FR 2702660 A1 19940923 FR 9303060 A 19930317 COMPOSITIONS THERAPEUTHIQUES STABILISEES ET LEURS PROCEDES DE PREPARATION La présente invention concerne des compositions thérapeutiques stabilisées et leurs procédés de préparation. La présente invention concerne plus particulièrement la stabilisation d'agents prophylactiques, ou thérapeutiques ou de diagnostic constitués ou contenant des macromolécules ou des complexes macromoléculaires. L'importance commerciale des macromolécules biologiques augmente. La plupart des agents thérapeutiques ou protecteurs agissent dans le milieu aqueux des espaces inter- ou intracellulaires, ou les surfaces muqueuses. Au cours de ces dernières années, les biotechnologies ont eu des influences considérables dans les industries du secteur de la santé. Les nouveaux procédés pour la fabrication et l'isolement de matériaux macromoléculaires sont capables de réaliser, en quantités commerciales, des produits naturels ou issus du génie génétique, dotés de spécificités précédemment irréalisables. Les anciens composés thérapeutiques de poids moléculaires relativement faibles (aspirine, paracétamol, catécholamines, pénicilline) ont été caractérisés par une certaine facilité de formulation dans les comprimés, les émulsions, suspensions ou solutions. Les macromolécules - telles que les acides nucléiques, les protéines (et leurs cofacteurs), les glucides complexes, les lipides - et leurs complexes, deviennent d'un intérêt de plus en plus important en tant qu'agents protecteurs, ou thérapeutiques ou de diagnostic. Dans les milieux aqueux, toutes les macromolécules et les complexes macromoléculaires indiqués ci-dessus ont une tendance à la dégradation, ce qui limite leur utilité d'agent thérapeutique vaccinant ou de diagnostic. Pour beaucoup d'agents, la dégradation n'est pas un problème sérieux (par exemple, en suivant les indications du fabricant, on évite les problèmes associés éventuellement avec l'utilisation d'une insuline périmée). Néanmoins, même dans le meilleur des cas, l'augmentation de la durée de vie de l'ordre de 50% à 100% (à la température de 20 "C) d'un produit thérapeutique, sera la bienvenue (par exemple: l'insuline). Pour d'autres agents, le stockage sous forme de poudre lyophilisée est tout à fait satisfaisant, la dégradation commençant simplement au moment de l'incorporation dans un milieu aqueux. Pour plusieurs autres agents, les problèmes de stockage sous forme sèche ne peuvent pas être résolus. Pour certaines, stables sous forme sèche, la dégradation en milieu aqueux est tellement rapide que la stabilité présente un problème, même dans la courte période entre l'incorporation en milieu aqueux et l'utilisation. 1l y a plusieurs facteurs causant la dégradation : les procédés de fabrication, les enzymes de dégradation (les enzymes protéolytiques, les nucléases, les lipases, les enzymes glycolytiques), les agents d'oxydation ou de réduction (comme l'oxygène, ou les produits chimiques organiques ou inorganiques), la contamination microbienne. Les liaisons chimiques faibles sont importantes pour les macromolécules biologiques. La dénaturation thermale ne peut pas être évitée, en raison des nombreuses liaisons chimiques faibles qui caractérisent les macromolécules biologiques. Néanmoins, cela peut-être limité, par exemple, en gardant les températures relativement basses (réfrigération ou congélation). Afin de remédier au phénomène de dénaturation, on peut utiliser des adjuvants tel que MgC12, le polyéthylène glycol, etc; cependant ceux-ci peuvent présenter l'inconvénient de ne pas toujours (en fonction des concentrations) être physiologiquement appropriés. Pour chaque température ambiante, il y a un spectre d'énergie disponible pour les changements de structure dans une macromolécule ou dans un complexe macromoléculaire (REF: Watson, James et al. pages 126 à 162, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition (1987) Publishers Benjamin Cummings, ISBN 0-8053-9612-8). Dans le pire des cas, ces changements peuvent être associés à la rupture ou à la création de liaisons chimiques covalentes. Les énergies moins importantes seront peut-être suffisantes pour la création ou la rupture des