FR 2718461 A1 19951013 FR 9404097 A 19940407 PROCZDZ DE DETECTION D'UN SITE DE RESTRICTION DANS UNE SéQUENCE D'ADN. La présente Invention est relative à un procédé de détection de fragments d'ADN comprenant un site de restriction défini, et de quantification de la proportion de ces fragments dans un échantillon d'acide nucléique. La détection de la présence ou de l'absence, chez tout ou partie d'une population de molécules d'ADN, d'un site de restriction déterminé à un locus donné peut être un élément de diagnostic de certaines pathologies, concernant en particulier le développement cancéreux de certains tissus. Il a été ainsi montré dans plusieurs pathologies cancéreuses, qu'intervenaient de fréquentes mutations et pertes d'hétérozygotie associées à un polymorphisme de restriction au niveau des séquences d'acide nucléique d'anti-oncogènes. Pour l'étude notamment de la perte d'hétérozygotie, on procède donc fréquemment à l'analyse du polymorphisme de restriction. Selon une technique de base, après digestion par une enzyme de restriction de 1ADN à analyser, les différents fragments de digestion sont séparés sur un gel d'électrophorèse, et analysés par transfert de Southern avec une sonde longue (plusieurs centaines de bases). Différents perfectionnements de cette technique de base ont été proposés : en particulier, une méthode dénommée PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism), a été récemment décrite [MERLO et al., Biotechniques, 11, p. 166-170, (1991)]. Après amplification par ACP de la portion du génome à analyser, le produit d'amplification est digéré par l'enzyme concernée, et le produit de la digestion est analysé par électrophorèse ; les homozygotes, pour l'un ou l'autre allèle, et les hétérozygotes sont distingués par le nombre et la taille des fragments de restriction. Cette méthode est rapide et reproductible. Elle présente en outre, du fait de l'amplification par PCR, l'avantage de pouvoir être effectuée à partir de très peu de matériel biologique. Cependant, elle implique, comme pour la technique de base, la mise en oeuvre d'une étape d'analyse par électrophorèse qui ne convient pas à la détection en nombre, ou aux analyses de routine dans les laboratoires médicaux. Le Brevet US 4 775 619 (Inventeur: URDEA) décrit un procédé de détection de séquences d'ADN dans lequel on procède à une hybridation sur support solide, entre un fragment d'ADN (analyte) susceptible de contenir la séquence d'intérêt, et un ou plusieurs oligonucléotides (sonde) dont l'un au moins est marqué, cette hybridation entraînant l'apparition d'un site de clivage spécifique, qui peut être en particulier un site de restriction. Le clivage de l'hybride au niveau de ce site entraîne la libération de la portion marquée, et l'hybridation est révélée par la détection du signal en résultant. I1 est indiqué dans ce document que ce procédé permet de réduire le bruit de fond entraîné par la fixation non-spécifique de la sonde marquée sur le support solide. Toutefois, le signal résultant du clivage de l'hybride apparaît en fait comme relativement faible par exemple, dans une des expérimentations décrites dans le Brevet US 4 775 619 (Essai V et tableau II, page 20), qui a été effectuée sur un système modèle ne comprenant que des fragments de séquence définie, il apparaît que tous les hybrides formés comprennent un site BamHI et devraient être coupés lors du traitement par l'enzyme correspondante, ce qui aboutirait théoriquement au relargage de la quasi-totalité du marquage dans le milieu réactionnel ; or, en pratique, moins de 15% du marquage fixé au support est libéré dans le milieu après 18 heures de traitement par BamHI. La sensibilité de cette méthode ne paraît donc pas suffisante pour qu'elle puisse être appliquée dans le cas d'analyses telles que la détection d'hétérozygotie, où il faut pouvoir obtenir des variations de signal significatives, afin non seulement de détecter l'existence d'un site de restriction dans les hybrides formés, mais également évaluer quantitativement, dans la population d'hybrides, la proportion de ceux qui portent le site. Les Inventeurs ont maintenant mis au point une méthode d'analyse d'un polymorphisme de restriction, pouvant être mise en oeuvre sur support solide, dans un tube à essai, ce qui permet de supprimer l'étape d'électrophorèse sur gel, et suffisamment sensible pour permettre de détecter la présence ou l'absence