FR 2715847 A1 19950811 FR 9401381 A 19940208 COMPOSITION CONTENANT DES ACIDES NUCLEIOUES. PREPARATION ET UTILISATIONS La présente invention concerne des compositions à base d'acides nucléiques, leur préparation et leur utilisation Plus particulièrement, elle concerne des compositions comprenant des acides nucléiques et des oligopeptides et leur utilisation en thérapie génique, notamment pour le transfert d'acides nucléiques. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anormalité (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différentes techniques ont été décrites pour le transfert de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran oeagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioLChem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovints. Toutefois, les techniques développées jusqu'à présent ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au transfert de gènes dans les cellules et/ou l'organisme. En particulier, les problèmes liés à la pénétration de l'acide nucléique dans les cellules ne sont pas entièrement résolus. En effet, la nature polyanionique des acides nucléiques prévient leur passage à travers les membranes cellulaires. S'il a été montré que les acides nucléiques nus sont capables de traverser la membrane plasmique ex vivo (voir notamment la demande n" WO90/11092), l'efficacité de transfection reste assez faible. De plus, les acides nucléique nus ont une demi-vie plasmatique courte, en raison de leur dégradation par les enzymes et de leur élimination par les voies urinaires. Par ailleurs, si les virus recombinants permettent d'améliorer l'efficacité de transfert des acides nucléiques, leur emploi présente certains risques tels que la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, la transformation, etc. La présente invention apporte une solution avantageuse à ces differents problèmes. La demanderesse a en effet montré qu'il est possible de former des paires d'ions entre des oligopeptides cationiques particuliers et les groupements phosphates des acides nucléiques, et que les complexes ainsi formés sont stables, et sont capables de pénétrer les cellules ou d'être encapsulés dans des vecteurs de transfert tels que des liposomes, des nanoparticules ou des lipoprotéines de faible densité DL) avec des rendements élevés. Un premier objet de l'invention réside donc dans une composition comprenant un acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires. Le terme structure secondaire désigne les peptides capables d'adopter une conformation spaciale particulière dans des conditions physiologiques, par opposition aux peptides ne présentant pas d'organisation particulière de leur structure primaire. La structure secondaire peut apparaitre soit dans certains solvants, soit en solution aqueuse, soit après complexation avec l'acide nucléique. Plus particulièrement, les oligopeptides utilisés dans le cadre de invention sont capables de former des hélices a ou des feuillets . La complexation d'un acide nucléique avec une polylysine a déjà été décrite dans l'art antérieur. Cependant, le taux de complexation et la stabilité du complexe formé avec la polylysine sont relativement faibles, et ces complexes ne peuvent être encapsulés dans des vecteurs de transfert de façon satisfaisante (voir exemples). Au contraire, les complexes selon l'invention, qui impliquent des oligopeptides cationiques capables de former des structures secondaires (hélices a, feuillets ,ss) présentent une stabilité élevée, peuvent être obtenus avec des rendements proches de 100%, et sont capables d'être encapsulés avec des rendements élevés dans des vecteurs de transfert. Ces complexes constituent donc des outils particulièrement avantageux pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Par ailleurs, selon la nature du vecteur de transfert utilisé, les compositions de l'invention peuvent être utilisées sur des cellules extraites de l'organisme (ex vivo) en vue de leur réadministration, ou directement in vivo. Plus particulièrement, les oligopeptides utilisés dans le cadre de la présente invention répondent à la formule (AOAyAyAO)n ou (AoAyAoAy)n dans laquelle Ao est un acide aminé hydrophobe, Ay est un acide aminé hydrophile, et n est un nombre entier supérieur ou égal à 4. La demanderesse a en effet montré que de tels oligopeptides sont