FR 2715307 A1 19950728 FR 9400778 A 19940125 PROCEDE DE SOLUBILISATION DANS UN MILIEU AQUEUX D'AGENTS ANTITUMORAUX DE LA FAMILLE DU TAXOL, ET CYCLODEXTRINES RAMIFIES UTILISABLES POUR CETTE SOLUBILISATION L'invention a pour objet un procédé de solubilisation dans un milieu aqueux d'agents antitumoraux de la famille du taxol. Le taxol, composé diterpénique issu de l'if (Taxus spp), et un certain nombre de ses dérivés dont notamment le Taxotère qui est obtenu par hémisynthèse en partant d'un précurseur naturel du taxol, appartiennent à l'une des familles les plus prometteuses d'agents antitumoraux, comme il est décrit notamment par P. Potier dans Chem. Soc. Rev., 21, 1992, p. 113-119 et par M.C. Bissery et al dans Cancer Research, 51, 1991, p. 4845-4852. Le Taxotère est présentement en phase II d'expérimentation clinique en Europe et aux Etats-Unis. L'un des problèmes que posent ces composés, concerne leur faible solubilité dans l'eau et les fluides biologiques, ce qui limite considérablement leurs possibilités d'administration clinique, notamment par injection parentérale. A titre d'exemple, le taxol a une solubilité dans l'eau inférieure à 0,004 mg/ml, et celle du Taxotère est à peine plus élevée. Pour résoudre ce problème, Nicolaou et al. ont décrit très récemment dans Nature, 364, 1993, p.464-466, des dérivés du taxol dénommé "protaxols", plus solubles dans l'eau qui seraient susceptibles de libérer le taxol dans des conditions physiologiques. Une autre approche pour résoudre ce problème, qui fait justement l'objet de la présente invention, a été de trouver des molécules appropriées présentant une solubilité élevée dans un milieu aqueux qui soient susceptibles de se combiner avec le taxol et ses dérivés pour les solubiliser dans un milieu aqueux. La présente invention a précisément pour objet un procédé de solubilisation dans un milieu aqueux d'agents antitumoraux de la famille du taxol, utilisant dans ce but des cyclodextrines ramifiées. Selon l'invention, le procédé de solubilisation dans un milieu aqueux d'un agent antitumoral appartenant à la famille du taxol et de ses dérivés, consiste à combiner cet agent antitumoral avec une cyclodextrine ramifiée de formule dans laquelle n est égal à 6, 7 ou 8 et les R1 qui peuvent être identiques ou différents, représentent OH ou SR2 avec R2 représentant un monosaccharide ou un oligosaccharide tel qu'un groupe de formule de type (II) lorsque le monosaccharide est le D-glucose ou un oligosaccharide du D-glucose lié as 4) ou de formule (III) lorsque le monosaccharide est le ss -D-glucose ou un oligosaccharide du D-glucose lié a-(1-+4) : dans lesquelles p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 5,à condition qu'au moins l'un des R1 représente SR2, pour former avec celle-ci un complexe d'inclusion soluble dans l'eau. Des dérivés de cyclodextrines de ce type ont eté décrits dans EP-A-0 403 366 qui illustre des dérivés de cyclomalto-oligosaccharide synthétisés en vue de diverses applications utilisant ces cyclomaltooligosaccharides pour former des complexes d'inclusion avec des molécules hydrophobes par association apolaire. D'autres dérivés appartenant à cette même famille de composés revendiqués ont été préparés plus récemment, tels les a-D-mannosyl- et ss-D-galactosyl cyclodextrines décrits par C. Lancelon-Pin et H. Driguez dans Tetrahedron Lett., 33(1992)3125-3128. Des ss-glycosylamines ss-cyclodextrines apparentées ont par ailleurs été décrites dans le même temps par H. Parrot-Lopez, H. Galons, A.W. Coleman, J. Mahuteau et M. Miocque dans Tetrahedron Lett. 33(1992) 209-212 comme agent de solubilisation de médicaments, et se sont trouvées également avoir des propriétés de solubilisation similaires vis-à-vis des diterpènes de la famille du taxol. Selon l'invention, on a trouvé que parmi les dérivés de cyclomalto-oligosaccharides décrits dans EP-A-0 403 366, les cyclodextrines ramifiées répondant à la formule I précitée permettaient d'améliorer la solubilité dans l'eau ainsi que la biodisponibilité d'agents antitumoraux de nature diterpénique de la famille du taxol, dont en particulier le Taxotère. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la cyclodextrine ramifiée répond à la formule I précitée dans laquelle tous les R1 sont identiques et représentent SR2. Des cyclodextrines ramifiées de ce type peuvent être préparées par réaction des dérivés totalement substitués en position 6 par un atome d'iode des cyclodextrines correspondantes avec le sel de sodium du thiomonosaccharide ou du thiooligosaccharide correspondant au groupe R2. Selon un second mode de réalisation de l'invention, la cyclodextrine ramifiée utilisée répond à la formule I dans laquelle un seul R1 représente SR2, les autres R1 représentant OH. Ces cyclodextrines ramifiées peuvent être préparées par réaction de la cyclodextrine correspondante substituée sur un seul cycle en position 6 par le groupe tolylsulfonyle, avec le sel de sodium du thiomonosaccharide ou du thiooligosaccharide correspondant au groupe R2. Dans les deux modes de réalisation de l'invention, les cyclodextrines ramifiées utilisées correspondent de préférence à la formule I avec n=7, c'est-à-dire à la ss-cyclodextrine. En effet, on a observé que les meilleurs résultats, en ce qui concerne l'augmentation de solubilité du taxol et de ses dérivés, étaient plus importants dans le cas de la ss-cyclodextrine que dans le cas de l'a- et de la y -cyclodextrine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, dans la cyclodextrine ramifiée utilisée répondant à la formule I, les groupes R2 sont de préférence des groupes a-maltosyle ou ss-maltosyle répondant respectivement aux formules Selon l'invention, l'agent antitumoral utilisé, est un composé appartenant à la famille du taxol et de ses dérivés. A titre d'exemple de tels agents, on peut citer le taxol et le Taxotère répondant à la formule où R3 représente -COOC(CH3)3 et R4 représente H dans le cas du Taxotère, et R3 représente -COC6H5 et R4 représente -COCH3 dans le cas du taxol. Bien entendu, on peut utiliser dans l'invention, des dérivés du taxol et du Taxotère ayant la même formule de base mais des substituants différents. L'invention concerne également les complexes d'inclusion d'une cyclodextrine ramifiée répondant à la formule (I) précitée avec un agent antitumoral de la famille du taxol et de ses dérivés Dans ces complexes d'inclusion, on préfère également que la cyclodextrine de formule (I) soit dérivée de la ss-cyclodextrine et que R2 représente le groupe a-maltosyle ou B-maltosyle. Ces complexes d'inclusion peuvent être préparés de façon classique, par exemple par addition en ajoutant à une solution de la cyclodextrine ramifiée de formule (I) utilisée, d'une solution concentrée de l'agent antitumoral de la famille du taxol dans un solvant organique miscible à l'eau, par exemple l'acétone, suivie d'une agitation de la solution homogène obtenue en la soumettant à un barbotage de gaz inerte tel que l'azote pour éliminer la plus grande partie du solvant organique. Après élimination du solvant organique, on peut congeler la solution aqueuse, puis la lyophiliser pour isoler le complexe d'inclusion ainsi formé. Pour éviter l'utilisation d'un solvant organique, on peut aussi préparer le complexe d'inclusion en dispersant l'agent antitumoral à inclure dans une solution aqueuse de la cyclodextrine ramifiée utilisée et agiter la suspension obtenue jusqu'à l'obtention d'une solution claire. On peut ensuite isoler comme précédemment le complexe d'inclusion ainsi formé par congélation et lyophilisation. Le complexe d'inclusion obtenu peut être utilisé dans une composition pharmaceutique comprenant ce complexe d'inclusion, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, en vue de l'administration de l'agent antitumoral. Ces compositions pharmaceutiques qui peuvent être administrées par voie orale ou parentérale sont par exemple des solutions, des poudres, des suspensions, etc. en particulier des solutions injectables. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Les figures 1 et 2 annexées représentent les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton à haute fréquence, de la cyclodextrine ramifiée de l'exemple 3 (figure 2) et du complexe d'inclusion de cette cyclodextrine avec le Taxotère (figure 1). Exemple 1 : Préparation de l'heptakis- (6-S-a -maltosyl-6-thio)cyclomaltoheptaose (composé n 1) Ce composé répond à la formule (I) dans laquelle n=7 et tous les R1 représentent SR2 avec R2 représentant le groupe de formule (IV). Il est préparé par réaction de l'heptakis- (6-désoxy-6-iodo) cyclomaltoheptaose avec le sel de sodium du l-thio-a-maltose. 1. Préparation de l'heptakis- (6-désoxy-6iodo) cyclomaltoheptaose L'heptakis- (6-désoxy-6-iodo) cyclomaltoheptaose est préparé par le procédé décrit par A. Gadelle et J. Defaye dans Angew Chem. Int. Ed. Engl., 30, 1991, p. 78-80. 2. Préparation du sel de sodium du 1-thio-a-maltose. Ce sel est préparé en effectuant les étapes suivantes a) Préparation du 2,3,6,2',3', 4',6'-hepta-O-acétyl-2-hydroxymaltal A une solution de bromure de 2,3,6,2',3',4',6'-hepta-O-acétyl-a-maltose (D.H. Brauns, J. Am. Chem. Soc., 51, 1929, 1820-1831 ; 9 g, 12,8 mmol) dans du diméthylformamide (33 ml), on ajoute goutte à goutte le 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undéc-7-ène(1,5-5) (1,95 ml, 13,11 mmol). Le mélange réactionnel est maintenu pendant 20 h à température ambiante puis versé dans un mélange d'eau et de glace. Le précipité obtenu (6,04 g, rendement de 76 %) est récupéré par filtration, séché dans un dessicateur et recristallisé dans un mélange éthanol-eau. Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes F : 122-123"C [a]D : + 680 (c 1,3, chloroforme) b) Préparation du 2,3,6,2',3', 4', 6' -hepta-O-acétyl-1-S-acétyl-l-thio-a-maltose A une solution de 2 g (2, 34 mmol) de 1 'hepta-O-acétyl-2-hydroxymaltal obtenu précédemment, dans 50 ml d'acétone, on ajoute 12 ml (168 mmol) d'acide thioacétique et goutte à goutte, l'hydroperoxyde de cumène. La solution est agitée pendant 40 h sous atmosphère d'azote, à température ambiante, puis concentrée à 20"C. Le résidu solide est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (acétate d'éthyle-hexane 1:1, v/v). On obtient 1,09 g (rendement 49 %) d'une poudre blanche, présentant un pouvoir rotatoire (a]D de +139 (c 0,46, chloroforme). c)) Préparation du sel de sodium du 1-thio-a -maltose A une solution de 2,1 g (3,03 mmol) de 1 'hepta-O-acétyl-1-thioacétyl-a-maltose obtenu précédemment, dans 11 ml de chloroforme à -150C, on ajoute du méthanolate de sodium (0,65 mol/l, 19 ml, 12,35 mmol) avec agitation et on maintient la réaction à -15 C pendant 15 min. Le thiolate qui précipite est séparé par filtration, lavé au chloroforme et séché dans un dessicateur. Il est utilisé sans autre purification ni caractérisation. 3. Préparation du composé n" 1 A une solution de 1 'heptakis- (6-désoxy-6-iodo) cyclomaltoheptaose obtenu dans l'étape 1) (0,5 g, 0,26 mmol) dans la 1,3-diméthyl-2-oxohexahydropyrimidine (30 ml), on ajoute le sel de sodium du 1-thio-a-maltose (1,05 g, 2,76 mmol) obtenu en 2. Le mélange réactionnel est chauffé à 700C sous atmosphère d'azote pendant 18 heures, puis refroidi et additionné d'acétone. Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé par l'acétone et séché sous vide. Il est ensuite dissous dans l'eau et purifié par ultrafiltation tangentielle (appareil Millipore, Minitan-S muni d'une membrane d'acétate de cellulose PCAC 1K). Le séchage de la solution par lyophilisation de la solution aqueuse résultante donne 0,89 g du composé n 1 (rendement 96 8). Ce composé présente les caractéristiques suivantes - [a]D : + 1640 (c 1,1, H2O) ; - spectre de masse (FAB+) : m/z 3539,3(65,[ M+Nal+), 3180,2 (72, [M-C12H21O10S+Na]+, 2823 (82,[ M-2 (C12H21O10S) +Na]+. Exemple 2 : Préparation de l'heptakis-(6-S-ss -maltosyl-6-thio)-cyclomaltoheptaose (composé n 2) Ce composé répond à la formule (I) dans laquelle n est égal à 7 et tous les R1 représentent SR2 avec R2 étant le groupe de formule (V). On suit le mode opératoire de l'Exemple 1 pour