FR 2699173 A1 19940617 FR 9215343 A 19921215 NOUVEAUX AMIDES DE L'ACIDE BUTYRIQUE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PEARHACEUTIQULS EN RENFERMANT La présente invention se rapporte au domaine de la chimie organique et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique. Elle a notamment pour objet de nouveaux amides de l'acide butyrique et leur procédé de préparation. Elle a spécifiquement de nouveaux piperazinyl butyramides choisis dans le groupe constitué par les phénylpipérazinyl butyramides de formule 1A dans laquelle R2 est de l'hydrogène ou un atome d'halogène ou un radical trifluorométhyle ou forme avec R1 un groupement alcoylènedioxy R1 est de l'hydrogène, un alcoxy inférieur ou forme avec R2 un groupement alcoylènedioxy - les benzylpipérazinyl butyramides de formule 1B dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un radical phényl R2 représente de l'hydrogène, un halogène ou forme avec R1 un radical alcoylènedioxy R1 représente de l'hydrogène, un alcoxy inférieur ou forme avec R2 un groupement alcoylènedioxy et - les (hydroxyalcoyl) pipérazinyl butyramides de formule Ic dans laquelle n est égal à 1, 2 ou 3 L'invention se rapporte également aux sels d'addition des composés de formule IA S la ou le avec un acide minéral ou organique thérapeutiquement compatible. Les sels avec un acide qui ne peut être utilisé en thérapeutique servent de mode d'isolement, de purification ou, le cas échéant, de dédoublement lorsque la molécule comporte un atome de carbone asymétrique. Il a été montré en biologie cellulaire que les acides gras volatils en C2 à C6 modifient la croissance et la morphologie de la cellule. L'acide n-butyrique est le plus intéressant par l'amplitude de ses effets - inhibition de la synthèse de l'ADN blocage du cycle cellulaire en phase G1 consécutif à une hyperacétylation des histones - induction de la synthèse enzymatiqe et protéique - inversion des caractéristiques des cellules néoplasiques par remaniement du cytosquelette et modification de la cytomorphologie - augmentation de la survie des animaux, porteurs de tumeurs expérimentales, traités par les butyrates de sodium, d'arginine, de polyols - potentialisation de certains agents antimitotiques - inhibition de la croissance de certains virus : Herpès, virus Epstein Barr, virus de l'Encéphalomyocardite - induction du HIV1 et activation du HIV LTR par le butyrate de sodium L'ensemble de ces travaux a conduit à des applications en thérapeutique humaine.Cependant, les études pharmacocinétiques avec les butyrates de sodium, d'arginine, de lysine ont montré que les demi-vies plasmatiques de ces dérivés étaient de l'ordre de quelques minutes. En effet, il s'agit de dérivés ioniques, rapidement métabolisés, après une injection IV. Il était donc important de rechercher des dérivés de l'acide n-butyrique, qui présentaient des actions retard "in vivo" pour atteindre une demi-vie significativement supérieure aux butyrates précédemment décrits. On a proposé, par ailleurs, des polybutyrates de polyols. Cependant, leur synthèse s'avère difficile, quant à la reproductibilité stéréochimique des formes actives. Il convenait donc de chercher des formes de condensation de l'acide n-butyrique avec des molécules non-toxiques permettant de créer des liaisons chimiques plus stables, métabolisables par les enzymes biologiques, avec une cinétique plus lente au niveau de l'ensemble du système compartimental de l'organisme. Il convenait également de chercher des molécules associées à l'acide butyrique dont les polarités lipophiles et hydrophiles favorisent les perméabilités au niveau des membranes cellulaires. L'objet de la présente invention consiste donc en des dérivés de l'acide butyrique à action prolongée présentés sous forme d'amide. Les sels comme ceux avec un acide minéral ou organique thérapeutiquement compatible, comme les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, phosphate, sulfite, thiosulfate, acétate, butyrate, caproate, subérate, succincte, tartrate, citrate, glutamate, aspartate, benzoate, gentisate, salicylate, triméthoxybenzoate, vanillinate, eugenate, nicotinate, naphtoate, benzenesulfonate, méthanesulfonate, isethionate, ethanesulfonate, p. toluène sulfonate, camphosulfonate, naphtalène sulfonate, glucose 1-phosphate et le glucose 1,6-diphosphate. L'invention se rapporte également à un procédé d'obtention des pipérazinylbutyramides selon l'invention qui consiste en ce que l'on soumet un dérivé pipérazinique choisi dans le groupe constitué par les phénylpipérazines de formule IIA les benzylpipérazines de formule IIB dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un radical phényle R2 représente de l'hydrogène, un halogène ou forme avec R1 un groupement alcoylènedioxy et R1 représente de l'hydrogène ou un alcoxy inférieur et les hydroxyalcoyl pipérazines de formule IIc dans laquelle n est égal à 1,2 ou 3 à l'action de l'acide butyrique ou d'un dérivé fonctionnel de l'acide butyrique. De préférence, on utilise un dérivé fonctionnel d'acide butyrique et notamment un halogénure d'acide comme le chlorure. La réaction d'amidification se déroule à froid en solution dans un solvant inerte. Le solvant de la réaction peut être un solvant polaire comme la pyridine ou l'acétonitrile en présence ou en l'absence d'un agent basique comme la triethylamine, la collidine ou la diméthylaniline. Il peut être approprié d'opérer en présence d'un catalyseur d'acylation comme la 4-diméthylaminopyridine ou le carbonyl bis imidazole. L'amide ainsi obtenue est