FR 2710152 A1 19950324 FR 9311086 A 19930917 PROCEDE DE DOSAGE D'UNE ENZYME ET PROCEDE DE DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE D'UN ANTIGENE UTILISANT UNE ELECTRODE MODIFIEE ET KIT DE DOSAGE La présente invention concerne un procédé de dosage d'une enzyme et un procédé de dosage immunoenzymatique d'un antigène, pour lesquels la détection se fait sur une électrode modifiée par un composé polyonique favorisant l'accumulation du produit de la réaction enzymatique. L'invention concerne également un kit de dosage, utilisé lors de la mise en oeuvre de ces procédés. Les enzymes sont des catalyseurs intervenant dans de nombreuses réactions du métabolisme humain et animal et à ce titre sont présentes dans les tissus et les organes. Plus précisément, ce sont des protéines ayant une activité catalytique sur des substrats spécifiques. A titre d'exemple, l'alcaline phosphatase est présente dans divers tissus et notamment dans le foie ou dans les os. Cette enzyme intervient dans le métabolisme des glucides. La diminution ou la disparition de certaines de ces enzymes entraîne généralement des troubles fonctionnels au niveau de l'organisme. Il est alors important d'effectuer des dosages de ces enzymes afin de pouvoir détecter certaines anomalies pathologiques. Par ailleurs, de nombreuses techniques de dosage immunoenzymatique se sont développées ces dernières années et sont utilisées dans le domaine médical, vétérinaire, dans l'industrie agro-alimentaire ou en écologie. Elles remplacent avantageusement les techniques de radio-immunodosage. Ces techniques permettent de doser tout type d'antigènes, notamment des produits toxiques, des médicaments et des molécules chimiques. Ainsi, les tests ELISA sont basés sur l'utilisation d'une enzyme comme marqueur. Les méthodes de dosage immunologique permettent de doser des antigènes même si ceux-ci sont présents en faibles quantités. Le dosage est basé sur le fait que les anticorps (Ac) reconnaissent, puis se lient de manière spécifique aux antigènes (Ag), pour donner un complexe anticorps-antigène, selon la réaction équilibrée suivante Ac + Ag t Ac - Ag fraction libre complexe Parmi les techniques de dosage immunoenzymatique, on connaît une méthode dite de "dosage compétitif hétérogène" qui consiste à introduire et à mettre en réaction une quantité définie d'antigènes marqués par une enzyme et une quantité indéfinie d'antigènes non marqués, (antigène à doser), face à une quantité limitée et connue d'anticorps fixés sur les parois d'un tube à essai. Après la première réaction immunologique, seule une fraction des antigènes marqués par une enzyme et des antigènes à doser a réagi avec les anticorps, tandis que le reste des antigènes à doser et des antigènes marqués se présente sous forme de fraction libre à l'intérieur du tube à essai. On effectue alors un rinçage et un lavage du tube à essai avant d'ajouter le substrat spécifique de l'enzyme de marquage. L'enzyme liée à l'antigène et à l'anticorps réagit alors de façon à transformer le substrat S en un produit P spécifique détecté généralement par des techniques spectroscopiques, telles que les mesures d'absorbance ou de fluorimétrie. Toutefois, les mesures d'absorbance ne sont pas toujours suffisamment sensibles et les mesures fluorimétriques, bien que présentant des limites de détection supérieures, sont également sensibles aux interférences endogènes, ce qui diminue la spécificité du dosage. On connaît également d'après l'art antérieur des procédés de dosages immunologiques dans lesquels l'en- zyme liée à un antigène transforme un substrat S non électro-actif (ou difficilement électro-actif) en un produit P électro-actif, susceptible d'être détecté par ampérométrie. Ainsi, l'article de V.J. RAZUMAS et al. "Kinetic amperometric determination of hydrolase activity", Analytica Chimica Acta, (1980) 117, 387-390, décrit l'un de ces procédés de détection utilisant, d'une part, l'alcaline phosphatase comme enzyme et les esters phosphates de polycatéchol et p-aminophénol comme substrat et, d'autre part, la ss-D-glucoside glucohydrolase comme enzyme et la p-aminophénol ss -D-glucoside comme substrat. L'article de K.R. Wehmeyer et al., "Competitive heterogeneous enzyme imunoassay for digoxin with electrochemical detection", Anal. Chem. (1986), 58, 135-139, décrit un dosage immunoenzymatique compétitif, hétérogène, pour la détermination de la digoxine (antigène) dans le plasma humain. L'enzyme utilisée est l'alcaline phosphatase et le substrat est le phénylphosphate. La demande de brevet EP 0 223 541 décrit un procédé de dosage enzymatique électrochimique. Ce procédé permettant de doser l'oestradiol utilise l'alcaline phosphatase comme enzyme et l'ester phosphate du 4-N-ferrocénoylaminophénol comme substrat. Enfin, la demande de brevet EP 0 424 586 divulgue un procédé de dosage immuno-électrochimique de l'alcaline phosphatase consistant à faire réagir cette enzyme avec le 1-naphtyl phosphate pour former le 1-naphtol électroactif, détecté par une électrode au carbone. Malheureusement, dans certains cas, le substrat et le produit obtenu présentent des électroactivités voisines et de ce fait, le procédé de dosage ne remplit pas les critères de sélectivité imposés. Parmi les techniques de dosage immunoenzymatique, on connaît également une méthode dite de "dosage compétitif homogène" qui consiste à faire réagir simultanément dans un tube à essai l'antigène à doser (Ag), un antigène marqué par une enzyme spécifique (Ag-E), l'anticorps (Ac) et le substrat (S) dont la transformation est catalysée par l'enzyme précitée. La réaction est la suivante Une partie des antigènes à doser et des antigènes marqués