FR 2723371 A1 19960209 FR 9409578 A 19940802 La présente invention concerne des composés oligonucléotidiques, leurs applications, notamment à des fins thérapeutiques ainsi qu'un procédé de préparation. L'association d'un oligonucléotide avec une portion d'un acide nucléique cible peut bloquer un processus biologique important dans lequel cet acide nucléique, ARN ou ADN, est engagé. Cette stratégie, dite antisens, peut permettre de réguler de façon sélective l'expression de tout gène dont la séquence primaire est connue. Dans cette approche devenue classique, l'association entre les deux séquences, antisens et cible, repose sur la formation de structure en double brin impliquant des paires de bases Adénine-Thymine (Uracile) et Guanine-Cytosine par le biais de liaisons hydrogènes dites de Watson-Crick". Le succès de cette approche dépend en partie de l'accessibilité de la séquence ciblée, c'est-à-dire de sa disponibilité pour engager les liaisons hydrogènes avec la séquence complémentaire. Or les acides nucléiques monocaténaires, tout particulièrement les ARN, adoptent, par suite de repliements complexes, des structures secondaires ou tertiaires qui peuvent considérablement affaiblir ou même rendre inopérants les oligonucléotides antisens traditionnels, c'est-à-dire ciblés sur une séquence en simple brin. Si la séquence visée par l'oligonucléotide antisens est impliquée dans de telles structures les repliements intra-moléculaires entrent en compétition avec l'association de l'oligonucléotide à sa cible. En particulier, les ARN monocaténaires, messagers, pré-messagers ou viraux peuvent adopter, dans des conditions d'environnement défini, des structures repliées conduisant localement à des conformations complexes. Les épingles à cheveux et les pseudo-noeuds constituent des exemples de telles structures tridimensionnelles. A côté de l'approche dite antis ens, une autre application des oligonucléotides est fondée sur la reconnaissance ADN-protéines. Dans cette approche l'oligonucléotide joue le rôle de piège à protéines, notamment des facteurs de transcription, selon des modes d'interaction ADN-protéine inconnus. Des techniques pour sélectionner des oligonucléotides reconnaissant une structure peptidique donnée ont été développées sous divers noms : "SELS" (1990, Science, 249, 505), "APTAMERES" (1990, Science, 250, 1104 et 1149), et "PET" (1992, TIBTECH, 10, 87). Dans ces méthodes on génère par la synthèse chimique une bibliothèque très large de toutes les séquences aléatoires possibles d'ADN. Ces séquences sont criblées à travers une colonne ou un filtre lié au ligand (chromatographie d'affinité) et cette première sélection permet de retenir un certain nombre de séquences possédant la bonne affinité recherchée. Ce mélange est ensuite amplifié par PCR et le cycle est recommencé. Les étapes successives de sélection et d'amplification résultent en un enrichissement exponentiel des séquences possédant la fonction recherchée, jusqu'à prédominance de la séquence possédant la plus forte affinité. Cette technique permet dans une première étape, la sélection d'un ou de plusieurs fragments oligonucléotidiques qui présentent la bonne affinité vis à vis du ligand et dans une deuxième étape, ces oligonucléotides sont étudiés pour leurs propriétés biologiques (inhibition, activité enzymatique). Le ciblage de régions d'acide nucléique à structure non linéaire par un oligonucléotide ne tenant pas nécessairement compte des interactions de type Watson-Crick (approche antisens) ou Hoogsteen (approche triple hélice"), c'est-à-dire dont la séquence n'est pas nécessairement déduite de la séquence primaire de la cible, n'a jamais été proposé. La présente invention concerne des oligonucléotides qui ne sont pas dirigés contre une séquence linéaire d'acide nucléique mais prennent en compte les structures locales non linéaires notamment les conformations tridimentionnelles de la cible. Plus précisément, la présente invention a pour objet un oligonucléotide dit "Aptastruc", caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'acide nucléique ADN ou ARN à structure non linéaire. On entend ici par "affinité" le fait que l'oligonucléotide Aptastruc forme un complexe stable avec la séquence cible. L'affinité pour la cible peut être déterminée par tout moyen connu: - soit par une réduction de mobilité électrophorétique, le complexe migrant moins vite que la cible libre, - soit par chromatographie, l'oligonucléotide Aptastruc étant retenu dans la colonne sur une phase greffée avec la structure cible, - soit par spectrophotométrie d'absorption UV. La dissociation des complexes formés par les acides nucléiques s'accompagne d'une augmentation d'absorbance à 260nm. L'enregistrement de ce paramètre en fonction de la température conduit à des courbes de fusion caractérisées par un point d'inflexion à une température dite de demitransition (Tm) lorsqu'on se trouve en présence d'un complexe. Les oligonucléotides, selon la présente invention ne sont pas déduits de la séquence primaire de la cible selon les règles d'appariement Watson Crick ou Hoogsteen, mais sont sélectionnés par affinité, au sein d'une population générée au moins en partie par synthèse aléatoire et des techniques classiques d'amplification qui permettent après clonage et séquençage, d'identifier des oligonucléotides dits Aptastruc, c'est-à-dire des oligonucléotides aptes à reconnaître une structure non linéaire. La présente invention concerne en effet le ciblage de régions