FR 2711523 A1 19950505 FR 9312743 A 19931026 La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un aérosol comprenant un virus. La formulation aérosol de diverses substances, notamment médicamenteuses, est connue depuis longtemps. La stabilité et la vitesse de chute négligeable constituent les caractéristiques essentielles d'un aérosol. C'est pourquoi, d'une part, afin d'éviter que les particules ne s'aggrègent entre elles ou présentent une vitesse de chute trop élevée, propriétés incompatibles avec une bonne efficacité, le dosage doit répondre à un certain nombre de contraintes spécifiques, tenant notamment à différents paramètres d'environnement tels que le degré d'humidité et la température, et, d'autre part, la formulation doit tenir compte d'un certain nombre de difficultés liées principalement à l'efficacité de la défense du tractus respiratoire contre les contaminants aériens (mécanismes de clairance), qui tend à dégrader rapidement les principes actifs inhalés. En particulier, dans le cas où le principe actif est constitué par des virus, l'intégrité de la particule virale est nécessaire pour l'infection et la pénétration dans les cellules de l'épithélium pulmonaire, ce qui impose des conditions d'obtention de l'aérosol très spécifiques. D'une manière générale, lors d'une aérolisation, un virus peut être inactivé en raison de trois causes majeures. Tout d'abord, la perte du pouvoir infectieux peut résulter des dommages subis par le virus pendant le processus de nébulisation (pulvérisation dans les voies respiratoires), il peut également être inactivé dans l'aérosol par déshydration, enfin, il peut être dégradé dans l'environnement potentiellement hostile que constitue le mucus qui recouvre l'ensemble du tractus respiratoire et qui contient un grand nombre d'enzymes (protéolytiques et autres). On a maintenant mis en évidence que l'inactivation virale pouvait être limitée et maintenue dans des limites raisonnables en appliquant pour l'obtention de l'aérosol le procédé selon l'invention mettant en oeuvre des conditions particulières de nébulisation et de conditionnement. Ce procédé permet, en outre, de délivrer efficacement et en quantité appropriée le virus dans le poumon, notamment au niveau de la voie trachéo-bronchique. C'est pouquoi la présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un aérosol viral permettant notamment son administration par les voies aériennes d'un mammifère, caractérisé en ce que (a) on prépare une suspension virale diluée correspondant à la dilution d'une suspension virale contenant de 104 à 1013 unités formant des plages (ufp) d'un virus dans une solution aqueuse contenant au moins de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent ou de 50 à 100 g/l d'un hexose; et (b) on nébulise la suspension virale diluée avec une pression de gaz de 0,5 à 3,5 bars ou une fréquence ultrasonore de 2 à 5 MHz. Le procédé selon la présente invention est applicable à un très grand nombre de virus administrable par voie aérosol, notamment les virus choisis dans le groupe constitué par les poxvirus, rétrovirus, virus de l'herpès, virus associé à l'adénovirus, rhinovirus, virus de l'influenza et adénovirus. Dans le cadre de la présente invention, le terme virus" désigne aussi bien un virus naturel, tel que trouvé dans la nature, qu'un virus modifié, dont le génome comporte des modifications par rapport à celui du virus parental dont il est issu. Il peut s'agir d'un virus atténué qui a perdu tout ou partie de son pouvoir pathogène par rapport au virus naturel dont il dérive. Son génome est modifié in vivo au cours des passages successifs en culture cellulaire ou dans un organisme vivant. Le terme virus" peut faire également référence à un virus recombinant, dont le génome est modifié in vitro par les techniques du génie génétique. La modification peut, par exemple, permettre d'inactiver au moins un gène essentiel à la réplication virale (rendant le virus défectif pour la réplication) et/ou d'insérer un fragment d'ADN codant pour une protéine hétérologue (normalement non codée par le virus naturel). L'insertion a lieu dans une région appropriée du génome viral, de manière à permettre l'expression du fragment d'ADN hétérologue dans une cellule hôte. Une cellule hôte est constituée par toute cellule eucaryote infectable par ledit virus, avantageusement une cellule humaine et de préférence une cellule épithéliale de la voie trachéo-bronchique. Aux fins de la présente invention, le fragment d'ADN hétérologue peut être issu d'un organisme eucaryote ou d'un virus autre que celui dans lequel il est inséré. I1 peut être isolé par toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art, par exemple par clonage, PCR (Polymerase Chain Reaction) ou synthèse chimique. I1 peut s'agir d'un fragment d'ADN de type génomique (comportant tout ou partie de l'ensemble des introns du gène naturel), de type ADN complémentaire (ADNc ; dépourvu d'introns) ou de type minigène, c'est-à-dire mixte (comportant au moins tout ou partie d'un intron). Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, le fragment d'ADN hétérologue peut être placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Par éléments nécessaires", on désigne l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN messager(ARNm) ou la traduction de l'ARNm en protéine. Le fragment d'ADN hétérologue peut coder pour une protéine (i) intracellulaire, (ii) membranaire présente à la surface de la cellule hôte ou (iii) sécrétée dans le milieu extérieur. Il peut donc comporter une séquence signal permettant la sécrétion de la protéine vers la membrane ou hors de la cellule hôte. De nombreux virus recombinants pouvant bénéficier d'une administration par voie aérosol sont décrits dans l'art antérieur. Leurs construction et propagation sont à la portée de l'homme du métier. A titre d'exemples, on peut citer l'Ad- -lAT (Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431-434), dans le génome duquel est inséré le gène humain codant pour l'al 1 antitrypsine (alAT) et l'Ad-CFTR (Rosenfeld et al., 1992, Cell, X, 143-155), dans le génome duquel est inséré le gène humain codant pour la protéine CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, en anglais). Le procédé selon la présente invention implique la préparation d'une suspension virale diluée. Cette suspension virale diluée correspond à la dilution d'une suspension virale contenant de 104 à 1013 upf de virus dans une solution aqueuse contenant au moins de 6 à 12 g/l d'un sel de cation monovalent ou de 50 à 100 g/l d'un hexose. Dans cette étape, la suspension à diluer est généralement formée de virus placés dans un milieu tamponné contenant éventuellement un cation divalent, tel que le magnésium, le calcium ou le manganèse. Ce type de suspension étant également utilisable pour la conservation. Pour une conservation sous forme congelée, il convient de supplémenter la suspension avec un agent stabilisant tel que le glycérol, à une concentration d'au moins 10 % ou le saccharose à une concentration d'environ 1 M. La suspension de particules virales à diluer peut, éventuellement, comprendre d'autres substances, notamment l'albumine sérique humaine (HSA), l'urée, le glutamate de sodium, la glycine et l'inositol. Selon le procédé de la présente invention, il est nécessaire que la suspension virale comprenne de 104 à 1013, avantageusement de 106 à 1012 et de préférence de 108 à 10 il upf d'un virus, l'activité de cette suspension pourra notamment dépendre du virus utilisé. Cette suspension à diluer est ensuite diluée avec la solution aqueuse selon un rapport en volume suspension /solution aqueuse de 1/5 à 1/20, avantageusement de 1/10 à 1/20, de préférence de 1/12 à 1/18 et de manière tout à fait préférée environ 1/16. La solution aqueuse comprend de préférence de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent, de préférence un sel de sodium ou un sel de potassium et de manière tout à fait préférée le chlorure de potassium, le lactate de sodium et/ou le chlorure de sodium. On préfère une concentration en sel d'un cation monovalent de 6 à 10 g/l et de manière tout à fait préférée d'environ 9 g/l. Lorsque la solution aqueuse comprend de 50 à 100 g/l d'un hexose et de préférence environ 50 g/l, il s'agit notamment de glucose et de mannose. En outre, la solution aqueuse peut comprendre d'autres composés, tels qu'un sel de calcium, par exemple du chlorure de calcium. La suspension ainsi diluée permet de générer un aérosol dont la stabilité particulière au niveau du tractus respiratoire est suffisante pour permettre le passage du virus. Bien entendu, il est possible d'obtenir une suspension virale correspondante par une autre séquence de manipulation. La nébulisation de la suspension diluée peut être réalisée par une pression de gaz ou par des ultrasons. Les conditions de cette nébulisation constituent également des paramètres critiques de mise en oeuvre du procédé. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, la suspension diluée est soumise à une pression de gaz de 0,5 à 3,5 bars, et de manière tout à fait préférée de 2 à 3,5 bars. D'une manière alternative, elle peut également être soumise à une fréquence ultrasonore de 2 à 5 MHz et, de préférence, environ 2 à 3 MHz. La pression gazeuse ainsi que la fréquence ultrasonore peuvent être appliquées au moyen d'un nébuliseur. D'une manière générale, un nébuliseur est un appareil permettant l'administration des aérosols. Les nébuliseurs peuvent être de type quelconque et leurs structures sont connues de l'homme de métier et ces appareils sont disponibles commercialement. Lorsqu'il s'agit d'appliquer une pression gazeuse, on met en oeuvre, de préférence, un nébuliseur de type pneumatique relié soit à une source de gaz comprimé, comme l'air ou l'oxygène médical, soit à une pompe pneumatique. S'agissant de nébuliser une suspension virale diluée avec une fréquence ultrasonore, on préfère utiliser un nébuliseur de type ultrasonique, lequel est pourvu d'un quartz vibrant à haute fréquence. Le procédé selon l'invention est tout particulièrement adapté à la préparation d'un aérosol destiné à des fins thérapeutiques, pour délivrer une quantité optimale de particules virales au niveau des voies trachéobronchiques du tractus respiratoire. D'une manière générale, chez l'homme, le tractus respiratoire est composé de trois régions disctinctes - la partie supérieure qui s'étend du nez jusqu'au sommet de la trachée - Les voies trachéo-bronchiques qui vont du haut de la trachée jusqu'aux bronchioles terminales ; et - la région alvéolaire qui s'étend des bronchioles aux sacs alvéolaires. Parmi les maladies pouvant être traitées en mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut citer les maladies pulmonaires touchant les voies trachéo-bronchiques et notamment la mucoviscidose, l'emphysème pulmonaire, l'asthme et le cancer du poumon. Dans ce contexte, les virus qu'il serait intéressant de délivrer par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont de préférence des virus recombinants dont le génome comprend un fragment d'ADN codant pour une protéine hétérologue capable notamment d'inhiber, ralentir la progression d'une maladie pulmonaire ou empêcher son établissement. Parmi les protéines hétérologues, on peut citer celles qui sont capables - de participer directement ou indirectement au transport des ions à travers les membranes cellulaires, et plus spécifiquement au transport des ions chlorure (CI-) ou sodium (Na+), comme la protéine CFTR (Riordan et al., Science, 245, 1066-1073); - de réduire l'activité des protéases présentes dans les poumons, notamment dans des conditions inflammatoires, comme I'alAT native (Long et al., 1984, Biochemistry, 23. 4828-4837) ou modifiée (Jallat et al., 1986, Protein Engineering, 1, 29-35); et - d'inhiber la croissance des cellules tumorales en renforçant l'immunité cellulaire, comme les interleukines (IL), les interférons (IFN) ou les facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et en ayant une activité suppressive de tumeur comme la protéine p53 (Baker et al., 1989, Science, 244 217-221) ou Rb (Friend et al., 1986, Nature, 323, 643 646). Cette liste n'est pas limitative. Des fragments d'ADN codant pour d'autres protéines décrites dans la littérature pour leur effet anti-tumoral ou leur effet inhibiteur à l'égard de la destruction des tissus pulmonaires peuvent être utilisés. Enfin, la présente invention a également trait à une méthode de traitement de maladies des voies respiratoires, notamment des maladies pulmonaires chez l'homme, selon laquelle on administre par inhalation, dans la cavité nasale ou buccale d'un patient ayant besoin d'un tel traitement, un aérosol préparé selon le procédé selon lequel (a) on prépare une suspension virale diluée correspondant à la dilution d'une suspension virale contenant de 104 à 1013 ufp de virus dans une solution aqueuse contenant au moins de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent ou de 50 à 100 g/l d'un hexose; (b) on nébulise la suspension virale diluée avec une pression de gaz de 0,5 à 3,5 bars ou une fréquence ultrasonore de 2 à 5 MHz. L'inhalation peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. L'invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants MENPLE 1 : Préparation d'un aérosol à partir d'une suspension virale conservée en présence de glvcérol 10 % et diluée dans une solution de cation monovalent Une suspension virale est constituée à partir d'un adénovirus recombinant dans le génome duquel est inséré le gène humain codant pour la protéine CFTR (Ad-CFTR) tel que décrit dans Rosenfeld et al. (1992, supra). Brièvement, il dérive de l'adénovirus de type 5, dont le génome est dépourvu, d'une part du gène E1A codant pour une protéine transactivatrice essentielle à la réplication de l'adénovirus et, d'autre part, du gène E3 non-essentiel. Le gène CFTR est inséré à la place du gène E1A. L'Ad-CFTR est propagé au moyen de la lignée 293 de cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 9, 59-72) qui exprime la fonction El de façon constitutive. Cette