FR 2723849 A1 19960301 FR 9410479 A 19940831 La présente invention se rapporte à un procédé permettant d'augmenter l'immunogénicité d'un antigène et à l'utilisation des produits susceptibles d'être obtenus notamment à titre de vaccin. Le cytomégalovirus humain (CMV), un herpès virus à l'état latent chez les individus immunocompétents est responsable de pathologies très diverses et souvent mortelles en cas d'immunodépression (foetus, greffe, Sida, leucémie, cancer) (pour revue voir (1)). Le CMV est la source principale de malformations congénitales d'origine infectieuse. Pour toutes ces raisons le CMV pose un grave problème de santé publique. La lutte contre ce virus est limitée à la chimiothérapie par des antiviraux non spécifiques comme Ganciclovir z et Foscarnet t', dont les effets secondaires et la néphrotoxicité ont été décrits. En matière de prévention, l'immunothérapie passive (injection de gammaglobulines) diminue l'incidence de la primo-infection chez les greffés de moelle séronégatifs. Chez les transplantés (allogreffes de moelle, de rein, de coeur, de foie), I'infection à CMV est associée au rejet du greffon. Les receveurs, sous immunosuppresseur (cyclosporine) sont traités au Ganciclovir 49 pendant la greffe et reçoivent des gammaglobulines pendant les trois mois suivant l'intervention. L'injection intra veineuse à haute dose d'immunoglobulines chez ces patients a permis, dans certains cas, une réduction de la fréquence des pneumonies et des rejets. Ceci soulève le problème non négligeable du coût très élevé associé à ces traitements. L'infection opportuniste par CMV chez les individus HIV+ est une des plus dramatiques et nécessite une chimiothérapie par des antiviraux. Les économies réalisées en élaborant une politique de prévention des maladies liées à l'infection par CMV chez les individus à risque seraient substantielles. En effet, des estimations du coût associé à la vaccination d'un individu et à sa prise en charge (analyses sérologiques, vaccin, traitement d'effets secondaires mineurs) effectuées aux Etats Unis (2) montrent que ce coût serait environ 50 fois inférieur à celui des soins apportés à un nouveau-né victime d'une infection congénitale. L'infection à CMV est observée chez les 2/3 des transplantés rénaux et à une fréquence élevée chez les autres transplantés. Si elle est associée à des complications chez environ 1/3 d'entre eux, le coût annuel ajouté à celui de la transplantation est considérable.Malgré l'impact de drogues comme le Ganciclovir es ou l'injection de gammaglobulines sur la maladie, la prévention de l'infection primaire et de la réactivation chez ces patients doit être une priorité. Les bénéfices de l'immunisation sont évidents tant sur le plan clinique qu'économique. La mise au point d'un vaccin anti-CMV devrait permettre d'enrayer le développement des pathologies associées aux infections congénitales en vaccinant les jeunes femmes avant et pendant la grossesse, d'assurer la protection des malades en attente de greffes et d'initier une réponse anticytomégalovirus chez les individus HlV+ asymptomatiques. L'utilisation de virus tué ne semble pas appropriée car les extraits viraux n'induisent pas, en général, de réponse de type TCD8+ cytotoxique. Le virus atténué soulève le problème du caractère oncogène, de la latence et de la réactivation des particules virales. Le développement de vaccins recombinants qui devrait permettre d'éviter ces risques, nécessite la connaissance des antigènes ou fragments d'antigènes (épitopes) les plus immunogènes de l'agent infectieux.Le but de la vaccination est l'induction d'une immunité protectrice. Une approche rationnelle de la vaccination doit impliquer trois étapes : (i) I'identification des mécanismes effecteurs responsables de la protection, (ii) le choix d'un antigène capable d'induire une réponse chez tous les individus, et (iii) I'utilisation d'une voie d'administration du vaccin capable d'induire le type de réponse souhaité (humorale: anticorps, cellulaire: cytotoxique et auxiliaire). La défense de l'organisme contre une infection virale est assurée essentiellement par le développement d'une réponse immunitaire humorale (production d'anticorps neutralisants) empêchant l'adsorption du virus à la surface cellulaire d'une part et d'une réponse cellulaire d'autre part (cellules TCD8+ cytotoxiques et TCD4+ auxiliaires) éliminant les cellules infectées et inhibant la réplication virale (synthèse de cytokines (TNFa, IFNy...)). En ce qui concerne le cytomégalovirus humain, parmi les 200 protéines codées par l'ADN double brin (230 kpb), trois d'entre elles sont les cibles majeures respectives de ces différents types de réponse: la glycoprotéine d'enveloppe gB (3), la phosphoprotéine du tégument pp65 (4) et la phosphoprotéine de régulation IE1 (5). Si la mise au point d'un vaccin anti-CMV semble être une nécessité, il subsiste le problème général de la vectorisation des antigènes recombinants. Les antigènes introduits dans des structures synthétiques doivent être capables d'initier ou de restaurer une réponse immunitaire B et T (auxiliaire CD4+ et cytotoxique CD8+) durable, assurant ainsi la protection des individus contre une infection primaire, une réinfection ou une réactivation du virus latent. L'activation des cellules T (cellules naives ou cellules mémoires) est liée à la capacité de présentation de l'antigène par les