FR 2712897 A1 19950602 FR 9314068 A 19931124 GENE DE RESISTANCE A LA TOXICITE DE LA MELASSE, PRODUITS RELIES ET LEUR UTILISATION POUR ANALYSER ET AMELIORER LES MICROORGANISMES ET LES PELASSES La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques et à leur utilisation pour analyser et améliorer les micro-organismes et les mélasses. I1 est connu que les levures, champignons et certaines bactéries peuvent se multiplier (cas de la production de biomasse) et/ou fermenter (cas de distilleries ou autre production) sur des sous-produits issus des sucreries. Ceux-ci constituent pour les micro-organismes un substrat qui est largement utilisé en industrie. Ces produits secondaires des sucreries peuvent être soit des produits dérivés de la betterave sucrière soit de la canne à sucre. Deux différents substrats issus de la betterave sucrière, sont utilisés: - le jus de betterave ; il est obtenu par diffusion de râpure de betterave dans l'eau chaude (70"C) et contient 12 à 16% de saccharose; - et la mélasse (ou égouts) ; elle correspond aux résidus de sucrerie. La première étape de la fabrication du sucre commence par l'obtention du jus de betterave, puis celui-ci est traité de manière à extraire le sucre blanc. Les résidus de cette extraction sont nommés mélasse et contiennent encore environ 50% (p/p) de saccharose. La différence principale entre le jus de betterave et la mélasse, mis à part leur différence de concentration en saccharose, est que la mélasse est beaucoup plus concentrée, d'un facteur 4 à 5, en diverses substances non-sucre (minérales et organiques) que le jus de betterave. L'extraction du sucre aboutit à la concentration de substances non-sucre dans la mélasse. Celles-ci gênent considérablement le métabolisme des micro-organismes, notamment la croissance. Un autre substrat utilisable est la mélasse de canne à sucre. Elle diffère de la mélasse de betterave sur plusieurs points - le métabolisme de la plante d'origine est très différent de celui de la betterave ainsi les diverses substances nutritives non-sucre sont d'une autre nature - les sucres (environ 50%) sont répartis en saccharose (30 à 40%) et en glucides réducteurs (15 à 208) constitués de glucose et de fructose - de nombreux acides minéraux et organiques sont présents ce qui donne, à l'inverse de la mélasse de betterave, un pH inférieur à 7 - de nombreuses gommes et polyglucosides divers sont répertoriés : pentosane, dextrane. Ces produits constituent environ 2 à 4% de la mélasse et proviennent de la plante ou sont synthétisés par divers micro-organismes. Ces molécules ne peuvent pas être utilisées par la levure - les matières minérales (environ 5 à 10%) sont souvent plus importantes que dans la mélasse de betterave ; les matières protéiques (2 à 3%) sont au contraire en quantité plus faible. I1 a été observé une diminution de croissance sur mélasse, d'où est apparue la notion de mélasse toxique. Afin de comprendre quels sont les éléments impliqués dans ce phénomène d'inhibition, divers travaux ont été menés pour réaliser un inventaire des constituants de la mélasse. Alors que les acides aminés, les sucres et les composés minéraux de la mélasse avaient déjà été étudiés de façon détaillée, divers composés volatiles non encore répertoriés ont été l'objet d'analyses. Ainsi il a été mise en évidence la présence dans les mélasses d'acide acétique, d'acide propionique, et d'alcool benzylique ainsi que divers autres acides. De nombreuses combinaisons contenant des pyrazines, des pyrrols, des furanes et des phénols ont été identifiés, résultant vraisemblablement des réactions chimiques relatives au chauffage (réactions de Maillard). D'autre part, des acides organiques aliphatiques ou aromatiques ont été également identifiés (Von Tressl et al. 1976). Les additifs, utilisés en sucrerie pour l'amélioration des rendements d'extraction, peuvent être retrouvés dans les mélasses en tant qu'éléments inhibiteurs. Des dosages de ces additifs (émulsifiants, désinfectants, agents de floculation, détartrants et agents mouillants) ont été entrepris (Bronn et Fattohi 1988 et Fiedler 1981). Il s'avèrent que chaque additif peut contribuer à l'inhibition des levures mais leurs concentrations dans la mélasse est inférieur au seuil d'inhibition. Ainsi les causes de la toxicité des mélasses restent encore obscures et peu connues. Concernant cette toxicité, les inventeurs ont mis en évidence qutil existe avant tout un élément spécifique premier, limitant la croissance des levures, qui correspond à l'effet majeur d'inhibition. Cet effet est le plus important et est dissociable de l'effet d'inhibition par le non-sucre lié à la pression osmotique. De plus cette toxicité est variable selon les lots de mélasse. Par le terme spécifique, ou toxicité spécifique, on entend tout élément de la mélasse dont la toxicité sur les micro-organismes peut être annulée ou diminuée par la présence dans ledit micro-organisme des séquences nucléotidiques de l'invention, de préférence en au moins quatre copies. Les moyens mis en oeuvre actuellement pour contourner ce phénomène de toxicité sont - l'utilisation de souches de micro-organisme naturellement résistantes (ce qui limite le nombre de micro-organismes utilisables). En effet les inventeurs ont observé que différentes souches industrielles présentaient des sensibilités naturelles différentes vis-à-vis de mélasses toxiques, - l'amélioration génétique classique des souches, de manière à élargir la gamme de souches utilisables. Cette amélioration consiste à créer soit par mutation soit par croisement une grande quantité de souches et à tester systématiquement leurs performances. En raison de la multiplicité des caractères et des gènes en jeu, cette sélection est fastidieuse et peu productive, - l'utilisation judicieuse des mélasses. Cette utilisation peut consister soit à un mélange de mélasses ayant des degrés de toxicité très différents pour amoindrir le niveau de toxicité de l'ensemble, soit à l'introduction de différents lots de mélasse à différentes étapes du procédé (par exemple : débuter la fermentation levurienne sur une mélasse peu toxique et lorsque le métabolisme est bien productif, finir la fermentation avec une mélasse beaucoup plus toxique) ou enfin simplement à diluer des mélasses fortement toxiques. Mais ce sont des solutions au coup par coup qui doivent être