FR 2711671 A1 19950505 FR 9312655 A 19931022 PROCIDI DZ DETECTION ET DZ QUANTIFICATION D'UNE SéQUENCE NUCLMOTIDIQUE DANS UNE POPULATION CELLULAIRE. La présente invention est relative à un procédé de détection, de quantification et de suivi de la présence d'une séquence nucléotidique dans une population cellulaire par amplification PCR "in situ" (ou intracellulaire) associée le cas échéant à un marquage d'antigènes membranaires, les séquences amplifiées et l'antigène membranaire étant l'un et l'autre marqués de telle façon que leur détection simultanée par microscopie confocale ou par cytofluorométrie de flux puisse être réalisée. Depuis sa première description en octobre 1985, la réaction de polymérase en chaine (polymerase chain reaction - PCR) inventée par K. Mullis (K.B. Mullis, U.S. Patent 4,683,195, July 1987; U.S. Patent 4,683,202, July 1987) [Saiki et al. 1985; Mullis et al. 1986; Mullis and Faloona 1987] a été très largement utilisée par de très nombreuses équipes scientifiques. Le nombre de publications mettant à profit cette technique est d'ailleurs encore sans cesse croissant, tant son champ d'application est vaste. Dans son principe, cette technique permet en effet, en utilisant un couple d'oligonucléotides (primers) spécifiques d'un segment de gène, d'amplifier une séquence d'ADN (de quelques centaines de paires de bases) interne à ces amorces. Des cycles répétés (25 & 40) de dénaturation thermique (940C), d'accrochage des amorces à leur séquence complémentaire (40-60 C), et d'extension (72'C) permettent d'obtenir une synthèse avec accumulation exponentielle de produits amplifiés de la séquence "cible". L'utilisation d'une ADN polymérase thermostable de Thermus apuaticus (Taq) a substantiellement accru la spécificité, la sensibilité de la réaction, ainsi que la taille des produits qu'il est possible d'amplifier [Saiki et al. 1988]. Elle a en outre permis de simplifier la méthode et de la rendre automatisable par l'intermédiaire de thermo-cycleurs. Les produits spécifiques d'amplification peuvent ensuite être identifiés en fonction de leur taille attendue (fonction de la localisation des amorces), soit par migration électrophorétique sur gel en présence de bromure d'éthidium puis hybridés i l'aide d'une sonde spécifique marquée après transfert sur membrane de nylon (Southern blot), soit directement identifiés sur un séquenceur automatique lorsqu'ils sont marqués par un fluorochrome. La PCR trouve actuellement des applications très variées dans tous les domaines de la biologie moléculaire, a des fins diagnostique ou de recherche, qu'il s'agisse de détection de segments de gène (ADN ou ARNm), ou de clonage et séquençage tennis et al. 1990, Erlich et al. 1991). Les principales limitations de la PCR standard sont, d'une part de ne pas pouvoir quantifier avec précision le nombre de copies initiales du segment de gène d'intérêt, d'autre part de ne pas pouvoir associer le résultat de l'amplification au nombre de cellules possédant ou exprimant le gène, ni à un type cellulaire donné caractérisable sur des critères morphologiques ou phénotypiques (la PCR étant effectuée sur les acides nucléiques extraits de plusieurs milliers voire millions de cellules). Le premier de ces écueils est actuellement surmonté par le développement des techniques de PCR quantitatives, qui sont particulièrement utiles pour l'étude du niveau d'expression des ARNm [Wang et al; 1989; Gilliland et al. 1990]. Le deuxième est également en voie d'être levé par la mise au point des techniques de PCR intracellulaire ou "in situ". La PCR in situ a été développée récemment et est appliquée essentiellement au domaine de la détection de cellules infectées par un virus. La cellule doit, dans un premier temps, être perméabilisée de façon à ce que tous les réactifs nécessaires & l'amplification puissent y diffuser et fixée afin qu'elle conserve une morphologie et une structure interne capables de résister en particulier aux cycles de variations thermiques. Puis, la réaction de PCR proprement dite peut alors être réalisée, généralement dans des cellules déposées et fixées sur une lame, laquelle lame était placée sur le bloc chauffant du thermo-cycleur, soit directement, soit i partir de coupes tissulaires. L'identification des segments amplifiés ne peut être faite par les méthodes habituelles de la PCR, puisque les produits d'amplification sont retenus à l'intérieur de compartiments intracellulaires, mais implique une étape de détection. Celle-ci est généralement effectuée par la technique d'hybridation "in situ" (HIS) qui consiste å incuber, dans des conditions d'hybridation, une sonde marquée spécifique de la séquence amplifiée. Tous les modes de marquage de la sonde peuvent être envisagés (radioactif, fluorescent ou enzymatique). La détection des cellules positives à l'intérieur desquelles l'amplification a pu avoir lieu et être révélée s'effectue par examen microscopique. Les premieres descriptions de détection de cellules infectées par un virus par PCR in situ concernent la détection intracellulaire de 1'ADN du lentivirus visna å partir de cellules en culture (Haase et al., 1990) et du papillomavirus à partir de coupes intraépithéliales de lésions cervicales infectées (Nuovo et al., 1991; 1992 et demande de brevet EP-524,808). Rapidement, le domaine de l'infection aux VIH a été exploré dans le but d'obtenir une meilleure appréciation de la charge virale circulante ou de celle des organes lymphoïdes (Bagasra et al., 1992, 1993; Embretson et al., 1993a, b; Pantaleo et al., 1993). I1 a ainsi été montré que le pourcentage des cellules infectées circulantes est en fait supérieur & celui précédemment observé par d'autres techniques (notamment HIS), et que le principal réservoir viral intracellulaire est localisé dans les organes lymphoïdes (notamment rate et ganglions), même au stade précoce de la maladie. D'une façon similaire, la distribution anatomique des cellules infectées a pu être étudiée et leur caractérisation phénotypique a pu être appréciée par combinaison avec des techniques d'immuno-histochimie (Embretson et al., 1993; Nuovo et al., 1993). Toutes ces études ont été conduites sur lame, et de ce fait, l'analyse des résultats ne permet qu'une semi-quantification du pourcentage de cellules positives. L'inconvénient majeur de ces approches est de rendre difficilement exploitables les techniques de PCR "in situ" pour le suivi routinier des patients VIH+, et notamment dans le cadre de l'évaluation de l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales. Une seule publication très récente tente de montrer qu'il est possible d'effectuer une quantification fiable sur des cellules maintenues en suspension durant les étapes de PCR "in situ", gr ce à l'utilisation d'une sonde révélée par un conjugué fluorescent, les cellules positives étant alors détectées par passage en cytofluorométrie de flux (Patterson et al., 1993). Les principaux écueils de la PCR "in situ" tiennent aux difficultés liées & la multiplicité des étapes réactionnelles, à la fin desquelles la morphologie et la structure cellulaire sont souvent assez profondément altérées avec possibilité d'artefacts liés à une fuite des