capables, une fois complexés aux acides nucléiques, de former des structures secondaires qui stabilisent fortement lesdits complexes. Plus préférentiellement, l'acide aminé hydrophobe est choisi parmi la leucine, la valine, l'isoleucine et la phénylalanine; et l'acide aminé hydrophile est choisi parmi la lysine, l'arginine et l'histidine. La capacité des oligopeptides à former des structures secondaires peut être vérifiée par dichroïsme circulaire ou en RMN, comme indiqué dans les exemples. Encore plus préférentiellement, l'oligopeptide selon l'invention est choisi parmi les oligopeptides de formule (LKKL)n, (LKLK)n, (LRRL)n, dans lesquelles n est défini comme précédemment. D'une manière générale, dans les oligopeptides de l'invention, n peut varier entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 50. La valeur de n est adaptée par l'homme du métier en fonction de la longueur et de la nature de l'acide nucléique, de la composition de l'oligopeptide, de l'utilisation recherchée, etc. Pour obtenir un effet optimum des compositions de l'invention, les proportions respectives de l'oligopeptide et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport charges positives de l'oligopeptide / charges négatives de l'acide nucléique soit égal ou supérieur à 1 (ce rapport est désigné R dans les exemples). Ainsi, plus l'acide nucléique est long, plus le nombre de charges positives apporté par l'oligopeptide doit être élevé pour obtenir un effet maximum. Ceci peut se traduire soit par l'utilisation d'oligopeptides dans lesquels la valeur de n est plus élevée, soit par l'utilisation de quantités plus élevées d'oligopeptides, soit encore par les deux. Les oligopeptides utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier. Préférentiellement, ils sont synthétisés par voie chimique, au moyen d'un synthétiseur de peptides, en utilisant tout type de chimie connue de l'homme du métier (F-moc, T-boc, etc). Lorsque les valeurs de n sont élevées, il est par ailleurs possible de synthétiser les oligopeptides en plusieurs fragments qui sont ensuite assemblés. Par ailleurs, selon la technique de synthèse utilisée (par exemple en phase homogène), l'oligopeptide obtenu peut être non pas un composé défini, mais un mélange d'oligopeptides ayant des longueurs différentes centrées autour d'une moyenne. Dans ce cas, la valeur de n de la formule de l'invention représente la moyenne des valeurs des n des différents constituants du mélange. Des méthodes de synthèse appropriées sont données dans les techniques générales de biologie moléculaire et dans les exemples. Au sens de la présente invention, le terme acide nucléique comprend aussi bien les acides désoxyribonucléiques que les acides ribonucléiques. ll peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN gnomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. lls peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques. Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques. des séquences régulatrices de la transcription, des séquences antisens, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour une ou des protéines (ou peptide ou polypeptide) ayant une activité pharmacologique. Il peut s'agir d'enzymes, d'hormones, de facteurs de croissance, de lymphokines, d'apolipoprotéines, etc. Par séquence antisens, on entend toute séquence capable, directement ou indirectement (après transcription en ARN) de réduire les niveaux d'expression d'une protéine désirée, voire de les supprimer (EP 140 308). Les ante sens comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201). Concernant plus particulièrement les acides ribonucléiques (ARN), il peut s'agir d'ARN antisens, capables de bloquer au moins partiellement la traduction d'ARNm cibles (cellulaires, viraux, bactériens, etc); ou également de ribozymes ou d'acides nucléiques capables de se lier à un autre acide nucléique par formation d'une triple hélice. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisés in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, elles peuvent permettre de transférer à des lignées cellulaires des séquences d'acides nucléiques désirées, par exemple dans le but d'exprimer une protéine recombinante ou une activité antisens, ou dans le but d'inhiber une protéine, par fixation de ladite protéine sur l'acide nucléique. Ex vivo, elles peuvent être utilisés pour le transfert thérapeutique d'un acide nucléique dans une cellule issue d'un organisme, en vue de conférer à ladite cellule des propriétés nouvelles ou renforcées, avant sa réadministration à un organisme. In vivo, elles peuvent être utilisés pour l'administration directe d'acide nucléique. Un autre objet de l'invention réside donc dans Rutilisation d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Comme indiqué plus haut, ce transfert peut être effectué in vitro, ex vivo ou in vivo. Les compositions selon l'invention peuvent permettre de transférer des acides nucléiques dans des types variés de cellules. Préférentiellement, il s'agit de cellules animales, de préférence humaine. Il peut s'agir notamment de cellules hématopoiétiques, endothéliales, myoblastiques, etc. Par ailleurs, il peut s'agir aussi bien de cellules saines que de cellules affectées par des dysfonctionnements (tumeur, infection virale, etc). L'invention concerne également un procédé pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule caractérisé en ce que l'on cultive ladite cellule en présence de l'acide nucléique et d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires. Par ailleurs, les complexes acide nucléique-oligopeptide de la présente invention permettent également l'encapsulation des acides nucléiques dans des vecteurs de transfert avec des rendements considérablement améliorés. Pour diminuer les problèmes de stabilité et de pénétration dans les cellules, les acides nucléiques peuvent en effet été associés à des transporteurs ou à des vecteurs de médicament appropriés. L'encapsulation des acides nucléiques dans de tels vecteurs de transfert permet de les protéger des nucléases sériques, de faciliter leur pénétration dans les cellules où se trouve leur cible pharmacologique, et de ralentir leur élimination. Toutefois, la difficulté majeure limitant l'utilisation de ces vecteurs réside dans les faibles rendements d'encapsulation des acides nucléiques. La demanderesse a maintenant montré que les complexes acide nucléique-oligopeptides de l'invention peuvent être encapsulés dans des vecteurs de transfert avec des rendements élevés. Plus particulièrement, les rendements d'encapsulation des complexes de l'invention dans des nanoparticules sont supérieurs à 50tu, alors qu'ils sont inférieurs à 1% avec des acides nucléiques nus, ou avec d'autres oligopeptides ne formant pas de structure secondaires (Cf exemples). Un autre objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires pour rencapsulation d'acides nucléiques dans un vecteur de transfert. L'invention a également pour objet les vecteurs de transfert d'acides nucléique comprenant une composition telle que définie ci-avant. Parmi les différents vecteurs de transfert, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des vecteurs biocompatibles, biodégradables, hydrophobes et de nature protéique ou polymérique. En particulier, les vecteurs préférés selon l'invention sont les liposomes, les nanoparticules ou les lipoprotéines de faible densité (LDL). Les liposomes sont des vésicules phospholipidiques comportant une phase aqueuse interne dans laquelle les acides nucléiques peuvent être encapsulés. La synthèse de liposomes et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques est connue dans l'art antérieur (WO91/06309, W092/19752, WO92/19730). L'utilisation de complexes selon l'invention permet d'améliorer l'efficacité d'encapsulation des acides nucléiques dans les liposomes. Les nanoparticules sont des particules de petite dimension, généralement inférieure à 500 nm, capables de transporter ou de vectoriser un principe actif (tel qu'un acide nucléique) dans les cellules ou dans la circulation sanguine. La présente invention permet également d'améliorer considérablement les rendements d'encapsulation d'acides nucléiques dans des nanoparticules. Préférentiellement, les nanoparticules selon l'invention sont constituées par des polymères comportant une majorité de motifs dégradables tels que l'acide polylactique, éventuellement copolymérisé à du polyéthylène glycol. D'autres polymères utilisables dans la réalisation de nanoparticules ont été décrits dans l'art antérieur (voir par exemple EP 275 796; EP 520 889). L'invention concerne donc également un procédé d'encapsulation d'acides nucléiques dans des vecteurs de transfert selon lequel on met en contact le vecteur de transfert ou les composants le constituant, l'acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires, ou éventuellement un complexe acide nucléique - oligopeptide déjà formé, dans des conditions permettant l'encapsulation de l'acide nucléique dans ledit vecteur de transfert, puis on récupère le vecteur de transfert formé. Comme indiqué plus haut, le procédé selon l'invention est préférentiellement appliqué pour la préparation de liposomes, de nanoparticules ou de lipoprotéines de faible densité. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant un acide nucléique thérapeutique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires, éventuellement encapsulés dans un vecteur de transfert. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Exemple 1: Préparation des oligopeptides Les trois oligopeptides suivants ont été synthétisés: 1.1. -(H)-(Leucine-Lysine-Lysine-Leucine)10-(OH) ou (LKKL)10. Cet oligopeptide a été synthétisé sous forme desel d'acide trifluoroacétique au moyen d'un synthétiseur de peptides Applied Biosystem 431A, sur une résine HMP (Applied Biosystem) et selon une stratégie F-MOC. Après la synthèse, le peptide a été libéré de la résine par traitement 90 minutes en présence d'une solution TFA/eau 95/5 (v/v), précipité par addition d'ether tertiobutylméthylique, puis purifié par HPLC phase inverse sur colonne C18 100 A (Biorad RSL). La pureté du peptide obtenu est supérieure à 95 Go et sa solubilité dans l'eau de 50 mg/ml. Il a été montré que le polytétrapeptide LKKL, non structuré dans l'eau, adopte une conformation en hélice a en solution saline. Cette conformation devrait améliorer la stabilité du complexe par formation de paires d'ions entre les charges positives des lysines de l'oligopeptide et les phosphates ionisés à pH physiologique de l'acide nucléique. 1.2.-(H)-(Leucine-Lysine-Leucine-Lysine)10-(OH)ou (LKLK)10. Cet oligopeptide a été synthétisé sous fonne de sel d'acide trifluoroacétique en suivant le protocole décrit ci-dessus. La pureté du peptide obtenu est supérieure à 90% et sa solubilité dans l'eau de 100 mg/ml. ll a été montré que le polytétrapeptide LKLK, non structuré dans l'eau, adopte une conformation en feuillets S en solution saline ou en présence d'acides nucléiques, en raison de rinteraction entre phosphates et groupements aminés. Le long d'un feuillet ss, la distance séparant 2 charges positives est de 6,9 A, ce qui est compatible avec les 6,2 A séparant 2 groupements phosphate d'un acide nucléique simple brin. Cette conformation devrait donc améliorer la stabilité du complexe. 1.3.-(H)-(Proline-Lysine-Lysine-Leucine)10-(OH) ou (PKKL) 10. Ce peptide (fourni par A. Brack, Centre de Biophysique Moléculaire, Orléans) n'est pas structuré en solution saline et a été utilisé comme controle. 1.4. Polvlvsine. La polylysine utilisée est d'origine commerciale. Ce peptide n'est pas structuré en solution saline et a été utilisé comme controle. Exemple 2 : Acides nucléiques utilisés 2.1. Acides nucléiques antisens anti-ras Vall2 Des acides nucléiques ante sens anti ras ont été préparés. Ces acides nucléiques sont des oligonucléotides de 12 et 13 résidus, synthétisés par la société Eurogentec (Belgique). Ces oligonucléotides sont dirigés contre une séquence de l'ARNm de ras muté au niveau du douzième codon. Les acides nucléiques utilisés sont l'antisens (AS-Val), son inverse (INV-Val : la séquence est identique mais orientée dans le sens inverse), ainsi que l'antisens de l'ARNm ras normal (AgGly) et qu'un acide nucléique témoin comportant 2 nucléotides non appariés au milieu de la séquence (Amut2). La séquences de ces acides nucléiques est la suivante: 3'-CGCGGCAGCCAC-5' (AS-Val i 2) 3'- GCGGCAGCCACAC-5' (AS-Val13) 3'-CACCGACGGCGC-5' (INV-Val12) 3'-CACACCGACGGCG-5' (INV-Vall 3) 3'-CGCGGCCGCCAC-5' (As-Glyl 2) 3'-CGCCGGAGCCAC-5' AS-mut212) 2.2. Acide nucléique (d(Tp)15T) L'acide nucléique (d(Tp)lST) est composé de 16 thymidines. I1 est d'origine commerciale (Pharmacia). Exemple 3: Ettide de complexation Cet exemple illustre la formation de complexes entre les acides nucléiques antisens décrits dans l'exemple 2 et les oligopeptides décrits dans l'exemple 1, dans différentes conditions de force ionique et de concentration (toutes les concentrations en acides nucléiques sont exprimées en phosphate). ll montre que des rendements de complexation très élevés peuvent être obtenus, témoignant ainsi de la stabilité des complexes. 