FR 2701710 A1 19940826 FR 9301833 A 19930218 La présente invention est relative à des conjugués protéiques à affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées, et plus particulièrement vis-à-vis de cellules cancéreuses et de cellules foetales, ainsi qu'à leurs applications en tant que médicament anticancéreux (propriétés cytolytiques) et en tant que réactif de diagnostic de cellules cancéreuses et/ou foetales. Le transport de molécules actives au niveau de sites biologiques particuliers a été suggéré par ERLICH, il y a plus de 100 ans. Les molécules utilisées sont plus efficaces et ont de moindres effets secondaires quand leur activité se manifeste seulement au contact des organes ou des cellules cibles. Cela est particulièrement important en cancérologie, où des substances toxiques ou hautement antigéniques sont administrées. Le progrès le plus important dans ce domaine a été obtenu avec des molécules qui possèdent à la fois une partie non spécifique et une partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules. Depuis le développement des anticorps monoclonaux (amc), l'un des buts de la biotechnologie a été la synthèse d'immunotoxines, c'est-à-dire d'amcs spécifiques d'un type de cellules, couplés à un agent capable de détruire lesdites cellules. En général, un amc est préparé de manière à avoir une spécificité pour un antigène présent à la surface de la cellule cible, de telle sorte que l'amc se liera à la cellule cible, et lorsqu'il sera incorporé à ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière. Le conjugué toxique est, la plupart du temps, de la ricine, ou la sous-unité A de la ricine. La sousunité B se lie aux résidus galactose omniprésents à la surface des cellules, tandis que la sous-unité A inactive enzymatiquement les ribosomes. I1 a été estimé qu'une seule molécule de ricin peut inactiver tous les ribosomes d'une cellule. La cellule envahie, incapable de produire de nouvelles protéines, meurt. Outre la ricine, d'autres agents peuvent être incorporés dans les immunotoxines ; on peut citer, notamment les toxines bactériennes ou végétales (ou leurs fragments actifs), les atomes radioactifs, et des agents utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. Dans tous les cas, les immunotoxines ainsi constituées, dirigent la substance active (la toxine ou l'anticancéreux) vers le domaine pathologique et conduisent ainsi à l'élimination des cellules cibles. Les conjugués toxine/anticorps spécifiques forment des immunotoxines très actives, mais ils possèdent aussi une toxicité non spécifique qui restreint leur application in vivo. D'autre part, des fragments de toxines, dépourvus de sites pouvant reconnaître les cibles visées et conjugués à des anticorps, sont employés couramment comme immunotoxines. De telles molécules hybrides, comme par exemple celles qui contiennent une chaîne ricine-A déglycosylée, sont ainsi rendues hautement spécifiques. Toutefois, leur activité est plus faible que celle des immunotoxines comprenant la ricine totale et cette activité dépend de l'intensité avec laquelle se fait l'endo- cytose. En effet, la translocation de l'immunotoxine dans la cellule cible dépend essentiellement de l'antigène de surface reconnu par la composante anticorps de l'immunotoxine. C'est une étape importante dans l'action des immunotoxines qui, dans un grand nombre de cas, ne conduit pas à l'endocytose ; en conséquence, la translocation intracellulaire de l'immunotoxine ne se produit donc pas. Dans de tels cas, le traitement se solde donc par un échec. De plus, de nombreux marqueurs antigéniques, présents à la surface des cellules, sont sécré tés aussi dans le milieu extracellulaire. L'efficacité de l'immunotoxine est donc de ce fait très réduite à cause de l'effet de compétition entre les antigènes de surface et les antigènes sécrétés. Dans le cas particulier de la thérapeutique antitumorale, les résultats obtenus à l'aide d'immunotoxines constituées de substances cytotoxiques liées à des anticorps spécifiques des tumeurs ne s'est pas révélée aussi concluante que ce que pouvait faire espérer la théorie En effet, cette dernière supposait que ces anticorps devaient conduire la molécule cytotoxique au sein