FR 2694020 A1 19940128 FR 9209174 A 19920724 PROCEDE DE PREPARATION DE SUBSTANCES AROMATIQUES PAR VOIE ENZYMATIQUE L'invention a pour objet un procédé de préparation de certaines substances aromatiques par voie enzymatique. Par substances aromatiques on entend toutes substances utilisées pour le parfum qu'elles dégagent et/ou le goût qu'elles procurent dans l'industrie alimentaire, pharmaceutique ou de la parfumerie. Le procédé conforme à l'invention permet la préparation de substances aromatiques de formule dans laquelle R2 peut être un radical -H, -OH, -O-CH3, R3 peut être un radical -H, -OH, -O-CH3, R2 et R3 peuvent former un pont méthylênedioxy Avantageusement ces substances aromatiques appartiennent au groupe comprenant : la vanilline, le benzaldéhyde, l'aldéhyde anisique, l'aldéhyde parahydroxybenzoïque, l'héliotropine et l'aldéhyde protocatéchique. Jusqu'à présent, il était connu de préparer la vanilline selon différents procédés - à partir de guaïacol, par voie chimique, mais la vanilline est obtenue dans un mélange comprenant de nombreuses impuretés, d'où des rendements moyens - à partir de la dégradation de la lignine, mais l'obtention de la vanilline à l'état pur nécessite une grande consom mation de produits chimiques et d'énergie et occasionne de nombreux rejets écotoxiques - à partir de safrole, composé présent dans l'essence de sassafras permettant ainsi l'obtention d'un mélange isovanilline-vanilline qui sont deux isomères difficiles à séparer ;; - à partir d'eugénol, composé présent dans l'huile de clou de girofle, ce composé subissant une première étape d'isomérisation en isoeugénol (cis et trans en proportions variables) puis une deuxième étape d'oxydation pour donner la vanilline ; cependant, ce procédé chimique donne des rendements très moyens. De plus, tous les procédés de l'art antérieur faisant appel à au moins une manipulation chimique, le produit obtenu ne peut qu'être appelé "vanilline de synthèse ou d'hémisynthèse" et ne peut en aucun cas être appelé "vanilline d'origine naturelle", même si le substrat de départ est naturel (cas de l'eugénol ou du safrole). En ce qui concerne le benzaldéhyde, il est produit par exemple à partir d'aldéhyde cinnamique traité en milieu alcalin sous pression et à haute température (brevet US 4 617 419). Quant à l'aldéhyde anisique, il est classiquement produit par oxydation chimique de l'anéthole que l'on trouve en grande quantité dans l'essence de badiane. Mais, tout comme la vanilline et pour les mêmes raisons, ces deux composés ne peuvent pas être qualifiés de "naturels". L'invention a pour but de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et propose un procédé biotechnologique permettant la préparation de certaines substances aromatiques de bonne pureté avec des rendements élevés. Ainsi, la Société demanderesse a eu le mérite d'établir qu'il était possible de préparer des substances aromatiques de formule en soumettant l'un de leurs précurseurs, appelé substrat, répondant à la formule dans laquelle R1 peut être un radical -CH3, -CH20H, -CHO, -COOH, R2 peut être un radical -H, -OH, -0-CH3, R3 peut être un radical -H, -OH, -O-CH3, R2 et R3 peuvent former un pont méthylènedioxy à l'action d'une enzyme : la lipoxygénase ou lipoxidase. Cette enzyme est naturellement présente dans certains végétaux tels que le soja, le blé ou la betterave, dans certains organes d'animaux tels que les foies de porc, de veau ou de poisson; elle est également synthétisée par certains microorganismes. Elle est connue notamment pour sa participation à la première étape d'un procédé permettant la synthèse d'aldé hydes à partir d'acides gras. En effet, son activité catalytique oxydative sur les acides gras insaturés, et plus particulièrement sur les acides linoléique et linolénique, donne lieu à la formation d'un hydroperoxyde pouvant ensuite être scindé en un oxoacide et un aldéhyde par une hydroperoxyde lyase. Or, dans le cadre de l'invention, il a été trouvé que la lipoxygénase, quelle que soit son origine, pouvait à elle seule permettre la préparation de substances aromatiques de formule à partir de substrats représentés par la formule ci-dessus mentionnée et selon la réaction suivante CH=CH-R1 CHO Lipoxygénase R1-COOH + R2 + + ou R,-CHO R3 R3 (R1, R2 et R3 ayant les significàtions données précédemment). Les substances aromatiques préférées préparées selon le procédé conforme à l'invention sont récapitulées dans le tableau I. TABLEAU I R1 Hz | R3 | SUBSTRAT | ISOMERE | PRODUIT -CH3 -H3 | -O-cH3 | -OH T isoeugénol | eugénol | vanilline -CH20H -O-cH3 -OH alcool vanilline coniférylique -MO -O-cH3 -OH aldéhyde vanilline coniférylique -COOH -0-CH3 -OH acide vanilline ferulique -cH2OH -H -H alcool benzaldéhpde cinnamique -CR0 -H -H aldéhyde ban: aldéhyde cinnamique -CoeH -CHO -H -K acide benzaldênyde cinnamique -cH3 -H3 -H -o-CH3 anethol estragol aldéhyde anisique -CR3 -H -OH anol chavicol aldéhyde para hydroxy bansoique -CH3 -O O- isosafrol safrole héliotropine l ~ l -COOH -OH H acide caféiquc aldéhyde proto catechique -o-CH3 -OH curcumine 7 vanilline EII2 t o-CH3 L'eugénol, le chavicol, l'estragol et le safrole qui sont respectivement les isomères de l'isoeugénol, de l'anol, de l'anéthole et de l'isosafrole peuvent eux-mêmes être transformés par la lipoxygénase en l'aldéhyde correspondant, soit la vanilline, l'aldéhyde hydroxybenzoïque, l'aldéhyde anisique et l'héliotropine mais avec un faible rendement qui correspond vraisemblablement au taux d'isomérisation spontanée entre chaque couple de molécule. En effet la condition la plus importante pour que la lipoxygénase puisse exercer son action est que le substrat comporte une liaison insaturée correctement positionnée c'est le cas de toutes les molécules représentées par la formule répondant au "substrat" ; c'est aussi le cas dans les exemples connus que sont les acides linoléique et linolénique qui voient soit leur carbone n" 9, soit leur carbone n" 13 être le siège d'une peroxydation. Le procédé conforme à l'invention consiste donc à mettre en présence, en milieu tamponné, agité et thermorégulé, une lipoxygénase et un substrat répondant à la formule ci-dessus représentée pendant un temps suffisant pour permettre la préparation de la substance aromatique correspondante, celle-ci pouvant être ensuite récupérée par des techniques classiques d'extraction par solvant ou par distillation. Dans le procédé conforme à l'invention, la lipoxygénase peut être utilisée sous forme purifiée ou non purifiée Avantageusement, lorsqu'elle est purifiée (c'est-àdire généralement quand elle présente une activité supérieure à 30000 u/mg, 1 unité correspondant à une augmentation de l'absorbance à 234 nm d'une valeur de 0,001 par minute lorsque l'acide linoléique est le substrat, à pH 9 et à 25"C), la lipoxygénase est utilisée à raison de 1 à 500 mg par gramme de substrat, de préférence de 5 à 100 mg par gramme de substrat et plus préférentiellement encore de 10 à 50 mg par gramme de substrat, et lorsqu'elle n'est pas purifiée ( Selon le procédé conforme à l'invention, les lipoxygénases préférentiellement utilisées sont la lipoxygénase de germes de soja et la lipoxygénase de germes de blé. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, on établit la concentration en substrat de la lipoxygénase entre 2,5 et 100 g par litre de milieu de réaction et de préférence entre 20 et 75 g par litre de milieu de réaction. Conformément à l'invention, ce milieu de réaction est un milieu aqueux tamponné. Les tampons utilisés sont des tampons classiques tels que le tampon phosphate de potassium et/ou le tampon phosphate de sodium et/ou le tampon borate de sodium. Avantageusement, les molarités de ces tampons sont comprises entre 0,05 M et 0,5 M et leur pH est compris entre 5 et 10. Les ajustements de pH se font soit avec de la potasse, soit avec de la soude, soit avec de l'acide phosphorique. Selon d'autres caractéristiques avantageuses de l'invention : - la température du milieu de réaction varie entre 4 et 40"C et de préférence entre 22 et 32"C ; - la durée de la réaction varie entre 30 minutes et 7 jours, de préférence entre 2 heures et 5 jours et est déterminée par suivi cinétique des réactions. En outre, un agent émulsifiant tel que le TWEEN 80 peut être introduit dans le milieu à raison de 0,05 à 2% en volume par rapport au milieu de réaction. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, en fonction du substrat utilisé, et en particulier quand le substrat est un composé de nature phénolique, du fait de la toxicité des phénols vis-à-vis de l'enzyme, il peut être nécessaire d'ajouter dans le milieu de réaction au moins un adsorbant choisi dans le groupe comprenant le charbon actif à une concentration comprise entre 5 et 50 g par litre, celui connu sous la marque "Amberlite" de type XAD2 à une concentration comprise entre 5 et 50 g par litre et la béta cyclodextrine à une concentration comprise entre 3 et 18 g par litre, de façon à protéger ladite enzyme. L'invention ne se limite pas strictement au procédé décrit, elle en embrasse au contraire toutes les variantes. La Société demanderesse a par exemple expérimenté de façon concluante la transformation du béta-carotène en béta-ionone par l'action de la lipoxygénase. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention ; ils ne sont pas limitatifs et concernent les modes de réalisation avantageux de l'invention. EXEMPLE 1 Dans un flacon contenant 20 ml de tampon borate de sodium présentant une molarité de 0.1M et un pH de 6.5, on ajoute 0,75 g d'isoeugénol, 20 mg de lipoxygénase issue de germes de soja et titrant 36000 u/mg et 0,05 g de TWEEN 80. Après trois jours d'incubation à 28"C et sous agitation à une vitesse de 150 tr/min, l'ensemble de l'échantillon est extrait par du dichloroéthane et la vanilline est ensuite dosée par HPLC. La production de vanilline est de 2,85 g/l. EXEMPLE 2 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, on ajoute au milieu de réaction 0,75 g d'eugénol à la place de l'isoeugénol en présence de 0,5 g de charbon actif. Le rendement en vanilline est de 28,5 mg/litre. EXEMPLE 3 Huit flacons contenant les mêmes ingrédients que dans l'exemple 1 sont incubés à 28"C sur une table agitée à 150 tr/min. Chaque jour un échantillon est extrait par le dichloroéthane et dosé par HPLC. La cinétique est reproduite sur la figure 1. La production de vanilline atteint 2,82 g/l. EXEMPLE 4 Dans les mêmes conditions que dans les exemples précédents, on fait varier les concentrations en isoeugénol de 5 à 100 g/l de milieu de réaction. On obtient une production de vanilline, représentée sur la figure 2, atteignant 2,2 g/l. EXEMPLE 5 Dans les conditions décrites dans l'exemple 1, on fait varier la concentration de la lipoxygénase ajoutée au milieu de réaction de O à 2,5 g/l de milieu de réaction. Les quantités de vanilline produites correspondantes sont représentées sur la figure 3. La production de vanilline atteint 2,9 g/l. EXEMPLE 6 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, on ajoute 10 g/l de curcumine, préalablement traitée par de la potasse pour la solubiliser dans le milieu tampon. La vanilline est obtenue avec un rendement de 37 mg/l. EXEMPLE 7 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, on remplace l'isoeugénol par 2 g/l d'alcool coniférylique. En deux jours, la vanilline est obtenue avec un rendement de 240 mg/l. EXEMPLE 8 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, on ajoute 25 g/l d'aldéhyde cinnamique. Après quatre jours d'incubation, on détecte 1,1 g/l de benzaldéhyde dans le milieu. EXEMPLE 9 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, on ajoute 8 g/l d'anéthole. Après quatre jours, on mesure 448 mg/l d'aldéhyde anisique. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de substances aromatiques de formule caractérisé par le fait que l'on soumet un substrat répondant à la formule dans laquelle R1 peut être un radical -CH3, -CH20H, -CHO, -COOH, R2 peut être un radical -H, -OH, -0-CH3, R3 peut être un radical -H, -OH, -0-CH3, R2 et R3 peuvent former un pont méthylènedioxy à l'action d'une lipoxygénase. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les substances aromatiques appartiennent au groupe comprenant: la vanilline, le benzaldéhyde, l'aldéhyde anisique, 1' aldéhyde parahydroxybenzoïque, 1 'héliotropine et l'aldéhyde protocatéchique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que la lipoxygénase sous forme purifiée est utilisée à raison de 1 à 500 mg par gramme de substrat, de préférence entre 5 et 100 mg par gramme de substrat et plus préférentiellement encore de 10 à 50 mg par gramme de substrat. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que la lipoxygénase sous forme non purifiée est utilisée à raison de 0,025 à 10 g par gramme de substrat et de préférence entre 0,1 et 5 g par gramme de substrat. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on utilise la lipoxygénase de germes de soja. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on utilise la lipoxygénase de germes de blé. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'on établit la concentration du substrat de la lipoxygénase entre 2,5 et 100 g par litre de milieu de réaction et de préférence entre 20 et 75 g par litre de milieu de réaction. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans un milieu tamponné présentant un pH compris entre 5 et 10. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que la température du milieu de réaction est comprise entre 4 et 40"C et de préférence entre 22 et 32"C. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que la durée de la réaction varie de 30 minutes à 7 jours et de préférence de 2 heures à 5 jours. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'un agent émulsifiant est ajouté à raison de 0,05 à 2% en volume par rapport au milieu de réaction. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que l'on peut ajouter dans le milieu de réaction, dans le cas où un composé de nature phénolique est utilisé comme substrat, au moins un adsorbant. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'adsorbant est choisi dans le groupe comprenant le charbon actif à une concentration comprise entre 5 et 50 g par litre, celui connu sous la marque "Amberlite" de type XAD2 à une concentration comprise entre 5 et 50 g par litre et la béta cyclodextrine à une concentration comprise entre 3 et 18 g par litre.