adaptées à chaque fermentation. Toutes ces techniques restent dépendantes d'une matière première éminemment variable conduisant par là même à des aléas imprévisibles dans les rendements de production, ce qui est préjudiciable à l'industrie en cause. - Diverses approches ont permis l'amélioration de souches de levures vis-à-vis d'éléments toxiques limitant la croissance et la compréhension de ces phénomènes. Ainsi il a été montré que la résistance de souche de Saccharomyces à une concentration élevée en cuivre était directement corrélée au nombre de copie de gène au locus CUP1. (Welch et al 1983). D'autre part, la surexpression du gène HAL1 permet l'amélioration de la croissance de levure sur un milieu à concentration élevée en NaCl. En effet la croissance des souches est très sensible aux fortes concentrations en NaCl qui constitue alors un élément inhibiteur en relation avec la pression osmotique (Gaxiola et al 1992). Par ailleurs concernant l'inhibition par la pression osmotique les gènes HOG 1 à 4 ont été identifiés et interviennent effectivement en réponse à l'augmentation de la pression osmotique (Brewster et al 1993). Au-delà de l'inhibition due à la pression osmotique, le ou les éléments, contenus dans la mélasse, inhibant la croissance des micro-organismes restent un problème imparfaitement résolu. Les auteurs ont mis en évidence que le degré d'inhibition de la croissance d'un micro-organisme sur une mélasse était dans la plupart des cas corrélable au nombre de copies d'un gène particulier dans ledit micro-organisme, et par voie de conséquence à la quantité d'une protéine exprimée par ledit gène. Ils ont mis en place des procédés de mesure de la sensibilité des micro-organismes aux mélasses et/ou de la toxicité de ces mélasses. La solution est apportée par l'isolement d'une séquence nucléotidique et son utilisation. La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle permet dans une cellule utilisant de la mélasse comme substrat dans un milieu de culture, l'expression d'une protéine ou d'un peptide capable de conférer à ladite cellule une résistance accrue à la toxicité de la mélasse, ladite séquence d'acide nucléique étant choisie dans le groupe constitué par a) la séquence représentée sur la figure 1 ou son brin complémentaire, b) la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, ladite séquence étant la région codante, appelée gène RTM1, c) la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 2235 de la séquence de la figure 1 ou son brin complémentaire, d) la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, e) les séquences dérivées de l'une ou de l'autre des séquences définies dans (a), (b), (c) ou (d) par substitution de un ou plusieurs de leurs nucléotides, voire même addition ou délétion de certains codons, dès lors que cette séquence continue à coder pour une protéine conférant la susdite propriété à l'hôte dans lequel elle est exprimée. On entend au sens de la présente invention, par séquence dérivée, aussi bien une séquence d'ADN ou d'ARN simple-brin ou double-brin, que leurs séquences complémentaires. La séquence de la figure 1 comprend notamment les sites de restriction suivants : BglII, HindIII, EcoRV, ClaI et BamHI, comme indiqué sur la figure 2, et utiles pour la préparation de sondes de détection. Font également partie de l'invention les séquences homologues comportant des nucléotides variants par rapport à ceux ci-dessus définis et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure où ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les acides nucléiques précédemment définis ou avec les fragments de ceux-ci. L'invention a également pour objet les fragments de ladite séquence utiles pour l'expression et la détection du gène, qui sont notamment des sondes ou des amorces d'amplification par PCR, et sont susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence définie dans la figure 1. Selon un mode de réalisation avantageux, la séquence de ladite sonde est homologue ou complémentaire d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence I. Au sens de la présente invention, "séquence homologue" englobe non seulement les séquences identiques à la séquence I, ou à un fragment (partie) de celle-ci, mais également celles n'en différant que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de nucléotides, à condition que les séquences ainsi modifiées aient une spécificité d'hybridation à la séquence I ou du segment considéré. De même, on entend par "séquence complémentaire", non seulement les séquences strictement complémentaires de la séquence I ou de ses fragments, mais également des séquences modifiées, comme indiqué précédemment, possédant une spécificité d'hybridation aux séquences strictement complémentaire. Les conditions d'hybridation sont celles qui sont communément connues et appliquées aussi bien pour des sondes courtes (de 10 à 100 nucléotides) que pour des sondes longues (supérieur à 100 nucléotides). Les sondes peuvent être choisies plus particulièrement dans le groupe constitué par a) les séquences définies dans (a) à (e) cidessus, b) les fragments de restriction de la séquence représentée dans les figures 1 et 2, notamment - le fragment compris entre les nucléotides 492 et 1538 de la séquence de la figure 1, - le fragment compris entre les nucléotides 1537 et 2167 de la séquence de la figure 1, c) toute séquence homologue ou dérivée d'une séquence définie dans (a) ou (b) par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs nucléotides dès lors que cette séquence s'hybride spécifiquement avec tout ou partie de la séquence nucléotidique représentée dans la figure 1. Les fragments, sondes ou amorces peuvent, le cas échéant, être associées de façon covalente à une substance de marquage détectable directement ou indirectement notamment par un signal radioactif optique ou luminescent. La détection peut s'effectuer par des méthodes aujourd'hui classiques d'amplification, la méthode la plus répandue étant la PCR (Polymerase Chain Reaction). Les couples d'amorces de polymérisations d'ADN constitués par des sondes telles que définies ci-dessus choisis de telle façon qu'ils autorisent l'amplification d'un fragment compris dans la séquence de la figure 1 font partie de l'invention. Un exemple de couple d'amorces utilisable est constitué des deux séquences suivantes 