FR 2712602 A1 19950524 FR 9313766 A 19931118 VIRUS RECOMBINANTS. PREPARATION ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'algine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue sous le controle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapie génique. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette infonnation génétique peut être inSroduite soit in vitro dans une cellule extraite de organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans rorganisme, soit directement in vivo dans le tissu rapproprié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de Cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et aL, PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioLChem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude, telles que les maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (alzheimer, Parkinson, etc), les maladies cardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers. Plus particulièrement, concernant le traitement des cancers, différentes stratégies ont été proposées dans l'art antérieur. Ainsi, la demande EP 259 212 décrit la préparation de vaccins destinés au traitement des cancers, comprenant un virus modifié capable d'exprimer un antigène spécifique d'une tumeur, permettant de générer une réponse immunitaire contre ces cellules. Par ailleurs, la demande WO91/15580 décrit la construction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont l'expression en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène. n est également connu de la demande WO 93/10814 d'utiliser des vecteurs exprimant des formes immunogéniques, non tumorigénique, d'oncogène cellulaires impliqués dans le développement des cancers. La demande WO 93/02556 décrit enfin ltilisation de cellules prélevées dans la tumeur, modifiées génétiquement ex vivo par introduction d'un gène toxique, puis réadministrées au patient. Toutefois, cette approche impose des étapes de chirurgie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule transformée ex vivo n'est pas démontrée. Aussi, bien que des résultats intéressants aient été obtenus, les cotîstructions décrites dans l'art antérieur ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante certaines difficultés, et notamment le ciblage précis des cellules à traiter. Ainsi, il a été proposé d'utiliser des rétrovirus recombinants comme vecteurs pour le transfert de gènes thérapeutiques. En effet, ces virus ne sont capables d'infecter que les cellules qui se divisent. Cependant, l'emploi de ce type de vecteur ne permet pas de cibler avec suffisamment de sélectivité les cellules tumorales. De plus, ces virus ne peuvent être obtenus avec des titres très élevés ce qui limité l'efficacité thérapeutique. n a par ailleurs été proposé d'administrer directement le gène dans la tumeur. Ici encore, les risques de diffusion aux cellules environnantes ne sont pas exclus. Pour cette raison, il a été proposé de modifier la spécificité d'hote des virus utilisés, en incorporant dans leur enveloppe des protéines reconnaissant des précepteurs spécifiques de cellules tumorales (W093/00103; W092/14829). Toutefois, ces constructions ne permettent pas d'obtenir des ciblages suffisants, notamment lorsque le virus utilisé code pour une protéine toxique destinée à la destruction des cellules. La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des vecteurs capables de diriger l'expression d'un gène donné sélectivement dans les cellules tumorales. La présente invention repose en particulier sur la mise en évidence que certains signaux de controle de la transcription sont actifs (ou activés) spécifiquement dans les cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés pour l'expression sélective de gène hétérologues. Elle résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les cellules tumorales. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules De plus, des adénovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui pennet de travailler à des multiplicités d'infection élevées, et d'introduire plusieurs copies du gène hétérologue par cellule. L'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables d'incorporer des séquences hétérologues comprenant de tels promoteurs, de transférer ces séquences dans les cellules tumorales, et d'exprimer des gènes désirés sous le controle de signaux spécifiques directement au niveau de tumeurs. Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers. Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. ll existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de rinvention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence d'ADN hétérologue. Cette séquence d'ADN hétérologue permet l'expression d'une activité biologique recherchée au niveau des cellules tumorales. De préférence, la séquence d'ADN hétérologue comprend au moins un gène choisi parmi un géne toxique pour la cellule infectée, un gène dont l'expression permet d'inhiber au moms partiellement la division cellulaire, ou un gène codant pour une lymphakine. Les adénovirus de l'invention peuvent en outre comporter plusieurs de ces séquences, afin d'obtenir dans certains cas un effet synergique anti-tumoral. Parmi les gènes toxiques pour la cellule infectée, on peut citer préférentiellement les gènes dont le produit d'expression confère à la cellule une sensibilité à un agent thérapeutique. Plus préférentiellement, le gène toxique est choisi parmi le gène de la thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le gacciclovir ou racyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaine d'ADN encours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spécifiquement les cellules exprimant le gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules encours de division sont affectées. Plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention b gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTiC HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931). ll est également possible d'utiliser le gène de la cytosine désaminase. dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoo cytosine (5-FC). Par ailleurs, parmi les gènes toxiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer également les gènes dont le produit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée. Parmi les gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, on peut citer plus particulièrement les gènes supprusseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif de ceux-ci; les séquences antisens ou les