FR 2703251 A1 19941007 FR 9303787 A 19930331 COMPOSITIONS POUR L'APPLICATION EN THERAPEUTIQUE HUMAINE, CARACTERISEES PAR L'ASSOCIATION D'UN MURKMYL-PEPTIDE A UNE CYTOKINE Les interférons (plus particulièrement l'interféron a) sont secrétés par les leucocytes. Ils sont à ce titre classés parmi les cytokines, médiateurs produits majoritairement par les cellules du système immunitaire. D'une façon générale, les cytokines peuvent être considérées comme des hormones caractéristiques du système immunitaire. La possibilité de produire des cytokines par recombinaison génétique a ouvert la voie à des études plus élaborées des comportements de certaines de ces cytokines, notamment d'interférons recombinants chez l'animal. Parmi les interférons, le plus étudié est l'interféron a (IFN a) qui se subdivise en IFN a 2a, IFN a 2b et IFN 2c. En particulier, l'activité antivirale de certains interférons de souris, et même la potentialisation de cette activité chez la souris par certains dérivés de la N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) ou d'homologues de ceux-ci ont déjà été mises en évidence. En revanche, comme l'indique F. Dianzani dans son article intitulé "Interferon Treatments: how to use an Endogenous System as a Therapeutic Agent" (Traitements par l'interféron : Comment utiliser un système endogène en tant qu'agent thérapeutique) dans le "Journal of Interferon Research, Special Issue, May 1992, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, pp.109-118, les nombreux essais cliniques tentés chez l'homme avec des interférons ont été "plus que décevants".En effet, bien que les essais chez l'animal paraissaient ouvrir des potentialités thérapeutiques étendues, leurs effets secondaires mal contrôlés n'ont autorisé à ce jour leur utilisation que dans un nombre restreint d'indications thérapeutiques. Aussi a-t-il été proposé à ce jour de n'utiliser 1'IFN a 2a que dans un nombre réduit de "niches" comme l'indique aussi le "Scrip's Cytokines Report", PJB publications Ltd. 1993, à propos des difficultés rencontrées dans l'application en thérapeutique humaine des interférons a) dans le traitement des cas d'hépatites B et C les plus graves. Les traitements consistent en administrations quotidiennes ou à raison de trois fois par semaine de 5 à 10 millions d'unités pendant 3 à 6 mois.Des résultats positifs sont observés dans 30 à 40t des cas b) dans le domaine du cancer, le traitement de la tricholeucémie chevelue (Hairy Cell Leukemia) et de la leucémie chronique myélogène, les applications envisagées sont le SIDA, le syndrome de Kaposi, le myélome multiple, le mélanome et certains types de carcinome. La gravité de ces syndromes est telle qu'elle a aussi entrainé l'acceptation des graves effets secondaires accompagnant l'utilisation de 1'IFN a en thérapeutique humaine. Quatre vingt dix huit pour cent des patients ainsi traités souffrent en effet d'un syndrome grippal, souvent extrêmement sévère, accompagné de nausées, de vomissements, de troubles du système nerveux central et périphérique et de troubles cardiaques. Ces effets, sont attribués au moins en partie à l'induction par l'interféron de médiateurs pyrétiques qui pourraient être l'IL-1 et des prostaglandines dont la production serait activée par l'interféron. I1 s'y ajoute des accès de fatigue, d'anorexie, de perte de poids, qui pourraient être liés au moins en partie à la production de TNF et/ou l'expression accrue de récepteurs de TNF également induits par les interférons.Toute procédure qui optimiserait les effets bénéfiques des interférons ou des cytokines thérapeutiquement utiles, tout en optimisant aussi les productions ou l'activité des cytokines ou d'autres médiateurs biologiques indésirables telles que IL-1, IL-8 et/ou TNF (abréviation de l'expression anglaise "Tumor Necrosis Factor" ou facteur de la nécrose tumorale), ne pourrait être que vouée à un échec certain. Enfin les administrations d'interférons s'accompagnent souvent de fortes leucopénies et thrombopénies accompagnées d'un blocage de la maturation de précurseurs myéloïdes. Ces phénomènes entraînent la nécessité d'interrompre périodiquement les traitements à base d'interférons, pour chaque fois autoriser une régénération de la formule sanguine. Autant d'inconvénients qui, jusqu'à ce jour, n'autorisent pas une exploration des possibilités réelles d'utilisation des interférons en thérapeutique humaine, hormis pour le traitement des quelques syndromes rappelés plus haut. Des difficultés semblables sont rencontrées avec d'autres cytokines dont l'intérêt thérapeutique serait certain s'il était possible de remédier à ces difficultés. I1 en serait ainsi par exemple de IL-2, IL-3, IL-6, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc... de TNF et de l'IL-1, lesquels ont eux-mêmes des potentialités thérapeutiques. Leur association avec les muramylpeptides pourrait permettre de prendre avantage de leurs effets bénéfiques dès lors qu'on pourrait alors les utiliser à des doses non toxiques. On sait qu'il a été suggéré d'utiliser en particulier IL-3 et certains CSF pour accélérer la récupération hématopoïétique chez des patients frappés d'aplasie de moelle (qui se manifeste sous l'effet d'un facteur pathogène endogène et/ou iatrogène), en particulier à l'issue de traitements chimiothérapiques ou chez des patients ayant