FR 2702374 A1 19940916 FR 9302661 A 19930308 La présente invention concerne des émulsions injectables destinées à stimuler la réponse immunitaire induite par des principes actifs, qui peuvent être des virus, des bactéries, des parasites, ou des fractions de ceux-ci, des toxines, des polysaccharides, mais aussi des protéines recombinantes, ou bien des petites molécules antigéniques, par exemple des peptides, couplées sur des molécules porteuses. Plus particulièrement la présente invention concerne les émulsions injectables eau-dans-l'huile entièrement métabolisables et les méthodes conduisant à la préparation d'émulsions eau-dans-l 'huile stables. Rappel des connaissances. La vaccination en stimulant le système de défense immunitaire est un moyen de lutte préventive contre les agents infectieux. Les vaccins utilisent actuellement comme antigène, soit des micro-organismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué, soit des micro-organismes tués, voire même des fractions purifiées à partir de ces microorganismes. Très souvent les vaccins inactivés ou sousunités contiennent une substance adjuvante qui est destinée à accroître la réponse immunitaire. La fonction de l'adjuvant est d'augmenter d'une part le niveau de la réponse immunitaire humorale et cellulaire, d'autre part la durée de cette réponse. Par voie de conséquence, l'adjuvant permet de réduire le nombre d'injections et la dose d'antigène incluse dans le vaccin, maintenant ainsi la vaccination à un coût acceptable.Les substances adjuvantes, en dehors de l'effet recherché sur la réponse immunitaire, peuvent induire une toxicité locale ou générale : oedème inflammatoire, abcès, fibrose au point d'injection, douleur, fièvre, stimulation d'un état d'hypersensibilité. Un adjuvant doit être efficace mais également être acceptable au plan toxicité. Parmi les nombreuses substances adjuvantes de l'immunité, on peut citer les gels dérivés de l'aluminium (hydroxyde, phosphate), qui sont seuls utilisés en médecine humaine, des saponines, qui sont des hétérosides complexes et qui sont employées en médecine vétérinaire, et aussi les émulsions qui semblent être l'un des excipients les plus actifs. En particulier, les émulsions contenant des mycobactéries dans l'huile minérale et comme tensio-actif l'Arlacel A R, qui est défini comme un monooléate de dianhydromannitol, sont largement utilisées sous le nom d'adjuvant de Freund complet, pour l'immunisation d'animaux de laboratoire.Néanmoins l'utilisation des mycobactéries tuées présente deux défauts majeurs : les réactions locales au point d'injection sont très importantes, et les animaux sont sensibilisés à la tuberculine ; cela conduit à rejeter cet adjuvant en médecine vétérinaire. Le même adjuvant sans mycobactéries, appelé adjuvant de Freund incomplet, est moins mal toléré et est encore largement utilisé dans les laboratoires pour la production de sérums hyperimmuns. Toutefois les émulsions préparées avec les adjuvants de Freund sont très visqueuses et peu stables, ce qui empêche leur développement industriel. Des composés analogues avec peptidoglycanes (MDP et dérivés) et des glycolipides (TDM) des mycobactéries ont été incorporés dans les émulsions à la place des mycobactéries de manière à réduire leur toxicité (WOODWARD L.F., 1990, Surface Chemistry and Classification of vaccine adjuvants and vehicles, in Bacterial Vaccines pp. 281-306, Alan R. Liss, New York). L'emploi d'émulsions dans les vaccins est resté longtemps anecdotique ; les essais qui ont été effectués, chez l'homme en particulier, avec d'une part un vaccin grippe en adjuvant type Freund incomplet, d'autre part une émulsion renfermant de l'huile d'arachide, de l'Arlacel A R et du stéarate d'aluminium connue sous le nom d"'adjuvant 65" ont finalement conduit à proscrire de telles formules de la médecine humaine. I1 a fallu attendre les travaux de Cessi et Nardelli (Develop. Biol. Standard., 1973, 25, 325-328) pour voir