenox (2 mg) 3.03 # 0.72 @ 153 # 48 25.2 # 2.1 20.8 # 0.9 Héparine (1 mg) 4.18 # 1.06 144 # 60 25.9 # 2.6 21.5 # 1.0 S1 (1 mg) 4.68 # 0.91 122 # 28 23.1 # 1.7 20.5 # 1.5 S2 (1 mg) 4.55 # 1.48 123 # 34 21.3 # 2.1 19.7 # 1.2 Lovenox (1 mg) 4.84 # 0.94 146 # 40 21.6 # 2.0 20.0 # 1.5 T.H.P. : Temps d'Hémorragie Provoquée T.C.K. : Temps de Céphaline Kaolin T.T.D. :Temps de Thrombine Diluée * : p TABLEAU VIII Plaquettes Globules blancs Globules rouges (x 109/l) (x 109/l) (x 1012/l) Contrôle 538 # 220 5.70 # 3.27 7.40 # 0.39 Héparine (2 mg) 684 # 241 4.25 # 1.80 7.71 # 1.06 S1 (2mg) 589 # 222 4.07 # 2.06 7.61 # 0.71 S2 (2 mg) 546 # 155 4.61 # 2.73 7.53 # 0.97 Lovenox (2 mg) 606 # 113 3.45 # 1.98 7.81 # 0.99 Héparine (1 mg) 692 # 263 5.02 # 3.25 7.71 # 1.05 S1 (1 mg) 575 # 200 4.23 # 1.68 7.26 # 0.39 S2 (1 mg) 600 # 242 4.21 # 2.70 7.46 # 1.15 Lovenox (1 mg) 621 # 188 5.47 # 2.62 7.88 # 0.81 Cette première étude montre que l'héparine neutralisée in vitro par la protamine dans un rapport héparine/protamine de 1/1 conduisant au surnageant S1 exerce, à une dose de 2 mq, une activité antithrombotique assez importante qui est comparable à celle de l'héparine non neutralisée et à celle du LOVENOX (héparine de bas poids moléculaire), tandis que l'activité anticoagulante et l'activité hémorragique ne sont que faiblement augmentées. Le surnageant S1 n'a aucun effet sur les cellules sanguines. Par ailleurs, le surnageant S2, obtenu par neutralisation selon un rapport héparine/protamine de 1/2, n'exerce aucune activité hémorragique mais possède une activité antithrombotique réduite. Les résultats de la seconde étude sont donnés dans le tableau IX ci-après TABLEAU IX CROUPES P.C (mg) T.H.P (S) T.C.K (S) T.T.D (S) PLAC@BO 6.91 # 1.09 126 # 49 22 # 1.8 19.6 # 1.0 . HEPARINE 3.41 # 1.08 * > 420 * > 180 * > 180 * 2 mg SN1 5.22 # 2.17 124 # 58 21.2 # 1.14 19.5 # 1.3 SN2 5.63 # 1.93 145 # 38 22.1 # 2.80 20.0 # 1.2 LOVENOX 4.33 # 1.06 * 182 # 56 * 24.9 # 0.70 21.3 # 1.3 HEPARINE 3.38 # 0.55 * > 420 * > 180 * > 180 * 3 mg SN1 4.73 # 1.77 151 # 14 22.0 # 1.6 19.5 # 0.@ SN2 5.26 # 1.24 131 # 47 20.4 # 1.8 20.8 # 1.8 LOVENOX 3.62 # 0.90 * 140 # 38 * 29.0 # 1.6 22.0 # 1.7 HEPARINE 2.75 # 0.91 * > 420 * > 180 * > 180 * 4 mg SN1 4.09 # 1.10 * 155 # 43 22.5 # 1.9 19.7 # 0.9 SN2 4.72 # 2.33 136 # 48 18.6 # 5.7 19.2 # 0.5 LOVENOX 3.33 # 0.98 * 198 # 76 * 50.9 # 3.9 * 39.4 # 1.9 * HEPARINE 2.15 # 0.83 * > 420 * > 180 * > 180 * 5 mg SN1 3.70 # 1.28 * 142 # 33 29.5 # 3.@ * 24.2 # 9.3 SN2 4.84 # 1.12 145 # 48 22.0 # 1.3 20.3 # 0.7 @@@ @.52 # 0.30 * 121 # 15 20.8 # 1.8 19.6 # 1.75 LOVENOX 2.85 # 1.14 * 389 # 86 * > 180 * > 180 * HE@ARINE 0.98 # 0.82 * > 420 * > 180 * > 180 * 10 mg SN1 3.15 # 1.21 * 171 # 64 * 30.2 # 2.5 * 32.6 # 6.9 * SN2 4.09 # 1.16 * 136 # 74 23.8 # 1.7 20.0 # 0.7 SN3 2.29 # 0.40 * 157 # 21 27.0 # 2.0 23.0 # 1.0 LOVENOX 1.44 # 0.48 * > 420 * > 180 * > 180 * P.C. : Poids du Caillot expérimental T.H.P. : Temps d'Hémorragie Provoqué T.C.K. : Temps de Céphaline-Kaolin T.T.D. : Temps de Thrombine Diluée Il résulte des résultats obtenus que l'activité antithrombotique des fractions S1, S2 et S3 selon l'invention croît avec des doses administrées croissantes. Si l'on se réfère aux courbes dose-effet, établies pour des doses allant de 2 mg/kg à 10 mg/kg, on voit, sur la figure 1, que quel que soit le type d'héparine traitée conformément à l'invention, la fraction d'héparine obtenue présente une activité hémorragique similaire à celle du groupe contrôle, même aux doses les plus élevées. L'héparine non fractionnée et l'héparine de bas poids moléculaire (LOVENOX), non neutralisées par la protamine, selon l'invention, présentent une activité hémorragique considérable par rapport aux fractions d'héparine de l'invention. La figure 2 montre que les fractions d'héparine obtenues selon l'invention présentent une activité antithrombotique intéressante. Dans le cas de la fraction S1 (rapport héparine/protamine de 1/1), cette activité est comparable à celle des héparines non neutralisées conformément à l'invention. b. Modèle préventif (administration par voie souscutanée une heure avant l'induction de la thrombose) L'étude