FR 2703080 A1 19940930 FR 9303805 A 19930326 PROCEDE D'IMPLANTATION DE S1IES DE FIXATION COVALENTE SUR UN SUBSTRAT EN FIBRE DE CARBONE ET CAPTEUR ENZYMATIQUE COMPRENANT UN ELEMENT CONDUCTEUR DE MESURE SUSCEPTIBLE D'ETRE OBTENU, NOTAMMENT, PAR CE PRO CODE Le domaine de l'invention est, de manière générale, celui des traitements chimiques de surface, et en particulier de ceux qui visent à créer, à la surface de matériaux, par exemple en carbone, plus particulièrement sous forme de fibres, des points d'ancrage aptes à permettre la fixation chimique covalente de molécules à fonctionnalités intéressantes et exploitables, telles que les enzymes. Une telle aptitude peut donner lieu à des retombées appréciables dans le secteur des biocapteurs, du type de ceux qui procèdent de l'association d'une enzyme et d'un capteur électrochimique utile pour la détection et le dosage d'au moins l'un des produits intervenant dans la réaction de catalyse enzymatique considérée. La présente invention concerne ainsi un procédé d'implantation de sites de fixation covalente du type carboxyle ou dérivés, sur un substrat en carbone, dans lequel une opération d'oxydation de la surface du substrat est mise en oeuvre. La présente invention est également relative à un capteur enzymatique comprenant un élément conducteur de mesure, de structure nouvelle et susceptible d'être obtenu notamment par le procédé visé ci-dessus. Le problème ici considéré est celui de l'immobilisation de molécules, telles que les enzymes, à proximité d'un transducteur électrochimique. Le document antérieur datant de 1991 et intitulé "Bioinstrumentation and Biosensors", édité par Donald L. WISE décrit, dans un chapitre intitulé "Amperometric Enzyme Membrane Electrodes" de P. COULET et al., quelques unes des diverses méthodes qui existent pour l'immobilisation de l'enzyme au voisinage du capteur électro-chimique dans des électrodes membranaires enzymatiques et ampérométriques. L'un des procédés courants consiste à fixer l'enzyme sur ou dans une matrice membranaire insoluble. Ces matrices sont, en général, réalisées en un matériau macromoléculaire, tel que des protéines comme la sérum-albumine, la gélatine ou le collagène, les polymères synthétiques, tels que les polyamides, polyàcrylamides ou les polyoléfines, comme le polyéthylène ou le polypropylène, ou bien encore les polymères naturels, comme la cellulose ou analogue. Classiquement, la liaison de l'enzyme avec le support membranaire se fait par l'adsorption physique ou la coréticulation, par exemple à l'aide de glutaraldéhyde. Une autre technique connue d'immobilisation consiste à greffer directement, par liaisons covalentes, l'enzyme à la surface de l'électrode. C'est ainsi que C. BOURDILLON ET AL. enseignent, dans l'article intitulé "Covalent Linkage of Glucose Oxidase on Modified Glassy Carbon Electrodes. Kinetic Phenomena", paru dans "Journal of the American Chemical Society", /102:12/June 4, 1980, pages 4231-4235, le greffage direct de molécules de glucose oxydase sur des électrodes en carbone vitreux, de façon à rapprocher les sites enzymatiques de la surface de l'électrode en carbone vitreux. Les molécules d'H202, formées à l'issue de la réaction enzymatique, sont dosées électrochimiquement, par transformation en 2 au niveau de l'électrode. Suivant cette technique, la surface de l'électrode en carbone est, tout d'abord, soumise à une longue et délicate préparation par polissage puis, ensuite, à une oxydation électro-chimique et chimique très sévère du carbone, de façon à générer des sites COOH en surface. Ces sites COOH sont ensuite activés à l'aide d'un agent choisi parmi les carbodiimides. La dernière étape du procédé consiste à faire réagir les COOH activés avec les extrémités NH2 terminales de l'enzyme. il est clair que les opérations contraignantes de préparation et d'oxydation propres à cette technique ne sont compatibles qu'avec des substrats en carbone de taille relativement importante, étant donné qu'une certaine partie de matière doit être éliminée par abrasion et que ladite matière doit avoir une tenue mécanique suffisante pour résister à l'attaque oxydante. Or, de nombreuses applications de ces capteurs enzymatiques ampérométriques sont dans le domaine biomédical, domaine dans lequel la biocompatibilité et la miniaturisation des équipements sont des objectifs permanents parmi d'autres. li existe donc un besoin en capteurs de très petite taille, offrant également une très bonne sensibilité et une très grande rapidité de mesure. Dans l'article paru dans leJ. Amer. Chem. Soc. 1991, 113, 1832-1833, sous le titre "Enzyme-Modified Carbon-Fiber Microelectrodes with Millisecond Response Times" et au nom de P. PANrANo et al., on rapporte une technique d'immobilisation covalente d'une enzyme à la surface d'une microclectrode (8 micromètres de diamètre) en fibre de carbone, par réalisation d'une structure macromoléculaire biotine/avidine/biotine/enzyme. Outre le fait qu'elle soit coûteuse, cette technique est relativement délicate à mettre en oeuvre et ne permet pas d'obtenir une fixation solide de l'enzyme sur la fibre de carbone.De plus, la présence du système macromoléculaire biotine/avidine, entre l'enzyme et la surface du substrat en carbone, est pénalisante au regard de la sensibilité de la détection ampérométrique de l'un des intervenants dans la réaction enzymatique. On connaît également, par l'article intitulé "Flow Cell Based on Glucose Oxydase - Modified Carbon Fiber Ultramicroelectrode", WANG et al., Electroanalysis, 1 (1989), 151-154, des ultramicroélectrodes en fibres de carbone, obtenues par modification électrochimique de fibres de carbone, en présence de glucose oxydase et d'un complexe à base de platine. Ce complexe sert d'intermédiaire de liaison entre la fibre de carbone et l'enzyme. Un tel procédé d'immobilisation d'enzymes s'est avéré être relativement onéreux, car il nécessite la mise en oeuvre de solutions d'acide chloroplatinique coûteuses et instables dans le temps. En outre, le dépôt de platine n'est, lui aussi, pas des plus stables, ni des plus fiables dans le temps. Par ailleurs, la présence de complexe chloroplatinique est un inconvénient au regard des applications médicales d'un tel capteur, en raison des problèmes de toxicité qu'elle sous-tend. Enfin, il convient de noter que ce document, sans proposer de solution technique avantageuse, souligne le fait qu'il est communément admis que les techniques traditionnelles d'immobilisation d'enzymes ne sont pas compatibles avec des dimensions ultramicroniques. Dans cet état de la technique, le développement de la miniaturisation de capteurs enzymatiques fonctionnant sur le principe de l'ampérométrie semblait, a priori, quelque peu dans l'impasse, étant donné que le greffage covalent direct sur des articles d'aussi petite taille que les fibres de carbone paraissait difficilement envisageable et que les techniques de fixation, par l'intermédiaire d'une membrane ou de complexes chloroplatiniques, ne donnaient pas satisfaction. La présente invention vise à sortir de cette impasse. Ainsi, il est du mérite de la Demanderesse d'avoir mis en évidence, après de nombreux essais et recherches, que l'implantation de sites de greffage du type carboxyle pouvait être réalisée par oxydation sur des substrats en carbone de très petite taille, moyennant le choix de conditions d'oxydation appropriées. n s'ensuit que la présente invention concerne un procédé d'implantation de sites de fixation covalente, du type carboxyle ou dérivés, par oxydation et sur un substrat en carbone, dont l'originalité tient: - au fait que l'on sélectionne un substrat constitué par au moins un fil de carbone comprenant au moins une fibre de carbone et présentant un diamètre inférieur ou égal à 150 ym, de préférence à 100 clam et, plus préférentiellement encore, à 50 ,um, - et au fait que l'on réalise l'oxydation au moins en partie par électrochimie, à un potentiel redox inférieur ou égal à 3 volts par référence à une électrode au calomel saturée (ECS), dans une solution aqueuse de sel et/ou d'acide, titrant au total 0,1 à 2 M, de préférence 0,2 à 1 M et, plus préférentiellement encore, 0,3 à 0,5 M. Par ces moyens, il est désormais possible de fixer solidement et durablement de manière covalente des composés, tels que des protéines (enzymes), sur des substrats en fibre de carbone de taille réduite. Cela permet, en outre, de réaliser, entre autres, des microcapteurs enzymatiques constitués par au moins un fil de carbone formé par au moins une fibre de carbone, ayant un diamètre inférieur ou égal à 150 ym et présentant à sa surface une couche sensiblement monomoléculaire d'enzymes fixées de façon covalente. Le procédé d'implantation de sites (COOH) conforme à l'invention permet d'obtenir des sites enzymatiques actifs relativement proches de la surface conductrice de l'électrode en carbone, ce qui permet d'éviter le recours à un quelconque médiateur, tout en satisfaisant aux exigences de miniaturisation et de biocompatibilité utiles dans de nombreuses applications biomédicales. Conformément à l'invention, le fil de carbone de départ peut être constitué de plusieurs fibres de carbone, par exemple d'une vingtaine, ayant