d'acides nucléiques à structure non linéaire par des oligonucléotides reconnaissant ces régions obtenues selon un processus en deux étapes a) production d'une population d'oligonucléotides de séquences au moins en partie aléatoire, et b) sélection par affinité au sein de cette population, des oligonucléotides aptes à reconnaitre la région à structure non linéaire. Les oligonucléotides Aptastrucs ainsi sélectionnés sont alors amplifiés, puis clonés et séquencés. Un oligonucléotide Aptastruc, selon l'invention est donc un oligonucléotide interagissant spécifiquement avec une structure non linéaire. La façon dont il est obtenu, prend en compte les particularités tridimensionnelles de la cible sans que la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc puisse être prédite de façon rationnelle compte tenu des connaissances actuelles sur les structures des acides nucléiques. En particulier, l'association entre l'Aptastruc et sa cible met en jeu des interactions physico-chimiques élémentaires (liaisons hydrogènes, empilements) entre bases nucléiques, des deux partenaires. Ces complexes peuvent éventuellement faire intervenir des interactions non encore identifiées dans les structures d'acides nucléiques naturels connues à ce jour. En particulier, l'oligonucléotide Aptastruc selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est constitué, en partie au moins, d'une séquence de bases nucléiques qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible et qu' il forme un complexe avec ladite séquence cible. On entend ici par "interactions canoniques", les interactions mises en jeu dans la formation de paires de base du type Watson-Crick ou de triplets de bases Pyrimidine. Purine. Pyrimidine ou Purine. Purine. Pyrimidine faisant intervenir des liaisons hydrogènes dites Hoogsteen. On entend par "complexe" que l'oligonucléotide selon l'invention forme un complexe suffisamment stable avec la séquence cible pour présenter notamment une mobilité électrophorétique réduite sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes lorsqu'il est mis en présence de la séquence cible. La complexation selon la présente invention peut faire intervenir des liaisons hydrogènes intramoléculaires entre bases nucléiques éventuellement très éloignées dans la séquence primaire. Ces liaisons hydrogènes peuvent être non conventionnelles, c'est-à-dire être formées entre paires de bases autres que A-T(U) ou G-C. Les structures dans lesquelles elles sont impliquées peuvent être d'un type non identifié à ce jour. Enfin, les méthodes de calcul conformationnel existantes peuvent être incapables de les prédire. Lorsque l'on a certaines données sur la séquence cible, notamment lorsque la séquence cible, bien que comportant une structure non linéaire, comporte également un fragment simple brin à structure linéaire adjacent à ladite structure non linéaire, l'oligonucléotide selon la présente invention est avantageusement caractérisé en ce qu'il comporte une séquence complémentaire d'une partie dudit fragment simple brin linéaire de la cible et le reste de la séquence est une séquence qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible. Ainsi l'oligonucléotide forme un complexe plus stable avec la séquence cible que le complexe formé par un oligonucléotide constitué par la seule séquence complémentaire dudit fragment simple brin à structure linéaire, avec la même séquence cible. Comme mentionné précédemment, la comparaison de la stabilité des complexes formés par les deux oligonucléotides (l'oligonucléotide Aptastruc et l'oligonucléotide complémentaire du fragment linéaire) avec la séquence cible peut être déterminée par la mesure de leur température de demi-transition. On peut également réaliser des expériences de compétition entre les deux oligonucléotides par chromatographie ou par mobilité sur gel d'électrophorèse. Pour ce faire, on dose les quantités respectives d'oligonucléotides non retenues par la colonne de chromatographie comportant une phase greffée avec la séquence cible ou les quantités respectives d'oligonucléotides nécessaires pour ralentir la mobilité de la séquence cible sur gel d'électrophorèse. Lorsque la séquence cible présente une structure auto- appariée en épingle à cheveux prolongée par une région simple brin non appariée, la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc est pour partie complémentaire de la séquence de ladite région simple brin. On entend ici par "épingle à cheveux" une séquence comportant une boucle non auto appariée, encadrée par des fragments 5' et 3' qui sont appariés entre eux. De façon appropriée, un oligonucléotide Aptastruc selon l'invention comporte de 15 à 35 nucléotides. Lorsque l'oligonucléotide comporte une séquence complémentaire de la séquence cible, celle-ci comprend un fragment de 5 à 10 nucléotides complémentaires d'une région simple brin de la séquence cible, lequel est couplé à un fragment de 10 à 25 nucléotides non complémentaires de la séquence primaire de la séquence cible. L'association entre l'oligonucléotide Aptastruc et la structure cible peut inhiber un processus biologique : traduction d'un ARNm, maturation d'un pré-ARN, transcription inverse d'un ARN rétroviral. Le complexe Aptastruc/structure peut empêcher a) la fixation d'une protéine ou d'une enzyme sur la structure, b) l'interaction ou la progression d'un complexe macromoléculaire, chargé de décrypter l'information génétique portée par la cible, ou c) la transition de la structure d'une forme X vers