liaisons chimiques secondaires (les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, les interactions de Van-der-Waals) qui jouent un rôle important dans les processus biologiques et les activités des macromolécules biologiques.L'importance des liaisons discutées ci-dessous, est la plus prononcée entre les températures de 0 C et 45"C, correspondant à la gamme des températures associées aux processus vivants dans les organismes supérieurs. Ces interactions faibles sont toutes favorisées par une complémentarité de structure physique. Par exemple, une hormone et son site d'attachement sont liés par plusieurs liaisons faibles. La complémentarité de structure augmente le nombre des interactions du type Van-der-Waals, hydrophobes ou hydrogène, et ainsi évite l'effet disruptif de l'énergie ambiante. L'eau elle-même joue un rôle important dans la stabilisation des macromolécules en milieu aqueux. Les liaisons hydrogène entre les molécules d'eau ordonnent la structure. La structure peut-être mise en évidence avec les techniques de diffraction des rayons-X ou des neutrons. A la périphérie des macromolécules, des molécules d'eau forment une sorte de couche, d'une profondeur de plusieurs molécules d'eau. Comme une cage, cette couche, renforcée par les liaisons hydrogène - entre des molécules d'eau et entre des molécules d'eau et les macromolécules - a pour effet de préserver l'intégrité du contenu. La structure électronique de l'eau permet le libre échange des protons (noyaux des atomes d'hydrogène) entre les éléments du treillis d'eau et avec les sites favorables sur les macromolécules en milieu aqueux. Dans les macromolécules, les molécules d'eau servent souvent de rôle de composant structurel, créant des ponts rigides entre les résidus protéiques, des bases nucléiques, des glucides ou des composants polaires des lipides. Les études cristallographiques montrent clairement l'inclusion des molécules d'eau dans plusieurs cristaux macromoléculaires. L'eau lourde (ou l'oxyde de deutérium, D2O ou 2H20) a été découverte par Urey en 1932. Cette découverte a précipité un intérêt immédiat, surtout concernant les éventuelles répercussions sur la chimie de la vie. Pendant des années 1932-1939, plus de 200 publications ont montré les effets de l'eau lourde sur les organismes vivants et leurs physiologie et biochimie. Dans tous les cas, D20 a été utilisée pour remplacer (entre 5% et 100%) H20 dans les milieux aqueux , mais les résultats obtenus n'ont pas permis de considérer l'eau lourde comme un agent stabilisateur. Pendant les années 1970-80, l'eau lourde est devenu un outil important, dans le domaine des études biophysiques, tel que la RMN ou la diffusion des neutrons monochromatiques. Pour la RMN, le noyau de deutérium possède l'atout de ne pas avoir de spin nucléaire. En milieu H20, dans un champs magnétique, les signaux de fréquence radio émis pars les noyaux excités ne peuvent pas être détectés, parce que tous les hydrogènes de l'eau créent un bruit de fond énorme. Dans le milieu D20, l'eau ne contribue pas à un bruit de fond, et la technique de résonance magnétique des protons est devenue très puissante- surtout pour les molécules qui contiennent des protons (1H) et qui sont solubilisées par D20. Les propriétés nucléaires des noyaux H et D sont bien différentes. Pour un faisceau de neutrons, le deutérium est relativement transparent, tandis que l'eau ordinaire est relativement opaque (Stuhrman H. (1974) J. Appl. Cryst. 7, 173187). Les diverses techniques permettent la différentiation des informations structurelles venant des différentes macromolécules. La cristallographie des neutrons est devenu un outil puissant. Ceci étant, bien qu'il soit connu que l'eau lourde apporte une augmentation d'énergie des liaisons hydrogène par un facteur de 0,24 kilocalorie par mole, rien ne permettait de prévoir l'influence de l'eau lourde sur la stabilisation de molécules solubilisées par l'eau, car interviennent des phénomènes autres que la nature de la liaison entre le solvant et la molécule, ces phénomènes tels que l'effet cage, étant à ce jour mal connus. L'un des buts de l'invention est de proposer des compositions thérapeutiques stabilisées, physiologiquement