FR 2702490 A1 19940916 FR 9302883 A 19930312 PROCEDE DE LYOPHILISATION DE CULTURES DE MICROORGANISMES, LYOPHILISATS OBTENUS ET LEUR UTILSATION L'invention concerne d'une façon générale la cryodessication ou lyophilisation de cultures de microorganismes. La cryodessication ou lyophilisation est une technique de déshydratation consistant à ôter l'eau d'un substrat quelconque préalablement congelé en sublimant la glace qui s'y trouve. La sublimation est le passage direct de l'état solide à l'état gazeux sans passage par l'état liquide. Le départ de la vapeur d'eau est alors assuré par le maintien du vide au dessus du substrat et l'apport d'énergie à celui-ci. Il faut en effet apporter 2800 joules pour sublimer un gramme de glace. Les cultures de microorganismes visées par l'invention s'entendent des moûts de culture ayant supporté la croissance de ces microorganismes et les contenant. Ces moûts pourront cependant avoir été concentrés en microorganismes par des techniques de centrifugation, filtration ou microfiltration. Les microorganismes peuvent être des procaryotes gram+ ou gram ou des eucaryotes et sont pris ici dans l'acception la plus générale du terme englobant également les cellules animales et végétales susceptibles de se multiplier dans un environnement favorable. L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycan naturel consistant en un polymère linéaire de 50.000 à 10.000.000 de daltons. C'est un polysaccharide constitué d'unités répétitives d'acide glucuronique et de N-acétylglucosamine liées alternativement par des liaisons 1-3 et 14. I1 est généralement extrait des crêtes de coq ou il est obtenu par fermentation bactérienne à l'aide de streptocoques du groupe A ou C. Dans la présente invention, le terme acide hyaluronique désigne aussi les sels de cet acide. Les biologistes et les industriels ont besoin de préserver les cultures de cellules animales, végétales, microbiennes pour un grand nombre de raisons. Parmi cellesci, il faut citer les impératifs de stabilisation et de stockage des souches de microorganismes, mais aussi l'intérêt de disposer de lots suffisamment importants et se conservant aisément pour servir eux mêmes de précultures utilisées pour ensemencer directement des réacteurs biologiques, ou pour être administrés à des humains ou des animaux.Les industries de la fermentation, parmi lesquelles on compte notamment la vinification, la panification, la brasserie, la laiterie, la fabrication d'acides alimentaires, d'antibiotiques, d'enzymes, de cultures cellulaires, sont particulièrement intéressées par ces impératifs de stabilisation et de stockage mais aussi par l'intérêt de disposer de levains ou précultures se conservant facilement et très longtemps dans des conditions ordinaires de stockage. La lyophilisation des cultures de microorganismes n'a apporté qu'une solution partielle à ces problèmes. La congélation et la dessication nécessaires à la lyophilisation sont en effet des étapes très éprouvantes pour les microorganismes, ce qui se traduit par des taux de survie ou de revivification très faibles, de l'ordre du pour cent pour certains microorganismes très fragiles. Des cryoprotectants ont été incorporés aux moûts de culture pour protéger les microorganismes lors de la phase préliminaire de congélation. Ceux-ci agissent par suppression de la formation des cristaux de glace qui endommagent les parois des microorganismes. Les cryoprotectants les plus employés sont le lait, le lactose, le glycérol, le diméthylsulfoxide (DMSO), les monosaccharides hydrogénés ou non, les hydrolysats d'amidon. Ces cryoprotectants de faible masse moléculaire exercent aussi, grâce à leur pouvoir rétenteur d'eau, une action protectrice qui se manifeste également lors de la fin de l'étape de sublimation de la glace. Il faut en effet conserver un certain taux d'humidité aux lyophilisats, de l'ordre de 2 %, pour maintenir à l'état de vie latente les microorganismes déshydratés. Cependant, ce taux doit être limité pour éviter aux microorganimes de se développer et de disparaître par manque de nourriture ou accumulation de produits métaboliques toxiques. Ce pouvoir rétenteur d'eau permet aussi d'assurer la création ou le maintien de liaisons hydrogène assurant la stabilité des différents constituants cellulaires. L'emploi de ces cryoprotectants a permis d'améliorer les taux de survie