FR 2710645 A1 19950407 FR 9311445 A 19930927 La présente invention concerne des oligonucléotides chimères d'anomérie alpha et bêta et leur application comme oligonucléotides antisens, ainsi qu'un procédé de préparation de ces oligonucléotides. Les oligonucléotides antisens ont comme objet l'inhibition de la traduction des ARNm cibles. Ceci peut être obtenu par hybridation spécifique dans la cellule visée et entrainent l'arrêt de la traduction. Ceci peut être aussi obtenu pour hybridation à l'ARN prémessager, ce qui entraîne la formation d'un ARN mesager non fonctionnel. Pour être efficaces, ces oligonucléotides doivent - Résister aux nucléases dans les milieux biologiques et dans les cellules pour maintenir leur activité le plus longtemps possible - Former des hybrides stables et spécifiques avec les acides nucléiques cibles - Inhiber efficacement la traduction et pour cela permettre à la RNase H de reconnaître le duplexe oligonucléotides/ARNm (ou prémessager) et de dégrader spécifiquement l'ARN de l'hybride. L'utilisation des oligonucléotides antisens, encore appelés aantimessagers", comme agents capables de moduler spécifiquement l'expression d'un gène s'est fortement développée ces dernières années [(16) à (30)l. Le principal problème rencontré par les utilisateurs de ce type de molécule est de les préserver de la dégradation par les nucléases afin d'obtenir le meilleur effet inhibiteur dans les milieux biologiques. Il a été décrit que ces molécules sont spécialement dégradées par des exonucléases et principalement des 3' exonucléases. Les oligonucléotides ADN naturels d'anomérie bêta, en formant des hybrides avec les ARN cibles, constituent un substrat pour la RNase H et sont de bons antisens i n vitro. Toutefois, leur sensibilité à la dégradation par les nucléases les rendent peu efficaces dans les expériences ex vivo ainsi qu'in vivo sur les modèles animaux Ceci a conduit à introduire dans la structure de ces molécules des modifications afin d'en accroître la résistance. Toutefois, ces modifications doivent préserver la capacité de ces molécules, d'une part à se fixer sur leur cible spécifique et, d'autre part, à inhiber les fonctions de celle-ci (traduction pour les ARNm, ou transcription ou réplication pour les ADN). Les principaux types de modifications proposées sont la substitution de l'un des oxygènes des phosphates par un CH3 dans la série des méthylphosphonates ; la substitution par un soufre dans la série des phosphorothioates ; la substitution par un ammoalkyl dans la série des phosphoramidites ; la modification de l'anomérie du sucre en utilisant les anomères non naturels d'anomérie alpha [(1) à (4)]. Ces différents types d'oligonucléotides non naturels possèdent une grande résistance vis-à-vis des nucléases. Toutefois, ces différentes modifications s'accompagnent d'une perte ou d'une diminution de l'induction de la dégradation du brin d'ARN complémentaire par la RNase H. En effet, cette enzyme est responsable de la dégradation des ARN dans les hybrides ARN:ADN. Il est à noter que ce mécanisme est responsable de l'activité antisens des oligonucléotides dans la majorité des situations décrites. Cette modification de l'effet RNase H a amené à introduire des groupements protecteurs à l'extrémité des oligonucléotides. Différentes molécules ont ainsi été introduites. Les agents intercalants utilisés pour accroître la stabilité des duplexes protègent les oligonucléotides de la dégradation du côté où ils ont été introduits. ns nécessitent cependant une chimie complexe (synthèse de l'intercalant et couplage délicat) et peuvent amener une augmentation de la fréquence des coupures aspécifiques par la RNase H (19). Les modifications comme les chaînes allyles fixées à l'une des extrémités des oligonucléotides ont été proposées dès le début de l'utilisation des oligonucléotides antisens (20) mais impliquent une chimie complexe. Une autre stratégie a été développée consistant à combiner différents types de nucléotides modifiés sur la même molécule. Ceci a été rendu plus aisé par l'évolution des synthétiseurs automatiques d'oligonucléotides et une meilleure maîtrise de la chimie utilisée dans ces appareils (types de synthons et agents oxydants) permettant d'introduire les différents types de modifications où on le désire. Cette méthode permet de fabriquer des oligonucléotides fenêtres constitués d'une partie centrale naturelle flanquée par deux régions possédant des phosphates modifiés (phosphorothioates, méthylphosphonates ou phosphoramidites). L'utilisation des oligonucléotides fenêtre formés d'un segment central non modifié flanqué par deux régions constituées de nucléotides possédant des phosphates substitués a été développée récemment dans différents groupes (7 à 13). L'enchaînement des différents nucléotides se fait en respectant la polarité 5'3' de l'oligonucléotide. Les régions flanquantes situées en 3' et en 5' de la molécule ont une longueur de deux à trois