FR 2699184 A1 19940617 FR 9215429 A 19921216 NOUVEAUX DÉRIVÉS DE COLLAGÈNE, LEUR PROCÉDÉ D'OBTENTION ET LEUR APPLICATION A LA PRÉPARATION DE BIOMATÉRIAUX La présente invention est relative à de nouveaux dérivés de collagène, en particulier réticulables et susceptibles d'être utilisés, notamment, dans la préparation de biomatériaux, à partir desquels des produits, applicables notamment en médecine et plus particulièrement en chirurgie ou en cosmétique, peuvent être obtenus. Parmi ces produits, on peut citer les tissus ou les organes artificiels, tels que la peau artificielle, les prothèses ou implants osseux, ligamentaires, cardiovasculaires, intra-oculaires, etc, ou bien encore, les sytèmes de bioencapsulation (implants, microsphères, microcapsules) permettant la libération contrôlée de principes actifs in vivo. A titre d'exemple, on peut également évoquer les accessoires médicaux, tels que les fils de sutures ou les revêtements de biocompatibilisation d'articles médicaux implantables. L'invention concerne, également, un procédé d'obtention de ces nouveaux dérivés de collagène, ainsi que de nouveaux produits intermédiaires intervenant dans le susdit procédé et, enfin, le collagène réticulé issu du collagène réticulable figurant parmi les nouveaux dérivés de collagène conformes à l'invention. Le domaine de l'invention est celui des matériaux biocompatibles à base de collagène, utiles comme matière première pour la réalisation d'articles destinés à être mis en contact avec ou implantés dans le corps humain ou animal et capables de s'assimiler au mieux aux matériaux biologiques, notamment sur le plan mécanique, de manière à pouvoir les remplacer. Le collagène est une protéine connue, présente à tous les niveaux de l'organisation des tissus conjonctifs : il s'agit de la principale protéine de la peau et du tissu conjonctif. Par nature, il possède des caractéristiques biochimiques et physico-chimiques relativement bien adaptées pour des utilisations en tant que biomatériaux. Au sens de la présente invention, le terme collagène désigne tout peptide de nature collagénique, tel que le collagène, le collagène dénaturé et la gélatine. Différentes qualités de collagène d'origine animale ou humaine sont actuellement commercialisées dans le monde, essentiellement pour l'élaboration de biomatériaux ou de produits cosmétiques. Dans les applications répandues à l'heure actuelle, on se satisfait des propriétés des différentes qualités disponibles. Ainsi, parmi ces collagènes on trouve d'excellents supports d'adhésion, de multiplication et de croissance cellulaire, appréciés pour la réalisation de milieux de culture cellulaire. On tire également profit de leur hydrophilie, de leur faible immunogénicité, de leur bonne résistance à la protéolyse et de leur caractère hémostatique. Les propriétés mécaniques des collagènes natifs sont acceptables pour un certain nombre d'utilisations. Cependant, force est de reconnaître que, dans le domaine des articles médicaux implantables, tels que les implants et les prothèses, les collagènes natifs du marché souffrent d'importantes lacunes quant à leur résistance mécanique et à leur résistance à la protéolyse. En effet, l'introduction de ces corps étrangers, que constituent les implants et les prothèses, dans un organisme vivant induit des phénomènes de rejet qui se traduisent, notamment, par des réactions inflammatoires provoquant, entre autre, la production de collagénase, qui hydrolyse le collagène. Il en résulte, pour le moins, une altération du comportement mécanique du greffon à base de collagène. On sait que la réticulation permet d'améliorer les propriétés mécaniques du collagène. Elle confère aux fibres de collagène une très grande résistance à la traction, à la déchirure et à la dégradation enzymatique, grâce aux nombreuses liaisons covalentes qu'elle crée entre les chaînes de collagène. Sur la base de cette connaissance scientifique, de nombreuses études ont été entreprises pour développer les possibilités de réticulation artificielle du collagène. li est ainsi apparu trois grands types de techniques de réticulation de cette protéine. Le premier type de technique est la réticulation à l'aide d'agent pontant dans laquelle des molécules exogènes, le plus souvent bifonctionnelles, réagissent pour permettre l'établissement des liaisons. Les réactifs les plus fréquemment employés sont: - Les mono- et di-aldéhydes, tels que le formaldéhyde (engendrant des ponts méthylènes), le malonaldéhyde et, surtout, le glutaraldéhyde (réticulant par liaisons imines et aldols). Les principaux problèmes sont dus à leurs extrémités - CllO qui sont irritantes et à l'autopolymérisation des di-aldéhydes qui produit des polymères cytotoxiques. - Les composés dicarboxyliques. Ils sont, à ce jour, essentiellement employés, soit pour modifier le collagène, soit pour le tannage des peaux. lls réagissent par formation de liaisons amides, voire esters. - Les diamines, telles que l'hexaméthylène diamine, qui agissent uniquement par liaisons amides. - Les diisocyanates, dont l'hexaméthylène diisocyanate qui est utilisé pour la réticulation par liaisons amides. - Les disulfonyl-chlorures qui établissent des liaisons intra et inter-caténaires. Suivant un second type de technique, on procède à la création d'un réseau par liaison covalente entre les molécules de collagène, et ce sans greffage de composés exogènes. Les principales méthodes employées sont: - L'irradiation (rayonnement ultra-violet ou gamma) qui