de la cellule. Or, il est apparu que soit l'efficacité de la molécule cytotoxique est amoindrie, soit l'affinité de l'anticorps est amoindrie, soit les deux. D'autre part, la pénétration des substances cytotoxiques dans les cellules cibles s'est révélée souvent très problématique et l'effet cytotoxique ainsi très réduit. De plus, il a été découvert que de nombreux produits obtenus par conjugaison entre des anticorps et de telles molécules cytotoxiques ne peuvent pas être employées en tant que médicaments pour des raisons de solubilité ou diverses incompatibilité. Parmi d'autres difficultés, le choix de l'agent cytotoxique est souvent problématique. En effet, celui-ci doit être relativement non toxique une fois conjugué et devenir beaucoup plus toxique après son transport sur son site d'action où des enzymes intracellulaires libèrent la substance toxique au sein des cellules tumorales. La Demanderesse s'est, en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition, à visée thérapeutique ou diagnostique, apte à agir uniquement au niveau de cibles spécifiques (cellules cancéreuses, notamment) et apte à promouvoir l'endocytose (stimulation du transport de substances à travers les membranes cellulaires). La présente invention a pour objet des conjugués protéiques, du type comprenant une partie non spécifique et une partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, caractérisés en ce que la partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, (également dénommée substance de transport spécifique vers la cellule cible) est de 1'a-foetoprotéine. Conformément à l'invention, la partie non spécifique dudit conjugué est choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques, les substances possédant une fonction de marqueur ou les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques. De manière surprenante, de tels conjugués conservent certaines des propriétés de la-foetoprotéine et sont, en particulier, facilement incorporés dans les cellules qui portent le récepteur de 1'a-foetoprotéine à leur surface, par un mécanisme d'endocytose qui stimule la pénétration de la partie non spécifique (substance cytotoxique, marqueur, séquence nucléotidique). Egalement de manière surprenante, aussi bien la partie non spécifique que lla-foetoprotéine conservent leur efficacité. De tels conjugués protéiques sont spécifiques des cellules foetales et/ou des cellules cancéreuses (notamment hépatomes, tératoblastomes, carcinomes de type embryonnaire et carcinomes ovariens, testiculaires ou présacraux). La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent, à titre de principe actif, au moins un conjugué protéique conforme à l'invention, constitué d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à une partie non spécifique, choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques et les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les substances cytotoxiques sont en particulier choisies, et ce de manière non limitative, parmi les toxines animales, les toxines végétales, les enzymes cytolytiques et les principes actifs anticancéreux (anthracyclines, cyclophosphamide etc...). Les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses sont notamment choisies parmi les séquences nucléotidiques exprimant une protéine et les séquences nucléotidiques anti-sens. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic de cellules cancéreuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par un conjugué protéique conforme à l'invention, composé d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN. De tels marqueurs sont facilement détectables par des moyens optiques ou par des moyens de détection de radiations. Parmi les marqueurs radioactifs, on peut citer les molécules tritiées, les molécules marquées au 32p ou au 14C ; parmi les molécules fluorescentes, on peut citer la fluorescéine et ses dérivés, le chlorure de dansyle, la rhodamine B, l'érythrosine B, les dérivés fluorescents de l'éosine et la R phycoérythrine ; parmi les substances opaques aux électrons et/ou aux rayons X, on peut citer les métaux lourds et les éléments de transition ; parmi les enzymes, on peut citer la peroxydase, l'uréase et la phosphatase alcaline. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic de cellules foetales, carac térisé en ce qu il est constitué par un conjugué protéique conforme à l'invention composé dla-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN. La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage du cancer, caractérisé en ce qu'il comprend (a) le prélèvement d'un échantillon biologique approprié, (b) la mise en contact dudit échantillon avec un réactif de diagnostic conforme à l'invention constitué par un conjugué protéique conforme à l'invention composé d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN, et (c) la lecture du résultat. La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de préparation de lla-foetoprotéine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (1) prélèvement d'un échantillon biologique contenant de la-foetoprotéine (sang du cordon de foetus humain ou cellules cancéreuses en culture (hépatomes, tératocarcinome)), (2) séparation de lla-foetoprotéine dudit échantillon, (3) première purification de lla-foetoprotéine par au moins une chromatographie convenable, suivie d'une électrophorèse, (4) séparation du produit obtenu en (3), (5) immunisation pendant une période courte, de l'ordre d'une semaine, de mammifères appropriés avec le produit obtenu en (4), pour produire des anticorps de faible affinité anti-a-foetoprotéine, (6) production d'hybridomes produisant des anticorps anti-a-foetoprotéine de faible affinité, par fusion des cellules ganglionnaires desdits mammifères avec des cellules de myélome, (7) purification des anticorps monoclonaux obtenus, (8) immobilisation desdits anticorps sur une colonne d'affinité, et (9) passage du produit obtenu en (3) sur ladite colonne d'immunoaffinité, pour l'obtention de quantités substantielles d'a-foetoprotéine avec une grande pureté. Cette protéine préparée dans ces conditions s'avère stable. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Obtention de lEa-foetoprotéine. a) Préparation Des quantités d'a-foetoprotéine, de l'ordre du milligramme peuvent être préparées par des techniques d'immunoaffinité. (1) La première étape consiste donc à préparer cette protéine assez pure et en quantité suffisante (environ 100 Rg) pour immuniser des souris et préparer des anticorps monoclonaux que l'on va ensuite utiliser pour purifier 1'a-foetoprotéine en quantités importantes en une seule étape. L'oC-foetoprotéine peut être préparée à partir de sang du cordon de foetus humain ou de cellules cancéreuses en culture (hépatomes, tératocarcinome). La méthode de production consiste en fait à séparer cette protéine des autres protéines qui l'accompagnent, selon des méthodes classiques et connues par elles-mêmes, telles que chromatographie d'échange d'ions, d'affinité, d'exclusion sur gel ou d'interaction hydrophobe, électrophorèse préparative, dialyse et ultrafiltration. Dans une première étape, la matière première, sang total ou suspension cellulaire, est centrifugée puis soumise à une dialyse ou à une ultrafiltration pour éliminer les sels minéraux et les molécules de faible poids moléculaire. On purifie ensuite les protéines totales par chromatographie puis par électrophorèse préparative de façon à éviter toute contamination par des protéines étrangères et en particulier par de l'albumine. De manière plus précise, 10 ml de sérum ombilical de foetus humain (12 semaines de gestation), sont dialysés contre une solution tampon pH 7,0 (6,5 mM bistris propane) pendant 24 heures à travers une membrane de cellulose régénérée d'un seuil de coupure de 6 000-8 000 daltons. Le sérum dialysé est ensuite placé sur une colonne de Cibacron Blue 2-Sépharosee (Fi) CL-6B (PHARMACIA) de 26 mm de diamètre et 70 cm de long dans le même tampon. Cette opération a pour but d'éliminer la plus grande partie de l'albumine qui reste fixée sur le gel. On recueille les protéines éluées et on réalise alors une chromatographie sur une colonne Mono Q (PHARMACIA FPLC SYSTEM). L'élution est effectuée par un gradient de chlorure de sodium (0-0,5 M) dans le même tampon que précédemment. L'a-foetoprotéine est éluée par 0,35 M de chlorure de sodium. Après concentration par ultrafiltration sur membrane PM-10 d'un seuil de coupure