FR 2724664 A1 19960322 FR 9411188 A 19940920 Souche bactérienne inhibitrice d'une bactérie Listeria dans le munster L'invention concerne une souche bactérienne inhibant différentes espèces du genre Listeria dont l'espèce pathogène Listeria monocytoqenes. La souche peut être utilisée en phase de production des fromages à pâte molle, notamment le munster. Etat de la technique La prévention de la contamination des produits laitiers par Listeria monocytcnenes, notamment des fromages à pâte molle, se pose avec une acuité particulière. En effet, plusieurs épidémies de listériose avaient comme origine la consommation de produits laitiers. Les fromages à pâte molle constituent un excellent milieu de culture. Par ailleurs, leur technologie de faorication et d'affinage est favorable au développement du germe pathogène. L'élimination de Listeria monocvtoqenes de la chaîne alimentaire est délicate du fait de son ubiquité et de sa résistance à des conditions hostiles (développement à la température de réfrigération, dans les milieux salés, tolérance d'une gamme de pH large). Dans les produits laitiers, dont les fromages, les bactéries lactiques sont capables d'inhiber le développement de microorganismes indésirables par la production d'acides organiques, de peroxyde d'hydrogène ou par la production de substances antibactériennes telles que les bactériocines. Ces substances antibactériennes, qui sont habituellement de nature protéique, ont tendance à montrer une activité bactéricide contre un éventail assez limité de bactéries proches de la bactérie productrice. Initialement détectée chez Escherichia coli puis chez des bactéries Gram+, ieurs propriétés biochimiques, poids moléculaires, spectres d'activité, modes d'action et supports génétiques peuvent être très hétérogènes. Leur utilisation dans les produits alimentaires nécessite une demande d'autorisation (réglementation en vigueur). Résumé de l'invention L'invention concerne une souche bactérienne provenant d'un fromage à pâte molle et croûte lavée, le munster. La souche bactérienne de l'invention inhibe différentes souches du genre Listeria, plus particuliérement Listeria monocvtoaenes 112a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d et V7, Listeria innocua 6a et 6b, Listeria seeliqeri et Listeria ivanovii. Plus particulièrement, la souche bactérienne selon l'invention est une souche bactérienne Lactobacillus brevis telle que la souche déposée au DSM le 21 juillet 1994 portant le numéro d'accession DSM 9296, caractérisée par une activité inhibitrice de type bactériolytique vis-à- vis de toutes les souches du genre Listeria étudiées. La présente invention concerne également un extrait de culture d'une souche bactérienne Lactobacillus brevis présentant une activité inhibitrice envers une bactérie Listeria. Plus particulièrement, le type de bactérie Listeria inhibé par l'extrait de culture de la présente invention est parmi le groupe mentionné plus haut. Encore plus particulièrement, l'extrait de culture selon la présente invention est caractérisé par une activité inhibitrice bactéricide. La présente invention concerne également l'utilisation de la souche bactérienne, de l'extrait de culture mentionnée précédemment et de la bactériocine dans la production de fromages, particulièrement le fromage à pâte molle, plus particulièrement le munster. De plus, la présente invention concerne une méthode d'application, en cours d'affinage, d'une suspension comprenant la souche de l'invention inhibitrice de Listeria monocytogenes par la production d'une bactériocine caractérisée ou encore d'une suspension comprenant la bactériocine. La présente invention est le résultat de travaux de recherches sur la prévention du germe pathogène dans un fromage à pâte molle et croûte lavée, le munster. Lors de ces travaux, il a été observé que les munsters fermiers (fabriqués au lait cru et à la ferme), étaient trés peu contaminés par rapport aux autres types de fromages (fabriqués en fromagerie, au lait pasteurisé ou au lait cru) tout en subissant les mêmes conditions d'affinage. A la suite de ces observations, une flore naturelle de la croûte d'un munster fermier a été analysée et une bactérie inhibitrice de Listeria a été isolée et caractérisée. Le comportement de Listeria monocytopenes en présence de la souche bactérienne isolée a été étudié dans un milieu de culture et dans un fromage artificiellement contaminé. Ces études ont ensuite été validées dans des conditions réelles et à l'échelle semi-industrielle. II a été déterminé que la souche isolée produit, dans les conditions nécessaires à son développement, une substance bactériocine anti-Listeria . La suite de l'exposé sera faite par référence aux figures cijointes, et dont les légendes suivent: - Figure 1: spectre d'activité de la bactériocine produite par la souche bactérienne (BN85) de l'invention, - Figure 2 absorbance (D.0650nm) de culture bactérienne de Listeria monocytoaenes en présence de la substance inhibitrice produite par une souche bactérienne de l'invention - Figure 3 prolifération de cellules Listeria monocvtonenes en présence ou en l'absence de la substance inhibitrice produite par la souche de l'invention (BN85), - Figure 4 étude de l'adsorption de la bactériocine produite par la souche de l'invention (BN85) sur des cellules bactériennes sensibles et non sensibles à cette bactériocine;; - Figure 5 sensibilité de la bactériocine produite par la souche de l'invention (BN85) à différentes enzymes; - Figure 6 sensibilité de la bactériocine produite par la souche bactérienne de l'invention (BN85) à différents traitements thermiques; - Figure 7 comportement de Listeria monocvtoqenes en présence de la souche bactérienne de l'invention (BN85) à 37 C; - Figure 8 comportement de Listeria monocvtoaenes en présence d'une souche bactérienne Lactobacillus brevis non productrice de bactériocines.. Descrintion détaillée de l'invention La présente invention conceme une souche bactérienne provenant d'un fromage à pâte molle, le munster, inhibant Listeria monocvtopenes. Plus particulièrement, la souche bactérienne de l'invention est une Lactobacillus brevis (BN85). Les techniques utilisées pour isoler la souche inhibitrice ainsi que ses caractéristiques et celles de la substance inhibitrice qu'elle secrète sont discutées de façon plus détaillée dessous. Isolement de la souche bactérienne Productrice de bactériocine La méthode d'isolement de la souche développée dans le contexte de la présente invention a permis d'isoler une souche bactérienne possédant des propriétés inhibitrices envers Listeria monocvtoaenes. Les principales étapes d'isolement de cette souche sont décrites en détail cidessous. Source d'isolement de la souche inhibitrice de l'invention Plusieurs types de bactéries, notamment les bactéries lactiques sont utilisées comme agents transformants pour le lait et autres produits alimentaires où elles ont plusieurs rôles technologiques. Elles participent à la formation d'odeurs, de flaveurs et des qualités rhéologiques des fromages et des laits fermentés. Elles ont également un rôle hygiénique en synthétisant une variété de composés inhibiteurs qui préviennent le développement de bactéries indésirables ou pathogénes. Dans beaucoup