des microorganismes dans les lyophilisats. Cependant, les conditions éprouvantes de congélation et de dessication ont également un effet notoire sur la durée de la phase de latence des microorganismes lyophilisés lorsque ceux-ci sont replacés dans des conditions favorables à leur multiplication. Le stress subi par ces microorganismes lors de la lyophilisation est en effet tel que non seulement une grande partie meurt, mais aussi que les survivants eux mêmes éprouvent de grandes difficultés à recoloniser le milieu dans lequel ils ont été introduits, ces microorganismes ne retrouvant pas rapidement leur capacité de multiplication. Or il est de la plus grande importance que cette phase de latence correspondant à un réveil des microorganismes soit aussi brève que possible. En effet, si ce réveil est bref ces microorganismes envahissent rapidement le milieu auquel on les a destinés, prévenant par là même toute contamination accidentelle qui prendrait immanquablement le pas sur des microorganismes revivifiables mais somnolents. L'objectif de la présente invention est d'obtenir des cultures lyophilisées de microorganismes pour lesquels la phase de latence soit très brève et le taux de survie des microorganismes très élevé. Et la Société Demanderesse a eu le mérite de découvrir que ces objectifs sont atteints lorsque l'on procède à la lyophilisation des moûts de culture en présence d'acide hyaluronique. La présente invention vise donc un procédé de lyophilisation de cultures de microorganismes caractérisé en ce que la lyophilisation est effectuée en présence d'acide hyaluronique. L'invention vise également des cultures de microorganismes lyophilisées caractérisées en ce qu'elles contiennent de l'acide hyaluronique. De préférence, l'acide hyaluronique utilisé conformément à l'invention présente une masse moléculaire supérieure à 300.000 daltons. L'acide hyaluronique est utilisé, conformément à l'invention, de préférence de façon telle que sa concentration dans le moût de culture à lyophiliser soit comprise entre 0,1 et 5 g/litre et plus préférentiellement encore entre 0,5 et 2 g/litre. Il faut noter que ces valeurs ne sont pas critiques mais concernent plutôt des valeurs en deçà desquelles l'effet de l'acide hyaluronique ne se fait que peu sentir et au delà desquelles une amélioration du raccourcissement de la phase de latence ou du taux de survie ne sont plus réellement perceptibles. De préférence, on utilise également pour procéder à la lyophilisation un cryoprotectant classique, tel que le lait, le lactose, le glycérol, le DMSO, les monosaccharides hydrogénés ou non ou les hydrolysats d'amidon, à raison de 5 à 100 g de cryoprotectant par litre de moût de culture et plus préférentiellement encore à raison de 10 à 50 g/litre. Bien que l'invention soit applicable aux microorganismes de façon générale, celle-ci s'applique de façon plus préférable aux microorganismes utilisés dans l'industrie laitière, dans l'industrie de la fermentation, dans la production et/ou l'utilisation des probiotiques ou d'extraits végétaux. On peut citer parmi ces microorganismes les Bacillus, les Lactobacillus, les Pseudomonas, les Corynebactéries, les Bifidobactéries, les Acetobacter, les Aspergillus, les Mucor, les Saccharomyces. L'invention sera plus particulièrement exemplifiée ci-dessous par des procaryotes bactériens du genre Lactobacillus, Streptococcus et Gluconobacter et par des eucaryotes tels que la levure Saccharomyces cerevisiae. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent et qui ne se veulent pas limitatifs. Dans tous les exemples, on a estimé la capacité qu'avaient des microorganismes différents, lyophilisés sur des supports témoins et des supports selon l'invention, à recoloniser les milieux dans lesquels on les ensemençait. On a utilisé deux méthodes pour estimer cette recolonisation, l'une classique mais laborieuse consistant à prélever au cours du temps des parties aliquotes de milieux de culture puis à dénombrer, par dilution et étalement sur boites, les Unités Formant Colonie (UFC). Dans cette méthode, le lyophilisat est remis en suspension dans 2 ml de milieu Tryptone/sel à 1 g/l de peptone et 8,5 g/l de NaCl et ces deux millilitres ont servi à ensemencer des erlenmeyers contenant 18 ml de milieu de culture adéquat. L'autre méthode utilisée, plus rapide mais nécessitant un matériel