FR 2703252 A1 19941007 FR 9303879 A 19930331 COMPLEXE IMMUNOMODULATEUR ANTI-S1DA MEMOIRE DESCRIPTIF a présente invention concerne la constitution d'un co m plexe thérapeutique antisidalque. Ce complexe "vaccinal thérapeutique" a un pouvoir vaccinant lié à la présence d'antigènes non spécifiques. Il est bien connu en bactériologie que les antigènes de surface des parois, des membranes ou des capsules- (libérés ou non sous forme soluble dans le milieu de culture) sont de nature glycoprotéique, polypeptidique ou polysaccharidique. Nous ne pouvions courir le risque majeur d'utiliser des vaccins vivants, qui peuvent donner sur un terrain im muno-déficient, une maladie authentique. Il a été largement publié de nouveaux vaccins à base D'ART (d'origine ribosomale), associés à des substances protéoglycaniques, polysaccharidique m e m branaire extraits de germes pathogènes. Ces vaccins ont utilisé des antigènes spécifiques correspondant à des affections microbiennes spécifiquement déterminées. Or le pouvoir antigénique est essentiellement lié au niveau de 1'ARN (des ribosomes en particulier) des cellules microbiennes, entre autres. Les C.LC. (Cellules Im munologiquement Compétentes) utilisent directement ces ARN comme trasporteurs actifs. Au lieu d'utiliser un antigène serotype bactérien, nous avons couplé (couplage = liaison de préférence covaLente) l'A R N (d'origine ribosomale de préférence) à une séquence d'acides aminés de nature glycoprotidique, collagénique de type m [(chez l'homme, le collagène représente approximativement le tiers des protéines de l'organisme). Le type m (en plus de séquences d'acides aminés) a été choisi, car il est présent essentiellement dans le derme et la paroi vasculaire]. L'ARN a déjà servi dans la préparation de vaccins acellulaires (Cf. Inf. and Im munity, 1, 574-82, 1970). Des facteurs associatifs ont permis d'assurer sa stabilité. Nous avons utilisé por cela des fractions membranaires cellulaires, issues des mêmes germes microbiens ayant servi à l'élaboration de l'ARN ribosomaL Ces fractions me m branaires contiennent la totalité des substances peptidoglycaniques et sont connues comme adjuvant d'immunité. n n'est, contrairement aux habitudes, pas nécessaire d'avoir les mêmes fractiors membranaires (gLucopolysaccharides ou protéoglycanes) issues des mêmes germes microbiens que ceux qui ont servi à fournir l'A R N par extraction de leurs ribosomes. Les ARN d'origine ribosomaie (pouvant être utilisés) peuvent être extraits des souches suivantes - Klebsiella pneumoniae - Streptococcus (pneumoniae et pyogenes) - Staphylococcus aureus - Serratia marcescents - Escherichia Coli - Salm onella typhlm uriu m - Corynebacterium (granulosum, parvum, acnes) - Mycobacterium (tuberculosis, smegmatis et chelonei) - Hemophilus influenzae - Pneumocoque (Type Il) - Rothia Dento cariosus - Bacterium Coli - Shigella dysentariae - Enterococcus - Nocardia (astéroides, brasiiiensis, rhodocrans, opaca, rubra) - Bacille de Calmette et Guerin Leur P.M. moyen se situe entre 5.10 E4 et 1.10 E8 DaLton Pour la préparation de l'A R N, il existe de multiples procédés industriels ou semiindustriels. Nous citerons l'extraction d'ARN des germes comme par exemple celui décrit dans Infect et Im munity, 1,574,82,1970 (bactéries broyées, précipitation fractionnée, solubilisation des protéines riboso m aies, précipitation de l'ARN traité par PRO NASE, et enfin l'A RN obtenu est purifié par chromatographie échangeuse d'ions). Si l'ARN est obtenu par méthode enzymatique, la purification