FR 2722974 A1 19960202 FR 9409668 A 19940729 La présente invention concerne un procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire par réalisation in vitro d'une matrice endothéliale physiologique. En chirurgie vasculaire, le pontage est l'une des techniques les plus utilisées pour traiter les lésions artérielles. L'idéal est de disposer d'un greffon artériel autologue ou, à défaut, d'un vaisseau autologue de type veineux : veine saphène interne la plupart du temps. Cette utilisation préférentielle de vaisseau autologue se heurte pourtant à un obstacle majeur : I'absence de greffon, que ce soit en fonction du site d'implantation, ou en raison des antécédents du malade (veine saphène strippée, utilisation précédente...) ou encore parce que des altérations importantes rendent le greffon inutilisable. On s'est donc efforcé de trouver une alternative valable au matériel autologue. C'est ainsi que le développement et l'utilisation, au cours des 30 dernières années, de matériaux synthétiques, en particulier le Dacron (polyéthylène-téréphtalate), tissé ou tricoté, et le PTFE (polytétrafluoroéthylène) ont permis à la chirurgie vasculaire d'avancer de façon considérable. Ces prothèses synthétiques donnent des résultats comparables, en terme de perméabilité, à ceux d'un vaisseau autologue pour les artères de gros et moyens calibres. Mais leur non-adaptation aux artères de petit calibre (inférieur ou égal à 4 mm) est vite devenue évidente. Ceci s'explique, entre autres, par la haute thrombogénéicité de la surface interne synthétique. En effet, après implantation, et lors de l'exposition au flux sanguin, il se produit très rapidement une adhésion et une agrégation plaquettaire, suivies par le développement d'un tissu fibreux inflammatoire sur la face interne (fibrine, fibroblastes, macrophages, leucocytes). L'augmentation de l'activité plaquettaire induit également une libération d'agents mitogènes des cellules musculaires lisses entraînant une hyperplasie aux zones d'anastomoses avec les vaisseaux adjacents. Chez l'animal, une endothélialisation spontanée de la surface peut parfois apparatifre au cours du temps, les cellules endothéliales provenant de capillaires extérieurs, de la circulation sanguine aussi bien que des vaisseaux adjacents Chez l'homme, par contre, il n'y a pas de colonisation spontanée de la surface endoluminale à l'exception des zones juxta-anastomotiques. Afin d'améliorer les prothèses synthétiques et pour les rendre utilisables même dans les petits calibres, on a pensé que la prothèse "idéale" devrait, entre autres, reproduire sur sa face interne la paroi vasculaire naturelle avec un revêtement endothélial fonctionnel et stable. En 1978, Herring et al. (Surgery 78 : 498 - 504) ont introduit le concept d'ensemencement des prothèses synthétiques par des cellules endothéliales autologues, afin d'obtenir une surface anti-thrombogénique. Par la suite, le développement des techniques de récolte et de multiplication en culture des cellules endothéliales, telles que celles décrites par Jarrel et al (1984 J. Vasc. Surg. 1: 757-764) ainsi que l'utilisation de facteurs adhésifs : fibronectine, laminine collagène...(Carabasi et al. 1991-Ann. Chir. Vasc. 5 : 477-184 et Vohra et al. 1991 Br.J. Surg. 78 : 417-420) ont permis le développement d'essais d'endothélialisation des prothèses vasculaires. De nombreux essais ont ainsi pu être réalisés aussi bien chez l'animal que chez l'homme, sur du Dacron ou du PTFE. Ces techniques permettent: - la création d'une monocouche cellulaire fonctionnelle uniforme avant l'implantation ; il en résulte une réduction de l'activité plaquettaire et une amélioration de la perméabilité à court et moyen terme - I'inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses - une meilleure résistance des prothèses à l'infection. Ces techniques ont pourtant des limites: - résistance de la monocouche au flux sanguin - différences de morphologie, de fixation et de potentiel de croissance des cellules endothéliales en fonction de leur origine (cellules veineuses ou artérielles) nécessitant leur réadaptation aux conditions physiologiques d'implantation - difficulté d'organisation d'une procédure fiable sur le plan clinique et dans le temps : prélèvement, culture cellulaire, nécessité de stérilité absolue tout au long de ces étapes. - difficultés d'évaluation clinique et recul dans le temps pour juger de la stabilité de la monocouche. Les inventeurs ont cherché à contourner les limitations rédhibitoires entraînées par