subi des transplantations de moelle. Mais l'utilisation de IL-3 en clinique humaine ou des CSFs les plus actifs (par exemple GM CSF) se heurte dans la pratique aux mêmes difficultés que l'interféron a. A ces inconvénients d'ordre thérapeutique, s'ajoutent les coûts extrêmes des traitements actuels à base de cytokines thérapeutiquement utiles. Les doses administrées, pour autant qu'on puisse en réguler l'effet in vivo, sont en effet considérables par rapport aux doses thérapeutiquement utiles, ce qui s'explique peut être par le fait que contrairement aux hormones endocrines, les cytôkines n'agissent pas à distance mais seulement sur les cellules proches des cellules sécrétrices. En d'autres termes, toute cytokine administrée n'atteignant pas les cellules cibles peut être considérée comme 1,thérapeutiquement perdue". L'invention a pour but de remédier au moins en grande partie à ces inconvénients et difficultés. La possibilité de bénéficier des effets thérapeutiques de 1'IFN a ou de cytokines thérapeutiquement utiles autres que 1'IFN a, le cas échéant en doses plus réduites, sans provoquer d'effets secondaires insupportables serait un pas très important tant sur le plan thérapeutique que sur le plan économique. C'est un des objectifs que l'invention s'est fixé. Plus précisément, l'invention a pour but d'accroître l'efficacité des thérapeutiques mettant en oeuvre un interféron ou, plus généralement, une cytokine ayant une valeur thérapeutique et, même, d'élargir les champs thérapeutiques de ces cytokines (dont naturellement 1' interféron), tout en remédiant en grande partie aux inconvénients indiqués ci-dessus, plus particulièrement en rapport avec les interférons. L'invention repose en grande partie sur la découverte que des administrations associées en clinique humaine de cytokines, par exemple de l'interféron, et de muramyl-peptides permettaient également d'induire la synthèse d'autres cytokines qui n'apparaissent pas, tout au moins à des taux décelables, à la suite de l'administration seulement de l'un des deux éléments, interféron et muramylpeptide, et par conséquent, d'élargir les spectres d'activité thérapeutiques des cytokines et des muramyl-peptides. Parmi les cytokines induites, on mentionnera plus notamment, l'interleukine 6 (IL-6), de G-CSF et, d'un antagoniste (IL-1 RA) du récepteur de l'interleukine I.Qui plus est, les administrations associées de certains muramyl-peptides et de l'interféron a (IFN a) permettent la production des effets recherchés en utilisant des doses sub-optimales de cytokine, notamment d'IFN a, grâce à la potentialisation des effets bénéfiques de la cytokine, mais en l'absence d'induction des cytokines indésirables, notamment de IL-1, de TNF ou d'IL-8. L'invention n'est pas limitée à l'association d'un interféron (a, ss ou a) à un muramyl-peptide. Les interférons peuvent également être remplacés par d'autres cytokines particulièrement par celles cidessus identifiées à titre d'exemple. En d'autres termes, il apparaît que l'on peut fortement présumer de la capacité des muramyl-peptides, lorsqu'ils sont administrés en association avec une cytokine - à potentialiser l'activité biologique de la cytokine considérée permettant aussi d'obtenir les effets recherchés après administrations de doses plus faibles que celles considérées actuellement comme thérapeutiquement nécessaires. - à ne pas favoriser et éventuellement même inhiber l'induction in vivo par cette cytokine des facteurs limitants ses possibilités d'applications thérapeutiques comme il a été observé dans le cas de l'association avec 1'INF et, le cas échéant et simultanément - à induire la production in situ, d'une part, d'inhibiteurs de ces facteurs limitants, par exemple IL-l RA et, notamment lorsque la cytokine consiste en un interféron, le récepteur soluble du TNF (STNF-R) et, d'autre part, la sécrétion in situ par les cellules compétentes du système lymphoïdes de cytokines, par exemple IL-6 et G CSF dans le cas des interférons, qui permettent alors l'élargissement du spectre d'action de la cytokine de l'association administrée. L'invention concerne donc toute association mettant en oeuvre une cytokine et tout muramyl-peptide n'induisant pas et même permettant si nécessaire l'inhibition chez l'homme de la sécrétion par ses cellules compétentes ou l'inhibition de leur activité de médiateurs biologiques tels IL-1 et/ou IL-8 et/ou TNF dont le râle est hautement vraisemblable dans les effets secondaires liés à l'administration de certaines cytokines.La capacité du muramyl-peptide à potentialiser l'action de la cytokine tout en protégeant l'hâte contre l'induction des cytokines ou d'autres médiateurs nuisibles peut, dans chaque cas, être vérifiée par des essais comparatifs in vivo, de préférence chez l'homme, faisant intervenir, d'une part, la cytokine choisie seule et, d'autre part, une association de cette cytokine avec le muramyl-peptide choisi, et la détection et la mesure sur une base comparative (par exemple dans des dosages RIA ou ELISA utilisant les anticorps appropriés) taux des cytokines induites étudiées. Les résultats susceptibles d'être obtenus sont illustrés de façon bien entendu non limitatives dans les exemples qui suivent appliqués à l'interféron a exposés plus loin. De préférence, les cytokines utilisées seront toujours des cytokines d'origine