produits amplifiés hors dés cellules. La positivité ne peut souvent pas être discriminée au niveau des zones nucléaire et cytoplasmique. Enfin, l'appréciation objective du seuil de détection et de la spécificité reste difficile, imposant de rigoureux contrôles. L'expression des résultats s'effectue comme pour 1'HIS seule, après examen des lames, et leur validité doit être confirmée par la présentation de documents photographiques seuls capables d'objectiver les caractéristiques morphologiques et topographiques des cellules positives. Toutefois, une quantification fiable de celles-ci reste délicate dans la mesure où il est difficile d'examiner un très grand nombre de cellules, ce qui est d'autant plus indispensable que le pourcentage de positivité attendue est faible. Une modification importante aux techniques de PCR "in situ" a été introduite grâce au marquage direct, lors de la PCR intracellulaire, des produits d'amplification par des fluorochromes préalablement liés aux amorces nucléotidiques, ce qui présente l'avantage de supprimer les étapes délicates d'HIS et de révélation par des conjugués. Ceci permet en outre, d'une part de visualiser directement les produits marqués intracellulaires en microscopie à fluorescence classique ou en microscopie confocale, d'autre part, en travaillant sur des cellules maintenues en suspension durant la PCR, d'effectuer une analyse en cytofluorométrie de flux de cellules positives. Cette approche nouvelle devrait ainsi ouvrir la voie & une réelle quantification sur un nombre important de cellules analysées, et à des stratégies de marquages multiples utilisant plusieurs fluorochromes (Embleton, 1992). Néanmoins, dans cette dernière mise en oeuvre, la PCR proprement dite est plus complexe et nécessite une stratégie de PCR "nestée", c'est-à-dire comportant deux ou trois étapes d'amplification successives de 30 cycles chacune, les amorces fluorescentes étant introduites uniquement lors de leur dernière étape. Compte tenu de cette technologie particulière, il semble difficile là encore d'utiliser en routine cette approche pour un suivi régulier des patients. En outre, la technique de perméabilisation utilisée ne permet pas de conserver les membranes cellulaires suffisamment intactes pour pouvoir également marquer des antigènes membranaires spécifiques de façon & pouvoir faire une numération relative des cellules comportant la séquence d'acides nucléiques qui a été amplifiée par rapport à une population cellulaire donnée. La présente invention est relative à un procédé de détection et de quantification d'une séquence d'acides nucléiques dans des cellules ou des tissus par PCR "in situ", caractérisé en ce que - les membranes sont perméabilisées aux réactifs de la PCR par un traitement des cellules par un produit de perméabilisation et de fixation de la membrane dans des conditions de concentration ou de durée assurant le maintien de la structure membranaire, - le marquage des produits d'amplification de la réaction PCR est réalisé par incorporation de nucléotides triphosphates marqués, - le cas échéant, un ligand spécifique d'un constituant membranaire et/ou cellulaire est ajouté, ledit ligand étant marqué ou susceptible d'être marqué directement ou par un intermédiaire chimique å un conjugué fluorescent. Par le terme "conservation de l'intégrité", ou "maintien de la structure membranaire", on entend le fait que les compartiments cellulaires sont préservés comme peut l'attester une observation au microscope, et que la fixation d'un ligand sur un récepteur spécifique n'est pas affectée par le traitement perméabilisant, si ce dernier est postérieur 9 ladite fixation. L'intérêt de la mise au point d'une technique de fixation et de perméabilisation cellulaire simplifiée est double, celui de contribuer à une meilleure préservation de la structure cellulaire en elle-même, et d'autre part, de conserver l'intégrité des molécules de surface et, en particulier, des protéines membranaires permettant un marquage concomitant des membranes et une numération différentielle des cellules marquées au niveau des membranes et ayant la séquence d'acides nucléiques amplifiée par la PCR "in situ". Un mode particulier de l'invention consiste en ce que le nucléotide triphosphate est marqué par une molécule fluorescente et que le constituant membranaire spécifique peut être le cas échéant marqué par une autre molécule fluorescente, la longueur d'onde d'excitation et d'émission de chacune de ces molécules fluorescentes étant suffisamment différente pour permettre une quantification différentielle en cytométrie de flux ou en microscopie confocale de la séquence d'acides nucléiques amplifiée et des cellules marquées au niveau de leur antigène membranaire. Les molécules fluorescentes, ou fluorochromes, utilisables peuvent être notamment la fluorescéine, la rhodamine, la phycoerythrine, des cyanines, des dérivés de ceux-ci. C'est un aspect très important de l'invention que la technique de perméabilisation, susceptible de préserver les structures cellulaires et membranaires, permettre à la fois cette double quantification et le fait de pouvoir travailler aussi bien quand les cellules sont en suspens ion que lorsque les cellules sont fixées sur lame. Autrement dit, ceci permet une quantification aussi bien en cytométrie de flux quand les marqueurs sont des marqueurs fluorescents, ou en microscopie confocale quand on souhaite travailler sur une coupe cellulaire ou sur des cellules fixées sur lame. De façon préférée, le nucléotide triphosphate marqué est le dUTP marqué å la fluorescéine en position 12 (Fl.dUTP), mais toute autre forme de dUTP, notamment couplée à de la biotine, de la digoxygénine, ou & des fluorochromes d'autres couleurs, tous autres types de bases nucléotides (dATP, dCTP, dGTP > , qu'elles soient couplées A un marquage froid ou chaud, par exemple du PdATP ou a32PdCTP. I1 est bien évident que le choix du type de marquage ou d'incorporation guide le système de révélation utilisable et ses caractéristiques. I1 faut également souligner que les amorces d'amplification peuvent être également marquées, soit dans le but de renforcer le signal liée å une incorporation directe de nucléotides fluorescents, soit avec un marquage différent permettant une double détection, par exemple de dUTP fluorescent pour l'analyse en cytométrie de flux et des amorces biotinylées pour une révélation sur une lame. LA encore, toutes les combinaisons permettant une double détection soit des cellules en suspension, soit des cellules fixées sur lame, sont envisageables. Le ligand spécifique du constituant cellulaire et/ou membranaire qui est ajouté, le cas échéant, dans le but de faire une double quantification des cellules comportant ce constituant et de la séquence d'ADN amplifiée par la PCR "in situ" peut être un anticorps monoclonal marqué à la biotine, la présence de cet anticorps monoclonal étant révélable par un conjugué streptavidine-fluorochrome, notamment streptavidineallophycocyanine ou, de façon plus générale, par tout conjugué streptavidine portant une molécule fluorescente. La double quantification est évidemment possible quand cette deuxième molécule de fluorescence a des longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de la molécule fluorescente couplée aux désoxyribonucléotides. Ce procédé de quantification relative de la présence de séquences d'acides nucléiques dans une population cellulaire donnée exprimant un constituant membranaire particulier fait également partie de l'invention. Cette quantification relative peut être réalisée soit dans un cytofluorimètre de flux lorsque l'on affaire à des cellules en suspension, soit en microscopie confocale lorsque les cellules sont fixées sur lame individuellement ou sous forme de coupes histologiques. Le procédé de l'invention est caractérisé par une technique de fixation légère des cellules préservant & la fois l'intégrité de la cellule elle-même et l'intégrité des membranes, y compris quand celles-ci sont préalablement couplées avec un ligand spécifique. Des techniques de PCR "in situ" et d'hybridation "in situ" impliquent une fixation des cellules & diverses concentrations de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde (PFA) en solution de 1 x PBS selon des durées variables allant de 20 mn à toute la nuit. Tous les auteurs travaillant en PCR "in situ" préconisent de traiter en outre les cellules ou coupes cellulaires par des protéases (protéinases K, pronases) et/ou des détergents (NP40) comme Embleton et al. (1992), dans le but de favoriser la perméabilisation cellulaire et de faciliter l'accès des réactifs dans la cellule. Ce traitement a plusieurs inconvénients, d'une part, lorsque les conditions de digestion ne sont pas correctement définies, il peut entrainer une perte des ARN messagers, ainsi qu'une altération de la morphologie et, d'autre part, les sites antigéniques membranaires sont également détruits, ce qui ne permet pas la combinaison avec le marquage des molécules membranaires. Enfin, une perméabilisation trop importante peut être à l'origine d'une mauvaise rétention des produits amplifiés & l'intérieur de la cellule et, donc, être un facteur de contamination interne. Tous ces inconvénients ont conduit à un des moyens de l'invention qui est une technique de fixation légère å la PFA 4%, suivie d'une étape d'acétylation dont le but est de saturer les protéines basiques qui peuvent entrainer une fixation non spécifique des réactifs. Cette étape est déterminante pour la préservation de l'intégrité cellulaire sur des cellules en suspens ion et également pour la fiabilité des résultats. Cette technique de fixation légère comprend la fixation par la formaldéhyde dans une concentration en poids/volume comprise entre 2 et 6% pendant une durée de 10 mn à 1 h et suivie le cas échéant par une étape d'acétylation ; de façon préférée, la concentration de formaldéhyde qui est utilisée est de 4% et sa durée d'action de 15 à 30 mn. La perméabilisation des cellules par cette technique est vérifiée par coloration au blue de trypan. Un autre moyen essentiel de l'invention est le marquage direct des produits d'amplification de la réaction de PCR "in situ" par incorporation de nucléotides triphosphates marqués. Actuellement, aucune étude de PCR "in situ" ne fait appel à un marquage direct des produits amplifiés. Seule l'équipe de G. Winter (Embleton, 1992) a utilisé un marquage & l'aide d'amorces d'amplification directement couplées à des fluorochromes (FAM ou ROX respectivement dérivés de la fluorescéine et de la rhodamine), mais avec la contrainte d'effectuer plusieurs PCR successives afin d'obtenir un signal en cytométrie de flux significativement détectable. Dans la présente invention, la méthodologie a été d'incorporer un analogue de la déoxythymidine triphosphate (dTTP) le déoxyuridyl triphosphate (dUTP) qui est couplé à de la fluorescéine. Cet analogue a la propriété de se substituer au dTTP lors de l'élongation des chaînes d'ADN en cours de synthèse avec un rendement qui est fonction du ratio des concentrations de dTTP/dUTP. Dans ce procédé de PCR "in situ" de l'invention, le meilleur signal de fluorescence est obtenu avec un ratio dUTP/dTTP compris entre 25 et 75%, ce mélange dUTP/dTTP étant lui-même dans une proportion de 5 à 20% dans un mélange des autres bases nécessaires & l'amplification (dATP, dGTP, dCTP), le rapport préféré étant de 50% de dUTP par rapport au dTTP, et le mélange dUTP/dTTP représentant de 10% a 50% par rapport aux autres bases nécessaires à l'amplification. Les atouts majeurs de l'utilisation de dUTP fluorescent dans cette technique sont a/ un gain très net en intensité de marquage, notamment par rapport à l'utilisation d'amorces marquées comme décrit dans l'article d'Embleton (1992), b/ une réduction corollaire du nombre de cycles d'amplification (30 à 40), c/ une diminution du bruit de fond non spécifique, d/ son utilisation polyvalente, quel que soit le type de gene d'intérêt, ce qui n'est évidemment pas le cas d'amorces d'amplification spécifiques. Tous ces avantages permettent l'utilisation dans un kit industriel d'utilisation polyvalente. L'utilisation de concentrations de dTTP équivalentes a celles des autres bases du mélange est possible, mais cela impliquerait, d'une part, une forte consommation de dUTP marqué pour respecter le ratio optimal, d'autre part, une probable augmentation importante du bruit de fond de fluorescence. Dans le cocktail d'amplification de la PCR, outre les quatre nucléotides dont un nucléotide marqué, les amorces et les enzymes sont ajoutées. La Taq polymérase est ajoutée pour ce qui concerne l'amplification des séquences d'ADN ; pour l'amplification de séquences d'ARN, il est nécessaire dans une première étape d'effectuer une reverse transcription par addition dans le cocktail d'amplification d'une reverse transcriptase. Cependant, il existe une nouvelle enzyme, la reverse transcriptase thermostable, å activité ADN polymérase (Tth DNA polymérase) dont la principale propriété est de posséder les deux types d'activité DNA polymérase-DNA dépendante ou DNA polymérase-RNA dépendante selon le type dé tampon dans lequel elle travaille. L'utilisation de cette enzyme dans le cocktail d'amplification permet donc de réaliser en une seule fois les deux étapes de reverse transcription et de PCR. Outre l'intérêt de l'utilisation de la Rth polymérase pour l'étude des ARN messagers, d'autres enzymes sont également utilisables å des fins d'amplification génique appliquant la PCR ou des techniques alternatives telles que la polymérase de Klenow ou la séquénase. Cette liste n'est bien sur pas limitative. Les oligonucléotides ajoutés dans le cocktail d'amplification sont des couples d'amorces spécifiques du gène ou de la séquence nucléotidique que l'on souhaite amplifier. Un troisième moyen important du procédé de detection et. de quantification d'une séquence dans une population cellulaire donnée est le marquage d'un constituant membranaire et/ou cellulaire spécifique par un ligand, lequel ligand est marqué ou susceptible d'être marqué directement ou indirectement par un intermédiaire chimique à un composé fluorescent. La mise au point d'un marquage membranaire utilisable en conjonction avec la PCR intracellulaire ("in situ") était au départ une gageure puisque toutes les molécules protéiques de surface sont profondément