par l'enzyme réagit avec l'anticorps pour former un complexe (Ac/Ag ou Ac/Ag-E), tandis qu'une partie des antigènes marqués par une enzyme reste libre. Seule cette fraction libre réagit avec le substrat S de façon à donner un produit P. La détection du produit P s'effectue par les mêmes techniques que celles citées pour la méthode dite de "dosage compétitif hétérogène" et présente donc les mêmes inconvénients. En outre, si cette technique de dosage homogène permet d'éviter les étapes de transfert, de décantation et de lavage, il faut toutefois que l'activité enzymatique de l'enzyme présente dans le complexe (Ac/Ag-E) soit nettement inférieure à celle de l'antigène libre marqué par une enzyme (Ag-E), voire même négligeable, pour que la transformation du substrat S en produit P soit effectuée préférentiellement par l'Ag-E libre. Ces inconvénients limitent donc le choix d'enzymes susceptibles d'être utilisées dans ces techniques. On connaît encore des techniques de dosage de type "sandwich hétérogène" dans lesquelles l'antigène à doser est pris en "sandwich" entre un anticorps fixé sur les parois d'un tube à essai et un anticorps marqué par une enzyme. Cette enzyme permet ultérieurement de transformer un substrat S en produit P, susceptible d'être détecté. Ces techniques de dosage présentent les inconvénients précédemment cités, inhérents au type de détection utilisé. En conséquence, l'invention concerne un procédé de dosage d'une enzyme et un procédé de dosage immunoenzymatique avec détection électrochimique dans lesquels la sensibilité de la détection du produit P est accrue. Selon les caractéristiques de l'invention, le procédé de dosage d'une enzyme comprend les étapes consistant à : - faire réagir l'enzyme à doser avec un substrat dont la transformation en un produit électroactif ionique ou pro-ionique est catalysée par ladite enzyme, - collecter ledit produit électroactif ionique ou pro-ionique obtenu, sur une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle dudit produit obtenu, de façon que ce produit se concentre dans ledit composé polyionique pendant une période d'accumulation, - mesurer le signal fourni par ladite électrode à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode. Un produit électro-actif "pro-ionique" est un produit qui devient ionique par oxydation anodique (composé "pro-cationique") ou par réduction cathodique (composé "pro-anionique") Le signal mesuré par les moyens de détection électrochimique augmente avec la quantité d'enzyme présente dans l'échantillon. Le composé polyionique de l'électrode est capable grâce à sa grande affinité pour le produit obtenu à l'issue de la réaction enzymatique, d'accumuler celui-ci par échange ionique et ainsi d'exalter l'effet amplificateur de l'enzyme. L'association d'un capteur électrochimique sensible avec les propriétés d'une enzyme spécifique conduit à une technique d'analyse simple à mettre en oeuvre, peu coûteuse et extrêmement performante puisqu'elle permet de détecter une enzyme à des concentrations pouvant atteindre 10-12 à 10~13mol.1~l. Le procédé de dosage immunoenzymatique d'un antigène selon l'invention comprend les étapes consistant a: - faire réagir une enzyme servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser avec un substrat dont la transformation en un produit électroactif ionique ou pro-ionique est catalysée par cette enzyme, - collecter le produit électroactif ionique ou pro-ionique obtenu par la réaction enzymatique, sur une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle dudit produit obtenu, de façon que ce produit se concentre dans ledit composé polyionique pendant une période d'accumulation, - mesurer le signal fourni par ladite électrode à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode. Ce procédé de dosage peut s'appliquer à toutes les catégories d'immunodosage et notamment aux dosages compétitifs homogènes ou hétérogènes ou aux dosages de type "sandwich". Le couple substrat/produit est choisi judicieusement de façon à ce que l'accumulation du produit dans le composé polyionique soit favorisée au détriment de l'accumulation du substrat, voire même que l'accumulation du substrat soit impossible. En concentrant préférentiellement le produit dans le composé polyionique, le signal électrochimique détecté à l'électrode est amplifié, ce qui accroît la sensibilité de la technique. Ce procédé de dosage permet de quantifier des antigènes tels que des médicaments, des hormones, des protéines, des pesticides, des toxines, avec une limite de détection de 10-12 à 10-13 mol.l-l. Enfin, l'invention concerne également un kit de dosage caractérisé en ce qu'il comprend - un substrat susceptible d'être transformé en un produit électroactif ionique ou pro-ionique, sous l'action de catalyse d'une enzyme, - une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle du produit électroactif ionique ou pro-ionique, et dans lequel ledit produit est susceptible de s'accumuler, - des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par cette électrode. Ce kit de dosage permet la mise en oeuvre des procédés de dosage précités. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation de l'invention donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif. Cette description est faite en faisant référence aux dessins joints, dans lesquels - la figure 1 est un schéma illustrant le procédé de dosage d'une enzyme selon l'invention, - les figures 2 et 3 illustrent deux variantes de réalisation de l'électrode utilisée dans les procédés de dosage selon l'invention, - les figures 4 et 5 sont des courbes représentant des résultats obtenus par voltamétrie à vague carrée, - la figure 6 est une courbe représentant la relation entre l'intensité de pic et la concentration (C) en 2- (N-ferrocenoyl-amino) 4, 6-diméthylphénol, - la figure 7 est un graphique représentant la variation de l'intensité de pic en fonction de la concentration en alcaline phosphatase, dans diverses conditions expérimentales, - les figures 8, 9 et 10 sont des schémas illustrant trois variantes de réalisation du procédé de dosage immunoenzymatique selon l'invention, - la figure 11 est une courbe de calibration de l'essai 2 décrit ci-après, - les figures 12 et 13 sont des courbes représentant respectivement la variation de l'intensité du pic en fonction de la concentration en anti-phénytoïne ou en phénytoine, et - la figure 14 est une courbe standard de titrage de la phénytoine utilisable dans le cadre d'un dosage compétitif hétérogène. La figure 1 illustre le principe du procédé de dosage d'une enzyme selon l'invention. Ce procédé consiste à faire réagir une enzyme E avec un substrat S de façon que cette enzyme catalyse la transformation du substrat S en produit P et que ce produit pénètre et s'accumule à l'intérieur d'un composé polyionique 1 inclu dans une électrode 3 constituée par exemple, d'un cylindre en carbone vitreux. L'accumulation du produit P dans le composé polyionique 1 permet d'amplifier le signal observé à la sortie de l'électrode 3. Cette électrode 3 est reliée à des moyens de détection électrochimique 5 permettant l'interprétation de ce signal. Ces moyens de détection 5 comprennent un dispositif de mesure 7 relié à un appareil 9 pour tracer des graphiques fournissant des courbes de résultats. Les moyens de détection 5 (ou plus précisément le dispositif de mesure 7) utilisent le principe de l'ampérométrie, de la coulométrie, de la voltampérométrie ou avantageusement de la voltammétrie à vague carrée. Dans le mode de réalisation illustré en figure 1, le composé polyionique se présente sous forme d'un film recouvrant la surface extérieure de l'électrode de travail 3. Toutefois, il serait également possible d'utiliser une série d'ultra microélectrodes recouvertes d'un film polyionique ou une électrode formée d'une pâte de graphite imprégnée du composé polyionique comme cela est illustré respectivement aux figures 2 et 3. La figure 2 illustre un exemple de réalisation d'électrode à ultra microdisques, telle que celle commercialisée par la Société Ecosse Sensor. Cette électrode 11 est réalisée par lithographie et constituée de 500 microdisques de carbone (diamètre = 10 ssm, surface totale S = 3,9.10-2 mm2) déposés sur un support 12 et contenus dans la partie circulaire 13. L'électrode 11 est placée à côté d'une électrode de référence 15 en Ag/AgF entourant la partie circulaire 13. Le film de composé polyionique 1 est déposé par dessus la partie 13 à l'aide d'une seringue puis séché au four pendant 10 minutes. La figure 3 illustre un exemple de réalisation d'une électrode 17 à pâte de graphite imprégnée du composé polyionique et présentant une surface renouvelable. Cette électrode 17 est montée à l'extrémité d'un embout 19 et elle est reliée par un conducteur 21 à une électrode tournante Taccusel 23. L'extrémité de l'électrode 17 peut être découpée après usage pour un nouvel usage. Le composé polyionique 1 peut être de nature polyanionique ou polycationique. Le produit P est alors respectivement cationique (ou pro-cationique) ou anionique (ou pro-anionique). Le composé polyionique 1 peut être d'origine minérale ou organique. Comme composés minéraux à propriétés d'échange cationique, on peut envisager par exemple, l'utilisation de zéolithes et d'argiles (montmorillonite, laponite) . Des argiles synthétiques du type hydrotalcite présentent, quant à elles, des propriétés d'échange anionique. Comme composé organique, un exemple de composé polyanionique est un polymère perfluoré auquel sont greffés des groupements acides sulfoniques. L'un de ces polymères est connu sous le nom de marque Nafion (fabriqué par E.I. Du Pont de Nemours), et présente la formule chimique suivante dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3. De préférence, le polymère utilisé a une masse de 1100g par mole de site SO3H. A pH 7,4, ce polymère se présente sous forme polyanionique. Ce polymère est en outre thermiquement et chimiquement très stable, insoluble dans l'eau seule et donc dans les analytes. Il présente de bonnes propriétés de transfert ionique. Les groupements fluorés assurent le caractère hydrophobe et les groupements S03 le caractère anionique du polymère. Toutefois, il serait également possible d'utiliser d'autres polymères organiques polyanioniques tels que, par exemple, du polypyrrole N-substitué par une chaîne alcanoique (ex : (CH2)nCO2H) ou sulfonique, (ex (CH2)nS03H). Il serait également possible d'utiliser des polymères organiques polycationiques, tels que l'un de ceux donnés dans le tableau I ci-dessous à titre d'exemple. Tableau 1 Nom du film polycationique Formule chimique polytyramine (utilisé en milieu acide) fH I CY t (utilisé en milieu acide) H poly-4-vinyl-1-méthyl pyridinium v C H S o e CH3 polypyrrole (utilisé à l'état oxydé) 'N/ J polypyrrole N-substitué par une chaîne alkyl ammonium ~te A Le choix de l'enzyme E et du couple substrat S/produit P s'effectue en ' fonction de la nature du composé polyionique 1. Il est en effet nécessaire que le produit P pénètre facilement dans le composé polyionique au détriment du substrat S, ce dernier étant ou non électroactif. Lorsque le composé polyionique 1 est de nature polycationique (cf tableau 1 précédent), on utilise avantageusement comme enzyme une hydrolase telle que la cholinesterase EC-3-1-1-8 par exemple. Cette enzyme intervient dans la