compatibles. L'un des buts de l'invention est de fournir des compositions thérapeutiques stabilisées, dans lesquelles les doses d'agents thérapeutiques peuvent être réduites par rapport aux mêmes compositions thérapeutiques non stabilisées. L'un des autres aspects de l'invention est de proposer un procédé de préparation simple de compositions thérapeutiques stabilisées. Ces différents aspects sont obtenus par les compositions de l'invention. A cet égard, la composition thérapeutique stabilisée de l'invention, contenant des macromolécules ou des complexes macromoléculaires, est caractérisée en ce qu'elle est en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable contenant de l'eau lourde (D20). On a trouvé que la substitution de la totalité ou d'une partie des noyaux d'hydrogène par des noyaux de deutérium, dans les molécules d'eau qui servent de solvant à une molécule ou à un complexe macromoléculaire qui constitue la substance active d'une composition thérapeutique, permettait de stabiliser ladite composition thérapeutique. Dans la nature, l'hydrogène est composé de 0,0156% de deutérium. Celuici peut-être purifié par la distillation ou l'électrolyse de l'eau, pour obtenir de l'eau lourde pure, qui peut-être alors électrolysée pour obtenir du deutérium pur. L'invention concerne l'utilisation de D20, ou des mélanges de D20 et de H20, comme agents de stabilisation des macromolécules ou complexes macromoléculaires en phases aqueuse (solutions, suspensions ou émulsions). Dans le contexte de cette invention, ce sont les propriétés de l'oxyde de deutérium, ou eau lourde, qui sont particulièrement intéressantes. Les noyaux H ou D qui s'échangent librement entre les molécules d'eau et entre les nombreux sites des macromolécules biologiques dissoutes, suspendues ou émulsifiées. D et H sont librement échangeables entre les sites d'hydrogène labiles, par exemple tous les hydrogènes dans la masse d'eau, ou beaucoup d'hydrogènes dans les macromolécules biologiques. Dans H20, D20 ou des mélanges des deux, les propriétés physiques des solutions montrent une graduation linéaire des propriétés physiques (telles que la densité ou le point d'ébullition ou les valeurs molaires pour l'énergie des liaisons hydrogènes) Selon un mode de réalisation avantageux, la composition de l'invention est telle que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires comprennent ou sont constitués par des acides nucléiques, des protéines, par exemple des anticorps polyclonaux ou monoclonaux - les susdits acides nucléiques, protéines, anticorps polyclonaux ou monoclonaux étant éventuellement complexés avec des lipides et/ou des glucides - des lipides, des glucides, ou des cofacteurs des protéines définies ci-dessus. A titre d'exemples de macromolécules biologiques et de complexes macromoléculaires, susceptibles d'entrer dans les compositions de l'invention figurent: 1) les acides nucléiques: 1'ADN, pour les applications in vivo (par exemple: thérapie génétique) et in vitro (par exemple: applications diagnostiques); l'ARN, des ribozymes pour les applications in vivo (modifications des acides nucléiques ou des complexes acides nucléiques/protéines); 1'ADN et 1'ARN, font partie des génomes des virus utilisés comme vecteurs dans la thérapie ou la vaccinologie; des complexes d'ADN/ARN naturels ou artificiels; les acides nucléiques utilisés peuvent être ceux existant sous des formes naturelles ou artificielles (créées par le génie génétique); 2) les protéines:: les facteurs catalytiques, tels que le Facteur VIII; les hormones responsables de la réglementation métabolique, telle que l'insuline les hormones médiatrices de la communication cellulaire, telles que les diverses cytokines et lymphokines; les enzymes, telles que le tPA (tissue Plasminogen Activator - activateur de plasminogène de tissus) utilisée pour la dispersion des caillots sanguins; les anticorps, polyclonaux et monoclonaux; parmi les applications éventuelles figurent: la thérapie - in-vivo et ex-vivo contre les cancers, contre les agents infectieux, contre d'autres activités biologiques - la diagnose - in vivo et in vitro les divers cofacteurs des protéines (par exemple: haem, des