l'endothélialisation per-opératoire, et ils ont choisi de créer une prothèse synthétique dont la surface interne soit recouverte d'un substrat permettant l'endothélialisation vraie, in vivo, par des cellules endothéliales autologues et fonctionnelles. On sait que l'adhésion, la prolifération et la migration des cellules endothéliales sont fonction, avant tout, du support sur lequel elles reposent ; c'est ce support qui détermine la polarité, l'orientation, la morphologie et la réponse de la cellule aux facteurs stimulants. Dans l'environnement vasculaire naturel, ce support correspond à la membrane basale sous-endothéliale. Cette matrice extracellulaire (MEC) secrétée par la cellule endothéliale à son pôle basal possède une organisation et une composition définie en protéines matricielles et en facteurs de croissance. Les inventeurs se sont donc efforcés de recréer cette membrane basale naturelle sur la surface interne des prothèses synthétiques. Différents travaux ont mis en évidence les propriétés adhésives de la MEC des cellules endothéliales de cornée ou d'aorte (Gospodarowicz D. 1984 A.R. Liss. Inc. N.Y. 275293). La MEC, secrétée par ces cellules en culture et déposée à leur pôle basai, reste fermement attachée au support de culture. Un lavage à l'aide d'un détergent doux de la monocouche cellulaire permet de libérer la matrice intacte et dépourvue d'éléments ou de débris cellulaires. En utilisant ce principe, les inventeurs ont mis au point un matriçage in vitro de prothèses synthétiques par de la MEC de cellules artérielles ; cette préparation autorise lors de l'implantation in vivo une colonisation rapide et complète de la surface endoluminale par les cellules endothéliales de l'hôte. Le procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire selon l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser sur ladite surface interne une matrice endothéliale physiologique obtenue in vitro à partir de cellules artérielles. On assure ainsi l'endothélialisation vraie, in vivo, par des cellules endothéliales autologues et fonctionnelles. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite surface interne est préalablement revêtue de fibronectine humaine. La présente invention sera mieux comprise, et ses avantages ressortiront bien de la description qui suit du protocole de validation in vitro. Préparation de lianées cellulaires Des lignées artérielles, destinées à l'étape de matriçage et d'endothélialisation, ont été préparées à partir d'aortes ou d'artères fémorales de mammifères. Chaque prélèvement artériel obtenu, quelque soit son origine ou sa nature, a été traité de la même façon, dans des conditions rigoureusement contrôlées de biosécurité (stérilité, innocuité). L'échantillon artériel, déposé sur un plateau, est incisé longitudinalement puis rincé délicatement à l'aide d'une solution saline pour éliminer les éléments sanguins résiduels. Les cellules endothéliales sont récoltées par grattage de toute la surface, puis ensemencées dans un puit de culture (plaque 24 puits). La plaque de culture est incubée 24 h minimum à 37"C avant le premier changement de milieu de culture. Le milieu de culture pour ce travail est de préférence le milieu EGM commercialisé par Clonetics : milieu MCDB 131 supplémenté en sérum de veau foetal, hydrocortisone, facteur de croissance épidermique recombinant humain (hEGF), extrait de cerveau bovin (Bovine Brain Extract BBE). Les cellules endothéliales peuvent être décollées de leur support pour récolte ou réensemencement par action d'une solution de Trypsine-EDTA. Validation du matrice sur PTFE Conformation : Les essais d'endothélialisation in vitro ont été réalisés sur des disques de PTFE + fibronectine humaine + MEC de cellules artérielles comparativement à des disques de PTFE non modifié et de PTFE enduit de fibronectine humaine seule. Une modification de tubes Ependorf a permis de réaliser des chambres de culture de 0,5 cm2 de surface, permettant une immobilisation du matériau prothétique (PTFE -Dacron) ; chaque disque ainsi formé est autoclavé avant son utilisation. Enduction Dar la fibronectine humaine - Les disques sont incubés 1 h à 37"C ou une nuit à 4"C avec 5 zg/cm2 de fibronectine de plasma humain. L'excès de gel est aspiré, laissant un film fin à la surface. Enduction Dar une couche matricielle artérielle Les cellules artérielles sont ensemencées à la densité de 105 cellules / cm2, sur la surface prothétique préalablement enduite de fibronectine. Elles sont alors maintenues en culture pendant environ 