FR 2696188 A1 19940401 FR 9211496 A 19920925 MOLECULE CD4 DE CHAT, SEQUENCE NUCLEIQUE CODANT POUR CETTE MOLECULE ET LEURS APPLICATION8 L'invention est relative à une nouvelle molécule présentant les propriétés caractéristiques de la molécule CD4 de chat. Elle est également relative aux produits qui peuvent en être dérivés, ainsi qu'aux applications qui peuvent en être faites pour le diagnostic d'un syndrome d'immunodéficience acquise chez le chat, voire même sa prévention ou son traitement. Enfin cette molécule ouvre des perspectives sur la possibilité de créer des modèles permettant de tester l'efficacité de principes actifs de médicaments contre des syndromes d'immunodéficience acquise induits par des rétrovirus de mêmes types dans d'autres espèces, voire même le SIDA humain. La molécule CD4, déjà identifiée dans un certain nombre d'espèces, s'exprime à titre principal dans des cellules du système immunitaire. Elle joue un rôle critique dans la différentiation et l'activation des lymphocytes T. Elle intervient aussi dans le cycle de développement du virus d'immunodéficience acquise chez l'homme HIV (1). La molécule CD4 humaine constitue un produit d'expression d'un gène appartenant à la super-famille des gènes d'immunoglobulines. Elle possède un segment extra-cellulaire comportant successivement quatre domaines de type immunoglobuline respectivement dénommés D1-D4, une région transmembranaire et une queue cytoplasmique (2). La molécule CD4 humaine participe à la fois aux réactions d'adhésion entre cellules et à la transduction des signaux (1,7). I1 a été suggéré que CD4 interagissait avec des molécules de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC : abréviation de l'expression anglaise "Major Histocompatibility complex"), sans que cela ait été complètement démontré au plan bio-physique (8,9). Outre son rôle dans le système immunitaire, la molécule CD4 est le récepteur du HIV (1). La glycoprotéine d'enveloppe du HIV présente une forte affinité pour la région D1 de la molécule CD4 humaine et se fixe sur celle-ci. I1 résulte d'analyses faites sur les effets de mutations induites dans CD4 dans le contexte de la structure cristallographique de ses régions D1-D2, d'une petite région de 10 acides constituerait le site principal, sinon unique de fixation de la glycoprotéine gp120 de HIV sur la CD4 humaine (10). Cette boucle est située sur une face à l'opposé de celle de la région CD4 présumée interagir avec les molécules NHC de classe II. Cette invention entre la glycoprotéine d'enveloppe de HIV et la molécule CD4 est essentielle pour le cycle viral du rétrovirus. Elle est considérée comme responsable du tropisme caractéristique des lentivirus de primates, tels que HIV-1, HIV-2 ou SIV (11 > . Des molécules CD4 ont également été identifiées chez la souris et le rat. Elles présentent des similitudes de structure avec la molécule CD4 humaine (3,4). De ce fait, il avait été envisagé d'utiliser de tels animaux comme modèles éventuels de l'infection de l'homme par le HIV. Mais un tel projet se heurtait au fait que les cellules de ces animaux ne peuvent pas être infectées par le rétrovirus humain. il en était de même pour des souris transgéniques, dont les cellules avaient été modifiées par incorporation dans leurs génomes d'une séquence génique codant pour la molécule CD4 humaine dans des conditions autorisant leur expression. Un certain nombre de souches de rétrovirus susceptibles d'induire une immunodéficience acquise chez le chat (FIV) : (abréviation de l'expression anglaise "Feline Immunodeficiency Virus") ont été récemment isolés (12). Alors qu'in vivo, comme le HIV; le FIV entraîne une déplètion progressive des lymphocytes CD4, le tropisme sélectif pour ces cellules semble être controversé ; en effet, certaines souches témoignent d'un tropisme sélectif pour des lymphocytes CD4- (13). D'autre part l'incubation préalable avec un anticorps monoclonal anti CD4 de chat (14) n'inhibe pas ou très peu l'infection d'une culture de