de 10 000 daltons (AMICON), les protéines sont chromatographiées à nouveau par filtration sur gel d'agarose réticulé (SuperoseX 12, PHARMACIA), dans une colonne de 25 mm de diamètre et 80 cm de long dans un tampon phosphate pH 7,0. La colonne ayant préalablement été étalonnée, on recueille les pics correspondant à un poids moléculaire de 70 kDa et 140 kDa.Ces deux fractions sont réunies et soumises ensuite à une électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide: l'électrophorèse est effectuée sans SDS, à partir d'une zone de gel de concentration t4 % de polyacrylamide dans le gel de concentration et 7,5 % dans le gel de séparation). On utilise un tampon Tris-HCl pH 6,7 dans le gel de concentration et un tampon Trisglycine pH 8,3 dans le gel de séparation. L'échantillon est dilué au demi par du tampon Tris-HCl pH 6,7. On ajoute une partie de glycérol pour une partie d'échantillon dilué dans le tampon, et on ajoute un dixième du volume à déposer de solution de bleu de bromophénol dans du tampon Tris-HC1 pH 6,7, pour visualiser le front de migration. On effectue l'électrophorèse à 15-C sous 30 mA pendant environ 4 heures. Afin de déterminer la localisation de lla- foetoprotéine sur le gel après migration, on effectue d'abord une électrophorèse de sérum foetal contre du sérum adulte dans les mêmes conditions. La concentration dla-foetoprotéine dans le sang adulte est extrêmement faible. Ainsi, la comparaison des deux électrophorèses permet de repérer la bande correspondant à lla-foeto- protéine entre l'albumine et la transferrine dans le sang foetal. Le gel est coloré en partie par du bleu de Coomassie et la bande, dans sa partie non colorée correspondant à 1'a-foetoprotéine, est découpée avec soin pour éviter la contamination avec l'albumine encore présente à ce stade de la purification. Le gel contenant lla-foeto- protéine est homogénéisé dans du tampon phosphate pH 7,0 et soumis à une agitation dans un tube, pendant 1 heure. Après centrifugation, le surnageant est recueilli et chromatographié sur Cibacron Blue 2-Sépharose comme précédemment mais dans du tampon phosphate pH 7,0. Les protéines non retenues par le gel sont recueillies puis concentrées par ultrafiltration, comme précédemment. Ces protéines sont alors utilisées pour immuniser des souris afin d'obtenir des anticorps qui vont permettre de préparer des quantités significatives dla- foetoprotéine par immunoaffinité. (2) A ce stade, 1'a-foetoprotéine est utilisée pour produire des anticorps de faible affinité anti-afoetoprotéine. Cette production intervient en injectant de lla-foetoprotéine à des souris, en présence d'adjuvant de Freund. Les ganglions lymphatiques poplités sont ensuite prélevés sur ces souris et les cellules de ces ganglions sont fusionnées avec des cellules de myélomes pour former des hybridomes. La période d'immunisation est choisie volontairement très courte (une semaine) contrairement aux méthodes habituelles qui s'étendent sur plusieurs mois. D'autre part, on utilise ici des cellules ganglionnaires pour réaliser la fusion au lieu des splénocytes. Cette méthode permet de produire des clones d'anticorps anti-a-foetoprotéine de faible affinité. De manière plus précise, deux souris BALB/c, âgées de 4 mois environ, sont immunisées par injection de 20 Rg de protéines associées à de l'adjuvant de Freund, dans une patte postérieure, deux fois à deux jours d'intervalle, puis une troisième fois par 50 tjg de protéines sans adjuvant, deux jours plus tard. Trois jours après la dernière injection, soit neuf jours en tout, les souris sont sacrifiées et on prélève les ganglions lymphatiques poplités. Ils sont homogénéisés et lavés par du milieu DMEM sans sérum de veau foetal et l'homogénat est utilisé pour effectuer une fu sion avec des cellules de myélome Sp2/o. Ces cellules de myélome de souris sont classiquement utilisées pour produire des hybridomes, elles ont la propriété de ne pas se développer dans le milieu HAT. On cultive les cellules Sp2/o sur milieu DMEM Hybrimax avec 10 % de sérum de veau foetal. La fusion est effectuée en présence de PEG 3 000, à une concentration de 50 % dans du milieu DMEM à partir des thymocytes F1 (CBA x BALB/c). Les hybridomes sont cultivés dans du milieu HAT. Les clones apparaissent en 10-15 jours dans 75 % des cultures et correspondent à des Sp2/o complémentés par des cellules immunocompétentes. Environ 40 clones différents produisent des anticorps monoclonaux anti-a-foetoprotéine. 