FR 2715305 A1 19950728 FR 9400786 A 19940125 DIESTERS DE MURAMYL PEPTIDES DANS UNE FORME ORALE La présente invention est relative à une composition pharmaceutique immunostimulante, active par administration externe, notamment par voie orale, nasale, transcutanée, aérosol ; cet effet immunostimulant pouvant être mis à profit soit pour une activité d'immuno-adjuvant en association avec un vaccin, soit en traitement prophylactique ou thérapeutique d'une infection éventuellement en association avec un autre traitement approprié au type d'infection. Les muramyl peptides et leurs dérivés esters sont une famille de molécules qui ont été décrites dans de nombreuses publications et de nombreux brevets depuis la première description du N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl Disoglutamine (MDP pour muramyl dipeptide). Brièvement, il sont capables d'exercer une grande variété d'activités biologiques incluant une activité immuno-adjuvante, une activité anti-infectieuse, une activité antitumorale, une activité anti-allergique et une régulation de la sécrétion des cytokines. Cependant, un certain nombre de ces muramyl peptides, s'ils peuvent présenter des activités biologiques tout à fait prometteuses, présentent souvent des effets secondaires ou des inconvénients qui en empêchent leur utilisation à titre de médicament, notamment des effets toxiques ou une difficulté de formulation du fait de leur faible solubilité dans des solutions aqueuses. Ils présentent en outre une grande variabilité dans leur spectre d'action. Le seul immuno-adjuvant utilisé en clinique humaine est actuellement l'hydroxyde d'aluminium, mais ce composé n'est actif que par voie systémique, c'està-dire qu'il doit être injecté par voie parentérale et n'est pas actif après administration par voie orale ou transcutanée. De plus, il produit des effets indésirables comme l'induction d'anticorps de type IgE qui créent un risque d'allergie. En outre, il produit principalement une réponse humorale et ne favorise pas la production d'immunoglobulines sécrétoires. La recherche, par conséquent, d'un immunostimulant qui présente à la fois des avantages d'efficacité, de formulation, et de toxicité reste un problème actuel qui n'avait encore jamais été résolu par l'un ou l'autre des dérivés du MDP ; en particulier, un immunomodulateur actif après administration par voie externe, notamment par voie orale ou percutanée ou aérosol, peut permettre d'envisager une utilisation plus large et plus souple de cet immunostimulant. La présente invention a justement permis de sélectionner parmi les nombreux dérivés et analogues du MDP des diesters de formule générale I dans laquelle - R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - R1 est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone. Un composé particulier répondant à cette formule est le muradimétide de formule II Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe lequel muradimétide est soluble dans l'eau, présente une faible toxicité et peut ainsi être intégré à titre de principe actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante qui est active par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, et ce dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids. Le muradimétide est une molécule synthétique dont une synthèse a été décrite dans le brevet français FR760680. L'invention consiste donc parmi l'ensemble des dérivés du muramyl dipeptide à sélectionner un composé répondant à la formule ci-dessus parmi des dérivés qui avaient déjà été préalablement décrits, lesdits dérivés présentant à la fois des qualités immunostimulantes remarquables qui permettent de les utiliser comme adjuvants de vaccins, comme substance antibactérienne ou antivirale, et dont la faible toxicité permette également leur administration par voie externe, notamment orale, nasale ou aérosol ou percutanée et ne présentant pas les effets secondaires observés pour le MDP ou d'autres dérivés, notamment des mono-esters. La combinaison de toutes ces caractéristiques permet de sélectionner les dérivés de formule générale I et, plus particulièrement, le muradimétide de formule II comme principe actif