terminale pourra être faite par chromatographie de tamisage moléculaire. Voir notam ment - EHRESMANN, C (1972) Biochimie 54 : 901 - KAGAWA, H (1972) J. Biochem 1972 : 827 - SANTER, M. (1973) J. Bact. 116 : 1304 - NOMURA (1074) - Ribosomes - Ed. Cold. Spring Harbor Laboratory. Les fractions membranaires de cellules bactériennes utilisables sont 1)- Les polysaccharides capsulaires Klebsiella pneumonie Streptococcus pneumoniae Hemophilus influenzae Escherichia C oli - - KlebSella pneumoniae - C. ERBING, L. KENNE, B. LINBERG, J. LONNGREN (1976) - Structural Studies of the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae type I (Carbohydr. Res, 50 (1976) 115-120) - W. NIM MIC H (1968) - Zur isolierung und qualitativen bausteianalyse der K. angigen von Klebsiellen (Med. MIKROBID. u. IMMUNOL, 154, 117, 131). - C. RICHARD (1973) - Etude antigénique et biochimique des 500 souches de Klebsiella (Ann. Biol Clin. (1973) - Streptococcus pneumonjae - KAUFFMANN F. ent LUND E (1954) (Int. BulL Bact. Nomencl. 4, 125 - 128) - FELTON et OTTINGER (J. of Bactériologie, 1942, 43, 94, 105) - COLIN M, MAC LEOD M.D. and aL - Prevention of pneumococcal pneumoniae by im m unization with specific capsular polysaccharides (J. Exp. Med. 1945, 82, 445, 465) - DO CHEZ, A.R. and O.T. AVERY. The elaboration of specific soluble substance by pneumoccocus during growth (1917) (J.Exp. Med. 26 / 477 493) - WEST PHAL and LUDERITZ (Z. Naturf. (1952) 7B, 148) - GLAUDEMANS C.P.J. and H.P. TREFFERS - an improved preparation of the capsular polysaccharide from Diplococcus pneumoniae (carbohydr.Res. 1967, 4, 181-184) Hémophiles influenzae polysaccharide capsulaire de type poly-ribosephosphate - P.ANDERSON et ai, (1972) Im m unization of hum ans with polyribosephosphate, the capsular antigen of Hem ophilus influenzae type b (J.of Clin. Invest. VoL 51, (1972) 39 - 44 - P. ANDERSON et al (1977) insolation of the capsular polysaccharide from super- natant of Hemophilus infuenzae type b. (Infect. and Immun 1977, 15 (2), 472 -477 - Escherichia coli polysaccharides capsulaires -- LUDERITZ et al (1977) - Somatic and Capsular antigens of gram. negative bacteria (compr.Biochem. 26 A : 105 - 228) 2) - Les lipopolysaccharides membranaires (LPS) extraits de corynebacterium (avidum, bovis, diphteriae, enzymicum, equi, fascians, flaccum, faciens, flavidum, fusiforme, granuiosum, helvolum, hypertrophicans, insidiosum, liquefaciens, parvum, pauro m etabolum, pyogenes,tu m escens, xerosis). et les gram -: - Klebsiella (pneumoniae et rhinoscleromatis) - Salmonella typhimurium - Serratia (marcesceus, corralina, indica, plymuthica, Ldluea) - Neisseria m eningitidis - Escherichia Coli - C. ERBINGet al (1977) - Structural Studies on the Klebsiella LPS (Carbohydr. Res., 56, 377 - 381) - C.B. CASTOR et al (1971) - Characteristics of a highly purified pyrogenic LPS of Klebsiella pneumoniae (J.of Pharm. Sci, 60, (10), 1578 - 1580) - K.FUKUSHI (1964) Extraction and Purification of endotoxin from Enterobac- teriaceae : A co m parison of selected m ethods and sources (J. of Bacteriol 87 (2) (391 - 400) - GUADALUPE A.LIMJUCO. Studies on the chimical composition of LPS frcm Neisseria meningitidis Group B (J. of Gen.Microbiol 1978 (104, 187 - 191) - G.A. ADAMS (1967) Extraction of LPS frcm Gram - negative bacteria with DMSO (Canad. J. Biochem., 45, p.422 - 426) - K.G. JOHNSON (1976) - Improved techniques for the preparation of bacterial LPS (Canad. J. Micro-bioL (22) (29 - 34) - Y.B. KIM et al (1967) - Biclogicaliy active endotoxins frcm Salmonella