FR 2724665 A1 19960322 FR 9411049 A 19940916 PROCEDE DE PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES PLASMIDES ET CELLULES MODIFlEES La présente invention concerne la production de protéines recoeinanes chez les bactéries. Elle concerne plus particulièrement un nouveau procédé permettant une production élevée de protéines recombinantes chez les bactéries, mettant en oeuvre un système d'expression particulièrement stable et efficace comprenant tm promoteur du bactériophage T7 et une région de stabilisation La presente invention concerne également les plasmides utilisables dans ce procédé, et les pRes recombinantes ainsi produites. Les bactéries, et en particulier E. coli peuvent être utilisées pour produire des protéines de diverses origines, aussi bien de procaryotes que d'eucaryotes. En particulier, des protéines humaines peuvent être produites chez E. colt. Pour ce faire le gène de structure, ou le cDNA du gène codant pour la protéine en question doit être placé derrière des signaux d'expression appropriés (promoteur et site de fixation des ribosomes) reconnus par la machinerie d'expression d'E. çs21i. Le système le plus efficace utilisé chez E. coli est le système décrit par Studier (Studier et al., 1990).Ce système consiste en l'utilisation d'un promoteur du phage 17 qui est reconnu spécifiquement par l'ARN polymérase de ce même bactériophage (E. poli ne possédant N se aucun promoteur reconnu par cette même polymérase). Dans ce système d'expression, il y a une induction, par exemple à l'IPTG, de l'expression du gène de L'ART polymérase du phage T7 (celui-ci étant positionné sous contrôle d'un promoteur inductible tel que PUV5 d'E. ÇQIi ). De cette induction résulte l'expression du gène placé sous contrôle du promoteur du bactériophage T7 reconnu par la polymérase.Comme la polymérase ne reconnaît que le promoteur en amont du gène à exprimer, celui-ci est exprimé, en général, à un niveau très élevé (au dessus de quelques pour-cent des protéines totales bactériennes). De très nombreuses publications font état aujourd'hui de l'utilisation de ce système initialement décrit par Studier (Studier et al., 1990). Comme indiqué cidessus, les bactéries, et en particulier E. coli. sont utilisées pour la production de protéines humaines d'intérêt pharmaceutique. Si ces dees protéines doivent être ensuite utilisées dans diverses thérapies, il convient de les préparer en respectant les règles de Bonne Pratique de Production (BPL). Pour ce faire il est indispensable de posséder un système de production qui soit reproductible et qui assure l'obtention d'un produit de qualité hautement définie ayant une très grande pureté. Un des aspects important d'un procédé de production d'une protéine d'intérêt pharmaceutique réside dans la souche qui permet la production de la dite protéine. En effet il faut que cette souche assure un mode de productian reproductible tant au niveau qualitatif que quantitatif. Au niveau qualitatif, par exemple, il convient de produire une prote d'une homogénéité totale, c'est à dire ayant une séquence primaire identique à celle de la protéine naturelle. En effet, si dans une cellule bactérienne, au cours de la fermentation, il se produisait une mutation ponctuelle qui modifie la séquence codée de la protéine à exprimer, il en résulterait la production d'une protéine modifiée mélangée avec la protéine de séquence sauvage. Une fois chez lnnomme, cette protéine modifiée pourrait entraîner une réaction immunitaire qui pourrait être très néfaste au traitement, ou bien, lors d'un traitement ultérieur, entamer cette fois-ci une réaction immunitaire sévère. Au niveau quantitatif, il est admis qu'un procédé doit être reproductible. Cela constitue un gage de la qualité du produit obtenu. Ainsi, il faut qu'il y ait entre les différents lots de production le même taux de synthèse de la protéine en question par unité de biomasse, dans la même unité de temps en utilisant les mêmes conditions de culture et de croissance. Un aspect très important de cette reproductibilité du niveau de la production de la protéine réside dans la présence du plasmide portant la cette d'expression dans les cellules bactériennes. Un procédé de fermentation est d'autant mieux maîtrisé que toutes les cellules ont le plasmide en fin de culture (avant et après la production de la protéine). Pour maintenir le plasmide dans les bactéries on ajoute en général dans le milieu de culture un antibiotique sélectif pour la présence du plasmide.Cela peut poser des problèmes divers: coût de l'antibiotique au niveau de la préparation du milieu du fermenteur; comme l'antibiotique ne peut pas être stérilisé par autoclavage, il convient de l'ajouter extemporanément au milieu de culture; l'antibiotique peut ne pas être stable et générer des produits de transfornon toxiques chez l'homme, ou du moins conduisant chez certains patients à des effets secondaires indésirables; l'antibiotique peut aussi, par lui-même être toxique chez l'homme, ou du moins conduire, chez certains patients, à des effets secondaires indésirables. Dans les deux derniers cas, il faudra montrer que dans le produit purifié, les traces de produits toxiques correspondant soit à l'antibiotique, soit à des poduits dérivés sont inférieures, par doses administrables, à des niveaux susceptible, de procurer des effets secondaires ou toxiques.Ceci se traduit par des études lourdes et coûteuses. La présente invention