5' ATGTCAAATGACTCTAGTGG3' et 5' GGTTTCAAGGACTGACACTC3'. Dans tout ce qui suit, les définitions suivantes sont adoptées. On entend par éléments permettant l'expression d'une séquence, les séquences régulatrices promotrices et terminatrices, qu'elles soient propres au gène ou que se soit toute séquence appropriée pour l'expression de la séquence minimale codante dans la cellule hôte choisie. On entend par cellule hôte tout micro-organisme approprié, notamment Saccharomyces, d 'autres levures, des champignons et des bactéries dans lesquels au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention précisée ci-dessus, sera introduite pour y être répliquée et/ou exprimée. On entend par transformation tout procédé permettant l'introduction dans la cellule hôte d'une ou plusieurs copies de la séquence nucléotidique conforme à l'invention précisée ci-dessus. Un tel procédé peut être utilisé pour la surexpression du gène RTM1. Cette surexpression peut être réalisée soit par un vecteur multicopie, soit par intégration simple ou multiple au même locus ou à différents loci et/ou sous le contrôle d'un promoteur fort et/ou inductible. La présente invention est également relative aux vecteurs d'expression contenant une ou plusieurs copies des séquences d'acides nucléiques, notamment celles décrites de (a) à (e), sous le contrôle de promoteurs appropriés à l'expression dans le micro-organisme dans lequel il est destiné. De façon préférée, et pour que la résistance à la toxicité de la mélasse soit notable, le nombre de copie de la séquence est égal ou supérieur à 4, et le vecteur utilisé est un vecteur multicopie. Comme il sera indiqué de façon détaillée dans les exemples qui suivent, un vecteur avantageux pour transformer la levure, et notamment Saccharomyces cerevisiae est le vecteur multicopie pFL44L, tel que décrit dans Bonneaud N. et al. (1991), dans lequel on intègre une ou plusieurs copies d'une séquence choisie dans le groupe constitué par a) la séquence représentée sur la figure 1 ou son brin complémentaire, b) la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, ladite séquence étant la région codante, appelée gène RTM1, cy la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 2235 de la séquence de la figure 1 ou son brin complémentaire, d) la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, e) les séquences dérivées de l'une ou de l'autre des séquences définies dans (a), (b), (c) ou (d) par substitution de un ou plusieurs de leurs nucléotides, voire même addition ou délétion de certains codons, dès lors que cette séquence continue à coder pour une protéine conférant la susdite propriété à l'hôte dans lequel elle est exprimée. Le vecteur ayant intégré la séquence de 2.8 kb entre les sites SphI et KpnI est représenté dans la figure 3 et est appelé pFL44L-2,8 est présent dans la souche LG16-2,8 déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n I-1376. L'invention est également relative aux hôtes cellulaires recombinants comprenant une ou plusieurs séquences telles que décrites dans les sections (a) à (e) ci-dessus, ou un vecteur ou plusieurs vecteurs selon l'invention, ces hôtes pouvant présenter une résistance accrue à la toxicité de la mélasse entrant dans la composition de leur milieu de culture. Ces cellules hôtes de l'invention sont des microorganismes d'intérêt industriel ; il peut s'agir notamment - de levures, notamment de levures de boulangerie, ou d'oenologie ou de distillerie, - de bactéries, notamment E. coli, Streptomyces spp, Bacillus spp, Corynebacterium spp ou Zymomonas mobilis, - de champignons, notamment Aspergillus, Penicillium oU Trichoderma reseii. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de surexpression du gène RTM1 ou équivalent, conférant une résistance à la toxicité de la mélasse peut être adapté par exemple à un vecteur multicopie contenant une origine de réplication d'un microorganisme hôte approprié (notamment une cellule eucaryote ou une bactérie), au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique totale ou minimale telle que définie ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression conférant à la cellule hôte une amélioration de croissance sur mélasse. Selon ce mode de réalisation avantageux, on obtient une cellule hôte transformée nommée 4126-2,8 DM déposée sous le n I-1377 en date du 23 novembre 1993 à la C.N.C.M. L'invention est également relative à une protéine ou un polypeptide caractérisé en ce qu'il contient la séquence d'acides aminés représentée dans la figure 6, ladite séquence étant susceptible de conférer à la cellule qui la contient une résistance accrue à la toxicité de la mélasse. On entend par protéine ou polypeptide de l'invention, outre la séquence représentée dans la figure 6, toute séquence modifiée par rapport à la séquence de la figure 6 par délétion, insertion, remplacement ou addition d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que le polypeptide ainsi modifié est impliqué dans une résistance à la toxicité de la mélasse entrant dans le milieu de culture d'un microorganisme d'intérêt industriel. Cette protéine ou polypeptide a une structure de type protéine membranaire, s'apparentant en terme de structure aux récepteurs adrénergiques et présentent une partie hydrophile et une partie hydrophobe. La partie hydrophile est un bon candidat pour représenter une partie active de la protéine dans sa fonction d'augmentation de la résistance à la toxicité de la mélasse. Elle est également un bon candidat comme immunogène dans l'objectif d'obtenir des anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques de la protéine de l'invention. La séquence comprise entre les acides aminés 1 et 309, ou toute séquence dérivée ou modifiée avec les significations données ci-dessus fait également partie de l'invention, à partir du moment où cette séquence est fonctionnellement associée à la résistance à la toxicité de la mélasse. Enfin, les anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine ou un de ses fragments font également partie de l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et de quantification de la présence, dans une culture de micro-organismes industriels, d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention, caractérisé par la succession d'étapes suivantes - 1'ADN du micro-organisme est rendu accessible à l'hybridation