réaction suivante (cH3)3-N-(cH2)-o-c-R + 1120 cho6 Cl O s (CH3)3-N±(cH2)2oH R-C-O Cl O P Lorsque le composé polyionique 1 est de nature polyanionique, comme le Nafion (marque déposée), par exemple, on utilise avantageusement comme enzyme une oxydoréductase telle que la péroxydase EC-1-11-1-7, une transférase telle que la y-glutamyltransférase EC-2-3-2-2 ou une hydrolase telle que la -D-glucu- ronidase EC-3-2-1-31 ou l'alcaline phosphatase EC-3-1-3-1. On rappelle ci-après pour chaque enzyme les réactions de transformation entre le substrat S et le produit P suite à la réaction de catalyse de l'enzyme. Les exemples sont choisis de façon à ce que le substrat S soit électro-inactif et/ou de charge globale négative, ce qui défavorise son accumulation dans le film polyanionique, et le substrat P cationique ou procationique. Dans ce dernier cas, il devient cationique pendant la période d'accumulation où il pénètre dans le film de composé 1 et s'oxyde à l'anode en une forme cationique. C'est sous cette forme qu'il s'accumule dans le film polyanionique. - Oxydoréductases ex.: péroxydase S P D représentant le donneur, c'est-à-dire par exemple la forme leuco du vert de malachite qui conduit au vert de malachite (D+). - Transférases ex.: y-glutamyltransférase R2NH2 représentant par exemple un aminoacide et R1NH2 des dérivés électroactifs de l'aniline. ex : ss-D glucuronidase COOH ro + OR "" glucuronidase, 1- r OH OH s COOH À;iOH + ROH OH OH OH ROH représentant, par exemple, l'un des alcools donnés dans le tableau 2 ci-après. ex : alcaline phosphatase (A.P.) R-0-P03- + 1120 > ROH + HPO2 S milieu neutre P ou faiblement basique Le reste R assure d'une part l'électroactivité de l'alcool et d'autre part, son caractère cationique ou procationique, de façon à favoriser son accumulation dans le film de Nafion. Quelques exemples d'esters de phosphate et d'alcools satisfaisant à ces critères sont donnés ci-dessous dans le tableau 2. Tableau 2 DSt5t S Produit P ester phosphate de ferrocénylméthanol terrocénylmethanol çCH20H çCH20m5 ç s ester phosphate je 2-(N-ferrocénoylamln0)4,o ~-IN-ferocén:am;i > ),u -dimethylphenol -i;méthylphénol O Me 11 ~{ Il Me I o C-N SON HO Me 0Pc; Me ester pncspnat 4-hydroxy-TEMPO 4-nydroxy-TEMFt OH MMe MÀk:: Me Me Me Me o. o. ester phosphate au - lorhyorate chlorhydrate de je 2-lN,N-dlméthyl3minométhil! 2-(N,N-diméthylamlno 4-amlnopnénol méthyl)4-amlnophenol ,CH3 OH , CH3 a $CH2-NH ; Cl ,CHz-NH ; Cl~ NH2 NHz ester pnospnate je hexafluorophosphate de i 'hexafluorophosphate je 4-N-cobaltocénoylamlno 4-N-coDaltocénoylamlnophénol phénol o H F6 3, 2 P C- N O C- OH - +Co s.- C- N pFs ester phosphate de 4-ferrocényl 4-ferrocényl phénol pnénoi oeo' Pour les couples substrat S/produit P 1, 2 et 6, le reste ferrocényle assure à la fois l'électroréactivité et le caractère procationique du composé. L'oxydation anodique du ferrocène en ferricinium se produit entre 0,2 et 0,4 volts (électrode Ag/Agcl). Il en est de même du reste NO dans le couple 3. L'oxydation du NO en NO+ se produit vers 0,5 volt. Le chlorhydrate d'amine du couple 4 est protoné jusqu'aux pH faiblement basiques. Dans ce cas, c'est l'aminophénol qui s'oxyde de façon réversible. Pour le couple 5, le cobalticinium se réduit de façon réversible en cobaltocène vers -1 volt. Les alcools des couples 1 et 3 sont commercialisés. L'ester phosphate du couple 3 est également commercialisé et les autres esters peuvent être synthétisés à partir du réactif POIL3 dans la pyridine. L'alcool du couple 2 a été préparé à partir d'aminophénoldiméthylé et de chlorure de l'acide carboxylique du ferrocène. Le point de fusion de cet alcool est de 221"C (acétate d'éthyle/hexane). Analyse de l'alcool C19H19NO2Fe (%) calculé : C = 65,35 ; H = 5,48 N = 4,01 ; Fe = 16,00, et C19H19NO2Fe (%) trouvé : C = 65,60 ; H = 5,55 N = 3,94 ; Fe = 15,76. L'ester phosphate du couple 2 a également été préparé et présente un point de fusion variant entre 214 et 2150C (acétone/CH2Cl2). Analyse de l'ester C19H20NOgFeP (8) calculé : C = 53,17 ; H = 4,97 N = 3,26 ; P = 7,22, et C19H20NO5FeP (;) trouvé : C = 53,38, H = 4,97 N = 3,32 ; P = 7,24. Mise en évidence des propriétés d'accumulation sélective des électrodes modifiées par un film de Nafion (marque déposée) Les propriétés d'accumulation sélective du Nafion ont été démontrées à partir du couple substrat/produit n02 du tableau 2, en utilisant l'alcaline phosphatase comme enzyme. Electrode de carbone recouverte d'un film de Nafion Ces mesures ont été effectuées par voltammétrie à vague carrée. La cellule d'électrolyse comprend un réservoir central dans lequel on dépose 0,5 à 1 ml de la solution à analyser contenant le substrat S n02 ou le produit P nO 2 dilué dans un tampon phosphate pH 7,4. Cette cellule comprend en outre une contre-électrode en fil de platine, une électrode de référence Ag/Agcl et l'électrode de travail constituée par un disque de carbone vitreux (diamètre = 3 mm surface S"= 7 mm2), recouvert d'un film élaboré à partir de Nafion en poudre en suspension dans un mélange alcools aliphatiques /eau, (disponible chez Aldrich, 27,470-4) d'une épaisseur de 0,4 clam. L'enregistrement des voltammogrammes sur électrode stationnaire a été précédé d'une période d'accumulation du substrat nO 2 ou du produit nO 2 dans le film de Nafion d'une durée de 5 minutes. Pendant la période d'accumulation, l'électrode recouverte du film de Nafion est mise en rotation à raison de 600 tours/min et est maintenue à un potentiel de 0,6 volt. Les voltammogrammes de la figure 4 ont été obtenus par balayage des potentiels entre 0,6 volt et 0 volt, ce qui correspond à la réduction du ferricinium en ferrocène. La courbe A illustre les