se développer au niveau industriel des vaccins en émulsion eau-dans-l'huile. Ces vaccins étaient destinés à protéger les poules pondeuses contre la maladie de Newcastle, due à un paramyxovirus, pendant toute la durée de la ponte, ce dont étaient incapables les vaccins classiques pour lesquels l'immunité plus faible se traduisait par une chute de la ponte lors d'un passage de virus à travers l'élevage. Les vaccins de ce type se sont rapidement développés dans le monde de l'aviculture, au niveau de l'Europe au moins, pour de nombreuses maladies aviaires (par exemple, bronchite infectieuse aviaire, maladie de Gumboro). Sont également apparus sur le marché des vaccins à base d'émulsion plus particulièrement de type huile-dans-l'eau pour la prévention de plusieurs maladies des mammifères, bactériennes (brucellose des ruminants, entérotoxémie des ovins, colibacillose), ou virales (fièvre aphteuse du porc, grippe porcine, maladie d'Aujeszky ...). Toutefois, ces vaccins, s'ils présentent généralement une activité immunogène très supérieure à celle des vaccins non huileux, peuvent provoquer des réactions locales au niveau du site d'injection du vaccin.Ces réactions dont l'intensité dépend de la formulation employée (eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau) et aussi de la nature des antigènes, sont classiquement attribuées à la présence de l'huile minérale. En effet, celle-ci ne semble pas être métabolisée par l'organisme et reste en partie à proximité des sites d'injection. I1 peut donc être souhaitable de substituer l'huile minérale par une huile métabolisable. Par l'huile métabolisable, il faut entendre notamment des hydrocarbures naturels présents dans la nature, tels que le squalène, le squalane et le pristane, les huiles végétales appartenant à la catégorie des triglycérides, des triglycérides d'hémisynthèse, comme la trioléine et les triglycérides à chaîne moyenne (C8/C10), les esters d'acides gras, et plus particulièrement les oléates d'oléyle, le dioléate de propylène glycol, les diesters des acides caprique/caprylique et du propylène glycol. A ce stade, une difficulté possible est que les émulsions doivent être injectables, donc assez fluides cela amène à privilégier les triglycérides à chaîne moyenne et certains esters, plutôt que les huiles végétales, dont la viscosité à 25"C est déjà appréciable (50 à 70 mPa.s). Mais la difficulté majeure est d'obtenir des émulsions eau-dans-l'huile stables avec ces huiles, et les huiles végétales en particulier. Pour ce faire, l'utilisation des monoglycérides est largement répandue dans l'industrie alimentaire, mais en général les émulsions recherchées et obtenues sont épaisses, ce qui favorise leur stabilité. Plusieurs formules d'émulsion de type eau-dans-l'huile à base d'huiles métabolisables ont déjà été publiées huile d'arachide et lécithine (BRUGH M. et al., Am. J. Vet. Res. 1983, 44, 72-75), huile enrichie en diglycérides et phospholipides modifiés (EP 0 417 562 Al), triglycérides ou ester gras associés à des hydrocarbures et des tensioactifs (Brevet Français n" 2 649 013). Aucune des formules d'émulsion ne correspond à la présente invention. Nous avons découvert que de manière surprenante, l'utilisation de ricinoléate de polyglycérol, ou de polyricinoléate de glycérol, seuls ou en association avec des monoglycérides ou des huiles de ricin polyoxyéthylénées, hydrogénées ou non, ou des esters de sorbitan, conduit à des émulsions eau-dans-l'huile très stables et fluides, ceci avec comme huile tant un ester de type oléate d'oléyle ou oléate de propylène glycol qu'une huile végétale de la série des triglycérides. Ces formules peuvent être valablement étendues aux hydrocarbures naturels, en particulier au squalène et au squalane. Par grande stabilité, au sens de la présente invention, on entend une stabilité qui se traduit par un aspect macroscopiquement homogène, par exemple à l'oeil nu, pendant une durée compatible avec la