permet de remédier à ces problèmes. La présente invention fournit en effet un système d'expression particulièrement efficace, dans lequel l'antibiotique n'est pas nécessaire pour le maintien du plasmide au coors des générations bactériennes se déroulant dans le fermenteur. La - invention réside en particulier dans la construction d'un système d'expression plasmidique dans lequel l'expression se fait grâce à un promoteur du bactériophage T7, et comporant en plus une région stabilisatrice.Le système selon l'invention est particulièrement avantageux puisque, contrairement à ce qui est observé pour le système de Studier et al., il permet de maintenir les plasmides dans toutes les cellules bactériennes apis l'induction de l'expression de la protéine à exprimer, dans des conditions de culture où il n'y a pas d'antibiotique, c'est à dire sans pression de sélection. Les plasmides de Studier (Studier et al., 1990), après induction de l'expression, ne sont retrouvés que dans une fraction très faible des cellules. I1 est clair que le système de l'invention stabilise fortement les plasmides, ce qui augmente les niveaux de production de protéines recombinantes et la reproductibilité du procédé.La région stabilis utilisée pour la construction des plasmides selon l'invention est plus précisément dérivée du fragment v du plasmide RP4. Un premier objet de l'invention réside donc dans un plasmide d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur du bactériophage T7 et une région stabilisatrice comprenant tout ou partie de la région W du plasmide RP4 ou d'un dérivé de celleci. Préférentiellement, le promoteur du bactériophage T7 utilisé dans les plasmides de la présente invention est le promoteur du gène 10. Comme indiqué ci-avant, la région de stabilisation utilisée dans les plasmides de l'invention est dérivée du fragment par du plasmide RP4 (Gerlitz et al., 1990). Ce fragment porte différentes fonctions (en particulier 5 gènes désignés parA. parC. parD et p & ), et notamment une protéine devant avoir une activité recombinase site spécifique permettant probablement de résoudre les dimères plasmidiques (Eberl et al., 1994). Ce fragment gLr peut être isolé à partir du plasmide RP4 et cloné sur les plasmides d'expression de la présente invention, comme démit dans les exemples. En outre, ce fragment peut être modifié avant ou après son introduction dans les plasmides de l'invention. Ainsi, la région stabilisatrice des plasmides de l'invention peut être constituée par tout ou partie de la région par du plasmide RP4 ou d'un dérivé de celleci. En particulier, la région stabilisatrice des plasmides peut être constituée de l'insert PstI du plasmide pTUG3 ou des sousfragments SphI-SphI-SphI du pOH23 ou SphI-hI-ÇI du pOH41 ou SphI-SphI-BamHI du pGMA28 ou du XhI I- OmHI du pGMA27qui sont décrits par Gerlitz et al., 1990 ou de tout sous-fragment de l'insert XI du pTUG3 contenant au minimum l'insert SphI-SpI-BamHI du pGMA27.Alors que l'insert PstI du pTUG3 contient les gènes parCBA-parDE et les régions flanquantes, les inserts du pGMA27 ou pGMA28 ne contiennent que les geais parCBA-parDE' et la région 5' flanquante. La région stabilisatrice peut également être constituée des gènes parDE ou du gène parD et de sa région promotrice ou d'un autre promoteur comme cela a déjà été décrit par Roberts et al, 1994. Cette région peut être obtenue à partir du fragment StvI I contenu dans le plasmide pTUG3. La région stabilisatrice peut aussi être constituée de toute combinaison de deux, trois ou quatre gènes par contenus dans le plasmide pTUG3, par exemple parA-parD ou parB-parD ou parAC-g2 ou parBA-parDE avec leur région promotrice ou un autre promoteur. Le terme dérivé de la région par comprend tout fragment obtenu par modification génétique et/ou chimique de la région par, et apte à la réalisation de plasmides stables selon l'invention. En particulier, ces dérivés peinent être obtenus par délétions, mutations, additions, clivages, ligations, etc au niveau de la région par du plasmide RP4, selon les techniques connues de homme du métier. Ensuite, il fonctionnalité des dérivés peut être testée comme décrit dans les exemples (voir exemple 2. notamment). Avantageusement, dans les plasmides selon la présente invention, la région stabilisatrice comprend une partie de la région par du plasmide RP4. Dans un mode particulier de réalisation, la région stabilisatrice est constituée du fragment coonris entre les résidus 6038 et 8499 de la séquence SEQ ID n 1. Dans un mode de réalisation préféré, les plasmides de l'invention comportent en outre l'opérateur lacO et le gène lacIq. I1 a en effet été constaté que malgré la présence d'un promoteur du bactériophage r7 spécifique d'une polymérase non présente chez E. coli, une expression basale de la séquence d'acide nucléique d'iniérét se produit sans inducteur. Cette expression résiduelle peut induire une certaine baisse de stabilité du plasmide. La présence, dans les plasmides de l'invention, de l'opérateur lacO et du gène lacIq permet avantageusement d'obtenir une expression plus régulée de la séquence d'acide nucléique et en particulier, d'inhiber toute expression en l'absence d'inducteur.Les plasmides incorporant ces éléments ont donc une stabilité et un contrôle de l'expression accus. Pour obtenir l'effet recherché, l'opérateur lacO est avantageusement placé en aval du promoteur du bactériophage T7 et en amont de la séquence d'acide