FR 2696181 A1 19940401 FR 9211498 A 19920925 SEQUENCES D'ADN IMPLIQUEES DANS LA TRANSCRIPTION DE GENES SOUS L'EFFET D'INDUCTEURS, ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES L'invention a pour objet des séquences d'ADN impliquées dans la transcription de gènes sous l'action d'inducteurs, ainsi que leurs applications biologiques. Elle concerne plus particulièrement des séquences sensibles à l'action de lymphokines comme les interférons, et tout spécialement de l'interféron (IFN # , en abrégé) qui constitue la lymphokine connue la plus puissante pour activer les cellules phagocytaires mononucléaires en régulant leur degré de différenciation. On connaît le rôle des interférons dans les réponses antivirales et immunes des cellules. Ils contrôlent la croissance et la différenciation cellulaire. Certains de ces effets dépendent de 11 activation de la transcription de gènes spécifiques induits par un interféron donné. Deux types d'interférons ont été décrits. Le type I, r formé des interférons a et p (IFN a/p), et le type II, constitué par l'interféron y ou IFN. Ces deux types d'interférons agissent sur des récepteurs de surface cellulaire spécifiques et induisent une transcription qui conduit à l'expression de nouveaux ARNm et protéines. En plus des ARNm et des protéines induits par 1' IFN a et 1'IFN p, 1'IFNX induit ltexpression d'ARNm et de protéines spécifiques. I1 apparaît que les deux types d'interférons déclenchent leur réponse biologique en utilisant des récepteurs distincts et en mettant en jeu des mécanismes différents impliquant le ciblage d'éléments transcriptionnels spécifiques. Des travaux antérieurs sur la régulation de la transcription sous l'action de ces deux types d'interférons ont montré le rôle majeur, dans la réponse à ces interférons, joué par des séquences nucléotidiques définies, appelées IRS ou ISRE (pour interferon-stimulated response element). Récemment, un autre motif d' ADN, chevauchant partiellement la séquence ISRE, a été identifié. Il s'agit de la séquence GAS ( K activating sequence). On a également identifié des facteurs protéiques qui se lient à l'IRS ou IRSE en réponse à 1' interféron. Des travaux portant sur l'activation par IFNT d'un gène codant pour le récepteur humain de haute affinité pour les immunoglobulines G ou IgG (gène hu-Fc g RI, ou gène R en abrégé) ont montré que la région responsable de l'induction est constituée par une séquence d' ADN appelée GRR. D'autres travaux ont montré que l'expression du gène R induite sélectivement par IFN # est limitée aux cellules myéloïdes, mais qu'un motif GRR cloné devant un gène rapporteur permettait d'induire l'expression de ce dernier dans des cellules Hela. Cependant, ni les séquences d'ADN en question, ni les facteurs ayant une affinité pour ces séquences identifiés jusqu' à présent, ne fournissent d'explications pour une régulation préférentielle par 1' IFNX \d de certains gènes spécifiques. Les recherches effectuées par les inventeurs sur le promoteur du gène R humain ont permis de caractériser la fonction des séquences définies, localisées dans ce dernier, l'une de ces séquences étant nouvelle, l'autre correspondant pratiquement au motif GRR évoqué ci-dessus. Sur la base de cette caractérisation, les inventeurs ont développé des moyens, outils et méthodes, permettant le ciblage de l'expression de gènes transférés dans des cellules d'intérêt, notamment au regard de la recherche et de certaines pathologies. L invention a donc pour but de fournir, en tant que produits nouveaux, des séquences d'ADN capables de conférer à un type cellulaire donné une réponse à IFN Elle vise également les facteurs protéiques se liant spécifiquement à ces séquences, et les complexes formés, ainsi que les anticorps dirigés contre ces facteurs et complexes. L'invention vise en outre les applications de ces séquences d'ADN et facteurs protéiques pour induire dans un type cellulaire donné, en particulier à des fins de recherche, de diagnostic ou thérapeutiques, la transcription de gènes sous le contrôle de promoteurs comportant ces séquences. Les séquences de nucléotides de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles correspondent à une ou plusieurs régions de l'enchaînement I de nucléotides, cette ou ces régions constituant une cible spécifique pour des facteurs protéiques présents uniquement dans des cellules hématopoïétiques, cette présence ne dépendant pas de l'IFN, ce ciblage conduisant à la formation de complexes tels qu'identifiés par électrophorèse sur gel. Les enchaînements de nucléotides auxquels il est fait référence dans la description et les revendications sont donnés en fin de description. L'enchaînement I correspond à la séquence de nucléotides de l'extrémité 5' du gène R. La numérotation démarre à l'adénosine (+1) du codon initiateur ATG. Les positions des séquences mentionnées dans la description correspondent à la numérotation de cet enchaînement. Selon une disposition préférée, l'invention vise les séquences de nucléotides constituées par au moins une partie de l'enchaînement Il, le cas échéant sous forme multimérique. L'enchaînement II sera appelé ci-après séquence MATE. Selon un aspect présentant un intérêt majeur, de telles séquences sont capables de conférer à un gène une activité transcriptionnelle restreinte à un type cellulaire donné (cellules hématopoïétiques), lorsqu'elles sont associées à d'autres motifs de l'enchaînement I. Des séquences préférées de ce type sont constituées par un ou plusieurs des enchaînements III ou IV. De telles séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles comportent ou qu'elles sont constituées par au moins un motif correspondant à une boîte PU répondant à l'enchaînement GAGGAA. On notera avec intérêt