humaine. I1 convient de souligner que cette expression doit être entendue comme couvrant, outre les cytokines naturelles d'origine humaine (on ne peut alors méconnaître les difficultés qu'implique leur isolement en quantités adéquates), les cytokines recombinantes correspondantes produites par des techniques de génie génétique, c'est-à-dire de cytokines néanmoins caractérisées par des séquences en acides aminés identiques à celles de ces cytokines naturelles, ce qui n'exclut néanmoins pas de séquences en acides aminés équivalents différant des précédentes, notamment par des substitutions, addition ou délétions d'acides aminés n'entraînant ni des modifications substantielles des propriétés caractéristiques des cytokines recombinantes à "séquences identiques", ni l'apparition de propriétés nuisibles (par exemple inductions d'anticorps chez l'hâte humain). De préférence les muramyl-peptides mis en oeuvre dans l'invention sont des muramyl-peptides hydrophiles. I1 sont notamment caracterisés par la formule générale suivante dans laquelle le groupe R est un hydrogène ou un groupe méthyle ; X est L-alanyle, L-leucyle, Lisoleucyle, L-valyle, L-thréonyle, L-(N-méthyl)alanyle et R7 et R8 sont indépendamment l'un de l'autre, des groupes hydroxyle, amino, O(CH2)xH avec x = 1, 2, 3, 4 ou 5 ou des groupes peptidiques comprenant de 1 à 3 résidus d'acides aminés, de préférence lévogyres. Des muramyl-peptides préférés sont constitués par le muramétide (R = CH3, X = L-Ala, R7 = OCH3 et R8 = NH2, le murabutide (R = CH3, X = L-Ala, R7 = OnC4H9 et R8 = NH2) et enfin le muradimétide (R = CH3, X = L-Ala, R7 = R8 = OCH3). D'autres muramyl-peptides préférés sont les homologues du MDP, du muramétide, du murabutide et du muradimétide, dans lesquels les groupes L-alanyle sont remplacés par des groupes thréonyle. I1 va de soi que cette classe de muramyl-peptides n'est nullement limitative. Des muramyl-peptides lipophiles, tels que ceux décrits dans le brevet français ne8407340, peuvent également être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. D'une façon générale tout muramyl-peptide utilisable en thérapeutique humaine peut être utilisé pour la constitution de l'association. I1 va enfin de soi que l'on peut aussi avoir recours à tous autres muramyl-peptides adjuvants porteurs de substituants en les positions 1, 4 ou 6 du groupe saccharidique. On remarquera enfin que l'expression "association"n'implique pas que la cytokine et le muramyl-peptide choisis soient nécessairement administrés à l'hâte humain en mélange ou de façons simultanées. Elle s'étend également à toute utilisation ou présentation impliquant leurs administrations à des intervalles de temps non nuls, étant néanmoins entendu que ces intervalles doivent être suffisamment courts pour autoriser les interactions mutuelles des deux constituants de l'association dans les conditions sus-indiquées. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore à la faveur des exemples non limitatifs décrits ci-après. Au cours d'essais cliniques effectués chez des volontaires humains sains, de 1'IFN a 2a (interféron Roféron A dosé à 3 MU/ml commercialisé par Roche sous la marque ROFERON A, a été administré en association avec des muramyl-peptides, en particulier le muramétide et le murabutide. I1 a été montré a) que la sécrétion de Néoptérine qui est le marqueur biologique reconnu signant l'activité immunostimulante de 1'IFN était très fortement augmentée, suite à des administrations de doses sub-optimales d'IFN, associées à des doses de Murabutide ou de Muramétide ; il en est de même de l'antagoniste du récepteur de l'IL-l (IL-1 RA) dont 1'IFN seul induit faiblement la synthèse qui est augmentée considérablement par l'addition de muramyl-peptides montrant ainsi une activité synergique entre IFN et les immunomodulateurs synthétiques ; ceci est également vrai pour le récepteur soluble du TNF (STNF-R) b) que les sujets recevant l'association montrent une augmentation significative du nombre de cellules de la lignée blanche par rapport au groupe traité par IFN c) qu'il apparaît, dans le plasma des sujets traités par l'association, des médiateurs de l'immunité Interleukine 6, G-CSF, alors que l'on n'observe l'induction d'aucun des médiateurs pyrogènes et inflammatoires principaux, plus particulièrement des cytokines IL-1, IL-8 et TNF. Ces constations reposent plus particulièrement sur les résultats des essais qui suivent. Des sujets sains subissent une série de tests afin de démontrer leur capacité à être inclus dans l'essai. Ils reçoivent par la voie sous-cutanée les mélanges décrits dans le tableau I suivant de Murabutide (MUB) ou Muramétide (MUM) avec de l'Interféron a 2a (IFN a). Tableau I IFN-&alpha; A MUB 105U 3 x 105U 106U 3 x 106U 6x106 O B MUB A 35 g/Kg A I A II A III A IV A V Témoin A 35 A 100 g/Kg A VI A VI A VIII A IX A X Témoin A 100 B 35 g/Kg B I B II B III B IV B V Témoin B 35 B 100 g/Kg B VI B VII B VIII B IX B X Témoin B 100 O Témoin Témoin Témoin Témoin Témoin Placebo IFN 105 IFN 3 x 105 IFN 106 IFN 3 x 106 IFN 6 x 106 Les sujets sont suivis pendant les trois jours suivant l'administration de 1'IFN et/ou des muramylpeptides et l'ensemble des tests et des examens nécessaires à la réalisation d'un essai de phase I sont effectués. En particulier les examens suivants sont pratiqués Analyse hématologique