mutans (J.of BacterioL 94) (5) (1320 - 1326) 3) - Les protéines membranaires de - Escherichia coli - Serratia marcescens - Streptococcus pyogènes - Salmonella typhimurium - Escherichia coli: - STIRM S.F. et al (1967) - Episome, carried surface antigen K 88 of Escherichia coli (J. Bacteriol 93 (2) (731 - 739) - SALLY, J.BETZ et al (1977) - Chimical and biological properties of a protein rich fraction of bacterial LPS (J. of ImmunoL 119 (4) (1475 - 1481) - Serratia marcescent - W. WEBER (1971) Studies on the protein moiety of endotoxin from gram - negative bacteria - characterization of tutie protein - moieting isolated by acetic acid hydrolysis of endotoxin of Serratia marcescens. - Salmonella typhimurium - NORA KUUSI et al (1979) Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonellosis of mice (Infect.and Immun. (1979) 25 (3), (857 - 862). - BARBER C et aL (1972) The protective role of proteins from S. typhimurium in infection of mice with their natural pathogen (Rev. Im munoL 36 77 - 81) - DELORD G. (1979) Etude d'un antigène vaccinant contenu dals le surnageant de culture de Salmonella typhimurium Souche M - 206 - Thèse Médecine de Lyon N 428 (1979) - G.W. GOODMAN (1979) Characterization of the chemical and physical properties of à novel B. - Lymphocyte activor - Endotoxin protein affect and Immun (1979), 24 (3) (685 - 696) - Streptococcus pyogènes - M.K.WITTNER (1977) - Homologous and Heterologous protection of mice with group A Streptococcal M Protein vaccine Infect and Im m un (1977) 15 (1) (104 - 108) - Les acides teicholcues et lipotéicholques de : streptocoques, staphylocoques et lactobacilles (1a surface des bactéries gam + est faite d'acide teicholque qui est un polymère du glycérol linké par des ponts phosphodiesters. Les articles suivants indiquent les procédés d'obtention - M.M. BURGER (1966) Teichoic Acids : antigenic determinants, chain separation, and their location in the cell wali (Microbiology (56), (p. 910 -917) - K.W. KNO X (1973) Im munological properties of teichoic acids (Bacteriol. Rewiews, 37 (21, 215 - 257) - GLENN A. MILLER (1976) Effects of Streptococcal Lipoteichoic acid on Host Response in Mice (Infect. and Immun. (1976) 13, (5) (1408 - 1417) - A.J. WICKEN et al (1975) Lipoteichoic acids : a new class of bacterial antigens : Science : 187 - 1161 - 1167) - Les différents dosages sont possibles pour l'ARN FISKE et SUBBAROW - J. Biol. Chem. (1926) (66, 375) dosage du phosphore. Chromatographie HPLC sur colonne echangeuse d'ions pour le contrôle qualitatif. ?≈LES PROTEINES LOWRY (J. Biol. Chem. (1951) 193, 265 - 275) * LES HEXOSES SCOTT T.A. (Analyt. Chem. (1953) 25, 1956 - 1961 - dosage colorimétrique à llanthrone. *LES HEXOSAMINES ELSON L.A. (Biochem J. (1933) 27, (1824 - 1828) * Les LIPOPO LYSACC HA RIDES JANDA J. et WORK E. (FEBS LETTERS) 1971, 16 (4) (343 - 345) Les facteurs adjuvants de l'immunité, en plus des fractions m e m branaires sont du collagène type III. puis dans un deuxième temps, le chlorure de sodium à 3,5 mg. lors des perfusions ou injections LV. Le collagène de type m utilisé est caractérisé par des séquences d'acides aminés suivantes, en gramme par kg. - Acide aspartique AA 51,5 - Hydroxyproline HP 107,o - Threonine TH 16,1 - Serine SE 27,8 - Acide Glutamique AG 95,9 - Praline PR 124,0 - Glycine GL 149,0 - Alanine AL 87,9 - Valine VA 23,3 - Methionine ME 7,5 -Isoleucine IL 14,4 - Leucine LE 27,8 - Tyrosine TY 6,7 - Phenylalanine PA 14,4 - Lysine LY 28,6 - Histidine HI 5,5 - Arginine AR 73,0 L'analyse-type du