FR 2699191 A1 19940617 FR 9215195 A 19921216 NOUVEAUX VECTEURS RETROVIRAUX, LIGNEES CELLULAIRES LES CONTENANT, ET LEUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES TUMEURS La thérapie génique offre de nouvelles possibilités pour le traitement des tumeurs. Parmi les différentes options, le transfert de gène peut avoir pour but de tuer les cellules tumorales soit indirectement par l'induction ou le renforcement d'une réponse immunitaire de l'hôte (S.A. Rosenberg, Cancer Res. 51:5074 (1991)) ou directement par l'insertion d'un "gène suicide" (F.L. Moolten, Cancer Res. 46:52-76 (1986)). Le gène suicide le plus étudié est celui codant pour la thymidine kinase du virus Herpès Simplex de type 1 (TK-HSV1) (G.B. Elion et al., J. Antimicrob. Chemother. 12:9-17 (1983)). Cette enzyme permet la phosphorylation d'analogues nucléosidiques tels que le ganciclovir (GCV). Ces molécules monophosphates sont ensuite transformées en formes triphosphatées par les enzymes cellulaires. Le GCV triphopshate (GCV-TP) peut alors être incorporé dans 1'ADN durant la division cellulaire, bloquant . la l'élongation et entraînant ainsi la mort de la cellule. Le CGV-TP n'est donc toxique que pour les cellules en division. Cette approche est particulièrement intéressante pour le traitement des tumeurs qui sont constituées de cellules en division rapide dans un tissu constitué de cellules non prolifératives, et l'expression de TK HSV1 par les cellules d'une tumeur située au sein d'un organe dont les cellules ne se divisent pas devrait permettre la destruction spécifique de ces cellules. De plus, il est possible de cibler le transfert de gène sur ces cellules tumorales en utilisant pour la transduction de TK-HSV1 des rétrovirus recombinant dont le génome ne peut s'intégrer et s'exprimer que dans des cellules en division. Le premier modèle expérimental d'ablation par le GCV de cellules tumorales exprimant TK-HSV1 a été réalisé par Moolten (F. L. MOOLTEN, Cancer Res, 46, 1986, p. 5276-5281) ; (F. L. MOOLTEN et J. M. WELLS, J. Natl. Cancer Inst., 82, 1990, p. 297-300). I1 a montré un effet antitumoral du GCV sur la croissance de cellules tumorales de souris, après transfection du gène TK-HSV1 in vitro, et réimplantation chez l'animal. Récemment, l'élimination de tumeurs cérébrales expérimentales microscopiques par injection stéréotaxique de cellules produisant des rétrovirus TK-HSV1 et traitement par le GCV a été rapportée par Culver (K.W. Culver et coll., Science 256:1550-1552 (1992)). Cependant, dans ce modèle les auteurs ne peuvent pas analyser l'effet d'un tel traitement sur des tumeurs établies macroscopiques qui sont rapidement létales. Or, chez les patients les tumeurs solides sont la cible principale de ce type de traitement et le problème de la transduction des gènes suicides dans le contexte d'une masse tumorale est beaucoup plus problématique. Chez l'homme, les métastases hépatiques sont une complication fréquente des cancers digestifs. L'hépatectomie partielle n'est possible que dans environ 15% des cas, et les autres traitements comme la chimiothérapie loco-régionale ou l'immunothérapie n'ont donné jusqu'a présent que des résultats modestes, voire décevants. Par le présent travail, il est montré l'efficacité du traitement de métastases hépatiques expérimentales chez le rat apres transfert in vivo du gène TK-HSV1 par injection directe de fibroblastes murins produisant des particules rétrovirales recombinantes. Dans ce cadre, un des buts de la présente invention est la mise au point d'un système cellules de packaging-vecteur rétroviral recombinant utilisable en thérapeutique pour soigner les tumeurs établies, notamment les tumeurs hépatiques, et dans lequel le produit d'expression du gène recombiné est capable de transformer une prodrogue non toxique en drogue toxique pour les cellules exprimant ledit gène recombinant. Plus précisemment la présente invention a pour but de construire un vecteur rétroviral recombinant susceptible, après transformation d'une lignée fibroblastique de packaging, de produire des pseudoparticules rétrovirales qui, après infection de cellules en division, aboutit à une expression du gène transduit, sans pour autant conduire à une inactivation desdits vecteurs comme cela se produit et a été décrit notamment avec le MuLV-moloney. Les lignées transgéniques murines de la serine Mov ont été établies par Jaenisch et coll. par infection d'embryons de souris par le virus de Moloney-MuLV avant implantation (Jaenisch et al., Cell 24:519-529 (1981)). A ce stade de développement, les animaux sont normalement résistants à l'infection par le MuLV, l'hypothèse étant que 1'ADN proviral