FR 2693740 A1 19940121 FR 9208872 A 19920717 PROCEDE DE DETECTION TISSULAIRE OU CELLULAIRE METTANT EN OEUVRE DES REACTIFS CHIMILUMINESCENTS La présente invention est relative à un nouveau procédé de détection tissulaire ou cellulaire de molécules, mettant en oeuvre des réactifs chimiluminescents. Les études biologiques ont, pour une large part, trait à l'identification, la quantification, la détermination topographique, dans les cellules et les tissus, de composés protéiques et d'acides nucléiques. A cette échelle et quelles que soient les techniques utilisées, les composés recherchés ne sont détectables que par l'intermédiaire de "traceurs" couplés à des "sondes" spécifiques de la cible recherchée. Les "traceurs" appartiennent aux mêmes familles de composés, que la recherche s'effectue en phase liquide (dosages), sur membrane (blots), sur cellules ou tissus (immunocytochimie, hybridation in situ). I1 s'agit de - radioisotopes - enzymes générant à partir d'un substrat, un composé coloré soluble ou insoluble - marqueurs fluorescents - émetteurs de photons dits "luminescents". On attend d'un système de signalisation moléculaire, qu'il soit sensible, spécifique et à l'épreuve du temps, qu'il se prete à la quantification et que les résultats soient disponibles rapidement. Une exigence supplémentaire intervient lorsqu'on travaille sur cellules ou tissus qui est celle d'une grande précision dans la résolution topographique. Les radioisotopes sont actuellement considérés comme les traceurs les plus performants, eu égard à leur grande sensibilité, aux possibilités de quantification qu'ils offrent en phase liquide comme sur tissus (autoradiographie). Cependant, leur toxicité et les exigences qui s'attachent à leur manipulation, leur coût élevé, leur durée de vie limitée imposent des contraintes de gestion sévères. De plus, sur tissus, les résultats se font attendre des semaines, voire des mois. Bien que depuis les années 40, pour les biochimistes, les radioisotopes soient les uniques sondes de haute sensibilité pour l'étude des processus biologiques intra ou extracellulaire leurs utilisations par les morphologistes en analyse tissulaire ou cellulaire in situ est moins répandue. Cette limitation est partiellement conditionnée par les contraintes d'utilisation de la radioactivité (toxicité biologique, court, obtention des autorisations pour l'exploitation des radioéléments, mise en place d'un équipement adapté laboratoire "chaud" et son matériel spécifique). Le peu d'engouement des histo-cytologistes pour les techniques isotopiques repose essentiellement sur la lenteur dlobtention du résultat de l'analyse.En effet, sur préparation cytologique ou histologique, la détection du rayonnement émis par l'isotope traceur ne peut Être réalisée en quelques minutes par un compteur à scintillations. Elle requiert souvent une exposition longue de la coupe de tissu sous une émulsion photographique pouvant s'étaler de quelques semaines à plusieurs mois. Par ailleurs, la résolution morphologique ainsi obtenue est proportionnelle à la durée de l'exposition. Ces raisons font que les traceurs enzymatiques et fluorescents, bien que nettement moins sensibles, demeurent les marqueurs les plus couramment utilisés. Les traceurs chimiluminescents sont connus depuis plusieurs années et ont été utilisés an phase liquide ou sur membrane synthétique. Les applications sont cependant impropres à l'examen histopathologique d'un organe affecté par un processus infectieux ou tumoral. Dans ce cas, l'intrication des structures saines et pathologiques rend indispensable la lecture morphologique fiable des structures et de la dispersion topographique de la sonde. L'utilisation des traceurs chimiluminescents sur coupes tissulaires se heurte à des difficultés particulières : - la durée de l'émission lumineuse par rapport à la durée du balayage d'une coupe histologique, - la diffusion du substrat luminescent au sein du film liquidien à la surface de la coupe. - l'identification des structures cellulaires auxquelles rapporter le signal. La faible intensité, la brièveté du signal (quelque dizaine de secondes), la diffusibilité à la surface de la coupe tissulaire du produit générant le signal lumineux semblent incompatibles avec la localisation topographique précise du signal émis et l'examen histologique qui requiert un temps d'analyse de quelques minutes. I1 a été tenté ces dernières années d'utiliser des réactifs chimiluminescents pour la localisation sur coupe