FR 2704556 A1 19941104 FR 9305125 A 19930430 VIRUS RECOMBINANTS ET LEUR UTILISATION EN THERAPIE GENIOUE La présente invention concerne de nouveaux virus recombinants, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique, pour le transfert et l'expression in vivo de gènes désirés. Plus précisément, elle concerne de nouveaux virus recombinants comprenant un gène inséré dont l'expression in vivo permet de réguler les niveaux plasmatiques d'apolipoprotéines. La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits virus recombinants. Plus particulièrement, la présente invention concerne des virus recombinants défectifs et leur utilisation pour la prévention ou le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, qui sont conues pour leur conséquences graves au niveau cardiovasculaire et neurologique. Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholestérolémie ou l'hypertriglycéridémie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibrolipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol.Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, etc. Il est donc particulièrement important de pouvoir disposer de traitements permettant de diminuer dans certaines situations pathologiques les taux de cholestérol plasmatique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus périphériques afin de décharger les cellules ayant accumulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipoprotéines dont les lipoprotéines de faible densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et/ou dégradé. Actuellement, les dyslipidémies et en particulier les hypercholestérolémies sont traitées essentiellement au moyen de composés agissant soit sur la biosynthèse du cholestérol (inhibiteurs de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzymeA reductase, les statines), soit sur la captation et l'élimination du cholestérol biliaire (les séquestrants ou résines), soit encore sur la lipolyse par un mode d'action qui reste à élucider sur le plan moléculaire (les fibrates). Par conséquent, toutes les grandes classes de médicaments, qui ont été utilisées dans cette indication (séquestrants, fibrates ou statines), s'adressent seulement à l'aspect préventif de la formation de la plaque d'athérome et non en fait au traitement de l'athérome.Les traitements actuels de l'athérome, post accident coronarien, ne sont que palliatifs puisqu'ils n'interviennent pas sur l'homéostase du cholestérol et qu'ils sont des actes chirurgicaux (by-pass coronarien, angioplastie). La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo de gènes capables de réguler les niveaux plasmatiques d'apolipoprotéines. L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et efficace de ces pathologies. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anormalité (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides oFelgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), I'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes capables de réguler les niveaux plasmatiques d'apolipoprotéines. La présente invention résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de tels gènes. En particulier, la présente invention montre que l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés de ces gènes pour produire l'effet thérapeutiqe recherché. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies cardiovasculaires et neurologiques liées aux dyslipoprotéinémies. Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré dont l'expression permet de réguler les niveaux d'apolipoprotéine in vivo. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. La présente invention repose plus particulièrement sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables de transférer et d'exprimer des gènes codant pour des apolipoprotéines au niveau du foie, et de sécréter lesdites apolipoprotéines dans le système circulatoire où elles exercent leur activité. Les exemples présentés plus loin indiquent que les adénovirus sont capables, selon le mode d'administration, de transférer et d'exprimer efficacement, pour une durée importante et sans effet cytopathologique, les gènes codant pour l'apolipoprotéine AI ou l'apolipoprotéine AIV. Au sens de la présente invention, le terme "adénovirus défectif' désigne un adénovirus incapable de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. ll existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions E1A et E1B. Au sens de la présente invention, le gène inséré capable de réguler les niveaux d'apolipoprotéine in vivo peut être un gène codant pour une apolipoprotéine ou pour un produit protéique ayant une activité de type apolipoprotéine, ou également un gène antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires codant pour des apolipoprotéines. Le terme produit protéique ayant une activité de type apolipoprotéine désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique d'une apolipoprotéine, ainsi que tous variants naturels des apolipoprotéines. Le gène inséré peut être un fragment d'ADNc, d'ADN génomique, ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Parmi les gènes insérés au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour tout ou une partie active des apolipoprotéines AI, AIV ou E. L'apolipoprotéine Al est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une prépropeptide de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et l'intestin et elle constitue la protéine essentielle des particules HDL (70% de leur masse en protéines). Elle est abondante dans le plasma (1.0-1.2 g/l). Son activité la mieux caractérisée sur le plan biochimique est l'activation de la lécithine-cholestérol acyl-transférase (LCAT), mais de nombreuses autres activités lui sont attribuées, comme notamment la stimulation de reflux de cholestérol cellulaire.Le rôle physiologique de l'apolipoprotéine AI semble contrebalancé par l'apolipoprotéine AII puisque chez l'homme, le rapport des deux concentrations plasmatiques (M1I'AI) est très étroitement corrélé avec le risque coronarien. L'apolipoprotéine M joue un rôle majeur dans la résistance à l'athérosclérose, probablement lié au transport inverse du cholestérol, puisque la seule expression de cette apolipoprotéine dans des souris transgéniques permet de réduire de 40 fois la surface des dépôts lipidiques au niveau de l'aorte par rapport à des souris contrôles (Rubin et al. 1993 Science, In Press). Son gène, long de 1863 bp, a été cloné et séquencé (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine AI, on peut citer notamment les variants naturels décrits dans l'art antérieur (tableau ci-après). Variant: Mutation Variant Mutation Milano Arg173 Cys Norway Glu 13 6Lys Marburg Lys107 Prol65Arg Munster2B Alal 58Glu Pro3His Giessen Prol43Arg ArglOLeu Munster3A Asp103Asn Gly26Arg Munster3B Pro4Arg Asp89Glu Munster3 C Pro3Arg Lys 1 07Met Munster3D Asp213Gly Glu139Gly Munster4 Glu 19 8Lys Glu 1 47Val Yame Asp13Tyr Alal58Glu Asp213Gly Glul69Gln Argl77His L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, synthétisée spécifiquement dans l'intestin sous la forme d'un précurseur de 396 résidu. La protéine plasmatique, est relativement abondante (0.16 g/I) et a une masse moléculaire de 46.000 daltons. Elle est un composant majeur des chylomicrons sécrétés dans la lymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associée avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24 : 52-59).Par ailleurs, l'apoAIV plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257: 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol. Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 : 41714178). Ces deux activités indiquent que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Le gène de rapoAIV a été cloné et décrit dans l'art antérieur (voir notamment WO 92/05253).Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine AIV, on peut citer notamment les fragments et dérivés décrits dans la demande de brevet FR 9200806. L'apolipoprotéine E comprend 317 résidus dont 18 correspondent au peptide signal. ll n'y a pas de propeptide. Le gène de l'apte a été cloné et séquencé (environ 3600bp) et code pour un ARNm de 1163bp. L'apoE est répartie dans le plasma entre les particules VLDL et HDL. Elle représente environ 10-20% des proteines des VLDL et 2% des protéines des HDL. Les HDL-E constituent une sous-classe distincte de HDL. La concentration plasmatique de l'apoE est d'environ 0.05 g/l. L'apoE est synthétisée sous la forme d'une sialo-protéine qui est ensuite désialilée dans le plasma. La synthèse de l'apoE est réalisée par le foie et faiblement par l'intestin. Cependant, contrairement aux autres apolipoprotéines, l'apoE est également synthétisée dans de nombreux autres tissus (cerveau, rein, surrénales, cellules réticulo-endothéliales...). L'apoE reconnait avec une très forte affinité le récepteur aux LDL (apoB/E receptor) mais également un autre récepteur sur les cellules héptiques ne reconnaissant pas l'apoB (chylomicron/remnant receptor). Un polymorphisme a été mis en évidence sur la base de mobilités electrophorètiques différentes. Six phénotypes majeurs (E2/2, E2/3, E2/4, E3/4, E3/3, E4/4) ont ainsi été décrits. Selon les études menées sur de grandes populations caucasiennes, la prévalence des allèles correspondants serait de 14-15% pour 84, de 74-78% pour 83 et 8-12% pour 82. Un écart est trouvé chez les Finlandais pour lesquels s4 est plus abondant (23%) et e2 moins abondant(4%). L'allèle normal est 83. L'allèle e2 correspondrait à la dyslipoprotéinémie de type III (phénotype E2/2), maladie associée à une augmentation du cholestérol et des triglyrérides, des xanthomes et à une athérosclerose précoce. Une association entre l'allèle 84 et la maladie d'Alzheimer familiale a été rapportée récemment (Strittmatter et al. P.N.A.S. 99 (1993) 1977). Plus récemment la destruction du gène de l'apoE dans la souris a montré l'apparition d'une hypersusceptibilité à l'athérosclérose (E. Rubin et al. Celui 1992). Au sens de l'invention, le terme "gène inséré" désigne également des séquences anti sens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires codant pour des apolipoprotéines. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine. Parmi les séquences antisens utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence antisens permettant de diminuer les niveaux de production d'apolipoprotéine MI, ainsi qu'illustré dans les exemples. Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes ElA, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, lorsque le gène inséré code pour une apolipoprotéine ou pour un produit protéique à activité de type apolipoprotéine, celui-ci comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de l'apolipoprotéine, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer. La recombinaison homologue se produit après cotransfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (il), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et ai., J. Gen.Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Ensuite, les vecteurs qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De telles compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramuscuIaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies liées aux dyslip oprotéinémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection intraveineuse, Préférentiellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, I'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, ou dans le domaine des affections neurologiques où certaines apolipoprotéines comme l'apte semblent jouer un rôle important (maladies du viellissement neuronal, Alzheimer familial, régénération neuronale). Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique d'une apolipoprotéine plasmatique peut être corrigé. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc. La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Stratégie de construction du plasmide pXL2099. Figure 2: Stratégie d'amplification du cDNA de l'apoAI. Figure 3 : Construction du plasmide pXL2235. Figure 4 : Représentation des plasmides pXL2244 et pXL2263. Figure 5 : Séquences des oligonucléotides sq3319, sq3320, sq3364 et sq3369. Figure 6: Séquence d'un antisens complet anti-apoAII Figure 7: Séquence d'un antisens partiel anti-apoAII de 263 pb. TECHNTOUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 54635467] en utilisant le kit distribué par Amersham. EXEMPLES Exemple A : Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant le gène de l'apolipoprotéine AI: Comme indiqué avant, les adénovirus recombinants défectifs ont été préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer, après co-transfection dans une lignée cellulaire appropriée. Al Préparation des plasmides portant le gène de l'apoM (voir figures 1-4) Les plasmides utilisés pour générer, par recombinaison homologue, les adénovirus recombinants exprimant le gène de l'apolipoprotéine AI humaine ont été construits comme suit: 1. Construction du plasmide pXL2236 Le plasmide pXL2236 contient notamment l'ADNc codant pour la préproApoM sous le contrôle du