d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, active dans une formulation compatible avec une administration comprise entre 0,1 mg et 5 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal. Les doses préférées étant de 0,5 mg à 3 mg/kg. Une propriété intéressante de la composition selon l'invention est qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisable en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. Plus particulièrement, la composition pharmaceutique utilisée comme adjuvant peut être administrée avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d'administration de cette dernière et par cet effet immuno-adjuvant conduire à une synthèse accrue d'anticorps protecteurs et permettre, le cas échéant, l'économie d'un ou deux rappels nécessaires dans le cadre de la vaccination classique. L'activité adjuvante s'obtient également si la première administration de la molécule est effectuée au moment du rappel. Dans tous les cas de figure, on obtient à la fois une augmentation des anticorps et une modification du profil isotypique en faveur de l'immunité sécrétoire. La composition pharmaceutique immunostimulante de l'invention peut également être utilisée pour prévenir ou traiter les infections virales, bactériennes, parasitaires ou autres. Le muradimétide notamment a la capacité tout à fait remarquable parmi l'ensemble des dérivés du MDP d'être actif dans la protection des sujets traités contre une infection lorsqu'il est administré par voie externe après ladite infection, un exemple particulièrement intéressant de voie externe étant la voie orale (per os). Les diesters de formule 1 peuvent être utilisés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immuno-stimulante administrable par voie externe, et si la voie orale est particulièrement intéressante, d'autres voies telles la voie des muqueuses, la voie percutanée, ou la voie aérosol sont également utilisables. Une autre particularité tout à fait remarquable du muradimétide et des autres composés inclus dans la formule I ci-dessus dans la composition pharmaceutique de l'invention est leur capacité à présenter une synergie dans l'effet protecteur à l'égard d'une infection lorsqu'elle est administrée conjointement ou parallèlement à un autre composé antiviral ou antiinfectieux. Par exemple, lorsque la composition de l'invention est utilisée en association avec 1'AZT dans le traitement des infections par HIV, une protection est observée lorsque 1'AZT est administré à une dose suboptimale de 0.01 M d'AZT, dose ne confèrant aucune protection à l'égard d'une infection quand elle est administrée seule, cette utilisation pouvant être simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Les exemples suivants montreront de façon non limitative et plus démonstrative, comment la combinaison des qualités du muradimétide, choisi à titre d'exemple, dans les composés de formule I en font un candidat de choix dans la fabrication d'une composition immunostimulante administrable par voie externe, et notamment par voie orale. Dans ces exemples, les figures ont les significations suivantes - La figure 1 représente l'activité adjuvante du muradimétide administré oralement sur la réponse anticorps de la souris à un vaccin hépatite B. - La figure 2 représente l'activité protectrice du muradimétide contre une infection par le virus EMC, c'est-à-dire le taux de survie à 60 jours exprimé en pourcentage de souris Swiss traitées par le muradimétide de façon systémique après une infection par 1'EMCV. - La figure 3 représente l'activité dose-réponse du muradimétide administré dans la protection des souris contre une infection EMCV. - La figure 4 représente l'effet du MDP ou du muradimétide (MDM) en association ou non avec un traitement antirétroviral par 1'AZT sur la production d'antigènes HIV dans des cultures de cellules U937 infectées par le virus HIV. - EXEMPLE I : Pharmacologie générale 1) Etude de la pyrogénicité Le tableau 1 est une comparaison de l'effet pyrogène chez le lapin du muradimétide et du MDP administrés par la voie veineuse (i.v.). Les essais de pyrogénicité ont été réalisés en suivant les règles de la pharmacopée européenne. Ces données montrent