soit par extraction, soit par perméabilisation cellulaire, - 1'ADN est hybridé avec une sonde associée directement ou indirectement à une substance de marquage détectable directement ou indirectement notamment par un signal radioactif optique ou luminescent, - le cas échéant, le procédé de détection utilise la technique PCR, 1'ADN étant amplifié en utilisant un couple d'amorces tel que défini plus haut, à savoir des séquences nucléotidiques homologues ou complémentaires à tout ou partie de la séquence définie dans la figure 1 et notamment les oligonucléotides suivants 5' ATGTCAAATGACTCTAGTGG3' et 5' GGTTTCAAGGACTGACACTC3' L'invention est aussi relative à un procédé de détection et de mesure de la présence d'un polypeptide dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse ou micro-organismes industriels caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des anticorps polyclonaux ou monoclonaux contre les protéines ou polypeptides correspondant à la séquence de la figure 6 ou des fragments de celle-ci, dans un test immunométrique notamment une méthode de type sandwich, ou de compétition. La mise en oeuvre des procédés de détection et/ou de quantification a l'avantage de permettre notamment: - l'évaluation de la sensibilité des micro-organismes vis-à-vis des mélasses, - la recherche du nombre de copies du gène RTM1 dans divers micro-organismes (Saccharomyces, champignons ou autre levure que Saccharomyces et bactéries), - la caractérisation de micro-organismes. En effet, il existe une telle variabilité concernant ce gène qu'il est possible de fournir un profil d'hybridation spécifique à chaque souche de levure Saccharomyces cerevisiae analysée. Un kit de détection de la présence d'un polypeptide dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse à des microorganismes industriels fait aussi partie de l'invention et est caractérisé en ce qu'il comprend: - des anticorps, le cas échéant marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction immunologique de type anticorps-antigène, - le cas échéant des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé. Une trousse de détection par PCR de la présence d'un gène dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse à des microorganismes industriels dont le milieu de culture contient de la mélasse fait partie de l'invention et se caractérise en ce qu'elle comprend notamment: - au moins des amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus, le cas échéant marquées, - des nucléotides triphosphate dATP, dCTP, dTTP et dGTP, - un agent de polymérisation de 1'ADN. La présente invention a également pour objet un procédé de mesure caractérisé en ce que les cellules hôtes transformées permettent, de façon spécifique, de mesurer la toxicité due à ou aux éléments inhibiteurs contenus dans les mélasses. Selon un mode de réalisation avantageux, la toxicité des mélasses se mesure par la croissance différentielle entre une cellule (un micro-organisme) d'origine sensible et la même cellule transformée par plusieurs copies (de préférence par un nombre supérieur à 3) de la séquence définie ci-dessus, et ceci dans les mêmes conditions de culture. Ce mode de réalisation permet de mesurer la toxicité des mélasses, selon les lots et le temps de stockage. I1 permet de mesurer la présence de ou des éléments spécifiques toxiques dans toute fraction de la mélasse. I1 permet enfin de mesurer (de quantifier) la sensibilité de toute souche de micro-organisme, en fabricant des lots de mélasse de référence. La présente invention est également relative à un procédé d'amélioration des micro-organismes et notamment des micro-organismes industriels, caractérisé en ce que la transformation d'un quelconque de ces micro-organismes par une séquence nucléotidique ou un vecteur contenant ladite séquence muni des éléments régulateurs appropriés, permet l'amélioration de sa croissance sur tous milieux solides et/ou liquides contenant de la mélasse. Ce procédé consiste préférentiellement à transformer le micro-organisme d'intérêt industriel par un vecteur multicopie comprenant au moins une copie d'une séquence et ses dérivés telle que définie dans la figure 1. Un exemple de micro-organisme amélioré par le procédé de l'invention est donné dans l'exemple 5 ciaprès dans lequel une souche de Saccharomyces cerevisiae a été transformée par le vecteur multicopie pFL44L-2,8-14 DM et a été identifiée sous la référence 4126-2,8 DM et déposée auprès de la C.N.C.M. sous le n" I-1377 en date du 23 novembre 1993. Ce procédé permet de répondre spécifiquement à la limitation de croissance de certains micro-organismes sur les mélasses. L'avantage de la présente invention par rapport à la génétique classique, est que ce procédé (la surexpression de ladite séquence dans une cellule hôte, notamment une levure) apporte une amélioration spécifique et importante sans obligation de remettre en jeu l'ensemble des autres caractères de la souche. Les souches obtenues auront des meilleures performances sur la plupart des lots de mélasse augmentation de la vitesse de croissance, amélioration du rendement en biomasse et reproductibilité des fermentations. Ainsi le domaine d'application recouvre, les industries produisant les levures (notamment les levures de boulangerie, de distillerie, d'oenologie et de brasserie), les industries utilisatrices de levures (notamment pour la production d'alcool comme les distilleries), les industries de production de toute sorte de métabolites (notamment protéines, enzymes, acides aminés, acides organiques, xanthame etc...) et autres industries de fermentation, en fait tout procédé utilisant la mélasse comme substrat de croissance de micro-organisme d'intérêt industriel. L'invention couvre également toute trousse de mesure de la toxicité spécifique d'une mélasse sur la croissance d'un micro-organisme, notamment une levure d'intérêt industriel, contenant - une ampoule d'un micro-organisme témoin, - une ampoule du même micro-organisme transformé et contenant au moins 4 copies du gène conférant la résistance à la toxicité de la mélasse audit microorganisme, ces deux ampoules se présentant sous une forme . permettant leur conservation, notamment la lyophilisation, - le cas échéant, des mélasses permettant de préparer un milieu de référence. L'invention permet de cribler des mélasses devant entrer dans la