FR 2704860 A1 19941110 FR 9305387 A 19930505 SEQUENCES DE NUCLEOTIDES DU LOCUS cryIIIA POUR LE CONTROLE DE L'EXPRESSION DE SEQUENCES D'ADN DANS UN HOTE CELLULAIRE L'invention a pour objet des séquences de nucléotides du gène cryIIIA pour le contrôle de l'expression de séquences d'ADN dans un hôte cellulaire. Le gène cryIIIA code pour une toxine spécifique des coléoptères et est faiblement exprimé dans Bacillus thuringiensis lorsqu'il est cloné dans un plasmide à faible nombre de copies. Bacillus thuringiensis est une bactérie Gram-positive qui produit des quantités significatives de protéines sous forme de cristal ayant une activité toxique visà-vis des larves d'insectes. On connaît deux groupes de protéines de cristal, établis selon les séquences d'acides aminés et les spécificités de toxicité 1) la classe des toxines Cry (I, II, III, etc...) qui ont des similitudes de structures 2) la classe des toxines Cyt, qui n'est pas apparentée à la classe cry (Hôte, H., et al 1989. Microbiol. Rev. 53:242-255). Ces toxines de B. thuringiensis sont intéressantes de façon générale en vue de l'élaboration de biopesticides, et également dans la mesure ou la synthèse des protéines du cristal est connue pour être parfaitement coordonnée avec la phase de sporulation de l'organisme, rendant cet organisme intéressant pour l'étude de la régulation génétique chez les bactéries sporulantes Gram-positives. Différents mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse des protéines du cristal de B. thuringiensis ont été décrits. Le haut niveau d'expression de ces protéines est attribué, au moins en partie, à la stabilité de l'ARNm. Certains auteurs ont attribué la stabilité de cet ARNm à la présence en aval du gène de la toxine, d'une structure jouant un rôle de terminateur qui pourrait agir comme un rétro-régulateur positif en protégeant l'extrémité 3' de ltARNm de la dégradation par les nucléases, augmentant ainsi la demi-vie des transcrits (Wong, H.C. et al 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3233-3237). On a également émis l'hypothèse de la présence de polypeptides impliqués dans la synthèse de protéines du cristal, polypeptides qui agiraient soit en dirigeant le repliement de la protéine sous forme d'une protéine ayant une conformation stable ou pour protéger ces protéines de la dégradation protéolytique. Des études au microscope électronique et des études biochimiques de la sporulation de B. thurinqiensis montrent que la production de la protéine de cristal est dépendante de la sporulation et se situe dans le compartiment de la cellule mère (Ribier, J. et al 1973.Ann. Inst.Pasteur 124A:311-344). Récemment, 2 facteurs sigma, sigma 35 et sigma 28, qui dirigent spécifiquement la transcription des gènes cryIA, ont été isolés et caractérisés. Ces séquences d'acides aminés montrent une identité de 88 et 85 % avec les facteurs sigma E et sigma K de Bacillus subtilis, respectivement (Adams, L. F., 1991. J. Bactériol. 173:3846-3854). Ces facteurs sigma sont produits exclusivement dans les cellules sporulantes et sont capables de fonctionner dans le compartiment de la cellule mère, confirmant que l'expression des gènes de la protéine du cristal est contrôlée dans le temps et dans l'espace. Ainsi dans l'art antérieur, on a conclu que l'expression du gène au cours du temps est, au moins en partie, assurée par l'activation successive des facteurs sigma spécifiques de la sporulation. Jusqu'à présent trois groupes de promoteurs ont été identifiés. Deux de ces groupes comprennent des promoteurs reconnus par des facteurs sigma déterminés, et selon l'art antérieur, les facteurs sigma liés au troisième groupe de promoteurs (dont celui du gène cryIII) n'ont pas été identifiés (Lereclus, D., et al 1989. American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Enfin le nombre de copies du plasmide portant le gène semble être un facteur important pour l'expression du gène cry dans B. thuringiensis. Dans la souche sauvage B. thurinqiensis, les gènes cry sont localisés sur des plasmides de grande taille, présents à un faible nombre de copies. Des expériences de clonage d'un fragment de 3 kb Hindili, cloné dans un plasmide à faible nombre de copies, conduisent à une production faible de toxines dans une souche acristalifère (crs~) ) de B. thuringiensis. Au contraire, de grandes quantités de toxines sont synthétisées lorsque le gène est cloné dans des plasmides à haut nombre de copies (Arantes, O. et al 1991. Gene 108:115-119). Les inventeurs ont maintenant identifié la séquence d'ADN, susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression de la séquence codante du gène cryIIIA, et permettant notamment d'obtenir un haut niveau de l'expression lorsque la séquence codante est placée sur un plasmide à faible nombre de copies. L'invention a donc pour objet des moyens permettant d'obtenir un haut niveau d'expression de la protéine codee par le gène cryIIIA et plus généralement des moyens permettant de contrôler le niveau d'expression de séquences d'ADN codant pour une protéine d'intérêt détermine, dans des souches de Bacillus, cette expression pouvant être obtenue lorsque la séquence d'ADN codante est située sur un vecteur en particulier sur un plasmide à faible nombre de copies. A cet égard, l'invention concerne une séquence d'ADN caractérisée par les propriétés suivantes - elle est comprise dans un enchainement d'ADN d'une longueur de 1692 pb environ, délimité par les sites de restriction HindIII-Pstl (fragment H2-P1), tel qu'obtenu par digestion partielle du fragment BamHI de 6 kb porté par le gène cryIIIA de Bacillus thuringiensis souche LM79 - elle est susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval, dans un hôte cellulaire du type Bacillus thuringiensis et/ou Bacillus subtilis. Les sites de restriction dont il est question ci-dessus sont représentés à la figure 1. Dans la suite du texte on utilisera les abréviations Hn pour désigner le site HindIII ayant la position "n" par rapport au premier site HindIII du fragment BamH1. De même l'expression Pn désigne le site Pstl en position "n" par rapport au premier site PstI sur le fragment BamHl. Les nucléotides composant la séquence d'ADN selon l'invention peuvent être consécutifs ou non sur l'enchaînement à partir duquel est définie la séquence d'ADN. Dans le cadre de la présente demande, l'expression "séquence d'ADN susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides" traduit la capacité de cette séquence d'ADN, d'initier ou d'empêcher l'expression de la séquence codante ou de réguler cette expression notamment au niveau de la quantité du produit exprimé. Une séquence d'ADN selon l'invention est telle que la séquence codante de nucléotides qu'elle contrôle est placée immédiatement en aval, en phase de lecture avec elle ou est au contraire séparée de cette séquence d'ADN par un fragment de nucléotides. La séquence d'ADN définie ci-dessus, peut être isolée et purifiée par exemple à partir du plasmide