FR 2710654 A1 19950407 FR 9311687 A 19930930 NOUVELLES lJGNEES DB CRLLULES SECRETRICES D'INSULINE LBURS PROCEDES D'OBTENTION PAR VOIE DR MANIPULATION GENETIQUE ET LEUR UTILISATION CHEZ DES SUJETS DîABETIOUES SOUS FORTS PROTEGEE La présente invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement au domaine de la biologie celltlAlre. Elle a plus particulièrement pour objet, une lignée cellulaire nouvelle, susceptihle d'être implantée dans un organe humain pour lui faire exprimer le produit biologique que la lignée cellulaire nouvelle exprime normalement dans les cultures L'invention a spécifiquement pour objet, une nouvelle lignée cellulaire dite lignée cellulaire ss répondant au glucose (lNS-l) dont la principale propriété est la sensibilité au glucuse. Ces cellules sont donc caractérisées par un contenu élevé en insuline, la possibilité d'exprimer de la glucokinase et du transporteur dc glucose Glut 2 à des niveaux comparables à ceux des cellules ss-noreales et, en outre, ces cellules sont rendues non proliférantes par manipulation génétiques. Cette lignée cellulaire est donc apte à être greffée dans les organes des sujets insulino-dépendants et d'assurer un contrôle physiologique11 de la glycémie dans le cas de diabète insulino-dépendant. La greffe d'orga:ie ou la greffe de tissu fait partie des outils thérapeutiques utilisés dans un certain nombre de maladies. Plus récemment, les techniques de manipulation génétique, ont fait entrevoir d'autres possibilités de traitement des maladies jusque-là incurables. On propose donc un projet de recherche qui combine la greffe et la thérapie génique pour le traitement du diabète sucré. En effet, les Demandeurs ont établi une lignée cellulaire ss, la lignée INS-l. Cette lignée sécrète l'insuline en réponse à des concentrations physiologiques du glucose et pourrait, après manipulation génétique, être utilisée pour la greffe et le contrôle "physiologique" de la glycémie dans le diabète insulino-dépendant. Malgré les efforts thérapeutiques réalisés dans la dernière décennie, le traitement du diabète reste très imparfait. C'est la raison pour laquelle des thérapeutiques nouvelles sont explorées; les greffes du pancréas ou d'îlots en font partie (Hellerstrom C, Andersson A, Groth C-G, Sandler S, Jansson L, Korsgren O, Swenne I, Petersson B, Tollemar J, Tydén G - Diabetes Care 11 (Suppl.1) 45-53 1988) (Pipelleers DG, Pipelleers-Marichal M, Hannaert J-C, Berghmans M, In't Veld PA, Rozin J, Van de Winkel M, Gepts W - Diabetes 40:908-919 1991). Plus d'un millier de greffe de pancréas entier et quelques dizaines de greffe d'îlots ont été réalisées de par le monde. Bien que porteuses d'espérance, ces techniques lourdes soulèvent schématiquement deux types de problèmes : les uns immunologiques, les autres logistiques. En plus des problèmes de tolérance inhérents à chaque type de greffe, il faut rappeler que le diabète est une maladie auto-immune et que le receveur, diabétique, garde une potentialité à détruire les cellules ss greffées. Il y a donc une nécessité absolue d'associer une thérapeutique immuno-suppressive à la greffe. Afin d'éviter cette immuno-suppression, certains auteurs ont proposé la transplantation d'îlots encapsulés (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Chicheportich D, Reach G Diabetologia 31:54-57 1988). L'avantage essentiel de la protection et notamment d'encapsulation est de soustraire le tissu greffé à l'attaque par le système immunitaire. Toutefois, la faible disponibilité des îlots rend difficile la préparation de quantités suffisantes du matériel dans des buts thérapeutiques. C'est pourquoi des efforts considérables ont été consacrés ces dix dernières années pour établir des lignées cellulaires ss comme modèles d'étude de l'insulinosecrétion et du diabète. La plupart de ces lignées ont perdu leur fonction cellulaire ss essentielle, à savoir la réponse au glucose par une secrétion d'insuline, cette perte survenant au cours des repiquages et des cycles cellulaires successifs. Les Demandeurs ont donc pu établir une lignée cellulaire ss très différenciée (INS-1) dont les caractéristiques sont très proches de celles des cellules ss normales (Asfari H, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB Endocrinology 130:167-178 1992) et ceci constitue l'essence de l'invention. Parmi les propriétés remarquables de ces cellules, on citera en particulier, le contenu en insuline élevé, l'expression de la glucokinase, du transporteur de glucose Glut 2, à des niveaux comparables à ceux de la cellule ss normale. Enfin, la réponse à des facteurs de croissance ou de différenciation comme l'hormone