9 d'entre eux ne réagissent pas avec le sérum humain normal par la technique ELISA et 5 ne réagissent pas par la méthode d'analyse immunologique après transfert (immunoblotting). Deux clones sont choisis pour réaliser la séparation en quantité plus importante de lla-foetoprotéine, ils ne possèdent pas d'affinité croisée avec d'autres protéines sériques. On injecte alors de 10 à 50 millions de cellules d'hybridomes chez une souris, afin de lui faire développer une tumeur productrice d'anticorps monoclonaux. Entre le 10ème et 17ème jour après l'implantation, on prélève le liquide d'ascite afin de récupérer les anticorps. Les anticorps monoclonaux de type IGg sont purifiés ensuite par chromatographie sur Protéine -A- Sépharose (PHARMACIA). 5 ml de liquide d'ascite sont centrifugés à 3 000 rpm pendant 20 minutes, dilués au demi par du tampon Tris-HCl, pH 8,1 et placés sur une colonne de Pro téine-A-SépharosLa La colonne est lavée par 100 ml de tampon Tris-HCl, pH 8,1, et les immunoglobulines sont éluées par un tampon acétate pH 6,0, puis pH 4,5 et enfin pH 3,5. Les anticorps à faible affinité anti-a-foetoprotéine de l'un des clones (10C3) sont élués à pH 4,5 et un autre (7H8) à pH 3,5. Les immunoglobulines sont ensuite concentrées par précipitation par du sulfate d'ammonium à 50 %, à 4 C, pendant 18 heures et centrifugées pendant 30 minutes à 4 000 rpm. Le culot de centrifugation est redis sous dans un volume minimal de tampon PBS et dialysé contre le même tampon, pendant 24 heures. On obtient ainsi de 3 à 5 mg d'anticorps pour 1 ml de liquide d'ascite prélevé sur les souris. Les immunoglobulines ainsi purifiées sont ensuite immobilisées sur un gel de SépharoseX (PHARMACIA) activé par le bromure de cyanogène selon la méthode préconisée par le fournisseur du gel. (3) On peut alors entreprendre la préparation en plus grande quantité de lla-foetoprotéine par chromatographie d'immunoaffinité après avoir immobilisé les anticorps sur support tel que le Sépharosee activé par la protéine A par exemple, de façon à lire la fraction Fc des Igl, Ig2 et 1g4. Cette méthode générale permet d'obtenir des quantités substantielles d'a-foetoprotéine avec une grande pureté. Cette protéine préparée dans ces conditions s'avère stable. De manière plus précise, on prépare une colonne de 25 mm de diamètre et 50 cm de long avec du gel de Sépharose sur lequel est fixé l'anticorps monoclonal comme décrit précédemment. On charge la colonne avec 50 ml de sérum foetal humain et 1'a-foetoprotéine est éluée par un tampon phosphate sous la forme d'un gradient de pH s'étendant de 3,5 à 6,0. L'a-foetoprotéine est éluée à pH 6,0, dans une proportion de 90 % environ. b) Conjugaison de lla-foetoprotéine à différentes molécules actives. L'a-foetoprotéine est une glycoprotéine. De la sorte, les deux domaines de la molécule, protéique et osidique, peuvent être utilisés comme sites de fixation de différentes substances. Toute substance ayant un site chimiquement actif peut être, a priori, conjuguée à l'a- foetoprotéine. D'une façon classique, les molécules contenant des résidus thiols peuvent être liées à lla- foetoprotéine par une réaction entre des groupes~-aminés de la protéine et des esters carboxyliques activés ou avec des imidates. La fixation de molécules contenant des résidus carboxyliques est opérée de façon particulièrement efficace par des dérivés de carbodiimides.En général, la fixation sur des résidus osidiques s'effectue par modification par le métapériodate de sodium, notamment quand il s'agit de fixer des molécules contenant des résidus aminés libres. Tous ces procédés sont déjà connus en euxmêmes. On peut ainsi envisager de fixer un grand nombre de substances, telles que des molécules cytotoxiques, du matériel génétique (séquences nucléotidiques), des inhibiteurs de réplication du génome (ADN antisens par exemple), des enzymes ou encore des agents fluorescents, dans le but de repérer sous lumière ultraviolette les