FR 2706466 A1 19941223 FR 9307128 A 19930614 La présente invention concerne un concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et le procédé de production dudit concentré. Diverses préparations d' immunoglobulines polyvalentes sont déjà utilisées depuis longtemps. D'une manière générale, elles sont préparées à partir d'un "pool" de sérums de 2.000 à 5.000 donneurs ce qui assure la présence de tous les anticorps normalement présents dans l'ensemble de la population d'une contrée choisie. Ces préparations d'immunoglobulines sont préparées selon la méthode classique de Cohn plus ou moins modifiée, c'est-à-dire par précipitation à l'éthanol. Ce procédé présente un désavantage important dû au traitement à l'éthanol qui provoque une certaine dénaturation des protéines et la formation d'agrégats de polymères d'immunoglobulines. Ceux-ci présentent un risque thérapeutique en provoquant l'activation du système complément et des réactions anaphylactiques. Ces préparations ne peuvent donc pas être utilisées en injections intraveineuses mais seulement en intramusculaires, ce qui en limite la dose injectable et l'efficacité. Différents traitements sont déjà appliqués pour contourner ce problème : le clivage des immunoglobulines par la pepsine ou par la plasmine, un traitement à la -propiolactone ou avec des agents réducteurs et alkylants, ou à pH 4, ou avec du PEG pour précipiter les agrégats. La Demanderesse a préféré éviter ces traitements enzymatiques ou chimiques et a supprimé l'étape de précipitation à l'éthanol. Elle a ainsi mis au point un procédé qui comprend une succession de séparations chromatographiques. La préparation de concentrés d'immunoglobulines par chromatographie a déjà été expérimentée par Friesen et al. (Friesen - Joint IABS/CSL Symp. on Standardization in Blood Fractionation - Australia 1986 - Develop. biol. Standard.67,1987, 3-13 ; Immunoglobulins - Pub. Central Lab.Netherlands Red Cross 1988 - Ed. Krynen, Strengers, Van Aken) qui utilisent une ou deux chromatographies d'échanges d'anions. - Une chromatographie unique sur DEAE-Sephadex permet la préparation de y. globulines spécifiques à partir de sérums hyperimmuns, mais elle n'est applicable qu'à de petits volumes. - Une chromatographie sur DEAE-Sepharose suivie d'une chromatographie sur DEAE-Sephadex permet de préparer de plus grands volumes et est applicable à la préparation d'immunoglobulines polyvalentes, mais le procédé ne s 'est pas révélé rentable à l'échelle industrielle. La purification des immunoglobulines pose des problèmes particuliers, outre ceux qui ont déjà été cités plus haut, parce que leur activité biologique est liée à leur intégrité structurale, or cette activité ne se mesure pas simplement, comme une activité enzymatique. Ainsi, par exemple, pour un anticorps spécifique, à taux égal en anticorps mesuré par ELISA, le pouvoir de neutralisation de l'infectivité d'un virus varie fortement d'un concentré à l'autre, en fonction du procédé de préparation. La Demanderesse s'est donc attachée à mettre au point un procédé de purification des immunoglobulines non dénaturant, applicable à l'echelle industrielle (par exemple sur des lots de serum de plus de 500 litres) et qui permet en outre, la récupération des autres protéines plasmatiques d' intérêt thérapeutique. Le procédé de production d'un concentré d'immunoglobulines, selon la présente invention, ne comprend pas de précipitation à l'éthanol et comprend une succession d'étapes chromatographiques au cours desquelles les immunoglobulines restent toujours en phase liquide et à un pH compris entre 5,5 et 7,8. Le procédé comprend également une étape d'inactivation virale, par exemple par traitement au solvant-détergent. Le procédé selon la présente invention s'applique au plasma total ou, de préférence, au surnageant du cryoprécipité. I1 s'applique aussi bien à de grands volumes de "pool" de plasmas destinés à la préparation d'immunoglobulines polyvalentes qu'à de plus petits volumes de plasmas hyperimmuns destinés à la préparation d'immunoglobulines spécifiques. I1 pourrait également s'appliquer au milieu de culture d'hybridomes pour préparer des anticorps monoclonaux. Le plasma ou la fraction de plasma de départ est de préférence soumis à une étape de prépurification, avant la mise en oeuvre du procédé proprement dit ; celle-ci est effectuée par filtration sur une série de cartouches filtrantes de porosité de 0,5 à 0,2R, constituées de cellulose et de perlites, portant des charges négatives, et d'une faible quantité de résine chargée positivement (filtres Zeta plusX fournis par Cuno - USA). Ces