FR 2724935 A1 19960329 FR 9411512 A 19940927 COMPOSITIONS NANOPARTICULAIRES CONTENANT DES DERIVES NUCLEOTIDIOUES. LEUR PREPARATION ET LEUR EMPLOI EN THERAPEUTIQUE La présente invention concerne des compositions comprenant des acides nucléiques antisens adsorbés, inclus ou encapsulés dans des nanoparticules; leur préparation et leur utilisation, notamment pour le traitement des maladies aurorales Elle concerne plus particulièrement des compositions comprenant des acides nucléiques antisens capables d'inhiber spécifiquement les oncogènes ras mutEs, adsorbés, inclus ou encapsulés dans des nanoparticules. Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceuxci, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogénique. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines ont été associées à la présence de gènes ras modifiés, et en particulier de gènes ras possédant des mutations ponctuelles, le plus souvent sur les positions 12, 13 et 61. De même, une surexpression des protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire.La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, et la mise au point de méthodes permettant d'inhiber leur activité dans les cellules tumorales constituent donc un enjeu majeur pour l'approche thérapeutique de la cancérogénèse. Une des approches proposées dans l'art antérieur pour inhiber l'activité des oncogènes ras réside dans l'utilisation d'oligonucléotides antisens. La régulation de l'expression de gènes-cible au moyen d'oligonucléotides antisens constitue en effet une approche thérapeutique en développement croissant Cette approche repose sur la capacité des oligonucléotides à s'hybrider spécifiquement à des régions complémentaires d'un acide nucléique, et à inhiber ainsi spécifiquement ltexpfesson de gènes déterminés. Cette inhibition peut intervenir soit au niveau traductiannel (oligonucléotide anti-sens) soit au niveau transcriptionnel (oligonucléotide anti-gène). Plus particulièrement, les acides nucléiques anti-sens sont des séquences nucléiques capables de s'hybrider sélectivement avec des ARNs messager cellulaires cible, pour inhiber leur traduction en protéine. Ces oligonucléotides forment avec l'ARNm cible, de manière locale, des régions double-brin, de type ARN/ARNm ou même ADN/ARNm, par interaction de type Watson-Crick classique. n peut s'agir par exemple d'oligonucléotides synthétiques, de petite taille, complémentaires d'ARNm cellulaires, et qui sont introduits dans les cellulesìble. De tels oligonucléotides ont par exemple été décrits dans le brevet nO EP 92 574. ll peut également s'agir de gènes anti-sens dont l'expression dans la cellule-cible génère des ARN complémentaires d'ARNm cellulaires. De tels gènes ont par exemple été décrits dans le brevet n" EP 140 308. Cependant l'utilisation in vivo d'acides nucléiques antisens dirigés contre les gènes ras se heurte à un certain nombre de difficultés qui limitent jusqu'à aujoutdhui leur exploitation thérapeutique. Tout d'abord, les acides nucléiques présentent une grande sensibilité à la dégradation par des enzymes de l'organisme, telles que les nucléases, ce qui implique l'emploi de doses importantes. De plus, ils ont une faible pénétration dans certains types cellulaires et une distribution intracellulaire souvent inadéquate, ce qui les rend sans effet thérapeutique. Enfin, il est important de pouvoir disposer de séquences suffisament sélectives et stables pour obtenir un effet spécifique sans altérer d'autres fonctions cellulaires. Pour tenter de résoudre certains de ces problèmes, il a été proposé de modifier chimiquement le squelette phosphodiester des acides nucléiques, pour donner lieu à de nouvelles classes d'oligonucléotides artificiels tels que les oligonucléotides phosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates et phosphorothioates qui sont décrits, par exemple, dans la demande de brevet W094/08003. Toutefois, si certains de ces composés modifiés présentent une bonne résistance aux nucléases, leur pouvoir de pénétration et de distribution dans les différents compartiments cellulaires reste très faible et ils présentent certains effets secondaires liés à la présence de motifs non-naturels dans leur structure. La présente invention offre une solution particulièrement avantageuse à ces problèmes. La présente invention fournit en effet de nouvelles compositions contenant des acides nucléiques antisens