3.1. Complexation en tampon phosphate L'acide nucléique (10~4 M exprimé en phosphate : Cphosphate = 12 X Cacide nucléique) et l'oligopeptide (concentration variant entre 2.10-3, 104 et 2.10-5 exprimées en charges positives) ont été mis en contact dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,4. La solution a ensuite été centrifugée, et l'absorbanoe (A) à 256 nm (maximum d'absorption des acides nucléiques) déterminée dans le surnageant. Pour chaque valeur du rapport R (Nombre de charges positives de l'oligopeptide / Nombre de charges négatives de l'acide nucléique) testée, la valeur A/A0 est déterminée, permettant d'évaluer la fraction d'acide nucléique libre et, par différence, la fraction complexée. Pour un rapport R = 1, la concentration en oligopeptide exprimée en lysine est donc de 10-4 M. Les résultats obtenus montrent que la fraction de complexe précipitant AS Vall3/LKKL10 ou INV-Vall3/LKKL10 est de 85 % pour un rapport R = 2. Pour un rapport R = 1, la fraction de complexe précipitant AS-Vall3/LKLK10 et INV Vall3/LKLK10 est inférieure : 30 Go. Ces résultats peuvent s'expliquer par une compétition entre les phosphates du tampon et les phosphates de l'acide nucléique pour la formation du complexe. Ces résultats sont cependant supérieurs à ceux obtenus avec l'oligopeptide controle : 15 % de complexe INV-Vall3/PKKL10 précipitant seulement. 3.2. Complexation en tampon Tris-HCl L'acide nucléique (104 M) et l'oligopeptide (concentration varriable) ont été mis en contact dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4. La solution a ensuite été centrifugée, et l'absorbance à 256 nm déterminée dans le surnageant. Pour chaque valeur du rapport R testée, la valeur A/A0 est déterminée comme précédemment. Les résultats obtenus montrent que la fraction de complexe précipitant AS Vall3/LKKL10 et AS-Vall3/LKLK10 est de 100 % pour un rapport R = 1. Pour un rapport R = 2, la fraction de complexe précipitant AS-Vall3/LKUC10 est également de 100 Go. Par tailleurs, 100 % de complexe précipitant AS-Vall3/=KL10 ont également été obtenus avec une concentration d'acide nucléique de 2.10-5 M et un rapport R = 1. En revanche, en ce qui concerne le complexe AS-Vall3/PKKL10, seulement 70 % des acides nucléiques impliqués dans le complexe précipite ce qui démontre que affinité des oligopeptides selon l'invention est supérieure. 3.3. Complexation dans l'eau Le protocole ci-dessus a été répété en remplaçant le tampon Tris-HCl par de l'eau Les mêmes résultats ont été obtenus (100 % de complexation pour R = 1), démontrant l'affinité élevée des oligopeptides de l'invention pour les acides nucléiques. 3.4. Conclusions L'ensemble de ces résultats démontre le rendement élevé de complexation des oligopeptides de l'invention aux acides nucléiques, et le fait que ce rendement est indépendant de la séquence et de la concentration de l'acide nucléique utilisé. Par ailleurs, comme le montre le tableau ci-après, l'étude des spectres dichroïques a pennis de confirmer les structures secondaires adoptées par les oligopeptides cationiques utilisés, en solution ou après complexation. Peptide Tampon Phosphate Tampon Phosphate Eau Eau / acide 50mM 50mM / NaCI O,2M nucléique LKKL hélice a hélice ex non structuré hélice a LKLK feuillet ss feuillet ss non structuré feuillet PKKL non structuré non structuré non structuré ~ non structuré Exemple 4 : Etude de l'encapsulation dans un vecteur de transfert: : les nanoparticules. Cet exemple illustre les propriétés très avantageuses des complexes de l'invetrtion, permettant l'encapsulation d'acide nucléique dans des vecteurs de transfert avec des rendements très élevés. 4.1. Nanoparticules utilisées : Les nanoparticules utilisées dans cet exemple sont des copolymères dibloc constituées d'un poly (D,L acide lactique) lié par une liaison ester à un poly (éthylène glycol) : PLAp(M)-PEG(N) où M et N sont respectivement les masses moléculaires moyennes (en kD) du PLA et du PEG, et p, le pourcentage d'acide L-lactique. Les 2 types de nanoparticules utilisés sont du PLA50(30)-PEG(2) et du PLA50(30)-PEG(5). Ces copolymères peuvent être synthétisés par toute technique connue de l'homme du métier (voir par exemple EP 520 889). 