bases de façon à introduire le minimum de déstabilisation à la molécule. Ceci permet d'accroître la résistance de ces molécules vis-à-vis des exonucléases tout en préservant une fenêtre "active" pour la RNase H. Toutefois, les modifications effectuées au niveau des phosphates sont responsables de l'introduction d'une isomérie au niveau de cet atome (composés R et S). Ceci entraîne l'apparition d'une famille de molécules (2n molécules où n représente le nombre de phosphates modifiés) ayant chacune un type d'interaction différent avec la cible. I1 est maintenant bien établi que ces nucléotides non naturels entraînent une déstabilisation de l'hybridation induite par l'introduction d'une isomérie non naturelle au niveau du phosphate (10, 21, 22). La longueur de la région modifiée doit donc être courte. Dans le cas des phosphorothioates, ces molécules forment des hybrides reconnus par la RNase H, il n'y a donc pas de diminution de la séquence active dans ce type de chimère, ce qui ne permet pas de gain de sélectivité pour la dégradation de l'ARNm cible et accroît les risques d'obtenir des effets inhibiteurs aspécifiques. En outre, il a été décrit également une interaction séquence indépendante avec les protéines (références 31 à 34). Ceci peut entraîner une perte d'efficacité en raison du détournement d'une partie des oligonucléotides vers d'autres cibles et peut engendrer des effets toxiques. Un autre type de toxicité peut être dû à l'incorporation des nucléotides modifiés dans les acides nucléiques de la cellule, après hydrolyse de l'oligonucléotide antisens. On a proposé depuis de nombreuses années (1985) l'utilisation des oligonucléotides alpha anomériques comme inhibiteurs de l'expression génétique et plus particulièrement comme antimessagers. On a décrit la résistance de ces molécules vis-à-vis soit de nucléases purifiées (exo- et endonucléases) soit d'extraits cellulaires. Toutefois, les hybrides formés par ces molécules avec des ARN complémentaires ne constituent pas un substrat pour la RNase H. Un effet antimessager produit par ces molécules a pu être décrit si l'oligonucléotide alpha anomérique est dirigé contre la région cap du messager (24). Ce mécanisme est indépendant de l'action de la RNase H. I1 a été développé une technique pour introduire des liaisons pyrophosphates dans des oligonucléotides d'ADN d'anomérie bêta, ou des oligonucléotides mixtes d'ADN et d'ARN de même anomérie bêta (5,6). Metelev et col. (5) ont observé que la présence d'un lien pyrophosphate, peut réduire le nombre de sites de coupure d'un ARN par la RNase H. ns en ont déduit que ce type de lien pouvait avoir un intérêt dans la conception de site de restriction pour ARN. Cette technique de ligation chimique a été utilisée pour introduire des liaisons pyrophosphates substituées dans des oligonucléotides d'anomérie bêta (6). Purmal et col. ont observé le caractère hydrolysable du lien pyrophosphate et sa faculté de se lier avec une protéine. Le but était, dans ce cas, de permettre un lien covalent entre l'oligonucléotide et une protéine suite à l'hydrolyse du lien internucléotidique pyrophosphate. Des oligonucléotides composés alternativement de thymines d'anomérie alpha et d'anomérie bêta liés par des liaisons phosphodiesters ont été synthétisés (14, 15). Chaque nucléotide d'anomérie bêta est relié par son extrémité 3' à l'extrémité 3' d'un nucléotide alpha et par son extrémité 5' à l'extrémité 5' d'un autre nucléotide alha et ce inversement pour les nucléotides alpha. Ces oligonucléotides sont plus résistants à la dégradation par les nucléases que les oligonucléotides non modifiés (14). Cependant, l'introduction de nucléotides alpha et bêta alternatifs dans un oligonucléotide entraîne une diminution de la stabilité thermique des hybrides qu'ils forment avec une séquence complémentaire (14). Le but de la présente invention est de fournir de nouvelles molécules oligonucléotidiques conférant un accroissement de résistance vis-à-vis de la dégradation par les nucléases tout en préservant ou en augmentant la spécificité de reconnaissance de cette nouvelle molécule pour sa cible. Pour ce faire, la présente invention fournit un oligonucléotide chimère comprenant un oligonucléotide d'ADN d'anomérie bêta relié à son extrémité 3', par un lien pyrophosphate, à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha. Les différents oligonucléotides sont liés les uns aux autres par un pont pyrophosphate représenté par la formule chaque phosphore étant lié aux positions 3' ou 5' des cycles osidiques des nucléotides concernés. Dans ces oligonucléotides chimériques, dans le cadre d'une application comme anti-sens: - L'acide nucléique naturel d'anomérie bêta (ci-après oligonucléotide core) confère à la molécule son activité biologique par la capacité d'induire la dégradation de la cible ARN messager ou prémessager par la RNase H; - Le ou les oligonucléotide(s) d'anomérie alpha flanquant en 3' et, éventuellement