nucléique d'intérêt comme indiqué dans les exemples. Le gène q est inséré dans le plasmide, préférentiellement avec son propre promoteur, dans une région non essentielle pour les propriétés recherchées du plasmide. Ainsi, le gène est préférentiellement inséré en dehors de la région par et de la cassette d'expression de la séquence d'acide nucléique d'intérêt.Les séquences de cet opérateur et du gène lacis sont données dans la séquence SEQ ID nO 1. H est entendu que ces éléments peuvent être remplacés par des séquences homologues ou possédant des fonctions équivalentes. Dans un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre, les Wawnidffl selon l'invention comportent également un terminateur de transcription, situé en aval de la séquence d'acide nucléique d'intérêt. Avantageusement, le niinateur de transcription utilisé est celui du gène du bactériophage"7 dont le promoteur est utilisé. Préférentiellement, il s'agit du terminateur T du bactériophage T7. La séquence d'acide nucléique d'intérêt présente dans les plasmides selon l'invention peut être toute séquence codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique, agroalimentaire, ou pouvant être utilisée pour de la biocatalyse. B peut s'agir d'un gène de structure, d'une séquence d'ADN complémentaire, d'une séquence synthétique, semi-synthétique, etc. Préférentiellement, la séquence d'acide nucléique code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique choisie par exemple parmi les enzymes, les dérivés sagums, les hormones, les lymphokines (interleukines, interférons, TNF, etc), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques:BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc, la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine Ce lu associée à la mucoviscwoee, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc, les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: Facteurs VII, VIII, Ix, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, etc. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour un facteur de croissance des fibablastes acide (aFGF). Le cDNA de la forme native du gène du aFGF humain a été identifié, séquencé et cloné (laye et al., 1986 et 1987). Ce cDNA peut coder pour différentes formes de aFGF, selon la présence de délétions dans la partie N-terminale, et notamment des formes comprenant 154, 140 ou même 134 acides aminés. Par ailleurs, des variants naturels ou artificiels peuvent également être produits, résultant de modifications par délétion, mutation et/ou addition d'une ou plusieurs paires de bases dans la séquence du gène natif (par exemple d'une méthionine N-terminale). Dans un mode de réalisation tout à fait spécifique de la présente invention, la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour le aFGF(154). A titre d'exemple tique, an peut citer le plasmide pXL2435 présentant la séquence SEQ ID n 1. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de protéines recombinantes. Plus particulièrement, le procédé de production selon l'invention consiste à cultiver une bactérie contenant: - un plasmide tel que décrit ci-avant portant une séquence d'acide nucléique codant pour ladite protéine, et, - le gène de l'ARN polymérase du bactériophage T7, dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique. Comme indiqué ci-avant, l'intérêt du système réside notamment dans l'utilisation d'un promoteur du bactériophage T7 reconnu spécifiquement par l'ARN polymérase du même bactériophage T7. La bactérie utilisée doit donc comporter. en plus du plasmide selon l'invention, une cassette permettant l'expression de l'ARN polymérase du bactériophage T7. Cette cassette peut être soit intégrée au génome de la bactérie utilisée (souche E. coli BL21,DE3), soit portée par un second plasmide ou un phage, soit encore présente sur le plasmide de l'inventiofL Avantat, dans la cassette d'expression, le gène codant pour l'ARN polymérase du bactéricsibage est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible tel que le promoteur laç, lr; ou recA. Ceci permet en effet d'induire de manière contrôlée la production d'ARN polymérase dans la cellule, et donc de contrôler l'expression de la séquence d'acide nucléique d'intérêt placée sous le contrôle du promoteur spécifique de ladite ARN polymérase. Préférentiellement, le promoteur inductible contrôlant l'expression de L'ART polymérase du bactériophage T7 est le promoteur PUV5 dz, g2li q!ii est induit spécifiquement en présence d'IPTG. Comme indiqué plus en détail dans les exemples, le procédé de rilIvenbon permet ainsi une production, à des taux élevés et de manière reproductible, de protéines non modifiées Ce procédé permet ainsi une production indussrielle de protéines recombinantes de qualité pharmaceutique. Le procédé selon la présente invention est tout particulièrement adapté pour la production de facteurs de croissance des fibroblastes recombinants (aFGF, bFGF notamment). Ainsi, un objet particulier de la présente invention réside dans un procédé de préparation de aFGF recombinant selon lequel on cultive une bactérie content le plasmide pXL2435 et le gène de l'ARN polymérase du bactériophage T7 dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique, et on récupère le aFGF produit. La présente invention sera décrite plus complètement à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Abréviations utilisées: aFGF: facteur de croissance acide des fibroblastes