FR 2703053 A1 19940930 FR 9303514 A 19930326 La présente invention concerne un nouveau type d'oligonucléotides. Les oligonucléotides sont de courtes molécules synthétiques d'ADN, d'ARN ou mixtes. En particulier les oligonucléotides dits "antisens" ont une séquence complémentaire à une séquence cible appartenant à un gène ou à un ARN messager dont on désire bloquer spécifiquement l'expression. Les oligonucléotides antisens peuvent être dirigés contre une séquence d'ARN messager, ou bien contre une séquence d'ADN. Les oligonucléotides antis ens hybrident à la séquence dont ils sont complémentaires et peuvent ainsi bloquer ltexpression de I'ARN messager portant cette séquence. Le terme "oligonucléotide" est ici utilisé de façon générale pour désigner un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de 5 à 50, nucléotides en série ribo-, désoxyribo- ou mixte. Lorsqu'il sera question qu'une propriété particulière liée à l'utilisation d'une série désoxyribo- ou d'une série ribo-, on utilisera la dénomination complète oligodésoxyribonucléotide ou oligoribonucléotide. Le terme "appariement" ou "hybridation" utilisé ici signifie la formation de liaisons hydrogènes entre des paires de bases complémentaires, telles que la guanine et la cytosine formant trois liens hydrogènes entre elles, et l'adénine et la thymine ou l'uracile en formant deux. I - ETAT DE IA TECHNIOUE I 1. Les oligonucléotides antisens modifiés Les oligonucléotides antisens sont synthétisés par voie chimique et comportent fréquemment des modifications altérant le squelette même de la molécule ou portent des groupement réactifs additionnels, localisés à leurs extrémités. Ces modifications introduites dans les oligonucléotides antis ens ont pour buts soit d'augmenter la résistance de ces molécules à la dégradation nucléolytique, soit de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, soit de permettre des réactions de dégradation/modification spécifiques des cibles, ARN ou ADN, soit d'accroître leur pénétration intracellulaire. Les oligonucléotides antisens sont sensibles aux dégradations nucléasiques, et principalement à l'action des exonucléases. Les nucléases se trouvent dans tous les compartiments -cellulaires et extra-cellulaires, en particulier dans le sérum- et provoquent une dégradation rapide de ces molécules. Une utilisation pharmacologique de molécules antisens implique la résolution de ces problèmes de dégradation afin d'arriver à une pharmacocinétique satisfaisante et donc à une pérennisation suffisante des effets de ces molécules. De nombreuses modifications chimiques permettent aux oligonucléotides antisens de devenir résistants aux nucléases. Certaines modifications affectent directement la structure ou la nature de la liaison phosphodiester (méthylphosphonates, phosphorothioates, oligonucléotides alpha, phosphoramidates, pour citer quelques exemples), d'autres consistent en l'addition de groupements de blocage aux extrémités 3' et 5' des molécules (Perbost et al., 1989; Bertrand et al., 1989; Bazile et al., 1989; Andrus et al., 1989; Cazenave et al., 1989; Zon, 1988; Maher and Dolnick, 1988; Gagnor et al., 1987; Markus-Sekura, 1987). I. 2. Ciblage des oligonucléotides antisens anti-ARN messager Toutes les régions d'un ARN messager ne sont pas sensibles de la même façon aux effets d'un oligonucléotide antis ens. Un ARN messager n'est pas une molécule linéaire figée, mais au contraire une molécule comportant de nombreuses structurations secondaires (hybridations intra-moléculaires complexes), tertiaires (repliements et conformations particulières, pseudo-noeuds), et interagissant avec des nucléoprotéines structurales et fonctionnelles (protéines basiques, complexes d'épissage, de poly-adénylation, de capping, complexe de traduction par exemple). La disponibilité effective et ltaccessibilité des différentes régions d'un ARN messager va dépendre de leurs engagements dans ces structurations. Corrélativement, l'efficacité d'un agent inhibiteur interagissant avec telle ou telle séquence va dépendre également de l'engagement de cette séquences dans une fonction particulière. Les régions cibles pour les molécules antisens doivent être accessibles à l'oligonucléotide. L'utilisation de logiciels de prédiction de structures secondaires permet de prévoir des degrés d'accessibilité théoriques et donc d'orienter le choix de cibles pour des oligonucléotide antisens. Globalement, les régions les plus utilisées comme cibles sont les sites de démarrage de la traduction (région de l'AUG initiateur) ainsi que les sites d'épissage (jonctions SD/SA). De nombreuses autres séquences n'ayant pas de fonctionnalités particulières et non engagées dans des appariement intramoléculaires se sont avérées également efficaces comme cible pour des oligonucléotides antisens (voir les exemples cités plus loin). I. 3. Oligonucléotides antisens dirigés contre 1'ADN Les oligodésoxyribonucléotides antisens peuvent également être dirigés contre certaines régions d'ADN bicaténaire (séquences homopurines/homopyrimidines ou riches en purines/pyrimidines) et former ainsi des triples hélices (Perroualt et al., 1990; François et al.(A), 1989; François et al.(B), 1989; François et al.(C), 1989; Wang et al., 1989; Maher et al., 1989; Sun et al., 1989; Boidot-Forget et al., 1988; Moser and Dervan, 1987; Dervan, 1986). Des oligonucléotides dirigées ainsi contre l'ADN ont été appelés "anti-gène" ou encore "anti-code".La formation d'une triple hélice, au niveau d'une séquence particulière, peut bloquer la fixation de protéines intervenant dans l'expression d'un gène et/ou permettre d'introduire des dommages irréversibles dans 1'ADN si l'oligonucléotide considéré possède un groupement réactif particulier. De tels oligonucléotides antis ens peuvent devenir de véritables endonucléases de restriction artificielles, dirigées à la demande contre des séquences spécifiques. I. 4. Mode d'action des oligonucléotides antisens L'hybridation entre un oligonucléotide antis ens et un ARN messager cible peut en bloquer l'expression de plusieurs manières, soit de façon stérique, soit de façon pseudo-catalytique (Gagnor et al., 1989; Jessus et al., 1988; Markus-Sekura, 1987): -l'interaction entre l'ARN messager et un oligonucléotide antis ens