que le muradimétide n'est pas pyrogène quand il est administré à des lapins à la dose de 3 mg/kg, alors que la dose minimum pyrogène du MDP est voisine de 0,33 mg/kg. En effet, lorsque 6 lapins par groupe sont utilisés, la pharmacopée dit un produit a) apyrogène à la dose administrée quand la somme des élévations maximum de température observées chez ces lapins pendant la durée de l'essai est inférieure à 3". b) pyrogène quand cette somme est supérieure à 4 et douteux donc que l'essai doit être répété sur un plus grand nombre d'animaux lorsque la somme est supérieure à 3". Tableau 1 Muradimétide MDP Dosages Lapin Delta T Lapin Delta T n n0 0,33mg/kg 1 0,10 1 0,10 2 0,30 2 0,20 3 0,40 3 0,30 4 0,20 4 1,20 5 0,05 5 0,60 6 0,00 6 0,65 10.05 30.05 1 mg/kg 1 0,75 1 0,60 2 0,50 2 1,20 3 0,80 3 0,50 4 0,40 4 0,70 5 0,10 5 0,40 6 0,10 6 0,80 2 .65 4 .20 3 mg/kg 1 1,10 1 1,50 2 0,55 2 0,30 3 0,20 3 0,45 4 0,15 4 0,50 5 0,70 5 0,80 6 0,20 6 0,50 2 .90 4ç.05 2) Mesure de la leucopénie chez les lapins La plupart des dérivés et analogues de MDP induisent une leucopénie lorsqu'ils sont administrés à des lapins. Au contraire, le muradimétide ne modifie pas la numération sanguine comme cela est indiqué dans le tableau 2 suivant Tableau 2 Traitement Leucocytes/mm3 100 g/kg/i.v. T.0 T + 3 heures Muradimétide 7850 7700 MDP 7600 2000 3) Absence d'induction du sommeil lent Le muradimétide et le MDP ont été administrés à des lapins soit I.V. soit par la voie intracérébroventriculaire (I.C.V.) soit oralement (P.O.). Les doses minimum somnogènes capables d'induire du sommeil paradoxal sont reportées sur le tableau suivant. Ces résultats montrent que la dose somnogène minimum du muradimétide est 10 fois plus élevée que celle du MDP par voie parentérale et qu'il n'est pas actif par la voie orale. Tableau 3 Absence d'activité somnogène du muradimétide administré oralement Administration Doses somnogènes minimales/kg Muradimétide MDP I.V. 1 mg 100 Ag I.C.V. 1 g 0.025 g P.O. négatif à 10 mg 1 mg - EXEMPLE Il : Activité adjuvante du muradimétide en administration orale Le muradimétide est administré oralement simultanément avec une vaccination parentérale par un antigène. 1) Réponse à la sérum albumine humaine (BSA) L'activité adjuvante du muradimétide, c'est-à-dire sa capacité à augmenter la réponse anticorps à l'antigène (BSA) a été comparée avec l'activité de plusieurs autres muramyl peptides après administration à des souris soit par voie orale, soit par voie souscutanée. La BSA est administrée en tant qu'antigène, toujours par voie sous-cutanée. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 suivant Tableau 4 Administration Muramyl peptides Nom abrégé de l'adjuvant Per os S.C. Témoins (sans adjuvant) 30 30 Nac-Mur-L-Ala-D-iGln MDP 1100 700 Nac-Mur-L-Ser-D-iGln MDP sérine 450 1300 Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln 100 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe Murametide 100 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu Murabutide 100 700 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu MDPA 200 1000 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu*(OMe)OMe Muradimetide 1100 1350 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu(OMe)OnBu 200 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe 200 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu 80 550 * D-Glu peut être substitué sur les fonctions carboxyles en a ou a. Les substitutions faites en z sont indiquées entre parenthèses. La BSA est donnée en sous-cutanée à raison de 0,5 mg le jour 0 et le jour 30. Le MDP et ses dérivés ou analogues sont donnés uniquement le jour 0, soit à raison de 1 mg per os, soit de 0,1 mg mélangé avec l'antigène en sous-cutanée. Les anticorps sont mesurés par hémaglutination passive au jour 36. Nous voyons dans ce tableau que trois composés parmi les plus efficaces sont le MDP, le MDPA et le muradimétide. Le MDP sérine étant hautement pyrogène, il est inutilisable en thérapeutique. Les résultats plus détaillés comparant ces trois composés sont donnés dans le tableau 5 suivant Tableau 5 Comparaison entre l'activité adjuvante du MDP et du muradimétide donnés en sous-cutanée ou par