que cette boîte PU a été caractérisée dans les promoteurs des gènes exprimés spécifiquement dans des cellules telles que les macrophages et les lymphocytes B, ce qui souligne son rôle dans les mécanismes d'activation de la transcription. D'autres séquences de nucléotides de ce type sont caractérisées en ce qu'elles comportent ou qu'elles sont constituées par au moins un motif TCTTTTC. Comme déjà indiqué, ces séquences sont reconnues spécifiquement par des facteurs protéiques, non inductibles par l'IFNt, Ces facteurs sont constitutifs et ne sont présents que dans les cellules, hématopoïétiques. Ces facteurs sont encore caractérisés en ce qu'ils forment des complexes. tels qu'identifiés en électrophorèse sur gel, avec les séquences de nucléotides définies ci-dessus, ces complexes présentant des migrations différentes selon l'état de différenciation des cellules. Ces facteurs et complexes entrent également dans le cadre de l'invention. Ils seront désignés ci-après par l'expression respectivement facteurs LM et complexes M facteurs LM, évoquant les propriétés de liaison (L) à la séquence MATE (M). Selon une autre disposition préférée, l'invention vise l'association des séquences d'ADN définies ci-dessus avec des séquences d'ADN impliquées dans l'induction par l'IFNX 7 ce qui permet de disposer de constructions utilisables pour conférer à un gène, en présence d'IFNg une activité transcriptionnelle limitée à un type cellulaire donné. Des associations préférées comprennent avantageusement, comme séquences d'ADN impliquées dans la réponse à l'IFN g , une ou plusieurs régions de l'enchaînement I de nucléotides, étant entendu que cette ou ces régions sont différentes de celles des séquences de nucléotides de l'invention, définies plus haut. Il s'agit plus spécialement de régions constituant une cible spécifique pour des facteurs protéiques tels que présents dans les cellules hématopoïétiques ou non hématopoïétiques après traitement par l'IFNg , ce ciblage conduisant à la formation de complexes tels qu identifiés par électrophorèse sur gel. L'invention vise en particulier les associations avec une ou plusieurs séquences de nucléotides constituées par au moins une partie de l'enchaînement V, le cas échéant sous forme multimérique. L'enchaînement V sera appelé ciaprès séquence GIRE. Les travaux des inventeurs, rapportés dans les exemples, montrent que la séquence GIRE, lorsqu'elle est intégrée dans le promoteur d'un gène, assure une régulation de la transcription de ce dernier sous l'effet d'IFNy Cette séquence joue le rôle d'un élément inductible par l'IFNg et est impliqué dans la réponse à cette cytokine Les séquences de nucléotides comportant, ou constituées par -des multimères de la séquence GIRE, ou d'une partie de celle-ci sont des produits nouveaux. D'une manière ' avantageuse, les associations comportant ces formes multimériques permettent d'augmenter le niveau de transcription d'un gène, lorsqu'elles contrôlent l'activité de son promoteur. Le plus généralement, ces multimères correspondent à des répétitions de 2 à 5 motifs. L'invention vise également, en tant que produits nouveaux, des motifs spécifiques de la séquence GIRE, en particulier, le fragment AGAAAAG. On notera que cette séquence est répétée trois fois dans l'enchaînement I, l'une des répétitions étant sous la forme inversée TCTTTTC dans la séquence MATE. Il est entendu que les bases des séquences de nucléotides de l'invention peuvent être dans un ordre différent de celui indiqué dans les différents enchaînements et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées chimiquement et/ou certaines d'entre elles délétées. Les séquences correspondantes entrent dans le cadre de l'invention, dès lors qu'elles donnent lieu à un complexe avec des facteurs protéiques présentant les caractéristiques définies plus haut. On remarquera que les associations de séquences de nucléotides plus spécialement envisagées selon l'invention comprennent des séquences capables de contrôler la réponse de cellules à l'action de l'IFN. Toutefois, il est clair que les séquences de nucléotides définies plus haut, qui permettent une expression tissu-spécifique, peuvent être associées, si on le souhaite à des séquences impliquées dans la transcription de gènes sous l'effet de'inducteurs autres que 1'IFNg. La séquence GIRE est caractérisée en ce qu'elle est la cible de facteurs protéiques spécifiques, après leur activation par 1'IFN y , ces facteurs étant différents de ceux évoqués plus haut. Ces facteurs qui constituent des produits - nouveaux entrent aussi dans le champ de l'invention. Ils seront désignés par l'expression facteurs LG pour évoquer leur liaison (L) à la séquence GIRE (G). Les complexes formés avec la séquence GIRE seront appelés complexes GIRE-facteurs LG. Ces facteurs LG activés par 1' IFN% sont préexistants dans les cellules hématopoïétiques ou non hématopoïétiques. Ils forment, avec au moins une partie de la région GIRE, des complexes dont la migration électrophorétique n' est pas modifiée en présence de compétiteurs des fragments nucléotidiques correspondant aux motifs précédemment décrits, tels qu'IRS, ISRE, boîte X/S et Y. Les complexes GIRE-facteurs LG sont encore caractérisés en ce que leur formation est inhibée sous l'effet de la stauroporine. En revanche, l'action d'autres inhibiteurs de protéine kinase comme la calphostine C, le (N-(2-( (3-(4-bromophényl)-2-propényl)-amino)-éthyl)-5- isoquinolinesulfonamide. di-HCl), ou d'un agent tumoral comme la thapsigargine, n'ont pas d'effet sur la formation du complexe. L'invention vise en outre les anticorps polyclonaux dirigés contre les facteurs LM et LG et les complexes, ainsi que les anticorps monoclonaux. D'une manière