bp : paire de bases DO : densité optique E. ÇQli: Escherichia coli IPTG: isopropylthio-ssD-galactoside kb: kilo bases kDa : kilo daltons Km : kanamycine LB : Luria-Bertani medium PAGE-SDS : électrophorèse en gel contenant de l'acrylamide, du N,N'- methylenebisacrylamide et du sodium dodécyl sulfate. T7 : bactériophage T7 Légendes des figures: Figure 1: Construction du plasmide pXL2435. A- Schéma des constructions: Les fragments çI-NdeI de 3,2 kb du pET11a et 2,8 kb du pXL2283 ont été ligaturés pour générer le plasmide pXL2434 ; le plasmide pXL2434 digéré par Bglll a été ligaturé avec le fragment hmEII de 2,4 kb du pXL2433 pour créer le pXL2435. B- Carte du plasmide pXL2435 : aFGF: gène codant pour le aFGF; Ampr: gène de résistance à l'ampicilline; Kmr: gène de résistance à la kanamycine ; laclq : gène codant pour une synthèse élevée du répresseur Lac ; ori : origine de réplication de ColEl ; parDEparCBA: gènes du locus par de RP4 ; pT7 : promoteur #10 de T7 et opérateur lacO ; T#: terminateur T# de T7. Les flèches indiquent la direction de transcription des gènes. Les sites des enzymes de restriction indiques sont ceux qui ont été utilisés lors des clonages. Les chiffres écrits entre parenthèse correspondent aux positions en paire de bases sur la séquence SEQ ID n01. Figure 2 : Visualisation de la protéine aFGF produite par E. a BL21, DE3 en absence d'antibiotique et en présence du plasmide pXL2283 ou pXL2434 ou pXL2435 après induction avec de l'IPTG. Les extraits cellulaires totaux sont déposés sur le gel. M: marqueur de poids moléculaires qui sont indiqués en kDa, la flèche indique le poids moléculaire du aFGF. Séquence SEQ ID n 1 : Séquence nucléotidique du plasmide pXL2435 de 8501 bp. La position 1 sur la séquence correspond au site de coupure de XII du pETlla. Le gène aFGF se situe entre les positions 108 à 575, le locus par entre les positions 6038 et 8499 c'est-à-dire parE' de 8248 à 8499, parD de 8001 à 8252, parC de 7850 à 7557, parB de 7560 à 7027 et parA de 7066 à 6407; le promoteur 10 de T7 entre les positions 20 et 36, lacO entre les positions 39 et 63, le terminateur TO de T7 entre les positions 586 et 708 et le gène lacIq entre les positions 5636 et 4554. Techniques générales de clonage, de biologie moléculaire et de biochimie. Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E. çpli la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Sambrook et ê1., 1989). Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Reseach Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose à 0,7 %, purifiés par électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Les ADN ligaturés ou les ADN plasmidiques purs sont utilisés pour transformer la souche rendue compétente: E. coli BL21, DE3 [F ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)] (Studier et al., 1990) et E. coli TG1 [A(lac proA.B), supE, thi, hsdD5/F traD36. proA+, B+, lacIq, lacZ#M15] (Gibson, 1984). Les ADN plasmidiques sont purifiés suivant la technique de la lyse alcaline décrite par Sambrook et a1., 1989. Le milieu de culture LB est utilisé pour la partie bactériologique (Sambrook et al., 1989). Les dilutions de la suspension bactérienne sont ensuite étalées sur des boites de mileu LB supplémentées avec, si nécessaire, de la kanamycine à 50 mg/l. Le protocole décrit par Studier et al., 1990 est utilisé pour produire du aFGF à l'aide de la souche BL21, DE3 portant un plasmide d'expression du aFGF, (pXL2283 ou pXL2434 ou pXL2435 décrit dans l'exemple 1). La production du aFGF est quantifiée sur des extraits cellulaires totaux. Après lyse des bactéries, les échantillons sont déposés sur un gel SDS-PAGE à 15% qui, après électrophorèse, est coloré au bleu de Coomassie (Denèfle et al., 1987). Avec les échantillons issus des souches produisant le aFGF une bande d'un poids moléculaire apparent de 16 kDa est observée. Un transfert semi-sec sur membrane de nitrocellulose est réalisé (Sambrook et al., 1989), la membrane est traitée selon le protocole du kit Vectastain (Biosys SA, France) pour permettre une détection du aFGF immunologique (anticorps anti-aFGF bovin obtenu chez le lapin est vendu par Sigma, France; et anti-IgG de lapin) colorimétrique à l'aide du complexe avidine péroxidase biotinylée.Un autre transfert semi-sec sur membrane Pro-Blott est réalisé (Matsudaira, 1987), la membrane est colorée au bleu de Coomassie et la bande de poids moléculaire apparent de 16 kDa est excisée. Cette partie de membrane est soumise à la dégradation d'Edman, 1956 à l'aide d'un microséquenceur d'Applied Biosystems modèle 477A possédant un analyseur 120/7 en ligne et utilisé selon les instructions du constructeur. Exemple 1- Construction d'un plasmide stable et régulé d'expression du cDNA du aFGF humain. Cet exemple décrit les constructions réalisées pour obtenir un plasmide stable et très régulé permettant la production du aFGF chez E. coli. Le cDNA de la forme native du gène du aFGF humain ( 470 pb) (laye et aL, 1986 et 1987) a été identifié, séquencé et cloné dans le vecteur d'expression pET9 (Studier et al., 1990) aux sites NdeI et BamHI pour générer le plasmide d'expression pMJ42, nommé dans ce qui suit pXL2283 (voir figure 1). L'insert NdeI-=I de 2,8 kb du plasmide pXL2283 a été ligaturé avec le fragment NdeI-AccI de 3,2 kb du plasmide pET11a (Studier et al., 1990) pour créer le plasmide d'expression pXL2434. Ce plasmide est différent du pXL2283 par la présence du gène q et