subirait un processus de méthylation acquis au cours des divisions cellulaires successives et cette méthylation empêcherait la transcription de 1'ADN. Cependant, avec certaines lignées Mov, le génome MuLV peut être réactivé à un stade particulier du développement et les rongeurs développent des leucémies induites par ce virus oncogène. Ceci est le cas pour les trois lignées suivantes : Mov3, Mov9 et Mov 13. Ce phénotype serait dû à des mutations dans le LTR. La présente invention a donc pour but la construction d'un vecteur rétroviral recombinant dérivé du MuLV-moloney porteur d'un gène suicide susceptible de transformer une substance inactive en substance toxique pour des cellules en division, et caractérisé dans sa structure par la présence de séquences LTR issues de tels variants du MuLV ayant la propriété de ne pas être inactivés lors d'un passage dans des cellules carcinoembryonnaires ou lignées germinales de souris et d'être capables de transfecter des cellules qui se divisent et notamment des cellules tumorales. Le gène suicide utilisé est celui de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex. L'invention concerne également des lignées de packaging transfectées par ce vecteur recombinant dérivé du rétrovirus de Moloney et comprenant le gène TK-HSV1. L'invention concerne plus particulièrement la lignée Mll déposée à la C.N.C.M. le 15 décembre 1992 sous le n I-1278. L'administration in situ dans une tumeur hépatique de ces lignées transfectées, porteuses de gène TK-HSV1 suivi par un traitement par un analogue de nucléotides tel le ganciclovir conduit à une réduction de la masse tumorale supérieure à 90% dans les conditions expérimentales décrites ci-dessous (cf. figure 2). L'invention concerne enfin des compositions thérapeutiques contenant les lignées cellulaires transfectées par des rétrovirus recombinants, utilisable en association avec une prodrogue pour conduire a une destruction sélective des cellules tumorales. L'invention met à profit trois phénomènes distincts 1) l'injection de la composition dans des cellules en divisions, elle-même environnées de cellules quiescentes ; 2) la présence dans cette composition de vecteurs rétroviraux recombinants qui n'infectent que les cellules en division, et par voie de conséquence, le gene ne s'exprime que dans ces cellules 3) l'expression du gène suicide ne tue que les cellules en division. Autrement dit, toutes les cellules en division infectées par les rétrovirus recombinants, et exprimant le gène TK-HSV1 sont susceptibles d'être tuées après traitement par l'analogue nucléosidique, qui peut être ainsi transformé en nucléotide triphosphate et stopper l'élongation de 1'ADN après son intégration dans la chaîne d'ADN en croissance. Les cellules susceptibles dans ce phénomène sont donc - les cellules tumorales cibles - les fibroblastes transfectés, de la composition de l'invention. Les conditions expérimentales ci-apres ont pour but d'illustrer la construction du vecteur rétroviral permettant la sélectivité de l'effet "tueur" décrit ci-dessus, la préparation des lignées transfectées par un tel vecteur, et l'efficacité thérapeutique de la composition contenant ces lignées, lorsque le traitement est associé à l'administration d'une prodrogue tel que le Ganciclovir. 1) Construction du vecteur rétroviral pMTK On décrit la construction d'un vecteur dans lequel le gène HSV1-TK a été placé sous le contrôle d'un 5'LTR des souches MuLV mutantes Mov3, Movl3 et Mov9. L'utilisation de ce plasmide pour la transfection des cellules fibroblastiques CRIP est décrite ensuite. Les ligatures des différents fragments de restriction des souches Mov3, Movl3 et Mov9 sont réalisées de la façon suivante LTR-5' - Mov3 jusqu'au site BamHI (-350 du départ de transcription). - Movl3 du site BamHI (-350) jusqu'au site KpnI (+30). - Mov9 du site KpnI (+30) jusqu'au site PstI (+560)(contient la séquence de packaging t). - La séquence non codante en 3' du site ClaI (+7674) jusqu'à U3 (+7817) provient de Mov3. LTR-3' - Mov3 jusqu'au site BamHI positionné en 7910 (ou -350). - Movl3 jusqu'à la fin de U5. Le fragment contenant le gène HSV1-TK, de 1100 paires de bases, et délimité par les extrémités SalI et NotI a été inséré dans le polylinker aux sites indiqués dans la figure 1. Toutes ces opérations de clonage ont été effectuées en utilisant des techniques classiques (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, a laboratory manual). La figure 1 représente le vecteur rétroviral recombinant. 