cellules présentatrices d'antigène dont les plus importantes sont les cellules dendritiques, les lymphocytes B et les macrophages. Dans ce contexte les particules vectrices devront permettre l'accès aux voies de présentation endogène (classe I, TCD8+) et exogène (classe II, TCD4+). La société A & Biovecteurs a développé un type de structure appelée Biovecteur Supramoléculaire constitué d'un noyau polysaccharidique (NPS) recouvert d'une ceinture d'acides gras (CA) ou de phospholipides (BVSM.) dont on peut faire varier la composition. La maille polysaccharidique possède un degré de réticulation modulable, peut être fonctionnalisée (radical anionique ou cationique), est très stable, et permet la fixation d'une quantité importante d'antigène à l'intérieur du noyau aussi bien qu'à sa périphérie. De manière inattendue, la Demanderesse a trouvé que l'association d'une protéine ou d'un peptide avec ces vecteurs permettait d'observer une potentialisation de la réponse immunogène par rapport à celle entrainée par l'administration de l'antigène seul. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène, caractérisé en ce que l'antigène est associé par des interactions stables à un vecteur particulaire, ledit vecteur comportant - un noyau hydrophile non liquide - une couche externe de composés choisis dans le groupe comprenant les phospholipides et les acides gras. De préférence, le noyau est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés. Selon l'un des aspects de l'invention, des ligands ioniques sont greffés sur le noyau, ce ligand pouvant notamment porter une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaires, amines secondaires, amines primaires. Les vecteurs permettant la mise en oeuvre du procédé peuvent avoir une taille comprise entre 10 nm et 5 Fm, et des résultats particulièrement avantageux sont obtenus pour des tailles comprises entre environ 25 nm et 200 nm, notamment de l'ordre de 80 nm. L'association d'un antigène à des vecteurs particulaires acylés ou phospholipidés augmente notamment la réponse proliférative de clones de cellules TCD4+ in vitro à cet antigène, en présence de leucocytes du sang périphérique et de lymphocytes B/EBV isolés. Les rendements d'association de l'antigène aux particules sont élevés et les complexes obtenus sont très stables en milieu physiologique. La mise en évidence d'une potentialisation de la réponse proliférative T souligne les propriétés remarquables de ces biovecteurs et l'intéret de leur utilisation potentielle en vaccination. Ces résultats ne sont pas obtenus avec un simple mélange, sans interaction préalable, de l'antigène et du vecteur particulaire. L'antigène est associé au vecteur particulaire par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Selon un aspect de l'invention, la couche externe du vecteur particulaire est constituée d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes. Selon un autre aspect, cette couche externe est constituée de phospholipides naturels ou synthétiques. L'invention a également pour objet un produit susceptible d'être obtenu par le procédé décrit, et qui comprend une association potentialisant l'immunogénicité, d'un antigène lié par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes à un vecteur particulaire, ledit vecteur particulaire comportant - un noyau hydrophile non liquide et, - une couche externe, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et constituée des composés choisis dans le groupe comprenant les phospholipides et les acides gras. L'antigène peut être une protéine ou un peptide, d'origine bactérienne ou virale, ou un fragment dérivé de ces antigènes. Plus particulièrement, l'invention concerne un produit potentialisant l'immunogénicité tel que défini précédemment dans lequel l'antigène est une protéine du CMV, ou un fragment d'une telle protéine. Les propriétés remarquables de ces vecteurs peuvent en effet être exploitées pour l'encapsulation d'antigènes du CMV humain, dans le but de concevoir un vaccin recombinant qui associerait les antigènes IE1, pp65 et gB pour les raisons évoquées plus haut. Un tel produit serait capable d'engendrer une réponse humorale et cytotoxique. L'antigène peut donc notamment être la protéine lEl du CMV, ou un fragment de cette protéine. Un fragment de la protéine virale recombinante IE1 du Cytomégalovirus humain (souche Toxine) a été produit et purifié, sous la forme d'une protéine de fusion (GST-e4) dans E. Coli. L'association de la protéine à différents types de particules (NPS, CA et BVSM) de 80nm est très stable et les rendements très élevés. Nous avons décrit un effet adjuvant des complexes antigène (Ag)/ particules sur la réponse proliférative de clones TCD4+ spécifiques in vitro. Cet effet a été observé en utilisant comme cellules présentatrices d'antigène des leucocytes du sang périphérique et des lymphocytes B transformés par EBV (B/EBV). La prolifération de clones T anti IE1 en présence de GST-e4 recombinante soluble ou associée à des particules suggère que le couplage de l'antigène viral à la GST bactérienne, l'absence de phosphorylation de la protéine dans ce système d'expression procaryote, et l'association à des biovecteurs n'ont pas eu d'influence sur la nature des peptides épitopes générés par les cellules présentatrices. L'une des hypothèses, par laquelle la Demanderesse n'entend aucunement limiter l'invention, est que