FR 2705148 A1 19941118 FR 9305941 A 19930512 CAPTEUR ELECTROCHIMIQUE DE DOSAGE ENZYMATIQUE DE TYPE ENFET ET DEPOSITIF DE DOSAGE LE METTANT EN OEUVRE La présente invention appartient au domaine technique général des capteurs électrochimiques intégrés, reposant sur le principe du dosage d'un substrat à l'aide d'une enzyme et d'un transistor à effet de champ, sensible à au moins une espèce ionique donnée (Ion Sensitive Field Effect Transistor, ISFET). De tels capteurs sont communément dénommés ENFET: ENzymatic Field Effect Transistor = transistors à effet de champ enzymatique. De manière plus précise, l'invention concerne un capteur électrochimique de dosage enzymatique de type ENFET, dans lequel la grille sélective, sensible à au moins une espèce ionique donnée, est au moins partiellement recouverte: - par au moins une membrane interne comprenant au moins une enzyme apte à catalyser la décomposition du substrat (ou des substrats) à doser, en formant et/ou en consommant la susdite espèce ionique donnée, - et par au moins une membrane additionnelle externe. Ce type de capteur exploite le fait que l'enzyme qu'il contient entraîne l'hydrolyse du substrat à doser et, par suite, une modification du pH de la solution de dosage au voisinage de la surface du capteur, par exemple. Dans ce cas, 1'ISFET mis en oeuvre est un ISFET de mesure de pH. Les variations de pH ainsi déterminées sont directement reliées à la concentration du substrat à doser. Ces capteurs ENFET ont l'avantage, entre autres, d'avoir une taille relativement réduite, d'être d'un coût de revient peu élevé, d'offrir une très bonne sensibilité de mesure, de donner accès à de multiples possibilités de dosages de différents substrats et d'être biocompatibles. I1 s'ensuit qu'il existe de nombreuses possibilités d'application de ces capteurs ENFET dans le domaine de l'analyse clinique. Parmi les substrats à doser les plus étudiés, on peut citer le glucose et l'urée qui font, respectivement, intervenir la glucose oxydase (GoD) et l'uréase. Les perspectives prometteuses de développement, pressenties initialement pour ces capteurs ENFET, ont été quelque peu contrariées par un certain nombre d'obstacles techniques sérieux. Le plus important d'entre eux est l'influence extrêmement négative de la capacité tampon du milieu de dosage sur la réponse du capteur. Ce problème est particulièrement aigu dans le cadre des applications en analyses biomédicales de ces capteurs, puisque les milieux biologiques sont, par définition, des milieux tampons. Corollairement à cela, il est clair que le pH du milieu de dosage et ses éventuelles variations constituent, également, un facteur pénalisant au regard des performances des capteurs ENFET. Un autre frein au développement des ENFET est que leur intervalle dynamique de mesure, i. e. la gamme de concentration en substrat dans laquelle la réponse du capteur est linéaire, est relativement limité. Bien souvent, cet intervalle dynamique de mesure se situe largement en deçà des concentrations biologiques normales de substrats, tels que le glucose ou l'urée. Cela impose donc de procéder à des dilutions du milieu de dosage, de manière à ramener celui-ci dans une fenêtre de concentration en substrat, pour laquelle la mesure du pH par l'IFsET est directement corrélée à la concentration à mesurer. Un certain nombre de scientifiques, dont les Inventeurs de la présente invention, ont pris en considération ces différents problèmes et ont proposé des solutions plus ou moins satisfaisantes. On sait, par exemple, que, pour éliminer l'influence des variations de pH dans le milieu de dosage, il est avantageux de mettre en oeuvre un dispositif de mesures différentielles comprenant un capteur de référence (REFET) et un capteur de mesure ENFET. SHULGA et al. ont, par ailleurs décrit dans "Sensors and Actuators B", 10 (1992), 41-46, deux types de capteurs ENFET destinés au dosage du glucose et comprenant une enzyme, la glucose oxydase, immobilisée dans un gel de polyacrylamide ou bien encore dans de Ia sérum albumine bovine réticulée au glutaraldéhyde. Ces ENFET ne permettent pas de supprimer l'opération pénalisante de dilution, pas plus que l'influence néfaste du tampon. En outre, l'effet de la force ionique, faible dans le cas d'échantillons biologiques, doit être neutralisé par un ajout de NaCl. SAITO et al. proposent dans "Sensors and Actuators B", 5 (1991), 237239, un capteur ENFET pour le dosage du glucose comprenant une membrane interne dans laquelle l'enzyme est immobilisée, ainsi qu'une membrane externe constituée d'albumine hautement réticulée à l'aide de glutaraldéhyde. Une telle disposition permet de restreindre la diffusion du glucose du milieu de dosage vers la membrane enzymatique et ainsi d'augmenter, de manière significative, l'intervalle dynamique de mesure du capteur. Dans le document "Analytica Chimica Acta", 231 (1990), 305-308, GARDIES et al. décrivent des capteurs ENFET dans lesquels la couche interne enzymatique n'est pas constituée par une membrane polymère formant une matrice d'immobilisation d'enzymes, mais est simplement constituée de l'enzyme en ellemême, directement liée par liaison covalente à la grille sélective. Un montage différentiel ENFET/REFET est en outre mis en oeuvre dans les expériences décrites dans ce document, en vue de limiter l'influence des variations de pH dans le milieu de dosage. En tout état de cause, cette variante dans le mode de support de l'enzyme ne résoud rien en ce qui concerne le problème majeur de l'influence néfaste du tampon. Un des objets de la présente invention est de fournir un capteur électrochimique de dosage enzymatique, de type ENFET, dans lequel l'effet négatif du tampon, éventuellement présent dans le milieu de dosage, ne se fait pas ressentir, notamment au regard du seuil de détection du substrat considéré. Un autre objet de l'invention est de fournir un capteur ENFET possédant un intervalle dynamique de mesure étendu, ainsi qu'une certaine insensibilité vis-àvis des variations de pH du milieu de dosage; mais en revanche une sensibilité de mesure de l'activité enzymatique, donc de la concentration en substrat à doser, élevée. Un autre objet de l'invention est de fournir un capteur ENFET dans lequel la réaction enzymatique d'hydrolyse du substrat se déroule sans perturbation, issue, par exemple, de la force ionique du milieu de dosage. Un autre objet de l'invention est de fournir un capteur ENFET de coût de revient limité. La Demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence que la nature du matériau constitutif de la membrane additionnelle est prépondérante au regard de l'insensibilisation du capteur vis-à-vis du tampon. C'est après de nombreuses recherches et expériences qu'elle a pu isoler la classe des matériaux ionomères comme étant particulièrement appropriée pour la membrane additionnelle. Ainsi, la présente invention atteint les objets ci-dessus, parmi d'autres, en proposant un capteur électrochimique de dosage enzymatique, du type transistor à effet de champ (ENFET), dans lequel la grille sélective, sensible à au moins une espèce ionique donnée, est au moins partiellement recouverte par au moins une couche interne enzymatique comprenant au moins une enzyme apte à catalyser la décomposition du substrat à doser, en formant et/ou en consommant la susdite espèce ionique donnée et par au moins une membrane additionnelle externe, superposée à la couche enzymatique, l'originalité de ce capteur provenant, essentiellement, du fait que cette membrane additionnelle est à base d'au moins un ionomère. Au sens de la présente invention, le terme "ionomère" désigne des polymères ioniques présentant des groupements salins inorganiques liés à la chaîne polymère. Cette définition correspond à celle donnée dans "Encyclopedia of Polymer Science and Engineering", volume 8, Identification to Lignin, 1987, pages 393-396. Conformément à l'invention, le ionomère, constitutif de la membrane additionnelle, est choisi parmi les familles de ionomères suivantes - copolymères d'éthylène et d'acide acrylique ou méthacrylique, - élastomères carboxylés, - polyisobutylènes sulfonatés téléchéliques, - terpolymères éthylène-propylène-diène sulfonatés, - polyvinyliques substitués dont les polyacylates, tels que le polyacétate ou butyrate et le polyvinylimidazole, - perfluorés, les ionomères perfluorés étant préférés et, parmi eux, les perfluorosulfonates étant particulièrement préférés. L'un des ionomères les plus appropriés est un copolymère de tétrafluoroéthylène et d'éther vinylique perfluoré, présentant un groupement fluorosulfonate. L"'Encyclopedia of Polymer Science and Engineering" donne, dans son volume 16 page 642-643, des précisions quant