12 jours dans le milieu de culture EGM + 4 % de Dextran T 40. Un changement régulier du milieu est effectué tous les 3 jours. Au terme de ce temps de culture, les cellules sont décollées par 2 incubations successives de 30 min. dans une solution d'urée 2 M à 37"C, laissant la MEC fermement attachée au disque de PTFE et dépourvue d'éléments cellulaires. Endothêlialisation in vitro Des cellules artérielles d'aorte de porc sont ensemencées, en parallèle, sur les différents supports (PTFE nu, PTFE + fibronectine humaine, PTFE + fibronectine humaine + MEC artérielle) à la densité de 105 cellules / disque ; elles sont ensuite cultivées pendant une période de 5 à 7 jours dans le milieu EGM. La capacité d'endothélialisation de chaque support est déterminée par les essais suivants: - numération cellulaire aux jours J + 1 et J + 5 de la culture des cellules détachées par l'action d'une solution de Trypsine -EDTA (compteur de cellule: Coulter ZM). Les résultats, exprimés par la moyenne d'essais réalisés en triplicate pour chaque support. sont illustrés par le dessin schématique annexé dans lequel: Figures 1, 2, et 3 sont des graphiques-barres de numération cellulaire. Sur ces figures, le nombre de cellules est porté en abscisses et le nombre de jours en ordonnées. On voit, sur la figure 1 la presque totale absence d'adhésion des cellules endothéliales sur le support PTFE nu (8 % seulement des cellules ont adhéré à J + 1). Ce paramètre est restauré par l'enduction de la surface prothétique par la fibronectine humaine (FN H) : 40 % d'adhésion, et est amélioré de façon significative sur le support PTFE + fibronectine humaine + MEC artérielle (MEC ART). La numération réalisée à J + 5 met en évidence la prolifération des cellules endothéliales sur ce support : le nombre de cellules est multiplié par 4 entre J + 1 et J + 5. Les propriétés de rn'servoir en facteurs de croissance de la MEC artérielle semblent être conservées permettant ainsi une stimulation de la croissance cellulaire sur ce support. - examen en microscoDie à balavaae : chaque disque endothélialisé a été fixé au glutaraldéhyde 2,5 % dans un tampon au phosphate (PBS : Phosphate Buffer Saline solution) pendant 1 h à température ambiante. Après 3 lavages de 20 min dans du PBS, on réalise une post-fixation dans du tétroxyde d'osmium 1 % dans du tampon cacodylate 0,3 M pendant 1 h à 4"C. La déshydratation des échantillons est obtenue par passage dans des bains d'éthanol de concentration croissante : 2 min. dans l'éthanol à 30 , 50 , 70 , 95 , puis 2 fois 3 min. dans l'éthanol à 100 . Après séchage par agitation rapide dans l'air, les échantillons sont recouverts d'or par pulvérisation cathodique et examinés à l'aide d'un microscope Philips XL20. On constate que la MEC secrétée sur le PTFE enduit de fibronectine humaine permet une couverture endothéliale homogène et complète. Un ensemencement de cellules artérielles sur les deux autres supports étudiés laisse la surface du matériau apparente en de multiples endroits, même après enduction par la fibronectine. Une éventuelle modification du matriçage a été ensuite étudiée. Par contraste avec l'endothélium, la lame basale sous endothéliale représente une surface hautement thrombogénique et I. Vlodavsky et al (1982 Thromb.Res. 28 179-191) concluent à une interaction spécifique plaquettes matrice et il propose deux traitements palliatifs: - fixation légère de la matrice par du glutaraldéhyde : ce traitement est connu pour son action inhibitrice sur la prolifération cellulaire mais également pour sa haute toxicité, ce qui interdit son utilisation lors d'une implantation chez l'homme. - dénaturation des protéines de la matrice par chauffage ; L'adhésion plaquettaire est inhibée par une exposition de la matrice à une température de 90"C pendant 10 min. Cette dénaturation protéique a aussi pour conséquence une diminution de l'adhésion des autres cellules. C'est cette technique, qui n'est pas toxique pour l'homme, que les inventeurs se sont proposés d'utiliser, en vérifiant toutefois que la diminution de capacité d'adhésion n'influence pas de façon significative la capacité d'endothélialisation. Traitement de la MEC Des disques de PTFE, matricés par la MEC de cellules artérielles et chauffés à 70"C et 90"C ont été ensemencés par des cellules artérielles de porc. L'adhésion et la prolifération cellulaire ont été évaluées par numération cellulaire aux jours J + 1 et J + 5 de la culture. Les résultats, obtenus pour des essais réalisés en triplicate, sont représentés