lymphocytes CD4+ de chat par le FIV. A ce jour l'existence d'une interaction entre les souches de FIV déjà isolés et la molécule CD4 de chat n'a toujours pas été démontrée. Le clonage de la molécule CD4 de chat est essentiel à l'analyse du tropisme des différents isolats de FIV, et peut améliorer nos connaissances quant à l'acquisition du tropisme pour la molécule CD4 par les lentivirus. L'invention se rapporte plus particulièrement à cette molécule CD4 de chat et à la séquence nucléique codant pour cette molécule. La stratégie du clonage (voir figure 1) de cette molécule a été basée sur l'hypothèse que certaines de ses régions devaient présenter une homologie de séquence élevée avec des régions correspondantes d'autres molécules CD4 déjà décrites dans la littérature, entre autres celles de l'homme, de la souris et du rat. Or il est connu que des régions de forte homologie existent dans la partie cytoplasmique de ces molécules CD4 et que des régions d'homologie plus faibles existent également dans la partie extra membranaire de ces CD4 ; en particulier il existe dans le domaine D3 de ces 3 molécules, une région bien conservée comportant dans chaque cas un site de glycosylation.L'hypothèse a donc été formulée que des amorces nucléiques dégénérées susceptibles de s'hybrider aux régions correspondantes des molécules CD4 de l'homme et de la souris pourraient éventuellement aussi s'hybrider à des régions correspondantes de la molécule CD4 de chat. Cette hypothèse s'est révélée féconde, dans la mesure où la mise en oeuvre d'une technique d'amplification par réaction de polymérisation de chaînes (PCR, selon l'abréviation de l'expression anglaise "Polymerase Chain Reaction") a donné accès aux ARNm codant pour la CD4 de chat et, par leur intermédiaire, à la molécule CD4 de chat. La première amorce ("amorce-sens") codant pour la séquence en acides aminés: AGSGNLTL a été calquée sur la région V3 hautement conservée de la séquence en acides aminés de la molécule CD4 de l'homme, de la souris (L3T4) et du rat (W3/25) et la seconde amorce ("amorce anti-sens") codant pour la séquence en acides aminés EKKTCQC correspondant à la région cytoplasmique de ces 3 molécules (voir Figure 1A). Les oligonucléotides ont été synthétisés par un synthétiseur d'oligonucléotides (Pharmacia). L'oligonucléotide dégénéré 5' (CAT/J3) correspondant à "l'amorce-sens" consistait en un 27-mer dégénéré comportant 256 variantes nucléotidiques codant toutes pour la séquence en acides aminés AGSGNLTL. Sa séquence peut être représentée par la formule suivante 5'TTGCTGG(T/C/G/A)TCTGG(T/C/G/A)AACCT(T/C/G/A)AC(T/C/G/A) CTGG3'. L'oligonucléotide 3' (CYT/R) était un 30-mer dégénéré, anti-sens, comportant aussi 256 variantes d'acides nucléiques codant tous pour EKKTCQC, et comportait à son extrémité 3' un site de restriction EcoR1. La séquence globale de ce 30-mer peut être représentée par la formule générale suivante 5'GGGAATTCGA(G/A)AAtG/A)AA(G/A)AC(T/C/G/A)TG(C/T)CA(G/A)TG (C/T)C3'. Pour permettre une amplification rapide des extrémités de l'ADNc selon la méthode décrite par Frohman et al. (15) une amorce hybride (ci-après dite "adaptateur-dT17" a été synthétisée comprenant un oligo (dT) (17 résidus) conjugé à une amorce (adaptateur) formé d'un oligonucléotide également synthétisé à cet effet et comportant 17 bases 5'GACTCGAGTCGACATCGA 3'. La séquence de l"'adaptateur-dT17" est alors la suivante 5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3'. Ces oligonucléotides dégénérés ont été mis en oeuvre pour amplifier un ADNc obtenu à partir de nodules lymphatiques de chat. Cette première étape (Figure 1B) devait conduire à l'isolement et à l'amplification d'une bande majeure comprenant approximativement 450 paires de base. Après clonage et séquençage de ce fragment, il apparut que la séquence en acides aminés qui pouvait en être déduite présentait des caractères d'homologie avec les régions correspondantes des molécules CD4 humaines et murines, toute en en différant sensiblement. Afin