FR 2706483 A1 19941223 FR 9306897 A 19930609 BIOREACTEUR, DESTINE NOTAMMENT A LA CULTURE DE CELLULES L'invention concerne un bioréacteur, destiné notamment à la culture de cellules d'un type quelconque. Un bioréacteur, tel que décrit par exemple dans la demande de brevet français 92 07345 de la demanderesse, comprend en général au moins une chambre de culture cellulaire en milieu liquide, délimitée notamment par des membranes perméables à porosité contrôlée et/ou par d'autres moyens appropriés assurant le confinement des cellules tout en permettant d'une part l'admission et la répartition uniforme d'un liquide nutritionnel frais et d'autre part l'évacuation du liquide nutritionnel usé et des produits secrétés par les cellules. Des moyens d'ensemencement ou d'inoculation de cellules dans la chambre de culture sont également prévus, ainsi que des moyens de récolte de produits ou de prise d'échantillons. Les moyens d'ensemencement ou d'inoculation débouchent en général directement dans la chambre de culture, si nécessaire en traversant une membrane de confinement des cellules, et peuvent donc être également utilisés pour la prise d'échantillons de cellules dans la chambre de culture. Cependant, aucun moyen n'est en général prévu pour récolter facilement et rapidement les cellules en culture, sauf à ouvrir le bioréacteur pour accéder directement à la chambre de culture et la vider. L'invention a notamment pour but de remédier à cette lacune. Elle a pour objet un bioréacteur du type précité comportant des moyens permettant de récolter de fa çon stérile, automatisable, rapide et simple, des cellules en culture, sans ouverture du bioréacteur. Elle propose à cet effet un bioréacteur comprenant au moins une chambre de culture cellulaire en milieu liquide, délimitée par une paroi périphérique et par deux membranes ou d'autres moyens perméables de confine ment des cellules, des moyens d'alimentation en liquide nutritionnel et des moyens de circulation de gaz dans ladite chambre, ainsi que des moyens obturables d'ensemencement ou d' inoculation débouchant dans ladite chambre de culture, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens de récolte des cellules contenues dans ladite chambre de culture, qui sont constitués par la combinaison de moyens d'apport de liquide nutritionnel et de moyens de sortie, ces derniers étant agencés dans la chambre de culture de telle sorte qu'une amenée de liquide dans cette chambre par les moyens d'apport pousse et entraîne les cellules vers les moyens de sortie lorsque ces derniers sont ouverts. L'invention permet ainsi de récolter la quasitotalité des cellules contenues dans la chambre de culture, de façon simple et rapide au moyen d'une quantité minimale de liquide introduite dans ladite chambre et déplaçant les cellules vers la sortie des moyens de récolte. Par ailleurs, ces moyens de récolte sont utilisables tout aussi bien pour le prélèvement d'échantillons dans la chambre de culture. Avantageusement, les moyens précités d'ensemencement peuvent constituer les moyens de sortie des moyens de récolte. Dans une première forme de réalisation de l'invention, les moyens de récolte comprennent un orifice formé dans une paroi de ladite chambre de culture et débouchant directement à l'intérieur de cette chambre, les moyens d'apport de liquide nutritionnel débouchant également dans cette chambre à l'opposé de cet orifice. De préférence, l'orifice précité des moyens de récolte est formé dans la paroi périphérique de la chambre de culture, et cette paroi périphérique est de forme cylindrique. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, les moyens d'apport comprennent des tubes microperforés ou microporeux ou des tronçons de tubes s'étendant à l'intérieur de la chambre de culture entre les membranes de confinement des cellules. Avantageusement, ces tubes ou tronçons de tubes peuvent être agencés dans un réseau de tubes perméables de circulation de gaz prévus dans ladite chambre, les tubes ou tronçons de tubes d'apport étant alors de préférence implantés dans le réseau à la place de certains des tubes de circulation de gaz. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels la figure 1 est une vue schématique en coupe axiale d'un bioréacteur d'un type connu; la figure 2 est une vue schématique en coupe transversale d'un bioréacteur selon l'invention, du même type que celui représenté en figure 1; la figure 3 est une vue schématique en coupe axiale d'une autre forme de réalisation d'un bioréacteur selon l'invention. Le bioréacteur représenté schématiquement en figure 1 et désigné généralement par la référence 10, est par exemple du type décrit dans la demande de brevet français 92 07345 de la demanderesse et comprend essentiellement une chambre de culture cellulaire 12 délimitée par une paroi périphérique 14 et par deux membranes microporeuses 16 de confinement de cellules, ainsi qu'une chambre 18 d'alimentation en liquide nutritionnel frais, comprenant des moyens appropriés (non représentés) d'amenée et de répartition de liquide nutritionnel, et une chambre 20 de sortie de liquide nutritionnel usé et de métabolites. Typiquement, les pores des membranes 16 ont une taille de l'ordre du Rm. En outre, la chambre de culture 12 comporte en général un réseau de tubes capillaires 22 de circulation de gaz dans l'espace de culture, ces tubes perméables aux gaz permettant par exemple un apport d'oxygène aux cellules en culture et une évacuation de l'oxyde de carbone dégagé par les cellules dans le cas de cellules aérobies. Des moyens d'ensemencement de la chambre de culture ou d'inoculation de cellules dans cette chambre sont également prévus, par exemple sous forme d'un orifice obturable formé dans la paroi périphérique 14 et associé à des moyens d'injection 24. Les mêmes moyens peuvent bien entendu être utilisés pour le prélèvement d'échantillons dans la chambre de culture 12. Un tel bioréacteur et ses caractéristiques générales sont bien connus de l'homme du métier et n'ont pas à être décrits ici plus en détail. L'utilisation du bioréacteur est la suivante une petite quantité de cellules est injectée par les moyens 24 dans la chambre 12 remplie de liquide nutritionnel, puis un débit faible de liquide nutritionnel est admis dans la chambre d'alimentation 18, traverse la membrane inférieure 16, circule dans la chambre de culture 12, puis sort par la membrane supérieure 16 et quitte la chambre de sortie 20 par un conduit 26 schématisé sous forme d'une flèche. Les produits secrétés par les cellules traversent également la membrane supérieure 16 et peuvent être prélevés par ce conduit 26 dans la chambre de sortie 20. L'oxygénation requise par les cellules en culture dans la chambre et l'évacuation des gaz rejetés par les cellules sont assurées par le réseau de tubes perméables 22. Un tel bioréacteur est bien adapté à la production et à la récolte de métabolites, mais ne permet pas de recueillir simplement et rapidement les cellules contenues dans la chambre de culture 12, à moins d'ouvrir le bioréacteur, d'en retirer la chambre de sortie 20 et la membrane supérieure 16 et de vider la chambre de culture 12. L'invention propose divers moyens permettant de simplifier et d'automatiser la récolte des cellules contenues dans la chambre de culture 12, tout en évitant les risques de contamination de ces cellules. On se réfère maintenant à la figure 2 qui représente un premier mode de réalisation de l'invention, pour un bioréacteur du même type que celui représenté en figure 1. On retrouve donc en figure 2, qui est une vue en coupe transversale de ce bioréacteur, la paroi périphérique 14 de la chambre de culture 12, le réseau de tubes capillaires 22 d'aération des cellules, et les moyens 24 d'ensemencement ou d'inoculation et de prise d'échantillons dans la chambre de culture 12. Selon l'invention, des moyens 30 sont également prévus pour l'apport de liquide nutritionnel frais directement dans la chambre de culture 12, ces moyens 30 comprenant des moyens d'alimentation 32 reliés par un conduit ou analogue 34 à au moins un orifice 36 formé dans la paroi périphérique 14 de la chambre, en face ou à l'opposé des moyens 24 précités, cet orifice 36 étant éventuellement associé à des moyens diffuseurs 38 permettant de distribuer et de répartir à peu près uniformément le débit de liquide