FR 2722509 A1 19960119 FR 9408820 A 19940715 IDENTIFICATION DE GENES CODANT POUR DES PROTEINES AYANT UNE ACTIVITE D'ESTERASE DANS DIFFERENTES SOUCHES DE MYCOPLASMA MYCOIDES. Les mycoplasmes constituent un groupe de micro- organismes procaryotes dépourvus de parois cellulaires rigides. De nombreux mycoplasmes ont été identifiés par les méthodes standard faisant appel notamment à des études sérologiques. Toutefois, l'existence de réactions sérologiques croisées entre les espèces et entre les souches peut contrarier l'identification des mycoplasmes isoles, en particulier à l'intérieur de Mycoplasma mycoides (cluster). Le groupe Mycoplasma mycoides contient six espèces ou sous-espèces de mycoplasmes capables de fermenter le glucose et présents chez les animaux des groupes bovin, caprin et ovin. Tous ces mycoplasmes sont pathogènes. Les six espèces ou sous-especes de ce groupe sont les suivantes: - M. mycoides, sous-espèce mycoides comprenant deux types, les mycoplasmes à petites colonies (SC ou "small colony") et les mycoplasmes à grandes colonies (LC ou "large colony"); la souche SC a un biotype bovin, elle provoque chez les bovins une péripneumonie contagieuse. Elle a été décrite par Nocard et Roux en 1898. La souche LC décrite par Laws en 1956, a un biotype caprin et provoque une agalaxie contagieuse ou une pneumopathie chez les caprins. - M. mycoides, sous-espèce capri (Chu et Beveridge, 1967); cette souche affecte les caprins chez qui elle provoque une agalaxie contagieuse ou une pneumopathie; - M. capricolum; les souches PG50-like et F38- like (Cottew et al (1987) Isrealian Journal of Medecin Science 23, 632635) ont été décrites. Elles ont respectivement pour hôtes les bovins ou les caprins. La souche PG50-like provoque une mammite ou une arthrite chez les bovins et la souche F38 provoque une pleuropneumonie contagieuse chez la chèvre. Elles sont de taxonomie incertaine. Les antibiotiques cyclines et macrolides donnent de bons résultats contre les infections dues à ces souches, mais le traitement doit durer au moins 5 jours et tous les animaux doivent être traités. Les échecs ou récidives à long terme ne sont pas rares (Lefèvre et coll., Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1987, 6;713-757). Aucun vaccin contre les pneumopathies n'a pratiquement été mis au point en raison de la diversité des espèces pathogènes. Rurangirwa et coll., (Isr. J. Med. Sci. , 1987, 23;641-643), ont réalisé un vaccin inactive par les ultrasons protégeant les chèvres contre la PPCC (péripneumonie contagieuse caprine) à % pendant 6 mois au moins. Les mesures sanitaires restent les plus efficaces si elles peuvent être appliquées rigoureusement. En Europe, la maladie n'est que rarement mortelle; parmi les animaux apparemment guéris se maintient une certaine proportion de porteurs chroniques. Le recours aux épreuves de laboratoire (dépistage sérologique systématique) pour le dépistage des porteurs asymptomatiques est un des aspects les plus importants de mesures de défense contre la PPCB (Lefèvre et coll., 1987). En Afrique, ces mêmes mesures ne sont pas envisageables. Le recours à une autre politique de prophylaxie est donc inévitable. En Afrique, la lutte passe obligatoirement par la vaccination annuelle des bovins. A l'heure actuelle, ne sont utilisés que les vaccins vivants de culture en milieu liquide et lyophilisés (Lefèvre et coll., 1987). L'efficacité des vaccins vivants est directement reliée à leur virulence et au nombre d'organismes vivants par dose. Les souches les plus virulentes stimulent une meilleure immunité, mais elles peuvent provoquer des réactions indésirables et même parfois la mort. Les souches très atténuées produisent moins d'effets secondaires, mais leur protection ne dure pas longtemps. Les vaccins vivants actuellement utilisés sont un compromis entre la virulence, l'immunogénicité et la sûreté. Jusqu'à présent, les facteurs de virulence chez les souches de mycoplasmes n'ont pas été identifiés de façon à permettre la conception de compositions de vaccins ou de moyens de traitement des maladies qu'ils provoquent. De plus le défaut de classification taxonomique des différentes espèces et sous-espèces à l'intérieur du groupe mycoplasma mycoides constituait un obstacle à la préparation de compositions protectrices contre l'infection par ces organismes pathogènes, puisque les paramètres nécessaires à la définition de ces compositions soit pour obtenir une protection spécifique d'espèce ou de sous-espèce, soit pour obtenir une protection spécifique de groupe, ne pouvaient pas être déterminés. Différentes méthodes telles que l'analyse du profil protéique (Rodwell (1982) Reviews of Infectious Diseases 4, S8-S17); Costas et al (1987) Journal of General Microbiology 133, 3319-3329) ou l'analyse de l'ADN (Christiansen et Erno (1982) Journal of General Microbiology 128, 2523-2526) et Taylor et al, International Journal of Systematic Bacteriology 42, 593-601) ont été utilisées pour affiner la taxonomie à l'intérieur du groupe Mycoplasma mycoïdes. Ces techniques nécessitent beaucoup de temps et les résultats obtenus ne permettent pas de conclure et de distinguer les différentes souches. Les inventeurs ont remédié au moins en partie à ces insuffisances de l'état de la technique en mettant au point des moyens pour l'identification des espèces et