en 5', l'oligonucléotide core protège(nt) ce dernier de la dégradation par les nucléases circulantes ou intracellulaires. La liaison 3'-3' entre l'oligonucléotide alpha anomérique et t'oligonucléotide bêta anomérique, masque t'extrémité 3' aux exonucléases dégradant les acides nucléiques par cette extrémité. Ces enzymes sont les plus abondantes dans les milieux extracellulaires. La propriété des oligonucléotides alpha anomériques de s'hybrider de façon parallèle avec les acides nucléiques d'anomérie bêta complémentaires (23) rend en effet possible dans un oligonucléotide chimère selon l'invention l'absence d'extrémité 3'. La présente invention permet donc de profiter de façon optimum de la propriété qu'ont les oligonucléotides alpha de s'hybrider de façon parallèle avec les acides nucléiques d'anomérie bêta complémentaire. Si on lie aussi les deux extrémités 5' d'un oligonucléotide alpha et bêta, cette configuration est moins résistante que la première vis-à-vis des nucléases des milieux biologiques. En effet, la présence d'un oligonucléotide alpha anomérique en 5' de la séquence core ne bloque pas totalement la dégradation par les nucléases. Toutefois, cette dégradation lente ralentit l'attaque de la séquence core et l'introduction d'une liaison pyrophosphate supplémentaire permet d'ajouter un surplus de résistance à la partie active de la molécule. C'est pourquoi, dans un mode de réalisation, l'oligonucléotide d 'anomérie bêta est donc également relié à son extrémité 5' par un lien pyrophosphate à l'extrémité 5' d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha. Les molécules selon la présente invention possèdent donc les propriétés avantageuses suivantes dues à l'association des anomères alpha et bêta. Les oligonucléotides alpha ne sont pas substrat des polymérases et ne peuvent pas conduire à une toxicité par incorporation dans le patrimoine génétique de la cellule de ces nucléotides non naturels. Leur résistance aux nucléases permet d'en faire de bons candidats pour les utilisations en milieu biologique. En outre, comme on l'a mentionné, on observe de façon surprenante, l'apparition d'une résistance aux nucléases localisées au niveau des liens pyrophosphates. La perte de stabilité thermique des chimères constituées avec ces anomères non naturels est faible. Le fait que les oligonucléotides constituant les oligonucléotides chimères alpha-bêta selon l'invention soient reliés par une liaison pyrophosphate de type 5'-5' ou 3'-3' permet en effet d'obtenir une stabilité d'hybridation car il est tenu compte de la polarité d'hybridation des oligonucléotides d'anomérie alpha, qui est inversée par rapport à celle des oligonucléotides d'anomérie bêta. Ceci est aussi sans doute la conséquence du lien pyrophosphate qui, en permettant une plus grande flexibilité qu'un lien phosphodiester entre les différents fragments, donne à l'ensemble une meilleure dynamique d'interaction et élimine les contraintes déstabilisantes d'une hybridation en présence de liens phosphodiesters. On observe que la spécificité d'inhibition de la traduction est augmentée par la diminution de la longueur de la région de l'hybride capable de constituer un substrat pour la RNase H. C'est pourquoi, de préférence, selon la présente invention, dans l'oligonucléotide chimère, l'oligonucléotide d 'anomérie bêta comporte de 5 à 10 nucléotides, de préférence 6 à 8. Il apparaît en effet que dans les oligonucléotides chimères selon la présente invention, 6 bases hybridées consécutivement suffisent généralement pour que la RNase H coupe un ARN. Dans les oligonucléotides chimères selon l'invention, seule la fenêtre d'anomérie bêta induit la coupure de l'ARN cible, les risques de dégradation aspécifique des ARN non cibles sont donc diminués, tout en conservant à la molécule dans son ensemble une bonne capacité d'hybridation. De façon appropriée, l'oligonucléotide chimère selon l'invention comporte 12 à 50 nucléotides, de préférence 15 à 25. Pour obtenir une bonne spécificité de reconnaissance de la séquence complémentaire de l'oligonucléotide sur l'ARN cible, tout en conservant une stabilité thermique suffisante pour permettre l'hybridation, une longueur d'environ 15 bases est considérée généralement comme nécessaire. Mais plus l'oligonucléotide est grand, moins l'hybridation avec l'ARNm complémentaire est spécifique, l'oligonucléotide pouvant s'hybrider partiellement avec d'autres séquences. Par ailleurs, plus est grand, plus il risque d'adopter des structures tertiaires comme l'ARN. Toutefois, selon un autre avantage de la présente invention, dans la mesure où les duplexes ADN alpha/ARN bêta ne sont pas substrats de la RNase H, la taille des fragments alpha dans les oligonucléotides chimères selon l'invention peut être relativement grande. Même si des hybridations non spécifiques se font lorsque les oligonucléotides s'hybrident partiellement avec d'autres séquences que la séquence cible, la RNase H n'agira