altérées lors des cycles de dénaturation thermique. En outre, toutes les techniques de PCR "in situ" utilisées jusqu'à présent utilisaient la protéine ASCA qui était également totalement destructrice des structures membranaires. L'originalité de l'invention réside donc dans la mise au point d'une méthode de perméabilisation/fixation permettant l'entrée de l'ensemble des réactifs permettant la PCR sans toutefois affecter de façon dramatique les structures cellulaires et membranaires. L'originalité du procédé tient en outre à une chronologie des opérations qui permet d'aboutir au résultat recherché, à savoir un double ' marquage spécifique. Ce procédé consiste d'abord en une étape de marquage sur les cellules fraîches non encore perméabilisées à l'aide d'un ligand couplé, par exemple un anticorps monoclonal couplé à de la biotine, possédant une bonne affinité de liaison vis-å-vis d'une molécule membranaire, par exemple un antigène de surface, puis une étape de révélation qui peut être, dans le cas où le ligand est couplé å la biotine, un conjugué streptavidine fluorescent. Le conjugué streptavidine fluorescent peut être ajouté avant ou après l'étape de perméation et d'amplification par PCR intracellulaire, mais de préférence après, afin d'éviter tout artefact de mesure dû aux conditions de la PCR. Un autre mode de réalisation est d'effectuer le marquage primaire d'un constituant cellulaire interne après l'étape de perméation des cellules, ce qui autorise une détection de molécules à localisation intracellulaire. Ce mode de réalisation peut permettre par exemple une quantification relative d'une séquence d'acides nucléiques susceptible d'être transcrite (ou traduite) en ARN messager (ou en protéine). Les paramètres critiques dans ce système est la thermostabilité de la molécule couplée au ligand initial ; toute molécule susceptible, comme la biotine de satisfaire ce critère et tout système de révélation correspondant permettant une amplification suffisante de ce signal font également partie du moyen de l'invention. Les ligands permettant de reconnaître des constituants membranaires ou cellulaires peuvent être, outre des anticorps monoclonaux, des fractions de ceux-ci telles les FAB ou FAB'2, ou des fragments simple chaîne, des chaînes légères ou des chaînes lourdes des anticorps monoclonaux ou toute molécule présentant une spécificité de reconnaissance avec ce constituant membranaire ou cellulaire, notamment les molécules reconnaissant spécifiquement certains récepteurs d'une cellule que l'on cherche à quantifier. L'invention concerne également un kit ou trousse de détection et de mesure en cytométrie de flux ou en microscopie confocale d'une séquence d'acides nucléiques amplifiée par PCR "in situ" dans des cellules entières caractérisé en ce qu'il contient - un produit de perméabilisation et de fixation des membranes dans des conditions de concentration et de durée assurant le maintien de la structure membranaire dans une suspension ou sur une plaque, - une solution de nucléotides triphosphates marquée, - les différents réactifs nécessaires å la réaction d'amplification par PCR intracellulaire d'une séquence d'acides nucléiques. Ce kit ou trousse est caractérisé en ce qu'il contient du dUTP marqué à la fluorescéine en position 12 et en ce que le dUTP marqué est dans une proportion comprise entre 25 et 75% avec du dTTP dans un mélange. Les autres désoxyribonucléotides triphosphates dXTP (dATP, dCTP, dGTP) sont également présents dans le kit ; le mélange dUTP/dTTP est de préférence dans une proportion de 5 å 20% dans le mélange des autres dXTP, mais peut être utilisé dans toute proportion permettant d'assurer un signal détectable et dénué d'un bruit de fond gênant la détection du signal spécifique. L'avantage de ce kit de diagnostic est qu'il permet d'effectuer une PCR "in situ" de n'importe quel type de séquence, à partir du moment où on lui fournit comme amorce d'amplification les oligonucléotides spécifiques de la séquence que l'on souhaite amplifier. Le kit de diagnostic peut contenir en outre - un ligand spécifique, lequel ligand peut par exemple être un anticorps monoclonal marqué à la biotine et révélé par un marquage spécifique du ligand, par exemple un conjugué streptavidine-composé fluorescent. Afin de pouvoir réaliser en une seule étape une quantification relative des deux marquages fluorescents, d'une part, du produit d'amplification PCR et, d'autre part, du constituant cellulaire et/ou membranaire marqué par un ligand, il est essentiel que les molécules fluorescentes marquant l'un et l'autre aient une longueur d'onde d'excitation et une longueur d'onde d'émission suffisamment différentes pour pouvoir être analysées simultanément, soit en microscopie confocale, soit en cytofluorimétrie de flux. Si le désoxynucléotide marqué est marqué & la fluorescéine, le conjugué streptavidine marqué avec une molécule fluorescente peut être marqué par exemple à 1 'allophycocyanine. L'invention concerne enfin l'utilisation du procédé et du kit à la détection et/ou à la quantification de séquences d'acides nucléiques dans de nombreuses situations il peut s'agir par exemple du suivi d'une infection d'une population cellulaire par un agent infectieux, par exemple un virus ou un parasite, a partir du moment où cette infection est de type intracellulaire il peut s'agir également de la détection, de la quantification ou du suivi de l'expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes immunitaires, le cas échéant en association avec l'étude de récepteurs membranaires associés, par exemple pour le suivi de maladies auto-immunes, de greffes tissulaires, ou de cancers, ainsi que pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui les sous-tendent, par exemple par une contribution à une meilleure définition des profils de réponses T auxiliaires de type TK1 et TH2, ou T-cytotoxique. I1 peut s'agir de la détection, de la quantification et/ou du suivi de marqueurs moléculaires associés a certaines proliférations malignes, le cas échéant en association avec l'étude de l'expression des antigènes associés, par exemple, l'étude et la détection des antigènes impliqués dans les oncogènes responsables du processus de la cancérogénèse ou encore dans certains lymphomes, & la détection de la translocation bcr/abl dans la leucémie myéloïde chronique, ou à certaines phases d'accélération de ces maladies. Le procédé de l'invention peut également permettre l'étude et le suivi des techniques de thérapie génique en cas de correction de déficit ou d'introduction d'un nouveau gene, ou encore de traitement par un oligonucléotide anti-sens. Cette liste n'est bien entendu pas exhaustive et peut concerner å terme de nombreux autres domaines où l'étude de la quantification de l'association d'un gène avec une protéine exprimée ou un marqueur cellulaire particulier peut conduire å des interprétations beaucoup plus fines soit d'un mécanisme moléculaire, soit d'un suivi thérapeutique. Les exemples qui suivent sont donnés & titre illustratif, mais ne sont en aucun cas limitatifs du procédé de l'invention. - Description des figures Figure : La figure 1 correspond å la détection en microscopie