FR 2704236 A1 19941028 FR 9304700 A 19930421 VECTEUR RETROVIRAL POUR LA PREPARATION DE CELLULES RECOMBINANTES SUSCEPTIBLES D'ETRE IMPLANTEES IN VIVO DANS UN BUT THERAPEUTIQUE La présente demande de brevet concerne des vecteurs rétroviraux pour la préparation de cellules recombinantes susceptibles d'être implantées in vivo dans un but thérapeutique. L'invention propose des moyens permettant de réaliser in vivo, l'expression d'une séquence de nucléotides choisie, dans des conditions telles que cette expression est obtenue sur une durée de plusieurs mois, de préférence plus de 6 mois, de telle façon que le produit de la séquence de nucléotides exprimée est présent en quantité suffisante et dans des conditions appropriées pour produire un effet thérapeutique recherché in vivo. L'invention fait appel à l'utilisation de rétrovirus recombinants ayant la capacité d'infecter des cellules et en particulier des cellules eucaryotes, ces cellules pouvant alors être administrées, ou implantées chez un patient, et produisant ainsi in vivo une protéine ou tout produit d'expression d'une séquence de nucléotides déterminée, insérée dans le rétrovirus recombinant. La demande de brevet internationale antérieure publiée sous le numéro 92/15676, décrit des moyens pour réaliser in vivo 1'expression de séquences de nucléotides déterminées, en vue d'un traitement thérapeutique de maladies résultant d'une anomalie génétique. Cette demande internationale 92/15676, propose d'utiliser des fibroblastes génétiquement modifiés par un vecteur rétroviral, en vue de les implanter dans le tissu conjonctif de la peau du sujet à traiter. La séquence de nucléotides dont l'expression est recherchée dans cette demande internationale antérieure, est placée sous le contrôle de la séquence LTR (Long Terminal Repeat) du vecteur rétroviral et/ou sous le contrôle de promoteurs exogènes constitutifs ou inductibles, la séquence LTR du rétrovirus étant néanmoins conservée lorsque le promoteur exogène est présent. Les inventeurs ont examiné quels étaient les paramètres qui, à différents niveaux, permettraient d'exprimer in vivo une séquence de nucléotides déterminée, de façon à améliorer l'expression de la séquence de nucléotides insérée dans le vecteur afin d'obtenir un effet thérapeutique, si nécessaire de longue durée. Ainsi, ils ont mis en évidence que lorsque la séquence de nucléotides exogène dont on cherche l'expression est avantageusement placée dans le vecteur destiné à l'infection des cellules, sous le contrôle d'un promoteur exogène constitutif, la séquence LTR interne au vecteur rétroviral doit alors être partiellement délétée. La délétion doit être suffisante pour affecter la transcription de l'ARNm. Les moyens définis dans la présente demande permettent de réaliser l'expression et la sécrétion d'une protéine, glycoprotéine, ou d'un peptide ayant un intérêt biologique, pour autoriser son utilisation thérapeutique in vivo. Un nouveau vecteur rétroviral recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN de provirus modifiée en ce que - les gènes gaq, pol et env ont été délétés au moins en partie, de façon à supprimer leur capacité à intervenir dans la réplication du rétrovirus, - la séquence LTR comporte une délétion dans la séquence U3, telle que la transcription sous forme d'ARNm qu'elle contrôle est réduite de manière significative, par exemple d'au moins 10 fois, et ce vecteur rétroviral recombinant comprenant en outre une séquence de nucléotides exogène sous le contrôle d'un promoteur constitutif exogène. Une séquence d'ADN de provirus ou n séquence d'ADN proviral" est une séquence d'ADN transcrite à partir de 1'ARN génomique du virus lorsqu'il est intégré dans les cellules hôtes du virus. L'ADN du provirus comprend ainsi des séquences codant pour les protéines gag, pol et env du rétrovirus, qui correspondent respectivement aux nucléoprotéines, polymérases, protéines et glycoprotéines d'enveloppe. L'ADN du provirus comporte également des enchaînements appelés LTR (Long Terminal Repeat), qui comportent des régions appelées R, U3 et US. Ces séquences de la région LTR interviennent dans le cycle de réplication du rétrovirus. Le vecteur rétroviral selon l'invention est tel que les gènes gag, pol et env de 1'ADN du provirus ont été délétés au moins en partie et ce afin d'obtenir un ADN proviral incapable de se répliquer, cet ADN ne pouvant, en outre, être muté de façon réverse ou recombiné pour former un virus sauvage. La séquence LTR de 1'ADN proviral a également été mutée par délétion, par exemple dans sa partie U3 ; cette délétion affecte les fonctions de l'activateur interne de la région LTR. De plus, cette délétion permet de diminuer et de préférence, de neutraliser l'effet négatif de la région LTR, sur la capacité du promoteur exogène de promouvoir et contrôler l'expression de la séquence de nucléotides exogène contenue dans le vecteur rétroviral. On peut aussi envisager la délétion de l'ensemble de la séquence constituant le promoteur et l'activateur. Toutefois, une telle délétion présente l'inconvénient d'être accompagnée d'une diminution importante