produit, à la fois, un certain nombre de désaminations oxydatives permettant des réticulations par liaisons imines et aldols, ainsi que des radicaux libres très réactifs pouvant créer des pontages covalents. Une telle méthode présente l'inconvénient de provoquer la réticulation du collagène uniquement dans une gamme étroite de basses énergies. Pour des énergies supérieures, elle entraîne des hydrolyses ou des dénaturations très préjudiciables au produit. - La déshydratation poussée (plus de 100" C sous vide) qui conduit à la formation de liaisons amides et esters, ainsi que de lysino-alanines intra et intermoléculaires. Parmi les réactifs employés, on peut citer les carbodiimides, tels que le cyanamide ou le dicyclohexylcarbodiimide. Ce mode de réticulation en est encore au stade expérimental. - La réticulation enzymatique par des protéines mimant l'effet de lysyloxydase (enzyme responsable de la réticulation naturelle). Cela reste, pour le moment, à l'étude. - L'oxydo-réduction qui induit une désamination oxydative des extrémités aminées qui deviennent aldéhydiques. On utilise, essentiellement, des cations métalliques (Cu2+, Fe2+, Ar+) associés à des cofacteurs (Ascorbate, Pyridoxal - 5P), ainsi que des sulfites ou des nitrites. Cette méthode est très utilisée pour le tannage du cuir. - L'activation fonctionnelle, en particulier des carboxyles qui peuvent fournir des azides d'acides ayant une réactivité très sélective vis-à-vis des extrémités - NlI2 et conduisant à la formation d'une liaison amide. Divers biomatériaux peuvent ainsi être réalisés. Le troisième type de technique est la réticulation par copolymérisation. Elle consiste à réunir, par des liaisons covalentes, le collagène à un autre polymère pour donner des conformations plus ou moins enchevêtrées. Les polymères le plus souvent associés au collagène sont: - Les dérivés d'acrylique, dont la toxicité est souvent rédhibitoire pour les applications en médecine humaine, du type implant. - Les mélanges acrylonitrile-styrène avec lesquels il n'a jusqu'alors pas été possible de dépasser le stade du laboratoire. - Les polyuréthannes surtout utilisés dans le renforcement des cuirs tannés. - Les polyalcools. - Les silicones. Les liaisons impliquées dans la copolymérisation sont très diverses et dépendent des groupements mis en jeu par chaque polymère. Toutes ces techniques, qu'elles soient de nature physique ou chimique, possèdent de nombreux inconvénients. Tout d'abord, concernant les réticulations chimiques, elles donnent lieu à des résidus toxiques dans le collagène réticulé. Les résidus peuvent être sous forme de réactifs non consommés ou de fonctions réactives libres, issues de réactifs bifonctionnels qui n'ont réagi que par une seule extrémité. De manière générale, ces deux types de réticulation entraînent une perte partielle ou totale de l'affinité des cellules tissulaires pour le collagène modifié. En outre, elles ne peuvent pas être mises en oeuvre pour l'obtention d'articles moulés, à partir de solutions de collagène. En effet, aucune d'elles ne permet de maîtriser la cinétique de réticulation, pas plus que le taux de réticulation. Dans de telles conditions aléatoires, il n'est pas possible d'envisager des fabrications industrielles simples, économiques et conduisant à des produits de qualité mécanique adaptée aux applications visées. C'est la raison pour laquelle, dans la grande majorité des cas, les techniques de réticulation ont été utilisées limitativement sur des pièces anatomiques ou des tissus contenant du collagène. De façon plus exceptionnelle, elles ont été mises en oeuvre pour la réticulation d'articles préformés en collagène, essentiellement des films ou des feutres. En tout état de cause, elles demeurent inopérantes dans le large domaine restant des applications à titre de biomatériaux. il a été proposé, par ailleurs, d'exploiter le pontage le plus couramment rencontré sur le plan biologique, la liaison disulfure - S - S -. L'article intitulé "Einbau von cystin-brücken in kollagen", F. SCHADE & H. ZAHN, Angew, Chem 74, 904 (1962), décrit ainsi la fixation directe d'un dérivé de la cystine sur du collagène, pour tenter d'effectuer une réticulation par pontage S - S -. Dans ce résumé succinct de leurs travaux, les auteurs prétendent avoir obtenu du collagène réticulé par des ponts disulfures. L'agent réticulant mis en oeuvre est un dérivé de la cystine, dans lequel les deux fonctions amines de la cystine ont été bloquées par un groupement protecteur, du genre benzyloxycarbonyle et dans lequel les deux fonctions acides de la cystine ont été activées par estérification à l'aide de nitrophénol. Le greffage de ce dérivé de cystine sur le collagène s'opère dans un milieu neutre à base de diméthylformamide et d'eau. Après greffage sur le collagène, les ponts du sulfure ont été réduits puis réoxydés par l'oxygène de l'air (facteur d'autoréticulation) en milieu basique. Même dans des conditions optimales théoriques, la technique de greffage direct employée ne permet d'atteindre que des taux de substitution faibles, égaux à 3 % en nombre maximum, ce qui correspond au taux de résidus lysyls dans le collagène. Dans tout le présent exposé, le taux de greffage sur le collagène est exprimé en % en nombre, ce qui correspond au nombre de greffons, e. g de motifs SH, présents dans la molécule pour 100 acides aminés du collagène de départ. Vingt ans après ce premier article, la demande de brevet EP 0 049 469 divulgue un pansement à