FR 2706484 A1 19941223 FR 9307089 A 19930611 POLYPEPTIDE MUTANT DE LA PROTEINE KINASE C, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR LEDIT POLYPEPTIDE ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet un nouveau polypeptide mutant de la protéine kinase C et les acides nucléiques codant pour ledit polypeptide. Elle a également pour objet les utilisations de ce polypeptide ou des acides nucléiques pour l'élaboration d'outils utiles pour le diagnostic des cancers et/ou pour la préparation de moyens pharmacologiques utiles pour le traitement des cancers, en particulier des cancers de l'hypophyse, du colon, du foie, du sein et de la vessie. La protéine kinase C, dénommée ci-après la PKC, est une enzyme calcium- et phospholipide-dépendante, qui joue un rôle important dans le métabolisme des cellules. En effet, elle participe à de nombreux procédés de régulation cellulaire, notamment à la sécrétion hormonale et la prolifération cellulaire. Elle est directement activée par les esters de phorbol, promoteurs des tumeurs et est une enzyme clé dans la transduction des signaux médiés par des facteurs de croissance ou des hormones. Cette enzyme ainsi que ses propriétés dans les cellules néoplasiques sont décrites notamment par ROTENBERG et al. dans l'ouvrage intitulé "Biochemical and Molecular Aspects of selected cancers" Vol. 1, ch. 2, 1991, édité par Academic Press Inc. Cette enzyme existe sous différentes isoformes, telles que notamment l'isoforme a. La séquence de l'isoforme a de la protéine kinase C humaine, dénommée ci-après la PKCa humaine, a été décrite par FINKENZELLER et al. dans Nucleic Acids Research Vol. 18, N 8, 2183 (1990). Des études récentes ont montré que l'activité et l'expression de la PKC étaient plus élevées dans les tumeurs humaines de l'hypophyse que dans les hypophyses humaines normales et les hypophyses de rat. A cet effet, on peut se référer aux travaux de V. ALVARO et al. dans Int. J. Cancer : 724-730 (1992). Aucune relation n'a été trouvée entre l'activité et l'expression d'un côté et le volume tumoral ainsi que les taux hormonaux dans le plasma de l'autre. Cependant, lorsque l'on considère le caractère invasif, une nette distinction peut être faite entre les tumeurs invasives d'une part et les tumeurs non-invasives d'autre part. Selon les tests rapportés dans l'article cité ci-dessus, on a noté une augmentation semblable de l'activité et de l'expression dans les tumeurs non invasives (x 3) alors que dans les tumeurs invasives, l'activité de la PKC était multipliée par 3 environ, tandis que l'expression était multipliée par environ un facteur 9. On sait que l'activité de la PKC est également altérée dans plusieurs autres tumeurs humaines, telles que par exemple les tumeurs du colon et du sein. Cette activité est augmentée de façon significative dans les tissus du sein malin alors que dans le tissu tumoral du colon elle est réduite par comparaison aux éléments normaux équivalents. Ces observations contribuent à l'idée que la PKC est affectée dans les tumeurs humaines et qu'elle participe à la tumorigénèse. Cependant, lorsque l'on considère l'expression de la PKC, peu d'investigations ont été faites à ce sujet et on n'a pas recherché si les isoformes PKC étaient impliquées dans les modifications observées de l'activité de la PKC. De plus, le manque de corrélation étroite entre l'augmentation de l'activité enzymatique et l'augmentation de l'expression de la PKC dans les tumeurs invasives hypophysaires humaines ainsi que la relation particulière entre la surexpression de la PKC et le caractère invasif dans les tumeurs de l'hypophyse humaine ont conduit à l'hypothèse qu'il existait une anomalie dans la structure de l'enzyme. On a maintenant trouvé que la PKCa est surexprimée dans les tumeurs invasives de l'hypophyse humaine et que cette PKCa possède une mutation ponctuelle. La présente invention a donc pour objet un nouveau polypeptide mutant de la protéine kinase C qui présente la séquence de 672 acides aminés représentée sur la figure 1. Cette séquence d'acides aminés diffère de la séquence connue de la PKCa par l'acide