portant le gène cryIIIA de Bacillus thuringiensis. Selon un premier mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN correspond à l'enchainement HindIII-PstI (H2-P1) ci-dessus décrit. L'invention a également pour objet une séquence d'ADN, caractérisée par les propriétés suivantes - elle est contenue dans un enchainement de nucléotides hybridant dans des conditions non stringentes avec le fragment d'ADN compris entre les nucléotides 1413 et 1559 de la séquence représentée à la figure 3 - elle est susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression notamment d'une séquence codant pour un polypeptide de Bacillus, toxique vis-à-vis des insectes ou d'une séquence codant pour un polypeptide exprimé pendant la phase stationnaire de Bacillus. Une hybridation en conditions non stringentes entre la séquence d'ADN testée et le fragment d'ADN compris entre les nucléotides 1413 et 1559 de la séquence de la figure 3 utilisée comme sonde sera effectuée comme suit La sonde ADN et les séquences fixées sur filtre de nitrocellulose ou sur filtre nylon sont hybridées à 42"C pendant 18 H avec agitation, en présence de formamide (30 %), de SSC 5X de la solution de Denhardt 1X. La solution de Denhardt 1X est composée de 0,02 % de ficoll, de 0,02 % de polyvinyl pyrrolidone et de 0,02 % de sérum albumine bovine. Le SSC 1X est composé de NaCl 0,15 M et de citrate de sodium 0,015 M.Après hybridation, le filtre est successivement lavé à 420C pendant 10 minutes dans chacune des solutions suivantes - Formamide (30 %), SSC 5x - SSC 2X - SSC 1X - SSC 0,5X Une séquence codant pour un polypeptide de Bacillus, toxique vis-à-vis des larves d'insectes est par exemple une séquence comprise dans le gène crvIIIB de B. thurinqiensis. Une séquence d'ADN répondant à cette définition peut être identifiée en utilisant des amorces oligonucléotidiques. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la séquence d'ADN correspond à l'enchaînement de nucléotides désigné par l'expression Seq N"1 et correspondant au fragment d'ADN comprenant les nucléotides 1 à 1692 de la séquence représentée à la figure 3. L'invention a également pour objet toute partie d'au moins 10 nucléotides naturellement consécutifs ou non de cet enchaînement H2-P1, r susceptibles de contrôler dans un hôte cellulaire de type Bacillus, l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval de cette partie de l'enchaînement H2-P1. Des fragments particulièrement préférés dans le cadre de la réalisation de l'invention sont les fragments suivants, représentés à la Figure 1 - l'enchaînement délimité par les sites de restriction TaqI--qI, - l'enchaînement délimité par les sites de restriction TaqI-PacI ; pour des raisons de commodité de langage, on a désigné par PacI l'extrémité de ce fragment qui se trouve en réalité au nucléotide 990 de la séquence de la figure 3 alors que le site PacI se termine en position 985. - l'enchaînement délimité par les sites de restriction xmnI--qI , - ou tout fragment de ces enchaînements, conservant les propriétés de ces enchaînements vis-à-vis du contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides. La capacité de ces fragments à intervenir dans le contrôle de l'expression de séquences de nucléotides, peut être vérifiée par la mise en oeuvre du test suivant - la séquence d'ADN de l'invention dont on veut évaluer la capacité à intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante est insérée dans un plasmide à faible nombre de copies, en amont d'une séquence codante de nucléotides. - le plasmide ainsi préparé est utilisé pour transformer (par exemple par électroporation) une souche de Bacillus thuringiensis et par exemple une souche B. thuringiensis HD1 cry'B - la souche de bacillus ainsi transformée est cultivée dans des conditions permettant l'expression de la séquence codante de nucléotides - on détecte le produit d'expression de cette séquence codante de nucléotides, par des techniques de mesure qualitative et/ou quantitative courantes. Pour la réalisation de ce test, la séquence codante de nucléotides sera avantageusement la séquence codante du gène crvIIIA de Bacillus thuringiensis ou, par exemple une séquence codant pour la p-galactosidase. Selon un autre mode de caractérisation de l'invention, les séquences d'ADN "de contrôle" dont il est question ci-dessus sont caractérisées par leur enchaînement de nucléotides. A cet égard, l'invention a notamment pour objet les séquences d'ADN correspondant aux enchaînements suivants - L'enchaînement Seq N"2, correspondant au fragment comprenant les nucléotides 907 à 1559 de la séquence représentée à la figure 3, - la séquence d'ADN correspondant à l'enchaînement Seq N"3 correspondant au fragment comprenant les nucléotides 907 à 990 de la séquence représentée à la figure 3, ou un variant comprenant les nucléotides des 907 à 985. - la séquence d'ADN correspondant à l'enchaînement Seq N"4 correspondant au fragment comprenant les nucléotides 1179 à 1559 de la séquence représentée à la figure 3. L'invention a aussi pour objet des séquences d'ADN hybridant dans des conditions non stringentes, telles qu'elles ont été définies précédemment, avec l'un des enchaînements ci-dessus décrits. Dans ce cas, l'un des enchaînements ci-dessus en question est utilisé comme sonde. Les séquences d'ADN selon l'invention peuvent être le cas échéant recombinées entre elles ou associées sur le vecteur en des sites différents le cas échéant. En particulier, on associera avantageusement sous forme d'un enchaînement unique, le fragment TaqI-PacI au fragment XmnI-TaqI définis ci-dessus. Une telle séquence a la propriété avantageuse de permettre un haut niveau d'expression (jusqu'à 60.000 unités Miller) de la séquence codante de nucléotides, niveau d'expression qui peut être constaté avec le gène de la 8-galactosidase. Les séquences d'ADN de l'invention peuvent être isolées et purifiées à partir de Bacillus, notamment de B. thuringiensis ; elles peuvent être préparées également par synthèse selon les techniques connues. Entrent également dans le cadre de l'invention, les séquences d'ARN correspondant aux séquences d'ADN cidessus décrites. De façon préférée, une séquence d'ADN de l'invention intervient au niveau du contrôle de la transcription de la séquence codante de nucléotides placée en aval. Avantageusement, une autre séquence de l'invention est choisie pour sa capacite à intervenir pour augmenter l'expression d'un gène, qui serait initiée par un promoteur situé en amont de cette séquence. L'invention a également pour objet une séquence d'ADN recombinant caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codante déterminée, sous le contrôle d'une séquence d'ADN répondant à l'une des définitions précédentes. Entre également dans le cadre de l'invention, un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il est modifié en l'un de ses sites, par une séquence d'ADN telle que décrite ci-dessus, de façon telle que ladite séquence d'ADN