une forme Y (signal). Si la structure cible appartient à un pathogène, l'oligonucléotide Aptastruc peut constituer un moyen de contrôler le développement de ce pathogène. La présente invention a en particulier pour objet un oligonucléotide, caractérisé en ce que la séquence cible est une séquence à structure non linéaire d'un acide nucléique ADN ou ARN qui commande l'expression d'un gène appliqué dans une pathologie humaine ou animale, et en ce qu'il permet le blocage du développement d'un virus, d'une bactérie ou d'un parasite. Un oligonucléotide selon l'invention, constitue donc un médicament, notamment anti-viral, anti-bactérien ou antiparasitaire. D'un point de vue chimique, les oligonucléotides Aptastrucs peuvent être des oligonucléotides conventionnels obtenus par synthèse ou générés in situ par transcription de la séquence adéquate placée en aval d'un promoteur approprié, ou des oligonucléotides synthétiques chimiquement modifiés notamment sur le squelette phosphodiester (liaison phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, methyl phosphonate), sur le sucre (2'-O-alkyl) ou sur le nucléoside en particulier d'anomérie a. En outre, les oligonucléotides Aptastrucs peuvent être des vecteurs actifs tels que ribozymes, ou oligonucléotides conjugés à des groupements chimiques susceptibles d'induire des coupures ou des pontages sur la cible. Pour les applications in vivo on utilise de préférence des oligonucléotides Aptastrucs résistants aux nucléases. Le processus initial de production et de sélection reste inchangé a) synthèse d'une population d'oligonucléotides en série phosphodiester ss, b) sélection par affinité pour la structure cible, c) clonage et séquençage. Une fois l'oligonucléotide Aptastruc identifié, il peut alors être synthétisé et utilisé en série ribo ou désoxyribo-nucléotide ou même comportant toute modification chimique susceptible de lui conférer un avantage par rapport aux oligomères conventionnels, par exemple du type phosphorothioate ou 2'-Ométhyl selon des méthodes connues. Un intérêt des oligonucléotides Aptastrucs réside donc dans le fait qu'aucune connaissance structurale préalable n'est en principe requise tant du point de vue de la séquence cible que du point de vue de l'oligonucléotide. La présente invention permet la sélection d'oligodésoxynucléotides dirigés contre des motifs essentiels au développement d'un virus, notamment du virus de l'Immunodéficience Humaine. Les cibles peuvent être constituées par le site PBS (Primer Binding Site) sur lequel est réalisé l'initiation de la copie ADNc avant intégration d'une part et par un élément du génome rétroviral avant encapsidation d'autre part. D'autres éléments ARN fonctionnels peuvent être définis sur la base des données de la littérature. On cite en particulier les exemples suivants. 1. La séquence mini-exon des trypanosomatidés Chez les parasites protozoaires de la famille des trypanosomatidés tous les ARN messagers commencent par un même motif, long de 39 nucléotides, la séquence mini-exon. Cette séquence, acquise lors d'un processus de maturation particulier joue un rôle essentiel lors de l'épissage et de la traduction. Chez les leishmanies cette séquence miniexon adopte une structure en épingle à cheveux qui affaiblit l'effet des oligonucléotides antisens conventionnels, cest-à-dire complémentaires de l'épingle ouverte. En effet, le bilan énergétique de la formation du complexe prend en compte l'énergie à fournir pour rompre les paires de bases de la tige de l'épingle. Un oligonucléotide Aptastruc reconnaissant cette structure de la séquence mini-exon peut au contraire stabiliser l'épingle. On sait que les ribosomes ont une capacité limitée pour rompre les structures secondaires, et décoder le message. En dehors de tout autre effet l'oligonucléotide Aptastruc fixé à l'épingle mini-exon peut bloquer la traduction des ARNm et donc le développement du parasite. Bien que peu de choses soient connues sur le rôle du mini-exon, il est clair que cette séquence joue un rôle clé lors de l'épissage. Selon la présente invention, un oligonucléotide Aptastruc fixé au mini-exon peut bloquer la maturation des messagers. L'ensemble de ces effets sur la production d'ARNm mûrs et sur la synthèse protéique fait donc de cette oligonucléotide Aptastruc une molécule leishmanicide. Certaines leishmanioses sont de nature cutanées ou cutanéomuqueuses. Les lésions et les parasites sont externes, c'est-à-dire accessibles à la lumière. Une fois l'Aptastruc identifié on peut lors de la synthèse lui lier un photosensibilisateur (groupement psoralène), générant ainsi un oligonucléotide Aptastruc photoactivable qui peut être plus efficace que l'oligonucléotide Aptastruc non modifié, puisque susceptible d'inactiver définitivement la cible. Pour d'autres applications (leishmanioses viscérales, par exemple) on peut lier l'oligonucléotide Aptastruc à des agents de coupure du type complexe métallique capables de produire des coupures par différents mécanismes. 