FR 2696190 A1 19940401 FR 9211470 A 19920925 ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UNE a-ACETOLACTATE SYNTHASE ET SES APPLICATIONS L'invention concerne un acide nucléique codant pour une a-acétolactate synthase ainsi que les vecteurs contenant cet acide nucléique et l'utilisation de ces derniers pour transformer des microorganismes chez lesquels la production d'a-acétolactate et de diacétyle sera favorisée. Le diacétyle est un arôme recherché dans la production de produits alimentaires comme le beurre, la crème fraîche et certains fromages. A l'inverse, cet arôme est indésirable dans la production d'autres produits alimentaires comme la bière. Un nombre restreint de bactéries, telles que Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacétylactis, ainsi que les bactéries des genres Leuconostoc, Pediococcus lactobacillius produisent naturellement du diacétyle, cette production se fait à partir d'un substrat présent dans le lait en faible quantité, le citrate; ces souches bactériennes sont capables de métaboliser le citrate en pyruvate, lequel est ensuite transformé en acétoine et en diacétyle. L'a-acétolactate est aussi un intermédiaire de la voie de synthèse des acides aminés branchés que sont la leucine, l'isoleucine, et la valine. Cette voie a été très largement étudiée chez les bactéries, les champignons et les plantes (1, 2, 3, 4). . Toutefois, les séquences de l'ensemble des gènes impliqués dans cette voie chez un même microorganismes n'ont jamais été rapportées. La régulation de l'expression des gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés est complexe en raison des étapes communes pour la synthèse de ces trois acides aminés et cette voie est souvent présentée comme un modèle d'étude d'organisation et de régulation. L'organisation de ces gènes a été caractérisée chez Escherichia coli (3), Salmonela typhinium (3), Bacillus subtilis (5, 6, 7), Corynebacterium gluamicum (8) et Stanhylococcus aureus (9) Sur le chromosome de E. coli, les gènes sont localisés en trois groupes (10). Le plus grand, situé à 85 minutes, est organisé en une unité de transcription large et deux unités de transcription petites, comprenant respectivement les gènes ilvGMEDA, ilvy et ilvC (11, 12); un autre groupe situé à 2 minutes, est composé de deux unités de transcription, comprenant les gènes ilvH et leuACBD (13, 14), et le dernier groupe, à 82 min, regroupe les gènes ilvBN dans une unité de transcription unique. On rencontre une organisation similaire chez d'autres enterobacteriacae. Chez B. subtilis, on rencontre les gènes ilvBN et leuACBD dans une région du chromosome (5) et les gènes ilvAD dans une autre région. Trois fragments chromosomiques noncontigüs clonés de C. glutamicum portent cinq gènes de la voie de synthèse des acides aminés branchés ilvCBN, ilvA et ilvE (9) Chez S. aureus, la cartographie génétique montre que huit gènes sont regroupés selon l'ordre suivant ilvABCD, leuABCD. La synthèse des acides aminés branchés, la leucine, l'isoleucine et la valine chez L. lactis subsp. lactis est une voie complexe faisant intervenir huit enzymes, dont quatre sont communes à la synthèse des trois acides aminés précédents. La synthèse de la valine fait intervenir uniquement ces quatre, alors que la synthèse de l'isoleucine et de la leucine fait intervenir respectivement une et quatre enzymes spécifiques supplémentaires. En outre, ce système est compliqué par le fait que l'excès de l'un des trois acides aminés interfère dans la synthèse des autres acides aminés. La présente invention a pour objet le clonage, la caractérisation et le séquençage des gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés chez L. lactis subsp. lactis. Ce travail a été réalisé à partir de la souche NCD02118 (AFRC, Institute of Food Research Reading Laboratory, Shinfield, Reading Berks, Royaume-Unis). Les gènes ont été caractérisés par clonage, complémentation chez E. coli et B. subtilis et analyse de séquence. Neuf gènes de structures sont assemblés sur un fragment d'ADN de 12 kb selon l'ordre suivant : leuABCDilvDBNCA. Parmi ces gènes, l'invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour deux polypeptides formant les sous-unités d'une protéine possédant une activité a-acétolactate synthase; cette enzyme présente un intérêt tout particulier puisqu'elle est responsable, chez L. lactis subsp. lactis, de la transformation directe du pyruvate en a-acétolactate indépendamment de la présence de citrate dans le milieu. Les techniques utilisées pour le clonage et le séquençage de l'acide nucléique de l'invention seront plus particulièrement décrites dans la description détaillée de l'invention. I1 sera fait référence dans ce qui suit aux aux tableaux et aux figures dans lesquels - le tableau I indique les souches bactériennes, les plasmides et phages utilisés pour le clonage des gènes de L. lactis subsp. lactis impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés; - le