base de collagène et de fibrinogène combinés. Dans ce document, on décrit l'introduction directe de fonctions thiols dans du collagène soluble extrait de tendons. Les fonctions thiols sont amenées par l'intermédiaire de la N-acétylhomocystéine thiolactone. De la même manière que précédemment, le greffage de cette molécule sur le collagène ne peut intervenir que sur les radicaux aminés libres, portés par les résidus lysyls, ce qui équivaut à un taux de greffage maximal de 3 % en nombre, en supposant que la réaction soit totale. Force est donc de constater que ces deux techniques antérieures mettent en oeuvre des collagènes sur lesquels sont greffés directement des résidus cystéiques et offrent ainsi, théoriquement, la possibilité de réaliser des réticulations par pontages S - S. Mais ces techniques antérieures présentent l'inconvénient majeur d'imposer une limitation rédhibitoire quant au nombre de pontages S - S envisageables. Elles n'ont donc pas débouché sur des applications biomédicales concrètes. Aussi, dans cet état de faits, la présente invention vise à proposer un collagène modifié, soluble dans l'eau et/ou dans les solvants organiques polaires aprotiques, porteur de fonctions thiols libres ou substituées appartenant à des résidus de cystéine ou de ses dérivés. Un autre but de l'invention est de proposer un collagène modifié qui soit réticulable, c'est-à-dire apte à réticuler par formation de ponts disulfures en présence d'oxydants doux, en permettant une excellente maîtrise de la cinétique et du taux de réticulation. Un autre but de l'invention est de fournir un collagène "thiolisé", réticulable en gels de densité de réticulation, donc de résistance mécanique, modulable à l'avance, de façon à être adaptable à divers types d'applications. Un autre but de l'invention est de fournir un collagène, modifié, réticulable, dont la souplesse et les performances de réticulation le consacrent comme une matière première particulièrement appropriée pour l'élaboration, par exemple par moulage ou extrusion, d'articles médicaux solides, du type implants ou prothèses. Aussi, c'est après avoir mené de nombreux essais et études que la Demanderesse est parvenue à surmonter les obstacles auxquels s'était heurté l'art antérieur et à atteindre ces buts et d'autres en fixant directement des résidus cystéiques sur le collagène, avec de forts taux de greffage. Ainsi, la présente invention concerne un nouveau collagène modifié, soluble dans l'eau et/ou dans les solvants organiques polaires aprotiques et contenant des fonctions thiols libres ou substituées, portées par des résidus de cystéine ou de ses dérivés, lesdits résidus étant, au moins en partie, des résidus fixés directement au collagène, caractérisé en ce qu'il possède un taux de fonctions thiols supérieur à 3, de préférence à 5 pour cent acides aminés. Les résidus de cystéine ou de ses dérivés (ci-après indifféremment désignés sous le terme général : résidus "cystéiques"), sont directement liés au collagène par l'intermédiaire de leur(s) fonction(s) carboxylique(s) et répondent à la formule générale suivante: dans laquelle: - x est un nombre entier, de préférence égal à 1 ou 2, ce qui correspond, respectivement, au squelette de la cystéine et de l'homocystéine, - R1 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles ou acyloxy, - R2 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux suivants : acyloxy, aralkyle, S-alkyle, S-aryle. Conformément à une forme préférée de mise en oeuvre de l'invention, le collagène modifié est réticulable. Au sens de la présente invention, le terme "réticulable" désigne des collagènes modifiés, aptes à s'autoréticuler, spontanément ou moyennant une étape intermédiaire aisée à mettre en oeuvre, par oxydation. De façon tout à fait avantageuse, le collagène modifié réticulable suivant l'invention est aisément façonnable et manipulable industriellement. I1 permet d'obtenir des articles médicaux, du type implant, prothèse ou peau artificielle, atoxiques, non immunogènes et dont les propriétés mécaniques et biologiques sont parfaitement adaptées à l'application visée. Le taux de substitution de ce collagène modifié réticulable par des fonctions thiols libres peut varier dans une large plage de valeurs. Ceci est particulièrement intéressant au regard de l'adaptabilité, notamment sur le plan des propriétés mécaniques, du biomatériau à diverses applications finales. Ce collagène modifié peut être associé à d'autres matériaux polymères utilisables dans l'élaboration de biomatériaux. Dans cette forme préférée de mise en oeuvre, le substituant R2 de la formule générale du résidu cystéique est éliminable, de manière à régénérer un SH donnant accès à l'aptitude à la réticulation. R2 correspond, de préférence, aux substituants suivants avec R3 = Q > ou: R4 étant égal à OH, NI' - coll, O - coll. De même que précédemment, x est, de préférence, égal à 1 ou 2 (cystéine/homocystéine), et R1 peut être constitué par les radicaux donnés ci-avant. On peut citer, en particulier l'hydrogène, Dans les formules ci-dessus et dans la suite du présent exposé, on désigne le radical phényle par le symbole s et une chaîne collagénique par l'abréviation coll. Suivant une variante avantageuse de l'invention, le substituant R, est une unité polymère de formule suivante (I): dans laquelle: - n 2 2, - Rs = R, - S - ou: avec R6 = R ou l'unité polymère (I) ci-dessus définie et avec R4 = OH, NH - coll, O - coll. La présente invention comprend, également, des