présentant une résistance élevée aux nucléases, une bonne pénétration cellulaire suivie d'une répartition appropriée dans les cellules, une très haute sélectivité vis-à-vis de leur cible, et formant des complexes particulièrement stables avec leur cibles. Un premier objet de la présente invention réside dans une composition comprenant des acides nucléiques simple-brin de 8 à 13 nucléotides, complémentaires d'une région d'un ARNm d'un oncogène ras humain portant une mutation ponctuelle, adsorbés, inclus ou encapsulés dans des nanoparticules. De manière surprenante, la demanderesse a maintenant montré qu'il était possible d'obtenir in vivo des effets thérapeutiques importants et sélectifs en utilisant des acides nucléiques antisens courts, non modifiés chimiquement et adsorbés dans des nanoparticules. Les acides nucléiques utilisés dans le cadre de la présente invention sont des acides nucléiques naturels, c'est-à-dire non modifiés chimiquements. La demanderesse a en effet montré que l'utilisation de nanoparticules permettait de prolonger la durée de vie et la pénétration des acides nucléiques naturels. Cette caractéristique de l'invention est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet d'éviter tous les inconvénients liés aux acides nucléiques modifiés chimiquement tels que les effets secondaires, les effets immunogènes, l'absence de biodégradabilité, la présence de plusieurs isomères en mélange, etc. Les composition selon l'invention sont constituées de produits naturels, métabolisables en monomères naturels, et de structure définie.De plus, ils sont également plus avantageux que les acides nucléiques artificiels, compte tenu de leur simplicité d'obtention et de leur faible prix de revient. Les acides nucléiques utilisés dans le cadre de la présente invention ont une longueur comprise entre 8 et 13 nucléotides. Contrairement à la ce que l'on pouvait attendre, la demanderesse a en effet montré qu'il était plus avantageux pour obtenir un effet sélectif combiné à une bonne stabilité, d'utiliser des oligonucléoddes relativement courts. Comme illustré dans les exemples, la sélectivité de l'acide nucléique antisens anti-ras diminue dès que l'oligonucléotide possède une longueur supérieure à 14 bases. Il est donc particulièrement important d'utiliser des acides nucléiques de taille inférieure à 14 bases. Préférentiellement, les acides nucléiques utilisés dans le cadre de la présente invention ont une longueur comprise entre 10 et 13 nucléotides. Des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec des acides nucléiques de 12 nucléotides. A titre d'exemple, on peut citer l'acide nucléique de séquences SEQ ID n" 10 qui possède des propriétés tout à fait remarquables. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, les acides nucléiques utilisés sont choisis de sorte que la mutation ponctuelle ciblée sur l'oncogène ras soit localisée au centre de la région complémentaire. La danandaesse a en effet montré qu'il était particulièrement avantageux que l'acide nucléique antisens utilisé soit centré autour de la mutation ciblée. Comme illustré dans les exemples, lorsque l'acide nucléique est centré sur la mutation, une inhibition sélective de 1004b est obtenue, alors que celle-ci n'est que de 50% lorsque la mutation est décalée seulement de 2 bases.Ces résultats particulièrement surprenants pm1 pour une région cible donnée, de préparer des acides nucléiques antiseus beaucoup plus efficaces. Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent des acides nucléiques antisens particuliers adsorbés, inclus ou encapsulés dans des nanoparticules. La demanderesse a en effet montré que l'emploi de nanoparticules permettait d'augmenter considérablement l'effet thérapeutique des acides nucléiques antisens anti-ras. Comme indiqué dans les exemples, l'activité des compositions selon l'invention est 100 fois supérieure à l'activité de l'acide nucléique seul. Les nanoparticules utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être toute particule de petite dimension, généralement inférieure à 500 nm, coostituée de polymère(s) biocompatible(s), capable de transporter ou de vectoriser un principe actif dans les cellules ou dans la circulation sanguine. PréférentiellemeS, les nanoparticules selon l'invention sont constituées par des polymères comportant une majorité de motifs dégradables tels que l'acide polylactique, éventuellement copolymérisé à du polyéthylène glycol, ou les cyanoacrylates d'alkyle. D'autres polymères utilisables dans la réalisation de nanoparticules ont été décrits dans Fart antérieur (voir par exemple EP 275 796 et EP 520 889). Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise des nanoparticules constituées de polymères de cyanoacrylates d'alkyle (telles que décrits dans le brevet européen EP 0 007 895 et le brevet français 8 08172) ou de polymères de l'acide lactique ou de copolymères de l'acide lactique et de l'acide glycolique (telles que décrites par G. Spenlehauer et coll., J. Control. Release, (1988), Z, 217229). Les nanoparticules selon l'invention possèdent généralement un diamètre moyen de l'ordre de 50 à 500 nanomètres. De préférence, les nanoparticules utilisées dans le cadre de la présente invention ont un diamètre moyen de l'ordre de 200 nanomètres. D'un intérêt tout particulier sont les nanoparticules obtenues par polymérisation des cyanoacrylates de méthyle, d'éthyle, d'isobutyle ou d'isohexyle ou celles obtenues par copolymérisation de l'acide lactique et de l'acide glycolique. Dans un mode de réalisation préféré des compositions de l'invention, les acides nucléiques sont associés à des composés hydrophobes cationiques. L'emploi de tels composés permet en effet de faciliter l'association des acides nucléiques avec les nanoparticules. Plus particulièrement, les composés hydrophobes cationiques utilisés dans les compositions selon l'invention permettent de former des paires d'ions entre les dérivés phosphorés chargés négativement de la chaine nucléique et les cations hydrophobes et d'augmenter ainsi le caractère lipophile et l'adsorption des acides nucléiques aux nanoparticules. D'une manière générale, les composés hydrophobes cationiques utilisables dans la préparation des compositions selon l'invention sont choisis parmi les halage nures de tétraphénylphosphonium, de préférence le chlorure; les sels d'ammonium quaternaires, choisis plus particulièrement parmi les halogénures de triméthylalkylammonium tels que les chlorures ou les bromures de dodécyltriméthylammonium, de tétradécyltriméthylammonium, d'héxadécylriméthylammonium ou de cétyltriméthylammonium; les amines grasses, telles que la D,L4ihydrosphingosine (D,L-dihydroxy-1,3 amines2 octadécane), ou les oligopeptides, tels que la polylysine et les oligopeptides de formule (LKKL)n, (LKLK)n ou (LRRL)n De manière particulièrement avantageuse, on utilise dans le cadre de l'invention du bromure d'héxadécylriméthylammonium ou un oligopeptide. Les compositions selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'adsorber, d'inclure ou d'encapsuler un acide nucléique, associé ou non à un composé hydrophobe cationique, dans une nanoparticule. Généralement, les compositions selon l'invention peuvent être obtenues: - par mise en présence de l'acide nucléique et éventuellement du composé hydrophobe cationique avec les nanoparticules dans des conditions qui permettent une rétention (ou une absorption) forte de l'acide nucléique sur les nanoparticules et une atteinte facile des cellules cibles, - soit par mise en présence de l'acide nucléique et éventuellement du composé hydrophobe cationique avec les unités monomères, suivie d'une polymérisation, - soit par mise en présence de l'acide nucléique et éventuellement du composé hydrophobe cationique avec le polymère au cours de la polymérisation c'est-à-dire après le démarrage de la polymérisation mais avant l'achèvement de celle-ci. De préférence, les compositions selon l'invention sont obtenues par adsorption, inclusion ou encapsulation sur les nanoparticules dâ formée. Les nanoparticules de polycyanoacrylates d'allyle peuvent être sépares dans les conditions décrites dans le brevet européen EP O 007 895 et le brevet français 8108172 et celles d'acide polylactique-polyglycolique dans les conditions décrites par G. Spenlehauer et coll., J. Control. Release, (1988), 1217-229. L'adsorption des l'acide nucléique complexés ou non par les composés hydrophobes cationiques sur les nanoparticules est généralement effectuée en agitant une suspension de nanoparticules avec l'acide nucléique complexé par le composé hydrophobe cationique dans des conditions déterminées. Les nanoparticules ainsi transformées sont généralement séparées par filtration ou centrifugation et sont utilisées pour préparer des compositions pharmaceutiques