Collagène retenu est - Couleur blanc-jaunâtre - Densité apparente 250 g/l - Humidité 6 g - pH d'une solution à 10g 6,9 - Viscosité Engler à 400 C 2,50 (Solution à 17,75 % ) - Taux de matière grasses 0,9 % - Taux de cendres 2,2 % - Taux de Fe + Cu + Ca 462 mg/Kg. - Métaux lourds non décelable au spectrographe d'émission d'arc - Analyse élémentaire C 46,80 % H 7,10 g N 14,96 % Technique d'administration Elle peut etre orale, Mais de préférence parentérale * intraveineuse par injection directe * ou par perfusion lente * ou par injection sous-cutanée Ces techniques d'administration on été expérimentées avec succés. La formation de notre complexe vaccinal thérapeutique, fait avec des A R N ou des fragments d'ARN ribosomaux, des fractions membranaires (par exemple, proteo-glycanes de Klebsiella pneumoniae), et du collagène III permet en administrant des doses dépourvues de toute toxicité, d'obtenir un haut niveau de protection et de guerison. A titre indicatif, et non limitatif, nous retiendrons dans l'énoncé, la forme injectable,le complexe vaccinal contenant comme principe actif au moins un principe tel que défini précedem ment. Il est possible d'utiliser d'autres supports ou additifs compatibles avec l'utilisation en médecine. Les dosages journaliers et leur fréquence dépendent beaucoup de l'état du patient. Un surdosage ne présente aucun risque, compte tenu de le très faible toxicité du complexe. Par voie intraveineuse, on peut utiliser des séquences d'une semaine par mois. Chaque jour de la semaine comprenant: - Perfusion LV. lente de 500 ml. de chlorure de sodium à 0,9 % Chlorure de sodium à 0,9 gr. Eau PPI = QSP 100 ml 154 m mole/L 6 aq (= 6 H20) ( Soluté inj ex table apyrogène - Fractions saccharidiques membranaires p protéoglycanes de Klebsiella Pneumoniae 40 microgram mes - ARN (ribosomal) de Diplococcus pneumoniae 7 microgrammes Streptococcus pyogène (A 12) 7 microgrammes Hemophilus influenzae 1 microgram me Klebsiella pneumoniae 7 microgrammes - Composition d'acides aminés décrits 10 microgram mes - Phosphate disodique de Bétaméthazone 8 mg (soit 2 ml de soluté injectable) Au traitement par perfusion LV. lente, peut succéder le traitement par injections sous cutanées sur les patients pouvant être suivis de façon ambulatoire. Chaque injection correspond à - Fraction saccharique membranaire (= protéogiycanes) de Klebsiella Pneu moniae (par exemple) .............................. 40 microgrammes - ARN (ribosomal) de Diplococcus Pneumoniae ...................... 7 microgrammes Streptococcus pyogène (A 12)............... 12 7 microgram mes Hemophilus influenzae ....................... 1 microgram me Klebsiella Pneumoriiae 7 ....................... 7 microgram mes - Composition d'acides aminés décrits ..............,.. 10 microgram mes - 0,5 ml. de chlorure de sodium à 0,9 % - Phosphate disodique de Betamethazone ................. 4 mg (soit 1 ml de soluté injectable) Ce traitement peut-être poursuivi plusieurs mois jusqu'à la NEGATIVATION COM PLETE de la séropositivité (c'est à dire AgP 24 = 0) Le complexe thérapeutique vaccinal ainsi obtenu présente les caractères d'une iymphokine se fixant aux macrophages et qui inhibe la croissance intra-eellulaire du virus. Depuis 1974-75 (YOUMANS AS. et G.P.), ila été constaté que le schéma d'inhibition de la réponse immune à l'A R N était réalisée par différents inhibiteurs. Ceci nous a incité à concevoir notre invention qui nous fait obtenir la même inhibition sur la replication des retrovirus V.L H. YO UM ANS avait travaillé sur une