composition de milieux de culture de micro-organismes industriels, par un procédé caractérisé en ce que l'on mesure la concentration minimale inhibitrice desdites mélasses sur une lignée cellulaire comportant au moins quatre séquences nucléotidiques selon l'invention comparée à la CMI obtenue avec une lignée cellulaire ne les comportant pas. L'invention permet encore d'identifier le ou les constituants de la mélasse responsable diune toxicité sur la croissance de micro-organismes industriels, caractérisé par la mise en oeuvre des étapes suivantes: - fractionnement de la mélasse par des techniques de fractionnement ménagé, - séparation des constituants de la ou des fractions pour lesquelles l'effet toxique est conservé, - mesure de l'effet toxique de chacun de ces constituants, les mesures de toxicité à chacune des étapes étant réalisées par mesure de la CMI d'une mélasse sur une lignée de référence et sur une lignée ayant incorporé au moins 4 copies d'une des séquences de l'invention, l'indice d'une toxicité spécifique étant apporté par l'effet différentiel du constituant sur la souche de référence et la souche transformée. Une souche de référence appropriée pour ce faire peut être par exemple la souche LG16 et la souche transformée LG16-pFL44L-2, 8. La présente invention est enfin relative à l'utilisation en tant que marqueur de sélection de la séquence nucléotidique conforme à la figure 1, ou ses dérivés, fragments ou séquences complémentaires notamment pour les levures, lors d'expérience de transformation. Elle constitue un système de sélection positive en tant que marqueur dominant, permettant la sélection des micro-organismes (notamment des levures) sur mélasse. Son utilisation avantageuse permet ainsi d'une part la sélection sur mélasse de la souche transformée par cette séquence et d'autre part l'amélioration de la croissance sur mélasse de ladite souche. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux figures annexées, dans lesquelles - la figure 1 représente la séquence nucléotidique de 2,8 kb contenant le gène RTM1, - la figure 2 représente la carte de restriction d'un fragment de 2,8 kb contenant le gène RTM1, dont la partie codante est indiquée par la flèche, - la figure 3 est une représentation du plasmide pFL44L-2,8, - la figure 4 est une représentation du plasmide pFL44L-2,8-14DM, - la figure 5 représente la détection par autoradiographie des chromosomes de levure Saccharomyces cerevisiae, hydridés par une sonde spécifique du gène RTM1, - la figure 6 représente la séquence peptidique de la protéine codée par le gène RTM1. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils constituent en aucune manière une limitation. Techniques moléculaires Les techniques générales de manipulation d'ADN utilise comme référence le manuel de laboratoire (Sambrook et al 1989). Les enzymes sont utilisées comme le recommande le fabricant et proviennent des laboratoires BRL (Bethesda Research Laboratories) et Boehringer (Boehringer Mannheim). Les techniques utilisées concernent essentiellement les étapes suivantes - digestion par des enzymes de restriction, - obtention d'extrémités franches d'ADN à partir de bouts cohésifs par l'activité de l'enzyme Klenow, - ligation de molécule d'ADN par la ligase du bactériophage T4, - marquage de sonde à a32P-dCTP par la méthode d"'amorçage au hasard" (ou random priming), - transfert d'ADN sur membrane à partir de gel d'agarose, - hybridation d'ADN par les sondes marquées, - préparation de chromosomes de la levure Saccharomyces cerevisiae dont le protocole est adapté de celui décrit par Carle et Olson (1985), - séparation de chromosomes de la levure Saccharomyces cerevisiae : les conditions de séparation sur un appareil de type CHEF correspondent à une migration à 200V durant 27 h dans un tampon 0,5 X TBE (50 mM Tris, 50 mM acide borique, 1 mM EDTA), avec des impulsions de 70 s durant une période de 15 h puis de 120 s durant une période de 12 h. Techniques de transformation La transformation des levures est réalisée soit par la méthode au LiCl (Ito et al (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168, ou soit par électroporation (Delorme 1989 et Becker et Guarente 1990). Préparation des milieux de culture contenant de la mélasse La mélasse apporte principalement la source de carbone indispensable à la croissance de la levure, ainsi que divers composés organiques, minéraux et des oligo-éléments. Elle est composée d'environ 50% de saccharose. Pour être certain d'apporter tous les minéraux et les oligo-éléments essentiels, on adjoint au milieu de culture de 1'YNB (Yeast Nitrogen Base) sans acides aminés (Difco). (En remarque il a été observé qu'avec ou sans YNB les mêmes résultats sont obtenus). Le pH du milieu d'une valeur de 8-9 est amené à pH 5 (condition de pH industrielle) par l'addition d'H2S04. I1 a été vérifié préalablement que cette acidification du milieu ne provoquait pas d'inhibition de la croissance des levures. Différentes concentrations en mélasse sont utilisées pour les différents tests. Composition des milieux de culture utilisés de 40 à 500 g mélasse 6,7 g YNB sans acides aminés 10 g agar (pour les milieux solides) qsp 1 litre eau distillée pH 5 Le milieu est stérilisé à llO'C pendant 30 minutes. Isolement du gène RTM1 I1 a été recherché la présence d'un gène qui, surexprimé, permet l'amélioration de la croissance de Saccharomyces cerevisiae sur un milieu de culture contenant de la mélasse. - Construction d'une banque d'ADN génomique L'ADN génomique a été extrait de la souche FL100 (Lacroute 1968). L'ADN a subit une digestion partielle par l'enzyme de restriction Sau3A. Les fragments d'ADN issus de cette digestion, dont la taille est comprise entre 5 et 8 kb ont été purifiés. Ceux-ci ont été clonés dans le vecteur multicopie pFL44L (Bonneaud N. 1991) au site BamHI du multi-sites de clonage. La souche F100 ure~, issue de la souche FL100, auxotrophe pour l'uracile, a été transformée par ces plasmides recombinants. - Sélection Le milieu de sélection consiste en un milieu de culture contenant une concentration en mélasse supérieure à la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice en mélasse) de la souche FL100 qui est de 16%. La banque a été étalée sur le milieu de sélection (contenant 40% de mélasse) gélosé et coulé en boîte de Petri (au total 108 cellules transformées