promoteur CMV, les signaux de polyadénylation du virus SV40, ainsi qu'une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue. Il a été construit de la manière suivante: Le fragment d'ADN correspondant au cDNA de l'apoAI humaine a été isolé sous forme d'un fragment PstI à partir du vecteur pMD1408 décrit par S.Law et B.Brewer Jr. (PNAS 81 (1984) 66-70). Ce fragment a été introduit dans le plasmide M13mpl9 (figure 1). Ce fragment a ensuite été modifié par PCR successives (figure 2) pour introduire un site Hindi en position 5'. Ainsi, une première réaction de PCR a été réalisée sur le plasmide obtenu ci-dessus au moyen des oligonucléotides Sq1851 (TCT GGC AGC AAG ATG AAA CCC CCC AGA GCC CCT GGG ATC GAG TGA AGG ACC TGG CCA CTG T) et Sq1852 (CGC GGA TCC GCG CAG CTT CTC TTG CAG CTC GTG).L'ADN issu de cette PCR a été réamplifié dans une seconde PCR avec les oligonucléotides Sq1849 (GGG GAA GCT TAT GAA AGC TGC GGT GCT GAC CTT GGC CGT GCT CTT CCT GAC GGG G), Sq1850 (GGG GGGG GTT CAT CTT GCT GCC AGA AAT GCC GAG CCT GGC TCC CCG TCA GGA AGA CGA CGG), Sq1851 et Sq1852. Une troisième PCR a enfin été pratiquée à partir du résultat de la seconde PCR avec les oligonucléotides Sq1849 et Sq1852. Le fragment d'environ 460pb obtenu a été cloné dans le plasmide PCR1000 (Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le plasmide résultant a été appelé plasmide pXL2050 (figure 1).Les fragments HindE-BstY1 de pXL2050 et BstY1-XbaI de pXL1773 (fragment PstI du plasmide pMDB1408 inséré dans M13mpl8) ont ensuite été clonés dans le plasmide pSV2 OLI (Subramani et al., MCB 1 (1991) 854) préalablement digéré par HindE-XbaI, pour générer le plasmide pXL2099 (figure 3). Le fragment SpeI-KpnI portant le promoteur du cytomégalovirus (CMV) a ensuite été isolé à partir du vecteur pEBVDdyadCMVlacIn (p189 CMV, Biard et al., Biochemichal et Biophysical Acta 1130 (1992) 68), puis inséré aux sites correspondants du vecteur pRSVssgal (Stratford-Perricaudet et ai., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626). Le plasmide obtenu a été désigné pXL2234. Lors de cette étape, les régions codantes RSV LTR et lac Z sont éliminées. Ensuite, le fragment Hind E-BarnHI aux extrémités franches contenant la région codant pour la pre-pro ApoI ainsi que les signaux de maturation de l'ARNm du virus SV40 a été isolé à partir du plasmide pXL2099, puis inséré au site EcoRV du plasmide pXL2234. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné pXL2236. 2. Construction du plasmide pXL2235 Un second plasmide, désigné pXL2235, a été construit. Ce plasmide contient notamment l'ADNc codant pour la préproApoAI sous le contrôle du promoteur CMV, les signaux de polyadénylation du virus SV40, ainsi qu'une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue. Il a été obtenu en deux étapes: - insertion du fragment HindE-BamHI du plasmide pXL2099 identifié cidessus, dans le vecteur pMTL22 (Chambers et al., Gene 68 (1988) 139) digéré par les mêmes enzymes, puis, - digestion du plasmide obtenu ci-dessus par les enzymes ClaI-EcoRV et insertion du fragment ClaI-EcoRV ainsi isolé dans le plasmide pXL2234 digéré par EcoRV. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné pXL2235 (figure 3). 3. Construction du plasmide pXL 2244 Le plasmide pXL2244 contient l'ADNc de l'ApoAI sous le contrôle du promoteur LTR du virus RSV. Il a été construit par insertion du fragment ClaI EcoRV de pXL2239 dans le vecteur pLTR RSV-Bgal digéré par les même enzymes. La structure du plasmide pXL2244 est donnée figure 4. 4. Construction du plasmide pXL2263 Le plasmide pXL2263 est dérivé du vecteur pXL 2235 dans lequel une partie du polylinker séparant le promoteur CMV de l'ADNc de l'Apo Al (fragment KpnI) a été délété. il a été construit en deux étapes: Tout d'abord, le fragment Hind m - BarnHI de pXL 2099 contenant l'ADNc de l'Apo AI et le fragment de SV40 a été cloné aux même sites d'un plasmide pBluescript, pour donner naissance au plasmide pXL2245. Ensuite, le fragment KpnI contenant l'ADNc de l'kapo AI de ce plasmide a été recloné dans le bon sens dans le vecteur pXL2235 digéré par KpnI. La structure du plasmide pXL2263 est donnée figure 4. A2. Expression d'apoAI in vitro Les vecteurs décrits en Al ont été testés pour leur fonctionalité, par expression dans les lignées Cosl ou Cos7. Pour cela, les vecteurs ont été introduits dans les cellules par électroporation, selon le protocole décrit par P.Benoit et al, Journal of Immunology 150 (1993) 707. 48 heures après la transfection, les surnageants cellulaires ont été récupérés et testés pour leur contenu en Apo AI par un test ELISA. Pour cela, des plaques Immulon II (Dynatech) ont été revêtues avec un anticorps monoclonal anti ApoAI (lOmg/ml dans du tampon carbonate pH 9,6), par incubation une nuit à 40C, puis saturées par 2% BSA en PBS pH 7,4 une heure à 37"C. Les surnageants cellulaires ont ensuite été incubés une heure à 37"C, éventuellement après dilution en PBS 2% BSA. La révélation a ensuite été effectuée par incubation une heure à 37"C avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti ApoAI marqués à la péroxydase, et dilué au 1/5000.La fixation des anticorps péroxydés est finalement révélée par incubation avec 2501rI de TMB (KPL) et lecture des plaques à 630nm. Les résultats obtenus montre que, dans tous les cas testés, I'expression d'ApoAI peut être détectée. A3. Préparation des adénovirus recombinants Les plasmides préparés en AI ont ensuite été linéarisés et cotransfectés pour la recombinaison avec le vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en frans les fonctions codées par les régions El (E1A et Elle) d'adénovirus. L'adénovirus Ad.CMVApoAI a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVBgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le plasmide pXL2235 selon le protocole suivant: après, Le plasmide pXL2235 linéarisé par Enzyme EagI et l'adénovirus Ad.RSVBgal linéarisé par Clal sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant radénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad.CMVApoAI est conservé à -800C dans 20 % de glycérol. Le même protocole a été reproduit avec le plasmide pXL2244, conduisant à l'adénovirus recombinant Ad.RSVApoAI. Exemple B : Transfert et expression in vivo du gène de l'apoAI Le stock de virus que l'on produit ainsi est ensuite utilisé pour l'infection in vivo. Dans un premier temps, les virus sont utilisés pour l'infection in vivo des hépatocytes chez la souris. Pour cela, les particules virales sont injectées par la voie portale chez des souris C57B16. Le mode d'injection et la spécificité d'expression ont été testés par une étude préalable réalisée avec des virus exprimant la B-galactosidase (une technique d'injection utilisable a aussi été décrite par Jaffe et ai., Nature Genetics, vol.l (1992) 372). Le niveau d'expression plasmatique d'aplat humaine est testé par ELISA à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine humaine, et la spécificité de l'expression du gène recombinant est vérifiée à l'aide de sondes oligonucléotidiques humaines spécifiques dans différents tissus (northern blotting et RT-PCR). Exemple C : Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant un eène antisens de l'anolinoorotéine All: C1. Préparation des plasmides portant un gène antisens de l'apoAII: 1. Construction du plasmide pXL2264 Le plasmide pXL2264 contient le cDNA codant pour l'apolipoprotéine A-II humaine. Il a été construit de la manière suivante: Le fragment d'ADN correspondant au cDNA de rapoA-II a été isolé par la technique de RT-PCR à partir des ARN totaux de cellules HepG2. Les cDNA ont été produits par transcription inverse des ARN polyA+ à l'aide d'amorces oligodT. Une PCR a alors été réalisée sur ces cDNA avec les oligonucléotides Sq3319 et Sq3320 (figure 5), spécifiques de la séquence de l'apoA-II (Chan et coll., Meth. Enzymol. 128 (1986) 745). Le fragment de 473 pb obtenu a été cloné dans le plasmide pCRII Onvitrogen) et sa séquence vérifiée. La partie 5' du brin codant du cDNA est à côté du site Hindi de pCRII et la partie 3' à côté du site XhoI. Le plasmide résultant a été appelé pXL2264. 2. Construction du plasmide pXL2267 Le plasmide pXL2267 contient le cDNA codant pour le gène antisens complet de l'apolipoprotéine A-II humaine (figure 6). C'est un des clones obtenus par clonage du fragment PCR de 473 pb dans le plasmide pCR-II (cf 1 ci-dessus). Sa séquence a été vérifiée. Le cDNA de 1'A-II est orienté de manière inversée par rapport au cDNA porté par le plasmide pXL2264 (partie 5' du brin codant à côté du site XhoI et partie 3' proche du site HindIlI). 