sous-espèces de mycoplasma mycoides, ces moyens offrant la possibilité de procéder à une discrimination entre ces espèces et sous-espèces. Ainsi les inventeurs ont défini des amorces nucléotidiques, utilisables dans des réactions d'amplification, notamment d'amplification en chaîne par PCR et conduisant à des profils d'amplification spécifiques des espèces et sous-espèces de mycoplasmes. Il a été décidé d'utiliser la technique de PCR aménagée pour comparer les polymorphismes des empreintes génétiques obtenues par amplification PCR avec des amorces choisies au hasard. La technique décrite par Caetano-Anollés et al (1991 Bio/Technology 9, 85-94 a été utilisée). Ainsi on a mis en oeuvre une PCR dans laquelle les amorces (primers) sont déterminées au hasard (AP-PCR): cette technique consiste à réaliser l'amplification au hasard de fragments d'ADN en utilisant des amorces d'oligonucléotides construites en l'absence d'informations spécifiques sur la séquence d'acides nucléiques du génome testé que l'on cherche à amplifier (Ralph et al (1993) Journal of Bacteriology 175, 973-981). La technique de PCR au hasard (AP-PCR) a été mise au point et optimisée de façon à générer une empreinte reproductible avec l'ADN génomique de la souche M. capricolum et a été appliquée à la classification et à l'identification des autres mycoplasmes à l'intérieur du groupe M. mycoides. Les conditions déterminées par les inventeurs pour la réalisation de la PCR, dans le but d'identifier les espèces et sous-espèces du groupe Mycoplasma mycoides, leur ont permis de mettre en évidence et de caractériser plusieurs gènes d'intérêt regroupés sur un opéron, dont certains au moins sont capables de coder pour des protéines de la famille des estérases. Les estérases sont des lipases particulières, ces dernières (EC 3.1.1.3) hydrolysant des liaisons ester de triacylglycérols donnant lieu a la production d'acides gras, de diacylglycérol et de monoacylglycérol. Les lipases connues présentent entre elles peu d'homologies à l'exception de la région cathalytique contenant le pentapeptide conservé G X S X G. Ce pentapeptide contient le résidu serine nucléophile essentiel pour la catalyse. Ces protéines favoriseraient le cas échéant la croissance des mycoplasmes et seraient susceptibles d'entrer dans la composition de vaccins protecteurs contre des infections dues à des mycoplasmes. Ces protéines sont aussi susceptibles de constituer des facteurs favorisant la virulence des souches de mycoplasmes chez les animaux. L'invention a donc pour objet des séquences d'acide nucléique le cas échéant contenues dans un opéron et codant pour trois polypeptides ayant un site actif de serine estérase. Elle concerne aussi les polypeptides codés par ses séquences ou leurs fragments susceptibles notamment d'entrer dans la constitution de compositions vaccinantes. La présente demande concerne aussi des fragments d'acide nucléique, ou sequences de nucléotides, utilisables comme sondes ou comme amorces pour la réalisation de réactions d'amplification. Entrent également dans le cadre de la présente demande des anticorps dirigés contre les protéines de l'invention, qu'ils soient polyclonaux ou monoclonaux; ces anticorps seraient utilisables pour détecter l'infection par les mycoplasmes de groupe M. mycoides, ou pour effectuer un suivi des animaux infectés, au cours d'un traitement thérapeutique. L'invention a donc pour objet une séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement représenté à la figure 6, ou en ce qu'elle comprend cet enchaînement. La séquence représentée à la figure 6 correspond à un opéron comportant au moins 3 gènes dont certains au moins codent pour des protéines ayant une activité de type estérase. L'invention a également pour objet des parties de la séquence représentée à la figure 6 et en particulier chacune des séquences codant pour chacune des protéines représentées à la figure 6. En particulier l'invention concerne la séquence de nucléotides correspondant à l'un des fragments suivants ou comprenant l'un de ces fragments définis par rapport à leurs nucléotides des extrémités 5' et 3': - le fragment compris entre les nucléotides 49 et 843, - le fragment compris entre les nucléotides 845 et 2036, - le fragment compris entre les nucléotides 2042 et 10049. L'invention a également pour objet selon un mode de réalisation préféré des séquences de nucléotides caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide comprenant l'une des séquences d'acides aminés suivantes ou pour un peptide ou un polypeptide capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre un polypeptide comprenant l'une des séquences d'acides aminés suivantes: - polypeptide LIP1 comprenant la séquence d'acides aminés située entre les positions 49 en nucléotides et 838 en nucléotides sur la séquence représentée à la figure 6, - polypeptide LIP2 comprenant la séquence située entre les positions 845 de nucléotides et 2034 en nucléotides sur la séquence représentée à la figure 6, - polypeptide LIP3 comprenant la séquence située entre les positions 2042 de nucléotides et 10046 en nucléotides sur la séquence représentée à la figure 6. Entrent également dans le cadre de l'invention, des séquences de nucléotides caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins 9 nucléotides et en ce qu'elles hybrident dans des conditions stringentes, avec l'une au moins des séquences ci-dessus. L'invention concerne aussi les séquences d'ADN complémentaires des séquences ci-dessus désignées. Des séquences de nucléotides préférées sont celles qui sont constituées par des fragments de la séquence représentée à la figure 6, conservés chez les mycoplasmes du groupe Mycoplasma mycoides ou au contraire des séquences non conservées dans l'hypothèse ou on recherche par exemple une détection spécifique par hybridation avec l'ADN d'une souche particulière de Mycoplasma mycoides. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence intéressante contient au moins 9 nucléotides et hybride dans des conditions non stringentes avec l'une au moins des séquences décrites ci-dessus. A titre d'exemple, les enchaînements répondant aux séquences suivantes constituent des enchaînements préférés de l'invention. AATTCTTGGTGAAAAAGATGGTGT ( séquence H3) TTGCTTATAAAATGCGT ( séquence 1) GG(A,T)CA(T,C)TCAATGGG(A,T) (A,T)CCCATTGA(G,A)TG(A,T)CC Les séquences décrites précédemment sont susceptibles d'être utilisées comme amorces dans une réaction d'amplification d'acide nucléique d'une souche de Mycoplasma mycoides ou comme sonde pour la recherche de l'ADN d'une telle souche dans un milieu biologique. Ainsi, on pourra avoir recours à des couples d'amorces spécifiques de chaque espèce ou sous-espèce pour la discrimination entre les différents mycoplasmes du groupe Mycoplasma mycoides. Au contraire, on pourra avoir recours à des couples d'amorces conservées entre les différentes espèces et sous-espèces, pour pratiquer une détection de l'un quelconque des représentants du groupe Mycoplasma mycoides. Des couples d'amorces préférés sont les suivants: Lip3A 5' - GG(A, T)CA(T,C)TCAATGGG(A,T) - 3' Lip3B 5' - (A,T)CCCATTGA(G,A)TG(A,T)CC - 3' Les amorces Lip3A et Lip3B conviennent à la détection après amplification de l'ADN de toutes les espèces du groupe M. mycoides. Les nucleotides dégénérés sont présentés entre parenthèses. L'invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage, de transfert ou d'expression, caractérisé en ce qu'il contient en un site non essentiel pour sa réplication, une sequence de nucléotides hétérologue constituée par l'une des séquences ci-dessus définies. Des vecteurs recombinants préférés sont les vecteurs choisis parmi l'un des plasmides recombinants suivants: - le plasmide pBS >lipG6 déposé à la C.N.C.M. le 12 juillet 1994 sous le numéro 1-1444 - le plasmide pBS 800H déposé à la C.N.C.M. le 12 juillet 1994 sous le numéro 1-1445. Ces plasmides sont contenus dans des souches de E.coli XL1 L'invention concerne aussi une cellule recombinante procaryote ou eucaryote, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur tel que défini précédemment, dans des conditions permettant l'expression de la séquence hétérologue contenue dans ce vecteur. Des cellules recombinantes intéressantes pour la réalisation de l'invention sont par exemple des cellules de E. coli, des levures, ou tout hôte approprié susceptible notamment d'être administré chez l'animal. L'invention a par ailleurs pour objet un polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'un des enchaînements d'acides aminés suivants ou à une partie de cet enchaînement de telle façon que: - le polypeptide ou le peptide obtenu a un site actif de serine estérase, ou/et - le polypeptide ou le peptide est reconnu par des anticorps formés contre un polypeptide comprenant l'une des séquences suivantes: Polypeptide LIP1 séquence comprise entre les positions 49 de nucléotides et 838 de nucleotides sur la séquence représentée à la figure 6, Polypeptide LIP2 séquence comprise entre les positions 845 de nucléotides et 2034 de nucléotides sur la séquence représentée à la figure 6, Polypeptide LIP3 séquence comprise entre les positions 2042 de nucléotides et 10046 de nucléotides sur la séquence représentée à la figure 6. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un polypeptide intéressant est choisi pour sa capacité à intervenir, seul ou en combinaison, sur la croissance des mycoplasmes qui le contiennent. Cette activité sur la croissance peut être testée en utilisant les méthodes décrites dans Methods in mycoplasmalogy (Ed. Shmuel Razin Joseph G. Tolly, Academic Press 1983) dans la partie intitulée "Test d'inhibition de croissance" ("Growth Inhibition Tests, Wallace A Clyde Jr. (Volume I p. 405-410 et p. 411-417, ou dans la partie intitulée "Test d'inhibition du métabolisme" ("Metabolism Inhibition Tests" - David Taylor-Robinson). Des peptides particulièrement avantageux pour la réalisation de l'invention sont les polypeptides conservés parmi les 3 gènes de l'opéron de Mycoplasma mycoides sous-espèce LC tels que représentés à la figure 6 et qui correspondent aux séquences données ci- dessous: I Y D Y D Y F K D N N N D Y F P KT F S L Y Y D P S L L I L G E K D G V. Un tel polypeptide peut également être modifié par addition, délétion, substitution d'au moins un acide aminé, dès lors que le peptide ainsi modifié est reconnu par des anticorps dirigés contre le peptide non modifié correspondant. Les peptides ou polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par tout procédé connu, notamment par synthèse chimique ou par voie recombinante. L'invention a également pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide ou un peptide décrits ci-dessus. Une composition immunogène particulière comprend l'ensemble des trois polypeptides représentés à la figure 6. Le cas échéant, le polypeptide ou le peptide utilisé à titre de principe actif de la composition immunogène est couplé à une molécule porteuse. De nombreuses molécules susceptibles de porter de tels peptides ou polypeptides ont été décrites dans l'état de la technique. A titre d'exemple, on citera l'antigène HBsAg du virus de l'hepatite B, la protéine mal E de E. coli. Avantageusement, le peptide présent dans la composition immunogéne à titre de principe actif, comprend environ 7 acides aminés et peut correspondre aux acides aminés 133 à 139 des deux premières protéines dont la séquence est représentée à la figure 6. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide ou peptide utilisé en tant que principe actif de la composition immunogène est présenté sous la forme d'une protéine recombinante. Lorsqu'il s'agit de peptides, on pourra également avoir intérêt à réaliser une polymérisation de ce peptide pour obtenir le principe actif de la composition immunogène. Le cas échéant, la composition immunogène peut être constituée par des cellules recombinantes exprimant un polypeptide ou un peptide, éventuellement recombinant, selon l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. Figures 1 à 4: analyse du polymorphisme de restriction pour les souches LC, SC, Capricolum, Capri, F38 et PG50. Figure 5: carte de restriction du fragment contenant les gènes codant pour les lipases, clones et séquences à partir de M. mycoides sous- espèce mycoides LC Figure 6: séquence de nucleotides contenant les gènes codant pour les protéines LIP1, LIP2 et LIP3. Figure 7: alignement des séquences d'acides aminés des protéines LIP1, LIP2 et LIP3. Les séquences ne sont représentées que dans leurs partie alignées. MATERIELS ET METHODES Les souches suivantes ont été utilisées: YG, GC 1176-2, 7730 et Farcha. M. mycoides sous-espèce S.C.: B17, PG1, Fatick, PO et KH3J. M. mycoides sp.: PG50 et F38. M. capricolum: Californica kid, Limoge, Vienne, PP, Goat 189 et 7714. Toutes ces souches de mycoplasmes ont été décrites dans l'état antérieur de la technique. Ces mycoplasmes ont été cultivés dans un milieu de culture conformément à la description donnée par Roulland-Dussoix et al (1994) Journal of Microbiological Methods 19, 127-134. Extraction de l'ADN pour l'amplification par AP-PCR L'ADN génomique a été extrait des mycoplasmes selon la procédure décrite par Carle et al (1983 dans Methods in mycoplasmology I ed. Razin et Tully, pp. 295-299 Academic Press:New York). L'ADN extrait a ensuite été purifié par centrifugation d'équilibre dans un gradient de CsCl-bromure d'éthidium selon la description de Sambrook et al (1989 a laboratory manual 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.). Amplification par PCR à l'aide d'amorces arbitraires (AP-PCR) Toutes les procédures de AP-PCR ont été réalisées dans un volume final de 50 1. Sauf dans les cas ou d'autres conditions sont précisées, entre 100 et 300 ng d'ADN génomique de mycoplasmes et 40 pmol de chaque amorce Lip3A et Lip3B (voir tableau 1) ont été ajoutés au milieu de réaction. Le milieu de réaction de 1'AP- PCR contenait (à moins d'une mention contraire) 200 gM de chacun des dNTP, 50mM KC1, 10 mM-Tris pH 8.5, 2.5 mM MgCl2 et 1,75 unités de polymérase d'ADN AmpliTaq de Perkin Elmer Cetus. Dans certains tests, la polymérase d'ADN Taq de Amersham a également été utilisée. Les paramètres des cycles de température correspondaient à deux niveaux de conditions de stringence. Le premier niveau de stringence correspondait aux conditions était de faible stringence, et comportait cinq cycles répondant aux caractéristiques suivantes: 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 37 C et 1,5 minutes à 72 C. Le second niveau de stringence correspondait à une augmentation de la stringence et comprenait une augmentation de la température de couplage de l'amorce à l'ADN de 37 C à C et l'amplification était réalisée pendant 30 cycles. L'amplification dans les conditions de plus faible stringence a eté précédée d'une étape de dénaturation de l'ADN à 94 C pendant 5 minutes et l'amplification dans les conditions de stringence plus fortes a été suivie par une étape d'extension de l'ADN à 72 C pendant 10 minutes. L'amplification par AP-PCR a été effectuée dans deux différents automates de PCR: Perkin Elmer Cetus 480 et Perkin Elmer Cetus 9600. Analyse des produits d'amplification 41 de chaque ADN amplifié ont été soumis a une électrophorèse au moyen d'un gel Métaphor 2,5% (FMC, France). L'ADN amplifié a été détecté par fluorescence UV après une coloration au bromure d'éthidium. On a utilisé en tant que marqueur de poids moléculaire l'ADNNX-174digéré avec l'enzyme de restriction HaeIII et l'ADN du phage lambda digéré avec l'enzyme de restriction BstEII (Biolabs, France). RESULTATS La technique de PCR mettant en oeuvre les amorces arbitraires (AP-PCR) a permis d'utiliser des amorces de PCR sélectionnées au hasard et des conditions de stringence faible pour générer des empreintes polymorphiques simples de l'ADN génomique. Plusieurs amorces de PCR ont été utilisées pour leur capacité à initier l'amplification avec mycoplasma Mycoides sous-espèce LC et SC (contenus dans le groupe Mycoplasma