collagènes modifiés non réticulables. C'est, notamment, le cas lorsque, dans la formule générale des résidus cystéiques donnée ci-dessus, le radical R2 correspond à l'un des substituants suivants Le greffage direct des résidus cystéiques sur les fonctions nucléophiles (OH, NI'2) des acides aminés du collagène donne accès à des taux de substitution supérieurs à ceux obtenus jusqu'alors. I1 en découle de meilleures propriétés mécaniques pour le produit réticulé obtenu à partir du collagène modifié. Le passage de ce collagène modifié à l'état réticulé s'opère aisément, par oxydation des fonctions thiols et création de ponts disulfures dans un environnement oxydant doux. Dans des conditions physiologiques in vivo, cela peut se produire par autooxydation par l'oxygène dissous ou par oxydation enzymatique, alors que, dans des conditions non physiologiques in vitro, l'oxydation peut s'effectuer à l'aide de réactifs non toxiques, tels que le peroxyde d'hydrogène ou de l'oxygène de l'air, en milieu faiblement basique. Le polymère réticulé peut être obtenu très stable et possédant une grande résistance mécanique. L'invention concerne, également, à titre de produit nouveau, un collagène réticulé, insoluble, notamment dans l'eau et/ou dans les solvants organiques, caractérisé en ce que ses pontages intercaténaires sont essentiellement constitués par des ponts du sulfure formés par des résidus cystéiques qui sont, au moins pour partie, des résidus cystéiques greffés directement sur le collagène, suivant un taux supérieur à 3, de préférence à 5 pour cent acides aminés d'une seule chaîne collagénique. Ce collagène réticulé peut être obtenu à partir du collagène modifié, autoréticulable décrit ci-dessus. La présente invention concerne, par ailleurs, un procédé d'obtention d'un collagène modifié, soluble dans l'eau et/ou dans les solvants organiques polaires aprotiques et comprenant des fonctions thiols libres ou substituées, portées par des résidus de cystéine ou de ses dérivés, ces résidus cystéiques étant, au moins pour partie, des résidus greffés directement sur le collagène. Ce procédé consiste, essentiellement, à: - placer le collagène de départ dans un solvant, en milieu homogène ou dispersif, - protéger les fonctions thiols et amines libres du résidu cystéique mis en oeuvre, - activer la (ou les) fonction(s) acide(s) dudit résidu, caractérisé en ce que le milieu solvant ou dispersif du collagène de départ est anhydre et en ce que: - on active les résidus cystéiques protégés par formation d'anhydride, - et on fait réagir les résidus protégés et activés en anhydride avec le collagène de départ, en présence d'une base organique et en absence d'eau, de manière à obtenir le collagène modifié vise. I1 est du mérite de la Demanderesse d'avoir mis en évidence que ces caractéristiques opératoires sont essentielles pour atteindre d'importants taux de greffage de résidus cystéiques, donc de fonctions thiols, libres ou substituées, sur le collagène. En particulier, il a été découvert que la réaction du collagène avec le résidu cystéique convenablement protégé et activé, par formation d'anhydride en présence d'une base et en absence d'eau est l'un des éléments déterminants pour l'optimisation du greffage. Le matériau de départ utilisé dans ce procédé peut être du collagène animal ou humain, présentant ou non des télopeptides. Selon le mode de formation d'anhydride de la (ou des) fonction(s) acide(s) retenu, il peut être avantageux, soit de solubiliser le collagène de départ dans un solvant organique, anhydre, tel que le diméthylsulfoxyde (DMsO), le diméthylacétamide (DMAC), le N-méthylpyrrolidone (NMP), soit de le disperser dans un milieu organique anhydre, tel que le tétrahydrofurane (111F). Dans le cas où il s'agit d'une solubilisation, elle est, de préférence, effectuée à l'aide d'un auxiliaire de solubilisation qui peut être un solvant, comme par exemple le méthanol ou un acide carboxylique. La base organique est une amine tertiaire. Suivant un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le collagène modifié obtenu est un précurseur d'un collagène réticulable, essentiellement par formation de ponts disulfure à partir de fonctions SH. Dans ce mode de mise en oeuvre, l'un des moyens possibles pour protéger la fonction thiol du résidu cystéique mis en oeuvre est d'introduire cette fonction thiol dans un pont disulfure. Ainsi, on utilise, de préférence, la cystine, à titre de résidu cystéique. Suivant une variante de protection de la fonction thiol, conduisant à du collagène réticulable, on greffe sur cette fonction thiol un radical R2 hydrocarboné sélectionné, de préférence, parmi les substituants suivants Pour obtenir cette aptitude à la réticulation, il est nécessaire que R2 soit éliminable et transformable en SR, radical qui donne accès à la "réticulabilité". Concernant les fonctions Miz, elles sont protégées par greffage d'un groupement R1 choisi parmi les radicaux acyles, ou alcoxy, les radicaux suivants étant particulièrement préférés Les groupements benzyloxycarbonyles sont très largement utilisés en synthèse peptidique, en particulier pour la protection des amines (voir : "The carbobenzoxy and related groups - Chemistry of the amino acids", J. P. GREENSTEIN and M. WINITZ, 1961, 2, 887-901, édité par J. WILEY, NEW YORK). L'optimisation du greffage du résidu cystéique sur le collagène passe, également, par une activation de la (ou des) fonction(s) acide(s) de ce greffon par formation d'anhydrides. Parmi