durée de stockage possible du produit ou vaccin contenant l'émulsion, durée de préférence de plusieurs mois et pouvant être supérieure à un an. L'invention a pour objet une émulsion injectable eaudans-l'huile, présentant une très bonne tolérance, utilisable chez l'homme et chez l'animal comme vaccin ou vecteur de principe actif pharmaceutique, caractérisée par une viscosité relativement faible (moins de 400 mPa.s à 25"C), une phase huileuse et des agents émulsionnants pharmaceutiquement acceptables. De préférence, la phase huileuse est en partie ou totalement métabolisable. La phase huileuse métabolisable peut être constituée d'hydrocarbures naturels, et de façon préférentielle le squalane (hexaméthyl-2, 6, 10, 15, 19, 23 tétracosane), le squalène (hexaméthyl-2, 6, 10, 15, 19, 23 tétracosahexaène2, 6, 10, 14, 18, 22), le pristane (tétraméthyl-2, 6, 10, 14 pentadécane). La phase huileuse métabolisable peut aussi être constituée d'huile végétale de la série des triacylglycérols. La phase huileuse métabolisable peut encore être constituée d'esters d'acides gras naturels et d'alcools. Les alcools peuvent être indifféremment seuls ou en mélange, le glycérol, le propylène glycol, l'éthanol ou un alcool gras, celui-ci étant de préférence l'alcool oléique (octodécène-9 ol-1). Les acides gras majoritaires sont de préférence des acides gras naturels de C6 à C24, de préférence l'acide oléique, et/ou linoléique, l'acide caprique et/ou caprylique. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, les tensioactifs émulgateurs contiennent en totalité ou en partie des esters de polyglycérol, en proportion finale de 0,4 à 20 % p/v, de préférence entre 1 et 10 % et plus particulièrement entre 3 et 5 % p/v. Les esters de polyglycérol peuvent être en totalité ou en partie des ricinoléates (hydroxy-12 octadécène-9 oate) de polyglycérol. Par exemple les esters de polyglycérol sont en totalité ou en partie des polyricinoléates de polyglycérol. De façon avantageuse, le polyglycérol possède 2 à 12 résidus glycérol, et plus particulièrement 2 à 5 résidus. L'ester de polyglycérol peut être associé à d'autres tensio-actifs, en particulier l'oléate de sorbitan, les ricins polyoxyéthylénés, hydrogénés ou non, et/ou des tensio-actifs naturels. Ces tensio-actifs naturels sont, par exemple, la lécithine ou bien les glycérides (mono + di), plus particulièrement les glycérides d'acides gras insaturés (oléique et/ou linoléique majoritaires) et d'acides gras à chaîne moyenne (caprylique et/ou caprylique). Avantageusement, la phase aqueuse de l'émulsion est en proportion telle que la viscosité de l'émulsion soit acceptable, pour que ladite émulsion puisse être facilement injectée, de préférence entre 5 et 50 % et plus particulièrement entre 12 et 25 % v/v. L'émulsion peut contenir des substances modulatrices de l'immunité. L'invention concerne également les vaccins caractérisés en ce que la phase aqueuse de l'émulsion selon l'invention contient, seuls ou en association, des antigènes entiers d'origine virale, bactérienne, parasitaire, ou bien des fractions desdits antigènes, ou des protéines obtenues par recombinaison génétique. Elle concerne également les médicaments immunologiques caractérisés en ce que la phase aqueuse contient une protéine étrangère, ou une protéine modifiée, ou un haptène conjugué à une molécule porteuse. Nous donnerons ci-après à titre d'illustration de la présente invention quelques exemples de formules et leurs propriétés. Exemple 1 Cet exemple est donné pour montrer la difficulté de préparer une émulsion eau-dans-l'huile avec des mono (+di) glycérides comme seuls tensio-actifs. Dans 800 ml d'oléate d'oléyle (Cétiol, Henkel) contenant 6 % p/v de mono + dioléate de glycérol (Pécéol, Gattefossé) sont émulsifiés, à l'aide d'un émulsionneur à turbine (Silverson), en additionnant très lentement la phase aqueuse dans la phase huileuse, 200 ml de tampon isotonique contenant l'antigène (NaCl 0,15M - phosphate 0,01M pH 7,5). L'émulsion obtenue est stable, sa viscosité est relativement faible : 200 mPa.s à 4"C. Quand l'oléate d'oléyle est remplacé par une huile végétale, l'émulsion n'est pas homogène, bien qu'elle ne soit pas déphasée. L'aspect final dépend en fait fortement de la nature des huiles émulsionnées et des mono + di glycérides associés, alors que la concentration en tensioactifs n'a guère d'influence (elle doit être en général supérieure à 4 %). Exemple 2 Cet exemple est destiné à illustrer l'efficacité du polyricinoléate de polyglycérol comme tensio-actif. Dans 800 ml d'oléate d'oléyle contenant 5 % (p/v) de polyricinoléate de polyglycérol sont émulsifiés à l'aide d'un émulsionneur à turbine (Silverson) 200 ml de tampon isotonique contenant l'antigène. L'émulsion obtenue est très stable et fluide (170 mPa.s à 4"C, 60 mPa.s à 25"C). La même formule, en utilisant de l'huile d'amande douce à la place de l'oléate d'oléyle, conduit aussi à une émulsion eau-dans-l'huile stable, à 4"C et à température ambiante, relativement fluide (360 mPa.s à 5"C, 140 mPa.s à 25"C). L'huile de soja conduit elle aussi à une émulsion stable. Exemple 3 Cet exemple est destiné à montrer la possibilité d'associer le polyricinoléate de polyglycérol à un monoglycéride. Deux phases huileuses contenant l'une 5 % (p/v) de polyricinoléate de polyglycérol (Radiamuls 2253, Oléofina) dans l'huile d'amande douce, l'autre 5 % (p/v) de monooléate de glycérol (Radiasurf 7150, Oléofina) sont mélangées en proportions variables. Puis 40 ml de phase aqueuse sont émulsifiés dans 160 ml de chacune des différentes phases huileuses préparées, à l'aide d'un émulsionneur à turbine (Silverson). Alors que l'émulsion ne contenant que le monooléate de glycérol devient hétérogène, voire se casse en quelques jours, celles contenant au moins 1,6 % final de Radiamuls 2253 sont stables à 4"C et à température ambiante. La formule contenant 2 % final de chacun des 2 tensio-actifs a une viscosité de 330 mPa.s à 4,5"C et 130 mPa.s à 25"C. Exemple 4 Cet exemple est destiné à montrer la possibilité d'associer le polyricinoléate de polyglycérol à une huile de ricin polyoxyéthylénée. Les conditions sont les mêmes que dans l'exemple 3, mais ici l'huile est de l'huile de soja et l'une des 2 phases contient à la place de la monooléine de l'huile de ricin hydrogénée polyoxyéthylénée à 7 OE (Dehymuls HRE 7, Henkel). Les émulsions contenant au moins 1,6 % final de Radiamuls 2253 sont stables à 4"C et à température ambiante. La viscosité, pour une émulsion contenant 1,6 % final de Radiamuls 2253, est 300 mPa.s à 5"C et 120 mPa.s à 25"C. Lorsque l'huile de soja est remplacée par l'oléate d'oléyle, ces émulsions ainsi préparées sont stables quelle que soit la proportion des deux phases. Exemple 5 Cet exemple est destiné à illustrer les propriétés tensio-actives de l'Arlacel 1689, qui contient du ricinoléate de polyglycérol-3. Trente-cinq ml de phase aqueuse, constituée d'un tampon isotonique contenant l'antigène, sont émulsifiés à l'aide d'un émulsionneur à turbine (Silverson) dans 140 ml de phase huileuse formée d'une solution d'Arlacel 1689 à 5 % (p/v) dans l'huile ; l'huile étant indifféremment soit de l'oléate d'oléyle, de l'huile d'amande douce, de l'huile de tournesol, ou des triglycérides à chaîne moyenne. Les 4 émulsions préparées avec les différentes huiles sont toutes stables et fluides à 4"C. Exemple 6 Cet exemple est destiné à mettre en évidence l'influence de la concentration en polyricinoléate de polyglycérol sur la stabilité des émulsions. Des émulsions ont été préparées avec 80 % v/v de phase huileuse (oléate d'oléyle) renfermant 1 à 8 % (p/v) de polyricinoléate de glycérol. Celles renfermant 3 à 8 % (p/v) de tensio-actif dans la phase huileuse sont homogènes, alors que celles en contenant moins présentent un phénomène de décantation (mais les émulsions ne sont pas déphasées). Le même résultat est obtenu en remplaçant l'oléate d'oléyle par de l'huile d'amande douce. REVENDICATIONS. 