séparée du milieu réactionnel par distillation du solvant ou par dilution à l'eau ou par neutralisation du milieu réactionnel. La N-butanoylpipérazine produite est convertie en sel d'addition par remise en solution ou en suspension dans un solvant organique et addition de la quantité calculée d'acide. L'invention concerne spécifiquement les N-butanoylpipérazines suivantes, qui sont les composés actuellement préférés - la 4-butanoyl 1-phénylpipérazine - la 4-butanoyl 1-(3-chlorophényl) pipérazine - la 4-butanoyl 1-(diphénylméthyl) pipérazine - la 4-butanoyl 1-pipéronylpipérazine - la 4-butanoyl 1-(ss-hydroxyéthyl) pipérazine - ainsi que leurs sels d'addition avec un acide minéral ou organique Ces composés selon l'invention se distinguent par des propriétés pharmacologiques tout à fait remarquables qui les rendent aptes à l'utilisation en thérapeutique humaine et animale.En particulier, ils possèdent, dans le domaine cardio-vasculaire, des propriétés anti-hypertensives, dans le domaine du système nerveux central des propriétés du type neuroleptique, dans le domaine biologique des propriétés inductrices de la différenciation cellulaire, des propriétés anti-virales notamment sur les retro-virus et, en outre, une activité spasmolytique. De ce fait, les composés selon l'invention trouvent un emploi dans le traitement de l'hypertension artérielle, dans les états d'agitation, pour le traitment des spasmes artériels, intestinaux ou vésicaux ou dans le traitement des maladies à virus. A ces fins, ils seront utilisés sous forme de compositions pharmaceutiques administrables par voie digestive, par voie parentérale, par voie rectale, par voie topique ou par voie permuqueuse en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule approprié pour cette voie. On pourra citer comme formes pharmaceutiques, les comprimés nus ou enrobés, les dragées, les gélules, les pilules, les sachets de poudre, les solutés ou les suspensions buvables ou injectables, les suppositoires, les capsules rectales, les crèmes, les pommades, les gels ou les solutions pénétrantes dans un solvant polaire. La posologie varie naturellement en fonction de l'indication thérapeutique, de la sévérité de l'affection à traiter, de la voie d'administration, de l'âge et du poids du malade. Elle s'échelonne selon les composés de 1 à 100 mg par prise unitaire et de 5 à 500 mg par jour. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter EXEMPLE I Synthèse d'amides butyriques des dérivés substitués de la pipérazine - N-butanoyl 1-phénylpipérazine (1-PPB) - N-butanoyl 1-(3-chlorophényl) pipérazine (mCPPB) - N-butanoyl benzhydrylpipérazine (BHPB) - N-butanoyl 1-pipéronylpipérazine (POB) - N-butanoyl ss-hydroxyéthylpipérazine (HEPB) Partie théorique Principe L'amidification du groupe amine du dérivé pipérazinique par le chlorure de butanoyle se déroule à froid (vers 50C) en solution dans le dichlorométhane. Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation continue jusqu'à la fin de la réaction dont l'évolution est suivie par chromatographie sur couche mince.Les produits sont synthétisés respectivement à partir de la 1-phénylpipérazine (1-PP)la, de la 1-(3-chlorophényl) pipérazine (mCPP)lb, de la benzhydrylpipérazine ou diphénylméthylpipérazine (BHP)lc, de la 1-pipéronylpipérazine (PO)ld et de la N-ss-hydroxyéthylpipérazine (HEP)le. Les sels respectifs comme les chlorhydrates sont préparés pour les essais pharmacologiques. Réaction générale Les composés sont préparés par réaction des diverses pipérazines monosubstituées Ia-é à l'aide du chlorure de butanoyle 2, en solution dans le dichlorométhane vers 50C. Les amides correspondants attendues, sont obtenus avec d'excellents rendements. EXEMPLE II Etude pharmacologique des composés selon l'invention 1 - Action cardio-vasculaire de type anti-hypertenseur, notamment le (POB) 2 - Effet psychotrope de type neuroleptique, notamment le (mCCPB) 3 - Inducteur de la différenciation cellulaire, notamment le (PPB) 4 - Activité anti-rétrovirale, notamment le (PPB) 50- Activité spasmolytique, notamment le (POB) et le (BHPB) EFFETS SUR LES ORGANES ISOLES - Essai de chaque substance à différentes concentrations, croissantes et cumulatives, avec enregistrement des modifications éventuelles des concentrations spontanées des fibres musculaires lisses. - Mise en évidence d'une éventuelle action spasmologique de type neurotrope ou musculotrope. On a recherché si les substances essayées modifiaient l'activité contracturante de l'Acétylcholine d'une part, et du chlorure de baryum d'autre part. - Un essai ponctuel a été réalisé avec le BHPB. Les concentrations spontanées ont été enregistrées en présence de concentrations croissantes en calcium dans le liquide de Tyrode, en l'absence puis en présence de BHPB. (La concentration initiale du Tyrode était réduite à 0,2 mM en CaCl2). Résultats expérimentaux a) Effets sur les contractions spontanées de l'intestin - Le POB id La DE50 déduite des mesures est de 2 mM à 5 mM, la préparation est totalement relaxée - Le BHPB ic Effets sur les contractions spontanées : la courbe dose/réponse montre une DE50 = 20 ijM. b) Recherche d'une action spasmolytique (antagonisme de l'Acétylchloline) - POB Ce composé montre un effet relaxant des muscles lisses dès 1 uM. L'acétylcholine n'est pas antagonisée par un traitement préalable de la préparation du POB. Son effet contracturant se retrouve intact. - BHPB I1 n'influence pas l'effet de l'acétylcholine (antagonisme du BaCl2) - POB Quell que soit la dose de POB (10-4 à 5 mM) ajoutée à la