cellules cancéreuses. c) Cibles de 1'a-foetoprotéine conjuguée. Toute cellule présentant à sa surface le récepteur de l'a-foetoprotéine est une cible possible pour lla-foetoprotéine conjuguée. Aucune cellule normale ou non foetale ne présente ce récepteur. Seules les cellules foetales et les cellules cancéreuses en sont pourvues dans une proportion qui dépasse 90 % et ce dans plus de 70 cas différents de cancers (R. MORO et al., Tumor Biol., 8, 293, 1987). EXEMPLE 2 : Conjugaison de lla-foetoprotéine au carboxyphosphoamide. Le carboxyphosphoamide est le métabolite du cyclophosphoamide, molécule anticancéreuse largement utilisée. Son métabolite, le carboxyphosphoamide, ne peut pénétrer dans les cellules à cause de sa forte charge négative, et manifeste ainsi une faible toxicité. Si, au moyen de la conjugaison, le carboxyphosphoamide pénètre dans les cellules, il va être scindé en acroléine et en phosphoramide par des phosphoamidases particulièrement actives dans les cellules en cours de prolifération. Le phosphoramide ainsi obtenu est hautement cytotoxique. La conjugaison entre lla-foetoprotéine et le carboxyphosphoamide est effectuée à +4 C dans de la pyridine contenant 0,01 M d'HCl et de 1'EDC (1-éthyl-3(3 diméthyl-aminopropyl) carbodiimide) dans une proportion de 2 500 molécules d'EDC pour une molécule dla-foeto- protéine On utilise, de plus, de l'hexaméthylènediamine (HMDA) comme agent intercalant. Les proportions finales a-foetoprotéine-hexaméthylènediamine-EDC sont de 1:10:120. Le conjugué qui en résulte est dialysé contre du PBS et conservé ensuite à -70 C. Le rendement final de la conjugaison est de 72 t. EXEMPLE 3 : Essai de l'a-foetoprotéine-carboxyphospho- amide sur des cellules humaines cancéreuses en culture On détermine la cytotoxicité de lla-foeto- protéine couplée au carboxyphosphoamide avec des proportions variables de HMDA-a-foetoprotéine comprises entre 0 et 120. Cette détermination est réalisée sur des cellules QOS, appartenant à une lignée lymphoblastoîde, en mesurant la quantité de thymidine tritiée incorporée par rapport aux témoins (a-foetoprotéine (AFP) seule, carboxyphosphoamide (CPA) et HMDA seuls ou en mélange dans les mêmes proportions que dans le conjugué). 1. Sans HMDA Concentration Proportion molaire Effet Effet en CPA dans CPA:AFP CPA-AFP CPA le milieu 0,75 iM 10:1 25 % 0 % 1,50 WM 20:1 98 % O % 3,75 ! 50:1 100 % 0 % 9,00 g 120:1 100 % 2 % 2.Avec HMDA Concentration Proportion molaire Effet Effet en CPA dans CPA:HMDA:AFP CPA-HMDA- CPA+AFP le milieu AFP 0,75 WM 120:20:1 97 % 0 % 1,50 WM 50:20:1 100 % 0 % 3,75 WM 20:50:1 100 % 0 % 9,00 WM 10:120:1 100 % 0 % EXEMPLE 4 : Conjugaison entre a-foetoprotéine et ricine A. 1 mg d'a-foetoprotéine est mis en solution dans 1 ml de tampon PBS et mélangé à 6 mg de SPDP (Nsuccimisyl-3-(2 pyridyldithio)propionate) en solution éthanolique à raison de 1 mg/ml. Le mélange est incubé pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation constante. L'a-foetoprotéine ainsi modifiée est dialysée contre un tampon borate 0,05 M, pH 8,5. Parallèlement, la ricine A est traitée dans les mêmes conditions et dans les mêmes quantités que lla- foetoprotéine. Les deux protéines modifiées sont ensuite mises en présence, concentrées par ultrafiltration sur membrane de cellulose à seuil de coupure 10 000 daltons jusqu'à un volume final de 5 ml, et incubées pendant 18 heures à température ambiante pendant 18 heures. Le résultat de la conjugaison ainsi réalisée est ensuite purifié par chromatographie de filtration sur gel de Séphacryle S-300. Le conjugué est récupéré dans son tampon pH 8,5, au poids moléculaire correspondant à la somme des poids moléculaires des deux protéines, soit environ 102 000 daltons. Le rendement final de la conjugaison est de 42 %. EXEMPLE 5 : Conjugaison entre lla-foetoprotéine et la toxine diphtérique. A 10 ml d'une solution d'a-foetoprotéine concentrée à 1 mg/ml dans du tampon PBS, on ajoute 100 mg de SPDP (N-succimisyl-3-(2 pyridyldithio)propionate) en solution dans 160 ml de diméthylformamide. La solution est ensuite dialysée contre du tampon PBS ou chromatographiée sur SéphadexO G-25 (PHARMACIA), après équilibrage par du tampon PBS. La protéine ainsi modifiée est recueillie et concentrée par ultrafiltration sur membrane de cellulose d'un seuil de coupure 10 000 daltons. 