FR 2708270 A1 19950203 FR 9309292 A 19930728 La présente invention concerne des composés oligonucléotidiques comprenant une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire du pré-ARN messager codant pour une protéine virale nécessaire au développement du virus HSV de type 1 ou 2. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des oligonucléotides antes en de séquences particulières capables inhiber ltexpression des virus Herpès Simplex de types 1 et 2 (HSV-1 et HSV-2) sensibles ou résistants à d'autres agents antiviraux. La présente invention concerne donc également une composition pharmaceutique antivirale pour lutter contre les infections par le virus Herpès Simplex de type 1 ou 2. Les virus de type Herpès constituent un groupe important de virus à ADN. On y trouve de nombreux membres parmi les espèces les plus variées. Chez lthomme, les Herpès sont impliqués dans de nombreuses pathologies: ils représentent une cause fréquente d'infection virale du foetus et sont à l'origine d'une morbidité importante chez le nouveau-né, ils sont à l'origine d'infections graves du système nerveux central, et sont l'un des agents infectieux transmis le plus fréquemment par voie sexuelle. Ces virus sont donc associés à un spectre pathologique très large, allant de l'infection la plus bénigne, à des évolution mortelles, et leurs impacts sur la santé publique sont considérables. S'ajoute à ce tableau la gravité des affections herpétiques chez les individus immunodéprimés. La prévalence des infections par les virus herpès est très élevée. On estime que 80 à 90% des personnes âgées de plus de quarante ans ont été infectées au moins une fois par ces différents virus et sont immunisées contre eux. Ces virus sont fragiles, et leurs modes de propagation nécessitent le plus souvent un contact direct, salivaire, sexuel, sanguin ou autre. La transmission de la mère à l'enfant peut également se produire au cours de la grossesse, de l'accouchement ou du maternage, et représente alors un risque important. Les virus de l'Herpès Simplex font partie d'une large famille de virus à ADN bicaténaire, linéaire, contenu dans une capside entourée d'une enveloppe. Le virus pénétre dans la cellule après une fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cellulaire. La capside est dégradée au cours de la migration vers le noyau. L'ADN viral, sous forme de complexe nucléo-protéique, est transcrit dans le noyau de la cellule. La première phase de transcription correspond à la synthèse des ARN messagers précoces codant pour des protéines impliquées dans la transactivation des promoteurs viraux, et dans la réplication de 1'ADN viral. La réplication de 1'ADN sera effectuée par des enzymes d'origine virales, comportant entre autre une ADN polymérase et une thymidine kinase. Après synthèse des protéines structurales tardives, les capsides sont assemblées dans le noyau et s'envelopperont dans les membranes nucléaires comportant les glycoprotéines virales. Les mécanismes d'expression génétique des virus Herpès sont complexes et font intervenir de très nombreuses protéines régulatrices, dont les activités aboutissent à des cascades de transcription et de traduction. Après pénétration et décapsidation, les gène IE (immediate early) ou CL sont les premiers à être exprimés, de 2 à 4 heures après l'infection. On connait cinq protéines de ce type, que l'on appelle protéines ICP, pour "infected cell polypeptides": ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 et ICP47. Les gènes codant pour ces protéines sont appelés respectivement IE1, IE3, IE4, IE2 et IE5. Les protéines IE sont des régulateurs qui interviennent en particulier dans la transcription du génome viral. Par exemple, les protéines ICP0 et ICP4 sont des transactivateurs de gènes viraux. La transcription des gènes de type E (early) ou ss, dont l'expression dépend de la présence des produits des gènes CL, intervient ensuite. Les gènes ss codent pour des enzymes du métabolisme de la réplication virale, en particulier pour la ribonucléotide réductase, la thymidine kinase, et 1'ADN polymérase. L'expression des gènes du groupe ss marque le démarrage de la réplication de 1'ADN viral. Les gènes de type L (late) ou y, qui sont exprimés plus tardivement, codent pour les protéines et glycoprotéines structurales impliquées dans la formation des capsides