tableau II représente la comparaison des protéines impliquées dans la voie de synthèse des acides aminés branchés entre L. lactis subsp. lactis et différents microorganismes; - la figure 1 représente la structure de la région d'ADN de L. lactis subsp. lactis portant les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés;; - la figure 2 représente la séquence nucléotidique ainsi que la séquence polypeptidique, déduite de cette séquence nucléotidique, de la région d'ADN de la souche NCDO2îî8 de L. lactis subsp. lactis portant les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés; - la figure 3 représente l'alignement de 6 protéines liant l'ATP avec ORF2 de L. lactis; - la figure 4 représente les structures secondaires du transcrit majeur servant d'atténuateur transcriptionel. Les travaux de recherche menés sur l'ADN de la figure 2, ainsi que sur le polypeptide déduit de ce dernier, conduisent aux observations suivantes - Dix gènes sont présents dans la région d'ADN de L. lactis subsp. lactis représentée à la figure 2 le gène leuA de 1539 nucléotide, situé entre les nucléotides 450 et 1988, et codant pour un polypeptide de 513 acides aminés; le gène leuB de 1041 nucléotides situé entre les nucléotides 2003 et 3037, et codant pour un polypeptide de 347 acides aminés; le gène leuC de 1380 nucléotides situé entre les nucléotides 3403 et 4782 et codant pour un polypeptide de 460 acides aminés; le gène leuD de 573 nucléotides situé entre les nucléotides 4805 et 5377, et codant pour un polypeptide de 191 acides aminés;; le gène orf2 de 606 nucléotiqes situé entre les nucléotides 5394 et 6170, et codant pour un polypeptide de 202 acides aminés; le gène ilvD de 1710 nucléotides situé entre les nucléotides 6295 et 8004, et codant pour un polypeptide de 570 acides aminés; le gène ilvB de 1725 nucléotides situé entre les nucléotides 8018 et 9742, et codant pour un polypeptide de 575 acides aminés; le gène ilvN de 474 nucléotides situé entre les nucléotides 9738 et 10211, et codant pour un polypeptide de 158 acides aminés; le gène ilvC de 1032 nucléotides situé entre les nucléotides 10260 et 11291, et codant pour un polypeptide de 344 acides aminés; le gène ilvA de 1323 nucléotides situé entre les nucléotides 11337 et 12659, et codant pour un polypeptide de 441 acides aminés; ; L'invention concerne tout acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 10211 de la figure 2, et codant pour une ou les deux sousunités d'une protéine capable de transformer le pyruvate en a-acétolactate. L'a-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis est une protéine constituée de deux sousunités; la première sous-unité est un polypeptide de 575 acides aminés codé par le fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 8018 et 9742 de la figure 2, et correspondant au gène ilvB; la seconde sous-unité est un polypeptide de 474 acides aminés codé par le fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 9738 et 10211 de la figure 2, et correspondant au gène ilvN. En conséquence l'activité a-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis n'est possible que si ces deux gènes sont exprimés. L'invention a plus particulièrement pour objet les fragments de l'acide nucléique précédent codant pour une ou les deux sous-unités d'une protéine susceptible de posséder les propriétés enzymatiques de l'oc-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis. Plus spécifiquement, l'invention concerne les acides nucléiques comprenant l'un ou l'autre ou les deux segments suivants - le premier segment correspondant au gène ilvB, délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 9742 de la figure 2, et codant pour le polypeptide de 1725 acides aminés correspondant à l'une des deux sous-unité de l'a-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis; - le second segment correspondant au gène ilvN, délimité par les nucléotides situés aux positions 9738 et 10211 de la figure 2, et codant pour le polypeptide de 474 acides aminés correspondant à l'autre sous-unité de l'a-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis. L'invention concerne aussi les acides nucléiques précédents dont les séquences sont modifiées, dès lors que les polypeptides codés par ces acides nucléiques conservent leurs propriétés enzymatiques du type a-acétolactate synthase. De telles modifications, de manière non limitative, conduisent par exemple à des acides nucléiques variantes qui se distinguent de l'acide nucléique de l'invention par addition et/ou suppression d'un ou de plusieurs nucléotides et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides. Ainsi, l'invention concerne encore les séquences d'ADN codant pour 1' a - acétolactate synthase de la voie de synthèse des acides aminés branchés de bactéries du genre lactococcus, telles que L. pîantarum, L. rafinolactis et L. lactis comme L. lactis subsp. cremoris; lesquelles séquences d'ADN présentent