de cloner la partie restante de la molécule CD4 féline par amplification, la procédure RACE (15) (Figure 1B) a été mise en oeuvre. Celle-ci impliquerait l'amplification entre une amorce spécifique et soit une amorce non spécifique hybridant avec l'extrémité naturelle "3"' soit avec une extrémité 5' synthétique (poly A). De cette façon deux fragments ont pû être clones, l'un comprenant l'extrémité 3' et incluant la séquence sus-indiquée de 450 paires de base, et l'autre comprenant l'extrémité 5' et incluant également la séquence de 450 paires de base de la molécule CD4 féline. A partir de ces deux fragments, 1'ADNc de la séquence nucléique codant pour la molécule CD4 féline (3,2) kilo-bases) a pû être reconstituée.La séquence complète de ces clones a pû être déterminée par le déplacement (walking) le long de la séquence d'ADN clonée, en mettant en oeuvre des amorces synthétiques séquentielles spécifiques. La séquence en acides nucléiques de l'ADNc codant pour la molécule CD4 féline conforme à l'invention est représentée à la Figure 2A. La séquence en acides aminés (représentée conformément au code à la lettre unique de désignation des acides amines) est représentée à la Figure 2B. Elle apparaît aussi à la Figure 3 dans laquelle les séquences correspondantes des molécules CD4 humaine et murine sont egalement indiquées, après mises en alignement de leurs acides aminés identiques respectifs, pour rendre compte des homologies relatives entre ces molécules et la molécule CD4 féline. Outre ces homologies relatives, la molécule CD4 de chat présente une particularité unique caractérisée par la presence d'une insertion de 17 acides aminés, riche en serine/threonine et située au début du domaine D2 (acides amines 108 à 123). 1) L'invention concerne donc plus particulièrement la protéine CD4 de chat, répondant à la séquence en acides amines de la Figure 1 ou tous fragments peptidiques issus de cette protéine, dès lors qu'ils contiendraient le site de fixation pour FIV. En particulier l'invention concerne le fragment de la protéine féline CD4+, soluble, qui comporte les régions D1 et D2 (respectivement s'étendant de l'aminoacide numéroté 1 à l'acide aminé 101, et de l'acide aminé 102 à l'acide aminé 196 de la Figure 3) qui apparaissent dans le Figure 2B, voire même la seule région D1.Ces fragments de polypeptides peuvent être obtenus à partir de la protéine entière par clivage de celle-ci par des enzymes (par exemple achromase, trypsine, alpha-chymotrysine, facteur anti-xa, etc...) qui sont aussi capables de reconnaître des liaisons peptidiques particulières et sélection de ceux des fragments capables d'interférer avec un virus FIV, présélectionné comme il sera indiqué plus loin, dans des essais d'infection de cellules CD4+ par ce virus FIV. En variante les fragments des polypeptides sus-indiqués peuvent être obtenus par expression de sequences correspondantes d'acide nucléique issues d'un ADNc codant pour la molécule CD4 de chat entière après insertion de ces séquences dans un vecteur recombinant approprié et transformation de cellules appropriées dans lesquelles ces séquences peuvent alors être exprimées. 2) L'invention concerne donc egalement des compositions pharmaceutiques vétérinaires contenant la susdite protéine ou le polypeptide correspondant, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. De préférence, la composition est injectable. Dans ce dernier cas, elle se présente notamment sous la forme d'une solution aqueuse, stérile, de préférence isotonique. I1 va de soi que ces compositions sont alors dosées de façon à assurer l'efficacité du principe actif au niveau de la prévention ou de l'inhibition in vivo de l'infection possible des lymphocytes CD4 de l'hôte félin par des variants de virus FIV susceptibles d'interagir avec ses molécules CD4.Cette molécule peut comporter toute ou partie de la protéine féline CD4, soluble, contenant les régions D1 et D4 (de l'acide amine 1 à l'acide aminé 385), qui apparaissent dans