FR 2710845 A1 19950414 FR 9312039 A 19931008 La présente invention concerne une méthode de traitement d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG et des moyens pour la mise en oeuvre de cette méthode. L'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG) est une glycoprotéine oligomérique constituée de l'association non covalente de deux sous-unités a(hCG-a) et p(hCG-p). Elle appartient à la famille des hormones gonadothyréotropes comprenant également l'hormone folliculotrope (FSH), l'hormone lutéotrope (LH) et 1 'hormone thyréotrope (TSH). L'hCG est secrétée physiologiquement par le trophoblaste dès le début de la grossesse et stimule le corps jaune pour maintenir la synthèse d'hormones stéroïdiennes essentielle à 1 'implan- tation de l'embryon. Par ailleurs, l'hCG et/ou ses sousunités sont également secrétées par une majorité de tumeurs trophoblastiques et certaines tumeurs non trophoblastiques, constituant ainsi des marqueurs biologiques pouvant aider au diagnostic ou au pronostic et à la surveillance de ces tumeurs (Bellet et al. Rev. Prat. 40:1677-1990). La séquence des acides aminés de l'hCG a été décrite par Morgan F. J. et al. The amino acid sequence of Human chorionic gonadotropin, J. Biol. Chem. 250, 5247, 1975. Au sein de la population normale, des taux sériques très faibles d'hCG dimèrique sont retrouvés chez l'homme ( Dans le cas de tumeurs trophoblastiques on a montré que les tumeurs placentaires bénignes (môles hydatiformes) et malignes (choriocarcinomes) sont caractérisées par un rapport hCG-ss/hCG sérique important : le pourcentage d'hCG-libre qui est de 0,05 à 1% lors de grossesses normales s'élève à 1-5% en cas de môle et dépasse 5% dans les choriocarcinomes. Ce rapport hCGss/hCG sérique est utilisé comme un témoin d'évolution des tumeurs testiculaires : un pourcentage d'hCG-p devenant inférieur à 5% est souvent caractéristique d'une évolution favorable de la tumeur au cours du traitement. Ce rapport s'élèvera rapidement en cas d'évolution défavorable ou de rechute. Dans le cas de tumeurs non trophoblastiques, Marcillac et al. Cancer Res. 52:3901, 1992 ont montré que l'hCG-p, non détectable chez les individus sains, est retrouvée chez de nombreux patients atteints de certaines tumeurs non trophoblastiques (tumeurs de la vessie, du pancréas, du col de l'utérus, les tumeurs sans primitif retrouvé, les tumeurs de l'endomètre et du poumon). La présente invention a pour objet une méthode de traitement d'un cancer secrétant l'hCG ou ses sous-unités libres ou des fragments de ces sous-unités, qui consiste à - identifier dans le sérum d'un patient à l'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides. - administrer au patient une quantité efficace d'au moins un polypeptide correspondant à un antigène responsable de l'état d'immunisation. Dans le cadre de la présente invention les polypeptides sont de préférence formés par un enchaînement de 15 à 40 aminoacides correspondant à une partie de la séquence primaire de l'hCG. On désigne par ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG un ensemble de polypeptides tels que définis cidessus qui correspondent à des séquences successives de l'hCG ou de ses fragments ou mieux qui correspondent à des séquences qui se chevauchent. On peut par exemple utiliser un ensemble de polypeptides correspondant aux séquences suivantes hCG-a 1-20 15-35 30-50 45-65 60-80 75-92 hCG-ss 1-20 15-35 30-50 45-65 60-80 75-95 90-110 105-125 120-145 De préférence on utilisera au moins un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous-unité ss de l'hCG. Par "polypeptide correspondant à un antigène responsable de l'état d'immunisation on désigne un polypeptide qui a la même séquence que l'un des polypeptides responsable de l'état d'immunisation ou une séquence résultant de la combinaison de séquences au moins partielles des polypeptides responsables de l'état d'immunisation. L'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides peut notamment être identifié par un test de stimulation de la prolifération des lymphocytes T par les polypeptides. On peut également mettre en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments. Ces anticorps peuvent etre mis en évidence notamment par une méthode immuno-enzymatique telle qu'une méthode ELISA. L'invention a également pour objet une méthode de traitement d'un cancer secrétant l'hCG, 1' hCG-ss ou des fragments de cette sous-unité qui consiste à administrer à un patient une quantité efficace de hCG13. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire de déterminer pour chaque patient le peptide reconnu par ses lymphocytes T. Ce peptide sera produit in vivo par dégradation de l'hCG-ss dans les cellules présentatrices d'antigène. La présente invention a également pour objet une composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG, ses sous-unités libres ou des fragments de ces sous-unités, comprenant une dose efficace d'une des sous-unités libres de l'hCG ou un polypeptide comprenant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et correspondant à un antigène responsable d'un état d'immunisation. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition comprend une dose efficace de la sous-unité ss de l'hCG. Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, la composition comprend une dose efficace d'un polypeptide correspondant à une partie de la séquence primaire de la sous-unité ss de l'hCG. Pour la thérapie on peut utiliser les polypeptides sous forme libre ou sous une forme plus immunogène, notamment une forme dans laquelle le peptide est couplé à une matrice de polylysine selon la technique du MAP (Posnett et al. J. Biol. Chem. 263, 17, 1988). En outre, pour la thérapie on administre les sous-unités libres de l'hCG ou le polypeptide avantageusement avec un agent adjuvant de l'immunité. Comme exemples d'adjuvants de l'immunité on peut citer le muramyldipeptide et le SAF-1 (Allison et al., J. Immunol. Methods 45, 157, 1986). On peut également administrer les sous-unités libres de l'hCG ou le polypeptide couplé à des nanosphères ou à des nanoparticules telles que celles décrites dans EP 0 240 424. Dans le cas du traitement de certains cancers et notamment dans le cas du cancer de la vessie, on peut également administrer en plus de façon concomitante ou en mélange du BCG (Bacille de Calmette Guérin) constitué par des souches vivantes atténuées de bacille tuberculeux (voir notamment D. Lamm et al, New England Journal of Medicine 325, 17, 1205, 1991). En variante on peut administrer un BCG recombinant exprimant une sous-unité de l'hCG ou du polypeptide comprenant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG. Un tel BCG recombinant présente des avantages: I1 suffit d'une seule immunisation pour obtenir une réponse immunitaire optimale. En effet, l'expression des antigènes protéiques étrangers persiste tant que le BCG recombinant est présent. Ainsi, cette expression continue permet de développer une immunité durable. Ceci constitue un avantage notable par rapport au cas où les quantités de polypeptides ou de protéines injectées à chaque immunisation sont définies et limitées. I1 faut rappeler que le BCG est une bactérie intracellulaire à localisation macrophagique. Cette caractéristique confère au BCG recombinant l'intérêt de délivrer des antigènes étrangers au sein même d'une des cellules les plus efficaces en tant que cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Les macrophages vont ainsi présenter efficacement les antigènes étrangers en association avec les molécules de classe II du CMH et permettre la stimulation des lymphocytes T auxiliaires spécifiques qui vont envoyer les signaux nécessaires à la mise en place des réponses cytotoxiques et anticorps. Cette forme d'administration permet 1 'expres- sion simultanée de plusieurs antigènes issus d'agents pathogènes différents. Dans le cas d'une composition pour le traitement d'un cancer de la vessie, le BCG recombinant présente un avantage supplémentaire. En effet, des études ont montré que le BCG était internalisé par les cellules tumorales de la vessie. De ce fait, le BCG recombinant permet l'expression d'une sous-unité de l'hCG ou de polypeptides par la cellule tumorale, amplifiant ainsi les mécanismes de présentation de ces antigènes aux lymphocytes T. Le BCG recombinant obtenu peut exprimer la sous-unité p de l'hCG ou des fragments de celle-ci sous forme d'une protéine de fusion à la surface de la cellule mycobactérienne, ou exprimer