lignée est disponible à l'ATCC (CRL 1573). Les cellules 293 sont cultivées selon les recommandations du fournisseur. Les cellules en culture sont infectées avant confluence par un inoculum initial de virus Ad-CFTR et selon une multiplicité d'infection (m.o.i.) de 2 à 10. On les incube à 37"C, et dès que l'on observe des effets cytopathiques, normalement après 4 à 10 jours de culture, les virus sont récoltés selon le protocole suivant. On centrifuge la suspension cellulaire à basse vitesse pendant 10 minutes. Le culot cellulaire est resuspendu dans environ 10 ml de milieu GMEM (Glasgow Modified Eagle Medium, Gibco BRL, Cergy-Pontoise) additionné de 2 % de sérum de veau foetal. Les virus sont séparés des cellules par plusieurs cycles de congélation/décongélation successifs dans un bain d'éthanolglace carbonique/bain-marie à 37"C. A la suite du dernier cycle, on élimine les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse pendant 5 à 10 minutes. On purifie les virus à partir du surnageant de centrifugation, par fractionnement sur un gradient de chlorure de césium à deux étages de densité 1,40 et 1,25 g/ml respectivement. On centrifuge à 100 000 g pendant quelques heures à température ambiante. Les virus apparaissent sous forme d'une bande blanche située à l'interface des deux étages et sont récupérés à l'aide d'une seringue. Ils sont soumis à une deuxième purification sur gradient de chlorure de césium auto-formé préparé à l'aide d'une solution à 1,33 g/ml. Les virus sont également récupérés par ponction du tube avec une seringue et 1/10 du volume en glycérol est ajouté. On élimine le chlorure de césium par dialyse contre un tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM et glycérol 10 9 & Le titre de la suspension virale ainsi obtenue est précisément déterminé selon la méthode du titrage en agar ou à 30 h (Graham et Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, I, 109-128, ed. EJ. Murray, The Human Press Inc. Clinton, NJ). La suspension est répartie dans des tubes (Nunc ou Nalgène) en aliquote de 100 ctl, de manière à contenir chacun 5x109 à 5x1010 upf. Ces tubes qui constituent le stock de la suspension virale, sont entreposés à -60 C jusqu'à leur utilisation. Au moment de l'utilisation, on ajoute 100 Fl de la suspension d'Ad-CFTR à 1,5 ml d'une solution de chlorure de sodium à 9 g/l (Meram, Melun). Les contrôles effectués montrent que le titre de la suspension virale diluée ainsi obtenue est stable plusieurs heures à température ambiante. On génère un aérosol en plaçant la suspension virale diluée dans le réservoir d'un nébuliseur Optineb 709 (Air Liquide, Paris). Il s'agit d'un appareil à génération pneumatique fonctionnant sous haute pression et offrant le choix du gaz vecteur. Il est relié à une source d'air comprimé et on applique une pression en air médical à 3,5 bars. EXEMPLE 2 : Préparation d'un aérosol à partir d'une suspension virale conservée en présence de saccharose 1M et diluée dans une solution de cation monovalent L'exemple 1 est répété avec la variante suivante Après récupération des virus après le deuxième gradient de chlorure de césium, ceux-ci sont dialysés contre un tampon Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM et saccharose 1 M. EXEMPLE 3 : PréDaration d'un aérosol à pardi d'une suspension virale diluée dans une solution de glucose L'exemple 1 est répété avec la variante suivante On constitue une suspension virale diluée en ajoutant 100 ctl de la suspension virale, à 1,5 ml d'une solution de glucose à 50 g/l (Laboratoire Chaix du Marais Lavoisier, Paris). EXEMPLE 4: Préparation d'un aérosol par vibration ultrasonique L'exemple 1 est répété avec la variante suivante On génère un aérosol en mettant en oeuvre un nébuliseur ultrasonique SAM LS (System Assistance Medical, Le Lédat, France), utilisé selon les recommandations du fournisseur. La suspension virale diluée obtenue selon l'exemple 1, est déposée dans la coupelle du nébuliseur et on la soumet à une vibration ultrasonique provoquée par un quartz vibrant à une fréquence de 2,4 MHi EXEMPLE 5: Méthode de traitement de la mucoviscidose L'exemple 1 est répété avec les variantes suivantes On génère un aérosol en plaçant la suspension virale diluée de l'exemple 1 dans le réservoir de l'Optineb 709. Après avoir prélevé 100 1ll, on relie l'appareil à une source d'air médical. On place l'embout buccal de l'appareil dans la bouche d'un patient atteint de mucoviscidose et on applique une pression gazeuse de 3,5 bars (première nébulisation). C'est l'inspiration du patient qui déclenche la nébulisation de l'aérosol dans les voies respiratoires. La nébulisation cesse avant le début de la phase expiratoire ; ce qui permet