de l'opérateur lacO. permettant d'obtenir une expression plus régulée du aFGF. Des sites BamHI ont ensuite été introduits aux extrémités du fragment ?arCBA-parDE' de 2,46 kb issu du plasmide pGMA28 (Gerlitz et al., 1990). Pour cela, le fragment 22h,I- SphI-BamHI de 2,46 kb du pGMA28 a été cloné dans le plasmide pUC18 (Yanish- Perron et al., 1985) digéré par XhI-BamHI pour générer le plasmide pGMA60 (H. Schwab et al., communication personnelle). Le fragment de 2,46 kb HindIII-EcoRI du plasmide pGMA60 a ensuite été cloné dans le plasmide pMTL22 (Chambers et al., 1988) digéré par HindIII et EcoRI pour générer pXL2433. L'insert BamHI (parCBA-parDE') du plasmide pXL2433 a été introduit au site = du plasmide pXL2434 pour créer le plasmide pXL2435. Sur la figure 1, un schéma des constructions et la carte du plasmide pXL2435 sont représentés et la séquence de 8501 pb du plasmide pXL2435 est décrite (SEQ ID n 1). Alors que la sé(pience décrite dans l'article de Gerlitz et al., 1990 n'est que partielle (125 paires de bases sont à ajouter en 3'), cette partie 3' de la séquence a été vérifiée sur les plasmides pXL2433 et pXL2435 et sur la séquence SEQ ID n 1.Un récapitulatif des caractéristiques des trois plasmides d'expression est présenté sur le tableau 1. Tableau 1. Caractéristiques des plasmides d'expression Plasmides pXL2283 ou pXL2434 pXL2435 pMJ42 taille (kb) 4.8 6 8.5 dérivé de pBR322 pBR322 pBR322 résistance à la kanamycine kanamycine kanamycine promoteur pT7 #10 de T7 #10 de T7 #10 de T7 lacO + + terminateur T# T# de T7 T# de T7 T# de T7 cDNA du aFGF + + + lacI q + + parCBA-parDE' - + Exemple 2- Stabilité du plasmide d'expression au cours de la production du aFGF Cet exemple décrit la production, en milieu liquide, du aFGF à partir d'une souche de E. Çgli recombinante, possédant un plasmide d'expression du aFGF, T7- polymérase dépendant, et qui est cultivée en absence de sélection du plasmide. As production du aFGF, la présence du plasmide est suivie par la résistance des bactéries à la kanamycine dont le gène de résistance est porté par les plasmides décrits dans l'exemple 1.Enfin la protéine aFGF produite est caractérisée par des mettrodes de biochimie classiques. Exemple 2.1-Stabilité du plasmide d'expression en absence des conditions d'induction de la production de aFGF. Les plasmides pXL2283, pXL2434 et pXL2435 sont introduits par transformation dans la souche BL21, DE3 (Studier et al., 1990). Parmi les transformants qui sont sélectionnés sur milieu gélosé LB contenant de la kanamycine, deux transformants, pris au hasard, sont cultivés 16 heures en milieu liquide LB en présence de kanamycine. La culture est diluée au 1/100ème et cultivée en milieu LB en présence de kanamycine jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm soit comprise entre 0,2 à 0,6. Une dilution des cultures au 1/lOOème en milieu LB est réalisée dans 10 ml de milieu, et les souches sont cultivées jusqu'à une DO comprise entre 0,17 à 0,6. Cette dilution-croissance des bactéries, dans le milieu sans antibiotique à 370C, est répétée six fois et correspond, au total, à un nombre de générations de plus de 30, obtenu après deux jours.Les bactéries sont étalées sur milieu gélosé LB. Après croissance, 100 clones sont striés sur les milieux gélosés LB et LB contenant de la Km. Sur le tableau 2 figure la fréquence de clones résistants à la Km après au moins 30 générations sans pression de sélection du plasmide. Cet exemple montre que le fragment de RP4 stabilise le plasmide en absence de pression de sélection, même si cet effet de stabilisation n'est que modéré. Exemple 2.2-Stabilité du plasmide d'expression dans les conditions d'induction de la production de aFGF. Les bactéries cultivées pendant au moins 30 générations en absence d'antibiotique (comme cela est décrit à l'exemple 2.1) sont diluées au 1/lOOème en milieu LB, et cultivées 12 heures puis diluées alors au 1/100eme en milieu LB. Lorsque les bactéries sont poussées jusqu'à une DO de 0,5 à 0,8; lmM d'IFrG sont ajoutés et les bactéries sont cultivées pendant 4 heures pour permettre la production du aFGF, qui est quantifiée sur les extraits cellulaires totaux déposés sur gel SDS PAGE à 15 %, coloré au bleu de Coomassie (voir figure 2). Les bactériens sont étalées sur milieu gélosé LB. Après croissance, 100 clones sont striés sur les milieux gélosés LB et LB contenant de la kanamycine. Sur le tableau 2 figure la fréquence des cloues résistants à la kanamycine après production du aFGF sans pression de sélection du plasmide. Cet exemple montre sans ambiguïté que le fragment W induit une stabilité ségrégationnelle très importante suite à l'expression du aFGF en utilisant le système d'expression dépendant de la polymérase du phage T7. Tableau 2. Pourcentage des clones résistants à la kanamycine après cmiscnce seulement ou croissance (au moins 30 générations) puis expression, sans pression de sélection du plasmide Culture dilution sans Culture expression sans Kanamycine Kanamycine plasmide nombre de % clones nombre de 56 clones Productioa :: pXL générations résistants à générations résistants à de aFGF la Km laKm 2283 (n"l) 30 20 45 0,1 E 2283 (n 2) 30 10 45 0,2 # 2434 (n 1) 40 100 45 1 ++ 2434 (n 2) 40 99 45 5 ++ 2435 (n 1) 40 100 45 99 ++ 2435 (n 1) 40 100 45 100 ++ #: expression du aFGF non détectée après coloration au bleu de Coomassie ++: expression très élevée du aFGF environ 10 % des protéines totales. Exemple 