des titres du vecteur. Une "séquence de nucléotides exogène" selon l'invention est une séquence qui n'est pas exprimée naturellement dans une cellule dans laquelle on introduit le vecteur rétroviral de l'invention, ce défaut d'expression résultant de la nature de la cellule ou survenant à cause d'une pathologie affectant cette cellule chez un individu donné. De même, le promoteur constitutif utilisé pour la construction de rétrovirus recombinants selon l'invention est exogène par rapport à la séquence dont il contrôle l'expression en ce sens qu'il ne lui est pas naturellement associé. Le promoteur utilisé dans le vecteur de l'invention est dit constitutif, par opposition à un promoteur de type inductible. Ce promoteur constitutif exogène contrôle l'expression de la séquence de nucléotides exogène. Un premier vecteur rétroviral particulier dans le cadre de l'invention est tel que la séquence de nucléotides exogène et le promoteur constitutif exogène, ainsi que la séquence de 1'ADN proviral, sont portés par un plasmide. A titre d'exemple, ces séquences peuvent être portées par le plasmide pBR322 qui permet l'introduction de 1'ADN dans les lignées cellulaires dans lesquelles on cherche à produire le vecteur. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, un vecteur répondant aux définitions précédentes est en outre caractérisé en ce que 1'ADN proviral est issu du rétrovirus Mo-MuLV. D'autres rétrovirus de la famille des NuLV peuvent être utilisés et l'on citera par exemple les rétrovirus HaSV ou F MuLV. De préférence, les séquences des gènes pol et env de 1'ADN proviral sont totalement délétées. Dans ce cas, la séquence du gène gag peut être également entièrement délétée ou au contraire être conservée en partie, dès lors que l'ADN du provirus ainsi constitué n'est plus susceptible de se répliquer. Avantageusement, un vecteur rétroviral tel que défini précédemment est caractérisé en ce que la région U3 du fragment LTR3' est délétée au niveau du nucléotide 2797 de la figure 1. Cette délétion correspond à une délétion d'un fragment situé entre les nucléotides 7935 et 8113 selon la numérotation de la séquence publiée par Shinnick et al (Nature 293, 543-548, 1981). Ce fragment délété de la séquence U3 du LTR3' comporte la région activatrice du LTR. De façon particulièrement avantageuse pour la réalisation d'un vecteur rétroviral selon l'invention, le promoteur constitutif exogène est le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK-1). Ce promoteur est soit le promoteur de souris ou le promoteur humain tel que décrit par Adra et al (Gene 60, 1987, 65-74). Ce promoteur présente l'avantage de permettre un haut niveau d'expression de la séquence de nucléotides exogène. D'autres promoteurs constitutifs peuvent être utilisés à la place du promoteur PGK-1. De façon générale, on aura recours à un promoteur actif dans les cellules que l'on cherche à transformer avec le vecteur rétroviral et en particulier des promoteurs actifs dans des fibroblastes à l'état quiescent, par exemple des promoteurs précédant les gènes du cytosquelette. On peut également citer le promoteur de la p-actine. Selon une variante de réalisation de l'invention, la séquence provirale en amont du promoteur constitutif exogène est la séquence de nucléotides située entre les nucléotides 1 et 1500 environ selon la numérotation de la séquence représentée à la figure 1. Cette séquence en amont du promoteur est essentiellement dépourvue de l'ensemble des gènes gag, pol et env de la séquence provirale. La séquence de nucléotides exogène est avantageusement insérée sous le contrôle du promoteur constitutif exogène, à la place des séquences gag, pol et env délétées. Lorsque le promoteur est le promoteur PGK-1, la séquence de nucléotides exogène est avantageusement insérée au site BamHI en aval de ce promoteur. A titre préféré, un vecteur rétroviral selon l'invention est le vecteur pN48 représenté à la figure 2, modifié par la séquence de nucléotides exogène au site BamHI. Le vecteur rétroviral M48 LacZ (encore désigné par l'expression pM48 LacZ) a été déposé à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Paris - France) sous le N I-1298, le 16 Avril 1993. Un autre vecteur intéressant dans le cadre de l'invention est le vecteur pM48 caractérisé en ce qu'il contient en aval du promoteur constitutif exogène, un fragment BamHI du gène de la B-galactosidase. Ce fragment du gène de la ss-galactodidase peut aisément être délété et remplacé par une séquence de nucléotides exogène d'intérêt, par exemple une séquence codant pour une protéine ou une glycoprotéine susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique ou contre le produit protéique de laquelle on souhaiterait par exemple obtenir des anticorps. Un vecteur rétroviral de l'invention peut également contenir, en amont du promoteur exogène, une séquence d'activateur. L'invention concerne par ailleurs des cellules recombinantes, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules ayant la capacité d'être tolérées immunologiquement par un organisme chez lequel elles seraient implantées, modifiées par