d'hétérozygotie. La présente Invention a pour objet un procédé de détection de la présence d'un site de restriction spécifique d'une enzyme dans une séquence cible d'ADN, lequel procédé comprend au moins - une étape au cours de laquelle on met en présence, en phase liquide, un fragment d'acide nucléique portant la séquence-cible et une sonde oligonucléotidique s'hybridant avec ladite séquence-cible, dans des conditions entrainant la formation d'un hybride entre ladite séquence cible et ladite sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible, et porte en outre un marquage permettant sa détection - une étape au cours de laquelle on procède à la fixation dudit hybride sur un support solide, de manière à ce que le site de restriction éventuellement formé soit situé entre l'extrémité fixée au support et la portion de l'hybride portant le marquage - une étape au cours de laquelle on procède au traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée - une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique. La sonde oligonucléotidique doit former un hybride stable avec la séquence cible, que celle-ci comprenne ou non le site de restriction et, bien entendu, doit comprendre une séquence strictement homologue de celle du site de restriction recherché. D'autre part, les Inventeurs ont constaté que la taille de la sonde oligonucléotidique jouait un rôle important pour la sensibilité et la reproductibilité du procédé de l'Invention. Pour obtenir les meilleurs résultats, cette taille doit être comprise entre 10 et 100 bases, de préférence inférieure à 50 bases, et très avantageusement inférieure à 30 bases. Par exemple, les Inventeurs ont observé que l'utilisation d'une sonde de longueur comprise entre 15 et 25 bases permettait d'obtenir un hybride stable, et un rendement de digestion très élevé. Avantageusement, le procédé conforme à l'Invention comprend une étape préalable d'amplification du fragment d'ADN portant la séquence cible. Cette amplification est effectuée in vitro par ACP (Amplification en Chaîne par Polymérase), ou toute autre méthode d'amplification, à partir de l'échantillon d'ADN à analyser. Outre le fait que cette amplification préalable permet d'obtenir une quantité de matériel suffisant pour procéder à l'analyse dans de bonnes conditions, et ce, même à partir d'une faible quantité d'échantillon, les Inventeurs ont observé que, de façon surprenante, elle améliorait très significativement la reproductibilité des résultats obtenus d'un échantillon à 1' autre. L'une des extrémités de l'hybride est pourvue d'un moyen de fixation au support solide ; ce moyen doit permettre d'opérer la fixation de l'hybride au support dans des conditions n'induisant pas la dénaturation dudit hybride ; il s'agira par exemple d'une molécule, telle que la biotine, capable d'établir une liaison d'affinité avec une autre molécule, telle que l'avidine, avec laquelle on aura préalablement recouvert le support. Outre le couple biotine/avidine, d'autres moyens de fixation peuvent être envisagés il peut s'agir par exemple de l'un des composants d'un couple d'affinité tel qu'un couple de type haptène anticorps anti haptène. Avantageusement, ledit moyen de fixation est associé (par exemple lié par liaison covalente), au fragment d'ADN portant la séquence cible. Cette association peut être effectuée en même temps que l'étape d'amplification ; par exemple, le fragment d'ADN portant la séquence-cible peut être amplifié en utilisant au moins une amorce biotinylée. La sonde ou le fragment d'ADN portant la séquence cible sont marqués pour permettre la détection de l'hybride formé ; ce marquage doit être régiospécifique, afin d'être limité à la partie de l'hybride qui est détachée du support après coupure par l'enzyme de restriction. N'importe quel type de marquage, radioactif ou non, peut être utilisé ; parmi les marqueurs radioactifs, on citera par exemple l'iode 125, le phosphore 32, etc parmi les marqueurs non radioactifs, on citera par exemple la biotine, ou l'un des composants d'un couple d'affinité (à condition, bien entendu, que le couple d'affinité utilisé comme moyen de marquage soit différent de celui utilisé comme moyen de fixation). La digestion par l'enzyme de restriction s'effectue dans les conditions habituelles pour ce type de réaction. Les conditions à utiliser, qui dépendent de l'enzyme concernée, sont décrites dans de nombreux ouvrages techniques, tel par