nutritionnel à l'intérieur de la chambre 12. Dans ce mode de réalisation, la récolte des cellules contenues dans la chambre de culture 12 a lieu de la façon suivante le conduit 24 est raccordé à des moyens récepteurs appropriés 40 et est ouvert, tandis qu'un liquide approprié (par exemple du liquide nutritionnel frais) est amené avec un débit prédéterminé dans la chambre de culture 12 par l'orifice 36 et éventuellement le diffuseur 38. Ce débit étant très faible, le liquide nutritionnel se déplace à l'intérieur de la chambre 12 de fa çon laminaire avec un front sensiblement plan, et pousse doucement vers les moyens de récolte 24, 40 les cellules et le liquide nutritionnel contenus dans la chambre 12. En théorie, il suffit donc d'injecter doucement dans la chambre 12 une quantité de liquide égale au volume libre de cette chambre pour la vider complètement des cellules et du liquide nutritionnel qu'elle contenait. En pratique, les résultats obtenus confirment la théorie, dès lors que la circulation du liquide nutritionnel dans la chambre 12 reste laminaire avec un front d'avance de forme régulière, et que les cellules n'ont pas d'interaction entre elles et avec les matériaux de la chambre 12. On notera que, dans cette forme de réalisation, la paroi périphérique 14 de la chambre 12 est de forme cylindrique à section circulaire, et que les moyens d'apport de liquide nutritionnel et de récolte sont orientés perpendiculairement aux tubes capillaires 22 du réseau d'oxygénation. En variante, la paroi cylindrique 14 pourrait avoir une forme différente en section transversale, par exemple ovale ou elliptique, et les moyens 30 d'apport de liquide nutritionnel et 24, 40 de récolte des cellules pourraient être orientés parallèlement aux tubes d'oxygénation 22. Par ailleurs, dans cette forme de réalisation, on peut conserver les membranes 16 de confinement des cellules comme dans le mode de réalisation de la figure 1, les chambres 18 et 20 formées de part et d'autre de ces membranes pouvant alors servir à la récupération du liquide nutritionnel usé et des métabolites produits par les cellules, ou bien on peut supprimer la membrane inférieure et conserver la membrane supérieure 16 ou un moyen équivalent de confinement de cellules pour récupérer le liquide nutritionnel usé et les produits secrétés par les cellules. Pour fixer les idées, on indiquera à titre d'exemple uniquement, que le diamètre de l'orifice débouchant des moyens de récolte 24 peut être de l'ordre de 1 à 2 mm, et que la vitesse de déplacement du liquide nutritionnel dans la chambre de culture 12 pour la récolte des cellules peut être de l'ordre du millimètre par seconde. On a représenté en figure 3 une variante de réalisation de l'invention, dans laquelle le bioréacteur utilisé est sensiblement du même type que celui de la figure 2 et comporte une chambre de culture 12 délimitée par une paroi cylindrique 14 et par deux membranes 16 microporeuses ou moyens équivalents de confinement des cellules, un réseau de tubes capillaires perméables 22 s'étendant transversalement dans la chambre de culture 12 pour l'oxygénation des cellules et la récupération de l'oxyde de carbone, et des moyens 24, 40 de récolte des cellules. Dans cette variante de réalisation de l'invention, on prévoit que les moyens 42 débouchant dans les chambres 18 et 20 formées de part et d'autre de la chambre de culture 12 peuvent être simultanément reliés à des moyens d'alimentation en liquide nutritionnel, et on remplace certains tubes 22 précités par des tubes 44 poreux ou perforés qui vont servir à l'ensemencement de la chambre de culture 12 et à l'apport de liquide nutritionnel pour la récolte des cellules et qui ont donc des pores ou des perforations de dimension appropriée, de l'ordre de 0, 1 à 1 mm par exemple.. Ces tubes 44 peuvent être du même diamètre que les tubes d'oxygénation 22, pour simplifier la construction, ou avoir un diamètre supérieur comme représenté, si nécessaire ou souhaité. On peut également monter des tronçons de tube ouverts à leurs extrémités, à la place des tubes 44. Dans ce cas, l'utilisation du bioréacteur est la suivante pour la culture des