10 mg de toxine diphtérique est placée dans une solution aqueuse contenant 50 mM de dithiotréitol et incubée pendant 1 heure à température ambiante. La protéine ainsi réduite est ensuite purifiée par chromatogra phie sur colonne de S épha G-25 équilibrée dans du tampon PBS, ou dialysée contre le même tampon. La toxine réduite est mise en présence de lla-foetoprotéine modifiée et la solution des deux protéines est concentrée par ultrafiltration sur membrane de cellulose d'un seuil de coupure 10 000 daltons. On laisse ensuite incuber pendant 18 heures à température ambiante. Le résultat de la conjugaison est ensuite purifié par chromatographie sur colonne de Séphacryle S-300 (PHARMACIA). Le rendement final de la conjugaison est de 34 t. EXEMPLE 6 : Conjugaison entre lla-foetoprotéine et 1 'amboclorine. L'amboclorine de formule HOOC-(CH2)3-C6H4 N(CH2-CH2-Cl)21 peut être conjuguée à lla-foetoprotéine de la même façon que le carboxyphosphoamide avec un rendement d'environ 65 %. EXEMPLE 7 : Conjugaison de 1'a-foetoprotéine avec la daunomycine. La daunomycine possède un radical aminé libre qui permet la conjugaison directe avec lla-foetoprotéine. La daunomycine est dissoute dans de la pyridine à une concentration de 10 %. On ajoute une solution dla-foetoprotéine dans un tampon chlorhydrique pH 5,0, puis on ajoute de l'acide adipique comme intercalant de façon à ce que les proportions entre les différents produits soient variables mais de façon à ce que le rapport entre a-foetoprotéine et EDC soit toujours de 1 à 2500. Le rendement de la conjugaison dépend fortement des différentes proportions entre les produits et s'étend de 22 % à 57 %. EXEMPLE 8 : Essai de 11a-foetoprotéine conjuguée à la daunomycine (DN) sur des cellules humaines cancéreuses en culture. L'essai est réalisé sur les mêmes cellules et dans les mêmes conditions que pour lla-foetoprotéine conjuguée au carboxyphosphoamide. 1. Sans intercalant : Concentration Proportion molaire Effet Effet en DN dans DN:AFP DN-AFP DN le milieu 0,15 WM 10:1 75 % 5 % 0,30 WM 20:1 75 % 26 % 0,75 WM 50:1 100 % 37 % 1,50 WM 100:1 100 % 100 % 1,80 WM 120:1 100 % 100 % 2.Avec l'acide aditipue comme intercalant Concentration Proportion molaire Effet Effet en DN dans DN:AFP DN-AFP DN le milieu 0,15 WM 10:50:1 75 % 5 % 0,75 iM 50:120:1 100 % 37 % 1,80 WM 120:20:1 100 % 100 % 1,80 gM 120:50:1 100 % 100 % 1,80 M 120:120:1 100 % 100 % 1,80 WM 120:250:1 100 % 100 % EXEMPLE 9 :Conjugaison de 1'a-foetoprotéine avec le méthotrexate et essai comparatif sur des cellules humaines normales et cancéreuses en culture. La conjugaison entre 1'a-foetoprotéine et le méthotrexate est réalisée selon la même méthode que pour la daunomycine. On n'utilise pas d'intercalant. Les essais comparatifs sont menés sur des cellules QOS (lignée lymphoblastoldes) et des lymphocytes humains normaux. Les conjugués, à différentes proportions de méthotrexate, sont ajoutés à des cultures de cellules QOS et à des cultures de lymphocytes humains normaux dans des boîtes à 96 puits (200 1 de milieu). Les cultures sont incubées pendant 72 heures. La détection et le comptage des cellules vivantes sont réalisés par coloration au bleu de thiazolyle (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol2-yl)-2,5-diphényltétrazolium). Une solution de bleu de thiazolyle à une concentration de 1 mg/ml est ajoutée à la fin de l'incubation à raison de 50 1 par puits. On incube à nouveau pendant 16 heures et on centrifuge pendant 5 minutes à 5 000 trs/min. Le surnageant est prélevé (150 1 exactement mesurés) et on ajoute 150 1 de DMSO. Après dissolution complète des cristaux de formazan, on lit la D.O. à 540 nm. Le témoin cultivé sans conjugué est affecté de la valeur 100 %. Concentration Proportion % de QOS % de en méthotrexate Méthotrexate-AFP survi- lymphocytes dans le milieu vantes survivants 1,50 WM 50:1 60 87 3,00 FM 100:1 53 82 6,00 FM 200:1 48 91 12,00 FM 400:1 45 90 EXEMPLE 10 : Conjugaison de 1'a-foetoprotéine avec la doxorubicine et essai comparatif sur des cellules humaines normales et cancéreuses en culture. La conjugaison entre lla-foetoprotéine