l'effet adjuvant observé lorsque l'antigène est associé aux particules pourrait être corrélé à une capture plus importante de protéine, par la cellule présentatrice que lorsque l'antigène est soluble, comme cela a été constaté par la Demanderesse.La concentration de l'antigène dans les compartiments endo-lysosomiaux pourrait favoriser l'interaction des molécules de classe II avec des peptides viraux plutôt qu'avec des peptides endogènes ou exogènes issus de protéines du sérum par exemple. Ceci aurait pour conséquence l'expression d'un plus grand nombre de complexes DR-peptide IE1 à la surface cellulaire. L'effet potentialisateur observé avec les CA pourrait être lié à une meilleure accessibilité de l'antigène. Les vecteurs que nous avons utilisés ont permis l'incorporation d'une masse importante d'antigène par simple mélange en solution aqueuse. Ceci représente un avantage important par rapport aux protocoles d'encapsulation dans d'autres types de particules comme les liposomes (6). I1 est possible que l'effet adjuvant observé puisse aussi être médié par une opsonisation des particules, faisant intervenir l'interaction entre des IgG sériques ou des fragments du complément comme C3b et leurs récepteurs respectifs à la surface des cellules présentatrices. La Demanderesse a montré qu'une protéine de fusion plus stable que e4 seul, entre le fragment e4 du CMV et la glutathion-S-transférase (GST), préparée par génie génétique peut être utilisée dans les vecteurs selon l'invention, sans nécessiter une étape de clivage afin d'éliminer la partie GST. Ceci représente un progrès considérable car une telle protéine est aisément purifiable et la suppression de l'étape de clivage permet d'augmenter le rendement et d'envisager sa production à grande échelle. L'invention a donc également pour objet une protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment e4 de la protéine IE1 du CMV et au moins une partie de la protéine glutathion-S-transférase. Le but de la vaccination est d'induire la maturation de cellules impliquées dans l'élimination spécifique d'un agent pathogène et de maintenir des clones de cellules mémoires spécifiques des antigènes cibles dans la circulation et dans les organes lymphoides secondaires. La contribution importante des cellules B en tant que cellules présentatrices d'antigène à l'activation des cellules T a été rapportée (7). Il a été montré que la cellule B n'endocyte efficacement les antigènes solubles, à faible concentration, que par l'intermédiaire de son immunoglobuline de surface. Les travaux destinés à cibler des liposomes sur des lymphocytes B faisaient appel à la fixation à leur surface d'anticorps monoclonaux (8) destinés à interagir avec les immunoglobulines de surface de ces cellules. La fréquence des lymphocytes B spécifiques étant très faible, l'effet observé ici en utilisant des particules devrait permettre d'amplifier la réponse T spécifique à l'antigène complexé sans passer par une reconnaissance par les lymphocytes B spécifiques. La présentation d'un Ag aux cellules TCD4+ activée induit, outre leur prolifération, la sécrétion de cytokines et l'expression de molécules de surface importantes pour la prolifération et la différentiation des cellules B en plasmocytes sécrétant des anticorps. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène associé à un vecteur particulaire selon les modalités définies précédemment, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables. Elle a également pour objet un produit ou une composition tels que définis précédemment, pour leur utilisation à titre de vaccin. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, on se réfèrera aux figures suivantes Figure 1 : Représentation schématique du fragment d'ADN génomique viral contenant l'ADNc de IEl. Figure 2 : Représentation schématique de la protéine de fusion GST-e4 Figure 3 : Analyse de l'expression de GST-e4 par E. Coli en électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE).: Les lysats de bactéries non recombinantes (1) et recombinantes GST-e4 (2) ont été soumis à une SDS-PAGE et colorés au bleu de coomassie. Après passage sur colonne d'affinité-glutathion, les éluats ont été analysés dans les mêmes conditions (2, 4). Le poids moléculaire apparent des marqueurs (M) est indiqué. Figure 4 : Analyse en "western blot" (A) et autoradiographie (B) de l'expression de GST-e4 par E Coli. Les lysats bactériens ont été soumis à une SDS-PAGE puis transférés sur membrane de nitrocellulose. Une incubation de la membrane en présence de l'anti peptide 85.75 a révèlé la présence de GST-e4 dans le lysat total (5), le culot et le surnageant de sonication (4, 3), et dans la fraction retenue sur la colonne d'affinité (2). La piste 1 contient un lysat de bactéries non recombinantes. La figure 4.B correspond à l'autoradiographie de la membrane. Figure 5: Courbe de saturation des BVSM par GST-e4 purifiée: Des quantités croissantes de GST-e4 froide (50 à 400 pg) ont été préincubées avec des BVSM (100 Fg). Les complexes ainsi formés, ont été incubés en présence de GST-e4 radiomarquée (GST-e4*) et le taux d'association (cpm) de la protéine chaude a été déterminé par comptage après ultrafiltration sur Microsep 300. Figure 6 Stabilité de l'association GST-e4/ particule: Des complexes GST-e4*/particule ont été incubés en milieu RPMI/SVF à 37C de 0 à 6 jours. Le pourcentage de GST-e4* associé