sont étalées par boîte). Après 2 à 4 jours de culture à 30"C, quelques colonies sont apparues sur un tapis de cellules mortes. Parmi les clones positifs, 10 ont été analysés. Tous contenaient un plasmide portant le même fragment d'ADN de 4,5 kb. Ce fragment porté par le vecteur multicopie pFL44L a été réduit (par digestion-religature) en un fragment de 2,8 kob SphI-KpnI présentant la capacité lors de sa surexpression d'améliorer la croissance de FL100 sur mélasse. Ce vecteur est présent à quelques dizaines de copies par cellules. Cette construction est nommée pFL44L-2,8 et présentée figure 3. - EXEMPLE 1 : Evaluation de la sensibilité des souches La détermination du nombre de loci portant le gène RTM1 est réalisée par hybridation des chromosomes de souches de Saccharomyces cerevisiae séparés par champs pulsés, par une sonde marquée. Cette sonde correspond au fragment de 1045 paires de bases HindIII-BamHI de la séquence I. L'évaluation de la capacité de croissance de ces souches est réalisée sur milieu solide et liquide contenant différente concentration de mélasse. Les résultats (tableau 1) montrent que les souches ne présentant aucun gène RTM1 ou uniquement une copie ont leur croissance totalement inhibée à 16 % de mélasse. Par contre les souches contenant 4 voire 5 copies du gène RTM1 sont beaucoup plus résistantes à la mélasse : elles sont capable de pousser sur un milieu contenant 40 % de mélasse. Tableau 1 nombre de copies du gène CMI RTM1 par souches (% de mélasse) 0 16 1 16 4 ou 5 > 40 Ainsi ces résultats démontrent bien qu'il existe, dans la plupart des cas, une corrélation entre le nombre de copies du gène RTM1 et la capacité de croissance sur mélasse. La CMI, ou concentration minimale inhibitrice, correspond à la concentration minimale de mélasse dans le milieu de culture qui inhibe à 100% la croissance, de préférence sur milieu solide, de la souche concernée. EXEMPLE 2 : Identification / Caractérisation de souches Un profil d'hybridation est présenté figure 5 représentant l'hybridation des chromosomes de 3 souches de Saccharomyces cerevisiae séparés par champs pulsés, par la sonde marquée utilisée dans l'exemple 1. On observe que les trois profils, correspondant à trois souches d'origine différente, sont bien distincts. Grâce au degré élevé de variabilité concernant la localisation du gène RTM1, il est possible de déterminer un profil d'hybridation caractéristique à une souche. Ceci est confirmé par l'obtention de profil spécifique pour 11 souches différentes (résultats non montrés). EXEMPLE 3 : Mesure de la toxicité des mélasses de façon spécifique L'utilisation de la levure de laboratoire LG16 ne contenant aucun gène RTM1 (Crouzet et al. 1991), ainsi que de cette même souche transformée par le vecteur multicopie pFL44L-2,8 décrit figure 3, a permis de mesurer la différence de toxicité entre 2 lots de mélasse. Cette souche ainsi transformée a été déposée sous la référence LG16-2,8 à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1376. Les résultats sont montrés tableau 2, dans lequel "+" signifie croissance de la souche, "-" non croissance et "+/-" croissance intermédiaire, suivant le comportement de la souche sur des milieux gélosés (test en goutte). Tableau 2 lot 1 lot 2 % de mélasse 16 30 30 50 souche LG16 - - + souche LG16 transformée par + + + pFL44L-2,8 A même concentration en mélasse dans le milieu de culture (30%), la souche LG16 est capable de pousser sur un milieu contenant le lot 2 mais pas le lot 1. Ce dernier est beaucoup plus toxique que le lot 2 et sa présence à 16% dans le milieu de culture suffit à inhiber la croissance de la souche de laboratoire LG16. En comparaison les croissances observées pour la souche LG16 transformée sont données. Présent en multicopie le gène RTM1 permet de restituer une croissance élevée sur le milieu contenant une mélasse toxique. Sa surexpression répond spécifiquement à l'inhibition de la croissance par le ou les éléments toxiques présents dans le lot 1. Ces éléments inhibiteurs sont en concentration beaucoup plus faible dans le lot 2 et la croissance de la souche transformée n'est pas beaucoup plus importante que celle de la souche non transformée. On observe par ailleurs à forte concentration en mélasse (50%) une inhibition équivalente pour les deux souches. Cette inhibition de croissance semble dans ce cas plutôt liée à la pression osmotique. Ainsi l'utilisation de la croissance différentielle entre une souche "sensible" et cette même souche transformée par le vecteur pFL44L-2,8, permet d'évaluer le degré de concentration de ou des éléments toxiques spécifiques. EXEMPLE 4 : Fabrication de lots de référence pour mesurer la sensibilité des souches de micro-organismes L'utilisation des souches LG16 ainsi que de cette même souche transformée par le vecteur multicopie pFL44L-2,8, permet de définir la concentration minimale inhibitrice (CMI) d'un lot de mélasse (tableau 3). Tableau 3 lot 1(% de mélasse) 4 8 12 16 20 30 40 50 LG16 + + +/- - - - - - LG16 transformée par pFL44L-2,8 + + + + + + + Ainsi pour le lot 1 de mélasse, cette CMI correspond à 16% ou 80g de saccharose/l de milieu. On peut définir quelque soit le lot de mélasse, sa dilution limite où on observe une discrimination de la croissance entre LG16 et LG16 transformée par pFL44L-2,8. A partir de cette valeur limite utilisée comme référence, on peut définir la sensibilité à la mélasse de toute souche (tableau 4). Tableau 4 lot 1(% de mélasse) 4 8 12 16 20 30 40 50 souche D + - - - - - - - Y + + + + + - - - Z + + + + + + + La souche D est la souche ATCC 4126. Celle-ci, transformée par le plasmide pFL44L-2,8 14DM décrit figure 4, est nommée 4126-2,8DM déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1377. Les CMI sont de 8%, 30% et supérieure à 50% pour les souches D, Y et Z respectivement. EXEMPLE 5 : Amélioration de la croissance sur mélasse Le vecteur multicopie (présenté figure 2 ) associé à un marqueur de sélection approprié peut être utilisé pour améliorer la croissance de micro-organismes industriels, notamment de levure. Le fragment BamHI-HindIII de 4,6 kb issu du pFD384 contenant le gène muté de la C14 a lanostérol déméthylase (p450 14DM) (Doignon et al 1993), est inséré par ligation dans le vecteur multicopie pFL44L-2,8 au site unique KpnI. Préalablement les extrémités de ces deux molécules sont rendues franches par l'activité de l'enzyme Klenow. La construction obtenue est nommée pFL44L-2,8-14DM (figure 4). La présence dans une levure du gène muté de la C14 a lanostérol déméthylase, confère à celle-ci une résistance à l'inhibiteur : fluzilazol. Une levure industrielle D est transformée par cette construction et sélectionnée sur un milieu contenant une concentration en fluzilazol (2pg/ml) supérieure à la CMI pour cette souche. Comme témoin cette même souche est transformée par pFD384. Les clones sélectionnés pour leur résistance à cette concentration inhibitrice de fluzilazol, sont testés pour leur capacité de croissance sur un milieu de culture contenant une concentration toxique en mélasse pour la souche (tableau 5). Tableau 5 Milieu solide Milieu liquide milieu de culture fluzilazol mélasse mélasse 20% 2 bg/ml 20% 0 16 40 48h souche D - - 0,01 0,01 0,01 0,03 D transformée par pFD384 + - 0,01 0,01 0,02 0,03 D transformée par pFL44L-2,8-14DM + + 0,01 0,2 9,0 20,0 Le tableau 5 montre, sous forme schématisée, la croissance sur milieu solide (mélasse et fluzilazol) et la croissance, mesurée en densité optique à différents temps de culture, sur milieu liquide contenant 20% de mélasse du lot 1. Ces mesures ont été réalisées pour la souche industrielle D, cette même souche transformée par le vecteur pFD384 et la souche industrielle D transformée par la construction pFL44L-2,8-14DM. Les mêmes résultats sont obtenus pour différents clones correspondant à ces trois type de levure. Ces résultats permettent de conclure que la surexpression du gène RTM1 dans une levure industrielle lui confère la capacité de se multiplier sur un milieu contenant une concentration normalement toxique en mélasse. EXEMPLE 6 : Marqueur de sélection Le vecteur pFL44L-2,8 défini figure 2, peut être utilisé pour le clonage d'un gène donné. Le gène RTM1 utilisé comme marqueur dominant permettra à la souche transformée par un tel plasmide d'être sélectionnée positivement sur mélasse. BIBLIOGRAPHIE - Becker D.M.et Guarente. Methods in Enzymology (1990) 194, 182. - Bonneaud N., O. Ozier-Kalogeropoulos, G. Li, M. Labouesse, L. Minvielle-Sebastia and F. Lacroute. A Family of Low and High Copy Replicative, Integrative and Single-Stranded S. cerevisiae/E. coli. Shuttle Vectors. Yeast (1991) 7,609-615. - Brewster J.L., T. de Valoir, N.D. Dwyer, E. Winter et M.C. 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Séquence d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle permet dans une cellule utilisant de la mélasse comme substrat dans un milieu de culture, l'expression d'une protéine ou d'un peptide capable de conférer à ladite cellule une résistance accrue à la toxicité de la mélasse, ladite séquence d'acide nucléique étant choisie dans le groupe constitué par a) la séquence représentée sur la figure 1 ou son brin complémentaire, b) la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, ladite séquence étant la région codante, c) la séquence comprise entre les nucléotides 664 et 2235 de la séquence de la figure 1 ou son brin complémentaire, d) la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1591 de la figure 1 ou son brin complémentaire, e) les séquences dérivées de l'une ou de l'autre des séquences définies dans (a), (b) ou (c) par substitution de un ou plusieurs de leurs nucléotides, voire même addition ou délétion de certains codons, dès lors que cette séquence continue à coder pour une protéine conférant la susdite propriété à l'hôte dans lequel elle est exprimée. 2. Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides nucléiques d'au moins 10 nucléotides susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence telle que définie dans la figure 1. 3. Sonde selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par a) les séquences définies dans (a) à (e) de la revendication 1, b). les fragments de restriction de la séquence représentée dans les figures 1 et 2, notamment - le fragment compris entre les nucléotides 492 et 1538 de la séquence de la figure 1, - le fragment compris entre les nucléotides 1537 et 2167 de la séquence de la figure 1. c) toute séquence homologue ou dérivée d'une séquence définie dans (a) ou (b) par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs nucléotides dès lors que cette séquence s'hybride spécifiquement avec tout ou partie de la séquence nucléotidique représentée dans la figure 1. 4. Sonde selon les revendications 2 et 3, caractérisée en ce qu'elle est associée de façon covalente à une substance de marquage détectable directement ou indirectement notamment par un signal radioactif optique ou luminescent. 5. Couple d'amorces de polymérisations d'ADN constitué par des sondes selon l'une des revendications 2 à 4 choisie de telle façon qu'il autorise l'amplification d'un fragment compris dans la séquence de la figure 1. 6. Couple d'amorces selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est constitué des deux séquences suivantes 5' ATGTCAAATGACTCTAGTGG3' et 5' GGTTTCAAGGACTGACACTC3' 7. Vecteur biologiquement fonctionnel, caractérisé en ce qu'il contient une ou plusieurs copies d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1. 8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur multicopie. 9. Vecteur selon les revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pFL44L-2,8 utilisé pour transfecter une souche de levure s. Cerevisiae LG16 et déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1376. 10. Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou une ou plusieurs copies d'un vecteur selon l'une des revendications 7 à 9, lequel hôte peut présenter une résistance accrue de la toxicité de la mélasse entrant dans la composition de son milieu de culture. 11. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de levures, notamment de levures de boulangerie, ou d'oenologie ou de distillerie. 12. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie, notamment E. coli, Streptomyces spp, Bacillus spp, Corynebacterium spp ou Zymomonas mobilis. 13. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un champignon, notamment Aspergillus, Penicillium ou Trichoderma reseii. 14. Cellule hôte selon les revendications 10 et 11, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche de levure Saccharomyces cerevisiae 4126-2,8 DM déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1377. 