intervient dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides déterminée. Un vecteur de l'invention peut être de préférence un plasmide par exemple un plasmide de type réplicatif. Un vecteur particulièrement avantageux est le plasmide pHT7902'lacZ déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Paris - France) le 20 Avril 1993 sous le N I-1301. L'invention a également pour objet un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence d'ADN telle que définie précédemment, ou par un vecteur d'expression décrit ci-dessus. Différents types d'hôtes cellulaires peuvent être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. On citera à titre d'exemple Bacillus, par exemple le Bacillus thuringiensis ou Bacillus subtilis. On peut egalement envisager d'utiliser des cellules telles que E. coli. Dans des hôtes cellulaires capables de sporuler, la sequence codante peut être exprimée pendant la phase végétative ou la phase stationnaire de croissance ou pendant la sporulation. Un hôte cellulaire intéressant dans le cadre de l'invention peut également être constitué par une cellule vegetale ou animale. Si cela est nécessaire ou souhaité, selon la nature de la séquence codante de nucléotides exprimée, une séquence signal peut être également insérée dans le vecteur d'expression de l'invention afin que le produit d'expression de la séquence codante soit exposé à la surface de l'hôte cellulaire, voire exporté, à partir de cet hôte cellulaire. De façon tout à fait intéressante, on pourra utiliser des souches asporogènes de bacillus soit naturellement, soit par mutation, et en particulier des souches de Bacillus subtilis ou Bacillus thurinqiensis. Les inventeurs ayant mis en évidence que les séquences d'ADN de l'invention permettent l'expression d'une séquence codante déterminée indépendamment de la phase de sporulation de souches de type Bacillus, un hôte asporogène peut présenter l'avantage de fournir des moyens d'expression de séquences codantes susceptibles d'entrer dans des compositons biopesticides dont les effets négatifs éventuels vis-à-vis de l'environnement seraient atténués, voire supprimés. L'hôte asporogène choisi est particulièrement avantageux pour exprimer une séquence codante pendant sa phase stationnaire de croissance, quand la séquence codante est sous le contrôle d'une des séquences de 1' invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention découlent des exemples qui suivent ainsi que des figures Figure 1 - Carte de restriction schématique des plasmides utilisés (A) - Carte physique du vecteur navette pHT304 Les flèches au-dessus ErmR et ApR indiquent la direction de transcription des gènes ermC et bla respectivement. La flèche et l'expression LacZp indiquent la direction de transcription à partir du promoteur du gène LacZ. ori Bt est la région de réplication du plasmide pHT1030 de B. thuringiensis. (B) - Carte de restriction simplifiée des fragments comportant le gène crvIIIA. Le fragment A est un fragment de 6 kb BamHI de B. thuringiensis LM79 ; les fragments de restriction G, P et H ont été obtenus à partir de digestion partielle par HindIII et C a été obtenu après digestion totale avec HindIII à partir du fragment A. Ces fragments ont été clonés dans pHT304 pour donner les dérivés pHT305A, pHT305G, pHT305P, pHT305H et pHT305C respectivement. Le gène crvIIIA (cadre hachuré) et la direction de transcription sont indiqués. Les nombres sous chaque site indiquent leur ordre de la gauche vers la droite. Figure 2 - Analyse des protéines des transformants de B. thuringiensis exprimant le gène CryIIIA. Un volume identique d'échantillons (20 pl) a été chargé dans chaque puits. Les lignes 1 à 4 et 6 à 8 de B. thuringiensis Kurstaki HD1 Cry-B portant pHT305A, pHT305G, pHT305H, pHT305P, pHT305HnH2-H, pHT305C et pHT304 respectivement. La ligne 5 correspond aux marqueurs de poids moléculaire (du haut vers le bas 97, 66, 60, 43 cet 30 kDa) , Les flèches indiquent les composants du cristal de 73 et 67 kDa. Figure 3 - Séquence de nucléotides de l'extrémité 5' de la région en amont du gène cryIIIA. (A) Carte physique du fragment H2-P1 (H2-H3+H3-P1) dans l'orientation 5' vers 3'. Les positions des nucléotides des deux sites HindIII (H2 et H3) qui délimitent le fragment grisé, sont indiquées. Le second segment séquencé (fragment H3-P1) était le fragment entre le troisième site HindIII et le site Pstl (P1). Un site ATG d'initiation de transcription de la toxine CryIIIA est montré. La numérotation des nucléotides est rapportée par rapport au fragment séquence et non par rapport à l'initiation de transcription. (B) - Séquence de nucléotides du fragment H2-P1. Le codon d'initiation ATG est indiqué en caractères gras et l'extrémité du transcrit majoritaire sur gel, spécifique du gène crvIIIA, correspond au T localisé en position 1413. Un autre transcrit commence au nucléotide 983 ; il est apparemment minoritaire sur gel. La séquence comporte au moins deux répétitions inversées. La numérotation des nucléotides débute à partir du second site HindIII et se termine au site Pstl montré sur la figure 3A. Figure 4 - Représentation des plasmides PAF1, pHT304'lacZ, pHT7901'lacZ et pHT7902'lacZ. Figure 5 - Profil d'activite p-galactosidase. La croissance des cellules Bt et les conditions de réalisation des échantillons ainsi que le test sont décrits dans "Matériel et Méthodes". Le temps to indique la fin de la phase exponentielle et t n est le nombre d'heures avant (-) ou apres le temps zéro. Figure 6 - Carte de restriction détaillée des plasmides pHT7902'lacZ, 7903'lacZ, 7907'lacZ, 7909'lacZ, 7930'lacZ et 7931'lacZ. Ces plasmides ont été insérés dans B. thuringiensis et l'activité 8-galactosidase a été mesurée au temps t6 de sporulation (en unités Miller). On observe des activités respectivement de 30.000, 30.000, 3.500, 2.000, 35.000 et 60.000. Figure 7 - Activité p-galactosidase dans des souches de B. subtilis Spo et Spo+ ; les cultures sont faites en milieu SP. Matériel et méthodes SOUCHES BACTERIENNES ET CONDITIONS DE CROISSANCE Escherichia coli K-12 TG1 tt(lac-proAB)supE thi hdsD (F' traD36 proA+ proB+ lacIs lacZEDM15)] Gibson, T.J. et al 1984. thesis. University of Cambridge, Cambridge a été utilisé en tant qu'hôte pour la construction des plasmides représentés à la figure 1B et pour le bactériophage M13. E. coli MC1061 (hsdR mcrB aras139 (araABC-leu) 7679 A lacX74 galU galK rpsL thi] (Meissner, P.S. et al 1987. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84:4171-4175) a été utilisé en tant qu'hôte pour la construction des plasmides représentés à la figure 7. B. thurinqiensis souche LM 79 qui contient le gène cryIIIA, a été isolé et caractérisé par Chaufaux J. et al 1991. Les colloques de 1'INRA. 58:317-324. Cette souche appartient au sêrotype 8 et produit des quantités de toxines similaires à celles produites par d'autres souches de B thuringiensis portant le gène crvIIIA (Donovan, V.P., et al 1988. Mol. Gen. Genet. 