4.2. Marquage radioactif des acides nucléiques: Les acides nucléiques ont été traités avec de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) en présence d'ATP.y32P (Amersham) dans un tampon kinase. Après 30 min d'incubation à 37"C, l'acide nucléique a été séparé de l'ATP n'ayant pas réagi par dépot sur colonne Séphadex G25 (Quick Spin) et centrifugation. 4.3. Encapsulation de l'acide nucléique INV-Vall3 Cet exemple décrit llencapsulation de l'acide nucléique INV-Vall3 dans une nanoparticule de PLA50(30)-PEG(2) en présence ou en l'absence d'oligopeptide (LKKL)1 o Le polymère utilisé (PLA50(30)-PEG(2)) a été solubilisé dans 1 ml d'acétone à une concentration de 10 g/l. La dilution isotopique de l'acide nucléique (concentration finale 10-5 M) a été ajoutée, puis l'oligopeptide (à une concentration telle que R = 1). La solution organique obtenue a ensuite été versée goutte à goutte dans 5 ml d'une solution aqueuse (tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4), sous agitation. Le polymère insoluble dans le mélange eau/acétone précipite sous forme de nanoparticules, emprisonnant le complexe acide nucléique-oligopeptide. L'acétone a ensuite été éliminée par évaporation sous vide partiel, jusqu'à un volume final de 2,5 mL Enfin, la suspension nanoparticulaire a été filtrée à travers un filtre Sartorius de porosité 1,2 Fm, qui tient lieu de crible de dispersion et d'injectabilité. Une expérience controle a été effectuée dans les mêmes conditions, mais en rabsence de loligopeptide (LKKL)10. Les résultats obtenus montrent que le rendement d'encapsulation de INV-Vall3 dans la nanoparticule est de 56 % en présence de roligopeptide, et de 5 % seulement sans l'oligopeptide. Le rendement d'encapsulation correspond au pourcentage d'acide nucléique encapsulé dans les nanoparticules, par rapport à la quantité totale d'acide nucléique présente au départ. 4.4. Encapsulation de l'acide nucléique (d(Tp)15T) Le rendement d'encapsulation de l'acide nucléique (d(Tp)15T) (exemple 2.2.) dans une nanoparticule de PLAso a été étudié, en présence des oligopeptides cationiques suivants: - LKKLn Hélice a : synthétisé en phase homogène sous forme d'un mélange de peptides de poids moléculaire moyen de 34900. - LKLKn Feuillet ss: synthétisé en phase homogène sous forme d'un mélange de peptides de poids moléculaire moyen de 7400. - PKKLn Pas de structure secondaire - Kn Pas de structure secondaire ou de sphingosine (lipide membranaire chargé positivement). Pour cela, l'acide nucléique (d(Tp)15T) a été mélangé à l'oligopeptide en solution dans l'eau. En ce qui concerne la sphingosine, elle est solubilise dans un mélange eau/éthanol 50 % v/v. Les concentrations utilisées sont indiquées dans le tableau qui suit. 100 Cll d'une solution d'acide polylactique (PLAso) solubilisée dans racétone à une concentration de 20 g/l ont été ajoutés au mélange, ainsi que 300 p1 d'acétone pure (concentration finale en PLASO : 5 g/l). Après homogénéisation au vortex, le mélange a été versé goutte à goutte dans une solution aqueuse de pluronic F68 à 2,5 Go (p/v) afin de précipiter le polymère sous forme d'une s Exemple 5 : Transfert d'acide nucléique dans les cellules Cet exemple illustre la capacité des composition de l'invention à transfert des acides nucléiques dans les cellules. 5.1. Cellules utilisées : Les essais de transfert d'acide nucléique décrits dans eet exemple ont été effectués sur une lignée de cellules issue d'un carcinome vésical humain, désignée I24/EJ accessible à l'ATCC. Les cellules ont été cultivées dans un milieu MEM-EAGLE ("minimum essential medium", Biological Industries) supplémenté en L-glutamine ((5 mM), streptomycine (50 ulmI), pénicilline (50 u/ml), en présence de 7 % de sérum de veau foetal décomplémenté 30 min à 600C. 5.2. Transfert des acides nucléiques: Les cellules (1500 / puits) ont été ensemencées dans des microplaques de 96 puits, en absence ou en présence d'acide nucléique, encapsulé ou non dans des nanoparticules, dans un volume total de 100 p1. Chaque point a été effectué en triple. La concentration en acide nucléique utilisée a été ajustée par dilution dans de l'eau ou par concentration par centrifugation 1 h à 12000 rpm. Dans ce cas, la suspension est centrifugée, le culot pesé puis le volume ajusté. L'efficacité du transfert a été déterminée