FR 2710653 A1 19950407 FR 9311874 A 19930930 La présente invention concerne un procédé de stimulation de la couleur des éléments pigmentaires secrétés par certaines cellules animales et notamment par celles du manteau des mollusques. Dans ce qui suit, la présente invention sera plus particulièrement décrite dans son application aux mollusques bivalves nacrifères, sans toutefois qu'il en résulte une limitation à sa portée. On sait que la mélanine est une substance protéique complexe, assez courante dans le règne animal. Elle concourt à l'élaboration des pigments qui colorent le pelage des mammifères, les plumes des oiseaux, la couleur de la peau humaine, I'opacité des nuages protecteurs des céphalopodes (pieuvre ou Octopus vulgaris), seiche (Sepia officinalis), poulpe (Eledone aldrovandii), calmar (Liligo vulgaris et Allotheutis subulata)... et intervient dans la coloration des coquilles et des perles de mollusques lamellibranches (Unio anodonte, Aviculina meleagrina, PtncCadines), la chair de mollusques telle la gryphée et les carapaces de certains arthropodes. Depuis la plus haute antiquité les perles fines ont été considérées comme particulièrement attrayantes et désirables. De nos jours encore elles représentent un symbole de luxe très recherché. Les perles noires en particulier ont une valeur qui est d'environ cinq fois celle des perles blanches et, actuellement les perles noires représentent en joaillerie environ 15 à 20 % des perles ramassées. Le prix très élevé des perles noires, naturelles ou de culture, a incité des négociants peu scrupuleux à teinter des perles beaucoup plus communes (akoya du Japon). Une des méthodes utilisées consiste à tremper des perles blanches dans une solution de nitrate ou d'un autre sel d'argent, puis dans de l'ammoniaque diluée, avant de les exposer à la lumière ou à l'action d'hydrogène sulfureux gazeux. On arrive ainsi à noircir de façon stable la perle qui présente alors une couleur noire profonde et uniforme. Une autre méthode, utilisée actuellement pour la perle akoya, consiste à la soumettre à une irradiation à un rayonnement gamma émis par une source au cobalt ; on obtient une perle d'un gris bleuâtre. Ces falsifications peuvent cependant être aisément décelées en laboratoire : à l'aide d'une loupe, on peut observer les traces de peinture autour du trou de perçage d'une perle colorée artificiellement. Pour les perles irradiées, le noyau, habituellement blanc chez les perles de culture de Tahiti, de couleur naturelle, apparait noirci à travers le trou de perçage. Par ailleurs une couleur intense et un lustre métallique sont l'indice d'un traitement. II en est de même pour le petit diamètre des perles (inférieur à 98 mm) car les vraies perles noires sont habituellement plus grosses (à l'exception des keshis, provenant de l'huitre perlière à lèvres noires). A l'heure actuelle, la méthode la plus précise de différenciation des perles de couleur naturelle et des perles colorées artificiellement est celle qui utilise la spectrophotométrie. Les perles Pinctada margaritifera présentent une absorption spécifique à 700 nm (ce qui est du à leurs pigments noirs naturels). De même la méthode de fluorescence aux rayons X fait apparaitre deux pics de fluorescence à 450 et 620 nm pour la Pinctada margaritifera et un seul pic de 620 nm pour la Pinctada maxima et la Pinctada fucata martensi. Nacre et perles sont indissociables ; leur nature (apatite, aragonite et conchioline) et leur origine physiologique (sécrétion de l'épithélium externe du manteau) sont communes. Plusieurs chercheurs ont déjà soupçonné la présence de la mélanine dans certaines nacres et perles. C'est ainsi que Abolins-Krogis A. (1963, Arkiv. Zool. 15,475) identifie l'eumélanine comme un facteur de stabilisation. R.A. Nicolaux (Melanins- Hermann Paris 1968, p. 67) émet l'hypothèse du rôle de capteur thermique de la mélamine dans les coquillages. L'origine mélanique de la couleur des perles noires a pu être récemment démontrée par deux observations: - La migration chromatographique des pigments des perles noires est semblable à celle des eumélanines des céphalopodes. - L'observation microscopique de ces pigments montre qu'ils sont constitués de petites vésicules d'aspect et de morphologie identiques à celles des mélanosomes. On a pu par ailleurs constater que le pigment extrait des perles