exemple celui de SAMBROOK, FRISTSCH, et MANIATIS, [Molecular cloning : A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]. Le résultat de la réaction enzymatique peut être évalué en déterminant soit le marquage relargué dans le milieu réactionnel, soit le marquage restant lié au support. Le procédé conforme à l'Invention peut comprendre en outre une étape, consécutive à l'étape de fixation de l'hybride sur le support solide et précédant l'étape de digestion par l'enzyme de restriction, au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage de l'hybride marqué fixé au support. Dans ce cas, le résultat de la réaction enzymatique peut être évalué par rapport au marquage initial correspondant à l'hybride lié au support avant digestion. Cette étape n'est toutefois pas indispensable : en effet, les Inventeurs ont constaté que grâce à la reproductibilité qui découle de l'amplification préalable du fragment d'ADN portant la séquence-cible, les résultats de la réaction de digestion par l'enzyme de restriction pouvaient être obtenus, et clairement interprétés, sans qu'il soit nécessaire de procéder préalablement à la détermination de la quantité d'hybride fixé au support. Ceci permet de simplifier encore la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention. La présente Invention englobe également des nécessaires de diagnostic comprenant l'ensemble des réactifs permettant la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'Invention. Le procédé conforme à l'Invention présente l'avantage de ne pas nécessiter la mise en oeuvre d'une étape d'électrophorèse, et en outre permet d'obtenir des données numériques quantifiables. Il s'agit d'une technique fiable, bien adaptée à l'analyse rapide d'un grand nombre d'échantillons car elle est aisément automatisable, en utilisant un matériel similaire à celui mis en oeuvre pour les immuno-analyses courantes. Cette méthode peut donc aisément être mise en pratique dans des laboratoires d'analyses médicales. En outre, de par sa sensibilité et sa reproductibilité, il convient tout particulièrement à la détection de la présence ou de l'absence d'hétérozygotie au niveau d'un locus d'intérêt. En effet, la variation de signal observée entre les trois possibilités (homozygote a/a, hétérozygote a/b, homozygote b/b) est suffisamment importante pour permettre de les différencier clairement. En outre, les résultats sont reproductibles d'un échantillon à l'autre. Ceci permet d'observer directement les résultats de l'analyse, en s'affranchissant de la nécessité de procéder à un dosage précis, ce qui facilite la mise en oeuvre du procédé selon l'Invention avec très peu de matériel, par exemple, dans le cadre d'analyses sur le terrain. L'exemple qui suit illustre l'application d'un procédé conforme à l'Invention pour détecter une perte d'hétérozygotie au niveau du gène P53 dans des échantillons de prélèvements colorectaux chez l'homme. Une perte d'hétérozygotie à ce niveau a fréquemment été mise en évidence dans certains cancers du trac tus digestif chez l'homme. Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXWPLE Prélèvements de tissus Les échantillons ont été obtenus à partir de prélèvements chirurgicaux effectués sur des patients atteints de cancer colorectal. Les tissus cancéreux et la muqueuse saine adjacente ont été prélevés sur le même patient. A partir de chaque biopsie, des fragments ont été prélevés pour l'analyse histologique. Le reste de tissu a été immédiatement congelé dans l'azote liquide et est conservé dans l'azote liquide en vue de l'extraction d'ADN. Extraction d'ADN Les tissus normaux ou tumoraux ont été homogénéisés. L'ADN a alors été extrait après digestion à la protéinase K en utilisant des techniques classiques [SAMBROOK, FRISTSCH, et MANIATIS, Molecular cloning A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]. Chaque échantillon d'ADN extrait a été analysé en triple, en utilisant le procédé conforme à l'Invention. Une analyse par PCR-RFLP a également été effectuée à titre de comparaison. Analyse de la perte d'hétérozygotie par la méthode conforme à l'invention Amplification par ACP L'amplification par ACP est effectuée à l'aide d'un jeu d'amorces dont l'une est biotinylée, qui encadrent le site du codon 72 de la protéine P53 (arginine CGC-proline CCC). Les réactions d'amplification d'ADN ont été réalisées dans un volume total de 50 1, contenant 0,5g d'ADN génomique, 0,24 SM de