complémentaire peut créer une barrière physique interdisant la fixation et/ou la progression de protéines ou de complexes protéiques nécessaire à la traduction, à la maturation, à la stabilisation ou au transport de L'ART messager. Ce blocage physique aboutira finalement à une inhibition de l'expression de l'ARN messager ciblé. -l'hybridation entre un ARN messager et un oligodésoxyribonucléotide antisens va créer un substrat pour la RNase H, enzyme présent dans toutes les cellules eucaryotes. La RNase H est un enzyme qui dégrade spécifiquement 1'ARN lorsqu'il est hybridé à de I'ADN. L'hybridation d'un oligonucléotide antisens ADN à un ARN cible aboutira donc à la coupure de cet ARN cible à l'emplacement de cette hybridation, et donc à son inactivation définitive. -Par ailleurs, comme indiqué plus haut, les oligonucléotides antisens peuvent comporter des groupement réactifs capables de produire directement des dommages irréversibles dans la molécules d'ARN cible. En ce qui concerne les oligonucléotides antisens dirigés contre l'ADN ils peuvent agir soit en inhibant la fixation d'une protéine de régulation indispensable à l'expression du gène ciblé (facteur de transcription par exemple), soit en introduisant des dommages irréversibles (coupures, cross-links) dans la molécule d'ADN, la rendant inapte, localement, pour l'expression génétique. I. 5 Exemples d'application des oligonucléotides antisens Les oligonucléotides antisens permettent de bloquer spécifiquement l'expression d'ARN messagers cellulaires, par exemple de messagers de type oncogénique, (Tortora et al., 1990; Chang et al., 1989; Anfossi et al., 1989; Zheng et al., 1989; Shuttleworth et al., 1988; Cope and Wille, 1989; Cazenave et al., 1989) et de nombreux différents types d'ARN messager viraux, provenant de virus aussi variés que le VSV (Degols et al., 1989; Leonetti et al., 1989), le SV40 (Westermann, et al., 1989), les virus influenza (Kabanov et al., 1990; Zerial et al., 1987), le virus de l'encéphalomyocardite (Sankar et al., 1989), l'adénovirus (Miroshnichenko et al., 1989), le HSV (Gao et al., 1988) et le HIV (Matsukura et al., 1989; Stevenson et al., 1989; Matsukura et al., 1988;Goodchild et al., 1988). Il . RÉSUMÉ DE L'INVENTION Il. 1. Problèmes soulevés par les applications pharmacologiques des antisens Les oligonucléotides antis ens sont donc des agents pharmacologiques potentiels, puissants et hautement spécifiques, permettant d'inhiber l'expression de messagers codant pour des produits exerçant des effets pathogènes. L'utilisation thérapeutique des oligonucléotides se heurte cependant à plusieurs problèmes de type physiologiques, en particulier celui de la délivrance intracellulaire de ces molécules et celui de leur sensibilité à la dégradation nucléolytique. Certaines modifications chimiques des oligonucléotides permettent de surmonter le problème de la sensibilité aux nucléases mais au prix d'un nouveau problème, celui de la toxicité éventuelle des modifications chimiques introduites dans la molécule. L'utilisation des oligonucléotides antis ens modifiés pose en effet des problèmes de nature toxicologiques. Si certaines des modifications sont réputées plutôt neutres, la plupart ne sont pas dénuées de toxicité potentielle. Des oligonucléotides antis ens modifiés chimiquement peuvent présenter une toxicité à plusieurs niveaux, soit directement par des effets de la molécule entière, soit indirectement via les effets des produits de dégradation. Des nucléotides porteurs de modifications chimiques, et présents dans une cellule à une concentration élevée peuvent ainsi présenter une toxicité -et plus particulièrement une génotoxicité- non négligeable au plan pharmacologique. Par exemple, de nombreux problèmes soulevés par l'emploi d'oligonucléotides antis ens modifiés, en particulier des effets anti-viraux non séquence-spécifiques, semblent bien être dus à la nature de certaines des modifications chimiques introduites dans les oligonucléotides antisens pour les rendre résistants aux nucléases. Au plan toxicologique, il est donc évident que moins on modifie la structure naturelle de l'oligonucléotide, moins on risque d'être confronté à des problèmes pharmacologiques. Une molécule naturelle d'ADN ou d'ARN, ainsi que ses produits de dégradation, ne pose pas ou peu de problème de toxicologie et de pharmacocinétique, ce qui n'est pas le cas d'une structure modifiée pouvant donner après métabolisation des dérivés multiples et potentiellement toxiques. Les oligonucléotides antisens peuvent également dans certains cas présenter une toxicité spécifique liée à la séquence ciblée. En effet l'oligonucléotide peut s'apparier à des séquences possédant un certain degré d'homologie avec la séquence cible induisant de ce fait un effet antisens indésiré et toxique. 11. 2. Sensibilité nucléolytique des oligonucléotides antisens. Dans les cellules, et plus encore dans un organisme, dans la circulation sanguine par exemple, les oligonucléotides antisens naturels sont sensibles aux nucléases. Les nucléases sont des enzymes de dégradation capables de couper les liaisons phosphodiester de l'ADN ou de 1'ARN, soit en introduisant des coupures internes sur des molécules mono- ou bicaténaires, soit en attaquant ces molécules à partir de leurs extrémités. Les enzymes attaquant de façon interne sont appelées les endonucléases et celles attaquant par les extrémités sont appelés exonucléases. La stabilité des oligonucléotides antisens -donc leur efficacité- peut être considérablement augmentée en introduisant diverses modifications chimiques les rendant résistants à la dégradation comme décrit ci-dessus. n est établi que ce sont les exonucléases qui sont la principale cause de dégradation des oligonucléotides antisens dans le sérum et dans la cellule. Plus particulièrement, il semble que les exonucléases s'attaquant à l'extrémité 3'0H soient surtout à incriminer dans ce phénomène. Des modifications apportées à la structure des extrémités des oligonucléotides antis ens peuvent les protéger, bloquer les activités des exonucléases, et conférer aux oligonucléotides une stabilisation accrue. Le but de la présente invention est de fournir des oligonucléotides antis ens notamment naturels, c'est-à-dire ne comportant que des désoxyou ribonucléotides normaux reliés entre eux par une liaison phosphodiester normale, mais présentant cependant une résistance à la dégradation, sans introduire de modifications chimiques susceptibles d'induire une toxicité, et permettant de plus de minimiser le risque d'appariement imparfait avec des séquences partiellement complémentaires, tout en conservant leur propriété d'hybridation et de pénétration cellulaire. 