2) Cultures cellulaires et transfection, établissement de la lignée packaginq Mll Les cellules fibroblastiques t CRIP (O. DANOS, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1988), 85 : 6460-64) ont été cotransfectées avec le vecteur rétroviral pMTK (20 yg) et exprimant TK-HSV1 sous le contrôle du LTR et un plasmide de sélection (1 yg)(pWLNeo, Stratagène). Plusieurs clones ont été isolés en sélection G418. La production de particules virales de ces clones a ensuite été testée par infection de cellules L TK- et sélection de cellules en HAT. L'infection se réalise avec des dilutions successives du surnageant contenant les particules virales, et le comptage du nombre de colonies obtenues dans ces conditions permet de déterminer un titre infectieux. Le clone Mil sélectionné possède un titre de 5.105 particules virales/ml. La lignée NB16 (N. FERRY et al Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88 : 8377-81), également dérivée de cellules Y CRIP, a été utilisée pour évaluer l'infection des cellules tumorales. Elle produit des particules virales exprimant le gène nls-LacZ avec un titre infectieux de 104 particules virales/ml. La lignée DHDK12 est une lignée cellulaire établie de cancer colique chimio-induit chez le rat BDIX, décrite dans Martin et al., Virchows Archiv. A Pathol. Anat. (1991) 418:193. L'invention concerne également les populations de cellules fibroblastiques transformées par un vecteur rétroviral recombinant porteur du gène suicide. 3) Protocole thérapeutique Des rats BDIX mâles syngéniques ont été utilisés. Une tumeur de foie isolée a été induite par une injection directe des cellules DHDK12 sous la capsule du foie. Au jour 5 les tumeurs du foie ont un diamètre compris entre 2 et 3 mm et contiennent approximativement 150 millions de cellules. A ce moment, les rats reçoivent une injection intra-tumorales des fibroblastes producteurs des rétrovirus recombinants (20.106 cellules). Les animaux du groupe contrôle ont reçu des cellules NB16 des fibroblastes qui produisent un rétrovirus recombinant exprimant le nls-lacZ gène. Ce gène code pour une p-galactosidase avec un signal de localisation dans le noyau et peut ainsi servir comme un gène indicateur de suivi de l'infection des cellules tumorales in vivo. Le clone NB16 produit le virus avec un titre de 104 unités formant plaques par millilitre. Le groupe d'animaux traités ont été infectés par la lignée Mll qui produit 5.105 particules infectieuses par millilitre. Après l'injection intra-tumorale des cellules packaging, une période de 5 jours est laissée pour que l'infection des cellules tumorales par le rétrovirus recombinant puisse se produire. Cinq jours plus tard, soit le dizième jour, tous les rats reçoivent du Ganciclovir (GCV) (Syntex), pendant cinq jours à la dose de 150 mg/kg deux fois par jour par voie intrapéritonéale et ce pendant 5 jours. Les rats étaient ensuite sacrifiés à la fin du traitement au Ganciclovir, soit 15 jours après la première injection et une autopsie a été réalisée comprenant une mesure de la taille des tumeurs et une étude anatomopathologique. La figure 2 résume le protocole expérimental décrit ci-dessus et les résultats obtenus sur la réduction des tumeurs, décrits ci-dessous. RESULTATS - Groupe contrôle (nombre de rats : 12) Lors de l'autopsie, tous les lobes injectés présentaient des tumeurs macroscopiques, dont le diamètre moyen le plus large était de 6.5 + 2.1 mm (extrêmes: 3 et 10 mm). Leur volume est calculé d'après la formule V = A x B2/2, dans laquelle A est le diamètre le plus large, et B le diamètre le plus petit mesuré au niveau de la section la plus large de la tumeur (G. Carlsson et al., 1983, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 105:20). Le volume calculé dans ces conditions était de 86.3 + 65.1 mm3 (moyenne + D.S.). L'examen pathologique des tumeurs révélait un aspect typique d'adénocarcinome faiblement différencié, consistant essentiellement en des cellules tumorales organisées en lobules d'épaisseurs variables. Le stroma apparaît fibrotique et entouré de cellules inflammatoires mononucléaires. Le pourcentage de cellules tumorales dans la tumeur peut être estimé à 60%. L'activité P-galactosidase nucléaire est détectée dans des coupes cryostatiques colorées Xdale chez les 6 foies témoins analysés. La fraction des cellules tumorales infectées était inférieure à 1%. - Groupe traité (nombre de rats : 13) : Le diamètre moyen des tumeurs était de 3 plus ou moins 1.1 millimètre (extrêmes : 0.5 et 4 mm) et le volume était de 8.1 plus ou moins 6.7 mm3 (P Mann and Withney Test) (Fig. 2). L'examen pathologique des tumeurs révèle l'efficacité de ce traitement par une diminution très importante de la taille des tumeurs. Sur les 11 foies analysées (2 étaient utilisées pour le contrôle analytique lacZ), deux