2. La séquence TAR du rétrovirus HIV La régulation de l'expression des gènes chez le rétrovirus de l'immunodéficience humaine (VIH) est assurée notamment par la fixation d'une protéine appelée TAT sur une séquence particulière : la séquence TAR. Cette séquence est structurée sous forme d'épingle imparfaite, certaines bases de la tige n'étant pas appariées. La position des bases nucléiques de TAR interagissant avec la protéine TAT a été déterminée par mutation ponctuelle systématique. Les éléments clés pour l'interaction TAT-TAR sont connus et l'on sait qu'en certaines positions la substitution d'une base nucléique par une autre (ou sa délétion) abolissent la formation du complexe et par conséquent perturbent l'expression des gènes du rétrovirus qui dépendent de TAT. La structure TAR peut faire l'objet d'une interaction avec un oligonucléotide Aptastruc. La formation du complexe TAR-Aptastruc peut perturber la fixation de la protéine TAT et donc dérègler la synthèse des protéines virales qui dépendent de TAT. Compte tenu du rôle joué par TAT, l'oligonucléotide Aptastruc anti-TAR peut donc constituer une molécule anti-HIV. D'autres structures secondaires ont été identifiées dans le génome de HIV, en particulier dans la région d'initiation de la transcription inverse (PBS). Sous certaines conditions, la transcriptase inverse peut être arrêtée par fixation d'un oligonucléotide. Un oligonucléotide Aptastruc anti-structure PBS peut donc agir comme inhibiteur de la transcriptase inverse. 3. L'élément IRE Si la plupart des éléments de régulation de l'expression des gènes se trouvent au niveau de la transcription, des éléments intervenant au niveau de la traduction commencent à être identifiés. Ces motifs, situés soit en amont soit en aval de la séquence codante, agissent au niveau de la traductibilité ou de la stabilité de l'ARN messager qui les contient. Ainsi le motif IRE (Iron Responsive Element) est une séquence qui intervient dans le contrôle de l'expression des gènes de la ferritine et de la transferrine. On peut replier cette séquence IRE sous forme d'une épingle à cheveux. Située en 5' du message de la ferritine, elle module le niveau de traduction de l'ARNm de la ferritine ; placée en 3' de l'ARNm de la transferrine, elle régule son temps de vie. On sait depuis peu que l'élément IRE est reconnu spécifiquement par un facteur protéique. La fixation d'une protéine sur l'élément IRE en absence de fer bloque la traduction de la ferritine et protège l'ARNm de la transferrine. En présence de fer, le facteur protéique se dissocie de l'élément IRE entrainant la synthèse de ferritine et la dégradation de l'ARNm de la transferrine. On peut donc sélectionner un oligonucléotide Aptastruc contre l'élément IRE. Le complexe Aptastruc IRE perturbe la fixation du facteur protéique et, probablement, la régulation des messages correspondants. Certains désordres métaboliques du fer pourraient trouver leur origine dans des éléments IRE défectueux. Dans ce cas on peut cibler ces IRE mutants par un oligonucléotides Aptastruc et réintroduire un gène fonctionnel par thérapie génique. L'oligonucléotide Aptastruc et le gène sauvage peuvent d'ailleurs être suppléés au cours de la même opération : une fois la séquence aptastruc identifiée, on peut réaliser une construction plaçant cet aptastruc en aval d'un promoteur adéquat, conduisant, après transfection, à la production in situ d'un oligoribonucléotide Aptastruc. La présente invention a également pour objet un procédé de sélection in vitro d'un oligonucléotide Aptastruc, caractérisé en ce que a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats de séquences aléatoires, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, les candidats étant en excès, de préférence large excès, par rapport à la séquence cible, c) on isole les oligonucléotides qui forment un complexe stable avec la séquence cible, d) on amplifie les échantillons d'acides nucléiques isolés à l'étape c), e) on réitère plusieurs fois les étapes b) et c), en particulier on réitère de 1 à 30 fois lesdites étapes. Une population d'oligonucléotides de séquences aléatoires est synthétisée au hasard par introduction simultanée des quatre nucléotides pour chaque position. Le mélange de candidats est mis en présence de la séquence cible dans des conditions qui imposent une compétition entre oligonucléotides pour l'association à celle-ci. Les complexes stables formés peuvent être isolés par chromatographie d'affinité, par électrophorèse en conditions non dénaturantes ou encore par rétention sur filtre de nitro-cellulose. La séquence cible alors éliminée et les candidats sélectionnés au cours d'un premier cycle peuvent être amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR) à l'aide de Taq polymérase commerciale. Une seconde génération de candidats est alors à son tour soumise au même processus de sélectionamplification selon les mêmes conditions. Cette opération peut être répétée x fois (1 Dans un mode de réalisation particulier le procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats présentant de 5' en 3': - une séquence correspondant à un premier site de restriction - un premier fragment de séquences complémentaires d'une partie d'un fragment simple brin à structure linéaire de la séquence cible - un second fragment de séquences aléatoires, et - une séquence correspondant à un deuxième site de restriction. b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, et d'un oligonucléotide dit sélecteur, ledit oligonucléotide sélecteur étant complémentaire à une partie dudit premier fragment, et les oligonucléotides candidats et sélecteurs étant en excès par rapport à la séquence cible, c) on soumet l'échantillon d'acides nucléiques obtenus à l'étape b) à une étape de digestion par une enzyme ayant pour substrat le complexe d'hybridation formé par l'oligonucléotide sélecteur et la partie dudit premier brin dont il est complémentaire, de sorte que les candidats ayant une affinité pour la