résultats obtenus avec le substrat S nO 2 (concentration 2.10-5 mol.l-l dans le tampon pH 7,4) et la courbe B les résultats obtenus avec le produit P n" 2 (concentration 10-5 mol.l-l dans le tampon pH 7,4). A partir des résultats de cette figure, on constate que le rapport entre la valeur du courant de pic et la concentration en substrat ou en produit dans le tampon est 80 fois plus élevé pour le produit que pour le substrat, ce qui montre la grande sélectivité du Nafion en faveur du produit P nO 2. Par ailleurs, la courbe C correspond au voltammogramme obtenu pour le produit P nO 2 (concentration 10-5 mol.l-1 dans le tampon pH 7,4), en l'absence du film de Nafion. La comparaison des courants de pic de la courbe B correspondant au produit P n" 2 et de la courbe C correspondant au produit P nO 2 sans le film de Nafion, montre que le signal est amplifié environ 14 fois sur l'électrode au Nafion par rapport à une électrode classique. Ultramicroélectrodes Des mesures ont également été effectuées dans des conditions identiques mais avec une électrode du type ultramicroélectrode recouverte par un film de Nafion telle que celle illustrée en figure 2. La figure 5 jointe représente les voltammogrammes à vague carrée obtenus pour le produit P nO 2 (concentration 2.10-5 mol.l-1 dans le tampon à pH 7,4). La courbe A représente les résultats obtenus immédiatement après le trempage de l'électrode dans la solution tandis que la courbe B représente les résultats obtenus après une accumulation du produit P nO 2 dans le film de Nafion pendant 10 minutes. Le courant de pic pour la courbe A présente une valeur de 0,065 zA et passe à une valeur de 0,23 tA pour la courbe B. Ceci traduit l'accumulation du produit dans le film de Nafion. Electrode à pâte de graphite Enfin, une troisième série de mesures a été effectuée avec l'électrode à pâte de graphite telle que celle illustrée en figure 3, (diamètre : 3 mm, surface : 7 mm2). La pâte de graphite imprégnée de Nafion contient entre autres du Nafion (disponible chez Aldrich 27,470-4), et de la poudre de graphite (disponible chez Ultra Corps CO14145-10/UCP 1M) . Les conditions expérimentales sont les mêmes que précédemment. La figure 6 illustre la relation de linéarité existant entre l'intensité de pic et la concentration c en produit P nO 2 du tableau 2. Cette électrode permet donc d'obtenir des résultats fiables et reproductibles. A partir du principe de dosage illustré en figure 1, il est possible d'envisager le dosage indirect d'une enzyme. Essai 1 : Dosage d'une enzyme Un exemple de dosage de l'enzyme alcaline phosphatase a été réalisé dans les conditions expérimentales suivantes. Un échantillon a été préparé en mélangeant dans un tampon NaHCO3 (pH 9,6) le substrat S nO 2 du tableau 2 à une concentration de 10-5 mol.l-l, MgSO4 à une concentration de 10-2 mol.l-l et de l'alcaline phosphatase (Sigma P 4252), à des concentrations variant entre 0,24 et 24 unités par litre. Le volume de l'échantillon est de 1 ml. L'échantillon est maintenu à 30"C. Après 15 minutes de période d'incubation, le pH est ramené à 7,5 par a Une seconde mesure a été effectuée en modifiant légèrement les conditions expérimentales. On utilise 100 zl de tampon TRIS (pH 10,2) contenant 10-4 mol.l-l du substrat S nO 2, 5.10-3 mol.l de NaCl, 10-2 mol.l-l de MgSO4 et l'alcaline phosphatase à des concentrations variant entre 0,24 et 1,8 unités par litre. Après incubation pendant 30 minutes, le volume de l'échantilon est ramené à 1,0 ml par ajout de 900 pl de NaHCO3 et 4 ptl d'acide chlorhydrique 4 M. L'échantillon a ensuite été transféré dans la cellule d'électrolyse identique à celle décrite dans les exemples précédents. La droite B de la figure 7 illustre les résultats obtenus. On atteint une limite de détection de 0,024 unités par litre, ce qui correspond à une concentration en alcaline phosphatase Sigma P 4252 de 1,3.10-12 mol.l~1. Sur un principe similaire à ce qui vient d'être décrit pour le dosage de l'enzyme, c'est-à-dire en associant une enzyme spécifique, un couple (substrat S /produit P) et un capteur comprenant un composé polyionique susceptible d'accumuler le produit P formé lors de la réaction enzymatique, il est possible d'effectuer des dosages immunoenzymatiques. Le principe général du dosage immunoenzymatique d'un antigène consiste à - faire réagir une enzyme E servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser, avec un substrat S de façon que l'enzyme catalyse la réaction de transformation du substrat S en un produit P électroactif ionique ou pro-ionique, et - collecter ledit produit P sur une électrode munie d'un des composés polyioniques précédemment décrits, de façon que le produit P se concentre dans le composé polyionique et puisse ensuite être détecté. Le principe de détection, les enzymes, les substrats et les produits sont identiques à ce qui vient d'être décrit pour le dosage enzymatique. Ce principe de dosage immunoenzymatique s'applique aux dosages compétitifs homogènes ou hétérogènes ou aux dosages de type sandwich. La figure 8 illustre un exemple d'immunodosage de type compétitif homogène. Dans ce cas, on fait réagir l'antigène à doser (Ag), l'antigène marqué par une enzyme (Ag-E), l'anticorps (Ac) et le substrat S. Au cours de la réaction, une partie des antigènes marqués par une enzyme (Ag-E)et des antigènes à doser (Ag) se fixe sur les anticorps (Ac), tandis que seule la fraction restée libre d'antigène marqué par une enzyme (Ag-E) réagit avec le substrat S pour donner le produit P qui s'accumule alors dans le composé polyionique 1. Le reste du dispositif (électrode 3 et moyens de détection) est identique à ce qui a été décrit pour la figure 1 