la Figure 2B et capables d'interférer avec un virus FIV. Le fragment comportant ces quatre regions a pû être exprimé par des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). Pour cet effet, le gène codant pour ces régions (de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 385) a été inséré dans un plasmide contenant le gène codant pour la dihydrofolate réductase (DHFR) (Figure 4A). Ce plasmide a ensuite été introduit dans des cellules CHO DHFR négatives.L'introduction de ce gène permet d'abord la sélection des cellules produisant la protéine d'intérêt, puis l'amplification de la production de cette protéine par l'emploi d'un analogue structural du substrat naturel de cet enzyme (16). Dans ces conditions, la molecule produite par ces cellules se lie de façon spécifique à l'anticorps monoclonal décrit comme reconnaissant la molécule CD4 de chat (14), lorsque l'on utilise une technique d'interaction récepteur-ligand en temps réel (17) (voir Figure 5). Le cas échéant, la molécule CD4 de chat (ou partie de cette CD4 > est conjuguée de façon covalente à un principe antivisuel, par exemple une chaîne de ricine A, une région active de l'exotoxine A de Pseudomonas, ou à tout autre agent anti-viral, immunomodulateur susceptible d'interférer avec l'effet pathogène de ces FIV. La molécule CD4 de chat (ou partie active de celle-ci) peut également coexister avec le principe antiviral ou analogue sus-mentionné au sein d'une protéine recombinante (voir par exemple les articles de Mark A. Till et al, Science, Vol. 242 (1988), pp.1166-1168 et Vijay K. Chaudhary et al, Nature, Vol. 335 (1988), pp.369-372 qui décrivent des techniques de ce type, mais appliquées à la molécule CD4 humaine). On constate alors que la molécule CD4 contribue au ciblage du principe antiviral vers les lymphocytes T infectés de l'hôte. 3) L'invention concerne aussi des vecteurs recombinants comportant une sequence nucléique codant pour ladite proteine CD4 féline deletée ou non de l'insertion de 17 acides aminés ou pour les fragments actifs correspondants, sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les hôtes cellulaires susceptibles d'être transformés par de tels vecteurs recombinants. 4) L'invention concerne plus particulièrement des cultures cellulaires initialement CD4 transformées par le vecteur recombinant sus-indiqué et de ce fait rendues CD4+. De telles cellules, surtout lorsqu'elles peuvent être cultivées sous forme de cellules attachées et lorsqu'elles peuvent être infectées par des souches de FIV préalablement adaptées à ces cellules, sont d'un intérêt particulier. A cet effet, le gène codant pour la molécule entière (domaines D1 à D4, regions transmembranaire et cytoplasmique) du CD4 de chat a été inséré dans un vecteur d'expression (Figure 4B) ; ce plasmide a ensuite été introduit dans 3 types de lignée cellulaire : CrFK, Fc3Tg et CHO. Ces lignees CD4 ont été dans ces conditions rendues CD4+ (voir Figure 6).La mise en oeuvre de telles cellules transformées peut alors permettre la sélection de ceux des isolants de FIV dont sera montrée la capacité à interagir avec un site actif de la molécule CD4 de chat. Ces cellules transformées peuvent alors être utilisées pour l'étude du degré d'interférence avec le FIV sélectionne de substances medicamenteuses à l'étude, lorsque des essais d'infection in vitro de cultures de ces cellules sont effectués avec le FIV ainsi adapté, en présence du principe médicamenteux étudié. Le degré d'activité du principe medicamenteux étudié est alors fonction du degré d'inhibition de l'infectiosité du FIV mis en oeuvre par rapport à celle mesuree chez des témoins. 5) L'invention concerne également l'utilisation de telles lignees transformées (avec ou sans l'insertion de 17 aa) dans le but de sélectionner ou d'adapter un ou plusieurs isolat(s) de FIV. Le tropisme du FIV pour la molécule CD4 de chat est contesté et n'a pas encore été clairement démontré ; l'hypothèse que la forme ancestrale du FIV aurait eu un tropisme spécifique pour cette molécule puis l'aurait progressivement perdu au cours du temps est avancée. D'autre part, la presence de l'insertion de 17aa aurait pu contribuer à la perte de ce tropisme d'où l'intérêt de transformer des lignées cellulaires sans cette insertion. il serait donc intéressant de sélectionner ou d'adapter un ou plusieurs isolats ayant "réacquis" un tropisme spécifique pour cette molécule et étant donc capables d'infecter des cellules CD4+.La méthode consisterait à rajouter continuellement de forte concentration de FIV dans le milieu de culture de cellules CD4+ adhérentes (avec ou sans l'insertion) afin d'isoler une souche infectieuse. 6) L'invention concerne également l'utilisation de cellules de souris ou de hamster exprimant la molécule CD4 féline avec ou sans l'insertion et l'analyse de leur sensibilité à l'infection par le FIV ou par un isolat prealablement sélectionné ou adapté (voir 5)) ou par un hybride HIV/FIV (voir 7)) dans le but de mettre au point des animaux transgéniques. 7) L'invention concerne également l'utilisation d'un hybride HIV/FIV possédant toutes les séquences du HIV mais où le gène codant pour l'enveloppe du HIV aurait été remplacé par celui codant pour l'enveloppe d'un isolat du FIV ayant un tropisme spécifique pour la molécule CD4 feline. Cet isolat pourra être un isolat "naturel" c'est-à-dire sélectionné parmi les isolats du FIV déjà décrits dans la littérature ou bien un isolat "adapte" issu d'une adaptation (voir 5)). 8) L'invention concerne aussi l'utilisation de l'insertion de 17 aa dans une autre molecule CD4 en particulier celle de l'homme afin d'observer l'influence qu'elle aurait sur l'infection par le HIV par exemple. 9) L'invention concerne aussi l'utilisation de toute ou partie de la molécule CD4 de chat dans des tests de laboratoire (ELISA, BIAcore, etc...) mettant en jeu son interaction avec la glycoprotéine d'enveloppe des variants FIV capables d'infecter des cellules CD4+. 10) L'invention concerne enfin la mise au point de souris transgéniques dont le patrimoine génétique aurait été modifié par incorporation dans les génomes de leurs cellules d'une séquence recombinante contenant une séquence codant pour la molecule CD4 de chat (avec ou sans l'insertion) sous le contrôle d'un promoteur plus spécifiquement actif dans les cellules lymphoïdes. Ces animaux transgéniques (par exemple obtenus par une méthode équivalente à celle décrite dans le brevet européen n"85304490.7 déposé le 24 juin 1985 auprès de 1'OEB) peuvent alors devenir, à leur tour, d'excellents modèles animaux pour l'étude de l'infection par le FIV, en particulier par un isolat adapté ou sélectionné ou par un hybride HIV/FIV.Ils peuvent aussi servir à l'étude des effets médicamenteux d'une substance à l'étude à l'égard du syndrome d'immunodéficience active du chat, voire même de l'homme. Les légendes des figures 1 à 6 sont indiquées v ci-après. Figure 1 : Stratégie du clonage du cDNA du CD4 de chat Fig. lA : Un fragment de cDNA du CD4 (CD4 cDNA dans le dessin) de chat a été obtenu par une technique d'amplification utilisant deux amorces dégénérées dérivées de deux régions hautement conserves entre les séquences en acides aminés des molécules CD4 de l'homme (T4), de la souris (L3T4) et du rat (W3/25). La première amorce, sens pour AGSGNLTL est localisée dans la région V3 et la seconde, antisens pour EKKTCQC est localisée dans la région cytoplasmique. Fig. 1B : Clonage de la totalité du cDNA du CD4 de chat par la technique RACE. Figure 2 Sequences en acides nucléiques (A) et en acides aminés (B) de la molécule CD4 de chat. Figure 3 : Alignement des séquences en aminoacides des molécules CDI de l'homme (H), de la souris (S) et du chat (C) Les chiffres sur la droite représentent la position des acides aminés. Les domaines Dl, D2, D3 et D4 et les regions transmembranaire (TM) et cytoplasmique (CYT) sont indiqués par des flèches horizontales. Les sites de N-glycosylation apparaissent sous forme ombrée. Les homologies