1. Emulsion injectable eau-dans-l'huile, présentant une très bonne tolérance, une grande stabilité, utilisable chez l'homme et chez l'animal comme vaccin ou vecteur de principe actif pharmaceutique, caractérisée par une viscosité relativement faible (moins de 400 mPa.s à 25"C), une phase huileuse et des agents émulsionnants pharmaceutiquement acceptables. 2. Emulsion selon la revendication 1, caractérisée en ce que la phase huileuse est en partie ou totalement métabolisable. 3. Emulsion selon la revendications 2, caractérisée en ce que la phase huileuse métabolisable est constituée d'hydrocarbures naturels, et de façon préférentielle le squalane (hexaméthyl-2, 6, 10, 15, 19, 23 tétracosane), le squalène (hexaméthyl-2, 6, 10, 15, 19, 23 tétracosahexaène2, 6, 10, 14, 18, 22), le pristane (tétraméthyl-2, 6, 10, 14 pentadécane). 4. Emulsion selon la revendication 3, caractérisée en ce que la phase huileuse métabolisable est constituée d'huile végétale de la série des triacylglycérols. 5. Emulsion selon la revendication 2, caractérisée en ce que la phase huileuse métabolisable est constituée d'esters d'acides gras naturels et d'alcools. 6. Emulsion selon la revendication 5, caractérisée en ce que les alcools peuvent être indifféremment seuls ou en mélange, le glycérol, le propylène glycol, l'éthanol ou un alcool gras, celui-ci étant de préférence l'alcool oléique (octodécène-9 ol-l). 7. Emulsion selon les revendications 4 et 5, caractérisée en ce que les acides gras majoritaires sont des acides gras naturels de C6 à C24, de préférence l'acide oléique, et/ou linoléique, l'acide caprique et/ou caprylique. 8. Emulsion selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les tensio-actifs émulgateurs contiennent en totalité ou en partie des esters de polyglycérol, en proportion finale de 0,4 à 20 % p/v, de préférence entre 1 et 10 % et plus particulièrement entre 3 et 5 % p/v. 9. Emulsion selon la revendication 8, caractérisée en ce que les esters de polyglycérol peuvent être en totalité ou en partie des ricinoléates (hydroxy-12 octadécène-9 oate) de polyglycérol. 10. Emulsion selon la revendications 9, caractérisée en ce que les esters de polyglycérol sont en totalité ou en partie des polyricinoléates de polyglycérol. 11. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisée en ce que le polyglycérol possède 2 à 12 résidus glycérol, et plus particulièrement 2 à 5 résidus. 12. Emulsion selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'ester de polyglycérol peut être associé à d'autres tensio-actifs, en particulier l'oléate de sorbitan, les ricins polyoxyéthylénés, hydrogénés ou non, et/ou des tensio-actifs naturels. 13. Emulsion selon la revendication 12, caractérisée en ce que les tensio-actifs naturels sont la lécithine ou bien les glycérides (mono + di), plus particulièrement les glycérides d'acides gras insaturés (oléique et/ou linoléique majoritaires) et d'acides gras à chaîne moyenne (caprylique et/ou caprique). 14. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la phase aqueuse de l'émulsion est en proportion telle que la viscosité de l'émulsion soit acceptable, pour que ladite émulsion puisse être facilement injectée, de préférence entre 5 et 50 % et plus particulièrement entre 12 et 25 % v/v. 15. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'émulsion peut contenir des substances modulatrices de l'immunité. 16. Vaccin selon les revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la phase aqueuse contient, seuls ou en association, des antigènes entiers d'origine virale, bactérienne, parasitaire, ou bien des fractions desdits antigènes, ou des protéines obtenues par recombinaison génétique. 17. Médicament immunologique selon les revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la phase aqueuse contient une protéine étrangère, ou une protéine modifiée, ou un haptène conjugué à une molécule porteuse.