214.365-372. - Sekar, V., et al 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7036-7040). B. thurinqiensis de la sous-espèce Kurstaki HD1 Cry'B a été utilisé comme hôte pour les études de régulation du gène cryIIIA. Les souches E. coli ont été cultivées à 37"C dans un milieu Luria et transformées selon la méthode décrite par Lederberg et Cohen (1974. Bacteriol. 119:1072-1074). La souche B thurinqiensis espèce Kurstaki HDl Cry'B a été cultivée et transformée par électroporation selon la technique décrite par Lereclus et al, (1989. FEMS Microbiol. Lett. 60:211-218). Les concentrations en antibiotiques pour la sélection des bactéries était de 100 pg/ml pour l'ampicilline et 25 zg/ml pour l'érythromycine. Constructions de plasmides Le fragment BamHI de 6 Kb portant le gène crvIIIA et les régions adjacentes a été isolé à partir de B. thuringiensis LM79 et a été inséré dans le site unique BamHI de pUCl9 pour produire pHT791, qui a été employé comme source d'ADN pour la construction des différents plasmides utilisés ici. Le plasmide pHT305A a été obtenu par insertion du fragment BamHI de 6 Kb dans le site unique BamHI du vecteur navette pHT304 (Arantes, O et Lereclus D. 1991, Gene 108:115-119)(Figure 1 A). Des échantillons du fragment BamHI de 6 Kb ont été partiellement ou complètement digérés avec HindIII et les fragments résultants ont été clonés entre les sites BamHI et HindîlI ou au site HindîlI de pHT304 pour donner les dérivés pHT305G, pHT305H, pHT305P et pHT305C (Figure 1).Le plasmide pHT305HnH2H3 a été obtenu en insérant le fragment H2-H3 rempli aux extrémités dans le site SmaI de pHT305H (fragment délimité respectivement par les deuxième et troisième sites HindIII du fragment de 6 kb). Le fragment de 4,5 Kb SmaI - KpnI du plasmide pTV32 (Perkins, J.B. et al 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:140-144) contenant les gènes lacZ ermC a été cloné dans pEBlll (Leonhardt, H., et al 1988. J. Gen. Microbiol. 134:605-609) pour donner le plasmide pMCll. Le plasmide pHT304'lacZ, utilisé pour construire les fusions de transcription, a été obtenu en clonant le fragment de restriction DraI-SmaI de 3,2 Kb contenant le gène lacZ dépourvu de promoteur, isolé à partir de pMCll, au site unique SmaI de pHT304. Le plasmide pHT7901'lacZ a été obtenu en clonant le fragment H3-P1 t(HindIII-PstI) voir figure 3A] entre les sites uniques HindIII et PstI de pHT304'lacZ. Le plasmide pHT7902'lacZ a été construit en clonant le fragment H2-H3 (figure 3A) dans le site unique HindIII de pHT7901'lacZ. L'orientation du fragment H2-H3 a été déterminée en cartographiant les sites de restriction HpaI et BalI par rapport au site PstI.Deux sites HpaI sont localisés aux positions nucléotidiques 50 et 392 le site BalI est localisé à la position nucléotidique 670 (figure 3). La structure générale des plasmides recombinants portant la fusion lacZ est donnée à la figure 4. Manipulations d'ADN Les procédures standard ont été utilisées pour extraire les plasmides à partir de E. coli, pour transfecter 1'ADN recombinant du phage M13 et pour purifier 1'ADN simple brin (Sambrook J, et al 1989. A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory - Cold Spring Harbor, N.Y.). Les enzymes de restriction, la ligase ADN T4 et la T4 polynucléotide kinase ont été utilisées selon les recommandations du fabricant. Le fragment de Klenow de 1'ADN polymérase I et des désoxyribonucléosides triphosphates ont été utilisés pour que les extrémités du fragment H2-H3 soient des extrémités franches. Les fragments de restriction d'ADN ont été purifiés sur gels d'agarose en utilisant le kit Prep A gene (Bio-Rad). Les séquences de nucléotides ont été déterminées par la méthode didéoxy de terminaison de chaîne (Sanger, F., et al 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 175, 1993 USA 74:5463-5467) en utilisant les phages M13mpl8 et M13mpl9 comme matrices, ainsi que le kit Séquenase version 2.0 (US Biochemical. Cor. Cleveland Ohio) et [a-35S] dATP (15 TBq ; Amersham, United Kingdom). Analyse informatique Les séquences d'ADN ont été analysées en utilisant les programmes de l'Institut Pasteur sur un ordinateur général de données MV10000. Extraction de 1'ARN, Extension des amorces, Analyse Northern de 1'ARN et analyse en dot blot La souche B. thuringiensis sous espèce Kurstaki HD1 Cry'B (pHT305P) a été cultivée dans un milieu HCT (Lecadet et al 1980. J. Gen. Microbiol. 121:203-212) à 30OC en agitant. Les échantillons ont été pris à to, t3, t6 et t9 (to est défini comme étant le début de la sporulation et t n indique le nombre d'heures après le début de la sporulation). Les cellules ont été récupérées par centrifugation, resuspendues dans un milieu HCO (Lecadet, M. M., et al 1980. J. Gen. Microbiol. 121:203-212) contenant 50 mM d'azide de sodium et immédiatement congelées à - 70 c jusqu'à l'extraction d'ARN (Glatron, M.F., et al 1972. Biochimie 54:1291-1301). Pour le test d'allongement de l'amorce, un premier oligonucléotide de 39 mer (3'-CTT AGG CTT GTT AGC TTC ACT TGT ACT ATG TTA TTT TTG-5') complémentaire de la région 3'-1544 à 1583-5'du gène cryIIIA a été synthétisé et son extrémité 5' a été marquée avec du [z-32p] dATP (110 TBq/mmol) par la T4 polynucléotide kinase. L'oligonucléotide de 39-mer a été purifié sur une colonne Sephadex G-25 (Pharmacia) (incorporation d'environ 70 %) et pour être utilisé comme amorce, il a été mélangé avec 50 pg d'ARN total. Un deuxième oligonucléotide de 32 mer, complémentaire la région localisée entre les positions 1090 et 1121, a été utilisé également comme amorce et a permis la détection d'un deuxième transcrit dont le démarrage de transcription est situé en position 983. Cet oligonucléotide correspond à la séquence 5' GTTAGATAAGCATTTGAGGTAGAGTCCGTCCG-3'. L'hybridation (à 30"c), l'extension de l'amorce et l'analyse des produits ont été effectuées comme décrit par Débarbouillé, M., et al (1983. J. Bacteriol. 153:1221-1227). Les amorces de 39 mer et de 32 mer ont été utilisées pour l'allongement du fragment H3-P1 cloné dans M13-mpl9 et pour l'allongement du fragment H2-P1 cloné dans pHT7902'lacZ, respectivement.Les produits résultant des réactions ont été placés sur des gels en parallèle avec des produits de transcription, pour déterminer les extrémités 5' des transcrits. Une analyse Northern blot a été réalisée avec de 1'ARN dénaturé fractionné par électrophorèse sur des gels d'agarose contenant du formaldehyde à 1,5 % et transféré sous vide sur des membranes Hybond-N+ (Amersham) dans 20 x SSC pour 1 h (1 x SSC correspond à 150 mM NaCl plus 15 mM citrate sodium, pH 7,0). Le fragment de restriction PstI-EcoRI de 874 bp (interne au gène cryIIIA) a été marqué avec du 32P avec un kit de translation de coupure (Boehringer Mannheim), puis dénaturé et utilisé comme sonde.Une préhybridation a été réalisée à 42"c pendant 4 heures dans un milieu contenant 50 % de formamide-lM NaCl-1% sodium dodecyl sulfate (SDS)-10 x Denhardt's solution-50 mM Tris-HCl (pH 7,5)-0,1 % sodium PP, ADN de