résidus glycosyl, des petites molécules organiques ou inorganiques); Les protéines utilisées peuvent être celles existant sous des formes naturelles ou artificielles (créées par le génie génétique); 3) les glucides: ces macromolécules n'ont pas encore trouvé d'applications comme thérapeutiques indépendantes, mais dans leurs complexes avec les protéines, elles sont reconnues comme facteur majeur dans la modification des activités de ces protéines; les différentes formes glucidiques peuvent invoquer des activités physiologiques significatives (comme c'est le cas pour la tPA, où les différentes "glycoformes" ont des activités bien différentes); 4) les lipides: les macromolécules lipidiques jouent des rôles importants dans les membranes cellulaires, mais hormis les molécules relativement petites comme les prostaglandines et les vitamines de groupe A, ces agents n'ont pas trouvé beaucoup d'applications thérapeutiques; leur intérêt se trouve dans leurs complexes macromoléculaires et en particulier dans leurs utilisations dans les liposomes utilisés comme systèmes de livraisons pour d'autres agents thérapeutiques; 5) les complexes macromoléculaires: les plus typiques sont les complexes des acides nucléiques et les protéines, ou les protéines et les glucides; un virus est un complexe macromoléculaire composé éventuellement d'acides nucléiques, de protéines, de glucides et de lipides (par exemple, le virus de la grippe ou le virus HIV); également, les complexes artificiels, telle qu'une couche lipidique enrobant un agent thérapeutique, ciblé par des activités localisées dans la couche lipidique, ayant une spécificité de liaison avec des composants de la cible visée; ; Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les compositions sont telles que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires sont soit en suspension, soit en solution, soit en émulsion dans le véhicule pharmaceutique. Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention le volume du véhicule pharmaceutique varie d'environ 0,1 ml à environ 20 ml, notamment d'environ 0,1 ml à environ 5 mi , et la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire varie d'environ l,u à environ 3g. Selon un mode de réalisation avantageux pour une dose unitaire, la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire est d'environ 10y pour un volume d'environ I ml de véhicule pharmaceutique. Selon encore un autre mode de réalisation, dans les compositions de l'invention, le véhicule pharmaceutique est un mélange H20-D20 et le rapport en poids entre H20 et D20 varie d'environ 10% à environ 100%, avantageusement d'environ 40% à environ 95%, et de préférence d'environ 80% à environ 95% . Dans la démonstration la plus générale, les mélanges D20/H20, contenant des concentrations élevées en D20 (90-100%), donnent une stabilisation équivalente à une réduction de température ambiante d'un facteur de 4-5"C (c'est à dire dans 95% de D20 à 25"C - par exemple - une macromolécule subit un effet de dégradation qui équivaut à celui observé normalement dans H20 à 20"C). Dans une autre démonstration, les concentrations élevées en D20 offrent une protection importante contre les suites de la contamination microbienne. Peu de microbes tolèrent les concentrations de D20 dépassant les 70%. Ainsi l'eau lourde est effectivement un milieu auto-stérilisant (à noter, que certaines microbes, généralement non-pathogéniques, peuvent être adaptés à la vie en milieu D20). Les compositions de l'invention sont non toxiques. En effet, il est connu que D20 à une concentration inférieure à 10% de l'eau corporelle n'a pas d'effet toxique significatif. Les agents thérapeutiques susceptibles de bénéficier de ces effets stabilisateurs sont souvent chers et contenus dans les petits volumes (vaccin oral, par exemple 0,15 ml), ainsi le prix relativement élevé de D20 a moins d'importance. Par ailleurs, actuellement D20 à 95% ne coûte que 10% du prix de D20 à 99,9%, et pour les applications de l'invention, la différence de concentrations est sans grande importance. L'augmentation de durée de vie est souvent très appréciable. Comme D20 et H20 sont entièrement miscibles, et comme les atomes d'hydrogène (1H et 2H) labiles s'échangent rapidement, on peut constater qu' une dose de D20 contenant un agent protecteur ou thérapeutique sera rapidement dispersée dans la masse d'eau corporelle. Avec une abondance naturelle de 0,0156% des atomes d'hydrogène, la masse de deutérium dans une personne de poids de 75kg sera d'environ lg, équivalent à 10g d'eau lourde. L'administration des petits doses (par exemple: 0,1 à 5,0 ml) ne dépassera pas la quantité d'eau lourde déjà présente dan le corps d'un adulte. Même les doses très élevées (10 ml à 50 ml) ne contribuent pas à un niveau de deutérium (environ 0,1 %) approchant les concentrations toxiques. L'eau lourde ne s'accumule pas et elle est rejetée dans l'urine, la transpiration et la respiration, au même titre que l'eau. En résumé, les expériences et les observations discutées démontrent qu'il y a un effet stabilisateur pour les macromolécules et leurs complexes, d'environ 5"C, associé à l'eau lourde. Les macromolécules et même les organismes vivants (certains microbes, généralement non-pathogéniques, pouvant être adaptés à la vie en milieu D20) ont montré une résistance aux températures normalement associées (en milieu H20) à la dénaturation thermale. Certains complexes ont montré une résistance réversible à la désagrégation induite par les solutions de faible force ionique (en H20, par exemple inférieure à KCl lmM). Dans les compositions de l'invention, le véhicule pharmaceutique contient un adjuvant de stabilisation, avantageusement MgCl2, de la carboxymethyl cellulose, du polyéthylène glycol, des molécules glucidiques, tels que glycérol, glucose, sucrose, (et autres sucres C6), les sucres pentoses et leurs polymères (les amidons par exemple), ces molécules glucidiques pouvant être complexées avec le polyéthylène glycole, le polyéthylène glycol présentant avantageusement un poids moléculaire d'environ 500 à environ 5000 daltons, et notamment d'environ 1000 à environ 5000 daltons. En application clinique, D20 (et ses mélanges) peut également être utilisé avec les régulateurs de tonicité, de pH, de viscosité et d'autres agents stabilisateurs tels que ceux indiqués ciessus. Dans les compositions de l'invention, le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est tel que le véhicule pharmaceutique ne présente pas une viscosité supérieure à environ 0,2 Pascal-seconde (20 centipoises). Dans les compositions de l'invention le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est inférieur à environ 3 %, et est avantageusement d'environ 1% à environ 30% Dans les compositions de l'invention les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés - dans des compositions vaccinantes, telles que celles contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre l'hépatite, notamment l'hépatite B ou C, contre la grippe, contre HIV, le DDT, le Tétracoq, ou, - en tant qu'agent de diagnostic, notamment pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des protéines, le facteur VIII, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des hormones, des acides nucléiques ou des ribozymes. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique de l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - soit la dilution à l'aide de D2O en quantité appropriée, de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse, préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse, contre D2O en quantité appropriée, de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharmaceutique, se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O, en quantité suffisante pour obtenir la concentration appropriée de la composition pharmaceutique. On utilise avantageusement la dialyse dans le cas où la composition pharmaceutique contient une substance active fragile, résistant mal aux autres traitements physiques. Les exemples cités ci-dessous ont purement une valeur illustratrice, et ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de cette invention. Ils démontrent: 1:- la thermostabilisation d'un vaccin important; 2:- la stabilisation d'un complexe macromoléculaire modèle, illustrant la réversibilité des effets de thermostabilisation dus à D2O est ses effets isotopes associés. Ces exemples peuvent