FR 2701265 A1 19940812 FR 9301392 A 19930209 NOUVEAUX POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEoTEUR SEROTONINERGIOUE ACIDES NUCLEIOUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISAIIONS La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et le matériel génétique permettant leur expression. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. La sérotonine est un neuromodulateur capable d'induire et de moduler une grande variété de comportements tels que le sommeil, l'appétit, la locomotion, l'activité sexuelle ou encore la contraction vasculaire. Il est admis que I1 activité de la sérotonine est médiée par son interaction avec des récepteurs, désignés récepteurs sérotoninergiques ou récepteurs 5-HT (pour 5-hydroxytryptamine). Des études de biologie moléculaire ainsi que des études pharmacologiques ont révélé qu'il existait un grand nombre de sous-types de récepteurs 5-HT. Les récepteurs 5-HT qui ont été décrits jusqu a aujourd'hui appartiennent soit à la famille des récepteurs liés à des canaux ioniques (récepteurs 5-HT3), soit à la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G et qui possèdent sept domaines transmembranaires.Par ailleurs, l'analyse des séquences d'acides aminés a montré que les récepteurs 5-HT interagissant avec des protéines G peuvent être sous-divisés en deux groupes distincts: Les récepteurs 5HT1, comprenant les sous-types mammifères 5HT1A, 5HT1B et 5HT1D ainsi que trois récepteurs 5HT de drosophile; et les récepteurs 5HT2 comprenant les sous-types 5HT2 et 5TIC. Ces récepteurs ne sont sans doute pas les seuls récepteurs 5HT existant, dans la mesure où des études pharmacologiques ont révélé d'autres sous-types tels que les récepteurs 5HT4 ainsi que certains récepteurs apparentés au sous-type 5HT1 (récepteurs "5HT1 like"). De plus, des études supplémentaires de biologie moléculaire ont également révélé des hétérogénéités au sein des sous-types 5HT1B/1D. La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Bien qu'appartenant à la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G, ces nouveaux polypeptides diffèrent des récepteurs sérotoninergiques déjà décrits (5HT1, 5HT2, 5HT3 et 5HT4) du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique. Plus particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caractérisation de ces nouveaux polypeptides, désignés 5HT5b, ainsi que du matériel génétique permettant leur expression ou leur identification. Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n" 2 ou d'un dérivé de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ ID n" 2. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide SEQ ID n" 2, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De tels polypeptides homologues peuvent être obtenus par des expériences d'hybridation comme décrit dans les exemples. Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont des polypeptides possédant la capacité de lier la sérotonine. Encore plus préférentiellement, il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont susceptibles d'être reconnus par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique SEQ ID n" 2 complète. Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par le polypeptide 5HT5b comprenant toute la séquence peptidique SEQ ID n" 2. Comme indiqué dans les exemples, ce polypeptide peut être exprimé dans différents types cellulaires pour former un récepteur sérotoninergique fonctionnel. Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n" 2 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques. Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont désignés par polypeptides 5HT5b. La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide 5HT5b. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence choisie parmi: (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID nO 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n" 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des phosphoramidites, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour la production des polypeptides 5HT5b tels que définis précédemment. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi.S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides 5HT5b de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniornyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces. Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes permettant la détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de récepteurs sérotoninergiques dans des échantillons biologiques et la mise en évidence d'anomalies génétiques (polymorphisme, mutations) ou d'expressions aberrantes. L'inhibition de l'expression de certains gènes par des oligonucléotides antisens s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les oligonucléotides antisens sont des oliogonucléotides de petite taille, complémentaires d'un ARNm, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec celui-ci, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les oligonucléotides antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides 5HT5b tels que définis précédemment. L'invention concerne également les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides 5HT5b. Les séquences antisens produisent dans la cellule cible des transcrits qui sont complémentaires d'ARNm cellulaires.De tels oligonucléotides ou séquences peuvent être constitués par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il s' agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides de l'invention. De tels oligonucléotides peuvent être obtenus à partir de la séquence SEQ ID nO 1, par fragmentation ou par synthèse chimique, etc.... Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides 5HT5b de l'invention, ou avec les ARNm correspondant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT5b, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Compte tenu des activités multiples de la sérotonine, les sondes de l'invention peuvent ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT5b.Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT5b tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent comporter jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées capables d'exprimer à leur surface un polypeptide 5HT5b tel que défini ci-avant. Ces cellules peuvent être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture desdites cellules dans des conditions d'expression de ladite séquence. Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptoinyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour mesurer la capacité de différentes molécules à se comporter comme ligand ou comme modulateur de l'activité des polypeptides de l'invention. Plus particulièrement, elles peuvent ainsi être utilisées dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de modulateur de l'activité des polypeptides de l'invention, et, plus préférentiellement, d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine. Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides 5HT5b de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention. Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine pour les polypeptides 5HT5b. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides 5HT5b de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT sur ledit polypeptide de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs 5HT5b. L'invention concerne également tout médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide 5HT5b de l'invention. Préférentiellement la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé décrit précédemment. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Table 1 : Profil pharmacologique du récepteur 5HT5b. Les résultats correspondent à des expériences de compétition pour la liaison du [1251]-LSD aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT5b. Les valeurs d'IC5O (correspondant à la concentration en ligand nécessaire pour déplacer 50 Go du [125I]-LSD lié) ont été calculées expérimentalement et converties en Ki selon l'équation suivante : Ki = In50/(1 + C/Kd) dans laquelle C est la concentration en [1251]-LSD (150 pM) et Kd est la constante de dissociation du [1251]-LSD. Les nombres entre parenthèses correspondent au nombre d'expériences indépendantes réalisées, chaque point étant réalisé en triple. Table 2: Pourcentages d'homologie de séquence peptidique entre le récepteur 5HT5b (SEQ ID n" 2) et d'autres récepteurs de la famille des récepteurs couplés à des protéines G. Les homologies ont été calculées sur les séquences conservées : le domaine transmembranaire et ses boucles de connection. Figure 1 : Courbe de saturation du [1251]-LSD aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT5b. Les membranes ont été incubées avec des concentrations de ligand allant de 50 pM à 1,25 nM, avec ou sans 10 I1M de 5HT. La liaison spécifique est représentée. L'encart représente l'analyse en Scatchard des résultats. Techniques générales de clonage Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherîchîa coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l1ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitre par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR Lolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354 ; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence normales sont généralement les suivantes : hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à 65 C; lavage: 0,5 x SSC à 65"C. 1. Isolement du récepteur 5HT5b Les comparaisons de séquences entre les différents récepteurs sérotoninergiques connus font apparaître une certaine conservation, particulièrement dans certaines régions transmembranaires potentielles telles que les domaines III et VI. Dans le but de mettre en évidence et d'isoler un nouveau récepteur, trois oligonucléotides dégénérés correspondant à ces deux régions ont été préparés, puis utilisés dans une série de réactions de PCR sur une préparation d'ARN de cerveau de souris.La séquence des oligonucléotides dégénérés est la suivante: Oligonucléotide (i) AGAACTAGTGGATCCAA(A/G)AA(A/G/C/T)GG(A/G/CIT)A(A/G)CCA(AIG)CA Oligonucléotide (ii) CTTGATATCGAATTCGA(T/C) (A/G)T (A/G/C/T) CT (A/G/C/T) TG (C/T)TG (C/T) A C Oligonucléotide (iii) GGTATCGATAAGCTTAT(C/T/A)GC(C/T) CT(A/G/C/T)GA(C/T) (C/A)G(A/G/C/ T)TA Les réactions de PCR ont été réalisées de la manière suivante: 5 g d'ARN de cerveau de souris adulte ont été soumis à une réaction de transcription inverse en présence de 500 ng d'oligonucléotide (i) et de 200 unités de transcriptase inverse MMLV (BRL).La moitié du produit de cette réaction a ensuite été soumise à 30 cycles d'amplification en présence de 5 unités de polymérase Taq (Cetus) et de 1 llg d'oligonucléotide (i) et d'oligonucléotide (ii). 1/20e du produit de cette réaction a ensuite été soumis à 30 cycles d'amplification supplémentaires en présence des oligonucléotides (i) et (iii). Les produits ainsi obtenus ont été digérés avec les enzymes BamHI et HindIII, insérés aux sites correspondant du plasmide Bluescript (Stratagène), et séquencés. L'un des fragments ainsi obtenus, présentant une certaine homologie avec les récepteurs sérotoninergiques, a été marqué par "random priming" (Feinberg et Vogelstein, Analytical Biochemistry 132 (1984) 6) et utilisé comme sonde pour cribler une banque de cDNA de cerveau de souris construite dans le phage UniZap (Stratagène). Parmi les phages positifs obtenus, l'un d'entre-eux, dénommé XNS et porté par le plasmide pNS, contenait un insert de 2,1 kb. Ce phage a été isolé, et son insert a ensuite été introduit dans le plasmide Bluescript. La séquence de ce fragment a été déterminée sur les 2 brins en utilisant la technique des dideoxynucléotides au moyen d'oligonucléotides synthétiques. La séquence ainsi obtenue correspond à la séquence SEQ ID n" 1. Elle montre que l'ADNc isolé porte une phase de lecture ouverte de 370 acides aminés. Par ailleurs, l'analyse d'hydrophobicité montre que cette protéine porte sept domaines hydrophobes, une particularité rencontrée chez les membres de la famille des récepteurs couplés à des protéines G. L'extrémité N-terminale contient par ailleurs 1 site de N-glycosylation, et le domaine cytoplasmique présumé contient les sites consensus de phosphorylation par les protéines kinases C et A. Un clone génomique codant pour le récepteur 5HT5b a également été isolé, par criblage d'une banque génomique au moyen de la séquence SEQ ID n" 1 comme sonde. La banque avait été obtenue par digestion partielle par Sau3A de l'ADN génomique de cellules souches d'embryon de souris, puis insertion dans le phage lambda EMBL3. Les fragments obtenus ont été sous clonés dans le plasmide Bluescript et partiellement séquencés. L'analyse de ces séquences révèle la présence d'un intron, localisé au milieu de la 3ème boucle cytoplasmique. 2. Etude d'homologîes de séquence La séquence du récepteur 5HT5b isolé ci-dessus a été comparée avec les séquences des récepteurs couplés à des protéines G suivants : 5HT1B, 5HT1D, 5HT5A, 5HT1A, 5HT-dro2A, 5HT-drol, a2, D2, B1, D1, H2, 5HTîC et 5HT2. Ces expériences ont révélé une certaine homologie dans le domaine transmembranaire potentiel et dans certaines boucles, mais aucune homologie dans les régions terminales ni dans la troisième boucle cytoplasmique. La table 2 donne les % d'homologie au niveau des régions conservées. 3. Expression du récepteur 5HT5b dans les cellules Cos-7 et caractérisation pharmacologique Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 1 a été inséré dans un vecteur d'expression eucaryote, qui a été utilisé pour transfecter des cellules Cos-7. Les membranes des cellules transfectées obtenues ont ensuite été préparées et testées pour leur capacité à lier certains ligands sérotoninergiques marqués. L'ADNc de 2,1 kb codant pour le récepteur 5HT5b a été isolé à partir du plasmide pNS sous forme d'un fragment EcoRI-XhoI, puis inséré aux sites correspondants du vecteur p513. Le vecteur p513 dérive du vecteur pSG5 [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] par addition d'un multisite de clonage. Le vecteur recombinant ainsi obtenu désigné p513NS a ensuite été utilisé (20 Mg par plaque de 10 cm) pour transfecter les cellules Cos-7 en présence de phosphate de calcium. 48 heures après la transfection, les cellules recombinantes sont récoltées et les membranes sont préparées selon la technique décrite par Amlaiky et Caron [J. Biol. Chem. 260 (1985) 1983]. Des expériences de liaison à saturation et de compétition ont ensuite été réalisées sur ces membranes en présence de différents ligands radiomarqués (cf. Table 1). Pour cela, les échantillons de membrane (10-20 ig de protéines) ont été incubés 10 minutes à 37"C en présence du ligand dans un volume final de 250 ,ul de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4). La réaction est ensuite stopée par filtration sous vide sur filtres en fibre de verre Whatman GF/C, et rinçage 4 fois avec 4 ml de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4).La liaison non-spécifique a été déterminée en présence de 10 pM de 5HT. La radioactivité a été mesurée avec un compteur y. Les résultats obtenus montrent que le [125I]-LSD présente un site de liaison saturable avec un Kd = 470 pM et un Bmax = 170 fmol/mg de protéines membranaires (figure 1). Dans une exprérience contrôle, il a par ailleurs été montré que le [l25I]-LSD ne liait pas les cellules Cos-7 transfectées par le plasmide p513. Pour déterminer le profil pharmacologique de ce récepteur, le [125I]-LSD lié aux membranes a été déplacé en présence de différentes drogues sérotoninergiques (table 1). Ces différentes drogues montrent l'ordre d'efficacité de déplacement suivant: ergotamine > 5-CT > methysergide > 5HT > RU24969 > 8-OH-DPAT > yohimbine > bufotenine (table 1). La kétansérine, le propanolol (-), le sumatriptan, la dopamine et la norépinéphrine sont inactifs. 4. Recherche de séquences homologues dans d'autres tissus La séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 a ensuite été utilisée pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus par hybridation in situ. Les expériences d'hybridation in situ ont été réalisées sur des sections cryostatées de cerveau de souris adulte (8 semaines environ) selon la technique décrite par Hafen et al. [EMBO J. 2 (1983) 617]. La sonde utilisée pour ces expériences est un ARN simple brin obtenu par transcription en présence de polymérase T3, de [35S]-CTP en utilisant comme matrice le plasmide pNS linéarisé par Xhol. Cette étude a permis de mettre en évidence des séquences homologues selon l'invention dans l'hippocampe (région CA1), le corps d'habenula et le raphé dorsal. 1l est entendu que les même expériences peuvent être répétées en utilisant d'autres tissus, et notamment des tissus d'origine humaine, d'autres sondes et d'autres techniques (PCR, hybridation en Northern blot. Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et/ou amplifiées par les techniques classiques de biologie moléculaire. TABLE 1 pKi LIGAND 5HT5b Cellules Cos-7 5-HT 6.6 (3) 5-CT 7.4 (3) RU 24969 6.4 (2) TFMPP 5.4 (2) 8-OHDPAT 6.4 (2) Sumatriptan 5.1 (3) Bufotenine 5.8 (2) Methylsergide 6.9 (2) Ergotamine 8.5 (2) 2-Bromo LSD Methiothepin 7.8 (3) Yohimbine ss 6.0 (2) (+)Pindolol 5.2 (2) (-)Propanolol 5.8 (2) Ketanserin Spiperone Dopamine 5(2) (-)Norepin 5(2) TABLE 2 5HT5B souris 100 5HT5A souris , 77 5HT1Bss souris 37 5HTlDa humain , 37 5HT1E&alpha; souris 37 5HT1E&alpha; souris 36 5HT1A humain souris 36 5HT-dro2A 41 5HT-drol l 38 &alpha;2 humain 34 D2 souris 36 H2 chien 26 ss1 humain 30 j32 souris , 29 D1 humain 31 5HT1C souris 30 5HT2 souris , 26 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSERM (B) RUE: 101, rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75654 (ii) TITRE DE L'INVENTION:NOUVEAUX POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEURS SEROTONINERGIQUES, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATIONS. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2036 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: SOURIS (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 312..1424 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: GAATTCGGCA CGAGCAGGCA CCAGTCCCCA ATCCTCTGCA GTCGGTTACC CTGAAGACCA 60 CAAAGGGACT GAGAGATTGA TGCGCTGGGC AAAGCTGGAC TAAGGAGTCT CATCTGGAAA 120 AGAGGGTCCA TGAAAAAAGC CAAAAGAAGC GCCAAAAGGA GGCTGCAGTT TGGAAAAGGG 180 ACAAGGGTGG CGCGGTTTGG ACATCTTTTT GCGTAGCTGG GCGCGCGGAG TGCCTCTCTT 240 GCTTCGCCAC CTATCCACAG TTCATGCAAC CACGGGCACA TCTCCTGCCC CAGAGCCCAA 300 GTCCCTGAAT A ATG GAA GTT TCT AAC CTC TCA GGC GCC ACT CCC GGC CTT 350 Met Glu Val Ser Asn Leu Ser Gly Ala Thr Pro Gly Leu 1 5 10 GCC TTT CCT CCG GGA CCT GAG AGC TGC AGT GAC AGC CCA AGT TCC GGC 398 Ala Phe Pro Pro Gly Pro Glu Ser Cys Ser Asp Ser Pro Ser Ser Gly 15 20 25 AGG AGC ATG GGA TCC ACC CCA GGT GGG CTC ATC TTG CCC GGC CGC GAG 446 Arg Ser Met Gly Ser Thr Pro Gly Gly Leu Ile Leu Pro Gly Arg Glu 30 , 35 40 45 CCG CCC TTC TCT GCT TTC ACC GTG CTT GTG GTG ACT CTA CTG GTG TTG 494 Pro Pro Phe Ser Ala Phe Thr Val Leu Val Val Thr Leu Leu Val Leu 50 55 60 CTG ATC GCT GCC ACT TTC TTA TGG AAT CTG CTA GTT CTG GTG ACT ATC 542 Leu Ile Ala Ala Thr Phe Leu Trp Asn Leu Leu Val Leu Val Thr Ile 65 70 75 CTG CGC GTC CGC GCC TTC CAC CGC GTG CCA CAT AAC TTG GTG GCC TCG 590 Leu Arg Val Arg Ala Phe His Arg Val Pro His Asn Leu Val Ala Ser 80 85 90 ACA GCC GTC TCG GAT GTC CTG GTG GCG GTT CTG GTG ATG CCT CTG AGC 638 Thr Ala Val Ser Asp Val Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Leu Ser 95 100 105 CTG GTG AGC GAG TTG TCC GCT GGG CGA CGT TGG CAG CTA GGC AGG AGT 686 Leu Val Ser Glu Leu Ser Ala Gly Arg Arg Trp Gln Leu Gly Arg Ser 110 115 120 125 CTG TGC CAC GTG TGG ATC TCC TTC GAC GTG TTG TGC TGC ACC GCC AGC 734 Leu Cys His Val Trp Ile Ser Phe Asp Val Leu Cys Cys Thr Ala Ser 130 135 140 ATC TGG AAC GTG GCG GCC ATC GCC CTG GAT CGC TAC TGG ACT ATC ACG 782 Ile Trp Asn Val Ala Ala Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Trp Thr Ile Thr 145 150 155 CGC CAC CTG CAG TAC ACG CTG CGC ACC CGG AGC CGT GCT TCT GCG CTC 830 Arg His Leu Gln Tyr Thr Leu Arg Thr Arg Ser Arg Ala Ser Ala Leu 160 165 170 ATG ATC GCG ATC ACC TGG GCA CTG TCC GCG GCG CTC ATT GCT CTC CCG 878 Met Ile Ala Ile Thr Trp Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Pro 175 180 185 CTG CTT TTT GGC TGG GGC GAA GCC TAT GAT GCT CGG CTG CAG CGT TGC 926 Leu Leu Phe Gly Trp Gly Glu Ala Tyr Asp Ala Arg Leu Gln Arg Cys 190 195 200 205 CAG GTG AGC CAG GAG CCC TCC TAT GCT GTC TTC TCC ACC TGC GGA GCC 974 Gln Val Ser Gln Glu Pro Ser Tyr Ala Val Phe Ser Thr Cys Gly Ala 210 215 220 TTC TAC CTG CCT CTA GCG GTG GTG CTC TTC GTC TAC TGG AAA ATA TAC 1022 Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Val Val Leu Phe Val Tyr Trp Lys Ile Tyr 225 230 235 AAA GCC GCC AAG TTT CGA TTC GGT CGC AGA CGG CGG GCG GTG GTA CCG 1070 Lys Ala Ala Lys Phe Arg Phe Gly Arg Arg Arg Arg Ala Val Val Pro 240 245 250 CTT CCT GCC ACC ACG CAG GCA AAG GAA GCA CCT CCG GAG TCT GAG ATG 1118 Leu Pro Ala Thr Thr Gln Ala Lys Glu Ala Pro Pro Glu Ser Glu Met 255 260 265 GTG TTC ACA GCC CGT CGC CGA GCA ACA GTG ACC TTC CAG ACA ACG GGA 1166 Val Phe Thr Ala Arg Arg Arg Ala Thr Val Thr Phe Gln Thr Ser Gly 270 275 280 285 GAC TCC TGG CGG GAG CAG AAG GAG AAG CGG GCA GCC ATG ATG GTC GGG 1214 Asp Ser Trp Arg Glu Gln Lys Glu Lys Arg Ala Ala Met Met Val Gly 290 295 300 ATC TTG ATT GGC GTG TTT GTG CTT TGT TGG ATC CCC TTC TTC CTG ACG 1262 Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Leu Cys Trp Ile Pro Phe Phe Leu Thr 305 310 315 GAG CTC ATC AGC CCG CTC TGT GCC TGC AGC ATG CCA CCC ATC TGG AAA 1310 Glu Leu Ile Ser Pro Leu Cys Ala Cys Ser Leu Pro Pro Ile Trp Lys 320 325 330 AGC ATA TTC CTG TGG CTT GGA TAT TCC AAT TCG TTC TTC AAC CCC TTG 1358 Ser Ile Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ser Asn Ser Phe Phe Asn Pro Leu 335 340 345 ATT TAC ACT GCC TTT AAT AAG AAT TAC AAC AAT GCC TTC AAG AGC CTC 1406 Ile Tyr Thr Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Ser Leu 350 355 360 365 TTT ACT AAG CAG AGA TAAGAAGGGC TGGGGAGAGA AAAGGGAAGA CCTGGGAAGA 1461 Phe Thr Lys Gln Arg 370 GAAAGGGGAC CTGTGATCCT CATTTCACCC GAGACCTTCT CCCCACCACC CACGGCCCGA 1521 TGATGACACT CCAAAAGTCA TACCATTGGC CCTGGACGTT GAAGAGTTCT CATGGGGGTT 1581 GGCAACTGTT TGCCAAACAC ACCCATGCCT TCTACAGAAG GACGTGACAG ACATTATTAG 1641 TGAATTGTGC TCCATTTCTG CACTAGGCAG AAACCCTGCC AAACACTTTC AGGATAGATT 1701 TTAGGTATTG GTGAGCATTT GTTAGACCTC ACATGTGACA AAGTTGATTT GCTTTTCCAT 1761 TATTTAGTAC TGTGTCCTCT CTCAGGAGTT TCCTGAGTCT GTCTCCTTGA CACAGCCTCT 1821 CCTCTATCCC TTATCCATCA GAGGAGTTTC CCTTTCTTAG CCTCCTATAC AACCTCCACA 1881 GGACAATGAT TCTCAGCTTA GAAGCGGGCC TCACCTGAAG CTTTGATAAA ACGTGTTCCA 1941 CGCAGGTGTC TTCAAGATGG CTCAGTAGGT GAAGGCACCT GCCCCTGAGC CTGGTGGCCT 2001 GCTTTTGATG GAGACACACG TAATGGAAGG AAAGG 2036 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 370 acides amin,s (B) TYPE: acide amin, (D) CONFIGURATION:Iin,aire (11) TYPE DE MOLECULE: prot,ine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ iD NO: 2: Met Glu Val Ser Asn Leu Ser Gly Ala Thr Pro Gly Leu Ala Phe Pro 1 5 10 15 Pro Gly Pro Glu Ser Cys Ser Asp Ser Pro Ser Ser Gly Arg Ser Met 20 25 30 Gly Ser Thr Pro Gly Gly Leu Ile Leu Pro Gly Arg Glu Pro Pro Phe 35 40 45 Ser Ala Phe Thr Val Leu Val Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Ile Ala 50 55 60 Ala Thr Phe Leu Trp Asn Leu Leu Val Leu Val Thr Ile Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Ala Phe His Arg Val Pro His Asn Leu Val Ala Ser Thr Ala Val 85 90 95 Ser Asp Val Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Leu Ser Leu Val Ser 100 105 110 Glu Leu Ser Ala Gly Arg Arg Trp Gln Leu Gly Arg Ser Leu Cys His 115 120 125 Val Trp Ile Ser Phe Asp Val Leu Cys Cys Thr Ala Ser Ile Trp Asn 130 135 140 Val Ala Ala Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Trp Thr Ile Thr Arg His Leu 145 150 155 160 Gln Tyr Thr Leu Arg Thr Arg Ser Arg Ala Ser Ala Leu Met Ile Ala 165 170 175 Ile Thr Trp Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Pro Leu Leu Phe 180 185 190 Gly Trp Gly Glu Ala Tyr Asp Ala Arg Leu Gln Arg Cys Gln Val Ser 195 200 205 Gln Glu Pro Ser Tyr Ala Val Phe Ser Thr Cys Gly Ala Phe Tyr Leu 210 215 220 Pro Leu Ala Val Val Leu Phe Val Tyr Trp Lys Ile Tyr Lys Ala Ala 225 230 235 240 Lys Phe Arg Phe Gly Arg Arg Arg Arg Ala Val Val Pro Leu Pro Ala 245 250 255 Thr Thr Gln Ala Lys Glu Ala Pro Pro Glu Ser Glu Met Val Phe Thr 260 265 270 Ala Arg Arg Arg Ala Thr Val Thr Phe Gln Thr Ser Gly Asp Ser Trp 275 280 285 Arg Glu Gln Lys Glu Lys Arg Ala Ala Met Met Val Gly Ile Leu Ile 290 295 300 Gly Val Phe Val Leu Cys Trp Ile Pro Phe Phe Leu Thr Glu Leu Ile 305 310 315 320 Ser Pro Leu Cys Ala Cys Ser Leu Pro Pro Ile Trp Lys Ser Ile Phe 325 330 335 Leu Trp Leu Gly Tyr Ser Asn Ser Phe Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Thr 340 345 350 Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Ser Leu Phe Thr Lys 355 360 365 Gln Arg 370 REVENDICATIONS 1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n" 2 ou d'un dérivé de celle-ci. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier la sérotonine. 3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur sérotoninergique. 4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique SEQ ID n" 2 complète. 5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique SEQ ID n" 2. 6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Séquence selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. 8. Séquence selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques. 9. Séquence selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. 10. Séquence antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 5. 11. Séquence selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle est constituée par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 7. 12. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 6 ou avec l'ARNm correspondant. 13 Sonde selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases. 14. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire. 15. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 12 à 13 pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT5b; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épi ss age, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT5b; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT5b. 16. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5. 17. Cellule selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes. 18. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 16 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide. 19. Procédé selon la revendication 18 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes de la sérotonine. 20. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 16 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT sur ledit polypeptide. 21. Ligand ou modulateur d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon les procédés des revendications 18 à 20. 22. Utilisation d'un ligand ou modulateur identifié et/ou obtenu selon les procédés des revendications 18 à 20 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs 5HT5b. 23. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5. 24. Médicament selon la revendication 23 caractérisé en ce que la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 18 à 20.