chacune un diamètre unitaire e. g. de l'ordre de 7 micromètres, soit un diamètre de 30 à 35 Ccm pour le fil. Les fibres de carbone mises en oeuvre sont, avantageusement mais non limitativement, celles commercialisées par la Société SOFICAR sous la dénomination M40. Ces fibres commerciales sont naturellement ensimées, de façon à pouvoir être manipulables. Aussi, conformément à l'invention, on procède à leur "désensimage" par lavage à l'aide d'un solvant organique, tel que le diméthyle formamide (DMF), le tétrahydrofurane (lel;). Une fois désensimé, le fil de carbone est soumis à une oxydation électrochimique à un potentiel redox inférieur ou égal à 3 volts/ECS, de préférence de l'ordre de 2,3 volts/ECS. Cette oxydation électrochimique se déroule dans une solution aqueuse dont le soluté, qui est constitué par un sel et/ou un acide, est choisi parmi les dérivés nitrés, chlorés, chromiques ou soufrés, de préférence parmi les nitrates, les chlorures, les composés sulfochromiques, potassochromiques ou nitrochromiques .. et, plus préférentiellement encore, parmi les produits suivants : HNO3, K2Cr2O7, KNO3. Le soluté est, par exemple, un milieu nitrate titrant à 0,5 M. L'oxydation dure entre 10 et 300 secondes, de préférence entre 60 et 250 et, plus préférentiellement encore, entre 80 et 200, par exemple 180 secondes. Le substrat carbone, oxydé est ensuite, de préférence, lavé, de préférence, à l'eau distillée et séché. Pour optimiser le greffage, il est avantageux d'activer les sites carboxyles générés à la surface du substrat par l'oxydation. Pour ce faire, on préfère mettre en oeuvre un agent de couplage choisi, par exemple, parmi les carbodiimides. L'agent de couplage utilisé peut, par exemple, être le îcyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)- carbodiimide-métho-p-toluène sulfonate (CMCI), ou bien encore le morphoîinocarbodiimide, 1' aminopropylcarbodiimide, le 1 -éthyl-3 (3 - diméthylaminopropyl) carbodiimide et/ou un éthoxy carbonyle, tel que le N éthoxycarbonyle-2-éthoxy-1-2 dihydroquinoline (EEDQ). Pratiquement, le fil de carbone est placé dans une solution de carbodiimide, tel que le CMCI, ou dans une solution d'éthoxycarbonyle, tel que 1'EEDQ, titrant 60 mg/ml, pendant environ 3 heures à la température ambiante. Après un nouveau rinçage à l'eau distillée, on obtient un substrat en carbone conducteur présentant, à sa surface, des sites de greffage carboxylés activés susceptibles de permettre la fixation covalente de tout composé présentant un radical susceptible de réagir avec la fonction carboxyle. Le radical NH2 fait évidemment partie de ces fonctions réactives. Il s'ensuit que les protéines, telles que les enzymes, peuvent être fixées à la surface du substrat carboné. L'étape suivante du procédé suivant l'invention, qui s'intègre dans la démarche d'obtention d'un élément conducteur utile pour la réalisation d'un capteur enzymatique, consiste à procéder à la fixation d'une enzyme sur les sites carboxyles activés (glucose oxydase - lactate déshydrogénase par exemple). Dans le présent exemple, cette enzyme est la glucose oxydase mise en solution en milieu tampon PBS (Phosphate Buffer Solution) dans une concentration de 750 U.I./ml et dans laquelle on plonge le substrat en carbone à sites carboxyles activés pendant environ 3 heures. Enfin, le fil de carbone chargé de glucose oxydase en surface est rincé à l'aide d'une solution de NaCl 4M, puis stocké à 4" C en milieu PBS. A titre d'alternative pour la conservation de l'enzyme, il est possible d'envisager une lyophilisation qui facilite le stockage. Le substrat carboné greffé obtenu constitue, en fait, un élément conducteur de mesure susceptible d'être utilisé pour la réalisation d'une électrode ou microcapteur enzymatique. Les fig. 1 et 2 annexées sont des représentations schématiques d'un exemple de réalisation d'un tel microcapteur enzymatique, la fig. 2 étant une vue de détail de la tête du microcapteur de la fig. 1. L'âme de ce microcapteur est constituée par le fil de carbone 1 de diamètre = 40 ym et sur lequel est greffée l'enzyme conformément au procédé selon l'invention, ledit fil 1 étant ceint dans un tube en verre 2 de longueur L et étiré à son extrémité 3. Le fil 1 émerge de l'extrémité 3 ouverte du tube 2 sur une longueur 1. Le tube 2 contient une pâte 4 faite de carbone mélangé à de la résine et dans laquelle est noyé le fil 1. Comme cela apparaît à la fig. 2, cette pâte 4 est remplacée, dans l'extrémité 3 du tube 2, par de la résine 5 utile elle aussi à l'immobilisation du fil 1. Ce dernier est connecté à un fil conducteur en cuivre 5 