un vecteur rétroviral répondant à l'une des définitions précédentes. De telles cellules, peuvent être des cellules issues de 1' organisme chez lequel elles doivent être implantées après recombinaison par transduction avec le vecteur de l'invention, ou des cellules dépourvues à leur surface d'antigènes reconnus par le système immunitaire de l'organisme chez lequel elles sont implantées. I1 peut également s'agir de cellules tumorales prélevées chez un patient et dont on souhaite modifier le patrimoine génétique afin qu'elles puissent intervenir sur le développement de la tumeur. A titre préféré, ces cellules recombinantes sont des fibroblastes recombinants et en particulier des fibroblastes cutanés. De préférence, il s'agit de fibroblastes autologues par rapport au patient chez lequel on souhaite les implanter après leur modification par un vecteur selon l'invention. Les cellules recombinantes selon l'invention peuvent être caractérisées selon un mode de réalisation avantageux, en ce que la séquence de nucléotides exogène qu'elles contiennent code pour une protéine dont on souhaite obtenir l'expression et la sécrétion, notamment pour une protéine soluble dans le sérum. A titre d'exemple, cette séquence de nucléotides exogène code pour la P-glucuronidase, ou une autre enzyme lysosomale telle que l'M-iduronidase ou l'aryîsulfatase B, un facteur de coagulation tel que le facteur VIII ou le facteur IX, l'érythropoïétine, ou toute partie active de l'une de ces protéines. L'invention a également pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules recombinantes telles que définies précédemment, en combinaison avec des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) et du collagène. Une telle composition est susceptible lorsqu'elle est implantée in vivo, de constituer un néo-organe vascularisé, individualisé au sein d'un tissu. Avantageusement, la composition telle que décrite cidessus comprend en outre un facteur de croissance, par exemple le bFGF(basic Fibroblast Growth Factor). Ce facteur de croissance favorise la vascularisation du néo-organe lorsque celui-ci est implanté in vivo. De préférence, le néo-organe est introduit dans la cavité péritonéale chez un patient chez lequel on souhaite obtenir l'expression de la séquence de nucléotides exogène contenue dans le vecteur de l'invention. Cette localisation du néo-organe est favorable au développement de sa vascularisation et au maintien sous forme invididualisée de cet organe. L'implantation de la composition comprenant les cellules recombinantes selon l'invention peut être permanente, ou au contraire transitoire le néo-organe formé pouvant dans ce cas être retiré après un temps donné d'implantation. L'invention vise par ailleurs un procédé pour la préparation d'une composition ci-dessus définie, comprenant les étapes de - mise en contact de cellules recombinantes préalablement incorporées à une solution de collagène avec des fibres de PTFE préalablement traitées avec du collagène et avec un facteur de croissance angiogénique, - incubation de la préparation obtenue à l'étape précédente afin d'obtenir la gélification du collagène, - culture des cellules ainsi obtenues pendant un temps suffisant pour permettre aux cellules de s'attacher sur les fibres de collagène, - récupération de la composition ainsi obtenue. Les cellules recombinantes selon l'invention ou les compositions de l'invention, peuvent être utilisées pour le traitement d'une pathologie susceptible d'être corrigée par l'expression et la sécrétion dans le sérum d'un patient, de la séquence de nucléotides exogène contenue dans ces cellules. Les cellules recombinantes de l'invention ou compositions les contenant sont particulièrement appropriées pour le traitement de maladies génétiques, en particulier pour le traitement de maladies de surcharge lysosomale, de l'hémophilie A ou de l'hémophilie B, de la Bthalassémie, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes correspondant respectivement à celles qui codent pour une enzyme lysosomale, le facteur VIII, le facteur IX ou l'érythropoïétine, ou pour une partie active de ces séquences. De même, ces cellules recombinantes ou compositions les contenant peuvent être utilisées pour le traitement de maladies acquises, par exemple pour le traitement de maladies virales, notamment pour le traitement d'une infection due au rétrovirus HIV par exemple par l'expression et la sécrétion dans le sérum de molécules CD4 solubles ou d'une protéine anti-virale soluble. Les moyens décrits dans l'invention permettent donc d'envisager le traitement de maladies génétiques ou acquises sur une période longue, supérieure à plusieurs mois, et ce sans administration répétée du produit d'expression de la séquence de nucléotides exogène dont on recherche l'activité thérapeutique. De plus, les moyens décrits dans l'invention permettent l'obtention sous forme de protéine sécrétée d'une quantité de produit d'expression de la séquence de nucléotides exogène, suffisante pour avoir un effet thérapeutique in vivo. Une autre application des cellules recombinantes selon l'invention ou des compositions