FR 2702478 A1 19940916 FR 9302662 A 19930308 NOUVEAUX DERIVES DE BISTRAMIDES, LEUR OBTENTION ET LEURS APPLICATIONS EN THERAPEUTIQUE L'invention a pour objet de nouveaux dérivés de bistramides, leur obtention et leurs applications en thérapeutique. Les bistramides sont ainsi appelés par analogie avec un organisme marin à partir duquel ils peuvent être extraits, à savoir l'ascidie Lissoclinum bistratum. Plusieurs bistramides ont déjà été décrits. Il s'agit en particulier des bistramides A, B et C. Leur structure chimique, complexe, n' a été élucidée que récemment (voir article de Foster et al. dans J.A.C.S. 1992, 114). Elle correspond à la formule (A) suivante: Formule A avec RI et R2 représentant, respectivement, pour le bistramide A pour le bistramide B pour le bistramide C L'intérêt pour ces produits résulte, d'une manière générale, de la forte activité cytostatique qu'ils présentent en particulier in vitro. Cependant, leur cytotoxicité et leur toxicité élevées invivo ne permettent pas d'envisager la mise à profit de leurs propriétés pour des utilisations comme médicaments antUtumoraux. La DOL50 de ces bistramides est en effet de l'ordre de 1,7 mg/kg (mesure sur la souris, apres injection du produit par voie intra-veineuse). Les travaux des inventeurs sur les invertébrés marins, en particulier sur l'ascidie Lissoclinum bistratum Sluiter, accompagnée de ses Prochlorons symbiontes, les ont conduits à mettre au point des conditions d'extraction spécifiques permettant d'isoler de nouveaux bistramides présentant une activité biologique de grand intérêt. De manière surprenante, l'étude de ces nouveaux bistramides a montré qu'ils étaient dotés d'un effet cytostatique invitro et d'un effet antitumoral invivo, mais que, contrairement aux bistramides évoqués plus haut, leur cytotoxicité et leur toxicité in vive étaient beaucoup plus faibles, voire inexistantes autorisant leur utilisation en thérapeutique. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux dérivés présentant un squelette structural du type des bistramides. Elle a également pour but de fournir un procédé d'obtention de ces produits par extraction à partir de L. bistratum. L'invention vise également les applications biologiques et biochimiques de ces nouveaux bistramides, en particulier pour la thérapie de cancers et, notamment, de tumeurs humaines solides. Les bistramides de l'invention sont caractérisés en ce que - ils sont capables d'exercer in vive une activité antitumorale entraînant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprimé par les cellules des lignées bronchopulmonaires non à petites cellules, - leur DL5O est supérieure à 30 mg/kg, voire 160 mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) dans laquelle -R1, X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R4 et R5, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe -OH, -NH2 ou -N02, ou un atome d'halogène, ainsi que leurs isomères et les produits résultant de déshydratation interne. L'expression "activité antitumorale in vivo" signifie qu'une inhibition de la prolifération tumorale des cancers bronchopulmonaires a été mise en évidence, sans toxicité aigüe pour 1' animal. Ces propriétés autorisent l'obtention d'un plateau thérapeutique permettant l'accès aux normes du National Cancer Institute pour les produits avec i C La DL50 des produits de l'invention a été mesurée sur la souris après injection des produits par voie intraveineuse. Compte tenu de la valeur de la DL5O des bistramides ainsi définis, les bistramides A, B, et C mentionnés plus haut se trouvent exclus du champ de l'invention. On notera de plus qu'en raison de leur forte toxicité ces bistramides A, B et C ne pourraient conduire, pendant la durée d'un traitement, à l'obtention des effets avantageux observés avec les produits de l'invention. Selon une disposition préférée de l'invention, R comporte de 5 à 15 atomes de carbone. Selon une autre disposition préférée, R1 comporte une ou deux doubles liaisons éthyléniques. R2 comprend de préférence de 6 à 10 atomes de carbone, notamment 8 ou 9 et comporte avantageusement une double liaison éthylénique. Dans encore une autre disposition préférée, X et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de 2 à 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5. R3 et R5 représentent avantageusement, dans l'une quelconque des dispositions qui précèdent, un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 à 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène. Des bistramides particulièrement préférés au regard des propriétés antitumorales in vive recherchées sont choisies parmi - le bistramide