chaque amorce, 200 CLAM de chaque déoxynucléotide triphosphate, 10 WM de Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM de MgC12, 50 mM de KC1 and 0,01% p/v de gélatine. Préalablement à l'amplification, les échantillons ont été chauffés à 95 C pendant 5 minutes, puis 2,5 unités d'ADN polymérase Taq (PERKIN ELMER CETUS, Emeryville, CA) ont été ajoutés. L'ADN a ensuite été soumis à 30 cycles d'amplification (94 C, 1,50 minute 55 C, 1,50 minute ; 72 C, 2 minutes) en utilisant un "480 DNA Thermal Cycler" (PERKINS ELMER CETUS). L'amplification a été effectuée dans des conditions expérimentales permettant d'éviter les faux positifs. [KWOK et al., Nature, 339, p. 237-238, (1989)]. Synthèse et marquage des oligonucléotides Les amorces oligonucléotidiques ainsi que les sondes, ont été synthétisées par la méthode classique des phosphoramidites et purifiées par chromatographie en phase inverse (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF-SUR-YVETTE, France). Les amorces utilisées encadrent une région de 267 paires de bases comprenant le codon 72 dans l'exon 4 de la P53 [MERLO et al.]. La sonde oligonucléotidique de détection est complémentaire du brin antisens, et comprend le site de restriction BstUI (5'CGCG3'). La séquence des différents oligonucléotides est la suivante Amorce amont P53 5' TTGCCGTCCCAAGCAATGGAT3'; Amorce aval P 53 (biotinylée) Bio 5' AGTCACAGACTTGGCTGTCCCAGA 3' Afin d'éviter l'analyse de produits d'ACP non spécifiques, et afin d'introduire un marquage permettant la détection, les segments amplifiés ont été hybridés à une oligosonde, marquée à l'iode 125I, contenant la séquence de reconnaissance de BstUI. Sonde de détection 125I 5' GCTCCCCGCGTGGCCCCTGCA 3'. Le marquage régio-spécifique des oligonucléotides par la biotine ou l'iode 125I a été effectué comme décrit par SAWAIGO et al. [Nucleic Acids Res., 18, p. 3175-3183]. L'activité spécifique obtenue pour la sonde P53 marquée à l'iode 125I est d'approximativement 107 cpm par picomole d'oligonucléotides. Hybridation en phase liquide La sonde (21 bases) marquée à l'iode 125I (62 fmol, 500 000 cpm) a été hybridée au produit d'ACP biotinylé (20 R1) dans un volume final de 35 1. La réaction a été effectuée dans un appareillage "DNA Thermal Cycler" dans les conditions suivantes 98'C pendant 10 minutes, associé à une étape à 58 C pendant 20 minutes. Après l'hybridation de l'oligosonde, l'analyse est effectuée dans le même tube par un procédé à deux étapes. Dans une première étape, la radioactivité totale liée (C1) est mesurée. Dans une seconde étape, les hybrides fixés sont mis en présence de l'enzyme BstUI, et la radioactivité restante, correspondant aux produits non digérés : (C2) est comptée. Les individus homozygotes b/b, homozygotes a/a, et hétérozygotes a/b (b est l'allèle contenant le site BstUI, et a est l'allèle dépourvu du site BstUI) peuvent ainsi être distingués. Capture sur support solide car affinité Les hybrides obtenus sont fixés par affinité sur des tubes recouverts d'avidine, selon le protocole suivant 30 111 du produit de la réaction d'hybridation ont été dilués dans 500 ,ul de tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, contenant 0,6 M de NaCl, puis incubés dans des tubes recouverts d'avidine (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF SUR YVETTE, FRANCE). Après 1 heure à 37 C, les tubes ont été lavés deux fois dans le même tampon pendant 5 minutes et la radioactivité liée a été mesurée directement dans un compteur gamma. Dans ces conditions, le signal C1 était de l'ordre de 25000 à 30000 cpm pour tous les ADN testés. Le signal non spécifique, déterminé sur une solution dépourvue de matrice d'ADN était toujours en dessous de 150 cpm. Conditions d'hybridation et de diaestion enzvmatioue : Influence de la lonaueur de l'oliaosonde et de la quantité d'enzvme de restriction Afin de définir les conditions de réaction permettant d'obtenir un signal reproductible et fiable, indépendant de la quantité d'ADN analysée, une étude de l'influence de la longueur de l'oligosonde et de la quantité d'enzyme de restriction a également été menée. L'étude de ces deux paramètres s'est faite sur trois types d'échantillon d'ADN (mesure en triple pour chaque échantillon), obtenus respectivement à partir d'un homozygote b/b, d'un hétérozygote b/a, et d'un homozygote a/a. La stabilité de l'hybride et la radioactivité résiduelle liée au support après digestion ont