11. 3. Oligonucléotides agrafes et semi-agrafes Pour ce faire la présente invention fournit une molécule d'oligonucléotide présentant au moins une extrémité 3' auto-appariée, appelée oligonucléotide semi-agrafe ou agrafe dans le cas où l'extrémité 5' de cette molécule est également auto-appariée. L'invention a pour objet des oligonucléotides dont les extrémités 3' et/ou 5' engagées dans des liaisons d'hybridations intramoléculaires réserveront un accés réduit aux exonucléases respectivement 3' et/ou 5' et par suite une sensibilité réduite et une protection partielle de ces oligonucléotides aux activités nucléolytiques de ces enzymes. Les oligonucléotides présentant ce type de structure secondaire seront par suite stabilisés dans les milieux contenant ce type d'activités enzymatiques comme le sérum ou le milieu intracellulaire. Plus précisément, la présente invention a pour objet des oligonucléotides semi-agrafes ou agrafes constitués d'une séquence oligonucléotidique dont l'extrémité 3' ou les deux extrémités 3' et 5' sont engagées dans un auto-appariement intracaténaire impliquant l'hybridation d'au moins les deux bases terminales de l'extrémité 3' ou respectivement de chaque extrémité 3' et 5', avec un même nombre de bases consécutives complémentaires situées sur le brin, de manière à former une boucle à l'extrémité 3' ou respectivement une boucle à chaque extrémité cucadrant une séquence centrale. De teis oligonucléotides peuvent étre utilisés leur étal naturel mais peuvent cependant comporter également des nucléotides modifiés' dans leurs liaisons internucléotidiques, dans les cycles osidiques ou dans les bases, dans le but de favoriser la pénétration cellulaire, et/ou la résistance aux nucléases, et/ou reuforcer ou stabiliser leur bybridation avec une séquence complémentaire, les oligonucléotides suivant l'invention pouvant comporter en outre des groupenuents intercalants ou réactifs, ou étre assoriés physiquement à d'autres molécules ou macromolécules dans le but de renforcer leur efficacité d'inhibidon, leur pénétration, leur affinité pour les cibles, leur ciblage cellulaire ou intracellulaire, ou pour optimiser toute autre propriété. Sont donc comprises dans l'invention, toute molécule d'ADN, ou d'ARN, -ou mixte ADN/ARN-, monocaténaire, obtenue de façon biologique, rhiiniquc, ou par des procédés associant les techniques de la chimic de synthése à celles dc la biologie et dc la biochimie, dont la séquence primaire des nucléotides qui la conIposenL induit l'apparition d'une structure secondaire particuliére définie par la présence au minimum de l'appariement des deux dernières bases situées à l'extrèmité 3' de la séquence avec deux bases nucléotidiques consécutives situées au sein de la même molécule, et présentant une résistance aux exonucléases supérieure à celle d'un oligonucléotide de longeureur et composition nucléotidique identique mais linéaire. Les molécules satisfaisant à cette définition peuvent être subdivisées en deux catégories, les molécules agrafes et les molécules semi-agrafes, et représentées schématiquement de la manière suivante: OLIGONUCLEIC ii'r. A0KAI A OLIGONUCLEIC SEMI-AGRAFE où pl, PZ et P3 représentent les nombres de nucléotides constituant les boucles et sont variables d'un oligonucléotide à l'autre; nl, nz et n3 représentent les nombres de nucléotides impliqués dans les appariements intracaténaires; ils sont variables d'un oligonucléotide à l'autre mais nécessairement supérieurs à 2 il résulte de cette structure qu'à l'extrémité, ou aux deux extrémités 3' et 5', les ni (au moins deux) bases terminales impliquées dans un appariement intracaténaire sont immédiatement suivies ou précédées de pi bases (au moins deux) non appariées, constituant une zone charnière en épingle à cheveux. La dite zone charnière est donc adjacente à une autre zone de ni (au moins deux) nucléotides consécutifs complémentaires des ni dites bases terminales. La boucle constituant les agrafes comporte donc une séquence oligonucléotidique charnière d'au moins 1, de préférence de 3 à 25 nucléotides, et de préference encore, de 4 à 20 nucléotides. En effet, si la boucle est de taille trop importante, la stabilité de l'hybridation intracaténaire se trouve fragilisée. I1 est intéressant de noter que dans un cas particulier d'oligonucléotide semi-agrafe, dit épingle à cheveux", l'extrémité 5' est appariée à l'extrêmité 3' et la totalité des nucléotides n'appartenant pas à la zone dite charnière sont appariés deux à deux. Dans la cas d'un oligonucléotide semi-agrafe "épingle à cheveux" constitués de n nucléotides, n3=(n-p3)/2. Des exemples concrets de chacune de ces structures sont présentés en figure 2. Différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation d'oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes. Les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes faisant l'objet de la présente invention sont composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant notamment de l'adénine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), de la thymine (T) et de l'uracile (U), reliées entre elles par des liaisons internucléotidiques, notamment naturelles c'est-à-dire phosphodiesters. Les formules générales de ces bases sont présentées en figure 1. Les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes selon l'invention peuvent également comporter des nucléotides rares (Inosine, I, ou ri par exemple) ou des nucléotides modifiés, soit en série désoxyribo- soit en série ribo-. Les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes selon l'invention peuvent comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l7oligonucléotide ou, dans une autre application, des liens intramoléculaires au sein même de l'oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe. Ainsi, les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalant pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide. Dans un cas particulièrement intéressant des groupements réactifs greffés sur certains des nucléotides de l'oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe pourront induire la formation d'un pontage intramoléculaire au sein même de la molécule. L'oligonucléotide pourra comporter des liaisons internes produites par des agents réactifs appartenant ou n'appartenant pas à la structure de la molécule elle-même. Font également partie de l'invention des oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes, dits chimériques, constitués par l'assemblage covalent de fragments nucléotides et non-nucléotides. Dans un cas particulièrement intéressant d'oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe chimérique la ou les dites zones charnière seront de nature non-nucléotidique. Font également partie de l'invention des oligonucléotides antisens agrafes ou semi-agrafes couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intra-cellulaire, et en particulier des groupement lipophiles, des polypeptides ou des protéines. D'une façon générale les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes décrits précédemment et faisant l'objet de l'invention sont destinés à fournir de nouveaux oligonucléotides stables capables d'être internalisés dans les cellules et d'interagir ensuite avec des facteurs cellulaires ou viraux présentant une affinité pour des séquences spécifiques d'acides nucléiques. Ainsi, les oligonucléotides selon l'invention peuvent comporter un ou des groupement(s) lipophile(s) ou toute autre structure moléculaire favorisant la pénétration, le ciblage, l'adressage cellulaire ou intra cellulaire de ces oligonucléotides, ou stabilisant la structure de ces oligonucléotides. Comme on l'a vu, les oligonucléotides selon l'invention sont tout à fait appropriés pour constituer des oligonucléotides antis ens, c'est-à-dire comportant une ou des séquence(s) nucléotidique(s) complémentaire(s) à une ou des région(s) d'ARN messager ou d'ADN dont on désire bloquer spécifiquement l'expression. La dite séquence d'intérêt peut se chevaucher partiellement ou totalement avec les séquences charnières. Ainsi, au moins une partie de la dite séquence charnière peut être constituée par au moins une partie de la dite séquence d'intérêt. Les oligonucléotides faisant l'objet de l'invention présentent alors des auto-appariements qui seront déplacés par l'hybride plus stable qu'ils formeront lorsqu'ils rencontreront leur séquence cible complémentaire. Par contre, ils ne seront pas déplacés par les hybrides moins stables qu'ils pourraient former avec des séquences partiellement complémentaires, limitant ainsi la toxicité séquence-spécifique qui est observée lors de l'utilisation de certains oligonucléotides antis ens. Les oligonucléotides antisens présentent en effet parfois une toxicité résultant d'appariements parasites avec des séquences partiellement homologues à la séquence cible. Du fait de leur structure secondaire auto-appariée, les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes selon ce mode de réalisation ne pourront s'apparier qu'avec des séquences qui, comme la séquence cible, seront capables de déplacer leurs hybridations intra-moléculaires au profit de la formation d'un duplex plus stable. Les oligonucléotides antisens agrafes et semi-agrafes présenteront par suite une toxicité limitée par rapport à un agent antis ens linéaire visant la même séquence mais doté d'extrémités non-engagées dans des auto-appariements. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la dite séquence d'intérêt comprend au moins llune des extrémités 3' ou 5' autoappariées intracaténairement. En particulier l'oligonucléotide semi-agrafe ou agrafe selon l'invention peut être constitué entièrement par la dite séquence d'intérêt dont l'extrémité 3' ou les deux extrémités 3' et 5' correspondent aux dites extrémités auto-appariées intracaténairement. ll reste bien entendu que, dans un autre mode de réalisation, la dite séquence d'intérêt peut être totalement comprise dans la dite séquence centrale. Les duplexs ADN/ARN sont substrats de la RNAse H. C'est pourquoi il peut être avantageux que la dite séquence d'intérêt comporte une séquence dlADN ou d'ARN de manière à former un duplex ADN/ARN avec la séquence cible d'ARNm ou ADN respectivement. Dans ce cas, il peut être approprié d'avoir recours à un oligonucléotide mixte avec, par exemple, une fenêtre d'ADN encadrée par deux séquences d'ARN ou, inversement, constituant les agrafes. Des exemples concrets de certaines de ces structures sont représentées en figure 4. Les oligonucléotides suivant l'invention peuvent par conséquent être obtenus par les méthodes conventionnelles de synthèse des oligonucléotides naturels, par voie chimique, biologique, ou par des approches faisant appel à des combinaisons des techniques de la chimie de synthèse et de la biologie moléculaire. Parmi les méthodes qualifiées de conventionnelles, diverses méthodes de synthèse chimique d'oligonucléotides naturels ont été développées et sont bien connu des spécialistes travaillant dans le domaine. Par exemple, une méthode consiste à utiliser un support solide dit CPG (controlled pore glass) sur lequel le premier nucléoside est fixe covalemment par un bras de couplage, par l'intermédiaire de son extrémité 3'OH. L'extrémité 5'OH du nucléoside est protégé par un groupe di-p-méthoxytrityl acido-labile. Cette approche, utilisant la chimie des phosphites triesters, et dans laquelle des désoxynucléosides 3'phosphoramidites sont utilisés comme synthons est appelée la méthode des phosphoramidites (Caruthers, 1985).Cette approche est la plus utilisée actuellement et présente l'avantage d'être entièrement automatique. Pour citer un second exemple, une autre approche utilisée pour la synthèse d'oligonucléotides est celle de la chimie des phosphonates (Froehler et al, 1986). Cette approche commence par la condensation d'un désoxynucléoside 3'-H-phosphonate avec un deoxynucléoside couplé à un support de verre de silice. Des cycles de condensation successifs conduisent à la synthèse d'oligonucléotides H-phosphonates. Ces oligonucléotides sont oxidés en une étape pour donner les phophodiesters. En utilisant