2.3-Caractérisation de la protéine aFGF produite en présence du plasmide d'expression du aFGF. Dans les conditions d'induction de production décrites dans l'exemple 2.2, la protéine aFGF obtenue est visualisée, voir figure 2, sur gel PAGSSDS à 15 % colorée au bleu de Coomassie, et migre avec un poids moléculaire apparent de 16 kDa, en accord avec les données biochimiques décrites et la séquence publiée (laye et al., 1986 et 1987). De plus cette protéine est révélée par détection immunologique colorimétrique utilisant des anticorps anti-aFGF bovin. La séquence N-terminale de la protéine produite avec la souche BL21, DE3 pXL2435 a ensuite été déterminée à partir de l'extrait total qui a été purifié par élecophorèse PAGESDS, comme cela a été décrit dans les techniques générales de biochimie.La séquence obtenue est A-S G-E-I-T-T-F-T-A-LT, elle est identique à la séquence N-terminale de la potine native (laye et al., 1986) et la méthionine terminale a été coupée par la méthionylaminopeptidase de E. coli comme cela a été discuté par Hirel et aL, 1989. Cet exemple montre donc que la protéine produite à l'aide d'un plasmide d'expression stable chez E. coli décrit dans l'exemple 2.2, est la protéine aFGF, et que sa séquence N-terminale n'est pas tronquée. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue R. ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 920165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé de production de protéines recombinantes, plasmides et cellules modifiées. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version Ni .25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8501 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: circulaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: GATCTCGATC CCGCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGG AATTGTGAGC GGATAACAAT 60 TCCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACATATG GCTGAAGGGG 120 AAATCACCAC CTTCACAGCC CTGACCGAGA AGTTTAATCT GCCTCCAGGG AATTACAAGA 180 AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG GCCACTTCCT GAGGATCCTT CCGGATGGCA 240 CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC AGTGCGGAAA 300 GCGTGGGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGGCCA GTACTTGGCC ATGGACACCG 360 ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG GAAAGGCTGG 420 AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA AGAAGCATGC AGAGAAGAAT UrUG 480 GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC CAGAAAGCAA 540 TCTTGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTTCTG ATTAAAGAGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC 600 GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG 660 CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATATCCAC 720 AGGACGGGTG TGGTCGCCAT GATCGCGTAG TCGATAGTGG CTCCAAGTAG CGAAGCGAGC 780 AGGACTGGGC GGCGGCCAAA GCGGTCGGAC AGTGCTCCGA GAACGGGTGC GCATAGAAAT 840 TGCATCAACG CATATAGCGC TAGCAGCACG CCATAGTGAC TGGCGATGCT GTCGGAATGG 900 ACGATATCCC GCAAGAGGCC CGGCAGTACC GGCATAACCA AGCCTATGCC TACAGCATCC 960 AGGGTGACGG TGCCGAGGAT GACGATGAGC GCATTGTTAG ATTTCATACA CGGTGCCTGA 1020 CTGCGTTAGC AATTTAACTG TGATAAACTA CCGCATTAAA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 1080 CAAACATGAG AATTCTTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 1140 ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 1200 ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 1260 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 1320 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC 1380 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT 1440 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 1500 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 1560 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT 1620 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA 1680 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGGAA CGCTACCTTT 1740 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC 1800 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG cATCCATGTT 1860 GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT 1920 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GACCAAAATC ccT1::'AACGTG 1980 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 2040 CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 2100 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 2160 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 2220 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 2280 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 2340 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 2400 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 2460 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 2520 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC 2580 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2640 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 2700 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 2760 GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCTG ATGCGGTATT 2820 TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATATA TGGTGCACTC TCAGTACAAT 2880 CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC 2940 ATGGCTGCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC 3000 CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT 3060 TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGGCAG CTGCGGTAAA GCTCATCAGC GTGGTCGTGA 3120 AGCGATTCAC AGATGTCTGC CTGTTCATCC GCGTCCAGCT CGTTGAGTTT CTCCAGAAGC 