en acides aminés identiques entre l'homme, la souris et le chat pour chaque domaine sont les suivantes : D1, 44% ; D2, 32% ; D3, 50% ; D4, 44% ; TM, 39% et CYT, 70%. Figure 4 : Vecteurs d'expression du gène codant pour la molécule CDO de chat Fig. 4A : Le gène inséré code pour la partie extramembranaire du CD4 de chat conduisant à la production de la molécule CD4 feline sous une forme recombinante soluble. Fig. 4B : Le gène inséré dans le vecteur code pour la totalité du CD4 de chat permettant ainsi son expression membranaire dans une lignée cellulaire donnee. Figure 5 : Mise en évidence de la protéine recombinante CD4 féline soluble (fsT4). Interaction du surnageant de culture de cellules CHO transfectées avec le plasmide contenant le gène codant pour sfT4 avec un anticorps monoclonal anti-CD4 de chat (A) ou un anticorps monoclonal irrelevant (B). (limites de résonances (RU) en fonction du temps t (en secondes). Figure 6A : Analyse par cytométrie de flux de l'expression de la molécule CD4 de chat à la surface de cellules CHO au moyen de l'anticorps monoclonal anti CD4 de chat (Fel7) (Fig. 6B) et à titre de comparaison au moyen d'un anticorps monoclonal ne réagissant pas avec la molécule CD4 de chat. Figure 6B : comparaison à titre de contrôle d'un anticorps non cross-reactif. REFERENCES. 1. Klatzmann, D. R., J. S. McDougal and P. J. Maddon. The CD4 molecule and HIV infection. Immunodeficiency Reviews. 2:43.(1990). 2. Maddon, P. J., D. R. Littman, M. Godfrey, D. E. Maddon, L. Chess and R. Axel. The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4 a new member of the immunoglobulin gene family. Cell. 42:93.(1985). 3. Tourvieille, B., S. D. Gorman, E. H. Field, T. Hunkapiller and J. R. Parnes. Isolation and sequence of L3T4 complementary DNA clones : expression in T celais and brain. Science. 234:610.(1986). 4. Clark, S. J., W. A. Jefferies, A. N. Barclay, J. 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Molécule CD4 de chat dont la séquence en acides aminés est représentée à la figure 2 ou fragment actif de cette molécule dès lors qu'elle comporte le site de fixation d'un rétrovirus FIV capable de se fixer sur la molécule entière. 2. Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est couplée avec une molécule anti-virale ou immunomodulatrice capable d'interférer avec l'action pathogène d'un FIV. 3. Molécule selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une molécule recombinante. 4. Séquence d'ADN codant pour la molécule ou fragment actif de la molécule de la revendication 1. 5. Séquence d'ADN selon la revendication 4, dont la séquence en nucléotides correspond à celle de la figure 2. 6. Séquence d'ADN selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle est fusionnée avec une séquence codant pour la susdite molécule antivirale ou immunomodulatrice. 7. Vecteur recombinant susceptible de transformer un hôte cellulaire déterminé et contenant une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, placé sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases de cet hôte cellulaire, et ce dans des conditions permettant son expression dans cet hôte cellulaire. 8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisée en qu'il est apte à transformer des cellules lympholdes de chat ou de souris et en ce que le promoteur est spécifique aux cellules lymphoïdes correspondantes. 9. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 7 ou la revendication 8. 10. Procédé de sélection de FIVs interagissant avec une molécule CD4 de chat caractérisée par une mise en contact d'un surnageant de culture cellulaire infectée avec un hôte cellulaire conforme à la revendication 9 et par la sélection de ceux des rétrovirus du surnageant qui, en raison de leur affinité pour la CD4 exprimée au sein de cet hôte cellulaire, est à même de pénétrer dans celui-ci. 11. Composition pharmaceutique vétérinaire contenant la molécule CD4, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou une partie hydrosoluble de celle-ci.