séquence cible restent intacts et les autres après association au sélecteur sont coupés, d) on ajoute des amorces 1 et 2 complémentaires respectivement des extrémités 3' et 5' des oligonucléotides candidats, lesdites extrémités correspondant auxdits premier et deuxième sites de restriction, e) on effectue une amplification enzymatique de l'ADN de l'échantillon, f) on réitère éventuellement les étapes b) à e) plusieurs fois, notamment de 1 à 30 fois, et g) on isole une oligonucléotide parmi ceux obtenus à l'étape f). On peut identifier l'oîigonucléotide par clonage et séquençage. Ce procédé présente l'avantage d'éviter une étape d'isolation par séparation des oligonucléotides obtenus après chaque cycle de sélection/amplification des étapes b) à e). D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de l'exemple détaillé de réalisation qui va suivre, relatif à la reconnaissance d'une épingle à cheveux Py-Pu. La figure 1 représente les séquences du fragment d'acide nucléique cible, des oligonucléotides candidats, de l'oligonucîéotide sélecteur, des amorces 1 et 2 et de 3 oligonucléotides aptastrucs C1, C2 et C3 décrits dans l'exemple qui suit. Le site de liaison du sélecteur sur les oligonucléotides candidats est surligné et le site de fixation des candidats sur la cible est souligné. Le site SacI utilisé pour la sélection est encadré. La région variable des candidats est indiquée par .. .NNN... où N est A, C, G ouT. La figure 2 décrit le schéma du procédé de sélection amplification. La figure 3 représente un schéma hypothétique d'une possible structure double épingle à cheveux résultant de la formation d'un complexe entre une séquence cible en épingle à cheveux et un oligonucléotide Aptastruc selon la présente invention. La figure 4 représente un gel d'analyse par électrophorèse d'oligonucléotides candidats en absence de la séquence cible (voir 1 à 3) ou en présence de la séquence cible en épingle à cheveux (voir 4 à 6). La figure S représente des courbes de fusion de séquence cible en épingle à cheveux en l'absence (O) ou en présence de l'oîigonucîéotide Aptastruc C3 (o). Les concentrations en oligonucléotides étaient de 0,7 tjM dans un tampon Tris50 mM, HC1, pH 6 et 10 mM MgCl2. L'absorbance UV a été enregistrée à 260 nm en fonction de la température à partir de 15"C. On a appliqué le procédé de sélection selon la présente invention à une séquence cible longue d'une cinquantaine de nucléotides. Cette séquence est susceptible de se replier pour donner naissance à une épingle comportant: a) une boucle de 8 nucléotides et, b) une tige formée de 13 paires de bases appariées. Cette tige comporte sur la branche amont (5') une suite de 10 purines (Pu) et bien sûr, la branche aval (3') comprend 10 pyrimidines (Py). En outre, une série de six purines est située dans une partie en simple brin à la base de la tige. Cette région simple brin est proche de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide. Les six purines précèdent immédiatement la branche amont. On a donc une succession de 16 purines dont les 10 dernières sont appariées par liaisons hydrogènes classiques (Watson-Crick). Les candidats longs de 45 nucléotides, comportent donc une partie fixe du côté 5' comprenant un site de fixation pour l'amorce utilisée en PCR, un site de restriction pour l'enzyme Sac I, et dix pyrimidines dont la séquence est en partie complémentaire de six purines en simple brin. Cette partie fixe 5' est suivie d'une région de composition aléatoire de 16 bases puis d'une partie fixe en 3' comprenant le site de fixation pour la deuxième amorce PCR (Fig 1). La sélection des candidats décrite dans la figure 2, implique un oligonucléotide sélecteur. L'association d'un candidat et du sélecteur conduit à la formation d'un site de restriction. Ce site de restriction est placé de telle façon que les candidats fixés sur la structure cible ne peuvent s'associer au sélecteur et sont donc protégés de l'action de Sac I. A l'issue de la sélection les candidats non associés à la cible ont donc perdu le site de fixation de l'amorce 5' et ne sont donc pas amplifiés (Fig. 2). On démontre que la structure Py-Pu de la séquence cible peut former un complexe stable avec un oligopyrimidine long de 26 nucléotides. Cet oligopyrimidine forme, dans sa partie 5', 6 paires de bases Watson-Crick avec la région purine en simple brin de l'épingle Py-Pu de la séquence cible. Selon une hypothèse, la partie 3' de l'oligopyrimidine se replie pour interagir avec le double brin comportant 16 purines. L'ensemble constitue un complexe double épingle (schéma 1, Figure 3) qui peut bloquer l'alkylation chimique ou la digestion de l'épingle Py-Pu par l'enzyme Rsa I qui possède un site à proximité de la boucle. Pour générer des oligonucléotides Aptastrucs, dans un premier temps, on produit une population d'oligodésoxyribonucléotides synthétiques conventionnels longs de 45 nucléotides composés (de 5' vers 3'): a) d'une séquence comportant un site de clonage et de restriction et un site de fixation de la première amorce PCR b) des six pyrimidines complémentaires de la séquence purine en simple brin à la base de l'épingle Py-Pu, c) de quatre thymines constituant la boucle dans le complexe double épingle, d) d'une série de seize nucléotides aléatoires, un mélange des quatre synthons étant introduit systématiquement à chacune de ces seize positions, et e) d'une séquence comportant sites de restriction et de clonage et le site de fixation de la seconde amorce PCR (schéma 