de cas, I'inhibition est due à la formation d'acides organiques ou de peroxyde d'hydrogène ou à une baisse de pH. L'échantillon à partir duquel les souches sont isolées peut varier considérablement. Par exemple, les souches peuvent être isolées de produits carnés ou encore de produits laitiers. Plus particuliérement, la souche inhibitrice de l'invention est isolée à partir d'un fromage à pâte molle et croûte lavée, notamment de type munster, particulièrement à partir de fromages à pâte molle fabriqués au lait cru. Cette souche produit une substance antibactérienne qui a été identifiée comme étant une bactériocine, inhibitrice de Listeria monocytopenes. L'échantillon à partir duquel des étapes subséquentes d'isolement de la souche peuvent être réalisées est obtenu par la dilution et le broyage d'un échantillon constitué par un fromage à pâte molle, le munster, dans un milieu de culture non sélectif. Le milieu de culture non sélectif est le milieu TSL (Tryptone Soja Levure) sous forme de bouillon. Afin d'obtenir un broyat , les proportions relatives d'échantillon par rapport au milieu de culture sont relativement faibles. L'échantillon représente 15% en poids du broyat. Méthode de détection des souches inhibitrices de Listeria monocvtoaenes par production de substance type bactériocine A partir des échantillons de broyat précédemment préparés, un nombre de dilutions décimales variant entre 5 et 8, particulièrement dans du trypone sel (TS) est effectué. Des boîtes de Pétri contenant des milieux de culture sélectifs sont ensemencés à partir de ces dilutions. Par exemple, pour chaque dilution décimale, 0,1 ml d'échantillons sont étalés en surface d'une boite de Pétri ayant un diamètre de 8 cm. Le milieu sélectif utilisé dépendra du type de bactérie à isoler. Le choix de ce milieu fait partie des connaissances de la personne versée dans l'art. Dans le cas de l'isolement des souches de Lactobacillus, le milieu MRS (Man Rogosa Sharp) est choisi. Après l'étalement sur le milieu, les boîtes de Pétri sont incubées pour une période de temps pouvant varier entre 18 et 24 h à une température de 37"C. Les boîtes de Pétri présentant des colonies individualisées, sont soumises au test de l'antagonisme non spécifique (inhibition due à différentes causes production d'acides organiques, ...) Les colonies sont couvertes d'une gélose (v = 10 ml), Lactobacilli agar (A.O.A.C.) ensemencée de Listeria monocvtonenes à une concentration de 106 à 107 UFC/ml. L'incubation à une température près de la température de croissance optimale de la bactérie indésirable (37"C environ dans le cas de Listeria) se poursuit pour une période de temps pouvant varier entre 12 et 24 heures. Les souches sont sélectionnées à partir des boîtes en double couche. Les colonies qui présentent des halos d'inhibition importants et qui sont nettement individualisées sont repiquées et isolées sur milieu gélosé MRS et incubées de nouveau pendant une période variant de 18 à 24 heures à la température de 37"C. Les souches sont purifiées par repiquages successifs sur le même milieu MRS aux mêmes conditions d'incubation. Elles sont ensuite ensemencées dans un bouillon MRS, puis incubées 18 à 24 h à 37"C. Les cultures obtenues sont centrifugées (5000 tourslmn), neutralisées (pH6), filtrées (0,45 pm). Le produit obtenu est l'extrait de culture. Par la méthode des puits en gélose, l'activité des extraits de culture obtenus est testée. 70 pI d'extraits sont déposés dans un puits creusé dans une gélose comprenant une couche inférieure de MRS et une couche supérieure de gélose Lactobacilli agar (AOAC) contenant 106 à 107 UFC de Listeria monocytopenes, et incubée entre 18 à 24 heures à 37"C. La mesure de l'activité des extraits de culture est révélée par la zone d'inhibition observée. Pour une activité acceptable, la zone d'inhibition devrait normalement être visible (diamètre 1 mm). La zone d'inhibition observée pour Lactobacillus brevis varie entre 12 et 20 mm. Caractéristiques des bactériocines De façon générale, les bactériocines possèdent les propriétés suivantes 1/ un spectre d'action habituellement étroit contre d'autres souches bactériennes, proche de la bactérie productrice. 21 une partie essentielle protéique biologiquement active, 3/ une activité bactéricide etlou bactériolytique; 4/ l'adsorption à des récepteurs spécifiques sur les cellules; 5/ des gènes pour la production des bactériocines et l'immunité des bactéries productrices généralement portées par des plasmides. Certaines bactéries lactiques produisent des bactériocines actives contre des flores lactiques. Ce type de bactériocine, qui agit donc contre des bactéries taxonomiquement proches de la bactérie productrice, favoriserait la croissance d'une souche bactérienne en compétition avec la flore naturelle. Cependant, les bactériocines produites par des bactériens lactiques peuvent également présenter des spectres d'activité qui ne sont pas toujours confinés aux espèces du même genre ou aux bactéries de la même espèce. On parle alors de bactériocines à spectre d'activité relativement large contre les bactéries GRAM+. Ces bactéries peuvent également avoir l'avantage de combattre certaines flores pathogènes. C'est ce deuxième type de bactériocines qui est produit par la souche bactérienne isolée dans le contexte de la présente invention. L'action des bactériocines est un processus en deux étapes. La première étape correspond à l'adsorption des bactériocines sur des récepteurs spécifiques ou non spécifiques se trouvant sur les enveloppes cellulaires de la cellule hôte. A ce stade, les bactériocines sont sensibles aux protéases. C'est donc une étape encore réversible. La seconde étape est irréversible. Elle entraîne des lésions pathologiques léthales dans les cellules sensibles. Ce phénomène a été décrit pour les bactéries GRAM* productrices de bactériocines et il semble applicable à la bactériocine produite par la souche de la présente invention. Les bactériocines sont un groupe de substances caractérisées par une assez grande hétérogénéité du point de vue des compositions et structures chimiques. II peut en effet s'agir de peptides, de protéines, ou de complexes protéiques avec des résidus lanthionines ou des méthyl-lanthionines et parfois des groupements lipidiques ou glucidiques. Dans le cas des bactériocines des bactéries lactiques, il semble qu'il existe trois principaux types de molécules: 1/ Lantibiotiques peptides à faible poids moléculaire (habituellement un nombre inférieur à 50 acides aminés) contenant une lanthionine. 2/ Peptides à faible poids moléculaire sans lanthionine. 