une forte homologie avec la séquence nucléique d'ilvBN. Avantageusement, ces séquences d'ADN sont identifiées, le cas échéant sélectionnées, par hybridation génétique avec une- ou plusieurs sondes nucléiques issues des séquences des acides nucléiques précédents, dans des conditions de stringence moyennes. A titre d'exemple, un procédé d'identification d'une telle séquence d'ADN comprend les étapes suivantes - extraction de l'ADN de la bactérie; - digestion de cette ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction, telle que EcoR1; - transfert des fragments d'ADN obtenus sur membrane de nitrocellulose; - hybridation avec la séquence complète d'ilvBN, dans une solution d'hybridation dont la composition est : 6 X SSC, environ 10 % formåmide, 5 X Denhardt, 100 ml de tampon phosphate pH7. L'invention concerne également les polypeptides comprenant tout ou partie des séquences polypeptidiques codées d'une part par la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 9742 de la figure 2, et d'autre part, par la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 9738 et 10211 de la figure 2; ces deux polypeptides constituant les sous-unités d'une protéine possédant les propriétés enzymatiques de 1'a-acétolactate synthase de L. lactis subsp. lactis L'invention a aussi pour objet toute séquence polypeptidique issue de chacune des séquences des polypeptides précédents, dès lors que la protéine constituée de ces polypeptides posséde des propriétés enzymatiques du type de celle de lla - acétolactate synthase. Les polypeptides précédents peuvent être modifiés dès lors qu'il conservent les propriétés enzymatiques définies précédemment. Par exemple, de manière non limitative, des polypeptides entrant dans le cadre de l'invention peuvent se distinguer des ceux définis ci-dessus par addition et/ou suppression d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou modification d'un ou plusieurs acides aminés. L'homme du métier dispose des moyens lui permettant d'identifier ceux des polypeptides de séquences plus courtes qui entrent dans le champ de l'invention. Un moyen général lui permettant de procéder à cette identification, consiste à traiter chacun des polypeptides précédents avec une protéase clivant les polypeptides au niveau d'un site précis, puis de séparer les fragments obtenus et de les tester pour leur activité enzymatique vis-à-vis du pyruvate. Un autre moyen permettant d'identifier des régions des polypeptides essentielles à l'activité aacétolactate synthase consiste à cliver les acides nucléiques correspondant aux gènes ilvB et ilvN, par exemple à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction, avant leur introduction dans l'hôte cellulaire ou le vecteur d'expression utilisé pour la production d'une protéine présentant une activité aacétolactate synthase. L'acide nucléique tronqué peut ainsi être testé, pour sa capacité à exprimer effectivement un produit possédant une activité a acétolactate synthase, ou au contraire ne la possédant plus. L'invention a aussi pour objet tout acide nucléique recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique du type sus-indiqué codant pour l'aacétolactate synthase associée avec au moins un promoteur et/ou un terminateur de transcription reconnu par les polymérases de l'hôte dans laquelle ledit acide nucléique recombinant est introduit. L'introduction de l'acide nucléique recombinant peut être réalisée à l'aide de vecteurs du type plasmide aptes à se répliquer dans le microorganisme hôte et à y permettre l'expression de la séquence codant pour l'enzyme, ou encore l'acide nucléique recombinant peut être introduit directement dans le génome par des techniques du génie génétique connues de l'homme du métier. Les microorganismes hôtes dans lesquels l'acide nucléique recombinant est susceptible d'être introduit sont préférentiellement des cellules procaryotes telles que Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, mais peuvent être aussi des eucaryotes comme les levures. Plus particulièrement, l'invention concerne tous microorganismes pouvant être utilisés comme levain dans un processus agroalimentaire, dans lesquels l'acide nucléique recombinant de l'invention est introduit en vue d'obtenir une surproduction de diacétyle dans un produit agroalimentaire, tel que des dérivés de produits laitiers, lactosérums fermentés, fromages frais, etc... Avantageusement, l'introduction de l'acide nucléique recombinant de l'invention chez les bactéries L. lactis est combinée à une inhibition de l'enzyme responsable chez ces bactéries de la transformation de l'acétolactate en acétoine ( 1 (lla-acétolactate décarboxylase), et/ou de l'enzyme impliquée dans la transformation du pyruvate en lactate (lactate dehydrogenase), afin d'augmenter le pool d'acétolactate conduisant au diacétyle. L'inhibition de ces enzymes peut être réalisé par tous moyens chimiques ou biologiques permettant d'augmenter le flux métabolique vers la production de diacétyle; un premier moyen biologique consiste en une délétion de tout ou partie des gènes sauvages codant pour ces enzymes; un second moyen biologique consiste à remplacer les gènes sauvages codant pour ces enzymes par des gènes mutés incapables d'exprimer les enzymes considérés. L'acide nucléique recombinant de l'invention peut aussi être introduit dans d'autres microorganismes, tels que les Bacillus, pour la production de diacétyle à des fins non agroalimentaires, par exemple en cosmétologie et comme antibactérien. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description qui suit, se rapportant d'une part au clonage à la caractérisation et au séquençage de la région de l'ADN de L. lactis subsp. lactis portant les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés, et d'autre part à l'introduction dans un hôte cellulaire d'un acide nucléique selon l'invention codant pour un polypeptide présentant une activité a-acétolactate synthase. I - CLONAGE DES GENES IMPLIQUES DANS LA SYNTHESE DES ACIDES AMINES CHEZ L. LACTIS SUBSP. LACTIS 1) Matériel et méthode a) Souches bactériennes, plasmides et milieux de culture Les souches bactériennes, plasmides et phages utilisés pour le clonage des gènes sont rapportés dans le tableau I ci-après. Tableau I Souches et Caractéristiques Références plasmides bibliographiques ou sources L. Lactis subsp. lactis NCDO2118 isolat naturel NCDO B. subtilis CU740 leuA5 trpC2 (SPss) (7) CU741 leuC7 trpC2 (7) CU315 leuD117 trp2 (SPss) (15) IL2685 leuB6 trpC2 ilvA r-/m- CmR MTll9 leuB6 trpC2 r-/m (16) GSY184 ilvC1 trpC2 (17) IL3151 ilvD4 leuB6 r-/m+ 1012 leuA8a metb5 r-/m+ (18) GSY276 ilvD4 trpC2 (17) E. coli CU518 leuA371 (19) CU514 leuB401 (19) CU520 leuC171 (19) CU526 leuD101 (19) AB1255 tonA2 lacY1 tax-5 supE44 (20) gal-6 - hisG1 rpsL8 malAl xyl-7 mtl-2 ilvA201 metB1 argH1 thi-l FD1062 ara-14 ilv614 ilvH612 #- glyA18 relA1 spoT1 ilvB619 bglR20 rbs-5:::tn5 ilvG468 (ilvG+) thi-l JP58 galK2 X rpsL704 xyl-5 mtl-1 (21) ilvC7 argE3 thi-l TG1 supE thi D(lac-proAB) hsdDS F+ (22) traD36 proAB lacI z#15 Plamides pIL253 ~ EmR, 4.9-kb (23) Tableau I (suite) Souches et Caractéristiques Références plasmides bibliographiques ou sources pHV438 Hybride entre pBR322, le gène CmR (42) de pC194, thyB et les segments X de l'ADN de B.Subtilis pIL371 Fragment Sau3A de 9.2-kb du du chromosome de L. lactis dans pIL253 pIL373 Fragment Sau3A de 4.5-kb du du chromosome de L. lactis dans pIL253 pIL374 Fragment Sau3A de 8.5-kb du du chromosome de L. lactis dans pIL253 pIL384 Fragment Sau3A de 13-kb du du chromosome de L. lactis dans pIL253 pIL389 Fragment gauche Sau3A de 7.5-kb de pIL384 dans pBS pIL500 Fragment XbaI de 18.5-kb du du chromosome de L. lactis dans pIL253 pIL505 Fragment droit SmaI-Sau3A de 6,5-kb de pIL384 dans pBS pIL253 Fragment gauche Sau3A-ExoIII de 2.5-kb de pIL384 pBluescript ApR, M13 ori, pBR322 ori (Stratagene) La souche L. lactis subsp. lactis IL1403 a été cultivée à 370C sur un milieu M17 (25) dans lequel le lactose a été remplacé par le glucose. Escherichia coli a été cultivé sur un milieu Luria-Bertani (LB) ou dans le milieu minimun M9 (26) à 370C. Bacillus subtillis a été cultivé sur un milieu à 370C sur un milieu LB ou dans un milieu minimum Spizizen-salt supplémenté avec les acides aminés appropriés. Si nécessaire, de l'erythromycine (5 Ag/ml pour L. lactis subsp. lactis ou 0,3 Fg/ml pour B. subtillis), de l'ampicilline (50 g/ml pour E. coli) ou de la tétracycline (10 g/ml pour E. coli) sont ajoutés au milieu. b) Clonage moléculaire et manipulation d'ADN Les plasmides et 1'ADN chromosomique ont été préparés selon les techniques connues de l'art antérieur (26, 27, 28, 29). La transformation des cellules E. coli a été réalisée soit par une procédure standard CaCl2 (36) ou par electroporation (30). L'induction de la compétence et la transformation des cellules de B. subtillis ont été réalisée comme décrit par Anagnotopoulos et Spizizen (31), avec quelques modifications (32). Les Southern blots et les hybridations d'ADN ont été réalisés comme décrit par Maniatis et al. (26) . Les sondes nucléique ont été préparées en utilisant du (a32P)-dCTP et un kit de nick translation conformément aux recommandation du fournisseur. Les autres techniques moléculaires ont été mises en oeuvre comme décrit par Maniatis et al. (26). c) Analyse de la séquence d'ADN Les clones d'E. coli mis en oeuvre pour le séquençage ont été obtenus par sous-clonage de fragments d'ADN dans les plasmides de la famille pBluescript et en utilisant l'exonucléase III et la nucléase "mung bean" de la Société Stratagene, afin de générer une série de clones contenant des fragments d'ADN se recouvrant. L'ADN a été ensuite séquencé en utilisant le kit "Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing" et le "Sequencer 370A" commercialisés par la Société Applied Biosystem. Les séquences nucléotidiques et polypeptidiques ont été analysées avec les logiciels "BISANCE" et "GCG" de l'Université du Wisconcin. Les séquences protéiques ont été alignées avec un logiciel "MULTALIN" (33). Les séquences nucléiques ont été déterminées sur les deux brins. De manière restrictive, les souches de B. subtilis mutées au niveau du gène ilvA ont été préparées en transformant les cellules compétentes MT119 avec pHV438 (34) en CmR. L'intégration de ce plasmide dans le chromosome par double crossing over remplace le gène ilvA par le gène CmR (24). Un clone représentatif ilvA leuB6 r-/m- CmR est désigné IL2685. Un double mutant ilvD4 leuB6 de B. subtilis a été construit par transformation, en utilisant l'ADN de GSY276 pour transformer des cellules compétentes 1012 en cellules prototrophes pour la méthionine. Les cellules transformées ont été ensuite testées pour leurs besoins en isoleucine et leucine et pour l'absence de restriction par titration du phage rho. Un clone ilvD4 leuB6 r-/m+ a été désigné IL3151. 2) Clonage des gènes L'ADN total de L. lactis subsp. lactis NCDO2îî8 a été partiellement digéré avec l'endonucléase Sau3Al. 20 Rg des segments d'ADN de taille supérieure à 10 kb ont été ligaturés à 10 g d' d'ADN de vecteur plamidique pIL253 clivé par BamHI, à une concentration finale de 500 Rg/ml. Le mélange ligaturé a été utilisé pour transformer les cellules compétentes de la souche B. subtilis mutante leuB6 ilV4, IL3151 en cellules isoleucine indépendantes. Quatre transformés étaient également EmR et contenaient des plasmides de 18 , 14,2 13,5 ou 9,5 kb désignés respectivement pIL384, pIL371, pIL374 et pIL373. Selon une expérience similaire, l'ADN de L. lactis subsp. lactis clivé par Xba-I a été cloné dans pIL253, en utilisant la souche IL2685 de B. subtilis ilvA mutante comme receveur. Les transformés ont été sélectionnés sur un milieu minimum enrichi en leucine et tryptophane mais dépourvu d'isoleucine. Deux clone EmR Ile+, contenant un plasmide apparemment identique de 23,5 kb, désignés pIL500, ont été obtenus. 3) Expériences de complémentation Les segments d'ADN clonés ont été utilisés pour complémenter dans B.subtilis des mutants leu et ilv, et dans E.coli après sous clonage dans pBluescript. Les résultats concernant ces travaux sont rapportés dans la figure 1. La figure 1 représente la structure de la région d'ADN portant les gènes des enzymes impliquées dans la voie de synthèse des acides aminés branchés chez L.îactis. Dans cette figure, les barres ouvertes représentent les segments utilisés pour les expériences de complémentation chez B.subtilis et E.coli. Ces segments sont portés par les plasmides indiqués dans la figure; lesquels ont été construit, comme décrit dans le tableau I précédent. Les résultats des expériences de complémentation avec les mutants listés dans le tableau I, sont représentés par (+) et (-), se référant à la croissance ou à l'absence de croissance sur le milieu de culture, dépourvus des aminoacides correspondants.On a également représenté dans le bas de la figure 1, l'organisation de la région d'ADN portant les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés (orfl, leuA, leuB, leuC, leuD, orf2, ilvD, ilvB, ilvN, ilvC, ilvA); pl et p2 indiquent les promoteurs de transcription et tl le terminateur de transcription. Le cadre ouvert entre pl et tl représente le peptide leader. Dans ces expériences de complémentation, la nomenclature de E.coli a été utilisée, les gènes leuB et leuC de E.coli correspondent respectivement aux gènes leuC et leuB de B.subtilis, et les trois isoenzymes de l'acétolactate synthase et de l'acétohydroxyde synthase codés par ilvBN, ilvIH et ilvGN dans E. coli, correspondent à une seule enzyme codée par ilvBN dans B. subtilis. Les gènes leuA, leuB, leuC, ilvD, ilvA complémentent les mutations correspondantes chez B. sbti1is; les gènes leuA, leuB, leuC, leuD et ilvC complémentent les mutations correspondantes dans E. coli. Ces résultats sont suffisants pour identifier neuf gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des acides aminés branchés chez L.Lactis subsp. lactis. 4) Séquences nucléotidiques des gènes La séquence nucléotidique d'une région de 12,720 pb a été déterminée. Cette séquence est indiquée à la figure 2. Une analyse informatique, selon la méthode de Griskov et al. (35) révèle dix phases de lecture ouverte (ORF) d'une taille supérieure à 200 pb. Chaque ORF est précédé par un site de fixation de ribosome, complémentaire à l'extrémité 3' de l'ARNr 16S de L. Lactis subsp. lactis (36). Tous les ORF commencent par le codon ATG à l'exception du second, lequel commence par le codon TTG, de plus quatres motifs répétés de 72pb sont présents entre le second et le troisième ORF. La figure 2 représente la séquence nucléotidique et la séquence polypeptidique déduite de cette séquence nucléotidique de la région d'ADN codant pour les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés de la souche L.Lactis NCDC2lî8; les nombres à droite indiquent la position des nucléotides; les noms des gènes sont indiqués au commencement de chaque séquence d'acides aminés; les codons d'arrêts de la transcription ainsi que les sites de fixation des ribosomes sont indiqués respectivement par (*) et RBS; les séquences consensus "-10" et "-35" des promoteurs sont soulignés; des motifs répétés inversés, lesquels peuvent constituer les "préampteurs" et "terminateurs" sont numérotés respectivement (1, 2) et (5, 6), ceux susceptibles de former les "antiterminateurs" sont numérotés (3 et 5), (voir à la figure 4 ci-après); la flèche (----- > ) indique le motif répété direct de 72 pb, les caractères gras indiquent les motifs répétés inversés de 6-pb qu'il contient. 