mycoides). Parmi ces amorces, seules Lip3A et Lip3B (tableau 1) étaient capables de conduire à une empreinte génomique. En utilisant les amorces Lip3A et Lip3B, les paramètres d'amplification ont été optimisés de façon tout à fait intéressante pour obtenir des empreintes reproductibles: on a donc défini les conditions relatives à la teneur en MgCl2, et les concentrations en matrice et en amorces (Bassam et ai (1992) Applied Microbial. Biotechnology 38, 70-76). La concentration en MgCl2 a été testée sur un intervalle de 0 à 3 mM et à différents niveaux de pH: 8,5; 9; 9,5 et 10. Dans les tests effectués, la quantité de matrice et les concentrations en amorces étaient respectivement fixées à 1,6 MM et 8 ng/Ml. Au moins 1,5 mM de magnésium (MgC12) a été requis pour initier l'amplification à pH 8,5. Les empreintes obtenues à 2 mM; 2,5 et 3 mM de MgCl2 montrent une légère différence dans l'apparition et la disparition de certaines bandes de polymorphisme. Les empreintes obtenues à pH9 étaient différentes de celles obtenues à pH8,5 à une concentration semblable de chlorure de magnésium. Aucune empreinte n'a été obtenue à pH9,5 et 10. Ces résultats ont permis de choisir les conditions optimum correspondant à 2,5 mM de chlorure de magnésium et un pH de 8,5. De très faibles quantités de matrice, entre 10 et pg peuvent être utilisées pour obtenir une empreinte d'amplification (Caetono-Anollés (1991). L'effet de la quantité de matrice sur l'obtention de différentes empreintes génomiques de mycoplasmes a été testé dans les conditions prévues plus haut par AP-PCR. Une empreinte fiable a été obtenue lorsque 100 et 500 ng de matrice étaient utilisés. A une concentration de matrice plus faible (0,2 ng/4l), l'empreinte génomique a été altérée alors que 20 ng/gl abolissait l'amplification. Ces résultats étaient reproductibles dans des tests distincts. Finalement, l'effet de la concentration en amorce sur l'obtention d'empreintes génomiques a été testé. Les résultats obtenus démontraient que la concentration minimum en amorces requise pour obtenir une empreinte génomique par AP-PCR était i^M. L'utilisation d'une concentration supérieure en amorces (jusqu'à 3, 5 pM) a augmenté la quantité de produit amplifié sans altérer le profil de l'empreinte. La concentration en amorces utilisée dans les essais ultérieurs a été fixée à 2 MM. En utilisant ces paramètres optimisés pour l'obtention d'une empreinte génomique des polymorphismes reproductible et fiable, au moyen de la technique AP-PCR avec M. capricolum, l'applicabilité de cette technique a été testée pour 1'ADN génomique de différentes souches de mycoplasmes contenus dans le groupe M. mycoides (tableau 2). Des profils d'empreinte simple ont été obtenus à partir des souches de mycoplasmes représentatrices de 6 espèces ou sous- espèces contenues dans le groupe M. mycoïdes. Ceci a permis d'établir la distinction entre différentes espèces ou sous-espèces déjà connues: M. mycoides sous-espèce mycoides S.C. (PG1), M. mycoides sous-espèce mycoides L.C. (YG), M. mycoïdes sous-espèce capri (PG3) et M. capricolum California Kid. L'espèce non classée M. mycoides spPG50 a conduit à l'obtention d'une empreinte de polymorphisme distincte de celles de toutes les autres souches. La technique de AP-PCR a ensuite été appliquée à l'ADN génomique de différentes souches de chaque sous- espèce, de façon à déterminer la possibilité d'utiliser cette technique pour différencier des souches apparentées de mycoplasmes. En comparant l'empreinte polymorphique obtenue avec 5 souches différentes de M. capricolum, il a été possible de distinger chacune de ces souches et de déterminer des bandes polymorphiques partagées par toutes ces souches. L'amorce Lip3b a été utilisée dans une procédure d'amplification avec amorce unique En mettant en oeuvre 3,5 mM de MgC12 et à pH 9,5, on a détecté une bande unique de 900pb dans l'ADN de M. mycoides sous-espèce mycoides LC. Ce produit d'amplification a été cloné en utilisant le système de clonage TA (Invitrogen). Le fragment de 900pb a ensuite eté séquencé. L'ADN de M. mycoides sous-espèce mycoides LC a été digéré avec les enzymes HindIII ou EcoRI et les produits de la digestion ont été insérés respectivement dans le vecteur pUC19 et dans le vecteur gt10. Le produit d'amplification par PCR comportant les 900pb a été utilisé pour cribler deux banques d'ADN de mycoplasmes. Les clones positifs contenaient des fragments HindIII de 1370pb et EcoRI de 4300pb. Le fragment HindIII a été entièrement séquence et le fragment EcoRI a été partiellement séquence. La séquence HindIII de 1370pb est contenue dans le fragment EcoRI de 4300pb. Le site HindIII est séparé du site EcoRI à l'extrémité 3', par 50pb (figure 5). Les fragments de 800pb et 4300pb ont été insérés dans des plasmides pBS pour donner respectivement pBS \lipG6 et pBS 800H. Ces plasmides ont été utilisés pour transformer des souches E.coli XL1. E.coli XL1 portant le vecteur pSK+ (Stratagène) dans lequel un fragment de 4300pb a été clone au site EcoRI contient donc 3 gènes des serines estérases de M.mycoides sous-espèce mycoides LC. Il manque la partie C-terminale du dernier gène. E.coli XL1 portant le vecteur pSK+ (Stratagène) dans lequel un fragment de 8000pb a été clone au site HindIII.Ce fragment contient la partie C-terminale du dernier (troisième) gène de