classique, les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisation d'animaux à l'aide des facteurs LM ou des complexes purifiés. Les anticorps monoclonaux sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes, avantageusement selon la technique de Kôhler et Milstein, Nature, vol. 256, p 495, 1975. Les séquences de nucléotides de l'invention sont avantageusement obtenues par voie de synthèse chimique, à l'aide de synthétiseurs d'oligonucléotides. Les facteurs protéiques LM ou LG sont purifiés à partir des extraits cellulaires les renfermant sous forme de complexes. Le matériel de départ est constitué par une production en masse de cellules induites par l'IFN telles que THP-1 ou PBL. Afin d'éliminer les protéines présentant une activité non spécifique vis-à-vis de l'ADN, on procède avantageusement à une purification préalable des facteurs présentant une affinité pour l'ADN. En opérant selon les techniques classiques, on utilise par exemple, à cet effet, des colonnes d'héparine-agarose. Les extraits cellulaires sont ensuite soumis à au moins une étape de chromatographie pour éluer, à une force ionique déterminée, l'activité M-facteur LM ou G-facteur LG recherchée. Ces activités pourront être détectées par formation d'un complexe M-facteur LM ou G-facteur LG par électrophorèse à l'aide de sondes spécifiques. Une phase finale de purification comprendra avantageusement le passage des éluats recueillis sur une colonne de chromatographie d'affinité où les séquences MATE ou GIRE sont fixées dans le support chromatographique. Les fractions retenues sur la colonne seront éluées en utilisant une force ionique appropriée. On sélectionnera les fractions renfermant les produits recherchés par analyse électrophorétique. Une étape de purification supplémentaire, par exemple par électrophorèse préparative et transfert sur nitrocellulose conduit à l'obtention de produits purs utilisables pour la production d'anticorps, ainsi que pour le séquençage des facteurs. Les fonctions des séquences de nucléotides définies ci-dessus vis-à-vis de l'activité transcriptionnelle de gène induite par IFN; , et de l'expression limitée à un type cellulaire donné, présentent un intérêt dans de nombreuses applications biologiques où l'on souhaite conférer à un type cellulaire donné une réponse à IFNX'. L'invention vise donc des constructions nucléotidiques utilisables comme vecteurs de transfert caractérisées en ce qu'elles renferment au moins l'une des associations de séquences nucléotidiques définies plus haut, avec les régions promotrices d'un gène donné. Le transfert de telles constructions, selon les techniques classiques, dans des cellules en culture d'un type donné, ou dans les cellules d'un tissu donné d'un animal permet de stimuler l'induction du gène transféré, contrôlé par ces séquences, en réponse à l'IFNy. On procède, par exemple, comme décrit par Skalnik dans P.N.A.S., 1991, vol. 88, 8505-8509. Les cellules en culture ainsi modifiées et les animaux transgéniques obtenus entrent dans le cadre de l'invention. De manière avantageuse, ces constructions sont transférées dans des cellules impliquées dans la réponse immunitaire comme les monocytes - macrophages, ou, plus généralement, dans les cellules hématopoïétiques. Les vecteurs d'expression renfermant les séquences de nucléotides de l'invention, destinés au ciblage de l'expression de gènes d'intérêt dans un type cellulaire donné (cellules hématopoïétiques), sont utilisables dans des kits comprenant, par exemple, en plus desdites séquences, des gènes d'intérêt, comme des gènes de résistance à des antibiotiques, ainsi que les drogues ou antibiotiques, et leur mode d'emploi nécessaires à l'établissement de lignées cellulaires transformées par ces vecteurs. Ces vecteurs peuvent être utilisés en thérapie génique dans des cas pathologiques où les gènes exprimés dans les cellules hématopoïétiques sont défectueux. Les séquences nucléotidiques définies dans l'invention, plus particulièrement les séquences MATE et GIRE, contrôlent l'expression du gène correspondant, assurant un ciblage spécifique dans les cellules hématopoïétiques. Selon un autre aspect de grand intérêt, ces séquences sont utilisables comme sondes pour détecter la présence de séquences complémentaires. Ces sondes permettent d'identifier des régions promotrices de gènes présentant les mêmes séquences, et sont donc utiles pour établir lors de la cartographie génique, la présence d' une région promotrice contrôlant un gène dont l'expression est restreinte aux cellules hématopoïétiques. -Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation à étudier. L' invention vise un procédé de détection in vitro de la présence dans un échantillon biologique de séquences complémentaires de celles définies ci-dessus, ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde telle que définie plus haut, dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et la séquence de nucléotides recherchée, et - la détection du complexe d' hybridation. Le cas échéant, on procède à une amplification préalable de la quantité de séquences de nucléotides susceptibles d'être contenues dans l'échantillon, à l'aide d'amorces capables de se lier respectivement, d'une part à l'extrémité 5' d'un brin de la séquence de nucléotides et, d'autre part, à l'extrémité 3' de 1' autre brin de la séquence. L' utilisation d'un tel procédé permet une détection rapide et de grande spécificité des ADN. Pour la mise en oeuvre de ce procédé de détection in vitro, on a recours avantageusement à un kit comprenant: - une quantité déterminée d'une sonde selon l'invention ; - un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde, et , le cas échéant, - des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés. Les anticorps dirigés contre les facteurs purifiés LM et LG constituent également des bioréactifs de grand intérêt. Ils permettent, notamment, d'établir des diagnostics de défauts génétiques liés à des défauts d'expression ou à des surexpressions de ces facteurs. L'invention vise donc également une méthode de détection in vitro de la présence de ces facteurs dans un échantillon à étudier, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact de cet échantillon avec une préparation d'anticorps, ou d' un fragment de ces derniers, immobilisés sur un support solide non immunogène, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène - anticorps avec les facteurs, - la mise en évidence de la formation du complexe. Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence de ces facteurs dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier. Leur utilisation en histochimie permet ainsi d'étudier leur distribution sub-cellulaire et de repérer des modulations qualitatives et quantitatives de ces facteurs. Le taux de facteurs LM ou Lg mesuré peut être corrélé à des défauts d'expression de certains gènes exprimés dans des cellules hématopoïétiques. Les résultats obtenus seront particulièrement précieux pour étudier la modulation de l'expression de ces facteurs dans des cas de pathologies ou pour établir des protocoles de recherche clinique. L'invention vise en outre un kit pour la détection in vitro de la présence de ces facteurs dans un prélèvement biologique. Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend: - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de microtitration, - une préparation d'anticorps, ou de fragments de ces derniers, libres ou immobilisés, - une préparation de facteurs LM ou LG, avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, -- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. D'autres cractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans les exemples qui suivent donnés à titre illustratif. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 8, qui représentent respectivement, - la figure 1, les résultats concernant l'activité CAT, induite sous l'effet d'un traitement avec de l'IFN de différentes constructions nucléotides dans des lignées humaines et murines, - les figures 2 et 3, la présence de complexes GIRE- facteurs LG dans différents extraits cellulaires, mise en évidence par analyse électrophorétique, - la figure 4, les résultats concernant l'activité CAT induite par traitement avec l'IFNg de cellules transfectées par des constructions de l'invention, - les figures 5 et 6, les résulyats d'analyses électrophorétiques montrant la présence de facteurs LM dans les cellules hématopoïétiques, - la figure 7 les résultats d'analyse électrophorétique de compétition croisée montrant la présence dans le motif GIRE d'une séquence entrant en compétition avec les facteurs LM, et - la figure 8, un vecteur de transfert selon l'invention. MATERIELS ET METHODES CELLULES On utilise des cellules RAW 264-7, Hela, HL60, U937 et THP-1 provenant de l'American Type Culture Collection. On établit des cultures en monocouches des lignées cellulaires RAW 264-7 (macrophages-monocytes murins) et des lignées cellulaires Hela épithéliales humaines d'adénomacarcinomes dans du DMEM supplémenté avec 10 t de sérum de veau foetal. On fait pousser les lignées cellulaires humaines promyélomonocytiques HL60 et U937 et monocytiques THP-1 en suspension dans RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal. INTERFERONS ET TNF IFN humain, activité spécifique 2x107 U/mg (ROUSSEL UCLAF) ; TNFa,INFa murin (BOEHRINGER MANNHEIM). CONSTRUCTIONS DES PLASMIDES Pour générer divers fragments à partir du gène R par la technique dite PCR, on utilise, comme matrice d'ADN, un fragment génomique EcoRI de 4,3 kb représentant l'exon 5' avec une région adjacente de 592 pb. Pour obtenir des constructions SV40 CAT r(206/45)SV CAT,(45/206) SV CAT], on utilise des amorces d'oligonucléotides englobant les séquences entre -206 à -186 et -63 à -45 (la numérotation démarrant à ATG) et ayant un site de restriction BglII à chaque extremité 5'. Le fragment PCR résultant est cloné dans le site unique BglII du plasmide rapporteur pCAT (tel que commercialisé par Promega Corp., Madison, W) qui contient le gène rapporteur bactérien de la chloramphénicol acétyl transférase, ou gène CAT, en aval du promoteur de SV40. D'autres fragments du promoteur du gène R ont été également clonés dans le site de restriction du vecteur BamHI du vecteur pBRAMS CAT2 contenant le gène CAT sous contrôle du promoteur TK. Pour obtenir les constructions (165/128)TK CAT, (128/165)TK CAT et (128/165)3 TK CAT, on a utilisé des amorces avec le site de restriction BamHI et correspondant aux séquence -165 à - 141 et - 158 à - 128. Les mêmes amorces avec un site de restriction EcoRV ont permis de cloner la même région (-165/-128) au site EcoRV localisé à une distance de 1 kb du promoteur TK( TK CAT-(165/128)) Les fragments génomiques de R formés de l'enchaînement de nucléotides allant de la position -140 à -45 et -206 à -107 sont générés respectivement par PCR avec la combinaison suivante d'amorces ayant un site de restriction BglII : -140 à -124/-63 à -45 et -206 à -186/ - 129 à -107. Les fragments amplifiés sont insérés dans le site BamHI du plasmide pBRAMS CAT2 de manière à obtenir les vecteurs TK CAT (140/45) et TK CAT (206/107). Les vecteurs TK CAT (103/78) et TK CAT (78/103) sont construits par clonage dans le site BamHI de pBRAMS CAT2 d'un oligomère de 25 pb obtenu après hybridation des deux brins avec les deux brins correspondant à la séquence -103 à -78 (numérotation à partir de l'ATG) GGATTC AATTTCCTTCCTCTTTTCTAATTTGGATTC. Après multimérisation de la région -165/-128 au site BamHI de pGEM3Z (tel