au terme de chaque période d'incubation a été déterminé par comptage après ultrafiltration. Figure 7 : Capture de GST-e4* soluble ou associée aux particules par des lymphocytes B/EBV. L'antigène radioactif GST-e4*, libre ou associé à des particules (NPS, CA, BVSM) a été incubé en présence de 5x105 lymphocytes B/EBV dans du RPMI/SVF, à 37"C pendant 15h. Le pourcentage de capture (A), la quantité d'antigène associé aux cellules (B), et la quantité d'antigène retrouvé dans le milieu (C) sont représentés en fonction de la concentration en protéine dans les puits Figure 8 : Capture de GST-e4* soluble ou associé aux particules par la lignée macrophagique "Mono Mac 6": L'antigène radioactif GST-e4*, libre ou associé à des particules (NPS, CA, BVSM) a été incubé en présence de 5x105 cellules Mono Mac 6 dans du RPMI/SVF, à 37"C pendant 15h.Le pourcentage de capture (A), la quantité d'antigène associé aux cellules (B), et la quantité d'antigène retrouvée dans le milieu (C) sont représentés en fonction de la concentration en protéine dans les puits Figure 9 : Test de prolifération du clone TCD4+ (A3) en présence de PBL Les cellules du clone A3 ont été incubées en présence de PBL irradiées et d'antigène soluble (GST, GST-e4) ou associé à des particules (NPS/GST-e4, CA/GST-e4, BVSM/GST-e4). La prolifération des cellules a été déterminée par l'incorporation de [3H]-thymidine, mesurée en cpm. Fizure 10 rTest de prolifération du clone TCD4+ (A3) en présence de lymphocytes B/EBV: Les cellules du clone A3 ont été incubées en présence de lymphocytes B/EBV irradiées et d'antigène soluble (GST, GST-e4) ou associé à des particules (NPS/GST-e4, CA/GST-e4, BVSM/GST-e4). La prolifération des cellules a été déterminée par l'incorporation de [3H]-thymidine, mesurée en cpm. Figure 1 1 : Test de prolifération du clone (A3) en présence de lymphocytes B/EBV et du mélange CA vides/GST-e4: Les cellules du clone A3 ont été incubées en présence de lymphocytes B/EBV irradiés et d'antigène soluble seul (GST, GST-e4), ou avec des CA vides (CA + GST-e4), et avec l'antigène associé à des CA (CA/GST-e4). La prolifération a été déterminée par l'incorporation de [3H]-thymidine, mesurée en cpm. Exemples 1) Matériels et méthodes Synthèse des vecteurs cationisés de taille 80 nm Les vecteurs utilisés dans cette étude ont tous été dérivés du même noyau polysaccharidique synthétisé à partir du même lot (NPS). Ces NPS ont été soit acylés avec de l'acide palmitique (CA), soit phospholipidés avec différents types de phospholipides (BVSM). Synthèse des NPS 100 g de Maltodextrine (Glucidex 6, Roquettes), conforme à la monographie maltodextrine de la pharmacopée US NF XVII, ont été dissous dans 17 ml d'eau sous agitation mécanique violente puis transférés dans un réacteur en verre, auquel ont alors été ajoutés 2.4 g de NaBH4. Une demi heure plus tard, ont été ajoutés 44 ml de soude 10 N puis 9.72 ml (0.124 mole) d'un agent réticulant, l'épichlorhydrine (Fluka). Après 90 min de réaction à température ambiante, 31.18 g d'un agent cationisant, l'hydroxycholine (glycidyltrimethylammonium chloride, Fluka), préalablement dissout dans 20 ml d'eau ont été ajoutés. L'incubation a été maintenue pendant 20 h sous agitation mécanique.Le gel obtenu a été dilué avec 1.5 l d'eau puis neutralisé à l'acide acétique. Le gel a ensuite été broyé dans un homogénéisateur par extrusion sous haute pression, puis ultrafiltré sur module filtrant de 40 kDa. L'ultrafiltration a été stoppée lorsque l'ultrafiltrat ne réagissait plus au nitrate d'argent. L'analyse de la taille des nanoparticules (NPS) a été effectuée avec un Nanosizer Coulter N4SD. Synthèse des coeurs acylés (CA) A 10 g de NPS fraichement lyophilisés préalablement dispersés dans 100 ml de dichlorométhane (distillé extemporanément), ont été ajoutés 9,34 ml de chlorure d'acide palmitique. La réaction a été poursuivie pendant 4 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 200 ml de diéthyl éther au milieu réactionel, les CA ont été filtrés sur Buchner, lavés à l'éthanol, repris dans 500 ml d'eau et homogénéisés. Synthèse des BVSM Les NPS ont été phospholipidés (20% pds/pds de NPS lyophilisés) avec différentes proportions de phospholipides Tests de toxicité in vivo Les vecteurs testés (NPS, CA, BVSM) ont été remis en suspension dans l'eau, à une concentration de lmg/ml. La pyrogénicité des échantillons a été déterminée in vivo chez le lapin à la dose de 100 g de vecteur par dose selon la pharmacopée Européenne. Production de la protéine de fusion GST-e4 dans Esch erichia coli Clonage dans Escherichia coli: L'ADNc correspondant à l'exon 4 (e4, figure 1) a été obtenu par amplification (PCR) à la Taq polymérase (Proméga, Coger, France) à partir du plasmide pRL 103 (don de R. LaFemina, (9)) contenant la région IE du CMV (souche Towne). Les amorces, A 1 (A1 = 5'CCCGGGOAATTCTCATGGTCAAACAGATTAAGGTTCGAG3') et A 2 (A2=. 