l'une ou l'autre de ces techniques, ou tout autre procédure séquentielle permettant la synthèse de chaînes polynucléotidiques de séquence déterminée à l'avance, on obtient des oligonucléotides présentant la structure primaire désirée. Cette sequence primaire est à l'origine des structures secondaires qu'adoptera spontanément la molécule en fonction de sa séquence nucléotidique et des paramétres physico-chimiques des solutions dans lesquelles elle se trouvera. L'obtention d'un oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe se fera par le choix d'une séquence primaire induisant la formation à l'extrémité 3' ou aux deux extrémités 3' et 5' de la molécule des structures secondaires caractèrisant les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes selon l'invention. On pourra choisir une séquence d'intérêt telle qu'elle adopte spontanément une structure en agrafe ou semi-agrafe selon ltinvention. La détermination des séquences primaires de ce type pourra, par exemple et de manière non systématique, être orientée par l'utilisation d'un logiciel de modélisation de la structure secondaire des acides nucléiques qui prévoit pour chaque séquence primaire soumise la possibilité de l'apparition des structures agrafes ou semi-agrafes. La confirmation de la présence de structures secondaires en agrafes ou en semi-agrafes au sein d'un oligonucléotide pourra se faire, par exemple et de manière non limitative par l'utilisation de tels logiciels, ou par toutes les techniques classiques combinant les ressources de la chimie, de la biologie ou de la biophysique moléculaire. Mais à partir de séquences oligonucléotidiques n'adoptant pas spontanément de structure en agrafe ou en semi-agrafe, il est possible d'induire l'apparition de ces structures par l'addition à l'une ou l'autre des extrémités, ou aux deux extrémités en même temps, de séquences nucléotidiques supplémentaires dont la nature et la longueur permettront l'apparition de ces structures. Ces séquences nucléotidiques supplémentaires pourront être de deux types : soit elles présenteront ellesmêmes une structure secondaire en semi-agrafe qui sera transmise aux séquences oligonucléotidiques dont elles seront les nouvelles extrémités; soit elles ne présenteront pas d'emblée ce type de structure secondaire mais les bases nucléotidiques constituant l'une ou l'autre de leurs extrémités seront capables d'aller s'apparier avec des nucléotides situés au sein des séquences auxquelles elles seront ajoutées conférant ainsi à la séquence finale une structure en agrafe ou en semi-agrafe. Divers exemples de l'utilisation de ce type de séquences additives et de leur utilisation sont présentés en figure 3. Les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes faisant l'objet de l'invention décrite ici pourront être utilisés dans tous les cas ou il sera avantageux de disposer d'un oligonucléotide incluant une séquence primaire définie, présentant une résistance accrue aux exonucléases et un risque moindre d'appariement avec des séquences partiellement complémentaires par rapport à un oligonucléotide linéaire incluant la même séquence primaire. Les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes pourront en particulier être utilisés comme agents antisens pour agir de façon spécifique sur la transcription ou la traduction de protéine(s) dont on désire moduler le niveau d'expression dans un but de recherche ou de thérapeutique. La présente invention a donc pour objet l'utilisation des oligonucléotides selon l'invention, à titre de médicament. Les quelques applications possibles qui sont données ci-dessous ne sont que des exemples non-exhaustifs et en aucun cas limitatifs de situations dans lesquelles une approche de type antisens pourrait être utile, et où l'utilisation d'oligonucléotides naturels résistants aux exonucléases et présentant une toxicité des plus réduites offre un avantage. De façon générale, les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes trouvent des terrains d'applications particulièrement adaptés dans le domaine de la dermatologie en raison de l'accessibilité des cibles à traiter, et de la toxicité mineure ou inexistante de ces composés. Toutes les affections dermatologiques, pouvant relever d'un mécanisme de dysfonctionnement génétique pour lesquelles on peut identifier un facteur étiologique, en connaître la séquence du gène, et/ou de L'ART messager permet d'appliquer une approche anti-sens. L'utilisation d'oligonucléotides phosphodiesters naturels, présentant la toxicité la plus réduite, permet d'envisager la possibilité de ce genre d'approche pour des affections graves ou mineures, et même éventuellement pour des utilisations de type cosmétologiques, c'est-à-dire sur peau saine, et dans un domaine d'application ou les toxicités des produits doivent êtres nulles. A côté des cibles virales définies plus loin, de nombreuses maladies dermatologiques peuvent êtres traitées par des oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes résistants aux exonucléases. Parmi les cibles potentielles de telles approches, on peut noter les maladies inflammatoires telles que les dermatites atopiques ou le lupus érythémateux, les maladies de la kératinisation comme l'ichtyose et le psoriasis, et les maladies tumorales comme le mélanome ou le lymphome T cutané.Ainsi par exemple, des oligonucléotides antisens agrafes ou semi-agrafes appliqués à la dermatologie peuvent être dirigés contre des ARN messagers de médiateurs de l'inflamation comme des interleukines, contre des RNA messagers de protéines impliquées dans les troubles de la prolifération des cellules épidermiques, ou bien contre des ARN messagers codant pour des protéines impliquées éventuellement dans le vieillissement cutané phénotypique, comme par exemple la collagénase, l'élastase, les transglutaminases. De façon plus générale, les oligonucléotides agrafes et semi-agrafes peuvent par exemple être utilisés comme agents antiviraux, antisens, que ce soit pour des indications topiques (dermatologiques) ou pour des indications systémiques. Par exemple, de tels oligonucléotides peuvent êtres utilisés comme agents anti-herpétiques (HSV 1 et HSV 2, CMV, EBV), comme agents anti-papillomavirus (HPV cutanés, génitaux, laryngés ou autres), comme