3180 GTTAATGTCT GGCTTCTGAT AAAGCGGGCC ATGTTAAGGG CGGTTTTTTC CTGTTTGGTC 3240 ACTGATGCCT CCGTGTAAGG GGGATTTCTG TTCATGGGGG TAATGATACC GATGAAACGA 3300 GAGAGGATGC TCACGATACG GGTTACTGAT GATGAACATG CCCGGTTACT GGAACGTTGT 3360 GAGGGTAAAC AACTGGCGGT ATGGATGCGG CGGGACCAGA GAAAAATCAC TCAGGGTCAA 3420 TGCCAGCGCT TCGTTAATAC AGATGTAGGT GTTCCACAGG GTAGCCAGCA GCATCCTGCG 3480 ATGCAGATCC GGAACATAAT GGTGCAGGGC GCTGACTTCC GCGTTTCCAG ACTTTACGAA 3540 ACACGGAAAC CGAAGACCAT TCATGTTGTT GCTCAGGTCG CAGACGTTTT GCAGCAGCAG 3600 TCGCTTCACG TTCGCTCGCG TATCGGTGAT TCATTCTGCT AACCAGTAAG GCAACCCCGC 3660 CAGCCTAGCC GGGTCCTCAA CGACAGGAGC ACGATCATGC GCACCCGTGG CCAGGACCCA 3720 ACGCTGCCCG AGATGCGCCG CGTGCGGCTG CTGGAGATGG CGGACGCGAT GGATATGTTC 3780 TGCCAAGGGT TGGTTTGCGC ATTCACAGTT CTCCGCAAGA ATTGATTGGC TCCAATTCTT 3840 GGAGTGGTGA ATCCGTTAGC GAGGTGCCGC CGGCTTCCAT TCAGGTCGAG GTGGCCCGGC 3900 TCCATGCACC GCGACGCAAC GCGGGGAGGC AGACAAGGTA TAGGGCGGCG CCTACAATCC 3960 ATGCCAACCC GTTCCATGTG CTCGCCGAGG CGGCATAAAT CGCCGTGACG ATCAGCGGTC 4020 CAGTGATCGA AGTTAGGCTG GTAAGAGCCG CGAGCGATCC TTGAAGCTGT CCCTGATGGT 4080 CGTCATCTAC CTGCCTGGAC AGCATGGCCT GCAACGCGGG CATCCCGATG CCGCCGGAAG 4140 CGAGAAGAAT CATAATGGGG AAGGCCATCC AGCCTCGCGT CGCGAACGCC AGCAAGACGT 4200 AGCCCAGCGC GTCGGCCGCC ATGCCGGCGA TAATGGCCTG CTTCTCGCCG AAACGTTTGG 4260 TGGCGGGACC AGTGACGAAG GCTTGAGCGA GGGCGTGCAA GATTCCGAAT ACCGCAAGCG 4320 ACAGGCCGAT CATCGTCGCG CTCCAGCGAA AGCGGTCCTC GCCGAAAATG ACCCAGAGCG 4380 CTGCCGGCAC CTGTCCTACG AGTTGCATGA TAAAGAAGAC AGTCATAAGT GCGGCGACGA 4440 TAGTCATGCC CCGCGCCCAC CGGAAGGAGC TGACTGGGTT GAAGGCTCTC AAGGGCATCG 4500 GTCGAGATCC CGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTTACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC 4560 CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG 4620 GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG TGAGACGGGC 4680 AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG GTCCACGCTG 4740 GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG ATGGTGGTTA ACGGCGGGAT ATAACATGAG 4800 CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG CAGCCCGGAC 4860 TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG CATCGCAGTG 4920 GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT GGCACTCCAG 4980 TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT ATGCCAGCCA 5040 GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC GATTrGCTGG 5100 TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG GGAGAAAATA 5160 ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC ATTAGTGCAG 5220 GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT CAGCCCACTG 5280 ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC GCTTCGTTCT 5344 ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT CGCCGCGACA 5400 ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG CAACGACTGT 5460 TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC CATCGCCGCT 5520 TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC GCGGGAAACG 5580 GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG TTTCACATTC 5640 ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA GGTTTTGCGC 5700 CATTCGATGG TGTCCGGGAT CTCGACGCTC TCCCTTATGC GACTCCTGCA TTAGGAAGCA 5760 GCCCAGTAGT AGGTTGAGGC CGTTGAGCAC CGCCGCCGCA AGGAATGGTG CATGCAAGGA 5820 GATGGCGCCC AACAGTCCCC CGGCCACGGG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC 5880 GCTCATGAGC CCGAAGTGGC GAGCCCGATC TTCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC 5940 GCCAGCAACC GCACCTGTGG CGCCGGTGAT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT 6000 CGAGATCCAT ATGACGTCGA CGCGTCTGCA GAAGCTTGCA TGCCAGCTTC TGGTTCGTCG 6060 GCTGGGTGAT GGCGTCGGTT TTGGCCGGCG GCGTCGGCGC GATCGCCAGC GCGAAGCAAC 6120 TGGCGTTCCT CGGCGAACAT AGCGGCATGG TGGCCTTCGG CTTCTTCCGC GACCAGGTGA 6180 AGGACATGCA CTGCGATGCG GACGTGATCC TGGCCCGGTG GGATGAAAAG GCGAACTCGC 6240 CGGTGGTCTA CCGCTGCCCG AAGGCGTACC TGCTCAACAG GTTCGCATCC GCGCCCTTCG 6300 TGCCCTGGCC GGACTACACC GAGGGGGAAA GCGAGGATCT AGGTAGGGCG CTCGCAGCGG 6360 CCCTGCGGGA CGCGAAAAGG TGAGAAAAGC CGGGCACTGC CCGGCTTTAT TTrrGCTGCT 6420 GCGCGTTCCA GGCCGCCCAC ACTCGTTTGA CCTGGCTCGG GCTGCATCCG ACCAGCTTGG 6480 CCGTCTTGGC AATGCTCGAT CCGCCGGAGC GAAGCGTGAT GATGCGGTCG TGCATGCCGG 6540 CGTCACGTTT GCGGCCGGTG TAGCGGCCGG CGGCCTTCGC CAACTGGACA CCCTGACGTT 6600 GACGCTCGCG CCGATCCTCG TAGTCGTCGC GGGCCATCTG CAAGGCGAGC TTCAAAAGCA 6660 TGTCCTGGAC GGATTCCAGA ACGATTTTCG CCACTCCGTT CGCCTCGGCG GCCAGCTCCG 6720 ACAGGTCCAC CACGCCAGGC ACGGCCAGCT TGGCCCCTTT GGCCCGGATC GACGCAACCA 6780 GGCGCTCGGC CTCGGCCAAC GGCAAGCGGC TGATGCGGTC GATCTTCTCC GCAACGACGA 6840 CTTCACCAGG TTGCAGGTCC GCGATCATGC GCAGCAGCTC GGGCCGGTCG GCGCGTGCGC 6900 CGGACGCCTT CTCGCGGTAG ATGCCGGCGA CGTAGTACCC GGCGGCCCGC GTGGCCGCTA 6960 CAAGGCTCTC CTGGCGTTCA AGATTCTGCT CGTCCGTACT GGCGCGCAGG TAGATGCGGG 7020 CGACCTTCAA CCTTCGTCCC TCCGGTTGTT GCTCTCGCGT CGCCATTTCC ACGGCTCGAC 7080 GGCGTGCGGA TCGGACCAGA GGCCGACGCG CTTGCCTCGC GCCTCCTGTT CGAGCCGCAG 7140 CATTTCAGGG TCGGCCGCGC GGCCGTGGAA GCGATAGGCC CACGCCATGC CCTGGTGAAC 7200 CATCGCGGCG TTGACGTTGC GCGGCTGCGG CGGCCGGCTG GCCAGCTCCA TGTTGACCCA 7260 CACGGTGCCC AGCGTGCGGC CGTAACGGTC GGTGTCCTTC TCGTCGACCA GGACGTGCCG 7320 GCGGAACACC ATGCCGGCCA GCGCCTGGCG CGCACGTTCG CCGAAGGCTT GCCGCTTTTC 7380 CGGCGCGTCA ATGTCCACCA GGCGCACGCG CACCGGCTGC TTGTCTACCA GCACGTCGAT 7440 GGTGTCGCCG TCGATGATGC GCACGACCTC GCCGCGCAGC TCGGCCCATG CCGGCGAGGC 7500 AACGACCAGG ACGGCCAGCG CGGCAGCGGC GCGCAGCATG GCGTAGCTTC GGCGCTTCAT 7560 GCGTGGCCCC ATTGCTGATG ATCGGGGTAC GCCAGGTGCA GCACTGCATC GAAATTGGCC 7620 TTGCAGTAGC CGTCCAGCGC