les différentes techniques utilisées en synthèse peptidique, la Demanderesse en a sélectionné trois convenant particulièrement bien pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. La première d'entre elles consiste à faire réagir chaque fonction acide du résidu cystéique, avec un réactif permettant d'obtenir un anhydride mixte ayant une grande affinité vis-à-vis des radicaux nucléophiles aminés et hydroxylés du collagène. L'agent réactif utilisé est un composé de formule: dans laquelle R7 est un radical hydrocarboné aliphatique et/ou alicyclique et/ou aromatique, le tertiobutyle étant préféré et X est un halogène, tel que le chlore. Le chlorure depivaloyle (triméthylacétyle) convient particulièrement bien à titre d'agent réactif: La deuxième voie d'activation de la ou des fonctions acides consiste à former des anhydrides carboniques mixtes à l'aide d'un composé de formule: dans laquelle R8 est un radical hydrocarboné aliphatique et/ou alicyclique et/ou aromatique, de préférence du type alkyle et, plus préférentiellement encore, éthyle et X est un halogène. A titre d'exemple, on peut citer l'éthyl chloroformate: L'anhydride formé est réactif vis-à-vis des amines et des hydroxyles du collagène. Le troisième mode d'activation est une formation de Ncarboxyanhydrides. Elle s'applique lorsque le résidu cystéique possède une (ou des) fonction(s) amine(s), protégée(s) par des radicaux N-acylalcoxylé, par exemple éthyloxy, méthyloxy ou benzyloxy. L'activation est alors réalisée par transformation du (ou des) fonction(s) acide(s) du résidu en halogénure d'acide, de préférence en chlorure d'acide, réagissant ensuite avec 1' (ou les) extrémité(s) N-acylalcoxylé(s), selon un mécanisme de cyclisation intramoléculaire, conduisant à des anhydrides de LEUCH. Dans le cas où le résidu cystéique est la cystine, l'anhydride de IEUCH formé a la formule suivante: Conformément au procédé suivant l'invention, l'étape, qui suit la protection des fonctions thiol et amine et l'activation des fonctions acides du résidu cystéique, est celle où l'on fait réagir ce dernier avec le collagène de départ, en présence d'une base organique et en absence d'eau, de manière à obtenir, soit le collagène modifié visé, soit un précurseur du collagène réticulable, modifié, visé. Les conditions générales de cette mise en réaction sont déduites des règles définies en synthèse peptidique et dépendent du type de protection et d'activation mis en oeuvre. Plus précisément et conformément à l'une des caractéristiques essentielles du procédé suivant l'invention, cette réaction doit s'opérer en présence d'une base aminée de type tertiaire, de préférence, la triéthylamine. Cette base augmente la nucléophilie, donc la réactivité, des amines libres des résidus lysyls du collagène. Elle doit être en quantité suffisante pour neutraliser les fonctions carboxyliques des résidus acides du collagène (acides aspartique et glutamique représentant environ 9 % en nombre des acides aminés du collagène, ainsi que les produits acides éventuellement formés lors du greffage. Lorsque les résidus cystéiques ont subi une activation de leurs fonctions acides selon le premier ou le deuxième mode d'activation décrit ci-dessus, on les fait réagir avec du collagène solubilisé dans un milieu solvant homogène organique et anhydre. A l'inverse, dès lors qu'ils sont activés suivant le troisième mode d'activation, le collagène mis en oeuvre est en suspension dans un milieu anhydre dispersif et hétérogène, du type solvant organique aprotique. La température et la durée de réaction sont fonction du type d'activation mis en oeuvre sur les résidus cystéiques. L'ajustement de ces paramètres est une opération parfaitement à la portée de l'homme du métier du domaine considéré. Après réaction, les produits sont précipités, soit à l'aide d'un solvant organique, tel que l'éther, lorsque l'on a à faire à une solution, soit filtrés, lorsque le milieu réactionnel est dispersif et hétérogène. On obtient ainsi, finalement, soit un collagène modifié, soit un précurseur de collagène SH, ce précurseur pouvant être du collagène lié à une cystine lorsque celle-ci est choisie comme résidu cystéique ou du collagène lié à un résidu cystéique dont l'extrémité soufrée est liée à un radical protecteur, par exemple du type: Dans le cadre du troisième mode d'activation, le résidu cystéique, comprenant des N-carboxyanhydrides peut donner lieu à la formation d'un collagène modifié, sur lequel sont greffés des restes polycystéiques de formule: Un tel collagène modifié peut lui aussi être un précurseur de collagène SH. La transformation du précurseur de collagène réticulable est obtenue par réduction à l'aide d'agents réducteurs spécifiques ou par hydrogénation catalytique, en fonction du groupement protecteur utilisé: les groupements protecteurs liés par un pont disulfure sont éliminés par réduction, les autres par hydrogénation catalytique. Les agents réducteurs spécifiques sont, e. g. le ss-mercaptoéthanol, l'acide mercaptoacétique, le mercaptoéthylamine, le benzylmercaptan, le thiocrésol ou bien encore le dithiothréitol. Ils peuvent être, également, formés par un sel comme, par exemple, le borohydrure de sodium ou l'hydrogénosulfite de sodium. Les phosphines, telles que la tributylphosphine conviennent bien également à titre d'agent réducteur. En pratique, on utilise, de préférence, le ss-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol. Cette étape de transformation permet de resolubiliser