préparation, le BaCl2 n'est pas antagonisé. On peut donc exclure une activité musculotrope du POB. - BHPB L'activité musculotrope du BHPB est notée sur un nombre d'expériences réduit et ne peut être déterminée avec précision. A titre indicatif, 10-4 mM de BHPB inhibe totalement les contractions provoquées par le chlorure de baryum. c) Action sur les contractions spontanées avec variation de concentration en calcium Les contractions des cellules musculaires lisses sont sous la dépendance de Ca2+. Lors de la contraction, la concentration en ion calcium est multipliée par 25 à 50 fois (ENDO et al 1977). Le potentiel électrochimique est en faveur d'une entrée des ions Ca2+ à l'intérieur de la cellule. Afn de compléter l'étude sur l'aorte isolée, exposée ci-après, une recherche d'interférence du BHPB avec les ions calcium a été entreprise sur un intestin isolé privé de calcium extracellulaire. Elle consiste à enregistrer la force contractile spontanée sous l'influence de concentrations externes de calcium, en présence ou l'absence de prétraitement. Les concentrations en CaCl2 sont modifiées progressivement en ajoutant du CaCl2 pour avoir une concentration finale de 1 mM; 2,5 mM, 5 mM, 6,8 mM. Les résultats montrent que les contractions spontanées dans ces conditions expérimentales sont influencées par l'addition de calcium seul, puisque les variations des contractions sont de l'ordre de 20 à 30%. Inversement, il y a une relaxation de l'intestin de 10 à 20% quand le calcium est ajouté 30 secondes après le BHPB. La relaxation de l'intestin est plus intense avec le BHPB seul. Le BHPB semble antagoniser le calcium pour son effet contracturant des fibres lisses. EFFETS SUR L'AORTE ISOLEE Matériels et méthodes - le 4-butanoyl-l(phényl)pipérazine la (PPB) - le 4-butanoyl-l(dihénylméthyl)pipérazine le (BHPB) - le 4-butanoyl-1(3,4-méthylèndioxybenzyl)pipérazine (POB) Id - Vérapamil Le PPB et le Vérapamil sont dissous dans l'eau puis dilué dans la solution de Krebs. Le BHPB et le POB sont solubilisés dans l'éthanol absolu puis dilués dans la solution de Krebs. L'aorte thoracique de rat isolée, coupée en bandelettes spiralées est placée dans un bain contenant la solution de Krebs dont la composition est la suivante (mM) NaCl 112,0 KCl 5,0 MgS047H20 1,2 KH2PO4 1,0 CaCl2 2H20 1,25 NaHCO3 25,0 glucose 11,5 La solution est aérée avec 95% d'oxygène et 5% de C02 et incubée à 370C. Une tension de ig est appliquée à la bandelette d'aorte qui, après 1 h d'incubation, est contractée par la solution de Krebs enrichie en K+ et de composition suivante (mM) (RAZZETI, 1984). NaCl 17,0 KCl 100,0 MgS047H20 1,2 KH2PO4 1,0 CaCl2 2H20 1,25 NaHCO3 25,0 glucose 11,5 Quant les contractions sont stabilisées, les composés sont ajoutés par dose cumulative selon la méthode décrite par VAN ROSSUM 1963. Les réponses sont mesurées à l'aide d'un microdynamomètre enregistreur U.Bazile. Elles sont exprimées en pourcentage d'inhibition de la contraction initiale. La concentration inhibitrice de 50% des contractions initiales (Cl50) est obtenue graphiquement. Résultats et discussion Principe Les fragments d'aorte isolée sont contractés par du KCl. La dépolarisation de la membrane de la cellule musculaire lisse par le K+ augmente l'entrée du Ca2+ extracellulaire par les canaux calciques, ce qui conduit à la contraction du vaisseau. L'interaction des différents produits avec cet agoniste (Ca2+) est recherchée sur ce modèle. La pente de la courbe du BHPB est plus abrupte que celle du POB. Avec le PPB on n'arrive pas à relaxer les vaisseaux. Pour avoir une action inhibitrice calcique, ces produits doivent être présents à des concentrations élevées. Les Cl50 sont de 0,1 mM pour le BHPB et 0,2 mM pour le POB. Dans le même modèle, la flunarizine a une Cl50 de 0,045 mM (MATSUI). A 0,01 mM on n'a que 30% d'inhibition de la contraction. I1 faut remarquer que ces résultats sont proches de ceux trouvés sur un modèle similaire avec le butyrate de sodium (Cl50 de 0,8 mM - NUTTING). Ce test préalable indique que ni le BHPB, ni le POB n'inhibent le mouvement du calcium. TABLEAU C150 des composés testés sur aorte isolée PRODUITS Cl50 BHPB 0,1 mM POB 0,2 mM PPB ACTION SUR LE COMPORTEMENT ET L'ACTIVITE MOTRICE Matériels et méthodes Les substances testées - (mCPPB) : 4-butanoyl-(métachlorophényl)pipérazine lb - chlorpromazine : témoin actif Les tests sont réaliés sur des souris blanches (Mus musculus, variété albinos, souche SWISS) pesant entre 18 et 23 g. Chaque test est effectué sur un lot de 10 souris maintenues à jeun depuis 2 heures dans une cage de Makrolon. Le lot témoin reçoit soit du sérum physiologique, soit du glycérol formal dilué dans le sérum physiologique (pour le mCPPB). La substance de référence est la chlorpromazine.Chaque composé est injecté par voie intra-peritonéale à raison de 0,1 ml pour 10 g de poids corporel. Pour la comparaison des moyennes, on a appliqué le test de Student. Les différents tests effectués - effets sur la température centrale - effets sur l'activité motrice - test de la traction - test de la tige tournante (Rota-Rod) - mise en évidence d'une action cataleptique - le test d'évasion Pour chacun des tests, 8 lots de souris sont utilisés - 1 lot reçoit le sérum physiologique (témoin négatif de la chlorpromazine) - 3 lots reçoivent la chlorpromazine (témoin positif) - 1 lot reçoit du glycérol formal dilué dans le sérum physiologique (15%) - 3 lots reçoivent le mCPPB (24 mg/kg) Effets sur la température centrale Les souris sont maintenues à la température ambiante (200C). La température est mesurée avant toute administration des produits puis 1 h 30 après le traitement. La température est appréciée à l'aide d'une sonde reliée à un thermotron. En dessous de 320C, la température est notée Mesure de l'activité motrice On mesure à l'aide d'un 11actimètre'1 de type cage à écureuil, les déplacements effectués par une souris en situation libre. L'appareil comporte une roue que l'animal peut faire tourner. Un contact à mercure permet l'enregistrement de chaque demi-évolution par un totaliseur. 