les contenant, pour la préparation d'anticorps contre le produit d'expression de la séquence de nucléotides exogène, contenu dans le vecteur introduit dans les cellules recombinantes. De préférence, ces anticorps sont obtenus in vivo lorsque les cellules recombinantes sont implantées dans un organisme. Cette utilisation permet par exemple de produire des anticorps contre un antigène dont on n'aurait pas identifié la séquence en acides aminés ni nécessairement séquencé 1'ADN ou 1'ADNc. Selon l'effet recherché, l'introduction du vecteur recombinant selon l'invention, sera effectuée dans un type cellulaire défini. De même, l'invention permet la production in vivo d'anticorps contre un antigène déterminé, par exemple à des fins de vaccination d'un patient. Des cellules recombinantes telles que décrites plus haut, ou des compositions les contenant peuvent également être mises en oeuvre pour le traitement de tumeurs, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes codant pour une substance capable de favoriser ou d'augmenter la réponse immunitaire contre les cellules de la tumeur. A titre particulier, les cellules recombinantes utilisables pour le traitement de tumeurs, peuvent être des cellules obtenues par recombinaison de cellules de tumeurs, prélevées chez un patient, avec un vecteur rétroviral répondant aux définitions données dans les pages précédentes. D'autres propriétés et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, dans lesquelles - Figure 1 : séquence de nucléotides du vecteur M48 - Figure 2 : représentation du vecteur PM48. Exemples Le transfert et l'expression de matériel génétique exogène permet de modifier expérimentalement les propriétés d'un tissu. Des traitements reposant sur ce principe pourraient être proposés à des malades présentant des déficiences génétiques ou des maladies acquises. L'exemple décrit ci-dessous fait appel à un vecteur rétroviral pour introduire dans des cellules l'information génétique codant pour une protéine secrétée. La réimplantation dans l'organisme des cellules génétiquement modifiées est réalisée en associant ces cellules avec du collagène, un facteur angiogénique et des fibres synthétiques. L'expression in vivo à long terme du matériel génétique ainsi transféré est obtenue en utilisant le promoteur du gène murin de la phosphoglycérate kinase. 1 - VECTEUR RETROVIRAL 1.1 - Caractéristiques Le vecteur rétroviral M48 (figure 2) est construit à partir de séquences provirales isolées de 1'ADN génomique de cellules de rat infectées par le rétrovirus leucemogène murin de Moloney (Mo-MuLV). Les gènes gag, pol et env qui codent pour les protéines du virus ont été retirés et remplacés par les séquences à véhiculer. On a conservé les séquences rétrovirales nécessaires en cis à la production et à la maturation des transcrits du génome viral recombinant, à leur empaquetage dans des particules virales infectieuses, à leur transcription inverse et à leur intégration dans le génome de la cellule infectée. Les séquences du provirus recombinant et les fragments flanquants d'ADN cellulaire sont portés par le plasmide bactérien pBR322. Le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK-1) de souris a été inséré à la place des gènes viraux. Un site de clonage unique BamHI permet de placer les séquences à véhiculer dans le vecteur rétroviral sous le contrôle de ce promoteur. Ce vecteur rétroviral comporte une délétion dans les séquences U3 du LTR interne (Cone et al., Mol. Cel. Biol. 7, 887-897, 1987). Ceci entraîne, dans la cellule infectée, une forte diminution des ARNm démarrant au niveau du LTR 5', et une prédominance des ARNm produits à partir du promoteur PGK-1. L'utilisation de ce vecteur résulte donc en l'insertion, dans le génome de la cellule cible d'une cassette d'expression de la séquence d'intérêt sous le contrôle du promoteur PGK-1. 1.2. - Structure du vecteur La séquence complète du vecteur M48 (Figure 1) comprend - Position 1 à 2019 : Séquences du Mo-MuLV comprenant la longue répétition terminale 5'(ou 5'LTR ou LTR5'), les séquences d'empaquetage t et t+ qui incluent une partie du gène gag (position -447 à 1564 dans la numérotation de Shinnick et al. (Nature 293, 543-548, 1981). Ces séquences sont modifiées de la façon suivante : insertion d'un linker Sac II (5'CCCGCGGG3') en position 1072 (position 626, Shinnick et al.). - Position 2020 à 2524 : Promoteur du gène de souris codant pour la phosphoglycérate kinase (position -524 à -20, avant le codon de début de traduction, d'après Adra et al. Gene 60, 65-74, 1987). - Position 2525 à 2534 : Site unique BamHI pour l'insertion de séquences qui seront exprimées sous le contrôle du promoteur PGK-1. - Position 2535 à 3101 : Séquences du Mo-MuLV comprenant l'extrémité 3' du gène env (32 codons) et le LTR3'. Ces séquences sont modifiées de la façon suivante : délétion des séquences du LTR comprises entre 7935 et 8113 dans la numérotation de Shinnick et al. et insertion d'un linker Sal I (2797 dans la numérotation présente). - Position 3102 à 3674 : Séquences génomiques de rat. - Position 3675 à 8003 : Séquences du plasmide