été déterminées. La digestion enzymatique a été effectuée directement sur les hybrides fixés par affinité au tube la quantité d'enzyme de restriction a été augmentée jusqu'à atteindre 200 unités par essai. Les hybrides fixés par affinité ont été mis à réagir en présence de 20\li de BstUI, pendant 2 heures, à 37 C, dans un volume final de 500tel de tampon de restriction. Après deux étapes de lavage comme décrit précédemment, la radioactivité correspondant aux hybrides non digérés a été mesurée. La stabilité est évaluée par le pourcentage de radioactivité résiduelle liée au support après incubation de l'hybride dans les conditions de digestion, mais en l'absence d'enzyme de restriction. Les résultats de ces expériences sont illustrés dans les tableaux I, II, III, IV, V, VI, et VII ci-après. TABLEAU I Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestion digestion après digestion (%) 17953 14283 3118 21,83% 200 U 16700 13287 3016 22,70% Moyenne 13785 3067 22,25% 12028 9569 2327 24,32% 100 U 17447 13881 3310 23,85% Moyenne 11725 2818,5 24,04% 17322 13781 3345 24,27% 50 U 20102 15993 4818 30,13% Moyenne 14887 4081,5 27,42% 12993 10337 3075 29,75% 25 U 16966 13498 3960 29,34% Moyenne 11918 3517,5 29,51% 18325 14579 5139 35,25% 10 U 17227 13706 5337 38,94% Moyenne 14143 5238 37,04% Sonde de 21 bases Homozygote b/b Stabilité : 79,56% TABLEAU II Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestif digestion après digestion (%) 18530 14652 7803 53,26% 200 U 17405 13762 7568 54,99% Moyenne 14207 7685,5 54,10% 19858 15702 8840 56,30% 100 U 19417 15353 7919 51,58% Moyenne 15527 8379,5 53,97% 22184 17541 9754 55,61% 50 U 26443 20908 12336 59,00% Moyenne 19225 11045 57,45% 19477 15400 8663 56,25% 25 U 16839 13315 10326 77,55% Moyenne 14358 9494,5 66,13% 21377 16903 7795 46,12% 10 U 19111 15111 9206 60,92% Moyenne 16007 8500,5 53,11% Sonde de 21 bases Hétérozygote a/b Stabilité : 79,07% TABLEAU III Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestif digestion après digestion (%) 20413 16457 16322 99,18% 200 U 17506 14113 13568 96,14% Moyenne 15285 14945 97,77% 15317 12349 11923 96,55% 100 U 17753 14312 14610 102,08% Moyenne 13331 13266,5 99,52% 15789 12729 12188 95,75% 50 U 13305 10726 10894 101,56% Moyenne 11728 11541 98,41% 16397 13219 13273 100,41% 25 U 17079 13769 13586 98,67% Moyenne 13494 13429,5 99,52% 15574 12556 12102 96,39% 10 U 18023 14530 14597 100,46% Moyenne 13543 13349,5 98,57% Sonde de 21 bases Homozygote a/a Stabilité : 80,62% TABLEAU IV Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestif digestion après digestion (%) 14865 9414 3741 39,74% 200 U 12732 8063 3304 40,98% Moyenne 8739 3522,5 40,31% 13362 8462 4448 52,56% 100 U 15490 9810 4777 48,70% Moyenne 9136 4612,5 50,49% 12467 7895 4335 54,91% 50 U 13848 8770 5069 57,80% Moyenne 8333 4702,5 56,43% 11526 7299 3352 45,92% 25 U 13911 8810 3933 44,64% Moyenne 8055 3642 45,22% Sonde de 31 bases Homozygote b/b Stabilité : 63,33% TABLEAU V Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestion digestion après digestion (%) 14300 9495 7291 76,79% 200 U 15098 10025 7106 70,88% Moyenne 9760 7198,5 73,75% 13506 8968 7139 79,61% 100 U 15206 10097 7695 76,21% Moyenne 9532 7417 77,81% 18727 12435 8849 71,16% 50 U 17107 11359 8249 72,62% Moyenne 11897 8549 71,86% 18703 12419 8988 72,37% 25 U 16431 10910 7092 65,00% Moyenne 11664 8040 68,93% Sonde de 31 bases Hétérozygote a/b Stabilité : 66,40% TABLEAU VI Quantité CPM CPM CPM Radioactivité d'enzyme avant corrigés après résiduelle digestion digestion après digestion (%) 17054 11460 12631 110,22% 200 U 17107 11496 13868 120,63% Moyenne 11478 13249,5 115,43% 12824 8618 9771 113,38% 100 U 15927 10703 12132 113,35% Moyenne 9660 10951,5 113,37% 15177 10199 12785 125,36% 50 U 9442 6345 6446 101,59% Moyenne 8272 9615,5 116,24% 14312 9618 8831 91,82% 25 U 11842 7958 7587 95,34% Moyenne 8788 8209 93,41% Sonde de 31 bases Homozygote a/a Stabilité : 67,20% TABLEAU VII HOMOZYGOTES HETEROZYGOTES HOMOZYGOTES b/b b/a a/a Quantité Digestion CV Digestion CV Digestif CV Enzyme (unités) % % % % % 200 79,8 3,6 49,3 4,2 0,4 2,9 100 76,0 4,2 46,2 3,9 0,4 2,4 50 72,6 3,9 42,5 5,1 1,6 1,9 25 70,5 5,7 33,8 6,2 0,4 1,8 10 63,0 9,0 ND ND 1,4 2,9 Sonde de 21 bases Le pourcentage de digestion pour des échantillons homozygotes a/a varie de 0,4% à 1,6%, pour des hétérozygotes b/a, de 33,8% à 49,3%, et pour des homozygotes b/b, de 63% à 79,8%. Le coefficient de variation (CV), est défini comme étant le rapport (écart-type/moyenne) x 100 des pourcentages de digestion mesures. Afin d'augmenter le niveau de la digestion, jusqu'à 100% (niveau théorique pour des homozygotes b/b), des expériences ont été effectuées avec des quantités d'enzyme plus importantes, des temps de digestion plus longs, et des températures de réaction plus élevées. Ceci n'a toutefois pas permis d'améliorer le rendement de l'essai. La radioactivité restante pour les homozygotes b/b est sans doute due à une population d'hybrides fixés sur les tubes recouverts d'avidine, et qui ne sont pas accessibles à la digestion par l'enzyme de restriction. Cependant, le pourcentage de non digestion est constant quel que soit 1'ADN homozygote b/b analysé. Cette digestion enzymatique en phase solide est reproductible, et produit des valeurs de CV qui ne sont pas plus élevées que 9%, dans le cas de 10 U d'enzyme, et inférieures à 4,2% à partir de 100 U d'enzyme. Détection de perte dZhétérozygotie par technique PCR-RFLP et par la méthode conforme à 1'Invention : Essai comparatif. Pour l'analyse de la perte d'hétérozygotie par méthode électrophorétique PCR-RFLP, un aliquot de 20 1 du produit d'ACP a été directement incubé avec 30 unités d'enzyme BstUI (SIGMA, St. Louis, MO). Les produits d'amplification digérés obtenus à partir des tissus normaux ou tumoraux ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Dans la technique PCR-RFLP, 1'ADN normal d'un patient hétérozygote montre trois bandes au locus correspondant à l'exon 4 de la P53 : une bande de 267 bp de l'allèle a, dépourvu du site de restriction BstUI, et deux bandes plus faibles, correspondant à l'allèle b. On peut conclure à la perte d'hétérozygotie au niveau du gène de la P53 quand 1'ADN tumoral d'un patient fait apparaître la perte, ou bien de la bande non digérée, ou bien des bandes digérées. Dans la méthode d'analyse conforme à l'Invention (Tableau VIII), les individus hét sans qu'il soit nécessaire de déterminer au préalable la valeur du signal C1 TABLEAU VIII Signal "C1" Signal "C2" Perte d'hétérozy tie Génotype cpm CV % cpm CV % a/b 26152 4,2 15429 8,4 non a 25528 5,3 24930 4,2 oui b 27187 3,6 5097 6,7 oui REVENDICATIONS 1) Procédé de détection de la présence d'un site de restriction spécifique d'une enzyme dans une séquence-cible d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une étape au cours de laquelle on met en présence, en phase liquide, un fragment d'acide nucléique portant la séquence-cible et une sonde oligonucléotidique s'hybridant avec ladite séquence-cible, dans des conditions entrainant la formation d'un hybride entre ladite séquence cible et ladite sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible, et porte en outre un marquage permettant sa détection - une étape au cours de laquelle on procède à la fixation dudit hybride sur un support solide, de manière à ce que le site de restriction éventuellement formé soit situé entre l'extrémité fixée au support et la portion de l'hybride portant le marquage - une étape au cours de laquelle on procède au traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée - une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une sonde oligonucléotidique dont la longueur est comprise entre 10 et 100 bases. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'amplification de la séquence cible. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par ACP. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fragment d'ADN contenant la séquence-cible porte un marquage permettant la détection de l'hybride. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la sonde oligonucléotique porte un marquage permettant la détection de l'hybride. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à ó, caractérisé en ce que la fixation de l'hybride au support est effectuée par liaison d'affinité. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape consécutive à l'étape de fixation de l'hybride sur le support solide et précédant l'étape de digestion par l'enzyme de restriction, au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage de l'hybride marqué fixé au support. 9) Nécessaire de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des réactifs permettant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10) Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour déterminer la présence ou l'absence d'hétérozygotie à un locus donné.