par mesure de l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par l'acide nucléique antisens, après 72 ou 96 heures de culture à 37"C en présence de 5 to de C02. Pour cela, 2 méthodes ont été utilisées: - Tout d'abord, l'incorporation de thymidine tritiée, qui a été déterminée après addition de 2 Ci de 3H thymidine par puits. Après 6 heures d'incubation à l'étuve, les plaques ont été lavées au Skatron (Lier, Norvège), l'ADN recueilli sur un filtre, et chaque rondelle du filtre (correspondant à chaque puits de la plaque) placée dans du liquide à scintillation puis comptée au compteur (LKB Wallac 1211 Minibeta). Les résultats correspondent à la moyenne des valeurs obtenues dans chacun des 3 puits. - Ensuite, la prolifération cellulaire a été évaluée par comptage des cellules en cellule de Malassez. Pour cela, le surnageant a été éliminé, les cellules trypsinisées (10 min à 37 C), puis additionnées de milieu de culture avant d'être comptées. Les résultats obtenus sont les suivants: - AS-Vall2, nu, 30 M... ...... 42 % d'inhibition - AS-Valî2/LKKL/nanoparticule, 100 nM (exprimé en antisens). 50% d'inhibition - nanoparticule blanche, même quantité de polymère ..... ..... Ces résultats démontrent clairement l'efficacité des compositions de Invention pour le transfert d'acides nucléiques. De plus, ils montrent que l'acide nucléique transféré conserve ses propriétés fonctionnelles, dans le cas présent, son activité d'antisens. REVENDICATIONS l Composition comprenant un acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'oligopeptide est capable de former des hélices a ou des feuillets ss. 3. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'oligopeptide répond à la formule (AoAyAyAo)n ou (AoAyAoAy)n dans laquelle Ao est un acide aminé hydrophobe, Ay est un acide aminé hydrophile, et n est un nombre entier supérieur ou égal à 4. 4. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'acide aminé hydrophobe est choisi parmi la leucine, la valine, l'isoleucine et la phénylalanine. 5. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'acide aminé hydrophile est choisi parmi la lysine, l'arginine et l'histidine. 6. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'oligopeptide est choisi parmi (LKKL)n, (LKLK)n, (LRRL)n. 7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que n est compns entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 50. 8. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique. 9. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 10. Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement. 11. Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens. 12. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. 13 Composition selon l'une des revendications 8 à 12 caractérisée en ce que le rapport charges positives de l'oligopeptide I charges négatives de l'acide nucléique est égal ou supérieur à 1 14. Vecteur de transfert d'acides nucléique comprenant une composition selon l'une des revendications précédentes. 15. Vecteur de transfert selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une nanoparticule, d'un liposome ou d'une lipoprotéine de faible densité. 16. Procédé d'encapsulation d'acides nucléiques dans des vecteurs de transfert caractérisé en ce que l'on met en contact le vecteur de transfert ou ces composants, l'acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires, ou éventuellement un complexe acide nucléique-oligopeptide déjà formé, dans des conditions permettant l'encapsulation de l'acide nucléique dans ledit vecteur de transfert, puis on récupère le vecteur de transfert formé. 17 Procédé pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule caractérisé en ce que l'on cultive ladite cellule en présence de l'acide nucléique et d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires. 18. Utilisation d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires pour le transfert in vitro ou ex vivo d'acides nucléiques dans les cellules. 19. Utilisation d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires pour la préparation d'une composition utile pour le transfert in vivo d'acides nucléiques dans les cellules. 20. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique thérapeutique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires, éventuellement encapsulés dans un vecteur de transfert.