la sous-unité de l'hCG dans le cytoplasme sous forme d'une protéine de fusion ou seule et éventuellement sécréter celles-ci. Le BCG recombinant peut être obtenu en insérant dans un vecteur d'expression s'intégrant dans le génome du BCG, par exemple un vecteur navette Myco bacterium/Escherichia Coli, la séquence d'ADN codant pour la sous-unité ss de l'hCG ou un fragment de celle-ci, associée éventuellement à une séquence d'ADN codant pour une lipoprotéine membranaire de mycobacterium dans le cas où l'on souhaite obtenir une protéine de fusion. Le plasmide comprend également un promoteur approprié, par exemple un promoteur mycobactérien dans le cas où l'on exprime la sous-unité de l'hCG sous forme de protéine de fusion associée à une lipoprotéine membranaire ou un promoteur approprié à la transcription de 1'ADN de la sous-unité ss de l'hCG dans le cas où l'on souhaite exprimer la sous-unité ss de l'hCG seule. Dans le cas où l'on cherche à obtenir une protéine sécrétée, on insère également dans le plasmide une séquence signal appropriée, par exemple la séquence signal codant pour l'antigène de 19 kDa ou l'antigène de 38 kDa de Mycobacterium tuberculosis. Le vecteur comprend également avantageusement un site de liaison ribosomal ainsi qu'une cassette contenant les séquences pour la replication mycobactérienne du plasmide ainsi qu'une cassette d'ADN contenant les séquences pour la replication dans Escherichia coli du plasmide, dans le cas où le vecteur est un plasmide navette Mycobacterium/Escherichia coli. Le vecteur comprend avantageusement également une cassette d'ADN contenant le gène apt (KANR) responsable de la résistance à la kanamycine. Les plasmides appropriés peuvent par exemple consister en plasmides tels que décrits dans WO 93/07897, dans lesquels on a remplacé 1'ADN codant pour la protéine de surface de Borrelia burgdorferi par 1'ADN codant pour la sous-unité ss de l'hCG ou un fragment de celle-ci. Les gènes codant pour les sous-unités de l'hCG sont connus. La sous-unité a est codée par un seul gène localisé sur le chromosome 6 et capable de s'exprimer aux niveaux pituitaire et placentaire (Fiddes et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 3, 1981). La synthèse de la sous-unité ss est sous la dépendance d'un groupe multigénique comportant 7 gènes (Talmadge et al., Nucl. Acids Res. 12, 8415, 1984). L'analyse des séquences nucléotiques montre que trois de ces gènes (1, 3, 5) ont une structure identique, quatre autres de ces gènes (2, 6, 7 et 8) codent un variant au niveau du codon 117 avec substitution de l'alanine à la place d'un acide aspartique. Une étude de l'expression des gènes (Bo et al., J. Biol. Chem., 267, 3179, 1992) montre que les gènes 1, 3 et 5 sont exprimés par le placenta normal. On pense que dans les processus de tumérogénèse intéressant les cellules non trophoblastiques l'expression de plusieurs gènes conduirait à la fois à la sécrétion de la protéine normale et d'une protéine mutée en 117. Dans la présente invention on désigne donc par sous-unité ss à la fois la protéine normale et la protéine mutée en 117. En pratique l'immunothérapie peut être réalisée avec des doses de sous-unités de l'hCG, de polypeptides ou de BCG recombinant les exprimant de 1 à 100 mg administrées au niveau de la tumeur. Le vaccin peut être administré dans le cas d'un cancer de la vessie, comme cela est pratiqué déjà dans le cas d'une immunothérapie par le BCG, c'est-à-dire par instillation intravésicale une semaine après la résection de la tumeur, puis cette administration est répétée chaque semaine pendant 6 semaines et des administrations intravésicales supplémentaires sont effectuées 3, 6, 12, 18 et 24 mois après. Des administrations percutanées ou intramusculaires sont également possibles. Pour les autres types de cancers on peut utiliser des administrations intradermiques. Description des fiaures. La Fig. 1 représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence de différents polypeptides. La Fig. 2 représente la prolifération des lymphocytes provenant de deux patients ayant un cancer de la vessie en présence d'hCG et d'hCG-13. La Fig. 3 représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence de différents polypeptides. On donnera ci-après le compte-rendu d'essais de diagnostic. 