qui permet de relier le microcapteur à un dispositif d'alimentation et de mesure. En pratique, la longueur L peut être de 10 à 30 mm et la longueur I du fil ou de l'élément conducteur en carbone 1 est d'environ 0,5 mm. Un tel microcapteur, greffé par exemple avec de la glucose oxydase (GOD), permet le dosage du glucose par détection ampérométrique de l'H2O2 produit par catalyse enzymatique du glucose par la GOD. Ce capteur fournit une intensité de quelques dizaines de nanoampères pour les concentrations de glucose de l'ordre de grandeur des concentrations biologiques. La fig. 3 annexée est un graphe montrant la réponse du microcapteur en intensité (nanoampères) à des ajouts de glucose dans le milieu de dosage à des divers temps T successifs. I1 ressort de ce qui précède que le procédé d'implantation selon l'invention est avantageux en ce qu'il permet le greffage covalent de l'enzyme sur le substrat ou fil en carbone par l'intermédiaire d'un pont amide, ce qui assure la stabilité du couplage et permet d'obtenir des durées de vie importantes, une bonne sensibilité et un temps de réponse court, grâce à la proximité du site réactionnel et du conducteur électronique, détecteur électrochimique. I1 permet, également, de n'utiliser que de faibles quantités d'enzymes, puisque juste limitées aux quantités nécessaires à la formation d'une monocouche. En outre, ce procédé est de mise en oeuvre simple et économique. I1 faut également souligner la taille réduite et la biocompatibilité des microcapteurs enzymatiques pouvant être obtenus à l'aide de ce procédé et qui permettent d'envisager des implantations in vivo. De nombreuses applications sont envisageables pour ces microcapteurs enzymatiques : génie biologique et médical, analyses médicales, monitoring de concentration d'espèces d'intérêt biologique (par exemple contrôle de l'état physiologique par suivi de l'évolution du métabolisme du glucose, pathologies, fatigues, états de vigilance ...), biotechnologie, agro-alimentaire (fermentations, contrôles en lignes ...). REVENDICATIONS: 1 - Procédé d'implantation de sites de fixation covalente, du type carboxyle ou dérivés, par oxydation et sur un substrat en carbone, caractérisé en ce qu'il consiste: - à sélectionner un substrat constitué par au moins un fil de carbone comprenant au moins une fibre de carbone et présentant un diamètre inférieur ou égal à 150 micromètres, de préférence à 100 tcm et, plus préférentiellement encore, à 50 ,um, - éventuellement à le désensimer à l'aide d'un solvant organique, - et à réaliser l'oxydation, au moins en partie par électrochimie, à un potentiel redox inférieur ou égal à 3 volts par référence à une électrode calomel saturé (ECS), dans une solution aqueuse de sel et/ou d'acide, titrant au total 0,1 à 2 M, de préférence 0,2 à 1 M et, plus préférentiellement encore, 0,3 à 0,5 M. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le soluté est choisi parmi les dérivés nitrés, chlorés, chromiques, soufrés, de préférence les nitrates, les chlorures, les composés sulfochromiques, potassochromiques ou nitrochromiques ... et, plus préférentiellement encore, parmi les produits suivants HNO3, K2Cr2O7, KNO3. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la durée de l'oxydation est comprise entre 10 et 300 secondes, de préférence entre 60 et 250 secondes et, plus préférentiellement encore, entre 80 et 200 secondes. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on fait suivre l'oxydation d'un lavage du substrat, de préférence à l'eau et, éventuellement, d'un séchage. S - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on greffe des protéines, de préférence des enzymes, de façon covalente, sur les sites carboxyles ou dérivés, éventuellement après activation desdits sites à l'aide d'un agent de couplage. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on effectue l'activation à l'aide d'au moins un carbodiimide et/ou un éthoxycarbonyle. 7 - Capteur enzymatique, caractérisé en ce qu'il comprend, au moins un élément de mesure conducteur constitué par au moins un fil de carbone: - susceptible d'être obtenu, notamment par le procédé selon la revendication 5 ou 6, - formé par au moins une fibre de carbone, - et présentant un diamètre inférieur ou égal à 150 micromètres, et etc ce qu'au moins une enzyme est greffée par liaison covalente sur ledit fil de carbone. 8 - Capteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fil de carbone, support de l'enzyme, est une électrode utile pour le dosage par détection ampérométrique de l'un des produits intervenant dans la réaction enzymatique considérée.