et porte les mêmes références. Toutes les autres variantes précédemment décrites concernant la structure des électrodes, les enzymes, le couple substrat/produit et le composé polyionique peuvent également être utilisés ici. La figure 9 illustre un exemple d'immunodosage du type compétitif hétérogène. Dans ce cas, l'anticorps (Ac) présent en quantité limitée est fixé sur les parois d'un tube à essai, par exemple, et l'on fait réagir une quantité fixe d'antigène marqué par une enzyme (Ag-E) en compétition avec l'antigène à doser (Ag) . Après les étapes de lavage et de rinçage, le substrat S est ajouté. Seuls les complexes Ac/Ag-E réagiront avec le substrat S pour le transformer en produit P de façon proportionnelle à la quantité d'antigène marqué présent sous forme de complexe Ac/Ag-E. Tous les autres paramètres du dosage (enzyme, couple substrat/produit, composé polyionique, électrode et moyens de détection) sont identiques à ce qui a été précédemment décrit en relation avec la figure 1 et le dosage de l'enzyme. La figure 10 illustre un exemple d'immunodosage du type "sandwich". Dans ce cas, l'anticorps (Ac) présent en excès est fixé sur les parois d'un tube à essai, par exemple. L'antigène à doser (Ag) est ajouté et réagit avec les anticorps (Ac). Ensuite, des anticorps marqués par une enzyme (Ac-E) sont ajoutés en excès et prennent en "sandwich" les antigènes liés aux anticorps. Le substrat S est ajouté après le rinçage du tube à essai. Tous les autres paramètres du dosage (enzyme, couple substrat/produit, composé polyionique, électrode et moyens de détection) sont identiques à ce qui été précédemment décrit en relation avec la figure 1 et le dosage de l'enzyme. Ces différents types de dosage immunoenzymatique selon l'invention peuvent être utilisés pour doser n'importe quel antigène susceptible d'être lié à une enzyme répondant aux impératifs de l'invention ou n'importe quel antigène ayant un anticorps spécifique susceptible d'être lié à une telle enzyme. On donnera ci-après deux exemples de réalisation de dosages compétitifs de type homogène et hétérogène, appliqués au dosage de la phénytoïne. Ce produit est un antiépileptique dont l'index thérapeutique est compris entre 2.10-5 mol.l-l et 8.10-5 mol.l-l. Essai 2 : Dosage compétitif en phase homogène On utilise pour ce dosage, la phénytoine marquée par l'alcaline phosphatase (Phen-A P, Interchim Ref. FIT 80-IP30, solution commerciale de 50 unités/ml dans un tampon TRIS). - courbe de calibration Celle-ci est illustrée sur la figure 11. Elle a été réalisée selon les conditions expérimentales de la courbe B de la figure 7. - vérification de l'affinité entre le phénytoine marquée à l'alcaline phosphatase et l'antisérum L'affinité entre l'antigène et l'anticorps est vérifiée de la façon suivante. On réalise une immunoréaction à 37 C pendant 30 minutes entre 100 unités par litre d'antigène marqué (phénytoïne marquée à l'alcaline phosphatase AP) et d'antisérum contenant des anticorps anti-phénytoine dans un volume de 250 ptl de NaCl (5.10-3 mol.l-1) en présence de sérum normal de lapin. On réalise alors la réaction enzymatique à 37 C, après addition de 250 ptl de tampon TRIS contenant NaCl (5.10-3 mol.l~1), MgSO4 (2.10-2 mol.l~1) et 2 10-5 mol.l-l de substrat n 2 du tableau 2 (ester phosphate de 2- 2-(N-ferrocénoylamino)4,6-diméthylphénol). La réaction dure 15 minutes. On ajoute enfin 500 ptl de NaHC03 (pH 9,6), 7 Ill de HCl 4 M et on procède à une période d'accumulation du produit n 2 pendant une durée de 5 minutes dans l'électrode de mesure. La détermination s'effectue par voltammétrie à vague carrée dans les mêmes conditions expérimentales que celle de la courbe A ou B de la figure 4. Cette réaction est répétée en ajoutant des quantités croissantes d'antisérum, le volume total d'antisérum et de sérum normal de lapin étant maintenu constant à 6 Ktl et le volume de la solution finale contenant la phénytoine marquée, le substrat et l'antisérum étant de 1 ml. En présence d'ajouts croissants d'antisérum anti-phénytoïne, la quantité de complexe anti-phénytoïne/phénytoïne marquée par AP augmente aux dépens de la phénytoine marquée par AP libre, et la diminution du signal électrique confirme que la transformation enzymatique du substrat n" 2 en produit n 2 ne peut se faire que par l'intermédiaire de la phénytoine marquée par AP libre. A partir des conditions expérimentales correspondant au point A de la figure 12, une courbe standard de titrage de phénytoine (figure 13) a été obtenue par ajout de quantités croissantes de phénytoine au niveau de l'étape d'immunoréaction. Cette courbe de calibration est directement utilisable pour doser des échantillons cliniques après dilution, et elle a été utilisée pour le dosage d'un échantillon El, en introduisant 1,5 pLi de El, 1,5 Zl de sérum normal de lapin et 3 Zl d'anti-phénytoïne au niveau de l'étape d'immunoréaction. Après accumulation et détermination voltammétrique, on obtient pour le courant de pic un signal de 6,3 ssA correspondant, d'après la courbe de calibration de la figure 13, à une concentration en phénytoine de 4,0.10~8mol.1~1, soit une concentration en phénytoine, dans l'échantillon El, de 2,7.10~5mol.1~1. La valeur théorique déterminée dans un laboratoire hospitalier par chromatographie liquide haute performance est de 3,2.10-5mol l-l. Essai 3 : Dosage compétitif en phase hétérogène Pour immobiliser l'antisérum sur les parois d'un tube à essai maxisorp (Polylabo réf. 470319), l'anticorps anti-phénytoine est dilué 100 fois dans un tampon phosphate pH 7,4, puis 200 pLi de cette solution sont introduits dans le tube à essai. Après 15 heures de contact à 4"C, le tube à essai est rincé par un mélange tampon phosphate/Tween 20 en volume 0,1% [Aldrich 27, 434-8] (400 lx3 pendant 10 minutes). L'évaluation de l'activité enzymatique de la phénytoïne marquée par l'alcaline phosphatase, lorsque tous les anticorps présents sur les parois du tube sont complexés par la phénytoïne marquée, s'effectue selon le protocole suivant : 1 L'introduction dans le tube de 10 Al de phénytoïne marquée (5000 Ul-1) et de 190 l de tampon phosphate, est suivie de 60 minutes d'incubation à 37 C, puis de deux rinçages pendant 10 minutes au tampon phosphate/Tween 20 et de deux rinçages au tampon TRIS. Il a été vérifié que la phase liquide (environ 200 zl) extraite à la seringue après incubation et avant rinçage, contient de la phénytoïne marquée libre en excès. 