que commercialisé par Promega Corp.), le fragment SacI-XbaI a été cloné aux mêmes sites de restriction que les plasmides décrits précedemment pour obtenir les vecteurs (GIRE)3 TK CAT, (GIRE)3-(140/45) TK CAT, (GIRE)2-(206/107) TK CAT, (GIRE)3-(103/78) TK CAT, (GIRE)3-(78/103) TK CAT. Le fragment SacI-XbaI contenant un hexamère de la séquence IRS a été excisé à partir du plasmide IRS-TK CAT et a été inséré aux sites SacI-XbaI des vecteurs pBRAMS CAT2 et (103/78) TK CAT. TRANSFECTIONS Un jour avant la transfection, on a appliqué les cellules à une densité de 5 x 106 cellules par boîte de culture de diamètre 100 mm. Les cellules THP-1 et RAW 264-7 sont transfectées avec 10 pg d' ADN en utilisant la méthode au DEAE-dextran (Fujita et al (1986), Cell, 46, 401-407). L' ADN est combiné avec 25 pg/ml de DEAE-dextran dans un volume final de 1 ml de HBSS (HBSS 5mM de KCl, 0,4 mM de KH2PO4 140 mM de NaCL, 0,3mM de Na2HPO4x 12 H20, 5,5 mM de glucose, 5mM d'EDTA). Après 5 min à température ambiante, le mélange ADN/DEAE-dextran est ajouté aux cellules préalablement lavées avec un milieu sans sérum et incubé 90 min à 37"C, avec 5 g de CO2. Les cellules sont alors incubées pendant 3 min. dans du DMSO à 10 g dans HBSS et sont lavées avec PBS 1 fois ; on ajoute ensuite du milieu complet. -24 h plus tard, les cellules sont divisées en 2 boîtes de culture de 60 mm. Après un laps de temps de 8 h, la couche cellulaire d'une boîte de chaque groupe de transfection est soumise à un traitement d'induction avec 500 U/ml de cytokines. Les cellules sont récoltées 12 h après la stimulation. La transcription des cellules Hela est réalisée selon la méthode au phosphate de calcium décrite par Chen et al dans Mol. Cell. Biol, 7 ; 2745-2752, 1987. EXTRAITS CELLULAIRES Les cellules sont collectées par centrifugation 20 min. à 3000 g, puis sont lavées 2 fois avec du PBS froid. Les extraits sont préparés selon un protocole modifié de la méthode de Zimarino et al décrite dans Nature, 5, 25292537, 1987. Les cellules sont remises en suspension dans 4 volumes de HEPES 10 mM, pH 7,9, NaC1 0,4 m, EDTA 0,1 M, DTT 0?5 mM, glycérol 5 v/v, PMSF 0,5 mM, Leupeptine 0,1 pg/ml, aprotinine 4 pg/ml, chymostatine 1 pg/ml, pepstaïne 1 pg/ml et antipaine 2 pg/ml. Les cellules remises en suspens ion sont congelées dans de l'azote liquide 1 fois et, après décongélation, homogéinisées par pipetage et centrifugées 5 min. à 100000 g . Les surnageants sont récupérés et conservés à -70 C. On prépare l'extrait cytoplasmique en utilisant le même tampon de lyse, mais NaCl est mis en oeuvre à raison de 0,14 M. Après congélation, les préparations cellulaires sont centrifugées 5 min. à 10 000-g. Le surnageant est considéré comme étant la fraction cytoplasmique. Le culot est remis en suspension dans 0,4 M de NaCl. Il est ensuite traité comme décrit pour les extraits cellulaires entiers. Après centrifugation à 100 000 g, le surnageant résultant correspond à la fraction nucléaire. INTERACTION ADN-PROTEINES ET ELECTROPHORESE Le protocole de ces expériences est le suivant: on procède tout d'abord à une pré-incubation d'extraits cellulaires entiers de a) THP-1 et b) Hela, non traités par IFIN# (-), ou traités par IFNg (+), avec 10 pg d'ADN de sperme de saumon soumis à un traitement de sonication,et éventuellement de compétiteurs. Les extraits cellulaires comprennent 10 pg de protéines dans 4 pl de tampon de liaison contenant du Ficoll à 20 %, 100 mM Hepes pH 7,5, 10 mM de DTT, 300 mM de KCl, 0,05* de NP40 et 500 pg/ml d'albumine bovine. On ajoute 5000 à 10000 cpm ( Cerenkov) d' une sonde marquée à l'aide de 32p et on effectue une incubation à température ambiante, pendant 30 min., avec un volume final de 20 pl, puis on procède à l'electrophorèse sur gel. Les oligonucléotides ou fragments d'ADN -165/-128 (sonde GIRE), sont marqués à 1' aide de (g -32P)ATP (5000 Ci/mmole ; Amersham) avec de la T4 polynucléotide kinase (Pharmacia). Chaque échantillon est chargé sur un gel de polyacrylamide natif à 4 g (29:1 acrylamide/bisacrylamide). Le gel est soumis à une tension de 150 V dans un tampon 0,5 x TBE. Après séchage, les gels sont soumis à une autoradiographie. Les séquences d'oligonucléotides utilisées comme compétiteurs sont les suivantes: - pour 1' élément donnant une réponse à l'interféron TGAGGAAACGAAACCA - pour la boîte Y et X/S du gène Ea murin, ATTTTTCTGATTGGTTAAAAGT et TGGACCTGGTTGCAAGGAACCCTTTCCTAGCAACAGATGTGTC (l'homologie avec le gène humain correspondant est soulignée). 1. Etude de la régulation du gêne R dans les cellules myéloldes humaines et les cellules myéloides murines. On clone un fragment d' ADN comportant le motif GRR devant un gène rapporteur sous le contrôle des promoteurs de SV40 et de TK respectivement, puis on transfecte, à l'aide de ces constructions, des lignées cellulaires humaines, telles que THP-1 , ou murines, telles que RAW 264-7. La séquence de nucléotides du motif GRR apparaît sur 1' enchaînementI qui donne la séquence de nucléotides de l'extrémité 5' du gêne R comportant le motif GRR. Le gène rapporteur choisi code pour la chloramphénicol acétyl transférase, ou CAT en abrégé. Les constructions correspondantes seront donc appelées constructions CAT. On rapporte, sur la figure 1, les résultats obtenus avec des constructions comportant le fragment contenant GRR allant des positions -206 à -45 (et l'orientation inverse) devant le vecteur SV4O-CAT, le fragment GIRE -165 à -128 ( et l'orientation inverse) devant le vecteur TK-CAT, le fragment GIRE à une distance de îkb du vecteur TK-CAT, et .un trimère de la région GIRE lié au vecteur TK CAT. Un gène chimère SV4O-p galactosidase est cotransfecté et cette activité est utilisée comme témoin interne pour évaluer l'efficacité de la transfection. Ces