voie orale Adjuvant Nombre Réponse anticorps de souris (gamme de titres) Témoins (sans 150 30 ( adjuvant) MDP S.C. 150 700 (50-3200) MDP P.O. 50 1100 (50-3200) Muradimetide S.C. 32 1350 (100-3200) Muradimetide P.O. 16 1100 (50-3200) MDPA S.C. 32 1000 (200-3200) MDPA P.O. 16 200 (12-800) Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans le tableau 4 ci-dessus. Ces données montrent que seulement deux molécules, le MDP et le muradimétide, sont actives de façon significative quand elles sont données par voie orale simultanément avec l'antigène administré par voie parentérale. De façon intéressante, le MDPA dont le muradimétide est le dérivé diester méthylique, est actif lorsqu'il est administré par voie systémique, mais peu actif quand il est administré par voie orale indiquant que l'activité biologique du muradimétide administré oralement ne peut être attribuée à la formation de MDPA résultant d'une hydrolyse de ses groupes esters méthyliques. Compte tenu de la toxicité du MDP telle qu'elle est connue et rappelée plus haut, il est clair que, parmi l'ensemble des dérivés et analogues du MDP, seul le muradimétide présente la combinaison des qualités de non-toxicité et d'activité adjuvante lorsqu'il est administré par voie orale. 2) Réponse à un vaccin hépatite B L'antigène utilisé est un antigène de surface recombinant du virus hépatite B (HBS) obtenu par recombinaison génétique et administré, absorbé sur de l'hydroxyde d'aluminium. I1 a été injecté par voie sous-cutanée à des souris Swiss au jour 1 et au jour 21. Le muradimétide a été donné oralement en même temps que le vaccin. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 1 ; dans cette figure, des souris Swiss (8 par groupe) reçoivent par voie sous-cutanée 1 ssg de HBS Ag (Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins) et du muradimétide soit par voie sous-cutanée (100 Zig), soit par voie orale (1 mg). Un rappel est donné au trentième jour. La figure 1 indique clairement que cette administration orale a de façon considérable augmenté la réponse au vaccin et permet une production beaucoup plus précoce d'anticorps contre l'antigène vaccinant. 3) Réponse à un peptide synthétique d'Escherichia coli administré par voie orale Le peptide représente la copie d'une structure vaccinante d'un antigène de surface d'Escherichia coli. Cet antigène est connu pour être un antigène potentiellement protecteur chez les humains. Le peptide a été encapsulé dans des microsphères poly(DL-lactide coglycolide) et donné par voie orale à des souris Swiss femelles soit seul, soit avec le muradimétide administré soit par voie sous-cutanée, soit par voie orale. La réponse anticorps dans le sérum a été évaluée par test ELISA soit contre le peptide, soit contre la structure naturelle de la protéine. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 6 suivant. Le tableau 5 représente la reconnaissance de la protéine naturelle par les anticorps obtenus après administration orale du peptide synthétique encapsulé dans les microsphères. Tableau 6 Groupes Réponse anticorps contre Peptide Protéine synthé- naturelle tique E. coli peptide P.O. 300 200 E. coli peptide P.O. 1100 1200 + muradimétide S.C. E. coli peptide+ muradimétide P.O. 4000 2000 Les souris Swiss ont reçu les jours 1 et 30 par voie orale 10 pg du peptide synthétique. Le peptide a été incorporé dans les microsphères et le muradimétide dans une solution saline a été administré soit en sous-cutanée (100 g), soit par voie orale à raison d'l mg par souris. Ces données montrent que le muradimétide, particulièrement lorsqu'il est donné par voie orale a permis d'obtenir dans le sérum des anticorps reconnaissant l'antigène synthétique et sa structure naturelle. 4) Le muradimétide est administré oralement avec une immunisation secondaire par un antigène administré par voie parentérale L'influence de l'administration orale du muramyl peptide au moment d'une injection secondaire d'antigène immunisant a été évaluée par la production d'isotype d'anticorps produits dans le serum et par la présence d'IgA sécrétoires (recherchées dans le fluide intestinal). Un antigène protecteur de Shistosoma mansoni (SMAg) a été administré par voie sous-cutanée à des souris Swiss (un groupe de 8) au jour 1 et au jour 21 cet antigène est absorbé sur l'hydroxyde d'aluminium. Pour l'immunisation secondaire, les souris reçoivent par voie orale 1 mg de muradimétide. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant Tableau 7 Influence du muradimétide administré oralement au temps du rappel sur la réponse humorale au SMAa Immunisation Titres anticorps dans Primaire Secondaire Liquide Sérum intestinal [ IgA | IclE SMAg + alum SMAg + alum 7800 2250 SMAg + alum SMAg + alum + 15000 3250 muradimétide p.o. Ces résultats démontrent que le muramyl dipeptide administré lors de l'immunisation secondaire peut augmenter et moduler la réponse à un antigène administré par voie parentérale. L'administration du muradimétide a augmenté la synthèse spécifique d'IgA sécrétoire. De façon surprenante, il a diminué considérablement la production d'IgE dans le sérum, confirmant en cela que l'administration orale de muradimétide peut moduler le profil isotypique de la réponse anticorps. 4) Le muradimétide et l'antigène sont administrés par voie orale ; le muradimétide n'étant administré que lors de l'immunisation secondaire. REPONSE A LA CHAINE P DE LA TOXINE CHOLERIQUE L'influence du muradimétide administré par voie orale en même temps que l'immunisation secondaire a également été étudiée dans la réponse anticorps à un immunogène actif par voie orale : la chaîne ss de la toxine cholérique (pCT). Des expériences ont été réalisées dans un groupe de 8 souris Swiss femelles recevant chacune d'elle par voie orale 10 ssg de pCT, deux fois à trois semaines d'intervalle. Les anticorps sont mesurés par la technique ELISA dans le sérum et dans les lavages vaginaux au jour 28. Les résultats sont exprimés dans le tableau 8 suivant. Tableau 8 Activité adjuvante du MDP associée avec vaccin oral ADJUVANT ANTI-ssCT Dans le Dans le sérum liquide vaginal IgG IgA IgG IgA Contrôle (sans adjuvant) 1800 900 20 5 Muradimétide p.o. 1 mg 4600 2700 35 85 au jour 25 Cette expérience démontre que le muradimétide administré par voie orale en même temps qu'un rappel d'immunisation par un vaccin oral peut exercer son pouvoir adjuvant aussi bien au niveau de l'immunité systémique qu'au niveau de l'immunité mucosale mesuré par la quantité d'IgA sécrétoire. - EXEMPLE III : Activité anti-infectieuse du muradimétide administré par voie orale 1) Protection contre les bactéries Le modèle utilisé est l'infection par Klebsiella pneumoniae. Le muradimétide est administré soit par voie parentérale, soit par voie orale avant ou après un challenge létal par des bactéries. Cette administration peut, comme le montre le tableau 9 ci-dessous, protéger de la mort les souris traitées ; cette protection peut être obtenue aussi bien chez les adultes que chez les nouveaux-nés. Tableau 9 Activité antibactérienne du muradimétide administré par voie orale et par voie systémique en comparaison avec la molécule parente MDPA Traitement % de protection (nombre d'animaux) Jour 1 (avant challenge) Muradimétide 100 g i.v. 53 (16) 2 mg p.o. 50 (24) 100 Ag s.c.* 75 (37) MDPA 100 Ag i.v. 56 (24) 2 mg p.o. 25 (16) Heure + 1 (après challenge) Muradimétide 100 Ag i.v. 69 (16) MDPA 100 ag i.v. 69 (16) Les animaux sont des souris femelles Swiss de 6/7 semaines, sauf pour le groupe noté d'un astérisque qui est constitué de souris nouveaux-nés. Ces résultats démontrent que le muradimétide est doué d'une activité immuno-stimulante non spécifique. De façon surprenante, il se montre comme l'un des dérivés ou analogues du MDP particulièrement efficaces, lorsqu'il est administré par voie orale et également aussi bien avant qu'après le challenge par une dose mortelle de bactéries. Au contraire, sa molécule parente, le MDPA, est aussi active que le muradimétide lorsqu'il est administré par voie systémique, mais, par contre, ne montre pas d'activité significative lorsqu'il est administré oralement (seulement 25% de protection, contre 50% pour le muradimétide). 