les collagènes qui sont ensuite dialysés contre de l'eau distillée, puis lyophilisés. Le produit final obtenu est un collagène modifié contenant plus de 3 fonctions thiols portées par les résidus cystéiques, pour cent acides aminés. Ce collagène modifié peut être soumis à une oxydation qui conduit à la formation de ponts disulfures entre les chaînes collagéniques. On obtient ainsi un réseau tridimensionnel, insoluble dans les milieux physiologiques et soluble dans des milieux réducteurs capables de réduire les ponts di sulfures. Le taux de réticulation est déterminant au regard de la résistance mécanique et de la biodégradabilité des réticulats obtenus. Les réactifs utilisés lors des modifications chimiques sont, soit transformables en produits non toxiques, soit facilement éliminables par des procédés non dégradants, comme la dialyse par exemple. Le collagène modifié sous forme réduite ne contient pas de fonctions activées résiduelles et le collagène réticulé oxydé ne peut contenir que des fonctions thiols n'ayant pas réagi. Ces fonctions ne sont pas toxiques, puisque naturellement présentes dans un grand nombre de protéines animales. Les procédés d'oxydation ne font pas appel à des substances toxiques, ni à des conditions agressives pour les tissus vivants. L'invention offre la possibilité très appréciable de pouvoir contrôler la cinétique et le taux de réticulation du collagène. Un autre avantage non négligeable de l'invention est qu'elle permet de moduler les propriétés mécaniques en contrôlant le nombre de résidus cystéiques introduits par unité de masse du collagène. il faut souligner que les produits selon l'invention sont stérilisables par les méthodes classiques de stérilisation de polymères biologiques. n s'ensuit que les produits réticulables selon l'invention trouvent des applications immédiates, d'une part, en médecine humaine et, d'autre part, dans le domaine de la biologie. En médecine humaine, il peut s'agir d'implants, par exemple ophtalmologiques, de prothèses, par exemple osseuses, de pansements sous forme de films ou de feutres, de tissus artificiels (épiderme, vaisseaux, ligaments, os), de systèmes de bioencapsulation (microsphères, microcapsules) permettant la libération contrôlée de principes actifs in vivo, de revêtements de biocompatibilisation d'articles médicaux implantables ou bien, encore, de fils de suture. En biologie, les matériaux suivant l'invention constituent d'excellents supports pour cultures cellulaires bidimensionnelles (films) et tridimensionnelles (feutres). Le collagène réticulé selon l'invention peut être utilisé seul ou en mélange avec des polymères biologiques modifiés ou non ou des polymères synthétiques. Pour chacune des applications biomédicales précitées, il est indispensable de disposer d'un collagène, réticulé, possédant des propriétés physicochimiques, mécaniques ou biologiques déterminées et spécifiques. Par conséquent, il est nécessaire de maîtriser parfaitement les modifications chimiques du collagène, de manière à pouvoir produire une large gamme de collagènes réticulables et répondre ainsi, de façon satisfaisante, à la plupart des contraintes apparaissant lors de l'élaboration du cahier des charges d'une application donnée. Comme cela ressort de la description ci-dessus, l'invention répond parfaitement à cette nécessité. D'autres avantages et variantes de la présente invention ressortent bien de l'exemple de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention donné ci-après. EXEMPLE A- THODOLOGE. 1 - PRÉPARATION DU COLLAGÈNE: Le collagène utilisé dans cet exemple est de l'atélocollagène commercialisé par la Société SADUC et constitué par un mélange d'atélocollagène de type I et ffi extrait de peau de veau. Dans le cas où l'activation des fonctions acides est obtenue par formation d'anhydrides mixtes ou d'anhydrides carboniques mixtes, le collagène est dissous dans un milieu organique polaire, aprotique et anhydre. Cela consiste, tout d'abord, à le faire gonfler dans un auxiliaire de solubilisation constitué par du méthanol. On ajoute, ensuite, un solvant organique, à savoir le DMAC, qui permet de solubiliser le collagène, qui reste dans cet état après évaporation du méthanol sous pression réduite. Une solution concentrée, contenant jusqu'à 8 % de collagène peut ainsi être préparée. Lorsque l'activation des fonctions carboxyles est réalisée par formation d'un anhydride de IEUCH, le collagène est mis en suspension dans du tétrahydrofurane. 2 - TRAITEMENT PRÉALABLE DU RÉSIDU CYSTÉXQUE: Le résidu cystéique ici mis en oeuvre est la cystine. On dispose ainsi d'une protection idéale de la fonction thiol. Il reste à procéder au masquage des fonctions amines de cette cystine. Pour cela, on ajoute 15,3 g de benzylchloroformate en suspension dans 120 ml de soude-l-N, à 7,2 g de L-cystine dissous dans 60 ml de soude-l N. Après trois heures sous agitation, le milieu est acidifé à pR2 à l'aide d'ECl 6N. Le précipité obtenu est extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique, séchée sur sulfate de sodium anhydre, est évaporée et le résidu huileux obtenu est repris dans 400 ml de chloroforme: la N-N'-di-benzyloxycarbonyl-cystine cristallise alors progressivement sous forme de longues aiguilles. Les fonctions acides du dérivé de cystine sont ensuite activées par mise en oeuvre de l'une des trois techniques suivantes : a, b, c. a) Activation par formation d'anhydrides mixtes: - Utilisation du chlorure de pivaloyle (triméthylacétyle) L'action