thérapeutiquement utiles. Généralement, l'adsorption est effectuée en milieu aqueux dont le pH est tamponné à une valeur voisine de 7. Comme tampon peut être utilisé le tampon TRIS-HCl. Par ailleurs pour stabiliser la suspension, il est particulièrement avantageux d'opérer en présence d'un agent stabilisant tel qu'un copolymère synthétique de polyoxyéthylène-polyoxypropylène non ionique comme le poloxamer 188 ou un polyoxyéthylène. Cet agent stabilisant permet en particulier de réduire les phénomènes d'adhésion entre particules par un effet de répulsion stérique. L'adsorption est généralement effectuée à une température voisine de 200C et la réaction est terminée après quelques heures d'agitation. Il est particulièrement avantageux d'utiliser, au début de l'opération d'adsorption, une concentration en nanoparticules comprise entre 0,5 et 50 mglcm3 et de préférence voisine de 1 mg/cm3. La concentration en acides nucléiques est généralement comprise entre 0,01 et 500 CLAM. La concentration choisie en acide nucléique dépend essentiellement de la concentration en nanoparticules et de la concentration finale désiree. Par ailleurs, pour augmenter l'adsorption des acides nucléiques sur les nanoparticules, il est avantageux d'opérer en présence d'un excès de composé hydrophobe cationique, l'adsorption étant d'autant meilleure que la concentration en composé hydrophobe cationique est plus forte. D'une manière générale, l'efficacité d'adsorption des acides nucléiques aux nanoparticules dépend essentiellement de la longueur de la chaîne nucléotidique et de la densité des charges à la surface des particules. Un autre objet de l'invention concerne les compositions pham comprenant une composition telle que définie cidessus, en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, elles peuvent permettre de transférer à des lignées cellulaires des acides nucléiques antisens, par exemple dans le but d'étudier la régulation des protéines ras et la voie de signalisation ras-dépendante. Ex vivo, elles peuvent être utilisés pour le transfert thérapeutique d'acides nucléiques antisens anti-ras dans une cellule issue d'un organisme, en vue de conférer à ladite cellule une résistance aux oncogènes ras, avant sa réadministration à un organisme.In vivo, elles peuvent être utilisés pour l'administration directe d'acides nucléiques antisens anti-ras. En particulier, une administration intra-tumorale est tout à fait avantageuse puisqu'elle permet de délivrer efficacement et localement la composition active. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent donc un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intratumorale. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par additif selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les compositions selon l'invention étant capables de moduler l'activité des protéines ras oncogènes, elles permettent d'inhiber le processus de développement et peuvent ainsi être utilisées pour le traitement de différents cancers. De nomixeux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques. Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gènes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du pancréas, dont 90 o ont un oncogène Ki-ras muté sur le douzième codon (Almoguera et coll., Cell S (1988) 549), les adénocarcinames du colon et les cancers de la thyroïde (50tu), les cancers de la vessie (40tu, voir Alcishi et al., Int. J.Onc. 4 (1994) 85) ou les carcinomes du poumon et les leucémies myéloïdes (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). La présente invention sera décrite plus en détail avec les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1: Position sur leur cible (A) et efficacité d'hybridation (B) des antiseris 1-5. Position sur leur cible (C) et efficacité d'hybridation (D) des antisens R1-R8. Figure 2: Inhibition de la croissance des cellules HBL100rasl Figure 3: Etude comparée de la pénétration cellulaire Figure 4: Effet in vivo des ante sens sur le volume des tumeurs Matériels et Méthodes Synthese des acides nucléiques antisens simple-brin Les différents acides nucléiques utilisés ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur automatique en phase solide (Applied Biosystems, Forster city, CA) selon la chimie des phosphoramidites. Les acides nucléiques ont ensuite été précipités deux fois à l'éthanol, lavés en présence de 75% d'éthanol, puis mis en