plus élaboré, consiste à mesurer les changements de la capacitance se produisant dans les milieux de culture au cours de leur recolonisation par des microorganismes lyophilisés. On sait que les variations de la capacitance d'un moût de culture sont corrélées assez étroitement et ce jusqu'au terme de la phase exponentielle de croissance, à la croissance des microorganismes. On pourra pour cela se référer à l'article de RUTH FIRSTENBERG-EDEN et coll., Journal of Microbiological Methods 2(1984) pp 103 - 115. On a utilisé pour cette technique d'estimation de la croissance des microorganismes par mesure de la capacitance, le BACTOMETER, Microbial Monitoring System M 120 SC, commercialisé par MERIEUX France, en reprenant 0,1 ml de lyophilisat remis en suspension dans 2 ml de milieu Tryptone/sel à 1 g/l de peptone et 8,5 g/l de NaCl par ampoule lyophilisée et en diluant ces 0,1 ml dans 0,9 ml de milieu de culture adéquat préalablement disposé dans les cupules de mesure de l'appareil. Ces cupules ont été thermostatées à 30 C et on a enregistré au cours de la croissance des microorganismes les courbes donnant le pourcentage de changement de la capacitance d'origine au cours du temps. EXEMPLE 1 : STREPTOCOCCUS LACTIS IL 561 (AFNOR 1989 NF-T-72181) Une souche de STREPTOCOCCUS LACTIS IL 561 a été cultivée durant 48 heures à 30 C en anaérobiose sur un milieu gélosé M.R.S. A partir de cette boîte cultivée, on a prélevé une ose de tapis bactérien qui a servi à ensemencer un erlenmeyer de 20 ml de milieu de culture liquide M.R.S. Après 24 heures de culture en anaérobiose à 30 C, on a prélevé plusieurs fois 1 ml de cette culture et on a dilué chaque prélèvement dans des ampoules à lyophiliser contenant 5 ml de milieux supports constitués de lait écrémé dilué à 10 % auquel on a ajouté - aucun produit, - 1 g/l d'acide hyaluronique, - 10 g/l de mannitol. Ces tubes ont ensuite été lyophilisés sur appareil de type LYOLAB, puis les ampoules ont été scellées puis conservées quinze jours à température ordinaire avant d'être réensemencées comme décrit plus haut, soit dans des erlenmeyers contenant du milieu M.R.S., soit dans les cupules contenant ce même milieu. On a ensuite mesuré par les deux méthodes : UFC et mesure de capacitance, 1 l'aptitude des microorganismes à recoloniser rapidement les milieux de culture. On a utilisé comme milieu de culture adéquat sur lequel on a procédé à ces deux types de mesure, le milieu M.R.S. TABLEAU 1 Support de iyophilisation 4 heures 8 heures 24 heures Lait témoin 1.5.10' 2.1 . 106 1.1.1010 Lait + 0,5 gll d'AH. 2,2 . 107 5. 6. 10' 9.1.1010 Lait + 10 g1 mannitol 3. 10' 6,1 .10' 1.8. 1010 La figure 1 montre les variations des pourcentages de capacitance, et le tableau 1 indique le nombre de UFC sur des prélèvements de 1 ml effectués à 4 heures, 8 heures et 24 heures de culture sur les erlenmeyers incubés de façon anaérobie à 30 C. Cette figure et ce tableau montrent à l'évidence une reprise très rapide de la culture microbienne selon l'invention. EXEMPLE 2 : STREPTOCOCCUS LACTIS IL 561 On a procédé comme dans l'exemple 1, mais le milieu M.R.S. a été remplacé par un milieu M17 (TERZAGHI - Applied Microb - June 1975 p 807-813) dans tous les cas où le milieu M.R.S. avait été utilisé dans l'exemple 1. La culture de Streptococcus lactis IL 561 avait été lyophilisée comme décrit dans l'exemple 1 sur des supports de lyophilisation constitués de - lait écrémé dilué à 10%, - lait écrémé dilué à 10% + 1 g/l d'acide hyaluronique, - lait écrémé dilué à 10% + 2 g/l d'acide hyaluronique, - lait écrémé dilué à 10% + 3 g/l d'acide hyaluronique. La mesure des variations de capacitance a donné les courbes de la figure 2. Ces courbes indiquent qu'en ajoutant au lait écrémé au 1/10e une quantité comprise entre 1 et 3 g/litre d'acide hyaluronique, on obtient une réduction de l'ordre de 10 heures de la phase de latence du microorganisme. EXEMPLE 3 : GLUCONOBACTER SUBOXYDANS. Une souche de Gluconobacter suboxydans a été cultivée pendant 24 heures sur un milieu de culture gélosé Trypticase/Soja à 15 g/l d'hydrolysat tryptique de caséine, 5 g/l de peptone de soja, 5 g/l de Nazi, de façon à obtenir un tapis homogène sur la surface du milieu après croissance en aérobiose. A partir de la boîte de Pétri ainsi cultivée, on a prélevé une ose qui a servi à ensemencer un erlen de 20 ml de milieu de culture