aminé en position 294 qui est une glycine au lieu d'un acide aspartique. Le nouveau polypeptide selon l'invention est donc la PKCa présentant une mutation ponctuelle en position 294, dénommée ci après mutation D 294 G. Il a un poids moléculaire d'environ 80 kdaltons. La mutation D 294 G est située dans une région stratégique de l'enzyme, la région V3. Les différentes régions de la PKC sont indiquées sur la figure 2 qui est une représentation schématique des domaines constants et variables de l'enzyme PKC, telle que décrite par Stabel et al. (Stabel, S, Parker, PJ, 1991, "Protein Kinase C". Pharmacol. Ther St : 71-95). Cette région V3 contient les sites sensibles à la calpaine, les sites de liaison des "récepteurs" intracellulaires de la PKC ainsi que le site potentiel de liaison du calcium. La mutation D 294 G est localisée dans ce site potentiel de liaison du calcium et peut affecter l'affinité de l'enzyme pour le calcium. Ce site n'a pas une configuration main EF classique correspondant à un motif hélice-boucle-hélice. En fait, il n'existe pas de possibilité pour qu'une première hélice se forme. La seconde hélice, bien que probablement plus courte que celle habituellement décrite est théoriquement possible (compte-tenu de la structure secondaire prédite en utilisant la méthode GOR ("Prediction of protein structures and the principles of protein conformation", edited by G. D. Fasman, Plenum Press New York. 1989:417-465)). La boucle calcium démarre à l'acide glutamique à la position 292 (position X dans la boucle) et se termine à l'acide aminé glutamine à la position 303 (position-Z dans la boucle). L'acide aminé 294, qui est habituellement l'acide aspartique ou l'asparagine, est changé ici par une mutation ponctuelle en la glycine apolaire. Ceci pourrait rendre compte des changements proposés pour l'affinité calcium et en conséquence pour la fonctionnalité de l'enzyme. Il est, en effet, connu que la liaison du calcium à l'enzyme est une condition nécessaire pour le transfert de l'enzyme du compartiment intra-cellulaire vers la membrane plasmique. En fait, il semble que la PKC soit accumulée dans le cytosol du fait que sa quantité dans le cytosol est sans aucun doute plus importante que dans la membrane pour les tumeurs invasives. Les conséquences de l'accumulation cytosolique de l'enzyme sont cependant difficiles à tester du fait que l'enzyme ne peut pas être activée in vitro par des activateurs usuels. Sa présence dans les cellules tumorales suggère que la mutation de la PKCa affecte probablement les processus de régulation normalement contrôlés par la PKC. La relation entre la mutation ponctuelle de la PKCa et le phénotype invasif des tumeurs de l'hypophyse conduit aux commentaires ci-après. En fait, la PKC est impliquée dans la régulation des protéinases secrétées telles que la stromélysine et la collagènase, qui sont des enzymes participant à l'apparition des métastases tumorales et à l'angiogénèse. Elle est également impliquée dans la biosynthèse des inhibiteurs des métalloprotéinases par des fibroblastes humains en culture. L'invention a également pour objet les variants de ce polypeptide résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, étant entendu que ledit variant appartient toujours à la famille protéine kinase C et présente la même mutation ponctuelle que le polypeptide ci-dessus. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomiques, les séquences d'ARNm ou d'ADNc, qui codent pour le polypeptide selon l'invention ou l'un quelconque de ses variants définis ci-dessus et qui sont constituées par: a) la séquence d'ADN représentée sur la figure 3; b) les séquences d'ADN hybridant avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et code pour le polypeptide tel que défini ci-dessus; d) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes. Le polypeptide selon l'invention peut être obtenu par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de: - culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transfectées à l'aide d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et - récupération du polypeptide produit par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme de métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA technology I, Editors Ales Prokop, Rakesh K. Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Les séquences d'ADN selon l'invention peuvent être obtenues à partir d'un ARN messager provenant d'une tumeur invasive selon les techniques classiques décrites par Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Par exemple, les séquences d'ADN selon l'invention, peuvent être obenues par le procédé qui consiste: - à préparer les ARN totaux à partir d'une tumeur invasive; - à synthétiser un double brin d'ADN complémentaire (ADNc) à partir de la préparation d'ARN avec une amorce oligodT; - à amplifier cet ADNc par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des oligonucléotides spécifiques; - à clôner ce produit amplifié dans un plasmide ou un vecteur d'expression; - à l'amplifier par transformation bactérienne. Pour chacune de ces étapes on utilise avantageusement les techniques classiques bien connues de l'homme de métier et décrites en détail par MANIATIS et al. dans l'ouvrage cité ci-dessus. L'invention a également pour objet les sondes nucléotidiques qui, par hybridation, permettent de détecter dans une tumeur, une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention, une séquence d'ADN complémentaire ou une séquence d'ARN correspondante. Les sondes nucléotidiques de l'invention sont spécifiques de la région caractéristique de la séquence d'ADN, d'ADNc ou d'ARN, à savoir de la partie portant la mutation ponctuelle du polypeptide selon l'invention. Les sondes nucléotidiques selon l'invention sont des oligonucléotides pouvant avoir une longueur variable qui est de préférence au minimum d'environ 5 à 15 nucléotides et au maximum d'environ 50 à 60 nucléotides. Ces sondes sont préparées selon les techniques bien connues de l'homme de métier, telles que celles décrites par Maillet-Baron et al. (Maillet-Baron L., Soussi T., Séquençage des acides nucléiques. Ed Tech Doc. Collection Génie Génétique, Chap. 6, 1993). A des fins de diagnostic, ces sondes sont soit marquées par un isotope radioactif soit chimiquement modifiées par un agent fluorescent ou un résidu, tel que la digoxigénine, reconnu par un anticorps ou une enzyme. Ces sondes ainsi marquées permettent selon les méthodes classiques d'identifier s'il y a hybridation ou non avec une séquence d'ADN, une séquence d'ADNc ou une séquence d'ARNm. Les sondes nucléotidiques selon l'invention conviennent également comme oligonucléotides antisens pour le blocage de la transcription ou de la traduction de l'ARNm de la PKCa portant la mutation D 294 G soit in vitro, soit in vivo. Ces oligonucléotides antisens sont des inhibiteurs de la transcription ou de la traduction de la PKCa mutée qui peuvent être utilisés en thérapie pour le traitement des cancers à tumeur invasive ou des tumeurs exprimant la PKCa mutée, éventuellement en combinaison avec une toxine, telle que la ricine ou tout autre élément permettant de détruire les cellules cancéreuses. La présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic des tumeurs, telles que par exemple des tumeurs du foie, du sein, du colon, de la vessie, qui consiste à détecter soit le polypeptide selon l'invention, soit une séquence d'ADN ou une séquence d'ARN codant pour ledit polypeptide dans un échantillon biologique de la tumeur. La détection de la séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide peut être réalisée par la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus. Ce procédé de diagnostic comprend les étapes: a) d'amplification préalable des séquences d'ADN génomiques ou d'ADNc fabriquées à partir d'ARNm contenues dans un échantillon biologique d'un patient, au moyen d'amorces, telles des amorces d'ADN, b) mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde nucléotidique selon l'invention; c) détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé. La détection de la séquence ARN codant pour ledit polypeptide peut être réalisée par la technique d'hybridation in situ à l'aide