de croissance, la prolactine IGF-1 et IGF-II à des concentrations physiologiques. L'intérêt essentiel de ces cellules est avant tout leur sensibilité au glucose. Les Demandeurs ont pu montrer précédemment qu'une augmentation des concentrations de glucose de 3 à 20 mM augmente de 4 fois la secrétion d'insuline des cellules INS-I en présence de substances qui élèvent le taux intracellulaire de AHPC. Récemment, il a été de plus montré que l'incubation de ces cellules avec des concentrations physiologiques de glucose (48h à 5 mM) les rend encore plus sensibles à des variations de concentration de glucose. Ces caractéristiques de différenciation font de ces cellules, les candidates les plus appropriées pour des xénotransplantations dans des capsules biocompatibles chez des sujets diabétiques. Cependant, avant la greffe, il est nécessaire de rendre ces cellules non proliférantes. En effet, l'inhibition de la prolifération est indispensable si l'on vent éviter une croissance anarchique et une éventuelle destruction de la capsule protectrice. Ceci est obtenu par destruction des gènes impliqués (directement ou indirectement) dans la prolifération cellulaire. On a pu montrer récemment que l'IGF-II est abondamment exprimé dans ces cellules. L'IGF-II est un facteur de croissance qui module la croissance cellulaire essentiellement de manière autocrine. On peut donc penser, sur la base des résultats récents qui sont décrits plus loin, que l'IGF-II est impliqué dans la croissance incontrôlée de ces cellules et que l'inhibition de l'expression du gène de l'IGF-II (par destruction du gène) est susceptible d'inhiber ou de diminuer considérablement la prolifération cellulaire. Par cette manipulation génétique, les cellules INS-I seraient en mesure d'être adaptées à l'encapsulation et à la transplantation en permettant d'éviter toutes les complications et les difficultés liées à la préparation et la transplantation d'îlots pancréatiques. Finallement, la prolifération des cellules ss, modifiées génétiquement, cultivées en l'absence de sérum, est réduite de manière considérable lorsque les cellules sont cultivées en présence de protéine de liaison IGFBP-3 (Gopinath R, Walton PE, Etherton ED - Endocrinol 120:231-236 1989). Dans le modèle IGFBP-3, mis au point par les Demandeurs, sequestrant IGF-II, on diminue son activité biologique. L'addition d'IGFBF inhibe la prolifération des cellules INS-I. Cette observaton suggère que 1'IGF-II joue un rôle majeur dans la prolifération des cellules INS-I car la seule fonction connue des protéines de liaison (BP) et en particulier BP3, est de se lier aux IGF. Un certain nombre de preuves indirectes sont en faveur des résultats obtenus : IGF-II stimule la prolifération cellulaire dans les lignées tumorales de manière autocrine-paracrine (El-Bardy OM, Romanus JAI, Helman LH, Cooper MH, Rrchler MM, Israel MA - J. Clin. Invest. 84:829 1989). Ceci aussi a été démontré sur des cellules transformées (Park JHY, McCusker RH, Vanderhoof JA, Mohammadpour H, Harty RF, MacDonald RG - Endocrinology 131:1359-1368 1992) et sur des cultures d'îlots ss primaires (Rabinovith A, Quigley C, Russel T, Patel Y, Mintz DH Diabetes 31:160-164 1982) (Hill DJ, Hogg J - E.M Spencer (ed), Elsvier Science publishing CO, INC 1991 235-240). L'invention a également pour objet, l'établissement de lignées cellulaires INS-I, modifiées génétiquement, encapsulées, en vue de leur implantation. RéSULTATS PRELI MINAIRES Ces résultats concernent essentiellement les relations entre l'IGF-II, la concentration de glucose dans le milieu de culture et la prolifération cellulaire. A 5 mM de glucose, la prolifération cellulaire ne semble pas modifiée. A partir de 5 mM jusqu'à 20 mM, on observe une augmentation de la prolifération pendant des périodes allant jusqu'à 72 h de culture. En parallèle, on observe une augmentation des ARN messagers d'IGF-II pour des concentrations de glucose allant de 10 à 20 mM. On n'a pas pu détecter ni la protéine IGF-I (radioimmunoessai)(Binoux M, Seurin D, Lassarre C, Gourmelen M - J. Clin. Endocrinol. Metab. 