FR 2699930 A1 19940701 FR 9215975 A 19921224 La présente invention concerne des réactifs et un procedé pour le dosage d'éléments réactifs et autres cofacteurs de rédaction. Le premier but recherché a ete d'ameliorer le procédé de dosage des nucléotides (ATP, ADP, AMP) par bioluminescence en optimisant l'ensemble des paramètres influant sur la reaction finale. Cette optimisation peut avoir d'autres applications, par exemple pour l'étude des croissances bactériennes et pour toutes les recherches faisant intervenir 1'ATP telles que - Recherches d'organismes vivants, - Suivi de biomasse, - Suivi de fermentation, - Contrôle de stérilité, - Recherche de contamination en IAM et en biomédical. Une des difficultés principales rencontrées pour ltoptimisation réside dans le nombre des paramètres influants dont - Concentration relative de la luciférase et de son substrat, la luciferine. - Effet de la concentration de l'ensemble luciférase, luciférine sur la sensibilité du dosage. - Condition de conservation des tractifs. - Stabilité des tractifs. - Effets d'agents protecteurs. - Effets d'inhibition d'anions et de cations sur l'émission lumineuse. - Effets d'agents chélatants. - Effets des agents d'extraction (détergents). Pour résoudre ces difficultés l'inventeur a eu l'idée de proposer les éléments de la reaction sous forme solide ou liquide en quantité predosée et prête à l'emploi pour realiser une réaction unitaire que l'on nomme dosage unitaire" dans la suite du texte. Ainsi l'opérateur n'a pas de dosage à realiser, il lui suffit d'employer le nombre de dosages unitaires nécessaire au nombre de mesures à réaliser. Les erreurs de manipulations et le gaspillage des produits sont supprimes. Pour l'application décrite le système de determination de 1'ATP est une preparation sous forme de dosages unitaires de luciférase de luciole et de tous les enzymes, cofacteurs et tampons associés pour déterminer en une seule étape la quantité d'ATP présente dans un échantillon liquide. Plus généralement le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu'il consiste à realiser un dosage de tous les éléments nécessaires à une mesure unitaire et à les présenter sous une forme appelée dosage unitaire, facilitant leur stockage et propre à leur conservation. On comprendra mieux l'invention à l'aide de a description qui suit faite en référence aux figures annexées suivantes - Figure I : Tableau de répartition en 1 des solutions nécessaires pour le dosage de 1'ATP, de 1'ADP, et de 1'AMP dans un échantillon. - Figure 2 : Courbe d'étalonnage par quantité ajoutée d'ATP pour palier les interférences et les inhibitions de la matrice de l'echantillon. - Figure 3 et 4 : Courbes de détermination différentielle des ATP/ADP/AMP. - Figure 5 : Tableau de composition des solutions pour le dosage de 1'ATP, de 1'ADP et de 1'AMP. - Figure 6 : schéma de principe du procédé. A titre d'exemple non limitatif les réactifs retenus sont représentés par les formulations de préparation suivantes - Formulation 1 : Système enzymatique bioluminescent . Luciférine Luciférase + Tampon (TRIS,Mg2+ , pH,7,75) Les proportions des constituants du tampon ainsi que les quantités respectives de luceférine et de lucéférase sont - Complexe Luciferase-luciferine 100 mg d'abdomens de luciole 1-1,5 g de sable de fontainebleau et 0,5ml de tampon d'extraction constitué de 0,02 M TRIS 10 mM acétate de magnésium, 1 mM DTT, 0,1 azide de sodium, le tout à pH 7,8. - Formulation 2 : Témoin interne ATP + Tampon La quantité fixée est habituellement de 10 ng Présence aussi de phosphoennol pyruvate (pour réduire les manipulations). - Formulation 3 : Système de détermination de 1'ADP PYRVATE KINASE (5U) ADP pyruvate kinase > ATP Phosphoenol pyravate Enol pyruvate Phoenolpyruvate (=9 g/tube) + tampon - Formulation 4 : Conversion de 1'AMP 2AMP Myokinase ,2ATP 2ADP Pyruvate Kinase > 2ATP (voir formule 3) .ATP (pour amorcer la réaction = 5ng) .Myokinase (sur) .Pyruvate (5 J) .Phospoenolpyruvate (9 g/tube) + tampon - Formulation 5 : (à partir de la formule 1) ATP + Luciférine Luciférase > Oxyluciferine + AMP +PPi + C02 + hJ Ces formulations sont présentées sous une forme permettant un dosage unitaire, c' est-à-dire un dosage assurant une économie maximale de réactif. Les dosages retenus peuvent se faire selon deux procédés. Procédé n 1 La quantité stricte de solution de réactif pour un dosage est introduite dans des cuvettes adaptables aux équipements de mesure de commerce (bioluminomètre) puis lyophilisée. Le tube obtenu hermétiquement bouché est conservé en congélation. La stabilité minimum est de l'ordre de six mois. Pour l'utilisation le lyophilisa est réactive à l'eau dans les tubes de formules de 2 à 5. L'échantillon est introduit par l'intermédiaire d'appareillagés existants. Un volume connu du tube I est dispensé dans les tubes de formules de 2 à 5 lorsque ceux-ci sont positionnés dans la chambre noire de mesure. Cette injection est réalisée soit par l'intermédiaire d'une pompe, soit par l'intermédiaire d'une seringue. L'utilisation de l'échantillonnage interne permet ici de palier les interférences et les inhibitions dus à la matrice de l'échantillon. Pour les tubes de formules 3 et 4, une incubation est necessaire pour permettre la transformation de 1'ADP en ATP ou de 1'AMP en ADP puis en ATP. Procédé n" 2 Dans ce procédé, les solutions mères des formulations 1 à 4 sont lyophilisées séparément. Ensuite, en vrac les quantités voulues des formulations suivantes sont mélangées Formulation 1 + Formulation 2 = Composition 1 "ATP" Formulation 1 + Formulation 3 = Composition 2 "ADP" Formulation 1 + Formulation 4 = Composition 3 "AMP" A chacune de ces compositions la quantité nécessaire d'adjuvents de compactage est ajoutée. Le mélange solide est homogénéisé. Une quantité massive voulue est mise sous forme de comprimé pour un dosage unitaire. En pratique, pour un dosage, un comprimé est introduit dans une cuvette adaptable aux luminomètres du commerce. I1 est dissout dans la quantité voulue d'eau puis le tube est introduit dans le luminometre. Le volume adéquat d'échantillon est alors dispensé soit par seringue soit par pompe. Le signal obtenu est stable dans le temps. Ceci permet 1) l'étalonnage par quantité ajoutee d'ATP pour palier les interférences et inhibitions de la matrice de l'échantillon. (Voir figure 2). 2) la détermination différentielle des ATP/ADP/AMP selon les courbes des figures 3 et 4. 3) l'étalonnage sur les cas évoques en 2 ci-dessus. Le dosage proprement dit se deroule alors comme suit On distribue dans les tubes de mesure (LUMACUVETTES) les dosages unitaires soit de 1 'ATP, de 1 'ADP ou de 1'AMP comme le montre les tableaux de repartition des solutions ne.cessaires pour le dosage de 1'ATP, de 1'ADP et de 1'AMP dans un échantillon et etablit en figures 1 et 5. L'injection de l'extrait de nucléotides ou, dans le cas de nucléotides extracellulaires, de l'échantillon filtré assure l'homogénéisation du mélange. les tubes sont incubés à 20"C pendant une heure pour permettre la transformation complète d'AMP en ATP. La réaction de bioluminescence est déclenchée par l'injection, dans le tube de mesure, de 100 , 1 de la preparation de luciferase-luciferine et la luminescence émise est mesuree pendant 10 secondes. Chaque dosage est effectué en triple exemplaires. L'etalon interne d'ATP est construite de 10 6 M ATP dans le tampon de dilution des mucléotides. Un luminomètre pour la mise en oeuvre du procéde selon l'invention a été développe au travers d'une cooperation étroite entre les biotechnologistes et des électroniciens pour produire un appareil pour les essais bioluminescents. Ses qualités sont GRANDE SENSIBILITE : l'instrument comprend une photodiode silicone, avec un amplificateur et un microprocesseur pour mesurer l'intensité lumineuse au dessous de 10 12 watts à des longueurs d'ondes de 490-950nm. PORTABILITE : des batteries rechargeables fournissent l'énergie nécessaire au fonctionnement du luminomètre, qui avec un poids de 2,3 Kg est facilement portable. CONCEPTION : la lumière émise par la luciférase dans un essai type croit dans le temps avant de déroître. Le microprocesseur est capable de détecter et de lire l'intensité du pic lumineux. CARACTERISTIQUES : un système d'ouverture et de fermeture électromagnétique permet la réception ou non du signal lumineux issu de l'échantillon. Le mode manuel donne une lecture directe du signal toutes les secondes ; le mode automatique donne l'intensité du signal correspondant à la valeur du pic. Les dosages unitaires comprennent les enzymes et les cofacteurs nécessaires au dosage bioluminescent. La simplicité de l'essai permet leur utilisation en dehors de l'environnement du laboratoire et le luminométre portable a té conçu à cet effet. L'essai necessite des tubes en plastique (acrylique ou polystyrène) de diamètre 12,5 mm et de 51 mm de haut et une pipette capable de délivrer un volume de O à 200 jil. Le mode d'utilisation se déroule comme suit Un comprimé est place dans le tube et dissous dans de l'eau distillée sans ATP. Pour des mesures de grande sensibilité, un minimum de 150 pl est recommandé. Afin de faciliter la dissolution du comprime, celui-ci est broyé dans le tube avant l'addition d'eau. I1 est important d'éviter de secouer trop énergiquement car l'écume qui se forme affecte l'émission de lumière. L'immersion du fond du tube dans une cuve à ultrasons donne une dissolution complete en 60 secondes. Pour des mesures de sensibilité plus faible, 450 jil d'eau sont recommandes ce qui facilite la dissolution. Une fois le comprime dissous, 200 ul de l'analysat sont ajoutes dans le tube et celui-ci est placé dans le luminometre pour effectuer la mesure. Les comprimés sont conçus pour émettre de la lumière au bout de 5-10 secondes et ceci durant 5 minutes. Sur le mode d'intégration, un temps d'intégration de 99 secondes maximise la sensibilité. Pour une gamme de 0,1-100 micromolaires d'ATP, le pic de détection est le mieux adapté. Quand le pic est détecté, l'écran indique une valeur correspondant à la lumière mise (avec la valeur du bruit de fond soustraite) ; le contrôle de sensibilité peut être ajusté ainsi puisque cette valeur est directement liée à la concentration en micromoles d'ATP. Pour des mesures de plus grande sensibilité, dans la gamme 0,01-100 nanomolaires, le mode d'intégration est préférable. Le temps d'intégration est entre par le tableau de bord et la sensibilité de l'appareil est reglée au maximum (s=10). Le luminomètre contient un programme de standardisation interne. En entrant par le clavier le facteur de calibration fourni en même temps que les pastilles, la lecture en mode integration est donnée directement en unités choisies, soit en picogrammes d'ATP par ml sans le besoin d'une calibration ultérieure. Pour convertir en concentration de bactériens, la lecture doit être multipliee par 1000. Dans ce cas, on évite une calibration interne par addition ATP étalon à chaque echantillon. Les dosages unitaires peuvent être stockes dans des flacons fermes a -20 C pendant au moins un mois sans perte significative d'activité. Une calibration avant chaque manipulation est conseillée. Une fois dissous la solution peut être conservée à température ambiante une demi-journée sans perte d'activité. Les échantillons utilisés peuvent être classés en quatre categories selon la quantité et l'origine de 1 'ATP. - ceux contenant que des cellules microbiennes : préculture, boues activees, liqueur de fermentation, - ceux contenant des cellules somatiques et microbiennes, - ceux contenant un faible niveau de cellules microbiennes produits pasteurises, stérilisés, urine, sang... - ceux contenant un mélange de microorganismes où seule la détection d'un seul type est requise. Le procéde s'applique dans de nombreux domaines et chaque fois qu'il est indispensable de réaliser un dosage précis d'élément tout en conservant leurs proprietes par exemple - Dans l'industrie agroalimentaire Contrôle d'hygiène : la présente d'ATP non microbien sur une surface est indicatif de la présence de débris organiques, il indique l'hygiène générale mais pas forcement la présence de microbes, Estimation de la biomasse en présence ou non de promoteur de croissance, Fermentation : mesure de la concentration de biomasse en cours de fermentation par Trichoderma viride, Brasserie : détection et énumération rapide par les microorganismes utilisées en brasserie, Eau : recherche de contaminants. - Dans l'industrie pharmaceutique La méthode n'est pas encore normalise et n'est utilisée aujourd'hui que pour le contrôle des matières premières et des en-cours (HUSSENET, 1985). - Dans l'environnement Boues activées : contrôle de process, Eaux résiduaires industrielles : evaluation de l'efficacité d'épuration, Milieu marin : determination de la biomasse vivante, Sol : évaluation de l'activité microbienne, . Toxicité : indicateur de toxicité. - Dans l'industrie textile Contrôle de la dégradation des textiles. - Dans le milieu médical Détection de l'anémie hémolytique (alccolisme, cirrhose), Détermination de la quantité d'Antigènes, Bactériurie, Cytolyse et titrage d'antiserum, dermatologie : suivi du renouvellement des cellules de la peau, Détermination de la dystrophie musculaire, Quantification des reactions immunologiques, . Dépistage de l'infarctus cardiaque, évaluation de la suceptibilité microbienne des médicaments, évaluation des vitesses métaboliques, Plaquette dentaire : détermination de la biomasse vivante, Détermination de la viabilité : erytrocyte, spermatozoide, vaccin. La figure 6 est un tableau synoptique résumant le procede de dosage unitaire selon les deux voies "liquide" et "solide". -REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage d'un au moins des nucléotides (ATP,ADP,AMP) par réaction de bioluminescence dans une préparation comportant lesdits nucléotides, des éléments réactifs cofacteurs, des tampons, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser un dosage de tous les éléments necessaires à une mesure unitaire et à la présenter sous une forme appelée dosage unitaire, facilitant leur stockage et propre à leur conservation. 2. Procédé de dosage selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'on lyophilise séparément les éléments, on les mélange selon la composition souhaitée et on les presente sous forme de comprimé solide après addition d'adjuvents de compactage. 3. Procédé de dosage selon la revendication 1 caractérisé en ce qu on mesure et on réalise le dosage des éléments puis on lyophilise la solution, qui est ensuite conservée en congélation. 4. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est réalisé dans un luminomètre portable comportant un mode automatique qui donne l'intensité de la valeur de pic. 5. Réactif pour l'application du procédé selon les revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il se présente en quantité prédosée pour une mesure unitaire et sous une forme permettant sa conservation. 6. Réactif selon la revendication 5 caractérisé en ce que la quantité prédosée est un comprimé solide. 7. Réactif selon la revendication 5 caractérisé en ce que la quantité prédosée est un liquide conservé en congelation. 8. Reactif selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il est préparé selon une formulation de préparation choisie dans l'ensemble suivant - Formulation 1 : Système enzymatique bioluminescent Luciférine Luciférase + Tampon (TRIS,Mg2+ , pH,7,75) Les proportions des constituants du tampon ainsi que les quantités respectives de lucéférine et de lucéférase sont - Complexe Luciférase-luciférine 100 mg d'abdomens de luciole 1-1,5 g de sable de fontainebleau et 0,5ml de tampon d'extraction constitué de 0,02 M TRIS 10 mM acétate de magnésium, 1 mM DTT, 0,1% azide de sodium, le tout à pH 7,8. - Formulation 2 : Témoin interne ATP + Tampon La quantité fixée est habituellement de 10 ng Presence aussi de phosphoennol pyruvate (pour réduire les manipulations). - Formulation 3 : Système de détermination de 1'ADP PYRVATE KINASE ( 5-r) ADP pyruvate Kinase > ATP Phosphoenolpyravate Enolpyruvate Phoenolpyruvate (=9 g/tube) + tampon - Formulation 4 : Conversion de 1'AMP 2AMP Myojinase 2ATP 2ADP Pyruvate Kinase > 2ATP (voir formule 3) .ATP (pour amorcer la réaction = 5ng) Myokinase (5#) Pyruvate (5 #) Phospoenolpyruvate (9 rg/tube) + tampon - Formulation 5 : ( partir de la formule 1) ATP + Luciférine Luciférase i Oxyluciférine + AMP +PPi + C02 + h J