FR 2718253 A1 19951006 FR 9403842 A 19940331 DISPOSITIF PORTE-ÉCHANTILLONS POUR L'EXAMEN D'UNE SURFACE, NOTAMMENT D'UN MATÉRIAU BIOLOGIQUE OU BIOCOMPATIBLE DANS UN FLUX DE LIQUIDE. La présente invention concerne un dispositif porte-échantillons pour l'examen d'un matériau et de l'interaction de sa surface avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible dans un flux de liquide physiologique. Un tel dispositif est destiné à l'observation au microscope du comportement de tissus ou de cultures cellulaires dans un flux physiologique, ou pour étudier les interactions de matériaux biologique ou biocompatibles avec le liquide physiologique, par exemple la formation de caillots sanguins dans un rétrécissement de conduit. La présente invention peut également être mise en oeuvre pour l'examen microscopique en temps réel d'un surface ou d'un revêtement quelconque et pour l'analyse des interaction avec un fluide (liquide ou gaz). On connaît dans l'état de la technique des dispositifs pour l'examen visuel de matériaux biologique ou biocompatibles dans un flux physiologique. On peut notamment citer le brevet français FR2573870 concernant un instrument comportant des moyens d'analyse microscopique de particules dans un écoulement de fluide traversant une chambre comportant une zone de formation d'images sur laquelle sont dirigés les moyens d'analyse, et des moyens servant à étaler l'échantillon de fluide et un fluide d'enveloppement sous la forme d'un écoulement sensiblement plat. La mise en oeuvre de ce dispositif consiste à réaliser un écoulement laminaire plat dans la zone de formation d'images. On dirige ensuite les moyens d'analyse dans cette zone suivant une direction parallèle a l'épaisseur de cette zone, on choisit la distance de travail et la profondeur de champ de la lentille des moyens d'analyse et on maintient le débit de la totalité du fluide pour que les particules de l'échantillon de fluide circulent a l'intérieur de la profondeur de champ des moyens d'analyse. Ce dispositif est notamment destiné à l'analyse des particules de sang et d'urine. Un tel dispositif est certes adapté à l'examen de cellules circulantes, mais ne permet pas d'observer des matériaux biologique ou biocompatibles ou des biomatériaux fixés sur support de culture. Par ailleurs, il ne permet pas de procéder à des observations par épifluorescence nécessitant une accumulation de photons émis par les marqueurs de cellules. L'objet de la présente invention est de remédier à ces inconvénients en proposant un dispositif permettant d'observer au microscope des matériaux biologique ou biocompatibles vivants dans un flux de liquide physiologique, et notamment l'interaction entre le matériau biologique ou biocompatible et le liquide. Le dispositif selon l'invention est constitué par une platine présentant un logement pour la mise en place d'un support de culture cellulaire recouvert par un matériau transparent, ledit logement communiquant avec un premier conduit pour l'arrivée d'un liquide physiologique et un second conduit pour l'évacuation du liquide physiologique. Selon une première variante de réalisation, la platine est constituée par deux parties complémentaires par rapport à un plan médian perpendiculaire à l'axe d'observation, l'une au moins des parties présentant un logement pour le positionnement d'une lame de culture cellulaire prolongée par deux conduits débouchant en des zones diamétralement opposées par rapport à un plan contenant l'axe d'observation, les deux parties étant raccordables de manière étanche. De préférence, la platine est constituée par deux parties complémentaires identiques, chacune des parties étant constituée par un cadre présentant une zone centrale munie d'une fenêtre transparente fixée de manière hermétique sur ledit cadre, le cadre présentant par ailleurs sur la face interne un logement pour le positionnement d'une lame de culture prolongée de part et d'autre d'une rainure s 'étendant jusqu'au bord du cadre. Selon une deuxième variante, le dispositif est constitué par une première pièce présentant une logement tubulaire pour le positionnement d'une boîte de culture cellulaire et dont le fond présente au moins une zone centrale transparente, une seconde pièce d'alimentation en liquide physiologique présentant une partie annulaire dont le diamètre extérieur correspond au diamètre intérieur de la boite de culture cellulaire, ladite pièce