2) Protection contre les virus Le muradimétide peut protéger des hôtes contre des infections virales d'éthiologies diverses comme cela va être montré ci-dessous dans lequel l'immunostimulant a été démontré actif de la même façon après administration par voie systémique ou administration par voie orale. a) Virus de l'influenza Le virus de l'influenza de l'espèce APR/8 est capable d'induire une pneumonie létale chez les souris adultes. Le muradimétide administré par voie orale 24 h après le challenge infectieux donné par voie orale a été capable de protéger 30% des animaux observés durant deux semaines. b) Virus de 1'encéphalomyocardite (ENCV) : L'EMCV induit dans les souris une encéphalomyocardite sévère conduisant à la mort après 5/6 jours dans nos conditions expérimentales (100 DL50 données en intrapéritonéal). L'effet protecteur du muradimétide a été évalué dans ce modèle après administration intrapéritonéale. b.l. Effet prophylactique Le muradimétide est administré à la dose de 1 mg/kg dans des souris 24 h avant une infection par 1'EMCV à la dose de 100 DL50. Les animaux sont observés pendant 60 jours. Les résultats comparatifs obtenus avec différents dérivés du MDP dans le tableau 10 suivant Tableau 10 Effet prophylactique Activité anti-virale de dérivés hydrophiles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV Muramyl peptides % de survie (300 ssg administrés 24h avant le virus) O O MDP O MDP OC4H9 10 Muradimétide 30 Muramét ide 10 I1 est évident à la lecture de ce tableau que le muradimétide seul, sans injection ultérieure d'interféron, permet d'obtenir un pourcentage de survie de 30% des souris. Pour mieux mettre en évidence l'activité remarquable du muradimétide dans le modèle EMCV, des expériences dose-réponse ont été entreprises en utilisant le muradimétide ou d'autres dérivés de muramyl peptides administré 24 h avant l'infection virale, Les résultats sont présentés dans le tableau 11 suivant Tableau 11 Dose efficace 50 des dérivés hydrophiles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV Muramyl peptides DE50 MDP > 600 g MDPA (OCH3)OC4H9 600 g Muradimétide 150 Ag Muramétide 300 Zg DE50 : dose du composé testé permettant d'assurer la survie de la moitié des animaux. On voit dans le tableau 11 qu'une dose de 150 Ag de muradimétide est suffisante pour obtenir 50% de survie. L'activité anti-virale du muradimétide est illustrée par la figure 2 qui montre qu'à la dose de 300 mg le muradimétide protège plus de 60% des souris contre la mort par infection virale, le MDP lui ne protège que 20% des animaux. La figure 3 représente l'activité dose réponses du muradimétide dans la protection des souris contre l'infection par 1'EMCV. Les souris Swiss (groupe de 10) ont été prétraitées par le muradimétide avant une infection par 100 DL50 d'unités infectieuses d'EMCV et les souris ont été observées pendant 60 jours. On voit, dans cette figure, que le muradimétide seul protège 80% des animaux à la dose la plus forte de 600 ssg/souris équivalente à 30 mg/kg. Le muradimétide a également été montré comme actif par administration orale contrairement aux autres dérivés muramyl peptides. L'administration de muradimétide par voie orale 1 h après le challenge infectieux est capable d'augmenter l'activité d'IFN a/ss administré au même moment par voie intrapéritonéale, comme ceci est montré dans le tableau 12 suivant Tableau 12 Traitement Taux de survie 1 h après le challenge final à 60 jours PBS (contrôle) 0/20 Muradimétide (150 mg/kg) p.o. 1/20 IFN-a/P 25,000 U.I. i.p. 6/20 Traitement combiné 10/20 MDM p.o. + IFN i.p. c) Virus Herpès Simplex type II (HSV II) : HSV Tableau 13 Activité du muradimétide dans le traitement de l'infection par HSV II Traitement Nombre de nécroses à + 1 heure par foie d'inhibition moyenne + SD Aucun 94 + 4 0 MDP 63 + 7 33 Muradimétide 35 + 4 63 Dans ces expériences, le muradimétide est capable d'interférer avec l'activité nécrotique du virus diffusé dans le foie. d) Virus de l'immunodéficience humaine L'effet de la combinaison des muramyl peptides avec des doses suboptimales de drogues antirétrovirales comme le 2',3'-dioxycytidine (ddC), l'azidothymidine (AZT) et d'autres agents inhibiteurs, a été investigué dans un modèle d'infection HIV de cellules d'origine humaine U937 monoplastoïdes Con positives. Le protocole expérimental utilisé pour étudier l'effet des différents