FR 2723818 A1 19960301 FR 9410505 A 19940825 COMPOSITION DE PERFUSION POUR AMELIORER LA CONSERVATION D'ORGANES VIVANTS. Les transplantations d'organes chez l'homme (rein, coeur, poumon, foie) sont maintenant des techniques chirurgicales bien maîtrisées, ne présentant que très peu d'échecs opératoires. Les principaux problèmes postopératoires rencontrés découlent d'une mauvaise conservations des greffons. Les solutions et les techniques de conservations d'organes sont par contre restées très archaïques. Au cours du prélèvement, les organes sont habituellement perfusés sur le donneur, au moyen d'un soluté de conservation à 4"C, rapidement explantés, et conservés dans de la glace à 4"C jusqu'au moment de la transplantation. Les greffons ne peuvent être conservés que pendant un temps très limité n'excédant pas quelques heures. Ils subissent néanmoins des dégradations métaboliques et structurales importantes. Quel que soit l'organe à transplanter, les objectifs de conservation à atteindre sont identiques et peuvent être exposés comme suit: - II faut avant tout assurer une bonne viabilité cellulaire de l'organe pour éviter les éventuels problèmes rencontrés après la transplantation. Dans le cas particulier de la transplantation rénale, une mauvaise conservation du greffon provoque des tubulopathies. Ceci va conduire le patient à quatre semaines de dialyses postopératoires - Il est souhaitable de conserver les réserves énergétiques du greffon pendant la conservation pour s'assurer de la bonne reprise de son activité métabolique au moment de la transplantation. - La conservation doit aussi prévenir l'oedème intracellulaire et interstitiel qui s'installe inévitablement pendant les longues périodes d'ischémie. Un oedème trop important ( > 40%) va provoquer une altération du cytosquelette, et de la membrane plasmique, pouvant aboutir à des nécroses localisées. - Dans le cas de la conservation cardiaque, il est nécessaire d'arrêter la contraction cardiaque (cardioplégie) au moment du prélèvement et pendant la conservation jusqu'à la transplantation. Pour tenter d'atteindre ces objectifs, les moyens connus à ce jour sont répartis selon deux grandes familles de solutions de conservation d'organes, à savoir: * les solutions de type extra cellulaires (potassium 16 à 20mM) utilisées pour la cardioplégie et la conservation cardiaque, * les solutions de type intracellulaires (potassium 120 mM), qui sont plutôt employées pour la conservation hépatique ou rénale. - Le D-glucose, le pyruvate ou les acétates sont habituellement utilisés comme substrat, pour éviter une trop grande perte des réserves énergétiques du greffon. De plus, certaines solutions contiennent aussi de l'insuline pour favoriser la pénétration du glucose à l'intérieur des cellules. - Le meilleur moyen pour lutter efficacement contre l'oedème est l'utilisation de colloïdes non diffusibles. Ils vont exercer une pression oncotique qui va favoriser l'appel d'eau du milieu intra-cellulaire vers l'espace extra cellulaire. L'albumine sérique est utilisée à cet effet, mais aussi l'hydroxyéthyl starch (HES) qui fait l'originalité de la solution UNIVERSITY OF WISCONSIN (UW) - Pour induire l'arrêt de la contraction du coeur (cardioplégie), on utilise actuellement des concentrations élevées en potassium. Ceci provoque un arrêt électrique des cellules contractiles. Or le potassium utilisé à forte concentration va aussi provoquer une altération de l'endotelium du muscle lisse vasculaire, et des myocytes du fait de la surchage calcique induite par la dépolarisation. Actuellement, les solutions de conservations utilisées, ne permettent qu'une préservation de courte durée. En effet, le temps d'ischémie n'excède jamais 6 à 7 heures pour le coeur, le poumon ou pour le foie, 48 à 72 heures pour rein (mais au prix d'une tubulopathie ischémique). Passé ces délais, I'organe a subi trop de dommages pour pouvoir être implanté chez le receveur. II serait pourtant souhaitable de pouvoir augmenter le temps de conservation afin d'effectuer tous les tests d'histocompabilité entre le donneur et le receveur. Ceci permettrait d'éviter un certain nombre de rejet aigu de greffe. L'invention s'est fixée pour but de remédier à ces inconvénients de manière simple, sûre, efficace et rationnelle. Le problème que se propose de résoudre l'invention est de pouvoir conserver les organes dans de parfaites conditions de viabilité cellulaire, pendant des temps beaucoup plus long tout en ayant pour objectifs de - lutter le plus efficacement possible contre l'oedème cellulaire - diminuer la fréquence des rejets de greffe. - induire une cardioplégie qui ne serait pas délétère pour le tissu cardiaque. Pour résoudre un tel problème, il a été conçu et mis au point une composition de perfusion pour améliorer la conservation d'organes vivants