et des enveloppes. Les virus herpès sont caractérisés par un cycle de réplication viral rapide et peuvent se développer dans de nombreux tissus, surtout d'origine ectodermique. Les virus herpès touchent la peau et les muqueuses, où ils provoquent des infections de gravités variées. Ils peuvent, plus rarement, atteindre le système nerveux central. Les cellules infectées par ces virus présentent des atteintes nucléaires caractéristiques, comportant en particulier une inclusion éosinophile et une disparition du nucléole. Les contaminations par les virus herpétiques entrainent fréquemment des infections latentes qui s'établissent après la primoinfection. C'est là une caractéristique de ces virus. Les infections latentes peuvent être réactivées ultérieurement par divers facteurs déclenchants, et induire alors le développement du cycle viral complet aboutissant à l'excrétion asymptomatique du virus, ou bien à l'apparition d'effet cytopathogènes variés. Ces réactivations sont fréquentes chez les sujets immunodéprimés, soit par des traitements immunosupressifs après des greffes d'organes, soit à la suite de maladies du système lymphocytaire. On connait également d'autres facteurs de réactivation, caractérisés comme des facteurs de stress, comportant notamment les rayons ultraviolets, les traumatismes, etc... ll existe deux sérotypes du virus herpétique, le type 1 (HSV-1) et le type 2 (HSV-2). Ces deux virus se distinguent par des réactions immunologiques spécifiques, d'importantes variations dans la séquence de leurs génomes, et présentent des tropismes caratéristiques différents. Le virus HSV-1 est le plus souvent transmis au niveau de la muqueuse orale. Cette infection provoque une gingivostomatite aigüe, avec ou sans lésions particulières, et qui régresse spontanément. Le virus se propage ensuite au niveau du trijumeau et y entretien une infection latente. Le virus, peut être réactivé ultérieurement, à la suite d'un stress et il en résulte une récidive de l'affection buccale, (gingivostomatite, éruption muqueuse ulcérée, etc..), nasale ou épidermique, le plus souvent située au site même de la primo-infection. Le virus HSV-1 peut également être introduit au niveau oculaire ce qui provoque une blépharite et une conjonctivite folliculaire pouvant endomager la cornée. Si une réactivation se produit, il y a risque grave de kérato-conjonctivite pouvant aboutir, à la suite de plusieurs épisodes, à une fibrose de la cornée et à une cécité partielle ou totale. Enfin, HSV-1 est également l'agent de l'encéphalite herpétique, rare mais de pronostic grave. Le virus HSV-2 (ou herpès génital) est quant à lui l'agent de lésions vésiculo-ulcératives inflammatoires, touchant principalement les organes génitaux externes et dont les récurrences se manifestent par des atteintes touchant les muqueuses génitales. Les primo-infections par HSV-2 présentent des signes cliniques semblables à ceux marquant une infection à HSV-1, mais souvent de façon plus virulentes. I1 n'existe pas de traitement définitif à une infection par HSV. Lorsque le virus a infecté une cellule humaine in vivo, il ne peut pas être détruit. On connait en revanche des drogues pouvant inhiber la production virale et réduire l'étendue d'une infection. Les molécules antiherpétiques actuelles sont des drogues interagissant dans le processus de réplication viral. L'acyclovir, introduit en 1984, est la molécule la plus utilisée dans le traitement des infections à HSV-1 et 2. C'est un nucléoside modifié qui devient actif après phosphorylation par la thymidine kinase virale dans les cellules infectées. Le produit actif, l'acyclovir triphosphate, constitue un leurre pour l'ADN polymérase virale. L'application topique d'acyclovir permet de réduire la propagation virale et accélère la cicatrisation. L'acyclovir est également utilisé en traitement IV et par voie orale. Des souches d'HSV-1 et 2 résistantes à ces traitements apparaissent de plus en en plus fréquemment, surtout chez les immunodéprimés. Les virus résistants à l'acyclovir sont généralement mutés au niveau du gène codant pour la thymidine kinase, plus rarement au niveau de celui de 1'ADN polymérase. L'émergence de la résistance de virus Herpès à l'acyclovir, en particulier chez les patients immunodéprimés pose de graves problèmes cliniques. Les atteintes herpétiques sont, dans