FR 2721606 A1 19951229 FR 9407701 A 19940623 NOUVELLE SUBSTANCE ANTITUMORALE ET ANTILEUCEMIOUE. SA PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIOUES OUI LA CONTIENNENT La présente invention concerne la (3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-7-méthy- lène-1-vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4-one de formule: ainsi que ses formes stéréoisomères, un procédé d'obtention à partir de la plante Ottelia alismöïdes et les compositions pharmaceutiques qui la contiennent. Plus particulièrement, la présente invention concerne le produit de formule (I) qui présente les caractéristiques suivantes - pouvoir rotatoire: [a]20(Na 589) = -20,8+1,0 (dichlorométhane, c = 0,5) [a]20(Hg 436) = -32+1,2 (dichlorométhane, c = 0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractéristiques à 3400, 3070, 2925, 2840, 1660, 1580, 1500, 1435, 1270, 1125 et 1025 cm-l. - spectre de masse (DCI NH3) : 328 (M + NH4)+ (EI) : 311 (M + NH4 - OH)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHz; CDCl3 ; 6 en ppm) :6,99 (d,J = 9Hz, 1H); 6,80 (d,J =2Hz, 1H); 6,77 (d,J = 8Hz, îHî, 6.69 (dd,J = 2 et 8 Hz, 1H); 5,94 (d, J = 9 Hz, 1H); 5,78 (m, 1H); 5053 (s, 1H); 5,32 (m, 2H); 4,98 (d, J = 10 Hz, 1H); 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,88 (s, 3H); 3,07 (m, 1H); 2,88 (dd, J = 6 et 8 Hz, 1H); 2,80 (t, J = 8 et 8 Hz, 1H); 2,62 (m, 1H); 2,51 (m, 2H); 1,74 (m, 1H); 1,58 (m, 1H). La (3-hydroxy4-méthoxy-benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3 ,3a,4,7,7a-hexahy- dro-indène-4-one peut être obtenue à partir de la plante Ottelia alismoides par extraction au moyen d'un solvant convenable suivie de la séparation de la (3-hydroxy-4mé- thoxy-benzyl)-7-méthylène-1-vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène4-one de l'extrait obtenu. Ottelia alismoïdes, qui appartient à la famille des hydrocharitacées, est une plante aquatique submergée ou partiellement flottante. Les feuilles d'Ottelia alismoides sont radicales formant, pour la partie immergée, une couronne rétrécie. La longue partie flottante est pétiolée, ovale et lancéolée, oblongue ou cordée. Les fleurs sont hermaphrodites et solitaires, sessiles avec une longue spate pédonculée, et sont constituées de trois sépales linéaires et oblongues et de trois pétales larges ovoïdes ou orbiculaires. Selon l'invention, Ottelia alismoïdes, sous forme de la plante entière, généralement séchée et finement broyée, est traitée une ou plusieurs fois par un solvant choisi parmi les alcools aliphatiques contenant 1 à 4 atomes de carbone pour fournir, après concentration, un extrait sec qui est repris par un hydrocarbure aliphatique contenant 5 à 8 atomes de carbone ou un hydrocarbure cycloaliphatique contenant 5 à 7 atomes de carbone pour obtenir une solution dont les insolubles sont séparés par filtration et qui, après concentration fournit un extrait sec dont on sépare la (3-hydroxy-4méthoxy benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3 ,3a,4,7,7a-hexahydro-indène4-one par application de techniques chromatographiques. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est particulièrement avantageux d'effectuer l'extraction de la plante entière au moyen d'éthanol et de traiter l'extrait sec obtenu par un hydrocarbure aliphatique tel que l'hexane. La séparation de la (3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl- 2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4-one à partir de l'extrait issu du traitement par un hydrocarbure aliphatique est généralement effectuée par chromatographie liquide à haute performance ou par chromatographie de partage centrifuge. La (3 -hydroxy-4-méthoxy-benz:yl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexa- hydro-indène4-one présente des propriétés biologiques remarquables. In vitro, la (3-hydroxy-4-méthoxy-benz:yl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3 ,3a,4,7,7a- hexahydro-indène4-one présente la propriété d'inhiber la polymérisation de la tubuline. La tubuline, issue de cervelles de porcs, est purifiée par trois cycles de polymérisation-dépolymérisation selon la méthode de M.L. SHELANSKI et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 765-768 (1973) suivie d'une chromatographie sur phosphocellulose