confocale å balayage laser d'ADN proviral HIV-1 dans des cellules Jurkat infectées. Les cellules positives sont fortement marquées (blanc) dans la zone nucléaire, l'effet cytopathique étant clairement documenté par la présence d'un syncitium avec quatre noyaux fluorescents (A). Absence de détection et bruit de fond quasi indétectable dans des cellules Jurkat non infectées contrôles (B). Figure 2 La figure 2 correspond a l'analyse (après PCR intracellulaire) en cytofluorométrie de flux de suspensions de cellules Jurkat HIV- (A) et HIV+ (B). Taille et structure des cellules et intensités de fluorescence permettant de quantifier le pourcentage des cellules ayant intégré un ADN proviral. Détection en gel d'agarose apres migration électrophorétique du produit d'amplification attendu dans la suspension HIV+ (307 pb), et & titre de contrôle d'un segment amplifié de la partie constante de la chaine P du récepteur T (190 pb), également réalisé en PCR intracellulaire. Figure 3 : La figure 3 correspond & la spécificité de la détection par PCR intracellulaire et cytométrie de flux: (A) courbe standard de cellules Jurkat infectées HIV+ diluées dans les mêmes cellules non infectées HIV (établie A partir de deux expériences indépendantes sur deux infections de cellules Jurkat distinctes) et (B) histogrammes de fluorescence correspondant aux différents points de dilution sur une expérience représentative. Figure 4 : La figure 4 correspond aux résultats sur des PBMCs d'un patient HIV+ : histogrammes représentatifs (A) contrôle négatif chez un donneur sain non infecté, (B) détection des cellules ayant intégré de 1'ADN proviral en PCR intracellulaire, (C) détection des cellules ayant une activité replicative en ARNm multi-épissé. Le pourcentage de cellules positives est reporté. Figure 5 : La figure 5 correspond à la détection par RT-PCR intracellulaire et microscopie confocale & balayage laser d'ARNm multi-épissés HIV-1 dans des cellules Jurkat infectées. Les cellules positives sont marquées (blanc å gris clair) & la fois dans la zone nucléaire et dans la zone cytoplasmique. Les différences d'intensité de marquage peuvent être en rapport avec des niveaux d'expression différents des ARNm. Figure 6 : La figure 6 correspond à l'analyse en double marquage (après PCR intracellulaire) de PBMCs d'un patient HIV+ avec détection (A) du nombre total de cellules infectées, (B) du CD4 membranaire et (C) du CD14 de façon combinée aux cellules positives en PCR. FL1 et FL4 correspondent respectivement aux intensités de fluorescence du fl-dUTP et du conjugué streptavidine-allophycocyanine. Les pourcentages de cellules positives sont reportés dans chaque quadrant. Figure 7 La figure 7 est un schéma général de la PCR intracellulaire. Les exemples suivants sont relatifs à la détection d'un ADN proviral de HIV, soit dans des lignées cellulaires chroniquement infectées par HIV1, soit dans des cellules prélevées de sang périphérique de patients infectés par le VIH aux différents stades de la maladie, cellules mononucléées totales de sang périphérique (PBMC). MATERIELS ET METHODES - Lignées cellulaires et culture Les lignées cellulaires chroniquement infectées par HIV1 qui ont été utilisées pour démontrer l'amplification intracellulaire de séquences virales sont 8E5/LAV qui est dérivée de la lignée T A3.01 (Folks et al., 1986), et U1 qui est une lignée établie à partir de la lignée promonocytaire U937 (Folks et al., 1987). Elles possèdent respectivement 1 et 2 copies de génome proviral intégré et possèdent une expression constitutive à faible niveau de HIV1. La lignée T leucémique Jurkat a également été étudiée après infection, et démontre en culture les effets cytopathiques caractéristiques d'une infection virale productive. L'infection de ces cellules Jurkat a été réalisée par incubation d'l heure en présence d'un surnageant de lignées précédemment infectées (CEM/LAV, Jurkat, LA/4) par la souche virale HIV1 Laï. L'effet cytopathique a été apprécié sur l'apparition de syncytia dès le jour 5 de la culture. Les cellules infectées ont été prélevées entre les jours 7 et 10. Toutes ces lignées cellulaires ont été maintenues en culture en milieu RPMI 160 supplémenté avec 10% de SVF, de la glutamine et les antibiotiques standard dans une atmosphère de 5% de C02. Des cellules non infectées A3.01, U937 et Jurkat ont été utilisées en parallèle à titre de contrôle négatif, ainsi des cellules Daudi (lignée B dérivée d'un lymphome de Burkitt) pour la validation du marquage membranaire. - Prélèvoients de patients Des prélèvements de sang périphérique ont pu être obtenus chez 21 patients infectés par le VIH aux différents stades de la maladie (stade II & IVD de la classification CDC), ainsi que 6 prélèvements d'organes lymphoïdes (rate ou ganglion). Les cellules mononucléées totales du sang périphérique (PBMCs) sont isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll hypaque, il en est de même pour celles issues des organes lymphoïdes préalablement dilacérés selon les techniques habituelles. Des PBMCs ont également été obtenus chez 17 donneurs volontaires sains VIH- pour servir des contrôles négatifs. - Fixation et permPabilisation Les cellules (2 & 5 106) ont été lavées 2 fois dans 1 ml de tampon phosphate-salin (PBS, pH 7.4) avec 0.5% de BSA, puis resuspendues dans 1 ml d'une solution de paraformaldéhyde 4% (pds/vol) fraîchement préparée en PBS pendant 20 mins à 4 C. Puis, elles sont centrifugées à 1.500 t/mn pendant 3 mins. Les surnageants sont retirés et les cellules délicatement resuspendues i la pipette Pasteur dans 1 ml de PBS. Cette procédure a été utilisée pour toutes les étapes ultérieures de lavage. Après centrifugation, elles sont incubées & température ambiante pendant 10 mins dans 1 ml d'une solution de triéthanolamine O.ln anhydreacétique 0.25% en PBS. Enfin, elles sont lavées 2 fois en tampon PBS 2% glycine et gardées dans 0.2 ml de PBS-BSA. Les cellules sont comptées en bleu trypan afin de contrôler leur perméabilisation et intégrité structurale, et peuvent ainsi être gardées à 4 pendant plus de 3 semaines. - Trancription inverse et synthèse d'un ADNc (RT) : Pour l'amplification des ARNm, une synthèse d'ADNc est réalisée sur un culot de 5 à 10 106 cellules fixées et perméabilisées selon un protocole dérivé des techniques standards. Le "mix" pour la synthèse d'un premier brin comprend : tampon 5X (250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 240 unités de RNase inhibiteur (RNase inh., Boehringer), 1 1 BSA, 0.5 mM déoxynucléotide 5'triphosphate (dNTPs), 1.5 ZM oligonucléotide polydT (oligodT), 3,000 unités de réverse transcriptase extrait du virus de Moloney (M-MLV RT, Gibco BRL, Gaithersburg) et de l'eau traitée au- diéthyl pyrocarbonate (DEPC 0.1%) dans un volume final de 200 iil. Après mélange, cellules et "mix" sont chauffées & 65 C pendant 5 Mins, refroidies dans la glace, puis placées à 37 C pendant 1 heure avec agitation manuelle intermittente. A la fin de la réaction, les cellules sont centrifugées, le surnageant réactionnel est retiré, puis les cellules sont resuspendues dans 0.2 ml de tampon PBS. - OligonulSotides : Les oligonucléotides utilisés ont été choisis sur des