ces cas, généralement cutanéo-muqueuses chroniques et progressives, touchant les régions orofaciales, anogénitales, digitales et cutanées diverses. I1 apparait qu'il serait avantageux de disposer d'une molecule capable d'excercer des effets anti-viraux efficaces sur les souches sensibles et résistantes aux drogues actuellement utilisées. Les oligonucléotides antis ens, dirigés contre un ARN messager viral peuvent bloquer l'expression d'une protéine virale nécessaire au développement du virus. Les oligonucléotides antisens sont des agents pharmacologiques potentiels, puissants et hautement spécifiques, permettant d'inhiber l'expression de messagers codant pour des produits exerçant des effets pathogènes. Les oligonucléotides antes en sont de courtes molécules synthétiques d'ADN, d'ARN ou mixtes. En particulier les oligonucléotides dits "antisens" ont une séquence complémentaire à une séquence cible appartenant à un gène ou à un ARN dont on désire bloquer spécifiquement l'expression. Les oligonucléotides antes en peuvent être dirigés contre une séquence de pré-ARN ou d'ARN messager, ou bien contre une séquence d'ADN. Les oligonucléotides antisens hybrident à la séquence dont ils sont complémentaires et peuvent ainsi bloquer l'expression de l'ARN messager portant cette séquence. Le terme "oligonucléotide" est ici utilisé de façon générale pour désigner un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de S à 50, nucléotides en série ribo-, désoxyribo- ou mixte. Les oligonucléotides antes en sont synthétisés par voie chimique et comportent fréquemment des modifications altérant le squelette même de la molécule ou portent des groupement réactifs additionnels, localisés à leurs extrémités. Ces modifications introduites dans les oligonucléotides antes en ont pour buts soit d'augmenter la résistance de ces molécules à la dégradation nucléolytique, soit de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, soit de permettre des réactions de dégradation/modification spécifiques des cibles, ARN ou ADN, soit d'accroître leur pénétration intracellulaire. Les oligonucléotides antes en sont sensibles aux dégradations nucléasiques, et principalement à l'action des exonucléases. De nombreuses modifications chimiques permettent aux oligonucléotides antisens de devenir résistants aux nucléases. Certaines modifications affectent directement la structure ou la nature de la liaison ph osphodiester ( méthylphosphonates, phosphorothioates, oligonucléotides alpha, phosphoramidates, pour citer quelques exemples), d'autres consistent en l'addition de groupements de blocage aux extrémités 3' et 5' des molécules (Perbost et al., 1989; Bertrand et al., 1989; Bazile et al., 1989; Andrus et al., 1989; Cazenave et al., 1989; Zon, 1988; Maher and Dolnick, 1988; Gagnor et al., 1987; Markus-Sekura, 1987). L'hybridation entre un oligonucléotide antes en et un pré-ARN ou ARN messager cible peut en bloquer l'expression de plusieurs manières, soit de façon stérique, soit de façon pseudo-catalytique (Gagnor et al., 1989; Jessus et al., 1988; Markus-Sekura, 1987): - l'interaction entre le pré-ARN ou ARN messager et un oligonucléotide antisens complémentaire peut créer une barrière physique interdisant la fixation et/ou la progression de protéines ou de complexes protéiques nécessaire à l'épissage, à la maturation, à la traduction, à la stabilisation ou au transport de l'ARN messager. Ce blocage physique aboutira finalement à une inhibition de l'expression de l'ARN messager ciblé. - l'hybridation entre un pré-ARN ou ARN messager et un oligodésoxyribonucléotide antes en va créer un substrat pour la RNase H, enzyme présent dans toutes les cellules eucaryotes. La RNase H est un enzyme qui dégrade spécifiquement l'ARN lorsqu'il est hybridé à de l'ADN. L'hybridation d'un oligonucléotide antisens ADN à un ARN cible aboutira donc à la coupure de cet ARN cible à l'emplacement de cette hybridation, et donc à son inactivation définitive. - Par ailleurs, comme indiqué plus haut, les oligonucléotides antisens peuvent comporter des groupement réactifs capables de produire directement des dommages irréversibles dans la molécule d'ARN cible. Les oligonucléotides antes en permettent de bloquer spécifiquement l'expression d'ARN messagers cellulaires, par exemple de messagers de type oncogénique, (Tortora et al., 1990; Chang