solution dans l'eau. Clivage par la RNase H Les expériences de clivage par la RNase H à partir d'extraits nucléaires de cellules HeLa (HeLa Scribe, Nuclear extract, Promega) ont été réalisées dans le mélange réactionnel (25 p1) contenant 40 mM Tris pH 7,9; 100 mM KC1; 2 mM MgC12; 0,8 p1 d'extrait nucléaire de HeLa, 2llg d'ADN transporur, 4 nM d'ARNm ras sauvage ou muté et 5 pM de chaque acide nucléique à tester. Les réactions ont été réalisées sans pré-mélangeage de l'ARNm et de l'acide nucléique à tester. Après traitement au phénol et précipitations, les produits de clivage par la RNase H ont été analysés par électrophorèse sur gel de séquençage polycarylamide (6%).Les gels ont ensuite été autoradiographés, et la quantité de matériel intact et de produit de clivage a été déterminée par densitométrie. Lignées cellulaires utilisées - HBL1OOrasî : Cette lignée dérive de la lignée mammaire humaine HBL100 par transformation avec un plasmide pSV2 portant l'oncogène Ha-Ras humain EJ524. Cette lignée exprime la forme sauvage de Ha-ras, ainsi que la forme portant la mutation ponctuelle G - > U en position 12, codant pour l'acide aminé valine au lieu d'une glycine (Ha-ras VAL12 (Lebeau et al., Oncogene 6 (1991) 1125). - HBLlOOnéo: Cette lignée dérive également de la lignée mammaire humaine HBL100, par transformation avec un plasmide pSV2 témoin. Cette lignée exprime donc uniquement la forme sauvage de Ha-ras. Préparation des nanoparticules Nanoparticules de polyisohexylcyanoacrylate Une suspension nanoparticulaire a été préparée par addition, sous agitation magnétique, delOO plitre d'isobutylcyanoacrylate ou d'isohexylcyanoacrylate à un milieu de polymérisation composé d'acide chlorhydrique (1 mM, pH = 3 ou 10 mM, pH = 2) et de 1 g/100 cm3 de dextran. La polymérisation des monomères cyanoacryliques s'effectue spontanément à une température voisine de 20"C. La polymérisation est totale après 2 heures en utilisant l'isobutylcyanoacrylate et après 6 heures en ueïimnt l'isohexylcyanoacrylate. Après neutralisation, 0,4 g/100 cm3 de poloxamer 188 est ajouté pour stabiliser les nanoparticules. - Nanoparticules d'acide lactique-acide glycolique : 10 mg/cm3 d'lm copolymère d'acide lactique-acide glycolique contenant 75 to d'unités lactiques D et L et 25 % d'unités glycoliques sont mis en suspension dans un milieu contenant 10 mM de TRIS-HCl à pH = 7 et 0,5 % de lécithine. Après 12 heures d'incubation, les nanoparticules peuvent être séparées de la suspension. Encapsulation des acides nucléiques dans les nanoparticules Les nanoparticules préparées ci-dessus à une concentration de 0,5 mg(cm3 sont incubées avec 500 pM d'acide nucléique, 500 tM de cation hydrophobe (par exemple le CTAB), dans un tampon Tris-HCl (10 mM, pH = 7) sans chlorure de sodium (Desmidt et al., Nucl. Acid. Res. 19 (1991) 4695). Après 6 à 8 heures d'incubation, les nanoparticules peuvent être séparées de la suspension ou bien la suspens ion peut être utilisée, après dilution, pour tester l'efficacité de l'acide nucléique adsorbé sur les cellules appropriées. Généralement, quelques til de la suspension diluée (environ 100 fois dans l'eau distillée) sont ajoutés à 100 Crl du milieu de culture contenant les cellules, le nombre de p1 ajoutés étant calculé pour obtenir la concentration souhaitée en acide nucléique. Exemples Exemple 1: Sélection de l'antisens 1.1. Effet de la longueur Cet exemple montre que la longueur peut avoir un impact important à la fois sur la sélectivité et sur l'affinité de l'antisens et que, contrairement à la tendance générale, l'utilisation d'antisens de taille limitée offre des avantages très importwits. Les antisens suivants ont été synthétisés: - 5'-CACACCGACGGC (SEQ ID n" 1) - 12 mer - 5'-CACACCGACGGCG (SEQ ID n" 2) - 13 mer - 5'-CACACCGACGGCGC (SEQ ID n" 3) - 14 mer - 5'-CACACCGACGGCGCC (SEQ ID nO 4) - 15 mer - 5'-CCACACCGACGGCGCC (SEQ ID n" 5) - 16 mer La position de ces antisens vis-à-vis de la séquence cible (SEQ ID n" 6) est présentée sur la figure 1A. Les antisens correspondants dirigés contre le messager de ras normal ont également été synthétisés. Ces différents antisens ont été incubés en présence d'extraits nucléaires de cellules HeLa, et leur capacité à hybrider avec le messager de ras muté a été déterminée par clivage par la RNase H comme décrit dans les matériels et méthode. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1B. Ils montrent que les antisens AS-Val et (b) produisent déjà une réponse maximale. Ils montrent également qu'un signal non-spécifique important apparait dès que la longueur de l'antisens dépasse 13 mer. Ces résultats montrent donc que le meilleur rapport sjélectivité/affinité est obtenu avec les antisens de 12 ou 13 mer. 1.2. Effet de la position Cet exemple montre que, en plus de la longueur, la position de l'antisens par rapport à sa séquence cible est importante. Les antisens 12-mer suivants ont été synthétisés: - 5'-TGCCCACACCGA (roi : SEQ ID n" 7) - 5'-GCCCACACCGAC (R2 : SEQ ID n" 8) - 5'-CCACACCGACGG (R3 : SEQ ID nO 9) - 5'-CACACCGACGGC (R4: SEQ ID nO 1) - 5'-CACCGACGGCGC (R5 : SEQ ID n" 10) - 5'-CCGACGGCGCCC (R6 : SEQ ID n" 11) - 5'-GACGGCGCCCAC (R7 : SEQ ID nO 12) - 5'-ACGGCGCCCACC (R8: SEQ ID n" 13) La position de ces antisens vis-à-vis de la séquence cible (SEQ ID nO 6) est présentée sur la figure 1C.Ces différents antisens ont été incubés en présence d'extraits nucléaires de cellules HeLa, et leur capacité à hybrider avec le messager de ras muté a été déterminée par clivage par la RNase H comme décrit dans les matériels et méthodes. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1D. Ils montrent que les antisens centrés autour de la région mutée de la séquence cible (R4 et R5) produisent une réponse maximale. Exemple 2: Inhibition de la croissance des cellules HBLlOOrasl (figure 2) Cet exemple démontre les propriétés d'inhibition tout à fait remarquables de l'antisens encapsulé selon l'invention. Les cellules HBLlOOrasl ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une concentration de 4.103 cellules par puits dans 50 iil de milieu supplémenté de 7% de sérum de veau fétal inactivé à la chaleur, d'antibiotiques et de glutamine. Lorsque les cellules adhèrent au puits de culture (généralement au bout de 2 à 3 jours), les antisens encapsulés sont ajoutés, dans chaque puits, à deux fois la concentration finale dans 50 p1 de milieu de culture, résultant dans un volume final de 100 Cll par puits.Les antisens encapsulés ajoutés sont les suivants: - AS-Val (R5 : SEQ ID n" 10): Cffigure 2, ligne 1; - AS-Gly (SEQ ID n" 14: 5'-CACCGÇCGGCGC), dirigé contre l'ARNm de Ha-ras normal : Cf figure 2, ligne 2; - INV-Val (SEQ ID n" 15), correspondant à l'antisens AS-Val, mais dans l'orientation inverse: Cf figure 2, ligne 3; - AS-Val complexé au CTAB, mais non encapsulé: Cf figure 2, ligne 4; - mélange de AS-Val libre et d'un antisens non-spécifique de 20 mer (SEQ ID n" 16: 5'-CCCTCCTACCGCGTGCGAC) encapsulé: Cf figure 2, ligne 5. Après 72 heures d'incubation à 370C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02, les cellules ont été comptées au moyen d'un hèmocytomètre. La viabilité cellulaire, examinée au même moment par coloration au bleu trypan, est supérieure à 95% pour les cellules traitées et non traitées. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. Ils sont exprimés sous forme de pourcentage d'inhibition de la croissance selon la formule suivante: 100 x (Nn-N) / (Nn-NO), dans laquelle NO est le nombre de cellules présentes au départ, Nn est le nombre de cellules non traitées après n jours de croissance, et N est le nombre de cellules traitées après n jours. Ces résultats montrent que: - avec l'antisens AS-Val adsorbé à des nanoparticules, on obtient une inhibition de la prolifération des cellules HBLlOOrasl à des concentrations très basses (50 à 200 nM). Ces concentrations sont environ 100 fois plus faibles que celles auxquelles l'antisens non encapsulé est actif. - l'antisens AS-Val est spécifique des cellules contenant ras muté puisque aucun effet n'est observé sur les cellules HBLlOOnéo. De même, l'antisens dirigé contre le gène normal (AS-Gly), l'oligonucléotide de séquence inversée (INV) et l'oligonucléotide non-spécifique (NS) n'ont pas d'effet sur la prolifération des cellules HBL100ras1. - l'antisens AS-Val complexé au CTAB, mais sans nanoparticule ne produit qu'un effet très limité, montrant que les deux éléments (antisens + nanoparticule) sont essentiels pour obtenir l'effet recherché. Ceci est confirmé par l'absne d'effet observé en présence de l'antisens AS-Val libre et d'un antiseens non-spécifique encapsulé. Ce dernier résultat indique également que le complexe antisens- nanoparticle doit être formé préalablement à l'administration pour que l'effet recherché se produise. Ces résultats montrent donc que