liquide Trypticase/Soja. Après 24 heures de culture agitée, on a repris 1 ml de cette culture pour la diluer dans 5 ml des supports de lyophilisation suivants - lait écrémé au 1/10e, - lait écrémé au 1/10e + 0.5 g/l d'acide hyaluronique, - lait écrémé au 1/10e + 1 g/l d'acide hyaluronique, - lait écrémé au 1/10e + 10 g/l de mannitol. Ces supports ensemencés ont ensuite été lyophilisés puis les ampoules ont été scellées et conservées quinze jours à température ambiante. On a ensuite mesuré par la méthode de 1'UFC les résultats obtenus après remise en culture dans un milieu Trypticase/Soja. Ces résultats figurent dans le tableau 2. TABLEAU 2 Support de lyophilisation 0 heure 4 heures 8 heures 24 heures Lait 10 % 106 12.#106 4.7#105 3.7#1010 Lait 10 % + 0.5 g/l A.H. 1.9#106 2.7#106 3#107 3.9#1010 Lait 10 % + 1 g/l A.H. 1.9#106 2.7#106 7.5#107 4.7#1010 Lait 10 % # 10 g/l mannitol 1.9#106 2.7#106 7.8#107 1.2#1010 Ces dénombrements montrent que l'acide hyaluronique, joue non seulement un rôle de diminution de la phase de latence mais joue également un rôle de protecteur lors de la lyophilisation puiqu'au temps O les bactéries revivifiables sont plus nombreuses. EXEMPLE 4 : LACTOBACILLUS PLANTARUM. On a procédé comme dans les exemples précédents avec cette fois une souche de Lactobacillus plantarum cultivée en aérobiose sur milieu M.R.S. à 30 C Cette souche a été lyophilisée sur les milieux suivants - lait écrémé au 1/10e, - lait écrémé au 1/10e + 0.5 g/l d'acide hyaluronique, - lait écrémé au 1/10e + 10 g/l de mannitol. Le tableau 3 donne les valeurs obtenues par la méthode de 1'UFC et la figure 3 les courbes obtenues par la mesure de la variation de la capacitance. TABLEAU 3 Support de lyophilisation 0 heure 4 heures 8 heures 24 heures Lait écrémé à 10 % 10 1.1#10 2.1#104 1.1#104 Lait à 10 % + 0.5 g/l A.H. 1.5#10 1.9#10 5.9#104 9.4#10 Lait à 10 % # 10 g/l mannitol 1.2#10 1.5#10 2.3#104 2.2#106 On peut tirer de ce tableau et des courbes de la figure 3, les mêmes conclusions que celles qui ont été tirées des l'exemples précédents. EXEMPLE 5 : SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été cultivée durant 24 heures sur un milieu de culture gélosé O.G.A. de DIAGNOSTIC PASTEUR, de façon à obtenir un tapis homogène sur la surface du milieu après croissance en aérobiose. A partir de la boîte, une ose a été prélevée et a servi à ensemencer un erlen de milieu de culture liquide formé de 5 % de glucose et de 1 % d'extrait de levure. Après 24 heures de culture agitée à 30 C on a repris 1 ml de cette culture pour les ajouter à 5 ml des supports de lyophilisation suivants - lait écrémé au 1/10e, - lait écrémé au 1/10e + 1 g/l d'acide hyaluronique. Ces supports ont été lyophilisés, puis après quinze jours de conservation à température ambiante on a remis les levures en culture dans les conditions générales décrites pour les autres exemples en utilisant le milieu glucose/extrait de levure. La méthode de 1'UFC a permis de relever les dénombrements figurant dans le tableau 4. TABLEAU 4 Support de lyophilisation 8 heures 24 heures Lait écrémé à 10 % 2#10 8.1#10 Lait à 10 % + 1 g/l A.H. 8.1#10 4.1#109 L'analyse par le BACTOMETER a permis d'obtenir les courbes de variation de capacitance montrées en figure 4 et qui indiquent aussi, pour les procaryotes que sont les levures, une phase de latence raccourcie. REVENDICATIONS 1. Procédé de lyophilisation de cultures de microorganismes caractérisé par le fait que la lyophilisation est effectuée en présence d'acide hyaluronique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité d'acide hyaluronique est comprise entre 0,1 et 5, de préférence entre 0,5 et 2 grammes/litre de culture de microorganismes. 3. Procédé selon l'un ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la lyophilisation est effectuée en présence d'un agent cryoprotectant. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'acide hyaluronique a une masse moléculaire supérieure à 300 000 daltons. 5. Cultures de microorganismes lyophilisées contenant de l'acide hyaluronique. 6. Utilisation des cultures de microorganismes lyophilisées selon la revendication 5, en tant que précultures pour les réacteurs biologiques ou en tant que probiotiques pour l'administration à des humains ou à des animaux. 7. Utilisation de l'acide hyaluronique pour la lyophilisation des cultures de microorganismes.