et nacres noires de Polynésie française migrait de manière assez semblable à la sepiamélanine (Eumélanine de Loligo : Calmar) ; en effet, - le pigment ainsi extrait réagissait vis à vis du peroxyde d'hydrogène comme l'eumélanine - I'observation microscopique des nacres digérées par l'EDTA montrait des granules bourrées de pigments noirs semblables aux mélanosomes. La présente invention s'est donné pour objet de procurer aux cellules pigmentées et notamment à celles des nacres et des perles des substances qui amplifient de manière importante la synthèse de la mélanine, sans en être pour autant un précurseur ou un élément de la réaction enzymatique. L'inventeur a pu en effet constater que certains composés choisis parmi ceux ayant comme noyau central une structure polycyclique isomère du naphtalène constituée de l'accolement d'un cyclopentène et d'un cycloheptène par l'un de leur côté et notamment l'azulène, étaient tout particulièrement adaptés à la stimulation de la synthèse des mélanines. II était ainsi possible de modifier les synthèses mélaniques et de doubler la quantité de la mélamine synthétisée par les mélanocytes des mammifères. Ces composés présentent la formule générale suivante: Les substances naturelles ou hémisynthétiques susceptibles de développer une telle activité ont souvent des substitutions méthyl, éthyl, propyl, isopropyl, sulfoné, et l'on peut plus particulièrement citer le chamazulène et le guaiazuluène. Les substitutions du noyau azulène se font sur des carbones préférentiels. Des atomes d'hydrogène sont souvent substitués par des radicaux aliphatiques. R1 R2 R3 Azulène H H H Chamazulène CH3 C2H5 CH3 Guaiazulène CH3 C3H7 CH3 Le chamazulène est un composé que l'on trouve à l'état naturel dans la camomille (Matricaria chamomilla), I'absinthe (Artemisia absinthium) et certains autres composés tels l'Achillea millefolium. Le guaiazulène est obtenu par extraction à partir de zygophylacée, de l'huile de bois de gaïac ou par hémisynthèse à partir du baume de Gurjun. L'adjonction d'une solution à 1 % de guaiazulène au milieu de culture (Mac Coy) des mélanocytes permet de doubler la production de pigments des mélanocytes caucasiens comme le montre le tableau suivant (résultats pour 106 cellules par 48 h) Témoin Mc Coy 4,5 | 0,32 lig / ml Mc Coy + 1 % Gaiazulène 11,2t0,74 igIml On a pu confirmer que, dans une préparation cosmétique, L'activité observée sur les cultures cellulaires se retrouvait au niveau de la peau et que le bronzage des sujets qui avaient été traités par une telle préparation durait deux fois plus longtemps que celui des témoins non traités. L'analyse des résultats et la quantité de mélanine néosynthétisée après application de gaiazulène permet d'entrevoir qu'il s'agit là d'un système assez ubiquitaire susceptibles de s'appliquer à toutes les cellules susceptibles de synthétiser la mélanine. L'inventeur s'est proposé d'appliquer l'aptitude que présentait ces dérivés de l'azulène comme le chamazulène et le guaiazulène libres ou encapsulées à la stimulation de la synthèse de la mélamine sur des sujets humains à la modification de couleur des éléments secrétés par certaines cellules animales et notamment par le manteau des mollusques. La présente invention concerne donc un procédé de stimulation de la coloration des éléments pigmentaires secrétés par certaines cellules animales et notamment par celles du manteau des mollusques, caractérisé en ce qu'il consiste à amplifier la synthése mélanique des mélanocytes par traitement desdits tissus ou cellules en présence de composés ayant comme noyau central une structure polycyclique isomère du naphtalène constituée de l'accolement d'un cyclopentène et d'un cycloheptène par l'un de leur côté (formule 1) et notamment l'azulène. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ces composés présentent des substitutions méthyl, éthyl, propyl, isopropyl, sulfoné, et ils sont spécialement choisis parmi le chamazulène et le guaiazuluène. Dans le but d'en améliorer l'activité, les produits actifs sont de préférence encapsulés au sein de vecteurs infracellulaires, c'est-à-dire d'une taille très inférieure à celle des cellules. Les concentrations sont comprises entre 10-6 et 1y2 g de substance par gramme de matières de vecteur. Plusieurs techniques d'encapsulation de liposomes peuvent être utilisées reverse phase (REV), injection d'éther, ultrasonication, évaporation de solvant, presse de French, méthode Bengham (vortex). L'ensemble des protocoles est décrit dans les ouvrages suivants: - P. Buri, F. Puisieux et al : "Formes pharmaceutiques nouvelles, aspects technologique, biopharmaceutique et médical" - F. Puisieux, "Les liposomes" -Leserman et Machy "Liposomes en biologie cellulaire et pharmacologie". L'ensemble de ces techniques donne satisfaction, à condition que l'élimination du solvant organique soit bien maîtrisée. II faut toutefois noter que la technique qui donne les résultats les plus cohérents est celle de la synthèse des liposomes et des nanocapsules par dépression positive décrite dans FR A - 8909275. A titre d'exemple, on trouvera ci-après quelques formulations de base de liposomes préparés selon cette technique: Exemple l: Lécithine d'oeuf 7 % Cholestérol 0,05 % Tocophérol 0,1 % Acide linoléique 0,05 % Guaiazulène 0,75 % Palmitate d'ascorbyle 0,01 % Eau q.s. 100 Exemple 2: (Vecteurs nanocapsules ou nanosphères) paraffine 2% Cires 0,75 % Cholestérol 1,5 % Palmitate d'ascorbyle 0,08 % Palmitate de saccharose 0,5 % Guiazulène 0,7 % Conservateur q.s. Eau q.s. 100 Les formes nanocapsulaires à base de cholestérol, d'acide cholique, de palmitate de saccharose, de palmitates d'acides aminés ou de petites séquences peptidiques conviennent. Les formes nanocapsulaires avec les acides siloxanique ou acrylique conviennent moins bien, alors que les formes nanosphériques de polymères tels les polylactique-polyglycosides, polypeptidiques, polyosidiques et les polymères d'acides gras polyinsaturés conviennent assez bien. Sont aussi bien adaptées les nanoparticules à structures poreuses (microsponges) et les nanoparticules à matrice pleine telles les nanosphères. Le tableau suivant représente les résultats obtenus avec le guaiazulène encapsulé dans les conditions de l'exemple l: TABLEAU I Actif encapsulé Quantité de mélanine svnthétisée (en g/106 cellules) Témoin 5,14 + 0,76 Vitamine A 5,37 + 0,93 Vitamine D2 6,05 i 0,67 Azulène substitué 8,19 + 0,96 Dans la présente invention, l'activité des mélanocytes a été étudiée dans des milieux de culture par une cellule pigmentaire susceptible de synthétiser de la mélamine choisie parmi les cellules des arthropodes, mollusques, etc ; elle a été étudiée pour une concentration en actifs comprise entre 1 gIl et 4 mgn ; les meilleurs résultats ont été obtenus avec des concentrations dans les milieux de culture comprises entre 0,01 mgn et 2 mgll. Les conditions expérimentales étaient les suivantes: Les manteaux de chaque espèce étudiée sont prélevés dans des conditions stériles puis rincés dans le milieu HBSS (Gibco). lis sont ensuite découpés en petits fragments de moins de 1 mm3. Les cellules sont dissociées à l'aide d'une solution de pronase E (Sigma). La digestion enzymatique se fait à 37 C sous agitation pendant 15 minutes. La suspension cellulaire ainsi obtenue est filtrée sur une toile de nylon dont les mailles ont un diamètre de 50 m afin de ne conserver que des cellules bien dissociées. Celles-ci sont rincées deux fois dans le milieu HBSS puis mise en culture dans un milieu décrit par Lenoir et Mathieu (1986) avec les modifications suivantes: milieu DMEM en poudre (Gibco) 1 gramme NaCI 2,047 KCI 0,372 H20 bi distillée 100 ml Les cellules sont incubées en présence de 1 % de gaiazulène vectorisé à une densité de 5.105 cellules par ml de milieu de culture. Ce dernier est renouvelé toutes les 24 heures. Après 48 heures d'incubation à 15 C à l'abri de la lumière, les cellules sont comptées au Coulter Counter puis centrifugées à 1000 tours/minute pendant 5 minutes. Le pigment contenu dans le culot cellulaire est homogénéisé dans 1 ml de NaOH-DMSO et la densité optique est lue à une longueur d'ondes de 470 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. La gamme étalon est réalisée avec de la mélanine synthétique (Sigma). TABLEAU Il COMPARAISON DES RESULTATS DE LA SYNTHESE DE LA MELANINE SUR DIFFERENTS MOLLUSQUES Microscopie Mollusques Témoin Gaiazulène vectorisé Lamellibranches Pas de cellules Pectunculus 0,008 0,008 ne synthétisant pigmentaires Glycynaris pas de mélanine Lamellibranches Peu de cellules Venus 21 * 1,7 36 i 1,8 synthétisant peu pigmentaires Mercenaria de mélanine Lamellibranches Bcp de cellules Mytilus Importante synthèse pigmentaires Galloprovin- 621 + 14 1303 *19 de mélanine cialis Lamellibranches Bcp de cellules Ostrea Importante synthèse pigmentaires Gryphae 717 + 14 1177 + 15 de mélanine Le dosage de la mélanine est exprimé en ng/ml pour 106 cellules après 48 heures de culture. Sur des cultures de cellules de mollusques (gryphées) I'inventeur a pu amplifier la synthèse de la mélamine de 400 ng pour 106 cellules chez les témoins à 1300 ng pour 106 cellules traitées en milieu marin conditionnné. La synthèse de la mélanine est bien proportionnelle au nombre de cellules pigmentaires observées. La stimulation par le gaiazulène, et tout spécialement le gaiazulène vectorisé donne une réponse doublement constante et proportionnelle à la quantité de mélanine synthétisée naturellement. Le tableau suivant permet de comparer la teneur en mélanine en ng par ml après 48 H de culture par million de cellules après ensemencement de 4.106 cellules à la densité de 5.105 cellules par ml de milieu de culture en présence de 1 % d'une solution à 1 % de galazulène vectorisé ou de chamazulène vectorisé (conditions de l'exemple l): TABLEAU III Témoin Gaiazulène Chamazulène Moules Mytilus galloprovincialis 710 1560 1018 a 20 35 10 Clams Venus mercenaria 36 54 34 a 4 3 1 Huitre Gryphae angulata 720 1180 1016 a 35 25 10 Amande Pectunculus glycymeris ns ns ns a ns ns ns Le chamazulène apparait un peu moins actif que le guaiazulène ; tout laisse à penser que l'azulène présente une activité comparable. Par ailleurs afin de déterminer l'activité du produit lors de la synthèse de la calcite et de l'aragonite (composant les couches de la coquille), on a effectué des mesures en système C.l.E. L. a. b. Ce système définit les axes suivants - L : luminescence ; elle varie de 0 pour le noir à 100 pour le blanc - Les valeurs a et b définissent les teintes ; plus les valeurs absolues de a ou de b sont grandes, plus la saturation de la teinte est importante: a positif = teinte rouge a négatif - teinte verte b positif : teinte jaune b négatif = teinte bleue. Les mesures ont été effectuées tant sur la nacre d'ostra ou crassostrea (gryphae) (A) que sur celle des zones stimulées (B) ; on observe les résultats suivants: A = 3 L:93,55 avec a = 1,26 a :0,05 avec a=0,05 b: 1,37 avec a = 0,21 B n=3 L:43,60avec a=1,55 a:1,21 avec a = 0,36 b: 0,67aveca=0,95 On conçoit, grâce à l'exposé ci-avant, tout l'intérêt que présente la présente invention en perliculture. II est en effet ainsi possible de traiter des mollusques bivalves perliers telles que la Pinctada Margaritiféra afin d'augmenter la coloration de la nacre. On peut de plus améliorer le rendement de la production des perles noires, orienter les perles de culture traditionnellement blanches vers des perles noires et faire varier la couleur des nacres et des perles du bleu pâle au noir de jais. Les traitements se font de préférence en discontinu, dans des bassins ou par pose d'un implant à relargage lent, come cela est classique en technique pharmaceutique. Les traitements en continu sont envisageables mais risquent de poser plus de problèmes notamment en raison du temps (plus de un an) nécessaire à la construction d'une perle. REVENDICATIONS 1 - Procédé de stimulation de la couleur des éléments pigmentaires secrétés par certaines cellules animales et notamment par celles du tissu du manteau des mollusques, caractérisé en ce qu'il consiste à amplifier la synthése mélanique des mélanocytes par traitement desdits tissus ou cellules en présence de composés de formule générale: dans laquelle R1 1, R2 et R3 sont choisis parmi l'hydrogène ou les radicaux méthyl, éthyl, propyl, isopropyl ou sulfoné. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composés sont encapsulés au sein de vecteurs infracellulaires. 3. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 2, caractérisé en ce que le composé est l'azulène. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé est le chamazulène. 5. Procédé selon la revendication 3 , caractérisé en ce que le composé est le guaiazuluène. 6. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à l'amélioration du rendement de la production de perles noires. 7. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la transformation des perles de culture blanches en perles noires. 8. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la variation de la couleur des nacres et des perles.