5'CCCGGGA6bAGCTTTTACTGGTCAGCCTTGCTTCTA3') c o r respondant respectivement à l'extrémité 5' et 3' de e4 ont été utilisées. Des sites EcoR I (0) et Hind III () ont été introduits dans ces amorces pour permettre l'insertion du fragment de PCR dans le plasmide pGE-KG (10). Le fragment inséré est en phase avec le gène de la glutathion-S-transférase (GST) dont le promoteur est inductible à l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG, Sigma, France). Entre l'extrémité 3' du gène de la GST et le site multiple de clonage se situe une région codant pour un site de clivage peptidique spécifique de la thrombine. La transformation des bactéries Escherichia coli DH5a (Gibco, Cergy, France) et le criblage des recombinants ont été effectués selon les techniques classiques (11).L'insertion du produit de PCR correspondant à l'exon 4 dans pGEX-KG a été vérifiée par l'analyse, sur plusieurs clones, des fragments de restriction de l'ADN plasmidique, visualisés après électrophorèse en gel d'agarose à 1% en bromure d'éthidium (BET). L'insertion dans pGEX-KG a été confirmée en testant l'expression du produit recombinant GST-e4 après induction par l'IPTG. Les clones positifs ont été séquencés selon la technique de Sanger (12) avec un kit "Hot tub sequenase" (Pharmacia, Saint Quentin Yvelines, France) selon les indications du fournisseur. Expression et purification de GST-e4 Les bactéries recombinantes conservées à -80 C ont été mises en culture dans du milieu "Luria broth" (Difco, Osi, France) contenant 50 llg/ml d'ampicilline (LB/Ap) (Sigma). Cette préculture, diluée au 1/10sème en LB/Ap a été cultivée dans les mêmes conditions jusqu'à DO/6OOnm = 1.0. L'induction de l'expression du produit recombinant GST-e4 a été réalisée en ajoutant 100 FM d'IPTG à la culture. L'incubation a été poursuivie pendant 2 heures à 25"C pour éviter la formation de corps d'inclusions (13). Les bactéries, récoltées par centrifugation ont été lavées dans du PBS ("phosphate buffered saline", pH 7.3, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI). Le culot de cellules, conservé une nuit à -80 C puis décongelé a été repris dans 50 ml de tampon de lyse (PBS, lmg/ml lysozyme, lmM phényl-méthyl-sulfonide-fluoride (PMSF) ). La suspension a été incubée pendant 30 minutes dans la glace puis soniquée.Le lysat a été agité pendant 30 minutes à température ambiante en présence de TRITON X 100 (concentration finale:1%) puis clarifié par centrifugation (30000g/lh). Le surnageant a été déposé sur une colonne d'affinité greffée avec le substrat de la GST (14) (Glutathione/Sepharose 4B, Pharmacia) préalablement équilibrée dans du PBS. Après lavage de la colonne avec du PBS, la protéine de fusion GST-e4 a été éluée avec 10 mM de glutathion réduit dans le tampon d'élution 50 mM Tris HCI, pH 8.0. Des marquages métaboliques de GST-e4 ont été réalisés en ajoutant au milieu de culture et à raison de 10 pCi/ml, les résidus L-[35S]-Methionine et -Cystéine (35S Express, NEN, Les Ulis, France) au moment de l'induction par l'lPTG. La purification du produit radioactif (GST-e4*) a été réalisée dans les mêmes conditions que pour le produit non radiomarqué. La concentration des produits purifiés a été déterminée par la méthode de Bradford (Kit "Bio-Rad Protein assay", Biorad, Yvry sur Seine, France). La production de la protéine de fusion GST-e4 a été contrôlée par électrophorèse en gel de polyacrylamide à 10% en présence de SDS (SDS PAGE) (15). Des marqueurs de poids moléculaire précolorés (Gibco) ont été utilisés.La révélation a été effectuée soit par coloration du gel au bleu de Coomassie soit en "western blot" (16) après transfert sur membrane de nitrocellulose (Hybond C super, Amersham, Les Ulis, France) comme suit. Après saturation dans du "blotto" (PBS, 0.2% NP40, 2.5% lait écrémé), la membrane a été incubée pendant 1 heure avec l'immun sérum d'un individu séropositif pour le CMV (CMV+) ou avec l'antipeptide de lapin 85,75 reconnaissant un épitope situé dans la partie C-terminale de l'exon 4 (don de J. A Nelson, (17)). L'immunsérum et l'antipeptide ont été dilués respectivement au 1/100ème et au 1/500ème dans du "blotto".La membrane a été lavée 3 x 5 minutes dans du PBS et incubée pendant 1 heure avec des IgG de chèvre anti-lg humaines ou anti-Ig de lapin marquées à la peroxydase (GAH/PO, GAR/PO, Nordic, Tebu, Le Perrey en Yvelines, France) diluées au 1/500ème dans du "blotto". Après 3 lavages de 5 minutes chacun dans du PBS, la membrane a été incubée dans la solution de révélation (PBS, 0.5 mg/ml diaminobenzidine (DAB), 0.1% H202). Quand les produits analysés étaient radiomarqués, une autoradiographie du gel ou de la membrane après western blotting a été réalisée sur film Kodak X-ONIAT (Polylabo, France). Association de GST-e4* aux particules: La protéine de fusion GST-e4*, en solution dans du tampon d'élution 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, a été incubée avec les trois principaux types de particules (NPS, CA, BVSM) en suspension dans l'eau, à une concentration de lmg/ml. L'incubation a été effectuée à 4"C sous agitation pendant 1 heure. Le pourcentage d'association a été déterminé en mesurant la radioactivité associée aux particules. L'antigène libre a été éliminé par ultrafiltration à 5000g sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa (microsep 300, Filtron, Coignieres, France). La mesure de la radioactivité libre dans l'éluat, dans les lavages et associée aux particules a été réalisée trois fois sur un compteur fi (BETAmatic, Kontron).Le pourcentage d'association a été calculé en faisant le rapport de la radioactivité liée sur la somme de la radioactivité libre et de la radioactivité liée aux particules. Des expériences d'association de GST aux particules ont été réalisées dans les mêmes conditions qu'avec GST-e4*. L'association de la GST aux particules après lavage a été confirmée en SDS PAGE. Stabilité