30 minutes après l'injection du produit à tester, on procède à la mesure en plaçant les souris individuellement dans la cage à écureuil. On relève le nombre de demi-évolutions effectuées par l'animal pendant une période de 5 minutes. Test de traction Il consiste à susprendre des souris par les pattes antérieures à un fil métallique tenu horizontalement. On considère comme soumis à une action sédative, tout animal qui ne parvient pas à effectuer, en 5 secondes, un rétablissement qui amène au moins l'une de ses pattes postérieures à toucher le fil, traction que tous les animaux témoins effectuent en moins de 5 secondes. Les souris sont chronométrées et on attribue le temps minimum de 3 secondes aux souris effectuant immédiatement un rétablissement. Les souris incapables d'effectuer le rétablissement sont assimilées pour plus de facilité à des souris mettant plus de 20 secondes. Les mesures sont effectuées 30 minutes après l'administration du produit. Le test de la tige tournante (Rota-rod) On détermine le temps pendant lequel une souris placée sur un axe tournant à vitesse lente (10 à 15 tours/minutes), est capable de s'y maintenir. L'appareil est constitué d'une tige rugueuse horizontale qui tourne à vitesse constante 10 tours/mn. Les souris sont déposées sur cette tige 30 mn après l'administration des composés. On note le temps au bout duquel celles-ci tombent ( Action cataleptique par le test des barres parallèles Le système est composé de 2 fils métalliques de 1 mm de diamètre, parallèles et horizontaux, distants de 6 cm. On place la souris de manière que les pattes antérieures prennent appui sur l'un des fils et les pattes postérieures sur l'autre fil situé 2 cm plus bas. La souris doit supporter cette situation anormale et imposée pendant au moins 20 secondes sans chercher à en changer. - une souris qui ne reste que 10 secondes dans la position inconfortable est notée + et comptée 0,5. - une souris non cataleptique est notée et comptée 0. Ce test est effectué 1 h 30 après l'injection par voie intrapéritonéale du produit à tester. RéSULTATS Effets sur la température centrale Le tableau 2 montre les variations de la température (%) par rapport au lot témoin. TABLEAU 2 Variation de la température centrale chez la souris Produit TO initiale TO à 90 mn Z variation Témoin Sérum 36,9 + 0,34 37,1 i 0,33 physiologique Chlorpromazine 36,7 + 0,28 35,43 + 0,47 - 4,5% ( 1 mg/kg) Chlorpromazine 37 t 0,29 32,3 ~ 0,54 - 12,9% (2 mg/kg) Chlorpromazine 37,02 t 0,21 32,13 t 0,19 - 13,4% (5 mg/kg) Témoins (glycérol formal) 36,45 + 0,12 36,68 + 0,04 + sérum physiologique mCPPB 37,65 j 0,06 32,06 + 0,06 - 12,60% (24 mg/kg) Le mCPPB a une action hypothermisante à 24 mg/kg. A cette dose, il est plus hypothermisant que le chlorpromazine à 1 et 2 mg/kg. Son activité est équivalente à celle obtenue par 5 mg/kg de chlorpromazine. Mesure de l'activité motrice par le test de la cage à écureuil Le tableau 3 montre le nombre de demi-révolutions effectuées par les souris 30 mn après administration de sérum physiologique de chlorpromazine et de mCPPB par voie I.P, et le pourcentage de variation par rapport au lot témoin. TABLEAU 3 Activité motrice chez la souris Produit m + ESs Z variation Témoin Sérum 151,8 i 74,2 physiologique Chlorpromazine 47,8 i 23,5 - 68,5 % (1 mg/kg) Chlorpromazine 38,6 i 24,9 - 74,5 % (2 mg/kg) Chlorpromazine 10,4 i 10,6 - 82,22 % (5 mg/kg) Témoins (glycérol formal) 86,89 i 12,3 + Eau physiologique mCPPB o - 100 % (24 mg/kg) L'action du mCPPB est très importante. Elle est supérieure à celle provoquée par 5 mg/kg de chlorpromazine. Les souris ne perdent pas le réflexe de redressement, signe d'un effet hypnotique. Il faut remarquer la différence entre le sérum physiologique et le solvant (GF + Sérum physiologique). Mise en évidence d'une activité cataleptique par le test des barres parallèles Le tableau 4 montre le nombre d'animaux cataleptiques 60 mn après administration des produits testés et les témoins correspondants. Le pourcentage de variation par rapport au témoin est relevé. TABLEAU 4 Activité cataleptique chez la souris Produit Nombre X variation Témoin Sérum O physiologique Chlorpromazine 4 40 % (1 mg/kg) Chlorpromazine 8 80 % (2 mg/kg) Chlorpromazine 9 90 % (5 mg/kg) Témoins (glycérol formal) 0 + Eau physiologique mCPPB 10 100 % (24 mg/kg) Discussion La catalepsie observée lors des essais de toxicité est vérifiée à la dose utilisée (24 mg/kg). Le pourcentage d'animaux cataleptiques à la dose de 24 mg/kg est de 100 %, il est donc supérieur à celui obtenu par la chlorpromazine à 5 mg/kg. Test de la traction Le tableau 5 montre le rétablissement ou non des souris ayant reçu du sérum physiologique, de la chlorpromazine ou le mCPPB et son témoin. TABLEAU 5 Action du mCPPB sur le tonus musculaire de la souris Produit Rétablissement Témoin sérum physiologique Chlorpromazine (1 mg/kg) Chlorpromazine + (2 mg/kg) (limite) Chlorpromazine + (5 mg/kg) Témoin glycérol formal mCPPB + (24 mg/kg) L'action du mCPPB sur le tonus musculaire est très