M.mycoides sous-espèce mycoides LC. Le fragment EcoRI de 4300pb contient trois cadres de lectures codant respectivement pour des polypeptides de 267, 267 et 270 acides aminés. Les trois protéines déduites de la séquence LIP1, LIP2, LIP3 contiennent le pentapeptide conservé, GHSMG pour LIP1 et LIP3 ET GKSMG pour LIP2. Ces trois protéines ont deux à deux une forte similitude (68 à 80%). Un peptide His-Gly est conservé au sein de LIP1, LIP2 et LIP3, et 65 acides aminés en amont de la serine du pentapeptide conservé. Ce dipeptide His-Gly pourrait constituer la séquence hydrophobe en amont du site catalytique. EXPRESSION DES GENES Le fragment EcoRI de 4500pb a été inséré dans le vecteur pBS-SK et testé pour l'expression dans la souche Ecoli PR 101 (pSU77) [Renbaum et al Nucl. Acids. Res. (1990) 18:1145] contenant le suppresseur fort opal. La souche PR 101 (pSU77) contenant le plasmide recombinant pBS-4300-EcoRI a été sélectionnée sur milieu LB-agar complété avec 30pg/ml de chloramphénicol et 100mg/ml d'ampicilline. L'expression du suppresseur opal dans E.coli souche PR 101 (pSU77) est sous le contrôle du promoteur Lac. Des concentrations identiques des bactéries PR 101 (pSU77) ayant poussé avec 2,5 mM d'IPTG avec ou sans plasmide recombinant pBS-4300-EcoRI ont été testées sur un système API Zym R5200 (BioMérieux) pour rechercher les activités enzymatiques. L'activité C4 lipase- estérase a été détectee seulement chez les souches contenant le plasmide recombinant. DISCUSSION Si le groupe de mycoplasma constitue le groupe connu sous le nom de M. mycoides, 4 sous-groupes appartiennent à des espèces (ou sous-espèces) et 2 sous-groupes restent non identifiés. Tous ces mycoplasmes sont pathogènes pour le bétail, les chèvres et les moutons. La classification par différentes méthodes biochimiques ou génétiques, des individus de ce groupe et principalement des groupes non-identifiés restaient jusqu'à présent difficile. L'utilisation des techniques dérivées de la PCR conduisant à l'obtention d'empreintes polymorphiques de l'ADN fournit des outils puissants pour identifier des génomes inconnus. En utilisant des amorces appropriées notamment des amorces arbitraires, les paramètres pour l'obtention d'empreintes génomiques fiables avec M. mycoides sous- espèce mycoides LC (YG) (Californica kid) ont été optimisés pour une application de la technique AP-PCR. Ensuite, l'applicabilité de cette méthode a été testée sur plusieurs mycoplasmes contenu dans le groupe M. mycoïides. Les empreintes polymorphiques obtenues par AP-PCR étaient reproductibles parmi plus de 4 essais distincts et faciles à interpréter. En réalité, différentes empreintes polymorphiques ont été obtenues à partir des 4 groupes de mycoplasmes appartenant aux mêmes espèces ou sous-espèces dans le groupe M. mycoides permettant la distinction entre tous ces groupes. En clonant des fragments résultant de l'amplification par AP-PCR de M. mycoides sous-espèce mycoides LC et en utilisant ces fragments pour l'hybridation avec l'ADN génomique de différents mycoplasmes, deux amorces spécifiques Séql et H3 pour M. mycoides sous- espèce mycoides LC et SC et PG50 ont été définies. L'analyse des séquences nucleotidiques du fragment situé entre ces deux amorces oligonucléotiques H3 et Seql a montré deux cadres ouverts de lecture. Cette technique a permis la détection par PCR de M. mycoides sous-espèce mycoides et PG50. Tableau 1: amorces séquence de nucleotides 5'-3' Lip3A GG(A,T)CA(T, C)TCAATGGG(A,T) AP4 (A,T)CCCATTGA(G,A)TG(A,T)CC Tableau 2: Mycoplasma mycoides sous-espèce mycoides L.C.: Y Goat (YG) (souche de référence) GC 1176-2 Farcha Myc.mycoides sous-espèce mycoides S.C.: PG1 déposée NCTC 10114 (souche type) B17 PO Fatick KH3J (souche vaccinale) Myc.capricolum: californica Kid (NCTC 10154), (souche type) limoges vienne pp goat goat189 M.mycoides sous-espèce capri: 1. souche PG3 = NCTC 10137 = souche type 2. souche 8812-117 3. souche L M. sous-espèce type F38 1. souche F38 = NCTC 10192 = souche type 2. souche Gabès 3. souche LKD 4. souche SLP M. sous-espèce type PG50 1. souche PBG50 = NCTC 1033 = souche type 2. souche 8897 3. souche C291 Obtention d'un vaccin Un peptide à 7 acides aminés a été synthétise et couplé à une molécule "carrier". Ce peptide correspond aux acides aminés 133 à 139 des trois serine estérases clonées et séquencees (ce peptide est identique donc commun aux trois estérases). Ce peptide est ensuite administré à des souris ou à des lapins pour produire des anticorps qui sont testés pour leur effet sur la neutralisation de la croissance des mycoplasmes. Des protéines de fusion peuvent aussi être produites en utilisant le kit de Biolabs qui met en oeuvre le gène mal E de E. coli. Différentes fusions sont faites, notamment pour commencer, une avec les 41 premiers acides aminés (n 42 = tryptophane = codon stop) dont les 17 premiers sont quasiment identiques ou avec ce peptide dont le tryptophane à la position 42 est muté et fusion de la séquence située entre les acides aminés 1 et 162 (position 163 = tryptophane) ce qui permet d'inclure les sites actifs de ces protéines. Des anticorps sont produits et leur capacité de neutralisation de l'activité et de la croissance des mycoplasmes est testée. REVENDICATIONS 1. Séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement de la figure 6, ou en ce qu'elle comprend cet enchaînement. 2. Séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'il s'agit d'un fragment de la séquence selon la revendication 1 et en ce qu'elle comprend l'enchaînement suivant ou en ce qu'elle correspond à cet enchaînement: / -+.-.- - --------.------- -.. -±-- ---.---.. CGAATATGATTAAGTAGATGTCTITAGAACTATATCAGGAGAGTGATGAATCTAATA _ +.....+.. ...+.......+ _....._......... _ _ + TATGATATGACTATC- TATT CATAATAA TNTAAATAAT + _... ..+......+........+ _........+ _ _ _ _ _ _ _ _ _ + CAT'GGGTAATTCCACCTAAAGCXT:'IGIG TAAIAAAAAATATrCAACAAGATCA _ + _._.._.._.__._+...... -..--..---..--...-- --+......+.........4---+ AATPATTATGCACTACAATCCAGGCAAATCTAGAA ATAAACCAGTTAAAGATCATAAA _ + _......+ _ _......+........+ _ _.... _ _ _ _ _ + _ _ _ _ _ _ _ + GTTACAGT,AAoTITICAATTArTAATTCATTITATAGAACAAAAAATAAA AATGTGGT TATTGGACATTCTAT GGTGGAGGAGrTATTAGTATTCGTTATAAAAG ------ ±------------- - ----------------- CGCCCTxGA rAT'AAAAAACTAA TATTATAACTCCTATGAATAAACCACAACGTGCT + -.....±.....±.....±.....+à.....+ - TTATAIXAACAATATAAAATTGIATTATITCCAAAAACATFDGAAGNATATATAAACAAC: + _._._.._._._+.......+.......+ _._._._._._+.........4- _ ACACITCATCTITATACTATGATCCATCAATACTAATCAAATAAAGAAAATCGAA -.................. -....- - - - -.... - -- - -.+ - - - -- - - - - - - - -- -........ -'4- - - - AAAGCAAAACAAGAA-TIGATCC]ATG'ATATAATAATGATGTTrCTI'GTSAACTAGGT _. - _+____._+ _- _.+_....+ - + à......... GAACCAAAAGATCGTACrAAArAATAGAACAAGGACAGACATAAAATACCA AGTITATTAA7 5VI===TL=IGTG Al AAGAGATT/GAAT4%AAATAT TTTGATCAACATGTTAAAG TGNTGAAATGCATTGAATGAAAAAAACAGGTCATATCGTC -+.........- --+.........- --+.........- --+..........- --+..........4- + 'PCAAGAAAACTTTGATGA TTATTAAAATAGTAGAAAACTTi'i'AAATAAAACTAAT 3. Séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'il s'agit d'un fragment de la séquence selon la revendication 1 et en ce qu'elle comprend l'enchaînement suivant ou en ce qu'elle correspond & cet enchaînement: +..........- +...........+.....+......... V1VJJWVTLVLLWVT.,LV' v rvT. T. T. TV, T.WTVc'J',T'TVW ......+.........±.------. +..-.. ---..CLMF: l' -....."-..........-1.....+. ....-...... +. .....+......+......+......+..... oOlI YLWWLV&JNVWDDLWLLLvvvv v vvVVVVVLWIVJLWvvVV.LVIw -.........+.........+.... .....+.........± - s- -- - +.. -. LLVDVVVD3IT.T.T.T'LLrT.T.LVVT,'V, T sLT''TVTL:L 'V.T.T:aDr 'JrVVWuT.We ".........-I -......-.....4....+. ....-...... G - G -....+ -..........+......+......+ -.... G-G........+ -... .....+.........+.......-......+..-- -- -- -- -- - - -- -- -- ---+ - - 4--- - - - - - - - - -- ------- -II " +. ....-......-.....+......+..... IF.....4....+. .....+......+......+..... Q G I, s-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - 4. Séquence de nucleotides caractérisée en ce qu'il s'agit d'un fragment de la séquence selon la revendication 1 et en ce qu'elle comprend l'enchaînement suivant ou en ce qu'elle correspond à cet enchaînement: i----.2722509-. ATGAAAAAAATAATTTATGrATGACTATATAS'ITAAA -... -. _ -+.... --_+_ _+. __. _. _+____..+ _________ ± GATAATAATAATGACACAGAAAATAT'TATCTITTCATGGTTAATGTCAATAAAT _+...........+........+.......+ _ _......... _ _ _ + GTIiTrAATATIIr'IAATTAACTAATAA A ATCAAATTATTATGCACTACAATCTCCA +......+... . ..+.....+.....+.....t GGAAATAATAATGTAAAACC AATTAAAGATGATGAAArTTCAGTAT]'ACAATiCAAA +......+.......+ _.............+ _......... _ _ _ _ _ _ _ _ + CTAGTAGTITIAATT'IGTAAAAATAATAATTrAAAAAACGTTACTTTA. + __.......+........+.........+ _ _.......+ _ _ _ _ _ _ _ _ _ + ATGGGTGGTC C ACrATTTcATTAGCTTATcAAcTAGcTccTGAATTATTTAAAAAATTA + _..... _ +..... +..... +.......+...... _ + _ _ _ _+ GTATATGTATGTCCTATGAATAAAGCTAGTGAAGATGTrAATAATAAT'TZTACATGAT TATTTTGGTT AACAATTAGAT +__.......+ _ _ _.....+ _........+ _........ + _ _ _ _ _ _ _ _ _ + CCATCATTTI'TAAC TTTTTAACTAAAGATCCTAAATGAATGCGATTAGCTAAJAXUGcAT iTFITCAGG TAATGAT'EATAACTGACT5,AAfJUUCrTGATAGiTA +........+ _.......+............... + _ _ _ _ _ _ AAAGAAITTACATGAACAAATITTATCAAG RAATAAAAC'rATTAAAATACCTACTTTATTA +.............+ _...... _.....+......+ _ _ _ _ + _ _ _ _ + AS'TCTTGGAAAUUAAGATGGTGTTIGTAAATAGAGAAGCTGTTTAAAATACTA3X-AAGAT ±--.........+ ---.........--'-.........±--.....-.....-- GAAGTTAAAAATGTAATTACTACTTGAATTCC.AAAAACTGGTCATATGGTATTTIUUAAAA GATTGAGATTCAT"TATAAAAATATTAGAACCATT'I'rATAAATAAATAAAAAAGA 5. Séquence de nucléotides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante ou pour un peptide ou un polypeptide capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante: gS 8 2722509 M N L.I. Y D Y D Y V F K.D N NN AD X N I I FV H G F N S S P K A F E I F E KY S TR S N Y Y A L Q F P G S NL V K P V K D H K TV T E G F A Q LL I H FI E Q NQ I K N V V A I GS MG G G VI SIRY KM R P D L F K K L IFI T P M N K PQ R A L Y E Q Y Y,) - y- F'P E X Y I NN T L S,S'L Y Y D P SII L T S N K EWM E K A K Q E F D P Y V Y N N D V I V EL G E P K D R T F E L I E Q G L D AI K I P S L L I L G E K D G V I L R D ECL K Y F D Q H V K G X E M H W M K K T GH M V F Q E N F D E F I K I V E N F L NK T N 6. Séquence de nucléotides selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante ou pour un peptide ou un polypeptide capable d'être reconnu par des anticorps diriges contre le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante: 9 I NIn A N AI DIA I3.: A N 3: I A U H 9 L N o a e6 I M H S E A N N A H N A A a q 3 3 a u ri I A Dqc a à i I ri a c I,L I S a 003 t oz3 D1 n ÀC A M A L d VN q àN I I N oof1 aNa x d N AN AN X N