avec comptes de globules blancs au moment de l'injection puis aux temps 6h, 12h, 24h, 36h, 60h et 72 heures après injection. Des échantillons de sang sont prélevés avant l'injection et 6h, 24h et 48 heure après l'injection, pour recueillir le sérum afin d'effectuer les dosages de Néoptérine, Interleukine 1,6 et 8 G-CSF, IL-1 RA et de TNF-a. Les comptes leucocytaires sont effectués dans une compteur automatique de cellules COULTER COUNTER. Les échantillons de sang pour les dosages dans le sérum sont centrifugés à 4"C à 3000 rpm pendant 10' juste après le prélèvement. Les sérums sont stockés à -20 C. Les comptes leucocytaires et les dosages de Néoptérine et de cytokine sont effectués en utilisant des kits commerciaux. RESULTATS DES EXAMENS ET DES TESTS 1) Effets secondaires Les effets secondaires qui ont été répertoriés au cours des essais (tels que migraine, fièvre et douleurs articulaires) ont été très modérés. En particulier, les effets de type syndrome grippal observés aux fortes doses d'IFN 3M et 6M d'unités ne sont pas augmentés par la combinaison avec les muramyl-peptides bien qu'il y ait une forte augmentation de l'activité biologique de 1'IFN et apparition d'un profil modifié de cette activité avec synthèse de nouveaux médiateurs biologiques. 2) Comptes leucocytaires Les neutrophiles sont les cellules qui sont les plus affectées par des traitements leucopéniants. C'est la baisse du taux de neutrophiles qui est responsable de la baisse des défenses immunitaires non spécifiques chez les sujets soumis à la radiothérapie ou à une chimiothérapie cytotoxique et/ou myélotoxique. Pour simplifier la lecture, seuls donc les comptes de neutrophiles ont été donnés à l'heure ou leur variation est la plus notable. Tableau II Augmentation du nombre de neutrophiles chez les volontaires sains après administration de l'association muramyl-peptides-IFN &alpha;. IFN-&alpha; adminstré Muramyl peptide adminismé No, Compte des mentrophiles (Nombre d'unités) Composé Dose ( g/Kg) testé % ligne de base n 0 Murabutide 100 6 268 # 43 0 Murabutide 100 4 279 # 67 1 x 105 - 0 6 143 # 34 1 x 105 Murabutide 100 6 265 # 61 3 x 105 - 0 6 169 # 47 3 x 105 Murabutide 100 6 292 # 112 1 x 106 - 0 6 147 # 42 1 x 106 Murabutide 100 6 207 # 46 1 x 106 Murabutide 100 6 232 # 78 3 x 106 - 0 6 144 # 19 3 x 106 Murabutide 100 6 252 # 59 3 x106 Murabutide 100 6 255 # 96 6 x 106 - 0 6 191 # 75 6 x 106 Murabutide 100 6 226 # 74 6 x106 Murabutide 100 6 298 # 71 a: Représentent les valeurs les plus élevées observées pendant 24 heures après l'administration. b: moyenne + déviation standard. 3) Dosages de la Néoptérine Les dosages sont effectués sur les serums prélevés au temps 0, 24h et 48 heures. Un kit RIA (Radio Immuno Assay) (Behring Diagnostic, France) est utilisé. Les résultats sont exprimés en nanomoles/ml, les valeurs normales varient de 4 à 9 nanomoles/ml. Tableau III IFN &alpha; Muramyl peptide T 0 10-5u 3 x 10 u 106 u 3 x 106 u 6 x 106 u Placebo Témoin IFN Témoin IFN Témoin IFN Témoin IFN Témoin IFN 0 0 6,00 # 0,80 6,03 # 1,58 5,78 # 2,03 3,26 # 0,85 3,22 # 0,73 4,87 # 2,50 24 5,50 # 0,40 9,02 # 2,75 10,21 # 2,20 9,20 # 2,13 14,39 # 2,58 20,95 # 3,73 48 5,20 # 0,40 9,43 # 2,11 11,20 # 1,36 9,72 # 2,90 14,80 # 2,22 18,73 # 2,62 AH A III A IV A V MUB 0 NI' NI' 5,23 # 1,06 5,06 # 6,77 4,26 # 0,34 5,21 # 0,73 35 g/Kg 24 9,78 # 1,18 13,00 # 3,62 17,31 # 2,03 22,61 # 3,94 48 10,67 # 3,41 12,41 # 2,90 18.01 # 3,56 21,30 # 6,25 Témoin MUB A VI A VII A VIII A IX A X MUB 0 6,37 # 0,99 5,97 # 1,78 4,91 # 0,96 3,83 # 0,82 4,14 # 0,49 5,85 # 0,68 100 g/Kg 24 7,33 # 0,75 11,30 # 3,64 12,43 # 2,67 20,11 # 6,73 19,45 # 4,09 29,14 # 0,97 48 8,22 # 1,39 11,76 # 4,87 13,42 # 2,75 18,13 # 6,92 19,18 # 4,00 28,19 # 0,92 B III B IV B V MUM 0 NI' NI' NI' 4,42 # 0,70 5,67 # 0,70 4,61 # 1,20 35 g/Kg 24 12,48 # 1,89 16,56 # 1,89 21,17 # 2,17 48 12,34 # 2,41 14,36 # 3,47 18,33 # 2,23 Témoin MUM B VI B VII B VIII MUM 0 5,43 # 0,66 NI' NI' 5,20 # 1,95 6,59 # 1,62 4,06 # 0,17 100 g/Kg 24 7,14 # 1,00 16,33 # 2,13 20,78 # 2,90 18,41 # 2,60 48 7,39 # 1,37 14,49 # 4,72 20,33 # 4,18 16,10 # 2,74 On voit sur ce tableau qu'au temps 0 tous les sujets ont des taux normaux de Néoptérine, que les sujets n'ayant reçu qu'un placebo ont un taux constant de Néoptérine et que le Muramétide, ou le Murabutide à la dose de 100 g/Kg n'influencent pas le taux de façon significative. Aux doses les plus faibles d'Interféron, l'association avec les muramyl-peptides permet d'obtenir des augmentations significatives du taux de Néoptérine. A la dose la plus forte, le Murabutide administré à 100 g/Kg permet certes aussi d'obtenir une augmentation significative, mais beaucoup plus faible que celle observée avec l'association. 