significative puisqu'aucune des 10 souris ne rétablit la patte postérieure sur le fil. La chlorpromazine a une action intense à 5 mg/kg. Test de la tige tournante (Rota-Rod) La tableau 6 présente le temps de maintien, en secondes, des souris ayant reçu les substances ou les témoins, ainsi que le pourcentage de variation. TABLEAU 6 Produit i + ES X variation Témoin Sérum 764 + 267 physiologique Chlorpromazine 604 j 372,9 - 20,8 Z (1 mg/kg) Chlorpromazine 480 + 354 - 37,1 Z (2 mg/kg) Chlorpromazine 16,4 i 15,4 - 97,8 Z (5 MG/KG) TÉMOINS (glycérol formal) 504 t 24 + Eau physiologique mCPPB 39,36 + 1,10 - 92,19 Z (24 mg/kg) Une inhibition totale est obtenue avec le mCPPB à 24 mg/kg ainsi qu'avec la chlorpromazine à 5 mg/kg. Discussion : De ces différentes études préliminaires, on peut noter - une activité leptique démontrée par le test de la cage à écureuil - la forte hypothermie et la présence de catalepsie indique l'activité de type neuroleptique qui est confirmée par les tests de traction et de la tige tournante, qui montrent par ailleurs, une diminution du tonus musculaire. Dans tous les essais, l'action du mCPPB (24 mg/kg) est au moins équivalente à celle de la chlorpromazine à 5 mg/kg. D'autre part, le rapport DLsO/dose active est de 350/24=14,58. I1 s'agit donc d'un indice très intéressant à préciser par d'autres essais utilisant des doses plus faibles ainsi que par des tests complémentaires d'antagonisme et surtout de potentialisation (ex. potentialisation du sommeil, toxicité de groupe, stéréotypie et activité anticonvulsivante). Le mCPPB contient dans sa structure le mCPP qui est le métabolite de la trazodone (un anti-dépresseur) (CACCIA, 1990). Le mCPP est un agoniste sérotoninergique qui réduit l'activité motrice des souris chez qui il provoque aussi une baisse de température proportionnelle à la dose (MURPHY, 1991). L'étude approfondie d'antagonisme nta pas permis d'identifier le sous type de récepteur 5-HT3 impliqué dans l'effet thermique du mCPP (FRANCES, 1988). Par contre, lors de l'étude de comportement qui est le test prédictif de l'efficacité antipsychotique, le mCPP déplace les ligands pour les sites 5-HT1, 5-HTXA et 5-HT2 avec un KI respectif de 25, 23 et 40 nM (MARTIN, 1988). En attendant les résultats de travaux en cours, on peut remarquer que le mCPP et le mCPPB ont les mêmes effets sur la température centrale et sur la catalepsie. Par ailleurs, les essais préliminaires sur les poissons combattants du Siam (Betta splendens), semblent confirmer cette activité leptique. EFFETS CARDIO-VASCULAIRES Résultats expérimentaux Les composés testés Le POB est retenu pour une étude approfondie. En effet, quelques essais ont montré une action hypertensive nette pour le mCPPB, et une régularité de réponse au BHPB. Celle-ci est entachée d'erreur puisque le composé étudié est solubilisé dans le glycérol formal. L'HEPB n'a aucune influence sur la pression artérielle et le rythme cardiaque. On a vérifié, par ailleurs, que ces paramètres ne présentaient aucune modification significative quand les rats sont traités par le sérum physiologique. Influence du POB sur la pression artérielle La pression artérielle moyenne initialle des deux lots d'animaux utilisés était respectivement de 164 et 163 mm de mercure pour le POB et le vérapamil. La chute de la pression artérielle croît avec l'augmentation des doses pour les deux substances chimiques. Le tableau 7 rapporte les pressions artérielles moyennes (PAM) pour POB. L'hypotension est franche dès le début de l'injection, atteint son maximum à la fin de celle-ci puis diminue pour atteindre la ligne de base après un temps fonction de la dose (tableau 7). Cet effet est dose dépendant jusqu'à 35 mg/kg. - le délai d'apparition de l'hypotension ne dépasse pas 15 secondes - la durée de l'hypotension augmente avec la dose -la dose qui provoque une baisse de 50D de la variation maximale (DE50)=12 mg/kg. A cette dose, l'hypotension est notable pendant plus de 2 mn. TABLEAU 7 Variation de la pression artérielle et de sa durée en fonction de la dose (POB 3d) mZ var de PAM durée (minutes) Doses (mg/kg) + ES i de la chute tensionnelle 5 - 8,19 + 3,12 0,87 10 - 11,63 + 1,98 2,05 15 - 21,59 t 2,81 2,99 20 - 24,19 t 2,55 4,48 25 - 25,55 + 3,08 6,96 30 - 28,48 t 3,08 4,93 35 - 35,90 i 2,02 4,29 40 - 32,94 + 2,01 10,55 Le Vérapamil provoque une hypotension dose-dépendance qui atteint son maximum à la dose de 0,1 mg/kg. La durée est beaucoup plus prolongée. Influence du POB sur le rythme cardiaque L'effet bradycardisant est brutal et commence dès l'injection de la dose la plus faible provoquant une hypotension (5 mg/kg). La bardycardie est proportionnelle à la dose jusqu'à 15 mg/kg. Toxicité et induction de la différenciation cellulaire Toxicité De tous les dérivés testés, seuls le PPB et HEPB présentent une toxicité acceptable. Parmi ces deux dérivés butyriques, la 4-butyryle l-phénylpipérazine est capable d'induire la différenciation à des concentrations comparables, voisines de celles observées avec le composé de référence MAG-3-But. Ceci se traduit par une normalisation du phénotype des cellules MSV qui, telles des cellules non malignes, perdent leur morphologie sphérique et reprennent une forme fibroblastique allongée (POUILLART). TABLEAU 8 Cytotoxicité et induction de la différenciation Induction de la Produits cytotoxicité (1H) différenciation MAG-3-But 7 0,5 à 1 PPB 4 à 5 0,5 à 1 BHPB 0,1 POB 2 HEPB 4 mCPPB 0,5 (-) : n'induit pas la diffférentiation cellulaire de 0,1 à 10 mM Potentialisation de l'effet antiviral de l'interféron L'activité potentialisatrice de l'interféron des nouveaux dérivés butyriques induisant la différenciation cellulaire (paragraphe récédent) et surtout de la 4-butyryl l-phénylpipérazine est équivalente à celle observée avec le produit de référence MAG-3-But préalablement publiée (POUILLART, 1992).On a constaté qu'à partir de 10 U.I d'interféron, l'inhibition de la réplication virale est beaucoup plus forte que pour la série témoin "IFN seul". Un maximum d'inhibition est atteint avec 1 mM de butyrate + 160 U.I d'IFN ,ss B sur ce modèle : titre hémagglutinant de 2, alors que l'IFN SEUL, à cette dose de 160 U.I, ne procure qu'un taux de 64 soit un gain de 32 fois moins d'interféron pour arriver au même résultat biologique. Le BHPB est quant à lui, inactif. Il ne module pas l'interféron. Ces résultats concourent à montrer qu'en présence de butyrate, la sensibilité à l'interféron des cellules MSV est augmentée pour atteindre un seuil comparable à celui d'une cellule fibroblastique non maligne. Le butyrate semble préparer la cellule à l'action future de l'interféron exogène comme l'a démontré POUILLART et al. (1991). Il est à remarquer que les butyrates, quelle que soit leur formule, n'inhibent pas le virus à eux seuls. En effet, lorsque les cellules prétraitées par les butyrates ne reçoivent pas d'IFN avant d'être infectées par l'EMC (concentration IFN=O), le titre expérimental : 2048 HA est égal à celui des témoins : 2048 HA. Ceci confirme les résultats obtenus avec d'autres dérivés (POUILLART, 1992b). CONCLUSION Parmi les composés testés, le PPB est inducteur de la différenciation cellulaire. En effet - il modifie le phénotype malin des cellules hautement transformées pour le "normaliser" en phénotype fibroblastique - il retaure une sensibilité quasi normale des cellules malignes à l'interféron (mise en évidence par un test de challenge infectieux in vitro).D'un point de vue général, le fait de retrouver une activité biologique semblabe en tout point sur ce modèle pour une molécule de structure différente du MAG-3-But et dont l'unique point commun réside dans la présence d'une harge butyrique hydrolysable, suggère le mécanisme d'action suivant un passage transmembranaire passif des composés au niveau cellulaire, plutôt qu'un système de récepteur suivi d'une cascade d'évènements biochimiques intracellulaires conduisant à l'effet biologique observé une hydrolyse progressive de la charge butyrique, non spécifique de la structure globale du véhicule,, par les esterases et amidases intracellulaires libérant ainsi le principe biologiquement actif, d'où la notion de prodrogue. Ceci est conforté par les travaux de cinétique "in vitro" de P.POUILLART (thèse, 1991) qui montre que 1. l'induction de la différenciation par le MAG-3-But est considérablement prolongée dans le temps comparativement à un traitment par le sel d'arginine ou de sodium de l'acide n-butyrique 2. et surtout que cette induction se maintient longtemps même après que le MAG-3-But ait été rtiré du milieu de culture, alors que celle-ci disparait rapidement dans le cas du sel correspondant. ACTIVITÉ BNTI-RÉTROVIRBLE ROMERO et al. (1991) ont testé des arylpipérazines ainsi que des bis(hétéroaryl)pipérazines sur des souris infectées par HIV-1, et évalué leur activité inhibitrice de la reverse transcriptase. Par ailleurs, le bytyrate de sodium a montré une inhibition du virus herpetique type 1 cultivé sur des cellules VERO (DANIEL & PIERI, 1985). Les composés selon l'invention contiennent un groupement arylpipérazine couplé au butyrate, ce qui a conduit à les tester sur un rétrovirus et sur sa reverse transcriptase. Matériel et méthodes 1. Les pipérazines utilisées Dans un premier temps, on a évalué le PPB 3a, le POB 3d et l'HEPB 3e qui sont très solubles dans l'eau. Un premier test a permis de retenir le PPB 3a. 2. Les cellules utilisées - cellules NTH/3T3 chroniquement infectées par le virus de Friend (cellules F57) (OLIFF et al. 1980) - cultivées dans un milieu Eagle modifié par DULBECO (DMEM, Gibco Europe) contenant 5% de sérum de veau foetal décomplémenté (chaufé 30 mn à 560C), 100 pg/mL de strptomycine et 100 v/mL de péniciline. Les cellules ont poussé dans une étuve à 370C avec 5% de CO2. Le test de transcription inverse L'activité de la polymérase inverse du virus de MOLONEY est déterminée sur une matrice oligo (dT)12-18:poly A, par mesure de l'incorporation de (3H)dTTP dans la fraction précipitable. La radioactivité est proportionnelle à l'activité transcriptase inverse. 1 U.I : c'est la quantité qui incorpore une nanomole de DTTP en 10 mn à 370C en utilisant le polyA comme matrice oligo (dT)12-18. Le milieu réactionnel Tris HCl pH=7,5 ................ 20 mM MgCl2 .......................... 10 mM Dithiotritol (DTT) ............. 50 mM NaCl ........................... 20 mM Poly A (Pharmacia) ............. 150 mM (3H) dTTP (NEN) ................ 1,5 mCi Reverse transcriptase .......... 1,5 mM (activité 200 UI/mL) PPB ............................ 