régions extrêmement conservées du génome de HIV1. Pour la détection de 1'ADN proviral, ont été utilisés P3 5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC-3' (POL 734-758) et P4 5' -CCTACATACAAATCATCCATGTATT-3' (POL1008-1033) donnant un produit de 307 paires de bases (pb). Pour l'évaluation de l'activité réplicative des couples d'oligonucléotides ne permettant d'amplifier que des ARNm dits multi-épissés, ont été utilisés, soit BK MULTI 5'-GAAGAAGCGGAGACAGCGACG-3' (REV 8-28) et FOR MULTI 5' -GGCCTGTCGGGTCCCCTCG-3' (ENV 2135-2153) donnant un produit court de 102 pb, soit BK2 5' AGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTC-3' (LTR 673-698) et FOR-CS 5'-AGATTCCACCAATA(TC)TT(GC)AGG(GA) (CT)TTCCCA-3' (ENV 2333-2361) donnant des produits plus longs de 564 ou 400 pb. Les séquences sont numérotées en fonctions de la classification Los Alamos (Myers et al., 1991). - PCR intracellulaire (ou "in situ") Toutes les expériences sont toujours réalisées en duplicats, voire plus, sur les lignées infectées ou sur des mélanges de lignées infectées avec leurs équivalents non infectés comme contrôle négatif. L'amplification in vitro est effectuée sur 5 105 cellules, mises en culot par centrifugation préalable, et distribuées dans des microtubes utilisables avec un thermocycleur GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). Pour obtenir un nombre suffisamment important de cellules pour la quantification en cytométrie de flux (en pratique au moins 1 106 cellules), les tubes sont multipliés en séries de 2 i 4 tubes, l'une avec des cellules non infectées contrôles, l'autre avec des cellules infectées. La réaction est conduite dans un volume final de 25 1 par tube contenant 2,5 1 de tampon PCR 10X (incluant notamment 25 mM de MgGl2), et 200 MM des déoxynucléotides triphosphates suivants : dATP, dCTP, dGTP. Le marquage des produits d'amplification n'est pas réalisé & l'aide d'amorces fluorescentes, mais par incorporation lors de la réaction de fluorescéine-12-déoxy-uridinetriphosphate (Fl-dUTP) 13 ZM, analogue compétitif du dTTP 26 AM. 2,5 unités d'ADN-polymérase thermostable (BioTaq, Bioprobe Systems, Paris, Fr.), ainsi que 20 pmoles d'amorces oligonucléotidiques ont été ajoutés & 80 lors du début de la réaction selon la technique de départ à chaud ("Hot Start"), qui accroit grandement la spécificité. L'amplification comporte 3 mn de dénaturation initiale & 95 , puis 35 A 40 cycles comportant 1 mn de dénaturation à 94 , 2 mn d'hybridation des amorces (à 50 pour les 5 premiers cycles, et à 40 pour les autres 30 cycles), 3 mn d'extension a 72-. Après 3 mn d'élongation finale, la réaction a été gardée à 4-. Les tubes de PCR sont ensuite centrifugés 5 mn à 1200 t/mn. Les cellules et leurs surnageants sont chacun récupérés et poolés par série. Vingt cinq 1 des surnageants sont directement déposés sur gel d'agarose à 2% pour analyse électrophorétique des produits spécifiques d'amplification (détectés à la taille attendue déduire de la position des paires de primers). Dans certains cas, les produits sont transférés sur membrane de nylon selon la technique de Southern blot et détectés par autoradiographie après hybridation avec une sonde oligonucléotidique spécifique marquée au z32p. Les cellules sont ensuite successivement lavées durant 20 mins à 37 C, d'abord dans 1 ml de 5XSSC (lXSSC comprend 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 mM DTT, puis dans 1 ml de 2XSSC, 1 mM DTT, 0.025% Tween 20, enfin dans 1 ml de tampon PBS. Après lavage, les suspensions cellulaires sont analysées pour la détection de fluorescence des produits intracellulaires. - Immuno-marquage pour la co-dâtection des antigènes lembranairos La validation du marquage membranaire a été réalisée sur les lignées cellulaires testées, ainsi que sur certains des PBMCs obtenus soit chez les donneurs sains HIV-, soit chez les patients HIV+. Le marquage est réalisé sur les cellules fraichement isolées à l'aide d'anticorps monoclonaux biotinylés anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD14, et anti-CDl9. L'anticorps est incubé en conditions saturantes durant 20 mins à 4 avec de 2 à 5 106 de cellules. Puis les cellules marquées sont fixées et perméabilisées selon le protocole décrit plus haut. Le marquage n'est révélé qu' & la fin des étapes de lavage après PCR intracellulaire grâce à un conjugué streptavidineallophycocyanine (ou streptavidine Red613). Celui-ci est incubé 1 heure en conditions saturantes à 4 en présence du million de cellules poilés ayant subi les différents cycles d'amplification. - Microscopie en épifluorescence ou confocale à balayage laser (CLSM) : Entre 103 et 105 cellules dans 5 1 de PBS sont déposées sur une lame en verre avec une goutte de 5 1 de 50% glycérol/2X PBS/0.l% NaN3/100 mg/ml DABCO (1,4diazabicyclo-octane, Sigma Co.) utilisé comme agent anti-extinction de fluorescence. Les échantillons sont recouverts par une lamelle et scellés au vernis pour examen microscopique, soit en épifluorescence classique, soit en microscopie confocale å balayage laser. Des images digitales sont collectées avec un instrument Leica CLSM disposé sur un microscope Leitz diaplan. Des longueurs d'onde excitatrice de 488/568 nm sont délivrées avec un laser Omnichrome argon-crypton refroidi par air. Une série de sections focales (généralement espacées de 1 Sm) sont acquises pour chaque préparation en utilisant un objectif å immersion X63, 1.4, Plan-Apochromatic. Chaque image représente la moyenne de 4 passages. Avant d'être photographiées avec un système Polaroïd, les images sont traduites en échelle de couleurs visualisant les différents niveaux d'intensité de marquage. La fluorescéine (Fl-dUTP) est excitée avec un faisceau laser a 488 nm et son signal d'émission détecté à travers un filtre interférentiel bande étroite Schott (535 + 8 nm). Lorsque deux signaux de fluorescence sont détectés (fluorescéine et Rend613 ou APC) les faisceaux 488 et 568 nm sont simultanément utilisés et les deux signaux d'émission séparés avant détection, la fluorescence rouge étant collectée à travers un filtre pass-haut RG610. - Analyse et quantification en cytofluoromâtrie de flux: Les cellules en suspension ont été analysées sur un cytofluoromètre de flux FACScan ou FACStar+ (Becton-Dickinson, Sunnyvale, Ca.). L'intensité de fluorescence a été appréciée å partir d'histogrammes logarithmiques de fluorescence pour 1 &commat; analyse en simple couleur, et en cytogrammes biparamétriques pour l'analyse en double couleur, en utilisant le logiciel Lysis II (Becton-Dickinson). Les débris cellulaires ont été exclus de la fenêtre d'analyse, qui a pris en compte de 10.000 a 50.000 cellules. RESULTATS Grâce & la méthodologie de l'invention, le premier résultat dans notre protocole est la conservation d'une morphologie cellulaire après perméation et fixation, qu'il s'agisse des lignées ou des PBMCs, qui permet au moins de distinguer avec certitude une zone nucléaire, une zone cytoplasmique, et une membrane cellulaire. Ceci est d'ailleurs nécessaire & une interprétation non équivoque des résultats, et indispensable pour l'analyse en cytométrie de flux, où l'on doit quantifier un pourcentage de cellules au sein