selon la méthode de M.D. WEINGARTEN et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1858-1862 (1975). La tubuline, à une concentration de 8,5cl dans un tampon Mes 0,05 M (pH = 6,8), MgCl2 0,25 mM, EGTA 0,5 mM, glycérol 3,4 M, GTP 1 mM est polymérisée à 37"C pendant 30 minutes après addition de MgCl2 (6 mM) et de concentrations croissantes de 0,8 à 16 HM de (3-hydroxy4-méthoxy-benzyl)-7- méthylène-1-vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4-one en solution à 1 mg/cm3 dans l'éthanol absolu. L'assemblage de la tubuline en microtubules se traduit par une augmentation de la turbidité observée à 350 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. La (3-hydroxy9-méthoxy-benzyl)-7-méthylène- 1-Wlyl-2,3 ,3a,4,7.7a-hexahy- dro-indène-4-one provoque une inhibition de la polymérisation de la tubuline qui se traduit par une augmentation du temps de latence, une diminution de la vitesse de polymérisation ainsi qu'une turbidité plus faible à l'état stationnaire. La concentration de produit de formule (I) qui inhibe de 50 Go la polymérisation de la tubuline à une concentration voisine de 1 CLAM. In vitro, la (3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-7-méthylène- 1-vinyl-2,3 ,3a,4,7,7a- hexahydro-indène-4-one manifeste une cytotoxicité inférieure à 1 ng/cm3 sur les li gnées cellulaires de la leucémie murine P388, ainsi que sur les lignées résistantes P388/DOX. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 On agite 8,8 kg d'Ottelia alismoïdes, sous forme de plante entière séchée et finement broyée, sont agités dans un filtre monoplaque garni d'une toile Tergal(8) avec 60 litres d'éthanol à 99,9 go, dénaturé au cyclohexane, pendant 1 heure. Après filtration sous un pression d'azote de 2 bars, la plante est à nouveau extraite par 60 litres d'éthanol pendant 1 heure, puis par 30 litres d'éthanol pendant 12 heures. La plante est alors lavée par 30 litres d'éthanol. La solution éthanolique ainsi obtenue est concentrée jusqu'à un volume de 15 litres dans un évaporateur à thermosiphon, puis concentrée à sec sous pression réduite à 40 C. On obtient ainsi 80 g d'extrait mou de couleur verte qui est repris par 3 litres d'hexane. Après filtration d'un insoluble (7 g), le filtrat est concentré à sec. On obtient ainsi 73 g d'un produit (extrait A) dont l'activité inhibitrice sur la polymérisation de la tubuline (CI50) est de 75 ,ug/cm3. On reprend 9,4 g d'extrait A par 200 cm3 de cyclohexane. Après filtration d'un insoluble inactif (2 g), la solution cyclohexanique est déposée sur une colonne de 200 g de silice Merck (0,040-0,063 mm) pour laquelle le rapport diamètre/hauteur est égal à 15. L'élution est réalisée avec un mélange cyclohexane-dichlorométhane avec un gradient croissant de 5 % en dichlorométhane en recueillant des fractions de 500 cm3. Les fractions qui correspondent à l'élution par les mélanges cyclohexane dichlorométhane 45-55, 40-60 et 35-65 en volumes sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite à une température voisine de 20"C. On obtient ainsi 1,2 g d'un produit dont l'activité est de 2,5 CLg/cm3. On reprend le produit ainsi obtenu par 5 cm3 d'un mélange dichlorométhaneméthanol (99-1 en volumes) et chromatographie sur une colonne de 50 g silice Merck 60H, pour laquelle le rapport diamètre/hauteur est égal à 15, préparée avec le même solvant. On élue avec un mélange dichlorométhane-méthanol (99-1 en volumes) en recueillant des fractions de 2 cm3. Les fractions 41 à 68 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 70 mg d'un produit, dont l'activité est de 1 llg/cm3, qui est purifié par chromatographie liquide à haute performance sur une colonne BIORAD C18 HL-90-10 en éluant avec un mélange acétonitrile-eau au débit de 3 cm3/minute et en effectuant la détection par absorption U.V. à 254 nm.La collecte du pic correspondant au pic de rétention de 19 minutes fournit 14 mg de (3 hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-7-méthylène-l -vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4- one pure sous forme d'un semi solide jaune pâle dont les caractéristiques sont les suivantes: - pouvoir rotatoire: [a]20(Na 589) = -20,8+1,0 (dichlorométhane, c = 0,5) [a]20(Hg 436) = -32+1,2 (dichlorométhane, c = 0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractéristiques à 3400, 3070, 2925, 2840, 1660, 1580, 1500, 1435, 1270, 1125 et 1025 cm-l. - spectre de masse (DCI NH3) : 328 (M + NH4)+ (EI) 311 (M+NH4-OH)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHz fCDC13 ; 6 en ppm) : 6,99 (d, J = 9 Hz, 1H) ;6,80 (d, J = 2 Hz, 1H); 6,77 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 2 et 8 Hz, 1H); 5,94 (d, J = 9 Hz, 1H); 5,78 (m, 1H); 5053 (s, 1H); 5,32 (m, 2H); 4,98 (d, J = 10 Hz, 1H); 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,88 (s, 3H); 3,07 (m, 1H); 2,88 (dd, J = 6 et 8 Hz, 1H); 2,80 (t, J = 8 et 8 Hz, 1H); 2,62 (m, 1H); 2,51 (m, 2H); 1,74 (m, 1H); 1,58 (m, 1H). Le produit obtenu peut être visualisé par chromatographie sur couche mince de silice Merck F254 en éluant avec un mélange dichlorométhane-méthanol (99-1 en volumes) et révélation, après chauffage de la plaque à 100"C, avec du sulfate cérique à 0,1 % dans l'éthanol. le produit apparaît sous forme d'un spot de Rf = 0,5 avec une couleur rouge-violet. EXEMPLE 2 On reprend 2 g d'extrait A obtenu à l'exemple 1 par 10 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-heptane-méthanol-eau (1-2-2-1 en volumes) puis chromatographie par chromatographie de partage à contre-courant sur un appareil CPC SANKI ayant une colonne de 245 cm3 en opérant dans les conditions suivantes: - phase stationnaire : phase lourde - phase mobile : phase légère - sens : ascendant - vitesse de rotation : 1000 tours/minute - débit : 3 cm3/minute - rétention : 80 Go - inversion du sens : à 170 minutes L'injection est réalisée à l'équilibre des 2 phases. On recueille les fractions toutes les 2 minutes.La chromatographie sur couche mince et le dosage montrent que les fractions 56 à 85 contiennent la (3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl)-7-méthylène- 1- vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4One. La purification du produit obtenu par HPLC dans les conditions décrites dans l'exemple 1 fournit 2 mg de (3-hydroxy4 méthoxy-benzyl)-7-méthylène-1-vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-indène-4-one pure. La (3-hydroxy-méthoxy-benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3,3a,4,7,7a-hexa- hydro-indène-4-one manifeste une activité inhibitrice significative de la prolifération cellulaire anormale et possède des propriétés thérapeutiques permettant le traitement de malades ayant des conditions pathologiques associées à une prolifération cellulaire anormale. Les conditions pathologiques incluent la prolifération cellulaire anormale de cellules malignes ou non malignes de divers tissus et/ou organes, comprenant, de manière non limitative, les tissus musculaires, osseux ou conjonctifs, la peau, le cerveau, les poumons, les organes sexuels, les systèmes lymphatiques ou rénaux, les cellules mammaires ou sanguines, le foie, l'appareil digestif, le pancréas et les glandes thyroides ou adrénales.Ces conditions pathologiques peuvent inclure également le psoriasis, les tumeurs solides, les cancers de l'ovaire, du sein, du cerveau, de la prostate, du colon, de l'estomac, du rein ou des testicules, le sarcome de Kaposi, le cholangiocarcinome, le choriocarcinome, le neuroblastome, la tumeur de Wilms, la maladie de Hodgkin, les mélanomes, les myélomes multiples, les leucémies lymphocytaires chroniques, les lymphomes granulocytaires aigus ou chroniques. Le nouveau produit selon l'invention est particulièrement utile pour le traitement du cancer du sein, de l'ovaire, du colon ou du rein. Le produit selon l'invention peut être utilisé pour prévenir ou retarder l'apparition ou la réapparition des conditions pathologiques ou pour traiter ces conditions pathologiques. Le produit selon l'invention peut être administré à un malade selon différentes formes adaptées à la voie d'administration choisie qui, de préférence, est la voie parentérale. L'administration par voie parentérale comprend les administrations intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. Plus particulièrement préférée est l'administration intrapéritonéale ou intraveineuse. La présente invention comprend également les compositions pharmaceutiques qui contiennent la (3 hydroxy-4-méthoxy-benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3,3 