2, Figure 3). On dispose en outre de deux amorces 1 et 2, complémentaires respectivement des extrémités des "candidats" et d'un sélecteur. Cet oligonucléotide sélecteur forme, après fixation à la partie complémentaire des candidats, un site de restriction pour l'enzyme Sac I. Le site de fixation du sélecteur est placé de telle sorte qu'il soit inaccessible lorsqu'un oligonucléotide candidat est hybridé à la structure Py-Pu. Des candidats Aptastrucs (c'est-à-dire une population de 416 = 4,29.109 oligonucléotides) ont été testés sur la structure Py-Pu, en présence du sélecteur. Ce mélange est ensuite soumis à l'action de Sac I. Les candidats ayant une affinité pour la structure Py-Pu re structure pour les complexes faisant intervenir des interactions connues. Les oligonucléotides C1, C2 et C3 de 26 nucléotides composés du motif fixe de 10 pyrimidines suivis du côté 3' de l'une des régions variables de 16 nucléotides déterminées ci-dessus ont été synthétisés (Figure 1). Leur interaction avec la structure cible a été suivie par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes (Figure 3) et par courbe de dénaturation thermique. Les courbes de transition de la figure 4 indiquent un hyperchromisme associé à la destruction du complexe C3cible par élévation de la température. Une expérience analogue a été réalisée avec l'hexamère 5'CTCCCT. Aucune transition ne peut être décelée dans la région (t=35"C) où une variation d'absorbance a été détectée avec C3, indiquant que dans ce dernier cas l'hyperchromisme observé n'est pas dû à la seule rupture des six paires de bases Watson-Crick. Les deux méthodes électrophorèse et absorption UV, montrent que les trois candidats forment des complexes avec l'épingle cible. Les oligomères C 1,C2 et C3 déplacent l'hexamètre complémentaire de la région en simple brin à la base de l'épingle. Des expériences de compétition ont montré que les complexes entre les candidats C1, C2 et C3 et la cible font intervenir des interactions plus fortes que les six paires pyrimidine-purines adjacentes à la tige de l'épingle. Les trois candidats baptisés C1, C2 et C3 ont une mobilité électrophorétique ralentie, sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, lorsqu'ils sont mis en présence de la cible Py-Pu, indiquant la formation de complexes. 2. Blocage d'une enzyme de restriction Un site de restriction (Rsa 1) a été placé dans la tige de l'épingle Py-Pu, à proximité immédiate de la boucle (schéma 2, Figure 3). Les trois candidats Cs, C2 et C3, empêchent l'action de Rsa 1 (Ces oligonucléotides n'ont aucun effet sur l'activité de l'enzyme sur d'autres sites). 3. Matériels et méthodes 3.1. Oligonucléotides et enzymes Les oligodésoxynucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur automatisé, Millipore 7500 mettant en oeuvre la chimie de synthèse au phophoramidite. On a préparé une population d'oligonucléotides "candidats" en introduisant dans le synthétiseur un mélange stoechiométrique des quatre synthons (A, T, G et C) à chacune des positions de la séquence. Tous les oligonucléotides ont été purifiés en une étape par HPLC sur colonne à phase inverse éluée avec un gradient d'acétonitrile 050 % dans un tampon d'acétate d'amonium 100 mM pH 7. Les oligonucléotides ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide/urée, après marquage à l'extrémité 5' avec des [32P] y ATP (1 î0TBq/mmoîe, NEN) et la polynucléotide kinase de T4, selon les protocoles conventionnels. La polynucléotide kinase et l'enzyme de restriction SacI ont été obtenus chez Promega. La Taq polymérase a été obtenue chez Stehelin et Cie. 3.2. Analyse des hybrides L'association entre la cible en épingle à cheveux et les candidats sélectionnés a été suivie et visualisée par électrophorèse sur gel dans des conditions non dénaturantes. La population d'oligonucléotides "candidats" marqués à l'extrémité 5' a été mélangée avec un excès de séquences cibles (en excès d'un facteur 10) dans un tampon acétate, Tris 50 mM pH 6 contenant 10 mM de MgCl2. Ils ont été chargés sur un gel de polyacrylamide 15 % dans le même tampon et exposés à 12 mA pendant 16 heures à 4" C. Les complexes d'oligonucléotides ont également été caractérisés par enregistrement des courbes de fusion suivies par absorption UV. Un mélange candidats/cibles (1/1) (0,7 zM chacun) dans un tampon Tris 50 mM HCl pH 6 contenant 10 mM MgCl2, placés dans une cellule de quartz, de trajet optique 1 cm. L'ensemble est disposé dans un portoir thermostaté piloté par un contrôleur HUBER. La température est élevée de 0,5 C par minute pendant que l'absorbance est enregistrée à 260 nm. 3.3. Sélection Les séquences des oligonucléotides cibles, candidats et sélecteurs sont données sur la figure 1. Le mélange contenant 33 nM de cible et 16, 6 rM de sélecteur et candidats est chauffé pendant 5 minutes à 75"C dans un tampon 50mM Tris acétate pH 6 contenant 10 mM MgCl2. Le mélange d'oligonucléotides est ensuite ramené à température ambiante et mis sur la glace pendant 30 minutes au moins. Après adition de 20 unités d'enzyme SacI les échantillons sont incubés pendant 20 heures à 21"C. Après digestion, l'ADN est mis à précipiter et redissous dans 10 pl d'H 20 pour ampification. L'ADN a été amplifié avec la Taq polymérase (0,25u) dans le tampon fournit avec l'enzyme dans 50 ctl de mélange de réaction contenant 0,4 mM de chacun des quatres NTPs et 1 zM de chaque amorce. Après dénaturation (10 minutes à 95"C) l'enzyme est ajoutée et l'amplification est effectuée pendant 30 cycles (10 secondes à 95"C, 30 secondes réhybridation à 40"C, 30 secondes à 72"C). Le mélange amplifié est précipité par 60 Fl d'éthanol suivant l'addition de 15 crl d'acétate ammonium 10 M. Le précipité est récupéré par centrifuguation sur un micro-centrifugeur, puis lavé avec de l'éthanol 70 % et dissous dans de l'eau pour une deuxième étape d'amplification. Ceci est effectué dans les mêmes conditions, excepté que l'on utilise alors uniquement l'amorce 1. 