filtres, grâce à leur charge négative, permettent l'adsorption et donc ici l'élimination du Facteur XI qui, sans cette étape de prépurification se retrouve copurifié avec les immunoglobulines ce qui peut entraîner une intolérance au produit final et des phénomènes d'hypotension. Le procédé comprend éventuellement une ou plusieurs étapes de prépurification qui permettent d'éliminer certaines protéines plasmatiques et ainsi de diminuer la taille des colonnes de chromatographie ultérieures, ce qui est particulièrement avantageux pour les grands volumes. Ainsi la fraction de protéines peut être prépurifiée en "bath" en présence dtun gel échangeur d'anions, de type DEAESephadex, qui permet la rétention et donc l'élimination du Facteur IX, du Facteur VII, de la protéine C. Elle peut ensuite être injectée sur une colonne de gel échangeur d'anions, de type DEAE-SepharoseQ, qui permet la rétention et l'élimination de l'albumine et de l'CC.antitrypsine. Ces dernières peuvent être désorbées et concentrées selon des méthodes connues, et avec un rendement particulièrement élevé grâce au procédé tel que décrit pour la présente invention. La fraction protéique constituant le filtrat de la colonne peut éventuellement être soumise à une chromatographie sur une colonne d'héparine-sepharose avant d'être soumise à la chromatographie suivante, afin d'éliminer l'antithrombine III. Le procédé selon la présente invention comprend une étape de dessalage, soit par ultrafiltration, soit par chromatographie de tamisage moléculaire, dans laquelle le filtrat des étapes de prépurification éventuelles est injecté sur une colonne de gel de type dextran réticulé, par exemple du SephadexG25, équilibré en tampon Tris-HCl 0,022M à pH 7,8 et la fraction contenant les protéines plasmatiques est récupérée. Ladite fraction protéique est ensuite injectée sur une colonne de chromatographie constituée d'un gel échangeur d'anions, plus particulièrement d'un gel greffé de groupements DEAE. On obtient un rendement particulièrement efficace avec un gel de type acrylamide réticulé comme le DEAE-TrisacrylX Plus LS (Sepracor-IBF, réf. 262080), équilibré en tampon Tris-Hcl 0,025M à pH 7,8. Cette colonne adsorbe pratiquement toutes les protéines plasmatiques sauf les immunoglobulines G. Ces dernières se retrouvent dans le filtrat et peuvent être concentrées à environ 50 g/l. La solution concentrée d'immunoglobulines est ensuite soumise à un traitement d'inactivation virale, par exemple, par un traitement en présence de solvant-détergent et de préférence de TnBP (tri(n-butyl)phosphate) 0,3 % et de Tween80 (polyoxyethylenesorbitane-monooléate) 1 %, à 250C sous légère agitation pendant au moins 6 heures. Le procédé selon la présente invention comprend ensuite une chromatographie sur gel échangeur de cations, plus particulièrement d'un gel greffé de groupements carboxyméthyle (CM). On obtient un rendement particulièrment efficace avec un gel de type CM-Trisacryls LS (Sepracor, réf. 260280) équilibré en tampon acétate de sodium 0,024M à pH 5,5. Ce gel adsorbe les immunoglobulines et permet l'élimination du solvant-détergent dans le filtrat. Les immunoglobulines sont ensuite désorbées et éluées par augmentation de la force ionique du tampon à 0,15 0,19 M NaCl. Elles sont additionnées de saccharose à 110g/l, conditionnées et lyophilisées. L'analyse du concentré d'immunoglobulines G obtenu par le procédé décrit plus haut confirme qu'il est dépourvu d'agrégats et d'immunoglobulines A et, de manière surprenante, qu'il est également dépourvu d'immunoglobulines E ou qu'il n'en contient plus qu'un taux inférieur à 10 % du taux présent dans le plasma, ce qui lui confère un avantage thérapeutique supplémentaire. La présente invention concerne donc un nouveau concentré d'immunoglobuline G d'origine plasmatique dépourvu d'agrégats dtimmunoglobulines G et d'immunoglobulines E, ainsi que d'IgA. Ces propriété le rendent donc particulièrement adapté à une injection par voie intraveineuse et il est formulé de manière appropriée en vue de ladite injection. Les exemples suivants décrivent des modes de mise en oeuvre du procédé sans toutefois limiter la portée de l'invention. Exemple 1 Le matériau de départ est un pool de 500 litres de plasma de donneurs sains, choisis au hasard dans une population normale. Après cryoprécipitation selon les méthodes classiques, le surnageant est récupéré pour être soumis aux différentes étapes de chromatographie 1-A Chromatographie de dessalage. Cette chromatographie est effectuée sur une colonne GF 04-06 (Sepracor) de 65 litres de SephadexG25 équilibrée en tampon Tris HCl 0,022M à