59:453-462 1984), ni son ARN messager dans ces cellules, même après de longues expositions à l'hormone de croissance. PRINCIPE DE LA HETHODB Le travail devra se dérouler en deux étapes - établir une lignée de cellules INS-I porteuse d'un gène d'IGF-II inactif, rendant les cellules non prolifératives tout en maintenant leur sensibilité au glucose - encapsulation de ces cellules et transplantation chez les animaux diabétiques dans la perspective de réaliser, ultérieurement, des greffes chez l'homme selon le même mode opératoire. PROTOCOLE EXPERI MENTAL Partie I : L'inactivation permanente du gène d'IGF-II a été réalisée par la technique de recombinaison homologue (Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990) (Pennington S, Vilson JH Proc. Natl. Acad.Sci. 88:9498-9502 1991). Les Demandeurs ont à leur disposition le gène cloné d'IGF-II dans le plasmide pUC 119 (Dr HOLTHUIZEN)(Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS Biochem Biophys. Acta 1087:341-343 1990). Parmi les quatre différents types d'ARN messager codant pour 1'IGF-II, principalement 1'ARN messager de 3,6kb est exprimé dans les cellules INs-I. Ce messager est transcrit à partir du promoteur P3 (Matsuguchi T, Takahashi K, Ikejiri K, Ueno r, Endo H, Yamamoto M - Biochem Biophys Acta 1048:165-170 1990). On se propose d'insérer une cassette codant pour le gène de résistance a la néomycine (néo) sous contrôle du promoteur des gènes précoces du CMV, placé en phase dans l'exon 4 du gène de l'IGF-ll. En aval de cette construction, une cassette codant pour la thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex sera insérée. Cette collstruction permet de sélectionner les rares clones ayant la construction IGF-II-néo par recombinaison homologue et non par insertion au hasard. En effet, les clones dûs à une recombinaison homologue seront résistants à la neomycine et au gancyclovlr alors que les clones dds â une recombinaison au hasard seront néomycino-résistants mais gancyclovir sensibles. Les cellules, aprés transfection, sont cultivées en présence de néomycine, de gancyclovir et d'IGF-Il. Les clones résistants sont testés pour leur capacité à proliférer en l'absence d'IGF-II endogène mais en présence d'IGF-lI exogène et seront étudiés par la technique du Southern Blot et analysés par PCR dans le but de controler si l'intégration a été correcte. L'expression d'IGF-II sera étudiée au niveau des ARN messagers et des protéines par les techniques de Northern et Western-Blot respectivemenl. Puisqu'il est établi que, seul l'allèle paternel du gène d'IGF-II est actif (De Chalara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A - Cell 64:849-859 1991), et puisque la recombinaison homologue est plus efficace au niveau des segments d'ADN, transcriptionnellement actifs (Nickoloff JC - MF 12:5311-5318 1992), on peut espérer obtenir des cellules INS-I n'exprimant plus IGP-1I par une seule étape de transfection/sélection. Toutefois, si ça n'était pas le cas, la destruction de la deuxième copie du gène IGF-II peut être entreprise (Riete H, Maandag EH, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990). A chaque étape de ce travail, le pouvoir du glucose à induire la sécrétion d'insuline doit entre vérifié. Partie Il Si la destruction ("knock-out") du gène d'IGF-II est réussie, on doit finalement obtenir une lignée cellulaire lNS-l, qui sera entiêrement ou en grande partie dépendante de l'administration hexogène d'IGF-II pour sa croissance. Théoriquement, cette nouvelle lignée cellulaire sera sensible au glucose de la même manière que la lignée parentale. Dans ce cas, ces cellules pourront donc être utilisées pour l'encapsulation et la transplantation. 1. Bncapsulation de la lignée cellulaire INS-I a) pour une encapsulation efficace, les cellules doivent être aggregçes dans une forme de "pseudo-ilots". Ceci peut être effectué par culture des cellules dans des boites de cultures non-adhésives. La taille des aggregats (="pseudo-ilots") peut être déterminée par la densité des cellules au moment de la mise en culture. D'autre part, le nombre de cellules dans les aggregats peut etre vérifié après trypsination des "pseudo-ilots" (PI) récoltés. b) un nombre connu de PI contenant une quantité d'insuline équivalente à celle trouvée dans 500-1000 îlots de rats adultes (2-4 x 10a cellules) est mis en suspension dans une solution d'alginate de sodium (Lacy P, Hegre 0P, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile PT, Dionne KE - Science 254:1782 1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natal. Acad. Sci 88:11100-11104 1991) et immobilisé par encapsulation dans cet hydrogel biocompatible par une solution aqueuse d'un sel de Caletulll. Les PI encapsulés seront ensuite placés dans des membranes tubulaires acryliques perméables 9 des molécules de poids moléculaire inférieur à 50 000-80 000 (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile F1, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1993) (Lanza RP, Buter DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Huller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci 88:11100-11104 1991). c) les PI encapsulés sont étudiés "in vitre par perifusion pour déterminer avec quelle intensité et à quelle vitesse ils provoquent un changement de sécrétion d'insuline en réponse à des concentrations de glucose variées. Lorsque cette partie de l'expérience se montre satisfaisante, les PI contenus dans des fibres seront utilisés pour la transplantation. 