dans l'espoir de prolonger le temps d'ischémie et d'améliorer la viabilité des tissus. Cette composition a aussi pour but de perfuser des organes ayant souffert (et habituellement récusés pour la transplantation) afin de pouvoir les utiliser après récupération de leur fonction. Un tel problème est résolu par la combinaison de deux molécules, le 2,3 Butanédione 2-Monoxime (BDM ou DAM) et le polyéthylène Glycol de haut poids moléculaire de 20000 daltons (PEG20M). Ces deux composés sont incorporés dans une solution cristalloïde classique de type Krebs (toute solution cristalloïde de type extra ou intra-cellulaire peut bénéficier de cet apport). L'invention sera mieux comprise dans la suite de la description et à l'aide des dessins annexés, dans lesquels: La figure 1 montre l'évolution de la phosphocréatine, en fonction des molécules employée dans la solution de conservation. La figure 2 montre, à l'aide de courbes, les taux de phosphocréatines représentant la réserve énergétique du myocarde, en fonction de la composition de la solution de conservation. La figure 3 montre l'état de conservation du myocarde, en fonction de la composition de la solution de conservation. Le BDM est une oxime nucléophile, ayant un effet phosphataselike. II était utilisé chez l'homme au cours d'intoxication par les organophosphorés en déphosphorylant l'acétylcholine estérase. II a aussi un effet inotrope négatif, dose dépendant, et surtout totalement réversible au lavage. Pour inhiber la contraction cardiaque, le BDM agit à deux principaux niveaux ; il inhibe le rélargage du calcium par le réticulum sarcoplasmique, et il diminue l'affinité de l'ATPase myofibrillaire au calcium. Si on l'utilise à des concentrations de 30mM environ, il exerce une protection myocardique en régulant les flux calciques, et en empêchant les contractures du myocarde. II a été démontré depuis peu que le BDM diminue aussi le métabolisme basal. Selon l'invention, cette molécule est utilisée pour induire la cardioplégie par arrêt métabolique, en remplacement des fortes concentrations en potassium délétères pour l'organe et les vaisseaux. Le PEG20M est une macromolécule non diffusible, qui va exercer une pression oncotique. Lors de la perfusion d'une solution contenant du PEG20M, il va y avoir un appel d'eau du milieu intracellulaire, vers le milieu extra-cellulaire. Ceci permet de lutter efficacement contre l'oedème qui survient pendant la conservation. Le PEG20M a aussi un effet d'immunotolérance et va permettre une diminution de la fréquence des rejets de greffe aigus. Ce phénomène s'explique de deux manières: - le PEG 20 M va pouvoir se fixer sur les membranes cellulaires et, par son encombrement, masquer des sites antigéniques pendant les premiers jours suivant la transplantation. - le PEG 20 M va aussi permettre un lavage efficace des cellules dendritiques. La composition de la solution de conservation s'établit comme suit: Le BDM est utilisé à des concentrations allant de 5mM à 50 mM (recommandé de 30mM). Le PEG de haut poids moléculaire (allant de 10000 daltons à 50000 datons, recommandé 20000 daltons) est employé à des concentrations allant de 5 gli à 70 gn (recommandé 25 glui). II est préférable d'utiliser du PEG20M qui ne soit pas synthétisé à partir de deux chaînes de 10 M, pour éviter la contamination d'impuretés qui devraient être éliminées avant son utilisation. Les rapports de poids (en grammes) entre le BDM et le PEG (BDM/PEG), utilisables pour la solution de conservation sont 1,011 à 7,210 x 10-3 (si l'on se réfère aux plages de concentration recommandées). II est préférable d'utiliser ces deux molécules dans une plage de rapport allant de 0,20 à 0,06. La composition de la solution cristalloïde recommandée contenant le BDM et le PEG est la suivante: B. D. M. (de 5 à 50mM) et de préférence 30mM PEG20M (de 5 à 70gon) et de préférence 25gA NaCI (de 50 à 170 mM) et de préférence 118mM KCI (de 3 à 140mM) et de préférence 6mM CaC12 (de 0 à 6mM) et de préférence 1,75mM MgC12,6H20 (de 0 à 50mM) et de préférence 1,20mM NaHCO3 (de0à70mM) et de préférence 25 mM E.G.T.A. (de 0 à 5mM) et de préférence 0,5 mM Glucose (de 0 à 200mM) et de préférence 1îmM La solution est administrée par les gros troncs artériels des organes sur un sujet en état de mort cérébrale, ou directement en perfusion des organes à conserver après leur prélèvement. Pour tirer le meilleur parti de la solution de conservation, il est souhaitable de l'utiliser oxygénée au moyen de Carbogène (95 %O2; 5%C02) ou d'oxygène pur, lors du prélèvement de l'organe, et pendant toute la conservation si des techniques de flushs ou de micro perfusion sont utilisées. Le Carbogène assure un apport en oxygène à l'organe et permet d'améliorer le pouvoir tampon du bicarbonate. Mise au point de la composition de la solution de conservation