pas à leur niveau. Dans un mode de réalisation avantageux des oligonucléotides chimères selon l'invention, l'oligonucléotide d'anomérie alpha en 3', et éventuellement en 5', comporte de 6 à 10 nucléotides. La simplicité de l'assemblage des oligonucléotides d'anoméries différentes pour former la molécule chimère selon l'invention constitue également un avantage de la présente invention. La synthèse de chacun des fragments de la molécule (quelle que soit l'anomérie) peut être effectuée par la méthode des phosphoramidites sur un synthétiseur automatique selon des procédés décrits dans la littérature (2-4) en introduisant si nécessaire un phosphate en 5' ou/et en 3' des oligonucléotides. La réalisation des différents oligonucléotides chimériques est effectuée par couplage de l'oligonucléotide core d'anomérie bêta avec les oligonucléotides d'anomérie alpha en 3' ou 5', soit individuellement soit, ensemble. La formation de la liaison pyrophosphate est effectuée en condensant les phosphates terminaux situés côte à côte après hybridation des différents oligonucléotides alpha et bêta sur un oligonucléotide complémentaire d'anomérie bêta selon une technique décrite (5, 6). Les fragments d'oligonucléotides d'anomérie alpha et bêta respectivement sont préparés par les méthodes conventionnelles de synthèse. Parmi les méthodes qualifiées de conventionnelles, diverses méthodes de synthèse chimique d'oligonucléotides ont été développées et sont bien connues des spécialistes travaillant dans ces domaines. Par exemple, une méthode consiste à utiliser un support solide dit "CPG" (controlled pore glass) sur lequel le premier nucléoside est fixé covalement par un bras de couplage, par l'intermédiaire de son extrémité 3 'OH. L'extrémité S'OH du nucléoside est protégée par un groupe di-pméthoxytrityl acido-labile. Cette approche dans laquelle des désoxynucléosides 3 'phosphoramidites sont utilisés comme synthons, est appelée la "méthode des phosphoramidites". Cette approche est la plus utilisée actuellement et présente l'avantage d'être entièrement automatique. Une autre approche utilisée pour la synthèse d'oligonucléotides est celle de la chimie des phosphonates. Cette approche commence par la condensation d'un désoxynucléoside 3'-H-phosphonate avec un déoxynucléoside couplé à un support de verre ou de silice. Des cycles de condensation successifs conduisent à la synthèse d'oligonucléotides H-phosphonates. Ces oligonucléotides sont oxydés en une étape pour donner les phosphodiesters. En utilisant l'une ou l'autre de ces techniques, ou tout autre procédure séquentielle permettant la synthèse de chaînes polynucléotidiques de séquence déterminée à l'avance, on obtient des oligonucléotides présentant la structure de départ désirée. Des synthèses détaillées d'oligonucléotides phosphorothioates diesters ont été décrites, par exemple, dans J. Am. Chem. Soc. 106: 6077-6079 (1984) et Nucleic Acids Res. 14: 5399-5407 (1986). En particulier, la synthèse des oligonucléotides précurseurs peut être effectuée en routine à l'aide des synthétiseurs automatiques. L'introduction des phosphates terminaux est effectuée au cours de la synthèse. Les oligonucléotides alpha anomériques possédant un phosphate 3' ou 5' peuvent être synthétisés à partir d'une colonne classique (possédant un synthon bêta fixé au CPG). Ceci économise les colonnes alpha anomériques, actuellement non fabriquées commercialement. La liaison pyrophosphate est synthétisée aisément avec un rendement supérieur à 95%. La différence de taille entre les différents constituants permet une purification facile des oligonucléotides chimères en fin de synthèse. La purification de grande quantité peut être facilité par l'immobilisation de l'oligonucléotide complémentaire sur une résine, puis élution des produits de la synthèse par un gradient de température. Dans ces conditions, les oligonucléotides qui n'auront pas réagi seront élués à faible température (Tm les plus bas). Les produits de la réaction seront élués du support à plus haute température. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un oligonucléotide chimère selon l'invention caractérisé en ce qu'on réalise un couplage covalent de l'extrémité 3', et éventuellement 5', d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie B et a ayant un groupe phosphate respectivement à ladite extrémité 3', et éventuellement 5', avec un groupe phosphate à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha et respectivement éventuellement un groupe phosphate à l'extrémité 5' d'un autre oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha pour former un lien pyrophosphate entre l'oligonucléotide d'anomérie bêta et le ou les oligonucléotide(s) d'anomérie alpha. Les techniques de synthèses d'oligonucléotides ayant un groupe phosphate à l'extrémité 3' et/ou 5' sont bien connues de l'homme de l'art (HORN T. and URDEA (1986) Tetrahedron Lett. 27: 4705). Selon la présente invention, on réalise le