vecteur pBR322 (position 4363 à 29) comprenant le gène de B-lactamase. Ces séquences sont modifiées de la façon suivante : destruction du site BamH I (position 7657, numérotation présente). - Position 8004 à 8378 : Séquences génomiques de rat. 1.3. - Production de vecteur rétroviral Cette production s'effectue en introduisant la structure provirale recombinante dans une lignée cellulaire où les gènes gag, pol et env sont exprimés constitutivement. Cette lignée, dite transcomplémentante ou d'empaquetage synthétise des particules rétrovirales dépourvues d'ARN génomique. La lignée çCRIP, dérivée de fibroblastes de souris NIH/3T3 est utilisée ici (Danos et Mulligan Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85, 6460-6465, 1988). Lorsque la construction recombinante est introduite par transfection, les ARN transcrits à partir du LTR5' sont encapsidés et les cellules produisent alors des particules capables de transmettre le génome recombinant mais incapables de se répliquer. Après transfection de la construction recombinante, les cellules productrices de vecteur rétroviral sont sélectionnées. On utilise pour la préparation de vecteur, soit un clone producteur de hauts titres viraux, soit une population polyclonale. Les étapes de l'isolement d'un clone producteur sont les suivantes 1) Les cellules çCRIP sont transfectées par un coprécipité au phosphate de calcium (Graham et Van Der Erb, Virology, 52, 456, 1973) de la construction rétrovirale et du plasmide pSV2neo (Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341, 1982), dans un rapport molaire de 10 pour 1. 2) Les cellules ayant intégré de manière stable et exprimant 1'ADN exogène sont sélectionnées en présence de G418 à 1 mg/ml (Geneticin, Gibco). 3) La population de cellules résistantes au G418 où des clones individuels isolés sont testés pour leur capacité à produire le vecteur rétroviral. Pour cela, des cellules cibles NIH/3T3 sont mises en présence du milieu de culture recueilli à partir de cellules TRIP, et la transmission du provirus recombinant est analysée après 48 heures. L'analyse, effectuée à partir de 1'ADN génomique des cellules cibles, se fait par PCR (méthode qualitative) ou par Southern blot (méthode quantitative). 4) Une banque de cellules productrices est conservée à - 135"C. 2 - PREPARATION DE8 STOCKS DE VECTEUR RETROVIRAL Le surnageant de culture des cellules d'empaquetage est recueilli après une incubation de 24 heures sur les cellules d'empaquetage produisant le vecteur rétroviral, et mis en contact avec les cellules cibles pour réaliser l'infection. 2.1. - Préparation en masse Un stock d'une centaine d'ampoules contenant des cellules productrices est conservé à -135 C. Après décongélation, les cellules sont amplifiées pendant 10 jours, successivement en flacon puis en rollers de 875 cm2, jusqu'à obtention de 20 rollers confluents. La production est alors commencée. Elle dure 4 ou 5 jours. Le milieu de culture est du DMEM contenant 1 g/l de glucose, 10 mM de pyruvate de Na, et additionné avec 5 % de sérum de veau nouveau-né (Hyclone). Chaque roller permet le conditionnement de 100 ml de milieu par 24 heures. Ce surnageant de culture est centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. La production hebdomadaire est de 8 à 10 litres de surnageant viral. 2.2. - Concentration Le surnageant peut être concentré pour augmenter le titre infectieux du vecteur rétroviral. Apres centrifugation, le surnageant est dialysé tangentiellement contre une membrane Sartocon de porosité 100.000, en utilisant le dispositif Crossflow de Sartorius. Une concentration de 20 fois est obtenue en 3 heures. Elle s'accompagne d'une augmentation de 20 fois des titres infectieux. Après concentration, la préparation virale est utilisée immédiatement, ou conservée à -80 C si le délai d'utilisation est supérieur à 2 semaines. 3 . FIBROBLASTES CUTANES 3.1. - Isolement et mise en culture Les fibroblastes destinés au transfert de gène sont obtenus par une biopsie cutanée effectuée en conditions d'aseptie très soigneuse. Chez la souris, un animal syngénique est sacrifié à cet usage. Chez le gros mammifère, un ou plusieurs fragments de peau d'environ 10 cm2 sont prélevés au cours d'une anesthésie générale. Après découpage en lambeaux de quelques mm2, les fragments sont dissociés par un traitement enzymatique. Pour un fragment de lOcm2, la réaction est effectuée pendant 2 heures à 37"C en agitation douce dans 50ml de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 100 mg de collagénase (Worthington), 500 U de dispase (Collaborative Research Inc.).Après centrifugation et lavage, les cellules sont comptées, puis ensemencées dans des flacons de 150 cm2 à la concentration de 1 à 5x106/cm2. Le milieu de culture est du RPMI 1640 additionné de 10 à 20 % de sérum de veau foetal. 