agents anti-hépatites (HBV, HCV, HDV), comme agents anti HIV (Hw-1 et HIV-2), comme agent anti-HTLV (HTLV-1 ou HTLV-2), etc.. Ces oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes peuvent également être utilisés comme agents de répression de l'expression de certaines protéines cellulaires directement responsables ou impliquées dans l'étiologie de maladies de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Par exemple, ces oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes peuvent être dirigés contre l'expression d'oncogènes cellulaires hyperexprimés ou exprimés de façon incontrôlés dans des types cellulaires tumoraux (RAS, ERB, NEU, SIS, MYC, MYB,etc...). En particulier, ces oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes naturels résistants aux exonucléases sériques peuvent êtres utilisés comme agent antis ens dirigés contre des ARN messagers d'oncogènes exprimés dans des cellules leucémiques et impliqués dans leur prolifération. Dans le cadre du traitement de certaines leucémies, pour des greffes de moëlle, les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes peuvent êtres utilisés dans le cadre d'applications "ex vivo". Pour ces nombreuses indications, des formulations galéniques adéquates doivent être établies afin d'optimiser la délivrance de ces molécules à leurs cellules cibles. Ainsi, par exemple, des oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes pourront être encapsulés dans des liposomes, des nano-particules, des particules LDL, ou dans tout autre type de microsphère permettant une conservation adéquate, et favorisant le ciblage. Les molécules oligonucléotidiques agrafes ou semi-agrafes peuvent également être associées à des agents surfactants cationiques. I1 est bien évident que ces quelques exemples ne sont ni exhaustifs ni limitatifs. Les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes faisant l'objet de l'invention décrite ici, sont donc susceptibles d'être inclus dans toutes sortes de préparations pharmaceutiques, parapharmaceutiques, cosmétologiques, ou destinées à des dosages d'acides nucléiques ou de diagnostic, à des concentrations variables selon les indications, avec les excipients appropriés. La présente invention a aussi pour objet un procédé de modulation de l'expression génétique d'une séquence cible appartenant à un ARN messager ou à un ADN, caractérisé en ce qu'on hybride la dite séquence cible avec un oligonucléotide selon l'invention comportant une séquence complémentaire à la dite séquence cible. Ce type de procédé peut être mis en oeuvre à des fins de recherche, thérapeutique ou diagnostic, dans des conditions in vitro, in vivo ou es vivo. II . EXEMPLES DE REALISATIONS DE L'INVENTION D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre en référence aux figures 1 à 7. La FIGURE 1 représente la structure des bases composant les oligonucléotides et la structure de la liaison phosphodiester reliant les oligonucléotides naturels entre eux. La FIGURE 2 représente des exemples d'oligonucléotides adoptant des structures secondaires en agrafe (a), en semi-agrafe (b et c) ou en semi-agrafe "épingle à cheveux". La FIGURE 3 représente des exemples de méthodes d'obtention oligonucléotides semi-agrafes avec en (a) l'obtention d'un oligonucléotide semi-agrafe par addition d'une structure oligonucléotidique auto-appariée à l'extrémité 3r d'un oligonucléotide linéaire; et en (b) l'obtention d'un oligonucléotide semi-agrafe par addition à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide linéaire d'un autre oligonucléotide linéaire dont la séquence 3' terminale est complémentaire à un fragment de la séquence du premier oligonucléotide. La FIGURE 4 représente en (a) les oligonucléotides agrafes (HA12), semi-agrafes (SA12, RA12, HA12/ml, RA12/ml) et linéaires (POLYA12, SA12/ml, HA12/m2) utilisés dans les expériences de dégradation par les enzymes sériques; et en (b) des oligonucléotides anti-sens anti-HSV-l semi-agrafes (HMV10, SMV10) et linéaires (MV10, SMVlO/ml) utilisés dans les expériences de dégradation par les enzymes sériques et les tests d'inhibition de la prolifération du virus de l'herpés simplex de type 1 (HSV-1). Les FIGURES 5a à 5e représentent les électrophorèses en conditions dénaturantes d'oligonucléotides agrafes, semi-agrafes ou linéaires après incubation en présence de 10% de sérum de veau foetal. Les FIGURES 6a et 6b représentent les demi-vies d'oligonucléotides agrafes, semi-agrafes ou linéaires incubés en présence de 10% de sérum de veau foetal. La FIGURE 7 représente l'inhibition de la prolifération du virus de l'herpés simplex de type 1 (HSV-1) par un oligonucléotide anti-sens semiagrafe (SMV10) et un mutant anti-sens linéaire ciblé sur la même séquence (SMVlO/ml). Les exemples expérimentaux sont donnés ci-dessous pour illustrer les avantages d'un oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe incluant une séquence nucléotidique linéaire donnée sur des oligonucléotides incluant la même séquence linéaire mais ne présentant de structure secondaire ni en agrafe, ni en semi-agrafe. Pour chaque comparaison un premier oligonucléotide phosphodiester linéaire a été synthétisé. A partir de cette séquence linéaire des oligonucléotides plus longs ont été synthétisés constitués de la même séquence linéaire prolongée à son extrémité 3', ou à ses deux extrémités 3' et 5' par des séquences oligonucléotidiques induisant l'apparition d'une structure secondaire en agrafe ou en semi-agrafe. Des mutants de ces molécules ont aussi été synthétisés par modification d'un nombre minimum de nucléotides permettant la déstabilisation des structures secondaires en agrafe ou semiagrafe. Ces mutants sont ainsi des molécules linéaires de longueur égale à celle des molécules en agrafe ou semi-agrafe et incluant la même séquence linéaire initiale. Exemple 1 : Résistance des oligonucléotides agrafes et semi-agrafe aux nucléases sériques Les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes présentent une résistance à la dégradation nucléolytique supérieure à celle d'oligonucléotides linéaires de séquence voisine lorsqu'ils sont incubés en présence de sérum. Pour ces expériences deux familles d'oligonucléotides ont été synthétisés conformément à la description ci-dessus. La première famille