couplage covalent des oligonucléotides d'anomérie bêta et alpha après hybridation de ces derniers sur un oligonucléotide de séquence complémentaire et plus longue que les différents oligonucléotides à assembler réunis. D'une manière générale, différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation des oligonucléotides chimères alpha-bêta selon l'invention. Les oligonucléotides faisant l'objet de la présente invention peuvent être composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant de l'adénine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), et de la thymine (T), ou les oligonucléotides peuvent également comporter des nucléotides rares (Inosine, I, ou rI par exemple) ou des nucléotides modifiés, en série désoxyribo-, reliés entre eux par des liaisons phosphodiesters naturelles ou modifiées, notamment la séquence centre d'anomérie bêta peut être constituée d'oligonucléotides phosphorothioates. Les oligonucléotides chimères peuvent également comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide. Ainsi, les oligonucléotides chimères alpha-bêta selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralène, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant agir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à t'oligonucléotide. Font également partie de l'invention des oligonucléotides chimères alpha-bêta couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intracellulaire, et en particulier des groupements lipophiles, des polypeptides ou des protéines. Les oligonucléotides peuvent être utilisés à titre de réactifs ou principes actifs dans des compositions diagnostiques, cosmétologiques ou pharmacologiques diverses à des concentrations actives variables et avec les excipients appropriés selon les applications. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter un ou des groupement(s) lipophile(s) ou tout autre structure moléculaire favorisant la pénétration, le ciblage, l'adressage cellulaire ou intracellulaire de ces oligonucléotides, ou stabilisant la structure des oligonucléotides. Comme on l'a vu, les oligonucléotides selon l'invention sont tout à fait appropriés pour constituer des oligonucléotides antisens, cest-à-dire comportant une ou des séquence(s) nucléotidique(s) complémentaire(s) à une ou des région(s) d'ARN messager ou prémessager dont on désire bloquer spécifiquement l'expression. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent en particulier être utilisés comme agents antes en pour agir de façon spécifique sur la transcription ou la traduction de protéine(s) dont on désire moduler le niveau d'expression dans un but de recherche ou de thérapeutique. La présente invention a donc pour objet l'utilisation des oligonucléotides selon l'invention à titre de médicament, notamment comme agent anti-viral, antibiotique, antiparasitaire, antitumoral, ou anti-athéromoteur dans le domaine cardiovasculaire. Les oligonucléotides trouvent des terrains d'application particulièrement adaptés dans le domaine de la dermatologie en raison de l'accessibilité des cibles à traiter, et de la toxicité mineure ou inexistante de ces composés. Toutes les affections dermatologiques pouvant relever d'un mécanisme de dysfonctionnement génétique pour lesquelles on peut identifier un facteur étiologique et connaître la séquence du gène, et/ou de l'ARN messager indiquent d'appliquer une approche anti-sens. Ces oligonucléotides peuvent également être utilisés comme agent antisens dirigés contre des ARN messagers d'oncogènes exprimés dans des cellules tumorales et impliqués dans leur prolifération. Dans le cadre du traitement de certaines leucémies, pour des greffes de moëlle, les oligonucléotides peuvent être utilisés dans le cadre d'applications "ex vivo Des formulations galéniques appropriées peuvent être développées afin de favoriser la délivrance de ces molécules à leurs cellules cibles. Ainsi, par exemple les oligonucléotides selon l'invention pourront être encapsulés dans des liposomes, ou d'autres particules lipidiques. Les oligonucléotides selon l'invention sont plus généralement susceptibles d'être inclus dans toutes sortes de préparations pharmaceutiques, parapharmaceutiques, cosmétologiques, ou destinées à des dosages d'acides nucléiques ou de diagnostic, à des concentrations variables selon les indications, avec les excipients appropriés. La présente invention a aussi pour objet un procédé de modulation de l'expression génétique d'une séquence cible appartenant à un ARN messager caractérisé en ce qu'on hybride ladite séquence cible avec un oligonucléotide selon l'invention comportant une séquence complémentaire à ladite séquence cible. Ce type de procédé peut être mis en oeuvre à des fins de recherche, thérapeutique ou diagnostic, dans des conditions, in vitro. in vivo ou ex vivo. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. Différents oligonucléotides chimères constitués de 2 ou 3 oligonucléotides d'anomérie alpha ou bêta ont été préparés. Un oligonucléotide central, ci-après "oligonucléotide-core" constitue la partie RNase H active, et/ou des oligonucléotides en 3' et 5' d 'anomérie alpha ou bêta flanquent l'oligonucléotide-core et lui confèrent la résistance aux nucléases en fonction de l'anomérie choisie. Ci-après, l' oligo 3'" correspond au fragment situé en 3' de l' oligonucléotide-core", et l"'oligo 5' correspond à celui situé en 5' de 1' "oligonucléotide-core". Le lien pyrophosphate est schématisé par: pp et -p symbolise un lien phosphodiester. La structure de ces différentes molécules est représentée sur le schéma suivant: Composés oligo 3' I oligo core oligo 5' C1 5'[(&alpha;dX-p)m-&alpha;dX]3'-p-p-3' [ssdX-(p-ssdX)n-p-ssdX]5'-p-p-5' [&alpha;dX-(p-&alpha;dX)0]3' B1 3'[ssdX-(p-ssdX)n-p-ssdX]5'-p-p-5' [&alpha;dX-(p-&alpha;dX)0)3' A 1 51[(adX-p)m-adX] 3' -p-p-31 [6dX-(p-BdX)-p-BdX)51 C2 3'[(ssdX-p)m-ssdX]5'-p-p-3'[ssdX)n-p-ssdX]5'-p-p-3'[ssdX-(p-ssdX)0]5' B2 3'[ssdX-(p-ssdX)n-p-p-3'[ssdX-(p-ssdX)0]5' B2 3 [ssdX-(p ssdX)n-p-BdX ] S -p-p-3 [Bdx-(p-Bdx)0)5' A2 3'[(ssdX-p)m-ssdX)5'-p-p-3' [ssdX-(p-ssdX)n-p-ssdX]5' m, n, o représentent le nombre de nucléotides constituant chacun des fragments de l'oligonucléotide chimère. La synthèse de chacun des fragments de la molécule (quelle que soit l'anomérie peut être effectuée par la méthode des phosphoramidites sur un synthétiseur automatique selon des procédés décrits dans la littérature (2-4) en introduisant si nécessaire un phosphate en 5' ou/et en 3' des oligonucléotides. La réalisation des différents oligonucléotides chimériques est effectuée par couplage de l'"oligonucléotide-core" avec les "oligos 3' ou 5'", soit individuellement, soit ensemble. La formation de la liaison pyrophosphate est effectuée en condensant les phosphates terminaux situés côte à côte après hybridation des différents oligos sur un oligonucléotide complémentaire d'anomérie bêta selon une technique décrite (5, 6). Cet oligonucléotide complémentaire sera choisi plus long que les oligonucléotides à lier afin de faciliter les purifications ultérieures. La concentration de chacun des oligonucléotides est de 1 mM exprimée en bases. Le couplage est effectué à 4 C dans un tampon 50 mM MES, 20 mM MgC12, pH 6 en présence de 0.2 M de 1-éthyl-3(3'diméthylaminopropyl)carbodiimide pendant 6 heures. Les produits de la réaction sont alors purifiés sur gel 20% polyacrylamide, 7 M urée. Ils sont détectés soit par "UV shadowing", soit par autoradiographie s'ils ont été préalablement marqués radioactivement à l'aide de la polynucléotidekinase de phage T4 et d'ATP [Y-32 P]. Le rendement de la synthèse est de 95-98% pour les oligonucléotides chimères constitués de deux oligonucléotides (une seule liaison pyrophosphate). Ce rendement de synthèse passe à 85-90% pour les oligonucléotides constitués par les trois éléments (deux liaisons pyrophosphate). On a choisi comme modèle biologique l'ARNm du protooncogène Dim murin. La cible de ces oligonucléotides correspond au site d'initiation de la traduction (AUG). La séquence des différents oligonucléotides est la suivante: Oligonucléotide-core 5' ssd(GAGCATCC)3' Oligonucléotide 3' 5' ssd(CCACCTCCA)3' S' ad(ACCTCCACC)3' Oligonucléotide 5' 5' ssd(TGGACAG)3' 5' ad(GACAGGT)3' Oligonucléotide cible ADN pour la synthèse 5'ssd(CCTGGAGGTGGGGATGCTCCTGTCCAAG)3' Ces séquences sont représentées sans phosphate terminal 3' et/ou 5', étant entendu qu'on introduit les phosphates en 3' et/ou 5' selon le besoin. Oligonucléotide contrôle thermostaté, dans une cuve en quartz de 1 cl à partir d'une solution équimolaire en brin de 1 zM. Le tampon a la composition suivante: 10 mM Phosphate de Na, 100 mM NaCl, pH 7.5. Les valeurs de température de demi-dénaturation (Tm) ont été calculées par la dérive de la courbe de dénaturation thermique. Le résultat est présenté dans le tableau suivant: Température de demi-dénaturation (Tm) des oligonucléotides chimères hybridés avec l'oligo cible Oligo chimère A1 A2 B1 B2 C1 C2 core Tm ("C) 60.5 61.5 50.5 55.5 67 71.2 33.1 Oligonucléotide chimère alpha-bêta: A1, B1, C1 Oligonucléotide d'anomérie bêta: A2, B2, C2 core L'ensemble de ces résultats indique que les chimères alpha-bêta présentent une stabilité thermique peu ou pas diminuée par rapport à leurs homologues bêta-bêta. La Tm de ces molécules est supérieure à 50 C, ce qui permet de prévoir que ces molécules seront parfaitement hybridées avec leurs cibles dans les conditions hybridées sur leur cible dans les conditions physiologiques (37 C). L'oligonucléotide-core ne sera hybridé que partiellement dans les conditions physiologiques (environ 35%). 