et al., 1989; Anfossi et al., 1989; Zheng et al., 1989; Shuttleworth et al., 1988; Cope and Wille, 1989; Cazenave et al., 1989) et de nombreux différents types d'ARN messager viraux, provenant de virus aussi variés que le VSV (Degols et al., 1989; Leonetti et al., 1989), le SV40 (Westermann, et al., 1989), les virus influenza (Kabanov et al., 1990; Zerial et al., 1987), le virus de l'encéphalomyocardite (Sankar et al., 1989), l'adénovirus (Miroshnichenko et al., 1989), le HSV (Gao et al., 1988) et le HIV (Matsukura et al., 1989; Stevenson et al., 1989; Matsukura et al., 1988; Goodchild et al., 1988). A ce jour, aucun oligonucléotide antisens phosphodiester efficace contre les virus HSV-1 et HSV-2 n'a été décrit. Le but de la présente invention est de fournir des oligonucléotides spécifiques capables d'inhiber l'expression des virus HSV-1 et HSV-2. Pour ce faire, la présente invention a pour objet des composés oligonucléotidiques comprenant une séquence d'ADN ou d'ARN d'au moins 14 nucléotides complémentaire d'une séquence correspondant à la jonction d'épissage intron-exon du pré-ARN messagers (pré-ARNm ) IE4 ou IE5 du virus Herpès Simplex de type 1 ou 2, qui, dans le cas de HSV-1, codent pour les protéines ICP22 ou ICP47 respectivement. On entend ici par "jonction d'épissage intron-exon du pré-ARN messagers (pré-ARNm ) IE4 ou IE5" une séquence des pré-ARNm IE4 ou IE5 comprenant le site accepteur d'épissage de ces pré-ARNm. Plus précisément, selon la présente invention, la dite séquence d'ADN ou d'ARN du composé oligonucléotidique est donc complémentaire d'une séquence commune des pré-ARN messagers IE4 et IE5 du virus HSV de type 1 ou 2 comprenant le site accepteur d'épissage. Dans un mode de réalisation, la dite séquence d'ADN ou d'ARN est complémentaire d'une séquence commune des pré-ARN messagers IE4 et lES du virus HSV de type 1 ou 2 centrée sur le site accepteur d'épissage. De préférence, la séquence oligonucléotidique du composé selon l'invention comporte 14 à 50, de préférence 14 à 28, nucléotides. Lorsque le composé selon l'invention est dirigé contre le virus HSV1, il comporte de façon avantageuse la séquence 14mère: GXXCCXCCXGCGGG avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire d'une séquence de jonction d'épissage des pré-ARNm IE4 et IE5 du virus HSV-1 centrée sur le site accepteur d'épissage. Plus, particulièrement, il peut comporter la séquence 16-mère: CGXXCCXCCXGCGGGGA ou de préférence la séquence 18-mère: ACGXXCCXCCXGCGGGAA avec X= T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Ces séquences sont également complémentaires d'une séquence de jonction d'épissage des pré-ARNm 1E4 et IE5 du virus HSV-1 centrée sur le site accepteur d'épissage. Les composés préférés comportent la séquence 18-mère ci-dessus. Lorsque le composé selon l'invention est dirigé contre le virus HSV-2, il comporte de façon avantageuse la séquence mère GCCCGGCCXGCGAG avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire d'une séquence de jonction d'épissage des pré-ARNm IE4 et IE5 du virus HSV-2 centrée sur le site accepteur d'épissage. Plus particulièrement, il comporte la séquence 16-mère: CGCCCGGCCXGCGAGA ou de préférence la séquence 18-mère: GCGCCCGGCCXGCGAGAA avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Ces séquences sont également complémentaires d'une séquence de jonction d'épissage des pré-ARNm IE4 et IE5 du virus HSV-2 centrée sur le site accepteur d'épissage. Les composés préférés comportent la séquence 18-mère ci-dessus. Les composés cités ci-dessus dirigés contre HSV-1 ou HSV-2 peuvent être encadrés en 3' et/ou 5' de 1 à 10 nucléotides supplémentaires. Dans une application antes en de préférence la séquence oligonucléotidique est une séquence d'ADN car les duplexes ADN/ARN sont substrats de la RNase H. De même, on préfère selon l'invention quand les séquences oligonucléotidiques sont de type naturel à lien internucléotidique de type phosphodiester car elles présentent la toxicité la plus réduite. Les composés selon l'invention peuvent être associés à tout composé favorisant leur application et/ou leur pénétration cellulaire. Différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation d'oligonucléotides. Les oligonucléotides faisant l'objet de la présente invention sont composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant notamment de l'adenine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), de la thymine (T) et de l'uracile (U), reliées entre elles par des liaisons internucléotidiques, notamment naturelles c 'est-à-dire phosphodiesters. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter des nucléotides rares (Inosine, I, ou rI par exemple) ou des nucléotides modifiés, soit en série désoxyribo- soit en série ribo-. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide, ou, dans une autre application, des liens intra-moléculaires au sein même de l'oligonucléotide. Ainsi, les oligonucléotides selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide Dans un cas particulièrement intéressant des groupements réactifs greffés sur certains des nucléotides de l'oligonucléotide pourront induire la formation d'un pontage intramoléculaire au sein même de la molécule. L'oligonucléotide pourra comporter des liaisons internes produites par des agents réactifs appartenant ou n'appartenant pas à la structure de la molécule elle-même. Font également partie de l'invention des oligonucléotides dits chimèriques, constitués par l'assemblage covalent de fragments nucléotidiques et non-nucléotidiques. En particulier, ils peuvent comporter en 3' et/ou en 5' une partie non-nucléotidique pouvant être un ou des groupement(s) lipophile(s), ou tout autre structure moléculaire favorisant la pénétration, le ciblage ou l'adressage cellulaire ou intra-cellulaire, ou stabilisant la structure de ces oligonucléotides. Font également partie de l'invention des oligonucléotides antisens couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intracellulaire en stabilisant la structure oligonucléotidique, et en particulier des groupements lipophiles, des polypeptides ou des protéines. Les oligonucléotides suivant l'invention peuvent par conséquent être obtenus par les méthodes conventionnelles de synthèse des oligonucléotides naturels, par voie chimique, biologique, ou par des approches faisant appel à des combinaisons des techniques de la chimie de synthèse et de la biologie moléculaire. Parmi les méthodes qualifiées de conventionnelles, diverses méthodes de synthèse chimique d'oligonucléotides naturels ont été développées et sont bien connu des spécialistes travaillant dans le domaine. Par exemple, une méthode consiste à utiliser un support solide dit CPG (controlled pore glass) sur lequel le premier nucléoside est fixé covalemment par un bras de couplage, par l'intermédiaire de son extrémité 3 'OH. L'extrémité 5'OH du nucléoside est protégé par un groupe di-p-méthoxytrityl acido-labile. Cette approche, utilisant la chimie des phosphites triesters, et dans laquelle des désoxynucléosides 3'phosphoramidites sont utilisés comme synthons est appelée la méthode des phosphoramidites (Caruthers, 1985). Cette approche est la plus utilisée actuellement et présente l'avantage d'être entièrement automatique. Pour citer un second exemple, une autre approche utilisée pour la synthèse d'oligonucléotides est celle de la chimie des phosphonates (Froehler et al, 1986). Cette approche commence par la condensation d'un désoxynucléoside 3'-H-phosphonate avec un deoxynucléoside couplé à un support de verre de silice. Des cycles de condensation successifs conduisent à la synthèse d'oligonucléotides H-phosphonates. Ces oligonucléotides sont oxidés en une étape pour donner les phophodiesters. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comportant à titre de principe actif au moins un composé selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable notamment appropié pour une application topique. Ces compositions sont utiles pour lutter contre les infections virales dues aux virus HSV-1 ou HSV-2. Des formulations galéniques adéquates peuvent être établies afin d'optimiser la délivrance de ces molécules à leurs cellules cibles. Ainsi, par exemple, les composés selon l'invention pourront être encapsulés dans des liposomes, des nano-particules, des particules LDL, ou dans tout autre type de micro-sphère permettant une conservation adéquate, et favorisant le ciblage. Les molécules oligonucléotidiques peuvent également être associées à des agents surfactants cationiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lumière des exemples qui vont suivre en référence aux figures 1 à 6. LEGENDE DES FIGURES La Figure 1 représente des