de GST-e4* associée aux particules L'association de GST-e4* aux trois types de particules a été effectuée comme précédemment avec un rapport GST-e4*/particule de 0.1 (R=0.1). Les lavages ont été réalisés en RPMI/10% sérum de veau foetal (RPMI/SVF) (Gibco) supplémenté avec 1 mM de pyruvate de sodium , 2mM de L-glutamine, 200 U/ml de pénicilline et 80 ng/ml de streptomycine. Les complexes GST-e4*/particule ont été repris dans le même milieu et incubés à 37"C. Des aliquots ont été prélevés à différents temps, et le pourcentage de GST-e4* associé aux particules a été déterminé comme précédemment. Capture de GST-e4* par des lignées de lymphocytes B et de macrophages "in vitro": L'analyse de la capture de GST-e4* soluble ou associé aux particules a été effectuée sur des lignées de macrophages ("MonoMac 6", DSM ACC 124) et de lymphocytes B immortalisés par le virus d'Epstein Barr (B/EBV). Les cellules (5x10S/ml), en plaques de 24 puits à fonds plats (Falcon, Becton Dickinson, New Jersey), ont été incubées dans du RPMI/SVF en atmosphère humide à 5% de CO2 , avec différentes concentrations de GST-e4* soluble ou complexé aux particules (R=0.1). Après 15 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées et lavées 2 fois dans du PBS. La radioactivité libre a été comptée dans le surnageant, dans le liquide de lavage et dans les cellules resuspendues dans du PBS. Les résultats de comptage correspondent à la moyenne de trois mesures. Le pourcentage de capture pour une concentration antigénique donnée a été exprimé par le rapport de la radioactivité liée aux cellules sur la radioactivité totale. Tests de prolifération des clones TCD4+ anti IEl: L'obtention des clones de lymphocytes TCD4+ anti lEl et l'analyse de leur prolifération en présence de cellules présentatrices d'antigène (CPA) autologues de donneurs CMV+ (Centre de Transfusion Sanguine de Toulouse) ont été décrits précédemment (18). Brièvement, 2x104 cellules d'un clone T CD4+ ont été incubées dans des plaques de 96 puits à fonds ronds (Falcon) avec les CPA irradiées correspondant à lux105 leucocytes du sang périphérique (PBL) ou 5x104 lymphocytes B/EBV, autologues ou possédant des molécules du CMH de classe II de même allotype DR.Les cellules ont été incubées dans un volume final de 100 z1 en RPMI contenant 10% d'un pool de sérums humains (RPMI/SH) (Laboratoires FANDRE, Ludres, France) et différentes dilutions d'antigène libre ou associé aux particules. Alternativement, 1'Ag soluble et les particules vides ont été ajoutés extemporanément aux cellules. Les complexes Ag/ particule ont été stérilisés par irradiation. Trois jours plus tard, la culture a été marquée pendant 15 heures avec 1 IlCi par puits de [3H]-thymidine (49 Ci/mmole, Amersham). La prolifération des clones T est déterminée par la mesure de l'incorporation de [3H]-thymidine par les cellules. Les résultats exprimés en cpm correspondent à la moyenne de trois expériences concomitantes. Les extraits d'astrocytomes humains (U373MG) transfectés par l'ADN génomique IE (A2) ou non transfectés (AO) qui avaient été utilisés pour générer les clones (18), ont été employés comme contrôles positifs et négatifs, respectivement. La détermination des allotypes DR des différents donneurs a été effectuée par PCR avec des amorces oligonucléotidiques spécifiques (Pr Abbal, Lab. Centr. Immunol, CHU Rangueil, Toulouse). Les clones D11 et A3 provenant d'individus (DR3/DR4) et (DR8/DR7) respectivement, ont été utilisés. 2) Résultats Caractérisation des particules synthétisées La taille des particules étaient de 80 nm, avec une déviation standart de 20 nm. Le taux de charge a été titré à 0,8 mmole d'hydroxycholine par gramme de nanoparticules lyophilisées. Les échantillons testés étaient apyrogènes. Production de GST-e4 Expression de GST-e4 dans E Coli L'expression du produit de fusion GST-e4 dans les lysats bactériens a été testée en SDS-PAGE. Les figures 3 et 4 correspondent à l'analyse des lysats de bactéries cultivées en présence d'IPTG. La figure 3 a révèlé la présence après coloration au bleu de coomassie, d'une bande correspondant à une masse relative de 82000 dont l'intensité est plus importante dans le lysat de bactéries recombinantes (piste 3) que dans l'échantillon de bactéries non recombinantes (piste 1). En revanche, dans la piste 1 une production importante de GST (Mr 27000) a été mise en évidence.L'analyse en "western blotting" des mêmes échantillons avec l'anti peptide 85.75 (Fig 4A) et un immunsérum humain anti-CMV a révélé une réactivité spécifique associée à une protéine de masse relative 82000 en accord avec la masse attendue pour la protéine de fusion GST-e4 (Figure 2). L'autoradiographie de la membrane (Fig 4B) a révélé une bonne incorporation des résidus radiomarqués dans la protéine de 82 kDa révélée par l'anti peptide, dans les conditions de culture décrites précédemment. Purification de GST-e4 par chromatographie d'affinité Les lysats bactériens ont été soumis à une chromatographie sur sépharose-glutathion et anlysés en SDS-PAGE. Les figures 3 et 4 montrent que les protéines GST (piste 2, Mr 27000) et GST-e4 (piste 4, Mr 82000) ont été retenues spécifiquement par le support. Des bandes de masse plus faible co-migrant avec GST-e4 ont été visualisées après western blotting (Fig4A). Ces produits copurifiés avec GST-e4 résultent probablement de la dégradation de la protéine de