à la figure 2. Ils ne démontrent pas de différence significative pour les deux paramètres considérés entre la MEC chauffée à 90"C et la MEC de contrôle; on constate par contre une légère diminution pour la MEC chauffée à 70"C. Validation du matriçage sur Dacron Les mêmes méthodes d'étude ont été appliquées au matériau Dacron et Ion voit, sur la figure 3, la nette amélioration de la capacité d'endothélialisation du Dacron matricé (MEC-ART) par rapport aux autres présentations de ce matériau nu ou enduit de fibronectine humaine (FNH) . Les résultats exposés ci-dessus ont conduit les inventeurs à proposer un protocole pour le procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques qui comporte les étapes suivantes: - Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine - lavage avec une solution saline pour élimination de l'excès de fibronectine - ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, puis culture cellulaire par incubation de cette prothèse dans un récipient stérile à 37"C - élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M - stockage de la prothèse ainsi matricée à 4"C dans un environnement stérile. Avantageusement, l'étape d'élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée est suivie d'une étape de chauffage de la prothèse à 90"C pendant 10 minutes Un protocole précis pour la modification de la surface interne des prothèses synthétiques selon l'invention est décrit ci-après: - enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine : 2 à 10 g /cm2 pendant 1 heure à 37"C. - lavage avec une solution saline (PBS) pour élimination de l'excès de fibronectine - ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, à une densité comprise entre 0,5.105 et 2.105 cellules par cm2 et incubation de cette prothèse dans un récipient stérile à 37"C avec rotations régulières, au rythme de 4 par heure pendant 2 à 3 heures. - culture dans un bain de milieu EGM + 4 % de Dextran T40 pour 10 à 15 jours avec changement du milieu 2 fois par semaine - au terme de cette période, élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M pendant 30 minutes à 37"C - chauffage de la prothèse à 90"C pendant 10 minutes - stockage de la prothèse ainsi matricée à 4"C dans un environnement présentant des garanties de parfaite stérilité pour une période pouvant aller de 3 à 6 mois. Des essais de validation in vivo ont ensuite été effectués et vont maintenant être décrits. Protocole opératoire Au cours de deux mois consécutifs, les inventeurs ont implanté 4 prothèses matricées chez 4 cochons. Cette expérimentation a été précédée de deux essais chez deux cochons pour juger de la faisabilité et mettre au point un protocole reproductible. Les cochons étaient âgés d'un mois, pesaient 20 kg, le sexe ratio était de 2 mâles et 2 femelles. Les prothèses étaient toutes matricées selon la technique de l'invention. Il s'agissait de 4 tubes droits, 3 en PTFE et 1 en Dacron de diamètre de 6 mm, sauf pour 1 tube en PTFE de diamètre 5 mm et de 6 cm de longueur implantée. Les cochons ont été opérés sous anesthésie générale au propofol après une prémédication par la kétamine, l'atropine et le midazolam. Ils étaient intubés et ventilés avec une voie veineuse périphérique. L'intervention a consisté en la mise en place, après laparotomie médiane d'un tube droit aorto-aortique sous rénal. Les anastomoses proximales et distales terminales ont été confectionnées avec un surjet de fils non résorbables en polypropylène. Les cochons ont été opérés sous héparinothérapie 500 Ul en injection intraveineuse avant le clampage puis, 500 Ul à la fermeture, associée à 250 mg d'acétyl salicylate de lysine en intraveineuse. On a poursuivi l'administration de l'acétyl salicylate de lysine per os (introduit directement dans l'anrière-gorge des cochons) à la dose de 500 mg, un jour sur deux, et ce pendant les 8 jours postopératoires. Les explantations ont été faites pour les prothèses en PTFE 8 jours, 15 jours et 1 mois après la première intervention et à 1 mois pour la prothèse en Dacron. Le jour de l'explantation, tous les cochons étaient en bon état général, sans signes fonctionnels, les membres inférieurs étaient chauds et il y avait des pouls périphériques perçus au doigt. L'explantation, menée sous anesthésie générale, a consisté en l'ablation de la prothèse avec repérage et prélèvement des anastomoses proximales et distales ; les animaux n'ont été sacrifiés qu'après l'intervention. Résultats Observation macroscopique Toutes les prothèses étaient perméables. Elles ont