2-Résistance aux nucléases dans les milieux biologiques: La résistance de ces oligonucléotides chimères a été étudiée dans trois types de milieux biologiques: le sérum de veau foetal EUROBIO, France (utilisé pour la confection des milieux de cultures cellulaires), dans le plasma humain et dans des lysats de cellules DUNNI. Pour cette étude, les oligonucléotides ont été marqués à leur extrémité 5' à l'aide de la polynucléotidekinase de phage T4 en présence d'ATP [r32Pi. Dans le cas des oligonucléotides B1 et B2, le marquage est effectué avant la synthèse et se trouve donc à l'intérieur de la molécule. Le plasma humain a été préparé par centrifugation de sang humain récupéré dans un tube hépariné. Les lysats cellulaires ont été préparés à partir du surnageant de 4x106 cellules DUNI repris par 1 ml d'eau et centrifugés 10 min. à 13.000 rpm. Les oligonucléotides préalablement marqués avec de l'ATP [y-32P] sont incubés dans le milieu biologique à 37 C. Cependant, l'étude avec des sérums a été effectuée à 25"C. A différents temps, un aliquot est prélevé, les protéines sont extraites au phénol, puis les oligonucléotides sont précipités à l'acétone en présence de 2% de perchlorate de lithium. Les fragments de digestion sont révélés par électrophorèse sur gel 20% acrylamide, 7 M urée suivie d'une autoradiographie. L'oligonucléotide intact est quantifié par la mesure de sa radioactivité après découpage de la bande correspondante sur le gel. Les résultats sont présentés sur le tableau suivant: Temps de demi-vie des oligonucléotides chimères dans les milieux biologiques Oligo A1 A2 B1 B2 C1 C2 (min) 120* 3 4 82 85 Nr Plasma Tri/2 (min) 22 22 1.6 55 55 2.7 Sérum T1/2 (min) 37 172 NF NF NF NF Lysat cell. (*20% de l'oligo est hydrolisé en 120 minutes) (NT = Non Testé) Oligonucléotide chimère alpha-bêta: A1, B1, C1 Oligonucléotide d'anomérie bêta: A2, B2, C2 Ces résultats indiquent que le composé le plus résistant dans le sérum et le plasma est la chimère Al, suivie par la chimère C1 sensiblement deux fois moins résistante. Les autres composés possèdent des demi-vies inférieures à 5 minutes dans les mêmes conditions. La résistance du composé Al s'explique par l'absence d'extrémité 3' libre et par la présence du fragment alpha. Paradoxalement, la chimère B1 est moins résistant que son homologue d'anomérie bêta B2. Cette sensibilité forte est probablement due à l'existence dans le composé B1 de deux extrémités 3'. En effet, les activités 3' exonucléases ont été décrites comme prépondérantes dans le sérum et le plasma (18). Il est à noter que l'existence des liaisons pyrophosphates entraîne l'apparition d'une pause à ce niveau par les nucléases. Ceci permet de donner un accroissement de résistance de la partie active de l'oligonucléotide chimère C1 dont la séquence core aura une durée de vie plus grande si elle est encadrée en 3' et en 5' par des séquences alpha anomériques, même si ces séquences sont dégradées partiellement (celle en 5' principalement). L'hydrolyse des oligonucléotides dans les lysats cellulaires est due à des activités endonucléases, ce qui est confirmé par les bandes observées sur le gel. 3 - Capacité d'induire la dégradation de l'ARN cible par la RNase H: Nous avons étudié la capacité des différents oligonucléotides chimères à induire la dégradation de l'ARN cible à un site spécifique par la RNase H de E. coli. L'ARNm de la bêta globine de lapin a été utilisé comme ARNm contrôle non cible. Pour cette étude, les différents ARNm ont été marqués au 32P avec de l'ATP [alpha-32P] lors de leur synthèse. Les ARN ont été ensuite incubés avec 4 Unités de RNase H de E. coli en présence d'une concentration de 5 FM d'oligonucléotide à 37"C pendant 20 minutes. Le tampon utilisé était le suivant: 20 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, pH 7.6. Les produits de digestion ont été révélés après électrophorèse sur gel 5% acrylamide, 7 M urée suivie d'une autoradiographie. L'ARNm intact a été enfin quantifié par la mesure de la radioactivité présente dans la bande correspondante après découpage de cette dernière du gel. Taux d'hydrolyse de l'ARN pim (cible) et de l'ARNm ss globine (contrôle) par la RNase H en présence des oligonucléotides chimères oligo pim B G core Al A2 B1 B2 C1 C2 % d'Hydrolyse 96 NT 47 n 94 89 92 89 94 ARN pim % d'hydrolyse NT 100 9 6 36 24 14 27 45 ARN B globine (NT = Non Teste) Oligonucléotides alpha-bêta: Al, B1, C1 Oligonucléotides d 'anomérie bêta: pim, BG, Core, A2, B2, C2 Les résultats que nous avons obtenus montrent que l'otigonucléotide non modifié Dim est le plus efficace, mais il donne des coupures aspécifiques sur le même ARN. Les oligonucléotides chimères donnent une coupure spécifique de l'ARNm Dim. Les oligonucléotides chimères constitués d'éléments d'anomérie alpha et bêta coupent à un site unique à la position attendue. Les oligonucléotides d'anomérie bêta (A2, B2 et C2) donnent sur l'ARNm de bêta globine des coupures aspécifiques (ARN non cible). Les oligonucléotides chimères B1 et C1 donnent également quelques coupures sur l'ARNm non cible. Ai , constitué uniquement de l'oligonucléotide-core et de l'oligonucléotide 3' alpha anomérique, donne la meilleure spécificité de coupure par la RNase H. 4 - Inhibition de la traduction par les oligonucléotides