3.2. - Infection par le vecteur rétroviral Les infections avec la préparation de vecteur rétroviral sont débutées le lendemain de la mise en culture, alors que la densité cellulaire est inférieure à 20 % de confluence. Elles sont répétées quotidiennement, suivant le même protocole pendant 4 ou 5 jours. Après retrait du milieu de culture, les cellules sont mises en contact avec la préparation de vecteur rétroviral non concentrée ou concentrée, dans tous les cas, additionnée avec 8pg/ml de polybrene. L'incubation est effectuée pendant 2 heures à 37C, puis, sans lavage préalable, la préparation virale est remplacée par du milieu de culture. Lorsqu'un vecteur codant pour une protéine détectable à l'examen microscopique est utilisé, on constate que ce procédé permet l'introduction du gène étranger dans plus de 90 % de fibroblastes. Le niveau de sécrétion de la protéine dans le surnageant de culture peut être contrôlé au cours et à la fin de ce processus. Les cellules peuvent être congelées en partie ou en totalité à ce stade. Après infection, les cellules sont amplifiées jusqu'à obtention d'un nombre suffisant pour la réimplantation, soit 2-6x108 cellules/kg de poids corporel. L'amplification est réalisée dans des plateaux de culture (multitray, Nunc). 3.3. - Recueil des cellules génétiquement modifiées. Après amplification, les cellules sont recueillies par traitement à la trypsine. Après lavage et comptage, elles sont disponibles pour servir à la formation d'un neo-organe. Un échantillon est conservé pour contrôler le transfert génétique par Southern blot, ainsi que l'expression et la sécrétion de la protéine étrangère par une technique appropriée. 4 - NEO-ORGANE 4.1. - Constituants Trois composants sont assemblés in vitro. La méthode décrite ci-dessous est applicable à la réalisation de néo-organes de 1 ml contenant 5x106 à 107 cellules génétiquement modifiées. Les mêmes proportions sont utilisées pour la formation de néo-organes de grande taille contenant 1 à 5x109 cellules. 1) Des fibres de polytetrafluoroéthylène (Gore et Associates) stérilisées par autoclavage (120"C, 30 minutes) sont recouvertes par du collagène de type 1. Les fibres sont baignées dans une solution de collagène de queue de rat (Sigma) à 0.1 % dans de l'acide acétique 0.1N. Ce traitement s'effectue sous vide pendant 1 heure à température ambiante, afin de chasser l'air présent entre les fibres synthétiques. Les collagènes d'origine murine, bovine ou humaine peuvent être indifféremment utilisés. Après séchage pendant 24 heures sous une hotte à flux luminaire, les fibres ainsi entourées d'une fine pellicule de collagène, sont incubées en présence d'un facteur de croissance angiogénique (FGF basique, Farmitalia, 10-20 ng/50 mg de fibres dans une solution de PBS-5% P- mercaptoethanol). Les fibres ainsi traitées, sont lavées en PBS et conservées à 4"C. 2) Une solution constituée des éléments suivants est préparée. Pour 1 ml : RPMI 1640 10x (Gibco), 100 Sl; bicarbonate 7,5 %, 12 l ; NaOH 7,5 N, 8 Ml ; Hepes 1 M, 2,5 iil ; Penicilline/Glutamine (Gibco), 100 pg ; ; bFGF (Farmitalia) 10 ng ; collagène (Bioethica) 1,5 mg eau distillée qsp 1 ml. Cette solution de consistance sirupeuse, est conservée à + 4"C. 3) Après lavage, les cellules génétiquement modifiées sont resuspendues dans 100 1 de RPMI 1640 avec 15 % de sérum de veau foetal. 4.2. - Assemblage 2) Les cellules génétiquement modifiées (1001ri) sont incorporées à la solution de collagène (lml), à l'aide d'un agitateur, 3) Ce mélange est déposé sur les fibres. L'ensemble est placé dans un incubateur (37 C, 5 % Cl, ) pendant 30 minutes afin d'obtenir la gélification du collagène. Lorsque celle-ci survient, lml de RPMI 1640 avec sérum de veau foetal est déposé sur le gel afin de compenser les variations de pH. Deux à quatre heures plus tard, le gel est délicatement décollé du bord de la boîte de culture à l'aide d'une aiguille à injection et transféré dans une boîte plus large, en présence d'un excès de milieu de culture pour une période de 12 à 24 heures. Pendant ce laps de temps, les fibroblastes inclus dans le gel de collagène s'attachent sur les fibres de collagène, ce qui induit une rétraction de la structure. Il est habituel de constater une réduction de plus de 50 % du volume initial. L'ensemble est alors prêt à être implanté dans l'organisme. 4.3. - Implantation Le néo-organe est introduit dans la cavité péritonéale au cours d'une laparotomie effectuée sous anesthésie générale. Chez la souris, l'implantation est effectuée en insérant sans fixation le néo-organe entre les anses intestinales au contact du mésentère. Chez le gros mammifère, le néo-organe est fixé par deux points entre les deux feuillets du tablier épiploïque. Des connexions vasculaires s'établissent dès les premiers jours. La protéine exogène peut alors être libérée dans la circulation de l'animal receveur. A partir de la troisième semaine suivant l'implantation, un organe souvent pédiculé, encapsulé et bien individualisé est formé. De nombreuses connexions vasculaires sont visibles à sa surface. Il n'existe pas d'adhérence inflammatoire. Les examens après 3 et 6 mois montrent un aspect identique.L'analyse histologique à ce stade révèle la présence d'un tissu conjonctif lâche, vascularisé et peu inflammatoire. 