d'une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus et détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé. La détection du polypeptide selon l'invention peut être réalisée par immunohistochimie à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement la PKCa mutée. L'invention a également pour objet les anticorps dirigés contre le polypeptide selon l'invention, qui conviennent notamment pour la détection du polypeptide selon l'invention. Ces anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux. Ces anticorps peuvent également être des anticorps monoclonaux obtenus selon le procédé bien connu des KOHLER G. et MILSTEIN C., Nature (1975) vol. 256, p. 495-497. L'invention a également pour objet les vecteurs recombinants pour le clonage et/ou l'expression qui contiennent une séquence d'ADN selon l'invention. Ces vecteurs, qui peuvent être des plasmides, des cosmides, des phages ou des virus, contiennent en plus de la séquence d'ADN selon l'invention, les moyens appropriés pour leur replication et/ou leur expression, tels que promoteurs forts de virus, promoteurs activables par des facteurs variés, origine de réplication, etc... Les vecteurs recombinants peuvent être utilisés pour transfecter des modèles cellulaires à des fins d'études in vitro et pour la sélection de médicaments ou autres agents anti-tumoraux. Ainsi la présente invention a également pour objet les cellules hôtes transfectées avec la séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide des vecteurs ci-dessus. Ces cellules peuvent être par exemple des cellules GC ou des cellules hypophysaires hyperplasiées. Un premier modèle cellulaire approprié peut être obtenu à partir d'une lignée de cellules hypophysaires tumorales n'exprimant pas le phénotype invasif, les cellules GC. Ces cellules sécrètent de l'hormone de croissance et forment des tumeurs in vivo lorsqu'elles sont implantées sous la peau du dos. In vivo, ces tumeurs ne donnent pas de métastases. En plus, elles n'expriment pas la forme mutée de la PKCa. Les cellules GC ainsi transfectées pourront être soit cultivées in vitro soit implantées in vivo. Sur les cellules GC cultivées in vitro on peut mesurer: - l'expression de la PKCa mutée, - l'hormone de croissance (GH), - le taux de prolifération cellulaire par incorporation de thyroïdine 3H, - l'activité et l'expression de la PKCa, - la morphologie des cellules, - la sécrétion de la cathépsine D, enzyme protéolytique participant à la destruction de la membrane basale. Sur les cellules implantées in vivo on peut mesurer: - l'invasion locale des tissus, - l'apparition de métastases, - l'hormone de croissance (GH), - l'expression et l'activité de la PKCa dans les tumeurs. Un deuxième modèle expérimental consiste à transfecter la PKC a mutée dans des cellules hypophysaires hyperplasiées, obtenue chez le rat estrogénisé. Dans ce cas, la transfection est transitoire et les mêmes paramètres que ceux mesurés in vitro pour les cellules GC peuvent aussi être estimés. Ces modèles expérimentaux conviennent particulièrement bien pour la sélection de médicaments ou agents anti-tumoraux appropriés. Le polypeptide selon l'invention peut également être utilisé en biochimie et en enzymologie pour étudier les conséquences de la mutation sur les fonctions de l'enzyme, pour tester des molécules visant à reconnaître spécifiquement le polypeptide selon l'invention, pour étudier les interactions spécifiques du polypeptide selon l'invention avec tout élément cellulaire. L'invention va être maintenant illustrée plus en détail par les exemples non limitatifs ci-après. Dans ces exemples, on a utilisé des tumeurs de l'hypophyse (sécrétant l'hormone de croissance (GH), sécrétant la prolactine (PRL) ou sécrétant l'hormone adénocorticotrope (AGI) et des tumeurs nonsécrétantes) qui ont été obtenues dans des salles d'opération après des adénomectomies transphénoïdales. Des fragments des tumeurs ont été congelés dans de l'azote liquide. D'autres fragments ont été utilisés pour des tests de microscopie et des tests immunocytochimiques. Le diagnostic avant l'opération a été établi par des critères