tissulaire. Cependant, les résultats ont été décevants du fait d'une mauvaise résolution morphologique et d'un mauvais gain en sensibilité par rapport aux réactifs colorés. Les inventeurs ont réussi à surmonter les difficultés liées à l'utilisation des réactifs chimiluminescents pour l'analyse de coupes de tissus, notamment le problème de la brièveté du signal et de son intensité faible, de la diffusibilité du produit de la réaction, par la mise au point d'un procédé de détection mettant en oeuvre des réactifs et une instrumentation permettant de procéder à la détection avec une sensibilité et une résolution morphologique particulièrement élevées. Cette sensibilité est de 100 à dix mille fois supérieure à celle des marqueurs chromogéniques en immunocytochimie et en hybridation in situ. Elle permet ainsi de révéler la présence de génomes viraux qui seraient passés inaperçus avec les méthodes classiques de détection. Elle permet par ailleurs de remplacer les méthodes mettant en oeuvre des radioisotopes (présentant les inconvénients mentionnés ci-dessus) pour la détection et la quantification de molécules à faible concentration, notamment dans le domaine de l'hybridation in situ. Ce procédé peut également être adapté à la démonstration précoce d'infection virale, et notamment sur des biopsies de patients greffés. Le procédé conforme à l'invention consiste essentiellement : (1) à mettre en contact une coupe cytologique ou histologique préparée de façon adéquate, avec un réactif chimiluminescent comprenant un susbrat luminogène d'une enzyme peroxidante associée à un agent d'amplification, (2) à procéder immédiatement à l'analyse et (3) à recueillir le signal luminescent par un microscope photonique équipé d'un objectif à immersion dont la sortie est reliée à une caméra ICCD, la caméra étant reliée à une unité de contrôle et à un processeur d'images equipé d'un dispositif de comptage de photons, l'image analogique étant visualisée sur un moniteur vidéo ou tout autre moyen de visualisation, de détection ou de reproduction. Conformément à l'invention, les préparations cytologiques ou histologiques résultent de l'application d'une sonde nucléique (ADNc, oligonucléotide ribosonde) pour l'hybridation in situ ou d'un anticorps primaire spécifique pour l'immunohistochimie sur un étalement cellulaire ou une coupe tissulaire. La sonde est ensuite "tracée" par detection immunologique utilisant une enzyme peroxidante telle que la péroxidase de raifort comme marqueur. Le réactif chimiluminescent plus particulièrement utilisable conformément à l'invention est le réactif dénommé Luminol amplifié tel que le produit commercialisé par la Société AMERSHAM sous la dénomination ECL detection reagent RPN 3004 qui comporte un sustrat luminogène de enzyme peroxidase associé en solution au para iodophenol comme agent amplificateur. D'autres réactifs chimiluminescents utilisables sont la phosphatase alkaline et le 3-(2'-spiroadomantane) 4methoxy 4-(3"-phosphoryloxy)-phenyl 1,2 - dioxetane (AMPPDi. Les préparations mises en oeuvre ne sont pas déshydratées et sont maintenues dans un milieu aqueux contenant le substrat luminogène. Le microscope photonique à immersion est de préférence équipé d'objectifs à immersion d'huile tel que le microscope vendu par Olympus de type BH2. L'utilisation de ce type d'objectif permet de maintenir le contact étroit entre la préparation et le système collecteur de photons et conditionne la qualité de la résolution morphologique. On réalise la mise au point de la préparation cellulaire sous le microscope de façon que l'image des cellules du tissu en lumière transmise disparait pratiquement de l'écran vidéo de contrôle, le réglage des occulaires étant conforme à l'écartement pupillaire de l'observateur. Ce réglage permet d'améliorer la résolution morphologique du signal lumineux. Le repérage morphologique sur la préparation observée en lumière transmise peut Être amélioré par la réalisation d'une contre-coloration de quelques secondes à quelques minutes par un colorant du type thiazine tel que le bleu de methylene ou le bleu de toluidine, avant que le réactif chimiluminescent ne soit mis au contact du tissu. Ces colorants n'éteignent pas le signal lumineux. Les inventeurs ont ainsi découvert que le procédé conforme à l'invention permettait de résoudre le problème lié à l'utilisation des marqueurs radioactifs beaucoup plus sensibles que les substrats chromogéniques mais présentant les problèmes mentionnés ci-dessus. En