présentant un fond plat transparent muni à sa surface inférieure d'une rainure débouchant à chacune de ses extrémités dans un canal traversant la pièce intermédiaire, et par une troisième pièce pour le blocage de la pièce intermédiaire, ladite troisième pièce étant constituée par une bague présentant une zone annulaire dont le diamètre intérieur correspond au diamètre intérieur de la pièce intermédiaire, et muni à sa surface latérale d'un moyen de raccordement sur l'embase. Selon un mode de réalisation avantageux, la pièce intermédiaire présente à sa surface inférieure une rainure circulaire dans laquelle est logé un joint d'étanchéité. De préférence, le dispositif comporte en outre une pièce de délimitation de la surface de culture constituée par une partie discale dont le diamètre extérieur correspond au diamètre intérieur de la boite de culture et présentant une découpe centrale, ladite partie discale étant munie d'un téton saillant dont la hauteur est au plus égale à la hauteur de la boite de culture cellulaire. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, faisant référence aux dessins annexés concernant deux modes de réalisations non limitatifs, où - la figure 1 représente une vue en coupe d'un premier exemple de réalisation de l'invention ; - la figure 2 représente une vue de face d'un premier exemple de réalisation de l'invention ; - la figure 3 représente une vue en coupe des composants d'un dispositif selon un deuxième exemple de réalisation ; - la figure 4 représente une vue de face de la pièce intermédiaire du dispositif selon le deuxième exemple de réalisation ; - la figure 5 représente une vue en coupe de la pièce intermédiaire du dispositif - la figure 6 représente une vue en coupe d'une pièce de délimitation de la surface de la culture ; - la figure 7 représente une vue en coupe des composants d'un dispositif selon un troisième exemple de réalisation. Les figures 1 et 2 représentent des vues respectivement en coupe et de face d'un premier exemple de réalisation de l'invention. Le dispositif est constitué par l'assemblage de deux ensembles (1, 2) identiques et complémentaires. Chacun des deux ensembles est constitué par deux pièces : un porteéchantillons (3) et un porte-hublot (4). Le porte-échantillons (3) est constitué par une plaque de PLEXIGLAS (nom commercial) ou tout autre matériau rigide. I1 présente une fenêtre centrale de forme circulaire pour la mise en place du porte-hublot (4). La plaque présente sur l'une de ses surfaces une rainure (5) s'étendant depuis l'un des bords latéraux (6) jusqu'au bord latéral opposé (7). Cette rainure (5) est dans l'exemple décrit de forme droite. Il peut présenter une forme différente, et notamment présenter une zone de moindre largeur pour créer un rétrécissement du canal formé avec la rainure du porteéchantillons complémentaire. Sa forme et/ou sa section peuvent également être modifiées par la mise en place d'un insert formé par une pièce de matière plastique transparente se logeant dans le canal. La rainure présente une zone centrale (8) dont le profondeur correspond dans l'exemple décrit à un cinquième de l'épaisseur de la plaque. Cette zone centrale (8) débouche à chacune de ses extrémités dans une zone (9, 10), permettant le raccordement avec les conduits d'arrivée et de départ du liquide physiologique. La zone centrale (8) est renforcée par un insert métallique (ll, 12) qui d'une part assure l'étanchéité du canal formé par les rainures complémentaires et d'autre part est taraudée pour recevoir le porte-hublot (3). Ce canal rectangulaire d'une largeur de 18 millimètres et d'une hauteur de 2 millimètres traverse la fenêtre centrale dans laquelle est logé le porte-hublot (3). Celui-ci est constitué par une bague annulaire (13) supportant un hublot (14) transparent de forme discal, en verre organique ou minéral. Ce hublot est collé sur la bague annulaire qui présente un épaulement (15) destiné au positionnement précis du hublot (14). L'ensemble formé par le porte-échantillons et par le porte-hublot présente par ailleurs un logement pour la mise en place d'un échantillon de surface à étudier. Dans l'exemple, la surface peut-être une lame de culture cellulaire, une membrane semi-perméable, ou un quelconque support capable de support l'adhésion cellulaire. L'assemblage des deux éléments complémentaires (1, 2) s'effectue à l'aide de vis non représentés sur les figures annexées. Il est