ribozymes, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber au moins partiel- lement l'expression de gènes favorisant la division cellulaire. Parmi les gènes suppresseurs de tumeur utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement le gène p53 (Baker et coll., Science 244 (1989) 217); le gène Rb (Friend et coll., Nature 323 (1986) 643; Huang et coll., Science 242 (1988) 1563), le gène rap 1A (Kitayama et colt., Cell 56 (1989) 77); le gène DCC (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49), les gènes k-rev2 et k-rev3; ou tout autre gène suppresseur de tumeur décrit dans la littérature (Cf part exemple WO 91/15580). La séquence d'ADN hétérologue peut également comprendre une séquence kantiens, dont rexpression dans la cellule cible permet de contrôler rexpression de gènes favorisant la prolifération cellulaire. Ce controle peut intervenir au niveau de la transcription, du splicing du prémessager, de la dégradation du messager, de sa traduction en protéine, ou de modifications post-traductionnelles. Préférentiellement, la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de controler la traduction d'un ARNm cible (EP 140 308). Parmi les séquences antisens utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence antisens permettant de diminuer les niveaux de production des oncogènes ras, myc, fos, c-erb B, etc. Parmi les gènes codant pour des lymphokines, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL3 de préférence), les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), le TGF-8, etc. Par ailleurs, le gène codant pour la lymphokine comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la lymphokine, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. De telles constnlctions permettent en particulier d'augmenter les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un antigène spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse immunitaire contre un type particulier de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux. Comme indiqué ci-dessus, la séquence d'ADN hétérologue est placée sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De cette façon, le gène utilisé n'est exprimé et ne produit son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule tumorale. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs. Encore plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome. Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers humains le lymphome de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inducable par rEBV permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasophauc Dans les biopsies de cancers du nasopharynx, un seul antigène nucléaire est régulièrement présent, EBNA1, qui est impliqué dans la maintenace du génome viral dans les cellules infectées par 1'EBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation, pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasopharynx, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus comprenant comme signal d'expression un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (top1). Les exemples décrits dans la présente demande montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1. Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été identifiés dans des lésions épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène E6 conduit à la formation de tumeurs en diminuant fortement la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-positives (Wrede et al., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171). L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par le HPV (par exemple la protéine E6) permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales correspondantes. n peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules normales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de ra-foetoprotéine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de l'IGF-II (Sussenbach et al., Growth Regulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chez l'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. ll est également possible d'utiliser des promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs hormonodêpendantes ou hormonaux associées (tumeur du sein ou de la prostate par exemple). En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de radénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes nO Fur 93 05954 et FR 93 08596. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. La presente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation directement injectable dans les tumeurs à traiter. I1 peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Toutefois, il est également possible d'utiliser des compositions pharmaceutiques formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, souscutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfuhi. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des cancers. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des cancers du nasopharynx ou des hépatocarcinomes. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2: Représentation du vecteur pONT- & gal Techniques generales de biologie moleculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives dADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, I'électrophorèse sur gels d'agarose ou cracrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de méthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloaing, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et aL (eds), "Current Protocoles in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de RADON ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fxntr. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et aI. lNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed chais Beaction, Saiki R K et al., Science 251 (1985) 1350 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. ErizyfiL (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Exemples Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sous le contrôle d'un promoteur chimère EBNAl-REtIfPl (figure 1 > . Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-REltIP1). 1.1. Construction du plasmide p7tkl Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114116 et codon stop TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage. Le fragment BgIII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site SmaI du plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et Bgm sont détruits lors de cette étape, le site NcoI est conservé. Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl. 1.2. Construction du plasmide pONT1 Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TP1 du virus EBV. Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al. (Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contient les séquences nécessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluesctipt II SK. Le plasmide obtenu a été désigné pONT1. 1.3. Construction du plasmide pONTtk Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) cloné dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 cloné dans le plasmide pONT1. Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment XhoI-ClaI de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAcLRSVj3gal. Le plasmide pARSV(3Gal contient, dans l'orientation 5'- > 3', - le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E1A; - le gène codant pour la ssgalactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd RSVssGal et l'adénovirus dol 324. Le plasmide pAd.RSVpGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et ai 0. Clin Invest. 90 (1992) 626). Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk (figure 1). 1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk Le vecteur pONTtk a été linéarité et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les foncions codées par les régions El (E1A et E11B) d'adénovirus. Plus précisément, l'adénovirus Ad-ONT- détruits au cours de cette étape. Le plasmide obtenu a été désigné pONT-Bgal (figure 2). 2.2. Construction de l'adénovirus Ad-ONT-Bgal Le vecteur pONT-Bgal obtenu dans l'exemple 2.1, a été utilisé, par recombinaison homologue selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4., pour préparer un adénovirus recombinant comprenant le gène de la béta-galactosidase d'E.coli (Bgal) sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RESI P1. L'adénovirus Ad-ONT1-ssgal ainsi obtenu peut être conservé à -800C dans 20 to de glycérol. Exemple 3. Construction du vecteur pONT-CAT Cet exemple décrit la construction d'un vecteur comprenant le gène de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RE/TP1). 3.1. Construction du vecteur Le promoteur TP1 de l'EBV a été isolé sous la forme du fragment NruI(166241)-PstI(166559) de l'EBV. Ce fragment a ensuite été fusionné au gène CAT, et inséré, sous forme d'un fragment NruI-BamHI, dans le plasmide pGem7ZF (promena). Le plasmide résultant a été désigné pTPl-CAT. Le fragment NniI-BamHl du plasmide pTP1-CAT a ensuite été fusionné, en aval du fragment EcoRI(7315) SmaI(8191) de l'EBV souche B95-8, contenant les séquences nécessaires à la trarsactivation par EBNA1 (Cf exemple 1.2.). Le fragment obtenu, comprenant le gène CAT sous contrôle du promoteur chimère EBNAl-RWI?1, a été inséré aux sites EcoRI et BamHI du plasmide pBluescript SK pour générer le plasmide pONT-CAT. Un plasmide a également été construit dans lequel les éléments de réponse à l'antigène EBNA2 du promoteur TP1 ont été délétés. Pour cela, le promoteur TP1 a été isolé sous la forme du fragment NruI(166375)-PstI(166559) de l'EBV. Ce plasmide a été désigné pOST-CAT. 3.2. Activité in vitro Cet exemple démontre que les constructions décrites ci-dessus sont induites spécifiquement par des antigènes du virus d'Epstein Barr. Les vecteurs pONT-CAT, pOST-CAT et pTPl-CAT ont été transfectés par électroporation dans une lignée de lymphocytes B EBV- (cellules DG75), soit seuls, soit en présence de vecteurs d'expression des antigènes viraux EBNA1, EBNA2 ou EBNA1 + EBNA2. 48 heures après la trasfection, les cellules ont été lysées par congélation/décongélation, les débris cellulaires éliminés, puis les extraits obtenus ont été normalisés suivant la quantité de protéines. L'activité CAT a ensuite été dosée dans ces extraits par dosage enzymatique. Les résultats obtenus sont les suivants: Seul +EBNA2 0 +EBNA1 +EBNAVA2 pTP1-CAT 1 35 2,5 17 pONT-CAT 1 16 34 136 pOST-CAT 1 1,4 19,5 22,5 Ces résultats montrent clairement que le promoteur ONT est spécifiquement actif en présence des antigènes EBNA1 et EBNA2, et qu'il induit une très forte expression du gène CAT. REVENDICATIONS 1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue sous le controle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. 2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible. 3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 5 ou canin de type CAV-2. 4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène toxique pour la cellule infectée. 5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène toxique est un gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée une sensibilité à un agent thérapeutique. 6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène toxique est le gène de la thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir. 7. Adénovirus selon rune des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire. 8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que le gène est choisi parmi les gènes suppresseur de tumeur, les séquences antisens et les ribozymes. 9. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène dont le produit d'expression induit l'apoptose de la cellule infectée. 10. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'il comprend des signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs. 11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome. 12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend une séquence répondant à l'antigène EBNA1. 13. Adénovirus selon la revendication 12 caractérisé en ce que le signal d'expression est constitué d'un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, de préférence le promoteur du gène de la terminale protéine 1 Cl1). 14. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'il comprend des signaux d'expression choisis parmi le promoteur de r -foetoprotéine et le promoteur P3 de l'IGF-II. 15. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 14 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers. 16. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 12 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers du nasopharynx. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique en vue d'une cadministration directe dans la tumeur à traiter. 18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 14. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable. 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs. 21. Promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, de préférence le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TP1).