et le méthotrexate est réalisée selon la même méthode que pour la daunomycine. On n'utilise pas d'intercalant. Les essais comparatifs sont menés sur des cellules QOS (lignée lymphoblastoldes) et des lymphocytes humains normaux exactement comme pour le méthotrexate. Concentration Proportion % de QOS % de en méthotrexate doxorubine-AFP survi- lymphocytes dans le milieu vantes survivant s 1,50 M 50:1 22 66 3,00 M 100:1 6 74 6,00 M 200:1 3 56 12,00 WM 400:1 2 71 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Conjugués protéiques, du type comprenant une partie non spécifique et une partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, caractérisés en ce que la partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, (également dénommée substance de transport spécifique vers la cellule cible) est de lla-foetoprotéine. 2 ) Conjugués protéiques selon la revendication 1, caractérisés en ce que la partie non spécifique dudit conjugué est choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques, les substances possédant une fonction de marqueur ou les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques. 3 ) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent, à titre de principe actif, au moins un conjugué selon la revendication 1 ou la revendication 2, constitué d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à une partie non spécifique, choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques et les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 4 ) Compositions pharmaceutiques selon la revendication 3, caractérisées en ce que les substances cytotoxiques sont choisies parmi les toxines animales, les toxines végétales, les enzymes cytolytiques et les principes actifs anticancéreux. 5 ) Compositions pharmaceutiques selon la revendication 3, caractérisées en ce que les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses sont choisies parmi les séquences nucléotidiques exprimant une protéine et les séquences nucléotidiques anti-sens. 6 ) Réactif de diagnostic de cellules cancé reuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par un conjugué selon la revendication 1 ou a revendication 2, composé d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN. 7 ) Réactif de diagnostic de cellules foetales, caractérisé en ce qu'il est constitué par un conjugué selon la revendication 1 ou a revendication 2, composé d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN. 8 ) Procédé de dépistage du cancer, caractérisé en ce qu'il comprend (a) le prélèvement d'un échantillon biologique approprié, (b) la mise en contact dudit échantillon avec un réactif de diagnostic selon la revendication 6, constitué par un conjugué composé d'a-foetoprotéine en tant que substance de transport spécifique vers la cellule cible, couplée à un marqueur choisi parmi les marqueurs radioactifs, les substances fluorescentes, les substances opaques aux électrons et aux rayons X, les réactifs colorés, les enzymes et les substances détectables par RMN, et (c) la lecture du résultat. 9 ) Procédé de préparation de lla-foeto- protéine apte à être utilisée dans le conjugué protéique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (1) prélèvement d'un échantillon biologique contenant de lla-foetoprotéine (sang du cordon de foetus humain ou cellules cancéreuses en culture (hépatomes, tératocarcinome)), (2) séparation de lla-foetoprotéine dudit échantillon, (3) première purification de lla-foetoprotéine par au moins une chromatographie convenable, suivie d'une électrophorèse, (4) séparation du produit obtenu en (3), (5) immunisation pendant une période courte, de l'ordre d'une semaine, de mammifères appropriés avec le produit obtenu en (4), (6) production d'hybridomes produisant des anticorps anti-a-foetoprotéine de faible affinité, par fusion des cellules ganglionnaires desdits mammifères avec des cellules de myélome, (7) purification des anticorps monoclonaux obtenus, (8) immobilisation desdits anticorps sur une colonne d'affinité, et (9) deuxième purification de 1'a-foetoprotéine par passage du produit obtenu en (3) sur ladite colonne d'immunoaffinité, pour ltobtention de quantités substantielles d'a-foetoprotéine avec une grande pureté.