2. Transplantation Les PI encapsulés sont transplantés par voie sous-cutanée ou intrapéritoneale. Les deux méthodes sont efficaces dans le maintien de la normoglycémie chez les modèles animaux du diabète insulino-dépendant humain. Les rats Bio-breeding (BB) et les souris non-obèses diabétiques (NOD) qui développent spontanément un diabète sont associés à un génotype particulier d'histocompatibilité et présentent les mêmes défauts sur le plan immunitaire que les sujets diabétiques (présence des lymphocytes T cytotoxiques) des animaux diabétiques transplantés (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci 88:11100-11104 1991). La transplantation par voie intra-péritonéale paraît la plus favorable pour assurer un bon environnement biologique aux cellules greffées. Cette technique est applicable de la même façon aux sujets insulinodépendants. Il faut implanter entre 50 000 et 200 000 PI pour atteindre une concentration efficace d'insuline. REVENDICATIONS 1 - Nouvelle lignée cellulaire ss insulinosecrétrice très différenciée (INS.I) dont les caractéristiques d'expression sont très proches de celles des cellules ss- normales et dont le gène d'expression de l'IGF II est inhibé d'une manière au moins prédominante et permanente. 20- Nouvelle lignée cellulaire ss insulinosecrétrice très différenciée (INS I) dont les caractéristiques d'expression sont celles des cellules 5- normales et dont le gène d'expression de l'IGF II est totalement réprimé. 30- Nouvelle lignée cellulaire ss insulinosecrétrice selon la revendication 10 ou la revendication 20 se présentant sous forme d'agrégats dénommés "pseudo-îlots". 40- Un procédé de production de la lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 30 qui consiste en ce que l'on insère dans le gène cloné d'IGF II dans le plasmide pUC 119 une cassette codant pour le gène de résistance à la néomycine placé en phase dans l'exon 4 du gène de l'IGF II et en aval de cette construction, une cassette codant pour la thymidine -kinase virale- pour obtenir les clones ayant la construction IGF II-Néomycine par recombinaison homologue, on introduit dans les cellules par transfection les clones néomycino-résistants et gancyclovir sensibles, les met en culture en présence de néomycine, de gancyclovir et d'IGF II, recueille les clones résistants au niveau des segments d'ADN transcriptionnellement actifs pour obtenir une lignée cellulaire INS.I entièrement ou principalement dépendante de l'administration exogène d'IGF II. 50- Un procédé selon la revendication 40 dans lequel les cellules sont aggrégées sous forme de pseudo-îlots en effectuant les cultures des cellules de la lignée INS.I dans des boîtes de culture non-adhésive. 6 - Un procédé selon la revendication 40 et la revendication 50 dans lequel les pseudo-îlots sont unis en suspension dans un agent gélifiant et immobilisés dans l'hydrogel bio-compatible par addition d'un agent d'immobilisation. 7 - Un procédé selon la revendication 60 dans lequel l'agent gélifiant est un alginate de sodium. 8e- Un procédé selon la revendication 60 dans lequel l'agent d'immobilisation est une solution aqueuse d'un sel de calcium. 90- Un procédé selon l'une des revendications 4 à 80 dans lequel les pseudo-ilots immobilisés par encapsulation dans un hydrogel bio-compatible et durcissement par addition d'une solution aqueuse d'un sel de calcium sont, ensuite, placés dans des membranes tubulaires acryliques, perméables à des molécules de poids moléculaire inférieur à 50.000-80.000. 10 - Un procédé selon l'une des revendications 4 à 80 dans lequel les pseudo-îlots, immobilisés et durcis, sont incorporés dans des fibres transplantables. 11.- Un procédé selon l'une des revendications 4 à 100 dans lequel les pseudo-ilots, agglomérés et immobilisés, contiennent une quantité d'insuline équivalente à celle trouvée dans 500 à 1000 îlots chez le rat adulte. 12- Un transplant destiné à la voie sous-cutanée ou intra-péritonéale caractérisé en ce qu'il contient des pseudo-îlots agglomérés et incorporés dans des membranes tubulaires acryliques perméables à des molécules de poids moléculaire inférieur à 50.000-80.000, puis distribués sous forme de fibres. 130- Transplants selon la revendication 120 caractérisés en ce qu'ils apportent au malade insulino-dépendant entre 50 000 et 200 000 pseudo-îlots pour atteindre une concentration efficace.