3.4. Clonage et séquençage Après quatre cycles de sélection, l'ADN généré par amplification en présence des deux amorces 1 et 2, a été digéré SacI et NdeII, puis cloné dans le plasmide pUC19, digéré par SacI et BamHI. NdeII et BamHI génèrent des sites compatibles pour la ligation. Des colonies blanches ont été sélectionnées, le plasmide a été isolé, les inserts séquencés en utilisant un kit basé sur la méthode de terminaison de chaines dideoxy. 4. Résultats La structure cible utilisée ici était une épingle à cheveux d'ADN représentée sur la figure 1 comportant une boucle de 8 nucléotides et une tige formée de 13 paires de bases. Cette tige est flanquée sur la branche amont 5' d'une suite de 10 bases comprenant une séquence de 6 purines adjacentes à la tige. Les candidats longs de 45 nucléotides comprenaient de 5' à 3': 1. Un site de liaison d'amorce 5' pour la réaction PCR et un site de restriction Sac! 2. Six pyrimidines complémentaires de la séquence purine en simple brin à la base de l'épingle à cheveux; 3. Quatre thymines; 4. Seize nucléotides aléatoires, un mélange de quatre synthons étant introduit systématiquement à chacune de seize positions 5. Un site de liaison de l'amorce 3', contenant un site de clonage NdeII (Figure 1). La synthèse de la population de candidats a été effectuée à une échelle de 0.2 jimole. En conséquence, on s'attend à voir apparaitre 2,8 x 107 fois chacune des 4,29 x 109 séquences possibles. 4.1. Sélection d'oligonucléotides Aptastruc La sélection des candidats oligonucléotides présentant une affinité pour la cible implique l'utilisation d'un oligonucléotide sélecteur qui après liaison à un candidat génère un site de restriction Saci. La séquence 5' GAGCTC reconnue par l'enzyme est située dans la séquence de l'oligonucléotide candidat à une telle position que l'association de la cible avec le candidat empêche la liaison du sélecteur et le clivage de la partie 5' terminale du candidat par SacI. Comme la région correspond au site de liaison d'une des amorces utilisées pour la réaction PCR, seuls les oligonucléotides candidats protégés de la digestion par Sac I, c'est-à-dire, liés à la cible, sont disponibles pour l'amplification (Figure 2). Les candidats sélectionnés par digestion SacI, sont ensuite amplifiés en deux étapes (voir Matériel et Méthode ci-dessus) pour générer une population de candidats enrichis en séquences reconnaissant la structure cible. Ce mélange est utilisé pour un deuxième cycle de sélection. Quatre cycles identiques de sélection sont effectués successivement à la fin desquels les candidats sélectionnés sont clonés dans le plasmide pUC19. L'ADN est extrait des clones recombinants et les inserts sont séquencés. Des séquences de la région de 16 bases correspondant aux fragments aléatoires de trois candidats sont données ci-dessous 5' TAC GAA CGT AGG CTA G 5' ACC ATT GTG TGG GGT G 5' GAA CTA TAA CGT GGC A 4.2. Liaisons des candidats sélectionnés à la cible Trois oligonucléotides 26 mère C1, C2 et C3 des séquences identifiées ci-dessus ont été synthétisés chimiquement sur un synthétiseur automatique, et on a étudié leur faculté de se lier à la cible d'ADN (Figure 1). Ces oligonucléotides ont été conçus par liaison des séquences 16-mère sélectionnées par le biais du motif conservé 5' CTCCCTTTTT capable de former six paires de bases avec l'extrémité 3' de la cible. Comme montré sur la Figure 3, chacun des trois candidats donnait lieu à une bande de mobilité réduite sur gel de polyacrylamide après avoir été mélangé à la séquence cible et soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions non dénaturantes. Cette mobilité réduite indique la formation d'hybrides stables candidats/cibles dans des conditions de température (4"C) et ionique (50 mM Tris, 10 mM Mg2+) utiisés pour ces expériences. On a également effectué l'analyse des courbes de fusion de ces complexes par absorption UV. La séquence cible seule présente une température de demi hybridation (Tm) d'environ 72"C correspondant à la structure en épingle à cheveux non repliée. En présence de l'un des candidats C1, C2 ou C3, la courbe de fusion présentait encore une température de transition élevée. En outre, la variation de l'absorbance à des températures inférieures, indique un comportement différent de celui observé avec la cible seule. En particulier une zone de transition large avec un point médiant autour de 30"C est observé avec C3 indiquant la dissociation d'un complexe de coopérativité limité (Figure 5). Les propriétés observées des complexes formés avec C1, C2 ou C3 n'étaient pas seulement dûes à la formation de six paires de bases avec la région mono brin 3' de la tige de la cible. On a effectué les expériences de compétition suivantes. Un excès de 10 fois de I'hexamère 5' CTCCCT par rapport à C2 était nécessaire pour réduire de 50 % la quantité de complexes C2-cible. 