chimères: L'effet antimessager des différents oligonucléotides chimères que nous avons synthétisés a été testé dans des lysats de germe de blé (possédant une forte activité RNase H) sur l'ARNm cible de Dim et sur l'ARNm contrôle de la bêta globine de lapin. Les oligonucléotides ont été utilisés à la concentration de 1 fi. L'incubation a été effectuée pendant 1 heure à 25"C dans les conditions décrites par le fournisseur (AMERSHAM ou PROMEGA). La concentration en potassium utilisée pour la traduction de l'ARN nim est de 53 mM. Elle est de 130 mM pour celle de l'ARNm de bêta globine de lapin. Les protéines marquées à la méthyonine 35S ont été révélées après électrophorèse sur gel SDS-PAGE à 12% d'acrylamide suivie d'une autoradiographie. Une inhibition de la traduction de 60% a été obtenue avec ces oligonucléotides. Ceci est comparable à ce que l'on obtient avec un oligonucléotide d'anomérie bêta d'une longueur de 15 bases dirigé contre la même cible et ne possédant pas de liaisons pyrophosphates. Ce résultat indique que l'introduction de liaisons pyrophosphates dans les oligonucléotides ne perturbe pas l'activité de la RNase H. L'utilisation d'une courte fenêtre (8 bases) est suffisante pour obtenir une bonne inhibition de la traduction sans que les fragments alpha anomériques ne viennent perturber cet effet. n est à observer que cette séquence de 8 bases seule ne donne pas d'inhibition de la traduction car elle est trop courte pour donner un hybride stable constituant un substrat pour la RNase H. Ces différents oligonucléotides n'entraînent aucune inhibition de la traduction de l'ARNm de la bêta globine de lapin. Conclusions L'ensemble de ces expériences montre donc que les oligonucléotides chimères présentent de nombreux avantages par rapport aux oligonucléotides constitués uniquement d'anomères bêta. En effet: - I1 possèdent une grande résistance vis-à-vis des nucléases des milieux biologiques (sérum, plasma et extraits cytoplasmiques) - Ils ont acquis une plus grande sélectivité d'action grâce à la diminution de la longueur de la séquence reconnue par la RNase H tout en conservant une bonne stabilité d'hybridation avec leur cible - Parmi les différentes constructions, les chimères alpha-bêta liées par les extrémités 3'-3' s'avèrent les plus résistantes vis-à-vis des nucléases, elles présentent une bonne sélectivité d'hybridation avec l'ARN cible et sont d'une synthèse aisée car elles ne sont constituées que de deux fragments oligonucléotidiques liés par un pont pyrophosphate. BIBLIOGRAPHIE l. Séquin U., 7 Nucleosides and nucleotides. Part 7. 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REVENDICATIONS 1) Oligonucléotide chimère comprenant un oligonucléotide d'ADN d'anomérie bêta relié à son extrémité 3', par un lien pyrophosphate, à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha. 2) Oligonucléotide chimère selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'oligonucléotide d'anomérie bêta est relié à son extrémité 5' par un lien pyrophosphate à l'extrémité 5' d'un oligonucléotide d'ADN d 'anomérie alpha. 3) Oligonucléotide chimère selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'oligonucléotide d'anomérie bêta comporte de 5 à 10 nucléotides, de préférence 6 à 8. 4) Oligonucléotide chimère selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte de 12 à 50 nucléotides, de préférence 15 à 25. 5) Oligonucléotide chimère selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'oligonucléotide d'anomérie alpha comporte de 6 à 10 nucléotides. 6) Oligonucléotide chimère selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN complémentaire d'une séquence cible d'ARN messager ou prémessager dont on désire bloquer ou moduler l'expression. 7) Oligonucléotide chimère selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN est complémentaire d'une séquence d'ARNm codant pour des protéines ayant des effets pathogènes. 8) Utilisation d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 7 à titre de médicament. 9) Procédé de préparation d'un oligonucléotide chimère selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'on réalise un couplage covalent de l'extrémité 3 ', et éventuellement 5', d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie bêta ayant un groupe phosphate à ladite extrémité 3', et, respectivement, éventuellement 5', avec un groupe phosphate à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha, et respectivement éventuellement un groupe phosphate à l'extrémité 5' d'un autre oligonucléotide d'ADN d'anomérie alpha pour former un lien pyrophosphate entre l'otigonucléotide d'anomérie bêta et le (ou les) oligonucléotide(s) d'anomérie alpha. 10) Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'on réalise le couplage covalent des oligonucléotides d'anomérie bêta et alpha après hybridation de ces derniers sur un oligonucléotide de séquence complémentaire et plus longue que les différents oligonucléotides à assembler réunis.