sperme de saumon dénaturé ( > 100 Zg/ml) et la sonde marquée (108cpm/pg) a été ajoutée à la solution de préhybridation et l'incubation a été poursuivie pendant toute la nuit. La membrane a été lavée à 65"c pendant 30 minutes 2 fois dans 2 x SSC-0,5 % SDS, une fois dans 2 x SSC-0,5 % SDS, et une fois dans 0,5 x SSC-0,5 % SDS. Des quantités égales d'ARN de cultures synchrones de B. thurinqiensis sous espèce Kurstaki HD1 Cry'B portant les plasmides pHT305P ou pHT305H prises à t3 ont été déposées sur des membranes Hybond-C Extra (Amersham) avec un appareil manifold (Schleicher & Schuel) en utilisant le protocole dot blot décrit par Sambrook et al (Sambrook, J., et al 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). La sonde et les conditions d'hybridation étaient celles décrites dans les tests Northen blot. Préparation du cristal et analyse Les cellules ont été cultivées dans un milieu HCT à 30OC avec agitation pendant 48 heures et les cristaux ont été préparés selon la méthode décrite dans la publication Lecadet, M.M., et al (1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:840-849), à l'exception du fait que la concentration en NaCl était de 150 mM. Pour l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (PAGE), 20 p1 de chaque échantillon ont été utilisés (Lereclus, D., et al 1989. (FEMS Microbiol. Lett. 66:211-218). Test de détection de la 8-Galactosidase Les souches de E. coli et B. thuringiensis contenant les fusions de transcription lacZ ont été détectées en déposant sur le milieu solide, le substrat chromogène, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (X-Gal) (40 pg/ml) et des antibiotiques appropriés. Les souches isolées ont été cultivées comme indiqué et récupérées à t2, t, tot t1,5, t3, t4,5, t6, et t7,5 Après centrifugation, les culots ont été immédiatement congelés à - 70"c (pour prévenir l'inactivation de la p-galactosidase) et décongelés juste avant le traitement par ultra-sons pour détecter la p- galactosidase (Msadek, T., et al 1990. J.Bacteriol. 172:824.834). Les activités spécifiques présentées (exprimées en unités Miller par milligramme de protéine) correspondent aux moyennes d'au moins deux expériences indépendantes. - RESULTAT8 - L'expression du gène cryIIIA nécessite la présence d'un fragment d'ADN en amont du gène. Arantes et Lereclus (1991. Gene 108:115-119) ont montré que le gène crvIIIA était seulement faiblement exprimé dans la souche B. thuringiensis HD1 CryB lorsqu'il était cloné dans un vecteur à faible nombre de copies tel que pHT304 (4 copies par équivalent chromosome). A partir d'un fragment BamHI de 6 kb portant le gène cryIIIA et les régions adjacentes (figure 1 B), isolé à partir de la souche B. thuringiensis LM79 spécifique pour les coléoptères, on a recherché si des régions en amont du gène pouvaient être impliquées dans la régulation de l'expression de ce gene. Le fragment de 6 kb a été cloné dans le site unique BamHI du vecteur pHT304 (figure 1 A) ; des fragments obtenus après digestions partielles ou totales par HindIII du fragment BamHI de 6 kb ont été également insérés de façon indépendante dans le même plasmide pour donner les dérivés pHT305A, pHT305G, pHT305H, pHT305P et pHT305C (figure 1 B).Les cinq plasmides recombinants ont été ensuite introduits dans B thuringiensis sous espece Kurstaki HD1 Cry B par électroporation, et les transformants ont été cultivés pendant deux jours à 30"C dans un milieu HCT (Lecadet, M. M., et al 1980. J. Gen. Microbiol. 121:203-212) contenant 25 pg d'érythromicine par ml. Des préparations de spores comportant des cristaux ont été récupérées à partir des cultures et examinées par microscopie en contraste de phases et SDS-PAGE (figure 2). Les souches recombinantes portant les vecteurs pHT305A, pHT305G et pHT305P (figure 2 lignes 1, 2 et 4 respectivement) produisaient des grandes quantités d'un cristal rhomboïde plat caractéristique des souches actives contre les larves de coléopteres. Les composants principaux de ces cristaux étaient deux peptides d'environ 73 et 67 kDa, tels que ceux préalablement décrits pour les souches de B. thurinqiensis portant cryIIIA (Donovan, W.P., et al 1988. Mol. Gen. Genet. 214:365-372). En revanche, aucune production de cristal n'a été détectée avec les souches portant pHT305H ou pHT305C (figure 2, lignes 3 et 7 respectivement). On a émis l'hypothèse que ces plasmides sont dépourvus de certains éléments présents au contraire dans les dérivés pHT305A, pHT305G et pHT305P. Cet élément supplémentaire éventuel est situé sur un fragment d'ADN de 1 kb, entre le second et le troisième site HindIII, ce fragment étant désigné par H2-H3 (figure 1 B). Pour tester si son effet d'activation dépendait de sa position, le fragment Hz-H3 a été ligaturé à un site SmaI de pHT305H. Dans le plasmide résultant (pHT305HRHzH3), le fragment H2H3 est localisé en aval du gène cryIIIA.La synthèse de la toxine CryIIIA de pHT305HnH2H3 s'est avérée aussi faible qu'avec le plasmide pHT305H (figure 2 ligne 6). Cette absence d'effet pourrait être due soit à la nouvelle localisation du fragment H2-H3, cette localisation etant inappropriée ou à la désorganisation de sa structure fonctionnelle. Dans ce cas, l'élement fonctionnnel démarrant à l'intérieur du fragment H2-H3 serait étendu à une région au-delà du site HindîlI décrit et comprendrait potentiellement la région du promoteur. Séquençge de 1'ADN et analyse La séquence nucléotide du fragment H2-H3 de 979pb du plasmide pHT791 a été déterminée (figure 3 B). De plus la séquence de 713pb s'étendant du troisieme site HindIII au premier site PstI (fragment H3-P1) a été déterminée (figure 3 B). Ce second fragment porte la région en amont du promoteur, le promoteur lui-même, le site potentiel de liaison au ribosome, et les premiers 151 codons du gène cryIIIA (Sekar, V. et al, 1987 PNAS. USA 84:7036-7040). I1 n'y a pas de différence entre la séquence du fragment H3-P1 isolé à partir de la souche LM79 et les régions correspondantes des gènes cryIIIA isolés à partir de B. thurinqiensis sous espèce tenebrionis, B. thuringiensis sous espèce san diego et la souche EG2158 (Donovan W.P. et al, Herrnstadt C. et al, Hotte H.J. et al, Sekar V. et al). Aucune séquence potentiellement codante pour une protéine autre que celle correspondant à l'extrémité 5' de cryIIIA n'a été trouvée. Cette région présente une forte proportion de bases A+T (adenine-plus-thymine) correspondant à environ 81 t entre les bases 770 et 990 et deux séquences inversées répétées.La premiere séquence inversée répétée est imparfaite (16 des 17 pb sont identiques) avec un centre de symétrie au nucléotide 858 et la seconde est une répétition inversée parfaite de 12 pb avec un centre de symétrie au nucléotide 1379. Les énergies libres conduisant à la formation des structures en tige boucle, calculées selon la méthode de Tinoco et al (Tinoco, J.J. et al 1973. Nature (London) New Biol. 246:40-41), étaient respectivement de - 57,7 et - 66,1 kJ/mol. Analyse du point