oligonucléotides utilisés dans les tests d'inhibition de la prolifération des virus HSV-1 et HSV-2. L'oligonucléotide antisens GT-3021 est dirigé contre la jonction d'épissage des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-1. L'oligonucléotide antisens GT-3023 est dirigé contre la jonction d'epissage des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-2. Les bases soulignés indiquent les nucléotides identiques dans les séquences de HSV-1 et HSV-2. L'oligonucléotide antisens GT-3022 correspond au dodécamère centrale de la séquence de GT-3021. L'oligonucléotide contrôle GT-4002 correspond à la séquence complémentaire à GT-3021. La Figure 2 représente l'inhibition de la prolifération (CPE REDUCTION) du virus HSV-1 souche F en fonction de la concentration des oligonucléotides GT-3022 PO, GT-3021 PO ou PS, et GT-4002 PO ou PS, pour une dose virale correspondant à 30 TCID50, calculée selon le protocole décrit dans l'exemple. La Figure 3 représente l'inhibition de la prolifération (CPE REDUCTION) du virus HSV-1 souche F par 40 pM des oligonucléotides GT3022 PO, GT-3021 PO ou PS et GT-4002 PO ou PS, pour des doses virales correspondant à 30 ou 300 TCID5o, calculées selon indiqué dans le protocole décrit dans l'exemple. La figure montre aussi les résultats obtenus dans ces conditions pour 1.2 llg/ml d'acyclovir. La Figure 4 représente l'inhibition de la prolifération (CPE REDUCTION) des virus HSV-1 ou HSV-2 en fonction de la concentration des oligonucléotides GT-3021 PO (spécifique de la jonction d'épissage de HSV-1) ou GT-3023 PO (spécifique de la jonction d'épissage de HSV-2), pour une dose virale correspondant à 30 TCID5o, calculée selon le protocole décrit dans l'exemple. La Figure 5 représente un fragment de 100 nucléotides de la séquence commune des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-1 centrée sur le site accepteur d'épissage marqué par une flèche. Cette séquence est déduite des séquences des gènes lE4 et lES de HSV-1 fournies dans la base de données EMBL sous la référence HE1CG, étant entendu que le pré-ARNm lE4 est codé par le brin représenté dans la banque de données EMBL, tandis que le pré ARNm IE5 est codé par le brin complémentaire. La Figure 6 représente un fragment de 70 nucléotides de la séquence commune des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-2 centrée sur le site accepteur d'épissage marqué d'une flèche. Cette séquence est déduite des séquences des gènes IE4 et lES de HSV-2 fournies dans la base de données EMBL sous la référence HEHS2IE (IE4) et l'article de Whitton et al. (1984) J. Gen. ViroL 65, 451-466 (IE5). L'oligonucléotide GT-3021 (voir Figure 1) qui fait l'objet de cette demande de brevet est dirigé contre la jonction d'épissage des pré-ARN messagers codant pour les protéines précoces ICP22 et ICP47 (ARN IE4 et IE5) du virus HSV de type 1. Ces pré-ARN messagers comportent une région d'homologie au niveau de la jonction intron-exon, séquence d'homologie contre laquelle on peut diriger un oligonucléotides antes en polyvalent. L'oligonucléotide GT-3023 (voir Figure 1) qui fait l'objet de cette demande de brevet est dirigé contre la jonction d'épissage des pré ARN messagers IE4 et lES du virus HSV de type 2, qui comme pour le cas du virus HSV-1, comportent une région d'homologie au niveau de la jonction intron exon. Inhibition de la urolifération du virus HSV-1 nar des olizonucléotides antisens Les propriétés anti-herpétiques des différents oligonucléotides ont été établies dans un test d'infection de cellules Véro (rein de singe vert d'Afrique) révélé par colorimétrie. Les cellules Véro sont permissives au virus HSV et permettent sa réplication complète menant à la lyse de la cellule hôte en environ 20 h. Ainsi, dans le système utilisé, la prolifération virale est proportionnelle au taux de lyse cellulaire mesuré par la rétention d'un colorant vital, le rouge neutre. L'acyclovir (Zovirax, Burroughs Wellcome), agent anti-herpétique couramment utilisé, a servi de contrôle positif dans tous les tests. Les séquences des oligonucléotides utilisés dans cette étude sont réprésentées dans la Figure 1. L'activité antivirale de GT-3021 et de GT-3023 a été comparée à celle de deux autres oligonucléotides: GT-4002, oligonucléotide complémentaire à GT-3021 (séquence identique à la séquence cible) et GT-3022, oligonucléotide