a été construite à partir d'une séquence linéaire homonucléotidique polyadénylate (POLYA12), à partir de laquelle une séquence en agrafe (HA12) et des séquences en semi-agrafes (HA12/ml, SA12, RA12, RA12/ml) de natures différentes ont été construites. Des mutants linéaires de longueurs égales à deux de ces molécules sont désignés respectivement par HA12/m2 et SA12/ml. En guise de contrôle supplémentaire des polyadénylates de longueurs égales à HA12, SA12 et RA12 ont également été synthétisés et étudiés.La deuxième famille a été construite à partir d'un duodécamère hétéronucléotidique linéaire (MV10) complémentaire à la jonction d'épissage d'un ARN messager précoce du virus de l'herpés simplex de type 1. Des séquences en semi-agrafes de différentes natures et de différentes tailles ont été synthétisés sur cette base linéaire : HMV10 (agrafe) et SMVîO (semi-agrafe). Un mutant linéaire de SMV10 a également été synthétisé et étudié: SMVlO/ml. Les formules chimiques de l'ensemble de ces oligonucléotides et leur structure secondaire sont indiquées sur la figure 4. Pour ces expériences 1 g de chacun des oligonucléotides 5'-32P est incubé à 37"C dans 10 zl de milieu MEM contenant 10% de sérum de veau foetal. La cinétique de la réaction est suivie jusqu'à 10 heures et les prélévements effectués au cours du temps analysés sur gel de polyacrylamide 20% en conditions dénaturantes. Les autoradiographies des gels de dégradation sont présentées en figure 7. Les bandes correspondants à la longueur initiale de chaque oligonucléotide sont excisées du gel et leur radioactivité mesurée par effet Cerenkov sur un compteur de radioactivité bêta. Cette mesure permet la quantification en fonction du temps de la proportion d'oligonucléotide non dégradé et par suite une estimation chiffrée de la cinétique de sa dégradation en terme de demi-vie. Les demivies des différents oligonucléotides évaluées dans les conditions décrites ci-dessus sont récapitulées dans le tableau de la figure 6. Ces expériences permettent de tirer les conclusions suivantes - les oligonucléotides linéaires, indépendamment de leur taille et de leur séquence sont dégradés rapidement par les nucléases du sérum; leur dégradation intervient dans les premières minutes de l'incubation et est complète après quelques heures; - le temps de demi-vie d'un oligonucléotide linéaire, indépendamment de sa taille et de sa séquence en présence de 10% de sérum de veau foetal est compris entre 30 et 60 minutes; - la dégradation des oligonucléotides linéaires est processive, et on observe l'apparition de produits de dégradation de longueur décroissante, devenant de plus en plus courts en fonction du temps, ce qui indique que la dégradation est principalement le fait d'exonucleases, et en particulier de 3'-exonucleases;; - en revanche les oligonucléotides agrafes ou semi-agrafes sont systématiquement plus résistants à la nucléolyse par les enzymes sériques, et une fraction non négligeable d'oligonucléotide non dégradé reste detectable même après plusieurs heures d'incubation à 37"C; - les temps de demi-vie des oligonucléotides agrafes et semi-agrafes étudiés varient d'un minimum de 2 heures à un maximum de l'ordre de 8 heures et sont en bonne corrélation avec les stabilités respectives théoriques des structures secondaires en semi-agrafes dans lesquelles sont engagées leur extrémité 3' (Fig.6). Ces résultats confirment que la dégradation des oligonucléotides phosphodiesters dans le sérum est principalement le fait d'exonucléases et non pas d'endonucléases et mettent en évidence la résistance à l'activité nucléolytique des enymes sériques des structures en agrafe ou en semiagrafe. Exemple 2 : Inhibition de la prolifération du virus de ltherpés simplex de type I (HSV-1) par un oligonucléotide an tiens semi-agrafe Les oligonucléotides SMV10 et SMVlO/ml dont les séquences sont données en figure 6 ont été utilisées dans ces expériences. L'oligonucléotide SMV10 comprend d'une part le fragment linéaire MV10, complémentaire sur 12 bases de la jonction d'épissage d'un ARN messager précoce du cycle de réplication du virus HSV-1 et d'autre part une extrémité 3' prolongée en semi-agrafe octamèrique. Le mutant SMVlO/ml comprend la même séquence antisens MV10 que SMVlO mais une mutation à été introduite dans la séquence octamèrique terminale, mutation qui confère à SMVlO/ml une structure linéaire. Infection des cellules en présence ou en l'absence d'oligonucléotides Les cellules (cellules Véro ATCC cultivées en milieu Gibco-MEM complémenté de 5% de sérum de veau foetal, de L-glutamine, d'acides aminés non-essentiels et de pénistrepto) sont ensemencées la veille de l'infection à une densité de 50 000 cellules par puits de 2 cm2. 16 à 24 heures plus tard, les cellules sont infectées avec HSV-1 à une multiplicité d'infection de 3 pfu/cellule en présence ou en l'absence d'oligonucléotides. 50 p1 d'oligonucléotides en solution dans du milieu de culture 2X exempt de sérum sont déposés sur la monocouche cellulaire. 50 p1 de solution virale sont déposés 5 minutes plus tard. Les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37C et agitées précautioneusement toutes les 15 minutes. Après 1 heure d'incubation, les 100 ml de milieu sont aspirés et 500 ml de milieu complet sont ajoutés sur les cellules. L'incubation est poursuivie 24 heures avant d'être arrêtée par congélation des plaques dans l'azote liquide. Toutes les mesures d'inhibition sont effectuées en duplicat ou en triplicat. Titration du virus Les virus sont récupérés directement dans le milieu de culture après 3 cycles rapides de congélation dans l'azote liquide - décongélation à 37"C. ns sont ensuite dilués en milieu sans sérum pour effectuer la titration proprement dite. Les cellules indicatrices sont ensemencées la veille en milieu complet à raison de 250 000 cellules par puits de 2 cm2. Le lendemain, le milieu est aspiré et on dépose 100 ml des différentes dilutions virales par puits. Après une incubation d'une heure à 37oC avec agitation toutes les 15 minutes, le milieu est aspiré et les cellules sont recouvertes par du milieu complet (2.5% en sérum) contenant 1.2% de méthyl-cellulose pour une incubation de 3 jours à 37"C. Après 3 jours, le milieu est éliminé, les cellules sont fixées