préparer ce composé en partant d'heptakis (6-désoxy-6-iodo) -cyclomaltoheptaose (0,5 g, 0,26 mmol) et du sel de sodium du 1-thio-ss-maltose (0,61 g, 2,76 mmol) préparé comme il est décrit par M. Mori et al.dans Chem. Pharm. Bull., 22, 1974, 1331-1338. On obtient ainsi 0,67 g (rendement de 75 %) du composé n 2. Ce composé présente les caractéristiques suivantes ~ la]D : + 760 (c 0,97,eau) ~ - spectre de masse (FAB+) : m/z 3554,6(29,5,[ M+K]+), 3197,3 (47,5 [M-C12H21O10S+Na]+) Exemple 3 : Préparation du 6~ S-a -maltosyl -o-l-thiocyclomal tohaptaose (composé n 3) Ce composé répond à la formule avec R2 étant le groupe de formule (IV). A une solution de 0,62 g (0,48 mmol) de 61-O-p-tolylsul fonyl-cyclomaltoheptaose préparé comme il est décrit par J. Defaye, A. Gadelle, A. Guiller, R. Darcy et T. O'Sullivan, dans Carbohydr. Res., 192, 1989, p. 251-258 , dans 3 ml de 1,3-diméthyl-2-oxohexahydropyrimidine, on ajoute 0,27 g (0,72 mmol) du sel de sodium du 1-thio-a -maltose. La solution est chauffée à 500C pendant 18 heures sous atmosphère d'azote, puis refroidie et additionnée d'acétone. Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé à l'acétone et séché sous vide. Il est ensuite redissous dans l'eau et la solution est débarrassée des sels minéraux par passage sur une colonne de résine mixte MB-6113. Le séchage par lyophilisation de la solution aqueuse donne un solide (0,65 g) qui montre en CLHP (colonne Nucléosil C-18, Su ; éluant MeOH--eau 3/22) un composant majoritaire; Ce composant est obtenu en CLHP préparative en utilisant les mêmes conditions de passage, sous forme d'une poudre blanche (0,46 g, rendement de 65 8). Il présente les caractéristiques suivantes - F : 2830C(déc.), [or]D : + 1700 (c 1, eau) ; - spectre de masse (FAB+) : m/z 1497(100 [M+Na]+), 1139(27, [M-C12H21O10S+Na]+) Exemple 4 : Préparation du 61,S,e -maltosyl-61 thiocyclomal toheptaose (composté n0 4) Ce composé répond à la formule (VI) avec R2 étant le groupe de formule (V). On suit le mode opératoire de l'Exemple 3 pour préparer ce composé en partant de 1,86 g (1,44 mmol) de 61-O-p-tolylsulfonyl-cyclomaltoheptaose et de 0,82 g (1,5 mmol) du sel de sodium du l-thio-B -maltose, dans 9 ml de la 1,3-diméthyl-2-oxohexahydropyrimidine. Après 18 heures de chauffage à 600C, le mélange réactionnel est traité comme dans l'Exemple 3. La purification par CLHP préparative du produit de la réaction conduit à 1,32 g (rendement de 62 %) d'un solide blanc qui présente les caractéristiques suivantes - F : 2850C - [a]D : + 840 (c 1, eau) Exemple 5 : Encapsulation du Taxotère dans le 61 -S-a -maltosyl-61-thiocyclomaltoheptaose (composé nO 3). On part d'une solution concentrée de Taxotère dans un solvant miscible à l'eau, constitué par de l'acétone, et on ajoute la quantité de solution concentrée correspondant à 0,75 umol de Taxotère à 500 ul d'une solution à 10 mmol/l du composé n 3 dans de l'eau stérile, à la température ambiante. On soumet la solution homogène ainsi obtenue à une agitation, tout en introduisant par barbotage un lent courant d'azote destiné à éliminer la plus grande partie de l'acétone. Après 2 heures, on congèle la solution aqueuse et on la lyophilise. On obtient ainsi un solide de composition parfaitement définie qui correspond à l'inclusion du Taxotère dans le composé n 3. Le spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton de ce produit à une concentration de 10 mmol/l (1,8 mmmol/l de Taxotère) dans D20, à 298K et 500 MHz, est représenté sur la figure 1. Sur la figure 2, on a représenté à titre comparatif le spectre RMN du composé n" 3 en l'absence de Taxotère dans les mêmes conditions. En comparant ces deux figures, on remarque une modification du spectre du composé nO 3 au niveau du signal des H-3, qui confirme l'encapsulation du Taxotère dans ce composé. Exemple 6 : Encapsulation du Taxotère dans le composé n0 3. Dans cet exemple, on part du Taxotère à l'état pur et on disperse 6 mg (7,5 umol) de ce produit dans 5 ml d'une solution contenant 10 mmol/l du composé n"3 dans l'eau