cliniques, biologiques et radiologiques. Les études morphologiques et immunocytochimiques ont confirmé le diagnostic. Le caractère invasif a été établi par le neurochirurgien au cours de l'opération et correspond à l'invasion de la "dura mata" ou du diaphragme sellaire. FIGURES: FIG. 1: Séquences d'acides aminés du polypeptide selon l'invention. FIG. 2: Représentation schématique des domaines variables et constants de la PKC ainsi que des fragments A, B, C et D obtenus par PCR. FIG. 3: Séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention FIG. 4: Autoradiographie d'un immunoblot de la PKCa: a et d, hypophyse normale ; b et e, tumeur non invasive; c et f, tumeur invasive; a, b, c, fraction cytosolique; d, e, f, fraction membranaire. FIG. 5.: Comparaison de l'activité et de l'expression de la PCK dans les tumeurs invasives et non invasives. FIG. 6: Analyse de la séquence nucléotidique dans la région amplifiée par PCR entourant le codon 294 obtenue par séquençage selon la technique de Sangler. Exemple 1 : mesure de l'activité et de l'expression de la PKCa dans des tumeurs invasives et des tumeurs non invasives de l'hypophyse humaine L'activité protéine kinase C a été déterminée selon la méthode de BIRMAN et al. décrite dans Acta endocrino., 121,489-494 (1989). Cette méthode consiste à préparer les fractions soluble et membranaire des homogénats tissulaires et à obtenir par filtration sur colonne échangeuse d'ions, une préparation semi-purifiée de la PKC. L'activité de l'enzyme est mesurée par incorporation de P32 dans un substrat exogène (histone IIIS) en présence et en absence de calcium, phospholipides et diacylglycérol. Comme indique sur la figure 4, l'expression de la PKCa est augmentée dans les fractions solubles et membranaires des tumeurs d'hypophyse testées par comparaison avec les fractions provenant d'hypophyses de rat normales et ceci quelque soit la nature de la tumeur (sécrétante ou non). L'expression de la PKCa est déterminée selon la méthode décrite par V. ALVARO et al. dans Int. J. Cancer: 50, 724-730 (1992). Les résultats sont reportés sur la figure 5 sur laquelle on a utilisé les légendes ci-après: activité PKC v-/ : expression PKC Cette figure montre que l'activité et l'expression de la PKC dans les tumeurs non invasives sont augmentées de la même façon alors que dans les tumeurs invasives l'augmentation de l'expression de la PKC est nettement supérieure à celle de l'activité de la PKC. Exemple 2: analvse "Western Blot (immunoblot)" Dans cet exemple, le matériel ci-après a été utilisé: - membrane "Immobilon" fournie par la Société Millipore. - anti-sérum polyclonal dirigé contre la protéine PKCa, donné généreusement par le Docteur SAITOH, Département de neurochimie, Université de Californie, San Diego, La Jolla, USA. - le second anticorps marqué à l'iode 125 (anti IgG de lapin) a été fourni par Amersham [Réf. IM 134]. Séquençage: Le RNAzole [RNA 15.01-100] et les oligonucléotides ont été obtenus auprès de la Société Bioprobe. La reverse transcriptase AMV (superscript preamplication système) a été fournie par Bethesda Research Laboratories USA. La polymèrase DNA Taq a été fourni par Boehringer. Le kit de clonage TA cloning version 1.3 fourni par Invitrogen et le kit de Séquençage par la séquenase 2.0 fourni par USB. Des tumeurs d'hypophyse humaine et des hypophyses de rat normales (200 mg) ont été homogénéisées (1/5 : poids/volume) dans 10 mmol/l de tampon Tris HCL contenant 2 mmol/l d'EDTA et 0,1 mmol/l de phénylméthylsulfonylfluorure pH 7,4 (tampon A). Après centrifugation à 800 x g pendant 4 minutes, le surnageant a été centrifugé pendant 45 minutes à 37000 x g fournissant le cystosol (fraction soluble) et le culot membranaire. Ce dernier a été remis en suspension dans 1 ml de tampon A contenant 1 % de Nonidet P40 [Sigma] et recentrifugé ultérieurement pendant 15 minutes à 37000 x g. Le surnageant résultant constitue la fraction membranaire. Les fractions solubles et les fractions membranaires ont été portées à ébullition pendant 10 minutes dans le tampon SDS PAGE (25 mM, Tris-HCl pH 8,8, 10 % de dodécyl sulfate de sodium, 