avaient des tumeurs montrant une réduction de 60 à 20% des cellules tumorales. Ces cellules étaient faiblement organisées et nécrotiques. Elles étaient regroupées dans une réaction fibrotique entourant des cellules mononucléaires inflammatoires et une hyperplasie cancéreuse. Dans 5 autres foies, moins de 10% de cellules cancéreuses ont pu être détectées, avec une réaction fibrotique massive.Dans les quatre derniers foies, quelques rares cellules cancéreuses ont été vus et une nécrose massive de la tumeur entourée par une réaction fibrotique a été observée. Chez tous ces rats, il y avait des signes d'une régénération parenchymateuse. Ces études montrent une régression de tumeurs établies après transfert in vivo d'un gène suicide. Chez des patients un ciblage précis de l'injection des fibroblastes packaging transformés dans la masse tumorale peut être facilitée par une assistance ultra sonographique ou par l'aide de toute microsonde dont la fonction est la localisation desdites masses tumorales. Sachant que le taux de cellules infectées exprimant le gène TK-HSV1 était inférieur à 10% et que la tumeur est réduite de plus de 90% après addition de Ganciclovir, on peut supposer que le phénomène de "coopération métabolique", déjà décrit par Moolten (Moolten, 1986) ou "effet de proximité" (Culver, 1992) est également effectif dans le cas d'une masse tumorale importante. Ce phénomène pourrait s'expliquer par le transfert du ganciclovir phosphorylé des cellules exprimant le gène TK-HSV1 aux cellules ne l'exprimant pas. L'utilisation des cellules fibroblastiques packaging, transformées par un vecteur rêtroviral recombinant portant un gène suicide comme médicament associé à un traitement par le ganciclovir, paraît être efficace pour la réduction de masse tumorales et le traitement des cancers établis. L'invention ne saurait être limitée au mode de réalisation qui a été illustré ci-dessus, - en particulier la mise en oeuvre le couple TK-HSV et le Ganciclovir. L'homme du métier est- à même d'imaginer d'autres couples actifs qui peuvent être mis en oeuvre à ces mêmes fins. On pourra citer par exemple comme gène tueur le gène de la thymidine kinase du cytomêgalovirus couplé au Ganciclovir. La séquence génétique et la structure de la protéine de cette thymidine kinase montrent que celle-ci est relativement différente des kinases cellulaires ou de la kinase du virus Herpès Simplex 1. On peut citer également une enzyme bactérienne, la cytosine désaminase qui est capable de convertir la 5 fluorocytidine en un analogue de nucléotide toxique : le 5 fluoro-Uracyl. On peut enfin imaginer tout autre système de toxicité conditionnelle fondée sur un couple enzyme-médicament et qui permette par le système décrit ci-dessus de tuer spécifiquement les cellules en division. REVENDICATIONS 1. Vecteurs rétroviraux recombinants, dérivés des Moloney MuLV, porteurs d'un gène suicide susceptible de transformer une substance inactive en substance toxique pour des cellules en division, et caractérisés par la présence dans leur structure de séquences LTR issues de variants du MuLV, ayant les propriétés - de ne pas être inactivés lors d'un passage dans des cellules carcino-embryonnaires ou lignées germinales de souris, - dont l'expression du gène suicide ne tue que les cellules en division. 2. Vecteurs rétroviraux recombinants selon la revendication 1, caractérisés en ce que les séquences LTR sont issues des variants Mov3, et/ou Mov9 et/ou Movl3. 3. Vecteurs rétroviraux recombinants selon les revendications 1 et 2, présentant la structure de la figure 1 et dans lesquels le gène suicide est celui de la thymidine kinase du virus herpès simplex. 4. Lignées cellulaires fibroblastiques .de packaging caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur rétroviral recombinant selon l'une des revendications 1 à 3 et productrices desdits virus recombinants. 5. Lignée cellulaire fibroblastique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est transformée en un vecteur recombinant selon la revendication 3, et déposée à la C.N.C.M. le 15 décembre 1992 sous le n" I-1278. 6. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle contient une lignée cellulaire selon les revendications 4 ou 5, ou un vecteur rétroviral recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, active en association avec une prodrogue, pour le traitement de tumeurs solides. 7. Composition thérapeutique selon la revendication 7, caractérisée en ce que le gène suicide intégré dans le vecteur recombinant est celui de la thymidine kinase du virus herpès simplex, et la prodrogue est un analogue de nucléotide tel le ganciclovir ou l'aciclovir.