également possible de prévoir des moyens de réglage de la hauteur du hublot en fonction de l'épaisseur de la lame à observer. L'ensemble est fixé sur la platine du microscope à l'aide d'un système de clips. Il est par exemple raccordé à un conduit d'arrivée de fluide thermostaté et oxygéné. Le fluide peut etre pulsé de façon à reproduire les interactions entre un tissu et des cellules dans le flux sanguin. Les matériaux observés peuvent notamment être constitués par des pièces de prothèses vasculaires, des biomateriaux, des membranes perméables ou semi-perméables ou des tissus vivants. L'examen microscopique est possible sur les deux faces de l'échantillon à analyser. I1 peut également être réalisé sur deux échantillons placés de part et d'autre du plan médian. Le dispositif permet de procéder à des examens tels que - l'étude de l'arrachement de cellules fixées au support - l'étude d'adhésions cellulaires sur des supports bruts ou modifiés par des molécules adhésives, par exemple des colles biologique ou biocompatibles - l'étude de drogues, et leurs effets sur des cellules adhérentes ou non adhérentes - l'étude des interactions de cellules ou de micro-particules avec des membranes perméables ou semiperméables - l'étude des interactions et modifications des cellules du sang ainsi que des cellules des parois vasculaires - l'utilisation comme modèle d'étude dynamique de l'faction d'un produit pharmaceutique ou autre sur différents types de cellules - l'étude de modifications cellulaires dans l'explorations des différentes pathologies humaines ou animales. Les figures 3 à 6 concernent un deuxième mode de réalisation plus particulièrement adapté à la culture de cellules dans des dispositifs standards connus sous le nom de "boites de PETRI". Ils permettent de proposer un dispositif de faible court, permettant d'utiliser des systèmes de cultures à usage unique. Le dispositif selon ce deuxième mode de réalisation est constitué de plusieurs pièces complémentaires - une embase (20) représentée - une boite de culture (21) - une pièce d'alimentation (22) - un bouchon (23). L'embase (20) est constituée par une pièce en acier inoxydable ou en PLEXIGLAS de forme cylindrique creuse dont le fond (25) présente une fenetre circulaire (26). Le bord de la fenêtre (26) présente un épaulement périphérique (27) pour le positionnement de la boîte de PETRI (21). Le diamètre intérieur de l'embase (20) correspond au diamètre extérieur de la boîte de PETRI (21). L'alésage de l'embase présente dans sa partie supérieure un filetage (28) pour le verrouillage du bouchon. Il est bien entendu que d'autres systèmes de raccordements sont envisageables, par exemple un système à baïonnette. Le bouchon (23) est constitué par une bague annulaire présentant un filetage latéral (29). La pièce d'alimentation (22) est représentée en vue de face en figure 4 et en vue de coupe suivant un plan perpendiculaire au plan de coupe de la figure 3. Elle est constituée par une pièce transparente de forme cylindrique présentant une partie tubulaire (30) d'un diamètre extérieur correspondant au diamètre intérieur de la boite de culture (21). La partie tubulaire (30) est fermée par un fond (33). La partie tubulaire (30) est traversée par deux alésages (31, 32) diamétralement opposés, débouchant dans une rainure (34) de forme rectangulaire, symétrique par rapport à l'axe médian passant par le centre de la pièce tubulaire et par les alésages (31, 32). Cette rainure forme avec le fond de la boîte de PETRI (21) un canal alimenté par le liquide physiologique. Pour assurer l'étanchéité de ce canal, le fond de la pièce intermédiaire (22) présente une rainure circulaire (35) dans laquelle est logé un joint torique (36). La figure 6 représente un adaptateur pour la délimitation d'une zone de culture centrale dans la boite de PETRI (21). Il est constitué par une pièce (38) en acier inoxydable de forme cylindrique, présentant une fenêtre centrale (39) de forme circulaire. Deux tétons (40, 41) facilitent la préhension de l'adaptateur. La figure 7 concerne un troisième mode de réalisation adapté à l'étude de supports de membranes perméables ou semi-perméables. Les composants du dispositif sont constitués, outre ceux déjà décrits en référence à la figure 3, une seconde pièce d'alimentation (43) présentant un canal d'alimentation (45) dont la forme générale correspond à celle du canal (34) de la première pièce