fusion et contiennent la séquence peptidique reconnue par l'antisérum 85.75. Aucun signal n'a été observé dans la piste correspondant à la GST (piste 1). Nous avons obtenu de façon reproductible et après un seul passage sur la colonne lmg de GST-e4* avec une activité spécifique de 400mCi /mmole. Association de GST-e4* aux particules Rendement d'association en fonction du type de particules Les particules (NPS, CA, BVSM) ont été incubées en présence de GST-e4 radiomarquée (GST-e4*) à raison de lmg de protéine pour 10 mg de vecteur (R=0.1). Les taux d'association moyens (20 tests) sont de l'ordre de 90% et identiques quelles que soient les particules. Saturation des particules par GST-e4* Des BVSM (100 Fg) ont été préincubés avec des quantités croissantes de GST-e4 froide dans un rapport de masse Ag/BVSM allant de 0.1 à 4 (R=0.1 à R=4). Pour chacun de ces rapports, GST-e4* a été ajoutée aux complexes et le taux d'association de la protéine chaude aux vecteurs a été déterminé par comptage après ultrafiltration. La figure 5 montre que les BVSM sont saturés en antigène quand le rapport massique Ag/BVSM est égal à 2. Stabilité de l'association GST-e4*/ particules en fonction du temps Des complexes GST-e4/particule (R=0.1) ont été incubés en RPMI/SVF à 37oC. L'analyse du pourcentage de GST-e4 qui est resté associé aux particules après plusieurs jours d'incubation (Fig 6), a montré que les cinétiques de relargage sont identiques pour les trois types de particules, avec une pente plus forte sur les premières 24 heures. Après 6 jours d'incubation, le taux de GST-e4* associé est de 85%, 80%, et 70% avec les BVSM, CA, et NPS, respectivement. Une analyse en SDS-PAGE des mêmes échantillons suivie d'une autoradio graphie a permis de visualiser la protéine associée aux particules. Capture de GST-e4* par des lignées de lymphocytes B et de macrophages Des complexes GST-e4*/particule (R=0.1) et la protéine soluble GST-e4* ont été incubés en quantité croissante avec des lignées de macrophages et de lymphocytes B/EBV. Une cinétique d'association des préparations d'antigène (0.6 cig/ml, R=0.1) aux cellules a montré une incorporation équivalente, pour un type d'échantillon donné, et pour des temps d'incubation allant de 10 min à 15h (résultat non montré). Les figures 7 et 8 représentent le pourcentage d'antigène associé aux cellules après 1 5h d'incubation, en fonction de la quantité de protéine complexée ou soluble ajoutée. Ces figures montrent que pour les lymphocytes B/EBV (Fig 7) et les macrophages (Fig 8), la quantité d'antigène soluble associée aux cellules est très faible même à des concentrations élevées. En ce qui concerne la capture de l'antigène en fonction des différents types de particule, les BVSM ont permis d'obtenir le rendement d'incorporation le plus élevé (30%) avec les deux types cellulaires. Des rendements de l'ordre de 5% à 10%, ont été obtenus avec les NPS et les CA, alors qu'ils avoisinent 1% avec l'antigène soluble. Réponse cellulaire TCD4+ in vitro Immunogénicité de GST-e4 Des tests de prolifération ont été réalisés avec deux clones TCD4+ anti IE1, D11 restreint par DR3 et A3 restreint par DR8. Une prolifération spécifique du clone A3 en présence de PBL (Fig 9) et de lymphocytes B/EBV (Fig 10) comme cellules présentatrices, a été observée avec l'antigène viral recombinant GST-e4. Des résultats du même ordre ont été obtenus avec le clone D11. Effet adjuvant des particules sur la prolifération des clones TCD4+ in vitro Les différents complexes (NPS, CA, BVSM) contenant GST-e4 ont été utilisés pour stimuler les clones T. Aucune prolifération n'a été observée en présence des particules associées à GST et des particules vides. La protéine GST-e4 associée aux particules stimule les mêmes clones de lymphocytes T que l'antigène soluble en présence de PBL (Fig 9) et de lymphocytes B/EBV (Fig 10). Des doses beaucoup moins importantes d'antigène complexé par rapport à l'antigène soluble sont nécessaires pour induire un niveau équivalent de prolifération. Cet effet adjuvant a été mis en évidence pour les trois types de particules, mais le meilleur effet est observé avec la préparation de CA.Dans ce cas, un même niveau de prolifération a été observé en utilisant 20 fois moins d'antigène avec des PBL (Fig 9) et 10 fois moins avec des lymphocytes B/EBV (Fig 10) par rapport à l'antigène soluble. La figure 1 1 correspond à un autre test effectué avec le clone A3 en présence de CA vides ajoutés extemporanément aux cellules (lymphocytes B/EBV), en même temps que l'antigène soluble. On peut noter une potentialisation de la réponse de l'ordre de 2 fois qui peut être dû à une association rapide de l'antigène au vecteur au moment de leur introduction dans le puits contenant les cellules. Bibliographie (1) Alford C.A., and Britt W.J. (1990) Cytomegalovirus. In: Virology, Second Edition, (ed. B. N. Fields, and D. M. Knipe et al. ), Raven Press Ltd., New York. (2) Rasmussen, L. (1993) Progress in the development of a human Cytomegalovirus glycoprotein subunit vaccine. In S Michelson, SA Plotkin eds. Multidisciplinary Approach to Understanding Cytomegalovirus Disease. Proceedings of the 4th international CMV workshop. Excerpta Medica. Amsterdam.311-320 (3) Liu Y-N, Klaus A, Kari B, Stinski M. F, Eckhardt J, and Gehrz R.C.(1991) The N-terminal 513 amino Acids of the Enveloppe Glycoprotein gB of Human Cytomegalovirus stimulates both B- and T-cell Immune responses in Humans. J.Virol. 