d'initiation et de la durée de la transcription en présence du fragment H-H. Sekar et al ont cartographié le site de début de la transcription du gene cryIIIA à partir des ARNs isolés à partir de cellules en phase précoce (stade II) et en phase intermédiaire (stades III à IV) de sporulation) en utilisant la nucléase de haricot (mung bean). Ces périodes de croissance correspondent à t2 à t5. L'extension à partir d'amorces a été réalisée sur des ARN extraits de cellules en culture à to, t3, t6 et tg pour déterminer si d'autres points d'initiation interviennent lors des phases précoces et tardives de la croissance, et pour déterminer à quel stade la transcription maximale apparaît. Un site de départ de la transcription est apparu sous forme d'un signal faiblement radioactif dans les échantillons à to et t9 et ce signal s'est avéré plus intense dans les échantillons à t3 et t6. Ce site d'initiation de transcription a été cartographié un nucléotide en amont de celui décrit par Sekar et al. Ces résultats indiquent que le transcrit majoritaire a pour extrémité 5' le T localisé en position 1413 (Fig.3). Cependant, le T localisé en position 1413 (Fig.3) pourrait constituer l'extrémité d'un messager stable dont le vrai démarrage se situerait en amont. Détection et analyse quantitative de l'ARNm spécifique de la toxine crvIIIA en présence du fragment H2-H3 La transcriptase inverse est satisfaisante pour l'extension à partir d'amorces pour des fragments contenant seulement 100 à 150 bases dans la mesure ou cette enzyme peut s'arrêter ou s'interrompre dans des régions comportant d'importantes structures secondaires au niveau de la matrice d'ARN. Pour étudier la présence d'un site potentiel d'initiation de transcription localisé très en amont de l'extrémité 5' du gène cryIIIA, une analyse Northern blot a été réalisée. L'ARN total de la souche portant pHT305P a été récupéré à t,, t3, t6 et t9. Les ARN ont été séparés par électrophorèse sur gels d'agarose et hybridés avec une sonde correspondant aux fragments internes de cryIIIA marqués (fragment PstI-EcoRI de 874 pb). Dans tous les échantillons, un transcrit principal d'environ 2,5 kb a été détecté. Ceci est cohérent avec la taille du transcrit délimité par le site d'initiation de transcription décrit ci-dessus et une séquence de terminaison potentielle localisée environ 400 pb en aval du codon stop de cryIIIA, décrite par Donovan et al. Les quantités relatives d'ARNm spécifiques de la toxine CryIIIA synthétisée par la souche portant pHT305P et par la souche portant pHT305H ont été comparées par une procédure dot blot. Des ARN isolés à partir de cultures synchrones récupérées à t3 ont été immobilisés sur une membrane de nitrocellulose et hybridés à un exces de sonde PstI-EcoRI de cryIIIA. La souche portant pHT305P contenait environ 10 à 15 fois plus d'ARNm spécifique de cryIIIA que la souche contenant pHT305H. Production de 8-galactosidase à partir de la fusion H,-H: :lacZ La synthèse relative du transcrit cryIIIA en présence et en l'absence du fragment H2-H3 a indiqué que ce segment d'ADN régule l'expression du gène cryIIIA au niveau de la transcription plutôt qu'au niveau de la traduction. Une fusion avec le gène lacZ a été réalisée pour tester l'effet sur la transcription, produit par le fragment H2-H3. Le gène lacZ dépourvu de promoteur a été sous-cloné dans le site SmaI de pHT304. Le plasmide résultant pHT304'lacZ constitue un système permettant de générer des transcriptions de fusion et d'étudier leur expression dans B. thuringiensis dans des conditions approchant celles ayant lieu naturellement avec les gènes cry (plasmide à faible nombre de copies).En conséquence, le fragment H3-P1 de 713pb a été cloné entre les sites HindIII et PstI de pHT304'lacZ pour donner pHT7901'lacZ. Finalement, le fragment H2-H3 a été cloné dans le site HindIII de pHT7901'lacZ pour donner pHT7902'lacZ, qui porte le fragment H2-H3 dans son orientation d'origine par rapport au fragment H3-P1 (figure 4). Les plasmides pHT304'lacZ, pHT7901'lacZ et pHT7902'lacZ ont été introduits dans B. thurinqiensis sous espèce Kurstaki HD1 CryB par électroporation.Le vecteur pHT304'lacZ avait un phénotype bleu potentiellement attribué au promoteur lacZ ou à une autre région d'ADN de pUC19 agissant comme promoteur, localisée en amont des sites de clonage. La sporulation de chaque souche a été induite et des échantillons ont été pris à t2 et t.1 (2 heures et 1 heure avant le déclenchement de la sporulation, respectivement) et de t0 à t715 à 1,5 heure d'intervalle et testés pour l'activité 8-galactosidase (figure 5).L'activité ss-galactosidase de la souche portant pHT304'lacZ était constante à environ 800 unités Miller de t2 à t7 5. Le niveau de la production d'enzymes de la souche portant pHT7901'lacZ a monté d'environ 250 unités Miller à t2 jusqu'a environ 1.200 unités Miller à t7,5, indiquant une petite mais significative augmentation de l'activité p- galactosidase pendant la sporulation (cette augmentation n'est pas apparente à cause de l'échelle utilisée sur la figure 5). Au contraire, la souche recombinante portant pHT7902'lacZ a produit beaucoup de p-galactosidase (33.000 unités Miller à t6 et t75). Son activité p-galactosidase a augmenté d'environ 20 fois entre to et t6 (Figure 5). Le ratio des activités des souches portant pHT790l'lacZ et pHT7902'lacZ a augmenté de 8 fois pendant la phase de croissance végétative à environ 25 fois pendant la phase tardive de la sporulation. Les résultats présentés ci-dessus et plus précisément les Figures 4 et 5, indiquent que le systeme d'expression de cryIIIA est fonctionnel (å bas nombre de copies) si la région H2-H3 est présente en amont de la région H3-H1. Si c'est le cas, de très hauts niveaux d'expression sont obtenus, que ce soit avec le gène cryIIIA ou avec le gène lac Z. 1) Définition précise de la région activatrice. Des délétions du fragment H2-P1 (Fig.3 A) ont montré qu'un fragment Taxi 2 I (positions 907 à 1559, Fig.3) était suffisant pour obtenir la forte expression du gène lac Z (plasmide pHT7930'lacZ, fig.6). De plus, une délétion interne du fragment, entre les sites PacI et XmnI (positions 990 à 1179) ne réduit pas l'expression du gène lac Z. Cette délétion interne a fait intervenir un adaptateur entre les sites PacI et XmnI. Les deux oligonucléotides suivants ont été synthétisés et hybridés ensemble pour construire une séquence d'ADN double brin pouvant servir d'adaptateur entre les sites PacI et XmnI -5'- TAAAGATATCTTTGAAGCTTCACGTGTTTAAACAGGCCTGCAG -3'- -3'- TAATTTCTATAGAzACTTCGAAGTGCACAAATTTGTCCGGACGTC -5'- L'adaptateur utilisé ici a une séquence telle que cinq nucléotides naturellement présents après le site PacI, sont reconstitués dans le plasmide pHT7931'lacZ. En présence de cette délétion, une meilleure expression semble être obtenue en rapprochant les deux régions TaqI - PacI (positions 907 à 990) et XmnI - TaqI (positions 1179 à 1559) (plasmide pHT7931'lacZ, fig.6). I1 s'ensuit que le système