résultats sont exprimés sous forme du rapport de l'induction à partir de la moyenne de comptage/pg de protéine rapportée à la même valeur p gal trouvée dans les extraits induits versus les extraits non induits. L'examen de ces résultats montre qu'après traitement des cellules transfectées avec l'IFN # , l'expression de l'activité CAT est augmentée dans les vecteurs ayant la séquence GIRE. Cette augmentation est particulièrement importante lorsqu'on utilise le trimère GIRE. Ces résultats mettent en évidence le rôle joué par le motif GIRE commme élément responsable de la réponse à 1'IFN IFN 2. Association, au motif GIRE, de protéines spécifiques activées par l'IFNy , capables de se lier à 1 'ADN. Les expériences de déplacement de bandes sur gel électrophorétiques, dont les résultats sont rapportés sur la figure 2, ont permis d'identifier les facteurs agissant en trans, présentant une affinité pour le motif GIRE. Sur cette figure, Co représente la séquence -165/-128 non marquée , utilisée en excès 10 fois molaire,et C1 à C3 correspondent à un excès 100 fois molaire ,respectivement de IRS, et des boîtes X/S et Y. L'examen des figures 2a et 2b montre qu'un complexe spécifique GIRE-facteurs LG est présent seulement dans les extraits cellulaires de THP-1 et de Hela ayant subi un traitement avec IFN On notera que la pré-incubation des cellules pendant 3 h avec du cycloheximide, avant l'addition d'IFNg n'affecte pas 1' apparition du complexe. Les expériences de compétition réalisées entre le motif GRR et différentes séquences consensus, mentionnées plus haut, connues pour conférer une réponse à l'IFNg montrent que - le complexe GIRE-facteur LG n'est pas détecté après pré-incubation de l'extrait cellulaire avec un excès 10 fois molaire du fragment -165/-128 non marqué (piste Co); - on n' observe pas de compétition significative lorsqu'on utilise un large excès (100 fois molaire) de compétiteur dont la séquence correspond aux motifs précédemment décrits impliqués dans la réponse aux interférons (IRS, IRSE, et motifs X/S et Y. 3. Etude des mécanismes de régulation par IFNX rôle distinct de la séquence GIRE On sait que les ARN-m de la 2'-5' oligo A synthétase sont faiblement exprimés dans les monocytes après traitement par IFNy seul ou TNFa seul, mais qu'un traitement combiné avec ces deux cytokines induit fortement leurs expressions (voir Wietzerbin et al , 1990, J.Leuk.Biol., 48, 149-155). Pour vérifier que cette exigence est reliée à un événement transcriptionnel et que le motif IRS est la cible de l'effet synergique observé, on a utilisé deux constructions CAT dans lesquelles le gène CAT est sous le contrôle, - soit du promoteur de la 2'-5' oligo A synthétase (pGEM CAT E). - soit du promoteur TK cloné en 3' d'un hexamère du motif IRS (IRS-TK CAT). On a comparé les capacités de réponse de ces constructions à une stimulation par différentes cytokines, avec celles soit de (GIRE)3 TK CAT, soit d'un vecteur (R CAT) où le gène CAT est sous le contrôle de la région adjacente à 5' du gène R (-799/-45). -Ces différentes constructions CAT sont utilisées pour transfecter des cellules THP-1. Dans le tableau suivant, on donne les résultats obtenus en traitant ces cellules, après leur transfection, avec 500 u/ml de IFN-a, IFN-, TNF-a, et IFN-t + TNF-a. Ces résultats sont exprimés comme indiqué pour la figure 1. IFN-a IFN-t TNF-a IFN-t Y + TNF-a R CAT 0.48 5.60 0.98 5.30 (165/128)3-TK CAT 0.75 5.30 0.85 4.80 pGEM CAT-E 14.72. 0.38 0.55 2.00 IRS-TKCAT 5.30 0.37 0.39 2.50 On constate que - les constructions R-CAT et (165/128)-TK CAT ne donnent de réponse, dans les cellules THP-1, qu'après traitement par l'IFNt, - une activité CAT induite avec les deux vecteurs pGEM CAT ou IRS-TK CAT n'est observée qu'après le traitement par IFNa ou après co-induction avec IFN g et TNFa. Ces résultats confirment que les deux cytokines sont nécessaires pour induire une activité 2'-5' oligo A synthétase comme dans les cellules promyelomonocytiques U937. La réponse différente à l'IFNg dans les cellules THP 1, des séquences minimales GIRE et IRS met en évidence que ces éléments d'ADN sont bien distincts. La présence du complexe GIRE-facteurs LG a été détectée 5 minutes après traitement par I l'IFNy et son niveau reste stable pendant 2 h au moins. Ce résultat montre que l'activité GIRE-LG est un phénomène précoce et correspond à une activation de facteurs pré-existants. Une activité similaire de liaison GIRE-facteurs LG a été mise en évidence chez d'autres cellules promyélomonocytiques HL60 et U937 (voir figure 3), cette activité étant particulièrement forte chez les extraits cellulaires de U937. 4. Rôle d'un élément agissant en cis dont dépend l'expression du gène R dans les cellules myéloïdes. Différents fragments du promoteur du gène R sont clonés dans des vecteurs TK CAT. Les constructions réalisées sont rapportées sur la figure 4. La transfection des cellules RAW 264-7 avec la construction IRS TK CAT est co-induite avec 500 u/ml de IFNg et de TNFa. Les autres activités CAT rapportées sont obtenues à partir de cellules traitées avec 500 u/ml de IFNy . Les résultats sont exprimés comme précédemment. L'examen de ces résultats conduit aux observations suivantes - le vecteur (GIRE)3 TK CAT est inductible chez les cellules Hela - le clonage de la région -140/-45 dans la construction (GIRE)3 (-140/-45) TK CAT supprime l'expression induite dans les cellules Hela mais n'affecte pas la réponse dans les cellules de la lignée monocytique RAW 264-7, - la transcription des cellules par le vecteur (GIRE)2-(206/107) TK CAT qui comprend l'insert -206/-107 de l'enchaînement I, contenant le motif GRR, ne conduit pas à une modification de l'induction et l'expression de CAT est observée dans les deux types