a,4, 7,7a-hexahydro-indène-4-one en une quantité suffisante adaptée à l'emploi en thérapeutique humaine ou vétérinaire. Les compositions peuvent être préparées selon les méthodes habituelles en utilisant un ou plusieurs adjuvants, supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables. Les supports convenables incluent les diluants, les milieux aqueux stériles et divers solvants non toxiques. De préférence les compositions se présentent sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses, de solutions injectables qui peuvent contenir des agents émulsifiants, des colorants, des préservatifs ou des stabilisants. Le choix des adjuvants ou excipients peut être déterminé par la solubilité et les propriétés chimiques du produit, le mode particulier d'administration et les bonnes pratiques pharmaceutiques. Pour l'administration parentérale, on utilise des solutions ou des suspensions stériles aqueuses ou non aqueuses. Pour la préparation de solutions ouae suspensions non aqueuses peuvent être utilisés des huiles végétales naturelles telle que l'huile d'olive, l'huile de sésame ou l'huile de paraffine ou les esters organiques injectables tels que l'oléate d'éthyle. Les solutions aqueuses conviennent pour l'administration intraveineuse dans la mesure où le pH est convenablement ajusté et où l'isotonicité est réalisée, par exemple, par une quantité suffisante de chlorure de sodium ou de glucose. La stérélisation peut être réalisée par chauffage ou par tout autre moyen qui n'altère pas la composition. I1 est bien entendu que tous les produits entrant dans les compositions selon l'invention doivent être purs et non toxiques pour les quantités utilisées. Les compositions peuvent contenir au moins 0,001 Go de produit thérapeutiquement actif. La quantité de produit actif dans une composition est telle qu'une posologie convenable puisse être prescrite. De préférence, les compositions sont préparées de telle façon qu'une dose unitaire contienne de 0,01 à 100 mg environ de produit actif pour l'administration par voie parentérale. Le traitement thérapeutique peut être effectué concuremment avec d'autres traitements thérapeutiques incluant des médicaments antinéoplastiques, des anticorps monoclonaux, des thérapies immunologiques ou des radiothérapies ou des modificateurs des réponses biologiques. Les modificateurs des réponses incluent, de manière non limitative, les lymphokines et les cytokines telles que les interleukines, les interférons (a, '3ou b) et le TNF.D'autres agents chimiothérapeutiques utiles dans le traitement des désordres dus à la prolifération anormale des cellules incluent, de manière non limitative, les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote comme la mechlo- retamine, le cyclophosphamide, le melphalan et le chlorambucil, des sulfonates d'alkyle comme le busulfan, les nitrosourées comme la carmustine, la lomustine, la sémustine et la streptozocine, les triazènes comme la dacarbazine, les antimétabolites comme les analogues de l'acide folique tel que le méthotrexate, les analogues de pyrimidine comme le fluorouracil et la cytarabine, des analogues de purines comme la mercaptopurine et la thioguanine, des produits naturels tels que les alcaloïdes de vinca comme la vinblastine, la vincristine et la vendésine, des épipodophyllotoxines comme l'étoposide et le teniposide, des antibiotiques comme la dactinomycine, la daunorubicine, la doxorubicine, la bléomycine, la plicamycine et la mitomycine, des enzymes comme la L-asparaginase, des agents divers comme les complexes de coordination du platine tel que le cisplatine, les urées substituées tel que l'hydroxuuréc, les dérivés de méthylhydrazine comme la procarbazine, les suppresseurs adrénocorticoiques comme le mitotane et l'aminoglutéthymide, les hormones et les antagonistes comme les adrénocorticostéroides comme la prednisone, les progestines comme le caproate d'hydroxyprogestérone, l'acétate de méthoxyprogestérone et l'acétate de megestrol, les oestrogènes comme le diéthylstilbestrol et l'éthynylestradiol, les antioestrogènes comme le tamoxifène, les androgènes comme le propionate de testostérone et la fluoxymesterone. Les doses utilisées pour mettre en oeuvre les