CACCCGCGAG CCGAACGCCG GCGAAAGGTA CTCGACCAGG 7680 CCGGGCCGGT CGCGGACCTC GCGCCCCAGG ACGTGGATGC GCCGGCCGCG TGTGCCGTCG 7740 GGTCCAGGCA CGAAGGCCAG CGCCTCGATG TTGAAGTCGA TGGATAGAAG TTGTCG(TAG 7800 TGCTTGGCCG CCCTCATCGC GTCCCCCTTG GTCAAATTGG GTATACCCAT TTGGGCCTAG 7860 TCTAGCCGGC ATGGCGCATT ACAGCAATAC GCAATTTAAA TGCGCCTAGC GCATTTTCCC 7920 GACCTTAATG CGCCTCGCGC TGTAGCCTCA CGCCCACATA TGTGCTAATG TGGTTACGTG 7980 TATTTTATGG AGGTTATCCA ATGAGCCGCC TGACAATCGA CATGACGGAC CAGCAGCACC 8040 AGAGCCTGAA AGCCCTGGCC GCCTTGCAGG GCAAGACCAT TAAGCAATAC GCCCTCGAAC 8100 GTCTGTTCCC CGGTGACGCT GATGCCGATC AGGCATGGCA GGAACTGAAA ACCATGCTGG 8160 GGAACCGCAT CAACGATGGG CTTGCCGGCA AGGTGTCCAC CAAGAGCGTC GGCGAAATTC 8220 TTGATGAAGA ACTCAGCGGG GATCGCGCTT GACGGCCTAC ATCCTCACGG CTGAGGCCGA 8280 AGCCGATCTA CGCGGCATCA TCCGCTACAC GCGCCGGGAG TGGGGCGCGG CGCAGGTGCG 8340 CCGCTATATC GCTAAGCTGG AACAGGGCAT AGCCAGGCTT GCCGCCGGCG AAGGCCCGTT 8400 TAAGGACATG AGCGAACTCT TTCCCGCGCT GCGGATGGCC CGCTGCGAAC ACCACTACGT 8460 TTTTTGCCTG CCGCGTGCGG GCGAACCCGC GTTGGTCGTC G 8501 Références Chambers, S., Prior, S., Barstow, D., and Minton, N. (1988) Gene 68: 139-149. Denêfle P., Kovarik, S., Guiton, J.D., Cartwright, T., and Mayas, J.-F. (1987) Gene 56: 61-70. Eberl L., Kristensen C., Givskov M., Grohmann E., Gerlitz M., and Schawb H. (1994) Mol. Microbiol. 12: 131-141. Edman P. (1956) Acta Chemica Scandinavia 10: 761-768. Gerlitz et al., (1990) J. Bact. 172: 6194-6203 Gibson T. (1984) Ph.D., University of Cambridge, Cambridge, England. Hirel P., Schmitter P., Dessen P., and Blanquet S. (1989) Proc. NatL Acd Sci. 86: 8247-8251. Jaye M., Howk R., Burgess W., Ricca G., Chui I., Ravera M., Ombrien S., Modi W., Maciag T., and Drohan W. (1986) Science 233: 541-545. Jaye M., Burgess W., Shaw A., Drohan W. (1987) J. Biol. Chern 262: 16612 16617. Matsudaira P. (1987)J. Biol. Chem. 262: 10035-10038. Roberts et al. (1994)J. Mol. Biol. 237: 35-51. Sambrook J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd edn. Cold Spring Harbor, New Yorlc: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Studier, W. F., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., and Duberndorff, J. W. (1990) Methods Enzymol. 185:89-60. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messin, J. (1985) Gene 33: 1033-119. REVENDICATIONS 1 Plasmide d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur du bactériophage T7 et une région stabilisatrice comprenant tout ou partie de la région par du plasmide RP4 ou d'un dérivé de celle-ci. 2. Plasmide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur du bactériophage T7 est le promoteur du gène 10. 3. Plasmide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la région stabilisatrice comprend une partie de la région par du plasmide RP4. 4. Plasmide selon la revendication 3 caractérisé en ce que la région stabilisatrice est constituée du fragment compris entre les résidus 6038 et 8499 de la séquence SEQ ID n" 1. 5 Plasmide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qurS comporte en outre l'opérateur lacO et le gène 1 q. 6. Plasmide selon la revendication 5 caractérisé en ce que ropérateur i0 est situé en aval du promoteur du bactériophage T7 et en amont de la séquence d'acide nucléique d'intérêt. 7. Plasmide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour une protéine intérêt pharmaceutique, agroalimentaire ou utilisable en biocatalyse. 8. Plasmide selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour une protéine choisie parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les neuro- transmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques, les apolipoprotéines, la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine CF1R, les gènes suppresseurs de tumeurs, les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation ou les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN. 9. Plasmide selon la revendication 8 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour un facteur de croissance acide des fibroblastes (aFGF). 10. Plasmide selon la revendication 9 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour le aFGF(154). 11. Plasmide pXL2435 présentant la séquence SEQ ID n" 1. 12. Procédé de production de protéine recombinante caractérisé en ce que l'on cultive une bactérie contenant: - un plasmide selon l'une des revendications 1 à 1 1 portant une séquence d'acide nucléique codant pour ladite protéine, et, - le gène de l'ARN polymérase du bactériophage T7, dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que le gène de rARN polymérase du bactériophage T7 est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible. 14. Procédé selon les revendications 12 ou 13 caractérisé en ce que le gène de l'ARN polymérase du bactériophage T7 est intégré au génome de la bactérie utilisée. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14 caractérisé en ce que la bactérie est choisie parmi les souches dE. coli. 16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la bactérie est la souche E, coli BL21, DE3. 17. Procédé selon les revendications 12 à 16 pour la production de aFGF recombinant. 18. Procédé de préparation de aFGF recombinant caractérisé en ce que ron cultive une bactérie contenant le plasmide pXL2435 et le gène de l'ARN polymérase du bactériophage T7 dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique, et on récupère le aFGF produit. 19. Bactérie transformée par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 11.