3/ Peptides à poids moléculaire variant entre 10 000 et 45 000 Daltons. Une fois la substance présentant les caractéristiques d'une bactériocine isolée, la détermination de sa structure chimique fait partie des connaissances générales de l'homme de métier. Par exemple, en se basant sur le fait que des bactériocines sont habituellement des molécules d'assez petite taille, on peut déterminer leur structure chimique par des méthodes telles la spectrométrie de masse, l'hydrolyse enzymatique, le couplage chromatographie-spectrométrie de masse ou encore l'utilisation de séquençeurs de protéine. La plupart des bactériocines semblent sensibles à une protéase comme la pepsine, la trypsine ou l'achymotrypsine. Cette sensibilité aux enzymes protéolytiques ou protéiques du métabolisme humain est intéressante car l'ingestion des bactériocines n'altérera donc pas 'écosystème du tractus gastro-intestinal et ne causera pas de risques, au contraire des antibiotiques communs. La bactériocine produite par la souche Lactobacillus brevis isolée dans le contexte de la présente invention présente l'avantage d'être sensible à plus d'ur type de protéase, par exemple, à une enzyme protéolytique d'origine gastrique. La bactériocine sensible à différents types de protéase est donc particulièrement préférée dans le contexte de la présente invention. La bactériocine produite par la souche bactérienne de la présente invention présente une thermorésistance élevée. En fait, non seulement cette bactériocine tolère-t-elle des températures d'au moins 1 000C pendant 15 minutes et est donc résistante à des traitements thermiques tels que la pasteurisation du lait, mais cette substance peut également subir des traitements thermiques allant jusqu'à 1200C sans subir une altération substantielle de ses propriétés inhibitrices. Par exemple, la bactériocine produite par Lactobacillus brevis conserve environ 70% de ses propriétés inhibitrices après avoir subi un traitement thermique à 121"C pendant 15 minutes. Généralement, les gènes de production des bactériocines et de résistance semblent situés sur des plasmides. II s'agit donc de caractères transmissibles par conjugaison. Le fait que les gènes de production et de résistance soient transmissibles est à la fois un avantage et un inconvénient. L'avantage réside dans le fait que le caractère production de bactériocines peut être transmis à d'autres bactéries plus intéressantes, les bactéries productrices étant résistantes à leur propre bactériocine. En revanche, I'inconvénient se manifeste au niveau de la stabilité des deux caractères (production et résistance) et de la possibilité de transmission de la résistance à d'autres bactéries indésirables présentes dans le milieu.Ceci est important si l'innocuité du produit alimentaire dépend de la production de bactériocine pour éliminer des flores pathogènes ou d'altération. La bactériocine produite par la souche L. Brevis de la présente invention présente la même séquence que la pédiocine décrite par Motlagh et al dans (1992) Letters in Applied Microbiology 15, 4548. Deux hypothèses peuvent expliquer ceci: 1/ II serait probable que le gène codant la bactériocine produite par la souche Lactobacillus brevis isolée ait été transmis naturellement à cette souche par conjugaison à la souche Pediococcus acidilactici H décrite par Motlagh et al. ou encore 21 Ce sont deux bactériocines identiques sécrétées par 2 souches différentes. Cette hypothèse s' appuie sur le fait que le plasmide contenant le gène responsable de la production de la bactériocine n'a pas la même taille, dans la souche Pediococcus acidilactici H que dans la souche L. brevis. Biosynthèse de bacténocines et conditions de production maximale De façon générale, la synthèse des bactériocines est maximale pendant ou à la fin de la phase exponentielle de croissance. Généralement, la bactériocine est un produit d'excrétion cellulaire. Une partie de l'activité antimicrobienne peut cependant dans certains cas être retenue dans la cellule. II existe une corrélation entre la production de bactériocine et la quantité de biomasse. Une production optimale peut être obtenue en supplémentant un milieu de culture donné de facteurs limitants tels que sucre, vitamines ou sources d'azote, en régulant la culture à un pH donné ou en choisissant le milieu de culture le plus adapté. Le milieu de culture doit bien sûr correspondre au mieux aux exigences de la bactérie productrice, et ceci peut être déterminé par la personne versée dans l'art. Par exemple, le milieu MRS semble un milieu de choix pour la production de bactéries inhibitrices de Listeria. Le pH initial du milieu a également un effet sur la production et la stabilité de la bactériocine. De façon générale, le pH de la solution est préférablement autour de 7.0 pour Lactobacillus brevis. Application des bacténocines à l'alimentation Les bactériocines sont principalement utilisées pour leur fonction d'agents antimicrobiens contre le développement des microorganismes pathogènes ou de détérioration. Les bactériocines peuvent être introduites de diverses façons dans les aliments 1/ Dans les produits carnés (fermentation lactique), les bactériocines peuvent être présentes en raison de la croissance de bactéries lactiques productrices. 21 Les bactériocines peuvent être purifiées, concentrées et additionnées directement comme un additif alimentaire. Pour être efficace comme conservateur, une bactériocine doit préférablement posséder un ou plusieurs des caractères suivants: - non toxique, - stable et hautement active, - un spectre d'activité large ou étroit en fonction de l'objectif recherché, - ne doit pas affecter les qualités sensorielles du produit, - peu chère et simple à utiliser. Dans le contexte de la présente invention, la souche inhibitrice de Listeria monocvtoaenes isolée à partir du munster s'est révélée facile à utiliser dans le fromage, car stable, hautement active vis-àvis du germe pathogène, sans affecter les qualités organoleptiques du munster. Application de bactériocines dans les produites laitiers L'utilisation de bactériocines produites par la souche de l'invention ou l'utilisation de la souche d'invention dans les fromages en cours d'affinage prévient la présence de bactéries pathogènes par l'intermédiaire de l'environnement extérieur par exemple dans le lait des vaches laitières ou dans le fromage par une post-contamination lors de la fabrication et l'affinage. On a d'abord cru qu'il était préférable, lors de la fabrication de fromage, d'ajouter des souches productrices de substances inhibitrices de Listeria directement au caillé lors de sa préparation. Cependant, I'état de la technique a démontré que cette approche avait ses limites, car elle posait notamment des problèmes au niveau de la diffusion de la bactériocine dans le caillé et fonctionnait de façon inégale, dépendant en partie du type de fromage fabriqué et du stade de la fabrication.Les inventeurs ont découvert que dans le cadre de la production de fromages à pâte molle tel le munster, la protection contre Listeria monocvtoaenes pouvait être effectuée efficacement en introduisant la souche de l'invention dans les solutions de lavage ou pulvérisation utilisées lors de l'affinage des fromages Exemple 1. Isolement de la souche inhibitrice de Listeria monocvtoaenes Détection de l'antagonisme spécifique Souches bactériennes Le stock de la collection de cultures bactériennes d'A.E.R.l.A.L. (Analyses, Etudes et Recherches pour l'lndustrie Alimentaire, Centre régional d'innovation et de transfert de technologie, Schiltigheim, France) est maintenu à 40C dans 30% de glycérol et 70% de bouillon coeur cervelle (BHI, oxoïd). Sont effectués à partir des cultures de cette collection, des repiquages sur milieux gélosés ou TSLA (Trypcase Soja Levure Agar). Les cultures bactériennes utilisées dans l'étude expérimentale sont stockées à +4"C. Celles-ci sont réactivées par repiquage en bouillon et incubées à +30"C pendant 24 heures pour chaque expérimentation ultérieure. Souches indicatrices (souches sur lesquelles est testée l'action inhibitrice) Elles proviennent de la collection d'A.E.R.I.A.L.: - Staphylococcus aureus - Lactococcus lactis - Brevibacterium linens - Escherichia coli - Salmonella typhimurium - Salmonella infantis - Les souches de Listeria appartenant à différentes espèces et serotypes * Listeria monocytogenes 112a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d et V7 Listeria innocua 6a et 6b * Listeria seeligeri * Listeria ivanovii Ces souches ont été isolées à partir de plusieurs aliments (fromages, lait cru, poulet) dans le laboratoire d'A.E.R.l.A.L. Souche test non productrice de bactériocine Cette souche sera reconnue sous la nomenclature Lactobacillus brevis non productrice de bactériocine. Elle fait partie de la collection de cultures bactériennes d'A.E.R.l.A.L. Elle est utilisée comme témoin négatif dans les tests de production de bactériocine. Toutes ces souches sont conservées sur gélose TSLA à +4"C pour la suite de l'étude. Milieux de culture Lors de la recherche de souches inhibitrices, les milieux sélectifs utilisés sont les milieux MRS (MAN ROGOSA and SHARPE Agar) M17 et le milieu non sélectif TSLA. Le milieu OXFORD sert à la numération de Listeria. Lors de l'étude de l'antagonisme spécifique et non spécifique, le milieu AOAC est utilisé en double couche AOAC/MRS. Détection de souches inhibitrices : SCREENING Le but du SCREENING est d'isoler à partir de fromages à pâte molle, des bactéries qui présentent une activité antagoniste contre les espèces de Listeria par la production de bactériocine. Préparation des échantillons La préparation des échantillons consiste à prélever stérilement 10 grammes de fromage à pâte molle le munster et à les diluer dans 90 millilitres de TSL dans un sac stomacher. Après broyage (2 minutes au stomacher), les échantillons sont transvasés stérilement dans des flacons. Détection de l'Antagonisme Non Spécifique : A.N.S. A partir des flacons précédemment préparés, sont effectués plusieurs dilutions décimales dans du TS (Tryptone sel). Les boîtes de Pétri avec les milieux M17, MRS, ELLIKER et OXFORD sont inoculés à partir des dilutions. Après étalement sur les milieux, les boîtes de Pétri sont incubées 24 heures à 30"C, sauf les milieux OXFORD qui sont incubés 24 heures à 37"C (température optimale de pousse de Listeria). Méthode de la double couche pour la détection de l'A,N.S. (Antagonisme non spécifique) Elle consiste à couler sur les milieux TSLA, MRS et M17 qui présentent des colonies (100 colonies individualisées au maximum) une couche d'AOAC (10 millilitres environ) ensemencée à 1% d'une culture de Listeria monocytopenes dans un bouillon ELLIKER (culture de 24 heures 37"C avec 108 UFC/ml) de façon à avoir 106 UFC (Unités Formant Colonies)/ml dans la couche d'AOAC. Listeria monocvtoaenes est la bactérie indicatrice pour la diffusion et la révélation d'une éventuelle substance inhibitrice. Toutes les boîtes sont incubées 24 heures à 37 C. Les souches sont sélectionnées à partir des boîtes en double couche. Celles qui présentent des halos d'inhibition importants et qui sont nettement individualisées, sont repiquées au fil droit une à une et isolées chacune sur une boîte de Pétri sur les milieux MRS, M17, Elliker et incubées 24 heures à 37"C. Sur un total de 30 fromages testés, I'A.N.S. a permis de détecter 222 souches qui présentaient des zones d'inhibition claires autour des colonies. Cette inhibition non spécifique est souvent due à une acidification du milieu par la production d'acide lactique ou d'acide acétique, ou autre. C'est le cas le plus général. Elle peut être aussi due à une production du peroxyde d'hydrogène. Cette possibilité reste peu probable étant donné que la bactérie indicatrice : Listeria monocytopenes est productrice de catalase. II peut s'agir également de la libération d'un bactériophage par la bactérie inhibitrice ou finalement de la production d'antibiotiques ou de bactériocines. Détection de l'Antagonisme Spécifique (A.S.) II permet d'éliminer toutes les autres possibilités d'inhibition pour ne garder qu'un type d'antagonisme spécifique aux bactériocines et antibiotiques. Après l'incubation de 24 heures à 37"C, les colonies obtenues sont raclées à l'ôse, repiquées dans des tubes de 30 millilitres de MRS et incubées 24 heures à 37"C. II y aura production éventuelle d'une substance inhibitrice. Les tubes contenant les cultures bactériennes sont centrifugés à 5000 tours/min. pendant 10 minutes. On prélève le surnageant, celui-ci est neutralisé à pH 7 avec de la soude 1N puis filtré (c'est-à-dire stérilisé avec un filtre CML 0,45 micromètres). On obtient des extraits de culture ou S.C.N.F. (Solution Centrifugée, Neutralisée et Filtrée) à tester pour l'A.S. Ces tests, qui sont des tests de diffusion, consistent à recouvrir des boîtes de MRS d'une couche de Lactobacilli agar ensemencée à 1% par Listeria monocytopenes provenant d'une culture de 24 heures à 37"C c'est-à-dire 108 UFC/ml. Des puits sont creusés dans la gélose et remplis de S.C.N.F. (0.007 ml environ). Les boîtes sont ensuite incubées 24 heures à 37"C. La lecture correspond à l'observation de zones d'inhibition éventuelles autour des puits (zones claires dans une nappe de culture de Listeria). Parmi les souches présentant une inhibition non spécifique, I'A.S. a permis de retenir 41 souches présentant toujours une zone d'inhibition claire. L'A.S. est positif , en effet les extraits de cultures centrifugés, neutralisés et filtrés sont actifs contre Listeria monocYtoaenes. 39 des souches isolées ont été identifiées comme étant des souches de Lactobacillus brevis. Cette souche sera reconnue dans cette étude sous la nomenclature BN85. Exemple 2 Caractérisation des substances inhibitrices produites Par la souche de l'invention Mesure de l'activité des substances Cette mesure est en relation avec la zone d'inhibition observée. Elle consiste à mesurer la distance allant du bord du puits jusqu'au point où se termine l'inhibition (fin de la zone d'éclaircissement). On retiendra la distance multipliée par deux, elle correspond au diamètre de ia zone d'inhibition en millimètres. Identification des souches sélectionnées Les souches sélectionnées sont identifiées tout d'abord à l'aide d'un Gram, des tests de la catalase et de l'oxydase, de galeries (API 50 CH avec 50 sucres, API 20 STREP avec 10 sucres et 10 autres substrats différents). Spectre d'activité La bactériocine est testée pour son activité contre différentes souches des genres et espèces de Listeria, de Lactobacillus et d'Enterococcus, contre Staphvlococcus aureus, Brevibacterium linens. Escherichia coli, Salmonella tvphimurium et Salmonella infantis. Ce test s'effectue par diffusion, c'est-à-dire que le milieu MRS est recouvert d'une couche de Lactobacilli Agar (AOAC) ensemencée à 1% de Listeria monocytocienes (culture de 18 à 24 heures à 37"C égale à 108 UFC/ml), des puits sont creusés et remplis d'extrait de culture des deux souches. L'activité est déterminée par mesures des diamètres des différentes zones d'inhibition. L'effet des extraits de culture