être appliqués aux cas suivants: à un anticorps monoclonal anti-tumoral, au facteur VIII recombinant, à un ribozyme, au vaccin recombinant contre l'hépatite B, au vaccin contre la grippe, au vaccin contre la rougeole, au vaccin DTP, au vaccin contre le tétanos, au kit pour le diagnostic d'HW. Descriptions des figures: La figure 1 représente la thermostabilité, à 37"C, d'une composition pharmaceutique selon l'invention. L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la concentration des particules virales. La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de 1M) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de 1M) comme adjuvant. La figure 2 représente la thermostabilité à 42"C d'une composition pharmaceutique selon l'invention. L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la concentration des particules virales. La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de 1M) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de 1M) comme adjuvant. La figure 3 représente la thermostabilité à 45"C d'une composition pharmaceutique selon l'invention. L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la concentration des particules virales. La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharmaceutique en solution aqueuse, contenant MgCk (à raison de 1M) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharmaceutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgCt (à raison de 1M) comme adjuvant. La figure 4 représente la présence ou l'absence de sédimentation de PMN, selon la force ionique de l'eau, et selon la présence ou non d'eau lourde. La sédimentation des PNN a été faite à pH 7,75 (en milieu de D2O, p11 8,15 selon l'électrode de verre) 0,2mM EDTA, à une force ionique selon le Tableau 1 ci-après. Toutes les sédimentations sont faites dans le MSE CENTRISCAN, ultracentrifugeuse analytique, dans le rotor comportant 6 cellules de mesure à 50.000 t/mn. Les parties A à C correspondent à un intervalle de mesure de 6 minutes, les parties D à G correspondent à un intervalle de mesure de 8 minutes, longueur d'onde: 254nm; concentration des échantillons: 0,5 à 1,0 mg/ml. L'axe des abscisses correspond au rayon de la mesure et ltaxe des ordonnés à la concentration en ADN. Cette figure démontre que l'eau lourde consolide les particules de PNN autant que la force ionique. EXEMPLE t Tltemzostabilisation du pollovirus avec l'eau lourde L'immunogénicité des virus atténués dans le vaccin de Sabin contre la polio, dépend de leur degré infectieux au moment de l'administration. Les niveaux de prises du vaccin oral contre la polio (OPV) sont liés à la dose de chacune des trois souches virales 1, 2 et 3, constituant le vaccin. Une explication pour les niveaux de prises assez bas dans certains pays du tiers monde, peut être les ruptures dans la chaise du froid avant l'administration du vaccin. La souche 3 du vaccin de Sabin est très critique, à cause de son immunogénicité et de sa thermostabilité qui sont relativement médiocres. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) demande à ce jour que l'OPV soit stabilisé par l'addition de MgCl2 (concentration 1 M) dans le vaccin. Loin d'être la solution idéale, (perte de moins de 0,5 log d'activité après sept jours à 45"C), cette méthode est actuellement le meilleur compromis. Il est démontré ici que selon l'invention, l'eau lourde à 95% offre, même sans aucun autre adjuvant, une stabilisation équivalente ou supérieure à celle offerte par MgCk, en suivant les procédés entièrement standard (à part, bien sûr, le fait d'utiliser l'eau lourde). Objectifs expérimentaux Toutes les références à l'eau lourde (D2O), dans les exemples ci-après, font référence à l'eau lourde à 95%. 1 Détermination et quantification des effets de D20 sur la stabilisation du vaccin de Sabin. 2 Comparaison des effets de thermostabilisation de: (a) D2O et (b) D2O additionné de MgCk. La souche type 3 est responsable de la plupart des problèmes associés au vaccin de Sabin. Pour cette raison, ce virus a été la cible des études préliminaires. Contexte globale de l'étude sur le vaccin de polio. Dans l'homme, l'immunogénicité de l'OPV est associée au caractère infectieux de la suspension virale. La possibilité que présente l'OPV de se dégrader dans les régions ayant des températures ambiantes élevées est un problème (voir ci-dessus). Pour l'OMS, le but d'éliminer la polio avant l'année 2000 dépend en partie de l'amélioration des procédés de stabilisation des vaccins actuels (surtout pour les pays en voie de développement). Les résultats suivants montrent que la souche 3 du vaccin de Sabin, bénéficie d'une stabilisation très marquée dans l'eau lourde à 95% (les autres conditions étant semblables à celles utilisées avec l'eau), sans autre agent de stabilisation. L'effet de D2O est légèrement supérieure à la meilleure des solutions actuelles (MgCt, 1M) Méthodes expénmentales La souche Sabin 3 est choisie comme modèle. La culture des virus est faite selon les procédés classiques. L'addition d'eau lourde est effectuée en resuspendant le culot de virus (sédimenté dans une ultracentrifugeuse selon les conditions standard) dans D2O (19 volumes) et un tampon PBS (tampon salin phosphaté) 20 fois concentré (1 volume). L'ultracentrifugation est sans gêne significative pour les virus. Les études comparatives sont faites avec les milieux standard (1120, H2O/MgCt et MgC12 + D20). La concentration du virus est ajustée à approximativement 1010 unités/ml dans D2O à 95%. Les virus sont soumis à différentes conditions thermiques selon les courbes montrées ci-après. Virus -titration Pour tous les échantillons, des dilutions de série sont effectuées (MEM Eagles avec sels d'Earle, 4%SVF, 3% bicarbonate de sodium, pénicilline, streptomycine) dans les puits d'une plaque de microtitration. Une suspension de cellules Hep2C est ajoutée et l'ensemble est incubé à 35"C pendant 5 à 7 jours. Les plaques sont colorées avec du "noir de naphtalène" pour évaluer la viabilité des cellules. Les titres sont ensuite calculés. Chaque expérience comporte des contrôles. Les résultats ci-après concernent la mesure de la stabilité des compositions de l'invention aux trois températures suivantes: 37"C, 42"C, 45"C. RESULTATS, Jours à 37"C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H20 MgC12 D2O MgCl2/D2O 0 10 10 10 10 2 8.6 9.5 9.6 9.6 5 7.8 8.1 8.1 8.2 7 6.8 7.5 7.7 7.8 RESULTATS, Jours à 42"C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H20 MgCl2 D2O MgCl2/D2O 0 10 10 10 10 2 5.4 8.8 9.4 9.3 5 3.4 5.4 6.0 6.2 7 2.8 5.2 5.5 5.4 RESULTATS, Jours à 45"C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H20 MgCl2 D2O MgCl2/D2O 0 10 10 10 10 2 4.6 7.8 8.5 8.7 5 1.8 4.8 5.8 6.5 7 0.4 4.7 4.7 4.9 EXEMPLE 2 Stabilisation de l'architecture de la nucléosome par D20 Le noyau de la nucléosome (PNN) est composé de quatre paires de molécules protéiques, les histones H2a H2b, H3 et H4. Chaque octamère de protéine est entouré de 144 paires de base d'ADN, complétant 1,75 tours superhélicale (Noll M. (1974) Nature 251, 249-251; Kornberg R.D. (1974) Science 184, 868-871; Finch J. et al. (1977) Nature 269, 29-35). Gordon a étudié l'effet de la force ionique (en milieu H2O) sur les propriétés de sédimentation de la PNN (Gordon V.C. et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci (USA). 75, 660-663).L'exemple ci-après illustre les différences importantes entre les propriétés de stabilisation de l'eau ordinaire et de l'eau lourde envers la PNN. La PNN peut être considérée comme une sorte de système modèle de la famille des complexes acide nucléique/protéine. Méthodes expérimentales La sédimentation des PNN préparées à partir d'érythrocytes de poulet (Suau P. et al (1977) Nuc. Acids. Res. 4, 3769-3786) est étudiée avec l'ultracentrifugeuse analytique (MSE CENTRISCAN) dans plusieurs conditions de force ionique et de concentrations en eau lourde. Plusieurs échantillons en H20 sont après ré-équilibrés dans l'eau lourde en dialysant contre un volume important d'eau lourde, à diverses concentrations et compositions ioniques. Toutes les solutions sont tamponnées avec 0,2mM EDTA, pH 7,75 (en D2O ajusté à pH 8,15 selon l'électrode de verre). La force ionique a été apportée par KC1. Résultats La sédimentation des PNN est dépendante de la composition ionique de l'eau. Très évidente est la désagrégation des PNN en milieu H20 à faible puissance ionique (Fig 