d'éviter la perte de matériel et le rejet de l'aérosol dans l'environnement. On règle les doses d'aérosol délivrées à chaque inspiration en fonction des capacités respiratoires du patient. Pour un nourrisson, qui a un rythme respiratoire de 30 à 40 cycles/minute, la quantité moyenne administrée par bouffée doit être de 1,8 pl. Pour un enfant, dont la fréquence respiratoire de 20 à 25 cycles/minute, on administre à chaque bouffée une dose de 3,2 rl. Enfin, pour un adulte, qui a en moyenne un rythme respiratoire de 15 à 20 cycles/minute, on administre à chaque bouffée un volume de 5 pl de l'aérosol. Selon ces critères, on délivre à un adulte 160 bouffées de l'aérosol permettant de nébuliser un volume correspondant à environ la moitié de la solution virale diluée de départ. Peu après cette première série d'inhalations, on ajoute dans le réservoir du nébuliseur 900 ,ul de la solution de chlorure de sodium à 9 g/l. Comme précédemment, on applique une pression gazeuse de 3,5 bars et on effectue une deuxième série d'inhalations comportant également 160 bouffées. Enfin, on effectue une troisième série dans les mêmes conditions, après avoir déposé dans le réservoir de l'appareil 900 ctl de la solution de chlorure de sodium à 9 g/l. REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'un aérosol viral permettant notamment son administration par les voies aériennes d'un mammifère, caractérisé en ce que: (a) on prépare une suspension virale diluée correspondant à la dilution d'une suspension virale contenant de 104 à 1013 ufp de virus dans une solution aqueuse contenant au moins de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent ou de 50 à 100 g/l d'un hexose ; et (b) on nébulise la suspension virale diluée avec une pression de gaz de 0,5 à 3,5 bars ou une fréquence ultrasonore de 2 à 5 MHz. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on nébulise la suspension virale diluée avec une pression de gaz de 0,5 à 3,5 bars. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on nébulise la suspension virale diluée avec une pression de gaz de 2 à 3,5 bars. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on nébulise ladite suspension virale diluée avec une fréquence ultrasonore de 2 à 5 MHz 5) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 4, caractérisé en ce qu'on nébulise la suspension virale diluée avec une fréquence ultrasonore de 2 à 3 MHz. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la suspension virale est une suspension d'un virus associé aux adénovirus ou d'un adénovirus recombinant. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite dilution est effectuée selon un rapport en volume suspension virale/solution aqueuse de 1/5 à 1/20. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite dilution est effectuée selon un rapport en volume suspension virale/solution aqueuse de 1/10 à 1/20. 9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite dilution est effectuée selon un rapport en volume suspension virale/solution aqueuse de 1/12 à 1/18. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale comprenant de 104 à 1013 ufp de virus dans une solution aqueuse comprenant de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale dans une solution aqueuse comprenant de 6 à 12 g/l d'un sel d'un cation monovalent sélectionné parmi le chlorure de sodium et le chlorure de potassium. 12) Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale dans une solution aqueuse comprenant environ 9 g/l d'un sel d'un cation monovalent. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale comprenant de 104à 1013 ufp de virus dans une solution aqueuse comprenant de 50 à 100 g/l d'un hexose. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale dans une solution aqueuse comprenant de 50 à 100 g/l d'un hexose sélectionné parmi le glucose et le mannose. 15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on dilue une suspension virale dans une solution aqueuse comprenant 50 g/l de glucose. 16) Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la suspension virale est une suspension d'un virus recombinant dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour une protéine hétérologue à ce virus. 17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la suspension virale est une suspension d'un virus recombinant dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour la protéine CFTR. 18) Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la suspension virale comprend de 106 à 1012 ufp de virus. 19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la suspension virale comprend de 108 à 1011 ufp de virus. 20) Aérosol obtenu en mettant en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 19.