4) Dosages de l'antagoniste du récepteur de 1'IL-1 (IL-1 RA) Les dosages effectués sur les sérums des sujets ayant reçus 106 unités d'IFN a sont rapportés dans le tableau suivant (tableau IV) et on voit un effet très fort de l'association muramyl-peptide et Interféron (ici aussi kit British Biotechnology Products Ltd.). Tableau IV Quantité d'antagoniste du récepteur de l'IL-l (IL-1 RA) présente dans le sérum de volontaires sains, 6 heures après l'administration de muramyl-peptides et d'IFN a. IFN-&alpha;-administré Muramyl peptide administré Taux sérique d'IL-1 RA (Nombre d'unités) Composé dose ( g/Kg) (Pg/ml)+ 0 Murabutide 100 496 # 326# 3 x 105 - 0 258 # 113 3 x 105 Murabutide 100 10294 # 16554* 1 x 106 - 0 2093 # 1278 1 x 106 Murabutide 100 16093 # 1621* 1 x 106 Murametide 100 16204 # 1879* 3 x 106 - 0 7322 # 3215 3 x 106 Murabutide 100 30563 # 23410* 6 x 106 - 0 15523 # 6554 6 x 106 Murabutide 100 66870 # 36554* +: détectés 6 heures après l'administration de composés, les taux avant administration étaient tous inférieurs aux 200Pg/ml #: moyenne + déviation standard chez les 6 volontaires d'un même groupe *: taux substantiellement différents des taux induits par le seul IFN a (p Mann Whitney Rank) 5) Dosages de 1'IL-6 Le dosage est effectué par un kit de dosage Elisa (British Biotechnology Products Ltd.) sur les sérums prélevés au temps 0 et après 6 heures. Les chiffres expriment des pg/ml, les valeurs normales sont inférieures à 6 pg. Tableau V IFN-&alpha;-administré Muramyl peptide administré Taux sériques d'IL-6 (Nombre d'unités) Composé dose( g/Kg) (Pg/ml)+ 0 Murabutide 100 2.80#1.60S 0 Murametide 100 4.30#1.80 1 x 106 - 0 2.00#1.70 1 x 106 Murabutide E 100 15.00 + 12.00* 1 x 106 Murametide 100 30.00#30,00* 3 x 106 - 0 3.60#0.40 3 x 106 Murabutide fi 100 30.00 + 23.00* 3 x 106 Murametide 100 31.00 + 19.00* 6 x 106 - 0 34.00#56.00 6 x 106 Murabutide 100 76.00#58.00 6 x 106 Murametide 100 107.00#72.00* : chaque groupe comprenait 6 volontaires sauf celui pour le muramétide qui n'en comprenait que 4 +: taux mesurés 6 heures après l'administration ; aucun taux n'a été détecté avant l'administration du composé détecté S: moyenne + déviation standard *: taux substantiellement différents des taux induits par le seul IFN a (p Mann Whitney Rank) On voit sur le tableau V qu'à toutes les doses étudiées le Murabutide et l'Interféron ont agi de façon synergique. 6) Dosages du G-CSF Ces dosages ont été effectués en utilisant le kit de British Biotechnology Products Ltd. (cf. tableau VI) Tableau VI Quantité de G-CSF présente dans le sérum de volontaires sains avant et 6 heures après l'administration de l'association muramyl-peptides et IFN a. IFN-&alpha;-administré Muramyl peptide administré Taux sériques de G-CSF apres (Nombre d'unités) Composé dose( g/Kg) 0 beure 6 heures 0 Murabutide 100 > 10 18#9 0 Murametide 100 61#103x 73#115 1 x 106 - 0 > 10 13#10 1 x 106 Murabutide 100 > 10 58#51x 1 x 106 Murametide 100 > 10 98#81x 3 x 106 - 0 > 10 17#21 3 x 106 Murabutide 100 > 10 77#65 3 x 106 Murametide 100 > 10 79#83 6 x 106 - 0 > 10 17#26 6 x 106 Murabutide 100 > 10 140#168 6 x 106 Murametide 100 12#15 284#425x *: chaque groupe comprenait 6 volontaires, sauf celui qui a reçu le muramétide est le seul qui ne comportait que 4 volontaires X: moyenne + déviation standard *: taux substantiellement différents des taux induits par le seul IFN a (p Mann Whitney Rank) Dans ce cas également on constate une activité synergique des muramyl-peptides et de 1'IFN pour induire du G-CSF. 7) Dosages du récepteur soluble du TNF (STNF-R) Ces dosages sont effectués par un test ELISA dans le sérum des sujets ayant un 6M d'unités d'IFN. A cette dose, il y a déjà une augmentation notable du taux de STNF-R mais l'addition de murabutide permet une augmentation significative de la sécrétion de ce médiateur. Tableau VII IFN - &alpha; Murabutide Taux de sTNF-R dans le sérum Augmentation nette unités ( g/Kg) (pg/ml) (pg/ml) 0 heure 6 heures 0 100 195+28 216+65 31 + 37 6 x 106 0 229#95 389#95 159#108 6 x 106 100 232#35 576#139 345#120* *: significativement différent des taux induits par 1'IFN-a seul (p = 0,005 Mann Whitney Rank Test) 8) Dosages de 1'IL-1, IL-8, TNF a Ces dosages ont été effectués dans les mêmes conditions et aucune de ces cytokines n'a pu être mise en évidence dans les sérums testés. Les kits utilisés sont tous de British Biotechnology Products Ltd. Les résultats obtenus montrent donc ce qui suit A) Notamment à propos de l'interféron: a) A des doses pour lesquelles il est incapable de modifier significativement le taux de synthèse de Néoptérine lorsqu'il est administré seul, l'association de 1'IFN a avec le Murabutide ou le Muramétide permet d'obtenir des taux importants de ce marqueur. Aux doses plus élevées d'IFN, l'association permet une élévation significative de son taux. La néoptérine étant considérée comme un des marqueurs principaux de l'activité de l'interféron au niveau des macrophages humains, ces résultats montrent donc que les effets de 1'IFN a liés à l'activation de ces cellules peuvent être obtenus avec des doses réduites, bien tolérées ; une remarque similaire s'applique à 1'IL-1 RA dont on observe des taux extrêmement élevés après administration de l'association.On peut même observer qu'il y a une activité synergique entre IFN et murabutide ou muramétide et que l'on obtient un effet-dosé, puisqu'approximativement un doublement du taux d'IL-l RA est obtenu quand la dose d'IFN est doublée. La même observation peut être faite pour STNF-R qui est induit par IFN seul mais faiblement en comparaison des taux induits par 1 'association. b) L'association 1'IFN avec le muramyl-peptide permet d'obtenir des comptes leucocytaires plus élevés que ceux des témoins c) L'association des muramyl-peptides avec 1'IFN a a de plus provoqué la sécrétion sélective d'autres cytokines ou médiateurs immunitaires. En effet, on peut noter chez les sujets traités par l'association, qu'il