5) Attribution des ORF Les protéines déduites des dix ORF ont été comparées avec les bases de données de protéines GENPRO et NBRF. Des homologies significatives ont été identifiées pour dix ORF, neuf d'entre elles correspondent aux gènes impliqués dans la voie de synthèse des acide aminés branchés, comme l'indique le tableau II ci-après. Tableau II Microorganisme %a d'acides aminés identiques Références LeuA LeuB LeuC LeuD IlvD IlvB IlvN IlvC IlvA bibliographiques E. coli ~b - - 46 42 42c 43e 37f (38) 40g Salmonella 41 - 49 - - - - - - (39, 40) typhymurium Bacillus - 53 - - - - - - 50 Genbank (41) subtilis Bacillus - 53 - - - - - - - (42) coagulans Thermus - 42 - - - - - - - (43) aquaticus Sacchharomyces 25 46 50i 52i - 41 - 33 38 (44, 45, 46, 47, cerevisiae 48, 49) Phycomyces - - soi 49; ; - - - - S- (50) blakesleeanus Mucor - - 49 - - - - - - (51) circinelloides Dans le tableau Il - (a) indique que le pourcentage a été calculé en utilisant un logiciel (52) à partir du pourcentage d'identité divisé par la taille de la protéine la plus petite; - (b) indique les séquences non disponibles - (C) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvB; - (d) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvN; - (e) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvI; - (f) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvH; - (g) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvG; - (h) indique la comparaison avec l'acide nucléique IlvM; - (i) extrémité N-terminale de Leul; - (i) extrémité C-terminale de Leul. En outre, deux gènes détectés par complémentation, le gène ilvB (homologue à ilvB, ilvI et ilvG de E.coli), et le gène ilvN (homologue à ilvH de E.Coli) pour lesquels des données de complémentation non pas été obtenues, ont été identifiés. La plupart des protéines de L. lactis ont une taille similaire à celles de leurs homologues. Toutefois, trois exceptions ont été observées. Par rapport aux protéines de E. coli, les protéines lactococcales IlvA et IlvC sont dépourvues respectivement des acides aminés C-terminaux 73 et 147, et IlvD présente une délétion de 36 acides aminés. L'un des ORF, désigné ORF2, code pour une protéine ne présentant aucune homologie avec les enzymes de la voie de synthèse des acides aminés branchés, mais porte deux régions conservées dans une superfamille de protéines fixant l'ATP (53). La figure 3 représente l'alignement de 6 protéines liant l'ATP avec la séquence ORF2 de t. lactis. Le logiciel de Needleman a été utilisé pour obtenir ces résulats (54). Dans la figure 3 - les domaines de fixation (53) sont représentés par NB1 et NB2; - une courte séquence partagée par tous les membres de la famille ATP dépendante est mise en évidence par les symboles (&num;); - les symboles (*) indiquent les acides aminés communs à toutes les protéines; - les symboles (.) indiquent les substitutions conservées; - les acides aminés représentés en caractères gras sont présents dans au moins cinq protéines; - les chiffres à gauche indiquent la position des acides aminés et les chiffres entre paranthèses indiquent la taille des protéines; - les fonctions des différentes protéines sont représentées de la manière suivante (1), nodulation chez Rhizobium leguinosarum (55); (2), transport du maltose chez E. coli (56);; (3), transport de la glutamine chez E. coli (57); (4), transport de la glycine, de la bétaine et de la proline chez E. coli (58); (5), sécrétion de l'hémolysine chez E. coli (59); (6), sécrétion de la cyclolysine chez Bordetella pertussis (60). L'organisation des segments séquencés est présentée à la figure 1. Tous les gènes, à l'exception du premier, en amont de leuA (ORF1), sont transcrits dans la même direction. Les gènes leu et ilv sont regroupés, et les deux groupes sont séparés par 121 pb. Les gènes leu sont séparés par moins de 19 pb, à l'exception de leuB et leuC qui sont séparés par quatre répétitions directes de 72 pb. La distance entre les gènes ilv est comprise entre entre environ 10 et 42 pb, à l'exception de de ilvB et ilvN qui sont séparés par 9 pb. 6) Signaux transcriptionnels Les séquences conforment aux motifs consensus des promoteurs lactococcus ont été identifiées en amont des ensembles de gènes leu et ilv (voir les positions de pl et p2 dans la figure 1). La région entre pl et leuA ressemble fortement aux régions de régulation des opérons de biosynthèse d'acides aminés controlés par atténuation (61). Le transcrit initié en pl peut suivre deux chemins. L'un conduit à la formation d'un "terminateur" de transcription rho-indépendant (comme indiqué à la figure 4A). En poutre, le transcrit porte un message de 51 pb, commençant par un codon ATG et se finissant par un codon TAG, lequel détermine un peptide leader de 16 acides aminés, dont quatre sont une succession de leucine et d'isoleucine (comme indiqué à la figure 4B).Le ribosome disposer au niveau des codons Leu et Ile prévient la formation du signal de terminaison et conduit à la transcription des gènes leu en aval. Les "terminateurs" de transcription indépendants n'ont pas été trouvés entre les deux ensembles de gènes ou en aval du gène ilvA. 7) Organisation de l'opéron ilv Les gènes impliqués dans la voie de synthèse des acides aminés branchés chez L. lactis subsp. lactis, sont organisés en un large ensemble divisé en deux unités regroupant les gènes leu et ilv. Les deux unités sont nécessaires pour la synthèse de la leucine, alors que seulement la seconde est requise pour la synthèse de l'isoleucine et de la valine. Une transaminase, impliqué dans la dernière étape de la voie de synthèse des acides aminés branchés (produit du gène ilvE chez E. coli), n'est pas codée par l'ensemble. Ceci sous-entend que cette réaction est réalisé par une transaminase non spécifique, ou bien, que le gène correspondant chez U lactis subsp. lactis se trouve ailleurs sur le chromosome. Les gènes leu et ilv sont tous deux précédés par un promoteur, toutefois, il ne sont pas séparés par un "terminateur" de transcription indépendant, ce qui suggère qu'ils forment un opéron unique. Le quel opéron s'étend au dela du dernier gène de biosynthèse, ilvA. 8) Régulation de l'opéron ilv L'analyse de la séquence suggère fortement que l'opéron est régulé par un mécanisme d'atténuation, dont le médiateur est un peptide leader riche en leucine. Ce peptide est très proche du peptide leader de l'opéron leu de E. coli et de S. typhimurium (62, 63), mais diffère de celui des opérons ilvBN et ilvGMEDA de E. coll. La figure 4 représente les structures secondaires du transcrit leader susceptible d'intervenir comme médiateur dans l'atténuation transcriptionelle - en A, on a repésenté la configuration de terminaison, les motifs (1) et (2) sont appariés et les motifs (5) et (6) forment un terminateur de transcription; - en B, on a représenté la configuration anti-terminaison, les motifs (3) et (4) sont appariés, lesquels masquant les motifs (5) et (6). Dans la figure 4, les nucléotides en gras indiquent la séquence codant pour le peptide leader, les nucléotides en italique et en gras indiquent les sites de fixation du ribosome du peptide leader et le gène leuA. L'encombrement du ribosome au niveau des résidus successifs Leu et Ile pourrait masquer le motif (1) et favoriser cette configuration. Les modèles courrants proposent que la force de l'atténuation soit dépendante de la charge de l'ARNtleu durant la traduction du peptide leader. La présence de codons rares augmente la réponse à la privation de leucine en augmentant la durée de l'encombrement du ribosome. Chez E. coli, le codon correspondant aux quatre résidus leucine présents dans le peptide leader est CUA, lequel correspond à seulement 2 % des codons de la leucine utilisés pour les protéines de cet organisme (64). Au contraire, le codon de la leucine UUG, rencontré trois fois dans le transcrit leader de la voie de synthèse des acides aminés branchés chez L. lactis, correspond à 24 % des codons de la leucine dans les protéines de L. lactis (65).Le codon de l'isoleucine est également présent dans le peptide leader de L. lactis, suivant de très près les codons Leu, ce qui ntest pas le cas chez E. coli, et peut donc affecter la réponse de l'opéron à un arrêt de la voie de synthèse des acides aminés branchés. D'autres études sont nécessaires pour déterminer si le modèle proposé pour la régulation chez E. coli peut être appliqué directement à L. lactis. 