1) Isolement des cellules mononuclées (PBMC) par qradient de ficoll Le sang total hépariné prélevé sur des patients présentant un cancer de la vessie est déposé sur une solution de ficoll-hypaque (1,077 g/l) dans un tube conique. Le tube est centrifugé 30 mn à 900 g, 18-20"C. La couche correspondant aux cellules mononuclées est récupérée à l'aide d'une pipette. Les cellules sont lavées dans du tampon de HANKs. 2) Test de prolifération lvmphocotaire Les PBMC sont cultivés (2x105 cellules par puits) dans du RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain AB, 2mM de L-glutamine, 1000 UI/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine, en présence de polypeptide à différentes concentrations. Les cellules sont alors mises à incuber à 37"C avec 5% de CO2 pendant 5 jours. Un uCi de thymidine tritiée est ensuite ajouté dans chaque puit. Les cellules sont collectées 18 heures après et l'incorporation de la radioactivité est analysée par spectrométrie dans un liquide de scintillation utilisant un compteur ss. On a donné sur la Fig. 1 les résultats de prolifération des lymphocytes provenant d'un patient A ayant un cancer de la vessie en présence - du milieu de culture (M) - de l'hCG et de ses sous-unités a et ss - de différents polypeptides appartenant aux sous-unités a et ss. Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide correspondant à la séquence 95-115 de la sous unité ss de l'hCG ainsi qu'avec le peptide correspondant à la séquence 1559 de la sous unité a de l'hCG. Les polypeptides 95-115 hCG-ss et 26-59 hCG-a peuvent être utilisés pour une immunothérapie chez le patient testé. On a donné sur les Fig. 2A et 2B les résultats de tests de prolifération de PBMC de deux patients B et C (respectivement Fig. 2A et 2B) en présence - du milieu de culture - de l'hCG - de l'hCG-ss à la dose de 3 ,uM, pendant 4 jours. Le patient B répond contre l'hCG-ss et le patient C répond contre l'hCG. On a donné sur la Fig. 3 les résultats de tests de prolifération de PBMC du patient B en présence de différents polypeptides recouvrant la totalité de la sous-unité ss de l'hCG (50 ,uM). Les résultats montrent que pour le patient B le polypeptide correspondant à la région ss (20-47) de l'hCG est le plus efficace pour induire une prolifération des cellules T. Par ailleurs, d'autres tumeurs (pancréatiques et testiculaires) ont été étudiées. Les cellules T d'un patient, présentant un cancer du testicule, ont répondu contre l'hCG-ss et plus précisément contre le peptide hCGss (20-47). Ces résultats montrent que I'hCG-P ou des peptides correspondant à une partie de la séquence de l'hCG-ss sont immunogéniques chez des malades ayant une tumeur productrice d'hCG-ss et peuvent ainsi être utilisées pour développer une immunothérapie antitumorale. A l'inverse, aucune réponse contre l'hCG, ses sous-unités ou des peptides de structure analogue n'a été observée chez 21 femmes enceintes. REVENDICATIONS 1. Composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG, ses sous-unités libres ou des fragments de ces sous-unités, comprenant une dose efficace d'une des sous-unités libres de l'hCG ou un polypeptide comprenant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et correspondant à un antigène responsable d'un état d'immunisation. 2. Composition selon la revendication 1, comprenant une dose efficace de la sous-unité ss de l'hCG. 3. Composition selon la revendication 1, comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspondant à une partie de la séquence primaire de la sousunité ss de l'hCG. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre du BCG. 5. Composition selon la revendication 1, comprenant un BCG recombinant exprimant une sous-unité de l'hCG ou un polypeptide comprenant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG. 6. Composition selon la revendication 5, comprenant un BCG recombinant exprimant la sous-unité ss de l'hCG. 7. Composition selon la revendication 5, comprenant un BCG recombinant exprimant un polypeptide correspondant à une partie de la séquence primaire de la sous-unité ss de l'hCG. 8. Composition selon la revendication 2, dans laquelle la sous-unité ss est une protéine mutée ayant un résidu alanine en 117.