Dans un premier temps l'efficacité des deux molécules (BDM et PEG) qui font l'originalité de la composition de conservation, ont été testés séparémment. Des coeurs de rats ont été perfusés pendant 50 minutes en continu à l'aide de différentes solutions. - Krebs - Krebs + PEG20M 25gA - Krebs + BDM 30mM - Krebs + BDM 30mM + PEG20M 25gA. L'évolution de la phosphocréatine (PCr) (réserve énergétique exprimée en %) de ces coeurs a été suivie par Résonance Magnétique Nucléaire du Phosphore 31 (RMN 31P). On renvoie aux courbes de la figure 1. Le PEG20M permet une meilleure conservation des réserves énergétiques après cinquante minutes de perfusion par rapport aux coeurs perfusés en Krebs. Le PEG stabilise la préparation en luttant contre l'oedème intracellulaire et en stabilisant la structure membranaire. Le BDM augmente les taux de phosphocréatine par arrêt de la contraction cardiaque et diminution du métabolisme basal. L'association de ces deux molécules améliore la conservation de la PCr grâce aux effets combinés du BDM et du PEG déjà décrit. Comoaraison entre la comDosition de conservation selon l'invention et des solutés déià existants: La composition de conservation a été comparée à deux autres solutés : I'un, de type extra cellulaire le Plégisol, I'autre, de type intracellulaire, le Wisconsin. L' étude a porté sur la conservation de coeurs de rat. Deux protocoles ont été effectués pour démontrer l'efficacité de la composition de conservation. Toxicité des solutions: Des coeurs ont été perfusés à l'aide de différentes solutions de conservation, pendant cinquante minutes à 37"C. Pour évaluer la toxicité des solutés utilisés, nous avons suivi les taux de phosphocréatine (PCr exprimée en %) par RMN 31 P, qui représentent la réserve énergétique du myocarde. On renvoie aux courbes de la figure2. On voit sur ces courbes que les réserves énergétiques du myocarde en perfusion continue sont conservés si le coeur est perfusé avec la composition de conservation BDM-PEG. Par contre la perfusion avec du Plegisol ou du Wisonsin entraîne une perte très rapide des taux de posphocréatine Conservation de 12 heures à 4 C: Des coeurs ont été arrêtés à l'aide de différentes solutions de conservation (BDM PEG, Plégisol, Wisconsin) puis conservés pendant 12 heures à 4"C. Après cette période d'ischémie, les coeurs sont perfusés avec du Krebs oxygéné à 37"C pendant 90 minutes. L'état de conservation du myocarde est apprécié en comparant les pourcentages de récupération de la phosphocréatine (PCr) et de la fonction contractile (triple produit : pression développée x fréquence cardiaque x temps de contraction). On renvoie aux graphiques de la figure 3. La composition de conservation contenant du BDM et du PEG20M permet une meilleure récupération de la fonction contractile et des réserves énergétiques après une conservation de 12 heures à 4"C. A noter que la composition telle que définie et revendiquée est ou peut être oxygenée par le carbogène (95% 02, 5% C02) ou par l'oxygène pur. Les avantages ressortent bien de la description. REVENDICATIONS -1- Composition de perfusion pour améliorer la conservation d'organes vivants (destinés à être transplantés) caractérisée en ce qu'elle contient dans une solution cristalloïde au moins du 2,3-butanedione 2-monoxime (BDM), et du polyéthylène glycol (PEG) de poids moléculaire d'au moins dix mille (10.000) daltons. -2- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la solution cristalloïde est du type Krebs. -3- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le PEG a un poids moléculaire compris entre 10 000 et 50 000 daltons, de préférence voisin de 20 000 daltons. -4- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le PEG est utilisé à une concentration de 5 à 70 gli de préférence voisine de 25 gon. -5 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les rapports en poids entre BDM et PEG sont 1,011 à 7,210 x 10-3 et, de préférence, dans une plage de rapport allant de 0,20 à 0,06. -6- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le BDM est utilisé à des concentrations comprises entre 5mM et 50mM, de préférence 30mM. -7- Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composition de la solution cristalloïde recommandée contenant le BDM et le PEG est la suivante: B. D.M. (de 5 à 50mM) et de préférence 30mM PEG20M (de 5 à 70g/l) et de préférence 25g11 NaCI (de 50 à 170 mM) et de préférence 118mM KCI (de 3 à 140mM) et de préférence 6mM CaCl2 (de 0 à 6mM) et de préférence 1,75mM MgCl2,6H2O (de 0 à 50mM) et de préférence 1,20mM NaHCO3 (de 0 à 70mM) et de préférence 25 mM E.G.T.A. (de 0 à 5mM) et de préférence 0,5 mM Glucose (de 0 à 200mM) et de préférence 1 1 mM -8- Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution est ou peut être oxygenée par le carbogène (95% 02, 5% C) ou par l'oxygène pur.