cellules, l'ensemencement de la chambre de culture 12 peut être réalisé au moyen d'un ou plusieurs tubes ou tronçons de tubes 44 précités, l'alimentation en liquide nutritionnel se faisant par l'intermédiaire des moyens 42 débouchant dans la chambre inférieure 18 et au travers de la membrane inférieure 16, la sortie du liquide nutritionnel usé et la récupération des métabolites se faisant dans la chambre supérieure 20 après traversée de la membrane supérieure 16, les tubes ou tronçons de tubes 44 étant bien entendu obturés après l'ensemencement. Pour la récolte des cellules contenues dans la chambre de culture 12, les moyens 42 des chambres 18 et 20 peuvent être reliés tous les deux à des moyens d'apport de liquide approprié (par exemple du liquide nutritionnel frais) comme le sont les tubes ou tronçons de tubes 44. Le flux de liquide pénétrant dans la chambre 12 par les tubes ou tronçons de tubes 44 et à travers les membranes 16 repousse et entraîne les cellules contenues dans cette chambre vers les moyens 24, 40 de récolte. Comme dans le mode de réalisation précédent, il suffit d'injecter dans la chambre 12 une quantité de liquide sensiblement égale à son volume libre interne, pour récolter la totalité ou la quasi-totalité des cellules contenues dans cette chambre. En variante, on peut faire arriver les moyens de récolte 24 sensiblement dans l'axe de la chambre 12 au travers de la membrane supérieure 16. Dans ce cas, ces moyens 24 peuvent servir à la purge de gaz au moment de la mise en route du bioréacteur, à l'ensemencement ou à l'inoculation de cellules, et à la récolte des cellules. REVENDICATIONS 1. Bioréacteur, comprenant au moins une chambre (12) de culture cellulaire en milieu liquide délimitée par une paroi périphérique (14) et par des membranes (16) ou autres moyens perméables de confinement des cellules, des moyens (18) d'alimentation en liquide nutritionnel et des moyens (22) de circulation de gaz dans ladite chambre, ainsi que des moyens obturables (24) d'ensemencement débouchant dans ladite chambre, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens de récolte des cellules contenues dans la chambre de culture (12) qui sont constitués par la combinaison de moyens (30) d'apport de liquide nutritionnel et de moyens de sortie (24), ces derniers étant agencés dans la chambre de culture (12) de telle sorte qu'une amenée de liquide dans cette chambre par les moyens d'apport (30) pousse et entraîne les cellules vers les moyens de sortie (24) lorsque ces derniers sont ouverts. 2. Bioréacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens de récolte comprennent un orifice formé dans une paroi de ladite chambre (12) et débouchant directement dans cette chambre, les moyens d'apport (30) débouchant également dans cette chambre à l'opposé de cet orifice. 3. Bioréacteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'orifice des moyens de récolte est formé dans la paroi périphérique (14) de ladite chambre (12). 4. Bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens d'ensemencement (24) constituent les moyens de sortie des moyens de récolte. 5. Bioréacteur selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les moyens d'apport (30) comprennent au moins un orifice (36) et éventuellement des moyens de diffusion (38) débouchant directement dans la chambre (12) de culture. 6. Bioréacteur selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la paroi périphérique (14) de la chambre de culture est de forme cylindrique. 7. Bioréacteur selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les moyens d'apport comprennent des tubes (44) microperforés ou microporeux ou des tronçons de tubes s'étendant à l'intérieur de la chambre (12) entre les membranes (16) de confinement des cellules. 8. Bioréacteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que les tubes ou tronçons de tubes (44) précités sont agencés dans un réseau de tubes perméables (22) de circulation de gaz dans ladite chambre. 9. Bioréacteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que les tubes ou tronçons de tubes (44) d'apport sont implantés dans le réseau à la place de certains tubes (22) de circulation de gaz.