pH 7,8, à un débit de 450 litres/heure. Le filtrat est suivi par densitométrie et la fraction contenant l'ensemble des protéines est récupérée. La colonne est régénérée par lavage avec une solution de NaCl 1M. 1.B Chromatographie sur ael échangeur d'anions. Cette chromatographie est effectuée sur des colonnes GF 08015 de 65 litres de DEAE-TrisacrylX équilibrées en tampon Tris-HCl 0,025M à pH 7,8, à un débit de 150 litres/heure. Dans ces conditions d'utilisation, les immunoglobulines G sont pratiquement les seules protéines qui ne s'adsorbent pas sur la colonne. Le filtrat est suivi par densitométrie et la fraction protéique est récupérée. Elle est donc constituée à près de 100 % d'immunoglobulines G. L'albumine qui est restée adsorbée sur la colonne est éluée par addition de NaCl 0,4M dans le tampon et elle est concentrée selon des méthodes classiques. La colonne est régénérée par lavage avec une solution de NaC1 2M. 1C. Traitement d'inactivation virale. La filtrat de la colonne précédente est concentré à environ 50g/l et soumis à un traitement classique par addition d'un mélange de solvant-détergent, pendant 6 heures à 250C sous agitation lente. Le mélange comprend du TnBP 0,3 % et du Tween 80 1 %. 1D. Chromatographie sur gel échangeur de cations. Cette chromatographie est effectuée sur une colonne GF 08015 de 65 litres de CM-TrisacrylX équilibrée en tampon acétate de sodium 0,024M à pH 5,5, à un débit de 20 à 100 litres/heure. Dans ces conditions d'utilisation les immunoglobulines s'adsorbent sur le gel et la combinaison solvant-détergent et les éventuels contaminants dénaturés ou autres résidus sont éliminés dans le filtrat. Les immunoglobulines sont ensuite désorbées par augmentation de la force ionique du tampon par addition de chlorure de sodium 0,15 à 019M La fraction dtimmunoglobulines récupérée a une concentration de 30 à 50g/l et peut donc être conditionnée telle quelle, après addition de saccharose à 110g/l. La colonne est régénérée par lavage avec une solution de NaCl 1M. Exemple 2 Au procédé décrit dans l'exemple 1 on ajoute une étape préliminaire de prépurification, avant la première chromatographie. Le surnageant du cryoprécipité est soumis à une filtration sur une batterie de 3 cartouches de filtres de porosité comprise entre 0,5 et 0,2 F et essentiellement chargés négativement (Filtres Zeta plus 8 fournis par Cuno, Process Filtration Products, filiales de Commercial Intertech Corp. USA, et décrit dans les brevets US 4,783,262 et 4,859,340, dénommés "filtres Cuno") . Ces filtres sont constitués de cellulose purifiée, de perlites et d'une faibles quantité de résine chargée positivement. D'autres systèmes de filtres disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés. Les filtres sont rincés en tampon citrate/phosphate comprenant du citrate de sodium, du phosphate disodique, du phosphate de potassium, du chlorure de sodium et de l'EDTA-disodique et ajusté à un pH compris entre 5,5 et 6,5 et, préférentiellement, à pH 6. Cette étape de filtration permet la rétention et donc l'élimination du Facteur XI. Exemple 3 Au procédé décrit dans l'exemple 1 ou dans l'exemple 2 on ajoute une étape préalable d'adsorption sur gel échangeur d'anions, avant la première chromatographie de dessalage sur Sephadex G25. Cette adsorption préalable est effectuée en "bat ch " en présence de DEAE-SephadexX à une concentration de 1,5g/litre de plasma, durant 2 à 5 heures. Ceci permet la rétention et donc l'élimination du Facteur IX, du Facteur VII et de la protéine C. Les immunoglobulines se retrouvent dans le surnageant. Celui-ci peut encore être soumis à une prépurification supplémentaire par chromatographie sur colonne de DEAE-Sepharose CL6B fast flow (Pharmacia). Le matériel plasmatique est dialysé et ajusté à une conductivité de 1,6 mS avec de l'acétate de sodium 0,025M. Le pH est ajusté à 7,6. La colonne est équilibrée en tampon acétate de sodium 0,025M à pH 7,6. Les immunoglobulines se retrouvent dans le filtrat. Ce procédé a le double avantage - de laisser filtrer des immunoglobulines déjà prépurifiées et ainsi de permettre une réduction de la taille des colonnes chromatographiques suivantes. - et de retenir l'albumine et l'a.antitrypsine qui peuvent ensuite être purifiées, selon des méthodes connues avec un rendement particulièrement élevé. Le filtrat contenant les immunoglogulines G prépurifiées peut encore être soumis à une chromatographie sur colonne d' héparine-SepharoseQ équilibrée en tampon phosphate 0,02 M -chlorure de sodium 0,154M à pH 6,8. Cette chromatographie permet d'adsorber et donc d'éliminer l'antithiombine III alors