fournissant des informations structurales et ou fonctionnelles au niveau cellulaire sans détruire l'organisation des systèmes étudiés et tout en améliorant les performances de l'hybridation in situ (HIS) et de l'immunohistochimie (IHC), le procédé par chimiluminescence conforme à l'invention couvre le même champ que ces techniques qui visent à détecter un large éventail de structures et ou produits cellulaires récepteurs, filaments, organites, produits synthétisé, virus, etc. Voir en particulier O.DEVERGE et coîl "Hybridation in situ", édition Inserm 1991, 79p, G. MOREL, "Microscopie électronique, cryométhodes, immunocytochimie, autoradiographie, hybridation in situ, édition Inserm 1991, 591p. EC RAMAEKERS et coll "Immunohistochemistry as an aid in diagnostic cytopathology" in Advances in immunohistochemîstry, R.A. DELELLIS, édition RAVEN PRESS 1988, pages 133-163. Le procédé par chimiluminescence sur cellules entières et/ou coupes de tissu conforme à l'invention peut recevoir dans les laboratoires de recherche et d'anatomopathologie les mêmes applications que l'HIS ou l'IHC, c'est-à-dire, dans le dépistage et le diagnostic du cancer, l'identification de produits synthétisés, la recherche d'infections virales, la reconnaissance de sites antigéniques membranaires, etc. Le procédé conforme à l'invention peut notamment recevoir des applications dans les méthodes de diagnostic cytologique ou tissulaire des tumeurs; dans la détermination des caractéristiques pronostiques ou étiologiques, telles que la classification des tumeurs, l'expression des oncogènes, la différenciation des antigènes associés ou non à des sites favorisant des métastases ou ayant un potentiel métastasique; dans la surveillance de l'évolution des maladies. Les exemples suivants sont plus particulièrement destinés à illustrer l'invention sans pour autant présenter un caractère limitatif. EXEMPLE 1 : Figure 1 On marque une coupe de thyroïde humaine à l'immunoperoxydase antikératine 56KD (KL 1-Immunotech) en utilisant une dilution au 1/200. La préparation cytologique est mise au contact avec une goutte de réactif chimiluminescent (ECL-detection reagent Amersham RPN 3004) qui est le luminol associé en solution au para iodophenol. On dépose une lamelle sur la coupe et la préparation est immédiatement analysée et le signal luminescent est recueilli par un microscope photonique Olympus équipé d'objectifs à immersion d'huile, dont la sortie vidéo est équipée d'une caméra ICCD (C2400-47 Hamamatsu photonic). L'ensemble microscope/caméra est disposé dans une chambre étanche à la lumière. La caméra est reliée à une unité de contrôle (HV control unit Hamamatsu photonic) et à un processeur d'image (Argus 10 Hamamatsu photonic) équipé de la fonction comptage de photons. L'image analogique est visualisée sur un moniteur vidéo couleur. On réalise la mise au point de la préparation cellulaire sous le microscope. Celle-ci correspond au moment où l'image des cellules ou du tissu en lumière transmise, disparait pratiquement de l'écran vidéo. L'image obtenue permet pour un temps d'acquisition de 5mn de détecter le marquage des filaments intermédiaires de kératine. (voir figure 1, photo 2). Le contrôle pour une même dilution d'antikératine permet de noter les mêmes éléments histologiques en utilisant une réaction colorée fournie par la diaminobenzidine (DAB) (figure 1 - photo 3). EXEMPLE 2 - Figure 1 On met en oeuvre le même procédé que dans l'exemple 1, mais avec une dilution d'antikératine au 1/50000. Après un temps d'acquisition de 1Omn, on retrouve un signal de même intensité pour une dilution de l'anticorps 250 fois supérieure (figure 1 - photo 4). Par contre, le contrôle pour une dilution d'antikératine au 1/50000, ne permet pas de détecter l'immunomarquage epithélial par colorimétrie (DAB) (figure 1 - photo 5). La photo 1 de la figure 1 représente le repérage de la structure histologique non colorée en lumière transmise. EXEMPLE 3 - Figure 2 On procède à la détection du Papilloma Virus Humain (PVH 16/18) sur une biopsie de col utérin. On a procédé à une hybridation in situ avec une sonde ADNc biotinylée (Enzo Diagnostic). On procède à l'analyse comme indiqué dans l'exemple 1. Les résultats paraissent sur la figure 2 sur laquelle la photo 1 correspond au signal colorimétique en DAB (diaminobenzidine) ; les noyaux ont été colorés par le rouge nucléaire. La présence du génome viral est difficile à déceler. Par l'utilisation du réactif chimiluminescent tel que défini dans