de la souche BN85 a été testé sur plusieurs bactéries différentes, le spectre d'activité de la bactériocine produite par BN85 est démontré à la figure 1. Les souches utilisées sont des souches de Listeria avec plusieurs espèces: Listeria innocua 6a et 6b (L. in), Listeria ivanovii (L. iv), Listeria seeliperi (L. see) et avec différents sérotypes Listeria monocvtooenes (L.m 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d, V7). En plus des souches Lactococcus lactis (Lc. lac), Brevibacterium linens (B.li), StaPhylococcus aureus (St.au), Escherichia coli (E.coli), Salmonella tvphimurium (S.ty), Salmonella infantis (S.inf), Enterococcus faecium (E.f.), Lactobacillus plantarum (Lb.pl), Lactobacillus rhamnosus (Lb.rh), Lactobacillus curvatus (L.c.). On peut remarquer que l'importance de l'inhibition occasionnée par la substance produite par BN85 dépend du genre de bactéries. Elle dépend aussi de l'espèce de Listeria et même du sérotype à l'intérieur de la même espèce. D'après la figure 1, l'extrait de culture de BN85 est actif contre Listeria monocvtoaenes précisément contre les souches 1/2b; 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d et W , contre Listeria ivanovii, Listeria seeliqeri, Listeria innocua 6a et 6b. Les zones d'inhibition sont comprises entre 12 et 20 millimètres (production optimale). Ceci peut s'expliquer par le fait que la position taxonomique des Listeria est proche de celle des lactobacilles. La bactériocine agit aussi sur les souches Enterococcus faecium et Lactobacillus curvatus avec des diamètres respectifs de 7 et 4 mm. En revanche les bactéries Gram telles que Escherichia coli. Salmonella tvphimurium, Salmonella infantis ne sont pas sensibles à la bactériocine, ainsi que des bactéries Gram+ telles que StaPhvlococcus aureus, Brevibacterium linens, en plus de la souche Lactococcus lactis. Mode d'action L'étude du mode d'action renseigne sur l'effet de la substance inhibitrice, si elle agit par effet bactéricide (en tuant les bactéries), bactériostatique (en arrêtant la croissance des bactéries) ou bactériolytique (en tuant les bactéries et en les lysant) sur la bactérie sensible, Listeria monocytopenes 4a. A cet effet, on réalise, d'une part, à partir d'une culture de 24 heures de Listeria monocytopenes dans T.S.L. à 37"C une dilution au 1/10 dans l'extrait de culture de la souche productrice de bactériocine et d'autre part à partir de la même culture de Listeria on réalise une dilution au 1/10 de l'extrait de culture de la souche non productrice de bactériocine. A différents temps sont effectuées des mesures d'absorbance à 650 nanomètres ainsi que des numérations sur gélose OXFORD qui indiquent le nombre de cellules viables en Listeria monocytopenes. D'après la figure 2, I'absorbance à 650 nm dans le cas de Listeria monocetoqenes dans l'extrait de culture de la souche non productrice au terme de 20 heures, a augmenté considérablement et par la suite est restée stable, alors que l'absorbance dans le cas de Listeria monocytogenes en présence de la bactériocine est restée faible et stable. Du point de vue de la viabilité des cellules (figure 3) . Listeria monocytopenes seule se développe et se multiplie normalement, sa phase de croissance exponentielle correspond aux 20 premières heures. Puis les cellules meurent après 30 heures d'incubation et une phase de déclin d'un cycle de croissance normal débute (due à un appauvrissement du milieu en substances nutritives). Dans le cas de Listeria monocytopenes, en présence de la bactériocine (figure 3), le taux de bactéries dénombré à 0 heure est de 103 UFC/ml (le taux initial est de 108 UFC/ml avec une dilution au 1 Il 0). Donc la bactériocine affecte les cellules de Listeria monocvtoqenes par un effet bactéricide immédiat. Après 'S heure le taux de bactéries passe à 6.102 UFC/ml et reste stable. Tel que mentionné précédemment, l'action de la bactériocine semble se dérouler en deux tapes. La première correspond à une adsorption de la bactériocine sur des récepteurs spécifiques ou non spécifiques se trouvant sur l'enveloppe cellulaire de la cellule bactérienne. Cette phase est réversible, puisque les bactériocines sont encore sensibles aux protéinases. La seconde étape est irréversible et correspond à des changements pathologiques dans la cellule cible. Etude de l'adsorption Des cultures de 24 heures de différentes bactéries. sensibles et non sensibles à l'action de la souche productrice Lactobacillus brevis à 37"C sont centrifugées à 4000tours/min. pendant 10 minutes. Chaque culot de cellules bactériennes est repris dans 30 millilitres d'extrait de culture de la souche productrice. Ensuite les échantillons sont incubés 4 heures à 37"C, puis centrifugés pour extraire la substance active comme il a été décrit précédemment. On détermine par la suite l'activité résiduelle. D'après la figure 4, on ne constate aucune adsorption. Cependant cela ne veut pas dire qu'il n'y a pas eu d'adsorption. En effet, en mettant en parallèle la spécificité d'adsorption et le mode d'action, on remarque que l'adsorption sur des récepteurs spécifiques ou non a eu lieu lors de l'effet bactéricide. Comme l'adsorption est évaluée après 4 heures d'incubation, celle-ci avait déjà eu lieu et n'a pas pu être constatée d'après la figure 4. Certains auteurs ont exprimé la possibilité d'une action bactéricide sans adsorption sur la cellule sensible. Cependant, l'hypothèse est controversée. Sensibilité aux enzymes Les extraits de culture de la souche productrice contenant la substance inhibitrice sont traités par différentes enzymes: - pepsine (1 mg/ml) - trypsine (6,3 ,ul/ml) - pronase (1 mg/ml) - a-chymotrypsine (1 mg/ml) - cc-amylase (17,6 pI/ml) - lipase (21,5 ,ul/ml) - catalase (1 mg/ml) - ficine (6.3 pi/ml) Les enzymes sont selon le cas, ajoutées directement ou diluées auparavant. L'incubation était de 1 heure à 25"C sauf pour la pronase, la pepsine et la lipase incubées à 37"C pendant 1 heure. L'activité résiduelle est déterminée par un test de diffusion avec Listeria monocvtonenes comme souche indicatrice. La bactériocine de BN85 est inactivée totalement par la pepsine, la pronase, la trypsine, I'a-chymotrypsine et la ficine. Aucune inactivation n'est constatée en présence de l'a-amylase de la lipase et de la catalase (figure 5). Elle est sensible aux enzymes protéolytiques d'origine pancréatique trypsine et achymotrypsine, d'origine gastrique: pepsine et aux enzymes protéiques, ficine et pronase. La nature protéique de cette substance confirme bien la définition des bactériocines à savoir que les bactériocines sont inactivées par au moins une enzyme protéique. Cette sensibilité aux enzymes du métabolisme humain est très intéressante pour l'utilisation des bactériocines dans les aliments. En effet, I'ingestion des bactériocines n'altéreraient pas la flore du tractus intestinal de l'homme, comme c'est le cas des antibiotiques. Sensibilité à la chaleur Les extraits de culture de la souche inhibitrice sont traités à différentes températures pendant 15 minutes, soit 25"C, 50"C, 75ex, 100"C et 121"C. Les traitements tels que 25"C, 50"C, 75"C et 100"C appliqués pendant 15 minutes n'affectent pas l'activité inhibitrice de la bactériocine (figure 6), tandis que le