3. Construction du plasmide pXL2268 Le plasmide pXL2268 contient le cDNA codant pour un gène antisens partiel de l'apolipoprotéine A-II humaine, dont la séquence est complémentaire à celle du cDNA de 1'A-II pour les bases +1 à +95 et +307 à +473 (figure 7). Il a été construit de la manière suivante: Deux PCR ont été réalisées sur le plasmide pXL2264 (portant l'A-ll sens), l'une avec les oligonucléotides Sq3319 et Sq3369, et l'autre avec les oligonucléotides Sq3320 et Sq3364 (figure 5). Les fragments issus de ces PCR sont respectivement de 96 et 167 pb. Une troisième PCR a été pratiquée sur un mélange de ces deux fragments avec les oligonucléotides Sq3319 et Sq3320. Le fragment de 263 pb obtenu a été cloné dans le plasmide pCRII Onvitrogen) et sa séquence vérifiée. La partie 5' du brin codant du cDNA de l'A-ll est à côté du site XhoI de pCRII. Le plasmide résultant a été appelé pXL2268. 4. Construction du plasmide pXL2269 Le plasmide pXL2269 est un vecteur d'expression eucaryote contenant le cDNA du gène de l'apolipoprotéine A-II humaine sous le contrôle de la séquence LTR du virus RSV. Il a été construit de la manière suivante: - digestion du plasmide pXL2264 par HindIII-XhoI, puis, - insertion du fragment HindE-XhoI contenant le cDNA sens de l'apoA-II dans le vecteur pREP4 (Invitrogen) préalablement digéré par les mêmes enzymes. 5. Construction des plasmides pXL2270 et pXL2271 Les plasmides pXL2270 et pXL2271 sont des vecteurs d'expression eucaryote contenant les cDNA des gènes antisens respectivement complets et partiels de l'apolipoprotéine A-II humaine, sous le contrôle des régions promotrices du virus CMV. Ils ont été construits de la manière suivante: - digestion des plasmides pXL2267 et pXL2268 par Hindm-XhoI, puis, - insertion des fragments HindE-XhoI de chaque plasmide, contenant les cDNA antisens de l'apoA-II, dans le vecteur pCEP4 (Invitrogen) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Les plasmides ainsi obtenus ont été désignés respectivement pXL2270 (antisens complet) et pXL2271 (antisens partiel). C2. Expression des ARN antisens apoA-II in vitro Les vecteurs ainsi construits (pXL2270 et pXL2271) ont été testés: - pour leur expression, après transfection transitoire dans les cellules COS et, - pour leur fonctionnalité par expression transitoire dans les mêmes cellules, après cotransfection avec pXL2269. C3. Préparation des adénovirus recombinants Les plasmides préparés en C1 sont ensuite linéarisés et cotransfectés pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trais les fonctions codées par les régions El (E1A et E11B) d'adénovirus, selon le protocole décrit dans l'exemple A3. REVENDICATIONS 1. Adénovirus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré capable de réguler les niveaux d'apolipoprotéine in vivo. 2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée. 3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un adénovirus de type Ad 5. 4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène inséré codant pour une apolipoprotéine ou pour un produit protéique à activité de type apolipoprotéine. 5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène inséré code pour tout ou partie de l'apolipoprotéine AI, de l'apolipoprotéine AIV, de l'apolipoprotéine E ou d'un dérivé ou variant naturel de celles-ci. 6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène inséré code pour l'apolipoprotéine Al ou un variant de celle-ci, de préférence, possédant une cystéine en position 173. 7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène antisens dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires codant pour des apolipoprotéines. 8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisée en ce que le gène antisens permet de diminuer les niveaux d'expression d'apolipoprotéine AII. 9. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le gène inséré comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. 10. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le gène inséré comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. 11. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 10 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. 12. Utilisation selon la revendication il pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'athérosclérose et/ou des maladies neurologiques.. 13. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 10. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml d'adénovirus recombinant défectif.