10 % de glycérol, 10 % de ss mercaptoéthanol et 0,05 % de bleu de bromophenol, concentrations finales). Des quantités égales de protéines de chaque échantillon (100 jtg) ont été déposées sur des gels selon la méthode de Laemmli [NATURE 227, 680-685 (1970)] en utilisant un gel de séparation contenant 10 % d'acrylamide, transférées sur la membrane immobilon. Cette membrane est incubée avec l'antisérum polyclonal dirigé contre la protéine PKCa (dilution finale 1/2000è). Les immunoblots ont été marqués avec le second anticorps, luimême marqué à l'iode 125 (anti IgG de lapin) et mis en contact avec un film Kodak à - 8OC. Les concentrations de protéine ont été déterminées par la méthode de Lowry [J. Biol. Chem. 193 265-271 (1951)J. Exemple 3 : séquençage Pour effectuer le séquençage de l'ADNc amplifié par PCR et sous-clôné, on a extrait l'ARN total de chaque homogénat de tumeurs avec le RNAzole, selon une méthode dérivée de celle de Chomczynski et al. (Annal Biochem, 162, 156, 1987). Un premier brin d'ADNc a été produit dans une réaction contenant 1 ,ccg d'ARN total, des amorces oligo (dT) et la reverse transcriptase en utilisant le kit de réserve transcriptase AMV selon les recommandations du fabricant. 50 % du volume réactionnel de l'ADNc a été amplifié selon la méthode décrite par SAIKI et al. dans SCIENCE 1988, 239, 487-491. La séquence totale de la protéine PKCa a été amplifiée en trois fragments de 1 kb chacun : A, B, C. Le mélange PCR contenait 2,5 U ADN polymérase de Thermus Aquaticus (Taq) et 50 pmoles de chaque amorce. Les amorces suivantes ont été utilisées: Pour le fragment A: 5'-GGAGCAAGAGGTGGTTGG-3' (amorce 5'; nucléotides 1 à 18); 5'-GITCAGAGGGACTGATGACT-3' (amorce 3'; nucléotides 975 à 985). Pour le fragment B : 5'-GCCTCTGCGGAATGGATCAC-3' (amorce 5'; nucléotides 472 à 492); 5'-CTCCATCCATCATGTGTfCC-3' (amorce 3'; nucléotides 1485 à 1505). Pour le fragment C: 5'-GACCTCATGTACCACATTCA-3' (amorce 5' ; nucléotides 1300 à 1320); 5'-ClTCCACTAAGATAATGTfC-5' (amorce 3'; nucléotides 2225 à 2245). L'amplification a été réalisée en 30 cycles de 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 55* C (amorce du fragment A), 60 C (amorce du fragment B), 60 C (amorce du fragment C), 1 minute à 72 C dans le Thermocycle Cetus Perkin-Elmer. L'ADN amplifié a été purifié sur du gel d'agarose puis cryoélué et précipité à l'éthanol. L'ADN purifié a été directement sous-clôné dans un vecteur PCRTM H selon la protocole du kit de clonage TA cloning fourni par Invitrogen. La méthode de séquençage à la séquenase a été utilisée pour déterminer la séquence codante entière de la protéine PKCa à partir d'au moins 7 sous-clones pour chaque fragment PCR (A, B, C) provenant de deux tumeurs différentes (N' 1 et N 2 du tableau I) et deux PCR différents pour chaque tumeur de manière à différencier les mutations des erreurs Taq. Le séquençage a été réalisé sur les deux brins avec les amorces utilisées dans la réaction d'amplification. Pour l'examen des autres tumeurs et les tissus contrôles (2 hypophyses humaines normales et un colon normal) le premier brin d'ADNc, l'ADNc amplifié par la méthode PCR et le sous-clonage ont été réalisés comme décrit ci-dessus en utilisant les deux amorces choisies autour du point de mutation trouvé dans les deux premières tumeurs délimitant ainsi un quatrième fragment le fragment D : 5' GACCGACGACTGTCTGTAGA-3' (amorce 5'; nucléotides 726 à 745) et 5'CAGGGAGACTTCTGTCUl l-3' (amorce 3'; nucléotides 983 à 1001). L'amplification a été réalisée au cours de 30 cycles de 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 55 C, 1 minute à 72 C dans un Thermocycle Perkin Elmer Cetus. Pour chaque fragment PCR, 7 sousclones ont été séquencés. RESULTATS Expression de la protéine PKCa Ainsi que cela est montré dans la figure 4, l'expression de la PKC a est augmentée dans les fractions membranaires et dans les fractions solubles de toutes les tumeurs d'hypophyse testées (n=5) par comparaison aux hypophyses de rats et ceci quelque soit la nature de la tumeur sécrétante ou non. Analyse de Ia séquence Le séquençage complet de l'ADNc de la protéine PKCa