2 Après introduction dans le tube de 10 Al du substrat n 2 (10~3mol.1~1) et de 190 zl de tampon TRIS contenant NaCl (5.10~3mol.1~1) et MgSO4 (10~2mol.1~1), la transformation enzymatique du substrat n 2 au produit n 2 s'effectue pendant 15 minutes à 37 C. 3 La détection électrochimique du substrat n 2 est réalisée après transfert des 200 l de solution dans la cellule d'électrolyse puis ajout de 100 l de NaCl (5.10~3mol.1~1), 300 ml de NaHCO3 et 6 Al de HCl 4 M, et enfin une accumulation sur une électrode revêtue d'un film de Nafion, pendant 5 minutes à 0,6 V. Le courant de pic du voltammogramme à vague carrée obtenu est de 14,3 A. La courbe standard de titrage de la phénytoïne de la figure 14 a été obtenue en ajoutant 1 Al de phénytoïne de concentration Co, diluée dans du tampon phosphate au niveau de la phase 1 du protocole. L'échantillon de volume 200 l contient également 10CL1 de phénytoïne marquée à l'alcaline phosphatase (5000 unités par litre). Cette courbe est directement utilisable dans la zone I (index thérapeutique) pour doser les échantillons cliniques (ajout d'1 pl d'échantillon au niveau de la phase 1 du protocole). Application au dosage de 2 échantillons hospitaliers E2 et E3 (E2) (E3) Phénytoïne 3,2.10-5 mol.l-l 5,0.10-5 mol.l-1 indiquée Phénytoïne 3,2.10-5 mol.l-l 5,2.10-5 mol.l'l trouvée On notera que E2 et E3 contiennent également du phénobarbital et 7 (ou 8) drogues. Enfin, 1 invention concerne un kit de dosage susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre des deux procédés précédemment décrits. Ce kit de dosage comprend - un substrat susceptible d'être transformé en un produit sous l'action de catalyse d'une enzyme, - une électrode munie d'un composé polyionique dont la polarité est opposée à celle du produit et dans lequel ledit produit est susceptible de s'accumuler, - des moyens de détection électrochimiques reliés à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par celle-ci. Les enzymes, les couples substrats/produits, l'électrode de mesure, le composé polyionique et les moyens de détection sont identiques à ceux qui ont été décrits précédemment. Lorsque l'enzyme est libre, le kit de dosage permet de doser cette enzyme. Lorsque l'enzyme est liée à un antigène donné ou à un anticorps spécifique d'un antigène donné, le kit de dosage permet de doser cet antigène. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage d'une enzyme (E), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à - faire réagir l'enzyme (E) à doser avec un substrat (S) dont la transformation en un produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, est catalysée par ladite enzyme (E), - collecter ledit produit électroactif ionique ou pro-ionique (P) obtenu, sur une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) d'origine minérale ou organique dont la charge est opposée à celle dudit produit (P) obtenu, de façon que ce produit (P) se concentre dans ledit composé polyionique (1) pendant une période d'accumulation, - mesurer le signal fourni par ladite électrode (3) à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode. 2. Procédé de dosage immunoenzymatique d'antigène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant a: - faire réagir avec une enzyme (E) servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser, avec un substrat (S) dont la transformation en un produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, est catalysée par cette enzyme (E), - collecter le produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, obtenu par la réaction enzymatique, sur une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) d'origine minérale ou organique dont la charge est opposée à celle dudit produit (P) obtenu, de façon que ce produit (P) se concentre dans ledit composé polyionique (1) pendant une période d'accumulation, - mesurer le signal fourni par ladite électrode (3) à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode. 3. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit (P) est cationique ou pro-cationique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et est choisi parmi les zéolithes, la montmorillonite, la laponite, les polypyrroles N-substitués par une chaîne alcanoïque ou sulfonique, ou un polymère perfluoré de formule dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3. 4. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit (P) est anionique ou pro-anionique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique et est choisi parmi les argiles synthétiques du type hydrotalcite, la polytyramine, la poly-4-vinylpyridine, le poly-4-vinyl-1-méthylpyridinium, le polypyrrole ou le polypyrrole N-substitué par une chaîne alkylammonium. 5. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les oxydoréductases, les transférases ou les hydrolases. 6. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique, en ce que l'enzyme (E) est la cholinesterase et en ce que le substrat (S) électropositif est un ester du chlorure de choline et le produit (P) électronégatif est un acide carboxylique électroactif. 7. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et en ce que l'enzyme (E) est choisie parmi la péroxydase, la y-glutamyltransférase, la ss-D-glucaronidase ou l'alcaline phosphatase. 8. Procédé de dosage selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme est l'alcaline phosphatase, en ce que le substrat (S) est choisi parmi les esters phosphate du type TOPO3 et en ce que le produit (P) est choisi parmi les alcools ROH, R étant un groupement cationique ou procationique. 9. Procédé de dosage selon la revendication 8, caractérisé en ce que les couples substrat (S)/produit (P) sont choisis parmi les couples : ester phosphate de ferrocénylméthanol/ferrocénylméthanol, ester phosphate de 2- 2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthylphénol/2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthyl-phénol, ester phosphate du 4-hydroxy-TEMPO/4-hydroxy-TEMPO, ester phosphate du chlorhydrate de 2- (N,N-diméthylaminométhyl) 4-aminophénol/chlorhydrate de 2- (N,N-diméthylaminométhyl) 4-aminophénol, ester phosphate de l'hexafluorophosphate de 4-N-cobaltocénoylaminophénol /hexafluorophosphate de 4-(N-cobaltocénoylaminophénol ou l'ester phosphate de 4-ferrocénylphénol/4-ferrocénylphénol. 10. Procédé de dosage selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme (E) sert de marqueur à l'antigène à doser et en ce que le dosage est de type compétitif homogène ou hétérogène. 11. Procédé de dosage selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme (E) sert de marqueur à l'anticorps et en ce que le dosage est de type "sandwich". 12. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique (5) sont choisis parmi l'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie ou la voltammétrie à vague carrée. 13. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode se présente sous forme d'une électrode (3) en carbone vitreux recouverte d'un film de composé polyionique (1). 14. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode (11) se présente sous forme de microdisques de carbone (13) déposés sur un support (12) et recouverts d'un film du composé polyionique (1). 15. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode (17) se présente sous forme d'une pâte de graphite imprégnée du composé polyionique (1) et connectée électriquement à une électrode tournante (23). 16. Kit de dosage caractérisé en ce qu'il comprend - un substrat (S) susceptible d'être transformé en un produit (P) électro-actif ionique ou pro-ionique, sous l'action de catalyse d'une enzyme (E), - une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) dont la charge est opposée à celle du produit (P) électro-actif ionique ou pro-ionique, et dans lequel ledit produit (P) est susceptible de s'accumuler, - des moyens de détection électrochimique (5) reliés à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par cette électrode. 17. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le produit (P) est cationique ou pro-cationique et en ce que le composé polyionique est de nature polyanionique et est choisi parmi les zéolithes, la montmorillonite, la laponite, les polypyrroles N-substitués par une chaîne aicanoique ou sulfonique ou un polymère perfluoré de formule dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3. 18. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le produit (P) est anionique ou pro-anionique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique et est choisi parmi les argiles synthétiques du type hydrotalcite, la polytyramine, la poly-4-vinylpyridine, le poly-4-vinyl-1-méthylpyridinium, le polypyrrole ou le polypyrrole N-substitué par une chaîne alkylammonium. 19. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique, en ce que l'enzyme (E) est la cholinesterase et en ce que le substrat (S) électropositif est un ester du chlorure de choline et le produit (P) électronégatif est un acide carboxylique électroactif. 20. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et en ce que l'enzyme (E) est choisie parmi la péroxydase, la y-glutamyltransférase, la ss-D-glucaronidase ou l'alcaline phosphatase. 21. Kit de dosage selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'enzyme (E) est l'alcaline phosphatase et les couples substrat (S)/produit (P) sont choisis parmi les couples : ester phosphate de 2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthylphénol/2- (N-ferrocénoylamino) -4, 6-diméthyl-phénol, ester phosphate du 4-hydroxy-TEMPO/4-hydroxy-TEMPO, ester phosphate du chlorhydrate de 2- (N,N-diméthylaminométhyl) 4-aminophénol/chlorhydrate de 2- (N,N-diméthylaminométhyl) 4-aminophénol, ester phosphate de l'hexafluorophosphate de 4 -N-cobaltocénoylaminophénol/hexafluorophosphate de 4-(N-cobaltocénoylaminophénol ou l'ester phosphate de 4-ferrocénylphénol/4-ferrocénylphénol. 22. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique (5) sont choisis parmi l'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie ou la voltammétrie à vague carrée. 23. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode se présente sous forme d'une électrode (3) en carbone vitreux recouverte d'un film de composé polyionique (1). 24. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode (11) se présente sous forme de microdisques de carbone (13) déposés sur un support (12) et recouverts d'un film du composé polyionique (1). 25. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode (17) se présente sous forme d'une pâte de graphite imprégnée du composé polyionique (1) et connectée électriquement à une électrode tournante (23).