5 - APPLICATIONS 5.1. - Traitement des maladies de surcharge lysosomale. Ce procédé a été appliqué au traitement d d'une maladie de surcharge lysosomale pour laquelle un modèle murin est disponible. Il s'agit d'un déficit en p- glucuronidase responsable d'une mucopoîysaccharidose. La ss-glucuronidase est phosphorylée et est donc, en partie, transportée vers les lysosomes et en partie, secrétée dans la circulation. Elle peut être captée par d'autres tissus, par l'intermédiaire du récepteur au mannose-6-phosphate exprimé à la surface de nombreuses cellules. Ce captage spécifique permet une approche thérapeutique où la distribution systémique continue de l'enzyme manquante est assurée par des cellules génétiquement modifiées. Des implants de 0,5 cm3 contenant 20x106 fibroblastes autologues sont bien tolérés par la souris. Les cellules implantées expriment le gène de la p-glucuronidase humaine inséré dans le vecteur M48, sous le contrôle du promoteur PGK et secrètent la protéine étrangère au-delà de 5 mois. L'effet biologique est objectivé par une chute rapide de l'élimination urinaire des catabolites intermédiaires de la dégradation des mucopolysaccharides. La normalisation histologique des tissus de l'animal receveur est spectaculaire, particulièrement au niveau du foie et de la rate. Elle est stable au cours du temps, et dépend de la présence du néo-organe dont l'exérèse induit un retour à l'état pathologique initial. Chez le chien non déficitaire pesant 25 kg (Golden Retriever), l'implantation de néo-organe contenant 2x109 cellules génétiquement modifiées permet la distribution de l'enzyme étrangère et son captage par le foie, où elle représente, 45 jours après implantation, 3 % de l'activité endogène. Ce procédé est applicable au traitement de l'ensemble des maladies de surcharge lysosomale humaines, y compris la maladie de Gaucher pour laquelle l'apport d'une forme soluble de la glucocérébrosidase est envisageable. 5.2. - Traitement de maladies génétiques ou acquises. Le procédé est applicable à la distribution dans le sérum de toute protéine soluble, ou de protéines transmembranaires tronquées de leur domaine d'immobilisation dans la membrane. Cependant, il ne permet pas une régulation des concentrations sériques de la protéine étrangère. Les applications suivantes sont envisagées pour les maladies génétiques : dans l'hémophilie B, l'apport de facteur IX ; dans l'hémophilie A, l'apport de facteur VIII sous forme d'une protéine délétée dans la région B ; dans la - thalassémie, l'apport d'érythropoiétine susceptible de corriger l'anémie par stimulation de la synthèse d'hémoglobine foetale. L'apport de CD4 soluble, ou de ses dérivés couplés à des immunotoxines ou des immunoglobulines, est envisageable dans les infections par des rétrovirus de la famille du VIH. Plus généralement, toute protéine anti-virale soluble pourrait être distribuée de cette façon. 5.3. - Production d'anticorps La distribution de protéine étrangère chez la souris induit une réponse immunitaire marquée par l'apparition d'anticorps spécifiques, comme nous l'avons observé pour la p-glucuronidase, le CD4 soluble, et l'érythropoïétine. Le procédé pourrait donc être appliqué pour immuniser des animaux contre le produit non encore identifié d'un cDNA isolé par génétique inverse ou par d'autres moyens. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux pourraient être obtenus de cette manière, sans nécessiter la préparation préalable de la protéine. La même approche est envisageable pour réaliser des immunisations dans un but thérapeutique ou préventif. Des applications vaccinales pourraient être proposées, par exemple, contre des épitopes neutralisants de l'enveloppe du VIH ou des virus apparentés. - REVENDICATIONQ - 1 - Vecteur rétroviral recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN de provirus modifiée de façon telle que - les gènes qaq, pol et env sont délétés au moins en partie, de façon à supprimer leur capacité à intervenir dans la réplication du rétrovirus, - la séquence LTR comporte une délétion dans la séquence U3, telle que la transcription sous forme d'ARNm qu'elle contrôle est réduite de manière significative, par exemple d'au moins 10 fois, et le vecteur rétroviral recombinant comprenant, en outre, une séquence de nucléotides exogène sous le contrôle d'un promoteur constitutif exogène. 2 - Vecteur rétroviral selon la revendication 1, en ce que la séquence d'ADN de provirus modifiée, la séquence de nucléotides exogène et le promoteur constitutif exogène sont portés par un plasmide. 3 - vecteur rétroviral selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que 1'ADN proviral est issu du rétrovirus Mo-MuLV. 4 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les séquences des gènes pol et env de 1'ADN proviral sont entièrement délétées. 5 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la région U3 du fragment LTR3' est délétée au niveau du nucléotide 2797 de la figure 1. 6 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le promoteur constitutif exogène est le promoteur PGK-1 de souris ou le promoteur PGK-1 humain. 7 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence provirale en amont du promoteur constitutif exogène est la séquence de nucléotides du provirus, situee entre les nucléotides 1 et 1500 environ de la séquence représentée à la figure 1. 