traitements sur l'infection virale dans ces cellules est le suivant Dés lignées cellulaires U937 non infectées sont incubées pendant 2 h avec un pool de virus en présence de 2 g de polybrène. Après l'infection, les cellules sont centrifugées et les cultures sont ensuite ensemencées dans un milieu RPMI supplémenté avec du sérum de veau foetal. Différentes quantités de dérivés de muramyl peptides et d'agents anti-rétroviraux, sont dissoutes dans la culture comme montré plus bas. Les cellules sont ensuite comptées par observation microscopique après coloration au bleu trypan. Association avec 1'AZT La mesure de l'antigène HIV présent dans des cultures cellulaires infectées et traitées par du MDP ou du muradimétide seuls ou en combinaison avec 1'AZT permet de montrer l'activité inhibitrice de ces molécules. La figure 4 représentant l'effet des traitements de 1'AZT, du MDP ou du muradimétide (MDM) administrés seuls ou en combinaison. L'activité inhibitrice de doses sub-optimales de 0,01 M d'AZT est manifeste au jour 10, mais non au jour 3 suivant l'infection par le HIV. Un effet synergique significatif est obtenu en utilisant 10 g de MDP ou du muradimétide en combinaison avec la dose sub-optimale 0,01 M d'AZT comme il est montré sur le test antigène/HIV. La combinaison des muramyl peptides et de 1'AZT montre une activité synergique également au jour 10, une période de temps pour laquelle les muramyl peptides seuls sont inefficaces. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique immunostimulante active par voie externe, caractérisée en ce qu'elle contient un diester de formule générale I dans laquelle - R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - R1 est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone, dans une formulation d'administration par voie externe compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal. 2. Composition pharmaceutique immunostimulante selon la revendication 1 caractérisée en ce que le composé est le muradimétide de formule II Nac-Mur-L-Ala-D-GluCOMe]-OMe 3. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie orale. 4. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie aérosol. 5. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie percutanée. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisé en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle peut être administrée par voie externe avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d'administration de ladite vaccination. 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour traiter ou prévenir les effets des infections pathogènes, notamment les infections bactériennes, virales ou parasitaires. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en association avec un agent antiviral, ou un agent antirétroviral, la composition et l'agent antiviral étant utilisés de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en association avec un analogue de nucléoside, notamment 1'AZT (azidothymidine), ou le 2',3'-didéoxycytidine, pour une utilisation simultanée séparée ou étalée dans le temps. 11. Utilisation d'un diester de formule: pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal. 12. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que le diester est le muradimétide de formule Il Nac-Mur-L-Ala-D-Glu [OMe] -OMe. 13. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12 caractérisée en ce que la formulation du diester est compatible avec une administration de principe actif comprises entre 0.5 et 3 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal. 14. Utilisation selon l'une des revendications 11, 12 ou 13 caractérisée en ce que la voie externe est la voie orale, la voie des muqueuses, la voie percutanée ou la voie aérosol. 15. Utilisation de muradimétide selon les revendications 11 à 14, pour la préparation d'un immuno-adjuvant de vaccin. 16. Utilisation selon les revendications 11 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné à être utilisé de façon simultanée séparée ou étalée dans le temps avec un agent anti-infectieux. 17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'agent infectieux est un agent antiviral notamment un analogue de nucléotide.