d'alimentation (22). Cette deuxième pièce d'alimentation (43) présente une section extérieure inférieure à la section intérieure de la pièce d'alimentation (22) permettant un encastrement des deux pièces. Le dispositif comporte ainsi deux conduits à section rectangulaire formant un canal primaire (34) et un canal secondaire (45), communiquant entre eux par un fenêtre (42) traversant le fond de la première pièce d'alimentation (22). Cette fenêtre (45) peut être équipée avec une membrane perméable ou semi-perméable. Les canaux primaire (34) et secondaire (45) comportent des arrivées et des départs de fluides différents permettant de faire circuler des fluides différents pour étudier par exemple le transport de nutriments ou de substances à travers la membrane disposée dans la fenêtre (45), ou pour effectuer des mesures de filtration tangentielle. Une bague (44) assure le blocage de la seconde pièce d'alimentation (43). L'invention est décrite dans ce qui précède à titre d'exemple non limitatif. Il est bien entendu que l'Homme de Métier sera à même de réaliser diverses variantes sans pour autant sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 - Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible dans un flux de liquide physiologique caractérisé en ce qu'il est constitué par un support présentant un logement pour la mise en place d'un support de culture cellulaire, ledit logement communiquant avec un premier conduit (31) pour l'arrivée d'un liquide physiologique et un second conduit (32) pour l'évacuation du liquide physiologique. 2 - Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit support est constituée par deux parties complémentaires (1, 2) par rapport à un plan médian perpendiculaire à l'axe d'observation, l'une au moins des parties (l, 2) présentant un logement pour le positionnement d'une lame de culture cellulaire ou d'un support de membrane prolongé par deux conduits débouchant en des zones diamétralement opposées par rapport à un plan contenant l'axe d'observation, les deux parties (1, 2) étant raccordables de manière étanche. 3 -Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit support est constitué par deux parties complémentaires (1, 2) identiques, chacune des parties (1, 2) étant constituée par un cadre présentant une zone centrale munie d'une fenetre transparente fixée de manière hermétique sur ledit cadre, le cadre présentant par ailleurs sur la face interne un logement pour le positionnement d'une lame de culture ou d'un support de membrane prolongé de part et d'autre d'une rainure s'étendant jusqu'au bord du cadre. 4 - Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est constitué par une première pièce (20) présentant une logement tubulaire pour le positionnement d'une boite de culture cellulaire (21) et dont le fond présente au moins une zone centrale transparente, une seconde pièce (22) d'alimentation en liquide physiologique présentant une partie annulaire dont le diamètre extérieur correspond au diamètre intérieur de la boîte de culture cellulaire, ladite pièce présentant un fond plat transparent muni à sa surface inférieure d'une rainure débouchant à chacune de ses extrémités dans un canal traversant la pièce intermédiaire, et par une troisième pièce pour le blocage de la pièce intermédiaire, ladite troisième pièce (23) étant constituée par une bague présentant une zone annulaire dont le diamètre intérieur correspond au diamètre intérieur de la pièce intermédiaire, et muni à sa surface latérale d'un moyen de raccordement sur l'embase (20). 5 - Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible selon la revendication 4 caractérisé en ce que la pièce intermédiaire (23) présente à sa surface inférieure une rainure circulaire (36) dans laquelle est logée un joint d'étanchéité (35). 6 - Dispositif porte-échantillons pour l'examen microscopique de l'interaction entre la surface d'un matériau ou d'un revêtement avec un fluide, notamment pour l'examen d'un matériau biologique ou biocompatible selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une pièce de délimitation de la surface de culture constituée par une partie discale (38) dont le diamètre extérieur correspond au diamètre intérieur de la boite de culture (21) et dont le fond présente une fenêtre centrale (39), ladite partie discale étant munie d'un téton saillant dont la hauteur est au plus égale à la hauteur de la boite de culture cellulaire.