cellulaires. - la construction (GIRE)3(103/78) TK CAT, qui contient une séquence plus courte donne lieu à une activité CAT exprimée d'une manière différente selon le type cellulaire utilisé pour la transfection. Le clonage de la région -103/-78 selon une orientation inverse ne change pas ces résultats. -- l'activité CAT induite est environ 4 fois moindre chez les cellules Hela, mais ne disparaît pas contrairement à l'expression réprimée (de 9 fois) mesurée avec le vecteur (GIRE)3-(-140/-45) TK CAT. - avec le vecteur IRS (-103/-78) TK CAT l'expression de CAT n'est pas réduite chez les cellules Hela, ce qui montre que le motif MATE (-103/-78) doit interagir avec le motif GRR pour qu'il y ait une expression tissu-spécifique. Ceci renforce les différences entre les séquences GRR et IRS. 5. ROLE DE FACTEURS AGISSANT EN TRANS, SPECIFIQUES DE TYPE CELLULAIRES SUR L'EXPRESSION DU GENE R DANS DES CELLULES MYELOIDES On réalise des expériences de déplacement de bandes en utilisant comme sonde un fragment d'ADN marqué à l'aide de 32P correspondant à la région - 140 à - 45 comprenant la partie en aval de GRR et le motif MATE. Cette sonde est incubée avec des extraits cellulaires entiers. On rapporte sur la figure 5, partie A, les résultats obtenus avec des cellules THP-1 ( pistes 1 à 6 ) et des cellules Hela (pistes 7 à 12 ). Les préparations non traitées par l'IFNg correspondent aux pistes 1 et 7 et celles traitées par IFN aux pistes 2 à 6 et 8 à 11. Un extrait cellulaire pré-incubé pendant 3h avec 10 pg/ml de cycloheximide avant l'addition de IFN correspond à la piste 6. La partie B de la figure 5 correspond à une expérience témoin dans laquelle on a utilisé une séquence contenant le motif de liaison NF-1 incubé avec les mêmes extraits de cellules Hela non traités (-) ou traités (+) par 1'IFNz, L' incubation de la sonde avec l'extrait de THP-1 non traité par IFN Y montre les 2 complexes spécifiques MATE-BP1 et MATE-BP2. Ces deux complexes sont observés aussi bien avec les extraits cellulaires non induits que ceux induits. ce qui confirme que la région -142/-45 n'est pas impliquée dans l'induction mais plutôt dans l'expression tissuspécifique du gène R La formation de ces deux complexes est inhibée de manière significative dans les extraits préparés à partir de cellules trairées avec du cycloheximide (figure A, piste 6). Dans la même expérience, la sonde (-142 à-45) ou une sonde présentant une affinité pour un facteur de type NF-1 (voir respectivement la figure 5 A, pistes 7 à 11 et la figure 5 B) sont incubées avec les extraits cellulaires préparés à partir de cellules Hela. On constate une liaison pratiquement totale de NF1 à sa cible spécifique. En revanche , aucun complexe n'est détecté avec la sonde aussi bien avec les cellules Hela taritées par l'IFN , qu'avec les cellules non traitées. Dans d'autres expériences, on a utilisé, comme sonde, un oligomère correspondant à la région -103/-78 (motif MATE).Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 6. La partie A correspond aux extraits cellulaires de HL60, U937 et THP-1. Les extraits préparés à partir des extraits cellulaires de THP-1 sont traités avec du cycloheximide, comme décrit ci-dessus en rapport avec la figure 4 (piste 6). Un excès 5 fois molaire d'ADN compétiteur homologue (Comp. Co) est inclus dans la réaction de liaison pour démontrer la spécifité. La partie B correspond aux extraits cellulaires de HL60, U937, et Hela, incubés en présence de la même sonde. On contrôle la spécificité de la liaison en effectuant une pré-incubation de l'extrait de HL60 avec un excès 5 fois molaire, soit du fragment -103/-78 non marqué Co), soit du fragment -142/-45 (cl). Deux complexes spécifiques sont visibles sur la figure 6 A, à savoir MATE-BP1 et MATE-BP2, après incubation de la sonde avec l'extrait cellulaire préparé à partir des cellules de THP-1 traitées par 1'IFN & , ou non traitées (voir figure 8 A). Ces deux complexes sont affctés par un traitement au cycloheximide. Dans les deux autres lignées de promyélomonocytes étudiés, HL60 et U937, on ne détecte qu'un complexe MATE BP3. Celui-ci migre plus vite que les complexes avec MATE identifiés dans les cellules de THP-1. Un excès 5 fois molaire des motifs correspondants -103/-78 et -142/-45 (figure 6 B) ne permet pas de réduire l'activité de liaison, ce qui montre la spécificité du complexe. On remarque de plus que la sonde ne forme aucun complexe lorsqu'elle est incubée avec des extraits cellulaires de Hela (figure 6 B). Ces résultats confirment que l'expression restreinte du gène R dans les seules cellules hématopoïétiques dépend de la liaison de facteurs constitutifs spécifiques du motif MATE de 25 pb. 6. VECTEUR D'EXPRESSION RENFERMANT DES SEQUENCES SELON L'INVENTION On rapporte sur la figure 8 une construction nuléotidique comportant des séquences de l'invention associées à un gène de résistance à la néomycine. L'introduction de cette construction dans des cellules permet de leur conférer une expression IFN-dépendante. GIRE3 = (BamHI/BamHI)3 = 120 bp 53-30 = Extrémités BamHI-BgIII = 100 bp GIRE 53-30 = Taille = 300 bp ENSCHAINEMENTE I LISTE DES SEQUENCES DE NUCLEOTIDES -206 # TCAGAGATTC AAACTGGGAG AGATGGGCTA ACAGGTATGA GCATGGGAAA -165 -140 -128 # # # AGCATGTTTC AAGGATTTGA GATGTATTTC CCAGAAAAGG AACATGATGA -107 -103 97 -83 -82 -78 # # # ## # AAATGGTCAG AAAAGGCAAT TTCCTTCCTC TTTTCTAATT TGGCTCTGGA -45 # GCCACCAGCA GAACCTCTTC AATATCTTGC ATGTTACAGA TTTCACTGCT -1 # CCCACCAGCT TGGAGACAAC ATG TGG TTC TTG ACA ACT CTG CTC ENCHAINEMENT II : AATTTCCTTCCTCTTTTCTAATTTGG ENCHAINEMENT III : T T T T TTCCTTCC XT T C C C C ENCHAINEMENT IV : CCC T CTTTTC TTT C ENCHAINEMENT V GCATGTTTCAAGGATTTGAGATGTATTTCCCAGAAAAGGAAC REVENDICATIONS 1. Séquences de nucléotides, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une ou plusieurs régions de l'enchaînement I de nucléotides, cette ou ces régions constituant une cible spécifique pour des facteurs protéiques présents seulement dans les cellules hématopoïétiques, cette présence ne dépendant pas de l'IFN ss , le ciblage des séquences par ces facteurs conduisant à la formation de complexes tels qu'identifiés par électrophorèse sur gel. 2. Séquences de nucléotides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par au moins une partie de l'enchaînement II, le cas échéant sous forme multimérique. 