d'expression de cryIIIA nécessite l'association de deux séquences d'ADN distinctes ; l'une est comprise entre les sites TaqI et PacI (positions 907 à 990), l'autre est comprise entre les sites XmnI et TaqI (positions 1179 à 1559). Cette conclusion est renforcée par le fait qu'en l'absence de la région XmnI - TaqI (positions 1179 à 1559), la région située en amont du site XmnI n'est pas suffisante pour obtenir le haut niveau d'expression du gène lac Z (plasmide pHT7907'lacZ, fig.6). En effet, la séquence d'ADN DraI - XmnI (positions 806 à 1179) placée en amont du gene lac Z (plasmide pHT7907'lacZ) ne permet d'obtenir chez Bt (B. thuringiensis) qu'une activité ss-galactosidase d'environ 3500 unités Miller (å comparer aux 30.000 u M obtenues avec le plasmide pHT7902'lac Z et pHT7903'lacZ). Ce résultat confirme donc que l'association des deux séquences Taxi - PacI (positions 907 à 990) et XmnI I (positions 1179 à 1559) est nécessaire pour que le système d'expression de cryIIIA fonctionne pleinement. L'expérience réalisée avec le fragment DraI - XmnI en amont de lacZ (plasmide pHT7907'lacZ) indique qu'une activité promotrice est incluse entre DraI et XmnI voire entre TaqI et PacI (positions 907 à 990) puisqu'une forte activité ss-galactosidase est obtenue quand le fragment PacI-XmnI (positions 991 à 1179) est absent. L'analyse des ARN par extension d'amorce permet en effet de détecter un démarrage de transcription dans cette région. Celui-ci est localisé en position 983 (Fig.3). I1 en résulte qu'un promoteur doit être situé quelques paires de bases en amont de ce démarrage. Bien qu'il n'y ait pas d'homologie évidente avec des promoteurs connus, les boîtes -35 et -10 du promoteur se trouveraient entre les positions 945 à 980. Un fragment d'ADN MunI - PstI (positions 952 à 1612) placé devant lacZ (plasmide pHT7909'lacZ) confère une faible activité p-galactosidase, comparable à celle obtenue avec le plasmide pHT7901'lacZ (Fig. 4 et 5). Ce résultat suggère que le promoteur situé en positions 945 et 980 peut être inactivé dans une construction débutant à MunI (position 952). On sait toutefois que la séquence minimale nécessaire à l'expression a été définie comme débutant au site Tacts (position 907). I1 résulte de ces différentes expériences, qu'une séquence d'ADN localisée entre les sites TaqI et PacI (positions 907 à 990) est requise pour obtenir une forte expression de lacZ et en conséquence une forte transcription de cryIIIA. Introduction de la fusion rsystème d'expression CryIIIA - Laczl dans le chromosome de Bacillus subtilis. Le vecteur pAF1 (fig4) non replicatif chez B.subtilis permet d'introduire les fusions avec le gene reporteur LacZ dans le chromosome de B.subtilis au locus amyE. (J. Bact 1990, 172:835 - 844). Le plasmide pHC1 est obtenu par insertion du fragment HindîlI-SacI (2,7 kb) du pHT7901'Lac Z entre les sites HindîlI-SacI du pAF1. Le plasmide pHC2 est obtenu par insertion du fragment HindîlI-SacI (3,7 kb) du pHT7902'LacZ entre les sites HindIII et SacI du pAF1. Les fusions sont introduites dans la souche B.s 168 trpC2 (Anagnostopoulos,C., et Spizizen,J.1961.J Bacteriol 81:741-746) (Bacillus subtilis 168) par transformation ; le phénotype (amy-] rend compte de l'intégration par double recombinaison. Etude du système d'expression du gène cryIIIA chez B. Subtilis. Les souches de B.subtilis obtenues après transformation et intégration des plasmides pHC1 et pHC2 sont appelées respectivement Bs 168 EH] et Bs 168 EP] La construction contenue dans le plasmide pHC2, c'est å-dire portant le fragment H2-P1 en amont de lac Z, a aussi été introduite dans la souche B.subtilis AsiqE. On obtient la souche AsigE en transformant une souche parentale (Spo+) avec un plasmide non réplicatif chez les bactéries gram-positives et portant un gène sigE dont une région interne est délétée. Le gène sigE a été décrit par Stragier et al 1984. Nature 312:376-378. La souche sigE est transformée avec le plasmide pHC2 et la souche résultante est AsigE [P]. Cette souche a été délétée pour le gène codant pour le facteur sigmaE spécifique de la sporulation. Cette souche est donc asporogène (Spo'), De même, la souche Bs 168 [P] a été transformée avec une "cassette KmR" qui interrompt le gène SpoOA. La souche d'ou provient le gene spoOA interrompu par une "cassette KmR" est obtenue en transformant une souche parentale (Spo+) avec un plasmide non réplicatif chez les bactéries Gram-positives et portant un gène SpoOA (décrit par Ferrari, F.A et al 1985. PNAS USA 82 2647-2651) interrompu par un gène de résistance à la kanamycine. L'ADN chromosomique de cette souche a été utilisé pour transformer la souche Bs 168 [P]. Ainsi la souche résultante Spo a été appelée Bs168 SpoOA [P]. I1 apparaît tout d'abord que la production de - galactosidase obtenue avec la souche de B.subtilis 168 [H] est très faible ( De plus, un résultat très surprenant a été obtenu l'expression dans la souche BsEsigE est identique à l'expression dans la souche Bs 168 sauvage. Ce résultat indique que le gene cryIIIA n'est pas contrôlé par un promoteur spécifique du facteur sigma E comme c'est le cas pour le gène cryIA. I1 est encore plus surprenant que l'expression dans la souche Bs SpoOA [P] soit supérieure à celle obtenue dans la souche Bs 168 [P]. Ce résultat montre que l'expression de cryIIIA est indépendante de la sporulation puisque le gène spoOA intervient au premier stade de la sporulation. Ces résultats sont très importants pour le développement et les applications du système d'expression de cryIIIA. Ils indiquent en effet que l'on peut envisager la production des toxines insecticides ou de tout autre protéine d'intérêt commercial dans des souches Spo de B.subtilis ou de B. thurinqiensis. Analyse de l'expression de la fusion Système d'expression CryIIIA - LacZ = pHC21 chez Bacillus subtilis en fonction du milieu de culture. En ce qui concerne l'expression de la fusion dans les milieux 1 à 5 respectivement dont la composition est donnée ci-dessous, on peut faire les observations suivantes - I1 y a expression (bien que faible) durant la phase végétative. L'expression augmente à l'entrée en phase stationnaire. - La comparaison des milieux 2 (carence en phosphate) et 5 (carence en acides aminés) montre que le système d'expression CryIIIA est activé par la carence en acides aminés. - L'expression dans le milieu 4 montre que cette activation nécessite la présence des sels : CaCl2, MnnCl2, CAF. - L'activation est indépendante de la sporulation En milieu de sporulation (milieu Sp) 1 l'expression s'arrête à t2. Dans le milieu 5 les cellules ne peuvent sporuler (le glucose inhibe la sporulation), et l'activation est maximum. - Quand la seule source d'azote est NH+4, 1 l'activation est moins importante, l'expression reste cependant importante (milieu 3). 