l'exemple 1, on constate la présence du génome viral dans de nombreuses cellules epithéliales d'une coupe contigüe (photo 2). Par contre, la photo 3 illustre un contrôle négatif (PVH 6/11) en mettant en oeuvre le réactif chimiluminescent selon l'exemple 1. La photo 4 représente la même coupe tissulaire en lumière transmise. EXEMPLE 4 - Figure 3 On procède, de la même façon que dans l'exemple 3, à la détection du Papilloma Virus Humain (PVH) sur culture de cellules Hela (10 à 50 copies de PVH 16/18). La figure 3 représente, sur la photo 1, l'observation des cellules en lumière transmise sans coloration, et sur la photo 2, le marquage positif PVH 16/18 par la diamino benzidine, sans aucune réaction spécifique colorée decelable dans les cellules. La photo 3 permet de constater un marquage positif PVH 16/18 grâce à l'utilisation du procédé décrit dans l'exemple 1, le génome viral est détecté dans toutes les cellules observées. La figure 4 constitue un contrôle néga tif (PVH 6/11) en luminescence. EXEMPLE 5 : Figure 4 On a procédé comme dans l'exemple 3 à la détection du Papilloma Virus Humain PVH 16/18 sur biopsie de col utérin. La figure 4 permet de constater, à la photo 1, le signal colorimétrique en diaminobenzidine jaune brun (les noyaux ont été colorés par le rouge nucléaire), le génome viral est détecté dans les noyaux des cellules superficielles de l'épithélium malpighien. La photo 2 réalisée sur une préparation mise en contact avec le réactif chimiluminescent dans les conditions définies dans l'exemple 1, permet de constater une distribution du marquage correspondant à la réaction colorée. La photo 3 est un repérage en lumière transmise des noyaux infectés par le virus. La photo 4 permet de montrer à un plus fort grossissement le signal luminescent résultant de la mise en oeuvre du procédé décrit dans l'exemple 1 ; il est bien intranucléaire. La photo 5 est une coupe tissulaire en lumière transmise de la coupe correspondant à la photo 4. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection tissulaire ou cellulaire caractérisé par le fait qu'il consiste (1) à mettre en contact une préparation cytologique ou histologique, préparée au préalable, avec un réactif chimiluminescent comprenant un substrat luminogène d'une enzyme peroxidante associée à un agent d'amplification, (2) à procéder immédiatement à l'analyse et (3) à recueillir le signal luminescent par un microscope photonique équipé d'un objectif à immersion dont la sortie est reliée à une caméra ICCD, la caméra étant reliée à une unité de contrôle et à un processeur d'images équipé d'un dispositif de comptage de photons, l'image analogique étant visualisée sur un moniteur vidéo ou tout moyen de visualisation, de traitement ou d'enregistrement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les préparations sont obtenues par application d'une sonde nucléique pour l'hybridation in situ ou d'un anticorps primaire spécifique. 3. Procédé selon la revendication 1 OQ 2, caractérisé par le fait que la sonde est "tracée" par une détection immunologique mettant en oeuvre une enzyme peroxydante comme marqueur. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le réactif chimiluminescent est le luminol comportant un substrat luminogène de l'enzyme peroxydase associé à du para-iodophenol comme amplificateur. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait les préparations sont maintenues en milieu aqueux. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé par le fait que le microscope photonique est équipé d'objectifs à immersion d'huile. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on maintient un contact étroit entre la préparation et le système collecteur de photons. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la mise au point de l'image vidéo fournissant le signal optimal diffère de la mise au point optique, les occulaires étant convenablement réglés. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à B,caractérisé par le fait que l'on procède à une contrecoloration des préparations pour améliorer le repérage morphologique sans altération du signal luminescent. 10. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, à la détection de sites antigéniques (récepteurs, filaments, organites, produits synthétisés, virus). 11. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, au dépistage et diagnostic du cancer, à la recherche d'infections virales. 12. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans le suivi thérapeutique.