D, de formule (II) - le bistramide K de formule (III) - le bistramide L de formule (IV) Les formes énantiomères ou diastéréoisonères, seules ou en mélanges, des bistramides définis ci-dessus font également partie de l'invention. La connaissance de la formule chimique de ces produits permet de recourir aux procedés de synthèse chimique pour leur obtention. L'invention vise également les bistramides tels qu'obtenus par extraction à partir de L. bistratum, et leurs dérivés. Ce procédé d'extraction comprend des fractionnements successifs par chromatographie à partir d'un extrait organique de L. bistratum. Ces fractionnements sont réalisés en mettant en oeuvre les opérations suivantes: - chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés. - chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné. La nature du support des colonnes de chromatographie et sa granulométrie, ainsi que le ou les mélanges de solvants utilisés sont choisis de manière à séparer sélectivement en peu d'étapes les bistramides biologiquement actifs. Les deux premiers fractionnements sont avantageusement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, dichlorométhane, avantageusement additionnés de méthanol. Dans l'étape de purification finale des fractions on utilise de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorométhane ou de l'acétonitrile. L'élution peut être réalisée selon un gradient, ou en variante de manière isocratique. Les fractions telles qu'isolées à chaque étape sont également visées par l'invention. L'extrait organique auquel est appliquée cette succession d'étapes de fractionnements est obtenu par le traitement de poudre lyophilisée de L. bistratum avec du dichlorométhane. L'étude des propriétés pharmacologiques des produits de l'invention a montré qu'ils exercent un effet cytostatique in vitro et agissent sur des cellules tumorales selon un mécanisme d'action différent de celui observé avec les agents antitumoraux utilisés habituellement en chimiothérapie des cancers. Il apparaît en effet que les bistramides induisent une différenciation terminale irreversible des cellules tumorales, se concrétisant par un arrêt du développement de la tumeur" Ce mode d'action, qui avait été envisagé pour le bistramide A, ne pouvait toutefois être mis à profit, étant donné la toxicité aigüe de ce produit. Son administration pendant la durée d'un traitement répétitif, entraînerait obligatoirement l'intoxication de l'organisme traité. Tout au contraire, le caractère faiblement toxique des produits de l'invention pour l'organisme permet à l'effet différenciateur de se manifester sur le tissu tumoral, sans effets défavorables, autorisant ainsi l'établissement d'un plateau thérapeutique en vue d'un traitement. L'invention vise donc la mise à profit des propriétés de ces bistramides pour 1 'élaboration de compositions pharmaceutiques. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un bistramide tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. Ces compositions renferment le cas échéant des principes actifs d'autres médicaments. On citera notamment leur association avec des médicaments anti-mitotiques poisons de fuseau, tels que la vincristine ou la vinblastine. Ces compositions sont particulièrement appropriées pour la chimiothérapie des cancers dans lesquels peu de cellules se trouvent en état de prolifération. Elles sont ainsi avantageusement utilisables pour le traitement des tumeurs humaines solides à évolution lente, donc très chimiorésistantes, comme certaines tumeurs pulmonaires, tumeurs coliques, tumeurs du sein et mélanomes pour lesquels la thérapeutique actuelle ne dispose d'aucun médicament réellement efficace. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélules, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de 10 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg. D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Ces formes injectables renferment par unité de prise de 10 à 50 mg de principe actif, de préférence de 15 à 30 mg. A titre indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient 10 à 30 à mg/jour, en une ou plusieurs prises pour le traitement de tumeurs bronchopulmonaires. L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les dérivés de bistramides définis plus haut. Ces réactifs peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études d'éventuelles activités antitumorales. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent relatifs à l'obtention de dérivés de bistramides et à l'étude de leur activité antitumorale et en se référant à la figure unique qui représente une courbe de croissance en fonction du temps de xénogreffes tumorales pulmonaires chez la souris nude après traitement avec des bistramides de l'invention. EXEMPLE 1 : Isolement des bistramides D, K et L par extraction à partir de Lissoclinum bistratum. On rapporte un exemple d'extraction à partir d'échantillons de Lissoclinum bistratum, accompagnée de ses Prochloron symbiontes, provenant des îles de Ua et de N'Do, Nouvelle Calédonie. Ces échantillons ont été débarassés des débris apparents, broyés, puis lyophilisés quelques heures après la récolte. PROCEDE D'EXTRACTION Les quantités pondérales et volumiques sont données pour le traitement de 100 g de matière première lyophilisée. La poudre lyophilisée d'ascidie est traitée à 4 reprises par 400 ml de dichlorométhane, à température ambiante, et sous agitation. La solution organique est filtrée, puis évaporée à sec à l'évaporateur rotatif (température inférieure ou égale à 40 C). Le poids d'extrait brut obtenu est de 750 mg. Cet extrait brut est fractionné par chromatographie liquide basse pression (silice 60-200 pm acétate d'éthyle:méthanol 93:7 en élution isocratique). Parmi la série des fractions obtenues, trois sont à nouveau fractionnées, mais par chromatographie liquide haute pression (CLHP) (silice 8 um ; dichlorométhane: méthanol 95:5 en élution isocratique). Les nouvelles fractions obtenues sont réunies en fonction de leur composition en bistramides : il en résulte trois lots : n" 1, n" 2 et n" 3. Le lot n" 1 (50,7 mg) est purifié par CLHP (C-18 15-25 pm ; méthanol:eau 85:15 en élution isocratique) et fournit 19,8 mg de bistramide D. Le lot n" 2 (9,0 mg) est purifié par CLHP (C-18 10 pm ; méthanol:eau 85:15 en élution isocratique) et fournit 3,6 mg de bistramide K. Le lot n" 3 (18,2 mg) est fractionné par CLHP (silice 10 pm ; dichlorométhane:méthanol:eau 96:3,9:0,1, élution isocratique, puis C18,8pm;acétonitrile:eau 60:40), ce qui conduit à l'isolement de 2,9 mg de bistramide L. Les trois produits se présentent comme des solides amorphes non colorés. Ils peuvent être chromatographiés sur couche mince (silice, dichlorométhane : méthanol 90:10) et révélés par un réactif à base de vanilline (vanilline lg, acide sulfurique pur 100 ml ; pulvérisés sur la chromatographie, puis celle-ci est chauffée 10 minutes à 1100C). Les rendements, par rapport au poids de poudre sèche, sont de : bistramide D 21,4.10-3%, bistramide K 3,7.10-3%, bistramide L 2,9.10-3%. FORMULES BRUTES ET POIDS MOLECULAIRES Bistramide D : C40H70N208, PM 706 ; ion C40H68N2 7 PM = 688,5006 Bistramide K : C4OH70N208, PM 706 ; ion C40H68N207, PM = 688,5022 Bistramide L : C40H68N208, PM 704,4968 FORMULES DEVELOPPEES Les formules développées données plus haut ont été établies sur la base des données spectrales habituelles (UV, IR, RMN et masse), et par comparaison avec celle du bistramide A comme décrit par Foster et al dans la référence précitée. EXEMPLE 2 : Etude des effets pharmacodynamiques des bistramides D, K, et L invitro et in vivo : Effets invitro On rapporte ci-après les résultats des cytoxicités exprimées en CI50 en ,ug/ml (concentration correspondant à une inhibition de 50 % de la croissance des cellules) sur différents types cellulaires. Les déterminations ont été effectuées selon le protocole donné dans Cancer Chemother. Pharmacol. (1991) 28:283-292 par Roussakis et al. Bistramide D Bistramide K Bistramide L NSCLC.N6-L16 3,43 3,23 0,12 B16 0,10 1,90 2,4 p388r 5,82 > 10 0,12 P388s 0,36 1,57 0,48 KB 10,00 > 10 0,72 HT 29 2,76 5,60 0,29 L'effet cytostatique des produits au niveau du cycle cellulaire a été également étudié par cytofluorimétrie. La technique utilisée correspond à celle rapportée par Roussakis et al. dans la référence ci-dessus. On constate un effet antiprolifératif des produits lié à un blocage irréversible en phase G1, entraînant la mort des cellules tumorales bronchopulmonaires "non à petites cellules" (NSCLC-N6). Ce blocage en phase G1 est suivi d'un passage en phase G1DT, qui caractérise l'état de la différenciation terminale. Les cellules qui atteignent cette phase G1DT produisent une substance intracytoplasmique, de nature protéique, qui est le produit de l'expression d'un gène spécifique, lequel joue probablement le rôle d d'un anti- oncogène. Lorsque les cellules NSCLC-N6 sont induites à la différenciation terminale sous l'effet des bistramides de l'invention, on observe en effet, invitro, l'inhibition de l'expression de l'oncogène erb-b2, habituellement exprimé par le modèle expérimental utilisé, et de son produit d'expression, ltoncoprotéine c-erb-b2. Effets in vive L'activité antitumorale des produits de l'invention a été étudiée à