8 - Vecteur rétroviral selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides exogène est insérée au site BamHI en aval du promoteur PGK-1 constitutif exogène. 9 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pM48 représenté à la figure 2, modifié par l'insertion de la séquence de nucléotides exogène au site BamHI. 10 - Vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il contient au site BamHI en aval du promoteur constitutif exogène, un fragment BamHI du gène de la p-galactosidase. 11 - Vecteur retroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il contient en outre, en amont du promoteur constitutif exogène, une séquence d'activateur. 12 - Cellules recombinantes caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules ayant la capacite d'être tolérées immunologiquement par un organisme auquel elles seraient administrées, modifiées par un vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13 - Cellules recombinantes selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'il s'agit de fibroblastes recombinants, notamment de fibroblastes cutanés. 14 - Cellules recombinantes selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules tumorales modifiées par un vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 15 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisées en ce que la séquence de nucléotides exogène qu'elles contiennent code pour une protéine dont on souhaite obtenir l'expression, notamment pour une protéine soluble dans le sérum. 16 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 caractérisées en ce que la séquence de nucléotides exogène qu'elles contiennent code pour la p-glucuronidase. 17 - Composition caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, des fibres de polytétrafluoroéthylène PTFE et du collagène. 18 - Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comprend 106 à 109 de préférence 5.106 à 107 cellules recombinantes, susceptible d'être obtenue par - étalement de fibres de PTFE préalablement traitées avec une solution de collagène et un facteur de croissance angiogénique, - depôt sur ces fibres de PTFE, de cellules recombinantes préalablement traitées avec une solution de collagène, - incubation du mélange obtenu afin d'obtenir la gélification du collagène, - culture du mélange incubé dans ces conditions, permettant l'attachement des cellules sur les fibres de collagène, - récupération de la composition obtenue. 19 - Procédé pour la préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18 comprenant les étapes de - mise en contact de cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 préalablement incorporées à une solution de collagène avec des fibres de PTFE préalablement traitées avec du collagène et avec un facteur de croissance, - incubation de la préparation obtenue à l'étape précédente afin d'obtenir la gélification du collagène, - culture des cellules ainsi obtenues dans des conditions permettant aux cellules de s'attacher sur les fibres de collagène, - récupération de la composition ainsi obtenue. 20 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, pour le traitement d'une pathologie susceptible d'être corrigée par l'expression et la sécrétion dans le serum d'un patient, de la séquence de nucléotides exogène contenue dans ces cellules. 21 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 ou composition selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18 pour le traitement de maladies génétiques, en particulier pour le traitement de maladies de surcharge lysosomale, de l'hémophilie A ou de l'hémophilie B, de la p- thalassémie, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes correspondant respectivement à celles qui codent la B-glucuronidase pour le facteur VIII, le facteur IX ou l'érythropoiétine, ou pour une partie active de ces séquences. 22 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 ou composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, pour le traitement de maladies acquises, par exemple pour le traitement de maladies virales, notamment pour le traitement d'une infection due au rétrovirus HIV par exemple par l'expression et la sécrétion dans le sérum de molécules CD4 solubles ou d'une protéine anti-virale soluble. 23 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 ou composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, pour la préparation d'anticorps contre le produit d'expression de la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes. 24 - Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 ou composition selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18 pour le traitement de tumeurs, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes codant pour une substance capable de favoriser ou d'augmenter la réponse immunitaire contre les cellules de la tumeur. 25 - Cellules recombinantes selon la revendication 24, telles qu'obtenues par recombinaison de cellules de tumeur avec un vecteur rétroviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.