4A). Dans l'eau lourde, cette dégradation des PNN ne se manifeste pas (Fig 4D). Même la dépendance ionique de la valeur de sédimentation (en unités Svedburg - s) devient très limitée (Voir Tableau 2 et Fig 4). La PNN désagrégée (4A), après dialyse contre l'eau lourde, redevient une particule discrète avec une sédimentation caractéristique pour une PNN. Dans toutes les études, les PNN ont adopté - en milieu D2O - la forme la plus compacte observée dans les milieux H20 (après normalisation des valeurs de sédimentation pour corriger les différences de densité et de viscosité de l'eau lourde et de ses mélanges). Dans les donnés complémentaires, non présentées ici, il est observé que la stabilisation à faible force ionique est manifeste à partir d'environ 40% de D2O. TABLEAU 1 rayon de la première Echantillon INCll mM Solvant Valeurs mesure mesure (voir indice)mm miii A o H2O l 63.15 B | 5 l 10.2 63.15 C 25 11.2 65.43 D O D20 11.0* 63 .29 E 25 11.2 63.44 F-Aredialysé o l 110* i 63.00 G- C redialysé 0 n 11.1* 63.22 * valeur s corrigé selon viscosité et densité de D2O. REVENDICATIONS 1. Composition thérapeutique stabilisée contenant des macromolécules ou des complexes macromoléculaires, caractérisés, en ce qu'elle est en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable contenant de l'eau lourde (D2O). 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle les macromolécules ou les complexes macromoléculaires comprennent ou sont constitués par des acides nucléiques, des protéines, par exemple des anticorps polyclonaux ou monoclonaux - les susdits acides nucléiques, protéines, anticorps polyclonaux ou monoclonaux étant éventuellement complexés avec des lipides et/ou des glucides - des lipides, des glucides, ou des cofacteurs des protéines définies ci-dessus. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires sont soit en suspension, soit en solution, soit en émulsion dans le véhicule pharmaceutique. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le volume du véhicule pharmaceutique varie d'environ 0,1 ml à environ 20 ml, notamment d'environ 0,1 ml à environ 5 ml, et la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire varie d'environ lju à environ 3g. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le véhicule pharmaceutique est un mélange H2O-D2O et en ce que le rapport en poids entre H2O et D2O varie d'environ 10% à environ 100%, avantageusement d'environ 40% à environ 95%, et de préférence d'environ 80% à environ 95%. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précedentes, caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique contient un adjuvant de stabilisation, avantageusement MgC12, de la carboxymethyl cellulose, du polyéthylène glycol, des molécules glucidiques, tels que glycérol, glucose, sucrose (et autres sucres en C6), pentoses et leurs polymères, ces molécules glucidiques pouvant être complexées avec le polyéthylène glycol, le polyéthylène glycol présentant avantageusement un poids moléculaire d'environ 500 à environ 5000 daltons, et notamment d'environ 1000 à environ 5000 daltons. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est tel que le véhicule pharmaceutique ne présente pas une viscosité supérieure à environ 0,2 Pascal-seconde- (20 centipoises). 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est inférieur à environ 3%, et est avantageusement d'environ 10% à environ 30%. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés - dans des compositions vaccinantes, telles que celles contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre l'hépatite, notamment l'hépatite B ou C, contre la grippe, contre HIV, le DDT, le Tétracoq, ou, - en tant qu'agent de diagnostic, tel que pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des protéines, le facteur VIII, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des hormones, des acides nucléiques ou des ribozymes. 10. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - soit la dilution à l'aide de D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse contre D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O en quantité suffisante pour obtenir la concentration appropriée de la composition pharmaceutique.