65:1644-1648 (4) Gilbert NI. J, Riddell S. R, Li C-H, and Greenberg, P. (1993) Selective interference with class I Major histocompatibility complex presentation of the Major Immediate-Early Protein following Infection with Human Cytomegalovirus. J.Virol. 67: 3461-3469 (5) Davignon J-L, Clément D., Alriquet J., Michelson S., and Davrinche C (1994) Analysis of the proliferative T cell response specific for the Human Cytomegalovirus Protein IE1: Phenotype, Frequency and Variability. Clin. Exp. Imm unol, submitted (6) Fattal, E., Couvreur, P., and Puisieux, F. (1993) Méthodes de préparation des liposomes In: Les Liposomes.eds.INSERM, Paris, France (7) Ron, Y.,De Baestelier, P., Gordon, J., Feldman, M., and Segal, S. (1981) Defective induction of antigen-reactive proliferating T cells in B cell-deprived mice Eur. J. Immunol. 11 964 (8) Machy, P., and Leserman, L. (1993) Internalisation des molécules de surface cellulaire: implications sur le ciblage des liposomes.In: Les Liposomes.eds INSERM, Paris, France (9). LaFemina, R. A., Pizzorno, M. C., Mosca, J. D., and Hayward, G. S. (1989): Expression of the acidic nuclear immediate early protein (IE1) of the human cytomegalovirusin stable cell lines and its preferential association with metaphase chromosome.Virology.172, 584-600 (10) Guan K, and Dixon J (1991) Eukariotic proteins expressed in Escherichia Coli: An improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathione S-transferase. Analyt. Biochem. 192: 262-267 (11) Sambrook, J., Fritsch, E , and maniais, T. (1989): Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (12) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (13) Marston, F. A. O. (1986): The purification of eukariotic polypeptides synthetized in Escherichia coli. Biochem. J. 240:1-12. (14) Smith, D. B. , and Johnson, K. S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione-S-transferase. Gene 67:31-40. (15) Laemmli, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature 227:680-685 (16) Towbin, H. , Staehelin, T. , and Gordon, J. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76:43504354. (17) Stenberg, R., Depto, A. S., Fortney, J., and Nelson, J. (1989) Regulated expression of early and late RNAs and protein from the human cytomegalovirus immediate early gene region. J. Virology63 2699-2708 (18) Davrinche C, Pasquier C, Cerutti M, Serradell, L Clement D, Devauchelle G, Michelson S, and Davignon J-L (1993) Expression of human Cytomegalovirus Immediate-early protein IE1 in insect cells: Splicing of RNA and recognition by CD4+ T-cell clones. Biochem. Biophys. Res. Com. 195 469-477 REVENDICATIONS 1. Procédé pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène, caractérisé en ce que l'antigène est associé par des interactions stables à un vecteur particulaire, ledit vecteur comportant - un noyau hydrophile non liquide - une couche externe de composés choisis dans le groupe comprenant les phospholipides et les acides gras. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le noyau est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que des ligands ioniques sont greffés sur le noyau. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le ligand ionique porte au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaires, amines secondaires, amines primaires. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que l'antigène est associé au vecteur particulaire par des liaisons ioniques. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'antigène est associé au vecteur particulaire par des liaisons hydrophobes. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la couche externe du vecteur particulaire est constituée d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la couche externe du vecteur particulaire est constituée de phospholipides naturels ou synthétiques. 9. Produit susceptible d'etre obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une association potentialisant l'immunogénicité, d'un antigène lié par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes à un vecteur particulaire, ledit vecteur particulaire comportant - un noyau hydrophile non liquide et, - une couche externe, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et constituée des composés choisis dans le groupe comprenant les phospholipides et les acides gras. 10. Produit selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'antigène est une protéine ou un peptide. 11. Produit selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'antigène est un déterminant antigénique d'une bactérie ou d'un virus. 12. Produit selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'antigène est une protéine du C1V. 13. Produit selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'antigène est la protéine IEl du CMV, ou un fragment de cette protéine. 14. Produit selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'antigène utilisé est le fragment e4 de la protéine 1El du CMV. 15. Produit selon la revendication 14, caractérisé en ce que le fragment e4 est associé à la GST. 16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un produit selon l'une des revendications 9 à 15, dispersé dans des excipients pharmaceutiq uement acceptables. 17. Produit selon l'une des revendications 9 à 15 ou composition selon la revendication 17, pour son utilisation à titre de vaccin.