stérile, puis on agite la suspension obtenue à la température ambiante jusqu'à l'obtention d'une solution claire qui indique l'encapsulation du Taxotère dans la molécule de cyclodextrine. La lyophilisation de cette solution fournit, comme précédemment, un solide de composition parfaitement définie, présentant la même structure que celui obtenu dans l'Exemple 5. Dans les deux cas, la solubilité dans l'eau du Taxotère peut être amenée à 8 mmol/l (6,5 g/l) dans une solution aqueuse à 48 mmol/l du composé nO 3. On obtient ainsi une augmentation importante de la solubilité du Taxotère, celle-ci étant de l'ordre de 0,004 g/l en l'absence de cyclodextrine. Exemple 7 : Encapsulation du Taxotère dans le composé nO 4. On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 5 pour encapsuler le Taxotère dans le composé nO 4. On obtient également un produit solide de composition parfaitement définie que l'on peut dissoudre dans l'eau. Toutefois, ce produit présente une solubilité dans l'eau légèrement inférieure à celle du complexe d'inclusion obtenu avec le composé n" 3 dans lequel le substituant R2 présente l'anomérie a. Bien que les exemples se rapportent au Taxotère, il va de soi que l'invention s'applique de la même façon au taxol et à d'autres dérivés du taxol. En effet, on observe avec le taxol et d'autres dérivés des résultats analogues. REVENDICATIONS 1. Procédé de solubilisation dans un milieu aqueux d'un agent antitumoral appartenant à la famille du taxol et de ses dérivés, caractérisé en ce qu'il consiste à combiner cet agent antitumoral avec une cyclodextrine ramifiée de formule dans laquelle n est égal à 6, 7 ou 8 et les R1 qui peuvent être identiques ou différents, représentent OH ou SR2 avec R2 représentant un monosaccharide ou un oligosaccharide, à condition qu'au moins l'un des R1 représente SR2, pour former avec celle-ci un complexe d'inclusion soluble dans l'eau. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 répond à la formule II lorsque le monosaccharide est le D-glucose ou des résidus D-glucose liés a-(1-+4) ou à la formule III lorsque le monosaccharide est le -D-glucose ou un oligosaccharide du D-glucose lié a(1-+4) dans lesquelles p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 5 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que tous les R1 sont identiques et représentent SR2. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'un seul R1 représente SR2, les autres R1 représentant OH. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que n est égal à 7. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que R2 représente un groupe de formule 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent antitumoral est le Taxotère de formule dans laquelle R3 représente -COOC(CH3)3 et R4 représente H. 8. Complexe d'inclusion d'une cyclodextrine ramifiée de formule dans laquelle n et R1 ont les significations données dans la revendication 1 ou 2, avec un agent antitumoral de la famille du taxol et de ses dérivés. 9. Complexe d'inclusion selon la revendication 8, caractérisé en ce que tous les R1 sont identiques et représentent SR2. 10. Complexe d'inclusion selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'un seul R1 représente SR2, les autres R1 représentent OH. 11. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que n est égal à 7. 12. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que R2 est un groupe répondant à la formule 13. Complexe d'inclusion selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en Çe que l'agent antitumoral est le Taxotère de formule dans laquelle R3 représente -COOC-CH3)3 et représent H. 14. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe d'inclusion d'une cyclodextrine ramifiée selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 15. Cyclodextrine ramifiée répondant à la formule dans laquelle n est égal à 7 et tous les R1 représentent SR2 avec R2 représentant un groupe de formule 16. Cyclodextrine ramifiée répondant à la formule dans laquelle RL représente un groupe répondant à la formule