3. Séquences de nucléotides selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un ou. plusieurs des. enchaînements III ou IV. 4. Séquences de nucléotides selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles comportent ou qu'elles sont constituées par au moins un motif correspondant à une boîte PU répondant à 1" enchaînement GAGGAA. 5. Séquences de nucléotides selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles comportent ou qu'elles sont constituées par au moins un motif TCTTTTC. 6. Facteurs protéiques, caractérisés en ce qu'ils sont non inductibles par 1'IFS , qu'ils pré-existent seulement dans les cellules hématopoïétiques, et qu'ils forment des complexes, tels qu'identifiés en électrophorèse sur gel, avec les séquences de nucléotides, selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Les complexes tels qu'obtenus par ciblage des séquences de nucléotides, selon l'une des revendications 1 à 5, par les facteurs protéiques selon la revendication 6. 8. Séquences de nucléotides, caractérisées en ce qu'elles comprennent l'une des séquences selon les revendications 1 à 5, en association avec des séquences d'ADN contrôlant une induction, notamment, par l'IFNy 9. Séquences de nucléotides selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles comprennent, comme séquences d'ADN contrôlant l'induction par 1'IFN # , une ou plusieurs régions de l'enchaînement I de nucléotides, en particulier, une ou plusieurs régions constituant une cible spécifique pour des facteurs protéiques tels que présents dans les cellules hématopoïétiques ou non hématopoïétiques, traitées après par l'IFNt, ce ciblage conduisant à ia formation de complexes tels qu'identifiés par électrophorèse sur gel. 10. Séquences de nucléotides selon la revendication 8 ou 9, caractérisées en ce que les séquences contrôlant l'induction par 1'IFNg sont constituées par au moins une partie de l'enchaînement V, le cas échéant sous forme multimérique. 11. Séquences de nucléotides , caractérisées en ce qu'elles comportent, ou qu'elles sont constituées par des multimères de l'enchaînement V ou d'une partie de celui-ci, ou qu'elles sont formées par le motif AGAAAAG. 12. Facteurs protéiques spécifiques de l'enchaînement V, caractérisés en ce qu ils forment des complexes avec au moins une partie de cet enchaînement après leur activation par l'IFNg ces facteur préexistants dans les cellules hématopoïétiques ou non hématopoïétiques. 13. Les complexes tels qu'obtenus par ciblage , en présence d'IFNÊ. , des séquences de nucléotides contrôlant la réponse à l'IFNt , selon l'une des revendications 8 à 11. 14. Les anticorps polyclonaux dirigés contre les facteurs protéiques selon les revendications 6 ou 12, ainsi que les anticorps monoclonaux. 15. Vecteurs de transfert, caractérisés en ce qu'ils comprennent des constructions nucléotidiques comportant au moins l'une des séquences nucléotidiques selon les revendications 1 à 5 et 8 à 11, avec les séquences promotrices d'un gène donné. 16. Utilisation des vecteurs selon la revendication 15, pour le transfert de constructions nucléotidiques dans des cellules en culture d'un type donné, notamment dans des cultures de cellules hématopoïétiques, ou dans les cellules d'un tissu donné d'un animal. 17. Les cellules en culture modifiées à l'aide des vecteurs de la revendication 15. 18. Les animaux, à l'exclusion de l'homme, dont le génome a été modifié à l'aide des vecteurs selon la revendication 15. 19. Utilisation des vecteurs comprenant des constructions nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 11, pour le ciblage de l'expression de gènes d'intérêt dans un type cellulaire donné (cellules hématopoïétiques), ou d'un gène transféré dont les défauts d'expression sont liés à une pathologie. 20. Kit utilisable pour le ciblage de l'expression de gènes d'intérêt dans un type cellulaire donné, caractérisé en ce qu'il comporte des vecteurs selon la revendication 15 associés à des gènes de résistance à un antibiotique, ainsi que des drogues et antibiotiques, et le mode d'emploi pour l'établissement de lignées cellulaires transformées par les vecteurs. 21. Sondes pour détecter la présence de séquences complémentaires dans un échantillon biologique, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de séquences de nucléotides selon l'une des revendications 1 à 5 et 8 à 11. 22. Utilisation des anticorps selon la revendication 14 comme bioréactifs, pour la détection in vitro de la présence des facteurs selon la revendication 6 ou 12 dans un échantillon à étudier, cette détection comprenant - la mise en contact de cet échantillon avec une préparation d'anticorps, ou d'un fragment de ces derniers immobilisés sur un support non immunogene, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec les facteurs, - la mise en évidence de la formation du complexe. 23. Kit pour la détection in vitro de la présence de facteurs selon la revendication 6 ou 12 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps, ou de fragments de ces derniers, libres ou immobilisés, - une préparation de facteurs selon la revendication 6 ou 12 avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.