4.3. Effet des candidats Aptastrucs sur la traduction L'épingle Py-Pu décrite sur la figure 1 a été utilisée pour générer une cible ARN pour les aptastrucs sélectionnés selon le processus préalablement décrit. En fait, il s'agit d'un dérivé délété des trois paires de bases CAT/GTA à proximité de la boucle. Cette épingle Py-Pa/ a été insérée dans la région "polylinker" du vecteur pGEM-luc (PROMEGA), c'est-à-dire en aval du promoteur SD6 et de la séquence codant pour la luciférase. Cette construction in vitro et les messages ainsi obtenus ont été exprimés en extrait acellulaire (germes de blé). L'activité luciférase a été suivie par la luminométrie en absence et en présence d'oligonucléotides aptastrucs. Les premiers résultats montrent que le candidat C1 produit une inhibition de l'activité luciférase. Cet effet est spécifique : aucun effet de C1 n'est détecté sur l'expression de la luciférase exprimée à partir du plasmide parent pGEM-luc ne portant pas l'épingle cible de C1. En outre, il faut noter que l'effet sur pGEM-luc Py-Pu a est plus important que celui produit par des 26 mère susceptibles de faire un complexe double épingle via des interactions canoniques décrites dans Brossalina et Toulmé, 1993, J. Am. Chem. Soc., et démontre donc l'intérêt des oligonucléotides aptastrucs comme inhibiteur spécifique de l'expression des gènes. REVENDICATIONS 1. Oligonucléotide Aptastruc caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'acide nucléique ADN ou ARN à structure non linéaire. 2. Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué, au moins en partie, d'une séquence de bases nucléiques qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible et qu'il forme un complexe avec ladite séquence cible. 3. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'ADN ou d'ARN comportant un fragment simple brin à structure linéaire adjacent à une structure non linéaire, et il comporte une séquence complémentaire d'une partie dudit fragment simple brin linéaire de la cible et le reste de la séquence de l'oligonucléotide ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible. 4. Oligonucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il forme un complexe avec la séquence cible plus stable que le complexe formé par un oligonucléotide constitué par la seule séquence complémentaire dudit fragment simple brin à structure linéaire, avec la même séquence cible. 5. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence cible présente une structure auto-appariée en épingle à cheveux prolongée par une région simple brin non appariée et la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc est pour partie complémentaire de la séquence de ladite région simple brin. 6. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte de 15 à 35 nucléotides. 7. Oligonucléotide selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte un fragment de 5 à 10 nucléotides de séquences complémentaires à une région simple brin de la séquence cible, couplé à un fragment de 10 à 25 nucléotides non complémentaires de la séquence primaire de la séquence cible. 8. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence cible est une séquence à structure non linéaire d'un acide nucléique ADN ou ARN qui commande l'expression d'un gène appliqué dans une pathologie humaine ou animale. 9. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il permet le blocage du développement d'un virus, d'une bactérie ou d'un parasite. 10. A titre de médicament un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Procédé de préparation par sélection in vitro d'un oligonucléotide selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que: a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats de séquences aléatoires, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, les candidats étant en excès par rapport à la séquence cible, et c) on isole les oligonucléotides qui forment un complexe stable avec la séquence cible, et d) on amplifie les échantillons d'acide nucléique obtenu à l'étape c), e) on réitère plusieurs fois les étapes b) et c), en particulier de 1 à 30 fois, 12. Procédé de préparation d'un oligonucléotide selon la revendication 11, caractérisé en ce que a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats présentant de 5' en 3': - une séquence correspondant à un premier site de restriction - un premier fragment de séquences complémentaires d'une partie d'un fragment simple brin à structure linéaire de la séquence cible - un second fragment de séquences aléatoires, et - une séquence correspondant à un deuxième site de restriction, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, et d'un oligonucléotide sélecteur, ledit oligonucléotide sélecteur étant complémentaire à une partie dudit premier fragment, les oligonucléotides candidats et sélecteurs étant en excès par rapport à la cible. c) on soumet l'échantillon d'acide nucléique obtenu à l'étape b) à une étape de digestion par une enzyme ayant pour substrat le complexe d'hybridation formé par l'oîigonucîéotide sélecteur et la partie dudit premier brin dont il est complémentaire, de sorte que les candidats ayant une affinité pour la séquence cible restent intacts et les autres après association au sélecteur sont coupés. d) on ajoute des amorces 1 et 2 complémentaires respectivement des extrémités 3' et 5' des oligonucléotides candidats, lesdites extrémités correspondant auxdits premier et deuxième sites de restriction. e) on effectue une amplification enzymatique de l'ADN de l'échantillon. f) on réitère éventuellement les étapes b) à e) plusieurs fois, notamment de 1 à 30 fois, et g) on isole un oligonucléotide parmi ceux obtenus à l'étape f).