dodécamérique constitué par la séquence centrale de GT-3021. Par ailleurs, GT-3021 et son contrôle GT-4002 ont été synthétisés et testés en série phosphodiester (PO) ou en série phosphorothioate (PS). D'autre part, les différents oligonucléotides ont été testés parallèlement sur une souche de HSV-1 sensible à l'acyclovir (HSV-1 F), sur une souche virale résistante à l'acyclovir (HSV-1 H29R), ainsi que sur une souche de HSV-2 sensible à l'acyclovir (HSV-2 G24). Protocole exDérimental Le protocole expérimental utilisé a été modifié d'aprés la méthode colorimétrique proposée par Langlois et col. (Langlois, M., Allard, J.P., Nugier, F. et Aymard, M. A raid and automated colorimetric assav for evaluating the sensitivitv of herpes simplex strains to antiviral drugs. 1986. Journal of Biological Standardization 14, 201-211). 100 pI d'une suspension de cellules Véro sont ensemencées à une densité de 25.104 cellules/ml dans des microplaques à 96 puits (8 lignes x 12 colonnes). Après 24 h d'incubation à 37"C sous une-atmosphère de 5% en C02, les cellules confluentes sont rincées avec du PBS (Phosphate Buffered Saline) et traitées par addition de 20 Ill d'une solution 5X d'oligonucléotide ou d'acyclovir (témoin positif), tous les puits d'une même ligne recevant la même concentration. Des dilutions décimales d'une suspension virale mère sont immédiatement distribuées dans chaque puit minutes à température ambiante. La densité optique (DO) de l'éluat, mesurée à 570 nm dans un lecteur de microplaques, est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes présentes dans chaque puits. La DO moyenne des puits contenant les contrôles cellulaires (DOo) est associée à un effet cytopathique nul (CPE=0%). La DO moyenne des puits contenant les cellules infectées par la plus forte concentration virale en l'absence de drogue (DOloo) est associée à un effet cytopathique généralisé (CPE=100%), en ayant pris la précaution de vérifier qu'une dilution au dixième de la préparation virale la plus concentrée induit un effet cytopathique équivalent. L'effet cytopathique dans chaque puits est ensuite calculé de la manière suivante: CPE (%) = 100 x (Doo-Domesaree)/(Doo-Doloo) En particulier, la dilution virale qui en l'absence de drogue induit 50% d'effet cytopathique (TCID5o) est obtenue par régression linéaire des CPE mesurés dans les puits contenant les contrôles du titre viral. Pour chaque plaque la TCID5o est déterminée, et ensuite, le CPE correspondant à 30 TCIDso est calculé pour chaque concentration d'oligonucléotide et d'acyclovir. L'effet antiviral est donc exprimé comme CPE REDUCTION (%) = 100-CPE Finalement, l'efficacité antivirale des oligonucléotides ou de l'acyclovir est quantifiée par 1' ED50 (dose efficace 50%), concentration de drogue qui réduit à 50% le CPE induit par une dose virale égal à 30 TCID50. Cette méthode de calcul permet de normaliser les résultats obtenus sur des plaques différentes en mesurant toujours l'efficacité d'un oligonucléotide ou de l'acyclovir dans des conditions équivalentes d'infection virale. Résultats Chaque résultat correspond à une moyenne de 8 expériences avec 3 lots différents de chaque oligonucléotide obtenus sur la souche virale sensible à l'acyclovir HSV-1 F ou sur la souche résistante à l'acyclovir HSV-1 H29R. Des résultats similaires concernant les différents oligonucléotides ont été obtenus dans les deux souches. L'acyclovir, par contre, actif contre la souche sensible (ED5o= 0.71lg/ml) est complétement inactif sur la souche mutante d'HSV-1 résistante à ce composé. La Figure 2 répresente la quantification correspondant aux différents oligonucléotides sur la souche sensible à l'acyclovir HSV-1 F. Ainsi, on observe que GT-3021, aussi bien en série phosphodiester (PO) que phosphorothioate (PS), induit une inhibition dose-dépendante de la prolifération de HSV-1 F dans des cellules Véro infectées par une dose égale à 30 TCID5o. L'ED5o vaut 21 FM pour GT-3021 PO et 8 zM pour GT-3021 PS, 70% et 80% d'inhibition étant observés respectivement pour une incubation en présence de 40 I1M d'oligonucléotide. Dans ces mêmes conditions expérimentales, le dodécamère GT-3022 PO est complètement inactif, tandis que le 18-mer contrôle GT-4002 PO présente une faible activité non-spécifique de l'ordre de 10%. Par contre, à 40 s1M l'oligonucléotide contrôle GT-4002 en