seule souche bactérienne (mycobacterium tuben culosis) dont le "parasitisme" est uniquement intra-cellulaire. VENNEMAN et COLL pensent dès 1972 que le véritable antigène pourrait être associé à llA R N dont le rôle serait celui d'un adjuvant. li vaccine des souris avec de l'ARN ribosomal extrait par le phénol à 650 C. de Ribosomes d'une souche de Salmonella typhimurium. Trente jours après cette vaccination, il s'avère que les animaux sont mieux protégés que par vaccin souche vivante (atténuée!. Il est sourtout constaté que le niveau de protection est fonction de la quantité de l' A R N injecté. li est maintenant connu que l'ARN Ribosomal de Streptococcus Pneumoniae induit une protection de nature humorale et que l'ARN Ribose mai extrait de Klebsiella Pneumoniae induit une protection de nature cellulaire. Pour cela, des expériences préliminaires faites par DUSSOURD d'HTEJTERLBND, par FONTANGES et COLL (Microbiological Division of the Research Center of the Military Heaith Service, Lyon, France) ont démontré que ce mélange, injecté in vivo sur souris et cobayes, a une action sur les macrophages alvéolaires. Cet effet "transitoire" se retrouve en dosant la phosphatase acide des plages d'hémolyse directe au contact des cellules spleniques de souris. Les cellules immunologiques menées par DUSSOURD d'HINTERLAND, à partir de vaccins ribosomaux induisent chez la souris OF femelle la production d'anticorps spécifiques lorsqu'ils sont administrés à l'animal en présence d'adjuvant de FREUND (incomplet) ou de proteoglycanes membranaires de Klebsiella. Notre traitement vaccinal est, quant à lui, suivi d'effet immunostimulant cellulaire et humoral avec une action non spécifique mais réelle sur les V.LH. On peut assimiler cette action à la production d'un "V.N.F." (Virus Necrosis Factor) car c'est l'organisme du patient, lui-même qui est sollicité pour rejeter les cellules infectées. (L'antigénémie P24 étant, de ce fait, dans la quasi totalité des cas, réduite à 0). La demande thérapeutique de STEVEN ROSENBERG n'est pas identique, bien que voisine grossièrement. Celui-ci a localisé sur l'A D N humain le gêne qui produit le T N F (Tumor Necrosis Factor). Après l'avoir cloné sur Escherichia Coli, et reproduit, celui-ci a été introduit à l'aide d'un virus vecteur dans les lymphocytes T (Tueurs) que l'on rencontre dans les tumeurs. Notre schéma permet de produire un clonage naturel grâce aux A R N (Ribosomaux bactériens non spécifiques) organisés par l'adjuvant mis au point (co n binaison de chlorure de calcium + protéoglycanes membranaires + séquences collagéniques d'acides aminés). Ceci induit une vaccination contre les idiotypes des anticorps anti HIV, et production d'anticorps contre le site de liaison du virus sur la molécule C D4, en particulier. Il est nécessaire, lors des phases thérapeutiques, d'utiliser des corticoldes (type Bétamethazone) sous forme de phosphate disodique : 20 à 60 mg, par voie LV. ou LM.) pour diminuer ou inhiber la réaction auto-im mune anti CD qui contribue à la lymphopénie CD4. Ceci avec également induction dtinterferon endogène et activation des cellules N.K. Le but de notre complexe vaccinal immuno-modulateur est d'induire une réponse immunitaire une réponse im munitaire qui prévienne ou diminue (jusqu'à un seuiL d'auto-défense possible) la prolifération d'un agent infectieux, viral en l'occurence, introduit dans l'organisme. Notre originalité thérapeutique est, entre autre, de modérer ou supprimer l'existence de "cellules suppressives" ayant une action pro-infectieuse. Notre technique a une action anti-sidaSque par réponse cellulaire et / ou humorale de défense. E N C O N C L UgO N, notre complexe thérapeutique agit par évolution dirigée, produisant des molécules d' A R N qui, en se liant à des protéines virales, bloquent l'infection par le retro-virus du sida. Les exemples suivants sont communiqués à titre illustratif, mais non limitatif pour présenter les résultats de notre complexe vaccinal thérapeutique. Exemple 1: Mr. J.A..., 65 ans, hémophile, transfusé 8 ans avant. Contamination sidaique et hépatite (groupe IV C2). Décompensation majeure en septembre 1991. Hospitalisation, asthénie, perte de poids, troubles intestinaux, rhino-sinusiens, etc...Echec du traitement AZT. Début de notre traitement vaccinal en septembre 1992 (séquences de perfusions LV.), puis en décembre 1992 (séquences d'injections sous-cutanges) Actuellement : Bon état général Reprise de poids Séronégativité Ag P24 obtenue Exemple 2: Mme A.A..., 59 ans, épouse du patient précédent. Décompensation majeure en mai 1992. Asthénie, perte de poids, (groupe IV A). Début de notre traitement vaccinal en septembre 1992 (séquences de perfusions T,V.) puis en décembre 1992 (séquences d'injections sous-cutanées). Actuellement: Excellent état général Reprise du poids initial Séronégativité Ag P24 obtenue Exemple 3: Mr. E. C..., 30 ans, contamination sexuelle 6 ans avant. Diagnostiquée en 1988 (groupe IV C1). Asthénie en 1992, suivie de début de pneumocystose (Traitement par AZT + Bactrim Forte). Début de notre traitement vaccinal en septembre 1992 (séquences d'injections sous-cutanées uniquement) avec arrêt de toute autre thérapeutique. Actuellement : Excellent état général (avec extension de l'activité professionnelle) Séronégativité Ag P24 obtenue Ces traitements pratiqués sur ces patients ont été faits sur leur demande expresse, et en raison de l'inefficacité avérée de leurs traitements en cours. REVENDICATIO NS 1) - Complexe im munomodulateur antisidaique induisant une vaccination anti-idiotypique par fractions menmbranaires - glycopeptides et Iypopolysaccharides membranaires et acides ribonucléiques microbiens sur les sujets séropositifs contre les idiotypes des anticorps anti HIV. 2) - Complexe im munomodulateur selon la revendication 1 caractérisé par la production dtanticorps dirigés contre le site de liaison du virus (sur la molécule du CD4, en particulier) 3) - Complexe im munomodulateur selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par un conditionnement sous une forme telle qu'il permet l'administration simultanée d'adjuvant fait d'acides aminés se liant au virus, de chlorure de sodium à 3,5 mg. lors des perfusions LV. 4) - Complexe immunomodulateur selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé par un conditionnement sous une forme telle qu'il permet l'administration simultanée d'anti-inflam matoires majeurs (type corticoldes : Bétamethazone - DCI sous forme de phosphate disodique : 20 à 60 mg. par voie LV. ou LM.), à effets immunosuppresseurs, pour inhiber ou diminuer la réaction auto-immune anti CD4, qui contribue à la lymphopénie CD4. Ceci avec également induction d-nterferon endogène et activation des cellules N.K. 5) - Complexe im m uno modulateur selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend des molécules duales constituées par le couplage d'un bras fonctionnel d'acides aminés assurant la liaison à une cible avec un bras génétique d'ARN correspondant à la description codée de la composition du bras fonctionnel.