méthodes selon l'invention sont celles qui permettent un traitement prophylactique ou un maximum de réponse thérapeutique. Les doses varient selon la forme d'administration et les caractéristiques propres du sujet à traiter. En général, les doses sont celles qui sont thérapeutiquement efficaces pour le traitement des désordres dus à une prolifération cellulaire anormale. Le produit selon l'invention peut être administré aussi souvent que nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique désiré. Certains malades peuvent répondre rapidement à des doses relativement fortes ou faibles puis avoir besoin de doses d'entretien faibles ou nulles. Généralement, de faibles doses seront utilisées au début du traitement et, si nécessaire, des doses de plus en plus fortes seront administrées jusqu'à l'obtention d'un effet optimum. Pour d'autres malades il peut être nécessaire d'administrer des doses d'entretien 1 à 8 fois par jour, de préférence 1 à 4 fois, selon les besoins physiologiques du malade considéré. I1 est aussi possible que pour certains malades il soit nécessaire de n'utiliser qu'une à deux administrations journalières. Chez l'homme, par voie intraveineuse, les doses sont généralement comprises entre 0,05 et 50 mg/kg et, de préférence entre 0,01 et 5 mg/kg et, encore plus spécifiquement entre 0,1 et 2 mg/kg. Il est entendu que, pour choisir le dosage le plus approprié, devront être pris en compte la voie d'administration, le poids du malade, son état de santé général, son âge et tous les facteurs qui peuvent influer sur l'efficacité du traitement. L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention. EXEMPLE On dissout 40 mg du produit obtenu à l'exemple 1 dans 1 cm3 d'Emulphor EL 620 et 1 cm3 d'éthanol puis la solution est diluée par addition de 18 cm3 de sérum physiologique. La composition est administrée par perfusion pendant 1 heure par introduction dans du soluté physiologique. REVENDICATIONS 1 - La (3-hydroxy-4-méthOxy-benzyl)-7-méthylène-1-vinyl-2,3,3a,4,7,7a- hexa-hydro-indène-4-one de formule: ainsi que ses formes stéréoisomères. 2 La (3-hydroxy-4-méthoxy-benzyl) -7-méthylène- 1 -vinyl-2,3,3a,4,7,7a- hexahydro-indène-4-one caractérisée en ce qu'elle présente les caractéristiques suivantes: - pouvoir rotatoire: [a] 20 (Na 589) = -20,8 + 1,0 (dichlorométhane, c = 0,5) [a]20(Hg 436) = -32+1,2 (dichlorométhane, c = 0,5) - spectre infra-rouge : principales bandes d'absorption caractéristiques à 3400, 3070, 2925, 2840, 1660, 1580, 1500, 1435, 1270, 1125 et 1025 cm-l. - spectre de masse (DCI NH3) : 328 (M + NH4)+ (EI) : 311 (M + NH4 - OH)+ - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (600 MHz ; CDCl3 ; 6 en ppm) : 6,99 (d, J = 9 Hz, 1H) ;6,80 (d, J = 2 Hz, 1H); 6,77 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 2 et 8 Hz, 1H); 5,94 (d, J = 9 Hz, 1H); 5,78 (m, 1H); 5055(s, 1H); 5,32 (m, 2H); 4,98 (d, J = 10 Hz, 1H); 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,88 (s, 3H); 3,07 (m, 1H); 2,88 (dd, J = 6 et 8 Hz, 1H); 2,80 (t, J = 8 et 8 Hz, 1H); 2,62 (m, 1H); 2,51 (m, 2H); 1,74 (m, 1H); 1,58 (m, 1H). 3 - Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce l'on extrait la plante Ottelia alismoides au moyen d'un solvant convenable puis sépare le produit selon la revendication 1 de l'extrait obtenu. 4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'on extrait la plante au moyen d'un solvant choisi parmi les alcools aliphatiques contenant 1 à 4 atomes de carbone pour obtenir, après concentration, un extrait sec que l'on reprend par un solvant choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques contenant 5 à 8 atomes de carbone ou les hydrocarbures cycloaliphatiques contenant 5 à 7 atomes de carbone pour obtenir une solution que l'on concentre, après séparation des insolubles puis, pour obtenir un extrait dont on sépare la (3-hydroxy4-méthoxy-benzyl) -7-méthylène-i -vinyl- 2,3,3a,4,7,7a-hexahydroeindène-4-one par application de techniques chromatographiques. 5 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient le produit selon l'une des revendications 1 ou 2 à l'état pur ou en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants et éventuellement avec ou plusieurs produits eux-mêmes thérapeutiquement actifs.