a été menée avec le surnageant S1 (exemple 1) selon le protocole suivant TO : injection des solutions par voir sous-cutanée T0+1 Heure : induction de la stase T0+24 Heures : prélèvements (sang et caillot) Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau X ci-dessous TABLEAU X Poids caillot(mg) T.C.K(sec) T.T.D(sec) Ti(sec) Contrôle 5.13 # 1.03 19.5 # 0.4 18.7 # 0.6 19.8 # 0.83 Héparine (4 mg) 3.40 # 0.70 * 20.7 # 0.4 19.3 # 0.8 19.8 # 1.30 S1 (4 mg) 3.23 # 0.61 * 20.5 # 1.1 19.4 # 0.8 19.3 # 0.83 Lovenox (4 mg) 3.48 # 0.94 * 19.6 # 0.8 19.7 # 0.9 19.7 # 109 T.C.K. : Temps de Céphaline Kaolin T.T.D. : Temps de Thrombine Diluée Ti : Temps de Titrarine (Laboratoire Stago) * : p Les résultats obtenus montrent, qu'à titre préventif, S1 exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine et du LOVENOX, 24 heures après l'induction de la thrombose. B. Etude expérimentale chez le rat dans un modèle de thrombose induite par génération de radicaux libres (référence : DOUTREMEPUICH - In press - Annales de Cardiologie et Angiologie) L'étude a été menée avec S1 (exemple 1) selon le protocole suivant (TO : injection des solutions par voie sous-cutanée) T0+25 min : injection de rose bengale à une dose de Smg/kg T0+30 min : induction des radicaux libres au niveau de la première artériole par réaction photo chimique T0+55 min : injection de rose bengale à la même dose T0+60 min : induction des radicaux libres au niveau de la deuxième artériole T0+85 min : injection de rose bengale à la même dose T0+90 min : induction des radicaux libres au niveau d'une veinule Après la dernière thrombose, on effectue un prélèvement sanguin par voie intra-cardiaque. Le temps d'excitation est fixé à 2 minutes et le temps d'observation à 10 minutes. On obtient les résultats donnés dans le tableau XI cidessous TABLEAU XI Artériole T0 + 30' CONTROLE S1 (2 mg/kg) HEPARINE (2mg/kg) Durée 4.50 # 0.82 9.68 #0.44* 6.80 # 2.32 d'embolisation (min) Nombre 12.00 # 2.45 4.00 # 3.56* 3.56 # 2.12* d'embols Artériole T0 + 60' Durée 3.49 # 0.36 9.81 # 0.25* 5.9 # 3.6 d'embolisation (min) Nombre d'embols 7.33 # 0.47 5.00 # 2.45 4.56 # 3.6 Velnule T0 + 90' CONTROLE S1 (2 mg/kg) HEPARINE (2mg/kg) Durée 4.53 # 2.04 3.68 # 2.06 - d'embolisation (min) Nombre d'embols 7.00 # 4.32 4.00 # 1.41* Durée d'embolisation durée entre le premier embole et le dernier embole se détachant du caillot Nombre d'emboles : nombre d'emboles se détachant du caillot Dans ce modèle de thrombose induite par radicaux libres, le surnageant S1 (exemple 1) exerce une activité antithrombotique significative par rapport au groupe placebo, qui persiste après 90 minutes (T0+90 min). Cette activité est plus importante que celle de l'héparine injectée à la même dose, après 30 et 60 minutes (T0+30 et T0+60 min). C. Etude expérimentale chez le rat dans un modèle de thrombose induite par lésion endothéliale au laser (Réf Vesvres, Haemostasis 1993, 23, 8-12) a. Etude 1 L'étude a été menée selon le protocole suivant TO : injection de la substance à tester à une dose de 2mg/kg par voie sous cutanée T0+35 min : induction de la thrombose artérielle par rayon laser Le temps d'observation est fixé à 10 minutes. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau XII ci-dessous TABLEAU XII T0 + 35' (THROMBOSE ARTERIELLE) CONTROLE S1 (2 mg/kg) HEPARINE (2mg/k Nombre de tirs laser 1.2 # 0.4 2.0 # 1.4 2.5 # 3.3 Nombre d'embols 10.2 # 2.7 1.5 # 0.7 * 3.3 # 2.4 * Durée d'embolisation (min) 6.3 # 1.8 1.0 # 0.0 * 2.1 # 1.8 * S1 exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine non neutralisée injectée à la même dose et réduit le nombre d'embolus ainsi que la durée d'embolisation de manière statistiquement significative. b. Etude 2 L'étude a été menée selon le protocole suivant TO : injection des substances à tester à une dose de 2mg/kg par voie sous-cutanée TO+lh : induction de la première thrombose artérielle T0+3h : induction de la deuxième thrombose artérielle T0+6h : induction de la troisième thrombose artérielle Le temps d'observation est fixé à 10 minutes. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau XIII ci-dessous Tableau XIII T0 + 1h T0 + 3 h T0 + 6 h S1 Hép S1 Hép S1 Rép Nombre de tirs 1.6#0.5 1.6#0.5 2.0#0.0 1.6#0.5 1.6#0.5 1.0#0.0 Nombre d'embols 3.0#1.0 5.0#1.7 5.3#3.5 6.7#1.2 8.3#3.0 7.5#2.1 Durée 1.3#0.5 2.6#1.2 2.3#1.5 3.0#1.0 4.3#2.4 3.0#1.4 d'embolisation S1 exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine non neutralisée par la protamine. En conclusion, les études décrites ci-dessus montrent que l'activité antithrombotique est observée dans les trois modèles de thrombose expérimentale à savoir le modèle veineux induit par stase, le modèle de thrombose artérielle induite par radicaux libres et le modèle de thrombose artérielle induite par lésion endothéliale au laser. Selon l'invention, la fraction d'héparine obtenue à partir d'une héparine de bas poids moléculaire, l'"Enoxaparine" (LOVENOX), présente une activité antithrombotique plus importante que celle de la même héparine de bas poids moléculaire non traitée in vitro par la protamine et plus importante également que celle des fractions obtenues à partir des héparines non fractionnées et non traitées in vitro par la protamine, tout en ne présentant plus aucun risque hémorragique. Le procédé selon l'invention permet, d'une manière simple et peu coûteuse, pratiquement de supprimer l'activité hémorragique des héparines tout en conservant leur activité antithrombotique. REVENDICATIONS 1/ Composition d'héparines présentant une activité antithrombotique et pratiquement dépourvue d'activité hémorragique, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine par la protamine. 2/ Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine non fractionnée par la protamine. 3/ Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine de bas poids moléculaire par la protamine. 4/ Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions dont au moins 25 % présentent un poids moléculaire inférieur à 2,5 kDa. 5/ Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions dont au moins 40 % présentent un poids moléculaire supérieur à 20 kDa. 6/ Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions de poids moléculaire inférieur à 2,5 kDa. 7/ Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une fraction présentant la distribution des masses moléculaires donnée au tableau I. 8/ Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une fraction présentant la distribution des masses moléculaires donnée au tableau II. 9/ Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement exempte de protamine. 10/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle présente des propriétés inhibitrices de l'activité hydrolytique de ltélastase leucocytaire humaine. 11/ Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend la neutralisation in vitro d'une héparine par la protamine. 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à mélanger une solution d'héparine et une solution d'un sel de protamine, à centrifuger le mélange obtenu et à récupérer le surnageant. 13/ Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que le sel de protamine est le sulfate de protamine. 14/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'héparine et la protamine sont utilisées dans un rapport de 1 pour 1. 15/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'héparine et la protamine sont utilisées dans un rapport de 1 pour 2. 16/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que l'on neutralise de l'héparine non fractionnée. 17/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que l'on neutralise de l'héparine de bas poids moléculaire. 18/ Utilisation d'une composition d'héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la préparation d'un médicament présentant une activité antithrombotique et pratiquement dépourvue d'activité hémorragique. 19/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu elle comprend une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 20/ Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution injectable. 21/ Composition pharmaceutique pour l'inlibition de l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 22/ Composition pharmaceutique selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie bronchopulmonaire.