S..I A d a a X Ai S ALI AL NN AL I 3 a o0% 1 x a I d a Id L q A N0 L N N N d.T I A I q N N q G a d{ N A V I V q. 0D 9 0N S 5 X 9 A VAA N N I 0 N 0 2 I A a I q q d) V O àq A S A NI H N N A a Cj 'Ol M A ' È S O a Ad I S A A XN 1L N JL M X N O00' . I H a V A S S N A H I X I I N q a s N N N a3 N A ri X ri N w Qos o 0s 7. Séquence de nucléotides selon la revendication 1 ou la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante ou pour un peptide ou un polypeptide capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés suivante: 2L M K K I I Y D Y,,fD Y I F K D N N N D T E N I I F C' H G F N A S I N V F N I F K N Y W T K S N Y Y A L Q S P G N N N V K P I K D D E I S V L Q F A K L V V E F V K N N N L K N V T L I G H S M G G G T I S L A Y Q L A P E L F K K L V Y V C P M N K A S E D V N N N F L HIl Y- F -P K T -- F E E F T T D F L G, 'YL Y- Y D F L T F LT K DP KW M R L AK W H F S G ND Y N T K E LT DL G K T LV S K E L H E Q I Y Q A I K' T I K I P T:-L, I L G ',E K-.D G V V N R E A C L K Y Y Q D E V K N V I T T W I P K T G H M V F E E D W D S F I K I L E P F L L N K * 8. Séquence de nucleotides caractérisée en ce qu'elle contient au moins 9 nucléotides et en ce qu'elle hybride dans des conditions stringentes, avec l'une au moins des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Séquence de nucleotides caractérisée en ce qu'elle contient au moins 9 nucléotides et en ce qu'elle hybride dans des conditions non stringentes, avec l'une au moins des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10. Séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 caractérisée en ce qu'elle répond à l'un des enchaînements suivants: 11. Séquences de nucléotides susceptibles d'être utilisées comme couples d'amorces dans une réaction d'amplification d'acide nucléique, caractérisées en ce qu'elles sont sont constituées par des fragments de la séquence représentée à la figure 6. 12. Vecteur recombinant de clonage, de transfert ou d'expression, caractérisé en ce qu'il contient en un site non essentiel pour sa réplication, une séquence de nucléotides hétérologue constituée par l'une des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'un des plasmides recombinants suivants: pBS xlipG6 déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-1444 pBS 800H déposé à la C.N.C. M. sous le n 1-1445 14. Cellule recombinante procaryote ou eucaryote, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, dans des conditions permettant l'expression de la séquence hétérologue contenue dans le vecteur. 15. Cellule recombinante selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit de E. coli. 16. Polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement d'acides aminés suivant ou à une partie de cet enchaînement de telle façon que: le polypeptide ou le peptide obtenu a un site actif de serine estérase, ou/et - le polypeptide ou le peptide est reconnu par des anticorps formés contre le polypeptide comprenant la séquence donnée à la revendication 5 et/ou, - le polypeptide a la capacité d'intervenir, seul ou en combinaison, sur l'activité de croissance des mycoplasmes qui le contiennent. 17. Polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement d'acides aminés suivant ou à une partie de cet enchaînement de telle façon que: le polypeptide ou le peptide obtenu a un site actif de serine estérase, ou/et - le polypeptide ou le peptide est reconnu par des anticorps formés contre le polypeptide comprenant la séquence donnée à la revendication 6 et/ou, - le polypeptide a la capacité d'intervenir, seul ou en combinaison, sur l'activité de croissance des mycoplasmes qui le contiennent. 18. Polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement d'acides aminés suivant ou à une partie de cet enchaînement de telle façon que: le polypeptide ou le peptide obtenu a un site actif de serine estérase, ou/et - le polypeptide ou le peptide est reconnu par des anticorps formés contre le polypeptide comprenant la séquence donnée à la revendication 7 et/ou, - le polypeptide a la capacité d'intervenir, seul ou en combinaison, sur l'activité de croissance des mycoplasmes qui le contiennent. 19. Peptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les suivants ou en ce qu'il s'agit d'un peptide modifié par addition, délétion, substitution d'au moins un acide aminé dans l'une des séquences suivantes, dès lors que le peptide modifié est reconnu par des anticorps dirigés contre le peptide non modifié correspondant: I Y D Y D Y F K D N N N D Y F P K T F S L Y Y D P S L L I L G E K D G V. 20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en ce qu'il a une activité sur la croissance des mycoplasmes, au sein desquels il est exprimé. 21. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide ou peptide selon l'une quelconque des revendications 16, 17, 18 ou 19 ou 20. 22. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle contient les polypeptides selon les revendications 16, 17 et 18. 23. Composition immunogène selon la revendication 21, caractérisée en ce que le peptide ou le polypeptide immunogène est couplé à une molécule porteuse. 24. Composition immunogène selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisée en ce que le polypeptide ou le peptide est présenté sous la forme d'une protéine recombinante. 25. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15.