avec une solution de PBS/10% formol pendant 20 minutes puis colorées par une solution 2% cristal violet dans du PBS/20% éthanol pendant 20 minutes. Les plaques sont ensuite rincées et les plages comptées par transparence sur le négatoscope. Les titrations sont effectuées en triple pour chaque point. Les calculs d'inhibition sont effectués par rapport aux titres viraux observés en l'absence de nucléotides. Résultats En expériences préliminaires, la cytotoxicité de SMV10 et SMVlO/ml a été testée sur les cellules Véro. Pour des incubations de 1 heure à 37"C et des concentrations en oligonucléotides atteignant 50 I1M aucune toxicité cellulaire n'a été détectée. L'inhibition de la prolifération virale induite par SMV10 et SMVlO/ml, pour des concentrations allant de 10 pM à 30 tjM est reportée sur la figure 7. Il y apparait clairement que l'oligonucléotide semi-agrafe est actif à des concentrations inférieures à son mutant antis ens linéaire. SMV10 induit 70% d'inhibition virale à 10 UM tandis que SMVlO/ml est inactif à cette concentration. Ce résultat confirme l'avantage, par rapport à une structure linéaire, du type de structure nucléotidique faisant l'objet de l'invention, dans le cadre de son utilisation comme agent antisens. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES CITEES DANS LE TEXTE Andrus, A.; Geiser, T.; Zon, G. (1989), Nucleosides Nucleotides, 8, 5-6, 967-8 Anfossi, Giovanni; Gewirtz, Alan M.; Calabretta, Bruno, (1989), Proc. NatL Acad. Sci. 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nucléotides deux à deux à l'exception de ceux constituant la séquence dite charnière. 4- Oligonucléotide agrafe ou semi-agrafe selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que les liaisons inter nucléotidiques sont des liaisons phosphodiesters naturelles. 5- Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte une ou des séquence(s) d'intérêt d'ADN, ARN ou mixte(s) complémentaire(s) à une ou des séquence(s) cible(s) appartenant à un ADN ou un ARN messager dont on désire bloquer spécifiquement l'expression. 6- Oligonucléotide selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce que au moins une partie de la dite séquence charnière est constituée par au moins une partie de la dite séquence d'intérêt. 7- Oligonucléotide selon la revendication 6, caractérisé en ce que la dite séquence d'intérêt comprend au moins l'une des dites extrémités 3' ou 5' auto-appariées. 8- Oligonucléotide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste en la dite séquence d'intérêt dont l'extrémité 3' ou les deux extrémités 3' et 5' correspondent aux dites extrémités auto-appariées. 9- Oligonucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce que la dite séquence d'intérêt est comprise dans la dite séquence centrale. 1S Oligonucléotide selon l'une des revendications 5 à 9 caractérisé en ce que la dite séquence d'intérêt comporte une séquence d'ADN ou ARN de manière à former un duplex ADN/ARN avec la séquence cible ARNm ou ADN respectivement. 11- Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte une partie non-nucléotidique pouvant être un ou des groupement(s) lipophile(s), ou tout autre structure moléculaire favorisant la pénétration, le ciblage ou l'adressage cellulaire ou intra-cellulaire ou stabilisant la structure de ces oligonucléotides. 12- Oligonucléotide selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que la zone charnière de la boucle est constituée par un fragment nonnucléotidique. 13- Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il comporte dans sa séquence des nucléotides modifiés soit en série ribo- soit en série désoxyribo-. 14 Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comporte des groupements réactifs greffés sur ses nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide ou induire la formation de pontage intramoléculaire au sein même de la molécule. 15- Oligonucléotide selon lrune des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il comporte des liaisons internes produites par des agents réactifs appartenant ou n'appartenant pas à la structure de la molécule elle-même. 16- Procédé de préparation d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'on prépare une séquence oligonucléotidique selon l'une des revendications 1 à 15, dont l'extrémité 3' ou les deux extrémités 3' et 5' s'engagent spontanément dans un appariement intra-caténaire impliquant au moins les deux bases terminales de l'extrémité ou des extrémités concernées, de manière à adopter la structure en semi-agrafe ou agrafe, ou on induit l'apparition de ces structures agrafes ou semi-agrafes par l'addition à l'une ou aux deux extrémités de séquences nucléotidiques supplémentaires dont la nature et la longueur permettent ou comportent un appariement intra-caténaire impliquant au moins les deux bases terminales de l'extrémité ou des extrémités concernées, de manière à adopter la structure en semi-agrafe ou agrafe. 17- Utilisation des oligonucléotides selon l'une des revendications 1 à 15, à titre de médicament. 18- Composition pharmaceutique destinée à des utilisations à visée thérapeutique et, en particulier, à des indications en dermatologie et en virologie ou en cancérologie comportant, à titre de principe actif, un ou plusieurs oligonucléotide(s) selon l'une des revendications 1 à 15 avec des excipients pharmaceutiques appropriés. 19- Utilisation des oligonucléotides selon l'une des revendications 1 à 15 à des fins de recherche de cosmétique ou de diagnostic. 2S Composition destinée à des usages para-pharmaceutiques et, en particulier, à des usages cosmétiques comportant à titre de principe actif, un ou plusieurs oligonucléotide(s) selon l'une des revendications 1 à 15 avec des excipients appropriés. 21- Composition, matériel ou kit destiné(e) à être utilisé(e) à des fins de dosage d'acides nucléiques ou de diagnostic, comportant un ou plusieurs oligonucléotide(s) selon l'une des revendications 1 à 15 avec des excipients appropriés. 22- Procédé de modulation de l'expression génétique d'une séquence cible appartenant à un ARN messager ou à un ADN, caractérisé en ce qu'on hybride la dite séquence cible avec un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 15, comportant une séquence complémentaire à la dite séquence cible.