traitement à 121"C pendant 15 minutes, équivalent à une stérilisation réduit son efficacité à inhiber Listeria monocvtopenes (réduction de 30% environ). La tolérance aux traitements thermiques permet à la bactériocine de tolérer au moins un traitement équivalent à la pasteurisation du lait (63"C pendant 30 minutes ou 72"C pendant 15 secondes). De plus, cette thermorésistance laisse supposer que son activité est due à une structure moléculaire relativement simple ne dépassant pas l'état secondaire. Selon la définition de TAGG et al (1976) les composés de nature protéique avec un effet bactéricide dirigé contre les bactéries taxonomiquement proches de la bactérie productrice sont appelées bactériocines. D'après cette définition et d'après les constatations faites concernant l'adsorption, le spectre d'activité, le mode d'action ainsi que la sensibilité aux enzymes protéiques, on peut conclure que la substance inhibitrice produite par BN85 est une bactériocine ou une substance de type bactériocine. Les caractéristiques de la souche inhibitrice de l'invention qui a été testée selon les méthodes décrites précédemment sont résumées cidessous. Lactobacillus brevis (BN85) - Substance produite bactériocine (Brévicine) - Bactérie productrice; Lactobacillus brevis - Poids moléculaire (Da) de la bactériocine purifiée : 4623 - Stabilité: - chaleur: la substance de type bactériocine est stable à 100"C pendant 15 minutes, une faible dégradation est observée à 121"C pendant 15 minutes - pH plutôt acides -sensibilité: Lactobacillus brevis est sensible à certaines enzymes protéolytiques d'origine pancréatique et gastrique - Paramètres de production de la substance type bactériocine - Milieux: * bouillon MRS - Température 37"C (zone d'inhibition est de 14 mm) ; 15"C (zone d'inhibition est de 8 mm) - pH . 5, 6, 7 (production équivalente) - croissance et production à une gamme de pH entre 4,5 et 8 et plus. - Phase de production; croissance exponentielle - Spectre d'inhibition Lactobacillus brevis inhibe; * Espèces de Listeria (tous les sérotypes de Listeria monocytoqenes) * Enterococcus faecium - Lactobacillus plantarum * Micrococcus sedentarius - Staphylococcus xylosus * pas les Gram E. coli, S. infantis, S. typhimurium * pas certains Gram+ Staphylococcus aureus, Brevibacterium Limens, Lactococcus Lactis. - Mode d'action; action bactéricide immédiate - Adsorption: Aucune adsorption aux bactéries (sensibles ou pas) n'a été observée. NB Les zones d'inhibition sont mesurées par rapport à Listeria monocvtoqenes 4d et selon la méthode de diffusion par puits décrite précédemment. Exemple 3. Production et stabilité à 1 50C dans un bouillon MRS Un bouillon MRS est inoculé à 0,01% à partir d'une culture de 24 heures à 37"C de la souche BN85 productrice de bactériocine puis incubé à 15"C pendant 14 jours. A différents intervalles de temps, on mesure le pH, l'activité de l'extrait de culture et on effectue également une numération des cellules bactériennes sur TSLA. Cette étude est importante dans la mesure où la température de 15"C représente à peu près les températures rencontrées dans les caves d'affinage des fromages. Tableau 1; Production de la bactériocine à 15"C dans un bouillon MRS iX- iw z x I J3 9 , 7.10 4,62 D 5 1,4.109 4,16 7 2,1.109 4,02 J10 3,9.10 .84 J14 1,3.109 3,75 B J17 4.10 ,71 24 .10 68 J31 ,210 .33 (1) Lactobacillus brevis productrice de bactériocine A cette température une croissance normale est enregistrée. En effet, d'après le tableau 1, on remarque qu'après 3 jours d'incubation le taux de BN85 passe de 1,1.103 à 9,7.10 UFC/ml. Au terme de 17 jours d'incubation, le taux de BN85 diminue. Cette diminution est liée à l'appauvrissement du milieu de culture et à l'inhibition par le pH. Au niveau du pH, le maximum d'acidification est atteint après 30 jours, où le pH est de 3,33. La diminution du pH est due à la production d'acides résultant de l'assimilation des sucres, plus particulièrement le lactose et le glucose, par les bactéries. La production de bactériocine atteint son maximum au terme de 5 jours (diamètre de la zone d'inhibition est de 8 mm). Cette activité demeure stable jusqu'au 31ème jour. ComPortement de Listeria monocytogenes en présence de BN85 dans un milieu de culture MRS à pH moulé BN85 inhibe la multiplication cellulaire de Listeria monocvtonenes. Cette inhibition de Listeria se traduit par une diminution du nombre d'UFClmi de Listeria qui passe de 2,8;106 à 6.103 en 8 heures (figure 7). De plus, cette diminution a lieu à la fin de la phase exponentielle de croissance de la bactérie productrice, c'est-à-dire au moment où il y a le maximum de production de bactériocine. La souche de BN85 montre une phase de latence qui est plus longue. En effet, le taux de Listeria monocvtoaenes passe de 2,8.104 à 2,8.6106 UFC en 16 heures. Durant ce temps, le taux de BN85 n'est augmenté que de 10 UFC/ml. La bactériocine produite est tout juste suffisante pour réduire le nombre de Listeria jusqu'à un certain seuil, mais toutes les bactéries de Listeria monocvtoqenes ne sont pas éliminées. Les bactéries non atteintes réussissent à se multiplier et à s'exprimer à partir de 28 heures. Au bout de 48 heures, elles atteignent un taux de 2,8.108 UFC/ml, égal à celui de BN85 (3,7. 108 UFC/ml). L'inhibition est due à la production de bactériocine, car cette inhibition n'est pas retrouvée lors de l'étude du comportement de Listeria monocvtogenes en présence de Lactobacillus brevis non productrice de bactériocine (Figure 8). De plus, le pH est maintenu neutre à pH 7. Exemple 4 Caractérisation de la structure de la bactériocine produite Dar Lactobacillus brevis 1. Méthodes utilisées - Spectrométrie de masse avec ionisation Electrospray couplée à un analyseur quadripolaire (Bio-Q de VG instrument Manchester) - Dégradation d'Edman en mode liquide pulsé sur un séquenceur de protéine (ABI modèle 473A) - Hydrolyse enzymatique par l'endoprotéinase Lys-C - Couplage Chromatographie liquide - Spectrométrie de masse pour la chromatographie de l'hydrolysat de peptide. La chromatographie liquide est faite sur une colonne C18 phase inverse (Macherey-Nagel 2x1 50 mm 30A 5,u) 2.Mesure de masse par ES-MS Le volume de l'échantillon de la bactériocine purifiée et conservée dans un milieu isopropanol à 30% a été réduit de moitié par lyophilisation et 10,ul de cet échantillon ont été utilisés pour faire une mesure de masse par électrospray. La masse trouvée par ES-MS est de 4623,6 + 0,15 Da. 3. Dégradation d'Edman du peptide intact Ce même échantillon (20 ,ul) a été déposé sur le séquenceur de protéine et soumis à la dégradation d'Edman. Une séquence incomplète, comportant 4 résidus X et un trou de 6 résidus dû à une panne du séquenceur, est déterminée; elle est reportée cidessous: 1 10 K-Y-Y-G-N-G-V-T-X-G-K-H-S-X-?-?-?-?-?-?21 30 40 A-T-T-X-I-I-N-N -G-A-M-A-W-A-T-G-G-H-Q-G- 41 N-H-K-X-?? 4. Coupure par l'endeprotéinase Lys-C du peptide non dérivé Une hydrolyse enzymatique avec l'endoprotéinase Lys-C est faite sur le reste de l'échantillon sans dérivation préalable. La moitié de l'hydrolysat est injecté sur une colonne HPLC C18 couplée à un spectrométre de masse.Deux grands pics 2076 et 2471 sont collectés et séquencés. 