1 mM, 2,5 mM, 5 mM Après une heure à 370C, la réaction est arrêtée par 1 mL d'EDTA (0,1 M) et 5 mL d'ADN de thymus de veau (1 mg/mL) (entraineur) à 40C. Le mélange réactionnel est alors déposé sur des filtres (type HA Millipore) qui sont ensuite plongés dans du T.C.A à 10% (Acide trichloracétique). Après rinçage et séchage des filtres, la radioactivité est comptée en présence du scintillant. Le focus immunoassay "FIA" : La FIA permet d'évaluer la présence de gp70 (protéine de l'enveloppe virale) au niveau de la membrane cellulaire. a) principe Lors de la réplication virale, une partie des protéines de l'enveloppe reste au niveau de la membrane cellulaire. La présence de ces protéines témoigne de la réplication virale. Lors d'une infection virale sur des cellules poussant en mono-couche, la dissémination virale se fait de deux manières. Lors de leur division cellulaire, les cellules infectées vont transmettre le provirus qui va ainsi s'exprimer chez les cellules filles. De plus, les virus qui sont libérés dans le milieu de culture peuvent infecter les cellules de proche en proche. Ces deux mécanismes vont créer des foyers de cellules infectées.Ces foyers sont détectables par des anticorps dirigés contre les protéines virales de l'enveloppe présentes à la surface des cellules infectées (SU gp70). Il sufit alors de révéler le premier anticorps par un second, qui est couplé à la peroxydase qui permet d'obtenir des foyers bruns en catalysant la réaction ci-dessous Peroxydase Aminoethylcarbazole + H202 ----- Imino-ethylcarbazole + 2H20 b) Essai proprement dit Le test est effectué dans des boîtes de 24 puits. 24000 cellules sont ensemenées par puits avec une dilution qui permet d'obtenir 100 foci (f.f.u) par alvéole. Les molécules à tester sont ajoutées aux cellules NTH/3T3 à différentes concentrations de 0,25 à 1,2 mM à raison de 0,25 mM, soit avant le virus (24 h), soit en même temps que celui-ci. Après 96 h d'incubation, le surnagant est éliminé. La première étape du FIA est l'incubation (30 mn) des cellules avec l'anticorps de souris anti-gp70 (CHESEBRO et al. 1981) suivie de lavage à l'eau physiologique stérile. Le second anticorps de chèvre anti-souris couplé à la péroxydase est ajouté pour une incubation de 30 mn. Les cellules sont rincées deux fois avec du TNE (Tris HCl 20 mM, pH=7,6 - NaCl 100 mM et EDTA 1 mM). 0,5 mL d'une solution de révélation préparée extemporanément sont ajoutés et laissés au contact pendant 20 mn à l'obscurité (le papier aluminium recouvrant la plaque). La solution substrat de la péroxydase est préparée à partir d'une solution stock de 3-amino-9-étylcarbazole (Sigma) (4 mg/mL) dans du diméthylformamide, conservé à -200C et à l'obscurité. On ajoute à un volume de la solution stock 24 volume de tampon d'acétate de sodium (0,05 M pH=5) et 1 mL de H202 30% pour 2 mL de solution. Les cellules sont rincées, séchées et les foyers colorés en brun sont comptés à la loupe binoculaire. Résultats : a) action du PPB sur la transcription reverse "in vitro" Les essais préliminaires à forte concentration (entre 10 mM et 75 mM) montrent une inhibition presque complète de l'incorporation de thymidine tritiée (88 à 96%). Le PPB a été alors sélectionné pour les épreuves "in vitro et "ex vivo" puisque 1'HEPB fournit des résultats très variables et que le POB permet une incorporation de radioactivité supérieure à celle mesurée pour par le PPB. Les pourcentages sont calculés par rapport aux témoins positis (sans PPB). On établit le pourcentage dtinhibition de la transcriptase inverse en fonction de la concentration du PPB. L'inhibition de transcriptase inverse est nette dès lmM et augmente avec la dose. A 5 mM, le PPB inhibe 32% de l'activité enzymatique, c'est-à-dire l'incorporation de 3H-thymidine. La spécificité de cette action reste à déterminer en premier lieu avec une polymérase a et 8. Ces doses doivent être comparées à celles des bishétéroarylpipérazines (DE50 de 1 à 10 pM) (ROMERO, 1991) et à celles de 1'AZT (Cl50 = 1,6 nM) (LAVIGNON, 1991), mais celui-ci est très toxique pour les cellules. b) Essai reverse transcription "ex vivo" (FIA) : TEST A: Le PPB, le virus et les cellules sont mis à incuber en même temps pendant 96 h (changement du milieu à 24 h). Le nombre de foyers est une moyenne sur 4 puits. Un effet-dose est net dans cette gamme de concentration. A 0,75 mM le PPB n'est pas toxique sur les cellules et prooque une inhibition de 33% de la rétro transcription. TEST B Le PPB est mis en contact des cellules pendant 24 h avant le virus. Le milieu est changé et le virus additionné pour une incubation de 96 h. La FIA fournit les résultats qui sont dose-dépendants. A 0,5 mM et 0,75 mM, l'inhibition est sensiblement la même (35%) que dans le test A. A 1,2 MM de PPB, l'inhibition est de 48%. Dans ce test, le PPB est mis en contact des cellules avant l'addition du virus afin de le mettre dans les mêmes conditions d'induction de différenciation. On obtient alors une inhibition de 22% de la production des glycoprotéines virales de surface, alors que dans le test A, l'inhibition n'est que de 6%. Y a-t-il un efet indirect de la synchronisation des cellules sur la réplication virale, ou un effet direct lié à l'accessibilité de la molécule dans le cellule ? Si c'est le cas, le problème de libération du butyrate au niveau de la cellule est à démontrer. Quoi qu'il en soit, cette activité antirétrovirale du PPB prouve qu'il agit différemment du butyrate puisque celui-ci se révèle inducteur du virus dormant. En effet, BOHAN et al. (1989) observent une augmentation de 30 à 50% du titre viral dans le surnageant issu de cultures de cellules HeLa transfectées par un plasmide (p Z6 néo) et exposées à 6 mM de butyrate de sodium pendant 72 heures. Alors que le butyrate altère le métabolisme des cellules infectées et leur confère un environnement cellulaire propice à la réplication du virus HTV1, le PPB semble agir dans le sens inverse puisque la multiplication virale évaluée par 1 gp SU70 est réduite. CONCLUSIONS GENERALES L'étude toxicologique des amides butyriques chez la souris a montré