extraite de 8 tumeurs d'hypophyse humaine a révélé la présence d'une mutation ponctuelle à la position 908 de l'ADNc (région V3 de la protéine, voir figure 2) des tumeurs invasives conduisant ainsi à un changement d'aminoacide. L'acide- aspartique chargé négativement (position 294) a été changé en une glycine apolaire, le codon GAC devenant alors le codon GGC (voir figure 6 et tableau 1). Au contraire, aucune mutation ponctuelle n'a été détectée dans les ADNc des tumeurs non-invasives. La proportion des sous-clones dérivés de l'ADNc de tumeurs invasives et présentant la mutation variait d'une tumeur à l'autre : 5 sur 7 pour l'adénome 1 ; 2 sur 7 pour l'adénome 2; 3 sur 7 pour l'adénome 3 ; et 1 sur 7 pour l'adénome 4. Le mutant de la PKCa est ainsi moins représenté que la PKCa normale. Tableau 1 : mutation de la PKCa dans les tumeurs de l'hypophyse Tumeur Immunocytochimie Codon 294 Groupe 1 : invasive 1 GH Gly 2 GH/PRL Gly 3 NIR Gly 4 ACTH Gly Groupe 2 : non invasive 5 NIR Asp 6 NIR Asp 7 GH Asp 8 PRL Asp * NIR: cellules non immunoréactives GH hormone de croissance; PRL Prolactine; ACITI Hormone Adrénocorticotrope; REVENDICATIONS 1. Polypeptide mutant de la protéine kinase C, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés selon la figure 1 et possède la mutation ponctuelle D 294 G par rapport à la PKCa ou en ce qu'il est un variant dudit polypeptide résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou de plusieurs acides aminés, ledit variant présentant la même mutation ponctuelle que ledit polypeptide. 2. Séquence d'acides nucléiques codant pour le polypeptide selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADN représentée sur la figure 3; b) les séquences d'ADN hybridant avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour un polypeptide tel que défini ci-dessus, d) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes. 3. Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oligonucléotique qui s'hybride avec la séquence d'ADN selon la revendication 2, les séquences d'ADNc ou d'ARN correspondante. 4. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre le polypeptide selon la revendication 1. 5. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter la séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide par les étapes a) d'amplification préalable des séquences d'ADN contenues dans un échantillon biologique susceptible de contenir ledit polypeptide, au moyen d'amorces, b) mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde nucléotidique selon la revendication 3; c) détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé. 6. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ledit polypeptide, une séquence d'ARN codant pour ledit polypeptide par hybridation in situ à l'aide d'une sonde nucléotidique selon la revendication 3. 7. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact un échantillon biologique susceptibIe de contenir ledit polypeptide avec un anticorps selon la revendication 4 et à détecter le complexe immunochimique forme. 8. Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN selon la revendication 2. 9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, contenant en outre les moyens nécessaires à son expression. 10. Microorganismes ou cellules hôtes transformés ou transfectés par un vecteur recombinant d'ADN selon la revendication 9. 11. Cellules hôtes selon la revendication 10, caractérisées en ce que lesdites cellules sont des cellules GC ou des cellules hypophysaires hyperplasiées. 12. Application de la sonde nucléotidique selon la revendication 3 à titre d'oligonucléotide antisens pour l'inhibition de la transcription ou de la traduction de l'ARNm de la PKCa portant la mutation D 294 G soit in vitro, soit in vivo 13. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'oligonucléotide antisens est utilisé en combinaison avec une toxine ou tout autre élément permettant de détruire la cellule. 14. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une sonde nucléotidique selon la revendication 3, éventuellement en combinaison avec une toxine ou un autre agent anti-tumoral