5. Séquence du peptide de masse 2076 Da Le premier pic de masse 2076,97 + 0,4 donne une double séquence parmi laquelle on reconnaît le peptide 2 à 11 et le peptide 12 à 20. La masse calculée pour ces deux peptides, si on considère que les résidus X représentent 2 cystéines reliées par un pont disulfure, est de 2077,3, ce qui est en parfait accord avec la masse mesuree. Séquence: Y-Y-G-N-G-V-T-X-G-K M=1061,2 + = 2079,3-2 = 2077,3 H-S-X-S-V-D-W-G-K M=1 018,1 6. Séquence du peptide de masse 2076 DA Le deuxiéme pic de masse 2471,86 donne la séquence suivante; A-T-T-X-I- I-N -N -G-A-M-A-W-A-T-G-G-H-Q-G-N-H-K Si on additionne les valeurs des peptides de coupure 2076,97+128 pour la lysine perdue en position 1 et que l'on compare avec la masse trouvée pour la protéine entière, c'est-àlire 4623,2, nous devrions trouver une différence égale 18 x nombre de peptides -1, c'est-à-dire 36 ; or, la différence est de 44, soit 18 Da en plus, ce qui signifie que nous avons dans le pic 2 également une hydrolyse. La masse calculée avec les résidus donnés par la séquence est de 2353,8, le seul acide aminé non visible en dégradation d'Edman et qui puisse rester accroché à un autre X est une cystéine. Si on considère que X est une cystéine et qu'elle forme un pont disulfure avec une cystéine se situant en C-terminal, on obtient la séquence suivante; A-T-T-X-l -I-N -N-G-A-M-A-W-A-T-G-G-H-O-G-N-H -K M = 2353,8 COH M = 121 ou CNH2 M = 120 M = 1373,8-2 = 2371,8 ou M = 1374,8-2 = 2372,8 Cette masse est en accord avec la masse mesurée. Conclusion La séquence proposée pour la protéine est la suivante: 1 10 20 K-Y-Y-G-N-G-V-T-C-G-K-H-S-C-S-V-D-W-G-K 21 30 40 A-T-T-C -I-l-N-N-G-A-M-A-W-A-T-G-G-H-Q-G- 41 N-H-K-C Sa masse calculée si on considère 2 ponts disulfure et un C-ter OH est de; 4624,2 un C-ter Nu 2 est de. 4623,2 La masse mesurée est de 4623,6 + 0,15 Da. La cystéine en position 9 est liée à la cystéine en position 14. La cystéine en position 24 est liée à la cystéine en position 44 C-terminal. Ces différentes mesures semblent identifier le C-terminal comme étant amidé. Exemple 5 - Effet de la souche productrice de bacteriocine sur les munsters artificiellement contamines 1 - Mode opératoire 1.1. Préparation de la souche productrice de bactériocine La suspension bactérienne de Lactobacillus brevis est obtenue par une préculture de la souche. Cette pré-culture est réalisée dans un bouillon MRS pendant 18 à 24 heures à 37"C. Elle est ensuite centrifugée à 5000 t/mn pendant 10 mn. Les bactéries constituant le culot sont reprises dans un tampon eau/tryptone. 1.2 Ensemencement 100 ml de la suspension bactérienne titrée à 107 UFC/ml sont ensuite dilués dans 10 I d'eau courante avant d'être pulvérisés à l'aide d'un pistolet relié à un compresseur, sur les fromages placés sur des claies en acier inox. Ainsi, le taux de la souche productrice de bactériocine atteint 105 UFC/ml environ. L'ensemencement de Lactobacillus brevis s'effectue une seule fois à J0, date d'entrée des fromages en cave d'affinage. 1.3 Contamination artificielle des fromages Les lots de fromages ensemencés en Lactobacillus brevis par pulvérisation ainsi que le lot de fromages témoins (formages non ensemencés par Lactobacillus brevis) sont contaminés avec Listeria monocvtooenes 4d à un taux variant entre 104 et 106 UFC/ml, notamment à un taux de 102 UFC/ml. Cette contamination s'effectue par pulvérisation notamment en début d'affinage, particulièrement une à trois fois. La contamination artificielle a eu lieu à J8 en laboratoire. Les tableaux 1 et 2 résument les différents traitements appliqués aux deux lots. 1.4 L'affinage II a lieu dans une enceinte climatisée avec une humidité relative de 95% nt des températures pouvant varier entre 12 et 15"C suivant l'évolution des fromages. Les munsters blancs sont lavés le premier jour, date de leur entrée en cave puis à raison d'une fois par semaine au cours de l'affinage. Le lavage s'effectue à l'eau courante. 1.5 Suivi bactériologique; dénombrement et identification Le dénombrement de Listeria monocvtoqenes est effectué tous les 2 ou 3 jours. II se fait sur milieu OXFORD selon la méthode F.D.A modifiée en 1988 (F.I.C. 143, 1990) et basée sur les travaux de LEVER, J. (1988). 5 échantillons sont analysés par traitement et par jour d'analyse. Les dates et la nature des différents traitements sont résumées dans les tableaux 1 et 2. Tableau 1 Les différents traitements appliqués au lot témoin - (loti) Jo arrivage laboratoire pH, L.m Jo lavage-eau laboratoire J8 Contamination laboratoire pH, L.m par L.m 1 fois/semaine lavage laboratoire suivi pH, L.m Tableau 2 Les différents traitements appliqués au lot de fromages ensemencés par Lactobacillus brevis par pulvérisation - (lot 2) ::pV , iFiBT Jo arrivage cave d'affinage Jo Pulvérisation cave d'affinage BN85 J4 Lavage cave d'affinage J6 transfert fromage laboratoire pH, L.m J8 Contamination pa laboratoire pH, L.m L.m 1 fois/semaine Lavage suivi pH, L.m Le lot témoin est affiné dans une enceinte climatisée à 15"C et HR 90 à 95%, au laboratoire d'AERIAL depuis J0, alors que le lot 2 a été gardé dans les caves d'affinage jusqu'à la date de la contamination artificielle par Listeria monocytopenes qui a eu lieu en laboratoire. Par la suite, l'affinage de ces fromages a été poursuivie dans l'enceinte climatisée.Les résultats du suivi du pH et de la contamination en Listeria monocvtooenes figurent dans les tableaux 3 et 4. 2 - Résultats Tableau 3; Evolution de la contamination en Listeria monocvtocenes i - srs absence Jo 5/5 - absence 515 absenoe J7 515; 2/5: 50 3/5: absence J10 2/5: 5/5: absence 1/5 50 1/5 9.102 J14 6. 102/8. 102 5,4.103 2/5 5/5 absence J17 103 5/5: absen /o 5 1o2l 1 1 102/ 1.3.102 Ainsi, dans cet essai, les munsters blancs ont été partagés en deux lots: * Lot (1) : Lot témoin non ensemencé par Lactobacillus brevis * Lot (2) Lot ensemencé par Lactobacillus brevis par pulvérisation manuelle 5/5 5 fromages sur 5 anal ses. D'après les résultats, on peut constater; 1 - Dans le lot 1 (témoin) Listena monocytocienes s'est installée ; son taux continue à croître lors de l'affinage. Après 17 jours, le taux maximum rencontré est de 2.103 UFC/g. 2. Dans le lot 2 les munsters ont été ensemencés par Lactobacillus brevis productrice de bactériocine, par pulvérisation manuelle. Dans ce lot, aucun développement de Listeria monocvtoaenes n'est observé durant les 17 jours d'affinage. Ces résultats révèlent l'efficacité de Lactobacillus brevis productrice de bactériocine dans la prévention du développement de Listeria monocvtoaenes. Par ailleurs on peut constater que l'évolution du pH au niveau de la croûte et le coeur du fromage est similaire quel que soit le lot de fromages analysé le lot (1) témoin et le lot 2 (fromages ensemencés par Lactobacillus brevis productrice de bactériocine). Tableau 4: Evolution du pH 1 ' '''''''''''''' v ç 1 coetr rate t .98 1, I Jb-- 501 4 5.10 5.06 5.08 5.04 5.05 5.02 J7 5.01 5.01 4.99 5.08 5.16 5.09 5.14 5.06 5.16 5.08 5.19 5.16 5.08 4.97 5.25 4.96 5.20 5.05 5.08 4.92 Jro 5.10 5.04 5.20 5.14 5.06 5.03 5.35 5.28 5.30 5.25 5.22 5.18 5.27 5.17 5.50 5.46 5.37 5.30 5.45 5.40 J17 5.23 5.16 5.08 5.03 5.00 5.05 5.13 5.01 5.34 5.14 5.18 5.10 5.10 5.06 5.55 5.47 5.31 5.17 5.44 5.20 Pour conclure, I'application de