y a des différences significatives entre leur taux sérique d'IL-6, de G-CSF et de STNF-R et ceux des sujets traités par 1'IFN seul ou le Murabutide seul. Par contre, on n'observe pas d'augmentation des taux d'IL-1, d'IL-8 ou de TNF a. Cet effet sélectif, de l'association des muramyl-peptides avec l'Interféron sur la sécrétion de cytokines est tout à fait inattendu et particulièrement intéressant. I1 ne pouvait être prédit à partir des propriétés connues des deux composants administrés seuls. Cette découverte offre des possibilités d'applications très intéressantes. B) Le G-CSF est la cytokine responsable de la différentiation des cellules souches vers la lignée granulocytaire et de leur régénération après un traitement myélotoxique et 1'IL-6 est également très impliquée dans l'hématopoïèse. Ainsi la possibilité d'associer à l'activité de 1'IFN a exogène les activités des G-CSF et IL-6 endogènes induites par cet IFN a exogène administré à l'hâte, constitue une avance thérapeutique importante.En effet a) cette association se fait dans des conditions d'effets secondaires minimums ; les doses d'IFN nécessaires sont peu élevées b) elle intervient dans des conditions beaucoup plus physiologiques de dosages et de disponibilité que si l'on administrait un "cocktail" des cytokines correspondantes c) l'absence de sécrétion de TNF, d'IL-l et d'IL-8 est un élément particulièrement favorable, d'autant plus qu'il y a sécrétion de STNF-R qui se combinant à d'éventuelles quantités de TNF neutraliserait son action comme le ferait IL-1 RA dans l'éventualité d'un quantité active d'IL-l. Cet ensemble de données conduit à de nouvelles applications thérapeutiques en médecine humaine et à un élargissement des domaines d'application thérapeutique existants. En particulier 1. toutes les situations où l'intérêt thérapeutique de 1'IFN a peut désormais être mis en évidence. En particulier, l'invention permet l'extension des interférons sous cette forme d'associations à des traitements d'affections tumorales qui ne sont guère envisagées à ce jour, essentiellement en raison de la trop grande importance relative des effets secondaires examinés plus haut. On peut penser à la leucémie chronique myéloïde, à différents carcinomes, au myélome multiple, au mélanome, à diverses leucémies et lymphomes. L'invention permet, grâce à l'effet de stimulation exercée quant à la production de cytokines thérapeutiquement utiles, de reconstituer au moins en partie les systèmes complexes biologiques physiologiques normalement impliqués dans le maintien de l'homéostase, grâce à l'interaction de leurs constituants avec d'autres facteurs de régulation solubles ou associes aux cellules. 2. plus particulièrement les situations impliquant un déficit des lignées granulocytaire spontané, comme dans le cas de syndromes myélodisplasiques, ou induit par des traitements médicamenteux, notamment à base de cytokines. L'un des grands avantages de l'utilisation de l'association conforme à l'invention réside dans la protection de l'hâte contre les actions leucopéniantes des mêmes cytokines utilisées seules, de sorte que des composés cytotoxiques mettant en oeuvre la cytokine appropriée, notamment pour le traitement de cancers, de maladies infectieuses, ou de déficiences d'origine génétique peuvent être prolongés jusqu'à autoriser un effet curatif plus sûr. En d'autres termes, l'association permet soit un ralentissement de la déplétion, soit même une suffisante restauration du système granulocytaire (voire même une réparation de la moelle) chaque fois que celle-ci est affectée par un traitement cytotoxique (chimiothérapie ou radiothérapie cancéreuse, traitement du SIDA par 1'AZT) et/ou immunosuppresseur.Une association peut aussi être utilisée dans des situations conformes à l'invention (cytokine et muramyl peptide) ou les agents cytotoxiques utilisés sont différents de la cytokine de l'association, concurremment avec le traitement cytotoxique du genre en question, ou chaque fois que le traitement avec l'agent cytotoxique est interrompu aux fins de permettre une restauration des phagocytes, des plaquettes sanguines et une stimulation de la moelle osseuse. Enfin, l'invention ouvre la voie à une reconstitution plus rapide du système hématopoïétique chez des personnes dont le système immunitaire avait été auparavant inhibé, voire même détruit, par exemple pour autoriser une transplantation de moelle osseuse ou plus généralement de tissus ou organes allogènes. L'induction d'IL-6 permet aussi de penser que Irassociation à un effet sur la mégacharyocytopolèse et donc sur la régénération des plaquettes. Ceci a d'ailleurs été observé chez quelques uns des sujets qui ont été suivis sur deux semaines. C) On observe également une production importante d'IL-1 RA et de STNF-R en l'absence de sécrétion de TNF, d'IL-1 et d'IL-8. Ceci conduit à un second volet d'applications. Tout d'abord vers la prévention et le traitement du choc septique dans lequel l'IL-l et le TNF jouent un rôle primordial. Les autres indications sont toutes celles ou il est nécessaire de s'opposer à l'inflammation, comme dans les cas d'arthrites rhumatoïdes ou de certaines maladies auto-immunes ou de maladies induites dans le cas de transplantations de moelle, de tissus ou d'organes, par une réaction du greffon contre l'hâte. D) Naturellement