15. Polypeptide caractérisé en ce qu'il contient la séquence d'acides aminés représentée dans la figure 6, ladite séquence étant susceptible de conférer à la cellule qui la contient une résistance accrue à la toxicité de la mélasse. 16. Polypeptide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés modifiée par rapport à la séquence de la figure 6 par délétion, insertion, remplacement ou addition d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que le polypeptide ainsi modifié est impliqué dans une résistance à la toxicité de la mélasse entrant dans le milieu de culture d'un micro-organisme d'intérêt industriel. 17. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 1 et 309 de la figure 6 ou à toute partie de cette séquence fonctionnellement associée à la résistance à la toxicité de la mélasse. 18. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement un polypeptide, défini selon l'une des revendications 15 à 17 ou un fragment de ceux-ci. 19. Procédé de détection et de quantification de la présence, dans une culture de micro-organismes industriels, d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé par la succession d'étapes suivantes - 1'ADN du micro-organisme est rendu accessible à l'hybridation soit par extraction, soit par perméabilisation cellulaire, - 1'ADN est hybridé avec une sonde marquée directement ou indirectement telle que défini dans les revendications 2 à 4, - le cas échéant, 1'ADN est amplifié par PCR en utilisant un couple d'amorces selon les revendications 5 ou 6, - la révélation de la présence et le cas échéant de la quantité de marquage. 20. Procédé de détection selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il utilise le procédé de la PCR avec un couple d'amorces selon la revendication 5 ou 6. 21. Procédé de mesure de la toxicité spécifique d'une mélasse sur la croissance d'un micro-organisme consistant à comparer les croissances relatives sur ladite mélasse d'un micro-organisme avant et après transformation avec un plasmide multicopie contenant au moins 1 copie du gène RTM1, et mesurer l'augmentation de la concentration minimale inhibitrice pour la souche transformée par rapport à la souche non transformée. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la souche témoin est Saccharomyces Cerevisiae LG16 et la souche transformée LG16-2,8 déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1376. 23. Trousse de mesure de la toxicité spécifique d'une mélasse sur la croissance d'un micro-organisme, notamment une levure d'intérêt industriel, contenant - une ampoule d'un micro-organisme témoin, - une ampoule du même micro-organisme transformé et contenant au moins 4 copies du gène conférant la résistance à la toxicité de la mélasse audit microorganisme, ces deux ampoules se présentant sous une forme permettant leur conservation, notamment la lyophilisation, - le cas échéant des mélasses permettant de préparer un milieu de référence. 24. Procédé d'amélioration de la croissance de production d'un micro-organisme d'intérêt industriel dont la croissance s'effectue sur un milieu de culture contenant de la mélasse consistant à transformer ladite souche par un vecteur contenant au moins une copie d'une séquence telle que définie dans la revendication 1. 25. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendications 1, comme marqueur de sélection d'un micro-organisme d'intérêt industriel dont la croissance se fait sur un milieu contenant de la mélasse. 26. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 2 à 4, comme marqueur de sélection de micro-organisme d'intérêt industriel dont la croissance se fait sur un milieu contenant de la mélasse. 27. Procédé de détection et de mesure de la présence d'un polypeptide dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse aux micro-organismes industriels dont le milieu de culture contient de la mélasse, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des anticorps selon la revendication 17 dans un test immunométrique notamment une méthode de type sandwich, ou de compétition. 28. Kit de détection de la présence d'un polypeptide dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse à des microorganismes industriels dont le milieu de culture contient de la mélasse, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps selon la revendication 18, le cas échéant marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction immunologique de type anticorps-antigène, - le cas échéant des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé. 29. Kit de détection de la présence d'un gène dont la présence confère une résistance accrue à la toxicité de la mélasse à des micro-organismes industriels dont le milieu de culture contient de la mélasse, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins des amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 5 ou 6, le cas échéant marquées, - des nucléotides triphosphates dATP, dCTP, dTTP, dGTP, - un agent de polymérisation de 1'ADN. 30. Procédé de criblage de mélasses devant entrer dans la composition de milieux de culture de microorganismes industriels, caractérisé en ce que l'on mesure la concentration minimale inhibitrice desdites mélasses sur une lignée cellulaire comportant au moins quatre séquences nucléotidiques selon la revendication 1 comparée à la CMI obtenue avec la même lignée cellulaire ne les comportant pas. 31. Procédé d'identification du ou des constituants de la mélasse responsable d'une toxicité sur la croissance de micro-organismes industriels, caractérisé par la mise en oeuvre des étapes suivantes - fractionnement de la mélasse par des techniques de fractionnement ménagé, - séparation des constituants de la ou des fractions pour lesquelles l'effet toxique est conservé, - mesure de l'effet toxique de chacun de ces constituants, les mesures de toxicité à chacune des étapes étant réalisées par mesure de la CMI de chacune des fractions sur une lignée de référence et sur la même lignée ayant incorporé au moins 4 copies d'une des séquences de la revendication 1, l'indice d'une toxicité spécifique étant apporté par l'effet différentiel du constituant sur la souche de référence et la souche transformée. 31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la souche de référence est la souche LG16 et la souche transformée LG16-2,8 déposée à la C.N.C.M. le 23 novembre 1993 sous le n" I-1376.