du chlorure de pivaloyle sur un acide carboxylique conduit à la formation d'un anhydride mixte, très réactif vis-à-vis des amines et des alcools et doivent être protégés contre l'humidité. La réaction d'activation de la cystine protégée par le chlorure de pivaloyle est réalisée suivant un protocole identique à celui utilisé avec l'éthylchloroformate, à la différence que la réaction est poursuivie pendant 3 heures. b) Activation par formation d'anhydrides carboniques mixtes: - Utilisation de l'éthylchloroformate: L'action de l'éthylchloroformate sur un acide carboxylique conduit à la formation d'un anhydride carbonique mixte très réactif vis-à-vis des amines et des alcools. Ce type de composé est très instable. I1 est, en particulier, inactivé par l'eau et doit donc être protégé contre l'humidité. La réaction d'activation de la N,N'-di-benzyloxycarbonyl-cystine par l'éthylchloroformate est réalisée dans les conditions suivantes. A la cystine protégée, en solution à 10 % dans le dioxanne, sont ajoutés deux équivalents de triéthylamine puis deux équivalents d'éthylchloroformate : un précipité de chlorhydrate de triéthylammonium se forme immédiatement. La réaction est poursuivie pendant 30 minutes. Le précipité formé est filtré, puis le dioxanne évaporé. L'huile résiduelle obtenue est utilisée extemporanément telle quelle. c) Activation par formation d'anhydride de LEUCH : Le chauffage d'un acide aminé N-acylalkoxylé (éthoxylé, méthoxylé, benzométhoxylé, ...), dont la fonction acide est activée sous forme d'halogénure d'acide, conduit à une cyclisation intramoléculaire, avec formation d'un N carboxyanhydride, encore appelé anhydride de LEUCH. Ce type de composé est réactif vis-à-vis des amines et des alcools et doit être protégé contre l'humidité. La formation de l'anhydride de Izucil de la cystine se déroule en deux étapes, comme indiqué ci-après. A la cystine protégée, en solution à 10 % dans le dioxanne, sont ajoutés cinq équivalents de PCl5. Après 15 minutes sous agitation, l'excès de Puis est filtré et le milieu réactionnel placé à 40 C. En quelques minutes, l'anhydride de LhuCEI de la cystine cristallise. La réaction est poursuivie 1 heure, puis les cristaux sont filtrés, rincés à l'éther, puis séchés sous vide. 3 - MISE EN RÉACTION DU RÉSIDU CYSTÉIQUE PROTÉGÉ ET ACTIVÉ AVEC LE COLLAGÈNE: Le protocole est identique pour tous les résidus activés selon les techniques a, b, c énoncées ci-dessus. Au collagène en solution dans du DMAc (techniques a), b)) ou en suspension dans du ffiF (technique c)), on ajoute la triéthylamine en quantité adéquate. Après 15 minutes sous agitation, les milieux sont amenés à la température de réaction et les dérivés activés de la cystine sont ajoutés. Pour chaque résidu cystine activé, les conditions exactes de mise en réaction sont indiquées dans le tableau I ci-après. TABLEAU I: CONDITIONS DE MISE EN RÉACTION DES DÉRIVÉS ACTIvÉS DE LA CYSTINE AVEC LE COLLAGENE -I- -11 Echantillons Chlorure de Ethyl Anhydride de i > ivaîoyle chloroformate LEUCH Collagène 1 g 1 g 1 g Solvant DMAc DMAc îIiF Milieu homogène homogène hétérogène Concentration en 5 % (p/v) 5 % (p/v) 5 % (p/v) collagène Quantité de 3 eq*/fonction 3 eq*/fonction 3 eq/fonction fonctions acides substituable substituable substituable activées Et3N 190 y1 1,12 rnl 1,12 ml Température - 5 C puis retour - 10 C puis retour Refroidissement à progressif à Ta progressif à Ta - 75 C avant ajout de l'anhydride, puis -35 C Temps de réaction 20 heures 20 heures 20 heures eq: équivalent. *: basé sur un rendement d'activation du résidu cystéique de 100 % Ta: température ambiante. B- RSSULTATS. Les échantillons I, II, ffi de collagène modifié sont soumis à une analyse de leur teneur en cystéine selon la technique de dosage par l'acide dithionitrobenzoïque (DTNB) décrite dans G. L. ELMANN, Arch, Biochem, Biophys, 1959, 82-70. L'ajout de DTNB à une solution contenant des SE libres conduit à l'apparition d'une coloration jaune proportionnelle à la quantité de thiols présents (33). Une étape d'hydrolyse en milieu réducteur est effectuée au préalable. Elle permet la coupure des ponts disulfures en SH, qui seuls sont dosés. A 20 mg de collagène (natif ou modifié), on ajoute 1 ml de NaOH-4N-, contenant 1 % de NaBH4. Après deux heures d'hydrolyse à 70 C, les milieux sont acidifiés par HCl-6N- jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de dégagement gazeux. Les témoins sont alors dilués au 1/500 et les échantillons au 1/200 par du tampon acétate 0,1 M, pH = 5. A 2 ml de ces solutions, on ajoute 100 ,ul d'une solution de DTNB 10 mM préparée dans du tampon phosphate 0,1 M pH = 7,2. L'absorption des échantillons à 410 nm est mesurée après 10 minutes d'incubation à l'obscurité. Les quantités de cystéine dans les échantillons sont calculées à partir d'une gamme étalon de cystéine (020 Clg/ml). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. TABLEAU 2: Echantilions %* moyen Collagène natif 0 I 6,4 " 0,5 ll 4,1 + 0,2 m 15,9 4,6 * = nombre de résidus cystéiques fixés pour 100 acides aminés du collagène. Ce tableau montre que le procédé suivant l'invention permet d'obtenir des collagènes modifiés, réticulables et contenant au moins trois résidus cystéiques pour 100 acides aminés du collagène. REVENDICATIONS: 1 - Collagène modifié, soluble dans l'eau et/ou dans les solvants organiques polaires aprotiques et comprenant des fonctions thiols libres ou substituées, portées par des résidus de cystéine ou de ses dérivés, lesdits résidus étant, au moins pour partie, des résidus greffés directement sur la chaîne collagénique, caractérisé en ce qu'il possède un taux de fonctions thiols, libres ou substituées, supérieur à 3, de préférence à 5 pour cent acides aminés. 