aux ionomères perfluorés. A titre de variante de ionomère, on peut citer le polyvinyle butyral, qui est un copolymère linéaire de vinyle butyrallalcool vinylique/acétate de vinyle. Les proportions respectives de ces comonomères varient de 60 à 90/9 à 33/1 à 7, de préférence de 70 à 80/28 à 19/1 à 2, le ratio 75/22/3 étant particulièrement préféré. Un autre composé ionomère avantageux est le polyvinylimidazole, qui est un polymère ionique chargé positivement. L'un des facteurs à prendre en compte dans le choix des ionomères est relatif au procédé d'obtention de la membrane additionnelle, qui s'effectue, classiquement, par immersion dans une solution de polymères (spin-coating). Cela impose que ledit polymère soit soluble dans un solvant compatible avec les autres constituants du capteur. L'ENFET, ainsi réalisé, bénéficie d'une sensibilité à l'égard de la capacité tampon environnante, extrêmement limitée. Il est également à relever que cet ENFET présente un intervalle dynamique de mesure relativement étendu et, qu'en outre, il permet à la réaction enzymatique de s'effectuer dans des conditions optimales. Suivant l'invention, la membrane additionnelle en ionomère a une épaisseur qui est le résultat d'un compromis entre l'insensibilité vis-à-vis du tampon visée et la vitesse de mesure. En effet, il est clair que, plus la membrane additionnelle est épaisse, plus la diffusion des espèces ioniques protagonistes s'opère lentement. La Demanderesse a déterminé que l'épaisseur de la membrane additionnelle peut être comprise entre 0,1 et 10 micromètres, de préférence entre 0,5 et 5 micromètres et, plus préférentiellement encore, entre 0,5 et 2,5 micromètres. Concernant la couche enzymatique interne, et conformément à un premier mode de réalisation, elle est constituée par une membrane formant une matrice dans laquelle est incluse et immobilisée l'enzyme. Le matériau constitutif de cette membrane est, avantageusement, au moins un composé macromoléculaire, de préférence choisi parmi les protéines, les polysaccharides, les polymères et copolymères synthétiques. A titre d'exemples de protéines préférées, on peut citer les protéines non enzymatiques, telles que les collagènes, les albumines, de préférence réticulées. S'agissant des polysaccharides, on peut parfaire l'illustration en évoquant les alginates, la chitine, la cellulose et ses dérivés, tels que la nitro cellulose ou les esters et les éthers de cellulose, ou bien encore les amidons et dérivés. Parmi les polymères convenables, on trouve les gels de polyacrylamide, les polymères vinyliques, dont notamment les polyacétates de vinyle, les alcools polyvinyliques, de préférence l'alcool polyvinylbutyral. Les polyuréthanes ou les polysiloxanes, du type hétéropolysiloxanes portant des groupements fonctionnels, tels que les amines, sont également appropriés. Dans le cas de l'albumine, la réticulation s'opère, avantageusement, à l'aide de glutaraldéhyde et, à ce propos, il est intéressant de noter que le niveau de réticulation a une incidence sur l'extension de l'intervalle dynamique de mesure. Ce niveau de réticulation est lié au temps d'exposition au glutaraldéhyde, lequel est choisi, de préférence, de 20 à 60 minutes et, plus préférentiellement encore, à 30 minutes à la température ambiante. Le ratio Rl = enzyme : composé macromoléculaire, a également son importance au regard de l'importance de la plage de linéarité de la réponse en différence de potentiel par rapport à la concentration en substrat. Ainsi, le ratio R, exprimé en % en masse, varie de 5 à 95, de préférence de 8 à 50 et, plus préférentiellement encore, de 9 à 11. Conformément à une disposition avantageuse de l'invention, la membrane interne contient au moins un polyol, de préférence le glycérol, le saccharose ou le sorbitol, le glycérol étant particulièrement préféré. Ce polyol a pour effet d'améliorer l'état de surface, les propriétés mécaniques et d'adhésion de la membrane enzymatique. Sur le plan pondérai, le rapport R2 composés macromoléculaires/polyols, exprimé en % en volume, s'tablit entre 2,5 et 20, de préférence entre 5 et 15 et, plus préférentiellement encore, est de l'ordre de 10; Selon un deuxième mode de réalisation de la couche enzymatique, l'enzyme (ou les enzymes) est directement liée de façon covalente à la grille sélective. Ce greffage est rendu possible grâce à une fonctionnalisation chimique préalable de la surface de la grille sélective (cf. notamment, dans le document GARDIES et al sus-mentionné). Le capteur ENFET selon l'invention possède, par exemple, une structure générale du type de celle des capteurs ISFET ou ENFET connus. Pour s'affranchir des phénomènes parasites, tels que les variations de pH, il est intéressant d'avoir recours à un dispositif de dosage électrochimique enzymatique mettant en oeuvre au moins un capteur de mesure ENFET, tel que décrit ci-dessus, ainsi qu'au moins un capteur de référence (REFET) semblable au susdit capteur de mesure, à la différence près qu'il ne comprend pas d'enzyme. Les exemples qui suivent mettent bien en évidence toutes les variantes et les avantages des capteurs ENFET selon l'invention et illustrent, également, un de leurs modes d'obtention. DESCRIPIION DES FIGURES Fig. 1: Graphes de la tension U mesurée en millivolts par des capteurs ENFET à glucose oxydase permettant la mesure du glucose, en fonction de la concentration en glucose en millimoles. Les courbes la, lb correspondent à un capteur 1 selon l'art antérieur exempt de membrane additionnelle et les courbes 2c, 2d à un capteur 2 comprenant une membrane additionnelle à base de Nafion4D conformément à l'invention. Pour a et c les mesures se sont faites dans un milieu titrant 1 millimole/l de tampon phosphate et de pH égal à 7,4, tandis que pour les mesures b et d, la concentration en tampon est de 10 millimoles/l pour un pH de 7,4. Fig. 2: Graphe de dU/dT (mV.ma') en fonction de la concentration en glucose (millimoles) pour les capteurs 1 et 2 dans les conditions a, b et c, d ci dessus. Fig. 3 : Graphe de la sensibilité de mesure d'un capteur 3 avec membrane additionnelle en polyvinyle butyral conforme à l'invention, en fonction de la concentration en glucose en millimoles/l. EXEMPLES EXEMPLE 1: Dans cet exemple, on se propose de fabriquer des capteurs ENFET enzymatiques, comprenant de la glucose oxydase et destinés au dosage du glucose. On réalise, d'une part, un ENFET 1 de référence conforme à l'art antérieur et ne présentant pas de membrane additionnelle en plus de la membrane enzymatique et, d'autre part, un capteur ENFET 2 possédant une membrane additionnelle à base de ionomère perfluorosulfonaté commercialisé sous la marque déposée Nafion&commat;. 1.1 CAPTEURS ENFET: Les capteurs ENFET mis en oeuvre sont d'un type parfaitement connu et sont obtenus à partir de capteurs ISFET pH, tels que ceux décrits dans Sensors and Actuators B, 10 (1992), page 42, paragraphe 2.1. 1.2 M4TERLuX: La glucose oxydase (GoD) mise en oeuvre provient de Penicillium vital, ayant une activité de 168 UI/mg et provenant de la fabrique COSARSKY (CHERKASY, Ukraine). La sérum albumine bovine est celle commercialisée par la Société SIGMA. Le glutaraldéhyde se présente en solution titrant 25 % et commercialisée par la Société MERCK. Le Nations utilisé est le produit commercial constitué par une solution à 5 % dans un mélange hydroalcoolique contenant 10 % d'eau et vendu par la Société ALDRICH sous la référence 27,470-4, page 937 catalogue. 1.3 MÉTEIODOLOGIE: 1.3.1 MEMBRANE ENZYMATIQUE: La procédure classique consiste à préparer une solution de tampon phosphate (KH2PO4 - NaOH) pH 7,4, titrant 20 millimoles et contenant 5 % de glucose oxydase, 5 % de sérum albumine bovine et 10 % de glycérol. La membrane est obtenue, tout d'abord, par dépôt d'une goutte de la solution précédente sur la partie sensible du capteur ENFET, le REFET étant traité par la même solution exempte d'enzyme, puis par exposition du capteur à des vapeurs de glutaraldéhyde pendant 30 min. Les capteurs ainsi préparés sont ensuite séchés à la température ambiante pendant 10 à 15 min. Ils sont conservés avant utilisation, dans du tampon phosphate à 20 mM à un pH de 7,4 ou à l'état sec. Dans ce dernier cas, l'ajout d'un agent conservateur n'est pas nécessaire. 1.3.2 FORMATION DES MEMBRANES ADDITIONNELLES : Elle s'opère par dépôt à la tournette d'une solution de Nafion4 > à 5 %, puis séchage à température ambiante. Le stockage des ENFET ainsi obtenus se fait dans du tampon phosphate 20 millimolaire à pH 7,4. 1.4 MESURES. On procède à une mesure différentielle de différence de potentiel entre I'ENFET/REFET du capteur 1 et du capteur 2, dans une cellule de mesure plus ou moins tamponnée et contenant du glucose en solution. Les mesures s'opèrent à température ambiante. 1.5 RÉSULTATS: La fig. 1 montre la surprenante et importante efficacité du capteur 2 selon l'invention, au regard de l'insensibilité de la mesure vis-à-vis des variations de pouvoir/tampon. Les courbes c, tampon = 1 millimole, et d, tampon = 10 millimoles, sont superposables, tandis que l'écart entre les courbes a et b est manifeste. On observe, également, sur la fig. 2 que le capteur 2 selon l'invention a une vitesse de réponse légèrement plus faible que le capteur 1 de référence. EXEMPLE 2: Dans cet exemple, on prépare un capteur ENFET 3 selon l'invention, de dosage du glucose (enzyme = glucose oxydase), de la même manière et avec les mêmes matériaux que ceux de l'exemple 1, à la différence près que la membrane additionnelle du capteur 3 n'est plus à base de Nafion&commat;, mais à base d'un ionomère formé par du polyvinyle butyral, c'est-à-dire un copolymère de vinyle butyral/d'alcool vinylique/d'acétate de vinyle (75 : 22: 3 respectivement). La solution de polyvinyle butyral utilisée pour le dépôt est éthanolique et titre 5 %. il ressort clairement de la fig. 3 que le capteur ENFET 3 selon l'invention permet d'obtenir une courbe de sensibilité de mesure (microvolts/s)/concentration en glucose (millimoles/l), approximativement linéaire de 1 millivolt à 50 millivolts. On peut donc en déduire que les membranes additionnelles à base de ionomères des capteurs selon l'invention ont, pour avantage supplémentaire, mais non négligeable, de permettre l'extension de l'intervalle dynamique de mesure du capteur. Cela facilite les mesures, car il n'est plus nécessaire de diluer le milieu de dosage. REVENDICATIONS: 1 - Capteur électrochimique de dosage enzymatique, du type transistor à effet de champ (ENFET), dans lequel la grille sélective, sensible à au moins une espèce ionique donnée, est, au moins partiellement, recouverte: - par au moins une couche interne enzymatique comprenant au moins une enzyme apte à catalyser la décomposition du (ou des) substrat(s) à doser, en formant et/ou en consommant la susdite espèce ionique donnée, - et par au moins une membrane additionnelle externe, superposée à la couche enzymatique, caractérisé en ce que cette membrane additionnelle est à base d'au moins un ionomère. 2 - Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ionomère est sélectionné parmi les familles de ionomères suivantes - copolymères d'éthylène et d'acide acrylique ou méthacrylique, - élastomères carboxylés, - polyisobutylènes sulfonatés téléchéliques, - terpolymères éthylène-propylène-diène sulfonatés, - polyvinyliques substitués dont les polyacylates, tels que le polyacétate ou butyrate et le polyvinylimidazole, - perfluorés, les ionomères perfluorés étant préférés et, parmi eux, les perfluorosulfonates étant particulièrement préférés. 3 - Capteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ionomère est un copolymère de tétrafluoroéthylène et d'éther vinylique perfluoré présentant un groupement fluorosulfonate. 4 - Capteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la membrane additionnelle a une épaisseur comprise entre 0,1 et 10 ,um, de préférence entre 0,5 et 5 m et, plus préférentiellement encore, entre 0,5 et 2,5 tcm. 5 - Capteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la couche enzymatique interne est constituée par une membrane formant une matrice dans laquelle est immobilisée l'enzyme et réalisée à partir d'au moins un composé macromoléculaire, de préférence choisi parmi les protéines, les polysaccharides ou les polymères et copolymères synthétiques. 6 - Capteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que la membrane enzymatique interne contient au moins un polyol, de préférence le glycérol, le saccharose ou le sorbitol, le glycérol étant particulièrement préféré. 7 - Capteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la couche enzymatique est formée par l'enzyme (ou les enzymes) directement liée(s) par liaison covalente à la grille sélective. 8 - Dispositif de dosage électrochimique enzymatique mettant en oeuvre au moins un capteur de mesure selon l'une quelconque des revendications l à 7 (ENFET), caractérisé en ce qu'il comporte, également, au moins un capteur de référence (REFET) semblable au susdit capteur de mesure, à la différence près qu'il est exempt d'enzyme.