l'association est tout aussi utile pour le traitement de maladies virales telles les hépatites chroniques C ou B ou des infections virales respiratoires, qu'il s'agisse d'un traitement dans lequel la cytokine est directement impliquée en sa capacité anti-virale (par exemple cas de l'interféron) ou d'un traitement de substitution ou s'intercalant entre des traitements antiviraux qui doivent être interrompus par intermittences (par exemple inhibition de la multiplication virale de HIV par 1'AZT ou d'autres dérivés de nucléosides ayant une spectre d'action antivirale similaire). D'une façon générale, l'invention concerne donc toute association répondant aux critères sus-indiqués, contenant, le cas échéant, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Sans qu'il y ait lieu de s'y limiter ces compositions pharmaceutiques sont avantageusement constituées de solutions pouvant être administrées par voie parentérale, notamment souscutanée, intraveineuse, ou par perfusion. Les muramyl-peptides peuvent être administrés oralement soit seuls, soit sous une forme galénique assurant leur protection (par exemple, en capsulation dans des liposomes capsules ou microsphères permettant le franchissement de la barrière gastrique. I1 en est de même pour les cytokines utilisées, notamment les interférons. Dans le cas de l'association interféron et muramyl-peptide, les doses préférées d'IFN pour une injection seront de 1 l'ordre de 5 x 104 à 5 x 106 (0,05M à 5M) Unités internationales et les doses de muramyl-peptide, notamment de muramétide ou de murabutide, sont de l'ordre de 10 g à 250 Ag/Kg. Pour le cas des associations GM-CSF et muramylpeptides, des doses préférées seront respectivement de 1 à 25 g/kg de GM-CSF pour 10 g à 250 ssg/Kg de muramyl-peptides. I1 va de soi que les doses indiquées ci-dessus n'ont d'autre valeur que celle d'illustrer l'invention. I1 relève naturellement du clinicien de déterminer quelles seront les doses à associer des constituants de l'association, selon l'état du patient et de l'affection dont il souffre. L'invention concerne aussi l'association avec 1'IL-2 qui possède des activités anti-tumorales reconnues, en particulier vis-a-vis des métastases du carcinome rénal ou d'autres cancers, mais dont l'index thérapeutique est extrêmement faible. Les doses préférées pour une injection seraient de 1 à 10 millions d'unités Kg/jour d'IL-2 associées à de 10 yg à 250 Zg/Kg de muramyl-peptides. A titre d'exemples supplémentaires, l'invention concerne aussi les associations avec un muramylpeptide du genre indiqué, de IL-6, de IFNT et/ou du facteur TGFP (abréviation anglaise de "Transforming Growth Factor" ou "facteur de transformation de la croissance"). On leur attribue une implication importante dans la régulation négative d'immunoglobulines de classe IgE, responsables de phénomènes allergiques. Par "régulation négative", il faut entendre une réduction de la production d'immunoglobulines de classe IgE relativement à la production d'autres immunoglobulines notamment des IgA et IgG.L'administration de l'association d'une ou plusieurs de ces cytokines en association avec un muramyl-peptide permet une modulation du profil des immunoglobulines synthétisées par les cellules du système immunitaire, dans un sens favorisant la production de IgG et IgA par rapport à celle des IgE, voire même au détriment de celles-ci. Ce résultat témoigne de la possibilité d'utiliser l'association conforme à l'invention pour le traitement des allergies en thérapeutique. Les doses préférées de chacun des constituants de l'association, notamment lorsqu'il s'agit de les administrer par voie parentérale, seraient notamment les suivantes, pour environ de 10 g à 250 g/Kg de muramyl-peptide - de 0,05 M à 6 M d'UI d'IFN7, - de 0,5 g à 100 g/Kg de TGFB, et/ou - de 0,1 g à 25 g/Kg de IL-6. I1 va enfin de soi que les revendications qui suivent ne peuvent qu'étendre leurs effets à des compositions, qui mettraient en jeu en association avec la cytokine choisie, une molécule du type muramyl-peptide utilisable en clinique humaine ou une molécule qui en présenterait les propriétés biologiques essentielles.On mentionnera à titre d'exemples les produits suivants - Nac Mur-L-Thr-D isoGln-sn glycéryl dipalmitoyle - Nac-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2 (1', 2' dipalmitoyl)sn-glycéro-3'-phosphoryléthylamide (MTP-PE) ; - N2 (Nac-Mur-L-Ala-D-isoGln) N6-stearoyl-L-Lysine (Muroctasine) ou MDP-Lys (L18) - NAc-glucosaminyl-NAc-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala Glyceryl-dipalmitate (DTP-GDP) ou NAc-glucosaminyl-NAc -Mur-L-Thr-D-iso-Gln-L-Ala-Glycéryl-ipa - Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln ; ; - Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol - Nac-Mur-D-Thr-D-isoGln-1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol - Les analogues du MDP dans lesquels le 2ème acide aminé, la glutamine est remplacée par une Norleucine, et qui sont dépourvus d'activité pyrogène - Les dérivés ou analogues (obtenus par fractionnement ou mieux par synthese) de produits bactériens suffisamment dépourvus de toxicité, notamment de pyrogénicité, parmi lesquels des endotoxines, notamment monomères ou peptidoglycanes, capables d'activer les cellules immunologiquement compétentes et d'induire des cytokines chez lthomme. REVENDICATION8 1. Composition associant, aux fins de leur application thérapeutique humaine, une cytokine naturelle ou recombinante, de préférence humaine, choisie parmi IFNz, TGFP et IL-6, avec un muramylpeptide cliniquement acceptable en médecine humaine. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le muramyl-peptide présente la formule générale suivante dans laquelle le groupe R est un hydrogène ou un groupe méthyle ; X est L-alanyle, L-leucyle, Lisoleucyle, L-valyle, L-thréonyle, L-(N-méthyl)alanyle et R7 et R8 sont indépendamment l'un de l'autre, des groupes hydroxyle, amino, O(CH2)xH avec x = 1, 2, 3, 4 ou 5. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le muramyl-peptide est choisi parmi l'un des muramyl-peptides suivants - Nac Mur-L-Ala-D isoGln-sn glycéryl dipalmitoyle - Nac Mur-L-Thr-D isoGln-sn glycéryl dipalmitoyle - NAc-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2 (1',2'dipalmitoyl)- sn-glycéro-3'-phosphoryléthylamide (MTP-PE) - Nz (Nac-Mur-L-Ala-D-isoGln) N6-stearoyl-L-Lysine (Muroctasine) ou MDP-Lys (L18) - NAc-glucosaminyl-NAc-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala Glyceryl-dipalmitate (DTP-GDP) ou NAc-glucosaminyl-NAc -Mur-L-Thr-D-iso-Gln-L-Ala-Glycéryl-dipalmitate - Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln ;; - Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol - Nac-Mur-D-Thr-D-isoGln-1, 2-dipalmitoyl-sn-glycérol - Les analogues du MDP dans lesquels le 2 acide aminé, la glutamine est remplacée par une Norleucine, et qui sont dépourvus d'activité pyrogène 4. Utilisation pour la composition pour la production d'une composition mettant en oeuvre une cytokine thérapeutiquement utile chez l'homme et pour le traitement des allergies, caractérisée en ce que les principes actifs de cette composition sont constitués par un muramyl-peptide et une cytokine tels qu'ils ont été revendiqués dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la cytokine est un CSF, notamment un GM-CSF. 6. Utilisation pour la production d'une composition mettant en oeuvre une cytokine thérapeutiquement utile chez l'homme et pour le traitement d'une affection dont les effets sont susceptibles d'être réduits, sinon supprimés par l'administration de ladite composition au patient, caractérisée par son association avec un muramylpeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la cytokine est une cytokine telle qu'un interféron, notamment un interféron a, susceptible, en association avec le muramyl-peptide, d'induire une sécrétion in situ, chez le patient traité, de G-CSF et/ou d'IL-6 et/ou d'IL-l RA. 8. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'association est destinée au traitement de cancers, de maladies infectieuses ou de déficiences génétiques compensables par la cytokine utilisée. 9. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'association est destinée à induire soit un ralentissement de la déplétion, soit même une suffisante restauration du système granulocytaire (voire même une réparation de la moelle), que ces affections soient d'un caractère, spontané ou qu'elles résultent d'un traitement cytotoxique, radiothérapique et/ou immunosuppresseur. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que l'association est destinée à un traitement mettant en peuvre un agent cytotoxique distinct de la cytokine de l'association, concurremment avec le traitement cytotoxique du genre en question, ou chaque fois que le traitement avec l'agent cytotoxique est interrompu aux fins de permettre une restauration des phagocytes, des plaquettes sanguines et une stimulation de la moelle osseuse. 11. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'association est destinée à un traitement visant à favoriser une reconstitution plus rapide du système hématopoïétique chez des personnes dont le système immunitaire avait été auparavant inhibé, voire même détruit, notamment pour autoriser une transplantation de moelle osseuse ou plus généralement de tissus ou organes allogènes ou même xénogènes. 12. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'association est destinée au traitement de maladies virales, qu'il s'agisse d'un traitement dans lequel la cytokine, notamment l'interféron, est directement impliquée en sa capacité anti-virale ou d'un traitement de substitution ou s'intercalant entre des traitements conduits avec d'autres substances antivirales qui doivent être interrompus par intermittences. 13. Utilisation selon la revendication 12, appliquée à l'inhibition de la multiplication virale de HIV par 1'AZT ou d'autres dérivés de nucléosides ayant une spectre d'action antivirale similaire). 14. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la cytokine est un interféron ou un CSF, notamment un GM-CSF, et en ce que l'association est destinée à la prévention ou au traitement du choc septique dans lequel l'IL-l joue un rôle primordial, au traitement ou à la prévention de processus inflammatoires, comme dans les cas d'arthrites ou de certaines maladies auto-immunes. 15. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la cytokine est une IL-2, et en ce que l'association est destinée au traitement de cancers. 16. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, pour pallier les effets de médicaments inducteurs ou d'infections inductrices d'une synthèse endogène de IL-1, IL-8 ou TNF.