d'une population de taille et de structure voisines de celles des mêmes cellules vivantes. - PCR intracellulaire/NIV Sur les lignées, en particulier Jurkat, les résultats obtenus en microscopie confocale ont constamment vérifié que la zone de fluorescence spécifiquement en rapport avec l'accumulation de produits d'amplification coïncidait très précisément avec la zone nucléaire (Fig. 1). Ceci est compatible avec la détection d'un ADN proviral intégré dans le génome de la cellule. Par ailleurs, le bruit de fond cytoplasmique des cellules positives est modéré, mais discrètement plus élevé que celui des cellules non infectées (Fig. 1). A été trouvé, par dépôt sur gel des surnageants, un produit d'amplification correspondant à la taille attendue pour les amorces utilisées, et il a été possible, après Southern blot, d'hybrider avec une sonde spécifique. Ceci atteste de l'efficacité de la réaction d'amplification, de sa spécificité et du fait qu'une partie des produits amplifiés sont probablement relargués du compartiment intracellulaire ou générés à partir de quelques cellules infectées détruites, sans que cela n'entraîne de conséquences nuisibles & l'interprétation des résultats en terme de quantification des cellules négatives par effet de contamination interne. L'analyse en cytométrie de flux a montré que les préparations de l'invention de Jurkat HIV+ étaient en fait infectées de façon reproductible entre 70 et 90% des cellules (Fig. 2). Dans les Jurkat infectées, le pic moyen d'intensité de fluorescence des cellules positives se dégage nettement de celui des cellules négatives, qui lui-même est un peu décale par rapport à celui des Jurkat non infectées contrôles. Afin de valider la fiabilité de la quantification, ont été réalisées des dilutions croissantes de cellules HIV+ avec des cellules HIV-, et il a été retrouvé des pourcentages de positives tout à fait concordantes avec les pourcentages attendus, surtout dans les plus faibles dilutions (Fig. 3). Ceci permet de confirmer que le relargage de produits amplifies dans les surnageants n'est pas un facteur de contamination majeure des cellules négatives. Sur les prélèvements de patients, il a été possible de détecter des cellules infectées, dans le sang périphérique chez 10 patients sur 12 avec une moyenne de pourcentage de 0.99% (limites 0-6,37%)n et dans les organes lymphoïdes chez 4 patients sur 4 avec un pourcentage moyen de 3,04% (limites 0,5-6,6%). Ces résultats sont tout à fait concordants avec les données acquises dans la littérature notamment avec les techniques PCR "in situ". - RT-PCR intracellulaire/!(IV Sur les lignées, en particulier Jurkat, en microscopie confocale, la localisation intracellulaire de la fluorescence correspondant aux produits amplifies marqués est plus délicate à interpréter. Néanmoins, d'une façon reproductible, il a été vérifié qu'elle se distribuait majoritairement dans la zone cytoplasmique, mais également dans la zone nucléaire (Fig. 5). Ceci est finalement compatible avec la détection d'ARNm primitivement synthétisés dans le noyau, puis exportés dans le cytoplasme. D'une façon similaire i l'amplification de 1'ADN, il a encore été retrouvé des produits d'amplification spécifique dans les surnageants des cellules infectées. En ce qui concerne la quantification en cytométrie de flux, l'amplification des ARNm pose le même problème qu'en PCR classique, qui est l'efficacité plus ou moins complète de la synthèse d'ADNc par reversetranscription. Ce problème reste probablement restreint dans la mesure ou, puisqu'il s'agit de détecter une positivité au niveau cellulaire, il suffit qu'une majorité d'ARNm soit transcrits pour que l'amplification se déroule correctement. Néanmoins, il sera nécessaire de préciser le seuil de sensibilité de la technique en terme de copies d'ARNm détectés, ce qui suppose le développement d'une technique de PCR intracellulaire quantitative. En règle générale, il a été retrouvé un pourcentage de cellules exprimant des ARNm multi-épissés de l'ordre de 60%, ce qui a été également vérifié en marquage intracytoplasmique et membranaire avec un anticorps dirigé contre la protéine p24. Les résultats obtenus chez les patients sont plus limités, car l'activité réplicative n'est détectable, au moins dans le sang périphérique, que chez les patients présentant les pourcentages de cellules infectées les plus importants (figure 4). I1 a été retrouvé une activité réplicative chez 11 patients sur 20 dans le sang périphérique (moyenne 1,29%; limites 0-7,7%) et chez 6 patients sur 6 dans les organes lymphoïdes (moyenne 2,81%; limites 0,13-5,9%). - Co-dâtection des antigènes meSbram-ir-s Il a été démontré la faisabilité technique de la détection des antigènes membranaires en parallèle de la technique selon l'invention d'amplification intracellulaire. Celle-ci est en effet possible, car le protocole de fixation et de perméabilisation initiale des cellules n'altère pas qualitativement les antigènes protéiques de membrane, par contre celles-ci sont sensibles aux cycles de dénaturation thermique, notamment dans les plus hautes températures (949), ce qui a pu être vérifié. I1 est donc essentiel d'effectuer le marquage des antigènes membranaires sur les cellules fraichement isolées. Le marquage avec un anticorps biotinylé n'est pas altéré quantitativement d'une façon majeure par l'amplification (la révélation après PCR n'implique qu'une perte de marquage d'au plus 10% des cellules par rapport å une révélation avant PCR), ce résultat peut être expliqué par le fait que la biotine est thermostable et peut encore être reconnue avec une grande affinité par la streptavidine après PCR. Par contre, qualitativement, on assiste à une diminution de l'intensité du signal spécifique qui reste néanmoins parfaitement détectable, ce qui est probablement en rapport avec l'effet de perméabilisation cellulaire et de PCR, qui contribuent & la perte d'une partie limitée du marquage, ainsi que d'un certain nombre d'épitopes antigéniques marqués. Quoiqu'il en soit, les résultats obtenus (figure 6), principalement sur les PBMCs où l'expression des antigènes étudiés est plus forte que sur les lignées, démontrent l'intérêt de pouvoir caractériser le phénotype des cellules infectées. Celui-ci est au moins double, d'une part de contribuer à terme à une meilleure définition in vivo du degré d'infection des différentes sous-populations de cellules mononucléées, d'autre part de pallier l'une des principales difficultés en matière d'évaluation de la charge virale au VIH qui est que, même aux stades les plus avancés de la maladie, le nombre de cellules infectées est faible, voire dans les limites de la détection en cytométrie de flux. Ce dernier écueil est encore majoré par l'importance de la déplétion en cellules CD4+. Grâce à une technique de double couleur CD4+/HIV, il est possible de rapporter le pourcentage de cellules infectées uniquement a la sous-population CD4+ et ainsi d'accroitre considérablement ce pourcentage. - Applications cliniques à l'étude de patients VIH : Dans l'état actuel, la technique d'amplification intracellulaire combinée à la détection de certains antigènes membranaires peut être considérée comme un outil d'exploration de la charge virale VIH. Même si elle reste délicate à mettre en oeuvre dans un laboratoire, sa réalisation pratique est tout à fait compatible avec un suivi régulier des malades. Nous avons d'ailleurs débuté une étude de recherche clinique sur des groupes de patients aux différents stades de la maladie, de façon å confronter notre méthodologie å des techniques complémentaires d'évaluation (virémie et PCR standard quantitatives, antigénémie circulante). Les résultats obtenus dans étude de validation, notamment en double détection, laissent penser qu'à terme cette approche, appliquée à des groupes importants et homogènes de patients, permettre de contribuer à une meilleure compréhension de l'histoire naturelle du SIDA, ainsi qu'à la détermination de facteurs prédictifs de son évolution, en particulier dans le cadre de l'évaluation de l'efficacité des stratégies thérapeutiques antivirales. 