été sectionnées en deux dans le sens longitudinal et l'on n'a pas constaté macroscopiquement de thrombose pariétale importante, ni de dépôts fibrino-plaquettaires. Microscopie électronique à balayage Dès leur retrait, les prothèses ont été rincées soigneusement afin d'éliminer les éléments sanguins résiduels puis elles ont été fixées une heure dans du glutaraldéhyde 2,5 % dans du PBS à température ambiante. On a ensuite procédé à leur étude en microscopie électronique à balayage suivant le protocole de préparation décrit lors de la validation in vitro. La chronologie d'implantation de 8 jours, 15 jours et 1 mois a permis de suivre l'endothélialisation progressive (8 et 15 jours) et complète (1 mois) de toute la surface interne des prothèses que ce soit en PTFE ou en Dacron: - 8 jours : début de couverture endothéliale en monocouche sur 1 cm environ à partir des anastomoses et apparition de zones cellulaires endothéliales au sein des dépots de fibrine observés sur toute la partie centrale de la prothèse - 15 jours : la couverture endothéliale est pratiquement achevée ; les macrophages visibles au centre même de la prothèse assurent le nettoyage des zones de fibrine - 1 mois (PTFE et Dacron) : endothélialisation totale et exclusive de la surface inteme de la prothèse. MicroscoDie électronique à transmission Les échantillons prothétiques fixés au glutaraldéhyde sont post-fixés au tétroxyde d'osmium 1 % dans un tampon cacodylate pendant 1 heure à 4"C. Ils sont ensuite déshydratés à l'aide d'une gamme progressive d'éthanol 5 minutes dans l'éthanol à 30 , 50", 70 , 95 , 3 fois 10 minutes dans l'éthanol à 100" puis 3 fois 10 minutes dans de l'oxyde de propylène. Après inclusion des échantillons dans une résine époxy des sections ultrafines sont réalisées à l'aide d'un ultramicrotome puis contrastées à l'acétate d'uranyl et au citrate de plomb avant leur observation. L'observation de la couche cellulaire endoluminale révèle, dans le sens lumière-paroi, les présences successives de cellules endothéliales jointives et en voie de quiescence, de cellules de nature macrophagiques au sein d'un réseau de fibrine et d'une couche de cellules de type myofibroblastique qui ont constitué une matrice conjonctive en contact direct avec le matriçage prothétique (mise en évidence de fibres de collagène). Cette organisation anticipe la formation d'un tissu endoluminal normal. REVENDICATIONS 1. Procédé de modification de la surface interne des prothèses synthétiques utilisées en chirurgie vasculaire. caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser sur ladite surface interne une matrice endothéliale physiologique obtenue in vitro à partir de cellules artérielles. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite surface inteme est préalablement revêtue de fibronectine humaine. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine - lavage avec une solution saline pour élimination de l'excès de fibronectine - ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, puis culture cellulaire par incubation de la prothèse dans un récipient stérile à 37"C - élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M - stockage de la prothèse ainsi matricée à 4"C dans un environnement stérile. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'étape d'élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée est suivie d'une étape de chauffage du segment à 90"C pendant 10 minutes 5. Procédé selon la revendication 3 et la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - Enduction de la surface interne de la prothèse par incubation avec une solution de fibronectine recombinante humaine: 2 à 10 g /cm2 pendant 1 heure à 37"C. - lavage avec une solution saline (PBS) pour élimination de l'excès de fibronectine - ensemencement de la face interne de la prothèse par une suspension de cellules endothéliales artérielles, à une densité comprise entre 0,5.105 et 2.105 cellules par cm2 et incubation de la prothèse dans un récipient stérile à 37"C avec rotations régulières, au rythme de 4 par heure pendant 2 à 3 heures. - culture dans un bain de milieu EGM + 4 % de Dextran T40 pour 10 à 15 jours avec changement du milieu 2 fois par semaine - au terme de cette période,élimination des cellules artérielles par action d'une solution d'urée 2 M pendant 30 minutes à 370C - chauffage de la prothèse à 90 C pendant 10 minutes - stockage de la prothèse ainsi matricée à 4"C dans un environnement présentant des garanties de parfaite stérilité pour une période pouvant aller de 3 à 6 mois.