Lactobacillus brevis aux munsters par pulvérisation et dans les conditions de cet essai, permet de mettre en évidence la capacité de Lactobacillus brevis productrice de bactériocine d'inhiber Listeria monocytocenes sans affecter l'évolution de l'affinage du fromage. Exemple 6 effet de la souche productrice de bactériocine sur les munsters naturellement contaminés Ces essais ont été effectués à l'échelle semi-industrielle. Souches bactériennes - Les souches tests La même souche productrice de bactériocines (BN85) isolée du munster fermier et testée pour son action contre Listeria monocetoaenes dans des conditions in vitro, a été utilisée dans les essais en cave dans des conditions serrWi-industrielles, - la souche indicatrice La souche indicatrice est Listeria monocytopenes à l'origine de la contamination naturelle des fromages en cave. Produit et échantillonnage Chaque essai est mené sur un lot de 700 claies. Chaque claie comprend 20 fromages au lait pasteurisé de 11 cm de diamètre. Ensemencement de la souche productrice de bactériocine Les ensemencements de la souche test sont réalisés par pulvérisation de la suspension bactérienne à travers les buses de la machine de lavage. Cette suspens ion bactérienne est obtenue par une pré-culture de la souche test préparée comme précédemment. 300 ml de la suspension bactérienne titrée à 109 UFC/ml sont ensuite dilués avec 300 I d'eau courante dans le bac de lavage de la machine. Ainsi, le taux de la souche productrice de bactériocine atteint 105 UFC/ml environ. Seuls les trois premiers lavages (à partir de la date d'entrée des fromages en cave) serviront à installer la souche productrice de bactériocine. Les autres lavages nécessaires à l'affinage sont effectués à l'eau courante additionnée de sel. Ces lavages ont lieu deux fois par semaine. Contamination Aucune contamination artificielle par Listeria monocvtonenes n'a eu lieu. La seule contamination serait naturelle et proviendrait en effet de l'ambiance des caves ou de la matière première (munster blanc). Affinage II est effectué en cave d'affinage. La température des caves varie de 12 à 15"C et l'humidité relative atteint 95%. Suivi de l'affinage Le suivi de l'affinage est réalisé par le contrôle du pH des fromages et du développement des ferments et des levures et donc de la coloration des fromages. Seuls les résultats de l'évolution du pH figureront dans ce rapport. Suivi microbiologique II se résume au suivi de la croissance de Listeria monocvtoqenes éventuellement présente dans les fromages. Le dénombrement de cette souche contaminante est effectué comme précédemment. Les prélèvements destinés au suivi microbiologique et du pH sont réalisés à chaque lavage (2 fois par semaine). Cinq échantillons sont prélevés par traitement et par jour d'analyse. Dans ces essais, deux paramètres diffèrent par rapport à l'essai effectué en laboratoire; 1) Le traitement est réalisé sur un échantillonnage très important (un lot de 700 claies), le lavage s'effectue mécaniquement à l'aide d'une machine à pulvérisation et l'affinage a lieu dans des conditions réelles. en cave d'affinage. 2) La contamination par Listeria monocvtoaenes n'est pas provoquée artificiellement. Elle est naturelle, liée à une contamination de l'environnement des caves d'affinage. Cependant, lors de ces essais, I'ensemencement de BN85 est réalisé en circuit fermé. En effet, une solution contenant cette souche diluée dans de l'eau, est mise dans le bac de la machine à pulvérisation, puis pompée pour être pulvérisée sur les fromages destinés à être traités: la quantité de cette solution en excédent est de nouveau recueillie dans le bac de la machine à pulvérisation pour être pulvérisée de nouveau, etc. Les fromages considérés comme témoins et donc non ensemencés par BN85, sont lavés en circuit ouvert à l'eau courante. D'après le tableau 4, on remarque que Listeria monocetoaenes apparaît dans les fromages à partir du Il éme jour d'affinage, alors que les fromages traités avec BN85 sont exempts de Listeria monocvtoaenes. ceci jusqu'à la fin de l'affinage (18 jours). Tableau 4 : Effet de l'ensemencement de BN85 sur le développement de Listeria monocytoqenes dans le fromage P- rl" i JOtS raux de Lm. (tg *Jo Absence Lls Absence Absence 1 .0.102/21 Absence 5015.1011,0.1016,0.10 12,0.10 Absence 18 2,1.103z3,5 2,1.10:13,5.1011,6.10 11,1.1012.10 Absence lavage avec la souche BN85 (104 UFC/ml) (1) fromage témoin . non ensemencé par BN85 productrice de bactériocine (2) fromage préalablement ensemencé par BN85 productrice de bactériocine Rappelons que la durée d'affinage des munsters de 11 cm de diamètre est estimée à 15 jours au minimum. REVENDICATIONS 1. Souche bactérienne provenant d'un fromage à pâte molle, notamment de type munster, ladite souche inhibant une bactérie Listeria. 2. Souche bactérienne selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche bactérienne de type. Lactobacillus 3. Souche bactérienne selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche du type Lactobacillus brevis (BN85). 4. Souche bactérienne selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'inhiber une bactérie Listeria parmi le groupe comprenant; - Listeria monocytopenes 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d et V7, - Listeria innocua 6a et 6b - Listeria seeliqeri - Listeria ivanovii. 5. Souche bactérienne présentant une activité inhibitrice envers une bactérie Listeria, ladite souche étant caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Lactobacillus brevis déposée à la DSM le 21 juillet 1994 et portant le numéro de dépôt DSM9296. 6. Extrait de culture d'une souche bactérienne selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ledit extrait étant caractérisé en ce qu'il présente une activité inhibitrice envers une bactérie Listeria monocytoqenes. 7. Extrait selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente une activité inhibitrice envers les souches de Listeria parmi le groupe comprenant - Listeria monocytoqenes 1/2a, 1t2b, 1/2c, 3a, 3b, 4b, 4d et V7, - Listeria innocua 6a et 6b - Listeria seeligeri - Listeria ivanovii. 8. Extrait selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'activité inhibitrice est bactéricide. 9. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans le munster. 10. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans la production de fromages, notamment le fromage à pâte molle, particulièrement le munster. 11. Souche bactérienne inhibant Listeria monocvtoqenes. 12. Méthode de production d'un fromage essentiellement libre de toute bactérie Listeria, ladite méthode comprenant l'application sur le fromage, après la production du caillé, d'une solution comprenant la souche de l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'une bactériocine. 13. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite souche ou ladite bactériocine est appliquée sur le fromage en cours d'affinage. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce que la solution appliquée sur le fromage comprend la souche à une concentration variant entre I 104 et 106 UFC/ml. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que ladite solution est appliquée sur le fromage par pulvérisation en début d'affinage, une à trois fois.