les composition de l'invention présentent une sélectivité et une activité très importantes. L'effet maximum pour une seule injection d'antisens a été observé trois jours après ajout de l'antisens à la culture. Exemple 3 : Etude comparée de la pénétration cellulaire (figure 3) Cet exemple montre que les antisens selon l'invention possèdent, outre leurs grandes sélectivité et efficacité, une capacité de pénétration cellulaire nettement améliorée par rapport aux antisens classiques. Pour mesurer la quantité d'antisens incorporée dans les cellules HBL100 (rasl et néo); les cellules ont été traitées avec des antisns, libres ou encapsulés, marqués en 5' au phosphore 32. Plus précisément, les cellules HBL100rasl (5.105) ont été étalées sur 2 ml de milieu complet pour chaque mesure. Lersque les cellules deviennent adhérentes, 5.106 cpm d'antisens et 400 pmoles d'oligonucléotide portera ont été ajoutés, seuls ou après adsorption sur nanoparticules comme décrit précédemment. Après les périodes d'incubation indiquées (Cf figure 3), les cellules sont récoltées et la radioactivité totale est mesurée (1) dans le milieu de culture et (2) dans la fraction comportant les débris cellulaires.Les antisens ont ensuite été extraits des lysats cellulaires comme décrit précédemment Ceichmann-Weinberg et al., Gene 72 (1988) 297), puis analysés en électrophorèse sur gel dénaturant contenant 20% de polyacrylamide pour analyser les antisens incorporés intracellulairement. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3. Cette figure donne, en fonction du temps, les quantités d'antisens intacts mesurées intracellulairement, pour les antisens encapsulés (parties hachurées) et pour les antisens non encapsulés (parties noires). Ces résultats montrent que les antisens encapsulés possèdent une capacité de pénétration cellulaire considérablement supérieure aux antisns libres. Par ailleurs, l'analyse en électrophorèse a également montré que les antiss intracellulaires adsorbés étaient intacts 24 heures après administration, et toujours détectables après 72 heures. Ceci est particulièrement remarquable dans la mesure où les mêmes antisens, sous forme libre, ne sont plus détectables au bout de 3 heures.Dans toutes les expériences, la quantité d'antisens incorporée à la cellule est environ 100 fois supérieure avec l'antisens adsorbé qu'avec l'antisens libre. En outre, les résultats obtenus montrent que les capacités d'incorporation des antisens encapsulés selon l'invention sont similaires pour les cellules HBL100ras1 et néo. Exemple 4: Activité in vivo des compositions de l'invention Cet exemple montre que les antisens selon l'invention possèdent des propriétés biologiques in vivo tout à fait remarquables et constituent ainsi des coutils thérapeutiques très promotteurs. 4.1. Effet des composition de l'invention sur le poids de tumeurs induites par l'inoculation de cellules HBLlOOrasl Il est connu que l'inoculation de cellules HBLlOOrasl à des souris " induit l'apparition de tumeurs (Lebeau et al., Oncogene 6 (1991) 1125). Cet exemple démontre l'effet de l'introduction préalable de composition selon l'invention dans les cellules HBLlOOrasl sur la génération de tumeurs. Les souris "nude" (males de 6 semaines obtenus auprès de l'Institut Aie) ont été maintenues dans des conditions aseptiques. Les cellules HBLlOOrasl ont été récoltées à partir de cultures monocouches sub-confluentes, puis mises en suspension à une concentration de 5.107 cellules par ml dans un tampon phosphate contenant 50 pM d'antisens (AS-Val ou INV-Val) préalablement adsorbé à 50 ig de nanoparticule PlHCA en présence de CTAB. Chaque souris (n=8) a ensuite reçu, par injection souscutanée, 100 Cll de la suspension cellulaire.Un jour avant puis 48 heures après l'injection des cellules, 100 trl de solution phosphate contenant 20 pM d'antisens adsorbé ont été injectés aux souris, au niveau de la région d'injection des cellules. L'injection a été répétée à 3 jours d'intervalle. Les souris contrôle (n=18) ont reçu 100 p1 de tampon PBS. Les animaux ont été sacrifiés 23 jours après l'injection des cellules, et les tumeurs sous-cutanées ont été excisées et pesées. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant. Ils montrent clairement que le poids des tumeurs des animaux traités par l'antisens AS-Val adsorbé diminue de manière statistiquement très significative. Ainsi, le poids moyen des tumeurs des animaux traités par l'antisens AS-Val est de 13 mg, alors qu'il est de 300 mg environ pour les animaux traités par l'antisens INV-Val. Animaux Antisens Antisens AS-Val adsorbé INV-Val adsorbé 1 15,7 587,6 2 63,4 768,1 3 31,2 384,8 4 0 402,3 5 0 168,6 6 0 65,6 7 0 56,9 8 0 15,8 4.2. Etude cinétique de l'évolution des volumes des tumeurs in vivo (figure 4) Dans l'exemple 4.1. , le traitement par l'antisens commence avant l'injection des cellules. Dans l'exemple qui suit, les tumeurs sont laissées 3 jours avant que le traitement à l'aide des compositions de l'invention ne commence. Cinq souris "nude" (males de 6 semaines obtenus auprès de lInstitut Curie) ont été inoculées avec 5.106 cellules HBLlOOrasl. Trois jours après rinoculabon, 100 pI de tampon phosphate contenant 50 IIM d'antisens (aval ou INV-Val) préalablement adsorbé à 50 llg de nanoparticule PIHCA en présence de CTAB ont été injectés au niveau de la tumeur établie (jour 1 sur la figure 4). 4 injections supplémentaires ont été réalisées aux jours 4, 6, 8 et 11. Les animaux ont été sacrifiés 21 jours après la dernière injection d'antisens. Sur l'ensemble du traitement, les souris ont reçu 100 zg d'antisens. Le volume des tumeurs palpables a ensuite été déterminé par 2 mesures perpendiculaires (longueur, largeur) et calculé selon la formule V = lo.la.2 / 2. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 4. Ils montrent clairement que le volume des tumeurs traitées par l'anises AS-Val (partie noire) est très inférieur à celui des tumeurs traitées par l'antisens INV-Val (partie hachurée). La différence peut être estimée environ à un facteur 5. Ces résultats démontrent que l'administratiuon locale (sous cutanée, intratumorale) de quantités très faibles d'antisens selon l'invention produit un effet thérapeutique important in vivo. Les compositions selon l'invention possèdent ainsi des propriétés particulièrement avantageuses pour le traitement des cancers ras dépendants. REVENDICATIONS 1 - Composition comprenant des acides nucléiques simple-brin de 8 à 13 nucléotides, complémentaires d'une région d'un ARNm d'un oncogène ras humain portant une mutation ponctuelle, adsorbés, inclus ou encapsulés dans des nanoparticules. 2 - Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les acides nucléiques ont une longueur comprise entre 10 et 13 nucléotides. 3 - Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que les acides nucléiques ont une longueur de 12 nucléotides. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la mutation ponctuelle est localisée au centre de la région complémentaire. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité active d'acide nucléique de séquence SEQ ID nO 10. 6. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les acides nucléiques sont associés à des composés hydrophobes cationiques. 7 - Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que les czxnpods hydrophobes cationiques sont choisis parmi les halogénures de tétraphénylphosphonium, les sels d'ammonium quaternaires, des amines grasses, des polypeptides cationiques ou des lipides cationiques. 8 - Composition selon la revendication 7 caractérisée en ce que les compoBés hydrophobes cationiques sont choisis parmi l'hexadécyltriméthylammoniwn bromure; les polypeptides de formule (LKLK)n ou (LKKL)n, Compléter. 9 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que les nanoparticules sont des polymères ou des copolymères d'un cyanoecryla(e d'alkyle, de l'acide lactique et/ou de l'acide glycolique. 10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que la nanoparticule est constituée de polyisohéxylcyanoacrylate. 1 1 - Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l'on agite en suspension la nanoparticule ou les monomères correspondants, avec l'acide nucléotidique, associé ou non à un composé hydrophobe cationique. 12 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'on opère à un pH voisin de 7. 13 - Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12 caractérisé en ce que l'on opère en présence d'un stabilisant des nanoparticules. 14 - Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que le stabilisant est un copolymère polyoxyéthylène-polyoxypropylène non ionique ou du polyoxyéthylène. 15 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une composition selon l'une des revendications 1 à 10 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables.