FR 2724385 A1 19960315 FR 9410379 A 19940829 VACCIN DE LA PERITONITE INFECTIEUSE FELINE Domaine de l'invention La présente invention a trait à des vaccins contre la Péritonite Infectieuse Féline (PIF) préparés à partir de la glycoprotéine SPIKE (S) du virus de la PIF dont les épitopes facilitants majeurs ont été modifiés par mutagénèse ou éliminés par délétion. Ces vaccins permettent une protection des chats vaccinés contre la PIF sans provoquer chez ces derniers le phénomène de facilitation qui conduit à une évolution accélérée de la maladie. Etat de l'art antérieur Le virus de la Péritonite Infectieuse Féline (FIPV = Feline Infectious Peritonitis Virus) est un virus à ARN simple brin positif, enveloppé, qui, au sein de la famille des Coronaviridae, appartient au groupe antigénique qui comprend le coronavirus félin entérique (FECV), le coronavirus canin (CCV), le virus de la gastroentérite transmissible du porc (TGEV) et le coronavirus respiratoire porcin (PRCV) (Sanchez C. et al. Virology, 1990, 174, 410417). Ce virus provoque une maladie complexe et toujours mortelle chez les chats, connue sous le nom de Péritonite Infectieuse Féline (PIF). Le virus de la PIF se singularise au sein des coronavirus parce qu'il induit chez le chat l'apparition d'anticorps facilitant l'infection par le virus et accélérant l'évolution de la maladie.Des chats possédant des anticorps neutralisant anti-FIPV suite à une infection naturelle antérieure par ce virus, suite à un transfert passif d'anticorps ou suite à une vaccination, développent très fréquemment une maladie beaucoup plus intense et beaucoup plus rapide que celle de chats simplement infectés pour la première fois en l'absence d'anticorps spécifiques (Pedersen N. et Boyle J., Am. J. Vet. Res. 1980, 41, 868-876 ; Weiss R. et al., Comp. Immunol. Microb. Infect. Dis. 1981, 4, 175-189 ; Weiss R. et al., Am. J. Vet. Res. 1980, 41, 663-671). On pense que la liaison des immuns complexes anticorps-virus aux récepteurs Fc présents à la surface des macrophages constitue le mécanisme qui facilite l'accélération de l'entrée du virus dans les cellules et sa diffusion rapide au sein de l'organisme (Porterfield, J. Advances in Virus research, 1986, 31, 335-355 ; Weiss et al. 1981). Ce phénomène de facilitation n'a été observé au sein des coronavirus qu'avec le virus de la PIF. Le virus de la PIF comprend trois protéines structurales. La plus importante en taille est la protéine "SPIKE" ou spicule (S). Cette protéine S est fortement glycosylée et c'est elle qui induit chez le chat à la fois des anticorps neutralisants et des anticorps facilitants. Des études in vitro réalisées avec des anticorps monoclonaux neutralisants dirigés contre le virus de la PIF ont montré que les épitopes neutralisants majeurs sont tous situés sur la glycoprotéine S et qu'ils correspondent, à un large degré, aux épitopes impliqués dans le phénomène de facilitation (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 66956705 ; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965). Une vaccination efficace contre la PIF doit conduire à l'apparition d'anticorps neutralisants sans qu'il y ait induction d'anticorps facilitants. Un tel vaccin n'a jamais pu être mis au point jusqu'ici. Les vaccins recombinants qui ne contiennent pas la glycoprotéine S peuvent probablement fournir la meilleure alternative pour les vaccins PIF futurs, mais ces antigènes ne contribuent que partiellement à l'induction de la réponse neutralisante contre le virus PIF. Des trois antigènes viraux structuraux, seule la glycoprotéine S est capable d'induire une importante réponse neutralisante. Malheureusement, cette glycoprotéine induit aussi l'apparition concomitante d'anticorps facilitants. Malgré son importance dans l'induction d'une bonne réponse neutralisante (et donc dans la réponse protectrice), la glycoprotéine S naturelle semble jouer un rôle essentiel dans le phénomène de facilitation de la PIF et ne peut donc être utilisée pour l'instant pour la fabrication de vaccins répondant aux critères exposés plus haut. La localisation et la caractérisation des épitopes présents sur S et en particulier ceux responsables de la neutralisation et de la facilitation est donc nécessaire pour déterminer les modifications à apporter à la glycoprotéine S (ou au gène qui code pour cette protéine) pour en faire un immunogène efficace pour la vaccination des chats contre la PIF. La séquence nucléotidique et la séquence protéique de la glycoprotéine S du virus de la PIF ont été déterminées (de Groot R. et al. EP-A-0 264 979). Cette demande de brevet n'enseigne pas comment identifier les épitopes neutralisants et/ou les épitopes facilitants sur S. Ce document n'enseigne pas non plus comment utiliser la séquence de S pour fabriquer un vaccin efficace et non facilitant contre la PIF. La demande de brevet PCT WO-A-93/23421 revendique l'utilisation d'une glycoprotéine S tronquée ou d'une séquence d'acide nucléique ne codant que pour une partie de S. En particulier, la région très conservée située à l'extrémité carboxy-terminale de S (124 derniers acides aminés) est revendiquée pour la préparation d'un vaccin "universel" contre les coronavirus. Ce document est très général et n'enseigne pas comment réaliser un vaccin PIF qui n'induise pas d'anticorps facilitants chez le chat. La demande de brevet PCT WO-A-92/08487 revendique l'utilisation de divers peptides sélectionnés sur les protéines S, ou codés par les gènes S, de diverses souches de virus FIPV ou par la séquence du gène S de FECV, à des fins de diagnostic, de traitement ou de prévention de la PIF chez le chat. En particulier, le peptide 598-615 de la séquence protéique de S du virus FIPV souche 79-1146 est revendiqué pour être utilisé sous la forme d'une protéine de fusion avec la galactokinase, protéine recombinante pouvant être utilisée ensuite pour le diagnostic des anticorps anti-PIF chez les chats infectés ou comme vaccin recombinant pour induire une protection contre la PIF chez les chats.Bien qu'envisageant des variations dans les séquences des peptides revendiqués, ce document n'enseigne pas précisément quels doivent être les changements dans les séquences proposées, et n'enseigne ni comment réaliser un vaccin PIF non facilitant, ni quelles sont les régions de la glycoprotéine S impliquées dans ce phénomène. Des efforts importants ont été réalisés pour identifier les sites antigéniques majeurs présents sur les protéines S du virus TGEV (Transmissible Gastro-Enteritis Virus) (Correa I. et al., J. Gen. Virol. 1990, 71, 271-279 Delmas B. et al., J. Gen. Virol. 1990, 71, 1313-1323), BCV (Bovine CoronaVirus) (Yoo D. et al., Virology 1991, 183, 91-98), MHV (Mouse Hepatitis Virus) (Takase-Yoden S. et al., Virus Res. 1990, 18, 99-108 ; Stuhler A. et al., J. Gen Virol. 1991, 72, 1655-1658) et FIPV (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705 ; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965 ; Olsen C. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 745-749). Dans tous les cas, de multiples domaines neutralisants ont été identifiés, et les domaines immunodominants ont été généralement localisés sur la partie S1 de la protéine. Les études portant spécifiquement sur le virus de la PIF ont montré l'existence sur la protéine S d'épitopes induisant à la fois une réponse neutralisante et une réponse facilitante vis-à-vis de l'infection avec FIPV (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705 ; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965 ; Olsen C. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 745-749). Ces mêmes auteurs ont montré que les anticorps monoclonaux neutralisants et facilitants de spécificité anti-S pouvaient être répartis en 6 groupes principaux selon leur capacité à reconnaître différentes souches de virus PIF et différents mutants résistants à la neutralisation par ces monoclonaux (mutants "mar" (monoclonal antibody resistant)). Toutefois, les épitopes correspondant aux régions antigéniques majeures sur FIPV S n'ont pas été caractérisés. Tous les anticorps monoclonaux non neutralisants décrits par ces auteurs (Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965) sont également non facilitants dans un test de facilitation in vitro, ce qui renforce l'hypothèse d'une relation étroite entre neutralisation et facilitation dans le cas du virus de la PIF.La facilitation de l'infection virale par les anticorps survient lorsque les monocytes ou les macrophages sont infectés plus efficacement par les immuns complexes, par une endocytose dépendante de récepteurs spécifiques, que par le virus seul. Malgré toutes les études réalisées sur le phénomène de facilitation dépendant des anticorps, de nombreuses questions restent sans réponse. En particulier, on ne sait pas quels sont les composants viraux spécifiques responsables de la facilitation pour chaque virus. Les études réalisées jusqu'ici chez FIPV indiquent que la facilitation dépend essentiellement d'épitopes présents sur S (Olsen C. et al. 1993 ; Vennema H. et al., J. Virol. 1990, 64, 1407-1409). Hohdatsu T. et al. (Arch. Virol. 1991, 120, 207217) ont trouvé que des anticorps monoclonaux anti-FIPV M pouvaient induire une facilitation de l'infection in vitro. Ceci n'a pas été confirmé in vivo avec les études réalisées avec des recombinants vaccine/FIPV M et vaccine/FIPV N. L'immunisation de chats avec ces deux recombinants n'a pas permis d'observer une facilitation induite par l'une ou l'autre de ces deux protéines (Vennema H. et al. 1990). Si M et N jouent un rôle dans la facilitation, c'est certainement à un degré très inférieur à celui joué par S. Au cours des études réalisées avec les différents systèmes viraux où la facilitation peut être observée, un fait constant a été mis en évidence : des épitopes individuels sont capables d'induire à la fois des anticorps neutralisants et des anticorps facilitants. Ceci a été démontré pour FIPV (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705 ; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965 ; Hohdatsu T. et al., Arch. Virol. 1991, 120, 207-217), pour le virus de la dengue (Morens D. et Halstead S., J. Gen. Virol. 1990, 71, 2909-2917), et pour HIV (Robinson W. Jr., J. Virol. 1991, 65, 4169-4176). Les résultats récents des tests réalisés avec des vaccins PIF expérimentaux semblent fournir l'argument le plus solide à ce jour pour l'existence d'une relation directe entre la facilitation observée in vitro et la maladie accélérée in vivo chez le chat. L'inoculation de chats avec des recombinants du virus de la vaccine exprimant la protéine S de la souche FIPV 79-1146 sensibilise les chats et induit après épreuve une maladie accélérée chez les chats vaccinés par rapport aux chats témoins non vaccinés (Vennema H. et al., J. Virol. 1990, 64, 1407-1409). L'inoculation de recombinants vaccine exprimant soit la protéine M, soit la protéine N, n'a pas prédisposé les chats à une maladie accélérée. Ces résultats in vivo sont à mettre en parallèle avec les résultats in vitro démontrant une localisation majoritaire des épitopes facilitants sur S (Corapi W. et al., J.Virol. 1992, 66, 6695-6705 ; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965). De plus, des expériences récentes réalisées pour étudier l'efficacité d'un autre candidat vaccin pour la PIF ont démontré une association statistiquement significative entre la capacité d'un sérum de chat à induire une facilitation in vitro et le développement chez le même chat d'une maladie accélérée (Olsen C., Vet. Microb. 1993, 36, 1-37). Description de l'invention La présente invention a pour objet la caractérisation des épitopes impliqués dans la facilitation de l'infection par le virus de la PIF. La connaissance précise des structures moléculaires responsables du mécanisme de facilitation permet de concevoir des antigènes n'induisant pas l'apparition d'anticorps facilitants. Ces antigènes sont les composants essentiels d'un vaccin PIF efficace. De manière surprenante, il a été découvert, par analyse de la séquence du gène S de virus FIPV mutants résistants à la neutralisation par des anticorps monoclonaux neutralisants et facilitants, ou résistants à des anticorps monoclonaux uniquement neutralisants et non facilitants, qu'il était possible de contourner le mécanisme d'induction de la facilitation par la glycoprotéine S. Deux sites antigéniques majeurs ont été caractérisés avec les anticorps monoclonaux étudiés : Al et A2. Ces sites sont de manière surprenante situés tous les deux dans la même région de la protéine S. Il semble que les anticorps fortement neutralisants et facilitants reconnaissent les deux sites en même temps. Cette information suggère que la liaison simultanée des deux épitopes par un même anticorps joue un rôle direct dans la facilitation.En effet, parallèlement à cette première dévouverte, il a été découvert que les anticorps neutralisants, mais non facilitants, ne reconnaissent que le site A2. La facilitation serait donc due à une modification conformationnelle par rapprochement entre les deux épitopes Al et A2. La région A2 inclut les acides aminés 637-662 sur la séquence protéique de S (De Groot R. et al., J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646). La nature hydrophile de cette région et le fait que les 3 anticorps monoclonaux testés reconnaissent tous ce petit domaine suggèrent que A2 est un épitope neutralisant dominant de la protéine S. Par ailleurs, l'étroite homologie mise en évidence entre le site Al et une partie du sous-site Aa identifié sur la protéine S de TGEV (Gebauer F. et al., Virology 1991, 183, 225-238) suggère que Al, qui comprend les acides aminés 562-598 doit être également un important épitope neutralisant pour le virus FIPV. Le rapprochement ou la liaison simultanée, par un même anticorps, des sites Al et A2 est nécessaire pour induire la facilitation par l'intermédiaire des anticorps. La présente invention a pour objet la modification par génie génétique de la séquence du gène FIPV S dans la région des sites Al et A2, en particulier pour modifier de préférence le site Al de manière qu'il n'induise plus d'anticorps facilitants. La région A1 peut être modifiée de diverses façons avec les moyens bien connus de l'homme de l'art. On peut modifier les sites Al ou A2 indépendamment ou simultanément. Pour le site Al, les modifications comprennent a minima une mutation pour l'un au moins et, de préférence, les deux codons codant pour Asp 568 et pour Asp 591 pour avoir tout autre acide aminé à ces positions. A la condition que les acides aminés 568 et 591 ne soient pas des Asp, tout autre acide aminé dans la région 562-598 peut être substitué à l'acide aminé naturel de la position considérée. Les modifications du site Al comprennent aussi la délétion complète de la région 562-598 et les délétions partielles de cette région comprenant les acides aminés 568 et/ou 591. Pour le site A2, les modifications comprennent a minima une mutation pour l'un au moins, et de préférence, les trois codons codant pour Asp 643, Arg 649 et Arg 656 pour avoir tout autre acide aminé à ces positions. Les modifications du site A2 comprennent aussi la délétion complète de la région 637-662 et les délétions partielles de cette région comprenant les acides aminés 643, 649 et/ou 656. La présente invention a encore pour objet l'utilisation des gènes FIPV ainsi modifiés pour l'expression in vitro de protéines FIPV S recombinantes et pour la préparation de vaccins sous-unités purifiées pour la vaccination des chats contre la PIF. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation des gènes FIPV S ainsi modifiés pour la construction de vecteurs viraux recombinants exprimant ces gènes modifiés. Ces vecteurs viraux peuvent plus particulièrement être des poxvirus (exemple : virus de la vaccine et ses dérivés, canarypox virus...), des herpèsvirus (herpèsvirus félin en particulier), ou des adénovirus. La présente invention a pour objet la préparation de vaccins contre la PIF avec ces virus recombinants. La présente invention a encore pour objet l'immunisation de chats contre la PIF avec des plasmides contenant les gènes FIPV S, modifiés selon la présente invention, et placés sous le contrôle d'un promoteur fort (par exemple HCMV IE, SV40, etc.) et de signaux de régulation pour la transcription et la traduction. La présente invention a enfin pour objet la préparation de vaccins contre la PIF comprenant une (ou des) protéine(s) FIPV S, modifiée(s) selon la présente invention, de préférence associée(s) à d'autres protéines du virus FIPV telles que par exemple la protéine M. Les séquences nucléotidiques modifiées selon l'invention comportent de préférence la séquence du gène FIPV S avec une ou plusieurs modifications selon l'invention dans l'un au moins des sites Al et A2. Ces séquences comportent également des séquences ne comprenant qu'un fragment du gène FIPV S incorporant les régions Al et/ou A2 modifiées. Elles comprennent encore, bien entendu, les séquences possédant un degré d'homologie élevé avec les séquences précédentes, y compris en tenant compte de la dégénérescence du code génétique, cette homologie étant suffisamment élevée pour que le polypetide exprimé permette d'induire une protection vaccinale. Exemples Exemple 1 : Clonage et expression des fragments du gène FIPV S. Dans le but de localiser la région du gène FIPV S responsable pour la neutralisation et pour la facilitation, le clonage de fragments chevauchants du gène FIPV S a été entrepris de manière à exprimer ces fragments sous forme de protéines de fusion avec la protéine du gène 10 du phage T7. La séquence des oligonucléotides pour l'amplification des différents fragments a été choisie de manière à couvrir l'ensemble de la région codante du gène S en 3 grands fragments d'environ 1600 paires de bases (pb) et 12 sousfragments plus petits d'environ 400 à 500 pb. Ces oligonucléotides contiennent les sites de restriction BamHI, XbaI ou XhoI pour faciliter leur clonage.La transcription réverse de l'ARN et l'amplification de l'ADN complémentaire par une réaction d'amplication en chaîne par polymérase ont été réalisées selon des techniques standards (Sambrook J. et ai., Molecular Cloning : a laboratory manual, 2ème éd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). L'ADN amplifié a été digéré par les enzymes appropriées et cloné dans le vecteur pBluescript (Stratagene, La Jolla, Ca.). Les limites des différents fragments clonés à partir du gène S de la souche 79-1146 du virus FIPV sont indiquées ci-dessous : (toutes les positions font référence à la séquence du gène S de la souche FIPV 79-1146 publiée par De Groot R. et al. (J. Gen. Virol. 1987, 68, 26392646). Fragment F1 : nucléotides 70 à 1736. Fragment F2 : nucléotides 1519 à 3160. Fragment F3 : nucléotides 2773 à 4428. Fragment S1 : nucléotides 70-535. Fragment S2 : nucléotides 394-862. Fragment S3 : nucléotides 742-1221. Fragment S4 : nucléotides 1045-1539. Fragment S5 : nucléotides 1339-1734. Fragment S6 : nucléotides 1594-2089. Fragment S7 : nucléotides 1963-2443. Fragment S8 : nucléotides 2296-2838. Fragment S9 : nucléotides 2743-3004. Fragment S10 : nucléotides 2890-3506. Fragment S11 : nucléotides 3352-4063. Fragment S12 : nucléotides 3895-4428. Les différents fragments FIPV clonés ont ensuite été isolés des clones Bluescript par digestion NotI et XhoI, puis reclonés dans le vecteur pTOPE-SX pour l'étape de transcription et de traduction in vitro. La construction de pTOPE-SX est décrite cidessous Le plasmide pTOPE-lb(+) (Novagen) contient le promoteur T7 et une partie du gène 10 du phage T7 suivie d'un polylinker. Ce polylinker a été entièrement éliminé par digestion avec les enzymes de restriction SacII et XhoI et remplacé par le fragment SacII-XhoI de 82 pb isolé du polylinker contenu dans pBluescript. Un nucléotide supplémentaire a été ajouté à ce fragment de manière à mettre tous les fragments FIPV clonés dans pBluescript en phase avec la phase du gène 10. Le nouveau plasmide a été appelé pTOPE-SX. La transcrition et la traduction in vitro avec l'ARN polymérase du phage T7 des inserts contenus dans pTOPE-SX permet d'obtenir des protéines de fusion contenant 260 acides aminés de la protéine du gène 10 suivis des acides aminés codés par les inserts FIPV. Exemple 2 : Reconnaissance des peptides FIPV S par les anticorps monoclonaux. Dans le but de localiser la région générale du gène S du virus FIPV responsable de la neutralisation et de la facilitation, des fragments chevauchants de ce gène ont été clonés par PCR dans le vecteur pBluescript sous la forme de trois grands fragments (F1, F2 et F3 ; figure 1) et de 12 petits sous-fragments (S1 à S12). Ces inserts FIPV ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur pTOPE-SX en vue de leur transcription et de leur traduction in vitro. Les réactions couplées de transcription et de traduction in vitro ont été réalisées en utilisant le système "TNT Reticulocyte Lysate" (Promega, Madison, WI) selon la technique recommandée par le fabricant en présence de 35S-methionine (Amersham France). Pour étudier l'effet de la maturation post-traductionnelle des protéines , les réactions ont également été réalisées en présence de membranes microsomales pancréatiques de chien (Promega). Les produits de traduction ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et révélés par autoradiographie. Les essais de radio-immunoprecipitation (RIPA) ont été effectués en mélangeant 5p1 du mélange de traduction de la protéine de fusion avec 5p1 d'anticorps monoclonal ou de sérum de chat dans 200 pl de tampon TNE Triton X-100 (NaCl 150 mM, Tris (pH 8,0) 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 0,1 %) et en agitant ce mélange à +4 c pendant 1 heure sous agitation. Des sérums de chat positifs et négatifs pour FIPV ainsi qu'un monoclonal dirigé contre les 10 premiers acides aminés de la protéine du gène 10 de T7 (anticorps monoclonal T7 Tag, Novagen) ont été utilisés comme contrôles.Les immuns complexes sont adsorbés par addition de 50p1 d'un conjugué agarose-protéine G recombinante (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) aux échantillons contenant les anticorps monoclonaux ou par addition de 50p1 d'un conjugué agarose-protéine A recombinante (Boehringer Mannheim) aux échantillons contenant les sérums de chats. Les immuns complexes fixés sur l'agarose ont été centrifugés pendant 30 s et lavés deux fois en tampon RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), 1 % Triton X-100, 0,5 % sodium désoxycholate, 0,1 % SDS) et une fois avec le tampon Tris-Triton (10 mM Tris (pH 8,0), 0,1 % Triton X-100). Les échantillons centrifugés sont ensuite séparés par électrophorèse. Les gels sont fixés et traités avec une solution d'Amplify (Amersham) et révélés par autoradiographie. Les grands fragments F1, F2 et F3 ont une taille d'environ 62 kDa, ce qui donnne des protéines de fusion d'environ 90 kDa correspondant effectivement aux tailles observées. Les petits fragments S1 à S12 ont des tailles d'environ 18 kDa, ce qui donne des protéines de fusion d'environ 46 kDa. Pour optimiser les conditions de reconnaissance des peptides de fusion FIPV S par les anticorps monoclonaux, les protéines de fusion ont été également traduites en présence de membranes microsomales de pancréas de chien. La glycosylation de l'extrémité N-terminale de S (fragment F1) se traduit par un changement de la taille de la protéine de fusion F1 de 90 kDa à 98 kDa ou 145 kDa correspondant respectivement à un accroissement de 8 ou de 55 kDa. Une augmentation de 8 kDa est également observée pour la taille du sous-fragment S1 qui passe de 48 à 54 kDa. La taille des autres fragments FIPV S n'est pas modifiée par la traduction effectuée en présence de membranes microsomales. Les anticorps monoclonaux spécifiques anti-FIPV S 23F4.5, 24H5.4 et 18A7.4 (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705) reconnaissent le fragment F2 et le sousfragment S6 qui ont en commun une séquence de 165 acides aminés (positions 509 à 673 sur la séquence de la protéine S de la souche 79-1146 (De Groot R. et al., J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646). La reconnaissance du fragment F2 n'est pas améliorée par l'utilisation de protéines traduites en présence de membranes microsomales, ce qui suggère que la glycosylation n'est pas nécessaire pour la reconnaissance des épitopes recherchés. Exemple 3 : séquençage des virus mutants résistants à la neutralisation par les anticorps monoclonaux anti-FIPV S (mutants "mar"). Pour localiser les sites antigéniques localisés sur le fragment S6, la région S6 de plusieurs mutants FIPV mar a été amplifiée par PCR et clonée dans le vecteur pBluescript SK+ et séquencée. La séquence des mutants mar a été établie sur des mutants mar indépendants obtenus avec le même monoclonal aussi bien qu'avec des clones issus d'amplifications PCR indépendantes avec le même mutant mar. La séquence de chaque clone a été établie sur les deux birns en utilisant le kit Sequenase (Amersham) selon la technique recommandée par le fabricant. Les séquences obtenues ont été comparées avec la séquence homologue du virus parental 79-1146. Les mutants mar analysés sont les mutants identifiés mar 23F4.5, mar 18A7.4 et mar 24H5.4. Ces mutants ont été obtenus respectivement avec les anticorps monoclonaux 23F4.5, 18A7.4 et 24H5.4 décrits par C. Olsen (Olsen C. et al., J. Virology 1992, 66, 956-965) et W. Corapi (Corapi W. et al., J. Virology 1992, 66, 6695-6705). Le monoclonal 23F4.5 possède un titre neutralisant de 20480 (Corapi, 1992) et induit une facilitation de l'infection in vitro d'au moins 100 fois le niveau normal (Olsen, 1992). Le mutant mar 23F4.5 présente des mutations aux positions 1840 et 2014 qui induisent des changements d'acides aminés dans la séquence de la protéine S pour les résidus 591 (Asp - > Tyr) et 649 (Arg - > Gly). Le monoclonal 18A7.4 possède un titre neutralisant de 5120 et induit une facilitation de l'infection in vitro d'au moins 100 fois le niveau normal. Le mutant mar 18A7.4 présente des mutations aux positions 1772 et 2036 qui induisent des changements d'acides aminés pour les résidus 568 (Asp - > Val) et 656 (Arg - > Lys). Le monoclonal 24H5.4 possède un titre neutralisant de 96 et il a la particularité de ne pas induire de facilitation de l'infection (Olsen, 1992). Le mutant mar 24H5.4 présente une seule mutation à la position 1996 qui induit un changement d'acide aminé pour le résidu 643 (Asp - > Tyr). Exemple 4 : Mutagénèse du site Al, Le fragment central du gène FIPV S HindIII- HindIII de 1723 pb (nucléotides 1696 à 3418) est cloné dans le vecteur pBS-SK+ pour donner le plasmide pFIPV-S2. Le site Al est situé sur le sous-fragment HindIII-SspI (positions 1696 à 1845) de ce fragment.Le site Al est mutagénisé par PCR en utilisant la stratégie suivante Les oligonucléotides suivants sont synthétisés OLIGO A11 (95 mer) (SEQ ID NO: 1) = 5 'ATGAAGCTTAGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCGACACTAAGTAACATCACACTA CCAATGCAGGATAACAATACTGTTGTGTACTGTATTCG 3' OLIGO A12 (88 mer) (SEQ ID NO: 2) = 5 'AAAAJTATTGTACCATAAAGAACTTTTGCAAGTGGAATGAACATAAACTGAGAATTG GTTAGAACGAATACAGTACACAACAGTATTG 3' OLIGO A13 (20 mer) (SEQ ID NO: 3) = 5' ATGAAGCTTAGTGGTTATGG 3' OLIGO A14 (20 mer) (SEQ ID NO: 4) = 5' AAAAATATTGTACCATAAAG 3' Les oligonucléotides A11 et A12 sont hybridés entre eux grâce à leur séquence complémentaire commune de 23 paires de bases. L'hybride ainsi obtenu sert alors, après élongation de ses extrémités 3', de matrice pour une réaction PCR utlisant les oligonucléotides A13 et A14. Cette réaction d'amplification par PCR permet d'obtenir un fragment de 159 pb. Ce fragment est alors digéré avec les enzymes de restriction HindIII et SspI pour produire un fragment HindIII-SspI de 149 pb (fragment A). Ce fragment contient le site Al modifié à deux positions (Val au lieu de Asp à la position 568 et Tyr au lieu de Asp à la position 591). Le plasmide pFIPV-S2 est digéré par Hindîli et digéré partiellement par SspI pour isoler le fragment SspI-HindIII de 1569 pb (fragment B) par Geneclean (BIO101 Inc., La Jolla, Ca.). Le vecteur pBS-SK+ est digéré par HindIII et déphosphorylé pour produire le fragment C (2960 pb). Les fragments A, B et C sont alors ligaturés ensemble pour produire le plasmide pFIPSA1*. Ce plasmide contient le fragment HindIII-HindIII du gène FIPV S modifié pour deux acides aminés du site Al. Le gène FIPV S est ensuite reconstitué en remplaçant par simple clonage le fragment HindIII-HindIII naturel (positions 1696 à 3418) par le fragment HindIII HindIII contenu dans le plasmide pFIPSA1*. Le gène complet FIPV S modifié au site Al peut alors être utilisé pour les constructions de plasmides d'expression ou de virus recombinants. Exemple 5 : Mutagénèse du site A2. Les oligonucléotides suivants sont synthétisés OLIGO A21 (20 mer) (SEQ ID NO: 5) = 5' GGACAATATTTTTAATCAAG 3' OLIGO A22 (36 mer) (SEQ ID NO: 6) 5' TTTAACAACCTGCTCATTGGTTCCTGTACGTGCAGC 3' OLIGO A23 (36 mer) (SEQ ID NO: 7) = 5' AAGTTTTATGTTGCTGCACGTACAGGAACCAATGAG 3' OLIGO A24 (20 mer) (SEQ ID NO: 8) = 5' ATCACTAACATTTTTAAAGC 3' Une réaction PCR (PCR A) est réalisée avec les oligonucléotides A21 et A22 et avec le plasmide pFIPV-S2 comme matrice pour synthétiser un fragment PCR de 199 pb (fragment A). Une réaction PCR (PCR B) est réalisée avec les oligonucléotides A23 et A24 et avec le plasmide pFIPV-S2 comme matrice pour donner un fragment PCR de 273 pb (fragment B). Les fragments PCR A et B sont hybridés entre eux grâce à leur région complémentaire de 46 pb et le produit de cette hybridation, après élongation des extrémités 3', est amplifié par une réaction PCR (PCR C) avec les oligonucléotides A21 et A24 pour donner un fragment PCR de 424 pb. Ce fragment PCR est alors digéré par SspI et DraI pour donner le fragment de restriction SspI-DraI de 402 pb (fragment C). Le plasmide pFIPV-S2 est digéré par HindIII et SspI pour isoler le fragment HindIII-SspI de 149 pb (fragment D). Le plasmide pFIPV-S2 est digéré par HindIII et DraI pour isoler le fragment de restriction DraI-HindIII de 1170 pb (fragment E). Le vecteur pBS-SK+ est digéré par HindIII et déphosphorylé pour donner le fragment F (2960 pb). Les fragments C, D, E et F