1/ Milieu Sp : milieu de sporulation 8 g nutrient hoth (Difco) / litre 1 mM MgSO4 13 mM KC1 10 ssM MnC12 1 pM FeSO4 1 mM CaCl2 2/ Milieu de carence en phosphate Tampon HEPES pH7;50 mM 1 mM MgSO4 0,5 mM CaC12 10 pM MnC12 4,4 mg/litre citrate ammonioferrique (CAF) 2 % glucose 10 mM KC1 100 mg/litre chaque acide aminé 50 mg/litre tryptophane 0,45 mM tampon phosphate pH 7 3/ Milieu minimum 44 mM KH2PO4 60 mM K2HP04 2,9 mM citrate tri Na 15 mM (NH4)2SO4 2 % glucose 4/ Milieu carencé en acides aminés sans CaCl2 MnC12 CAF 44 mM KH2PO4 60 mM K2HPO4 2,9 mM citrate tri Na 2 % glucose 1 mM NgSO4 50 mg/litre tryptophane 0,5 hydrolysat de Caséine (HC) 5/ idem 4 en ajoutant 0,5 mM CaCl2 10 M MnCl2 4,4 mg/litre CAF - REVENDICATIONS 1) Séquence d'ADN caractérisée par les propriétés suivantes - elle est comprise dans un enchaînement d'ADN d'une longueur de 1692 pb environ, délimité par les sites de restriction HindIII-Pstl (fragment H2-P1), tel qu'obtenu par digestion partielle du fragment BamHI de 6 kb porté par le gène cryIIIA de Bacillus thuringiensis souche LM79 - elle est susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval, dans un hôte cellulaire du type Bacillus thuringiensis ou/et Bacillus subtilis. 2) Séquence d'ADN selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement HindIII-Pstl d'une longueur de 1692 pb environ (fragment H2-P1) tel qu'obtenu par digestion partielle du fragment BamHI de 6 kb portant le gène cryIIIA de Bacillus thuringiensis souche LM79. 3) Séquence d'ADN caractérisée par les propriétés suivantes - elle est contenue dans un enchaînement de nucléotides hybridant dans des conditions non stringentes avec le fragment d'ADN compris entre les nucléotides 1413 et 1559 de la séquence représentée à la figure 3 - elle est susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression notamment d'une séquence codant pour un polypeptide de Bacillus toxique vis-à-vis des insectes ou d'une séquence codant pour un polypeptide exprimé pendant la phase stationnaire de Bacillus. 4) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement de nucléotides suivant désigné par l'expression Seq N"1 compris entre les nucléotides 1 et 1692 de la séquence de la figure 3, ou en ce qu'elle correspond à toute partie d'au moins 10 nucléotides naturellement consécutifs ou non de cet enchaînement, susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval dans un hôte cellulaire du type Bacillus. 5) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement délimité par les sites de restriction TaqI-TaqI. 6) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée ce qu'elle correspond à l'enchaînement de nucléotides suivant désigné par l'expression Seq Ne2 compris entre les nucléotides 907 et 1559 de la séquence de la figure 3, ou en ce qu'elle correspond à toute partie d'au moins 10 nucléotides naturellement consécutifs ou non de cet enchaînement, susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval dans un hôte cellulaire du type Bacillus. 7) Séquence d'ADN selon 1'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement délimité par les sites de restriction TaqI-P-I. 8) Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement Seq N"3 compris entre les nucléotides 907 et 990 de la séquence de la figure 3, ou un variant comprenant les nucléotides 907 à 985, ou caractérisée en ce qu'elle correspond à toute partie d'au moins 10 nucléotides naturellement consécutifs ou non de cet enchaînement, susceptible d'intervenir pour le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval dans un hôte cellulaire du type Bacillus. 9) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement délimité par les sites de restriction XmnI-TaqI. 10) Séquence d'ADN selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement Seq N"4 compris entre les nucléotides 1179 et 1559 de la séquence de la figure 3, ou en ce qu'elle correspond à toute partie d'au moins 10 nucléotides naturellement consécutifs ou non de cet enchaînement, susceptible d'intervenir dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides placée en aval dans un hôte cellulaire du type Bacillus. 11) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment TaqI-PacI répondant à l'enchaînement Seq N"3, en association avec le fragment XmnI-TaqI répondant à l'enchaînement Seq N 4. 12) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence intervenant dans le contrôle de la transcription de la séquence codante de nucléotides ou d'une séquence intervenant pour augmenter l'expression d'une séquence codante. 13) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée par - sa capacité d'hybridation dans des conditions non stringentes avec un enchaînement de nucléotides choisi parmi les enchaînements Seq N 1, Seq N"2, Seq N"3 et Seq N"4 et par, - sa capacité à intervenir dans le contrôle de l'expression, dans un hôte cellulaire du type Bacillus, d'une séquence codante de nucléotides placée en aval. 14) Séquence d'ADN recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codante déterminée, sous le contrôle d'une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15) Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il est modifié en l'un de ses sites, par une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, de façon telle que ladite séquence d'ADN intervient dans le contrôle de l'expression d'une séquence codante de nucléotides déterminée. 16) Vecteur d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, par exemple d'un plasmide intégratif, ou d'un plasmide répl icatif. 17) Vecteur d'expression selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pHT7902'lacZ déposé à la CNCM le 20 Avril 1993 sous le N I-1301. 18) Séquence d'ADN recombinant selon la revendication 14 ou vecteur d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que la séquence codante de nucléotides qu'il contient est une séquence toxique vis-à-vis des insectes et en particulier une séquence à activité larvicide, par exemple la séquence codante du gène cryIIIA de B. thuringiensis. 19) Séquence d'ADN recombinant selon la revendication 14 ou vecteur d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que la séquence codante de nucléotides qu'il contient est une séquence codant pour une enzyme. 20) Séquence d'ADN recombinant selon la revendication 14 ou vecteur d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que la séquence codante de nucléotides qu'il contient est une séquence codant pour un antigène. 21) Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il est modifié par une sequence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 14 à 18 ou par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20. 22) Hôte cellulaire selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un Bacillus, par exemple de B. thuringiensis ou de B. subtilis. 23) Hôte cellulaire selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche asporogène de Bacillus, par exemple d'une souche de B. subtilis asporogène, en particulier une souche capable d'exprimer la séquence codante de la séquence d'ADN selon d'une quelconque des revendications 14 à 18, pendant la phase stationnaire de croissance.