série PS inhibe la réplication de HSV-1 F entre 35 et 40%. Aucune cytotoxicité n'est observée à ces concentrations pour les différents oligonucléotides. Par affleures, l'effet antivirale de GT-3021 PO et PS est observable aussi à des doses infectieuses supérieures à 30 TCID5o. Ainsi, comme on peut ltobserver sur la Figure 3, GT-3021 PO et GT-3021 PS sont capables d'inhiber à 40 FM le CPE induit aussi bien par 30 TCIDso que par 300 TCID5o, tandis que l'effet de l'acyclovir à 300 TCID5o est considérablement réduit Finalement, la Figure 4 montre la spécificité de sérotype des oligonucléotides antisens dirigés contre la jonction d'épissage des pré ARN messagers IE4 et IE5. Ainsi, l'oligonucléotide GT-3021, qui est spécifique des ARN IE4 et IE5 de HSV-1, est capable d'inhiber la prolifération du virus HSV-1 mais pas la prolifération du virus HSV-2. Par contre, l'oligonucléotide GT-3023, qui est dirigé contre la jonction d'épissage des ARN IE4 et IE5 spécifique de HSV-2, n'inhibe pas la multiplication de HSV-1, tout en étant actif contre le virus HSV-2. A une dose infectieuse de HSV-2 égale à 30 TCID5o, 1' ED5o de GT-3023 vaut 27 CLAM, 70% d'inhibition étant observé à 40 sM. REVENDICATIONS 1. Composé oligonucléotidique comprenant une séquence d'ADN ou d'ARN d'au moins 14 nucléotides complémentaire d'une séquence commune des pré-ARN messagers IE4 et IE5 du virus HSV de type 1 ou 2 comprenant le site accepteur d'épissage. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dite séquence d'ADN ou d'ARN est complémentaire d'une séquence commune aux pré-ARN messagers IE4 et IE5 du virus HSV de type 1 ou 2 centrée sur le site accepteur d'épissage. 3. Composé selon l'une de revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il comporte de 14 à 50 nucléotides, de préférence 14 à 28. 4. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence 18-mère A C G X X C C X C C X G C G G G A A complémentaire des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-1 avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. 5. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence 18-mère G C G C C C G G C C X G C G A G A A complémentaire des pré-ARNm IE4 et IE5 de HSV-2 avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. 6. Composé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte la dite séquence d'ADN ou d'ARN flanquée en 3' et/ou 5' de 1 à 10 nucléotides. 7. Composé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en que la séquence oligonucléotidique est une séquence d'ADN. 8. Composé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les séquences oligonucléotidiques sont de type naturel à lien internucléotidique de type phosphodiester. 9. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte dans sa séquence des nucléotides modifiés soit en série ribo- soit en série désoxyribo-nucléotide. 10. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte en 3' et/ou en 5' une partie non-nucléotidique pouvant être un ou des groupement(s) lipophile(s), ou tout autre structure moléculaire favorisant la pénétration, le ciblage ou l'adressage cellulaire ou intra-cellulaire, ou stabilisant la structure de ces oligonucléotides. 11. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un groupement réactif greffé sur un de ses nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide ou induire la formation de pontage intramoléculaire au sein même de la molécule. 12. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 8 à titre de médicament. 13. Composition pharmaceutique comportant à titre de principe actif au moins un composé selon l'une des revendications 1 à Il et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comporte un excipient approprié pour une application topique. 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé est dans une formulation galénique appropriée pour une application topique. 16. Composition pour lutter contre les infections virales dues aux virus HSV-1, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 4 et 6 à 11. 17. Composition pour lutter contre les infections virales dues aux virus HSV-2, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 3, 5 et 6 à 11. 18. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 1 1 pour préparer une composition pharmaceutique antivirale contre les virus HSV de type 1 ou 2 selon les revendications 13 à 17.