sont ligaturés ensemble pour donner le plasmide pFIPSA2*. Le fragment central HindIII-HindIII 1723 pb du gène FIPV S contenu dans pFIPSA2* possède un site A2 modifié au niveau de 3 acides aminés (Tyr au lieu de Asp à la position 643, Gly au lieu de Arg à la position 649, et Lys au lieu de Arg à la position 656). Le gène FIPV S est ensuite reconstitué en remplaçant par simple clonage le fragment HindIII-HindIII naturel (positions 1696 à 3418) par le fragment HindIII- HindIII contenu dans le plasmide pFIPSA2*. Le gène complet FIPV S modifié au site A2 peut alors être utilisé pour les constructions de plasmides d'expression ou de virus recombinants. Exemple 6 : Mutagénèse des sites Al et A2. Les fragments A (exemple 4), C et E (exemple 5) sont ligaturés avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par HindIII et déphosphorylé, pour donner le plasmide pFIPSAl*A2*. Le fragment central HindIII-HindIII 1723 pb du gène FIPV S contenu dans pFIPSAl*A2* présente 2 changements d'acides aminés au niveau du site Al (voir exemple 4) et 3 changements d'acides aminés au niveau du site A2 (voir exemple 5). Le gène FIPV S est ensuite reconstitué en remplaçant par simple clonage le fragment HindIII-HindIII naturel par le fragment HindIII-HindIII 1723 pb contenu dans pFIPSAl*A2*. Le gène complet FIPV S comprenant des modifications au niveau des sites Al et A2 peut alors être utilisé pour la construction de plasmides d'expression ou de virus recombinants. Exemple 7 : Construction de délétions au niveau des sites Al et A2. Selon la stratégie de clonage décrite précédemment (mutagénèse par utilisation de réactions PCR), des délétions respectant la phase de lecture du gène FIPV S peuvent être introduites au niveau des sites Al et/ou A2. Pour le site Al, ces délétions éliminent au maximum les nucléotides 1771 à 1842 de la séquence nucléotidique du gène naturel. Pour le site A2, ces délétions éliminent au maximum les nucléotides 1996 à 2037 de la séquence nucléotidique du gène naturel. Selon le même schéma que décrit précédemment (voir exemple 6), on peut construire un fragment central HindIII-HindIII du gène FIPV S présentant simultanément une délétion du site Al et une délétion du site A2. REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique comprenant le gène FIPV S ou un fragment dudit gène, modifiée dans l'une au moins des régions antigéniques Al et A2 impliquées dans la facilitation. 2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, comprenant une modification dans la région Al codant pour les acides aminés 562-598. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2, comprenant une mutation dans l'un au moins des codons codant pour Asp 568 et Asp 591. 4. Séquence nucléotidique selon la revendication 3, dans laquelle au moins le(s) codon(s) codant pour les acides aminés 568 et/ou 591 sont délétés. 5. Séquence nucléotidique selon la revendication 2, comprenant une délétion complète de la région codant pour les acides aminés 562 à 598. 6. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant une modification dans la région A2 codant pour les acides aminés 637-662. 7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, comprenant une mutation dans l'un au moins des codons codant pour Asp 643, Arg 649 et Arg 656. 8. Séquence nucléotidique selon la revendication 7, comprenant une délétion de l'un au moins des codons codant pour les acides aminés 643, 649 et 656. 9. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, comprenant une délétion complète de la région codant pour les acides aminés 637-662. 10. Polypeptide exprimé par l'une des séquences selon les revendications 1 à 9. 11. Utilisation des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la construction de virus recombinants ou de plasmides d'expression. 12. Vaccin comprenant un virus recombinant exprimant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 9 pour la vaccination contre la péritonite infectieuse féline. 13. Composition pour la vaccination contre la péritonite infectieuse féline comprenant une préparation de plasmides d'expression contenant une séquence selon l'une des revendications 1 à 8 dans un véhicule susceptible de permettre l'injection directe desdits plasmides chez le chat. 14. Vaccin comprenant au moins une protéine FIPV S modifiée, selon la revendication 10.