des doses létales 50 très acceptables conduisant à un indice favorable. Les résultats préliminaires de l'étude de triage pharmacologique des composés synthétisés a permis de choisir quatre molécules différentes et ayant chacune un spectre d'action relativement spécifique. - la 4-butanoyl-1-(phényl) pipérazine 3a (PPB) qui se révèle comme un inducteur de la différenciation cellulaire, de même qu'elle potentialise l'efet antiviral de l'interféron "in vitro" sur le virus de l'encéphalomyocardite (EMC). Cette même molécule montre une activité non négligeable au niveau de la transcription inverse "in vitro, laquelle est corroborée par un test ex vivo sur les cellules NTH 3T3. L'inhibition de 42% de la réplication virale est atteinte à 1,2 mM. Ceci permet d'envisager l'éventualité d'association de ce composé avec l'interféron en vue de potentialiser l'activité de celui-ci sur les cellules tumorales chez l'animal. - la 4-butanoyl-1-(3,4-methylène dioxybenzyl) pipérazine 3d (POB) se révèle antihypertenseur et bradycardisant chez le rat SHR. Aucun mécanisme d'action n'a pu être déterminé lors de cette étude préliminaire de ce composé. - la 4-butanoyl-1-(diphénylméthyl) pipérazine 3c (BHPB) inhibe les contractions spontanées de l'intestin au niveau duquel il semble antagoniser le calcium extracellulaire. Elle inhibe modestement les contractions de lambeaux d'aorte précontractés par le chlorure de potassium. Ce dernier test prédictif de l'inhibition calcique permet de la comparer à la flunarizine à laquelle elle est apparentée par le groupement benzhydrylpipérazine. L'étude de la pression artérielle et du rythme cardiaque amène à préparer des sels autres que les chlorhydrates. En effet, les chlorhydrates de ce composé se sont révélés peu solubles dans l'eau et leur dissolution dans le glycérolformal entâche les résultats d'erreurs inhérentes à l'activité hypotensive de ce dernier solvant. - la 4-butanoyl-1-(3-chlorophényl) pipérazine 3b (mCPPB) est le composé qui a montré l'effet le plus important sur le comportement et l'activité motrice chez la souris. L'activité cataleptique et hypothermisante est très nette et comparable à celle de la chlorpromazine. Son étude permet donc de continuer son exploration afin de déterminer son profil pharmacologique et d'élucider son mécanisme d'action. - la 4-butanoyl-1-(2-hydroxyethyl) pipérazine 3e (HEPB) a montré une moindre influence sur les différents systèmes étudiés. Ce composé non toxique chez la souris, ne présente pas de noyau aromatique. Du point de vue structure-activité, on peut dégager l'importance du chlore, élément attracteur d'électrons, augmentant la lipophilie de la molécule, dans la détermination de l'activité au niveau du système nerveux central. Généralement, les groupements pipéronylpipérazine et benzhydrylpipérazine ont un profil cardiovasculaire, ce qui est le cas pour les composés POB et BHPB. REVENDICATIONS L'invention a pour objet 1 - De nouveaux pipérazinylbutyramides choisis dans le groupe constitué par - les phénylpipérazinyl butyramides de formule générale 1A dans laquelle R2 est de l'hydrogène ou un atome d'halogène ou un radical trifluométhyle ou forme avec R1 un groupement alcoylènedioxy R1 est de l'hydrogène, un alcoxy inférieur ou forme avec R2 un groupement alcoylènedioxy - les benzylpipérazinyl butyramides de formule générale IB dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un radical phényle R2 représente de l'hydrogène, un halogène ou forme avec R1 un radical alcoylènedioxy et R1 représente de l'hydrogène ou forme avec R2 un radical alcoylènedioxy - et les (hydroxyalcoyl)rpipérazinyl butyramides de formule Ic dans laquelle n est égal à 1, 2 ou 3 2 - Les sels des pipérazinylbutyramides selon la revendication 10 aec un acide minéral ou organique. 3 - Un composé selon la revendication 10 ou la revendication 20 à savoir la 4-butanoyl 1-phénylpipérazine et son chlorhydrate. 4 - Un composé selon la revendication 10 ou la revendication 20 à savoir la 4-N-butanoyl 1-(3-chlorophényl) pipérazine et son chlorydrate 50- Un composé selon la revendication 10 ou la revendication 20 à savoir la 4-butanoyl 1-benzhydryl pipérazine et son chlorhydrate. 6 - Un composé selon la revendication 10 ou la revendication 20 à savoir la 4-butanoyl 1-pipéronylpipérazine et son chlorhydrate. 7 - Un composé selon la revendication 10 ou la revendication 20 à savoir la 4-butanoyl l-(hydroxyéthyl) pipérazine et son chlorhydrate. 8 - Un procédé d'obtention des pipérazinylbutyramides selon l'une des reendication 1 à 70 dans lequel on soumet un dérivé pipérazinique choisi dans le groupe constitué par - les phénylpipérazines de formule IIA dans laquelle R1 et R2 ont les significations fournies précédemment - les benzylpipérazines de formule IIB dans laquelle R1 et R2 sont définis comme précédemment - et les (hydroxyalcoyl) pipérazines de formule IIC dans laquelle n est égal à 1, 2 ou 3 à l'action d'un dérivé fonctionnel d'acide butyrique dans un solvant inerte à basse température puis après séparation des amides ainsi formés les convertit, le cas échéant, en sels d'addition par ajout d'un acide minéral ou organique. 90- Les compositions pharmaceutiques renfermant, à titre de principe actif, au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 70, en association ou en mélange, avec un excipient ou un véhicule inerte, non-toxique, pharmaceutiquement-acceptable. 10 - Une composition pharmaceutique selon la revendication 90 dans laquelle la quantité de principe actif par prise unitaire s'échelonne de 1 à 100 mg.