2 - Collagène selon la revendication 1, caractérisé en ce que les résidus cystéiques répondent à la formule générale suivante: dans laquelle: - x est un nombre entier, de préférence égal à 1 ou 2, - R1 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles ou acyloxy, - R2 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux suivants : acyloxy, araikyle, S-alkyle, S-aryle. 3 - Collagène selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est réticulable et en ce que R2 est, de préférence, choisi parmi les substituants suivants avec R3 = s ou: R4 étant égal à OH, NH - coll, O - coll. 4 - Collagène selon la revendication 2, caractérisé en ce que R2 est choisi parmi les substituants suivants 5 - Collagène selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que: 6 - Collagène selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que Rl est une unité polymère de formule suivante (I) dans laquelle: - n # 2, - R5 = H, - S - # ou : avec R6 = H ou l'unité polymère (I) ci-dessus définie et avec R4 = OH, NH - coil, O - coll. 7 - Collagène réticulé, insoluble, caractérisé en ce que ses pontages intercaténaires sont essentiellement constitués par des ponts disulfure formés par des résidus cystéiques qui sont, au moins pour partie, des résidus cystéiques greffés directement sur le collagène et présents à un taux supérieur à 3, de préférence à 5 pour cent acides aminés d'une seule chaîne collagénique. 8 - Collagène selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du collagène selon la revendication 3 et, éventuellement, l'une au moins des revendications 1, 2, 5 et 6. 9 - Procédé d'obtention d'un collagène modifié, soluble dans l'eau et/ou dans les solvants organiques polaires aprotiques et comprenant des fonctions thiols libres ou substituées, portées par des résidus de cystéine ou de ses dérivés, ces résidus cystéiques étant, au moins pour partie, des résidus greffés directement sur le collagène, consistant à: - placer le collagène de départ dans un milieu solvant ou dispersif, - protéger les fonctions thiols et amines libres du résidu cystéique mis en oeuvre, - activer la (ou les) fonction(s) acide(s) dudit résidu, caractérisé en ce que le milieu solvant ou dispersif de collagène de départ est anhydre et en ce que:: - on active les résidus cystéiques protégés par formation d'anhydride, - et on fait réagir les résidus protégés et activés en anhydride avec le collagène de départ, en présence d'une base organique et en absence d'eau, de manière à obtenir le collagène modifié visé. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la base organique est une amine tertiaire. 11- Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le milieu polaire aprotique est à base d'un produit ou d'un mélange de produits choisis parmi la liste suivante: DiMéthylSulfOxyde (DMsO), DiMéthylAcétamide (DMAC), N MéthylPyrrolidone (NMP), TétraHydroFurane (TlIF). 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le collagène modifié obtenu est un précurseur d'un collagène réticulable essentiellement par formation de ponts disulfure à partir de fonctions SH. 13 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que la protection des fonctions thiols est obtenue par sélection de la cystine à titre de résidu cystéique et en ce que les fonctions NH2 sont protégées par greffage d'un groupement Rl choisi parmi les radicaux acyles, les radicaux suivant étant particulièrement préférés 14 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'activation de la (ou des) fonction(s) acide(s) est réalisée par formation d'un anhydride mixte d'acide, à l'aide d'un composé de formule: dans laquelle R7 est un radical hydrocarboné aliphatique et/ou alicyclique et/ou aromatique, le tertiobutyle étant préféré, et X est un halogène. 15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'activation de la (ou des) fonction(s) acide(s) est réalisée par formation d'un anhydride carbonique mixte d'acide, à l'aide d'un composé de formule: dans laquelle R8 est un radical hydrocarboné aliphatique et/ou alicyclique et/ou aromatique, de préférence du type allyle et, plus préférentiellement encore, éthyle, et X est un halogène. 16 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que le résidu cystéique est N-acylalcoxylé et en ce que l'activation de la (des) fonction(s) acide(s) est réalisée par formation d'un N-carboxyanhydride, à l'aide d'un halogénure d'acide, de préférence un chlorure, réagissant avec l'(ou les) extrémité(s) N-acylalcoxylée(s) pour former un anhydride de IEUCII par cyclisation intramoléculaire. 17 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que le précurseur est transformé en collagène S - H par réduction, à l'aide de réducteurs spécifiques, tels que le P-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol ou par hydrogénation catalytique. 18 - Application du collagène modifié, réticulable, selon la revendication 3 et éventuellement l'une au moins des revendications 1, 2, 5 et 6 ou du collagène obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17 ou du collagène réticulé selon la revendication 7 ou 8, à la préparation d'articles utilisables en médecine, du type implants, prothèses, peaux artificielles, pansements, revêtements de prothèses ou autres.