que les immunoglobulines G se retrouvent dans le filtrat. Exemple 4 On a comparé les titres en anticorps mesurés par ELISA et le pouvoir neutralisant de l'infectivîté d'un virus choisi comme modèle, le cytomegalovirus, avec les immunoglobulines préparées selon les méthodes classiques de fractionnement par l'éthanol suivi d'un traitement à pH4 en présence de pepsine et selon le procédé de la présente invention. Mode de préparation Titre ELISA Pouvoir des IgG (U/ml) neutralisant (titre du CMV) Méthode traditionnelle lot 1 100 1280 lot 2 110 640 lot 3 110 640 Selon la présente invention lot 1 90 2560 lot 2 120 5120 lot 3 100 5120 Ces résultats indiquent clairement que, pour une quantité équivalente d'anticorps (en ELISA) la qualité de ceux-ci, évaluée par leur activité biologique (pouvoir neutralisant) est nettement supérieure pour les anticorps produits par voie chromatographique. Exemple 5 On a mesuré la quantité d'IgE présente dans le plasma de départ, dans des lots de concentré d'IgG préparés selon la méthode classique (comme rappelé dans l'exemple 4) et par la méthode chromatographique selon la présente invention. Le tableau suivant montre qu il ne subsiste presque pas d'IgE dans la préparation par chromatographie alors qu'elles sont plus concentrées que dans le plasma de départ dans les préparations classiques. NO. de lot IgE (UI/ml) PLASMA DEPART 99030120 96 30162 108 30170 118 TgG classiques 50020200 293 20231 259 20291 272 23300 220 30070 230 30071 210 30072 246 30080 242 30081 258 30082 248 30090 214 30091 212 30092 170 30100 160 30101 117 30102 144 30110 250 30112 224 30120 195 30121 161 30122 220 30130 238 30131 248 30132 227 IgG préparées 50230050 12 par 070 6 chromatographie 080 8,1 090 4,1 100 7,5 110 3,5 REVEND I CAT IONS 1. Concentré d'immunoglobulines G d'origine plasmatique à usage thérapeutique, caractérisé en ce qu'il est dépourvu d'agrégats d'immunoglobuîines G et qu'il ne contient qu'un taux d'immunogîubulines E inférieur à 10 % du taux présent dans le plasma. 2. Concentré d'immunoglobulines G selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa formulation est plus particulièrement adaptée en vue de son injection par voie intraveineuse. 3. Procédé de production dtun concentré d'immunoglobulines G selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il ne comprend pas de précipitation à l'éthanol et qu'il comprend une succession d'étapes de chromatographie au cours desquelles les immunoglobulines restent toujours en phase liquide et à un pH compris entre 5,5 et 7,8, ainsi qu'une étape d'inactivation virale. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend successivement a- une étape de dessalage, b- une chromatographie sur gel échangeur d'anions, c- un traitement d'inactivation virale, d- et une chromatographie sur gel échangeur de cations. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le matériau de départ est la fraction du plasma surnageant après cryopécipitation. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le surnageant de la cryoprécipitation est soumis à une étape de prépurification par filtration sur une série de cartouches de filtres de porosité de 0,5 à 0,2 A, constitués de cellulose et de perlites, portant des charges négatives, et d'une faible quantité de résine chargée positivement. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs étapes de prépurification par adsorption de certaine protéines plasmatiques sur des gels choisis parmi les gels échangeurs d'anions et lthéparine-sepharose. 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée sur un gel de type dextran réticulé, équilibré en tampon Tris-HCl 0,022M à pH 7,8 et que la fraction comprenant les protéines plasmatiques est récupérée pour être soumise à l'étape b). 9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée sur un gel de type acrylamide réticulé, greffé avec des groupements DEAE, équilibré en tampon Tris-HCl 0,025M à pH 7,8 et que le filtrat est récupéré pour être soumis à l'étape c). 10. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée par traitement au solvantdétergent pendant au moins 6 heures à 250C. 11. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape d) est réalisée sur un gel de type acrylamide réticulé, greffé avec des groupements carboxyméthyle, équilibré en tampon acétate de sodium 0,024M à pH 5,5, et que les immunoglobulines adsorbées sur le gel sont éluées par augmentation de la force ionique du tampon à 0,15 - 0,19M NaCl 12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les immunoglobulines éluées de l'étape d) sont additionnées de saccharose à 110g/l puis lyophilisées.