l'encontre de tumeurs solides de type NSCLC greffées chez la souris nude. Les tumeurs greffées en sous-cutanée ont été mesurées sur leur grande longueur L et leur petite longueur 1. Le volume tumoral a été évalué d'après la formule Vt=Lx12/2. La croissance tumorale au jour j a été calculée par la formule Vtj/Vtjo pour chaque souris, Vtjo étant le volume tumoral au début du traitement. La figure unique montre les courbes de croissance tumorale en fonction du temps (jours) obtenues avec ou sans traitement par les bistramides. La courbe " g se rapporte à l'expérience témoin, les courbes "- -", " -- o --" et " --z--" aux expériences avec respectivement 10, 20 et 5 mg/kg de bistramide D et la courbe "= à å une expérience avec 10 mg/kg de bistramide K. Chaque point est la moyenne des croissances tumorales de 6 souris. Dans ces expériences, le bistramide K est injecté à raison de 10 mg/kg par voie intrapéritonéale, pendant 16 jours, et le bistramide D à raison de 5 mg/kg par voie intrapéritonéale quotidiennement pendant 16 jours ; à 10 mg/ kg par voie intraveineuse aux jours 1, 5, 9, 14, et à 20 mg/kg par voie intraveineuse aux jours 1, 5, 9, 14. L'examen de ces courbes montre que par rapport aux témoins (100 %), la croissance tumorale s'établit, au bout de 30. jours, pour les animaux traités, à bistramide D (5 mg/kg, IP) : 100 % (10 mg/kg, IV) : 76 % (20 mg/kg, IV) : 53 % bistramide K (10 mg/kg, IP) : 49 % EXEMPLE 3 : Prépraration d'une solution injectable de bistramide D. On dissout 2 g de bistramide D dans 1000 ml de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est répartie, dans des conditions aseptiques, dans des ampoules de 10 ml, contenant 20 mg de produit par ampoule. REVENDICATIONS 1. Dérivés de bistramides biologiquement actifs, caractérisés en ce que - ils sont capables d'exercer in vive une activité antitumorale entraînant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprime par les cellules des lignées bronchopulmonaires non à petites cellules, - leur DL5O est supérieure à 30 mg/kg, voire 160 mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) dans laquelle -R1,- X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R4 et R5, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe -OH, -NH2 ou -NO2, ou un atome d'halogène, ainsi que leurs isomères et les produits résultant de déshydratation. 2. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R1 comporte de 5 à 15 atomes de carbone. 3. Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que R1 comporte 1 ou 2 doubles liaisons éthyléniques. 4. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que R2 comporte de 6 à 10 atomes de carbone, notamment 8 ou 9 et, avantageusement une double liaison éthylénique. 5. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que X et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de 2 à 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5. 6. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que R3 et R5 représentent un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 à 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène. 7. Le bistramide D de formule (II) 8. Le bistramide K de formule (III) 9. Le bistramide L de formule (IV) 10. Dérivés de bistramides selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de formes énantiomères ou diastéréoisomères. 11. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité efficace d'au moins 1 bistramide selon l'une des revendications 1 à 10, en association avec un véhicule pharmaceutique. 12. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable. 13. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules et qu'elles renferment de 10 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg. 14. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement par unité de prise de 10 à 50 mg de principe actif, de préférence de 15 à 30 mg. 15. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 11 à 14, utilisées comme médicaments antitumoraux, en particulier pour le traitement de tumeurs solides. 16. Procédé d'obtention de bistramides selon l'une des revendications 1 à 10 par extraction à partir de L. bistra tum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de - chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés. - chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné, les deux premiers fractionnements étant avantageusement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, dichlorométhane, avantageusement additionnés de méthanol, et l'étape de purification finale des fractions, en utilisant de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorométhane ou de l'acétonitrile.