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Procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence d'acides nucléiques dans des cellules ou tissus par PCR in situ, caractérisé en ce que - les membranes sont perméabilisées aux réactifs de la PCR par un traitement des cellules par un produit de perméabilisation et de fixation de la membrane dans des conditions de concentration ou de durée assurant le maintien de la structure membranaire, - le marquage des produits d'amplification de la réaction PCR est réalisé par incorporation de nucléotides triphosphates marqués, - le cas échéant, un ligand spécifique d'un constituant membranaire et/ou cellulaire est ajouté, ledit ligand étant marqué ou susceptible d'être marqué directement ou par un intermédiaire chimique à un conjugué marqué. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nucléotide triphosphate est marqué par une molécule fluorescente ou fluorochrome, et en ce que le constituant membranaire spécifique est marqué par une autre molécule fluorescente, la longueur d'onde d'excitation et d'émission de chacune de ces molécules fluorescentes étant suffisamment différente pour permettre une quantification différentielle de la séquence d'acides nucléiques amplifiée et des cellules marquées au niveau de leur antigène membranaire. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le nucléotide triphosphate marqué est le dUTP et que le fluorochrome est la fluorescéine (Fl.dUTP), en ce que le produit d'amplification est détectable par fluorescence, et en ce que le ligand spécifique du constituant cellulaire et/ou membranaire ajouté le cas échéant est un anticorps monoclonal marqué a la biotine, lequel est révélable par un conjugué streptavidine-fluorochrome, ce deuxième fluorochrome ayant de préférence des longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes du fluorochrome couplé au désoxyribonucléotide. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le Fl.dUTP est ajouté dans une proportion allant de 25 à 75% avec du dTTP, le mélange dUTP-dTTP étant de préférence dans une proportion allant de 5 & 20% dans un mélange avec les trois autres désoxyribonucléotides. 5. Procédé de quantification relative de la présence de séquence d'acides nucléiques dans une population cellulaire donnée exprimant un constituant cellulaire et/ou membranaire particulier caractérisé en ce que ladite séquence est amplifiée par PCR in situ et marquée par une première molécule fluorescente, et en ce que le constituant membranaire et/ou cellulaire est marqué par un ligand spécifique révélable directement ou indirectement par une deuxième molécule fluorescente différente de la première par une longueur d'onde d'excitation et d'émission de fluorescence suffisamment différentes pour être mesurées simultanément, et que l'on mesure le pourcentage relatif du premier marquage par rapport au second. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé de perméabilisation des membranes comprend un traitement des cellules à la paraformaldéhyde en solution à une concentration poids/volume comprise entre 2 et 6%, pendant une durée de 10 mn à 1 h, suivi, le cas échéant, par une étape d'acétylation. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la formaldéhyde est utilisée à la concentration de 4% pendant une durée de 15 & 30 mn. 8. Kit ou trousse de détection et de mesure en cytométrie de flux ou en microscopie confocale d'une séquence d'acides nucléiques amplifiée par PCR in situ dans des cellules entières, caractérisé en ce qu'il contient - un produit de perméabilisation et de fixation des membranes dans des conditions de concentration et de durée assurant le maintien de la structure membranaire dans une suspension, - une solution de nucléotide triphosphate marqué, - les différents réactifs nécessaires å la réaction d'amplification par PCR d'une séquence d'acides nucléiques. 9. Kit ou trousse selon la revendication 8, caractérisé en ce que le désoxyribonucléotide marqué est du dUTP marqué par une molécule fluorescente, notamment la fluorescéine, et que ce dUTP marqué est dans une proportion comprise entre 25 et 75% avec du dTTP dans un mélange. 10. Kit ou trousse selon les revendications 8 et 9, caractérisé en ce qu'il contient en outre un ligand spécifique de ladite cellule marqué directement ou indirectement par une molécule fluorescente, cette dernière ayant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de la molécule de marquage du désoxynucléotide. 11. Kit ou trousse selon la revendication 10, caractérisé en ce que le ligand est un anticorps monoclonal marqué à la biotine et est susceptible d'être révélé par un conjugue streptavidine allophycocyanine. 12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la détection et/ou la quantification et/ou au suivi de la présence de séquences d'acides nucléiques dans une population cellulaire, par mesure comparative du ' marquage spécifique de la séquence d'acides nucléiques après amplification par PCR "in situ" et du marquage d'un constituant cellulaire et/ou membranaire spécifique d'une cellule ou d'un tissu. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que les mesures de marquage de l'acide nucléique et du constituant cellulaire et/ou membranaire sont simultanées et peuvent être notamment une double mesure de fluorescence en microscope confocal ou en cytométrie de flux. 14. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 a la détection et/ou a la quantification et/ou le suivi dune infection d'une population cellulaire par un agent infectieux. 15. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 & la détection et/ou la quantification et/ou le suivi de l'expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes immunitaires, le cas échéant en association avec l'étude de récepteurs membranaires associés. 16. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 & 7 à la détection et/ou la quantification et/ou au suivi des marqueurs moléculaires associés à certaines proliférations malignes, le cas échéant en association avec l'étude de l'expression des antigènes associés. 17. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 au suivi des greffes, notamment des greffes de moelle osseuse, au suivi des traitements par thérapie génique.