9) La phase de lecture ouverte ORF2 ORF2, dans la mesure où il corresponds à un produit appartenant à la superfamille des protéines fixant l'ATP, n'est pas un gène de biosynthèse dans la voie synthèse des acides aminés branchés. Les protéines de cette superfamille se rencontrent tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes, et partagent une organisation de base similaire (66, 67) . Chez les procaryotes, la plupart des membres de cette superfamille sont des composants des sytèmes de transport qui impliquent des protéines periplasmatiques de fixation. Ces gènes sont généralement cotranscrits avec d'autres gènes (67), et n'ont jamais été trouvés dans l'opéron de biosynthèse.D'autres travaux sont nécessires pour établir la fonction de ORF2, mais sans doute celui-ci est impliqué dans le transport de la chaîne de synthèse des acides aminés branchés, ou dans la régulation des gènes de cette voie. L'isoleucine, la leucine et la valine représentent 20 % des acides aminés de L. lactis (68), alors que le tryptophane et l'histidine, deux autres acides aminés dont les voies de biosynthèse chez L. lactis ont été étudiées représentent moins de 2 t. Ceci suggère qu'une régulation fine de l'expression des gènes de la voie de synthèse des acides aminés branchés est nécessaire. II - INTRODUCTION D'UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UNE a-ACETCLACTATE SYNTASE DANS UN HOTE L'acide nucléique constitué de la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 7977 et 10246 de la figure 2 et codant pour les polypeptides IlvB et IlvN est amplifié par la réaction en chaîne de la polymérase Taq à partir de 1' ADN de la figure 2, et à l'aide de deux oligonucléotiqes situés en amont et en aval de la séquence nucléique codant pour IlvBN. Les deux oligonucléotides suivants ont été utilisés CTAGTGAAGGTTGCGTTACA TGCCATTTTTGTTTCCTCTA Après réaction en chaîne de la polymérase, le produit de la réaction est cloné dans un vecteur d'expression comme pIL252, pIL253, pWV01, contenant un promoteur tel que la promoteur de l'operon lactose, de l'operon tryptophane, et éventuellement un terminateur. Après clonage dans l'orientation appropriée du segment amplifié, le plasmide obtenu est introduit par transformation dans une souche de L. lactis telle que IL1403 ou MG1363, laquelle exprime IlvBN à un niveau élevé. Il en résulte en détournement d'une partie du pool de pyruvate obtenu après la glycolyse vers l'&alpha;- acetolactate précurseur du diacétyle. Références 1 - Calvo, J. M. 1983, p. 267-284. In Herrman, K. M. Somerville, R. L. (eds.) Amino acids, biosynthesis and genetic regulation, Addison-wesley, Reading, Mass. 2 - Kohlhaw, G.B. 1983, p. 285-299. In Heerrmman, K.M. and Somerville, R.L. (eds.) Amino acids, biosynthesis and genetic regulation, Addison-Wesley, Reading, Mass. 3 - Umbarger, H.E. 1983. p. 245-266; in Herman, KM. ans Zomerville, R.L. (eds.) Ammino acids, biosynthesis and genetic regulation, Addison-Wesley, Reading, Mass. 4 - Umbarger, H.E. 1987. p. 353-367. In F.C. Neidhardt, J.L. Ingraham, KB. Low, B. Magasanik, M. Schaechter and H.E. 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REVENDICATIONS 1) Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 10211 de la figure 2, et en ce qu'il code pour une ou les deux sous unités d'une protéine capable de transformer le pyruvate en a-acétolactate. 2) Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 9742, et en ce qu'il code pour une sous unité d'une protéine capable de transformer le pyruvate en a-acétolactate. 3) Acide nucléqique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 9738 et 10211 de la figure 2, et en ce qu'il code pour une sous unité d d'une protéine capable de transformer le pyruvate en a-acétolactate. 4) Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 8018 et 9742 et la séquence d'ADN délimitée par les nucléotides situés aux positions 9738 et 10211, et en ce qu'il code pour les deux sous-unités d'une protéine capable de transformer le pyruvate en a-acétolactate. 5) Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4 associée avec au moins un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour un ou plusieurs signaux de terminaison de la transcription. 6) Vecteur recombinant capable de transformer une cellule hôte, ledit vecteur contenant au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 sous le contrôle d'élements de régulation permettant l'expression de cet acide nucléique dans la cellule hôte. 7) Procédé de transformation d'un microorganisme, notamment du type susceptible d'être utilisé comme levain, caractérisé en ce que l'on introduit directement dans 1'ADN dudit microorganisme au moins un acide nucléique selon la revendication 5. 8) Procédé de transformation d'un microorganisme, notamment du type susceptible d'être utilisé comme levain, caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme au moins un vecteur recombinant selon la revendication 6. 9) Microorganisme, notamment du type susceptible d'être utilisé comme levain, caractérisé en ce qu'il est transformé par au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5. 10) Microorganisme selon la revendication 9, caractérisé en ce que ses gènes codant pour la lactate dehydrogenase et/ou 1' a - acétolactate décarboxylase sont inactivés. 11) Protéine possédant une activité aacétolactate synthase, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un premier polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la figure 2 codée par l'acide nucléique selon la revendication 2, et d'un second polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la figure 2 codée par l'acide nucléique selon la revendication 3.